Melia Selenia tesi

ALMA MATER STUDIORUM – UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
DOTTORATO DI RICERCA IN
Biotecnologie degli Alimenti
Ciclo XXI
Settore scientifico disciplinare di afferenza:
AGR/15
Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del
latte bovino di razza Reggiana con diverso fenotipo per κ-caseina
e β-lattoglobulina
Presentata dalla dott.ssa:
SELENIA MELIA
Coordinatore Dottorato
Relatore
Chiar.mo Prof.
Chiar.mo Prof.
GIUSEPPE LOSI
GIAN BATTISTA CASTAGNETTI
Esame finale anno 2009
INDICE
CAPITOLO 1 LA RAZZA REGGIANA………………………………………...................4
1.1.
LA STORIA DELLA RAZZA REGGIANA…………………………………………………..4
1.2. I CARATTERI MORFOLOGICI E LE CARATTERISTICHE PRODUTTIVE………………………6
CAPITOLO 2 IL LATTE......................................................................................................9
2.1.
SECREZIONE E COMPOSIZIONE MACROSCOPICA DEL LATTE……………………………..9
2.2.
I FATTORI CHE INFLUENZANO LA COMPOSIZIONE DEL LATTE………………………… 15
CAPITOLO 3 LA FRAZIONE PROTEICA………………………………………………20
3.1. LA FRAZIONE PROTEICA DEL LATTE BOVINO…………………………………………...20
3.2. IL POLIMORFISMO GENETICO DELLE PROTEINE……………………………………….. 29
3.3. L’INFLUENZA DEL POLIMORFISMO GENETICO SULLE CARATTERISTICHE
TECNOLOGICHE DEL LATTE……………………………………………………………35
3.4. L’INFLUENZA DELLE VARIANTI GENETICHE DELLE PROTEINE SULLE
CARATTERISTICHE PRODUTTIVE DEL LATTE…………………………………………...38
CAPITOLO 4 LA FRAZIONE LIPIDICA………………………………………………..41
4.1. LA FRAZIONE LIPIDICA DEL LATTE BOVINO…………………………………………….41
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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4.2. CLASSIFICAZIONE E NOMENCLATURA
DEGLI ACIDI GRASSI…………………………….45
4.3. SINTESI DEGLI ACIDI GRASSI…………………………………………………………..47
4.4.
METABOLISMO LIPIDICO RUMINALE…………………………………………………..48
4.5. IL GLOBULO DI GRASSO……………………………………………………………….53
4.6. LA MEMBRANA DEL GLOBULO DI GRASSO……………………………………………...58
4.7. ALTERAZIONI DEL GRASSO……………………………………………………………61
4.8. VARIABILITÀ
DELLA COMPOSIZIONE IN ACIDI GRASSI…………………………………63
•
4.8.1. L’IMPORTANZA A LIVELLO NUTRIZIONALE
•
4.8.2. I CLA (CONJUGATED LINOLEIC ACIDS) NEL LATTE………………………69
•
4.8.3.
DEGLI ACIDI GRASSI……….66
GLI ω-6 E ω-3 NEL LATTE……………………………………………. ..71
CAPITOLO 5 PARTE SPERIMENTALE…………………………………………….77
5.1. INTRODUZIONE………………………………………………………………………...77
5.2. SCOPO DELLA RICERCA………………………………………………………………...79
5.3. MATERIALI E METODI…………………………………………………………………..80
•
5.3.1 Selezione delle bovine Reggiane e raccolta dei campioni di latte dagli
allevamenti……………………………………………………………………80
•
5.3.2. Caratterizzazione del polimorfismo genetico proteico del latte
bovino………………………………………………………………………...82
•
2
5.3.3. Trattamento dei campioni……………………………………………...82
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
•
5.3.4. Determinazione della composizione macroscopica dei campioni di
latte…………………………………………………………………………...82
•
5.3.5. Determinazione della composizione in acidi grassi dei campioni di
latte…………………………………………………………………………...82
•
5.3.6. Analisi statistica………………………………………………………..83
•
5.3.7 Selezione delle bovine di razza Reggiana e Frisona e raccolta dei
campioni di latte………………………………………………………………83
•
5.3.8.
Determinazione
e
analisi
della
dimensione
dei
globuli
di
grasso………......................…………………………………………………..84
5.4
RISULTATI E DISCUSSIONE……………………………………………………………..85
•
5.4.1. Analisi della composizione macroscopica del latte con differenti fenotipi
per κ-Cn e β-Lg……………………………………………………………….85
•
5.4.2. Analisi della composizione in acidi grassi del latte con differenti fenotipi
per κ-Cn e β-Lg……………………………………………………………….90
•
5.4.3. Analisi della composizione in acidi grassi del latte con differenti fenotipi
per κ-Cn e β-Lg nei due allevamenti selezionati……………………………..98
•
5.4.4. Analisi della distribuzione della dimensione dei globuli di grasso nel
latte di razza Frisona e Reggiana……………………………………………109
5.5. CONCLUSIONI………………………………………………………………………..114
RINGRAZIAMENTI………………………………………………………………………...115
BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………………116
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Capitolo 1 La razza reggiana
CAPITOLO 1
1.1 .
LA STORIA DELLA RAZZA REGGIANA
La bovina Reggiana è una razza autoctona dell’Italia settentrionale, presente in particolar
modo nelle province di Reggio Emilia e di Parma. Secondo fonti storiche, le origini della
razza Reggiana sono molto antiche e risalgono ai bovini giunti nel nostro paese con le
invasioni barbariche. Le prime notizie sulla razza bovina Reggiana, conosciuta anche come
“vacca rossa” o “Fromentina” fornite dall’agronomo Filippo Re, risalgono all’inizio
dell’Ottocento, ma la sua storia si fonde nelle origini con quella del popolo Longombardo
che, dilagò verso occidente dopo la disgregazione dell’Impero romano ed entrò in Italia nel
568 (VI secolo), introducendo nella Val Padana bovini depredati nelle pianure della Russia
meridionale e dell’antica Pannonia.
Figura 1. Bovina di razza Reggiana [Da: www.itazanelli.it]
Molti di questi bovini, appartenenti al ceppo podolico, avevano il mantello rosso, una
caratteristica dominante trasmessa dalle antiche bovine rosse della steppa russa, tuttora
presenti
nell’Ucraina
e
nella
Russia
centrale
[www.agraria.org;
www.aiab.it;
www.itazanelli.it; www.razzareggiana.it; Salza et al., 2005]. Con i Longobardi inizia,
pertanto, una riconversione zootecnica che porta i bovini a sostituire gli ovini, dando
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Capitolo 1 La razza reggiana
origine ad una “rivoluzione casearia”. Grandi sostenitori di questi nuovi indirizzi furono i
monaci Benedettini, i quali con le loro opere di bonifica e la successiva messa a
coltivazione dei terreni, crearono le premesse per lo sviluppo di nuove attività agricole
quali l’allevamento del bestiame e la produzione del formaggio Grana. Le vacche rosse a
triplice attitudine, nei territori in destra Po’, trovarono condizioni ambientali
particolarmente favorevoli per il loro sviluppo e, fin dai secoli intorno al Mille,
sostituirono le razze locali preesistenti, mantenendo una supremazia incontrastata fino alla
prima metà del ‘900. Infatti la razza fu protagonista nel contesto agricolo e zootecnico
reggiano e parmense tanto da essere la più allevata fino alla metà del XX secolo, quando
raggiunse l’apice nel 1954 con una consistenza di 139.695 capi. Nel 1956 viene costituita
l’associazione nazionale Allevatori bovini di razza Reggiana (ANaBoRaRe), riconosciuta
ufficialmente nel maggio del 1962. Ma la politica zootecnica italiana del dopoguerra, per
perseguire più elevati obiettivi di produzione attraverso la selezione, iniziò incroci di
sostituzione di queste bovine con razze cosmopolite, per far fronte ad un maggior sviluppo
dell’industria casearia con crescenti richieste di latte da destinare alla trasformazione
[www.itazanelli.it].
Proprio in questi anni, infatti, avvengono profondi cambiamenti nell’agricoltura e nella
società [Diolaiti, 2008]. Tra le cause della progressiva riduzione dei bovini di razza
Reggiana si possono annoverare la scomparsa della mezzadria, le mutate condizioni di
allevamento, il ritardo del pagamento del latte su parametri qualitativi, l’introduzione di
razze cosmopolite più produttive e la mancanza di un concreto programma di
miglioramento genetico. Negli anni ’70 la razza Reggiana risultava quasi scomparsa, ma il
minimo storico venne raggiunto nel 1981 con 985 capi. Dal 1985 è stato istituito il
Registro Anagrafico delle popolazioni bovine autoctone e gruppi etnici a limitata
diffusione, per salvaguardare le razze bovine minacciate di estinzione e i loro patrimoni
genetici. Pertanto negli ultimi 20 anni grazie agli allevatori, tecnici e strutture pubbliche è
stato possibile un parziale recupero e un rinnovato interesse per questa razza, che dal 1987
ha iniziato a far registrare una lenta ripresa numerica. Dopo anni di attività selettiva da
parte degli allevatori, questa razza oggi può essere considerata ad attitudine esclusivamente
lattifera, infatti in particolare, la qualità del latte e nuove strategie di valorizzazione,
sostenute dal Ministero per le Politiche Agricole e Forestali e della Regione Emilia
Romagna, ne determinarono da allora un costante recupero demografico, tanto che la
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Capitolo 1 La razza reggiana
consistenza attuale è di 2.565 capi presenti in 177 allevamenti, con la maggior parte delle
aziende presenti in provincia di Reggio Emilia [www.razzareggiana.it]. Ciò è stato
possibile, in particolar modo, dopo aver ricostruito un’identità razza-prodotto (produzione
di Parmigiano Reggiano delle Vacche Rosse) e la sua tracciabilità, che ha permesso il
recupero di una valenza economica che è stata alla base della ripresa dello sviluppo
numerico della razza [www.arpa.emr.it].
1.2 . I CARATTERI MORFOLOGICI E LE CARATTERISTICHE PRODUTTIVE
Bovino contraddistinto da una notevole rusticità e longevità, la
razza Reggiana si caratterizza morfologicamente per il
mantello rosso “fromentino” uniforme (dal colore della
cariosside di frumento), che può assumere varianti di tonalità
nelle parti interne ed inferiori degli arti, nel contorno degli
occhi, attorno al musello e nella parte interna della coda. Da
questa colorazione deriva la denominazione di “vacca rossa”.
La testa è molto distinta, caratterizzata da una fronte spaziosa
lievemente concava, profilo fronto-nasale rettilineo, occhi
grandi, sguardo tranquillo. Il torace è ben sviluppato, la pelle è
di medio spessore e gli arti sono robusti.
Figura 2.
[Da: www.razzareggiana.it]
La mammella è l’organo che presenta ancora una certa eterogeneità nelle caratteristiche
della razza, in quanto generalmente è sviluppata ma non voluminosa. Infatti oggi il trend
morfologico-funzionale è in costante miglioramento, con particolare attenzione
all’apparato mammario.
I soggetti di questa razza sono di carattere docile ma nevrile, presentano una taglia media,
con altezza al garrese che varia, nei capi adulti dai 145/155 cm dei tori (con un peso medio
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Capitolo 1 La razza reggiana
di 9-10 quintali) ai 140/145 cm delle bovine (con un peso medio di 6,5-7 quintali)
[www.itazanelli.it; www.razzareggiana.it; Salza et al., 2005].
Figura 3. Bovina di razza Reggiana [Da: www.razzareggiana.it]
La rusticità della razza le consente, rispetto a razze più selezionate, di sfruttare meglio
foraggi grossolani, ridurre le spese sanitarie e la quota di rimonta, infatti in media si
raggiungono 4-5 parti a capo, con qualche eccezione rappresentata da alcune bovine che
raggiungono anche 10 parti. Buoni i parametri di fertilità e fecondità, con un intervallo
medio parto-concepimento di 98 giorni e un numero di interventi fecondativi di 1,7.
Utilizzata a suo tempo come razza a triplice attitudine, la razza Reggiana è attualmente
impiegata per la sua prevalente attitudine alla produzione lattiera, in quanto il latte ottenuto
risulta caratterizzato, come è noto, da elevati parametri qualitativi particolarmente idonei
alla trasformazione in formaggio Parmigiano Reggiano.
Le differenze più interessanti e significative tra le razze bovine locali (Reggiana, Bruna
Alpina e Bianca Val Padana) e la Frisona Pezzata Nera sono note da più di 25 anni. In
particolare alcuni studi [Morini et al., 1975; 1983; Castagnetti et al., 1986; Mariani et al.,
1987] hanno dimostrato la superiorità del latte della Reggiana, che presenta contenuti più
elevati di sostanza secca, caseina, ceneri, calcio, fosforo e acido citrico; ha un’acidità
titolabile superiore, una buona capacità di affioramento e si caratterizza infine per un minor
contenuto di cloruri.
Nel latte della Reggiana, inoltre, tra le frequenze fenotipiche delle proteine evidenziate fino
ad oggi mediante l’utilizzo delle tecniche elettroforetiche, le più frequenti sono quelle
omozigoti per A, per B ed eterozigoti per AB; in particolare la variante B, di β-caseina e di
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Capitolo 1 La razza reggiana
κ-caseina, è ritenuta maggiormente vantaggiosa per la caseificazione, in quanto è noto che
il latte prodotto da bovine con κ-Cn BB, presenta dei parametri lattodinamometrici e
reologici nettamente più favorevoli rispetto al latte caratterizzato dal fenotipo κ-Cn AA
[Morini et al., 1975; Mariani et al., 1976;
Morini et al.,1983; Schaar et al., 1985;
Castagnetti et al., 1986]. Nella razza Reggiana gli studi del latte effettuati sulla frequenza
genica e genotipica su tutta la popolazione e continuamente aggiornati, evidenziano come
la variante B della κ-caseina sia presente con una frequenza del 27%, considerata fra le più
elevate tra le razze ad attitudine lattifera [www.aiab.it; www.itazanelli.it].
La media produttiva della razza rilevata dall’Associazione italiana allevatori (AIA)
nell’anno 2004 è stata di 5.680 Kg, con il 3,57% di grasso ed il 3,40% di proteine. Da
questi dati si può affermare che la razza Reggiana produce mediamente il 30% in meno
della razza Frisona, ma la minor quantità è compensata dalla maggior resa economica,
grazie al pagamento latte-qualità [Salza et al., 2005].
La storia della razza Reggiana, infatti, dimostra che il recupero di questa razza è stato
possibile solo attraverso il legame con il prodotto principe del suo comprensorio, il
“Parmigiano Reggiano delle Vacche Rosse”, sul quale vengono apportati due marchi
aggiuntivi a quelli del Parmigiano Reggiano: il marchio “Vacche Rosse, razza Reggiana”
di proprietà della Grana d’oro” e il marchio “Razza Reggiana” di proprietà
dell’AnaBoRaRe.
(b)
(a)
Figura 4. (a) Marchio “Vacche Rosse, razza Reggiana” e (b) marchio “Razza Reggiana”
[Da: www.razzareggiana.it]
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Capitolo 2 Il latte
CAPITOLO 2
2.1 .
SECREZIONE E COMPOSIZIONE MACROSCOPICA DEL LATTE
La produzione del latte è regolata da un meccanismo ormonale neuroendocrino che
avviene a livello delle cellule secretici mioepiteliali della ghiandola mammaria. Esse sono
localizzate attorno agli acini che costituiscono la mammella, le quali versano il loro secreto
nei vari lumi, influenzate dalla presenza di ossitocina, che permette la loro contrazione e la
fuoriuscita del latte (Fig. 5).
Figura 5. Struttura dell’alveolo della ghiandola mammaria.
Da: Qi P., 2007 (mod.).
Gli acini, a loro volta, confluiscono nella cisterna del latte (seno galattoforo), dalla quale
avviene, in assenza di stimoli inibitori, l’eiezione del latte attraverso lo sfintere del
capezzolo. Quest’ultima fase è consentita da una regolazione neuro-ormonale ipotalamoipofisaria. L’ipofisi posteriore, infatti, contribuisce alla secrezione di ossitocina, che agisce
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Capitolo 2 Il latte
sui recettori specifici delle cellule mioepiteliali, mentre l’ipofisi anteriore permette la
produzione degli ormoni lattogeni, tra cui la prolattina, la somatropina e l’ormone
placentario lattogeno. Rilevante è la capacità di sintesi della mammella (lattogenesi), infatti
il 92% della sostanza secca, le proteine (caseine, α-lattoalbumina e β-lattoglobulina), i
lipidi (trigliceridi), i glucidi (essenzialmente il lattosio) sono sintetizzati a livello della
suddetta ghiandola secretoria, partendo da componenti più semplici, gli aminoacidi, il
glicerolo, il glucosio che vengono trasportati dal flusso ematico.
Il latte è un prodotto molto importante nell’alimentazione umana e questa sua peculiarità
è dovuta alla complessa ed eterogenea composizione, che ne permette diversi utilizzi e ne
fa al contempo un alimento completo e variabile.
Il latte infatti è un prodotto complesso con molte sostanze differenti che si trovano sospese
o in soluzione [Brunelli, 2008]. È un alimento fondamentalmente composto da acqua, che
rappresenta l’87% del peso complessivo e da componenti di varia natura, presenti sia allo
stato di soluzione vera (sali, vitamine idrosolubili, sostanze azotate non proteiche,
zuccheri), sia allo stato colloidale (proteine e parte dei fosfati e citrati di calcio) e sia allo
stato di emulsione (lipidi e vitamine liposolubili). Inoltre, esso contiene altre sostanze di
importanza non trascurabile dal punto di vista nutritivo, come vitamine, enzimi, ormoni ed
oligoelementi. Questi costituenti del latte sono tra di loro strettamente legati mediante
un’interdipendenza più o meno stretta ed in ogni modo, la loro concentrazione è differente
a seconda la specie (Tab. 1), la razza, la dieta, il periodo di lattazione, etc. [Salvadori del
Prato, 1998; 2005]. La miscela di tutte queste sostanze fa del latte un alimento completo,
caratterizzato da un determinato livello energetico e ad alto valore nutritivo, unico nel suo
genere.
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Capitolo 2 Il latte
Tabella 1. Composizione media dei latti di alcune specie.
Specie
Acqua
Grasso
Lattosio
Vacca
%
87-89
Residuo
secco
%
11-13
Caseina
%
4,6-4,7
Sost.
azotate
%
3,4-3,6
%
3,4-3,6
Bufala
78-84
16-22
6-9
4,7-4,9
4,4-4,8
3,90
Capra
83-89
11-17
4,3-4,4
4,3-4,7
4,0-4,2
3,00
Pecora
79-82
18-21
5-7
4,5-5,0
5,6-6,0
4,50
Asina
89-90
10-11
1,5
6,7
1,65
0.95
Balena
52-55
45-48
35,0
0,7
10,00
-
Cagna
81-82
18-19
4,0
4,8
9,0
4,50
Cavalla
90-91
9-10
1,1
5,6
2,0
1,25
Coniglia
70-71
29-30
12,0
1,8
13,0
9,00
Donna
87-88
12-13
3,3
6,6
1,40
0,85
Gatta
81-83
17-19
4,0
4,9
9,10
2,80
Renna
66-68
32-34
17,5
2,8
9,90
7,90
Scrofa
82-84
16-18
5,0
3,0
7,20
3,70
Zebù
81-82
18-19
5,2
5,1
4,20
3,30
%
2,50
Da: Salvadori del Prato, 1998.
La caratteristica che rende il latte un alimento così importante è che in esso sono presenti
macromolecole indispensabili per una corretta alimentazione (carboidrati, lipidi e
proteine), insieme ai micronutrienti. Le proteine, in particolare, hanno un elevato valore
biologico e contribuiscono al valore nutrizionale di questo alimento come fonte di azoto e
aminoacidi [Brunelli, 2008]. Come è noto, infatti, fra i diversi alimenti funzionali, il latte
ha assunto negli ultimi anni un nuovo ruolo come fonte di molecole bioattive, in grado di
influenzare alcuni aspetti della salute umana (Tab. 2), in quanto ad alcune proteine e
peptidi, originati dalla loro idrolisi, sono state associate proprietà fisiologiche (Tab. 3).
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Capitolo 2 Il latte
Tabella 2. Le principali proteine bioattive del latte.
Proteine maggiori
Proprietà fisiologiche
Lattoperossidasi
Azione enzimatica
Immunoglobulina
Azione antibatterica
Transferrina
Chelazione dei metalli
β Caseina
Chelazione dei metalli
Proteine minori
Proprietà fisiologiche
Lisozima
Azione enzimatica
Lattoferrina
Chelazione dei metalli
Prolattina
Azione ormonale
Insulina
Azione ormonale
Somatostatina
Azione ormonale
Calcitonina
Azione ormonale
TSH ( Thyroid Stimulating Hormone)
Azione ormonale
TRH ( Thyrotropin Releasing Hormone)
Azione ormonale
ACTH
Azione ormonale
EGF ( Epidermal Growth Factor )
Fattore di crescita
TGF – beta ( Transforming Growth Factor) Citochinine
Da: Bountonnier, 2000 (mod.).
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Capitolo 2 Il latte
Tabella 3. I principali peptidi bio – attivi estratti dalle proteine del latte.
Peptidi estratti
Proteine
Proprietà fisiologiche
Casomorfine
α e β caseine
Agonista oppioide
α Lattorfina
α lattoalbumina
Agonista oppioide
β Lattorfina
β lattoglobulina
Agonista oppioide
Lattoferroxine
lattoferrina
Antagonista oppioide
Casoxine
ĸ-caseina
Antagonista oppioide
Casochinine
α
Casoplateline
ĸ- caseina
s1
e β caseine
Anti – ipertensione (inibizione
dell’A.C.E.)
Anti – ipertensione (inibizione
dell’A.C.E.)
Antitrombotico (inibizione della
Caseinomacropeptide ĸ-caseina
formazione dei coaguli sanguigni per
aggregazione delle placche)
Immunopeptidi
α e β caseine
Lattoferricine
lattoferrina
Fosfopeptidi
α e β caseine
Immunostimolanti ( attivazione dei
leucociti)
Trasporto dei minerali e
immunomodulazione
Trasporto dei minerali
Da: Bountonnier, 2000 (mod.).
Un’altra componente rilevante è rappresentata dalla frazione lipidica del latte, che negli
ultimi anni è stata oggetto di numerosi studi, focalizzati in particolar modo sulle
caratteristiche nutrizionali degli ω3, ω6 e CLA e sui possibili effetti benefici di
quest’ultimi sulla salute umana, riscontrati attraverso l’impegno della ricerca scientifica in
ambito nutrizionale ed alimentare.
La frazione lipidica del latte è pertanto una componente fondamentale dal punto di vista
nutrizionale nell’alimentazione umana, ed inoltre, è un elemento chiave nell’ambito della
struttura e dell’aroma di molti prodotti lattiero-caseari [Michalski, 2007].
Naturalmente anche le altre componenti del latte (Tab. 4), rappresentate dalla frazione
glucidica, vitaminica, minerale ed enzimatica rivestono una notevole importanza
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Capitolo 2 Il latte
nutrizionale e tecnologica. Nel latte, infatti, troviamo elevati livelli di calcio e di
riboflavina (vit. B 2 ), che coprono la maggior parte dei fabbisogni giornalieri di un
individuo e un buon apporto di altre vitamine, come la vitamina A ed E [Paina,1996].
In particolare, in questo lavoro ci focalizzeremo su due frazioni principali, quella proteica e
lipidica, e in particolar modo sul polimorfismo genetico delle proteine e
sulla
composizione in acidi grassi del latte bovino.
Tabella 4. Composizione media del latte bovino.
Composizione
g/L
Stato fisico dei componenti
Acqua
905
Acqua libera (solvente) +
acqua legata (3,75)
Glucidi:lattosio
49
Soluzione
Lipidi:
35
Emulsione
-
sostanze
grasse
34
di
globuli
di
grasso (3-5 micron)
propriamente dette;
-
lecitina (fosfolipidi);
0,5
-
parte
0,5
insaponificabile
(steroli,
caroteni,
tocoferoli)
Protidi:
34
Sospensione
fosfocaseinato
micellare
di
di
calcio
(0,08-0,12 micron)
-
caseina
-
proteine
27
solubili
5,5
Soluzione (colloidale)
(globulina,
albumina)
-
sostanze azotate non
1,5
Soluzione
proteiche
Sali:
9
Soluzione o stato colloidale
(P o Ca)
-
dell’acido citrico
14
2
(Sali di K, Ca, Na, Mg, etc..)
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Capitolo 2 Il latte
-
dell’acido fosforico
(P 2 O 5 )
-
2,6
dell’acido cloridrico
(NaCl)
1,7
Costituenti diversi (vitamine,
enzimi, gas disciolti)
tracce
Estratto secco (totale)
Residuo magro
127
92
Da: Alais, 2000.
2.2.
I FATTORI CHE INFLUENZANO LA COMPOSIZIONE DEL LATTE
La composizione del latte può essere influenzata da diversi fattori, che possono incidere
sulle caratteristiche dei suoi elementi strutturali e, di conseguenza, sulle proprietà
chimico–fisiche del latte stesso. A seconda della loro origine, i fattori di variazione
possono essere distinti in endogeni ed in esogeni:
Fattori endogeni:
Genetici:
razza
caratteristiche individuali
Fisiologici: stato di salute
stato di lattazione
Fattori esogeni:
Zootecnici: alimentazione
clima
sistema di allevamento
stabulazione
tecniche e intervalli di mungitura
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15
Capitolo 2 Il latte
Per quanto riguarda le cause di origine genetica, esiste una variabilità ereditaria
individuale della produzione e composizione del latte, caratteristica di ogni singolo
animale della stessa razza e nelle stesse condizioni di allevamento. Naturalmente la
composizione del latte varia in funzione della razza considerata e in particolar modo, il
contenuto di grasso varia moltissimo tra razze e tra individui all’interno della stessa razza
[Mariani et al. 1987; Alais, 2000]. Infatti sia il tenore in grassi che in proteine del latte
sono determinati per il 40 % dalla genetica (ereditabilità) e per il 60 % dell’ambiente,
mentre le produzioni di latte, grasso e proteine (kg di grasso e proteine prodotti in
lattazione) sono determinate dalla genetica per un 25–30 % e dall’ambiente per un 70–75
% [Salvadori del Prato, 1998]. Le componenti che presentano minore variabilità sono il
lattosio e i sali minerali che sono indici utilizzati per l’individuazione di latti normali,
anche perché il lattosio è un fattore limitante della capacità di sintesi della mammella e
quindi della produzione di latte.
Gli effetti di variazione più significativi della composizione del latte sono quelli connessi
con lo stato fisiologico dell’animale, infatti durante il corso della lattazione si verificano
cambiamenti nel contenuto di vari componenti [Alais, 2000]. Più specificatamente il
grasso e le proteine totali tendono a diminuire fino a raggiungere valori minimi,
rispettivamente, al secondo e al quinto mese dall’inizio della lattazione per poi
progressivamente aumentare a mano a mano che ci si avvicina alla fine del ciclo. La curva
di produttività al contrario ha un andamento opposto a quello del grasso e delle proteine,
raggiungendo il suo massimo fra il primo e il terzo mese. Le variazioni che si riscontrano
maggiormente durante il ciclo di lattazione sono visibili nei primi e negli ultimi giorni
della lattazione stessa. Immediatamente dopo il parto, e per i primi 3–4 giorni, l’animale
produce il colostro, un liquido che non ha ancora le caratteristiche del latte vero e proprio,
essendo più ricco di tutti i componenti (soprattutto di immunoglobuline), ad eccezione di
lattosio, potassio, azoto non proteico e acqua. La sua composizione tende a mutare
velocemente e le variazioni durante le successive fasi della lattazione avvengono
soprattutto a carico delle proteine, del fosforo, del calcio e del residuo magro che, dopo
un’iniziale diminuzione, tendono a rimanere costanti per aumentare al termine della
lattazione [Strzalkowska et al., 2002]. In quest’ultima fase il latte, oltre ad avere un più
elevato contenuto di materia secca totale per maggiori tenori di grasso, proteine e ceneri,
presenta delle variazioni anche nella componente salina, la quale è ricca di calcio e sodio
16
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Capitolo 2 Il latte
ed è povera di potassio e fosforo. Inoltre per il variare degli equilibri calcio/fosforo il latte
a fine lattazione ha una minore stabilità ai trattamenti termici.
La composizione del latte risente anche dello stato di salute dell’animale, infatti i
fenomeni mastitici provocano una diminuzione e un’alterazione della produzione di latte.
Tali patologie provocano un aumento nel latte delle cellule somatiche, proporzionale
all’intensità del fenomeno infettivo, con conseguente arricchimento di enzimi di origine
cellulare, oltre all’aumento delle immunoglobuline. La mastite provoca inoltre una
diminuzione della capacità di sintesi della ghiandola mammaria, con conseguente
diminuzione di grasso, caseina, lattosio ed un aumento dei prodotti di filtrazione diretta
dal plasma sanguineo (sieroproteine, sali minerali, enzimi, etc..), determinato da una
maggiore permeabilità dei capillari [Corradini, 1995]. Le mastiti inoltre rappresentano la
principale fonte di profonde alterazioni, non solo a livello di composizione quanto
piuttosto nei riguardi dell’attitudine alla coagulazione [Mariani et al., 1987]. Infine nel
loro insieme tutte le variazioni di composizione provocano un aumento del pH del latte,
spesso superiore a 6,8 ( 6,6 – 6,65 nel latte normale ).
I fattori ambientali possono esercitare influenze diverse sulla produzione e sulla
composizione del latte durante il corso della lattazione delle bovine [Garcìa et al., 2001],
in particolar modo se quest’ultimo è ottenuto in montagna o in pianura [Collomb et al.,
2002]. Le variazioni stagionali ad esempio comportano un incremento del grasso, del
residuo magro, delle proteine e dei sali minerali nel periodo invernale. Mentre per
temperature ambientali, comprese tra 0 e 29°C, la composizione percentuale dei
costituenti del latte non mostra variazioni significative, al contrario per temperature
superiori ai 30 °C diminuisce il livello di produzione, il contenuto proteico, il residuo
magro ed il lattosio. Inoltre in determinate condizioni ambientali si possono verificare
perdite di produzione, come ad esempio, il caldo eccessivo provoca una
maggiore
frequenza di latti ipoacidi. L’effetto dei valori ambientali non è però uguale per tutti i
componenti del latte, infatti sul lattosio e sui sali minerali è praticamente trascurabile,
mentre le percentuali di grasso e proteine possono essere modificate rispettivamente di 2-3
punti decimali (es. da 3,5 a 3,7%) e di 0,1–0,4 decimali in concomitanza con i fattori
nutrizionali [Salvadori del Prato, 1998]. Anche l’alimentazione quindi detiene un ruolo
fondamentale, sebbene i cambiamenti nella composizione del latte possono anche essere
influenzati attraverso le tecniche di allevamento e di gestione, l’alimentazione è in grado
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17
Capitolo 2 Il latte
di indurre più rapidamente cambiamenti nella direzione voluta [Fredeen, 1996]. È noto
che, la sintesi della caseina nel latte è limitata dalla disponibilità degli aminoacidi
essenziali, che a loro volta, variano con lo stadio di lattazione e con la composizione della
dieta. Infatti, un corretto rapporto energia/proteine può favorire la sintesi di aminoacidi e
proteine, mentre impiegando i corretti equilibri tra le quantità di foraggio e concentrati
somministrati si può favorire la produzione di lipidi (questa produzione può essere
influenzata anche dalla quantità di fibra presente nella dieta) [Chilliard et al., 2000]. Di
particolare interesse è anche l’influenza che il bilancio energetico (Tab. 5) della razione
può esercitare, oltre che sulla quantità di grasso prodotta, anche sulla composizione dei
lipidi.
Tabella 5. Effetto del bilancio energetico della razione sulla composizione centesimale
acidica del grasso del latte.
Acidi grassi
Livello energetico
100%
75%
50%
Butirrico
6,9
7,1
6,5
Caproico
3,4
3,1
2,3
Caprilico
1,8
1,4
1,0
Caprico
4,1
1,9
1,8
16,2
14,5
11,6
Laurico
4,9
3,1
1,9
Miristico
13,3
11,5
8,5
Palmitico
39,1
33,4
28,3
Somma 12:0-16:0
57,3
48,0
38,7
7,2
7,8
7,9
16,6
26,5
38,3
Linoleico
1,9
1,9
2,2
Linolenico
0,8
1,3
1,3
26,5
37,5
49,7
Somma 4:0-10:0
Stearico
Oleico
Somma 18:0-18:3
Da: Corradini, 1995.
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Capitolo 2 Il latte
I componenti lipidici della dieta possono influire direttamente sulla composizione
percentuale di grasso, mentre il livello energetico della razione può modificare le attività
fermentative ruminali che determinano la disponibilità di precursori per la sintesi dello
stesso grasso e la secrezione degli ormoni che regolano il metabolismo lipidico [Corradini,
1995].
Infine anche i fattori tecnologici, quali le operazioni di mungitura, possono variare la
composizione del latte. Infatti il tenore di grasso del latte aumenta sensibilmente nel corso
della stessa mungitura, o nel caso di modificazione dell’intervallo tra due mungiture e in
tal caso, se si effettua una mungitura incompleta si ottiene un latte più povero di grasso
[Alais, 2000].
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Capitolo 3 La frazione proteica
CAPITOLO 3
3.1. LA FRAZIONE PROTEICA DEL LATTE BOVINO
Le proteine del latte rivestono una grande importanza dal punto di vista nutrizionale, in
quanto, come abbiamo visto, conferiscono al latte un elevato valore biologico. Hanno una
digeribilità molto elevata, contengono aminoacidi essenziali, cioè aminoacidi che
l’organismo non è in grado di sintetizzare autonomamente, e grazie alle loro proprietà
funzionali influenzano le caratteristiche tecnologiche del latte. Nel latte il contenuto
proteico è circa il 3,2%, ma la distribuzione media delle principali sostanze azotate varia a
seconda della specie presa in considerazione (Tab. 6). Nel caso del latte vaccino
considerando 100% l’azoto totale è possibile rilevare un 78% di azoto caseinico, un 17% di
azoto sotto forma di proteine del siero ed un 5% di sostanze azotate non proteiche (urea,
aminoacidi liberi, peptidi ammoniaca) [Salvadori del Prato, 2005].
Tabella 6. Distribuzione media delle frazioni azotate nel latte bovino caprino e ovino.
Vacca
% di
Capra
Pecora
proteina
proteina
proteina
proteina
proteina
proteina
grezza
vera
grezza
vera
grezza
vera
(n*6,38) (N-NPN)6,38 (N*6,38) (N-NPN)6,38 (N*6,38) (N-NPN)6,38
Caseina
77,8
82,0
75,6
82,7
78,5
82,4
Proteine
17,0
18,0
15,7
17,3
16,8
17,6
5,2
-
8,7
-
4,7
-
del siero
N.P.N.
Da: Salvadori del Prato, 2005.
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Capitolo 3 La frazione proteica
Le proteine, dal greco “protos” che vuol dire “primo” perché sono le sostanze primarie
degli esseri viventi, sono costituite da aminoacidi legati tra di loro da un legame
covalente, il legame peptidico. L’ordine in cui sono legati gli aminoacidi determina la
struttura primaria della proteina e quindi, di conseguenza, le sue proprietà funzionali. In
particolare la stuttura primaria è data appunto dalla sequenza degli aminoacidi, mentre la
struttura secondaria è dovuta alle molecole proteiche che possiedono una determinata
conformazione spaziale (α-elica o β a fogli ripiegati) e tali strutture sono rese stabili con
legami idrogeno. Nella struttura terziaria e quaternaria, la proteina può essere formata da
una unica catena ripiegata su se stessa o da più catene e la rigidità viene assicurata
principalmente da ponti disolfuro. La sequenza aminoacidica infatti è determinata dal
codice genetico e in base a questa sequenza, la proteina si ripiega su se stessa con una
conformazione tridimensionale caratteristica (Fig.6) [Brunelli, 2008].
Figura 6. Struttura tridimensionale della β-lattoglobulina.
Da: www.google.it.
All’interno delle cellule epiteliali della mammella, che costituiscono l’alveolo (o acino), il
pool aminoacidico viene assemblato in proteine secondo precise informazioni genetiche
fornite dal nucleo delle cellule. Appena sintetizzate sui ribosomi, penetrano nel reticolo
endoplasmatico e migrano verso l’apparato del Golgi, in cui si realizzano le modificazioni
molecolari che portano all’addizione di gruppi fosforici e glicosidici alle caseine. Infine da
questa struttura cellulare si staccano vacuoli contenenti le proteine neosintetizzate, che
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Capitolo 3 La frazione proteica
migrano verso il polo apicale della cellula epiteliale e riversano il loro contenuto proteico
nel lume dell’acino [Qi, 2007].
Nel latte esistono due importanti categorie di proteine: l’80% è rappresentata dalla
frazione delle caseine e il 20% dalle proteine del siero (Tab. 7).
Tabella 7. Proteine presenti nel latte bovino.
g/L
%
Proteine totali
33
100
Caseine totali
26
79,5
Caseina αs1
10
30,6
Caseina αs2
2,6
8,0
Caseina β
9,3
28,4
Caseina κ
3,3
10,1
Caseina γ
piccole
quantità
Proteine totali
6,3
19,3
α lattoalbumina
1,2
3,7
β lattoglobulina
3,2
9,8
Siero albumina bovina
0,4
1,2
Immunoglobuline
0,7
2,1
del siero
Da: Brunelli, 2008 (modificata).
La caseina (dal latino “caseus”= formaggio) rappresenta la materia prima, il vero e
proprio fulcro dell’intero processo di caseificazione [Mariani et al., 1991].
È presente nel latte sotto forma di particelle sferiche, conosciute come micelle caseiniche
con diametro variabile da 30 a 300 nm. Il numero di queste micelle è estremamente
elevato, pari a 1014/ml. Le micelle presentano pertanto una notevole superficie di reazione
(4 m2/ml di latte) e risultano molto sensibili alle variazioni del mezzo. Le loro proprietà
naturalmente influenzano in modo determinante il comportamento del latte durante i
processi tecnologici, come i trattamenti termici e la caseificazione. I primi possono essere
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Capitolo 3 La frazione proteica
applicati in base alla stabilità della fase colloidale, costituita appunto dalle micelle, mentre
la seconda dipende dalla destabilizzazione, che provoca il passaggio della dispersione
colloidale dallo stato di solido a quello di gel con idonee proprietà reologiche.
Le micelle hanno inoltre una componente minerale relativamente elevata, tra il 7–8 % sul
secco, costituita per il 90 % da fosfato di calcio. Esse presentano un aspetto spugnoso e
poroso, composte da un gran numero di sub-unità con diametro di circa 12 – 20 nm, che
prendono il nome di submicelle. Infatti allo stato nativo la caseina è costituita dalle frazioni
α
s1
, α
s2
, β e κ in vario modo strutturate in submicelle. Queste a loro volta, con il
concorso determinante del fosfato colloidale si aggregano in unità più grandi di varia
dimensione [Mariani et al., 1991]. A seconda della specie considerata (Tab. 8), le
proporzioni delle diverse caseine variano in un ampio range [Qi, 2007].
Tabella 8. Distribuzione caseinica (%) in diversi tipi di latte.
α
s1
α s2
β
κ
Caprino
da 5 a 17
da 6 a 20
50
15
Bovino
38
10
40
12
Uomo
tracce
tracce
70
27
Da: Qi P., 2007.
In passato si pensava che la caseina fosse una singola frazione proteica, ma
successivamente sono stati identificati distinti gruppi di proteine, sulla base della loro
diversa velocità elettroforetica sintetizzate a livello della ghiandola mammaria.
Le caseine, pertanto, sono costituite da aggregati etero – proteici fosforilati presenti nel
latte allo stato micellare, che possono essere separate per acidificazione (pH 4,6),
ultracentrifugazione e coagulazione enzimatica. Esse quindi sono fosforilate, hanno cioè
fosforo organico (acido fosforico esterificato con la serina), il cui numero di atomi varia
fra le diverse frazioni caseiniche:
Caseina
α
s1
Atomi di fosforo
8-9
α s2
10 - 13
β
(4) 5
κ
1–2
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Capitolo 3 La frazione proteica
Pertanto la stabilità delle strutture viene raggiunta con l’intervento del calcio e dei fosfati,
i quali si legano ai gruppi R – COO- ed agli R – NH 3 + [Salvadori del Prato, 1998].
I complessi così formati si associano mediante l’ intervento di calcio e fosforo (legando
internamente le due caseine α e β), fino a formare una micella sulla quale la κ caseina, più
idrofila, si dispone esternamente assumendo la funzione di colloide protettore. La κ-Cn,
infatti, differisce dalle altre caseine, in quanto è solubile in un ampio range di
concentrazione di ioni di calcio ed ha, pertanto, la funzione naturale di mantenere le
micelle in sospensione, ponendosi come interfaccia tra le caseine calcio-sensibili e
l’ambiente acquoso [Creamer et al., 1998]. E’ questa condizione che ha portato Waugh e
von Hippel ad assegnare a quest’ultima, il ruolo di stabilizzare nel complesso la micella
caseinica [Kumosinski et al., 1991].
Naturalmente il calcio e il fosforo colloidali ed inorganici sono in equilibrio nel latte, ma
tale equilibrio è instabile e dinamico perché è influenzato dal pH e dalla temperatura. Le
micelle caseiniche inoltre trattengono acqua attraverso gli zuccheri della κ caseina che li
avvolge, rendendo stabile la loro distribuzione nel plasma latteo, caratteristica da cui
dipende l’integrità del latte stesso. Occorre pertanto un elevatissimo grado di idratazione,
per permettere alle micelle di restare in dispersione e non interagire, mantenendo a livelli
appropriati il pH e gli zuccheri idrofili all’esterno delle micelle. Se quest’ultime
condizioni variano, lo stato di idratazione non è più sufficiente e le micelle interagiscono
flocculando o coagulando. In particolare la κ caseina, distribuita per lo più nella parte
superficiale della micella, rappresenta l’elemento di massima stabilità dell’intera struttura
[Mariani et al., 1991]. Nello stesso tempo, però, ne costituisce anche il punto debole, in
quanto substrato specifico dell’azione del caglio. In particolar modo è sensibile all’azione
dell’enzima proteolitico chimosina (enzima estratto dal quarto stomaco del vitello) che
rompe il legame peptidico 105-106 (fenilalanina–metionina) della molecola liberandone,
rispettivamente, la para-κ-caseina e la porzione terminale fortemente idrofila, il
caseinomacropeptide o glicomacropeptide. Il suo distacco fa perdere alla κ caseina la
funzione di colloide protettore delle micelle caseiniche, diminuiscono le forze repulsive e
lo stato di idratazione delle micelle decresce, permettendo interazioni reciproche tra i
gruppi idrofobici che portano alla coagulazione del latte. Pertanto le micelle si
destabilizzano e prendono avvio i processi di disidratazione dell’intero sistema. Nelle
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Capitolo 3 La frazione proteica
associazioni tra le molecole delle caseine giocano un ruolo importante gli ioni calcio, i
quali riducono la carica negativa delle molecole rendendo possibile tale associazione a
temperature non inferiori a 15 °C.
Si tratta quindi di fenomeni tra loro strettamente interconnessi, che rappresentano il
motivo conduttore della fase centrale e fondamentale dell’intero processo di
caseificazione. La loro evoluzione dipende da numerosi fattori intrinseci ed estrinseci: pH
e acidità del latte, contenuto di caseina, proporzioni delle singole caseine, varianti
genetiche, dimensione delle micelle, concentrazione di ioni calcio e di fosfato di calcio
colloidale, acidificazione in caldaia, quantità di caglio, temperatura di coagulazione,
tempo di rassodamento, tempi e modalità di lavorazione della cagliata, modalità di
spinatura, curve termiche, temperature di cottura, tempi di lavorazione, etc. [Mariani et
al., 1991].
Analizzando le differenti caseine, possiamo dire brevemente che [Farrell et al., 2004]:
• La caseina α s1 è una fosfoproteina composta da una singola catena polipeptidica di
199 aminoacidi, costituisce circa il 40 % della frazione caseinica del latte bovino
ed è sensibile al calcio. È priva di cistina e cisteina e il suo aminoacido carbossi–
terminale è il triptofano.
• La caseina α s2 invece è composta da una catena polipeptidica di 207 aminoacidi,
costituisce circa il 10% della frazione caseinica e il carbossi-terminale è la leucina.
• La caseina β formata da una catena polipeptidica di 209 aminoacidi è anch’essa
priva di cistina e cisteina, costituisce circa il 37% della frazione caseinica e il suo
carbossi terminale è la valina. Questa caseina è meno sensibile al calcio della α s ,
ma è la caseina più idrofobica. Quest’ultima mostra tre legami fortemente
plasmino-sensibili, Lys28–Lys29, Lys105–His106 e Lys107–Glu108, con conseguente
formazione di γ-caseina e residui N-terminali (proteoso-peptoni, PP). Infatti per
idrolisi post–secretoria l’enzima plasmina scinde il legame lisina–lisina e in base al
sito in cui agisce l’enzima, si ottengono i diversi proteosi–peptoni e le γ caseina
[Bastian et al., 1996; Crudden et al., 2003; Crudden et al., 2005]:
Proteoso – peptoni
Proteoso – peptone
aminoacidi
caseina
aminoacidi
1 – 28
γ1
29 – 209
1 – 105
γ2
106 – 209
(8 fast)
Proteoso – peptone 5
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Capitolo 3 La frazione proteica
Proteoso – peptone
29 – 105
γ3
108 – 209
(8 slow)
Le destinazioni di entrambi naturalmente sono diverse, infatti i proteoso–peptoni si
ritrovano nel siero, mentre le γ caseina nella cagliata.
• La κ caseina rappresenta circa il 13% della caseina [Kumosinski et al., 1991], è la
sola fosfo–glicoproteina tra le caseine e la sua componente zuccherina è costituita
da acido N-acetilneuraminico, galattosio e N–acetilgalattosamina. Essa è composta
da una catena polipeptidica di 169 residui aminoacidi, con la valina che
rappresenta l’aminoacido carbossi–terminale. È stato dimostrato che il grado di
glicosilazione della κ-Cn nel latte è altamente variabile tra e all’interno delle
bovine. I fattori che lo influenzano sono: il numero dei parti, lo stadio di lattazione,
la quantità delle cellule somatiche e il fenotipo della κ-Cn [Robitaille et al., 1991].
Un’altra frazione azotata molto importante è rappresentata dalle sieroproteine, la quale
comprende il 17% circa delle sostanze azotate del latte di bovina e denominate anche
proteine solubili [Salvadori del Prato, 2005]. In particolare l’ α-lattoalbumina (α-La) e la
β-lattoglobulina (β-Lg) presentano un bilanciato profilo nutrizionale, in quanto sono
costituite da una quantità elevata di aminoacidi solforati (metionina, cistina e cisteina) ed
hanno una serie di proprietà funzionali, che includono la capacità di formare e stabilizzare
gels, emulsioni e schiume [Davis et al., 2004], ed è proprio per queste caratteristiche che,
già allo stato nativo, possono trovare utili impieghi in preparazioni alimentari [Corradini,
1998; Lefévre et al., 2000].
Si distinguono dalla caseina per il minor peso molecolare, che non permette la
precipitazione di queste proteine al punto isoelettrico. Le sieroproteine infatti non sono
degli aggregati proteici, ma sono presenti nel latte come monomeri o polimeri che
precipitano non per azione enzimatica, ma per trattamento acido-termico o per
modificazioni degli equilibri salini. Queste proteine non contengono fosforo, sono
semplici, solubili in acqua pura (albumine) o in soluzioni saline molto diluite (globuline).
Si possono distinguere (su 100 parti):
- albumine 70 %
- globuline 15 %
- proteso – peptoni 10 %
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Capitolo 3 La frazione proteica
- metalloproteine et al. 5%
Le metalloproteine comprendono la lattoferrina, la transferrina e la ceruplasmina,
importanti nella fissazione e nel trasporto dei metalli pesanti.
Le albumine sono costituite da:
- β lattoglobulina (β-Lg)
PM 18.000
45 %
- α lattoalbumina (α-La)
PM 14.000
15 %
- albumina del siero di sangue (SA)
PM 70.000 10 %
Le globuline comprendono:
- euglobuline
PM 150.000 7,5 %
- pseudoglobuline
PM 150.000 7,5 %
Quest’ultime includono anche le immunoglobuline (Ig), particolarmente abbondanti nel
colostro, le quali raggiungono una concentrazione di 0,5 g/L di latte con un tenore di azoto
intorno all’ 1–2 % dell’azoto totale del latte. Esse assieme all’albumina del siero di sangue
sono filtrate direttamente dal sangue, mentre le α lattoalbumine e le β lattoglobuline sono
di sintesi mammaria.
Pertanto le maggiori componenti della frazione delle sieroproteine sono rappresentate da
β-Lg, α-La, siero albumina (SA), Ig e proeoso-peptoni.
La β lattoglobulina è una catena peptidica di 162 aminoacidi ed è la più rappresentata tra
le proteine del siero rintracciata nel latte dei ruminanti [Ballester et al., 2005]. Il latte
bovino ne contiene circa 2–3 g/L con un tenore di azoto equivalente al 7–12 % dell’azoto
totale del latte (le variazioni dipendono dalla razza considerata, dall’alimentazione e dallo
stadio di lattazione) [Kontopidis et al., 2004]. In particolare, la β-Lg è una proteina
globulare, con una zona idrofobica esposta al solvente in grado di legare, al suo interno,
una varietà di molecole idrofobiche, come gli acidi grassi (acido palmitico), retinoidi (es.
vitamina A), vitamina D 2 e steroidi (colesterolo) [Papiz et al.,1987; Brownlow et al.,1997;
Jameson et al., 2002; Farrell et al., 2004].
L’ α lattoalbumina è costituita da una catena peptidica di 123 aminoacidi ed è presente nel
latte intorno a 1,2 – 1,5 g/L con un tenore in azoto corrispondente al 2–5 % dell’azoto
totale del latte. Questa sieroproteina ha una specifica e definita funzione fisiologica nella
ghiandola mammaria. All’interno dell’apparato del Golgi delle cellule epiteliali della
ghiandola mammaria, l’α-La interagisce con l’enzima β-1,4-galactosiltransferasi per
consentire la formazione dell’enzima lattosio-sintetasi. Nello specifico, l’α-La modifica la
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Capitolo 3 La frazione proteica
specificità del substrato β-1,4-galactosiltransferasi permettendo la formazione del lattosio
dalle molecole di glucosio e UDP-galattosio [Bleck et al., 1993; Farrell et al., 2004]. In un
secondo momento, l’α-La e il lattosio, prodotto dal complesso (circa 5%), vengono secreti
nel latte [Bleck et al., 1993]. Un’altra caratteristica dell’α-La è la capacità di legare il
calcio, lo zinco e altri metalli. La concentrazione di questa sieroproteina nel latte decresce
in prossimità della fine della lattazione delle bovine e nei soggetti con infezioni alla
ghiandola mammaria [Farrell et al., 2004].
Le prime a destabilizzarsi e precipitare a seguito di fenomeni che alterano la stabilità del
siero, come l’aggiunta di sali o per riscaldamento, sono le globuline che hanno una scarsa
velocità elettroforetica dato il loro elevato peso molecolare, seguite successivamente dalle
albumine del siero di sangue, dalla β lattoglobulina e infine dalla α lattoalbumina. Le
sieroproteine infatti sono ricche di ponti disolfuro (S–S), che per mezzo di riscaldamento
si scindono, formando gruppi SH che creano un ambiente riducente. In seguito con il
distacco dei gruppi SH, si origina l’idrogeno solforato (H 2 S), che impartisce un tipico
odore di cotto. Sempre a causa del riscaldamento può verificarsi un’altra reazione, che
consiste nell’interazione fra la κ caseina e la β lattoglobulina, mediante ponti disolfuro
[Hill et al., 1997]. Questa reazione ostacola l’azione del caglio sulla κ caseina ed è per
questo motivo che latti sottoposti a riscaldamento coagulano meno bene dei latti non
trattati termicamente o non coagulano, come nel caso del latte sterilizzato o bollito.
Analizzando infine, le proprietà funzionali delle proteine del latte, esse dipendono dalle
caratteristiche strutturali e subiscono l’influenza di fattori chimico – fisici ed enzimatici
(Tab. 9).
Tabella 9 Principali proprietà funzionali delle proteine del latte.
Proprietà
Caseine
Sieroproteine
Solubilità
Insolubili a pH 4,6
Molto solubili a tutti i pH.
Insolubili
a
pH
5
se
termodenaturate.
Viscosità
Soluzioni molto vischiose a Soluzioni poco vischiose,
pH neutro o alcalino.
salvo quando denaturate col
Viscosità minima al punto calore.
isoelettrico.
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Capitolo 3 La frazione proteica
Idratazione
Elevata riduzione di acqua La ritenzione di acqua
con formazione di colla alle aumenta con la
Gelificazione
alte concentrazioni.
denaturazione.
Nessuna gelificazione
Termogelificazione a partire
termica salvo che in
da 70°C con influenza del
presenza di calcio.
pH e dei sali.
Gelificazione delle micelle
per azione della chimasi.
Proprietà emulsionanti
Proprietà schiumogene
Ritenzioni di aromi
Eccellenti proprietà
Buone proprietà
emulsionanti, soprattutto a
emulsionanti salvo a pH 4 e
pH neutro e alcalino.
5, se vi è denaturazione.
Buon accrescimento di
Buon accrescimento di
volume, ma debole
volume ed eccellente
stabilità della schiuma.
stabilità delle schiume.
Buona ritenzione.
Ritenzione molto variabile
con lo stato di denaturazione
Da: Corradini, 1995.
3.2. IL POLIMORFISMO GENETICO DELLE PROTEINE
Considerando ora l’aspetto genetico, possiamo dire che l’eterogeneità delle frazioni azotate
dipende, oltre che dal grado di fosforilazione o di glicolisazione (ad eccezione delle
sieroproteine), anche dal polimorfismo genetico.
Il termine polimorfismo indica l'esistenza nell’ambito di una popolazione di più di un allele
per un dato locus con frequenza superiore all'1%. In genetica, per allele si intende ogni
forma vitale di DNA codificante per lo stesso gene: in altre parole, l'allele è responsabile
della particolare modalità con cui si manifesta il carattere ereditario controllato da quello
specifico gene.
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Capitolo 3 La frazione proteica
Ciascun individuo definito diploide, come gran parte dei viventi, possiede per ciascun
carattere, ovvero per ciascun gene, due alleli, ossia due copie; ognuno dei due alleli è
presente su uno stesso locus (posizione), su ciascuno dei due cromosomi che costituiscono,
nella cellula, una coppia di omologhi. Nel caso in cui, sui cromosomi omologhi è presente
una duplice copia dello stesso allele, si dice che l'individuo è omozigote per quel carattere;
se gli alleli sono differenti, l'individuo è detto eterozigote. Ogni carattere, all'interno di una
popolazione, può essere rappresentato anche da molti alleli (sebbene ogni individuo ne
possa portare solo due). L'insieme degli alleli presenti in una popolazione è detto pool
genico. La variabilità della frequenza con cui gli alleli compaiono nel pool è l'oggetto di
studio della branca della genetica detta genetica di popolazione. Non tutti gli alleli
determinano un effetto visibile nell'individuo che ne è portatore. Se il carattere da essi
controllato si manifesta, si parla di alleli dominanti; in caso contrario si parla di alleli
recessivi. Un individuo può essere quindi omozigote dominante, se possiede due alleli
dominanti; eterozigote, se possiede due alleli differenti; omozigote recessivo, se possiede
entrambi gli alleli recessivi. Un allele dominante sarà espresso sempre, anche se l'individuo
è eterozigote. Un allele recessivo potrà essere espresso solo in individui omozigoti
recessivi. L'insieme dei caratteri visibili in un organismo prende il nome di fenotipo,
mentre l'insieme del suo corredo di geni (comprendente quindi alleli dominanti e recessivi)
è detto genotipo. Per convenzione, gli alleli sono indicati da una singola lettera, maiuscola
per indicare l'allele dominante (ad esempio A) e minuscola per l'allele recessivo (ad
esempio a). Gli eterozigoti (Aa) e omozigoti (AA) per un determinato gene hanno un
fenotipo A, poiché mostrano l'effetto dell'allele dominante, mentre gli omozigoti (aa)
mostrano l'effetto dell'allele recessivo e hanno fenotipo a.
Le proteine del latte che presentano il fenomeno del polimorfismo genetico sono le caseine
α s1 , α s2 , β e κ e tra le sieroproteine l’α-lattoalbumina e la β-lattoglobulina.
L’identificazione delle diverse varianti si effettua mediante elettroforesi in idonee
condizioni di pH e molarità, poiché la maggior parte delle mutazioni sono causate da
cambiamenti delle cariche elettriche delle proteine e pertanto, possono essere identificate
attraverso le tecniche elettroforetiche [Recio et al., 1997; Amigo et al., 2000].
L'elettroforesi, infatti, è una tecnica analitica separativa, basata sul movimento di particelle
elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato
mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Tra le tecniche elettroforetiche
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Capitolo 3 La frazione proteica
attualmente impiegate, troviamo l’elettroforesi su gel di agarosio (Pulsed field gel
electrophoresis, PFGE), l’elettroforesi su gel di poliacrilammide, l’elettroforesi
bidimensionale,
la
SDS-PAGE
(Sodium
Dodecyl
Sulphate-PolyAcrylamide
Gel
Electrophoresis), l’elettroforesi capillare (CE). In particolare, il compito del materiale di
supporto su cui vengono fatte “correre” le molecole è quello di eliminare le correnti
convettive limitando la diffusione, in modo tale che i campioni separati siano contenuti in
zone ristrette. In generale si tratta di materiali porosi, che vengono opportunamente bagnati
nel tampone di corsa all’interno del quale si ha l'elettroforesi. I primi supporti utilizzati
erano costituiti da carta da filtro o da strisce di acetato di cellulosa, imbevute nel tampone
di corsa. Attualmente questi sono poco usati, anche se, per certe applicazioni, trovano
ancora impiego. L'utilizzo dei gel invece, come materiale di supporto per elettroforesi, ha
portato ad un rapido miglioramento nei metodi di analisi delle macromolecole. Il primo gel
ad essere usato fu quello di amido, ma oggi, per la maggior parte delle tecniche
elettroforetiche, si utilizzano gel di agarosio o di poliacrilammide. Inoltre oggi con
l’impiego di queste nuove tecniche e della PCR (Polymerase Chain Reaction), tecnica
molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di DNA dei
quali si conoscano le sequenze iniziali e terminali, è possibile ottenere un profilo proteico
analizzando direttamente il sangue o i peli degli animali e non solo il latte, come accadeva
in passato.
Oltre alle tecniche elettroforetiche, altri metodi sono stati impiegati per analizzare la
frazione proteica del latte, come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)
attraverso scambio ionico, interazioni idrofobiche e metodi fase-inversa, combinazione
della mappatura peptidica, spettrometria di massa e combinazioni di questi, al fine di
identificare le varianti genetiche che non sono state determinate attraverso i metodi
elettroforetici, in particolar modo, nel momento in cui non si verificano cambiamenti delle
cariche elettriche delle stesse [Burr et al., 1997; Chin et al., 1997; Bonfatti et al., 2008].
Pertanto, per quanto riguarda la frazione proteica del latte, con il termine polimorfismo
(dal greco, letteralmente, “l’avere molte forme") si intende la presenza di molte forme
genetiche (Fig. 7) di una stessa proteina, che si distinguono tra loro per la sostituzione o la
delezione di alcuni aminoacidi all’interno della catena polipeptidica [Martin et al., 1999;
Alais, 2000].
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Capitolo 3 La frazione proteica
Figura 7. Polimorfismo genetico e relazione filogenetica tra le varianti di sei principali
proteine del latte bovino. I numeri indicano la posizione a livello della quale avvengono i
punti di mutazione o delezione all’interno della catena peptidica.
Da: Martin et al., 1999
Il polimorfismo delle proteine del latte determina differenze della struttura molecolare
delle proteine, che a loro volta si traducono in differenze delle proprietà fisico-chimiche e
biologiche delle proteine in questione e delle caratteristiche tecnologiche del latte
[Bovenhuis et al., 1992; Macheboeuf et al., 1993; Nuyts-Petit et al., 1997]. La frequenza
delle varianti genetiche di ogni proteina del latte considerata varia con la specie e con la
razza. Ad esempio nelle diverse razze lattifere allevate nel comprensorio del Parmigiano
Reggiano si osservano nette differenze a livello delle frequenze dei tre genotipi della κ-Cn
tra le razze locali e la razza Frisona, in quanto la variante B oscilla tra il 21 ed il 24,8%
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Capitolo 3 La frazione proteica
nelle prime e tra il 5,2 e il 9,9% nella Frisona [Mariani et al., 1971; Mariani,1975; Losi et
al., 1973].
Dalla prima scoperta delle varianti genetiche sulla β-Lg compiuta da Aschaffenburg e
Drewry [1955] sono state effettuate molte ricerche sul polimorfismo genetico delle
proteine del latte e in particolar modo, la maggior parte dello studio in questo campo è
stato effettuato sulla specie bovina [Martin et al., 1999].
Dal 1984 [Eigel et al., 1984] al 2004 [Farrell et al., 2004] sono state identificate nuove
varianti genetiche nel latte bovino sia a livello delle caseine che delle sieroproteine
(Tab.10).
Tabella 10. Le varianti genetiche delle proteine del latte bovino.
Proteine
Varianti genetiche
α s1 -Cn
A, B, C, D, E, F, G, H
α s2 -Cn
A, B, C, D
β-Cn
A1, A2, A3, B, C, D, E, F, G, H1, H2, I
κ-Cn
A, B, C, E, F1, F2, G1, G2, H, I, J
β-Lg
A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, W
α-La
A, B, C
In particolare per l’ α
s1 -Cn
sono state identificate 3 nuove varianti genetiche: α
s1 -Cn
F
[Erhardt, 1993], α s1 -Cn G [Mariani et al., 1995] e α s1 -Cn H [Mahé et al., 1999].
Anche per la β-Cn, oltre alle varianti genetiche già individuate (A1, A2, A3, B, C, D, E) e
riportate nella precedente revisione [Eigel et al., 1984] sono state identificate nuove
varianti: β-Cn F, precedentemente definita β-Cn X [Visser et al., 1995], β-Cn G [Dong et
al., 1998], β-Cn H1 [Han et al., 2000], β-Cn H2 [Senocq et al., 2002] e infine la variante I,
determinata da Jann et al. [2002]. In uno studio in particolare, è risultato che la variante
A1 sia aterogenica rispetto alla variante A2 , in quanto i risultati ottenuti suggeriscono
l’esistenza di una stretta relazione tra la mortalità causata dalle malattie cardiovascolari e
il consumo della β-Cn A1 [Tailford et al., 2003]. Il meccanismo d’azione ipotizzato si
riferisce alla presenza di peptidi bioattivi, i quali sono prodotti nel latte con la variante A1
e non con la variante A2. Tali peptidi sembrano influenzare il sistema nervoso, endocrino
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Capitolo 3 La frazione proteica
ed immunitario ed aumentare l’ossidazione delle lipoproteine a bassa densità [Bell et al.,
2008].
La scoperta del polimorfismo della κ-Cn risale al 1964. Mediante elettroforesi a pH
alcalino, furono individuate due distinte bande o frazioni di κ-Cn, denominate A e B, la cui
sintesi è controllata da geni autosomici codominanti [Mariani et al., 1991] e
successivamente le differenze riscontrate sono state identificate come mutazioni nel gene
CNS3 [Strzalkowska et al., 2002].
In seguito sono state individuate altre 9 varianti genetiche della κ-Cn: κ-Cn C ed E
[Miranda et al., 1993], κ-Cn F1 [Sulimova et al., 1992], κ-Cn F2 e κ-Cn G [Prinzenberg et
al., 1996]. Quest’ultima variante è stata scoperta solo nelle razze Alpine ed è stata in
seguito definita G1, in quanto Sulimova et al. [1996] scoprirono un’altra variante della κCn nello yak (Bos grunniens) che potrebbe essere denominata κ-Cn G2. Infine sempre
Prinzenberg et al. [1999] hanno determinato la κ-Cn H e la κ-Cn I e Mahé et al. [1999]
hanno riportato la κ-Cn J nei bovini Bos taurus.
In particolar modo però, tra le 11 varianti genetiche della κ-Cn, quelle con una maggiore
frequenza sono rappresentate dalle varianti A e B. Quest’ultima differisce dalla variante A
per la sostituzione dell’aminoacidico isoleucina con la treonina in posizione 136 e
dell’alanina con l’acido aspartico in posizione 148 [Mercier et al., 1973; Strzalkowska et
al., 2002; Farrell et al., 2004]. Quest’ultima sostituzione determina una differenza di carica
netta, che conferisce alla variante A una maggiore mobilità elettroforetica in campo
alcalino nei confronti della variante B.
Nell’ambito delle sieroproteine, la proteina più rilevante è rappresentata dalla β-Lg (LGB).
Da quando Aschaffenburg e Drewry [1955] hanno riscontrato per la prima volta il
polimorfismo della stessa, nuove varianti genetiche di quest’ultima sono state identificate
fino ad oggi e in particolar modo dall’ultima revisione del 1984 [Eigel et al., 1984] sono
state identificate: β-Lg H [Conti et al., 1988; Davoli et al., 1988], β-Lg I e J [GodovacZimermann et al., 1996] e infine β-Lg W [Godovac-Zimermann et al., 1990].
Tra le 11 varianti genetiche della β-Lg, le varianti A e B risultano essere però le più
frequenti e, in particolare, la variante B si differenzia dalla A per la sostituzione
dell’aminoacido glicina con l’acido aspartico in posizione 64 e dell’alanina con la valina in
posizione 118 [Strzalkowska et al., 2002; Farrell et al., 2004].
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Infine l’ α-La presenta due varianti genetiche predominanti rappresentate dalla variante A
e B. Inoltre una terza variante (C) è stata riportata per quest’ultima sieroproteina, ma non è
stata confermata con la sequenza proteica [Bell et al., 1981].
3.3. L’INFLUENZA DEL POLIMORFISMO GENETICO SULLE CARATTERISTICHE
TECNOLOGICHE DEL LATTE.
Negli ultimi anni il polimorfismo genetico delle proteine del latte è stato oggetto di grande
interesse all’interno del settore lattiero-caseario, dovuto in particolar modo, alla possibile
relazione tra quest’ultimo e le caratteristiche di produzione, la composizione e le proprietà
tecnologiche del latte.
Dagli studi effettuati infatti, è stato notato che le differenze tra le varianti genetiche delle
singole proteine, anche se ridotte, possono influire sul comportamento della stessa
proteina ed a livello del latte nei diversi processi tecnologici [Russo et al., 1978].
È stato osservato che la variante A della α s1 -Cn differisce dalle altre varianti per la perdita
di un gruppo di 13 aminoacidi, in posizione 14-26, in una regione a carattere
prevalentemente idrofobico posta tra due zone idrofile e pertanto, presenta alcune
proprietà fisiche che conferiscono al latte un diverso comportamento nel corso dei
trattamenti termici e dei processi di trasformazione. La caratteristica che la
contraddistingue è la solubilità in presenza di ioni calcio (CaCl 2 ) a concentrazioni
superiori a 0,1 M ed a 1°C, mentre le varianti B e C precipitano nelle stesse condizioni.
Inoltre la sua presenza conferisce alle micelle caseiniche un minor grado di solvatazione e
determina una maggior eterogeneità nelle dimensioni delle micelle in relazione alla più
elevata capacità di legare calcio e alla minore interazione, che in normali condizioni,
manifesta nei riguardi della κ-Cn. Dal punto di vista caseario, in alcuni studi è stato
notato che il latte con la variante A della α s1 -Cn presenta una velocità di acidificazione
peggiore e un coagulo poco consistente e inadatto alla produzione casearia, che influenza
di conseguenza la normale maturazione del formaggio, a differenza del latte con α s1 -Cn
BC, per il quale sono state messe in evidenza migliori caratteristiche del coagulo [Russo et
al., 1978; Mariani et al., 1999]. Tale comportamento sembra sia dovuto alla mancanza del
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Capitolo 3 La frazione proteica
legame sensibile alla chimosina Phe23- Phe24 presente nel segmento della α s1 -Cn B o C ma
non dell’ α s1 -Cn A [Mariani et al., 1999; Creamer et al., 1997].
Nel caso della β-Cn, gli studi effettuati sulle varianti genetiche A e B di questa caseina
hanno rilevato diversi comportamenti a livello della velocità di coagulazione. In particolar
modo è stato verificato che la variante B è maggiormente idonea ai fini della produzione
casearia [Russo et al., 1978; Pecorari et al., 1990]. Le micelle della β-Cn B , infatti, sono
più stabili, ma anche molto più sensibili all’azione della chimosina rispetto a quelle che
contengono β-Cn A, per cui esse tendono a coagulare in tempi più ridotti. Tale
comportamento sembra esser dovuto ad una diversa dispersione micellare della caseina
nativa, che vede nella β-Cn B una maggiore frequenza di micelle di piccolissima
dimensione, quadro che potrebbero spiegare il diverso comportamento tecnologico, in
quanto sembra legato alla maggior capacità con cui la variante B reagisce con il caglio,
reattività determinata da una più ampia superficie di reazione della caseina nativa [Mariani
et al., 1999]. In altri studi inoltre è stato dimostrato che la β-Cn è il miglior emulsionante
tra le caseine, in particolar modo la variante A1 ha una elevata capacità emulsionante
rispetto alla variante A2 [Euston et al., 1997].
Per quanto riguarda la κ-Cn, come è noto da diversi studi, la variante B è quella
considerata più favorevole per il latte destinato alla trasformazione casearia, in quanto
determina la presenza di micelle caseiniche più piccole e numerose, che coagulano più
velocemente e formano un coagulo più consistente e con caratteristiche reologiche della
massa caseosa (maggiore capacità di contrazione e di espulsione del siero) migliori a
differenza della variante A, composta da micelle grandi e poco numerose [Losi et al.,
1973; Morini et al., 1975; Morini et al.,1983; Schaar et al., 1985; Castagnetti et al., 1986].
Pertanto il quadro micellare caseinico del latte con κ-Cn B risulta migliore rispetto a quello
del latte con la variante A, in quanto è stato osservato che le micelle presentano una
maggiore superficie complessiva e sono di dimensione più omogenea e ciò determina una
coagulazione più rapida del latte [Macheboeuf et al., 1993], la formazione di una cagliata
più consistente e migliore in fase di caseificazione, in quanto i granuli caseosi sono più
uniformi e presentano una maggiore sineresi, il cui grado di coesione porta alla formazione
di masse caseose con migliori caratteristiche reologiche e una maggior resa in formaggio
[Mariani et al., 1976; Pecorari et al., 1990]. La variante A, al contrario, sembra conferire
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maggiore stabilità alle micelle caseiniche disperse nel latte e di conseguenza il latte con
tale variante è più adatto per la produzione di latte alimentare [Russo et al., 1978].
Le caratteristiche attribuite alla variante B sono state confermate anche in altri studi più
recenti [Mariani et al., 1991; Walsh et al., 1995; FitzGerald et al., 1997; Walsh et al.,
1999; Gastaldi et al., 2003].
Tra le sieroproteine, la β-Lg presenta con maggior frequenza la variante A e la B, che
risultano le più importanti dal punto di vista del settore lattiero caseario. Queste varianti
sono rilevanti perché sono associate ad effetti quantitativi sulla composizione del latte e
sulle sue proprietà tecnologiche, come ad esempio, la consistenza del coagulo [McLean et
al., 1984; Ng-Kwai-Hang et al., 1986; Aleandri et al., 1990; Van Eenennaam et al., 1991;
Ng-Kwai Hang et al., 1992]. Nello specifico la variante B, come è noto, è correlata con
elevati contenuti di caseina del latte e con l’indice di caseina, e quindi con una maggior
resa in formaggio [Lundén et al., 1997; Mariani et al., 1999; Robitaille et al., 2002],
mentre la variante A è correlata a maggiori contenuti in sieroproteine [Mariani et al.,
1979b; Morini et al., 1983; Jacob et al., 1992; Hill, 1993] ed ad una alta capacità
emulsionante [Euston et al., 1997]. Inoltre le caratteristiche di idrolisi di quest’ultima sono
differenti dalle varianti B e C [Creamer et al., 2004].
Nel latte ad uso alimentare, come è noto, la componente proteica in seguito ai trattamenti
termici, può essere soggetta a denaturazione, che interessa in “primis” ed in particolar
modo, le proteine del siero [Nielson et al., 1996; Manderson et al., 1997]. In questo caso,
dagli studi eseguiti, è emerso che la β-Lg A risulta più stabile al calore rispetto alla
variante B, in quanto quest’ultima interagisce più velocemente della A con la κ-caseina
nel formare il complesso β-lattoglobulina-caseina e, di conseguenza, il latte che la
contiene è meno stabile al calore [FitzGerald et al., 1997]. Pertanto la variante A è più
idonea per la produzione di latte alimentare, il quale è sottoposto ai trattamenti di
pastorizzazione e di sterilizzazione, con minore rischio che si verifichi l’inconveniente
della formazione di precipitati.
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3.4.
L’INFLUENZA DELLE VARIANTI GENETICHE DELLE PROTEINE SULLE
CARATTERISTICHE PRODUTTIVE DEL LATTE.
Numerose ricerche sono state realizzate per constatare se le varianti genetiche sono
associate ad alcuni caratteri produttivi delle bovine zootecnicamente interessanti e, di
conseguenza, possono essere impiegate per il miglioramento di quest’ultimi. Appare,
pertanto, evidente l’importanza che ha assunto negli ultimi anni, lo studio delle relazioni tra
le varianti genetiche delle proteine del latte e le caratteristiche produttive delle bovine,
anche se in diversi studi le scoperte riscontrate sono state contraddittorie [Schaar et al.,
1985; Jacob et al., 1992].
D’altronde in molti studi l’attenzione è stata focalizzata sull’effetto di un singolo locus
delle proteine del latte, piuttosto che sull’effetto di fenotipi composti (aplotidi) sulla
composizione e le proprietà tecnologiche del latte [Mayer et al., 1997]. La combinazione
degli alleli su un particolare cromosoma è chiamata aplotipo, la frequenza del quale può
essere solo stimata attarverso l’esame delle frequenze osservate dalle combinazioni
genotipiche. Infatti è stato dimostrato, attraverso modelli genetici nel campo della
selezione, che esiste un effetto combinato tra i loci, il cosiddetto “linkage”. Quest’ultimo
naturalmente deve essere preso in considerazione quando si seleziona per un determinato
genotipo, in modo tale da ottenere effetti altamente significativi nei riguardi della
composizione e delle principali proprietà tecnologiche del latte, in quanto la selezione a
favore di un allele comporta necessariamente anche la selezione per gli altri alleli ad esso
associati [Ojala et al., 1997]. Non bisogna, inoltre, dimenticare che oltre ai fattori genetici,
altri fattori possono influenzare le caratteristiche produttive delle bovine, come il numero di
lattazioni, lo stadio di lattazione e lo stato fisiologico, così come, le condizioni ambientali e
il tipo di razionamento alimentare.
Mediante tecniche di mappatura genetica è stato confermato che i loci delle caseine (α s1 , β
e κ) sono localizzati sul cromosoma 6, il gene della β-Lg sul cromosoma 11 e il gene della
α-La sul cromosoma 5 [Bleck et al., 1993; Ruottinen et al., 2004].
Per quanto riguarda gli effetti delle varianti genetiche, il genotipo BB della α s1 -Cn sembra
influenzare la produzione del latte, del grasso e delle proteine [Aleandri et al., 1990], anche
se secondo alcuni studi sono stati riscontrati alcuni effetti solo sulla percentuale delle
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 3 La frazione proteica
proteine [Bovenhuis et al., 1992], mentre in altri non è stato riscontrato alcun effetto, ad
eccezione del fenotipo BC associato con alti contenuti proteici rispetto al fenotipo BB [NgKwai Hang et al., 1997].
In alcune ricerche il genotipo della β-Cn non sembra esser associato ai caratteri produttivi
[Aleandri et al., 1990], mentre in altri studi gli effetti del genotipo di questa caseina sono
risultati significativi sulla produzione di latte, la percentuale di grasso e il contenuto
proteico [Bovenhuis et al., 1992]. In particolare, la variante A2 nel latte delle bovine di
razza Frisona sembra esser associata ad una maggior produzione di latte, grasso e proteine
rispetto alla variante A1, mentre un effetto opposto è stato riscontrato nel latte delle bovine
di razza Jersey [Winkelman et al., 1997]. In altri studi, invece, nel latte con la variante A2 è
stata riscontrata una minor concentrazione di proteine totali e di caseina [Ng-Kwai Hang et
al., 1997]. Per quanto riguarda la variante B, quest’ultima sembra influire positivamente
sulla sintesi della caseina, mentre non sembra in grado di esercitare effetti importanti nei
riguardi delle sieroproteine [Pecorari et al., 1990].
Gli studi effettuati, inoltre, hanno dimostrato l’influenza del genotipo della κ-Cn sulla
produzione di latte, grasso, proteine, che risultano maggiori nel latte con la variante B
rispetto alla variante A [Strzalkowska et al., 2002]. In particolare κ-Cn B è associata con un
alto contenuto di proteine, caseina e una maggior produzione di latte [Aleandri et al., 1990;
Bovenhuis et al., 1992; FitzGerald et al., 1997]. Il contenuto di caseina nel latte è, come
già sottolineato in precedenza, fondamentale per la determinazione di alcune caratteristiche
del coagulo, con particolare riferimento alla sua consistenza, in quanto il latte con un
determinato contenuto di caseina, dà origine ad una
cagliata reologicamente più
equilibrata, omogenea e sufficientemente elastica, dotata di una buona capacità di
contrazione, condizione basilare per ottenere un formaggio uniformemente disidratato
[Pecorari et al., 1990].
Alcune differenze sono state riportate anche per il contenuto di acido citrico nel latte, il
quale è stato dimostrato essere inferiore del 10% circa nel latte con la variante B rispetto
alla variante A [Mariani et al., 1979a; Schaar et al., 1985].
Per quanto riguarda i genotipi della β-Lg, il genotipo omozigote AA sembra contenere una
concentrazione inferiore del 7% di caseina totale, 11% di grasso e 6% di solidi totali e nello
stesso tempo, una maggior concentrazione del 30% di sieroproteine (β-Lg) e di proteine
totali rispetto al genotipo BB [Hill, 1993]. Quest’ultimo a sua volta, risulta esser associato
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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Capitolo 3 La frazione proteica
ad un maggior contenuto di caseina e di grasso, ad un elevato indice caseinico ed ad una
maggior produzione di formaggio e contemporaneamente, ad una minor produzione di latte
e di proteine [Aleandri et al., 1990; Pecorari et al., 1990; Bovenhuis et al., 1992]. Tali
risultati non sono stati confermati in altri studi, nei quali appunto, non è stata riscontrata
alcuna influenza del genotipo della β-Lg sulla produzione e composizione del latte, ad
eccezione per un elevato contenuto proteico nel latte delle bovine con la variante A
[Strzalkowska et al., 2002]. Nel settore lattiero-caseario ed in particolare nella produzione
dello yogurt, inoltre, è stato dimostrato che la sineresi è maggior con β-Lg A rispetto a
β-Lg B, pertanto quest’ultima sembra più idonea per essere impiegata in quest’ultimo
settore [FitzGerald et al., 1997].
Infine per l’ α-La A è stata riscontrata una maggior produzione di latte ed una minor
percentuale di grasso e di proteine, mentre al contrario, la variante B è stata associata ad
una minor produzione di latte e ad una maggior percentuale di grasso e di proteine
[Bleck et al., 1993].
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Selenia Melia Tesi di dottorato
”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
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Capitolo 4 La frazione lipidica
CAPITOLO 4
4.1. LA FRAZIONE LIPIDICA DEL LATTE BOVINO
I lipidi (dal greco “lipos” = “grasso”) sono sostanze caratterizzate da insolubilità in acqua e
solubilità in solventi organici non polari. Hanno diverse funzioni in natura, prima fra tutte,
sono una importante fonte energetica, in quanto il loro apporto calorico è di 9 kcal/g, che
viene trasformato in energia termica per mantenere costante la temperatura corporea, in
energia meccanica per permettere la contrazione muscolare ed in energia chimica per
consentire lo svolgimento delle funzioni biochimiche corporee.
I lipidi, pertanto, sono molto diffusi sia nel mondo animale che vegetale, in quanto
rappresentano i componenti a più alta concentrazione energetica. Quelli più complessi
svolgono funzioni biologiche delicate ed importanti, come precursori di molti ormoni ed
inoltre, sono presenti in maggiori concentrazioni nei tessuti od organi complessi, come
quelli riproduttivi, cerebrali, epatici, etc.
Considerando la frazione lipidica del latte bovino, quest’ultima presenta una percentuale
di grasso che varia dal 3,5 al 4%, con ampie oscillazioni individuali e stagionali e si ritrova
nel latte come emulsione sottoforma di globuli sferici, la cui sintesi avviene a livello delle
cellule secretrici dell’epitelio della ghiandola mammaria [McPherson et al., 1983; Walstra
et al., 1984; Danthine et al., 2000; Secchiari et al., 2002]. Nelle altre specie lattifere la
percentuale può raggiungere anche punte dell’8% (latte ovino di alcune razze).
È la componente più variabile in funzione dello stadio di lattazione, dell’alimentazione,
della razza, delle caratteristiche lattifere individuali e delle condizioni ambientali. La
sostanza grassa è sintetizzata in parte nella ghiandola mammaria a partire da acidi grassi
volatili sintetizzati nel rumine dei ruminanti (da C 4:0 a C 16:0 ), in parte da acidi grassi
provenienti dalla dieta (C 18:0 >).
Tale componente è mediamente rappresentato da:
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Capitolo 4 La frazione lipidica
- trigliceridi 98% (lipidi neutri)
- fosfolipidi 1% (lipidi complessi o polari)
- sostanze insaponificabili < 1%
Chimicamente i trigliceridi derivano dall’esterificazione degli acidi grassi con un alcol
trivalente, la glicerina. Pertanto a seconda del numero dei legami esterificati, i grassi si
distinguono in trigliceridi (3 legami esterificati), digliceridi (2 legami esterificati) e
monogliceridi (1 legame esterificato). Gli ultimi due sono presenti nel latte assieme ai
trigliceridi rispettivamente intorno a 1,5 e 0,25% dei lipidi totali.
Per quanto riguarda la composizione in acidi grassi, il grasso del latte è uno dei
componenti più complessi, essendo costituito da 150 acidi grassi diversi, presenta una
proporzione pari a circa 2/3 di acidi grassi saturi ed 1/3 di acidi grassi insaturi ed una
specifica proporzione elevata di acidi grassi volatili a basso peso molecolare.
Nel grasso del latte sono presenti principalmente gli acidi grassi a numero pari di atomi di
carbonio compresi tra il C 4:0 e il C 20:0 , mentre quelli a numero dispari sono presenti solo in
tracce. Quasi tutti gli acidi grassi saturi hanno un numero pari di atomi di carbonio, dal
momento che il punto di partenza della loro sintesi è l’acido acetico (C 2:0 ) (Tab. 11).
Inoltre quelli compresi tra C 4:0 e C 10:0 e una parte del C 12:0 sono volatili, se presenti allo
stato libero, cioè non esterificati con la glicerina e sono molto importanti, in quanto
influenzano le caratteristiche organolettiche del latte e la qualità dei prodotti caseari, così
come ad esempio sono responsabili della formazione dell’aroma [Poveda et al., 1999].
Soprattutto i primi due acidi volatili (butirrico e caproico) costituiscono la parte più
caratteristica del latte dei ruminanti, sono solubili in acqua e rappresentano circa il 5%
dell’insieme. Naturalmente nei non ruminanti, in cui l’utilizzazione dell’acido acetico nella
mammella è molto meno intensa, la presenza di questi acidi volatili è inferiore.
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Capitolo 4 La frazione lipidica
Tabella 11. Principali acidi grassi del grasso di latte bovino
Categoria
N° di atomi % sul totale
Stato fisico
di C
(temperatura
di fusione, °C)
Acidi grassi saturi CH 3 – (CH 2 ) n – COOH
67%
Volatili solubili:
Butirrico
C 4:0
3- 4 (tr.) *
Liquido (- 8)^
Caproico
C 6:0
2-5 (tr.)
Liquido (- 3)
Caprilico
C 8:0
1 – 1,5 (tr.)
Liqu. Solido (+ 16)
Caprico
C 10:0
2 (2)
Solido (+ 30)
Laurico
C 12:0
3 (8)
Solido (+ 42)
Miristico
C 14:0
11 (10)
Solido (+ 54)
Palmitico
C 16:0
25 – 30 (23)
Solido (+ 62)
Stearico
C 18:0
12 (7)
Solido (+ 70)
Arachico
C 20:0
0,2
Solido (+ 75)
Palmitoleico
C 16:1
2 (5)
Liquido (+ 0,5)
Oleico (cis9)
C 18:1
23 (35)
Liq. Solido (+ 16)
Vaccenico (trans11)
C 18:1
2–3
Solido (+ 43)
(dieni) Linoleico
C 18:2
2 ( 8,5 )
Liquido
(trieni) Linolenico
C 18:3
0,5 ( 2 )
Liquido
0,2
Liquido
0,8
Liquido
Volatili insolubili:
Fissi:
Acidi insaturi 33 %
Monoeni:
Polinsaturi
non
coniugati:
(tetraeni) Arachidonico C 20:4
Polinsaturi coniugati:
Dieni
C 18:2
Trieni e tetraeni
C 18:3 -C 18:4 tracce
Liquido
( * ) Tra parentesi alcune percentuali relative al latte umano
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Capitolo 4 La frazione lipidica
( ^ ) Il punto di fusione dei trigliceridi è vicino a quello dell’acido grasso, nel caso degli
acidi fissi.
Da: Salvadori del Prato, 1998.
Fra gli acidi grassi saturi, determinati mediante tecniche cromatografiche (GC, GC-MS,
HPLC), il componente principale è l’acido palmitico (dal 25 al 30% sul totale degli acidi
grassi), seguito dalle concentrazioni intermedie dell’acido stearico e miristico (~12% e
11% rispettivamente), mentre fra gli acidi grassi insaturi, quello presente in maggiori
concentrazioni è l’acido oleico (~23%) [Malacarne et al., 2001]. Inoltre, sono presenti
piccole quantità di acidi grassi monoinsaturi e polinsaturi, dienici e trienici, ed in
particolare, questi ultimi rientrano nel gruppo degli acidi grassi considerati essenziali per
l’alimentazione umana.
Una componente importante della frazione lipidica è rappresentata dai fosfolipidi, che si
distinguono dai trigliceridi, in quanto sono lipidi polari che si ritrovano maggiormente
legati alla membrana del globulo di grasso (circa il 60% dei fosfolipidi totali del latte) e
presentano una parte lipofila, costituita da acidi grassi per lo più insaturi, esterificati ad una
molecola di glicerolo, e una parte idrofila costituita da una molecola di acido fosforico
legata ad una base azotata [Caboni et al., 1983]. Tra i principali fosfolipidi del latte
troviamo la lecitina, che ha come base organica la colina, le cefaline, che contengono
etanolammina e le sfingomieline, con basi sfingosina e colina. Le lecitine sono eccellenti
agenti emulsionanti e giocano un ruolo importante nella costituzione delle membrane dei
globuli di grasso del latte, contribuendo a rendere stabile la sospensione della sostanza
grassa.
Il grasso del latte è costituito, in concentrazioni modeste (0,5 % del totale degli acidi
grassi), anche da cheto e ossiacidi e da lattoni derivanti dagli ossiacidi. Questi composti
sono parzialmente responsabili dell’aroma del latte e dei prodotti lattiero–caseari e la loro
concentrazione aumenta con il riscaldamento.
La quota insaponificabile del grasso del latte è costituita da steroli, carotenoidi e vitamine
liposolubili. Il più abbondante è il colesterolo (~0,3% del grasso, cioè 0,1 g/L di latte), che
riveste una grande importanza nutrizionale come precursore di molti ormoni e della
vitamina D. Esso agisce da emulsionante e stabilizzatore del grasso, mantenendo l’integrità
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funzionale delle membrane cellulari, di cui regola la fluidità e la permeabilità, ed ha un
effetto parzialmente inibitore sulle lipasi. Gli steroli del latte, inoltre, sembrano
strettamente associati alla lecitina, di cui regolano il potere idrofilo.
I carotenoidi sono i coloranti naturali del latte e dei latticini e il loro contenuto varia con
l’alimentazione degli animali e quindi con l’andamento stagionale. Nel latte si trovano
principalmente i caroteni isomeri α e β, la vitamina A ed una bassa concentrazione di
xantofilla, di squalene e di licopene. I caroteni, come i grassi, sono protetti dall’ossidazione
dei tocoferoli (vit. E), che a loro volta, svolgono la funzione di antiossidanti, ed in
particolare, nel latte bovino il loro tenore è molto variabile (da 0,2 a 1,2 mg/L).
4.2. CLASSIFICAZIONE E NOMENCLATURA
DEGLI ACIDI GRASSI
La composizione in acidi grassi del latte è caratterizzata da acidi grassi saturi ed insaturi a
seconda del numero dei doppi legami presenti nella catena molecolare.
La definizione di un acido grasso, pertanto, è basata sul numero di atomi di carbonio (C),
sul numero di doppi legami che determinano il grado di insaturazione e sulla posizione di
quest’ultimi sulla catena molecolare.
Gli acidi grassi possono essere classificati in vari modi anche se la classificazione in base
alla lunghezza ed al grado di insaturazione sembra essere la più utile per schematizzare la
relativa funzione biologica [Gabaldo et al., 2007]:
¾ Saturi: non contengono alcun doppio legame, rappresentano quantitativamente la
maggior parte degli acidi grassi presenti in natura e sono normalmente allo stato solido a
temperatura ambiente;
¾ Insaturi: sono caratterizzati da uno o più doppi legami, sono presenti in minor quantità
rispetto a quelli saturi e sono liquidi a temperatura ambiente. Essi si dividono in :
a) Acidi grassi monoinsaturi con un solo doppio legame;
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b) Acidi grassi polinsaturi con più doppi legami tra gli atomi di carbonio.
Per la nomenclatura di tali acidi si utilizza il sistema ω (indicato anche con il termine “n”),
nel quale è considerata la posizione del primo doppio legame più lontano dal metile (CH 3 )
presente nella molecola dell’acido grasso in posizione 1 [O’Keefe, 1998]. L’acido oleico,
ad esempio, è un C 18.1 con un doppio legame ed appartiene alla serie ω 9, perché il doppio
legame più lontano dal metile è situato a livello del nono carbonio.
Un altro metodo utilizzato per la nomenclatura degli acidi grassi insaturi, si avvale del
simbolo Δ (delta), per indicare la posizione dei doppi legami partendo dal gruppo
carbossilico (COOH).
Il sistema omega (ω o n) viene utilizzato quando si esaminano gli acidi grassi con
riferimento alla nutrizione, mentre il sistema Δ è adottato in particolar modo per osservare
le reazioni chimiche degli acidi grassi. Gli enzimi desaturasi per esempio, si riferiscono a
quest’ultimo sistema, perché la loro azione catalitica è conforme con l’inserzione
stereospecifica di un doppio legame dal carbossile terminale degli acidi grassi.
Per quanto riguarda gli acidi grassi coniugati, quest’ultimi si distinguono dagli altri per
avere un legame semplice tra due legami doppi (es. isomeri dell’acido linoleico coniugato
= CLA) (fig. 8).
Un’altra differenza da ricordare, è la possibilità di avere forme isometriche, sia di
posizione nella catena, che di posizione intorno al doppio legame, cioè di avere l’isomeria
geometrica in forma cis o trans [Secchiari et al., 2002]. Questa due configurazioni si
differenziano a seconda della disposizione spaziale attorno al doppio legame. Se i gruppi
della catena si dispongono dalla stessa parte del doppio legame, la configurazione è cis, se
si verifica il contrario la configurazione è trans (Fig. 8).
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Figura 8. Isomeri del CLA più comuni nei prodotti di origine animale.
Da: Secchiari et al., 2002.
4.3. SINTESI DEGLI ACIDI GRASSI
Le cellule secernenti della ghiandola mammaria sintetizzano i lipidi del latte partendo dagli
acidi grassi che, per il 40% viene sintetizzato de novo nelle cellule stesse, a partire
dall’acetato e dal β-idrossibutirrato (che contribuisce per il 15%) e per il rimanente 60% è
costituito da acidi grassi prelevati dal flusso ematico [Secchiari et al., 2002].
Come è noto, infatti, la popolazione microbica del rumine è responsabile della
degradazione e della fermentazione dei carboidrati e delle proteine presenti nella dieta e, di
conseguenza, della produzione di acidi grassi volatili (AGV) quali l’acido acetico,
propionico e butirrico, indicati normalmente come acetato, propionato e butirrato. In
particolare, l’acetato e il butirrato (preventivamente convertito in 3-idrossibutirrato a
livello delle pareti ruminali) sono i precursori degli acidi grassi a media e corta catena del
latte e del tessuto adiposo [Chilliard et al., 2000] e il loro equilibrio dipende anche dalla
composizione della dieta ed in particolar modo, dalla proporzione della fibra nella razione
alimentare. Al contrario, la produzione del propionato dipende dalla proporzione dei
concentrati inseriti nella razione alimentare.
Nei ruminanti, al contrario dei monogastrici, è il tessuto adiposo e non il fegato, il cui
metabolismo è orientato verso la sintesi del glucosio, il sito maggiormente attivo per la
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Capitolo 4 La frazione lipidica
sintesi degli acidi grassi, mentre per gli animali in lattazione è rappresentato dalla
ghiandola mammaria.
In particolare, la sintesi degli acidi grassi saturi fino a 16 atomi di carbonio avviene nel
citoplasma mediante il coinvolgimento di due enzimi: l’acetil-CoA-carbossilasi (ACC) e la
sintasi acidi grassi (FAS) [Chilliard et al., 2000]. Nella ghiandola mammaria, pertanto,
l’allungamento della catena può proseguire fino alla formazione di acidi grassi con 14 o 16
atomi di carbonio, ma quest’ultimo non può essere convertito ad acido stearico (C 18:0 ),
sebbene una piccola proporzione di C 14:0 e C 16:0 è desaturato a C 14:1 e C 16:1 .
Pertanto gli acidi grassi preformati a media e a lunga catena (con 16 o più atomi di
carbonio) presenti nel plasma sanguigno e provenienti dalla dieta o dalla mobilizzazione
delle riserve corporee, possono essere utilizzati dai tessuti, grazie all’azione dell’enzima
lipoproteinlipasi (LPL), mediante il prelievo diretto dal circolo ematico degli acidi grassi
non esterificati (NEFA) o da quelli contenuti nei chilomicroni e nelle lipoproteine molto
bassa densità (VLDL). Inoltre, le cellule della ghiandola mammaria mediante l’enzima
Stearoil-CoA-desaturasi (SDC), che è in grado di introdurre un doppio legame in posizione
Δ9, consentono di convertire l’acido stearico in acido oleico.
Pertanto, gli acidi grassi così formati possono essere utilizzati nella ghiandola mammaria e
nel tessuto adiposo per la sintesi dei trigliceridi e dei fosfolipidi.
Gli acidi grassi a lunga catena sono potenti inibitori della sintesi degli acidi grassi di sintesi
mammaria, attraverso un diretto effetto inibitorio sull’attività dell’acetil-CoA-carbossilasi
(ACC). Un terzo fattore che potrebbe provocare questo cambiamento è anche la ridotta
disponibilità di acetato e di 3-idrossibutirrato per la sintesi mammaria.
4.4.
METABOLISMO LIPIDICO RUMINALE
Alcuni studi sul metabolismo lipidico ruminale si sono concentrati principalmente sul
destino degli acidi grassi, ed in particolare, su come essi attraversino il rumine e siano così
soggetti all’azione della popolazione microbica [Jenkins, 1993; Doreau et al., 1994]. Da
tali studi, sono state evidenziate due importanti trasformazioni microbiche nel rumine: la
lipolisi e la bioidrogenazione.
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La lipolisi comporta il rilascio degli acidi grassi liberi consentendo così la successiva
bioidrogenazione, che consiste nella riduzione del numero dei doppi legami presenti sulla
catena carboniosa.
La presenza microbica comporta una sintesi di acidi grassi “de novo” dai precursori dei
carboidrati, pertanto i lipidi che raggiungono il duodeno sono composti da acidi grassi la
cui origine può essere sia alimentare che microbica.
Lo studio del metabolismo lipidico ruminale nella bovina da latte riveste particolare
importanza per due motivi [Buccioni et al., 2002]:
1. poter controllare gli effetti antimicrobici degli acidi grassi, al fine di consentire
l’integrazione della razione con fonti lipidiche, senza andare incontro ai disturbi
delle fermentazioni ruminali e dei processi digestivi;
2. poter regolare le bioidrogenazione al fine di regolare l’assorbimento di specifici
acidi grassi che possono esaltare le performaces produttive degli animali o
migliorare la qualità nutrizionale del latte.
Per quanto riguarda la sintesi degli acidi grassi di origine microbica, il contenuto lipidico
totale della sostanza secca batterica nel rumine varia da un 10 ad un 15%. Questa
variazione è possibile dal momento che i lipidi di origine batterica provengono sia da fonti
esogene (aumento di acidi grassi a lunga catena nella dieta) che da fonti endogene (sintesi
“de novo”), ed il loro contributo dipende dal contenuto lipidico della dieta e dalle specie
batteriche specifiche.
Gli acidi grassi monoinsaturi invece rappresentano il 15-20% degli acidi grassi batterici e
sono sintetizzati per via anaerobica, mentre gli acidi grassi polinsaturi non sono
comunemente sintetizzati dai batteri, ad eccezione per i cianobatteri. Pertanto, gli acidi
grassi presenti nei microbi ruminali sono probabilmente il risultato di un aumento esogeno
di acidi grassi preformati.
Molto importante da ricordare è che, i lipidi aggiunti nelle diete dei ruminanti possono
interferire con le fermentazioni nel rumine, causando una ridotta digeribilità delle fonti
energetiche non lipidiche. La digestione ruminale dei carboidrati strutturali, per esempio,
può essere ridotta del 50% più o meno con il 10% del grasso aggiunto. Questa riduzione è
accompagnata da una bassa produzione di metano, idrogeno e acidi grassi volatili,
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Capitolo 4 La frazione lipidica
compreso un più ridotto rapporto di acetato/proprionato. Quando i supplementi lipidici
inibiscono la fermentazione ruminale, limitando la fermentazione nell’ultima parte
dell’intestino, potrebbero anche diminuire la digeribilità della fibra nell’intero tratto
digestivo. Ciò non avviene invece con il grasso della dieta, il quale risulta meno nocivo per
la digeribilità dei carboidrati non strutturali. È stato anche osservato che, l’aumento del
livello del grasso nella dieta dei ruminanti comporta un incremento degli acidi grassi a
lunga catena e contemporaneamente una riduzione di quelli a corta e a media catena
[Carroll et al., 2006].
Anche il metabolismo delle proteine nel rumine viene alterato quando i supplementi in
grasso interferiscono con la fermentazione. Infatti è stato dimostrato che negli ovini
integrando alla razione olio di semi di lino, si riduce la digestione della frazione proteica
nel rumine, seguita da una diminuzione della concentrazione di ammoniaca e da un
incremento del contenuto di azoto nel flusso duodenale. Questi cambiamenti sono spesso
accompagnati da un aumento dell’efficienza della sintesi proteica microbica nel rumine.
Tale efficienza è stata attribuita alla riduzione del numero dei protozoi nel rumine e al
minor contenuto di azoto batterico o all’aumento della dose diluita di solidi nel rumine
come conseguenza del grasso aggiunto.
Analizzando le proprietà interferenti dei lipidi sulle fermentazioni, alcuni studi hanno
chiarito che gli effetti variabili delle fonti di grasso di solito si possono attribuire a poche
differenze di base, che riguardano in particolare la struttura lipidica. Un fattore da
considerare ad esempio è il livello di insaturazione, dal momento che soprattutto gli acidi
grassi insaturi inibiscono maggiormente le fermentazioni rispetto agli acidi grassi saturi.
Anche un gruppo carbossile libero è importante per l’inibizione delle fermentazioni a causa
degli acidi grassi derivati, come i sali di calcio degli acidi grassi a lunga catena, alcoli
grassi, acil amidi grassi e trigliceridi, che d’altronde inibiscono la fermentazione in minor
misura rispetto agli acidi grassi liberi. Per questo motivo, oggi esistono dei grassi
ruminalmente inerti come i sali di calcio degli acidi grassi a lunga catena, i grassi arricchiti
in acidi grassi saturi e i grassi protetti mediante incapsulazione.
I maggiori cambiamenti che si verificano nella concentrazione ruminale riguardano
principalmente gli acidi grassi liberi insaturi (Fig. 9), in quanto quest’ultimi probabilmente
determinano degli effetti negativi maggiori sulla capacità fermentativa rispetto alle altre
frazioni lipidiche (acidi grassi liberi saturi e trigliceridi).
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Sali di calcio
Lipidi esterificati presenti nella dieta
Lipolisi
pH basso
Acidi grassi insaturi
Ca2+; Mg2+
Bioidrogenazione
Lipidi microbici
FFA saturi
Attacco alle particelle di alimento
Figura 9. Modificazioni ruminali degli acidi grassi insaturi.
Da: Buccioni et al., 2002.
La concentrazione degli acidi grassi insaturi nel rumine è regolata dal contenuto e dal tipo
di grasso aggiunto e anche dal tasso di lipolisi, bioidrogenazione e formazione di sali
carbossilati. Alte concentrazioni di trigliceridi nella dieta aumentano il contenuto dei lipidi
totali nel rumine, ma il corrispondente aumento nel pool ruminale di acidi grassi liberi
insaturi potrebbe essere più ridotto se la lipolisi e la bioidrogenazione fossero diminuite o
se la formazione di sali carbossilati fosse alta. I livelli di lipolisi di solito sono sufficienti
per convertire la maggior parte dei trigliceridi nella dieta in acidi grassi liberi. Alcuni studi
hanno rivelato, inoltre, che i livelli di lipolisi e bioidrogenazione sono alterati
sostanzialmente dall’inclusione di foraggi ad elevato stadio di maturità, dal basso
contenuto di azoto e dalla taglia (alimenti finemente macinati) delle particelle alimentari
nel rumine [Buccioni et al., 2002]. In quest’ultimo caso, le dimensioni delle particelle
alimentari rivestono una importanza fondamentale, in quanto influenzano l’aderenza dei
batteri sulla loro superficie ed aumentano la velocità di transito attraverso la barriera
ruminale, diminuendo il tempo di esposizione all’attività batterica.
Pertanto, anche la composizione della dieta di base potrebbe influenzare, come una fonte di
grasso, le fermentazioni ruminali. Infatti i grassi che normalmente inibiscono la
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Capitolo 4 La frazione lipidica
fermentazione e la digestione, possono ridurre tale capacità quando il contenuto di fieno
nella razione è elevato.
Se consideriamo, in particolare, la regolazione del flusso duodenale degli acidi grassi
insaturi, possiamo sottolineare che il rumine rappresenta una barriera formidabile per la
distribuzione degli acidi grassi insaturi nel piccolo intestino. Infatti l’idrogenazione degli
insaturi presenti nella dieta da parte dei microbi ruminali, arricchisce il chimo duodenale di
acidi grassi saturi, i quali vengono assorbiti e depositati nei vari tessuti del corpo. Inoltre è
stato dimostrato che l’aggiunta di lipidi nella dieta dei ruminanti, comporta solo un
aumento passeggero dei polinsaturi nell’abomaso e pertanto si ha un aumento limitato del
flusso di acidi grassi polinsaturi nel duodeno.
Alcuni studiosi inoltre, hanno verificato che miscelando del grasso aggiunto di origine
animale e vegetale (59% acidi grassi insaturi) nella dieta giornaliera di alcuni bovini,
aumenta la quantità di acido linoleico da 171 a 296 g/d, ma nel flusso duodenale aumenta
solo da 45 a 54 g/d. Tuttavia gli studi effettuati, hanno chiarito che alcuni acidi grassi
insaturi della dieta riescono a sottrarsi alla bioidrogenazione e quando sono aggiunti elevati
contenuti di polinsaturi non protetti, l’assorbimento di questi aumenta solo lievemente. Il
grado di acidi grassi insaturi che riescono a sfuggire all’idrogenazione dipende, soprattutto,
dalle condizioni di crescita microbica, che influenza i livelli di lipolisi e bioidrogenazione.
Le granaglie per esempio, diminuiscono la bioidrogenazione ruminale e promuovono
l’aumento degli insaturi nel grasso della carcassa degli animali e nel latte. Questo effetto è
attribuito alla diminuzione della lipolisi come conseguenza di un basso pH ruminale.
Comunque, la completa idrogenazione degli insaturi ad acido stearico diminuisce sia
quando aumenta la concentrazione degli acidi grassi insaturi aggiunti, sia quando i
trigliceridi vengono sostituiti dagli acidi liberi.
Per permettere, quindi, un passaggio elevato di acidi grassi insaturi dal duodeno, sin dal
1970, sono stati effettuati diversi tentativi per proteggere quest’ultimi dalla
bioidrogenazione, e il primo approccio è stato l’incapsulazione dei lipidi in una matrice di
proteine trattate con formaldeide [Ashes et al., 1979]. Questa tecnologia ha infatti
dimostrato l’aumento dell’assorbimento degli acidi grassi insaturi nei ruminanti e, di
conseguenza, un aumento di insaturazione nella carne e nel latte. Tutto ciò ha portato,
comunque, a considerare che gli acidi grassi protetti sono necessari in quanto
effettivamente resistono alla bioidrogenazione,
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senza interferire con le fermentazioni
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ruminali o con l’assorbimento lipidico intestinale. Tra le altre tecniche studiate, l’impiego
dei sali di calcio degli acidi grassi, oggi è la tecnica più riconosciuta [Ferlay et al., 1993;
Chilliard et al., 2000], seguita dall’impiego di semi integrali opportunamente trattati
(estrusione, tostatura, etc.), il tegumento e le pareti cellulari dei quali rappresentano una
sufficiente protezione nei riguardi dei lipidi contenuti [Antongiovanni et al., 2002].
4.5. IL GLOBULO DI GRASSO
Il grasso nel latte si presenta come un’emulsione sottoforma di globuli di diametro
variabile a seconda della specie da 0,1 a 15 μm (es. nel latte caprino, i globuli sono più
piccoli rispetto quelli del latte bovino [Urbiené et al., 1997]), con un diametro medio di 3-4
μm. L’80% dei globuli di grasso ha un diametro inferiore a 1 μm, il rimanente 20 %, che
rappresenta in peso la quasi totalità del grasso, fra i 2 e i 6 μm. I globuli variano per
dimensione e ciò naturalmente influenza le proprietà chimico-fisiche e sensoriali del latte e
dei prodotti lattiero-caseari, mentre meno variabile è il numero di globuli per unità di
volume, il che ha come conseguenza che nei latti ricchi di grasso i globuli tendono a
presentare dimensioni più grandi [Corradini, 1995; Salvadori del Prato, 2005].
I globuli di grasso sono protetti da una membrana, non hanno una struttura omogenea, ma
lamellare concentrica, dovuta alla sovrapposizione di strati di trigliceridi. In particolare,
quelli altofondenti si dispongono esternamente nel globulo, quelli bassofondenti
internamente e tale stratificazione si verifica nel corso della cristallizzazione frazionata del
grasso durante il raffreddamento.
I gliceridi che costituiscono la parte interna del globulo sono rappresentati in massima
parte da trigliceridi. Quest’ultimi sono delle molecole che hanno la capacità di
cristallizzare in diverse forme polimorfiche e quelle principali sono α, β’ e β nell’ordine di
aumento di stabilità e punto di fusione.
La cristallizzazione dei trigliceridi è un processo lento che vede il grasso del latte
inizialmente liquido a temperatura corporea, mentre in un secondo momento, cristallizza a
temperature di raffreddamento, come avviene nel corso dei processi tecnologici. Tale
comportamento termico, legato alla struttura cristallina di trigliceridi ad una determinata
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Capitolo 4 La frazione lipidica
temperatura, è di notevole importanza per quanto riguarda le proprietà sensoriali,
tecnologiche e funzionali dei globuli di grasso del latte [Michalski et al., 2004]. Nelle
emulsioni, ad esempio nelle creme, si deve formare almeno un nucleo in ogni globulo per
raggiungere la piena cristallizzazione e il tempo necessario per ottenere tale nucleo è
inversamente proporzionale al volume del globulo. Di conseguenza, un maggior
raffreddamento è necessario per indurre la cristallizzazione in un sistema disperso con
globuli di grasso più piccoli.
All’interno delle cellule secretrici dell’epitelio della ghiandola mammaria (adipociti), i
piccoli globuli di grasso originano dal reticolo endoplasmatico e sono rilasciati dallo
stesso, nel citosol protetti da uno strato di proteine e lipidi polari. Ancora oggi comunque, è
sconosciuto se esiste una regione selettiva o specifica per il sito di origine dei globuli
all’interno del reticolo endoplasmatico, se esistono fattori che inducono l’aumento dei
triacilgliceroli nei globuli e se tale processo di formazione del globulo sia in qualche modo
regolato.
Questi piccoli globuli (microlipidi), pertanto, si fondono tra di loro dando origine a globuli
più grandi, denominati globuli di grasso citoplamastici, mediante l’intervento del calcio e
dei gangliosidi, che sembrano coinvolti, in qualche modo, nel processo di fusione [Heid et
al., 2005]. Pertanto i globuli di grasso transitano dal luogo di origine verso la regione
apicale della cellula, ma il processo di
migrazione non è ancora conosciuto con
certezza. Una volta raggiunta la zona apicale
i
globuli
circondati
si
dissociano
dalla
dalla
membrana
cellula,
plasmatica
(doppio strato), mediante esocitosi (Fig. 10).
Questo processo è stato descritto per la
prima volta nel 1959 [Heid et al., 2005], ma
altri studiosi hanno descritto anche un
meccanismo
alternativo
basato
su
un’associazione tra i globuli di grasso e le
vescicole secretorie nella regione apicale
della cellula, che permettono l’esocitosi del
Figura 10. Tipica cellula in lattazione.
Da: Qi P., 2007.
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Capitolo 4 La frazione lipidica
globulo mediante vacuoli citoplasmatici. Inoltre, del materiale citoplasmatico può essere
intrappolato tra il rivestimento interno e lo strato esterno della doppia membrana e tale
risultato è conosciuto come “rigonfiamento citoplasmatico” [Dewettinck et al., 2008].
Negli ultimi anni inoltre, la diversa dimensione dei globuli di grasso è stata oggetto di
diversi studi, in quanto è noto che, le differenze legate a quest’ultimo aspetto hanno un
notevole interesse sia a livello delle proprietà nutrizionali sia a livello delle caratteristiche
tecnologiche e sensoriali per la produzione dei prodotti lattiero-caseari [Michalski et al.,
2003; Fauquant et al., 2005].
Nel 1998, Goudedranche et al., [Michalski et al., 2004] hanno studiato un processo di
microfiltrazione in grado di separare dal latte i globuli di grasso di diverso diametro, in
quanto altri Autori [Walstra, 1967; Timmen et al.,1988] avevano suggerito,
rispettivamente, l’esistenza di una diversa cristallizzazione e composizione tra i globuli di
grasso di diverse dimensioni, ma non erano stati in grado di separarli accuratamente.
Successivamente, Briard et al. [2003] impiegando tale processo, hanno dimostrato che i
globuli di piccole dimensioni (~1-3 μm) presentano una diversa composizione in acidi
grassi totali rispetto ai globuli di dimensioni maggiori (~6 μm), presenti nella stesso latte.
In particolare hanno osservato che, i globuli di piccole dimensioni hanno maggiori
concentrazioni di C 12:0 , C 14:0 e C 16:1 e ridotte concentrazioni di C 18:0 rispetto ai globuli di
dimensioni maggiori.
In seguito, anche altri Autori [Fauquant et al., 2005; Michalski et al., 2005a] hanno
rilevato che la dimensione dei globuli potrebbe essere correlata ad una diversa
composizione in acidi grassi del latte. Nello specifico, gli stessi Autori hanno riscontrato
maggiori concentrazioni di acido laurico, miristico, palmitico e palmitoleico e ridotte
concentrazioni di acido stearico nei globuli di piccole dimensioni nei confronti di quelli di
maggiori dimensioni. Ciò naturalmente comporta delle differenze a livello delle proprietà
nutrizionali, sensoriali e tecnologiche dei prodotti lattiero-caseari.
In uno studio, ad esempio, è stata valutata l’influenza della dimensione dei globuli di
grasso sulle proprietà fisico-chimiche e sensoriali del formaggio Camembert, utilizzando
frazioni con piccoli (3 μm) e grandi (6 μm) globuli di grasso ottenuti mediante
microfiltrazione. Da tale studio è emerso che, il formaggio prodotto con globuli di piccole
dimensioni si differenzia da quello prodotto con quelli di maggiori dimensioni, in quanto
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Capitolo 4 La frazione lipidica
ha un contenuto maggiore di umidità, la cagliata è meno rigida, compatta e gessosa, ha una
proteolisi più spinta e presenta una struttura più elastica ed uniforme ed un colore più
giallo. Tali risultati trovano una spiegazione nel fatto che, i globuli piccoli hanno una
maggiore area di superficie, sono intrappolati in modo migliore nella matrice caseinica ed
hanno una minor distanza interglobulare, che potrebbe consentire una miglior percezione
del grasso. Inoltre, con una proteolisi più spinta, l’intensità dell’aroma del formaggio è
maggiore, dovuta alla presenza di peptidi liberi e aminoacidi [Michalski et al., 2003;
Michalski et al., 2007b]. In un’altra ricerca, inoltre, la media della dimensione dei globuli
sembra sia stata proposta come un utile indicatore delle proprietà di coagulazione del latte
[Martini et al., 2008].
Pertanto l’impiego dei globuli di grasso con differenti dimensioni potrebbe portare alla
nascita di nuovi prodotti con differenti proprietà tecnologiche e sensoriali, anche perchè è
stato dimostrato che i globuli di piccole dimensioni hanno una più bassa temperatura di
cristallizzazione e i cristalli di trigliceride sono più piccoli [Michalski, 2007a].
Inoltre sembra che, in quelli con dimensioni inferiori (1-3 μm) sono presenti più acidi
grassi insaturi rispetto a quelli con dimensioni superiori (6 μm) [Michalski et al., 2005a;
Martini et al., 2005]. Per tale motivo, la dimensione dei globuli potrebbe essere considerata
come un parametro che definisce e determina la qualità nutrizionale del latte, in quanto i
globuli di grasso di maggiori dimensioni potrebbero essere più sensibili agli effetti
meccanici durante i processi tecnologici e, pertanto, potrebbero essere più suscettibili alla
lipolisi e portare alla formazione di particolari aromi, che influenzano naturalmente il
gusto, così come le proprietà fisico-chimiche del latte e del burro, attraverso l’influenza
della temperatura di fusione [Carroll et al., 2006].
La distribuzione dei globuli di grasso inoltre può variare in funzione di alcuni fattori come
la razza, lo stadio di lattazione e le modificazioni nutrizionali [Michalski et al., 2005b;
Carroll et al., 2006; Couvreur et al., 2006].
Pertanto, la capacità di comprendere le caratteristiche fisico-chimiche, così come le
proprietà strutturali e termiche dei piccoli vs i grandi globuli, può consentire lo sviluppo di
nuovi prodotti alimentari con diverse proprietà sensoriali e di migliorare il controllo dei
processi tecnologici.
Bisogna comunque ricordare che, la frazione lipidica ha per il latte e i suoi derivati, una
fondamentale importanza tecnologica. Essa ad esempio, è una componente fondamentale
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Capitolo 4 La frazione lipidica
che conferisce le caratteristiche organolettiche ai formaggi, in quanto la sua presenza e la
sua distribuzione condizionano tutti i parametri di caseificazione e la struttura del
formaggio. In uno studio di Lopez et al. [2007] infatti sono state osservate le caratteristiche
del grasso (composizione, organizzazione e proprietà termiche), che possono migliorare le
proprietà funzionali, sensoriali e nutrizionali dei prodotti alimentari. In questa ricerca è
stato osservato come i processi caseari possono influenzare sia l’organizzazione
sopramolecolare che la composizione superficiale del grasso. Utilizzando la microscopia
confocale è stato notato che, il grasso può essere disperso nel latte come globuli liberi,
globuli aggregati, globuli omogeneizzati piccolissimi ricoperti principalmente da caseine e
infine come grasso non globulare o libero. Inoltre sono stati valutati i cambiamenti che
avvengono nell’organizzazione del grasso durante la produzione e la maturazione di
formaggi a pasta dura. È stato osservato pertanto che, la pressatura della cagliata porta alla
distruzione delle membrane e alla formazione di grasso libero, favorendo la localizzazione
della microflora lipolitica all’interfaccia grasso/proteine e contribuendo alla qualità e
tipizzazione del formaggio. Inoltre, impiegando la calorimetria a scansione differenziale è
stato sviluppato un metodo per determinare il contenuto in grasso solido nei prodotti
alimentari. È stato notato che, aumentando la concentrazione in acidi grassi insaturi per
migliorare le proprietà nutrizionali del latte, il contenuto in grasso solido si modifica in
funzione della temperatura e della resistenza dei globuli di grasso alla distruzione e di
conseguenza, si modicano le proprietà funzionali, tessutali e sensoriali dei prodotti caseari
ricchi in grasso, come il burro [Lopez et al., 2007a].
La distruzione dei globuli di grasso durante la pressatura può dipendere da diversi fattori,
quali: la loro dimensione, la loro aggregazione a causa di una parziale riorganizzazione
della membrana, la composizione del grasso che influenza il contenuto di grasso solido; la
composizione, struttura e le proprietà della membrana, la viscosità del network di caseina e
i parametri della pressatura: temperatura, tempo e pressione applicata [Lopez et al., 2007].
Mediante l’impiego della microscopia, pertanto, è possibile ottenere delle informazioni
sulla localizzazione di diverse componenti di un preparato biologico. In particolare, la
microscopia in fluorescenza permette di localizzare, in cellule o tessuti, molecole marcate
con determinate sostanze, conosciute come “fluorocromi”. Inoltre oggi, con l’utilizzo della
microscopia confocale è possibile esplorare la struttura tridimensionale dei preparati
biologici, con la finalità di risolvere dettagli fini, di eliminare emissioni di fluorescenza
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Capitolo 4 La frazione lipidica
aspecifica e di ottenere sezioni di un certo spessore (fino a 200μm), senza ricorrere a
drastici tagli fisici che potrebbero danneggiare la struttura [Lanni, 2008].
4.6. LA MEMBRANA DEL GLOBULO DI GRASSO
La membrana del globulo di grasso rappresenta circa il 2-6% della massa del globulo
(dipende dalla sua dimensione), ha uno spessore di circa 10-20 nm, al fine di mantenere
una determinata distanza tra la superficie più esterna e quella citoplasmatica più interna, ed
inoltre gioca un ruolo fondamentale nella stabilità dei globuli di grasso [McPherson et al.,
1983; Walstra et al., 1984; Keenan et al., 1995].
Presenta una composizione piuttosto complessa e variabile in funzione di alcuni fattori
(dieta, razza, salute, stadio di lattazione); essa è costituita principalmente da fosfolipidi,
glicolipidi, proteine, lipoproteine ed enzimi [Lee et al., 2002; Michalski, et al., 2003;
Evers, 2004; Lopez et al., 2007], ed in particolare, quella del globulo di grasso del latte
bovino è stata caratterizzata a partire dagli anni ’70-80.
Figura 11. La membrana del globulo di grasso.
Da: Michalski et al., 2001.
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Capitolo 4 La frazione lipidica
Le proteine di membrana sono disposte in modo asimmetrico e tra le più importanti
ritroviamo la butirofilina e la xantina ossido-riduttasi (Fig.12). In studi più recenti sono
state caratterizzate anche la adipofillina, la PAS 6/7 (lactaderina) e il cluster di
differenzazione (CD36), la proteina mucina 1 (una proteina glicosilata) e il proteoso
peptone 3 (PP3, una proteina fosforilata). Recentemente, sono state identificate altre 6
proteine minori: proteina recettore Ig polimerica, apolipoproteina E, apolipoproteina A1,
71 kDa heat-shock proteina affine, peptidilprolil isomerasi A e clusterin. Inoltre altre due
proteine minori, la lattoperossidasi e la catena pesante Ig, sono state recentemente
riscontrate sia nel latte umano che bovino [Fong et al., 2007; Dewettinck et al., 2008].
La butirofilina è la maggior proteina presente nella membrana del globulo di grasso bovino
e rappresenta circa il 20-40% delle proteine totali associate alla membrana [Heid et al.,
2005]. Anche la xantina ossido-riduttasi è una delle maggiori proteine ed a differenza della
butirofilina, è un enzima citosolico solubile. È stato purificato nel latte bovino circa 60
anni fa, è uno degli enzimi più studiati ed è ampiamente distribuito nei tessuti, in
particolare nel fegato e nell’intestino. Esso è coinvolto nel catabolismo della purina,
nell’ossidazione della ipoxantina a xantina e di quest’ultima ad acido urico, ed inoltre,
potrebbe avere un’attività antimicrobica nell’intestino del neonato [Harrison, 2006].
Figura 12. Struttura del globulo di grasso con disposizione delle principali proteine di
membrana.
Da: Dewettinck et al., 2008.
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Capitolo 4 La frazione lipidica
I lipidi neutri di membrana costituiscono la maggior parte dei lipidi presenti nella
membrana (56–80 % dei lipidi totali) e sono soprattutto costituiti dai trigliceridi (53–74
%), la cui composizione in acidi grassi presenta una proporzione maggiore di acidi grassi
saturi a lunga catena (C 16 –C 18 ), come l’acido palmitico e lo stearico, ed una ridotta
concentrazione di acidi grassi insaturi, al fine di contribuire di gran lunga alla stabilità
dell’intera membrana [Fong et al., 2007].
Le lipoproteine e gli steroli presentano una parte lipofila (idrofoba) e una parte proteica
(idrofila), mentre i fosfolipidi, presenti in modo predominante nella componente lipidica
della membrana (60-70%), accanto alla parte lipidica presentano una parte aminica, legata
al fosfato, idrofila ed emulsionante. Queste sostanze disponendosi con la parte idrofila
all’esterno della membrana dei globuli di grasso, concorrono a mantenere i globuli in
emulsione e in sospensione nel plasma latteo. Tra quest’ultimi ritroviamo la fosfatidiletanolamina (PE 30,5%), fosfatidil-inositolo (PI 7,1%), fosfatidil-serina (PS 5%),
fosfatidil-colina (PC 31%), sfingomieline (SM 19,9%), lattosil-cerebroside (3,4%) e il
glucosil-cerebroside (0,3%) [Fong et al., 2007]. In particolare, le sfingomieline giocano un
ruolo importante nella maturazione dell’intestino del neonato, contribuiscono al processo
di mielinizzazione per lo sviluppo del sistema nervoso centrale e i suoi metaboliti sono
importanti modulatori delle funzione vascolari [Dewettinck et al., 2008].
In generale, la composizione in acidi grassi dei fosfolipidi comprende acidi grassi C 18:1 e/o
C 18:2 , che potrebbero essere essenziali per la fluidità della membrana. Inoltre è stato
osservato che, il contenuto totale dei fosfolipidi e del colesterolo nelle bovine a 180 giorni
di lattazione è inferiore rispetto all’inizio del ciclo e che la composizione in acidi grassi dei
fosfolipidi varia durante l’intera lattazione e questo pertanto, potrebbe portare ad un
cambiamento nella fluidità di membrana e alla stabilità del globulo [Evers, 2004].
La membrana dei globuli di grasso, oltre ad avere una funzione protettiva nei confronti dei
globuli al fine di prevenire la coalescenza e la degradazione enzimatica, ha proprietà
adsorbenti per particelle di piccole dimensioni (batteri) e agglutinanti, dovute alla presenza
della agglutinine accumulate sulla membrana e tale proprietà è accresciuta dalla parziale
acidificazione del latte. Al contrario, è noto che la pastorizzazione della crema a
temperatura maggiori di 78°C comporta una completa inattivazione delle agglutinine, in
quanto tale processo modifica la composizione della membrana e crea delle interazioni tra
la β-lattoglobulina e le proteine di membrana mediante ponti disolfuro [Morin et al., 2007].
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Capitolo 4 La frazione lipidica
La membrana naturalmente preserva l’individualità dei globuli di grasso e ne determina il
comportamento in alcuni processi, ad esempio nell’affioramento della crema. Essa ha
anche la funzione di proteggere i trigliceridi contenuti nella parte interna dei globuli, dalle
alterazioni di origina chimica ed enzimatica che provocano, come è noto, i fenomeni di
irrancidimento. Essa però può subire alterazioni in funzione di diversi fattori, quali la dieta,
la razza, la salute o lo stadio di lattazione degli animali. Inoltre la sua funzionalità può
essere compromessa da tutti i trattamenti meccanici violenti (omogeneizzazione,
centrifugazione, etc.), che provocano una totale o parziale distruzione della membrana,
provocando una destabilizzazione del grasso [Michalski et al., 2002; Iametti et al., 2007].
Al termine del processo di omogeneizzazione, in particolare, la superficie di una
determinata quantità di globuli di grasso è ricoperta di proteine e pertanto i nuovi globuli di
grasso che si formano, presentano diverse proprietà fisico-chimiche, dovute alle interazioni
con le differenti componenti del latte, come le caseine e le sieroproteine associate con
ponti disolfuro, che naturalmente influenzano le proprietà dei prodotti caseari [Michalski et
al., 2001; Evers et al., 2004; Argov et al., 2008].
4.7. ALTERAZIONI DEL GRASSO
Nell’ambito del settore alimentare le condizioni di conservazione dei prodotti sono un
fattore di fondamentale importanza, in quanto permettono di evitare lo sviluppo di
alterazioni dei prodotti stessi. La shelf-life di quest’ultimi, infatti, può essere influenzata
dalla temperatura, dalla presenza di luce, di ossigeno e di metalli che favoriscono le
reazioni di ossidazione, in particolar modo, a carico degli acidi grassi a lunga catena.
I grassi del latte, pertanto, possono subire alterazioni di natura chimica ed enzimatica,
denominate reazioni di irrancidimento, che provocano variazioni di gusto e aroma, in
genere non gradite dal consumatore. Le alterazioni più importanti che hanno conseguenze
tecnologiche, igieniche e nutrizionale sono l’irrancidimento idrolitico (o lipolisi),
chetonico ed ossidativo.
•
L’irrancidimento idrolitico è essenzialmente di natura enzimatica, in quanto
provocato dalle lipasi presenti nel latte, sia native sia di origine microbica (batteri
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61
Capitolo 4 La frazione lipidica
psicrofili), che catalizzano la lisi del legame estere dei lipidi con liberazione di
glicerina e acidi grassi. A questo tipo di irrancidimento, ed in particolare agli acidi
grassi volatili a corta catena (acido butirrico e caproico), sono dovute le alterazioni
di gusto. Naturalmente questo fenomeno è favorito dai trattamenti e sollecitazioni
di natura chimico–fisica (stress meccanici), che provocano alterazioni della
membrana dei globuli di grasso, con fuoriuscita di lipidi allo stato liquido, i quali
vengono così a contatto con le lipasi. Quest’ultime hanno temperatura ottimali
diverse a seconda dell’origine e sono disattivate da trattamenti termici a
temperature superiori a 70 °C. La lipolisi, inoltre, può verificarsi spontaneamente in
base a fattori genetici, fisiologici e zootecnici. Essa è ostacolata dai metalli pesanti
(che d’altro canto favoriscono l’irrancidimento ossidativo), dall’acidità lattica, dalle
basse temperature, dall’ossigeno e dal sale. In alcuni casi, la liberazione di acidi
grassi per azione della lipasi è desiderata, in quanto costituisce la prima fase della
trasformazione dei grassi nei formaggi caratterizzati dal gusto piccante nel corso
della maturazione.
•
L’irrancidimento chetonico è un’alterazione di natura in parte chimica e in parte
enzimatica, provocata da muffe (genere Penicillium) batteri e lieviti. Tale reazione
ossidativa avviene solo sugli acidi grassi liberi, pertanto essa presuppone un previo
irrancidimento idrolitico. L’enzima in gioco è la β-ossidasi, che facilita
l’ossidazione del gruppo metilenico in posizione β rispetto al carbossile di un acido
grasso. Questo enzima è prodotto da alcune muffe, alcune delle quali impiegate
nella produzione di alcuni formaggi erborinati (es. Gorgonzola, Roquefort e
Camembert), ai quali viene conferito l’aroma caratteristico grazie alla formazione
di metilchetoni provenienti da questo tipo di irrancidimento. Questa alterazione è
favorita principalmente dal riscaldamento del latte.
•
L’irrancidimento ossidativo è un fenomeno di natura chimica che avviene in
seguito all’assorbimento di ossigeno da parte degli acidi grassi insaturi. È
un’alterazione che modifica le caratteristiche organolettiche e può portare allo
sviluppo di sostanze tossiche. Si tratta essenzialmente di una reazione
autocatalitica, infatti, una volta raggiunta una concentrazione critica in
idroperossidi nella prima fase (fase di induzione) del fenomeno, si innesca una
reazione a catena con la formazione di nuovi radicali attivati (fase di
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Capitolo 4 La frazione lipidica
propagazione). Dagli idroperossidi si formano prodotti secondari (fase di
terminazione), quali acidi, aldeidi, chetoni insaturi e idrocarburi, tra i quali i
composti responsabili del sapore di rancido. I fattori che favoriscono
l’irrancidimento ossidativo sono la presenza di ossigeno (0,5 mg/100 g di grasso),
le tracce di metalli pesanti (Fe, Cu, etc.), la luce solare, un elevato contenuto di
acidi grassi insaturi, la bassa concentrazione di sostanze antiossidanti (fosfolipidi,
grassi insaponificabili), ed infine anche la presenza di sostanze riducenti (acido
ascorbico, flavine, tocoferoli, etc.). Per valutare analiticamente la fase di
irrancidimento ossidativo si ricorre alla determinazione del numero dei perossidi e
dei carbonili presenti.
4.8. VARIABILITÀ
DELLA COMPOSIZIONE IN ACIDI GRASSI
La composizione in acidi grassi del latte bovino varia in rapporto all’influenza di diversi
fattori legati alla specie (Tab. 12), alla razza [Malacarne et al., 2001; Carroll et al., 2006],
alle caratteristiche lattifere individuali, all’alimentazione, alle tecniche di allevamento e
alle condizioni ambientali [Palmquist et al., 1993; Ferlay et al., 2006; Ferlay et al., 2008].
Tra quest’ultimi sono molto importanti quelli di natura alimentare: tipo di razione,
modalità di somministrazione, concentrazione energetica e livello energetico della razione,
stato fisico degli alimenti e dell’intera razione, quantità, qualità e lunghezza della fibra,
tipo, forma fisica e trattamento dei cereali, etc. Anche l’impiego di oli e grassi protetti e di
sali di calcio rivestono un ruolo determinante nel modificare la composizione in acidi
grassi del latte [Malacarne et al., 2001].
In particolar modo, la composizione varia durante l’anno anche in funzione dell’andamento
stagionale, che determina una diversa concentrazione delle varie componenti del latte.
Pertanto le differenti strategie alimentari impiegate possono influenzare gli aspetti
nutrizionali, sensoriali e tecnologici della qualità del grasso del latte [Kraggerud et al.,
2008], che si ripercuotono, di conseguenza, sulle produzioni lattiero-caseari, ed in
particolar modo sulla produzione dei formaggi, le cui caratteristiche tecnologiche e
organolettiche dipendono dalla composizione in acidi grassi del latte di partenza.
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Capitolo 4 La frazione lipidica
Tabella 12. Effetto della specie sulle caratteristiche nutrizionali del latte.
Latte caprino
Latte bovino
Acidi grassi
Min.
Media ± DS
Max.
Min.
Media ± DS
Max.
SFA
67,4
71,8 ± 2,4
77,8
56,9
68,2 ± 5,0
78,1
C 4: 0
1,53
2,51 ± 0,4
3,23
3,22
3,74 ± 0,3
4,85
C 6: 0
2,26
2,61 ± 0,3
3,23
1,60
2,29 ± 0,2
2,76
C 8: 0
2,84
3,24 ± 0,3
3,84
0,87
1,42 ± 0,2
1,86
C 10: 0
8,43
10,5 ± 1,2
12,5
1,63
3,01 ± 0,6
4,12
C 12: 0
3,33
4,98 ± 1,0
6,85
1,91
3,42 ± 0,8
5,06
C 14: 0
8,76
11,0 ± 1,1
12,8
7,04
11,6 ± 1,7
14,6
C 16: 0
20,7
23,4 ± 1,9
26,4
21,8
29,0 ± 3,6
39,0
C 18: 0
6,61
9,58 ± 1,9
14,0
5,94
9,54 ± 1,8
13,9
17,4
22,9 ± 2,1
27,2
18,7
27,0 ± 4,1
35,4
C 18:1 c9
13,1
18,2 ± 1,9
22,2
13,0
19,1 ± 3,2
25,3
C 18:1 t11(+t10)
0,65
1,07 ± 1,97
1,97
0,96
1,92 ± 1,0
4,76
3,33
4,24 ± 0,5
5,08
2,54
3,87 ± 1,0
6,43
C 18:2 c9 c12
1,47
2,28 ± 0,4
2,82
1,17
1,58 ± 0,3
2,18
C 18:2 c9 t11 (CLA)
0,36
0,50 ± 0,1
0,71
0,33
0,77 ± 0,4
1,77
C 18:3 c9 c12 c15
0,43
0,82 ± 0,3
1,39
0,33
0,74 ± 0,3
1,32
MUFA
PUFA
Da: Lucas et al., 2006.
Un fattore rilevante è rappresentato anche dalla natura dei foraggi [Lourenco et al., 2008]
impiegati a livello dell’alimentazione dei ruminanti, in quanto la composizione botanica, lo
stadio di maturità e la tecnica di conservazione possono influire in maniera considerevole
sulla composizione in acidi grassi, vitamine e carotenoidi.
La natura dei foraggi è quindi un fattore critico, basti pensare alla differenza fra il pascolo
di montagna e quello di pianura. In uno studio [Antongiovanni et al., 2002], infatti, è stato
dimostrato che, il pascolo di montagna è migliore rispetto a quello di pianura per quanto
riguarda il contenuto di acido butirrico, laurico, miristico, palmitico, stearico ed oleico, non
tralasciando naturalmente, le concentrazioni di acido linoleico e linolenico. Pertanto, le
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caratteristiche organolettiche dei prodotti caseari sono migliori ed il burro presenta un
miglior grado di spalmabilità.
I foraggi freschi, in particolare, contengono circa l’1%-3% di acidi grassi, in particolar
modo, in primavera ed in autunno, e la maggior parte di tali acidi è rappresentato
dall’acido α-linolenico. Ciò comporta, come è stato dimostrato, l’aumento della
concentrazione degli acidi grassi a lunga catena e la riduzione, contemporaneamente, della
sintesi de novo degli acidi grassi a corta e media catena nella ghiandola mammaria [Khanal
et al., 2008; Palmquist et al., 2008].
Particolarmente significative, inoltre, sono le variazioni legate allo stato fisiologico delle
bovine, specie con riferimento alle variazioni di alcuni acidi grassi (es. acido oleico,
linoleico e linolenico), nel confronto tra le fasi iniziali e la fase finale della lattazione. Da
alcuni studi, infatti, [Secchiari et al., 2002] è emerso che lo stato di lattazione rientra tra i
principali fattori di variazione della composizione in acidi grassi del latte, in quanto, com’è
noto, all’inizio della lattazione le bovine sono in bilancio energetico negativo e questo
comporta una mobilitazione delle riserve adipose e l’incorporazione nel grasso del latte
degli acidi grassi a lunga catena in esse contenuti. L’aumento di questa frazione prelude
alla riduzione della sintesi de novo degli acidi grassi a corta catena nel tessuto mammario,
la quale è influenzata in maniera differente a seconda del numero di atomi di carbonio
interessati. Questo fenomeno naturalmente tende ad attenuarsi con il progredire della
lattazione e il raggiungimento del bilancio energetico positivo.
Per quanto riguarda le diverse tecnologie di produzione casearia non sono state osservate
variazioni rilevanti [Collomb et al., 2002; Lucas et al., 2006], in quanto non è stato
osservato alcun effetto sulle diverse componenti del latte, ad eccezione dei minerali e dei
folati.
Un altro aspetto osservato e preso in considerazione negli ultimi anni, è stata la relazione
tra la composizione in acidi grassi e il diverso polimorfismo genetico delle proteine del
latte [MacGibbon et al., 1997; Bobe et al., 1999; Bobe et al., 2004]. In uno studio ad
esempio è stato dimostrato che il polimorfismo genetico della caseina α s1 ha importanti
effetti sulla composizione in acidi grassi del latte caprino e in particolar modo, a livello
degli acidi grassi a media catena e a livello dell’enzima Δ9 desaturasi [Chilliard et al.,
2006]. In un altro studio ancora [Bobe et al., 2004] è stata ipotizzata una associazione tra i
diversi fenotipi per κ-caseina e per β-lattoglobulina e la composizione in acidi grassi del
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Capitolo 4 La frazione lipidica
latte bovino, con speciale riferimento alla presenza di alcuni acidi grassi sintetizzati a
livello della ghiandola mammaria.
Studi relativi su quest’ultimo argomento sono ancora scarsi in letteratura, ma potrebbero
essere utili soprattutto nell’ambito della produzione industriale, in quanto è stato osservato
che, le differenze a livello della composizione in acidi grassi potrebbero essere impiegati
per il controllo delle proprietà di fusione dei prodotti alimentari, come ad esempio il burro
[Bobe et al., 2003].
4.8.1. L’IMPORTANZA A LIVELLO NUTRIZIONALE
DEGLI ACIDI GRASSI
Sebbene i prodotti lattiero-caseari forniscono solo il 15-25% del grasso totale
nell’alimentazione umana, quest’ultimi procurano il 25-35% degli acidi grassi saturi totali,
che se consumati in eccesso, potrebbero giocare un ruolo determinante nello sviluppo delle
malattie cardiovascolari [Chilliard et al., 2000; Ferlay et al., 2008].
La qualità nutrizionale dei prodotti lattiero-caseari dipende, in parte, dalla composizione in
acidi grassi del latte. Gli acidi grassi, come abbiamo visto, si distinguono in funzione della
lunghezza della catena e del grado di insaturazione in:
•
Acidi grassi a corta catena, che comprendono dall’acido butirrico all’acido
caprilico (C 4:0 – C 8:0 );
•
Acidi grassi a media-lunga catena, che considerano dall’acido caprico all’acido
palmitico (C 10:0 - C 16:0 );
•
Acidi grassi a lunga catena, che comprendono gli acidi grassi con 18, ed oltre,
atomi di carbonio (C 18:0 >).
La composizione in acidi grassi del latte ha, pertanto, diversi effetti sulla qualità
(comprese le proprietà fisiche: punto di fusione, cristallizzazione e frazionamento della
frazione lipidica del latte), sulle caratteristiche organolettiche, così come sulle proprietà
nutrizionali. Tra gli acidi grassi a corta catena, ad esempio, quello più rappresentativo è
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l’acido butirrico, al quale è stato riconosciuto, in alcuni studi, il ruolo protettivo della
mucosa del colon [Ballarini, 1998; Russo et al., 1999; Parodi, 1999].
Gli acidi grassi a media catena, invece, hanno principalmente funzioni metaboliche ed
energetiche, anche se in alcuni studi, è stato riscontrato l’effetto ipercolesterolemico
dell’acido laurico, miristico e palmitico, dovuto all’aumento del colesterolo LDL, mentre
l’acido stearico sembra essere neutrale e non avere un effetto aterogenico, nonostante sia
un acido grasso saturo [Mensink et al., 1998]. In particolare, l’acido laurico e l’acido
palmitico sono considerati a media nocività per la salute umana, a differenza dell’acido
miristico, considerato il peggiore di tutti per la sua nocività [Ulbricht et al., 1991].
Per quanto riguarda gli acidi grassi monoinsaturi, diversi studi [Secchiari et al., 2002] sono
stati mirati alla determinazione dei loro effetti sulla salute umana ed alcuni di essi hanno
affermato che i MUFA (acidi grassi monoinsaturi) sono in grado di ridurre il livello serico
di colesterolo in maniera analoga ai PUFA (acidi grassi polinsaturi), ma al contrario dei
PUFA ω-6, non abbassano il livello di HDL [Mensink et al., 1998]. Quest’ultimo aspetto è
molto importante perché le HDL esercitano un ruolo protettivo nei confronti delle malattie
coronariche, in quanto per effetto della loro funzione di trasporto inverso del colesterolo,
sono in grado di rimuovere il colesterolo stesso dalle cellule periferiche e di ridurre
l’entrata delle LDL nelle pareti dei vasi. Il ruolo protettivo degli acidi grassi insaturi in
generale e dell’acido oleico in particolare, nei confronti di diverse patologie, è da mettere
in relazione al mantenimento dell’integrità funzionale delle membrane cellulari. In
generale, una maggiore insaturazione delle membrane cellulari porta ad un incremento
della loro fluidità con conseguente aumento del metabolismo cellulare ed, inoltre, ad un
aumento del tasso di divisione cellulare.
Gli acidi grassi polinsaturi del latte, pertanto, oltre ad avere funzioni energetiche,
metaboliche e strutturali, hanno rilevanti attività salutistiche, in particolare di tipo
extranutrizionale. Per quanto riguarda le attività antinfettive, alcuni studi hanno dimostrato
l’importanza dell’acido linoleico coniugato (CLA) nella prevenzione del calo peso dovuto
a infezioni e a stimolazione del sistema immunitario [Ballarini, 2000]. Oggi è noto infatti
che l’acido linoleico e in particolare l’acido linoleico coniugato, noto anche per le sue
attività anticancerogene e le sue proprietà antiossidanti, svolge azioni di protezione
metabolica in caso di infezioni, vaccinazioni e stimolazione del sistema immunitario.
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Un’altra funzione extranutrizionale riguarda le attività ormonali dei grassi del latte, le quali
possono essere dirette o indirette. Quelle dirette derivano soprattutto dagli ormoni naturali,
di tipo liposolubile e soprattutto di tipo steroideo (estrogeni, etc.) e dai fitormoni presenti
nell’alimentazione degli animali. Quelle indirette invece sono da collegare ad alcune
vitamine liposolubili (vit. D) ed al colesterolo, in quanto base biochimica degli ormoni
steroidei (es. ormoni sessuali, corticosteroidi, etc.).
Altre attività molto importanti sono le attività psicodietetiche svolte dai grassi, i quali oltre
ad apportare energia, partecipano in modo attivo alla costruzione delle membrane cellulari
ed hanno un ruolo essenziale a livello del sistema nervoso, soprattutto durante la fase del
suo sviluppo. Le membrane cellulari infatti sono costituite principalmente da lipidi e
proteine, ed in particolare, i fosfolipidi rappresentano circa il 60 % dei lipidi di membrana.
Più di 1/3 degli acidi grassi dei fosfolipidi è costituito da acidi grassi essenziali, con
particolare preminenza degli acidi linoleico e α-linolenico. Tali acidi grassi di membrana,
detti anche strutturali, sono estremamente importanti nell’alimentazione e in una dieta
equilibrata dovrebbero coprire gran parte del fabbisogno lipidico. Tra gli organi che, in
particolar modo, durante il loro sviluppo risentono delle carenze degli acidi grassi
essenziali, troviamo il cervello, l’organo in assoluto più ricco di grassi come tutto il
sistema nervoso, il quale ricava energia prevalentemente dal glucosio ematico. Pertanto
una carenza degli acidi polinsaturi alimentari è particolarmente dannosa nel periodo in cui
si realizza lo sviluppo cerebrale, immediatamente dopo la nascita e nei primi anni di vita.
Per quanto riguarda le attività anticancerogene dei grassi, alcuni studi hanno dimostrato
che diverse componenti del grasso hanno caratteristiche anticancerogene. I più importanti
sono l’acido linoleico coniugato, le sfingomieline, l’acido butirrico e gli eteri lipidici
(alchilgliceroli ed alchilglicerolfosfolipidi e loro derivati).
L’acido linoleico, in particolare, è un acido grasso polinsaturo essenziale che insieme
all’acido α-linolenico, anch’esso polinsaturo essenziale, rappresentano i capostipiti
rispettivamente delle serie polinsature ω-6 ed ω-3 [Antongiovanni et al., 2002]. Gli acidi
linoleico e α-linolenico sono contenuti in quantità differenti nella carne e nel latte e sono
assorbiti a livello intestinale praticamente inalterati. Essi rivestono notevole importanza
perché sono i precursori dei PUFA ed i loro derivati polinsaturi biologicamente più attivi
sono l’acido arachidonico C 20:4 ω-6 per la serie ω-6, gli acidi eicosapentaenoico C 20:5 ω-3
(EPA) e docosaesaenoico C 22:6 ω-3 (DHA) per la serie ω-3. Inoltre assolvono essi stessi
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Capitolo 4 La frazione lipidica
importanti funzioni: l’acido linoleico entra, infatti, a far parte dei complessi lipidici che
concorrono a formare le barriere di permeabilità dell’epidermide, mentre una carenza di
acido α-linolenico potrebbe rappresentare un significativo fattore di rischio nei confronti di
malattie cardiache, tumori e disturbi delle funzioni neurologiche sia nei bambini, sia negli
adulti.
4.8.2.
I CLA (CONJUGATED LINOLEIC ACIDS) NEL LATTE
Negli ultimi tempi è stato osservato un aumento del numero di studi e di ricerche (oltre
2.000 articoli) rivolte agli effetti benefici esercitati da alcuni acidi grassi essenziali; tra
quest’ultimi è possibile ricordare l’acido linoleico (C 18:2 cis-9, cis-12), che non essendo
sintetizzato dal nostro organismo deve essere introdotto attraverso un’adeguata
alimentazione. Questo acido grasso è il precursore dei CLA (conjugated linoleic acids),
intendendo con tale acronimo l’insieme degli isomeri di posizione e geometrici dell’acido
linoleico con doppi legami coniugati [Parodi, 1997]. Nell’ambito dei CLA, il cis-9, trans11 (acido rumenico) è l’unico acido grasso che presenta in maniera inequivocabile attività
anticarcinogena in esperimenti realizzati su animali [Banni et al., 1999; Kelsey et al.,
2003; Destaillats et al., 2005; Jenkins et al., 2006] e si è dimostrato attivo anche verso altre
patologie, come l’aterosclerosi, il diabete, l’obesità, mostrando elevate capacità di
interferire positivamente con il sistema immunitario [Melis et al., 2003]. Per di più, a
differenza degli altri isomeri che hanno un’origine esogena, grazie alla presenza nel rumine
del batterio Butyrivibrio fibrisolvens che è in grado di convertire per via enzimatica
l’acido linoleico, largamente presente nella componente foraggiera della dieta dei
ruminanti, in CLA, l’acido rumenico può avere un’origine endogena (ghiandola mammaria
e tessuto adiposo) a partire dall’acido vaccenico C 18:1 trans-11, in seguito all’azione
dell’enzima Δ9 desaturasi, anche denominato Stearoil-CoA-Desaturasi (SCD) [Jianget et
al., 1996; Griinari et al., 2000; AbuGhazaleh et al., 2004; Kay et al., 2004; Whitlock et al.,
2006].
Inoltre è stato dimostrato con certezza che compete con l’acido linoleico riducendo la
formazione dell’acido arachidonico, precursore degli eicosanoidi che svolgono un ruolo
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Capitolo 4 La frazione lipidica
importante nella carcinogenesi [Secchiari et al., 2002]. Alcune prove sperimentali
effettuate sui ratti, dimostrerebbero che l’isomero cis-9, trans-11 è un promotore della
crescita, in quanto agisce positivamente sull’efficacia di utilizzo dei nutrienti, senza
modificare la composizione corporea. Al contrario l’isomero trans-10, cis-12 modifica la
composizione corporea facendo aumentare la massa magra e riducendo quella grassa.
Quest’ultimo isomero infatti è stato oggetto di molti studi, perché è un potente inibitore
della sintesi del grasso del latte.
Fra le attività dei CLA (principalmente dei due isomeri) si ritrovano anche quella
antiaterogenica ed ipocolesterolemica, in quanto è stata osservata una diminuzione del
livello di colesterolo LDL nel plasma con conseguente decremento della formazione di
placche aterose in ratti alimentati con diete arricchite con questo acido grasso.
Gli effetti positivi sul diabete invece sono correlati al miglior utilizzo del glucosio presente
nel plasma ed a una maggiore efficienza dell’insulina.
Nel latte dei ruminanti e nei suoi derivati la presenza dei CLA è più elevata rispetto a
quella presente nella carne e circa l’80-90% è rappresentato dall’isomero cis-9, trans-11
[Jiang et al., 1998; Zhang et al., 2006a; Zhanget al., 2006b]. Naturalmente la variazione
del contenuto dei CLA risente dell’andamento stagionale [Thorsdottir et al., 2004; Chamba
et al., 2006] e risulta anche influenzata dall’alimentazione, dallo stadio di lattazione e dalla
razza [Delmonte et al., 2000; Collomb et al., 2002; Kelsey et al., 2003; Bernal-Santos et
al., 2003]. Per quanto riguarda quest’ultima infatti, benchè la capacità di sintetizzare acido
rumenico a partire dal suo precursore sembri essere comune a molte specie, esistono
tuttavia differenze sostanziali che vedono, ad esempio, il grasso del latte e dei tessuti di
animali appartenenti alle specie ruminanti, caratterizzato da contenuti più elevati di acido
rumenico rispetto ai monogastrici (Tab.13). In particolare, il latte che contiene la maggior
quantità di CLA e, pertanto di acido rumenico, è quello ovino, seguito da quello bovino e
da quello caprino. Nell’ambito dei monogastrici invece è il latte di donna a contenere la
quantità più elevata di CLA [Mele et al., 2002].
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Capitolo 4 La frazione lipidica
Tabella 13. Contenuto medio di CLA nel latte di differenti specie.
Ruminanti
Non ruminanti
Pecora Vacca Dromedaria Capra
CLA (g/100g grasso) 1,2%
0,7%
0,7%
0,6%
Donna
0,4%
Scrofa
0,2%
Cavalla
0,1%
Da: Mele et al., 2002.
Pertanto i ricercatori del settore zootecnico hanno cercato di realizzare strategie alimentari
e regimi dietetici per i ruminanti finalizzati all’incremento di questi acidi grassi nel latte e
di conseguenza nei suoi derivati [Perfield et al., 2004; Piperova et al., 2004; Khanal et al.,
2005], agendo in particolare modo, sulla composizione della razione alimentare [Lawless
et al., 1998; Dhiman et al., 1999; De Veth et al., 2005; Loor et al., 2005; Rego et al.,
2005].
4.8.3.
GLI ω-6 E ω-3 NEL LATTE
Nell’ambito degli acidi grassi polinsaturi (PUFA), riconosciuti fondamentali per
l’organismo umano, ritroviamo gli acidi grassi della serie ω-6 (acido linoleico LA C 18:2 ,
γ-linolenico C 18:3 e arachidonico AA C 20:4 ) e della serie ω3 (l’α-linolenico ALA C 18:3 ,
l’eicosapentaenoico EPA C 20:5 e il docosaesaenoico DHA C 22:6 ). Questi acidi grassi sono
definiti essenziali, poiché non possono essere sintetizzati dai mammiferi, ma devono essere
introdotti obbligatoriamente con la dieta. È noto che, una fonte di notevoli quantità di ω-3 è
rappresentata dalle microalghe marine, con rilevanti differenze quali–quantitative tra le
varie specie. Anche il grasso degli organismi acquatici, rispetto a quello dei vertebrati
omeotermi è caratterizzato dalla presenza di una maggiore quantità di PUFA e fra questi,
soprattutto di EPA e di DHA. L’alto contenuto di questi acidi grassi nel pesce è una
conseguenza del consumo di fitoplancton (ricco di ω-3), il quale contribuisce anche
all’adattamento del pesce alle temperature d’acqua fredda. Pertanto il contenuto degli acidi
grassi polinsaturi ω-3 varia a seconda della specie ittica (tonno, arringa, sardine, salmone,
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Capitolo 4 La frazione lipidica
pesce azzurro, sgombro), dalla stagione dell’anno e dalla disponibilità del fitoplancton
[Lòpez Huertas et al., 2003]. L’α-linolenico (Fig.13) invece si ritrova principalmente nei
vegetali di color verde scuro (spinaci, lattuga), nell’olio dei semi di lino (57% degli acidi
grassi totali), nei semi di colza, di soia, nel germe di grano, nelle noci (che contengono dal
7 al 13% di ALA). In particolare l’olio di soia, per la sua particolare composizione acidica,
può essere considerato una importante fonte di acidi grassi ω-3, presenti soprattutto sotto
forma di acido α –linolenico [Caponio et al., 2003].
Gli acidi grassi ω-6 (LA, AA) invece hanno come fonte alimentare i cereali, le uova, il
pollo, la maggior parte degli oli vegetali, le granaglie, i cibi cotti al forno, i cibi fritti e la
margarina [Lòpez Huertas et al., 2003].
Figura 13. Biosintesi e distribuzione dei PUFAs
Da: Gabaldo et al., 2007.
Per quanto riguarda la sintesi degli acidi grassi ω-3 ed ω-6 (acido linoleico C 18:2 , γlinolenico C 18:3 e arachidonico C 20:4 ), quest’ultima avviene in modo indipendente a partire
dai due rispettivi precursori (acido α-linolenico ALA ed acido linoleico LA
rispettivamente), ma le vie metaboliche competono per gli stessi enzimi che risultano
72
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Capitolo 4 La frazione lipidica
importanti per le reazioni di elongazione e di desaturazione, che avvengono a livello della
catena molecolare (Fig. 14 e 15).
Figura 14. Genesi degli acidi grassi polinsaturi ω-6.
Da: Antongiovanni et al., 2002.
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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Capitolo 4 La frazione lipidica
Figura 15. Genesi degli acidi grassi polinsaturi ω-3.
Da: Antongiovanni et al., 2002.
Pertanto, una variazione della dieta che favorisce la produzione di acidi grassi appartenenti
alla serie ω-3 determina, non solo un aumento degli acidi di detta serie, ma anche una
diminuzione degli acidi della serie ω-6 [Secchiari et al., 2002; Stam et al., 2003; Lòpez
Huertas et al., 2003; Gabaldo et al., 2007].
Essendo una fonte di energia, gli acidi grassi ω-6 ed ω-3 sono incorporati nelle membrane
cellulari, dove attraverso le reazioni catalizzate dagli enzimi cicloossigenasi e
lipoossigenasi, generano sostanze ad azione ormone-simile come le prostaglandine, le
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Capitolo 4 La frazione lipidica
prostacicline, i trombosani e leucotrieni (eicosanoidi), coinvolti nell’ampia gamma dei
normali processi fisiologici, come la coagulazione del sangue, e nelle reazioni
infiammatorie e immunologiche.
Diversi studi hanno evidenziato le proprietà anti-aterogeniche, anti-trombotiche ed antiinfiammatorie degli acidi grassi polinsaturi a lunga catena ω-3. L’acido arachidonico,
molto rappresentato nella carne di varie specie, ha un effetto contrapposto sulla salute
umana. Esso infatti svolge delle funzioni importanti nella fase fetale, in quanto una sua
carenza comporta rischi a livello di disordini nervosi, psicomotori e dello sviluppo
motorio, ma è precursore di tutta una serie di composti biologicamente attivi come gli
eicosanoidi del gruppo 2 ed i leucotrieni del gruppo 4. Alcuni composti come le
prostaglandine E 2 (PGE 2 ), appartenenti agli eicosanoidi del gruppo 2, hanno un ruolo
importante (e negativo) nell’ambito del processo di risposta immunitaria. Infatti inducono
il catabolismo delle proteine muscolari associato alla risposta immunitaria stessa. Inoltre,
l’acido arachidonico è precursore di un altro composto appartenente agli eicosanoidi della
serie 2, il Trombosano A 2 (TXA 2 ), conosciuto come un fortissimo aggregante piastrinico.
Questi sono tutti fattori, pertanto, che favoriscono la formazione di trombi (protrombotici), mentre al contrario, gli eicosanoidi di tipo 3 derivati dall’EPA sono meno proinfiammatori e meno pro-trombotici.
I ricercatori, pertanto, hanno osservato gli effetti benefici degli ω-3, che risultano in
particolar modo evidenti, a livello delle malattie cardio-vascolari, del livello del colesterolo
e dei trigliceridi. Questi acidi grassi tendono a ridurre anche l’ipertensione, dovuta ad un
abbassamento del livello globale della pressione sanguigna, migliorano l’artrite
reumatoide, la depressione e i sintomi di altre malattie mentali e sono attivi anche verso
altre patologie.
Per questo motivo è stata considerata la possibilità di arricchire diversi tipi di prodotti
alimentari, regolarmente utilizzati da gran parte della popolazione [Berra et al., 2003]. Tra
quest’ultimi, il cui consumo ha diverse finalità, ritroviamo il latte. Da diversi studi è stato
infatti riscontrato che, modificando la composizione in acidi grassi della frazione lipidica
attraverso la razione alimentare, gli animali (in particolare i bovini) alimentati con razioni a
base di foraggio fresco, presentano un maggior contenuto in PUFA ω-3 (acido α-linolenico
ed EPA) nel tessuto adiposo ed in particolare nei fosfolipidi. Al contrario diete a base di
cereali comportano un aumento di PUFA ω-6.
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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Capitolo 4 La frazione lipidica
Quando non è possibile l’utilizzo dei foraggi freschi, l’unica alternativa è l’aggiunta nella
razione di olio di fegato di pesce, ricco di acidi grassi polinsaturi a lunga catena,
opportunamente protetto al fine di non peggiorare le performances degli animali e la
concentrazione di grasso nel latte.
Inoltre non bisogna dimenticare che, gli studiosi sono concordi nell’individuare
nell’evoluzione alimentare dell’uomo, tre eventi principali: la rivoluzione agricola, la
rivoluzione industriale e infine la rivoluzione dei fast-food del ventesimo secolo, per la
quale, la qualità della dieta umana è cambiata in maniera drammatica, tendendo alla
“globalizzazione” [Antongiovanni et al., 2002].
Pertanto oggi è possibile rilevare sul mercato l’aumento costante dei cosiddetti “functional
foods”, arricchiti di acido α-linolenico, EPA e DHA. Ciò è stato possibile grazie
all’impiego delle tecnologie alimentari moderne, che rendono possibile l’arricchimento in
acidi grassi ω-3 di qualsiasi alimento a livello mondiale. In particolare, in Europa i prodotti
funzionali sono rappresentati dai prodotti da forno (pane), dalle creme, dalle uova e dagli
ovoprodotti, dalla pasta, dai sughi, dai succhi e dalle bevande leggere, dai prodotti carnei e
di pollame e naturalmente dal latte e derivati.
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Capitolo 5 Parte sperimentale
CAPITOLO 5
PARTE SPERIMENTALE
5.1.
INTRODUZIONE
Numerosi studi sono stati realizzati sulla frazione lipidica del latte, considerata una
componente fondamentale dal punto di vista nutrizionale nell’alimentazione umana ed un
elemento chiave nell’ambito della struttura e dell’aroma di molti prodotti lattiero caseari
[Michalski, 2007].
Se consideriamo in particolar modo il latte vaccino, quest’ultimo presenta una percentuale
di grasso che varia dal 3,5 al 4%, con ampie oscillazioni individuali e stagionali e si ritrova
nel latte come emulsione sottoforma di globuli sferici, la cui sintesi avviene a livello delle
cellule secretrici dell’epitelio della ghiandola mammaria [McPherson et al., 1983; Walstra
et al., 1984; Danthine et al., 2000; Secchiari et al., 2002]. La dimensione dei globuli di
grasso varia da 0,1 μm a 20 μm , con una media di circa 3-4 μm e può essere influenzata
dalla razza, dallo stadio di lattazione, dall’alimentazione e dalla stagione. La struttura di
tali globuli non è omogenea, ma lamellare concentrica, dovuta alla sovrapposizione di
strati di trigliceridi e alla presenza di una membrana che avvolge il globulo di grasso
[Corradini, 1995; Salvadori del Prato, 2005]. Quest’ultima ha uno spessore di circa 10-20
nm, presenta una composizione piuttosto complessa e variabile in funzione di alcuni
fattori (dieta, razza, salute, stadio di lattazione) e gioca un ruolo fondamentale nella
stabilità dei globuli di grasso [Corradini, 1995; Lee et al., 2002; Michalski, et al., 2003;
Evers, 2004].
Se si considerano gli acidi grassi presenti nel grasso del latte, questi originano da diverse
fonti [Secchiari et al., 2002; Corl et al., 2006] e come è noto, la frazione lipidica in
generale e la composizione in acidi grassi in particolare risentono dell’influenza di diversi
fattori sia endogeni (razza, caratteristiche lattifere individuali, stato di salute, stadio di
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Capitolo 5 Parte sperimentale
lattazione) che esogeni (condizioni ambientali e management aziendale, con particolare
riferimento al tipo di alimentazione).
Pertanto negli ultimi anni è stato osservato un aumento delle ricerche rivolte alla relazione
tra la composizione in acidi grassi e le altre componenti del latte, principalmente alla loro
interazione ed alla loro influenza sulle proprietà tecnologiche e sensoriali [Mariani et al.,
1987; Pecorari et al., 1990; Mayer et al., 1997; Mariani et al., 1999]. Uno dei filoni di
ricerca preso in questo senso in considerazione è stato quello relativo alla relazione tra la
composizione in acidi grassi e il diverso polimorfismo genetico delle proteine [MacGibbon
et al., 1997; Bobe et al., 1999; Bobe et al., 2004; Chilliard et al., 2006]. In uno studio di
Bobe et al. [2004] in particolare è stata infatti ipotizzata una associazione tra i diversi
fenotipi per κ-caseina e per β-lattoglobulina e la composizione in acidi grassi del latte, con
speciale riferimento alla presenza di alcuni acidi grassi sintetizzati a livello della ghiandola
mammaria.
Come è noto, con il termine polimorfismo si intende la presenza di molte forme genetiche
di una stessa proteina, che si distinguono tra loro per la sostituzione o la delezione di alcuni
aminoacidi all’interno della catena polipeptidica [Alais, 2000].
Se consideriamo le caseine, in particolare la κ-Cn, delle 11 varianti genetiche riscontrate
con tecniche elettroforetiche, quelle con una frequenza maggiore sono rappresentate dalle
varianti A e B. Quest’ultima differisce dalla variante A per la sostituzione
dell’aminoacidico isoleucina con la treonina in posizione 136 e dell’alanina con l’acido
aspartico in posizione 148 [Farrell et al., 2004]. Come è noto da diversi studi, la variante B
è quella considerata più favorevole per il latte destinato alla trasformazione casearia, in
quanto determina la formazione di micelle caseiniche più piccole che coagulano più
velocemente e formano un coagulo più consistente, determinando una maggior resa in
formaggio [Morini et al., 1975; Mariani et al., 1976; Morini et al.,1983; Schaar et al.,
1985; Castagnetti et al., 1986]. Queste caratteristiche attribuite alla variante B sono state
confermate anche in altri studi più recenti [Mariani et al., 1991; Walsh et al., 1995; Walsh
et al., 1999; Gastaldi et al., 2003].
Nell’ambito delle sieroproteine, la proteina più rilevante è rappresentata dalla β-Lg. Da
quando Aschaffenburg and Drewry [1955] hanno riscontrato per la prima volta il
polimorfismo della stessa, 11 varianti genetiche di quest’ultima sono state identificate fino
ad oggi [Godovac-Zimmermann et al., 1990; Godovac-Zimmermann et al., 1996; Ng-
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Capitolo 5 Parte sperimentale
Kwai-Hang et al., 1992] e la variante A e la variante B risultano essere le più frequenti. In
particolare quest’ultima si differenzia dalla A per la sostituzione dell’aminoacido glicina
con l’acido aspartico in posizione 64 e dell’alanina con la valina in posizione 118 [Farrell
et al., 2004].
Un altro filone di ricerca è stato quello relativo alla relazione tra la composizione in acidi
grassi e la diversa dimensione dei globuli di grasso nel latte. In particolar modo, alcune
ricerche hanno dimostrato una maggior concentrazione di acido laurico, miristico,
palmitico e palmitoleico e una ridotta concentrazione di acido stearico nei globuli di grasso
di piccole dimensione rispetto a quelli di grandi dimensioni [Briard et al., 2003; Fauquant
et al., 2005; Michalski et al., 2005; Michalski et al., 2007b].
Negli ultimi anni infatti la diversa dimensione dei globuli di grasso è stata oggetto di
diversi studi in quanto è stato osservato che, le differenze collegate a quest’ultimo aspetto
hanno un notevole interesse sia a livello delle proprietà nutrizionali sia a livello delle
caratteristiche tecnologiche e sensoriali per la produzione dei prodotti lattiero-caseari
[Michalski et al., 2003; Cecchi et al., 2005; Martini et al., 2005; Fauquant et al., 2005].
Pertanto l’impiego dei globuli di grasso con differenti dimensioni potrebbe portare alla
nascita di nuovi prodotti con differenti proprietà tecnologiche e sensoriali e per tale
motivo, la dimensione dei globuli potrebbe essere considerata come un parametro che
definisce e determina la qualità nutrizionale del latte.
5.2.
SCOPO DELLA RICERCA
Lo scopo della presente ricerca è stato quello di verificare l’esistenza di una possibile
associazione tra il polimorfismo genetico delle proteine e la composizione in acidi grassi
del latte bovino e di confermare, pertanto, i risultati ottenuti da Bobe et al. [2004],
attraverso lo studio della composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza
Reggiana con differenti fenotipi per κ-Cn e β-Lg. Obiettivo prioritario del lavoro è stato
pertanto quello di verificare se la composizione in acidi grassi risulta effettivamente
associata anche ad un diverso polimorfismo genetico e di valutare inoltre se la variabilità di
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Capitolo 5 Parte sperimentale
alcuni acidi grassi più significativi può influenzare la composizione e le proprietà chimicofisiche del grasso del latte.
Nel corso dello studio sulla frazione lipidica del latte bovino, è stata inoltre studiata la
distribuzione della dimensione dei globuli di grasso nel latte bovino, in quanto secondo
alcuni Autori [Briard et al., 2003; Fauquant et al., 2005; Michalski et al., 2003; Michalski
et al., 2005; Michalski et al., 2007b], la diversa dimensione di questi potrebbe esser legata
ad alcune differenze a livello delle proprietà chimico-fisiche e della composizione in acidi
grassi del latte e di conseguenza potrebbero essere utilizzate per la produzione dei prodotti
lattiero-caseari.
5.3.
MATERIALI E METODI
5.3.1 Selezione delle bovine Reggiane e raccolta dei campioni di latte dagli
allevamenti.
Il presente studio è stato effettuato all’interno di due allevamenti di bovine da latte di
razza Reggiana, collocati vicini e all’interno del comprensorio di produzione del
formaggio Parmigiano-Reggiano in provincia di Reggio Emilia, a conduzione da
considerare sostanzialmente omogenea a livello di management aziendale, in particolare
per quanto riguarda il razionamento alimentare. Più in dettaglio, nell’ambito dei citati
allevamenti, la razione alimentare di base delle bovine, riportata nella Tabella 14, è
risultata uguale e impostata in conformità alle norme del disciplinare del Consorzio del
Parmigiano Reggiano ed ha seguito il normale condizionamento collegato all’andamento
stagionale, caratterizzato dal largo impiego dei foraggi di erba medica e di prato polifita,
somministrati allo stato fresco o essiccato.
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Tabella 14. Razione alimentare delle bovine di latte in funzione del periodo stagionale.
Periodo
Razione alimentare
Dicembre- Marzo
Foraggi essiccati (fieno + MCI*)
Aprile - Novembre
Foraggi verdi (40% di erba medica e
60% di prato polifita) + MCI*
*MCI: mangime composto integrato (1Kg 3L-1 latte)
Nei due allevamenti sono state identificate 55 bovine da latte di razza Reggiana con ordine
di parto tra il 2° e il 5° parto (Tabella 15) e con differenti fenotipi per κ-Cn e β-Lg. Lo
stadio di lattazione è stato ricostruito per ciascuna bovina nei due allevamenti in funzione
della data-parto. Dalle stesse a parità di epoca di lattazione e nell’arco di quest’ultima,
sono stati effettuati tre campionamenti di latte per singola bovina per un totale di 165
campioni, raccolti in tre fasi della lattazione (inizio lattazione = circa 60 giorni dopo il
parto; metà lattazione = circa 120 giorni dopo il parto; fine lattazione = circa 180 giorni
dopo il parto), in modo tale da ridurre l’influenza di alcuni effetti legati alla curva di
lattazione, alle variazioni stagionali e alla diversa razione alimentare, che possono influire
sulla composizione del latte e nella fattispecie sulle proprietà chimico-fisiche del grasso.
Tabella 15. Distribuzione dei fenotipi della κ-caseina e della β-lattoglobulina tra le bovine
di razza Reggiana.
Fenotipo
κ-caseina
a
AA
Fenotipo β-lattoglobulina
AB
BB
Totale
AA
3a
5
AB
10
9
8
27
BB
6
8
6
20
Totale
19
22
14
55
8
Numero delle bovine
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5.3.2. Caratterizzazione del polimorfismo genetico proteico del latte bovino.
Il polimorfismo genetico delle proteine, in particolare della κ-Cn e della β-Lg delle bovine
degli allevamenti citati è stato ottenuto in collaborazione con l’APA (Associazione
Provinciale Allevatori), la cui metodica di identificazione delle varianti genetiche delle
proteine del latte mediante elettroforesi, fa riferimento allo studio di Davoli [1981].
5.3.3. Trattamento dei campioni.
I campioni di latte individuale, previa agitazione, sono stati prelevati in doppio in appositi
contenitori del volume di 150 mL durante la mungitura della sera e sono stati conservati a
2-4°C per 24 h fino al momento dell’effettuazione delle analisi.
5.3.4. Determinazione della composizione macroscopica dei campioni di latte.
I campioni di latte sono stati analizzati per rilevare la composizione macroscopica del latte,
insieme ad altri parametri con le rispettive metodiche di seguito indicate.
Il contenuto in caseina e grasso è stato determinato con Milkoscan FT-IR120 (Foss
Analytical A/S, Hilleroed, Denmark); la rilevazione del pH è stata effettuata con pHmetro
Orion ad una temperatura di 20°C; l’acidità titolabile ottenuta per titolazione di 50 mL di
latte con NaOH 0,25 mol L-1 in presenza di fenoftaleina è stata espressa in °SH (SoxlhetHenkel); infine il conteggio delle cellule somatiche è stato eseguito con metodo fluoroptoelettronico mediante Fossomatic [Schmidt, 1975].
5.3.5. Determinazione della composizione in acidi grassi dei campioni di latte.
L’estrazione del grasso del latte, da 165 campioni individuali di latte, è stata eseguita in
doppio utilizzando il metodo Röse-Gottlieb [AOAC, 1990] e il profilo in acidi grassi dei
campioni di latte è stato determinato mediante l’analisi degli esteri metilici degli acidi
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grassi (FAME), previa trans-metilazione, utilizzando KOH in metanolo (2 mol L-1), come
descritto da Christie [Christie, 1998].
La determinazione della composizione in acidi grassi è stata eseguita con un gascromatografo Perkin Elmer, modello Clarus 500, fornito di una colonna capillare Restek
2330 (30 m x 0,25 mm i.d. x 0,2 µm, cianopropilica), un detector a ionizzazione di fiamma
(FID) ed un autocampionatore. Il detector FID è stato mantenuto a 250°C con un flusso di
aria di 400 mL min-1 e un flusso di idrogeno di 40 mL min-1. L’iniettore è stato mantenuto
a 250°C con un rapporto di splittaggio 1:20. E’ stato iniettato un volume di 1 μL. La
temperatura della colonna è stata programmata come segue: da 40°C a 160°C a 12 °C
min-1, da 160°C a 200 °C a 10 °C min-1 ed infine, da 200°C a 240°C a 10 °C min-1. Il
tempo totale della corsa cromatografica è risultato di 23 minuti. Il metil-pelargonato
(Sigma-Aldrich, Milano, Italia) è stato usato come standard interno (C 9 methylpelargonate, 1 mg mL-1 ).
5.3.6. Analisi statistica.
I dati ottenuti relativi alla composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza
Reggiana sono stati elaborati mediante analisi della varianza multivariata, utilizzando un
test del modello lineare generale (GLM), eseguito con il pacchetto statistico SPSS per
Windows, versione 13.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA).
Il test di Tukey HSD è stato impiegato per confrontare le medie dei campioni di latte e le
valutazioni sono state basate su un livello di significatività del 5% ( p<0,05).
5.3.7 Selezione delle bovine di razza Reggiana e Frisona e raccolta dei campioni di
latte.
La seconda parte di questa ricerca è stata effettuata inizialmente in un allevamento di
bovine da latte di razza Reggiana e Frisona, situato all’interno del comprensorio di
produzione del formaggio Parmigiano-Reggiano in provincia di Reggio Emilia.
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Capitolo 5 Parte sperimentale
In particolare si è proceduto al prelevamento di singoli campioni di latte di massa in
appositi contenitori del volume di 150 mL durante la mungitura della sera e alla
conservazione a 2-4°C per 24 h fino al momento dell’effettuazione delle analisi.
Successivamente sono state identificate 12 bovine da latte di sola razza Reggiana con
differente fenotipo per κ-Cn, in un allevamento situato all’interno del comprensorio di
produzione del formaggio Parmigiano-Reggiano in provincia di Reggio Emilia, con ordine
di parto tra il 2° e il 6° parto e al 4° mese di lattazione.
I campioni di latte individuale, previa agitazione, sono stati prelevati in appositi contenitori
del volume di 150 mL durante la mungitura della sera e conservati a 2-4°C per 24 h fino al
momento dell’effettuazione delle analisi.
5.3.8. Determinazione e analisi della dimensione dei globuli di grasso.
L’analisi dei campioni di latte di massa ed individuali di bovine da latte di razza Reggiana
e Frisona è stata effettuata secondo il metodo di Cecchi et al. [2005], al fine di determinare
le dimensioni dei globuli di grasso. In particolare, quest’ultimi sono stati marcati con una
soluzione di arancio di acridina 0,1% in tampone fosfato (0,1 mol/ L, pH 6,8).
L’acquisizione e la elaborazione dell’ immagine (40 immagini 60x per un totale di circa
1000 globuli per ogni campione) sono state eseguite utilizzando un microscopio a
fluorescenza (NIKON ECLIPSE modello TE 2002-E) con un kit ottico per la fluorescina,
equipaggiato con il software NIS-Elements AR 2.20 per l’acquisizione ed analisi
dell’immagine.
L’analisi statistica è stata realizzata mediante l’analisi della varianza (ANOVA), eseguita
con il pacchetto per Windows Stat Soft (Tulse, OK,USA), versione 6.
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5.4.
RISULTATI E DISCUSSIONE
5.4.1 Analisi della composizione macroscopica del latte con differenti fenotipi per κCn e β-Lg.
I dati e le osservazioni delle analisi chimico-fisiche complessivamente raccolte nel corso
della lattazione delle singole bovine seguite durante la sperimentazione, sono riportati
nelle Tabelle 16 – 23. Nelle Tabelle 16 e 17 ritroviamo i valori medi dei dati relativi ad
alcune componenti della composizione macroscopica del latte, agli indici chimico-fisici e
al contenuto in cellule somatiche registrati nell’arco dell’intera lattazione delle bovine con
differenti fenotipi per κ-Cn e per β-Lg, noti per ogni singola bovina. La valutazione dei
risultati di queste analisi non permette di riscontrare delle differenze sostanziali all’interno
dei diversi fenotipi del latte delle bovine prese in esame, sia per κ-Cn in accordo con
Schaar et al. [1985] e Macheboeuf et al. [1993], che per β-Lg [Strzalkowska et al., 2002]
ed inoltre essi non si discostano, in modo rilevante, dai dati rilevabili in tesi generale in
letteratura relativi a detti parametri.
Tabella 16. Caratteristiche chimico-fisiche e conteggio delle cellule somatiche del latte
delle bovine di razza Reggiana con differenti fenotipi per κ-Cn (valori medi ± D.S., n=165
campioni).
Fenotipo κ-Cn
AA
AB
BB
Latte (Kg d-1)
23,16 ± 5,88
22,76 ± 4,77
23,28 ± 5,46
pH
6,71 ± 0,03
6,72 ± 0,01
6,71 ± 0,02
3,19 ± 0,09
3,34 ± 0,03
3,35 ± 0,04
Caseina g 100g-1
2,60 ± 0,32
2,67 ± 0,21
2,68 ± 0,28
Grasso g 100g-1
3,81 ± 0,12
3,66 ± 0,15
3,82 ± 0,13
Acidità titolabile
°SH 50 mL-1
Conteggio cellule
somatiche 103 mL-1
155,97 ± 27,55
123,85 ± 16,86 135,83 ± 29,90
AA = 8 bovine; AB = 27 bovine; BB = 20 bovine
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Tabella 17. Caratteristiche chimico-fisiche e conteggio delle cellule somatiche del latte
delle bovine di razza Reggiana con differenti fenotipi per β-Lg (valori medi ± D.S., n=165
campioni).
Fenotipo β-Lg
AA
AB
BB
Latte (Kg d-1)
21,26 ± 5,96
23,64 ± 4,56
23,12 ± 5,80
pH
6,71 ± 0,03
6,72 ± 0,01
6,69 ± 0,01
3,37 ± 0,04
3,28 ± 0,06
3,43 ± 0,06
Caseina g 100g-1
2,70 ± 0,28
2,65 ± 0,26
2,62 ± 0,21
Grasso g 100g-1
3,90 ± 0,09
3,74 ± 0,19
3,53 ± 0,22
159,23 ± 59,09
109,34 ± 19,19
147,51 ± 40,43
Acidità titolabile
°SH 50 mL-1
Conteggio cellule
somatiche 103 mL-1
AA = 19 bovine; AB = 22 bovine; BB = 14 bovine
Inoltre, i risultati delle analisi chimico-fisiche sono stati suddivisi per le tre fasi principali
della lattazione delle bovine.
Come si può osservare nelle Tabelle 18, 19 e 20 nel latte delle bovine con fenotipo per
κ-Cn, oltre al normale andamento dei costituenti del latte durante la lattazione (aumento
fisiologico del contenuto percentuale in caseina e in grasso), è stato notato un aumento
della percentuale di caseina e di grasso nel latte delle bovine con la variante B per κ-Cn
rispetto al latte delle bovine con la variante A.
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Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 18. Caratteristiche chimico-fisiche e conteggio delle cellule somatiche del latte
delle bovine di razza Reggiana con differenti fenotipi per κ-Cn (Inizio lattazione = circa 60
giorni dopo il parto).
Fenotipo κ-Cn
AA
AB
BB
Latte (Kg d-1)
29,06
28,10
28,94
pH
6,69
6,71
6,69
3,25
3,36
3,34
Caseina g 100g-1
2,31
2,48
2,43
Grasso g 100g-1
3,67
3,49
3,71
183,80
106,35
114,11
Acidità titolabile
°SH 50 mL-1
Conteggio cellule
somatiche 103 mL-1
Tabella 19. Caratteristiche chimico-fisiche e conteggio delle cellule somatiche del latte
delle bovine di razza Reggiana con differenti fenotipi per κ-Cn (Metà lattazione = circa
120 giorni dopo il parto).
Fenotipo κ-Cn
AA
AB
BB
Latte (Kg d-1)
23,16
21,22
22,86
pH
6,70
6,72
6,71
3,23
3,31
3,32
Caseina g 100g-1
2,53
2,62
2,61
Grasso g 100g-1
3,89
3,71
3,77
128,70
125,23
123,44
Acidità titolabile
°SH 50 mL-1
Conteggio cellule
somatiche 103 mL-1
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 20. Caratteristiche chimico-fisiche e conteggio delle cellule somatiche del latte
delle bovine di razza Reggiana con differenti fenotipi per κ-Cn (Fine lattazione = circa 180
giorni dopo il parto).
Fenotipo κ-Cn
AA
AB
BB
Latte (Kg d-1)
17,30
18,94
18,04
pH
6,74
6,72
6,72
3,09
3,36
3,40
Caseina g 100g-1
2,95
2,90
2,99
Grasso g 100g-1
3,88
3,78
3,97
155,41
139,97
169,94
Acidità titolabile
°SH 50 mL-1
Conteggio cellule
somatiche 103 mL-1
Lo stesso tipo di valutazione, relativamente ai tre periodi della lattazione individuati, è
stata realizzata anche per i campioni di latte delle bovine con fenotipo per β-Lg (Tab. 21,
22, 23), ma in questo caso non è stato rilevato lo stesso andamento per la variante B
rispetto alla variante A della β-Lg.
Tabella 21. Caratteristiche chimico-fisiche e conteggio delle cellule somatiche del latte
delle bovine di razza Reggiana con differenti fenotipi per β-Lg (Inizio lattazione = circa 60
giorni dopo il parto).
Fenotipo β-Lg
AA
AB
BB
Latte (Kg d-1)
27,74
28,28
29,66
pH
6,68
6,72
6,68
3,42
3,21
3,47
Caseina g 100g-1
2,45
2,44
2,43
Grasso g 100g-1
3,80
3,55
3,28
99,41
100,79
192,90
Acidità titolabile
°SH 50 mL-1
Conteggio cellule
somatiche 103 mL-1
88
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 22. Caratteristiche chimico-fisiche e conteggio delle cellule somatiche del latte
delle bovine di razza Reggiana con differenti fenotipi per β-Lg (Metà lattazione = circa
120 giorni dopo il parto).
Fenotipo β-Lg
AA
AB
BB
Latte (Kg d-1)
20,02
23,46
21,14
pH
6,72
6,72
6,69
3,33
3,31
3,36
Caseina g 100g-1
2,66
2,58
2,60
Grasso g 100g-1
3,93
3,74
3,62
160,71
95,91
134,30
Acidità titolabile
°SH 50 mL-1
Conteggio cellule
somatiche 103 mL-1
Tabella 23. Caratteristiche chimico-fisiche e conteggio delle cellule somatiche del latte
delle bovine di razza Reggiana con differenti fenotipi per β-Lg (Fine lattazione = circa 180
giorni dopo il parto).
Fenotipo β-Lg
AA
AB
BB
Latte (Kg d-1)
16,02
19,16
18,58
pH
6,74
6,73
6,69
3,37
3,30
3,44
Caseina g 100g-1
3,00
2,94
2,85
Grasso g 100g-1
3,97
3,93
3,69
217,57
131,32
115,33
Acidità titolabile
°SH 50 mL-1
Conteggio cellule
somatiche 103 mL-1
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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Capitolo 5 Parte sperimentale
5.4.2 Analisi della composizione in acidi grassi del latte con differenti fenotipi per κCn e β-Lg.
Nelle Tabelle 24 e 28 sono riportati i valori medi dei dati relativi alla composizione in
acidi grassi dei campioni di latte analizzati con diverso fenotipo per κ-Cn e per β-Lg.
Nella Figura 16 è illustrato un cromatogramma “tipo” relativo ad un campione di latte di
razza Reggiana, nel quale risultano ben evidenziati i principali acidi grassi considerati nel
corso del presente studio. Come si può notare, in questa ricerca sono stati identificati
undici maggiori acidi grassi presenti nel latte bovino, in quanto lo scopo della ricerca è
stato quello di confermare i risultati ottenuti da Bobe et al. [2004]. E’ stata inoltre
considerata la somma degli acidi grassi da C 6:0 a C 14:0 come indicatore della sintesi de
novo degli acidi grassi nella ghiandola mammaria, al fine di evidenziare maggiormente le
differenze tra i diversi fenotipi per κ-Cn e per β-Lg [Ferlay et al., 2008].
90
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Figura 16. Profilo gas-cromatografico degli acidi grassi di un campione di latte di razza Reggiana (C 9:0 = standard interno).
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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Capitolo 5 Parte sperimentale
A seguito di un’accurata analisi statistica sono state verificate delle associazioni
statisticamente significative tra la variazione di alcuni acidi grassi e il polimorfismo
genetico per κ-Cn e per β-Lg. In particolare è possibile notare come la composizione in
acidi grassi sembra essere influenzata dai fenotipi per κ-Cn, in quanto nel grasso del latte
delle bovine con la variante B è stata riscontrata un’elevata concentrazione statisticamente
significativa (p<0,05) di acido caprico (C 10:0 ), di acido laurico (C 12:0 ) e di acido miristico
(C 14:0 ) e contemporaneamente una ridotta concentrazione di acido stearico (C 18:0 ) e di
acido oleico (C 18:1 ) rispetto alla composizione in acidi grassi del grasso del latte delle
bovine con la variante omozigote per A (Tab. 24).
Tabella 24. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn (valori medi ± D.S., n=165 campioni).
Fenotipo κ-Cn
AB
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
2,02 ± 0,41
1,39 ± 0,21
0,96 ± 0,2
2,29a ± 0,61
2,77a ± 0,73
9,22a ± 1,87
21,16 ± 3,76
1,62 ± 0,47
7,84b ± 2,57
19,19b ± 7,31
2,49 ± 0,77
2,04 ± 0,5
1,42 ± 0,21
1,00 ± 0,18
2,53b ± 0,67
3,17b ± 1,05
10,25b ± 2,44
22,76 ± 6,57
1,55 ± 0,47
7,20a,b ± 2,48
16,81a ± 4,79
2,60 ± 0,70
1,99 ± 0,47
1,42 ± 0,21
1,02 ± 0,17
2,59b ± 0,55
3,20b ± 0,72
10,27b ± 2,01
22,15 ± 4,58
1,59 ± 0,42
6,94a ± 2,02
16,79a ± 4,29
2,49 ± 0,68
Somma C 6:0 -C 14:0
16,62a ± 3,37
18,37b ± 3,78
18,49b ± 3,78
ab
AA
BB
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
AA = 8 bovine; AB = 27 bovine; BB = 20 bovine
Pertanto le maggiori proporzioni di acido laurico e miristico potrebbero far presupporre
che la κ-Cn omozigote per B possa essere associata positivamente con l’aumento della
sintesi de novo degli acidi grassi a livello della ghiandola mammaria, in accordo con i
risultati di Bobe et al. [2004]. Infatti, se si considera la somma degli acidi grassi da C 6:0 a
92
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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C 14:0 (p<0.05) nel grasso del latte delle bovine con la variante B, quest’ultima presenta
una concentrazione maggiore statisticamente significativa, rispetto a quella del grasso del
latte delle bovine caratterizzata dalla variante A. Anche κ-Cn AB sembra avere lo stesso
effetto.
Inoltre, i valori medi dei dati relativi alla composizione in acidi grassi dei campioni di
latte analizzati con diverso fenotipo per κ-Cn sono stati suddivisi per le tre fasi principali
della lattazione delle bovine (Tab. 25, 26, 27). Dalla valutazione di quest’ultimi dati, in
particolar modo, elevate proporzioni da C 8:0 a C 14:0 nel grasso del latte delle bovine con κCn AB e BB vs κ-Cn AA sono state statisticamente significative (p<0.05) a 60 e 180
giorni, ma non a 120 giorni dopo il parto. Contemporaneamente ridotte concentrazioni di
acido stearico (C 18:0 ) e di acido oleico (C 18:1 ) sono risultate statisticamente significative
(p<0.05) solo a 60 giorni dopo il parto nel grasso del latte delle bovine con κ-Cn AB e BB
vs κ-Cn AA.
Tabella 25. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn (Inizio lattazione = circa 60 giorni dopo il parto; valori medi
± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
2,22a ± 0,41
1,38a ± 0,19
0,92a ± 0,18
2,09a ± 0,48
2,51a ± 0,56
8,62a ± 1,49
22,13a ± 4,5
1,67a ± 0,62
9,33b ± 2,59
22,91b ± 9,01
2,72a ± 0,61
Fenotipo κ-Cn
AB
2,21a ± 0,53
1,54b ± 0,22
1,09b ± 0,19
2,68b ± 0,71
3,22b ± 1,04
9,99b ± 2,54
21,64a ± 5,17
1,50a ± 0,41
8,42a,b ± 2,83
17,58a ± 5,23
2,80a ± 0,82
BB
2,15a ± 0,47
1,47a,b ± 0,15
1,05b ± 0,14
2,61b ± 0,48
3,17b ± 0,65
10,2b ± 2,21
22,46a ± 5,28
1,51a ± 0,39
7,80a ± 2,21
17,92a ± 4,68
2,73a ± 0,77
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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Tabella 26. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn (Metà lattazione = circa 120 giorni dopo il parto; valori medi
± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,99a ± 0,37
1,48a ± 0,21
1,09a ± 0,19
2,73a ± 0,6
3,32a ± 0,73
10,50a ± 1,98
21,03a ± 3,29
1,48a ± 0,36
7,12a ± 2,42
16,64a ± 5,18
2,40a ± 1,01
Fenotipo κ-Cn
AB
2,03a ± 0,49
1,38a ± 0,18
0,99a ± 0,14
2,57a ± 0,64
3,32a ± 1,17
10,88a ± 2,37
25,04b ± 8,07
1,53a ± 0,54
7,12a ± 2,32
16,65a ± 4,97
2,56a ± 0,67
BB
1,96a ± 0,49
1,43a ± 0,27
1,03a ± 0,22
2,67a ± 0,67
3,31a ± 0,85
10,55a ± 2,09
22,45a,b ± 4,98
1,55a ± 0,45
6,56a ± 1,84
15,88a ± 4,54
2,37a ± 0,67
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
Tabella 27. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn (Fine lattazione = circa 180 giorni dopo il parto; valori medi ±
D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,66a ± 0,20
1,25a ± 0,17
0,83a ± 0,13
1,93a ± 0,36
2,36a ± 0,41
8,21a ± 1,05
19,53a ± 2,29
1,79a ± 0,17
6,19a ± 0,52
16,29a ± 1,89
2,23a ± 0,48
Fenotipo κ-Cn
AB
1,89a ± 0,43
1,34a ± 0,17
0,93a,b ± 0,17
2,33b ± 0,61
2,90b ± 0,83
9,64b ± 2,26
20,75a ± 4,31
1,64a ± 0,41
6,04a ± 1,58
16,24a ± 3,96
2,44a ± 0,55
BB
1,80a ± 0,35
1,32a ± 0,19
0,95b ± 0,14
2,44b ± 0,46
3,09b ± 0,62
10,01b ± 1,5
21,27a ± 2,32
1,79a ± 0,36
6,04a ± 1,27
16,16a ± 2,75
2,28a ± 0,40
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
94
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Capitolo 5 Parte sperimentale
Contemporaneamente, la composizione in acidi grassi del latte non sembra essere
influenzata dai fenotipi della β-Lg, in quanto il grasso del latte delle bovine con la
variante omozigote per B presenta concentrazioni statisticamente significative (p<0,05) di
acido laurico (C 12:0 ) ed una quantità rilevante, ma non statisticamente significativa di
acido miristico (C 14:0 ) e palmitico (C 16:0 ) rispetto al grasso del latte delle bovine con la
variante omozigote per A. Concentrazioni minori (p<0,05) di acido stearico (C 18:0 ) e acido
oleico (C 18:1 ) sono state riscontrate nel grasso del latte delle bovine con la variante A e B
rispetto a quella del grasso del latte delle bovine con la variante AB (Tab. 28).
Tabella 28. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg (valori medi ± D.S., n=165 campioni).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
Somma C 6:0 -C 14:0
ab
AA
Fenotipo β-Lg
AB
BB
1,97 ± 0,43
1,39 ± 0,21
0,99 ± 0,18
2,47 ± 0,59
3,05a ± 0,82
9,85 ± 2,27
21,72 ± 5,06
1,59 ± 0,44
6,93a ± 1,81
16,74a,b ± 4,27
2,50 ± 0,67
2,05 ± 0,52
1,42 ± 0,21
0,99 ± 0,18
2,47 ± 0,58
3,04a ± 0,75
10,18 ± 2,10
22,90 ± 4,81
1,56 ± 0,39
7,86b ± 2,81
18,24b ± 5,95
2,65 ± 0,81
2,06 ± 0,48
1,42 ± 0,2
1,03 ± 0,18
2,65 ± 0,71
3,33b ± 1,20
10,35 ± 2,43
22,28 ± 7,31
1,59 ± 0,55
6,59a ± 2,04
16,07a ± 4,65
2,46 ± 0,56
17,76 ± 3,62
18,10 ± 3,76
18,78 ± 3,80
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
AA = 19 bovine; AB = 22 bovine; BB = 14 bovine
Anche in questo caso, le maggiori proporzioni di acido laurico, miristico e palmitico
potrebbero far presupporre che la β-Lg omozigote per B possa essere associata
positivamente con l’aumento della sintesi de novo degli acidi grassi a livello della
ghiandola mammaria, sempre in accordo con i risultati di Bobe et al. [2004]. Infatti, la
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somma degli acidi grassi da C 6:0 a C 14:0 nel grasso del latte delle bovine con la variante B
presenta una concentrazione maggiore, ma non statisticamente significativa, rispetto a
quella del grasso del latte delle bovine con la variante A.
Inoltre i valori medi dei dati relativi alla composizione in acidi grassi dei campioni di latte
analizzati con diverso fenotipo per β-Lg sono stati suddivisi per le tre fasi principali della
lattazione delle bovine (Tab. 29, 30, 31). Dalla valutazione di quest’ultimi dati, è emerso
che elevate proporzioni di acido palmitico (C 16:0 ) , di acido stearico (C 18:0 ) e acido oleico
(C 18:1 ) nel grasso del latte delle bovine con β-Lg AB vs β-Lg AA e BB risultano
statisticamente significative (p<0.05) solo a 60 giorni dopo il parto. Le elevate
concentrazioni di acido caprico (C 10:0 ), acido laurico (C 12:0 ), di acido miristico (C 14:0 ), e di
acido palmitico (C 16:0 ) nel grasso del latte delle bovine con β-Lg BB vs β-Lg AA sono
risultate statisticamente significative (p<0.05) solo a 120 giorni dopo il parto.
Tabella 29. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg (Inizio lattazione = circa 60 giorni dopo il parto; valori medi ±
D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
2,15a ± 0,45
1,46a ± 0,22
1,04a ± 0,19
2,58a ± 0,7
3,15a ± 1,04
9,75a ± 2,65
21,93b ± 5,55
1,55a ± 0,44
7,63a ± 1,93
17,03a ± 4,91
2,57a ± 0,73
Fenotipo β-Lg
AB
2,21a ± 0,54
1,49a ± 0,20
1,02a ± 0,18
2,48a ± 0,55
3,01a ± 0,71
10,22a ± 2,22
23,83b ± 4,93
1,55a ± 0,50
9,35b ± 2,97
20,99b ± 7,01
3,02b ± 0,84
BB
2,21a ± 0,45
1,52a ± 0,14
1,09a ± 0,16
2,63a ± 0,64
3,07a ± 0,81
9,27a ± 1,77
18,90a ± 2,33
1,46a ± 0,36
7,69a ± 2,32
17,01a ± 4,97
2,61a ± 0,5
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
96
Selenia Melia Tesi di dottorato
”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 30. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg (Metà lattazione = circa 120 giorni dopo il parto; valori medi
± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,88a ± 0,36
1,39a ± 0,22
0,99a ± 0,18
2,45a ± 0,51
3,00a ± 0,57
9,90a ± 1,85
21,76a ± 4,76
1,51a ± 0,45
7,08a,b ± 1,66
16,64a ± 4,3
2,46a ± 0,69
Fenotipo β-Lg
AB
2,04a ± 0,51
1,42a ± 0,21
1,02a ± 0,18
2,59a,b ± 0,6
3,23a ± 0,79
10,77a,b ± 2,06
23,6a,b ± 5,36
1,49a ± 0,29
7,47b ± 2,65
17,16a ± 5,23
2,54a ± 0,82
BB
2,08a ± 0,52
1,42a ± 0,21
1,05a ± 0,16
2,86b ± 0,75
3,79b ± 1,47
11,61b ± 2,52
26,04b ± 9,73
1,59a ± 0,71
6,12a ± 1,85
15,17a ± 4,77
2,42a ± 0,65
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
Tabella 31. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg (Fine lattazione = circa 180 giorni dopo il parto; valori medi ±
D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,82a ± 0,39
1,32a ± 0,14
0,93a ± 0,13
2,35a ± 0,50
2,99a ± 0,76
9,92a ± 2,23
21,38a ± 4,84
1,73a ± 0,41
5,84a ± 1,25
16,49a ± 3,30
2,45a ± 0,57
Fenotipo β-Lg
AB
1,83a ± 0,42
1,33a ± 0,20
0,92a ± 0,18
2,26a ± 0,56
2,78a ± 0,67
9,23a ± 1,64
20,49a ± 2,52
1,66a ± 0,32
6,27a ± 1,47
15,81a ± 3,12
2,26a ± 0,45
BB
1,86a ± 0,36
1,31a ± 0,19
0,94a ± 0,18
2,36a ± 0,65
2,92a ± 0,86
9,61a ± 2,07
20,27a ± 2,61
1,74a ± 0,40
6,06a ± 1,48
16,42a ± 3,95
2,37a ± 0,47
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
97
Capitolo 5 Parte sperimentale
Tali dati confermano i risultati ottenuti nello studio effettuato da Bobe et al. [2004], nel
quale sono stati considerati gli stessi acidi grassi presi in considerazione nel corso della
nostra ricerca sperimentale. Nello specifico, i nostri dati confermano l’andamento degli
acidi grassi in relazione al polimorfismo genetico per κ-Cn. Al contrario, l’andamento
seguito dagli acidi grassi in relazione al fenotipo per β-Lg, pur con qualche lieve
differenza, non è risultato comunque statisticamente significativo e di conseguenza non ha
confermato i risultati raggiunti dagli Autori sopracitati. Sempre in riferimento al fenotipo
per β-Lg, anche alcuni studi effettuati in Nuova Zelanda, non hanno rilevato una
associazione tra il fenotipo per β-Lg e la composizione in acidi grassi del latte bovino
[MacGibbon et al., 1997; Mackle et al., 1999]. In particolare i risultati di questi studi
suggeriscono che i cambiamenti nella composizione in acidi grassi, dovuti alla
composizione della dieta o alle tecniche di selezione delle bovine da latte, potrebbero
spiegare le differenze evidenziate negli studi eseguiti in Nuova Zelanda [Bobe et al.,
2004; Mackle et al., 1999].
Saranno necessari pertanto, ulteriori studi per raggiungere una conclusione definitiva e per
verificare se la composizione in acidi grassi del latte bovino può essere influenzata da tutti
o solo da alcuni polimorfismi genetici delle proteine del latte.
Osservando la percentuale di acido oleico presente nei campioni di latte (Tab. 24 e 28)
emerge inoltre che, la presenza di tale acido è notevolmente inferiore rispetto a quella
rilevata nei dati riscontrabili in letteratura, in quanto come è noto, esso rappresenta tra gli
acidi grassi insaturi quello presente in maggiori proporzioni [Malacarne et al., 2001;
Lucas et al., 2006]. Una logica spiegazione per un tale rilevato andamento potrebbe essere
collegata al livello energetico della razione di base delle bovine, che può influire oltre che
sulla quantità di grasso prodotta, anche sulla composizione dei lipidi [Corradini, 1995].
Inoltre tutto ciò potrebbe essere messo in relazione alla diversa origine degli acidi grassi
del latte. Di conseguenza si può dedurre che i componenti lipidici della dieta possono
influire direttamente sulla composizione del grasso, mentre il livello energetico della
razione può modificare le attività fermentative ruminali che determinano la disponibilità
di precursori per la sintesi del grasso e la secrezione degli ormoni che regolano il
metabolismo lipidico.
98
Selenia Melia Tesi di dottorato
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
5.4.3 Analisi della composizione in acidi grassi del latte con differenti fenotipi per κCn e β-Lg nei due allevamenti selezionati.
Nelle Tabelle 32-47 sono riportati i valori medi dei dati relativi alla composizione in
acidi grassi dei campioni di latte analizzati con diverso fenotipo per κ-Cn e per β-Lg,
considerando separatamente i valori medi dei dati dei campioni prelevati nei due
allevamenti durante l’intero arco della lattazione delle bovine.
Come si può notare nell’allevamento n° 1, i valori medi dei dati relativi alla composizione
in acidi grassi dei campioni di latte analizzati con diverso fenotipo per κ-Cn sono stati
suddivisi per le tre fasi principali della lattazione delle bovine (Tab. 32, 33, 34), mentre
nella Tabella 35 sono stati riportati i dati relativi all’intera lattazione delle bovine con
fenotipo per κ-Cn.
Dalla valutazione statistica dei dati si rileva, in particolar modo all’inizio e durante l’intera
lattazione, un’elevata concentrazione statisticamente significativa (p<0,05) di acido
caprico (C 10:0 ), di acido laurico (C 12:0 ) e di acido miristico (C 14:0 ) e contemporaneamente
una ridotta concentrazione di acido stearico (C 18:0 ) e di acido oleico (C 18:1 ) nel grasso del
latte delle bovine con la variante B rispetto al grasso del latte delle bovine con la variante
omozigote per A. Nella fase finale della lattazione è stata comunque riscontrata una
concentrazione elevata ma non statisticamente significativa di acido caprico (C 10:0 ), di
acido laurico (C 12:0 ) e di acido miristico (C 14:0 ) e contemporaneamente una ridotta
concentrazione di acido stearico (C 18:0 ) nel grasso del latte delle bovine con la variante B
rispetto al grasso del latte delle bovine con la variante omozigote per A.
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 32. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn nell’allevamento n.°1 (Inizio lattazione = circa 60 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
2,25a ± 0,46
1,30a ± 0,13
0,84a ± 0,13
1,89a ± 0,36
2,31a ± 0,47
8,18a ± 1,39
22,85a ± 4,92
1,70a ± 0,68
10,08a ± 2,6
25,55b ± 8,97
2,79a ± 0,68
Fenotipo κ-Cn
AB
2,11a ± 0,58
1,53b ± 0,16
1,06b ± 0,16
2,59b ± 0,69
3,20b ± 1,11
10,06b ± 2,62
22,64a ± 5,84
1,63a ± 0,43
8,67a ± 2,54
19,22a ± 5,39
2,95a ± 0,74
BB
2,15a ± 0,55
1,48b ± 0,13
1,03b ± 0,10
2,55b ± 0,29
3,17b ± 0,46
10,60b ± 2,00
24,57a ± 5,61
1,42a ± 0,37
8,51a ± 2,42
19,43a ± 4,84
3,05a ± 0,81
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
Tabella 33. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn nell’allevamento n.°1 (Metà lattazione = circa 120 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
2,03a ± 0,46
1,50a ± 0,21
1,04a ± 0,20
2,59a ± 0,68
3,17a ± 0,91
10,24a ± 2,51
22,20a ± 3,85
1,70a ± 0,21
8,99a ± 1,55
20,38a ± 3,70
3,02a ± 0,85
Fenotipo κ-Cn
AB
2,04a ± 0,55
1,39a ± 0,21
0,98a ± 0,16
2,56a ± 0,73
3,47a ± 1,43
11,71a ± 2,55
28,73b ± 8,57
1,72a ± 0,54
7,89a ± 2,58
19,01a ± 4,74
2,79a ± 0,61
BB
1,99a ± 0,56
1,47a ± 0,29
1,02a ± 0,20
2,51a ± 0,57
3,15a ± 0,71
10,64a ± 2,18
25,15a,b ± 6,15
1,69a ± 0,42
7,49a ± 2,29
18,25a ± 4,7
2,71a ± 0,72
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
100
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 34. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn nell’allevamento n.°1 (Fine lattazione = circa 180 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,64a ± 0,21
1,29a ± 0,18
0,87a ± 0,13
2,08a ± 0,3
2,54a ± 0,29
8,51a ± 0,91
20,01a ± 2,22
1,77a ± 0,19
6,52a ± 0,41
15,74a ± 2,46
2,20a ± 0,39
Fenotipo κ-Cn
AB
1,86a ± 0,53
1,27a ± 0,18
0,86a ± 0,16
2,17a ± 0,68
2,76a ± 1,00
9,58a ± 2,81
21,39a ± 5,45
1,80a ± 0,38
6,76a ± 1,85
18,24a ± 4,11
2,62a ± 0,56
BB
1,64a ± 0,27
1,30a ± 0,20
0,91a ± 0,12
2,27a ± 0,33
2,90a ± 0,39
9,25a ± 0,96
21,38a ± 2,87
1,83a ± 0,27
5,81a ± 1,35
15,69a ± 3,12
2,31a ± 0,26
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
Tabella 35. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn nell’allevamento n.°1 (Intera lattazione; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
2,07a ± 0,47
1,36a ± 0,19
0,91a ± 0,18
2,15a ± 0,57
2,63a ± 0,72
8,90a ± 1,97
22,14a ± 4,25
1,71a ± 0,49
9,10b ± 2,4
22,14b ± 7,65
2,76a ± 0,74
Fenotipo κ-Cn
AB
2,01a ± 0,56
1,40a ± 0,21
0,97a,b ± 0,17
2,47b ± 0,72
3,20b ± 1,26
10,66b ± 2,78
24,99a ± 7,79
1,71a ± 0,47
7,82a ± 2,48
18,87a ± 4,76
2,80a ± 0,65
BB
2,01a ± 0,54
1,44a ± 0,21
1,01b ± 0,14
2,49b ± 0,4
3,11b ± 0,53
10,36b ± 1,95
24,14a ± 5,47
1,57a ± 0,40
7,71a ± 2,41
18,39a ± 4,68
2,82a ± 0,76
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
101
Capitolo 5 Parte sperimentale
Contemporaneamente i valori medi dei dati relativi alla composizione in acidi grassi dei
campioni di latte analizzati con diverso fenotipo per β-Lg sono stati suddivisi per le tre
fasi principali della lattazione delle bovine (Tab. 36, 37, 38), mentre nella Tabella 39 sono
stati riportati i valori medi dei dati relativi all’intera lattazione delle bovine con fenotipo
per β-Lg. Dalla valutazione statistica è stata riscontrata, in particolar modo nella seconda
fase della lattazione, una concentrazione statisticamente significativa (p<0,05) di acido
caprico (C 10:0 ), di acido laurico (C 12:0 ), di acido miristico (C 14:0 ), di acido palmitico
(C 16:0 ) e palmitoleico (C 16:1 ) e contemporaneamente una ridotta concentrazione di acido
stearico (C 18:0 ) nel grasso del latte delle bovine con la variante B rispetto al grasso del
latte delle bovine con la variante omozigote per A. Se prendiamo in considerazione
l’intera lattazione nell’allevamento n°1 emerge una concentrazione elevata ma non
statisticamente significativa di acido caprico (C 10:0 ), di acido laurico (C 12:0 ) e di acido
miristico (C 14:0 ), di acido palmitico (C 16:0 ) e palmitoleico (C 16:1 ) nel grasso del latte delle
bovine con la variante B rispetto al grasso del latte delle bovine con la variante omozigote
per A.
Tabella 36. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg nell’allevamento n.°1 (Inizio lattazione = circa 60 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
Fenotipo β-Lg
AB
BB
2,18a ± 0,59
1,47a ± 0,17
1,04a ± 0,16
2,61a ± 0,71
3,33a ± 1,16
10,28a ± 2,78
24,54b ± 6,88
1,62a ± 0,48
8,28a ± 2,36
19,09a ± 5,29
2,94a ± 0,72
2,13a ± 0,52
1,44a ± 0,16
0,97a ± 0,15
2,34a ± 0,50
2,88a ± 0,69
9,99a ± 2,27
23,97b ± 5,08
1,59a ± 0,52
9,22a ± 2,6
21,9a ± 7,29
3,02a ± 0,84
2,20a ± 0,56
1,51a ± 0,16
1,03a ± 0,14
2,37a ± 0,47
2,78a ± 0,56
8,79a ± 1,19
19,92a ± 2,68
1,39a ± 0,34
9,03a ± 2,71
19,55a ± 5,84
2,78a ± 0,49
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
102
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 37. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg nell’allevamento n.°1 (Metà lattazione = circa 120 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,82a ± 0,34
1,35a ± 0,27
0,92a ± 0,19
2,27a ± 0,49
2,86a ± 0,55
10,08a ± 2,36
23,75a ± 6,27
1,74a ± 0,26
8,09a ± 1,50
19,49a ± 3,37
2,75a ± 0,45
Fenotipo β-Lg
AB
2,04a,b ± 0,55
1,42a ± 0,22
0,99a,b ± 0,16
2,51a,b ± 0,53
3,16a ± 0,68
10,92a ± 1,97
24,98a ± 5,81
1,52a ± 0,32
8,34a ± 2,73
18,82a ± 5,42
2,75a ± 0,85
BB
2,23b ± 0,61
1,51a ± 0,20
1,08b ± 0,15
2,96b ± 0,95
4,28b ± 2,00
13,18b ± 2,72
34,54b ± 8,56
2,07b ± 0,7
7,02a ± 2,32
19,02a ± 3,9
3,00a ± 0,37
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
Tabella 38. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg nell’allevamento n.°1 (Fine lattazione = circa 180 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
Fenotipo β-Lg
AB
BB
1,78a ± 0,50
1,28a ± 0,17
0,90a ± 0,14
2,34b ± 0,61
3,07b ± 1,00
10,03a ± 3,1
22,27a ± 7,28
1,84a,b ± 0,37
5,83a ± 1,37
16,55a ± 4,3
2,58a ± 0,56
1,79a ± 0,49
1,29a ± 0,17
0,88a ± 0,15
2,24a,b ± 0,56
2,81a,b ± 0,70
9,49a ± 1,79
21,10a ± 2,34
1,69a ± 0,24
6,81a ± 1,56
16,72a ± 3,10
2,34a ± 0,41
1,74a ± 0,30
1,25a ± 0,22
0,81a ± 0,15
1,79a ± 0,36
2,19a ± 0,47
7,99a ± 1,44
19,78a ± 3,13
2,03b ± 0,36
6,76a ± 2,06
19,77a ± 4,19
2,70a ± 0,59
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
S.elenia Melia Tesi di dottorato
”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
103
Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 39. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg nell’allevamento n.°1 (Intera lattazione; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,96a ± 0,52
1,38a ± 0,22
0,97a ± 0,17
2,43a ± 0,63
3,11a ± 0,96
10,15a ± 2,69
23,72a ± 6,72
1,71a,b ± 0,4
7,62a ± 2,12
18,60a ± 4,57
2,79a ± 0,61
Fenotipo β-Lg
AB
2,02a ± 0,53
1,40a ± 0,19
0,96a ± 0,16
2,38a ± 0,53
2,97a ± 0,70
10,23a ± 2,12
23,73a ± 5,11
1,59a ± 0,40
8,37a ± 2,61
19,64a ± 6,21
2,77a ± 0,81
BB
2,11a ± 0,57
1,45a ± 0,22
1,00a ± 0,18
2,50a ± 0,84
3,31a ± 1,63
10,54a ± 3,11
26,31a ± 9,48
1,83b ± 0,61
7,65a ± 2,56
19,37a ± 4,60
2,86a ± 0,47
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
Anche nell’allevamento n° 2 i valori medi dei dati relativi alla composizione in acidi
grassi dei campioni di latte analizzati con diverso fenotipo per κ-Cn sono stati suddivisi
per le tre fasi principali della lattazione delle bovine (Tab. 40, 41, 42), mentre nella
Tabella 43 sono stati riportati i valori medi dei dati relativi all’intera lattazione delle
bovine con fenotipo per κ-Cn.
Nello specifico, alla fine della lattazione è stata osservata un’elevata concentrazione
statisticamente significativa (p<0,05) di acido caprico (C 10:0 ), di acido laurico (C 12:0 ) e di
acido miristico (C 14:0 ) nel grasso del latte delle bovine con la variante B rispetto al grasso
del latte delle bovine con la variante omozigote per A.
Nell’intero arco della lattazione è emersa comunque una concentrazione elevata ma non
statisticamente significativa di acido caprico (C 10:0 ), di acido laurico (C 12:0 ) e di acido
miristico (C 14:0 ) di acido palmitico (C 16:0 ) e palmitoleico (C 16:1 ) nel grasso del latte delle
bovine con la variante B rispetto al grasso del latte delle bovine con la variante omozigote
per A.
104
Selenia Melia Tesi di dottorato
”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 40. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn nell’allevamento n.°2 (Inizio lattazione = circa 60 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
2,13a ± 0,18
1,60a ± 0,18
1,14a ± 0,11
2,66a ± 0,28
3,09a ± 0,31
9,87a ± 1,01
20,07a ± 2,19
1,57a ± 0,46
7,18a ± 0,56
15,45a ± 3,01
2,51a ± 0,25
Fenotipo κ-Cn
AB
2,33a ± 0,43
1,55a ± 0,27
1,13a ± 0,22
2,78a ± 0,74
3,25a ± 0,96
9,91a ± 2,50
20,46a ± 4,04
1,34a ± 0,32
8,13a ± 3,17
15,64a ± 4,39
2,63a ± 0,89
BB
2,14a ± 0,31
1,46a ± 0,18
1,07a ± 0,18
2,70a ± 0,68
3,17a ± 0,88
9,60a ± 2,44
19,20a ± 2,27
1,64a ± 0,39
6,71a ± 1,25
15,58a ± 3,34
2,23a ± 0,32
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
Tabella 41. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn nell’allevamento n.°2 (Metà lattazione = circa 120 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,95a ± 0,23
1,46a ± 0,23
1,14a ± 0,18
2,90a ± 0,46
3,50a ± 0,43
10,83a ± 1,11
19,60a ± 1,73
1,20a ± 0,30
4,84a ± 0,50
12,08a ± 1,98
1,63a ± 0,57
Fenotipo κ-Cn
AB
2,01a ± 0,41
1,37a ± 0,11
1,01a ± 0,12
2,58a ± 0,47
3,10a ± 0,55
9,67a ± 1,36
19,62a ± 2,01
1,25a ± 0,39
6,00b ± 1,24
13,19a ± 2,81
2,22b ± 0,62
BB
1,93a ± 0,44
1,40a ± 0,25
1,04a ± 0,23
2,78a ± 0,73
3,43a ± 0,94
10,49a ± 2,06
20,54a ± 2,76
1,46a ± 0,46
5,90b ± 1,08
14,20a ± 3,66
2,13b ± 0,52
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
105
Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 42. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn nell’allevamento n.°2 (Fine lattazione = circa 180 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,67a ± 0,20
1,22a ± 0,17
0,79a ± 0,14
1,78a ± 0,38
2,18a ± 0,46
7,92a ± 1,18
19,05a ± 2,47
1,81a ± 0,16
5,86a ± 0,41
16,85b ± 1,04
2,25a ± 0,60
Fenotipo κ-Cn
AB
1,91a ± 0,32
1,40b ± 0,140
1,01b ± 0,16
2,49b ± 0,50
3,03b ± 0,62
9,70b ± 1,62
20,14a ± 2,77
1,49a ± 0,38
5,34a ± 0,83
14,32a ± 2,70
2,26a ± 0,49
BB
1,89a ± 0,37
1,33a,b ± 0,18
0,98b ± 0,14
2,53b ± 0,49
3,18b ± 0,70
10,40b ± 1,60
21,21a ± 2,05
1,76a ± 0,40
6,15a ± 1,25
16,41a,b ± 2,57
2,26a ± 0,46
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
Tabella 43. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per κ-Cn nell’allevamento n.°2 (Intera lattazione; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,92a ± 0,27
1,43a ± 0,25
1,04a ± 0,22
2,51a ± 0,61
3,00a ± 0,68
9,72a ± 1,62
19,58a ± 2,02
1,48a,b ± 0,41
5,80a ± 1,10
14,4a ± 2,94
2,06a ± 0,62
Fenotipo κ-Cn
AB
2,08a ± 0,42
1,44a ± 0,20
1,05a ± 0,17
2,61a ± 0,58
3,12a ± 0,72
9,75a ± 1,84
20,05a ± 2,98
1,36a ± 0,38
6,43a ± 2,26
14,31a ± 3,45
2,36a ± 0,69
BB
1,98a ± 0,39
1,40a ± 0,21
1,03a ± 0,19
2,67a ± 0,64
3,27a ± 0,85
10,19a ± 2,06
20,35a ± 2,50
1,61b ± 0,43
6,23a ± 1,22
15,34a ± 3,33
2,20a ± 0,45
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
106
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
I valori medi dei dati relativi alla composizione in acidi grassi dei campioni di latte
analizzati con diverso fenotipo per β-Lg sono stati suddivisi per le tre fasi principali della
lattazione delle bovine (Tab. 44, 45, 46), mentre nella Tabella 47 sono stati riportati i
valori medi dei dati relativi all’intera lattazione delle bovine con fenotipo per β-Lg. Dalla
valutazione statistica è stata riscontrata per tutte le fasi della lattazione, una
concentrazione elevata ma non statisticamente significativa di acido caprico (C 10:0 ), di
acido laurico (C 12:0 ) e di acido miristico (C 14:0 )
e contemporaneamente una ridotta
concentrazione di acido stearico (C 18:0 ) nel grasso del latte delle bovine con la variante B
rispetto al grasso del latte delle bovine con la variante omozigote per A.
Tabella 44. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg nell’allevamento n.°2 (Inizio lattazione = circa 60 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
2,13a ± 0,27
1,44a ± 0,27
1,05a ± 0,22
2,56a ± 0,71
2,98a ± 0,91
9,26a ± 2,48
19,53a ± 2,05
1,49a ± 0,39
7,02a ± 1,18
15,13a ± 3,70
2,22a ± 0,56
Fenotipo β-Lg
AB
2,50b ± 0,51
1,68b ± 0,20
1,21b ± 0,12
2,97a ± 0,46
3,49a ± 0,60
11,00a ± 1,94
23,31b ± 4,55
1,42a ± 0,42
9,80b ± 4,14
17,8a ± 4,92
3,03b ± 0,87
BB
2,22a,b ± 0,34
1,53a,b ± 0,11
1,14a,b ± 0,16
2,87a ± 0,69
3,35a ± 0,92
9,72a ± 2,12
17,95a ± 1,49
1,52a ± 0,38
6,44a ± 0,67
14,64a ± 2,29
2,44a ± 0,46
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
S.elenia Melia Tesi di dottorato
”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
107
Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 45. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg nell’allevamento n.°2 (Metà lattazione = circa 120 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,93a ± 0,36
1,42a ± 0,18
1,04a ± 0,17
2,58a ± 0,50
3,09a ± 0,57
9,76a ± 1,40
20,31a ± 2,52
1,35a ± 0,49
6,34b ± 1,37
14,55b ± 3,69
2,25a ± 0,76
Fenotipo β-Lg
AB
2,05a ± 0,44
1,42a ± 0,19
1,08a ± 0,21
2,77a ± 0,73
3,40a ± 1,00
10,45a ± 2,27
20,53a ± 2,10
1,42a ± 0,19
5,52a ± 0,84
13,45a,b ± 1,86
2,09a ± 0,53
BB
1,96a ± 0,40
1,35a ± 0,20
1,02a ± 0,17
2,78a ± 0,54
3,40a ± 0,60
10,32a ± 1,40
19,09a ± 1,99
1,20a ± 0,44
5,38a ± 0,85
12,02a ± 2,62
1,94a ± 0,37
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
Tabella 46. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg nell’allevamento n.°2 (Fine lattazione = circa 180 giorni
dopo il parto; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,85a ± 0,33
1,34a ± 0,12
0,95a ± 0,13
2,35a ± 0,43
2,95a,b ± 0,6
9,85a,b ± 1,61
20,85a ± 2,63
1,66a ± 0,43
5,84a ± 1,19
16,45a ± 2,65
2,38a ± 0,58
Fenotipo β-Lg
AB
1,88a ± 0,29
1,39a ± 0,22
0,96a ± 0,21
2,30a ± 0,58
2,73a ± 0,65
8,85a ± 1,35
19,60a ± 2,59
1,61a ± 0,42
5,49a ± 0,89
14,48a ± 2,73
2,14a ± 0,49
BB
1,92a ± 0,38
1,35a ± 0,17
1,00a ± 0,16
2,66a ± 0,56
3,30b ± 0,78
10,47b ± 1,84
20,53a ± 2,35
1,59a ± 0,32
5,69a ± 0,94
14,64a ± 2,43
2,20a ± 0,28
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
108
Selenia Melia Tesi di dottorato
”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 47. Composizione in acidi grassi del latte delle bovine di razza Reggiana con
differenti fenotipi per β-Lg nell’allevamento n.°2 (Intera lattazione; valori medi ± D.S.).
Composizione in acidi
grassi (peso % degli
acidi grassi totali)
C 4: 0
C 6: 0
C 8: 0
C 10: 0
C 12: 0
C 14: 0
C 16: 0
C 16:1
C 18: 0
C 18:1
C 18:2
ab
AA
1,97a ± 0,34
1,40a ± 0,20
1,01a ± 0,18
2,50a ± 0,57
3,01a ± 0,71
9,62a ± 1,89
20,22a,b ± 2,44
1,50a ± 0,45
6,41a,b ± 1,33
15,35b ± 3,45
2,28a ± 0,64
Fenotipo β-Lg
AB
2,11a ± 0,48
1,48a ± 0,24
1,07a ± 0,21
2,66a ± 0,66
3,20a,b ± 0,85
10,05a ± 2,07
20,98b ± 3,37
1,49a ± 0,35
6,68b ± 2,94
14,99a,b ± 3,62
2,36a ± 0,74
BB
2,02a ± 0,39
1,40a ± 0,19
1,05a ± 0,17
2,77a ± 0,59
3,35b ± 0,74
10,2a ± 1,76
19,23a ± 2,20
1,41a ± 0,42
5,77a ± 0,93
13,57a ± 2,75
2,16a ± 0,42
Lettere differenti indicano una differenza significativa a p<0,05
Concludendo, dall’osservazione dei dati relativi alla composizione in acidi grassi del latte
è stato possibile notare la variazione del contenuto degli acidi grassi durante l’intero arco
della lattazione in entrambi gli allevamenti, considerando soprattutto l’andamento di
alcuni acidi grassi, in particolar modo quelli sintetizzati a livello della ghiandola
mammaria. In generale nei due allevamenti è stata infatti osservata una elevata
concentrazione di acido caprico, laurico e miristico e contemporaneamente una ridotta
concentrazione di acido stearico nel grasso del latte delle bovine con la variante B rispetto
al grasso del latte delle bovine con la variante omozigote per A. Nonostante ciò, degne di
rilievo, appaiono le sensibili differenze all’interno dei due allevamenti, in particolar modo
per quanto riguarda i valori medi dei dati relativi al contenuto degli stessi acidi grassi
citati,
che
risultano
maggiormente
significativi
nell’allevamento
n°1
rispetto
all’allevamento n°2.
S.elenia Melia Tesi di dottorato
”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
109
Capitolo 5 Parte sperimentale
5.4.4 Analisi della distribuzione della dimensione dei globuli di grasso nel latte di
razza Frisona e Reggiana.
I dati riguardanti le osservazioni della distribuzione della dimensione dei globuli di grasso
complessivamente raccolti nel corso della seconda parte di questa ricerca sono riportati
nelle Figure 17 – 20 e nella Tabella 48.
Nelle Figure 17 e 19 sono stati riportati i valori medi dei dati relativi alla distribuzione
della dimensione dei globuli di grasso nel latte di massa di razza Frisona e Reggiana,
analizzati inizialmente nel corso di questo studio. Le Figure 18 e 20 rappresentano alcuni
esempi di immagini ottenuti in microscopia in fluorescenza dei globuli di grasso
rispettivamente nel latte di razza Reggiana e di razza Frisona.
Come è possibile notare nel latte di razza Reggiana la media della distribuzione della
dimensione dei globuli di grasso è di 3,06 μm (D.S. ± 0,89), mentre nel latte di razza
Frisona la media della distribuzione della dimensione dei globuli di grasso è di 2,98 μm
(D.S. ± 0,85). Nella prima fase di questo studio, pertanto, nelle condizioni analizzate non
sono state riscontrate delle differenze significative tra la distribuzione della dimensione
dei globuli di grasso nel latte di massa di razza Reggiana e quella di razza Frisona. I
risultati ottenuti suggeriscono infatti che, la distribuzione della dimensione dei globuli di
grasso è molto simile nel latte delle due razze.
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
p<0,05
Figura 17. Distribuzione della dimensione dei globuli di grasso (μm) nel latte di massa di
razza Reggiana.
Figura 18. Esempi di immagini dei globuli di grasso nel latte di razza Reggiana.
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Capitolo 5 Parte sperimentale
p<0,00001
Figura 19. Distribuzione della dimensione dei globuli di grasso (μm) nel latte di massa di
razza Frisona.
Figura 20. Esempi di immagini dei globuli di grasso nel latte di razza Frisona.
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Selenia Melia Tesi di dottorato
”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
Successivamente è stato analizzato il latte individuale di 12 bovine di razza Reggiana con
differente fenotipo per κ-Cn, allo scopo di valutare se il polimorfismo genetico delle
proteine potesse anche influenzare la dimensione dei globuli di grasso nel latte e di
conseguenza alcune caratteristiche chimico-fisiche ed organolettiche dei prodotti lattierocaseari.
Nel precedente studio, infatti, è stata rilevata un’associazione tra il polimorfismo genetico
e la composizione in acidi grassi nel latte di razza Reggiana, quest’ultima apparentemente
influenzata dai fenotipi per κ-Cn. Pertanto in questa prova sperimentale è stata valutata la
possibilità di riscontrare anche un’ associazione tra il fenotipo per κ-Cn e la dimensione dei
globuli di grasso nel latte di razza Reggiana.
Nella Tabella 48 ritroviamo i valori medi dei dati relativi ad alcune componenti della
composizione macroscopica del latte delle bovine di razza Reggiana con differente
fenotipo per κ-Cn, agli indici chimico-fisici e al contenuto in cellule somatiche registrati
nell’arco di questa fase sperimentale, ma dalla valutazione dei risultati di queste analisi
non sono state riscontrate delle differenze sostanziali all’interno dei diversi fenotipi per
κ-Cn.
Inoltre in via preliminare, anche per quanto riguarda lo studio della distribuzione della
dimensione dei globuli di grasso nel latte di razza Reggiana con fenotipo per κ-Cn, dalle
prime osservazioni effettuate non sono state evidenziate delle differenze significative tra i
diversi fenotipi per κ-Cn.
Una spiegazione logica potrebbe esser data dal fatto che secondo alcuni studiosi, le
diverse dimensioni dei globuli di grasso sono influenzate dai fattori nutrizionali e
fisiologici delle bovine, mentre i fattori genetici ed ambientali hanno un effetto limitato
sulla variabilità della dimensione dei globuli di grasso [Cecchi et al., 2005].
Saranno necessari, pertanto, ulteriori studi per raggiungere una definitiva conclusione e
per studiare, nello specifico, l’associazione tra la distribuzione della dimensione dei
globuli di grasso e i diversi fenotipi per κ-Cn nel corso di una intera lattazione per ogni
singola bovina, in modo
da confermare o meno l’ipotesi di una associazione tra il
polimorfismo genetico delle proteine e la variabilità della dimensione dei globuli di grasso
e per valutare se il fattore genetico possa influire anche sulla dimensione dei globuli di
grasso.
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”Studi ed approfondimenti sulla composizione in acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana
con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
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Capitolo 5 Parte sperimentale
Tabella 48. Caratteristiche chimico-fisiche e conteggio delle cellule somatiche del latte
delle bovine di razza Reggiana con differenti fenotipi per κ-Cn (valori medi, n = 12
campioni).
Fenotipo κ-Cn
AA
AB
BB
Latte (Kg d-1)
20,26
19,50
19,00
pH
6,75
6,71
6,64
Proteine g 100g-1
3,53
3,66
3,76
Grasso g 100g-1
3,68
3,70
3,73
Lattosio g 100g-1
4,88
4,96
4,73
285
63
220
Conteggio cellule
somatiche 103 mL-1
AA = 4 bovine; AB = 4 bovine; BB = 4 bovine
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con diverso fenotipo per κ-caseina e β-lattoglobulina”
Capitolo 5 Parte sperimentale
5.5.
CONCLUSIONI
Nell’ambito di questa ricerca è stata studiata la frazione lipidica del latte, con particolare
riferimento all’associazione tra il polimorfismo genetico proteico e la composizione in
acidi grassi del latte bovino di razza Reggiana con differenti fenotipi per κ-Cn e β-Lg. In
particolare, i risultati ottenuti in questo studio potrebbero indicare profili significativi della
composizione degli acidi grassi nel grasso del latte delle bovine con κ-casein BB e
β-lattoglobulina BB. Infatti, dalle prime osservazioni ottenute, è stato possibile riscontrare
delle differenze statisticamente significative per quanto riguarda la concentrazione di
alcuni acidi grassi sintetizzati de novo nel grasso del latte delle bovine con differenti
fenotipi per κ-Cn e per β-Lg. Tali differenze possono pertanto suggerire ai ricercatori
impegnati nel campo della selezione genetica, di poter migliorare la struttura e le proprietà
sensoriali e fisico-chimiche di molti prodotti lattiero-caseari, attraverso la selezione della
variante B, in particolar modo della κ-Cn, già considerata di rilevante importanza nel
settore delle produzioni e delle trasformazioni casearie, in quanto le maggiori
concentrazioni dall’acido laurico all’acido palmitico nel grasso del latte sono associate
con una maggiore struttura e un miglior gusto rispettivamente del burro e del formaggio.
Nel corso di questo studio, inoltre, è stata osservata la distribuzione della dimensione dei
globuli di grasso nel latte bovino di razza Reggiana e Frisona e nel latte individuale di sola
razza Reggiana con differente fenotipo per κ-Cn. Tuttavia dalle prime osservazioni
effettuate non sono state riscontrate delle differenze significative tra il latte di massa di
razza Reggiana e quello di razza Frisona e nel latte di razza Reggiana con differenti
fenotipi per κ-Cn. Infatti secondo alcuni studiosi, la variabilità delle dimensioni dei
globuli di grasso nel latte è influenzata dai fattori nutrizionali e fisiologici delle bovine
piuttosto che dai fattori genetici e ambientali. Pertanto ulteriori studi saranno necessari per
stabilire se è possibile considerare una associazione tra il polimorfismo genetico delle
proteine e la variabilità della dimensione dei globuli di grasso, soprattutto in quanto
quest’ultima ha assunto negli ultimi anni una notevole importanza determinata
dall’ associazione tra la dimensione dei globuli di grasso e la composizione in acidi grassi
del latte, che di conseguenza è associata alle caratteristiche tecnologiche e sensoriali dei
prodotti lattiero-caseari.
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Ringraziamenti
RINGRAZIAMENTI
Si ringrazia l’APA (Associazione Provinciale Allevatori), in particolare il dott. Clinio
Villa per la sua disponibilità, l’Università degli Studi di Bologna (sede di Cesena) per la
collaborazione nel corso di questo studio e il Dott. Gianotti A. (Università degli Studi di
Bologna) per il suo contributo nella seconda parte di questa ricerca.
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