Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften

Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften
Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Beziehungen zwischen Eutergesundheit und Funktionalität von
aus Blut und Milch isolierten Leukozyten des Rindes unter besonderer
Berücksichtigung der Chemilumineszenz
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Roswitha Merle
aus Fürth
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. Dr. Jörn Hamann
1. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. Dr. Jörn Hamann
2. Gutachter:
Apl. Prof. Dr. Martin Kaske
Tag der mündlichen Prüfung:
26. November 2003
Diese Arbeit wurde durch Mittel der Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
gefördert.
Meinen Eltern und meinem Sohn
in Liebe gewidmet
Roswitha Merle:
Beziehungen zwischen Eutergesundheit und Funktionalität von
aus Blut und Milch isolierten Leukozyten des Rindes unter
besonderer Berücksichtigung der Chemilumineszenz
I n h a l t s ve r z e i c h n i s
1.
Einleitung .................................. 1
2.
Literaturübersicht ...................... 3
2.1
Mastitis – Ursachen und Diagnostik ................ 3
2.1.1
Ursachen und Einteilung .............................................................. 3
2.1.2
Verfahren zum Entzündungsnachweis ........................................ 4
2.1.2.1
Anzahl somatischer Zellen ...............................................................4
2.1.2.2
Elektrische Leitfähigkeit ................................................................... 5
2.1.2.3
N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase (NAGase) ………………………….. 6
2.2
Somatische Zellen in der Milch ....................... 7
2.2.1
Zellarten .......................................................................................... 7
2.2.2
Zelldifferentialbild .......................................................................... 8
2.2.3
Zelluläre Abwehr ............................................................................ 9
2.2.3.1
Allgemeines ..................................................................................... 9
2.2.3.2
Rekrutierung von Leukozyten aus dem Blut .................................... 9
2.2.3.3
Opsonine ......................................................................................... 10
2.2.3.4
Makrophagen ................................................................................... 11
2.2.3.5
PMN ................................................................................................. 11
2.2.3.6
Lymphozyten ....................................................................................12
Inhaltsverzeichnis
2.3
Funktionelle Eigenschaften der PMN .............. 13
2.3.1
Phagozytose ...................................................................................13
2.3.1.1
Erkennung ........................................................................................13
2.3.1.2
Ingestion .......................................................................................... 13
2.3.1.3
Reifestadien, die zur Phagozytose befähigt sind ............................. 14
2.3.2
Respiratory Burst .......................................................................... 14
2.3.2.1
NADPH-Oxidase .............................................................................. 16
2.3.2.2
Superoxid-Dismutase (SOD) …………………………………………. 17
2.3.2.3
Myeloperoxidase (MPO) ................................................................. 17
2.4
Labordiagnostische Methoden ........................ 18
2.4.1
Klinische Labordiagnostik aus Blutproben ................................ 18
2.4.2
Methoden zur Zellisolation aus Blut und Milch .......................... 19
2.4.2.1
Isolierung von PMN aus Vollblut ...................................................... 19
2.4.2.2
Isolierung somatischer Zellen aus Milch ......................................... 23
2.4.3
Labordiagnostische Methoden zur Messung der
Phagozytoseaktivität ................................................................... 27
2.4.3.1
Szintillationsspektrometrie ............................................................... 27
2.4.3.2
Kultivierung ...................................................................................... 28
2.4.3.3
Durchflusszytometrie ....................................................................... 28
2.4.4
Labordiagnostische Methoden zur Messung der freien
Sauerstoffradikale ......................................................................... 32
2.4.4.1
Nitroblau-Tetrazolium-Reduktionstest ............................................. 32
2.4.4.2
ROS-Bildung .................................................................................... 33
2.4.4.3
2.4.4.3.1
2.4.4.3.1.1
2.4.4.3.1.2
2.4.4.3.2
2.4.4.3.2.1
2.4.4.3.2.2
Chemilumineszenz (CL) ................................................................. 33
Reagenzien ......................................................................................33
Lumineszierende Stoffe ................................................................... 33
Aktivatoren ....................................................................................... 34
Geräte .............................................................................................. 35
Szintillationsspektrometer ................................................................ 35
Luminometer .................................................................................... 36
Inhaltsverzeichnis
2.4.4.3.3
2.4.4.3.3.1
2.4.4.3.3.2
2.4.4.3.3.3
Einflussfaktoren auf die CL-Messung .............................................. 37
Vitalität ............................................................................................. 37
Makrophagen ................................................................................... 38
Eosinophile Granulozyten ................................................................ 38
2.5
Vergleich der Zellfunktionalität boviner
Abwehrzellen aus Blut und Milch ................... 38
2.5.1
Unterschiede in der Funktionalität zwischen PMN aus Blut
und Milch ....................................................................................... 38
2.5.2
Varianzen in der Zellaktivität von PMN aus Milch ...................... 39
2.5.3
Zellfunktionalität in der Frühlaktation von PMN aus Blut
und Milch ....................................................................................... 40
2.5.4
Einfluss des Stoffwechsels auf die Funktionalität von
Zellen aus Blut und Milch ............................................................. 41
2.5.5
Zellfunktionalität von PMN aus Blut und Milch im
Zusammenhang mit Mastitiden .................................................... 41
2.5.6
Einfluss verschiedener Antibiotika auf die Zellfunktionalität
von PMN aus Blut und Milch ........................................................ 43
2.5.7
Immunologische Ansatzpunkte zur Prävention von
Mastitiden ....................................................................................... 43
2.6
Zielsetzung der eigenen Untersuchungen
anhand des aktuellen Forschungsstandes ...... 45
3.
Material und Methoden ............... 47
3.1
Versuchstiere ................................................. 47
3.1.1
Versuchstiere für die methodischen Versuche .......................... 47
3.1.2
Betrieb 1 ......................................................................................... 47
3.1.3
Betrieb 2 ......................................................................................... 48
Inhaltsverzeichnis
3.2
Probenahme .................................................... 48
3.2.1
Blut .................................................................................................. 48
3.2.2
Milch ................................................................................................49
3.2.2.1
Vorgemelk ........................................................................................49
3.2.2.2
Viertelanfangsgemelk (VAG) ........................................................... 49
3.2.2.3
Viertelhandgemelk (VGH) ................................................................ 50
3.3
Allgemeine Probenanalyse .............................. 51
3.3.1
Geräte ............................................................................................. 51
3.3.2
Glas- und Einmalartikel ................................................................ 52
3.3.3
Reagenzien ..................................................................................... 53
3.3.4
Medien, Puffer und Lösungen ...................................................... 54
3.3.4.1
Ethanol für die Desinfektion ............................................................. 54
3.3.4.2
Fixationslösung zur Zellzahlbestimmung aus Milch .........................54
3.3.4.3
Färbelösungen für mikroskopische Untersuchungen ...................... 54
3.3.5
Blut .................................................................................................. 54
3.3.5.1
Leukozytenzahl (WBC) .................................................................... 53
3.3.5.2
3.3.5.2.1
3.3.5.2.2
Mikroskopische Zelldifferenzierung ................................................. 54
Herstellen und Färben eines Ausstriches ........................................ 54
Differenzieren des Ausstriches ........................................................ 55
3.3.6
Milch ................................................................................................55
3.3.6.1
Bakteriologie .................................................................................... 55
3.3.6.2
Zellzahlbestimmung ........................................................................ 55
3.3.6.3
NAGase ........................................................................................... 56
Inhaltsverzeichnis
3.4
Zellisolierung und mikroskopische
Zelldifferenzierung der Zellsuspensionen ....... 56
3.4.1
Geräte ............................................................................................. 56
3.4.2
Glas- und Einmalartikel ................................................................. 58
3.4.3
Reagenzien ..................................................................................... 58
3.4.4
Puffer und Lösungen .....................................................................58
3.4.4.1
Phophatgepufferte Kochsalzlösung ................................................. 58
3.4.4.2
Nährlösung ...................................................................................... 59
3.4.5
Blut .................................................................................................. 59
3.4.5.1
3.4.5.1.1
3.4.5.1.2
3.4.5.1.3
Zellisolierung ....................................................................................59
Entfernen von Plasma und Buffy Coat .............................................59
Lyse der Erythrozyten ...................................................................... 60
Waschen der PMN ...........................................................................60
3.4.5.2
Mikroskopische Differenzierung der Blutzellsuspension ................. 61
3.4.5.3
Bestimmung der Zellkonzentration .................................................. 61
3.4.5.4
Bakteriologie .................................................................................... 61
3.4.6
Milch ................................................................................................62
3.4.6.1
3.4.6.1.1
3.4.6.1.2
Zellisolierung ....................................................................................62
Gewinnung des Milchsediments ...................................................... 62
Waschen der Zellen ......................................................................... 62
3.4.6.2
3.4.6.2.1
3.4.6.2.2
Mikroskopische Zelldifferenzierung der Milchzellsuspension .......... 63
Herstellen eines Ausstriches ........................................................... 63
Differenzieren des Ausstriches ........................................................ 63
3.4.6.3
Bestimmung der Zellkonzentration .................................................. 63
3.5
Vitalitätsbestimmung aus Blut- und
Milchzellen ..................................................... 64
3.5.1
Geräte ............................................................................................. 64
3.5.2
Glas- und Einmalartikel ................................................................. 64
3.5.3
Reagenzien ..................................................................................... 64
Inhaltsverzeichnis
3.5.4
Lösungen für die Durchflusszytometrie ...................................... 64
3.5.4.1
Sheath fluid ...................................................................................... 64
3.5.4.2
Propidiumjodidlösung ...................................................................... 65
3.5.5
Funktionsweise des Durchflusszytometers ................................ 65
3.5.6
Prinzip ............................................................................................. 66
3.5.7
Durchführung ................................................................................. 66
3.5.8
Auswertung .................................................................................... 66
3.6
Phagozytoseaktivität aus Blut- und
Milchzellen ..................................................... 68
3.6.1
Geräte ............................................................................................. 68
3.6.2
Glas- und Einmalartikel ................................................................. 68
3.6.3
Reagenzien ..................................................................................... 68
3.6.4
Medien ............................................................................................ 69
3.6.4.1
Gepooltes Rinderblutserum ............................................................. 69
3.6.4.2
3.6.4.2.1
3.6.4.2.2
Bakteriensuspension ....................................................................... 69
Stammlösung ................................................................................... 69
Arbeitslösung ................................................................................... 70
3.6.4.3
Lösungen für die Durchflusszytometrie ........................................... 70
3.6.5
Prinzip ............................................................................................. 70
3.6.6
Durchführung ................................................................................. 70
3.6.7
Auswertung .................................................................................... 71
3.7
Chemilumineszenz aus Blut- und Milchzellen
3.7.1
Geräte ............................................................................................. 74
3.7.2
Glas- und Einmalartikel ................................................................. 74
3.7.3
Reagenzien .................................................................................... 75
..
74
Inhaltsverzeichnis
3.7.4
Puffer und Lösungen .................................................................... 75
3.7.4.1
3.7.4.1.1
3.7.4.1.2
Luminollösung ..................................................................................75
Stammlösung ................................................................................... 75
Arbeitslösung ................................................................................... 75
3.7.4.2
3.7.4.2.1
3.7.4.2.2
PMA-Lösung .................................................................................... 76
Stammlösung ................................................................................... 76
Arbeitslösung ................................................................................... 76
3.7.4.3
Reaktionslösung .............................................................................. 76
3.7.5
Funktionsweise des Luminometers ............................................. 76
3.7.6
Prinzip ............................................................................................. 77
3.7.7
Durchführung ................................................................................. 77
3.7.8
Auswertung .................................................................................... 78
3.8
Statistische Auswertungen ............................. 80
3.9
Versuche ........................................................ 81
3.9.1
Methodische Versuche zur Phagozytoseaktivität in Blut .......... 81
3.9.1.1
Inkubationszeit ................................................................................. 81
3.9.1.2
Zellkonzentration ............................................................................ 81
3.9.1.3
Bakterienkonzentration ................................................................... 82
3.9.2
Methodische Versuche zur CL-Aktivität in Blut ......................... 82
3.9.2.1
Zellisolierung bei verschiedenen Temperaturen .............................. 82
3.9.2.2
Inkubation bei verschiedenen Temperaturen................................... 83
3.9.2.3
Lagerungsdauer der Proben ............................................................ 83
3.9.2.4
Zellkonzentration ............................................................................. 83
3.9.2.5
PMA-Konzentration ......................................................................... 84
3.9.2.6
pH-Wert ........................................................................................... 85
3.9.2.7
Messung der CL-Aktivität aus Vollblut, lysiertem Blut und
aufbereiteter Zellsuspension ........................................................... 86
3.9.2.8
Wiederholbarkeit innerhalb eines Tages ......................................... 86
Inhaltsverzeichnis
3.9.3
Versuch 1: Einfluss der Zahl der erkrankten Euterviertel
pro Kuh auf die Zellfunktionalität von PMN aus Milch
und Blut .......................................................................................... 87
3.9.3.1
Tier- und Probenmaterial ................................................................. 87
3.9.3.2
Datengruppierung und statistische Auswertung .............................. 89
3.9.4
Versuch 2: Verlaufsuntersuchung ............................................... 90
3.9.4.1
Tier- und Probenmaterial ................................................................. 90
3.9.4.2
Datengruppierung und statistische Auswertung .............................. 90
3.9.5
Versuch 3: Beurteilung der Eutergesundheit anhand von
Kriterien der Zellfunktionalität auf Tierebene ............................. 91
3.9.5.1
Tier- und Probenmaterial ................................................................. 91
3.9.5.2
Datengruppierung und statistische Auswertung .............................. 94
3.9.6
Gesamtdatenbank: Beurteilung der Eutergesundheit
anhand von Kriterien der Zellfunktionalität auf Viertelebene ... 96
3.9.6.1
Datenmaterial .................................................................................. 96
3.9.6.2
Datengruppierung und statistische Auswertung .............................. 96
4.
Ergebnisse ................................ 98
4.1
Methodische Versuche zur Phagozytoseaktivität in Blut .............................................. 98
4.1.1
Inkubationszeit ............................................................................. 99
4.1.2
Konzentration der Zellen .............................................................. 99
4.1.3
Konzentration der Bakterien ........................................................ 100
4.2
Methodische Versuche zur CL-Aktivität
in Blut ........................................................... 102
4.2.1
Zellisolierung bei verschiedenen Temperaturen ........................ 102
4.2.2
Inkubation bei verschiedenen Temperaturen ............................. 103
4.2.3
Lagerungsdauer der Proben .........................................................104
Inhaltsverzeichnis
4.2.4
Zellkonzentration ........................................................................... 106
4.2.5
PMA-Konzentration ....................................................................... 107
4.2.6
pH-Wert .......................................................................................... 109
4.2.7
Messung der CL-Aktivität aus Vollblut, lysiertem Blut und
aufbereiteter Zellsuspension ....................................................... 110
4.2.8
Wiederholbarkeit innerhalb eines Tages .................................... 110
4.3
Versuch 1: Einfluss der Zahl der erkrankten
Euterviertel pro Kuh auf die Zellfunktionalität
von PMN aus Milch und Blut ........................... 112
4.3.1
Gruppen auf Basis der Zellzahl im VAG ….................................. 112
4.3.2
Blutproben ..................................................................................... 113
4.3.2.1
4.3.2.1.1
4.3.2.1.2
Korrelationen.................................................................................... 113
Vollblutuntersuchungen ................................................................... 113
Zellfunktionalität in Blut .................................................................... 114
4.3.2.2
Gruppenvergleich............................................................................. 114
Gliederung s. Abschnitt 4.3.3.1
4.3.3
Milchproben ................................................................................... 117
4.3.3.1
4.3.3.1.1
4.3.3.1.2
4.3.3.1.3
Korrelationen.................................................................................... 117
Eutergesundheit ...............................................................................117
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................118
Zellfunktionalität in Milch ..................................................................118
4.3.3.2
Gruppenvergleich............................................................................. 119
Gliederung s. Abschnitt 4.3.4.1
4.4
Versuch 2: Verlaufsuntersuchung ................... 123
4.4.1
Eutergesunde Tiere ....................................................................... 123
4.4.1.1
Zellzahl im VAG ............................................................................... 123
4.4.1.2
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................124
4.4.1.3
Zellfunktionalität in Blut und Milch ................................................... 124
4.4.2
Tiere mit unspezifischer Mastitis oder Mastitis .......................... 127
Gliederung s. Abschnitt 4.4.2
Inhaltsverzeichnis
4.5
Versuch 3: Beurteilung der Eutergesundheit
anhand von Kriterien der Zellfunktionalität
auf Tierebene ................................................ 132
4.5.1
Mehrfach untersuchte Tiere ......................................................... 133
4.5.2
Gruppen auf Basis der Zellzahl ................................................... 134
4.5.2.1
4.5.2.1.1
4.5.2.1.1.1
4.5.2.1.1.2
4.5.2.1.2
Blutproben ....................................................................................... 134
Korrelationen ................................................................................... 134
Vollblutuntersuchungen ................................................................... 134
Zellfunktionalität in Blut .................................................................... 135
Gruppenvergleich ............................................................................ 135
Gliederung s. Abschnitt 4.5.3.1.1
4.5.2.2
4.5.2.2.1
4.5.2.2.1.1
4.5.2.2.1.2
4.5.2.2.1.3
4.5.2.2.2
Milchproben ..................................................................................... 137
Korrelationen ................................................................................... 137
Eutergesundheit ...............................................................................137
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................138
Zellfunktionalität in Milch ..................................................................138
Gruppenvergleich ............................................................................ 139
Gliederung s. Abschnitt 4.5.3.2.1
4.5.3
Euterkranke Tiere ......................................................................... 141
4.5.3.1
4.5.3.1.1
4.5.3.1.2
Kranke Viertel (T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400) ........................ 142
Blutproben ....................................................................................... 142
Milchproben ..................................................................................... 142
Gliederung s. Abschnitt 4.5.3.2.1
4.5.3.2
Vergleich gesunder Viertel kranker Kühe (Gruppe T2&3/<25)
mit denen gesunder Kühe (Gruppe T1/<25) ..................................... 145
Blutproben ....................................................................................... 145
Milchproben ..................................................................................... 145
Gliederung s. Abschnitt 4.5.3.2.1
4.5.3.2.1
4.5.3.2.2
4.5.3.3
4.5.3.3.1
4.5.3.3.2
Vergleich der gesunden Viertel kranker Kühe (Gruppe T2&3/<25)
mit den kranken Vierteln derselben Tiere (Gruppe T2&3/>100) ....... 147
Blutproben ....................................................................................... 147
Milchproben ..................................................................................... 147
Gliederung s. Abschnitt 4.5.3.2.1
4.5.4
Bakteriologischer Status und Zellfunktionalität ......................... 149
4.5.4.1
Blutproben ....................................................................................... 150
Gliederung s. Abschnitt 4.5.3.1.1
Inhaltsverzeichnis
4.5.4.2
Milchproben ..................................................................................... 152
Gliederung s. Abschnitt 4.5.3.2.1
4.5.4.3
Differenzierte Auswertung gesunder und kranker Viertel der Tiere
mit Mastitis (Gruppen Kat4/<100 undKat4/>100) ............................... 154
Blutproben ....................................................................................... 155
Milchproben ..................................................................................... 155
Gliederung s. Abschnitt 4.5.3.2.1
4.5.4.3.1
4.5.4.3.2
4.6
Gesamtdatenbank: Beurteilung der Eutergesundheit anhand von Kriterien der
Zellfunktionalität auf Viertelebene .................. 158
4.6.1
Gruppen auf Basis der Zellzahl ................................................... 159
4.6.1.1
4.6.1.1.1
4.6.1.1.2
4.6.1.1.3
Korrelationen .................................................................................. 160
Eutergesundheit ...............................................................................160
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................161
Zellfunktionalität in Milch ..................................................................161
4.6.1.2
Gruppenvergleich ............................................................................ 162
Gliederung s. Abschnitt 4.6.3.1
4.6.2
Gruppen auf Basis der CL-Aktivität M ......................................... 165
4.6.2.1
Eutergesundheit ............................................................................... 165
4.6.2.2
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................ 165
4.6.2.3
Zellfunktionalität in Milch .................................................................. 168
4.6.2.4
Auswertung der Gruppe CL2 anhand der Zellzahl (Gruppen
CL2/T<100, CL2/V<100 und CL2/V>100) ............................................. 168
Eutergesundheit ..............................................................................170
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................170
Zellfunktionalität in Milch ..................................................................170
4.6.2.4.1
4.6.2.4.2
4.6.2.4.3
Inhaltsverzeichnis
5.
Diskussion ...............................171
5.1
Methodische Versuche zur Phagozytoseaktivität in Blut ............................................... 171
5.1.1
Inkubationszeit ............................................................................. 171
5.1.2
Zellkonzentration .......................................................................... 171
5.1.3
Bakterienkonzentration ............................................................... 172
5.1.4
Zusammenfassende Beurteilung.................................................. 172
5.2
Methodische Versuche zur CL-Aktivität
in Blut ............................................................ 173
5.2.1
Zellisolierung bei verschiedenen Temperaturen ........................ 173
5.2.2
Inkubation bei verschiedenen Temperaturen ............................. 173
5.2.3
Lagerungsdauer der Proben .........................................................174
5.2.4
Zellkonzentration ........................................................................... 174
5.2.5
PMA-Konzentration ....................................................................... 175
5.2.6
pH-Wert .......................................................................................... 175
5.2.7
Messung der CL-Aktivität aus Vollblut, lysiertem Blut und
aufbereiteter Zellsuspension ....................................................... 176
5.2.8
Wiederholbarkeit innerhalb eines Tages .................................... 176
5.2.9
Zusammenfassende Beurteilung ................................................. 177
Inhaltsverzeichnis
5.3
Versuch 1: Einfluss der Zahl der erkrankten
Euterviertel pro Kuh auf die Zellfunktionalität
von PMN aus Milch und Blut ........................... 178
5.3.1
Blutproben ......................................................................................178
5.3.1.1
Vollblutuntersuchungen ................................................................... 178
5.3.1.2
Zellfunktionalität in Blut .................................................................... 178
5.3.2
Milchproben ................................................................................... 179
5.3.2.1
Eutergesundheit ............................................................................... 179
5.3.2.2
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................ 180
5.3.2.3
Zellfunktionalität in Milch .................................................................. 181
5.3.3
Zusammenfassende Beurteilung ................................................. 182
5.4
Versuch 2: Verlaufsuntersuchung ................... 184
5.4.1
Eutergesunde Tiere ....................................................................... 184
5.4.1.1
Zellzahl im VAG ............................................................................... 184
5.4.1.2
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................184
5.4.1.3
Zellfunktionalität in Blut und Milch ................................................... 184
5.4.2
Tiere mit unspezifischer Mastitis oder Mastitis .......................... 185
5.4.2.1
Zellzahl im VAG ............................................................................... 185
5.4.2.2
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................186
5.4.2.3
Zellfunktionalität in Blut und Milch ................................................... 186
5.4.3
Zusammenfassende Beurteilung ................................................. 188
Inhaltsverzeichnis
5.5
Versuch 3: Beurteilung der Eutergesundheit
anhand von Kriterien der Zellfunktionalität
auf Tierebene ................................................ 189
5.5.1
Mehrfach untersuchte Tiere ..........................................................189
5.5.2
Gruppen auf Basis der Zellzahl ................................................... 189
5.5.2.1
5.5.2.1.1
5.5.2.1.2
Blutproben ....................................................................................... 189
Vollblutuntersuchungen ................................................................... 189
Zellfunktionalität in Blut .................................................................... 190
5.5.2.2
5.5.2.2.1
5.5.2.2.2
5.5.2.2.3
Milchproben ..................................................................................... 190
Eutergesundheit ..............................................................................190
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................191
Zellfunktionalität in Milch ..................................................................192
5.5.2.3
Folgerungen ..................................................................................... 193
5.5.3
Euterkranke Tiere ......................................................................... 193
5.5.3.1
Blutproben ....................................................................................... 193
5.5.3.2
5.5.3.2.1
5.5.3.2.2
5.5.3.2.3
Milchproben ..................................................................................... 193
Eutergesundheit .............................................................................. 193
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................195
Zellfunktionalität in Milch ..................................................................195
5.5.3.3
Folgerungen .....................................................................................196
5.5.4
Bakteriologischer Status und Zellfunktionalität ......................... 197
5.5.4.1
Blutproben ....................................................................................... 197
Gliederung s. Abschnitt 5.5.2.1
5.5.4.2
Milchproben ..................................................................................... 198
Gliederung s. Abschnitt 5.5.2.2
5.5.4.3
Differenzierte Auswertung gesunder und kranker Viertel der Tiere
mit Mastitis (Gruppen Kat4/<100 und Kat4/>100) .............................. 200
Blutproben ....................................................................................... 200
Milchproben ..................................................................................... 200
Gliederung s. Abschnitt 5.5.2.2
5.5.4.3.1
5.5.4.3.2
5.5.4.4
Folgerungen ..................................................................................... 202
5.5.5
Zusammenfassende Beurteilung ................................................. 202
Inhaltsverzeichnis
5.6
Gesamtdatenbank: Beurteilung der Eutergesundheit anhand von Kriterien der
Zellfunktionalität auf Viertelebene .................. 205
5.6.1
Gruppen auf Basis der Zellzahl ................................................... 205
5.6.1.1
Eutergesundheit ............................................................................... 205
5.6.1.2
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................ 205
5.6.1.3
Zellfunktionalität in Milch .................................................................. 206
5.6.1.4
Folgerungen ..................................................................................... 207
5.6.2
Gruppen auf Basis der CL-Aktivität M ......................................... 208
5.6.2.1
Eutergesundheit ............................................................................... 208
5.6.2.2
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................ 208
5.6.2.3
Zellfunktionalität in Milch .................................................................. 209
5.6.2.4
5.6.2.4.1
5.6.2.4.2
5.6.2.4.3
Auswertung der Gruppe CL2 anhand der Zellzahl (Gruppen
CL2/T<100, CL2/V<100 und CL2/V>100) ............................................. 210
Eutergesundheit ..............................................................................210
Zelldifferentialbild in Milch ................................................................210
Zellfunktionalität in Milch ..................................................................211
5.6.2.5
Folgerungen ..................................................................................... 212
5.6.3
Zusammenfassende Beurteilung ................................................. 212
5.7
Forschungsergebnisse der eigenen
Untersuchungen ............................................. 214
6.
Zusammenfassung .................... 216
7.
Summary .................................. 219
8.
Q u e l l e n ve r z e i c h n i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2
Ab b i l d u n g s ve r z e i c h n i s
Abbildung 1:
Chemische Abläufe des Respiratory Burst ..................................15
Abbildung 2:
Untersuchungen aus Blut- und Milchproben ............................... 50
Abbildung 3:
Auswertung der Vitalitätsbestimmung im Durchflusszytometer ...67
Abbildung 4a: Auswertung der Phagozytosemessung im Durchflusszytometer. 72
Abbildung 4b: Auswertung der Phagozytosemessung im Durchflusszytometer. 73
Abbildung 5:
Verlaufskurve einer Chemilumineszenzmessung ........................79
Abbildung 6:
CL-Aktivität im zeitlichen Verlauf aus Blutproben von 4 Tieren ... 105
Abbildung 7:
CL-Aktivität (unbereinigt) in Abhängigkeit von der
Zellkonzentration, Versuchstag 1 ................................................ 107
Abbildung 8:
Vergleich verschiedener PMA-Konzentrationen anhand der
CL-Aktivität, Versuchstag 3 ......................................................... 108
Abbildung 9:
Gruppeneinteilung in Versuch 1; SCC: Anzahl somatischer
Zellen / ml .................................................................................... 112
Abbildung 10: Zellzahl im VAG im Laktationsverlauf von drei gesunden Tieren. 125
Abbildung 11: Verteilung der Zellarten in der Zellsuspension Milch von drei
gesunden Tieren, dargestellt in Laktationswochen ..................... 125
Abbildung 12: Phagozytoseaktivität von aus Milch isolierten Zellen im Verlauf
der Laktationswochen W1 bis W14 von drei gesunden Tieren ... 126
Abbildung 13: CL-Aktivität von aus Blut bzw. Milch isolierten PMN im
Laktationsverlauf von drei gesunden Tieren ................................126
Abbildung 14: Anzahl somatischer Zellen im VAG aus gesunden und kranken
Eutervierteln von drei Tieren vor, während und nach einer
Mastitis ........................................................................................ 129
Abbildung 15: Anteil PMN in der Milch-Zellsuspension von gesunden und
kranken Vierteln von drei Tieren vor, während und nach einer
Mastitis ........................................................................................ 129
Abbildung 16: Anteil aktiver PMN in der Phagozytose aus Milch von
gesunden und kranken Vierteln (V.) von drei Tieren im
Verlauf einer Mastitis ................................................................... 130
Abbildung 17: MFI der Phagozytose aus Milch von gesunden und kranken
Eutervierteln (V.) von drei Tieren vor, während und nach einer
Mastitis ........................................................................................ 130
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 18: CL-Aktivität / 1 Mio. PMN von PMN aus Blut und Milch von
gesunden und kranken Vierteln von drei Tieren im Verlauf
einer Mastitis ............................................................................... 131
Abbildung 19: Log CL-Aktivität / ml Milch von PMN aus Milch gesunder und
kranker Viertel von drei Tieren vor, während und nach einer
Mastitis ........................................................................................ 131
Abbildung 20: Gruppeneinteilung für Versuch 3 ................................................. 133
Abbildung 21: Gruppeneinteilung nach Eutergesundheitskategorien ................ 149
Abbildung 22: Gruppeneinteilung der Gesamtdatenbank ...................................159
Abbildung 23: CL-Aktivität von PMN aus Milch der Gruppen V1 bis V4 .............162
Abbildung 24: CL-Aktivität aus Milch-PMN und Zellzahl im VAG der Gruppen
CL1 bis CL3 ................................................................................. 167
Abbildung 25: Übersicht über die Zusammenhänge der untersuchten
Parameter in Hinsicht auf Mastitisgeschehen ............................. 222
T a b e l l e n ve r z e i c h n i s
Tabelle 1:
Beurteilung zytologisch-mikrobiologischer Befunde im Rahmen
der Mastitis-Kategorisierung (HAMANN u. FEHLINGS 2002).......... 4
Tabelle 2:
Zellmorphologie von Milchzellen (SCHRÖDER 2003) .....................7
Tabelle 3:
Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse (nach
SCHRÖDER (2003) ......................................................................... 8
Tabelle 4:
Chemische Reaktionen des Respiratory Burst ................................15
Tabelle 5:
Methoden zur Isolation von PMN aus Vollblutproben ......................20
Tabelle 6:
Methoden zur Isolation von somatischen Zellen aus
Milchproben ..................................................................................... 24
Tabelle 7:
Verschiedene Techniken zur Bestimmung der Phagozytoseaktivität von PMN im Vergleich ........................................................ 30
Tabelle 8:
Belegung der Mikrotiterplatte für die Messung mit
unterschiedlichen PMA-Konzentrationen .........................................84
Tabelle 9:
Belegung der Mikrotiterplatte für die Messung mit
unterschiedlichen pH-Werten .......................................................... 85
Tabelle 10: Laktationsnummer der Versuchstiere aus Versuch 1 ...................... 88
Tabelle 11: Durchgeführte Untersuchungen in den Versuchen 1 und 2 .............88
Tabelle 12: Datengruppierung in Versuch 1 ....................................................... 89
Tabelle 13: Allgemeines zum Probenumfang von Versuch 3 ............................. 92
Tabelle 14: Laktationsnummer der Versuchstiere aus Versuch 3 ...................... 92
Tabelle 15: Laktationstage der Versuchstiere aus Versuch 3, nach
Tagesprobensätzen ......................................................................... 93
Tabelle 16: Durchgeführte Untersuchungen in Versuch 3 ..................................93
Tabelle 17: Datengruppierung in Versuch 3 ....................................................... 95
Tabelle 18: Datengruppierung der Gesamtdatenbank ....................................... 97
Tabelle 19: Vergleich der Phagozytoseaktivität von Blut-PMN mit
verschiedenen Inkubationszeiten .................................................... 99
Tabelle 20: Vergleich der Phagozytoseaktivität in Blut-PMN mit
verschiedenen Zellkonzentrationen in der Probe ............................ 100
Tabelle 21: Vergleich der Phagozytoseaktivität in Blut-PMN mit
verschiedenen Bakterienkonzentrationen in der Probe ................... 101
Tabellenverzeichnis
Tabelle 22: Mittelwerte (X), Standardabweichungen (sd) und
Variationskoeffizienten (VK) der Gruppen 1 und 2
(Versuch Zellisolation) ..................................................................... 102
Tabelle 23: Probenschema für den Versuch zur Inkubation mit
verschiedenen Temperaturen .......................................................... 103
Tabelle 24: Mittelwerte (X), Standardabweichungen (sd) und
Variationskoeffizienten (VK) der Ansätze 1 bis 3, nach Tieren
getrennt (Versuch zur Inkubation) ................................................... 104
Tabelle 25: Einfluss unterschiedlicher Inkubationszeiten auf die CL-Aktivität
und die Vitalität von 4 Blutproben .................................................... 105
Tabelle 26: CL-Aktivität unter Berücksichtigung verschiedener
Zellkonzentrationen an Versuchstag 1 .....................................
106
Tabelle 27: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten
der CL-Aktivität / 1 Mio. PMN, gemessen mit drei verschiedenen
PMA-Konzentrationen RL1, RL2 und RL3 ....................................... 108
Tabelle 28: CL-Einheiten / 1 Mio. PMN der Gruppen RL 1 (pH = 10,8) und
RL 2 (pH = 7,1) ................................................................................ 109
Tabelle 29: Variationskoeffizienten (VK in %) aus den CL-Aktivitäten zwischen
den Versuchstagen 1 – 3 ................................................................. 109
Tabelle 30: CL-Aktivität / 1 Mio. PMN von 4 Tieren an einem Versuchstag aus
isolierten PMN und lysierten Blutproben ..........................................110
Tabelle 31: Mittelwerte (X), Standardabweichungen (sd) und
Variationskoeffizienten (VK) der vier Ansätze pro Tier für die
Tage 1 bis 4 (Versuch zur Wiederholbarkeit) .................................. 111
Tabelle 32: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus
Blutproben zum Anteil PMN in Blut (n = 20) .................................... 113
Tabelle 33: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der
Zellfunktionalität von aus Blut isolierten Zellen zueinander
(n = 20) ............................................................................................ 114
Tabelle 34: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) von aus Blut
gewonnenen Daten der Gruppen A, B und C .................................. 115
Tabelle 35: Signifikanzen von aus Blutproben gewonnenen Daten zwischen
den Gruppen A bis C ....................................................................... 116
Tabelle 36: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus
Milchproben zu log SCC (n = 79) .................................................... 117
Tabelle 37: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus
Milchproben zum Anteil PMN in Milch (n = 79) ................................ 118
Tabelle 38: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der
Zellfunktionalität von aus Milch isolierten Zellen zueinander
(n = 79) ............................................................................................ 119
Tabellenverzeichnis
Tabelle 39: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) von aus
Milchproben gewonnenen Daten der Gruppen A, B und C ............. 120
Tabelle 40: Signifikanzen von aus Milchproben gewonnenen Daten zwischen
den Gruppen A bis C ....................................................................... 121
Tabelle 41: Einteilung der Daten der gesunden Tiere nach
Laktationswochen (W) ..................................................................... 124
Tabelle 42: Signifikanzen der Blut- und Milchwerte zwischen den Tagen der
mehrfach untersuchten Tiere ........................................................... 134
Tabelle 43: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus
Blutproben zum Anteil PMN in Blut (n = 69) .................................... 135
Tabelle 44: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der
Zellfunktionalität aus Blutzellen zueinander (n = 69) ....................... 135
Tabelle 45: Grunddaten der Gruppen T1 bis T3 der aus Blut gewonnenen
Daten ............................................................................................... 136
Tabelle 46: Signifikanzen der Blutwerte zwischen den Gruppen T1 bis T3 ....... 137
Tabelle 47: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus
Milchzellen zu log SCC im VAG ...................................................... 137
Tabelle 48: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus
Milchzellen zum Anteil PMN in Milch ............................................... 138
Tabelle 49: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der
Zellfunktionalität aus Milchzellen zueinander (n = 270) ................... 138
Tabelle 50: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der aus Milch
gewonnenen Daten der Gruppen T1 bis T3 .................................... 140
Tabelle 51: Signifikanzen der aus Milchproben gewonnenen Daten zwischen
den Gruppen T1, T2 und T3 ............................................................ 141
Tabelle 52: Gruppenbildung für die Auswertung der euterkranken Tiere
(kranke Viertel) ................................................................................ 142
Tabelle 53: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte
der Gruppen T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400 ............................. 143
Tabelle 54: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen T2/100–400,
T3/100–400 und T3/>400 .................................................................................. 144
Tabelle 55: Gruppenbildung für die Auswertung der euterkranken Tiere
(gesunde Viertel) ............................................................................. 145
Tabelle 56: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte
der Gruppen T1/<25 und T2&3/<25 und Signifikanzen zwischen
den Gruppen ....................................................................................146
Tabelle 57: Mittelwerte (X), Standardabweichungen (sd) der Milchparameter
der Gruppen T2&3/<25 und T2&3/>100 und Signifikanzen
zwischen diesen Gruppen ............................................................... 148
Tabellenverzeichnis
Tabelle 58: Struktur der Gruppen Kat1 bis Kat4 .................................................150
Tabelle 59: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Blutwerte
der Gruppen Kat1 bis Kat4 .............................................................. 151
Tabelle 60: Signifikanzen der Blutwerte zwischen den Gruppen Kat1 bis Kat4.. 151
Tabelle 61: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der aus
Milchproben erhobenen Daten der Gruppen Kat1 bis Kat4 ............. 153
Tabelle 62: Signifikanzen der aus Milchproben gewonnenen Daten zwischen
den Gruppen Kat1 bis Kat4 ............................................................. 154
Tabelle 63: Gruppen für die Auswertung der Tiere mit Mastitis ......................... 155
Tabelle 64: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte
der Gruppen Kat1, Kat4/<100 und Kat4/>100 .................................... 156
Tabelle 65: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen Kat1,
Kat4/<100 und Kat4/>100 ...................................................................157
Tabelle 66: Einteilung der Gruppen V1 bis V4 auf Basis der Zellzahl im VAG ...160
Tabelle 67: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus
Milchproben zu log SCC im VAG .................................................... 160
Tabelle 68: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus
Milchproben zum Anteil PMN in Milch ............................................. 161
Tabelle 69: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der
Zellfunktionalität aus Milchproben zueinander ................................ 161
Tabelle 70: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte
der Gruppen V1 bis V4 .................................................................... 163
Tabelle 71: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen V1 bis V4 ..... 164
Tabelle 72: Einteilung der Gruppen CL1, CL2 und CL3 auf Basis der
CL-Aktivität M .................................................................................. 165
Tabelle 73: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) von Milchwerten
der Gruppen CL1 bis CL3 ................................................................ 166
Tabelle 74: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen CL1, CL2
und CL3 ........................................................................................... 167
Tabelle 75: Einteilung der Gruppe CL2 in die Gruppen CL2/T<100, CL2/V<100
und CL2/V>100 ................................................................................. 168
Tabelle 76: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte
der Gruppen CL2/T<100, CL2/V<100 und CL2/V>100 ......................... 169
Tabelle 77: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen CL2/T<100,
CL2/V<100 und CL2/V>100 ................................................................ 170
Tabelle 78: Methodenvergleich Phagozytosebestimmung
Immunologie – Merle ....................................................................... 173
Tabelle 79: Methodenvergleich CL-Aktivität nach Mehrzad und nach Merle ..... 177
Tabellenverzeichnis
Tabelle 80: Beurteilung der Eutergesundheit der Tiere in den Gruppen A, B
und C anhand der Parameter SCC und elektrische Leitfähigkeit .... 180
Tabelle 81: Beurteilung der Eutergesundheit der Tiere in den Gruppen T1,
T2 und T3 anhand der Parameter SCC, elektrische Leitfähigkeit
sowie NAGase ................................................................................. 191
Tabelle 82: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen
T1/<25, T2&3/<25, T2&3/>100, T2/100–400, T3/100–400 und
T3/>400 anhand der Parameter SCC, elektrische Leitfähigkeit
sowie NAGase ................................................................................. 194
Tabelle 83: Beurteilung der Eutergesundheit der Tiere in den Gruppen Kat1
bis Kat4 anhand der Parameter SCC, elektrische Leitfähigkeit,
NAGase sowie Bakteriologie ........................................................... 199
Tabelle 84: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen
Kat4/<100 und Kat4/>100 anhand der Parameter SCC, elektrische
Leitfähigkeit, NAGase sowie Bakteriologie ...................................... 201
Tabelle 85: Veränderungen ausgewählter Parameter in Milch kranker Tiere im
Vergleich zu den Vierteln eutergesunder Tiere ............................... 204
Tabelle 86: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen V1
bis V4 anhand der Parameter SCC und elektrische Leitfähigkeit .... 205
Tabelle 87: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen CL1
bis CL3 anhand der Parameter SCC und elektrische Leitfähigkeit ..208
Tabelle 88: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen
CL2/T<100, CL2/V<100 und CL2/V>100 anhand der Parameter
SCC und elektrische Leitfähigkeit .................................................... 210
Tabelle 89: Kritische Bereiche der Zellzahl in Milch und der CL-Aktivität von
Milch-PMN in Bezug auf den Beginn entzündlicher
Veränderungen ................................................................................ 213
Ab k ü r z u n g s ve r z e i c h n i s
Allgemeines:
A. monodest.
Aqua monodestillata
A. tridest.
Aqua tridestillata
BAP
Blutagarplatte
BSA
bovines Serumalbumin
E. coli
Escherichia coli
Eos B
Anteil Eosinophiler Granulozyten im Blutausstrich in %
k
Korrelationskoeffizient
LF
elektrische Leitfähigkeit in mS / cm
Lym B
Anteil Lymphozyten im Blutausstrich in %
Lym M
Anteil Lymphozyten in der Milch-Zellsuspension in %
Makro M
Anteil Makrophagen in der Milch-Zellsuspension in %
n
Stichprobengröße
NAGase
NAGase in nmol × min-1 × ml-1
PBS
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PMN
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
PMN B
Anteil PMN im Blutausstrich in %
PMN M
Anteil PMN in der Milch-Zellsuspension in %
S. aureus
Staphylococcus aureus
SCC
Anzahl somatischer Zellen / ml Milch im VAG
sd
Standardabweichung
Tps
Tagesprobensatz, umfasst die Blut- und Milchdaten eines
Tieres von einem Untersuchungstag
VAG
Viertelanfangsgemelk
VGH
Viertelhandgemelk
Vitalität
Prozentsatz vitaler Zellen in der Milch-Zellsuspension
WBC
Leukozytenzahl in 106 / ml
X
arithmetischer Mittelwert
Abkürzungsverzeichnis
Phagozytose:
%n
Prozentsatz aktiver Zellen der nicht opsonisierten Proben
bei der Phagozytose (s. 3.6.7)
%o
Prozentsatz aktiver Zellen der opsonisierten Proben bei
der Phagozytose (s. 3.6.7)
FITC
Fluoreszeinisothiocyanat
MFI
mittlere Fluoreszenzintensität
MFI n
mittlere Fluoreszenzintensität (geometrisches Mittel) der
nicht opsonisierten Proben bei der Phagozytose
MFI o
mittlere Fluoreszenzintensität (geometrisches Mittel) der
opsonisierten Proben bei der Phagozytose
Chemilumineszenz:
CL
Chemilumineszenz
CL-Aktivität B
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN in der Blut-Zellsuspension
CL-Aktivität M
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN in der Milch-Zellsuspension
DPBS
Dulbecco´s PBS
DMSO
Dimethylsulfoxid
NTB-Reduktion
Nitroblau-Tetrazolium-Reduktion
Max
Maximum der Kurve der CL-Messung in RLU (relative light
units)
PMA
Phorbol-Myristat-Acetat
RL
Reaktionslösung
RLU
Relative Light Units
Time
Zeit bis zum Erreichen des Maximums in Sekunden
1.
Einleitung
Der Zellgehalt der Milch wird seit langem zur Beurteilung der Eutergesundheit herangezogen. Dabei wird ein Zellgehalt bis 100.000 Zellen / ml Milch einer Viertelgemelksprobe als Grenzwert betrachtet. Liegt der Zellgehalt darunter, so wird das
betreffende Euterviertel als normal sezernierend beurteilt, liegt er darüber, so gilt das
Euterviertel als erkrankt.
Neben der Gesamtzellzahl in der Milch ist das Differentialzellbild und die Aktivität der
Zellen im Euter für eine differenziertere Aussage über die Gesundheit des Euters
bedeutsam. Während einer Infektion verändert sich das Zellbild im Euter drastisch.
Ein starker Zustrom v. a. von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN)
in das Gewebe führt schon vor dem Auftreten von klinischen Symptomen zu einem
Anstieg der Gesamtzellzahl in der Milch.
Die Differenzierung der Zellarten in der Milch ist ein wichtiger Ansatz, um Informationen über die Eutergesundheit zu erhalten. In der Tat sind aber nur vitale Zellen zur
Infektionsabwehr fähig, wobei zu beachten ist, dass auch lebende Zellen unterschiedliche Reaktionsfähigkeiten haben. Eine Möglichkeit, die Aktivität von Zellen zu
erfassen, ist die Messung der Chemilumineszenz (CL). Mit diesem Verfahren wird
die Bildung der reaktiven Sauerstoffmetaboliten in PMN gemessen, die eine besondere Fähigkeit dieser Zellen im Rahmen der Abwehr darstellt. Sauerstoffradikale
greifen die Bakterienwand an und zerstören damit die Bakterien. Im Rahmen der
Chemilumineszenzreaktion werden die gebildeten Sauerstoffmetaboliten, speziell
Hydrogenperoxid, in Licht umgesetzt, welches vom Luminometer erfasst wird. Dieser
Wert ermöglicht eine Aussage über die Reaktionsbereitschaft der PMN, die im
Zusammenhang mit Mastitiden üblicherweise erhöht ist.
Die Messung der CL-Aktivität von PMN aus dem Blut ist ein bekanntes Verfahren. Im
Rahmen dieses Promotionsvorhabens wurde die CL-Aktivität von aus Milch isolierten
PMN gemessen, was im Falle einer Mastitis Informationen über die Entzündungsreaktion im Gewebe lieferte. Die starke Variabilität dieses Parameters durch technische
Einflüsse der Probengewinnung und -behandlung wie auch durch biologische Ein-
1
Einleitung
flüsse (z. B. Stoffwechsel, Hormonstatus, Arzneimittel) erschwerten jedoch bisher
eine Etablierung des Verfahrens.
Parallel zur Beurteilung des lokalen Abwehrgeschehens im Euter wurde anhand von
Blutuntersuchungen der allgemeine Gesundheitszustand des Tieres erfasst. Aus diesem Grund wurden auch PMN aus Blutproben isoliert und auf ihre Aktivität hin untersucht. Weitere Blutparameter wurden als Information über den Allgemeinzustand des
Tieres ebenfalls erhoben.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde versucht, ein genaueres Verständnis über die immunologischen Abläufe während einer Mastitis zu erlangen. Dabei wurde einerseits
die Entwicklung funktioneller Parameter wie das Zelldifferentialbild, die Phagozytoseund die CL-Aktivität von aus Blut und Milch isolierten Zellen im Zusammenhang mit
steigender Anzahl somatischer Zellen verfolgt. Ebenfalls wurde untersucht, in welchem Zellzahlbereich Tiere als eutergesund bezeichnet werden können bzw. mit
welchem Zellgehalt die Veränderungen der immunologischen Parameter darauf hindeuten, dass eine gestörte Euterfunktion vorliegt. Solche Informationen können hilfreich sein, um Konzepte für die Mastitisprävention zu entwickeln.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Arbeit bestand darin, den Einfluss erkrankter Euterviertel auf die nicht betroffenen Viertel derselben Tiere hinsichtlich der Zellfunktionalität zu überprüfen.
Da die genannten Parameter der Zellaktivität Informationen über den Gesundheitszustand der Euterviertel bieten, die über die der Zellzahl hinausgehen, wurde versucht, für diese Parameter Grenzwerte zur Unterscheidung zwischen gesunden und
kranken Eutervierteln festzulegen.
2
2.
Literaturübersicht
2.1
Mastitis – Ursachen und Diagnostik
2.1.1
Ursachen und Einteilung
Die Mastitis ist eine Entzündung des Euters. Ihre Ursachen sind vielfältig, wobei häufig bakterielle Besiedlung und Infektionen mit Pilzen nachgewiesen werden (TOLLE
1975). Unter den bakteriellen Erregern zählen Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae und Streptococcus dysgalactiae zu den klassischen Vertretern. Die Liste der Bakterien, die Mastitiden hervorrufen
oder aufrechterhalten, ist jedoch lang (GRUNERT 1996).
Es ist anzunehmen, dass es in der Regel dem Zusammenwirken mehrerer auslösender Faktoren (Stress, Haltungs- und Fütterungsmängel, mangelnde Melkhygiene
etc.) bedarf, um eine Mastitis zu verursachen (TOLLE 1975; HAMANN u. FEHLINGS
2002).
Die Euterentzündung liegt entweder in subklinischer oder in klinischer Form vor. Die
klinische Mastitis ist durch Merkmale wie Flocken in der Milch, Schwellung, Wärme
des Euterviertels und evtl. Fieber gekennzeichnet. Je nach Schwere wird zwischen
gering-, mittel- und hochgradigen Mastitiden unterschieden, je nach Dauer der Erkrankung zwischen akuten, subakuten und chronischen Formen (HAMANN u. FEHLINGS 2002). Der subklinischen Mastitis fehlen diese grobsinnlich erfassbaren Symptome, sie zeichnet sich durch eine erhöhte Zellzahl (s. u.) und einen bakteriologisch
positiven Befund aus (HAMANN u. FEHLINGS 2002).
Ist nur die Zellzahl erhöht, ohne dass pathogene Bakterien nachgewiesen werden, so
wird von einer unspezifischen Mastitis gesprochen (s. Tabelle 1). Der Nachweis von
pathogenen Mikroorganismen ohne erhöhten Zellgehalt stellt hingegen eine latente
Infektion dar (TOLLE 1975; HAMANN u. FEHLINGS 2002).
3
Literatur
Tabelle 1: Beurteilung zytologisch-mikrobiologischer Befunde im Rahmen der
Mastitis-Kategorisierung (HAMANN u. FEHLINGS 2002)
Euterpathogene Mikroorganismen
Zellgehalt pro ml Milch
nicht nachgewiesen
nachgewiesen
< 100.000
normale Sekretion
latente Infektion
> 100.000
unspezifische Mastitis
Mastitis
Während einer Mastitis, auch einer subklinischen Mastitis, ändert sich die Komposition der Milchinhaltsstoffe. Die Milchleistung sowie der Fett- und Eiweißgehalt sinken,
aber auch die Zusammensetzung der Elektrolyte verändert sich (KITCHEN 1981).
Dies führt zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen in der Milchproduktion (HAMANN
u. FEHLINGS 2002). Hinzu kommen Verluste durch vorzeitigen Abgang erkrankter
Tiere und Tierarztkosten (HAMANN u. FEHLINGS 2002). Daher hat die Vermeidung
von Mastitiden in der Milchkuhhaltung oberste Priorität.
2.1.2
Verfahren zum Entzündungsnachweis
Es gibt eine lange Reihe von Parametern, die sich in Milch im Zusammenhang mit
einer Mastitis messbar verändern (GRABOWSKI 2000). Im Folgenden sind die in
den eigenen Untersuchungen eingesetzten Parameter näher beschrieben.
2.1.2.1
Anzahl somatischer Zellen
Die Zahl der somatischen Zellen in der Milch hat einen hohen Aussagewert hinsichtlich des Gesundheitsstatus eines Euterviertels. Dringen pathogene Mikroorganismen
in das Euter ein, so wird eine immunologische Reaktion ausgelöst. Ein Teil dieser
Reaktion ist der Zufluss von Abwehrzellen in das betroffene Euterviertel.
Als physiologisch werden Zellgehalte von 20.000 bis 50.000 Zellen / ml Milch angesehen, mit einem Schwankungsbereich bis 100.000 Zellen / ml Milch (HAMANN u.
REICHMUTH 1990; HAMANN 1992; HAMANN u. FEHLINGS 2002). Liegt die Zell-
4
Literatur
zahl über 100.000 Zellen / ml Milch, so kann nicht mehr von normaler Sekretion gesprochen werden, sondern es liegt ein Entzündungsgeschehen vor, welches wiederum sinkende Milchleistung und Änderung der Milchinhaltsstoffe zur Folge hat (HAMANN 1995; SCHÜTTEL 1999; GRABOWSKI 2000).
Rasse, Alter, Laktationsstadium und verschiedene Stressfaktoren nehmen ebenfalls
Einfluss auf die Zellzahl in der Milch. Diese physiologischen Parameter verändern die
Zellzahl entweder direkt oder indirekt, indem sie die Abwehrleistung des Tieres verändern (REICHMUTH 1975). Auch das Melkintervall lässt die Zellzahlen schwanken:
Mit einem Melkintervall von 4 Stunden liegt die Zellzahl im Viertelanfangsgemelk signifikant höher als mit einem Melkintervall von 12 Stunden (HAMANN et al. 1997).
Stress alleine führt zu keiner signifikanten Zellzahlerhöhung (HAMANN 1992). Insofern ist die Grenze zwischen physiologischen und pathologischen Zellzahlschwankungen nicht deutlich zu ziehen, weil nur ein durch Bakterien vorgeschädigtes Euter
durch „physiologische“ Stressoren eine klinische Mastitis ausbilden wird (HAMANN
u. REICHMUTH 1990).
Da die Anzahl somatischer Zellen ein geeigneter Indikator zur Feststellung von Entzündungsvorgängen im Euter ist, gibt es eine Reihe von Verfahren, mit denen die
Zellzahl einer Milchprobe festgestellt werden kann. Die am weitesten verbreitete Methode zur Zellzählung ist die der Fossomatic®. Es handelt sich hierbei um ein fluoreszenzoptisches Verfahren (SCHMIDT MADSEN 1975), in dem die Milchprobe zunächst mit dem fluoreszierenden Farbstoff Ethidiumbromid gefärbt und anschließend
im Gerät Fossomatic® gemessen wird. Jeder gefärbte (fluoreszierende) Partikel wird
als elektrischer Impuls empfangen. Auf diese Weise kann die Zellzahl in 1.000 pro ml
ermittelt werden (SCHRÖDER 2003).
2.1.2.2
Elektrische Leitfähigkeit
Die elektrische Leitfähigkeit ist ein Maß für die Konzentration und Beweglichkeit der
Ionen, die in der Milch dissoziiert vorliegen (v. a. Chlorid-, Kalium- und NatriumIonen). Ihre Maßeinheit ist Millisiemens / cm (mS/cm). Gesunde Milch enthält eine
höhere Kaliumkonzentration, aber eine niedrigere Natrium- und Chloridkonzentration
5
Literatur
als das Blut. Das jeweilige Konzentrationsgefälle wird durch die Blut-Milch-Schranke
aufrechterhalten. Ist diese geschädigt, so gleichen sich die Konzentrationen der Ionen in der Milch denen des Blutes an (HAMANN u. ZECCONI 1998), und die elektrische Leitfähigkeit steigt.
Da die elektrische Leitfähigkeit von vielen Faktoren (Laktationsstadium, Fütterung
und Rasse) beeinflusst wird, muss ihre Interpretation vorsichtig vorgenommen werden. Der Fettgehalt der Milch spielt ebenfalls eine Rolle, da die Ionenbeweglichkeit
durch die Fettmicellen eingeschränkt wird. Die elektrische Leitfähigkeit kann als orientierende Information über die Eutergesundheit genutzt werden, da sie, im Gegensatz zu den meisten anderen Entzündungsparametern, bereits im Stall schnell und
einfach bestimmt werden kann. Hierbei dient vor allem ein deutlicher Unterschied
zwischen den Ergebnissen der einzelnen Viertel einer Kuh als Hinweis auf ein
Krankheitsgeschehen. Eine sichere Diagnose kann jedoch nur zusammen mit anderen Parametern erhoben werden (HAMANN u. ZECCONI 1998; GRABOWSKI 2000).
Als orientierender Referenzwert für das Sekret eutergesunder Kühe kann der Bereich
von 4,8 – 6,2 mS / cm angesehen werden (HAMANN & FEHLINGS 2002).
Die Bestimmung der elektrischen Leitfähigkeit kann mit Handgeräten („Cow side
test“) oder durch Sensoren in der Melkmaschine erfolgen (SCHULTZE 1985).
2.1.2.3
N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase (NAGase)
N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase (NAGase) ist ein Enzym, das von den Leukozyten
produziert und in deren Lysosomen gespeichert wird. Es ist an der Abwehr von Infektionserregern beteiligt. 1,1 bis 2,8 nmol ml-1 min-1 in Milch gelten als Referenzbereich
(SCHÜTTEL 1999). Während einer Infektion wird vermehrt NAGase freigesetzt. Da
dies nur lokal geschieht, ist die Bestimmung der Enzymaktivität zur Mastitisdiagnostik
besonders aussagekräftig.
Die Messung der NAGase-Aktivität erfolgt wiederum fluoreszenzoptisch im Mikrotiterplattenverfahren. Das Ergebnis wird in nmol ml-1 min-1 angegeben (SCHÜTTEL
1999).
6
Literatur
2.2
Somatische Zellen in der Milch
2.2.1
Zellarten
In Milch finden sich verschiedene Zellarten, deren Morphologie im mikroskopischen
Zellausstrich in der Dissertation von SCHRÖDER (2003) ausführlich beschrieben
wurde. In Tabelle 2 sind Größe und Aussehen der Zellen kurz dargestellt.
Tabelle 2: Zellmorphologie von Milchzellen (SCHRÖDER 2003)
Zellart
Größe
Kern
Zytoplasma
PMN
10 – 14 µm
intensiv gefärbt, stabför- dichte neutrophile Granumig oder gelappt
la; 0,5 – 1 µm
Eosinophile
Granulozyten
10 – 14 µm
intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt
eosinophile Granula;
0,5 – 1,5 µm
Basophile
Granulozyten
9 – 12 µm
intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt
basophile Granula;
1,5 µm
Lymphozyten/
Blasten
5 – 10 µm
bis 25 µm
intensiv gefärbt, rund bis
oval
sehr wenig, intensiv gefärbt
Makrophagen
8 – 30 µm
schwach gefärbt, vielfäl- schwach gefärbt, oft nicht
tige Formen
angefärbte Vakuolen
Epithelzellen
10 – 14 µm intensiv gefärbt, groß und
rund
schwach gefärbt, nicht
angefärbte Vakuolen
möglich
Während polymorphkernige Granulozyten (PMN), eosinophile und basophile Granulozyten sowie Lymphozyten Abwehrzellen sind, die direkt aus dem Blut stammen,
sind Makrophagen als gewebsständige Zellen nicht im Blut zu finden (KRAFT u.
DÜRR 1997). Ihre Vorläufer sind Monozyten, die im Knochenmark gebildet werden,
mit dem Blut an ihren Bestimmungsort gelangen und dort zu Makrophagen reifen
(KLINKE u. SILBERNAGL 1994). Epithelzellen entstehen im Gewebe durch Zellteilung.
7
Literatur
2.2.2
Zelldifferentialbild
PAAPE et al. (1981a) haben folgende Differenzierung der somatischen Zellen in
Milch aufgestellt: 60 % Makrophagen, 28 % Lymphozyten, 10 % PMN und 2 % Epithelzellen. Diese Zahlen beziehen sich auf eine durchschnittliche Verteilung der Zellarten in Milch aus gesunden Eutervierteln. Sie unterliegen individuellen, laktationsund altersbedingten Schwankungen (REICHMUTH 1975; BURVENICH et al. 1995).
Tabelle 3: Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse (nach SCHRÖDER 2003)
Zellart
MAK
LYM
PMN
EPI
Lee et al. 1980
80 %
16 %
3%
1%
Paape et al. 1981a
60 %
28 %
10 %
2%
Kurzhals et al. 1985
63 %
2%
34 %
2%
Fox et al. 1985
51 %
12 %
32 %
Wever u. Emanuelson
1989
48 %
15 %
37 %
Miller et al. 1991
30 %
24 %
26 %
Östensson 1993
74 %
14 %
12 %
Leitner et al. 1999
13 %
3,4 %
29 %
Dosogne et al. 2003
10 %
58 %
28 %
Schröder 2003
39 %
25 %
34 %
Quelle
19 %
45 %
Tabelle 3 (nach SCHRÖDER 2003) zeigt eine Übersicht über die veröffentlichten Untersuchungen zu Zelldifferentialbildern verschiedener Autoren. Es ist ersichtlich, dass
zwischen den Ergebnissen der einzelnen Untersucher hohe Schwankungen bestehen. So liegt nach LEE et al. (1980) der Schwerpunkt der Zellverteilung noch stärker
auf Seiten der Makrophagen, hier erfolgt auch der Hinweis auf Makrophagen, die
nach dem Zentrifugieren mit der Fettschicht entfernt werden. Die Studie von KURZ-
8
Literatur
HALS et al. (1985) weist einen wesentlich höheren PMN-Anteil nach als die Studien
anderer Autoren; nach LEITNER et al. (1999) überwiegen die Epithelzellen.
Erkrankt ein Euterviertel, so kommt es zu einem raschen massiven Einstrom von
PMN aus dem Blut in die Milch, sodass der Anteil PMN 90 % und mehr betragen
kann (JAIN 1976; PAAPE et al. 1979; CONCHA 1986; BURVENICH et al. 1995).
2.2.3
Zelluläre Abwehr
2.2.3.1
Allgemeines
Allgemein wird die Abwehr in zwei Gruppen eingeteilt: die zelluläre und die humorale
Abwehr (CRAVEN u. WILLIAMS 1985; ZECCONI et al. 1994). Der zelluläre Teil besteht aus Immunzellen, die humorale Abwehr aus nicht-zellulären Komponenten, die
Einfluss auf das Infektionsgeschehen nehmen, indem sie z. B. Abwehrzellen aktivieren oder hemmen, eine Ansammlung von Lymphflüssigkeit bewirken (Schwellung)
und vieles mehr. Zur humoralen Abwehr gehören u. a. Immunglobuline, Komponenten des Komplementsystems und Interleukine.
Im gesunden Euterviertel sind stets sowohl Abwehrzellen als auch humorale Bestandteile vorhanden. Im Falle einer Mastitis steigt der Gehalt somatischer Zellen
und auch der bestimmter Mediatoren. Außerdem ändert sich die Zusammensetzung
dieser Botenstoffe, d. h. einige Teile überwiegen in bestimmten Phasen der Entzündung (RIOLLET et al. 2000).
2.2.3.2
Rekrutierung von Leukozyten aus dem Blut
In Milch aus einem gesunden Euterviertel stellen Makrophagen nach Angabe der
meisten Autoren den größten Anteil der Zellpopulation dar (z. B. PAAPE et al. 1981a;
KURZHALS et al. 1985; WEVER u. EMANUELSON 1989). Ihre vorrangige Funktion
ist die Phagozytose und Abtötung von Bakterien (PAAPE et al. 1979; BURVENICH et
al. 1994). Werden sie stimuliert, setzen sie chemotaktische Faktoren frei, die PMN
anlocken. Während einer Untersuchung über die Reaktion bestimmter Mediatoren
9
Literatur
und der Entzündungszellen auf eine artifizielle Euterinfektion brach zwölf Stunden
nach der Inokulation von 30 CFU Escherichia coli (E. coli) in ein Euterviertel die BlutMilch-Schranke zusammen, gefolgt von Fieber und einem erhöhten Leukozyteneinstrom (SHUSTER et al. 1997). Unter den Mediatoren wurden zunächst die Komplementkomponente C5a, der Tumornekrosefaktor (TNF) und Interleukin-1 (IL-1), später
IL-6 und IL-8 produziert. Diese Stoffe fördern den Einstrom von PMN, indem sie zunächst die Endothelzellen aktivieren, vermehrt E-Selektin und P-Selektin zu exprimieren. Dadurch können PMN leichter an die Endotheloberfläche binden. Auf den
PMN wird nun das Molekül Mac-1 (auch CD11b/CD18 genannt) exprimiert, das wiederum für eine feste Bindung zwischen Endothel und Zelle sorgt (ARNAOUT 1990;
RIOLLET et al. 2000; SMITS et al. 2000). Das Endothel bildet hierfür den Rezeptor
ICAM-1 (intercellular adhesion molecule – 1) aus (ROTHLEIN et al. 1986). Nun können die PMN entlang des Konzentrationsgradienten der Chemokine durch das Endothel, das Interstitium und das Euterepithel in die Milch wandern (SMITS et al. 2000).
Eines der stärksten Chemokine ist Interleukin-8 (HUBER et al. 1992; SHUSTER et
al. 1996). Aber auch Endotoxin, Interleukin-1ß oder die Komplementkomponente
C5a zeigen starke chemotaktische Wirkung auf PMN (PERSSON et al. 1993).
2.2.3.3
Opsonine
Opsonine sind Botenstoffe, die die Phagozytose von Bakterien durch PMN oder
Makrophagen unterstützen. Zu ihnen gehören Immunglobuline und bestimmte Komponenten des Komplementsystems (BURVENICH et al. 1995).
Immunglobuline sind stets in der Milch vertreten. Ihre Konzentration steigt im Rahmen einer Mastitis an. Besonders IgG2 und IgM aktivieren die Abwehrzellen zur Phagozytose (MILLER et al. 1988). Die Verteilung in Kolostrum beträgt etwa 85 – 90 %
IgG, 7 % IgM und ca. 5 % IgA, wobei vermutlich der größere Teil des IgA nicht frei,
sondern an die Fettkügelchenmembran gebunden vorliegt (CRAVEN u. WILLIAMS
1985).
Komplement ist besonders in Kolostrum und in Milch aus entzündeten Eutervierteln
vorhanden. Die Komplementkomponente C3 liegt in der Mittellaktation in einer Se-
10
Literatur
rumkonzentration von 1 – 5 % im Milchserum vor, im Falle einer Mastitis steigt die
Konzentration auf 3 – 12 % (CRAVEN u. WILLIAMS 1985). Die Komplementkomponente C3b fördert die Phagozytoseaktivität von PMN (PAAPE et al. 1985).
2.2.3.4
Makrophagen
Makrophagen gehören zusammen mit den PMN zu den funktionellen Phagozyten im
Euter (JAIN 1976; PAAPE et al. 1981a). Es sind sehr große Zellen, die meist Fettvakuolen enthalten (OUTTERIDGE u. LEE 1981). Sie sind gewebsständig, kommen
aber auch in der Milch selbst vor. Ihre Hauptaufgaben sind die Phagozytose von
Fremdpartikeln und die Rekrutierung anderer Immunzellen durch die Produktion bestimmter Mediatoren (Chemokine, s. Abschnitt 2.2.3.2). Weiterhin produzieren auch
sie Sauerstoffradikale, jedoch in geringerem Umfang als die PMN (ALLEN u. LOOSE
1976; OUTTERIDGE u. LEE 1981). In Makrophagen aus Milchzellsuspensionen
konnte die Bildung von Hydrogenperoxid nachgewiesen werden (MULLAN et al.
1986). Andere Autoren stellten fest, dass Makrophagen weder Myeloperoxidase besitzen noch Sauerstoffradikale bilden (HALLÉN SANDGREN et al. 1991; MEHRZAD
2002).
In der Trockenstehzeit scheinen die Makrophagen verstärkt Fett und Kasein zu phagozytieren, Milchreste und untergegangene Zellen aufzunehmen und damit zur
Rückbildung des Euters beizutragen (OUTTERIDGE u. LEE 1981; FOX et al. 1988).
2.2.3.5
PMN
Im Falle einer bakteriellen Invasion strömen PMN, durch die Mediatoren angelockt, in
Massen in das Euter ein. Die Hauptaufgabe der PMN in Milch ist die Abtötung von
Bakterien. Hierfür stehen ihnen die Phagozytose (Aufnahme von Bakterien) und die
Freisetzung verschiedener Reagenten zur Verfügung. Generell wird zwischen sauerstoffabhängigen und sauerstoffunabhängigen Reaktionen unterschieden. Die sauerstoffabhängigen Reaktionen werden unter dem Begriff „Respiratory Burst“ zusammengefasst und in einem eigenen Kapitel beschrieben (s. Abschnitt 2.3.2). Als sauerstoffunabhängiges System werden verschiedenartige Proteine bezeichnet, die
11
Literatur
mikrobizid wirken. Dazu gehören u. a. Lysozym, Laktoperoxidase, Laktoferrin und
kationische Proteine (TARGOWSKI 1983; CRAVEN u. WILLIAMS 1985; PAAPE et
al. 1985; SORDILLO et al. 1997). Welches der beiden Systeme wirksam ist, hängt
von dem jeweiligen Bakterium ab, das angegriffen wird (CRAVEN u. WILLIAMS
1985).
PMN haben drei verschiedene Arten von Granula: In den primären (azurophilen)
Granula werden lysosomales Protein und einige Komponenten der sauerstoffabhängigen Reaktionen wie Myeloperoxidase gespeichert (COORAY et al. 1993; ZECCONI et al. 1994), in den sekundären (spezifischen) Granula werden hauptsächlich Lysozym und Laktoferrin gelagert (ZECCONI et al. 1994). 1983 wurde eine neue Population von Granula in bovinen PMN entdeckt, in denen Enzyme der sauerstoffunabhängigen Reaktionen gespeichert werden (GENNARO et al. 1983).
PMN in Milch enthalten 38 % weniger Glykogen als solche aus dem Blut (NAIDU u.
NEWBOULD 1973). Die Ursachen hierfür liegen auf der Hand: Alle Vorgänge wie
z. B. Diapedese (VANGROENWEGHE et al. 2001) und Phagozytose (PAAPE et al.
1979) verbrauchen Glucose. In Milch stehen nur geringe Glucosekonzentrationen zur
Verfügung, sodass die PMN in der Milch nach und nach ihre Glykogenreserven aufbrauchen und schließlich zugrunde gehen (NEWBOULD 1970, 1973). Als Bestätigung dafür wurde eine Untersuchung über den Vorgang der Diapedese von PMN
aus dem Kapillarendothel durch das Euterepithel in die Milch durchgeführt (SMITS et
al. 1999). Dabei wurde festgestellt, dass die Diapedese die Kapazität der PMN zur
Phagozytose und zum Respiratory Burst senkt.
2.2.3.6
Lymphozyten
Lymphozyten regulieren die Immunantwort auf ein Antigen. Jeder Lymphozyt ist für
ein spezifisches Antigen sensibel. Bekommt er Kontakt zu diesem Antigen, so wird
eine Reihe von immunologischen Reaktionen in Gang gesetzt, zu denen auch die
Produktion von Immunglobulinen gehört. B- und T-Lymphozyten haben hierbei unterschiedliche Aufgaben zu erfüllen (TARGOWSKI 1983). In der Milch sind die T-Zellen
für zellverbundene Immunreaktionen verantwortlich, während die B-Zellen Antikörper
12
Literatur
produzieren. Die Lymphozytenanteile in der Milch betragen etwa 50 % TLymphozyten und ca. 20 % B-Lymphozyten (CONCHA et al. 1978; TARGOWSKI
1983), wobei diese Zahlen stark variieren.
2.3
Funktionelle Eigenschaften von PMN
2.3.1
Phagozytose
2.3.1.1
Erkennung
Um von PMN phagozytiert werden zu können, müssen einige Bakterienarten opsonisiert sein. Dies geschieht durch Anlagerung von Immunglobulinen (v. a. IgG2 und
IgM) oder von Komplementkomponenten (besonders C3b und C3bi) an die Bakterien
(CRAVEN u. WILLIAMS 1985; BURVENICH et al. 1995). Diese Opsonine lagern sich
mit ihrem Endstück an ihre komplementären Rezeptoren der PMN an und erleichtern
dadurch die Phagozytose.
Eine Reihe von Bakterien und anderen Partikeln wie z. B. Pilze, Parasiten, Latexoder Carbonpartikel werden von den PMN auch ohne Opsonisierung als körperfremd
erkannt (TARGOWSKI 1983).
2.3.1.2
Ingestion
Opsonisierte Teilchen binden über die Endstücke der Immunglobuline bzw. die C3bRezeptoren an die Zellen. Nicht opsonisierte Partikel werden entweder auch über die
o. g. Rezeptoren oder über spezifische Rezeptoren erkannt und gebunden (TARGOWSKI 1983). Ist der Partikel einmal an die Zelle gebunden, so folgt der Akt der
Ingestion. Dabei bilden sich Pseudopodien um den Partikel herum aus, bis er vollständig von der Zellmembran umgeben ist. Die entstehende Vakuole, Phagosom
genannt, fusioniert mit einem Lysosom zum Phagolysosom. Darin wird das Bakterium getötet und verdaut. Zum Abtöten stehen die bereits erwähnten sauerstoffunabhängigen bzw. sauerstoffabhängigen Enzymsysteme zur Verfügung (TARGOWSKI 1983).
13
Literatur
2.3.1.3
Reifestadien, die zur Phagozytose befähigt sind
Die verschiedenen Reifestadien von PMN aus dem Blut unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Phagozytosekapazität: Segmentkernige PMN, stabkernige PMN und Metamyelozyten betreiben Phagozytose, Myelozyten jedoch kaum. Promyelozyten und
Myeloblasten sind dazu gar nicht in der Lage (SILVA et al. 1989).
2.3.2
Respiratory Burst
Der Respiratory Burst ist eine Gruppe chemischer Reaktionen, die als sauerstoffabhängige Abwehrmechanismen der PMN zusammengefasst werden. Sie sind eine
Folge der Aktivierung von PMN durch Mediatoren wie z. B. die Komplementkomponente C3b. Einhergehend mit der Phagozytosereaktion werden durch die entstehenden Sauerstoffradikale die aufgenommenen Bakterien abgetötet (KWON 1987).
Nur reife PMN sind zum Respiratory Burst befähigt (GLASSER u. FIEDELEIN 1987).
Die Reaktion beginnt wenige Sekunden nach dem Kontakt mit einem Stimulus und
ist gekennzeichnet durch einen Anstieg der Sauerstoffaufnahme (ROSSI u. ZATTI
1964; BABIOR 1984). Auslösen können den Respiratory Burst Partikel wie Bakterien,
Viren oder Zellreste, aber auch lösliche Faktoren wie chemotaktische Peptide, Komplementkomponenten, Fettsäuren, Ca2+-Ionophore, Phorbolester und Endotoxin
(ROSSI 1986).
Die chemischen Reaktionen sind in Tabelle 4 und in Abbildung 1 dargestellt (BABIOR 1984).
14
Literatur
Tabelle 4: Chemische Reaktionen des Respiratory Burst
Reaktion
2 O2 + NADPH
Enzym
2 O2 + NADP+ + H+
2 O2 + 2 H+
H2O2 + O2
O2 + H2O2
OH. + OH + O2
Cl + H2O2
HOCl + H2O
NADPH-Oxidase
Superoxiddismutase
Haber-Weiss-Reaktion
Myeloperoxidase
Respiratory burst
O2
NADPH
NADPHOxidase
NADP +
O 2 - (Superoxidanion)
Superoxiddismutase
OH-
2 H+
H 2 O 2 (Hydrogenperoxid)
(Hydroxylradikal)
Cl -
Myeloperoxidase
HOCl ( Hypochlorit)
Abbildung 1: Chemische Abläufe des Respiratory Burst
Das Schlüsselenzym für den Respiratory Burst ist die NADPH-Oxidase, die in der
Plasmamembran angesiedelt ist. Sie reduziert O2 zu O2-, wobei NADPH zu NADP+
oxidiert wird. Durch NADP+ wird der Hexose-Monophosphat-Weg aktiviert, der
NADP+ wieder in NADPH verwandelt. Dieser Prozess verbraucht Glucose und damit
Energie.
15
Literatur
Das O2- wird nun mit Protonen zu Hydrogenperoxid (H2O2) und Wasser reduziert,
entweder spontan oder katalysiert durch das Enzym Superoxiddismutase. Damit ist
der eigentliche, sauerstoffverbrauchende Vorgang des Respiratory Burst abgeschlossen. Superoxidanion und Hydrogenperoxid sind potente Sauerstoffradikale.
Durch Sekundärreaktionen entstehen noch weitere reaktive Sauerstoffmetaboliten
wie OH. und OH- (BABIOR 1984). Mehrere oder alle der entstehenden freien Sauerstoffradikalen sind an der Lichtbildung in der Chemilumineszenzreaktion (CLReaktion) beteiligt (CHESON et al. 1976).
Mit Halogenionen wie Cl-, J- oder Br- und katalysiert durch das Enzym Myeloperoxidase (MPO) bildet H2O2 Halogensäuren, die ebenfalls bakterizid wirken.
Diese freien Sauerstoffmetaboliten und die Halogensäuren wirken einerseits in den
Phagosomen der Zelle und töten phagozytierte Bakterien ab. Sie werden aber auch
nach außen freigesetzt und greifen alles an, was sich in der Umgebung befindet:
Bakterien oder absterbende Zellen. Da sie sehr aggressiv sind, werden die umliegenden Zellen teilweise auch abgetötet (BABIOR 1984; ROSSI 1986). Die PMN
selbst haben einige Enzyme zum Schutz vor ihren eigenen Sauerstoffmetaboliten.
Superoxiddismutase, Katalase und das Glutathionperoxidase-GlutathionreduktaseSystem bauen H2O2 wieder zu Wasser und Sauerstoff ab.
2.3.2.1
NADPH-Oxidase
Dieses Enzym findet sich in der Plasmamembran der PMN und wird nur an der Stelle
der Membran aktiviert, die mit dem auslösenden Agens Kontakt hat (ROSSI 1986).
Seine Aktivierung ist reversibel. Es katalysiert folgende chemische Reaktion:
2 O2 + NADPH + H+
2 O2- + NADP+ + 2 H+
Die NADPH-Oxidase wird im Falle von bspw. opsonisierten Partikeln oder Immunkomplexen über Rezeptorbindung und die direkte Interaktion von Molekülen und
Substraten aktiviert (ROSSI 1986). Dadurch wird eine Kette von biochemischen Reaktionen ausgelöst, die letztendlich zur Phosphorylierung von Proteinen und zur Akti-
16
Literatur
vierung der NADPH-Oxidase führt. Sie ist von kurzer Dauer und kann ausschließlich
durch die fortbestehende Bindung an das Stimulans aufrechterhalten werden.
2.3.2.2
Superoxid-Dismutase (SOD)
SOD katalysiert die Reaktion des Superoxidanions zu Hydrogenperoxid und Sauerstoff. Da das Superoxidanion sehr toxisch für Zellen ist, ist diese Reaktion Bestandteil des Schutzmechanismus der Zellen vor Schäden durch reaktive Sauerstoffmetaboliten (HUU et al. 1984). Dennoch ist Hydrogenperoxid selbst ein freies Sauerstoffradikal, das jedoch von den Zellen durch Katalasen weiter abgebaut werden kann
(ROSSI 1986).
Das Superoxidanion wird während der Chemilumineszenzmessung durch Luminol
oxidiert. Die Zugabe von SOD hemmt daher die Lichtbildung durch Luminol (PUGET
u. MICHELSON 1974; BENSINGER u. JOHNSON 1981).
2.3.2.3
Myeloperoxidase (MPO)
MPO ist ein lysosomales Protein in den primären Granula der PMN und eine wichtige
Komponente der sauerstoffabhängigen antimikrobiellen Aktivität (COORAY et al.
1993). Es lässt sich als Entzündungsenzym diagnostisch nutzen (COORAY 1994).
Reife Makrophagen bilden zwar Superoxidanionen, haben aber keine MPO. Daher
ist die Messung der Chemilumineszenz aus Makrophagen nicht möglich (HOLMBERG u. CONCHA 1985). MPO findet sich nicht in eosinophilen Granulozyten oder
in reifen Makrophagen, aber in den Lysosomen juveniler Monozyten und Makrophagen (BABIOR 1984; HALLÉN SANDGREN et al. 1991).
Eine Methode zur Bestimmung der MPO-Aktivität findet sich unter ROTH und KAEBERLE (1981). KIMURA et al. (1999) und KIMURA et al. (2002) verweisen in ihren
Veröffentlichungen auf diese Quelle.
Die CL-Messung aus Zellen von Menschen mit MPO-Defizienz ergab keine messbaren Werte, wohl aber die Bestimmung der O2--Produktion. Letztere wurde im Photospektrometer über die Reduktion von Cytochrom c erfasst (DAHLGREN u. STEN-
17
Literatur
DAHL 1983). Die Zugabe von MPO zu den Zellen der Patienten bewirkte eine Antwort in der CL-Messung.
2.4
Labordiagnostische Methoden
2.4.1
Labordiagnostik aus Blutproben
Vollblutuntersuchungen liefern Informationen über den allgemeinen Gesundheitszustand des Tieres. Mastitiden können systemische Auswirkungen haben, aber auch
andere systemische Erkrankungen können die Eutergesundheit beeinträchtigen.
Zu den Untersuchungen zählen im Wesentlichen das rote Blutbild mit Erythrozytenzahl und Hämatokrit, die Leukozytenzahl und das Differentialzellbild (KRAFT u.
DÜRR 1997).
Die Bestimmung des weißen Blutbildes gibt Informationen über den Immunstatus des
Tieres. Ist die absolute Zahl der Leukozyten unterhalb des Referenzbereiches, so ist
dies ein Zeichen für virale Infektionskrankheiten, Zellgifte oder einen erhöhten Leukozytenverbrauch im Rahmen von perakuten Entzündungen. Die Leukozytose ist
häufig eine Antwort des Immunsystems auf Infektionskrankheiten (BICKHARDT
1992). Sie kann auch Ausdruck einer Vergiftung, einer endokrinen Schwankung (Gabe von Kortikosteroiden) oder einer Leukose sein.
Die Auswertung des Differentialzellbildes gibt weiteren Aufschluss über die Art der
Störung. Unterschieden wird zwischen reifen (segmentkernigen) und unreifen (stabkernigen) PMN, eosinophilen Granulozyten, basophilen Granulozyten, Lymphozyten
und Monozyten (BICKHARDT 1992). Eine genauere Unterteilung der Zellarten, insbesondere ihrer Vorläufer, die nur selten im Blut zu finden sind, ist möglich. Außer für
besondere Fragestellungen werden diese letztgenannten Zellarten während der Differenzierung jedoch nicht berücksichtigt.
Die Neutrophilie geht häufig mit der Leukozytose einher und hat als häufigste Ursache Infektionskrankheiten, vornehmlich bakterieller Art. Die Neutropenie dagegen ist
oft Zeichen einer viralen Infektion. Chronische Infektionskrankheiten zeichnen sich
18
Literatur
durch eine Lymphozytose aus (KRAFT u. DÜRR 1997). Erhöhte Zahlen der eosinophilen Granulozyten in Rinderblutproben sprechen für Parasitosen (BICKHARDT
1992).
2.4.2
Methoden zur Zellisolation aus Blut und Milch
2.4.2.1
Isolierung von PMN aus Vollblut
CARLSON und KANEKO haben im Jahre 1973 ein Verfahren zur Isolation von PMN
aus Blut beschrieben, das von vielen Autoren zitiert wird (PAAPE et al. 1975; WEBER at al. 1983; SILVA et al. 1989; SALGAR et al. 1991; SMITS et al. 2000; MEHRZAD et al. 2001a, 2002; MEHRZAD 2002). Eine genaue Beschreibung der Vorgehensweise ist in Tabelle 5 dargestellt.
Der Einsatz von Percoll® ermöglicht die Herstellung reiner PMN-Suspensionen
(MOTTOLA et al. 1980). Nach der Zentrifugation und hypotonen Lyse der Erythrozyten nach dem Verfahren von CARLSON und KANEKO (1973) folgt ein weiterer Arbeitsschritt, in dem mittels Percoll® eine hochreine PMN-Fraktion ohne eosinophile
Granulozyten gewonnen werden kann.
Obwohl ROTH und KAEBERLE (1981) selbst die Methode von CARLSON und KANEKO (1973) als Quelle angaben, modifizierten sie die Vorgehensweise der Zellisolation aus Blut derartig, dass viele Autoren dieses Verfahren später zitierten, z. B.
ROTH et al. 1983, KEHRLI U. GOFF 1989, KEHRLI et al. 1989, SHUSTER et al.
1996, DOSOGNE et al. 1999 und KIMURA et al. 2002. Auch in der vorliegenden Arbeit wurde die Isolation von Blut-PMN in Anlehnung an ROTH und KAEBERLE
(1981) durchgeführt.
HALLÉN SANDGREN und BJÖRK stellten 1988 ein Verfahren vor, in dem Metrizamid als Dichtegradient benutzt wird. Einige Untersucher beziehen sich in ihren Quellenangaben auf diesen Artikel (z. B. PERSSON et al. 1993). Drei Jahre später gelang
es ihnen, diese Technik auch auf die Isolation von Zellen aus der Milch zu übertragen (HALLÉN SANDGREN et al. 1991).
Weitere Verfahren zur Isolation von PMN aus Blut werden in Tabelle 5 vorgestellt.
19
Literatur
Tabelle 5: Methoden zur Isolation von PMN aus Vollblutproben
Autor
Carlson u.
Kaneko 1973
Vorgehen
• 40 ml EDTA-Blut aufgeteilt in 4 mal 10 ml
Zentrifugation 10 Minuten bei 1000xg
Entfernen von Plasma und oberem Teil der
Erythrozyten
Paape et al.
1975
• Hypotone Lyse:
Zugabe von 20 ml deionisiertem Wasser
Nach 30 Sekunden Zugabe von 10 ml phosphatgepufferter 2,7%iger NaCl-Lösung
Zentrifugation 10 Minuten bei 200xg
Silva et al. 1989
• Aspiration und Verwerfen des Überstandes
Resuspendierung in 5 ml PBS
Zweimaliges Waschen in 35 ml PBS und
Zentrifugation 8 Minuten bei 200xg
Mehrzad et al.
2001a
• Resuspendierung in 5 ml PBS
Mottola et al.
1980
zitiert von:
Weber at al.
1983
Salgar et al.
1991
Smits et al. 2000
Mehrzad et al.
2002
• Zentrifugation und hypotone Lyse s. Carlson
u. Kaneko 1973
Heyneman et al.
1990
• Percoll® mit einer Dichte von 1,10 g/ml
Dosogne et al.
1997
• Zentrifugation von 34 ml Percoll® 30 Minuten
bei 35000xg
• Überschichtung des Percoll® mit 2 – 3 x 108
Granulozyten
Zentrifugation 10 Minuten bei 7500xg
• Absaugen der beiden zellhaltigen Schichten
Dreimaliges Waschen in Krebs Ringer Phosphatlösung bei 100xg
• Resuspendierung in Krebs Ringer Phosphatlösung
20
Literatur
Tabelle 5: Methoden zur Isolation von PMN aus Vollblutproben
Autor
Roth u. Kaeberle 1981
Vorgehen
zitiert von:
• Zentrifugation der Zitrat-Blutprobe 20 Minuten
bei 1000xg
Abnahme von Plasma und Buffy Coat
Roth et al. 1983
• Hyoptone Lyse:
Zugabe von 2 Teilen phosphatgepuffertem
deionisiertem Wasser
Nach 45 Sekunden Zugabe von einem Teil
phosphatgepufferter 2,7%iger NaCl-Lösung
Zentrifugation
Kehrli et al. 1989
Kehrli u. Goff
1989
Shuster et al.
1996
Dosogne et al.
1999
• Zweifaches Waschen in HBSS ohne Ca2+ und Kimura et al.
Mg2+
2002
Endkonzentration: 5,0 x 107 PMN / ml
Saad u. Hageltorn 1985
• 10 ml heparinisiertes Blut
• Dichtegradienten mit Percoll®:
10 ml mit Dichte 1,103 g/ml; 20 ml mit Dichte
1,087 g/ml
• Überschichtung des Dichtegradienten mit 9 ml
Blut (1:1 verdünnt mit PBS)
Zentrifugation bei 1800xg, 15´
• Abnahme von Plasma, Buffy Coat und 1 cm
Percoll®
• Absaugen der Fraktion zwischen den beiden
Gradienten (enthält PMN) mit Pasteurpipette
• Lyse der Erythrozyten mit dest. Wasser, 45
Sekunden
• Zweimaliges Waschen der PMN in HBSS mit
2 % BSA
Endkonzentration: 5 x 106 PMN/ml in HBSS
mit 2 % BSA
21
Literatur
Tabelle 5: Methoden zur Isolation von PMN aus Vollblutproben
Autor
Vorgehen
Hed et al.
1987
• 0,1 ml humanes EDTA-Blut
zitiert von:
• Lyse der Erythrozyten mit 2 ml NH4Cl ‚Lysing
reagent’
Zentrifugation bei 300xg für 5 Minuten
• Waschen des Pellets in Gey´s Medium
Hallén
Sandgren u.
Björk 1988
• 20 ml Zitratblut
• Herstellung verschiedener Dichtegradienten
mit Metrizamid in Tyrode´s gel solution
• Zentrifugation 15 Minuten bei 1000xg ohne
Bremse
• Hypotone Lyse
• Resuspendierung des Zellpellets in 1 ml
0,9%iger NaCl-Lösung
• Überschichtung des Metrizamidgradienten
Zentrifugation 45 Minuten bei 1200xg
• Aspiration der Zellen jeder der Phasen,
Auffüllen der Probe mit 0,9% NaCl auf 10 ml
Gesamtvolumen
Zentrifugation 5 Minuten bei 200xg
• Hypotone Lyse verbliebener Erythrozyten
• Zentrifugation 5 Minuten bei 200xg
• Resuspendierung der Pellets in 0,5 ml GBSS
22
Hallén Sandgren
et al. 1991
Persson et al.
1993
Literatur
Tabelle 5: Methoden zur Isolation von PMN aus Vollblutproben
Autor
Cooray 1996
Vorgehen
zitiert von:
• Verdünnung von heparinisiertem Vollblut 1:2
mit PBS
• Überschichtung des Ficoll-Paque®
Zentrifugation 45 Minuten bei 700xg
Gewinnung der PMN mit Erythrozyten
• Hypotone Lyse:
Zugabe von deionisiertem Wasser
Nach 30 Sekunden Zugabe von 3,6%igem
NaCl
• Zweifaches Waschen in PBS mit Zentrifugation für 10 Minuten bei 400xg
• Resuspendierung in PBS mit Ca2+ und Mg2+
2.4.2.2
Isolierung somatischer Zellen aus Milch
Für die Gewinnung der Zellen aus Milchproben gibt es bis jetzt kein Standardverfahren. Dennoch führen viele Autoren die Milchzellisolation auf ähnliche Weise durch.
Einige Untersucher orientierten sich dabei an der von CARLSON und KANEKO
(1973) etablierten Technik zur Zellisolation aus Blut und entfernten den Schritt der
hypotonen Lyse von Erythrozyten aus dem Arbeitsprotokoll (PAAPE et al. 1975,
WEBER et al. 1983, SALGAR et al. 1991, s. Tabelle 6).
PAAPE et al. veröffentlichten 1977 eine genaue Beschreibung ihrer Methode, die
noch 20 Jahre später nachgearbeitet wurde (DULIN et al. 1984, PAAPE et al. 1990b,
VANGROENWEGHE et al. 2001).
Auch das von SAAD 1987 vorgestellte Verfahren wird von anderen Autoren zitiert
(z. B. ZECCONI et al. 1994).
Weitere Quellenangaben zu diesem Thema sind in Tabelle 6 niedergelegt. Die Verfahren unterscheiden sich im Wesentlichen durch die benötigte Milchmenge, die
23
Literatur
g-Zahl während der Zentrifugationsschritte und das verwendete Medium. Milchproben mit variierenden Zellgehalten sowie der Verwendungszweck der gewonnenen
Zellen bedingen unterschiedliche Isolationsverfahren. In der vorliegenden Arbeit
wurde die Methode nach PAAPE et al. (1990a) modifiziert angewandt.
Tabelle 6: Methoden zur Isolation von somatischen Zellen aus Milchproben
Autor
Paape et al.
1977
Vorgehen
zitiert von:
• 150 ml Milch
Dulin et al. 1984
• Filtration durch Seide
Paape et al.
1990b
• Zentrifugation 30 Minuten bei 1200xg
Entfernen des Überstands
• Aufnahme des Pellets in 40 ml PBS und zweimaliges Waschen
Zentrifugation 15 Minuten bei 200xg
Vangroenweghe
et al. 2001
• Endkonzentration: 25 oder 100 x 106 PMN/ml
Weber et al.
1983
• 40 ml Milch
• Zentrifugation 20 Minuten bei 1000xg
Entfernen der Fettschicht
Dekantieren des Überstandes
• Zweifaches Waschen in Eagle´s Medium mit
Zentrifugation 10 Minuten bei 200xg
Dulin et al.
1988
• 250 ml Milch
Mehrzad et al.
2001a
• Filtration durch Seide
• Zentrifugation 15 Minuten bei 1000xg
Entfernen des Fetts und der Magermilch
• Auffangen und Waschen des Sediments in 80
ml PBS
Zentrifugation bei 200xg
• Hypotone Lyse
• Waschen mit PBS
• Endkonzentration 2,5 x 107 Zellen/ml
24
Literatur
Tabelle 6: Methoden zur Isolation von somatischen Zellen aus Milchproben
Autor
Saad 1987
Vorgehen
• Verdünnung von 20 – 25 ml Milch mit PBS auf
100 ml
• Filtration durch Nylonnetz
• Zentrifugation 15 Minuten bei 1500xg
Entfernen der Fettschicht
Dekantieren des Überstandes
• Auffangen des Pellets in 7 ml PBS
• Bei Bedarf Lyse mit 2 Teilen destilliertem Wasser 45 Sekunden
Zugabe von 1 Teil phophatgepufferter 2,7%iger
Salzlösung
• Zweifaches Waschen in HBSS mit 0,05 % humanem Serumalbumin
Zentrifugation bei 200xg
Fox u.
McDonald
1988
• 50 ml Nachgemelk
• Zentrifugation 30 Minuten bei 300xg
Entfernen des Fetts
Dekantieren des Überstandes
• Waschen des Zellpellets in PBS
Zentrifugation 15 Minuten bei 350xg
• Endkonzentration: 6,25 x 106 Zellen/ml
Paape et al.
1990a
• 250 ml Milch
• Filtration durch Seide
• Zentrifugation 15 Minuten bei 1000xg
Entfernen des Fetts
Dekantieren des Überstandes
• Zweimalige Resuspension des Pellets in 80 ml
PBS
Zentrifugation bei 200xg
• Endkonzentration: 25 x 106 Zellen / ml PBS
25
zitiert von:
Zecconi et al.
1994
Literatur
Tabelle 6: Methoden zur Isolation von somatischen Zellen aus Milchproben
Autor
Daley et al.
1991
Vorgehen
zitiert von:
• 250 ml Milch
• Filtration
• Zentrifugation 30 Minuten bei 1200xg
Entfernen des Fetts
Dekantieren des Überstandes
• Zweimaliges Waschen des Zellpellets in 50 ml
PBS
• Endkonzentration: 106 Zellen / ml in RPMI Medium mit 5 % fetalem Kälberserum
Salgar et al.
1991
• 100 ml Milch
• Zentrifugation 5 Minuten bei 1500xg
Entfernen des Fetts
Dekantieren des Überstandes
• zweifaches Waschen in PBS
Zentrifugation 2 Minuten bei 500xg
• Endkonzentration: 1 x 107 / ml
Mehrzad et
al. 2001b
• 2 l Milch
Verdünnung mit PBS
Mehrzad et al.
2002
• Zentrifugation 15 Minuten bei 600xg
Entfernen des Fetts
Dekantieren des Überstandes
• Resuspension in PBS
Zentrifugation 10 Minuten bei 300xg
• Resuspension in PBS
Zentrifugation 15 Minuten bei 200xg
• Resuspension in DPBS mit 0,5 mg/ml Gelatine
Endkonzentration: 5 x 106 / ml
26
Literatur
2.4.3
Labordiagnostische Methoden zur Messung der Phagozytoseaktivität von PMN
Zur in vitro Messung der Phagozytoseaktivität wurden mehrere Methoden evaluiert.
Es besteht die Möglichkeit, Bakterien radioaktiv zu markieren und nach Inkubation
dieser Bakterien mit PMN die Radioaktivität der Zellen zu messen (s. Abschnitt
2.4.3.1). In einem anderen Verfahren wird die Zahl der phagozytierten Bakterien
nach Kultivierung mikroskopisch bestimmt (s. Abschnitt 2.4.3.2). Sind die Bakterien
mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, so können die aktiven und die nicht
aktiven Zellen anhand dieses Farbstoffes im Durchflusszytometer voneinander unterschieden werden (s. Abschnitt 2.4.3.3). Alle Verfahren zur Diagnostik der Zellfunktionalität lassen sich nur an isolierten Zellen und nicht im Ausgangsmedium durchführen.
2.4.3.1
Szintillationsspektrometrie
PAAPE et al. (1975) beschreiben eine Technik zur Messung der Phagozytoseaktivität von PMN aus Blut und aus Milch. Dafür benutzten sie Staphylococcus aureus (S.
aureus), die mit radioaktivem 32P markiert waren. Zur Opsonisierung wurden sie noch
mit Serum, Vollmilch, Magermilch, Molke oder PBS inkubiert. PMN aus Blut bzw.
Milch wurden zugegeben und inkubiert. Die nicht phagozytierten Bakterien wurden
durch die Zugabe von Lysostaphin in einer weiteren Inkubation zerstört. Durch
Zentrifugation wurden nun die PMN mit den phagozytierten S. aureus entfernt, und
die Radioaktivität im Überstand im Szintillationsspektrometer gemessen (s. Tabelle
7).
Mit Hilfe eines Standards, der statt Zellen nur PBS enthielt, und eines Blindwertes
(ohne Bakterien) zur Bestimmung der Hintergrundradioaktivität, konnte nun der Prozentsatz phagozytierter Bakterien errechnet werden.
PMN aus Blut phagozytierten 80 % (Serum), 44 % (Vollmilch), 74 % (Magermilch),
72 % (Molke) bzw. 11 % (PBS) der Bakterien. Die PMN aus der Milch phagozytierten
27
Literatur
entsprechend 78 %, 44 %, 72 %, 74 % bzw. 22 % der S. aureus (PAAPE et al.
1975). Die unterschiedlichen Ergebnisse liegen im Fettanteil der Medien begründet.
Auf diese Methode wird in den folgenden Jahren häufig in der Literatur hingewiesen
(PAAPE et al. 1977; DULIN et al. 1984, 1988, 1990a; PAAPE u. MILLER 1988;
KLUCIŃSKI et al. 1988) (s. Tabelle 7).
2.4.3.2
Kultivierung
Im Rahmen einer Untersuchung über den Zusammenhang zwischen Phagozytose
und intrazellulärem Abtöten von S. aureus in PMN aus Blut wurde ein ähnlicher Versuchsaufbau angewandt (WILLIAMS et al. 1985). Nach der Inkubation mit Lysostaphin wurde jedoch Trypsin zugegeben. Dadurch wurde die Wirkung des Lysostaphin neutralisiert, sodass die intrazellulär überlebenden S. aureus geschont
wurden. Durch Ausstrich auf einer Blutagarplatte (BAP) konnte dann die Zahl der
überlebenden Bakterien bestimmt werden. Die Zahl der aktiven Phagozyten und der
aufgenommenen Bakterien wurden mikroskopisch ermittelt.
Diese Technik machten sich auch FOX und MCDONALD (1988) für ihre Untersuchung von Milch aus mit S. aureus infizierten Eutervierteln zunutze (s. Tabelle 7).
Ebenfalls im Ausstrichverfahren auf Blutagarplatten bestimmten SORDILLO und BABIUK (1991) die Phagozytoseaktivität von aus Milch isolierten PMN.
2.4.3.3
Durchflusszytometrie
Aus bovinen Blut-PMN lässt sich die Phagozytoseaktivität auch im Durchflusszytometer bestimmen (SAAD u. HAGELTORN 1985). Die Isolation der PMN aus dem
Blut erfolgt in diesem Versuch unter Einsatz eines diskontinuierlichen Dichtegradienten (s. Tabelle 5). Die gewonnenen PMN phagozytieren Bakterien (S. aureus) oder
Zymosanpartikel, die mit dem fluoreszierenden Farbstoff FITC (Fluoresceinisothiocyanat) gekoppelt sind (s. Tabelle 7). Die Probe wird inkubiert und anschließend im
Durchflusszytometer ausgewertet. Damit werden die Zahl der freien Bakterien und
der Anteil aktiver Zellen anhand der Fluoreszenz der in den PMN befindlichen Bakte-
28
Literatur
rien bestimmt. Benutzt wurde in dieser Untersuchung ein Zytofluorograf 50L mit einer
Anregungswellenlänge von 488 nm (SAAD u. HAGELTORN 1985).
Für die Messung der Phagozytoseaktivität von PMN aus Milch wurden 25 ml Milch
eingesetzt (SAAD 1987). Die Messung und Auswertung am Durchflusszytometer erfolgte nach dem von SAAD und HAGELTORN (1985) beschriebenen Verfahren (s.
Tabelle 7).
Diese Technik wird von zahlreichen Autoren zitiert. So wurden Korrelationen zwischen der Schwere der Infektion und der Gesamtzahl phagozytierender PMN und
reifer PMN im Blut direkt vor einer Infektion mit E. coli festgestellt (DOSOGNE et al.
1997).
Die Phagozytoseaktivität von humanen Granulozyten kann auch in Vollblutproben
gemessen werden (HED et al. 1987). Anstelle von Bakterien wurden mit FITC gekoppelte Hefe-Partikel, die mit C3b opsonisiert waren, verwendet. Außerdem wurde
mit Trypanblau zwischen angelagerten und aufgenommenen Partikeln unterschieden. Dies wurde von einigen Autoren übernommen (DOSOGNE et al. 1997; VAN
WERVEN et al. 1997).
SMITS et al. (1999) setzten bei ähnlichem Vorgehen Propidiumjodid als fluoreszierenden Farbstoff ein und verwendeten für die Messung von aus Blut isolierten PMN
ein FACScan-Durchflusszytometer.
Aus zwei Blutproben desselben Rindes von einem Tag konnten keine Unterschiede
in der Phagozytoseaktivität festgestellt werden, ebenso wenig aus Doppelansätzen
der gleichen Proben (PAAPE u. MILLER 1988). Die Variation von Woche zu Woche
von 36,4 % wurde auf die Isolationstechnik zurückgeführt.
29
Literatur
Tabelle 7: Verschiedene Techniken zur Bestimmung der Phagozytoseaktivität von
PMN im Vergleich
Quelle
Bakterien
Zellen
Inkubation
weitere
Schritte
Paape et al. 1975
Dulin et al. 1984
Williams et al. 1985
0,5 ml 32P-gekoppelte
S. aureus
0,5 ml 32P-gekoppelte
S. aureus
0,1 ml S. aureus
(2 x 108/ml)
(4 x 108/ml)
(6 x 106/ml)
1 ml Zellsuspension
0,5 ml Zellsuspension
0,2 ml PMN
(2,5 x 107/ml)
(2,5 x 107/ml)
(107/ml)
30 Minuten bei 37°C
60 Minuten bei 37°C
1,5 h bei 37°C
2 ml Serum, Vollmilch,
Magermilch, Molke oder PBS
1 ml Magermilch, Molke, Kolostrum, Serum
oder anderes
mit 1 % Serum, Ausstrich 1 auf BAP
Lyse der nicht phagozytierten S. aureus durch
Zugabe von 5 ml Lysostaphin (10 U),
Inkubation 30 Minuten, 37°C,
Zentrifugation und Messen des Überstands
Zentrifugation, vom
Überstand Ausstrich 2
auf BAP,
0,6 ml Lysostaphin,
Inkubation 20´, 0,05 ml
Trypsin, Inkubation 10´,
Ausstrich 3 auf BAP
Auswertung Szintillationsspektrometer: erfasst die Radioakti- Ausstrich 1: Erhebung
vität von 32P
der gesamten bakteriziden Aktivität,
Standard: keine Zellen
Blindwert: keine Bakterien
Ausstrich 2: extrazelluErgebnis: Prozentsatz phagozytierter Bakterien läre Bakterien,
Ausstrich 3: intrazellulär überlebende Bakterien
zitiert von:
Paape et al. 1977
Paape u. Wergin 1977
Paape et al. 1978
Guidry et al. 1980
Kluciński et al. 1988
Paape u. Miller 1988
Paape et al. 1990a
Dulin et al. 1988
Miller et al. 1988
30
Literatur
Tabelle 7: Verschiedene Techniken zur Bestimmung der Phagozytoseaktivität von
PMN im Vergleich
Quelle
Saad u. Hageltorn
1985
Fox u. McDonald
1988
Sordillo u. Babiuk 1991
0,1 ml FITC-gekoppelte S. aureus
(5 x 108/ml)
0,1 ml S. aureus
Zellen
0,5 ml Zellsuspension
(5 x 106 PMN/ml)
5 x 106 PMN/ml
1 ml Zellsuspension
(1 x 106/ml)
Inkubation
15 Minuten bei 37°C
mit 0,4 ml verdünntem
Serum,
gesamt:
20 Bakterien:1 PMN,
10 % Serum
30 Minuten bei 37°C
mit 0,1 ml Serum
10 Minuten bei 37°C
weitere
Schritte
Zugabe von 6 ml
0,9 % NaCl mit
0,02 % EDTA zum Beenden der Phagozytose,
Zugabe von Akridinorange
siehe Paape et al.
1975,
Zugabe von 1 ml
0,05 % Trypsin zum
Neutralisieren des
Lysostaphin,
Inkubation 60 Minuten
Zentrifugation, Resuspension in HBSS
mit 0,1 mg Lysostaphin, Inkubation 30
Minuten, Zentrifugation, Resuspension in 1
ml HBSS
Bakterien
Auswertung Zytofluorograf 50L mit
100 mW Argon-Ionenlaser, 488 nm,
Fluoreszenz bei 600 –
650 nm bzw. 515 –
575 nm gemessen,
Anteil phagozytierender PMN anhand Zahl
fluoreszierender Zellen, Bakterien pro PMN
anhand MFI bestimmt
zitiert von:
(20 x 106 cfu/ml)
1 ml opsonisierte S.
aureus
(1 x 106 cfu/ml)
vor Trypsinzugabe:
Ausstrich und KolonieAusstrich und mikro- zählung auf Blutagarskopische Bestimplatte
mung aktiver Zellen
und Zahl der phagozytierten Bakterien;
nach Trypsinzugabe:
Ausstrich auf Blutagarplatte zur Bestimmung der Zahl der cfu
Saad 1987
Daley et al. 1991
Dosogne et al. 1997
van Werven et al. 1997
31
Literatur
2.4.4
Labordiagnostische Methoden zur Messung der freien Sauerstoffradikale
Für die Messung der freien Sauerstoffradikale gibt es mehrere Verfahren. Entweder
werden die gebildeten reaktiven Gruppen (H2O2, O2- und OH-) über bestimmte chemische Reaktionen in Licht umgewandelt, welches im Luminometer erfasst wird (s.
Abschnitt 2.4.4.3). Diese Methode wird Chemilumineszenz genannt. Ebenfalls besteht die Möglichkeit, die Bildung dieser Oxidantien (reactive oxygen species = ROS)
mithilfe eines zu oxidierenden, fluoreszierenden Farbstoffes im Durchflusszytometer
zu ermitteln (s. Abschnitt 2.4.4.2). In Abschnitt 2.4.4.1 ist der Nitroblau-TetrazoliumReduktionstest beschrieben, mit dem die Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten
ebenfalls bestimmt werden kann.
2.4.4.1
Nitroblau-Tetrazolium-Reduktionstest
Dieser Test beruht auf dem Prinzip der Reduktion von Nitroblau-Tetrazolium zu Formazan, wobei der Farbumschlag im Spektrophotometer bestimmt wird. Mehrere Autoren haben Methoden zur Bestimmung der Nitroblau-Tetrazolium-Reduktion vorgestellt. Beispielhaft ist hier diejenige von ROTH und KAEBERLE (1981) beschrieben.
Für die Reaktion wird Nitroblau-Tetrazolium zu PMN und Zymosan gegeben und fünf
Minuten inkubiert. Anschließend wird die optische Dichte bei 580 nm im Spektrophotometer bestimmt.
Die Verbindung zwischen erhöhten Östradiol- und Progesterongehalten im Blut und
veränderten Zellfunktionen wurde mit dieser Technik untersucht (ROTH et al. 1983).
Messbare Ergebnisse finden sich im Nitroblau-Tetrazolium-Reduktionstest nur in
segmentkernigen PMN aus Blut und Knochenmark und in eosinophilen Granulozyten
aus Blut (SILVA et al. 1989). Milchzellen wurden nicht untersucht.
32
Literatur
2.4.4.2
ROS-Bildung
Eine modernes Verfahren zur Messung der Respiratory-Burst-Aktivität ist die Bestimmung der ROS-Bildung im Durchflusszytometer. Hierbei wird DichloroFluorescin-Diacetat (DCFH-DA) zum Einsatz gebracht. Dieser Stoff kann durch die
Zytoplasmamembran in die Zelle wandern, wo es durch Plasmaesterasen zu Dichloro-Fluorescin (DCFH) deacetyliert wird. DCFH ist nun nicht mehr in der Lage, die Zelle wieder zu verlassen. Wird die Zelle zur Bildung von Sauerstoffmetaboliten angeregt, z. B. durch PMA, so oxidiert das Hydrogenperoxid DCFH zu nativem fluoreszierendem Dichlorofluorescin (DCF). Die entstehende Fluoreszenz ist zellgebunden und
kann im Durchflusszytometer erfasst werden (BASS et al. 1983).
Die optimale PMA-Konzentration beträgt für diesen Versuchsaufbau 10 ng / ml (SALGAR et al. 1991). Als Hauptquelle für Variationen gelten technische Schwankungen
während der Isolation der PMN.
2.4.4.3
Chemilumineszenz (CL) und labordiagnostische Methoden
Diese Methode wurde in der Humanmedizin entwickelt (ALLEN et al. 1972). Heute
wird die CL-Aktivität auch in PMN aus Blut und Milch von Rindern untersucht.
Das Prinzip der CL-Messung beruht darauf, dass PMN durch Zugabe eines Aktivators angeregt werden, freie Sauerstoffradikale zu produzieren. Die Oxidantien werden dann durch eine weitere Chemikalie in Licht umgewandelt, welches im Luminometer erfasst werden kann. Die Lichtemission wird über einen längeren Zeitraum in
mehreren Einzelmessungen erfasst. Aus den Einzelwerten wird dann das Maximum,
aber auch das Integral der entstehenden Kurve als Ergebnis berechnet.
2.4.4.3.1
Reagenzien
2.4.4.3.1.1
Lumineszierende Stoffe
Für die Messung der CL-Aktivität wird ein Reagenz benötigt, das die Sauerstoffradikalen in Licht umsetzt. Dafür ist der Einsatz von zwei Stoffen üblich: Lucigenin und
33
Literatur
Luminol sind die am besten untersuchten lichtbildenden Chemikalien. Luminol (5amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion) ist eine Substanz, die Licht emittiert, während
sie oxidiert wird (BROLIN u. WETTERMARK 1992).
BENSINGER und JOHNSON stellten 1981 fest, dass bei Anwesenheit von SOD keine luminolabhängige CL-Aktivität mehr messbar ist. Sie schlossen daraus, dass Luminol von Superoxid oxidiert wird. Im Gegensatz dazu kamen DECHATELET et al.
(1982) zu dem Schluss, dass nur die CL-Messung ohne Luminol von Superoxid abhängig ist, da nach Zugabe von SOD keine Aktivität gemessen werden kann. Die
luminolabhängige CL-Aktivität dagegen ist gegenüber SOD unempfindlich, Luminol
infolgedessen vom MPO-System und von Hydrogenperoxid abhängig.
Die Messung der CL-Aktivität mit und ohne Zugabe von Luminol ergibt aus den Proben mit Luminol etwa viermal höhere Werte als aus denen ohne Luminol (WEBER et
al. 1983). Andere Autoren beschreiben, dass in bestimmten Proben eine CL-Aktivität
überhaupt nur mit Zusatz von Luminol zur Probe gemessen werden kann (ALLEN u.
LOOSE 1976).
Die mit Luminol gemessenen Proben haben stets höhere Werte als solche, die mit
Lucigenin gemessen werden (HALLÉN SANDGREN et al. 1991).
MEHRZAD (2002) gibt an, dass mit einer Konzentration von 0,1 mmol/l Luminol die
maximale CL-Antwort während der Messung von PMN aus Blut und aus Milch erreicht werden kann.
2.4.4.3.1.2
Aktivatoren
Die CL-Aktivität wird in vivo durch eine Vielzahl von Partikeln oder Proteinen zur Bildung von freien Sauerstoffmetaboliten angeregt (s. o.). Ebenso vielfältig sind die
Möglichkeiten, diese Reaktion in vitro zu provozieren. Neben der Variante, Bakterien
mit oder ohne opsonisierende Stoffe wie z. B. die Komplement-komponente C3b einzusetzen, gibt es auch einige chemische Substanzen.
34
Literatur
Unter Verwendung von Bakterien werden diese phagozytiert. Das ist der Grund,
weshalb manche Autoren die Messung der CL-Aktivität als Phagozytoseaktivität bezeichnen (ZECCONI et al. 1994).
Chemische Substanzen, die häufig eingesetzt werden, sind fMLP (FormylmethionylLeucyl-Phenylalanin), Ca2+-Ionophore, Zymosan und PMA. Da sie sich in ihrem Wirkungsmechanismus voneinander unterscheiden, differieren auch die Ergebnisse der
CL-Messung.
fMLP ist ein chemotaktisches Peptid, das ebenso wie Zymosan am GTP-bindenden
Protein angreift. Ca2+-Ionophore nehmen direkt Einfluss auf den Calcium-Einstrom in
die Zellen. PMA (Phorbol-Myristat-Acetat) dagegen aktiviert die Protein Kinase C
(ROSSI 1986) und ist daher Calcium-unabhängig (DECHATELET u. SHIRLEY
1982).
Unter Einsatz von fMLP an humanen PMN aus Blut kam es zu einer CLVerlaufskurve mit zwei Peaks (DAHLGREN u. STENDAHL 1982, BRIHEIM et al.
1984), mit PMA zeigte sich nur ein Peak. Erklärt wurde dieses Phänomen damit,
dass der erste Peak der Messung mit fMLP von extrazellulären Reaktionen herrührte, während PMA nur intrazelluläre Reaktionen hervorrief. Ein Vergleich von CaIonophoren mit PMA (DECHATELET et al. 1982) zeigte, dass Ca-Ionophore höhere
CL-Antworten verursachen als PMA.
PMA bringt nur in Anwesenheit von Protein oder Luminol messbare Ergebnisse hervor. DMSO hat keinen Einfluss auf die CL-Messung (WESTRICK et al. 1980).
Nach MEHRZAD (2002) liegt die optimale PMA-Konzentration zwischen 100 und 500
ng/ml für PMN aus Blut und zwischen 100 und 200 ng/ml für PMN aus Milch.
2.4.4.3.2
Geräte
2.4.4.3.2.1
Szintillationsspektrometer
Diese Methode wurde 1972 von ALLEN et al. evaluiert. Zellsuspension, Luminol
(z. T. mit BSA) und ein Aktivator werden, häufig nach Inkubation im Dunkeln (WEBER et al. 1983), im Flüssigszintillationsspektrometer gemessen. In diesem Gerät
35
Literatur
werden Lichtquanten durch zwei Photomultiplier in Elektronen umgewandelt und gezählt. Die Ausgabe des Messergebnisses erfolgt üblicherweise in Impulsen pro Minute (FALBE u. REGITZ 1992). Das Gerät ist im „Out-of-coincidence“-Modus, um eine
höhere Sensitivität zu erzielen (KEHRLI et al. 1989). In diesem Modus genügt es,
wenn einer der zwei Photomultiplier einen Impuls empfängt. Manche Autoren schreiben auch, dass der Coincidence-Modus geeignet sei, in dem Impulse von beiden
Photomultipliern gleichzeitig detektiert werden müssen, da ihre Proben stärker leuchten (ALLEN u. LOOSE 1976; HOEBEN 1999). Um Blindwerte zu erhalten, werden
die Proben zweimal gemessen, bevor der Aktivator hinzugefügt wird. Wahlweise
dient ein Probengefäß ohne Zellen als Blindwert (ROTH u. KAEBERLE 1981). Die
Proben werden in Intervallen von drei bis 16 Minuten gemessen, die Gesamtdauer
der Messung liegt zwischen 20 (DECHATELET u. SHIRLEY 1982) und 170 Minuten
(PAAPE et al. 1990b). Wichtig ist, dass die Messung in einem dunklen Raum stattfindet, die Proben und Reagenzien werden meist vor der Messung bereits auf 37° C
erwärmt (WEBER et al. 1983).
Folgende Autoren wandten diese Technik für ihre Untersuchungen an: KEHRLI et al.
1989, PAAPE et al. 1990a, 1990b, HOEBEN et al. 1997, DOSOGNE et al. 1999
u. a.
2.4.4.3.2.2
Luminometer
Das Gerät verfügt über einen Photomultiplier, mit dem Licht in einer Wellenlänge von
270 – 670 nm detektiert wird. Während des Messvorganges werden Lichtereignisse
erfasst.
EASMON et al. (1980) stellten eine Möglichkeit zu Messung der CL-Aktivität im Luminometer vor. Es sind weniger Zellen in der Probe erforderlich, und die Temperatur
kann im Gerät stabil gehalten werden. Außerdem ist die Durchführung einfacher und
kostengünstiger als im Szintillationsspektrometer.
Um die Untersuchung durchzuführen, werden ebenfalls die Zellsuspension, Luminol
und ein Aktivator gemeinsam in einem Reaktionsgefäß gemessen. Auch hier werden
mehrere Einzelmessungen (z. B. in 30-Sekunden-Intervallen, ANGLE u. KLESIUS
36
Literatur
1983) über einen längeren Zeitraum hinweg durchgeführt. Das Luminometer besitzt
eine lichtdichte Kammer, in der die Temperatur regulierbar ist. Der Raum muss daher
nicht abgedunkelt werden. Üblicherweise wird die Messung bei 37° C durchgeführt
(ANGLE u. KLESIUS 1983; MEHRZAD 2002). Das Ergebnis wird in mV (EASMON et
al. 1980; WILLIAMS et al. 1985) oder als Impulsrate (z. B. HOEBEN et al. 2000a;
MEHRZAD 2002) angegeben. Es werden das Integral der Einzelwerte (z. B. HOEBEN et al. 2000a; MEHRZAD 2002) oder das erreichte Maximum (WILLIAMS et al.
1985) als Endergebnis verwendet.
Die Autoren LOHUIS et al. 1990, KREMER et al. 1993, HOEBEN et al. 2000a, 2000b
und MEHRZAD 2001a, 2002 geben diese Methode in ihren Veröffentlichungen an.
2.4.4.3.3
Einflussfaktoren auf die CL-Messung
Um die tatsächliche Aktivität der PMN zu ermitteln, bedarf es einer bereinigenden
Berechnung. Zunächst muss die Vitalität der Zellen in der Zellsuspension ermittelt
werden. Abgestorbene Zellen in der Probe sollten nicht in die Berechnung der CLAktivität eingehen. Sofern die PMN nicht hochrein vorliegen, muss die CL-Aktivität
der vorhandenen sonstigen Zellarten bekannt sein und deren Anteile rechnerisch
erfasst werden.
2.4.4.3.3.1
Vitalität
MEHRZAD (2002) beschreibt die Bestimmung der Vitalität von isolierten Zellen im
Durchflusszytometer. Vitale Zellen lassen sich mit dem fluoreszierenden Farbstoff
Propidiumjodid nicht anfärben. Im Durchflusszytometer kann die Rotfluoreszenz
durch den entsprechenden Laser bei 650 nm detektiert werden. Auf diese Weise
kann zwischen lebenden (nicht fluoreszierend) und toten Zellen (fluoreszierend) unterschieden werden. SCHRÖDER (2003) wandte diese Methode in ihren Untersuchungen ebenfalls an.
37
Literatur
2.4.4.3.3.2
Makrophagen
Makrophagen in der Zellsuspension aus Milch sind auch in der Lage, Sauerstoffradikale zu produzieren. Im Luminometer kann jedoch keine CL-Aktivität in Makrophagen
nachgewiesen werden (HALLÉN SANDGREN et al. 1991; MEHRZAD 2002).
2.4.4.3.3.3
Eosinophile Granulozyten
Eosinophile Granulozyten sind in der Zellsuspension von Blut stets enthalten, wenn
die Isolation ohne Percoll® durchgeführt wird. Sie sind nicht zum Respiratory Burst
befähigt, besitzen aber ein starkes Eigenleuchten. Die im Luminometer erfasste
Leuchtkraft ist etwa fünf Mal höher als die der angeregten PMN. Deshalb wird der
Anteil des Lichtes, der von eosinophilen Granuolzyten stammt, von dem Gesamtergebnis abgezogen (HEYNEMAN et al. 1990; MEHRZAD et al. 2001b, 2002).
Auch in der Zellsuspension von Milch finden sich gelegentlich eosinophile Granulozyten, deren Leuchten auf die beschriebene Weise berücksichtigt werden muss.
2.5
Vergleich der Zellfunktionalität boviner Abwehrzellen aus Blut und Milch
2.5.1
Unterschiede in der Funktionalität zwischen PMN aus Blut und
Milch
Die Phagozytoseaktivität und die CL-Aktivität sind in Zellen aus Milch im Vergleich zu
denen aus Blutzellen herabgesetzt (DULIN et al. 1988; MEHRZAD et al. 2002). PMN
aus Milch sind schwächere Phagozyten als die aus Blut. Sie phagozytieren Fett und
Kasein aus der Milch und haben daher eine geringere Kapazität, andere Bestandteile
wie Bakterien aufzunehmen (PAAPE et al. 1975, 1979; RUSSELL et al. 1977).
Gründe hierfür liegen darin, dass PMN aus Milch während der Inkubation mit Bakterien aggregieren, da die Fettkügelchen sie aneinander binden (SAAD 1987). Auch
38
Literatur
weitere Untersuchungen bestätigten, dass PMN aus der Milch weniger aktiv sind als
solche aus dem Blut (DULIN et al. 1988; SMITS et al. 1999).
Nicht nur der Anteil phagozytierter Bakterien in aus Milch isolierten PMN ist signifikant niedriger als in PMN aus Blut, sondern auch die Zahl der PMN, die Phagozytose
betreiben (SAAD 1987).
Die Phagozytoseaktivität von Zellen aus Blut und Milch desselben Tieres korreliert
(SAAD 1987), während zwischen den Kühen große Unterschiede bestehen (PAAPE
et al. 1978).
Zellen aus Milch erreichen in der Chemilumineszenzmessung gewöhnlich nur ca. ein
Drittel der Werte der Blutzellen desselben Tieres (WEBER et al. 1983). Ebenso ist
das Verhältnis der CL-Aktivität aus Milchzellen der vier Euterviertel zu der aus Blutzellen relativ konstant, während zwischen verschiedenen Tieren erhebliche Schwankungen bestehen (WEBER et al. 1983).
Auch in anderen Untersuchungen wurde eine hohe Schwankung zwischen verschiedenen Tieren (62,4 – 70,8 % Variationskoeffizient), aber Varianzen zwischen Doppelmessungen derselben Proben von nur 0,05 % beobachtet (SALGAR et al. 1991).
2.5.2
Varianzen in der Zellaktivität von PMN aus Milch
Mit aus Milch isolierten Zellen wurden lebende S. aureus mit unterschiedlichen Anteilen toter S. aureus gemischt (WILLIAMS et al. 1985). Im Phagozytosetest stieg die
Rate der phagozytierten, aber noch lebenden Bakterien an, je mehr tote S. aureus in
der Suspension waren. Dies wurde damit erklärt, dass die PMN mit steigendem Angebot zwar mehr Bakterien aufnehmen, jedoch nicht genügend Kapazität zur Abtötung haben.
Durch die vermehrte Anwesenheit von Opsoninen in entzündeten Eutervierteln wird
die Phagozytoseaktivität von PMN deutlich erhöht (JAIN und LASMANIS 1978;
GUIDRY et al. 1980 ; PAAPE et al. 1981a). Dies deckt sich mit der Vermutung, dass
die unterschiedliche Potenz von Milch zur Unterstützung der Phagozytose mit der
39
Literatur
Mastitisprävalenz in Verbindung gebracht werden kann (s. Tabelle 7) (PAAPE et al.
1978).
Zwischen Zellen aus niedrigzelliger Milch und Zellen aus hochzelliger Milch besteht
ein Aktivitätsunterschied. Nach experimenteller Infektion mit S. aureus stiegen sowohl die Zellzahl als auch die Phagozytosekapazität der Zellen an, der Anteil aktiver
Zellen erhöhte sich von 15 auf 80 % (DALEY et al. 1991).
Nach Infusion einer Salzlösung, die 0,1 % Austernglykogen enthielt, in das Euter
liess sich 11 Stunden später Milch gewinnen, deren PMN 68 % der
32
P-gekoppelten
S. aureus phagozytierten (PAAPE et al. 1977).
Der Vergleich der Zellaktivität von Zellsuspensionen aus infizierten Vierteln, nicht
infizierten Vierteln der gleichen Kühe und aus Vierteln gesunder Kühe zeigte jedoch
keine signifikanten Unterschiede in der Phagozytoseaktivität (FOX und MCDONALD
1988). Untersucht wurden Nachgemelke aus Vierteln, die 14 Stunden vorher mit
Austernglykogen infundiert worden waren. Unterschiede in der Durchführung der
Versuche sind in Tabelle 7 ersichtlich.
2.5.3
Zellfunktionalität in der Frühlaktation von PMN aus Blut und Milch
Die Chemilumineszenzaktivität von aus Milch isolierten PMN ist in der Frühlaktation
signifikant niedriger als in der Mittellaktation (VANGROENWEGHE et al. 2001;
MEHRZAD 2002).
Im Rahmen einer Untersuchung des Peripartalzeitraumes wurden neben der Chemilumineszenzaktivität auch andere Parameter der Zellfunktionalität wie Migration und
antikörperabhängige, zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) aus zirkulierenden PMN in
der Peripartalperiode untersucht (KEHRLI et al. 1989) und eine Aktivitätserhöhung
zwei Wochen vor der Geburt beobachtet, der ein dramatischer Abfall der Abwehrkapazität in der Woche post partum folgte. In einer ähnlichen Untersuchung wurde
festgestellt, dass die CL-Aktivität in Woche 2 post partum ihr Minimum erreichte, ab
Woche 3 post partum wieder anstieg, um 6 Wochen post partum wieder ihre Ursprungswerte zu erreichen (HOEBEN et al. 2000a). Die genannten Untersuchungen
40
Literatur
wurden an aus Blut isolierten PMN durchgeführt. In aus Blut und aus Milch isolierten
PMN kann in der Peripartalperiode eine minimale CL-Aktivität an Tag 2 post partum
in beiden Probenarten beobachtet werden (MEHRZAD et al. 2002).
2.5.4
Einfluss des Stoffwechsels auf die Funktionalität von Zellen aus
Blut und Milch
Mit steigender Progesteronkonzentration sinkt die Reduktion von NitroblauTetrazolium und damit die Bildung freier Sauerstoffradikale (ROTH et al. 1983).
Der Einfluss von Ketonkörpern auf die Phagozytoseaktivität von Makrophagen und
PMN aus Milch und von PMN aus Blut wurde ebenfalls untersucht (KLUCIŃSKI et al.
1988) und festgestellt, dass Makrophagen stark, PMN weniger stark in ihrer Aktivität
eingeschränkt werden. Die Zellfunktionalität von PMN aus Milch wurde durch ßHydroxybuttersäure schon in subketotischen Konzentrationen gesenkt. Dieser Umstand mag dazu beitragen, dass Kühe in der Postpartalperiode eine höhere Empfänglichkeit für Mastitiden haben (HOEBEN et al. 1997).
Das Auftreten einer postpartalen Hypokalzämie scheint jedoch die zelluläre Immunitätslage nicht zu beeinflussen (KEHRLI u. GOFF 1989).
2.5.5
Zellfunktionalität von PMN aus Blut und Milch im Zusammenhang
mit Mastitiden
Im Rahmen einer Untersuchung über den Zusammenhang zwischen der Zellzahl, der
bakteriologischen Untersuchung und der CL-Aktivität an 4.883 Viertelgemelksproben
wurde eine starke Korrelation zwischen der Zellzahl und der CL-Aktivität festgestellt
(LILIUS u. PESONEN 1990). Die Anwesenheit von minoren Pathogenen verursachte
einen 7-fachen Anstieg von SCC und CL-Aktivität, während mit majoren Pathogenen
in der Probe die Zellzahl um das 14-fache und die CL-Aktivität um das 25-fache anstiegen.
41
Literatur
In einem anderen Versuch wurden 12 Kühe kurz nach der Kalbung mit E. coli infiziert
(DOSOGNE et al. 1997). Einige Tiere hatten prae infectionem eine hohe Leukozytenzahl im Blut und entwickelten eine schwächere Mastitis als die Tiere mit geringerer Leukozytenzahl. Die Ersteren wurden als moderat (M), die anderen als schwer
(S) erkrankt bezeichnet. Die S-Tiere hatten drei Tage lang eine herabgesetzte CLAntwort von aus Blut isolierten PMN, die M-Tiere nur einen Tag. Die CL-Aktivität vor
der Infektion hatte keinen Einfluss auf die Schwere der Mastitis. Zu gleichen Ergebnissen kamen auch schon KREMER et al. (1993).
Auch im Rahmen einer ausführlichen Untersuchung über E. coli-Mastitiden mit Kühen in der Postpartalphase wurden die Tiere in moderat (M) und schwer (S) Erkrankende eingeteilt (VANDEPUTTE-VAN MESSOM et al. 1993). Neben der ROSKapazität von PMN aus Blut wurden auch klinische Symptome, Milchmengenverluste
und Veränderungen in der Milchkomposition registriert. Eine besonderer Schwerpunkt lag auch hier im Zustand des Immunsystems vor der Infektion.
Allgemeiner wurde beschrieben, dass die Zellfunktionalität vor einer Infektion mit E.
coli ausschlaggebend für die Schwere der Mastitis war (LOHUIS et al. 1990). Die
Autoren testeten dies an aus Blut gewonnenen PMN mittels Migration, Chemotaxis,
Phagozytose und Chemilumineszenz.
Eine intramammäre LPS-Injektion nimmt Einfluss auf die CL-Aktivität von aus Blut
und aus Milch isolierten PMN (MEHRZAD et al. 2001a). Der Anstieg der CL-Aktivität
in PMN aus Milch war so hoch, dass die aus Blut gewonnenen Werte übertroffen
wurden. Im Blut kam es zu einem biphasischen Anstieg mit minimalen Werten ca.
acht Stunden post infectionem.
42
Literatur
2.5.6
Einfluss verschiedener Antibiotika auf die Zellfunktionalität von
PMN aus Blut und Milch
Einige Autoren untersuchten den Einfluss von Antibiotika auf immunologische Parameter wie Phagozytose, NTB-Reduktion oder Chemilumineszenz (PAAPE et al.
1990a, 1990b; HOEBEN et al. 1998, 2000a). Im Vergleich von Florfenicol, Chloramphenicol und Thiamphenicol wurde nur für Chloramphenicol eine hemmende
Wirkung festgestellt (PAAPE et al. 1990a). In einer weiteren Untersuchung wurde
entdeckt, dass Tetrazyklin und Gentamicin die Phagozytoseaktivität hemmten, und
Tetrazyklin darüber hinaus auch die CL-Aktivität zum Erliegen brachte (PAAPE et al.
1990b). Beide Untersuchungen wurden an aus Milch isolierten Zellen durchgeführt.
Von den untersuchten Antibiotika Ampicillin, Cloxacillin, Dihydrostreptomycin, Doxycyclin, Lincomycin, Neomycin und Oleandomycin hatte nur Cloxacillin keinen Einfluss
auf die Messung der Chemilumineszenz von aus Blut isolierten PMN (HOEBEN et al.
1998). Die Herabsetzung der CL-Aktivität durch Oleandomycin, Neomycin, Lincomycin und Dihydrostreptomycin war jedoch auf eine Hemmung der Lichtproduktion zurückzuführen, etwa durch Interferenzen zwischen Luminol und dem MPO-System.
Auch bezüglich Doxycyclin lag der niedrigeren CL-Aktivität nur teilweise eine gesunkene Superoxidbildung zugrunde. Nach HOEBEN et al. (2000a) hat die Behandlung
der Tiere mit Enrofloxacin während einer E. coli-Mastitis keinen Einfluss auf die CLAktivität zirkulierender PMN.
2.5.7
Immunologische Ansatzpunkte zur Prävention von Mastitiden
In einer Studie über hochleistende Kühe wurde festgestellt, dass Tiere mit einer hohen Milchleistung signifikant mehr zirkulierende PMN und mononukleäre Zellen im
Blut hatten. Diese PMN wiesen ebenfalls eine höhere Chemilumineszenzaktivität und
eine stärkere gerichtete Migration auf (DETILLEUX et al. 1995).
Schon 1964 wurde in einer Untersuchung beobachtet, dass sieben Euterviertel mit
einer Zellzahl über 200.000 / ml Milch gegen eine experimentelle Infektion mit Aerobacter aerogenes geschützt waren (SCHALM et al. 1964). Ein achtes Viertel, das
43
Literatur
nach der Infektion nur 50.000 Zellen / ml Milch aufwies, entwickelte eine akute Mastitis. Dies deckt sich mit der Beobachtung (SCHALM et al. 1966), dass die Etablierung
einer künstlichen Infektion mit Streptococcus agalactiae im Euter von der Immunantwort abhängig ist. Viertel mit einer höheren Zellzahl (200.000 bis 500.000 Zellen / ml
Milch) waren gegen eine erneute Infektion geschützt, während die Viertel mit einer
um 12 bis 24 Stunden verzögerten zellulären Reaktion gefährdet waren, eine chronische Mastitis zu entwickeln. Auch im Jahr 2000 wurden niedrige Zellzahlen in der
Milch mit einem gesteigerten Risiko für klinische Mastitiden in Verbindung gebracht
(SURIYASATHAPORN et al. 2000).
Einige Untersucher suchten deshalb nach Wegen, die Zellzahl in der Milch dauerhaft
zu erhöhen, um damit einen Schutz vor Infektionen zu erlangen. Das Setzen eines
Reizes erhöht die Zellzahl im Sinne einer Stimulation des Immunsystems. Austerglykogen, das in anderen Bereichen als chemotaktisches Agens dient, wurde in jeweils
ein Euterviertel von sechs gesunden Kühen infundiert. Nach elf Stunden konnte ein
vierfacher Anstieg der Zellzahl aus diesem Euterviertel festgestellt werden. Die daraus isolierten Zellen waren phagozytotisch hoch aktiv (PAAPE et al. 1977).
In den 80er Jahren führte PAAPE mit seinen Kollegen mehrere Versuche über das
Einbringen von kunststoffbeschichteten Spiralen (Intramammary Device = IMD) in
das Euterlumen durch. Ein IMD verursacht als Fremdkörper eine chronische Entzündungsreaktion und damit wiederum erhöhte Zellzahlen in der Milch. 1981 wurden
Tiere untersucht, bei denen 2 Euterviertel mit einem IMD versehen waren. Die Zellzahl in diesen Vierteln stieg rasch an und stabilisierte sich etwa 50 % über der der
anderen Viertel. Die Milchleistung und die Anteile von Fett und Protein in der Milch
veränderten sich nicht. Nach der Injektion von Endotoxin in das Euter stieg die Zellzahl in den Vierteln mit IMD auf 4,3 Millionen Zellen / ml und in den Vierteln ohne
IMD auf 1,8 Millionen Zellen / ml Milch. Nachdem die Viertel mit S. aureus infiziert
waren, entwickelten 9 von 10 unbehandelten und 5 von 10 behandelten Vierteln eine
Mastitis (PAAPE et al. 1981b).
44
Literatur
In einer späteren Untersuchung dagegen manifestierte sich mit gleichem Versuchsaufbau in allen Vierteln eine Infektion mit S. aureus (SCHULTZE u. PAAPE
1984).
Der Einfluss von rekombinantem bovinem IFN-γ auf die Aktivität von PMN aus Milch
wurde ebenfalls untersucht (SORDILLO u. BABIUK 1991). Parameter der Zellaktivität
waren in dieser Untersuchung die Phagozytose, die bakterizide Aktivität und die CLAktivität. Ein Teil der PMN wurde nochmals in Milch inkubiert, ein Teil in Puffer: Nach
Behandlung mit IFN-γ zeigten beide Gruppen deutlich stärkere Aktivitäten (s. Tabelle
7).
2.6
Zielsetzung der eigenen Untersuchungen anhand
des aktuellen Forschungsstandes
Funktionalitätsuntersuchungen aus Milchzellen sind in der Literatur kaum beschrieben, sodass keine fest etablierten Verfahren zur Verfügung stehen. Aus diesem
Grund wurden veröffentlichte Methoden zur Bestimmung der Phagozytoseaktivität
und der CL-Aktivität auf das Medium Milch übertragen und teilweise modifiziert.
Im Versuchsteil wurde zunächst versucht, die Interpretationsmöglichkeiten funktioneller Parameter zu definieren, da zu dieser Fragestellung bisher wenig Daten publiziert
wurden. Dazu sollten klassische Entzündungsparameter wie die Zellzahl in Milch mit
immunologischen Parametern in einen Zusammenhang gebracht und festgestellt
werden, welche Gemeinsamkeiten und welche Unterschiede zwischen den Ergebnissen der beiden Parametergruppen bestehen.
Weiterhin wurde nach Grenzwerten gesucht, die dazu beitragen, den Gesundheitszustand eines Euterviertels zu beschreiben. Einige Studien beschäftigten sich mit der
zellulären Reaktion in einem Euterviertel auf einen spezifischen Reiz, z. B. Endotoxin
oder verschiedenen Bakterien. Auch der Einfluss einer Antibiose auf die CL-Aktivität
wurde mehrfach untersucht. Hierbei wurden hauptsächlich Fragestellungen zum Ablauf perakuter Infektionen bearbeitet. Ergänzend dazu wurde in der vorliegenden Ar-
45
Literatur
beit die Zellaktivität von Tieren mit chronischen, subklinischen Mastitiden unter moderat erhöhten Zellzahlen bestimmt.
Die gegenseitige Beeinflussung der Euterviertel eines Tieres wurde in Veröffentlichungen kaum thematisiert. SCHRÖDER (2003) machte zu dieser Frage erstmalig
Angaben hinsichtlich Zellmorphologie und Zelldifferenzierung, welche in der vorliegenden Studie aufgegriffen und auf funktionelle Eigenschaften von Milchzellen erweitert wurden.
46
3.
Material und Methoden
3.1
Versuchstiere
Für die methodischen Versuche mit Blutzellen (Abschnitte 3.9.1 und 3.9.2) wurden
Tiere der Klinik für Rinder und der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe des Rindes der Tierärztlichen Hochschule Hannover beprobt. Die übrigen Versuche (Abschnitte 3.9.3 – 3.9.5) wurden mit Kühen des Lehr- und Forschungsguts Ruthe der
Tierärztlichen Hochschule Hannover (Betrieb 1) und des Landwirtes Thomas Meldau
in Adelheidsdorf (Betrieb 2) durchgeführt.
3.1.1
Versuchstiere für die methodischen Versuche
Die Blutproben für die Versuche zur CL-Aktivität wurden von vier Versuchstieren, die
der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover gehören, gewonnen.
Diese Rinder waren ovariektomiert und laktierten daher nicht.
Tier 1 = Ohrmarke Nr. 07412
Tier 2 = Ohrmarke Nr. 62973
Tier 3 = Ohrmarke Nr. 07411
Tier 4 = Ohrmarke Nr. 07409
Für die methodischen Versuche zur Phagozytoseaktivität standen diese klinikeigenen Tiere nicht zur Verfügung. Statt dessen wurden Patienten der Klinik für Rinder
der Tierärztlichen Hochschule Hannover zufällig ausgewählt und beprobt.
3.1.2
Betrieb 1
Das Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover hatte
eine Herde mit ca. 80 laktierenden Tieren (Deutsche Holstein Farbrichtung Schwarzbunt), die eine durchschnittliche Jahresleistung von etwa 9.500 kg aufwies. Die Herde war in zwei Gruppen aufgeteilt, eine Gruppe im konventionellem Melksystem und
47
Material und Methoden
eine Gruppe im automatischen Melksystem. Im konventionellen Melksystem wurde
zweimal täglich von 4.30 – 6.30 Uhr und von 14.30 – 16.30 Uhr in einem DoppelVierer Autotandem Melkstand der Firma DeLaval gemolken, während im automatischen Melksystem (VMS) ein Melkroboter des gleichen Herstellers rund um die Uhr
betriebsbereit war. Hier kamen die Kühe (im Rahmen bestimmter Mindest- und
Höchstintervalle) in einem individuellen Rhythmus zum Melken. Die Gruppe aus dem
konventionellen Melksystem war in einem Tiefstreustall mit Fressgitter untergebracht,
die Gruppe des VMS stand im Boxenlaufstall auf Spaltenboden, ein Fressgitter war
auch hier vorhanden. Das Grundfutter wurde in Form einer aufgewerteten Mischration verabreicht, das Kraftfutter stand über eine Transponderfütterung am Kraftfutterautomaten zur Verfügung. Wasser wurde ad libitum angeboten.
3.1.3
Betrieb 2
Der Landwirt Thomas Meldau molk täglich etwa 80 Kühe der Rasse Deutsche Holstein Farbrichtung Schwarzbunt um 5.30 Uhr und um 17 Uhr (durchschnittliche Jahresleistung: ca. 8.000 kg) in einem Doppel-Sechser Fischgrätenmelkstand der Firma
Westfalia. Seine Tiere wurden in einem Boxenlaufstall mit Spaltenboden gehalten
und hatten im Sommer tagsüber Weidegang. Zum Grundfutter aus Grassilage wurde
ergänzend Kalk und Mineralfutter angeboten, das Kraftfutter wurde wiederum über
einen Automaten verabreicht. Wasser stand ad libitum zur Verfügung.
3.2
Probenahme
3.2.1
Blut
Nach Anlegen der Staukette wurde die zu punktierende Hautstelle mit Alkohol gereinigt und aus der gestauten V. jugularis die gewünschte Blutmenge im Vacutainersystem entnommen.
Für die methodischen Versuche wurde EDTA-Blut in unterschiedlichen Mengen verwendet. Pro Tier 30 ml ETDA-Blut und 10 ml Blutserum benötigt.
48
Material und Methoden
Die Blutentnahme an den Tieren aus dem Betrieb 1 erfolgte nach dem Melken und
an den Tieren aus dem Betrieb 2 unmittelbar davor. Während des Transports und bis
zur weiteren Verarbeitung wurden die Proben kühl gelagert.
3.2.2
Milch
Von den zu untersuchenden Tieren wurden aus jedem funktionellen Viertel Milchproben entnommen. Dabei wurden pro Viertel drei unterschiedliche Fraktionen gewonnen:
Vorgemelk
Viertelanfangsgemelk
Viertelhandgemelk
Die Probeentnahme fand während der Morgenmelkzeit statt, die der Tiere aus Betrieb 1 / Gruppe VMS entsprechend zur Morgenmelkzeit der konventionellen Gruppe.
Von diesen Tieren wurden die Proben gelegentlich aus betriebstechnischen Gründen
ca. eine Stunde später genommen.
Der Transport der Proben erfolgte zügig und bei Bedarf mit Kühlung durch Kühlelemente zum Institut, wo sie bis zur weiteren Verwendung bei 4° C aufbewahrt wurden.
3.2.2.1
Vorgemelk
Im Melkstand wurden die ersten Milchstrahlen des unstimulierten Euterviertels mit
dem Leitfähigkeitsmessgerät Mastitron® aufgefangen und ihre Leitfähigkeit bestimmt.
3.2.2.2
Viertelanfangsgemelk (VAG)
Die Zitze und das Euter wurden zunächst trocken gereinigt und anschließend desinfiziert. Dafür wurde Haushaltspapier, das mit 70 %igem Alkohol getränkt war, verwendet. 10 ml Milch wurden in ein steriles Glasröhrchen gemolken, das umgehend
wieder verschlossen wurde.
49
Material und Methoden
Tier
Milch
VAG
Blut
VGH
NAGase
Chemische
Mikroskop.
Zellisolierung
(Versuch 3)
Labordiagnostik
Zelldiff.
el.
Leitfähigkeit
Somatische
NAGase
Zellzahl
(Versuch 3)
Mikroskop.
Zelldiff.
Vitalität
Mikrobiologie
Phagozytose
(Versuche 1&2)
Chemilumineszenz
Abbildung 2: Untersuchungen aus Blut- und Milchproben
3.2.2.3
Viertelhandgemelk (VGH)
Im Anschluss an die Entnahme des VAG erfolgte die Gewinnung des Viertelhandgemelkes in sterilen Babyflaschen (250 ml). In der Regel wurde je Viertel eine Babyflasche Milch ermolken, für Versuch 3 wurden zwei Flaschen (500 ml) je Euterviertel
benötigt.
Die durchgeführten Untersuchungen aus den Blut- und Milchproben sind in Abbildung 2 dargestellt.
50
Material und Methoden
3.3
Allgemeine Probenanalyse
3.3.1
Geräte
Autoklav Varioklav® Dampfsterilisator
H + P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim
Blutanalysegerät Hematology Analyzer,
NIHON KOHDEN, Bad Homburg
Modell MEK – 6108G für
Veterinärmedizin
Elektrische Zählhilfe
®
Karl Hecht Assistent GmbH, Altnau TG,
Assistent Counter AC – 8
Schweiz
Fluorometer Fluoroscan®
Labsystems, Helsinki/SF
Fossomatic®
Foss Electric, Dänemark
Hamburg MS 1 Minishaker IKA®
Landgraf Laborgeräte OHG, Langenhagen
Heidolph Reax top
Landgraf Laborgeräte OHG, Langenhagen
Heißluftsterilisator
Rubarth Apparate GmbH, Hannover
Kühlzentrifuge Sigma® 4K-1
Sigma, Osterode
Leitfähigkeitsmessgerät Mastitron®
Milku, Uelzen
plus V
Lichtmikroskop Zeiss Axiolab
Zeiss, Oberkochen
Staukette nach Hauptner
Eickemeyer, Tuttlingen
Sterildrucktopf
Millipore Corporation, Bedford/USA
Wärmeschrank
Memmert, Schwabach
51
Material und Methoden
3.3.2
Glas- und Einmalartikel
Glas- und Einmalartikel sind für alle Methoden an dieser Stelle beschrieben.
Eindrückstopfen farblos
Sarstedt AG (65.793), Nümbrecht
Einmalösen 10 µl
Landgraf Laborgeräte OHG
(02P1621403), Langenhagen
Filtrationseinheit,
Sarstedt AG (83.1826.001), Nümbrecht
Porengröße 0,2 µm
Glasflaschen Duran® mit
Landgraf Laborgeräte OHG (11 21 85117,
Schraubverschluss
11 21 85144 und 11 21 85173),
50 ml, 500 ml und 5 l
Langenhagen
Kanülen Precision Glide™ 38 mm,
Becton Dickinson (360215), Heidelberg
20 G 1 ½’’, steril
Messpipetten 10 ml Brand, aus Glas
Landgraf Laborgeräte OHG
(14 49 12758), Langenhagen
Milchflaschen 250 ml Jenaer Glas
Schott (3501), Mainz
Objektträger 76 x 26 mm
IDL (190000004), Nidderau
Pasteurpipetten aus Glas, 10 ml
Anfertigung von Landgraf Laborgeräte
OHG, Langenhagen
Reagenzglas Duran® 10 ml
Schott Glaswerke, Mainz
Röhrchen, 15 ml und 50 ml
Sarstedt AG (62.554.502 und 62.547.254),
Nümbrecht
Röhrchen, 13 ml
Sarstedt AG (55.468), Nümbrecht
Safe-Lock-Tubes 1,5 ml
Eppendorf (0030120.086), Hamburg
(Eppendorf Reaktionsgefäße)
52
Material und Methoden
Standardtips,
Eppendorf, Hamburg
2 – 200 µl
0030 000.870
50 – 1000 µl
0030 000.919
1 – 5 ml
0030 000.978
Transferpipetten 3,5ml
Sarstedt AG (86.1171.010), Nümbrecht
Vacutainer Adapters™
Becton Dickinson (364887), Heidelberg
Vacutainerröhrchen™, 7 ml,
Becton Dickinson (367655), Heidelberg
mit 0,084 ml 0,34 M EDTA
Vacutainerröhrchen™, 10 ml,
Becton Dickinson (368430), Heidelberg
ohne Zusatz
3.3.3
Reagenzien
Bronopol
Merck Eurolab GmbH (8.17017.0250),
Darmstadt
Ethanol 94 % Vol, denaturiert
CG Chemikalien, Laatzen
(Brennspiritus)
Färbesystem Hemacolor
Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Fixierlösung
Nr. 1.11955.2500
Farbreagenz rot
Nr. 1.11956.2500
Farbreagenz blau
Nr. 1.11957.2500
Immersionsöl für Mikroskopie
Merck Eurolab GmbH (1.04699.0100),
Darmstadt
53
Material und Methoden
3.3.4
Medien, Puffer und Lösungen
3.3.4.1
Ethanol für die Desinfektion
Zur Desinfektion der Zitzen und Punktionsstellen wurde 70 %iger Alkohol verwendet,
hergestellt aus 700 ml Brennspiritus und Aqua (A.) monodest. ad 1 l.
3.3.4.2
Fixationslösung zur Zellzahlbestimmung aus Milch
Um die Milchproben zur Zellzahlbestimmung zu fixieren, wurden 60 µl Bronopol (10
mg / ml) pro 10 ml Milch eingesetzt.
3.3.4.3
Färbelösungen für mikroskopische Untersuchungen
Die Lösungen aus dem Färbesystem Hemacolor® lagen gebrauchsfertig vor.
3.3.5
Blut
3.3.5.1
Leukozytenzahl (WBC)
Im klinischen Labor der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover
wurde aus den Blutproben der Versuche 1 und 3 die Leukozytenzahl im Gerät Hematology Analyzer bestimmt.
3.3.5.2
Mikroskopische Zelldifferenzierung
3.3.5.2.1
Herstellen und Färben eines Ausstriches
Zur Erstellung eines Differentialzellbildes wurden 10 µl gründlich geschwenktes
EDTA-Blut auf dem rechten Rand eines Objektträgers aufgetragen. Mit der Kante
eines zweiten Objektträgers wurde dieser Tropfen gleichmäßig von rechts nach links
ausgestrichen. Nach Lufttrocknung erfolgte die Färbung mit dem Färbesystem Hemacolor® (Firma Merck Eurolab). Dabei wurde der Ausstrich nacheinander jeweils
54
Material und Methoden
etwa 5 bis 8 Sekunden in die Lösungen 1, 2 und 3 getaucht und anschließend unter
einem dünnen Wasserstrahl abgespült.
3.3.5.2.2
Differenzieren des Ausstriches
Nachdem der Ausstrich vollständig getrocknet war, konnte er unter dem Lichtmikroskop Axiolab beurteilt werden. 100 Zellen wurden mit 1000facher Vergrößerung unter
Ölimmersion und mit einer Zählhilfe beurteilt. Zur Erhöhung der statistischen Sicherheit wurden für die Versuche 1 bis 3 jeweils 300 Zellen differenziert.
3.3.6
Milch
3.3.6.1
Bakteriologie
10 µl VAG wurden mit einer Einmalöse auf der halben Fläche einer Blutagarplatte
(Schafblut mit Aeskulin) ausgestrichen. Nach 24 und 48 Stunden Bebrütung bei
37° C wurden die gewachsenen Kolonien nach kulturellen, mikroskopischen und ggf.
biochemischen Gesichtspunkten beurteilt. Im Bedarfsfall erfolgte eine Subkultivierung einzelner Kolonien. Die Diagnose ergab sich aus der zusammenfassenden Interpretation aller vorhandenen Befunde.
3.3.6.2
Zellzahlbestimmung
Nach der Entnahme der Proben für die mikrobiologische Untersuchung und die
NAGase-Bestimmung wurde das VAG mit 60 µl Bronopol fixiert und bei 4° C gelagert. Der Gehalt somatischer Zellen (Somatic Cell Count = SCC) in der Milchprobe
wurde mit dem Gerät Fossomatic® im Zentrum für Tiergesundheit, Milch und Lebensmittelanalytik des Ahlemer Instituts der Landwirtschaftskammer Hannover bestimmt.
55
Material und Methoden
3.3.6.3
NAGase
Für diese Untersuchung wurde 1 ml des VAG verwendet, das bis zur Messung in
einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß eingefroren war.
Die Aktivität des Enzyms NAGase (N-Acetyl-ß-D-glucosaminidase) wurde nach dem
von KITCHEN et al. (1978) und NOGAI et al. (1996) evaluierten Nachweisverfahren
im Fluorometer bestimmt. Die Messung basiert auf dem Prinzip, dass das Enzym
NAGase in der Lage ist, das nichtfluoreszierende Substrat 4-Methyl-Umbelliferyl-NAcetyl-ß-D-Glucosaminidin (4-MeUNAG) in N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und in die
fluoreszierende Substanz 4-Methyl-Umbelliferon (4-MeU) zu hydrolisieren. Die Stärke der Fluoreszenz wird im Fluorometer Fluoroscan® erfasst und in der Einheit nmol
× min-1 × ml-1 angegeben.
Die Bestimmung der NAGase-Aktivität erfolgte im VAG, im VGH und im Blutserum
(Versuch 3).
3.4
Zellisolierung und mikroskopische Zelldifferenzierung der Zellsuspensionen
3.4.1
Geräte
Analysenwaage Sartorius analytic
Sartorius, Göttingen
Aqua dest. Aufbereitungsanlage
Gesellschaft für Labortechnik, Hannover
GFL-Wasserdestillierapparat (Metall)
Autoklav Varioklav® Dampfsterilisator
H + P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim
Blutanalysegerät Hematology Analyzer,
NIHON KOHDEN, Bad Homburg
Modell MEK – 6108G für
Veterinärmedizin
Eismaschine Typ UBE 30-10
Ziegra, Isernhagen
56
Material und Methoden
Elektrische Pipettierhilfe
Hirschmann® Laborgeräte, Eberstadt
pipetus® - akku
Elektronische Mehrkanalpipette
Eppendorf, Hamburg
Response® 4850, 20 – 200 µl
Hamburg MS 1 Minishaker IKA®
Landgraf Laborgeräte OHG, Langenhagen
Heißluftsterilisator
Rubarth Apparate GmbH, Hannover
Kühlzentrifuge Omnifuge 2.0RS
Heraeus Sepatech, Hanau
Multipette® plus
Eppendorf, Hamburg
Pipetten Eppendorf Research®,
Eppendorf, Hamburg
einstellbar von 500 – 5000 µl,
100 – 1000 µl, 20 – 200 µl
Pipetten Eppendorf Research®,
Eppendorf, Hamburg
Fixvolumen 50µl, 10 µl
Präzisionswaage Mettler P 1200
Spoerhase AG, Gießen
Quarzdestillierapparat Destamat®
Heraeus, Hanau
Sterildrucktopf
Millipore Corporation, Bedford/USA
Zentrifuge für Deckgläschen
Eigenbau der ZA Hygiene und Technolo-
(„Kaffeemühle“)
gie der Milch (M. Krückeberg) auf Basis
einer drehzahlgesteuerten Krups Kaffeemühle, Hannover
57
Material und Methoden
3.4.2
Glas- und Einmalartikel
Deckgläschen 18 x 18 mm
IDL (190001818), Nidderau
Weitere verwendete Glas- und Einmalartikel sind in Abschnitt 3.3.2 beschrieben.
3.4.3
Reagenzien
Albumin, bovin, Fraktion V,
Life Technologies™ (11018-017),
98 % pulverisiert
Karlsruhe
(BSA, bovines Serumalbumin)
DPBS (Dulbecco´s Phosphatge-
Life Technologies™ (14 287-080),
pufferte Kochsalzlösung) mit Glucose,
Karlsruhe
Ca2+ und Mg2+, 500 ml
Einbettmittel Corbit®
I. Hecht, Kiel – Hassesee
Färbesystem Hemacolor
Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Fixierlösung
Nr. 1.11955.2500
Farbreagenz rot
Nr. 1.11956.2500
Farbreagenz blau
Nr. 1.11957.2500
Immersionsöl für Mikropskopie
Merck Eurolab GmbH (1.04699.0100),
Darmstadt
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Sigma Aldrich Chemie GmbH (1000 – 3),
(PBS), pH 7,4 ohne Ca ++/Mg ++
3.4.4
Puffer und Lösungen
3.4.4.1
Phophatgepufferte Kochsalzlösung
Ein Beutel PBS-Trockensubstanz wurde in 1 l A. tridest. gelöst. Der pH-Wert betrug
7,4.
58
Material und Methoden
Bestandteile:
NaCl
137,0 µmol / ml
KCl
2,7 µmol / ml
Na2HPO4
8,1 µmol / ml
KH2PO4
1,12 µmol / ml
Zur Herstellung des doppelt konzentrierten PBS (2 x PBS) wurde die doppelte Menge PBS in 1 l A. tridest. gelöst.
Vor Gebrauch wurde der Puffer autoklaviert und kühl gelagert.
3.4.4.2
Nährlösung
750 mg BSA wurden abgewogen und mit DPBS ad 10 g gebracht. Diese Lösung
wurde, nachdem das BSA vollständig gelöst war, durch einen 0,2 µm-Filter sterilfiltriert und anschließend bei 4° C aufbewahrt.
Zu 28 ml DPBS wurden 2 ml der BSA-Stammlösung gegeben. Die Lösung wurde auf
Eis aufbewahrt, sie wurde an jedem Versuchstag neu hergestellt und unter sterilen
Bedingungen behandelt.
3.4.5
Blut
3.4.5.1
Zellisolierung
Die Proben und alle Lösungen wurden bis zum Abschluss der Untersuchungen auf
Eis gelagert. Sämtliche Lösungen, Glas- und Einmalartikel wurden vor Gebrauch im
Autoklaven sterilisiert. Die Proben wurden unter sterilen Kautelen behandelt.
3.4.5.1.1
Entfernen von Plasma und Buffy Coat
22,5 ml EDTA-Blut wurden in ein 50 ml-Röhrchen gegeben und 15 Minuten bei
1000xg und 4° C ohne Bremse zentrifugiert. Nach dem Stillstand der Zentrifuge wurden die Proben erschütterungsarm entnommen. Plasma, Buffy Coat und etwa ein
Drittel der Erythrozyten wurden mit einer Pasteurpipette aus Glas vorsichtig abge-
59
Material und Methoden
nommen und verworfen. 1 ml Plasma wurden für die spätere Anfertigung der Milchzellausstriche (siehe 3.4.6.2.1) in einem Eppendorf Reaktionsgefäß auf Eis gelagert.
Nun erfolgte die Zugabe von etwa 30 ml PBS zum Sediment. Nach sanftem Schwenken wurden die Proben nochmals zentrifugiert (s. o.), Überstand, Buffy Coat und etwa die Hälfte der Erythrozyten wurden wie beschrieben entnommen.
3.4.5.1.2
Lyse der Erythrozyten
Durch Rütteln wurde das Sediment vom Boden gelöst.
Jeweils 20 ml A. tridest. bzw. doppelt konzentriertes PBS (2 x PBS) wurden in einem
50 ml-Glasfläschchen vorgelegt. Das vorbereitete A. tridest. wurde nun zur Probe
gegeben, die daraufhin 20 Sekunden sanft geschwenkt wurde. Im Anschluss erfolgte
die Zugabe des 2 x PBS.
Nach einem 10-minütigen Zentrifugationsgang bei 1000xg und 4° C mit automatischer Bremse konnte der Überstand abgegossen und verworfen werden. Das entstandene Zellpellet wurde aufgerüttelt und erneut lysiert.
Diese zweite und die darauf folgende dritte Lyse erfolgten nach dem gleichen Verfahren wie die erste. Es wurden aber nur noch je 10 ml A. tridest. und 2 x PBS verwendet. Nach der dritten Lyse erschien das Pellet reinweiß.
3.4.5.1.3
Waschen der PMN
Nach der Lyse wurde das Pellet aufgerüttelt und mit 10 ml PBS versetzt, bevor der
Waschgang (5 Minuten) bei 1000xg und 4° C mit Bremse stattfand. Nach Verwerfen
des Überstandes wurde das Zellpellet mit 500 µl Nährlösung in ein 1,5 mlReaktionsgefäß
überführt. Durch Nachspülen des 50 ml-Röhrchens mit 500 µl Nährlösung konnten
anhaftende Zellen gewonnen werden.
60
Material und Methoden
3.4.5.2
Mikroskopische Differenzierung der Blutzellsuspension
Aus der unverdünnten Zellsuspension wurde ein Ausstrich angefertigt und mikroskopisch differenziert, so wie unter 3.3.5.2 für Vollblut beschrieben. Die Zahl der differenzierten Zellen betrug stets 300.
3.4.5.3
Bestimmung der Zellkonzentration
Die Bestimmung der Konzentration aus den Zellsuspensionen erfolgte im Hematology Analyzer.
50 µl der Suspension wurden angesaugt, mit isotonischer Lösung verdünnt und nach
dem Prinzip der Impedanzmessung mit Hilfe von Kapillaren gezählt.
Nach einmaliger Bestimmung der Konzentration in der Ausgangssuspension wurde
diese bei Bedarf mit Nährlösung in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß verdünnt, bis die
gewünschte Arbeitskonzentration von 4 x 106 Zellen / ml erreicht war. Anschließend
wurde die tatsächliche Konzentration der Arbeitslösung durch eine Zweifachmessung
überprüft.
3.4.5.4
Bakteriologie
Zur Bestimmung der Zellfunktionalität war es wichtig, dass die Proben bis zum Beginn der Untersuchungen steril waren. Die Keimfreiheit der Probe wurde mittels Kultivierung auf einer Blutagarplatte überprüft, wie in Abschnitt 3.3.6.1 beschrieben.
Diese Untersuchung fand jeweils mit den Zellsuspensionen Blut und der Nährlösung
aus den methodischen Versuchen und Versuch 3 statt. Für die Versuche 1 und 2
wurden diese Proben stichprobenartig auf Keimfreiheit untersucht.
61
Material und Methoden
3.4.6
Milch
3.4.6.1
Zellisolierung
Auf durchgehende Eiskühlung der Proben und aller Lösungen bis zum Abschluss der
Untersuchungen wurde geachtet. Es wurden nur autoklavierte Lösungen, Glas- und
Einmalartikel benutzt. Die Behandlung der Proben erfolgte unter sterilen Kautelen.
3.4.6.1.1
Gewinnung des Milchsediments
200 ml Milch und 200 ml PBS wurden in ein Zentrifugengefäß (450 ml Volumen) gegeben und 15 Minuten bei 1000xg und 4° C ohne Bremse zentrifugiert. Anschließend
wurde die Fettschicht mit einem Metalllöffel vorsichtig entfernt, und die Magermilch
abgegossen. Das am Boden haftende Sediment wurde mit etwa 5 ml PBS versetzt
und mit einer Transferpipette in ein 50 ml-Röhrchen überführt. Im Zentrifugengefäß
verbliebene Zellen konnten durch Nachspülen mit ca. 5 ml PBS gewonnen werden.
Das 50 ml-Röhrchen wurde nun mit PBS auf ein Volumen von 30 ml aufgefüllt.
Für Versuch 3 bedurfte es einer größeren Menge Milchzellen. Daher wurden pro
Probe zwei Zentrifugengefäße wie oben beschrieben befüllt und behandelt. Die Sedimente beider Gefäße wurden dann in einem gemeinsamen Röhrchen aufgefangen.
3.4.6.1.2
Waschen der Zellen
Es folgte ein Zentrifugationsgang von 15 Minuten Dauer bei 400xg und 4° C mit automatischer Bremse. Der Überstand wurde abgegossen, und das Sediment mit einer
Pipette in 1 ml PBS resuspendiert. Nachdem die Zellen in ein 15 ml-Röhrchen überführt worden waren, wurde das größere Röhrchen mit 1 ml PBS nachgespült, und
das 15 ml-Röhrchen mit PBS auf 10 ml aufgefüllt.
Die sich anschließende Zentrifugation erfolgte bei 300xg 15 Minuten (4° C, mit
Bremse). Nach dem Dekantieren des Überstandes wurden die Zellen in 1 ml PBS
vorsichtig aufgerüttelt, wieder mit 9 ml PBS versehen und sanft gemischt.
62
Material und Methoden
Der letzte Zentrifugationsschritt verlief wie die vorhergegangenen, jedoch betrug die
Beschleunigung lediglich 200xg.
Das Pellet wurde in 250 µl Nährlösung in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß aufgenommen, und das Röhrchen einmal mit 250 µl Nährlösung nachgespült.
3.4.6.2
Mikroskopische Zelldifferenzierung der Milchzellsuspension
3.4.6.2.1
Herstellen eines Ausstriches
Die Herstellung eines Ausstriches für die mikroskopische Differenzierung geschah
nach dem als „Kaffeemühle“ bezeichneten Verfahren. Ein Deckgläschen wurde in die
zur Minizentrifuge umgebaute Kaffeemühle plaziert. Auf diesem Deckgläschen wurden zunächst 10 µl Blutplasma mit der Pipettenspitze gleichmäßig verteilt. Anschließend kamen 40 µl unverdünnter Zellsuspension auf das Deckgläschen, die Kaffeemühle wurde etwa drei Sekunden angestellt. Die Geschwindigkeit entsprach ungefähr 200xg. Auf einen vorbereiteten Objektträger, mit einem Tropfen Corbit® versehen, wurde nun das Deckgläschen vorsichtig mit einer Pinzette aufgeklebt.
3.4.6.2.2
Differenzieren des Ausstriches
Nach einer Trockenzeit von mindestens einer Stunde wurde der Ausstrich mit dem
Färbesystem Hemacolor® angefärbt, wie in Abschnitt 3.3.5.2 beschrieben. Die mikroskopische Auswertung erfolgte analog zu den Blutausstrichen. Da von einigen Proben sehr wenig Material zur Verfügung stand, war es nicht immer möglich, 100 Zellen in einem Ausstrich zu differenzieren. Waren nach 20 Minuten weniger als 20 Zellen differenzierbar, so wurde abgebrochen und der prozentuale Anteil der einzelnen
Zellarten mit entsprechendem Vermerk als Ergebnis verwendet.
3.4.6.3
Bestimmung der Zellkonzentration
Die Zellkonzentration wurde wie unter 3.4.5.3 beschrieben gemessen und auf 4 x 106
Zellen / ml verdünnt.
63
Material und Methoden
3.5
Vitalitätsbestimmung aus Blut- und Milchzellen
3.5.1
Geräte
Hamburg MS 1 Minishaker IKA®
Landgraf Laborgeräte OHG, Langenhagen
Fluoreszenz-Durchflusszytometer,
Becton Dickinson, Heidelberg
Modell FACSCalibur®, mit
angeschlossener Computereinheit
Weitere Geräte sind in den Abschnitten 3.3.1 und 3.4.1 beschrieben.
3.5.2
Glas- und Einmalartikel
Röhrchen für die
Becton Dickinson (35 2008), Heidelberg
Durchflusszytometrie, 5 ml
(FACS-Röhrchen)
Weitere verwendete Glas- und Einmalartikel sind in Abschnitt 3.3.2 dargestellt.
3.5.3
Reagenzien
Propidiumjodid (PJ)
Sigma Aldrich Chemie GmbH (28.707 – 5),
MG = 668,4 g / mol
Steimheim
3.5.4
Lösungen für die Durchflusszytometrie
3.5.4.1
Sheath fluid
Die Trägerflüssigkeit für die Durchflusszytometrie wurde hergestellt, indem zu sterilfiltriertem PBS (0,2µl-Filter im Dampfdrucktopf) 0,1 mg / ml NaN3 gegeben wurden.
64
Material und Methoden
3.5.4.2
Propidiumjodidlösung
Als Stammlösung diente 1 mg / ml Propidiumjodid in PBS, welche bei -18° C gelagert wurde. Die Gebrauchslösung wurde durch eine 1 : 5 – Verdünnung der Stammlösung mit PBS hergestellt.
In der zu messenden Probe lag Propidiumjodid im Überschuss zwischen 20 und 40
µg / ml vor.
3.5.5
Funktionsweise des Durchflusszytometers
Für eine detaillierte Beschreibung dieses Gerätes wird auf die Dissertation von
SCHRÖDER (2003) verwiesen.
In Kürze ist ein Durchflusszytometer ein Gerät, das Partikel in ihrer Größe, Struktur
und Fluoreszenzintensität erfasst. Dafür besitzt es einen oder mehrere Laser. Ein
Laser sendet in der Regel Licht mit einer Wellenlänge von 488 nm aus. Die zu charakterisierenden Partikel werden in einer Trägerflüssigkeit durch den Laserstrahl hindurchgeführt, stets nur einer zum selben Zeitpunkt. Der Laserstrahl wird dadurch abgelenkt. Ein Detektor gegenüber des Lasers, der sog. Forward Scatter (FSC), erfasst
die Dauer und Stärke der Abschwächung des Strahls und damit die Größe des Partikels. Ein weiterer Detektor, der im 90°-Winkel zum Laserstrahl angebracht ist, empfängt die Stärke des Seitwärtsstreulichts. Er wird Side Scatter (SSC) genannt und
beschreibt Oberflächenbeschaffenheit und Granularität des Partikels.
Sendet der Partikel im Laserstrahl eine Fluoreszenz aus, so stehen Fluoreszenzdetektoren in verschiedenen Wellenlängen (Grün-: 500 – 560 nm, Orange-: 543 – 627
nm und Rotfluoreszenz: > 650 nm) zur Verfügung, die die Intensität der Fluoreszenz
an die Messeinheit weitergeben. Ein zweiter Laser (Anregungswellenlänge 635 nm)
registriert eine zusätzliche Fluoreszenz im Rotbereich (645 – 676 nm). Auf diese
Weise können bis zu vier verschiedene fluoreszierende Farbstoffe während einer
Messung erkannt werden (SCHRÖDER 2003).
65
Material und Methoden
Die Auswertung einer Probe erfolgt, nachdem meist mehrere tausend Partikel dieser
Probe gemessen wurden. Der an das System angeschlossene Computer ermöglicht
die statistische Auswertung der Daten.
3.5.6
Prinzip
Zur Markierung somatischer Zellen sind Fluorochrome wie Propidiumjodid (PJ) geeignet. Diese Farbstoffe reagieren mit Teilen der DNA membrandefekter Zellen, wodurch lebende (membranintakte) von toten (membrandefekten) Zellen unterschieden
werden können. Die lebenden Zellen werden nicht angefärbt. Ebenso wenig werden
Zellreste, die keine DNA enthalten, registriert. PJ wird im Durchflusszytometer vom
Fluorezenzdetektor FL3 erkannt.
3.5.7
Durchführung
In einem FACS-Röhrchen wurden 400 µl Nährlösung mit 100 µl Zellsuspension (4 x
106 Zellen / ml) aus Blut oder Milch und 50 µl Propidiumjodidlösung gemischt und
umgehend im Durchflusszytometer FACSCalibur® (Fa. Becton Dickinson) gemessen.
Die Lagerung der Proben bis zur Messung erfolgte im Dunkeln und auf Eis. Nach der
Registrierung von 10.000 Partikeln je Probe wurde die Messung beendet und ausgewertet.
3.5.8
Auswertung
Für die Auswertung wurde die Software CellQuest Pro® benutzt, mit der die Messereignisse zunächst in einem Punktdiagramm (FSC/SSC-Dot Plot, s. Abbildung 3a und
3c) dargestellt wurden. Aufgrund der charakteristischen Größe und Struktur war es
möglich, den Bereich für PMN zu identifizieren. Nur die in diesem Bereich liegenden
Events wurden für die weitere Auswertung verwandt. Weiter wurde ein Histogramm
erstellt, in dem auf der x-Achse die Stärke der Fluoreszenz im Detektor FL3 der PMN
dargestellt wurde (s. Abbildung 3b und 3d). Durch Festlegen eines Bereiches (Gate),
66
Material und Methoden
in dem die Partikel als PJ-positiv (angefärbt) bezeichnet werden, wird der Anteil der
fluoreszierenden Partikel (hier nur PMN) an der Gesamtmenge der PMN berechnet.
Die einmal festgelegten Bereiche für PMN und für die Unterscheidung zwischen angefärbten (M2) und nicht angefärbten Partikeln (M1) wurden für sämtliche Proben
unverändert eingesetzt.
3a: Blut-Zellsuspension im
FSC/SSC-Dot Plot
3b: Blut-Zellsuspension im FL3Histogramm
3c: Milch-Zellsuspension im
FSC/SSC-Dot Plot
3d: Milch-Zellsuspension im FL3Histogramm
Abbildung 3a bis 3d: Auswertung der Vitalitätsbestimmung im Durchflusszytometer;
Erklärung siehe Text
67
Material und Methoden
3.6
Phagozytoseaktivität aus Blut- und Milchzellen
3.6.1
Geräte
Fluoreszenz-Durchflusszytometer,
Becton Dickinson, Heidelberg
Modell FACSCalibur® , mit
angeschlossener Computereinheit
Hamburg MS 1 Minishaker IKA®
Landgraf Laborgeräte OHG, Langenhagen
Wärmeschrank
Memmert, Schwabach
Weitere Geräte sind in den Abschnitten 3.3.1 und 3.4.1 beschrieben.
3.6.2
Glas- und Einmalartikel
Röhrchen für die
Becton Dickinson (35 2008), Heidelberg
Durchflusszytometrie, 5 ml
(FACS-Röhrchen)
Weitere verwendete Glas- und Einmalartikel sind in Abschnitt 3.3.2 dargestellt.
3.6.3
Reagenzien
Fluoreszeinisothiocyanat Isomer 1
Sigma (F 7250), Taufkirchen
(FITC)
Omnisorbin™
Calbiochem (496250), Bad Soden
68
Material und Methoden
3.6.4
Medien
3.6.4.1
Gepooltes Rinderblutserum
Serumblutproben von mindestens zehn Rindern wurden zentrifugiert (1400xg, 15
Minuten, 4° C). Die Überstände der Proben wurden gemeinsam in einem 50 ml-Röhrchen aufgefangen, gut gemischt und anschließend in 500-µl-Aliquots bei -18° C eingefroren.
3.6.4.2
Bakteriensuspension
3.6.4.2.1
Stammlösung
Die Bakteriensuspension wurde von der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. Zur ihrer Herstellung wurde ein
Puffer aus 0,1 M Na2CO3 und 0,1 M NaCl mit einem pH-Wert von 9,2 benötigt. 1 mg
FITC wurden in 15 ml Puffer vollständig gelöst. Zur Markierung der S. aureus wurden
0,3 ml Omnisorbin™ mit 0,7 ml des FITC-Puffers und 5 µl 10 % NaN3 gemischt, sodass eine Suspension mit der Endkonzentration von 0,05 % FITC entstand. Diese
Suspension wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur im 1,5 ml-Reaktionsgefäß inkubiert.
Es folgten drei Waschgänge in PBS bei 1400xg. Unter Zuhilfenahme eines UVLichtmikroskopes und einer Zählkammer wurde die Konzentration der Suspension
auf 2 x 108 Bakterien / ml eingestellt. Die Suspension wurde in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen bei -18° C gelagert.1
1
Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover:
FITC-Markierung von Bakterien für Phagozytose-Assay.
Persönliche Information
69
Material und Methoden
3.6.4.2.2
Arbeitslösung
Unmittelbar vor Beginn der Phagozytosemessung wurden zwei verschiedene
Arbeitslösungen vorbereitet: Ein mit „n“ (nicht opsonisiert) beschriftetes 13 mlRöhrchen wurde mit 2 ml PBS und 1 ml Bakteriensuspension beschickt, während ein
mit „o“ (opsonisiert) beschriftetes 13 ml-Röhrchen 1,8 ml PBS, 0,2 ml gepooltes Rinderblutserum (s. Abschnitt 3.6.4.1) und 1 ml Bakteriensuspension enthielt. Die Endkonzentration an S. aureus betrug in diesen Lösungen 0,7 x 108 / ml. Nach einer
15-minütigen Vorinkubation bei 37° C im Wärmeschrank wurden die Arbeitslösungen
umgehend zum Einsatz gebracht.
3.6.4.3
Lösungen für die Durchflusszytometrie
s. Abschnitt 3.5.4
3.6.5
Prinzip
Für diese Untersuchung wurden S. aureus eingesetzt, die mit dem fluoreszierenden
Farbstoff FITC markiert wurden. Diese Bakterien wurden gemeinsam mit isolierten
PMN inkubiert. Anschließend konnte im Durchflusszytometer der Anteil der PMN, die
Bakterien phagozytiert hatten, anhand der Fluoreszenz bestimmt werden.
3.6.6
Durchführung
Die Vorbereitung und Vorinkubation der bakterienhaltigen Arbeitslösungen ist in Abschnitt 3.6.4.2 beschrieben. Die Arbeitslösung der Zellsuspension Milch oder Blut
wurde auf eine Konzentration von 2 x 106 Zellen / ml gebracht, indem 200 µl Zellsuspension mit 200 µl PBS gemischt wurden.
Nun wurde eine Mikrotiterplatte folgendermaßen belegt: Von jeder Probe wurden
viermal je 100 µl Zellsuspension in eine Vertiefung (Well) pipettiert. Zu zwei dieser
Wells wurden jeweils 100 µl Bakterien aus dem Röhrchen „n“ gegeben, zu den beiden anderen Wells entsprechend 100 µl Bakterien aus dem Röhrchen „o“.
70
Material und Methoden
Nach dem Aufrütteln wurde die Mikrotiterplatte in den 37° C-Wärmeschrank gegeben
und eine Stunde inkubiert. Nach 30 Minuten wurde die Platte einmal entnommen und
auf dem Rüttler neu gemischt. Zum Beenden der Inkubation wurde die Mikrotiterplatte 15 Minuten lang auf Eis gestellt.
Nun wurden die Proben in FACS-Röhrchen überführt, wobei die beiden Ansätze „n“
bzw. „o“ jeweils gemeinsam in einem Röhrchen aufgefangen wurden. Zuletzt befanden sich in jedem FACS-Röhrchen etwa 400 µl Probe.
Einige Milchzellsuspensionen enthielten in ihrer unverdünnten Form weniger als 3 x
106 Zellen / ml. Diese Proben wurden nicht verdünnt. Um Probenmaterial zu sparen,
wurde auf Doppelansätze verzichtet. Hier beschränkte sich das Volumen im FACSRöhrchen auf 200 µl pro Probe.
Es folgten die Zugabe von 50 µl Propidiumjodid zu jedem FACS-Röhrchen und die
Lagerung bis zur Messung auf Eis und im Dunkeln.
Im Durchflusszytometer wurden von jeder Blutprobe 10.000 und von jeder Milchprobe 40.000 Partikel gemessen. Dabei wurden pro Event die Parameter Größe (FSC),
Struktur (SSC), die grüne Fluoreszenzintensität durch FITC (FL1) und die rote Fluoreszenzintensität durch PJ (FL3) ermittelt.
3.6.7
Auswertung
An der angeschlossenen Computereinheit wurden die Proben mit Hilfe der Software
CellQuest Pro® unter folgenden Gesichtspunkten ausgewertet: Alle Zellen, die in FL3
deutlich fluoreszierten, waren membrandefekt und nicht vital. Diejenigen Zellen, die
nicht angefärbt waren, wurden im FL3-Histogramm durch Setzen eines geeigneten
Gates ausgewählt (s. Abbildungen 4a und b, Plot 1). Von diesen Zellen wurden diejenigen selektiert, die sich im FSC/SSC-Dot Plot in dem für PMN üblichen Bereich
befanden (s. Abbildungen 4a und b, Plot 2).
71
Material und Methoden
Blutprobe, nicht opsonisiert
Plot 1
Plot 2
Plot 3
Plot 3
Auswertung Bild 3a, Plot 3 (n)
Quadrant
Prozentsatz
MFI
Oben links
64,61
1,04
Oben rechts
35,39
10,91
Abbildung 4a: Auswertung der Phagozytosemessung im Durchflusszytometer; Erklärung siehe Text
72
Material und Methoden
Blutprobe, opsonisiert
Plot 1
Plot 2
Plot 3
Plot 3
Plot 3
Auswertung Bild 3b, Plot 3 (o)
Quadrant
Prozentsatz
MFI
Oben links
7,73
1,11
Oben rechts
92,27
188,36
Abbildung 4b: Auswertung der Phagozytosemessung im Durchflusszytometer; Erklärung siehe Text
73
Material und Methoden
Die vitalen PMN wurden nun in einem FL1-Histogramm dargestellt. Im Detektor FL1
wird der fluoreszierende Farbstoff FITC registriert, mit dem die Bakterien markiert
waren. PMN, die FITC-positiv waren, hatten Bakterien phagozytiert (s. Abbildungen
4a und b, Plot 3). Auf diese Weise entstand eine Aussage über den Prozentsatz lebender PMN, die Bakterien aufgenommen hatten. Darüber hinaus konnte über die
mittlere Intensität der Fluoreszenz (MFI) auch abgeschätzt werden, wie viele Bakterien pro Zelle aufgenommen worden waren (s. Abbildungen 4a und b).
Auch für diese Auswertung wurden die Felder einmal festgelegt und dann für alle
Proben unverändert angewandt, um technische Schwankungen in der Auswertung
zu vermeiden.
Die Phagozytosekapazität wurde in den Proben der Versuche 1 und 2 untersucht.
3.7
Chemilumineszenz aus Blut- und Milchzellen
3.7.1
Geräte
Microprocessor pH-Meter pH 539
WTW, Weilheim
Luminometer, Modell Luminoscan
Labsystems, Helsinki/SF
Ascent® Typ 392 mit angeschlossener
Computereinheit
Weitere Geräte sind in den Abschnitten 3.3.1 und 3.4.1 beschrieben.
3.7.2
Glas- und Einmalartikel
Mikrotiterplatten für Chemi-
Nunc GmbH (13 61 01), Wiesbaden
lumineszenzversuche: 96-wellPlatten, Farbe: weiß, Flachboden
Weitere Glas- und Einmalartikel sind in Abschnitt 3.3.2 beschrieben.
74
Material und Methoden
3.7.3
Reagenzien
DMSO (Dimethylsulfoxid)
Sigma Aldrich Chemie GmbH (99H3655),
MG = 78,13 g / mol
Steimheim
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-
Sigma Aldrich Chemie GmbH
1,4-phthalazindion)
(20666-12-0), Steimheim
MG = 155,16 g / mol
Natronlauge (NaOH),
Merck Eurolab GmbH (9138), Darmstadt
0,5 mol / l, 1 l
PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat)
Sigma Aldrich Chemie GmbH MG = 616,8
g / mol
(16561-290), Steimheim
3.7.4
Puffer und Lösungen
3.7.4.1
Luminollösung
3.7.4.1.1
Stammlösung
1,1798 g Luminol wurden in 50 ml DMSO gelöst. Die Luminolkonzentration in der
Lösung betrug 0,3112 mol / l. Sie wurde bei -80° C unter Lichtausschluss gelagert.
3.7.4.1.2
Arbeitslösung
40 ml DMSO wurden in einem Messkolben vorgelegt, mit 10 ml Stammlösung versetzt und anschließend mit A. tridest. auf 100 ml Gesamtvolumen aufgefüllt, sodass
eine 1:10-Verdünnung entstand. Die Lösung wurde gut geschüttelt, mit Aluminiumfolie umwickelt, in ein Eiswasserbad gestellt und zuletzt im Exsiccator unter Vakuum
entgast.
Die Arbeitslösung wurde in 1-ml-Aliquots bei -80° C und vor Lichteinfall geschützt
aufbewahrt.
75
Material und Methoden
3.7.4.2
PMA-Lösung
3.7.4.2.1
Stammlösung
Zur Herstellung einer Stammlösung wurden 5 mg PMA in 1 l DMSO gelöst und bei
-18° C aufbewahrt.
3.7.4.2.2
Arbeitslösung
Dazu wurden 200 µl Stammlösung mit 4800 µl DMSO verdünnt. Die entstandene
Arbeitslösung hatte eine Konzentration von 200 µg PMA / 1 ml DMSO.
Jeweils 100 µl dieser Lösung wurden in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen bei -18° C gelagert.
3.7.4.3
Reaktionslösung
500 ml DPBS wurden mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 10,0 eingestellt. Dabei
musste der pH-Wert der Lösung regelmäßig kontrolliert und ggf. korrigiert werden.
Unmittelbar vor der Messung der Chemilumineszenz wurden zu
-
19 ml Reaktionslösung
-
1 ml Luminol-Arbeitslösung und
-
0,1 ml PMA-Arbeitslösung gegeben.
Die Endkonzentration für Luminol betrug 666 nmol / ml, die für PMA 1.000 ng / ml in
der Reaktionslösung.
3.7.5
Funktionsweise des Luminometers
Das Luminometer Luminoskan Ascent® nimmt die Proben in weißen Mikrotiterplatten
auf. Es ist für Mikrotiterplatten aller gängigen Größen (1 bis 384 Wells) geeignet. Die
Lumineszenzkraft wird für jedes Well einzeln bestimmt.
Das Gerät verfügt über einen Elektronenvervielfältiger, mit dem Licht in einer Wellenlänge von 270 – 670 nm detektiert wird. Die Sensitivität liegt < 1 fmol ATP / Well. Er-
76
Material und Methoden
gebnisse in der Höhe von 0,0001 bis 5.000 RLU (relative light units) werden während
des Messvorganges erfasst.
Mit Hilfe der Software Ascent™ können die Schritte Dispensieren, Inkubieren, Schütteln und Messen ausgewählt und beliebig in das Arbeitsprotokoll der Messung eingefügt werden. Über Dispenser besteht die Möglichkeit, bis zu drei verschiedene Lösungen während des Messvorganges im Gerät standardisiert in die Wells der Mikrotiterplatte zu geben.
3.7.6
Prinzip
Isolierte PMN werden durch den Aktivator PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat) angeregt, freie Sauerstoffradikale zu produzieren. Luminol (5-Amino-2,3-Dihydro-1,4Phthalazindion) bildet mit Hydrogenperoxid (H2O2) 5-Amino-2,3-Phthalat, wobei
Stickstoff und Photonen freigesetzt werden. Diese Reaktion läuft nur im alkalischen
Milieu ab. Im Luminometer wird das gebildete Licht detektiert. Dabei wird jede Probe
innerhalb eines bestimmten Zeitraumes mehrmals gemessen.
3.7.7
Durchführung
Aus technischen Gründen wurde die Messung immer zur selben Uhrzeit durchgeführt
(siehe Abschnitt 4.2). Alle Proben eines Tages wurden in einer Platte gemessen, um
die Untersuchungszeit exakt einhalten zu können.
Mit einer 50 µl-Fixpipette wurden in jede Vertiefung (Well) einer sterilen und gekühlten Mikrotiterplatte für Chemilumineszenzversuche 50 µl Probe bzw. Nährlösung
(Blindwerte) gegeben.
Der Blindwert (Nährlösung) wurde stets in 12 Wells einer Platte aufgetragen. 5 bis 7
Wells einer Platte wurden jeweils mit der selben Probe belegt. Stand nicht genügend
Probenmaterial zur Verfügung, so wurden entsprechend weniger Wells mit dieser
Probe befüllt.
77
Material und Methoden
Unmittelbar nach dem Auftragen der Proben wurde die Platte in das Luminometer
verbracht. Dort wurde die frisch angefertigte Reaktionslösung mit PMA und Luminol
an das Dispensiersystem des Gerätes angeschlossen, und die Messung wurde umgehend gestartet.
Der Start und der Ablauf der Messung wurden von der angeschlossenen Computereinheit mit Hilfe der Ascent Software™ gesteuert. Nach einer von Hand eingerichteten Arbeitsvorlage liefen folgende Schritte stets gleich und vollautomatisch ab:
„Dispense“: Nach dem Start der Messung wurden je 150 µl Reaktionslösung mit
einem Dispenser nacheinander in jedes Well gegeben. Die Endkonzentration von Luminol, bezogen auf das Gesamtreaktionsvolumen von
200 µl, betrug nun 500 nmol / ml, die für PMA 750 ng / ml.
„Shake“:
Die Proben wurden durch Schütteln bei 600 U / min 3 Sekunden lang
gemischt.
„Incubate“:
Um die Reaktion zu starten, wurde 10 Sekunden bei 38° C inkubiert.
„Measure“:
Die Photonenemission wurde für jedes Well einzeln in 90-SekundenIntervallen je 1000 ms lang erfasst. Von jedem Well wurden 30 Einzelwerte in einer Gesamtmesszeit von 45 Minuten erhoben.
3.7.8
Auswertung
Aus den 30 Einzelwerten desselben Wells (s. Abbildung 5) wurde eine Funktionsgleichung erstellt und das Integral abgeleitet. Dieser Wert entspricht dem oxidativen Potential der Probe und wird im weiteren Text als CL-Aktivität (unbereinigt) bezeichnet.
Von jedem Well wurden folgende Informationen gespeichert:
oxidatives Potential als Integral
Maximum der Kurve (Max)
Zeit bis zum Erreichen des Maximums (Time)
78
Material und Methoden
Max
Time
Blut
Mi lch
Abbildung 5: Verlaufskurve einer Chemilumineszenzmessung, links aus einer Blutzellsuspension, rechts aus einer Milchzellsuspension; Max: Maximum
der Kurve, Time: Zeit bis zum Erreichen des Maximums
CL-Einheiten / 1 Million PMN
Zur Berechnung des Parameters „CL-Einheiten / 1 Million PMN“ waren mehrere
Schritte erforderlich. Zunächst wurde aus den Wells, die die selben Proben enthielten, jeweils ein Mittelwert für die Parameter CL-Aktivität (unbereinigt), Max und Time
gebildet.
Die Zahl der vitalen PMN im Well wurde anhand der Parameter Zellkonzentration in
der Arbeitslösung (a), Prozentsatz PMN in der mikroskopischen Differenzierung (b)
und Prozentsatz vitaler PMN in der Vitalitätsbestimmung (c) nach folgender Formel
berechnet:
vitale PMN = a x b x c.
Zur Bestimmung der Zahl vitaler eosinophiler Granulozyten wurde entsprechend verfahren.
Die Zahl der errechneten eosinophilen Granulozyten in der Zellsuspension wurde
verfünffacht und zur Zahl der PMN hinzugerechnet:
79
Material und Methoden
Zahl der PMN (bereinigt) = vitale PMN + 5 x vitale eosinophile Granulozyten
Zuletzt wurde die unbereinigte CL-Aktivität durch die bereinigte Zahl der PMN geteilt
und auf eine Million Zellen hochgerechnet:
CL-Aktivität / 1 Mio. PMN = CL x 1.000.000 / Zahl vitaler PMN (bereinigt)
CL-Aktivität / ml Milch
Aus den Milchzellproben wurde noch der Parameter „CL-Aktivität / ml Milch“ erhoben. Dieser setzt sich zusammen aus dem Zellgehalt der Milch (a), aus der CLAktivität / 1 Million PMN (b), dem Anteil PMN in der Milchzellsuspension (mikroskopisch) (c) und dem Anteil lebender PMN in der Milchzellsuspension (d). Die zur Berechnung nötige Formel lautet:
CL-Aktivität / ml Milch = a x b x c x d
3.8
Statistische Auswertungen
Die statistischen Auswertungen wurden mit den Programmen Microsoft Excel Version 2000 und SAS Version 8e 2002, SAS Institute Inc., Cary, NY durchgeführt.
Die Normalverteilung der Datenbanken wurde mit Microsoft Excel überprüft. Nicht
normalverteilte Daten wurden logarithmisch transformiert und nochmals gestestet.
Lineare Korrelationen zweier Parameter zueinander wurde ebenfalls mit dem Programm Excel berechnet.
Mittelwerte, Standardabweichungen, Student´s t-Tests und alle Varianzanalysen
wurden mit den entsprechenden SAS-Prozeduren erstellt.
Die Berechnungen von Normalverteilung und Korrelationen wurden aus den Daten
der Versuche 1 bis 3 und der Gesamtdatenbank durchgeführt. Mit den Datenbänken
der Versuche 1 und 3 und mit der Gesamtdatenbank wurden Ryan-Einot-GabrielWelsch Multiple Range Tests und t-Tests für unabhängige Stichproben berechnet.
Aus den Daten von Versuch 3 wurden zudem einfaktorielle Varianzanalysen für wiederholte Messungen und t-Tests für abhängige Stichproben erhoben.
80
Material und Methoden
3.9
Versuche
3.9.1
Methodische Versuche zur Phagozytoseaktivität in Blut
Eine grundlegende Methodenbeschreibung für diese Untersuchung wurde von SAAD
und HAGELTORN (1985) veröffentlicht. Zusätzlich lag eine Arbeitsanweisung aus
der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover2 vor. Es war
jedoch erforderlich, die Methode an die örtlichen und organisatorischen Gegebenheiten anzupassen. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag auf den Parametern Inkubationszeit, Konzentration der Zellen und Konzentration der Bakterien.
Für die unter 3.9.1.1 bis 3.9.1.3 beschriebenen Versuche wurden jeweils PMN eingesetzt, die aus 30 ml EDTA-Blut gewonnen wurden.
3.9.1.1
Inkubationszeit
Unter Einhaltung des oben beschriebenen Versuchsaufbaus (s. Abschnitt 3.6.6) wurde eine Inkubationszeit von
a)
30 Minuten,
b)
60 Minuten oder
c)
90 Minuten
eingehalten. Während der Inkubation wurden die Proben in einem Zeitintervall von
30 Minuten aufgerüttelt.
3.9.1.2
Zellkonzentration
Auch für diese Untersuchung wurde der genannte Versuchsaufbau eingehalten (s.
Abschnitt 3.6.6). Die Zellen wurden in einer Konzentration von
2
Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover:
Phagozytoseaktivitätsbestimmung von PMN im FACS.
Persönliche Information
81
Material und Methoden
a)
4 Mio. Zellen / ml,
b)
2 Mio. Zellen / ml oder
c)
200.000 Zellen / ml
eingesetzt.
3.9.1.3
Bakterienkonzentration
Bei gleichbleibendem Versuchsaufbau wurden zu 1 ml PBS
a)
100 µl Bakteriensuspension (0,15 x 108 / ml Endkonzentration) bzw.
b)
500 µl Bakteriensuspension (0,7 x 108 / ml Endkonzentration)
gegeben.
3.9.2
Methodische Versuche zur CL-Aktivität in Blut
Da die Messung der CL-Aktivität hohen technischen Schwankungen unterliegt, wurden bereits vorhandene Methoden (EASMON et al. 1980; HOEBEN 2002) an die
örtlichen Gegebenheiten angepasst und optimiert. Ursachen für die Variationen sollten erkannt und minimiert werden. Als Versuchstiere dienten vier klinikeigene Tiere
der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover (s. Abschnitt 3.1.1).
Von jeder Probe wurden die Parameter Vitalität, mikroskopisches Zelldifferentialbild,
NAGase, CL-Aktivität / 1 Million PMN, Max und Time erfasst.
3.9.2.1
Zellisolierung bei verschiedenen Temperaturen
Dieser Versuch wurde mit je 60 ml EDTA-Blut von den Tieren 1 bis 4 durchgeführt.
Von jeder Blutprobe wurden zweimal je 22,5 ml Blut auf Eis und mit Kühlung der
Zentrifuge (Probe 1) bzw. bei Raumtemperatur und ohne Kühlung der Zentrifuge
(Probe 2) isoliert. Anschließend wurden alle Proben gemeinsam im Luminometer
gemessen.
Gruppe 1 (0° C):
Proben 1 der Tiere 1 bis 4
Gruppe 2 (25° C):
Proben 2 der Tiere 1 bis 4
82
Material und Methoden
Der Versuch wurde einmal wiederholt. Im Rahmen der Auswertung wurde der Fragestellung nachgegangen, in welcher Gruppe die Unterschiede innerhalb eines Tieres
von Tag zu Tag größer sind. Weiterhin wurden die Varianzen der Proben von Gruppe
1 mit denen von Gruppe 2 verglichen.
3.9.2.2
Inkubation bei verschiedenen Temperaturen
Blutproben von den Tieren 1 bis 4 wurden untersucht. Nach der Zellisolation wurden
je 800 µl Messlösung in drei 13 ml-Röhrchen verbracht und etwa eine Stunde entweder auf Eis (ca. 0° C), bei Raumtemperatur (ca. 25° C) oder im Wasserbad (38° C)
inkubiert.
Ansatz 1:
Inkubation bei 0° C
Ansatz 2:
Inkubation bei 25° C
Ansatz 3:
Inkubation bei 38° C
Der Versuch fand an fünf Tagen statt. Nach Abschluss der Untersuchungen wurde
anhand von Variationskoeffizienten überprüft, inwieweit die Ergebnisse der drei Ansätze eines Tieres miteinander übereinstimmen.
3.9.2.3
Lagerungsdauer der Proben
Aus Blutproben der Tiere 3 und 4 und von zwei an Mastitis erkrankten Patienten aus
der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe des Rindes der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden PMN isoliert. Die Arbeitslösungen wurden auf Eis gelagert und
jeweils nach 0, 6, 18 und 24 Stunden auf Vitalität und CL-Aktivität hin untersucht.
Mit diesem Versuch wurde erhoben, in welchem Maße Vitalität und CL-Aktivität nach
längerer Lagerung der Proben abfallen.
3.9.2.4
Zellkonzentration
Von den Tieren 1 bis 4 wurden Blutproben gewonnen und aufbereitet (s. Abschnitt
3.4.5.1). Die Zellsuspensionen wurden jeweils dreimal verdünnt.
83
Material und Methoden
Zellkonzentration: Ansatz a:
4
Millionen Zellen / ml
Ansatz b:
2
Millionen Zellen / ml
Ansatz c:
1,3 Millionen Zellen / ml
Die CL-Aktivität aller drei Verdünnungen wurde nun in einem Messgang gemessen
(s. Abschnitt 3.7.7) und deren Korrelation zur Zellzahl überprüft.
Der Versuch wurde an vier verschiedenen Tagen durchgeführt.
3.9.2.5
PMA-Konzentration
Von den Tieren 1 bis 4 wurden PMN isoliert. Die Reaktionslösung (RL) wurde dreimal mit verschiedenen PMA-Konzentrationen vorbereitet.
RL 1:
0,05 ml PMA (= 375 ng / ml)
RL 2:
0,1 ml PMA (= 750 ng / ml)
RL 3:
0,2 ml PMA (= 1.500 ng / ml)
Nach der Belegung der Mikrotiterplatte (s. Tabelle 8) wurde diese umgehend in das
Luminometer eingesetzt und gemessen. Für diesen Versuchsaufbau wurden die
Schritte „Dispense“ und „Incubate“ aus dem Programm gelöscht.
Dieser Versuch wurde dreimal durchgeführt. Die Ergebnisse wurden daraufhin überprüft, ob Korrelationen zwischen der PMA-Konzentration und der CL-Aktivität bestehen. Weiterhin wurde untersucht, mit welcher Konzentration die Variationskoeffizienten zwischen den Proben einer RL am niedrigsten sind.
Tabelle 8: Belegung der Mikrotiterplatte für die Messung mit unterschiedlichen
PMA-Konzentrationen
Spalte
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Tier
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
RL
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
Reaktionslösung (RL) 1 = 375 ng PMA / ml; RL 2 = 750 ng PMA / ml; RL 3 = 1.500 ng PMA / ml;
84
Material und Methoden
3.9.2.6
pH-Wert
Von den vier Versuchstieren wurden Blutzellen isoliert, um den Einfluss des pHWertes auf die Messung zu untersuchen. Für die Herstellung der Reaktionslösung
(RL) wurde das DPBS einmal mit Natronlauge auf den pH-Wert von 10,8 eingestellt,
und einmal wurde der pH-Wert von 7,1 belassen. Im ersten Fall ergab sich nach der
CL-Messung in der Mikrotiterplatte ein pH-Wert von 8,4, im zweiten Fall ein pH-Wert
von 7,2.
RL 1:
pH = 10,8
RL 2:
pH = 7,1
Nach der Belegung der Mikrotiterplatte (s. Tabelle 9) mit den Zellsuspensionen und
den Reaktionslösungen wurde die Messung der Chemilumineszenzaktivität ohne
Verzögerung gestartet. Wiederum lief das Programm ohne die Schritte „Dispense“
und „Incubate“.
Der Versuch fand an drei Tagen statt. Die Ergebnisse wurden auf die Variationen
zwischen RL1 und RL2 sowie zwischen den Tieren hin überprüft. Hierfür wurden Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten ermittelt.
Tabelle 9: Belegung der Mikrotiterplatte für die Messung mit unterschiedlichen pHWerten
Spalte
1
2
3
4
5
6
7
8
Tier
1
2
3
4
1
2
3
4
RL
1
1
1
1
2
2
2
2
Reaktionslösung (RL) 1 = pH 10,8; RL 2 = pH 7,1
85
9
10
11
12
Material und Methoden
3.9.2.7
Messung der CL-Aktivität aus Vollblut, lysiertem Blut und aufbereiteter
Zellsuspension
Blutproben von den Tieren 1 bis 4 wurden analysiert. Vor der Zellisolation wurden
etwa 2 ml Vollblut getrennt auf Eis aufbewahrt (Gruppe a). 10 ml jeder Vollblutprobe
wurden in ein 50 ml -Röhrchen gegeben und lysiert, wie in Abschnitt 3.4.5.1.2 beschrieben. In diesen Proben waren also alle Leukozyten enthalten, jedoch keine roten Blutkörperchen (= lysierte Proben, Gruppe b). Zusätzlich wurden aus 22,5 ml
EDTA-Blut nach dem beschriebenen Verfahren PMN isoliert (Gruppe c) (s. Abschnitt
3.4.5.1).
Gruppe a:
Vollblutproben der Tiere 1 bis 4
Gruppe b:
lysierte Proben der Tiere 1 bis 4
Gruppe c:
isolierte PMN der Tiere 1 bis 4
Nun wurden die CL-Aktivitäten aller Proben (je drei Proben pro Tier) in einer Mikrotiterplatte gemessen.
Nach zweimaliger Wiederholung des Versuches wurden die Ergebnisse der Proben
eines Tieres anhand der Korrelationskoeffizienten auf ihre Übereinstimmung getestet.
3.9.2.8
Wiederholbarkeit innerhalb eines Tages
Zwei Tieren wurden je 60 ml EDTA-Blut entnommen. Von jeder Blutprobe wurden
zweimal 22,5 ml Blut aufbereitet.
Tier 1:
Probe 1
Probe 2
Tier 2:
Probe 3
Probe 4
Nach Bestimmung der Zellkonzentrationen wurden von den Proben 1 bis 4 je zwei
Arbeitslösungen mit der Konzentration von 4 Mio. Zellen / ml hergestellt. Auf diese
Weise entstanden pro Tier 4 Arbeitslösungen.
86
Material und Methoden
Probe 1:
Arbeitslösung 1a
Arbeitslösung 1b
Probe 2:
Arbeitslösung 2a
Arbeitslösung 2b
Nach der Messung wurde die Wiederholbarkeit der Ergebnisse aus den Proben eines Tieres mithilfe von Variationskoeffizienten berechnet. Dabei wurden die Proben 1
und 2 miteinander verglichen, ebenso die beiden Arbeitslösungen a und b jeder Probe.
Die Wiederholbarkeit wurde an vier Tagen untersucht.
3.9.3
Versuch 1: Einfluss der Zahl der erkrankten Euterviertel pro Kuh
auf die Zellfunktionalität von PMN aus Milch und Blut
3.9.3.1
Tier- und Probenmaterial
Zur Überprüfung der Aussagefähigkeit der Blutzellaktivität bezüglich der Eutergesundheit wurden in beiden Betrieben gezielt Tiere ausgesucht, die auf allen vier Eutervierteln die Zellzahl von 100.000 Zellen / ml Milch überschritten (Gruppe C).
Gleichzeitig wurden Tiere beprobt, deren Milch in allen vier Drüsenkomplexen weniger als 30.000 Zellen / ml Milch enthielt (Gruppe A). Zusätzlich wurden Proben von
Tieren genommen, die auf einem bis drei Eutervierteln Zellzahlen deutlich über
100.000 Zellen / ml Milch und auf den übrigen Vierteln Zellzahlen unter 30.000 Zellen / ml Milch aufwiesen (Gruppe B). Die vorläufige Auswahl geeigneter Tiere erfolgte
anhand der Milchleistungsprüfungsdaten (MLP-Daten) des Landeskontrollverbandes
Niedersachsen – Bremen e.V. für die Betriebe Ruthe und Meldau der den Versuchen
vorausgehenden Monate.
In diesem Versuch wurden Blut- und Milchproben von 6 Tieren aus Betrieb 1 und von
14 Tieren aus Betrieb 2 jeweils einmal untersucht. Da ein Tier nur auf drei Eutervierteln Milch gab, enthielt die Datenbank 20 Blut- und 79 Milchproben.
87
Material und Methoden
Die Laktationsnummern der Tiere sind der Tabelle 10 zu entnehmen. Unter den untersuchten Tieren befand sich eines innerhalb der ersten 60 Laktationstage, alle anderen darüber.
Tabelle 10: Laktationsnummer der Versuchstiere aus Versuch 1
Laktationsnummer
Zahl der Tiere
1
6
2
6
3
4
4
3
5
1
Probenart
Untersuchung
Viertelanfangsgemelk
elektrische Leitfähigkeit
Bakteriologie
Zytologie
Zellsuspension
Mikroskopische Zelldifferenzierung
Vitalität
CL-Aktivität
Phagozytose
EDTA-Blut
Leukozytenzahl (WBC)
Mikroskopische Zelldifferenzierung
Viertelhandgemelk
Blut
Milch
Tabelle 11: Durchgeführte Untersuchungen in den Versuchen 1 und 2
Mikroskopische Zelldifferenzierung
Vitalität
CL-Aktivität
Phagozytose
Zellsuspension
88
Material und Methoden
Die durchgeführten Untersuchungen sind detailliert in Tabelle 11 dargestellt. Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität erfolgte anhand der in Abschnitt 3.6 beschriebenen Vorgehensweise, die der CL-Aktivität so wie in Abschnitt 3.7 erläutert.
3.9.3.2
Datengruppierung und statistische Auswertung
Die Tiere wurden nach dem in Tabelle 12 dargestellten Schema in Gruppen eingeteilt.
Tabelle 12: Datengruppierung in Versuch 1
Gruppe
n (Tiere)
SCC / ml Milch
A
5
< 30.000 in allen Vierteln
B
10
> 100.000 in 1 bis 3 Vierteln
C
5
> 100.000 in allen Vierteln
Die Auswertung des Datenmaterials wurde anhand von Tests auf Normalverteilung,
Berechnung von Korrelationskoeffizienten, Student´s t-Tests und Ryan-Einot-GabrielWelsch Multiple Range Tests vorgenommen. Die Daten von SCC im VAG, Max of
well und CL-Aktivität / ml Milch wurden in logarithmierter Form in die Datenbank aufgenommen. Die Werte der Parameter MFI „n“ und „o“ wurden als Umkehrbruch (1/x)
verwendet.
Die nicht normalverteilten Parameter PMN (Blut-Zellsuspension), eosinophile Granulozyten (Milch-Zellsuspension) und Epithelzellen (Milch-Zellsuspension) wurden nicht
in statistische Berechnungen einbezogen. Da die Vitalität der Blut-Zellsuspension
(nicht normalverteilt) immer über 98 % lag, und ihre Schwankungen – anders als in
den Milch-Zellsuspensionen – lediglich labortechnische Ursachen hatte, wurden auch
diese Werte in den Auswertungen nicht berücksichtigt. Der Ausdruck „Vitalität“ bezieht sich daher stets auf die Vitalität der Milch-Zellsuspensionen.
89
Material und Methoden
3.9.4
Versuch 2: Verlaufsuntersuchung
3.9.4.1
Tier- und Probenmaterial
Um die Zellfunktionalität in der Frühlaktation und im Verlauf einer Mastitis verfolgen
zu können, wurden acht Tiere ab Woche 1 nach der Abkalbung etwa drei Monate
lang in wöchentlichem Abstand beprobt. Vier der Tiere gehörten zu Betrieb 1, die
anderen vier zu Betrieb 2. Zur Selektion geeigneter Tiere wurden wiederum die MLPDaten herangezogen. Ausgewählt wurden Tiere, die in sich in der zweiten Laktation
befanden und mehrere Monate vor dem Trockenstellen keine erhöhten Zellzahlen im
Gesamtgemelk aufwiesen. Zwei Tiere waren Erstkalbinnen, sodass keine MLPDaten vorlagen.
2 Tiere wurden 11 Mal, 2 Tiere 12 Mal und 4 Tiere 13 Mal untersucht. An jedem
Termin wurden sowohl Blut- als auch Milchproben gewonnen.
An die Tiere wurden die Nummern 1 bis 8 vergeben. Die durchgeführten Untersuchungen waren die gleichen wie in Versuch 1 (s. Tabelle 11).
3.9.4.2
Datengruppierung und statistische Auswertung
Drei Tiere waren eutergesund und wurden in einer Gruppe zusammengefasst, die
anderen Gruppen enthielt drei Tiere, die eine Mastitis entwickelten. Zwei Tiere mit
latenten Infektionen wurden von einer Auswertung ausgeschlossen. Die Auswertung
erfolgte nach den Tests auf Normalverteilung innerhalb der Gruppen von Woche zu
Woche anhand von Mittelwerten und Standardabweichungen.
90
Material und Methoden
3.9.5
Versuch 3: Zusammenhang zwischen Kriterien der Zellfunktionalität und der Eutergesundheit, Betrachtung auf Tierebene
3.9.5.1
Tier- und Probenmaterial
Um einen Überblick über die Zellfunktionalität unter Berücksichtigung der
Eutergesundheit zu erhalten, wurden insgesamt 36 Tiere ausgewählt, die entweder
auf allen Vierteln gesund waren (SCC < 100.000 Zellen / ml Milch, Bakteriologie
wurde nicht berücksichtigt), auf mindestens einem Viertel mittelgradig (SCC
100.000 – 400.000 Zellen / ml Milch) oder hochgradig (SCC > 400.000 Zellen / ml
Milch) erkrankt waren. Die Selektion der Tiere erfolgte in Betrieb 1 anhand von
Daten, die alle drei Wochen aus Viertelgemelksproben erhoben wurden. In Betrieb 2
wurde der zytobakteriologische Zustand möglicher Versuchstiere während einer
Anamnesephase dreimal in wöchentlichem Abstand erfasst. In die Gruppe der
eutergesunden Tiere wurden nur Tiere aufgenommen, die von der letzten Abkalbung
bis zum Zeitpunkt der Untersuchung keine Mastitis hatten. Aufgrund mangelnden
Tiermaterials wurden in der Gruppe der hochgradig kranken Tiere auch solche Tiere
berücksichtigt, deren Trächtigkeit nicht mit Sicherheit festgestellt werden konnte.
Zur Überprüfung der Wiederholbarkeit wurden 10 Tiere der Versuchsgruppe dreimal
an drei aufeinanderfolgenden Tagen und ein weiteres Mal in wöchentlichem Abstand
untersucht.
Untersucht wurden jeweils Blut- und Milchproben. In die Versuchsgruppe wurden drei
Tiere aufgenommen, die nur auf drei Eutervierteln laktierten. Die genauen Zahlen der
untersuchten Milch- und Blutproben sind der Tabelle 13 zu entnehmen. Um Missverständnisse zu vermeiden, werden im Weiteren die Proben, die von einem Tier an
einem bestimmten Tag untersucht wurden, als „Tagesprobensatz“ bezeichnet. Ein
Tagesprobensatz enthält somit bis zu vier Milchproben und eine Blutprobe desselben
Tieres vom selben Tag. Aus dieser Untersuchung standen 69 Tagesprobensätze zur
Auswertung zur Verfügung.
91
Material und Methoden
Tabelle 13: Allgemeines zum Probenumfang von Versuch 3
Untersuchungen
pro Tier
Tierzahl
Summe Blutproben
Summe Milchproben
1
25
24
97
2
1
2
8
3 oder mehr
10
41
168
gesamt
36
67
273
Tabelle 14 gibt eine Übersicht über die Laktationsnummer der untersuchten Tiere
und Tabelle 15 über die Laktationstage der Tiere. Aufgrund der Mehrfachuntersuchungen einzelner Tiere sind die Laktationstage nach den Tagesprobensätzen geordnet. Die durchgeführten Untersuchungen sind in Tabelle 16 dargestellt.
Tabelle 14: Laktationsnummer der Versuchstiere aus Versuch 3
Laktationsnummer
Zahl der Tiere
1
15
2
9
3
5
4
6
7
1
92
Material und Methoden
Tabelle 15: Laktationstage der Versuchstiere aus Versuch 3,
nach Tagesprobensätzen
Tagesprobensätze
Laktationstage
Tagesprobensätze
Laktationstage
3
36 – 42
12
151 – 180
2
43 – 49
22
181 – 210
1
50 – 56
7
211 – 240
1
56 – 90
8
241 – 270
3
91 – 120
4
271 – 300
6
121 – 150
1
331 – 360
Milch
Tabelle 16: Durchgeführte Untersuchungen in Versuch 3
Probenart
Untersuchung
Viertelanfangsgemelk
elektrische Leitfähigkeit
Bakteriologie
Zytologie
NAGase
Viertelhandgemelk
Mikroskopische Zelldifferenzierung
Vitalität
CL-Aktivität
Blut
Zellsuspension
EDTA-Vollblutproben
Leukozytenzahl (WBC)
Mikroskopische Zelldifferenzierung
Blutplasma
NAGase
Zellsuspension
(aus EDTA-Blutproben)
NAGase
Mikroskopische Zelldifferenzierung
Vitalität
CL-Aktivität
93
Material und Methoden
3.9.5.2
Datengruppierung und statistische Auswertung
Für die Auswertung des gesamten Datenumfanges wurden Tests auf Normalverteilung und Korrelationskoeffizienten durchgeführt. Folgende Parameter waren erst
nach Logarithmierung normalverteilt: elektrische Leitfähigkeit, SCC im VAG, NAGase
VAG (Viertelanfangsgemelk), NAGase VGH (Viertelhandgemelk), Max und CLAktivität / ml Milch. Die nicht normal verteilten Parameter eosinophile Granulozyten
(Zellsuspension Milch), Epithelzellen (Zellsuspension Milch) und Vitalität der Zellsuspension Blut wurden in den Auswertungen nicht berücksichtigt (s. auch Abschnitt
3.9.3.2).
Zur Beurteilung der Wiederholbarkeit der mehrfach untersuchten Tiere wurden einfaktorielle Varianzanalysen für wiederholte Untersuchungen und t-Tests für abhängige Stichproben berechnet.
Die für die Auswertung gebildeten Gruppen sind in Tabelle 17 aufgeführt. Dabei wurden die Gruppen Kat1 bis Kat4 auf der Grundlage der Mastitiskategorisierung (HAMANN u. FEHLINGS 2002, s. Abschnitt 2.1.1) erstellt. Die statistischen Berechnungen erfolgten anhand von Student´s t-Tests für unabhängige Stichproben und einem
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test.
94
Material und Methoden
Tabelle 17: Datengruppierung in Versuch 3
Titel
Gruppen auf Basis der
Zellzahl
Gruppe
n
Selektionskriterien
Tps*:
SCC / ml Milch
T1
24
(96 V)
< 100.000 in allen
Vierteln
T2
21
(84 V)
100.000 – 400.000 in
mind. 1 Viertel
T3
24
(93 V)
> 400.000 in mind. 1
Viertel
aus Gruppe
Viertel: SCC / ml Milch
Euterkranke Tiere
Bakteriologischer
Status und
Zellfunktionalität
Gruppe Kat4 & SCC
T1/<25
40
< 25.000
T1
T2&3/<25
26
< 25.000
T2 & T3
T2&3/>100
111
> 100.000
T2 & T3
T2/100–400
43
100.000 – 400.000
T2
T3/100–400
27
100.000 – 400.000
T3
T3/>400
41
> 400.000
T3
Tps*:
SCC / ml Milch (Bakteriologie)
Kat 1
18
(72 V)
≤ 100.000 (negativ)
Kat 2
8
(32 V)
≤ 100.000 (positiv)
mind. 1 Viertel
Kat 3
9
(36 V)
> 100.000 (negativ)
mind. 1 Viertel
Kat 4
33
> 100.000 (positiv)
(130 V)
mind. 1 Viertel
Viertel: SCC / ml Milch (Bakteriologie)
Kat4/<100
26
≤ 100.000 (negativ)
Kat4/>100
68
> 100.000 (positiv)
n: Stichprobengröße (Tiere bzw. Viertel); Tps*: Tagesprobensätze; V: Viertel
95
Kat4
Material und Methoden
3.9.6
Gesamtdatenbank: Zusammenhang zwischen Kriterien der Zellfunktionalität und der Eutergesundheit, Betrachtung auf Viertelebene
3.9.6.1
Datenmaterial
Für weitere Auswertungen wurden die vorhandenen Daten der Versuche 2 (s. Abschnitt 3.9.4) und 3 (s. Abschnitt 3.9.5) in einer gemeinsamen Datenbank zusammengefasst. Es wurde darauf geachtet, nur einen Datensatz der mehrfach untersuchten Kühe einzubringen, sodass 171 Milchproben von 43 Tieren ausgewertet
werden konnten. Die Ergebnisse aus Blutproben wurden nicht berücksichtigt.
3.9.6.2
Datengruppierung und statistische Auswertung
Das vorliegende Datenmaterial wurde auf Normalverteilung und auf Korrelationen
einzelner Parameter zueinander geprüft. Die Parameter elektrische Leitfähigkeit,
SCC im VAG und Max waren normalverteilt, nachdem sie logarithmisch transformiert
worden waren.
CL-Aktivität / ml Milch Die Parameter eosinophile Granulozyten (Zellsuspension
Milch), Epithelzellen (Zellsuspension Milch) waren nicht normalverteilt und wurden
nicht in statistische Berechnungen einbezogen (s. auch Abschnitt 3.9.3.2).
Die gebildeten Gruppen (s. Tabelle 18) wurden mittels Student´s t-Tests und einfaktoriellen Varianzanalysen für unabhängige Stichproben miteinander verglichen.
96
Material und Methoden
Tabelle 18: Datengruppierung der Gesamtdatenbank
Titel
Gruppe
n
Selektionskriterien
aus Gruppe
Viertel: SCC / ml Milch
Gruppen auf Basis der
Zellzahl
V1
77
< 50.000
V2
18
50.000 – 100.000
V3
22
> 100.000 – 200.000
V4
50
> 200.000
Viertel: CL-Einh. / 1 Mio. PMN
Gruppen auf Basis der
CL-Aktivität M
CL1
54
< 3.000
CL2
44
3.000–6.000
CL3
70
> 6.000
Viertel: SCC / ml Milch
Gruppe CL2 & SCC
CL2/T<100
15
< 100.000 auf Tierebene
CL2/V<100
10
< 100.000 auf Viertelebene
CL2/V>100
14
≥ 100.000 auf Viertelebene
n: Stichprobengröße
97
CL2
4.
Ergebnisse
Die Untersuchungen wurden durchgeführt, um Zusammenhänge zwischen der Eutergesundheit und der Funktionalität von aus Blut und Milch isolierten Leukozyten zu
erkennen. Am Anfang standen Etablierung und Standardisierung der empfindlichen
Untersuchungssysteme der Zellfunktionalität (s. Abschnitte 4.1 und 4.2). Dann wurden gezielt Versuchstiergruppen gebildet, mit denen bestimmte Fragestellungen bearbeitet wurden. In Versuch 1 wurde die Aktivität der Zellen aus Milch auf Abhängigkeit von der Zellfunktionalität der PMN aus Blut überprüft (s. Abschnitt 4.3). In einer
Verlaufsuntersuchung (Versuch 2, Abschnitt 4.4) wurde die Entwicklung der Zellfunktionalität von einzelnen Tieren in den ersten drei Laktationsmonaten verfolgt. In einem abschließenden Versuch 3 und anhand einer Gesamtdatenbank wurde die Eutergesundheit mit zytologischen Methoden bestimmt und mit den neueren funktionellen Parametern verglichen (Abschnitte 4.5 und 4.6).
4.1
Methodische Versuche zur Phagozytoseaktivität
in Blut
Da es weder für die Messung der Phagozytoseaktivität noch für die Bestimmung der
Chemilumineszenz im Luminometer allseits anerkannte Arbeitsvorschriften gab, die
sich an aus Milch isolierten Zellen anwenden lassen, war es notwendig, vorhandene
Anweisungen zu überprüfen und zu modifizieren. Das in den Versuchen 1 bis 3 angewandte Vorgehen ist in Abschnitt 3.6 beschrieben, die Unterschiede zur Arbeitsanweisung der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
sind in Abschnitt 5.1.4 tabellarisch dargestellt.
98
Ergebnisse
4.1.1
Inkubationszeit
Wie in Abschnitt 3.9.1.1 beschrieben, wurde der Einfluss der Inkubationszeit auf das
Ergebnis der Phagozytosemessung untersucht.
Der Anteil phagozytierender Zellen (% n bzw. % o) stieg mit längerer Inkubationszeit
an. Die Auswertung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI), mit der die Zahl der
aufgenommenen Bakterien pro Zelle abgeschätzt werden kann, zeigte für die Proben
„o“ (opsonisiert mit Serum) mit steigender Inkubationszeit ebenfalls einen kontinuierlichen Anstieg, für die Proben „n“ (nicht opsonisiert) lagen die Werte für 30 und 60
Minuten auf ähnlichem Niveau (s. Tabelle 19).
Tabelle 19: Vergleich der Phagozytoseaktivität von Blut-PMN mit verschiedenen
Inkubationszeiten
Inkubation in
Minuten
30
60
90
Tier
Probe
%
MFI
%
MFI
%
MFI
A
n
8,3
15,7
10,3
14,6
18,6
55,8
A
o
24,0
90,1
52,2
95,3
79,8
226,5
B
n
20,6
10,2
19,9
8,9
25,8
16,1
B
o
29,7
36,4
46,1
47,3
68,3
76,5
%: Anteil phagozytierender PMN;
MFI: mittlere Fluoreszenzintensität;
n: nicht opsonisierte Proben;
o: opsonisierte Proben
4.1.2
Zellkonzentration
Bezüglich der Phagozytosemessung mit unterschiedlichen Zellkonzentrationen (s.
Abschnitt 3.9.1.2) war in den Proben „n“ der Anteil phagozytierender Zellen höher, je
niedriger die Zellzahl war. Der Anteil aktiver Zellen der Proben „o“ sank für Tier A mit
der Zellkonzentration ab und blieb für Tier B in allen Ansätzen etwa gleich. Mit
99
Ergebnisse
200.000 Zellen / ml in der Probe (Ansatz c) war der Unterschied zwischen den opsonisierten (o) und den nicht opsonisierten Proben (n) geringer als in den Ansätzen a
und b (s. Tabelle 20).
Tabelle 20: Vergleich der Phagozytoseaktivität in Blut-PMN mit verschiedenen Zellkonzentrationen in der Probe
Zellen / ml
4 Mio. (a)
2 Mio. (b)
200.000 (c)
Tier
Probe
%
MFI
%
MFI
%
MFI
A
n
10,3
14,6
11,3
19,9
29,4
66,1
A
o
52,2
95,3
42,8
96,2
32,4
99,1
B
n
24,1
8,92
30,3
11,0
39,4
31,8
B
o
46,7
52,4
47,4
64,0
45,0
56,4
%: Anteil phagozytierender PMN;
MFI: mittlere Fluoreszenzintensität;
n: nicht opsonisierte Proben;
o: opsonisierte Proben
4.1.3
Bakterienkonzentration
Um die geeignete Zahl der Bakterien zu eruieren, wurden zwei Ansätze mit unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen gemessen (s. Abschnitt 3.9.1.3).
Mit steigender Bakterienkonzentration stiegen sowohl der Prozentsatz aktiver Zellen
als auch die mittlere Fluoreszenzintensität (s. Tabelle 21). Bezogen auf den Anteil
phagozytierender Zellen war der Unterschied zwischen den Proben „n“ und „o“ in den
Proben mit der höheren Bakterienkonzentration größer.
100
Ergebnisse
Tabelle 21: Vergleich der Phagozytoseaktivität in Blut-PMN mit verschiedenen Bakterienkonzentrationen in der Probe
0,15 x 108/ml
Bakterienkonz.
0,7 x 108/ml
Tier
Probe
%
MFI
%
MFI
A
n
6,2
8,3
11,1
19,9
B
n
18,4
4,3
30,3
11,0
A
o
15,0
34,9
42,8
96,2
B
o
19,2
9,3
47,4
64,0
%: Anteil phagozytierender PMN;
MFI: mittlere Fluoreszenzintensität;
n: nicht opsonisierte Proben;
o: opsonisierte Proben
101
Ergebnisse
4.2
Methodische Versuche zur CL-Aktivität in Blut
In diesem Abschnitt wurde der Einfluss einzelner Parameter auf die CL-Aktivität überprüft. Für die Versuche 1 bis 3 wurde die Messung unter den optimalen Bedingungen durchgeführt (s. Abschnitt 3.7). In Tabelle 79 (s. Abschnitt 5.2.9) werden die
eigenen Ergebnisse den Angaben von MEHRZAD (2002) gegenübergestellt.
4.2.1
Zellisolierung bei verschiedenen Temperaturen
Nach der Isolation der Blutzellen bei 0° C und bei 25° C (s. Abschnitt 3.9.2.1) wurden
die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen hinsichtlich ihrer CL-Aktivität untersucht.
Die CL-Aktivität / 1 Million PMN der Blutproben der Tiere 1, 2 und 4 war in Gruppe 2
(25° C) regelmäßig niedriger als in Gruppe 1 (0° C). Tier 3 wies jedoch stets in Gruppe 1 die geringeren Werte auf.
Der Varianzkoeffizient aller Proben pro Gruppe (jeweils n = 8) betrug zwischen den
Proben aus Gruppe 1 24,8 %, der zwischen den Proben aus Gruppe 2 33,0 % (s.
Tabelle 22).
Tabelle 22: Mittelwerte (X), Standardabweichungen
(sd) und Variationskoeffizienten (VK) der Gruppen 1
und 2 (Versuch Zellisolation)
Gruppe 1
(0° C)
Gruppe 2
(25° C)
X
2.098
2.001
± sd
520,5
659,6
VK
24,8
33,0
Stichprobengröße n = 8;
dargestellt sind CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
102
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Vitalitätsmessung im Durchflusszytometer (s. Abschnitt 3.5.8)
ließen im FSC/SSC-Dot Plot erkennen, dass in den Proben aus Gruppe 2 mehr Zellaggregate vorhanden waren als in den Proben aus Gruppe 1.
4.2.2
Inkubation bei verschiedenen Temperaturen
Nach der Isolierung der PMN wurde jeweils ein Teil der Zellsuspension ca. 1 Stunde
bei 0° C (Ansatz 1), 25° C (Ansatz 2) bzw. 38° C (Ansatz 3) inkubiert (s. Abschnitt
3.9.2.2). Der Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Höhe der CL-Aktivität wurde
untersucht. Das Probenschema ist der Tabelle 23 zu entnehmen.
Von allen durchgeführten Messungen wurden die CL-Einheiten / 1 Mio. PMN berechnet.
Tabelle 23: Probenschema für den Versuch zur Inkubation mit verschiedenen Temperaturen
Tier
Tag 1
Tag 2
Tag 3
Tag 4
Tag 5
1
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
2
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
4
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 1
Ansatz 2
Ansatz 3
Für jedes Tier wurden der Mittelwert, die Standardabweichung und der Variationskoeffizient aus den Ergebnissen von Ansatz 1 (Tag 1) bis Ansatz 1 (Tag 5) gebildet.
Entsprechend wurde mit den Ansätzen 2 und 3 verfahren. Der niedrigste mittlere Variationskoeffizient lag in Ansatz 1 (s. Tabelle 24).
103
Ergebnisse
Der erste Messwert der 30 Einzelwerte, die während der Chemilumineszenzmessung
erhoben werden (s. 3.7.7), lag in den Ansätzen 3 häufig über 0.
Tabelle 24: Mittelwerte (X), Standardabweichungen (sd) und Variationskoeffizienten
(VK) der Ansätze 1 bis 3, nach Tieren getrennt (Versuch zur Inkubation)
Tier
Ansatz 1 (0° C)
Ansatz 2 (25° C)
Ansatz 3 (38° C)
X
1.711
1.679
1.520
± sd
500
622
362
VK
29,2
37,1
23,8
X
1.430
1.448
1.619
± sd
279
360
539
VK
19,5
24,9
33,3
X
2.033
2.139
2.716
± sd
552
541
1.430
VK
27,1
25,3
52,6
X
2.963
2.934
2.612
± sd
946
1.598
939
VK
31,9
54,5
36,0
mittlerer VK
26,9
35,5
36,4
1
2
3
4
dargestellt sind die CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
4.2.3
Lagerungsdauer der Proben
Nach mehrmaliger Messung der selben Proben innerhalb von 24 Stunden wurde für
die Tiere 3 und 4 ein kontinuierlicher Abfall von Vitalität und CL-Aktivität beobachtet
(s. Abbildung 6). Für die Tiere 1 und 2 wies die CL-Aktivität ein Maximum nach 6
Stunden auf und fiel danach ab. Insgesamt blieben die CL-Aktivitäten der Tiere 1 und
2 höher als die der beiden anderen Tiere. Bei der ersten Messung lagen die Ergebnisse der CL-Bestimmung der gesunden Tiere 3 und 4 jedoch nicht niedriger als die
der kranken Tiere 1 und 2.
104
Ergebnisse
Tabelle 25 gibt die Werte der CL-Aktivität und der Vitalität zu allen Messzeitpunkten
wieder.
CL-Aktivität im zeitlichen Verlauf:
Tiere 1 & 2 Mastitis, Tiere 3 & 4 gesund
CL-Einheiten/1 Mio. PMN in
1.000
25
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 4
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
Stunden
Abbildung 6: CL-Aktivität im zeitlichen Verlauf aus Blutproben von 4 Tieren
Tabelle 25: Einfluss unterschiedlicher Inkubationszeiten auf die CL-Aktivität und
die Vitalität von 4 Blutproben
Inkubation in
Stunden
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 4
0
6
18
24
CL
11.985
8.629
15.796
14.776
Vit.
98,2
97,3
97,0
93,6
CL
21.267
12.971
6.117
7.475
Vit.
97,3
98,8
96,7
93,6
CL
12.663
10.519
2.099
2.709
Vit.
97,2
98,6
92,5
93,0
CL
10.817
8.641
1.069
1.400
Vit.
95,3
96,9
79,1
79,4
CL: CL-Aktivität / 1 Mio. PMN
Vit.: Vitalität in %
105
Ergebnisse
4.2.4
Zellkonzentration
Die Abhängigkeit der CL-Aktivität von der Zahl der Zellen in der Probe wurde untersucht (s. Abschnitt 3.9.2.4). Jeder der drei Ansätze bestand aus 16 Stichproben.
Die CL-Aktivität entwickelte sich etwa parallel zur Zellkonzentration in der Messlösung (s. Abbildung 7). Die Korrelation zwischen der CL-Aktivität (unbereinigt) und der
Anzahl vitaler PMN in 50 µl Arbeitslösung betrug, je nach Tier und Versuchstag, 0,97
bis 0,99.
Tabelle 26 gibt die CL-Aktivitäten eines Versuchstages von allen vier Tieren in Abhängigkeit von der Zellkonzentration wieder. Die Ergebnisse dieses Versuchstages
sind als CL-Aktivität (unbereinigt) in Abbildung 7 noch einmal graphisch dargestellt
und zeigen in drei von vier Tieren einen linearen Anstieg der CL-Aktivität mit steigender Zellzahl.
Tabelle 26: CL-Aktivität unter Berücksichtigung verschiedener Zellkonzentrationen
an Versuchstag 1
Tier Ansatz
Zellkonzentration in 103 / ml
vitale PMN /
50 µl
CL-Aktivität
(unbereinigt)
CL-Einheiten /
1 Mio. PMN
1
a
b
c
1,450
2,175
4,350
58.500
87.751
175.502
148,3
245,7
372,0
2.162
2.389
1.809
2
a
b
c
1,330
2,000
4,000
57.346
86.234
172.469
116,9
159,2
271,6
1.838
1.666
1.422
3
a
b
c
1,283
1,952
3,850
42.128
63.209
126.419
93,2
120,5
194,0
1.943
1.676
1.350
4
a
b
c
1,267
1,900
3,800
50.871
76.286
152.573
173,7
233,5
378,8
2.642
2.369
1.922
106
Ergebnisse
CL-Aktivität in Abhängigkeit von der Zellkonzentration,
Versuchstag 1
CL-Aktivität (unbereinigt)
400
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 4
350
300
250
200
150
100
50
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Zellkonzentration in Mio./ml
Abbildung 7: CL-Aktivität (unbereinigt) in Abhängigkeit von der Zellkonzentration,
Versuchstag 1
4.2.5
PMA-Konzentration
Mit dieser Untersuchung wurde die Frage verfolgt, welche PMA-Konzentration für die
Bestimmung der CL-Aktivität geeignet ist (s. Abschnitt 3.9.2.5). Dafür wurden drei
Reaktionslösungen mit jeweils verschiedenen PMA-Konzentrationen zur Messung
der CL-Aktivität eingesetzt.
Für jede Reaktionslösung (RL) lagen Daten von vier Tieren und je drei Versuchstagen vor. Insgesamt bestand daher die Stichprobengröße je Reaktionslösung aus 12
Datensätzen.
In 7 von 12 Probensätzen bestand zwischen der Konzentration des PMA und der CLAktivität / 1 Mio. PMN eine positive Korrelation größer als 0,78.
Aus allen Proben mit RL 1 (375 ng PMA / ml, n = 12) wurden Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient gebildet. Ebenso wurden die RL 2 (750 ng
PMA / ml) und 3 (1.500 ng PMA / ml) ausgewertet. Der Variationskoeffizient betrug
für RL 1 35,7 %, für RL 2 22,2 % und für RL 3 32,0 % (s. Tabelle 27).
107
Ergebnisse
Eine graphische Darstellung der Ergebnisse des dritten Versuchstages befindet sich
in Abbildung 8.
CL-Aktivität in Abhängigkeit verschiedener
PMA-Konzentrationen, Versuchstag 3
2.000
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 4
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
1.800
1.600
1.400
1.200
1.000
800
600
400
200
0
0
200
400
600
800
1.000
1.200
1.400
Konzentration PMA in Reaktionslösung in ng / ml
Abbildung 8: Vergleich verschiedener PMA-Konzentrationen anhand der CL-Aktivität,
Versuchstag 3
Tabelle 27: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten der
CL-Aktivität / 1 Mio. PMN, gemessen mit drei verschiedenen PMAKonzentrationen RL1, RL2 und RL3
PMA-Konzentration
RL 1
(375 ng / ml)
RL 2
(750 ng / ml)
RL 3
(1.500 ng / ml)
Mittelwert
411,9
496,0
475,0
Standardabweichung
147,2
110,3
151,9
Variationskoeffizient
35,7
22,2
32,0
n = 8 pro RL;
dargestellt sind CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
108
Ergebnisse
4.2.6
pH-Wert
Um den Einfluss des pH-Wertes in der Reaktionslösung (RL) auf die Messung der
CL-Aktivität einordnen zu können, wurden die Proben von vier Tieren an drei Versuchstagen mit unterschiedlichen pH-Werten gemessen (s. Abschnitt 3.9.2.6).
Aus allen gemessenen Proben wurden die mit RL 1 und die mit RL 2 in Gruppen zusammengefasst. Die Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten
der beiden Gruppen sind der Tabelle 28 zu entnehmen.
Der Vergleich der Ergebnisse der Versuchstage 1 bis 3, getrennt nach Tier und pHWert, ergab für den pH-Wert von 7,1 höhere Varianzen als für den pH-Wert von 10,8
(s. Tabelle 29).
Tabelle 28: CL-Einheiten / 1 Mio. PMN der
Gruppen RL 1 (pH = 10,8) und RL 2
(pH = 7,1)
pH 10,8
pH 7,1
Stichproben
n = 12
n = 12
Mittelwert
2.748
272
Standardabweichung
927,5
89,7
VK
33,7
33,0
dargestellt sind CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
109
Tabelle 29: Variationskoeffizienten
(VK in %) aus den CL-Aktivitäten
zwischen den Versuchstagen 1 – 3
Tier
pH 10,8
pH 7,1
1
9,6
33,0
2
21,0
24,3
3
18,2
28,6
4
28,8
50,4
Ergebnisse
4.2.7
Messung der CL-Aktivität aus Vollblut, lysiertem Blut und aufbereiteter Zellsuspension
Mit dieser Untersuchung sollte gestestet werden, ob die Messung der CL-Aktivität
auch ohne die zeitaufwändige Zellisolierung möglich ist (s. Abschnitt 3.9.2.7). Gemessen wurden drei Arten von Proben: Vollblutproben (a), lysierte Proben (b) und
isolierte PMN (c).
Aus den Proben a konnte im Luminometer keine CL-Aktivität erfasst werden. Die Ergebnisse in CL-Einheiten / 1 Million PMN der beiden anderen Probenarten sind beispielhaft für Versuchstag 1 in Tabelle 30 dargestellt. Die Werte der isolierten PMN
lagen etwas höher.
Der Korrelationskoeffizient zwischen der Gruppe b und der Gruppe c (n = 12 in jeder
Gruppe) betrug, wenn jeweils alle Tiere und alle Tage zusammengefasst wurden,
0,96.
Tabelle 30: CL-Aktivität / 1 Mio. PMN von 4 Tieren an einem Versuchstag aus isolierten PMN und lysierten Blutproben
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 4
isolierte PMN
4.705
3.722
8.012
8.243
lysiertes Blut
3.579
3.142
7.184
7.269
dargestellt sind CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
4.2.8
Wiederholbarkeit innerhalb eines Tages
Ziel der Untersuchungen war es, die Wiederholbarkeit der CL-Aktivitätsbestimmung
zu überprüfen.
In diesem Versuch wurde zwischen Proben und Arbeitslösungen unterschieden (s.
Abschnitt 3.9.2.8). An vier Tagen wurden von jedem Tier zwei Proben getrennt aufbereitet (Proben 1 und 2). Von jeder Probe wurden wiederum je zwei Arbeitslösungen hergestellt (Arbeitslösungen 1a, 1b, 2a und 2b).
110
Ergebnisse
Für die Auswertung wurde der Parameter CL-Einheiten / 1 Million PMN verwendet.
Aus den beiden Arbeitslösungen jeder Probe wurden Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient berechnet. Die Variationskoeffizienten lagen zwischen 0,2 und 14,2 %, im Mittel bei 4,7 %.
Ebenfalls wurden für jeden Tag aus den vier Proben 1a, 1b, 2a und 2b eines Tieres
die Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten erhoben, die Variationskoeffizienten betrugen in diesem Fall zwischen 5,2 und 24,1 %, im Schnitt
10,5 % (s. Tabelle 31).
Tabelle 31: Mittelwerte (X), Standardabweichungen (sd) und Variationskoeffizienten (VK) der vier Ansätze pro Tier für die Tage 1 bis 4 (Versuch zur
Wiederholbarkeit)
Tier
1
2
Tag 1
Tag 2
Tag 3
Tag 4
X
2.495
1.963
3.654
2.496
± sd
275
103
436
275,
VK
11,0
5,2
11,9
11,0
X
5.227
2.128
2.635
5.228
± sd
303
193
634
303
VK
5,8
9,1
24,1
5,8
mittlerer VK
10,5
dargestellt sind CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
111
Ergebnisse
4.3
Versuch 1: Einfluss der Zahl der erkrankten Euterviertel pro Kuh auf die Zellfunktionalität von
PMN aus Milch und Blut
Ziel der Untersuchungen war es, die Aktivität der aus Blut gewonnenen Zellen hinsichtlich der Eutergesundheit einzuordnen. Außerdem sollten gezielt Tiere untersucht
werden, die auf allen vier Eutervierteln erkrankt waren, und mit gesunden Tieren verglichen werden. Hierfür wurden Milch- und Blutproben von 20 Tieren aus den beiden
Betrieben untersucht (s. Abschnitt 3.9.3). Neben der zytobakteriologischen Untersuchung wurde besonderes Augenmerk auf die Zelldifferenzierung und die funktionellen Parameter Chemilumineszenz und Phagozytose gerichtet.
Auf der Grundlage der Zellzahl im VAG wurden drei Gruppen gebildet (s. Abschnitt
4.3.1), und diese untereinander verglichen. Die Ergebnisse für die Blutwerte sind in
Abschnitt 4.3.2 und die für die Milchwerte in Abschnitt 4.3.3 dargestellt.
4.3.1
Gruppen auf Basis der Zellzahl im VAG
Aus den vorhandenen Datensätzen wurde die in Abbildung 9 dargestellte Gruppeneinteilung vorgenommen.
20 Tiere
Gruppe A
5 Tiere
SCC < 30.000
in allen Vierteln
Gruppe B
10 Tiere
SCC > 100.000
in 1 bis 3 Vierteln
Gruppe C
5 Tiere
SCC > 100.000
in allen Vierteln
Abbildung 9: Gruppeneinteilung in Versuch 1; SCC: Anzahl somatischer Zellen / ml
VAG
112
Ergebnisse
4.3.2
Blutproben
4.3.2.1
Korrelationen
4.3.2.1.1
Vollblutuntersuchungen
Tabelle 32 gibt Korrelationen zwischen dem Anteil PMN im Blutausstrich und verschiedenen Parametern wieder.
Korrelationen zum Anteil PMN im Zelldifferentialbild aus Vollblut bestanden für die
jeweiligen Anteile eosinophiler Granulozyten und Lymphozyten, für WBC und Time.
Tabelle 32: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener
Parameter aus Blutproben zum Anteil
PMN in Blut (n = 20)
Parameter
WBC
k
0,64
eosinophile Granulozyten B
-0,38
Lymphozyten B
-0,94
%n
-0,23
MFI n
-0,07
%o
-0,13
MFI o
-0,05
CL-Aktivität B
0,06
log Max
0,08
Time
-0,50
n: Stichprobengröße (Tiere)
113
Ergebnisse
4.3.2.1.2
Zellfunktionalität in Blut
In Tabelle 33 werden die Korrelationskoeffizienten der Parameter aus Blutproben
untereinander dargestellt.
Tabelle 33: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der Zellfunktionalität von aus Blut isolierten Zellen zueinander (n = 20)
Parameter 1
Parameter 2
k
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
log Max
0,81
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
Time
-0,12
log Max
Time
0,07
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
%n
0,22
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
MFI n
-0,26
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
%o
-0,03
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
MFI o
0,28
n: Stichprobengröße (Tiere)
Für die funktionellen Parameter aus Blut lag eine Korrelation zwischen der CLAktivität / 1 Mio. PMN und log Max vor.
4.3.2.2
Gruppenvergleich
Tabelle 34 gibt die Werte der Untersuchungen aus Blutproben wieder. Die Signifikanzen zwischen diesen Gruppen sind in Tabelle 35 aufgeführt.
114
Ergebnisse
Tabelle 34: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) von aus Blut gewonnenen Daten der Gruppen A, B und C
Gruppe
A
B
C
WBC
PMN
Eos
Lym
%n
1 / MFI n
X
6,9
42,6
2,6
53,4
37,6
0,15
sd
2,1
10,6
0,9
10,2
23,9
0,09
n
5
5
5
5
5
5
X
8,4
47,5
7,1
44,0
42,3
0,20
sd
1,4
16,0
5,0
13,2
17,5
0,05
n
10
10
10
10
10
10
X
9,7
54,6
9,6
34,2
32,9
0,21
sd
3
16,5
5,3
11,7
12,3
0,02
n
5
5
5
5
5
5
log Max
Time
Gruppe
%o
X
40,4
0,01
15.499
0,21
1.449
sd
18,8
0,01
5.330
0,22
297
n
5
5
5
5
5
X
45,1
0,02
11.008
0,14
1.481
sd
12,7
0,02
4.639
0,24
367
n
10
10
10
10
10
X
39,0
0,02
11.336
0,17
1.477
sd
15,6
0,02
4.799
0,15
424
n
5
5
5
5
5
A
B
C
1 / MFI o CL-Aktivität B
n = Stichprobengröße (Tiere)
115
Ergebnisse
Tabelle 35: Signifikanzen von aus Blutproben gewonnenen Daten zwischen den
Gruppen A bis C
Gruppen
WBC
PMN
Eos
Lym M
%n
1 / MFI n
A
B
n. s.
n. s.
*
n. s.
n. s.
n. s.
A
C
n. s.
n. s.
*
*
n. s.
n. s.
B
C
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
Allgemein
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
Gruppen
%o
1 / MFI o
CLAktivität B
log Max
Time
A
B
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
A
C
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
B
C
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
Allgemein
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
*: p < 0,05;
**: p < 0,01;
***: p < 0,001
4.3.2.2.1
Vollblutuntersuchungen
Statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05) waren nur für die Anteile eosinophiler
Granulozyten und Lymphozyten zu ermitteln. Dennoch lagen in Gruppe C die Werte
von WBC (9,7 Mio. / ml) und der Anteil PMN (54,6 %) höher als in den beiden anderen Gruppen.
4.3.2.2.2
Zellfunktionalität in Blut
Die größten Anteile phagozytierender Zellen hatte die Gruppe B sowohl in den nicht
opsonisierten (42,3 %) als auch in den opsonisierten Proben (45,1 %). Die Gruppe A
wies für die Parameter CL-Aktivität B (15.499 Einheiten / 1 Mio. PMN) sowie log Max
(0,21) die höchsten Werte auf.
116
Ergebnisse
4.3.3
Milchproben
4.3.3.1
Korrelationen
4.3.3.1.1
Eutergesundheit
In Tabelle 36 sind die Korrelationskoeffizienten verschiedener Parameter zur Zellzahl
im VAG aufgeführt.
Tabelle 36: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus Milchproben zu log SCC (n = 79)
Parameter
k
elektrische Leitfähigkeit
0,65
PMN M
0,59
Lymphozyten M
-0,61
Makrophagen M
-0,35
%n
-0,37
MFI n
-0,05
%o
-0,68
MFI o
-0,68
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN M
0,39
log Max
0,65
Time
-0,57
log CL-Aktivität / ml Milch
0,89
n: Stichprobengröße (Viertel)
Die Zellzahl korrelierte mit der elektrischen Leitfähigkeit, den Anteilen PMN, Lymphozyten und Makrophagen aus dem mikroskopischen Zelldifferentialbild und mit den
Parametern der CL-Aktivität. Bezüglich der Phagozytose zeigten besonders die Daten der opsonisierten Proben Korrelationen zur Zahl somatischer Zellen.
117
Ergebnisse
4.3.3.1.2
Zelldifferentialbild in Milch
In Tabelle 37 sind die Korrelationen verschiedener Parameter aus Milchproben zum
Anteil PMN in Milch dargestellt.
Tabelle 37: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener
Parameter aus Milchproben zum Anteil
PMN in Milch (n = 79)
Parameter
k
Lymphozyten M
-0,83
Makrophagen M
-0,77
%n
-0,49
MFI n
-0,13
%o
-0,57
MFI o
-0,84
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN M
0,48
log Max
0,85
Time
-0,56
log CL-Aktivität / ml Milch
0,80
n: Stichprobengröße (Viertel)
Der Anteil PMN in der Milchzellsuspension zeigte hohe Korrelationen zu den entsprechenden Anteilen Lymphozyten und Makrophagen, aber auch zu den funktionelle Parametern.
4.3.3.1.3
Zellfunktionalität in Milch
Tabelle 38 führt die Korrelationskoeffizienten verschiedener Parameter der Zellfunktionalität aus Milchzellen auf.
118
Ergebnisse
Tabelle 38: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der Zellfunktionalität von aus Milch isolierten Zellen zueinander (n = 79)
Parameter 1
Parameter 2
k
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
log Max
0,76
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
Time
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
log CL-Aktivität / ml Milch
log Max
Time
log Max
log CL-Aktivität / ml Milch
0,88
Time
log CL-Aktivität / ml Milch
-0,62
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
%n
-0,14
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
MFI n
-0,06
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
%o
-0,39
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
MFI o
-0,54
-0,23
0,66
-0,60
n: Stichprobengröße (Viertel)
Unter den Werten der Phagozytosemessung korrelierten nur die Daten der opsonisierten Proben mit der CL-Aktivität. Die Parameter der CL-Aktivität zeigten, abgesehen von der CL-Aktivität / 1 Mio. PMN zum Parameter Time, untereinander deutliche
Korrelationen.
4.3.3.2
Gruppenvergleich
Für die statistischen Auswertungen wurde aus den vier Vierteln eines Tieres jeweils
der Mittelwert gebildet. Die Berechnung der t-Tests und Varianzanalysen erfolgte
dann anhand dieser Mittelwerte. Aus diesem Grund hat die Gruppe A bspw. eine
Stichprobenzahl n = 5.
Die Grunddaten der Gruppen A bis C sind der Tabelle 39 zu entnehmen. Signifikanzen zwischen den Gruppen sind in Tabelle 40 aufgeführt.
119
Ergebnisse
Tabelle 39: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) von aus Milchproben
gewonnenen Daten der Gruppen A, B und C
Gruppe
log SCC
LF
PMN M
Lym M
4,22
5,43
41,9
27,7
25,5
66,9
49,6
0,19
0,22
16,2
8,7
3,3
7,9
6,0
n
5
5
5
5
5
5
5
X
5,00
6,06
65,2
12,2
21,0
79,3
32,9
0,75
0,44
17,5
7,9
10,9
14,6
8,8
n
10
10
10
10
10
10
10
X
5,90
6,62
83,9
2,8
13,2
80,4
35,7
0,32
0,56
10,7
1,6
9,4
13,1
16,7
5
5
5
5
5
5
5
log Max
Time
log ClAktivität / ml
Milch
X
A ± sd
B ± sd
C ± sd
n
Gruppe 1 / MFI n
X
%o
CL-Akti1 / MFI o
vität M
Makro M Vitalität
%n
0,21
54,5
0,16
4.419
-1,43
2.017
1,14
0,05
7,8
0,03
1.568
0,38
415
0,46
n
5
5
5
5
5
5
5
X
0,22
43,5
0,09
6.615
-0,79
1.593
2,32
0,06
10,4
0,03
4.369
0,45
267
0,65
n
10
10
10
10
10
10
10
X
0,22
32,2
0,03
9.304
-0,33
1.425
3,62
0,06
2,6
0,01
3.928
0,14
350
0,22
5
5
5
5
5
5
5
A ± sd
B ± sd
C ± sd
n
n = Stichprobengröße (Tiere)
120
Ergebnisse
Tabelle 40: Signifikanzen von aus Milchproben gewonnenen Daten zwischen den
Gruppen A bis C
Gruppen
log SCC
LF
PMN M
Lym M
Makro M Vitalität
%n
A
B
***
*
*
**
n. s.
n. s.
**
A
C
***
**
**
**
*
n. s.
n. s.
B
C
***
n. s.
*
**
n. s.
n. s.
n. s.
Allgemein
***
**
**
***
n. s.
n. s.
*
Gruppen
1 / MFI
n
%o
1 / MFI
o
CL-Aktivität M
log Max
Time
log ClAktivität / ml
Milch
A
B
n. s.
n. s.
***
n. s.
*
*
**
A
C
n. s.
***
***
*
***
*
***
B
C
n. s.
**
**
n. s.
n. s.
n. s.
***
n. s.
**
***
n. s.
**
*
***
Allgemein
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
*: p < 0,05;
**: p < 0,01;
***: p < 0,001
4.3.3.2.1
Eutergesundheit
Mit der Zellzahl im VAG stiegen die Werte der elektrischen Leitfähigkeit an.
4.3.3.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Die Anteile der PMN und Lymphozyten in der Milchzellsuspension veränderten sich
von Gruppe zu Gruppe signifikant (s. Tabelle 40). Dabei lag der Anteil PMN in Gruppe C am höchsten, der der Lymphozyten in Gruppe A.
4.3.3.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Die Phagozytoseaktivität der opsonisierten Proben zeigte deutlichere Unterschiede
zwischen den Gruppen als die der nicht opsonisierten. In den opsonisierten Proben
121
Ergebnisse
sank der Prozentsatz aktiver Zellen ebenso wie der Wert 1 / MFI von Gruppe A bis
Gruppe C signifikant ab (p < 0,01).
Hinsichtlich der CL-Aktivität wurde ein Anstieg der Werte von Gruppe A zu Gruppe C
festgestellt, der jedoch nur für den Vergleich von Gruppe A mit Gruppe C statistisch
signifikant war. Die CL-Aktivität / ml Milch stieg von Gruppe zu Gruppe signifikant an
(p < 0,01).
122
Ergebnisse
4.4
Versuch 2: Verlaufsuntersuchung
Die Tiere 1 bis 8 wurden von der Abkalbung an in wöchentlichem Abstand zwischen
elf und 13 Mal untersucht. Auf diese Weise wurden Informationen über den Gesundheitszustand der Kühe über die ersten drei Monate der Laktation gesammelt.
Die Tiere, die im gesamten Zeitraum der Untersuchung eutergesund waren, wurden
in einer Gruppe zusammengefasst und hinsichtlich des Laktationsstadiums ausgewertet (Abschnitt 4.4.1).
Drei Tiere entwickelten im Verlauf der Untersuchung eine Mastitis. Die Datensätze
aus den Untersuchungswochen vor, während und nach der Euterentzündung wurden
miteinander verglichen. Dabei wurden sowohl die betroffenen Euterviertel als auch
die nicht betroffenen Viertel derselben Tiere in die Bewertungen einbezogen (Abschnitt 4.4.2).
Zwei Tiere hatten eine latente Infektion mit S. aureus und wurden in der Auswertung
der Daten nicht berücksichtigt.
4.4.1
Eutergesunde Tiere
Drei Tiere blieben während des gesamten Untersuchungszeitraumes eutergesund.
Die Daten dieser Tiere wurden in Laktationswochen eingeteilt und von Woche zu
Woche miteinander verglichen. Dadurch ergab sich eine Datengruppierung nach
dem in Tabelle 41 dargestellten Schema.
4.4.1.1
Zellzahl im VAG
Die durchschnittlichen Zellzahlen der Gruppen W1 bis W14 sind in Abbildung 10 graphisch dargestellt. In den Wochen W1 bis W3 lag log SCC jeweils über 4,4, in den
übrigen Wochen befanden sich die Werte zwischen 3,5 und 4,2.
123
Ergebnisse
Tabelle 41: Einteilung der Daten der gesunden Tiere nach Laktationswochen (W)
Woche
Laktationstage
n
Woche
Laktationstage
n
W1
1–7
12
W8
50 – 56
12
W2
8 – 14
8
W9
57 – 63
12
W3
15 – 21
8
W10
64 – 70
12
W4
22 – 28
12
W11
71 – 77
12
W5
29 – 35
12
W12
78 – 84
12
W6
36 – 42
8
W13
85 – 91
12
W7
43 – 49
12
W14
92 – 98
12
n: Stichprobengröße (Viertel)
4.4.1.2
Zelldifferentialbild in Milch
Das Zelldifferentialbild der Milch-Zellsuspensionen (s. Abbildung 11) wurde in den
Wochen W2, W8 und W14 von PMN dominiert. In den übrigen Wochen waren die
Lymphozyten die stärkste Zellfraktion.
4.4.1.3
Zellfunktionalität in Blut und Milch
Die Werte der opsonisierten Proben o lagen stets über denen der nicht opsonisierten
Proben n (s. Abbildung 12). Für alle Parameter ließ sich ein Peak in Woche W2 feststellen.
In Abbildung 13 sind die CL-Einheiten / 1 Mio. PMN der Zellen aus Blut und aus
Milch nach Wochen aufgeführt. Die Werte der PMN aus Blut waren höher als die der
PMN aus Milch. Maxima lagen in Woche W2 sowie in den Wochen W11 und W12
vor.
124
Ergebnisse
Zahl somatischer Zellen in Milch im Laktationsverlauf
gesunder Tiere
6
5
log SCC
4
3
2
1
0
W1
W2
W3
W4
W5
W6
W7
W8
W9
W10 W11 W12 W13 W14
Laktationswoche
Abbildung 10: Zellzahl im VAG im Laktationsverlauf von drei gesunden Tieren
Verteilung der Zellarten in der Milch-Zellsuspension im
Laktationsverlauf gesunder Tiere
100
PMN
Lymphozyten
Makrophagen
90
80
Anteil in %
70
60
50
40
30
20
10
0
W1
W2
W3
W4
W5
W6
W7
W8
W9
W10 W11 W12 W13 W14
Laktationswoche
Abbildung 11: Verteilung der Zellarten in der Zellsuspension Milch von drei gesunden Tieren, dargestellt in Laktationswochen
125
Ergebnisse
Phagozytoseaktivität von PMN aus Milch im
Laktationsverlauf gesunder Tiere
1,8
100
%n
MFI n
%o
MFI o
1,6
80
1,4
70
1,2
60
1,0
50
0,8
40
log MFI
Anteil aktiver PMN in %
90
0,6
30
20
0,4
10
0,2
0
0,0
W1
W2
W3
W4
W5
W6
W7
W8
W9 W10 W11 W12 W13 W14
Laktationswoche
Abbildung 12: Phagozytoseaktivität von aus Milch isolierten Zellen im Verlauf der
Laktationswochen W1 bis W14 von drei gesunden Tieren
CL-Aktivität von PMN aus Blut und Milch im
Laktationsverlauf gesunder Tiere
CL-Aktivität / 1 Mio. PMN in 1.000
24
Blut
Milch
20
16
12
8
4
0
W1
W2
W3
W4
W5
W6
W7
W8
W9
W10 W11 W12 W13 W14
Laktationswoche
Abbildung 13: CL-Aktivität von aus Blut bzw. Milch isolierten PMN im Laktationsverlauf von drei gesunden Tieren
126
Ergebnisse
4.4.2
Tiere mit unspezifischer Mastitis oder Mastitis
Drei Tiere gaben während des Untersuchungszeitraumes in mindestens einem Euterviertel Milch mit über 100.000 Zellen / ml VAG, von denen zwei in den betroffenen
Vierteln zudem bakteriologisch positiv waren. Die Viertel mit einem Zellgehalt über
100.000 Zellen / ml Milch wurden als krank bezeichnet. Diese Zellzahlen ließen sich
aus jedem der betroffenen Viertel an vier aufeinanderfolgenden Wochen nachweisen. Anhand der Daten dieser Tiere wurde folgendes Schema erstellt:
Woche 0:
Woche vor der Erkrankung, n = 8 Viertel
Woche 1:
erste Woche der Mastitis, n = 12 Viertel
Woche 2:
zweite Woche der Mastitis, n = 12 Viertel
Woche 3:
dritte Woche der Mastitis, n = 12 Viertel
Woche 4:
vierte Woche der Mastitis, n = 12 Viertel
Woche 5:
erste Woche nach der Erkrankung, n = 8 Viertel
Die Höhe einzelner Entzündungsparameter der betroffenen Viertel („kranke Viertel“)
und der nicht betroffenen Viertel derselben Tiere („gesunde Viertel“) sind für die einzelnen Wochen in den Abbildungen 14 bis 19 dargestellt.
4.4.2.1
Zellzahl im VAG
Log SCC der kranken Viertel war in den Wochen 1 bis 4 über 5,0, die Werte der gesunden Viertel lagen zwischen 4,1 und 4,6 (Abbildung 14).
4.4.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Der Anteil PMN im Zelldifferentialbild der Milch-Zellsuspensionen wies in den kranken Vierteln schon in Woche 0 deutlich höhere Werte als in den gesunden Vierteln
auf (s. Abbildung 15). Er stieg sowohl in den kranken als auch in den gesunden Vierteln bis Woche 4 kontinuierlich an, und fiel in Woche 5 in beiden Gruppen ab.
127
Ergebnisse
4.4.2.3
Zellfunktionalität in Blut und Milch
Die Phagozytoseaktivität stellte sich im Verlauf der Mastitis folgendermaßen dar: In
den Wochen 1 bis 5 lag der Anteil aktiver Zellen in den Proben o höher als in den
Proben n, und in den gesunden Vierteln stets höher als in den kranken (s. Abbildung
16). In Woche 0 jedoch war der Anteil phagozytierender Zellen der kranken Viertel
höher als der der gesunden.
Der Parameter MFI hatte stets in der Gruppe der erkrankten Euterviertel die höheren
Werte (s. Abbildung 17).
Die CL-Aktivität / 1 Mio. PMN der aus Blut isolierten PMN war höher als die aus Milch
und fiel von Woche 0 bis Woche 5 deutlich ab (s. Abbildung 18). Die Zellen aus kranken Vierteln wiesen eine höhere CL-Aktivität auf als die aus den gesunden Vierteln.
In den Wochen 0 und 5 befand sich die CL-Aktivität der kranken Viertel unter 4.000
Einheiten / 1 Mio. PMN, in den Wochen 1 bis 4 darüber. Abgesehen von Woche 2 lag
die CL-Aktivität der gesunden Viertel stets unter diesem Wert.
Auch die CL-Aktivität / ml Milch wies in den kranken Vierteln höhere Werte auf als in
den gesunden Eutervierteln (s. Abbildung 19). In beiden Gruppen war in Woche 1
eine Zunahme der Aktivität und in Woche 4 ein weiterer Anstieg zu verzeichnen. Woche 5 hatte die niedrigsten Werte.
128
Ergebnisse
Zahl somatischer Zellen in Milch im Verlauf einer Mastitis
7
gesunde Viertel
kranke Viertel
6
log SCC
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
Woche
Abbildung 14: Anzahl somatischer Zellen im VAG aus gesunden und kranken Eutervierteln von drei Tieren vor, während und nach einer Mastitis
Anteil PMN in der Milch-Zellsuspension im Verlauf einer
Mastitis
100
90
80
gesunde Viertel
kranke Viertel
Anteil in %
70
60
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
Woche
Abbildung 15: Anteil PMN in der Milch-Zellsuspension von gesunden und kranken
Vierteln von drei Tieren vor, während und nach einer Mastitis,
129
Ergebnisse
Phagozytose: Anteil aktiver PMN im Verlauf einer Mastitis
100
gesunde V., n
gesunde V., o
Anteil aktiver PMN in %
90
kranke V., n
kranke V., o
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
Woche
Abbildung 16: Anteil aktiver PMN in der Phagozytose aus Milch von gesunden und
kranken Vierteln (V.) von drei Tieren im Verlauf einer Mastitis
Phagozytose: MFI im Verlauf einer Mastitis
2,5
log MFI
2,0
gesunde V., n
kranke V., n
gesunde V., o
kranke V., o
1,5
1,0
0,5
0,0
0
1
2
3
4
5
Woche
Abbildung 17: MFI der Phagozytose aus Milch von gesunden und kranken Eutervierteln (V.) von drei Tieren vor, während und nach einer Mastitis
130
Ergebnisse
CL-Aktivität / 1 Mio. PMN in 1.000
16
CL-Aktivität von PMN aus Blut und Milch im Verlauf einer
Mastitis
Blut
gesunde Viertel
kranke Viertel
14
12
10
8
6
4
2
0
0
1
2
Woche
3
4
5
Abbildung 18: CL-Aktivität / 1 Mio. PMN von PMN aus Blut und Milch von gesunden
und kranken Vierteln von drei Tieren im Verlauf einer Mastitis
CL-Aktivität / ml Milch im Verlauf einer Mastitis
5,0
gesunde Viertel
kranke Viertel
log CL-Aktivität / ml Milch
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0
1
2
3
4
5
-1,0
-2,0
-3,0
Woche
Abbildung 19: Log CL-Aktivität / ml Milch von PMN aus Milch gesunder und kranker
Viertel von drei Tieren vor, während und nach einer Mastitis
131
Ergebnisse
4.5
Versuch 3: Beurteilung der Eutergesundheit anhand von Kriterien der Zellfunktionalität auf Tierebene
Für die Auswertung dieses Versuches standen 69 Tagesprobensätze von 36 Tieren
zur Verfügung (s. Abschnitt 3.9.5). Die statistischen Auswertungen basierten auf den
69 Tagesprobensätzen, die infolge dessen im vorliegenden Abschnitt mit der Bezeichnung „Tier“ belegt wurden (n = 69 Tiere).
Von 10 Tieren lagen mehrere Tagesprobensätze vor. Anhand dieser Daten wurde
die Wiederholbarkeit der Untersuchungen berechnet (s. Abschnitt 4.5.1).
In Abschnitt 4.5.2 wurden die Tiere in Gruppen kategorisiert und deren Gesundheitszustand mit Hilfe der Zellzahl und der Zellfunktionalität beschrieben. In einem zweiten Schritt wurden von den als krank eingestuften Tieren die einzelnen Viertel nochmals in Gruppen eingeteilt (Abschnitt 4.5.3). Dafür wurden zunächst die Viertel mit
einer Zellzahl über 100.000 Zellen / ml Milch einer näheren Betrachtung unterzogen.
Weiterhin wurden diese Viertel mit den dazugehörigen Vierteln verglichen, die eine
Zellzahl unter 25.000 Zellen / ml Milch aufwiesen. Auch der Vergleich der Daten als
gesund eingeordneter Tiere mit denen Befunden gesunder Viertel erkrankter Tiere
wurde durchgeführt.
Die Untersuchungen über den Zusammenhang zwischen Zellzahl, dem bakteriologischen Status des Euterviertels im Rahmen der Mastitiskategorisierung und der Zellfunktionalität werden in Abschnitt 4.5.4 beschrieben.
In den Abbildungen 20 und 21 (s. Abschnitt 4.5.4) sind die in diesem Versuch gebildeten Gruppen dargestellt.
132
Ergebnisse
69 Tps*
Gruppe T1
24 Tps
SCC < 100.000
in allen Vierteln
Gruppe T2
21 Tps
SCC 100.000 –
400.000 in mind. 1
Viertel
T2/100-400
43 Viertel
SCC 100.000 –
400.000
T1/<25
40 Viertel
SCC < 25.000
Gruppe T3
24 Tps
SCC > 400.000
in mind. 1 Viertel
T3/100-400
27 Viertel
SCC 100.000 –
400.000
T2&3/<25
26 Viertel
SCC < 25.000
T3/>400
41 Viertel
SCC > 400.000
T2&3/>100
111 Viertel
SCC > 100.000
Abbildung 20: Gruppeneinteilung für Versuch 3;
*Tps: Tagesprobensatz; SCC: Anzahl somatischer Zellen / ml VAG
4.5.1
Mehrfach untersuchte Tiere
Zehn Tiere wurden an drei aufeinander folgenden Tagen und ein weiteres Mal im
Abstand von etwa einer Woche untersucht. In die Berechnungen zur Wiederholbarkeit flossen jeweils nur die Daten der drei zusammenhängenden Tage ein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 42 als Signifikanzen wiedergegeben. Außer im Anteil
Makrophagen in Milch unterschieden sich die Ergebnisse der drei aufeinander folgenden Tage nicht voneinander.
133
Ergebnisse
Tabelle 42: Signifikanzen der Blut- und Milchwerte zwischen den Tagen der mehrfach untersuchten Tiere
Parameter
WBC
PMN
B
Signifikanz
n. s.
n. s.
Parameter
Lym
M
Makro
M
Vitalität
CL-Aktivität M
Signifikanz
n. s.
*
n. s.
n. s.
log
log
log
PMN
NAGase NAGase
SCC
M
VAG
VGH
CL-Aktivität B
LF
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
log
Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,5;
*: p < 0,5
4.5.2
Gruppen auf Basis der Zellzahl
4.5.2.1
Blutproben
4.5.2.1.1
Korrelationen
4.5.2.1.1.1
Vollblutuntersuchungen
Tabelle 43 stellt Korrelationskoeffizienten zwischen dem Anteil PMN im Vollblut und
Parametern des weißen Blutbildes sowie der Zellfunktionalität aus Blut dar.
134
Ergebnisse
Tabelle 43: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener
Parameter aus Blutproben zum Anteil
PMN in Blut (n = 69)
Parameter
k
WBC
0,19
eosinophile Granulozyten B
0,04
Lymphozyten B
-0,83
CL-Aktivität B
0,09
log Max
-0,09
Time
-0,06
n: Stichprobengröße (Tiere)
4.5.2.1.1.2
Zellfunktionalität in Blut
In Tabelle 44 sind die Korrelationskoeffizienten der Parameter der Zellfunktionalität
aus Blut aufgeführt.
Tabelle 44: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der Zellfunktionalität aus Blutzellen zueinander (n = 69)
Parameter 1
Parameter 2
k
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
log Max
0,79
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
Time
-0,48
log Max
Time
-0,41
n: Stichprobengröße (Tiere)
4.5.2.1.2
Gruppenvergleich
Die vier Viertel eines Tieres waren stets in derselben Gruppe. Daher konnte der
Blutwert eines Tieres einer konkreten Gruppe zugeordnet werden. Die Mittelwerte
und Standardabweichungen der aus Blut gewonnen Informationen sind, aufgegliedert in die Gruppen T1 bis T3, in den Tabelle 45 dargestellt. Die Signifikanzen zwischen diesen Gruppen sind in Tabelle 46 zusammengefasst.
135
Ergebnisse
4.5.2.1.2.1
Vollblutuntersuchungen
Die Parameter WBC und eosinophile Granulozyten im Blut stiegen von Gruppe T1
bis Gruppe T3 an. Der Anteil PMN B war in Gruppe T1 niedriger als in den beiden
anderen Gruppen.
Tabelle 45: Grunddaten der Gruppen T1 bis T3 der aus Blut gewonnenen Daten
CL-Aktilog Max
vität B
Time
50,4
10.218
0,06
1.551
2,4
10,2
3.513
0,16
302
24
24
24
23
23
23
7,3
45,2
5,8
46,2
8.431
-0,06
1.683
± sd
1,3
10,5
2,9
9,6
3.071
0,22
296
n
20
20
20
20
20
20
20
X
7,8
45,0
7,4
45,9
10.893
0,06
1.291
± sd
1,3
8,8
3,5
9,6
5.018
0,25
403
n
24
24
24
24
24
24
24
Gruppe
T1
T2
T3
WBC
PMN B
Eos B
Lym B
X
7,0
40,9
5,1
± sd
1,5
12,4
n
24
X
X: arithmetischer Mittelwert;
sd: Standardabweichung;
n: Stichprobengröße (Tiere)
4.5.2.1.2.2
Zellfunktionalität in Blut
Die CL-Aktivität B (8.431 Einheiten / 1 Mio. PMN) und log Max (-0,06) hatten in
Gruppe T2 die niedrigsten Werte. Der Wert des Parameters Time war in Gruppe T3
mit 1.291 Sekunden signifikant niedriger als in den Gruppen T1 und T2 (s. Tabelle
46).
136
Ergebnisse
Tabelle 46: Signifikanzen der Blutwerte zwischen den Gruppen T1 bis T3
Gruppen
WBC
PMN B
Eos B
Lym B
CL-Aktivität B
log
Max
Time
T1
T2
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
T1
T3
n. s.
n. s.
*
n. s.
n. s.
n. s.
*
T2
T3
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
***
n. s.
n. s.
*
n. s.
n. s.
n. s.
**
Allgemein
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
*: p < 0,05;
**: p < 0,01;
***: p < 0,001
4.5.2.2
Milchproben
4.5.2.2.1
Korrelationen
4.5.2.2.1.1
Eutergesundheit
Tabelle 47: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus Milchzellen
zu log SCC im VAG
Parameter
Stichprobengröße
k
elektrische Leitfähigkeit
264
0,34
NAGase VAG
274
0,53
NAGase VGH
275
0,50
PMN M
274
0,63
Lymphozyten M
274
-0,49
Makrophagen M
274
-0,48
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN Milch
269
0,38
log Max
269
0,66
Time
269
-0,66
log CL-Aktivität / ml Milch
268
0,89
Stichprobengröße: Viertel
137
Ergebnisse
Tabelle 47 zeigt Korrelationen zwischen der Zellzahl und den erhobenen Parametern
der Zelldifferenzierung sowie der Zellfunktionalität auf.
4.5.2.2.1.2
Zelldifferentialbild in Milch
Tabelle 48 stellt Zusammenhänge zwischen dem Anteil PMN in der Milchzellsuspension und der CL-Aktivität in Milch dar.
Tabelle 48: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus Milchzellen zum Anteil PMN in Milch
Parameter
Stichprobenzahl
k
Lymphozyten M
277
-0,65
Makrophagen M
277
-0,86
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
269
0,24
log Max
269
0,63
Time
269
-0,52
log CL-Aktivität / ml Milch
268
0,70
Stichprobengröße: Viertel
4.5.2.2.1.3
Zellfunktionalität in Milch
In Tabelle 49 sind die Korrelationskoeffizienten der verschiedenen Parameter der
Zellfunktionalität aus Milch zueinander dargestellt.
Tabelle 49: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der Zellfunktionalität aus Milchzellen zueinander (n = 270 Euterviertel)
Parameter 1
Parameter 2
n
k
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
log Max
270
0,54
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
Time
270
-0,46
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
log CL-Aktivität / ml Milch
269
0,59
log Max
Time
270
-0,68
log Max
log CL-Aktivität / ml Milch
269
0,41
Time
log CL-Aktivität / ml Milch
269
-0,73
138
Ergebnisse
4.5.2.2.2
Gruppenvergleich
Die Grunddaten der drei Gruppen T1, T2 und T3 der aus Milch gewonnenen Daten
sind in Tabelle 50 aufgeführt. Die Signifikanzen zwischen den Gruppen sind für die
einzelnen Parameter in Tabelle 51 ersichtlich.
4.5.2.2.2.1
Eutergesundheit
Die herkömmlichen Entzündungsparameter log SCC im VAG, NAGase VAG und
NAGase VGH stiegen mit steigender Gruppenzahl signifikant an (s. Tabelle 51).
4.5.2.2.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Im Zelldifferentialbild aus Milch stieg der Anteil PMN von 28,9 % (Gruppe T1) auf
72,3 % (Gruppe T3) an. Die Anteile der Lymphozyten und Makrophagen sanken von
22,3 % bzw. 45,5 % (Gruppe T1) auf 8,7 % bzw. 18,2 % (Gruppe T3).
4.5.2.2.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Unter den funktionellen Parametern wiesen CL-Aktivität Milch, log Max und log CLAktivität / ml Milch signifikant steigende Werte auf (s. Tabelle 51). Die Zeit bis zum
Erreichen des Maximums (Time) verkürzte sich von 1.980 Sekunden (Gruppe T1) auf
1.334 Sekunden (Gruppe T3).
139
Ergebnisse
Tabelle 50: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der aus Milch gewonnenen Daten der Gruppen T1 bis T3
log SCC
log LF
log
NAGase
VAG
X
4,37
0,76
0,22
0,18
28,9
22,3
45,5
± sd
0,29
0,06
0,17
0,19
19,5
14,8
20,1
n
96
92
96
96
96
96
96
X
4,88
0,77
0,37
0,36
53,2
14,4
31,3
± sd
0,50
0,08
0,31
0,31
25,5
10,6
20,7
n
84
76
83
84
84
84
84
X
5,37
0,78
0,48
0,41
72,3
8,7
18,2
± sd
0,61
0,05
0,35
0,33
20,7
9,9
12,6
n
92
93
93
93
93
93
93
Vitalität
CL-Aktivität M
log Max
Time
log CLAktivität / ml Milch
X
75,7
5.040
-1,38
1.980
1,11
± sd
11,5
5.079
0,64
401
0,75
n
91
91
91
91
90
X
78,3
5.695
-0,95
1.799
2,00
± sd
12,2
3.791
0,67
411
0,99
n
84
84
84
84
84
X
78,6
8.856
-0,57
1.334
2,89
± sd
16,8
6.138
0,60
563
0,95
n
93
93
93
93
91
Gruppe
T1
T2
T3
Gruppe
T1
T2
T3
log
NAGase
VGH
PMN M
Lym M
Makro M
X: arithmetischer Mittelwert;
sd: Standardabweichung;
n: Stichprobengröße (Viertel)
140
Ergebnisse
Tabelle 51: Signifikanzen der aus Milchproben gewonnenen Daten zwischen den
Gruppen T1, T2 und T3
Gruppen
log
SCC
log LF
log
NAGase
VAG
log
NAGase
VGH
PMN
M
Lym
M
Makro
M
T1
T2
***
n. s.
***
***
***
***
***
T1
T3
***
**
***
***
***
***
***
T2
T3
***
n. s.
*
n. s.
***
**
***
Allgemein
***
n. s.
***
***
***
***
***
Gruppen
Vitalität
CL-Aktivität M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
T1
T2
n. s.
n. s.
***
**
***
T1
T3
n. s.
***
***
***
***
T2
T3
n. s.
***
***
***
***
Allgemein
n. s.
***
***
***
***
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
*: p < 0,05;
**: p < 0,01;
***: p < 0,001
4.5.3
Euterkranke Tiere
Die Gruppe T1 setzt sich aus Vierteln zusammen, die alle der gleichen Zellzahlklasse
angehören (SCC < 100.000 Zellen / ml). In den Gruppen T2 und T3 befinden sich
Datensätze mit Zellzahlen über 100.000 Zellen / ml Milch, aber auch solche mit geringeren Zellzahlen. Um dieser Tatsache Rechnung zu tragen, wurden die Datensätze der Gruppen T2 und T3 erneut kategorisiert.
141
Ergebnisse
4.5.3.1
Kranke Viertel (T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400)
Zunächst wurden die als krank eingestuften Viertel vergleichend ausgewertet. Dazu
wurden die Viertel mit Zellzahlen > 100.000 Zellen / ml Milch wie in Tabelle 52 dargestellt gruppiert.
Tabelle 52: Gruppenbildung für die Auswertung der euterkranken Tiere (kranke
Viertel)
Gruppe
n
Zellzahl / ml Milch
aus Gruppe
T2/100–400
43
100.000 – 400.000
T2
T3/100–400
27
100.000 – 400.000
T3
T3/>400
41
> 400.000
T3
T2&3/>100
111
> 100.000
T2 & T3
n: Stichprobengröße (Viertel)
4.5.3.1.1
Blutproben
In Abschnitt 4.5.3, wie auch in vielen anderen Abschnitten der Arbeit, waren die vier
Viertel eines Tieres nicht zwangsläufig in derselben Gruppe vertreten. Sind die Viertel eines Tagesprobensatzes in verschiedenen Gruppen, so lassen sich die Ergebnisse der Blutprobe dieses Datensatzes nicht einer bestimmten Gruppe zuordnen
und sind daher nicht auswertbar.
4.5.3.1.2
Milchproben
Die Mittelwerte und Standardabweichungen der aus Milch gewonnenen Daten der
Gruppen T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400 sind in Tabelle 53 dargestellt, die Signifikanzen zwischen den Gruppen finden sich in Tabelle 54.
142
Ergebnisse
Tabelle 53: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte der
Gruppen T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400
log LF
log
NAGase
VAG
log
NAGase
VGH
PMN
M
Lym
M
Makro
M
5,29
0,78
0,47
0,49
62,1
10,3
25,6
± sd
0,17
0,09
0,30
0,33
23,7
8,7
20,0
n
43
40
42
43
43
43
43
X
5,29
0,79
0,42
0,40
72,5
7,3
19,9
± sd
0,18
0,06
0,28
0,28
21,5
7,9
14,6
n
27
27
27
27
27
27
27
X
5,91
0,79
0,62
0,55
78,7
6,0
14,6
± sd
0,27
0,05
0,31
0,30
17,4
8,7
10,9
n
41
41
41
41
41
41
41
Vitalität
CL-Aktivität M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
X
79,9
6.865
-0,62
1.633
2,69
± sd
12,6
3.743
0,40
328
0,42
n
43
43
43
43
43
X
79,8
10.357
-0,38
1.363
2,97
± sd
13,6
5.512
0,37
326
0,42
n
27
27
27
27
27
X
80,2
9.904
-0,40
1.052
3,59
± sd
15,8
5.700
0,50
482
0,52
n
41
41
41
41
41
log
SCC
X
Gruppe
T2/100–
400
T3/100–
400
T3/>400
Gruppe
T2/100–
400
T3/100–
400
T3/>400
n: Stichprobengröße (Viertel)
143
Ergebnisse
Tabelle 54: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen T2/100–400,
T3/100–400 und T3/>400
log LF
n. s.
n. s.
n. s.
T3/>400
***
n. s.
T3/>400
***
*
Gruppen
T2/100–
T3/100–
400
400
T2/100–
400
T3/100–
400
Allgemein
Gruppen
T2/100–
T3/100–
400
400
T2/100–
400
T3/100–
400
log
log
NAGase NAGase
VAG
VGH
log
SCC
PMN
M
Lym
M
Makro
M
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
*
n. s.
***
*
**
n. s.
**
*
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
**
n. s.
**
CL-AktiVitalität
log Max
vität M
Time
log CLAktivität / ml
Milch
n. s.
**
*
**
**
T3/>400
n. s.
**
*
***
***
T3/>400
n. s.
n. s.
n. s.
**
***
n. s.
**
*
***
***
Allgemein
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
*: p < 0,05;
**: p < 0,01;
***: p < 0,001
4.5.3.1.2.1
Eutergesundheit
Die Zellzahl im VAG der Gruppe T3/>400 war signifikant höher als die der beiden anderen Gruppen (s. Tabelle 54).
4.5.3.1.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Obwohl die elektrische Leitfähigkeit und SCC in den Gruppen T2/100–400 und T3/100–
400
gleich waren, lag der Anteil PMN (72,5 %) in der Milch in Gruppe T3/100–400
deutlich höher.
144
Ergebnisse
4.5.3.1.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Die CL-Aktivität in Milch (7.962 Einheiten / 1 Mio. PMN) sowie log Max (-0,62) der
Gruppe T2/100–400 hatten signifikant niedrigere Werte als die der beiden anderen
Gruppen. Bezüglich der Parameter Time und log CL-Aktivität / ml Milch unterschieden sich die Werte in allen Gruppenpaaren signifikant (s. Tabelle 54).
4.5.3.2
Vergleich gesunder Viertel kranker Kühe (Gruppe T2&3/<25) mit denen
gesunder Kühe (Gruppe T1/<25)
Die Viertel der Gruppen T2 und T3, deren Zellzahlen 25.000 / ml nicht überschritten,
wurden in einer Gruppe T2&3/<25 zusammengefasst und mit den Vierteln aus Gruppe T1 verglichen, die ebenfalls höchstens 25.000 Zellen / ml VAG hatten (Gruppe
T1/<25) (s. Tabelle 55).
Tabelle 55: Gruppenbildung für die Auswertung der euterkranken Tiere (gesunde
Viertel)
Gruppe
n
Zellzahl / ml Milch
aus Gruppe
T1/<25
40
≤ 25.000
T1
T2&3/<25
26
≤ 25.000
T2 & T3
n: Stichprobengröße (Viertel)
4.5.3.2.1
Blutproben
Eine Auswertung der Daten aus Blut wurde wie in Abschnitt 4.5.3.1.1 beschrieben
nicht durchgeführt.
4.5.3.2.2
Milchproben
In Tabelle 56 sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der Gruppen T1/<25
und T2&3/<25 einschließlich der Signifikanzen zwischen den Gruppen dargestellt.
145
Ergebnisse
Tabelle 56: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte der
Gruppen T1/<25 und T2&3/<25 und Signifikanzen zwischen den Gruppen
PMN
M
Lym
M
Makro
M
0,08
22,4
25,0
43,9
0,13
0,15
10,9
17,8
22,8
40
40
40
40
40
40
4,15
0,74
0,20
0,22
38,4
19,1
28,1
± sd
0,13
0,03
0,30
0,23
10,0
14,2
17,5
n
26
25
26
26
26
26
26
n. s.
n. s.
n. s.
**
***
n. s.
**
Gruppe
T1/<25
T2&3/<25
log SCC
log LF
X
4,12
0,75
0,13
± sd
0,12
0,03
n
40
X
Signifikanzen
CL-AktiVitalität
vität M
Gruppe
T1/<25
T2&3/<25
log
log
NAGase NAGase
VAG
VGH
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
X
71,7
4.780
-1,58
2.162
0,72
± sd
10,4
5.810
0,65
450
0,67
n
40
40
40
40
39
X
70,2
2.592
-1,78
2.124
0,66
± sd
19,0
2.105
0,47
434
0,71
n
26
26
26
26
26
n. s.
*
n. s.
n. s.
n. s.
Signifikanzen
n: Stichprobengröße (Viertel);
**: p < 0,01;
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
***: p < 0,001
*: p < 0,05;
4.5.3.2.2.1
Eutergesundheit
Die Parameter LF, SCC im VAG und NAGase VAG unterschieden sich nicht signifikant (s. Tabelle 56).
146
Ergebnisse
4.5.3.2.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Der Anteil PMN in Milch war mit 38,4 % in Gruppe T2&3/<25 signifikant höher
(p < 0,001) als in Gruppe T1/<25 (22,4 %).
4.5.3.2.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Die CL-Aktivität / 1 Mio. PMN war in Gruppe T2&3/<25 mit 2.592 Einheiten (Gruppe
T1/<25: 4.780 Einheiten) ebenso niedriger wie die log CL-Aktivität / ml Milch mit 0,66
(Gruppe T1/<25: 0,72).
4.5.3.3
Vergleich der gesunden Viertel kranker Kühe (Gruppe T2&3/<25) mit
den kranken Vierteln derselben Tiere (Gruppe T2&3/>100)
Die Gruppe der gesunden Viertel kranker Kühe (T2&3/<25, s. Tabelle 55) wurde mit
den dazugehörigen kranken Vierteln dieser Tiere verglichen. Um eine Gruppe „kranke Viertel“ zu bilden, wurden die Gruppen T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400 in einer
Gruppe zusammengeführt (T2&3/>100, s. Tabelle 52).
4.5.3.3.1
Blutproben
Die Daten aus Blut wurden nicht ausgewertet (s. Abschnitt 4.5.3.1.1).
4.5.3.3.2
Milchproben
Tabelle 57 gibt Mittelwerte, Standardabweichungen der Milchparameter und die Signifikanzen zwischen den Gruppen T2&3/<25 und T2&3/>100 wieder.
4.5.3.3.2.1
Eutergesundheit
Die Werte der Parameter elektrische Leitfähigkeit, log SCC im VAG, NAGase VAG
und NAGase VGH waren in Gruppe T2&3/>100 signifikant höher (s. Tabelle 57).
147
Ergebnisse
Tabelle 57: Mittelwerte (X), Standardabweichungen (sd) der Milchparameter der
Gruppen T2&3/<25 und T2&3/>100 und Signifikanzen zwischen diesen
Gruppen
log
log
NAGase NAGase
VAG
VGH
log
SCC
log LF
PMN
M
Lym
M
Makro
M
X
4,15
0,74
0,20
0,22
38,4
19,1
28,1
± sd
0,13
0,03
0,30
0,23
10,0
14,2
17,5
n
26
25
26
26
26
26
26
X
5,52
0,79
0,51
0,49
70,8
8,0
20,1
0,37
0,07
0,31
0,31
22,1
8,7
16,4
n
111
108
110
111
111
111
111
Signifikanzen
***
***
***
***
***
***
*
Gruppe
Vitalität
CL-Aktivität M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
X
70,2
2.592
-1,78
2.124
0,66
± sd
19,0
2.105
0,47
434
0,71
n
26
26
26
26
26
X
80,0
8.837
-0,48
1.353
3,09
13,9
5.182
0,45
464
0,61
111
111
111
111
111
*
***
***
***
***
Gruppe
T2&3/<25
T2&3/>100 ± sd
T2&3/<25
T2&3/>100 ± sd
n
Signifikanzen
n: Stichprobengröße (Viertel);
**: p < 0,01;
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
***: p < 0,001
*: p < 0,05;
4.5.3.3.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Statistisch abgesicherte Unterschiede fanden sich auch im Zelldifferentialbild, in welchem die Gruppe T2&3/>100 bezüglich der PMN größere und bezüglich der Lymphozyten und Makrophagen jeweils kleinere Anteile als Gruppe T2&3/<25 aufwies.
148
Ergebnisse
4.5.3.3.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Die Vitalität war in Gruppe T2&3/>100 mit 80,0 % signifikant höher als in Gruppe
T2&3/<25. Der Unterschied in der CL-Aktivität Milch zwischen 2.592 (Gruppe
T2&3/<25) und 8.837 Einheiten / 1 Mio. PMN (Gruppe T2&3/>100) war hochsignifikant
(s. Tabelle 57). Auch log Max und log CL-Aktivität / ml Milch lagen in Gruppe
T2&3/>100 höher.
4.5.4
Bakteriologischer Status und Zellfunktionalität
Alle Daten wurden nach den Kriterien Zellzahl und bakteriologischer Status (Mastitiskategorisierung nach HAMANN u. FEHLINGS 2002, s. Tabelle 1) in Gruppen eingeteilt. Wie in Abschnitt 4.5.2 wurden die vier Viertel eines Tieres stets der selben
Gruppe zugeordnet. Die gebildeten Gruppen sind in Tabelle 58 und in Abbildung 21
beschrieben.
68 Tps*
Kat1
18 Tps
SCC < 100.000
Bakt. negativ
Kat2
8 Tps
SCC < 100.000
Bakt. positiv
Kat3
9 Tps
SCC > 100.000
Bakt. negativ
Kat4/<100
26 Viertel
SCC < 100.000
Kat4
33 Tps
SCC > 100.000
Bakt. positiv
Kat4/>100
68 Viertel
SCC > 100.000
Abbildung 21: Gruppeneinteilung nach Eutergesundheitskategorien;
Tps: Tagesprobensätze; SCC: Anzahl somatischer Zellen / ml VAG;
Bakt.: Bakteriologie
149
Ergebnisse
Tabelle 58: Struktur der Gruppen Kat1 bis Kat4
Gruppe
n
n
Zellzahl / ml Bakteriologie
(Tiere) (Viertel)
Viertel
Kat1
18
72
≤ 100.000
negativ
alle Viertel des Tieres
Kat2
8
32
≤ 100.000
positiv
mind. ein Viertel
die übrigen Viertel wie Kat1
Kat3
9
36
> 100.000
negativ
mind. ein Viertel
die übrigen Viertel wie Kat1
oder Kat2
Kat4
33
130
> 100.000
positiv
mind. ein Viertel
die übrigen Viertel wie
Kat1, Kat2 oder Kat3
n: Stichprobengröße
4.5.4.1
Blutproben
Die Tabelle 59 gibt die Mittelwerte und Standardabweichungen der Gruppen, Tabelle
60 die Signifikanzen zwischen den Gruppen wieder.
4.5.4.1.1
Vollblutuntersuchungen
Der Parameter WBC hatte in Gruppe Kat4 die höchsten Werte. Der Anteil PMN lag
mit 54,5 % in Gruppe Kat3 am höchsten.
4.5.4.1.2
Zellfunktionalität in Blut
Die Werte der CL-Aktivität (7.207 Einheiten / 1 Mio. PMN) und von log Max (-0,19)
waren in Gruppe Kat3 am niedrigsten. Die höchsten Werte für diese Parameter fanden sich in Gruppe Kat2 (11.593 Einheiten / 1 Mio. PMN bzw. 0,09).
150
Ergebnisse
Tabelle 59: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Blutwerte der
Gruppen Kat1 bis Kat4
WBC
PMN B
Eos B
Lym B
CL-Aktivität B
log Max
Time
X
6,9
43,0
4,9
50,2
9.864
0,05
1.465
± sd
1,4
11,2
2,4
11,1
3.313
0,19
224
n
18
18
18
18
16
16
16
X
7,1
37,6
6,1
48,9
11.593
0,09
1.726
± sd
1,6
13,6
3,5
7,6
4.107
0,11
357
n
8
8
8
8
8
8
8
X
7,3
54,5
3,9
39,2
7.207
-0,19
1.652
± sd
1,4
10,2
1,4
10,3
1.481
0,12
253
n
9
9
9
9
9
9
9
X
7,9
42,6
7,4
47,8
10.214
0,05
1.411
± sd
1,1
8,1
3,2
8,8
4.755
0,25
445
n
32
32
32
32
32
32
32
Gruppe
Kat1
Kat2
Kat3
Kat4
n: Stichprobengröße (Tiere)
Tabelle 60: Signifikanzen der Blutwerte zwischen den Gruppen Kat1 bis Kat4
Gruppen
WBC
PMN B
Eos B
Lym B
CL-Aktivität B
log Max
Time
Kat1 Kat2
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
*
Kat1 Kat3
n. s.
*
n. s.
*
*
**
n. s.
Kat1 Kat4
*
n. s.
**
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
Kat2 Kat3
n. s.
*
n. s.
*
*
***
n. s.
Kat2 Kat4
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
Kat3 Kat4
n. s.
***
***
*
**
***
n. s.
Allgemein
n. s.
**
**
*
n. s.
*
n. s.
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
**: p < 0,01;
*: p < 0,05;
***: p < 0,001
151
Ergebnisse
4.5.4.2
Milchproben
Aus den Gruppen Kat1 bis Kat4 wurden für die Parameter der Milchproben Mittelwerte und Standardabweichungen gebildet (s. Tabelle 61). Die Signifikanzen zwischen
diesen Gruppen sind in Tabelle 62 dargestellt.
4.5.4.2.1
Eutergesundheit
Der Parameter log SCC im VAG war in Gruppe Kat4 am höchsten (5,26), in Gruppe
Kat3 am zweithöchsten (4,85). Aus den insgesamt 88 bakteriologisch positiven
Milchproben der Gruppen Kat2 und Kat4 wurde in 59 % der Proben CNS sowie in
30 % der Proben S. aureus nachgewiesen.
4.5.4.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Der Anteil PMN war in Gruppe Kat4 mit 66,2 % am größten, gefolgt von Gruppe Kat3
mit 54,9 %.
4.5.4.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Die Werte der Vitalität unterschieden sich zwischen Gruppe Kat3 und Kat4 signifikant
(s. Tabelle 62). Gruppe Kat4 wies mit 8.586 Einheiten / 1 Mio. PMN eine signifikant
höhere CL-Aktivität als die anderen Gruppen auf. Auch bezogen auf den Parameter
log CL-Aktivität / ml Milch hatte die Gruppe Kat4 signifikant höhere Werte als die übrigen Gruppen.
152
Ergebnisse
Tabelle 61: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der aus Milchproben
erhobenen Daten der Gruppen Kat1 bis Kat4
log LF
log
NAGase
VAG
log
NAGase
VGH
PMN M
Lym M
Makro M
4,37
0,75
0,22
0,17
28,7
23,1
41,9
± sd
0,31
0,05
0,17
0,19
18,0
15,0
20,7
n
71
67
71
71
72
72
72
X
4,38
0,77
0,26
0,22
32,6
14,9
39,8
± sd
0,32
0,06
0,14
0,25
22,7
13,4
26,1
n
32
32
32
32
32
32
32
X
4,85
0,77
0,43
0,53
54,9
13,1
20,8
± sd
0,72
0,05
0,36
0,26
24,0
11,8
15,2
n
35
35
36
35
36
36
36
X
5,26
0,78
0,43
0,37
66,2
9,9
22,2
± sd
0,53
0,07
0,34
0,32
24,5
10,3
17,5
n
129
122
129
130
129
129
129
Gruppe
Vitalität
CL-Aktivität M
log Max
Time
log CLAktivität / ml Milch
X
74,7
4.950
-1,40
1.992
1,03
± sd
11,3
4.926
0,69
454
0,80
n
64
64
64
64
64
X
76,7
5.582
-1,35
1.978
1,25
± sd
12,3
5.372
0,58
244
0,81
n
31
31
31
31
30
X
71,8
5.016
-1,08
1.840
1,95
± sd
19,0
3.724
0,63
457
1,09
n
35
35
35
35
35
X
80,9
8.586
-0,62
1.439
2,75
± sd
13,0
5.608
0,59
544
0,92
n
130
130
130
130
128
Gruppe
log
SCC
X
Kat1
Kat2
Kat3
Kat4
Kat1
Kat2
Kat3
Kat4
n: Stichprobengröße (Viertel)
153
Ergebnisse
Tabelle 62: Signifikanzen der aus Milchproben gewonnenen Daten zwischen den
Gruppen Kat1 bis Kat4
Gruppen
log SCC
log LF
log
log
NAGase NAGase
VAG
VGH
PMN
M
Lym
M
Makro
M
Kat1
Kat2
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
**
n. s.
Kat1
Kat3
***
n. s.
**
***
***
***
***
Kat1
Kat4
***
**
***
***
***
***
***
Kat2
Kat3
**
n. s.
*
***
***
n. s.
***
Kat2
Kat4
***
n. s.
***
*
***
n. s.
***
Kat3
Kat4
**
n. s.
n. s.
**
*
n. s.
n. s.
Allgemein
***
*
***
***
***
***
***
Gruppen
Vitalität
CL-Aktivität M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
Kat1
Kat2
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
Kat1
Kat3
n. s.
n. s.
*
n. s.
***
Kat1
Kat4
*
***
***
***
***
Kat2
Kat3
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
**
Kat2
Kat4
n. s.
**
***
***
***
Kat3
Kat4
*
***
***
***
***
***
***
***
***
***
Allgemein
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
**: p < 0,01;
*: p < 0,05;
***: p < 0,001
4.5.4.3
Differenzierte Auswertung gesunder und kranker Viertel der Tiere mit
Mastitis (Gruppen Kat4/<100 und Kat4/>100)
Die Gruppe Kat4 stellt eine Gruppe dar, in der sowohl bakteriologisch negative als
auch positive Viertel enthalten sind. Aus den betroffenen positiven Vierteln, die Zellzahlen über 100.000 Zellen / ml Milch enthielten, und aus den bakteriologisch unauffälligen Vierteln mit Zellzahlen unter 100.000 Zellen / ml Milch wurde jeweils eine
154
Ergebnisse
Gruppe gebildet (Gruppe Kat4/>100 bzw. Kat4/<100). Die Daten dieser beiden Gruppen wurden miteinander und mit denen aus Gruppe Kat1 verglichen (s. Tabelle 63).
Tabelle 63: Gruppen für die Auswertung der Tiere mit Mastitis
Gruppe
Stichproben
Zellzahl / ml
Milch
Bakteriologie
aus Gruppe
Kat1
72
≤ 100.000
negativ
Kat1
Kat4/<100
26
≤ 100.000
negativ
Kat4
Kat4/>100
68
> 100.000
positiv
Kat4
n: Stichprobengröße (Viertel)
4.5.4.3.1
Blutproben
Wie in Abschnitt 4.5.3.1.1 beschrieben, war eine Auswertung der Daten aus Blut
auch hier nicht möglich.
4.5.4.3.2
Milchproben
Die Milchparameter sind in Tabelle 64 nach Mittelwerten und Standardabweichungen
für die einzelnen Gruppen dargestellt. Signifikanzen zwischen den Gruppen sind der
Tabelle 65 zu entnehmen.
4.5.4.3.2.1
Eutergesundheit
Ebenso wie die Zellzahl im VAG waren die Parameter elektrische Leitfähigkeit, NAGase VAG und VGH in Gruppe Kat4/>100 signifikant höher als in den anderen beiden
Gruppen (s. Tabelle 65).
4.5.4.3.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Die Parameter des Zelldifferentialbildes unterschieden sich signifikant zwischen allen
drei Gruppen (p < 0,001).
155
Ergebnisse
Tabelle 64: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte der
Gruppen Kat1, Kat4/<100 und Kat4/>100
PMN
M
Lym
M
Makro
M
0,17
28,7
23,1
41,9
0,17
0,19
18,0
15,0
20,7
67
71
71
72
72
72
4,56
0,75
0,15
0,13
49,2
16,8
30,9
± sd
0,26
0,03
0,22
0,24
24,0
11,8
18,9
n
26
23
26
26
25
25
25
X
5,57
0,79
0,49
0,42
72,7
6,1
19,7
± sd
0,34
0,06
0,31
0,30
22,8
6,3
17,5
n
68
65
67
68
68
68
68
Vitalität
CL-Aktivität M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
X
74,7
4.590
-1,40
1.992
1,03
± sd
11,3
4.926
0,69
454
0,80
n
64
64
64
64
64
X
80,7
7.302
-1,13
1.874
1,72
± sd
12,0
6.615
0,75
580
0,92
n
26
26
26
26
25
X
80,8
10.443
-0,39
1.199
3,24
± sd
14,7
5.318
0,41
430
0,57
n
68
68
68
68
68
Gruppe
Kat1
Kat4/
<100
Kat4/
>100
log SCC
log LF
X
4,37
0,75
0,22
± sd
0,31
0,05
n
71
X
Gruppe
Kat1
Kat4/
<100
Kat4/
>100
log
log
NAGase NAGase
VAG
VGH
n: Stichprobengröße (Viertel)
156
Ergebnisse
Tabelle 65: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen Kat1, Kat4/<100
und Kat4/>100
Gruppen
Kat1
Kat4/
Kat1
Kat4/
Kat4/
Kat4/
<100
>100
<100
>100
Gruppen
Kat4/
Kat1
Kat4/
Kat4/
Kat4/
<100
>100
<100
>100
PMN
M
Lym
M
Makro
M
n. s.
***
*
*
***
***
***
***
***
***
***
***
***
**
log SCC
log LF
**
n. s.
n. s.
***
***
***
***
Vitalität
Kat1
log
log
NAGase NAGase
VAG
VGH
CL-Aktilog Max
vität M
Time
log CLAktivität / ml
Milch
*
n. s.
n. s.
n. s.
***
**
***
***
***
***
n. s.
*
***
***
***
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
**: p < 0,01;
*: p < 0,05;
***: p < 0,001
4.5.4.3.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Die Vitalität war in Gruppe Kat1 signifikant niedriger als in den beiden anderen Gruppen (p < 0,05). Die Werte der Parameter CL-Aktivität M und log CL-Aktivität / ml
Milch stiegen von Gruppe Kat1 über Gruppe Kat4/<100 zu Gruppe Kat4/>100 kontinuierlich an.
157
Ergebnisse
4.6
Gesamtdatenbank: Beurteilung der Eutergesundheit anhand von Kriterien der Zellfunktionalität
auf Viertelebene
Die Erstellung der Gesamtdatenbank ist in Abschnitt 3.9.6 beschrieben. In dieser Datenbank ist von jedem Tier nur jeweils ein Datensatz enthalten (171 Viertel von 43
Tieren). Dadurch war es möglich, die einzelnen Viertel als unabhängige Stichproben
zu betrachten und entsprechende Varianzanalysen und Student´s t-Tests zu berechnen. Mit der Gesamtdarstellung wurden die Zusammenhänge zwischen der Zellzahl
und der Zellfunktionalität in Milch untersucht. Auf eine Auswertung der Parameter,
die aus den Blutproben erhoben worden sind, wurde in diesem Kapitel verzichtet.
Daraufhin folgte die Einordnung der Daten in drei Gruppen auf der Grundlage der
Zellzahl (s. Abbildung 22; Abschnitt 4.6.1).
Um die Aussagekraft der funktionellen Parameter zu ermitteln, wurden die Daten erneut kategorisiert, wobei das Kriterium CL-Aktivität / 1 Million PMN in Milch für die
Gruppenzugehörigkeit ausschlaggebend war (Abschnitt 4.6.2).
158
Ergebnisse
171 Milchproben
von 43 Tieren
V1
77 Viertel
SCC < 50.000
V2
18 Viertel
SCC 50.000 –
100.000
V3
22 Viertel
SCC > 100.000
– 200.000
V4
50 Viertel
SCC > 200.000
CL1
54 Viertel
CL < 3.000
CL2
44 Viertel
CL 3.000 – 6.000
CL3
70 Viertel
CL > 6.000
CL2/T<100
15 Viertel
SCC < 100.000
in allen Vierteln
CL2/V<100
10 Viertel
SCC < 100.000
CL2/V>100
14 Viertel
SCC > 100.000
Abbildung 22: Gruppeneinteilung der Gesamtdatenbank;
SCC: Anzahl somatischer Zellen / ml VAG;
CL: CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
4.6.1
Gruppen auf Basis der Zellzahl
Aus der Gesamtheit der Datensätze wurden vier Gruppen gebildet, wobei als Selektionseinheit das einzelne Viertel verwendet wurde (s. Abbildung 22). Die Kriterien der
Gruppeneinteilung anhand der Zellzahl sind der Tabelle 66 zu entnehmen.
159
Ergebnisse
Tabelle 66: Einteilung der Gruppen V1 bis V4 auf Basis der Zellzahl im VAG
Gruppe
n
Zellzahl / ml Milch
V1
77
< 50.000
V2
18
50.000 – 100.000
V3
22
> 100.000 – 200.000
V4
50
> 200.000
n: Stichprobengröße (Viertel)
4.6.1.1
Korrelationen
4.6.1.1.1
Eutergesundheit
In Tabelle 67 sind die Korrelationskoeffizienten zwischen der Zellzahl im VAG und
den erhobenen Parametern der Zelldifferenzierung sowie der Zellfunktionalität aus
Milchproben dargestellt.
Tabelle 67: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus Milchproben
zu log SCC im VAG
Parameter
Stichprobengröße
k
elektrische Leitfähigkeit
163
0,37
PMN M
170
0,69
Lymphozyten M
170
-0,68
Makrophagen M
170
-0,31
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN M
167
0,49
log Max
167
0,72
Time
167
-0,77
log CL-Aktivität / ml Milch
163
0,90
Stichprobengröße: Viertel
160
Ergebnisse
4.6.1.1.2
Zelldifferentialbild in Milch
Korrelationen zwischen dem Anteil PMN in der Milchzellsuspension und den
Parametern der CL-Aktivität aus Milchproben sind in Tabelle 68 ersichtlich.
Tabelle 68: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus Milchproben
zum Anteil PMN in Milch
Parameter
Stichprobengröße
k
Lymphozyten M
171
-0,75
Makrophagen M
171
-0,69
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN M
167
0,36
log Max
167
0,67
Time
167
-0,67
log CL-Aktivität / ml Milch
163
0,73
Stichprobengröße: Viertel
4.6.1.1.3
Zellfunktionalität in Milch
Die Korrelationen zwischen den Parametern der Zellfunktionalität von aus Milch gewonnenen Daten sind der Tabelle 69 zu entnehmen.
Tabelle 69: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der Zellfunktionalität aus Milchproben zueinander
Parameter 1
Parameter 2
n
k
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
Log Max
168
0,57
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
Time
168
-0,44
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
log CL-Aktivität / ml Milch
163
0,65
log Max
Time
168
-0,66
log Max
log CL-Aktivität / ml Milch
163
0,85
Time
log CL-Aktivität / ml Milch
163
-0,74
n: Stichprobengröße (Viertel)
161
Ergebnisse
4.6.1.2
Gruppenvergleich
Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Parameter aus Milch sind
nach Gruppen in Tabelle 70 dargestellt, die Signifikanzen zwischen den Gruppen in
Tabelle 71. Abbildung 23 gibt die CL-Aktivitäten aus Milch der vier Gruppen wieder.
4.6.1.2.1
Eutergesundheit
Die Zellzahl im VAG stieg von Gruppe V1 bis Gruppe V4 hochsignifikant an
(p < 0,001).
4.6.1.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Der Anteil PMN in Milch wurde von 30,7 % in Gruppe V1 zu 76,3 % in Gruppe V4
hochsignifikant größer (p < 0,001). Die Anteile Lymphozyten und Makrophagen sanken von Gruppe V1 bis Gruppe V4 ab (von 30,5 auf 6,7 % bzw. von 30,9 auf 16,6 %).
CL-Aktivität aus Milch-PMN der Gruppen V1 bis V4
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN in 1.000
12
10
8
6
4
2
0
V1
V2
V3
Gruppe
Abbildung 23: CL-Aktivität von PMN aus Milch der Gruppen V1 bis V4
162
V4
Ergebnisse
Tabelle 70: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte der
Gruppen V1 bis V4
Gruppe
V1
V2
V3
V4
log SCC
log LF
PMN M
Lym M
Makro M
X
4,18
0,75
30,7
30,5
30,9
± sd
0,38
0,04
19,2
20,2
20,4
n
77
76
77
77
77
X
4,83
0,77
49,8
16,8
31,2
± sd
0,08
0,07
27,5
18,5
20,6
n
18
15
18
18
18
X
5,17
0,78
67,5
10,4
21,7
± sd
0,09
0,08
20,9
8,8
15,8
n
22
20
22
22
22
X
5,76
0,81
76,3
6,7
16,6
± sd
0,30
0,07
16,8
7,1
11,1
n
50
49
50
50
50
Vitalität
CL-Aktivität
M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
X
76,8
3.607
-1,61
2.147
0,66
± sd
10,5
4.835
0,69
519
0,96
n
77
77
74
74
73
X
74,8
6.241
-1,14
1.667
1,80
± sd
16,1
5.096
0,71
416
0,96
n
18
18
18
18
18
X
75,3
6.554
-0,70
1.418
2,49
± sd
17,1
3.741
0,51
308
0,55
n
22
22
22
22
22
X
81,9
10.019
-0,33
1.095
3,42
± sd
12,8
4.977
0,36
479
0,51
n
50
50
50
50
50
Gruppe
V1
V2
V3
V4
n: Stichprobengröße (Viertel)
163
Ergebnisse
Tabelle 71: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen V1 bis V4
Gruppen
log SCC
log LF
PMN M
Lym M
Makro M
V1
V2
***
n. s.
*
*
n. s.
V1
V3
***
n. s.
***
***
n. s.
V1
V4
***
***
***
***
***
V2
V3
***
n. s.
*
n. s.
n. s.
V2
V4
***
n. s.
***
*
**
V3
V4
***
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
***
***
***
***
***
Vitalität
CL-Aktivität
M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
gesamt
Gruppen
V1
V2
n. s.
*
*
***
***
V1
V3
n. s.
**
***
***
***
V1
V4
*
***
***
***
***
V2
V3
n. s.
n. s.
*
*
*
V2
V4
n. s.
**
***
***
***
V3
V4
n. s.
**
**
**
***
n. s.
***
***
***
***
gesamt
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
*: p < 0,05;
**: p < 0,01;
***: p < 0,001
4.6.1.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Die Parameter CL-Aktivität Milch (10.019 Einheiten / 1 Mio. PMN), Max (-0,33) und
log CL-Aktivität / ml Milch (3,42) hatten ihre Maxima in Gruppe V4, während der Parameter Time in dieser Gruppe mit 1.095 Sekunden den niedrigsten Mittelwert aufwies.
164
Ergebnisse
4.6.2
Gruppen auf Basis der CL-Aktivität M
Die Datenbank wurde nach der Höhe der CL-Aktivität M gruppiert (s. Abbildung 22).
Hierfür wurden die drei Gruppen CL1, CL2 und CL3 gebildet, deren Selektionskriterien der Tabelle 72 zu entnehmen sind.
Tabelle 72: Einteilung der Gruppen CL1, CL2 und CL3 auf Basis der CL-Aktivität M
Gruppe
n
CL-Einheiten / 1 Mio. PMN
CL1
54
< 3.000
CL2
44
3.000 – 6.000
CL3
70
> 6.000
n: Stichprobengröße (Viertel)
Die Tabelle 73 stellt die Grunddaten der drei Gruppen dar. Eine graphische Darstellung der Zellzahl und der CL-Aktivitäten aus Blut und Milch findet sich in Abbildung
24. Die Signifikanzen zwischen den Gruppen sind in Tabelle 74 wiedergegeben.
4.6.2.1
Eutergesundheit
Die Zellzahl im VAG stieg von Gruppe CL1 bis Gruppe CL3 hochsignifikant an (s.
Tabelle 74).
4.6.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Der Anteil PMN in der Milch-Zellsuspension stieg von 33,1 (CL1) auf 68,0 % (CL3).
Der höchste Anteil Makrophagen fand sich in der Gruppe CL2 mit 30,8 %.
165
Ergebnisse
Tabelle 73: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) von Milchwerten der
Gruppen CL1 bis CL3
Gruppe
CL1
CL2
CL3
log SCC
log LF
PMN M
Lym M
Makro M
X
4,2
0,75
33,1
33,4
26,6
± sd
0,5
0,03
22,0
22,2
21,4
n
54
54
53
53
53
X
4,9
0,79
46,4
17,1
30,8
± sd
0,6
0,09
24,0
12,8
16,8
n
44
39
44
44
44
X
5,4
0,79
68,0
9,9
21,3
± sd
0,5
0,06
25,7
12,5
16,5
n
69
67
70
70
70
Vitalität
CL-Aktivität
M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
X
71,1
1.104
-1,84
2.214
0,23
± sd
13,2
912
0,65
584
0,92
n
54
54
51
51
50
X
80,0
4.510
-1,04
1.666
2,01
± sd
10,4
788
0,47
515
0,77
n
44
44
44
44
44
X
82,0
11.232
-0,46
1.304
3,05
± sd
12,4
4.834
0,54
521
0,82
n
70
70
70
70
69
Gruppe
CL1
CL2
CL3
n: Stichprobengröße (Viertel)
166
Ergebnisse
Tabelle 74: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen CL1, CL2 und CL3
Gruppen
log SCC
log LF
PMN M
Lym M
Makro M
CL1
CL2
***
*
**
***
n. s.
CL1
CL3
***
***
***
***
n. s.
CL2
CL3
***
n. s.
***
**
**
Allgemein
***
**
***
***
*
Gruppen
Vitalität
CL-Aktivität
M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
CL1
CL2
***
***
***
***
***
CL1
CL3
***
***
***
***
***
CL2
CL3
n. s.
***
***
***
***
***
***
***
***
***
Allgemein
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
*: p < 0,05;
**: p < 0,01;
***: p < 0,001
Zellzahl in Milch und CL-Aktivität aus Milch der Gruppen
CL1 bis CL3
16
CL-Aktivität
SCC
6
12
5
10
4
8
3
6
2
4
2
1
0
0
CL1
CL2
log Zellzahl / ml
CL-Einheiten / 1 Mio.
PMN x 1.000
14
7
CL3
Gruppe
Abbildung 24: CL-Aktivität aus Milch-PMN und Zellzahl im VAG der Gruppen CL1
bis CL3
167
Ergebnisse
4.6.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Die Vitalität war in Gruppe CL1 (71,1 %) signifikant niedriger als in den anderen
Gruppen. Die Werte der Parameter log Max und log CL-Aktivität / ml Milch stiegen
von Gruppe zu Gruppe hochsignifikant an (p < 0,001), für den Parameter Time war
ein entsprechender Abfall der Werte zu beobachten (2.214 Sekunden in Gruppe
CL1, 1.304 Sekunden in Gruppe CL3).
4.6.2.4
Auswertung der Gruppe CL2 anhand der Zellzahl (Gruppen CL2/T<100,
CL2/V<100 und CL2/V>100)
Um einen engeren Zusammenhang der CL-Aktivität zur Eutergesundheit herzustellen, und um der Abhängigkeit der Euterviertel einer Kuh voneinander Rechnung zu
tragen, wurde die Gruppe CL2 erneut kategorisiert. Die Kriterien für die Einteilung
der Gruppen CL2/T<100, CL2/V<100 und CL2/V>100 sind der Tabelle 75 zu entnehmen. Dabei enthält die Gruppe CL2/T<100 Daten von Tieren, die auf allen Vierteln
Zellzahlen unter 100.000 Zellen / ml Milch aufweisen. Die Daten der beiden anderen
Gruppen wurden jedoch auf Viertelebene selektiert.
Tabelle 75: Einteilung der Gruppe CL2 in die Gruppen CL2/T<100, CL2/V<100 und
CL2/V>100
Gruppe
n
Zellzahl / ml Milch
Selektionsebene
CL2/T<100
15
< 100.000
Tier
CL2/V<100
10
< 100.000
Viertel
CL2/V>100
14
≥ 100.000
Viertel
n: Stichprobengröße (Viertel)
Die Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Parameter innerhalb der
einzelnen Gruppen sind in Tabelle 76 dargestellt. Tabelle 77 legt die Signifikanzen
zwischen den drei Gruppen dar.
168
Ergebnisse
Tabelle 76: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte der
Gruppen CL2/T<100, CL2/V<100 und CL2/V>100
Gruppe
log SCC
log LF
PMN M
Lym M
Makro M
4,45
0,77
24,6
22,8
38,0
0,27
0,07
12,8
17,5
20,6
n
15
15
15
15
15
X
4,61
0,77
54,7
15,4
26,9
0,31
0,03
17,8
8,6
8,3
n
10
6
10
10
10
X
5,49
0,83
65,5
12,0
22,6
0,39
0,12
17,1
8,7
11,9
14
13
14
14
14
Vitalität
CL-Aktivität M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
80,1
4.630
-1,28
1.858
1,34
9,3
760
0,60
350
0,39
n
15
15
15
15
15
X
82,5
4.361
-1,12
1.795
1,87
5,8
841
0,43
567
0,45
n
10
10
10
10
10
X
77,9
4.303
-0,74
1.382
2,80
14,1
814
0,15
481
0,44
14
14
14
14
14
X
CL2/T<100 ± sd
CL2/V<100 ± sd
CL2/V>100 ± sd
n
Gruppe
X
CL2/T<100 ± sd
CL2/V<100 ± sd
CL2/V>100 ± sd
n
n: Stichprobengröße (Viertel)
169
Ergebnisse
Tabelle 77: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen CL2/T<100,
CL2/V<100 und CL2/V>100
Gruppen
log SCC
log LF
PMN M
Lym M
Makro M
CL2/T<100 CL2/V<100
n. s.
n. s.
***
n. s.
n. s.
CL2/T<100 CL2/V>100
***
n. s.
***
*
*
CL2/V<100 CL2/V>100
***
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
Allgemein
***
n. s.
***
n. s.
*
Gruppen
Vitalität
CL-Aktivität M
log Max
Time
log CLAktivität / ml
Milch
CL2/T<100 CL2/V<100
n. s.
n. s.
n. s.
n. s.
**
CL2/T<100 CL2/V>100
n. s.
n. s.
**
**
***
CL2/V<100 CL2/V>100
n. s.
n. s.
*
n. s.
***
Allgemein
n. s.
n. s.
**
*
***
n. s.: nicht signifikant, p ≥ 0,05;
*: p < 0,05;
**: p < 0,01;
***: p < 0,001
4.6.2.4.1
Eutergesundheit
Leitfähigkeit und Zellzahl im VAG lagen in der Gruppe CL2/V>100 signifikant höher als
in den beiden anderen Gruppen (p < 0,001).
4.6.2.4.2
Zelldifferentialbild in Milch
Der Anteil PMN in der Zellsuspension Milch stieg von Gruppe CL2/T<100 bis Gruppe
CL2/V>100 stetig an. Zwischen Gruppe CL2/T<100 (24,6 %) und Gruppe CL2/V<100
(54,7 %) lag ein hochsignifikanter Unterschied vor (s. Tabelle 77).
4.6.2.4.3
Zellfunktionalität in Milch
Log Max und log CL-Aktivität / ml Milch wurden mit steigender Gruppenzahl größer.
170
5.
Diskussion
Ziel der Arbeit war es, das mikroskopische Differentialzellbild aus Milch sowie die
Parameter der Zellfunktionalität aus Blut und Milch im Zusammenhang mit den Parametern Zellzahl, elektrische Leitfähigkeit und NAGase zu vergleichen. Zunächst
mussten die Methoden der funktionellen Untersuchungen an die Besonderheiten der
aus Milch isolierten Zellen angepasst werden. Nach der Beurteilung der methodischen Versuche werden die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen diskutiert.
5.1
Methodische Versuche zur Phagozytoseaktivität
in Blut
5.1.1
Inkubationszeit
Die Inkubationszeiten von 30, 60 und 90 Minuten der mit Bakterien versetzten
Blutzellsuspensionen wurden miteinander verglichen (s. Abschnitt 4.1.1). Da die
Anteile aktiver Zellen der Proben n (z. B. von 8,3 % auf 18,6 % für Tier A) und o (z.
B. von 24,0 % auf 79,8 % für Tier A) sowie die MFI der Proben o (z. B. von 90,1 auf
226,5 für Tier A) kontinuierlich anstiegen, wurde die Inkubationszeit von 60 Minuten,
die der Arbeitsanweisung der Arbeitsgruppe Immunologie entspricht, beibehalten. In
der Literatur werden Angaben zur Inkubationszeit von 15 (SAAD u. HAGELTORN
1985) bis 90 Minuten (WILLIAMS et al. 1985) genannt.
5.1.2
Zellkonzentration
Die Zellkonzentrationen 4 Mio., 2 Mio. und 200.000 Zellen / ml Blutzellsuspension
wurden einem Vergleich unterzogen (s. Abschnitt 4.1.2). Mit sinkender Zellkonzentration stieg der Anteil phagozytierender Zellen in den Proben n an (z. B. von 10,3 auf
29,4 % für Tier A). Zwischen den Werten der Proben n und o war ein deutlicher Un-
171
Diskussion
terschied erwünscht, der in Ansatz c (200.000 Zellen / ml) geringer als in den anderen Proben war. Unter Berücksichtigung niedrigzelliger Milchproben sollte der
Verbrauch an Probenmaterial allerdings eingeschränkt werden. Die Zellkonzentration
in der Zellsuspension wurde daher auf 2 Mio. Zellen / ml festgelegt, was ebenfalls mit
den Angaben aus der Arbeitsanweisung der Arbeitsgruppe Immunologie übereinstimmt. In der Literatur sind Zellkonzentrationen von 1 (SORDILLO u. BABIUK 1991)
bis 25 Mio. Zellen / ml (PAAPE et al. 1975) zu finden.
5.1.3
Bakterienkonzentration
Zwei Ansätze aus Blut-PMN mit verschiedenen Bakterienkonzentrationen (0,15 x
108/ml bzw. 0,7 x 108/ml) wurden einander gegenübergestellt (s. Abschnitt 4.1.3).
Auch hier war ein deutlicher Unterschied zwischen den Proben n und o erwünscht.
Zudem musste der Tatsache Rechnung getragen werden, dass einige Zellsuspensionen aus Milch weniger Zellen enthielten als die Zellsuspensionen aus Blut. Um einen Überschuss an Bakterien in allen Proben zu sichern wurde eine Bakterienkonzentration von 0,7 x 108 Bakterien / ml eingesetzt. Andere Autoren setzten zwischen
6 x 106 Bakterien / ml (WILLIAMS et al. 1985) und 5 x 108 Bakterien / ml (SAAD u.
HAGELTORN 1985) ein.
5.1.4
Zusammenfassende Beurteilung
Die Phagozytosemessung wurde in den weiteren Versuchen mit 2 x 106 Zellen / ml
sowie 0,7 x 108 Bakterien / ml unter Einhaltung einer Inkubationszeit von 60 Minuten
durchgeführt. In Tabelle 78 wird diese Methode der Arbeitsanweisung der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover gegenübergestellt.
172
Diskussion
Tabelle 78: Methodenvergleich Phagozytosebestimmung Immunologie – Merle
Parameter
Immunologie
Merle
Inkubation
60 Minuten
60 Minuten
Zellkonzentration
2 x 106 Zellen / ml
2 x 106 Zellen / ml
Bakterienkonzentration
0,15 x 108 Bakterien / ml
0,7 x 108 Bakterien / ml
5.2
Methodische Versuche zur CL-Aktivität in Blut
5.2.1
Zellisolierung bei verschiedenen Temperaturen
Blut-PMN wurden bei 0° C (Gruppe 1) bzw. bei 25° C (Gruppe 2, s. Abschnitt 4.2.1)
isoliert und hinsichtlich ihrer CL-Aktivität untersucht. Dabei hatten drei von vier Tieren
nach der Aufbereitung mit 0° C höhere Ergebnisse als mit 25° C. Auch der Variationskoeffizient war in Gruppe 1 (24,8 %) niedriger als in Gruppe 2 (33,0 %). Zudem
wurde die unerwünschte Aggregatbildung der PMN verstärkt in den Proben der
Gruppe 2 beobachtet. In Übereinstimmung mit den Angaben aus der Literatur (z.B.
PAAPE et al. 1975; WEBER et al. 1983; MEHRZAD 2002) wurde die Zellisolation im
Weiteren auf Eis durchgeführt.
5.2.2
Inkubation bei verschiedenen Temperaturen
Der Einfluss einer Inkubation der Blutzellsuspension vor der Messung bei 0° C, 25° C
und 38° C auf die CL-Aktivität wurde untersucht (s. Abschnitt 4.2.2). Der mittlere Variationskoeffizient zwischen den Ergebnissen von Tag 1 bis Tag 5 lag in Ansatz 1
(0° C) mit 26,9 % am niedrigsten.
Der erste Messwert der 30 Einzelwerte (s. Abschnitt 3.7.7) der CL-Messung soll 0
betragen, um sicherzustellen, dass die Sauerstoffradikale erst nach Beginn der Mes-
173
Diskussion
sung ausgeschüttet werden. Die Ansätze 3 (38° C) wiesen oft Werte über 0 auf, wodurch die Standardisierung der Messung behindert wurde.
Für die weiteren Versuche wurden die Zellsuspensionen bis zum Beginn der Messung auf Eis gelagert. MEHRZAD (2002), der ebenfalls mit einem Luminometer arbeitete, bewahrte die isolierten Zellen bis zur Messung auf Eis auf. Da HOEBEN
(1999) in seinen Untersuchungen statt des Luminometers ein Szintillationsspektrometer einsetzte, gab er eine optimale Inkubationstemperatur von 26° C an.
5.2.3
Lagerungsdauer der Proben
Die CL-Aktivität und die Vitalität von vier Blutzellsuspensionen wurden innerhalb von
24 Stunden mehrmals bestimmt (s. Abschnitt 4.2.3). Zwischen 0 und 6 Stunden stiegen die Werte der CL-Aktivität für die kranken Tieren an, während sie für die gesunden Tieren abfielen. Dem Anstieg kann eine vorausgegangene Behandlung der Tiere
mit Antibiotika zugrunde liegen, die die Zellaktivität beeinflussen (HOEBEN 1999).
Eine längere Lagerungsdauer führte in allen Blutproben zu einem Abfall der CLAktivität und der Vitalität. Aus diesen Daten wurde geschlossen, dass eine kurzfristige Lagerung der Zellsuspensionen auf Eis nach Abschluss der Zellisolation die Messung der CL-Aktivität nicht beeinflusst, eine Lagerungsdauer über sechs Stunden
jedoch zu vermeiden ist. HOEBEN (1999) stellte in vergleichbaren Untersuchungen
fest, dass eine Inkubationszeit isolierter PMN (4° C) von einer Stunde optimal ist und
drei Stunden nicht überschreiten sollte.
5.2.4
Zellkonzentration
Die CL-Aktivität verschiedener Zellkonzentrationen aus Blut-PMN wurde bestimmt
und miteinander verglichen (s. Abschnitt 4.2.4). Die Anzahl vitaler PMN in der Zellsuspension und die CL-Aktivität korrelierten stark miteinander (k = 0,97 – 0,99). Die
CL-Aktivität stieg demnach linear zur Zellzahl in der Probe an (s. Abbildung 7), sodass die genaue Einhaltung einer bestimmten Zellkonzentration in den Zellsuspensionen nicht erforderlich war. Die Präzision des Blutanalysegerätes Hematology Ana-
174
Diskussion
lyser, mit dem die Zellkonzentration bestimmt wurde, ist im Bereich zwischen 2 und
10 x 106 Zellen mit einem Variationskoeffizienten unter 0,5 % am höchsten. Festgelegt wurde daher eine Zellkonzentration von 4 x 106 / ml. Die Angaben aus der Literatur reichen von 0,5 – 2,5 x 106 (MEHRZAD 2002) bis 5 x 107 (KREMER et al. 1993)
Zellen / ml. Für Milch liegt nach MEHRZAD (2002) die optimale Zellkonzentration
zwischen 0,25 und 4 x 106 / ml.
5.2.5
PMA-Konzentration
Der Einsatz verschiedener PMA-Konzentrationen (375, 750 und 1.500 ng / ml) für die
Messung der CL-Aktivität aus Blutzellsuspensionen (s. Abschnitt 4.2.5) zeigte eine
deutliche Korrelation zwischen der Konzentration PMA in der Probe und der Höhe
der CL-Aktivität (k > 0,78 in 7 von 12 Probensätzen). Die graphische Darstellung
machte jedoch deutlich, dass es sich nicht um einen kontinuierlichen Anstieg handelte. Offensichtlich war das Anregungspotential der PMN mit 750 ng / ml nahezu ausgeschöpft, da zwischen 750 ng / ml und 1500 ng / ml nur noch ein geringer Anstieg
der CL-Aktivität zu verzeichnen war. Auch der Variationskoeffizient lag für 750
ng / ml mit 22,2 % am niedrigsten. Daher wurde eine PMA-Konzentration von 750
ng / ml festgelegt.
Nach MEHRZAD (2002) liegt die optimale PMA-Konzentration mit 100 bis 500
ng / ml für PMN aus Blut niedriger. Die größeren Variationen zwischen den Proben in
diesem Bereich beruhen auf der individuellen Sensibilität der PMN gegenüber PMA.
Dadurch wirken sich geringste Schwankungen in der PMA-Konzentration auf das
Ergebnis aus. Die in der vorliegenden Arbeit verwendete Menge an PMA aktiviert alle
Zellen maximal, sodass die unvermeidbaren geringen Schwankungen wenig Einfluss
auf das Ergebnis haben.
5.2.6
pH-Wert
Da die Luminol-Reaktion nur im alkalischen Milieu abläuft (BROLIN u. WETTERMARK 1992), wurde der Einfluss der pH-Wertes auf die Messung der CL-Aktivität
175
Diskussion
aus Blutzellsuspensionen untersucht (s. Abschnitt 4.2.6). Die Messungen mit einem
pH-Wert von 10,8 ergaben etwa 10fach höhere Werte als die Messungen mit pH 7,1.
Die Variationskoeffizienten der Ergebnisse eines Tieres von mehreren Tagen waren
mit einem pH-Wert von 10,8 durchgehend niedriger als die entsprechenden Variationskoeffizienten mit pH 7,1. Die folgenden Versuche wurden mit dem pH-Wert von
10,8 durchgeführt. MEHRZAD (2002) führte seine CL-Messungen mit pH 7,2 durch.
5.2.7
Messung der CL-Aktivität aus Vollblut, lysiertem Blut und aufbereiteter Zellsuspension
Die Ergebnisse von drei verschiedenen Probenarten wurden miteinander verglichen:
Vollblutproben (a), lysierte Proben (b) und isolierte PMN (c) (s. Abschnitt 4.2.7). Aus
Vollblutproben konnte keine CL-Aktivität gemessen werden, auch wenn NAGAHATA
et al. (1988) dies gelungen war. Die Ergebnisse der lysierten Proben und der isolierten PMN korrelierten miteinander, die Werte der isolierten PMN waren jedoch etwas
höher als die der lysierten Proben. Dies erklärt sich dadurch, dass sich vorhandene
Lymphozyten an der Oberfläche der Probe aufhielten und durch ihr Volumen die
Freisetzung und Detektion des Lichtes im Luminometer behinderten. Im Konsens mit
anderen Untersuchern (z. B. HOEBEN et al. 2000a, 2000b; MEHRZAD 2002) wurde
die Isolation der PMN daher weiterhin durchgeführt.
5.2.8
Wiederholbarkeit innerhalb eines Tages
Die Wiederholbarkeit der CL-Aktivitätsmessung aus Blut-PMN innerhalb eines Tages
wurde überprüft (s. Abschnitt 4.2.8). Der Variationskoeffizient aus den beiden
Arbeitslösungen derselben Probe (z. B. Proben 1a und 1b) betrug im Mittel 4,7 %.
Diesen Schwankungen lagen das Auftragen der Proben in die Mikrotiterplatte und die
Messungenauigkeit des Luminometers zugrunde. Technische Schwankungen einer
Methode von 5 bis 10 % können als akzeptabel bezeichnet werden. MEHRZAD
(2002) ermittelte in einer gleichartigen Untersuchung einen Variationskoeffizienten
von 4,3 %.
176
Diskussion
Der mittlere Variationskoeffizient aus den vier Arbeitslösungen desselben Tieres
(z. B. Proben 1a, 1b, 2a und 2b) lag mit 10,5 % mehr als doppelt so hoch. Die Ursachen für diese Schwankungen waren in der Technik der Zellisolierung und ebenfalls
in der Durchführung der Messung zu finden. Diese Beobachtungen lassen darauf
schließen, dass der Vorgang der Zellseparation ebenso großen Einfluss auf das Ergebnis nahm wie die Messung selbst. Es gilt daher, die Isolation der PMN so gleichmäßig wie möglich durchzuführen.
5.2.9
Zusammenfassende Beurteilung
Die laboranalytischen Vorarbeiten zur Standardisierung der Untersuchung von Blutproben führten zu folgenden Modifikationen der bisher etablierten Methoden: Die Zellen wurden bei 0° C separiert, anschließend wurden die Proben zwischen 1 und 3
Stunden auf Eis gelagert. Die Messung wurde mit einer Zellkonzentration von 4 x 106
Zellen / ml, 750 ng PMA / ml sowie einem pH-Wert von 10,0 in der Reaktionslösung
durchgeführt. Dieses Verfahren kann als hinreichend reproduzierbar angesehen
werden. Abgesehen von der PMA-Konzentration und von pH-Wert fügt sich die Vorgehensweise in die Angaben aus der Literatur ein. Ein Vergleich zwischen dem methodischen Vorgehen und Angaben von MEHRZAD (2002) findet sich in Tabelle 79.
Tabelle 79: Methodenvergleich CL-Aktivität nach MEHRZAD (2002) und nach Merle
Parameter
Mehrzad
Merle
Zellisolierung
Eis
Eis
Inkubation
Eis
Eis
Lagerung
0 – 3 Stunden
1 – 6 Stunden
0,5 – 2,5 x 106 Zellen / ml
4 x 106 Zellen / ml
100 – 500 ng / ml
750 ng / ml
7,2
10,0
4,3 %
4,7 %
Zellkonzentration
PMA-Konzentration
pH-Wert
Wiederholbarkeit
177
Diskussion
5.3
Versuch 1: Einfluss der Zahl der erkrankten Euterviertel pro Kuh auf die Zellfunktionalität von
PMN aus Milch und Blut
5.3.1
Blutproben
5.3.1.1
Vollblutuntersuchungen
Liegt eine Entzündung im Körper vor, so steigt mit der Zahl der Leukozyten (WBC)
auch der Anteil PMN im Blut (KRAFT u. DÜRR 1997). In der vorliegenden Untersuchung korrelierten beide Parameter erwartungsgemäß miteinander (k = 0,64).
Eine Darstellung der Gruppenstruktur findet sich in Abbildung 9 (Abschnitt 4.3.1). Der
Anteil PMN in Gruppe C lag mit 54,6 % oberhalb des Grenzwertes von 50 % (KRAFT
u. DÜRR 1997), die Leukozytenzahl (WBC) blieb in dieser Gruppe mit 9,7 Mio. Zellen / ml noch im Referenzbereich von 4 – 10 Mio. Zellen / ml (KRAFT u. DÜRR
1997). Während die Tiere der Gruppen A und B allgemeingesund waren, wies der
Anstieg beider Parameter in Gruppe C auf ein Krankheitsgeschehen hin (KRAFT u.
DÜRR 1997). REDETZKY (2000) konnte in Untersuchungen mit einer höheren
Stichprobengröße (n = 42 Tiere) ebenfalls einen tendenziellen Anstieg der Leukozytenzahl im Blut im Zusammenhang mit klinischen Mastitiden feststellen.
5.3.1.2
Zellfunktionalität in Blut
Die Parameter der Zellfunktionalität aus Blut-PMN zeigten keine Korrelationen zum
Anteil PMN in Blut. Beiden Parametern scheinen unterschiedliche Aktivierungsmechanismen zugrunde zu liegen. Innerhalb der Parameter der Zellfunktionalität korrelierten lediglich log Max und die CL-Einheiten / 1 Mio. PMN aus Blut miteinander
(k = 0,81). Diese Korrelation beschreibt die Abhängigkeit des aus 30 Einzelmessungen gebildeten Integrals, aus dem die CL-Einheiten / 1 Mio. PMN berechnet werden,
vom Maximum der Kurve. Die hohe Übereinstimmung beider Parameter drückt aus,
dass der Kurvenverlauf in allen Proben ähnlich war. Obwohl auch HOEBEN (1999) in
178
Diskussion
seinen Untersuchungen die Parameter Max, Time und das Integral der Kurve (CLEinheiten / 1 Mio. PMN) aus der CL-Messung im Blut erhob, gab er keine Korrelationen zwischen diesen Parametern an.
Die hohe Phagozytoseaktivität in Gruppe B (42,3 % der Proben n; 45,1 % der Proben
o) deutete auf eine Aktivierung des Immunsystems hin, die auch von DALEY et al.
(1991) beobachtet wurde. In Gruppe C (32,9 % der Proben n; 39,0 % der Proben o)
war die Phagozytosekapazität vermutlich deshalb besonders niedrig, da es sich um
allgemeinerkrankte Tiere mit einem geschwächten Immunsystem handelte. Eine Erkrankung aller vier Euterviertel gleichzeitig ist äußerst selten und unterstützt diese
Annahme.
Die CL-Aktivität lag in den Gruppen B und C tendenziell niedriger als in Gruppe A.
Dies kann auf einen krankheitsbedingt erhöhten Anteil stabkerniger PMN im Blut zurückgeführt werden, von denen aufgrund mangelnder Reife nur ca. 57 % zum Respiratory Burst befähigt sind (GLASSER u. FIEDERLEIN 1987). Es ist aber auch denkbar, dass diese Tiere z. B. aufgrund chronischer Infektionen eine grundsätzlich inaktivere Abwehrlage besaßen.
5.3.2
Milchproben
5.3.2.1
Eutergesundheit
Die elektrische Leitfähigkeit in Milchproben gesunder Euterviertel liegt nach HAMANN und FEHLINGS (2002) zwischen 4,8 und 6,2 mS / cm. Vermutlich aufgrund
der geringeren Stichprobenzahl korrelierte dieser Parameter stärker mit der Zellzahl
in Milch (k = 0,65) als von GRABOWSKI (2000) angegeben (k = 0,30). Log SCC in
Milch weist einen Modalwert von 20.000 Zellen / ml (log 4,30) bis 50.000 Zellen / ml
(log 4,70) mit der doppelten Standardabweichung bis 100.000 Zellen / ml (log 5,00)
auf (DOGGWEILER u. HESS 1983; HAMANN u. REICHMUTH 1990). Die Anzahl
somatischer Zellen wird allgemein dahingehend interpretiert, dass eine entzündliche
Reaktion oberhalb der Grenzwertes von 100.000 Zellen / ml Milch beginnt (REICHMUTH 1975; HAMANN u. FEHLINGS 2002).
179
Diskussion
Die Tiere der Gruppe A wurden anhand dieser Parameter als eutergesund bezeichnet (s. Tabelle 80). Anhand der Gruppenstruktur (Tiere mit SCC über 100.000 Zellen / ml Milch in 1 bis 3 Vierteln) konnten die Tiere der Gruppe B ebenfalls als erkrankt definiert werden. Die Tiere der Gruppe C waren nach diesen Richtlinien euterkrank.
Tabelle 80: Beurteilung der Eutergesundheit der Tiere in den Gruppen A, B und C
anhand der Parameter SCC und elektrische Leitfähigkeit
Parameter
Referenzbereich*
Gruppe A
Gruppe B
Gruppe C
SCC in Zellen / ml
VAG
≤ 100.000
≤ log 5,00
ca. 16.600
log 4,22
100.000
log 5,00
ca. 800.000
log 5,90
elektr. Leitfähigkeit
in mS / cm
4,8 – 6,2
5,43
6,06
6,62
eutergesund
euterkrank**
euterkrank
Beurteilung
*: Referenzwerte nach HAMANN u. FEHLINGS (2002)
**: Begründung für diese Beurteilung s. Text
5.3.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Die Korrelationskoeffizienten der Anteile PMN und Lymphozyten in der Milchzellsuspension zur Zellzahl in Milch waren mit k = 0,59 bzw. -0,61 gegensinnig, aber gleich
hoch. Die Tatsache, dass mit steigendem SCC in der Milch auch der Anteil PMN in
der Zellsuspension zunimmt, wurde bereits wiederholt festgestellt (z. B. PAAPE et al.
1981a; KURZHALS et al. 1985; CONCHA 1986; LEITNER et al. 1995; SCHRÖDER
2003). Wie die Zellzahl dient auch ein erhöhter Anteil PMN als Ausdruck eines
infektiösen Geschehens im Euter.
Das Differentialzellbild der Gruppe A mit 41,9 % PMN, 27,7 % Lymphozyten und
25,5 % Makrophagen wies im Vergleich zu veröffentlichten Daten einen hohen PMNAnteil auf (z. B. WEVER u. EMANUELSON 1989; DOSOGNE et al. 2003; SCHRÖDER 2003; s. Abschnitt 2.2.2). Aufgrund der geringen Stichprobenzahl und im Ver-
180
Diskussion
gleich zu den Ergebnissen der Gruppen B und C wurde dennoch davon ausgegangen, dass in Gruppe A die Tiere eutergesund waren.
Die Zelldifferentialbilder der Tiere der Gruppen B (65,2 % PMN) und C (83,9 % PMN)
sprachen für das Vorliegen einer Euterinfektion. Vermutlich war die Tatsache, dass in
Gruppe B viele der Tiere chronische Infektionen aufwiesen, verantwortlich für das
Zelldifferentialbild in dieser Gruppe, da chronische Infektionen im Vergleich zu akuten durch einen höheren Lymphozyten- und Makrophagenanteil gekennzeichnet sind
(CONCHA 1986; KRAFT u. DÜRR 1997). Eine getrennte Betrachtung der erkrankten
sowie der nicht erkrankten Euterviertel würde weitere Informationen über das Krankheitsbild liefern. Gruppe C erreichte beinahe den Wert von 90 % PMN, der in der Literatur für akute Mastitiden häufig angegeben wird (z. B. PAAPE et al. 1979) und
erklärt auch den erhöhten PMN-Anteil im Blut.
5.3.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Prozentsatz und MFI der opsonisierten Proben korrelierten negativ mit der Zellzahl in
Milch (k = -0,68 für beide Parameter) und dem Anteil PMN in Milch (k = -0,57 bzw.
-0,84). Höhere Zellzahlen in Milch führten offensichtlich zu einer verminderten Aktivität der Zellen.
Entsprechend dieser Korrelationen war für die Milchwerte wie schon für die Blutwerte (s. Abschnitt 5.3.1.2) die niedrigste Phagozytoseaktivität in Gruppe C zu finden.
Dies steht im Widerspruch zu anderen Veröffentlichungen (z. B. DALEY et al. 1991).
Die niedrigere Phagozytoseaktivität trotz hohem PMN-Anteil in der Zellsuspension
führt zu der Annahme, dass beide Parameter durch unterschiedliche immunologische
Vorgänge gesteuert werden. Die Tiere der Gruppe C waren vermutlich immungeschwächt, da sie auch in Blut erhöhte Leukozytenzahlen sowie eine herabgesetzte
Phagozytoseaktivität hatten und offensichtlich besonders infektionsanfällig waren.
Unter den Parametern der CL-Aktivität war besonders log CL-Aktivität / ml Milch eng
mit der Zellzahl (k = 0,89) und dem Anteil PMN in der Milchzellsuspension (k = 0,80)
korreliert. Dieser Wert führt die Parameter Zellzahl in Milch, Anteil und Vitalität der
PMN in der Milchzellsuspension sowie die CL-Aktivität / 1 Mio. PMN zusammen, so-
181
Diskussion
dass die hohen Korrelationen den Erwartungen entsprachen. Auch von LILIUS und
PESONEN (1990) wurde schon festgestellt, dass die CL-Aktivität von Milchzellen
zellzahlabhängig steigt. Aber auch eine positive Korrelation zwischen dem PMNAnteil und der CL-Aktivität wurde bereits belegt (MEHRZAD 2002).
Die Parameter der CL-Aktivität aus Milchzellen korrelierten erwartungsgemäß untereinander deutlich (k = -0,60 oder kleiner bzw. 0,66 oder größer). Zwischen der CLAktivität M und den Parametern zur Beschreibung der Phagozytose bestanden, wie
auch von WILLIAMS et al. (1985) beschrieben, keine signifikanten Korrelationen.
Auch hier scheinen jeweils unterschiedliche Mechanismen für die Aktivierung verantwortlich zu sein.
In Gruppe A wies die CL-Aktivität im Gegensatz zur Phagozytose die niedrigsten Mittelwerte auf. Besonders deutlich wurden die Unterschiede zwischen den Gruppen für
den Parameter CL-Aktivität / ml Milch (p < 0,01). Dies hat seine Ursachen darin, dass
in der Milch gesunder Euterviertel andere immunmodulatorische Stoffe vorliegen als
in Milch infizierter Viertel (RIOLLET et al. 2000). Die geringere Zellzahl in der Milch
gesunder Viertel hat zur Folge, dass die Zellen länger in der Milch verweilen und
ihre Aktivität durch sinkende Energiereserven (Glykogenspeicher) nach und nach
verlieren (NEWBOULD 1970, 1973). Anhand der Untersuchungen zur Vitalität von
Zellen aus Blut und Milch konnte MEHRZAD (2002) eine niedrige Vitalität von Zellen
aus Milch mit geringer Zellzahl feststellen.
5.3.3
Zusammenfassende Beurteilung
Ziel der Untersuchungen war es, die Aktivität der aus Blut gewonnenen PMN mit Parametern der Eutergesundheit und der Zellfunktionalität aus Milch in Zusammenhang
zu bringen. Dazu wurden gezielt Tiere, die auf allen vier Eutervierteln erkrankt waren,
mit Tieren, die auf einem bis drei Vierteln erkrankt waren, sowie mit gesunden Tieren
verglichen.
Die Auswertung der Daten bestätigte, dass die Tiere der Gruppe A gesund und die
der Gruppe B auf einem bis drei Vierteln euterkrank waren. Die Allgemeingesundheit
182
Diskussion
dieser Tiere war nicht beeinträchtigt, während die Tiere der Gruppe C sowohl allgemein- als auch euterkrank waren. Da alle vier Euterviertel gleichzeitig erkrankt waren, die Leukozytenzahl sowie der Anteil PMN im Vollblut erhöht, die funktionellen
Zelleigenschaften in Blut sowie in Milch jedoch herabgesetzt waren, handelte es sich
vermutlich um immundefiziente Tiere. Die aus Blut gewonnenen Daten unterschieden sich allerdings nicht signifikant (p ≥ 0,05) von denen der Gruppen A und B. Die
Aussagekraft der Funktionalitätsbestimmung von Blut-PMN blieb demnach darauf
beschränkt, den allgemeinen Gesundheits- und Abwehrstatus der Kuh zu beschreiben. Die häufig auftretende subklinische Erkrankung eines Euterviertels verursacht
keine signifikanten Änderungen der untersuchten Blutparameter.
HOEBEN (1999), der die Eutergesundheit anhand der Chemilumineszenz aus BlutPMN beurteilte, untersuchte lediglich den Zeitraum von 4 Tagen vor bis 9 Tagen
nach einer experimentellen Infektion und stellte Unterschiede in der Blutzellaktivität
fest. Die stichprobenartige Struktur der vorliegenden Studie ließ solche Beobachtungen nicht zu, da der Infektionsbeginn nicht bekannt war.
Die Milchparameter der Tiere, die auf einem bis drei Vierteln erkrankt waren, unterschieden sich von den Kühen, die auf allen vier Eutervierteln erkrankt waren. Dies
führt zu dem Schluss, dass auf funktioneller Ebene eine einfache Unterteilung der
Tiere in „gesund“ und „krank“ nicht ausreicht, den Eutergesundheitszustand zu beschreiben. Vielmehr stellen Entzündungsvorgänge ein komplexes System immunologischer Reaktionen dar, das genauerer Untersuchungen insbesondere des Übergangsbereiches zwischen gesund und krank bedarf.
183
Diskussion
5.4
Versuch 2: Verlaufsuntersuchung
5.4.1
Eutergesunde Tiere
5.4.1.1
Zellzahl im VAG
In den ersten drei Laktationswochen lagen die Zellzahlen in der Milch der drei eutergesunden Tiere über dem Niveau der übrigen Wochen. Der Wert von 100.000 Zellen / ml Milch, der als Grenzwert für die Gesundheit eines Euterviertels gilt (HAMANN
u. FEHLINGS 2002), wurde jedoch nur in der Standardabweichung von Woche W1
überschritten. Hohe Zellzahlen zu Beginn der Laktation wurden von anderen Autoren
festgestellt (REICHMUTH 1975; GRABOWSKI 2000) und sind in der Kolostralmilchphase physiologisch bedingt (GRABOWSKI et al. 2002).
5.4.1.2
Zelldifferentialbild in Milch
Der Anteil PMN in der Milchzellsuspension lag stets unter 40 %. Dies stimmte mit
den Angaben einiger Autoren überein (FOX et al. 1985; KURZHALS et al. 1985;
WEVER u. EMANUELSON 1989; SCHRÖDER 2003). Abgesehen von den Wochen
W2, W8 und W14 waren die Lymphozyten die dominierende Zellart, wie auch in den
Veröffentlichungen von DOSOGNE et al. (2003) und SCHRÖDER (2003) beschrieben. Das kurzfristige Überwiegen der PMN im Zelldifferentialbild (Wochen W2, W8
und W14) zeigt, dass in gesunden Vierteln trotz hohen Infektionsdrucks, z. B. im
Stall, bakterielle Erreger erfolgreich abgewehrt wurden. Zu beachten ist hierbei die
niedrige Stichprobenzahl von n = 8 oder 12.
5.4.1.3
Zellfunktionalität in Blut und Milch
Die Phagozytoseaktivität der Milch-PMN wies in den opsonisierten Proben (60 –
70 % phagozytierende PMN, log MFI: ca. 1,3) höhere Werte auf als in den nicht
opsonisierten Proben (ca. 50 %, log MFI: ca. 0,9). Korrespondierend zum Anteil PMN
im Differentialzellbild war die Phagozytoseaktivität in Woche W2 höher als in den üb-
184
Diskussion
rigen Wochen, ein weiterer Hinweis auf eine Auseinandersetzung mit Krankheitserregern. Ab Woche W9 war die Aktivität der Zellen in den Milchproben höher. Die
zugrunde liegende Immunsuppression in der Frühlaktation wurde auch in anderen
Untersuchungen festgestellt (BURVENICH et al. 1994; SHUSTER et al. 1996;
MEHRZAD 2002).
Wie schon in der Literatur beschrieben (DULIN et al. 1988; MEHRZAD et al. 2002),
war die CL-Aktivität der Blut-PMN deutlich höher als die der Milch-PMN. Der Peak in
Woche W2 stimmte mit den Beobachtungen der Zelldifferenzierung und der Phagozytoseaktivität überein und weist auf ein kurzfristiges Abwehrgeschehen hin. Da die
Werte ab Woche W8 in beiden Medien geringfügig höher lagen, konnte auch anhand
der CL-Aktivität die Immunsuppression post partum nachvollzogen werden. Allerdings waren die Unterschiede in der CL-Aktivität aus Blut und Milch zwischen Frühund Mittellaktation nicht so ausgeprägt wie von MEHRZAD (2002) beschrieben. Besonders hochleistende Kühen weisen metabolische Störungen wie Ketose oder Infektionskrankheiten in den ersten zwei Wochen post partum gehäuft auf. Diese stehen in Zusammenhang mit den metabolischen und hormonellen Veränderungen in
diesem Zeitraum, aber auch mit einer niedrigen Aktivität zirkulierender PMN (KLUCIŃSKI et al. 1988; NAGAHATA et al. 1988; KEHRLI et al. 1989; HOEBEN et al.
1997). Nach HOEBEN et al. (2000a) ist die Zellaktivität erst sechs Wochen post partum wieder vollständig regeneriert.
5.4.2
Tiere mit unspezifischer Mastitis oder Mastitis
5.4.2.1
Zellzahl im VAG
Die Viertel, die in den Wochen der Erkrankung (Wochen 1 bis 4) Zellzahlen über
100.000 Zellen / ml Milch hatten, konnten nach der allgemein anerkannten Definition
(HAMANN u. FEHLINGS 2002) als mastitiskrank eingestuft werden. Eines der drei
Tiere hatte in zwei Eutervierteln eine unspezifische Mastitis, die übrigen Kühe zeigten auf je einem Viertel Mastitis.
185
Diskussion
5.4.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Bereits in Woche 0 lag der Prozentsatz PMN in der Milchzellsuspension der kranken
Euterviertel höher als der der gesunden Viertel derselben Tiere. In den Wochen 1 bis
4 (Infektionsphase) lagen die PMN-Anteile der kranken zwischen 53 (Woche 1) und
68 % (Woche 4). Hohe PMN-Anteile sind ein charakteristisches Merkmal infizierter
Euterviertel (z. B. PAAPE et al. 1979; CONCHA 1986). Auch die Anteile PMN der
gesunden Viertel befanden sich in der Infektionsphase (43 – 58 %) oberhalb der in
Abschnitt 5.4.1.2 für gesunde Tiere ermittelten Grenze von 40 %. Dies deutet die
Abhängigkeit der Viertel eines Tieres voneinander an, deren Ursache in der Aktivierung des Immunsystems zu finden sein dürfte.
Eine positive Korrelation zwischen dem PMN-Anteil und der Zellzahl in Milch wurde
bereits belegt (PAAPE et al. 1979; KURZHALS et al. 1985; ÖSTENSSON et al.
1988; SCHRÖDER 2003). SCHRÖDER (2003) beschrieb mit Hilfe des Zelldifferentialbildes erstmals einen Einfluss kranker Euterviertel auf die nicht betroffenen gesunden Viertel desselben Tieres. Sie ermittelte mit 45 % PMN für gesunde und 61 %
PMN für kranke Euterviertel in der Milchzellsuspension Werte, in die sich die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung einfügten.
In Woche 5 waren die PMN-Anteile niedriger, blieben jedoch in den gesunden wie in
den kranken Vierteln über dem Niveau der Woche 0. Aus anderen Veröffentlichungen ist bekannt, dass der Prozentsatz PMN nach einer Infektion erhöht bleibt (CONCHA 1986; BURVENICH et al. 1995).
5.4.2.3
Zellfunktionalität in Blut und Milch
In Woche 0 (vor Beginn der Mastitis) lagen Prozentsatz aktiver Zellen und MFI der
kranken Viertel höher als die der gesunden Viertel. Die hohe Aktivität dieser Zellen
führte offensichtlich nicht zu einem verbesserten Infektionsschutz des Euterviertels,
sondern ist vielmehr Ausdruck eines schon vorhandenen entzündlichen Geschehens.
In den Wochen 1 bis 5 dagegen hatten die Milchzellsuspensionen aus gesunden
Vierteln, ähnlich wie in Versuch 1 (s. Abschnitt 5.3.2.3), stets höhere Anteile phago-
186
Diskussion
zytierender Zellen als diejenigen aus kranken Vierteln. Die MFI, die für die Zahl der
aufgenommenen Bakterien pro Zelle steht, war dennoch in den kranken Vierteln
durchgehend höher. Da Milch aus erkrankten Eutervierteln mehr phagozytosestimulierende Mediatoren enthält als Milch aus einem gesunden Viertel (JAIN u. LASMANIS 1978; GUIDRY et al. 1980; PAAPE et al. 1981a), ist davon auszugehen, dass
die PMN der kranken Viertel schon im Euter stärker stimuliert waren als die der gesunden Viertel, was eine höhere MFI zur Folge hatte. Es ist auch denkbar, dass in
vielen Zellen der kranken Viertel aufgrund der starken Stimulation über einen längeren Zeitraum der größte Teil ihrer Phagozytosekapazität oder ihrer Glykogenreserven
bereits vor der Messung erschöpft war, und sie deshalb keine Bakterien mehr aufnahmen. Da über die genauen Vorgänge der Aktivierung von Milchzellen bisher nur
wenig bekannt ist, liegen diesem Modell keine wissenschaftlichen Erklärungen
zugrunde.
Auch in Woche 5 (nach Abklingen der Mastitis) kehrten die Werte der Phagozytoseaktivität nicht auf das Niveau von Woche 0 zurück: Die MFI blieb für alle Viertel
leicht erhöht, der Anteil aktiver PMN war in den kranken Vierteln zwar höher als während der Infektionsphase (Wochen 1 bis 4), aber niedriger als in Woche 0. Korrespondierend mit dem PMN-Anteil blieb der Immunstatus nach Abklingen der Entzündung erhöht.
Besonders die nicht betroffenen Viertel hatten während der Krankheitsphase höhere
Prozentsätze aktiver Zellen (Proben n: 55 – 65 %, Proben o: ca. 75 %) als die Viertel
der gesunden Tiere (Proben n: ca. 50 %, Proben o: 60 – 70 %, s. Abschnitt 5.4.1.3).
Die CL-Aktivität / 1 Mio. PMN aus Blut war stets größer als die aus Milch, wobei die
kranken Viertel wiederum höhere Werte aufwiesen als die gesunden. Dies stimmt mit
den Ergebnissen anderer Untersucher überein (DULIN et al. 1988; MEHRZAD 2002).
Die betroffenen Viertel erzeugten in der Infektionsphase CL-Aktivitäten über 4.000
Einheiten / 1 Mio. PMN. Im Gegensatz zur Zelldifferenzierung und zur Phagozytosebestimmung fiel die CL-Aktivität in Woche 5 auf ihre Ausgangswerte zurück.
Die CL-Aktivität / ml Milch der kranken Viertel lag in jeder Woche etwa um das Zehnfache höher als die der gesunden Viertel. Dem Peak in Woche 4 folgte in gesunden
187
Diskussion
wie in kranken Vierteln ein drastisches Absinken der Werte in Woche 5. Diese Ergebnisse deuten eine Abhängigkeit gesunder und kranker Viertel voneinander an.
Genauere Untersuchungen könnten die Festlegung eines Grenzwertes zwischen
gesunden und kranken Eutervierteln ermöglichen.
5.4.3
Zusammenfassende Beurteilung
Mit diesem Versuch wurden die Zellzahl und die Parameter des Zelldifferentialbildes
sowie der Zellfunktionalität von gesunden und erkrankten Tieren in den ersten drei
Laktationsmonaten dokumentiert. Die Werte erkrankter Tiere wurden dabei mit denen der gesunden verglichen. Es wurde jedoch nicht der Anspruch erhoben, anhand
der Daten gesunder und kranker Tiere Referenzwerte für die Parameter der Zelldifferenzierung, der Phagozytose- oder der CL-Aktivität zu bilden.
Neben einer konstanten Zellzahl und einem von Lymphozyten dominierten Zelldifferentialbild in Milch ließen sich in der Gruppe der gesunden Tiere steigende Tendenzen in der Phagozytose- und der CL-Aktivität beschreiben. Diese liegen in einer Immunsuppression zu Beginn der Laktation begründet, die auch von anderen Autoren
beobachtet wurde (KEHRLI et al. 1989; HOEBEN et al. 2000a; VANGROENWEGHE
et al. 2001; MEHRZAD 2002) und zur höheren Empfänglichkeit für Mastitiden beiträgt (z. B. EBERHART et al. 1979).
Die drei an Mastitis erkrankten Tiere wiesen nur in den betroffenen Eutervierteln erhöhte Zellzahlen auf. Die Veränderungen der Zelldifferentialbilder und der funktionellen Eigenschaften der PMN erstreckten sich jedoch auch auf die nicht betroffenen
Viertel. Der Anteil PMN im Zelldifferentialbild war sowohl in den kranken als auch in
den gesunden Vierteln kranker Tiere höher als in den gesunden Tieren, gleiches galt
für die MFI der Phagozytosemessung. Die CL-Aktivität war gegenüber den nicht erkrankten Tieren lediglich in den kranken Vierteln deutlich erhöht. Alle untersuchten
Parameter ließen bereits in Woche 0 Unterschiede zwischen gesunden und kranken
Vierteln erkennen. Der Anteil PMN und die Phagozytoseaktivität blieben auch nach
Abklingen der Mastitis in Woche 5 im Vergleich zu Woche 0 verändert, bestehen
blieb auch der Unterschied zwischen den gesunden und den kranken Vierteln.
188
Diskussion
5.5
Versuch 3: Beurteilung der Eutergesundheit anhand von Kriterien der Zellfunktionalität auf Tierebene
5.5.1
Mehrfach untersuchte Tiere
Da die Werte der selektierten Parameter der Eutergesundheit für jedes Euterviertel
zwischen den drei Tagen nicht variierten, konnten die Parameter der Zelldifferenzierung und der Zellfunktionalität unter der Annahme eines gleichbleibenden Eutergesundheitszustandes von Tag zu Tag verglichen werden. Die durchgeführten Varianzanalysen zeigten außer für den Anteil Makrophagen im Zelldifferentialbild Milch keine
signifikanten Unterschiede zwischen den Tagen. Die Anteile PMN und Lymphozyten
im Differentialzellbild blieben konstant, sodass die Varianz im Prozentsatz
Makrophagen vernachlässigt werden konnte. Daher ließ sich eine gute Wiederholbarkeit der aus der Zelldifferenzierung und der Zellfunktionalität erfassten Parameter
belegen.
MEHRZAD (2002) ermittelte für die CL-Aktivitätsbestimmung Variationskoeffizienten
zwischen 2,6 und 3,5 % aus Blutzellen sowie von 5,2 bis 11,5 % aus Milchzellsuspensionen, sodass auch in dieser Untersuchung eine gute Reproduzierbarkeit angenommen werden konnte.
5.5.2
Gruppen auf Basis der Zellzahl
5.5.2.1
Blutproben
5.5.2.1.1
Vollblutuntersuchungen
PMN und Lymphozyten stellen in der Regel gemeinsam über 90 % der Leukozyten
im Blut (BICKHARDT 1992). Ihre Anteile im Zelldifferentialbild korrelierten daher
stark (k = -0,83).
189
Diskussion
Die Leukozytenzahl und das Zelldifferentialbild aus Blut bewegten sich in allen drei
Gruppen innerhalb der jeweiligen physiologischen Bereiche (KRAFT u. DÜRR 1997),
daher konnten alle Tiere als allgemeingesund eingeordnet werden.
5.5.2.1.2
Zellfunktionalität in Blut
Log Max und die CL-Einheiten / 1 Mio. PMN aus Blut korrelierten miteinander
(k = 0,79), sodass von einem ähnlichen Kurvenverlauf in allen Proben ausgegangen
werden konnte (s. Abschnitt 5.3.1.2).
Die CL-Aktivität im Blut wies keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei
Gruppen auf und bestätigte daher die Annahme, dass es sich in allen Gruppen um
allgemeingesunde Tiere handelte. Die Gruppe T2 hatte jedoch mit 8.431 Einheiten /
1 Mio. PMN die niedrigste CL-Aktivität.
5.5.2.2
Milchproben
5.5.2.2.1
Eutergesundheit
Der Korrelationskoeffizient zwischen der elektrischen Leitfähigkeit in Milch und dem
SCC im VAG von 0,34 entsprach etwa der von GRABOWSKI (2000) ermittelten Korrelation von k = 0,30. Die Korrelationen zwischen NAGase VAG und VGH sowie dem
Zellgehalt in Milch von k = 0,50 und 0,53 stimmten ebenfalls mit dem von GRABOWSKI (2000) angegebenen Korrelationskoeffizient von 0,42 überein.
Die Gruppen wurden wie beschrieben auf Tierebene gebildet (s. Abbildung 20). Anhand dieser Parameter konnten die Tiere der Gruppe T1 als eutergesund betrachtet
werden (s. Tabelle 81). In den Gruppen T2 und T3 war lediglich die Zellzahl der
Gruppe T3 mit ca. 234.000 Zellen / ml Milch (log 5,37) erhöht (HAMANN u. FEHLINGS 2002). Dies beruht auf der Struktur dieser Gruppen, die sich aus Vierteln mit
hohen Zellzahlen und Vierteln mit niedrigen Zellzahlen gleichermaßen zusammensetzten. Gemäß ihrer Definition waren jedoch in den Gruppen T2 und T3 die Tiere
vertreten, die in mindestens einem Euterviertel eine Zellzahl von 100.000 – 400.000
190
Diskussion
Zellen / ml Milch (T2) bzw. über 400.000 Zellen / ml Milch (T3) enthielten. Die Tiere
der Gruppen T2 und T3 wurden daher als euterkrank bezeichnet.
Tabelle 81: Beurteilung der Eutergesundheit der Tiere in den Gruppen T1, T2 und
T3 anhand der Parameter SCC, elektrische Leitfähigkeit sowie NAGase
Parameter
Referenzbereich*
Gruppe T1
Gruppe T2
Gruppe T3
SCC in Zellen / ml
VAG
≤ 100.000
≤ log 5,00
ca. 23.400
log 4,37
ca. 76.000
log 4,88
ca. 234.000
log 5,37
elektr. Leitfähigkeit
in mS / cm
4,8 – 6,2
5,75
5,89
6,02
log NAGase in
nmol x min-1 x ml-1
0,22 – 0,50
0,22 (VAG)
0,18 (VGH)
0,37 (VAG)
0,36 (VGH)
0,48 (VAG)
0,41 (VGH)
eutergesund
euterkrank**
euterkrank**
Beurteilung
*: Referenzwerte für SCC und elektr. Leitfähigkeit nach HAMANN u. FEHLINGS (2002), für NAGase
nach GRABOWSKI (2000)
**: Begründung für diese Beurteilung s. Text
5.5.2.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Die Zellzahl in Milch korrelierte mit dem Anteil PMN in der Milchzellsuspension
(k = 0,63). Auf den Zusammenhang zwischen diesen beiden Parametern wurde bereits mehrfach hingewiesen (z. B. PAAPE et al. 1981a; KURZHALS et al. 1985;
SCHRÖDER 2003; s. auch Abschnitt 5.3.2.2).
Die Verteilung der Zellen in Gruppe T1 von 28,9 % PMN, 22,3 % Lymphozyten und
45,5 % Makrophagen entsprach den Angaben einiger anderer Autoren bezüglich der
Zelldifferenzierung gesunder Euterviertel (FOX et al. 1985; WEVER u. EMANUELSON 1989).
Die PMN-Anteile stiegen in den Gruppen T2 und T3 auf 53,2 bzw. 72,3 % an und
bildeten die größte Zellfraktion. In den Literaturangaben liegen die PMN-Anteile in
Milch gesunder Viertel stets unter 40 %, wobei entweder Makrophagen (z. B. WEVER u. EMANUELSON 1989; ÖSTENSSON 1993) oder Lymphozyten (DOSOGNE
191
Diskussion
et al. 2003; SCHRÖDER 2003) die dominierende Zellart darstellen. Die vorliegenden
Zelldifferentialbilder der Gruppen T2 und T3 bestätigten damit das anhand des Zellzahlbefundes ermittelte Entzündungsgeschehen. Besondere Aufmerksamkeit verdient diese Beobachtung im Hinblick auf die bereits beschriebene Struktur der Gruppen, die Viertel mit unterschiedlichen Zellzahlen enthielten. Dies gilt als Hinweis auf
die Abhängigkeit der gesunden Viertel kranker Tiere von den erkrankten Vierteln und
ließ den hochsignifikanten Unterschied (p < 0,001) zwischen den Gruppen T2 und T3
besonders auffällig erscheinen.
5.5.2.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Auch die Parameter der CL-Aktivität M wiesen Korrelationen zur Zellzahl auf, wobei
vor allem die CL-Aktivität / ml Milch (k = 0,89) stark von der Zellzahl abhängig war.
Die Gründe dafür wurden bereits in Abschnitt 5.3.2.3 erläutert. Ebenso zeigten die
Parameter der CL-Aktivität aus Milch untereinander und zum Anteil PMN erwartungsgemäß überwiegend deutliche Korrelationen.
Während die CL-Aktivität / 1 Mio. PMN in den Gruppen T1 und T2 etwa gleiche Werte hatte und lediglich in Gruppe T3 deutlich höher lag, stieg die CL-Aktivität / ml Milch
kontinuierlich an. Die Angaben aus der Literatur bestätigen einen Zusammenhang
zwischen der Zellzahl in Milch und der CL-Aktivität (LILIUS und PESONEN 1990),
der für den Parameter CL-Aktivität / ml Milch trotz der Selektion auf Tierebene nachvollzogen werden konnte. Für die Gruppe T3 deutete sich an, dass die CL-Aktivität
der Tiere sowohl in Blut als auch in Milch insgesamt auf einem höheren Niveau lag
als die der anderen Gruppen, was auf eine Aktivierung des gesamten Immunsystems
schließen lässt. Die Ergebnisse der Zelldifferenzierung und der Zellzahlbestimmung
aus Milch fügten sich in dieses Bild ein. Für die in Gruppe T2 durchgehend niedrigeren funktionellen Zelleigenschaften von Blut und Milch finden sich mehrere denkbare
Gründe. Entweder war das Abwehrpotential dieser Tiere aufgrund individueller Unterschiede geringer oder es lagen chronische Infektionen vor, gegen die vor allem
lymphozytäre Abwehrsysteme und nicht PMN aktiviert werden (KRAFT u. DÜRR
1997).
192
Diskussion
5.5.2.3
Folgerungen
Anhand der für die Gruppenbildung vorgegebenen Zellzahlen (s. Abschnitte 3.9.5.2
und 4.5.2) konnten die Tiere der Gruppe T1 als eutergesund, die der Gruppen T2
und T3 als euterkrank eingestuft werden. Die Parameter WBC und PMN-Anteil aus
Blut sowie elektrische Leitfähigkeit und NAGase aus Milch wiesen in allen drei Gruppen Werte innerhalb ihrer Referenzbereiche auf. Die Ergebnisse der Zelldifferenzierung und der CL-Aktivität aus Milch zeigten jedoch deutliche Unterschiede zwischen
den Gruppen. Trotz der Selektion auf Tierebene konnte anhand der letztgenannten
Parameter in den Gruppen T2 und T3 auf ein Entzündungsgeschehen geschlossen
werden. Allerdings wurde auch deutlich, dass eine Aufteilung dieser Gruppen in Viertel mit hoher und solche mit niedriger Zellzahl zur genauen Beschreibung der Eutergesundheit nötig ist.
5.5.3
Euterkranke Tiere
5.5.3.1
Blutproben
Wie schon in Abschnitt 5.5.2.1 festgestellt, lag die CL-Aktivität aus Blut der Gruppe
T2 (hier: T2/100-400) unter der von Gruppe T3 (hier: T3/100-400 und T3/>400). Deshalb
ließ sich eine stärkere Abwehraktivität in Gruppe T3 vermuten.
5.5.3.2
Milchproben
5.5.3.2.1
Eutergesundheit
Wie anhand ihrer Selektion auf Basis der Zellzahl (s. Abschnitt 4.5.3.2) zu erwarten,
überschritten die beiden Gruppen T1/<25 und T2&3/<25 für die Parameter elektrische
Leitfähigkeit, SCC im VAG und NAGase die jeweiligen Grenzwerte nicht und wiesen
nur eine signifikant höhere NAGase-Aktivität im VGH der Gruppe T2&3/<25 auf (s.
Tabelle 82, p < 0,01). Für den Parameter NAGase wurde ein derartiger Anstieg
schon von SCHÜTTEL (1999) beschrieben. Die Viertel beider Gruppen konnten daher als eutergesund bezeichnet werden.
193
Diskussion
Gemäß ihrer Definition (s. Abschnitt 4.5.3.1 & Abbildung 20) befanden sich die Zellzahlen im VAG der Gruppen T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400 im entzündlichen
Bereich über 100.000 Zellen / ml Milch (HAMANN u. FEHLINGS 2002, s. Tabelle
82). Der physiologische Bereich für die NAGase-Aktivität wurde nur in der Gruppe
T3/>400 (log 0,62 in VAG und log 0,55 in VGH) überschritten, bezüglich der elektrischen Leitfähigkeit erreichten die Gruppen T3/100–400 und T3/>400 mit 6,2 mS / cm
(log 0,79) den Grenzwert. Anhand dieser Parameter konnte demnach bereits ein Unterschied im Grad der Entzündung zwischen den Gruppen festgestellt werden, obwohl die Zellzahlen aller Viertel im Bereich krankhafter Veränderungen lagen.
Tabelle 82: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen T1/<25,
T2&3/<25, T2&3/>100, T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400 anhand der
Parameter SCC, elektrische Leitfähigkeit sowie NAGase
Parameter
Referenzbereich*
T1/<25
T2&3/<25
T2&3/>100
SCC in Zellen / ml
VAG
≤ 100.000
≤ log 5,00
ca. 13.000
log 4,12
ca. 14.000
log 4,15
ca. 330.000
log 5,52
elektr. Leitfähigkeit
in mS / cm
4,8 – 6,2
5,62
5,50
6,17
log NAGase in
nmol x min-1 x ml-1
0,22 – 0,50
0,13 (VAG)
0,08 (VGH)
0,20 (VAG)
0,22 (VGH)
0,51 (VAG)
0,49 (VGH)
gesund
gesund
krank
Beurteilung
Parameter
Referenzbereich*
T2/100–400
T3/100–400
T3/>400
SCC in Zellen / ml
VAG
≤ 100.000
≤ log 5,00
ca. 195.000
log 5,29
ca. 195.000
log 5,29
ca. 800.000
log 5,91
elektr. Leitfähigkeit
in mS / cm
4,8 – 6,2
6,03
6,17
6,17
log NAGase in
nmol x min-1 x ml-1
0,22 – 0,50
0,47 (VAG)
0,49 (VGH)
0,42 (VAG)
0,40 (VGH)
0,62 (VAG)
0,55 (VGH)
krank
krank
krank
Beurteilung
*: Referenzwerte für SCC und elektr. Leitfähigkeit nach HAMANN u. FEHLINGS (2002), für NAGase
nach GRABOWSKI (2000)
194
Diskussion
5.5.3.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Der Anteil PMN in Milch wies in Gruppe T2&3/<25 (38,4 %) signifikant höhere Werte
(p < 0,001) auf als in Gruppe T1/<25 (22,2 %). Dieses als Reaktion der gesunden Euterviertel auf die Erkrankung benachbarter Viertel zu betrachtende Phänomen wurde
bereits von SCHRÖDER (2003) beschrieben. Die Erkrankung einzelner Euterviertel
sorgt für eine Ausschüttung von PMN aus dem marginalen Pool ins Blut, von dem
aus diese dann vermehrt ins Euter gelangen (BURVENICH et al. 1994). Korrespondierend zu den Angaben von SCHRÖDER (2003) war der Unterschied im Anteil
PMN in der Milchzellsuspension zwischen den gesunden (T2&3/<25) und den kranken Eutervierteln erkrankter Tiere (T2&3/>100) hochsignifikant (p < 0,001). Systemische Einflüsse spielten hier jedoch keine Rolle, die lokale Immunitätslage schien in
den erkrankten Vierteln für einen vermehrten Zustrom von PMN verantwortlich zu
sein.
In den Gruppen T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400 stieg der Anteil PMN in der Milchzellsuspension von Gruppe zu Gruppe an. In der einzigen bisher zu diesem Thema
durchgeführten Untersuchung (SCHRÖDER 2003) konnte ebenfalls ein Anstieg des
Prozentsatzes PMN von Vierteln mit 100.000 – 400.000 Zellen / ml Milch zu Vierteln
mit über 400.000 Zellen / ml Milch festgestellt werden. In der vorliegenden Arbeit war
der Anteil PMN in der Milchzellsuspension in Gruppe T3/100–400 (72,5 %) höher als in
Gruppe T2/100–400 (62,1 %), obwohl beide Gruppen gleiche Zellzahlen hatten. Der
Unterschied zwischen den Gruppen T3/100–400 und T3/>400 war nicht signifikant
(p ≥ 0,05), was auf eine gegenseitige Beeinflussung der Viertel eines Tieres schließen lässt.
5.5.3.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Im Widerspruch zum Zelldifferentialbild war die CL-Aktivität M in Gruppe T2&3/<25
(2.595 Einheiten / 1 Mio. PMN) signifikant niedriger (p < 0,05) als in Gruppe T1/<25
(4.780 Einheiten / 1 Mio. PMN). Welche Aktivierungsvorgänge oder stimulierende
Mediatoren dabei eine Rolle spielen, blieb unklar. Die CL-Aktivität / ml Milch dagegen
war in dieser Gruppe nur geringfügig niedriger. Wenn dieser Parameter den Schutz
195
Diskussion
des Euters vor Infektionen ausdrückt, so stand eindringenden Krankheitserregern in
beiden Gruppen das gleiche Abwehrpotential gegenüber.
Die Unterschiede zwischen den Gruppen T2&3/<25 und T2&3/>100 in der CL-Aktivität
aus Milch waren im Hinblick auf die Tatsache, dass die Milchproben beider Gruppen
denselben Tieren entstammten, besonders auffällig. Dies ist dahingehend einzuordnen, dass in Milch aus erkrankten Eutervierteln wesentlich mehr Mediatoren vorhanden sind als in Milch aus gesunden Vierteln (JAIN u. LASMANIS 1978; GUIDRY et
al. 1980; PAAPE et al. 1981a; RIOLLET et al. 2000). Die PMN aus Gruppe
T2&3/>100 erfuhren dadurch offensichtlich eine dramatisch stärkere Stimulation als
die aus Gruppe T2&3/<25. Die Diskrepanz zwischen dem vermehrten PMN-Einstrom
in die nicht betroffenen Euterviertel und der ausbleibenden Stimulation dieser Zellen
gehört zu den Phänomenen, die in zukünftigen Untersuchungen geklärt werden
müssen.
Die CL-Aktivität aus Milch in Gruppe T2/100–400 (6.865 Einheiten / 1 Mio. PMN) lag
signifikant niedriger als in den Gruppen T3/100–400 und T3/>400 (p < 0,01). Sowohl
die höhere Zellzahl als auch der größere PMN-Anteil in Gruppe T3 waren Hinweise
auf eine stärkere Aktivierung des Immunsystems der Tiere dieser Gruppe. Untersuchungen dieser Art zur Zellfunktionalität sind bisher nicht veröffentlicht worden.
5.5.3.3
Folgerungen
Die Viertel der Gruppen T1/<25 und T2&3/<25 waren eutergesund (s. Abschnitt
5.5.3.2). Dennoch war der Anteil PMN in Milch der Gruppe T2&3/<25 signifikant höher
(p < 0,001) und die CL-Aktivität dieser Gruppe signifikant niedriger (p < 0,05) als in
Gruppe T1/<25. Der hohe Prozentsatz PMN ist auf die Abhängigkeit der gesunden
von den kranken Eutervierteln eines Tieres zurückzuführen, die niedrige CL-Aktivität
wurde bisher weder beschrieben noch begründet. Im Rahmen zukünftiger Forschungsvorhaben könnte der Einfluss der in Milch enthaltenen Mediatoren auf funktionelle Zelleigenschaften untersucht werden.
Als euterkrank eingestuft wurden die Viertel der Gruppen T2/100–400, T3/100–400,
T3/>400 sowie T2&3/>100. Der Vergleich der erkrankten Euterviertel zwischen den
196
Diskussion
Gruppen T2 und T3 ließ Unterschiede in den Parametern der Zelldifferenzierung und
der CL-Aktivität erkennen. Hier war, unabhängig vom Zellzahlbefund, die Zellaktivität
in Blut und Milch der Tiere aus Gruppe T3 durchgehend höher als die aus Gruppe
T2. Der Unterschied in der CL-Aktivität zwischen den Gruppen T2 und T3 im Blut
zeigte, dass das gesamte Immunsystem des Tieres aktiviert wurde, was sich wiederum in der höheren CL-Aktivität in den Milch-PMN der Gruppe T3/100–400 verglichen
mit Gruppe T2/100–400 äußerte. Dies ist als Ausdruck dafür zu bewerten, dass über
einen systemischen Einfluss die Zellaktivitäten aller Euterviertel voneinander abhängig sind. Weiterhin schien sich abzuzeichnen, dass erkrankte Euterviertel CLAktivitäten über 6.000 Einheiten / 1 Mio. PMN aufwiesen.
Die großen Unterschiede zwischen gesunden und kranken Vierteln derselben Tiere
(Gruppe T2&3/<25 bzw. T2&3/>100) hinsichtlich des Zelldifferentialbildes und der Zellfunktionalität in Milch lagen vermutlich in einem stark unterschiedlichen Vorkommen
von Mediatoren wie Immunglobulinen und der Komplementkomponente C3b in der
Milch begründet (CRAVEN u. WILLIAMS 1985; MILLER et al. 1988), die die PMN
zunächst anlocken und dann aktivieren. Die Zellen der Gruppe T2&3/>100 erfuhren
dadurch bereits im Euter eine Vorstimulation. Die niedrigen Werte der gesunden
Viertel dieser Tiere ließen sich dadurch jedoch nicht endgültig erklären, da das Wissen über die Immunabwehr des Euters noch zu gering ist.
5.5.4
Bakteriologischer Status und Zellfunktionalität
5.5.4.1
Blutproben
5.5.4.1.1
Vollblutuntersuchungen
Der Grenzwert von 10 Mio. Leukozyten / ml Blut (WBC) wurde in keiner der Gruppen,
der des Anteils PMN in Blut von 50 % nur in Gruppe Kat3 (54,5 %) überschritten
(KRAFT u. DÜRR 1997). Die Tiere der Gruppen Kat1, Kat2 und Kat4 konnten daher
als allgemeingesund bezeichnet werden, während die Allgemeingesundheit in Gruppe Kat3 in Frage gestellt werden musste.
197
Diskussion
5.5.4.1.2
Zellfunktionalität in Blut
Die CL-Aktivität B lag in Gruppe Kat3 signifikant niedriger als in allen anderen Gruppen (p < 0,05). Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass im Blut vermehrt
stabkernige PMN zirkulierten, die ein geringeres Potential zur Bildung von Sauerstoffradikalen besitzen (GLASSER u. FIEDERLEIN 1987).
5.5.4.2
Milchproben
5.5.4.2.1
Eutergesundheit
Unter Berücksichtigung der bakteriologischen Untersuchung waren die Tiere der
Gruppe Kat1 nach der allgemein anerkannten Kategorisierung (HAMANN u. FEHLINGS 2002) eutergesund und die der Gruppe Kat2 latent infiziert (s. Abschnitt 4.5.4,
Abbildung 21).
Den Maßstäben für die Gruppenzuordnung entsprechend hatten die Tiere der Gruppe Kat3 eine unspezifische Mastitis, die Tiere der Gruppe Kat4 eine Mastitis (s. Tabelle 83). Die Abweichung der mittleren Zellzahlen von den genannten Angaben erklärt sich dadurch, dass meist nur ein Viertel eines Tieres erkrankt war, die Gruppenbildung aber auf Tierebene vorgenommen worden war.
198
Diskussion
Tabelle 83: Beurteilung der Eutergesundheit der Tiere in den Gruppen Kat1 bis
Kat4 anhand der Parameter SCC, elektrische Leitfähigkeit, NAGase
sowie Bakteriologie
Parameter
Referenzbereich*
Kat1
Kat2
SCC in Zellen /
ml VAG
≤ 100.000
≤ log 5,00
ca. 23.500
log 4,37
ca. 24.000
log 4,38
elektr. Leitfähigkeit in mS / cm
4,8 – 6,2
5,62
5,89
log NAGase in
nmol x min-1 x
ml-1
0,22 – 0,50
Kat3
Kat4
ca. 71.000 ca. 180.000
log 4,85
log 5,26
5,89
6,03
0,22 (VAG) 0,26 (VAG) 0,43 (VAG) 0,43 (VAG)
0,17 (VGH) 0,22 (VGH) 0,53 (VGH) 0,37 (VGH)
Bakteriologie
negativ
positiv
negativ
positiv
Beurteilung
normale
Sekretion
latent infiziert**
unspez.
Mastitis**
Mastitis
*: Referenzwerte für SCC und elektr. Leitfähigkeit nach HAMANN u. FEHLINGS (2002), für NAGase
nach GRABOWSKI (2000)
**: Begründung für diese Beurteilung s. Text
5.5.4.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Die Gruppen Kat1 und Kat2 wiesen bezüglich des Anteils PMN in Milch mit 28,7 bzw.
32,6 % Werte auf, deren Zuordnung zu gesunden Eutervierteln in der Literatur Bestätigung findet (z. B. KURZHALS et al. 1985; FOX et al. 1985; DOSOGNE et al. 2003;
SCHRÖDER 2003).
Da die PMN mit 54,9 bzw. 66,2 % die dominierende Zellart in den Milchzellsuspensionen der Gruppen Kat3 und Kat4 waren, wurden die Tiere anhand dieses Parameters ebenfalls als nicht gesund eingestuft. Auch hier war der Anteil PMN offensichtlich sowohl in den erkrankten als auch in den nicht betroffenen Eutervierteln höher
als in den Tieren der Gruppen Kat1 und Kat2, wobei für die Verteilung der Zellarten
die Höhe des SCC, aber nicht die Anwesenheit von Bakterien entscheidend war.
199
Diskussion
5.5.4.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Anders als in den übrigen Parametern unterschieden sich die Vitalität sowie die CLAktivität zwischen den Gruppen Kat3 und Kat4 signifikant voneinander (p < 0,05). Die
CL-Aktivität der Gruppe Kat3 lag mit 5.016 Einheiten / 1 Mio. PMN etwa so hoch wie
die der Gruppen Kat1 und Kat2. So ließ sich für die funktionellen Zelleigenschaften
lediglich in Gruppe Kat4 ein Einfluss erkrankter Euterviertel auf die gesunden Viertel
sicher feststellen.
Sofern die CL-Aktivität / ml Milch als Ausdruck eines Infektionsschutzes betrachtet
werden kann, war die Abwehr in den Tieren der Gruppe Kat3 mit log 1,95 signifikant
höher (p < 0,001) als in den Gruppen Kat1 (log 1,03) und Kat2 (log 1,25).
5.5.4.3
Differenzierte Auswertung gesunder und kranker Viertel der Tiere mit
Mastitis (Gruppen Kat4/<100 und Kat4/>100)
5.5.4.3.1
Blutproben
Wie schon in Abschnitt 5.5.4.1.1 festgestellt, lag die Leukozytenzahl der Gruppe Kat4
signifikant höher als in Gruppe Kat1, jedoch innerhalb des Referenzbereiches. Die
Tiere beider Gruppen waren allgemeingesund.
5.5.4.3.2
Milchproben
5.5.4.3.2.1
Eutergesundheit
Obwohl sich die Zellzahlen in Milch der Gruppen Kat1 (gesunde Tiere) und Kat4/<100
(gesunde Viertel kranker Tiere) signifikant voneinander unterschieden (p < 0,01),
stimmten die Werte der Entzündungsparameter elektrische Leitfähigkeit, NAGase
VAG und VGH miteinander überein. Die Viertel dieser Gruppen konnten als eutergesund bezeichnet werden (s. Tabelle 83 und 84). Die Viertel der Gruppe Kat4/>100
(kranke Viertel) wurden anhand des zytobakteriologischen Befundes als mastitiskrank eingestuft.
200
Diskussion
Tabelle 84: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen Kat4/<100
und Kat4/>100 anhand der Parameter SCC, elektrische Leitfähigkeit,
NAGase sowie Bakteriologie
Parameter
Referenzbereich*
Kat4/<100
Kat4/>100
SCC in Zellen / ml
VAG
≤ 100.000
≤ log 5,00
ca. 36.000
log 4,56
ca. 370.000
log 5,57
elektr. Leitfähigkeit
in mS / cm
4,8 – 6,2
5,62
6,17
log NAGase in
nmol x min-1 x ml-1
0,22 – 0,50
0,15 (VAG)
0,13 (VGH)
0,49 (VAG)
0,42 (VGH)
Bakteriologie
negativ
positiv
Beurteilung
normale Sekretion
Mastitis**
*: Referenzwerte für SCC und elektr. Leitfähigkeit nach HAMANN u. FEHLINGS (2002), für NAGase
nach GRABOWSKI (2000)
**: Begründung für diese Beurteilung s. Text
5.5.4.3.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
Wie in Abschnitt 5.5.3.2.2 variierte auch das Zelldifferentialbild zwischen den Vierteln
gesunder Tiere (Kat1) und den gesunden Vierteln kranker Tiere (Kat4/<100) deutlich.
Im Gegensatz zu Gruppe Kat1 (28,7 %) waren die PMN in Gruppe Kat4/<100
(49,2 %) die dominierende Zellart. In Gruppe Kat4/>100 lag der Prozentsatz PMN mit
72,4 % in einem Bereich, der auch an anderer Stelle als Ausdruck einer Entzündungsreaktion bewertet wurde (SCHRÖDER 2003). Die Abhängigkeit der Euterviertel
eines Tieres voneinander wurde dadurch unterstrichen.
5.5.4.3.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Analog zum Zelldifferentialbild lag die CL-Aktivität der Gruppe Kat4/<100 höher als die
aus Gruppe Kat1, aber unter der der Gruppe Kat4/>100. Die Vitalität der beiden
Gruppen aus Kat4 war jedoch identisch. Daraus lässt sich schließen, dass die Tiere
der Gruppen Kat1 und Kat4 ein grundsätzlich unterschiedliches Zellaktivitätsniveau
besaßen, und dass die PMN im Euterviertel je nach spezifischem Gesundheitszu-
201
Diskussion
stand eine weitere Aktivierung erfuhren. Konkrete Daten zu dieser Thematik sind aus
keiner Veröffentlichung bekannt.
5.5.4.4
Folgerungen
Die Parameter der Zelldifferenzierung und der Zellfunktionalität wurden im Zusammenhang mit der zytobakteriologischen Kategorisierung der Eutergesundheit untersucht (HAMANN u. FEHLINGS 2002).
Dabei wurde festgestellt, dass sich das Zelldifferentialbild hauptsächlich in Abhängigkeit von der Zellzahl ändert, während bezüglich der CL-Aktivität die Zellzahl sowie
der bakteriologische Status eine Rolle zu spielen scheinen.
Der Vergleich gesunder Viertel kranker Tiere (Kat4/<100) mit den Vierteln eutergesunder Tiere (Kat1) zeigte, dass Viertel aus Gruppe Kat4, die anhand der zytobakteriologischen Untersuchung normale Sekretion aufwiesen (HAMANN u. FEHLINGS
2002), sich im Zelldifferentialbild ebenso wie in der CL-Aktivität signifikant von gesunden Tieren unterschieden, und bestätigte damit die Beobachtungen aus Abschnitt
5.5.3, dass sich die Viertel eines Tieres gegenseitig beeinflussen. Auch der Unterschied zwischen den gesunden und den kranken Vierteln erkrankter Tiere konnte
wiederholt dargestellt werden. Im Widerspruch zu den hier vorliegenden Daten wurde
in Abschnitt 5.5.3.2.2.3 für die gesunden Viertel kranker Tiere eine wesentlich niedrigere CL-Aktivität festgestellt als für die Viertel gesunder Tiere, wobei die Zellzahlen
in beiden Gruppen jedoch im Bereich unter 25.000 Zellen / ml Milch lagen. Der in
diesem Zellzahlbereich scheinbar bessere Gesundheitszustand als der Bereich bis
100.000 Zellen / ml Milch bietet Anlass, den Grenzwert von 100.000 Zellen / ml Milch
zwischen gesund und krank zu überprüfen.
5.5.5
Zusammenfassende Beurteilung
Im Rahmen einer Beurteilung der Eutergesundheit auf Tierebene wurde mit zunehmender Reduktion der Eutergesundheit ein Anstieg des PMN-Anteils und der CLAktivität in den Milchzellsuspensionen festgestellt. Die niedrige CL-Aktivität im Blut
202
Diskussion
der Tiere von Gruppe T2 deutete auf eine schlechtere Abwehrlage dieser Tiere hin,
obwohl die Prozentsätze PMN der Gruppen T2 und T3 gleich waren.
Die Auswertung der Daten aus den Gruppen T2 und T3 ließ eine Abhängigkeit der
Euterviertel eines Tieres voneinander erkennen. Im Zelldifferentialbild und in der Zellfunktionalität von Milch unterschieden sich die gesunden Viertel kranker Tiere deutlich von den Vierteln gesunder Tiere. Während der höhere PMN-Anteil in Milch in
Gruppe T2&3/<25 den Erwartungen entsprach, konnte die Ursache für die niedrige
CL-Aktivität in dieser Gruppe nicht abschließend geklärt werden. Vermutlich spielen
Entzündungsmediatoren in der Milch dabei eine Rolle.
Der Vergleich der erkrankten Euterviertel aus den Gruppen T2 und T3 zeigte in
Gruppe T3 sowohl höhere Anteile PMN im Zelldifferentialbild als auch höhere Zellaktivitäten. Trotz unterschiedlicher Zellzahlen lagen die PMN-Anteile der Milchzellsuspensionen sowie die Zellaktivität in Milch der erkrankten Euterviertel aus Gruppe T3
(T3/100–400 und T3/>400) auf gleichem Niveau, während die Werte in Gruppe T2/100–
400
signifikant darunter lagen (p < 0,01). Offensichtlich erstreckt sich die Aktivierung
der Immunabwehr auf das ganze Tier und nicht nur auf das einzelne Euterviertel. Die
Veränderungen der untersuchten Parameter in den gesunden Vierteln euterkranker
Tiere (T2&3/<25) sowie in den kranken Eutervierteln (T2&3/>100) im Vergleich zu den
Vierteln eutergesunder Tiere (T1) sind in Tabelle 85 zusammenfassend dargestellt.
Die Einteilung der Daten anhand der zytobakteriologischen Untersuchung bestätigte
die Ergebnisse aus den ersten beiden Abschnitten und zeigte darüber hinaus, dass
die Zelldifferenzierung sowie die Zellfunktionalität stärker von der Zellzahl als vom
bakteriologischen Status beeinflusst werden.
203
Diskussion
Tabelle 85: Veränderungen ausgewählter Parameter in Milch kranker Tiere im Vergleich zu den Vierteln eutergesunder Tiere
Parameter
SCC
Elektr. Leitfähigkeit
NAGase
PMN
Lymphozyten
Makrophagen
Vitalität
CL-Aktivität / 1 Mio. PMN
CL-Aktivität / ml Milch
gesunde Viertel kranker
Tiere
kranke Euterviertel
→
→
↑
↑
→
↓
→
↓
→
↑
↑
↑
↑
↓
↓
↑
↑
↑
204
Diskussion
5.6
Gesamtdatenbank: Beurteilung der Eutergesundheit anhand von Kriterien der Zellfunktionalität
auf Viertelebene
5.6.1
Gruppen auf Basis der Zellzahl
5.6.1.1
Eutergesundheit
Die Korrelation zwischen der elektrischen Leitfähigkeit und dem SCC in Milch von
k = 0,37 fügte sich in die Angaben von GRABOWSKI (2000) ein (k = 0,30).
Anhand der Zellzahl und der elektrischen Leitfähigkeit (s. Tabelle 86) konnten die
Viertel der Gruppen V1 (SCC < 50.000 Zellen / ml VAG, s. Abbildung 22) und V2
(SCC 50.000 – 100.000 Zellen / ml VAG) als eutergesund eingestuft werden (HAMANN u. FEHLINGS 2002). Nach HAMANN und FEHLINGS (2002) beginnen entzündliche Veränderungen oberhalb einer Zellzahl von 100.000 Zellen / ml Milch, sodass die Viertel aus Gruppe V3 (100.000 – 200.000 Zellen / ml VAG) erkrankt waren.
Tabelle 86: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen V1 bis V4
anhand der Parameter SCC und elektrische Leitfähigkeit
Parameter
Referenzbereich*
SCC in Zellen / ml
VAG
≤ 100.000
≤ log 5,00
elektr. Leitfähigkeit
in mS / cm
4,8 – 6,2
Beurteilung
V1
V2
ca. 15.000 ca. 68.000
log 4,18
log 4,83
V3
V4
148.000
log 5,17
575.000
log 5,76
5,62
5,89
6,03
6,46
gesund
gesund
krank
krank
*: Referenzwerte für SCC und elektr. Leitfähigkeit nach HAMANN u. FEHLINGS (2002)
5.6.1.2
Zelldifferentialbild in Milch
Sowohl der Anstieg der Zellzahl in Milch als auch des Anteils PMN in der Milchzellsuspension sind Hinweise auf ein Entzündungsgeschehen im Euter (PAAPE et al.
205
Diskussion
1981a; KURZHALS et al. 1985; SCHRÖDER 2003). Dies ließ sich anhand der positiven Korrelation zwischen diesen beiden Parametern nachvollziehen (k = 0,69).
Die als gesund eingeordneten Viertel der Gruppe V1 hatten mit 31,6 % PMN, 30,5 %
Lymphozyten und 30,9 % Makrophagen ein Zellbild in Milch, das nicht mit den Angaben aus der Literatur übereinstimmte. Bei den gesunden Tieren (Gruppe T1) aus
Versuch 3 lag der PMN-Anteil mit 28,9 % nur geringfügig niedriger, die Makrophagen
stellten jedoch mit 45,5 % analog zu den Erkenntnissen anderer Autoren den dominierenden Zellanteil dar (FOX et al. 1985; WEVER u. EMANUELSON 1989). Da der
Anteil PMN mit den Ergebnissen eigener Untersuchungen (s. Abschnitte 4.3.3.2.2,
4.4.1.2 und 4.5.2.2.2.2) und auch mit neueren Quellen (DOSOGNE et al. 2003;
SCHRÖDER 2003) korrespondierte, wurde die Annahme, dass die Viertel dieser
Gruppe eutergesund waren, aufrechterhalten.
Bereits in Gruppe V2 befand sich der Prozentsatz PMN mit 49,8 % über dem für gesunde Euterviertel zu erwartenden (z. B. SCHRÖDER 2003), in den Gruppen V3
(67,5 % PMN) und V4 (76,3 % PMN) war zudem ein deutlicher Rückgang der
Makrophagenanteile festzustellen. Ein Anteil von bis zu 95 % PMN in Milch, der häufig für akut erkrankte Euterviertel angegeben wird (PAAPE et al. 1979; CONCHA
1986), wurde aus dem Grund nicht erreicht, dass in der vorliegenden Untersuchung
überwiegend Tiere mit chronischen Mastitiden beprobt wurden. Chronische Entzündungen zeichnen sich durch einen Rückgang des PMN-Anteils zugunsten von
Makrophagen und Lymphozyten aus (CONCHA 1986; KRAFT u. DÜRR 1997). Die
genannten Prozentzahlen für PMN der Gruppen V2 bis V4 können deshalb als Zeichen für ein Entzündungsgeschehen im Euter gewertet werden.
5.6.1.3
Zellfunktionalität in Milch
Die Parameter der CL-Aktivität in Milch zeigten sowohl zur Zellzahl als auch zum Anteil PMN Korrelationen, was auf einen Zusammenhang zwischen der CL-Aktivität und
der Eutergesundheit schließen ließ (MEHRZAD 2002). Die von LILIUS und PESONEN (1990) beschriebene Abhängigkeit der CL-Aktivität von der Zellzahl in Milch
konnte damit bekräftigt werden.
206
Diskussion
Analog zu Zellzahl und PMN-Anteil stieg die CL-Aktivität in der Milchzellsuspension
von Gruppe V1 zu Gruppe V4 an. Während die CL-Aktivität in Gruppe V1 mit 3.607
Einheiten / 1 Mio. PMN noch unter dem Durchschnitt von Gruppe T1 (Versuch 3) lag
und als Grundwert für Viertel mit normaler Sekretion betrachtet werden könnte, gaben bereits die Gruppen V2 und V3 mit je über 6.000 Einheiten Anlass zu der Annahme, dass diese PMN durch Entzündungsmediatoren in der Milch aktiviert wurden
(JAIN u. LASMANIS 1978; GUIDRY et al. 1980; PAAPE et al. 1981a). Die Gruppe V4
wies mit über 10.000 Einheiten / 1 Mio. PMN Werte auf, die gewöhnlich nur in BlutPMN nachgewiesen werden (s. z. B. Abschnitt 5.5.2.1) und die ein hohes Aktivitätsniveau der PMN deutlich erkennen ließen.
5.6.1.4
Folgerungen
Zusammenfassend ließen sich die Viertel der Gruppe V1 anhand aller erhobenen
Parameter als eutergesund bezeichnen. In Gruppe V2 lag die mittlere Zellzahl unter
dem Grenzwert von 100.000 Zellen / ml Milch, der Anteil PMN im Zelldifferentialbild
und die CL-Aktivität ließen jedoch das Vorliegen einer Entzündung vermuten. Obwohl in Gruppe V3 Zellzahl und Anteil PMN signifikant höher waren (p < 0,05), lag
die CL-Aktivität auf gleicher Höhe wie in Gruppe V2. Dadurch liegt die Vermutung
nahe, dass entzündliche Veränderungen schon unterhalb von 100.000 Zellen / ml
Milch beginnen. Die Immunitätslage verändert sich jedoch kontinuierlich, sodass eine
klinische Manifestation einer Mastitis erst in einem höheren Zellzahlbereich zu erwarten ist. Es scheint gerechtfertigt, den Zellzahlbereich von 50.000 bis 200.000 Zellen / ml Milch als Übergangsbereich zu betrachten, in dem entzündliche Veränderungen beginnen. In Gruppe V4 wiederum sprachen die Werte aller erfassten Parameter
eindeutig für das Vorliegen einer Mastitis. Eine CL-Aktivität in Milch über 6.000 Einheiten / 1 Mio. PMN ist daher möglicherweise ein Hinweis auf das Vorliegen einer
Eutererkrankung im betroffenen Viertel.
207
Diskussion
5.6.2
Gruppen auf Basis der CL-Aktivität M
5.6.2.1
Eutergesundheit
Die Viertel wurden auf der Grundlage einer ansteigenden CL-Aktivität in Milch in die
Gruppen CL1, CL2 und CL3 unterteilt (s. Abbildung 22 und Tabelle 87). Trotz der
abweichenden Selektionsgrundlage stieg die Zellzahl im VAG von Gruppe CL1 zu
Gruppe CL3 kontinuierlich an. Der Grenzwert von 100.000 Zellen / ml Milch (HAMANN u. FEHLINGS 2002) wurde nur in Gruppe CL3 überschritten. Die Gruppe CL2
lag mit fast 80.000 Zellen / ml Milch jedoch in dem als kritisch anzusehenden Bereich
von 50.000 bis 200.000 Zellen / ml Milch (s. Abschnitt 5.6.1). Anhand der in Tabelle
87 aufgeführten Parameter ließen sich die Viertel der Gruppen CL1 und CL2 als eutergesund, die der Gruppe CL3 als euterkrank einstufen. Der von LILIUS und PESONEN (1990) dokumentierte Anstieg der CL-Aktivität im Rahmen steigender
Zellzahlen konnte hiermit bestätigt werden.
Tabelle 87: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen CL1 bis
CL3 anhand der Parameter SCC und elektrische Leitfähigkeit
Parameter
Referenzbereich*
CL1
CL2
CL3
SCC in Zellen / ml
VAG
≤ 100.000
≤ log 5,00
ca. 16.000
log 4,2
ca. 80.000
log 4,9
ca. 250.000
log 5,4
elektr. Leitfähigkeit
in mS / cm
4,8 – 6,2
5,62
6,17
6,17
gesund
gesund
krank
Beurteilung
*: Referenzwerte für SCC und elektr. Leitfähigkeit nach HAMANN u. FEHLINGS (2002)
5.6.2.2
Zelldifferentialbild in Milch
In Gruppe CL1 wurde ein Zelldifferentialbild in Milch von 33,1 % PMN, 33,4 % Lymphozyten und 26,6 % Makrophagen ermittelt, welches den Angaben über gesunde
Euterviertel nicht vollständig entsprach. In Milchzellsuspensionen aus Vierteln gesunder Tiere überwog in einigen Untersuchungen der Anteil Makrophagen (PAAPE
208
Diskussion
et al. 1981a; KURZHALS et al. 1985; FOX et al. 1985), während neuere Veröffentlichungen eine Dominanz des Lymphozytenanteils herausstellten (DOSOGNE et al.
2003; SCHRÖDER 2003). Aber das Laktationsstadium und eventuell vorangegangene Infektionen beeinflussen den Anteil dieser Zellarten in Milch. Da in der Gruppe
CL1 Viertel von gesunden und von kranken Tieren sowie aus verschiedenen Laktationsstadien vertreten waren, ist ein solches Zelldifferentialbild aus eutergesunden
Vierteln vorstellbar. Der Anteil PMN stimmte mit den Ergebnissen aus eigenen Untersuchungen (s. Abschnitte 4.4.1.2 und 4.6.1) und denen anderen Autoren überein
(z. B. KURZHALS et al. 1985; FOX et al. 1985; DOSOGNE et al. 2003; SCHRÖDER
2003), sodass im Hinblick darauf die Viertel der Gruppe CL1 als gesund eingestuft
wurden.
Der Anteil PMN betrug in Gruppe CL2 46,4 % und in Gruppe CL3 68,0 %. Beide
Werte lagen damit oberhalb der eigenen sowie der in der Literatur diskutierten Angaben über Milch gesunder Euterviertel, sodass die Viertel als krank bezeichnet werden
konnten (z. B. FOX et al. 1985; WEVER u. EMANUELSON 1989; DOSOGNE et al.
2003). Ein für akute Mastitiden angegebener PMN-Anteil von 90 % (PAAPE et al.
1979; CONCHA 1986) wurde vermutlich deshalb nicht erreicht, da es sich bei den
beprobten Tieren vornehmlich um solche mit chronischen Euterkrankheiten handelte.
5.6.2.3
Zellfunktionalität in Milch
Aufgrund der beschriebenen Gruppenselektion wurde die CL-Aktivität in Milch von
Gruppe zu Gruppe größer. Die Vitalität dagegen war nur in Gruppe CL1 niedriger als
in den anderen Gruppen, ein Parameter, der von MEHRZAD (2002) ausführlich untersucht wurde. Er stellte fest, dass die Vitalität positiv mit der CL-Aktivität korrelierte.
Beide Beobachtungen bestätigen, dass es für die Vitalität in Milch einen Grenzwert
zwischen gesunden und erkrankten Eutervierteln geben muss.
Die Gruppe CL1 enthielt mit einer Zellzahl unter 50.000 Zellen / ml Milch, einem niedrigem PMN-Anteil in der Milchzellsuspension sowie einer geringen CL-Aktivität
(1.104 Einheiten / 1 Mio. PMN) gesunde Euterviertel. Der Bereich von 3.000 bis
6.000 Einheiten / 1 Mio. PMN in Milch (Gruppe CL2) stellte wahrscheinlich den Be-
209
Diskussion
ginn von Immunreaktionen gegen Erreger dar. In der Gruppe CL3 lagen die Parameter Zellzahl, PMN-Anteil und CL-Aktivität so hoch, dass von dem Vorliegen einer Infektion ausgegangen werden konnte. Wie in Versuch 3 (s. Abschnitt 5.5) wiesen die
euterkranken Viertel aus Gruppe CL3 CL-Aktivitäten über 6.000 Einheiten / 1 Mio.
PMN auf, sodass dies als Grenzwert betrachtet werden kann.
5.6.2.4
Auswertung der Gruppe CL2 anhand der Zellzahl (Gruppen CL2/T<100,
CL2/V<100 und CL2/V>100)
5.6.2.4.1
Eutergesundheit
Die Gruppenbildung basierte auf einer Auswahl von Vierteln mit CL-Aktivitäten zwischen 3.000 und 6.000 Einheiten / 1 Mio. PMN in der Milchzellsuspension, die anhand der Zellzahl in Milch auf Tierebene (CL2/T<100) bzw. auf Viertelebene
(CL2/V<100 und CL2/V>100) selektiert wurden (s. Abbildung 22). In den Gruppen
CL2/T<100 und CL2/V<100 konnte von gesunden Eutervierteln ausgegangen werden.
Die Viertel der Gruppe CL2/V>100 wurden als euterkrank bezeichnet (s. Tabelle 88).
Tabelle 88: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen CL2/T<100,
CL2/V<100 und CL2/V>100 anhand der Parameter SCC und elektrische
Leitfähigkeit
Parameter
Referenzbereich*
CL2/T<100
CL2/V<100
CL2/V>100
SCC in Zellen / ml
VAG
≤ 100.000
≤ log 5,00
ca. 28.000
log 4,45
ca. 41.000
log 4,61
ca. 310.000
log 5,49
elektr. Leitfähigkeit
in mS / cm
4,8 – 6,2
5,89
5,89
6,76
gesund
gesund
krank
Beurteilung
*: Referenzwerte für SCC und elektr. Leitfähigkeit nach HAMANN u. FEHLINGS (2002)
5.6.2.4.2
Zelldifferentialbild in Milch
Trotz ähnlicher Zellzahlen und geringer Stichprobengrößen wiesen die Gruppen
CL2/T<100 und CL2/V<100 signifikante Unterschiede in der Zelldifferenzierung der
210
Diskussion
Milchzellsuspensionen auf (p < 0,001). Das Zellbild in Gruppe CL2/T<100 gab mit
24,6 % PMN, 22,8 % Lymphozyten und 38,0 % Makrophagen eine in gesunden Eutervierteln übliche Verteilung der Zellarten wieder (z. B. WEVER u. EMANUELSON
1989; MILLER et al. 1991). Der hohe Anteil PMN in Gruppe CL2/V<100 deutete auf
ein Entzündungsgeschehen in diesen Vierteln hin, was dem Zellzahlbefund jedoch
widersprach. Dies bestätigte die Vermutung, dass gesunde Viertel von benachbarten
erkrankten Vierteln hinsichtlich ihres Immunstatus beeinflusst werden. Durch den
noch höheren Anteil PMN in Gruppe CL2/V>100 (65,5 %) konnten diese Viertel auch
anhand der Zelldifferenzierung als krank erkannt werden (s. Abschnitt 5.6.2.2).
5.6.2.4.3
Zellfunktionalität in Milch
Die CL-Aktivität / 1 Mio. PMN in Milch war in allen drei Gruppen gleich hoch. Aufgrund der Abhängigkeit von der Zellzahl stieg die CL-Aktivität / ml Milch jedoch von
Gruppe zu Gruppe an.
Die relativ hohe CL-Aktivität trotz niedriger Zellzahlen bot den Vierteln gesunder Tiere in Gruppe CL2/T<100 mit einer CL-Aktivität / ml Milch von log 1,34 einen guten Infektionsschutz.
Die Gruppe CL2/V<100 beinhaltete gesunde Viertel kranker Kühe, deren hoher Infektionsschutz sich in der gestiegenen CL-Aktivität / ml Milch von log 1,87 ausdrückte.
Die erkrankten Viertel der Gruppe CL2/V>100 hatten mit log 2,80 hohe CLAktivitäten / ml Milch. Da sich ihre CL-Aktivität / 1 Mio. PMN jedoch nicht von der gesunder Viertel unterschied, könnte die Abwehrkapazität der PMN dieser Tiere aufgrund chronischer Infektionen geschwächt gewesen sein.
Die Betrachtung der Gruppe CL2 unter Berücksichtigung des Zellzahlbefundes ließ
erkennen, dass die CL-Aktivität von 3.000 bis 6.000 Einheiten / 1 Mio. PMN Viertel
gesunder Tiere ebenso einschloss wie gesunde und kranke Viertel euterkranker Tiere. Die Einordnung dieser Gruppe als Übergangsbereich zwischen eindeutig gesunden und eindeutig erkrankten Eutervierteln bestätigte sich daher.
211
Diskussion
5.6.2.5
Folgerungen
Anhand der Gruppierung der Daten nach der CL-Aktivität in Milch ließ sich erkennen,
dass die CL-Aktivität zwar von der Zellzahl in Milch abhängig ist, beide Parameter
jedoch nicht gleichzusetzen sind. Vielmehr bietet die Interpretation der CL-Aktivität
Informationen über den Gesundheitszustand, die sich aus dem Zellzahlbefund nicht
ableiten lassen. Die Viertel der Gruppe CL1 mit niedriger CL-Aktivität (< 3.000 Einheiten / 1 Mio. PMN) waren eutergesund, während die Viertel der Gruppe CL3 (>
6.000 Einheiten / 1 Mio. PMN) auch anhand der Zellzahl im VAG und des Zelldifferentialbildes in der Milchzellsuspension als euterkrank beurteilt werden konnten.
6.000 CL-Einheiten / 1 Mio. PMN in Milch scheinen einen Grenzwert darzustellen,
oberhalb dessen Infektionen vorliegen.
Vermutlich im Bereich von 3.000 bis 6.000 Einheiten / 1 Mio. PMN in Milch (Gruppe
CL2) beginnen die Abwehraktivitäten gegen Erreger. Die mittlere Zellzahl der Gruppe
CL2 von 80.000 Zellen / ml VAG lag dicht unter dem anerkannten Grenzwert von
100.000 Zellen / ml Milch (HAMANN u. FEHLINGS 2002) und innerhalb des in Abschnitt 5.6.1 vermuteten kritischen Bereiches von 50.000 bis 200.000 Zellen / ml
Milch. In dieser Gruppe fanden sich Viertel eutergesunder Tiere, deren relativ hohe
CL-Aktivität auf einen Entzündungsherd außerhalb des Euters schließen ließ. Ebenso waren gesunde Viertel vertreten, die durch benachbarte erkrankte Viertel eine
hohe CL-Aktivität und einen hohen Anteil PMN in Milch aufwiesen. Die euterkranken
Viertel in dieser Gruppe hatten vermutlich eine unzureichende systemische Abwehrlage.
5.6.3
Zusammenfassende Beurteilung
Die Beurteilung der Eutergesundheit auf Viertelebene befasste sich mit der Einordnung der Zelldifferenzierung und der Zellaktivität von Milchzellsuspensionen in gegebene Zellzahlgrenzwerte aus Milch. Dabei wurde festgestellt, dass es sinnvoller erscheint, statt eines Grenzwertes von 100.000 Zellen / ml Milch einen Übergangsbe-
212
Diskussion
reich geringgradiger Erkrankung von etwa 50.000 bis 200.000 Zellen / ml Milch anzunehmen.
Sowohl der Anteil PMN als auch die CL-Aktivität stiegen kontinuierlich mit der Anzahl
somatischer Zellen an, ohne dabei feste Schwellenwerte zwischen gesund und krank
erkennen zu lassen. Ein breites Spektrum von 3.000 bis 6.000 CL-Einheiten / 1 Mio.
PMN in Milch zwischen eindeutig gesunden und eindeutig kranken Eutervierteln
stimmt ungefähr mit dem oben genannten Zellzahlbereich überein und eröffnet die
Möglichkeit, die CL-Aktivität / ml Milch von log 1,5 bis 2,5 als kritische Höhe zu betrachten. Tabelle 89 fasst mögliche Grenzbereiche für die verschiedenen Parameter
zusammen.
Anhand des Anteils PMN im Zelldifferentialbild und der Zellfunktionalität konnte festgestellt werden, dass in der Gruppe mit 50.000 bis 200.000 Zellen / ml Milch gesunde und kranke Viertel euterkranker Tiere wie auch Viertel gesunder Tiere vertreten
waren. Um die Eutergesundheit von Vierteln mit einer Zellzahl zwischen 50.000 und
200.000 Zellen / ml Milch genau beurteilen zu können, ist die zusätzliche Berücksichtigung des Differentialzellbildes und der CL-Aktivität des betroffenen wie auch der
benachbarten Viertel dieses Tieres nötig.
Tabelle 89: Kritische Bereiche der Zellzahl in Milch und der CL-Aktivität von MilchPMN in Bezug auf den Beginn entzündlicher Veränderungen
SCC in 1.000 / ml
CL-Aktivität / 1 Mio. PMN
log CL-Aktivität / ml Milch
50 – 200
3.000 – 6.000
1,5 – 2,5
213
Diskussion
5.7
Forschungsergebnisse der eigenen Untersuchungen
Abbildung 25 zeigt schematisiert die wichtigsten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit.
Gesundes Euter
Gesundes Tier
SCC < 50.000
PMN < 40 %
CL < 3.000
WBC 4 – 10 Mio./ml
PMN 20 – 50 %
CL > 10.000
Milch
Blut
?
Beginn entzündlicher
Veränderungen
Mastitiskrankes
Euter
SCC 50.000 – 200.000
PMN > 40 %
CL 3.000 – 6.000
Gesunde Viertel
Kranke Viertel
SCC →
PMN ↑↑↑
Vitalität →
CL
↓
SCC ↑↑↑
PMN ↑↑↑
Vitalität ↑
CL
↑↑↑
Krankes Tier
WBC (↑)
PMN (↑)
CL (↓)
Abbildung 25: Übersicht über die Zusammenhänge der untersuchten Parameter in
Hinsicht auf Mastitisgeschehen;
SCC: Anzahl somatischer Zellen / ml VAG; WBC: Leukozyten / ml
Blut; PMN: Anteil PMN in Blut bzw. Milchzellsuspension; CL: CLAktivität / 1 Mio. PMN
Die gewonnenen Erkenntnisse lassen vermuten, dass die Blutparameter WBC, PMNAnteil im Blutausstrich und CL-Aktivität Blut auf die Entstehung einer Mastitis reagieren, auch wenn dies statistisch nicht nachgewiesen werden konnte. In einem allgemeingesunden Organismus liegen WBC und der PMN-Anteil im Blut innerhalb ihrer
bekannten Referenzbereiche (KRAFT u. DÜRR 1997) sowie die CL-Aktivität über
10.000 Einheiten / 1 Million PMN. Erkrankt ein Tier, so steigen WBC und der Anteil
PMN (KRAFT u. DÜRR 1997). Tendenziell konnte ein Absinken der CL-Aktivität
festgestellt werden.
214
Diskussion
Im Medium Milch konnten Zusammenhänge zwischen funktionellen Zelleigenschaften und dem Gesundheitszustand des Euterviertels statistisch abgesichert werden.
Milch aus gesunden Vierteln enthält unter 100.000 Zellen / ml Milch (HAMANN u.
FEHLINGS 2002) und einen PMN-Anteil im Zelldifferentialbild unter 40 % (z. B. PAAPE et al. 1981a; WEVER u. EMANUELSON 1989; SCHRÖDER 2003). In der
vorliegenden Arbeit wurde ein Zellzahlgrenzwert von 50.000 Zellen / ml Milch angenommen und festgestellt, dass die CL-Aktivität in gesunden Eutervierteln unter 3.000
Einheiten / 1 Mio. PMN lag.
HAMANN und FEHLINGS (2002) betonten, dass „bei 100.000 Zellen / ml Milch die
normale zelluläre Abwehr in eine entzündliche Reaktion überzugehen beginnt“. Die
Annahme einer Übergangszone zwischen gesund und krank wurde in der vorliegenden Arbeit aufgegriffen und bestätigt. Der Bereich zwischen 50.000 und 200.000 Zellen / ml Milch wurde als Beginn entzündlicher Veränderungen definiert, in dem der
PMN-Anteil bereits über 40 % und die CL-Aktivität 3.000 – 6.000 Einheiten / 1 Mio.
PMN betrug.
Bei Vorliegen einer Mastitis lassen sich neben einer bakteriologisch positiven Untersuchung stark erhöhte Zellzahlen (bis zu mehreren Millionen Zellen / ml Milch) (HAMANN u. FEHLINGS 2002) sowie ein sehr hoher Anteil PMN im Zelldifferentialbild
nachweisen (bis über 90 %) (z. B. PAAPE et al. 1981a). Die Zellaktivität steigt ebenfalls stark an. Dies ist aus der Literatur bekannt (z. B. LOHUIS et al. 1990; LILIUS u.
PESONEN 1990; PAAPE et al. 1990a, 1990b; KREMER et al. 1993; DOSOGNE et
al. 1997; MEHRZAD 2002) und konnte in den eigenen Untersuchungen wiederholt
festgestellt werden.
Die Reaktion nicht betroffener Viertel erkrankter Tiere wurde jedoch bisher nur von
SCHRÖDER (2003) beschrieben: Der PMN-Anteil in der Milchzellsuspension steigt
in diesen Eutervierteln ebenfalls signifikant an. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem ein Abfall der CL-Aktivität in den gesunden Vierteln kranker Kühe beobachtet.
Damit konnte eine gegenseitige Abhängigkeit der Euterviertel eines Tieres nachgewiesen werden, auch wenn die zugrunde liegenden immunologischen Reaktionen
noch nicht bekannt sind. Eine Arbeit zu diesem Themenkreis steht noch aus.
215
Roswitha Merle: Beziehungen zwischen Eutergesundheit und Funktionalität von aus
Blut und Milch isolierten Leukozyten des Rindes unter besonderer
Berücksichtigung der Chemilumineszenz
6.
Zusammenfassung
Die Diagnostik von Mastitiden schließt neben der zytobakteriologischen Untersuchung zunehmend die Analyse der Zelldifferentialbildes sowie der Zellfunktionalität
aus Milch mit ein. Die Chemilumineszenzmessung (CL) ist ein Verfahren zur Bestimmung der Zellfunktionalität von PMN aus Blut, das seit einiger Zeit auch an PMN
aus Milch durchgeführt wird.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Eutergesundheit, welche anhand von Bakteriologie, Anzahl somatischer Zellen (SCC), elektrischer Leitfähigkeit und NAGase kategorisiert wurde, mit den funktionellen Nachweisverfahren Phagozytose und Chemilumineszenz von PMN aus Blut und aus Milch sowie dem mikroskopischen Zelldifferentialbild aus Milch in Zusammenhang gebracht.
Im Rahmen methodischer Untersuchungen zur Bestimmung der CL-Aktivität im Luminometer wurde die Vorgehensweise wie folgt optimiert:
Isolation und Lagerung der Zellen auf Eis, eine bis maximal sechs Stunden
Zellkonzentration: 4 x 106 Zellen / ml
PMA-Konzentration: 750 ng PMA / ml
pH-Wert: 10,0
Der Vergleich gesunder Tiere mit Tieren, die auf allen Eutervierteln erkrankt waren,
sowie mit solchen, die auf ein bis drei Vierteln erkrankt waren (Versuch 1), zeigte,
dass die Funktionalitätsbestimmung von Blut-PMN zwar die Allgemeingesundheit der
Tiere beschreibt, aber nicht ausreicht, um den Eutergesundheitszustand zu beurteilen. Die Untersuchung von Viertelgemelken zur Feststellung des Eutergesundheitsstatus ist unentbehrlich.
216
Zusammenfassung
In einer wöchentlichen Verlaufsuntersuchung über die ersten drei Laktationsmonate
(Versuch 2) wurden drei eutergesunde sowie drei kranke Tiere einbezogen. Die gesunden Tiere wiesen im Laktationsverlauf neben einer konstanten Zellzahl und einem von Lymphozyten dominierten Zelldifferentialbild in Milch geringfügig steigende
Tendenzen in der Phagozytose- (von ca. 45 % auf etwa 60 % aktive Zellen in den
nicht opsonisierten Proben) und der CL-Aktivität (von etwa 1.000 bis ca. 4.000 Einheiten / 1 Mio. PMN) der Milchzellsuspensionen auf.
Die Tiere, die an Mastitis erkrankten, hatten zwar nur in den betroffenen Eutervierteln
erhöhte Zellzahlen (ca. 200.000 Zellen / ml Milch), der Anteil PMN im Zelldifferentialbild sowie die funktionelle Aktivität der Zellen in Milch stiegen jedoch auch in den benachbarten Vierteln, allerdings weniger ausgeprägt. Nach Abklingen der Mastitis
blieben der PMN-Anteil und die funktionelle Aktivität im Vergleich zu den gesunden
Tieren erhöht, bestehen blieben auch die abweichenden Zelldifferentialbilder und
Zellaktivitäten zwischen den gesunden und den kranken Vierteln der erkrankten Tiere.
Im Rahmen einer Beurteilung der Eutergesundheit auf Tierebene an 36 Tieren (Versuch 3) wurde mit zunehmendem Krankheitsgeschehen (Zellzahlanstieg) ein Anstieg
des PMN-Anteils von 29 % auf 72 % und der CL-Aktivität von ca. 5.000 auf etwa
8.800 Einheiten / 1 Mio. PMN in den Milchzellsuspensionen festgestellt, obwohl meist
nur ein Euterviertel pro Tier erkrankt war. Die aus Blut gewonnenen Daten (Leukozytenzahl, Zelldifferentialbild, CL-Aktivität) befanden sich, soweit vorhanden, innerhalb
ihrer Referenzwerte und unterschieden sich nicht zwischen den gebildeten Gruppen,
sodass alle Tiere als allgemeingesund betrachtet werden konnten.
Die differenzierte Auswertung betroffener und nicht betroffener Viertel euterkranker
Tiere ließ eine Abhängigkeit der Euterviertel eines Tieres voneinander erkennen.
Durch systemische Einflüsse hatten die gesunden Viertel kranker Kühe im Vergleich
zu den Vierteln gesunder Tiere einen hohen Anteil PMN in Milch (38 %), aber eine
niedrigere CL-Aktivität (ca. 2.600 Einheiten / 1 Mio. PMN). Die dabei zugrunde liegenden immunologischen Vorgänge konnten nicht grundsätzlich geklärt werden.
Auch im Bereich entzündlicher Veränderungen oberhalb von 100.000 Zellen / ml
217
Zusammenfassung
Milch stiegen der PMN-Anteil und die Zellaktivität in der Milchzellsuspension von mittelgradig (SCC 100.000 – 400.000 Zellen / ml) zu hochgradig (SCC > 400.000 Zellen / ml) erkrankten Eutervierteln an. Vermutlich aufgrund unterschiedlicher lokaler
Abwehrkomponenten in der Milch (Mediatoren) variierten die Zelldifferentialbilder und
die funktionellen Zelleigenschaften gesunder und kranker Viertel derselben Tiere
stark.
Die Einteilung der Daten anhand der zytobakteriologischen Ergebnisse zeigte, dass
das Zelldifferentialbild sowie die Zellfunktionalität stärker von der Zellzahl als vom
bakteriologischen Status beeinflusst werden.
Die Beurteilung der Eutergesundheit auf Viertelebene (n = 171 Viertel) ließ erkennen,
dass die Zellaktivität in Milch mit zunehmender Zellzahl stieg. Dabei schien es geeignet, den Zellzahlbereich zwischen 50.000 und 200.000 Zellen / ml Milch als Beginn
entzündlicher Veränderungen zu betrachten, da auch die Zelldifferenzierung und die
Zellfunktionalität in diesem Bereich kontinuierliche Veränderungen aufwiesen. 3.000
bis 6.000 CL-Einheiten / 1 Mio. PMN in Milch stellten beginnende Abwehrreaktionen
im Euterviertel dar, während CL-Aktivitäten in Milch über 6.000 Einheiten / 1 Mio.
PMN auf die Manifestation einer Eutererkrankung schließen ließ. Diese Werte stimmten mit den oben genannten Zellzahlen und einem Anstieg des PMN-Anteils in der
Milchzellsuspension überein.
Die Einordnung funktioneller Eigenschaften von PMN aus Blut und Milch in die Parameter der Eutergesundheit sowie die Zelldifferenzierung aus Milch ließ steigende
Zellaktivitäten im Zusammenhang mit einem Mastitisgeschehen bereits dann erkennen, wenn der Zellzahlbefund selbst wenig auf entzündliche Vorgänge hinwies. Zudem wurde ein deutlicher funktioneller Einfluss kranker Viertel auf die nicht betroffenen benachbarten Viertel nachgewiesen.
218
Roswitha Merle:
Relationships between udder health and functionality of bovine
blood and milk leucocytes with special regard to the chemiluminescence
7.
Summary
The diagnosis of mastitis has been extended beyond cytobacteriology to the analysis
of differential cell counts along with the cell functionality of milk. The chemiluminescence (CL) is a procedure for determining PMN functionality in blood, sometimes
also used for milk PMN.
In the present work the udder health categorised by means of bacteriology, somatic
cell counts (SCC), electrical conductivity and NAGase, was evaluated by functional
methods, i. e. phagocytosis and chemiluminescence of blood and milk PMN as well
as the microscopic cell differentiation of milk.
Regarding methodic investigations for the determination of the CL activity in a luminometer, the procedure was optimized as follows:
Isolation and storage of the cells on ice, by a maximum of six hours
Cell concentration: 4 x 106 cells / ml
PMA concentration: 750 ng PMA / ml
pH-value: 10.0
The comparison of healthy animals with animals who were sick on all udder quarters
as well as those that had fallen ill on one to three quarters (experiment 1), showed
that the determination of the functionality of blood PMN is not sufficient to judge the
udder health state, though it describes the general health of the animals. Analysis of
quarter milk for the determination of the health status is therefore indispensable.
In a weekly trial over the first three months of lactation (experiment 2), three udder
healthy as well as three diseased animals were included. During lactation healthy
animals showed a constant cell count in milk with a differential cell count dominated
by lymphocytes in milk and slightly increasing tendencies in phagocytosis (from
219
Summary
approx. 45 % to about 60 % cells in the non opsonisized tests) and CL activity (from
approx. 1,000 to approx. 4,000 units / 1 million PMN) in the milk cell suspensions.
While within the diseased animals higher cell counts were closely linked to mastitic
quarters only (approx. 200,000 cell / ml), increased PMN fractions in differential cell
counts and functional activity were also observed in neighouring quarters, although
not as marked as in the diseased ones. After convalescence the PMN fraction and
the functional activity remained high compared to the healthy animals and the differences between the healthy and the sick quarters of diseased cattles also persisted.
Within classification of udder health on animal level of 36 animals (experiment 3), a
rise in the PMN fraction from 29 % to 72 % and in the CL activity from approx. 5,000
to about 8,800 units / 1 million PMN in the milk cell suspensions was found in association with increasing cell numbers, although in most cases only one udder quarter
per animal was affected. Data from blood (number of leucocytes, cell differential
count, CL activity) ranged, if available, within their reference values and did not differ
between the groups, so all animals could be considered generally healthy.
The evaluation of data from affected and unaffected quarters of udder-diseased animals revealed a mutual influence within udder quarters from one animal. By systemic
influences the healthy quarters of sick cows compared to the quarters of healthy
animals presented a high PMN fraction in milk (38 %), but a lower CL capacity
(approx. 2,600 units / 1 million PMN). The underlying immunological processes could
not be clarified completely. Considering inflammable changes above 100,000 cells /
ml milk both the PMN fraction and the cell activity in the milk cell suspensions rised
from moderately (SCC 100,000 – 400,000 cells / ml) to seriously (SCC > 400,000
cells / ml) diseased udder quarters. Cell differential counts and functional cell activities of healthy and diseased quarters in the same cows varied probably because of
different local defensive components in milk (mediators).
The categorisation of the data by cytobacteriologically means showed that the cell
differentiation as well as the cell functionality were influenced more by the cell count
than by the bacteriological status.
220
Summary
The evaluation of udder health on quarter level (n = 171 quarters) made clear that the
cell activity in milk was enhanced with increasing cell counts in milk. The cell counts
between 50,000 and 200,000 cells / ml milk were considered to be a beginning of
inflammatory changes in the udder since changes in cell differentiation and cell functionality were observed continuously from this cell count level on. 3,000 to 6,000 CL
units / 1 million PMN in milk represented the beginning of defence reactions in the
udder quarter, while CL activities in milk > 6,000 units / 1 million PMN are likely to be
indicative of an udder illness. These values corresponded to the above-mentioned
cell counts and to a rise of the PMN fraction in the milk cell suspension.
The evaluation of blood and milk cell functionality in parameters of udder health an
milk cell differentiation showed positive effects on udder health catgorization even
when commonly-empolyed diagnostic procedures yielded little evidence of inflammation. Moreover, a clear functional influence of sick quarters to the unaffected
neighbouring quarters was proven.
221
Roswitha Merle: Beziehungen zwischen Eutergesundheit und Funktionalität von aus
Blut und Milch isolierten Leukozyten des Rindes unter besonderer
Berücksichtigung der Chemilumineszenz
8.
Quellenverzeichnis
ALLEN, R. C., U. L. D. LOOSE (1976):
Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar
and peritoneal macrophages.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 69, 245 – 252
ALLEN, R. C., R. L. STJERNHOLM U. R. H. STEELE (1972):
Evidence for the generation of an electronic excitation state(s) in human polymorphonuclear leukocytes and its participartion in bactericidal activity.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 47, 679 – 684
ANGLE, M. J., U. P. H. KLESIUS (1983):
Luminol-dependent chemiluminescence analysis of the variables of the phagocytic
response by canine granulocytes.
Vet. Immunol. Immunopathol. 4, 333 – 344
ARNAOUT, M. A. (1990):
Structure and function of the leukocyte adhesion molecules CD11/CD18.
Blood 75, 1037 – 1050
BABIOR, B. M. (1984):
Oxidants from phagocytes: agents of defence and destruction.
Blood 64, 959 – 966
222
Quellenverzeichnis
BASS, D. A., J. W. PARCE, L. R. DECHATELET, P. SZEJDA, M. C. SEEDS U. M. THOMAS
(1983):
Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: a graded response to membrane stimulation.
J. Immunol. 130, 1910 – 1917
BENSINGER, R., U. C. M. JOHNSON (1981):
Luminol assay for superoxide dismutase.
Anal. Biochem. 116, 142 – 145
BICKHARDT, K. (1992):
Kompendium der Allgemeinen Inneren Medizin und Pathophysiologie für Tierärzte.
Verlag Parey, Berlin, Hamburg
BRIHEIM, G., O. STENDAHL U. C. DAHLGREN (1984):
Intra- and extracellular events in luminol-dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes.
Infect. Immun. 45, 1 – 5
BROLIN, S., U. G. W ETTERMARK (1992):
Bioluminescence analysis.
Verlag VCH, Weinheim
BURVENICH, C., A. J. GUIDRY U. M. J. PAAPE (1995):
Natural defence mechanisms of the lactating and dry mammary gland.
in: 3rd IDF Int. Mastitis Seminar, Tel Aviv, Israel, Kongressbericht, 3 – 13
BURVENICH, C., M. J. PAAPE, A. W. HILL, A. J. GUIDRY, R. H. MILLER, R. HEYNEMAN, W.
D. J. KREMER U. A. BRAND (1994):
Role of the neutrophil leucocyte in the local and systemic reactions during experimentally induced E. coli mastitis in cows immediately after calving.
Vet. Q. 16, 45 – 49
223
Quellenverzeichnis
CARLSON, G. P., U. J. J. KANEKO (1973):
Isolation of leukocytes from bovine peripheral blood.
Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 142, 853 – 856
CHESON, B. D., R. L. CHRISTENSEN, R. SPERLIN, B. E. KOHLER U. B. M. BABIOR (1976):
The origin of the chemiluminescence of phagocytosing granulocytes.
J. Clin. Invest. 58, 789 – 796
CONCHA, C. (1986):
Cell types and their immunological functions in bovine mammary tissues and secretions – a review of the literature.
Nord. Vet. – Med. 38, 257 – 272
CONCHA, C., O. HOLMBERG U. B. MOREIN (1978):
Proportion of B- and T-lymphocytes in normal bovine milk.
J. Dairy Res. 45, 287 – 290
COORAY, R. (1994):
Use of bovine myeloperoxidase as an indicator of mastitis in dairy cattle.
Vet. Microbiol. 42, 317 – 326
COORAY, R. (1996):
Casein effects on the myeloperoxidase-mediated oxygen-dependent bactericidal activity of bovine neutrophils.
Vet. Immunol. Immunopathol. 51, 55 – 65
COORAY, R., C. G. B. PETERSSON U. O. HOLMBERG (1993):
Isolation and purification of bovine myeloperoxidase from neutrophil granules.
Vet. Immunol. Immunopathol. 38, 261 – 272
CRAVEN, C., U. M. R. WILLIAMS (1985):
Defences of the bovine mammary gland against infection and prospects for their enhancement.
Vet. Immunol. Immunopathol. 10, 71 – 127
224
Quellenverzeichnis
DAHLGREN, C., U. O. STENDAHL (1982):
Effect of in vitro preincubation of polymorphonuclear leukocytes on formylmethionylleucyl-phenylalanine-induced chemiluminescence.
Infect. Immun. 37, 34 – 39
DAHLGREN, C., U. O. STENDAHL (1983):
Role of myeloperoxidase in luminol-dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes.
Infect. Immun. 39, 736 – 741
DALEY, M. J., E. R. OLDHAM, T. J. W ILLIAMS U. P. A. COYLE (1991):
Quantitative and qualitative properties of host polymorphonuclear cells during experimentally induced Staphylococcus aureus mastitis in cows.
Am. J. Vet. Res. 52, 474 – 479
DECHATELET, L. R., C. J. LEES, C. E. WALSH, G. D. LONG U. S. P. SHIRLEY (1982):
Comparison of the calcium ionophore and phorbol myristate acetate on the initiation
of the respiratory burst in human neutrophils.
Infect. Immun. 38, 969 – 974
DECHATELET, L. R., U. S. P. SHIRLEY (1982):
Chemiluminescence of human neutrophils induced by soluble stimuli: effect of divalent cations.
Infect. Immun. 35, 205 – 212
DETILLEUX, J. C., M. E. KEHRLI, JR., J. R. STABEL, A. E. FREEMAN U. D. H. KELLEY
(1995):
Study of immunological dysfunction in periparturient Holstein cattle selected for high
and average milk production.
Vet. Immunol. Immunopathol. 44, 251 – 267
DOGGWEILER, R., U. E. HESS (1983):
Zellgehalt in der Milch ungeschädigter Euter.
Milchwissensch. 38, 5 – 8
225
Quellenverzeichnis
DOSOGNE, H., C. BURVENICH, A. E. FREEMAN, M. E. KEHRLI JR., J. C. DETILLEUX, J.
SULON, J.-F. BECKERS U. D. HOEBEN (1999):
Pregnancy-associated glycoprotein and decreased polymorphonuclear leukocyte
function in early post-partum dairy cows.
Vet. Immunol. Immunopathol. 67, 47 – 54
DOSOGNE, H., C. BURVENICH, T. VAN W ERVEN, E. ROETS, E. N. NOORDHUIZEN-STASSEN
U.
B. GODDEERIS (1997):
Increased surface expression of CD 11b receptors on polymorphonuclear leukocytes
is not sufficient to sustain phagocytosis during Escherichia coli mastitis in early postpartum dairy cows.
Vet. Immunol. Immunopathol. 60, 47 – 59
DOSOGNE, H., F. VANGROENWEGHE, J. MEHRZAD, A. M. MASSART-LEEN U. C. BURVENICH (2003):
Differential leukocyte count method for bovine low somatic cell count milk.
J. Dairy Sci. 86, 828 – 834
DULIN, A. M., M. J. PAAPE U. S. C. NICKERSON (1988):
Comparison of phagocytosis and chemiluminescence by blood and mammary gland
neutrophils from multiparous and nulliparous cows.
Am. J. Vet. Res. 49, 172 – 177
DULIN, A. M., M. J. PAAPE U. B. T. WEINLAND (1984):
Determination of phagocytosis of 32P-labeled Staphylococcus aureus by bovine polymorphonuclear leukocytes.
Am. J. Vet. Res. 45, 786 – 789
EASMON, C. S. F., P. J. COLE, A. J. W ILLIAMS U. M. HASTINGS (1980):
The measurement of opsonic and phagocytic function by Luminol-dependent
chemiluminescence.
Immunology 41, 67 – 74
226
Quellenverzeichnis
EBERHART, R. J., R. P. NATZKE, F. H. S. NEWBOULD, B. NONNECKE U. P. THOMPSON
(1979):
Coliform mastitis - a review.
J. Dairy Sci. 62, 1 – 22
FOX, L. K., U. J. S. MCDONALD (1988):
Functional activity of neutrophils from bovine mammary glands infected with Staphylococcus aureus.
J. Dairy Sci. 71, 3521 – 3524
FOX, L. K., J. S. MCDONALD, J. K. HILLERS U. L. B. CORBEIL (1988):
Function of phagocytes obtained from lacteal secretions of lactating and nonlactating
cows.
Am. J. Vet. Res. 49, 678 – 681
FOX, L. K., G. E. SHOOK U. L. H. SCHULTZ (1985):
Factors related to milk loss in quarters with low somatic cell counts.
J. Dairy Sci. 68, 2100 – 2107
GENNARO, R., L. DOLZANI U. D. ROMEO (1983):
Potency of bactericidal proteins from the large granules of bovine neutrophils.
Infect. Immun. 40, 684 – 690
GLASSER, L., U. R. L. FIEDERLEIN (1987):
Functional differentiation of normal human neutrophils.
Blood 69, 937 – 944
GRABOWSKI, N. T. (2000):
Körpergewichtsentwicklung, Milchinhaltsstoffe und Milchmengenleistung als Kriterien
zur laktationsbegleitenden Beurteilung des Gesundheitszustandes hochleistender
DSB-Kühe in Laufstallhaltung.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
227
Quellenverzeichnis
GRABOWSKI, N. T., J. HAMANN U. V. KRÖMKER (2002):
Mastitis detection during the colostral phase by somatic cell count in quarter foremilk
samples.
Milchwissensch. 57, 601 – 604
GRUNERT, E. (1996):
Buiatrik.
5. Aufl. Verlag Schaper, Hannover
GUIDRY, A. J., M. J. PAAPE, R. E. PEARSON U. W. F. W ILLIAMS (1980):
Effect of local immunization of the mammary gland on phagocytosis and intracellular
kill of Staphylococcus aureus by polymorphonuclear neutrophils.
Am. J. Vet. Res. 41, 1427 – 1431
HALLÉN SANDGREN, C. , U. I. BJÖRK (1988):
A rapid technique for the isolation of highly purified, functionally intact bovine neutrophilic granulocytes.
Vet. Immunol. Immunopathol. 18, 81 – 94
HALLÉN SANDGREN, C. , K. NORDLING U. I. BJÖRK (1991):
Isolation and phagocytic properties of neutrophils and other phagocytes from nonmastitic bovine milk.
J. Dairy Sci. 74, 2965 – 2975
HAMANN, J. (1992):
Zum Einfluß von Streßsituationen auf die Anzahl somatischer Zellen der Milch.
Prakt. Tierarzt, Sonderheft colleg. vet. 23, 38 – 41
HAMANN, J. (1995):
Herdensammelmilchzellzahlbeurteilung unter lebensmittelhygienischen und mastitispräventiven Gesichtspunkten.
Prakt. Tierarzt, Sonderheft colleg. vet. 25, 18 – 20
228
Quellenverzeichnis
HAMANN, J., U. K. FEHLINGS (2002):
Leitlinien zur Bekämpfung der Mastitis des Rindes als Bestandsproblem.
4. Aufl. Verlag DVG, Gießen
HAMANN, J., U. J. REICHMUTH (1990):
Exogene Einflüsse auf den Zellgehalt der Milch unter Berücksichtigung des Gesundheitszustandes der Milchdrüse.
Milchwissensch. 45, 286 – 290
HAMANN, J., H. STAHLHUT-KLIPP, V. KRÖMKER U. P. GYODI (1997):
Milchqualität: Variationen majorer und minorer Milchinhaltsstoffe.
in: 38. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der Dtsch.
Veterinärmed. Ges., Garmisch-Partenkirchen 1997 Ber., 214 – 219
HAMANN, J., U. A. ZECCONI (1998):
Evaluation of the electrical conductivity of milk as a mastitis indicator.
Bulletin of the IDF 334, 5 – 22
HEYNEMAN, R., C. BURVENICH U. R. VERCAUTEREN (1990):
Interaction between the respiratory burst activity of neutrophil leukocytes and experimentally induced E. coli mastitis in cows.
J. Dairy Sci. 73, 985 – 994
HOEBEN, D (1999):
Pathogenesis of Escherichia coli and Streptococcus uberis mastitis around parturition: role of the activity of bone marrow derived and circulating leukocytes with regard
to possible hormonal and pharmacological influences.
Ghent/B, Faculty of Veterinary Medicine, Diss.
HOEBEN, D., C. BURVENICH U. R. HEYNEMAN (1998):
Antibiotics commonly used to treat mastitis and respiratory burst of bovine polymorphonuclear leukocytes.
J. Dairy Sci. 81, 403 – 410
229
Quellenverzeichnis
HOEBEN, D., R. HEYNEMAN U. C. BURVENICH (1997):
Elevated levels of ß-hydroxybutyric acid in periparturient cows and in vitro effect on
respiratory burst activity of bovine neutrophils.
Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 165 – 170
HOEBEN, D., E. MONFARDINI, C. BURVENICH U. J. HAMANN (2000A):
Treatment of acute Escherichia coli mastitis in cows with enrofloxacin: effect on clinical signs and chemiluminescence of circulating neutrophils.
J. Dairy Res. 67, 485 – 502
HOEBEN, D., E. MONFARDINI, G. OPSOMER, C. BURVENICH, H. DOSOGNE, A. DE KRUIF U.
J.-F. BECKERS (2000B):
Chemiluminescence of bovine polymorphonuclear leucocytes during the periparturient period and relation with metabolic markers and bovine pregnancy-associated glycoprotein.
J. Dairy Res. 67, 249 – 259
HOLMBERG, O., U. C. CONCHA (1985):
The function of leucocytes in mammary secretion.
Kiel. Milchwirtsch. Forschungsber. 37, 458 – 461
HUBER, A. R., S. L. KUNKEL, R. F. TODD U. S. J. W EISS (1991):
Regulation of transendothelial neutrophil migration by endogenous interleukin-8.
Science 254, 99 – 102
HUU, T. P., C. MARQUETTY, C. PASQUIER U. J. HAKIM (1984):
Luminol assay for microdetermination of superoxide dismutase activity: its application
to human fetal blood.
Anal. Biochem. 142, 467 – 472
JAIN, N. C. (1976):
Neutrophil leukocytes and inflammation of the bovine mammary gland.
Theriogenology 6, 153 – 173
230
Quellenverzeichnis
JAIN, N. C., U. J. LASMANIS (1977):
Phagocytosis of serum-resistant and serum-sensitive coliform bacteria (Klebsiella) by
bovine neutrophils from blood and mastitic milk.
Am. J. Vet. Res. 39, 425 – 427
KEHRLI, M. E., U. J. P. GOFF (1989):
Periparturient hypocalcemia in cows: effects on peripheral blood neutrophil and lymphocyte function.
J. Dairy Sci. 72, 1188 – 1196
KEHRLI, M. E., B. J. NONNECKE U. J. A. ROTH (1989):
Alterations in bovine neutrophil function during the periparturient period.
Am. J. Vet. Res. 50, 207 – 214
KIMURA, K., J. P. GOFF U. M. E. KEHRLI (1999):
Effects of the presence of the mammary gland on expression of neutrophil adhesion
molecules and myeloperoxidase activity in periparturient dairy cows.
J. Dairy Sci. 82, 2385 – 2392
KIMURA, K., J. P. GOFF, M. E. KEHRLI U. T. A. REINHARDT (2002):
Decreased neutrophil function as a cause of retained placenta in dairy cattle.
J. Dairy Sci. 85, 544 – 550
KITCHEN, B. J. (1981):
Review of the progress of dairy science: bovine mastitis: milk compositional changes
and related diagnostic tests.
J. Dairy Res. 48, 167 – 188
KITCHEN, B. J., G. MIDDLETON U. M. SALMON (1978):
Bovine milk N-acetyl-ß-D-glucosaminidase and its significance in the detection of abnormal udder secretions.
J. Dairy Res. 45, 15 – 20
231
Quellenverzeichnis
KLINKE, R., U. S. SILBERNAGL (1994):
Lehrbuch der Physiologie.
Verlag Thieme, Stuttgart, New York
KLUCIŃSKI, W., A. DEGÓRSKI, E. MIERNIK-DEGÓRSKA, S. TARGOWSKI U. A. W INNICKA
(1988):
Effect of ketone bodies on the phagocytic activity of bovine milk macrophages and
polymorphonuclear leukocytes.
J. Vet. Med. A 35, 632 – 639
KRAFT, W., U. U. M. DÜRR (1997):
Klinische Labordiagnostik in der Tiermedizin.
4. Aufl. Verlag Schattauer, Stuttgart
KREMER, W. D. J., E. N. NOORDHUIZEN-STASSEN, F. J. GROMMERS, A. J. J. M. DAEMEN,
P. A. J. HENRICKS U. A. BRAND (1993):
Preinfection chemotactic response of blood polymorphonuclear leukocytes to predict
severity of E. coli mastitis.
J. Dairy Sci. 76, 1568 – 1574
KURZHALS, P., H. KLIMA U. D. MANZ (1985):
Beziehungen zwischen Zellzahl, Zellbild und bakteriologischen Befunden bei der
subklinischen Mastitis des Rindes.
Milchwissensch. 40, 6 – 8
KWON, M. S. (1987):
Vergleichende Untersuchungen neutrophiler Granulozyten.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
LEE, C.-S., F. B. P. WOODING U. P. KEMP (1980):
Identification, properties, and differential counts of cell populations using electron
microscopy of dry cows secretions, colostrum and milk from normal cows.
J. Dairy Res. 47, 39 – 50
232
Quellenverzeichnis
LEITNER, G., E. SHOSHANI, O. KRIFUCKS, M. CHAFFER U. A. SARAN (1999):
Milk leucocyte population in bovine udder infection of different aetiology.
J. Vet. Med. B 47, 581 – 589
LILIUS, E.-M., U. U. PESONEN (1990):
Use of inflammatory cell activities in bovine milk to diagnose mastitis.
Am. J. Vet. Res. 51, 1527 – 1533
LOHUIS, J. A. C. M. , Y. H. SCHUKKEN, P. A. J. HENRICKS, R. HEYNEMAN, C. BURVENICH,
J. H. M. VERHEIJDEN, A. S. J. P. A. M. VAN MIERT U. A. BRAND (1990):
Preinfection functions of blood polymorphonuclear leukocytes and the outcome of
experimental Escherichia coli mastitis in the cow.
J. Dairy Sci. 73, 342 – 350
MEHRZAD, J. (2002):
Respiratory burst activity and viability of bovine blood and milk neutrophils during different stages of lactation and mastitis.
Ghent/B, Faculty of Veterinary Medicine, Diss.
MEHRZAD, J., H. DOSOGNE, E. MEYER U. C. BURVENICH (2001A):
Local and systemic effects of endotoxin mastitis on the chemiluminescence of milk
and blood neutrophils in dairy cows.
J. Vet. Res. 32, 131 – 144
MEHRZAD, J., H. DOSOGNE, E. MEYER, R. HEYNEMAN U. C. BURVENICH (2001B):
Respiratory burst activity of blood and milk neutrophils in dairy cows during different
stages of lactation.
J. Dairy Res. 68, 399 – 415
MEHRZAD, J., L. DUCHATEAU, S. PYÖRÄLÄ U. C. BURVENICH (2002):
Blood and milk neutrophil chemiluminescence and viability in primiparous and pluriparous dairy cows during late pregnancy, around parturition and early lactation.
J. Dairy Sci. 85, 3268 – 3276
233
Quellenverzeichnis
MILLER, R. H., A. J. GUIDRY, M. J. PAAPE, A. M. DULIN U. L. A. FULTON (1988):
Relationship between immunoglobulin concentrations in milk and phagocytosis by
bovine neutrophils.
Am. J. Vet. Res. 49, 42 – 45
MILLER, R. H., M. J. PAAPE U. L. A. FULTON (1991):
Variation in milk somatic cell of heifers at first calving.
J. Dairy Sci. 74, 3782 – 3790
MOTTOLA, C., R. GENNARO, A. MARZULLO U. D. ROMEO (1980):
Isolation and partial characterization of the plasma membrane of purified bovine neutrophils.
Eur. J. Biochem. 111, 341 – 346
MULLAN, N. A., E. A. CARTER U. K. A. T. NGUYEN (1986):
Secretion of hydrogen peroxide by phagocytic cells from bovine non-lactating mammary glands.
Res. Vet. Sci. 41, 265 – 370
NAGAHATA, H., S. MAKINO, S. TAKEDA, H. TAKAHASHI U. H. NODA (1988):
Assessment of neutrophil function in the dairy cow during the perinatal period.
J. Vet. Med. B 35, 747 – 751
NAGAHATA, H., S. TAKEDA, N. SAITO U. H. NODA (1988):
The use of luminol-dependent chemiluminescence assay for monitoring the phagocytic and opsonic activity in bovine whole blood.
Br. Vet. J. 144, 158 – 165
NAIDU, T. G., U. F. H. S. NEWBOULD (1973):
Glycogen in leukocytes from bovine blood and milk.
Can. J. comp. Med. 37, 47 – 55
234
Quellenverzeichnis
NEWBOULD, F. H. S. (1970):
Enhancement of phagocytosis in bovine milk leukocytes in vitro.
Can. J. comp. Med. 34, 261 – 264
NEWBOULD, F. H. S. (1973):
The effect of added serum and glucose, and some inherent factors, on phagocytosis
in vitro by milk leukocytes from several cows.
Can. J. comp. Med. 37, 189 – 194
NOGAI, K., V. KRÖMKER, P. GYODI U. J. HAMANN (1996):
Zur fluoreszenzspektroskopischen und photometrischen Bestimmung von N-Acetylß-D-glucosaminidase in Milch – ein Methodenvergleich.
in: 37. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft, Garmisch-Partenkirchen, 299 – 306
ÖSTENSSON, K. (1993):
Trafficing of leukocytes and immunoglobulin isotypes in the bovine udder.
Uppsala, Swedish University of Agricultural Sciences, Diss.
ÖSTENSSON, K., M. HAGELTORN U. G. ÅSTRÖM (1988):
Differential cell counting in fraction-collected milk from dairy cows.
Acta vet. scand. 29, 493 – 500
OUTTERIDGE, P. M., U. C. S. LEE (1981):
Cellular immunity in the mammary gland with particular reference to T, B lymphocytes and macrophages.
Adv. Exp. Med. Biol. 137, 513 – 534
PAAPE, M. J., A. J. GUIDRY, S. T. KIRK U. D. J. BOLT (1975):
Measurement of phagocytosis of 32P-labeled Staphylococcus aureus by bovine leukocytes: lysostaphin digestion and inhibitory effect of cream.
Am. J. Vet. Res. 36, 1737 – 1743
235
Quellenverzeichnis
PAAPE, M. J., U. R. H. MILLER (1988):
Sources of variation introduced into a phagocytosis assay as a result of the isolation
of neutrophils from bovine blood.
Am. J. Vet. Res. 49, 1210 – 1213
PAAPE, M. J., R. H. MILLER U. G. ZIV (1990A):
Effects of florfenicol, chloramphenicol and thiamphenicol on phagocytosis, chemiluminescence and morphology of bovine polymorphonuclear neutrophil leukocytes.
J. Dairy Sci. 73, 1734 – 1744
PAAPE, M. J., S. C. NICKERSON U. G. ZIV (1990B):
In vivo effects of chloramphenicol, tetracycline, and gentamicin on bovine neutrophil
function and morphologic features.
Am. J. Vet. Res. 51, 1055 – 1061
PAAPE, M. J., R. E. PEARSON U. W. D. SCHULTZE (1978):
Variation among cows in the ability of milk to support phagocytosis and in the ability
of polymorphonuclear leukocytes to phagocytose Staphylococcus aureus.
Am. J. Vet. Res. 39, 1907 – 1910
PAAPE, M. J., R. E. PEARSON, W. P. W ERGIN U. A. J. GUIDRY (1977):
Enhancement of chemotactic response of polymorphonuclear leukocytes into the
mammary gland and isolation from milk.
J. Dairy Sci. 60, 53 – 62
PAAPE, M. J., W. D. SCHULTZE U. A. J. GUIDRY (1985):
Development of natural defense mechanisms.
Kiel. Milchwirtsch. Forschungsber. 37, 447 – 457
236
Quellenverzeichnis
PAAPE, M. J., W. D. SCHULTZE, A. J. GUIDRY, W. M. KORTUM U. B. T. WEINLAND
(1981B):
Effect of an intramammary polyethylene device on the concentration of leukocytes
and immunoglobulins in milk and on the leukocyte response to Escherichia coli endotoxin and challenge exposure with Staphylococcus aureus.
Am. J. Vet. Res. 42, 774 – 783
PAAPE, M. J., U. W. P. WERGIN (1977):
The leukocyte as a defense mechanism.
J. Am. Vet. Med. Assoc. 170, 1214 – 1223
PAAPE, M. J., W. P. WERGIN, A. J. GUIDRY U. R. E. PEARSON (1979):
Leukocytes – second line of defense against invading mastitis pathogens.
J. Dairy Sci. 62, 135 – 153
PAAPE, M. J., W. P. WERGIN, A. J. GUIDRY U. W. D. SCHULTZE (1981A):
Phagocytic defense of the ruminant mammary gland.
Adv. Exp. Med Biol. 137, 555 – 578
PERSSON, K., I. LARSSON U. C. HALLÉN SANDGREN (1993):
Effects of certain inflammatory mediators on bovine neutrophil migration in vivo and
in vitro.
Vet. Immunol. Immunopathol. 37, 99 – 112
PUGET, K., U. A. M. MICHELSON (1974):
Iron containing superoxide dimutases from luminous bacteria.
Biochimie 56, 1255 – 1267
REDETZKY, R. (2000):
Biochemisches Blutprofil, Milchinhaltsstoffe und Milchmengenleistung als Kriterien
zur laktationsbegleitenden Beurteilung des Gesundheitszustandes hochleistender
HF-Kühe in Anbindehaltung.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
237
Quellenverzeichnis
REICHMUTH, J. (1975):
Somatic cell counting – interpretation of results.
in: IDF-Bulletin Doc. 85, 93 – 109
RIOLLET, C., P. RAINARD U. B. POUTREL (2000):
Cells and cytokines in inflammatory secretions of bovine mammary gland.
Adv. Exp. Med. Biol. 480, 247 – 258
ROSSI, F. (1986):
The O2--forming NADPH oxidase of the phagocytes: nature, mechanisms of activation and function.
Biochim. Biophys. Acta 853, 65 – 89
ROSSI, F., U. M. ZATTI (1964):
Changes in the metabolic pattern of polymorphonuclear leucocytes during phagocytosis.
Br. J. Exp. Pathol. 45, 549 – 559
ROTH, J. A., U. M. L. KAEBERLE (1981):
Evaluation of bovine polymorphonuclear leukocyte function.
Vet. Immunol. Immunopathol. 2, 157 – 174
ROTH, J. A., M. L. KAEBERLE, L. H. APPELL U. R. F. NACHREINER (1983):
Association of increased estradiol and progesterone blood values with altered bovine
polymorphonuclear leukocyte function.
Am. J. Vet. Res. 44, 247 – 253
ROTHLEIN, R., M. L. DUSTIN, S. D. MARLIN U. T. A. SPRINGER (1986):
A human intercellular adhesion molecule (ICAM-1) distinct from LFA-1.
J. Immunol. 137, 1270 – 1274
238
Quellenverzeichnis
RUSSELL, M. W., B. E. BROOKER U. B. REITER (1977):
Electron microscopic observations of the interaction of casein micelles and milk fat
globules with bovine polymorphonuclear leucocytes during the phagocytosis of
Staphylococci in milk.
J. comp. Pathol. 87, 43 – 52
SAAD, A. M. (1987):
Flow cytometric measurement of bovine milk neutrophil phagocytosis.
Acta vet. scand. 28, 333 – 342
SAAD, A. M., U. M. HAGELTORN (1985):
Flow cytometric characterization of bovine blood neutrophil phagocytosis of fluorescent bacteria and zymosan particles.
Acta vet. scand. 26, 289 – 307
SALGAR, S. K., M. J. PAAPE, B. ALSTON-MILLS U. R. H. MILLER (1991):
Flow cytometric study of oxidative burst activity in bovine neutrophils.
Am. J. Vet. Res. 52, 1201 – 1206
SCHALM, O. W., E. J. CARROLL U. J. LASMANIS (1964):
The leukocyte barrier and serologic investigations of experimental coliform (Aerobacter aerogenes) mastitis in cattle.
Am. J. Vet. Res. 25, 90 – 96
SCHALM, O. W., J. LASMANIS U. E. J. CARROLL (1966):
Significance of leukocytic infiltration into the milk in experimental Streptococcus agalacatiae mastitis in cattle.
Am. J. Vet. Res. 27, 1537 – 1546
SCHMIDT MADSEN, P. (1975):
Fluoro-opto-electronic cell-counting on milk.
J. Dairy Res. 42, 227 – 239
239
Quellenverzeichnis
SCHRÖDER, A. (2003):
Untersuchungen zum Zelldifferentialbild von Milch mit Hilfe monoklonaler Antikörper
unter besonderer Berücksichtigung der Lymphozyten.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
SCHULTZE, W. D. (1985):
Developments in the identification of diseased udder quarters or cows.
Kiel. Milchwirtsch. Forschungsber. 37, 319 – 328
SCHULTZE, W. D., U. M. J. PAAPE (1983):
Effect on outcome of intramammary challenge exposure with Staphylococcus aureus
of somatic cell concentration and presence of an intramammary device.
Am. J. Vet. Res. 45, 420 – 423
SCHÜTTEL, M. (1999):
Vergleich von N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase-Aktivitäten (NAGase) in Milch, Blut und
Harn beim laktierenden Rind.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
SHUSTER, D., M. E. KEHRLI, P. RAINARD U. M. PAAPE (1997):
Complement fragment C5a and inflammatory cytokines in neutrophil recruitment during intramammary infection with Escherichia coli.
Infect. Immun. 65, 3286 – 3292
SHUSTER, D. E., E. K. LEE U. M. E. KEHRLI (1996):
Bacterial growth, inflammatory cytokine production, and neutrophil recruitment during
coliform mastitis in cows within ten days after calving, compared with cows at midlactation.
Am. J. Vet. Res. 57, 1569 – 1575
SILVA, I. D., N. C. JAIN U. L. W. GEORGE (1989):
Phagocytic and nitroblue tetrazolium reductive properties of mature and immature
neutrophils and eosinophils from blood and bone marrow from cows.
Am. J. Vet. Res. 50, 778 – 781
240
Quellenverzeichnis
SMITS, E., C. BURVENICH, A. J. GUIDRY, R. HEYNEMAN U. A. MASSART-LEËN (1999):
Diapedesis across mammary epithelium reduces phagocytic and oxidative burst of
bovine neutrophils.
Vet. Immunol. Immunopathol. 68, 169 – 176
SMITS, E., C. BURVENICH, A. J. GUIDRY U. A. MASSART-LEËN (2000):
Adhesion receptor CD11b/CD18b contributes to neutrophil diapedesis across the
bovine blood-milk barrier.
Vet. Immunol. Immunopathol. 73, 255 – 265
SORDILLO, L. M., U. L. A. BABIUK (1991):
Modulation of bovine mammary neutrophil function during the periparturient period
following in vitro exposure to recombinant bovine interferon gamma.
Vet. Immunol. Immunopathol. 27, 393 – 402
SORDILLO, L. M., K. SHAFER-W EAVER U. D. DEROSA (1997):
Immunology of the mammary gland.
J. Dairy Sci. 80, 1851 – 1865
SURIYASATHAPORN, W., Y. H. SCHUKKEN, M. NIELEN U. A. BRAND (2000):
Low somatic cell count: a risk factor for subsequent clinical mastitis in a dairy herd.
J. Dairy Sci. 83, 1248 – 1255
TARGOWSKI, S. P. (1983):
Role of immune factors in protection of mammary gland.
J. Dairy Sci. 66, 1781 – 1789
TOLLE, A. (1975):
Mastitis – the disease in relation to control methods.
IDF-Bulletin Doc. 85, 3 – 15
241
Quellenverzeichnis
VANDEPUTTE-VAN MESSOM, G., C. BURVENICH, E. ROETS, A.-M. MASSART-LEËN, R.
HEYNEMAN, W. D. J. KREMER U. A. BRAND (1993):
Classification of newly calved cows into moderate and severe responders to experimentally induced E. coli mastitis.
J. Dairy Res. 60, 19 – 29
VANGROENWEGHE, F., H. DOSOGNE, J. MEHRZAD U. C. BURVENICH (2001):
Effect of milk sampling techniques on milk composition, bacterial contamination, viability and function of resident cells in milk.
J. Vet. Res. 32, 565 – 579
VAN W ERVEN,
T., E. N. NOORDHUIZEN-STASSEN, A. J. J. M. DAEMEN, Y. H. SCHUKKEN,
A. BRAND U. C. BURVENICH (1997):
Preinfection in vitro chemotaxis, phagocytosis, oxidative burst, and expression of
CD11/CD18 receptors and their predictive capacity on the outcome of mastitis induced in dairy cows with Escherichia coli.
J. Dairy Sci. 80, 67 – 74
WEBER, L., E. PETERHANS U. R. W YLER (1983):
The chemiluminescent response of bovine polymorphonuclear leucocytes isolated
from milk and blood.
Vet. Immunol. Immunopathol. 4, 397 – 412
WESTRICK, M. A., P. S. SHIRLEY U. L. R. DECHATELET (1980):
Generation of chemiluminescence by human neutrophils exposed to soluble stimuli
of oxidative metabolism.
Infect. Immun. 30, 385 – 390
WEVER, P., U. U. EMANUELSON (1989):
Effects of systematic influences and intramammary infection on differential and total
somatic cell counts in quarter milk samples from dairy cows.
Acta vet. scand. 30, 465 – 474
242
Quellenverzeichnis
WILLIAMS, M. R., N. CRAVEN, T. R. FIELD U. K. J. BUNCH (1985):
The relationship between phagocytosis and intracellular killing of Staphylococcus
aureus by bovine neutrophils.
Br. Vet. J. 141, 362 – 371
ZECCONI, A., V. BRONZO, R. PICCININI, G. SPREAFICO U. G. RUFFO (1994):
Phagocytic activity of bovine polymorphonuclear neutrophil leucocytes.
J. Dairy Res. 61, 271 – 279
243
Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Hamann für die Überlassung des Themas und für die herausragende fachliche Betreuung, die durch sein außergewöhnliches Wissen von besonderer Qualität war.
Den wissenschaftlichen Mitarbeitern Dr. Karl Nogai, Dr. Nils Grabowski und Dr. Ralf
Redetzky danke ich dafür, dass sie jederzeit geduldige Ansprechpartner für Fragen
aller Art waren und mir oft nützliche Hilfestellung boten.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Anke Schröder, die meinen Weg zunächst als Partnerin im Labor und später als wissenschaftliche Betreuerin engagiert und geduldig begleitete. Ihre zahlreichen Anregungen und ihre persönliche Kreativität haben mir oft
gerade dann geholfen, wenn mir die Ideen ausgingen.
Ein großer Dank geht außerdem an Herrn Jürgen Falkenhagen und Herrn Manfred
Krückeberg sowie an meine Mitdoktoranden Heidi Halm, Doris Klocke, Cordula Köss,
Florian Pfannenschmidt und Astrid Sulzer, die mich alle bei meinen zahlreichen Probenentnahmen frühmorgens im Stall tatkräftig unterstützten.
Auch den Mitarbeitern des Lehr- und Forschungsgutes Ruthe und der Familie Meldau sei mein herzlichster Dank ausgesprochen, dass sie den erheblichen Arbeitsaufwand durch die Probenahme so hilfsbereit auf sich nahmen.
Frau Busse und Frau Kirchschlager habe ich zu danken für die zuverlässige Auswertung der mikrobiologischen Befunde und für die prompte Beantwortung diverser Fragen. Frau Kirchschlager übernahm zudem einen Teil der oft nervenaufreibenden Tätigkeit des Mikroskopierens.
Den Mitarbeitern des chemischen Labors der Klinik für Rinder gilt dafür zu danken,
dass sie mir stets freundlich und zuvorkommend die benötigten Geräte zur Verfügung stellten. Auch den Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Immunologie danke ich für
die große Hilfsbereitschaft in fachlichen Fragen und die Herstellung von Bakteriensuspensionen und einigen hundert Litern Puffer.
Der Firma Boehringer sei auf diesem Wege ebenfalls für ihre Unterstützung gedankt.
244
Danksagung
Meinem lieben Lebensgefährten Manfred Krückeberg möchte ich nicht nur für die
fachliche Betreuung der technischen Geräte und die geduldige Beantwortung unzähliger Fragen über Datenbänke und statistische Probleme, sondern vor allem für monatelanges Zuhören, Mitfiebern, Aufbauen und Trösten danken. Die Kombination
kompetenter Beratung und einfühlsamer Motivation sucht seinesgleichen.
Ich danke meinen Eltern, Gerhard und Regine Merle, die mir das Studium und die
Promotion so sorgenfrei wie möglich gestalteten. Ohne ihr liebevolles Vertrauen und
ihre fortwährende Unterstützung wäre diese Arbeit nie vollendet worden. Meiner
Schwester Franziska Merle danke ich für das intensive Lektorat meiner Dissertationsschrift und so manch aufmunterndes Wort.
Zuletzt muss ich auch meinem Sohn Daniel dafür danken, dass er mich – manchmal
unsanft – an die wirklich wichtigen Dinge im Leben erinnerte.
245