Die Bedeutung von PDGF und PDGF

Die Bedeutung von PDGF und PDGF-Rezeptoren für die
Fibrosierung des Myokards im Modell der
Coxsackievirus B3 (CVB3)-induzierten Myokarditis
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena
von Dipl.-Biologin Katja Grün
geboren am 26. Juli 1975 in Ilmenau
Gutachter:
1.
Prof. Dr. med. habil. Axel Stelzner
2.
Prof. Dr. rer. nat. Frank-D. Böhmer
3.
Doz. Dr. rer. nat. Andreas Simm
Tag des Rigorosums: 12. Oktober 2006
Tag der öffentlichen Verteidigung: 20. November 2006
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1.
Zusammenfassung
2.
Einleitung
-1-
2.1
Das Coxsackievirus B3 – ein humpathogener Vertreter der Picornaviren
-3-
2.2
Enteroviral induzierte Myokarditis und Dilatative Kardiomyopathie
-6-
2.3
Chronisch verlaufende murine CVB3-Infektionsmodelle
-8-
2.4
Das Mausmodell der CVB3-induzierten chronischen Myokarditis
-9-
2.5
Fibroblastenmitogene und Fibrosierungsprozesse
2.5.1
Normal- und pathologisch-verlaufende Wundheilung und Gewebereparatur
- 10 -
2.5.2
Die Rolle der Wachstumsfaktoren im Prozess der Fibroblastenproliferation
- 11 -
2.5.3
Coxsackievirus B3-induzierte Fibrosierungsprozesse
- 13 -
2.6
Die Wachstumsfaktoren der Platelet-derived growth factor (PDGF)-Familie
- 14 -
2.6.1
Gliederung der PDGF-Liganden
- 14 -
2.6.2
Die PDGF-Rezeptoren
- 14 -
2.6.3
Die Signalgebung des PDGF/PDGFR-Systems auf die Entwicklung von
Zellen und Gewebe
2.6.4
- 16 -
Der Einfluss von PDGF und seiner Rezeptoren im fibrotisch
verlaufenden Krankheitsgeschehen
2.7
- 18 -
Therapeutische Ansatzmöglichkeiten im Modell chronischer Fibrosierungsprozesse durch Einsatz spezifischer Tyrosinkinase-Inhibitoren
- 19 -
2.7.1
Der Protein-Tyrosinkinase-Inhibitor STI571
- 20 -
2.7.2
Inhibierende Wirkung von STI571 auf verschiedene fibrotische Prozesse
- 21 -
2.8
3.
- 10 -
Zielstellung der Arbeit
- 22 -
Material
3.1
Coxsackievirus B3 (Nancy)
- 23 -
3.2
Versuchstiere
- 23 -
3.2.1
3.2.2
Immunkompetente C57BL/6 Maus
- 23 0
0
Immundefekte MHC Klasse II (B6-Aa /Aa ) knockout Maus
- 23 -
3.3
Oligonukleotid-Primer
- 24 -
3.4
Plasmid
- 24 -
3.5
Chemikalien
- 25 -
3.6
Enzyme
- 28 -
3.7
Antikörper
- 28 -
3.8
Inhibitoren
- 29 -
3.9
Geräte
- 29 -
Inhaltsverzeichnis
3.10
4.
5.
Puffer und Stammlösungen
- 30 -
Methoden
4.1
Infektion der Versuchstiere
- 33 -
4.2
Sektion und Organentnahme
- 33 -
4.3
Histologie
- 34 -
4.4
TCID50-Test (Tissue culture infection dose)
- 34 -
4.5
RNA-Präparation
- 35 -
4.6
Reverse Transkription
- 36 -
4.7
Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
- 36 -
4.8
Semiquantitative Polymerase-Kettenreaktion
- 36 -
4.9
Agarose-Gelelektrophorese
- 37 -
4.10
In Situ-Hybridisierung
- 37 -
4.10.1
Nachweis des CVB3-Kapsid-Protein-Gens VP1
- 37 -
4.10.2
Nachweis von PDGF-C
- 38 -
4.11
Immunhistochemischer Nachweis von PDGF-Isoformen
- 39 -
4.12
Bestimmung von PDGF-Aktivität im extrahierten Myokardgewebe
- 40 -
4.13
Detektion von PDGFR-Aktivierung mittels Immunpräzipitation
- 41 -
4.14
SDS-PAGE und Immunblot
- 41 -
4.15
Herzgewebe-Extraktion zur Analyse von STI571 (Glivec)
- 42 -
4.16
Statistik
- 42 -
Ergebnisse
5.1
Erhöhte Expression von PDGF-Isoformen in der CVB3-induzierten
Herzmuskelentzündung
5.1.1
Histologische Untersuchung von CVB3-infizierten Herzen
- 43 - 43 -
5.1.1.1
Infiltration des Myokards
- 43 -
5.1.1.2
Bewertung der Fibrose im Myokard
- 44 -
5.1.2
Expressionsmuster von Zytokinen und PDGF-Isoformen
- 48 -
5.1.2.1
Zytokinexpression
- 48 -
5.1.2.2
Expression von PDGF-Isoformen
- 51 -
5.1.3
Zelluläre Charakterisierung der CVB3-induzierten Myokardinfiltrate
- 52 -
5.1.3.1
Nachweis von PDGF-C im Myokard
- 53 -
5.1.3.2
Nachweis des viralen Genoms im Gewebeschnitt
- 55 -
5.1.4
Immunhistochemische Untersuchung des PDGF/PDGFR-Systems im entzündeten
Myokardgewebe
- 57 -
5.1.4.1
Nachweis von PDGF-Faktoren im Myokard während der akuten CVB3-Infektion
- 57 -
5.1.4.2
Nachweis des PDGF/PDGFR-Systems im chronisch entzündeten Myokardgewebe
- 58 -
5.1.5
Analyse von gesteigerter PDGF-Aktivität im CVB3-infizierten Myokard
- 64 -
Inhaltsverzeichnis
5.2
PDGF-Rezeptoren als mögliches Target zur Verringerung einer CVB3induzierten Fibrosierung des Myokards
5.2.1
Bioverfügbarkeit und Effizienz von STI571 im Myokardgewebe
- 65 - 66 -
5.2.1.1
STI571-Konzentrationen im Myokardgewebe
- 66 -
5.2.1.2
Toxizität und Nebenwirkungen der STI571-Behandlung
- 67 -
5.2.2
Effekte der STI571-Wirkstoffbehandlung auf die Aktivität des PDGF/PDGFR-Systems
- 69 -
5.2.3
Testung von generellen Effekten der STI571-Behandlung auf kardiale Fibroblasten - 70 -
5.2.3.1
Einfluss der STI571-Behandlung auf CVB3-Infektion
5.2.3.2
Effekte der STI571-Behandlung auf die Entwicklung von Fibrose im chronisch
entzündeten Myokard
- 72 -
5.2.3.3
Etablierung von Indikationsmarkern einer Fibrose
- 74 -
5.2.3.4
Verminderung der PDGFR-Aktivität durch Behandlung mit STI571 in der Entwicklung
von Myokardfibrose
6.
- 76 -
Diskussion
6.1
Rolle von Immundefizienz und Viruspersistenz für die Ausbildung einer
chronischen Myokarditis
6.2
6.3
- 81 -
Erhöhte PDGF-Produktion im Herzgewebe korreliert mit Infiltration und
Fibrose
6.4
- 78 -
Bedeutung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren für die Myokarditis und
Fibrosierung des Myokard
- 83 -
STI571/Glivec vermindert die Fibroseentwicklung im CVB3-infizierten
Myokard
- 85 -
6.4.1
Verfügbarkeit des Tyrosinkinase-Inhibitors STI571 im murinen Myokard
- 86 -
6.4.2
STI571 inhibiert die PDGF-Rezeptor Aktivierung in vivo
- 87 -
6.4.3
Verminderte Myokardfibrosierung durch eine STI571-Behandlung
- 88 -
6.4.4
Der Einfluss weiterer Faktoren auf Fibrosierungsprozesse
- 90 -
6.5
7.
- 71 -
Ausblick
Literaturverzeichnis
Anhang
Abkürzungsverzeichnis
Bilder- und Tabellenanhang
Danksagung
Selbstständigkeitserklärung
- 91 -
- 93 -
Abbildung- und Tabellenverzeichniss
Abbildung- und Tabellenverzeichnis
Abb. 1:
Klassifizierung des Coxsackievirus B3.
-3-
Abb. 2:
Das Zwei-Schrittsystem der Myofibroblasten Differenzierung.
- 12 -
Abb. 3:
Rezeptor spezifische Bindung von PDGF.
- 15 -
Abb. 4:
Protolytische Reifung der PDGF-C und -D Isoformen.
- 16 -
Abb. 5:
Struktur und Wirkungsmechanismen des 2-Phenylaminopyrimidin-Derivates
STI571.
- 21 -
Abb. 6:
Histologische Darstellung der Infiltrate im Myokard nach Infektion mit CVB3.
- 46 -
Abb. 7:
Nachweis von Fibrose im Myokard nach CVB3-Infektion.
- 47 -
Abb. 8:
Semiquantitative β-Aktin RT-PCR. Untersuchung einer Myokardprobe auf
β-Aktin Expression unter Verwendung eines kompetitiven Kontrollfragmentes.
Abb. 9:
- 49 -
Expression von entzündungsspezifischen Zytokinen im Myokard während einer
CVB3-Infektion.
- 50 -
Abb. 10:
Expression von PDGF-Isoformen während der CVB3-Infektion.
- 52 -
Abb. 11:
In Situ-Hybridisierung (ISH) von PDGF-C mRNA im Myokard nach
CVB3-Infektion.
Abb. 12:
In Situ-Hybridisierung (ISH) des viralen Genoms im Herzmuskel nach
CVB3-Infektion.
Abb. 13.1:
- 54 -
- 56 -
Befunde der IHC-Untersuchung von PDGF-C im myokardialen Infiltrat nach
Infektion mit CVB3.
- 59 -
Abb. 13.2:
IHC-Detektion von PDGF-B im Herzgewebe nach CVB3-Infektion.
- 60 -
Abb. 13.3:
IHC-Nachweis von PDGF-A im Myokard nach Infektion mit CVB3.
- 61 -
Abb. 13.4:
Befunde der IHC-Untersuchung von PDGFR-α im Myokard nach
CVB3-Infektion.
- 62 -
Abb. 13.5:
IHC-Detektion von aktiviertem Akt/PKB (p-Akt) im CVB3-infizierten Myokard.
- 63 -
Abb. 14:
Testung von Herzgewebe-Extrakten auf den Gehalt an PDGF durch Aktivierung
von PDGF-Rezeptoren in Swiss 3T3 Fibroblasten in vitro.
Abb. 15:
- 65 -
Entwicklung und Änderung des Körpergewichtes von CVB3-infizierten MHC
Klasse II ko Mäusen unter Behandlung mit 150 mg/kg, 50 mg/kg und
100 mg/kg STI571.
- 68 -
Abb. 16:
Detektion von aktiverten PDGF-Rezeptoren in Herzextrakten.
- 70 -
Abb. 17:
Nachweis von CVB3 im Herzmuskelgewebe von MHC Klasse II ko Mäusen
21 Tage nach CVB3-Infektion und Behandlung mit und ohne STI571.
Abb. 18.1:
Histopathologische Darstellung von Infiltrat und Fibrose im Myokard von
CVB3-infizierten Mäusen unter STI571 Behandlung.
Abb. 18.2:
- 71 -
- 73 -
Graphische Darstellung von Fibrose im Myokard von CVB3-infizierten Mäusen
unter STI571 Behandlung.
- 74 -
Abbildung- und Tabellenverzeichniss
Abb. 19:
Expression von Fibrosemarker.
- 75 -
Abb. 20:
Immunhistochemie Detektion von aktiviertem Akt/PKB.
- 77 -
Abb. 21:
Der TGF-β-Weg.
- 91 -
Abb. 22:
Schematische Darstellung des pBluescript II KS(+) Plasmides.
Tab. 1:
Die häufigsten durch Coxsackieviren A und B verursachten Erkrankungen.
Tab. 2:
Überexpression von verschiedenen Proteinen und ihrer Folgen im Myokard.
Tab. 3:
Expressionsanalyse der vier PDGF-Ketten im humanen Gewebe, mittels
Anhang
-4- 13 -
Northern Blot Analyse.
- 17 -
Tab. 4:
PDGF-Rezeptor-Tyrosinkinase Inhibitoren.
- 20 -
Tab. 5:
STI571-Konzentrationen im Herzgewebe von CVB3-infizierten und
scheininfizierten MHC Klasse II knockout Mäusen.
Tab. 6:
- 67 -
Darstellung der densiometrischen Auswertung, der in Abb. 19 analysierten
Argarosegel-Banden von β-Aktin, Tenascin-C und Fibronektin-Fn.
- 76 -
Tab. 7:
Verwendete Oligonukleotid-Primer
Anhang
Tab. 8:
Reagenzien für die RT-PCR
Anhang
Tab. 9:
PCR-Bedingungen
Anhang
Tab. 10:
Histologische Bewertungskriterien für das Myokard
Anhang
Tab. 11:
Antikörper-Verdünnung
Anhang
Tab. 12:
Konzentration des Tyrosinkinase Hemmstoffes STI571 im Myokard von
CVB3-infizierten und scheininfizierten MHC Klasse II ko Mäusen, die 2x
täglich mit 50 bzw. mit 150 mg/kg STI571 behandelt wurden.
Tab. 13:
Anhang
Körper- und Herzgewicht sowie das Verhältnis des Herz- zum Körpergewicht
am Sektionstag (21 d p. i.) von CVB3-infizierten MHC Klasse II ko
Mäusen, die entweder mit STI571 oder mit einer Vergleichslösung behandelt
wurden, im Vergleich zu scheininfizierten Tieren, die STI571
oder die Vergleichslösung appliziert bekamen.
Anhang
1. Zusammenfassung
Zusammenfassung
Humanpathogene Coxsackie B3-Viren (CVB3) sind die häufigste virale Ursache einer
Myokarditis. Für das chronische Stadium dieser Erkrankung ist eine Fibrosierung des
Herzmuskels kennzeichnend. Die der Fibrosierung zugrunde liegenden pathologischen
Mechanismen sind bisher weder im humanen Krankheitsbild noch im murinen Tiermodell
hinreichend geklärt. In Analogie zu fibrotischen Prozessen in anderen Geweben kann
angenommen werden, dass die Bindegewebsvermehrung durch lokal erhöhte Spiegel von
Zytokinen und Wachstumsfaktoren ausgelöst wird. Faktoren der platelet-derived growth
factor-Familie (Wachstumsfaktor aus Blutplättchen/PDGF) kommen als Mediatoren dieser
Prozesse in Betracht, da sie sehr potente Mitogene für Fibroblasten sind, welche im Rahmen
einer Entzündung in das Gewebe einwandern.
Die Zielstellung dieser Arbeit bestand deshalb darin, die Rolle des PDGF/PDGFR-Systems,
insbesondre von PDGF-C, für die der Fibrosierung zugrunde liegenden Prozesse in einem
etablierten Mausmodell der CVB3-induzierten Myokarditis zu klären.
Zunächst wurde nachgewiesen, dass die wesentlichen Merkmale des unter Bedingungen der
offenen Tierhaltung etablierten Modells auch unter Bedingungen der SPF-Haltung vorliegen.
Eine Infektion mit CVB3-Mü/J (Nancy) induzierte in männlichen 8-12 Wochen alten MHC
Klasse II knockout Mäusen nach einer akuten Myokarditis (7. Tag p. i.) mit ausgeprägten
Zellinfiltraten
reproduzierbar
eine
chronische
Myokarditis
mit
nachfolgender
Myokardfibrosierung (21. Tag p. i.). Die Erkrankung heilte in Wildtypmäusen (C57BL/6) mit
identisch genetischem Hintergrund (2Hb) – ohne sichtbare histologische Spuren zu
hinterlassen – aus. Die Charakterisierung des späten chronischen CVB3-Verlaufes ergab
eine Zunahme von interstitiellem Bindegewebe vom 21. zum 56. Tag p. i. Die Entzündung
korrelierte auch zu späten Infektionszeitpunkten mit einer Persistenz von CVB3, was über
Titerbestimmungen und dem Nachweis des Virus-Kapsidgens VP1 durch RT-PCR und In
Situ-Hybridisierung
belegt
werden
konnte.
Ebenfalls
korrelierend
mit
dem
Entzündungsprozess konnte die Expression der Zytokine IFN-β, IL-2, IFN-γ, IL-10, IL-12,
TNF-α, IL-1α, IL-1β und IL-6 durch semiquantitative RT-PCR nachgewiesen werden.
Mittels RT-PCR konnte erstmals eine erhöhte Expression der mRNA der PDGF-Isoformen A,
B und C in den entzündeten Herzen dokumentiert werden. Diese Befunde wurden durch den
Nachweis der mRNA von PDGF-C mittels In Situ-Hybridisierung und den Nachweis von
PDGF-A, -B und -C durch Immunhistochemie erhärtet. Insbesondre die detektierten Signale
des
PDGF-C
mittels
Immunhistochemie
wiesen
auf
einen
Zusammenhang
von
Expressionsregulierung des PDGF/PDGFR-Systems und anhaltender Virusinfektion im
Myokard von MHC Klasse II knockout Mäusen hin. Die Lokalisation des PDGF-C in
Infiltrationsnähe ging mit dem Nachweis des CVB3-Kapsidgenes VP1 im Myokard einher. In
den entzündeten Arealen konnte ebenso der Rezeptor für PDGF-A und PDGF-C, PDGFR-α
nachgewiesen werden. Die Detektion der aktivierten Akt/PKB-Kinase, welche stromabwärts
-1-
Zusammenfassung
in der PDGFR-Signalkette liegt, war konsistent mit einer erhöhten Aktivität des PDGFRSystems in den entzündeten Herzen.
Um zu prüfen, ob die Expression von Faktoren der PDGF-Familie und die Aktivierung des
PDGFR-Systems kausal zur Fibrosierung der chronisch entzündeten Herzen von MHC
Klasse II knockout Mäusen beiträgt, wurden Behandlungen von CVB3-infizierten Tieren mit
dem oral verfügbaren, potenten und relativ selektiven PDGFR-Tyrosinkinase-Hemmstoff
STI571(CGP57148B)/Glivec durchgeführt.
Voruntersuchungen ergaben, dass STI571 mit einer Applikationsdosis von 50 und 100 mg/kg
für MHC Klasse II knockout Mäuse gut verträglich war und in ausreichender Menge im
Myokardgewebe vorlag, um die PDGFR-Aktivität zu unterbinden. Damit erfolgte konsistent
durch die STI571-Behandlung eine durch Immunhistochemie detezierbare Verringerung der
entzündungsinduzierten
Aktivität
von
Akt/PKB.
Mittels
des
TCID50-Testes
konnte
nachgewiesen werden, dass STI571 keinen Einfluss auf eine bestehende CVB3-Replikation
im Myokard hat.
Durch Behandlung von CVB3-infizierten MHC Klasse II knockout Mäusen mit STI571 über
einen Zeitraum von 20 Tage konnte eine signifikante Verringerung der Myokardfibrose erzielt
werden, was qualitativ und quantitativ an Siriusrot gefärbten Myokardschnitten sichtbar
gemacht werden konnte. Indikativ für eine reduzierte Bindegewebsbildung unter STI571Behandlung war auch die verringerte Expression früher Indikationsmarker für die Fibrose
(Tenascin-C und Fibronektin-Fn) was mit Hilfe der RT-PCR nachgewiesen wurde. Die
erhaltenen Ergebnisse belegten somit, dass eine Applikation von STI571 mit einer Dosis 50
und 100 mg/kg gut verträglich war, keinen Einfluss auf den Virustiter im CVB3-infizierten
Myokardgewebe hatte und die Fibroseentwicklung deutlich abschwächen konnte. Damit
könnte der beim Menschen für die Behandlung der chronisch myeloischen Leukämie (CML)
zugelassenen Wirkstoff STI571/Glivec, sich als potentieller neuer Indikator für die
Behandlung der chronischen Myokarditis erweisen.
-2-
2. Einleitung
Einleitung
2.1
Das Coxsackievirus B3 – ein humpathogener Vertreter der Picornaviren
Das humanpathogene Coxsackievirus B3 (CVB3) ist ein bedeutendes Virus aus der Familie
der Picornviridae. Die Picornaviren sind unbehüllte, gegen Äther und Chloroform resistente
Viren mit einer Größe von ca. 30 nm. Sie besitzen als Genom einzelsträngige,
plusstrangorientierte RNA. Neben der physikalisch-chemisch-serologischen Klassifikation
werden die ca. 230 bekannten Serotypen zunehmend anhand von Basensequenzen
klassifiziert1-3. Anhand der Säureempfindlichkeit differenziert man säurestabile Genera von
säurelabilen Genera. Diese Eigenschaften haben entscheidende Konsequenzen für die
Pathogenese der Viren, da säurestabile Viren ihren Wirt über den Verdauungstrakt infizieren
können, indem sie das saure Magenmilieu überstehen, säurelabile Viren hingegen den
Nasopharynx als Infektionsweg bevorzugen1. Abb. 1 veranschaulicht die derzeit angewandte
Systematik der Picornaviren, wodurch die Einordnung des in der Arbeit verwendeten
Coxsackievirus B3 nach der derzeit gültigen Nomenklatur deutlich wird4.
säurelabile Viren
Aphthovirus
Rhinovirus
Erbovirus
bovine
Enteroviren
humane
Enteroviren A
Picornaviren
Hepatovirus
Kobuvirus
Cardiovirus
Enterovirus
Techovirus
Parechovirus
humane
Enteroviren B
A-2-Plaque-
Virus
humane
Enteroviren C
humane
Enteroviren D
Polioviren
porzine
Enteroviren
humane
Enteroviren 73-78
säurestabile Viren
Coxsackie
B Viren
Echoviren
humanes
Enterovirus 69
Coxsackie
B3 Virus
Nancy
München/
Jena
Abb. 1: Klassifizierung des Coxsackievirus B34
-3-
Einleitung
Die Coxsackieviren gehören zu den humanen Enteroviren5 und werden auf Grund der
beobachteten unterschiedlichen Pathogenität in neugeboren Mäusen in die Coxsackieviren
der Gruppen A und B eingeteilt6. Die häufigsten durch Coxsackieviren verursachten
Erkrankungen sind in Tab. 1 aufgelistet.
Tab. 1: Die häufigsten durch Coxsackieviren A und B verursachten Erkrankungen2
Coxsackie-Virustyp
Typ A24
Typ A2-6, A8, A10, A22
Typ A4-6, A9, A16
Typ A1-2, A4-7, A9-10, A14, A16, A22; B1-6
Typ A4, A7, A9, A10; B1-5
Typ A4, A9; B5
Typ A9-10, A16, A21, A24; B4-5
Typ A10
Typ A18, A20-22, A24; B5
Typ B1-6
Typ B1-5
Typ B5
Typ B4
Erkrankungen
akute hämorrhagische Konjunktivitis
Herpangina
Schleimhautläsionen
aseptische Meningitis
Lähmungen
Hepatitis
Erkrankungen des Respirationstraktes
Pharyngitis
Durchfallerkrankungen bei Kindern
Fieber, grippale Infekte
Pleurodynie,
Perikarditis,
Myokarditis,
systemische Infektionen bei Kindern,
Meningoenzephalitis
Hautausschläge
Diabetes mellitus Typ-I
Das Kapsid der Picornaviren hat eine ikosaedrische Struktur. Die Seitenflächen des Kapsids
werden aus je 60 Einheiten der vier Proteine VP1 bis VP4, die aus dem gespaltenen
Vorläuferprotein P1 hervorgehen, gebildet. Während VP1 bis VP3 die Oberfläche des
Ikosaeders bilden, ist VP4 an der Protomerinnenseite lokalisiert und mit dem RNA-Genom
assoziiert7. Das Kapsid dient nicht nur dem Schutz der RNA, es vermittelt im Besonderen
den Kontakt zu den Membranrezeptoren der zu infizierenden Zelle. Die verschiedenen
Genera der Picoravirus-Familie bedienen sich unterschiedlicher Rezeptoren. So erkennen
Coxsackie B-Viren gemeinsam mit den Adenoviren ein zelluläres Oberflächenmolekül, das
als Coxsackievirus-Adenovirus-Rezeptor (CAR) bezeichnet wird. Einige Coxsackie B-Viren,
stehen zusätzlich in Wechselwirkung mit dem Korezeptor decay-accelerating-factor (DAF).
Ebenso kommen stark sulfatierte Heparansulfat-Proteoglykane (HSPG) als mögliche
Rezeptoren speziell für Coxsackie B3-Viren in Frage8-12. Nachdem das Virus an die
Rezeptoren adhäriert, erfolgt über Endozytose die Penetration13. Durch zelluläre Polysome
wird das virale Genom translatiert, indem die plusstrangorientierte virale RNA direkt als
mRNA fungiert. Das Genom der Coxsackieviren besitzt mit einer Größe von ~7400
Basenpaaren einen einzigen offenen Leserahmen. Mit diesem kodiert das Virus für das
schon erwähnte Polyprotein (247 kDa), in dessen Sequenz alle Proteine und Funktionen
enthalten sind, die es für eine erfolgreiche Infektion benötigt14. Bereits während der
Translation wird das Polyprotein proteolytisch durch in viruseigenen Proteasen 2A und 3C
-4-
Einleitung
prozessiert15. Eines der Translations- und Spaltprodukte ist eine RNA-abhängige RNAPolymerase, die 3D Polymerase (3Dpol). Dieses Enzym synthetisiert den zum Virusgenom
komplementären Negativstrang über ein kurzlebiges doppelsträngiges Zwischenprodukt, so
dass der Negativstrang schnell für die Synthese von bis zu acht Positivsträngen zur
Verfügung steht. Liegen ausreichend synthetisierte virale Proteine und Virus-RNA im
Zytoplasma der Zelle vor, erfolgt die Aggregation der Kapsidproteine zu Prokapsiden und die
virale Plusstrang-RNA wird verpackt (self assembly). Der lytischen Freisetzung der Viren
geht eine Erhöhung der Plasmamembranpermeabilität voraus16-18. Die säurestabile
Eigenschaft der Coxsackieviren gestattet einen fäkal-oralen Infektionsweg. Die Viren
vermehren sich in den Peyerschen-Plaques, dem lymphatischen Gewebe des Darms. Über
die ableitenden Lymphbahnen erfolgt die Abgabe in die Blutbahnen oder direkt in den
Darm19. Zusätzlich ist eine lokale Vermehrung im Lymphgewebe des Nasen- und
Rachenraumes durch Aerosolinfektion möglich20. Die Art und Schwere einer CoxsackievirusInfektion ist abhängig vom Virusstamm21,22, vom Alter23, Geschlecht24 und vom genetischen
Hintergrund des Wirtes25. Von Coxsackieviren hervorgerufene Krankheiten verlaufen in 80%
mild oder gar subklinisch. In ausgewiesenen Fällen können sich jedoch schwere bis fatale
Verläufe entwickeln2,19.
Besonders der Serotyp 3 der Coxsackie B-Viren (CVB3) kann neben einer akuten auch eine
chronische Infektion des Herzmuskels hervorrufen20, dessen Verlauf im Einzelfall bis hin zur
dilatativen Kardiomyopathie (DCM) führen kann16,26. Dennoch besitzen etwa 60-90% der
Bevölkerung CVB3-Antikörper im Serum27. Eine Infektion im Säuglingsalter ohne den Schutz
mütterlicher CVB3-Antikörper führt zu schweren Verläufen und endet oft tödlich28,29. Wie
bekannt ist, werden auch 62% der aseptischen Meningitiden im Säuglingsalter durch
Coxsackieviren der Gruppe B verursacht30.
Die für diese Arbeit relevante CVB3-Variante „München/Jena“31 ist aus einem Prototyp des
von Melnick isolierten, herzadaptierten Virusstammes Nancy32 hergestellt.
-5-
Einleitung
2.2
Enteroviral induzierte Myokarditis und Dilatative Kardiomyopathie
Unter einer Myokarditis versteht man eine Entzündung, die sich herdförmig oder diffus im
Herzmuskel ausbreitet und akut oder chronisch rezidivierend verläuft. Die Diagnose
Myokarditis kann derzeit nur über eine Endomyokardbiopsie und anschließender
histologischer,
molekularbiologisch-virologischer
Befunderhebung erstellt werden
33-35
und
immunhistochemischer
. Die sogenannten „Dallas“-Kriterien bilden die Grundlage
der histomorphologischen Einteilung einer Myokarditis36-39. Epidemiologische Daten zur
Insidenz einer Herzmuskelentzündung sind nur teilweise zuverlässig, da in vielen Fällen
durch einen subklinischen Verlauf von Spontanheilung ausgegangen werden muss. Männer
erkranken in der Regel mit einer Quote von 2:1 häufiger als Frauen34. Neben rheumatoider
Arthritis kann auch der Missbrauch von Alkohol zu einer nichtinfektiösen Myokarditis führen.
Als Hauptursache einer Myokard-Entzündung werden infektiöse Agenzien gesehen. Neben
bakteriellen Infektionen (z. B. Salmonellen, Clostridien, Chlamydien, Borrelien und
Rickettsien) können ebenso Pilze (z. B. Aspergillus, Candida und Kryptokokken) und
Protozoen (z. B. Trypanosoma, Toxoplasmen, Plasmodien und Leishmanien) eine
Myokarditis induzieren27,40-42. Bei viralen Erkrankungen liegt der Anteil an Myokarditiden bei
3-6%43. Hierbei kann die Myokarditis durch HIV44, das Herpes-Simplex-Virus vom Typ-II,
Hepatitis-C-Virus, Adenoviren45, Cytomegalieviren46, und das Parvovirus B1933,47 induziert
werden. Die Einwirkung der Erreger kann direkt oder indirekt durch toxische, chemische oder
physikalische Agenzien oder von bisher nicht verstandenen genetischen Ursachen
beeinflusst werden48.
Die, mit einer Insidenz bis zu 50% bei akuter Myokarditis, häufigste kardiovaskuläre
Viruserkrankung wird durch Enteroviren, vor allem vom Serotyp Coxsackievirus B3,
verursacht16,26,41. Das Virus befällt nach hämatogener Ausbreitung Kardiomyozyten, repliziert
sich aktiv im Zytoplasma und führt zu Myonekrosen. In der frühen Phase der Virusreplikation
ist vor der Entwicklung eines reaktiven Entzündungsinfiltrates eine hohe Kopienzahl
enteroviraler Genome nachweisbar49. Im Anschluss bilden sich durch die Aktivierung des
Monozyten-Makrophagen-Systems
reaktive
Entzündungsinfiltrate
mit
fokalen
Entzündungsherden16,50,51. Die enterovirale Protease 2Apol induziert in kardialen Myozyten
die Dystrophinspaltung, was zu einer Unterbrechung des Aktin-Zytoskelettes mit der
Zellmembran und zur weiteren Ausbreitung der Infiltrate führt52. Die Aktivierung von THelferzellen (CD4), zytotoxischen T-Lymphozyten (CD8) sowie die Sezernierung ihrer
spezifischen Zytokine in die Entzündungsinfiltrate im Myokard sind charakteristisch für die
Ausbildung einer akuten Myokarditis und regeln die spezifische Immunantwort50,51. Durch die
Zunahme der humoralen und zellulären Immunantwort kann eine sich ausbreitende Infektion
eingedämmt16,53 und das Virus vollständig aus dem Myokard eliminiert werden.
-6-
Einleitung
Durch bislang unbekannte Faktoren gelingt es bei einigen Fällen der Erkrankung dem Virus,
sich der Überwachung des Immunsystems zu entziehen und eine persistierende, chronische
Infektion auszulösen16. Diese chronische Phase der myokardialen Erkrankung wird durch ein
diffuses bzw. fokales Entzündungsinfiltrat, eine myozelluläre Hypertrophie, eine nekrotische
Veränderung der Myozyten und durch die Persistenz des viralen Agens charakterisiert54. Im
Vergleich zur akuten Myokarditis geht die chronische Verlaufsform mit einer eingeschränkten
Virusreplikation einher. Sie ist durch eine wesentlich geringere Anzahl infizierter
Myokardzellen gekennzeichnet51,55 und mit dem Bild einer inflammatorischen dilatativen
Kardiomyopathie (DCM) gleichzusetzen39,56. Die klinische Relevanz einer DCM liegt in der
Tatsache begründet, dass diese mit einer jährlichen Insidenz von 5-10 Fällen/100000
Einwohnern eine der häufigsten zur Herztransplantation führende Herzerkrankung ist35,57. Bei
einer Diagnose DCM ist eine Mortalitätsrate von 20-40% zwei Jahre nach Diagnosestellung,
zu erwarten38,40. Kennzeichnend für eine DCM sind Myozytennekrosen mit reparativen
fibrotischen Veränderungen des Myokardgewebes. Die interstitielle Fibrose ist durch eine
massive Proliferation residenter Fibroblasten und einer erhöhten Anzahl interstitieller Zellen
wie Makrophagen und Lymphozyten gekennzeichnet58. Zudem scheint ein Ungleichgewicht
von matrixdegradierenden Enzymen die Umbauprozesse der extrazellulären Matrix (ECM)
auszulösen. Dies geht mit einer konsekutiven Störung der myokardialen Funktion einher59.
Die starke Persistenz von Zytokinen wie IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4 und IL-10 ist
charakteristisch bei einer Persistenz der Infiltrate und Entwicklung von Fibrose. Sie kann
sowohl in experimentellen Modellen von chronischer Myokarditis der Maus60-62 als auch bei
der dilatativen Kardiomyopathie von Patienten63,64 nachgewiesen werden. In 20-40% der
Patienten mit Diagnose Myokardits oder DCM kann mittels In Situ-Hybridisierung
enterovirale RNA nachgewiesen werden38,54. Dies unterstreicht die Dringlichkeit der
Entwicklung einer antiviralen Therapie oder einer effektiven Prävention.
-7-
Einleitung
2.3
Chronisch verlaufende murine CVB3-Infektionsmodelle
Der derzeitige Stand der Forschung und die jetzt bestehenden Therapiemöglichkeiten einer
chronischen Myokarditis erlauben bislang nur die symptomatische Behandlung bzw. im
Endstadium der Erkrankung eine Herztransplantation. Auch kann bis heute ein Fortschreiten
der Fibroseentwicklung therapeutisch nicht verhindert werden. Aus diesem Grund sind
Tiermodelle entwickelt worden, die sowohl akute als auch persistierende CVB3-Infektionen in
verschiedenen murinen Modellen beschreiben54,65-71. Zahlreiche Untersuchungen haben eine
Abhängigkeit der CVB3-induzierten Myokarditis nicht nur von der Verwendung des
eingesetzten Virusstammes und dessen Virulenz ausgemacht72,73, sondern in besonderem
Maße eine Abhängigkeit vom Immunstatus der Rezipienten Mäuse festgestellt70. Das murine
kardiale Krankheitsbild weist zwei charakteristische Phasen auf: eine akute Phase, in der die
Gewebezerstörung direkt durch das zytolytisch wirkende Virus bzw. durch die gegen das
Virus gerichteten Abwehrmechanismen erfolgt50,72 und eine chronische Phase, die durch
fortschreitende Fibrose im Myokard gekennzeichnet ist.
Für die Untersuchung des chronischen Verlaufes einer Herzmuskelentzündung im murinen
Modell eignen sich Mausmodelle wie A.CA/SnJ, A.BY/SnJ und SWR/J. Bei diesen
Mäusestämmen ist die Chronizität der Herzerkrankung mit einer Persistenz viraler RNA im
Myokard verbunden72,74. Tiermodelle wie NMRI-Mäuse stehen wegen ihrer genetischen
Vielfalt in der Heterogenität der humanen Population sehr nahe. Dieses Mausmodell
entwickelt nach einer Infektion mit der lytischen CVB3-Variante 31-1-93 eine chronische
Myokarditis mit ausgeprägter Fibrose und Nekrose in den Entzündungsarealen66,75.
Beinhaltet die Fragestellung im chronisch verlaufenden myokardialen Krankheitsgeschehen
die Aufklärung bestimmter Immunmechanismen, dann finden knockout Mäuse, denen
bestimmte Komponenten des Immunsystems fehlen, Verwendung53,72. So entwickeln BALB/c
Mäuse, die kein CD40 Gen76 aufweisen, eine chronische Myokarditis mit nachfolgender
Fibrose,
während
immunkompetente
Wildtypmäuse
eine
akute
Myokarditis
mit
77
anschließender vollständiger Heilung ausbilden . Ähnliche Ergebnisse zeigen Experimente
mit C57BL/6 Mäusen, denen das Zytokin IL-478 für den Aufbau einer effektiven TH-2
vermittelnden Immunantwort fehlt. Bei 50% diese Tiere geht die Erkrankung in eine
chronischen Myokarditis mit starken myokardialen Schäden und Persistenz des CVB3 im
Herzmuskel über79. BALB/c Mäuse mit einem identischen Immundefekt hingegen zeigen
keine chronische Entzündung, sondern heilen nach einer akuten Myokarditis aus80. B-Zelldefizienten Mäusen (µMT-ko)81 mit fehlender IgM- und IgG-Antikörperantwort weisen nach
CVB3-Infektion eine stete Viruslast im Myokard auf, welche zu einer Entwicklung einer
schwere Myokarditis mit großen Infiltraten und Fibrose führt, an denen die Mäuse
versterben82. Der Verlust der β2-Mikroglobulin-Expression in C57BL/6 Mäusen führt nach
Virusinfektion zu einem geringen neutralisierenden Antikörper- und virusspezifischen IgG-8-
Einleitung
Spiegel sowie zu einer verringerten Produktion von protektiven Zytokinen, wie z. B.
Interferon-γ, was zu einer persistierenden Entzündung und kardialer Fibrose führt69. Die für
diese Arbeit verwendeten C57BL/6 knockout Mäuse, denen das Gen für MHC Klasse II83
fehlt, entwickeln eine schwere, chronisch verlaufende Myokarditis, die viele Parallelen zum
humanen Krankheitsbild der DCM aufweist71.
2.4
Im
Das Mausmodell der CVB3-induzierten chronischen Myokarditis
Rahmen
der
Charakterisierung
protektiver
bzw.
pathogenitäts-begünstigender
Eigenschaften des Immunsystems auf den Krankheitsverlauf einer CVB3-induzierten
Myokarditis sind immundefiziente MHC Klasse II knockout Mäuse83 mit der Virusvariante
München/Jena
(CVB3
Mü/J)
des
Stammes
CVB3
(Nancy)
infiziert
und
mit
immunkompetenten C57BL/6 Mäusen (identischer genetischer Hintergrund; H-2b) verglichen
worden71,79. CVB3 induziert in C57BL/6 Mäusen eine akute Myokarditis mit ausgeprägten
Zellinfiltraten, die drei Wochen nach Infektion zur Ausheilung kommt. Im Unterschied zu
immunkompetenten Mäusen zeigen histologische Untersuchungen des Myokards CVB3infizierter MHC Klasse II knockout Mäusen, die resultierend aus ihrem Gendefekt eine stark
verringerte Anzahl peripherer CD4+-T-Zellen aufweisen, eine chronische Myokarditis mit
starker Fibrosierung des Herzmuskels sowie ausgeprägte Areale von Entzündungszellen, die
hauptsächlich aus CD11b+-Zellen und CD8+-T-Zellen bestehen. Der Virustiter ist am 7. Tag
p. i. im Myokard beider Mäusestämme identisch. C57BL/6 Mäuse eliminieren bis zum Tag 14
p. i. das infektiöse Virus aus dem Myokard. Im Gegensatz dazu persistiert das Virus im
Myokard von MHC Klasse II defizienten Mäusen bis zum 56. Tag p. i. (derzeit letzter
untersuchter Zeitpunkt). Virusspezifische Antikörper der Immunglobulinklasse IgM wurden
unabhängig von funktionellen CD4+-T-Zellen gebildet. MHC Klasse II knockout Mäuse zeigen
bis zum 21. Tag p. i. weder einen Anstieg der virusspezifischen IgG-Antikörper noch konnten
virusneutralisierende Antikörper nachgewiesen werden. Aus den bisherigen Untersuchungen
geht hervor, dass ein Defekt im Bereich der MHC Klasse II Präsentation und das daraus
resultierende Fehlen funktionsfähiger CD4+-T-Zellen eine konstante Viruspersistenz im
Myokard zur Folge hat. Als Konsequenz kommt es reproduzierbar zur Entwicklung einer
chronischen Myokarditis mit nachfolgender progressiven Fibrosierung. Dieses Modell
erscheint
daher
besonders
geeignet,
Mechanismen
und
Effektoren
des
Fibrosierungsprozesses zu analysieren.
-9-
Einleitung
2.5
Fibroblastenmitogene und Fibrosierungsprozesse
Fibroblasten können in vielen Organen von Wirbeltieren gefunden werden und assoziieren
mit verschiedenen Formen von Bindegewebe84. Fibroblasten sind mesenchymalen
Ursprungs und haben die Funktion der Bildung interstitiellen Kollagens, vor allem vom Typ I,
III und IV85. In einem Myokardgewebe stellen Kardiomyozyten mit ca. 75% den Hauptanteil
des Gewebevolumens. Ihre Zellanzahl beträgt jedoch nur zwischen 30-40%. Die Mehrheit
der restlich identifizierten Zellpopulationen ist überwiegend Fibroblasten. Fibroblasten
umgeben
die
Kardiomyozyten
und
bilden
so
„Brücken“
zwischen
verschiedenen
Myokardschichten. Die Interaktion zwischen kardialen Fibroblasten und kardialen Myozyten
scheint für den Prozess des Umbaus von Herzmuskelgewebe essentiell zu sein86. Die
Bildung von Kollagen im Myokard eines gesunden Erwachsenen ist relativ gering. Der Anteil
des durch Fibroblasten gebildeten Netzwerkes im Myokardgewebe steigt mit zunehmenden
Alter an85.
2.5.1 Normal- und pathologisch-verlaufende Wundheilung und Gewebereparatur
Fibroblastenproliferation und Geweberemodelling sind Hauptmerkmale eines normalen
Wundheilungsprozesses. Im physiologischen Verlauf der Wundheilung im adultem
Organismus sind Fibroblasten maßgeblich an der Synthese der extrazellulären Matrix (ECM)
beteiligt. Sie wandern in die Wunde ein und produzieren eine Kollagen- und
Fibronektinreiche ECM87. Wenige Stunden nach Gewebeverletzung treten erste Zellen, wie
Neutrophile, im zerstörten Gewebe auf, gefolgt von Monozyten und Lymphozyten.
Substanzen wie Histamine und TNF-α werden durch einwandernde Makrophagen freigesetzt
und induzieren in Monozyten die IL-6-Sekretion. Während dieser akuten Phase wird das
zerstörte Gewebe durch Degradation und Produktion von Matrixbestandteilen und
Angiogenese umgebaut86. In dem entzündeten Gewebe angereicherten Makrophagen,
Mastzellen und Thrombozyten geben zudem eine Reihe von Wachstumsfaktoren (EGF, IGF1, PDGF, TGF-β) und Zytokine (IL-1, IL-6, TNF-α) ab, die chemotaktisch die Proliferation von
residenten Fibroblasten anregen können88. Diese Faktoren stimulieren ebenso die Synthese
von Proteoglykan und Kollagen-Typ III, die den raschen Umbau in ein kapillarreiches
Bindegewebe zulassen. Das neu entstandene Bindegewebe vom reißfesteren Kollagen-Typ I
stellt seine mitotische Aktivität ein. Es bildet sich ein faserreiches, zellarmes und
kapillararmes Narbengewebe, welches das ehemalige ortsständige defekte Gewebe ersetzt
hat85,86.
Bei
länger
Gewebeentzündungen,
anhaltenden
kommt
es
retraktilen
zu
weiteren
Vorgängen,
wie
chronischen
Fibroblastenproliferationen.
Diese
Fibrosierung eines Organs kann als Ergebnis einer überschießenden und letztlich
deregulierten Wundheilung bei fortgesetzter Schädigung aufgefasst werden. Unter Ersatz
des kontinuierlich geschädigten Gewebes entsteht eine irreversible Narbe, welche zwar den
- 10 -
Einleitung
Organerhalt gewährleistet, aber eine Minderung der Funktionsleistung des Organs
verursacht.
In einer Vielzahl von Organen wie Lunge, Leber, Niere, Darm, Herz, Haut und Knochenmark
können fibrotisch verlaufende Prozesse dokumentiert werden. Für Fibrosierungen scheint
eine bestimmte Klasse von Fibroblasten, die so genannten „Myofibroblasten“ von besonderer
Bedeutung zu sein. Myofibroblasten zeichnen sich durch ein ausgeprägtes Aktin-Zytoskelett,
eine vermehrte Motilität und Kontraktilität, eine hohe Proliferationsrate und eine exzessive
Synthese von Komponenten der ECM aus89. Die zelluläre Herkunft der Myofibroblasten ist
derzeit in der Literatur Gegenstand zahlreicher Diskussionen. Favorisiert wird die Hypothese
der
Umwandlung
Fibrinolyseaktivität
von
Fibroblasten
in
Myofibroblasten
(Plasminogen-Aktivator-Enzyme)
im
durch
eine
wachsende
pathologisch
veränderten
Gewebe87,90. Myofibroblasten sind große spindel-, oft sternförmige Zellen. Im Gegensatz zu
anderen Fibroblasten bilden ihre Aktin-Mikrofilamente kein kortikales Netzwerk längs der
Zellmembran, sondern sind entlang der langen Zellachse lokalisiert. Die Filamente sind
schmaler als in den glatten Muskelzellen87. Für eine Differenzierung der Myofibroblasten aus
Fibroblasten spricht der Nachweis von Vimentin und Myosin sowohl in Fibroblasten als auch
in Myofibroblasten. Das Fehlen von Proteinen, wie Lamin und Desmin in Myofibroblasten, die
für die glatten Muskelzellen charakteristisch sind, unterstützen diese These85,91. Abb. 2 zeigt
die
Differenzierung
eines
Fibroblasten
in einen
Myofibroblasten
in
einem
Zwei-
Schrittsystem87.
2.5.2 Die Rolle der Wachstumsfaktoren im Prozess der Fibroblastenproliferation
In allen fibrotischen Erkrankungen spielen Myofibroblasten eine wichtige Rolle. Der
Myofibroblast kann auto- und parakrin fibrogene Wachstumsfaktoren sezernieren und
unterhält die Fibrogenese im jeweiligen Organ, indem die Differenzierung von Fibroblasten in
Myofibroblasten weiter gefördert wird87.
Der Wachstumsfaktor aus Blutplättchen (PDGF) scheint eine mitogene Schlüsselposition in
der Differenzierung der Myofibroblasten einzunehmen und wirkt chemotaktisch auf diesen
Zelltyp89. Weiterhin wird durch PDGF die Produktion von Kollagen durch Fibroblasten
stimuliert92.
Ein weiterer wichtiger Mediator im Prozess von Wundheilung und Fibrose ist der
transformierende Wachstumsfaktor-beta (TFG-β). TGF-β ist an multiplen Funktionen wie
Zellwachstum, Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Induktion von Apoptose im
Organismus beteiligt93. Es existieren drei Isoformen von TGF-β. Als zelluläre Rezeptoren
fungieren transmembrane Serin/Threonin-Kinasen. Für die Aktivierung des Komplexes ist die
Phosphorylierung
der
Rezeptoren
erforderlich.
Nachfolgend
werden
auf
der
zytoplasmatischen Seite der Membran Proteine der Smad-Familie phosphoryliert. Rezeptor- 11 -
Einleitung
spezifische Smad-Moleküle – Smad2/3 – bilden nachfolgend mit Smad4 ein Heterodimer und
fungieren als Transkriptionsfaktoren86,93,94. Neue Studien belegen, dass durch TGF-β auch
unabhängig vom Smad2/3-Weg Signale über den c-Abelson-Tyrosinkinase-Weg (c-Abl)
vermittelt werden können. Die Aktivierung der c-Abl-Kinase durch TGF-β geschieht dabei
unabhängig von der Phosphorylierung des PDGF-Rezeptors oder dessen Expression95,96.
TGF-β wirkt chemotaktisch auf Monozyten, Fibroblasten und Makrophagen und nimmt auf
diesem Weg Einfluss auf die Produktion von Kollagen und Fibronektin sowie auf die
Inhibition der Kollagen-Degradation86,97. Ebenso vermag TGF-β in diesen Zellen die eigene
Expression sowie die von IL-1, IL-6, TNF-α und PDGF zu aktivieren93.
Zellkern
?
fokale Adhesionsseite
Korticales zytoplasmatisches Aktin
zytoplasmatisches Aktin
α-smooth Muskel Aktin
Fibronektin
ED-A Fibronektin
Fibroblast
kontraktile
Kräfte
ausdifferenzierter Myofibroblast
Proto-Myofibroblast
TGF-β1
ED-A Fibronektin
Mechanische Anspannung
Abb. 2: Das Zwei-Schrittsystem der Myofibroblasten Differenzierung. Unter Stresseinwirkung
erfolgt eine Differenzierung des Fibroblasten in einen Proto-Myofibroblasten. Durch Erhöhung von
Wachstumsfaktoren wie TGF-β und PDGF kommt es zu einer verstärkten Expression von Fibronektin.
Dies bewirkt die Modulation des Proto-Myofibroblasten in einen ausdifferenzierten Myofibroblasten87.
- 12 -
Einleitung
2.5.3 Coxsackievirus B3-induzierte Fibrosierungsprozesse
Fibrosierungen des Myokards können offenbar über verschiedene Mechanismen ausgelöst
werden. Im Fall der Coxsackievirus B3-induzierten chronischen Myokarditis mit Entwicklung
einer massiven Fibrose ist es eine noch nicht endgültig geklärte Frage, ob die Virusinfektion
des Myokards selbst für die Progression der Erkrankung verantwortlich ist. Alternativ könnten
die vom Virus induzierten Immunmechanismen oder die Ausbildung einer Autoimmunität
zum Fortschreiten von myokardialen Umbauprozessen führen. Für die Hypothese einer
Viruspersistenz spricht, dass selbst die Expression einer Coxsackie B3-cDNA im Myokard,
die Entwicklung des typischen Bildes einer myokardialen Fibrose auslösen kann98,99. Bei
einigen Mausmodellen der CVB3-induzierten chronischen Myokarditis bzw. DCM bei
Patienten lassen sich jedoch Antikörper gegen kardiales Myosin nachweisen50,100,101. Es wäre
denkbar, dass sich in Folge einer Virusreplikation und des Gewebeuntergangs im Myokard
parallel zu den reparativen Prozessen, ein Autoimmunprozess aufbaut. Als mögliches
Autoantigen könnte kardiales Myosin wirken, das in suszeptiblen Mäusestämmen eine
Myokarditis mit Entzündungsinfiltraten induziert, wobei es auch zur Bildung von Myosinspezifischen Antikörpern kommt102,103. Bekannt ist auch, dass durch eine kardiale
Überexpression verschiedener Zytokine und Wachstumsfaktoren (Tab. 2) die Proliferation
der Fibroblasten im Myokard stimuliert werden kann und dies zu einer Myokarditis und
Fibrose führt.
Tab. 2: Überexpression von verschiedenen Proteinen und ihrer Folgen im Myokard
überexpremierendes Protein
murines TNF-α (stark)
murines TNF-α (schwach)
ausbildender Phänotyp
Referenz
104
Myokarditis, Kardiomegalie, letal
diffuse, milde, interstitielle Infiltrate, 23% 105
Letalität nach 6 Monaten
106
murines TNF-α
Myokarditis, Fibrose, Herzversagen
99
CVB3,
Replikationszyklus Fibrose, Herzversagen
gehemmt
Grün fluoreszierendes Protein erhöhtes Herz/Körpergewicht, Herzdilatation, 107
(GFP)
Herzversagen, Tod bei starker Expression,
keine Entzündung, keine Fibrose
humanes IL-1
Tiere
überleben
maximal
14
Tage, 108
Hypertrophie von kardialen Myozyten,
Lungenödeme
109,110
murines PDGF-C
Geschlechtsspezifische Unterschiede:
Weibchen:
schwerer
Befall,
dilatative
Kardiomyopathie, Herzinfarkt, plötzlicher Tod
Männchen:
hypertrophischer
Phänotyp,
massive Fibrose, zusätzlich Leberfibrose und
Leberkarzinome
murines TGF-β
erhöhtes
Herz/Körpergewicht,
erhöhte 111
Kollagen-Typ I und III Produktion, Anstieg
von MMP´s und TIMP´s dadurch Entstehung
einer myokardialen Fibrose.
- 13 -
Einleitung
2.6
Die Wachstumsfaktoren der Platelet-derived growth factor (PDGF)-
Familie
Der Platelet-derived growth factor (PDGF/Blutplättchenwachstumsfaktor) gehört in die
Gruppe der Wachstumsfaktoren und ist ursprünglich in Blutplättchen gefunden worden, die
ihn bei der Blutgerinnung über sekretorische Vesikel freisetzen112.
2.6.1 Gliederung der PDGF-Liganden
Der Begriff „Platelet-derived growth factor“ bezeichnet eine Familie von homo- bzw.
heterodimeren Wachstumsfaktoren, die aus zwei über Disulfidbrücken verknüpften
Polypeptiden bestehen und wichtig für das Wachstum, Überleben und die Funktion
verschiedener Bindegewebsarten sind113. Es existieren mehre PDGF-Isoformen A, B, C und
D114-118, wobei die Bildung von Homodimeren AA, BB, CC, DD gegenüber der heterodimeren
Isoform AB bevorzugt zu sein scheint. Die reifen PDGF-Isoformen A und B bestehen aus
ungefähr 100 AS, mit acht stark konservierten Zysteinen, wobei zwei für die Disulfidbrücken
zwischen den jeweiligen Untereinheiten verwendet werden119. Die Gene der PDGFIsoformen A und B sind auf den Chromosomen 7 und 22 lokalisiert120. Die kürzlich neu
beschriebenen PDGF-Isoformen C und D besitzen zusätzlich in ihrem Aufbau eine so
genannte CUB-Domäne (Abb. 4), die durch limitierte Proteolyse abgespalten wird. PDGF-C
und -D werden somit aus latenten Vorstufen in aktive Liganden umgewandelt118,121. Die
Isoformen C und D bestehen aus ca. 350 AS117,122. Für die PDGF-Isoformen C und D
befinden sich die Gene auf den Chromosomen 4 und 11123 und kodieren für 6 bzw. 7 Exons.
In Abb. 3 ist die Bindungsspezifität der fünf PDGF-Isoformen dargestellt. Diese weisen
unterschiedliche Bindungseigenschaften zu den PDGF-Rezeptor-Isoformen auf.
2.6.2 Die PDGF-Rezeptoren
Als zelluläre Rezeptoren aller PDGF-Isoformen fungieren zwei Rezeptor-Isoformen, PDGFRα (170 kDa) und PDGFR-β (180 kDa). Diese Rezeptoren gehören zu den transmembranen
Tyrosinkinasen und sind strukturell mit dem CSF-1R (Makrophagen-Kolonie-StimulationsFaktor 1 Rezeptor), c-Kit/SCFR-Rezeptor (Stammzell-Faktor-Rezeptor) und Flt3 (FMSähnliche Tyrosinkinase III) verwandt116,124,125. Die Lokalisation der Rezeptor-kodierenden
Gene ist auf den Chromosomen 4 (PDGFRα)126 und 5 (PDGFRβ)127. Die Struktur der
Rezeptoren ist durch eine extrazelluläre Domäne, eine intrazelluläre Domäne (die eine
Insertionssequenz hat) und eine transmembrane Domäne gekennzeichnet. Die im
extrazellulären Teil befindlichen Immunglobulin-ähnlichen Domänen (Ig-ähnliche Domäne)
sind für die Bindung des Liganden, vermittelt durch die drei außen liegenden Ig-ähnlichen
Domänen, verantwortlich. Eine vierte Ig-ähnliche Domäne der Rezeptoren, ebenfalls ein
- 14 -
Einleitung
extrazelluläres Strukturmotiv, dient offenbar wesentlich der Dimerisierung des Rezeptors und
ist somit direkt am Prozess der Rezeptor-Rezeptor-Interaktion beteiligt128. Essentiell für die
Funktion der PDGF-Rezeptoren ist die Aktivierung der intrazellulären Tyrosinkinase-Domäne
des Rezeptors. Diese erfolgt nach der Ligandenbindung durch die Bildung von
Rezeptordimeren
und
die
125,129
(Autophosphorylierung)
gegenseitige
Phosphorylierung
der
Rezeptormoleküle
. Die Funktionseinheiten der Rezeptoren sind Homodimere mit
den Isoformen αα, ββ sowie αβ als Heterodimere-Isoform125. Die verschiedenen LigandenIsoformen weisen dabei unterschiedliche Affinität zu den Rezeptor-Isoformen auf. Während
die PDGF-Isoform BB an alle Rezeptor-Isoformen binden kann, vermögen PDGF-AA und
PDGF-C nur an den PDGFR-α bzw. PDGF-D nur an den PDGFR-β zu binden, siehe Abb.
3115,118,121,130.
latent
aktiv
latent
aktiv
PDGF-Liganden
PDGF-Rezeptoren
Abb. 3: Rezeptor spezifische Bindung von PDGF. Die fünf PDGF-Isoformen binden und aktivieren
spezifisch die homo- bzw. heterodimeren PDGFα- oder PDGFβ-Rezeptoren131.
- 15 -
Einleitung
Abb. 4: Protolytische Reifung der PDGF-C und -D Isoformen. Schematische Darstellung der
PDGF-C und PDGF-D C-terminalen Wachstumsfaktor-Domäne und der N-terminalen CUB-Domäne,
die durch extrazelluläre Proteasen abgelöst wird132.
2.6.3 Die Signalgebung des PDGF/PDGFR-Systems auf die Entwicklung von Zellen
und Gewebe
Sowohl die homo- als auch die heterodimeren Formen der PDGF-Rezeptoren und die
PDGF-Liganden sind während der embryonalen Entwicklung an der Differenzierung und
Ausbildung verschiedener Organen beteiligt und können im adulten ausdifferenzierten
Gewebe nachgewiesen werden116. Tab. 3 gibt einen Überblick über die Expressions-Analyse
der vier PDGF-Ketten im adultem humanen Gewebe und zeigt eine weite Verbreitung der
PDGF´s132. PDGF-A mRNA ist vor allem im Herz, im Pankreas und in der Skelett-Muskulatur
besonders hoch exprimiert. Die PDGF-B Isoform wird in vielen Organen exprimiert,
hauptsächlich jedoch im Herz und in der Plazenta116. Besonders gut untersucht sind die auf
zellulärer Ebene basierenden Expressionsnachweise von PDGF-A und -B116. PDGF-C
mRNA kann im humanen Geweben mannigfaltig nachgewiesen werden, so in einem hohen
Expressionsspiegel im Herz, in der Niere, im Pankreas sowie in moderatem Niveau in der
Leber, in der Testis, im Gehirn und in den Ovarien. In der Milz, im Kolon und in peripheren
Blutleukozyten
konnte
PDGF-C
nicht
detektiert
werden114,117,122.
Ebenso
ist
eine
Koexpression von PDGF-Rezeptor und dem zugehörigen PDGF-Liganden in einigen
Geweben beobachtbar. Die PDGF-Isoformen A und C, beide PDGF-α Rezeptor-Liganden
sind, wie PDGFR-α im Herz, im Gehirn, in der Niere und in der Testis exprimiert. Die
Expression der PDGF-Liganden im Mausmodell weist zum humanen System eine hohe
Ähnlichkeit auf132. Die Expression des „jüngsten“ Mitgliedes der PDGF-Familie, PDGF-D,
einem Liganden des PDGF-β Rezeptors, ist im humanen Gewebe im Vergleich zu den
anderen PDGF-Ketten weniger stark verbreitet132. Ein Nachweis ist jedoch im Herz und in
der Niere möglich118, weiterhin im Pankreas, im adipösem Gewebe, im Magen, in Ovarien
- 16 -
Einleitung
und in der Testis sowie in vaskulären Gefäßen117,123. Während der embryonalen Entwicklung
sind die PDGF-Ketten A und B sowie die PDGF-Rezeptoren an verschiedenen epithelialenmesenchymalen und vaskulären Interaktionen beteiligt116. PDGF-C hat in der embryonalen
Entwicklung großen Einfluss auf neurale und mesenchymale Gewebe114,133, z. B.
synthetisieren Kardiomyozyten während der embryonalen Entwicklung PDGF-C114. PDGF-D
kann im embryonalen Gewebe im Herz, in der Lunge, in der Niere und in einigen
Muskelderivate gefunden werden132. Dass mesenchymale Zellen in der embryonalen
Entwicklung auf das PDGF/PDGFR-System angewiesen sind, zeigen die Phänotypen von
PDGF-A, -B sowie PDGF-α und -β Rezeptor knockout Mäusen
134,135
. Eine Inaktivierung der
PDGF-B Kette bzw. des PDGFR-β führt zu schweren Störungen in der Bildung der
Blutgefäße und der Niere. Dieser Phänotyp erlaubt kein Überleben, die Mäuse sterben
zumeist im Uterus oder kurz nach der Geburt136-138. Bei PDGF-A null Mutanten sterben 50%
der Embryonen im Uterus bis zum 10. Tag der Embryogenese ab, diejenigen, die bis etwa
drei Wochen nach der Geburt überleben, weisen einen abnormalen postnatalen Phänotyp in
Lunge, Haut und Nervensystem auf123,139. Bei PDGFR-α knockout Mäusen treten
kardiovaskuläre und skelettale Defekte auf, welche ebenfalls zum Absterben der Embryonen
führen140.
Tab. 3: Expressionsanalyse der vier PDGF-Ketten im humanen Gewebe, mittels Northern Blot
Analyse 132
Organ
Herz
Gehirn
Plazenta
Lunge
Leber
SkelettMuskel
Niere
Pankreas
Milz
Thymus
Prostata
Testis
Ovarien
Dünndarm
Dickdarm
PDGF-A
+++
++
++
++
+
+++
PDGF-B
+++
+
+++
+++
+
+++
PDGF-C
++
+/+
+/+++
++
PDGF-D
++
+/+/-
++
+++
++
+
+/++
+
+++
++
++
+/++
++
+++
++
+
+++
+++
+
++
++
+++
+
-
+
+++
+/+
++
+++
+++
+
+
- 17 -
Einleitung
2.6.4 Der Einfluss von PDGF und seiner Rezeptoren im fibrotisch verlaufenden
Krankheitsgeschehen
Eine Veränderung des PDGF-vermittelten Signalweges kann zu einer Vielzahl von
Erkrankungen in unterschiedlichen Organen führen. Faktoren der PDGF-Familie nehmen
durch ihre chemotaktische Anziehung auf Myofibroblasten während der Pathogenese von
fibrotischen Erkrankungen vermutlich eine Schlüsselrolle ein89,141. Eine besondere Rolle des
PDGF/PDGFR-Systems konnte durch verschiedene Arbeitsgruppen im Prozess der
Fibroseentwicklung an Lunge und Niere dargestellt werden. Die systematische Applikation
von PDGF-B in Ratten führte zu einer strukturellen Proliferation pulmonarer Stomazellen und
zu Kollagen-Deposition in der Lunge142 sowie zu einer interstitieller Fibrose in der Niere143.
Beim Menschen wurde im Fall der durch Asbest oder Kohlestaub induzierten Lungenfibrose
eine stark erhöhte Expression von PDGF-A und -B Genen nachgewiesen142,144-146. Eine
kritische Rolle konnte für die Proliferation von Mesangium-Zellen im Fall der experimentell
induzierten Glomerulonephritis in Ratten gezeigt werden. Die Gabe von neutralisierenden
Antikörpern gegen PDGF führte in vivo zu einer deutlichen Reduktion der MesangiumZellproliferation und Matrix-Deposition147. In der interstitiell induzierten Nierenfibrose bei
Ratten konnte durch die Gabe von spezifischen PDGF-Rezeptorblockern eine Herabsetzung
der Fibrosierung nachgewiesen werden148. PDGF könnte im Kontext chronischer
Entzündungen offenbar sowohl als direkter Aktivator der Fibroblastenproliferation als auch im
Zusammenspiel mit anderen Wachstumsfaktoren und Zytokinen wirken. TGF-β z. B.
stimuliert die PDGF-Expression in Monozyten149, die Kombination von TGF-β und TNF-α
induziert synergistisch die PDGF-Expression in Astrocyten150, IL-1 steigert die Expression
von PDGF-Rezeptoren in Lungenfibroblasten151 und PDGF stimuliert synergistisch mit
Glukose die Expression von TGF-β in der Niere152. Über die kürzlich neu beschriebenen
PDGF-Isoformen C und D ist noch relativ wenig hinsichtlich ihrer Beteiligung an fibrotischen
Prozessen bekannt. Die Isoform PDGF-C jedoch scheint an der Steuerung von pulmonarer
und kardialer Fibrose beteiligt zu sein109,153. Ebenso weiß man, dass sowohl PDGF-C als
auch PDGF-D an der Entwicklung von renaler Fibrose beteiligt sind154,155.
Untersuchungen zur Rolle des PDGF-Systems für die Fibrosierung im Fall der chronischen
Myokarditis sind nach bisherigem Kenntnisstand nicht erfolgt. Jedoch könnte z. B. eine
Überexpression eines der PDGF-Liganden als mögliches potentes Mitogen wirken. So ist
bereits dargelegt worden, dass eine Überexpression von PDGF-C in transgenen Mäusen zu
einer massiven Fibrose im Myokard führt121. Parallel dazu entwickeln diese Mäuse eine
Leberfibrose sowie zelluläre Leberkarzinome110. Die Überexpression von PDGF-C resultiert
in einer geschlechtsspezifischen Ausbildung der Myokardfibrose. So entwickeln die
weiblichen Mäuse eine letale Form der dilatativen Kardiomyopathie, wohingegen die
männlichen Mäuse einen mehr progressiven hypertrophischen Phänotyp mit Myokardfibrose
- 18 -
Einleitung
ausbilden109. Diese Studien vermitteln neue Einblicke in die Rolle des PDGF-C und
bestätigen das Potential des PDGFR-α zur Auslösung kardialer Fibrose. Dies war bereits auf
Grundlage dessen vermutet worden, dass PDGF-A als besonders potentes Mitogen für
isolierte Herzfibroblasten wirkt156.
2.7
Therapeutische
Ansatzmöglichkeiten
im
Modell
chronischer
Fibrosierungsprozesse durch Einsatz spezifischer Tyrosinkinase-Inhibitoren
Möglichkeiten zur experimentellen Ausschaltung des PDGF/PDGFR-Systems bestehen auf
der Ebene der Ligandenbindung, der Rezeptordimerisierung, der Tyrosinkinase-Aktivität oder
der „stromabwärts“ gelegenen Schritte der Signaltransduktion125. Von der Arbeitsgruppe um
A. Östman ist ein Blockadensystem der Ig-ähnlichen Domäne-4 des PDGF-Rezeptors
beschrieben worden. Die isolierte, lösliche, Ig-ähnliche Domäne-4 verhindert bei Zugabe zu
Zellen mit intaktem PDGF-Rezeptor effizient deren Aktivierung, ohne dabei mit der PDGFBindung zu interferieren157. Als eine pharmakologisch aussichtsreiche Strategie zur
Interferenz der Aktivierung des PDGF/PDGFR-Systems hat sich die Blockade der
enzymatischen Aktivität der PDGF-Rezeptor-Tyrosinkinase etabliert125. Tab. 4 gibt einen
Überblick über derzeit verfügbare PDGFR-Kinase-Inhibitoren158. Diese sind kleine,
zellmembran-permeable Moleküle, die mit hoher Selektivität intrazellulär Tyrosinkinasen
blockieren können159,160. Grundlage der Hemmung ist dabei zumeist eine Interferenz mit dem
ATP-Bindungszentrum der jeweiligen Kinase161,162. Effiziente und in niedriger Konzentration
funktionsfähige Blocker für die PDGF-Rezeptor-Tyrosinkinase sind AG-1295 und AG-1296.
Diese Chinoxalin-Derivate hemmen wirkungsvoll die durch PDGF ausgelöste Proliferation
von Fibroblasten, jedoch nicht deren Stimulation durch andere Wachstumsfaktoren163. Für
die Verbindung AG1295 konnte im Tiermodell gezeigt werden, dass bei lokaler Applikation
AG1295 die Proliferation glatter Muskelzellen und die damit verbundene Bildung der
interstitiellen Neointima sowie Restenose Prozesse abschwächt164. Im Modell der
interstitiellen Nierenfibrose durch eine einseitige Ureterligatur bei der Ratte zeigt die
Applikation trotz drastischer und irreversibler Nierenschädigung eine Abschwächung der
ausgebildeten Fibrose148. Ein anderer Dual-Blocker, AGI1872/PP1, hemmt sowohl die
Tyrosinkinase-Aktivität des PDGF-Rezeptors als auch die Aktivität der wesentlich an der
Generation des mitogenen Signals des Rezeptors beteiligten Zytoplasma-Tyrosinkinase
p60c-Src165.
- 19 -
Einleitung
Tab. 4: PDGF-Rezeptor-Tyrosinkinase Inhibitoren158
PDGFR Kinase Inhibitoren
AG17 (Hydroxybenzyliden-Malononitril)
AG370 (Indol)
AG1295, AG1296 (Chinoxalin)
Pyridinyl-Chinoline
Phenylbenzimidazole
RPR101511A (Chinoxalin)
STI571/Glivec (Phenylaminopyrimidin)
CT52923 (Chinoxalin)
SU11248 (Indolinon)
AGL 2033, AGL 2043 (Chinoxaline)
Jahr und Referenz
1991166
1992167
1994163
1994168
1998169
1999170
2000171,172
2001173
2003174
2003175
2.7.1 Der Protein-Tyrosinkinase-Inhibitor STI571
Das im Jahr 2001 durch die FDA (Food and Drug Administration) der USA zugelassene
Medikament STI571-(CGP57148B) der Firma Novartis (Schweiz) gilt durch die Hemmung
der intrazellulären Signaltransduktion (STI) als neues kausales Therapieprinzip in der
Onkologie. STI571 (Glivec), ein Phenylaminopyrimidin-Derivat, liegt als Mesylat vor und wirkt
direkt inhibitorisch auf die Phosphorylierung des Signalproteins, indem es die ATPBindungsstelle der Tyrosinkinase Bcr-Abl in vitro und in vivo blockiert (Abb. 5). STI571
hemmt selektiv das Wachstum von CML-Zelllinien und Bcr-Abl-positiven Kolonien176,177.
Außerdem ist STI571 ein potenter Hemmstoff der Tyrosinkinasen Arg, PDGFR-α und -β und
c-Kit172,178,179. Ebenso vermag STI571 als effektiver Inhibitor des Makrophagen-KolonieStimulations-Faktor Rezeptors c-fms zu wirken259,260. STI571 inhibiert die Proliferation von
Leukämiezellen von Patienten mit chronisch myeloischer Leukämie (CML) oder akuter
lymphatischer Leukämie (ALL) und induziert deren Apoptose180,181. In der CML wurden mit
dem selektiv wirkenden Inhibitor STI571 rasche hämatologische und zytogenetische
Remissionen bei geringen Nebenwirkungen wie leichte Übelkeit, Ödemen, Muskelkrämpfe
oder Hautreizungen erreicht182,183. Pharmakokinetische Studien über STI571 an gesunden
Probanten und Patienten mit CML ergaben bei oraler Verabreichung des Medikamentes eine
Bioverfügbarkeit von 98% bei einer Dosis von 100 bzw. 400 mg/d184. Weitere Einsatzgebiete
sind derzeit neben der CML, Hämoblastosen185, gastrointestinale Stromatumoren (GIST)186,
Glioblastome171, Mastozystosen187 und Neoplastien, die auf einer Aktivierung der
Tyrosinkinasen c-Kit und der PDGF-Rezeptoren beruhen185. Ein weiteres mögliches
therapeutisches Einsatzgebiet von STI571 könnte die Behandlung von Pankreaskarzinomen
darstellen. Patienten mit einer Diagnose von Pankreas-Adenokarzinom haben derzeit eine
niedrige Überlebensrate. Im Mausmodell konnte durch eine Behandlung mit STI571 die
Inhibierung des Zellwachstums im Pankreas durch die Blockade der Tyrosinkinasen des
PDGF-Rezeptors und c-Kit/SCFR gezeigt werden188,189.
- 20 -
Einleitung
Veränderte zelluläre Adhäsion
Abnormale Zellproliferation
Inhibition von Apoptose
Veränderte zelluläre Adhäsion
Abnormale Zellproliferation
Inhibition von Apoptose
Abb. 5: Struktur und Wirkungsmechanismus des 2-Phenylaminopyrimidin-Derivats STI571.
STI571 verdrängt ATP von der spezifischen Bindungsstelle an der Tyrosinkinase-Domäne von Bcr-Abl
und verhindert somit die Phosphorylierung von Substraten190,191.
2.7.2 Inhibierende Wirkung von STI571 auf verschiedene fibrotische Prozesse
Basierend auf der Fähigkeit von STI571 zur Hemmung einer begrenzten Anzahl von
Tyrosinkinasen
steigt
die
Möglichkeit
für
ein
größeres
Anwendungsspektrum
in
verschiedenen humanen Krankheitsbildern stetig an. Ebenso stützen neue Serien im
Rahmen dieser Arbeit erhaltenden Daten die Hypothese, dass das PDGF/PDGFR-System
an der Ausbildung von Fibrose in verschiedenen Organen beteiligt ist und eine Interferenz
mit diesen Prozessen in vivo durch Applikation des Tyrosinkinase-Blockers STI571 möglich
ist. Erste Studien am Mausmodell zeigten unter Verwendung des PDGF-Inhibitors STI571
die Beteiligung aller PDGF-Liganden und der PDGFR-Tyrosinkinase an der Fibrosierung der
Lunge. STI571 zeigt entsprechende Wirksamkeit für die Behandlung der Lungenfibrose192.
Zusätzlich konnte in diesem Krankheitsbild dokumentiert werden, dass profibrotische
Zytokine wie TGF-β, ebenfalls an der Ausbildung von Lungenfibrose beteiligt sind. TGF-β
stimulierte die c-Abl-Kinase-Aktivität unabhängig vom Smad2/3-Weg. Die Aktivierung der cAbl-Kinase
über
TGF-β
schien
dabei
nicht
abhängig
von
der
PDGFR-Tyrosin-
Phosphorylierung oder -Expression zu sein. Eine Inhibition der c-Abl-Kinase-Aktivität durch
STI571 vermindert eine TGF-β-vermittelte morphologische Veränderung in der Lunge95. Ein
ähnliches Bild konnte in der interstitiellen Nierenfibrose im Tiermodell beobachtet werden.
Eine Behandlung mit STI571 vermochte nicht die Infiltration von Makrophagen in der Niere
- 21 -
Einleitung
zu verhindern, allerdings inhibiert STI571 den Anstieg von interstitiellen Fibroblasten und
Myofibroblasten und die damit vermehrte Expression und Akkumulation vom Kollagen Typ III
und IV sowie Fibronektin96.
2.8
Zielstellung der Arbeit
Eine Infektion mit den humanpathogenen Coxsackievirus B3 gilt als der häufigste Auslöser
einer viralen Herzmuskelentzündung, die in ihrer chronischen Phase zu einer dilatativen
Kardiomyopathie mit progendienter Herzinsuffizienz führen kann. Pathogenetisch ist für die
Dysfunktion des Herzens eine Myozytennekrose und die Fibrosierung des Myokards
verantwortlich. Der Mechanismus, welcher der Fibrosierung des Myokards im chronischen
Stadium der Erkrankung zugrunde liegt und die Faktoren, die bei einem Patienten nach einer
CVB3-Infektion zum Entstehen einer DCM führen, sind bislang unzureichend geklärt.
In Analogie zu fibrotischen Prozessen in anderen Geweben kann angenommen werden,
dass die Bindegewebsvermehrung durch lokal erhöhte Spiegel von Zytokinen und
Wachstumsfaktoren ausgelöst wird. Faktoren der PDGF-Familie kommen als Mediatoren
dieses Prozesses in Betracht, da sie sehr potente Mitogene für Fibroblasten darstellen, die
im Rahmen einer Entzündung in das Gewebe einwandern.
Aufgrund der beschriebenen pathologischen Eigenschaften von PDGF-Isoformen und ihrer
Rezeptoren im entzündeten Geweben bestand die Zielstellung dieser Arbeit darin, die Rolle
des PDGF/PDGFR-Systems, insbesondre PDGF-C, für die der Fibrosierung zugrunde
liegenden Prozessen in einem etablierten Mausmodell der CVB3-induzierten Myokarditis an
MHC Klasse II knockout Mäusen zu klären. Die Expression der PDGF- und PDGF-RezeptorIsoformen sollte analysiert und der Aktivitätszustand der PDGF-Rezeptoren „In Situ“ erfasst
werden. Die erhaltenen Daten wurden mit denen von immunkompetenten C57BL/6
Wildtypmäusen, die einen identischen genetischen Hintergrund aufweisen (2Hb), verglichen.
Die vorgesehenen histologischen, serologischen und molekularbiologischen Analysen sollten
eine Charakterisierung der CVB3-induzierten, progressiv verlaufenden Myokardfibrose
gestatten.
Die Prüfung der Hypothese, dass die Expression von Faktoren der PDGF-Familie und die
Aktivierung des PDGFR-Systems kausal zur Fibrosierung der chronisch entzündeten Herzen
von MHC Klasse II knockout Mäusen beiträgt, sollte durch Behandlungen von CVB3indizierten Tieren mit dem Inhibitor der PDGF-Rezeptorsignaltransduktion STI571/Glivec,
(Imatinib) erfolgen. Diese Untersuchungen sollten zugleich der Prüfung einer auf die
Blockade der Signaltransduktion des PDGF-Rezeptors gerichteten Behandlung als ein
mögliches neues therapeutisches Konzept für die chronische Myokarditis dienen.
- 22 -
3. Material
Material
3.1
Coxsackievirus B3 (Nancy)
Für die Untersuchungen am Tiermodell wird die Virusvariante CVB3-München/Jena (Stamm
Nancy) verwendet, die freundlicherweise von Prof. R. Kandolf (Institut für Pathologie der
Universität Tübingen) zur Verfügung gestellt wurde55. Das Virus wird in mykoplasmenfreien
HeLa-Zellen zur Weitervermehrung passagiert und steht als Virusstock in 50 µl Portionen bei
-70°C im Labor zur Verfügung. Der verwendete Virusstock enthält 8x 107 pfu/ml.
3.2
Versuchstiere
Zur Untersuchung des PDGF/PDGFR-Systems in der CVB3-induzierten Myokarditis im
Mausmodell werden zwei Mäusestämme eingesetzt, die einen genetisch identischen
Hintergrund (H-2b) besitzen. Im Tierversuch werden männliche, 8-12 Wochen alte Tiere
verwendet. Die Tiere wurden bis zum Versuchsbeginn räumlich von infizierten Mäusen
getrennt und erhalten Futter und Wasser ad libitum.
Die Versuche wurden bis 2002 im Infektionstierhaus des Institutes für Virologie unter
konventionellen Haltungsbedingungen durchgeführt. Ab 2003 erfolgte die Haltung aller Tiere
unter spezifisch-pathogenfreien Bedingungen (SPF) im Laborhaus des Institutes für Virologie
und Antivirale Therapie des Universitätsklinikums.
Die dargestellten Ergebnisse der mRNA-Expression von Zytokinen und PDGF-Faktoren
mittels semiquantitativer RT-PCR erfolgte an Myokardmaterial von C57BL/6 und MHC
Klasse II knockout Mäusen, die aus der konventionellen, offenen Versuchstierhaltung
stammten. Nach Einführung der SPF-Haltung wurde dieser Punkt erneut untersucht. Die
erhaltenen Daten zeigten keine Änderungen und bestätigten die Ergebnisse der offenen
Tierhaltung.
3.2.1 Immunkompetente C57BL/6 Maus
Alle
verwendeten
Versuchstiere
wurden
am
Institut
für
Versuchstierkunde
des
Universitätsklinikums der Friedrich-Schiller Universität Jena unter SPF-Haltung gezüchtet.
3.2.2 Immundefekte MHC Klasse II (B6-Aa0/Aa0) knockout Maus
Die MHC Klasse II (B6-Aa0/Aa0) knockout Maus wurde freundlicherweise von H. Blüthmann
(Hoffmann La Roche, Basel) zur Verfügung gestellt83. Die Nachzucht erfolgte bis 2002 im
Infektionstierhaus des Institutes für Virologie, räumlich getrennt von infizierten Mäusen. Seit
2003 findet die Zucht und Haltung der Mäuse unter SPF-Bedingungen im Laborhaus des
Institutes für Virologie und Antivirale Therapie in eizelbelüfteten-Käfigen (IVC) statt. Die
- 23 -
Material
Haltung der Mäuse erfolgt wie oben beschrieben und die Handhabung entspricht denen der
C57BL/6 Mäuse.
3.3
Oligonukleotid-Primer
Die angegebenen Primer sind, sofern nicht anders vermerkt, käuflich erworben oder im
Institut für Virologie und Antivirale Therapie Jena von Dr. E. Birsch-Hirschfeld synthetisiert
und in 5` zu 3` Richtung angegeben (S`: sense; AS`: antisense). Laut Hersteller amplifizieren
die Primerpaare für IL-2, IL-1α, IL-6 keine genomische DNA oder das Amplifikationsprodukt
besitzt nicht die angegebene Basenpaargröße (IFN-γ, IL-10, TNF-α, IFN-β). Für die PCR mit
Primeramplifikation der PDGF-Familie ist eine PCR mit genomischer DNA durchgeführt
worden. Die erhaltenen Produkte weisen nicht die angegebene Größe auf, damit kann eine
Vervielfältigung von genomischer DNA ausgeschlossen werden (Tab. 7 im Anhang).
3.4
Plasmid
Das pBluescript II KS(+) Plasmid, 2961 bp, (Abb. 21 im Anhang) der Firma Stratagene
(STRATAGENE, Ja Jolla, USA) ist für die Konstruktion des Kontrollfragmentes der
semiquantitativen PCR sowie für die Herstellung der spezifischen RNA-Sonden für die In
Situ-Hybridisierung verwendet wurden.
Die MSC (multiple cloning site), 657-759 bp, wird durch die T7 (5´-GTA ATAVCGA CTC ACT
ATA GGG C-3´) und T3 (5´-GTA ATAVCGA CTC ACT ATA GGG C-3´) RNA-PolymerasePromotoren flankiert, was eine in vitro RNA-Synthese gestattet. Des Weiteren besitzt das
Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-Gen (1975-2832 bp), ein lacZ-Gen, das durch eine αKomplementation eine Blau/Weiß-Farbselektion der Plasmide ermöglicht. Die Induktion des
lac-Promotors (816-938 bp) ermöglicht eine Protein-Fusions-Expression mit dem βGalactosidase Gen. Das in Abwesenheit von Helferphagen benutzte Co/E1 (1032-1972 bp)
stellt das origion of replication dar.
- 24 -
Material
3.5
Chemikalien
Name
Hersteller
10% AP (Ammoniumpersulfat)
SIGMA, Deisenhofen
100 bp Ladder
MBI FERMENTAS, GmbH St. Leon-Rot
10x cloned Pfu DNA-Polymerase-Puffer
ROCHE, Mannheim
10x PCR-Synthesepuffer
HYBRID AGS, Heidelberg
20x SSC
SERVA, Heidelberg
2-Mercaptoaethanol (Thioaethylenglykol)
FERAK, Berlin
5x First Strand Puffer
LIFE TECHNOLOGIES, Praisley, Schottland
6x Loading Dye Solution (Ladepuffer)
MBI FERMENTAS, GmbH St. Leon-Rot
Aceton
J.T. BAKER, Deventer, Holland
Acetonitril
CARL Roth, Karlsruhe
Acrylamide/Bisacrylamide (AB)
CARL ROTH, Karlsruhe
Agarose
LIFE TECHNOLOGIES, Praisley, Schottland
Aquatex
MERCK, Darmstadt
Äther (zur Narkose)
MALLINCKRODT BARKER, Gieselheim
ATP (Adenosintriphosphat)
SIGMA, Deisenhofen
Avidin
FLUKA AG, Neu-Ulm
Bench Mark
GIBCO BRL
Blockierungsreagenz
MERCK, Darmstadt
Borsäure
SERVA, Heidelberg
Bromphenolblau
SIGMA, Deisenhofen
BSA (Rinder (bovine) Serumalbumin)
SIGMA, Deisenhofen
Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24:1)
SIGMA, Deisenhofen
Cryomatrix (Einbettmedium für Gefrierschnitte)
SHANDON, Frankfurt am Main
Dextransulfat
SERVA, Heidelberg
DEPC (Diethylpyrocarbonat)
FLUKA/ Chemika, Buchs
DIG-RNA-Labelling-Mix
ROCHE, Mannheim
DMEM
SIGMA, Deisenhofen
dNTPs (Desoxyribonukleosidtriphosphate)
PROMEGA, Madison, USA
dNTPs (10xDIG-RNA-Labeling-Mix)
ROCHE, Mannheim
DTT (1,4-Dithroreitol)
LIFE TECHNOLOGIES, Praisley, Schottland
ECL-Western Lightning
NEN LIFE SCIENCE, Bosten, USA
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)
SERVA, Heidelberg
EGTA
SIGMA, Deisenhofen
Eosin
MERCK, Darmstadt
- 25 -
Material
Ethanol
MERCK, Darmstadt
Ethanol (vergällt)
EURO-ALKOHOL, Nordhausen
Ethidiumbromid
SERVA, Heidelberg
FCS (fetal calf serum, fötales Kälberserum)
PAA, Linz, Österreich
Formaldehyd
ROTH, Karlsruhe
Formalin
SIGMA, Deisenhofen
Formamid
SERVA, Heidelberg
Glas-Mikrofilter-Papier (Porengröße: 22µm)
WHATMAN, Maidstone, England
Glycin
SIGMA, Deisenhofen
Glyzerin
SIGMA, Deisenhofen
Guanidinisothiocyanat
SIGMA, Deisenhofen
H2O2 (Wasserstoffperoxid)
MERCK, Darmstadt
Hämatoxylin
FLUKA AG, Neu-Ulm
HCl (Salzsäure)
SERVA, Heidelberg
HEPES
(N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-
SERVE, Heidelberg
Ethansulfonsäure)
Heringssperma-DNA
INVITROGEN, Karlsruhe
Hypermount (Eindeckelmedium)
SHANDON, Frankfurt am Main
Ionenaustauscher
GRÜNBECK GENO-Sep, Wien, Österreich
Isopropanol absolut (2 Propanol)
CARL ROTH GmbH + Co, Karlsruhe
KCl (Kaliumchlorid)
LABORCHEMIE, Apolda
KH2PO4 (Kaliumhydrogenphosphat)
MERCK, Darmstadt
LB-Medium
MERCK, Darmstadt
Ligationspuffer
SIGMA, Deisenhofen
Lithiumchlorid
CARL ROTH, Karlsruhe
Magermilchpulver
NESTLE, Frankfurt a. M.
Maleinsäure
SERVA, Heidelberg
Mausserum
DIANOVA, Hamburg
MEM/E
SIGMA, Deisenhofen
Methylbenzoat
MERCK, Darmstadt
MgCl2 (Magnesiumchlorid)
HYBRID AGS, Heidelberg
MnCl2 (Manganchlorid)
CARL ROTH, Karlsruhe
Na2HPO4 * 12H2O (Natriumhydrogenphosphat)
SIGMA, Deisenhofen
Na-Acetat
MERCK, Darmstadt
NaCl (Natriumchlorid)
SERVA, Heidelberg
NaHPO4 (Natriumphosphat)
LABORCHEMIE, Apolda
Na-N-Laurylsarcosine
SIGMA, Deisenhofen
- 26 -
Material
NaOH (Natriumhydroxid)
SIGMA, Deisenhofen
Natriumcitrat-Dihydrat
MERCK, Darmstadt
Natriumdesoxycholsäure
FLUKA AG, Neu-Ulm
Natriumphyrophosphat
FLUKA AG, Neu-Ulm
NBT/BCIP-Stock Lösung
ROCHE, Mannheim
NKS (newborn calf serum)
PAA, Linz, Österreich
Nylon-Membran
MILLIPORE, Bedford
Oligo-d(T)
INSTITUT FÜR VIROLOGIE, Jena
Paraffin
SHANDON, Frankfurt am Main
PCR-DIG-Probe-Synthesis-Kit
ROCHE, Mannheim
Penicillin
SIGMA, Deisenhofen
Peroxidase Substrat Kit (AEC) (Chromogenes LINARIS; Wertheim-Bettingen
Substrat)
Phenol
SIGMA, Deisenhofen
Platelet-derived growth factor (PDGF)
TEBU, Frankfurt a. M.
Polyvinylpyrroliden
SERVA, Heidelberg
Prestaind Protein Marker
BIO LABS, New England
Protease VIII
SIGMA, Deisenhofen
Protein-A-Sepharose
PVDF-Membran
AMERSHAM
BIOSCIENCES,
Schweden
MILLIPORE, Bedford
RNase-Inhibitor; 40 U/µl
ROCHE, Mannheim
SDS (Dodecylsulfat; Na-Salz)
SERVA, Heidelberg
Siriusrot
SPK (Streptavidin-Peroxidase-Komplex)
ALDRICH
CHEMICAL
Milwaukee, USA
DIANOVA, Hamburg
Streptomycin
SIGMA, Deisenhofen
TEMEM (N`,N`,N`,N´-Tetramethylethylenediamine)
SERVE, Heidelberg
Transkriptionspuffer für in vitro Transkription
ROCHE, Mannheim
TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan)
SERVA, Heidelberg
TritonX X100
FERAK, Berlin
TWEEN 20
SERVA, Heidelberg
Weizenkeim-Lecitin-Agarose
AMERSHAM PHARMACIA,
Uppsala
COMPANY,
- 27 -
Material
3.6
Enzyme
Name
SuperscriptTM II-RT
Hersteller
Enzymtyp
LIFE
Reverse Transkriptase
TECHNOLOGIES, Praisley, (RNA-abhängige-DNASchottland
Polymerase)
TAQ-DNAPOLYMERASE
ANGEWANDTE
GENTECHNOLOGY
SYSTEM GmbH, Heidelberg
PfuTurbo-Hotstart DNA- STRATAGENE,
Polymerase
La Jolla, CA, USA
T3-RNA-Polymerase
ROCHE, Mannheim
T7-RNA-Polymerase
ROCHE, Mannheim
BssH II
SIGMA, Deisenhofen
BamH I
SIGMA; Deisenhofen
EcoR V
MERCK, Darmstadt
T4-Ligase
ROCHE, Mannheim
3.7
Aktivität
200 U/µl
DNA-abhänige-DNAPolymerase
5,0 U/µl
DNA-abhänige-DNAPolymerase
DNA-abhängige-RNAPolymerase
DNA-abhängige-RNAPolymerase
RestriktionsEndonuklease
RestriktionsEndonuklease
RestriktionsEndonuklease
DNA-Ligase
2,5 U/µl
20 U/µl
20 U/µl
0,3 U/µg
0,5 U/µg
0,2 U/µg
200 U/µl
Antikörper
Primärantikörper
AK-Klon
I-20
H-55
SP1
951
958
Ser473
4GL 10
H-10
Sc-2027
Isotyp / Antigen-Spezifität
Ziege anti-PDGF-A (polyclonal)
Kaninchen anti-PDGF-B (polyclonal)
Kaninchen anti-PDGF-C (polyclonal)
Kaninchen anti-PDGFR-α
Kaninchen anti-PDGFR-β
Kaninchen anti-Phospho-Akt (polyclonal)
Maus anti-Phosphotyrosin
Maus anti-Vinculin
Normales Kaninchen IgG (Isotypkontrolle)
Firma / Referenz
SANTA CRUZ, USA
SANTA CRUZ, USA
193
SANTA CRUZ, USA
SANTA CRUZ, USA
CELL SIGNALING, USA
UPSTATE, USA
SANTA Cruz, USA
SANTA CRUZ, USA
Sekundärantikörper
Sekundärantikörper
BIOTIN-konjugiert-polyclonal
Isotyp / Antigen-Spezifität
Ziege anti-Kaninchen IgG
Firma / Referenz
BD PHARMINGEN,
Heidelberg
IgG DIANOVA, Hamburg
BIOTIN-SP-konjugiertaffinitätsgereingt-F(ab`)2-Fragment
Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragment
HRP-konjugiert-affinitätsgereinigt
Kaninchen anti-Ziege
(H+L)
DIG anti-Schaf IgG
Ziege anti-Maus IgG
ROCHE, Mannheim
SANTA CRUZ, USA
- 28 -
Material
3.8
Inhibitoren
Inhibitoren
Aprotinin
Leupeptin
PMSF (Phenylmethylsulfonylflurid)
Natriumorthovanadat
3.9
Bezugsquelle
BAYER (Trasylol®), Leverkusen
SIGMA, Deisenhofen
APPLICHEN, Darmstadt
SIGMA, Deisenhofen
Geräte
Geräte
Absauggerät Vakuboy Bottle Set
Bildverarbeitungsprogramm, Axio-Vision
Version 3.1.
Brutschrank (mit 5% CO2-Begasung)
diverse Eppendorfpipetten
elektronische Präzisionswaage
Elektrophoresekammer HYBAID AGB
Extinktionsmeßgerät (DYNATECH MR 5000)
Fotokamera CONTAX 167 MT
Gewebeeinbettautomat Citadel 1000
Herolab E.A.S.Y.
Kryotom AS 620 E
Mikroskop Axioskop 2
Paraffinausgießsystem Histocenter 2
PCR-Cycler
Schlittenmikrotom Jung SM 2000R
Schüttler GFL 3006
SDS-Gelelektrophotese-Kammer
Semi-Dry-Transfer-Kammer
Taumler REAX 3
Transferpipette
Ultra-Turrax T 25
UV-Visible Recording Spektrophotometer
Vakuumpumpe / Vakuumexikator
Vortexgerät GENIE
Werkbank (Laminarbox)
Hersteller
INTEGRA, BIOSCIENCES, Fernwald
CARL-ZEISS-VISION GmbH, Jena
HERAEUS, Hanau
EPPENDORF, Köln
SARTORIUS, Göttingen
THERMO ELECTRON GmbH, Karlsruhe
DIAS, Guernsey, Island
YASHICA, Hamburg
SHANDON, Frankfurt am Main
MOLEKULARE
TRENNTECHNIKSYSTEME,
Wiesbaden
SHANDON, Frankfurt a. Main
CARL-ZEISS, Jena
SHANDON, Frankfurt am Main
BIOZYM, Oldendorf
LEICA, Bensheim
GFL, Burgwedel
BIO RAD, München
BIO RAD, München
HEIDOLPH, Kehlheim
BRAND, Wertheim
JANKE + KUNKEL, IKA Labortechnik
SHIMADZU, Kyoto, Japan
INOTECH, Dottikon, Schweiz
SCIENTIFIC INDUSTRIES Inc., Springfield,
Massachusetts, USA
KENDRO/HERAEUS, Hanau
- 29 -
Material
3.10
Puffer und Stammlösungen
Lösungen
Zellen für Testassays
Zusammensetzung
HeLa-Zellen (humane Cervixcarcinom-Zellen);
CCL-2, ATCC, Rockville, USA
SWISS 3T3 Fibroblasten (humane Fibroblasten);
ATCC, Manassas, USA
M15[pREP4] (kompetenter Escherichia coli- Stamm)
Allgemeine Reagenzien
PBS
0,11 M NaCl; 2,7 mM KCl; 6,5 mM
Na2HPO4*12H2O; 1,5 mM KH2PO4; pH 7,2
Reagenzien für die RNA-Isolierung
Alle Lösungen sind unter der Laminarbox
hergestellt und abgefüllt.
Inkubationslösung (Lösung I)
4,0 M Guanidinisothiocyanat in 50 ml Aqua
dest. lösen; 17 mM Na-N-Laurylsarcosin;
50 mM Na-Citrat; pH 7,0 (mit 1 M NaOH);
filtrieren mit sterilen Glas-Mikro-Filterpapier
(Porengröße: 22µm); vor Versuchsbeginn
14 ml Lösung mit 114 µl 2-Mercaptoethanol
versetzten
Chloroform-Phenol-Lösung: 10 ml Phenol; 1
ml Na-Acetat; 2 ml Chloroform
Isopropanol absolut
1000
ml
Aqua
dest.;
1
ml
Diethylpyrocarbonat ; 24 h rühren; 2x
autoklavieren
Lösung II
Lösung III
DEPC-H2O
Reagenzien für Reverse Transkription
2,5 µl Oligo-d(T); 10 µl 5x First-Strand
Puffer; 2,5 µl 0,1mM DTT; 2,5 µl 10mM
dNTP; 2,5 µl SuperscriptTM II RT
Reagenzien für RT-PCR-Reaktion
Reagenzien für Gelelektrophorese
siehe Tab. 8 (im Anhang)
5x TBE-Puffer
0,45 M Tris; 0,45 M Borsäure; 12,5 mM
EDTA; 1000 ml Aqua dest. auffüllen; pH 8,0
Stammlösung:
5 mg/ml
Gebrauchslösung:
1 µg/ml
pro 1,5% Agarosegel: 12 µl Ethidiumbromid
(120ml 1x TBE-Puffer + 1,8 g Agarose)
Ethidiumbromid
Reagenzien für die Herstellung der VP1-DNA Die Herstellung der VP1-DNA Sonde erfolgt
Sonde
unter Verwendung der Lösungen und
Reagenzien des PCR-Sonden-Synthese-Kit
der Firma ROCHE.
Reagenzien für die Herstellung der PDGF-CRNA Sonde
Herstellung des blund-end-PCR-Fragmentes
4,0 ml Aqua dest.; 5,0 µl 10x Pfu DNAPolymerase-Puffer; 1,0 µl dNTP ; 1,0 µl
- 30 -
Material
PDGF-C AS`/S`-Primer; 1,0 µl verdünnte
(1:10) PDGF-C cDNA; 0,75 µl Pfu-DNAPolymerase (2,5 U/µl)
1 µl DNA (3 µg/mg PBS); 3 µl 10 µl Puffer;
0,3 µl 100xBSA; 1 µl Enzym Eco RV; 25 µl
Aqua dest.
1 µl 10x Ligationspuffer; 0,25 µl 10 mM ATP;
1 µl 50% PEG 6000; 1 µl pBS Vektor; 2 µl
PCR-Fragment (625 bp); 1,0 µl T4-Ligase;
3,5 µl Aqua dest.
80 µl kompetente Zellen (M15[pREP4]); 20
µl 5x KMC ; 5 µl Ligationsansatz
4 µl DNA; 2 µl 10x Puffer; 1 µl BAM HI; 13 µl
Aqua dest.
2 µl DNA; 2 µl 10x Puffer; 1,5 µl BssH II; 15
µl Aqua dest.
13 µl cDNA; 2 µl 10xTranskriptionspuffer; 2
µl dNTPs; Rnase-Inhibitor (40 U/ml); 2 µl
T3- bzw. T7-Polymerase (20 U/µl)
pBluescript-Vektor
Ligationsansatz
Transformation
Restriktionsverdau
partieller BssH II-Verdau
In vitro Transkription
Puffer und Reagenzien
Hybridisierung
der
In
Puffer 1
Blockierungspuffer-Stammlösung
Puffer 2
Puffer 3
Hybridisierungspuffer
2-fach SET-Puffer
Formamidersatzpuffer
20x SSC
Protease VIII
Situ100 mM Maleinsäure; 150 mM NaCl in 800
ml Aqua dest. lösen; pH 7,5 (konz. NaOH);
mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen
10 g Blockierungsreagenz in 100 ml Puffer 1
lösen, Lagerung bei –20°C
Blockierungspuffer-Stammlösung 1:10 in
Puffer 1 verdünnen
100 mM Tris; 100 mM NaCl; in Aqua dest.
lösen; 9,5 (1 M HCL); 50 mM MgCl2; auf
1000 ml Aqua dest. auffüllen
1 g Dextransulfat in 5 ml 2x SET-Puffer
lösen; 5 ml deioisiertes Formamid (2,5 g
Ionenaustauscher + 25 ml Formamid); 200
µl Polyvinylpyrrolidon (50 mg/ml); 50 µl 20%
SDS; durch 45 µm Filter filtrieren; 500 µl
Heringssperma-DNA (10 mg/ml)
50 mM Tris; 300 mM NaCl; 2 mM EDTA in
1000 ml Aqua dest. lösen; pH 7,4 (HCL)
80 ml 5x SSC; 80 µl 10% N-Laurylsacrosin;
16 µl 10% SDS
3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat in 250 ml
Aqua dest. lösen; pH 7,0; auf 1000 ml Aqua
dest. auffüllen
Verdünnung; 500 µg/ml; 1 mg Protease VIII
in 2 ml PBS (komplett)
Waschlösungen der PDGF-C Sonde
Formamidwaschpuffer
Waschpuffer
Detektionspuffer
60% Formamid in 0,2x SSC
100 mM Tris; 150 mM NaCl; pH 7,5; auf
1000ml mit Aqua dest. auffüllen
100 mM Tris; 50 mM MgCl2; pH 9,5; auf
1000 ml mit Aqua dest. auffüllen
Puffer für PDGF/PDGFR
- 31 -
Material
Aktivitätsnachweis im Myokardgewebe
Tris-HCL Lysispuffer
Triton-Lysispuffer
5x TBS / TWEEN 20 Waschpuffer
HNTG-Puffer
0,5 M Tris, pH 7,5; 0,1 M NaCl; 0,1 mM
EDTA; 200 KIE/ml Aprotinin; 4 mM PMSF
50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 1,5
mM MgCl2; 1 mM EDTA; 1% TritonX 100;
1% Natriumdeoxycholsäure; 0,1% SDS;
10% Glyzerin; 10 mM Natriumpyrophosphat;
1 mM DTT; auf 500 ml Aqua dest. auffüllen,
aliquotieren und bei –20°C lagern; vor der
Benutzung die Inhibitoren frisch dazugeben:
1 µg/ml Leupeptin; 1 mM PMSF; 200 KIE/ml
Aprotinin; 1 mM Natriumorthovanadat (vor
Benutzung 5 min bei 95°C denaturieren)
10 mM Tris; pH Wert 7,4; TWEEN 20
20 mM HEPES; 150 mM NaCl2; 0,1%
TritonX 100; 10% Glyzerin
Puffer und Reagenzien für den SDS-PAGE
Sammelgelpuffer für SDS-Gel
Trenngelpuffer für SDS-Gel
0,5 M Tris; pH 6,8; auf 500 ml mit Aqua
dest. auffüllen
2,0 M Tris; pH 8,8; auf 500 ml mit Aqua
dest. auffüllen
Laufpuffer für SDS-Gelektrophorese (10fach 384 mM Glycin; 50 mM Tris, pH 8,7; 0,1%
konzentriert)
SDS; auf 1000 ml Aqua dest. auffüllen
6x Probenpuffer (6xA)
30% β-Mercaptoethanol; 40% Glyzerin; 7%
SDS (20%iges), Bromphenolblau
Ammoniumpersulfat (10%ig)
1 g Ammoniumpersulfat in 10 ml Aqua dest.
lösen, aliquotieren, bei -20°C lagern
Transferpuffer für semi-dry Blot
39 mM Glycin; 48 mM Tris; pH 9,0; 20%
Methanol; 0,037% SDS; auf 1000 ml mit
Aqua dest. auffüllen
- 32 -
4. Methoden
Methoden
4.1
Infektion der Versuchstiere
Adulte 8-12 Wochen alte, männliche C57BL/6 und MHC Klasse II knockout Mäuse werden
durch eine Injektion von 1x 104 pfu CVB3-Mü/J (Stamm Nancy) in 0,5 ml serumfreien MEM/E
im Bereich des Unterbauches mit dem Virus infiziert. Je nach Fragestellung und
Untersuchungsmethode werden an den Tagen 7, 21 und 56 nach CVB3-Infektion, Tiere von
beiden Stämmen unter Äthernarkose abgetötet. Diese Tage repräsentieren verschiedene
Zeitpunkte der Infektion; akute Phase der Infektion: 7. Tag p. i. sowie zwei späte Zeitpunkte:
21. Tag p. i., der bereits in die chronische Phase der Infektion reicht und Tag 56 p. i., der
einen Progress des chronischen Krankheitsbildes geben soll. Eine Kontrollgruppe von je 3
Tieren jedes Mausstammes erhält je nach Versuchsplanung keine Infektion bzw. anstelle
des Virus eine Infektion mit MEM/E (Scheininfektion). Diese Tiere werden getrennt von den
infizierten Mäusen gehalten und parallel zu diesen abgetötet. In die Untersuchungen der
CVB3-induzierten Myokarditis sind alle Tiere beider Mäusestämme eingegangen, die einen
positiven Nachweis einer stattgefundenen Virusinfektion aufwiesen259.
4.2
Sektion und Organentnahme
Die Tiere werden mit Äther betäubt und abgetötet. Nach Eröffnen des Bauchraumes und
Durchtrennung der Aorta erfolgt die Blutentnahme. Die Organe Herz, Pankreas, Milz, Leber
und Lunge werden entnommen und im Ganzen gewogen. Je nach Fragestellung werden
diese geteilt und für die entsprechenden Untersuchungsmethoden vorbereitet. Die
Organhälften (Herz und Pankreas) für die histologische Bewertung werden in 4%-igem
Formalin fixiert. Die Organe (Herz, Pankreas) für die TCID50-Bestimmung werden gewogen
und für 2 h in 0,9%-iger Natriumchloridlösung mit Penicillin und Streptomycin eingelegt,
anschließend wird die Lösung abgesaugt und die Organteile bei -20°C tiefgefroren. Die
Organteile (Herz), die für biochemische Untersuchungen vorgesehen sind, werden in PBS
gewaschen, gewogen und in sterilen Gefrierröhrchen mit flüssigem Stickstoff schockgefroren
und bis zur Aufarbeitung bei -80°C gelagert. Die Myokardteile zur immunhistochemischen
Untersuchung werden mit Cryomatrix (Einbettmedium für Gefrierschnitte) benetzt und dann
in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Myokardhälften, die für die RNA-Isolierung
vorgesehen sind, werden ebenfalls in sterilen Gefrierröhrchen mit flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt.
- 33 -
Methoden
4.3
Histologie
Die in Formalin fixierten Organe (Herz, Pankreas) werden mit dem Gewebeeinbettautomat in
einer
ansteigenden
Alkoholreihe
entwässert
und
in
Paraffin
eingebettet.
Am
Schlittenmikrotom wird das eingebettete Organ in 6 µm dünne Scheiben geschnitten. Die
Schnitte gleiten in ein Wasserbad, woraus sie sich faltenlos auf die Objektträger auftragen
lassen. Die Präparate werden bei 37°C über Nacht getrocknet und durch eine absteigende
Alkoholreihe entparaffiniert, mit Hämatoxylin/Eosin oder Siriusrot194 gefärbt. Die Auswertung
der mit Hypermount eingedeckelten Präparate erfolgt lichtmikroskopisch am Axioskop 2 der
Firma Carl Zeiss Jena, anhand von im Labor festgelegten Kriterien (Tab. 10 im Anhang). Die
Bilder
wurden
mit
der
Kamera
CONTAX
167
MT
aufgenommen.
Das
Bildverarbeitungsprogramm, Axio-Vision Version 3.1. von Carl Zeiss Jena, ermöglicht eine
computergestützte Bilddokumentation und ist für die Anfertigung des Bildmaterials in der
vorliegenden Arbeit verwendet worden.
Um qualitative Unterschiede differenzierter erfassen zu können, wird die Siriusrot-Färbung
mit einem Bildanalysesystem der Firma Leica ausgewertet. Dazu wird das histologische
Präparat mit einer Bildanalysekamera in den Farben Rot (Bindegewebe), Grün (Hohlräume,
Einbettmaterial) und Blau (Muskelzellen) aufgenommen und mit der Software QWin
Standard der Firma Leica analysiert. Der ermittelte Wert wird in Prozent (%) angegeben.
4.4
TCID50-Test (Tissue culture infection dose)
Die zu untersuchenden Organe (Herz) werden steril mit Seesand in Mörsern mit
Zerreibungsmedium (MEM/E + 100 I.E. Penicillin und 0,1% mg/ml Streptomycin + 2% NKS)
zerrieben, so dass eine 2%-ige (w/v) Lösung entsteht. Bezugswert dieser Lösung ist das
Gewicht der einzelnen Organteile. Die hergestellte Suspension verbleibt 2 h bei
Raumtemperatur und wird anschließend tiefgefroren (-20°C). Um möglichst alle Zellen aus
dem Gewebe der Organe zu zerstören, werden die Proben insgesamt 3x aufgetaut und
wieder eingefroren. Für die Durchführung des Testes werden auf eine 96-LochMikrotiterplatte HeLa-Zellen (100 µl pro Loch, ca. 1,7x 105 Zellen pro ml) ausgesät und für 2
h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. In vier Parallelen wird pro Loch 50 µl einer Verdünnung
der Organsuspension auf die HeLa-Zellen gegeben. Die Organsuspension wird in
Verdünnungsschritten von 10-1 bis 10-7 (in Abhängigkeit vom Tag der Infektion und dem zu
untersuchenden Organ) im Medium verdünnt. Pro Mikrotiterplatte wird eine Zellkontrolle in 4
Parallelen mitgeführt, wobei anstelle der Organsuspension Medium auf die HeLa-Zellen
aufgetragen wird. Die Inkubation der Platten erfolgt in einer feuchten Kammer bei 37°C und
5% CO2 für 5 Tage. Jedes einzelne Loch der Mikrotiterplatte wird am 5. Tag der Inkubation
lichtmikroskopisch auf das Vorhandensein zytopathischer Effekte ausgewertet. Die
- 34 -
Methoden
Berechnung des Virustiters erfolgt nach der Methode von Reed und Muench195 und wird als
lg TCID50/100 mg Gewebe angegeben. Die Nachweisgrenze des Testes liegt bei 2,33.
4.5
RNA-Präparation
Die Extraktion zellulärer RNA erfolgt mit Lösungen, deren Zusammensetzungen dem
Arbeitsprotokoll „Isolation Roti®-Quick-Kit“ der Firma Roth, Karlsruhe, zur Isolierung von
RNA aus Zellen und Gewebe entspricht. Alle verwendeten Lösungen werden mit DEPCWasser angesetzt, die verwendeten Pipetten sind RNAse frei und alle Inkubations- und
Arbeitsschritte werden bei 4°C auf Eis durchgeführt. Die bis zur Aufarbeitung bei -80°C
gelagerten Myokardproben werden mit 1 ml Inkubationslösung (Lösung I) versetzt und im
Ultra-Turrax auf Eis homogenisiert. Die genomische DNA wird im Anschluss mit Hilfe einer 1
ml Spritze mit einer Kanüle geschert. Nach Zugabe von 1,3 ml Lösung eines ChloroformPhenol-Gemisches (Lösung II) wird die Suspension 30 min auf Eis inkubiert. Während dieser
Zeit bilden sich zwei Phasen, die durch 25 minütiges Zentrifugieren bei 4°C und 10000 U/min
noch exakter getrennt werden. Die obere/wässrige Phase, welche die RNA enthält, wird
abgenommen und ein gleiches Volumen Isopropanolabsolut (Lösung III) hinzu gegeben. Zur
Ausfällung der RNA aus der Lösung wird der Ansatz 2-4 h bei -20°C inkubiert. Der
Überstand wird nach erneutem Zentrifugieren für 35 min bei 1400 U/min und 4°C
abgenommen. Das RNA-Pellet wird in 600 µl Lösung I gelöst und nochmals mit 600 µl
Lösung III versehen. Zur kompletten Ausfällung der RNA erfolgt eine Inkubation über Nacht
bei -20°C. Die RNA wird am Folgetag bei 4°C und 13000 U/min für 30 min sedimentiert, das
Pellet in 500 µl eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen und anschließend bei 12000 U/min
für 15 min bei 4°C zentrifugiert. Der angegebene Waschschritt wird wiederholt und
anschließend das gewaschene Pellet im Vakuumexikator für 15 min getrocknet. Das RNAPellet wird in 30 µl DEPC-H2O aufgenommen, gelöst und 30 min auf Eis inkubiert. Zur
Konzentrationsbestimmung der extrahierten RNA wird die optische Dichte bei 260 nm am
UV-Spektrophotometer gemessen. Dazu werden 5 µl der RNA mit DEPC-H2O verdünnt
(Verdünnung 1:200). Die Konzentration wird berechnet nach c (µg/ml) = OD260 x Verdünnung
x 40. Der Reinheitsgrad der isolierten RNA ermittelt sich aus dem Quotienten von 280 nm
und 260 nm. Eine anschließende Untersuchung auf mögliche Degradationen der RNA ist
mittels eines RNA-Geles stichprobenhaft durchgeführt worden. Beim Vorhandensein von
intakter RNA sind die Banden 18S und 26S rRNA deutlich zu erkennen.
- 35 -
Methoden
4.6
Reverse Transkription
Mit Hilfe retroviraler reverser Transkriptase kann RNA in cDNA umgeschrieben werden.
Dafür wird ein oligo-d(T)-Primer verwendet, der die mRNA der Zelle sowie die virale RNA auf
Grund ihrer Poly-A-Sequenz am 3´ Ende umschreiben kann. Zur reversen Transkription
werden 5 µg RNA der entsprechenden Probe mit DEPC-H2O auf 25 µl aufgefüllt und 2,5 µl
oligo-d(T)-Primer (0,5 µg/µl Endkonzentration: 82 µM) zugegeben. Bei anschließender 10minütiger Inkubation bei 70°C erfolgt die Denaturierung. Für diesen Ansatz werden folgende
Lösungen benötigt: 10 µl 5x First Strand Puffer, 5 µl 100 mM DTT, 5 µl 10 mM dNTP und 2,5
µl SuperscriptTM II RT (200 U/µl). Im Anschluss erfolgen im Biozym-DNA-Cycler das PrimerAnnealing für 10 min bei Raumtemperatur, der reverse Transkriptionsschritt bei 42°C für 50
min und eine Denaturierung von 5 min bei 90°C. Die gewonnene cDNA wird anschließend
auf Eis gestellt und kann für die Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden. Die
Lagerung der cDNA erfolgt bei -20°C.
4.7
Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
Die Methode dient zur Amplifizierung von DNA-Molekülen. Durch Verwendung einer
thermostabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) wird die zyklische Wiederholung der
benötigten
Reaktionsschritte
(Denaturierung,
Primer-Annealing,
DNA-Polymerisation)
ermöglicht. Die Parameter der einzelnen Schritte (Zeit, Temperatur) sind abhängig vom
Template, von der Länge des zu amplifizierenden Abschnittes und von der Länge der
verwendeten Primer ab. Zur Amplifizierung spezifischer cDNA-Sequenzen wird die PCRMischung auf Eis pipettiert und in einem Biozym-DNA-Cycler unter den angegebenen
Bedingungen (Tab. 9 im Anhang) zur Reaktion gebracht. Die erhaltenen PCR-Produkte
werden mittels Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht.
4.8
Semiquantitative Polymerase-Kettenreaktion
Die semiquantitative Polymerase-Kettenreaktion wurde nach dem Verfahren von Platzer et.
al.196 durchgeführt, indem die zu untersuchenden cDNAs unter Verwendung eines
kompetitiven Kontrollfragmentes (pMCQ) im PCR-Ansatz auf einen β-Aktin Wert von 4x 106
Moleküle/PCR-Ansatz eingestellt werden. Das aus dem Plasmid pMCQ selektionierte
Kontrollfragment weist spezifische Primer-Bindungssequenzen für β-Aktin auf und wird
ausgehend
von
einer
Stockkonzentration
7
von
2x
1010
Moleküle/PCR-Ansatz
in
5
Konzentrationen von 1x 10 bis 4x 10 Molekülen/PCR-Ansatz eingesetzt. Aus diesem Grund
kommt es während der PCR-Reaktion zu einem Konkurrenzverhalten zwischen dem
Kontrollfragment und der Proben-cDNA um die eingesetzten β-Aktin Primer. Durch
Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen des Kontrollfragmentes in mehreren PCR- 36 -
Methoden
Ansätzen ist die Konzentration feststellbar, die zu einer gleichen Bandenstärke von
Kontrollfragment und Proben-cDNA führt, d. h. gleiche Konzentration im PCR-Ansatz. Die in
Tab. 8 (im Anhang) angegebene β-Aktin PCR-Mischung ist dahingegen modifiziert, das 5 µl
Kontrollfragment an Stelle von 5 µl Aqua dest. pro Ansatz pipettiert wurden. Die erhaltenen
PCR-Produkte werden mittels Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung
sichtbar gemacht. Beide Fragmente unterscheiden sich im Agarosegel in ihrer Bandengröße
– Kontrollfragment (265 bp) und Proben-cDNA (348 bp).
4.9
Agarose-Gelelektrophorese
Zur exakten Trennung der verwendeten Fragmente werden die PCR-Proben auf ein
1,5%iges Agarosegel aufgetragen und bei 5 V/cm für 1,5 h laufen gelassen. Die Gele
befinden sich während der Elektrophorese in 1x TBE-Puffer, welcher besonders für die
Auftrennung kleinerer Fragmente (< 1kb) geeignet ist und eine große Pufferkapazität besitzt.
Um die DNA-Banden im Agarosegel sichtbar zu machen, wird dem Agarosegel
Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 0,5 µg/ml zugegeben. Die amplifizierten DNABanden werden am Herolab mittels UV-Licht sichtbar und können so ausgewertet werden.
4.10
In Situ-Hybridisierung
4.10.1 Nachweis des CVB3-Kapsid-Protein-Gens VP1
Der Nachweis viraler RNA im Myokard erfolgt durch die In Situ-Hybridisierung (ISH) mit einer
Digoxigenin (DIG)-markierten DNA-Sonde gegen das CVB3-Kapsid-Protein-Gen VP1. Für
die Herstellung der Sonde werden HeLa-Zellen mit CVB3 Mü/J (Nancy) mit einer Dosis von
1x 104 pfu infiziert. Die RNA ist nach dem Arbeitsprotokoll des „RNeasy Mini-Kits“ der Firma
QUIAGEN isoliert und eine reverse Transkriptase (siehe 4.7) durchgeführt wurden. Die VP1DNA-Sonde ist über eine PCR mit DIG-markierten dNTPs aus dem PCR-Sonden-Synthese
Kit der Firma Roche unter Verwendung von spezifischen VP1 Primern hergestellt.
Formalinfixierte, in Paraffin eingebettete, 6 µm dicke Schnitte von Myokardpräparaten
werden über Nacht bei 56°C getrocknet und mit Xylolbehandlung (2x 10 min) entparaffiniert.
Die Entfernung des restlichen Xylols und die Hydratisierung der Myokardschnitte erfolgt über
eine absteigende Ethanolreihe (10 min in 100%igen Ethanol und anschließend jeweils 5 min
in 95%-, 70%- und 50%igem Ethanol). Anschließend erfolgt ein Protease VIII-Verdau
(Proteasestammlösung 500 µg/ml, SIGMA), verdünnt in PBS 1:10 für 30 min bei 37°C in
einer feuchten Kammer. Die Schnitte werden 1x 5 min in Aqua dest. gewaschen und eine
aufsteigende Ethanolreihe durchgeführt, wobei die Objektträger jeweils 5 min in 70%- 95%und 100%igen Ethanol gestellt werden. Die ISH gegen das CVB3-Kapsid-Protein-Gen VP1
erfolgt mittels DIG-makierter VP1-DNA Sonde. Hierzu wird die VP1-DNA Sonde vor dem
- 37 -
Methoden
Auftragen auf die Myokardschnitte 1:5 in Aqua dest. verdünnt, 20 min bei 95°C inkubiert und
5 min auf Eis gelagert. Nachfolgend wird nochmals eine 1:10 Verdünnung mit
Hybridisierungspuffer vorgenommen, diese für 5 min bei 95°C denaturiert und anschließend
auf Eis bis zur Verwendung gelagert. Die Sonde wird auf die Myokardschnitte gegeben und
diese mit Deckgläsern abgedeckt. Als Negativkontrolle werden konsekutive Schnitte mit
Hybridisierungspuffer versehen und in gleicher Weise behandelt. Zur gesteigerten
Expression und Sondenbindung werden die Schnitte samt Sonde optional für 8 min bei 95°C
denaturiert. Die Hybridisierung erfolgt in einer feuchten Kammer bei 37°C für 16 h.
Ungebundene VP1 Sonde wird am Folgetag mit einer stringenten Formamidersatzlösung
entfernt, indem die Schnitte in einer Küvette mit Formamidersatzlösung für 20 min
gewaschen werden. Zum immunologischen Nachweis der Sonde wird der unspezifische
Hintergrund der Myokardschnitte mit Blockierungsreagenz (Stammlösung 1:10 in Puffer I
verdünnt) für 30 min abgesättigt. Der aufgetragene Antikörper (Anti-DIG-AP, Fab-Fragment),
der zuvor in Blockierungslösung 1:500 verdünnt wird, verbleibt 1 h auf den Präparaten, die
im Anschluss 3x 5 min mit PBS gewaschen werden. Die Farbreaktion erfolgt über
BCIP/NBT-Reagenz (1:50 in Puffer 3) für 2 h bei Raumtemperatur und wird mikroskopisch
kontrolliert. Die Farbreaktion wird mit PBS abgestoppt, die Myokardpräparate werden mit
Hämatoxylin (5 min) gefärbt, dann zum Bläuen für 1 min in Leitungswasser gestellt und mit
Glycerol-Gelantine dauerhaft eingebettet.
4.10.2 Nachweis von PDGF-C
Als Nachweis der gesteigerten PDGF-C-Expression im Myokardgewebe wird eine ISH mit
einer RNA-sense- und RNA-antisense-Sonde durchgeführt, da durch endogen vorhandenes
PDGF-C im Myokard konsekutive Kontrollschnitte nicht ausreichen. Die benötigten Sonden
für die Detektion von PDGF-C mRNA werden durch PCR-Amplifikation mit einer PfUPolymerase (STRATAGENE, Ja Jolla, USA) hergestellt. Als Template dient PDGF-C-cDNA
(„Fallotein“-cDNA), das freundlicherweise von Dr. Yuan-Jang Tsai, Division of Reproduction
and Endocrinology, Department of Medical Research, Mackay Memorial Hospital, Tamshui,
Taiwan zur Verfügung gestellt wurde. Das 625 bp große PCR blunt-end-Fragment wird in
einen Eco-RV-verdauten pBluescript-Vektor II KS(+) kloniert. Zur Synthese der sense- bzw.
antisense-RNA-Sonde wird das Plasmid mit BamH I linearisiert. Über eine in vitro
Transkription mit dem DIG-RNA-Labelling Kit (Roche, Mannheim) unter Verwendung der T3bzw. T7-RNA-Polymerasen werden die spezifischen Sonden erzeugt. Die linearisierten RNASonden werden mit 2,5 mM Lithiumchlorid-Ethanol gefällt, aliquotiert und bei -80°C bis zur
Verwendung gelagert.
Die PDGF-C-RNA ISH ist nach dem Protokoll von Diikman et. al.197 durchgeführt wurden. 6
µm dicke in Paraffin eingebettete Myokardschnitte sind in Xylol (2x 10 min) fixiert und über
- 38 -
Methoden
eine absteigende Ethanolreihe (10 min in 100%igem Ethanol und anschließend jeweils 5 min
in 95%-, 70%- und 50%igem Ethanol) hydriert worden. Die Myokardpräparate werden mit
Hybridisierungspuffer in einer feuchten Kammer für 1 h bei 37°C vorhybridisiert. Der
Nachweis von PDGF-C mRNA im Gewebe erfolgt mittels Inkubation einer mit 200 ng/ml DIGmarkierter antisense- (T7) bzw. sense- (T3) Sonde in Hybridisierungspuffer, in einer feuchten
Kammer bei 37°C für 16 h. Durch verschiedene stringente Waschschnitte (2x SSC für 5 min
bei 37°C, dann mit 60%-igem Formamid in 0,2x SSC für 3x 5 min bei 37°C und schließlich 2x
SSC für 2x 5 min bei RT mit jeweils einer Menge von 100 µl/Schnitt) am Folgetag wird
ungebundene PDGF-C sense- bzw. antisense-Sonde von den Myokardschnitten entfernt.
Die Schnitte werden anschließend 1x 5 min mit Waschpuffer gewaschen. Die Blockierung
der Schnitte erfolgt analog der VP1 ISH mit Blockierungspuffer für 30 min bei RT. Die
Immundetektion
wird
mit
einem
Anti-DIG-AP
(Fab-Fragment)-Antikörper,
in
einer
Verdünnung von 1:200 in Blockierungspuffer für 2 Stunden bei RT vorgenommen.
Überschüssiger, ungebundener Antikörper wird durch 2x 5 min waschen in Waschpuffer und
1x 10 min waschen mit Detektionspuffer von den Schnitten entfernt. Die Farbreaktion wird
ebenso wie bei der VP1 ISH mit NBT/BCIP-Stock-Lösung unter mikroskopischer Kontrolle
durchgeführt. Das Abstoppen der Reaktion erfolgt mit Waschpuffer, die Präparate werden
mit flüssiger Glycerol-Gelantine dauerhaft verschlossen und mikroskopisch ausgewertet.
4.11
Immunhistochemischer Nachweis von PDGF-Isoformen
Das immunhistochemisch zu untersuchende Myokardgewebe wird in Cryomatrix (Thermo
Shadon, Pittsburgh, USA) eingebettet, in flüssigen Stickstoff eingefroren und bei -70°C
gelagert. Das gefrorene Gewebe wird bei -20°C am Kryotom in 10 µm Scheiben geschnitten.
Diese werden auf ungekühlte PLL-beschichtete Objektträger aufgeschmolzen und bei RT für
mind. 2 h oder über Nacht luftgetrocknet. Zur immunhistochemischen Detektion werden die
Objektträger 3 min in Aceton fixiert, luftgetrocknet, die Herzschnitte mit einem PAP-Fettstift
umrandet und 2 min in PBS gewaschen. Die Hemmung der endogenen Peroxidase erfolgt in
0,04%iger H2O2-Lösung für 30 min bei RT. Während der Inaktivierung mit H2O2 ist auf
Bläschenbildung auf den Schnitten zu achten. Anschließend werden die Objektträger 3x 4
min in PBS gewaschen. Alle folgenden Schritte werden in einer feuchten Kammer
durchgeführt, damit die Schnitte nicht austrocknen. Die Absättigung des endogenen Biotins
erfolgt duch eine Inkubation mit 0,01% Avidin und 0,1% Biotin, verdünnt in PBS für je 30 min
bei RT. Die Schnitte werden zwischen den Inkubationsschritten 3x 4 min mit PBS
gewaschen. Um unspezifische Reaktionen Im Myokardschnitt zu verhindern, wird dieser mit
einem Blockierungspuffer (2% Magermilch, 1% FCS in PBS) für 30 min bei RT absorbiert.
Der Blockierungspuffer wird nur abgespült und danach der entsprechende Primärantikörper
verdünnt in PBS (Tab. 11 im Anhang) auf die Myokardschnitte gegeben. Parallel zu jedem
- 39 -
Methoden
untersuchten Antikörper wird eine Negativkontrolle eines Myokardschnittes mitgeführt, der
anstelle des Primärantikörpers mit PBS inkubiert wird. Die Inkubation erfolgt ü. N. bei 4°C.
Ungebundener Primärantikörper wird am Folgetag 3x 4 min mit PBS abgewaschen und ein
biotinylierter Sekundärantikörper (mit 2% MS) in entsprechender Verdünnung (Tab. 11 im
Anhang) für 30 min bei RT auf die Schnitte gegeben. Im Anschluss erfolgt wiederum ein
Waschen der Objektträger für 3x 4 min in PBS. Zur Signalverstärkung wird StreptavidinPeroxidase (SPK; Verdünnung 1:300 in PBS) an den Biotin-gekoppelten-Sekundärantikörper
für 30 min bei RT gebunden. Überschüssiges SPK wird 3x 4 min mit PBS abgespült. Die
Farbdetektion
erfolgt
über
chromogenes
Substrat
(3-Amino-9-Ethyl-Carbazol).
Die
Färbungen im Myokardpräparat werden am Mikroskop kontrolliert. Im Folgenden werden die
Schnitte 2x 4 min in PBS und 1x 4 min in Aqua dest. gewaschen. Die Desinfektion des
infektiösen Materials findet für 15-20 min in einer 4% Formalinlösung statt. Zur
Sichtbarmachung der Infiltrate und Gegenfärbung der Zellkerne im Myokard werden die
Schnitte für 15 min in Hämatoxylin gegeben und nachfolgend zum Bläuen mit
Leitungswasser gespült. Die Schnitte werden mit Aquatex eingedeckelt und am Mikroskop
ausgewertet.
Die Spezifität der käuflich erworbenen polyklonalen Antikörper (PDGF-A, PDGF-B, PDGFRα, phospho-Akt) ist mit einer IgG-Isotypkontrolle vom Kaninchen (4 µg/ml) geprüft worden, in
denm Kaninchen-IgG anstelle des verwendeten Antikörpers auf die Myokardschnitte
gegeben
wurde.
Blockierungspeptid
Für
den
Antikörper
gegen
(CDCVCRGNAGG-Amide)
die
zum
Isoform
Nachweis
PDGF-C
der
konnte
ein
PDGF-C-Spezifität
verwendet werden. Dieses wird dem Antikörper vor dem Auftragen auf den Myokardschnitt in
einer Konzentration von 200 µg/ml beigemischt. Die Blockierung erfolgt bei einer Inkubation
von 1 h bei 37°C.
4.12
Zur
Bestimmung von PDGF-Aktivität im extrahierten Myokardgewebe
Bestimmung
der
PDGF-Konzentration
im
Myokardgewebe
werden
konfluent
gewachsene Swiss 3T3 Fibroblasten in einer 24 well Mikrotiterplatte mit serumfreien DMEM/
Medium für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Myokardgewebe von MHC Klasse II knockout
Mäusen und C57BL/6 Wildtypmäusen von verschiedenen CVB3-Infektionszeitpunkten (7, 21
und 56 p. i.) wird in einer PBS-haltigen Lösung homogenisiert und für 10 min auf die 3T3
Fibroblasten gegeben. Zum Vergleich und zur Standardisierung werden die Zellen unter
denselben Bedingungen mit verschiedenen Konzentrationen (1,0; 2,5 oder 5,0 ng/ml) PDGFBB inkubiert. Von der auf Eis gestellten Mikrotiterplatte werden die Überstände abgesaugt,
die Zellen 1x mit PBS gewaschen und anschließend in 0,2 ml Triton-Lysispuffer lysiert und
für 15 min bei 4°C und 14000 U/min zentrifugiert. Die im Überstand enthaltenen
Glycoproteine werden an Weizenkeim-Lecitin-Agarose bei 4°C für 30 min gebunden. Das
- 40 -
Methoden
gebundene Material wird 2x mit Triton-Lysispuffer und 1x mit HNTG-Puffer gewaschen und
anschließend mit 5 µl 6x A-Puffer versetzt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Es erfolgt ein
SDS-PAGE und Immunblot mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (4G10). Die entstehende
Bande des phosphorylierten PDGFR (185 kDa) wird quantifiziert und densiometrisch am
Computer mit dem Bearbeitungsprogramm „Herolab“ ausgewertet.
4.13
Detektion von PDGFR-Aktivierung mittels Immunpräzipitation
Myokardgewebe von MHC Klasse II knockout Mäusen, die für 7 Tage mit 150 mg/kg STI571
oder entsprechender Vergleichslösung behandelt worden, wird unter Verwendung eines
Triton-Lysispuffer (im Verhältnis 100 mg Gewebe/1000 µl Puffer) im Ultra-Turrax
homogenisiert. Die Homogenisate werden für 20 min auf Eis inkubiert und anschließend die
Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 14000 U/min für 20 min und 4°C entfernt. Die
Gewebelysate werden unter Zugabe von 1 µg/ml PDGF-BB, 5 mM MnCl2 und 300 µM ATP
bei 4°C für 20 min inkubiert. Die im Anschluss durchgeführte Immunpräzipitation von PDGFR
aus den Lysaten erfolgt mit einem Mix aus vorgebundenen PDGFR-α- und PDGFR-βAntikörper (Konzentration von je 2 µg) an Protein-A-Sepharose ü. N. bei 4°C auf einen
Schüttler. Die Präzipitate werden am Folgetag 2x mit Triton-Lysispuffer und 1x mit HNTGPuffer gewaschen und im Anschluss die PDGFR-Phosphorylierung mittels SDS-PAGE und
Immunblot unter Verwendung eines Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers (4G10) durchgeführt.
Zusätzlich ist aus den Gewebelysaten mittels Immunblot unter Verwendung eines AntiVinculin-Antikörpers, ein Konzentrationsvergleich der aufgetragenen Proben durchgeführt
worden.
4.14
SDS-PAGE und Immunblot
Durch die Kombination beider Methoden ist eine exakte Trennung und Nachweismöglichkeit
von Proteinen bzw. die Modifikation an Proteinen oder ihrer Phosphorylierung möglich. Falls
nicht anders beschrieben, werden die zu untersuchenden Lysate mit 6x A-Probenpuffer
versetzt, 5 min bei 100°C denaturiert und auf das Poly-Acryl-Amid-Gel (PAA-Gel)
aufgetragen. Die Elektrophoresebedingungen für ein 7,5% PAA-Gel sind 30 mA, 100 V für 1
Stunde. Das PAA-Gel wird anschließend für den Immunblot weiter verwendet. Der Transfer
der Proteine auf eine PVDF-Menbran erfolgt mittels Semi-Dry-Verfahren bei 17 V und 2 mA/
cm² Membran für 2 h. Die verwendeten Antikörper (Tab. 3.7) sind in TBS-T 0.01% Puffer
verdünnt, der auch zum Blocken und Waschen der Membran verwendet wird. Die Proteine
werden durch eine Chemoluminesszenz-Reaktion der Meerrettich-Peroxidase (HRP) mit
ECL-Western Lightning als Substrat auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht.
- 41 -
Methoden
4.15
Herzgewebe-Extraktion zur Analyse von STI571 (Glivec)
Die Konzentrationsbestimmung von STI571 im Myokardgewebe übernahm in dankenswerter
Weise Dr. Gilles-Jaques Riviere (NOVARTIS Pharma, Rueil-Malmaison, Frankreich). Da bei
der Versendung von infektiösem Material große Vorsicht geboten ist, erfolgten die ersten
Aufarbeitungsschritte für die Analyse von STI571 im Herzgewebe nach dem Protokoll von
Dr. Riviere im Institut für Virologie und Antivirale Therapie in Jena.
Das entnommene Herzgewebe wird bei der Organentnahme gewogen und bei -80°C
tiefgefroren. Zu 100 mg Herzgewebe wird 400 µl PBS zugegeben und die Proben am UltraTurrax homogenisiert. 200 µl des PBS-Homogenisates werden abgenommen und zur
Präzipitation der Proteine mit 250 µl Acetonitril vermischt. Die Proben werden 1 min am
Vortexer gemischt, anschließend bei 2500 U/min für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird
abgenommen und bis zur Versendung bei -20°C gelagert. Das versendete Material muss
Virusfrei
sein.
Stichprobenhaft
wurden
ausgewählte
Myokardextrakte,
nach
dem
beschriebenen Protokoll aufgearbeitet. Diese Proben sind in einer Speedvac Zentrifuge
getrocknet und das Pellet in äquivalenten PBS-Volumen gelöst wurden. Die Detektion von
möglichen CVB3-Partikeln erfolgte mittels TCID50-Test (siehe 4.4).
4.16
Statistik
Ausgehend von den ermittelten Stichproben erfolgt die Berechnung der Mittelwerte und der
Standardabweichung mit dem Computerprogramm Excel (Version Microsoft XP). Da sich die
Anzahl der untersuchten Stichproben auf ein Minimum beschränkt und somit nicht von einer
normalverteilten
Grundgesamtheit
und
gegebenenfalls
von
Varianzhomogenität
ausgegangen werden kann, muss ein voraussetzungsfreies Verfahren angewandt werden,
welches lediglich die ordinale Information der Daten auswertet198. Es wird der Vergleich von
zwei unabhängigen Stichproben (U-Test nach Mann und Whitney) hinsichtlich ihrer zentralen
Tendenz, als nichtparametrischer Test, angewandt (signifikanter Unterschied bei einer
Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05). Die Berechnung der Werte erfolgt mit dem
Computerprogramm SPSS (Version 11.5 für Windows, SheePS Counting Software).
- 42 -
5. Ergebnisse
Ergebnisse
5.1
Erhöhte Expression von PDGF-Isoformen in der CVB3-induzierten
Herzmuskelentzündung
5.1.1 Histologische Untersuchung von CVB3-infizierten Herzen
Für die Untersuchung eines fortschreitenden Krankheitsverlaufes einer CVB3-induzierten
Myokarditis in Abhängigkeit von der Zeit post infectionem (p. i.) wurden CD4-T-Zell-defiziente
MHC Klasse II knockout Mäuse im Vergleich zu immunkompetenten C57BL/6 Mäusen mit
der Virusvariante CVB3-Mü/J (1x104 pfu) infiziert. Die Analyse der myokardialen Infektion
erfolgte an Zeitpunkten, die nach früheren Untersuchungen71 charakteristisch für den
Krankheitsverlauf sind – Tag 7 (akute Myokarditis), Tag 21 (chronische Myokarditis) und Tag
56 (chronische Myokarditis, massive Fibosierung). Für dieses Mausmodell konnte bereits in
einer konventionell geführten Tierhaltung gezeigt werden, dass immundefiziente MHC
Klasse II knockout Mäuse sowie immunkompetente C57BL/6 Mäuse eine akute Myokarditis
ausbilden. Diese heilte in den immunkompetenten Tieren komplett aus, während es in den
immundefizienten Mäusen bis zum Untersuchungszeitpunkt – 21 Tage p. i. – zu einer
Persistenz der Infiltrate und Entwicklung einer chronischen Myokarditis kam71. Diese
bekannten histologischen Parameter einer CVB3-Infektion wurden an SPF-gehaltenen
Mäusen beider Tierstämme ein weiteres Mal untersucht.
Weiterhin wurden nicht-infizierte Kontrolltiere beider Stämme parallel untersucht, um den
Einfluss
Mausstamm-spezifischer
Faktoren
auszuschließen.
Als
Parameter
einer
stattgefundenen Virusinfektion war die histologische Beurteilung der Pankreaszerstörung
notwendig71. Danach erfolgte die Entscheidung über die Einbeziehung der betroffenen Tiere
in die weiteren Untersuchungen. Die histologische Auswertung des Myokards erfolgte
lichtmikroskopisch an mit Hämatoxylin/Eosin und mit Siriusrot gefärbten Paraffin-Präparaten.
Der Schweregrad der entstehenden viral-induzierten Herzmuskelschädigung, deren Folge
schwere myokardiale Läsionen und Entwicklung von Fibrose sein kann, wurde anhand von
im Labor festgelegten Kriterien von 0 bis 3 ausgewertet (Tab. 10 im Anhang)71.
5.1.1.1 Infiltration des Myokards
Der Nachweis von infiltrierenden Zellen im Myokard erfolgte mittels Hämatoxylin/Eosin
Färbung. Das humanpathogene Coxsackie-B3 Virus induzierte in beiden untersuchten
Mäusestämmen bis 7 Tage nach CVB3-Infektion eine schwere akute Myokarditis. Die
entstehende Myozytenschädigung in beiden Mäusestämmen reichte von mehreren fokalen
Entzündungszellen bis hin zu diffusen Infiltrationen, die zuweilen mit einer kompletten
zellulären Durchsetzung der gesamten Ventrikelwand einhergingen (Abb. 6C und D). Ein
Unterschied im Schweregrad der Infiltration zwischen beiden Mäusestämmen war nicht
feststellbar. Hingegen ließen sich 21 bzw. 56 Tage nach CVB3-Infektion zwischen beiden
- 43 -
Ergebnisse
Mäusestämmen deutliche histologische Unterschiede in den Myokardschnitte erkennen. Die
CVB3-induzierte Myokarditis in C57BL/6 Mäusen heilte bis zum 21. Tag p. i. aus und
entsprach histologisch dem Bild der nicht-infizierten Kontrolltiere (Abb. 6F). Entsprechend
ließen sich auch 56 Tage p. i. im Herzmuskelgewebe dieser Mäuse keine Anzeichen von
Entzündungszellen oder Infiltraten nachweisen (Abb. 6H). Im Gegensatz dazu war der
histologische Befund bei MHC Klasse II knockout Mäusen an den untersuchten
Infektionszeitpunkten different. Bis einschließlich 56 Tage p. i. konnten hochgradige
myokardiale Schädigungen der Myozyten detektiert werden, die teilweise große Bereiche der
Ventrikelwand destruktiv veränderten (Abb. 6E und G).
5.1.1.2 Bewertung der Fibrose im Myokard
Die pathologische Vermehrung des Bindegewebes im Myokard als Folge einer CVB3Infektion konnte durch Färbung der histologischen Präparate mit Siriusrot nachgewiesen
werden. Dadurch werden die Kardiomyozyten gelb und das Bindegewebe des Interstitiums
sowie die dort befindlichen Gefäße rot gefärbt. Die Lokalisation des veränderten
Bindegewebes im Myokard korrespondierte mit den entzündeten Arealen im Bereich der
Infiltrate, die mit Hilfe der Hämatoxylin/Eosin Färbung detektiert wurden. Zum Zeitpunkt der
akuten Infektion – 7. Tag p. i. – zeigte sich in den Herzmuskelpräparaten von Versuchstieren
beider Mäusestämme eine Anreicherung von lockerem Bindegewebe (Abb. 7C und D). Die
Lokalisation dieser netzartigen Strukturen korrespondierte mit den Stellen, an denen mit der
HE-Färbung Infiltrate im Myokardgewebe detektiert wurden (Abb. 6C und D). Dieses
Granulationsgewebe füllte im Herzmuskel die Bereiche aus, die aufgrund des zytopathischen
Effektes
von
CVB3
zerstört
wurden.
Deutliche
Unterschiede
zwischen
beiden
Mäusestämmen waren am 21. bzw. 56. Tag nach CVB3-Infektion zu beobachten (Abb. 7E
und F sowie G und H). Im Herzmuskelgewebe der immunkompetenten C57BL/6 Mäuse war
keine Anreicherung von proliferierendem Bindegewebe mehr sichtbar. Das Myokardgewebe
entsprach dem der nicht-infizierten Kontrollmäuse und zeichnete sich durch eine einheitliche
gelbe Färbung der Kardiomyozyten sowie lediglich durch eine rote Anfärbung der
Gefäßwände und des Interstitiums aus (Abb. 7F). Hingegen war durch die Persistenz der
Infiltrate im Myokardgewebe von immundefizienten MHC Klasse II knockout Mäusen – 21
Tage p. i. – eine moderate bis großflächige Anreicherung von Bindegewebe deutlich zu
erkennen. Davon waren einzelne Muskelareale betroffen oder es erfolgte teilweise auch ein
bindegewebsartiger Umbau der kompletten Ventrikelwand (Abb. 7E). Die Myokardpräparate
vom 56 Tage p. i. wiesen ein deutliches Fortschreiten dieses myokardialen Umbauprozesses
im Vergleich zum 21. Tag p. i. auf. Noch größere Bereiche des Myokards waren durch
fibrotisches Gewebe ersetzt. Diese pathologische Veränderung führt sehr wahrscheinlich zu
- 44 -
Ergebnisse
einem funktionsunfähigen Myokardgewebe mit Einschränkungen in der Pumpleistung (Abb.
7G).
Zusammenfassend war feststellbar, dass sich eine CVB3-Mü/J-Infektion bei MHC Klasse II
knockout Mäusen und C57BL/6 Wildtypmäusen in einer akute Myokarditis manifestierte, die
bis zum 21. Tag p. i. in den immunkompetenten Mäusen ausheilte. Die Persistenz der
Myokardentzündung und die Zunahme von interstitiellem Bindegewebe im Myokard von
MHC Klasse II knockout Mäusen – 21 bzw. 56 Tage p. i. – waren der Beleg für einen
chronischen Krankheitsverlauf. Die Ergebnisse unter SPF-Bedingungen bestätigten die
bereits
erbrachten
Befunde
aus
der
konventionellen
Tierhaltung.
Damit
kann
ausgeschlossen werden, dass die Exposition gegenüber zusätzlichen Keimen einen Bezug
zum früher beschriebenen Krankheitsverlauf geleistet hat. Die beschriebenen Pathologien
sind wahrscheinlich ausschließlich auf die CVB3-Infektion zurückzuführen.
- 45 -
Ergebnisse
MHC Klasse II ko Maus
C57BL/6 Maus
A
B
C
D
E
F
G
H
KT
7 p. i.
d 21 p. i.
d 56 p. i.
Abb. 6: Histologische Darstellung der Infiltration im Myokard nach Infektion mit CVB3. Vergleich
von MHC Klasse II ko (A, C, E und G) und immunkompetenten C57BL/6 Mäusen (B, D, F und H).
A+B: Die Kontrolltiere beider Stämme waren frei von Entzündungszellen. C+D: Am 7 d p. i.
entwickelten MHC Klasse II ko (C) und C57BL/6 Mäuse (D) eine akute Myokarditis mit multifokalen
Läsionen und starker Infiltration. E+F: Am 21. d p. i. heilte die Myokarditis bei immunkompetenten
Mäusen (F) vollständig aus, während immundefiziente MHC Klasse II ko Mäuse eine persistierende
Infiltration im Myokard aufwiesen (E). G+H: Nach 56 d p. i. glich das Herzmuskelgewebe
immunkompetenter C57BL/6 Mäusen (H) histologisch dem Bild von nicht-infizierten Kontrollmäusen
(B). Zu diesem Zeitpunkt der Infektion stellte eine moderate bis starke Infiltration (Pfeile) des
Myokards und geschädigte Myozyten die Befunde der histologischen Präparate von MHC Klasse II ko
Mäusen dar. (Hämatoxylin/Eosin Färbung; ko: knockout; KT: Kontrolltiere; d: Tag; 100-fach
Vergrößerung)
- 46 -
Ergebnisse
MHC Klasse II ko Maus
C57BL/6 Maus
A
B
C
D
KT
GR
d 7 p. i.
GR
F
E
F
G
H
d 21 p. i.
d 56 p. i.
Abb. 7: Nachweis von Fibrose im Myokard nach CVB3-Infektion. Vergleich von MHC Klasse II ko
(A, C, E und G) und immunkompetenten C57BL/6 Mäusen (B, D, F und H). A+B: Bei den
Kontrolltieren beider Stämme waren keine Anzeichen von Fibrose erkennbar. C+D: Am 7. d p. i. war
aufgelockertes Bindegewebe in beiden Mäusestämmen detektierbar. Dieses netzartige Bindegewebe
entsprach den Lokalisationen der Infiltrate (Abb. 7C+D). Es handelte sich dabei um
Granulationsgewebe (GR). E+F: Am 21. d p. i. waren die immunkompetenten Mäuse frei von
fibrotischen Veränderungen (F). Die MHC Klasse II ko Mäuse (E) entwickelten eine starke
Fibrosierung des Myokards (Pfeil), welche zum bindegewebigen Umbau ganzer Muskelareale führte.
G+H: 56 d p. i. glich das Herzmuskelgewebe immunkompetenter C57BL/6 Mäuse (H) histologisch
dem Bild von nicht-infizierten Kontrollmäusen (B). Im Myokard von MHC Klasse II ko Mäusen (G) war
eine Zunahme der myokardialen Fibrose im Vergleich zum 21. d p. i. zu beobachten (Pfeile).
(Siriusrot-Färbung; ko: knockout; KT: Kontrolltiere; d: Tag; 100-fache Vergrößerung)
- 47 -
Ergebnisse
5.1.2 Expressionsmuster von Zytokinen und PDGF-Isoformen
5.1.2.1 Zytokinexpression
Um zu untersuchen, ob der Immundefekt der CD4-T-Zell defizienten MHC Klasse II knockout
Mäuse einen Einfluss auf die Expression von Zytokinen im Herzmuskelgewebe hat, wurden
ausgesuchte Zytokine, die den Infektionsverlauf beeinflussen können, an markanten
Infektionszeitpunkten – 7, 21 und 56 Tage – nach CVB3-Infektion in beiden Mäusestämmen
analysiert und mit nicht-infizierten Kontrolltieren verglichen. Dazu wurde, wie unter Methoden
beschrieben, die mRNA aus dem Herzgewebe isoliert. In die Untersuchung gingen pro
Versuchszeitpunkt
und
Mausstamm
5
bis
9
Tiere
ein.
Um
Veränderungen
im
Expressionsspiegel der zu untersuchenden Zytokine und Wachstumsfaktoren im Verlauf der
CVB3-Infektion nachzuweisen, wurden die Myokardproben durch eine semiquantitative PCR
auf einen konstanten β-Aktin Wert eingestellt. In der semiquantitativen β-Aktin PCR
konkurrierte die zu analysierende Myokard-cDNA mit einem kompetitiven Fragment in
verschiedenen Verdünnungen um die spezifischen β-Aktin Primer. In Abb. 8 ist das Beispiel
einer so quantifizierten Proben-cDNA (348 bp/β-Aktin) und der kompetitiven Fragmentbande
(264 bp/Kontrollfragment) dargestellt. Die Proben-cDNA wurde in konstanter Menge in die
Reaktion eingesetzt, wohingegen das kompetitive Fragment in Verdünnungen von 107 bis
104 zum PCR Ansatz gegeben wurde. Im dargestellten Beispiel glichen sich beide Proben
bei einer Fragmentverdünnung von 4x106 Molekülen in der dargestellten β-Aktin
Bandenstärke an. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass in dieser Myokardprobe eine βAktin Konzentration von 4x106 Molekülen vorzufinden war.
Für den RNA-Nachweis mittels RT-PCR der Zytokine und Wachstumsfaktoren wurden alle
Myokardproben auf einen konstanten Wert von 4x106 Molekülen β-Aktin eingestellt. Mit der
Amplifikation der mRNA des antiviralen Zytokins IFN-β, der Zytokine IL-2, IFN-γ, IL-10 und
IL-12p40 wurde eine Beteiligung des Immunsystems am myokardialen Entzündungsprozess
demonstriert. Mit der Detektion von TNF-α, IL-1α, IL-1β und IL-6 wurde eine Reihe von
Zytokinen getestet, die als spezifische Marker für Entzündungsprozesse im Myokard gelten.
Die Amplifikation des CVB3-Kapsidgens VP1 gab zusätzlich zu dem mittels TCID50
ermittelten Virustiter Aufschluss über die Viruspersistenz im Myokard. In Abb. 9 sind neben
den Ergebnissen der PCR die histologische Bewertung für zelluläre Infiltration und Fibrose
sowie der mit dem TCID50-Test nachgewiesene Virustiter im Myokard dargestellt.
Zum Zeitpunkt der akuten Phase – 7 Tage p. i. – war im Myokard der Versuchstiere beider
Mäusestämme eine mäßige bis starke Expression der untersuchten Zytokine messbar. Dies
ging mit dem Nachweis des Virusgenoms (VP1-Gen) einher, welches sich durch eine starke
Expression zu diesem Infektionszeitpunkt auszeichnete und die durch den TCID50-Test
nachgewiesene Infektion in den Myokardproben bestätigte.
- 48 -
Ergebnisse
MW
100bp 4x107
7
6
6
6
1x10 8x10 4x10 1x10 4x10
Kontrollfragment
(264 bp)
5
4x10
4
co
7
4x10 1x10
7
8x10
6
6
4x10 1x10
Anzahl der
Moleküle
6
cDNA-Probe (β-Aktin)
(348 bp)
Abb. 8: Semiquantitative β-Aktin RT-PCR. Untersuchung einer Myokardprobe auf β-Aktin
Expression unter Verwendung eines kompetitiven Kontrollfragmentes. Das Kontrollfragment
wurde in Verdünnungen von 4x107 bis 1x104 in die PCR eingesetzt, die zu untersuchende
Myokardprobe in Verdünnungen von 4x107 bis 1x106. Beide Fragmente unterschieden sich im
Agarosegel durch unterschiedliche Basenpaargrößen. (MW: Molekulargewicht; bp: Basenpaare; co:
PCR ohne Kontrollfragment)
Das Zytokinmuster wies am Tag 7 p. i. keine Unterschiede in den Expressionssignalen
zwischen beiden Mäusestämmen auf, ausgenommen die CD4-T-Zell relevanten Zytokine IL2 und IL-10, die sehr schwach oder gar nicht im Myokard von MHC Klasse II knockout
Mäusen nachweisbar waren (Abb. 9).
Die Untersuchungszeitpunkte der chronischen Phase – 21. und 56. Tag p. i. – waren für
Myokardproben immunkompetenter Mäuse durch eine fehlende Expression des VP1-Gens
gekennzeichnet. Dieser Befund korrelierte mit den Daten der Virustiterbestimmung und war
konsistent mit der Ausheilung der akuten Myokarditis in diesen Mäusen (Abb. 9).
Entsprechend konnte bei dem immunkompetenten Mausstamm eine Verringerung der
Expression der Zytokine auf ein schwaches bzw. nicht mehr nachweisbares Niveau
beobachtet werden. Das Expressionsmuster ähnelte dem nicht-infizierter Kontrollmäuse
(Abb. 9). Im Vergleich dazu konnte an den Tagen 21 und 56 p. i. in immundefizienten
Mäusen ein unverändert hohes VP1-Expressionsniveau detektiert werden. Dies belegte die
Persistenz der viralen mRNA im Herzmuskelgewebe und bestätigte den mittels TCID50
ermittelten unverändert hohen Virustiter (Abb. 9). Ebenso zeigten diese Mäuse
persistierende hohe Zytokinspiegel (Abb. 9). Besonders die Zytokine IFN-γ, TNF-α, IL-6 und
IL-1β waren an den beiden untersuchten Zeitpunkten der chronischen Phase in konstanter
Expressionsstärke nachweisbar und stützten damit den Befund einer manifestierten
chronischen Myokarditis in diesem Mausstamm (Abb. 9).
- 49 -
Ergebnisse
C57BL/6 Maus
Infiltration
Fibrose
Virustiter
Tage p. i. KT
MW 100bp -
7
7
++++ +++
8,0 6,76
21
-
MHC Klasse II ko Maus
21
+/-
56
-
56
-
KT
-
7
+++
6,33
7
+++
5,63
21
+++
+++
6,0
21
56
56
+++ +++ ++++
+++ ++++ ++++
5,0 6,0 4,83
β-Aktin
VP1
IFN-β
IL-2
IFN-γ
IL-10
IL-12p40
TNF-α
IL-1α
IL-1β
IL-6
Abb. 9: Expression von entzündungsspezifischen Zytokinen im Myokard während einer CVB3Infektion. Dargestellt ist die mRNA Expression von β-Aktin, VP1 sowie von spezifischen Zytokinen im
Myokard von MHC Klasse II ko Mäusen und C57BL/6 Mäusen 7, 21 und 56 d p. i. im Vergleich zu
nicht-infizierten Kontrolltieren. Angegeben sind zusätzlich die histologische Bewertung des
Infiltrations- und Fibrosegrades der entsprechenden Mäuse sowie der Virustiter im Herzmuskel. (MW:
Molekulargewicht; bp: Basenpaare, KT: nicht-infizierte Kontrolltiere; d: Tag; ko: knockout)
- 50 -
Ergebnisse
5.1.2.2 Expression von PDGF-Isoformen
Die Fibrosierung des Myokards als Folge eines chronischen Entzündungsprozesses trägt
wesentlich zur Entstehung einer Herzinsuffizienz bei. Für die Entstehung der Fibrose stellt
die Proliferation myokardialer Fibroblasten einen entscheidenden Faktor dar. Dieser Prozess
kann durch verschiedene Wachstumsfaktoren, wie dem Blutplättchenwachstumsfaktor
(platelet-derived growth factor/ PDGF) und seiner Rezeptoren, stimuliert werden.
Die Untersuchung der mRNA-Expression im Prozess der CVB3-induzierten Myokardfibrose
erfolgte für die PDGF-Isoformen A, B und C. Die PDGF-D-Isoform wurde wegen ihrer
geringfügigen Beteiligung an inflammatorischen Prozessen nicht analysiert.
In Abb. 10 sind neben der Expression der mRNA von PDGF-Faktoren zusätzlich die
Amplifikation des β-Aktin und des CVB3-Kapsidgens (VP1) sowie die histologischen Befunde
und
der
nachgewiesene
Virustiter
dargestellt.
In
Korrelation
mit
dem
akuten
Entzündungsprozess am 7. Tag p. i. konnte in den entsprechenden Herzen eine moderate
bis starke Expression der untersuchten PDGF-Isoformen A, B und C festgestellt werden.
Zwischen
beiden
Mäusestämmen
bestanden
zu
diesem
Infektionszeitpunkt
keine
Unterschiede in der Expression. Im Vergleich zu CVB3-infizierten Tieren wurden in nichtinfizierten Kontrollmäusen nur geringe mRNA-Spiegel der PDGF-Isoformen nachgewiesen.
Zum Untersuchungszeitpunkt der chronischen CVB3-Infektion – 56 Tage p. i. – wies die
PDGF mRNA-Expression jedoch Differenzen zwischen beiden Mäusestämmen auf. Im
ausgeheilten Myokard immunkompetenter C57BL/6 Mäuse war zu diesen Zeitpunkten die
mRNA der untersuchten PDGF-Isoformen nur noch entsprechend dem Expressionsniveau
von nicht-infizierten Kontrolltieren detektierbar. Die Expression der PDGF-Isoformen B und C
war schwach bis kaum noch nachweisbar. Nur PDGF-A mRNA konnte in diesem Stadium
der Infektion im Myokard von C57BL/6 Mäusen mit einem schwachen bis moderaten
Expressionsniveau dokumentiert werden. In Korrelation mit der persistierenden Myokarditis
im Myokard von MHC Klasse II knockout Mäusen war eine moderate Expression der mRNA
der untersuchten PDGF-Isoformen auch am Tag 21 und 56 nach CVB3-Infektion feststellbar
(Abb. 10).
Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass eine akute CVB3-induzierte Myokarditis
in beiden Mäusestämme eine starke Expression der PDGF-Isoformen A, B und C und der
Zytokine TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6 und IFN-β bewirkt. Die Beteiligung einiger dieser Faktoren
am Prozess der sich ausbildenden Fibrose im Myokard von MHC Klasse II knockout Mäusen
konnte vermutet werden, da zu den chronischen Zeitpunkten eine uneingeschränkte
Expression dieser Faktoren nachweisbar bleibt.
- 51 -
Ergebnisse
C57BL/6 Maus
Infiltration
Fibrose
Virustiter
Tage p. i. KT
MW 100bp -
7
7
++++ +++
8,0 6,76
21
-
21
+/-
MHC Klasse II ko Maus
56
-
56
-
KT
7
7
21
21 56 56
+++ +++ +++ +++ +++ ++++
+++ +++ ++++ ++++
6,33 5,63 6,0 5,0 6,0 4,83
β-Aktin
VP1
PDGF-A
PDGF-B
PDGF-C
Abb. 10: Expression von PDGF-Isoformen während der CVB3-Infektion. Die Expression der
mRNA von PDGF-A, -B, -C sowie von β-Aktin und des Kapsidproteins von CVB3 VP1 wurde nach
einer Infektion von CVB3 nach 7, 21 und 56 Tage p. i. im Herzmuskelgewebe von MHC Klasse II ko
Mäusen und C57BL/6 Mäusen untersucht und mit nicht-infizierten Kontrolltieren verglichen. Die PCRBedingungen waren so eingestellt, dass in nicht-infizierten Kontrollmäusen nur ein minimales
Hintergrundsignal verblieb. Weiterhin sind die histologische Bewertung hinsichtlich Infiltrat und Fibrose
sowie der mittels TCID50 analysierte Virustiter im Myokard der abgebildeten Probe angegeben. (MW:
Molekulargewicht; bp: Basenpaare, KT: nicht-infizierte Kontrolltiere; d: Tag; ko: knockout)
5.1.3 Zelluläre Charakterisierung der CVB3-induzierten Myokardinfiltrate
Die Methode der RT-PCR gestattete eine Aussage über ein erhöhtes Expressionsniveau von
verschiedenen PDGF-Isoformen im viral-entzündeten Myokardgewebe, gab aber keinen
Aufschluss über die mögliche zelluläre Herkunft des jeweiligen Wachstumsfaktors im
Gewebe. Eine mögliche Methode derartige Informationen zu erhalten, ist die In SituHybridisierung (ISH). Der Nachweis von spezifischer mRNA direkt auf den zu
untersuchenden
Gewebeschnitten
ist
im
Vergleich
zur
immunhistochemischen
Verfahrenstechnik von Vorteil, da es in der zellulären Entwicklung oft eine signifikante
zeitliche Differenz zwischen Transkription der mRNA und Translation der Proteine des zu
untersuchenden Gens gibt. Weiterhin ist die Spezifität der ISH, insbesondere durch die
Verwendung von sense-Sonden als Kontrolle, gegenüber der Immunhistochemie gegeben.
In Paraffin eingebettete Herzgewebeschnitte von immundefizienten MHC Klase II knockout
Mäusen und immunkompetenten C57BL/6 Mäusen wurden an den Tagen 7, 21 und 56 p. i.
- 52 -
Ergebnisse
mittels ISH auf die mRNA-Expression von PDGF-C und des viralen Gens VP1 untersucht
und mit naiven nicht-infizierten Kontrollmäusen beider Stämme verglichen.
5.1.3.1 Nachweis von PDGF-C im Myokard
Um Auskunft über die mögliche zelluläre Herkunft und die exakte Lokalisation von PDGF-C
im viral induzierten Herzgewebe zu erhalten, wurde die mRNA von PDGF-C mittels einer
DIG-markierten antisense-RNA-Sonde nachgewiesen. Der Vorteil der RNA-Sonde lag in
ihrer hohen Sensitivität und Spezifität. Der zum Vergleich erfolgte Einsatz einer PDGF-C
DIG-markierten sense-RNA-Sonde belegte die Spezifität der mit der antisense-Sonde
erhaltenen Signale. Als weitere Kontrolle wurden konsekutive Gewebeschnitte ohne
Gensonde behandelt. Alle abgebildeten Myokardpräparate wurden nicht gegengefärbt und
mit einer 200-fachen Vergrößerung mikroskopisch aufgenommen. In Abb. 11 (C und D) ist
die Expression von PDGF-C im Herzgewebe 7 Tage nach CVB3-Infektion in beiden
Mäusestämmen dargestellt. Es konnten starke PDGF-C Hybridisierungssignale mit der
antisense-Sonde festgestellt werden. Die Lokalisation der nachgewiesenen Signale befand
sich im Bereich der Infiltrate. Infolgedessen wird vermutet, dass entweder die infiltrierenden
Zellen oder die myokardialen Fibroblasten eine mögliche Quelle für die Sekretion von PDGFC darstellen. Die Myokardschnitte, die mit der PDGF-C sense-Sonde behandelt wurden,
zeigten, ebenso wie die ohne Gensonde behandelten, keine spezifischen Signale, sondern
nur leichte Hintergrundsignale. Diese Kontrollen belegten die Spezifität der PDGF-C
antisense-Sonde (Abb. 11). Das ISH-Bild der PDGF-C Expression änderte sich mit dem
Zeitverlauf. Während in der akuten Phase der Myokarditis – 7. Tag p. i. – kein Unterschied
zwischen den untersuchten Myokardproben beider Mäusestämme nachzuweisen war,
konnten an den Tagen der chronischen Phase deutliche Diskrepanzen festgestellt werden.
Einhergehend mit dem Abheilen der akuten Myokarditis in immunkompetenten C57BL/6
Mäusen konnte nach 21 bzw. 56 Tagen p. i. nur ein basales Expressionsniveau von PDGF-C
mRNA in den Kardiomyozyten detektiert werden (Abb. 11F und H). Dies deutet auf ein in
niedriger Konzentration stetig vorhandenes endogenes PDGF-C im Myokard hin und deckt
sich mit den Ergebnissen der nicht-infizierten Kontrollproben in der RT-PCR (Abb. 10). Im
Gegensatz dazu war ein gleich bleibend hohes PDGF-C mRNA-Signal in den
Myokardproben der MHC Klasse II knockout Mäuse am 21. und 56. Tag p. i. nachweisbar.
Die Hauptlokalisation von PDGF-C lag wiederum in den Bereichen von infiltrierenden,
inflammatorischen Zellen (Abb. 11E und G).
- 53 -
Ergebnisse
PDGF-C
MHC Klasse II ko Maus
C57BL/6 Maus
A
B
C
D
E
F
G
H
KT
d 7 p. i.
d 21 p. i.
d 56 p. i.
Abb. 11: In Situ-Hybridisierung (ISH) von PDGF-C mRNA im Myokard nach CVB3-Infektion.
Vergleich von MHC Klasse II ko Mäusen (A, C, E und G) und C57BL/6 Mäusen (B, D, F und H). Der
PDGF-C Nachweis erfolgte mit einer DIG-markierten PDGF-C antisense-RNA-Sonde, die mit einer
DIG-markierten PDGF-C sense-RNA-Sonde (Negativkontrolle; kleine Abbildungen) verglichen wurde.
In den Kontrolltieren (A+B) war ein Basalsignal von PDGF-C mRNA detektierbar. Starke
Hybridisierungssignale von PDGF-C mRNA ließen sich am 7. d p. i. in beiden Mäusestämmen (C+D)
sowie am 21. (E) und 56. (G) d p. i. im Myokard von MHC Klasse II ko Mäusen durch dunkelblau bis
braun gefärbte Areale nachweisen. Sehr gut zu unterscheiden sind positive, reagierende
inflammatorische Zellen (schwarze Pfeile) von weniger reaktiven Kardiomyozyten (grüne Pfeile). 21
(F) und 56 (H) d p. i. ließ sich im Myokard der C57BL/6 Mäuse kein PDGF-C mehr nachweisen. (ko:
knockout, KT: Kontrolltiere; d: Tag, 200-fache Vergrößerung)
- 54 -
Ergebnisse
5.1.3.2 Nachweis des viralen Genoms im Gewebeschnitt
Die Detektion des CVB3-Genoms im infizierten Herzmuskelgewebe mittels ISH stellt eine
Nachweismöglichkeit zur Untersuchung von Kinetik und Persistenz des viralen Agens im
Myokard dar. Insbesondere die genaue Lokalität des Virusgenoms im Myokardgewebe
während der Infektion kann durch diese Methode sichtbar gemacht werden. Die Verwendung
einer DIG-markierten DNA-Sonde gegen das CVB3 Kapsidgen VP1 gestattete auf Grund der
hohen Sensitivität nicht nur den Nachweis in der akuten Infektionsphase sondern auch die
Untersuchung der persistierenden Infektion im Herzgewebe. Als Kontrolle wurden
konsekutive Gewebeschnitte ohne Gensonde behandelt. Dies stellt keine sehr stringende
Spezifitätskontrolle dar, jedoch konnte die Spezifität dieses Nachweises des Virusgenoms
durch frühere Untersuchungen ausführlich abgeklärt werden
66
. Alle Myokardpräparate
wurden mit Hämatoxylin zur besseren Darstellung gegengefärbt und mit einer 400-fachen
Vergrößerung lichtmikroskopisch aufgenommen.
In Übereinstimmung mit der Virustiterbestimmung (TCID50-Test) und dem VP1-Nachweis in
der RT-PCR war 7 Tage p. i. die Genomsequenz für das CVB3-Kapsidgen VP1 mittels ISH
im Myokardgewebe beider Mäusestämme nachweisbar (Abb. 12C und D). Die Lokalisation
des CVB3-Genoms erschien als Folge der hämatogenen Infektion der Myozyten
typischerweise in Gefäßnähe. Ein Unterschied in der Stärke der Infiltration und der Anzahl
der viruspositiven Myozyten war zwischen beiden Mäusestämmen nicht festzustellen.
Während 21 bzw. 56 Tage p. i. kein CVB3-Genom-Nachweis in immunkompetenten C57BL/6
Mäusen mehr belegbar war (Abb. 12F und H) und das Bild den dokumentierten
Heilungsprozess reflektierte, zeigte sich in den untersuchten Myokardpräparaten von MHC
Klasse II knockout Mäusen eine vermehrte Anzahl von viruspositiven Myozyten (Abb. 12E
und G). Das persistierende Virusgenom war bevorzugt in Gebieten endomyokardialer
Läsionen zu finden, was histologisch mit dem Bild einer progressiven interstitiellen Fibrose
korrelierte und das Modell der chronisch manifestierten Myokarditis vervollständigte (Abb.
12E und G).
Zusammenfassend konnte festgehalten werden, dass durch ISH eine Lokalisation von
PDGF-C und VP1-Genom in der akuten Phase einer CVB3-Infektion in und um die
myokardialen Infiltrate gelang. Die Persistenz der PDGF-C-Signale in MHC Klasse II
knockout
Mäusen
korrelierte
mit
dem
Nachweis
des
Virusgenoms
zu
diesen
Infektionszeitpunkten und legte einen Zusammenhang hohen Expressionssignalen von
PDGF-C und anhaltender Virusinfektion im Myokard nahe.
- 55 -
Ergebnisse
virale RNA
MHC Klasse II ko Maus
C57BL/6 Maus
A
B
C
D
KT
d 7 p. i.
E
F
d 21 p. i.
G
H
d 56 p. i.
Abb. 12: In Situ-Hybridisierung (ISH) des viralen Genom im Herzmuskel nach CVB3-Infektion.
Vergleich von MHC Klasse II ko Mäusen (A, C, E und G) sowie C57BL/6 Mäusen (B, D, F und H). Die
Spezifität der Sonde belegen Kontrollschnitte (kleine Inserts), die keine positiven
Hybridisierungssignale aufweisen. Die Kontrolltiere (A+B) zeigen keine positiven Signale gegen das
Kapsidgen VP1. VP1-RNA ist 7 d p. i. in beiden Mäusestämmen (C+D) sowie am 21. (E) und 56. (G) d
p. i. im Myokard von MHC Klasse II ko Mäusen durch dunkelblaue bis braune Färbung erkennbar.
VP1-RNA ist hauptsächlich in Kardiomyozyten detektierbar (weiße Pfeile). Myokardpräparate von
C57BL/6 Mäusen 21 (F) und 56 (H) d p. i. weisen keine Spuren einer Virusinfektion mehr auf.
(Hämatoxylin-Färbung; ko: knockout, KT: Kontrolltiere; d: Tag, 400-fache Vergrößerung)
- 56 -
Ergebnisse
5.1.4 Immunhistochemische
Untersuchung
des
PDGF/PDGFR-Systems
im
entzündeten Myokardgewebe
Unter Verwendung spezifischer Antikörper sollten in der Immunhistochemie (IHC)
Informationen über zelluläre Aktivitäten des PDGF/PDGFR-Systems im Verlauf der CVB3induzierten Myokarditis erhalten werden. Dazu wurden 10 µm Kryoschnitte des jeweiligen
Myokardgewebes
immunhistochemisch
untersucht.
Dabei
war
die
Reaktion
des
entsprechenden Antikörpers mit dem spezifischen Antigen im Gewebeschnitt durch ein rotes
Signal zu erkennen. Alle Präparate wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, so dass die
Zellkerne dunkelblau und das Zytoplasma zur besseren Darstellung im Präparat hellblau
erschienen. Weitergehend wurden die Präparate mit einer 200-fachen Vergrößerung
mikroskopisch aufgenommen. Der Antikörper gegen das PDGF-C – der freundlicherweise
von Dr. Yuan-Jang Tsai, Division of Reproduction and Endocrinology, Department of Medical
Research, Mackay Memorial Hospital, Tamshui, Taiwan zur Verfügung gestellt wurde –
erkannte im Myokardschnitt spezifisch ein Epitop in biologisch aktivierten PDGF-C. Die
Antikörper-Antigen-Reaktion dieses Antikörpers konnte – als Negativkontrolle – mit dem zur
Immunisierung verwendetem Peptid blockiert werden (Abb. 13.1C und D – kleine Inserts).
Für den Nachweis der PDGF-Isoformen A und B, des PDGFα Rezeptors sowie der
aktivierten Form von Akt/PKB (p-Akt) im viral entzündeten Myokardgewebe wurden käuflich
erworbene Antikörper verwendet. Für diese wurde als Negativkontrolle anstelle des
spezifischen Antikörpers polyklonales Kaninchen IgG (4µg/ml, Santa Cruz) auf die
Myokardschnitte gegeben (exemplarisch dargestellt in Abb. 13.2C und D – kleine Inserts).
Bei allen Untersuchungen wurden außerdem Negativkontrollen unter weglassen des
Primärantikörpers durchgeführt (exemplarisch gezeigt in Abb. 13.3C und D – kleine Inserts).
5.1.4.1 Nachweis von PDGF-Faktoren im Myokard während der akuten CVB3-Infektion
Positive Signale der PDGF-Isoformen (A, B und C) sind in der Abb. 13.1-13.3 dargestellt. Die
Lokalisation der Antikörperfärbungen erfolgte in den massiven Infiltraten und den damit
einwandernden Immunzellen im Herzgewebe (Abb. 13.1-13.3C und D). Es waren keine
Unterschiede in der Stärke der nachgewiesenen Färbung zwischen beiden Mäusestämmen
an diesem Infektionstag zu erkennen. Die mitgeführten Kontrollschnitte der einzelnen
Myokardpräparate wiesen keine Antigen-Antikörper-Reaktion auf (Abb. 13.1-13.3C und D –
kleine Inserts). Die Untersuchung des PDGFα Rezeptors zeigte ebenfalls eine spezifische
Färbung im inflammatorischen Gewebe. Der Rezeptor konnte somit in unmittelbarer Nähe
von PDGF-C detektiert werden (Abb. 13.1/13.4). Zusätzlich war eine spezifische Färbung
von Gefäßzellen bei der Verwendung dieses Antikörpers zu beobachten. Akt/PKB ist ein
Signalmolekül „stromabwärts“ von aktivierten PDGF-Rezeptoren und wird über den PI3Kinase Weg durch den Lipidmediator Phosphatidyl-3,4,5-triphosphat (PIP3) aktiviert. Der
- 57 -
Ergebnisse
verwendete Antikörper erkannte selektiv aktiviertes Akt/PKB (p-Akt) und gab auf diese Weise
indirekt Informationen zur Aktivierung der PDGF-Rezeptoren im entzündeten Herzgewebe
(Abb. 13.5). Die nachgewiesene Antikörperfärbung am 7. Tag p. i. im entzündeten Myokard
beider Mäusestämme gruppierte sich im Wesentlichen um den Bereich von infiltrierenden
Immunzellen (Abb. 13.5C und D), ähnlich der nachgewiesenen Färbung des PDGFα
Rezeptors (Abb. 13.4C und D).
5.1.4.2 Nachweis des PDGF/PDGFR-Systems im chronisch entzündeten Myokardgewebe
Die durch Coxsackievirus B3 verursachte akute Entzündung des Myokards heilte bis zum 21.
Tag p. i. in immunkompetenten C57BL/6 Mäusen aus. Die Intensität der Färbungen für
PDGF-A, -B, -C, PDGFα Rezeptors und p-Akt/PKB Antigene ging bis zu einem geringen
Hintergrundssignal am 21. bzw. 56. Tag p. i. zurück und glich der nicht-infizierter naiver
Kontrollmäuse (Abb. 13.1-13.5B, F und H). In immundefizienten MHC Klasse II knockout
Mäusen ergab die immunhistochemische Untersuchung der PDGF-Isoformen A, B und C am
21. und 56. Tag p. i. jedoch weiterhin intensive Färbungen, die vor allem in Regionen mit
massiven immunzellulären Infiltraten zu erkennen waren (Abb. 13.1-13.3E und G). Diese
Ergebnisse glichen dem am 7. Tag p. i. erhaltenem Muster und bestätigten die
Expressionsmuster der RT-PCR sowie – für PDGF-C – die Ergebnisse der ISH. Ebenso
konnte in den chronischen Infektionsphasen im Myokardgewebe von MHC II knockout
Mäusen der PDGFα Rezeptor nachgewiesen werden (Abb. 13.4E und G). Dieser befand
sich bevorzugt in Regionen von Inflammation und Fibrose. Die spezifische Färbung war nicht
nur in Kardiomyozyten vorzufinden, ebenso konnte der PDGFα Rezeptor in kleinen Zellen
außerhalb der inflammatorischen Reaktion detektiert werden. Die Färbung von aktiviertem
Akt/PKB wurde in der Nähe der PDGFR-α Färbung lokalisiert und könnte die Folge einer
Aktivierung von PDGFR-α in den residenten Herzzellen sein (Abb. 13.5E und G).
Zusammenfassend war festzustellen, dass im Gewebe von immunkompetenten und
immundefizienten Mäusen zum Zeitpunkt der akuten Myokarditis kein Unterschied in der
Expression der PDGF-Isoformen, des PDGFR-α und der Aktivierung von Akt/PKB
feststellbar war. Die Lokalisation erfolgte hauptsächlich in Bereichen der Entzündungsherde.
Einhergehend mit dem Abheilen der akuten Myokarditis war ein Rückgang der Farbsignale
der untersuchten Antikörper im Myokard von C57BL/6 Mäusen feststellbar. Dagegen nahm
die zelluläre Zerstörung des Herzmuskels in den immundefizienten MHC Klasse II knockout
Mäusen zum späten Zeitpunkt der CVB3-Infektion weiter zu, besonders in Arealen der
Infiltrate konnte eine unveränderte Detektion von PDGF- und PDGFR-positiven Zellen
detektiert werden.
- 58 -
Ergebnisse
PDGF-C
MHC Klasse II ko Maus
C57BL/6 Maus
A
B
C
D
E
F
G
H
KT
d 7 p. i.
d 21 p. i.
d 56 p. i.
Abb. 13.1: Befunde der IHC-Untersuchung von PDGF-C im myokardialen Infiltrat nach Infektion
mit CVB3. Dargestellt sind Kryoschnitte von MHC Klasse II ko Mäusen (A, C, E und G) und C57BL/6
Mäusen (B, D, F und H), 7 (C+D), 21 (E+F) sowie 56 (H+G) d p. i., im Vergleich zu nicht-infizierten
Kontrolltieren (A+B). Durch schwarze Pfeile sind PDGF-C immunreaktive Zellen gekennzeichnet, die
sich in inflammatorischen Regionen und außerhalb des Infiltrates anfärben ließen. Die in C und D
dargestellten Inserts zeigen Negativkontrollen unter Verwendung des zur Blockierung der
Antikörperreaktion eingesetzten Peptids. (Hämatoxylin-Färbung; ko: knockout; KT: Kontrolltiere; d:
Tag; 200-fache Vergrößerung)
- 59 -
Ergebnisse
PDGF-B
MHC Klasse II ko Maus
C57BL/6 Maus
A
B
C
D
E
F
G
H
KT
d 7 p. i.
d 21 p. i.
d 56 p. i.
Abb. 13.2: IHC-Detektion von PDGF-B im Herzgewebe nach CVB3-Infektion. Vergleich von MHC
Klasse II ko Mäusen (A, C, E und G) und C57BL/6 Mäusen (B, D, F und H) an den
Untersuchungstagen 7 (C+D), 21 (E+F) sowie 56 (H+G) d p. i. Am 7. d p. i. konnte in und um das
Infiltrat von beiden Mäusestämmen PDGF-B detektiert werden (C+D) (schwarze Pfeile). Die
Anfärbung von PDGF-B immunreaktiven Zellen gelang nur bei einer Persistenz des myokardialen
Infiltrates in MHC Klasse II ko Mäusen (E+G). Die abgebildeten Inserts in C und D zeigen konsekutive
Kontrollschnitte unter Verwendung von Kaninchen IgG anstelle des primären Antikörpers.
(Hämatoxylin-Färbung; ko: knockout; KT: Kontrolltiere; d: Tag; 200-fache Vergrößerung)
- 60 -
Ergebnisse
PDGF-A
MHC Klasse II ko Maus
C57BL/6 Maus
A
B
C
D
E
F
KT
d 7 p. i.
d 21 p. i.
d 56 p. i.
Abb. 13.3: IHC-Nachweis von PDGF-A im Myokard nach Infektion mit CVB3. Kryoschnitten von
MHC Klasse II ko Mäusen (A, C, E und G) und C57BL/6 Mäusen (B, D, F und H) am 7. (C+D), 21.
(E+F) und 56. (G+H) d p. i. im Vergleich zu nicht-infizierten Kontrolltieren (A+B). PDGF-A konnte in
der akuten Phase in und um das entzündliche Infiltrat in beiden Mäusestämmen (C+D) (schwarze
Pfeile) sowie im Myokard von MHC Klasse II ko Mäusen an den beiden chronischen Zeitpunkten, 21.
(E) und 56. d p. i. (G) dokumentiert werden. Die abgebildeten Inserts in C und D stellen konsekutive
Negativkontrollen unter Verwendung von PBS anstelle des Primärantikörpers dar. (HämatoxylinFärbung; ko: knockout; KT: Kontrolltiere; d: Tag; 200-fache Vergrößerung)
- 61 -
Ergebnisse
PDGFR-α
MHC Klasse II ko Maus
C57BL/6 Maus
A
B
C
D
E
F
G
H
KT
d 7 p. i.
d 21 p. i.
d 56 p. i.
Abb. 13.4: Befunde der IHC-Untersuchung von PDGFR-α im Myokard nach CVB3-Infektion.
Vergleich von MHC Klasse II ko Mäusen (A, C, E und G) und C57BL/6 Mäusen (B, D, F und H) am 7.
(C+D), 21. (E+F) und 56. (G+H) d p. i. zu nicht-infizierten Kontrolltieren (A+B). Der PDGF-α Rezeptor
war nicht nur in infizierten Kardiomyozyten präsent, sondern auch in kleinen Zellen in und um die
Myokardläsionen (C+D) (schwarze Pfeile) sowie im persistent infizierten Myokard von MHC Klasse II
ko Mäusen am 21. (E) und 56. (G) d p. i. (Hämatoxylin-Färbung; ko: knockout; KT: Kontrolltiere; d:
Tag; 200-fache Vergrößerung)
- 62 -
Ergebnisse
Akt/PKB
MHC Klasse II ko Maus
C57BL/6 Maus
A
B
C
D
E
F
G
H
KT
d 7 p. i.
d 21 p. i.
d 56 p. i.
Abb. 13.5: IHC-Detektion von aktiviertem Akt/PKB (p-Akt) im CVB3-infizierten Myokard.
Kryoschnitte von MHC Klasse II ko Mäusen (A, C, E und G) und C57BL/6 Mäusen (B, D, F und H).
Während am 7. d p. i. in beiden Mäusestämmen im Infiltrat eine immunhistochemische Färbung von pAkt gelang (C+D) (schwarze Pfeile), konnte diese 21 (E) bzw. 56 (G) d p. i. nur noch im Infiltrat von
MHC Klasse II ko Mäusen nachgewiesen werden. Myokardpräparate von C57BL/6 Mäusen zeigten zu
diesen Zeitpunkten keine Antigen-Antikörper-Reaktionen mehr (D+F) und ähnelten den
Myokardschnitten von nicht-infizierten Kontrolltieren (A+B). (Hämatoxylin-Färbung; ko: knockout; KT:
Kontrolltiere; d: Tag; 200-fache Vergrößerung)
- 63 -
Ergebnisse
5.1.5 Analyse von gesteigerter PDGF-Aktivität im CVB3-infizierten Myokard
Die bisher beschriebenen mRNA-Expressionsnachweise und immunistochemische Analysen
belegten die erhöhte Expression von PDGF-Isoformen im CVB3-infizierten Myokardgewebe,
gaben jedoch nicht direkt Auskunft über ihre Aktivierung. Als Möglichkeit, die erhöhte
Aktivität von PDGF-Faktoren im CVB3-infizierten Herzmuskelgewebe nachzuweisen,
erschien die Extraktion der Faktoren und der Nachweis ihrer Aktivität an kultivierten
Fibroblasten in vitro. Fibroblasten besitzen durch das Vorhandensein beider PDGFRezeptoren – PDGFR-α und PDGFR-β – die Fähigkeit alle PDGF-Liganden zu binden. Die
Rezeptor-Aktivierung kann mittels SDS-PAGE und Immunblot unter Verwendung eines AntiPhosphotyrosin-Antikörpers (4G-10) dargestellt werden.
Myokardgewebe von MHC Klasse II knockout Mäusen und C57BL/6 Wildtypmäusen wurde
am 7., 21. und 56. Tag nach CVB3-Infektion in einer PBS-haltigen Lösung homogenisiert
und der erhaltende Extrakt oder entsprechendes Kontrollmedium wurde auf konfluent
gewachsene Swiss 3T3 Fibroblasten gegeben. Zum Vergleich und zur Standardisierung
wurden die Zellen unter denselben Bedingungen mit verschiedenen Konzentrationen (1,0;
2,5 oder 5,0 ng/ml) PDGF-BB inkubiert. PDGF-BB bindet an beide PDGFR-Isoformen
gleichermaßen gut. Die Fibroblasten wurden lysiert und die Zellüberstände für SDS-PAGE
und
Immunblot
aufgearbeitet.
Die
entstandenen
Banden
wurden
densiometrisch
ausgewertet. In Abb. 14 sind ein repräsentativer Immunblot mit der PDGFR-α/β-Bande (185
kDa) und die graphische Darstellung der quantifizierten Banden aus 9 Experimenten
dargestellt. Die Analyse zeigte, dass im CVB3-infizierten Myokard beider Mäusestämme
potentiell ein erhöhter Spiegel von aktiviertem-PDGF im Vergleich zu nicht-infizierten
Kontrolltieren vorhanden ist. Da jedoch bei dieser Untersuchungsmethode mit der
eingesetzten Menge an Herzgewebe die Nachweisgrenze erreicht war und die Signale sehr
stark schwankten, kann über signifikante Unterschiede zwischen beiden Mäusestämmen
oder über einen Anstieg oder Abfall der Expression zu späteren Infektionszeitpunkten – 21
und 56 Tage p. i. – aus diesen Daten keine Aussagen getroffen werden.
- 64 -
Ergebnisse
Densiometrische Anayse der PDGFR-Banden
18
16
Zell 1.0 2.5 5.0 C57BL/6
KT ng/ml PDGF-BB KT 7 21
14
MHC Klasse II ko
KT 7 21 Tag p. i.
12
PDGFRα/β
10
8
6
4
2
0
Zell-KT
1,0
ng/ml
PDGF-BB
2,5
ng/ml
5,0
ng/ml
KT
7
21
56
KT
C57BL/6 Maus
7
21
56
Tag p. i.
MHC Kasse II ko Maus
Abb. 14: Testung von Herzgewebe-Extrakten auf den Gehalt an PDGF durch Aktivierung von
PDGF-Rezeptoren in Swiss 3T3 Fibroblasten in vitro. Konfluente Swiss 3T3 Fibroblasten wurden
mit einem serumfreien Medium, in dem entweder die angegebene PDGF-BB Konzentration enthalten
war oder mit PBS-haltigen Myokardextrakten von nicht-infizierten oder CVB3-infizierten MHC Klasse II
ko Mäusen und C57BL/6 Mäusen (7 , 21 und 56 d nach CVB3-Infektion) inkubiert. Die Zellen wurden
lysiert und auf PDGFR-Phosphorylierung durch einen Immunblot mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörper
analysiert. Die Immunblots wurden über eine densiometrische Analyse quantifiziert. Die angegebenen
Werte sind relativ, in dem die mit 1 ng/ml PDGF-BB erhaltenen Signale mit 1,0 angegeben sind. Die
Abb. zeigt die graphische Darstellung und Zusammenfassung der Mittelwerte und
Standardabweichung aller analysierten Myokardproben sowie ein Immunblot als Beispiel. (Zell-KT:
3T3-Zellkontrolle; KT: Kontrolltiere; ko: knockout)
5.2
PDGF-Rezeptoren als mögliches Target zur Verringerung einer CVB3-
induzierten Fibrosierung des Myokards
Die in Teil 1 der Arbeit dargelegten Ergebnisse legen eine gesteigerte Aktivierung des
PDGF/PDGFR-Systems im Prozess der myokardialen Fibrosierung, ausgelöst durch eine
CVB3-Infektion, nahe. Mit den Methoden der semiquantitativen RT-PCR, der In SituHybridisierung und der Immunhistochemie konnte dokumentiert werden, dass ein lokal
erhöhter PDGF-Spiegel mit erhöhter Bindegewebsvermehrung im Myokard einherging. Die
denkbare kausale Beteiligung des PDGF/PDGFR-Systems an der Entwicklung von
Myokardfibrose sollte im zweiten Teil der Arbeit durch den Einsatz von Inhibitoren für die
PDGF-Rezeptor Signaltransduktion geprüft werden. Eine pharmakologisch aussichtsreiche
Strategie stellt dabei die direkte Blockade der enzymatischen Aktivität der PDGFR-Kinase
dar. Ein potenter und funktionsfähiger Blocker der PDGFR-Kinase ist die von NovartisPharma entwickelte Verbindung STI571 (CGP57148B) – Glivec.
- 65 -
Ergebnisse
Um den Effekt dieser Substanz auf die Fibrosierung des Myokard zu prüfen, wurden MHC
Klasse II knockout Mäuse mit CVB3-Mü/J infiziert und 2x täglich über die orale
Applikationsroute mit STI571 behandelt. Als Kontrollgruppen dienten parallel mitgeführte
MHC Klasse II knockout Mäuse, die mit CVB3-infiziert wurden und eine Vergleichslösung
(Aqua dest.) appliziert bekamen, sowie scheininfizierte Mäuse, denen entweder die STI571
Dosis oder eine Vergleichslösung verabreicht wurden.
5.2.1 Bioverfügbarkeit und Effizienz von STI571 im Myokardgewebe
Grundlage für eine effiziente Behandlung mit dem PDGFR-Blocker STI571 ist eine genügend
hohe Konzentration des Hemmstoffes im Zielorgan. Eine weitere Voraussetzung ist die
Verträglichkeit des Medikaments in der gewünschten Dosis.
5.2.1.1 STI571-Konzentrationen im Myokardgewebe
Zur Klärung der Frage, ob eine ausreichende STI571-Konzentration im Myokard erreicht
werden kann, wurde STI571 in zwei verschiedenen Konzentrationen – 50 und 150 mg/kg
Körpergewicht – über einen Zeitraum von 1 bis 3 Tagen an MHC Klasse II knockout Mäuse
verabreicht. Die STI571-Konzentration im Myokardgewebe wurde analysiert, indem das
Gewebe gemäß einer von NOVARTIS vorgegebenen Methode (Herzgewebe-Extraktion zur
Analyse von STI571(Glivec)) aufgearbeitet wurde. Die Konzentration des aus dem
Myokardgewebe extrahierten STI571 wurde freundlicher Weise von Dr. Gilles-Jaques Riviere
(NOVARTIS
Pharma,
Rueil-Malmaison,
Frankreich)
mittels
HPLC
bestimmt.
Die
gemessenen Rohdaten sind in Tab. 5 und 12 (im Anhang) dargestellt. Zu erkennen ist, dass
eine orale Applikation von STI571 ausreichte, um eine messbare Akkumulation dieser
Substanz im Herzgewebe zu erreichen. Diese war abhängig von der Dauer der Applikation
und der verabreichten Dosis. Im Vergleich zu scheininfiziertem Herzgewebe waren die
STI571-Anreicherungen im CVB3-infiziertem Herzgewebe offenbar erhöht. Da wegen der
Gruppeneinteilung und des begrenzten Myokardmaterials nur jeweils 2 Stichproben
genommen werden konnte, ließ die entsprechend niedrige Versuchstieranzahl keine
Berechung von Signifikanzen zu. Gleichwohl wird deutlich, dass, im Vergleich zu einer
Behandlung mit 50 mg/kg STI571, bei einer Behandlung mit 150 mg/kg STI571 eine höhere
Konzentration im Myokardgewebe messbar war. Ebenso führte eine Behandlung über einen
Zeitraum von 2-3 Tagen, gleich welcher Dosis, zu einer höheren STI571 Akkumulation im
Zielorgan. Der IC50-Wert von Glivec für die Inhibition der PDGFR-Tyrosinkinase in vitro liegt
bei 0,1 µM/l176 und wurde bei der Applikationsdauer von 3 Tagen in allen Fällen deutlich
überschritten.
- 66 -
Ergebnisse
Tab. 5: STI571-Konzentrationen im Herzgewebe von CVB3-infizierten und scheininfizierten
MHC Klasse II knockout Mäusen. Die vollständige Tabelle (Tab. 12), mit allen erstellten Daten
befindet sich im Anhang. Dargestellt ist neben der Behandlungsdauer und der verabreichten
STI571 Dosis die Berechung der vorliegenden STI571 Konzentration im Herzgewebe.
Herzgewebe
Behandlung
Tage
Konzentration Konzentration Konzentration
von
mit STI571
der
von STI571
von STI571
von STI571
scheininfizierten
Behandim
im
im
/CVB3lung
Herzextrakt;
Herzgewebe;
Herzgewebe;
infizierten
[ng/ml]
[ng/ml] (x10-²)
[µMol/l]
Mäusen
scheininfiziert
50 mg/kg
1
11,5
1,29
0,22
CVB3-infiziert
8. d p. i.
scheininfiziert
50 mg/kg
1
99,0
2,47
0,42
50 mg/kg
3
48
5,40
0,92
CVB3-infiziert
10. d p. i.
scheininfiziert
50 mg/kg
3
535
13,37
2,27
150 mg/kg
1
75,3
8,47
1,44
CVB3-infiziert
8. d p. i.
scheininfiziert
150 mg/kg
1
693
17,32
2,94
150 mg/kg
3
824
92,70
15,60
CVB3-infiziert
10. d p. i.
150 mg/kg
3
1810
45,25
7,67
5.2.1.2 Toxizität und Nebenwirkungen der STI571-Behandlung
Um toxische Eigenschaften und mögliche Nebenwirkungen im murinen Myokard, ausgelöst
durch eine STI571 Behandlung, zu untersuchen, wurden MHC Klasse II knockout Mäuse mit
CVB3-Mü/J infiziert und 20 Tage 2x täglich oral mit 50, 100 und 150 mg/kg STI571 behandelt
und das Körpergewicht gemessen. In Abb. 15 sind die Gewichtsverluste der einzelnen
Gruppen in Bezug auf das Ausgangsgewicht der Mäuse in Gramm dargestellt. Bei Mäusen,
die mit 150 mg/kg STI571 über einen Zeitraum von mehr als 7 Tagen behandelt wurden,
traten Gewichtsverluste auf, die binnen einer Woche zwischen 5 und 9 Gramm betrugen. Da
aus diesem Grund mit einer hohen Absterberate im Infektionsversuch gerechnet werden
musste, wurde der Versuch am 9. Tag abgebrochen. Die gewonnen Ergebnisse
dokumentierten, dass eine Behandlung mit 150 mg/kg STI571 zwar zu einer nachweisbar
hohen Dosis von STI571 im Myokard führte, die genannte Behandlung jedoch zu toxisch auf
die Mäuse wirkte. Dagegen vermochte die oral applizierte Dosis von 50 mg/kg STI571 eine
bereits ausreichende Konzentration im Herzgewebe zu erzielen und war darüber hinaus für
die
behandelten
Mäuse
gut
verträglich.
Die
Verwendung
einer
intermediären
Behandlungsdosis von 100 mg/kg STI571 zeigte ebenfalls eine gute Verträglichkeit für die
behandelten Mäuse (Abb. 15).
- 67 -
Ergebnisse
CVB3+150mg/kg
STI 571; n=5
Körpergewichtsverlust in Gramm
2
1
0
CVB3+Aqua dest;
n=5
-1
-2
nicht infizierte,
unbehandelteMäus
e; n=10
-3
-4
-5
Körpergewichtsverlust in Gramm
-6
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Scheininfekt
ion +
50mg/kg
STI 571; n=5
9
Tage p. i.
2
1
CVB3 +
50mg/kg
STI571; n=9
0
-1
-2
-3
CVB3 +
Aqua dest,
n=3
-4
-5
-6
0
1
2 3
4
5
6
7 8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Tage p. i.
2
nichtinfizierte,
unbehandelt
e Mäuse
Körpergewichtsverlust in Gramm
1
Scheininfektion
+ Aqua bidest;
n= 10
0
-1
Scheininfektion
+ 100mg/kg
STI571; n=19
-2
-3
CVB3 +
100mg/kg
STI571; n=19
-4
CVB3 + Aqua
bidest; n=15
-5
-6
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
Tage p. i.
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Abb. 15: Entwicklung und Änderung des Körpergewichtes von CVB3-infizierten MHC Klasse II
ko Mäusen unter Behandlung mit 150 mg/kg, 50 mg/kg und 100 mg/kg STI571. Als Vergleich
dienten CVB3-infizerte und mit Vergleichslösung behandelte Mäuse sowie scheininfizierte Mäuse, die
mit STI571 (für 50 bzw. 100 mg/kg) behandelt wurden. Des Weiteren ist eine Gruppe von naiven,
nicht-infizierten und unbehandelten Kontrollmäusen aufgeführt. Diese Gruppe wurde einmal
untersucht und als Kontrolle für alle weiteren Experimente verwand.
- 68 -
Ergebnisse
5.2.2 Effekte der STI571-Wirkstoffbehandlung auf die Aktivität des PDGF/PDGFRSystems
Um die Wirksamkeit der STI571-Behandlung auf die Aktivität des PDGF/PDGFR-Systems
direkt zu prüfen, wurden MHC Klasse II knockout Mäuse mit CVB3-Mü/J infiziert und 2x
täglich oral, von Tag 1 bis 6 p. i., mit STI571 behandelt. Das Myokardgewebe wurde
extrahiert und PDGF-Rezeptoren wurden durch Rezeptor-spezifische Immunpräzipitation
isoliert (siehe Methode: Detektion von PDGFR-Aktivierung mittels Immunpräzipitation). Als
Ladekontrolle wurde in den Lysaten ein Vinculinnachweis durchgeführt. Die technische
Qualität dieser Experimente war nicht zufrieden stellend. Der biochemische Nachweis von
aktivierten PDGF-Rezeptoren im Gewebe mit relativ geringem endogenem Spiegel ist
generell schwierig199. Im Myokardgewebe von CVB3-infizierten MHC Klasse II knockout
Mäusen war zum Zeitpunkt der akuten Infektion – 7. Tag p. i. – im Vergleich zu
scheininfizierten Mäusen, ein stärkeres Signal von phosphorylierten PDGF-Rezeptor
nachweisbar (Abb. 16). Die Zugabe von exogenen PDGF-BB zu den scheininfizierten
Myokardproben bewirkte die Phosphorylierung der immunpräzipitierten PDGFR, die somit
detektierte Bande war in einem verstärkten Niveau nachweisbar. Dagegen erzielte die
zusätzliche Gabe von PDGF-BB zu CVB3-infizierten Myokardproben keine verstärkte
Signalgebung des phosphorylierten PDGFR. Durch die orale Applikation des Tyrosin-KinaseHemmers STI571 in CVB3-infizierte Mäuse war eine deutliche Inhibierung der PDGFRPhosphorylierung im Myokardgewebe bestimmbar, die auch durch Zugabe von PDGF-BB
nicht reaktiviert werden konnte (Abb. 16).
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass trotz erheblicher Variabilität und dem
relativ niedrigen Anteil der PDGF-Rezeptoren in den Myokardproben ein verstärktes
PDGFR-Phosphorylierungssignal in der Mehrheit der CVB3-infizierten Myokardproben
vorgefunden wurde. Mit STI571 war es möglich, der PDGFR-Phosphorylierung im viral
entzündeten Herzgewebe entgegen zu wirken.
- 69 -
Ergebnisse
naive KT
CVB3
STI571
7 d p. i.
unbehandelt
7 d p. i.
150 mg/kg
unbehandelt
PDGFR-α/β
Vinculin
-
PDGF - BB
+
-
+
-
+
Abb. 16: Detektion von aktivierten PDGF-Rezeptoren in Herzextrakten. Myokardproben von
scheininfizierten und CVB3-infizierten MHC Klasse II ko Mäusen, die mit 150 mg/kg STI571 oder einer
Vergleichslösung für 6 Tage behandelt wurden, wurden mit einem Detergenz enthaltenden Lysispuffer
extrahiert. Durch Zugabe von einem Mix aus PDGFR-α und PDGFR-β Antikörpern wurden PDGFRezeptoren beider Klassen immunpräzipitiert. Diese Proben wurden mittels SDS-PAGE und
Immunblot mit Anti-Phosphotyrosin Antikörpern analysiert. Um eine annähernd gleiche Lademenge in
den Präzipitatproben zu erhalten, wurde eine Anti-Vinculin Kontrolle mit korrespondierenden
Lysataliquots (untere Reihe) durchgeführt. (ko: knockout; d: Tag; KT: Kontrolle)
5.2.3 Testung
von
generellen
Effekten
der
STI571-Behandlung
auf
kardiale
Fibroblasten
Ausgehend von den dargestellten Vorversuchen war zu erwarten, dass der Tyrosin-Kinase
Hemmstoff STI571 (Glivec) im Myokard von CVB3-infizierten MHC Klasse II knockout
Mäusen in ausreichender Konzentration vorliegt, um die PDGFR-Phosphorylierung zu
hemmen. Für den Fall einer kausalen Beteiligung der nachgewiesenen erhöhten Expression
von Faktoren der PDGF-Familie an der Fibrosierung im Myokard sollte die STI571Behandlung
entsprechend
einen
hemmenden
Einfluss
auf
die
Entwicklung
einer
myokardialen Fibrose nehmen. Zur Klärung dieser Frage wurden MHC Klasse II knockout
Mäuse mit CVB3 infiziert und vom frühesten möglichen Zeitpunkt – Tag 1 p. i. – 2x täglich
mit 50 oder 100 mg/kg STI571 für 20 Tage behandelt. Da durch die Behandlung mit STI571
die Anzahl der verwendeten Mäuse begrenzt gehalten werden musste, wurde die
Stichprobenanzahl in den einzelnen Gruppen im jeweiligen Behandlungsversuch (50 mg/kg
und 100 mg/kg) gering gehalten. Um dennoch eine Aussage über signifikante Unterschiede
- 70 -
Ergebnisse
in den jeweiligen Experimenten erstellen zu können, wurden die verwendeten Mäuse aus
den einzelnen Behandlungsgruppen vereint.
5.2.3.1 Einfluss der STI571-Behandlung auf CVB3-Infektion
Die Ausbildung einer massiven myokardialen Fibrose mit destruktiver Veränderung des
Myokards geht in diesem Mausmodell mit einer Persistenz des Coxsackievirus B3 einher.
Um auszuschließen, dass eine Behandlung mit STI571 einen Einfluss auf die CVB3
Replikation im Myokard von MHC Klasse II knockout Mäusen ausübt und somit den
Krankheitsverlauf unerwartet verändert, wurde der Virustiter am 21. Tag p. i. mittels TCID50
untersucht. Im Herzmuskelgewebe von Scheininfizierten Mäusen mit oder ohne STI571
Behandlung waren keine replizierenden Viren detektierbar. Der ermittelte Virustiter von
CVB3-infizierten Mäusen, behandelt mit STI571 oder einer Vergleichslösung am 21. Tag p.
i., zeigte keinen Unterschied (Abb. 17). Die Viruslast war in uneingeschränkter Höhe
nachweisbar. Parallel zur Bestimmung des Virustiters im Myokard wurden die Organe
Pankreas und Milz auf replizierendes Coxsackievirus B3 untersucht. In CVB3-infizierten
Mäusen von beiden Versuchsgruppen, behandelt mit STI571 oder Vergleichslösung war 21
Tage p. i. in diesen Organen kein replizierendes Virus mehr nachweisbar.
6,33
5,83
lg TCID50/100mg Herzgewebe
5,33
4,83
4,33
3,83
3,33
2,83
kein replizierendes Virus detektierbar
2,33
scheininfiziert+Aqua dest; n=15
1
Scheininfektion+STI571;
n=28
CVB3+STI571; n=36
CVB3+Aqua dest; n=21
Abb. 17: Nachweis von CVB3 im Herzmuskelgewebe von MHC Klasse II ko Mäusen 21 Tage
nach CVB3-Infektion und Behandlung mit und ohne STI571. Zur statistischen Absicherung der
Stichprobenanzahl wurde die Summe aller Tiere verwendet. Graphisch dargestellt sind die Mittelwerte
und die Standardabweichungen. Der Vergleich der Mittelwerte erfolgte mit dem U-Test nach MannWhitney. In den Gruppen der scheininfizierten Mäuse, behandelt mit STI571 oder einer
Vergleichslösung, war kein replizierendes Virus feststellbar. Zwischen CVB3-infizierten und mit
STI571 behandelten Mäusen (dunkelgrau) und CVB3-infizierten mit Vergleichslösung behandelten
Mäusen (rot) konnte kein statistisch signifikanter Unterschied (p>0,05) festgestellt werden. Die
Nachweisgrenze lag bei 2,33 log TCID50 pro 100 mg Gewebe.
- 71 -
Ergebnisse
5.2.3.2 Effekte der STI571-Behandlung auf die Entwicklung von Fibrose im chronisch
entzündeten Myokard
Zur Analyse von Behandlungseffekten des PDGF-Rezeptor-Blockers STI571 auf die sich
entwickelnde Fibrose im Myokardgewebe von MHC Klasse II knockout Mäusen wurden zum
einen das Verhältnis des Herzgewichts zum Körpergewicht und zum anderen der
Schweregrad der sich ausbildenden Fibrose gemessen.
Die lange Behandlungsdauer mit STI571 offenbarte keine Anzeichen von Toxizität oder
erkennbaren Nebenwirkungen. Beide STI571-Konzentrationen – 50 mg/kg und 100 mg/kg –
zeigten somit gute Verträglichkeit. Die mit STI571 behandelten Mäuse wiesen im Vergleich
zu den mit einer Vergleichslösung behandelten Mäusen keinen Unterschied im ermittelten
Verhältnis des Herzgewichts zum Körpergewicht auf (Tab. 13 im Anhang).
Die histologische Untersuchung der Herzmuskelschädigung durch eine CVB3-Infektion
erfolgte an Paraffinschnitten, die zur Darstellung der Fibrosierung mit Siriusrot gefärbt
wurden. Um quantitative Unterschiede in der fibrotischen Entwicklung differenzierter
erfassen zu können, wurde die Siriusrot-Färbung mit einem Bildanalysesystem ausgewertet.
Das histologische Präparat wurde mit einer Bildanalysekamera aufgenommen und mit der
Software QWin der Firma Leica analysiert. In diese Auswertung gingen alle Tiere ein, die
einen positiven histopathologischen Befund im exokrinen Pankreas, verursacht durch die
CVB3-Infektion, aufwiesen. In Abb. 18.2 sind die Daten der graphischen Bildanalyse der
Siriusrot gefärbten Myokardschnitten dargestellt. Anzumerken im Hinblick auf diese Methode
ist, dass nicht nur neu gebildetes Bindegewebe detektiert wurde, sondern das ebenso
Gefäße sowie das Perikard rot dargestellt wurden. Aus diesem Grund war in Präparaten von
scheininfizierten Tieren ein Rotanteil von 2 bis 4% nachweisbar, der als Hintergrundwert
angesehen wurde (Abb. 18.2). Das histologische Bild von Kontrolltieren zeigte gelb gefärbte
Kardiomyozyten, die von einem rot gefärbten Perikard umgeben waren (Abb. 7). Im
Gegensatz dazu konnte in CVB3-infizierten MHC Klasse II knockout Mäusen am 21. Tag
nach Virusinfektion eine deutliche Vermehrung des Bindegewebes – manifestiert als Fibrose
– nachgewiesen werden (Abb. 7/18.1B und D). Es konnten Differenzen im gemessenen
Rotanteil des Herzmuskelgewebes zwischen CVB3-infizierten Mäusen, behandelt mit STI571
und den mit einer Vergleichslösung behandelten Mäusen festgestellt werden. Ein signifikant
geringerer Rotanteil war in STI571 behandelten Mäusen detektierbar (Abb. 18.2). Ferner
zeigten Siriusrot gefärbte Herzmuskelpräparate von CVB3-infizierten Mäusen, die mit STI571
behandelt wurden, häufiger Granulationsgewebe (Abb. 18.1A und C). Diese netzartigen
Strukturen bestimmen vornehmlich das Bild einer akuten CVB3-Infektion. Im Vergleich dazu
konnten in den Myokardpräparaten von CVB3-infizierten, mit einer Vergleichslösung
behandelten Mäusen, das typische Bild einer chronischen Myokarditis mit destruktiver
- 72 -
Ergebnisse
Zerstörung ganzer Muskelareale und massiver Bindegewebsvermehrung, vorgefunden
werden (Abb. 18.1B und D).
Schlussfolgernd kann festgehalten werden, dass die STI571 Konzentrationen 50 und 100
mg/kg STI571 im Mausmodell unter CVB3-Infektion gut verträglich waren und eine
signifikante Reduktion der Fibroseentwicklung bewirkten.
CVB3 + STI571
CVB3 + Aqua dest.
A
B
C
D
Abb. 18.1: Histopathologische Darstellung von Infiltrat und Fibrose im Myokard von CVB3infizierten Mäusen unter STI571 Behandlung. Abgebildet sind Myokardschnitte von CVB3infizierten STI571 behandelten (A und C) und CVB3-infizierten Aqua dest. (B und D) behandelten
MHC Klasse II ko Mäusen, 21 d nach CVB3-Infektion. Die Gewebeschnitte wurden entweder mit HE
(kleine Inserts) oder mit SI (große Abb.) gefärbt. Extensive inflammatorische Infiltrate (schwarze
Pfeile) und eine schwächere Ausbildung der Fibrose (SI-Färbung) sind in den STI571 behandelten
Myokardpräparaten sichtbar (A und C). Fibrotische Regionen sind durch blaue und GR Areale durch
grüne Pfeile gekennzeichnet. (ko: knockout; d: Tag; HE: Hämatoxylin/Eosin-Färbung; SI: SiriusrotFärbung; GR: Granulationsgewebe; 100-fache Vergrößerung).
- 73 -
Ergebnisse
**
18
*
Schweregrad der Fibrosierung [%]
16
14
12
10
8
6
4
2
0
scheininfiziert+Aqua bidest;n= 15
1
scheininfiziert+STI571; n=28
CVB3+STI571; n=34
CVB3+Aqua bidest; n=21
Abb. 18.2: Graphische Darstellung von Fibrose im Myokard von CVB3-infizierten Mäusen unter
STI571 Behandlung. Schweregrad von ausgebildeter Fibrose im Myokard von CVB3-infizierten MHC
Klasse II ko Mäusen – 21 d p. i. – mit CVB3. Die Mäuse wurden entweder mit STI571 (dunkelgrau)
oder mit einer Vergleichslösung (rot) behandelt. Als Kontrolle dienten scheininfizierte Mäuse, die mit
STI571 behandelt wurden (hellgelb) und scheininfizierte mit Aqua dest. behandelte Tiere (hellgrau).
Zur statistischen Absicherung der Stichprobenanzahl der Mittelwerte wurden alle Tiere aus den
Versuchen über 21 d Behandlung mit 50 und 100 mg/kg STI571 zusammengezogen. Graphisch
dargestellt sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen. Der Vergleich der Mittelwerte erfolgt
statistisch mit dem U-Test nach Mann-Whitney und zeigt zwischen den Werten der CVB3-infizierten
STI571 behandelten Tieren und den CVB3-infizierten, mit einer Vergleichslösung behandelten Tieren
einen signifikanten Unterschied (p< 0.05**/*). (ko: knockout; d: Tag)
5.2.3.3 Etablierung von Indikationsmarkern einer Fibrose
Nach einer CVB3-Infektion kann eine ausgebildete Fibrose im Herzgewebe mit einer
Siriusrot-Färbung nicht vor dem 21 Tag p. i. dargestellt werden. Zudem erlaubt die
Quantifizierung des Rotanteils keine Differenzierung zwischen ausgebildeter Fibrose und
Granulationsgewebe. Dementsprechend wären andere potentielle Fibroseindikatoren, die
schon sehr frühzeitig einen Behandlungserfolg im etablierten Mausmodell anzeigen von
Vorteil. Es ist publiziert, das Tenascin-C ein Marker für Fibrose ist200. Immunhistochemische
Analysen gegen Tenascin-C lassen jedoch keine Differenzierung zwischen akuter und
chronischer Infektionsphase zu. Aus diesem Grund kann Tenascin nicht als alleiniger
Indikationsmarker für Fibrose verwendet werden. Mit Hilfe der RT-PCR Methode wurde
neben einer Tenascin-C Expression auch die Expression von Fibronektin-Fn (gesamt
Fibronektin) im Myokardgewebe untersucht. Für Fibronektin ist bekannt, dass es im
Rattenmodell der Nierenfibrosen Unterschiede in der Expression zwischen akuter und
chronischer Phase aufzeigt201. Die Expression von Tenascin-C und Fibronektin-Fn wurde
- 74 -
Ergebnisse
durch eine semiquantitative RT-PCR analysiert. Die entstehenden PCR-Produkte wurden
mittels Ethidiumbromidfärbung und Densiometrie quantifiziert. Tenascin-C konnte 21 Tage p.
i. nur in den CVB3-infizierten Mäusen, behandelt mit einer Vergleichslösung, in einem
moderatem Niveau nachgewiesen werden (Abb. 19), wohingegen in Myokardproben von
CVB3-infizierten Mäusen, behandelt mit STI571, eine Reduktion des exprimierten TenascinC ersichtlich war. Ein ähnlich verlaufender Trend war in der Expression des Fibronektins
erkennbar (Abb. 19). Die densiometrische Auswertung der im Agarosegel sichtbaren DNABanden ist in Tab. 6 dargestellt. Um die mögliche Zu- oder Abnahme der Expression von
Tenascin-C und Fibronektin-Fn besser darstellen zu können, wurden die detektierten GelBanden der scheininfizierten, mit Vergleichslösung behandelten Kontrollmaus auf 1% und
alle folgenden Gel-Banden der verwendeten Myokardproben in das entsprechende
Verhältnis gesetzt.
MHC Klasse II knockout Mäuse; 21 Tage p. i.
CVB3
STI571
Infiltration
Fibrose
Virustiter
-
+
-
- + + +
+ + +
+ +
+ + + +
+
- ++ + +/- +++ + ++ ++ ++
- ++ +/++ - ++ +/++ ++ ++ +++
- 5.0 4.33 6.33 3.5 4.65 3.5 6.67 5.5
1
2
3
β-Aktin
VP1
Tenascin-C
FibronektinFn
4
5
6
7
8
9
10 11
Abb. 19: Expression von Fibrosemarker. Expression von β-Aktin, VP1, Tenascin-C und FibronektinFn im Myokard von MHC Klasse II ko Mäusen 21 d p. i. mit CVB3 behandelt mit STI571 oder
Vergleichslösung, im Vergleich zu scheininfizierten Mäusen, behandelt mit STI571 oder
Vergleichslösung. Angegeben sind zusätzlich die histologische Bewertung des Infiltrations- und
Fibrosegrades der entsprechenden Mäuse sowie der analysierte CVB3-Titer im Herzmuskelgewebe.
Scheininfizierte Mäuse: Reihe 1-3; CVB3-infizierte Mäuse: Reihe 4-11; Mäuse behandelt mit STI571:
Reihe 2-7; Mäuse behandelt mit Aqua dest: Reihe 1 und 8-11 (MW: Molekulargewicht; bp:
Basenpaare; ko: knockout; d: Tag)
- 75 -
Ergebnisse
Tab. 6: Darstellung der densiometrischen Auswertung, der in Abb. 19 analysierten AgarosegelBanden von β-Aktin, Tenascin-C und Fibronektin-Fn.
scheininfiziert + Aqua dest
scheininfiziert + 50 mg/kg STI571
scheininfiziert + 100 mg/kg STI571
CVB3 + 50 mg/kg STI571
CVB3 + 100 mg/kg STI571
CVB3 + 100 mg/kg STI571
CVB3 + 100 mg/kg STI571
CVB3 + Aqua dest.
CVB3 + Aqua dest.
CVB3 + Aqua dest
CVB3 + Aqua dest.
β-Aktin
Tenascin-C
Fibronektin-Fn
1,0
1,2
1,0
1,0
0,9
1,0
0,9
1,0
1,0
0,9
1,0
1,0
1,5
1,6
4,4
6,4
17,2
0,8
42,0
43,4
38,4
34,4
1,0
4,3
1,2
2,6
2,1
4,8
1,5
13,4
3,4
17,0
17,2
5.2.3.4 Verminderung der PDGFR-Aktivität durch Behandlung mit STI571 in der Entwicklung
von Myokardfibrose
Untersuchungen über die erhöhte Aktivität des PDGF-Rezeptors während der CVB3induzierten Myokarditis im ersten Teil dieser Arbeit zeigten eine Beteiligung des Rezeptors
am sich fibrotisch entwickelnden CVB3-induzierten Krankheitsverlauf. Dennoch konnten mit
den
verwendeten
Methoden
zum
Nachweis
der
PDGFR-Phosphorylierung
(Immunpräzipitation) und der PDGF-Ligandenaktivierung (Fibroblastenaktivierung) im
Myokard keine Unterschiede an verschiedenen Untersuchungszeitpunkten im chronisch
verlaufenden Krankheitsbild experimentell festgestellt werden. Die Gründe hierfür könnten in
technischen und methodischen Schwierigkeiten liegen. Ebenso stellten die begrenzten
Ressourcen des Myokardmaterials zur Analyse des aktivierten PDGF-Rezeptors ein Problem
dar. Eine indirekte Möglichkeit der Darstellung der Effektivität von STI571 im chronisch
entzündeten Myokard gestattet der immunhistochemische Nachweis von aktivierter Akt/PKBKinase (p-Akt). Zum chronischen Zeitpunkt – 21. Tag p. i. – einer CVB3-Infektion konnte in
Kryoschnitten von MHC Klasse II knockout Mäusen, die mit einer Vergleichslösung
behandelt wurden, myokardiales Infiltrat durch eine Hämatoxylin-Färbung aufgezeigt werden.
In den Regionen des Infiltrates zeigten sich starke Signale für p-Akt (Abb. 20B und D). Im
Vergleich dazu wiesen Herzpräparate von CVB3-infizierten, mit STI571 behandelten Tieren,
eine reduzierte Färbung mit Anti-p-Akt Antikörpern auf (Abb. 20A und C).
- 76 -
Ergebnisse
CVB3 + Aqua dest.
CVB3 + STI571
A
B
C
D
Abb. 20: Immunhistochemische Detektion von aktiviertem Akt/PKB. Kryoschnitte von CVB3infizierten MHC Klasse II ko Mäusen, 21 d p. i., behandelt mit STI571 (A und C) und einer
Vergleichlösung (B und D). Die Myokardpräparate wurden mit dem Antikörper phospho-Akt (Akt/PKB)
(große Abb.) oder zur Kontrolle ohne Primärantikörper (kleine Inserts) behandelt. Schwarze Pfeile
markieren Akt/PKB-immunreaktive Zellen im zellulären Infiltrat. (Hämatoxylin-Färbung; co: ohne
Primärantikörper; ko: knockout; 200-fache Vergrößerung)
Im Ergebnis bleibt festzuhalten, dass die Daten aus Teil 2 der Arbeit eine effiziente Wirkung
des PDGF-Rezeptor Blockers STI571 auf die Reduktion der Fibroseentwicklung in vivo
belegen. Der oral verfügbare Tyrosin-Kinase-Hemmstoff STI571 war im etablierten
Mausmodell der MHC Klasse II knockout Maus gut verträglich, im Myokardgewebe in
ausreichender
Konzentration
zur
Inhibierung
der
PDGF-Rezeptor-Phosphorylierung
nachweisbar und zeigte keinen Einfluss auf eine bestehende CVB3-Infektion. Bezüglich der
Unterdrückung bzw. Inhibierung einer sich entwickelnden Fibrose kann derzeit von einem
positiven Ergebnis ausgegangen werden. Weiterführende Untersuchungen im Hinblick auf
die Modalitäten des Behandlungszeitraumes werden zusätzliche Einblicke in die Effizienz
des Wirkstoffes STI571 und dessen Bedeutung für therapeutische Ansätze geben.
- 77 -
6. Diskussion
Diskussion
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, im etablierten Mausmodell der CVB3induzierten Myokarditis Fibrosierungsmechanismen am chronisch entzündeten Myokard mit
besonderem Augenmerk auf Faktoren des PDGF/PDGFR-Systems zu untersuchen. Ferner
wurde die denkbare kausale Beteiligung dieses Systems an der Entwicklung einer
Myokardfibrose durch den Einsatz eines Inhibitors der PDGFR-Signaltransduktion – STI571
– geprüft.
6.1
Rolle von Immundefizienz und Viruspersistenz für die Ausbildung einer
chronischen Myokarditis
Humanpathogene Coxsackie B3-Viren gelten als die häufigste virale Ursache einer
Herzmuskelentzündung und sind mit einer Insidenz von bis zu 50% als Erreger einer
Myokarditis verantwortlich16,26. Die genauen Pathomechanismen einer viralen bzw. chronisch
verlaufenden Myokarditis sind bis zum heutigen Zeitpunkt vielfach noch ungeklärt. Ebenso ist
der Übergang einer akuten Myokarditis in den chronischen Zustand mit Myokardfibrosierung
eine weitere unaufgeklärte Fragestellung.
Um Fibrosierungsmechanismen im viral-induzierten Myokard zu analysieren, sind MHC
Klasse II knockout Mäuse mit CVB3-Mü/J infiziert und mit histologischen, serologischen und
molekularbiologischen
Methoden
untersucht
worden.
Die
Ergebnisse
wurden
mit
b
Wildtypmäusen (C57BL/6), die einen identischen genetischen Hintergrund (H-2 ) besitzen,
verglichen. Die CD4-T-Zell defiziente MHC Klasse II knockout Maus ist durch das Fehlen des
MHC II Komplexes nicht in der Lage, auf eine bestehende CVB3-Infektion, CVB3spezifische-IgG und virusneutralisierende Antikörper zu bilden71.
Die Untersuchung des Myokards nach histologischen Parametern von immunkompetenten
C57BL/6 und immundefizienten MHC Klasse II knockout Mäusen am 7. und 21. Tag nach
CVB3-Infektion wurde in dieser Arbeit erneut vorgenommen, um einen Bestätigung der aus
der konventionellen Tierhaltung erhaltenden Daten zum beschriebenen Krankheitsbild zu
erhalten. Ebenso erfolgte die bisher ausstehende Charakterisierung eines späteren
Zeitpunktes in der chronischen Phase, der 56. Tag nach CVB3-Infektion. Im Stadium der
chronischen
Erkrankung
–
21
bzw.
56
Tage
nach
CVB3-Infektion
–
ist
die
Entzündungsreaktion in C57BL/6 Mäusen vollständig ausgeheilt. Im Gegensatz zu den
immunkompetenten Tieren bleibt die myokardiale Infiltration in MHC Klasse II knockout
Mäusen über die akute Phase hinaus bis einschließlich 56 Tage nach CVB3-Infektion
bestehen. Das histologische Bild dieser Mäuseherzen entspricht Befunden, die ebenso im
menschlichen myokardialen Krankheitsbild erhoben werden und kann demnach als
chronische Myokarditis gewertet werden58. Die fehlende Expression des MHC Klasse II Gens
und die damit verbundene Unfähigkeit dieser Mäuse zur Ausbildung einer virusspezifischen
IgG-Antikörper Antwort ist offenkundig die Ursache dafür, dass sich bei diesen
- 78 -
Diskussion
immundefizienten Mäusen bis zum 21. Tag nach CVB3-Infektion eine chronische
Verlausform der Myokarditis entwickelt. Die weitere Zunahme der Myozytenschädigung und
die damit verbundene Funktionsstörung des Myokards bis zum 56. Tag nach CVB3-Infektion
gleichen dem Bild einer inflammatorischen Kardiomyopathie beim Menschen. Ähnliche
Ergebnisse wurden in anderen immundefizienten Mäusestämmen erhalten. B-Zell-defiziente
Mäuse entwickeln nach einer CVB3-Infektion eine persistierende Myokardinfektion mit
schwerer Fibrosierung202. Ebenfalls zeigten Untersuchungen an IL-4-defizienten C57BL/6
Mäusen, dass diese Tiere nach einer CVB3-Infektion eine verzögerte Viruseliminierung im
Myokard aufweisen, die mit einer nachfolgenden Infiltration und Fibrosierung des Myokard in
bis zu 50% der infizierten Tieren einhergeht79. Auch bei immundefizienten CD40/BALB/c
knockout Mäusen, die auf eine CVB3-Infektion keine ausreichende anti-CVB3-IgG-Antikörper
entwickeln, ist die anti-CVB3-IgM-Antikörperantwort nicht hinreichend genug, um eine
chronische Myokarditis und Fibrosierung in der späten Infektionsphase zu verhindern,
wohingegen immunkompetente BALB/c Mäuse keine Chronizität ausbilden77.
Für die Entstehung einer chronischen Myokarditis und die Entwicklung einer dilatativen
Kardiomyopathie ist mehrfach in suszeptiblen Mäusestämmen gezeigt worden, dass eine
anhaltende Entzündung sowie die Fibrosierungsprozesse im Myokard unmittelbar gekoppelt
sind an eine Persistenz des Virusgenoms im Gewebe54,60,66,71. In ähnlicher Weise konnten
Enteroviren im Myokard von Patienten mit der Diagnose akute Myokarditis bzw. dilatative
Kardiomyopathie nachgewiesen werden20.
Nach dem in dieser Arbeit mittels Virustiterbestimmung sowie RT-PCR erhaltenen Daten
persisiert CVB3 in der chronischen Phase der Myokarditis bis einschließlich 56 Tage nach
CVB3-Infektion nur in MHC Klasse II knockout Mäusen. Die persistent infizierten
Myokardzellen sind hierbei in geschädigten Herzmuskelarealen lokalisiert, welche sich in der
histopathologischen
Untersuchung
durch
eine
interstitielle
Fibrose,
degenerierte
Kardiomyozyten und vereinzelte mononukleäre Zellen auszeichnen. Der Nachweis von viral
persistierenden CVB3-Genom wurde bereits früher in verschiedenen Mäusestämmen
beschrieben54,60,66. In der akuten Infektionsphase erfolgt nach diesen Daten in myokardialen
Zellen die Synthese großer Mengen viraler plusstrang RNA (Plusstrang zu Minusstrang
100:1), während in der chronischen Phase das Verhältnis zwischen Plus- zu Minusstrang
annähernd gleich ist54,203,204. Die virale Genexpression nimmt mit anhaltender Viruspersistenz
in den soliden Organen ab und spiegelt die eingeschränkte RNA-Synthese zu diesem
Zeitpunkt wieder54. Entsprechende Daten sind jedoch für das hier beschriebene
Infektionsmodell noch nicht erhoben worden. Es ist anzunehmen, dass die eingeschränkte
Antikörperproduktion, die in verschiedenen immundefizienten Mäusen zu beobachten ist, für
eine bestehende Persistenz des viralen Genoms im Myokard verantwortlich ist. In der Tat
weisen B-Zell-defiziente Mäuse nach einem B-Zell-Transfer aus CVB3-immunen Mäusen
- 79 -
Diskussion
eine Verringerung der Viruslast im Serum und in verschiedenen Organen auf, wodurch diese
Tiere überleben202. Inzwischen durchgeführte Untersuchungen an den hier verwendeten
CD4-T-Zell-defizienten MHC Klasse II knockout Mäusen zeigen, dass diese nach Gabe von
IgG-haltigem Serum von immunkompetenten C57BL/6 Mäusen in der Lage sind, den CVB3Titer im Myokard bis zum 21. Tag p. i. zu senken und die Ausbildung von myokardialen
Infiltraten stark zu verringern (Leipner et. al., unveröffentlichte Daten). Damit ist die kritische
Rolle der Viruspersistenz für die Unterhaltung der Myokarditis überzeugend belegt worden.
Auch für das menschliche Krankheitsbild wurde gezeigt, dass die Unfähigkeit zur
Antikörperproduktion zumindest zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber persistierenden
Coxsackievirus-Infektionen
führt205.
Die
Bedeutung
der
TH1/TH2
ausgeprägten
Immunantwort wurde auch anhand des Verlaufes der Virusmyokarditis beim Menschen
deutlich. Einen günstigeren Verlauf der Krankheit weisen die Patienten mit einer TH2vermittelten Immunantwort auf. So zeigten Patienten mit Spontanremission der Myokarditis
einen TH1/TH2-Übergang, während bei einem persistierenden Entzündungsprozess ein
TH1-Zytokinmuster oder TH2-Zytokinmuster mit verringertem IL-4 Spiegel dokumentiert ist48.
Ob die Anwesenheit des Enterovirusgenoms im Myokard für den klinischen Verlauf der
Erkrankung bedeutsam ist, wird in der Literatur widersprüchlich diskutiert. Figulla und
Mitarbeiter
fanden
Krankheitsverlauf
eine
in
verringerte
Patienten
mit
Letalität
und
einen
insgesamt
Enterovirusnachweis206,207.
Eine
günstigeren
gegensätzliche
Auffassung vertrat die Arbeitsgruppe um Why et. al., die zeigten, dass ein positiver Nachweis
von Entervirusgenom im Myokard bei Patienten mit DCM mit einer signifikant höheren
Letalität einherging208. Dessen ungeachtet scheint die Viruseliminierung eine wichtige
Strategie für eine kausale Therapie zu sein. Verschiedene Therapieansätze mit Interferon,
Hyperimmunserum und antiviralen Substanzen werden derzeit auf ihre Wirksamkeit
getestet209. Gegen Enteroviren ist das Virusstatika „Pleconaril“, das die Anheftung der Viren
an den Zell-Rezeptor verhindert, entwickelt worden210. Obwohl in einer klinischen Studie bei
78% der Patienten gute Verträglichkeit nachgewiesen werden konnte211, zeigt es keine
Wirksamkeit gegen den CVB3 Stamm Nancy210.
Eine andere antivirale Therapie bei Patienten mit molekularbiologisch nachgewiesener
Viruspersistenz könnte die Therapie mit Interferonen sein. Erste Daten von Patienten mit
DCM und positiven Enterovirusbefund zeigten, dass eine Behandlung mit IFN-β zu einer
vollständigen Viruselimination, zur Verbesserung der Pumpleistung sowie zur Reduktion der
Ventrikelgröße führte212.
- 80 -
Diskussion
6.2
Bedeutung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren für die Myokarditis
und Fibrosierung des Myokard
Der entstehende fibrotische Prozess im Herzmuskel nach einer CVB3-Infektion umfasst den
Austausch von mesenchymalen Zellen und der extrazellulären Matrix und endet zumeist im
Funktionsverlust des Gewebes213. Verschiedene Zytokine und Wachstumsfaktoren können
mesenchymale Zellproliferation und Matrixsynthese stimulieren und sind in Prozessen der
pathophysiologischen Fibrose und begleitenden chronischen Myokarditis beteiligt214,215.
Untersuchungen in verschiedenen Mausmodellen weisen auf die Expression von einer
Vielzahl von Zytokinen im Myokard nach Induktion mit kardiotrophen Viren sowohl in der
akuten wie auch chronischen Phase der Infektion hin60,75,79. Dass Immunmechanismen, wie
die Induktion von Zytokinen, eine wichtige Rolle im Entzündungsprozess des Herzmuskels
spielen, kann anhand der Untersuchung von Biopsien von Patienten mit akuter Myokarditis
bzw. dilatativer Kardiomyopathie angenommen werden. In diesem Material wurden deutlich
erhöhte Zytokinspiegel nachgewiesen63,216-218.
Um das Zytokinspektrum im Krankheitsverlauf der CVB3-induzierten Myokardits mit
besonderem Augenmerk auf fibrotische Prozesse zu untersuchen, ist in der vorliegenden
Arbeit das Expressionsmuster der Zytokine IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-12, TNF-α, IL-1 und
IL-6 analysiert worden. Am 7. Tag p. i. ist eine mäßige bis starke Expression der
untersuchten Zytokine nachweisbar, was auf eine maximal stimulierte Immunantwort
schließen lässt. Die untersuchte Zytokinantwort geht mit dem Nachweis des Virusgenoms
und der zellulären Infiltration im Myokard in dieser Phase der CVB3-Infektion einher. Eine
mögliche Quelle der Zytokinexpression während der akuten Phase der Myokarditis könnten
myokardiale Zellen, wie Myozyten, Fibroblasten und Endothelzellen darstellen. Vor allem
aber dürfte der Anstieg der Expression der Zytokine durch infiltrierende Leukozyten
erfolgen75,219,220. Auch in anderen tierexperimentellen Modellen der CVB3-induzierten
Myokarditis konnte während der akuten Phase eine verstärkte Expression von Zytokinen
nachgewiesen werden60,67,70,75.
Mit der Eliminierung von Coxsackie B3-Viren bis zum 21. Tag p. i. aus dem Myokard und
einem Abklingen der Entzündungsreaktion in der immunkompetenten C57BL/6 Maus geht
eine starke Reduktion der Zytokinexpression im Herzgewebe einher (Abb. 9). Eine erhöhte
Expression der Zytokine erfolgte in der chronischen Phase – 21 und 56 Tage p. i. – in den
Mäusen mit persistierendem Virus. Ähnliche Ergebnisse werden in anderen Mausmodellen
erhalten, in denen sich durch eine Viruspersistenz eine chronische Herzmuskelentzündung
ausbildet60,67. Die chronische Phase der CVB3-induzierten Myokarditis in MHC Klasse II
knockout Mäusen ist demnach nicht nur charakterisiert durch die Persistenz des viralen
Genoms sondern ebenso durch eine anhaltende Expression der Zytokin-mRNA. Einzelne
- 81 -
Diskussion
Zytokine des Immunsystems scheinen eine besondere Rolle in der anhaltenden Entzündung
im Myokard einzunehmen und sollen im Folgenden separat diskutiert werden.
Das antivirale Zytokin IFN-β, ein in die Gruppe der Typ-I-Interferone zu zählendes Zytokin,
wird nur in den Mäusen exprimiert, die im chronischen Entzündungsstadium persistierende
Viren im Myokard aufweisen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei NMRI-Mäusen erhalten,
die nach einer CVB3-Infektion eine chronische Myokarditis ausbilden60. IFN-β wird durch die
Virusreplikation induziert und scheint protektive Wirkungen für die betroffenen Mäuse
aufzuweisen, da IFN-I-Rezeptor knockout Mäuse eine 100%ige Mortalität auf Grund einer
massiven Virusreplikation in der Leber zeigen221. Jedoch vermag das endogene Typ-I-IFN,
im Gegensatz zum exogen zugeführten IFN-β, die Virusreplikation im Herzen nicht
vollständig zu unterdrücken222.
Eine starke Persistenz des Zytokins IFN-γ – eines Typ-II-Interferons – im Myokard von MHC
Klasse II knockout Mäusen in der späten Phase der CVB3-induzierten Myokarditis wird
ebenso in anderen experimentellen Modellen von chronischer Myokarditis in der Maus60,61
und bei Patienten mit DCM63 gefunden. INF-γ besitzt antivirale Wirkmechanismen durch
Hemmung der CVB3-Replikation223. Zugleich vermag eine IFN-γ-Antwort im murinen
Mausmodell eine schwere chronische Myokarditis durch eine Reduzierung der MastzellDegranulation und profibrotischer Zytokinantwort (TGF-β, IL-1β) zu vermindern224. Es kann
entsprechend angenommen werden, dass die beobachtete IFN-γ-Persistenz ebenfalls eine
protektive Wirkung auf die Mäuse hat.
Die inflammatorischen Zytokine IL-6, IL-1α und TNF-α können 21 bzw. 56 Tage nach CVB3Infektion in Mäusen mit persistierendem Virustiter im Myokard weiterhin in uneingeschränkt
hoher Expression detektiert werden. Für diese Zytokine (IFN-γ und TNF-α) ist bekannt, dass
sie die Expression der induzierbaren Stickoxidsynthetase (iNOS) stimulieren, welche die
Bildung von Stickoxid (NO) katalysiert67,225. Möglicherweise beruht die anti-CVB3-Wirkung
von NO auf der Inhibition der viralen Proteasen 3C und 2A, deren Cystein am aktiven
Zentrum nitrosyliert und dadurch inaktiviert wird. NO führt damit zur Inhibition der
Dystrophinspaltung und zur Unterbrechung des viralen Lebenszyklus52,225. Demnach kann für
diese Zytokine vermutet werden, dass die anhaltende Expression im Myokard im Sinne einer
verlängerten Immunabwehr gegen persistierende Coxsackie B3-Viren zu werten ist. Jedoch
könnten diese inflammatorischen Zytokine an der Induktion myokardialer Schäden und der
Entstehung der Fibrose während der chronischen Myokarditis beteiligt sein. So ist bekannt,
dass eine kontinuierliche IL-6 Expression im Myokard zur Schädigung von Myozyten führt218.
In TNF-α-transgenen Mäusen entwickelt sich eine schwere myokardiale Fibrose und
Kardiomegalie, die durch eine transmurale Myokarditis, ein dilatatiertes Herz und durch
myokardiale Apoptose gekennzeichnet ist104,106. Ein ähnliches Bild einer chronischen
Myokarditis ist im IL-1α transgenen Mausmodell zu finden108. Unter Bedingungen einer
- 82 -
Diskussion
systemischen TNF-α-Expression im frühen Immunstadium von Infektionen scheint diese
Reduktion ein begünstigender Faktor des schweren Krankheitsverlaufes zu sein. Die
Applikation von anti-TNF-α Antikörpern vor Versuchsbeginn hatte einen therapeutischen
Effekt bezüglich der auf die Überlebensrate der Mäuse226. Im TNF-α knockout Mausmodell
für C57BL/6 Mäuse, infiziert mit einer letalen CVB3-Variante, war ein Überleben der TNF-αdefizienten Tiere gegenüber den C57BL/6-Wildtypmäusen beobachtbar, was den Schluss
zuließ, dass TNF-α am fulminanten Verlauf der Myokarditis beteiligt war227. Im menschlichen
Krankheitsbild sind die Zytokine IL-6 und TNF-α unabhängige Prädikatoren für eine erhöhte
Mortalität bei Herzinsuffizienz und werden regelmäßig bei Patienten mit DCM gefunden228,229.
Das fibrinogene Zytokin TGF-β bewirkte im transgenen Mausmodell die Entwicklung einer
kardialen Hypertrophie111,230. TGF-β wirkt stark chemotaktisch für Makrophagen und
Monozyten und induziert die Synthese von Zytokinen (IL-1 und IL-6) in Makrophagen. Diese
stimulieren die Proliferation von Fibroblasten und haben demnach einen beträchtlichen
Einfluss auf die Ausbildung der extrazellulären Matrix. Die Expression von TGF-β-RNA ist im
Rahmen dieser Arbeit in den MHC Klasse II knockout Mäusen nicht untersucht worden, da
bereits aus anderen Mausmodellen bekannt war, das TGF-β ab der frühen Infektionsphase
in konstant hohem Niveau exprimiert wird60.
6.3
Erhöhte PDGF-Produktion im Herzgewebe korreliert mit Infiltration und
Fibrose
Ein wesentliches Element, welches zur Entstehung einer Herzinsuffizienz beiträgt, ist die
Fibrosierung des Myokards als Folge eines chronischen Entzündungsprozesses. Die in der
Entzündungsreaktion proliferierenden kardialen Fibroblasten können, durch vermehrte
Bildung von Kollagen und Fibronektin, Gewebsschädigungen hervorrufen59,231. Verschiedene
Stimulatoren, wie IL-1, TNF-α, TGF-β, Angiotensin II und Aldosteron führen in Fibroblasten
zur Induktion der Kollagensynthese und des extrazellulären Umbauprozesses59,213. Eine
Überexpression
eines
dieser
Stimulatoren
kann
entsprechend
zu
hypertrophen
Myokardfunktionsstörungen führen. Die profibrotische Wirkung der Überexpression von TNFα und TGF-β wurde bereits angesprochen.
Ein weiterer wichtiger Mediator, dessen potentielle Eigenschaft zur Induktion von
Fibrosierungsprozessen
Blutplättchen
mehrfach
belegt
wurde,
ist
der
Wachstumsfaktor
aus
141
. Eine vermehrte Expression von PDGF-Isoformen ist bei verschiedenen
inflammatorischen und profibrotischen Erkrankungen, wie Arteriosklerose, Restenose,
Lungenfibrose, Glomerulonephritis und rheumatoider Arthritis, gefunden worden116.
Die im Rahmen dieser Arbeit erstmals im Modell der CVB3-induzierten Myokarditis
analysierte mRNA-Expression der PDGF-Isoformen A, -B und -C korrelierte sehr gut mit der
- 83 -
Diskussion
Entzündung bzw. dem inflammatorischen Geschehen im Myokard beider Mäusestämme
während der akuten und chronischen Phase der Infektion (Abb. 10). Die Lokalisation der
erhöht exprimierten PDGF-Isoformen im CVB3-infizierten Herzgewebe deutet darauf hin,
dass eine Expression in Bereichen von inflammatorischen Zellen vorkommt. Folglich könnten
die infiltrierenden Zellen im massiven Entzündungsinfiltrat, das hauptsächlich aus CD11b+Zellen besteht, die vorrangig auf Makrophagen, natürlichen Killerzellen und dentritischen
Zellen gefunden werden71, die Quelle der PDGF-Sekretion sein. In diesem Kontext war
PDGF-C von besonderem Interesse, da dieses im Herzmuskel von transgenen Mäusen zur
Proliferation kardialer Fibroblasten führt und eine Myokardfibrose induziert109,121. Im CVB3infizierten Myokard konnte PDGF-C unter Verwendung einer RNA-Sonde in der In SituHybridisierung direkt in den Infiltraten lokalisiert werden (Abb. 11). Neben der Untersuchung
auf RNA-Ebene wurde auch eine immunhistochemische Analyse der PDGF-Isoformen im
Myokard vorgenommen. Alle untersuchten PDGF-Isoformen zeigten unter Inflammation
starke immunhistochemische Signale im Bereich der Infiltrate, die mit dem Abklingen der
Entzündung in C57BL/6 Mäusen nicht mehr nachweisbar sind, während im persistent
entzündeten Myokard ein gleich bleibender Nachweis der Signale bestehen bleibt (Abb. 13).
Die erhaltenen Daten, sowie parallel erfolgte analoge Untersuchungen in anderen
immunkompromitierten Mäusestämmen,232 unterstützen die Auffassung, dass PDGFFaktoren, insbesondere PDGF-C einen kausativen Beitrag zur Ausbildung der kardialen
Fibrose leisten könnte. Für PDGF-C ist beschrieben worden, dass es in allen drei Phasen
der Wundheilung – Inflammation, Proliferation und Remodelling – involviert ist233 und im
Besonderen in den Phasen der Proliferation und des Remodellings einen vermehrten
Anstieg von MMP´s und TIMP´s vermittelt234. Es kann vermutet werden, dass die anhaltende
Inflammation im Herzmuskelgewebe von MHC Klasse II knockout Mäusen, ausgelöst durch
die persistierende CVB3-Replikation, zu einer kontinuierlichen PDGF-C Expression führt. Die
nachfolgend permanent stimulierte Proliferation von Fibroblasten durch PDGF-C würde zu
der beobachteten Bindegewebsvermehrung beitragen.
Die PDGF-D Isoform, ist im Kontext der viral-entzündeten chronischen Myokarditis wegen
ihrer geringen Beteiligung an inflammatorischen Prozessen der Wundheilung nicht
untersucht worden235.
Neben erhöhten Spiegeln von PDGF-Faktoren konnte in den CVB3-infizierten Herzen auch
PDGFR-α nachgewiesen werden. Die Expression von PDGFR-α war im entzündeten
Gewebe ebenfalls erhöht, ähnlich wie in anderen Systemen bereits früher beschrieben236,237.
Eine Aussage über eine erhöhte PDGF-Rezeptor Aktivität in residenten Fibroblasten, als
Konsequenz einer PDGF-Überexpression, erwies sich jedoch als schwierig. Um dennoch
einen Beleg für eine PDGFR-Aktivierung indirekt zu erhalten, ist ein wichtiger Signalmediator
der PDGF-Rezeptoren – die Akt/PKB-Kinase – mittels immunhistochemischen Nachweises
- 84 -
Diskussion
analysiert worden. Die stark erhöhte spezifische Färbung von p-Akt, die mit PDGFR-α im
Gewebe lokalisiert war, wies klar auf einen aktivierten Zustand der PDGF-Rezeptoren im
entzündeten Gewebe hin.
Neben seiner profibrotischen Wirkung könnte PDGF durch seine chemotaktische
Anziehungskraft auf neutrophile Zellen, Makrophagen und Fibroblasten auch zur weiteren
Aufrechterhaltung
der
Inflammation
im
Herzmuskel
beitragen.
Fibroblasten
und
Makrophagen vermögen PDGF selber zu sezernieren, wobei eine Wechselwirkung mit
anderen Zytokinen, wie IFN-γ, IL-1 und TGF-β existiert116,238. IL-1 und TGF-β sind beide in
der Lage, die Induktion und die Aktivierung von PDGF und seinen Rezeptoren zu
bewirken239,240.
Ein möglicher therapeutischer Ansatzpunkt zur Verminderung einer Fibrosierung des
Myokards könnte somit in der Blockade eines der PDGF-Liganden oder der PDGFRezeptoren liegen.
6.4
STI571/Glivec vermindert die Fibroseentwicklung im CVB3-infizierten
Myokard
Die Bedeutung der PDGF-Familie und seiner Rezeptoren in der Entwicklung von Fibrose ist
anhand von Tiermodellen bereits für die Lunge- und für die Nierenfibrose beschrieben142145,148
.
Ein experimenteller Ansatz zum Nachweis einer kausalen Beteiligung des PDGF/PDGFRSystems an der Fibrosierung ist die Blockade der Tyrosinkinase-Aktivität der PDGFRezeptoren. Alle bisher identifizierten Signalwege und alle zellulären Reaktionen, die auf
einer PDGF-Stimulation basieren, erfordern die Aktivierung der PDGFR-Tyrosinkinase125,129.
Möglichkeiten zur experimentellen Ausschaltung dieses Systems bestehen auf den Ebenen
der Ligandenbindung, der Rezeptordimerisierung, der Tyrosinkinase-Aktivität oder in
„stromabwärts“ gelegenen Schritten der Signaltransduktion des PDGF/PDGFR-Systems125.
Erste Studien unter Verwendung der Verbindung AG1295 zeigten, dass diese bei lokaler
Applikation im Rattenmodell der einseitigen Ureterligatur eine Abschwächung der
ausgebildeten Nierenfibrose bewirkten148. Vor kurzem präsentierten Eitner und Mitarbeiter,
dass der Prozess einer entstehenden Nierenfibrose mit einer Hochregulation der PDGF-C
Isoform assoziiert ist241. Die Aktivierung und die nachfolgende Phosphorylierung der PDGFRezeptoren scheinen kausale Faktoren für die Organfibrosierung unter Beteiligung des
PDGF/PDGFR-Systems zu sein.
Ein potenter PDGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor, der für den Einsatz in vivo geeignet ist, ist das
Imatinib-Derivat (STI571/Glivec). Dieser Protein-Tyrosinkinase-Inhibitor, fand zunächst
Eingang in die klinische Anwendung, wegen seines Vermögens, die Tyrosinkinase-Aktivität
von Bcr-Abl sehr stark und spezifisch zu hemmen185 und dadurch Apoptose zu
- 85 -
Diskussion
induzieren180,182. Auf dieser Grundlage eignete er sich zur Therapie der chronisch
myeloischen Leukämie (CML). STI571 hemmt jedoch auch die Tyrosinkinasen c-Abl, Arg,
PDGFR-α und -β und c-Kit
172
. Damit besteht mit dieser Verbindung die Möglichkeit die
kausale Beteiligung des PDGF/PDGFR-Systems bei der CVB3-induzierten Myokardfibrose
zu prüfen.
6.4.1 Verfügbarkeit des Tyrosinkinase-Inhibitors STI571 im murinen Myokard
Zur Testung eines möglichen funktionsfähigen Inhibitors (STI571) der PDGFR-Kinase im
System der CVB3-induzierten chronischen Myokarditis mit Entwicklung von massiver
Myokardfibrose sind MHC Klasse II knockout Mäuse mit Coxsackievirus B3 (Mü/J) infiziert
und 2x täglich oral mit STI571 behandelt worden. Experimentelle Vorversuche ergaben, dass
die oral verabreichten Dosen von 2x täglich 50 bzw. 100 mg/kg STI571 eine gute
Verträglichkeit in den Mäusen zeigten und zu einer ausreichenden Konzentration im
Herzmuskel führten, um die CVB3-getriggerte PDGFR-Aktivierung zu unterbinden. Bei einer
dritten Behandlungsdosis – 150 mg/kg STI571 – konnte zwar die höchste Konzentration von
STI571 im Herzmuskelgewebe festgestellt werden, jedoch schien diese Dosis für die
behandelten Mäuse toxisch zu sein. Die maximal verträgliche und effektive Dosis des
Wirkstoffes STI571 beim Menschen in erbrachten Versuchen der initiierten klinischen Phase
I-Testung betrug 300 mg/d pro 70 kg Körpergewicht (durchschnittliches Körpergewicht einer
erwachsenen Person). In der klinischen Phase II, Testung in der chronischen CML-Phase
wurden 400 bzw. 600 mg/d eingesetzt (5,7- 8,6 mg/kg)191. Die verabreichte Dosis von
STI571 an MHC Klasse II knockout Mäuse lag im Vergleich deutlich höher. Der IC50-Wert
von STI571 beträgt in vitro für PDGF-Rezeptoren ca. 0,1-0,3 µM/l242. Mit einer 150 mg/kg
STI571-Behandlung über 3 Tage konnte im Myokardgewebe von MHC Klasse II knockout
Mäusen eine Konzentration von ca. 0,92 µM/l, bei scheininfizierten Mäusen und von bis zu
ca. 7,67 µM/l bei CVB3-infizierten Mäusen detektiert werden. Diese Ergebnisse implizieren,
dass STI571 über die orale Applikationsroute im Myokardgewebe in ausreichender
Konzentration vorliegt, um eine PDGFR-Aktivierung effizient zu unterbinden. Es ist möglich,
dass in den entzündeten Herzen eine verbesserte Aufnahme von STI571 erfolgt. Jedoch
sind die Zahlen der zur kardialen Verfügbarkeit analysierter Tiere bisher zu klein, um diese
Aussage sicher treffen zu können.
Die Analyse des Körper- und des Herzgewichtes der mit STI571 behandelten Mäuse ergab
eine gute Verträglichkeit der verabreichten STI571 Dosen 50 und 100 mg/kg. In
scheininfizierten Myokardproben von MHC Klasse II knockout Mäusen, welche mit STI571
behandelt wurden, konnten keine pathologischen Abnormalitäten im Herzmuskelgewebe
vorgefunden werden, die auf eine toxische Reaktion des Medikamentes hätte schließen
können. Im Herzmuskelgewebe von CVB3-infizierten, STI571-behandelten MHC Klasse II
- 86 -
Diskussion
knockout Mäusen konnte neben den viralen Schädigungen keine zusätzlichen myokardialen
Beeinträchtigungen vorgefunden werden.
6.4.2 STI571 inhibiert die PDGF-Rezeptor Aktivierung in vivo
Die biochemische oder immunhistochemische Analyse der PDGFR-Aktivierung und ihrer
Blockade durch STI571 im Myokard wäre wünschenswert. Immunpräzipitationen und
nachfolgende Immunoblot-Analysen stoßen auf Grund des geringen zur Verfügung
stehenden Myokardmaterials und der damit verbundenen niedrigen Rezeptorausbeute an die
Nachweisgrenze. Dennoch konnte im CVB3-infizierten Myokardgewebe von MHC Klasse II
knockout Mäusen eine erhöhte PDGFR-Aktivierung nachgewiesen werden, welche durch die
Behandlung mit STI571 reduziert wurde (Abb. 16). Die derzeit in der Literatur dargestellte
inhibierende Wirkung des STI571 auf die PDGFR-Aktivierung in vivo, in Hinblick auf eine
mildere Ausbildung von Organfibrose, erfolgte zumeist am Rattenmodell243. Die hierbei
untersuchten Organe, wie Lunge, Herz oder Leber weisen im Vergleich zu dem in dieser
Arbeit verwendeten murinen Myokard eine höhere Material- und damit Rezeptorausbeute
auf. Eine Möglichkeit, die PDGFR-Aktivierung und deren Hemmung durch STI571 im CVB3induzierten murinen Myokard besser darzustellen, wäre eine radioaktive Markierung der
Immunpräzipitate und die Auswertung über SDS-PAGE und Autoradiographie244.
Als eine indirekte Möglichkeit die Effizienz von STI571 auf die PDGFR-Aktivierung im
Herzmuskelgewebe von immundefizienten MHC Klasse II knockout Mäusen darzustellen,
eignet sich wiederum der immunhistochemische Nachweis von Akt/PKB. Durch eine
Behandlung
der
Mäuse
immunhistochemischen
mit
Färbung
STI571
von
über
20
aktivierten
Tage
Akt/PKB
war
im
eine
Reduktion
myokardialen
der
Infiltrat
beobachtbar (Abb. 20). Diese Betrachtung ist konsistent damit, dass STI571 die Proliferation
von Fibroblasten durch eine Inhibierung der PDGFR-Aktivierung und -Phosphorylierung und
der nachgeschalteten Signalwege – p-Akt – unterdrückt. Dennoch wären weitere und
verbesserte Analysen nötig, um qualitativ bessere Daten und Informationen zur örtlichen
Lokalisation der PDGFR-Signale im Myokardgewebe zu erhalten. Sinnvoll wäre vor allem,
geeignete Antikörper gegen den aktivieren PDGF-Rezeptor in der Immunhistochemie
einzusetzen, um die Inhibierung der Rezeptoraktivität durch den Tyrosinkinase-Hemmer
STI571 besser darstellen zu können. Solche Antikörper waren zum Zeitpunkt der
Durchführung dieser Arbeit noch nicht verfügbar.
- 87 -
Diskussion
6.4.3 Verminderte Myokardfibrosierung durch eine STI571-Behandlung
Die Ergebnisse im ersten Teil dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine anhaltende
Expression von PDGF-Isoformen, speziell PDGF-C, im Myokard von immundefizienten
Mäusen zur Entstehung der Fibrose beiträgt. Die Ausbildung einer viral-induzierten
Myokardfibrose beginnt in immundefizienten MHC Klasse II knockout Mäusen zwei Wochen
nach CVB3-Infektion und ist drei Wochen nach Infektion im gesamten Herzmuskel
detektierbar71. Die Behandlung der Mäuse mit STI571 erfolgte deshalb vom 1. bis zum 20.
Tag nach CVB3-Infektion.
Einige in vitro Studien haben gezeigt, dass verschiedene niedermolekulare Inhibitoren, wie z.
B. der antifibrotisch wirksame Serin-Elastase-Hemmer ZD0892 oder der TyrosinkinaseInhibitor PP2, Einfluss auf die Virusreplikation von Enteroviren durch Blockade der viralen 2A
Protease, durch Herunterregulierung der Zell-Protein-Synthese des Wirtes sowie durch eine
Reduzierung der viralen Polypeptidsynthese ausüben können245,248. Um zu prüfen, ob
STI571 die Virusreplikation von Coxsackievirus B3 im Herzmuskel verändert, ist der
Virustiters im Myokard von MHC Klasse II knockout Mäusen 21 Tage nach CVB3-Infektion
untersucht worden. Die erhaltenen Daten zeigten, dass eine Behandlung mit STI571 keinen
Einfluss auf die CVB3-Replikation im Myokardgewebe von MHC Klasse II knockout Mäusen
auszuüben vermag (Abb. 17). Damit kann ausgeschlossen werden, dass die beobachteten
Effekte auf die Fibrosierung als Folge von Effekten der Virusreplikation auftraten.
Die durch eine CVB3-Infektion verursachte pathologische Veränderung des Bindegewebes
im Myokard kann mit der Siriusrot-Färbung in histologischen Präparaten dargestellt werden.
Die Auswertung der Präparate von MHC Klasse II knockout Mäusen, die mit STI571
behandelt wurden, zeigte im Vergleich zu Präparaten von CVB3-infizierten und mit einer
Vergleichslösung
behandelten
Mäusen,
eine
signifikant
geringere
Ausbildung
der
rotgefärbten Areale. Diese Ergebnisse zeigen deutlich eine Hemmwirkung von STI571 in
Bezug auf die Ausbildung der Fibrose (Abb. 18).
Während der Erstellung dieser Arbeit haben andere Arbeitsgruppen Ergebnisse zur Wirkung
von STI571 in anderen Fibrosierungsmodellen vorgelegt. Im Modell der induzierten
Leberfibrose in Ratten führt eine Behandlung mit STI571 zu einer Verminderung des
induzierten Krankheitsbildes. Gleichzeitig konnte durch die Behandlung mit STI571 in diesem
Modell eine Inhibierung der Proliferation von Myofibroblasten nachgewiesen werden246. In
der Angiotensin-II-induzierten kardialen Hypertrophie und interstitiellen Myokardfibrose in
Ratten konnte durch eine STI571-Behandlung eine Abschwächung der Myokardfibrose,
durch Inhibierung der PDGFR-β-Phosphorylierung und der ERK-1/2-Aktivierung beobachtet
werden247. Im Krankheitsbild der CVB3-induzierten Myokarditis führt eine Inhibierung der
Src-Protein-Tyrosinkinase und der extrazellulären Signalregulierende Kinase (ERK-1/2), ein
stromabwärts gelegener Mediator der Tyrosinkinasen, durch PP2, einem Src-Protein- 88 -
Diskussion
Tyrosinkinase-Inhibitor zur Hemmung der viralen Replikation in Kardiomyozyten248. Diese
Daten stützen die Hypothese, dass eine Hemmung der Proliferation von Fibroblasten eine
wichtige Rolle für die Abschwächung der Fibrose durch einen Tyrosinkinase-Inhibitor, wie z.
B. STI571, spielt.
Eine
weitere
Nachweismöglichkeit
des
antifibrotischen
Effektes
von
STI571
im
Myokardgewebe liegt in der biochemischen Analyse von Hydroxyprolin. Dieses hat mit 25%
neben Glycin (30%) im normalen Kollagengewebe von Säugetieren den höchsten
Aminosäureanteil.
Die
mit
der
Fibroseentwicklung
einhergehende
vermehrte
Bindegewebsproliferation resultiert zugleich in einem Anstieg des Kollagenanteils und damit
auch
im
Hydroxyprolinzuwachs110,245,249.
Ebenso
konnte
auch
bei
Patienten
eine
antifibrotische Wirkung von STI571 festgestellt werden. In Patienten mit CML, für deren
Behandlung der Tyrosinkinase-Wirkstoff STI571 seine Zulassung erhielt, kann durch die
Behandlung mit STI571 eine Reduzierung von Knochenmarksfibrose festgestellt werden250.
Im Modell der Nierenfibrose in Ratten konnte mit einer STI571-Behandlung neben der
verminderten Anzahl von interstitiellen Fibroblasten und Myofibroblasten ebenso eine
Reduzierung in der Expression und Akkumulation des Kollagens vom Typ III und IV sowie
des Fibronektin beobachtet werden96. Laut Literatur ist bekannt, dass PDGF für ein erhöhtes
Expressionsniveau von MMP und TIMP im Gewebe verantwortlich ist234. Im Modell der durch
Schweineseren induzierten Leberfibrose in Ratten kann durch eine STI571-Gabe nicht nur
eine Reduktion der Aktivierung des PDGF/PDGFR-Systems im Organ erreicht werden,
vielmehr wird auch eine unterdrückende Wirkung auf die TIMP-1 Expression ausgeübt243.
Die extrazellulären Matrixbestandteile, Tenascin-C200 und Fibronektin-Fn201 gelten in der
Literatur ebenfalls als Indikatoren zum Nachweis von Fibrose. Tenascin-C und FibronektinFn wurden in den hier vorgesehenen Untersuchungen am Myokard von CVB3-infizierten
MHC
Klasse
II
knockout
Mäusen
auf
der
Ebene
der
mRNA-Expression
als
Fibroseindikatoren herangezogen (Abb. 19). Die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse und
die diskutierten publizierten Daten unterstreichen deutlich das Potential des TyrosinkinaseHemmers STI571 als mögliches neues Therapiekonzept bei fibrotischen Prozessen.
- 89 -
Diskussion
6.4.4 Der Einfluss weiterer Faktoren auf Fibrosierungsprozesse
Neben
PDGF/PDGFR-System
transformierende
ist
ein
weiterer
Wachstumsfaktor-beta
wesentlicher
(TGF-β).
Fibroseinduktor
Untersuchungen
an
der
TGF-β
überexprimierenden Mäusen zeigten eine Entstehung von interstitieller Fibrose in der
Lunge251 und im Myokard111. Zur Rolle der Wirkmechanismen von TGF-β bei der Myokarditis
bzw. der Fibrosierung des Herzens sind bislang nur wenige Daten verfügbar. In der CVB3induzierte Myokarditis als auch bei der DCM konnten erhöhte TGF-β-Spiegel und ein
Einfluss auf die Kollagensynthese nachgewiesen werden252,253.
Ähnlich wie beim PDGF/PDGFR-System ist für die Aktivierung der TGF-β nachgeschalteten
Signalwege, die Phosphorylierung der TGF-β-Rezeptoren erforderlich. Der durch vielfältige
Untersuchungen
gut
etablierte
Siganltransduktionsweg
von
TGF-β
führt
nach
Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung zur Phosphorylierung des Smad2/3-Komplexes.
Dieser bildet mit Smad4 einen heterodimeren Komplex aus86,93,94. Neue Studien legen nahe,
dass TGF-β auch unabgängig vom Smad2/3-Weg über die Aktivierung der c-Abl-Kinase,
Zellen stimulieren kann95. Damit könnte der c-Abl-Kinase eine neue Funktion zugeordnet
werden. STI571 ist nicht nur eine potenter Hemmstoff der Bcr-Abl-Kinase, sondern auch des
entsprechenden Proto-Oncogen-Produktes c-Abl185.
In der experimentell induzierten Lungenfibrose in Ratten konnte eine Beteiligung von TGF-β
an der Fibroblastenproliferation belegt werden. Diese Proliferation kann durch eine direkte
Behandlung mit STI571 vermindert werden95,96. Die Aktivierung der c-Abl-Kinase durch TGFβ soll dabei unabhängig von der Phosphorylierung des PDGF-Rezeptors oder dessen
Expression geschehen. Die Inhibierung oder der Verlust der c-Abl-Kinase kann jedoch eine
durch
TGF-β
induzierte
interstitielle
Infiltration
von
Makrophagen
oder
anderen
Entzündungszellen im Krankheitsgeschehen über die Aktivierung des Smad2/3-Signalweges
nicht verhindern. Stattdessen führt die Hemmung der c-Abl-Kinase zu einer selektiven
Hemmung solcher TGF-β-vermittelten Funktionen, welche für die Expression von
extrazellulären Matrixbestandteilen und die Zellproliferation und somit für die Fibrosierung
wichtig sind95,96,243.
Für die hier dargestellten Untersuchungen kann nicht ausgeschlossen werden, dass
zumindest ein Teil der antifibrotischen Wirkung von STI571 über die Hemmung dieses c-Ablabhängigen TGF-β-Signalweges erfolgt.
- 90 -
Diskussion
c-Abl-Kinase
induzierter
Signalweg
?
Abb. 21: Der TGF-β-Weg94. TGF-β bindet an TGF-β Typ II-Rezeptoren. Nachfolgend rekrutiert dieser
Komplex TGF-β Typ I-Rezeptoren. Diese Bindung führt zur Phosphorylierung und Aktivierung des
Rezeptorkomplexes, was wiederum die Phosphorylierung von Smad2/3 nach sich zieht.
Phosphoryliertes Smad2/3 bildet mit Smad4 einen Komplex aus, der im Zellkern zur Aktivierung der
Zielgene führt94. Eine Aktivierung des c-Abl-Signalweges durch TGF-β ist beschrieben, jedoch ist der
zu Grunde liegende Mechanismus noch nicht geklärt96.
6.5
Ausblick
Die Ergebnisse dieser Arbeit legen eine gesteigerte Aktivierung des PDGF/PDGFR-Systems
im Prozess der myokardialen Fibrose nahe, ausgelöst durch eine von der CVB3-Infektion
unterhaltenden Entzündung. Durch Behandlungen mit dem Tyrosinkinase-Hemmstoff
STI571/Glivec ist eine Reduzierung der CVB3-induzierten myokardialen Fibrosierung, ohne
Einfluss auf die Virusreplikation auszuüben, erkennbar. Weiterführende Untersuchungen
könnten zusätzliche Einblicke in die Effizienz des Wirkstoffes STI571 und dessen Bedeutung
für therapeutische Ansätze geben:
1. Im
Hinblick
auf
die
Modalitäten
des
Behandlungszeitraumes,
sind
bisher
Untersuchungen bis 21. Tag p. i. vorgenommen worden. Eine Bestätigung der
Wirksamkeit des STI571 zur Abschwächung der myokardialen Fibrosierung könnte in
einem verlängerten Behandlungszeitraum, z. B. bis zum 35. Tag p. i. (späte
chronische Phase) erzielt werden.
2. Die Untersuchung des Kollagenanteils im Myokardgewebe mittels biochemischen
Hydroxyprolinbestimmung wäre neben der quantitativen Siriusrot-Auswertung eine
weitere Methode, die Verringerung der Myokard Fibrosierung durch STI571 direkt im
Gewebe zu analysieren254.
- 91 -
Diskussion
Zur Klärung der Beteiligung einer Hemmung des TGF-β/c-Abl-Weges an der beobachteten
antifibrotischen Wirkung von STI571 wäre es denkbar:
1. Alternative Strategien zur Blockade des PDGFR-Systems einzusetzen, die den c-AblWeg nicht beeinflussen, z. B. durch den Einsatz des Hemmstoffes AG1295, ein
Chinoxalin-Derivat, das im Tiermodell der Ratte die Ausbildung der Nierenfibrose
signifikant abschwächt.
2. Vergleichend
eine
selektive
Hemmung
des
TGF-β/TGF-β-Rezeptor-Systems
hinsichtlich seiner Auswirkung auf die Fibrosierung in diesem Modell zu prüfen.
Hierfür käme z. B. der Einsatz von nicht-Tyrosinkinase-Inhibitoren, wie z.B. AG1879
oder TGF-β-RII transgenen Mäusen in Frage.
Trotz der positiven Wirksamkeit des STI571 konnte eine komplette Ausheilung der CVB3induzierten Fibrose in MHC Klasse II knockout Mäusen nicht beobachtet werden. Daraus
kann abgeleitet werden, dass das PDGF/PDGFR-System nicht der alleinige Faktor bei der
Ausbildung
von
Bindegewebsvermehrung
ist.
Möglichkeiten
hinsichtlich
weiterer
Versuchsansätze zur Verminderung von Fibrose in diesem Mausmodell könnten auf
folgenden Ebenen bestehen:
1. Die Prüfung der Rollen anderer Zytokine (TGF-β und TNF-α) in diesem
Krankheitsbild, durch geeignete Inhibierungsstrategien.
2. Die chronische Viruspersistenz im Myokard ist vermutlich kritisch für den Unterhalt
einer Myokarditis. Damit ist die Viruselimination eine wichtige Strategie hinsichtlich
einer kausalen Therapie. Versuche an MHC Klasse II knockout Mäusen zeigten auf
diesem Gebiet bereits gute Ergebnisse, wenn die Mäuse mit anti-CVB3-IgG-haltigem
Serum von CVB3-infizierten immunkompetenten C57BL/6 Mäusen behandelt wurden.
Die MHC Klasse II knockout Mäuse weisen mit dieser Behandlung 21 Tage nach
CVB3-Infektion eine Eliminierung des Virus im Myokard auf, ebenso können nur noch
kleine, vereinzelte Infiltrate im Myokard gefunden werden. Allerdings lassen sich im
Herzgewebe
dieser
Mäuse
noch
Spuren
von
Fibrose
nachweisen.
Eine
Kombinationsbehandlung mit IgG-haltigem Serum und STI571 könnte vielleicht dazu
führen, dass eine komplette Ausheilung des Myokards von immundefizienten Mäusen
möglich wäre.
Die Beteiligung des PDGF/PDGFR-System in anderen entzündlichen Geweben ist mehrfach
belegt. Eigene Vorversuche an Mäusen und Literaturdaten von Patienten
255
belegen stark
positive PDGF-C- und PDGF-D-Signale in der Rheumatoiden Arthritis in den Knorpel- und
Knochendestruktionen. Eine Verbesserung des Krankheitsbildes könnte durch eine lokal
applizierte Behandlung mit dem Tyrosinkinase-Hemmstoff STI571 führen. Gleichzeitig würde
sich damit ein weiteres humanes Einsatzgebiet für diesen Wirkstoff erschließen.
- 92 -
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Dewar AL, Cambareri AC, Zannettino ACW, Miller BL, Doherty KV, Hughes TP, Lyons AB.
Macrophages colony-stimulating factor receptor c-fms is a novel target of Imatinib. Blood.
2005; 105:3127-3132.
260.
Taylor JR, Brownlow N, Domin J, Dibb NJ. FMS receptor for M-CSF (CSF-1) is sensitive to
the kinase inhibitor Imatinib and mutation of Asp-802 to Val confers resistance. Oncogene.
2005; 25:147-151.
- 108 -
Anhang
Anhang
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildungen
Ak
Antikörper
Akt/PKB
Proteinkinase B
ALL
akute lymphatische Leukämie
APC
Antigen-präsentierende Zelle (antigene presenting cells)
Arg
Abelson-ähnliches Gen (Abelson related gene)
Aqua dest.
Destilliertes Wasser (deionisiert und autoklaviert)
AS
Aminosäure(n)
AS`
antisense Richtung
ATCC
American Tissue Culture Collection
ATP
Adenosintriphosphat
Bcr-Abl
Philadelphia-Chromosom-Translokation
BG
Bindegewebe
BMP-1
Knochenmorphogenetische Proteine
Bp
Basenpaare
bzw.
beziehungsweise
CAR
Coxsackie-Adenovirurs Rezeptor
c-Abl
c-Abelson; Oncogen
cDNA
komplementäre DNA (complementary DNA)
c-Kit/SCFR
Stammzellfaktor Rezeptor
CML
chronisch myeloische Leukämie
CVB3
Coxsackievirus B3
CVB3-Mü/J
Coxsackievirus B3-Variante München/Jena
d
Tag
DAF
Oberflächenprotein CD55 (decay accerlerating factor)
DCM
Dilatative Kardiomyopathie
d. h.
das heißt
DIG
Digoxigenin
DMEM
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium
DNA
Desoxyribonukleinsäure (desoxyribunucleinic acid)
EGF
epidermaler Wachstumsfaktor (epidermal growth factor)
ECM
extrazelluläre Matrix
ERK1/2
extrazelluläre Signalregulierende Kinase
F
Fibrose
FDA
Food and Drug Administration
FGF
Fibroblasten Wachstumsfaktor
Anhang
Flt3
FMS-ähnliche
Tyrosinkinase
III
(FMS-like
tyrosine
kinase III)
g
Gramm
GF
Granulationsgewebe
GIST
gastrointestinale Stromatumore
H
Herz
h
Stunde
H-2
Histokompatibilitätsantigen der Maus
HE
Färbung mit Hämatoxylin/Eosin
HIV
Humanes Immundefizientes Virus
(human immunodeficiency virus)
HSPG
sulfatierte Heparansulfat-Proteoglykane
HRP
Meerrettich Peroxidase (horseradish peroxidase)
I
Infiltrat
I.E.
internationale Einheiten
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
Ig-ähnliche Domäne
Immunglobulin-ähnliche Domäne
IGF(1)
Insulin-ähnlicher Faktor-1(Insulin-like growth factor 1)
IHC
Immunhistochemie
IL
Interleukin
i. p.
intraperitoneal
IP3
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat
ISH
In Situ-Hybridisierung
IVC
einzelbelüftete Käfige
kb
kiloBasen, 1000 Basenpaare
kDa
kiloDalton
ko
knockout
KT
Kontrolltiere
Lsg.
Lösung
m
Milli
M
Molar
MCSF-1R
Makrophagen-Kolonie-Stimulations Faktor 1-Rezeptor
MEM/E
Minimum Essential Medium (von Harry Eagle)
MHC
Major Histokompatibility Complex
min
Minute
mind.
mindestens
Anhang
mRNA
Boten RNA (messenger RNA)
MSC
multiple cloning site
MW
Molekulargewicht
NG
Nachweisgrenze
nm
Nanometer
NP-1
Neutrophile Proteine
o. g.
oben genannte
OD
optische Dichte
p. i.
post infectionem
PAA-Gel
Poly-Acryl-Amid-Gel
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
PDGF
von
Blutplättchen
stammender
Wachstumsfaktor
(platelet-derived growth factor)
PDGFR
PDGF-Rezeptor
pfu
Plaque-bildende Einheiten (plaque-forming units)
RNA
Ribonukleinsäure
RT
Raumtemperatur
RTK´s
Transmembran-Tyrosinkinase-Rezeptor
RT-PCR
reverse Transkriptase-PCR
s
Sekunde
S`
sense Richtung
Ser
Serin
s. o.
siehe oben
SPF
spezifisch Pathogenfrei
SR
Färbung mit Sirius-Rot
STI
intrazelluläre Signaltransduktion
Tab.
Tabelle
TBE
Tris-Borat-EDTA
TCID50
Tissue culture infection dose50
TGF
transformierender Wachstumsfaktor
(transforming growth factor)
Thr
Threonin
TH-Zelle
T-Helfer-Zelle
TNF
Tumornekrosefaktor (tumor necrosis factor)
Tyr
Tyrosin
Anhang
U
Einheiten (units)
u. a.
unter anderem
ü. N.
über Nacht
V
Virus
VP1-VP4
virales Protein 1-4
Vergrößerung x100/ x200/ x400
100-, 200- oder 400-fache Vergrößerung
VP
Viruskapsidprotein
w/v
weight per volume
z. B.
zum Beispiel
ZNS
zentrales Nervensystem
β-Aktin
beta-Aktin
µ
Mikro
3Dpol
3D-Polymerase
Anhang
Bilder- und Tabellenanhang
Tab. 7: Verwendete Oligonukleotid-Primer
Molekül
pMCQ
β-Aktin196
Proben
mRNA
(bp)
348
KontrollFragment
(bp)
264
Zyklen Primer-Sequenzen
Bindungstemperatur
35
60°C Bindungstemperatur
S`-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG
AAA C
AS`-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG
TCC G
Molekül
Proben
mRNA
(bp)
Zyklen
Primer-Sequenzen
Bindungstemperatur
β-Aktin256
590
30
VP1
851
30
56,0°C Bindungstemperatur
S`-ATG GAT GAC GAT ATC GCT
AS`-ATG AGG TAG TCT GTC AGG T
56,0°C Bindungstemperatur
S`-GGC CCA GTG GAA GAC GCG
AS`-AAA TGC GCC CGT ATT TGT CAT TG
PDGF-A
226
30
PDGF-B
538
28
PDGF-C193
395
30
TNF-α
Clontec,
Palo-Alto, USA
354
30
IFN-β
Clontec,
Palo-Alto, USA
509
30
IFN-γ
Clontec,
Palo-Alto, USA
365
30
IL-1α
Clontec,
Palo-Alto, USA
491
30
IL-1β
Clontec,
Palo-Alto, USA
363
35
(PD Dr. A. Henke,
Institut für Virologie und
Antivirale
Therapie,
Jena)
60,0°C Bindungstemperatur
S`-GCC TGT GCC CAT TCG CAG GAA GA
AS´-GGC CAC CTT GAC ACT GCG GTG G
59,1°C Bindungstemperatur
S`-TCT TCC TTC CTC TCT GCT GCT ACC
AS`-GGG GTC ACT ATT GTC TCA CAC TTG C
56,1°C Bindungstemperatur
S`-TGG ACA GCC TCT ACA AGC CAA C
AS`-TGC GTT TCC TCT ACA CAC ACA GTC
60,0°C Bindungstemperatur
S`-TTC TGT CTA CTG AAC TTC GGG GTG
ATC GGT CC
AS`-GTA TGA GAT AGC AAA TCG GCT GAC
GGT GTG GG
60,0°C Bindungstemperatur
S`-CAG CTC CAG CTC CAA GAA AGG ACG
AAC ATT CG
AS`-CCA CCA CTC ATT CTC ATT CTG AGG
CAT CAA CTG ACA GG
60,0°C Bindungstemperatur
S`-TGC ATC TTG GCT TTG CAG CTC TTC CTC
ATG GC
AS`-TGG ACC TGT GGG TTG TTG ACC TCA
AAC TTG GC
60,0°C Bindungstemperatur
S`-AAG ATG TCC AAC TTC ACC TTG AAG
GAG AGC CG
AS`-AGG TCG GTC TCA CTA CCT GTG ATG
AGT TTT GG
60,0°C Bindungstemperatur
S`-ATG GCA ACT GTT CCT GAA CTC AAC T
AS`-CA GGA CAG GTA TAG ATT CTT TCC TTT
Anhang
IL-2
Clontec,
Palo-Alto, USA
413
30
IL-6
Clontec,
Palo-Alto, USA
IL-10
Clontec,
Palo-Alto, USA
638
33
455
30
IL-12p40257
365
30
Tenascin-C258
447
27
Fibronektin-Fn201
531
29
Molekül
Proben
mRNA
(bp)
625
PDGF-C Sonde193
60,0°C Bindungstemperatur
S`-TTC AAG CTC CAC TTC AAG CTC TAC
AGC GGA AG
AS`-GAC AGAAGGCTA TCC ATC TCC TCA
GAA AGT CC
60,0°C Bindungstemperatur
S`-ATG AAG TTC CTC TCT GCA AGA GAC T
AS`-CAC TAG GTT TGC CGA GTA GAT CTC
60,0°C Bindungstemperatur
S`-ATG CAG GAC TTT AAG GGT TAC TTG
GGT T
AS`-ATT TCG GAG AGA GGT ACA AAC GAG
GTT T
Bindungstemperatur
S´-GAG GTG GAC TGG ACT CCC GA
AS´-CAA GTT CTT GGG CGG GTC TG
60,0°C Bindungstemperatur
S`-GCA AGC TGA TCC AAA CCA TCT TCA
CAA C
AS`-AGT CAC CTG CTG TTC CAC TGT ATC C
60,0°C Bindungstemperatur
S`-GCC ATC ACG CCG AGC ATT CT
AS`-CAT TTT TGG GAG CGG TGG TCA
Zyklen
Primer-Sequenzen
Bindungstemperatur
35
56,5°C Bindungstemperatur
S`-TCC AGC GAC AAG GAA CAG AAC G
AS`-GGA GAT TCA GAT TCA CCA CTT TGC
Tab. 8: Reagenzien für die RT-PCR
PCRFragment
β-Aktin
VP1
PDGF-C
PDGF-B
PDGF-A
IFN-β
IFN-γ
TNF-α
IL-1α
IL-1β
IL-2
IL-6
IL-10
IL-12p40
Tenascin-C
FibronektinFn
5 µM
Primer
(2x 1 µl
sense +
antisense
Primer)
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
Aqua
dest.
[µl]
10x PCRSynthese
Puffer
[µl]
1,25
mM
dNTP
[µl]
MgCl2
mM
Solution
Q
[µl]
TaqPolymerase
[µl]
20,75
22,75
30,75
20,75
20,75
30,75
30,75
20,75
32,75
22,75
32,75
32,75
32,75
32,75
20,75
22,75
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
8,0
2,5
1,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
2,5
1,5
10,0
10,0
---10,0
10,0
--------10,0
----10,0
----------------10,0
10,0
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
Anhang
Tab. 9: PCR-Bedingungen
PCRFragment
β-Aktin
VP1
PDGF-C
PDGF-B
PDGF-A
IFN-β
IFN-γ
TNF-α
IL-1α
IL-1β
IL-2
IL-6
IL-10
IL-12p40
Tenascin-C
Fibronektin
-Fn
pMCQ
Denaturierung
Primer-Annealing
Polymerisation
Zyklen
Temperatur
[°C]
94
94
94
94
94
94
94
94
94
94
94
94
94
94
94
94
Zeit
[s]
60
60
45
60
60
45
45
45
45
45
45
45
45
45
60
45
Temperatur
[°C]
56
45
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
Zeit
[s]
50
50
45
60
60
45
45
60
45
45
45
45
45
60
60
45
Temperatur
[°C]
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
72
Zeit
[s]
50
50
120
60
60
120
120
120
120
120
120
120
120
60
60
60
30
33
28
28
35
30
33
30
32
30
35
35
30
30
26
30
94
60
60
60
72
60
35
Tab. 10: Histologische Bewertungskriterien für das Myokard
Bewertung
0
1
2
3
Infiltrat
(Hämatoxylin/Eosin-Färbung)
kein Infiltrat
fokale Entzündungszellen/ bis zu 2
kleine Infiltrate und/oder ein großes
Infiltrat pro Ventrikel/ milde Infiltration
mehr als ein großes Infiltrat/ mehr als
2 konfluierende oder kleine Infiltrate/
moderate Infiltration
diffuse und/ oder starke Infiltration
der gesamten Ventrikelwand
Fibrose
(Siriusrot-Färbung)
keine Fibrose
sichtbare pathologische Anreicherung
von Bindegewebe und/oder sichtbare
milde Fibrose an mehr als einer Stelle
bindegewebiger Umbau ganzer
Muskelareale/ moderate Fibrose
Fibrose der kompletten Ventrikelwand/
strenge Fibrose
Tab. 11: Antikörper-Verdünnung
Antigen
goat-anti-mPDGF-A (I-20)
rabbit-anti-mPDGF-B (H-55)
rabbit-anti-mPDGF-C
rabbit-anti-mPDGFR-α (951)
rabbit-anti-phospho-Akt (Ser473)
rabbit-IgG Isotypkontrolle (Sc-2027)
Primärantikörper
1:100
1:100
1:300
1:200
1:100
4µg/ml
Sekundärantikörper
1:500
1:200
1:200
1:200
1:200
1:200
Anhang
Tab. 12: Konzentration des Tyrosinkinase Hemmstoffes STI571 im Myokard von CVB3infizierten und scheininfizierten MHC Klasse II ko Mäusen, die 2x täglich mit 50 mg/kg bzw. 150
mg/kg STI571 behandelt wurden. Dargestellt ist neben der Behandlungsdauer und der
verabreichten STI571 Dosis die Berechnung der vorliegenden STI571-Konzentration im
Herzgewebe (ko: knockout).
Herzgewebe
Behandvon
lung
scheininfizierten mit STI571
/CVB3infizierten
Mäusen
scheininfiziert
50 mg/kg
Tage
der
Behandlung
Konzentration
von STI571 im
Herzextrakt;
[ng/ml]
Konzentration
von STI571 im
Herzgewebe;
[ng/ml] (x10-²)
Konzentration von
STI571 im
Herzgewebe
[µMol/l]
1
11,5
1,29
0,22
scheininfiziert
50 mg/kg
1
39,6
4,45
0,75
scheininfiziert
50 mg/kg
2
94,9
10,67
1,81
scheininfiziert
50 mg/kg
2
66,5
7,48
1,27
scheininfiziert
50 mg/kg
3
44,7
5,02
0,85
scheininfiziert
50 mg/kg
3
48
5,40
0,92
CVB3-infiziert
8. d p. i.
CVB3-infiziert
8. d p. i.
CVB3-infiziert
9. d p. i.
CVB3-infiziert
9. d p. i.
CVB3-infiziert
10. d p. i.
CVB3-infiziert
10. d p. i.
scheininfiziert
50 mg/kg
1
99,0
2,47
0,42
50 mg/kg
1
99,5
2,48
0,42
50 mg/kg
2
129
3,22
0,55
50 mg/kg
2
90,4
2,26
0,38
50 mg/kg
3
288
7,20
1,22
50 mg/kg
3
535
13,37
2,27
150 mg/kg
1
75,3
8,47
1,44
scheininfiziert
150 mg/kg
1
61,5
6,91
1,17
scheininfiziert
150 mg/kg
2
107
12,03
2,04
scheininfiziert
150 mg/kg
2
258
29,00
4,92
scheininfiziert
150 mg/kg
3
824
92,70
15,60
scheininfiziert
150 mg/kg
3
6860
771,75
130,86
CVB3-infiziert
8. d p. i.
CVB3-infiziert
8. d p. i.
CVB3-infiziert
9. d p. i.
CVB3-infiziert
9. d p. i.
CVB3-infiziert
10. d p. i.
150 mg/kg
1
631
15,77
2,67
150 mg/kg
1
693
17,32
2,94
150 mg/kg
2
1850
46,25
9,54
150 mg/kg
2
1320
33,00
5,60
150 mg/kg
3
1810
45,25
7,67
Anhang
lacZ
BssH II 619
T7
EcoR I
Ampicillin
pBC SK(+)
EcoR V
2691bp
T3
BssH II 792
Co/E1 origin
Abb. 22: Schematische Darstellung des pBluescript II KS(+) Plasmides. Das Plasmid ist für die
Konstruktion des Kontrollfragmentes der semiquantitativen RT-PCR sowie für die Erstellung der
spezifischen RNA-Sonden für die In Situ-Hybridisierung verwendet wurden. Die Sequenz für murines
PDGF-C ist aus GenBank, Acc.No. NM 019971.2.
Tab. 13 Körper- und Herzgewicht sowie das Verhältnis des Herz- zum Körpergewicht am
Sektionstag (21 d p. i.) von CVB3-infizierten MHC Klasse II ko Mäuse, die entweder mit STI571
oder mit einer Vergleichslösung behandelt wurden, im Vergleich zu scheininfizierten Tieren,
die STI571 oder die Vergleichslösung appliziert bekamen. Dargestellt sind die Mittelwerte und
Standardabweichungen. (d: Tag)
Versuchsgruppe
Scheininfektion +
Aqua dest.; n=15
Scheininfektion +
STI571; n=29
CVB3 + STI;
n=35
CVB3 + Aqua dest.;
n=21
Körpergewicht am
Sektionstag
(21. d p. i.)
[g]
25,69 ± 2,72
Herzgewicht am
Sektionstag
(21 d p. i.)
[g]
0,11 ± 0,01
Verhältnis
Herzgewicht zum
Körpergewicht
24,61 ± 3,04
0,11 ± 0,02
4,47
23,48 ± 1,61
0,11 ± 0,01
4,53
23,74 ± 2,67
0,11 ± 0,01
4,76
4,32
Anhang
Danksagung
An dieser Stelle, möchte ich mich bei vielen wissenschaftlichen Ratgebern für die
vielen großen und kleinen Dinge, ohne die diese Arbeit nie zustande gekommen wäre,
bedanken.
An erster Stelle und ganz besonderes danke ich Dr. Carola Leipner und Prof. Dr. Frank
Böhmer, nicht nur für das Thema der Arbeit und für die zahlreichen anregenden
Diskussionen bei der Planung, Durchführung und Interpretation der Experimente, sondern
auch für ihre ausdauernde, optimistische und freundliche Betreuung meiner Doktorarbeit.
Des Weiteren möchte ich Prof. Dr. A. Stelzner, Leiter des Institutes für Virologie und Prof. Dr.
P. Wutzler, Leiter des Institutes für Virologie und Antivirale Therapie für die Möglichkeit in
Ihren Einrichtungen zu promovieren und die mir gewährte Forschungsfreiheit danken.
Allen Mitarbeitern des Institutes für Virologie und Antivirale Therapie, besonders PD. Dr.
Andreas Henke, Dr. Eckhard Birsch-Hirschfeld sowie den Mitarbeitern des Institutes für
Molekulare Zellbiologie, besonders Dr. Boyka Markova und Andrea Uecker gilt mein Dank für
die vielen Gespräche, die angenehme Atmosphäre und die Freude bei der Arbeit.
Besondere Annerkennung verdienen auch Dr. Ilka Schneider, Dipl.-Biol. Diana Freitag, Frau
Heike Urban und Frau Veronika Güntzschel, die mich bei der alltäglichen Laborarbeit
unterstützt und durch ihre vielen praktischen Tipps zum Gelingen der Laborversuche
wesentlich beigetragen haben. Bei den Assistentinnen des Infektionstierhauses, Frau Birgit
Schikowski und Frau Birgit Meißner bedanke ich mich für die Aufzucht der Mäuse und die
intensive Betreuung bei den Tierversuchen.
Bei PD. Dr. Alexander Berndt (Institut für Pathologie, AG Extrazelluläre Matrix,
Universitätsklinikum Jena) bedanke ich mich für die Unterstützung bei der quantitativen
Auswertung der histologischen Präparate.
Den Mitarbeitern des Institutes für Versuchstierkunde des Universitätsklinikums der
Friedrich-Schiller-Universität unter der Leitung von Herrn Dr. H. Schubert danke ich für die
Aufzucht und intensive Betreuung der verwendeten Mäusestämme.
Für die finanzielle Unterstützung während der Erstellung der Arbeit danke ich der Deutschen
Forschungsgemeinschaft (DFG; BO 1043/5-1) und der Pharmagruppe NOVARTIS Pharma
AG Basel.
Bei all meinen Freunden möchte ich mich bedanken, die auf ganz besondere Art und Weise
zur Vollendung der Arbeit beigetragen haben.
Schließlich gilt meinen Eltern ganz besonderer Dank, nicht nur für ihre vielfältige und
moralische Unterstützung, durch die meine lange Ausbildung erst möglich werden konnte,
sondern auch für ihre Liebe, Kraft und Zuversicht.
Anhang
Selbstständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich,
dass mir die Promotionsordnung der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der FriedrichSchiller-Universität Jena bekannt ist,
dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter Verwendung der angegebenen
Hilfsmittel und Literatur angefertigt habe.
dass ich weder die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen habe noch das
Dritte unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen, die im Zusammenhang mit dem Inhalt
der vorliegenden Disserationen stehen, von mit erhalten haben,
dass ich mich mit der vorliegenden Arbeit an keiner anderen Hochschule um den
akademischen Grad Doctor rerum naturalium beworben habe und dass ich weder früher
noch gegenwärtig die Eröffnung eines Verfahrens zum Erwerb des oben genannten
akademischen Grades an einer anderen Hochschule beantragt habe.
Jena, d. 06. Juli 2006
Katja Grün
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