HABILITATIONSSCHRIFT - Dissertationen Online an der FU Berlin

Aus dem CharitéCentrum für Chirurgische Medizin
Klinik für Allgemein-, Viszeral- und
Transplantationschirurgie
(Direktor: Prof. Dr. med. P. Neuhaus)
HABILITATIONSSCHRIFT
DIE BEDEUTUNG DER VASKULÄREN
NUKLEOSID-TRIPHOSPHATDIPHOSPHOHYDROLASE (NTPDase 1/CD39)
FÜR DEN HEPATISCHEN UND
INTESTINALEN ISCHÄMIEREPERFUSIONSSCHADEN IN DER MAUS
zur Erlangung der Venia legendi
für das Fach Chirurgie
vorgelegt der Medizinischen Fakultät
Charité – Universitätsmedizin Berlin
von
Dr. med. Olaf Guckelberger
geboren am 15. Juli 1967 in Berlin
eingereicht:
März 2007
Dekan:
Prof. Dr. med. Martin Paul
1. Gutachter: Prof. Dr. med. Holger Eltzschig
2. Gutachter: Prof. Dr. med. Ulrich Hopt
Für Anna Philine
Inhaltsverzeichnis 3
0 INHALTSVERZEICHNIS
0 Inhaltsverzeichnis
3
0.1 Abbildungen
6
0.2 Tabellen
8
0.3 Abkürzungen und Symbole
9
1 Einleitung
1.1 Nukleotide und purinerge Rezeptoren
11
11
1.1.1 Nukleotide
11
1.1.2 Purinerge Rezeptoren
14
1.2 Extrazellulärer Nukleotid-Stoffwechsel
18
1.2.1 Ekto-Nukleotidasen
18
1.2.2 Ekto-Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase (NTPDase)
19
1.2.3 Ekto-5’-Nukleotidase (5’-NT)
19
1.2.4 Vaskuläre Ekto-Nukleotidasen
21
1.3 CD39-Aktivität und Thrombogenese
22
1.3.1 Physiologische Thromboregulation
22
1.3.2 Ischämie und Reperfusion
24
1.3.3 Organtransplantation
25
1.3.4 Endothelzell-Aktivierung
26
1.4 cd39-null Mäuse
27
1.5 Hypothesen und Fragestellung
29
2 Material und Methoden
2.1 Tiermodelle
30
30
2.1.1 Tiere und Tierhaltung
30
2.1.2 Modell der intestinalen Ischämie
31
2.1.3 Modell der hepatischen Ischämie
31
2.1.4 Modell der heterotopen, xenogenen Herztransplantation
33
2.1.5 Modell der akuten toxischen Hepatitis
35
2.2 Behandlungsgruppen
35
2.2.1 NTPDase
35
2.2.2 Adenosin/Amrinon
36
2.2.3 A20-Gentransfer
36
Inhaltsverzeichnis 4
2.3 Überlebensstudien
37
2.4 Intravitale Videomikroskopie
38
2.4.1 Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen
38
2.4.2 Intestinales Kapillarleck
40
2.5 Intestinale Gefäßpermeabilität
42
2.6 Serum- und Gewebeproben
44
2.6.1 Probengewinnung
44
2.6.2 Serumzytokine und –VEGF
44
2.6.3 Myeloperoxidase-Aktivität
45
2.6.4 NTPDase-Aktivität
46
2.6.5 Histologie
47
2.7 Endothelzell-Aktivierung durch Nukleotide
48
2.8 Statistik
48
3 Ergebnisse
3.1 NTPDase-Aktivität in murinen Geweben
49
49
3.1.1 Native Mausgewebe
49
3.1.2 Intestinale Ischämie
56
3.1.3 Xenogene Herztransplantation
58
3.1.4 Akute toxische Hepatitis
60
3.1.5 Adenoviraler CD39-Gentransfer
62
3.2 Überlebensraten in den Ischämie-Reperfusionsmodellen
63
3.2.1 Modell der hepatischen Ischämie
63
3.2.2 Modell der intestinalen Ischämie
67
3.3 Thrombozyten-Adhäsion nach intestinaler Ischämie
71
3.4 Kapillarleck nach intestinaler Ischämie
73
3.4.1 Intravitale Videomikroskopie
73
3.4.2 Evans Blue Farbstoff
74
3.5 Serum- und Gewebemarker
76
3.5.1 Zytokine nach intestinaler Ischämie
76
3.5.2 Myeloperoxidase-Aktivität nach intestinaler Ischämie
78
3.5.3 Vascular-Endothelial-Growth-Factor (VEGF)
79
3.6 Endothelzell-Aktivierung durch Nukleotide
4 Diskussion
80
82
4.1 NTPDase-Aktivität in nativen Organen
82
4.2 NTPDase-Aktivität bei akuten Organschäden
85
Inhaltsverzeichnis 5
4.3 Bedeutung der NTPDase 1 für die hepatische Ischämietoleranz
88
4.4 Bedeutung der vaskulären NTPDase für den intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden 89
4.4.1 Ischämietoleranz
89
4.4.2 Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen
91
4.4.3 Vaskuläre Permeabilität
92
4.5 Resümee und Ausblick
93
5 Schlussfolgerungen
96
6 Zusammenfassung
98
7 Danksagung
101
8 Literaturverzeichnis
103
9 Erklärung
120
Inhaltsverzeichnis 6
0.1 ABBILDUNGEN
Nummer
Titel der Abbildung
Seite
1
Chemische Struktur der Adenosinnukleotide
12
2
Familie der plasmamembranständigen
Ekto-Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolasen (NTPDase)
20
3
Vaskuläre Ekto-Nukleotidasen
21
4
CD39 und Thromboregulation
23
5
Modell der hepatischen Ischämie
32
6
Modell der heterotopen, xenogenen Herztransplantation
34
7
Adhärente und rollende Thrombozyten in der intravitalen Videomikroskopie 39
8
Intestinales Kapillarleck in der intravitalen Videomikroskopie
41
9
Intestinale Gefäßpermeabilität
43
10
NTPDase-Aktivität des Gehirns
50
11
NTPDase-Aktivität der Lunge
50
12
NTPDase-Aktivität des Herzens
51
13
NTPDase-Aktivität der Leber
52
14
NTPDase-Aktivität des Pankreas
53
15
NTPDase-Aktivität der Niere
53
16
NTPDase-Aktivität des Jejunums
55
17
NTPDase-Aktivität der Milz
55
18
NTPDase-Aktivität des Jejunums nach intestinaler Ischämie
56
19
NTPDase-Aktivität des Mesenteriums nach intestinaler Ischämie
57
20
NTPDase-Aktivität der Spenderherzen nach xenogener Transplantation
59
21
NTPDase-Aktivität der Leber in der akuten toxischen Hepatitis
60
Inhaltsverzeichnis 7
Nummer
Titel der Abbildung
Seite
22
NTPDase-Aktivität des Jejunums nach adenoviralem CD39-Gentransfer
61
23
Überleben der cd39-Genotypen nach hepatischer Ischämie
63
24
Postmortale Befunde nach hepatischer Ischämie
64
25
Überleben nach hepatischer Ischämie unter
NTPDase- oder Adenosin-Substitution
65
26
Überleben nach hepatischer Ischämie und A20-Gentransfer
66
27
Überleben nach intestinaler Ischämie in Wildtyp-Mäusen
67
28
Histopathologie nach intestinaler Ischämie in Wildtyp-Mäusen
68
29
Überleben nach intestinaler Ischämie in cd39-heterozygoten Mäusen
69
30
Überleben nach intestinaler Ischämie in cd39-null Mäusen
70
31
Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen nach intestinaler Ischämie
72
32
Kapillarleck nach intestinaler Ischämie
73
33
Gefäßpermeabilität nach intestinaler Ischämie
75
34
Interleukin-1α nach intestinaler Ischämie
76
35
Interleukin-6 nach intestinaler Ischämie
77
36
Tumor-Nekrose-Faktor-α nach intestinaler Ischämie
78
37
Myeloperoxidase-Aktivität nach intestinaler Ischämie
79
38
Veränderungen des Zytoskeletts durch Nukleotid-Stimulation
81
Inhaltsverzeichnis 8
0.2 TABELLEN
Nummer
1
2
3
4
Titel der Tabelle
Seite
Zelluläre Mechanismen und pathophysiologischer Kontext der Freisetzung
von Nukleotiden in den Extrazellularraum
13
Überblick über die Nomenklatur und pathophysiologischen Funktionen
der Adenosin-Rezeptoren
15
Überblick über die Nomenklatur und pathophysiologischen Funktionen
der P2X-Rezeptor-Familie
16
Überblick über die Nomenklatur und pathophysiologischen Funktionen
der P2Y-Rezeptor-Familie
17
Inhaltsverzeichnis 9
0.3 ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE
Abkürzung oder Symbol
Definition
5’-NT
5’-Nukleotidase
ADP
Adenosindiphosphat
AMP
Adenosinmonophosphat
ATP
Adenosintriphosphat
AOI
Area of Interest
BSA
Bovines Serumalbumin
cAMP
Zyklisches Adenosinmonophosphat
CD39 oder CD73
Beschreibt das humane Protein
CD39
Beschreibt das humane Gen oder Gentranskript
cd39
Beschreibt das murine Protein
cd39 oder cd73
Beschreibt das murine Gen oder Gentranskript
cd39-/-
cd39-null
cd39+/-
cd39-heterozygot
cd39+/+
cd39-Wildtyp
cGMP
Zyklisches Guaninmonophosphat
D-gal
2-Amino-2-Deoxy-D-Galaktose
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EC
Endothelzellen
HUVEC
Humane aus Umbilikalvenen isolierte Endothelzellen
Ip
Perivaskuläre Lichtintensität
Inhaltsverzeichnis 10
Abkürzung oder Symbol
Definition
Iv
Lichtintensität der Venole
IL-1α
Interleukin-1α
IL-6
Interleukin-6
IPC
Ischämische Präkonditionierung
IRI
Ischämie-Reperfusionsschaden
LPS
Lipopolysaccharid
MPO
Myeloperoxidase
mRNA
messenger-Ribonukleinsäure
NO
Stickstoffmonoxid
NTPDase
Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase
OD
Optische Dichte
Pi
Freies Phosphat
PFU
Plaque Forming Units
PMN
Neutrophile Granulozyten
rCD39Ad
Rekombinante CD39-kodierende Adenoviren
RNA
Ribonukleinsäure
Sham
Scheinoperierte Versuchstiere
SMA
Arteria mesenterica superior
TNF-α
Tumor-Nekrose-Faktor-α
UTP
Uridintriphosphat
VEGF
Vascular-Endothelial-Growth-Factor
xCTX
Xenogene Herztransplantation
β-gal
β-Galaktosidase
Einleitung 11
1 EINLEITUNG
1.1 NUKLEOTIDE UND PURINERGE REZEPTOREN
1.1.1 Nukleotide
Die Bezeichnung Nukleotid geht auf die Erstbeschreibung des Nucleins (Nukleinsäure) im
Jahre 1871 durch Friedrich Miescher im Zellkern von Eiterzellen (Leukozyten) zurück
[Miescher, 1871]. 1929 identifizierte Phoebus Levene die Bausteine der Nukleinsäuren und
bezeichnete die Einheit aus Purin- oder Pyrimidinbase, einer Pentose und einem
Phosphatrest als Nukleotid (zitiert nach: [Dunn, 1991]). Die Verbindung aus einer solchen
Base und einer Pentose wird Nukleosid genannt. Entsprechend der Anzahl an Phosphatresten
wird
für
die
Nukleotide
die
Bezeichnung
Nukleosidmono-,
Nukleosiddi-
oder
Nukleosidtriphosphat verwendet.
Die biologische Bedeutung der Nukleotide ergibt sich aus ihrer Beteiligung an einer Vielzahl
intrazellulärer Funktionen. Als monomere Einheiten der Desoxyribonukleinsäure (DNA) und
der Ribonukleinsäure (RNA) kodieren sie die genetischen Informationen der Zelle und sind
direkt oder indirekt an allen spezifischen Leistungen einer Zelle beteiligt. Die energiereichen
Nukleotide, zumeist Adenosintriphosphat (ATP), sind zudem sowohl Endprodukte als auch
Regulatoren vieler Reaktionen des Zellstoffwechsels. Entsprechend etablierte Daniel
Atkinson 1968 das Konzept der Energieladung der Zelle, basierend auf den intrazellulären
Konzentrationen
der
drei
Adenosinphosphate
(Adenosinmonophosphat
(AMP),
Adenosindiphosphat (ADP) und ATP) [D. E. Atkinson, 1968]. Die zyklischen
Monophosphate der Purinbasen (zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) und zyklisches
Guaninmonosphosphat
extrazelluärer,
(cGMP))
hormoneller
hingegen
Signale
konnten
identifiziert
als
intrazelluläre
werden
(„second
Mediatoren
messenger“).
Einleitung 12
Des weiteren haben Adenosinnukleotide eine Bedeutung als Komponenten gruppen- oder
wasserstoffübertragender Koenzyme (Koenzym A, Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD),
Flavin-Mono-Nukleotid (FMN), Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD), NikotinamidAdenin-Dinukleotidphosphat (NADP)).
Abbildung 1: Chemische Struktur der Adenosinnukleotide. Die Purinbase Adenin (grün) bildet mit dem
Monosaccharid Ribose (blau, Pentose) das Nukleosid Adenosin. Entsprechend der Anzahl der
Phosphatreste (gelb) ergibt sich die Bezeichnung Adenosintriphosphat (ATP), Adenosindiphosphat
(ADP) oder Adenosinmonophosphat (AMP).
Einleitung 13
Physiologische Aktivitäten extrazellulärer Adeninderivate (Abbildung 1) wurden erstmals
1929 von Drury und Szent-Györgyi beschrieben [Drury,Szent-Györgyi, 1929]. Die
experimentelle, intravenöse Injektion von ATP führte zu einem Abfall der Herzfrequenz und
des arteriellen Blutdrucks. Im Jahre 1959 folgte als wesentlicher Schritt die Beschreibung
des ATP als Neurotransmitter durch P. Holton [Holton, 1959]. Die Identifikation der
verschiedenen Rezeptorklassen für Purinderivate (purinerge Rezeptoren) geht auf
grundlegende Arbeiten von G. Burnstock im Jahre 1978 zurück [Burnstock, 1978]. In den
neunziger Jahren konnte durch die Sequenzierung der verschiedenen purinergen Rezeptoren
eine Funktion der extrazellulären Purine in einer Vielzahl physiologischer und
pathophysiologischer Prozesse des Gefäß-, Immun- und Nervensystems nachgewiesen
werden: Reizweiterleitung an Synapsen, Nozizeption, Regulation des Gefäßtonus,
Regulation der Thrombozytenaggregation, Mastzelldegranulation, programmierter Zelltod
(Apoptose) immunkompetenter Zellen (zusammengefasst in: [Brake,Julius, 1996]).
Als Mechanismen der Sekretion der Nukleotide in den Extrazellularraum wurden sowohl die
Exozytose nukleotidreicher Granula, der Efflux durch Membrankanäle als auch die
Aufnahme in den Golgi-Apparat und die Ausscheidung in Transportvesikeln gemeinsam mit
Glykoproteinen beschrieben (Tabelle 1).
Zellulärer Mechanismus
Pathophysiologischer Kontext
Zelllyse
Zelltod (Nekrose)
Exozytose
Thrombozytenaggregation
Neurotransmission
Plasmamembran-Permeabilität Mechanische Stimulation
Hypoxie
Bakterielle Infektion
Vesikeltransport
Konstitutiv
Mechanische Stimulation
Tabelle 1: Zelluläre Mechanismen und pathophysiologischer Kontext der Freisetzung von Nukleotiden
in den Extrazellularraum (modifiziert nach: [Boeynaems et al., 2005]).
Einleitung 14
Außerdem werden hohe Nukleotidkonzentrationen im Rahmen von Zelllysen (Nekrose)
freigesetzt [Boeynaems et al., 2005].
1.1.2 Purinerge Rezeptoren
Historisch erfolgte die Klassifikation der purinergen Rezeptoren in P1 und P2 entsprechend
ihrer Agonisten [Stone, 1991]. Der physiologische Agonist der P1-Rezeptoren ist das
Nukleosid Adenosin, während die P2-Rezeptoren vorwiegend von den Di- und
Triphosphatnukleotiden des Adenosins stimuliert werden.
Entsprechend ihrer pharmakologischen Eigenschaften wurden die P1-Rezeptoren zunächst in
die Subtypen A1, A2A und A2B eingeteilt. Molekularbiologische Studien konnten die Existenz
dieser drei Subtypen bestätigen und einen weiteren (A3) identifizieren [Yaar et al., 2005].
Nach einer Empfehlung des Committee on Receptor Nomenclature and Classification der
International Union of Pharmacology (NC-IUPHAR) sollte der Terminus P1-Rezeptor durch
die Verwendung des Begriffes Adenosin-Rezeptor ersetzt werden [Fredholm et al., 2001].
Alle vier Adenosin-Rezeptoren sind G-Protein gekoppelte, transmembranöse Proteine, die
zum Teil koexistent auf einer einzelnen Zelle exprimiert werden und gegensätzliche
physiologische Antworten auslösen können. Die Aktivierung der einzelnen AdenosinRezeptor-Subtypen wird durch die Adenosinkonzentration beeinflusst [Daly,Padgett, 1992;
Zhou et al., 1992; Peakman,Hill, 1994]. Durch Phosphorylierung der intrazellulären
Schleifen kann eine Desensibilisierung der Rezeptoren eintreten [Palmer,Stiles, 1997].
Während die Subtypen A2A und A2B an die Adenylatzyklase der Zelle gekoppelt sind und
ihre Stimulation die intrazelluläre Konzentration des cAMP erhöht, verringert die
Aktivierung der A1- und A3-Rezeptoren das intrazelluläre cAMP und erhöht gleichzeitig die
intrazelluläre Kalziumkonzentration über eine Aktivierung der Phospholipase C (PLC)
[Abbracchio et al., 1995; Fredholm et al., 2001]. Die aktuelle Nomenklatur der AdenosinRezeptoren und deren Beteiligung an physiologischen und pathophysiologischen Prozessen
sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Einleitung 15
Rezeptor
A1
A2A
A2B
A3
Pathophysiologische
Bradykardie,
Regulation der
Relaxation der glatten Verstärkung der
Funktion
Inhibition der
sensomotorischen
Muskulatur in
Mastzell-
Lypolyse,
Integration in den
Gefäßen und im
degranulation,
Reduktion der
Basalganglien,
Intestinum,
Präkonditionierung
glomerulären
Inhibition der
Inhibition der
Filtration,
Thrombozyten-
Monozyten- und
tuberoglomerulärer
aggregation und der
Makrophagen-
Feedback,
neutrophilen
funktion,
Antinozizeption,
Granulozyten,
Stimulation der
Reduktion der
Vasodilatation,
Mastzell-
sympathischen und
Protektion vor
degranulation
parasympathischen
Ischämieschäden,
Aktivität,
Stimulation der
präsynaptische
Aktivität sensorischer
Inhibition,
Nerven
neuronale
Hyperpolarisation,
ischämische
Präkonditionierung
Phänotyp
Pathophysiologische
Pathophysiologische
Pathophysiologische
Funktionen in
Funktionen in
Funktionen in
Knockout-Mäusen
Knockout-Mäusen
Knockout-Mäusen
bestätigt
bestätigt
bestätigt
Tabelle 2: Überblick über die Nomenklatur und pathophysiologischen Funktionen der AdenosinRezeptoren (modifiziert nach: [Fredholm et al., 2001]).
Die P2-Rezeptoren werden aufgrund ihrer molekularen Struktur und dem Mechanismus der
Signaltransduktion in zwei Familien, P2X und P2Y, unterteilt. Die Familie der ionotropen
P2X-Rezeptoren sind kationenselektive, ligandengesteuerte Ionenkanäle („ligand gated ion
channels“) mit dem primären Agonisten ATP und sieben sequenzierten Subtypen (P2X1 –
P2X7, Tabelle 3) [Boeynaems et al., 2005]. Alle P2X-Rezeptoren weisen eine geringe
Selektivität für Natrium- (Na+) gegenüber Kalium-Ionen (K+) auf, die Permeabilität für
Einleitung 16
Kalzium-Ionen (Ca2+) hingegen unterscheidet sich erheblich zwischen den einzelnen
Subtypen. Während P2X1- und P2X3-Rezeptoren unter kontinuierlicher ATP-Stimulation
eine rasche Abnahme des Stromflusses zeigen, setzt die Desensibilisierung der P2X2-, P2X4und P2X7-Rezeptoren nur langsam ein. P2X-Rezeptoren treten als multimere Komplexe
(Homo- oder Heteromere) auf und zeigen als Heteromere Eigenschaften, die sich aus der
Kombination der einzelnen Subtypen ableiten. Aufgrund ihrer Expression in den
verschiedenen Zellsystemen wurden P2X-Rezeptoren mit einer Vielzahl physiologischer und
pathophysiologischer Funktionen in Verbindung gebracht. Das Fehlen stabiler und
spezifischer Agonisten und Antagonisten erschwert die Untersuchungen in nativen
biologischen Systemen jedoch erheblich. Studien in Knockout-Mäusen bestätigten die
funktionelle Bedeutung der P2X-Rezeptoren vor allem bei der neurogenen Kontrolle der
glatten
Muskulatur,
bei
der
Schmerz-
und
Viszeralperzeption
und
bei
der
Makrophagenfunktion [Khakh et al., 2001].
Subtyp Agonist Phänotyp in Knockout-Mäusen
P2X1
ATP
Reduktion der Kontraktilität des Vas deferens, männliche Infertilität,
Reduktion der neurogenen Vasokonstriktion,
Reduktion der Autoregulation des renalen Blutflusses
P2X2
ATP
Reduktion der ventilatorischen Antwort auf Hypoxie
P2X3
ATP
Hyporeflexie der Harnblase,
Reduktion der Schmerzantwort auf ATP und Formalin
P2X4
ATP
unbekannt
P2X5
ATP
unbekannt
P2X6
ATP
unbekannt
P2X7
ATP
Reduktion der ATP-induzierten antimykobakteriellen Aktivität
und Zytokinfreisetzung in Makrophagen,
Alterationen der Knochenformation und -resorption
Tabelle 3: Überblick über die Nomenklatur und pathophysiologischen Funktionen der P2X-RezeptorFamilie (ATP: Adenosintriphosphat) (modifiziert nach: [Boeynaems et al., 2005]).
Einleitung 17
Die Familie der metabotropen P2Y-Rezeptoren besteht dagegen ebenfalls aus G-Proteingekoppelten, transmembranösen Proteinen, von denen bisher acht humane Subtypen
identifiziert wurden [Boeynaems et al., 2005]. Pharmakologische Unterschiede zwischen den
einzelnen Subtypen der P2Y-Rezeptoren ergeben sich aus der Bindung an die verschiedenen
G-Protein-Subtypen, der Aktivierung durch Purin- oder Pyrimidin-Nukleotide und der
Aktivierung durch Nukleotiddi- oder Nukleotidtriphosphate (Tabelle 4) [Burnstock, 2006].
Gruppe Subtyp Agonist
G-Protein Phänotyp in Knockout-Mäusen
A
Gq
P2Y1
ADP
Inhibition der Thrombozytenaggregation,
Verlängerung der Blutungszeit,
keine Thromboembolie
P2Y2
ATP = UTP
Gq (+Gi)
Aufhebung der Chloridsekretion in den
Atemwegen nach ATP/UTP
P2Y4
UTP
Gq (+Gi)
Aufhebung der Chloridsekretion in
Jejunum und Kolon nach ATP/UTP
B
P2Y6
UDP
Gq
unbekannt
P2Y11
ATP
Gq +Gs
Kein P2Y11-Gen in Mäusen vorhanden
P2Y12
ADP
Gi
Inhibition der Thrombozytenaggregation,
Verlängerung der Blutungszeit,
keine Thromboembolie
P2Y13
ADP
Gi
unbekannt
P2Y14
UDP-Glukose Gi
unbekannt
Tabelle 4: Überblick über die Nomenklatur und pathophysiologischen Funktionen der P2Y-RezeptorFamilie. Die Pharmakologie der P2Y-Rezeptoren differiert in den verschiedenen Spezies, die
angegebenen Agonisten beziehen sich auf die humanen Rezeptoren (ATP: Adenosintriphosphat, ADP:
Adenosindiphosphat,
UTP:
[Boeynaems et al., 2005]).
Uridintriphosphat,
UDP:
Uridindiphosphat)
(modifiziert
nach:
Einleitung 18
Viele Zellen exprimieren mehrere P2Y-Subtypen. Die Stimulation rekombinanter P2YRezeptoren aktiviert entweder die Phospholipase C und setzt intrazelluläres Kalzium frei
oder beeinflusst die Aktivität der Adenylatzyklase und damit die intrazelluläre cAMPKonzentration. Die Kopplung einzelner P2Y-Subtypen an verschiedene G-Proteine und die
Aktivierung
unterschiedlicher
intrazellulärer
Enzyme
lässt
ligandenspezifische
Rezeptorkonformationen vermuten. Aus der Vielzahl der durch P2Y-Rezeptoren
vermittelten Wirkungen der Nukleotide haben insbesondere die Stimulation der
Thrombozytenaggregation (P2Y12) und der Chloridsekretion der Epithelien (P2Y2) klinische
Bedeutung erlangt [Boeynaems et al., 2005].
1.2 EXTRAZELLULÄRER NUKLEOTID-STOFFWECHSEL
1.2.1 Ekto-Nukleotidasen
Interzelluläre Signalwege erfordern Mechanismen zur Inaktivierung der Stimulation und
Wiederherstellung
des
Ruhezustandes.
Neben
der
verminderten
Sekretion
von
Signalmolekülen, der Rezeptordesensibilisierung (siehe auch 1.1.2) und der verminderten
Expression von Rezeptoren, hat der extrazelluläre Abbau der Signalmoleküle eine
entscheidende Bedeutung. Die extrazellulären Enzyme der Nukleotid-Nukleosid-Kaskade
werden unter dem Begriff der Ekto-Nukleotidasen subsummiert und liefern als Endprodukte
der Nukleotid-Hydrolyse das jeweilige Nukleosid und freies Phosphat (Pi). Als letzter Schritt
folgt die rasche zelluläre Aufnahme der Nukleoside aus dem extrazellulären Raum durch
spezifische membranständige Transportproteine (Nukleosid-Transporter) [Thorn,Jarvis,
1996; Noji et al., 2004].
Zu
den
bekannten
Ekto-Nukleotidasen
gehören
die
Nukleosid-Triphosphat-
Diphosphohydrolasen (NTPDase), Nukleotid-Pyrophosphatasen/Phosphodiesterasen (NPP),
alkalischen Phosphatasen und die 5’-Nukleotidase (5’-NT), die ein nahezu ubiquitäres
Einleitung 19
Vorkommen zeigen [Zimmermann, 2000]. Die katalytisch aktiven Abschnitte der
plasmamembranständigen Ekto-Nukleotidasen sind in den Extrazellularraum gerichtet und
benötigen für eine maximale Aktivität divalente Kationen (Ca2+ oder Mg2+) oder eine
alkalische Umgebung. Relevante Daten zur funktionellen Bedeutung der Ekto-Nukleotidasen
für die purinergen Signalwege liegen derzeit vor allem für die NTPDasen und die 5’-NT vor
[Zimmermann, 2001].
1.2.2 Ekto-Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase (NTPDase)
Der Familie der NTPDasen gehören sechs Mitglieder an (NTPDase 1 bis NTPDase 6), die
mit unterschiedlicher Präferenz verschiedene Nukleosid-Diphosphate oder -Triphosphate
hydrolysieren und fünf über alle Mitglieder konservierte Aminosäuresequenzen enthalten
(„apyrase conserved regions“). Während die NTPDasen 1 bis 4 je zwei transmembranöse
Domänen aufweisen, besitzen die NTPDasen 5 und 6 nur je eine solche Region und sind
auch von der Membran abgespalten in löslicher Form nachweisbar [Zimmermann, 2001].
Lokalisiert sind die NTPDasen 1 bis 3 auf der Plasmazellmembran und hydrolysieren ATP
und ADP mit erheblich variierender Aktivität (Abbildung 2). Die NTPDasen 4 bis 6
hingegen werden den Zellorganellen zugeordnet.
1.2.3 Ekto-5’-Nukleotidase (5’-NT)
Die 5’-Nukleotidase ist als Ekto-Enzym über eine Glykosylphosphadityl-Inositol-Brücke in
der Zellmembran verankert, jedoch auch in abgespaltener, löslicher Form nachweisbar und
zeigt eine weite Verbreitung in den Geweben [Zimmermann, 2000]. Somit ist die 5’-NT das
gewichtigste Enzym für die Katalyse des letzten Schrittes des extrazellulären NukleotidMetabolismus, die Hydrolyse der Nukleosid-Monophosphate (NMP → Nukleosid + Pi)
[Zimmermann, 2001], mit einer hohen Affinität für AMP [Hunsucker et al., 2005].
Extrazelluläre Nukleoside werden rasch über Nukleosid-Transporter-Proteine in den
Intrazellularraum aufgenommen und dort weiter metabolisiert [Noji et al., 2004].
Einleitung 20
Abbildung
2:
Familie
der
plasmamembranständigen
Ekto-Nukleosid-Triphosphat-
Diphosphohydrolasen (NTPDase). In Klammern sind die alternativen Bezeichnungen für die
NTPDasen 1 bis 3 angegeben. Alle drei NTPDasen weisen je zwei transmembranöse Regionen und fünf
„apyrase conserved regions“ auf. Sowohl die Hydrolyse-Aktivität für die verschiedenen Substrate als
auch die katalysierten Reaktionen variieren und sind im unteren Teil der Grafik wiedergegeben (NTP:
Nukleosidtriphosphat, NDP: Nukleosiddiphosphat, NMP: Nukleosidmonophosphat, Pi: freies
Phosphat,
ATP:
Adenosintriphosphat,
[Zimmermann, 2000]) .
ADP:
Adenosinmonophosphat)
(modifiziert
nach:
Einleitung 21
1.2.4 Vaskuläre Ekto-Nukleotidasen
CD39 wurde ursprünglich als Aktivierungsmarker von Natural-Killer-Zellen, B-Zellen und
Subpopulationen von T-Zellen beschrieben [Kansas et al., 1991]. In den folgenden Jahren
konnte eine Sequenzhomologie zur vaskulären Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase
nachgewiesen und CD39 (NTPDase 1) als die dominante Ekto-Nukleotidase des
Endotheliums etabliert werden, die intravaskuläres ATP und ADP zu AMP hydrolisiert
[Robson et al., 2005]. Der folgende Stoffwechselschritt, die Konversion von AMP zu
Adenosin (Abbildung 3), wird im Gefäßsystem überwiegend durch die 5’-NT katalysiert
[Deussen et al., 1993], die bereits früher als Differenzierungsmarker (CD73) von B- und TLymphozyten beschrieben wurde [Thomson et al., 1990].
Abbildung 3: Vaskuläre Ekto-Nukleotidasen. Die Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase 1 (CD39
/ NTPDase 1) hydrolysiert kalzium- und magnesiumabhängig intravasales Adenosintriphosphat (ATP)
und –diphosphat (ADP). Die Konversion des entstandenen Adenosinmonophosphat (AMP) wird durch
die 5’-Nukleotidase (CD73 / 5’-NT) katalysiert.
Einleitung 22
1.3 CD39-AKTIVITÄT UND THROMBOGENESE
1.3.1 Physiologische Thromboregulation
Das ruhende Endothel bildet die antithrombotische Oberfläche des Gefäßsystemes. Zur
Regulation der Thrombozyten-Aktivität und Aufrechterhaltung des Blutflusses im
Gefäßsystem wurden drei Mechanismen beschrieben [Marcus et al., 2005]. Während
Eikosanoide (Prostazyklin und Thromboxan) Zell-Zell-Interaktionen modulieren und
Stickstoffmonoxid (NO) die intrazelluläre cGMP-Konzentration in Thrombozyten und
Endothelzellen reguliert, metabolisiert die vaskuläre NTPDase 1 (CD39) prothrombotisches
ADP.
ADP wurde bereits im Jahre 1961 als Agonist der Thrombozytenaggregation identifiziert
[Gaarder et al., 1961]. Es wirkt synergistisch mit anderen Agonisten [KinloughRathbone,Mustard,
1986;
Ware
et
al.,
1987]
und
stabilisiert
reversible
Thrombozytenaggregate [Cattaneo et al., 1990; Trumel et al., 1999]. Als Quelle des
intravaskulären ADP wurden Makrophagen, Endothelzellen unter mechanischem oder
oxidativem Stress und aktivierte Thrombozyten (Exozytose der elektronendichten Granula)
beschrieben [Robson et al., 2005]. Die thrombogene Wirkung des ADP wird über die P2Y1und P2Y12-Rezeptoren der Thrombozyten vermittelt und die Stimulation des P2X1-Rezeptors
durch freigesetztes ATP zeigt eine synergistische Wirkung [Packham,Mustard, 2005]. CD39
hydrolysiert freies intravasales ATP und ADP und kontrolliert somit die Konzentration
dieser Nukleotide in der Mikroumgebung der endothelialen Oberfläche [Zimmermann,
1999]. Während Eikosanoide und NO im Ruhezustand der Gewebe nicht in den
Extrazellularraum abgegeben werden, ist CD39 eine konstitutive Komponente der
Endothelzellmembran und hält den Blutfluss unabhängig von den beiden anderen Systemen
aufrecht [Marcus et al., 2005]. Der sequentielle Metabolismus des entstandenen AMP durch
die 5’-NT (CD73) generiert zusätzlich antiaggregatorisch wirkendes Adenosin (A2ARezeptor, Abbildung 4) [Zimmermann, 1999; Fredholm et al., 2001].
ATP und ADP sowohl die Thrombozytenaggregation hemmt als auch endothelzellprotektiv wirkt.
durchbrechen. Die weitere Degradation des entstandenen AMP durch die 5’-Nukleotidase (CD73) generiert Adenosin, das im Gegensatz zu den Nukleotiden
Triphosphat-Diphosphohydrolase 1 (CD39) hydrolisiert ATP und ADP zu Adenosinmonophosphat (AMP) und hat die Kapazität diesen Kreislauf zu
als auch die Endothelzell-Aktivierung, induzieren ein prothrombotisches Milieu und unterhalten einen positiven Feedback-Mechanismus. Die Nukleosid-
Adenosintriphosphat (ATP) und –diphosphat (ADP) in den intravasalen Raum. Die freigesetzten Nukleotide stimulieren sowohl die Thrombozyten-Aggregation
Abbildung 4: CD39 und Thromboregulation. Verschiedenste Noxen, sei es durch toxische oder mechanische Schädigung, führen zu einer Freisetzung von
Einleitung 23
Einleitung 24
1.3.2 Ischämie und Reperfusion
Die Transplantation solider Organe ist obligat mit kalter und warmer Ischämie verbunden,
die von der Reperfusionsphase des Transplantates gefolgt wird. Die Re-Exposition des
Endothels gegenüber dem zirkulierenden Blut induziert im Transplantat eine akute
Entzündungsreaktion [Serracino-Inglott et al., 2001]. Als Charakteristika dieses IschämieReperfusionsschadens (IRI) wurden die Formation von Mikrothromben und die Bildung von
Aggregaten zirkulierender Blutzellen in Kapillaren oder hepatischen Sinusoiden, gefolgt von
der Gewebeinfiltration mit Leukozyten, beschrieben [Cywes et al., 1993; Pinsky et al., 1995;
Lentsch et al., 2000; Serracino-Inglott et al., 2001]. Eine Schlüsselrolle bei der Ausbildung
des IRI wird der Endothelzell-Aktivierung durch oxidativen Stress zugeschrieben
[Lefer,Lefer, 1993].
Neben der Expression von Selektinen und Integrinen mit konsekutiver Adhäsion und
Migration von neutrophilen Granulozyten [Milazzo et al., 1996; Thiagarajan et al., 1997],
zeigt sich mit der Aktivierung der Endothelzellen ein Verlust ihrer gerinnungshemmenden
Eigenschaften [Moore et al., 1989; Platt et al., 1990]. Die Antikoagulantien Heparansulfat
und Thrombomodulin werden von der Endothelzellmembran eliminiert. Zusätzlich konnte
sowohl nach Aktivierung kultivierter Endothelzellen (EC) durch Tumor-Nekrose-Faktor-α
(TNF-α) als auch nach renaler Ischämie und Reperfusion experimentell ein signifikanter
Verlust der NTPDase-Aktivität nachgewiesen werden [Candinas et al., 1996; Robson et al.,
1997]. Entsprechend geht die Fähigkeit CD39-transfizierter COS-7-Zellen zur Hemmung der
Thrombozyten-Aggregation nach Stimulation mit ADP, Kollagen oder Thrombin durch
oxidativen Stress verloren [Kaczmarek et al., 1996]. Es entsteht eine prokoagulatorische
Oberfläche mit der Ausbildung von Mikrothromben, die als relevanter Trigger für die
Genese der postischämen Entzündungsreaktion angesehen werden [Massberg et al., 1998;
Massberg et al., 1999; Salter et al., 2001].
Einleitung 25
1.3.3 Organtransplantation
Ischämie, Reperfusion und Konservierung eines Organtransplantates traumatisieren zunächst
das vaskuläre Endothel und gehen sekundär sowohl mit initialen Funktionsstörungen als
auch vermehrten akuten und chronischen Abstoßungsepisoden oder chronischen
Vaskulopathien einher [Lu et al., 1999; Robson et al., 2005]. Besonders eindrücklich und
experimentell reproduzierbar manifestieren sich diese Sequenzen in den verschiedenen
xenogenen Transplantations- und Abstoßungsmodellen, deren universelles histologisches
Charakteristikum neben der Entzündungsreaktion die Ausbildung von Thrombosen darstellt
[Robson et al., 1999; Soares et al., 1999].
Sowohl im xenogenen Herztransplantationsmodell der antikörpervermittelten hyperakuten
Abstoßung als auch im komplementdepletierten Modell der verzögerten xenogenen
Abstoßung konnte die intravenöse Administration einer wasserlöslichen NTPDase das
Überleben der Xenotransplantate signifikant verbessern [Koyamada et al., 1996]. Das Serum
der mit Apyrase, eine aus der Kartoffel isolierte wasserlösliche NTPDase, behandelten Tiere
verhinderte in vitro zuverlässig die Thrombozytenaggregation. In den histologischen
Präparaten
zeigte
sich
entsprechend
eine
signifikante
Verminderung
der
Thrombozytenaggregation und –aktivierung. Nach Infektion von xenogenen Spenderherzen
mit rekombinanten, CD39-kodierenden Adenoviren im Modell der verzögerten Abstoßung
war das Transplantatüberleben ebenfalls signifikant verlängert [Imai et al., 2000b]. 48
Stunden nach heterotoper Transplantation ließ sich ein Anstieg der NTPDase-Aktivität in
den transplantierten Herzen nachweisen. Während die Kontrolltiere zu diesem Zeitpunkt in
der Histologie erhebliche vaskuläre Thrombosen demonstrierten, zeigten die behandelten
Herzen lediglich geringe Störungen der Myokardstruktur. Gleichartige histologische
Befunde finden sich 24 Stunden nach Injektion von Antikörpern in einem Modell der
antikörpervermittelten Abstoßung [Dwyer et al., 2004]. Humanes CD39 exprimierende
Herzen transgener Spendertiere überlebten die Antikörpergabe im Median um drei Tage bis
zur zellvermittelten Allograftabstoßung, während die Wildtyp-Organe innerhalb von 24
Stunden hyperakut abgestoßen wurden.
Einleitung 26
Spenderorgane von cd39-null Mäusen hingegen zeigten im verzögerten Abstoßungsmodell
signifikant verkürzte Überlebenszeiten im Vergleich zu den Kontrollen [Enjyoji et al., 1999].
Neben ausgedehnten Infarktarealen und Einblutungen fanden sich in den transplantierten
cd39-null Herzen deutlich ausgeprägte Fibrinablagerungen und eine vermehrte Expression
von P-Selectin.
Die Wichtung des antithrombotischen oder eines generellen endothelzellprotektiven Effektes
der aktiven vaskulären NTPDasen für das verlängerte Transplantatüberleben verbleibt
zunächst unklar.
1.3.4 Endothelzell-Aktivierung
Von aktivierten Thrombozyten oder geschädigten Endothelzellen freigesetzte Nukleotide
[Luthje, 1989] stimulieren nicht nur die Thrombogenese (siehe 1.3.1) sondern führen auch zu
einer Aktivierung lokaler Endothelzellen [Motte et al., 1995] mit konsekutiver Sekretion
gespeicherter
(Typ-I-Aktivierung)
[Cotran,Pober,
1989;
Cotran,Pober,
1990;
Vischer,Wollheim, 1998] oder de novo synthetisierter Proteine (Typ-II-Aktivierung)
[Pober,Cotran, 1990; Bach et al., 1994].
Nach Inkubation mit CD39-Antisense-Nukleotiden führt die Aktivierung kultivierter
Endothelzellen mit einem ADP-Stimulus zu einem prompten und mit den Kontrollen
vergleichbaren Anstieg der ATP-Konzentration im Zellmedium [Imai et al., 1999b]. Der
supprimierten CD39-Aktivität entsprechend, erfolgt die extrazelluläre Degradation des
freigesetzten ATP jedoch deutlich verzögert. Somit moduliert CD39 das inflammatorische
Milieu der Endothelzellen. Die Stimulation der Endothelzellen mit ATP selbst führt zu einer
Typ-I-Aktivierung mit Freisetzung von von-Willebrand-Faktor [Goepfert et al., 2000]. Die
Überexpression von CD39 durch einen rekombinanten adenoviralen Vektor limitiert diese
Reaktion signifikant. In gleicher Weise werden die ATP-induzierte Typ-II-Aktivierung (ESelectin-Expression), die Translokation des nukleären Faktors κB (NF-κB) in den Zellkern
und die Apoptoseinduktion vermindert. Neben Nukleotiden führt auch die Aktivierung
kultivierter Endothelzellen mit Lipopolysacchariden zu einer initialen Freisetzung von
Einleitung 27
intrazellulärem
ATP,
die
von
einer
steigenden
Interleukin-1α-Konzentration
im
Zellüberstand gefolgt wird [Imai et al., 2000a]. Die Infektion der Endothelzellen mit
rekombinanten CD39-Adenoviren kupiert den sekundären ATP-Stimulus und führt zu einer
deutlich verminderten Interleukin-1α-Sekretion. Eine vermehrte NTPDase-Aktivität schützt
somit in vitro vor einer Typ-I- oder Typ-II-Aktivierung der Endothelzellen sowie einer
Apoptose-Induktion.
1.4 cd39-NULL MÄUSE
Zum Studium der Bedeutung der vaskulären NTPDase für die Regulation der Hämostase und
der
Thrombogenese
in
vivo
wurden
cd39-null
Mäuse
generiert,
die
keine
Entwicklungsauffälligkeiten und eine ungestörte Reproduktion zeigten [Enjyoji et al., 1999].
Isolierte und kultivierte kardiale Endothelzellen dieser Tiere weisen eine signifikant
verminderte NTPDase-Aktivität im Vergleich zu ihren Wildtyp-Kontrollen auf und
inhibieren die durch ADP induzierte Thrombozytenaggregation nur unvollständig. Die
Plasmakonzentrationen von ATP, ADP und Adenosin unterscheiden sich nicht von den
entsprechenden
Werten
in
Wildtyp-Kontrollen.
Entgegen
dem
Postulat
eines
prothrombotischen Phänotyps der cd39-null Mäuse findet sich jedoch eine signifikant
verlängerte Blutungszeit bei einer nur geringgradig verminderter Thrombozytenzahl und
einer ungestörten plasmatischen Gerinnung. Entsprechend zeigt sich in vivo eine
substantielle Verzögerung der kapillären Thrombusformation nach Induktion eines
vaskulären Schadens durch freie Radikale, bei unveränderter Plasmakonzentration von PSelectin im Vergleich zu den Kontrollen. In vitro ist die Aggregation der isolierten
Thrombozyten aus cd39-null Mäusen nach Stimulation mit ADP, Kollagen und Thrombin
erheblich eingeschränkt. Ursächlich findet sich eine Desensibilisierung des P2Y1-Rezeptors
der cd39-null Thrombozyten, die sich durch Inkubation mit ATP bei Wildtyp-Kontrollen
reproduzieren lässt. Die Inkubation mit Apyrase (wasserlösliche NTPDase) führt zu einer
Einleitung 28
Rekonstitution der Thrombozytenfunktion in vitro und in vivo. Auf eine prothrombotische
Störung der Endothelzellfunktion in cd39-null Mäusen weisen vermehrte Fibrinablagerungen
in
den
Organen
und
eine
gesteigerte
Aktivität
des
Tissue-Factors
hin.
Das
Transplantatüberleben von cd39-null Spenderherzen in Wildtyp-Empfängern ist deutlich
reduziert (siehe 1.3.3).
Zusammenfassend zeigen die generierten cd39-null Mäuse einen dualen Phänotyp mit einer
Thrombozytendesensibilisierung und entsprechender Blutgerinnungsstörung bei einem
gleichzeitigen prothrombotischen Zustand des Blutgefäßbettes der Organe.
Einleitung 29
1.5 HYPOTHESE UND FRAGESTELLUNG
Die im Folgenden dargestellten und zu untersuchenden Hypothesen beschreiben die
Bedeutung der vaskulären NTPDase-Aktivität für die Ausprägung eines IschämieReperfusionsschadens (Abbildung 4):
1. Der Verlust der vaskulären NTPDase-Aktivität tritt in der frühen Phase der
Organreperfusion auf.
2. Die intravasale NTPDase-Aktivität wirkt protektiv auf das Ausmaß des IschämieReperfusionsschadens, unabhängig von weiteren antiinflammatorischen Wirkungen
im Rahmen der Organtransplantation.
3. Die NTPDase eliminiert den prothrombotischen und proinflammatorischen Stimulus
der intravasalen Nukleotide ATP und ADP und stellt das Substrat für die
Generierung des antithrombotischen und antiinflammatorischen Adenosin bereit.
4. Die Substitution der intravasalen NTPDase-Aktivität vermindert die postischäme
Ausbildung von Mikrothromben und hat einen protektiven Einfluss auf die
postischäme Endothelzell-Aktivierung.
Die folgenden Experimente zeigen zunächst den quantitativen Anteil der NTPDase 1/cd39
an der globalen NTPDase-Aktivität der verschiedenen Organe. Aus dem zeitlichen Verlauf
der NTPDase-Aktivität in postischämen murinen Organen und nach xenogener
Transplantation wird eine deletäre Wirkung des intravasalen NTPDase-Mangels in der
frühen Reperfusionsphase postuliert und in hepatischen und intestinalen IschämieReperfusions-Modellen überprüft. Für beide Organsysteme werden Strategien zur
Kompensation des ischämiebedingten Verlustes der NTPDase-Aktivität entwickelt und in
Überlebensexperimenten
angewandt.
Die
Thrombozytenadhäsion
in
postkapillären,
intestinalen Venolen und die Ausprägung des intestinalen Kapillarlecks zeigen die
Auswirkungen in vivo an.
Material und Methoden 30
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 TIERMODELLE
2.1.1 Tiere und Tierhaltung
Alle Tiere wurden in einer pathogenfreien, durch die American Association for Accreditation
of Laboratory Animal Care akkreditierten Einrichtung und in Übereinstimmung mit den
Anforderungen an eine humane Tierhaltung entsprechend den Richtlinien des United States
Department of Agriculture und des United States Department of Health and Human Services
gehalten. Die Versuchstiere waren einem 12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus ausgesetzt,
wurden mit kommerziell erhältlicher Tiernahrung versorgt und hatten freien Zugang zum
Trinkwasser. Alle experimentellen Protokolle wurden durch das Beth Israel Deaconess
Medical Center Animal Care and Use Program, Boston, USA genehmigt.
Wildtyp (C57BL/6x129Svj, cd39+/+), cd39-null (cd39-/-) und hemizygote (cd39+/-) männliche
Mäuse wurden in den Tierversuchseinrichtungen des Beth Israel Deaconess Medical Center
gezüchtet. Weitere Kontrolltiere des selben genetischen Hintergrundes sowie BALB/cMäuse wurden von Taconic (Germantown, NY, USA) bezogen. Das Gewicht der Mäuse
zum Versuchszeitpunkt betrug 17-25 g. Männliche Lewis-Ratten wurden von Harlan
Sprague Dawley (Indianapolis, IN, USA) bezogen und wogen 250-300 g.
Die Anästhesie für die operativen Prozeduren erfolgte mittels Methoxyfluran Inhalation
(Metofane, Mallinckrodt, Mundelain, IL, USA) oder im Falle einer prolongierten Narkose
durch eine intraperitoneale Instillation von Pentobarbital (40-70 µg/g Körpergewicht,
Nembutal, Abbott, North Chicago, IL, USA). Postoperativ wurde das Trinkwasser der
Versuchstiere zur Analgesie mit Buprenorphin versetzt (0,01 mg/ml, Buprenex, Reckitt &
Colman, Richmond, VA, USA).
Material und Methoden 31
2.1.2 Modell der intestinalen Ischämie
Vor der chirurgischen Intervention wurden die Mäuse einer nächtlichen Fastenperiode mit
ungehindertem Trinkwasserzugang unterzogen. Über eine mediane Laparotomie wird die
Arteria mesenterica superior (SMA) aufgesucht und an ihrem Ursprung aus der Aorta von
dem umgebenden Gewebe isoliert. Die Induktion der intestinalen Ischämie erfolgt durch
Okklusion der SMA mit einer atraumatischen mikrochirurgischen Gefäßklemme. Das
Sistieren der Pulsation in der SMA wird mit dem stereoskopischen Zoommikroskop (SMZU, Nikon, Melville, NY, USA) überprüft und anschließend die Peritonealhöhle zur
Vermeidung von Flüssigkeits- und Wärmeverlusten mit einer fortlaufenden Naht
verschlossen (4/0-Seide, Ethicon, Somerville, NJ, USA). Fünf Minuten vor Freigabe des
Blutstromes in der SMA erfolgt die erneute Anästhesieeinleitung und die intravenöse
Injektion der verschiedenen Testsubstanzen oder die Kanülierung der linken Nierenvene zur
Infusion der Testsubstanzen. Tiere in Überlebensstudien erhalten vor dem zweischichtigen
Bauchdeckenverschluss (4/0-Dermalon, Sherwood-Davis & Geck, St. Louis, MO, USA)
eine
intraperitoneale
Instillation
von
2
ml
physiologischer
Kochsalzlösung.
Scheinoperationen erfolgen nach dem gleichen Muster, jedoch ohne Verschluss der
Gefäßklemme.
2.1.3 Modell der hepatischen Ischämie
Die Induktion der hepatischen Ischämie in der Maus erfolgte nach einer Modifikation der
von Surinder Yadav beschriebenen Technik [Yadav et al., 1998]. Nach einer medianen
Laparotomie wird ein Retraktor in der Peritonealhöhle platziert, die untere Thoraxapertur
über eine Klemme am Xyphoid angehoben und das Intestinum auf eine mit Kochsalzlösung
getränkte Gaze ausgelagert und mit einer Plastikfolie abgedeckt. Nach Isolierung der
Leberlappen erfolgt, jeweils so nah wie möglich am Eintritt des Gefäßpedikels in das
Parenchym, die Ligatur (6/0-Seide, Ethicon) und Resektion des Lobus caudatus, des rechten
lateralen Lobus sowie des Processus quadratus gemeinsam mit dem Processus papillaris
(Abbildung 5a). Nach Verlagerung des Lobus medianus und des linken lateralen Lappens
nach rechts wird nun zur Induktion der kompletten Leberischämie ein 2 mm breites
Material und Methoden 32
Gummiband um die Basis der verbliebenen Leberlappen geschlungen. Die Okklusion des
rechten und linken Pedikels des Lobus medianus sowie des Pedikels des linken lateralen
Leberlappens erfolgt nun durch Festziehen des Gummibandes (Abbildung 5b). Das Band
wird durch eine atraumatische mikrochirurgische Gefäßklemme fixiert. In der Phase der
Ischämie wird die Peritonealhöhle mit einer fortlaufenden Naht verschlossen (4/0-Seide,
Ethicon). Fünf Minuten vor der Freigabe der Leberperfusion erfolgen die erneute
Anästhesieeinleitung und die intravenöse Injektion bzw. Kanülierung der linken Nierenvene
wie oben beschrieben (siehe 2.1.2). Tiere in Überlebensstudien erhalten vor dem
zweischichtigen Bauchdeckenverschluss (4/0-Dermalon, Sherwood-Davis & Geck) ebenfalls
eine intraperitoneale Instillation von 2 ml physiologischer Kochsalzlösung.
Abbildung 5: Modell der hepatischen Ischämie.
a) Nach der von Yadav beschriebenen Technik werden zunächst der Lobus caudatus, der rechte
laterale Leberlappen und der Processus quadratus mit dem Processus papillaris ligiert und reseziert
[Yadav et al., 1998].
b) Zur Induktion der Leberischämie werden die Pedikel der verbliebenen Leberlappen mit einem 2 mm
breiten Gummiband umschlungen (linker lateraler Leberlappen sowie rechter und linker Pedikel des
Lobus medianus).
Material und Methoden 33
2.1.4 Modell der heterotopen, xenogenen Herztransplantation
Die heterotope Transplantation der murinen Spenderherzen in die Empfängerratten erfolgte
in einer modifizierten Technik nach Ono und Lindsey [Ono,Lindsey, 1969]. Nach der
medianen Laparotomie und bilateralen Thorakotomie der Spendermaus werden zunächst der
Aortenbogen und die Pulmonalarterie isoliert. Dann erfolgt die Kanülierung der Vena cava
inferior und das Spenderherz wird mit eiskalter heparinisierter Kochsalzlösung perfundiert
(4°C, 200 IU Heparin in 5 ml physiologischer Kochsalzlösung). Im Anschluss erfolgen die
Durchtrennung der Aorta direkt proximal der Arteria anonyma und der Arteria pulmonalis so
weit distal wie möglich. Dann wird das Herz angehoben und eine Ligatur um beide Vorhöfe
platziert (6/0-Seide, Ethicon). Es folgen die Durchtrennung der Vena cava und der Vena
pulmonalis. Das Herz wird entnommen und für eine Stunde in eiskalter University-ofWisconsin-Lösung (Viaspan, Barr Laboratories, Pomona, NY, USA) aufbewahrt. Es folgen
die mediane Laparotomie der Empfängerratte und das Einbringen eines Retraktors. Das
Intestinum wird in die rechte Hälfte der Peritonealhöhle verlagert und mit einer
angewärmten, kochsalzgetränkten Gaze abgedeckt. Nach der Mobilisation der abdominellen
Aorta und der Vena cava inferior erfolgt nun das Ausklemmen beider Gefäße mit einer
Bulldog-Klemme.
Die
terminolateralen
Anastomosen
der
Spenderaorta
mit
der
Empfängeraorta und der Pulmonalarterie mit der Vena cava inferior werden in
Einzelknopftechnik mit 8/0-Prolene (Ethicon) angelegt (Abbildung 6). Im Anschluss erfolgt
die Freigabe des Blutstromes. Nach dem Eintritt einer vollständigen Hämostase und dem
Einsetzen des Herzschlages wird der zweischichtige Bauchdeckenverschluss durchgeführt
(4/0-Dermalon, Sherwood-Davis & Geck). Die Vitalität des Transplantates wird zweimal
täglich durch Palpation überprüft.
Zum Erreichen einer Akkommodation [Bach et al., 1991] des konkordanten murinen
Spenderherzens
in
der
Ratte
werden
die
Empfänger
vor
der
Transplantation
komplementdepletiert und postoperativ immunsuppressiv behandelt. Am Vortag der
Transplantation und nach Beginn der Anästhesie erfolgt jeweils eine intraperitoneale
Injektion von Cobra-Venom-Faktor (Tag –1: 60 U/kg Körpergewicht, Tag 0: 20 U/kg,
Quidel, San Diego, CA, USA). Postoperativ werden täglich 15 mg/kg Körpergewicht
Cyclosporin
A
intramuskulär
injiziert
(Novartis
Pharma,
Basel,
Schweiz).
Material und Methoden 34
Im Rejektionsmodell der xenogenen Transplantation erhalten die Empfängertiere keine
Vorbehandlung und im Verlauf keine Immunsuppression. Die Abstoßung der WildtypSpenderherzen erfolgte zwischen 58 und 65 Stunden nach Transplantation im
Rejektionsmodell, während das Akkommodationsmodell Überlebenszeiten von mehr als 45
Tagen zeigte [Imai et al., 1999c].
Abbildung 6: Modell der heterotopen, xenogenen Herztransplantation. Das Spenderherz (Maus) wird
in das Abdomen des Empfängertieres (Ratte) transplantiert. Es erfolgt jeweils eine terminolaterale
Anastomose zwischen der Pulmonalarterie des Spenders und der Vena cava inferior des Empfängers
sowie zwischen dem Aortenbogen des Spenders und der Aorta abdominalis des Empfängers. Die
Vorhöfe des Spenderorganes werden ligiert.
Material und Methoden 35
2.1.5 Modell der akuten toxischen Hepatitis
Zur Induktion der akuten toxischen Hepatitis wurden Wildtyp-Mäuse nach dem von C.
Galanos beschriebenen Modell mit D-gal (2-Amino-2-Deoxy-D-Galaktose) sensibilisiert und
mit einer geringen Dosis Lipopolysaccharid (LPS) behandelt [Galanos et al., 1979]. D-gal
führt zu einem metabolischen Arrest der Hepatozyten und erhöht signifikant die Sensibilität
der Mäuse für LPS. 20 mg D-gal (Sigma, St. Louis, MO, USA) und 0,5 µg Salmonella
abortus equi LPS (Sigma) in 100 µl werden intraperitoneal injiziert. Die Überlebensraten in
diesem Modell betrugen 91 % nach acht Stunden und 73 % nach 24 Stunden [Imai et al.,
1999a].
2.2 BEHANDLUNGSGRUPPEN
2.2.1 NTPDase
Tiere, die der NTPDase-Behandlungsgruppe zugeordnet wurden, erhalten unmittelbar vor
Freigabe des Blutstromes eine einmalige intravenöse Substitution mit wasserlöslicher
NTPDase (0,2 U/g Körpergewicht, Stammlösung: 20 U/ml, Apyrase Grade VII, Sigma). Die
Injektion erfolgt in die Penisvene der männlichen Versuchstiere. Die Kontrolltiere erhalten
ein äquivalentes Volumen physiologischer Kochsalzlösung.
Ein Gruppe der cd39-null Mäuse erhält im Modell der intestinalen Ischämie zusätzlich
achtstündlich intraperitoneale Apyrase-Injektionen (0,2 U/g Körpergewicht, bis 48 Stunden
postoperativ).
Material und Methoden 36
2.2.2 Adenosin/Amrinon
Die Applikation von Adenosin erfolgt mittels einer kontinuierlichen Infusion und wird mit
der Gabe von Amrinon, einem selektiven Phosphodiesterase-III-Inhibitor, kombiniert.
Amrinon
erhöht
die
intrazelluläre
cAMP-Konzentration
und
verstärkt
die
pharmakologischen Wirkungen von Adenosin [Kauffman et al., 1987]. Nach Kanülierung
der Vena cava inferior oder der linken Nierenvene werden 1 µmol/kg/min Adenosin (Sigma)
und 0,5 µmol/kg/min Amrinon (Sigma), fünf Minuten vor Reperfusion beginnend, über 60
Minuten kontinuierlich infundiert (Compact Infusion Pump Model 975, Harvard Apparatus,
Holliston, MA, USA). Das gesamte Volumen der Infusion beträgt 0,576 ml. Während der
Infusion wird die offene Peritonealhöhle mit einer angewärmten, kochsalzgetränkten Gaze
bedeckt, um Wärme- und Flüssigkeitsverluste zu minimieren.
2.2.3 A20-Gentransfer
A20 ist ein antiapoptotisch wirksames Protein, dessen Expression Teil der physiologischen
Antwort der Hepatozyten auf eine toxische Schädigung ist [Arvelo et al., 2002].
Entsprechend zeigten Mäuse, die mit einem rekombinanten A20-Adenovirus infiziert
wurden, in einem Modell der akuten toxischen Hepatitis einen deutlichen Überlebensvorteil.
Fünf Tage vor der hepatischen Ischämie erfolgt bei einer Versuchsgruppe der cd39-null
Mäuse der A20-Gentransfer über eine Injektion in die Penisvene (1x109 Plaque Forming
Units (PFU) in 100 µl). Die A20-Adenoviren wurden freundlicherweise von C. Ferran (Beth
Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, MA, USA) zur Verfügung
gestellt. Eine weitere Gruppe von Versuchstieren wurde mit Kontrollviren infiziert (βGalaktosidase: β-gal), die freundlicherweise von R. Gerard (University of Texas South
Western, TX, USA) zur Verfügung gestellt wurden.
Material und Methoden 37
2.3 ÜBERLEBENSSTUDIEN
In den Überlebensstudien wurden die operierten Tiere nach 60-minütiger intestinaler (siehe
2.1.2) oder 45-minütiger hepatischer (siehe 2.1.3) Ischämie für insgesamt sieben Tage
nachbeobachtet. Die Ischämiezeiten orientierten sich an der in Pilotstudien bestimmten
medianen Letalitätsdosis (LD50) für unbehandelte Wildtyp-Mäuse im intestinalen IschämieReperfusions-Modell sowie für unbehandelte cd39+/--Mäuse im Modell der hepatischen
Ischämie.
Die Überlebensraten wurden in folgenden Studiengruppen ermittelt:
1. 45 Minuten hepatische Ischämie in C57BL/6x129Svj-Mäusen
(cd39+/+, cd39+/-, cd39-/-, n=25 je Gruppe)
2. 45 Minuten hepatische Ischämie in cd39-heterozygoten C57BL/6x129Svj-Mäusen
(lösliche NTPDase, Adenosin/Amrinon, n=6 je Gruppe)
3. 45 Minuten hepatische Ischämie in cd39-null C57BL/6x129Svj-Mäusen
(A20-Gentransfer, n=5)
4. 60 Minuten intestinale Ischämie in Wildtyp-C57BL/6x129Svj-Mäusen
(nativ, lösliche NTPDase, Adenosin/Amrinon, n=5 je Gruppe)
5. 60 Minuten intestinale Ischämie in cd39-heterozygoten C57BL/6x129Svj-Mäusen
(nativ, lösliche NTPDase, n=5 je Gruppe)
6. 60 Minuten intestinale Ischämie in cd39-null C57BL/6x129Svj-Mäusen
(nativ, lösliche NTPDase einfache und wiederholte Gabe, Adenosin/Amrinon,
n=5 je Gruppe)
Material und Methoden 38
2.4 INTRAVITALE VIDEOMIKROSKOPIE
2.4.1 Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen
Die Fluoreszenzmarkierung der Spenderthrombozyten erfolgte nach der von C. Denis
beschriebenen Methode [Denis et al., 1998]. Für jedes Versuchstier wurden Vollblutproben
von zwei Wildtyp-Spendermäusen gesammelt und mit 10 Volumen-% Antikoagulanz
versetzt (38 mM Citratsäure / 75 mM Trisodiumcitrat / 100 mM Dextrose). Die Präparation
des thrombozytenreichen Plasmas erfolgte durch zwei subsequente Zentrifugenzyklen (280 x
g) für sechs und vier Minuten. Gereinigte Thrombozyten wurden mittels einer PIPES-Puffer
(25 mM Pipes / 137 mM NaCl / 4 mM KCl / 0,1 % Dextrose / pH 7,0) äquilibrierten
Säulenfiltration
(25
ml
Trockenvolumen,
Sepharose
2B,
Sigma)
erhalten.
Die
Thrombozytenkonzentrationen wurden mit einem automatisierten Partikelzähler bestimmt
(Z1, Coulter, Miami, FL, USA) und auf eine endgültige Konzentration von 3x108/ml
verdünnt. Zur Markierung der gefilterten Thrombozyten erfolgte eine 15 minütige,
lichtgeschützte Inkubation mit 1 µg/ml Calcein AM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA).
Vor Verwendung der markierten Thrombozyten erfolgte eine Kontrolle der Fluoreszenz.
Alle Verarbeitungsschritte der Thrombozyten wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Nach Induktion einer einstündigen intestinalen Ischämie erfolgt vor Reperfusion die
intraperitoneale Instillation von Pentobarbital sowie die Injektion der fluoreszenzmarkierten
Spenderthrombozyten (5x106 Thrombozyten pro g Körpergewicht in 200 bis 400 µl PIPESPuffer) allein oder in Kombination mit den Testsubstanzen über die Penisvene. Sofort nach
Freigabe des Blutstromes folgt die Lagerung des Versuchstieres auf eine selbstgebaute
Mikroskophalterung und die Auslagerung und Fixierung einer proximalen Jejunumschlinge
in der Spülkammer. Die exponierte Jejunumschlinge wird kontinuierlich mit angewärmter
(37°C) Ringer-Lactat-Lösung (Baxter, Deerfield, IL, USA) umspült. Anschließend erfolgt
die Kontrolle der erfolgreichen Reperfusion mit der konventionellen Durchlichtmikroskopie.
Je 10 Segmente submuköser Arteriolen und Venolen werden zufällig ausgewählt und über
30 Sekunden mittels Epiillumination über ein 40x Wasserimmersionsobjektiv visualisiert.
Das Mikroskop (Optiphot, Nikon, Melville, NY, USA) ist mit einer 100 Watt
Material und Methoden 39
Quecksilberlampe (HB-1010 AF, Nikon) und den passenden Exzitations-Emissions-Filtern
bestückt. Die Aufnahme der mikroskopischen Bilder erfolgt mittels einer CCD-Videokamera
(CCD 72, Dage-MTI, Michigan City, IN, USA) mit einer Online-Wiedergabe auf einem 12Zoll-Monitor (HR 120, Dage-MTI). Die Aufzeichung erfolgt im S-VHS-Format auf einem
kommerziell erhältlichen Videorekorder (PV-S7670, Panasonic, Secaucus, NJ, USA). Die
Auswertung wurde off-line unter Verwendung des beschriebenen analogen Videosystems
oder nach Digitalisierung auf einem Macintosh Computer durchgeführt. Zur digitalen
Bildanalyse wurde das unter einer Public Domain Lizenz erhältliche Programm NIH Image
verwendet (entwickelt am U.S. National Institute of Health und verfügbar über das Internet
unter http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).
Abbildung 7: Adhärente und rollende Thrombozyten in der intravitalen Videomikroskopie. Die
Abbildungen a bis d zeigen die gleiche jejunale Venole (Durchmesser 86 µm, weißer Balken in a) zu
unterschiedlichen Zeitpunkten (obere linke Ecke). Der Blutfluss ist von der oberen rechten Bildecke
nach links unten gerichtet (grauer Pfeil). Obere Reihe: Ein adhärenter, fluoreszenzmarkierter
Thrombozyt (offener Pfeil) verbleibt während der gesamten Beobachtungszeit von 30 s ortsständig an
der Gefäßwand haften (a: Beginn der Beobachtungszeit, b: Ende der Beobachtungszeit). Untere Reihe
(stärkere Vergrößerung): Ein rollender Thrombozyt bewegt sich mit deutlich reduzierter
Geschwindigkeit entlang der Gefäßwand. Die Distanz beträgt 37 µm innerhalb von einer Sekunde
(weißer Pfeil, c: 4. Sekunde, d: 5. Sekunde).
Material und Methoden 40
Die Klassifikation der Interaktionen der markierten Thrombozyten mit dem Endothel
erfolgte nach der von S. Massberg angegebenen Definition als adhärent oder rollend
[Massberg et al., 1998]. Adhärente Thrombozyten waren während der gesamten
Beobachtungszeit stationär an der Gefäßwand angeheftet (Abbildung 7). Markierte
Thrombozyten, die innerhalb von 30 Sekunden wenigstens einmal ihre Position veränderten,
wurden als rollend klassifiziert, genauso wie Thrombozyten, die eine beliebige zum
Blutstrom vertikale Ebene mit einer signifikant gegenüber dem zentralen Blutstrom
verminderten Geschwindigkeit kreuzten. Unter der Annahme einer zylindrischen Geometrie
des beobachteten Gefäßsegments erfolgte die Quantifizierung der adhärenten Thrombozyten
als Anzahl der Zellen pro Quadratmillimeter endothelialer Oberfläche. Rollende
Thrombozyten werden als Anzahl der Zellen pro Millimeter Gefäßdurchmesser und Sekunde
angegeben.
Untersucht wurden Wildtyp-Mäuse in der Reperfusionsphase nach 60-minütiger Okklusion
der Arteria mesenterica superior, die entweder mit physiologischer Kochsalzlösung oder
löslicher NTPDase behandelt wurden (n=5 je Gruppe) sowie scheinoperierte Tiere (n=3).
2.4.2 Intestinales Kapillarleck
Nach Induktion einer 45-minütigen intestinalen Ischämie wurde bei allen Versuchstieren ein
Infusionsport (Micro Implantable Infusion Port, Harvard Apparatus) implantiert und die
rechte Jugularvene kanüliert. Vor der Freigabe des intestinalen Blutstromes erfolgt die
Injektion fluoreszenzmarkierten Albumins über den Infusionsport (4 µl/g Körpergewicht
einer 6,25 mg/ml phosphatgepufferten Kochsalzlösung, FITC-Albumin, Sigma) und die
Spülung der Portkammer mit 120 µl physiologischer Kochsalzlösung. Sofort nach
Reperfusion werden die Versuchstiere wiederum auf einer selbstgebauten Halterung gelagert
und eine proximale Jejunumschlinge in der Spülkammer fixiert (Abbildung 8a). Unter
konstanter Spülung mit angewärmter Ringer-Lactat-Lösung erfolgt die Auswahl der Area of
Interest (AOI) mittels Durchlichtmikroskopie. Die gewählte AOI wird in der Folge innerhalb
einer Stunde alle 10 Minuten für 10 Sekunden mittels Epiillumineszenz visualisiert. Das
Mikroskop (Axiovert 100, Zeiss, Thornwood, NY, USA) ist mit einem 40x-Objektiv, einer
Material und Methoden 41
100 Watt Quecksilberlampe (HBO100, Zeiss) und einem passenden Exzitations-EmissionsFilterset ausgestattet. Die Aufnahme der mikroskopischen Bilder erfolgt über eine CCDVideokamera mit manuellen Reglern für die Bildverstärkung und Schwarzanpassung (RC
300, Dage-MTI). Zur Aufzeichnung wird ein S-VHS Videosystem (SVO-9500 MD, Sony,
San Jose, CA, USA) mit einer Online-Wiedergabe auf einem 13-Zoll-Monitor (PVM-137,
Sony) verwendet (Abbildung 8b). Zu Beginn der ersten aufgezeichneten Sequenz erfolgt die
manuelle Einstellung der Bildverstärkung und Schwarzanpassung, die für die restlichen
Sequenzen des jeweiligen Experimentes unverändert beibehalten wird. Für die Auswertung
wurden die Videosequenzen digitalisiert und ebenfalls mit dem NIH Image Programm
analysiert. Der mittlere Anstieg der Lichtintensität über die Beobachtungszeit in einer
perivaskulär gelegenen AOI (maximale Distanz zum Gefäß: 20 µm) wurde in Werten auf der
Grauskala (arbiträre Einheit, 0-255) angegeben (IP) und in Relation zur mittleren
Lichtintensität in der benachbarten postkapillären Venole bewertet (IV). Der Quotient IP/IV
galt als Parameter für das kapilläre Albuminleck.
Abbildung 8: Intestinales Kapillarleck in der intravitalen Videomikroskopie. FITC-markiertes Albumin
wurde intravenös injiziert und die narkotisierte Maus auf der selbstgebauten Halterung platziert (a).
Das proximale Jejunum wurde ausgelagert und in der Spülkammer fixiert. In dem rechten Bild ist der
Aufbau des Videomikroskops mit CCD-Videokamera, manuellem Verstärkungsregler, Videorekorder
und Kontrollmonitor wiedergegeben (b, Hersteller und technische Details siehe Text).
Material und Methoden 42
Untersucht wurden Wildtyp- und cd39-null Mäuse in der Reperfusionsphase nach 45minütiger Okklusion der Arteria mesenterica superior (n=5 je Gruppe) sowie scheinoperierte
Tiere (n=3).
2.5 INTESTINALE GEFÄßPERMEABILITÄT
Nach Induktion einer 45-minütigen intestinalen Ischämie und 10 Minuten vor der Freigabe
des Blutstromes erfolgt die Injektion von 8 µl/g Körpergewicht einer 0,5%-igen Evans Blue
Lösung (Sigma) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung über die Penisvene. Alle
Testsubstanzen werden in diesem Versuchsaufbau, fünf Minuten vor Reperfusion beginnend,
kontinuierlich über die rechte Iliacalvene appliziert. Unter Verwendung der Infusionspumpe
wird ein konstantes Volumen von 0,576 ml innerhalb von 60 Minuten injiziert. Die
Konzentrationen der Testsubstanzen wird dem Körpergewicht des Versuchstieres
entsprechend variiert. Eine Stunde nach der Freigabe des Blutstromes erfolgt die Inzision der
Portalvene und die arterielle Perfusion mit angewärmter physiologischer Kochsalzlösung
über die linke Herzkammer, bis zum Erreichen eines klaren Ausstromes aus der Vena portae.
Das Lumen des entnommenen Dünndarmes wird ebenfalls mit angewärmter Kochsalzlösung
gespült (10 ml) und die jejunalen Proben anschließend in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Die Akkumulation des Evans Blue Farbstoffs in den Geweben (Abbildung
9) steht in enger Relation zum Albumintransport über die Endothelbarriere und wird deshalb
als Parameter für die vaskuläre Permeabilität angesehen [Fry et al., 1977]. Die quantitative
Bestimmung des Evans Blue Farbstoffs erfolgte nach der von G. W. Barone angegebenen
Technik [Barone et al., 1989]. Das Gewicht der Jejunumproben (ca. 50 mg) wurde bestimmt
und die Formamide-Extraktion (1,5 ml, Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, USA) für zwei
Stunden bei 55°C durchgeführt. Die Lichtadsorption des Überstandes wurde in dreifacher
Ausfertigung bei einer Wellenlänge von 610 nm gemessen und die Referenzadsorption bei
450 nm subtrahiert. Die Datenangabe erfolgt in arbiträren Einheiten der Lichtadsorption
Material und Methoden 43
(optische Dichte, OD) pro g Probengewicht.
Neben den ischämen und scheinoperierten Wildtyp- und cd39-null Versuchstieren in den
Behandlungs- und Kontrollgruppen wurden zusätzliche Bestimmungen der basalen
vaskulären intestinalen Permeabilität in nativen Tieren durchgeführt (n=3 je Gruppe). Ohne
vorhergehende Eröffnung der Peritonealhöhle erfolgte die Injektion der Evans Blue Lösung
und 60 Minuten später die Gewinnung der Gewebeproben wie oben beschrieben.
Abbildung 9: Intestinale Gefäßpermeabilität. Evans Blue Farbstoff wurde intravenös injiziert und die
Akkumulation in jejunalen Gewebeproben als Parameter für die vaskuläre Permeabilität gemessen. Im
Foto gezeigt ist die Verfärbung des Intestinums einer cd39-null Maus nach vorangegangener
Scheinoperation.
Material und Methoden 44
2.6 SERUM- UND GEWEBEPROBEN
2.6.1 Probengewinnung
Die Gewinnung der Serum- und Gewebeproben erfolgte unmittelbar vor Freigabe des
Blutstromes, zum angegebenen Zeitpunkt nach Reperfusion oder von nativen Tieren. Nach
Einleitung der Anästhesie wurde die Peritonealhöhle eröffnet und eine vollständige
Entnahme des zirkulierenden Blutes über die Vena cava inferior mit einer heparinisierten
Spritze durchgeführt. Die zentrifugierten Serumproben wurden in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei –80°C bis zur endgültigen Analyse aufbewahrt. Nach Entnahme der
verschiedenen
Gewebeproben
erfolgte
zunächst
die
Spülung
mit
angewärmter
physiologischer Kochsalzlösung. Die Lumina von Hohlorganen wurden ebenfalls mit
angewärmter Kochsalzlösung gespült. Zur Aufbewahrung bis zur Durchführung der unten
beschriebenen Analysen wurden die Gewebeproben entweder in Formalin fixiert oder
ebenfalls in flüssigem Stickstoff, teilweise unter Verwendung eines Gefriermediums (TBS,
Master*Tech Scientific, Lodi, CA, USA), schockgefroren und bei –80°C gelagert.
2.6.2 Serumzytokine und -VEGF
Für die Bestimmung der Serumkonzentrationen des Interleukin-1α (IL-1α), Interleukin-6
(IL-6), TNF-α und des Vascular-Endothelial-Growth-Factor (VEGF) wurden kommerziell
erhältliche ELISA-Kits von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) bezogen. Die
Durchführung der Experimente erfolgte entsprechend der Empfehlungen des Herstellers.
Alle Proben wurden in dreifacher Ausfertigung gemessen.
Die Serumzytokine wurden in scheinoperierten Wildtyp-Mäusen sowie nach einer
einstündigen Reperfusionsphase nach 60-minütiger Okklusion der Arteria mesenterica
superior bestimmt. Die postischämen Tiere wurden entweder mit löslicher NTPDase oder
dem Vehikel behandelt (n=3 je Gruppe).
Material und Methoden 45
Die Bestimmung der VEGF-Konzentration erfolgte in nativen Wildtyp- und cd39-null
Mäusen (n=3 je Gruppe).
2.6.3 Myeloperoxidase-Aktivität
Die Aktivität der Myeloperoxidase (MPO) wurde als Parameter für das Ausmaß der
Infiltration ischämer Gewebe mit neutrophilen Granulozyten beschrieben [Mullane et al.,
1985]. Die Quantifizierung der MPO erfolgte nach der von K. M. Mullane beschriebenen
Technik. Das Gewicht der gefrorenen intestinalen Probe wurde bestimmt (ca. 100 mg) und
die Probe in 4 ml 0,5%-igem Hexadecyltrimethylammonium-Bromid bei 4°C homogenisiert
und anschließend für 10 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein
frisches Reaktionsgefäß transferiert und mit 100 mM KH2PO4 versetzt, um eine finale
Konzentration von ca. 1 mg/ml zu erreichen. Je 10 µl Probenvolumen wurden in die
Vertiefung der Mikrotiter-Platte übertragen. Der Start der Reaktion erfolgte durch die
Zugabe von je 200 µl Tetramethylbenzidine Liquid Substrate System (Sigma). Nach 30
Minuten wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100 µl 0,5 M H2SO4 gestoppt und der
Farbumschlag bei 450 nm gelesen. Eine Einheit der MPO-Aktivität wurde definiert als
Degradation von 18 µmol H2O2 pro Minute bei 25°C und einem pH von 6,0. Alle Proben
wurden in dreifacher Ausfertigung gemessen.
Die Bestimmung der MPO-Aktivität erfolgte in scheinoperierten Wildtyp-Mäusen sowie
nach einer einstündigen Reperfusionsphase nach 60-minütiger Okklusion der Arteria
mesenterica superior. Die postischämen Tiere wurden entweder mit löslicher NTPDase oder
dem Vehikel behandelt (n=3 je Gruppe).
Material und Methoden 46
2.6.4 NTPDase-Aktivität
Die Enzymaktivität der schockgefrorenen Mausgewebe wurde nach den von J. Sévigny
[Sevigny et al., 1997] und A. A. Baykov [Baykov et al., 1988] beschriebenen Techniken
bestimmt. Die Gewebeproben wurden bei 4°C in Tris-Puffer homogenisiert (95 mM NaCl /
45 mM Tris / 0.1 mM PMSF / 10 µg/mL Aprotinin, pH 7,6) und anschließend für fünf
Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß
übertragen und auf eine Konzentration von ca. 800 µg/ml mit Tris-Puffer verdünnt. Zur
Durchführung des Enzymassays erfolgte die Zugabe von 10 µl Probenvolumen zu einem
Milliliter Reaktions-Puffer (50 mM Tris / 50 mM Imidazol / 8 mM CaCl2, pH 7.5) und die
Inkubation bei 37°C für drei Minuten. Durch die fakultative Zugabe von Tetramisol (5mM)
zum Reaktions-Puffer wurde in einzelnen Experimenten die Hemmung der alkalischen
Phosphatase erreicht [Van Belle, 1972]. Zum Start der Reaktion wurde das Substrat ATP
oder ADP mit einer endgültigen Konzentration von 0,3 mM zugegeben. Die Terminierung
der Reaktion erfolgte nach fünf bis 15 Minuten durch die Zugabe von 0,25 ml Malachit Grün
Reagenz (Stammlösung: 10 ml 0,122 % Malachite-Grün-Hydrochlorid in 6N H2SO4 + 2,5
ml 7,5 % Ammonium Molybdate + 0,2 ml 11 % Tween 20 ). Die Lichtadsorption wurde bei
610 nm in dreifacher Ausfertigung gelesen und die Adsorption in den doppelten
Referenzproben (Zugabe des Proteins nach der Terminierung der Reaktion) subtrahiert. Die
Angabe der Enzymaktivität erfolgte in nmol Pi / mg Protein / min. Die Bestimmung der
Proteinkonzentration wurde nach der von Bradford angegebenen Methode durchgeführt
[Bradford, 1976].
Zusätzlich wurden Jejunumproben von systemisch mit einem rekombinanten CD39Adenovirus infizierten Wildtyp-Mäusen untersucht. Die Gewebeproben wurden von M. Imai
(Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, MA, USA) zur Verfügung
gestellt. Die Entnahme der Organe erfolgte fünf Tage nach dem adenoviralen CD39Gentransfer (1x109 bis 5x1010 PFU in 100 µl). Die Injektion von 1x109 PFU führte in den
entnommenen Lebern zu einer Verfünffachung der Kapazität zur ATP-Hydrolyse bei
gleichzeitiger Halbierung der plasmatischen ATP-Konzentration [Imai et al., 1999a].
Material und Methoden 47
Die NTPDase-Aktivität wurde in folgenden Studiengruppen bestimmt:
1. Native Gewebe (Gehirn, Lunge, Herz, Leber, Pankreas, Niere, Magen, Duodenum,
Jejunum, Milz) von C57BL/6x129Svj-Mäusen
(cd39+/+, cd39-/-, cd39+/-, n ≥ 3 je Gruppe)
2. Jejunum und Mesenterialwurzel nach intestinaler Ischämie und Reperfusion oder
Scheinoperation von C57BL/6x129Svj-Mäusen
(cd39+/+, lösliche NTPDase, n ≥ 3 je Gruppe)
3. Herzen nach xenogener Transplantation im Akkommodations- oder
Rejektionsmodell von C57BL/6x129Svj –Mäusen
(cd39+/+, Zeitverlauf, n ≥ 3 je Gruppe)
4. Leber nach Induktion einer akuten toxische Hepatitis von BALB/c-Mäusen
(Zeitverlauf, n ≥ 3 je Gruppe)
5. Jejunum nach adenoviralem CD39-Gentransfer von BALB/c-Mäusen
(Pilotstudie mit verschiedenen Titern, n=5)
2.6.5 Histologie
Formalinfixierte jejunale Gewebeproben wurden in Paraffin eingebettet. Die Färbung der
Schnitte für die Durchlichtmikroskopie erfolgte mit Hämatoxylin und Eosin.
Material und Methoden 48
2.7 ENDOTHELZELL-AKTIVIERUNG DURCH NUKLEOTIDE
Humane aus Umbilikalvenen isolierte Endothelzellen (HUVEC) wurden von Cambrex
(Walkersville, MD, USA) bezogen und in EGM-2 BulletKit-Medium kultiviert (Cambrex).
Das Medium enthielt Human-Epidermal-Growth-Factor, Hydrokortison, Human-FibroblastGrowth-Factor, VEGF, Ascorbinsäure, Gentamicin, Amphotericin-B, Human-Insulin-likeGrowth-Factor, Heparin und 2 Vol.-% fetales Rinderserum. Die Zellen wurden nach
vollständiger Konfluenz in der vierten Passage für die Experimente verwendet.
Unbehandelte sowie mit 100 µM ATP oder Uridintriphosphat (UTP) inkubierte HUVEC
wurden für 10 Minuten in 3,7 Vol.-% Paraformaldehyd fixiert, für drei bis fünf Minuten mit
0,1 Vol.-% Triton X-100 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) permeabilisiert und für 20
Minuten mit 1 % bovinem Serumalbumin (BSA in phosphatgepufferter physiologischer
Kochsalzlösung, Gewicht/Volumen) geblockt. Die Färbung des Zytoskeletts erfolgte durch
eine 20 minütige Inkubation mit Alexa Fluor 488 Phalloidin (Molecular Probes, 20 µl
Methanol-Stammlösung
in
250
µl
BSA
1%).
Für
die
Durchführung
der
Fluoreszenzmikroskopie wurde das unter 2.4.2 beschriebene Videomikroskop verwendet.
Die Experimente erfolgten in dreifacher Ausführung.
2.8 STATISTIK
Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler angegeben. Die Berechnungen wurden mit
der SPSS-Software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt. In der statistischen Analyse
wurde für kontinuierliche Variablen der Mann-Whitney-U-Test oder der Student-t-Test im
Falle einer Gauss’schen Verteilung verwendet. Die Überlebenskurven wurden nach der von
Kaplan und Meier angegebenen Methode berechnet und unter Verwendung des Log-RankTest verglichen. Ein p-Wert kleiner als 0,05 wurde als statistisch signifikant interpretiert.
Ergebnisse 49
3 ERGEBNISSE
3.1 NTPDase-AKTIVITÄT IN MURINEN GEWEBEN
3.1.1 Native Mausgewebe
Die gesamte NTPDase-Aktivität der untersuchten Proteinpräparationen zeigte, ebenso wie
der Anteil der NTPDase 1 und die Substratspezifität, eine erhebliche organspezifische
Variabilität. Während rund 90 % der NTPDase-Aktivität der Lunge und der Milz auf die
NTPDase 1 entfielen, führte der cd39-Mangel nur zu einer geringen quantitativen Änderung
der Nukleotidase-Aktivität der Leber und des Herzens. Gleichzeitig betrug die spezifische
Aktivität in den beiden letztgenannten Organen für das Substrat ADP nur rund 10% der
Aktivität für ATP. In der Milz, im Duodenum und in der Lunge hingegen betrug die
spezifische Aktivität für ADP mehr als 60% der Aktivität für ATP.
Der cd39-Mangel führte zu einer signifikanten Verminderung der NTPDase-Aktivität des
Gehirns der cd39-null Mäuse im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen (ATP: 106,3 ± 27,49
vs. 151,76 ± 9,73 nmol Pi / mg / min, p=0,027; ADP: 7,14 ± 0,59 vs. 25,15 ± 3,72 nmol Pi /
mg / min, p<0,001; Abbildung 10). Die Substratspezifität war deutlich zu Gunsten des ATP
verschoben.
Die pulmonale substratspezifische Nukleotidase-Aktivität für ADP betrug 62% der Aktivität
für ATP in Wildtyp-Mäusen. Insgesamt zeigte sich für beide Substrate eine deutliche
Reduktion der Hydrolyse-Kapazität von Proteinpräparationen der cd39-null Mäuse
gegenüber den Kontrollen (ATP: 43,1 ± 2,13 vs. 447,29 ± 3,49 nmol Pi / mg / min, p<0,001;
ADP: 3,53 ± 0,57 vs. 277,43 ± 8,43 nmol Pi / mg / min, p<0,001; Abbildung 11).
Ergebnisse 50
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
Gehirn
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
*
cd39 +/+
cd39 -/-
**
ATP
ADP
Substrat
Abbildung 10: NTPDase-Aktivität des Gehirns. Die Nukleotidase-Aktivität nativer Gehirne von
Wildtyp- (cd39 +/+) und cd39-null (cd39 -/-) Mäusen zeigte eine deutliche Substratspezifität für
Adenosintriphosphat (ATP) gegenüber Adenosindiphosphat (ADP). Der cd39-Mangel führte zu einer
signifikanten Reduktion der Nukleotid-Hydrolyse (*: p=0,027 vs. cd39+/+, **: p<0,001 vs. cd39+/+,
NTPDase: Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase, Pi: freies Phosphat).
Lunge
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
500
400
300
cd39 +/+
200
cd39 -/-
100
*
*
0
ATP
ADP
Substrat
Abbildung 11: NTPDase-Aktivität der Lunge. Der cd39-Mangel führte in nativen Lungen von cd39-null
(cd39 -/-) Mäusen zu einem nahezu vollständigen Verlust der Nukleotidase-Aktivität (*: p<0,001 vs.
Wildtyp (cd39 +/+), NTPDase: Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase, Pi: freies Phosphat, cd39
+/+: Wildtyp, ATP: Adenosintriphosphat, ADP: Adenosindiphosphat).
Ergebnisse 51
Native Herzen zeigten mit dem Substrat ATP die höchste NTPDase-Aktivität aller
untersuchten Organe mit einer hohen Substratspezifität (Abbildung 12). Der Verlust der
vaskulären NTPDase in cd39-null Mäusen führte zu keiner Änderung der kardialen Aktivität
(ATP: 522,99 ± 154,63 vs. 462,59 ± 118,48 nmol Pi / mg / min, p=0,263; ADP: 39,38 ±
41,03 vs. 49,61 ± 28,0 nmol Pi / mg / min, p=0,335).
Herz
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
700
600
500
400
cd39 +/+
300
cd39 -/-
200
100
0
ATP
ADP
Substrat
Abbildung 12: NTPDase-Aktivität des Herzens. Das Herz zeigte, mit einer deutlichen Substratspezifität
für Adenosintriphosphat (ATP), die höchste Nukleotidase-Aktivität aller untersuchten Organe. Der
cd39-Mangel führte zu keiner messbaren Veränderung der Nukleotid-Hydrolyse-Aktivität (NTPDase:
Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase, Pi: freies Phosphat, cd39 +/+: Wildtyp, cd39 -/-: cd39null, ADP: Adenosindiphosphat).
Die Nukleotidase-Aktivität der nativen Wildtyp-Leber zeigte ebenfalls eine deutliche
Substratspezifität für ATP, die sich in den cd39-null Organen unverändert darstellte (ATP:
134,02 ± 13,85 vs. 136,7 ± 14,09 nmol Pi / mg / min, p=0,413; Abbildung 13). Die Aktivität
für das Substrat ADP betrug in den Wildtyp-Organen nur 9 % der ATP-Aktivität und zeigte
eine signifikante Reduktion in den cd39-null Lebern (ADP: 11,9 ± 1,08 vs. 4,13 ± 0,59 nmol
Pi / mg / min, p<0,001).
Ergebnisse 52
Wurde die Aktivität der alkalischen Phosphatase durch die Zugabe von Tetramisol gehemmt,
so verringerte sich die NTPDase-Aktivität für ATP in beiden Genotypen gleichermaßen um
rund 60 %.
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
Leber
160
140
120
100
80
60
40
20
0
5 mM Tetramisol
cd39 +/+
cd39 -/-
*
ATP
ADP
*
ATP
ADP
Substrat
Abbildung 13: NTPDase-Aktivität der Leber. Die deutliche Substratspezifität der Leber für
Adenosintriphosphat (ATP) blieb auch nach Hemmung der alkalischen Phosphatase durch Tetramisol
erhalten. Der cd39-Mangel führte zu keiner messbaren Veränderung der ATP-Hydrolyse. Die geringe
Nukleotidase-Aktivität der Leber für Adenosindiphosphat (ADP) war in cd39-null Organen weiter
reduziert (*: p<0,001), wurde aber durch Tetramisol nur wenig beeinflusst, (NTPDase: NukleosidTriphosphat-Diphosphohydrolase, Pi: freies Phosphat, cd39 +/+: Wildtyp, cd39 -/-: cd39-null).
Die NTPDase-Aktivität des cd39-heterozygoten Pankreas zeigte für die beiden Substrate
ATP und ADP (ATP: 71,52 ± 11,28 nmol Pi / mg / min, ADP: 23,85 ± 3,69 nmol Pi / mg /
min) Werte, die im Mittel zwischen den Wildtyp- (ATP: 100,89 ± 73,15 nmol Pi / mg / min,
ADP: 36,04 ± 25,39 nmol Pi / mg / min) und cd39-null Organen (ATP: 39,94 ± 13,96 nmol
Pi / mg / min, ADP: 2,96 ± 0,77 nmol Pi / mg / min) lagen, auch wenn das Signifikanzniveau
durch die hohen Standardfehler in den Wildtyp-Organen nicht erreicht wurde (Abbildung
14). Die Differenz der Nukleotidase-Aktivität zwischen den cd39-heterozygoten und den
cd39-null Pankreata war für beide Substrate signifikant (ATP: p=0,019, ADP: p<0,001).
Ergebnisse 53
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
Pankreas
160
140
120
100
80
60
40
20
0
cd39 +/+
cd39 +/-
*
cd39 -/#
**
ATP
ADP
Substrat
Abbildung 14: NTPDase-Aktivität des Pankreas. Die Nukleotidase-Aktivität des cd39-heterozygoten
(cd39 +/-) Pankreas lag im Mittel sowohl für Adenosintriphosphat (ATP) als auch Adenosindiphosphat
(ADP) zwischen den Werten der Wildtyp- (cd39 +/+) und cd39-null (cd39 -/-) Organe. Aufgrund des
hohen Standardfehlers in den Wildtypen wurde das Signifikanzniveau jedoch nicht erreicht. Die
Differenzen zwischen den heterozygoten und cd39-null Organen waren signifikant (*: p=0,019 vs. cd39
+/-,**: p<0,001 vs. cd39 +/-, #: p=0,044 vs. cd39+/+, NTPDase: Nukleosid-TriphosphatDiphosphohydrolase, Pi: freies Phosphat).
Niere
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
300
250
200
cd39 +/+
150
cd39 -/-
100
50
*
0
ATP
ADP
Substrat
Abbildung 15: NTPDase-Aktivität der Niere. Die Nukleotidase-Aktivität der nativen Niere zeigte eine
deutliche Substratspezifität für Adenosintriphosphat (ATP), die sich in den cd39-null Organen nahezu
unverändert darstellte. Die Kapazität der Niere zur Hydrolyse des Adenosindiphosphat (ADP) wurde
durch den cd39-Mangel weiter vermindert (*: p<0,001, NTPDase: Nukleosid-TriphosphatDiphosphohydrolase, Pi: freies Phosphat, cd39 +/+: Wildtyp, cd39 -/-: cd39-null).
Ergebnisse 54
Die NTPDase-Aktivität der Niere zeigte eine Substratspezifität für ATP, die sich in den
cd39-null Organen nahezu unverändert darstellte (ATP: 257,68 ± 22,92 vs. 196,83 ± 64,79
nmol Pi / mg / min, p=0,064; Abbildung 15). Die ADP-Hydrolyse-Kapazität der Niere wurde
durch den cd39-Mangel weiter vermindert (ADP: 58,86 ± 8,39 vs. 11,83 ± 7,59 nmol Pi / mg
/ min, p<0,001).
Die Organe des oberen Intestinums (Magen, Duodenum und Jejunum) zeigten eine
vergleichbare Verminderung der Nukleotidase-Aktivität in den cd39-null Tieren auf rund
60 % der Aktivität der Wildtypen für ATP. Die absolute Höhe der Enzymaktivität variierte
jedoch deutlich (Magen: 354,68 ± 55,38 vs. 209,1 ± 69,0 nmol Pi / mg / min, p=0,023;
Duodenum: 410,02 ± 26,5 vs. 291,51 ± 74,07 nmol Pi / mg / min, p<0,001; Jejunum: 233,64
± 32,4 vs. 122,18 ± 29,75 nmol Pi / mg / min, p=0,019). Die ATP-Substratspezifität war im
Magen am Stärksten, im Duodenum am Geringsten ausgeprägt. Die Reduktion der ADPHydrolyse-Kapazität in den cd39-defizienten Organen war in allen Fällen signifikant
(Magen: 129,6 ± 17,07 vs. 10,72 ± 2,84 nmol Pi / mg / min, p<0,001; Duodenum: 302,08 ±
16,46 vs. 192,34 ± 83,47 nmol Pi / mg / min, p=0,020; Jejunum: 108,13 ± 28,25 vs. 41,7 ±
21,52 nmol Pi / mg / min, p=0,048). Die Kapazität des Duodenums zur ADP-Hydrolyse war
die höchste aller untersuchten Organe. In Abbildung 16 ist die NTPDase-Aktivität des
Jejunums wiedergegeben.
Die Nukleotidase-Aktivität der cd39-null Milz betrug, ähnlich wie in der Lunge, nur rund
10 % der Enzymaktivität in den Wildtyp-Kontrollen für ATP (128,97 ± 15,46 vs. 16,01 ±
2,94 nmol Pi / mg / min, p<0,001; Abbildung 17). Die Kapazität zur ADP-Hydrolyse ging in
der cd39-null Milz fast vollständig verloren (99,83 ± 15,26 vs. 2,36 ± 0,17 nmol Pi / mg /
min, p<0,001).
Ergebnisse 55
Jejunum
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
300
250
200
cd39 +/+
*
150
cd39 -/-
100
**
50
0
ATP
ADP
Substrat
Abbildung 16: NTPDase-Aktivität des Jejunums. Das native Jejunum zeigte eine signifikante
Verminderung der Nukleotidase-Aktivität für Adenosintriphosphat (ATP) und Adenosindiphosphat
(ADP) in den cd39-null Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen (*: p=0,019 vs. cd39+/+, **: p=0,049
vs. cd39+/+, NTPDase: Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase, Pi: freies Phosphat, cd39 +/+:
Wildtyp, cd39 -/-: cd39-null).
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
Milz
160
140
120
100
80
60
40
20
0
cd39 +/+
cd39 -/-
*
*
ATP
ADP
Substrat
Abbildung 17: NTPDase-Aktivität der Milz. Die Milz der cd39-null Mäuse zeigte eine signifikante
Verminderung der Nukleotidase-Aktivität für Adenosintriphosphat (ATP) im Vergleich zu den
Wildtypen und einen nahezu vollständigen Verlust der Hydrolyse-Kapazität für Adenosindiphosphat
(ADP) (*: p<0,001 vs. cd39+/+, NTPDase: Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase, Pi: freies
Phosphat, cd39 +/+: Wildtyp, cd39 -/-: cd39-null).
Ergebnisse 56
3.1.2 Intestinale Ischämie
Wildtyp Mäuse wurden einer 60-minütigen intestinalen Ischämie oder einer Scheinoperation
unterzogen. Die jejunalen Gewebeproben der scheinoperierten Kontrollen zeigten sowohl
zum Zeitpunkt der „Reperfusion“ (Sham 0’) als auch 60 Minuten später (Sham 60’) eine
stabile Nukleotidase-Aktivität (ATP: 220,35 ± 33,74 vs. 188,94 ± 20,51 nmol Pi / mg / min,
p=0,235; ADP: 102,75 ± 20,43 vs. 82,06 ± 15,51 nmol Pi / mg / min, p=0,233), die sich im
Niveau der nativen Organe bewegte (siehe 3.1.1). Die Proteinpräparationen des ischämen
Jejunums wiesen weder zum Zeitpunkt der Freigabe des Blutstromes (IRI 0’; ATP: 183,50 ±
8,73 nmol Pi / mg / min, p=0,175; ADP: 85,08 ± 2,17 nmol Pi / mg / min, p=0,219) noch
nach einer 60-minütigen Phase der Reperfusion (IRI 60’; ATP: 216,42 ± 16,58 nmol Pi / mg
/ min, p=0,461; ADP: 108,50 ± 7,45 nmol Pi / mg / min, p=0,402) eine Verminderung der
NTPDase-Aktivität gegenüber den Sham 0’-Tieren auf (Abbildung 18).
Intestinale Ischämie - Jejunum
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
300
0' Ischämie +
0' Reperfusion
250
0' Ischämie +
60' Reperfusion
200
150
60' Ischämie +
0' Reperfusion
100
60' Ischämie +
60' Reperfusion
50
0
ATP
ADP
Substrat
Abbildung 18: NTPDase-Aktivität des Jejunums nach intestinaler Ischämie. Das Jejunum zeigte nach
60-minütiger Okklusion der Arteria mesenterica superior (60’ Ischämie) weder zum Zeitpunkt der
Reperfusion (0’ Reperfusion) noch nach 60-minütiger Reperfusion (60’ Reperfusion) eine signifikante
Verminderung der Nukleotidase-Aktivität im Vergleich zu den scheinoperierten Kontrollen (0’
Ischämie) (NTPDase: Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase, Pi: freies Phosphat, ATP:
Adenosintriphosphat, ADP: Adenosindiphosphat).
Ergebnisse 57
Umgekehrt führte die Behandlung der ischämen Tiere vor Reperfusion mit einer Einmaldosis
löslicher NTPDase zu keiner messbaren Erhöhung der Nukleotidase-Aktivität des Jejunums
zum Zeitpunkt der Freigabe des Blutstromes (ATP: 171,23 ± 10,16 nmol Pi / mg / min,
p=0,206 vs. IRI 0’; ADP: 90,90 ± 5,00 nmol Pi / mg / min, p=0,173 vs. IRI 0’) oder nach 60
Minuten Reperfusion (ATP: 180,63 ± 11,20 nmol Pi / mg / min, p=0,425 vs. IRI 0’; ADP:
90,18 ± 9,30 nmol Pi / mg / min, p=0,311 vs. IRI 0’).
Intestinale Ischämie - Mesenterium
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
200
0' Ischämie +
0' Reperfusion
150
100
0' Ischämie +
60' Reperfusion
*
60' Ischämie +
0' Reperfusion
50
**
0
ATP
60' Ischämie +
60' Reperfusion
ADP
Substrat
Abbildung 19: NTPDase-Aktivität des Mesenteriums nach intestinaler Ischämie. Das Mesenterium
zeigte nach 60-minütiger Okklusion der Arteria mesenterica superior (60’ Ischämie) zum Zeitpunkt der
Reperfusion (0’ Reperfusion) einen signifikanten Abfall der Nukleotidase-Aktivität im Vergleich zu den
scheinoperierten Kontrollen (0’ Ischämie). Nach 60-minütiger Reperfusion (60’ Reperfusion) fand sich
eine vollständige Rekonstitution der Enzymaktivität (*: p=0,033 vs. 0’ Ischämie + 0’ Reperfusion, **:
p=0,030 vs. 0’ Ischämie + 0’ Reperfusion, NTPDase: Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase, Pi:
freies Phosphat, ATP: Adenosintriphosphat, ADP: Adenosindiphosphat).
Die Homogenate der Mesenterialwurzel hingegen zeigten nach der 60-minütigen Okklusion
der Arteria mesenterica superior einen signifikanten Abfall der NTPDase-Aktivität (IRI 0’;
ATP: 75,64 ± 29,27 nmol Pi / mg / min, p=0,033 vs. Sham 0’; ADP: 20,77 ± 6,29 nmol Pi /
mg / min, p=0,030 vs. Sham 0’; Abbildung 19) im Vergleich zu den scheinoperierten
Kontrollen zum Zeitpunkt der „Reperfusion“ (Sham 0’; ATP: 156,58 ± 13,42 nmol Pi / mg /
Ergebnisse 58
min, p=0,033 vs. IRI 0’; ADP: 38,85 ± 2,93 nmol Pi / mg / min, p=0,030 vs. IRI 0’). 60
Minuten nach Reperfusion fand sich eine vollständige Rekonstitution der Enzymaktivität
(IRI 60’; ATP: 150,34 ± 22,12 nmol Pi / mg / min, p=0,411 vs. Sham 0’; ADP: 34,22 ± 4,37
nmol Pi / mg / min, p=0,215 vs. Sham 0’).
3.1.3 Xenogene Herztransplantation
Im Modell der heterotopen, xenogenen Herztransplantation (xCTX) zeigten die
transplantierten Spenderherzen in den ersten postoperativen Stunden den Trend einer
abnehmenden Nukleotidase-Aktivität für das Substrat ATP, der im Akkommodationsmodell
nach 12 Stunden das Signifikanzniveau erreichte (p=0,035 vs. 0 Stunden, Abbildung 20a).
Im weiteren Zeitverlauf stieg die Kapazität zur ATP-Hydrolyse im Akkommodationsmodell
wieder an, während sich im Rejektionsmodell ab 48 Stunden eine signifikante Abnahme der
Enzymaktivität gegenüber den Ausgangswerten darstellte (48 Stunden: p=0,048 vs. 0
Stunden, Zeitpunkt der Rejektion: p=0,013 vs. 0 Stunden).
Die Kapazität der transplantierten Herzen zur ADP-Hydrolyse hingegen zeigte einen rapiden
Abfall innerhalb der ersten Stunde nach Reperfusion (Rejektionsmodell: p=0,002 vs. 0
Stunden, Akkommodationsmodell: p=0,004 vs. 0 Stunden, Abbildung 20b). Eine
Rekonstitution der Enzymaktivität stellte sich in den akkommodierten Spenderherzen nach
48 Stunden dar, während die Aktivität im Rejektionsmodell unverändert niedrig blieb
(p=0,009 Akkommodation vs. Rejektion).
Ergebnisse 59
Xenogene Herztransplantation - ATP
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
250
200
150
Rejektion
100
Akkommodation
**
50
*
0
0
1
3
6
12
24
48
*
72
#
Stunden nach xCTX
a
Xenogene Herztransplantation - ADP
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
70
60
50
40
Rejektion
**
30
Akkommodation
20
10
*
0
0
1
3
6
12
24
48
72
#
Stunden nach xCTX
b
Abbildung 20: NTPDase-Aktivität der Spenderherzen nach xenogener Transplantation. a) Nach
xenogener Transplantation (xCTX) zeigten die Spenderherzen eine im Trend abnehmende Kapazität zur
Hydrolyse des Adenosintriphosphates (ATP), die im Akkommodationsmodell nach 12 Stunden das
Signifikanzniveau erreichte und sich im weiteren Verlauf rekonstituierte. Im Rejektionsmodell stellte
sich ab 48 Stunden eine signifikante Verminderung der Enzymaktivität dar. b) Für das
Adenosindiphosphat (ADP) stellte sich in beiden Modellen eine rasche, signifikante Abnahme der
Aktivität dar, die sich im Akkommodationsmodell nach 48 Stunden rekonstituierte. (*: p<0,05 vs. 0
Stunden im Rejektionsmodell, **: p<0,05 vs. 0 Stunden im Akkomododationsmodell, NTPDase:
Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase, Pi: freies Phosphat, #: 72 Stunden nach xCTX oder
Zeitpunkt der Abstoßung im Rejektionsmodell (58 bis 65 Stunden)).
Im Modell der heterotopen, xenogenen Herztransplantation (xCTX) zeigten die
Ergebnisse 60
3.1.4 Akute toxische Hepatitis
Im Modell der akuten toxischen Hepatitis fand sich in den Lebern 24 Stunden nach
Sensibilisierung mit D-gal und LPS-Injektion ein signifikanter Abfall der NTPDase-Aktivität
gegenüber der basalen Enzymaktivität (ATP, 5mM Tetramisol: 41,09 ± 5,01 vs. 12,61 ± 1,91
nmol Pi / mg / min, p=0,012; ADP, 5mM Tetramisol: 8,37 ± 0,37 vs. 4,00 ± 0,37 nmol Pi /
mg / min, p=0,002; Abbildung 21). 48 Stunden nach der Intoxikation zeigten die Organe der
überlebenden Tiere eine vollständige Rekonstitution der Nukleotidase-Aktivität für ATP und
einen Trend zu einer steigenden ADP-Hydrolyse-Kapazität.
60
20
45
15
30
10
15
**
#
5
ADP-Hydrolyse [nmol Pi/mg/min]
ATP-Hydrolyse [nmol Pi/mg/min]
Toxische Hepatitis
ATP
ADP
*
0
0
0
4
12
24
48
Stunden nach LPS-Injektion
Abbildung 21: NTPDase-Aktivität der Leber in der akuten toxischen Hepatitis. 24 Stunden nach
Sensibilisierung mit 2-Amino-2-Deoxy-D-Galaktose und Injektion von Lipopolysaccharid (LPS) zeigte
die Leber einen signifikanten Abfall der Hydrolyse-Kapazität für Adenosintriphosphat (ATP, linke
Achse) und Adenosindiphosphat (ADP, rechte Achse). Die Lebern der überlebenden Tiere wiesen 48
Stunden nach Injektion eine vollständige Rekonstitution der Enzymkapazität für ATP auf (#: p=0,012
vs. 0 Stunden für ATP, *: p=0,002 vs. 0 Stunden für ADP, **: p=0,026 vs. 0 Stunden für ADP, Pi:
freies Phosphat).
Ergebnisse 61
CD39-Gentransfer Jejunum - ATP
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
400
300
200
100
0
0
1,0E+09
5,0E+09
1,0E+10
5,0E+10
rCD39Ad [PFU]
a
CD39-Gentransfer Jejunum - ADP
NTPDase-Aktivität
[nmol Pi/mg/min]
150
100
50
0
0
1,0E+09
5,0E+09
1,0E+10
5,0E+10
rCD39Ad [PFU]
b
Abbildung 22: NTPDase-Aktivität des Jejunums nach adenoviralem CD39-Gentransfer. Unabhängig
von der Quantität der rekombinanten CD39-Adenoviren (rCD39Ad) zeigte sich fünf Tage nach
Injektion eine Verminderung der Nukleotidase-Aktivität des Jejunums im Vergleich zu der nativen
Kontrolle (0). a) Substrat: Adenosintriphosphat (ATP), b) Substrat: Adenosindiphosphat (ADP)
(NTPDase: Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase, Pi: freies Phosphat, PFU: Plaque Forming
Units).
Ergebnisse 62
3.1.5 Adenoviraler CD39-Gentransfer
Die intravenöse Injektion der rekombinanten CD39-Adenoviren (rCD39Ad) führte entgegen
der Erwartung nicht zu einem Anstieg der jejunalen NTPDase-Aktivität. Unabhängig von
der Quantität der injizierten rCD39Ad zeigte sich in der Pilotstudie ein deutlicher Abfall der
Enzymaktivität für die beiden Substrate ATP und ADP im Vergleich zu den nativen
Kontrollen (Abbildung 22).
Ergebnisse 63
3.2 ÜBERLEBENSRATEN IN DEN ISCHÄMIE-REPERFUSIONS-MODELLEN
3.2.1 Modell der hepatischen Ischämie
92 % der Wildtyp-Mäuse überlebten die 45-minütige komplette Ischämie der Leber für mehr
als sieben Tage, während 68 % der cd39-heterozygoten (p<0,001 vs. cd39+/+) und 92 % der
cd39-null Mäuse (p=0,025 vs. cd39+/-, p<0,001 vs. cd39+/+) innerhalb von sechs Stunden
nach Reperfusion verstarben (Abbildung 23). Postmortal zeigten die Wildtyp-Mäuse
fleckförmige Nekroseareale sowie eine Stauung der Sinusoide während die cd39-null Tiere
venöse Thrombosen und den venösen Abflussgebieten entsprechende hämorrhagische
Nekrosen aufwiesen (Abbildung 24).
Hepatische Ischämie - cd39-Genotypen
1,0
cd39+/+
cd39+/-
Kumulatives Überleben
cd39-/0,8
cd39+/+ -zensiert
cd39+/- -zensiert
cd39-/- -zensiert
0,6
0,4
0,2
0,0
0
4
8
12
16
20
24
Stunden nach Reperfusion
Abbildung 23: Überleben der cd39-Genotypen nach hepatischer Ischämie. 92 % der Wildtyp-Mäuse
(cd39+/+)
überlebten
die
45-minütige
hepatische
Ischämie.
Die
signifikant
verminderten
Überlebensraten der cd39-heterozygoten (cd39+/-) und cd39-null Mäuse (cd39-/-) betrugen 32 und 8 %.
Für die grafische Darstellung wurde die Nachbeobachtungszeit nach 24 Stunden zensiert.
Ergebnisse 64
a
d
b
e
c
f
Abbildung 24: Postmortale Befunde nach hepatischer Ischämie. In der Abbildung sind repräsentative
postmortale Befunde nach einer 45-minütigen hepatischen Ischämie von Wildtyp- (linke Spalte, a-c)
und
cd39-null
Mäusen
(rechte
Spalte,
d-f)
wiedergegeben.
Makroskopisch
zeigen
das
Oberbauchpräparat (a) und die Leberschnittfläche (b) der Wildtyp-Maus vereinzelte, fleckförmige
Nekroseareale. Im mikroskopischen Bild (Vergrößerung: 100-fach, c) findet sich eine weitgehend
erhaltene Leberarchitektur mit den Zeichen einer sinusoidalen Stauung. Die makroskopischen Befunde
der cd39-null Maus (Oberbauchpräparat: d, Leberschnittfläche: e) zeigen segmentale, den venösen
Abflussgebieten entsprechende Nekroseareale. In der Histologie (Vergrößerung: 100-fach, f) finden
sich hämorrhagische Nekrosen.
Ergebnisse 65
Sowohl durch Substitution mit löslicher NTPDase als auch durch Supplementation mit
Adenosin und Amrinon ließ sich in den cd39-heterozygoten Tieren eine Überlebensrate von
67 % erreichen (lösliche NTPDase: p=0,086 vs. cd39+/+, Adenosin/Amrinon: p=0,077 vs.
cd39+/+, Abbildung 25).
Hepatische Ischämie - Supplementation
1,0
Vehikel-cd39+/+
Vehikel-cd39+/-
Kumulatives Überleben
NTPDase-cd39+/0,8
Adenosin/Amrinoncd39+/Vehikel-cd39+/+ zensiert
0,6
Vehikel-cd39+/- zensiert
NTPDase-cd39+/- zensiert
0,4
Adenosin/Amrinoncd39+/- -zensiert
0,2
0,0
0
4
8
12
16
20
24
Stunden nach Reperfusion
Abbildung 25: Überleben nach hepatischer Ischämie unter NTPDase- oder Adenosin-Substitution. Die
Überlebensrate der nativen Wildtyp-Mäuse (cd39+/+) betrug 92 % nach 45-minütiger hepatischer
Ischämie. Das kumulative Überleben der cd39-heterozygoten Tiere (cd39+/-) war signifikant vermindert
und betrug 32 %. Durch Substitution der intravasalen Nukleotidase-Aktivität (Apyrase, NTPDase) oder
Applikation von Adenosin und Amrinon konnten für cd39-heterozygote Mäuse Überlebensraten von
67 % erreicht werden. Für die grafische Darstellung wurde die Nachbeobachtungszeit nach 24
Stunden zensiert.
Ergebnisse 66
Nach adenoviralem A20-Gentransfer zeigten die cd39-null Mäuse eine signifikant
verlängerte Überlebenszeit gegenüber ihren Kontrollen (p=0,005 vs. native cd39-/-, p=0,040
vs. β-gal), ein Langzeitüberleben ließ sich jedoch nicht erreichen (Abbildung 26).
Hepatische Ischämie - A20-Gentransfer
1,0
cd39+/+
cd39-/-
Kumulatives Überleben
beta-gal-cd39-/0,8
A20-cd39-/cd39+/+ -zensiert
cd39-/- -zensiert
0,6
0,4
0,2
0,0
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
Stunden nach Reperfusion
Abbildung 26: Überleben nach hepatischer Ischämie und A20-Gentransfer. Die Überlebensrate der
nativen Wildtyp-Mäuse (cd39+/+) betrug 92 % nach 45-minütiger hepatischer Ischämie. Das
kumulative Überleben der cd39-null Tiere (cd39-/-) war signifikant vermindert und betrug 8 %. Alle mit
dem Kontrollvirus (β-Galaktosidase, beta-gal) infizierten cd39-null Mäuse verstarben innerhalb von
acht Stunden. Nach A20-Gentransfer zeigten die cd39-null Mäuse eine signifikant gegenüber ihren
Kontrollen verlängerte Überlebenszeit bis zu 51 Stunden. Für die grafische Darstellung wurde die
Nachbeobachtungszeit nach 72 Stunden zensiert.
Ergebnisse 67
3.2.2 Modell der intestinalen Ischämie
60 % aller Wildtyp-Mäuse starben innerhalb von 24 Stunden nach der 60-minütigen
intestinalen Ischämie (Abbildung 27). Die Applikation einer einzigen Dosis löslicher
NTPDase unmittelbar vor Freigabe der Reperfusion führte zu einem Überleben aller
Wildtyp-Versuchstiere (p=0,038 vs. native Kontrollen).
Intestinale Ischämie - cd39+/+
1,0
Vehikel-cd39+/+
Kumulatives Überleben
NTPDase-cd39+/+
Adenosin/Amrinoncd39+/+
0,8
Vehikel-cd39+/+ zensiert
NTPDase-cd39+/+
-zensiert
0,6
Adenosin/Amrinoncd39+/+ -zensiert
0,4
0,2
0,0
0
12
24
36
48
60
72
Stunden nach Reperfusion
Abbildung 27: Überleben nach intestinaler Ischämie in Wildtyp-Mäusen. Die Überlebensrate der
kochsalzbehandelten Wildtyp-Mäuse (Vehikel-cd39+/+) betrug 40 % nach 60-minütiger intestinaler
Ischämie. Die Substitution einer einzigen Dosis löslicher Nukleotidase vor Freigabe der Reperfusion
(NTPDase) führte zu einer Überlebensrate von 100 %. Die Supplementation mit Adenosin und Amrinon
(Adenosin/Amrinon) hingegen erhöhte das kumulative Überleben nicht. Für die grafische Darstellung
wurde die Nachbeobachtungszeit nach 72 Stunden zensiert.
Ergebnisse 68
a
b
Abbildung 28: Histopathologie nach intestinaler Ischämie in Wildtyp-Mäusen. Nach 60-minütiger
Okklusion der Arteria mesenterica superior und einstündiger Reperfusion zeigten mit dem Vehikel
behandelte Wildtyp-Mäuse eine erhebliche Störung der vaskulären und mukosalen Integrität mit
Einblutungen, segmentalem Verlust des Epithels und einer venösen Stauung (a, Vergrößerung: 250fach). Nach Substitution der intravaskulären Nukleotidase-Aktivität zeigte sich nur eine geringe
Ablösung des Epithels im Bereich der jejunalen Villi, minimale Einblutungen und eine venöse Stauung
(b, Vergrößerung: 250-fach).
Repräsentative histologische Befunde sind in Abbildung 28 wiedergegeben und zeigten eine
Stunde nach Reperfusion erhebliche Störungen der vaskulären und mukosalen Integrität in
Ergebnisse 69
den nativen Wildtyp-Kontrollen mit segmentalem Verlust des Epithels sowie beträchtlichen
Einblutungen. Die apyrasebehandelten Tiere zeigten lediglich eine geringfügige Ablösung
des Epithels im Bereich der jejunalen Villi sowie minimale Einblutungen. Die Behandlung
mit Adenosin und Amrinon führte zu keiner Verlängerung der Überlebenszeiten.
80 % der nativen cd39-heterozygoten Versuchstiere verstarben innerhalb von 24 Stunden
nach Reperfusion (p=0,549 vs. native cd39+/+). Die Substitution mit löslicher NTPDase vor
Freigabe des Blutstromes führte zu keiner signifikanten Verlängerung der Überlebenszeiten
(p=0, 361 vs. native cd39+/-, Abbildung 29).
Intestinale Ischämie - cd39+/-
1,0
Vehikel-cd39+/+
Vehikel-cd39+/-
Kumulatives Überleben
NTPDase-cd39+/0,8
Vehikel-cd39+/+ zensiert
Vehikel-cd39+/- zensiert
0,6
NTPDase-cd39+/- zensiert
0,4
0,2
0,0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
Stunden nach Reperfusion
Abbildung 29: Überleben nach intestinaler Ischämie in cd39-heterozygoten Mäusen. Die
Überlebensrate der nativen cd39-heterozygoten Mäuse (Vehikel-cd39+/-) betrug 20 % nach 60minütiger intestinaler Ischämie. Durch Substitution der intravasalen Nukleotidase-Aktivität (Apyrase,
NTPDase) konnte die Überlebensrate für cd39-heterozygote Mäuse nicht verbessert werden. Das
kumulative Überleben der nativen Wildtyp-Mäuse (Vehikel-cd39+/+) betrug 40 %. Für die grafische
Darstellung wurde die Nachbeobachtungszeit nach 120 Stunden zensiert.
Ergebnisse 70
Die nativen cd39-null Mäuse zeigten unmittelbar nach Freigabe der SMA erhebliche
intestinale Blutungen und 80 % der Versuchstiere verstarben postoperativ innerhalb von 48
Stunden (p=0,78 vs. native cd39+/+).
Sowohl die einmalige als auch die repetitive Substitution mit löslicher NTPDase sowie die
Supplementation mit Adenosin/Amrinon führte zu keiner Verbesserung der Überlebensraten
(Abbildung 30).
Intestinale Ischämie - cd39-/-
1,0
Vehikel-cd39+/+
Vehikel-cd39-/-
Kumulatives Überleben
NTPDase-cd39-/0,8
Adenosin/Amrinoncd39-/rep. NTPDasecd39-/-
0,6
Vehikel-cd39+/+ zensiert
Vehikel-cd39-/- zensiert
0,4
NTPDase-cd39-/- zensiert
Adenosin/Amrinoncd39-/- -zensiert
0,2
rep. NTPDasecd39-/- -zensiert
0,0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
Stunden nach Reperfusion
Abbildung 30: Überleben nach intestinaler Ischämie in cd39-null Mäusen. Die Überlebensrate der
nativen cd39-null Mäuse (Vehikel-cd39-/-) betrug 20 % nach 60-minütiger intestinaler Ischämie.
Sowohl durch einmalige Substitution der intravasalen Nukleotidase-Aktivität (Apyrase, NTPDase) vor
der Freigabe des Blutstromes als auch durch wiederholte Gabe bis 48 Stunden postoperativ (rep.
NTPDase) konnte keine Verbesserung der kumulativen Überlebensrate der cd39-null Mäuse (cd39-/-)
erreicht werden. Die Applikation von Adenosin und Amrinon zeigte ebenfalls keine Steigerung der
Überlebensrate für cd39-null Mäuse. Die Überlebensrate der nativen Wildtyp-Mäuse (Vehikel-cd39+/+)
betrug 40 %. Für die grafische Darstellung wurde die Nachbeobachtungszeit nach 120 Stunden
zensiert.
Ergebnisse 71
Die postmortalen Befunde zeigten ausschließlich in den unbehandelten cd39-null Tieren
einen signifikanten intestinalen Blutverlust. Die Behandlung sowohl mit NTPDase als auch
mit Adenosin/Amrinon verhinderten größere intestinale Blutungen in den cd39-null Mäusen.
Alle verstorbenen Tiere zeigten ein massives intestinales Ödem und Zeichen des toxischen
Schocks mit petechialen Einblutungen. Pulmonale Infarkte fanden sich postmortal nach
intestinaler Ischämie bei allen nativen und einem Viertel der NTPDase-behandelten cd39heterozygoten Mäuse sowie bei zwei Drittel der verstorbenen und mit einer Einmaldosis
NTPDase behandelten cd39-null Tiere.
3.3 THROMBOZYTEN-ADHÄSION NACH INTESTINALER ISCHÄMIE
Nur eine geringe Zahl der fluoreszenzmarkierten Thrombozyten zeigten sich in den
untersuchten intestinalen Arteriolen und Venolen der scheinoperierten Wildtyp-Mäuse
(Sham) adhärent (Abbildung 31a). In der Reperfusionsphase nach 60-minütiger intestinaler
Ischämie fand sich in den mit dem Vehikel behandelten Tieren ein signifikanter Anstieg der
adhärenten Thrombozyten in den postkapillären Venolen (Vehikel vs. Sham: 27,98 ± 4,99
/mm2 vs. 4,39 ± 2,62 /mm2, p=0,007). Dieser Anstieg konnte durch die einmalige
Supplementation mit löslicher NTPDase vor der Freigabe des Blutstromes vollständig
verhindert werden (2,95 ± 1,62 /mm2, p=0,002 NTPDase vs. Vehikel). Die Änderung der
Thrombozytenadhäsion in den Arteriolen erreichte nicht das Signifikanzniveau. Andererseits
zeigte sich in den postischämen Arteriolen eine signifikante Zunahme der rollenden
Thrombozyten im Vergleich zu den scheinoperierten Kontrollen (Vehikel vs. Sham: 146,2 ±
25,6 /mm/s vs. 66,7 ± 2,0 /mm/s, p=0,029, Abbildung 31b). Dieser Trend fand sich
unverändert auch nach Applikation der löslichen NTPDase (157,3 ± 48,6 /mm/s, p=0,088 vs.
Sham). Die Anzahl der rollenden Thrombozyten in den Venolen änderte sich hingegen nicht
signifikant.
Ergebnisse 72
Die cd39-null Mäuse zeigten nach 60-minütiger Okklusion der Arteria mesenterica superior
instabile Kreislaufverhältnisse und wurden deshalb von dieser Analyse ausgeschlossen.
Adhärente Thrombozyten
Thrombozyten / mm 2
35
*
30
25
20
Arteriolen
15
Venolen
10
5
0
Kontrolle
Vehikel
NTPDase
a
Rollende Thrombozyten
Thrombozyten / mm / s
250
200
**
150
Arteriolen
Venolen
100
50
0
Kontrolle
Vehikel
NTPDase
b
Abbildung 31: Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen nach intestinaler Ischämie. Nach 60minütiger Okklusion der Arteria mesenterica superior zeigte sich in der Reperfusionsphase ein
signifikanter Anstieg der adhärenten Thrombozyten in den postkapillären Venolen im Vergleich zu den
scheinoperierten Kontrollen (a, *: p=0,007 vs. Kontrolle und p=0,002 vs. NTPDase). Die Substitution
der intravasalen Nukleotidase-Aktivität (NTPDase) vor Freigabe des Blutstromes verhinderte diesen
Anstieg. In den postischämen Arteriolen zeigte sich entsprechend eine Zunahme der rollenden
Thrombozyten im Vergleich zu den Kontrollen, die im Trend auch nach Substitution der NTPDaseAktivität unverändert bestand (b, **: p=0,029 vs. Kontrolle).
Ergebnisse 73
3.4 KAPILLARLECK NACH INTESTINALER ISCHÄMIE
3.4.1 Intravitale Videomikroskopie
Die Sequestration des fluoreszenzmarkierten Albumins in das perivaskuläre Gewebe
unterschied sich unter den Bedingungen einer konstanten Spülung mit angewärmter
Kochsalzlösung nicht in scheinoperierten Wildtyp- und cd39-null Mäusen (Sham, Abbildung
32).
Kapilläres Albuminleck
Albumin Sequestration (I
P /IV )
1,6
*
1,4
1,2
1,0
0,8
0
10
20
30
40
50
60
Minuten nach Reperfusion
Sham-cd39+/+
Sham-cd39-/-
IR-cd39+/+
IR-cd39-/-
Abbildung 32: Kapillarleck nach intestinaler Ischämie. Der Quotient aus der Lichtintensität im
perivaskulären Gewebe (IP) und der benachbarten Venole (IV) wurde als Parameter für die
Sequestration fluoreszenzmarkierten Albumins bestimmt. In scheinoperierten Wildtyp- und cd39-null
Mäusen (Sham-cd39+/+, Sham cd39-/-) fand sich eine vergleichbare Albumin-Anreicherung. Nach 45minütiger intestinaler Ischämie zeigten cd39-null Mäuse (IR-cd39-/-) im Trend eine vermehrte
Albumin-Sequestration im Vergleich zu den postischämen Wildtyp-Tieren (IR-cd39+/+), die nach 60
Minuten Reperfusion das Signifikanzniveau erreichte (*: p=0,035). Die Wildtyp-Mäuse demonstrierten
nach 45-minütiger Ischämie kein signifikantes Albuminleck.
Ergebnisse 74
Unmittelbar nach Freigabe des Blutstromes nach 45-minütiger intestinaler Ischämie (IR)
zeigten die cd39-null Tiere bei stabilem Kreislauf bereits einen Trend zu einer erhöhten
Albumin-Akkumulation im perivaskulären Gewebe (p=0,078 vs. Sham cd39+/+), während
die Werte der Wildtyp-Mäuse in der gesamten Beobachtungszeit von 60 Minuten keinen
Anstieg gegenüber den Kontrollen demonstrierten. Eine Stunde nach Beginn der
Reperfusionsphase
fand
sich
eine
deutlich
vermehrte
Anreicherung
des
fluoreszenzmarkierten Albumins im perivaskulären Gewebe der cd39-null Mäuse (p=0,035
vs. IR cd39+/+).
3.4.2 Evans Blue Farbstoff
60 Minuten nach der intravenösen Injektion der Evans Blue Lösung zeigte sich in den
nichtoperierten Wildtyp- und cd39-null Kontrolltieren eine vergleichbare Akkumulation des
Farbstoffs in den jejunalen Proben (Kontrolle, 21,6 ± 2,83 OD/g vs. 25,8 ± 1,98 OD/g,
p=0,149, Abbildung 33). Die Eröffnung der Peritonealhöhle und Durchführung der
Scheinoperation führte in den cd39-null Mäusen bereits zu einer deutlich erhöhten
Anreicherung des Evans Blue Farbstoffs im Jejunum (Sham, 39,7 ± 1,84 OD/g, p=0,004 vs.
Kontrolle), während die Wildtyp-Tiere unter diesen Bedingungen keine Steigerung der
Gefäßpermeabilität zeigten (21,4 ± 2,34 OD/g, p=0,484 vs. Kontrolle). In der
Reperfusionsphase nach einer 45-minütigen intestinalen Ischämie fand sich sowohl in den
Wildtyp-Mäusen eine vermehrte Akkumulation des Farbstoffs im jejunalen Gewebe als auch
eine weitere Zunahme in den cd39-null Mäusen (Vehikel; cd39+/+: 44,6 ± 0,97 OD/g,
p=0,002 vs. Sham; cd39-/-: 51,7 ± 2,10 OD/g, p=0,007 vs. Sham, p=0,030 vs. cd39+/+). Die
Substitution der intravasalen NTPDase sowie die Applikation von Adenosin/Amrinon
verhinderten den Anstieg der Evans Blue Akkumulation in der Reperfusionsphase nach
intestinaler Ischämie in den Versuchstieren beider Genotypen. Die gemessenen Werte
unterschieden sich nicht von denen der jeweiligen nichtoperierten Kontrollen (cd39+/+: 25,4
± 7,50 OD/g, p=0,335 NTPDase vs. Kontrolle, 24,6 ± 3,99 OD/g, p=0,285
Adenosin/Amrinon vs. Kontrolle; cd39-/-: 25,0 ± 1,95 OD/g, p=0,397 NTPDase vs.
Kontrolle, 21,1 ± 2,91 OD/g, p=0,130 Adenosin/Amrinon vs. Kontrolle).
Ergebnisse 75
Evans Blue Akkumulation [OD/g]
Gefäßperm eabilität
60
# ##
50
°
40
cd39+/+
* **
30
cd39-/-
20
10
0
Kontrolle
Sham
Vehikel
NTPDase Adenosin/
Amrinon
Abbildung 33: Gefäßpermeabilität nach intestinaler Ischämie. Die optische Dichte (OD) in den
Extrakten der Jejunumproben nach Evans Blue Injektion wurde als Parameter für die
Gefäßpermeabilität bestimmt. Die scheinoperierten cd39-null Mäuse (Sham, cd39-/-) demonstrierten
bereits eine deutlich vermehrte jejunale Evans Blue Akkumulation im Vergleich zu den nichtoperierten
Kontrollen (*: p=0,004) sowie den scheinoperierten Wildtyp-Tieren (cd39+/+, **: p=0,002). Nach 45minütiger intestinaler Ischämie zeigte sich in der Reperfusionsphase in beiden Genotypen eine
Zunahme der Gefäßpermeabilität gegenüber den scheinoperierten Tieren (°: p=0,002, ##: p=0,007).
Die Evans Blue Anreicherung war in den postischämen cd39-null Mäusen signifikant höher als in den
Wildtypen (#: p=0,030). Durch Substitution der intravasalen Nukleotidase-Aktivität (NTPDase) oder
Applikation von Adenosin und Amrinon wurde der postischäme Anstieg der Gefäßpermeabilität
verhindert.
Ergebnisse 76
3.5 SERUM- UND GEWEBEMARKER
3.5.1 Zytokine nach intestinaler Ischämie
Wildtyp-Mäuse zeigten eine Stunde nach Freigabe des Blutstromes nach einer 60-minütigen
Okklusion der Arteria mesenterica superior signifikant höhere Serumkonzentrationen des IL1α als die scheinoperierten Kontrollen (148,2 ± 38,22 pg/ml vs. 62,2 ± 4,49 pg/ml, p=0,045).
Versuchstiere, die vor dem Beginn der Reperfusion mit löslicher NTPDase substituiert
wurden, demonstrierten keinen Anstieg des IL-1α im Serum gegenüber den scheinoperierten
Tieren (81,5 ± 17,87 pg/ml, p=0,176, Abbildung 34).
Interleukin-1α
200
*
IL-1 α [pg/ml]
160
120
80
40
0
Kontrolle
Vehikel
NTPDase
Abbildung 34: Interleukin-1α nach intestinaler Ischämie. Wildtyp-Mäuse zeigten nach 60-minütiger
intestinaler Ischämie (Vehikel) einen signifikanten Anstieg der Serumkonzentration des Interleukin-1α
(IL-1α, *: p=0,045) im Vergleich zu den scheinoperierten Kontrollen. Die Substitution der intravasalen
Nukleotidase-Aktivität (NTPDase) vor Freigabe der Reperfusion verhinderte die vermehrte
Zytokinfreisetzung.
Die Messwerte für das Interleukin-6 wiesen in der Gruppe der postischämen Wildtyp-Mäuse
extreme Abweichungen auf und lieferten somit bei der kleinen Grundgesamtheit nur einen
statistischen Trend zu erhöhten Serumkonzentrationen gegenüber den scheinoperierten
Ergebnisse 77
Tieren (1889,0 ± 1039,53 pg/ml vs. 189,5 ± 1,74 pg/ml, p=0,089, Abbildung 35).
Interleukin-6
3500
IL-6 [pg/ml]
3000
2500
2000
1500
*
1000
500
0
Kontrolle
Vehikel
NTPDase
Abbildung 35: Interleukin-6 nach intestinaler Ischämie. Die Bestimmung der Serumkonzentration des
Interleukin-6 (IL-6) nach 60-minütiger intestinaler Ischämie in Wildtyp-Mäusen (Vehikel) zeigte einen
extremen Standardfehler, so dass sich statistisch nur ein Trend zu einer erhöhten Konzentration im
Vergleich zu den scheinoperierten Kontrollen ergab. Die Substitution der intravasalen NukleotidaseAktivität (NTPDase) vor Freigabe der Reperfusion verhinderte die vermehrte Zytokinfreisetzung nicht
vollständig (*: p=0,003).
Jeder einzelne Messwert der mit dem Vehikel behandelten Tiere lag jedoch über denen der
scheinoperierten Tiere. Die Substitution der intravasalen Nukleotidase-Aktivität konnte die
vermehrte postischäme Freisetzung des IL-6 im Vergleich zu den scheinoperierten Mäusen
nicht verhindern (962,1 ± 138,88 pg/ml, p=0,003).
Die Freisetzung des Tumor-Nekrose-Faktors-α war nach intestinaler Ischämie signifikant
höher als in den scheinoperierten Kontrolltieren (125,9 ± 10,22 pg/ml vs. 61,3 ± 3,53 pg/ml,
p=0,002, Abbildung 36), ein Befund, der sich für die NTPDase-substituierten Tiere nur im
Trend bestätigt (96,2 ± 19,87 pg/ml, p=0,079).
Ergebnisse 78
Tum or Nekrose Faktor α
160
TNF- α [pg/ml]
*
120
80
40
0
Kontrolle
Vehikel
NTPDase
Abbildung 36: Tumor-Nekrose-Faktor-α nach intestinaler Ischämie. Die Serumkonzentration des
Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) in der Reperfusionsphase nach 60-minütiger intestinaler Ischämie in
Wildtyp-Mäusen (Vehikel) zeigte signifikant höhere Werte als in den scheinoperierten Kontrollen
(*: p=0,002). Die Substitution der intravasalen Nukleotidase-Aktivität (NTPDase) vor Freigabe der
Reperfusion verminderte die Zytokinfreisetzung (p=0,079 vs. Kontrolle).
3.5.2 Myeloperoxidase-Aktivität nach intestinaler Ischämie
In der Reperfusionphase nach 60-minütiger Okklusion der Arteria mesenterica superior
zeigten die mit dem Vehikel behandelten Wildtyp-Mäuse keinen signifikanten Anstieg der
MPO-Aktivität in den untersuchten Jejunum-Proben gegenüber den scheinoperierten
Kontrolltieren (123,2 ± 39,31 mU/g vs. 75,1 ± 18,88 mU/g, p=0,166, Abbildung 37). Die
MPO-Aktivität der mit löslicher NTPDase substituierten Tiere lag im Mittel zwischen den
Werten der Kontrolltiere und der postischämen Mäuse (109,0 ± 36,26 mU/g). Trotz der
fehlenden statistischen Signifikanz zum Untersuchungszeitpunkt (60 Minuten nach Freigabe
der Reperfusion) zeigten die Mittelwerte der MPO-Aktivität in den postischämen Geweben
eine Tendenz, die den Ergebnissen der Zytokin-Messungen entsprechen (siehe 3.5.1).
Ergebnisse 79
MPO [mU/g]
Myeloperoxidase
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Kontrolle
Vehikel
NTPDase
Abbildung 37: Myeloperoxidase-Aktivität nach intestinaler Ischämie. Am Ende einer einstündigen
Reperfusionsphase nach 60-minütiger intestinaler Ischämie wurde die jejunale Aktivität der
Myeloperoxidase (MPO) bestimmt. Die Werte der unbehandelten, postischämen Wildtyp-Mäuse
(Vehikel) unterschieden sich nicht signifikant von denen der scheinoperierten Kontrollen oder den
Werten nach Substitution der intravasalen Nukleotidase-Aktivität (NTPDase).
3.5.3 Vascular-Endothelial-Growth-Factor
Die Serumkonzentrationen des VEGF in nativen Wildtyp- und cd39-null Mäusen zeigten mit
74,3 ± 2,75 pg/ml und 98,3 ± 16,75 pg/ml keine signifikante Differenz (p=0,293).
Ergebnisse 80
3.6 ENDOTHELZELL-AKTIVIERUNG DURCH NUKLEOTIDE
Die Stimulation der kultivierten HUVEC mit ATP oder UTP führte zu einer deutlichen
Veränderung der Zellarchitektur im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen. Neben einer
Spreizung
der
Zellen
Fluoreszenzmikroskopie
zeigte
deutlich
sich
die
nach
Färbung
Ausbildung
der
von
Aktinfilamente
sogenannten
in
der
Stressfasern.
Repräsentative Aufnahmen der Experimente sind in Abbildung 38 wiedergegeben.
Ergebnisse 81
a
b
c
d
Abbildung 38: Veränderungen des Zytoskeletts durch Nukleotid-Stimulation. Fluoreszenzmiskoskopie
humaner aus Umbilikalvenen isolierter Endothelzellen (HUVEC) nach Färbung der Aktinfilamente mit
Alexa Fluor 488 Phalloidin. Nach Stimulation mit Adenosintriphosphat (b, Vergrößerung: 100-fach)
oder Uridintriphosphat (c, Vergrößerung: 100-fach) zeigte sich im Vergleich zu den unbehandelten
Kontrollen (a, Vergrößerung: 100-fach) eine Zellspreizung und die Ausbildung von Stressfasern, die in
d) mit einer höheren Vergrößerung wiedergegeben sind (Stimulation mit Adenosintriphosphat,
Vergrößerung: 200-fach).
Diskussion 82
4 DISKUSSION
4.1 NTPDase-AKTIVITÄT IN NATIVEN ORGANEN
Den biologischen Funktionen der Organe entsprechend weist die gesamte NukleotidaseAktivität ebenso wie der Anteil der NTPDase 1 an der Gesamtaktivität eine erhebliche
Variabilität auf. Die höchsten Aktivitäten finden sich in der Lunge mit einem nahezu
vollständigen Aktivitätsverlust nach cd39-Deletion und im Herzen, dessen Gesamtaktivität
durch den cd39-Mangel nicht beeinflusst wird. Mehr als die Hälfte der NukleotidaseAktivität der Leber entfällt auf die alkalische Phosphatase, während die NTPDase 1
quantitativ keine Relevanz aufweist. Im Pankreas und Jejunum hingegen entfällt die Hälfte
der Nukleotidase-Aktivität auf die NTPDase 1.
Die biologische Bedeutung der NTPDase 1 ergibt sich jedoch nicht aus dem quantitativen
Anteil an der globalen Nukleotidase-Aktivität des Organs, als vielmehr aus den variierenden
pharmakologischen Eigenschaften der NTPDasen und deren bevorzugter Lokalisation in den
verschiedenen Kompartimenten der Organsysteme [Sevigny et al., 2002]. Die NTPDase 1
hydrolisiert die Substrate ATP und ADP ohne Zwischenschritt zu AMP und wird in
immunhistologischen Färbungen vorwiegend auf dem Endothel größerer und kleinerer
vaskulärer Strukturen lokalisiert. Die NTPDase 2 hingegen ist vorwiegend eine NukleosidTriphosphatase, liefert als Produkt ADP und wird in der Adventitia und auf Perizyten
exprimiert. Die unterschiedliche biochemische Aktivität dieser beiden NTPDasen und die
Lokalisation in verschiedenen Kompartimenten des Gefäßsystems hat erhebliche Bedeutung
für die Thromboregulation. Das intakte Endothel erhält mit seiner NTPDase 1 eine
antithrombotische Gefäßoberfläche. Nach Störung der Oberflächenintegrität führt die
Freisetzung von ATP aus geschädigten Zellen oder aus den elektronendichten Granula
aktivierter Thrombozyten durch die Aktivität der NTPDase 2 zu einer lokal erhöhten ADPKonzentration. ADP ist ein potenter Agonist der P2Y1- und P2Y12-Rezeptoren der
Thrombozyten
und
stimuliert
prothrombotisches Milieu.
die
Thrombozytenaggregation.
Es
ensteht
ein
Diskussion 83
Neben der Lokalisation im Gefäßsystem finden sich auch in den spezifischen
Kompartimenten der Organe signifikante NTPDase-Aktivitäten, die mit den verschiedenen
physiologischen und pathophysiologischen Funktionen und Funktionszuständen in
Verbindung gebracht werden. Die Azini des exokrinen Pankreas der Maus zeigten eine
kräftige, dem Lumen zugewandte Expression der NTPDase 1, während sich basolateral und
auf den duktalen Epithelzellen eine überwiegende Expression der NTPDase 2 fand [Kittel et
al., 2004]. Dieses Verteilungsmuster weist jedoch eine erhebliche Speziesvariabilität und
inkonstante Ausprägung auf, die im Zusammenhang mit den variierenden biologischen
Funktionen des exokrinen Pankreas interpretiert wird [LeBel et al., 1980; Sevigny et al.,
1998; Beaudoin et al., 1999; Kittel et al., 2002; Kittel et al., 2004]. Die Inselzellen des
humanen Pankreas zeigen ebenfalls eine signifikante NTPDase-Aktivität [Kittel et al., 2002]
und der cd39-Mangel in den cd39-null Mäusen führt zu einer diabetischen Stoffwechsellage
(S.C. Robson, persönliche Kommunikation). Das Verteilungsmuster der purinergen P2Xund P2Y-Rezeptoren korreliert mit den oben beschriebenen Befunden und adaptiert sich
unter pathophysiologischen Bedingungen [Coutinho-Silva et al., 2003]. Extrazelluläre
Nukleotide führten sowohl zu einer verstärkten Insulinsekretion der β-Zellen [FernandezAlvarez et al., 2001] als auch zu einer gesteigerten Chloridsekretion der duktalen
Epithelzellen [Nguyen et al., 2001].
In der Leber des Hausschweins zeigen sich sowohl die Endothelzellen als auch die
Hepatozyten und Gallengangsepithelien positiv für die NTPDase 1 [Leclerc et al., 2000]. In
der Ratte hingegen beschränkt sich der Nachweis der NTPDase 1 auf die vaskulären
Strukturen, während die NTPDase 2 in der Umgebung der intrahepatischen Gallengänge auf
portalen Fibroblasten exprimiert wird, die möglicherweise eine bedeutende Rolle bei der
Enstehung einer Gallengangssklerose haben [Dranoff et al., 2002]. In isolierten hepatischen
Sternzellen zeigte sich eine konstante Expression der NTPDase 1, während die NTPDase 2
nur im aktivierten Zustand nachgewiesen werden konnte, der mit einem veränderten
Expressionsmuster der purinergen P2Y-Rezeptoren einherging und Bedeutung bei der
Fibrosebildung erlangt [Dranoff et al., 2004a; Dranoff et al., 2004b]. Des weiteren wurde in
der Leber verschiedener Spezies eine weitere, neue NTPDase geklont und nachgewiesen
(NTPDase 8), die ebenfalls als Protein der Zelloberfläche imponiert und extrazelluläre
Diskussion 84
Nukleotide hydrolisiert [Bigonnesse et al., 2004; Knowles,Li, 2006]. Die physiologische
Bedeutung
und
Lokalisation
in
der
Leber
verbleibt
zunächst
unklar.
Die
Gallengangsepithelien zeigen eine variable Expression von P2X- und P2Y-Rezeptoren und
ihre Stimulation reguliert die Gallesekretion der Leber [Dranoff et al., 2001].
Der immunhistologische Nachweis der NTPDasen 1 und 2 in murinen Herzen beschränkt
sich auf die vaskulären Strukturen und das Endokard, mit der oben beschriebenen
Kompartimentierung [Sevigny et al., 2002]. Neben dem beschriebenen Einfluss auf die
Thromboregulation wird der Expression der NTPDase 1 auf der glatten Muskulatur der
größeren Gefäße eine Bedeutung in der Regulation des Gefäßtonus zugeschrieben. Die
vasomotorischen Eigenschaften der glatten Muskelzellen werden im Wesentlichen durch
P2X1-Rezeptoren gesteuert und durch die Aktivierung der P2Y-Rezeptoren moduliert
[Erlinge et al., 1998]. Die Stimulation der P2Y-Rezeptoren induzieren darüber hinaus eine
Proliferation der glatten Muskulatur [Hou et al., 2000]. Eine regulierende Rolle der
NTPDase 1 kann in diesem Zusammenhang postuliert werden. Patienten mit einer
chronischen (ischämischen) Herzerkrankung zeigen als Zeichen der veränderten
pathophysiologischen Bedingungen neben dem Nachweis der NTPDase 1 auch auf
Kardiomyozyten [Kittel et al., 2005] zusätzlich ein verändertes Expressionsmuster der
myokardialen P2-Rezeptoren [Banfi et al., 2005]. Der quantitativ größte Anteil der
NTPDase-Aktivität des Herzens wird der NTPDase 6 (CD39L2) zugeschrieben, deren
Genprodukt ausschließlich im Herz und fetalen Gehirn nachweisbar war [Yeung et al.,
2000]. Die messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) der NTPDase 6 wurde in kapillären
Endothelzellen und Kardiomyozyten lokalisiert und das bevorzugte Substrat der NTPDase 6
ist ADP.
Systematische Untersuchungen zur Expression und Funktion von NTPDasen im
Gastrointestinaltrakt liegen bisher nur unvollständig vor. Wir konnten in dieser Arbeit
zeigen, dass rund 60% der Aktivität auf die NTPDase 1 entfällt. Neben dem Nachweis der
endothelialen NTPDase-Aktivität im mesenterialen Stromgebiet [Duval et al., 2003], konnte
CD39/NTPDase 1 ebenso als Antigen auf Enterozyten identifiziert werden [Martin-Villa et
al., 1997]. Der epithelialen NTPDase-Aktivität wurde eine physiologische Rolle bei der
Degradation von Nahrungs-Nukleotiden zugeordnet [Schweickhardt et al., 1995]. Neuere
Diskussion 85
Untersuchungen zeigten unter hypoxischen Bedingungen einen erheblich gesteigerten
epithelialen cd39-mRNA-Nachweis, der mit einer vermehrten Permeabilität des Epithels
einhergeht [Synnestvedt et al., 2002]. Eine signifikante NTPDase-Aktivität fand sich darüber
hinaus in den intestinalen Lymphstrukturen [Benrezzak et al., 1999]. Die enteralen
Gliazellen waren positiv für die NTPDase 2 [Braun et al., 2004]. Entsprechend lassen sich
P2-Rezeptoren in den vaskulären Strukturen und der glatten Muskulatur des Intestinums
nachweisen, die den Gefäßtonus und die Darmmotilität regulieren [Giaroni et al., 2002]. Die
Aktivierung der purinergen Rezeptoren des Epitheliums beeinflusst die Kalium-, Bikarbonatund Chlorid-Sekretion und hemmt die Natrium-Rückresorption [Bucheimer,Linden, 2004].
Die Lokalisation der Ekto-Nukleotidasen in der Niere und insbesondere ihre variierende
Verteilung entlang der verschiedenen Abschnitte des Nephrons wurde kürzlich ausführlich
dargestellt [Vekaria et al., 2006]. Es fand sich eine Koexpression mit den verschiedenen
Adenosin-
und
P2-Rezeptoren.
Die
biologischen
Wirkungen
dieses
komplexen
Verteilungsmusters verbleiben jedoch zunächst unklar.
4.2 NTPDase-AKTIVITÄT BEI AKUTEN ORGANSCHÄDEN
Nach warmer intestinaler Ischämie zeigen die Proteinpräparationen der Jejunumsegmente
keinen messbaren Abfall der NTPDase-Aktivität. Die mesenterialen Präparate mit einem
hohen Anteil vaskulärer Strukturen hingegen demonstrieren zum Zeitpunkt der Freigabe des
Blutstromes nach 60-minütiger Okklusion der Arteria mesenterica superior eine signifikante
Verminderung der NTPDase-Aktivität. Innerhalb einer Stunde nach Reperfusion findet sich
eine vollständige Rekonstitution. Im Modell der xenogenen Herztransplantation mit einer
einstündigen kalten Ischämie zeigt sich eine prolongierte Rekonstitutionsphase. Nach einem
signifikanten Abfall der globalen NTPDase-Aktivität des Herzens unmittelbar nach Freigabe
des Blutstromes bleibt dieser für mehr als 24 Stunden im Akkommodationsmodell bestehen.
Im Rejektionsmodell findet sich bis zum Zeitpunkt des Organverlustes keine Zunahme der
Diskussion 86
Aktivität. Im Modell der akuten toxischen Hepatitis wird die erwartete Verminderung der
globalen hepatischen NTPDase-Aktivität 24 Stunden nach Injektion des Lipopolysaccharids
nachgewiesen. Bei den überlebenden Tieren zeigt sich 48 Stunden nach der Injektion eine
Regeneration der Enzymaktivität.
Der
Verlust
der
vaskulären
NTPDase-Aktivität
in
Ischämie-Reperfusions-
und
Transplantationsmodellen wurde bereits mehrfach demonstriert [Candinas et al., 1996;
Koyamada et al., 1996; Robson et al., 1997; Robson et al., 1999]. Mit den hier vorgestellten
Daten kann jedoch erstmals der Verlust der Aktivität unmittelbar nach der Ischämiephase
und der Zeitverlauf der Rekonstitution in Abhängigkeit vom Ausmaß der Schädigung belegt
werden. In vorhergehenden immunhistologischen Untersuchungen zeigte sich nach
Ischämie-Reperfusion kein vollständiger Verlust der endothelialen cd39-Expression. Die
verminderte NTPDase-Aktivität wurde vielmehr als Folge einer Konformationsänderung des
Proteins angesehen. Im Modell der xenogenen Herztransplantation jedoch folgte die
Rekonstitution der NTPDase-Aktivität dem Nachweis einer gesteigerten cd39-mRNATranskription [Imai et al., 1999c].
Als Folge der verminderten cd39-Aktivität des postischämen Gefäßendothels kann eine lokal
erhöhte ATP- und ADP-Konzentration postuliert werden, die ein prothrombotisches und
proinflammatorisches Milieu entstehen lässt. Primär durch das Ischämie-Trauma oder
sekundär durch freie Nukleotide aktivierte Thrombozyten setzen einerseits weitere
Adenosinnukleotide frei und unterhalten das prothrombotische Milieu (siehe 1.3.1 und
1.3.2), andererseits aktivieren sie das Komplementsystem [Del Conde et al., 2005]. Die
Ausbildung von Mikrothromben wurde außerdem als Promoter der Monozytenrekrutierung
beschrieben [Mause et al., 2005]. Insgesamt wurden aktivierte Thrombozyten bereits früher
als Mitinitiator einer postischämen Entzündungsreaktion angesehen [Massberg et al., 1998;
Massberg et al., 1999; Salter et al., 2001]. Weiterhin kann in den vorgestellten Experimenten
in vitro eine direkt durch Nukleotide induzierte Endothelzell-Aktivierung mit einer
entsprechenden Veränderung des Zytoskeletts nachgewiesen werden (siehe 3.6), die durch
P2Y-Rezeptoren vermittelt wird [Kaczmarek et al., 2005]. Ähnliche Experimente mit einer
gezielten Stimulation der P2-Rezeptoren in kultivierten HUVEC führten zu einer
Zellschrumpfung, die als Ursache für eine gesteigerte vaskuläre Permeabilität angesehen
Diskussion 87
wurde [Tanaka et al., 2004]. Somit kommt der vaskulären NTPDase-Aktivität eine
Schlüsselrolle in der Pathophysiologie des Ischämie-Reperfusionsschadens zu.
Neben den beschriebenen Auswirkungen der erhöhten ATP- und ADP-Konzentrationen,
kann durch den postischämen Verlust der NTPDase-Aktivität zusätzlich ein vermindertes
Substratangebot für die 5’-NT erwartet und somit eine verminderte endogene
Adenosingeneration postuliert werden. Adenosin selbst antagonisiert, insbesondere durch die
Stimulation der A2A-Rezeptoren, eine Vielzahl der Wirkungen der Adenosinnukleotide und
wird als antiinflammatorisches Agens angesehen [Sullivan, 2003]. Adenosin hemmt die
Thrombozytenaggregation,
inhibiert
die
Leukozytenaktivierung
und
wirkt
endothelzellprotektiv. Der vaskuläre NTPDase-Mangel vermag somit den IschämieReperfusionsschaden durch den Erhalt eines prothrombotischen und proinflammatorischen
Milieus (ATP, ADP) sowie durch Hemmung antiinflammatorischer Effekte (Adenosin) zu
verstärken.
Im Gegensatz zur NTPDase 1 wurde die Expression und Aktivität der 5’-NT (cd73) durch
akuten oxidativen Stress induziert [Chen et al., 2001]. Eine chronische Hypoxie hingegen
führte in vitro sowohl zu einer vermehrten Aktivität der 5’-NT als auch zu einer Induktion
der NTPDase 1 in kultivierten Endothelzellen [Eltzschig et al., 2003; Li et al., 2006].
Ausreichende Daten zur Bewertung der Rolle der Nukleotidasen und der purinergen
Metabolite im Modell der akuten toxischen Hepatitis liegen derzeit nicht vor. In den
vorliegenden Experimenten haben wir eine Verminderung der globalen NTPDase-Aktivität
24 Stunden nach Lipopolysaccharid-Injektion nachgewiesen. Die Applikation eines
selektiven A2A-Rezeptor-Agonisten führte in einem vergleichbaren Mausmodell zu einer
signifikanten Reduktion sowohl der TNF-α-Produktion als auch der Letalität im Vergleich
zu den unbehandelten Kontrollen [Odashima et al., 2005]. Andererseits führte die 5-fach
vermehrte CD39-Expression nach adenoviralem Gentransfer in Hepatozyten und
Sinusoidalzellen zu einer erhöhten Letalität nach LPS-induzierter Hepatitis im Vergleich zu
den
vektorinfizierten
oder
unbehandelten
Kontrolltieren
[Imai
et
al.,
1999a].
Diskussion 88
Allerdings bedingte die erhebliche Überexpression der NTPDase 1 in den infizierten Mäusen
eine signifikante Reduktion der ATP-Plasmakonzentration, so dass die erhöhte Letalität
möglicherweise vorrangig durch eine Energiedepletion bedingt sein könnte (M. Imai und O.
Guckelberger, unveröffentlichte Daten).
4.3 BEDEUTUNG DER NTPDase 1 FÜR DIE HEPATISCHE ISCHÄMIETOLERANZ
Die in den Wildtyp-Mäusen mit einer niedrigen Letalität einhergehende, 45-minütige
hepatische Ischämie führt in Tieren mit einem cd39-Mangel zu einer signifikanten
Mortalität. Die Substitution mit Adenosin/Amrinon oder löslicher NTPDase in der
Reperfusionsphase verbessert die Überlebensraten der heterozygoten Mäuse signifikant. Die
Expression des protektiven Gens A20 führt zu einer verlängerten Überlebenszeit, ohne
jedoch ein Langzeitüberleben erreichen zu können.
Eine systematische Analyse der Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen während der
Leberreperfusion zeigte mit Verlängerung der Ischämiezeit eine Zunahme der mit dem
Endothel interagierenden Thrombozyten, die linear mit der Störung der sinusoidalen
Perfusion korrelierte [Khandoga et al., 2003]. Die hier vorgestellten Daten zeigen ebenfalls
eine sinusoidale Stauung bei den postischämen Wildtyp-Mäusen mit einer Überlebensrate
von 92 %. Die cd39-null oder cd39-heterozygoten Tiere demonstrieren eine deutlich
verminderte Ischämietoleranz. In den cd39-null Tieren formieren sich bei fehlender
vaskulärer NTPDase-Aktivität segmentale Thrombosen der venösen Abflussgebiete mit
einer Letalität von 92 %. Die Mortalität der cd39-heterozygoten Tiere beträgt 68 %, die sich
unter der Substitution mit löslicher NTPDase auf 33 % reduziert. Der cd39-Mangel lässt sich
durch die Supplementation in der Reperfusionsphase kompensieren.
Adenosin, das Endprodukt des extrazellulären purinergen Stoffwechsels durch die
Nukleotidasen, wurde als bedeutender Mediator der hepatischen Präkonditionierung
Diskussion 89
identifiziert [Serracino-Inglott et al., 2002; Carini,Albano, 2003; Koti et al., 2003;
Teoh,Farrell, 2003]. Durch die Exposition gegenüber einer kurzfristigen hepatischen
Ischämie wird eine erhöhte Ischämietoleranz der Leber induziert (ischämische
Präkonditionierung, IPC). Dieser Effekt kann ebenfalls durch verschiedene chemische
Substanzen erreicht werden (pharmakologische Präkonditionierung). Die detailliertesten
Daten liegen für die Applikation von Adenosin oder selektiven A2A-Rezeptor-Agonisten vor
[Harada et al., 2000; Ben-Ari et al., 2005]. Die pharmakologische Präkonditionierung erfolgt
vor Induktion der hepatischen Ischämie. In den vorgestellten Experimenten zeigt die
Substitution mit Adenosin/Amrinon während der Reperfusionsphase den gleichen Effekt wie
die Supplementation der NTPDase-Aktivität in den cd39-heterozygoten Mäusen (33 %
Mortalität). Auch für Wildtyp-Tiere konnte ein Nutzen der A2A-Rezeptor-Stimulation in der
Reperfusionsphase nach hepatischer Ischämie gezeigt werden [Day et al., 2004]. Eine
verzögerte Applikation bis zu einer Stunde nach Freigabe des Blutstromes war ebenfalls
noch hepatoprotektiv wirksam.
Die NTPDase 1 stellt einen essentiellen Faktor für die Ischämietoleranz der Leber dar, deren
pathophysiologische Bedeutung sich insbesondere in der frühen Phase der Reperfusion
manifestiert. Im Rahmen der hepatischen Ischämietoleranz stellt die Generierung des AMP
einen bedeutsamen Teil der Wirkung der vaskulären NTPDase dar. Das AMP ist als Substrat
der 5’-NT eine signifikante, endogene Quelle des hepatoprotektiven Adenosins. Das
protektive Gen A20 kompensiert den NTPDase 1-Mangel nur teilweise.
4.4 BEDEUTUNG DER VASKULÄREN NTPDase FÜR DEN INTESTINALEN
ISCHÄMIE-REPERFUSIONSSCHADEN
4.4.1 Ischämietoleranz
Die 60-minütige intestinale Ischämie ist in nativen Wildtyp-, cd39-null und cd39heterozygoten Mäusen mit einer hohen Letalität verbunden. Die einmalige Substitution mit
Diskussion 90
löslicher NTPDase vor Freigabe des Blutstromes führt bei den Wildtyp-Versuchstieren zu
einer Ischämietoleranz, mit dem Erhalt der vaskulären und mukosalen Integrität in den
jejunalen Histologien. Die Mäuse mit einem cd39-Mangel hingegen profitieren nicht
signifikant von der NTPDase-Supplementation. Die Applikation von Adenosin/Amrinon
führt in dem Modell des ausgeprägten intestinalen Ischämie-Reperfusionsschadens sowohl
bei den Wildtypen als auch bei den cd39-defizienten Mäusen zu keiner Verbesserung der
Überlebensraten [Guckelberger et al., 2004].
In der Frühphase nach Reperfusion einer Dünndarmischämie konnte die Beteiligung der
Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen
an
den
pathophysiologischen
Prozessen
experimentell nachgewiesen [Massberg et al., 1998; Massberg et al., 1999] und eine
postischäme Dysfunktion der frei zirkulierenden Thrombozyten, im Sinne einer
Verbrauchskoagulopathie, gezeigt werden [Aydemir-Koksoy et al., 1999]. Dementsprechend
kann der protektive Effekt der löslichen NTPDase bei Wildtyp-Mäusen in dem vorgestellten
Modell der intestinalen Ischämie durch die Elimination des ADP als antithrombogene
Wirkung interpretiert werden. In den cd39-defizienten Tieren muss durch die NTPDaseSubstitution hingegen mit einer Resensibilisierung der Thrombozyten und einem ReboundPhänomen gerechnet werden [Robson et al., 2000]. Die reaktive Hyperaktivität der
Thrombozyten könnte den fehlenden protektiven Effekt und die pulmonalen Infarkte bei
diesen Tieren erklären.
Auch für den Dünndarm wurde das Konzept der ischämischen Präkonditionierung mit
wechselnden Protokollen angewendet und mit einer Vielzahl von Mediatoren assoziiert
[Mallick et al., 2004]. Die pharmakologische Präkonditionierung mit Adenosin zeigte einen
mit der IPC vergleichbaren protektiven Effekt [Unal et al., 2003], während die Applikation
eines A1-Rezeptor-Antagonisten die Induktion der Ischämietoleranz durch die IPC
verhinderte [Davis et al., 1999]. Die alleinige Supplementation mit Adenosin/Amrinon in der
Reperfusionsphase führt in unserem Modell der intestinalen Ischämie zu keiner signifikanten
Steigerung der Ischämietoleranz.
Der deutliche Überlebensvorteil der mit löslicher NTPDase behandelten Wildtyp-Mäuse
kann als Folge der dualen Wirkung (ADP-Elimination und endogene Adenosin-Generation)
Diskussion 91
angesehen werden und geht mit einer verminderten postischämen Zytokinfreisetzung (TNFα und IL-1α) im Vergleich zu den Kontrollen einher. Die postischämen Konzentrationen von
TNF-α und IL-1α werden als Parameter sowohl für den oxidativen Stress im Gewebe als
auch für die Aktivierung des Komplementsystems angesehen [Cerqueira et al., 2005].
Die Infiltration des postischämen Intestinums mit neutrophilen Granulozyten (PMN)
verursacht durch die Freisetzung proteolytischer Enzyme, die Produktion freier Radikale und
die Störung der Mikrozirkulation einen erheblichen Gewebeschaden [Mallick et al., 2004].
Die Emigration der PMN aus den postkapillären Venolen stellt einen komplexen dreistufigen
Prozess dar („rolling, adhesion, and extravasation“), der verschiedene Adhäsionsmoleküle,
Chemoattractants, Chemokine und Integrine involviert. Die Infiltration des Gewebes wird
indirekt durch die Myeloperoxidase-Aktivität bestimmt. Zu dem von uns ausgewerteten
frühen Zeitpunkt (60 Minuten nach Freigabe des Blutstromes) zeigt sich weder bei den
nativen noch bei den NTPDase-behandelten Wildtyp-Mäusen ein signifikanter Anstieg der
jejunalen MPO-Aktivität.
4.4.2 Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen
Bereits in den ersten Minuten der Reperfusion nach einer 60-minütigen Okklusion der
Arteria mesenterica superior zeigt sich bei den Wildtyp-Mäusen eine signifikante Zunahme
der in den postkapillären Venolen adhärenten Thrombozyten im Vergleich zu den
scheinoperierten Kontrollen. Durch die einmalige Substitution der intravasalen NTPDaseAktivität vor Freigabe des Blutstromes kann dieser Anstieg vollständig verhindert werden.
Die Adhäsion der Thrombozyten am Endothel erfolgt direkt durch Ligand-RezeptorBindung oder indirekt durch Leukozyten-Vermittlung [Massberg et al., 1999; Cooper et al.,
2004] und wird im Wesentlichen durch P-Selectin initiiert, das sowohl von aktivierten
Thrombozyten als auch aktivierten Endothelzellen exprimiert wird [Massberg et al., 1998;
Vandendries et al., 2004]. Für die Interaktionen der Thrombozyten mit der Gefäßwand
während der intestinalen Reperfusion wurden zwei Phasen beschrieben, die zeitlich mit einer
gesteigerten Expression von P-Selectin korrelieren [Cooper et al., 2003]. In der frühen Phase,
Diskussion 92
Minuten nach Freigabe des Blutstromes, werden präformierte Adhäsionsmoleküle aus den
Weibel-Palade-Körpern an der Oberfläche der Endothelzellen exprimiert [Eppihimer et al.,
1997]. Fünf Stunden nach Reperfusionsbeginn zeigte sich ein erneuter Anstieg der PSelectin-Expression, dem ein vermehrter mRNA-Nachweis voranging. Die irreversible
Bindung der Thrombozyten an die Endothelzellen wurde als fibrinogenassoziiert beschrieben
[Massberg et al., 1999]. Neben der Störung der Mikrozirkulation durch die Thrombogenese,
fördern aktivierte und adhärente Thrombozyten die Gewebeinfiltration mit neutrophilen
Granulozyten und werden somit als früher Mediator des Reperfusionsschadens angesehen
[Kirton,Nash, 2000; Cooper et al., 2003; Vandendries et al., 2004].
Die Substitution der intravasalen NTPDase-Aktivität unmittelbar vor Beginn der
Reperfusion des ischämen Intestinums kann in unseren Experimenten die frühe Phase der
Thrombozyten-Adhäsion zuverlässig verhindern. Dabei dürfte sowohl die verminderte
Thrombozyten- als auch die verminderte Endothelzellaktivierung von pathogenetischer
Bedeutung sein.
4.4.3 Vaskuläre Permeabilität
Bereits eine moderate intestinale Ischämie führt in der ersten Stunde nach Freigabe des
Blutstromes zu einem signifikanten Anstieg der Gefäßpermeabilität. Dieser Anstieg ist in
cd39-null Mäusen bereits nach Durchführung einer Scheinoperation evident und nach
Okklusion der Arteria mesenterica superior signifikant stärker ausgeprägt als in den WildtypTieren. Die erhöhte vaskuläre Permeabilität kann in beiden Genotypen durch die Substitution
mit
löslicher
NTPDase
oder
Adenosin/Amrinon
verhindert
werden.
Die
Serumkonzentrationen des VEGF, das einen potenten Stimulus für die Gefäßpermeabilität
darstellt [Josko et al., 2000], sind in nativen Mäusen beider Genotypen vergleichbar.
Die Aktivierung von Endothelzellen durch mechanische oder chemische Reize führt unter
Beteiligung einer Vielzahl von Signalwegen zu einer Verminderung ihrer Barrierefunktion
für Makromoleküle [Wu, 2005; Mehta,Malik, 2006]. In vitro führte ADP als Agonist der
P2Y1-Rezeptoren zu einer Kontraktion von kultivierten Endothelzellen [Tanaka et al., 2004]
Diskussion 93
und die hier vorgestellten Daten beschreiben nach Stimulation mit ATP ebenfalls eine
Änderung der Zellarchitektur. Die Substitution mit löslicher NTPDase kann somit durch
Elimination der Nukleotide ATP und ADP das postischäme Kapillarleck vermindern.
Außerdem konnten sowohl Adenosin als auch Adenosin-Rezeptor-Agonisten in vitro eine
Verminderung der vaskulären Permeabilität induzieren [Wang et al., 2005]. In-vivoExperimente zeigten darüber hinaus eine wirksame Verminderung des Kapillarlecks unter
Hypoxie-Bedingungen durch die Aktivität der 5’-NT (cd73), deren Wirkung der
Generierung von endogenem Adenosin zugeschrieben und durch Adenosin-RezeptorAgonisten in cd73-null Mäusen teilweise kompensiert wurde [Thompson et al., 2004]. Durch
die Hydrolyse der Adenosinnukleotide ATP und ADP zu AMP stellt die NTPDase im
postischämen Gefäßbett zusätzlich das Substrat für die Generation von endogenem Adenosin
bereit und kann auch über diesen Mechanismus die vaskuläre Permeabilität vermindern.
Neben Adenosin zeigte auch die alleinige Applikation eines selektiven PhosphodiesteraseIII-Inhibitors eine Verminderung der Ischämie-Reperfusion induzierten Gefäßpermeabilität
[Mizutani et al., 2005], was möglicherweise die potente Wirkung der in unseren
Experimenten verwendeten Adenosin/Amrinon-Kombination erklärt.
4.5 RESÜMEE UND AUSBLICK
Im Rahmen der experimentellen, warmen hepatischen oder intestinalen Ischämie stellt die
vaskuläre NTPDase 1 (cd39) einen bedeutenden Faktor für die Ischämietoleranz der murinen
Organe dar, der in cd39-defizienten Versuchstieren durch die Substitution mit löslicher
NTPDase teilweise kompensiert werden kann. In der frühen Reperfusionsphase des
Intestinums zeigt sich in den vaskulären Strukturen der Wildtyp-Mäuse ein signifikanter
Abfall der NTPDase-Aktivität, die innerhalb von 60 Minuten eine vollständige
Rekonstitution
erfährt.
In
dem
Transplantationsmodell
mit
einem
zusätzlichen
Diskussion 94
Konservierungsschaden und fortgesetzten immunologischen Insulten zeigt sich eine
erheblich verzögerte Rekonstitution der NTPDase-Aktivität. In dem Modell der intestinalen
Ischämie in Wildtyp-Mäusen kann die einmalige Substitution mit einer löslichen NTPDase
vor Freigabe des Blutstromes einen nahezu vollständigen Erhalt der vaskulären und
mukosalen Integrität erreichen und das Überleben der Tiere signifikant verbessern. Die
NTPDase-Substitution verhindert in diesem Modell die frühe Phase der gesteigerten
Thrombozyten-Adhäsion an das postischäme Endothel und geht mit einer deutlich
reduzierten vaskulären Permeabilität einher. Als Ausdruck des verminderten IschämieReperfusionsschadens finden sich 60 Minuten nach Freigabe des Blutstromes keine
signifikant erhöhten Serumkonzentrationen der Zytokine TNF-α und IL-1α in der Gruppe der
NTPDase-substituierten Wildtyp-Tiere.
Für die beschriebenen protektiven Eigenschaften der NTPDase postulieren wir einen dualen
Wirkmechanismus. Einerseits führt die Hydrolyse der intravasalen Nukleotide ATP und
ADP zu einer verminderten Stimulation der prothrombotischen und proinflammatorischen
purinergen Rezeptoren der Thrombozyten und Endothelzellen. Andererseits ist das Produkt
der ATP- und ADP-Hydrolyse (AMP) gleichzeitig das Substrat der 5’-NT mit dem
Endprodukt Adenosin. Das endogene Adenosin wirkt über die Stimulation der AdenosinRezeptoren antiaggregatorisch und antiinflammatorisch.
Die Stimulation der Adenosin-Rezeptoren durch endogenes Adenosin (ischämische
Präkonditionierung) oder selektive Agonisten (chemische Präkonditionierung) ist als
Strategie zur Verminderung des Ischämie-Reperfusionsschaden bereits fest etabliert [Riksen
et al., 2004a; Riksen et al., 2004b]. Die Blockierung der proaggregatorischen Wirkung des
ADP
durch
Clopidrogel
(P2Y12-Antagonist)
hat
sich
in
einem
Modell
der
Extremitätenischämie ebenfalls als wirksam erwiesen [Kanko et al., 2005].
Zur pharmakologischen Anwendung der NTPDase wurde zunächst eine rekombinante,
wasserlösliche Form des CD39 konstruiert (solCD39) [Gayle et al., 1998] und erfolgreich in
einem murinen Schlaganfallmodell eingesetzt [Pinsky et al., 2002]. Zur Konservierung der
hohen biologischen Nukleotidase-Aktivität der membrangebundenen, natürlichen Form des
CD39 wurde in einem neuen Ansatz CD39 in Liposomen rekonstituiert und die Funktion in
Diskussion 95
einem Thromboemboliemodell überprüft [Haller et al., 2006].
Außer in den zitierten Ischämie-Reperfusions- und Transplantationsmodellen wurden
weitere potentielle pharmakologische Applikationen der intravasalen NTPDase-Substitution
diskutiert [Marcus et al., 2005; Robson et al., 2005; B. Atkinson et al., 2006]. In einem
Schlaganfallmodell mit verzögerter Substitution der vaskulären NTPDase (drei Stunden nach
Induktion der cerebralen Ischämie) war das Infarktvolumen signifikant reduziert [Pinsky et
al., 2002]. Neben der Reduktion des Infarktvolumens wurde weiterhin ein protektiver
Einfluss der NTPDase auf das elektrophysiologische kardiale Infarktgeschehen durch
Interferenz mit der Freisetzung von Neurotransmittern postuliert [Marcus et al., 2005]. Zum
weiteren Studium der Effekte der vaskulären NTPDase in vivo wurden transgene Mäuse
generiert, die humanes CD39 exprimieren [Dwyer et al., 2004].
Schlussfolgerungen 96
5 SCHLUSSFOLGERUNGEN
Ausgehend von den formulierten Hypothesen und Fragestellungen (siehe 1.5) lassen sich die
Bedeutung der vaskulären NTPDase 1/CD39 für den hepatischen und intestinalen IschämieReperfusionsschaden sowie die Implikationen für andere Organe und vergleichbare
pathophysiologische Zustände wie folgt zusammenfassen:
1. Der quantitative Anteil der NTPDase 1 an der globalen Nukleotidase-Aktivität der
Organe lässt keinen Rückschluss auf deren Bedeutung für die Ischämietoleranz des
Organsystems zu, da sich der Ischämie-Reperfusionsschaden initial am Endothel des
Gefäßbettes manifestiert.
2. Nach Freigabe des Blutstromes lässt sich ein unmittelbarer Verlust der vaskulären
NTPDase-Aktivität nachweisen, der sich in Abhängigkeit vom Ausmaß der
Schädigung in der Ischämiephase und den fortgesetzten Insulten in der
Reperfusionsphase innerhalb von einer Stunde rekonstituiert oder erst in Tagen eine
Regeneration erfährt.
3. Die Substitution der intravasalen NTPDase-Aktivität unmittelbar vor Freigabe des
Blutstromes erhöht die Ischämietoleranz der Leber und des Intestinums signifikant.
4. Im postischämen Jejunum lässt sich nach Supplementation der NTPDase eine
Verminderung der frühen Phase der Thrombozyten-Endothelzell-Interaktionen in
postkapillären Venolen sowie eine signifikant verminderte Gefäßpermeabilität
nachweisen.
5. Die protektiven Effekte der vaskulären NTPDase lassen sich nur teilweise durch die
Applikation von Adenosin/Amrinon in der Reperfusionsphase reproduzieren.
6. Die postischäme Substitution der intravasalen NTPDase hat sowohl das Potential,
den prothrombotischen und proinflammatorischen Stimulus der Nukleotide ATP und
ADP zu eliminieren als auch die antiaggregatorisch und antiinflammatorisch
wirksame Generation des endogenen Adenosins zu fördern.
Schlussfolgerungen 97
7. Vergleichbare Effekte der pharmakologischen Applikation löslicher NTPDasen
lassen sich sowohl für die Transplantation aller soliden Organe als auch für arterielle
Verschlusskrankheiten postulieren. Ein potentieller Nutzen kann darüber hinaus für
chronisch entzündliche Prozesse angenommen werden.
Zusammenfassung 98
6 ZUSAMMENFASSUNG
Die Nukleotide Adenosintriphosphat (ATP) und –diphosphat (ADP) sowie das Adenosin
selbst wurden in der Mitte des 20. Jahrhunderts als interzelluläre Signalmoleküle
identifiziert, nachdem ihre Bedeutung für den Stoffwechsel der Zelle bereits zu Beginn des
Jahrhunderts evident wurde. Als Quelle der extrazellulären Nukleotide wurden sowohl aktive
(Exozytose und Vesikeltransport) als auch passive (Zelllyse und Membranpermeabilität)
zelluläre Mechanismen beschrieben. Mit der Sequenzierung der verschiedenen Rezeptoren in
den neunziger Jahren begann die Zuordnung der Nukleotide und des Nukleosids zu den
verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen.
Der Katabolismus der extrazellulären Nukleotide erfolgt im Wesentlichen durch die
plasmamembranständigen Ekto-Nukleotidasen, von denen relevante funktionelle Daten
derzeit lediglich für die Familie der Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolasen
(NTPDase) und die 5’-Nukleotidase (5’-NT) vorliegen. Die NTPDase 1/CD39 wird auf
Endothelzellen exprimiert, hydrolisiert effektiv ATP und ADP zu Adenosinmonophosphat
(AMP) und wurde als die dominante vaskuläre NTPDase identifiziert. Die 5’-NT zeigt eine
ubiquitäre Verbreitung, findet sich auch in löslicher Form und katalysiert die Hydrolyse des
AMP zu Adenosin. Die frei zirkulierenden Nukleoside werden dann rasch über
zellmembranständige Transportproteine in den Intrazellularraum aufgenommen.
Als Folge von Ischämie und Reperfusion konnte in verschiedenen Organsystemen eine
Abnahme der Aktivität der NTPDase 1 nachgewiesen werden. In der Konsequenz wurde
eine lokal erhöhte ADP-Konzentration postuliert, die über die Stimulation der
Thrombozytenaggregation den Ischämie-Reperfusionsschaden manifestiert. Die Substitution
einer wasserlöslichen NTPDase ist geeignet, diesen Prozess zu unterbrechen. Die
Elimination der Nukleotide ATP und ADP reduziert den thrombogenen Reiz und minimiert
darüber hinaus die proinflammatorische Stimulation der Endothelzellen. Weiterhin ist das
Produkt der Hydrolyse, AMP, das Substrat der 5’-NT und somit eine endogene
Adenosinquelle. Dem Adenosin wurde eine bedeutende Rolle bei der Induktion einer
Ischämietoleranz zu geschrieben.
Zusammenfassung 99
Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es, den quantitativen Anteil der NTPDase 1 an der
globalen Nukleotidase-Aktivität durch Vergleich von murinen Wildtyp- und cd39defizienten Organen sowie die Dynamik des postischämen Aktivitätsverlustes in
Transplantations- und Ischämie-Reperfusionsmodellen zu bestimmen. Die qualitative
Bedeutung
der
NTPDase
1
für
den
hepatischen
und
intestinalen
Ischämie-
Reperfusionsschaden wird anhand der Überlebensraten in Wildtyp- und cd39-defizienten
Mäusen dargestellt. Verschiedene Strategien zur Kompensation des cd39-Mangels werden in
den Überlebensstudien überprüft. Die Analyse der frühen Phase der ThrombozytenEndothelzell-Interaktionen
nach
intestinaler
Ischämie
erfolgt
mittels
intravitaler
Videomikroskopie in Wildtyp-Mäusen, mit oder ohne Substitution der intravasalen
NTPDase-Aktivität. Als Parameter der Endothelzell-Aktivierung wird die Dynamik der
postischämen intestinalen Gefäßpermeabilität in cd39-null und Wildtyp-Mäusen bestimmt
und die Farbstoffakkumulation im Gewebe nach Substitution der intravasalen NTPDaseAktivität oder Adenosin/Amrinon quantifiziert.
Die globale Nukleotidase-Aktivität der verschiedenen Organe ebenso wie der Anteil der
NTPDase 1 an der Gesamtaktivität weist eine erhebliche Variabilität auf. Mehr als die Hälfte
der Nukleotidase-Aktivität der Leber entfällt auf die alkalische Phosphatase, während die
NTPDase 1 quantitativ keine Relevanz hat. Im Jejunum hingegen entfällt die Hälfte der
Nukleotidase-Aktivität auf die NTPDase 1. Unabhängig von diesen Befunden stellt die
NTPDase 1 einen bedeutenden Faktor für die Ischämietoleranz beider Organsysteme dar.
Der cd39-Mangel der Versuchstiere kann durch die Substitution mit löslicher NTPDase oder
Adenosin/Amrinon teilweise kompensiert werden. In der frühen Reperfusionsphase des
Intestinums zeigt sich in den vaskulären Strukturen der Wildtyp-Mäuse ein signifikanter
Abfall der NTPDase-Aktivität, die innerhalb von 60 Minuten eine vollständige
Rekonstitution
erfährt.
In
dem
Transplantationsmodell
(heterotope,
xenogene
Herztransplantation) mit einem zusätzlichen Konservierungsschaden und fortgesetzten
immunologischen Insulten zeigt sich eine erheblich verzögerte Rekonstitution der NTPDaseAktivität. In dem Modell der intestinalen Ischämie in Wildtyp-Mäusen führt die Substitution
mit der löslichen NTPDase in der Reperfusionsphase zu einer signifikanten Verminderung
des Ischämie-Reperfusionsschaden, die Applikation von Adenosin/Amrinon erhöht die
Zusammenfassung 100
Überlebensrate hingegen nicht. Die vermehrte Adhäsion der Thrombozyten an der
Gefäßwand der postkapillären Venolen in der frühen Reperfusionsphase wird durch die
NTPDase-Substitution auf die Werte der scheinoperierten Kontrollen reduziert. In den
Untersuchungen zur Gefäßpermeabilität des Jejunums zeigt sich eine signifikant erhöhte
Empfindlichkeit der cd39-null Mäuse für intestinale Traumen (Ischämie-Reperfusion und
Scheinoperation) im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen. In beiden untersuchten
Genotypen kann die postischäme Steigerung der Gefäßpermeabilität durch Substitution der
intravasalen NTPDase oder von Adenosin/Amrinon verhindert werden.
In der Schlussfolgerung kommt der NTPDase 1 eine zentrale Bedeutung für die
Ischämietoleranz der Leber und des Intestinums der Maus zu. Der Verlust der NTPDaseAktivität in der Frühphase der Reperfusion kann durch die Substitution der intravasalen
NTPDase kompensiert werden, die den intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden
signifikant vermindert. Die duale Wirkung der NTPDase reduziert die ThrombozytenEndothelzell-Interaktionen und verringert die vaskuläre Permeabilität. Vergleichbare Effekte
können für die Transplantation aller soliden Organe, bei arteriellen Verschlusskrankheiten
sowie bei chronischen entzündlichen Prozessen postuliert werden.
Danksagung 101
7 DANKSAGUNG
Meinem Lehrer, Herrn Prof. Dr. med. P. Neuhaus, Direktor der Klinik für Allgemein-, Viszeralund Transplantationschirurgie, Charité – Universitätsmedizin Berlin, Campus VirchowKlinikum, danke ich für die immerwährende Förderung meiner klinischen, chirurgischen und
wissenschaftlichen Ausbildung. Ohne diesen Rückhalt hätte diese Arbeit nicht entstehen
können. Dankbar habe ich darüber hinaus eine besondere Unterstützung meiner
berufspolitischen Aktivitäten erfahren. Professor Neuhaus prägt mein Bild der modernen
akademischen Chirurgie.
Herrn Prof. Dr. S. C. Robson, Director of Liver Research, Beth Israel Deaconess Medical
Center, Harvard Medical School, Boston, USA, danke ich für die enge Begleitung und
fortwährende Unterstützung meiner Forschungsprojekte. Meine Zeit als Postdoc in seinem
Labor produzierte die Grundlagen dieser Monographie und die stets inspirierenden
Diskussionen und Anregungen haben wesentlichen Anteil an der Realisierung. Der
Forschungsaufenthalt
in
Boston
wurde
durch
ein
Stipendium
der
Deutschen
Forschungsgemeinschaft (Gu 490/1-2) finanziert.
Besondere Erwähnung bedürfen außerdem die folgenden Wissenschaftler, die mir unermüdlich
und in enger Freundschaft mit ihrem Sachverstand die notwendigen Einblicke vermittelten:
Jean Sévigny, Quebec City, Kanada (Molekularbiologie und Biochemie der NTPDasen),
Elzbieta „Kita“ Kaczmarek, Boston (purinerge Rezeptoren),
Masato Imai, Boston
(mikrochirurgische Modelle), Christiane Ferran, Boston (A20), Jonathan „Jonny“ Kruskal,
Boston (intravitale Videomikroskopie).
Weiterhin gilt mein besonderer Dank den Kolleginnen und Kollegen aus dem Vascular Biology
Research Center, Boston, und assoziierten Laboren, die mir stets freundschaftlich zugewandt
waren und jederzeit mit Rat und Tat zur Seite standen. Stellvertretend für das ganze Team seien
hier Eva Csizmadia, Boston, Imrana Qawi, Boston, Katarzyna Koziak, Warschau, Polen, Soizic
Daniel, Boston, Maria Arvelo, Boston, Shane Grey, Sydney, Australien, Eduardo Rocha, Rio de
Janeiro, Brasilien und Miguel Soares, Lissabon, Portugal genannt.
Danksagung 102
Der Weg zur Habilitation führte über eine solide chirurgische Ausbildung, die ich
dankenswerter Weise erfahren durfte. Stellvertretend für die vielen beteiligten Personen seien
hier Prof. Dr. med. H. Weidemann, Berlin und Prof. Dr. med. W. O. Bechstein, Frankfurt/Main
genannt.
Sowohl meine chirurgische Tätigkeit als auch die wissenschaftlichen Aktivitäten konnten nur in
dem kollegialen Umfeld der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie
gedeihen, das mir jederzeit Unterstützung im klinischen Alltag war und gleichzeitig die
notwendigen
Freiräume
ermöglichte.
Ich
danke
allen
aktuellen
und
ehemaligen
Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Klinik. Frau PD Dr. med. N. Nüssler und Herrn Dr. med.
R. Lohmann gebührt mein besonderer Dank, denn sie beeinflussten maßgeblich meine
Entscheidung für die Chirurgie.
Bei dem „kleinen Kreis“ der Ärzteinitiative der Charité und allen Unterstützern möchte ich
mich für die engagierte gemeinsame Arbeit und das entgegengebrachte Vertrauen bedanken.
Wir prägten signifikant die neuen bundesweiten Tarifverträge für Ärzte und werden weiterhin
konstruktiv und kritisch die Bedingungen für Klinik, Wissenschaft und Lehre an der Charité
begleiten. Die Ärzteinitiative ist eine willkommene Herausforderung und Erweiterung meiner
beruflichen Tätigkeiten.
Der allergrößte Dank gebührt jedoch meiner Frau, Ina Pöche-Guckelberger und meiner Tochter,
Philine, die die Höhen und Tiefen meiner klinischen, wissenschaftlichen und politischen Arbeit
aufmerksam begleiteten. Mit Humor quittierten sie gelegentlichen übermäßigen Eifer, mit
Freude zelebrierten sie zwischenzeitliche Erfolge und mit Ansporn trieben sie mich aus der
Talsohle. Ohne ihre Unterstützung hätte diese Monographie nicht vollendet werden können.
Literaturverzeichnis 103
8 LITERATURVERZEICHNIS
Abbracchio MP, Brambilla R, Ceruti S, Kim HO, von Lubitz DK, Jacobson KA, Cattabeni F: G
protein-dependent activation of phospholipase c by adenosine a3 receptors in rat brain.
Mol Pharmacol 1995; 48: 1038-1045
Arvelo MB, Cooper JT, Longo C, Daniel S, Grey ST, Mahiou J, Czismadia E, Abu-Jawdeh G,
Ferran C: A20 protects mice from d-galactosamine/lipopolysaccharide acute toxic lethal
hepatitis. Hepatology 2002; 35: 535-543
Atkinson B, Dwyer K, Enjyoji K, Robson SC: Ecto-nucleotidases of the cd39/ntpdase family
modulate platelet activation and thrombus formation: Potential as therapeutic targets.
Blood Cells Mol Dis 2006; 36: 217-222
Atkinson DE: The energy charge of the adenylate pool as a regulatory parameter. Interaction
with feedback modifiers. Biochemistry 1968; 7: 4030-4034
Aydemir-Koksoy A, Koksoy C, Kuzu MA, Demirpence E, Cinel I, Kesenci M, Yavuzer S:
Intestinal ischemia-reperfusion leads to platelet dysfunction. Thromb Res 1999; 94: 395400
Bach FH, Robson SC, Ferran C, Winkler H, Millan MT, Stuhlmeier KM, Vanhove B, Blakely
ML, van der Werf WJ, Hofer E, et al.: Endothelial cell activation and thromboregulation
during xenograft rejection. Immunol Rev 1994; 141: 5-30
Bach FH, Turman MA, Vercellotti GM, Platt JL, Dalmasso AP: Accommodation: A working
paradigm for progressing toward clinical discordant xenografting. Transplant Proc 1991;
23: 205-207
Banfi C, Ferrario S, De Vincenti O, Ceruti S, Fumagalli M, Mazzola A, N DA, Volonte C,
Fratto P, Vitali E, Burnstock G, Beltrami E, Parolari A, Polvani G, Biglioli P, Tremoli
E, Abbracchio MP: P2 receptors in human heart: Upregulation of p2x6 in patients
Literaturverzeichnis 104
undergoing heart transplantation, interaction with tnfalpha and potential role in
myocardial cell death. J Mol Cell Cardiol 2005; 39: 929-939
Barone GW, Farley PC, Conerly JM, Flanagan TL, Kron IL: Morphological and functional
techniques for assessing endothelial integrity: The use of evans blue dye, silver stains,
and endothelial derived relaxing factor. J Card Surg 1989; 4: 140-148
Baykov AA, Evtushenko OA, Avaeva SM: A malachite green procedure for orthophosphate
determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Anal
Biochem 1988; 171: 266-270
Beaudoin AR, Grondin G, Enjyoji K, Robson SC, Sevigny J, Fische B, Grendon F-P (1999)
The physiological role of ntpdases (atp diphosphohydrolases) in mammals. In:
Vanduffel L, Lemmens R (eds) Ecto-atpases and related ectonucleotidases. Shaker
Publishing, Maastricht, pp 125-135
Ben-Ari Z, Pappo O, Sulkes J, Cheporko Y, Vidne BA, Hochhauser E: Effect of adenosine a2a
receptor agonist (cgs) on ischemia/reperfusion injury in isolated rat liver. Apoptosis
2005; 10: 955-962
Benrezzak O, Grondin G, Sevigny J, Gendron FP, Rousseau E, D'Orleans-Juste P, Beaudoin
AR: Identification and immunolocalization of two isoforms of atp-diphosphohydrolase
(atpdase) in the pig immune system. Arch Biochem Biophys 1999; 370: 314-322
Bigonnesse F, Levesque SA, Kukulski F, Lecka J, Robson SC, Fernandes MJ, Sevigny J:
Cloning and characterization of mouse nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-8.
Biochemistry 2004; 43: 5511-5519
Boeynaems JM, Communi D, Gonzalez NS, Robaye B: Overview of the p2 receptors. Semin
Thromb Hemost 2005; 31: 139-149
Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72: 248-254
Literaturverzeichnis 105
Brake AJ, Julius D: Signaling by extracellular nucleotides. Annu Rev Cell Dev Biol 1996; 12:
519-541
Braun N, Sevigny J, Robson SC, Hammer K, Hanani M, Zimmermann H: Association of the
ecto-atpase ntpdase2 with glial cells of the peripheral nervous system. Glia 2004; 45:
124-132
Bucheimer RE, Linden J: Purinergic regulation of epithelial transport. J Physiol 2004; 555: 311321
Burnstock G (1978) A basis for distinguishing two types of purinergic receptor. In: Straub RW,
Bolis L (eds) Cell membrane receptors for drugs and hormones: A multidisciplinary
approach. Raven Press, New York, pp 107-118
Burnstock G: Purinergic signalling. Br J Pharmacol 2006; 147 Suppl 1: S172-181
Candinas D, Koyamada N, Miyatake T, Siegel J, Hancock WW, Bach FH, Robson SC: Loss of
rat glomerular atp diphosphohydrolase activity during reperfusion injury is associated
with oxidative stress reactions. Thromb Haemost 1996; 76: 807-812
Carini R, Albano E: Recent insights on the mechanisms of liver preconditioning.
Gastroenterology 2003; 125: 1480-1491
Cattaneo M, Canciani MT, Lecchi A, Kinlough-Rathbone RL, Packham MA, Mannucci PM,
Mustard JF: Released adenosine diphosphate stabilizes thrombin-induced human
platelet aggregates. Blood 1990; 75: 1081-1086
Cerqueira NF, Hussni CA, Yoshida WB: Pathophysiology of mesenteric ischemia/reperfusion:
A review. Acta Cir Bras 2005; 20: 336-343
Chen YF, Li PL, Zou AP: Oxidative stress enhances the production and actions of adenosine in
the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2001; 281: R1808-1816
Cooper D, Chitman KD, Williams MC, Granger DN: Time-dependent platelet-vessel wall
Literaturverzeichnis 106
interactions induced by intestinal ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver
Physiol 2003; 284: G1027-1033
Cooper D, Russell J, Chitman KD, Williams MC, Wolf RE, Granger DN: Leukocyte
dependence of platelet adhesion in postcapillary venules. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 2004; 286: H1895-1900
Cotran RS, Pober JS: Effects of cytokines on vascular endothelium: Their role in vascular and
immune injury. Kidney Int 1989; 35: 969-975
Cotran RS, Pober JS: Cytokine-endothelial interactions in inflammation, immunity, and
vascular injury. J Am Soc Nephrol 1990; 1: 225-235
Coutinho-Silva R, Parsons M, Robson T, Lincoln J, Burnstock G: P2x and p2y purinoceptor
expression in pancreas from streptozotocin-diabetic rats. Mol Cell Endocrinol 2003;
204: 141-154
Cywes R, Mullen JB, Stratis MA, Greig PD, Levy GA, Harvey PR, Strasberg SM: Prediction of
the outcome of transplantation in man by platelet adherence in donor liver allografts.
Evidence of the importance of prepreservation injury. Transplantation 1993; 56: 316323
Daly JW, Padgett WL: Agonist activity of 2- and 5'-substituted adenosine analogs and their n6cycloalkyl derivatives at a1- and a2-adenosine receptors coupled to adenylate cyclase.
Biochem Pharmacol 1992; 43: 1089-1093
Davis JM, Gute DC, Jones S, Krsmanovic A, Korthuis RJ: Ischemic preconditioning prevents
postischemic p-selectin expression in the rat small intestine. Am J Physiol 1999; 277:
H2476-2481
Day YJ, Marshall MA, Huang L, McDuffie MJ, Okusa MD, Linden J: Protection from ischemic
liver injury by activation of a2a adenosine receptors during reperfusion: Inhibition of
chemokine induction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2004; 286: G285-293
Literaturverzeichnis 107
Del Conde I, Cruz MA, Zhang H, Lopez JA, Afshar-Kharghan V: Platelet activation leads to
activation and propagation of the complement system. J Exp Med 2005; 201: 871-879
Denis C, Methia N, Frenette PS, Rayburn H, Ullman-Cullere M, Hynes RO, Wagner DD: A
mouse model of severe von willebrand disease: Defects in hemostasis and thrombosis.
Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95: 9524-9529
Deussen A, Bading B, Kelm M, Schrader J: Formation and salvage of adenosine by
macrovascular endothelial cells. Am J Physiol 1993; 264: H692-700
Dranoff JA, Kruglov EA, Robson SC, Braun N, Zimmermann H, Sevigny J: The ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase ntpdase2/cd39l1 is expressed in a novel
functional compartment within the liver. Hepatology 2002; 36: 1135-1144
Dranoff JA, Kruglov EA, Toure J, Braun N, Zimmermann H, Jain D, Knowles AF, Sevigny J:
Ectonucleotidase ntpdase2 is selectively down-regulated in biliary cirrhosis. J Investig
Med 2004a; 52: 475-482
Dranoff JA, Masyuk AI, Kruglov EA, LaRusso NF, Nathanson MH: Polarized expression and
function of p2y atp receptors in rat bile duct epithelia. Am J Physiol Gastrointest Liver
Physiol 2001; 281: G1059-1067
Dranoff JA, Ogawa M, Kruglov EA, Gaca MD, Sevigny J, Robson SC, Wells RG: Expression
of p2y nucleotide receptors and ectonucleotidases in quiescent and activated rat hepatic
stellate cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2004b; 287: G417-424
Drury AN, Szent-Györgyi A: The physiological activity of adenine compounds with special
reference to their action upon the mammalian heart. J Physiol 1929; 68: 213-237
Dunn LC (1991) A short history of genetics: The development of some of the main lines of
thought: 1864-1939. Iowa State University Press, Ames
Duval M, Beaudoin AR, Bkaily G, Gendron FP, P DO-J: Characterization of the ntpdase
activities in the mesentery pre- and post-capillary circuits of the guinea pig. Can J
Literaturverzeichnis 108
Physiol Pharmacol 2003; 81: 212-219
Dwyer KM, Robson SC, Nandurkar HH, Campbell DJ, Gock H, Murray-Segal LJ, Fisicaro N,
Mysore TB, Kaczmarek E, Cowan PJ, d'Apice AJ: Thromboregulatory manifestations in
human cd39 transgenic mice and the implications for thrombotic disease and
transplantation. J Clin Invest 2004; 113: 1440-1446
Eltzschig HK, Ibla JC, Furuta GT, Leonard MO, Jacobson KA, Enjyoji K, Robson SC, Colgan
SP: Coordinated adenine nucleotide phosphohydrolysis and nucleoside signaling in
posthypoxic endothelium: Role of ectonucleotidases and adenosine a2b receptors. J Exp
Med 2003; 198: 783-796
Enjyoji K, Sevigny J, Lin Y, Frenette PS, Christie PD, Esch JS, 2nd, Imai M, Edelberg JM,
Rayburn H, Lech M, Beeler DL, Csizmadia E, Wagner DD, Robson SC, Rosenberg RD:
Targeted disruption of cd39/atp diphosphohydrolase results in disordered hemostasis
and thromboregulation. Nat Med 1999; 5: 1010-1017
Eppihimer MJ, Russell J, Anderson DC, Epstein CJ, Laroux S, Granger DN: Modulation of pselectin expression in the postischemic intestinal microvasculature. Am J Physiol 1997;
273: G1326-1332
Erlinge D, Hou M, Webb TE, Barnard EA, Moller S: Phenotype changes of the vascular smooth
muscle cell regulate p2 receptor expression as measured by quantitative rt-pcr. Biochem
Biophys Res Commun 1998; 248: 864-870
Fernandez-Alvarez J, Hillaire-Buys D, Loubatieres-Mariani MM, Gomis R, Petit P: P2 receptor
agonists stimulate insulin release from human pancreatic islets. Pancreas 2001; 22: 6971
Fredholm BB, AP IJ, Jacobson KA, Klotz KN, Linden J: International union of pharmacology.
Xxv. Nomenclature and classification of adenosine receptors. Pharmacol Rev 2001; 53:
527-552
Fry DL, Mahley RW, Weisgraber KH, Oh SY: Simultaneous accumulation of evans blue dye
Literaturverzeichnis 109
and albumin in the canine aortic wall. Am J Physiol 1977; 233: H66-79
Gaarder A, Jonsen J, Laland S, Hellem A, Owren PA: Adenosine diphosphate in red cells as a
factor in the adhesiveness of human blood platelets. Nature 1961; 192: 531-532
Galanos C, Freudenberg MA, Reutter W: Galactosamine-induced sensitization to the lethal
effects of endotoxin. Proc Natl Acad Sci U S A 1979; 76: 5939-5943
Gayle RB, 3rd, Maliszewski CR, Gimpel SD, Schoenborn MA, Caspary RG, Richards C,
Brasel K, Price V, Drosopoulos JH, Islam N, Alyonycheva TN, Broekman MJ, Marcus
AJ: Inhibition of platelet function by recombinant soluble ecto-adpase/cd39. J Clin
Invest 1998; 101: 1851-1859
Giaroni C, Knight GE, Ruan HZ, Glass R, Bardini M, Lecchini S, Frigo G, Burnstock G: P2
receptors in the murine gastrointestinal tract. Neuropharmacology 2002; 43: 1313-1323
Goepfert C, Imai M, Brouard S, Csizmadia E, Kaczmarek E, Robson SC: Cd39 modulates
endothelial cell activation and apoptosis. Mol Med 2000; 6: 591-603
Guckelberger O, Sun XF, Sevigny J, Imai M, Kaczmarek E, Enjyoji K, Kruskal JB, Robson SC:
Beneficial effects of cd39/ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 in murine
intestinal ischemia-reperfusion injury. Thromb Haemost 2004; 91: 576-586
Haller CA, Cui W, Wen J, Robson SC, Chaikof EL: Reconstitution of cd39 in liposomes
amplifies nucleoside triphosphate diphosphohydrolase activity and restores
thromboregulatory properties. J Vasc Surg 2006; 43: 816-823
Harada N, Okajima K, Murakami K, Usune S, Sato C, Ohshima K, Katsuragi T: Adenosine and
selective a(2a) receptor agonists reduce ischemia/reperfusion injury of rat liver mainly
by inhibiting leukocyte activation. J Pharmacol Exp Ther 2000; 294: 1034-1042
Holton P: The liberation of adenosine triphosphate on antidromic stimulation of sensory nerves.
J Physiol 1959; 145: 494-504
Literaturverzeichnis 110
Hou M, Moller S, Edvinsson L, Erlinge D: Cytokines induce upregulation of vascular p2y(2)
receptors and increased mitogenic responses to utp and atp. Arterioscler Thromb Vasc
Biol 2000; 20: 2064-2069
Hunsucker SA, Mitchell BS, Spychala J: The 5'-nucleotidases as regulators of nucleotide and
drug metabolism. Pharmacol Ther 2005; 107: 1-30
Imai M, Goepfert C, Kaczmarek E, Robson SC: Cd39 modulates il-1 release from activated
endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 2000a; 270: 272-278
Imai M, Guckelberger O, Kaczmarek E, Robson SC: Over-expression of cd39/atp
diphosphohydrolase exacerbates lipopolysaccharide / galactosamine induced hepatic
failure [abstract]. Hepatology 1999a; 30: 378A
Imai M, Kaczmarek E, Koziak K, Sevigny J, Goepfert C, Guckelberger O, Csizmadia E,
Schulte Am Esch J, 2nd, Robson SC: Suppression of atp diphosphohydrolase/cd39 in
human vascular endothelial cells. Biochemistry 1999b; 38: 13473-13479
Imai M, Takigami K, Guckelberger O, Enjyoji K, Smith RN, Lin Y, Csizmadia E, Sevigny J,
Rosenberg RD, Bach FH, Robson SC: Modulation of nucleoside [correction of
nucleotide] triphosphate diphosphohydrolase-1 (ntpdase-1)cd39 in xenograft rejection.
Mol Med 1999c; 5: 743-752
Imai M, Takigami K, Guckelberger O, Kaczmarek E, Csizmadia E, Bach FH, Robson SC:
Recombinant adenoviral mediated cd39 gene transfer prolongs cardiac xenograft
survival. Transplantation 2000b; 70: 864-870
Josko J, Gwozdz B, Jedrzejowska-Szypulka H, Hendryk S: Vascular endothelial growth factor
(vegf) and its effect on angiogenesis. Med Sci Monit 2000; 6: 1047-1052
Kaczmarek E, Erb L, Koziak K, Jarzyna R, Wink MR, Guckelberger O, Blusztajn JK, TrinkausRandall V, Weisman GA, Robson SC: Modulation of endothelial cell migration by
extracellular nucleotides: Involvement of focal adhesion kinase and phosphatidylinositol
3-kinase-mediated pathways. Thromb Haemost 2005; 93: 735-742
Literaturverzeichnis 111
Kaczmarek E, Koziak K, Sevigny J, Siegel JB, Anrather J, Beaudoin AR, Bach FH, Robson
SC: Identification and characterization of cd39/vascular atp diphosphohydrolase. J Biol
Chem 1996; 271: 33116-33122
Kanko M, Maral H, Akbas MH, Ozden M, Bulbul S, Omay O, Yavuz S, Berki KT: Protective
effects of clopidogrel on oxidant damage in a rat model of acute ischemia. Tohoku J
Exp Med 2005; 205: 133-139
Kansas GS, Wood GS, Tedder TF: Expression, distribution, and biochemistry of human cd39.
Role in activation-associated homotypic adhesion of lymphocytes. J Immunol 1991;
146: 2235-2244
Kauffman RF, Schenck KW, Utterback BG, Crowe VG, Cohen ML: In vitro vascular relaxation
by new inotropic agents: Relationship to phosphodiesterase inhibition and cyclic
nucleotides. J Pharmacol Exp Ther 1987; 242: 864-872
Khakh BS, Burnstock G, Kennedy C, King BF, North RA, Seguela P, Voigt M, Humphrey PP:
International union of pharmacology. Xxiv. Current status of the nomenclature and
properties of p2x receptors and their subunits. Pharmacol Rev 2001; 53: 107-118
Khandoga A, Biberthaler P, Messmer K, Krombach F: Platelet-endothelial cell interactions
during hepatic ischemia-reperfusion in vivo: A systematic analysis. Microvasc Res
2003; 65: 71-77
Kinlough-Rathbone RL, Mustard JF (1986) Synergism of agonists. In: Holmsen H (ed) Platelet
responses and metabolism., vol Vol. I. CRC Press, Boca Raton, FL, pp 193-207
Kirton CM, Nash GB: Activated platelets adherent to an intact endothelial cell monolayer bind
flowing neutrophils and enable them to transfer to the endothelial surface. J Lab Clin
Med 2000; 136: 303-313
Kittel A, Garrido M, Varga G: Localization of ntpdase1/cd39 in normal and transformed human
pancreas. J Histochem Cytochem 2002; 50: 549-556
Literaturverzeichnis 112
Kittel A, Kiss AL, Mullner N, Matko I, Sperlagh B: Expression of ntpdase1 and caveolins in
human cardiovascular disease. Histochem Cell Biol 2005; 124: 51-59
Kittel A, Pelletier J, Bigonnesse F, Guckelberger O, Kordas K, Braun N, Robson SC, Sevigny J:
Localization of nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (ntpdase1) and ntpdase2
in pancreas and salivary gland. J Histochem Cytochem 2004; 52: 861-871
Knowles AF, Li C: Molecular cloning and characterization of expressed human ecto-nucleoside
triphosphate diphosphohydrolase 8 (e-ntpdase 8) and its soluble extracellular domain.
Biochemistry 2006; 45: 7323-7333
Koti RS, Seifalian AM, Davidson BR: Protection of the liver by ischemic preconditioning: A
review of mechanisms and clinical applications. Dig Surg 2003; 20: 383-396
Koyamada N, Miyatake T, Candinas D, Hechenleitner P, Siegel J, Hancock WW, Bach FH,
Robson SC: Apyrase administration prolongs discordant xenograft survival.
Transplantation 1996; 62: 1739-1743
LeBel D, Poirier GG, Phaneuf S, St-Jean P, Laliberte JF, Beaudoin AR: Characterization and
purification of a calcium-sensitive atp diphosphohydrolase from pig pancreas. J Biol
Chem 1980; 255: 1227-1233
Leclerc MC, Grondin G, Gendron FP, Sevigny J, Beaudoin AR: Identification, characterization,
and immunolocalization of a nucleoside triphosphate diphosphohydrolase in pig liver.
Arch Biochem Biophys 2000; 377: 372-378
Lefer AM, Lefer DJ: Pharmacology of the endothelium in ischemia-reperfusion and circulatory
shock. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1993; 33: 71-90
Lentsch AB, Kato A, Yoshidome H, McMasters KM, Edwards MJ: Inflammatory mechanisms
and therapeutic strategies for warm hepatic ischemia/reperfusion injury. Hepatology
2000; 32: 169-173
Li X, Zhou T, Zhi X, Zhao F, Yin L, Zhou P: Effect of hypoxia/reoxygenation on cd73 (ecto-5'-
Literaturverzeichnis 113
nucleotidase) in mouse microvessel endothelial cell lines. Microvasc Res 2006;
Lu CY, Penfield JG, Kielar ML, Vazquez MA, Jeyarajah DR: Hypothesis: Is renal allograft
rejection initiated by the response to injury sustained during the transplant process?
Kidney Int 1999; 55: 2157-2168
Luthje J: Origin, metabolism and function of extracellular adenine nucleotides in the blood.
Klin Wochenschr 1989; 67: 317-327
Mallick IH, Yang W, Winslet MC, Seifalian AM: Ischemia-reperfusion injury of the intestine
and protective strategies against injury. Dig Dis Sci 2004; 49: 1359-1377
Marcus AJ, Broekman MJ, Drosopoulos JH, Olson KE, Islam N, Pinsky DJ, Levi R: Role of
cd39 (ntpdase-1) in thromboregulation, cerebroprotection, and cardioprotection. Semin
Thromb Hemost 2005; 31: 234-246
Martin-Villa JM, Ferre-Lopez S, Lopez-Suarez JC, Corell A, Perez-Blas M, Arnaiz-Villena A:
Cell surface phenotype and ultramicroscopic analysis of purified human enterocytes: A
possible antigen-presenting cell in the intestine. Tissue Antigens 1997; 50: 586-592
Massberg S, Enders G, Leiderer R, Eisenmenger S, Vestweber D, Krombach F, Messmer K:
Platelet-endothelial cell interactions during ischemia/reperfusion: The role of p-selectin.
Blood 1998; 92: 507-515
Massberg S, Enders G, Matos FC, Tomic LI, Leiderer R, Eisenmenger S, Messmer K,
Krombach F: Fibrinogen deposition at the postischemic vessel wall promotes platelet
adhesion during ischemia-reperfusion in vivo. Blood 1999; 94: 3829-3838
Mause SF, von Hundelshausen P, Zernecke A, Koenen RR, Weber C: Platelet microparticles: A
transcellular delivery system for rantes promoting monocyte recruitment on
endothelium. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25: 1512-1518
Mehta D, Malik AB: Signaling mechanisms regulating endothelial permeability. Physiol Rev
2006; 86: 279-367
Literaturverzeichnis 114
Miescher F: Ueber die chemische zusammensetzung der eiterzellen. Med-Chem Untersuch
1871; 4: 441-460
Milazzo VJ, Ferrante RJ, Sabido F, Silva MB, Jr., Hobson RW, 2nd, Duran WN: Time course
of leukocyte adhesion to endothelium in ischemia-reperfusion. J Surg Res 1996; 61:
139-142
Mizutani A, Murakami K, Okajima K, Kira S, Mizutani S, Kudo K, Takatani J, Goto K, Hattori
S, Noguchi T: Olprinone reduces ischemia/reperfusion-induced acute renal injury in rats
through enhancement of camp. Shock 2005; 24: 281-287
Moore KL, Esmon CT, Esmon NL: Tumor necrosis factor leads to the internalization and
degradation of thrombomodulin from the surface of bovine aortic endothelial cells in
culture. Blood 1989; 73: 159-165
Motte S, Communi D, Pirotton S, Boeynaems JM: Involvement of multiple receptors in the
actions of extracellular atp: The example of vascular endothelial cells. Int J Biochem
Cell Biol 1995; 27: 1-7
Mullane KM, Kraemer R, Smith B: Myeloperoxidase activity as a quantitative assessment of
neutrophil infiltration into ischemic myocardium. J Pharmacol Methods 1985; 14: 157167
Nguyen TD, Meichle S, Kim US, Wong T, Moody MW: P2y(11), a purinergic receptor acting
via camp, mediates secretion by pancreatic duct epithelial cells. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol 2001; 280: G795-804
Noji T, Karasawa A, Kusaka H: Adenosine uptake inhibitors. Eur J Pharmacol 2004; 495: 1-16
Odashima M, Otaka M, Jin M, Komatsu K, Wada I, Matsuhashi T, Horikawa Y, Hatakeyama
N, Oyake J, Ohba R, Linden J, Watanabe S: Selective a2a adenosine agonist atl-146e
attenuates acute lethal liver injury in mice. J Gastroenterol 2005; 40: 526-529
Ono K, Lindsey ES: Improved technique of heart transplantation in rats. J Thorac Cardiovasc
Literaturverzeichnis 115
Surg 1969; 57: 225-229
Packham MA, Mustard JF: Platelet aggregation and adenosine diphosphate/adenosine
triphosphate receptors: A historical perspective. Semin Thromb Hemost 2005; 31: 129138
Palmer TM, Stiles GL: Identification of an a2a adenosine receptor domain specifically
responsible for mediating short-term desensitization. Biochemistry 1997; 36: 832-838
Peakman MC, Hill SJ: Adenosine a2b-receptor-mediated cyclic amp accumulation in primary
rat astrocytes. Br J Pharmacol 1994; 111: 191-198
Pinsky DJ, Broekman MJ, Peschon JJ, Stocking KL, Fujita T, Ramasamy R, Connolly ES, Jr.,
Huang J, Kiss S, Zhang Y, Choudhri TF, McTaggart RA, Liao H, Drosopoulos JH,
Price VL, Marcus AJ, Maliszewski CR: Elucidation of the thromboregulatory role of
cd39/ectoapyrase in the ischemic brain. J Clin Invest 2002; 109: 1031-1040
Pinsky DJ, Yan SF, Lawson C, Naka Y, Chen JX, Connolly ES, Jr., Stern DM: Hypoxia and
modification of the endothelium: Implications for regulation of vascular homeostatic
properties. Semin Cell Biol 1995; 6: 283-294
Platt JL, Vercellotti GM, Lindman BJ, Oegema TR, Jr., Bach FH, Dalmasso AP: Release of
heparan sulfate from endothelial cells. Implications for pathogenesis of hyperacute
rejection. J Exp Med 1990; 171: 1363-1368
Pober JS, Cotran RS: Cytokines and endothelial cell biology. Physiol Rev 1990; 70: 427-451
Riksen NP, Smits P, Rongen GA: Ischaemic preconditioning: From molecular characterisation
to clinical application--part i. Neth J Med 2004a; 62: 353-363
Riksen NP, Smits P, Rongen GA: Ischaemic preconditioning: From molecular characterisation
to clinical application--part ii. Neth J Med 2004b; 62: 409-423
Robson SC, Kaczmarek E, Siegel JB, Candinas D, Koziak K, Millan M, Hancock WW, Bach
Literaturverzeichnis 116
FH: Loss of atp diphosphohydrolase activity with endothelial cell activation. J Exp Med
1997; 185: 153-163
Robson SC, Schulte am Esch J, 2nd, Bach FH: Factors in xenograft rejection. Ann N Y Acad
Sci 1999; 875: 261-276
Robson SC, Sevigny J, Imai M, Guckelberger O, Enjyoji K: Thromboregulatory potential of
endothelial cd39/nucleoside triphosphate diphosphohydrolase: Modulation of purinergic
signalling in platelets. Emerging Therapeutic Targets 2000; 4: 155-171
Robson SC, Wu Y, Sun X, Knosalla C, Dwyer K, Enjyoji K: Ectonucleotidases of cd39 family
modulate vascular inflammation and thrombosis in transplantation. Semin Thromb
Hemost 2005; 31: 217-233
Salter JW, Krieglstein CF, Issekutz AC, Granger DN: Platelets modulate ischemia/reperfusioninduced leukocyte recruitment in the mesenteric circulation. Am J Physiol Gastrointest
Liver Physiol 2001; 281: G1432-1439
Schweickhardt C, Sabolic I, Brown D, Burckhardt G: Ecto-adenosinetriphosphatase in rat small
intestinal brush-border membranes. Am J Physiol 1995; 268: G663-672
Serracino-Inglott F, Habib NA, Mathie RT: Hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Surg
2001; 181: 160-166
Serracino-Inglott F, Virlos IT, Habib NA, Williamson RC, Mathie RT: Adenosine
preconditioning attenuates hepatic reperfusion injury in the rat by preventing the downregulation of endothelial nitric oxide synthase. BMC Gastroenterol 2002; 2: 22
Sevigny J, Grondin G, Gendron FP, Roy J, Beaudoin AR: Demonstration and
immunolocalization of atp diphosphohydrolase in the pig digestive system. Am J
Physiol 1998; 275: G473-482
Sevigny J, Levesque FP, Grondin G, Beaudoin AR: Purification of the blood vessel atp
diphosphohydrolase, identification and localisation by immunological techniques.
Literaturverzeichnis 117
Biochim Biophys Acta 1997; 1334: 73-88
Sevigny J, Sundberg C, Braun N, Guckelberger O, Csizmadia E, Qawi I, Imai M, Zimmermann
H, Robson SC: Differential catalytic properties and vascular topography of murine
nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 (ntpdase1) and ntpdase2 have
implications for thromboregulation. Blood 2002; 99: 2801-2809
Soares MP, Lin Y, Sato K, Stuhlmeier KM, Bach FH: Accommodation. Immunol Today 1999;
20: 434-437
Stone TW: Receptors for adenosine and adenine nucleotides. Gen Pharmacol 1991; 22: 25-31
Sullivan GW: Adenosine a2a receptor agonists as anti-inflammatory agents. Curr Opin Investig
Drugs 2003; 4: 1313-1319
Synnestvedt K, Furuta GT, Comerford KM, Louis N, Karhausen J, Eltzschig HK, Hansen KR,
Thompson LF, Colgan SP: Ecto-5'-nucleotidase (cd73) regulation by hypoxia-inducible
factor-1 mediates permeability changes in intestinal epithelia. J Clin Invest 2002; 110:
993-1002
Tanaka N, Kawasaki K, Nejime N, Kubota Y, Nakamura K, Kunitomo M, Takahashi K,
Hashimoto M, Shinozuka K: P2y receptor-mediated ca(2+) signaling increases human
vascular endothelial cell permeability. J Pharmacol Sci 2004; 95: 174-180
Teoh NC, Farrell GC: Hepatic ischemia reperfusion injury: Pathogenic mechanisms and basis
for hepatoprotection. J Gastroenterol Hepatol 2003; 18: 891-902
Thiagarajan RR, Winn RK, Harlan JM: The role of leukocyte and endothelial adhesion
molecules in ischemia-reperfusion injury. Thromb Haemost 1997; 78: 310-314
Thompson LF, Eltzschig HK, Ibla JC, Van De Wiele CJ, Resta R, Morote-Garcia JC, Colgan
SP: Crucial role for ecto-5'-nucleotidase (cd73) in vascular leakage during hypoxia. J
Exp Med 2004; 200: 1395-1405
Literaturverzeichnis 118
Thomson LF, Ruedi JM, Glass A, Moldenhauer G, Moller P, Low MG, Klemens MR, Massaia
M, Lucas AH: Production and characterization of monoclonal antibodies to the glycosyl
phosphatidylinositol-anchored lymphocyte differentiation antigen ecto-5'-nucleotidase
(cd73). Tissue Antigens 1990; 35: 9-19
Thorn JA, Jarvis SM: Adenosine transporters. Gen Pharmacol 1996; 27: 613-620
Trumel C, Payrastre B, Plantavid M, Hechler B, Viala C, Presek P, Martinson EA, Cazenave
JP, Chap H, Gachet C: A key role of adenosine diphosphate in the irreversible platelet
aggregation induced by the par1-activating peptide through the late activation of
phosphoinositide 3-kinase. Blood 1999; 94: 4156-4165
Unal S, Demirkan F, Arslan E, Cin I, Cinel L, Eskandari G, Cinel I: Comparison of ischemic
and chemical preconditioning in jejunal flaps in the rat. Plast Reconstr Surg 2003; 112:
1024-1031
Van Belle H: Kinetics and inhibition of alkaline phosphatases from canine tissues. Biochim
Biophys Acta 1972; 289: 158-168
Vandendries ER, Furie BC, Furie B: Role of p-selectin and psgl-1 in coagulation and
thrombosis. Thromb Haemost 2004; 92: 459-466
Vekaria RM, Shirley DG, Sevigny J, Unwin RJ: Immunolocalization of ectonucleotidases along
the rat nephron. Am J Physiol Renal Physiol 2006; 290: F550-560
Vischer UM, Wollheim CB: Purine nucleotides induce regulated secretion of von willebrand
factor: Involvement of cytosolic ca2+ and cyclic adenosine monophosphate-dependent
signaling in endothelial exocytosis. Blood 1998; 91: 118-127
Wang J, Whitt SP, Rubin LJ, Huxley VH: Differential coronary microvascular exchange
responses to adenosine: Roles of receptor and microvessel subtypes. Microcirculation
2005; 12: 313-326
Ware JA, Smith M, Salzman EW: Synergism of platelet-aggregating agents. Role of elevation
Literaturverzeichnis 119
of cytoplasmic calcium. J Clin Invest 1987; 80: 267-271
Wu MH: Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol 2005; 569: 359-366
Yaar R, Jones MR, Chen JF, Ravid K: Animal models for the study of adenosine receptor
function. J Cell Physiol 2005; 202: 9-20
Yadav SS, Gao W, Harland RC, Clavien PA: A new and simple technique of total hepatic
ischemia in the mouse. Transplantation 1998; 65: 1433-1436
Yeung G, Mulero JJ, McGowan DW, Bajwa SS, Ford JE: Cd39l2, a gene encoding a human
nucleoside diphosphatase, predominantly expressed in the heart. Biochemistry 2000; 39:
12916-12923
Zhou QY, Li C, Olah ME, Johnson RA, Stiles GL, Civelli O: Molecular cloning and
characterization of an adenosine receptor: The a3 adenosine receptor. Proc Natl Acad
Sci U S A 1992; 89: 7432-7436
Zimmermann H: Nucleotides and cd39: Principal modulatory players in hemostasis and
thrombosis. Nat Med 1999; 5: 987-988
Zimmermann H: Extracellular metabolism of atp and other nucleotides. Naunyn Schmiedebergs
Arch Pharmacol 2000; 362: 299-309
Zimmermann H: Ectonucleotidases: Some recent developments and a note on nomenclature.
Drug Development Research 2001; 52: 44-56
Erklärung 120
9 ERKLÄRUNG
§ 4 Abs. 3 (k) der HabOMed der Charité
Hiermit erkläre ich, dass
•
weder früher noch gleichzeitig ein Habilitationsverfahren durchgeführt oder angemeldet
wird bzw. wurde,
•
die vorgelegte Habilitationsschrift ohne fremde Hilfe verfasst, die beschriebenen
Ergebnisse selbst gewonnen sowie die verwendeten Hilfsmittel, die Zusammenarbeit
mit anderen Wissenschaftlern/Wissenschaftlerinnen und mit technischen Hilfskräften
sowie die verwendete Literatur vollständig in der Habilitationsschrift angegeben
wurden,
•
mir die geltende Habilitationsordnung bekannt ist.
Berlin, den 01. März 2007
Dr. med. Olaf Guckelberger