Dokument 1 - Justus-Liebig

EXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN ZUM EINFLUSS VON
EICOSAPENTAENSÄURE VERSUS ARACHIDONSÄURE AUF DIE
IMMUNANTWORT
GRANULOZYTEN
POLYMORPHKERNIGER
IN
EINEM
KOINKUBATIONSMODELL
GRANULOZYTEN UND ENDOTHELZELLEN
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
des Fachbereichs Humanmedizin
der Justus-Liebig-Universität Gießen
vorgelegt von
Olaf Herm
aus
Wiedenest
Gießen 2001
NEUTROPHILER
VON
Aus dem Medizinischen Zentrum für Innere Medizin, Medizinische Klinik und Poliklinik II
Direktor: Prof. Dr. Seeger
Klinische Forschergruppe Respiratorische Insuffizienz
Leiter: Prof. Dr. Dr. Grimminger
des Klinikums der Justus-Liebig-Universität Gießen
Gutachter:
Prof. Dr. Seeger
Gutachter:
Prof. Dr. Reiter
Tag der Disputation: 04.11.2002
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung......................................................................... 8
1.1.
Vorwort ........................................................................................... 8
1.2.
PMN in der Lungenstrombahn ..................................................... 8
1.3.
Steuerung der zellulären Reizantwort und Signaltransduktion 9
1.4.
Metabolismus und physiologische Bedeutung der Lipidmediatoren..................................................................................... 10
1.5.
Interaktion von PMN und EC unter inflammatorischen
Bedingungen: Kooperative Eicosanoidsynthese ........................ 13
2.
1.6.
Eicosapentaensäure als alternatives Substrat der Lipoxygenase15
1.7.
Fragestellung................................................................................. 18
Materialien und Methoden............................................ 19
2.1.
Materialien .................................................................................... 19
2.1.1. Rezepturen der Puffer und Nährmedien .............................................. 19
2.1.2. Reagenzien und Pharmaka................................................................... 21
2.1.3. Authentische Standards........................................................................ 23
2.1.4. Sonstige Materialien ............................................................................ 23
3
2.1.5. Geräte................................................................................................... 24
2.2.
Methoden....................................................................................... 25
2.2.1. Isolation humaner Granulozyten .......................................................... 25
2.2.2. Vorbereitung und Inkubation der Endothelzellen................................ 26
2.2.3. Versuchsprotokoll ................................................................................ 26
2.2.4. Inhibition der Cyclooxygenase und der Phospholipase A2 .................. 27
2.2.5. Messung der Elastaseaktivität.............................................................. 27
2.2.6. Analytik der Lipoxygenaseprodukte .................................................... 28
2.2.7. Messung der Adhärenz ........................................................................ 30
2.2.8. Analytik der Inositolphosphate ............................................................ 31
2.2.9. Statistik ................................................................................................ 32
3.
Ergebnisse..................................................................... 33
3.1.
Einfluß
der
Vorinkubation
Eicosapentaensäure
versus
von
Endothelzellen
Arachidonsäure
auf
mit
die
Immunantwort koinkubierter PMN ........................................... 33
3.1.1. Degranulationsreaktion ........................................................................ 33
3.1.2. Produktion von Lipoxygenasemetaboliten........................................... 34
3.1.3. Adhärenz von PMN an EC .................................................................. 35
3.1.4. Inositolphosphatbildung....................................................................... 35
4
3.2.
Auswirkung der selektiven Inhibition zweier Enzyme auf
Degranulationsreaktion und Produktion von Lipoxygenasemetaboliten durch PMN am Inkubationsmodell ....................... 36
3.2.1. Cyclooxygenaseinhibition.................................................................... 36
3.2.2. Inhibition der Phospholipase A2 .......................................................... 36
4.
Diskussion ..................................................................... 56
4.1.
Modulation der Immunantwort von PMN durch Eicosapentaensäure ................................................................................. 56
4.1.1. Verminderung der Degranulationsreaktion.......................................... 56
4.1.2. Verändertes Profil der Lipoxygenasemetabolite.................................. 57
4.1.3. Herabgesetzte Adhärenz von PMN an Endothelzellen ........................ 58
4.1.4. Veränderung der Signaltransduktion ................................................... 60
4.2.
Bedeutung der Cyclooxygenase und Phospholipase A2 für die
immunmodulierende Wirkung von EPA am Inkubationsmodell61
4.2.1. Bedeutung der Cyclooxygenase ........................................................... 61
4.2.2. Bedeutung der Phospholipase A2 ......................................................... 62
5.
Zusammenfassung ....................................................... 64
5
6.
Literaturverzeichnis ...................................................... 66
7.
Lebenslauf......................................................................72
8.
Danksagung....................................................................73
6
Abkürzungen
AA
Arachidonsäure (arachidonic acid)
EC
Endothelzelle (endothelial cell)
EPA
Eicosapentaensäure (eicosapentaenoic acid)
HEPE
Hydroxyeicosapentaensäure
HETE
Hydroxyeicosatetraensäure
HPET(P)E
Hydroperoxyeicosatetra(penta)ensäure
HPLC
Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie
(high-performance
liquid
chromatography)
HUVEC
Aus menschlichen Nabelschnüren gewonnene Endothelzellen (human umbilical
vein endothelial cells)
IL
Interleukin, z.B. IL-1, Interleukin 1
IP
Inositolphosphat
LT
Leukotrien, z.B. LTB4, Leukotrien B4
PAF
Plättchen-aktivierender Faktor
PG
Prostaglandin, z.B. PGE2, Prostaglandin E2
PMN
Polymorphkerniger Neutrophiler Granulozyt
TNF-α
Tumor-Nekrose-Faktor α
7
1.
Einleitung
1.1. Vorwort
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Mai 1995 bis April 1996 in der Klinischen Forschergruppe "Respiratorische Insuffizienz" unter der Betreuung von Herrn Prof. Dr.
Seeger und Herrn Prof. Dr. Dr. Grimminger. Die Untersuchungen befaßten sich mit dem Einfluß
zweier verschiedener freier Fettsäuren auf die Immunantwort polymorphkerniger neutrophiler
Granulozyten (PMN) an einem Koinkubationsmodell von PMN und Endothelzellen. Hintergrund
ist die Notwendigkeit der parenteralen Ernährung von Patienten mit schweren inflammatorischen
Lungenerkrankungen (v.a. ARDS und Sepsis) mit Lipiden und deren Einfluß auf die
inflammatorische Kapazität der PMN in der Lungenstrombahn.
1.2. PMN in der Lungenstrombahn
In der kapillären Strombahn der Lunge befindet sich ein großer Pool von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN), der in ständigem Austausch mit der systemischen
Zirkulation steht. Dieser Pool kann sich auf zahlreiche Reize hin innerhalb kürzester Zeit noch
um ein Vielfaches vergrößern (1). PMN und Gefäßendothelzellen (EC) treten dabei in engen
Kontakt miteinander, da der Fluß durch die Kapillaren der Endstrombahn für die PMN mit einer
Verformung des Zellskeletts verbunden ist - ihr durchschnittlicher Durchmesser ist größer als der
der Kapillaren. So kommt es zu einer Verlangsamung der Flußgeschwindigkeit der PMN, dem
sogenannten "Sticking".
Werden PMN oder EC stimuliert - dies geschieht z.B. durch bakterielle Toxine oder
durch die Freisetzung von Chemotaxinen aus Monozyten oder Granulozyten - so kommt es zur
Exprimation korrespondierender Adhäsionsmoleküle auf den Zelloberflächen von PMN und EC.
8
Diese gehören zu der Gruppe der Selectine (P-, E-, L-Selectin), durch die zunächst eine lockere
Bindung zustandekommt - die PMN "rollen" auf den EC, bis sie einem inflammatorischen Focus
näherkommen. Dort kommt es zur festen Adhäsion mittels β2-Integrinen (CD 11, CD 18) und
den endothelialen Gegenrezeptoren VCAM-1 und ICAM-1. Die adhärenten PMN können
anschließend die Lungenstrombahn verlassen (Transmigration); sie werden von Chemotaxinen
ins Interstitium geleitet, wo sie ihr antimikrobielles Potential durch Degranulation von Proteasen,
Hydrolasen und reaktiven toxischen Sauerstoffspezies freisetzen (2,3).
1.3. Steuerung der zellulären Reizantwort und Signaltransduktion
Diese komplexe Interaktion wird koordiniert durch lokale und systemische Mediatoren.
Lokalmediatoren entfalten ihre Wirkung nur auf eng begrenztem Raum, ohne daß dabei systemische Wirkungen auftreten müssen. Zu ihnen zählen im Wesentlichen Leukotriene, Komplementfaktoren und der Plättchenaktivierende Faktor (PAF). Diese Botenstoffe binden an entsprechende
Rezeptoren der Zellmembran der Zielzellen. Im Zellinneren werden die Signale durch Second
Messenger weitergeleitet: Die Bindung der Mediatoren an die Rezeptoren bewirkt unter anderem
eine Aktivierung der membrangebundenen Phospholipase C. Diese katalysiert die Bildung von
Inositoltrisphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) aus in der Zellmembran vorhandenem
Phosphatidylbisphosphat. IP3 wiederum stimuliert die intrazelluläre Freisetzung von Ca2+ aus
dem endoplasmatischen Retikulum, was die Effektorsysteme der Zielzelle aktiviert. DAG
aktiviert die Proteinkinase C (2). Zu den Zielzellen gehören u.a. Granulozyten, die auf diesem
Wege zu vermehrter Produktion von Leukotrienen, Proteasen und Sauerstoffradikalen angeregt
werden, sodaß innerhalb kurzer Zeit eine außerordentlich potente, lokal begrenzte
Abwehrreaktion entsteht.
Die vorliegende Arbeit befaßt sich v.a. mit Lipidmediatoren aus der Gruppe der Leuko9
triene. Lipidmediatoren werden aus Arachidonsäure, einer mehrfach ungesättigten Fettsäure,
synthetisiert.
1.4. Metabolismus und physiologische Bedeutung der Lipidmediatoren
Arachidonsäure ist eine vierfach ungesättigte Fettsäure aus 20 Kohlenstoffatomen, deren
letzte Doppelbindung 6 C-Atome vom Methylende entfernt ist (C20:4:6, ω-6-Fettsäure). Sie wird
im Organismus in den Phospholipidpools der Zellmembranen gespeichert. Die Freisetzung der
Fettsäure unterliegt dabei der Kontrolle durch Phospholipasen (4). Alternativ kann Arachidonsäure dem Organismus parenteral zur Verfügung gestellt werden: Aus Lipidinfusionen, die
vor allem Triglyzeride enthalten, können unter dem Einfluß der Lipoproteinlipase freie Fettsäuren abgespaltet werden (5). Intrazellulär wird die Arachidonsäure im Wesentlichen auf zwei
Wegen metabolisiert: durch Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen. Produkte der Cyclooxygenasen sind die verschiedenen Prostaglandine und Thromboxane. Im folgenden soll v.a. auf den
Lipoxygenaseweg eingegangen werden, dessen Hauptprodukte die Leukotriene sind.
Erster Schritt im Metabolismus der Arachidonsäure ist der Einbau eines Sauerstoffmoleküls an Position 5, 12 oder 15 der Kohlenstoffkette durch die 5-, 12- bzw. 15-Lipoxygenase.
Produkte dieser Reaktion sind 5-, 12- und 15-S-Hydroxyperoxyeicosatetraensäure (HPETE).
Diese werden in einem Reduktionsschritt zu 5-, 12- und 15-Hydroxyeicosatetraensäure (HETEs)
metabolisiert. HETEs können in die Phospholipidpools der Zelle integriert werden, wo sie die
Eigenschaften der Membran modulieren (6). Sie besitzen aber auch direkte physiologische
Wirkungen, indem sie die Aktivität von Lipoxygenasen und Phospholipasen beeinflussen:
5-HPETE und 5-HETE können zur erhöhten Freisetzung von Arachidonsäure aus
10
Zellmembranen durch Phospholipasen beitragen (7), 15-HETE hemmt die 5-Lipoxygenase in
Granulozyten (8).
Alternativ kann aus 5-HPETE LTA4 synthetisiert werden, ein Molekül mit einer Halbwertszeit von nur wenigen Sekunden, das auf drei verschiedenenWegen weiter metabolisiert
wird:
a) Nichtenzymatische, spontane Hydrolyse zu 5,6-diHETEs und 6-trans-LTB4 sowie 6-trans12-epi-LTB4,
b) Hydrolyse durch die LTA-Hydrolase, die als Produkt LTB4 liefert, und
c) Ringöffnung und Einbau von Glutathion durch eine Glutathion-Transferase; Produkt ist dabei
LTC4.
LTB4 ist eines der stärksten bekannten Chemotaxine für PMN. Es bindet über spezifische
Rezeptoren an PMN und führt zu verstärkter Degranulation lysosomaler Enzyme und kann
außerdem als Ca2+-Ionophor wirken (9). Des weiteren verstärkt es die Adhärenz von PMN an EC,
indem es die Exprimation von Adhäsionsmolekülen auf der Zelloberfläche von PMN steigert (2).
LTB4 wird von Cytochrom P-450 zu 20-Hydroxy-LTB4 und weiter zu 20-Carboxy-LTB4
abgebaut.
LTC4 wird von einer Transpeptidase zu LTD4, dieses wiederum von einer Dipeptidase
zu LTE4 metabolisiert. LTC4, D4 und E4 bilden die Gruppe der Cysteinylleukotriene, die z.B. an
den Atemwegen stark vasokonstriktorisch, bronchokonstriktorisch und hypersekretorisch wirken
(10).
In PMN überwiegt der Metabolismus von Arachidonsäure über die 5-Lipoxygenase (11).
5-Lipoxygenase kann durch einen intrazellulären Anstieg freien Calciums aktiviert werden,
welches eine Translokation des Enzyms vom Cytosol an die Zellmembran bewirkt (12). Nach
der Aktivierung der 5-Lipoxygenase kann die Menge der gebildeten Leukotriene durch ein
11
Abbildung 1: Metabolismus der Arachidonsäure durch 5-Lipoxygenase. Dargestellt
sind die Entstehung des zentralen Produktes LTA4 sowie dessen enzymatischer
Abbau zu LTB4 und den Cysteinylleukotrienen LTC4, LTD4 und LTE4, außerdem der
spontane Zerfall von LTA4 zu den stereoisomeren Paaren 5,6-DiHETE und 6-trans (12-epi)-LTB4.
12
erhöhtes Angebot an Substrat (freie Fettsäure) um ein Vielfaches gesteigert werden (13).
Eine Übersicht des Arachidonsäuremetabolismus zeigt Abbildung 1.
1.5. Interaktion von PMN und EC unter inflammatorischen Bedingungen: Kooperative Eicosanoidsynthese
Unter inflammatorischen Bedingungen kann das Zusammenspiel zwischen PMN und EC
nachhaltig gestört werden, vor allem durch die Produktion von Exotoxin oder die Freisetzung
von Endotoxin aus Bakterien. Endotoxin wirkt dabei als "Primer" von PMN und EC, der sie
durch erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen und eine Erhöhung des Destruktionspotentials der PMN empfänglicher macht für einen späteren zweiten Stimulus (14). Dieser
Stimulus kann z.B. durch Exotoxin entstehen, das an den PMN als Porenbildner für Ca2+ wirkt,
somit einen sofortigen Calcium-Influx bewirkt und die geregelte Signaltransduktion über Second
Messenger kurzschließt (15). Dies führt zur Degranulation und Freisetzung der Proteasen des
PMN noch in der Kapillarstrombahn mit der Folge schwerer lokaler Gewebsdestruktion (16). Die
Stimulation des PMN bewirkt darüberhinaus eine erhöhte Produktion von Lipidmediatoren, die
ihrerseits stimulierend auf den PMN einwirken, so daß es zu einer überschießenden
Immunantwort kommt. In Untersuchungen an koinkubierten PMN und EC konnte außerdem
gezeigt werden, daß Leukotriene, ebenso wie PAF, eine vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen (Integrine und ICAMs) bewirken, während 15-HETE diese Wirkung inhibiert (17).
Die Synthese der Leukotriene geschieht dabei kooperativ zwischen PMN und EC: PMN
synthetisieren aus Arachidonsäure, die ihnen von Endothelzellen geliefert wird, LTA4. LTA4 wird
zum einen von PMN zu LTB4 weiterverarbeitet, zum anderen an die EC zurückgegeben und dort
zu LTC4, LTD4 und LTE4 metabolisiert (18,19,20). Beide Zelltypen ergänzen sich
13
Abbildung 2: Das Konzept der kooperativen Eicosanoidsynthese. Aus
Arachidonsäure (AA), das aus den Phospholipidpools der Endothelzelle (EC)
freigesetzt wird, synthetisiert der PMN LTA4. Dieses kann entweder im PMN zu
LTB4 metabolisiert, oder an die Endothelzelle zurückgegeben und dort zu den
Cysteinylleukotrienen verarbeitet werden.
14
durch gegenseitige Bereitstellung der notwendigen Substrate und durch ihre komplementäre
Enzymausstattung, ein Mechanismus, der vermutlich der Feinabstimmung der Immunantwort
dient (Abb. 2). Durch die Kooperation von PMN und Endothelzellen wird die Leukotriensynthese
gesteigert und das resultierende Leukotrienprofil moduliert im Sinne eines Anstiegs der
Cysteinylleukotriene und eines Abfalls des produzierten 5-HETE (21).
1.6. Eicosapentaensäure als alternatives Substrat der Lipoxygenase
Vor dem Hintergrund der proinflammatorischen Wirkung der Metabolite der Arachidonsäure hat der Einsatz von alternativen Fettsäuren, insbesondere der in Fischölen enthaltenen
Eicosapentaensäure (EPA), das wissenschaftliche Interesse erregt. Ausgehend von Untersuchungen an Bevölkerungsgruppen, die sich hauptsächlich von Tiefseefisch ernähren, konnte gezeigt
werden, daß Fischöle antiinflammatorische Wirksamkeit besitzen (22, 23). Inzwischen wurden
zahlreiche klinische Studien und experimentelle Untersuchungen durchgeführt, die sich mit der
Wirkung der aus Fischölen gewonnenen freien Fettsäuren beschäftigen.
Eicosapentaensäure kann als natürlich vorkommendes Äquivalent zu Arachidonsäure
angesehen werden: sie besitzt wie die Arachidonsäure eine Kohlenstoffkette aus 20 Atomen,
verfügt jedoch über eine fünfte Doppelbindung, die 3 C-Atome vom Methylende entfernt ist
(C20:5:3), und wird daher als ω-3-Fettsäure bezeichnet. Eicosapentaensäure wird wie Arachidonsäure von Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen metabolisiert, dabei entstehen entsprechende
Metabolite (Abb. 3), die in ihrer inflammatorischen Potenz aber weit unter der der Metabolite
der Arachidonsäure bleiben (24, 25). Da EPA im Vergleich zu Arachidonsäure das bevorzugte
Substrat der Lipoxygenase ist (26), kann eine Anreicherung der Diät mit EPA positive Effekte
auf zahlreiche inflammatorische Erkrankungen haben. Dies gilt insbesondere für die parenterale
Zufuhr, denn auf diesem Weg lassen sich die Hürde der enteralen Aufnahme und der Einbau der
15
Abbildung
3:
Metabolismus
der
Eicosapentaensäure
durch
5-
Lipoxygenase. In Analogie zum Metabolismus der Arachidonsäure
entsteht zunächst LTA5, welches enzymatisch zu LTB5 und den
Cysteinylleukotrienen LTC5, LTD5 und LTE5 verarbeitet wird, bzw. spontan
in die stereoisomeren Paare 5,6-DiHEPE und 6-trans(-12-epi)-LTB5
zerfällt.
16
Fettsäure in Transportvesikel umgehen, so daß wesentlich höhere Konzentrationen an freier
Fettsäure für die Synthese aktiver Metabolite zur Verfügung stehen.
Im einzelnen konnte in klinischen Studien gezeigt werden, daß die Zufuhr von ω-3-Fettsäuren den Verlauf chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (27), Rheumatoider Arthritiden
(28) und der Psoriasis (29) positiv beeinflußt. Ω-3-Fettsäuren haben einen positiven Effekt nach
Nierentransplantation (30) und können den Verlauf der Sepsis verbessern (31).
Im Tierversuch konnten darüber hinaus nach Auslösung akuter inflammatorischer
Vorgänge im Lungenkapillarbett ein Benefit in Bezug auf pulmonale Hypertension und eine
verringerte Gefäßpermeabilität nachgewiesen werden (32, 33, 34). Ebenfalls am Tiermodell
wurden eine verminderte Graft-versus-Host-Reaktion (35) und verringerte Zellschäden bei
Herztransplantation festgestellt (36).
Diese Wirkungen beruhen vermutlich u.a. auf folgenden Vorgängen:
1) Ω-3-Fettsäuremetabolite unterdrücken die Freisetzung von TNF-α und IL-1, zwei
Cytokinen mit zentraler Rolle in der Pathogenese inflammatorischer Prozesse (37).
2) Die Metabolite der ω-3-Fettsäuren, insbesondere LTB5 und PGE3 haben geringere
inflammatorische bzw. sogar protektive Potenz, was die chemotaktische und stimulierende
Wirkung auf PMN betrifft (38): Die Zytokin-induzierte Bildung und Expression des Adhäsionsmoleküls VCAM-1 an der Zelloberfläche von Endothelzellen wird herabgesetzt (39).
3) Ω-3-Fettsäuren und ihre Metabolite beeinflussen die Signaltransduktion in der Zelle
sowohl auf Ebene der Second-Messenger-Bildung als auch auf der Ebene der Gentranskription
(40, 41).
Die Infusion von Lipidemulsionen führt über eine Aktivierung der Lipoproteinlipase zur
Freisetzung freier Fettsäuren (5). Diese können von den Zellen direkt metabolisiert werden. Die
17
Verwendung von ω-3-Lipidemulsionen stellt daher eine potente Quelle für die Zufuhr
freier ω-3-Fettsäuren dar. Da bei vielen Patienten mit septischen Krankheitsbildern auch die
Notwendigkeit zur parenteralen Ernährung u.a. mit Lipiden besteht, kann die alternative Gabe
solcher ω-3-Lipidemulsionen zu einer Modulation der Immunantwort führen (Übersichten bei
42, 43).
1.7. Fragestellung
Im einzelnen wurden in der vorliegenden Arbeit folgende Fragestellungen bearbeitet:
1)
Wird Eicosapentaensäure bei Zufuhr als freie Fettsäure in vitro in den Phospholipidpools
der EC gespeichert?
2)
Kann Eicosapentaensäure die Immunantwort von PMN auch über den Umweg der
Endothelzellen modulieren?
Welche Auswirkungen zeigen sich insbesondere
- auf das entstehende Leukotrienprofil?
- auf die Degranulationsreaktion von PMN am Beispiel der Elastase?
- auf die Adhärenz von PMN an EC?
- auf die Bildung von Second-Messenger-Produkten?
3)
Lassen sich eventuelle Effekte durch Inhibition von Enzymsystemen verändern?
Welchen Einfluß hat am vorliegenden Modell
- die Inhibition der Cyclooxygenase?
- die Inhibition der Phospholipase A2?
18
2.
Materialien und Methoden
2.1. Materialien
2.1.1. Rezepturen der Puffer und Nährmedien
Elastase-Messpuffer
1,21 g Trispuffer (Trometamol)
+5,62 g NaCl
+60 ml Aqua Dest.
pH ad 8,3
ad 100 ml Aqua Dest.
Elastase-Substrat
25 mg Chromogenes Substrat S-2484 in 7 ml DMSO gelöst, 1:4 verdünnt mit Aqua
Dest.
Elastase-Verdünnungspuffer
1,2 ml Eisessig
+60 ml Aqua Dest.
+1 n NaOH ad pH 5,5
+0,1 g Tween 80
ad 100 ml Aqua Dest.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), Gibco (Karlsruhe, Deutschland)
Hanks/HEPES - Puffer mit Calcium und Magnesium (1l):
100 ml HBSS
+900 ml Aqua Dest.
+6 g HEPES (=25 mM)
19
+1 n NaOH ad pH 7,4
HBS (HEPES-Buffered Saline)-Puffer (0,5l):
500 ml Aqua Dest.
+2,383 g HEPES
+4 g NaCl
+1 n NaOH ad pH 7,6
HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N!-2-ethanesulfonic acid); MW 238,3; pKa 7,5 bei
25°C, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
PBS (Phosphate-Buffered Saline)-Puffer ohne Calcium und Magnesium(1l):
8,0 g NaCl
+0,2 g KCl
+0,2 g KH2PO4
+1,5 g Na2HPO4x2 H2O
ad 1000 ml Aqua Dest.
1n NaOH ad pH 7,4
PBS (Phosphate-Buffered Saline)-Puffer mit Calcium und Magnesium(1l):
8,0 g NaCl
+0,2 g Kcl
+0,2 g KH2PO4
+1,5 g Na2HPO4x2 H2O
+0,1 g MgCl2x6H2O
ad 1000 ml Aqua Dest.
1 n NaOH ad pH 7,4
+10 ml CaCl2-Lösung (1,5g CaCl2 ad 100 ml Aqua Dest.)
20
RPMI 1640 Medium, Boehringer (Mannheim, Deutschland)
Waymouth MB 752/1-Medium, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
2.1.2. Reagenzien und Pharmaka
A 23187 free acid, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
AACOCF3, Calbiochem (La Jolla, USA)
Acetonitril (CH3CN), geeignet für HPLC, Fluka (Bern, Schweiz)
Ameisensäure (HCOOH), pro analysi, Merck (Darmstadt, Deutschland)
Ammoniakalische Lösung (NH4OH) 25%, pro analysi, Merck (Darmstadt, Deutschland)
Ammoniumformiat (NH4FO), aus Ameisensäure und Ammoniakalischer Lösung hergestellt
Aqua Tridestillata, im Milli-Q Wasseraufbereitungssystem entionisiert und gefiltert, Millipore
(Eschborn, Deutschland)
Arachidonsäure (all-cis-5, 8, 11, 14-Eicosatetraen-Säure; C20:4:6), Calbiochem (La Jolla,
USA)
Aspisol (D,L-Lysin-mono-acetylsalicylat/Glycin), Bayer (Leverkusen, Deutschland)
Borax (Phosphoglycerolinositol), Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
Chromogenes Substrat S-2484 (L-Pyroglutamyl-L-Propyl-L-Valine-P-Nitroanilide), Chromogenix (Mölndal, Schweden)
Diethylether (C2H5-O-C2H5), Merck (Darmstadt, Deutschland)
DMSO (Dimethylsulfoxid), Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
EDTA Na2x2H2O (Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatrium-Dihydrat), Merck (Darmstadt,
Deutschland)
Eicosapentaensäure (all-cis-5, 8, 11, 14, 17-Eicosapentaen-Säure; C20:5:3), Calbiochem (La
Jolla, USA)
21
Eisessig, Merck (Darmstadt, Deutschland)
Ficoll-Paque, Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden)
FMLP (N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin), Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
[111In]-Chlorid, Amersham Buchler (Braunschweig, Deutschland)
Isopropanol (CH3CHOHCH3), geeignet für HPLC, Fluka (Bern, Schweiz)
Liquemin 25.000:5000 IE/ml (Na-Heparin), Hoffman La Roche (Grenzach-Wyhlen, Deutschland)
Lithiumchlorid, Merck (Darmstadt, Deutschland)
Methanol (CH2OH) destilliert in Glas, geeignet für HPLC, Burdick & Jackson Lab. Inc.;
Vertrieb durch Fluka (Bern, Schweiz)
Myoinositol, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
Myo-[3H]-Inositol, Amersham Buchler (Braunschweig, Deutschland)
NaCl 0,9%, Braun (Melsungen, Deutschland)
NaOH, Roth (Karlsruhe, Deutschland)
Polyvinylalkohol 72000, Merck Schuchard (Hohenbrunn, Deutschland)
Salzsäure 32%, Merck (Darmstadt, Deutschland)
Stickstoff 4.0, Messer Griesheim (Krefeld, Deutschland)
TNF-α, Coulter-Immunotech (Hamburg, Deutschland)
Trichloressigsäure, Merck (Darmstadt, Deutschland)
Triethylamin, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
Trispuffer (Trometamol), Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
Triton-X (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol), Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
Tropolone (2-Hydroxy-2,4,6-Cycloheptatrienone), Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
Tween 80 (Polyoxyethylensorbitmonooleat), Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
22
2.1.3. Authentische Standards
LTB4, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
LTC4, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
LTD4, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
LTE4, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
5-HETE, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
12-HETE, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
15-HETE, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
LTB5, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
LTC5, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
LTD5, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
LTE5, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
5-HEPE, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
12-HEPE, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
15-HEPE, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
2.1.4. Sonstige Materialien
Dowex-1 Anionenaustauscherharz-Säulen, Sigma (Deisenhofen, Deutschland)
Festphasen-Vorsäulen Chromabond C18ec, Varian (Frankfurt/Main, Deutschland)
HPLC- Säule, Shandon (Frankfurt/Main, Deutschland)
Octadecylsilyl (ODS)-Hypersil (3 µM), Macherey-Nagel (Düren, Deutschland)
Szintillator Rotiszint Eco Plus, Roth (Karlsruhe, Deutschland)
Zellkulturplatten, 12-Well und 24-Well, Costar (Cambridge, USA)
Zentrifugenröhrchen 14 ml und 50 ml, Polypropylen, Falcon, über Becton Dickinson (Meylan
23
Cedex, Frankreich)
2.1.5. Geräte
Absorbance Detector Spectroflow 773, Kratos, über BAI (Weiterstadt, Deutschland)
Beta-Szintillationscounter 1900 TR, Canberra Packard (Dreieich, Deutschland)
CO2-Inkubator IR 1500, Flow Laboratories (Meckenheim, Deutschland)
Flow-Arbeitsbank, Flow Laboratories (Meckenheim, Deutschland)
Gamma-Counter Cobra Auto-Gamma, Canberra Packard (Dreieich, Deutschland)
High Precision Pump Modell 300 C (Gradientenpumpe), Gynkothek (München, Deutschland)
Integrator C-R3A, Gynkothek (München, Deutschland)
Mikroskop IMT-2, Olympus Optical Co.(Hamburg, Deutschland)
Pipetten, Eppendorf-Netheler-Hinz (Hamburg, Deutschland)
PH-Meter Delta 320, Mettler Toledo (Gießen, Deutschland)
Photodiode Array Detector Model 990, Waters (Eschborn, Deutschland)
Photometer Uvikon 860, Kontron Instruments (Zürich, Schweiz)
Präzisionsspritze 50 µl, Hamilton (Darmstadt, Deutschland)
Probenaufgabeventil Modell 7125, Rheodyne, über Latek (Eppelheim, Deutschland)
Vorsäulenkammer, Macherey-Nagel (Düren, Deutschland)
Waage PB 303 und H 20 T, Mettler Toledo (Gießen, Deutschland)
Wasseraufbereitungsanlage Milli Q, Millipore (Eschborn, Deutschland)
Zentrifuge RPC Rotanta, Hettich (Tuttlingen, Deutschland)
24
2.2. Methoden
2.2.1. Isolation humaner Granulozyten
Die Isolation humaner Polymorphkerniger Granulozyten (PMN) erfolgte unter sterilen
Arbeitsbedingungen mit Hilfe eines Ficoll-Paque Gradienten nach der Methode von Boyum (44).
Das Prinzip der Trennung einzelner Zelltypen durch einen Dichtegradienten beruht auf deren
unterschiedlichen Sedation durch den Gradienten bei der Zentrifugation: Während Monozyten
und Lymphozyten sich in der oberen Schicht des Gradienten sammeln, wandern Erythrozyten und
Granulozyten aufgrund ihrer höheren Dichte durch ihn hindurch.
Bei freiwilligen Spendern wurde aus der Cubitalvene Blut entnommen und im Verhältnis
1:2 mit PBS-Puffer (ohne Calcium und Magnesium) verdünnt. Das verdünnte Blut wurde auf
Ficoll-Paque-Gradienten aufgeschichtet und bei 350 x g 35 Minuten lang zentrifugiert. Anschließend wurden die oberen Phasen (Serum, Mononukleäre Zellen, Ficoll-Gradient) abgenommen und verworfen. Die unterste Phase, bestehend aus Erythrozyten und Granulozyten wurde
im Verhältnis 1:3 verdünnt mit Polyvinylalkohol (PVA) und gut durchmischt. Nach 15 Minuten
Sedimentationszeit für die Erythrozyten wurde wiederum die obere Phase (PVA und PMN)
abgenommen und in ein neues Gefäß gegeben, die sedimentierten Erythrozyten wurden verworfen. Nach anschließender Zentrifugation bei 250 x g für 10 Minuten und absaugen des
PVA-Überstandes verblieb ein granulozytenreiches Pellet. Es folgte die hypotone Lyse der
restlichen Erythrozyten mit eisgekühltem Aqua Dest. für 20 Sekunden. Der Ansatz wurde
wiederum bei 250 x g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, das Erythrozyten-freie PMN-Pellet
in PBS-Puffer (ohne Calcium und Magnesium) resuspendiert. Jetzt konnte die Zahl der PMN
lichtmikroskopisch in der Neubauer-Zählkammer bei 400facher Vergrößerung bestimmt werden.
Nach erneuter Zentrifugation (250 x g, 10 Minuten) wurden die PMN in RPMI 1640 Medium
gegeben und ca. 30 Minuten im CO2-Inkubator aufbewahrt. Zum Einsatz im Versuch wurden die
25
PMN erneut zentrifugiert und anschließend in 600 µl Hanks/HEPES- Puffer (mit Calcium und
Magnesium) je 10 Mio. Zellen aufgenommen.
Die Reinheit der isolierten Granulozyten wurde in regelmäßigen Abständen durch
manuell durchgeführte Differentialblutbilder kontrolliert. Diese ergaben einen PMN-Anteil von
ca. 97%.
2.2.2. Vorbereitung und Inkubation der Endothelzellen
Die Endothelzellen wurden aus Umbilikalvenen nach der Methode von Jaffe et al. (45)
isoliert und als Monolayer auf 12- bzw. 24-Well Zellkulturplatten angezüchtet. Die Monolayer
wurden vor Versuchsbeginn mikroskopisch auf gleichmäßiges, dichtes Wachstum und Zellintegrität geprüft. Anschließend wurde der Überstand des Nährmediums (Waymouth-Medium)
abgesaugt und die Zellen 2 mal mit je 1 ml Hanks/HEPES-Puffer pro Well gewaschen. Pro Well
wurde 1 ml Hanks/HEPES-Puffer vorgelegt und die Zellen - je nach Versuchsansatz - wahlweise
mit freier Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure in verschiedenen Konzentrationen beschickt.
Die Fütterung mit freier Fettsäure erfolgte 4 mal in 2 Stunden (Zeitpunkte 0, 30', 60', 90'). Die
Zellen wurden während dieser Zeit im Wasserbad bei 37°C aufbewahrt. Danach wurde der
Überstand abgesaugt und die Zellen erneut 2 mal mit je 1ml Hanks/HEPES-Puffer pro Well
gewaschen. Danach wurden 850 µl Hanks/HEPES-Puffer pro Well vorgelegt.
2.2.3. Versuchsprotokoll
Je Well wurden 150 µl der PMN-Suspension hinzugefügt, was einer PMN-Konzentration
von 2,5 Mio. Zellen pro Well entspricht. Der Ansatz wurde im Wasserbad bei 37°C zunächst für
15' aufbewahrt, um eine Sedimentation der PMN auf die Endothelzellschicht zu ermöglichen.
26
Anschließend wurde mit 1 µM A 23187 pro Well stimuliert und der Versuchsansatz nach 15'
durch Kühlung der Platten auf Eis abgestoppt. Die Überstände der Wells wurden abpipettiert und
in Eppendorfcups gegeben, es folgte eine Zentrifugation bei 10000 U/min für 3 Minuten, um
Zellüberreste zu beseitigen. Vom Überstand wurden 100 µl für die Messung der Elastaseaktivität
abgenommen, die restlichen 900 µl wurden für die weiteren Messungen bei -20° C aufbewahrt.
2.2.4. Inhibition der Cyclooxygenase und der Phospholipase A2
Die Inhibition der Cyclooxygenase wurde mit Acetysalicylsäure (Aspisol) vorgenommen. Diese wurde in einer Konzentration von 250 µM wahlweise gleichzeitig mit der Zugabe der
PMN oder vor der Fettsäureinkubation zu den HUVECs gegeben, was einer Einwirkzeit der
Acetylsalicylsäure von 30 bzw. 150 Minuten entspricht.
Die Hemmung der Phospholipase A2 wurde mit AACOCF3 durchgeführt, das durch
direkte Bindung an das Enzym seine inhibitorische Wirkung entfaltet (46). Zur Inhibition der
Endothelzellphospholipase A2 wurde AACOCF3 in einer Konzentration von 100 µM nach dem
Waschen der HUVECs und noch vor der Zugabe der freien Fettsäure auf die Wells gegeben. Die
weitere Vorgehensweise entsprach der oben beschriebenen Versuchsdurchführung.
2.2.5. Messung der Elastaseaktivität
Zur quantitativen Erfassung der Degranulationsreaktion der Granulozyten wurde die
Aktivität der Elastase, eines proteolytischen Enzyms, im Zellüberstand gemessen. Die Enzymaktivität wurde photometrisch bei 405 nm Wellenlänge bestimmt (Methode nach Kramps, 47).
Meßzelle und Reagenzien wurden auf 37°C temperiert. Zur Messung wurden 100µl Probenvolumen mit 100µl Verdünnungspuffer und je 200µl Meßpuffer und chromogenes Substrat S-2484
27
in der Küvette gut durchmischt. Nach 60 Sekunden Inkubationszeit im Photometer wurde anhand
von 20 Messungen der Extinktionszunahme über 3 Minuten die Enzymkinetik bestimmt.
2.2.6. Analytik der Lipoxygenaseprodukte
Die quantitative Erfassung der Lipoxygenaseprodukte erfolgte mittels High-Performance
Liquid Chromatography. Die entsprechende Methodik wurde etabliert von Kiss et al. (48).
2.2.6.1. Festphasenextraktion
Die Festphasenextraktion erfolgte mit Chromabond C18ec-Vorsäulen (100 mg ODS, 1
ml Probenvolumen), die auf einer Vakuumkammer installiert wurden. Die Vorsäulen wurden
zunächst konditioniert mit Lösung A (s. Tabelle 1). Nach zweimaligem Waschen der Säulen mit
Aqua Tridestillata erfolgte die Äquilibration mit Lösung B. Die Proben wurden in 1 ml der
HPLC-Phase aufgenommen und die vorbereiteten Vorsäulen damit beschickt. Es folgten
Reinigungsschritte mit Lösung B (4x 1 ml) und Spülung mit Aqua Tridestillata (3x 1 ml), um
eventuelle Verunreinigungen in den Proben zu beseitigen. Anschließend wurden die Eicosanoide
mit 1 ml der Lösung A eluiert. Das Eluat wurde in Spitzbodenvials aufgefangen, zum Trocknen
mit Stickstoff abgeblasen und bei -20°C gelagert. Zum Aufspritzen wurden die Proben in 50 µl
HPLC-Phase aufgenommen, davon wurden 20 µl aufgespritzt.
2.2.6.2. Reversed-Phase HPLC
Als mobile Phase wurde eine Acetonitril-Methanol-Wasser-Lösung verwendet (s. Tabelle
1), die vor der Verwendung durch eine Teflonmembran filtriert und im Ultraschallbad entgast
wurde. Bei der Herstellung der mobilen Phase kamen ausschließlich Reagenzien in
28
CHPLC-Qualität" zur Anwendung. Als feste Phase diente eine mit 3 µm ODS-Hypersil gepackte
Säule (Länge 25 cm, Innendurchmesser 4,6 mm). Diese wurde zunächst konditioniert mit Aqua
Tridestillata (1 h) und 1 mM EDTA Na2 in Methanol:Wasser (10:90) (2 h). Anschließend erfolgte
die Äquilibration des Systems mit HPLC-Phase.
Nach Aufspritzen der Proben erfolgte die Messung bei 270 nm Wellenlänge für Leukotriene (15 Minuten), anschließend bei 237 nm für HETEs und HEPEs. Die Flow-Rate betrug 1
ml/h. Zusätzlich wurden die Eicosanoide mit einem Photodioden Array identifiziert, der die
Messung des vollen UV-Spektrums erlaubte (190-340 nm). Eine Koelution mit eventuellen
Verunreinigungen konnte auf diese Weise ausgeschlossen werden.
Reagentien
Lösung A
Lösung B
Mobile Phase
Aqua Tridest.
5,0
83,0
38,0
Methanol
95,0
Isopropanol
Ameisensäure
8,0
9,0
0,002
Triethylamin
Acetonitril
1,7
0,001
6,3
54,0
pH
4,5
5,0
4,38
Tabelle 1: Zusammensetzung der Lösungen für die Reversed Phase HPLC.
Angaben in Volumenprozent.
Zur Ermittlung der Recovery der einzelnen Eicosanoide mit dem verwendeten
HPLC-System wurden authentische Standards in unterschiedlichen Konzentrationen aufgespritzt.
Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2.
29
Standard
Recovery (% +/- SEM)
6t-LTB4 + 6t,12e-LTB4
92,0 3,1
LTB4
90,8 1,4
5-HETE
71,9 4,1
6t-LTB5 + 6t,12e-LTB5
86,4 1,9
LTB5
87,8 2,8
5-HEPE
76,1 3,6
Tabelle 2: Recovery-Daten aus 6 unabhängigen Versuchen. Angaben in Prozent.
2.2.7. Messung der Adhärenz
Die Messung der Adhärenz von PMN auf HUVECs erfolgte mittels radioaktiver Markierung der PMN mit [111In]-Tropolonat nach der Methode von Danpure, Osman und Brady (49).
Zur Herstellung des Indium-Tropolonat-Komplexes wurde [111]In-Chlorid der Firma
Amersham zunächst in 0,04 M Salzsäure verdünnt auf eine Konzentration von 4 µCi/ml. Diese
Lösung wurde im Verhältnis 1:10 mit Tropolone gemischt und 15 Minuten im Wasserbad bei
37°C aufbewahrt.
Die Isolation der PMN erfolgte wie oben beschrieben. 70 Mio. PMN wurden anschließend in 3ml HBS-Puffer suspendiert und 300 µl des Indium-Tropolonat-Komplexes zugegeben.
Diese Suspension wurde weitere 15 Minuten im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Es folgten 2
Waschschritte mit HBS-Puffer in der Zentrifuge (300 x g für 5 Min.).
Die radioaktiv markierten PMN wurden auf HUVECs gegeben (Zellzahl 2,5 Mio. pro
Well), die vorher mit 1 ng TNF-α pro Well für 2 Stunden inkubiert worden waren. Nach 15
Minuten Sedimentationszeit wurde mit 0,1 µM FMLP pro Well für 15 Minuten stimuliert. Der
Ansatz wurde auf Eis abgestoppt und die Überstande abpipettiert. Zusätzlich wurden die auf den
30
Wells verbliebenen Zellen mit 0,5%igem Triton-X lysiert und mit einem Cell-Scraper aus den
Wells entfernt. Die Aktivität sowohl im Probenüberstand, als auch in den lysierten Zellen wurde
im Gamma-Counter ermittelt, so daß, ausgehend von der Gesamtaktivität des Ansatzes, der
Prozentsatz der auf den HUVECs adhärenten PMN errechnet werden konnte.
2.2.8. Analytik der Inositolphosphate
Phosphatidylinositole sind Bestandteile der Zellmembran. Sie dienen als "Second
Messenger", die Signale im Zellinneren weiterleiten, die an der Zellmembran, z.B. durch
Rezeptorbindung von Hormonen, entstehen. Dabei wird Phosphatidylbisphosphat der Zellmembran zu Inositoltrisphosphat (IP3) hydrolysiert. Die Freisetzung der Inositolphosphate ist streng
an die Aktivität der Phospholipase C gebunden.
2.2.8.1. Prinzip der Methode
Die Messung der IP3-Freisetzung erfolgte nach der Methode von Berridge et al. (50).
Dazu wurden zunächst die Inositolphosphate der PMN mit [3H]-beladenem Inositol markiert.
Durch Stimulation der Zellen wurde die IP3-Freisetzung initiiert. Da IP3 normalerweise bis zum
Inositol schrittweise dephosphoryliert wird, wurde das letzte Enzym dieser Abbausequenz, die
IP1-Phosphatase mit Lithium-Ionen gehemmt. Auf diese Weise konnte eine Akkumulation der
Inositolphosphate im Cytoplasma erreicht werden. Nach Lyse der Zellmembranen wurde die
Lipidfraktion mit den in der Zellmembran verbliebenen Phosphatidylinositolen abgetrennt und
die Menge der freigesetzten Inositolphosphate in der wässrigen Phase des Cytoplasmas quantitativ erfaßt (IPx= IP1+IP2+IP3).
2.2.8.2. Versuchsablauf
31
70 Mio. der Granulozyten wurden nach der Isolation in 700 µl RPMI 1640-Medium
suspendiert. Nach Zugabe von 50 µl [3H]-Inositol (entsprechend 50 µCi) wurde der Ansatz für
eine Stunde im CO2 -Inkubator aufbewahrt. Anschließend wurde das nicht von den Granulozyten
inkorporierte [3H]-Inositol in 3 Zentrifugationsschritten mit PBS-Puffer ohne Calcium und
Magnesium (je 5 Min. bei 250 x g) abgewaschen. Die so vorbehandelten PMN wurden in 600
µl PBS-Puffer mit Calcium und Magnesium pro 10 Mio. Zellen aufgenommen und je 150 µl
dieser Suspension auf jedes Well gegeben. Zusätzlich wurde dem Ansatz 10 mM Lithiumchlorid
zugefügt. Nach 15 Minuten Inkubationszeit erfolgte die Stimulation mit 10 µM FMLP. Abgestoppt wurde die Reaktion mit je 1ml 15%iger Trichloressigsäure in einer Zeitreihe, nämlich nach
30 Sekunden, 1, 3, 5 und 10 Minuten. Der Probenüberstand wurde abgenommen und bei 10000
u/min für 3 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurden die Proben zur Abtrennung der
Lipidphase 3 mal mit je 2 ml Diethylether ausgeschüttelt.
Die
Extraktion
der
Inositolphosphate
erfolgte
mit
Hilfe
der
Ionen-
austausch-Chromatographie. Dazu wurden die mit Dowex-Ionenaustauscherharz gepackten
Chromatographiesäulen zunächst mit je 4 ml Ammoniumformiat konditioniert und mit je 5 ml
Aqua Dest. gewaschen. Nach Zugabe der Proben erfolgten Auswasch- und Reinigungsschritte
mit je 3 ml Myoinositol und je 5 ml Borax. Nun wurde mit je 4 ml Ammoniumformiat eluiert.
Die Proben wurden im Verhältnis 1:5 mit Szintillator durchmischt. Nach 2 Std. Ruhezeit für den
Szintillator wurde die Aktivität der Proben im ß-Counter gemessen.
2.2.9. Statistik
Alle Daten sind als Mittelwert Standardfehler des Mittelwertes (SEM) angegeben. Die
statistische Signifikanz der Daten wurde mit dem gepaarten T-Test für normalverteilte Proben
ermittelt. Werte von p < 0,05 wurden als signifikant angesehen.
32
3.
Ergebnisse
3.1. Einfluß der Vorinkubation von Endothelzellen mit Eicosapentaensäure versus Arachidonsäure auf die Immunantwort koinkubierter PMN
3.1.1. Degranulationsreaktion
Die im Zellüberstand gemessene Elastaseaktivität von A 23187-stimulierten PMN allein
lag bei 1,4 0,1 U/l. Durch Koinkubation von PMN mit HUVECs stieg die Aktivität der Elastase
auf 6,1 0,6 U/l. Die zusätzliche vorherige Zufuhr von freier Arachidonsäure bewirkte einen
weiteren Anstieg der Elastaseaktivität um maximal 18% auf 7,2 0,5 U/l. Der maximale Anstieg
ergab sich bei Inkubation der Endothelzellen mit 1 µmol/l Arachidonsäure. Im Gegensatz dazu
konnte die Aktivität der Elastase durch vorherige Inkubation der Endothelzellen mit
Eicosapentaensäure um maximal 15% auf 5,3 0,5 U/l gesenkt werden, verglichen mit der
Koinkubation ohne Fettsäurezufuhr. Dabei war der maximale Effekt ab einer Zufuhr von
mindestens 5 µmol/l Eicosapentaensäure zu beobachten. Verglichen mit den Werten bei Inkubation mit Arachidonsäure war die Elastaseaktivität bei Inkubation mit Eicosapentaensäure bis zu
31% niedriger. Der Unterschied der Daten war signifikant (p<0,05) für die Versuche mit 1 bzw.
5 µmol/l freier Fettsäure (Abb. 4). Das Gesamtniveau der Elastasedegranulation differierte dabei
zum Teil zwischen den einzelnen Versuchsreihen, die Werte der EPA-Ansätze lagen jedoch stets
niedriger als die der AA-Ansätze innerhalb eines Versuches.
33
3.1.2. Produktion von Lipoxygenasemetaboliten
Die im Zellüberstand gemessene Freisetzung von LTB4 durch PMN ohne HUVECs lag
bei 42,2 5 nmol/l. Nur unwesentlich steigern ließ sich die LTB4-Produktion durch alleinige
Koinkubation mit HUVECs ohne Zufuhr freier Fettsäuren. Dagegen stieg die LTB4-Freisetzung
in Versuchen mit vorheriger Zufuhr freier Arachidonsäure um max. 36% auf 58,5 2,7 nmol/l
an, bei Zufuhr von freier Eicosapentaensäure war jedoch nur ein geringfügiger Anstieg um max.
12% auf 47,2 2,2 nmol/l zu messen. (Abb. 5). Die LTB4-Ausschüttung nach Inkubation mit
EPA war ab einer Konzentration von 1 µmol/ signifikant niedriger als nach Inkubation mit AA
(p<0,05), die maximale Differenz zwischen AA- und EPA-Werten lag bei 11,3 nmol/l.
Ein ähnlicher Effekt konnte bei der Messung von 5-HETE beobachtet werden. Hier lag
der maximale Anstieg unter Zufuhr von AA sogar bei max. 80% gegenüber Versuchen ohne
Fettsäure, während unter EPA-Gabe nur ein Anstieg um max. 39% auftrat. Ein signifikanter
Effekt konnte bei einer Konzentration von 5 µmol/l freier Fettsäure gezeigt werden (Abb. 6).
Im Gegensatz dazu lag die Menge an nichtenzymatischen Zerfallsprodukten des LTA4 bei
Vorinkubation mit AA und EPA auf gleichem Niveau. Lediglich gegenüber Versuchen ohne
Zufuhr freier Fettsäure ließ sich eine Steigerung der Zerfallsprodukte auf maximal fast die
doppelte Menge messen. Dabei war ein linearer Anstieg der Zerfallsprodukte mit steigenden
Konzentrationen zugeführter freier Fettsäure zu beobachten (Abb. 7).
Parallel zum verminderten Auftreten von Produkten der 4er-Reihe erschienen unter
Zufuhr von EPA die 5er-Produkte der Lipoxygenase. Quantitativ lagen diese in einem Bereich
von 16% (LTB5) bis 47% (5-HEPE) der Mengen an gemessenen 4er-Produkten. Bei Versuchen
mit AA-Zufuhr waren dagegen keine 5er-Produkte messbar (Abb. 8).
34
3.1.3. Adhärenz von PMN an EC
Zum Vergleich der Adhärenz von PMN an HUVECs, die mit AA, EPA oder nicht mit
freier Fettsäure vorinkubiert worden waren, wurden Versuchsreihen mit steigenden Konzentrationen an zugeführter freier Fettsäure durchgeführt. Ohne Stimulation und ohne vorherige
Inkubation mit freier Fettsäure wurden 28 4% der PMN adhärent. Dieser Prozentsatz stieg auf
knapp 59 6% bei Stimulation mit FMLP. Wurden die HUVECs mit AA vorinkubiert und
anschließend mit FMLP stimuliert, sank die Adhärenz mit steigender Konzentration freier
Fettsäure leicht ab auf Werte von 57 bis 49 4%. Auf HUVECs, die mit EPA vorinkubiert
worden waren, lag der Anteil adhärenter PMN dagegen bis zu 21% niedriger als in den Versuchen mit AA-Inkubation. Dieser Effekt war statistisch signifikant (p<0,05) für die Versuche mit
0,1, 0,5 und 5 µmol/l freier Fettsäure (Abb. 9).
3.1.4. Inositolphosphatbildung
Der Einfluß einer Vorinkubation von HUVECs mit AA bzw. EPA auf die Bildung von
Second Messengern in PMN wurde anhand der quantitativen Erfassung der Abbauprodukte von
Inositoltrisphosphat bestimmt. In Versuchen, in denen die EC mit 1 µmol/l AA inkubiert wurden,
verzögerte sich der charakteristische frühe Peak der Inositolphosphatbildung um etwa eine halbe
Minute und war um 5% höher als in den Versuchen, in denen keine freie Fettsäure zugeführt
wurde (Abb. 10). Im Vergleich dazu verzögerte sich das Maximum der Inositolphosphatbildung
in EPA-vorinkubierten Versuchen um über 4 Minuten, ein früher Peak war nicht mehr zu
erkennen. Vielmehr zeigten diese Versuche einen verzögerten Anstieg der Inositolphosphate über
5 Minuten hinweg (Abb. 11).
35
3.2. Auswirkung der selektiven Inhibition zweier Enzyme auf Degranulationsreaktion und Produktion von Lipoxygenasemetaboliten
durch PMN am Inkubationsmodell
3.2.1. Cyclooxygenaseinhibition
Die Hemmung der Cyclooxygenase von PMN und HUVECs mit 250 µmol/l Acetylsalicylsäure wurde in zwei Versuchsreihen durchgeführt: In einer ersten Reihe wurde die Inhibition
über 30 Minuten, in einer zweiten Reihe über 150 Minuten hinweg durchgeführt. Dabei ergaben
sich nur minimale Effekte gegenüber den Versuchsreihen ohne Cyclooxygenaseinhibition. Bei
der Messung der Elastaseaktivität fiel ein leicht erhöhter Wert bei Versuchen ohne Zufuhr freier
Fettsäure auf, ansonsten konnte kein wesentlicher Effekt festgestellt werden (Abb. 12). Die
quantitative Messung der Lipoxygenaseprodukte zeigte eine minimale Annäherung der Werte für
Versuche mit Arachidonsäure und Eicosapentaensäure sowie Versuche ohne Zufuhr freier
Fettsäure, dies jedoch nur bei Inhibition über 150 Minuten. Bei Inhibition über 30 Minuten
konnte kein signifikanter Effekt gezeigt werden (Abb. 13-15). Auch die Menge und das Profil
der 5er-Produkte in Versuchen mit EPA-Zufuhr blieben in diesen Versuchsreihen unberührt
(Abb. 16).
3.2.2. Inhibition der Phospholipase A2
Unter Inhibition der Phospholipase A2 der HUVECs mit 100µmol/l AACOCF3 ergab sich
folgendes Bild: Die Elastaseaktivität sank auf Werte, die 25-40% unter den Werten ohne
Inhibition lagen (Abb. 17). Die LTB4-Produktion lag ebenfalls zwischen 20 und 40% niedriger
als die Vergleichswerte. Signifikante Unterschiede zwischen AA-, EPA- und Versuchen ohne
36
freie Fettsäure waren nicht mehr auszumachen (Abb. 18).
Die Menge an nichtenzymatischen Zerfallsprodukten und 5-HETE sank um vergleichbare
Werte wie die LTB4-Menge, hier blieben die Differenzen zwischen den verschiedenen
Versuchsreihen aber erhalten: Die Werte der Versuche ohne Zufuhr freier Fettsäure waren
niedriger als die der Versuche mit AA-Zufuhr, aber höher als die der Versuche, in denen EPA
zugeführt wurde (Abb. 19, 20). 5er-Produkte blieben nachweisbar, ihre Menge sank jedoch auf
65% (LTB5), 27% (6-trans(-12-epi)-LTB5) bzw. 42% (5-HEPE) der Ausgangswerte ab (Abb. 21).
37
8
7
Elastase [U/l]
6
*
*
5
4
EPA
AA
ohne FFA
PMN ohne HUVECs
3
2
1
PMN
0
0,5
1
5
10
FFA [µmol/l]
Abbildung 4: Änderung der Elastaseaktivität im Zellüberstand nach vorheriger
Inkubation der Endothelzellen mit steigenden Konzentrationen freier Arachidonsäure
bzw. Eicosapentaensäure. Stimulation mit 1 µmol/l A 23187. Alle Daten ± SEM, n=8.
P<0,05 für mit “*” gekennzeichnete Datenpaare.
38
70
EPA
AA
PMN
ohne FFA
LTB4 [nmol/l]
60
50
*
*
5
10
*
40
30
PMN
0
0,5
1
FFA [µmol/l]
Abbildung 5: LTB4-Ausschüttung in den Zellüberstand nach vorheriger Inkubation der
Endothelzellen
mit
steigenden
Konzentrationen
freier
Arachidonsäure
bzw.
Eicosapentaensäure. Stimulation mit 1 µmol/l A 23187. Alle Daten ± SEM, n=6. P<0,05
für mit “*” gekennzeichnete Datenpaare.
39
80
PMN
ohne FFA
AA
EPA
70
5-HETE [nmol/l]
60
50
*
40
30
20
10
PMN
0
0,5
1
5
10
FFA [µmol/l]
Abbildung 6: Ausschüttung von 5-HETE in den Zellüberstand. Stimulation mit 1 µmol/l
A 23187. Alle Daten ± SEM, n=3. P<0,05 für mit “*” gekennzeichnete Datenpaare.
40
6-t-LTB4 + 6-t,12-e-LTB4 [nmol/l]
50
40
30
PMN ohne HUVECs
ohne FFA
EPA
AA
20
10
PMN
0
0,5
1
5
10
FFA [µmol/l]
Abbildung 7: Ausschüttung der LTA4-Zerfallsprodukte (6-trans- und 6-trans, 12-epiLTB4) in den Zellüberstand. Stimulation mit 1 µmol/l A 23187. Alle Daten ± SEM, n=5.
41
40
LTB5
6-t + 6-t,12-e
5-HEPE
[nmol/l]
30
20
10
0
0,5
1
5
10
EPA [µmol/l]
Abbildung 8: Synthese von EPA-abgeleiteten Produkten der 5-Lipoxygenase durch
PMN nach vorheriger Inkubation der Endothelzellen mit steigenden Konzentrationen
freier Eicosapentaensäure. Stimulation mit 1 µmol/l A 23187. Alle Daten ± SEM, n=4.
42
70
AA
EPA
ohne FFA, ohne fmlp
ohne FFA
adhärente PMN [%]
60
50
*
*
0,1
0,5
*
40
30
20
0
1
5
10
FFA [µmol/l]
Abbildung 9: Adhärenz von PMN an EC nach vorheriger Inkubation der EC mit
steigenden Konzentrationen freier Arachidonsäure bzw. Eicosapentaensäure. Priming
der EC mit TNF-α. Stimulation mit 0,1 µmol/l FMLP. Alle Daten ± SEM, n=5 für AA und
EPA, n=4 ohne FFA. P<0,05 für mit “*” gekennzeichnete Datenpaare.
43
150
140
IPx [% von Leerwert]
ohne FFA
1µM AA
130
120
110
100
90
80
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
t [min] (ohne FFA)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
t [min] (AA)
Abbildung 10: Zeitlicher Verlauf der Inositolphosphatbildung von PMN nach vorheriger
Inkubation der EC mit 1 µmol/l freier Arachidonsäure bzw. ohne Inkubation mit freier
Fettsäure. Stimulation mit 10 µmol/l FMLP. Alle Daten ± SEM, n=3 für AA, n=6 ohne
FFA. Getrennte x-Achsen zur besseren Übersicht.
44
160
ohne FFA
1µM EPA
IPx [% von Leerwert]
150
140
130
120
110
100
90
80
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
t [min]
Abbildung 11: Zeitlicher Verlauf der Inositolphosphatbildung von PMN nach vorheriger
Inkubation der EC mit 1 µmol/l freier Eicosapentaensäure bzw. ohne Inkubation mit
freier Fettsäure. Stimulation mit 10 µmol/l FMLP. Alle Daten ± SEM, n=5 für EPA, n=6
ohne FFA.
45
12
Elastase [U/l]
10
8
6
4
ohne FFA
PMN ohne HUVECs
5 µM AA
5 µM EPA
2
0
ohne ASA
30 min. ASA
150 min. ASA
Abbildung 12: Auswirkung der Cyclooxygenaseinhibition mit Acetylsalicylsäure (ASA)
auf die Elastaseaktivität im Zellüberstand. Inhibition über 30 bzw. 150 Minuten. Daten
± SEM, n=3.
46
70
60
LTB4 [nmol/l]
50
40
30
20
ohne FFA
PMN ohne HUVECs
5µM EPA
5µM AA
10
0
ohne ASA
30 min. ASA
150 min. ASA
Abbildung 13: Auswirkung der Cyclooxygenaseinhibition mit Acetylsalicylsäure (ASA)
auf die Ausschüttung von LTB4 in den Zellüberstand. Inhibition über 30 bzw. 150
Minuten. Daten ± SEM, n=3.
47
120
5-HETE [nmol/l]
100
80
60
40
ohne FFA
PMN ohne HUVECs
5µM EPA
5µM AA
20
0
ohne ASA
30 min. ASA
150 min. ASA
Abbildung 14: Auswirkung der Cyclooxygenaseinhibition mit Acetylsalicylsäure (ASA)
auf die Ausschüttung von 5-HETE in den Zellüberstand. Inhibition über 30 bzw. 150
Minuten. Daten ± SEM, n=3.
48
6-t + 6-t,12-e LTB4 [nmol/l]
40
30
20
10
ohne FFA
PMN ohne HUVECs
5µM EPA
5µM AA
0
ohne ASA
30 min. ASA
150 min. ASA
Abbildung 15: Auswirkung der Cyclooxygenaseinhibition mit Acetylsalicylsäure (ASA)
auf die Ausschüttung von LTA4-Zerfallsprodukten (6-trans- und 6-trans,12-epi-LTB4) in
den Zellüberstand. Inhibition über 30 bzw. 150 Minuten. Daten ± SEM, n=3.
49
80
[nmol/l]
60
40
20
LTB 5
6-t + 6-t,12-e
5-HEPE
0
ohne ASA
30 min. ASA
150 min. ASA
Abbildung 16: Auswirkung der Cyclooxygenaseinhibition mit Acetylsalicylsäure (ASA)
auf die Ausschüttung EPA-abgeleiteter Produkte der 5-Lipoxygenase in den
Zellüberstand. Inhibition über 30 bzw. 150 Minuten. Daten ± SEM, n=3.
50
8
7
Elastase [U/l]
6
5
4
ohne FFA
5µM AA
5µM EPA
PMN ohne EC
3
2
1
0
kein
e In
HU
hibi
tion
VEC
s in
hibi
ert
Abbildung 17: Auswirkung der Phospholipase A2-Inhibition der EC auf die
Elastaseaktivität im Zellüberstand. Daten ± SEM, n=3.
51
80
70
LTB4 [nmol/l]
60
50
40
30
20
ohne FFA
5µM AA
5µM EPA
PMN ohne EC
10
0
ke
ine
HU
Inh
ibi
tio
VE
Cs
n
inh
ibi
ert
Abbildung 18: Auswirkung der Phospholipase A2-Inhibition der EC auf die Ausschüttung
von LTB4 in den Zellüberstand. Daten ± SEM, n=3.
52
40
5-HETE [nmol/l]
30
20
10
ohne FFA
5µM AA
5µM EPA
PMN ohne EC
0
ke
ine
HU
Inh
ibi
tio
n
VE
Cs
inh
ibi
ert
Abbildung 19: Auswirkung der Phospholipase A2-Inhibition der EC auf die Ausschüttung
von 5-HETE in den Zellüberstand. Daten ± SEM, n=3.
53
6-t + 6-t,12-e-LTB4 [nmol/l]
20
16
12
8
ohne FFA
5µM AA
5µM EPA
PMN ohne EC
4
0
ke
ine
HU
Inh
ibi
tio
n
VE
Cs
inh
ibi
ert
Abbildung 20: Auswirkung der Phospholipase A2-Inhibition der EC auf die Ausschüttung
von LTA4-Zerfallsprodukten (6-trans- und 6-trans, 12-epi-LTB4) in den Zellüberstand.
Daten ± SEM, n=3.
54
30
[nmol/l]
20
10
LTB 5
6-t+6-t,12-e-LTB 5
5-HEPE
0
ke
ine
HU
Inh
ibi
tio
n
VE
Cs
inh
ibi
ert
Abbildung 21: Auswirkung der Phospholipase A2-Inhibition der EC auf die Ausschüttung
von EPA-abgeleiteten Produkten der 5-Lipoxygenase in den Zellüberstand. Daten ±
SEM, n=3.
55
4.
Diskussion
4.1. Modulation der Immunantwort von PMN durch Eicosapentaensäure
4.1.1. Verminderung der Degranulationsreaktion
Die Freisetzung verschiedener proteolytischer Enzyme und Sauerstoffradikale aus
cytoplasmatischen Granula von PMN spielt eine wichtige Rolle in der gezielten Abwehrreaktion
des Organismus, aber auch in der Entstehung überschießender Abwehrreaktionen, die den
Organismus selbst schädigen. Eine zentrale Rolle nimmt in diesem Zusammenhang die Elastase
ein (3, 51, 52). In den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, daß die Vorinkubation von
Endothelzellen mit Eicosapentaensäure die Degranulationsreaktion von PMN reduziert, während
die vorherige Inkubation mit Arachidonsäure sie erhöht. Diese Beobachtung stimmt überein mit
anderen Untersuchungen: Bates et al. beschreiben eine verminderte Schädigung von
Endothelzell-Monolayern durch PMN, die mit EPA vorbehandelt wurden gegenüber solchen, die
mit AA gefüttert wurden (53). Dieser Effekt ist durch spezifische Elastaseinhibitoren antagonisierbar, also auf eine verminderte Degranulation von Elastase zurückzuführen.
Die Ursache der verminderten Degranulation wurde bisher nicht ermittelt. Denkbar ist
jedoch, daß durch die verminderte Bildung von LTB4 und die damit herabgesetzte autokrine
Stimulation des PMN auch die Degranulationsreaktion herabgesetzt wird. Auch die Modulation
der Signaltransduktion in der Zelle durch EPA könnte eine Rolle spielen (s.unten).
56
4.1.2. Verändertes Profil der Lipoxygenasemetabolite
Die Bildung von LTB4 und 5-HETE durch PMN unter Koinkubation mit Endothelzellen
wird durch die vorherige Inkubation der Endothelzellen mit EPA signifikant gesenkt gegenüber
PMN, die mit AA-vorinkubierten Endothelzellen koinkubiert werden. Dabei ist hervorzuheben,
daß Koinkubation und Stimulation ohne Anwesenheit freier Fettsäuren stattfanden; sämtliche
Effekte sind also auf eine Aufnahme der Fettsäuren in die EC innerhalb der 2 Stunden Inkubationszeit zurückzuführen. Zwar konnte bisher in zahlreichen Untersuchungen gezeigt werden, daß
freie EPA die Bildung von LTB4 durch PMN herabsetzt und die Bildung von LTB5 bewirkt, dies
jedoch entweder bei direkter Zugabe von freier Fettsäure zu isolierten PMN (26, 34) oder nach
längerfristiger oraler Einnahme von EPA-Präparaten durch die Probanden (24, 38).
Die Tatsache, daß die Menge an nichtenzymatischen Zerfallsprodukten des LTA4 bei AAund EPA-Versuchsreihen etwa gleich war zeigt, daß in beiden Fällen LTA4 effektiv metabolisiert
wird, und beispielsweise die geringere LTB4-Produktion in EPA-Versuchen nicht auf einen
vermehrten spontanen Zerfall des LTA4 zurückzuführen ist.
Das Auftreten von Lipoxygenaseprodukten der 5er-Reihe ist darüber hinaus ein weiterer
Beweis für die kooperative Eicosanoidsynthese von PMN und EC (18, 19): Das zur Bildung von
LTB5 und 5-HEPE notwendige Substrat EPA kann den PMN nur von den EC zugeführt worden
sein. EC allein wiederum besitzen nicht die notwendige Enzymausstattung, um LTB5 oder 5HEPE zu synthetisieren.
Es kann also gefolgert werden, daß EC sowohl freie AA als auch freie EPA innerhalb von
wenigen Stunden aufnehmen und auf einen Stimulus hin den PMN wieder zur Verfügung stellen
können. Angesichts der kurzen Inkubationszeit und der relativ niedrigen Konzentration der
Fettsäuren könnte sogar vermutet werden, daß EPA bevorzugt gegenüber AA von den EC wieder
freigegeben bzw. von den PMN metabolisiert wird, da die Gesamtmenge der von vornherein in
57
der Zellmembran gespeicherten AA die Menge der im Versuch zugeführten EPA bzw. AA ja weit
übersteigt. Dies würde die Beobachtung unterstützen, daß EPA gegenüber AA das bevorzugte
Substrat der Lipoxygenase ist (26).
4.1.3. Herabgesetzte Adhärenz von PMN an Endothelzellen
PMN und Endothelzellen treten über Adhäsionsmoleküle miteinander in Kontakt. Dieser
Vorgang kann als erster Schritt in der weiteren Abfolge der Abwehrreaktion wie auch überschießender inflammatorischer Prozesse angesehen werden. Eine Blockade der Adhäsionsmoleküle auf EC verhindert die Rekrutierung von PMN und damit die folgende entzündliche
Reaktion (54). Die enge Kooperation von PMN und EC ist gleichzeitig die Quelle erhöhter
Leukotrienproduktion (55, 56). In den von uns durchgeführten Versuchen konnte eine signifikante Abnahme der Adhärenz stimulierter PMN an solchen EC beobachtet werden, die mit EPA
vorinkubiert worden waren - dies sowohl gegenüber Versuchen mit AA-Vorinkubation, als auch
gegenüber Versuchen ohne Zufuhr freier Fettsäuren. Dieses Ergebnis läßt sich in Einklang
bringen mit Untersuchungen von Collie-Duguid (57), Weber (58), De Caterina (59) und Hoover
(60). Collie-Duguid, Weber und De Caterina fanden eine erniedrigte Expression von VCAM-1Adhäsionsmolekülen auf stimulierten EC nach Behandlung mit EPA oder DHA. Hoover et al.
berichten von erhöhter Adhärenz von PMN auf EC durch Behandlung der EC mit LTB4. Zum
einen scheint also die verminderte Produktion von LTB4 durch PMN, bzw. die alternative
Synthese von LTB5 eine Rolle bei der reduzierten Adhärenz an EC in den vorliegenden Versuchen zu spielen. Zum anderen könnte eine herabgesetzte Expression von Adhäsionsmolekülen
durch die Fütterung mit EPA einen Erklärungsansatz liefern. Im Widerspruch dazu steht eine
Arbeit von Bates et al. (61), in der eine Steigerung der Adhärenz von PMN durch Fütterung
sowohl mit AA als auch mit EPA oder DHA beobachtet wurde. Jedoch wurden dort Versuche
58
nur mit PMN ohne EC durchgeführt, die erhöhte Adhärenz wurde an Kunststoffwells gemessen
und auf eine erhöhte Expression von CD11b-Rezeptoren auf den PMN zurückgeführt. Entscheidend für die effektive Vermittlung der Adhärenz von PMN und EC ist jedoch das Vorhandensein korrespondierender Adhäsionsmoleküle auf beiden Zelltypen. Bei unseren Versuchen
wurden außerdem ausschließlich die EC differentiell mit freien Fettsäuren gefüttert, nicht aber
die PMN.
Ein weiterer Aspekt in der Frage der verminderten Adhärenz von PMN an EC ist die
Rolle von PAF. PAF ist ein Lipidmediator mit vielfältigen biologischen Wirkungen. Unter
anderem kann er als Vermittler der Adhäsion von PMN und EC angesehen werden: Zimmerman
et al. belegen, daß erst durch die Koexpression von Selectin und PAF auf der Zelloberfläche von
EC nach Stimulation der Übergang vom Rollen der PMN zu einer festen Adhäsion und folgender
Transmigration der PMN zustandekommt (62, 63). In bisher unveröffentlichten Untersuchungen
von Mayer et al. konnte gezeigt werden, daß EC-Monolayer, die mit EPA inkubiert wurden,
weniger PAF exprimieren als solche, die mit AA inkubiert wurden. Eine mögliche Ursache dafür
wäre die Metabolisierung von PAF: PAF unterliegt einem schnellen Ab- und Aufbau durch eine
Deacylierung bzw. Reacylierung, bei der AA an der sn2-Position des Phospholipids eingebaut
wird. In Versuchen mit PMN, denen EPA zugeführt worden war, wurde statt AA teilweise EPA
in den PAF-Precursor eingebaut (64). Dieser Einbau von EPA erscheint auch für in EC
vorhandenen PAF-Precursor möglich. Auf diesem Weg könnte die Funktion von PAF moduliert
und in der Folge seine Exprimation auf der Zelloberfläche herabgesetzt werden.
Neben der Vermittlung der Adhärenz ist PAF auch ein potenter Stimulus für Chemotaxis
und Degranulation von PMN (65). Eine durch EPA modulierte Funktion von PAF könnte also
auch bei der oben beschriebenen reduzierten Degranulationsreaktion der PMN eine Rolle spielen.
59
4.1.4. Veränderung der Signaltransduktion
Auf eine Modulation der Signaltransduktion in PMN deuten die Ergebnisse bezüglich der
Bildung von Inositolphosphaten (IP) hin. Der Weg der Signalübermittlung über Inositolphosphate
wird von vielen Hormonen, Neurotransmittern, Wachstumsfaktoren u.ä. genutzt. Diese aktivieren
Phospholipase C, die Phosphatidylinositolbisphosphat zu -trisphosphat hydrolysiert, welches
wiederum einen Ca2+-Einstrom in die Zelle bewirkt und damit zahlreiche Effektormechanismen
in Gang setzt (66, 67). Zu den Folgen gehören im Falle von PMN u.a. Degranulation,
respiratorische Burstreaktion und Lipidmediatorproduktion. In vorliegenden Versuchen zeigt die
IP-Bildung in PMN, die mit EPA-gefütterten EC inkubiert wurden, einen deutlich verzögerten
Anstieg. Die Verzögerung liegt im Bereich mehrerer Minuten, und der charakteristische frühe
Peak der IP-Bildung ist nicht mehr zu erkennen.
Sperling et al. zeigten einen ähnlichen Effekt bei PMN von Spendern, die 3-10 Wochen
lang eine EPA-reiche Diät bekommen hatten (38). Dort wurde die Bildung von Inositolphosphaten bereits nach 15 Sekunden gestoppt. Ergebnis war eine deutlich geringere Produktion von
IP3 in solchen PMN, die unter dem Einfluß der EPA-Diät gestanden hatten. Dies bestätigt unsere
Ergebnisse, die ebenfalls eine deutlich geringere IP-Menge zu einem frühen Zeitpunkt nach
Stimulation in der EPA-Gruppe zeigen. Sperling führt diese Änderung u.a. auf eine sterische
Inhibition der spezifischen Phospholipase C durch EPA zurück.
Daß die Signaltransduktion der PMN moduliert wird, wenn sie mit EC koinkubiert
werden, die vorher mit EPA inkubiert waren, könnte zum einen an der - oben beschriebenen veränderten Exprimation von PAF an der EC-Zelloberfläche liegen, mit konsekutiver Veränderung der Adhärenzzustände der PMN und veränderter Interaktion der Zellen. Zum anderen
könnte die verminderte LTB4-Synthese und die vermehrte Bildung von EPA-abgeleiteten
Metaboliten die autokrine Stimulation (autokriner loop) der PMN beeinflussen: Sowohl PAF als
60
auch LTB4 können die Second-Messenger-Reaktion (und damit die Inositolphosphatbildung)
auslösen bzw. verstärken, was wiederum zu vermehrter LTB4-Produktion durch PMN führt und
die Second-Messenger-Produktion erhöht usw. Eine geringere PAF- bzw. LTB4-Produktion
könnte also auch die Bildung von Second-Messenger-Produkten modulieren.
Ein weiteres Feld der Signaltransduktion, auf dem die antiinflammatorische Wirksamkeit
der Eicosapentaensäure ihren Ursprung haben könnte, ist der direkte Angriff am Zellkern: Neuere
Untersuchungen zeigen, daß freie Fettsäuren an den Peroxisomen Proliferations-Aktivator
Rezeptor α (PPARα) des Zellkerns binden können, der die Expression von u.a. für den
Lipidmetabolismus wichtigen Genen steuert (68, 69, 70). Allerdings bedarf es weiterer Untersuchungen, um zu erforschen, ob EPA auch auf diesem Level einen Einfluß auf die Signaltransduktion hat.
4.2. Bedeutung der Cyclooxygenase und Phospholipase A2 für die
immunmodulierende Wirkung von EPA am Inkubationsmodell
4.2.1. Bedeutung der Cyclooxygenase
In den durchgeführten Versuchen hatte die Inhibition der Cyclooxygenase von PMN und
EC keinen signifikanten Einfluß auf die Bildung von Lipoxygenaseprodukten und Elastase.
Durch die Hemmung der Cyclooxygenase wird der zweite wichtige Abbauweg der AA (neben
dem Lipoxygenaseweg) gehemmt. Produkte der Cyclooxygenase sind die Thromboxane und
Prostaglandine, die ihrerseits teils proinflammatorische, teils antiinflammatorische Wirkung
besitzen. Ziel der Inhibition war es, mögliche Einflüsse der Cyclooxygenaseprodukte im Hinblick
auf die antiinflammatorische Wirkung der EPA herauszufiltern und die alleinige Auswirkung der
61
Lipoxygenaseprodukte beurteilen zu können. In früheren Untersuchungen am Tiermodell konnte
gezeigt werden, daß eine Inhibition der Cyclooxygenase die Wirkung der EPA teilweise aufheben
konnte, so z.B. die herabgesetzte Vasokonstriktion in der pulmonalen Strombahn nach
Stimulation (32). Auch wurden - ebenfalls am Tiermodell - höhere Mengen an Leukotrienen
gefunden, was auf eine höhere Menge an verfügbarem Substrat für die Lipoxygenase
zurückgeführt wurde. Ein solcher Effekt trat in den hier beschriebenen Versuchen nicht auf. Auch
Bates et al. (53) fanden in ihren Versuchen mit koinkubierten PMN und EC, in denen allerdings
die PMN mit freier Fettsäure behandelt wurden, keinen Effekt einer Cyclooxygenasehemmung
in Bezug auf die Elastasefreisetzung. Eine mögliche Erklärung dafür wäre die Tatsache, daß zwar
einerseits die verfügbare Substratmenge für die Lipoxygenase unter Cyclooxygenasehemmung
erhöht ist, andererseits aber auch die zusätzliche Stimulation durch Prostaglandine fehlt, so daß
beide Effekte sich nivellieren. Jedenfalls scheint die An- oder Abwesenheit der
Cyclooxygenaseprodukte keinen entscheidenden Einfluß auf die antiinflammatorische Wirkung
von EPA gegenüber AA am vorliegenden Modell zu haben.
4.2.2. Bedeutung der Phospholipase A2
Phospholipasen spalten Fettsäuren aus den Phospholipidpools der Zellmembranen ab und
sorgen somit für das Substrat $freie Fettsäure#, das Lipoxygenasen zur Bildung von Leukotrienen
benötigen (71, 72). Eine Hemmung der Phospholipase A2 der EC müsste also zu einer
verminderten Bildung von Leukotrienen durch die PMN führen, wenn diese wirklich von den EC
mit Arachidonsäure bzw. Eicosapentaensäure versorgt werden (kooperative Eicosanoidsynthese).
Dies wäre gleichzeitig ein Zeichen dafür, daß die in den Versuchen gefütterten freien Fettsäuren
wirklich in die Phospholipidpools der EC eingebaut wurden und somit der kontrollierten
Freisetzung durch Phospholipasen unterlagen.
62
Dieser Effekt konnte in den durchgeführten Versuchen gezeigt werden: Unter Inhibition
der Phospholipase A2 der EC sank die Bildung von Leukotrienen sowohl der 4er- als auch der
5er-Reihe deutlich ab. Gleichzeitig verschwand der Elastase- und LTB4-supprimierende Effekt
der EPA-Zufuhr. Daraus kann zunächst geschlossen werden, daß freie AA und EPA bereits nach
2stündiger Inkubation in den Phospholipidpools der EC gespeichert werden, denn offensichtlich
ist Phospholipase A2 erforderlich, um die vorher gezeigten Effekte hervorzurufen. Außerdem
kann aus den vorliegenden Ergebnissen auf eine zentrale Rolle der 5er-Reihe der Leukotriene als
Vermittler der antiinflammatorischen Wirkung von EPA geschlossen werden: Bei Reduktion der
5er-Produkte läßt sich auch kein antiinflammatorischer Effekt mehr zeigen. Darüber hinaus
bestätigt dieses Ergebnis die kooperative Eicosanoidsynthese von PMN und EC, denn es
entstehen deutlich weniger Lipoxygenaseprodukte, wenn selektiv die Phospholipase der EC
inhibiert wird, d.h. diese den PMN kein Substrat mehr liefern können.
63
5.
Zusammenfassung
Die Interaktion von Polymorphkernigen Neutrophilen Granulozyten und Endothelzellen
spielt eine zentrale Rolle in der Enstehung inflammatorischer Erkrankungen der Lunge. Ausgehend von der Notwendigkeit parenteraler Zufuhr von Lipiden bei schwerstkranken Patienten und
dem Wissen um die proinflammatorischen Wirkungen der darin enthaltenen Arachidonsäure
sollte in der vorliegenden Arbeit der Wirkung einer alternativen Fettsäure, der aus Fischölen
gewonnenen ω-3-Fettsäure Eicosapentaensäure, nachgegangen werden. Fischöle stehen inzwischen zur alternativen parenteralen Zufuhr zur Verfügung. Daher sollte geprüft werden, ob
Endothelzellen angebotene freie Fettsäuren innerhalb kurzer Zeit aufnehmen, und ob sich die
Fettsäurezufuhr auf eine spätere Koinkubation mit Granulozyten im Hinblick auf deren Immunantwort auswirkt. Des weiteren wurden Ansätze untersucht, die eine Erklärung für die Modulation der Immunantwort liefern könnten.
Als Parameter zur Erfassung der Immunantwort der Granulozyten dienten Leukotriene
als Lipidmediatoren, Elastase als proteolytisches Enzym bei Degranulationsreaktionen, sowie die
Adhärenz von PMN an EC und die Bildung von Second-Messenger-Produkten durch PMN. Die
Zellen wurden in vitro isoliert, koinkubiert und mit dem Calcium-Ionophor A 23187 bzw. mit
FMLP stimuliert.
Sowohl bei der Elastase- als auch bei der Leukotrienproduktion der Granulozyten konnte
die antiinflammatorische Wirkung der EPA gezeigt werden. Zusammen mit dem Auftreten der
von EPA abgeleiteten von den Granulozyten produzierten Lipidmediatoren zeigt dies die
effektive Aufnahme der EPA durch die Endothelzellen und deren Bereitstellung bei darauffolgender Stimulation. Dies konnte noch erhärtet werden durch die Hemmung der Phospholipase
A2 der Endothelzellen, die den positiven Effekt der EPA teilweise wieder aufhob. Demgegenüber
64
blieb eine Inhibition der Cyclooxygenase weitgehend ohne Effekt.
Des weiteren konnte die Herabsetzung der Adhärenz von PMN an EPA-gefütterten
Endothelzellen nachgewiesen werden. Die Messung der Second-Messenger-Bildung anhand der
Inositolphosphatproduktion sollte den Einfluß von EPA auf die Signaltransduktion in der Zelle
klären. Hier zeigte sich eine Modulation der Signalantwort von PMN im Sinne einer verzögerten
Bildung von Inositolphosphaten.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die parenterale Zufuhr von Lipidemulsionen auf Basis von
ω-3-Fettsäuren eine hemmende Wirkung auf inflammatorische Prozesse im Organismus haben
kann, da EPA von Endothelzellen innerhalb kurzer Zeit gespeichert wird und hierüber die
Immunantwort von endotheladhärenten PMN beeinflußt.
65
6.
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71
7.
Lebenslauf
Persönliche Daten
geboren am 11.4.1969 in Wiedenest als Sohn von Daniel Herm und seiner Ehefrau Marlis
Herm, geb. Hüsken.
seit 1994 verheiratet mit Karin Herm, geb. Wenk, Redakteurin
1998 Geburt von Maximilian Herm
2002 Geburt von Paul Herm
Schulausbildung
1975-79 Gemeinschaftsgrundschule Bergneustadt
1979-88 Wüllenweber-Gymnasium Bergneustadt, Abitur Juni 1988
Zivildienst
1988 bis 1990 im Evangelischen Krankenhaus Bad Godesberg
Hochschulausbildung
1990 bis 1997 Studium der Humanmedizin an der Justus-Liebig-Universität Gießen
1992 Ärztliche Vorprüfung
1993 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
1995 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
1997 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
1995 bis 1996 experimenteller Teil der Dissertation bei Prof. Dr. W. Seeger und Prof. Dr.
Dr. F. Grimminger in der Klinischen Forschergruppe $Respiratorische Insuffizienz# am
Zentrum für Innere Medizin der JLU Gießen
Berufliche Weiterbildung
07/1997 bis 09/1999 Arzt im Praktikum und Assistenzarzt im Hochwaldkrankenhaus Bad
Nauheim, Abteilung für Anästhesie und Intensivmedizin
01/1999 Approbation als Arzt
seit 10/1999 Assistenzarzt im Leopoldina-Krankenhaus Schweinfurt, Institut für
Anästhesie und operative Intensivmedizin
72
8.
Danksagung
Bei allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, möchte ich mich sehr
herzlich bedanken.
Mein Dank gilt zunächst Herrn Prof. Dr. Seeger und Herrn Prof. Dr. Dr. F. Grimminger
dafür, daß sie diese Dissertation ermöglicht und in jeder Hinsicht unterstützt haben.
Ganz herzlich danke ich Herrn Dr. K. Mayer für seine engagierte und ausdauernde
Betreuung, die entscheidend zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
Ebenso möchte ich mich bei Frau Dipl. Biol. S. Gokorsch und den Mitarbeitern der
Arbeitsgruppe Prof. Grimminger für ihre wichtige und tatkräftige Hilfe während der Arbeit im
Labor bedanken.
Nicht zuletzt danke ich meiner Frau Karin für ihre Geduld und Unterstützung.
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