User manual | Dissertation Michael Cornelius

INAUGURAL – DISSERTATION
ZUR
ERLANGUNG DER DOKTORWÜRDE
DER
NATURWISSENSCHAFTLICH-MATHEMATISCHEN GESAMTFAKULTÄT
DER
RUPRECHT – KARLS – UNIVERSITÄT
HEIDELBERG
VORGELEGT VON
APOTHEKER MICHAEL GÜNTER CORNELIUS
AUS MANNHEIM
TAG DER MÜNDLICHEN PRÜFUNG: 4. MAI 2006
ANALYSE VON DNA- UND RNA-MODIFIKATIONEN DURCH
FLUORESZENZ-POSTLABELING MIT BODIPY UND
KAPILLARELEKTROPHORESE MIT LASER-INDUZIERTER
FLUORESZENZDETEKTION
Gutachter:
PD Dr. Heinz H. Schmeiser
Prof. Dr. Gert Fricker
AUS DER ABTEILUNG
MOLEKULARE TOXIKOLOGIE
LEITER: PROF. DR. RER. NAT. MANFRED WIEßLER
AM DEUTSCHEN KREBSFORSCHUNGSZENTRUM HEIDELBERG
DIESE ARBEIT WURDE DURCH EIN PROMOTIONSSTIPENDIUM
DER DEUTSCHEN BUNDESSTIFTUNG UMWELT GEFÖRDERT
AZ: 264/2002
Meinen Eltern
Zusammenfassung
Michael Günter Cornelius, Apotheker, Tag der mündlichen Prüfung: 04.05.2006
Analyse von DNA- und RNA-Modifikationen durch Fluoreszenz-Postlabeling mit
BODIPY und Kapillarelektrophorese mit Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion
Referent:
Koreferent:
PD Dr. Heinz H. Schmeiser
Prof. Dr. Gert Fricker
90% aller Substanzen, die beim Menschen Krebs auslösen, verursachen strukturelle
Veränderungen an der DNA, sie wirken genotoxisch durch Bildung von Addukten bzw.
Modifikationen. Diese DNA-Modifikationen können endogenen oder exogenen Ursprungs
sein. Die Detektion und Analyse von DNA-Modifikationen ist daher von großer Bedeutung,
nicht nur für die Bestimmung der biologisch effektiven Dosis der genotoxischen Substanz,
sondern auch für die Aufklärung des Zusammenhangs zwischen Exposition und Krebsrisiko.
Da DNA-Addukte in vivo nur in geringen Konzentrationen auftreten, ergeben sich höchste
Anforderungen an eine Analysen-Methode zu ihrem Nachweis.
In dieser Arbeit wurde eine neue Methode zum Nachweis von DNA- und RNAModifikationen entwickelt und validiert.
Sie beruht auf der enzymatischen Hydrolyse von DNA bzw. RNA zu Nukleosid-5’Monophosphaten, deren chemischer Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff (BODIPYFL-EDA), sich anschließender Trennung mit mizellarer elektrokinetischer Chromatographie
und Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion (CE-LIF).
Zur Methodenentwicklung wurden sowohl synthetische Standardverbindungen der
Modifikationen, modifizierte 2’-Desoxy- und Ribo-Oligonukleotide, als auch definiert
modifizierte Lambda-DNA eingesetzt. Die neue Methode ist in der Lage verschiedene, durch
oxidativen Stress und Deaminierungen verursachte DNA-Modifikationen (8-Oxo-Guanin, 8Oxo-Adenin, Uracil, Inosin), sowie die epigenetisch interessanten Methyl-Modifikationen
von Cytosin und Adenin (5-Methylcytosin, N6-Methyladenin) mit hoher Präzision,
Selektivität und Empfindlichkeit nachzuweisen. Die Nachweisgrenze der DNAModifikationen lag bei 100pM (50attomol, 3 Addukte je 107 normale Nukleotide) für N6Methyladenin, 200pM (ca. 100attomol, 6 Addukte je 107 normale Nukleotide) für Uracil und
Inosin und 1nM für 8-Oxo-Guanin und 8-Oxo-Adenin (0.3 Addukte je 107 normale
Nukleotide), die der RNA-Modifikationen bei 80pM (40attomol, 2 Addukte je 107 normale
Nukleotide) für Pseudouracil und 2’-O-Methyladenin. Die schlechtere Detektierbarkeit der
Guanin-Modifikationen konnte auf eine basenspezifische Fluoreszenzlöschung des
Farbstoffes zurückgeführt werden.
Mit der validierten Methode wurden verschiedene Basenmodifikationen in in vitro
modifizierter Kalbsthymus-DNA und der Anteil der natürlich vorkommenden, seltenen Base
Pseudouracil in RNA verschiedener Organismen bestimmt.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Analysenbedingungen der älteren Variante der
Methode, die auf dem Verdau von DNA zu 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphaten mit
anschließender Fluoreszenzmarkierung und CE-LIF Analyse beruht, optimiert. Hiermit
gelang es verschiedene Deaminierungsprodukte und oxidative Schäden in in vitro behandelter
Kalbsthymus-DNA zu bestimmen. In Bezug auf ihre Empfindlichkeit und Genauigkeit
erwiesen sich beide Varianten als gleichwertig. Des Weiteren wurde speziell für N6Methyladenin eine Analysenmethode ausgearbeitet und validiert, und so der AdeninMethylierungsgrad von Lambda-DNA aus Wildtyp E. coli bestimmt (0.59%).
Summary
Michael Günter Cornelius, Pharmacist, Oral Examination: 04.05.2006
Analysis of DNA and RNA modifications using fluorescence postlabeling and capillary
electrophoresis with laser-induced fluorescence detection
Supervisor:
Co-Supervisor:
PD Dr. Heinz H. Schmeiser
Prof. Dr. Gert Fricker
90% of all substances that cause cancer in humans are genotoxic by exerting their biological
effects through the formation of structural changes of DNA, so called DNA modifications or
DNA adducts. Detection and analysis of these DNA modifications resulting from endogenous
or exogenous exposures to carcinogens is essential not only for quantifying biologically
effective doses, but also for establishing relationships between exposure and cancer risk.
Since DNA adducts are only present in minute quantities in vivo, analytical methods for their
detection have to meet high demands.
In this work a new analytical method for the detection of DNA and RNA modifications was
developed and validated.
The method is based on enzymatic hydrolysis of DNA or RNA to nucleoside-5’monophosphates, chemical derivatization with a fluorescent dye (BODIPY-FL-EDA) and
subsequent separation by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection
(CE-LIF).
Method development was carried out using synthetic DNA adduct standards, modified 2’deoxy- and ribooligonucleotides as well as defined modified lambda-phage DNA. The new
method has the ability to detect a wide range of DNA modifications caused by oxidative
stress and deamination (8-oxo-guanine, 8-oxo-adenine, uracil, inosine) as well as the
epigenetically important methyl modifications of cytosine and adenine (5-methylcytosine, N6methyladenine) with high precision, selectivity and sensitivity. The limit of detection for the
examined DNA modifications was found to be in a range from 100pM (ca. 50attomole, 3
adducts per 107 normal nucleotides) for N6-methyladenine, 200pM (ca. 100attomole, 6
adducts per 107 normal nucleotides) for uracil and inosine to 1nM for 8-oxo-guanine, 8-oxoadenine (3 adducts per 106 normal nucleotides). For RNA modifications the limit of detection
was approximately 80pM (40attomole, 2 adducts per 107 normal nucleotides) for pseudouracil
and 2’-O-methyladenosine. The higher detection limit for modifications of the nucleobase
guanine could be ascribed to a base specific fluorescence quenching effect.
The validated method was used to detect various base modifications in in vitro modified calf
thymus DNA and to determine the amount of the naturally occurring rare base pseudouracil in
RNA of different organisms.
In the second part of this thesis the separation conditions of an older version of the
fluorescence postlabeling method, which is based on DNA digestion to 2’-deoxnucleoside-3’monophosphates, fluorescence labeling with BODIPY-FL-EDA and CE-LIF analysis, was
optimised. Using the modified procedure different deamination products and oxidative
damage in in vitro modified calf thymus DNA were determined. Both versions of the
fluorescence postlabeling method turned out to be equally efficient and sensitive. Furthermore
an analytical method for the detection of N6-methyladenine was devised and validated. Using
this method it was possible to quantify the methylation level of adenine in lambda DNA of
wild-type E. coli (0.59%)
VERÖFFENTLICHUNGEN
Publikationen:
Bieler CA, Cornelius MG, Klein R, Arlt VM, Wiessler M, Phillips DH, Schmeiser HH
DNA adduct formation by the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone after
intratracheal instillation in rats. International Journal of Cancer, 116 (2005) 833-38;
Cornelius MG, Wörth CCT, Kliem H-C, Wießler M, Schmeiser HH
Detection and separation of nucleoside-5’-monophosphates of DNA by conjugation with the
fluorescent dye BODIPY and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence
detection. Electrophoresis, 26 (2005) 2591-98;
Poster-Präsentationen:
46. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie (DGPT),
Mainz, 15.-17. März 2005;
Cornelius MG, Bieler CA, Klein R, Arlt VM, Wiessler M, Phillips DH, Schmeiser HH
DNA adduct formation by the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone after
intratracheal instillation in rats
Naunyn-Schmiedeberg´s Archives of Pharmacology, 371 (2005), R111 (Suppl. 1)
35th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society (EEMS2005), Kos,
Griechenland, 3.-7. Juli 2005;
Cornelius MG, Wörth CCT, Kliem H-C, Wießler M, Schmeiser HH
Detection and separation of nucleoside-5’-monophosphates of DNA by conjugation with the
fluorescent dye BODIPY and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence
detection
European Journal of Genetic Toxicology, Juli 2005
Vorträge:
5. 32P-Postlabeling-Workshop, 29.-30. April 2003, Schering AG, Berlin;
Anwendungen der Kapillarelektrophorese mit Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion zur
Analyse von DNA-Addukten
Inhaltsverzeichnis
I Inhaltsverzeichnis
II
Abkürzungsverzeichnis
1
Einleitung
1
2
Theoretischer Hintergrund
3
2.1
2.2
2.3
2.3.1
2.3.1.1
2.3.1.2
2.3.1.3
2.3.1.4
2.3.1.5
2.3.2
2.3.2.1
2.3.2.2
2.3.2.3
2.3.2.4
2.3.3
2.4
2.4.1
2.4.2
2.5
2.5.1
2.5.2
2.5.2.1
2.5.2.2
2.5.2.3
2.5.2.4
2.5.2.5
2.6
2.6.1
iii
Chemische Kanzerogenese
Metabolische Aktivierung chemischer Kanzerogene
Endogene und exogene Kanzerogene
Exogene Kanzerogene
Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe
Aromatische Stickstoffverbindungen
Alkylantien
α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen
Naturstoffe
Endogene Kanzerogene
DNA-Schädigung durch endogene Oxidation
DNA-Schädigung durch Fettsäureoxidation
Reaktive Stickstoffspezies
Spontane hydrolytische Deaminierung und Apurinische Stellen
DNA-Methylierung
RNA-Modifikationen
Natürliche RNA-Modifikationen
RNA-Schäden (Addukte)
Nachweismethoden für DNA-Addukte
32
P-Postlabeling
Kapillarelektrophorese mit Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion
Grundlagen der Fluoreszenz
Fluoreszenzlöschung (Quenching)
Laser-induzierte Fluoreszenzdetektion (LIF)
Grundlagen der Kapillarelektrophorese
Kapillarelektrophoretische Methoden
Theoretischer Hintergrund – Fluoreszenzmarkierung
Fluoreszenzmarkierung von Mononukleotiden
3
4
4
5
5
5
7
7
8
8
8
9
9
10
10
12
12
13
13
14
16
16
17
17
18
20
21
21
3
Aufgabenstellung
25
4
Ergebnisse und Diskussion
26
Stand der Forschung
Fluoreszenzmarkierung von 2’-Desoxynukleosid-5’-Phosphaten
Vergleich der Kopplungsausbeuten von Nukleosid-3’- und -5’-Monophosphaten
Fluoreszenzmarkierung von pdNs und dNps mit BODIPY-FL-EDA
Entwicklung alternativer Hydrolyseverfahren für DNA
Überprüfung neuer Puffersysteme
Überprüfung der Hydrolyse mit dem 32P-Postlabeling-Verfahren
Hydrolyse von DNA mit DNaseI/SVPD
Hydrolyse von DNA mit Nuklease P1
Methodenentwicklung zur kapillarelektrophoretischen Trennung von
5-Methyl-2’-Desoxycytosin-5’-Phosphat-Bodipy (p5mdC-Bodipy)
Die 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
Validierung
Bestimmung der Nachweisgrenze
Reproduzierbarkeit und Präzision der 5’-Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
Bestimmung der Linearität des Messbereiches
Bestimmung der Korrekturfaktoren
Nachweis von natürlichen DNA-Schäden
Analyse von Deaminierungsprodukten
26
29
30
31
34
34
36
38
39
4.1
4.2
4.2.1
4.2.2
4.3
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.3.4
4.3.5
4.4
4.4.1
4.4.1.1
4.4.1.2
4.4.1.3
4.4.1.4
4.4.2
4.4.2.1
41
46
46
50
52
53
54
58
62
i
Inhaltsverzeichnis
4.4.2.2
4.4.2.3
4.4.3
4.4.3.1
4.4.3.2
4.4.3.3
4.4.3.4
4.5
4.5.1
4.5.2
4.5.3
4.5.4
4.5.4.1
4.5.4.2
4.5.5
4.6
4.6.1
4.6.1.1
4.6.1.2
4.6.2
4.6.3
4.6.4
4.6.5
4.6.5.1
4.7
4.7.1
4.7.1.1
4.7.1.2
4.7.1.3
4.7.1.4
4.7.2
4.7.2.1
4.7.3
5
Nachweis von Uridin in Bisulfit-behandelter CT-DNA
Nachweis von Deaminierungsprodukten in Nitrit-behandelter CT-DNA
Nachweis von veränderten Basen in 2’-Desoxy-Oligonukleotiden
N6-Methyl-2’-Desoxyadenosin
1,N6-Etheno-2’-Desoxyadenosin
8-Oxo-2’-Desoxyguanosin
8-Oxo-2’-Desoxyadenosin
Analyse von RNA mittels CE-LIF
Methodenentwicklung
Kapillarelektrophoretische Trennung von 2’-Desoxy- und Ribonukleosid-5’-Phosphaten
Nachweis von Pseudouracil und 2’-O-Methyladenosin in Oligoribonukleotiden
durch Fluoreszenz-Postlabeling und CE-LIF
Validierung der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode für Ribonukleosid-5’-Phosphate
Bestimmung der Nachweisgrenze
Linearität des Messbereichs, Reproduzierbarkeit und Präzision der Analyse
RNA-Analysen (verschiedene Organismen und tRNA)
Weiterentwicklung der 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling Methode
Analyse von 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphat Addukt-Standards
Analyse von Aminobiphenyl-Addukten
Fluoreszenzspektroskopie von BODIPY-FL-EDA
Untersuchung des 1,N2-Propano-2’-Desoxyguanosin Adduktes von Trans-2-Hexenal
mit der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
Untersuchungen von 8-Oxo-2’-Desoxyguanosin-3’-Phosphat (8-oxo-dGp) in DNA
Nachweis von 2’-Desoxyinosin-3’-Phosphat in DNA
Entwicklung einer Analysenmethode zur Bestimmung von N6-Methyladenosin mit der
3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
In vitro dam Methylierung von Lambda-DNA
Abschliessende Diskussion
Vergleich der Fluoreszenz-Postlabeling-Methoden
Nachweisgrenzen
Reproduzierbarkeit
Migrationsverhalten bei der kapillarelektrophoretischen Trennung
Analysendauer
Korrekturfaktoren und Quenching-Effekte
Beziehung zwischen Struktur und Signalintensität
Ausblick
64
67
70
71
73
76
82
84
86
90
91
96
96
98
99
106
106
106
112
116
119
128
130
134
139
139
140
140
140
142
143
144
147
Experimenteller Teil
148
Geräte und Materialien
Methoden
32
P-Postlabeling Analysen
Fluoreszenzmarkierung enzymatischer DNA- und RNA-Hydrolysate
Kapillarelektrophorese
In vitro Systeme
Synthese von Addukt-Standardverbindungen
148
152
152
156
159
163
166
6
Literaturverzeichnis
169
7
Danksagungen
180
5.1
5.2
5.2.1
5.2.2
5.2.3
5.2.4.
5.3
ii
Abkürzungsverzeichnis
II Abkürzungsverzeichnis
λ-DNA
µg
µl
µm
µM
3-NBA
4-ABP
5mC
5mdCp
5mdCp-Bodipy
8-oxo-dGp
8-oxo-dGp-Bodipy
8-oxo-pdG
8-oxo-pdG-Bodipy
AA I
AA II
ATP
amol
B[a]P
BODIPY-FL-EDA
C
CE
CGE
CHAPS
Cisplatin
cm
CTAB
CT-DNA
CZE
dA-AA I,II
dAp
dAp-Bodipy
dCp
dCp-Bodipy
DCC
DDT
dG-AA I,II
dGp
dGp-Bodipy
DMF
DMSO
DNA
DNaseI
Dnmt
dNp
dNp-Bodipy
EDC
ELISA
EOF
ESI
ESI-DAU (X)
etheno-dAp
etheno-dAp-Bodipy
etheno-pdA
etheno-pdA-Bodipy
fM
FLNS
Lambda-Phagen-DNA
Mikrogramm (10-6g)
Mikroliter (10-6l)
Mikrometer (10-6m)
Mikromolar (10-6mol/l)
3-Nitro-7H-benz[d,e]anthracen-7-on (3-Nitrobenzanthron)
4-Aminobiphenyl
5-Methylcytosin
5-Methyl-2’-Desoxycytidin-3’-Phosphat
5-Methyl-2’-Desoxycytidin-3’-Phosphat Bodipy-Konjugat
8-Oxo-7,8-Dihydro-2’-Desoxyguanosin-3’-Monophosphat
8-Oxo-7,8-Dihydro-2’-Desoxyguanosin-3’-Monophosphat Bodipy Konjugat
8-Oxo-7,8-Dihydro-2’-Desoxyguanosin-5’-Monophosphat
8-Oxo-7,8-Dihydro-2’-Desoxyguanosin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
Aristolochiasäure I
Aristolochiasäure II
Adenosintriphosphat
Attomol (10-18mol)
Benzo[a]pyren
4,4-Difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionylethylendiaminhydrochlorid
Cytosin
Kapillarelektrophorese
Kapillargelelektrophorese
3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxypropansulfonat
cis-Diamindichlorplatin(II)
Zentimeter (10-2m)
Hexadecyl-trimethylammoniumchlorid
Kalbsthymus-DNA, calf thymus DNA
Kapillarzonenelektrophorese
7-(2’-Desoxyadenosin-N6-yl)-Aristolactam I,II
2’-Desoxyadenosin-3’-Monophosphat
2’-Desoxyadenosin-3’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
2’-Desoxycytidin-3’-Monophosphat
2’-Desoxycytidin-3’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
N,N’-Dicyclohexylcarbodiimid
1,1-(p,p’-Dichlordiphenyl)-2-trichlorethan
7-(2’-Desoxyguanosin-N2-yl)-Aristolactam I,II
2’-Desoxyguanosin-3’-Monophosphat
2’-Desoxyguanosin-3’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
N,N-Dimethylformamid
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
DNaseI aus Rinderbauchspeicheldrüse
DNA-Methyltransferase
2’-Desoxynukleosid-3’-Monphosphat
2’-Desoxynukleosid-3’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid
enzyme-linked immunosorbent assay
elektroosmotischer Fluß
electrospray-ionization
Tochterionenspektrum der Verbindung der Masse X
1,N6-Etheno-2’-Desoxyadenosin-3’-Monophosphat
1,N6-Etheno-2’-Desoxyadenosin-3’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
1,N6-Etheno-2’-Desoxyadenosin-5’-Monophosphat
1,N6-Etheno-2’-Desoxyadenosin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
Femtomolar (10-15 mol/l)
fluorescence-line-narrowing spectroscopy
iii
Abkürzungsverzeichnis
FQY
GC
GLY
GSH
H 2O 2
HEPES
HPLC
IARC
HSA
Leff
Lges
LIF
LOD
M
MALDI-TOF
MeIQ
MEKC
MES
mg
mM
MN
mRNA
MS
MSP
N6mA
N6mdAp
N6mdAp-Bodipy
N6mpdA
N6mpdA-Bodipy
nl
nm
nM
nmol
NMR
NP1
PAH
PCR
p5mdC
pdA
pdA-Bodipy
pdC
pdC-Bodipy
pdG
pdG-Bodipy
pdI
pdI-Bodipy
pdN
pdN-Bodipy
pdR
pdU
pdU-Bodipy
pH
PhIP
pKs
pM
prA
prA-Bodipy
prC
prC-Bodipy
prG
iv
Fluoreszenzquantenausbeute (fluorescence quantum yield)
Gaschromatographie
Glycinethylester
Glutathion
Wasserstoffsuperoxid
N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N’-2-ethansulfonsäure
high performance liquid chromatography
International Agency for Research on Cancer
humanes Serumalbumin
effektive Länge der Kapillare bis zum Detektionsfenster
Gesamtlänge der Kapillare
Laser-induzierte Fluoreszenz
limit of detection, Nachweisgrenze
Molar (1mol/l)
matrix-assisted laser-desorption ionization – time-of-flight
2-Amino-3,4-dimethylimidazol[4,5-f]chinolin
micellare elektrokinetische Chromatographie
2-(N-morpholino)-ethansulfonsäure
Milligramm (10-3g)
millimolar (10-3mol/l)
Mikrokokkennuklease
messenger RNA
Massenspektrometrie
methylation specific PCR
N6-Methyladenin
N6-Methyl-2’-Desoxyadenosin-3’-Monophosphat
N6-Methyl-2’-Desoxyadenosin-3’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
N6-Methyl-2’-Desoxyadenosin-3’-Monophosphat
N6-Methyl-2’-Desoxyadenosin-3’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
Nanoliter (10-9l)
Nanometer (10-9m)
nanomolar (10-9mol/l)
Nanomol (10-9mol)
nuclear magnetic resonance
Nuklease P1
polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe
Polymerase-Kettenreaktion
5-Methyl-2’-Desoxycytidin-5’-Monophosphat
2’-Desoxyadenosin-5’-Monophosphat
2’-Desoxyadenosin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
2’-Desoxycytidin-5’-Monophosphat
2’-Desoxycytidin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
2’-Desoxyguanosin-5’-Monophosphat
2’-Desoxyguanosin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
2’-Desoxyinosin-5’-Monophosphat
2’-Desoxyinosin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
2’-Desoxynukleosid-5’-Monophosphat
2’-Desoxynukleosid-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
2’-Desoxyribose-5’-Monophosphat
2’-Desoxyuridin-5’-Monophosphat
2’-Desoxyuridin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
potentia hydrogenii
2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin
Logarithmus der Dissoziationskonstante der protonierten Form
picomolar (10-12mol/l)
Adenosin-5’-Monophosphat
Adenosin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
Cytidin-5’-Monophosphat
Cytidin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
Guanosin-5’-Monophosphat
Abkürzungsverzeichnis
prG-Bodipy
prI
prI-Bodipy
prN
prn-Bodipy
prU
prU-Bodipy
prX
prX-Bodipy
psi
pT
pT-Bodipy
RAL
Rel. Stabw.
RFU
RIA
RP-HPLC
rRNA
S9-Mix
s.d.
SDS
SEC
SFS
snRNA
SPD
SVPDE
Tp
Tp-Bodipy
tRNA
TRIS
USERIA
UVzeptomol
Guanosin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
Inosin-5’-Monophosphat
Inosin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
Nukleosid-5’-Monophosphat
Nukleosid-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
Uridin-5’-Monophosphat
Uridin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
Xanthosin-5’-Monophosphat
Xanthosin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
pounds per square inch (1psi = 6894,75729 Pascal)
Thymidin-5’-Monophosphat
Thymidin-5’-Monophosphat Bodipy-Konjugat
relatives Addukt-Labeling
relative Standardabweichugn
relative Fluoreszenzeinheiten, relative fluorescence units
Radioimmunoassay
reversed-phase high performance liquid chromatography
ribosomale RNA
Rattenleberhomogenat
siehe dort
Natriumdodecylsulfat
size exclusion chromatography, Größenausschlußchromatographie
synchronous fluorescence spectrophotometry
small nuclear RNA
Milz-Phosphodiesterase, (spleen phosphodiesterase)
Schlangengift-Phosphodiesterase
Thymidin-3’-Monophosphat
Thymidin-3’-Monophosphat Bodipy Konjugat
transfer RNA
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
ultrasensitive enzymatic radioimmunoassay
ultraviolettZeptomol (10-21mol)
v
Abkürzungsverzeichnis
vi
Einleitung
1 Einleitung
In Deutschland ist Krebs nach den Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems die
zweithäufigste Todesursache. Als hauptverantwortlich für die Krebsentstehung gelten
Umwelteinflüsse wie UV-Strahlung, bestimmte Bakterien oder Viren und die Exposition
gegenüber chemischen Substanzen. Der größte Teil der Krebsfälle (80-90%) kann daher auf
letztendlich vermeidbare Expositionsarten zurückgeführt werden, zu denen insbesondere die
Ernährungsgewohnheiten, sowie Tabak- und Alkoholkonsum gehören, aber auch berufliche
Expositionen und die generelle Belastung der Bevölkerung durch Luftschadstoffe [1]. War
man anfangs noch der Meinung, dass zwei Mutationen zur Krebsentstehung ausreichen
(Knudsons „two-hit model“ 1971 [2]), so ist die derzeitige Lehrmeinung, dass die
Krebsentstehung ein mehrstufiger Prozess ist, bei dem sich im Laufe der Zeit Schäden im
Erbgut anhäufen („multi hit model“[3]). Eine wichtige Rolle spielen bei diesem Prozess
chemische Substanzen als genotoxische Agenzien. Derzeit sind über 500 Chemikalien, das
entspricht 20% aller chronisch-toxikologisch getesteten Substanzen, im Tierexperiment als
krebserzeugend eingestuft [3]. Von den beim Menschen als krebsauslösend bekannten
Substanzen führen 90% spontan oder nach metabolischer Aktivierung zu kovalenten
Veränderungen der DNA, d. h. sie bilden so genannte DNA-Addukte [4]. Diese strukturellen
Modifikationen der DNA stellen als prämutagene Läsionen oftmals den ersten Schritt in der
Kanzerogenese dar. Daher können sie einerseits als individuelle interne Dosimeter für die
Exposition gegenüber genotoxischen Substanzen, aber andererseits auch als frühe Biomarker
des Krebsrisikos für die molekulare Epidemiologie genutzt werden [5]. Gleichzeitig wird die
Analyse von DNA-Addukten für die Erkennung von Präventionsmaßnahmen und zur
Diagnostik in der Krebstherapie eingesetzt.
DNA-Addukte treten in vivo nur in extrem geringen Konzentrationen auf, da nur wenige
DNA-Basen
modifiziert
werden
und
die
Zelle
über
außerordentlich
effiziente
Reparatursysteme für Schäden am Erbgut verfügt. Im Allgemeinen findet man für die
verschiedensten
Substanzen,
denen
der
6
Organismus
ausgesetzt
ist,
einen
DNA-
8
Gesamtadduktlevel von 1 Addukt in 10 bis 10 unmodifizierten Nukleotiden. Bezogen auf
ein bestimmtes DNA-Addukt finden sich jedoch oft nur 1 oder 2 in 109 bis 1010 normalen
Nukleotiden, z. B. im Blut von nicht beruflich exponierten Personen [6]. Verbunden mit dem
Umstand, dass in der Regel nur sehr wenig DNA aus biologischen Proben für eine Analyse
zur Verfügung steht, ergeben sich höchste Anforderungen an die Sensitivität einer
analytischen Methode zur Bestimmung von DNA-Addukten in vivo. Gleichzeitig bedarf es für
1
Einleitung
die Untersuchung von DNA-Adduktmustern aus komplexen Gemischen genotoxischer
Schadstoffe, entsprechend den realen humanen Expositionsgegebenheiten, wie zum Beispiel
Autoabgase oder Zigarettenrauch, einer sehr selektiven Analysenmethode. Diese ist nötig, um
möglichst alle der gebildeten DNA-Addukte trennen und simultan detektieren zu können,
auch wenn sie chemisch und strukturell stark unterschiedlich sind.
Im Laufe der letzten Jahre wurden viele Anstrengungen unternommen, Analysenmethoden zu
entwickeln, die alle diese Ansprüche erfüllen [6-17]. Wirklich etablieren konnte sich in der
Routineanalytik jedoch nur das
9
Addukt in 10 bis 10
10
32
P-Postlabeling-Verfahren, welches die Detektion von 1
unmodifizierten Nukleotiden ermöglicht und dabei mit einer DNA-
Menge von nur 10µg auskommt [6-8]. Allerdings hat auch diese Methode noch gravierende
Nachteile:
-
schlechte Reproduzierbarkeit
-
keine simultane Analytik verschiedener Adduktklassen
-
Probleme bei der Analyse kleinvolumiger Addukte
-
geringer Probendurchsatz
-
keine Automatisierungsmöglichkeit
-
Verwendung radioaktiver Materialien
-
keine absolute Addukt-Quantifizierung
Eine neue Trennmethode, der zugetraut wird einige dieser Nachteile überwinden zu können,
ist die in den achtziger Jahren entwickelte Kapillarelektrophorese. Dieses Verfahren kommt
mit kleinsten Probenmengen aus und sollte in Verbindung mit der Laser-induzierten
Fluoreszenzdetektion (LIF) in der Lage sein, die erforderliche hohe Sensitivität zu erreichen
[16]. Darüber hinaus sind kapillarelektrophoretische Trennungen automatisierbar und
ermöglichen durch kurze Analysenzeiten, verbunden mit einer potentiellen Miniaturisierung,
z. B. auf Glas- oder Kunststoff-Chips, einen hohen Probendurchsatz bei vergleichsweise
geringen Kosten. Damit kann die Bestimmung von DNA-Addukten in Zukunft in
umfangreiche molekularepidemiologische Studien eingebunden werden, was zu einem
besseren
Verständnis
der
Krebsentstehung
umweltbezogener Risikofaktoren führen sollte.
2
und
lebensgewohnheitsbedingter
und
Theoretischer Hintergrund
2 Theoretischer Hintergrund
2.1 Chemische Kanzerogenese
Es ist mittlerweile für eine ganze Reihe von chemischen Substanzen gut belegt, dass sie an
der Auslösung bestimmter Krebserkrankungen des Menschen beteiligt sind. Historisch
betrachtet vermutete zum ersten Mal Paracelsus um 1500 einen Zusammenhang zwischen
dem Lungenkrebs von Bergleuten und Rauschrot (Realgar, As4S4). Aktuelle Beispiele sind
Farbstoffe, vor allem aromatische Amine, als Ursache für Blasenkrebs oder auch das
Auftreten von Mesangiotheliomen bei Personen, die mit Asbest gearbeitet haben [3].
Beide Substanzen gehören jedoch in bezug auf ihren Wirkmechanismus zu ganz
unterschiedlichen Klassen von chemischen Kanzerogenen: Aromatische Amine (z. B. βNaphthylamin) auf der einen Seite gehören zu den genotoxischen Kanzerogenen, die direkt
mit der DNA reagieren und DNA-Addukte bilden. Zu dieser Klasse gehören auch die
polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAH), Nitrosamine und einige Naturstoffe.
In vielen Fällen ist zuvor jedoch noch eine "Giftung" der chemischen Kanzerogene durch
metabolische Aktivierung nötig [18].
Die zweite Kategorie der chemischen Kanzerogene umfasst die „epigenetisch“ wirksamen
Substanzen wie z. B. DDT, Diethylstilböstrol und Asbest, die nicht direkt mit DNA reagieren,
sondern beispielsweise über Rezeptoren für Wachstumsfaktoren tumorpromovierend,
pseudohormonell oder cytotoxisch wirken [19, 20].
Zur Erklärung des molekularen Wirkmechanismus der Krebsentstehung hat sich ein
Mehrstufenkonzept durchgesetzt. Demnach wandeln sich normale Körperzellen nicht
unmittelbar in maligne Zellen um, vielmehr handelt es sich dabei um einen lang andauernden
Prozess, der in vielen kleinen Schritten, die jeweils eine genetische Veränderung bewirken,
verläuft. Dabei geht man von einer Mutation des Erbgutes als erstem Schritt aus (Initiation),
gefolgt von einem epigenetischen Ereignis, das zu einer Stimulation des Zellwachstums führt
(Promotion). DNA-Schäden (wie DNA-Addukte, Strangbrüche u. a.) gelten als Vorläufer für
diese Mutationen, da es im Zuge der Replikation an den Positionen dieser DNAModifikationen oder in der unmittelbaren Nähe zu Basensubstitutionen oder Deletionen und
Leserasterverschiebungen ("frame-shift") kommt. Dieses klassische Modell wurde erweitert
durch die Progression. In diesem dritten Schritt wird aus der gutartigen Wucherung durch
Anhäufung weiterer Gendefekte ein maligner Tumor [3]. Eine zentrale Rolle nehmen dabei
3
Theoretischer Hintergrund
Protoonkogene und Tumorsuppressorgene ein, die auch als "critical target genes" der
Kanzerogenese bezeichnet werden [21]. Das bekannteste Gen aus dieser Familie ist sicherlich
p53, das unter anderem verhindert, dass sich Zellen teilen, deren Erbgut Schäden aufweist.
Fällt diese Kontrollinstanz aus, können sich entartete Zellen nahezu ungehindert vermehren
und weiter Schäden ansammeln, die sich letztendlich fatal auswirken können [22].
2.2 Metabolische Aktivierung chemischer Kanzerogene
Der größte Teil der bekannten krebsauslösenden Stoffe muss im Körper metabolisch aktiviert
werden, bevor er mit der DNA kovalent reagieren kann. Verantwortlich hierfür sind
insbesondere Enzyme, die Biotransformationen von xenobiotischen Stoffen katalysieren.
Dabei werden kanzerogene Chemikalien
als "Prokanzerogene" durch metabolische
Aktivierung in „proximale" und letztendlich in „ultimale“ Kanzerogene umgewandelt. Die
dabei gebildeten reaktiven elektrophilen Spezies reagieren dann mit den vorhandenen
nukleophilen Zentren in Proteinen oder Nukleinsäuren. Dabei entstehen für die einzelnen
Stoffe charakteristische und nachweisbare Addukte.
Allgemein kann man fremdstoffmetabolisierende Enzyme in zwei Kategorien einteilen: Der
Phase-I-Metabolismus wandelt unpolare, lipophile Stoffe in polare, hydrophilere Stoffe um.
Dies kann oxidativ durch Epoxidierung, Hydroxylierung, N- oder S-Desalkylierung oder
reduktiv durch Nitroreduktion oder Carbonylreduktion geschehen. Wichtigster Vertreter
dieses Metabolismus-Systems ist die Cytochrom P450-Familie, von der mindestens 40
verschiedene Vertreter in jeweils einer einzigen Spezies vorkommen [18].
Enzyme des Phase-II-Metabolismus konjugieren Fremdstoffe oder Phase-I-Metabolite an
hoch hydrophile, endogene Moleküle durch Glutathionkonjugation, Glucuronidierung,
Acetylierung oder Sulfatierung, wodurch die Ausscheidung über Niere und Galle ermöglicht
wird. Allerdings können auch Konjugate des Phase-II-Metabolismus nach Hydrolyse wieder
zu Elektrophilen zerfallen und DNA-Addukte bilden.
2.3 Exogene und endogene Kanzerogene
DNA-Addukt-bildende Substanzen können entsprechend ihres Ursprungs in endogene und
exogene Kanzerogene unterteilt werden [23]. Zu Beginn der Adduktforschung standen vor
allem
Umweltgifte
im
Mittelpunkt
der
Untersuchungen.
Stetig
verbesserte
Nachweismethoden ermöglichen heutzutage allerdings auch die Detektion genotoxischer
4
Theoretischer Hintergrund
Nebenprodukte des normalen Metabolismus. Eine eindeutige Trennung zwischen diesen
beiden Klassen ist dabei nicht immer leicht möglich, da zum Beispiel manche Nitrosamine
sowohl exogen vorkommen (Zigarettenrauch) als auch endogen gebildet werden können [3].
2.3.1 Exogene Kanzerogene
Die
wichtigsten
Kohlenwasserstoffe,
Vertreter
dieser
aromatische
Kategorie
sind
Stickstoffverbindungen,
polyzyklische
Alkylantien
aromatische
und
manche
Naturstoffe wie Mykotoxine oder Pflanzeninhaltstoffe.
2.3.1.1 Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe
Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH) sind ubiquitäre Umweltschadstoffe, die
durch unvollständige Verbrennung von organischem Material entstehen. Sie sind
beispielsweise in Teer, Ruß, Petroleum, Ölen, Autoabgasen und Tabakrauch enthalten [24].
Die bekanntesten Vertreter der polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe sind das
Benzo[a]pyren (B[a]P) und das 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen. Kanzerogene Kohlenwasserstoffe waren die ersten reinen Chemikalien, für die eine kanzerogene Wirkung im
Tierversuch ermittelt werden konnte, wobei auch große Speziesunterschiede zu Tage traten.
Die krebsauslösende Wirkung dieser Substanzklasse durch die Induktion von Mutationen im
ras-Protoonkogen im Tier und die Bedeutung der PAH-DNA-Addukte bei Tumoren der
Lunge durch Zigarettenrauch im Menschen ist mittlerweile allgemein anerkannt [25, 26].
2.3.1.2 Aromatische Stickstoffverbindungen
Aromatische Stickstoffverbindungen lassen sich ihrerseits in Arylamine, heterozyklische
aromatische Amine und aromatische Nitroverbindungen unterteilen:
Arylamine kommen in der Natur nicht vor, sondern werden als Farbstoffe, für die
Arzneimittelherstellung und als Antioxidantien synthetisch hergestellt. Zu ihnen gehören zum
Beispiel Anilin, Aminofluoren, 4-Aminobiphenyl oder 6-Aminochrysen.
Die metabolische Aktivierung der Arylamine erfolgt in der Regel oxidativ über Cytochrom
P450-katalysierte N-Hydroxylierung [18]. Die gebildeten N-Hydroxylamine bilden im Sauren
direkt oder nach Sulfatierung durch Sulfotransferasen bzw. nach Acetylierung durch N,OAcetyltransferasen und anschließender Hydrolyse elektrophile Nitreniumionen, die als
ultimale Kanzerogene DNA-Basen angreifen.
5
Theoretischer Hintergrund
Das 4-Aminobiphenyl (4-ABP) wurde bereits von der International Agency for Research on
Cancer (IARC) in die Kategorie 1, nachgewiesenermaßen krebserzeugend beim Menschen,
eingestuft. Es hat sich herausgestellt, dass die Substanz eine wichtige Rolle bei der
Entstehung von Blasenkrebs spielt und möglicherweise auch Brustkrebs verursachen kann.
Beruflich exponiert sind vor allem Arbeiter in der Farben-, Textil-, Leder- und
Gummiindustrie. Die Normalbevölkerung ist 4-ABP vor allem durch Zigarettenrauch,
Haarfärbemittel und durch Abgase bei der Verbrennung fossiler Energieträger ausgesetzt.
Eine besondere Stellung hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen Krebserkrankungen und
Lebensgewohnheiten nehmen heterozyklische aromatische Amine ein [28]. Diese
Substanzklasse,
deren
wichtigster
Vertreter
2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo(4,5-
b)pyridin (PhIP) ist, entsteht durch Pyrolyse von Aminosäuren und somit bei der Zubereitung
von Fisch und Fleisch. So wurde die mutagene Wirkung von gekochtem Fisch und
Rindfleisch bereits vor 20 Jahren im Ames-Test nachgewiesen [29]. Auch hier erfolgt der
Angriff an die DNA-Basen über ein Nitrenium-Ion. Die bis heute charakterisierten Addukte
heterozyklischer aromatischer Amine entstehen ausschließlich durch Bindung des ultimalen
Kanzerogens an die N2- und C8-Position des Guanins [28].
Unter den aromatischen Nitroverbindungen erregte in jüngster Vergangenheit 3Nitrobenzanthron (3-NBA) als Umweltgift in Dieselabgasen besonderes Interesse [30].
2
NO2
1
3
11
4
10
9
5
7
6
8
O
Abb. 1: Strukturformel von 3-Nitro-7H-benz[d,e]anthracen-7-on (3-Nitrobenzanthron)
Diese Substanz zeigte im Ames-Test eine der höchsten je gemessenen Revertantenzahlen
überhaupt. In vitro erfolgt die DNA-Adduktbildung durch reduktive Aktivierung mittels Zink,
Xanthinoxidase oder mittels Rattenleberhomogenat [31]. In vivo sind CYP1A2 und CYPOxidoreduktase als Phase-I-Enzyme sowie als Phase-II-Enzyme Sulfotransferase und NAcetyltransferase 2 an der metabolischen Aktivierung beteiligt [32]. 3-NBA bildet dabei
6
Theoretischer Hintergrund
Addukte mit Guanin und Adenin, wobei die genaue Struktur noch nicht geklärt werden
konnte.
2.3.1.3 Alkylantien
DNA
alkylierende
Substanzen
finden
besonders
bei
der
Chemotherapie
von
Krebserkrankungen Anwendung. So beruht die therapeutische Wirkung von cisDiamindichlorplatin(II) (Cisplatin) auf der kovalenten Modifikation von Nukleobasen, indem
es an die N7-Position von Guanin und Adenin bindet. Aufgrund der Quervernetzung zweier
DNA-Stränge durch dieses Agens kommt es zu Strangbrüchen und einer Inhibierung der
DNA-Replikation [33]. Alkylantien sind aber auch als Umweltgifte von Bedeutung. So haben
N-Nitrosoverbindungen aus Zigarettenrauch und Lebensmitteln nach metabolischer
Aktivierung ebenfalls alkylierende Wirkung [4].
2.3.1.4 α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen
Diese bisfunktionalen Verbindungen sind wichtige Industriechemikalien, kommen aber auch
natürlich als Umweltkontaminanten oder als endogene Metabolismus-Produkte vor. Acrolein,
Acrylamid und Crotonaldehyd werden in großem Maßstab als Monomere in der
Kunststoffproduktion eingesetzt und entstehen bei Verbrennungsprozessen (Autoabgase,
Tabakrauch und Waldbrände) [34].
Beim Braten, Backen und Frittieren von stärkehaltigen Lebensmitteln wie etwa
Kartoffelprodukten, Kleingebäck oder Knäckebrot kann je nach Herstellungsbedingungen
Acrylamid im zweistelligen ppm Bereich entstehen. Hierfür ist insbesondere der
Asparagingehalt der Nahrungsmittel von Bedeutung [35, 36]. Obwohl kanzerogen im
Tierversuch, konnte bislang noch kein Zusammenhang zwischen der Acrylamid-Exposition
und einem humanen Krebsrisiko festgestellt werden [37]. Acrolein oder Crotonaldehyd
entstehen hauptsächlich bei der Erhitzung von Fetten.
Zu der gleichen homologen Reihe von α,β-ungesättigten Aldehyden gehört auch das Trans-2Hexenal. Diese Verbindung ist ein häufiger Inhaltsstoff im Pflanzenreich („leaf aldehyde“).
Aufgenommen wird die Substanz vor allem beim Verzehr von Obst und Gemüse. Hexenal ist
aber auch als Aromastoff (sog. „green notes“) in der EU und den USA zugelassen [38].
Ähnliche Verbindungen wie 4-Hydroxy-2-nonenal und Malondialdehyd können auch
endogen beim Abbau von Fettsäuren aus Lipidmembranen entstehen.
7
Theoretischer Hintergrund
Alle diese Verbindungen sind genotoxisch wirksam, entweder direkt oder nach metabolischer
Epoxidierung. Es konnten cyclische DNA-Addukte, aber auch Quervernetzung der DNA
nachgewiesen werden [34].
2.3.1.5 Naturstoffe
Einige der potentesten Kanzerogene werden durch Mikroorganismen oder in Pflanzen
gebildet. So ist das Stoffwechselprodukt des Schimmelpilzes Aspergillus flavus, Aflatoxin
B1, eines der wirksamsten bekannten Leberkanzerogene. Zu den pflanzlichen Kanzerogenen
werden
unter
anderem
auch
Safrol
und
Aristolochiasäure,
ein
Inhaltsstoff
der
Aristolochiaceen, gezählt. Letztere wird reduktiv durch Nitroreduktasen metabolisch aktiviert
und bildet N6-Adenosin- und N2-Guanosin-Addukte. Diese DNA-Addukte sind in der Lage,
durch Mutationen im Protoonkogen H-ras Tumore im Vormagen und Gehörgang in der Ratte
zu induzieren. Aktuelle Belege sprechen auch für eine tumorauslösende Wirkung im
Harnleiter beim Menschen [39, 40].
2.3.2 Endogene Kanzerogene
Hierbei handelt es sich um chemische Modifikationen der DNA, ausgelöst durch normale
physiologische Prozesse. Die Substanzen endogenen Ursprungs umfassen Oxidantien,
Produkte der Fettsäureoxidation, reaktive Stickstoffspezies und Intermediate unterschiedlicher
Metabolisierungswege [23]. So wurden bei der Untersuchung der Kanzerogenität von
Vinylchlorid und Ethylcarbamat strukturell verwandte DNA-Addukte auch in Kontrolltieren
gefunden [41]. Auch wenn viele endogene Substanzen kein akutes toxisches Potential
besitzen, wird ihr schädigender Beitrag aufgrund der lebenslangen Exposition diskutiert [42].
2.3.2.1 DNA-Schädigung durch endogene Oxidantien
Die oxidative Schädigung der DNA liefert den Hauptanteil der endogenen DNAModifikationen [43]. So beträgt die Menge an ausgeschiedenen oxidierten Nukleobasen bei
der Ratte 70 000 pro Zelle pro Tag [44]. Diese oxidativen Veränderungen werden vermutlich
durch Superoxidanionradikale (O2.-) und Wasserstoffperoxid (H2O2) hervorgerufen [22]. H2O2
kann zum Beispiel durch Monoaminoxidasen des Neurotransmitterkatabolismus gebildet
werden. In Escherichia coli konnte auch gezeigt werden, dass Mutanten, die defizient an
Sauerstoffradikal-abfangenden Proteinen wie Superoxiddismutase oder Katalase sind, eine
erhöhte Rate an Spontanmutationen aufweisen [45]. Das Hauptprodukt oxidativer DNASchädigungen
8
ist
8-Oxo-2’-Desoxyguanosin
(8-oxo-dG),
aber
auch
2-Hydroxy-2’-
Theoretischer Hintergrund
Desoxyadenosin (2-OH-dA), 5-Hydroxy-2’-Desoxycytidin und seine Desaminierungsprodukte 5-Hydroxyuridin und Uridinglykol wurden nachgewiesen [46].
2.3.2.2 DNA-Schädigung durch Fettsäureoxidation
Ungesättigte Fettsäuren stellen im Vergleich zur DNA bedeutend bessere Targets für
Oxidantien dar. Allerdings löst die Oxidation dieser Substanzen eine autokatalysierte
Reaktionskaskade aus, bei der zahlreiche genotoxische Substanzen gebildet werden [47].
Unter diesen Fettsäuremetaboliten nehmen Malondialdehyd und verschiedene 4-Hydroxy-2alkenale
(z.B.
4-Hydroxy-2-nonenal)
oder
2-Trans-Alkenale
(z.B.
Acrolein
und
Crotonaldehyd s.o.) eine bedeutende Stellung ein. In Anwesenheit von Hydroperoxiden
werden diese ungesättigten Aldehyde epoxidiert und bilden exozyklische Etheno-Addukte mit
Guanin, Adenin und Cytosin [48, 49]. Das am Besten untersuchte Beispiel ist hier das 1,N6Etheno-2’-Desoxyadenosin (etheno-dA, εdA).
2.3.2.3 Reaktive Stickstoffspezies
Verschiedene humane Tumorerkrankungen sind eng mit chronischen viralen, bakteriellen und
parasitischen Infektionen verknüpft, so dass hier ein ursächlicher Zusammenhang zwischen
dem erhöhten Krebsrisiko und einer gesteigerten Produktion von Stickstoffmonoxid vermutet
wird [50]. Durch die pathophysiologischen Prozesse der chronischen Infektionen bzw.
Entzündungen wird die Überproduktion von Stickstoffmonoxid (NO) durch die induzierbare
Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) ausgelöst. Die erhöhte Produktion von NO und O2.- bei
entzündlichen Prozessen und die damit einhergehende Bildung von Peroxynitrit (ONOO-,
entsteht aus der Reaktion von NO mit O2.-) wird nicht nur als Ursache für Krebserkrankungen
sondern auch für verschiedene andere Krankheiten wie Atherosklerose und neurodegenerative
Erkrankungen diskutiert.
Schäden an der DNA, die durch NO ausgelöst werden, sind vor allem Deaminierungen (s. d.),
Alkylierungen durch endogen gebildete Nitrosamine und Strangbrüche, verursacht durch den
Zerfall von Peroxynitrit [51, 52]. Weiterhin scheint die Überproduktion von NO zu einer
erhöhten Bildung von etheno-dA und etheno-dC Addukten aus dem Fettsäuremetabolismus zu
führen [53]. Eine relativ neue Entdeckung ist die Bildung eines umgelagerten Guanosins nach
Nitrosierung durch Peroxynitrit, dem Oxanosin [54]. Peroxynitrit ist unter physiologischen
Bedingungen wesentlich stabiler als NO und leistet daher vermutlich einen wesentlichen
Beitrag zum Toxizitätsmechanismus von NO [55].
9
Theoretischer Hintergrund
2.3.2.4 Spontane hydrolytische Deaminierung und Apurinische Stellen (AP-Stellen)
Trotz der hohen Stabilität der DNA-Moleküle gibt es chemische Veränderungen, die ohne
äußeres Zutun, einfach aufgrund der chemischen Natur der Nukleotide, stattfinden. Die
häufigste dieser Veränderungen ist der Verlust einer Purinbase durch hydrolytische Spaltung
der glycosidischen Bindung zwischen der Base und dem Zucker-Phosphat-Gerüst der DNA.
Dieses Ereignis tritt ca. 10 000mal pro Zelle und Tag auf. Auch der Verlust von PyrimidinBasen ist möglich, ist aber deutlich seltener als die Abspaltung einer Purin-Base. Daneben
gibt es noch die hydrolytische Deaminierung von Cytosin zu Uracil, die schätzungsweise
400mal pro Tag und Genom auftritt, noch seltener ist die Deaminierung von Adenin zu
Hypoxanthin (ca. 10mal/Tag/Genom) [56]. Alle diese DNA-Modifikationen können zu
Mutationen bei der Replikation führen, da an der gegenüberliegenden Stelle einer „fehlenden
Base“ praktisch jedes der vier möglichen Nukleotide eingebaut werden kann. Häufiger als
erwartet wird jedoch ein Adenin eingesetzt, so dass eine AP-Stelle oft die Ursache für die
Überführung eines GC-Basenpaares in ein AT-Paar ist. Die Umwandlung eines Cytosins in
ein Uracil führt zur Fehlpaarung mit Adenin, was letztendlich ebenfalls zur Umwandlung in
ein AT-Paar führt. Für diese auf die chemische Natur der Basen zurückzuführenden
Instabilitäten haben sich im Laufe der Evolution sehr effiziente und spezifische
Reparaturmechanismen entwickelt, die der Entstehung von Mutationen entgegenwirken.
2.3.3 DNA-Methylierung
In der DNA verschiedener Organismen wurden im Laufe der Jahre drei verschiedene MethylModifikationen des Cytosins und Adenosins entdeckt. Es handelt sich dabei um N6Methyladenin (N6mA), N4-Methylcytosin und 5-Methylcytosin (5mC). Diese DNAMethylierungen wurden zunächst nur als Bestandteile von Restriktionsenzymsystemen zum
Schutz vor viralem Erbgut in niederen Organismen erkannt [57]. Vor etwa 30 Jahren stellte
man aber fest, dass es außer der bekannten Regulation der Proteinexpression auf RNA-Ebene
noch eine übergeordnete, epigenetische Genregulation in Form von DNA- und HistonModifikationen gibt. Als hierfür entscheidende DNA-Veränderung stellte sich in Eukaryoten
die Methylierung an der Position 5 des Cytosins durch DNA-Methyltransferasen (Dnmt)
heraus [58], die in enger Korrelation mit den Modifikationen der Histone, LysinMethylierungen und Acetylierung steht, was als „epigenetic crosstalk“ bezeichnet wird. Die
überraschende Häufigkeit von 5-Methylcytosin, im menschlichen Erbgut sind ca. 4% aller
Cytosine methyliert, hat ihm auch den Beinamen „5. Base“ eingetragen (ca. 0.8% aller Basen
des menschlichen Genoms) [59]. 5-Methylcytosin befindet sich vor allem in Regionen, in
10
Theoretischer Hintergrund
denen Cytosin (C) und Guanin (G) zusammen auftreten, seien es Dinukleotide der Struktur
CpG (C-Phosphat-G), Trinukleotide der Struktur CpNpG, wobei N ein beliebiges Nukleotid
darstellt, oder Pentanukleotide der Struktur CpCpWpGpG (W steht für wahlweise A oder T),
vor allem als Cp5mCpWpGpG. Neben diesen sehr kurzen DNA-Abschnitten von CpGHäufung gibt es auch sog. "CpG-islands". Das sind DNA-Abschnitte, in denen über große
Regionen hinweg (einige hundert Basenpaare) gehäuft die Nukleotide C und G vorkommen,
und die charakteristisch für die Promotorregionen von Genen sind. Die Promotorregionen von
etwa 60 Prozent aller Gene sind in CpG-islands eingebettet [60]. In voll ausdifferenzierten
Zellen sind etwa 80 Prozent der CpG-Dinukleotide methyliert, während die Cytosine in den
CpG-islands größtenteils unmethyliert bleiben. Grob vereinfacht kann man sagen, dass die
Methylierung von Promotorregionen zur Stilllegung der entsprechenden Gene führt. Allein
daraus lässt sich bereits erahnen, wie wichtig die korrekte DNA-Methylierung für die
Ausdifferenzierung von Geweben und die gesamte Embryonalentwicklung ist. Seit 1983 [61]
weiß man außerdem, dass Krebsgewebe, genomweit betrachtet, weniger CytosinMethylierung aufweist als das zugehörige gesunde Organ. Mit immer ausgefeilteren
Methoden wurde inzwischen nachgewiesen, dass sich außerdem das Methylierungsmuster
(methylation pattern) des Genoms von Krebszellen von dem gesunder Zellen unterscheidet.
Das führt beispielsweise zur Abschaltung wichtiger Tumorsuppressorgene, bzw. zur
Aktivierung eigentlich nicht mehr benötigter embryonaler Wachstumsprotokolle [62].
Gegenwärtig
wird
die
Frage,
ob
eher
die
genomweite
Mindermethylierung
(Hypomethylierung) mit der einhergehenden chromosomalen Instabilität, oder die erhöhte
Promotormethylierung (Hypermethylierung) wichtiger für die Krebsentstehung ist, heftig
diskutiert.
Daneben sollte noch darauf hingewiesen werden, dass die Anwesenheit von 5mC selbst die
Mutationsfrequenz im methylierten Genabschnitt gegenüber dem unmethylierten erhöht.
Durch spontane hydrolytische Deaminierung (s. d.) entsteht aus 5mC nämlich Thymin, das im
Gegensatz zu Uracil, das aus Cytosin entsteht, nicht von der DNA-Uracil-Glycosylase erkannt
und repariert wird. Die durch Deaminierung von 5mC entstehenden T-G Fehlpaarungen
werden zwar von sog. „Mismatch Repair-Systemen“ erkannt, die aber naturgemäß nur in 50%
aller Fälle das Thymin in ein Cytosin korrigieren, da sie nicht erkennen können, welcher der
korrekte Strang ist. Durch Veränderungen in der UV-Absorption durch die Methylierung
kommt es weiterhin zur vermehrten Bildung von CC-Pyrimidin-Dimeren, die zu typischen
CC nach TT Mutationen führen [63]. Außerdem gibt es Hinweise, dass große polyzyklische
11
Theoretischer Hintergrund
Kohlenwasserstoffe (B[a]P) bevorzugt an Guanin binden, wenn ein benachbartes Cytosin
methyliert ist [64].
2.4 RNA Modifikationen
2.4.1 Natürliche RNA-Modifikationen
Während die DNA, abgesehen von unerwünschten Veränderungen, aus fünf Basen aufgebaut
ist, gibt es in der RNA nahezu 100 verschiedene Basen, für deren Herstellung die Natur zum
Teil erhebliche Anstrengungen unternimmt [65]. RNA kommt in der Zelle in verschiedenen
Formen vor: die ribosomale-RNA (rRNA) ist am Aufbau der Ribosomen beteiligt und damit
an der Proteinbiosynthese, die messenger-RNA (mRNA) übernimmt die genetische
Information von der DNA und bringt sie zu den Ribosomen, wo sie in Proteine übersetzt wird.
Die transfer-RNA (tRNA) dient der Aktivierung der Aminosäuren, die an sie binden und von
ihr zu den Ribosomen transportiert werden. Die small nuclear RNA (snRNA) ist im Zellkern
von Eukaryonten zuständig für das Spleißen der hnRNA (heterogene nucleäre RNA) einer
Vorstufe der mRNA. Alle diese Formen der zellulären RNA (mRNA, rRNA, tRNA, snRNA)
enthalten modifizierte Nukleoside, wobei die mit Abstand meisten Veränderungen in tRNA
gefunden wurden (z. Zt. 79), danach folgen mRNA (12) und snRNA (11). Die Mehrheit
dieser Veränderungen beschränkt sich auf einfache Methylierungen, Reduktionen (z.B.
Dihydrouridin), Isomerisierungen (Pseudouracil) oder den Einbau von Schwefel anstelle von
Sauerstoff (2- bzw. 4-Thiouracil). Es gibt aber auch sehr komplexe Hypermodifikationen,
deren Synthese mehrere Enzymsysteme benötigt. Diese hypermodifizierten Nukleoside
kommen hauptsächlich in tRNA vor, wohingegen die einfacheren Modifikationen in den
anderen RNA-Typen dominieren [66].
Generell ist die tRNA die am höchsten modifizierte RNA, bei höheren Eukaryonten bestehen
einige tRNAs zu 25% aus Basen, die in irgendeiner Weise verändert sind. Ebenso
bemerkenswert ist der hohe Grad an Modifikationen in der rRNA von Mensch, Maus und
Xenopus, die bis zu 200 ungewöhnliche Basen (ca. 3% der 5.8S, 18S und 28S RNA)
aufweisen. Die meisten davon finden sich im hochkonservierten „Core-Bereich“ der rRNA.
Gesichert ist mittlerweile die wichtige Rolle von modifizierten Nukleosiden bei der Reifung
von snRNA und mRNA, dem Zusammenbau der Ribosomen, Übersetzung des genetischen
Codes in RNA und Proteine (Translation), der Stabilisierung der 3D-Struktur, v. a. von tRNA
und Erkennungsprozessen zwischen tRNA und Aminosäuren [67].
12
Theoretischer Hintergrund
2.4.2 RNA-Schäden (Addukte)
Chemische Kanzerogene führen nach metabolischer Aktivierung nicht nur zur Bildung von
DNA-Addukten sondern auch zu RNA-Addukten, indem sie die nukleophilen Zentren der
RNA-Basen angreifen. Dabei wurde mehrfach beobachtet, dass die RNA sogar das
bevorzugte Target für die elektrophilen ultimalen Kanzerogene ist. So zeigten Sotomayor et
al., dass bei der Behandlung von Ratten mit Aflatoxin B1 drei bis neun Mal mehr Aflatoxin B1
RNA-Addukte (AFB1- Guanosin) als Aflatoxin B1 DNA-Addukte (AFB1-2’-Desoxyguanosin)
gebildet werden [68]. Auch im Zusammenhang mit den Schäden, die durch oxidativen Stress
entstehen wurde von Hofer et al. nachgewiesen, dass bei der in vitro Behandlung von
Lungenepithel-Zellen mit H2O2 14-25 Mal mehr 8-Oxo-Guanosin als 8-Oxo-2’Desoxyguanosin gebildet wird [69]. Solche Befunde weisen darauf hin, dass RNA-Addukte
auf Grund ihrer größeren Menge und damit einfacheren Nachweisbarkeit, besser als
Expositions-Biomarker geeignet sind als DNA-Addukte. Über die Auswirkungen der RNAAddukte auf die Lebensfähigkeit von Zellen oder sogar auf die Kanzerogenese ist wenig
bekannt, es gibt aber Hinweise, dass auch oxidative Schäden und Schäden durch Alkylantien
in der RNA repariert werden [70].
2.5 Nachweismethoden für DNA-Addukte
Zur Zeit stehen eine ganze Reihe von spezifischen und sensitiven Nachweismethoden für
DNA-Addukte zur Verfügung, die alle ihre Vor- und Nachteile haben. Die empfindlichste ist
die Accelerator Mass Spectrometry (AMS), für die jedoch
14
C-markierte Kanzerogene
synthetisiert werden müssen [71]. Außerdem ist die Messung des Isotopenverhältnisses derart
aufwendig, dass weltweit nur ungefähr vier Laboratorien diese Analysen überhaupt
durchführen können. Andere Nachweismethoden umfassen Immunoassays, für die spezifische
Antikörper gegen das DNA-Addukt zur Verfügung stehen müssen und weitere radioaktive
Methoden (32P-Postlabeling,
verschiedene
3
H-Markierung der Kanzerogene). Des weiteren können
chromatographische
Trennmethoden
(HPLC,
CE,
GC)
mit
diversen
Detektionssystemen (UV, Fluoreszenz, MS) kombiniert werden, wobei vor allem mit den
massenspektrometrischen Verfahren auch Informationen über die Struktur unbekannter
Addukte gewonnen werden können. Eine kurze Übersicht der verschiedenen Methoden zum
Nachweis von Addukten in genomischer DNA gibt die folgende Tabelle:
13
Theoretischer Hintergrund
Tab. 1: Vergleich der gebräuchlichsten Methoden zum Nachweis von DNA-Addukten
Methode
Nachweisgrenze
(fmol, 1x10-15 mol)
Radioaktive Methoden
Accelerator Mass Spectrometry (AMS)
DNA-Bindung von 3H markierten
Substanzen
32
P-Postlabeling
Standard Methode
Butanol-/ Nuklease P1 Anreicherung
Chromatographische Methoden
HPLC-MS(/MS)
HPLC-ECD
HPLC-FD
Eigenfluoreszenz
Fluoreszenzmarkiert
HPLC-UV
GC-MS
Elektrophoretische Methoden
CE-UV
CE-LIF
CE-MS
CE-RID
Immunoassays
RIA
ELISA kompetitiv
ELISA nicht kompetitiv
USERIA
Slot Blot
Fluoreszenzmethoden
SFS
FLNS
Addukte/
Nukleotide
benötigte
DNA Menge
Lit.
1 in 1011
20µg -1mg
[71]
10
1 in 107-109
1mg
[72]
10
0.01
1 in 107
1 in 1010
1-10µg
1-10µg
[77]
[78]
15
50
100
100 000
0.5
1 in 107-108
1 in 108
1 in 107
1 in 105
1 in 108
1 in 105
1 in 109
10-100µg
10-100µg
100µg
1mg
1mg
[74]
[74]
[73]
[76]
[76]
[73]
[72]
40nM
0.01 (850pM)
15
-
1,4 in 107
1 in 109
10µg
-
[76]
[16]
[76]
[75]
40
1
3
1
1
1 in 108
1 in 6x 108
1 in 107
1 in 107
1 in 3x 106
bis zu 10mg
50µg
0.1µg
25µg
1µg
[73]
[73]
[73]
[73]
[73]
20
1
1 in 5x108
1 in 108
100µg
1mg
[73]
[73]
RIA = Radioimmunoassay; ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay; USERIA = ultrasensitive enzymatic
radioimmunoassay; SFS = synchronous fluorescence spectrophotometry; FLNS = fluorescence-line-narrowing
spectroscopy; GC/MS = Gaschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion; HPLC = high
performance liquid chromatography; UV = Ultraviolett-Detektion; FD = Fluoreszenz-Detektion; ECD =
elektrochemische Detektion
2.5.1
32
P-Postlabeling
Die zur Zeit gebräuchlichste Methode zum Nachweis von DNA-Addukten ist das Anfang der
achtziger Jahre entwickelte
32
P-Postlabeling-Verfahren [6, 7, 77]. Adduktierte DNA wird
nach ihrer Isolierung enzymatisch zu Mononukleotiden hydrolysiert. Im Allgemeinen wird
Mikrokokkennuklease (MN) und Milz-Phosphodiesterase (SPD) zum Verdau der DNA
eingesetzt, was zur Bildung sowohl der adduktierten wie unmodifizierten Nukleosid-3’-
14
Theoretischer Hintergrund
Monophosphate führt. Im Anschluss an diese Hydrolyse wird auf die freie 5’-OH-Gruppe der
Nukleosid-3’-Phosphate mit Hilfe von T4-Polynukleotidkinase (T4-PNK) die
32
P-haltige
Phosphatgruppe aus [γ-32P]-Adenosintriphosphat übertragen.
Die so entstandenen radioaktiv markierten Nukleosid-3’,5’-Bisphosphate werden durch
mehrdirektionale Dünnschichtchromatographie aufgetrennt und autoradiographisch detektiert.
Dadurch erhält man distinkte Addukt-Flecken mit definiertem Laufverhalten, die durch
cochromatographischen Vergleich mit synthetisierten Standardverbindungen den einzelnen
Kanzerogenen zugeordnet werden können. Alternativ können die markierten Nukleosid-3’,5’Bisphosphate auch mittels HPLC aufgetrennt und durch on-line-Radioaktivitäts-Detektion
bestimmt werden. Die Empfindlichkeit des Standardverfahrens von 1 Addukt in ca. 107
unmodifizierten Nukleotiden ist durch Anreicherungsverfahren, die dem radioaktiven
Markierungsschritt vorausgehen, um zwei Zehnerpotenzen verbessert worden. So können
hydrophobe Addukte durch Extraktion mit n-Butanol aus der wäßrigen Phase extrahiert und
somit angereichert werden [78]. Die Phosphataseaktivität der Nuklease P1 (NP1) aus
Penicillium citrinum kann ebenfalls zur Anreicherung ausgenutzt werden [6]. Dieses Enzym
dephosphoryliert unmodifizierte Nukleosid-3’-Phosphate, während es die Mehrzahl der
adduktierten Nukleotide nicht als Substrat akzeptiert. Dephosphorylierte Nukleotide erkennt
die zur Markierungsreaktion eingesetzte T4-PNK dann nicht mehr als Substrat, wodurch
überwiegend die modifizierten Basen, die als Nukleosid-3’-Phosphate vorliegen, markiert und
anschließend detektiert werden. Mit dieser universell anwendbaren Methode sind Addukte
aller wichtigen genotoxischen Substanzklassen wie Arylamine, Nitroaromaten, polyzyklische
aromatische Kohlenwasserstoffe, heterozyklische aromatische Amine und Alkylantien
nachgewiesen worden [8]. Ein Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie auch für noch
unbekannte Addukte verwendet werden kann und somit zur Untersuchung des genotoxischen
Potentials neuer chemischer Substanzen geeignet ist. Allerdings besitzt diese Methode auch
entscheidende Nachteile, die für die Analyse von DNA-Addukten in quantitativer wie
qualitativer Hinsicht ungünstig sind. So erhält man zwar durch das Laufverhalten der
modifizierten Nukleotide bei der Dünnschichtchromatographie und der Sensitivität der
Addukte gegenüber den unterschiedlichen Anreicherungsverfahren Rückschlüsse auf die
Natur und die Position der Modifikationen, eine strukturelle Aufklärung ist jedoch nicht
möglich. Zudem müssen die dünnschichtchromatographischen Trennbedingungen der
chemischen Natur der zu untersuchenden Modifikation angepasst werden, womit eine
simultane Untersuchung von Addukten unterschiedlicher genotoxischer Substanzklassen
15
Theoretischer Hintergrund
ausgeschlossen ist. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass mehrere enzymatische Schritte
bei diesem Verfahren aufeinander folgen. Da die Enzymreaktionen für verschiedene
Modifikationen unterschiedlich effektiv ablaufen, gestaltet sich die Quantifizierung
problematisch [8]. Gegen eine universelle Anwendung spricht aber vor allem die Verwendung
radioaktiver
Phosphor-Isotope
Arbeitssicherheit
und
und
die
Abfallentsorgung.
damit
Darüber
verbundenen
hinaus
ist
Anforderungen
die
an
mehrdirektionale
Dünnschichtchromatographie arbeitsintensiv und nicht automatisierbar.
2.5.2 Kapillarelektrophorese mit Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion
2.5.2.1 Grundlagen der Fluoreszenz
Fluoreszenz ist ein optisches Phänomen, bei dem ein Atom oder Molekül ein Photon
absorbiert und später ein Photon mit niedrigerer Energie (d.h. größerer Wellenlänge) emittiert.
Dieses Phänomen tritt bei bestimmten Molekülen, z.B. polycyclischen aromatischen
Kohlenwasserstoffen, sog. Fluorophoren, auf und ist ein dreistufiger Prozess, der sich
besonders anschaulich mit Hilfe des Jablonski-Termschemas erklären lässt.
Abb. 2: Jablonski Termschema
Stufe 1: Anregung
Ein Photon bestimmter Energie (hȞex) wird mit einer externen Quelle, z. B. einem Laser, zur
Verfügung gestellt und von einem Fluorophor absorbiert, was zu einem angeregten
elektronischen Singulett-Zustand S1´ führt.
Stufe 2: Lebensdauer des angeregten Zustandes
Der angeregte Zustand hat normalerweise eine Lebenszeit von 1-10ns. In dieser Zeit
unterliegt der Fluorophor verschiedenen Einflüssen wie Konformationsänderungen und
16
Theoretischer Hintergrund
Kollisionen mit anderen Molekülen. Daraus ergeben sich zwei bedeutsame Konsequenzen.
Erstens verliert der angeregte Zustand geringfügig an Energie, was zu dem relaxierten
Zustand S1 führt, von welchem aus dann die Fluoreszenz stattfindet. Zweitens kehren nicht
alle ursprünglich angeregten Moleküle über Fluoreszenzemission in den Grundzustand
zurück, sondern werden durch andere Prozesse [Löschung, FRET (fluorescence resonance
energy transfer), intersystem crossing] daran gehindert. Dies führt zu einer reduzierten
Photonenausbeute. Das Verhältnis aus der Zahl der emittierten Fluoreszenzphotonen (Stufe 3)
und der Zahl der ursprünglich absorbierten Photonen (Stufe1) bezeichnet man als
Fluoreszenz-Quantenausbeute (fluorescence quantum yield, FQY).
Stufe 3: Fluoreszenzemission
Ein Photon der Energie hνem wird emittiert und der Fluorophor kehrt in den Grundzustand
zurück. Auf Grund des Energieverlustes im angeregten Zustand (Stufe 2) ist die Energie
dieses Photons geringer und hat daher eine höhere Wellenlänge als das Anregungs-Photon
(Stokesche
Verschiebung).
Diese
Verschiebung
ist
essentiell
für
Fluoreszenz-
detektionstechniken, da sie die Detektion der Fluoreszenzphotonen ohne Beeinträchtigung
durch das eingestrahlte Licht erlaubt [79].
2.5.2.2 Fluoreszenzlöschung (Quenching)
Als Fluoreszenzlöschung bezeichnet man alle Prozesse, die die Quantenausbeute erniedrigen
ohne das Fluoreszenzspektrum zu verändern. Man unterscheidet dabei zwei verschiedene
Typen von Löschvorgängen:
•
Die dynamische Löschung tritt bei Zusammenstößen von Fluorophor und Löscher
während des angeregten Zustandes auf. Der Fluorophor überträgt seine Energie auf
den Löscher und kehrt strahlungslos in den Grundzustand zurück.
•
Beim statischen Löschen wird im angeregten Zustand ein nicht fluoreszierender
Komplex zwischen Löscher und Fluorophor gebildet.
Bei beiden Vorgängen müssen also Löscher und Fluorophor in Kontakt miteinander treten.
Die Löschprozesse verursachen keine chemischen Veränderungen an den beteiligten
Molekülen [80].
2.5.2.3 Laser-induzierte Fluoreszenzdetektion (LIF)
Bei der Fluoreszenz-Detektion ist die Anregung des Fluorophors mittels einer inkohärenten
(z. B. Glühlampe) oder einer kohärenten Lichtquelle (z. B. Laser, „light amplification by
17
Theoretischer Hintergrund
stimulated emission of radiation“) notwendig. Fluoreszenzdetektoren verwenden als
Lichtquelle meist Hochdruck-Gasentladungslampen (Quecksilber- oder Xenonlampen). Ihre
Strahlungsintensität muss möglichst konstant gehalten werden, da die Fluoreszenzintensität
des Fluorophors von der Intensität des Anregungslichtes abhängt. Durch den Einsatz von
Laserlicht erhöht sich die Intensität der Anregung und daher die Empfindlichkeit enorm.
Diese als LIF bezeichnete Detektionstechnik ist geeignet um 1-0.01 amol Substanz
nachzuweisen und ist 100-Mal empfindlicher als die normale Fluoreszenzdetektion und ca.
1000-Mal empfindlicher als die Detektion über UV-Absorption [81]. Bei der Erzeugung von
Laserlicht steht im Gegensatz zu inkohärenten Lichtquellen die stimulierte Emission im
Vordergrund. Dazu wird ein aktives Medium (z. B. ein Festkörper oder ein Gas) durch eine
Blitzlampe oder Spannung in einen angeregten Zustand gebracht (Inversion). Durch die
Positionierung des aktiven Mediums zwischen zwei Spiegeln kommt es zu einer Verstärkung
des Laserstrahls. Der dabei entstehende Laserstrahl ist monochromatisch (einfarbig), kohärent
(phasenkonstant)
und
nahezu
parallel.
Das
bedeutet,
dass
man
gezielt
das
Absorptionsmaximum des Fluorophors mit einem speziellen Laser anregen kann. Laserlicht
ist weiterhin gut über Glasfasern zum Detektionsfenster der Kapillare zu transportieren, wo es
sich sehr genau auf das Innere der nur 50-100µm dicken Kapillare fokussieren lässt und auch
kleinste Substanzmengen mit hoher Effizienz zur Fluoreszenz anregen kann.
2.5.2.4 Grundlagen der Kapillarelektrophorese
Unter dem Begriff der Elektrophorese versteht man die unterschiedliche Wanderung
geladener Teilchen in einem elektrischen Feld. Verantwortlich für dieses Verhalten sind die
Differenzen in den Ladungsdichten der Moleküle und unterschiedliche Reibungswiderstände,
die der Wanderung entgegenwirken. Bei der klassischen Elektrophorese, eingeführt von
Tiselius 1937, wurden zunächst Proteine in einem Tubus zwischen Elektrolyten platziert und
nach Anlegen eines elektrischen Feldes getrennt [80]. Später wurden dann mit Elektrolyten
imprägnierte Gele oder Papierstreifen verwendet, was die Störungen durch Diffusion und
Konvektion stark reduzierte und die Trennleistung entscheidend verbesserte. Erst Jorgensen
und Lukacs erreichten Anfang der 80er Jahre unter Verwendung von fused-silica Kapillaren
aus der Gaschromatographie hocheffiziente Trennungen [83-86]. Dies ist vor allem auf das
günstige Oberflächen-Volumen-Verhältnis dieser Kapillaren mit nur 50-200µm Innendurchmesser zurückzuführen, was die störende thermisch induzierte Konvektion stark
reduziert.
Die
Verwendung
von
Kapillaren
erweiterte
darüber
hinaus
das
Anwendungsspektrum der Elektrophorese über das Feld der Trennung von Makromolekülen
18
Theoretischer Hintergrund
hinaus bis hin zur Analyse kleiner Kationen oder Anionen und sogar neutraler Moleküle. Der
schematische Aufbau einer Kapillarelektrophorese ist in der folgenden Abbildung dargestellt.
Abb. 3: Schematischer Aufbau einer Kapillarelektrophorese [87]
Bei der Kapillarelektrophorese erfolgt die Trennung heute typischerweise in Polyimid
beschichteten Kapillaren von 30-100cm Länge und 25-75µm Innendurchmesser bei
Spannungen von bis zu 30 000 Volt. Die puffergefüllte Kapillare taucht dabei in Pufferreservoirs ein, die über Elektroden mit einer Hochspannungsquelle verbunden sind. Zur
Injektion der Probe wird ein Reservoir durch ein Probengefäß ausgetauscht und durch
Anlegen eines Druckes (hydrodynamisch) oder eines elektrischen Feldes (elektrokinetisch)
eine definierte Menge der Probe injiziert (Inlet). Nach erneutem Austausch des Probengefäßes
gegen das Pufferreservoir wird die Trennspannung angelegt, wodurch die Analyten im
elektrischen Feld unterschiedlich schnell Richtung des anderen Kapillarendes (Outlet)
migrieren und dort mit Hilfe eines on-line Detektors qualitativ und quantitativ nachgewiesen
werden können.
Um die hohen Effizienzen zu gewährleisten, muss eine Überladung der Kapillare vermieden
werden, weshalb nur wenige Nanoliter Probe injiziert werden. Deshalb werden hohe
Anforderungen an das Probenaufgabesystem einer kapillarelektrophoretischen Apparatur
gestellt. Der kritische Faktor dabei ist die Größe des Probenpfropfens, der etwa 1% der
Kapillarlänge betragen sollte. Dies bedeutet eine zur Verfügung stehende Injektionslänge von
wenigen Millimetern. Unter Berücksichtigung des Kapillardurchmessers ergeben sich
typischerweise Injektionsvolumina von 1 bis 50nl. Dies ist vorteilhaft, wenn nur geringe
19
Theoretischer Hintergrund
Probenmengen zur Verfügung stehen, limitiert aber gleichzeitig die Sensitivität für verdünnte
Lösungen. Es kann entweder die hydrodynamische oder elektrokinetische Injektion eingesetzt
werden. In beiden Fällen ist das Injektionsvolumen mathematisch zugänglich.
2.5.2.5 Kapillarelektrophoretische Methoden
Das einfache Prinzip der kapillarelektrophoretischen Trennungen ermöglicht eine große
Anzahl unterschiedlicher Applikationen. Die wichtigsten Ausführungstechniken sind:
- Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
- mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
- Kapillargelelektrophorese (CGE)
Kapillarzonenelektrophorese
Bei der CZE findet die Trennung in einer lediglich mit Puffer gefüllten Kapillare statt. Nach
der Probenaufgabe wird eine Spannung zwischen Inlet und Outlet angelegt und unter dem
Einfluss des elektrischen Feldes migrieren die Probenkomponenten mit unterschiedlichen
Geschwindigkeiten zu den entsprechenden Elektroden. Da in fused-silica-Kapillaren der
elektroosmotische Fluss zur Kathode gerichtet ist und in den meisten Fällen die
Elektromigration der Anionen überkompensiert, können sowohl Kationen, Anionen und
neutrale Teilchen am kathodischen Ende der Kapillare detektiert werden. Getrennt werden die
Teilchen hierbei nach ihrer Ladungsdichte (Verhältnis von Ladung zu Masse), das bedeutet
auch, dass neutrale Teilchen bei dieser Methode nicht getrennt werden können. Somit eignet
sich diese Trennmethode nur für ionische Analyten.
Mizellare elektrokinetische Chromatographie
Die
MEKC
stellt
eine
Kombination
aus
elektrophoretischen
und
mizellaren
flüssigkeitschromatographischen Trennprinzipien dar. Diese Technik wurde von Terabe et al.
eingeführt, um im Gegensatz zur CZE auch ungeladenen Probenkomponenten trennen zu
können. [88, 89]. Sie beruht auf dem Verteilungsgleichgewicht zwischen einer mobilen, durch
Elektroosmose bewegten Phase und einer „pseudo-stationären“ Phase, gebildet durch
Mizellen. Als Mizellenbildner werden Tenside oberhalb ihrer kritischen mizellaren
Konzentration eingesetzt, also der Konzentration, ab der sich die Moleküle des Detergens in
Lösung zusammenlagern und Mizellen bilden. Die dabei verwendeten Detergentien können
sowohl
anionisch
(Natriumdodecylsulfat,
SDS),
kationisch
(Hexadecyltrimethyl-
ammoniumchlorid, CTAB) oder zwitterionisch (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-
20
Theoretischer Hintergrund
2-hydroxypropansulfonat, CHAPS) sein. Daneben gibt es ungeladene Pufferadditive wie
chirale Cyclodextrine zur Trennung von ionischen Enantiomerengemischen oder Kronenether,
die als Wirtsmoleküle dienen.
Kapillargelelektrophorese
Bei
der
CGE
erfolgt
die
Trennung
auf
Grund
der
Größenunterschiede
der
Probenkomponenten. Insbesondere biologische Makromoleküle, die als Polyanionen oder
Polykationen vorliegen, unterscheiden sich nur gering in ihren Ladungsdichten und somit in
ihrer elektrophoretischen Mobilität. Ist aber die Kapillare mit einer Polymerlösung gefüllt, die
ein dreidimensionales Netzwerk darstellt, wird die Mobilität der Probenkomponenten
größenabhängig beeinflusst. Somit beruht der Transport durch die Kapillare auf der Ladung
der Makromoleküle, die Migrationszeit hängt jedoch von der Molekülgröße ab. Daher wird
die Methode vor allem bei der Trennung von DNA-Bruchstücken, zum Beispiel bei der DNASequenzierung eingesetzt. Die verwendeten Polymere in der CGE können kovalent
miteinander verknüpft (bis-Polyacrylamid) oder durch Wasserstoffbrücken verbunden
(Agarose) sein oder als Netzwerk linearer Polymerlösungen (Polyacrylamid oder
Methylcellulose) vorliegen.
2.6 Theoretischer Hintergrund - Fluoreszenzmarkierung
Radioaktive Markierungen ermöglichen den Nachweis sehr geringer Substanzmengen,
allerdings ist der Einsatz radioaktiver Isotope mit erheblichen Nachteilen behaftet. Die
Vorkehrungen zur Vermeidung gesundheitlicher Folgen, die Entsorgungskosten sowie die
erforderlichen behördlichen Umgangsgenehmigungen haben dazu geführt, dass in den letzten
Jahrzehnten
große
Anstrengungen
unternommen
wurden,
klassische
radioaktive
Analysenmethoden durch weniger gefährliche, aber ähnlich sensitive Fluoreszenzmethoden
zu ersetzen [90]. In der Regel ist das zu analysierende Biomolekül nicht selbst fluoreszierend,
so dass es selektiv mit entsprechenden Fluorophoren chemisch oder enzymatisch gekoppelt
werden muss. Die dabei eingesetzten Fluoreszenzmarker bestehen aus zwei getrennt zu
betrachtenden Molekülteilen, nämlich dem eigentlichen Fluorophor als signalgebendem
Baustein und der Ankergruppe (Spacer, Linker), welche als reaktive Kopplungseinheit die
selektive Anbindung an das zu markierende Molekül ermöglicht. Inzwischen gibt es eine
kaum noch zu überschauende Bandbreite an einsetzbaren Fluorophoren für die
verschiedensten Wellenlängenbereiche, die mit einer Vielzahl von unterschiedlichen
21
Theoretischer Hintergrund
Ankergruppen kombiniert werden können, so dass sich immer mehr Anwendungsgebiete
eröffnen [80].
Unter den Fluorophoren nimmt BODIPY (4,4-Difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen) eine
Sonderstellung ein. So sind die Fluoreszenzeigenschaften unabhängig vom pH-Wert des
Lösungsmittels und die schmalen Emissionsbanden bedingen eine höhere Signalintensität als
bei den meisten anderen Fluorophoren [80].
8
7
1
2
6
N
5
4a
F
4
B
N
3a
3
F
Abb. 4: 4,4-Difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen, „BODIPY“
Dieser Fluorophor besitzt mit einem Extinktionsmaximum bei 503nm und einem
Emissionsmaximum bei 510nm [80] geeignete spektroskopische Eigenschaften zur Anregung
mit Argon-Ionen-Lasern mit einer Emmissionswellenlänge von 488nm. Darüber hinaus
verfügt BODIPY trotz des Fehlens von Carbonsäuregruppen über eine ausreichende
Wasserlöslichkeit.
2.6.1 Fluoreszenzmarkierung von Mononukleotiden
In der DNA-Addukt Analytik gibt es zum einen den Fall, dass bestimmte DNA-Addukte
polyzyklischer Kohlenwasserstoffe im Bereich von 320nm eine Eigenfluoreszenz aufweisen;
so konnten beispielsweise dG-Addukte des B[a]P mit HPLC-FD und CE-LIF detektiert
werden [91, 92]. Zum anderen gibt es den Fall, dass die zu analysierenden DNA-Addukte vor
der Analyse mit einem fluoreszierenden Molekül versehen werden müssen. Die meisten in der
Literatur beschriebenen Methoden stammen aus den Bereichen der DNA-Sequenzierung und
Hybridisierungstechniken und verwenden Fluoreszenzmarker, die entweder an das 3’- oder
5’-Ende eines Oligonukleotids [93, 94], an die Phosphatbrücke zwischen zwei Nukleotiden
[95, 96], an die Ribose [97, 98] oder die Nukleobase [99, 100] über einen Spacer gekoppelt
werden.
Im Jahre 1983 stellten Chu et al. eine einfache und effiziente Methode vor, Mono- und
Oligonukleotide in wässrigen Medien unter Carbodiimid-Aktivierung mit Ethylendiamin zu
22
Theoretischer Hintergrund
konjugieren [101]. Dabei wird das 5’-Phosphat-Ende der Nukleotide in ein reaktives
Imidazolid überführt, welches in Anwesenheit von Aminen in 85%iger Ausbeute zu 5’Phosphoramidaten umgesetzt werden kann.
O
O
HO P O
Base EDC
O
Imidazol
OH
N
N P O
OH
OH OH
O
O
H2N
Base
NH P O
O
OH
EDA
OH OH
Base
OH OH
Abb. 5: Darstellung von Nukleosid-5’-Ethylendiaminphosphoramidaten nach Chu et al.; Base = Uracil, Adenin,
Cytosin oder Guanin; EDC = 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid; EDA =
Ethylendiamin
Diese Synthesestrategie eröffnete nun die Möglichkeit, Amin-reaktive Fluoreszenzmarker
über die generierte primäre Aminogruppe an 2’-Desoxy- und Ribonukleotide zu koppeln, was
man in Analogie zu den radioaktiven Postlabeling-Methoden auch als FluoreszenzPostlabeling bezeichnet. Die Übertragung dieser Strategie auf 2’-Desoxynukleosid-5’Phosphate wurde allerdings erst 1988 von Kelman et al. [102] beschrieben. Hierbei wurden
2’-Desoxynukleosid-5’-ethylendiamin-phosphoramidate
mit
Dansylchlorid
zu
fluores-
zierenden Konjugaten verknüpft, mittels HPLC getrennt und detektiert.
H2N
O
NH P O
OH
O
Base
SO2 HN
Dansylchlorid
(CH3)2N
OH
O
NH P O
OH
O
Base
OH
Abb. 6: Darstellung dansylierter 2’-Desoxynukleosid-5’-Phosphate nach Kelman et al.; Base = Adenin, Cytosin,
Guanin, Thymin
Die Analyse verschiedener dansylierter, z. T. auch an der Base modifizierter, 2’Desoxynukleosid-5’-ethylendiamin-phosphoramidate unter Verwendung der mizellaren
elektrokinetischen Chromatographie mit Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion (MEKC-LIF)
wurde erstmals 1991 von Lee et al. beschrieben [103]. Basierend auf dem gleichen Prinzip
stellten Al-Deen et al. 1990 ebenfalls Fluorescein-konjugierte Nukleotide dar [104]. Auch hier
wurden die 2’-Desoxynukleosid-5’-Phosphate nach Chu et al. [101] zuerst in EthylendiaminPhosphoramidate überführt. Die Darstellung fluoreszenzmarkierter Nukleotide erfolgte dann
durch Umsetzung der primären Aminogruppe mit Fluoresceinisothiocyanat, wobei eine
stabile Thioharnstoff-Bindung gebildet wird. Zur Detektion von DNA-Addukten mittels
23
Theoretischer Hintergrund
Fluoreszenz-Postlabeling durchgesetzt hat sich zunächst die Markierung der Nukleotide mit
Ethylendiamin und Dansylchlorid, mit deren Hilfe verschiedene DNA-Addukte untersucht
wurden, z. B. UV-induzierte Schäden [102], 8-oxo-dG [105], Platinaddukte [106] und O6Methyl-Guanin [107]. Nachteilig an der Methode war aber vor allem, dass die DNA-Addukte
vor der Fluoreszenzmarkierung durch HPLC von den normalen Nukleotiden getrennt werden
mussten, um dann anschließend erneut mit HPLC/CE (LIF) getrennt und detektiert zu werden.
Wang und Giese stellten 1993 eine Derivatisierungstechnik vor, die ebenfalls auf das
beschriebene Prinzip der Konjugation einer Aminogruppe an die 5’-Phosphatgruppe von
Mononukleotiden unter Carbodiimid-Aktivierung beruht [108]. Sie machten sich die von Chu
et al. [101] beschriebene Imidazolid-Bildung zunutze, in dem sie einen an N-Acetyl-LHistidin gekoppelten Fluorophor (BODIPY-IMI) einsetzten. Dieses Konjugat koppelt über
den Imidazol-Ring des Histidins an die 5’-Phosphatgruppe der Mononukleotide unter
Ausbildung eines Nukleotid-Fluorophor-Imidazolids (Abb. 7). Da allerdings die N1- und N3–
Positionen nicht äquivalent sind, kommt es bei jeder Reaktion zu regioisomeren Gemischen
[14].
3
N
O
N
F
B
O
N
F
O
O
HO P O
OH
HN
NH
HN
O
Base
EDC
1
NH
O
R
N
N P O
OH
O
Base
R
OH
OH
Abb. 7: Darstellung fluoreszenzmarkierter 2’-Desoxynukleosid-5’-Monophosphate nach Wang und Giese [14]
In den letzten Jahren wurde diese Markierungsstrategie weiter ausgebaut, indem spezielle
Fluoreszenzfarbstoffe mit besonderen Eigenschaften eingesetzt wurden: 4-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-2,1,3-benzoxadiazol als Fluorophor war deutlich stabiler gegenüber
Hydrolyse, die Nachweisgrenze mit einem Helium-Cadmium Laser (Anregungswellenlänge
λex = 442 nm, Detektion bei λem = 560nm) war jedoch 10fach schlechter als mit BODIPY-IMI
[109]. Ein Cyanin-Farbstoff mit einer Fluoreszenz im nahen Infrarot Bereich besticht durch
erhöhte Empfindlichkeit auf Grund der geringen natürlichen Störsignale der biologischen
Matrix in diesem spektralen Bereich. Allerdings ist das nötige Zubehör für die CE bisher nicht
kommerziell erhältlich, sondern wurde speziell angefertigt [110, 111].
24
Aufgabenstellung
3 Aufgabenstellung
Die derzeit am häufigsten zur Analyse von DNA-Addukten eingesetzte Methode, ist das 32PPostlabeling-Verfahren, welches die Detektion von einem Addukt in 109 unmodifizierten
Nukleotiden ermöglicht und dabei mit einer DNA-Menge von 10µg auskommt. Neben diesen
vorteilhaften Eigenschaften hat diese Methode jedoch mehrere Nachteile. Hauptnachteile
sind, dass es sich um ein radioaktives Nachweisverfahren handelt, die Analysen
zeitaufwendig sind und unterschiedliche DNA-Addukte nicht simultan analysiert werden
können. In den letzten Jahren wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen Methoden zum
Nachweis von DNA-Addukten entwickelt, die auf Fluoreszenzdetektionstechniken beruhen.
Besonders vielversprechend erscheint eine im Arbeitskreis von Prof. Wießler entwickelte
Fluoreszenz-Postlabeling-Methode, die die ausgezeichnete Selektivität der kapillarelektrophoretischen Trennung mit der hohen Empfindlichkeit der Laser-induzierten
Fluoreszenzdetektion kombiniert. Die Methode beruht auf dem enzymatischen Verdau von
DNA zu 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphaten, deren chemischer Fluoreszenzmarkierung mit
dem
Farbstoff
BODIPY-FL-EDA
und
der
anschließenden
Analyse
mittels
Kapillarelektrophorese und Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion.
In der vorliegenden Arbeit sollte diese Methode weiterentwickelt werden, um sie zur
Detektion von DNA-Addukten in in vivo Proben einsetzen zu können. Der Schwerpunkt
dieser Optimierungsversuche sollte auf der Verbesserung der Empfindlichkeit der Methode
liegen. Des weiteren sollte, aufbauend auf der bereits etablierten Analysenmethode, eine
Variante entwickelt und validiert werden, die auf der Hydrolyse von DNA zu 2’Desoxynukleosid-5’-Phosphaten basiert. Hierzu sollten zunächst geeignete Bedingungen für
Hydrolyse, Fluoreszenzmarkierung und die kapillarelektrophoretische Trennung ausgearbeitet
werden. Im Anschluss an die Validierung der Methode sollten verschiedene DNAModifikationen, die durch endogene Prozesse wie oxidativen Stress, Lipidperoxidation und
Deaminierungen entstehen, in Oligonukleotiden und DNA untersucht werden.
Eine auf der Basis von Nukleosid-5’-Phosphaten beruhende Fluoreszenz-PostlabelingMethode bietet auch die Möglichkeit, normale und modifizierte Ribonukleotide zu
untersuchen. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte diese Methode deshalb auch zur Analyse
von RNA ausgearbeitet und validiert werden. Mit dieser Methode sollte dann zunächst
versucht werden die häufigste veränderte RNA-Base (Pseudouracil) in verschiedenen RNATypen nachzuweisen, und die Zusammensetzung der RNAs unterschiedlicher Organismen
miteinander zu vergleichen.
25
Ergebnisse und Diskussion
4 Ergebnisse und Diskussion
4.1 Stand der Forschung
In der Arbeitsgruppe von Prof. Wießler wurde mit Unterstützung durch die Deutsche
Bundesstiftung Umwelt (DBU) in den letzten Jahren eine neue Methode zur Analyse von
DNA-Addukten und DNA-Modifikationen entwickelt [16, 112]. Sie basiert zwar auf den
anderen in der Literatur beschriebenen Methoden des Fluoreszenz-Postlabelings von
Nukleotiden [14, 102], d. h. Konjugation eines Fluoreszenzmarkers über eine primäre
Aminofunktion an die Phosphatgruppe, ist diesen aber in einigen Punkten überlegen. Diese
neue Analysenmethode lässt sich in drei Stufen unterteilen, die nacheinander im selben
Reaktionsgefäß durchgeführt werden:
1. Die enzymatische Hydrolyse der DNA zu 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphaten (dNps)
mit
einem
Enzymgemisch
aus
Mikrokokkennuklease
(MN)
und
Milz-
Phosphodiesterase (SPD).
2. Die Derivatisierung der modifizierten und unmodifizierten Nukleotide mit dem
Fluoreszenzfarbstoff
4,4-Difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-
propionyl-ethylendiamin (BODIPY-FL-EDA, s. Abb. 8).
3. Die auf mizellarer elektrokinetischer Chromatographie (MEKC) basierende Trennung
der Bodipy-Konjugate mit anschließender Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion
(CE-LIF).
N
F
B
N
F
NH
NH2 .HCl
O
Abb.
8:
4,4-Difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionylethylendiaminhydrochlorid
(BODIPY-FL-EDA) von Molecular Probes (Eugene, Oregon USA)
Von besonderer Bedeutung ist, dass die Ankergruppe des BODIPY-FL-EDA als Analogon zu
Ethylendiamin aufgefasst werden kann, was die Übertragung der von Chu et al. [101]
erarbeiteten Darstellung von 2’-Desoxynukleosid-3’-Ethylendiamin-Phosphoramidaten auf
die Bedingungen nach der DNA-Hydrolyse ermöglichte. Auf diese Weise konnte der
Fluoreszenzfarbstoff
in
einer
„1-Schritt-Reaktion“
ohne
Aufreinigung
von
Zwischenprodukten, wie noch bei Kelman [102] und Wang [108] notwendig, an die
Phosphatgruppe gekoppelt werden. Im Gegensatz zu den über den Imidazol-Ring des
26
Ergebnisse und Diskussion
Histidins gebundenen Fluoreszenzmarkern [14] wurde auf diese Weise auch die Bildung
regioisomerer Kopplungsprodukte durch eine primäre Aminofunktion als Ankergruppe sicher
vermieden.
Die selektive Konjugation der Phosphatgruppe der 2’-Desoxynukleosid-3’-Monophosphate an
die Aminogruppe des BODIPY-FL-EDA wurde durch Aktivierung des Phosphats mit dem
wasserlöslichen
Carbodiimid
N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid
(EDC)
erreicht (siehe Abb. 9). Um die gewünschte Kopplung des Markers an das Nukleotid zu
gewährleisten, muss sichergestellt sein, dass die Reaktionslösung und insbesondere die
verwendeten Puffer frei von Amino-, Phosphat- und Carbonsäuregruppen sind. Natürlich
dürfen auch die verwendeten Fluoreszenzmarker keine weiteren derartigen funktionellen
Gruppen tragen, da dies zu Reaktionen der Farbstoffe untereinander führen würde.
H
+
N
H3C
HO P O
O
+
NH
CH3
NH
-
C2H5N C N
C2H5NH
CH3
OR
C2H5N C
O
O
P
O
OR
CH3
HN
O
Nu
P OR
C O
+
-
O
+
Nu
HN
CH3
H3C
H
Abb. 9: Darstellung N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) vermittelter nukleophiler
Phosphorsäuremonoester-Modifikationen; Nu = Nukleophil
Folglich wurde bislang für die Derivatisierung der dNps mit BODIPY-FL-EDA als Puffer N(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N’-2-ethansulfonsäure (HEPES) pH 6.5 verwendet, obwohl
HEPES mit einem pKs Wert von 7.4 wenig geeignet erscheint. Um einen Reinigungsschritt
zu vermeiden, wurde die vorgeschaltete enzymatische DNA-Hydrolyse ebenfalls in HEPESPuffer, pH 6.0, durchgeführt. Dafür mussten allerdings in beiden Schritten relativ hohe
Pufferkonzentrationen verwendet werden, um den pH-Wert stabil zu halten. Mit der
32
P-
Postlabeling Methode konnten Schmitz et al. [16] zeigen, dass die enzymatische Hydrolyse
von Kalbsthymus-DNA (CT-DNA) in HEPES-Puffer trotzdem mit gleichen Ausbeuten an
dNps abläuft wie die routinemäßig eingesetzte Hydrolyse in Natrium-Succinat, pH 6.0. Die
Bedingungen der Derivatisierungsreaktion wurden durch die Bildung des 2’-Desoxyadenosin3’-Phosphat Bodipy-Konjugats (dAp-Bodipy) kontrolliert und auch hierauf optimiert. dApBodipy ist auch das einzige vollständig durch 1H-,
13
C-,
19
F- und
11
B-NMR spektroskopisch
charakterisierte Bodipy-Konjugat [112].
27
Ergebnisse und Diskussion
Diese Fluoreszenz-Postlabeling Methode mit anschließender kapillarelektrophoretischer
Trennung und Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion (CE-LIF-Methode) wurde dann zur
Detektion von apurinischen Stellen (AP-Stelle), 5mC und zur Bestimmung verschiedener
endogener und exogener DNA-Addukte in Oligonukleotiden, CT-DNA oder humaner DNA
eingesetzt [16]. Sowohl die Bedingungen der Derivatisierungsreaktion als auch die
Trennparameter der CE-LIF-Analyse waren für alle erwähnten Untersuchungen identisch. Die
Reproduzierbarkeit der Methode wurde durch die mehrfache Analyse von Aliquots der selben
Kalbsthymus-DNA bestimmt. Unter Zusatz von Fluorescein als internem Standard wurden
Standardabweichungen für die korrigierten Peakflächen der Nukleotide zwischen 5.6% und
8.4% (n = 29) erhalten. Zur Signal-Identifizierung und exakten Quantifizierung wurden die
2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphat Bodipy-Konjugate der vier normalen Nukleotide (dAp, Tp,
dCp,
dGp)
synthetisiert,
Quantenausbeuten
(FQY)
massenspektrometrisch
(s.
Punkt
2.5.2.1)
charakterisiert,
ermittelt
und
ihre
Fluoreszenz-
standen
somit
als
Standardverbindungen zur Verfügung. Die einzelnen FQYs wurden auf die FluoreszenzQuantenausbeute des dAp-Bodipy-Konjugates normiert. Damit ergeben sich relative
Quantenfaktoren von 1.00 für dAp-Bodipy, 0.55 für das 2’-Desoxyguanosin-3’-Phosphat
Bodipy-Konjugat (dGp-Bodipy), 0.97 für Thymidin-3’-Phosphat Bodipy-Konjugat (TpBodipy) und 0.98 für das 2’-Desoxycytidin-3’-Phosphat Bodipy-Konjugat (dCp-Bodipy).
40
dAp-Bodipy
30
rel. Fluoreszenz
Tp-Bodipy
dCp-Bodipy
20
dGp-Bodipy
10
5mdCp-Bodipy
0
10
20
30
Migrationszeit [min]
Abb. 10: CE-LIF Analyse einer CT-DNA nach MN/SPD-Verdau zu 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphaten und
Derivatisierung mit BODIPY-FL-EDA. Der Ansatz wurde vor der Analyse 1:10 000 mit Wasser verdünnt.
28
Ergebnisse und Diskussion
In Abbildung 10 ist ein typisches Elektropherogramm einer CE-LIF Analyse von CT-DNA
nach Verdau mit MN/SPD zu dNps und anschließender Fluoreszenzmarkierung mit BODIPYFL-EDA gezeigt. Die Nachweisgrenze für reines dAp-Bodipy wurde mit den in Tabelle 4
angegebenen Bedingungen bestimmt und beträgt 8.5pM. Das bedeutet, dass bei einer
Probenaufgabe von 20x psi·s etwa 48nL einer 8.5pM dAp-Bodipy Lösung in die Kapillare
injiziert wurden (Stoffmenge = 0.4amol).
Für eine Analyse von DNA-Addukten in einer DNA-Probe muss diese auf Grund der hohen
Salzkonzentration und des großen Überschusses an unmodifizierten Nukleotiden vor der CELIF-Analyse allerdings mindestens einhundertfach mit Wasser verdünnt werden. Dies führt
generell zu einer um den Faktor 100 schlechteren Nachweisgrenze von 850 pM, was einer
Addukt-Häufigkeit von zwei DNA-Addukten in 106 unmodifizierten Nukleotiden entspricht.
Diese Sensitivität reicht für die Detektion vieler endogener DNA-Modifikationen und
Addukte sowie zur exakten Quantifizierung der DNA-Methylierung aus [113], aber nicht für
die Detektion exogener DNA-Addukte in vivo. Für die quantitative Analyse der GesamtGenom-Methylierung (Methylierungsgrad) in Tumorproben von Patienten mit chronisch
lymphatischer Leukämie (CLL) wurden mit Hilfe von DNA-Molekülen genau bekannter
Sequenzen (lambda DNA, bluescript plasmid) Korrekturfaktoren bestimmt, die zusätzlich zu
den
unterschiedlichen
Fluoreszenzeigenschaften
der
dNp-Bodipy-Konjugate
die
unterschiedlichen Reaktivitäten der verschiedenen dNps bei der Derivatisierung mit
BODIPY-FL-EDA widerspiegeln. Auf diese Weise konnte eine mittlere Standardabweichung
für den Methylierungsgrad von weniger als 5% erreicht werden [113]. Außerdem wurde die
Methode soweit optimiert, dass sie bereits mit 100ng DNA-Material (z. B. aus TumorBiopsien) zu zuverlässigen Ergebnissen für die Messung der genomweiten Methylierung führt
[114].
4.2 Fluoreszenzmarkierung von 2’-Desoxynukleosid-5’-Monophosphaten
Aus den oben gemachten Angaben lässt sich leicht erkennen, dass die Fluoreszenzmarkierung
mittels Kopplung von BODIPY-FL-EDA für den Nachweis vieler biologischer Moleküle
geeignet ist, sofern sie eine Phosphatgruppe bzw. eine Carbonsäuregruppe tragen. Deshalb lag
es nahe abzuklären, ob die auf dNps basierende Fluoreszenz-Postlabeling-Methode auf 2’Desoxynukleosid-5’-Phosphate (pdNs) übertragbar ist. Des Weiteren wurden die meisten in
der Einleitung beschriebenen Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Nukleotiden mit 5’Monophosphaten durchgeführt, da sie gegenüber den 3’-Monophosphaten eine Reihe von
29
Ergebnisse und Diskussion
Vorteilen aufweisen, darunter nicht zuletzt ihre leichtere Verfügbarkeit und der geringere
Preis. Weiterhin ist aus vielen
32
P-Postlabeling-Studien bekannt, dass adduktierte DNA
oftmals relativ resistent gegenüber dem Verdau mit MN/SPD ist, was sich in einer schlechten
Nachweisbarkeit bestimmter Addukte äußert [115]. Daher könnte der Verdau von
adduktierter DNA mit anderen Enzymen oder Bedingungen die Möglichkeit einer
verbesserten Addukt-Freisetzung bieten.
4.2.1 Vergleich der Kopplungsausbeuten von Nukleosid-3’- und -5’-Phosphaten
Versuche zur Kopplung von primären Aminen an pdNs unter Carbodiimid-Aktivierung
wurden bereits von Wörth durchgeführt [112]. Dabei wurden ausgehend von der von
Ivanovskaya et al. [116] beschriebenen Methode pdNs und dNps mit Glycinethylester unter
Zugabe von EDC zur Reaktion gebracht (Abb. 11).
NH2
N
OH
H3C
O
NH2
+
HO P O
O
O
O
N
NH2
N
EDC
Puffer
N
H3C
NH P O
O
O
OH
Abb.
11:
Darstellung
von
N
OH
O
O
N
N
N
OH
2’-Desoxyadenosin-5’-Glycinethylester-Phosphoramidat
(5’-dA-GLY-
Phosphoramidat)
Nach Optimierung der Reaktionsbedingungen wurden jeweils gleiche Volumina 1mM
Nukleotid-, 50mM EDC- und 300mM Glycinethylesterlösung in jeweils 100mM HEPESPuffer pH 6.5 bei Raumtemperatur für 36h umgesetzt. Wie Tab. 2 zeigt erzielten die pdNs
deutlich bessere Ausbeuten an Phosphoramidaten als die dNps, was mit der sterisch
anspruchsvolleren 3’-Phosphatgruppe erklärt wurde (s. Tab. 2).
Tab. 2: Vergleich der Kopplungsausbeuten der Umsetzung von 2’-Desoxynukleosid-5’- und 3’-Phosphaten
mit Glycinethylester unter EDC-Aktivierung [112]
30
2’-Desoxy-Nukleotid
5’-GLY-Phosphoramidat
3’-GLY-Phosphoramidat
Adenosin
91%
56%
Cytidin
76%
45%
Guanosin
91%
66%
Thymidin
66%
55%
Ergebnisse und Diskussion
Ersetzt man unter den oben beschriebenen Reaktionsbedingungen Glycinethylester durch den
Fluoreszenzfarbstoff BODIPY-FL-EDA, sinken die Ausbeuten deutlich, vor allem für die
pdNs. Tabelle 3 zeigt die Ausbeuten der Umsetzung von 2’-Desoxynukleosid-3’- bzw. 5’Phosphat mit EDC und BODIPY-FL-EDA in 100mM HEPES, pH 6.5, Reaktionszeit 36h bei
35°C [112]. Diese Ergebnisse führten dazu, dass nur die Derivatisierung der dNps mit
BODIPY-FL-EDA für die Fluoreszenz-Postlabeling-Methode zur DNA-Addukt Analytik mit
CE-LIF eingesetzt wurde.
Tab. 3: Vergleich der Kopplungsausbeuten der Umsetzung von 2’-Desoxynukleosid-5’- und 3’-Phosphaten
mit BODIPY-FL-EDA unter EDC-Aktivierung [112]
2’-Desoxy-Nukleotid
5’-Bodipy-Phosphoramidat
3’-Bodipy-Phosphoramidat
Adenosin
10%
34%
Cytidin
24%
26%
Guanosin
17%
24%
Thymidin
24%
24%
4.2.2 Fluoreszenzmarkierung von pdNs und dNps mit BODIPY-FL-EDA
Die unter 4.2.1 vorgestellten Ergebnisse zeigen aber, dass neben der Markierung von dNps
auch die Markierung von pdNs mit BODIPY-FL-EDA möglich ist, wenn auch mit
niedrigeren Ausbeuten. Eine vollständige Analyse von DNA nach Verdau zu 2’Desoxynukleosid-5’-Phosphaten, Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FL-EDA und die
kapillarelektrophoretische Trennung der entstandenen Konjugate wurde bisher nicht berichtet.
Um zu überprüfen, wie sich das Reaktionsverhalten der dNps von den pdNs unter den neuen
etablierten Standardbedingungen der Derivatisierung mit BODIPY-FL-EDA [16, 113]
unterscheidet, wurden die reinen 3’- und 5’-Monophosphate dAp und pdA sowie dCp und
pdC mit BODIPY-FL-EDA umgesetzt. Dafür wurden je 10µg dNp bzw. pdN in 30µl 0.8M
HEPES pH 6.5 gelöst, mit 30µl einer 1.8M EDC-Lösung (in 0.8M HEPES, pH 6.5) und 30µl
einer 25mM BODIPY-FL-EDA-Lösung (in 0.8M HEPES, pH 6.5) für 25h bei 25°C im
Dunkeln inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden anschließend 1:10 000 mit einer wässrigen
Fluorescein-Lösung
Kapillarelektrophorese
(1ng/ml)
und
als
internem
Laser-induzierter
Standard
verdünnt
Fluoreszenzdetektion
und
mittels
analysiert.
Die
Trennungen wurden in einer unbeschichteten fused-silica-Kapillare der Gesamtlänge 64cm
(effektive Länge bis zum Detektionsfenster = 59.4cm) mit einem Durchmesser von 50µm
31
Ergebnisse und Diskussion
durchgeführt,
und
die
Analyten
durch
Laser-induzierte
Fluoreszenz
bei
488nm
Anregungswellenlänge (Argon-Ionen-Laser) detektiert. Die Trennspannung betrug 25 000V
(390 V/cm) mit kathodischem Outlet. Die Injektion der Analyten erfolgte hydrodynamisch
mit 20x psi·s. Als Trennparameter wurden die etablierten Bedingungen für 3’-PhosphatBodipy-Konjugate verwendet: Trennpuffer 75mM SDS, 15% (v/v) Methanol in 17mM
Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0.
Zur quantitativen Auswertung wurden die Signalflächen zeitnormiert und auf die Fläche des
internen Standards bezogen. Die Korrektur der Signalflächen in Abhängigkeit von der
Migrationszeit ist bei kapillarelektrophoretischen Analysen immer notwendig, da die
Analyten im Gegensatz zu den üblichen chromatographischen Verfahren unterschiedlich
lange im Detektionsfenster der Kapillare verweilen. Eine langsamer wandernde Substanz
verursacht durch ihre längere Verweildauer im Detektionsfenster deshalb eine höhere
Signalintensität und damit eine größere Peakfläche als eine schneller migrierende mit
identischen Fluoreszenzeigenschaften. Aus diesem Grund werden alle Peakflächen vor einer
weiteren Auswertung durch die Migrationszeit dividiert, im Folgenden als korrigierte
Peakfläche bezeichnet [117].
Nach den Vorversuchen von Wörth (s. Seite 30/31) war zu erwarten, dass die
Derivatisierungsausbeute und damit die in der CE-LIF-Analyse erhaltenen Signalflächen für
die dNps größer sein würden als für die pdNs. Diese Einschätzung wurde durch die erhaltenen
Reaktionsausbeuten der Adenosin-Phosphate bestätigt, d. h. die normierte Peakfläche von
pdA-Bodipy betrug nur ca. 60% der Peakfläche von dAp-Bodipy. Dagegen zeigten die
Cytosin-Phosphate das umgekehrte Bild, die normierte Peakfläche des 3’-Phosphates war
deutlich kleiner als die des 5’-Phosphates (ca. 65% der Peakfläche). Unter der Annahme, dass
die Fluoreszenzeigenschaften der 5’- und 3’-Phosphat-Bodipy-Konjugate der jeweiligen
Nukleotide
gleich
sind,
kann
man
schließen,
dass
unter
den
verwendeten
Derivatisierungsbedingungen die Kopplungsausbeuten von dNps und pdNs mit BODIPY-FLEDA zwar unterschiedlich sind, aber nicht alle 5’-Phosphate schlechter markiert werden, wie
nach den Versuchen von Wörth [112] zu erwarten gewesen wäre. Dies war auch hinsichtlich
der Derivatisierungsbedingungen überraschend, da diese auf dNps optimiert waren.
Für weitere Untersuchungen wurden die pdNs der vier in der DNA vorkommenden Basen (je
10µg) unter den oben beschriebenen Bedingungen einzeln derivatisiert und standen danach
als Standards zum Aufstocken und zur Identifizierung der Signale in Gemischen zur
32
Ergebnisse und Diskussion
Verfügung. In einem zweiten Schritt wurden je 2.5µg der einzelnen pdNs zuerst gemischt und
dann gleichzeitig unter den selben Bedingungen derivatisiert.
In Abb. 12 ist das entsprechende Elektropherogramm der CE-LIF-Analyse für die vier
gemeinsam derivatisierten Nukleotide nach 1:10 000 Verdünnung mit Fluorescein-Lösung
gezeigt. Die Trennung der vier normalen pdN-Bodipy-Konjugate gelingt mit sehr guter
Basislinientrennung unter den für dNp-Bodipy-Konjugate entwickelten Trennbedingungen.
pdC-Bodipy
pdA-Bodipy
30
25
rel. Fluoreszenz
pT-Bodipy
20
Fluorescein
15
10
pdG-Bodipy
5
0
0
10
20
30
40
Migrationszeit [min]
Abb. 12: Trennung der vier normalen 2’-Desoxynukleosid-5’-Monophosphat-Bodipy-Konjugate mit Fluorescein
als internem Standard nach Derivatisierung einer Mischung von je 2.5µg der einzelnen pdNs. Trennbedingungen
wie in Tab. 4 angegeben
Zum Vergleich wurden die separat derivatisierten Standards zu gleichen Teilen gemischt
(jeweils 5µl der einzelnen Ansätze), danach 1:10 000 verdünnt und unter identischen
Bedingungen kapillarelektrophoretisch analysiert. Die Signalflächen der jeweiligen BodipyKonjugate waren nahezu identisch, so dass man davon ausgehen kann, dass die dNps in
beiden Versuchen mit gleicher Ausbeute fluoreszenzmarkiert wurden. Im Gegensatz zu den
dNp-Konjugaten
(s.
Abb.
10)
hat
sich
die
Migrationsreihenfolge
bei
gleichen
Trennbedingungen leicht verändert. Das pdG-Bodipy migriert nun am langsamsten, was für
die höchste Lipophilie spricht (längste Verweildauer in der Mizelle). Bei den dNp-BodipyKonjugaten nimmt diese Stellung das dCp-Bodipy bzw. das 5mdCp-Bodipy ein. Ansonsten
sind keine gravierenden Unterschiede zu beobachten, vielmehr erhält man gleich große
33
Ergebnisse und Diskussion
Peakflächen für die jeweiligen 5’- bzw. 3’-Phosphat-Bodipy-Konjugate und der für dGpBodipy beschriebene Fluoreszenz-Quenching-Effekt ist auch für pdG-Bodipy zu beobachten.
Allerdings wandern pdN-Bodipy-Konjugate prinzipiell schneller als ihre korrespondierenden
3’-Phosphat-Bodipy-Konjugate.
In Tabelle 4 sind noch einmal die verwendeten Bedingungen für die Fluoreszenzmarkierung
der 2’-Desoxynukleosid-5’- und 3’-Monophosphate und der CE-LIF-Analyse als Übersicht
dargestellt.
Tab. 4: Bedingungen für die CE-LIF Analyse von 2’-Desoxynukleosid-Monophosphaten
Analysenschritt
Bedingungen
Fluoreszenzmarkierung
10µl Nukleotidlösung (10µg pdN oder dNp, 30nmol)
(Derivatisierung)
+ 20µl 800mM HEPES, pH 6.5 (1mM Nukleotid)
+ 30µl 25mM BODIPY-FL-EDA in 800mM HEPES, pH 6.5
+ 30µl 1.8M EDC in 800mM HEPES, pH 6.5
Inkubation bei 25°C für 25h
Kapillarelektrophorese
unbeschichtete fused-silica-Kapillare, Lges = 64cm, Leff = 59.4cm
(MEKC), BioRad
Durchmesser = 50µm
2
BioFocus 3000 LIF
25kV Trennspannung ≈ 400V/cm
hydrodynamische Injektion 20x psi·s
Trennpuffer bestehend aus 17mM Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0;
75mM SDS, 15% Methanol
4.3 Entwicklung alternativer Hydrolyseverfahren für DNA
4.3.1 Überprüfung neuer Puffersysteme
Wie bereits dargelegt, ist die Auswahl des Puffersystems von entscheidender Bedeutung für
die selektive Kopplung der Phosphatgruppe mit der primären Aminofunktion des
Fluoreszenzmarkers. Dabei darf die Puffersubstanz keine primäre Aminogruppe oder
Carbonsäure enthalten. Gleichzeitig sollte der Puffer sowohl für den DNA-Verdau, als auch
für die anschließende Derivatisierung verwendbar sein, um eine Mischung verschiedener
Puffersalze
zu
vermeiden,
da
sich
diese
in
der
Regel
negativ
bei
der
kapillarelektrophoretischen Trennung bemerkbar macht. Für die enzymatische Hydrolyse der
DNA werden gleichzeitig ganz verschiedene Anforderungen an den Pufferbereich gestellt, da
34
Ergebnisse und Diskussion
die verwendeten Enzyme nur in einem bestimmten pH-Bereich optimal arbeiten. Die folgende
Abb. 13 gibt einen Überblick über die gebräuchlichsten Methoden Nukleinsäuren (DNA und
RNA) zu 3’- oder 5’-Nukleosid-Monophosphaten zu verdauen.
DNA/RNA
MN/SPD
pH 6.0
DNaseI/SVPD
pH 7.5
NP1
pH 5.5
O
O
Base
HO
O
HO
P
Base
O
HO
O
P
Base
O
O
OH
OH
O
P
O
(OH)
OH
(OH)
OH
(OH)
OH
OH
pdN (prN)
dNp (rNp)
Abb.
13:
Strukturen
der
Mononukleotide
aus
enzymatischer
pdN (prN)
DNA/RNA-Hydrolyse;
MN
=
Mikrokokkennuklease; SPD = Milz-Phosphodiesterase; NP1 = Nuklease P1; DNaseI = DNaseI aus
Rinderbauchspeicheldrüse; SVPD = Schlangengift-Phosphodiesterase aus Crotalus atrox; dNp = 2’Desoxynukleosid-3’-Phosphat; pdN = 2’-Desoxynukleosid-5’-Phosphat; prN = Ribonukleosid-5’-Phosphat; rNp
= Ribonukleosid-3’-Phosphat
Hieraus ist ersichtlich, dass für die optimale enzymatische Hydrolyse von DNA und RNA der
bisher verwendete HEPES-Puffer, pH 6.5, nur für den Verdau mit MN/SPD zu dNps geeignet
ist. Bei den anderen Vorschriften wird jedoch eine Puffersubstanz mit einem niedrigeren oder
höheren pKs-Wert benötigt.
Für die Derivatisierungsreaktion der Phosphatgruppen von Nukleotiden mit primären Aminen
sind in der Literatur bereits eine Reihe geeigneter Puffer beschrieben: Lutidin (2,6Dimethylpyridin) [101], Methylimidazol, HEPES und 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
(MES). Für die DNA-Hydrolyse wurde bisher allerdings nur HEPES, pH 6.0, analog zum
etablierten MN/SPD-Verdau bei der 32P-Postlabeling-Methode eingesetzt [112].
In Vorversuchen wurde für die Derivatisierung von 10µg dAp und pdA mit BODIPY-FLEDA unter den etablierten Bedingungen (s. Tab. 4) zunächst der 0.8M HEPES-Puffer, pH 6.5,
gegen 100mM Methylimidazol, pH 6.0, wie von Kelman et al. [102] verwendet, bzw. 250mM
MES, pH 6.5, ausgetauscht. Die Reaktionsansätze wurden anschließend gemäß der in Tabelle
35
Ergebnisse und Diskussion
4 beschriebenen Bedingungen mittels CE-LIF analysiert. Bei allen Versuchen konnte das
erwartete dAp- bzw. pdA-Bodipy-Konjugat zwar detektiert und durch Vergleich mit
Standards identifiziert werden, Methylimidazol gepufferte Reaktionen erzielten aber die
schlechtesten Ausbeuten für beide Konjugate. Wahrscheinlich läuft die Konjugation mit
BODIPY-FL-EDA bei pH 6.5 besser ab, als die von Kelman beschriebene Reaktion mit
Ethylendiamin (pH 6.0).
Die Kopplungsreaktionen in MES Puffer, pH 6.5, liefen ohne Probleme und mit etwa gleichen
Ausbeuten ab wie die in HEPES, pH 6.5. Diese Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit der
Hydrolyse von DNA mit NP1 zu pdNs, da MES-Puffer bei pH 5.5 einsetzbar ist. Durch das
Fehlen reaktiver funktioneller Gruppen ist MES ebenfalls für den Einsatz zur Derivatisierung
mit BODIPY-FL-EDA geeignet, so dass in diesem Schritt der Puffer nicht gewechselt werden
muss.
HO
O
N
N
SO3H
N
SO3H
MES
HEPES
Abb. 14: Strukturformeln von 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) und N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N’2-ethansulfonsäure (HEPES)
4.3.2 Überprüfung der DNA-Hydrolyse mit dem 32P-Postlabeling Verfahren
Um zu klären, ob die beiden Puffersubstanzen HEPES und MES bei der DNA-Hydrolyse mit
MN/SPD gleichwertig sind, wurden vergleichende Versuche durchgeführt und mit der
32
P-
Postlabeling Methode ausgewertet. Hierzu wurde CT-DNA, die in vitro mit 3Nitrobenzanthron behandelt war, verwendet (Proben NBA2 und NBA9). Die zuvor mit der
32
P-Postlabeling Methode bestimmten Gesamt-DNA-Addukt Mengen betrugen für NBA2 2
Addukte pro 108 normale Nukleotide und 4 Addukte pro 107 normale Nukleotide für NBA9.
Je vier Aliquots (12.5µg DNA) der beiden Proben wurden mit MN/SPD zu dNps verdaut.
Dabei wurden anstelle des standardmäßig verwendeten Natriumacetat-Puffers (100mM, pH
6.0) unterschiedliche Konzentrationen von HEPES und MES-Puffer des selben pH Wertes
eingesetzt (100mM und 250mM) und die DNA 3h bei 37°C hydrolysiert. Danach wurden
Aliquots, die 2.5µg DNA entsprachen, entnommen und mit [γ-32P]ATP mittels T4Polynukleotidkinase radioaktiv markiert [118]. Die radioaktiv markierten Proben wurden
36
Ergebnisse und Diskussion
nach Verdünnung auf Polyethylenimin-Cellulose-Fertigfolien aufgetragen, dünnschichtchromatographisch getrennt (Laufmittel 0.28M Ammoniumsulfat, 50mM Natriumphosphat,
pH 6.5) und autoradiographisch entwickelt (Abb. 15). Die quantitative Auswertung der
Radioaktivmarkierung erfolgte durch Messung der Zählraten (radioaktive Zerfälle pro
Minute) der markierten Nukleotide korrigiert durch die in Bahn 9 gemessenen
Hintergrundaktivität (Negativkontrolle, Wasser) mit einem Instant-Imager. Die Auswertung
ergab in allen Fällen keine Unterschiede in der gemessenen Radioaktivität, so dass man davon
ausgehen kann, dass die DNA mit den verwendeten Puffern und Konzentrationen gleich gut
verdaut wurde. Von Schmitz et al. war bereits nachgewiesen worden, dass die Verwendung
von HEPES-Puffer die gleichen Hydrolyse-Ausbeuten für CT-DNA liefert, wie der beim 32PPostlabeling verwendete Natriumsuccinat-Puffer [16].
32
Pi
T
C
A+V
G
[32P]-ATP
Origin
1
Abb. 15:
32
2
3
4
5
6
7
8
9
P-Postlabeling-Analyse unterschiedlicher DNA-Hydrolysate; Bahn 1-4: NBA2 verdaut in 100mM
HEPES (1), 250mM HEPES (2), 100mM MES (3) und 250mM MES (4); Bahn 5-8: NBA9 verdaut in 100mM
HEPES (5), 250mM HEPES (6), 100mM MES (7) und 250mM MES (8); Bahn 9: Negativkontrolle mit Wasser;
Origin = Auftragspunkt; G,A,C,T = radioaktiv markierte Nukleosid-3’,5’-Bisphosphate; V: Verunreinigung im
[32P]-ATP; 32Pi = freies, radioaktives Phosphat
37
Ergebnisse und Diskussion
Die DNA-Addukte in den restlichen 10µg des DNA-Verdaus wurden wie von Bieler et al.
beschrieben mit Butanol-Extraktion angereichert, radioaktiv markiert und getrennt [31]. Die
quantitative Auswertung der Addukt-Flecken ergab für NBA2 ein Gesamt-Addukt-Level von
3.2 Addukten pro 108 normalen Nukleotiden (100mM MES) bis 8.7 Addukten pro 108
normalen Nukleotiden (100mM HEPES). Bei NBA9 lagen die Werte zwischen 1.9 Addukten
pro 107 normalen Nukleotiden (250mM MES) und 3.8 Addukten pro 107 normalen
Nukleotiden (100mM HEPES). Die beobachteten Abweichungen liegen im üblichen Bereich
der
32
P-Postlabeling-Methode, so dass man davon ausgehen kann, dass die verwendeten
Puffer nicht nur gleich effektiv bei der DNA-Hydrolyse einsetzbar sind, sondern auch den
Addukt-Nachweis nicht beeinflussen.
4.3.3 Hydrolyse von DNA mit DNaseI/SVPD
Die Hydrolyse der DNA mit DNaseI und Snake Venom Phosphodiesterase (SVPD) zu pdNs
wird in der Literatur häufig beschrieben und ist auch für kleine DNA Mengen gut
standardisiert [119]. Sie baut ähnlich wie die Hydrolyse mit MN/SPD auf ein System aus
einer Endonuklease (DNaseI) und einer Exonuklease (SVPD). DNaseI verdaut die DNA in
kleine Einheiten von ca. vier Nukleotiden, die am 5’-Ende eine Phosphatgruppe und am 3’Ende eine OH-Gruppe besitzen. Die Exonuklease (SVPD) zerschneidet dann diese kleinen
Stücke vom 3’-OH Ende her in pdNs.
Die ersten Versuche zur Übertragung dieser Version des DNA-Verdaus orientierten sich an
den Angaben von Liuzzi et al. [120] und Dipple et al. [121]. Beide Methoden unterscheiden
sich grundsätzlich darin, dass einmal DNaseI und SVPD gleichzeitig zur DNA-Hydrolyse
eingesetzt werden [120], wogegen im anderen Fall der DNA-Verdau in zwei Schritten
durchgeführt wird; zuerst die Inkubation mit DNaseI, danach mit SVPD. Die beschriebenen
DNA- und Enzymkonzentrationen wurden übernommen und die Tris-Puffer durch HEPES
gleicher Molarität und gleichen pH-Wertes ersetzt (s. Tab. 39 und 40 im Experimentellen
Teil).
Die so erhaltenen CT-DNA Hydrolysate wurden danach wie gewohnt (s. Tab. 4) mit EDC
und BODIPY-FL-EDA umgesetzt. Dabei traten allerdings Probleme in Form von
Farbveränderungen auf, bzw. es bildeten sich rötliche Niederschläge im Reaktionsansatz. Der
Niederschlag wurde nach 16h kurz abzentrifugiert, die Probe 1:100 mit Wasser oder
Fluorescein-Lösung
(1ng/ml)
verdünnt
und
mit
CE-LIF
analysiert.
In
den
Elektropherogrammen wurden jedoch keine Peaks identifiziert, die mit den synthetisierten
38
Ergebnisse und Diskussion
Standards der pdN-Bodipy-Konjugate [112] übereinstimmten (nicht gezeigt). Die
wahrscheinlichste Ursache hierfür ist wohl die SVPD. Sie ist nur in Form von grob
aufgereinigtem Schlangengift erhältlich und zeigt nach dem Auflösen eine gelbliche Farbe.
Dies läßt auf Verunreinigungen schließen, die wiederum zu störenden Nebenreaktionen
führen können. Generell hatten die Elektropherogramme große Ähnlichkeit mit solchen, die
man nach Verwendung von Succinat-Puffern (störende Carbonsäure) für die DNA-Hydrolyse
erhält. Ein DNA-Verdau mit DNaseI/SVPD zu pdNs ist offenbar nicht mit den Bedingungen
zur Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FL-EDA kompatibel. Es konnte im Rahmen dieser
Arbeit jedoch nicht abschließend geklärt werden, ob das entscheidende Problem bei der
Markierungsreaktion mit dem Fluoreszenzfarbstoff, oder bereits bei der Hydrolyse der DNA
auftritt. Daher wurde diese Variante des DNA-Verdaus nicht weiter verfolgt.
4.3.4 Hydrolyse von DNA mit Nuklease P1
Eine weitere häufig gebrauchte Methode zum Verdau von DNA zu 2’-Desoxynukleosid-5’Phosphaten nutzt das Enzym NP1 aus Penicillium citrinum. Diese hat den Vorteil, dass sie
sowohl Endo- als auch Exonuklease-Aktivität aufweist und somit kein Enzymgemisch für die
vollständige Hydrolyse der DNA zu pdNs nötig ist. Das bedeutet auch, dass man den pHWert exakt auf das Optimum für NP1 einstellen kann (pH 5.5), ohne Kompromisse im
Hinblick auf ein zweites Enzym einzugehen oder den Verdau in zwei Schritte aufteilen zu
müssen. Für die Versuche zum Verdau von CT-DNA wurden die von Li et al. [122]
optimierten Hydrolyse-Bedingungen übernommen (s. Tab. 5), außer dass MES (50mM, pH
5.5), anstelle von Natriumacetat (50mM, pH 5.5) eingesetzt wurde. Die Hydrolyse wurde bei
37°C in 2h unter leichtem Schütteln (500rpm) in einem Eppendorf Thermomixer
durchgeführt.
Tab. 5: Modifizierte Bedingungen für die DNA-Hydrolyse zu 2’-Desoxynukleosid-5’-Phosphaten nach Li
et al. [122]
Substanz
Menge
Endkonzentration
CT-DNA
10µg (30.8nmol)
3.08nmol/µl
Nuklease P1 gelöst in H2O
2µl (0.066µg/µl)
0.0132µg/µl
Zinkchlorid (ZnCl2)
2µl (2mM)
0.4mM
MES 50mM, pH 5.5
6µl
30mM
Gesamtvolumen
10µl
39
Ergebnisse und Diskussion
Im Anschluss an den Verdau wurde die Probe, wie in Tabelle 6 angegeben,
fluoreszenzmarkiert und mit CE-LIF analysiert. Da für diese Versuche nun ein neues
Kapillarelektrophorese-Gerät
(Beckman
P/ACETM
MDQ
Glycoprotein-System)
zur
Verfügung stand, ergaben sich neben der Umstellung der Puffersubstanz von 800mM HEPES
auf 350mM MES für die Fluoreszenzmarkierung auch einige gerätespezifische Änderungen
für die elektrophoretische Trennung.
Tab. 6: Bedingungen für die CE-LIF-Analyse fluoreszenzmarkierter 2’-Desoxynukleosid-5’-PhosphatBodipy-Konjugate
Analysenschritt
Bedingungen
Fluoreszenzmarkierung
10µl Hydrolyselösung (10µg pdN, 30nmol)
(Derivatisierung)
+ 20µl 350mM MES, pH 6.5 (1mM Nukleotid)
+ 30µl 25mM BODIPY-FL-EDA in 350mM MES, pH 6.5
+ 30µl 1.8M EDC in 350mM MES, pH 6.5
Inkubation bei 25°C für 25h
Kapillarelektrophorese
unbeschichtete fused-silica-Kapillare, Lges = 59cm, Leff = 49cm
(MEKC),
Durchmesser = 50µm
Beckman Coulter,
25kV Trennspannung (420V/cm)
P/ACE MDQ
hydrodynamische Injektion 7.5x psi ·s (ca. 15nl)
Glycoprotein System
Trennpuffer bestehend aus 17mM Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0, 75mM
SDS, 15% Methanol
Lges = Gesamtlänge der Kapillare; Leff = effektive Länge der Kapillare bis zum Detektionsfenster; psi = pounds per
square inch
Im Gegensatz zu den CT-DNA-Hydrolysaten nach DNaseI/SVPD-Verdau traten während der
Fluoreszenzmarkierungs-Reaktion zu keiner Zeit Probleme auf, die Lösung blieb klar orange
und konnte nach 1:1000 Verdünnung mit Wasser ohne Schwierigkeiten analysiert werden.
Die vier Signale im Elektropherogramm (Abb. 16) wurden durch Aufstocken mit den
Standards der einzelnen pdN-Bodipy-Konjugate eindeutig identifiziert. Es fehlt jedoch der
Peak für das 5-Methyl-2’-Desoxycytosin-5’-Phosphat Bodipy-Konjugat (p5mdC-Bodipy). Da
bei einem Methylierungsgrad der CT-DNA von ca. 6% auch die Signalhöhe des 5mdCpBodipy etwa 6% der Höhe des dCp-Bodipys beträgt, war ein erkennbares Signal von ca. 0.5
relativen Fluoreszenzeinheiten (relative fluorescence units, RFU) zu erwarten. Da eine
unvollständige Freisetzung von p5mdC aus CT-DNA unwahrscheinlich erschien, wurde
40
Ergebnisse und Diskussion
systematisch versucht, die Trennbedingungen zu optimieren. Auch im Hinblick auf eine
spätere Anwendung für die Messung der genomweiten Cytosinmethylierung war dies von
Interesse. Die unsymmetrische Peakform des pdC-Bodipy ließ vermuten, dass p5mdC-Bodipy
mit pdC-Bodipy comigrierte. Aus den Ergebnissen konnte jedoch abgeleitet werden, dass
MES, 50mM, pH 5.5, für den Verdau, und MES, 350mM, pH 6.5, für die
Fluoreszenzmarkierung geeignet sind. Daher wurden diese Bedingungen für die weiteren
Versuche beibehalten.
12
pdA-Bodipy
10
pT-Bodipy
rel. Fluoreszenz
8
pdC-Bodipy
6
4
pdG-Bodipy
2
0
8
10
12
14
16
18
20
Migrationszeit [min]
Abb. 16: CE-LIF-Analyse von CT-DNA nach Nuklease P1 Verdau und Fluoreszenzmarkierung,
Trennbedingungen s. Tab. 6.
4.3.5 Methodenentwicklung zur kapillarelektrophoretischen Trennung von 5Methyl-2’-Desoxycytosin-5’-Phosphat-Bodipy (p5mdC-Bodipy)
Zur Optimierung der Trennbedingungen wurde auf das mittlerweile bewährte System aus
Natriumphosphatpuffer, pH 9.0, mit SDS als Mizellbildner und Methanol als „organischem
Modifier“ zurückgegriffen. Wie in Tab. 41 (s. S. 161) aufgeführt, wurden zehn Trennpuffer
mit unterschiedlichen Verhältnissen von SDS zu Methanol bei zwei verschiedenen
Stromstärken (20kV und 25kV) getestet.
41
Ergebnisse und Diskussion
Für die Peakidentifizierung und die Entwicklung der Trennbedingungen standen zwei
Oligodesoxynukleotide unterschiedlicher Länge, die jeweils ein 5mdC (C*) als Modifikation
enthielten, zur Verfügung:
Oligo Mod1: 5’-TCC*-ATC-TGG-AAC-3’
(12mer)
Oligo Mod2: 5’-TGC-C*AC-GTC-AGC-CTG-GAT-ACC-3’
(21mer)
Da nach dem Verdau der Oligonukleotide mit NP1 das 5’-endständige Nukleotid keine
Phosphatgruppe aufweist und deshalb nicht mit BODIPY-FL-EDA markiert werden kann,
fehlt es in der Analyse. Unter Berücksichtigung dieses Sachverhaltes berechnen sich die
prozentualen Anteile der einzelnen Nukleotide am gesamten Oligonukleotid wie in Tabelle 7
angegeben.
Tab. 7: Zusammensetzung der für die Methodenentwicklung verwendeten Oligodesoxynukleotide
Oligo Mod1 (12mer)
Oligo Mod2 (21mer)
Nukleotid
Anzahl
Anteil (%)
dA
3
27.3
dT
2
18.2
dG
2
18.2
dC
3
27.3
5mdC
1
9.1
dA
4
20
dT
3
15
dG
5
25
dC
7
35
5mdC
1
5
Durch die unterschiedlichen Anteile an 5-Methylcytosin in den Oligonukleotiden von 9.1%
bzw. 5% kann das 5mdC-Signal über die Proportionalität zur Gesamt-Peakfläche eindeutig
identifiziert werden.
Beide modifizierte Oligonukleotide (10µg) wurden nach den Bedingungen aus Tabelle 5 mit
Nuklease P1 verdaut und anschließend, wie in Tabelle 6 beschrieben, fluoreszenzmarkiert.
Verdünnungen dieser Derivatisierungsansätze wurden mit CE-LIF analysiert, wobei sich in
zwei der getesteten Trennpuffer-Systemen eine vollständige Basislinientrennung aller pdNBodipy-Konjugate zeigte. Dies waren 16mM Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0, 20% Methanol
(v/v), 75mM SDS (Abb. 17) und 18.5mM Natriumphosphat-Puffer pH 9.0, 7.5% Methanol
42
Ergebnisse und Diskussion
(v/v), 90mM SDS, die sich vor allem im Verhältnis Methanol/SDS unterscheiden. Dabei
erwies sich eine Trennspannung von 20kV durchweg als besser geeignet als 25kV, auch wenn
dafür eine etwa fünf Minuten längere Analysendauer in Kauf genommen werden musste. Des
weiteren war es für die Analysen völlig ausreichend nur 2.5x psi·s (ca. 5nl) in die Kapillare zu
injizieren. Dies führte zu einer weiteren Verbesserung der Auftrennung zwischen p5mdCBodipy und pdC-Bodipy.
4
pdC-Bodipy
pT-Bodipy
rel. Fluoreszenz
3
p5mdC-Bodipy
pdA-Bodipy
2
pdG-Bodipy
1
0
18
20
22
24
26
28
30
32
34
Migrationszeit [min]
Abb. 17: Analyse von Oligo Mod1 nach Verdau mit Nuklease P1 und Fluoreszenzmarkierung; Trennung auf
P/ACE MDQ mit 16mM Natriumphosphat, pH 9.0, 20% Methanol (v/v) 75mM SDS, 20kV
Eine
Erhöhung
der
Konzentration
des
Mizellbildners
SDS
bei
gleicher
Methanolkonzentration führte zu einer Verschiebung des p5mdC-Bodipy-Peaks hin zu
längeren Migrationszeiten (nicht gezeigt). Leider führt dieser Weg letztendlich zu einer
schlechteren Trennung von pdA-Bodipy und pT-Bodipy. Die zweite Variante mit 16mM
Natriumphosphat pH 9.0, 20% Methanol und 75mM SDS beschreibt dagegen das andere
Extrem einer hohen Methanolkonzentration bei niedrigerer SDS-Konzentration, wie Abb. 17
zeigt. Bei diesen Trennbedingungen konnten besser reproduzierbare Ergebnisse erzielt
werden, weshalb diese Elektrolytzusammensetzung für die weiteren Analysen verwendet
wurde.
43
Ergebnisse und Diskussion
Die in Tab. 7 berechneten Verhältnisse der einzelnen Nukleotide zueinander sowie ihr
prozentualer Anteil am gesamten Oligonukleotid spiegeln sich näherungsweise auch in den
Peakflächen des Elektropherogramms der Analyse von Oligo Mod2 wider (Abb. 18). Oligo
Mod2 besteht aus dA, T, 5mdC, dC, und dG im Verhältnis 4:3:1:7:5.
6
pdC-Bodipy
5
rel. Fluoreszenz
4
pdA-Bodipy
3
p5mdC-Bodipy
pT-Bodipy
2
pdG-Bodipy
1
0
18
20
22
24
26
28
30
32
Migrationszeit [min]
Abb. 18: Analyse von Oligo Mod2 nach Verdau mit Nuklease P1 und Fluoreszenzmarkierung; Trennung auf
P/ACE MDQ mit 16mM Natriumphosphat, pH 9.0, 20% Methanol (v/v), 75mM SDS, 20kV
Die quantitative Auswertung der CE-LIF-Analyse von Oligo Mod2 wird im Folgenden kurz
erläutert und ist in Tabelle 8 aufgelistet.
Dargestellt sind die Mittelwerte der Signalflächen aus acht aufeinander folgenden
Analysenläufen einer Probe, welche nach Division durch die Migrationszeit die korrigierte
Peakfläche ergeben. Für die Ermittlung des Nukleotidverhältnisses wurden alle korrigierten
Flächen durch die Fläche des p5mdC-Signals dividiert. Der aus der Analyse ermittelte
prozentuale Anteil der Nukleotide am Oligonukleotid (gemessener Nukleotidanteil in Tab. 8)
errechnet sich aus dem Verhältnis der einzelnen korrigierten Peakflächen zur Gesamtfläche
aller Nukleotide. Der Korrekturfaktor errechnet sich aus dem Verhältnis des praktisch
bestimmten Nukleotidanteils zum tatsächlichen Anteil des Nukleotids im Oligonukleotid.
44
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 8: Auswertung der CE-LIF Analyse von Oligo Mod2 (n = 8)
pdA-Bodipy
pT-Bodipy
pdC-Bodipy
p5mdC-
pdG-Bodipy
Bodipy
Fläche [Einheiten]
1958601 ±
1376566 ±
4113251 ±
525887 ±
818198 ±
90924
60185
163781
22593
24046
Migrationszeit [min]
22.247
23.463
24.944
24.451
26.227
Korrigierte Peakfläche
88211 ±
58787 ±
165234 ±
24545 ±
31218 ±
6342
4101
10939
1376
685
4.1
2.73
7.67
1.0
1.45
Gem. Nukl.-Anteil (%)
24.16 ± 0.24
16.16 ± 0.12
45.26 ± 0.18
5.90 ± 0.09
8.58 ± 0.43
Tats. Nukl.-Anteil (%)
20
15
35
5
25
0.83 ± 0.008
0.93 ± 0.007
0.77 ± 0.003
0.85 ± 0.013
2.92 ± 0.015
1.00
1.06
1.12
1.10
1.18
Nukleotidverhältnis
Korrekturfaktor
Normierte
Migrationszeit
Gem. Nukl.-Anteil = Gemessener Nukleotid-Anteil, Tats. Nukl.-Anteil = Tatsächlicher Nukleotid-Anteil
Die so bestimmte Zusammensetzung des Oligonukleotids stimmt bis auf den Gehalt an dG
näherungsweise mit der Realität überein. Wie erwartet erhält man aber Abweichungen zur
tatsächlichen Zusammensetzung, da die Signalflächen von den chemischen Reaktivitäten der
einzelnen Nukleotide und den Fluoreszenz-Quantenausbeuten ihrer Bodipy-Konjugate
abhängen.
Anhand der experimentell bestimmten Zusammensetzung des Oligonukleotids und der
tatsächlichen Zusammensetzung wurden für die einzelnen pdNs Korrekturfaktoren berechnet
(s. Tab. 8). Aus den Versuchen mit den dNp-Bodipy-Konjugaten ist allerdings bekannt, dass
Korrekturfaktoren, die mit Oligonukleotiden bestimmt werden, die Situation für reale DNA
Proben nicht korrekt wiedergeben, da die Vollständigkeit der Hydrolyse bei Oligonukleotiden
anders ist als bei großen DNA-Abschnitten. Korrekturfaktoren sollten daher mit komplexeren,
in ihrer Zusammensetzung bekannten DNA-Molekülen ermittelt werden (4.4.1 Validierung).
Die in Tabelle 8 aufgeführte normierte Migrationszeit ist ein Hilfsmittel zur Identifikation von
Signalen bei der Kapillarelektrophorese. Treten im Verlauf von Analysenreihen
Verschiebungen beim elektroosmotischen Fluss (EOF) und damit in der Migrationszeit der
Analyten auf, z. B. durch Belegung der Kapillarwände mit Proteinen aus der Hydrolyse der
45
Ergebnisse und Diskussion
DNA, so lassen sich Peaks dennoch sicher mit Hilfe von normierten Migrationszeiten
zuordnen. Dabei wird die Migrationszeit des fraglichen Signals durch die Migrationszeit eines
bekannten Signals des gleichen Laufes dividiert. Diese kann mit den früher ermittelten
normierten Migrationszeiten verglichen werden. Alle Signale wurden auf pdA-Bodipy
normiert, da es das erste und in der Regel höchste Signal eines Analysenlaufes darstellt und
somit eindeutig zu identifizieren ist.
Nun stand ein komplettes Methodenspektrum für die Hydrolyse von DNA zu pdNs, die
Derivatisierung mit BODIPY-FL-EDA unter EDC Aktivierung und die anschließende CELIF-Analyse zur Verfügung. Dieses, im Folgenden als 5’-Variante der FluoreszenzPostlabeling-Methode bezeichnete Verfahren, wurde in weiteren Untersuchungen validiert
und mit der bekannten Methode zur Fluoreszenzderivatisierung von dNps (3’-Variante der
Fluoreszenz-Postlabeling-Methode) verglichen.
4.4 Die 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
4.4.1 Validierung
Für einen Einsatz der 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode zur Analyse von
DNA und DNA-Schäden ist eine Validierung der Methode unverzichtbar. Dazu zählt die
Bestimmung der wichtigsten Parameter einer analytischen Methode wie die Nachweisgrenze,
die Überprüfung der Linearität des Messbereiches, die Präzision und Reproduzierbarkeit der
Methode [123], sowie die Ermittlung der Korrekturfaktoren. Da solche Untersuchungen für
die 3’-Variante von Stach et al. und Wirtz et al. bereits durchgeführt wurden, orientierte ich
mich an der beschriebenen Vorgehensweise [113, 114]. Damit war es gleichzeitig möglich,
beide Verfahren miteinander zu vergleichen und ihre jeweiligen Stärken bzw. Schwächen
aufzudecken.
Die unter Punkt 4.3.5 beschriebene Methodenentwicklung führte zu den in Tab. 9
dargestellten Bedingungen für die folgenden Validierungsexperimente.
46
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 9: Versuchsbedingungen für die 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
Analysenschritt
Bedingungen
DNA-Hydrolyse
10µg CT-DNA (30nmol) zur Trockene einengen, in 6µl MES 50mM, pH
5.5, lösen
Zugabe von 2µl ZnCl2 (2mM) und 2µl NP1 (0.02U) in Wasser
Inkubation bei 37°C für 2h
Fluoreszenzmarkierung
10µl Hydrolyselösung (10µg pdN, 30nmol)
(Derivatisierung)
+ 20µl 350mM MES, pH 6.5 (Endkonzentration 340µM Nukleotid)
+
30µl
25mM
BODIPY-FL-EDA
in
350mM
MES,
pH
6.5
(Endkonzentration 8.33mM BODIPY-FL-EDA)
+ 30µl 1.8M EDC in 350mM MES, pH 6.5 (Endkonzentration 0.6M EDC)
Endvolumen 90µl
Inkubation bei 25°C für 25h
Kapillarelektrophorese
unbeschichtete fused-silica-Kapillare, Lges = 59cm, Leff = 49cm
(MEKC),
Durchmesser = 50µm
Beckman Coulter,
20kV Trennspannung (340V/cm)
P/ACE MDQ
hydrodynamische Injektion 2.5x psi·s (5nl)
Glycoprotein System
Trennpuffer: 16mM Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0, 75mM SDS,
20% Methanol (v/v)
Die bereits validierte 3’-Variante des Fluoreszenz-Postlabeling-Assays wurde nach den
Bedingungen von Stach [113] und Wirtz [114] mit kleinen Änderungen durchgeführt. Diese
Änderungen betreffen insbesondere die Verwendung einer höheren Konzentration an MilzPhosphodiesterase (SPD) beim Verdau der DNA, bzw. die Durchführung der CE-LIFAnalysen mit der Beckman P/ACE MDQ anstelle der BioRad Biofocus 3000 [113]. Die so
modifizierte Methode ist in Tabelle 10 dargestellt.
47
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 10: Versuchsbedingungen für die 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
Analysenschritt
Bedingungen
DNA-Hydrolyse
10µg CT-DNA (30nmol) zur Trockene einengen in 5µl H2O (Millipore) lösen
Herstellung eines Enzym-Mix aus 5µl MN/SPD Mischung in Wasser
(12.5mU/µl SPD und 150µU/µl MN) und 1µl HEPES 250mM, 100mM
CaCl2, pH 6.0
Zugabe von 5µl des Enzym Mix zur gelösten DNA
Inkubation bei 37°C für 3h
Fluoreszenzmarkierung
10µl Hydrolyselösung (10µg dNp, 30nmol)
(Derivatisierung)
+ 20µl 0.8M HEPES, pH 6.5 (Endkonzentration 340µM Nukleotid)
+ 30µl 25mM BODIPY-FL-EDA in 0.8M HEPES, pH 6.5 (Endkonzentration
8.33mM BODIPY-FL-EDA)
+ 30µl 1.8M EDC in 0.8M HEPES, pH = 6.5 (Endkonzentration 0.6M EDC)
Endvolumen 90µl
Inkubation bei 25°C für 25h
Kapillarelektrophorese
unbeschichtete fused-silica-Kapillare, Lges = 59cm, Leff = 48.5cm
(MEKC),
Durchmesser = 50µm
Beckman Coulter,
20kV Trennspannung (340V/cm)
P/ACE MDQ
hydrodynamische Injektion 2.5x psi·s (ca. 5nl)
Glycoprotein System
Trennpuffer: 18mM Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0; 90mM SDS,
10% Methanol (v/v)
Für erste vergleichende Untersuchungen wurden je 10µg CT-DNA nach den jeweiligen
Standardbedingungen mit MN/SPD zu dNps (Tab. 10) bzw. mit NP1 zu den pdNs (Tab. 9)
verdaut und mit BODIPY-FL-EDA fluoreszenzmarkiert. Die erhaltenen Reaktionslösungen
wurden dann zu gleichen Teilen gemischt (jeweils 5µl) und 1:500 mit Wasser verdünnt
(Gesamtverdünnung der einzelnen Probe 1:1000). Die erhaltene Mischung aus fünf pdNBodipy- und fünf dpN-Bodipy-Konjugaten wurde unter verschiedenen Trennbedingungen
mittels CE-LIF analysiert. Die beste Trennung wurde mit den Analysenbedingungen für die
dNp-Bodipy-Konjugate (siehe Tab. 10) erreicht. Neun Signale wurden basisliniengetrennt
detektiert, nur p5mdC-Bodipy und pdC-Bodipy migrierten gemeinsam (s. Abb. 19).
48
Ergebnisse und Diskussion
5
dAp-Bodipy
pT-Bodipy
4
Tp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
pdA-Bodipy
3
pdC-Bodipy + p5mdC-Bodipy
2
dCp-Bodipy
dGp-Bodipy
pdG-Bodipy
5mdCp-Bodipy
1
0
10
15
20
25
30
Migrationszeit [min]
Abb. 19: CE-LIF-Analyse einer Mischung von pdN-Bodipy- und dNp-Bodipy-Konjugaten aus je 10µg CT-DNA
Aus dem abgebildeten Elektropherogramm lässt sich unschwer erkennen, dass die pdNBodipy-Konjugate, mit Ausnahme des pdG-Bodipy, unter den gegebenen Bedingungen
schneller migrieren als die korrespondierenden dNp-Bodipy-Konjugate. Wie Tabelle 11 zeigt,
sind die korrigierten Peakflächen der einzelnen dNp-Bodipy-Konjugate mit denen der
entsprechenden pdN-Bodipy-Konjugate vergleichbar groß, was darauf hinweist, dass die
beiden Varianten der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode ähnlich effizient sind. Daher kann
man
annehmen,
dass
beide
Hydrolysemethoden
Fluoreszenzmarkierung
mit
Desoxynukleotide
vergleichbaren
mit
BODIPY-FL-EDA
Ausbeuten
für
sowie
die
ablaufen,
die
anschließende
korrespondierenden
und
die
2’-
Fluoreszenz-
Quantenausbeuten der einzelnen 5’-Phosphat-Bodipy-Konjugate in etwa denen der 3’Phosphat-Bodipy-Konjugate entsprechen.
49
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 11: Vergleich der korrigierten Peakflächen von pdN-Bodipy- und dNp-Bodipy-Konjugaten einer
Mischung aus CT-DNA (s. Abb. 19); Mittelwerte aus 3 Analysenläufen
Gesamtfläche
dA
dG
T
dC+5mdC
5’-Phosphate
332134 ± 17021
116029 ± 5727
30639 ± 1860
98090 ± 6696
87376 ± 2112
3’-Phosphate
337057 ± 24977
128939 ± 7093
32991 ± 4222
97692 ± 8221
77436 ± 6450
4.4.1.1 Bestimmung der Nachweisgrenze
Zur Bestimmung der Nachweisgrenze der 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
wurde CT-DNA, wie in Tab. 9 beschrieben, mit NP1 verdaut und fluoreszenzmarkiert.
Anschließend wurde der Reaktionsansatz so lange mit Wasser verdünnt bis die pdN-BodipySignale gerade noch detektierbar waren (Signal-Rausch Verhältnis, S/N 3:1). Die
Nachweisgrenze definiert sich somit als die Probenkonzentration, die einen Peak des BodipyKonjugates mit einer Signalintensität ergibt, die dreimal so groß ist wie die
Standardabweichung des Grundrauschens der Basislinie. Das Rauschen (Noise) sind
statistische Fluktuationen des „Detektor-Outputs“, die z. B. durch Schwankungen der
Laserintensität oder elektrische Phänomene im Photomultiplier verursacht werden.
Wie Abb. 20 zeigt, konnten nach Verdünnung der Probe mit Wasser von 1:106 gerade noch
die Signale von pdA-Bodipy, pdC-Bodipy und pT-Bodipy detektiert werden. pdG-Bodipy war
auf Grund des basenspezifischen Quenching-Effektes nicht mehr mit dem geforderten S/N
von 3:1 zu erkennen.
Nach Tab. 9/10 beträgt die Konzentration der Nukleotide in der Reaktionslösung nach Verdau
und Derivatisierung 342µM. Da CT-DNA zu 42% aus G/C Basenpaaren und 58% A/T
Basenpaaren aufgebaut ist, bedeutet das für die einzelnen Nukleotide, bei vollständiger
Hydrolyse, eine Konzentration von 99.2µM für pdA und pdT sowie 71.9µM für pdG und
pdC. Nach der Verdünnung dieses Reaktionsansatzes (1:106) ergeben sich daher als
Konzentrationen für die Nachweisgrenze 99.2pM für pdA und pT und 71.9pM für pdC. Da
mit der hydrodynamischen Injektion ca. 5nl (2.5x psi·s) der Lösung auf die Kapillare
aufgegeben wurden, entspricht das einer Stoffmenge von ca. 0.36 amol für pdC bzw. 0.5 amol
für pT und pdA. Das pdG-Bodipy-Konjugat konnte nur bis zu einer Verdünnung des
Reaktionsansatzes von 1:350 000 mit dem geforderten S/N-Verhältnis von 3:1 detektiert
werden. Die Nachweisgrenze für pdG liegt somit bei etwa 200pM, was einer injizierten
Stoffmenge von 1amol entspricht.
50
Ergebnisse und Diskussion
0.018
Verunreinigung
0.016
pdA-Bodipy
EOF
pT-Bodipy
rel. Fluoreszenz
0.014
pdC-Bodipy
0.012
pdG-Bodipy
0.010
0.008
0.006
0.004
0.002
5
10
15
20
25
30
35
Migrationszeit [min]
Abb. 20: Bestimmung der Nachweisgrenze von 2’-Desoxyribonukleosid-5’-Phosphat-Bodipy-Konjugaten. CELIF-Analyse von CT-DNA nach NP1-Verdau und Fluoreszenzmarkierung, Verdünnung 1:106 mit Wasser;
Trennbedingungen s. Tab. 9
Im Vergleich zu der von Schmitz et al. [16] publizierten Nachweisgrenze für das 3’-Phosphat
dAp von 8.5pM, ergibt sich auf den ersten Blick eine Diskrepanz von fast einer Zehnerpotenz.
Der Unterschied ist aber durch das deutlich höhere Injektionsvolumen zu erklären. So haben
Schmitz et al. etwa 48nl (20x psi·s) einer 8.5pM dAp-Bodipy Lösung aufgegeben, was einer
Stoffmenge von 0.41 amol entspricht. Man darf daher davon ausgehen, dass dAp mit gleicher
Sensitivität wie pdA detektierbar ist. Eigene Versuche mit einem Injektionsvolumen von 50nl
(18psi) ergaben eine Nachweisgrenze von 10pM für die Bodipy-Konjugate von pdA, pT und
pdC und belegen die gleiche Empfindlichkeit zusätzlich. Beide Varianten der FluoreszenzPostlabeling-Methode erzielen daher die gleiche Sensitivität mit einer Nachweisgrenze im
Bereich von 90pM (bei 1:1000 Verdünnung 90nM) für A, C und T, wenn die Methode zur
DNA-Analyse im Routinebetrieb durchgeführt wird.
51
Ergebnisse und Diskussion
4.4.1.2 Reproduzierbarkeit und Präzision der 5’-Variante der Fluoreszenz-PostlabelingMethode
Zur Untersuchung der Präzision der Messung und der Reproduzierbarkeit der Methode
wurden vier Aliquots einer CT-DNA-Stammlösung in Wasser (1mg/ml) parallel unter
Standardbedingungen, wie in Tab. 9 angegeben, mit NP1 verdaut und mit dem
Fluoreszenzmarker umgesetzt. Für die Bestimmung der Präzision wurde eine der Proben
1:1000 verdünnt und sechsmal in aufeinander folgenden Analysenläufen mit CE-LIF
untersucht. Die Peakflächen wurden auf die Migrationszeit normiert und der Anteil der
jeweiligen pdN-Bodipy Konjugate an der Gesamtfläche bestimmt. Die Mittelwerte betrugen:
pdA-Bodipy 36.58% ± 0.25; pdC-Bodipy 24.42% ± 0.08; pT-Bodipy 28.79% ± 0.11; pdGBodipy 8.43% ± 0.09; p5mdC 1.56% ± 0.03. Diese Ergebnisse spiegeln, wie bei der Analyse
von Oligo-Mod2 beschrieben (Punkt 4.3.5), die individuellen Ausbeuten der Derivatisierung
mit dem Fluoreszenzmarker und die spezifischen Fluoreszenz-Quantenausbeuten der
einzelnen Bodipy-Konjugate wider und nicht die Zusammensetzung von CT-DNA, die etwa
29% A, 29% T und 21% C (inklusive 5mC), 21% G beträgt.
Wenn angenommen wird, dass Hydrolyse und Derivatisierung für pdC und p5mdC mit etwa
gleichen Ausbeuten ablaufen, und sich die Fluoreszenz-Quantenausbeuten beider BodipyKonjugate auf Grund des nur geringen strukturellen Unterschiedes nicht unterscheiden, so
kann der Methylierungsgrad der CT-DNA nach folgender Formel errechnet werden:
korr . Fläche ( p5mdC −Bodipy )
× 100 = Methylieru ngsgrad (%)
korr . Fläche ( p5mdC −Bodipy ) + korr . Fläche ( pdC −Bodipy )
Auf diese Weise erhält man mit der 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode für
CT-DNA einen Methylierungsgrad von 6.02% ± 0.09, der sehr gut mit dem von Wirtz et al.
[114] publizierten Methylierungsgrad von 6.47%, der mit der 3’-Variante bestimmt wurde,
übereinstimmt.
Um die Reproduzierbarkeit der Analyse zu kontrollieren, wurden die vier CT-DNA-Aliquote
1:1000 verdünnt, je sechsmal vermessen und wie beschrieben ausgewertet. Die Daten sind in
Tab. 12 dargestellt und belegen die gute Reproduzierbarkeit (geringe Standardabweichung)
der 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode und eine hohe Präzision bei der
wiederholten Analyse ein und der selben Probe.
52
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 12: Ergebnisse der Reproduzierbarkeitsanalysen
pdA
pT
pdC
p5mdC
pdG
Mittelwert (%) (n = 4)
37.11
28.42
24.35
1.55
8.28
Standardabweichung
0.62
0.56
0.47
0.05
0.35
rel. Standardabw. (%)
1.67
1.98
1.93
3.34
4.18
Die
relativen
Standardabweichungen
(Mittelwert/Standardabweichung
x
100;
Variationskoeffizient) sind naturgemäß für die kleineren Peakflächen etwas höher, liegen aber
immer noch weit unter der angestrebten Grenze von 5%. Aus den Mittelwerten der vier
parallel analysierten Proben ergibt sich ein Methylierungsgrad der CT-DNA von 6.03% ±
0.18. Verglichen mit den Resultaten aus den Validierungen der 3’-Variante der FluoreszenzPostlabeling-Methode liegen die erhaltenen Mittelwerte und Standardabweichungen im
gleichen Bereich [114].
4.4.1.3 Bestimmung der Linearität des Messbereichs
Für die Untersuchungen zur Linearität des Messbereiches wurde ein Derivatisierungsansatz
der CT-DNA aus der Reproduzierbarkeitsstudie ausgewählt und in verschiedenen
Verdünnungen (1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10000) je siebenmal analysiert. Die Messergebnisse
sind wiederum als prozentualer Anteil der einzelnen korrigierten Peakflächen der pdNBodipy-Konjugate an der Gesamtfläche ausgedrückt (Tab. 13) und zeigen nur geringe
Abweichungen.
Tab. 13: Ergebnisse der Linearitätsversuche
Verdünnung
pdA
pT
pdC
p5mdC
pdG
1:500
1:1000
1:5000
1:10000
34.39 ± 0.40
34.19 ± 0.11
34.54 ± 0.41
34.85 ± 0.27
29.96 ± 0.23
29.82 ± 0.05
29.93 ± 0.52
29.73 ± 0.27
26.03 ± 0.33
26.16 ± 0.12
26.02 ± 0.23
26.33 ± 0.23
1.75 ± 0.03
1.78 ± 0.05
1.71 ± 0.12
1.66 ± 0.08
7.56 ± 0.21
7.75 ± 0.04
7.48 ± 0.26
7.29 ± 0.33
34.49
0.28
0.80
29.86
0.10
0.34
26.14
0.15
0.56
1.72
0.05
3.15
7.52
0.19
2.52
Mittelwert
Stabw.
rel. Stabw.
Alle Angaben in Prozent, für jede Verdünnung n = 7
53
Ergebnisse und Diskussion
Die erhaltenen fast identischen Peakflächen zeigen eindeutig, dass die Methode im getesteten
Messbereich linear arbeitet und 20fache Konzentrationsunterschiede korrekt wiedergibt.
4.4.1.4 Bestimmung der Korrekturfaktoren
Wie unter Punkt 4.4.1.2 beschrieben, geben die durch LIF-Detektion gemessenen korrigierten
Peakflächen der pdN-Bodipy-Konjugate das Verhältnis der Nukleotide in der DNA-Probe
nicht korrekt wieder. Die Hauptursache liegt in den schon mehrfach erwähnten
unterschiedlichen Ausbeuten der Kopplungsreaktion der 2’-Desoxynukleotide mit BODIPYFL-EDA und den unterschiedlichen Fluoreszenz-Quantenausbeuten der Nukleotid-BodipyKonjugate. Insbesondere die basenabhängige Fluoreszenzlöschung des Guanosins erschwert
die unmittelbare Quantifizierung anhand der Signalstärke der LIF-Detektion. Dieser
methodische Nachteil kann durch die Bestimmung von Korrekturfaktoren ausgeglichen
werden [113, 114]. Ansatzweise wurde die Vorgehensweise zur Bestimmung von
Korrekturfaktoren bereits bei der Untersuchung des Oligonukleotids Mod2 beschrieben. Es
hat sich aber herausgestellt, dass Oligonukleotide zur Ermittlung der Korrekturfaktoren für
die Analyse genomischer DNA wenig geeignet sind. Besser geeignet sind hierfür komplexere,
in ihrer Sequenz genau bekannte, doppelsträngige DNA-Moleküle. Verwendet wurde daher
das Genom des Bakteriophagen Lambda (λ-DNA), das komplett sequenziert, also in seiner
Zusammensetzung genau bekannt ist und keine methylierten Basen enthält (kein 5mC und
kein N6mA). Es besteht aus 48502 Basenpaaren mit je 24320 A/T-Paaren und 24182 G/CPaaren. Die kommerziell erhältliche λ-DNA wurde, um Salze zu entfernen, zunächst gefällt,
mit Ethanol gewaschen und wieder in Wasser gelöst. Nach Gehaltsbestimmung durch UVSpektroskopie bei 260nm wurden zwei Aliquots von je 10µg nach den Bedingungen aus
Tabelle 9 prozessiert. Jede der beiden Proben wurde anschließend zehn Mal mittels
Kapillarelektrophorese und Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion analysiert und wie
beschrieben ausgewertet (s. S. 45).
In Abbildung 21 ist einer der Analysenläufe beispielhaft dargestellt. Verglichen mit den
bisher gezeigten Analysen von CT-DNA wird auf den ersten Blick deutlich, dass das Signal
für p5mdC-Bodipy fehlt, das λ-Genom also keine Cytosin-Methylierung aufweist. Weiterhin
ist nun pdC-Bodipy das zweithöchste Signal nach pdA-Bodipy und größer als pT-Bodipy.
54
Ergebnisse und Diskussion
7
pdA-Bodipy
6
pdC-Bodipy
rel. Fluoreszenz
5
pT-Bodipy
4
3
pdG-Bodipy
2
1
0
15
20
25
30
Migrationszeit [min]
Abb. 21: CE-LIF-Analyse der DNA des Bakteriophagen Lambda nach Nuklease P1 Verdau. Trennung mit
P/ACE MDQ; Trennbedingungen: Natriumphosphat-Puffer 16mM pH 9.0, 20% Methanol (v/v), 75mM SDS,
20kV
Tabelle 14 fasst die Ergebnisse der beiden Versuche zusammen. Die tatsächliche
Zusammensetzung des λ-Genoms wurde mit den gemessenen Werten verglichen und daraus
der Korrekturfaktor berechnet. Die letzte Spalte gibt den Mittelwert (MW) des so bestimmten
Korrekturfaktors an.
Tab. 14: Bestimmung der Korrekturfaktoren für die 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
unmethyliert
Anzahl der Basen
Lambda Genom
dA
T
dC
dG
24320 (25.07%)
24320 (25.07%)
24182 (24.93%)
24182 (24.93%)
Aliquot 1 (n=10)
Aliquot 2 (n=10)
korr. Peakfläche (%) korr. Peakfläche (%)
33.78 ± 0.93
25.92 ± 0.74
30.69 ± 0.94
9.61 ± 0.40
34.40 ± 0.54
25.76 ± 0.23
29.98 ± 0.48
9.86 ± 0.29
Korrekturfaktor
(MW)
0.735 ± 0.011
0.970 ± 0.009
0.822 ± 0.013
2.561 ± 0.076
Da λ-DNA nicht methyliert ist, kann auf diese Weise nicht der Korrekturfaktor für p5mdC
bestimmt werden. Allerdings wurde der Korrekturfaktor für das 3’-Phosphat des 5-
55
Ergebnisse und Diskussion
Methylcytosins (5mdCp), nach vollständiger enzymatischer Methylierung von λ-DNA und
anschließender Hydrolyse mit MN/SPD schon von Wirtz et al. [114] und Stach et al. [113]
ermittelt. Er beträgt 0.93 ± 0.09 und unterscheidet sich nur unwesentlich von dCp-Bodipy
0.95 ± 0.08 [114]. Unter der Annahme, dass sich pdNs ähnlich verhalten wie die dNps, wurde
für die im folgenden beschriebenen quantitativen Auswertungen der CT-DNA für pdC und
p5mdC der selbe Korrekturfaktor verwendet. Benutzt man die oben errechneten
Korrekturfaktoren zur Berechnung der Zusammensetzung von CT-DNA mit den Daten aus
den Reproduzierbarkeits-Versuchen, so erhält man eine sehr gute Übereinstimmung mit den
wirklichen Verhältnissen (s. Tab. 15).
Tab. 15: Anwendung der Korrekturfaktoren auf CT-DNA (Mittelwert aus vier unabhängig
hydrolysierten und derivatisierten CT-DNA Proben, die jeweils fünfmal analysiert wurden)
Reale Probe
CT-DNA
dA
T
dC
dG
5mdC
Anteil der
Base (%)
ca.
29
29
20
21
1
Messung (%) Korrekturfaktor
37.11 ± 0.62
28.42 ± 0.56
24.35 ± 0.47
8.28 ± 0.35
1.55 ± 0.05
0.735
0.970
0.822
2.561
0.822
Berechnet
(%)
28.23 ± 0.52
27.36 ± 0.54
20.30 ± 0.50
21.97 ± 0.88
1.29 ± 0.04
In der letzten Spalte ist die mit dem Korrekturfaktur errechnete Zusammensetzung der CT-DNA angegeben.
Im Gegensatz dazu ergibt sich bei Anwendung der Korrekturfaktoren, die mit dem 2’Desoxyoligonukleotid (Mod2) bestimmt wurden, eine Zusammensetzung der CT-DNA von
30.80% dA, 26.43% T, 18.75% dC, 1.31% 5mdC und 24.18% dG. Damit wird noch einmal
deutlich, dass für die Ermittlung von Korrekturfaktoren zur Analyse genomischer DNA
möglichst langkettige, doppelsträngige DNA-Moleküle verwendet werden müssen.
Zum Vergleich wurde ein weiteres Aliquot λ-DNA (10µg) mit MN/SPD zu dNps verdaut und
fluoreszenzderivatisiert (Bedingungen s. Tabelle 10). Nach 1:1000 Verdünnung und CE-LIF
Analyse wurde das erwartete Elektropherogramm (Abb. 22) aus den vier normalen dNpBodipy-Konjugaten ohne 5mdCp-Bodipy erhalten. Auch aus diesem Experiment wurden die
Korrekturfaktoren wie oben beschrieben berechnet:
56
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 16: Bestimmung der Korrekturfaktoren für die 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
(n = 7)
unmethyliert
Lambda Genom
dA
T
dC
dG
Anzahl der Basen
korr. Peakfläche (%)
Korrekturfaktor
F [114]
24320 (25.07%)
24320 (25.70%)
24182 (24.93%)
24182 (24.93%)
35.88 ± 0.30
25.80 ± 0.58
26.41 ± 0.66
11.91 ± 0.23
0.699 ± 0.006
0.972 ± 0.021
0.944 ± 0.024
2.093 ± 0.041
0.706
0.957
0.950
2.122
In der letzten Spalte sind zum Vergleich die von Wirtz et al. [114] mit der selben Methode ermittelten
Korrekturfaktoren angegeben
5
dAp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
4
dCp-Bodipy
Tp-Bodipy
3
dGp-Bodipy
2
1
0
16
18
20
22
24
26
28
30
Migrationszeit [min]
Abb. 22: CE-LIF-Analyse von λ-DNA nach MN/SPD Verdau und Derivatisierung. Trennung mit P/ACE-MDQ;
Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0, 90mM SDS, 10% Methanol (v/v), 20kV
Hier zeigt sich eine hervorragende Übereinstimmung, obwohl die Analysen völlig unabhängig
voneinander in verschiedenen Laboratorien durchgeführt wurden. Beim Vergleich der
Korrekturfaktoren von pdNs und dNps erhält man die größten Unterschiede für Cytosin und
Guanin.
57
Ergebnisse und Diskussion
4.4.2 Nachweis von natürlichen DNA-Schäden
Neben den Veränderungen durch oxidativen Stress (s. Kap. 2.3.2.1) oder durch genotoxische
Substanzen unterliegt DNA auch ständig Veränderungen, die in der chemischen Stabilität der
DNA-Basen begründet sind. Zum einen sind dies spontane Deaminierungen von Cytosin zu
Uracil und Adenin zu Hypoxanthin (als Nukleosid Inosin), zum anderen der Verlust der
gesamten Base durch Spaltung der N-glykosidischen Bindung zur 2’-Desoxyribose (apurinic
site bzw. AP-Stelle) (s. Theorie 3.3.2.4). Letzteres geschieht auch häufig nach Reaktion von
alkylierenden Substanzen am N7 des Guanins. Ein Vorteil der neu entwickelten und
validierten Fluoreszenz-Postlabeling-Methode mit pdNs ist, dass die DNA-Schäden 2’Desoxyuridin und 2’-Desoxyinosin sowie 2’-Desoxyribose als 5’-Phosphate kommerziell
erhältlich sind und daher nicht erst aufwendig synthetisiert werden müssen, wie das für die 3’Phosphate der Fall ist. Die folgenden Abbildungen zeigen die Bildung sowie die Häufigkeit
dieser DNA-Schäden (Abb. 23, 24).
O
NH2
N
N
O
HO
P
O
NH
O
HO
O
H
OH
P
H
H
N
O
O
OH
H
H
OH
H
H
H
2’-Desoxycytidin-5’-Phosphat
ca. 400/Tag und Zelle
Häufigkeit: 7.5 pro 106
normale Nukleotide
O
H
OH
O
H
2’-Desoxyuridin-5’-Phosphat
Abb. 23: Spontane Deaminierung von Cytosin zu Uracil
NH2
N
N
O
HO
P
O
O
N
H
H
N
O
HO
O
H
OH
N
N
P
O
H
OH
H
H
OH
H
H
H
2’-Desoxyadenosin-5’-Phosphat
H
2’-Desoxyinosin-5’-Phosphat
Abb. 24: Spontane Deaminierung von Adenin zu Hypoxanthin
58
O
OH
NH
N
ca. 10/Tag und Zelle
Häufigkeit: 3 pro 108
normale Nukleotide
Ergebnisse und Diskussion
Eine Sonderstellung unter diesen Veränderungen nimmt die AP-Stelle ein, da das entstehende
2’-Desoxyribose-5’-Phosphat (pdR) nach der Hydrolyse nicht als eine stabile Verbindung
vorliegt, sondern verschiedene, offenkettige oder ringförmige, isomere Strukturen einnehmen
kann (Abb. 25).
OH
HO
H
H
O
O
HO
H
O
H
O
H
Ox.
H
O
O
H
O
H
O-
H
H
O
H
P
O-
H
HO
O-
O
O
H
H
O
H
P
OH
O-
OOH
OH
O
H
P
O-
O-
O
H
H
O-
HO
HO
Ox.
H
P
O
H
O-
OH
H
H
O
P
O
HO
O
H
O
H
H
O
H
P
OH
O-
O-
O-
Abb. 25: Isomere Strukturen der AP-Stelle nach [124], dargestellt am Beispiel des 2’-Desoxyribose-3’Phosphates
Zur Darstellung eines Standards für die AP-Stelle wurde 2’-Desoxyribose-5’-Phosphat (10µg)
nach den üblichen Bedingungen (s. Tab. 9) mit BODIPY-FL-EDA derivatisiert. Die
anschließende CE-LIF Analyse ergab vier Signale, von denen das größte (4) eine um den
Faktor zehn geringere Intensität zeigte als das der normalen Nukleotide, wenn diese unter
diesen Bedingungen derivatisiert und analysiert werden. Daher wurde die Reaktionslösung
nicht wie sonst üblich 1:1000 sondern nur 1:100 vor Aufgabe auf die Kapillare verdünnt
(Abb. 26).
59
Ergebnisse und Diskussion
16
4
14
rel. Fluoreszenz
12
10
8
2
6
3
4
1
2
0
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Migrationszeit [min]
Abb. 26: CE-LIF-Analyse von 10µg fluoreszenzmarkiertem 2’-Desoxyribose-5’-Phosphat, Verdünnung 1:100;
Trennung auf P/ACE MDQ, 16mM Natruimphosphat pH 9.0; 20% Methanol (v/v), 75mM SDS, 20kV
Aus diesem Ergebnis ist jedoch nicht abzuleiten, dass hier die vier Signale den vier Isomeren
aus Abb. 25 entsprechen. Zum einen ist selbst das Hauptsignal (Nr. 4) bei 21.5min viel
kleiner als erwartet, so dass ein Zerfall des Ribose-Phosphates während der Derivatisierung
zu unbekannten Produkten angenommen werden muss. Zum anderen sind auch Reaktionen
zwischen dem Fluoreszenzmarker und der Aldehydfunktion der offenkettigen Ribose
denkbar, was zu mehrfach markierten Molekülen führen kann. Diese sind eventuell nicht zu
detektieren, da sich die Bodipy-Moleküle gegenseitig auslöschen können. Bisher gibt es
keinen 2’-Desoxyribose-3’-Phosphat-Standard (dRp) für vergleichende Untersuchungen.
Auch Wirtz [124] erhielt mehrere Signale bei der CE-LIF Analyse nachdem sie dGp durch
saure Hydrolyse in die Base und den Zucker-Phosphat Rest gespalten und die
Reaktionsprodukte mit BODIPY-FL-EDA derivatisiert hatte. Sollte sich die Ribose nach der
DNA-Hydrolyse tatsächlich derart schnell zersetzen, müsste die Analysenzeit von AP-Stellen
deutlich verkürzt werden, um höhere Ausbeuten an fluoreszenzmarkiertem Produkt zu
erhalten. Ansonsten ist die Nachweisgrenze (geschätzt 1µM) für in vivo Anwendungen
deutlich zu gering. Voraussetzung dafür ist natürlich, dass diese Produkte lange genug stabil
60
Ergebnisse und Diskussion
sind, um mit CE-LIF analysiert zu werden. Zusätzlich müssten zuvor die bei der Reaktion von
dR-5’-Phosphat mit BODIPY-FL-EDA entstehenden Produkte charakterisiert und ihre
Fluoreszenz-Quantenausbeuten bestimmt werden.
Um den Einfluss der Reaktionsprodukte von pdR mit BODIPY-FL-EDA auf das
Signalmuster einer DNA-Analyse zu untersuchen, wurde der Derivatisierungsansatz 1:100
verdünnt und zu einem fluoreszenzmarkierten NP1-Verdau von CT-DNA (Verdünnung
1:1000) zugegeben. Abbildung 27 macht deutlich, dass unter den verwendeten
Trennbedingungen nur das erste, kleinere Signal (Nr. 1) von den normalen pdN-BodipyKonjugaten getrennt wird, das Hauptsignal (Nr. 4) migriert ähnlich wie das pdG-Bodipy und
wurde daher bisher möglicherweise übersehen. Für die Anwendung der Methode zur
Bestimmung von apurinischen Stellen in DNA muss also auch eine verbesserte CE-Trennung
entwickelt werden.
10
pdG-Bodipy + 4
8
rel. Fluoreszenz
pT-Bodipy
6
pdC-Bodipy
pdA-Bodipy
4
p5mdC-Bodipy
2
3
1
2
0
15
20
25
30
Migrationszeit [min]
Abb. 27: CE-LIF-Analyse einer NP1 verdauten und fluoreszenzmarkierten CT-DNA nach Aufstocken mit dem
Reaktionsansatz von 2’-Desoxyribose-5’-Phosphat mit BODIPY-FL-EDA, Trennbedingungen s. Abb. 26
61
Ergebnisse und Diskussion
4.4.2.1 Analyse von DNA-Deaminierungsprodukten
Je 10µg (30nmol) 2’-Desoxyuridin-5’-Phosphat (pdU) und 2’-Desoxyinosin-5’-Phosphat
(pdI) wurden unter Verwendung der Standardbedingungen aus Tabelle 9 mit BODIPY-FLEDA derivatisiert und kapillarelektrophoretisch analysiert. In beiden Fällen wurde ein Signal
erhalten, welches in Analogie zu den vorangegangenen Untersuchungen mit den normalen
Nukleotiden als pdI-Bodipy (21.2 min; auf pdA-Bodipy normierte Migrationszeit 1.081) und
pdU-Bodipy (21.7min; auf pdA-Bodipy normierte Migrationszeit 1.062) identifiziert wurde.
Spektroskopische Untersuchungen zur eindeutigen Charakterisierung der Reaktionsprodukte
konnten auf Grund der geringen Mengen nicht durchgeführt werden.
Mischt man die erhaltenen Reaktionsansätze mit den Standards der normalen pdN-BodipyKonjugate oder mit NP1-verdauter und mit BODIPY-FL-EDA fluoreszenzmarkierter CTDNA, so zeigt sich bei der CE-LIF-Analyse, dass mit dem auf die Trennung von p5mdCBodipy optimierten Puffersystem (16mM Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0, 75mM SDS, 20%
Methanol (v/v), 20kV) weder die Trennung von pdI-Bodipy noch von pdU-Bodipy gelingt:
pdU-Bodipy eluiert mit pT-Bodipy und pdI-Bodipy überlagert das p5mdC-Bodipy (nicht
gezeigt).
Auch der Einsatz der in Tab. 41 (s. S. 161) aufgeführten Puffersysteme führte nicht zur
Trennung
aller
sieben
pdN-Bodipy
Konjugate.
Zur
Verbesserung
der
kapillarelektrophoretischen Trennung wurde daher ein von Kaneta et al. [125] beschriebener
Weg eingeschlagen. Durch Beimischung verschiedener Kohlenhydrate, v. a. Glukose, zum
Trennpuffer wurde die kapillarelektrophoretische Trennung verschiedener NukleosidPhosphate verbessert. Bisher ist das genaue Wirkprinzip dieser Strategie noch weitgehend
unverstanden, Erklärungsversuche machen vor allem die Erhöhung der Viskosität des
Trennmediums für die Verbesserung der Trennleistung verantwortlich. Demnach wird das
mizellare Fenster durch eine Reduktion der Wanderungsgeschwindigkeit der Mizellen
(Abnahme der elektrophoretischen Mobilität) vergrößert und die Wechselwirkung der
Analyten mit der Mizelle intensiviert. Daneben scheinen auch Wechselwirkungen zwischen
der hydrophilen Zuckerstruktur der Glukose und den Zuckerstrukturen der Ribose
stattzufinden. Alles zusammen führt zu einer besseren Auflösung, wenn auch auf Kosten einer
längeren Analysendauer. Durch Zusatz von Glukose wurde ein Trennsystem erhalten mit dem
die
Trennung
aller
sieben
pdN-Bodipy-Konjugate
ermöglicht
wurde
(18mM
Natriumphosphat, pH 9.0, 75mM SDS, 8% Methanol (v/v), 0.5M Glukose, 20kV (Abb. 28)).
62
Ergebnisse und Diskussion
6
pdU-Bodipy
pT-Bodipy
5
pdI-Bodipy
rel. Fluoreszenz
4
pdA-Bodipy
pdC-Bodipy
3
p5mdC-Bodipy
2
pdG-Bodipy
1
0
20
25
30
35
40
Migrationszeit [min]
Abb. 28: Trennung von sieben pdN-Bodipy Konjugaten unter den optimierten Trennbedingungen nach GlukoseZugabe. Für die Analyse wurde ein NP1-Verdau von 10µg CT-DNA nach den Standardbedingungen
fluoreszenzmarkiert und 1:1000 mit Wasser verdünnt. Die pdU und pdI-Bodipy-Konjugate sind zum besseren
Nachweis jeweils nur 1:500 verdünnt in der Mischung enthalten.
Um zu überprüfen, ob die durch Deaminierung entstehende Modifikation pdI auch nach
Hydrolyse von DNA mit NP1 analysiert werden kann, wurde poly(dI·dC)·(dI·dC) analysiert.
Poly(dI·dC)·(dI·dC) ist ein doppelsträngiges DNA-Analogon, das abwechselnd aus 2’Desoxycytidin und 2’-Desoxyinosin besteht, wobei immer dI mit dC paart:
5’-dI-dC-dI-dC-dI-dC-usw.-3’
3’-dC-dI-dC-dI-dC-dI-usw.-5’
Die CE-LIF Analyse des fluoreszenzmarkierten Verdaus von poly(dI·dC)·(dI·dC) sollte also
zwei Signale etwa gleicher Stärke ergeben. Es zeigte sich jedoch, dass die korrigierten
Flächen der beiden erhaltenen Signale unterschiedlich groß waren (Abb. 29).
63
Ergebnisse und Diskussion
6
pdC-Bodipy
5
rel. Fluoreszenz
4
pdI-Bodipy
3
2
1
0
16
18
20
22
24
26
28
Migrationszeit [min]
Abb. 29: CE-LIF-Analyse von 10µg Nuklease P1 verdautem poly(dI·dC)·(dI·dC) nach Fluoreszenzmarkierung
mit BODIPY-FL-EDA. Trennbedingungen: 16mM Natriumphosphat, 75mM SDS, 20% Methanol (v/v), 20kV
Das Verhältnis der korrigierten Flächen von pdI-Bodipy zu pdC-Bodipy beträgt ca. 3:7.
Ursachen hierfür könnten sein, dass pdI schlechter mit dem Fluoreszenzmarker reagiert, oder
dass pdI-Bodipy eine schlechtere Fluoreszenz-Quantenausbeute besitzt als pdC-Bodipy oder
eine Kombination aus beidem. Wurden je 10µg pdI und pdC getrennt mit BODIPY-FL-EDA
markiert, zu gleichen Teilen gemischt und mit CE-LIF analysiert, ergaben sich identische
Peakverhältnisse wie nach dem Verdau von poly(dI·dC)·(dI·dC). Auch damit lässt sich aber
nicht endgültig klären, ob eine schlechtere Reaktivität von pdI die Ursache für die niedrigere
Signalintensität ist, oder doch ein Quenching-Effekt ähnlich dem von pdG vorliegt.
4.4.2.2 Nachweis von Uracil in Bisulfit-behandelter CT-DNA
Nachdem die Bedingungen zur Analyse von 2’-Desoxyuridin erarbeitet waren (4.4.2.1),
wurden diese auf die Bestimmung des Uracilgehaltes in DNA angewendet. Da der
Uracilgehalt zellulärer DNA nur 7.5 in 1 Million normaler Nukleotide beträgt und damit
bisher mit unserer Fluoreszenz-Postlabeling-Methode nicht nachweisbar ist, wurde eine DNA
mit deutlich höherem Uracilgehalt zur Erprobung der Methode eingesetzt. Hier bietet es sich
64
Ergebnisse und Diskussion
an von der lange bekannten chemischen Umwandlung von Cytosin in Uracil in DNA
Gebrauch zu machen. Durch ihren Einsatz in der Epigenetik ist diese Methode vielfach
standardisiert und validiert: die Bisulfit-Reaktion.
NH2
HSO3
HN
H
H
HN
OH
O
O
NH2
N
R
Cytidin
O
N
H
SO3
R
Cytidinsulfonat
H2O
NH4
H
H
HN
O
O
N
R
Uridinsulfonat
H
SO3
OH
HN
HSO3
O
N
R
Uridin
R = 2’-Desoxyribose
Abb. 30: Reaktion von Cytidin mit Bisulfit zu Uridin
Wie in Abb. 30 dargestellt, wird bei der Reaktion von DNA mit Natriumbisulfit im
Alkalischen Cytosin zu Uracil umgewandelt. Alle anderen Basen der DNA reagieren unter
diesen Bedingungen nicht und bleiben unverändert. Bei epigenetischen Fragestellungen macht
man sich zunutze, dass 5mdC ebenfalls nicht verändert wird und kann so nach Behandlung
von DNA mit Bisulfit die genaue Position der methylierten Cytosine in der DNA bestimmen,
z. B. durch die Bisulfit–Sequenzierung [126] oder methylation specific PCR (MSP) [127,
128]. Aliquote von je 2µg CT-DNA wurden wie von Frommer und Herman beschrieben [127,
128] mit Natriumbisulfit umgesetzt, isoliert, gereinigt, mit NP1 hydrolysiert und mit
BODIPY-FL-EDA derivatisiert (Bedingungen wie in Tab. 9).
In Abb. 31 ist das Elektropherogramm einer solchen Analyse dargestellt. Wie erwartet ist
zwischen pdA-Bodipy und pT-Bodipy ein Signal zu erkennen, welches durch Aufstockung
mit der Standardverbindung eindeutig als pdU-Bodipy identifiziert wurde. Daneben treten
weitere drei Signale auf (? in Abb. 31), die bisher nicht identifiziert werden konnten.
Möglicherweise handelt es sich um DNA-Abbauprodukte, die bei der Behandlung mit Bisulfit
entstehen.
65
Ergebnisse und Diskussion
0,5
pdA-Bodipy
0,4
pT-Bodipy
rel. Fluoreszenz
0,3
pdU-Bodipy
pdC-Bodipy
0,2
p5mdC-Bodipy
pdG-Bodipy
?
?
0,1
0,0
20
22
24
26
28
30
32
34
36
Migrationszeit [min]
Abb. 31: CE-LIF-Analyse von Bisulfit-behandelter CT-DNA (2µg) nach Verdau mit NP1 und
Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FL-EDA. Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat, 75mM SDS, 8%
Methanol (v/v), 0.5 M Glukose, 20kV
Die quantitative Auswertung ist zusammen mit den Daten für unbehandelte CT-DNA in
Tabelle 17 dargestellt.
Tab.
17:
Vergleich
der
Peakflächenverhältnisse
zwischen
Bisulfit-behandelter
CT-DNA
und
unbehandelter CT-DNA (Mittelwerte aus zwei unabhängigen Derivatisierungen, je drei Analysenläufe)
pdA
pdU
pT
pdC
pdG
p5mdC
Bisulfit-behandelte
CT-DNA
Peakfläche (%)
Unbehandelte CTDNA
Peakfläche (%)
Korrekturfaktor
Bisulfit-behandelte
CT-DNA korrigierte
Peakfläche (%)
34.91 ± 0.18
17.88 ± 0.15
32.49 ± 0.15
2.29 ± 0.09
10.85 ± 0.31
1.59 ± 0.08
37.11
0.00
28.42
24.35
8.28
1.55
0.735 ± 0.011
n. b.
0.970 ± 0.009
0.822 ± 0.013
2.561 ± 0.076
0.822 ± 0.013
25.65%
n. b.
31.51%
1.88%
27.78%
1.31%
n. b. = nicht bestimmt
66
Ergebnisse und Diskussion
Da 10µg DNA im Mittel 550 000 Flächeneinheiten für die Gesamtfläche aller NukleotidBodipy-Konjugate ergeben, wurden für die verwendeten 2µg CT-DNA etwa 110 000
Einheiten erwartet. Detektiert wurden nur ca. 30 000 Einheiten, was etwa einem Viertel der
erwarteten Fluoreszenzeinheiten und damit ca. 0.5µg DNA entspricht. Mögliche Erklärungen
hierfür sind Verluste bei der Aufreinigung oder Zerfall in nicht markierbare Bestandteile.
Derartige Abbauvorgänge während der Bisulfit-Behandlung von DNA wurden bereits
beobachtet und quantifiziert. Diese Zerstörung der DNA durch die Behandlung könnte eine
Erklärung für die beobachtete veränderte DNA-Zusammensetzung (Tab. 17) sein, wenn nicht
alle Basen in gleichem Maße davon betroffen sind. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die
Korrekturfaktoren von der eingesetzten DNA Menge abhängig sind und sich daher für 2µg
DNA (bzw. 0.5µg) und 10µg unterscheiden, wie es von Wirtz et al. [114] für die 3’-Variante
der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode bereits beschrieben wurde (Unterschiede zwischen
10µg und 100ng DNA).
Wie in Tab. 17 angegeben und im Elektropherogramm klar ersichtlich ist das Signal des pdCBodipys (2.28%) noch vorhanden, was eine unvollständige chemische Konversion zu Uridin
von 90% bedeutet. Dies steht im Gegensatz zum Bericht von Grunau et al. [129], der unter
ähnlichen Bedingungen eine vollständige Deaminierung von Cytosin fand.
Der Nachweis von Uracil in DNA gelingt also mit den entwickelten Bedingungen der 5’Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode ohne Probleme. Nach den bisherigen
Erfahrungen ist ein Uracilgehalt von 0.2% und ein Cytosingehalt von 0.1% mit der Methode
nachweisbar und eignet sich somit zur Überprüfung der Vollständigkeit der Bisulfit-Reaktion
vor einer Sequenzierung .
4.4.2.3 Nachweis von Deaminierungsprodukten in Nitrit-behandelter CT-DNA
Eine weitere Möglichkeit DNA-Basen in vitro in ihre Deaminierungsprodukte zu überführen,
ist die Behandlung von DNA mit salpetriger Säure (HNO2). Die mutagene Wirkung von
HNO2 wurde schon 1960 gezeigt und wenig später konnten die Haupt-Reaktionsprodukte
identifiziert werden [130]. Dies sind 2’-Desoxyuridin, 2’-Desoxyinosin (Abb. 23 u. 24) und
2’-Desoxyxanthosin (Abb. 32), die Deaminierungsprodukte von 2’-Desoxycytosin, 2’Desoxyadenosin bzw. 2’-Desoxyguanosin.
67
Ergebnisse und Diskussion
O
O
N
N
O
HO
P
O
N
NH
NH2
N
H
OH
H
N
O
HNO2
O
HO
P
H
O
H
H
2’-Desoxyguanosin-5’-Phosphat
O
N
H
O
OH
H
OH
NH
H
H
OH
H
H
2’-Desoxyxanthosin-5’-Phosphat
Abb. 32: Deaminierung von Guanosin zu Xanthosin unter dem Einfluss von HNO2
Daneben wurden auch verschiedene Nitrierungsprodukte (v. a. 2-Nitroinosin [131]) und in
jüngster Zeit ein weiteres Deaminierungsprodukt, Oxanosin [132] s. Abb. 33, nachgewiesen.
Oxanosin entsteht wie Xanthosin unter dem Einfluss von HNO2 (bzw. N2O3) aus Guanosin.
Im ersten Schritt erfolgt der Angriff einer reaktiven Spezies (vermutlich N2O3) an der N2Position
des
Guanosins
unter
Bildung
eines
N2-Nitroso-Intermediates.
Dieses
Zwischenprodukt wandelt sich in ein Diazotat-Ion um, welches die stabilste Zwischenstufe
der Reaktion darstellt. Im zweiten Schritt wandelt sich das Diazotat-Ion in ein Diazonium-Ion
um, welches unter gleichzeitiger Stickstoffabspaltung und Ringöffnung zwischen C6 und N1
ein offenes Kation mit Carbodiimid-Struktur bildet. Durch Anlagerung von Wasser an der
C6-Position entsteht nach Ringschluss Oxanosin. Lagert sich Wasser hingegen an der C2Position (am Carbodiimid) an, so entsteht nach Ringschluss Xanthosin [133].
O
O
N
N
O
HO
P
O
H
H
OH
N
NH2
H
P
O
O
N
NH2
O
OH
H
H
N
O
HNO2
HO
O
OH
N
NH
H
H
H
OH
H
H
Abb. 33: Reaktion von 2’-Desoxyguanosin-5’-Phosphat zu 2’-Desoxyoxanosin-5’-Phosphat
DNA, die mit salpetriger Säure behandelt wurde, sollte also eine ganze Reihe modifizierter
Nukleotide enthalten, die mit der 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
analysiert und identifiziert werden können. Daher wurden 100µg CT-DNA nach Suzuki et al.
[132] in 3M Natriumacetat-Puffer (pH 3.7) gelöst und mit Natriumnitrit (100mM) für 2h bei
68
Ergebnisse und Diskussion
37°C inkubiert. Die DNA wurde anschließend über eine Sephadex-Säule von den Salzen
befreit und ein Aliquot (10µg) nach den Standardbedingungen (Tab. 9) zu pdNs verdaut, mit
BODIPY-FL-EDA derivatisiert und analysiert. Uridin und Inosin konnten durch Aufstocken
mit Standardverbindungen in der HNO2-behandelten DNA identifiziert werden (Abb. 34).
3,5
pT-Bodipy
pdA-Bodipy
3,0
rel. Fluoreszenz
2,5
pdC-Bodipy
pdU-Bodipy
2,0
pdI-Bodipy
1,5
p5mdC-Bodipy
pdX-Bodipy ?
1,0
pdG-Bodipy
0,5
0,0
12
14
16
18
20
22
24
26
28
Migrationszeit [min]
Abb. 34: CE-LIF-Analyse von HNO2-behandelter CT-DNA nach Verdau mit NP1 und Derivatisierung mit
BODIPY-FL-EDA. Trennbedingungen wie in Tab. 9 angegeben.
Ebenfalls zu erkennen ist, dass pdG-Bodipy im Vergleich zu unbehandelter CT-DNA ein
deutlich kleineres Signal liefert. Die Signalstärke entspricht nur noch 1.7% der gesamten
Peakflächen, in unbehandelter CT-DNA ist es dagegen 8.3% (Tab. 13). Auch für pdA-Bodipy
und pdC-Bodipy ist eine leichte Abnahme der Signalintensität gegenüber unbehandelter CTDNA zu beobachten. Darüber hinaus enthält das Elektropherogramm einen neuen Peak bei ca.
15.5min, der dem 2’-Desoxyxanthosin-5’-Phosphat-Bodipy (pdX-Bodipy) entsprechen
könnte. Die Zuordnung der aus 2’-Desoxyguanosin entstehenden Produkte ist jedoch
schwierig, da entsprechende Standardverbindungen fehlen. Vergleicht man jedoch das
Migrationsverhalten
der
pdN-Bodipy-Konjugate
mit
dem
der
korrespondierenden
Ribonukleosid-5’-Phosphat-Konjugate (siehe Kapitel 4.5.1), so ist es möglich, dass es sich bei
69
Ergebnisse und Diskussion
dem ersten Signal (ca. 15.5min) um pdX-Bodipy handelt, da Xanthosin-5’-Phosphat (prX) als
Standardverbindung zur Verfügung steht, und das entsprechende Bodipy-Konjugat das
schnellste bisher beobachtete Wanderungsverhalten zeigte. 2’-Desoxyoxanosin, das in etwa
gleicher Menge wie 2’-Desoxyxanthosin bei der Umsetzung mit HNO2 aus 2’Desoxyguanosin gebildet wird [132], kann unter den verwendeten CE-Trennbedingungen (bei
pH 9.0) nicht detektiert werden. Offenbar steht es in einem pH-abhängigen Gleichgewicht
und migriert daher über einen sehr breiten Bereich hinweg [134].
Aus den Ergebnissen lässt sich ableiten, dass mit der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode unter
Verwendung der optimierten Trennbedingungen (18mM Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0,
75mM SDS, 8% Methanol (v/v), 0.5M Glukose, 20kV) eine Analyse von entsprechend
geschädigter DNA möglich ist. Da diese DNA-Modifikationen vor allem bei chronisch
entzündlichen Erkrankungen entstehen, bietet sich der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode hier
ein interessantes und klinisch relevantes Einsatzfeld zur Untersuchung des Zusammenspiels
zwischen weit verbreiteten (Zivilisations-) Krankheiten wie z. B. Atherosklerose und der
Entstehung von Krebserkrankungen.
Da die Bodipy-Konjugate der untersuchten Deaminierungsprodukte (pdX, pdU, pdI) offenbar
einen ähnliche Fluoreszenz-Quenching-Effekt aufweisen wie pdG-Bodipy, liegt ihre
Nachweisgrenze vermutlich ebenfalls im Bereich von 200pM. Das bedeutet bei einer
hydrolysierten DNA-Probe von 10µg (30nmol, cNukleotide = 340µM) und einer 100fachen
Verdünnung eine theoretische Nachweisgrenze von 20 000pM (= 20nM). Das entspricht etwa
sechs modifizierten Nukleotiden pro 100 000 normalen Nukleotiden.
4.4.3 Nachweis von veränderten DNA-Basen in 2’-Desoxy-Oligonukleotiden
Für weitere Untersuchungen zum Nachweis von modifizierten 2’-Desoxynukleotiden in DNA
wurden
verschiedene
2’-Desoxy-Oligonukleotide
mit
jeweils
einer
der
folgenden
Veränderungen eingesetzt. Abbildung 35 zeigt die vier modifizierten 2’-Desoxynukleosid-5’Phosphate, die in den 2’-Desoxy-Oligonukleotiden enthalten waren:
70
Ergebnisse und Diskussion
H3C
N
NH
N
N
N
O
HO
P
O
OH
HO
P
H
H
N
O
N
O
H
O
H
H
OH
H
H
H
N6-Methyl-2’-Desoxyadenosin-5’-Phosphat
N
O
OH
H
OH
N
N
H
1,N6-Etheno-2’-Desoxyadenosin-5’-Phosphat
(pN6mdA)
(etheno-pdA)
NH2
O
H
N
H
N
N
O
N
O
HO
P
O
N
O
H
OH
N
O
HO
P
O
H
H
8-Oxo-2’-Desoxyadenosin-5’-Phosphat
(8-oxo-pdA)
N
NH2
O
H
H
OH
NH
O
OH
H
H
H
OH
H
H
8-Oxo-2’-Desoxyguanosin-5’-Phosphat
(8-oxo-pdG)
Abb. 35: Strukturformeln der modifizierten 2’-Desoxynukleosid-5’-Phosphate
4.4.3.1. N6-Methyl-2’-Desoxyadenosin
Wie im theoretischen Teil bereits beschrieben, handelt es sich bei N6mdA um eine der drei
natürlichen Methyl-Modifikationen, die man bisher in der DNA von einigen niederen
Organismen nachgewiesen hat. Im Gegensatz zum 5mdC ist über die biologische Bedeutung
noch sehr wenig bekannt, fest steht nur, dass die Präsenz von N6mdA in der
Erkennungssequenz einen Schutz vor bestimmten Restriktionsenzymen bietet [135]. Für die
Analysen von N6mdA wurde ein Oligonukleotid folgender Sequenz verwendet (A* =
N6mdA): 5’ - GAG TCT TCC A*GT GTG ACA CAT – 3’ (Oligo IBA 3).
Oligo IBA 3 wurde nach den Standardbedingungen (Tab. 9) mit NP1 zu pdNs verdaut, mit
BODIPY-FL-EDA fluoreszenzmarkiert und für die CE-LIF-Analyse 1:1000 mit Wasser
verdünnt. Mit den etablierten CE-LIF Trennbedingungen (16mM Natriumphosphat-Puffer,
pH 9.0, 75mM SDS, 20% Methanol (v/v), 20kV) wurden nur vier Signale mit Migrations71
Ergebnisse und Diskussion
zeiten, die den normalen pdN-Bodipy-Konjugaten entsprachen, detektiert. Allerdings war die
korrigierte Peakfläche des pT-Bodipy-Signals entschieden zu groß.
Abbildung 36 zeigt, dass Änderungen der Elektrolyt-Pufferzusammensetzung (Salzkonzentration, Methanol- und SDS-Anteil) zur Auftrennung des pT-Bodipy-Signals führten,
wobei ein fünftes Signal zwischen pT-Bodipy und pdC-Bodipy erschien. Dieses Signal, mit
einer Migrationszeit von ca. 17.2min, läßt sich pN6mdA-Bodipy zuordnen (Trennbedingungen 17mM Natriumphosphat, pH 9.0, 75mM SDS, 15% Methanol (v/v) 20kV). Die
Lage des Peaks entspricht den Erwartungen, da pN6mdA-Bodipy durch die Methylgruppe
etwas lipophiler als pdA-Bodipy ist, sich daher länger in der SDS-Mizelle aufhalten sollte und
deshalb langsamer migriert als pdA-Bodipy.
10
pT-Bodipy
pdC-Bodipy
8
rel. Fluoreszenz
pdA-Bodipy
6
4
pN6mdA-Bodipy
pdG-Bodipy
2
0
10
12
14
16
18
20
22
24
Migrationszeit [min]
Abb. 36: CE-LIF-Analyse von Oligo IBA 3, Trennbedingungen s. Text
Die Position des Signals ist aber in der Hinsicht ungünstig, da unter diesen Bedingungen an
der gleichen Stelle sowohl 8-oxo-pdG-Bodipy (s. Punkt 4.4.3.3), als auch p5mdC-Bodipy
erscheint. Das bedeutet, dass mit diesen Trennbedingungen nicht alle bisher nachweisbaren
DNA-Modifikationen, die in einer realen DNA Probe vorhanden sein können, gleichzeitig
detektiert und quantifiziert werden können.
72
Ergebnisse und Diskussion
Die quantitative Auswertung (Mittelwerte aus drei Analysenläufen) ist in Tabelle 18
dargestellt. Zur Ermittlung des Nukleotidverhältnisses wurden die errechneten korrigierten
Peakflächen durch die korrigierte Fläche des pN6-mdA-Bodipys dividiert.
Tab. 18: Quantitative Auswertung der CE-LIF-Analysen von IBA 3 (n = 3)
pdA
pT
pdC
pN6mdA
pdG
4053119 ±
68316
4140363 ±
78341
4766818 ±
113697
848032 ±
6428
1125814 ±
42453
16.27
16.84
17.74
17.24
18.37
249162 ±
2818
245836 ±
4342
268674 ±
5068
49184 ± 436
31218 ±
1957
Nukleotidverhältnis
5.07 ± 0.03
5.00 ± 0.07
5.46 ± 0.08
1.0 ± 0.00
1.25 ± 0.03
Gem. Nukl.-Anteil (%)
28.50 ± 0.24
28.12 ± 0.12
30.74 ± 0.18
5.63 ± 0.09
7.01 ± 0.43
Tats. Nukl.-Anteil (%)
20
30
25
5
20
0.70 ± 0.008
1.07 ± 0.007
0.81 ± 0.003
0.89 ± 0.013
2.85 ± 0.015
1.00
1.04
1.09
1.06
1.13
Fläche [Einheiten]
Migrationszeit [min]
Korrigierte Peakfläche
Korrekturfaktor
Norm. Migrationszeit
Gem. Nukl.-Anteil = Gemessener Nukleotid-Anteil, Tats. Nukl.-Anteil = Tatsächlicher Nukleotid-Anteil
Wie Tabelle 18 zeigt, ist das Verhältnis von pdA zu pN6mdA nicht wie auf Grund der
Oligonukleotidzusammensetzung erwartet 4:1 sondern etwa 5:1. Die Ursachen dafür sind,
dass N6mdA etwas schlechter mit BODIPY-FL-EDA reagiert oder die markierte Substanz
schlechter fluoresziert. Der Korrekturfaktor für pN6mdA ist dementsprechend etwas größer,
als der für pdA bestimmte Korrekturfaktor von 0.7, liegt aber mit 0.89 im Bereich der anderen
Nukleotide
(Ausnahme
pdG-Bodipy).
Die
mit
diesem
Oligonukleotid
ermittelten
Korrekturfaktoren stimmen generell eher mit denen von Oligo-Mod2 überein als mit denen,
die mit λ-DNA bestimmt wurden (s. Seite 56).
Auf Grund der Schwierigkeiten mit der elektrophoretischen Trennung des pN6mdA-BodipyKonjugates von den normalen pdN-Bodipy-Konjugaten wurden alle weiteren Versuche zur
Validierung der Messung von N6mdA mit der 3’-Variante der Fluoreszenz-PostlabelingMethode durchgeführt (s. Punkt 4.6.5).
4.4.3.2 1,N6-Etheno-2’-Desoxyadenosin
1,N6-Ethenoadenosin (εA, etheno-dA) wird den exocyclischen DNA-Addukten zugerechnet,
welche im Zusammenspiel von freien Sauerstoffradikalen und ungesättigten Fettsäuren
73
Ergebnisse und Diskussion
gebildet werden (s. Punkt 2.3.2.2) Die Menge der so entstehenden Addukte liegt beim
Menschen im Bereich von 1 Addukt pro 100 Millionen Basen [136] und hängt stark von den
individuellen Ernährungsgewohnheiten ab [137]. Die Untersuchungen zum Nachweis von
εdA in DNA mittels Verdau mit NP1 zu pdNs, Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FLEDA und anschließender CE-LIF-Analyse wurden mit zwei 2’-Desoxy-Oligonukleotiden
durchgeführt, die je zwei bzw. vier veränderte Adenosine enthielten (Verdau und
Fluoreszenzmarkierung s. Tab. 9):
Oligonukleotid Nr. 614357: 5’ - AGεA-GCG-εAGεA-TTC-CεAA-TCA - 3’
Oligonukleotid Nr. 614358: 5’ - GAG-TCT-TCC-εAGT-GTG-εATG-AT - 3’
20
pdC-Bodipy
15
rel. Fluoreszenz
pT-Bodipy
pdG-Bodipy
pdA-Bodipy
10
etheno-pdA-Bodipy
5
0
10
12
14
16
18
20
22
24
26
Migrationszeit [min]
Abb. 36: CE-LIF-Analyse von Oligonukleotid 614357 (4x etheno-dA), Trennbedingungen: 16mM
Natriumphosphat, pH 9.0, 75mM SDS, 20% Methanol (v/v), 25kV
Die Elektropherogramme beider Oligonukleotide enthielten neben bekannten Signalen für die
normalen fluoreszenzmarkierten pdNs einen weiteren fünften Peak bei ca. 21min. Dieses
Signal war für Oligo 614357 (Abb. 36) doppelt so groß wie für Oligo 614358. Damit konnte
dieses Signal eindeutig über die Intensitäten, entsprechend der Verhältnisse von εdA in den
beiden Oligonukleotiden, als etheno-pdA-Bodipy identifiziert werden.
74
Ergebnisse und Diskussion
Die Lage des Signals stimmt wiederum gut mit den theoretischen Überlegungen überein,
wonach etheno-pdA-Bodipy durch den Ethylen-Baustein deutlich lipophiler und schwerer ist
und damit längere Migrationszeiten aufweist als das pdA-Bodipy. Durch die Erhöhung der
Trennspannung auf 25 000V wurde die Analysenzeit ohne Effizienz-Einbußen bei der Trennleistung unter 30 Minuten gehalten. Die quantitative Auswertung der Analysen ergab einige
Unterschiede zwischen den Oligonukleotiden, so dass hier beide getrennt aufgeführt sind.
Dabei ist wiederum zu beachten, dass das 5’-endständige Nukleotid auf Grund der fehlenden
Phosphatgruppe nach der Hydrolyse nicht fluoreszenzmarkiert wird, und deshalb nicht
nachgewiesen werden kann.
Wie aus den beiden Tabellen (19 und 20) ersichtlich, werden unterschiedliche
Korrekturfaktoren für die einzelnen Nukleotid-Bodipy-Konjugate erhalten. Die niedrigsten
Korrekturfaktoren ergaben sich wiederum für pdA-Bodipy und pdC-Bodipy. Interessanterweise ähnelt der Korrekturfaktor des etheno-pdAs von 1.6 bzw. 1.8 eher dem des pdG von
etwa 2.0 als dem des pdA mit einem Korrekturfaktor von 0.73 bzw. 0.61. Daher dürfte die
Nachweisgrenze für etheno-dA auch eher der von pdG entsprechen und etwa 200pM
betragen. Bezogen auf eine Probenverdünnung von 1:100 vor der Analyse ergibt sich somit
eine Nachweisgrenze von 20 000pM, was etwa sechs Addukten in 105 normalen Nukleotiden
entspricht.
Tab. 19: Auswertung der CE-LIF-Analyse von Oligonukleotid Nr. 614357 nach Nuklease P1 Verdau und
Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FL-EDA (n = 6)
614357
4x etheno-dA
PdA
pT
pdC
etheno-pdA
pdG
2
3
4
4
4
Gem. Nukl.-Anteil (%)
16.12 ± 0.70
19.81 ± 0.84
38.45 ± 0.60
14.39 ± 0.75
11.22 ± 0.76
Tats. Nukl.-Anteil (%)
11.76
17.65
23.53
23.53
23.53
0.731 ± 0.032
0.892 ± 0.039
Nukleotidverhältnis
4.50 ± 0.39
5.53 ± 0.47
10.71 ± 0.62
4.00 ± 0.00
3.12 ± 0.12
Normierte MT (dA)
1.00
1.04
1.11
1.39
1.21
Nukleotide
Korrekturfaktor
0.612 ± 0.01 1.639 ± 0.083
2.105 ± 0.136
Gem. Nukl.-Anteil = Gemessener Nukleotid-Anteil, Tats. Nukl.-Anteil = Tatsächlicher Nukleotid-Anteil,
Normierte MT (dA) = auf dA normierte Migrationszeit
75
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 20: Auswertung der CE-LIF Analyse von Oligonukleotid Nr. 614358 nach Nuklease P1 Verdau und
Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FL-EDA (n = 3)
614358
2x etheno-dA
pdA
pT
pdC
etheno-pdA
pdG
2
7
3
2
5
Gem. Nukl.-Anteil (%)
17.22 ± 0.91
40.43 ± 0.85
23.88 ± 0.62
5.72 ± 0.04
12.74 ± 0.62
Tats. Nukl.-Anteil (%)
10.53
36.84
15.79
10.52
26.32
0.612 ± 0.032
0.911 ± 0.019
0.662 ± 0.017
1.839 ± 0.013
2.069 ± 0.10
Nukleotidverhältnis
6.01 ± 0.32
14.15 ± 0.32
8.34 ± 0.25
2.00 ± 0.00
4.46 ± 0.22
Normierte MT (dA)
1.00
1.03
1.09
1.35
1.19
Nukleotide
Korrekturfaktor
Gem. Nukl.-Anteil = Gemessener Nukleotid-Anteil, Tats. Nukl.-Anteil = Tatsächlicher Nukleotid-Anteil,
Normierte MT (dA) = auf dA normierte Migrationszeit
4.4.3.3 8-Oxo-2’-Desoxyguanosin
Der wichtigste und am besten untersuchte Biomarker für oxidative DNA-Schäden ist 8-OxoGuanin. Seine Häufigkeit in der DNA des Menschen wird je nach verwendeter
Analysenmethode und untersuchtem Gewebe mit etwa 30 in 106 (GC-MS) bis 1 in 107
(Postlabeling, ELISA, HPLC-ECD) normalen Nukleotiden angegeben [136] und liegt damit
in einem Bereich, der mit der CE-LIF Methode erreichbar sein sollte. Zur Identifizierung und
Charakterisierung von 8-oxo-pdG in DNA standen zunächst drei Oligonukleotide
unterschiedlicher Sequenz mit jeweils einem bzw. zwei 8-oxo-dG Bausteinen (G*) zur
Verfügung:
IBA 5:
5’ - GAG TCT TCC AG*T GTG ACA CAT - 3’
995297:
5’ - AGA-GCG-AG*A-TTC-CAA-TCA - 3’
995298:
5’ - GAG-TCT-TCC-AGT-G*TG*-ATG-AT - 3’
Die Oligonukleotide wurden wie in Tab. 9 beschrieben zu pdNs verdaut und analysiert. Die
Elektropherogramme enthielten alle ein neues Signal zwischen pT-Bodipy und pdC-Bodipy,
das aber deutlich kleiner war als erwartet (s. Abb. 37). Dieses Signal mit einer Migrationszeit
von 21min erscheint damit an der gleichen Stelle wie das p5mdC-Bodipy Konjugat, wodurch
die gleichzeitige Analyse beider DNA-Modifikationen unter diesen Trennbedingungen nicht
möglich ist (s. auch Abb. 39). Die korrigierte Peakfläche des neuen Signals war für das
Oligonukleotid 995298 mit 23201 ± 291 Flächeneinheiten etwa doppelt so groß wie für
76
Ergebnisse und Diskussion
Oligonukleotid 995297 (11984 ± 270), entsprechend dem Verhältnis von 8-oxo-dG in den
Oligonukleotiden, wodurch der Peak als 8-oxo-pdG-Bodipy identifiziert wurde.
16
pT-Bodipy
14
rel. Fluoreszenz
12
pdC-Bodipy
10
pdA-Bodipy
8
8oxo-pdG-Bodipy
6
4
pdG-Bodipy
2
0
12
14
16
18
20
22
24
26
28
Migrationszeit [min]
Abb. 37: CE-LIF-Analyse von Oligo 995298 (2x 8-oxo-dG). Trennbedingungen s. Text
Es wurde vermutet, dass das Bodipy-Konjugat des 8-oxo-pdGs, ähnlich wie das pdG-Bodipy,
einen Fluoreszenz-Quenching-Effekt aufweisen würde. Die Auswertung der Peakflächen für
8-oxo-pdG der drei Oligonukleotide zeigte aber eine erstaunlich schlechte Detektierbarkeit
(Tab. 21). Der Korrekturfaktor für 8-oxo-pdG von etwa 6 ist noch 2.5 Mal größer als der für
das pdG (ca. 2.3), was aber gut mit den bei den Ribonukleotiden gemachten Beobachtungen
(siehe Kapitel 4.7.2.1) übereinstimmt, wonach die Oxidation der Base (Einführung einer
Ketogruppe in das Molekül) zu einer schlechteren Fluoreszenz des Bodipy-Konjugates führt.
Die vollständige quantitative Auswertung der Analysen der drei Oligonukleotide ist in den
Tabellen 42-44 im Experimentellen Teil der Arbeit zu finden (Kap. 5.2.3).
77
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 21: Korrekturfaktoren für die drei 8-oxo-dG enthaltenden Oligonukleotide (Mittelwerte, n = 3)
Oligo-995297
pdA
pT
pdC
8-oxo-pdG
pdG
0.737 ± 0.003
1.088 ± 0.003
0.865 ± 0.002
5.873 ± 0.091
2.277 ± 0.018
0.678 ± 0.001
0.952 ± 0.003
0.740 ± 0.002
5.528 ± 0.204
2.250 ± 0.007
0.746 ± 0.013
0.994 ± 0.021
0.843 ± 0.009
6.314 ± 0.238
2.559 ± 0.132
1x 8-oxo-dG
IBA 5 (72875)
1x 8-oxo-dG
Oligo-995298
2x 8-oxo-dG
Man beachte, dass das 5’-endständige Nukleotid wiederum in der Analyse fehlt (s. o.)
Für weitere Untersuchungen wurde synthetisiertes 8-Oxo-2’-Desoxyguanosin-5’-Phosphat
eingesetzt. Die Substanz wurde am Institute of Cancer Research in London von M. Osborne
durch Umsetzung von pdG mit Wasserstoffperoxid, Natriumascorbat und Kupfersulfat nach
der Methode von Schuler et al. [138] synthetisiert und am DKFZ spektroskopisch
charakterisiert (MS, 1H-und
13
C-NMR). Die erhaltenen spektroskopischen Daten stimmten
mit den Literaturangaben überein.
Nach der Reaktion von 10µg 8-oxo-pdG mit BODIPY-FL-EDA und EDC (Bedingungen s.
Tab. 9) wurde mit CE-LIF ein deutliches Signal bei ca. 26min detektiert.
Zur besseren Vergleichbarkeit wurde pdG unter identischen Reaktionsbedingungen
fluoreszenzmarkiert und die beiden Ansätze 1:1 gemischt.
Die CE-LIF Analyse dieser Mischung nach 1:100 Verdünnung mit Wasser ist in Abbildung
38 gezeigt.
Bedingt durch die geringere Verdünnung ist nun auch ein kleines Signal kurz vor dem pdGBodipy zu erkennen, möglicherweise ein Nebenprodukt aus der Synthese des 8-oxo-pdGs.
Das Verhältnis der Peakflächen von 8-oxo-pdG-Bodipy und pdG-Bodipy zueinander beträgt
ca. 40:60 (Faktor 1.5) und ist damit kleiner als das zuvor mit den modifizierten
Oligonukleotiden ermittelte (Faktor 2.5). Das lässt darauf schließen, dass nicht nur eine
reduzierte Reaktionsausbeute gegenüber pdG bei der Fluoreszenzmarkierung und eine
niedrigere Fluoreszenzquantenausbeute vorhanden ist, sondern auch die Hydrolyse der 8-oxodG modifizierten Oligonukleotide gehemmt ist.
78
Ergebnisse und Diskussion
25
pdG-Bodipy
8-oxo-pdG-Bodipy
rel. Fluoreszenz
20
15
10
?
5
0
20
22
24
26
28
30
32
34
Migrationszeit [min]
Abb. 38: Analyse einer 1:1 Mischung von Reaktionsansätzen mit 8-oxo-pdG und pdG, Verdünnung 1:100 mit
Wasser, Trennbedingungen s. Tab. 9
Dabei handelt es sich um ein bekanntes Phänomen, dem man im Allgemeinen mit einer
Erhöhung der Enzymkonzentration begegnet oder ein Gemisch aus mehreren Enzymen
(DNaseI, SVPD, MN, SPD, Alkalische Phosphatase) verwendet [139]. Die Verwendung
dieses Enzymgemisches ist aber nur dann praktikabel, wenn die nachfolgende
Analysenmethode auf Nukleosiden beruht, da dabei die Phosphatgruppe der Nukleotide
verloren geht.
Um die erarbeiteten Analysenbedingungen zur Detektion von 8-oxo-pdG auf DNA
anzuwenden, wurde CT-DNA in vitro mit H2O2 oxidiert und diese DNA mit HPLC und
elektrochemischer Detektion (ECD) untersucht (M. Osborne, London). Sie enthielt laut dieser
Analyse etwa 1.3% 8-oxo-dG, d. h. 13 von 1000 Nukleotiden sind 8-oxo-dG. Bei etwa 21%
pdG-Gehalt in der verwendeten CT-DNA entspricht das 6.2% aller pdGs.
Ein Aliquot der in vitro oxidierten CT-DNA (10µg) wurde nach den Bedingungen aus Tab. 9
analysiert. Nach Aufstocken mit dem Reaktionsansatz des 8-oxo-pdGs wurde das in Abb. 39
79
Ergebnisse und Diskussion
gezeigte Elektropherogramm erhalten. Wie vermutet konnten mit den bisher verwendeten
Trennbedingungen die Signale des 8-oxo-pdG-Bodipys und des p5mdC-Bodipys nicht
voneinander getrennt werden.
3,0
pdA-Bodipy
2,5
pT-Bodipy
rel. Fluoreszenz
2,0
pdC-Bodipy
1,5
p5mdC-Bodipy +
8-oxo-pdG-Bodipy
1,0
pdG-Bodipy
0,5
0,0
16
18
20
22
24
26
28
30
32
Migrationszeit [min]
Abb. 39: CE-LIF-Analyse von in vitro oxidierter CT-DNA nach Aufstocken mit dem Reaktionsansatz von 8oxo-pdG. Trennbedingungen: 16mM Natriumphosphat, pH 9.0, 75mM SDS, 20% Methanol (v/v), 20kV
Die unruhigere Basislinie des Elektropherogramms gegenüber der Analyse unbehandelter CTDNA weißt darauf hin, dass auch andere oxidative Schäden (z.B. Thymidinglykol,
Hydroxyuracil, 8-oxo-Adenosin etc.) durch die H2O2-Behandlung entstanden sein könnten.
Eine Änderung des Elektrolyten zu 17mM Natriumphosphat, pH 9.0, 15% Methanol (v/v),
75mM SDS, 20kV, ermöglicht die Trennung von 8-oxo-pdG-Bodipy von den normalen
Nukleotid-Bodipy-Konjugaten. Allerdings kann p5mdC-Bodipy nicht vollständig von pdCBodipy getrennt werden (s. Abb. 40).
80
Ergebnisse und Diskussion
2,0
pT-Bodipy
pdA-Bodipy
rel. Fluoreszenz
1,5
pdC-Bodipy
1,0
0,5
p5mdC-Bodipy
pdG-Bodipy
8-oxo-pdG-Bodipy
0,0
16
18
20
22
24
Migrationszeit [min]
Abb. 40: CE-LIF-Analyse von in vitro oxidierter CT-DNA nach NP1 Verdau und Reaktion mit BODIPY-FLEDA. Trennbedingungen s. Text; Verdünnung 1:1000 mit Wasser
Zur quantitativen Auswertung wurden zwei Korrekturfaktoren für 8-oxo-pdG verwendet.
Zum einen 2.56, also der selbe Faktor wie für pdG-Bodipy, für den Fall, dass sich die beiden
Bodipy-Konjugate sehr ähnlich verhalten und die großen Korrekturfaktoren bei der Analyse
der modifizierten Oligonukleotide durch Probleme beim Verdau verursacht wurden, da der 8oxo-pdG Gehalt hoch ist (bis 10%). Zum anderen wurden die Berechnungen mit dem
Mittelwert der Korrekturfaktoren aus den drei Bestimmungen mit den modifizierten
Oligonukleotiden von 5.98 durchgeführt, für den Fall, dass die Unterschiede in der Reaktivität
bzw. der Fluoreszenz-Quantenausbeute tatsächlich so groß sind. Mit dem Korrekturfaktor von
2.56 ergab sich ein Anteil von 1.72% 8-oxo-pdG an der Gesamtfläche (also der DNA) aller
Bodipy-Konjugate. Nimmt man für die Berechnungen den Korrekturfaktor von 5.98, so erhält
man einen Anteil von 4.03% 8-oxo-dG bezogen auf alle Basen der DNA. Die bessere
Übereinstimmung mit der HPLC-ECD Analyse (1.3% 8-oxo-pdG) wird also für den
Korrekturfaktor von 2.56 (1.72% 8-oxo-pdG) erhalten.
81
Ergebnisse und Diskussion
Analog der Berechnung des Methylierungsgrades (s. S. 52) wurde der Anteil an 8-oxo-pdG
nach folgender Formel bestimmt:
korr. Fläche (8−oxo− pdG−Bodipy)
× 100 = 8−oxo− pdG−Bodipy (%)
korr. Fläche (8−oxo− pdG−Bodipy) + korr. Fläche ( pdG−Bodipy)
Dabei ergab sich je nach verwendetem Korrekturfaktor mit 9.0% (Faktor 2.56) bzw. 18.7%
(Faktor 5.98) oxidierten dGs wiederum die bessere Übereinstimmung mit der HPLC-Methode
für den niedrigeren Korrekturfaktor. Überraschenderweise erhält man etwa die gleichen
Ergebnisse für die Menge an 8-oxo-pdG in der H2O2 behandelten DNA, wenn man für 8-oxopdG und pdG den gleichen Korrekturfaktor verwendet und nicht den deutlich höheren Faktor,
der durch die Analyse von Oligonukleotiden bestimmt wurde.
Die Methode ist also in der Lage bei 1:100 Verdünnung der Probe eine Adduktmenge von 1
8-oxo-dG pro 1000 Nukleotide zu detektieren, was aber für die in vivo Anwendung nicht
ausreicht. Problematisch ist ebenfalls, dass noch keine Trennbedingungen gefunden werden
konnten, die die Basislinien-getrennte Analyse von allen sechs relevanten Nukleotid-BodipyKonjugaten (pdA, pdC, pdG, pT, p5mdC, 8-oxo-pdG) gewährleistet.
4.4.3.4 8-Oxo-2’-Desoxyadenosin
Neben 8-Oxo-Guanin gibt es weitere DNA-Schäden, die ebenfalls durch freie
Sauerstoffradikale verursacht werden. Eine dieser Basenveränderungen ist das 8-Oxo-Adenin
(8-oxo-dA), das auf Grund der geringeren Oxidationsempfindlichkeit des Adenins im
Verhältnis zum Guanin aber wesentlich seltener entsteht, und daher deutlich schwieriger zu
detektieren ist. In der Literatur gibt es nur wenige Angaben über die Häufigkeit dieser DNAModifikation; sie wird in der Regel mit etwa 1 Addukt pro 108 normalen Nukleotiden
angegeben [136].
Für Untersuchungen stand ein 2’-Desoxy-Oligonukleotid (IBA 4) mit folgender Sequenz zur
Verfügung (A* = 8-oxo-dA): 5’ - GAG TCT TCC A*GT GTG ACA CAT - 3’ (Oligo IBA 4).
10µg des Oligonukleotids wurden nach den Standardbedingungen aus Tab. 9 mit NP1 zu
pdNs verdaut und mit BODIPY-FL-EDA derivatisiert. Die CE-LIF Analyse mit den normalen
Bedingungen (16mM Natriumphosphat, pH 9.0, 75mM SDS, 20% Methanol (v/v), 20kV)
zeigte zunächst nur die vier Signale der normalen pdN-Bodipy-Konjugate. Durch Änderungen
82
Ergebnisse und Diskussion
der Pufferzusammensetzung gelang die Detektion eines fünften Signals, das hinter dem pdGBodipy erscheint (s. Abb. 41).
10
pT-Bodipy
pdC-Bodipy
8
rel. Fluoreszenz
pdA-Bodipy
6
4
pdG-Bodipy
2
8-oxo-pdA-Bodipy
0
10
12
14
16
18
20
22
24
Migrationszeit [min]
Abb. 41: CE-LIF-Analyse von Oligonukleotid IBA 4 nach NP1 Verdau und Fluoreszenzmarkierung.
Trennbedingungen: 17mM Natriumphosphat, pH 9.0, 75mM SDS, 15% Methanol (v/v), 20kV
Eigentlich war das Signal des 8-oxo-dA-Bodipy auf Grund seiner höheren Hydrophilie durch
die Ketogruppe am C8-Atom bei kleineren Migrationszeiten als pdA-Bodipy erwartet
worden.
Die Auswertung der korrigierten Signalflächen (s. Tab. 22) ergab für die vier normalen
Nukleotide ähnliche Korrekturfaktoren wie mit den anderen untersuchten Oligonukleotiden.
Für das 8-oxo-pdA-Bodipy Konjugat wurde ebenso wie für 8-oxo-pdG-Bodipy ein deutlich
höherer Korrekturfaktor ermittelt, als für das nicht oxidierte Nukleotid.
83
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 22: Auswertung der Oligonukleotid-Untersuchung von IBA 4 (Mittelwerte, n = 3)
IBA 4 (72874)
1 x 8-oxo-dA
pdA
pT
pdC
8oxo-pdA
pdG
4
6
5
1
4
Gem. Nukl.-Anteil (%)
28.37 ± 0.12
30.53 ± 0.98
31.59 ± 0.09
1.59 ± 0.01
7.91 ± 0.05
Tats. Nukl.-Anteil (%)
20
30
25
5
20
Korrekturfaktor
0.705 ± 0.003
0.983 ± 0.002
0.791 ± 0.002
3.135 ± 0.015
2.529 ± 0.02
Nukleotidverhältnis
17.79 ± 0.16
19.14 ± 0.10
19.81 ± 0.04
1.00 ± 0.00
4.96 ± 0.02
Normierte MT (dA)
1.00
1.04
1.09
1.19
1.15
Nukleotide
Gem. Nukl.-Anteil = Gemessener Nukleotid-Anteil, Tats. Nukl.-Anteil = Tatsächlicher Nukleotid-Anteil
Man beachte, dass das 5’-endständige Nukleotid wiederum in der Analyse fehlt (s.o.)
Das Elektropherogramm in Abb. 40 zeigt, dass im Bereich des 8-oxo-pdA-Bodipy-Signales
(ca. 22min) mehrere kleine Signale zu erkennen sind, die aber bisher nicht zugeordnet werden
konnten. Da der Korrekturfaktor für 8-oxo-pdA-Bodipy mit 3.135 um den Faktor 1.24 höher
ist als der Korrekturfaktor für pdG-Bodipy, sollte auch die Nachweisgrenze um den gleichen
Faktor höher sein. Das bedeutet, dass für 8-oxo-pdA eine Nachweisgrenze von ca. 250pM zu
erwarten ist. Bei einer Probenverdünnung von 1:100 vor der Analyse bedeutet dies die
Detektierbarkeit 25000pM und damit etwa sieben Addukte in 100 000 normalen Nukleotiden.
4.5 Analyse von RNA mittels CE-LIF
Das Prinzip der Fluoreszenzmarkierung von Oligo- oder Mononukleotiden durch chemische
Konjugation von Fluorophoren über primäre Aminofunktionen an ihre Phosphatgruppen hat
seit der Arbeit von Chu et al. 1983 [101] relativ weite Verbreitung gefunden. Diese Technik
bietet nicht nur die Möglichkeit 2’-Desoxyribonukleotide sondern auch Ribonukleotide und
andere Moleküle, die eine Phosphatgruppe tragen, zu markieren. Über die Fluoreszenzmarkierung von Ribonukleosid-Monophosphaten liegt jedoch nur ein Bericht von Jain et al.
vor [140]. In dieser Arbeit wurden die vier normalen Ribonukleosid-5’-Phosphate (prNs)
sowie 7-Methylguanosin-5’-Phosphat nach der Methode von Kelman et al. [102] zunächst mit
Ethylendiamin und EDC zu den entsprechenden Phosphoramidaten umgesetzt und dann in
einem zweiten Schritt mit Dansylchlorid fluoreszenzmarkiert (s. Abb. 5 und 6). Zur Analyse
der
Konjugate
via
HPLC
mit
Fluoreszenzdetektion
chromatographische Anreicherung der Addukte notwendig.
84
war
zuvor
jedoch
eine
Ergebnisse und Diskussion
Während der Entwicklung unserer Fluoreszenz-Postlabeling-Methode mit BODIPY-FL-EDA
zur Analyse von DNA wurde die Frage aufgeworfen, ob isolierte DNA mit RNAVerunreinigungen zu Störungen bei der CE-LIF-Analyse führen könnten. Erste Versuche
zeigten jedoch, dass die Zugabe von Ribonukleosid-3’-Phosphaten (rNps) zu MN/SPD
verdauter DNA vor der Fluoreszenzmarkierung keine anderen Signale in der CE-LIF Analyse
erzeugten als mit reiner CT-DNA allein. Der Grund hierfür liegt in der Bildung eines stabilen
cyclischen Phosphates, das, wie von Dekker und Khorana beschrieben [141], bei der
Umsetzung von Ribonukleosid-3’-Phosphaten mit Carbodiimiden gebildet wird (Abb. 42,
oben). Durch die direkte Nachbarschaft der 2’-OH-Gruppe der Ribose zu der durch EDC
aktivierten Phosphatgruppe kommt es zu einem nukleophilen Angriff der freien
Elektronenpaare des Sauerstoffes, der sofort zur Bildung des cyclischen Phosphates führt.
Andere Nukleophile (wie z.B. BODIPY-FL-EDA) haben keine Möglichkeit mit der
aktivierten Phosphatgruppe zu reagieren. Da 2’-Desoxyribose an der fraglichen Position keine
OH-Gruppe besitzt, läuft in diesem Fall die Reaktion mit BODIPY-FL-EDA mit EDCAktivierung ohne Probleme ab (Abb. 42, unten).
Base
HO
O
H
MN/SPD
H
O
P
O
OH
Base
HO
H
O
H
H
H
H
O
O
OH
+
H
P
Chemische
Derivatisierung
OH
N
B
F
N
NH
NH2
F
O
OH
O
RNA
CE-LIF
NP1
OH
O
P
Base
O
N
O
H
OH
H
OH
H
OH
F
H
Chemische
Derivatisierung
B
O
N
NH
F
O
NH
P
O
Base
O
OH
H
H
H
OH
H
OH
Abb. 42: Möglichkeiten der Hydrolyse von RNA mit anschließender Fluoreszenzmarkierung. Reaktionsschema
für Ribonukleosid-3’- und -5’-Monophosphate mit EDC und BODIPY-FL-EDA
Inzwischen wurde auch am Beispiel des Adenosin-3’-Monophosphates (rAp) gezeigt, dass bei
der Reaktion mit EDC und BODIPY-FL-EDA das cyclische 2’,3’-Adenosin-Monophosphat
gebildet wird, und die Phosphatgruppe nicht mehr für die Reaktion mit dem
Fluoreszenzmarker zur Verfügung steht. Nach Isolierung dieses Reaktionsproduktes aus dem
85
Ergebnisse und Diskussion
Derivatisierungsansatz mittels HPLC wurde es spektroskopisch (MS, 1H-NMR) als 2’,3’Adenosin-Monophosphat identifiziert [143].
Daraus ergibt sich einerseits, dass RNA-Verunreinigungen die Untersuchung von DNA mit
der 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode nicht oder nur unwesentlich
beeinflussen; andererseits bietet diese Variante der Methode aber auch keine Möglichkeit zur
Analyse von RNA und RNA-Addukten [68, 69] oder seltenen RNA-Basen, wie sie zum
Beispiel gehäuft in tRNA vorkommen (s. Theorie 2.4).
Der Nachweis von RNA-Basen gelingt jedoch, wenn man RNA mit Nuklease P1 zu
Ribonukleosid-5’-Phosphaten verdaut. In diesem Fall ist die Phosphatgruppe zu weit von der
Hydroxyl-Funktion in der 2’-Position der Ribose entfernt, um nach Aktivierung mit EDC ein
cyclisches Phosphat zu bilden. Somit findet die Markierung mit BODIPY-FL-EDA statt
(Abb. 42).
4.5.1 Methodenentwicklung
Für erste Untersuchungen zur Fluoreszenzmarkierung von prNs mit BODIPY-FL-EDA
wurden 10µg Adenosin-5’-Monophosphat (prA) unter den für pdNs entwickelten
Bedingungen (s. Tab. 10) mit EDC und BODIPY-FL-EDA in 350mM MES Puffer pH 6.5
umgesetzt und anschließend mit CE-LIF analysiert. Die Derivatisierungsreaktion verlief ohne
Probleme und im Elektropherogramm konnte ein Signal der erwarteten Intensität detektiert
werden, welches in Analogie zu den Umsetzungen der pdNs nur das prA-Bodipy sein konnte.
Daher wurde auf eine spektroskopische Identifizierung dieses Bodipy-Konjugates verzichtet.
Ein Aliquot dieser Reaktionslösung wurde mit einem Aliquot des Derivatisierungsansatzes
von pdA so gemischt, dass gleiche molare Mengen vorlagen. Das Gemisch wurde 1:1000 mit
Wasser verdünnt und mit CE-LIF analysiert (Abb. 43).
Das Elektropherogramm zeigt annähernd gleich große Peakflächen und prA-Bodipy
(13.8min) wandert etwas schneller als pdA-Bodipy (15min). Durch die zusätzliche 2’-OH
Gruppe ist prA-Bodipy hydrophiler als pdA-Bodipy und hat daher wahrscheinlich eine
reduzierte Aufenthaltswahrscheinlichkeit in der Mizelle, was die kürzere Migrationszeit
erklären könnte. Die beiden kleinen, nicht bestimmten Signale (? in Abb. 43) entstammen
dem Reaktionsansatz des prAs und sind vermutlich Verunreinigungen des käuflich
erworbenen prAs (Reinheit lt. Hersteller, SIGMA, 98%).
86
Ergebnisse und Diskussion
80
prA-Bodipy
pdA-Bodipy
rel. Fluoreszenz
60
40
?
20
0
10
12
14
16
18
20
22
Migrationszeit [min]
Abb. 43: CE-LIF-Analyse der Mischung aus den Derivatisierungsansätzen von prA und pdA mit BODIPY-FLEDA; Trennbedingungen: 17mM Natriumphosphat, pH 9.0, 75mM SDS, 15% Methanol (v/v), 20kV;
Verdünnung 1:1000 mit Wasser
Um die oben angestellten Überlegungen zu untermauern, wurde ein Hybrid-Oligomer aus
poly-rA und poly-dT (poly rA·dT) mit einer Länge von 8-12 Basenpaaren mit MN/SPD zu 2’Desoxy- und Ribonukleosid-3’-Monophosphaten verdaut und derivatisiert (Tabelle 10). Es
sollte nur das Tp-Bodipy entstehen, da rAp unter den gegebenen Bedingungen nicht mit
BODIPY-FL-EDA reagieren kann (s. o.). Bei der anschließenden CE-LIF-Analyse wurde im
Elektropherogramm tatsächlich nur das Signal des Tp-Bodipys nachgewiesen (nicht gezeigt).
Nach Verdau mit NP1 zu den entsprechenden 5’-Monophosphaten mit anschließender
Derivatisierung und CE-LIF Analyse wurden demzufolge zwei Peaks für pT-Bodipy und prABodipy erwartet. Das folgende Elektropherogramm (Abb. 44) bestätigt diese Vermutung:
87
Ergebnisse und Diskussion
40
prA-Bodipy
rel. Fluoreszenz
30
pT-Bodipy
20
10
0
10
15
20
25
30
Migrationszeit [min]
Abb. 44: CE-LIF-Analyse von 10µg poly-rA·dT nach NP1 Verdau zu Nukleosid-5’-Phosphaten.
Trennbedingungen für 3’-Phosphate: 18mM Natriumphosphat, pH 9.0, 90mM SDS, 10% Methanol (v/v), 20kV.;
Verdünnung 1:1000 mit Wasser.
Wie bei den pdNs wurden von den prNs neben den normalen in der RNA vorkommenden
Nukleotiden (Adenosin-5’-Phosphat, Uridin-5’-Phosphat, Cytidin-5’-Phosphat und Guanosin5’-Phosphat) auch leicht modifizierte Nukleotide (Inosin-5’-Phosphat, Xanthosin-5’Phosphat) sowie Ribose-5’-Phosphat als Standardverbindungen für die FluoreszenzPostlabeling-Methode hergestellt. Dazu wurden je 10µg dieser Substanzen einzeln, unter den
Standardbedingungen für pdNs (s. Tab. 9) mit EDC und BODIPY-FL-EDA umgesetzt. In
allen Reaktionsansätzen wurde durch CE-LIF-Analyse nur ein Signal des entsprechenden
prN-Bodipy-Konjugates detektiert. Im Gegensatz zu pdR konnte bei Ribose-5’-Phosphat (pR)
auch nur ein Signal detektiert werden. Die sieben Reaktionsansätze wurden mit Wasser
verdünnt (1:100), je 50µl dieser Lösungen wurden gemischt und mit Wasser auf 0.5ml
aufgefüllt (Verdünnung 1:1000). Mit den Trennbedingungen für die dNps (18mM
Natriumphosphat, pH 9.0, 90mM SDS, 10% Methanol (v/v) bei 20kV) konnte das Gemisch
kapillarelektrophoretisch vollständig getrennt werden (s. Abb. 45).
88
Ergebnisse und Diskussion
20
prA-Bodipy
15
rel. Fluoreszenz
prC-Bodipy
prU-Bodipy
10
prG-Bodipy
prI-Bodipy
pRibose-Bodipy
prX-Bodipy
5
0
10
15
20
25
30
Migrationszeit [min]
Abb. 45: CE-LIF-Analyse eines Gemisches aus sieben Ribonukleosid-5’-Phosphat-Bodipy-Konjugaten.
Trennbedingungen s. Text.
Aus dem Elektropherogramm (Abb. 45) ist ersichtlich, dass die prN-Bodipy-Konjugate ein
ähnliches Migrationsverhalten zeigen wie die pdN-Bodipy-Konjugate, lediglich die
Migrationsreihenfolge für prI und prU ist vertauscht (vgl. Abb. 28). Obwohl von allen
Ribonukleosid-5’-Phosphaten die gleiche Menge (10µg) für die Derivatisierungsreaktion
eingesetzt wurde, sind die korrigierten Flächen der einzelnen Signale sehr unterschiedlich.
Tabelle 23 vergleicht die auf molare Massen korrigierten Peakflächen der einzelnen
Nukleotide miteinander:
89
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 23: Peakflächenauswertung der CE-LIF-Analyse von Abb. 45 bezogen auf die eingesetzten
Molmengen (n = 3)
Base
rA
rC
rU
rG
rI
rX
Ribose
Nmol
22.66
20.86
20.75
19.89
25.50
23.00
24.82
Mittelwert (n=3)
Fläche/nmol
16183
± 743
15168 ±
625
9191 ±
463
5111 ±
122
5289 ±
220
3570 ±
104
5409 ±
140
% prA
100.00
93.73
56.79
31.58
32.68
22.06
33.43
Die korrigierten Peakflächen (Mittelwert aus drei Analysenläufen) wurden durch die
eingesetzte Stoffmenge dividiert, wodurch eine „Signalfläche pro mol“ erhalten wurde. Diese
Werte wurden zur besseren Vergleichbarkeit noch auf den höchsten Wert (prA-Bodipy)
normiert (% prA). Nur wenig kleiner als für prA-Bodipy ist die Signalfläche für prC-Bodipy.
Alle übrigen Bodipy-Konjugate zeigen deutlich niedrigere Intensitäten, am geringsten ist sie
für prX-Bodipy. Also müssen für eine quantitative RNA-Analyse ebenfalls Korrekturfaktoren
bestimmt werden.
4.5.2 Kapillarelektrophoretische Trennung von 2’-Desoxy- und Ribonukleosid-5’Phosphaten
Ein Vorteil der 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode ist, dass RNAVerunreinigungen in der DNA-Präparation nicht markiert werden, und damit keine störenden
Signale bei der CE-LIF-Analyse verursachen. Beim Verdau von DNA mit NP1 zu pdNs wird
anwesende RNA jedoch ebenfalls zu fluoreszenzmarkierbaren prNs verdaut, was zu
zusätzlichen Signalen im Elektropherogramm führt. Wie Abbildung 46 zeigt, gelang die
vollständige Trennung einer Mischung von NP1 verdauter und fluoreszenzmarkierter DNA
und den vier normalen Ribonukleosid-Bodipy Konjugaten (prA-Bodipy, prU-Bodipy, prGBodipy, prC-Bodipy), die jeweils getrennt derivatisiert worden waren, nur durch Zusatz von
1M Glukose zum Elektrolyten. Dies bedingt jedoch eine wesentlich längere Migrationszeit, so
dass es im Sinne einer Hochdurchsatz-Methode sinnvoller ist, schon bei der DNA-Isolation
auf die Reinheit der DNA zu achten. Aus dem Elektropherogramm ist jedoch ersichtlich, dass
die Peakflächen für die entsprechenden prN und pdN-Bodipy-Konjugate in etwa gleich groß
sind.
90
Ergebnisse und Diskussion
10
pdA-Bodipy
8
prC-Bodipy
pdC-Bodipy
prA-Bodipy
rel. Fluoreszenz
pT-Bodipy
6
prG-Bodipy
4
pdG-Bodipy
prU-Bodipy
p5mdC-Bodipy
2
0
30
40
50
60
Migrationszeit [min]
Abb. 46: CE-LIF-Analyse einer Mischung von DNA verdaut mit NP1 (2’-Desoxyribonukleosid-5’-Phosphat
Bodipy-Konjugate) und Ribonukleosid-5’-Phosphat Bodipy-Konjugaten; Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat, pH 9.0, 10% Methanol (v/v), 90mM SDS, 1M Glukose, 20kV
4.5.3
Nachweis
von
Pseudouracil
(Ψ)
und
2’-O-Methyladenosin
in
Oligoribonukleotiden durch Fluoreszenz-Postlabeling und CE-LIF
RNA enthält neben den vier normalen Basen, Adenin, Cytosin, Uracil und Guanin, noch eine
Vielzahl von veränderten Basen. Die häufigste ist das Pseudouracil (Abb. 47), ein Isomer des
Uracils, bei dem die Verknüpfung der Ribose mit dem Pyrimidin-Ring nicht über den
Stickstoff sondern über einen Kohlenstoff erfolgt. Auf Grund seiner Häufigkeit hat
Pseudouracil ein eigenes Symbol (Ψ) für die Notation von RNA-Sequenzen erhalten und wird
in Analogie zum 5-Methylcytosin in der DNA als „Fünfte RNA-Base“ bezeichnet.
91
Ergebnisse und Diskussion
NH2
O
N
HN
N
O
O
HO
O
P
O
HO
O
H
OH
P
O
H
H
OH
O
H
H
H
OH
Pseudouridin-5’-Phosphat
N
O
OH
H
H
OH
N
NH
CH3
2’-O-Methyladenosin-5’-Phosphat
Abb. 47: Strukturformeln von Pseudouridin (5-Ribosyluracil)-5’-Phosphat und 2’-O-Methyladenosin-5’Phosphat
Die Bildung erfolgt erst nach der Synthese des RNA-Stranges durch ein spezielles
Enzymsystem, das sequenzspezifisch bestimmte Uridine in Pseudouridine umwandelt. In
tRNA, snRNA und rRNA von höheren Organismen (vielzellige Pflanzen und Tiere) erreicht
der Gehalt an Pseudouridin 2-3%.
Eine weitere häufige Modifikation der RNA ist die Methylierung der 2’-OH Position der
Ribose. Diese Veränderung ist für alle vier (bzw. fünf) normalen Ribonukleoside bekannt und
tritt häufig an bestimmten Positionen der tRNA auf (T-loop). Sie ist auch in stark
konservierten Bereichen von Untereinheiten der ribosomalen RNA (rRNA) verschiedener
Organismen nachgewiesen worden und scheint sehr wichtig für den korrekten Zusammenbau
von Ribosomen zu sein [67]. Generell herrscht heute die Meinung vor, dass Schlüsselprozesse
wie der Peptidyl-Transfer bei der Proteinbiosynthese und der Aufbau der Ribosomen aus den
RNA Untereinheiten stark von der korrekten Modifikation der RNA abhängen.
Um abzuklären, ob solche RNA-Modifikationen mit der 5’-Variante der FluoreszenzPostlabeling-Methode untersucht werden können, wurden zunächst RNA-Oligonukleotide
(21mere), die jeweils ein Pseudouridin oder ein 2’-O-Methyladenosin (mA, s. Abb. 47)
enthalten, analysiert.
Ribo-Oligo U1:
5’ - p-GAG UCU UCC AGΨ GUG ACA CAU - 3’
Ribo-Oligo mA:
5’ - p-GAG UCU UCC AGmA GUG ACA CAU - 3’
Beide Oligoribonukleotide tragen am 5’-Ende eine Phosphatgruppe, so dass nach Verdau mit
NP1 alle 21 Basen als Ribonukleosid-5’-Phosphate mit BODIPY-FL-EDA markiert werden.
Für den Verdau mit NP1 wurden die Bedingungen des DNA-Verdaus übernommen (s. Tab.
92
Ergebnisse und Diskussion
9). 10µg der Oligoribonukleotide wurden mit NP1 in MES-Puffer bei pH 5.5 zu prNs verdaut
und anschließend mit EDC und BODIPY-FL-EDA unter identischen Bedingungen wie die
pdNs fluoreszenzmarkiert. Die erhaltene Reaktionslösung wurde 1:1000 mit Wasser verdünnt
und mit den in Tabelle 24 angegebenen Trennbedingungen kapillarelektrophoretisch
analysiert (Abb. 48 und 49).
Tab. 24: Versuchsbedingungen für die Analyse von RNA mit der 5’-Variante der FluoreszenzPostlabeling-Methode
Analysenschritt
Bedingungen
RNA-Hydrolyse
10µg RNA (oder Oligonukleotid, 31nmol) zur Trockene einengen in 6µl
MES 50mM, pH 5.5, lösen
Zugabe von 2µl ZnCl2 (2mM) und 2µl NP1 (0.02U) in Wasser
Inkubation bei 37°C für 2h
Fluoreszenzmarkierung
10µl Hydrolyselösung (10µg pdN, 31nmol)
(Derivatisierung)
+ 20µl 350mM MES, pH 6.5 (Endkonzentration 340µM Nukleotid)
+ 30µl 25mM BODIPY-FL-EDA in 350mM MES, pH 6.5
(Endkonzentration 8.33mM BODIPY-FL-EDA)
+ 30µl 1.8M EDC in 350mM MES, pH 6.5
(Endkonzentration 0.6M EDC)
Endvolumen 90µl
Inkubation bei 25°C für 25h
Kapillarelektrophorese
(MEKC),
unbeschichtete fused-silica-Kapillare, Lges = 59cm, Leff = 49cm
Beckman Durchmesser = 50µm
Coulter, P/ACE MDQ
20kV Trennspannung (340V/cm)
Glycoprotein System
hydrodynamische Injektion 2.5x psi·s (ca. 5nl)
Trennpuffer: 18mM Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0, 90mM SDS, 10%
Methanol (v/v)
Für
beide
Oligoribonukleotide
liefen
Verdau
und
Derivatisierungsreaktion
ohne
Auffälligkeiten ab, so dass die Lösungen ohne Probleme mit CE-LIF analysiert werden
konnten (s. Abb. 48 und 49).
93
Ergebnisse und Diskussion
2,5
prA-Bodipy
2,0
rel. Fluoreszenz
prC-Bodipy
1,5
prU-Bodipy
1,0
prG-Bodipy
pΨ-Bodipy
0,5
0,0
18
20
22
24
26
28
30
32
Migrationszeit [min]
Abb. 48: CE-LIF-Analyse von Ribo-Oligo U1 nach Verdau mit Nuklease P1 und Fluoreszenzmarkierung mit
BODIPY-FL-EDA. Trennbedingungen s. Tab. 24, Verdünnung 1:1000 mit Wasser
Das Elektropherogramm in Abb. 48 zeigt die CE-LIF-Analyse von Ribo-Oligo U1 mit einem
neuen Signal zwischen prA-Bodipy und prU-Bodipy, das dem Pseudouridin-Bodipy (pΨBodipy) zugeordnet wurde. Die korrigierte Peakfläche des Signals entspricht der erwarteten
Fläche für ein normales prN-Bodipy, d. h. pΨ-Bodipy weist ähnliche Fluoreszenz-QuenchingEffekte auf wie die vier normalen RNA-Nukleotide. Die korrigierten Peakflächen wurden mit
der Zusammensetzung des Oligoribonukleotides verglichen und Korrekturfaktoren für die
einzelnen prN-Bodipy-Konjugate ermittelt. Tabelle 25 bestätigt die bei den einzeln
derivatisierten prNs gemachten Beobachtungen. Wiederum ist prA-Bodipy das Konjugat mit
dem niedrigsten und prG-Bodipy das mit dem höchsten Korrekturfaktor (Quenching-Effekt
wie das pdG-Bodipy).
94
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 25: Auswertung der CE-LIF-Analyse von Ribo-Oligo U1 (n = 5)
Ribo-Oligo U1
Anzahl der Basen
Messung (%)
Korrekturfaktor
rA
rU
rC
rG
Ψ
5 (23.81%)
5 (23.81%)
5 (23.81%)
5 (23.81%)
1 (4.76%)
33.10 ± 0.19
20.71 ± 0.14
31.79 ± 0.26
9.56 ± 0.24
4.83 ± 0.07
0.719 ± 0.004
1.150 ± 0.008
0.784 ± 0.006
2.491 ±0.064
0.986 ± 0.014
Auch die CE-LIF-Analyse von Ribo-Oligo mA ergab ein zusätzliches Signal für 2’-OMethyladenosin-Bodipy
(p2’OmrA-Bodipy),
das
aber
unter
den
verwendeten
Trennbedingungen nicht vollständig vom prC-Bodipy getrennt wurde.
Die beste Trennung erzielte der in Tab. 24 angegebene Puffer mit einem pH-Wert von 8.5
(Abb. 49). Dies führte zwar zu längeren Migrationszeiten aller Ribonukleosid-5’-BodipyKonjugate, war aber ausreichend für eine Auswertung der korrigierten Peakflächen mit einer
relativen Standardabweichung von ca. 5%. Die Auswertung der Analysendaten von RiboOligo mA ergab ähnliche Korrekturfaktoren wie bei Ribo-Oligo U1 (s. Tab. 26).
1,4
prA-Bodipy
1,2
prC-Bodipy
rel. Fluoreszenz
1,0
prU-Bodipy
0,8
p2´OmrA-Bodipy
0,6
prG-Bodipy
0,4
0,2
0,0
20
22
24
26
28
30
32
34
Migrationszeit [min]
Abb. 49: CE-LIF-Analyse von Ribo-Oligo mA nach Verdau mit NP1 und Fluoreszenzmarkierung;
Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat, pH 8.5, 10% Methanol (v/v), 90mM SDS, 20kV.
95
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 26: Auswertung der CE-LIF Analyse von Ribo-Oligo mA (n = 7)
Ribo-Oligo mA
Anzahl der Basen
Messung (%)
Korrekturfaktor
rA
rU
rC
rG
2’-O-mrA
4 (19.05%)
6 (28.57%)
5 (23.81%)
5 (23.81%)
1 (4.76%)
27.38 ± 1.33
18.06 ± 1.31
29.20 ± 1.32
10.25 ± 0.78
7.15 ± 0.37
0.689 ± 0.033
1.201 ± 0.068
0.772 ± 0.033
2.308 ± 0.169
0.667 ± 0.034
Interessant ist, dass der Korrekturfaktor für 2’-O-Methyladenosin dem für prA entspricht, also
keine Unterschiede beim Verdau mit NP1, bei der Markierungsreaktion mit BODIPY-FLEDA und in den Fluoreszenzeigenschaften bestehen. Das ist insofern bemerkenswert, als dass
die Methylierung der 2’-Position der Ribose im Allgemeinen zu einer erhöhten Resistenz der
RNA gegenüber dem Verdau mit Nukleasen und RNasen führt [143]. Die korrigierten
Peakflächen für die in beiden Oligoribonukleotiden gleich häufig vertretenen Nukleotide (prG
und prC, je 5x) sind ebenfalls vergleichbar (Tab. 27)
Tab. 27: Auswertung der Peakflächen der RNA-Oligonukleotide (n = 5)
rC
rG
Ribo-Oligo U1
41043 ± 3808
15000 ± 1539
Ribo-Oligo mA
44061 ± 5369
14550 ± 1300
4.5.4 Validierung der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode für Ribonukleosid-5’Phosphate
Für einen Einsatz der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode zur Analyse von RNA ist es ebenso
wie für die bisher vorgestellten Fluoreszenz-Postlabeling-Assays unerlässlich, die Methode zu
validieren. Dazu wurden die Nachweisgrenze, die Reproduzierbarkeit und Präzision der
Methode bestimmt, sowie die Linearität des Messbereiches überprüft. Dafür wurde mangels
einer geeigneten Modell-RNA das Oligoribonukleotid U1 verwendet.
4.5.4.1 Bestimmung der Nachweisgrenze
Zur Bestimmung der Nachweisgrenze der Ribonukleotide aus dem RNA-Verdau wurden
10µg des Oligonukleotides U1 mit NP1 zu prNs verdaut und mit BODIPY-FL-EDA
fluoreszenzmarkiert (Bedingungen s. Tab. 24). Der Reaktionsansatz wurde anschließend so
lange mit Wasser verdünnt, bis die Signale der Bodipy-Konjugate bei der CE-LIF-Analyse
96
Ergebnisse und Diskussion
gerade noch mit einem Signal/Rausch-Verhältnis (S/N) von 3:1 detektiert werden konnten.
Die prA-, prC- und prU-Bodipy-Konjugate konnten bei einer Verdünnung des Reaktionsansatzes von 1:106 noch detektiert werden. Für prG-Bodipy war die Nachweisgrenze um den
Faktor zwei schlechter (s. Abb. 50).
0,020
rel. Fluoreszenz
0,015
prC-Bodipy
prU-Bodipy
prG-Bodipy
prA-Bodipy
0,010
0,005
0,000
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
Migrationszeit [min]
Abb. 50: CE-LIF-Analyse von Ribo-Oligo U1 nach Verdau mit Nuklease P1 und Fluoreszenzmarkierung.
Trennbedingungen s. Tab. 24, Verdünnung 1:106 mit Wasser
Da die durchschnittliche Molmasse eines prN im Oligonukleotid U1 321.57 g/mol beträgt,
ergibt sich nach dem NP1 Verdau von 10µg eine Konzentration von 345.55µM
Ribonukleotide im Reaktionsansatz (90µl), vollständigen Verdau vorausgesetzt. Da das
Oligoribonukleotid zu je 23.86% aus rA, rC, rU, rG und zu 4.76% aus Ψ besteht, beträgt die
Konzentration der Ribonukleotide im Reaktionsansatz 82.45µM für die vier normalen prNs
und 16.45µM für pΨ. Damit liegt die Nachweisgrenze für prA, prC und prU bei 82.45pM und
entsprechend bei 165pM für prG. Eine Konzentration von 16.45pM reicht für die Detektion
von Ψ nicht aus, das Signal ist gerade noch vor dem prU-Bodipy zu erahnen (bei ca. 20min).
Ab einer Verdünnung von 1:200 000, was einer Konzentration von 82pM entspricht, ist das
Signal jedoch eindeutig mit einem S/N von 3:1 zu erkennen. Eine Nachweisgrenze von 80pM
97
Ergebnisse und Diskussion
entspricht bei der Injektion von 2.5x psi·s (≈ 5nl) in die Kapillare etwa einer Stoffmenge von
41amol (4.1x 10-17 mol). Hieraus folgt, dass die Nachweisgrenzen von prNs sehr gut mit den
unter Punkt 4.4.1.1 erhaltenen Werten für die pdNs und den von Schmitz et al. [16]
publizierten Daten für das 2’-Desoxyadenosin-3’-Phosphat übereinstimmen. Damit kann man
davon ausgehen, dass nicht nur die pdNs und dNps (wie in Kap. 4.4 gezeigt), sondern auch
die prNs mit gleicher Sensitivität mit der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode detektierbar sind.
4.5.4.2 Linearität des Messbereiches, Reproduzierbarkeit und Präzision der Analyse
Diese Untersuchungen wurden analog denen mit den pdN-Bodipy-Konjugaten durchgeführt.
Dafür wurden 10µg des Oligonukleotides U1 mit NP1 zu den prNs verdaut und mit BODIPYFL-EDA fluoreszenzmarkiert (s. Tab. 28). Der Reaktionsansatz wurde mit Wasser
entsprechend verdünnt (Verdünnungen 1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10 000) und die Lösung
fünfmal hintereinander mit CE-LIF analysiert. Die Ergebnisse wurden wiederum als Anteil
der einzelnen korrigierten Peakflächen der pdN-Bodipy-Konjugate an der Gesamtfläche
ausgedrückt (Tab. 28).
Tab. 28: Ergebnisse der Linearitätsversuche (Anteil der Signalfläche an der Gesamtfläche in %, n = 5)
Verdünnung
prA
prU
prC
pΨ
prG
1:500
1:1000
1:5000
1:10000
31.92 ± 0.21
33.10 ± 0.19
32.50 ± 0.27
32.70 ± 0.13
20.53 ± 0.06
20.71 ± 0.14
20.62 ± 0.26
20.87 ± 0.06
33.06 ± 0.11
31.79 ± 0.26
32.51 ± 0.24
31.88 ± 0.21
5.08 ± 0.07
4.83 ± 0.07
4.94 ± 0.12
4.84 ± 0.15
9.40 ± 0.27
9.56 ± 0.24
9.42 ± 0.28
9.68 ± 0.20
32.55
0.49
1.50
20.69
0.15
0.71
32.31
0.59
1.84
4.92
0.12
2.41
9.52
0.13
1.39
Mittelwert
Stabw.
rel. Stabw.
Die Peakflächen der prN-Bodipy-Konjugate waren proportional zur Verdünnung mit relativen
Standardabweichungen unter 3% und damit über einen Bereich von drei Größenordnungen
linear. Aus den insgesamt 20 Messungen konnten ebenfalls Aussagen über die Präzision der
Analyse abgeleitet werden. Für alle vier Verdünnungen lagen die Schwankungen der
korrigierten Peakflächenanteile bei den Wiederholungen der CE-LIF-Analyse unter 3%.
Aus allen 20 Messungen wurden wieder die Korrekturfaktoren und die normierte
Migrationszeit der prN-Bodipy Konjugate berechnet. Dazu wurden die Migrationszeiten von
prC-, prU-, prG- und pΨ-Bodipy durch die Migrationszeit von prA-Bodipy dividiert. Die
normierte Migrationszeit zeigte eine relative Standardabweichung von 0.45% für pΨ-Bodipy
98
Ergebnisse und Diskussion
bis 1.27% für prG-Bodipy und lag damit genauso deutlich unter 3% wie die von Schmitz et al.
für dNp-Bodipy beschriebenen normierten Migrationszeiten [16].
Tab. 29: Korrekturfaktoren für Ribo-Oligo U1 (n = 20)
rA
rG
rU
rC
Ψ
0.732 ± 0.011
2.504 ± 0.069
1.151 ± 0.011
0.772 ± 0.013
0.968 ± 0.029
1.5
2.7
0.9
1.7
3.0
norm.
Migrationszeit
1.00
1.20 ± 0.02
1.08 ± 0.01
1.16 ± 0.01
1.06 ± 0.01
rel. Stabw. (%)
0.0
1.27
0.57
0.70
0.45
Korrekturfaktor
(n=20)
rel. Stabw. (%)
Die so erhaltenen Korrekturfaktoren unterscheiden sich kaum von den oben beschriebenen (s.
Tab. 25), beruhen aber auf einer größeren Datenbasis und wurden daher für die Auswertung
der RNA-Analysen im folgenden Kapitel verwendet.
4.5.5 RNA-Analysen (verschiedene Organismen und tRNA)
Mit der nunmehr validierten Analysen-Methode wurden folgende vier RNAs untersucht:
•
Gesamt-RNA aus Drosophila melanogaster (AK Lyko, DKFZ)
•
Gesamt-RNA aus humaner Leber (BD Bioscience, Heidelberg)
•
Gesamt-RNA aus humaner Niere (BD Bioscience, Heidelberg)
•
tRNA aus Saccharomyces cerevisiae (Böhringer, Mannheim)
Gesamt-RNA enthält alle RNA-Typen (mRNA, tRNA, rRNA etc.), wobei die ribosomale
RNA mit > 70% den größten Anteil ausmacht [144]. Im Gegensatz dazu macht tRNA nur 1020% der gesamten RNA einer Zelle aus. Sie besteht aus den verschiedenen tRNAs für die 20
proteinbildenden Aminosäuren, aus denen die Proteine bei Eukaryonten zusammengesetzt
sind und besitzt wesentlich mehr modifizierte Nukleotide als die anderen RNA-Typen. Die
Phenylalanin-tRNA von Saccharomyces cerevisiae ist z. B. aus 76 Nukleotiden aufgebaut,
von denen elf modifiziert sind (14.5%), darunter je 2x Pseudouridin, 2x 5-Methylcytidin und
2x Dihydrouridin [145].
Mit den in Tabelle 24 angegebenen Bedingungen wurden 10µg der Gesamt-RNA aus
Drosophila zu prNs verdaut und fluoreszenzmarkiert. Der erhaltene Reaktionsansatz wurde
wie gewohnt 1:1000 mit Wasser verdünnt und kapillarelektrophoretisch analysiert. In dem
99
Ergebnisse und Diskussion
resultierenden Elektropherogramm (Abb. 51) wurden die vier normalen prN-BodipyKonjugate durch Aufstocken mit Standardverbindungen identifiziert.
12
prA-Bodipy
10
prU-Bodipy
rel. Fluoreszenz
8
prC-Bodipy
6
4
prG-Bodipy
pΨ-Bodipy
2
0
10
12
14
16
18
20
22
24
26
Migrationszeit [min]
Abb. 51: CE-LIF-Analyse von Gesamt-RNA aus Drosophila melanogaster nach Verdau mit Nuklease P1 und
Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FL-EDA. Trennbedingungen s. Tab. 24
Zusätzlich wurde ein fünfter Peak detektiert, dessen korrigierte Migrationszeit von 1.05 gut
mit pΨ-Bodipy (1.06) übereinstimmt. Die Analyse einer Mischung aus dem Reaktionsansatz
der Drosophila-RNA und des Oligoribonukleotids U1, das Ψ enthält, ergab an der fraglichen
Stelle im Elektropherogramm ein Signal, was ebenfalls für pΨ-Bodipy spricht. Daneben sind
vor allem im Bereich des prC-Bodipys noch einige kleinere Signale im Elektropherogramm
zu erkennen, die vermutlich von weiteren, bisher nicht identifizierten, modifizierten
Ribonukleosiden stammen. Die Auswertung der korrigierten Flächen der einzelnen Signale
unter Verwendung der in Tabelle 29 berechneten Korrekturfaktoren ergab die folgende RNAZusammensetzung (s. Tab 30).
100
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 30: Auswertung der CE-LIF-Analyse von Drosophila melanogaster Gesamt-RNA
Gesamt RNA
Drosophila
rA
rU
rC
rG
Ψ
Messung (%)
(n = 5)
44.32 ± 0.37
21.45 ± 0.29
22.05 ± 0.21
10.45 ± 0.24
1.45 ± 0.01
Korrekturfaktor
Berechnet (%)
0.732 ± 0.004
1.151 ± 0.011
0.772 ± 0.013
2.504 ±0.069
0.968 ± 0.029
31.89 ± 0.30
24.27 ± 0.35
16.73 ± 0.15
25.72 ± 0.56
1.38 ± 0.01
Folglich besteht Drosophila-RNA zum größten Teil aus rA (ca. 32%), rU und rG sind mit
ungefähr 25% etwa gleich häufig, rC ist mit 17% am wenigsten vertreten. Das Signal des ΨBodipy ist mit 1.4% der Gesamtfläche klar die häufigste modifizierte Base.
In einer weiteren Untersuchung wurde mit den selben Analysenbedingungen humane GesamtRNA aus Leber und Niere von zwei verschiedenen Personen untersucht (BD Bioscience,
Heidelberg). Die CE-LIF-Analyse enthielt ebenfalls die Signale der vier normalen
Ribonukleoside und des Ψ (Abb. 52).
6
prC-Bodipy
5
prU-Bodipy
rel. Fluorescence
4
prA-Bodipy
3
prG-Bodipy
2
pΨ-Bodipy
1
0
12
14
16
18
20
22
24
26
Migrationszeit [min]
Abb. 52: CE-LIF-Analyse von Gesamt-RNA aus humaner Leber. Trennbedingungen wie in Tab. 24 angegeben.
Verdünnung 1:1000 mit Wasser
101
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 31: Auswertung der CE-LIF Analyse von Gesamt-RNA aus humaner Leber
Gesamt RNA
Leber (human)
rA
rU
rC
rG
Ψ
Messung (%)
(n = 7)
28.51 ± 1.64
14.12 ± 0.76
39.53 ± 1.37
15.07 ± 0.85
1.62 ± 0.08
Korrekturfaktor
Berechnet (%)
0.732 ± 0.004
1.151 ± 0.011
0.772 ± 0.013
2.504 ±0.069
0.968 ± 0.029
19.52 ± 1.23
15.20 ± 0.89
28.54 ± 0.93
35.27 ± 1.19
1.46 ± 0.20
Gesamt-RNA aus humaner Niere wurde auf die gleiche Weise untersucht. Für die CE-LIFAnalyse wurde jedoch ein 18mM Natriumphosphat-Puffer mit einem pH von 8.5 eingesetzt,
was die Analysenzeit etwas verlängerte, die Trennung der einzelnen Peaks hingegen
verbesserte (Abb. 53).
4
prC-Bodipy
prA-Bodipy
rel. Fluoreszenz
3
prU-Bodipy
2
prG-Bodipy
pΨ-Bodipy
1
0
15
20
25
30
35
Migrationszeit [min]
Abb. 53: CE-LIF-Analyse von humaner Gesamt-RNA aus Niere. Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat
pH 8.5, 90mM SDS, 10% Methanol (v/v), 20kV; Verdünnung 1:1000 mit Wasser
Die Auswertung der Peakflächen ergab im Rahmen der Fehlergenauigkeit identische Werte
wie für die Gesamt-RNA aus Leber (s. Tab. 32).
102
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 32: Auswertung der CE-LIF-Analyse von Gesamt-RNA aus humaner Niere
Gesamt RNA
Niere (human)
rA
rU
rC
rG
Ψ
Messung (%)
(n = 7)
28.61 ± 1.73
14.11 ± 0.79
38.82 ± 1.28
15.25 ± 0.85
1.70 ± 0.08
Korrekturfaktor
Berechnet (%)
0.732 ± 0.004
1.151 ± 0.011
0.772 ± 0.013
2.504 ±0.069
0.968 ± 0.029
19.58 ± 1.28
15.18 ± 0.92
28.01 ± 1.01
35.68 ± 1.56
1.54 ± 0.08
Im Elektropherogramm ist deutlich die bessere Auflösung der einzelnen Signale zu sehen.
Alleine neben dem prC-Bodipy sind nun mindestens drei kleinere Signale zu beobachten.
Leider konnte das Signal bei etwa 26.5min, mit einem Anteil an der Gesamtfläche von ca.
1%, bisher noch nicht identifiziert werden.
Der Vergleich der Flächenanteile für die einzelnen Bodipy-Konjugate der prNs zwischen
Drosophila-RNA (Tab. 30) und den beiden humanen Gesamt-RNAs (Leber und Niere) (Tab.
31 u. 32) zeigte jedoch erhebliche Unterschiede. Im Falle der humanen Gesamt-RNAs ist das
Signal des prC-Bodipys deutlich am größten, gefolgt von prA-Bodipy. Die quantitative
Auswertung ergibt jedoch, dass prG das am häufigsten vorkommende Nukleotid ist, dann
folgen prC, prA und prU. Im Gegensatz dazu ist bei der Drosophila Gesamt-RNA das prABodipy sowohl das höchste Signal als auch das am häufigsten vorkommende Nukleotid,
gefolgt von prU und prG. Ψ ist in Drosophila Gesamt-RNA und in den humanen GesamtRNAs etwa in gleicher Menge enthalten. Daneben sind in den humanen Gesamt-RNAs noch
mehrere kleinere Signale im Bereich des prC-Bodipys (ab 19min) zu erkennen, die in den
Analysen der Drosophila-RNA nicht zu erkennen sind.
tRNA ist der mit Abstand am höchsten modifizierte RNA-Typ, weshalb ein natives Gemisch
aller 20 tRNAs von Saccharomyces cerevisiae mit der Fluoreszenz-Postlabeling-Technik
untersucht
wurde.
Dazu
wurden
10µg
tRNA
hydrolysiert,
markiert
und
kapillarelektrophoretisch analysiert. Bereits unter den normalen Trennbedingungen (18mM
Natriumphosphat, pH 9.0, 90mM SDS, 10% Methanol, 20kV) waren deutlich mehr
Nebenpeaks zu beobachten (nicht gezeigt).
Das Signalmuster entsprach in etwa dem humaner Gesamt-RNA, obwohl diese hauptsächlich
aus rRNA besteht. Das prC-Bodipy war das höchste Signal im Elektropherogramm, und auch
die bei den CE-LIF-Analysen der humanen Gesamt-RNAs beobachteten Nebenpeaks waren
103
Ergebnisse und Diskussion
deutlich stärker ausgeprägt. Zusätzlich konnten um die Signale von pΨ-Bodipy und prUBodipy weitere kleinere Signale nachgewiesen werden.
Um die Selektivität der kapillarelektrophoretischen Trennung zu verbessern, wurde wieder
Glukose als zusätzlicher Bestandteil des Trennpuffers verwendet. Dies führte zwar nicht zu
einer vollständigen Basislinientrennung aller Signale, es konnten aber vier neue Signale, die
vermutlich von modifizierten RNA-Basen stammen, detektiert werden (s. Abb. 54). Die drei
größten dieser Signale (P1-P3) wurden bei der Auswertung der CE-LIF-Analyse
berücksichtigt (s. Tab. 33), obwohl die unvollständige Trennung zu merklich höheren
Standardabweichungen führte.
3,5
3,0
prC-Bodipy
prA-Bodipy
rel. Fluoreszenz
2,5
prU-Bodipy
2,0
prG-Bodipy
1,5
1,0
pΨ-Bodipy
P2
P1
P3
0,5
0,0
30
35
40
45
Migrationszeit [min]
Abb. 54:
CE-LIF-Analyse
von
tRNA aus
Saccharomyces
cerevisiae.
Natriumphosphat, pH 9.0, 90mM SDS, 10% Methanol (v/v), 1M Glukose, 20kV
104
Trennbedingungen:
18mM
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 33: Auswertung der CE-LIF-Analyse von tRNA aus Saccharomyces cerevisiae (Angaben in % der
Gesamtfläche, n = 3)
tRNA Saccharomyces
Fläche (%)
(n = 3)
Stabw.
rel.
Stabw.
rA
rU
rC
rG
Ψ
P1
P2
P3
25.88
15.65
32.83
12.34
4.35
1.54
1.88
5.52
0.69
2.67
0.56
3.60
0.57
1.72
0.22
1.79
0.19
4.39
0.21
13.73
0.16
8.30
0.38
6.92
Wendet man die Korrekturfaktoren aus Tabelle 29 auf die fünf bereits untersuchten prNBodipy Konjugate an, so ergibt sich mit ca. 31% der höchste Anteil für prG, gefolgt von prC
mit etwa 25%, prA und prU sind mit 18 bzw. 19% etwa gleich häufig vertreten. Der für pΨBodipy ermittelte Wert (4.35%) ist deutlich höher als in den zuvor untersuchten GesamtRNAs (1.74%). Dies war auch so zu erwarten, da Gesamt-RNA zu 70% aus der deutlich
geringer modifizierten rRNA besteht. So lässt sich auch die hohe Anzahl an neuen Signalen
erklären. Die drei neuen Signale haben einen Anteil an der Gesamtfläche (ohne
Korrekturfaktoren) von ca. 1.5 bis 5.5%. Peak 3 (P3) ist sogar größer als das Ψ-Bodipy, es
könnte sich beispielsweise um das 5-Methylcytosin handeln. In der Regel sind etwa 10% aller
Basen in den verschiedenen tRNAs verändert, in der Phenylalanin tRNA der Hefe
(Saccharomyces) sind es sogar 14.5%. Neben 2x Ψ sind auch 5-Methylcytosin und
Dihydrouracil je zweimal vertreten [145]. Addiert man die Peakflächenanteile (ohne
Verwendung von Korrekturfaktoren) von Ψ und der neuen Peaks 1-3 der untersuchten tRNA
aus Saccharomyces, so ergibt sich ein Anteil der Gesamtfläche von 13.3%, was mit den
Literaturdaten gut übereinstimmt.
105
Ergebnisse und Diskussion
4.6 Weiterentwicklung der 3’-Variante der Fluoreszenz-PostlabelingMethode
Die 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode ist seit der ersten Beschreibung von
Schmitz et al. [16] nun schon mehrere Jahre in Gebrauch, und daher weiter entwickelt als die
von mir neu beschriebene 5’-Variante zur Fluoreszenzmarkierung von pdNs und prNs mit
BODIPY-FL-EDA. So wird die 3’-Methode bereits routinemäßig zur Bestimmung des
Cytosin-Methylierungsgrades in Tumorproben eingesetzt [146] und kommt mit DNA Mengen
von 100ng aus [114], was zur Untersuchung von Biopsien des Menschen ausreicht.
Außerdem wurden einige DNA-Addukt-Standards als Nukleosid-3’-Phosphate für
32
P-
Postlabeling-Analysen synthetisiert, die auch für die Markierung mit BODIPY-FL-EDA zur
Verfügung stehen. Aus diesem Grund lag es nahe, Untersuchungen zur Detektion von
großvolumigen („bulky“) DNA-Addukten mit der 3’-Variante der Fluoreszenz-PostlabelingMethode durchzuführen. Schmitz et al. [16] gelang es verschiedene DNA-Addukte der
Aristolochiasäure (AA) aus in vitro behandelter CT-DNA nach Verdau zu dNps,
Fluoreszenzmarkierung
mit
BODIPY-FL-EDA
und
anschließender
CE-LIF-Analyse
nachzuweisen. Mit der selben Methode waren auch DNA-Addukte des B[a]P nach
Umsetzung des ultimalen Metaboliten mit dGp detektierbar. Problematisch bei diesen
Analysen war, dass immer mehrere zusätzliche fluoreszierende Signale erhalten wurden, die
nicht vollständig spektroskopisch charakterisiert und somit nicht eindeutig den AA- bzw.
B[a]P-Addukten zugeordnet werden konnten.
4.6.1 Analyse von 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphat-Addukt-Standards
4.6.1.1 Analyse von Aminobiphenyl-Addukten
4-Aminobiphenyl (4-ABP, s. Abb. 55) ist eine humantoxikologisch relevante Substanz, die
vor allem im Tabakrauch und in Produkten der Farbstoff- und Gummiindustrie vorkommt.
Die IARC hat 4-ABP in die Kategorie 1, nachgewiesenermaßen krebserzeugend beim
Menschen, eingestuft (s. Theorie 2.3.1.2).
NH2
Abb. 55: Strukturformel des 4-Aminobiphenyls
106
Ergebnisse und Diskussion
Von 4-Aminobiphenyl sind mehrere Reaktionsprodukte mit DNA-Basen bekannt. Nach
metabolischer Aktivierung werden in vivo hauptsächlich Addukte an der C8-Position des
Adenins und Guanins gebildet, wobei das N-(Desoxyguanosin-8-yl)-4-aminobiphenyl (dGC8-4-ABP) das Hauptaddukt darstellt (1 in Abb. 56) [147]. Ein weiteres inzwischen
identifiziertes 2’-Desoxyguanosin-Addukt entsteht durch den Angriff des durch metabolische
Aktivierung
gebildeten
Nitrenium-Ions
an
der
N2-Position
[148].
Für
die
Markierungsversuche mit BODIPY-FL-EDA standen diese beiden von Haack et al. [149]
synthetisierten und vollständig charakterisierten Addukte (MS, 1H-NMR,
13
C-NMR,
31
P-
NMR) des dGps zur Verfügung (s. Abb. 56).
O
N
HO
N
NH
H
N
N
O
NH2
N
HO
O
H
H
O
H
H
(1)
OH
OH
N
H
N
H
N
O
H
O
P
N
NH
H
O
H
H
O
H
P
H
(2)
OH
OH
Abb. 56: Strukturformeln von N-(Desoxyguanosin-8-yl)-4-aminobiphenyl-3’-Phosphat (dGp-C8-4-ABP (1) und
N-(Desoxyguanosin-N2-yl)-4-aminobiphenyl-3’-Phosphat (dGp-N2-4-ABP) (2)
Von beiden Standardverbindungen, die nach der chromatographischen Aufreinigung als
Tetrabutylammonium-Salze vorlagen, wurden Stammlösungen (3.08nmol/µl) in Wasser
erstellt. Die Löslichkeit des N2-4-ABP-Adduktes in Wasser war deutlich besser als die des
C8-4-ABP-Adduktes. Untersuchungen der Stammlösungen mit der 32P-Postlabeling-Methode
nach Verdünnung mit CT-DNA zeigten die von Haack et al. beschriebenen Addukt-Flecken
in der gewünschten Stärke, womit die Identität der Addukte und die Konzentration der
Stammlösungen bestätigt werden konnte.
Aliquots von 30.8nmol (≈ 23.3µg) wurden dann entsprechend der etablierten Standardmethode (s. Tab. 10) mit BODIPY-FL-EDA derivatisiert und mit Kapillarelektrophorese und
Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion analysiert. Zum Vergleich wurden auch 30.8nmol
dGp fluoreszenzmarkiert und nach 1:1000 Verdünnung mit Wasser mit CE-LIF analysiert.
Dabei wurde ein Signal von ca. 5-6 relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) mit einer
Migrationszeit von ca. 24min erhalten, das dem dGp-Bodipy entsprach (ca. 50 RFU bei 1:100
107
Ergebnisse und Diskussion
Verdünnung mit Wasser). Die Höhe der entsprechenden Peaks der beiden Addukt-Standards
wurde in der gleichen Größenordnung erwartet, und zwar im Zeitfenster von ca. 15-20min, da
die bisher auf diese Weise analysierten, großvolumigen Addukte (B[a]P, Aristolochiasäure
[16]) alle vor dem Signal des dAp-Bodipy detektiert wurden.
Bereits während der Markierungsreaktion beider 4-ABP-Standardverbindungen traten jedoch
Probleme in Form tiefroter Ausfällungen auf. Der Ansatz wurde daher nach Beendigung der
Reaktion (25h) kurz zentrifugiert und 1:100 mit Wasser verdünnt. Die anschließende CE-LIFAnalyse des Reaktionsansatzes zeigte für beide 4-ABP-Addukte keine Signale im erwarteten
Bereich. Abbildung 57 zeigt ein typisches Elektropherogramm für die CE-LIF-Analyse eines
Reaktionsansatzes von dGp-C8-4-ABP.
2,5
rel. Fluoreszenz
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
10
20
30
40
Migrationszeit [min]
Abb. 57: CE-LIF-Analyse des Reaktionsansatzes von dGp-C8-4-ABP mit BODIPY-FL-EDA nach 1:100
Verdünnung mit Wasser. Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat, 10% Methanol (v/v), 90mM SDS, 20kV
Lediglich die Peaks im Bereich um 30min konnten den bekannten Abbauprodukten des
Bodipys zugeordnet werden. Natürlich bestand die Möglichkeit, dass die durch den
Aminobiphenyl-Rest lipophilen Addukte durch die Konjugation mit BODIPY-FL-EDA im
Wässrigen nicht mehr ausreichend löslich und ausgefallen waren. Daher wurden die
Präzipitate der Markierungsreaktionen in Methanol bzw. DMSO gelöst und danach mit CE108
Ergebnisse und Diskussion
LIF analysiert. Auch diese Untersuchungen förderten keine Signale zu Tage, die größer als 2
RFU waren. In weiteren Versuchen wurden 30.8nmol der Standards in 10µl DMSO gelöst
(anstelle von H2O) und dann mit BODIPY-FL-EDA und EDC in HEPES-Puffer umgesetzt
(Tab. 10). Auf diese Weise konnten die Ausfällungen während der Derivatisierung reduziert
werden, die anschließende CE-LIF-Analyse erbrachte jedoch keine neuen Signale. Da die
dGp-4-Aminobiphenyl-Addukte direkt nach den NMR-Untersuchungen verwendet wurden,
ist es unwahrscheinlich, dass sich die Verbindungen in der kurzen Zeit zersetzt haben. In der
Literatur sind keine Berichte über Instabilitäten zu finden, und auch wiederholte
32
P-
Postlabeling-Analysen bestätigten, dass die verwendeten Standards intakt waren.
Mögliche Erklärungen für das Fehlen der Fluoreszenzsignale der dGp-4-ABP AdduktStandards in der CE-LIF Analyse sind:
1. Die Standards liegen als Tetrabutylammonium-Salze vor.
2. Sterische Probleme verhindern die Derivatisierung mit BODIPY-FL-EDA.
3. Fluoreszenzquenching-Effekte des Bodipys durch den Aminobiphenyl-Rest.
Zu 1.: Aus Vorversuchen war bekannt, dass Tetrabutylammoniumchlorid (TBA) störende
Einflüsse auf die Derivatisierungsreaktion mit BODIPY-FL-EDA hat. Da die AdduktStandards durch die Aufreinigung (HPLC-Ionenpaar-Chromatographie) als TBA-Salze
vorliegen (lt. NMR etwa im Verhältnis 1:1), lag es nahe, dass hier eine Ursache für die
Derivatisierungsprobleme liegt. Daher wurden sowohl TBA alleine (30.8nmol in 10µl
Wasser), TBA gemischt mit dGp (je 30.8nmol in Wasser) und die Negativkontrolle, die nur
Wasser enthielt nach den Standardbedingungen (Tab. 10) fluoreszenzmarkiert, die Ansätze
1:100 mit Wasser verdünnt und analysiert. Nur die CE-LIF-Analyse des Reaktionsansatzes
der 1:1 Mischung von dGp und TBA ergab einen Unterschied zur Negativkontrolle (Wasser),
nämlich das Signal des dGp-Bodipy in der erwarteten Höhe von etwa 60RFU (nicht gezeigt).
In keinem der beiden Reaktionsansätze traten die bei den 4-ABP-Addukten beobachteten
Ausfällungen auf, so dass TBA als Einflussfaktor auf die Analyse ausgeschlossen wurde. Um
auszuschließen, dass sich noch andere Substanzen in den Stammlösungen der ABP-Addukt
Standards befinden, die die Markierungsreaktion mit BODIPY-FL-EDA behindern, wurden je
15.4nmol der beiden Standards mit je 15.4nmol dGp gemischt (gesamt 30.8nmol) und mit
BODIPY-FL-EDA derivatisiert. Der Reaktionsansatz wurde anschließend 1:100 mit Wasser
verdünnt und kapillarelektrophoretisch analysiert.
109
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 58 zeigt exemplarisch das Ergebnis der beiden Versuche. Neben dem Signal des
dGp-Bodipy bei ca. 24min mit 63RFU-Einheiten ist noch ein kleines Signal bei etwa 14.5min
zu erkennen, das aber nachweislich aus der Reaktion des dGps mit BODIPY-FL-EDA
stammt. Somit verhindern weder TBA noch andere Bestandteile der Aminobiphenyl-dGpAddukt Standard-Lösungen die Konjugation mit dem Fluoreszenzmarker.
Das Signal bei 26min stimmt mit dem Hauptsignal aus Abb. 57 überein und bleibt damit der
einzige Kandidat für ein mögliches dGp-C8-4-ABP-Bodipy Konjugat, auch wenn es 100mal
kleiner ist als erwartet.
70
60
dGp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
50
40
30
20
Verunreinigung
10
0
10
15
20
25
30
Migrationszeit [min]
Abb. 58: CE-LIF-Analyse des Reaktionsansatzes von 15.4nmol dGp-C8-4-ABP und 15.4nmol dGp mit
BODIPY-FL-EDA nach 1:100 Verdünnung mit Wasser. Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat, pH 9.0,
10% Methanol (v/v), 90mM SDS, 20kV
Zu 2.: Sterische Einflüsse des voluminösen 4-Aminobiphenyl-Restes am dGp auf die
Kopplungsreaktion mit BODIPY-FL-EDA sind nicht auszuschließen. Der Hypothese steht
aber entgegen, dass bereits voluminöse Addukte des B[a]P mit der 3’-Variante der
Fluoreszenz-Postlabeling-Methode nachgewiesen wurden, ebenso wie Addukte der
Aristolochiasäure [16]. Ferner haben Giese et al. bereits mit der von ihnen entwickelten
110
Ergebnisse und Diskussion
Fluoreszenz-Postlabeling-Methode C8-[N-Acetyl-N-(2-fluorenyl)]amino-2’-Desoxyguanosin5’-Phosphat (AAF-pdG) mit Bodipy-IMI markiert und mit CE-LIF nachgewiesen [14].
Zu 3.: Ein weiteres Problem für die Detektion der 4-Aminobiphenyl-dGp-Addukt-BodipyKonjugate
kann
die
bekannte
Empfindlichkeit
der
Bodipy-Farbstoffe
gegenüber
Fluoreszenzlöschungseffekten (Quenching) sein. Wie bereits gezeigt, haben vor allem die
Bodipy-markierten Guanine (prG-, pdG- und dGp-Bodipy) deutlich schlechtere FluoreszenzQuantenausbeuten als die anderen normalen Nukleotide. Für die dNp-Bodipy-Konjugate
wurden
die
Quantenausbeuten
bereits
an
massenspektrometrisch
charakterisierten
Standardverbindungen bestimmt (s. Tab. 34).
Tab. 34: Spektroskopische Eigenschaften der BODIPY-FL-EDA-markierten 2’-Desoxynukleosid-3’Phosphate
Verbindung
λex [nm]
λem [nm]
OD(λex)
∫500-720(FS)
rel. QA
normiert
dAp-Bodipy
495
516
0.0506
14338
283359.68
100%
dCp-Bodipy
495
516
0.0456
12632
277626.37
98%
dGp-Bodipy
495
516
0.0390
6106
156564.10
55%
Tp-Bodipy
495
516
0.0503
13783
274015.90
97%
λex = Extinktionsmaximum; λem = Emissionsmaximum; OD(λex) = optische Dichte der 1µM-Lösungen am
Extinktionsmaximum; ∫500-720(FS) = Integral des Fluoreszenzsignals von 500-720nm; rel. QA = relative
Quantenausbeute; modifiziert nach [112]
Neben den Nukleobasen, und hier insbesondere Guanin und seine Analoga (7-Deazaguanin,
7-Deazaxanthosin), ist auch bekannt, dass die Aminosäure Tryptophan die Fluoreszenz von
BODIPY zu löschen vermag [150]. Verantwortlich hierfür ist die Ausbildung eines nur
schwach
fluoreszierenden
Grundzustand-Komplexes
(„koplanares
stacking“)
des
Fluoreszenzfarbstoffes mit Tryptophan [150]. Die Ausbildung solcher Komplexe bestehend
aus BODIPY-Farbstoffen und polyzyklischen Kohlenwasserstoffen ist bekannt und auch für
andere, ähnlich aufgebaute Moleküle wie z. B. 4-ABP zu erwarten [Sauer, pers. Mitteilung].
Solch eine Wechselwirkung ist vor allem dann denkbar, wenn BODIPY-Farbstoff und
Löscher in einem Molekül vereint sind, d. h. sich räumlich sehr nahe stehen, so dass diese
intramolekulare Interaktion während des kurzen angeregten Zustandes mit hoher
Wahrscheinlichkeit eintritt. Außerdem ist zu bedenken, dass die Umgebung der Moleküle
während der CE-Trennung eher wässrig ist, demnach eine Aggregation der lipophilen
111
Ergebnisse und Diskussion
Molekülteile begünstigt wird. Voraussetzung hierfür ist allerdings, dass es die Beweglichkeit
der chemischen Bindungen der dGp-4-ABP-Bodipy Konjugate erlaubt, dass sich der
Fluorophor (BODIPY) und das Aminobiphenyl entsprechend zusammenlagern.
Zur Ermittlung der Fluoreszenzquantenausbeuten der Bodipy-Konjugate von DNA-Addukten
wie dGp-4-ABP müssen diese in ausreichender Menge hergestellt werden, was schon aus
finanziellen Gründen problematisch ist. Allerdings kann die Beeinflussung der Fluoreszenz
von BODIPY-FL-EDA innerhalb der DNA-Addukt-Konjugate in erster Näherung auch
dadurch abgeschätzt werden, dass man anstelle der intramolekularen die intermolekulare
Beeinflussung untersucht.
4.6.1.2 Fluoreszenzspektroskopie von BODIPY-FL-EDA
Um den Einfluss verschiedener Substanzen auf die Fluoreszenzeigenschaften von freiem
BODIPY-FL-EDA zu ermitteln, wurde der Fluoreszenzmarker in einer, gut mit einem
Fluoreszenzspektrometer messbaren, Konzentration (1µM) in Wasser vorgelegt, und dann die
zu untersuchende Substanz in steigender Konzentration zugegeben. Um zu gewährleisten,
dass mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit ein Zusammenstoß zwischen fluoreszierendem
Molekül im angeregten Zustand und Substanzmolekül erfolgt, wird mit einem 1000fachen
Überschuss an Substanz (also 1mM) begonnen. Mit diesen einfachen Experimenten sind
Trend-Aussagen über eventuelle Löscheffekte möglich. Da dabei Stammlösungen der
vermuteten Quencher von 100mM nötig sind, die meisten interessanten Karzinogene (DNAAddukt-Bildner) aber lipophile aromatische Kohlenwasserstoffe sind, die in Wasser nahezu
unlöslich sind, sind solche Konzentrationen unmöglich. Messungen in organischen
Lösungsmitteln sind ungeeignet, da hier die Zusammenlagerung von BODIPY-FL-EDA mit
dem Kohlenwasserstoff durch das lipophile Milieu verhindert wird, und so den
Gegebenheiten der wässrigen CE-LIF-Trennung nicht entspricht.
Um die Übertragbarkeit der Ergebnisse des intermolekularen Quenchings auf die
intramolekular bei der CE-LIF-Analyse beobachteten Effekte zu prüfen, wurden Vorversuche
mit zwei 2’-Desoxynukleosid-5’-Phosphaten (pdG und pdC) durchgeführt. Es sollte dabei ein
Unterschied in der Beeinflussung der Fluoreszenz des BODIPYs zwischen dem bekannten
Quencher pdG und dem nicht quenchenden pdC zu beobachten sein. Die Versuche wurden
mit einem Cary Eclipse Fluoreszenzspektrometer (Varian, Darmstadt) am Physikalisch
Chemischen Institut der Universität Heidelberg durchgeführt. Es wurde 1ml der 1µM
112
Ergebnisse und Diskussion
BODIPY-FL-Lösung in Wasser vorgelegt und zunehmende Mengen einer 100mM
Stammlösung des jeweiligen pdNs zugegeben, so dass ein Konzentrationsbereich von 1mM
pdN bis 37.5mM pdN abgedeckt wurde. Die Anregungswellenlänge betrug 465nm, das
Fluoreszenzspektrum wurde von 470 bis 650nm aufgezeichnet und das Emissionsmaximum
in Fluoreszenzeinheiten als Maß der Fluoreszenz gemessen. Die von der normalerweise bei
den CE-LIF Analysen abweichende Anregungswellenglänge von 465nm (sonst 488nm)
wurde gewählt, da bei der verwendeten BODIPY-FL-EDA Konzentration genau bei dieser
Wellenlänge die Detektorsensitivität des Fluoreszenzspektrometers voll ausgeschöpft wurde.
Die Ergebnisse wurden dann noch auf Grund der Volumenzunahme durch die Zugabe der
untersuchten (quenchenden) Substanz korrigiert. Im einfachsten Fall wird die gemessene
Fluoreszenz gegen die Konzentration des Quenchers aufgetragen und im Falle einer
Nichtbeeinflussung eine Gerade parallel zur x-Achse erhalten. Dies ist beim pdC auch
tatsächlich so zu beobachten (Abb. 59, links). Im Gegensatz dazu kann mit steigender
Konzentration an pdG eine Abnahme der Fluoreszenz von BODIPY-FL-EDA beobachtet
werden (Abb. 59, rechts).
Fluoreszenzintensität von BODIPY-FL-EDA in
Gegenwart von pdG
Fluoreszenzintensität von BODIPY-FL-EDA in
Gegenwart von pdC
Korrigierte
Fluoresz enzeinheiten
Korrigierte
Fluoreszenzeinheiten
1000
800
600
400
200
0
0
10
20
30
40
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0,00
10,00
Konzentration pdC [mM]
20,00
30,00
40,00
Konzentra tion pdG [mM]
Abb. 59: Ergebnisse der Fluoreszenuntersuchungen von BODIPY-FL-EDA in Gegenwart von pdC und pdG.
(Der Knick am Anfang der Kurve für pdC ist gerätebedingt, häufig ergeben sich nach der ersten Zugabe der
Testsubstanz noch Verschiebungen der Messküvette, die zu Ausreißern führen.)
Eine andere, in der Literatur häufiger gewählte Auswertungsart, ist der sog. Stern-Volmer
Plot. Dabei wird die Ausgangsintensität der Lösung ohne Quencher (I0) durch die gemessene
Intensität bei Anwesenheit einer bestimmten Konzentration des Quenchers (I) geteilt und
gegen die Konzentration des Quenchers (mM) aufgetragen. Je größer die Steigung der
erhaltenen Kurve, desto stärker ist der löschende Einfluss der Substanz. Verwendet man diese
Art der Auswertung (s. Abb. 60), ergeben sich prinzipiell keine neuen Erkenntnisse, es wird
lediglich deutlich, dass die Abhängigkeit des pdG-Quenchings nahezu linear ist (r2 = 0.999).
113
Ergebnisse und Diskussion
Stern-Volmer Diagram pdC
Stern-Volmer Diagram pdG
3,00
4,00
2,50
3,50
3,00
I(0)/I
I(0)/I
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
0
5
10
15
20
25
30
35
40
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
0,00
Konzentration pdC [mM]
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
Konzentration pdG [mM ]
Abb. 60.: Stern-Volmer Diagramm der Fluoreszenzquenching Untersuchungen von BODIPY-FL-EDA in
Gegenwart von pdC und pdG.
Da analoge Untersuchungen mit 4-ABP und B[a]P, zwei Verbindungen deren DNA-Addukte
bereits mit der 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode untersucht wurden, wegen
Unlöslichkeit in diesem wässrigen System nicht möglich waren, wurden die QuenchingEffekte von Aristolochiasäure und Hexenal bestimmt. Durch die Carbonsäuregruppe ist
Aristolochiasäure als Natrium-Salz in Wasser besser löslich (bis ca. 50mM) als die
polycyclischen Kohlenwasserstoffe, ist ihnen aber strukturell (Phenanthren) ähnlich (Abb. 61,
(3)). Trans-2-Hexenal, ein D-E-ungesättigter Aldehyd (s. Einleitung), bildet mit Guanin
stereoisomere exocyclische 1-N2-Propano-Addukte folgender Struktur (Abb. 61, (6) und (7)).
Auch die DNA-Addukte dieser beiden Substanzen wurden bereits mit BODIPY-FL-EDA
fluoreszenzmarkiert und mit CE-LIF nachgewiesen [16].
114
Ergebnisse und Diskussion
O
O
COO-
O
NO2
O
H3CO
(3)
N
H
HN
N
O
N
Na+
N
OCH3
HO
O
H
H
O
N
O
(5)
O
P
(4)
H
H
H
OH
OH
H
OH
O
N
N
N
N
N
H
HO
HO
H
O
H
O
H
P
H
(6)
O-
O-
N
N
H
O
O
H
N
N
N
OH
O
H
O
H
H
O
H
P
H
(7)
O-
O-
Abb. 61: Strukturformeln von Aristolochiasäure I Na-Salz (3) und dem Haupt-DNA-Addukt mit 2’Desoxyadenosin-3’-Phosphat (dAp-Aristolactam I (4)); Strukturformeln von Trans-2-Hexenal (5) und dessen
Guanin-Addukten 1-N2-Propano-2’-Desoxyguanosin-3’-Phosphat (Hex-dGp-1 und 2) (6 und 7)
Die chemische Struktur von Trans-2-Hexenal ließ nicht erwarten, dass durch die Zugabe zu
BODIPY-FL-EDA ein Einfluß auf die Fluoreszenz zu beobachten sein würde. Diese
Vorhersage wurde auch bestätigt (Abb. 62), für Aristolochiasäure hingegen wurden sehr
überraschende Ergebnisse erhalten.
115
Ergebnisse und Diskussion
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0,00
Fluoreszenzintensität von BODIPY-FL EDA in
Gegenwart von Aristolochiasäure
korrigierte
Fluoreszenzeinheiten
korrigierte
Fluoreszenzeinheiten
Fluoreszenzintensität von BODIPY-FL-EDA in
Gegenwart von Hexenal
10,00
20,00
30,00
800
700
600
500
400
300
200
100
0
40,00
0
1
Konzentration Hexenal [mM]
2
3
4
5
6
7
Konzentration Aristolochiasäure [mM]
Abb. 62: Ergebnisse der Fluoreszenzuntersuchungen von Trans-2-Hexenal und Aristolochiasäure.
(Der Knick am Anfang der Kurve für Hexenal ist gerätebedingt, häufig ergeben sich nach der ersten Zugabe der
Testsubstanz noch Verschiebungen der Messküvette, die zu Ausreißern führen.)
Bereits ab einer Konzentration von 3mM Aristolochiasäure war praktisch kein
Fluoreszenzmaximum mehr zu erkennen und ab etwa 6mM war die Fluoreszenz des
BODIPY-FL-EDA vollständig gelöscht (s. Abb. 62). Damit ist Aristolochiasäure eine der am
stärksten quenchenden Substanzen in Bezug auf BODIPY-Farbstoffe, die je entdeckt wurden.
Die Ergebnisse der Fluoreszenzuntersuchungen stimmen gut mit den bei den CE-LIFAnalysen gemachten Beobachtungen überein. Besonders die beiden Nukleotide pdC und pdG
zeigen das erwartete Fluoreszenzverhalten. Während pdC keinen löschenden Einfluss auf
BODIPY-FL-EDA ausübt, ist dieser Effekt bei pdG deutlich ausgeprägt. Ebenso bestätigte
sich in weiteren Versuchen die Erwartung, dass die DNA-Addukte des Trans-2-Hexenals mit
dGp mit der CE-LIF Methode nachzuweisen sind (s. 4.6.2). Im Gegensatz dazu ist zu
erwarten, dass es beim Nachweis der DNA-Addukte der Aristolochiasäure mit beiden
Fluoreszenz-Postlabeling-Methoden zu Problemen durch Fluoreszenz-Quenching-Effekte
kommt.
4.6.2 Untersuchung des 1,N2-Propano-2’-Desoxyguanosin Adduktes von Trans-2Hexenal mit der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
Dieses DNA-Addukt wird durch eine Michael-Addition von Trans-2-Hexenal mit Guanin
gebildet und war auch in verschiedenen Organen der Ratte nach oraler Verabreichung von
Trans-2-Hexenal nachweisbar [151]. Für meine Untersuchungen mit der FluoreszenzPostlabeling-Methode standen einige Mikrogramm des 1,N2-Propano-2’-Desoxyguanosin-3’Phosphat-Adduktes
116
(Hex-dGp-2
siehe
Abb.
61)
als
vollständig
spektroskopisch
Ergebnisse und Diskussion
charakterisierter Standard [152] zur Verfügung (Prof. Eder, Würzburg). 10µg des Hex-dGp-2
Standards wurden wie in Tabelle 10 beschrieben mit BODIPY-FL-EDA fluoreszenzmarkiert,
1:1000
mit
Wasser
verdünnt
und
mit
CE-LIF
analysiert.
Das
resultierende
Elektropherogramm (Abb. 63) zeigte ein Hauptsignal bei 26min, welches dem Hex-dGp-2
zugeordnet wurde und ein deutlich kleineres Signal bei 25min, welches wahrscheinlich das
bei der HPLC-Reinigung nicht vollständig abgetrennte Diastereomer Hex-dGp-1 ist [152].
14
12
Hex-dGp-Bodipy2
rel. Fluoreszenz
10
8
6
4
Hex-dGp-Bodipy1?
2
0
18
20
22
24
26
28
30
32
34
Migrationszeit [min]
Abb. 63: CE-LIF-Analyse von fluoreszenzmarkiertem Hex-dGp-2. Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat,
pH 9.0, 10% Methanol (v/v), 90mM SDS, 20kV
Da die erhaltene Signalhöhe von Hex-dGp-2-Bodipy (12RFU) sogar höher als die für die
gleiche Menge dGp (7-8RFU) ist, kann man davon ausgehen, dass sich das Hexenal-dGp
Addukt in Bezug auf die Effizienz der Fluoreszenzmarkierung und die FluoreszenzQuantenausbeute des Bodipy-Konjugates ähnlich verhält wie das unmodifizierte dGp, und
eventuell sogar weniger quencht. Nebenreaktionen und Ausfällungen während der
Derivatisierung mit BODIPY-FL-EDA wurden ebenfalls nicht beobachtet, auch die 1:1
Mischung des Standards mit dGp und anschließende Fluoreszenzmarkierung mit BODIPYFL-EDA führte zu den erwarteten Intensitäten der beiden Hauptsignale. Abschließend wurde
eine mit MN/SPD zu dNps verdaute und mit BODIPY-FL-EDA markierte CT-DNA mit dem
117
Ergebnisse und Diskussion
markierten
Hex-dGp-2
Standard
aufgestockt,
und
eine
CE-Trennung
unter
Standardbedingungen (18mM Natriumphosphat, pH 9.0, 10% Methanol (v/v), 90mM SDS,
20kV) durchgeführt. Das Addukt-Konjugat hatte die längste Migrationszeit, da es deutlich
lipophiler ist als die anderen dNp-Bodipy-Konjugate und daher stärker mit den Mizellen
interagieren kann (Abb. 64). Es läßt sich somit gut abtrennen und quantifizieren.
20
Hex-dGp-Bodipy2
rel. Fluoreszenz
15
dAp-Bodipy
Tp-Bodipy
10
dCp-Bodipy
dGp-Bodipy
5
5mdCp-Bodipy
Hex-dGp-Bodipy1?
0
16
18
20
22
24
26
28
30
32
Migrationszeit [min]
Abb. 64: CE-LIF-Analyse einer Mischung von fluoreszenzmarkierter CT-DNA nach Verdau mit MN/SPD zu 2’Desoxynukleosid-3’-Phosphaten und Hex-dGp-2-Bodipy (1:1). Trennbedingungen s. Text
Die Ergebnisse der CE-LIF-Analysen bestätigen in diesem Fall die Ergebnisse der
Fluoreszenzlöschungs-Versuche durch Trans-2-Hexenal. Die 1,N2-Propano-Modifikation am
Guanin hat keinen zusätzlichen Einfluss auf die Fluoreszenz des Bodipy-Konjugates. Damit
kann das DNA-Addukt Hex-dGp-2 mit der gleichen Empfindlichkeit wie dGp detektiert
werden. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass es möglich ist, beide HexenalAddukte mit der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode in DNA mit der selben Nachweisgrenze
wie für dGp (200pM, sechs Addukte in 100 000 normalen Nukleotiden) zu bestimmen. Da
Hexenal in vielen Früchten in hoher Konzentration auftritt (Bananen 76ppm) und in Europa
und den USA als Aromastoff zugelassen ist, eignen sich die Hexenal-dG-Addukte
möglicherweise als ernährungsspezifischer Biomarker. Da Trans-2-Hexenal aber auch in
118
Ergebnisse und Diskussion
geringen Konzentrationen durch Autooxidationsprozesse beim Fettsäureabbau gebildet wird,
sollte jeder Mensch einen gewissen Hintergrundlevel an diesem Addukt aufweisen [153].
4.6.3 Bestimmung von 8-Oxo-2’-Desoxyguanosin-3’-Phosphat (8-oxo-dGp) in
DNA
Nachdem für großvolumige DNA-Addukte einige Probleme hinsichtlich der Detektion durch
mögliche Fluoreszenzquenchingeffekte auftraten, sollte geklärt werden, ob solche Effekte
auch mit einer kleineren Basenmodifikation wie 8-oxo-dG auftreten. Diese DNAModifikation wurde bereits von Schmitz et al. [16] mit der 3’-Variante der FluoreszenzPostlabeling-Methode untersucht. Die von mir mit der 5’-Variante der FluoreszenzPostlabeling-Methode durchgeführten Untersuchungen sind in Kapitel 4.4.3.3 beschrieben.
Das von Schmitz et al. veröffentlichte Elektropherogramm (Abbildung 65) der Analyse des
20-mer Oligodesoxynukleotides 995298, das zwei 8-oxo-dGs trägt, enthielt neben den
normalen dNps zwei zusätzliche Signale, von denen das bei 18min als 8-oxo-dGp-Bodipy
identifiziert wurde. Für die Identität des anderen Signales (15min) wurde ein BODIPY-FLEDA markiertes 2’-Desoxyribose-3’-Phosphat (AP-Stelle), welches durch Depurinierung des
8-oxo-dGp-Bodipys entsteht, vorgeschlagen. Allerdings migriert der als 8-oxo-dGp
identifizierte Peak überraschenderweise langsamer als das unmodifizierte dGp-Bodipy. Durch
die Keto-Gruppe an der C8-Position ist das 8-oxo-dGp-Bodipy hydrophiler als das dGpBodipy und sollte daher schneller wandern, so wie es für das 8-oxo-dG-5’-Phosphat (8-oxopdG) von mir beobachtet wurde (s. S. 77).
119
Ergebnisse und Diskussion
Abb. 65: aus [16] Verdau des Oligodesoxynukleotides 995298 mit MN/SPD und anschließender
Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FL-EDA, Trennung mit BioFocus3000, 17mM Natriumphosphat, pH 9.0,
75mM SDS, 15% Methanol (v/v), 25kV, Injektion 20x psi·s, Verdünnung 1:10 000 mit Wasser
8-oxo-dGp wurde nach der selben Methode wie das 8-oxo-pdG [138] synthetisiert, eindeutig
spektroskopisch charakterisiert (MS,
1
H-NMR) und stand damit für weitergehende
Untersuchungen als Standard für die Fluoreszenz-Postlabeling-Methode zur Verfügung. 10µg
8-Oxo-2’-Desoxyguanosin-3’-Phosphat Standard wurden unter Verwendung der in Tab. 10
angegebenen Bedingungen mit BODIPY-FL-EDA derivatisiert, 1:100 mit Wasser verdünnt
und mit CE-LIF analysiert.
Das resultierende Elektropherogramm (Abb. 66) zeigt ein Hauptsignal bei etwa 22min und
ein Nebensignal bei 23.8 min. Durch Aufstocken mit dem dGp-Bodipy Standard, wurde das
kleine Signal als dGp-Bodipy identifiziert und der Peak bei 22min dem 8-oxo-dGp
zugeordnet. Um abzuklären, wie stabil der Standard in wässriger Lösung ist, wurde er
mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert. Die anschließende NMR-Analyse brachte
kaum Abbauprodukte zum Vorschein.
120
Ergebnisse und Diskussion
35
30
8-oxo-dGp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
25
20
15
10
dGp-Bodipy
5
0
18
20
22
24
26
28
Migrationszeit [min]
Abb. 66: CE-LIF-Analyse des 8-Oxo-2’-Desoxyguanosin-3’-Phosphat Standards nach Fluoreszenzmarkierung
mit BODIYP-FL-EDA. Trennbedingungen s. Tab. 10
In einem zweiten Schritt wurden je 15.4nmol dGp und 8-oxo-dGp gemischt, gemeinsam mit
BODIPY-FL-EDA fluoreszenzmarkiert (Bedingungen s. Tab. 10) und mit CE-LIF untersucht.
Das Elektropherogramm (Abb. 67) bestätigt die Zuordnungen aus Abb. 66. Das kleine Signal
bei 15min stammt von einer Verunreinigung des verwendeten dGp. Wie auch schon bei den
5’-Phosphaten beobachtet, ist das Signal des 8-oxo-dGp-Bodipys trotz äquimolarer Mengen
kleiner als das des dGp-Bodipys. Das Verhältnis der korrigierten Peakflächen zueinander
beträgt ca. 30:70 (8-oxo-dGp:dGp, Faktor 2.3). Damit ist der Unterschied zwischen den
beiden Peakflächen etwas größer als für die entsprechenden 5’-Phosphate 8-oxo-pdG und
pdG, so dass die Vermutung nahe liegt, dass 8-oxo-dGp noch schlechter fluoreszenzmarkiert
wird als 8-oxo-pdG bzw. eine schlechtere Fluoreszenzquantenausbeute besitzt als 8-oxo-pdGBodipy.
121
Ergebnisse und Diskussion
30
dGp-Bodipy
25
rel. Fluoreszenz
20
8-oxo-dGp-Bodipy
15
10
5
0
10
15
20
25
30
Migrationszeit [min]
Abb. 67: CE-LIF-Analyse einer gemeinsamen Derivatisierung von 8-oxo-dGp und dGp nach 1:100Verdünnung
mit Wasser, Trennbedingungen s. Tab 10
Um den Einfluß von 8-oxo-dGp-Bodipy auf das Signalmuster der normalen dNp-Bodipy
Konjugaten in der CE-LIF Analyse zu bestimmen, wurde Lachssperma-DNA (Salmon Testes
DNA, ST-DNA) mit MN/SPD unter den Standardbedingungen aus Tabelle 10 zu dNps
verdaut und fluoreszenzmarkiert. Der Derivatisierungsansatz wurde mit dem Ansatz des 8oxo-dGps im Verhältnis 10:1 gemischt, 1:100 mit Wasser verdünnt und analysiert
(Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat-Puffer, pH 9.0, 10% Methanol (v/v), 90mM
SDS, 20kV). Wie das Elektropherogramm (Abb. 68) zeigt, wurde das Signal vor dem dApBodipy auf Grund seiner normierten Migrationszeit (0.964) und Signalintensität als 8-oxodGp-Bodipy identifiziert. Im Unterschied zur kapillarelektrophoretischen Trennung nach
Schmitz et al. (Abb. 65) war zwischen Tp-Bodipy und dCp-Bodipy kein Signal zu detektieren.
122
Ergebnisse und Diskussion
60
dAp-Bodipy
50
rel. Fluoreszenz
40
Tp-Bodipy
dCp-Bodipy
30
dGp-Bodipy
20
8-oxo-dGp-Bodipy
5mdCp-Bodipy
10
0
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
Migrationszeit [min]
Abb. 68: CE-LIF-Analyse einer 10:1 Mischung von MN/SPD verdauter und fluoreszenzmarkierter ST-DNA mit
8-oxo-dGp-Bodipy. Trennbedingungen s. Text.
Nachdem diese Analysenprobe aber 24h im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert wurde,
enthielt die erneute Analyse neben einer deutlichen Zunahme der Bodipy-Abbauprodukte bei
26-27min auch ein neues Signal zwischen Tp-Bodipy und dCp-Bodipy (Abb. 69).
Möglicherweise ist dies identisch mit dem fälschlicherweise von Schmitz et al. [16] dem 8oxo-dGp-Bodipy zugeordneten Signal, welches erst durch längeres Lagern der Probe bei
Raumtemperatur, z. B. im Probenraum der CE, entsteht.
123
Ergebnisse und Diskussion
10
dAp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
8
dCp-Bodipy
Tp-Bodipy
5mdCp-Bodipy
6
dGp-Bodipy
4
Abbauprodukte
des Bodipys
!!
8-oxo-dGp-Bodipy
2
0
16
18
20
22
24
26
28
30
Migrationszeit [min]
Abb. 69: CE-LIF-Analyse der Probe aus Abb. 68 nach Lagerung für 24h bei Raumtemperatur, identische
Trennbedingungen
Um den Einfluss der Hydrolyse auf die Analysierbarkeit des 8-oxo-dGps mit der 3’-Variante
des Fluoreszenz-Postlabeling-Assays zu untersuchen, wurden die drei 2’-DesoxyOligonukleotide mit 8-oxo-dG Modifikation (G*) eingesetzt, die schon mit der 5’-Variante
analysiert wurden. Je 10µg der folgenden 2’-Desoxy-Oligonukleotide wurden mit MN/SPD
zu dNps verdaut, fluoreszenzmarkiert und nach 1:1000 Verdünnung mit CE-LIF analysiert
(Bedingungen s. Tab. 10).
IBA 5:
5’ - GAG TCT TCC AG*T GTG ACA CAT - 3’
995297:
5’ - AGA-GCG-AG*A-TTC-CAA-TCA - 3’
995298:
5’ - GAG-TCT-TCC-AGT-G*TG*-ATG-AT - 3’
In allen Oligonukleotid-Analysen wurde neben den Bodipy-Konjugaten der normalen dNps
ein weiteres Signal detektiert, das mit der normierten Migrationszeit des 8-oxo-dGp-Bodipy
Standards (0.968) eluierte. Das Elektropherogramm in Abb. 70 zeigt beispielhaft die CE-LIFAnalyse des Oligos Nr. 995298.
124
Ergebnisse und Diskussion
12
dAp-Bodipy
10
Tp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
8
6
dCp-Bodipy
dGp-Bodipy
4
8-oxo-dGp-Bodipy
2
0
20
22
24
26
28
30
32
34
Migrationszeit [min]
Abb. 70: CE-LIF-Analyse von Oligo 995298 nach MN/SPD Verdau und Fluoreszenzmarkierung.
Trennbedingungen s. Tab. 10
Die Fläche des 8-oxo-dGp-Bodipy Signals war proportional zum 8-oxo-dG-Gehalt in den
Oligonukleotiden. Allerdings war das 8-oxo-dGp-Bodipy-Signal für Oligo 995298 mit ca.
14000 ± 1500 Flächeneinheiten etwa dreimal so groß wie für IBA 5 (4600 ± 700) und Oligo
995297 (4700 ± 900) und nicht, wie eigentlich zu erwarten, doppelt so groß. Die quantitative
Auswertung der Oligonukleotid-Analysen erbrachte deutliche Unterschiede zwischen den
Oligonukleotiden mit nur einer und mit zwei 8-oxo-dGp Modifikationen. Besonders für die
Oligonukleotide IBA 5 und 995297 erhält man hohe Korrekturfaktoren für 8-oxo-dGp von
10.5 und 13.2, während mit Oligo 995298 ein Korrekturfaktor von 6.7 bestimmt wurde, was
in etwa dem Korrekturfaktor des 8-oxo-pdG entspricht.
125
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 35: Korrekturfaktoren ermittelt aus den drei 8-oxo-dG enthaltenden Oligonukleotiden (jeweils n = 3)
dAp-Bodipy
Tp-Bodipy
dCp-Bodipy
8-oxo-dGp-
dGp-Bodipy
Bodipy
995297
0.696 ± 0.002
1.067 ± 0.009
1.053 ± 0.010
13.221 ± 0.203
1.761 ± 0.013
0.707 ± 0.007
0.922 ± 0.004
0.960 ± 0.003
10.545 ± 0.410
1.814 ± 0.020
0.592 ± 0.02
0.954 ± 0.012
0.877 ± 0.015
6.736 ± 0.773
1.801 ± 0.088
1 x 8-oxo-dG
IBA 5 (72875)
1 x 8-oxo-dG
995298
2 x 8-oxo-dG
Ebenfalls auffällig ist der niedrige Korrekturfaktor für dGp in allen untersuchten
Oligonukleotiden von ca. 1.8, der sich deutlich von dem mit λ-DNA bestimmten
Korrekturfaktor von 2.09 unterscheidet. Auch die anderen Korrekturfaktoren stimmen, wie
schon bei den Nukleosid-5’-Phosphaten, nicht genau mit den für λ-DNA ermittelten überein,
die Abweichungen sind jedoch deutlich geringer. Vergleicht man die Signalfläche für 8-oxodGp-Bodipy in den Oligonukleotiden (ca. 4700RFU) mit der für dGp-Bodipy (ca.
29000RFU), so ist die Fläche für dGp-Bodipy etwa sechsmal so groß. Für die reinen
Standards erhielt man nach Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FL-EDA ein um den Faktor
2.3 höheres dGp-Bodipy Signal. Diese großen Unterschiede lassen darauf schließen, dass bei
der Analyse der Oligonukleotide aller Wahrscheinlichkeit nach v. a. die Effizienz der
Hydrolyse, neben der Fluoreszenzquantenausbeute der Bodipy-Konjugate und der Effizienz
der chemischen Derivatisierung, eine Rolle spielt.
Für die nächsten Versuche wurde die selbe H2O2 behandelte CT-DNA wie für die Analysen
mit der 5’-Variante verwendet. Der mit HPLC und elektrochemischer Detektion bestimmte
Gehalt an 8-oxo-dG für diese DNA lag bei 13 pro 1000 Nukleotiden. Mit der 5’-Variante des
Fluoreszenz-Postlabelings wurde ein Adduktlevel von 17 bzw. 40 8-oxo-dG pro 1000
Nukleotiden gemessen, abhängig vom verwendeten Korrekturfaktor (vgl. S. 81). 10µg der
DNA wurden nach den Standardbedingungen aus Tabelle 10 zu dNps verdaut und
derivatisiert. Nach 1:100 Verdünnung mit Wasser ergab die CE-LIF Analyse das folgende
Elektropherogramm (Abb. 71).
126
Ergebnisse und Diskussion
8
dAp-Bodipy
dGp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
6
Tp-Bodipy
dCp-Bodipy
4
8-oxo-dGp-Bodipy
2
5mdCp-Bodipy
?
0
20
22
24
26
28
30
32
34
Migrationszeit [min]
Abb. 71: CE-LIF-Analyse von in vitro mit H2O2 oxidierter CT-DNA nach MN/SPD Verdau und Reaktion mit
BODIPY-FL-EDA. Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat, pH 9.0, 10% Methanol (v/v), 90mM SDS,
20kV
Neben den normalen dNp-Bodipy-Konjugaten waren, wie schon bei Anwendung der 5’Variante, mehrere kleine Signale zu erkennen. Zwei davon migrierten im Bereich kurz vor
dem dAp-Bodipy. Das kleinere der beiden Signale konnte durch Aufstocken mit dem
Reaktionsansatz des 8-oxo-dGps sicher als dieses identifiziert werden (nicht gezeigt). Die
Quantifizierung ohne den Korrekturfaktor ergab für 8-oxo-dGp einen Anteil von 0.1 ± 0.02%
(n = 5) in H2O2 behandelter DNA (1 Addukt pro 1000 Nukleotide). Unter Verwendung der
mit den beiden Oligonukleotiden IBA 5 und 995297 bestimmten Korrekturfaktoren von 10.5
bzw. 13.2 ergibt sich daher ein Adduktlevel von 10 bzw. 13 8-oxo-dG pro 1000 Nukleotide,
was sehr gut mit den Ergebnissen übereinstimmt, die mit HPLC und elektrochemischer
Detektion ermittelt wurden (13 Addukte pro 1000 Nukleotide). Die Nachweisgrenze für 8oxo-dGp-Bodipy in DNA liegt bedingt durch den hohen Korrekturfaktor jedoch im Bereich
von 1 Addukt pro 1000 Nukleotide, so dass die Methode für in vivo Anwendungen noch nicht
sensitiv genug ist. Dafür sind die erarbeiteten Trennbedingungen bei den dNp-Bodipy-
127
Ergebnisse und Diskussion
Konjugaten jedoch ausreichend, um 8-oxo-dGp-Bodipy Basislinien-getrennt neben den
normalen Nukleotiden zu detektieren.
4.6.4 Nachweis von 2’-Desoxyinosin in DNA
Die Erarbeitung einer Analysenmethode für modifizierte Nukleotide auf der Grundlage von
dNps wird dadurch erschwert, dass modifizierte dNps als Standardverbindungen kommerziell
nicht erhältlich sind. Im Gegensatz dazu sind von den pdNs bzw. prNs die
Deaminierungsprodukte 2’-Desoxyinosin-5’-Phosphat, 2’-Desoxyuridin-5’-Phosphat, Inosin5’-Phosphat und Xanthosin-5’-Phosphat erhältlich. Auch Oligonukleotide mit definierten
Modifikationen bieten sich als Standardverbindungen zur Etablierung von Analysenmethoden
an. Allerdings sind auch hier nur wenige Oligonukleotid-Modifikationen erhältlich (8-oxodG, etheno-dA) und Probleme bei der Hydrolyse des Oligonukleotides können die
Identifikation des Signals erschweren (s. 8-oxo-dGp).
Im Falle des 2’-Desoxyinosin-3’-Phosphats (pdI) konnte auf das mit der 5’-Variante der
Methode bereits untersuchte poly(dI·dC)·(dI·dC) zurückgegriffen werden. Nach Verdau von
10µg poly(dI·dC)·(dI·dC) mit MN/SPD zu dNps und anschließender Fluoreszenzmarkierung
mit BODIPY-FL-EDA wurden zwei annähernd gleich große Signale in der CE-LIF Analyse
erwartet. Das Elektropherogramm (Abb. 72) zeigt zwar zwei Signale, von denen jedoch das
erste bei 18.2min deutlich kleiner war als das zweite bei 26min. Durch Aufstocken mit dem
dCp-Bodipy Standard wurde das zweite Signal sicher identifiziert, während das Signal bei
18.2min dem dIp-Bodipy zugeordnet wurde. Das Verhältnis der korrigierten Peakflächen
betrug etwa 40:60 (dIp-Bodipy:dCp-Bodipy, Faktor 1.5) und bestätigte damit die Ergebnisse
mit der 5’-Variante der Methode aus Kapitel 4.4.2.1, die zeigen, dass 2’-Desoxyinosin mit
unserer Fluoreszenz-Postlabeling-Methode etwas schlechter zu detektieren ist als dC.
Allerdings war der Unterschied für die 3’-Phosphat Bodipy-Konjugate kleiner als für die 5’Phosphat Bodipy-Konjugate (Faktor: 2.3). Ebenfalls interessant ist der größere Unterschied
zwischen den Migrationszeiten der Bodipy-Konjugate. Während der Abstand zwischen pdIBodipy und pdC-Bodipy nur etwa 0.5min beträgt, sind es zwischen dIp-Bodipy und dCpBodipy 6min. Kürzlich wurde von Wirtz et al. die Synthese von dIp durch Phosphorylierung
von 2’-Desoxyinosin sowie seine Detektion via Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FLEDA
beschrieben
[154].
Die
CE-LIF-Analyse
bestätigte,
dass
trotz
anderer
Trennbedingungen dIp-Bodipy schneller wandert als dCp-Bodipy, und auch die Signalfläche
des dIp-Bodipys fiel kleiner aus als für dCp-Bodipy. Ferner wurde nach Normierung auf dCp-
128
Ergebnisse und Diskussion
Bodipy für dIp ein Korrekturfaktor von 1.35 ermittelt, der gut mit dem von mir bestimmten
Faktor von 1.5 übereinstimmt. Dabei ist zu berücksichtigen, dass bei dem von mir über
poly(dI·dC)·(dI·dC) bestimmten Faktor noch der Einfluss der Hydrolyse mit einbezogen ist.
14
12
dCp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
10
dIp-Bodipy
8
6
4
2
0
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Migrationszeit [min]
Abb. 72: CE-LIF-Analyse von 10µg MN/SPD verdautem poly(dI·dC)·(dI·dC) nach Fluoreszenzmarkierung mit
BODIPY-FL-EDA. Trennbedingungen: 18mM Natriumphosphat, pH 9.0, 90mM SDS, 10% Methanol (v/v),
20kV
Um 2’-Desoxyinosin als 3’-Phosphat in DNA nachzuweisen, wurde die selbe HNO2behandelte CT-DNA wie für die Analysen mit der 5’-Variante verwendet (s. Punkt 4.4.2.3).
Ein Aliquot von 10µg wurde mit MN/SPD zu dNps verdaut, fluoreszenzmarkiert und mit CELIF analysiert. Im Elektropherogramm (Abb. 73) fanden sich eine ganze Reihe neuer Signale,
von denen das Signal bei 18min durch Aufstocken mit dem Reaktionsansatz des
poly(dI·dC)·(dI·dC) dem dIp-Bodipy zugeordnet wurde. Wie in Abb. 34 (5’-Variante), ist
auch hier eine deutliche Abnahme des dGp-Bodipy-Signals durch die HNO2-Behandlung zu
beobachten. Eines der beiden Signale kurz vor dAp-Bodipy könnte nach den Untersuchungen
von Wirtz das dUp-Bodipy, welches nach Deaminierung von Cytosin entsteht, sein. Die
Signale im Bereich von 15-16 min sind ähnlich wie in Abb. 34, eines davon ist vermutlich das
129
Ergebnisse und Diskussion
Bodipy-Konjugat des 2’-Desoxyxanthosin-3’-Phosphats, da dieses die kürzeste Migrationszeit
der gebildeten Deaminierungsprodukte aufweist (vergl. Ribonukleotide).
5
dAp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
4
Tp-Bodipy
3
dGp-Bodipy
2
dCp-Bodipy
dIp-Bodipy
5mdCp-Bodipy
1
0
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Migrationszeit [min]
Abb. 73: CE-LIF-Analyse von HNO2-behandelter CT-DNA nach Verdau mit MN/SPD und Derivatisierung mit
BODIPY-FL-EDA. Trennbedingungen wie in Abb. 72 angegeben.
4.6.5 Entwicklung einer Analysenmethode zur Bestimmung des Gehaltes von N6Methyladenosin mit der 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode
Da
sich
die
kapillarelektrophoretische
Trennung
des
markierten
N6-Methyl-2’-
Desoxyadenosin-5’-Phosphates von den normalen pdNs als schwierig erwies, wurden
entsprechende Trennversuche zur Analyse von N6mdA mit der 3’-Variante der FluoreszenzPostlabeling-Methode durchgeführt. Dazu wurden 10µg des Oligonukleotides IBA3 (Oligo
72853) mit der Sequenz:
5’ - GAG TCT TCC A*GT GTG ACA CAT - 3’ (A* = N6-Methyladenosin)
mit MN/SPD zu dNps verdaut, fluoreszenzmarkiert und analysiert. Die CE-LIF-Analyse mit
den etablierten Trennbedingungen erbrachte eine hervorragende Trennung des N6mdA von
den vier normalen dNps (s. Abb. 74). Da 5mdCp-Bodipy unter den gleichen
Trennbedingungen wesentlich später (nach dem dCp-Bodipy) im Elektropherogramm
130
Ergebnisse und Diskussion
erscheint, bietet sich die Möglichkeit in einem Lauf die beiden epigenetisch interessanten
DNA-Methyl-Modifikationen, 5-Methylcytosin und N6-Methyladenin, nachzuweisen und zu
quantifizieren.
12
dAp-Bodipy
10
Tp-Bodipy
dCp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
8
6
dGp-Bodipy
4
N6mdAp-Bodipy
2
0
16
18
20
22
24
26
28
30
32
Migrationszeit [min]
Abb. 74: CE-LIF-Analyse von Oligo IBA 3 nach Verdau mit MN/SPD und Fluoreszenzmarkierung mit
BODIPY-FL-EDA, Trennbedingungen s. Tab. 10, Verdünnung 1:1000 mit Wasser.
Da nach Verdau mit MN/SPD das Nukleosid am 3’-Ende des 21mer-Oligonukleotides nicht
fluoreszenzmarkiert werden kann (OH-Funktion am 3’-Ende), werden durch die CE-LIFDetektion nur zwanzig 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphate nachgewiesen: 4x dAp (20%), 5x
dGp (25%), 5x dCp (25%), 5x Tp (25%) und 1x N6mdAp (5%). Die Auswertung von fünf
aufeinanderfolgenden Analysenläufen ergab die in Tab. 36 angegebenen Flächenanteile für
die einzelnen dNp-Bodipy-Konjugate, aus denen die entsprechenden Korrekturfaktoren in
gleicher Weise wie für die pdN-Bodipy-Konjugate berechnet wurden (s. S. 44). Die auf dApBodipy normierte Migrationszeit für das N6mdAp-Bodipy betrug 1.13.
131
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 36: Auswertung der CE-LIF-Analyse von Oligo IBA3 nach Verdau mit MN/SPD
Oligo–IBA3
dA
T
dC
dG
N6mdA
Anzahl der Basen
4 (20%)
5 (25%)
5 (25%)
5 (25%)
1 (5%)
Messung (%)
29.59 ± 1.08
25.81 ± 0.66
26.53 ± 0.86
11.29 ± 0.84
6.46 ± 0.28
Faktor
0.677 ± 0.025
0.969 ± 0.025
0.943 ± 0.031
2.225 ± 0.166
0.775 ± 0.033
Die aus dem Oligonukleotid ermittelten Korrekturfaktoren stimmen gut mit den in Kapitel
4.4.1.4 durch Analyse von λ-DNA erhaltenen Korrekturfaktoren überein (Tabelle 16). Beide
Adenosin-Bodipy-Konjugate haben die niedrigsten Korrekturfaktoren, die von Tp-Bodipy
und dCp-Bodipy sind sich sehr ähnlich und pdG-Bodipy hat auf Grund des FluoreszenzQuenching-Effektes einen deutlich höheren Korrekturfaktor.
Trotzdem ist es notwendig ein komplexeres, doppelsträngiges DNA-Molekül mit definierter
Zusammensetzung für die Bestimmung der Korrekturfaktoren aller Nukleotide zur Verfügung
zu haben, bevor die Methode in realen Proben zum Einsatz kommen kann. Stach und Wirtz
[113, 114] lösten dieses Problem für 5-Methylcytosin, indem sie λ-DNA in vitro an
definierten Stellen methylierten. Hierfür nutzten sie das Enzym M.HpaII Methylase, das in
der Sequenz 5’-CCGG-3’ das innere Cytosin zu 5’-CC*GG-3’ methyliert. Diese
Basenabfolge findet sich genau 328 Mal im λ-Genom, so dass bei vollständiger Methylierung
auf beiden Strängen genau 656 5-Methylcytosine in der λ-DNA vorhanden sind. Zur
Bestätigung
wurde
dann
mit
einem
Restriktionsenzym,
das
die
DNA
an
der
Konsensussequenz im unmethylierten Zustand zerschneidet (im methylierten Zustand
hingegen nicht, restriction/protection assay), verdaut. Da nach Restriktionsverdau keine
DNA-Bruchstücke auftraten, wurde die vollständige Methylierung aller Konsensussequenzen
bestätigt. Auf diese Weise ist es also möglich, ein komplexes, doppelsträngiges DNAMolekül mit definiertem 5mdC-Gehalt zu generieren, mit dem dann der Korrekturfaktor für
5-Methylcytosin für den Fluoreszenz-Postlabeling-Assay deutlich realitätsnäher ermittelt
werden kann, als mit modifizierten Oligonukleotiden.
Da auch die Methylierung der N6-Position des Adenins in der Sequenz 5’-GATC-3’ von
einem Restriktionsenzym erkannt wird, besteht auch hier die Möglichkeit das LambdaGenom in vitro an bestimmten Sequenzen gezielt und vollständig zu methylieren. Wird
hierfür das Enzym dam Methylase verwendet, das in der Sequenz 5’-GATC-3’ Adenin
methyliert, so finden sich im λ-Genom genau 112 derartige Konsensussequenzen, die
132
Ergebnisse und Diskussion
wiederum auf beiden Strängen methyliert werden (insgesamt 224 N6mdA). Das entspricht
einer Methylierung von 0.23% aller Basen (97004), bzw. 0.92% aller Adenine (24320).
Um zu überprüfen, ob ein N6mdA-Methylierungsgrad von 0.92% mit der etablierten
Standardmethode der 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode nachzuweisen ist,
wurde ein weiteres Oligonukleotid (Oligo X) mit der Sequenz 5’ - GAG TCT TCC AGT
GTG ACA CAT - 3’ mit MN/SPD verdaut und fluoreszenzmarkiert (Bedingungen s. Tab.
10). Da die Zusammensetzung von Oligo X derjenigen von Oligo IBA 3 entspricht, es jedoch
kein N6mdA enthält, war es möglich, die Modifikation gezielt zu verdünnen. Das bedeutet,
dass bei einer Mischung von 39 Teilen Oligo X mit 1 Teil Oligo IBA 3 genau eine Base von
insgesamt 800 Basen ein N6mdA ist, was einer Häufigkeit von 0.125% entspricht. Bezogen
auf Adenosin ist eines von 200 ein N6mdA (0.5%). Abbildung 75 zeigt die CE-LIF Analyse
einer entsprechenden Mischung der beiden getrennt mit MN/SPD verdauten und mit
BODIPY-FL-EDA fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide. Das Signal des N6mdAp-Bodipy
ist klar bei 24.5min zu erkennen, wie auch der vergrösserte Bildausschnitt verdeutlicht.
8
dAp-Bodipy
0.6
rel. Fluoreszenz
6
N6mdAp-Bodipy
0.4
Tp-Bodipy
dCp-Bodipy
0.2
4
0.0
20
22
24
2
26
28
30
dGp-Bodipy
0
10
15
20
25
30
Migrationszeit [min]
Abb. 75: CE-LIF-Analyse einer 39+1 Mischung von Oligo X und Oligo IBA 3 nach Hydrolyse mit MN/SPD
und Fluoreszenzmarkierung. Trennbedingungen s. Tab. 10
133
Ergebnisse und Diskussion
4.6.5.1 In vitro dam Methylierung von Lambda-DNA
Die Methylierung der Lambda-DNA wurde in Anlehnung an die Vorgaben des Herstellers
(New England Biolabs), jedoch mit einem Überschuss an S-Adenosyl-Methionin
(Methylgruppen-Donor) durchgeführt. Je 2µg N6-Methyladenin freie λ-DNA wurden in fünf
parallelen Ansätzen mit 16 Units dam Methylase und S-Adenosyl-Methionin (SAM, 200µM)
für 2h 30 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden vereinigt und die DNA mit
dem QIAquick PCR Purification Kit aufgereinigt. Um die Vollständigkeit der Methylierung
zu überprüfen, wurde ein restriction/protection assay durchgeführt. Hierfür wurde das
Restriktionsenzym DpnII verwendet, welches die Sequenz 5’-GATC-3’ zerschneidet. Ist das
Adenin in der Konsensussequenz methyliert, kann das Enzym an dieser Stelle jedoch nicht
mehr schneiden, wodurch die DNA vor Verdau geschützt ist.
2µg der methylierten und aufgereinigten λ-DNA wurden mit 10 Units DpnII für 2h bei 37°C
inkubiert. Als Kontrollen dienten 2µg N6-Methyladenin freie λ-DNA und DNA des λ-Phagen
aus einem Wildtyp E.coli Stamm, die in gleicher Weise mit DpnII behandelt wurden wie die
methylierte DNA. Die Bezeichnung „Wildtyp“ bezieht sich in diesem Zusammenhang auf den
E. coli Stamm in dem der Phage gezüchtet wurde, d. h. der Wildtyp Stamm von E. coli besitzt
das Enzym dam Methylase, weswegen das Phagen-Genom an einigen Stellen methylierte
Adenine besitzt. Die N6-Methyladenin freie DNA des λ-Phagen wird indes in einer E. coli
Mutante gezüchtet, die die dam Methylase nicht besitzt (dam-).
Alle Ansätze wurden per Gelelektrophorese (1% Agarose/1xTBE-Gel mit 0.03%
Ethidiumbromid) analysiert. Das Ergebnis ist in Abbildung 76 dargestellt.
134
Ergebnisse und Diskussion
1
2
3
4
5
6
Abb. 76: Gelelektrophoretische Untersuchung verschiedener Lambda DNAs nach Restriktionsverdau
Bedingungen: 60V bei 60mA und 4 Watt, 45min
Bahn 1: DNA wide range marker
Bahn 2: λ-DNA N6mdA-frei, Negativkontrolle (nicht mit DpnII behandelt) (mock incubated)
Bahn 3: „Wildtyp“ Lambda-Genom mit DpnII behandelt
Bahn 4: λ DNA N6mdA-frei, DpnII behandelt
Bahn 5+6: in vitro methylierte λ DNA, DpnII behandelt
Auf den Bahnen 2, 5 und 6 ist jeweils nur eine Bande zu erkennen, was zum einen bedeutet,
dass die nicht mit dam Methylase behandelte DNA von Beginn an unfragmentiert war (Bahn
2), und dass die mit dam Methylase inkubierte DNA vollständig vor dem Verdau mit DpnII
geschützt, also vollständig methyliert war. Wäre dies nicht der Fall gewesen hätte das Enzym
die DNA in viele kleine Bruchstücke zerschnitten, die bei der Gelelektrophorese als
wandernde Banden nachgewiesen werden können. Genau das ist auch auf den Bahnen 3 und 4
für die N6-Methyladenin-freie λ-DNA und die Wildtyp-DNA zu sehen. Die komplett N6Methyladenin-freie λ-DNA ist dabei deutlich stärker verdaut als die DNA des „Wildtyp“
Lambda-Phagen, was an der größeren Anzahl von Banden deutlich zu erkennen ist.
6µg dam Methylase behandelte DNA wurden mit den in Tabelle 10 angegebenen
Standardbedingungen mit MN/SPD zu dNps verdaut und derivatisiert. Der Reaktionsansatz
wurde 1:1000 mit Wasser verdünnt und kapillarelektrophoretisch analysiert. Wie in
Abbildung 77 zu sehen ist, wurde das Signal des N6mdA an der erwarteten Stelle im
Elektropherogramm (24.3min) detektiert. In unbehandelter, N6-Methyladenin-freier LambdaDNA ist dieser Peak nicht vorhanden (Abb. 22). Die auf das dAp-Bodipy normierte
135
Ergebnisse und Diskussion
Migrationszeit von N6mdAp-Bodipy betrug im Durchschnitt 1.13 und bestätigte damit die
Identifizierung des Signals.
1,2
dAp-Bodipy
0,20
1,0
0,15
N6mdAp-Bodipy
rel. Fluoreszenz
0,10
Tp-Bodipy
0,8
0,05
0,6
0,00
dGp-Bodipy
20
22
24
26
28
30
0,4
dCp-Bodipy
0,2
0,0
20
22
24
26
28
30
32
34
36
Migrationszeit [min]
Abb. 77: CE-LIF-Analyse von in vitro dam methylierter Lambda-DNA nach Hydrolyse mit MN/SPD und
Fluoreszenzmarkierung. Trennbedingungen s. Tab. 10
Die Auswertung der korrigierten Peakflächen ergab eine Gesamtfläche von ca. 115 000
Flächeneinheiten, was für 6µg DNA zu gering ist. Normalerweise werden mit 10µg CT-DNA
oder λ-DNA etwa 300 000 Flächeneinheiten erhalten, d. h. nach Aufreinigung wurden nur
etwa 3.5µg der methylierten λ-DNA wiedergewonnen. Daher sind die hier berechneten
Korrekturfaktoren mit etwas weniger DNA bestimmt als bei den vorhergehenden Versuchen,
was die Abweichungen zu diesen Versuchen erklären kann. Die oben beschriebene in vitro
dam-Methylierung wurde zweimal an verschiedenen Tagen als voneinander unabhängige
Experimente durchgeführt (Versuch 1 + 2), die DNA entsprechend den Standardbedingungen
(Tab. 10) mit MN/SPD zu dNps verdaut und derivatisiert. Vor der CE-LIF-Analyse wurden
die Ansätze wie gewohnt 1:1000 mit Wasser verdünnt. In Tabelle 37 sind die Mittelwerte der
Messergebnisse (n = 7) dargestellt.
136
Ergebnisse und Diskussion
Tab. 37: Auswertung der CE-LIF-Analysen von in vitro methylierter Lambda-DNA
dam methyliert
Anzahl der Basen
Versuch 1
Messung (%)
Versuch 2
Messung (%)
Korrekturfaktor
Lambda Genom
dA
T
dC
dG
N6mdA
24096 (24.84%)
24320 (25.07%)
24182 (24.93%)
24182 (24.93%)
224 (0.23%)
37.33 ± 1.33
25.34 ± 1.40
24.54 ± 1.02
12.30 ± 0.35
0.29 ± 0.04
37.74 ± 0.36
25.19 ± 0.37
24.37 ± 0.86
12.22 ± 0.21
0.30 ± 0.04
0.658 ± 0.006
0.997 ± 0.015
1.002 ± 0.035
2.041 ± 0.035
0.783 ± 0.10
Aus den Daten geht hervor, dass beide Versuche sehr gut übereinstimmende Ergebnisse
erbrachten, im Versuch 1 jedoch höhere Abweichungen zu beobachten waren. Die
berechneten Korrekturfaktoren zeigen kleinere Abweichungen zu denen mit unmethylierter λDNA bestimmten in Tabelle 16. Möglicherweise hängt dies mit der geringeren DNA Menge
zusammen (3.5µg gegenüber 10µg).
Im nächsten Schritt wurde versucht die Menge an N6mdA in der λ-Phagen-DNA aus dem
Wildtyp E. coli zu bestimmen. Wie der Restriktionsverdau mit DpnII zeigte (Abb. 76), war
diese DNA im Vergleich zu der komplett unmethylierten DNA partiell geschützt, was auf
einen gewissen Anteil an Adenin-Methylierung zurückzuführen ist.
10µg dieser λ-DNA wurden nach den Standardbedingungen fluoreszenzmarkiert und
kapillarelektrophoretisch analysiert. In Abbildung 78 ist ein Ausschnitt aus dem
resultierenden Elektropherogramm zu sehen. Deutlich ist das Signal des N6mdAp-Bodipy an
der erwarteten Stelle nach dem Tp-Bodipy zu erkennen. Trotz der etwas längeren
Migrationszeiten aller Nukleotid-Bodipy-Konjugate stimmte die auf dAp-Bodipy normierte
Migrationszeit des N6mdAp-Bodipy mit 1.14 mit der zuvor beobachteten überein. Die
größeren Signale bei 31-32min sind Abbauprodukte des Fluoreszenzmarkers (Bodipy).
137
Ergebnisse und Diskussion
0,5
dAp-Bodipy
0,4
rel. Fluoreszenz
dCp-Bodipy
Tp-Bodipy
0,3
0,2
N6mdAp-Bodipy
dGp-Bodipy
0,1
0,0
20
22
24
26
28
30
32
Migrationszeit [min]
Abb. 78: CE-LIF-Analyse von λ-DNA aus Wildtyp E. coli nach Verdau mit MN/SPD und Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FL-EDA. Trennbedingungen s. Tab. 10
Verglichen mit den bereits durchgeführten Analysen von λ-DNA zeigte die Auswertung der
korrigierten Peakflächen wiederum sehr gute Übereinstimmungen in Bezug auf die
Korrekturfaktoren und die damit berechnete Zusammensetzung von λ-DNA (s. Tab 38). Da
die genaue Anzahl der methylierten Adenine der Wildtyp λ-DNA nicht bekannt ist, können
die Basenanteile für Adenin und N6-Methyladenin nur ungefähr angegeben werden.
Tab. 38: Auswertung der CE-LIF-Analyse von Lambda-Phagen DNA aus E. coli (Wildtyp)
Reale Probe Anteil der
Base (%)
Lambda-wt
dA
ca. 24.75
T
25.07
dC
24.93
dG
24.93
N6mdA
??
138
Messung (%) Korrekturfaktor
36.62 ± 0.61
24.51 ± 0.67
26.30 ± 0.86
12.39 ± 0.24
0.18 ± 0.01
0.699 ± 0.006
0.972 ± 0.021
0.944 ± 0.024
2.093 ± 0.041
0.783 ± 0.10
Berechnet
(%)
25.52 ± 0.41
23.75 ± 0.64
24.75 ± 0.85
25.85 ± 0.46
0.13 ± 0.01
Ergebnisse und Diskussion
Für N6mdA wurde ein Anteil an der Gesamtfläche von 0.18% ermittelt, was nach
Berücksichtigung des Korrekturfaktors (0.783) 0.13% entspricht, oder anders ausgedrückt
einen Adenin-Methylierungsgrad (s. Formel S. 52) von 0.59% ergibt. Im Durchschnitt enthält
also das λ-Phagen Genom aus E. coli (Wildtyp) 126 N6mdA. Dieser Wert stimmt mit dem in
der Literatur beschriebenen N6-Methyladenosin Gehalt im λ-Phagen Genom überein. So
ermittelte Hattman für verschiedene E. coli Wirtsstämme und anwesende Plasmide eine
Menge von 105 bis 220 N6mA-Moleküle je Genom [155]. Die Nachweisgrenze für N6mdA
liegt etwa im gleichen Bereich wie für dA. Daher können theoretisch bei einer Verdünnung
von 1:100 vor der Analyse 10 000pM, d. h. etwa 3 Addukte in 100 000 normalen Nukleotiden
detektiert werden.
Die beschriebene Methode ist somit in der Lage, den N6mdA-Gehalt des Genoms
verschiedener Organismen nachzuweisen und akkurat zu quantifizieren. Dies kann zur
Bestimmung von epigenetischen Effekten, besonders in Organismen, die nicht über
Enzymsysteme zur Methylierung des Cytosins verfügen, beitragen.
4.7 Abschliessende Diskussion
4.7.1 Vergleich der Fluoreszenz-Postlabeling-Methoden
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei verschiedene Methoden zur Analyse von DNA- bzw.
RNA-Modifikationen verwendet. Diese Methoden beruhen beide auf dem Prinzip der
Hydrolyse der Nukleinsäuren zu Nukleosid-3’- oder -5’-Monophosphaten, Fluoreszenzmarkierung mit BODIPY-FL-EDA und Analyse mit CE-LIF. Da Hydrolyse und
Markierungsreaktion hintereinander im selben Reaktionsgefäß, ohne Aufreinigungsschritte
durchgeführt werden sollten, war es nötig, für den Verdau von DNA zu pdNs zunächst neue,
mit der chemischen Fluoreszenzmarkierung kompatible Puffersubstanzen zu testen. Im
Prinzip erwiesen sich sowohl 1-Methylimidazol, MES und HEPES als geeignet, die besten
Reaktionsausbeuten wurden jedoch mit MES, pH 5.5, erzielt, so dass alle weiteren Versuche
mit MES als Puffer durchgeführt wurden. Diese ersten Versuche belegten auch die Eignung
von MES als Alternative für den Verdau von DNA mit MN/SPD zu dNps (entgegen früheren
Berichten von Wörth). Die Hydrolyse von DNA zu pdNs kann enzymatisch mit NP1 und
DNaseI/SVPD durchgeführt werden. Vergleichende Untersuchungen lieferten nur für die
NP1-verdaute CT-DNA reproduzierbare Analysendaten. Der Verdau mit DNaseI/SVPD
scheiterte vermutlich an der Qualität der SVPD, die nicht die nötige Reinheit für die
Derivatisierungsreaktion besaß, und so zu erheblichen Nebenreaktionen führte. Der Verdau
139
Ergebnisse und Diskussion
mit NP1 zu Nukleosid-5’-Phosphaten bildete die Grundlage zur Entwicklung der 5’-Variante
der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode sowohl für DNA als auch auch für RNA. Eine Analyse
von RNA mit der schon länger bekannten 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling- Methode
ist hingegen nicht möglich, da bei der Aktivierung der 3’-Phosphatgruppe mit EDC während
der Fluoreszenzmarkierung ein stabiles cyclisches Phosphat mit der benachbarten 2’-OH
Gruppe gebildet wird, und die Phosphatgruppe somit nicht mehr mit BODIPY-FL-EDA
reagieren kann. Weitere Vorteile der 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode sind
die leichtere und preiswertere Verfügbarkeit von DNA-Addukt Standards und die für
bestimmte Addukte bessere Freisetzung aus DNA im Vergleich zum MN/SPD-Verdau.
4.7.1.1 Nachweisgrenzen
Vergleicht man die analytischen Parameter der beiden Postlabeling-Assays miteinander, so
ergeben sich generell große Übereinstimmungen. Beide Varianten erzielen für die BodipyKonjugate der normalen Nukleotide Nachweisgrenzen von etwa 100pM, mit Ausnahme des
Guanosins, das eine Nachweisgrenze von etwa 200pM aufweist. Hierfür ist ein
basenspezifischer Quenchingeffekt verantwortlich, der in dem besonders niedrigen
Oxidationspotential des Guanosins begründet liegt [156].
4.7.1.2 Reproduzierbarkeit
Die Standardabweichungen der Signalflächen, ausgedrückt in Prozent der Gesamtfläche, für
die Analyse von CT-DNA, bzw. eines mit Pseudouracil modifizierten Oligoribonukleotids
lagen bei wiederholten Analysen der selben Proben unter 3%, und sind damit vergleichbar mit
der für die 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode publizierten Standardabweichung.
Des weiteren arbeiten beide Methoden im getesteten Verdünnungsbereich der Probe (von
1:500 bis 1:10 000) gleichermassen linear.
4.7.1.3 Migrationsverhalten bei der kapillarelektrophoretischen Trennung
Betrachtet man das Migrationsverhalten der einzelnen Bodipy-Konjugate während der
kapillarelektrophoretischen Trennung genauer, so stellt man fest, dass unter identischen
Trennbedingungen die prN-Bodipy Konjugate am schnellsten migrieren (schneller als die
pdNs und dNps). Dieses Verhalten lässt sich mit der höheren Hydrophilie durch die
zusätzliche 2’-OH Funktion dieser Verbindungen erklären, die dazu führt, dass sie weniger
140
Ergebnisse und Diskussion
mit den SDS-Mizellen interagieren. Die Migrationsreihenfolge der prN-Konjugate ist wie
folgt: prX, prA, pΨ, prI, prU, p2’OmrA, prC, prG. Es ist daher anzunehmen, dass diese
Reihenfolge auch in etwa die steigende Lipophilie der Verbindungen widerspiegelt. Für die
korrespondierenden pdN-Bodipy Konjugate ist die Migrationsreihenfolge fast identisch: pdA,
dT, pdU, pdI, p5mdC, pdC, pdG. Lediglich pdI wandert also langsamer als pdU. In diesem
Fall ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die Trennbedingungen nicht identisch sind, und
dieser Unterschied auch auf die andere Pufferzusammensetzung, insbesondere den Zusatz von
Glukose zurückzuführen sein kann (Abb. 34).
Vergleicht man hingegen die kapillarelektrophoretische Migrationsreihenfolge der Nukleosid5’-Phosphat-Konjugate mit denen der Nukleosid-3’-Phosphat-Konjugate (dIp, dAp, dGp, Tp,
dCp, 5mdCp), so ergeben sich zwei deutliche Unterschiede: dGp-Bodipy ist nun nicht mehr
das am langsamsten wandernde Konjugat, sondern 5mdCp-Bodipy und dIp-Bodipy ist nun
das am schnellsten migrierende Bodipy-Konjugat. Offenbar ändert sich die Lipophilie von
pdG-Bodipy zu dGp-Bodipy und von pdI zu dIp erheblich, möglicherweise durch eine
Konformationsänderung. Mischt man pdN und dNp Konjugate, so zeigt sich, dass die dNpKonjugate insgesamt langsamer wandern als ihre korrespondierenden pdN-Konjugate,
vermutlich also stärker mit den Mizellen wechselwirken. Dieser Effekt ist aus der RP-HPLCAnalytik bekannt, auch hier haben Nukleosid-3’-Phosphate längere Elutionszeiten als
Nukleosid-5’-Phosphate [157].
Bezieht man die modifizierten Nukleoside mit in die Betrachtung ein, so kann man zumindest
innerhalb der Reihe der Nukleosid-5’-Phosphat-Konjugate, pdN-Bodipys bzw. prN-Bodipys,
Voraussagen über das Migrationsverhalten der Bodipy-Konjugate anstellen. So bewirkt die
Methylierung der Base, bzw. der 2’-OH Gruppe eine langsamere Migrationsgeschwindigkeit
im Vergleich zum ursprünglichen Nukleotid-Bodipy-Konjugat. Gleiches konnte auch in
dieser Arbeit für das pdN-Konjugat des 1,N6-Etheno-Adenins und das dNp-Konjugat des
1,N6-Propano-Guanins (Hex-dG) gezeigt werden, welche durch die Einführung der AlkylBausteine wesentlich lipophiler geworden sind als die entsprechende unmodifizierte Base,
und dadurch langsamer wanderten. (Schmitz et al. haben das auch für etheno-dAp gezeigt
[158]).
Ausnahme ist hierbei p5mdC-Bodipy, welches unter den entwickelten Trennbedingungen
schneller wandert als pdC-Bodipy. Das könnte jedoch auch auf den sehr hohen
Methanolanteil im Trennpuffer bei dieser Methode zurückzuführen sein.
141
Ergebnisse und Diskussion
Im Gegensatz dazu sollten die oxidativ veränderten Nukleoside (8-oxo-dA und 8-oxo-dG)
nach Einführung einer weiteren Hydroxylfunktion schneller wandern, da sie sich seltener in
den Mizellen aufhalten als das unmodifizierte Nukleotid-Bodipy-Konjugat. Diese Annahme
trifft allerdings nur auf die beiden 8-oxo-dG-Bodipy-Konjugate zu, während 8-oxo-pdABodipy langsamer als pdA-Bodipy und sogar noch langsamer als pdG-Bodipy migriert.
Auch für das elektrophoretische Wanderungsverhalten der Deaminierungsprodukte ist ein
eindeutiger Zusammenhang mit dem Austausch der NH2-Gruppe gegen eine Ketogruppe nicht
festzustellen. Die Deaminierung von Cytosin zu Uracil führt sowohl bei den 3’- als auch 5’Phosphat-Bodipy Konjugaten zu einer schnelleren Migration des Deaminierungsproduktes
(Uracil-Bodipy). Die Deaminierung von Adenosin zu Inosin führt zu einer Beschleunigung
der Migration von dIp-Bodipy im Vergleich zu dAp-Bodipy (s. Abb. 73). Im Gegensatz dazu
wandern pdI-Bodipy und prI-Bodipy deutlich langsamer als pdA-Bodipy und prA-Bodipy (s.
Abb. 34 und 45). Xanthosin, das Deaminierungsprodukt des Guanosins, konnte nur als
Ribonukleotid untersucht werden. Hier kommt es zu einer ganz erheblichen Beschleunigung
der Migrationsgeschwindigkeit des prX-Bodipys im Vergleich zu prG-Bodipy. Da sich die 2’Desoxyribonukleosid- und Ribonukleosid-5’-Phosphate im Bezug auf die kapillarelektrophoretische Trennung sehr ähnlich verhalten, kann man aus diesem Ergebnis ableiten,
dass eines der ersten Signale im Elektropherogramm der mit NP1 verdauten, HNO2behandelten DNA (Abb. 34), das pdX-Bodipy Konjugat darstellt. Ebenso liegt die Vermutung
nahe, dass es sich bei einem der ersten Signale in Abbildung 73 (HNO2 behandelte DNA,
MN/SPD verdaut) um das dXp-Bodipy-Konjugat handelt. Die endgültige Klärung dieser
Frage erfordert jedoch einen charakterisierten Bodipy-Konjugat Standard von dXp bzw. pdX.
4.7.1.4 Analysendauer
In den bisher durchgeführten kapillarelektrophoretischen Trennungen bei 20kV migrierten die
Bodipy-Konjugate aller Nukleosid-3’- und -5’-Phosphate in einem Zeitfenster von etwa 15
bis 30min, so dass keine Probleme bestehen, die normalen Nukleotide innerhalb einer
vertretbaren Analysendauer zu trennen. Auch ein oder zwei zusätzliche modifizierte
Nukleotide lassen sich in der Regel mit nur leichten Änderungen der Trennbedingungen
neben den normalen Nukleotiden analysieren. Je mehr verschiedene modifizierte Nukleotide
man jedoch in einem Analysenlauf analysieren will, desto schwieriger wird eine
Basisilinientrennung innerhalb dieses Zeitfensters (z. B. p5mdC gemeinsam mit 8-oxo-pdG,
Abb. 39). Untersuchungen in dieser Arbeit haben gezeigt, dass die Zugabe von Glukose zum
142
Ergebnisse und Diskussion
Trennpuffer als zusätzlichem „Modifier“ dieses Fenster erweitern kann, wenn auch auf
Kosten der Dauer eines Analysenlaufes.
4.7.2 Korrekturfaktoren und Quenching-Effekte
Neben den Migrationszeiten bei der kapillarelektrophoretischen Trennung unterscheiden sich
die Nukleotid-Bodipy-Konjugate auch in ihrer Signalintensität bei der Laser-induzierten
Fluoreszenzdetektion. Ein Teil dieser Unterschiede ist auf die unterschiedliche FluoreszenzQuantenausbeute (FQY) der Bodipy-Konjugate, ein Teil auf die unterschiedlichen
chemischen Ausbeuten bei der Kopplungsreaktion und ein weiterer Teil auf die
unvollständige Freisetzung der Nukleotide bei der Hydrolyse der Nukleinsäuren
zurückzuführen. Daher ist für die quantitative Bestimmung von Nukleotiden mit der
Fluoreszenz-Postlabeling-Methode die Ermittlung von Korrekturfaktoren für die einzelnen
Bodipy-Konjugate unverzichtbar. Die spektroskopischen Eigenschaften der aufgereinigten
und charakterisierten dNp-Bodipy-Konjugate wurden bereits von Wörth ermittelt [112] und
zeigen jeweils für die Konjugate von dAp, dCp und Tp nahezu identische FQYs, während die
Quantenausbeute von dGp-Bodipy hingegen nur ca. die Hälfte der für die anderen Nukleotide
gemessenen Werte (s. Tab. 34) betrug. In den mit λ-DNA ermittelten Korrekturfaktoren sind
neben der FQY auch die Unterschiede in der Hydrolyse und der Derivatisierung für die
einzelnen dNps enthalten. Vergleicht man nun diese Korrekturfaktoren miteinander (Tab. 16),
so hat dAp mit 0.7 einen deutlich niedrigeren Korrekturfaktor als Tp und dCp (beide etwa
0.95). Dies lässt sich wahrscheinlich auf eine bessere Reaktionsausbeute von dAp mit
BODIPY-FL-EDA zurückführen, was auch mit den von Wörth gemachten Beobachtungen
übereinstimmt (vgl. Tab. 3). Wegen der kostenintensiven Synthese liegen von den pdNBodipy Konjugaten bisher weder fluoreszenzspektroskopische Daten noch Daten zur
spektroskopischen Charakterisierung vor. Die mit λ-DNA ermittelten Korrekturfaktoren
entsprechen aber in etwa denen der dNp-Konjugate (s. Tab. 14). Die größten Unterschiede
erhält man für Cytosin und Guanin. pdC wird unter den verwendeten Bedingungen offenbar
deutlich besser mit BODIPY-FL-EDA umgesetzt als dCp (niedrigerer Faktor), pdG dagegen
reagiert offensichtlich schlechter als dGp, oder aber die FQYs der Bodipy-Konjugate
unterscheiden sich erheblich. Die höchsten Signalintensitäten nach DNA-Hydrolyse erzielen
aber die 3’- und 5’-Phosphate des 2’-Desoxyadenosins, möglicherweise weil die Bedingungen
der 3’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode auf dAp optimiert wurden [16].
143
Ergebnisse und Diskussion
Da für die Analyse der Ribonukleotide kein, der Ȝ-DNA entsprechendes, definiertes RNAMolekül zur Verfügung stand, wurden die Signalintensitäten einzeln derivatisierter prNs
miteinander verglichen, und die Korrekturfaktoren mit Ribo-Oligonukleotiden bestimmt. Die
dabei für prA, prC und prG erhaltenen Korrekturfaktoren stimmen besser mit den
entsprechenden pdNs als mit den dNps überein. Der Korrekturfaktor von prU (1.15) liegt
etwas höher als der von pT (0.97) und stimmt nicht mit dem Faktor für Ȍ (0.97) überein,
obwohl es sich dabei um ein Isomer des prUs handelt.
4.7.2.1 Beziehung zwischen Struktur und Signalintensität
Um weitere Erkenntnisse über den Einfluss der chemischen Struktur der Basen auf die
Signalintensität ihrer Bodipy-Konjugate zu erhalten, wurden die Ergebnisse der CE-LIFAnalysen der Derivatisierungsreaktionen von einzelnen prNs miteinander verglichen (Tab.
23, Abb. 45). Dabei ergibt sich folgende Reihenfolge der Signalintensität der BodipyKonjugate: prA > prC > prU > prI > prG > prX. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden die
gemessenen Signalflächen auf den höchsten Wert von prA (100%) normiert. Auffällig ist
hierbei vor allem, dass durch den Austausch einer Aminofunktion gegen eine Ketofunktion in
der Base die Signalintensität stark abnimmt. Dies gilt sowohl für das Paar prC und prU (Abb.
79) als auch für prA und prI (Abb. 80).
O
NH2
N
N
O
R
P
O
NH
O
R
O
H
OH
H
OH
H
OH
N
O
P
O
O
O
OH
H
H
H
H
OH
OH
H
prC-Bodipy
prU-Bodipy
(94% der Signalintensität von prA-Bodipy)
(57% der Signalintensität von prA-Bodipy)
R=
N
N
NH
B
F
N
H
F
O
Abb. 79: Vergleich der Signalintensität der Bodipy-Konjugate von prU und prC in Abhängigkeit von der
Struktur
144
Ergebnisse und Diskussion
O
NH2
N
N
N
O
R
P
N
O
N
R
O
P
O
H
OH
H
H
H
H
OH
OH
H
H
OH
OH
prA-Bodipy
N
O
O
OH
NH
N
H
prI-Bodipy
(Signalintensität = 100%)
(33% der Signalintensität von prA-Bodipy)
Abb. 80: Vergleich der Signalintensität der Bodipy-Konjugate von prA und prI in Abhängigkeit von der
Struktur. R = BODIPY-FL-EDA, s. Abb. 79
Auch die Deaminierung von prG, das sowohl eine Aminofunktion als auch eine Ketofunktion
besitzt zu prX, welches dann zwei Ketogruppen trägt, führt zu einer, wenn auch geringeren,
Abnahme der Signalintensität (Abb. 81).
O
N
N
O
R
P
O
O
N
NH
N
NH2
R
O
H
OH
H
OH
H
OH
N
O
P
O
prG-Bodipy
(32% der Signalintensität von prA-Bodipy)
N
H
O
O
OH
H
NH
H
H
OH
OH
H
H
prX-Bodipy
(21% der Signalintensität von prA-Bodipy)
Abb. 81: Vergleich der Signalintensität der Bodipy-Konjugate von prG und prX in Abhängigkeit von der
Struktur. R = BODIPY-FL-EDA, s. Abb. 79
Vergleicht man die Signalintensität von prA mit prG unter diesem Gesichtspunkt, so stellt
man fest, dass die im Guanin zusätzlich zur Aminofunktion vorhandene Ketogruppe die
Signalintensität stark reduziert. Seidel et al. haben bereits ähnliche Fluoreszenz-QuenchingEffekte für Dansyl-gekoppelte Nukleobasen, vor allem Guanin, beschrieben [156]. Sie fanden
eine Abhängigkeit der FQY von der Höhe des Oxidationspotentials der Base, d. h. je geringer
das Oxidationspotential der Base, desto ausgeprägter war der Quenching-Effekt. Da die
145
Ergebnisse und Diskussion
Einführung der Ketogruppe eine Oxidation darstellt, liegt es nahe, auch für die von mir
beobachteten Fluoreszenz-Quenching-Effekte unterschiedliche Oxidationspotentiale als
Erklärung heranzuziehen, auch wenn diese nicht direkt bestimmt wurden.
Diese für die Ribonukleotide eingehender beschriebenen strukturellen Effekte auf die
Signalintensität der Bodipy-Konjugate finden sich auch bei den 2’-Desoxyribonukleotiden
wieder. Die Signalintensitäten für pdI-Bodipy und pdU-Bodipy waren deutlich niedriger als
die ihrer entsprechenden Aminoverbindungen pdA-Bodipy und pdC-Bodipy. Daher wurden
die entsprechenden Standards für die CE-LIF-Analyse in Abb. 28 auch in doppelter
Konzentration eingesetzt. Niedrige Signalausbeuten an pdI-Bodipy und dIp-Bodipy wurden
auch nach Hydrolyse von poly(dI·dC)·(dI·dC) (Abb. 29) und an pdU-Bodipy nach Hydrolyse
Bisulfit-behandelter DNA beobachtet (Abb. 31).
Auch die Signalintensitäten der modifizierten Nukleotide wiesen z.T. erhebliche Unterschiede
zu den Signalintensitäten der unmodifizierten Nukleotide auf. In nahezu allen Fällen wurde
eine Reduzierung der Signalintensitäten gemessen. Den geringsten Einfluss auf die
Peakfläche der Bodipy-Konjugate haben offenbar einfache Methylierungen (vgl. 5mdC,
N6mdA, 2’OmrA). Die ermittelten Korrekturfaktoren entsprechen hier in etwa denen für die
normalen Nukleotide oder sie sind nur wenig größer. Die oxidierten Basen 8-oxo-dG und 8oxo-dA haben hingegen deutlich höhere Korrekturfaktoren und damit niedrigere
Signalintensitäten als dG bzw. dA. Auch diese beiden Verbindungen tragen eine zusätzliche
Ketogruppe in der Base, d. h. ihr geringeres Oxidationspotential könnte hier eine Rolle
spielen. Wie aber für das 8-oxo-dG gezeigt werden konnte, ist möglicherweise eine nicht
vollständige DNA-Hydrolyse der stärkere Einflussfaktor. Mit dieser Theorie hingegen nicht
erklärbar sind der kleinere Korrekturfaktor für Pseudouracil im Vergleich zu Uracil und der
deutlich größere Korrekturfaktor von etheno-dA im Vergleich zu dA.
Einen extremen Fall für die Beeinflussung der Fluoreszenz-Quantenausbeute von NukleotidBodipy-Konjugaten stellen die großen aromatischen Reste der DNA-Addukte polyzyklischer
aromatischer Kohlenwasserstoffe dar. Hier konnte am Beispiel der Aristolochiasäure ein
ausgeprägter löschender Einfluss auf den Fluoreszenzmarker BODIPY-FL-EDA aufgezeigt
werden. Dieses Phänomen dürfte zu Schwierigkeiten beim Nachweis dieser Adduktklasse mit
der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode mit BODIPY-FL-EDA als Marker führen.
146
Ergebnisse und Diskussion
4.7.3 Ausblick
Mit der in dieser Arbeit entwickelten 5’-Variante der Fluoreszenz-Postlabeling-Methode steht
nun eine neue Analysenmethode zur Verfügung, die es ermöglicht modifizierte Nukleotide in
DNA und RNA mit CE-LIF nachzuweisen. Die einzelnen Schritte, enzymatischer Verdau und
chemische Fluoreszenzmarkierung, lassen sich nacheinander in einem Reaktionsgefäss ohne
weitere Aufreinigungsschritte durchführen. Durch die Möglichkeit der Automatisierung der
CE-LIF-Analyse lässt sich eine große Anzahl an Proben in vergleichsweise kurzer Zeit
analysieren, wobei bei Mehrfachmessungen sehr gut reproduzierbare Ergebnisse erhalten
wurden. Ein weiterer Vorteil der neuen Methode ist die Möglichkeit der simultanen Messung
der unmodifizierten Nukleotide und verschiedenster modifizierter Nukleotide in einem Lauf.
Da sämtliche Schritte der Methode (enzymatischer Verdau, chemische Markierung mit
BODIPY-FL-EDA und Laser-induzierte Fluoreszenzdetektion) abhängig vom Nukleotid,
bzw. vom modifizierten Nukleotid, mit unterschiedlichen Ausbeuten ablaufen, müssen
allerdings für alle Nukleotide Korrekturfaktoren ermittelt werden. Ähnliche Probleme haben
aber auch alle anderen zum Nachweis von DNA-Addukten verwendeten Methoden (Spezifität
von Antikörpern, Effizienz der Anreicherung/Markierung beim 32P-Postlabeling, Effizienz der
Ionisierung bei HPLC-MS etc.). Eines der Hauptprobleme der Fluoreszenz-PostlabelingMethode ist jedoch auch weiterhin die für humane Proben noch zu geringe Nachweisgrenze
von ca. 1 Addukt in 106 normalen Nukleotiden oder 100pM. Hier kann der Einsatz neuartiger
Fluorophore und neuer Derivatisierungsstrategien zu einer Verbesserung der Nachweisgrenze
führen. Weniger Quenching-empfindliche Fluoreszenzfarbstoffe, die auch noch eine höhere
Quantenausbeute als BODIPY besitzen, wären besonders geeignet. Wie von anderen
Arbeitsgruppen bereits gezeigt, können Markierungen mit Farbstoffen, die im längerwelligen
Bereich des Spektrums fluoreszieren, die Nachweisbarkeit von Nukleotiden in einer
biologischen Matrix verbessern [109, 110]. Zusätzlich wäre es zunächst möglich beim
32
P-
Postlabeling-Verfahren erprobte Anreicherungsverfahren (z.B. Butanol-Extraktion) für
bestimmte lipophile DNA-Addukte auf die Fluoreszenz-Postlabeling-Methode zu übertragen.
Dies würde jedoch zu extrem niedrigen Mengen an zu markierenden Nukleotiden führen (ca.
4pmol [159]), was die Entwicklung völlig neuer Derivatisierungsbedingungen erforderlich
machen dürfte, da es sonst zu erheblichen Störsignalen bei der Detektion durch
Nebenreaktionen kommt.
147
Experimenteller Teil
5 Experimenteller Teil
5.1 Geräte und Materialien
Kernresonanzspektren:
1
H-NMR:
250MHz Bruker AC-250
500MHz Bruker AM-500
int. Standard: Tetramethylsilan, δ = 0.00ppm;
13
C-NMR:
500MHz Bruker AM-500
int. Standard: Tetramethylsilan, δ = 0.00ppm;
Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS):
Finnigan MAT TSQ 7000;
Chromatographie:
DC-Folien:
Kieselgel 60 F254, Merck (Darmstadt)
RP-18 F254s, Merck (Darmstadt)
UV-aktive Substanzen wurden bei 254nm detektiert;
Analytische und präparative HPLC:
Jasco PU-980 Intelligent HPLC-Pump; Jasco (Groß-Umstadt)
Jasco LG-980-02 Ternary Gradient Unit; Jasco (Groß-Umstadt)
Jasco DG-980-50 3-Line Degaser; Jasco (Groß-Umstadt)
Analytische Säule: Nucleosil 100 C18, 5µm, 250x4mm, Latek (Eppelheim)
Präparative Säule: Nucleosil 100 C18, 10µm, 250x10mm; Latek (Eppelheim)
UV-Detektion: Lambda Max Model 481 LC Spectrophotometer, Millipore Waters (Milford,
Massachusetts)
Datenaufzeichnung und Auswertung: HP 3394A Integrator, Hewlett Packard (Cambridge,
Massachusetts)
Laufmittel der Firmen Merck (Lichrosolv) und Roth (Rotisolv®, HPLC Gradient Grade);
Entgasung durch 5min beschallen mit Ultraschall;
Ammoniumformiat 10mM, pH 4.7:
300µl 25% Ammoniaklösung (Merck, Darmstadt) werden in 1l HPLC Grade Wasser (Fluka,
Neu-Ulm) gelöst und mit konzentrierter Ameisensäure auf pH 4.7 eingestellt.
148
Experimenteller Teil
32
P-Postlabeling-Analysen:
Filterpapier Whatman 3 MM CHR;
PEI-Cellulose DC-Fertigfolien, Macherey&Nagel (Düren);
[γ-32P]-ATP, spezifische Aktivität >7000Ci/mmol, MP Biomedicals (Eschwege);
Dialyse-Kassette Slide-A-Lyzer® 10 K, (Molecular weight cutoff 10 000, Pierce (Rockford,
Illinois);
Mikrokokken-Endonuklease (MN) aus Stapylococcus aureus, Sigma (Taufkirchen);
Phosphodiesterase aus Kalbsmilz (Phosphodiesterase II, Spleen Phosphodiesterase, SPD),
Calbiochem/Merck (Darmstadt);
Nuklease P1 (NP1) aus Penicillium citrinum, Sigma (Taufkirchen);
T4-Polynukleotidkinase (T4-PNK), USB (Cleveland, Ohio);
Butanol (Spectranal), Riedel-de Haën (Seelze);
Quantifizierung radioaktiver Spots mittels Instant-Imager-System von Canberra Packard
(Meriden, Connecticut);
Kapillarelektrophorese:
BioFocus 3000TC Kapillarelektrophorese-System mit LIF2 -Detektor (Ar-Ionen-Laser der
Wellenlänge 488nm, Ausgangsleistung 3.8mW Emissionsfilter 520 DF 30), BioRad
(München);
Auswertungssoftware: Biofocus 3000 Integrator;
unbeschichtete fused-silica-Kapillare, Innendurchmesser = 50µm, CS-ChromatographieService (Langerwehe);
Gesamtlänge 64cm, effektive Länge zum Detektor 59.4cm;
Kapillare und Probenraum temperiert auf 25°C
Probenaufgabe 20x psi·s (48nl), hydrodynamisch;
P/ACE MDQ Glycoprotein System mit LIF Detektor (Ar-Ionen Laser, der Wellenlänge
488nm, Ausgangsleistung 3mW, Emissionsfilter 520nm); Beckman Coulter (Krefeld)
Auswertungs- und Steuersoftware: 32Karat;
unbeschichtete fused-silica-Kapillare, Innendurchmesser = 50µm, CS-ChromatographieService (Langerwehe);
Kapillare und Probenraum temperiert auf 25°C
Gesamtlänge 59cm, effektive Länge zum Detektor 48.5cm (PACE/MDQ);
Probenaufgabe 2.5x psi·s, hydrodynamisch (ca. 5nl) soweit nicht anders angegeben;
149
Experimenteller Teil
Trennpuffer und Kapillarkonditionierung:
Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Merck (Darmstadt
Natriumlaurylsulfat (Natriumdodecylsulfat, SDS), Fluka (Seelze)
Methanol (Lichrosolv) HPLC gradient grade, Merck (Darmstadt)
Salzsäure 1M und Natronlauge 1M, Baker (Deventer, Niederlande)
Fluoreszenzmarker:
4,4-Difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl-ethylendiaminhydrochlorid (BODIPY-FL-EDA), Molecular Probes (Eugene, USA);
bezogen über MoBiTec (Göttingen) bzw. Invitrogen (Karlsruhe)
Absorption: λmax = 503 nm, Extinktion 74 700 cm-1 M-1
Fluoreszenzemission: λmax = 510nm
Fluoreszenzmarkierungen:
N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC), Fluka (Seelze)
2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure (MES), Sigma (Taufkirchen)
N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N’-2-ethansulfonsäure, Gerbu (Gaiberg)
1-Methylimidazol, Fluka (Seelze)
UV-Absorptionsmessungen:
UV/Visible Spectrometer Cary 50 Scan, Varian (Darmstadt)
UV/Vis Diode Array Spectrophotometer lightwave, WPA (Cambridge, Großbritannien)
Lyophilisation von DNA Proben:
Speed-Vac Concentrator, Savant, GMI (Ramsey, Minnesota) mit einer HV-5 Ölpumpe,
Edwards High Vacuum International (Sussex Crawley, Grossbritannien)
Unmodifizierte DNA Oligonukleotide:
Applied Biosystems (Weiterstadt):
5’ - GAG TCT TCC AGT GTG ACA CAT - 3’ (Oligo X)
150
Experimenteller Teil
Modifizierte Oligonukleotide:
DNA-Oligonukleotide:
5-mdC:
5’ - TGC C*AC GTC AGC CTG GAT ACC - 3’ (Oligo-Mod1)
5-mdC:
5’ -TCC*-ATC-TGG-AAC-3’ (Oligo-Mod2)
5-mdC:
5’ - GAG TCT TCA C*GT GTC ACA CAT - 3’ (Oligo-Mod3)
IBA (Göttingen):
8-oxo-dG:
5’ - GAG TCT TCC AG*T GTG ACA CAT - 3’ (IBA 5, 72875N)
8-oxo-dA:
5’ - GAG TCT TCC A*GT GTG ACA CAT - 3’ (IBA 4, 72874N)
N6-mdA:
5’ - GAG TCT TCC A*GT GTG ACA CAT - 3’ (IBA 3, 72873N)
Eurogentec (Lüttich, Belgien):
4x etheno-dA: 5’ - AGεA-GCG-εAGεA-TTC-CεAA-TCA - 3’ (Oligo-614357)
2x etheno-dA: 5’ - GAG TCT TCC εAGT GTG εATG AT-3’ (Oligo-614358)
8-oxo-dG:
5’ - ACA TCG* ACA TTC CAA TCA-3’ (Oligo-614359)
DKFZ-Abteilung Oligonukleotidsynthese: G* = 8-oxo-dG
995297:
5’ – AGA-GCG-AG*A-TTC-CAA-TCA – 3’
995298:
5’ – GAG-TCT-TCC-AGT-G*TG*-ATG-AT – 3’
RNA-Oligonukleotide:
Dharmacon (Lafayette, CO) über Perbio (Bonn):
Pseudouracil: 5’- GAG UCU UCC AGΨ GUG AUA CAU - 3’
2’O-methyl-rA: 5’- GAG UCU UCC mAGU GUG AUA CAU - 3’
Kalbsthymus-DNA und Lachssperma-DNA: Sigma (Taufkirchen)
In vitro Assays:
Adenin-Methylierung:
Lamda-Phage Genom (Wildtyp und N6mdA frei), dam Methylase, DpnII, S-AdenosylMethionin (SAM) und zugehörige Puffer: New England Biolabs (Beverly, Massachusetts)
QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen (Hilden)
QIAquick Gel Extraktion Kit, Qiagen (Hilden)
1% Agarose Gel (1xTAE)
Gelelektrophorese Apparatur: MINI SUB® CELL GT, BioRad (München)
151
Experimenteller Teil
Imaging System: E.A.S.Y 429K Kamera, E.A.S.Y RH-3 Dunkelhaube; Software E.A.S.Y
Win32, Herolab (Wiesloch)
DNA-Inkubationen, Hydrolyse und Derivatisierungen:
Schüttelwaserbad Julabo SW-20C, Julabo (Seelbach);
Tischzentrifuge, Mikro 12-24, Hettich (Tuttlingen);
Thermomixer compact und Thermomixer comfort, Eppendorf (Hamburg);
Aristolochiasäure I, Madaus
pH-Messungen: φ340 pH TempMeter, Beckman Coulter (Krefeld);
DNA Isolierung aus Gewebe (Phenol-Extraktionen):
Minifuge RF, Heraeus (Hanau);
Sorvall Super T21, Kendro (Langenselbold);
Überkopfschüttler Reax 2 und Vortex-Schüttler Reax Control, Heidolph (Schwabach);
Reinstwasseranlage: Milli Q, Millipore (Schwalbach);
5.2 Methoden
5.2.1 32P-Postlabeling-Analysen:
Bestimmung der DNA-Konzentration
Aliquots der DNA-Lösungen werden 1:50 mit Wasser verdünnt und die UV-Extinktionen bei
260 und 280nm bestimmt. Für reine DNA liegt der Quotient OD260:OD280 bei ca. 1.8. Die
DNA-Konzentration ergibt sich aus:
c(DNA) [µg/ml] = OD260 · 50 · Verdünnung
Herstellung des Enzym-Mixes zum DNA-Verdau
Da die Enzyme Mirokokken-Nuklease (MN) und Milz-Phosphodiesterase (SPD) in Form von
gepufferten Lösungen, bzw. stabilisierten Lyophilisaten geliefert werden, müssen sie vor
einer Verwendung von diesen Substanzen (Salzen) gereinigt werden. Von besonderer
Bedeutung beim
152
32
P-Postlabeling-Verfahren ist das NH4+ Ion, welches kompetitiv die T4-
Experimenteller Teil
PNK inhibiert und die Übertragung der radioaktiven Phosphatgruppe verhindert. Auch beim
Fluoreszenz-Postlabeling störende Substanzen mit Carbonylfunktion (z. B. Acetat) werden in
diesem Schritt abgetrennt.
330µl SPD Lösung werden mit bidestilliertem Wasser auf 1ml aufgefüllt, in eine Slide-ALyzer® Dialysekassette gespritzt und zweimal für 10h gegen 10l Wasser dialysiert. Die
erhaltene Lösung wird an der Speed-Vac zur Trockene eingeengt und entsprechend der
gewünschten SPD Konzentration wieder in bidest. Wasser gelöst: in 2ml für 1fach SPD
(5mU/µl), in 400µl für 5fach SPD (25mU/µl), in 133µl für 15fach SPD (75mU/µl).
500U MN (Lyophilisat) werden in 250µl bidest. Wasser aufgenommen, in die DialyseKassette überführt und zweimal 10h gegen 10l Wasser dialysiert. Die erhaltene Lösung wird
an der Speed-Vac zur Trockene einrotiert und der Rückstand in 1667µl bidest. Wasser gelöst
(300mU/µl). Zur Herstellung des Enzym-Mixes werden gleiche Volumina MN- und SPDLösung gemischt, was die gewünschten Endkonzentrationen ergibt.
Enzymatische DNA-Hydrolyse
Durch Verwendung von Mikrokokken-Nuklease (MN) und Phosphodiesterase aus Kalbsmilz
(SPD) wird DNA zu 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphaten hydrolysiert. Je Probe werden
Aliquots der DNA-Proben, die 12.5µg DNA enthalten, im Vakuum zur Trockene eingeengt
und in 6.5µl destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung werden 1µl des Standard-VerdauPuffers
(100mM
CaCl2,
250mM
Natriumsuccinat,
pH
6.0)
oder
des
für
die
Fluoreszenzderivatisierung angepassten Verdau-Puffers (100mM CaCl2, 250mM HEPES, pH
6.0) zugegeben. Diese Lösung wird mit 5µl MN/SPD-Mix bestehend aus 2.5mU/µl SPD und
150mU/µl MN versetzt. Die Lösung wird 3h bei 37°C inkubiert.
Vorbehandlung der Dünnschichtplatten
Die PEI-Cellulose Fertigplatten werden vor ihrer Verwendung einer Vorentwicklung mit
demineralisiertem Wasser als Fließmittel (ca. 16h, über Nacht) unterzogen. Dadurch werden
fertigungsbedingte Verunreinigungen am oberen Ende der Platte als gelbliche Zone
konzentriert.
153
Experimenteller Teil
Radioaktiv-Markierung zur Bestimmung der „Normals“
2.5µl des enzymatischen DNA-Verdaus werden 1:1500 verdünnt. Dazu werden 2.5µl des
Hydrolysats zu 247µl Wasser gegeben. Dann werden 10µl dieser Lösung zu 140µl Wasser
pipettiert. 5µl dieser 1:1500-Verdünnung werden zu 2.5µl TRIS-Puffer (10mM, pH 9.0)
gegeben. Zu dieser Nukleotid-Lösung (Volumen 7.5µl) werden 2.5µl eines frisch
hergestellten „Label-Mix“, bestehend aus 1µl Kinase-Puffer (200mM Bicin, 100mM DTT,
100mM Magnesiumchlorid, 10mM Spermidin, pH 9.5), 0.5µl ATP (90µM), 0.34µl T4-PNK
(30U/µl), 100µCi [γ-32P]-ATP (Volumen abhängig von Aktivität) und Wasser (Differenz zu
2.5µl) zugegeben. Zu beachten ist dabei, dass die Kinase als letztes dem „Label-Mix“
beigefügt wird. Die Inkubationsdauer beträgt 30min bei Raumtemperatur. Die 2’Desoxynukleosid-3’-Phosphate werden dabei in 3’,5’-(32P)-Nukleosid-Bisphosphate überführt
und anschließend chromatographisch getrennt.
Chromatographische Trennung der „Normals“
4µl der Lösung der markierten Nukleotide werden entnommen und mit 750µl TRIS-Puffer
(10mM, pH 9.0) verdünnt. Von dieser Verdünnung werden je Probe 5µl 2cm vom unteren
Rand entfernt auf eine PEI-Cellulose-DC-Folie aufgetragen. Die Entwicklung erfolgt in
0.28M NH2SO4, 50mM NaH2PO4, pH 6.5. Nach Trocknung im Warmluftstrom wird die
Radioaktivität mit einem Instant-Imager gemessen.
Butanol Anreicherung der DNA-Addukte
Diese Methode wurde speziell für die Anreicherung großer lipophiler DNA-Addukte
entwickelt. Dabei werden die veränderten Nukleotide in die lipophile Phase (Butanol)
ausgeschüttelt und so von den deutlich hydrophileren Normals abgetrennt, bzw. stark
angereichert. Zu den erhaltenen 10µl DNA-Hydrolysat werden 215µl AmmoniumformiatPuffer (11.6mM, pH 3.5) und 25µl Tetrabutylammoniumchlorid-Lösung (10mM) gegeben
und gut gemischt. Die Lösung wird mit 1 Vol. (250µl) H2O-gesättigtem n-Butanol
überschichtet und 2min bei höchster Stufe gevortext, danach für 1min bei 9000rpm bis zur
vollständigen Phasentrennung zentrifugiert. Die Butanolphase (oben) wird in ein neues
Eppendorf-Tube überführt, und der Extraktionsvorgang wie beschrieben wiederholt, die
Butanol-Phasen vereinigt. Zu den ca. 500µl organische Phase werden 400µl Butanol
gesättigtes Wasser gegeben und wie beschrieben zweimal extrahiert. Dieses Mal wird nach
jedem Extraktionsvorgang die untere, wässrige Phase mit einer Spritze (abgeschnittene
Kanüle) entnommen und verworfen. Die letztendlich erhaltene Butanolphase wird mit 3µl
154
Experimenteller Teil
Tris-Puffer (250mM) neutralisiert und an der Speed-Vac zur Trockene eingeengt. Der
Rückstand wird in 50µl Butanol aufgenommen, das Tube gevortext („geschnippt“) und erneut
zur Trockene einrotiert. Der Rückstand wird in 16µl H2O gelöst und für die Analyse der
Addukte verwendet.
Nuklease P1 Anreicherung der DNA-Addukte
Bei diesem von Reddy und Randerath [6] erstmals beschriebenen Verfahren wird die
Eigenschaft der Nuklease P1 ausgenutzt 2’-Desoxynukleosid-3’-Monophosphate zu
dephosphorylieren. Große sperrige („bulky“) Addukte werden dabei von dem Enzym nicht als
Substrat akzeptiert, was dazu führt, dass nur unmodifizierte 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphate
zu 2’-Desoxynukleosiden verdaut werden. So erreicht man eine relative Anreicherung der
Addukte. Die Methode ist nicht universell anwendbar, da kleinere Addukte (z. B. alkylierte)
oder bestimmte großvolumige C8-Addukte zum Teil dephosphoryliert werden.
Zu den restlichen 10µg Hydrolysat werden 3µl NP-1 Mix, bestehend aus 1.25µl Nuklease P1
(4µg/µl), 0.65µl Natriumacetat pH 5.0 (0.8M), 0.65µl ZnCl2 (2mM) und 0.45µl H2O, gegeben
und 30min bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wird die Reaktion durch Zugabe von 3µl TrisPuffer (0.427M) gestoppt.
32
P-Postlabeling der DNA-Addukte
Nach DNA-Verdau und Anreicherung folgt nun die eigentliche Markierungsreaktion. Die
(verbliebenen)
2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphate
werden
durch
enzymatische
Phosphorylierung mit der T4-PNK in die 3’,5’(32P)-Nukleosid-Bisphosphate überführt. Dazu
werden die nach Anreicherung erhaltenen 16µl mit 4µl des unter „Normals“ beschriebenen
Labeling-Cocktails gemischt und 30min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird
der gesamte Ansatz vorsichtig am Origin (s. Abb. 82) aufgetragen und in Richtung D1
(Laufmittel s. u.) entwickelt. Insgesamt sind vier DC Entwicklungen nötig, auf die Richtung
D2 kann im Allgemeinen verzichtet werden. Hierbei sind D1 und D5 Waschschritte über
Nacht, bei denen übrig gebliebene unmodifizierte Nukleotide und radioaktives ATP auf ein
angeheftetes Filterpapier abgetrennt werden. Die eigentliche zweidimensionale Trennung der
DNA-Addukte erfolgt mit den Laufmitteln D3 und D4.
155
Experimenteller Teil
Nach den entsprechenden Läufen wird die Platte an den gestrichelten Linien geschnitten. Die
Aktivitätsbestimmung der erhaltenen Addukt-Spots erfolgt mittels eines Instant Imagers.
paper wick
D1
Origin
D4/5
DNA Addukte
D2
D3
Abb. 82: Schema der mehrdirektionalen Dünnschichtchromatographie
D1: 1M Natriumphosphat-Puffer, pH 6.8
D3: 3.5M Lithiumformiat-Puffer, 8.5 M Harnstoff, pH 3.5
D4: 0.8M Lithiumchlorid, 0.5 M Tris, 8.5 M Harnstoff, pH 8.0
D5: 1.7M Natriumphosphat-Puffer, pH 6.0
5.2.2 Fluoreszenzmarkierung enzymatischer DNA-und RNA-Hydrolysate
Auf Grund der Hydrolysempfindlichkeit von RNA wurde darauf geachtet, dass alle
verwendeten Lösungen mit RNase freiem Wasser bereitet wurden und die Arbeitsflächen und
Geräte entsprechend mit RNase freeTM (Continental Laboratory Products, San Diego)
behandelt waren.
Bestimmung der DNA-Konzentration
Die DNA-Konzentration genomischer DNA wurde entsprechend der bei der 32P-PostlabelingMethode angegebenen Gleichung ermittelt. Im Fall von Oligonukleotiden erfolgt die
Bestimmung der Konzentration nach:
156
Experimenteller Teil
c(DNA) [µg/ml] = OD260 · 30 · Verdünnung
oder es wurde die Konzentrationsangabe des Herstellers verwendet.
Enzymatische DNA-Hydrolyse zu 2’-Desoxyribonukleosid-3’-Monophosphaten
Durch Verwendung von Mikrokokken-Nuklease (MN) und Phosphodiesterase aus Kalbsmilz
(SPD) wird DNA zu 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphaten hydrolysiert. Je Probe werden
Aliquots der DNA-Proben/Oligonukleotide, die 10µg DNA enthalten, im Vakuum zur
Trockene eingeengt und in 5µl destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung werden 5µl
eines Enzym-Mixes gegeben, der aus 1µl Verdaupuffer (100mM CaCl2, 250mM HEPES, pH
6.0) und 5µl MN/SPD Mischung besteht. Je nach Adduktierung wurden verschiedene
Konzentrationen an SPD eingesetzt:
1-fach SPD: 2.5mU/µl SPD, 150mU/µl MN
5-fach SPD: 12.5mU/µl SPD, 150mU/µl MN
15-fach SPD: 72.5mU/µl SPD, 150mU/µl MN
Die Lösung wird 3h bei 37°C inkubiert.
Enzymatische DNA-Hydrolyse zu 2’-Desoxyribonukleosid-5’-Monophosphaten mit NP1
Unter Verwendung von NP1 wird DNA zu 2’-Desoxynukleosid-5’-Monophosphaten verdaut.
Dazu werden Aliquots der DNA-/Oligonukleotidproben an der Speed-Vac lyophilisiert und in
6µl 50mM MES Puffer pH 5.5 gelöst. Nach Zugabe von 2µl 2mM ZnCl2 Lösung (in Wasser)
und 2µl NP1 (0.266µg = 0.2U) wurde der Ansatz 2h bei 37°C inkubiert
Enzymatische RNA-Hydrolyse zu Ribonukleosid-5’-Monophosphaten mit Nuklease P1
10µg RNA oder Oligoribonukleotid wurden unter den gleichen Bedingungen wie DNA zu
den entsprechenden Ribonukleosid-5’-Monophosphaten verdaut.
Enzymatische DNA-Hydrolyse zu 2’-Desoxyribonukleosid-5’-Monophosphaten mit
DNaseI/SVPD
a) Methode nach Liuzzi und Weinfeld [119, 120]
Die beschriebenen und in Tab. 39 wiedergegebenen Inkubationsbedingungen wurden
übernommen, außer dass der 10mM Tris-EDTA-Puffer pH 7.5 durch HEPES 10mM pH 7.5
157
Experimenteller Teil
ersetzt wurde. 10µg zur Trockene eingeengte DNA wurden im Puffer gelöst, die
Enzymlösung zugegeben und der Ansatz 16h bei 37°C inkubiert.
Tab. 39: Modifizierte Bedingungen für die DNA-Hydrolyse zu 2’-Desoxynukleosid-5’-Phosphaten nach
Liuzzi et al. und Weinfeld et al. [119, 120]
Substanz
Menge
Endkonzentration
10µg (30.8nmol)
770µM
DNaseI gelöst in H2O
2µl (2U/µl)
0.1U/µl
SVPD gelöst in H2O
2µl (0.02U/µl)
1mU/µl
CT-DNA
HEPES 10mM, 4mM MgCl2 pH 7.5
36µl
Gesamtvolumen
40µl
b) Methode nach Dipple und Piggot [121]
Die beschriebenen Bedingungen wurden an die Bedingungen der CE-LIF-Methode angepasst
indem die verwendeten Tris-Puffer durch HEPES gleicher Molarität und gleichen pH-Wertes
ersetzt wurden (s. Tab. 40). 10µg zur Trockene eingeengte CT-DNA Stammlösung wurden im
Puffer gelöst und nach Zugabe der DNaseI 1h bei 37°C inkubiert. Danach wurde die SVPD
zugegeben und eine weitere Inkubation von 48h bei 37°C angeschlossen.
Tab. 40: Modifizierte Bedingungen für die DNA-Hydrolyse zu 2’-Desoxynukleosid-5’-Phosphaten nach
Dipple und Piggot [121]
Substanz
Menge
Endkonzentration
10µg (30.8nmol)
770µM
2µl (0.1mg = 200U)
6.67U/µl
Schritt 1:
CT-DNA
DNaseI gelöst in H2O
HEPES 10mM, 1mM MgCl2 pH 7.0
26µl
Schritt 2:
SVPD gelöst in H2O
10µl (0,1U)
HEPES 200mM pH 9.0
20µl
Gesamtvolumen
60µl
1.67mU/µl
Chemische Derivatisierung von 2’-Desoxyribonukleosid-3’-Monophosphaten
Das DNA Hydrolysat (10µl) wird zunächst mit 20µl 0.8M HEPES-Puffer pH 6.5 versetzt.
Danach werden 30µl einer 25mM BODIPY-FL-EDA Lösung (0.3mg in 33µl HEPES 0.8M,
pH 6.5) und 30µl einer 1.8M EDC-Lösung (11.2mg in 32.5µl HEPES 0.8M pH 6.5)
158
Experimenteller Teil
zugegeben, gut vermischt (Vortex) und der Ansatz unter Lichtausschluss 25h bei 25°C
inkubiert.
Chemische
Derivatisierung
von
2’-Desoxyribonukleosid-5’-Monophosphaten
und
Ribonukleosid-5’-Monophosphaten
Die Lösung aus der DNA- bzw. RNA-Hydrolyse (10µl) wird zunächst mit 20µl 0.25M MES
Puffer pH 6.5 vermischt. Danach werden 30µl einer 25mM BODIPY-FL-EDA Lösung
(0.3mg in 33µl MES 0.25M, pH 6.5) und 30µl einer 1.8M EDC-Lösung (11.2mg in 32.5µl
MES 0.25M, pH 6.5) zupipettiert und gut vermischt (Vortex). Der Ansatz wird unter
Lichtausschluss 25h bei 25°C inkubiert.
5.2.3. Kapillarelektrophorese
Kapillarkonditionierung
Eine neu installierte Kapillare wurde unabhängig vom Gerätetyp (BioRad oder PACE/MDQ)
vor der ersten Messung konditioniert, indem sie nacheinander 15min mit 1M NaOH, 15min
mit 1M HCl, 15min mit 1M NaOH, 5min mit destilliertem Wasser (Millipore) und 15min mit
dem entsprechenden Trennpuffer gespült wurde (High pressure Mode für BioRad, 50psi für
PACE/MDQ). Anschließend wurde für 120min ein Strom von 20KV angelegt.
Kapillarspülung
Nach ungefähr 15-20 Analysen macht sich die Belegung der Innenwand der Glaskapillare mit
Proteinen aus der Hydrolyse der DNA Proben durch eine schlechtere Trennung der
Nukleotid-Bodipy Konjugate bemerkbar, v. a. durch verstärktes Tailing, bzw. deutlich längere
Migratioszeiten. Daher wurde ein Spülschritt mit Methanol entwickelt, der die Proteine aus
der Kapillare entfernen soll. Dabei wurde folgende, optimierte Spülsequenz benutzt: 3min
dest. Wasser (Millipore), 10min Methanol, 5min dest. Wasser (Millipore), 5min SDS
(200mM), 10min 1M NaOH, 5min dest. Wasser (Millipore), 10min Trennpuffer und
anschließend für 120min 20KV angelegt. Die Beckman PACE/MDQ wurde mit 20psi, die
BioRad im High Pressure Mode gespült.
Kapillarelektrophoretische Trennung (Analyse)
Zwischen den Analysenläufen wurde die Kapillare jedesmal für 1min mit 200mM SDS,
1.5min mit 1M NaOH, 1min mit dest. Wasser (Millipore) und 2min mit dem Trennpuffer
gespült um die Kapillare für die nächste Analyse vorzubereiten, d. h. den Bodipy-Überschuss
159
Experimenteller Teil
des letzten Laufes auszuwaschen und möglichst auch alle weiteren an die Kapillaroberfläche
adsorbierten Substanzen (z.B. Proteine) zu entfernen. Danach wurde die Probe
hydrodynamisch injiziert (PACE 2.5x psi·s, BioRad 20x psi·s), 20 000V (25 000V bei der
BioRad-Anlage) zwischen den beiden Kapillarenden angelegt und das Kapillaroutlet
kathodisch geschaltet. Ein gewöhnlicher Analysenlauf dauert 40min, die Signale der BodipyNukleotid-Konjugate erscheinen in der Regel zwischen 17 und 30 Minuten.
Herstellung der Elektrolyte (Standardvorschrift)
Für
den
Natriumphosphatpuffer
Natriumdihydrogenphosphat
werden
(NaH2PO4)
und
zwei
Stammlösungen
von
Dinatriumhydrogenphosphat
20mM
(Na2HPO4)
angesetzt. Dazu werden 1.3799g NaH2PO4 in genau 0.5l destilliertem Wasser (Millipore)
gelöst, sowie 1.7799g NaH2PO4 · 2H2O ebenfalls in genau 0.5l destilliertem Wasser
(Millipore) gelöst. Von der 20mM NaH2PO4 Lösung (pH ca. 9.2-9.5 je nach Wasserqualität)
wird die gewünschte Menge vorgelegt und mit der 20mM NaH2PO4 Lösung auf pH 9.0 bei
25°C eingestellt.
Die gewünschte Menge an Natriumlaurylsulfat (SDS) wird in einem 50ml Falcon Tube
eingewogen (für 75mM SDS 1.0814g, für 90mM SDS 1.2968g) und in der entsprechenden
Menge Natriumphosphat-Puffer pH 9.0 gelöst. Die Menge hängt vom Methanolgehalt (v/v)
des Puffers ab:
75mM SDS, 15% Methanol: 1.0814g SDS in 42.5ml Natriumphosphat-Puffer lösen, 7.5ml
Methanol zugeben, gut mischen und über Nacht stehen lassen. (Endkonzentrationen 17mM
Na-Phosphat Puffer, 75mM SDS, 15% Methanol (v/v), pH 9.0
75mM SDS, 20% Methanol: 1.0814g SDS in 40ml Natriumphosphat-Puffer lösen, 10ml
Methanol zugeben, gut mischen und über Nacht stehen lassen. (Endkonzentrationen 16mM
Na-Phosphat Puffer, 75mM SDS, 20% Methanol (v/v), pH 9.0
90mM SDS, 10% Methanol: 1.2968g SDS in 45ml Natriumphosphat-Puffer lösen, 5ml
Methanol zugeben, gut mischen und über nacht stehen lassen. (Endkonzentration 18mM NaPhosphat Puffer, 90mM SDS, 10% Methanol (v/v), pH 9.0
Für Puffer die Glukose enthalten wird eine entsprechende Menge an D(+)-Glukose, in 0.5l
(90.08g für 1M) des 20mM Natriumphosphat-Puffers pH 9.0 (s.o.) gelöst, sterilfiltriert und im
Kühlschrank gelagert. Diese Stammlösung kann wie der normale Natriumphosphat-Puffer
zum Lösen des SDS eingesetzt werden, bzw. die benötigte Verdünnung für Trennpuffer, die
160
Experimenteller Teil
weniger Glukose enthalten. Vor Gebrauch sollte der pH-Wert der Stammlösung überprüft und
gegebenenfalls nachjustiert werden. Es ist dabei zu beachten, dass sich die Molarität der
Glukose durch die Zugabe von Methanol verändert.
Im Falle des zur Trennung von pdU-Bodipy aus Bisulfit-behandelter DNA verwendeten 0.5M
Glukose-Puffers wurden 25ml 1M Glukose-Stammlösung in 20mM Natrium-Phosphatpuffer,
pH 9.0 mit 21ml Natrium-Phosphatpuffer, pH 9.0, gemischt, 1.08142g SDS darin gelöst und
4ml Methanol zugegeben.
Tab. 41: Übersicht über die getesteten Trennpuffer zur Analyse von p5mdC-Bodipy
Pufferzusammensetzung
Verhältnis
Methanol/SDS
Konzentration
Konzentration
Konzentration
SDS
Methanol [% v/v]
Natriumphosphat
50mM
20%
16mM
0.4
75mM
5%
19mM
0.067
75mM
7.5%
18.5mM
0.1
75mM
10%
18mM
0.133
75mM
15%
17mM
0.2
75mM
20%
16mM
0.267
90mM
5%
19mM
0.055
90mM
7.5%
18.5mM
0.083
90mM
10%
18mM
0.111
100mM
5%
19mM
0.05
Natriumlaurylsulfat (SDS) 200mM:
2.5954g SDS werden in einem 50ml Falcon-Tube eingewogen und in 45ml destilliertem
Wasser (Millipore) gelöst.
161
Experimenteller Teil
Ausführliche Auswertung der 8-oxo-dG enthaltenden Oligonukleotide
Tab. 42: CE-LIF-Analyse von Oligonukleotid Nr. 995397 nach NP1-Verdau und Fluoreszenzmarkierung
mit BODIPY-FL-EDA
Oligo 995397
pdA
pT
pdC
8-oxo-pdG
pdG
11312703 ±
309842
4028325±
89254
7157384 ±
171987
257986 ±
8325
2140755 ±
50426
19.75
20.77
22.00
21.52
23.09
572819 ±
11442
193938 ±
2690
325287 ±
4735
11984 ± 270
92709 ±
1145
Nukleotidverhältnis
47.80 ± 0.82
16.19 ± 0.27
27.15 ± 0.40
1.0 ± 0.00
7.74 ± 0.09
Gem. Nukl.-Anteil (%)
47.86 ± 0.16
16.21 ± 0.05
27.18 ± 0.06
1.00 ± 0.02
7.75 ± 0.06
Tats. Nukl.-Anteil (%)
35.29
17.64
23.52
5.88
17.64
0.74 ± 0.003
1.09 ± 0.007
0.87 ± 0.003
5.87 ± 0.091
2.28 ± 0.018
1.00
1.05
1.11
1.09
1.17
Fläche [Einheiten]
Migrationszeit [min]
Korrigierte Peakfläche
Korrekturfaktor
Norm. Migrationszeit
Tab. 43: CE-LIF-Analyse von Oligonukleotid Nr. 995398 nach NP1-Verdau und Fluoreszenzmarkierung
mit BODIPY-FL-EDA
Oligo 995398
pdA
pT
pdC
8-oxo-pdG
pdG
7270749 ±
301737
9539603±
424587
5552866 ±
224781
484725 ±
6760
1910232 ±
92961
19.27
20.23
21.37
20.90
22.35
377821 ±
9591
471441 ±
12981
259372 ±
5596
23201 ± 291
85438 ±
2395
Nukleotidverhältnis
32.58 ± 1.22
40.65 ± 1.61
22.40 ± 0.75
1.0 ± 0.00
7.37 ± 0.30
Gem. Nukl.-Anteil (%)
31.03 ± 0.03
38.72 ± 0.11
21.33 ± 0.07
1.91 ± 0.07
7.02 ± 0.02
Tats. Nukl.-Anteil (%)
21.05
36.84
15.79
10.53
15.73
0.75 ± 0.013
0.95 ± 0.021
0.84 ± 0.009
6.31 ± 0.238
2.56 ± 0.132
1.00
1.05
1.11
1.09
1.16
Fläche [Einheiten]
Migrationszeit [min]
Korrigierte Peakfläche
Korrekturfaktor
Norm. Migrationszeit
162
Experimenteller Teil
Tab. 44: CE-LIF-Analyse von Oligonukleotid IBA5 nach NP1-Verdau und Fluoreszenzmarkierung mit
BODIPY-FL-EDA
Oligo IBA5
pdA
pT
pdC
8-oxo-pdG
pdG
5695723 ±
81178
5723605±
237427
5513460 ±
110645
137689 ±
16988
1130598 ±
103624
17.62
18.37
19.34
18.91
20.32
323074 ±
5426
290885 ±
13399
285548 ±
6254
7648 ± 67
56653 ±
4476
Nukleotidverhältnis
42.11 ± 0.87
38.39 ± 2.13
37.27 ± 1.06
1.0 ± 0.00
7.50 ± 0.70
Gem. Nukl.-Anteil (%)
33.54 ± 0.59
30.18 ± 0.62
29.64 ± 0.33
0.76 ± 0.07
5.87 ± 0.30
Tats. Nukl.-Anteil (%)
25.00
30.00
25.00
5.00
15.00
0.68 ± 0.001
0.95 ± 0.003
0.74 ± 0.002
5.53 ± 0.204
2.25 ± 0.007
1.00
1.046
1.105
1.081
1.162
Fläche [Einheiten]
Migrationszeit [min]
Korrigierte Peakfläche
Korrekturfaktor
Norm. Migrationszeit
5.2.4 In vitro Systeme
In vitro Adenin-Methylierung
Die in vitro Methylierung des Lambda-Phagen Genoms wurde angelehnt an die Vorschrift des
Herstellers (New England Biolabs) durchgeführt, alle Reagenzien wurden jedoch im
Überschuss eingesetzt um eine wirklich vollständige Methylierung aller GATC Sequenzen
des Genoms zu erreichen.
2µg (4µl) der N6-Methyladenin-freien Lambda-Phagen DNA wurden mit 27.5µl
bidestilliertem Wasser gemischt und mit 4µl 10fach reaction buffer versetzt. Das mitgelieferte
S-Adenosyl-Methionin wurde 1:10 mit bidestilliertem Wasser verdünnt und davon 2.5µl zum
Reaktionsansatz zugegeben. Zum Schluss wurden noch 2µl (16U) der dam Methylase
zupipettiert und der Ansatz für 2h 30min bei 37°C inkubiert.
Nach der Methylierung wurde die DNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit unter
Verwendung des Herstellerprotokolls aufgereinigt:
•
Zugabe von fünf Teilen Puffer PB (200µl)
•
Probe auf die Membran der „spin column“ pipettieren und 60s bei 13 000rpm
zentrifugieren (DNA bindet an die Membran)
•
Eluat verwerfen
•
Zum Waschen 750µl Puffer PE auf die Membran pipettieren und wiederum 60s bei
13000rpm zentrifugieren
163
Experimenteller Teil
•
Eluat verwerfen und das leere Tube nochmals 1min bei 13 000 rpm zentrifugieren um
übrig gebliebenes Ethanol zu entfernen
•
„Spin column“ mit der an die Membran gebundenen DNA aus dem Tube nehmen und
in ein sauberes Eppendorf Gefäß (1.5ml) überführen.
•
30µl bidestilliertes Wasser auf die Membran geben, 5min bei Raumtemperatur
einwirken lassen und dann 1min zentrifugieren (13 000rpm) um die DNA zu eluieren.
Restriktionsverdau (restriction/protection assay) zur Überprüfung der Vollständigkeit
der Methylierung
DpnII ist ein Restriktionsenzym, das die Sequenz GATC nur dann schneidet, wenn das
Adenin nicht methyliert ist. Dabei hinterlässt das Enzym überstehende GATC Enden („sticky
ends“). Im Gegensatz zu der N6 methyl-dA freien Lambda-Phagen DNA sollte die vollständig
methylierte DNA nach der Behandlung mit dam Methylase nicht zerschnitten werden,
Wildtyp DNA von Lambda-Phagen aus dam+ E. Coli sollte wegen der natürlichen,
unvollständigen Methylierung, deutlich weniger Bruchstücke aufweisen.
Es wurde eine etwas abgewandelte Methode des Enzymherstellers (NEB) verwendet.
Die 30µl Eluat aus der Methylierungsreaktion wurden mit 4µl 10fach konzentriertem DpnII
Puffer gemischt, dann 4µl bidestilliertes Wasser und zum Schluss 1µl DpnII Lösung (10U)
zugegeben und 2h bei 37°C inkubiert. Das Ergebnis wurde über ein 1% Agarose/1xTBE-Gel
mit 0.03% Ethidiumbromid bestimmt. Die 40µl wurden mit 5µl loading buffer vermischt und
komplett aufgetragen, die Spannung betrug 60V bei 60mA und 4 Watt (ca. 45min). Zur
anschließenden Betrachtung unter UV-Licht wurde das Imaging-System Herolab Wiesloch
(E.A.S.Y 429K Kamera, E.A.S.Y RH-3 Dunkelhaube; Software E.A.S.Y Win32) verwendet.
Extraktion der unverdauten DNA aus dem Agarosegel:
Die Extraktion der DNA aus dem Gel hat den Vorteil, dass bei einer nicht vollständig
verlaufenen Methylierung nur die unverdaute Bande (d.h. komplett methylierte DNA)
ausgeschnitten und verwendet werden kann.
Die Extraktion wurde mit dem QIAquick Gel Extraktion Kit nach Vorschrift des Herstellers
durchgeführt:
•
164
Ausschneiden der Bande aus dem Agarosegel
Experimenteller Teil
•
Zu je 100mg Gel 300µl Puffer QC pipettieren und bei 50°C für 10min inkubieren. Zur
besseren Auflösung des Gels alle 2-3min kurz vortexen.
•
Wenn das Gel komplett gelöst ist sollte die Farbe der Mischung gelb sein (ähnlich wie
die Pufferfarbe vor dem Auflösen des Gels)
•
Pro 100mg Gel 100µl Isopropanol zugeben und Mischen
•
Die Lösung auf die Membran einer „spin column“ geben und wie oben beschrieben
die DNA isolieren.
Bisulfit-Behandlung von Kalbsthymus DNA
EcoRI verdaute DNA wurde wie beschrieben [127, 128] denaturiert und mit Natriumbisulfit
behandelt. Kalbsthymus DNA (2µg) wurde in einem Volumen von 50µl mit Natronlauge
(Enkonzentration 0.2mM) 30min bei 37°C denaturiert. Frisch zubereitete Hydrochinonlösung
(30µl, 10mM) und Natriumbisulfit-Lösung (3M, 520µl, pH 5.0) wurden zugegeben, gemischt
und der Ansatz unter einer Ölschicht 14h bei 55°C inkubiert. Anschließend wurde die DNA
mit dem Gene Clean Kit (Qbiogene) nach Vorschrift des Herstellers aufgereinigt und in 100µl
Wasser eluiert. Die Modifikation wurde durch eine 20minütige Behandlung mit NaOH bei
37°C abgeschlossen, die DNA mit Ethanol gefällt und bis zur Analyse in Wasser gelöst bei 20°C aufbewahrt (max. 2 Wochen).
Behandlung von CT-DNA mit 3-NBA in vitro
Zur in vitro Adduktierung von DNA mit Nitroaromaten gibt es 3 StandardAktivierungssysteme: Reduktion mit Zink, Xanthinoxidase oder S9 Mix.
Inkubation mit Zink: 250µl Kaliumphosphat-Puffer (100mM, pH 5.8) wurden mit 158µl CTDNA Lösung (3mg/ml) und 18µl 3-NBA Stammlösung in einem Pyrex®-Röhrchen gemischt
und mit 74µl H2O auf 500µl Gesamtvolumen aufgefüllt. Nach Zugabe von 20mg Zink wurde
der Ansatz 3h bei 37°C inkubiert. Die Farbe schlug dabei von leicht gelb nach rosa um
(Reduktion zum Aminobenzanthron). Nach der Inkubation wurde das Zink abzentrifugiert,
der Überstand entnommen und mit 1ml Ethylacetat extrahiert. Die DNA wurde nach Zugabe
von 50µl NaCl-Lösung (5M) mit 1.25ml Ethanol (-20°C) gefällt.
165
Experimenteller Teil
Deaminierung von DNA mit Natriumnitrit nach Suzuki et al. [132]
100µg Kalbsthymus-DNA gelöst in 1ml 3 M Natriumacetat-Puffer pH 3.7 wurden mit 100µl
NaNO2-Lösung (1M in Wasser) versetzt und 6h bei 37°C inkubiert. Ausfällen der DNA mit
2.5 Vol. Ethanol (-20°C) war anschließend aufgrund der starken Schädigung der DNA nicht
mehr möglich, daher wurde für die Isolierung der DNA eine Sephadex-NAP G-25M Säule
verwendet (Herstellervorschrift).
5.3 Synthesen von Addukt-Standardverbindungen
Alle Verbindungen wurden von Martin Osborne, Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey
synthetisiert.
1-N2-Propano-2’-Desoxyguanosin-3’-Monophosphat (Hex-dGp)
(6S,8S) und (6R,8R)-3-(2’-deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl-3’-phosphat)5,6,7,8-tetrahydro8-hydroxy-6-propylpyrimodo[1,2-a]purin-9(3H)-on
Martin Osborne, Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey
OH
O
N
N
HO
N
N
N
H
O
H
HO
H
H
O
H
P
H
O
OH
Die Synthese wurde nach der Methode von Schuler et al. [152] durchgeführt.
14mg (0.04mmol) 2’-Desoxyguanosin-3’-Monophosphat (dGp) Natriumsalz wurden mit 50µl
Hexenal (0.43mmol) in einem 0.1M Natriumphosphatpuffer, pH 10.7, bei 37°C für vier Tage
zur Reaktion gebracht. Das Hexenal wurde danach dreimal mit je 0.7ml Diethylether
extrahiert und der Ether mit Stickstoff abgeblasen.
Die Produkte wurden mittels präparativer HPLC aufgereinigt und bei 254nm detektiert:
Jupiter ODS (Phenomenex, Macclesfield) 250 x 4.6mm, Laufmittel A: Ammoniumformiat
0.05M, pH 6.0, Laufmittel B Methanol, Flussgeschwindigkeit: 0.8ml/min. Es wurde ein
diskontinuierlicher Gradient bei Raumtemperatur verwendet: 0-10% Methanol in 5min, auf
25% Methanol in 25min, dann auf 40% Methanol in 10min. Zwei Peaks wurden gesammelt,
Hex-dGp1 bei ca. 40min und Hex-dGp2 bei ca. 42min. Die Produktfraktionen wurden
166
Experimenteller Teil
eingeengt und mit einer Waters C-18 Sep Pak Säule entsalzt. Ausbeuten: 4mg Hex-dGp1 und
5.3mg Hex-dGp2 (9.3mg gesamt = 52%).
UV-Spektrum, MS und H1-NMR entsprechen der Literatur [152].
1-N2-Propano-2’-Desoxyguanosin-5’-Monophosphat (Hex-pdG)
(6S,8S) und (6R,8R)-3-(2’-deoxy-ß-D-erythro-pentofuranosyl-5’-phosphat)5,6,7,8-tetrahydro8-hydroxy-6-propylpyrimodo[1,2-a]purin-9(3H)-on
OH
O
N
N
OH
HO
P
O
N
N
N
H
O
O
H
H
H
OH
H
H
Die Synthese wurde analog zu den 3’-Phosphaten nach [152] durchgeführt.
30mg (0.86mmol) 2’-Deoxyguanosin-5’-Monophosphat (pdG) Natriumsalz wurden mir 50µl
(0.43mmol) Hexenal in einem 100mM Natriumphosphat-Puffer, pH 10.7, versetzt und acht
Tage bei Raumtemperatur, bzw. vier Tage bei 37°C inkubiert. Nicht abreagiertes Hexenal
wurde dreimal mit je 0.7ml Diethylether extrahiert und der Ether mit Stickstoff abgeblasen.
Die Produkte wurden mittels präparativer HPLC aufgereinigt und bei 254nm detektiert:
Jupiter ODS (Phenomenex, Macclesfield) 250 x 4.6mm, Laufmittel A: Ammoniumformiat
0.05M, pH 6.0, Laufmittel B Methanol, Flussgeschwindigkeit: 0.8ml/min. Die Trennung der
Produkte erfolgte mit einem Gradienten von 0 auf 40% Methanol in 40min. Nicht
umgesetztes pdG eluierte bei ca. 9min, die beiden Produkte Hex-pdG1 und Hex-pdG2 bei ca.
40 und 42min.
Ausbeuten: 1.7mg Hex-pdG1 und 1.9 Hex-pdG2 (3.6mg gesamt = 5%)
UV, MS, H1-NMR entsprechen der Literatur
167
Experimenteller Teil
8-Hydroxy-2’-Desoxyguanosin-3’-Phosphat (8-oxo-dGp)
O
N
NH
HO
N
HO
N
NH2
O
H
O
H
H
O
H
H
OH
P
OH
Die Synthese wurde analog der in der Literatur beschriebenen Methode [138] durchgeführt.
Zu 4mg (0.01mmol) 2’-Desoxyguanosin-3’-Monophosphat (pdG) Natriumsalz, gelöst in
0.4ml Wasser, wurden 160µl Natriumascorbat-Lösung (34g/l Wasser), 160µl KupfersulfatLösung (5g/l Wasser) und 100µl Wasserstoffperoxid-Lösung (28%) zugegeben und der
Ansatz 15min bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC
isoliert und bei 254nm detektiert: Jupiter ODS (Phenomenex, Macclesfield) 250 x 4.6mm,
Ammoniumformiat 25mM, pH 4.7, isokratisch; Flussgeschwindigkeit: 0.8ml/min. Der letzte
Peak war 8-oxo-dGp (ca. 12min). Die gesammelten Fraktionen wurden lyophilisiert und über
eine C18 Säule (Sep-Pak, Waters) entsalzt.
Ausbeute: ca. 0.2mg (5%). Aufgrund der geringen Ausbeute wurde auch das dGp wieder
aufgereinigt und erneut umgesetzt bis letztendlich 0.8mg 8-oxo-dGp erhalten wurden.
UV-Spektrum, MS und H1-NMR entsprechen den Literaturangaben.
8-Hydroxy-2’-Desoxyguanosin-5’-Phosphat (8-oxo-pdG)
O
N
NH
HO
N
O
HO
P
O
N
NH2
O
OH
H
H
H
OH
H
H
Synthese und Aufreinigung wurden wie bei der Synthese des 3’-Phosphates durchgeführt.
Ausbeute: ca. 1.7mg
UV-Spektrum, MS und H1-NMR entsprechen den Literaturangaben.
168
Literaturverzeichnis
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Danksagungen
7 Danksagungen
Mein Dank gilt ganz besonders Herrn PD Dr. H. Schmeiser für die ausgezeichnete Betreuung,
die interessante Themenstellung und die stete Gesprächs- und Hilfsbereitschaft. Die
freundschaftliche Atmosphäre, die wohlwollende Förderung meiner Arbeit, sowie die
gewährten Freiheiten waren Grundlage für den Erfolg dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. G. Fricker danke ich für die freundliche Übernahme des zweiten Referates.
Für die freundliche Übernahme der Nebenfachprüfung gilt mein Dank auch auch Herrn Prof.
Dr. Reichling.
Herrn Prof. Dr. M. Wießler danke ich für die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe,
die Unterstützung meines DBU-Antrages, die stete Diskussionsbereitschaft bei allen
chemischen Problemen und die Übernahme der zweiten Nebefachprüfung.
Weiterhin gilt mein herzlichster Dank:
• meinem ersten Laborkollegen Dirk Stach, für seine geduldige Einführung in alle
Fragen der Kapillarelektrophorese, die allzeit gute Zusammenarbeit und seine
Gesellschaft in der Exklave unserer Abteilung.
• meinem zweiten Laborkollegen und Nachfolger Jochen vom Brocke für die gute
Laboratmosphäre, die interessanten Diskussionen und seine Hilfe als mein
verlängerter Arm in Heidelberg während der Fertigstellung der Dissertation.
• Herrn PD Dr. O. Schmitz (Universität Wuppertal) für seine Hilfsbereitschaft bei allen
CE-Problemen und seine Korrekturen und Anmerkungen zum Manuskript dieser
Arbeit.
• den anderen Korrekturlesern Dr. Christian Bieler, Dr. Regine Garcia-Boy und Dr. H.C. Kliem für die kritische Durchsicht der Arbeit während des Enstehungsprozesses
und ihre wertvollen Kommentare und Anmerkung.
• der Arbeitsgruppe von Dr. Frank Lyko, besonders Cora, Carlo, Joachim, Bodo und
Natascha für ihre Hilfe in allen Fragen der Epigentik und ihre häufigen aufmunternden
Besuche im Labor.
• Hans-Hermann Schrenk für seine Geduld und Hilfe bei der Arbeit mit der HPLC.
• Der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. M. Sauer (Universität Bielefeld) für die
Unterstützung bei den fluoreszenzspektrometrischen Untersuchungen.
• Prof. Dr. D. Philipps, Dr. Volker Arlt und Dr. Martin Osborne (Institute of Cancer
Research, Sutton) für die Synthese der DNA-Addukt Standardverbindungen.
• Ed, Peter, Heinz, Hélène, Andrea und Ilse für ihre Beiträge zum Gelingen dieser
Arbeit.
• der Badmintonfraktion um Regine, Katrin, Britta, Markus und Tobias für ihre
Überredungskünste und Anleitungen zur Aufnahme einer Zweitsportart .
• Evi, Bernd, Evelyn, Thomas, Bettina, Claas, Sonja, Erwin, Christoph, Volker, Markus,
Julio, Annette, Marlis, Maike, Tabea, Jutta, Melanie, Nicole, Anna, Marina und allen
anderen ehemaligen und aktuellen Doktoranden, Praktikanten und Mitarbeitern der
Abteilung für das gute Arbeitsklima und die schöne Zeit.
Der Deutschen Bundesstiftung Umwelt danke ich für die Gewährung eines
Promotionsstipendiums (Aktenzeichen 264/20002), ohne das diese Arbeit nicht möglich
gewesen wäre.
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* Your assessment is very important for improving the work of artificial intelligence, which forms the content of this project