DissMMueller2

DissMMueller2
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich- Mathematischen
Gesamtfakultät
der Ruprecht - Karls - Universität
Heidelberg
vorgelegt von
Dipl.-Phys. Marcel Müller
aus Karl-Marx-Stadt (jetzt Chemnitz)
Tag der mündl. Prüfung: 25.06.07
Entwicklung, Aufbau und Erprobung
eines nicht-invasiven
Temperatur-Gradienten-Infrarot-Emission-Glukometers
zur Bestimmung des Blutzuckers bei Mäusen
Gutachter:
Prof. Dr. Michael Grunze
Prof. Dr. Dr. Christoph Cremer
1
Abstract
Im Rahmen der Entwicklung zu schmerzfreien Methoden für die Behandlung von Diabetes
beschäftigt sich diese Arbeit mit der Konzeption, dem Aufbau und der ersten Erprobung eines
kompakten nicht-invasiven Blutglukose-Messgerätes für Mäuse. Zu diesem Zweck wurde die
aus dem Schwanz der Maus austretende Infrarotstrahlung genutzt, die aufgrund der Differenz
zwischen Körper- und Außentemperatur eine Temperaturgradientenregion innerhalb der
äußeren Hautschichten durchläuft. Dieser Temperaturgradient entspricht einer Durchstrahlung
der Hautschichten, wodurch ein Absorptionsspektrum der beinhalteten Substanzen erzeugt
wird. Im Fingerprint-Bereich der Glukose zwischen 9-10µm wird dadurch eine
Absorptionsmessung und somit eine Konzentrationsbestimmung von Glukose in den
Hautschichten möglich. Die Umsetzung dieser Messung fand mit einer speziell für Mäuse
entwickelten Infrarot-Messeinheit statt, mit der die Geometrie des Mäuseschwanzes optimal
detektiert werden kann. Zur exakteren Bestimmung der Werte wurden mehrere
Einzeldetektoren verwendet, wovon ein Referenzkanal die Hintergrundstrahlung misst. Das
Rauschen der ankommenden Signale wurde zusätzlich mittels Modulation durch ein
Chopperrad und einen in der Software integrierten Lock-in-Effekt stark reduziert. Bei den
Testmessungen konnte beim Vergleich mit konventionellen Glukosetoleranztests gezeigt
werden, dass das hier entwickelte Gerät zur Glukosekonzentration proportionale Messwerte
liefern kann. Vergleichmessungen mit einem implantierten Sensor zeigten einen nahezu
identischen Verlauf der Glukosewerte, wodurch die prinzipielle Funktionsfähigkeit des
Messprinzips deutlich bestätigt wurde.
Focussing on the development of pain-free methods for the treatment of diabetes, this thesis
discusses the design, the construction and the first field tests of a new non-invasive bloodglucose-analyser for mice. For this purpose the infrared radiation from a mouse tail was used.
Thermal radiation passes through a temperature gradient between the body and the ambient
temperature within the outer skin layers. The temperature gradient causes an effective
radiography of the colder skin layers so an absorption spectrum of the finger-print-region
between 9 and 10µm is obtained allowing the determination of the glucose concentration. The
realisation of these measurements reqired an optical geometry adjusted for the optimal
detection of the tail radiation. The implementation of a signal modulation and a lock-in-effect
within the software reduces additionally the noise of the measurement.
The constructed analyser delivers signals proportional to glucose concentration. Continious
glucose measurements were done and compared to an implanted sensor. The glucose values
found in both methods are similar, proofing the concept for the non-invasive blood-glucoseanalyser developed in the thesis.
2
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ............................................................................................................................... 5
2. Theoretische Grundlagen ..................................................................................................... 10
2.1. Chemische Eigenschaften von Glukose ........................................................................ 10
2.2. Wärmeübertragung........................................................................................................ 11
2.2.1. Wärmeleitung ......................................................................................................... 11
2.2.2. Infrarotstrahlung..................................................................................................... 12
2.2.3. Wärmeübertragung in realen Systemen ................................................................. 13
2.3. Spektroskopie ................................................................................................................ 14
2.3.1 Grundlagen der Infrarot-Spektroskopie .................................................................. 14
2.3.2. Infrarot-Detektoren................................................................................................. 16
2.3.3. FTIR-Spektroskopie mit ATR-Aufbau .................................................................. 16
2.3.4. Temperaturgradienten Spektroskopie .................................................................... 17
2.3.5. Spektrum von Glukose ........................................................................................... 19
2.4.Biologische Aspekte....................................................................................................... 22
2.4.1. Das Versuchstier .................................................................................................... 22
2.4.2. Hautschichten ......................................................................................................... 24
2.4.4. Glukose-Toleranz-Test........................................................................................... 26
2.4.5. Herkömmliche Glukosemessungsverfahren........................................................... 26
3. Vorversuche ......................................................................................................................... 29
3.1. Infrarot Untersuchungen von Glukose in flüssigem Blut.............................................. 29
3.2. Optische Simulationen .................................................................................................. 32
4. Aufbau und gewählte Komponenten.................................................................................... 36
4.1. Gesamter Aufbau und geplante Funktionsweise ........................................................... 36
4.2. Spiegel und Halterung ................................................................................................... 39
4.3. Linsen ............................................................................................................................ 43
4.4. Chopper ......................................................................................................................... 44
4.5. Filterfenster ................................................................................................................... 47
4.6. Detektor ......................................................................................................................... 48
3
4.7. Verstärkerschaltung....................................................................................................... 52
4.8. Analog/Digital-Messkarte ............................................................................................. 55
5. Abschätzung des zu erwartenden Messsignals..................................................................... 58
5.1. Berechnung des Signal-Hintergrund-Verhältnisses ...................................................... 58
5.2. Berechnung der Signalstärke......................................................................................... 59
5.3. Vergleich des Signals mit bekannten Rauschquellen.................................................... 61
6. Messungen und Ergebnisse .................................................................................................. 65
6.1. Vergleich des realen Signals mit der Abschätzung....................................................... 65
6.2. Qualität der Signale nach der Software-Bearbeitung .................................................... 65
6.3. Zeitlicher Verlauf der Signale und dessen Ursachen .................................................... 67
6.4. Glukosetoleranztests...................................................................................................... 71
6.5. Intravenöse Glukose-Injektionen .................................................................................. 74
6.6. Vergleichende Messungen mit einem implantierten Sensor ......................................... 76
7. Zusammenfassung................................................................................................................ 84
8. Anhang ................................................................................................................................. 88
8.1. Daten und elektrische Funktionsweise des Detektors ................................................... 88
8.2. Schaltung und Erläuterung der Verstärkerelektronik.................................................... 89
8.3. Software ........................................................................................................................ 92
8.4. Gehäuse ......................................................................................................................... 96
8.5. Kühlung ......................................................................................................................... 97
9. Abbildungsverzeichnis ....................................................................................................... 100
10. Tabellenverzeichnis.......................................................................................................... 102
11. Literatur............................................................................................................................ 103
12. Danksagung...................................................................................................................... 110
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1. Einleitung
Herkömmliche Methoden zur Glukosebestimmung waren bisher immer mit Blutabnahme und
den damit verbundenen Schmerzen verbunden. Besonders betroffen sind dabei Patienten
deren Glukosewert mehrmals täglich untersucht werden muss. Die Häufigkeit solcher
Untersuchungen hat besonderes Interesse gefunden seit dem die „Diabetes Control and
Complications Trial Research Group“[Dia93] 1993 einen Bericht veröffentlicht hat, in dem
gezeigt wird, dass häufige und genaue Kontrolle des Blutzuckerwertes und ein entsprechender
Ausgleich mittels Insulin die durch Diabetes verursachten Langzeit-Komplikationen deutlich
senken kann. Aus diesem Grund ist eine häufige oder sogar permanente Überwachung des
Glukosewertes für Diabetiker durchaus erstrebenswert. Um dies zu realisieren muss alternativ
zu den schmerzbehafteten Standardmethoden verstärkt an neuartigen nicht-invasiven
Messprozessen geforscht werden. Verschiedenste Ansätze wurden dabei getestet, die man im
wesentlichen in zwei physikalische Verfahren unterteilen kann. Zum einen die gering
invasiven Methoden, die die interzellulare Flüssigkeit mit einem Sensor in Berührung bringen
und zum anderen die Vielfalt an optischen Methoden. Die erste Gruppe lässt sich wiederum in
zwei Methoden, je nach Ort des Sensors, unterteilen. Wird der Sensor subkutan in der Haut
implantiert, wie z.B. bei Choleau et al.[Cho02], kann er dort in situ die Leitfähigkeit der
interzellularen Flüssigkeit messen und das Signal nach außen senden. Diese Methode ist bis
auf die Implantation schmerzfrei, kann jedoch am Ort des Implantats zu Unannehmlichkeiten
führen, wie am Beispiel des „Continuous Glucose Monitoring System Gold“ der Firma
Medtronic Minimed (Northridge, CA) von Klonoff [Klo05] berichtet wird. Außerdem ist die
relativ kurze Lebensdauer der Sensoren ein kritisches Problem, da genaue Messungen nur
über ein paar Tage stattfinden können und danach der Sensor bereits erneuert werden muss.
Eine weitere Möglichkeit, die interzellulare Flüssigkeit zum Sensor zu bringen, ist die
umgekehrte Iontophorese [Pot02]; dabei wird der Sensor außen auf der Haut angebracht, wie
z.B. bei dem „Gluco Watch G2 Biographer“ (Cygnus, Redwood City, CA, USA) anstelle
einer Armbanduhr. Nun wird eine Spannung zwischen 0,3 und 0,8V angelegt, die Ionen
entgegengesetzter Polarität anzieht, die sich in der Haut befinden. Der dadurch resultierende
Ionenstrom zur Oberfläche trifft nun unter anderen auf Glukose-Moleküle und bewegt diese
ebenfalls in Richtung Hautoberfläche, wo sie dann gemessen werden können. Die
Genauigkeit dieses schon in der Praxis Anwendung gefundenen Sensors liegt laut einer Studie
der „Diabetes Research in Children Network(DirectNet) Study Group“ bei etwa 16% mittlerer
5
Abweichung [Dia03]. Diese Messungen sind somit zur Zeit noch wesentlich ungenauer als die
herkömmlichen Blutbestimmungsmethoden. Probleme dieser Messmethodik resultieren vor
allen aus den Hautbelastungen, die durch die angelegte Spannung hervorgerufen werden und
zu Hautirritationen führen. Auf dieses Problem ging die Gruppe um Tamada ein [Tam04], die
vorschlug dieses Problem mittels einer Vorbehandlung der Haut mit Corticosteroid Spray zu
reduzieren. Ein mit diesen Methoden nicht zu behebendes Problem ist die alleinige Messung
der Glukose in der interzellularen Flüssigkeit anstatt im Blut. Dabei findet besonders bei
raschen Veränderungen der Blutglukose nach Kulcu et al. [Kul03] ein Auseinandergehen
beider Werte statt. Dadurch kann die Blutglukose von den genannten Sensoren nicht mehr
exakt registriert werden und eine eventuell gefährliche Situation des Patienten wird
übersehen. Diese Tatsache führt nunmehr zur Erforschung optischer und elektromagnetischer
Methoden, die direkt oder indirekt Blutglukose messen und so risikoreiche Situationen
vermeiden können. Im Gegensatz zu den gering invasiven Methoden findet man bei diesen
Messprinzipien zur Zeit bei nur sehr wenigen eine erprobte und zugelassene Apparatur. Als
Beispiel ist hier das Gerät Pendra der Firma Pendragon Medical (Zürich, Schweiz) zu nennen,
das den Blutzuckerspiegel mittels Impedanzspektroskopie bestimmt. Sie beruht darauf, dass
Veränderungen des Glukose-Spiegels im Blut zu Veränderungen der dielektrischen
Eigenschaften der Haut und des darunter liegenden Gewebes führen. Die Pendra erzeugt ein
schwaches, elektromagnetisches Feld. Durch Wechselwirkungen erkennt es indirekt und
schnell
die
Veränderungen
der
elektromagnetischen
Eigenschaften,
die
auf
den
Schwankungen der Blutglukose beruhen [Pen03]. Hauptproblem dieses Gerätes war hierbei,
dass es nur bei einigen Hauttypen arbeitete und in Feldstudien mit anderen Typen teilweise
sogar gegenteilige Ergebnisse lieferte [Pfü04]. Aufgrund dessen ist das Gerät vorerst vom
Markt genommen wurden und weitere Forschungen wurden wegen Insolvenz der Firma nicht
durchgeführt [Sch05]. Die Optikmethode, die wohl am meisten erforscht wird, beruht auf
Transmission oder Reflexion von naher Infrarot-Strahlung. Nachteil ist hierbei jedoch, dass
Glukose einer der am schwächsten im NIR absorbierenden Substanzen im menschlichen
Körper ist. Transmissionsmessungen finden dabei zum Beispiel am Ohrläppchen, an den
Fingerzwischenhäuten
und
Reflexionsmessungen
am
Unterarm
oder
an
der
Lippenschleimhaut im Bereich von 1000 bis 2500nm statt. Diffuse Reflexionsmessungen
zeigten ebenfalls eine gute Korrelation mit der Blutglukose, dennoch lagen bei Studien von
Jagemann et al. [Jag95] zumindest 10% der gemessenen Werte komplett außerhalb des
klinisch akzeptablen Bereichs. Außerdem wurden von Marbach et al. [Mar93] bei
Reflexionsmessungen an der inneren Lippe Zeitverzögerungen von bis zu zehn Minuten
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zwischen Messsignal und tatsächlichen Blutzuckerlevel festgestellt, die sich bei starken
Veränderungen wie bereits beschrieben negativ auswirken können. Weitere Probleme dieser
Methodik sind die starken Interferenzen mit anderen Komponenten des Blutes, wie einfachen
Eiweißen und Triglyceriden sowie Störungen durch Wasser und Hemoglobin. Hinzu kommen
Fehler durch Einflüsse der Umwelt wie Veränderungen der Temperatur, Feuchtigkeit,
Hautfeuchtigkeit, Kohlendioxid und Atmosphärischer Druck [Klo05].
Ein weiterer Schwerpunkt der optischen Forschung ist die Raman-Spektroskopie. Diese nutzt
gestreutes Licht, welches durch die Schwingungen und Rotationen des Streuzentrums
beeinflusst wird. Auch dabei berichten Roe et al. [Roe05] von einer Reihe von Problemen, so
z.B. der relativ große störende Einfluss der anderen Blutkomponenten, lange Messzeiten und
die Instabilität der Laser-Intensität und -Wellenlänge, die für die Messung der erzeugten
Wellenlängenverschiebungen hinderlich ist. Aufgrund der bekannten Drehung der
Polarizationsebene des Lichtes durch die Glukose liegt ebenfalls eine Methode, die diesen
Effekt nutzt, nahe. Die Oberfläche der normalen Haut ist dafür allerdings ungünstig, da hier
starke Streuung des Lichtes und damit eine Abschwächung des Signals stattfindet. Stattdessen
bevorzugt March [Mar77] eine Messung in der Hornhaut des Auges. Dazu wird mit einer
größeren Anzahl von Wellenlängen eingestrahlt, um die geringe Selektivität dieser Methode
zu verbessern. Die unangenehme Position des Sensors am Auge begrenzte jedoch die
Anwendung des Gerätes. Hutchison [Hut91] verbesserte Jahre später diese Anwendung indem
er doch blutdurchflossene Stellen des Körpers durchleuchtete. Schwierigkeiten ergaben sich
erneut durch interferierende optische Substanzen sowie durch variierende Temperatur und
pH-Wert.
Eine weitere optische Methode ist photoakustischer Art. Hierbei erhitzt ein optischer Strahl
die Probe in kürzester Zeit und erzeugt dadurch eine akustische Druckwelle, die mittels
Mikrophon gemessen werden kann. Nach Christison et al. [Chr93], sowie nach Duncan et al.
[Dun95] kann mit diesem Ansatz bei günstig gewählten physikalischen Bedingungen eine
bessere Sensitivität erreicht werden als mit der konventionellen Spektroskopie. Nachteile sind
auch hier die bereits genannten Einflüsse der Umgebung und der anderen chemischen
Substanzen, die mit der Glukose interferieren.
Ebenso erwähnenswert sind Versuche von Bruulsema et al.[Bru96], die Messungen anhand
der
Veränderungen
der
Streuungseigenschaften
im Optischen
und
Nah-infraroten
Wellenlängenbereich vornahmen. Sie zeigten dabei eine Korrelation zwischen steigender
Blutglukose und einem steigenden Brechungsindex, was besagte Veränderung der
Streuparameter beinhaltet. Allerdings sorgen auch hier viele andere Einflüsse für eine
7
natürliche Drift der Streuungseigenschaften, so dass zunächst noch Methoden gesucht werden
müssen, diese zu kompensieren.
Was an den hier aufgezählten Varianten der Messmöglichkeiten auffällt, ist, dass sie bereits
durch die Genauigkeit der Einstrahlung und den gewählten optischen Bereich erste und leider
auch nicht wirklich vermeidbare Fehlerquellen erzeugen, die sich auf das Endresultat negativ
auswirken. Um diese zu verringern, stellt sich die Frage nach einer optischen Methode, die
nur auf Emission von Infrarotstrahlung basiert und in einem Bereich stattfindet in dem
Glukose nicht bzw. nur wenig mit anderen Substanzen überlappt. Erste Vorschläge zu dieser
Thematik findet man bei Braig et al. [Bra97], der aufgrund des in der Haut befindlichen
Temperaturgradienten eine Emissionsspektroskopie vorschlägt, die im Bereich der
Fingerprint-Region des Blutzuckers zwischen 9.1 und 10.5 µm liegen soll. Der darin vorgeschlagene Aufbau sieht eine Modulierung der von der Haut kommenden Strahlung und eine
Filterung dieser bzgl. Glukose vor. Anschließend findet dann mittels elektronischen
Bandpasses eine Demodulierung statt, die das Detektorrauschen minimieren soll. Eine
entsprechende
Abschätzung
des
Signals-Hintergrund-Verhältnisses
anhand
von
thermodynamischen Überlegungen findet man dazu bei Klonoff et al. [Klo98], der dieses
Verhältnis bei einer Glukose Konzentration von 100mg/dl auf etwa 10-4 festsetzt, was im
Prinzip die meisten IR-Detektoren bewältigen können.
Dasselbe Messprinzip wurde ebenfalls in einem Patent von Buchert et al. [Buc97]
beschrieben. Hier wurde aber zur Sammlung und Weiterleitung der Strahlung eine Faseroptik
verwendet, die das Signal unmoduliert auf einen Zweikanal-Detektor lenkt, der zur Signal und
zur Referenzmessung gleichzeitig dient.
Bei beiden Ansätzen ist auffällig, dass kaum eine Optimierung oder Anpassung an die
gegebene Geometrie zur Fokussierung der abgestrahlten Wärmeleistung stattgefunden hat.
Diese Anpassung würde jedoch eine Vergrößerung des Signals und damit eine automatische
Verminderung
des
Rauscheinflusses
bedeuten.
An
dieser
Stelle
ist
sicher
Verbesserungspotential vorhanden. Ebenso kann mit verbesserter Halbleitertechnik die
Detektivität des Detektors und die Verstärkung des Signals mittels OPVs inzwischen deutlich
verbessert werden. Weiterer Fortschritt wäre auch eine größere Anzahl von gemessenen
Signalen, deren Abgleich den Einfluss der biologischen Faktoren minimieren könnte.
Alle hier vorgestellten Verfahren wurden außerdem nahezu ausschließlich an menschlichen
Probanden durchgeführt. Das es in der biologischen Forschung, die sich ebenfalls in großem
Maße mit Diabetes beschäftigt, meist um andere, einfacher zu handhabende Versuchsobjekte
8
geht, wurde völlig vernachlässigt. In den meisten Laboratorien dieser Art wird deswegen die
Nachfrage nach einem einfachen nicht-invasiven Glukometer, das einen hohen Durchsatz hat,
zunehmend stärker. Besonderer Beachtung gilt in diesem Zusammenhang den am häufigsten
verwendeten Versuchstieren, den Mäusen. Diese eignen sich durch einfache Haltung, hohe
Reproduktionsraten und die genetische Ähnlichkeit zum Menschen hervorragend für
biologische Messreihen.
Die Konzeption eines nicht-invasiven Infrarot-Emissions-Glukometers für Mäuse sowie deren
Umsetzung und Erprobung liegt daher nahe und soll innerhalb dieser Arbeit ausführlich
behandelt werden. Dabei soll auf die Probleme der kleinen Messflächen der Maus, der
rauscharmen Messung des sich nahe an der Messgrenze befindlichen Nutzsignals, sowie die
biologischen Schwierigkeiten bei Messungen an Mäusen eingegangen werden.
9
2. Theoretische Grundlagen
2.1. Chemische Eigenschaften von Glukose
Glukose ist das am meisten vorkommende Kohlenhydrat und hat die Summenformel
C6H12O6. Glukose besitzt mehrere Alkohol- und eine Aldehyd-Gruppe und ein Gerüst aus
sechs Kohlenstoff-Atomen, was lang genug ist um sich auch ringförmig anordnen zu können.
Betrachtet man zunächst die lineare Konfiguration, so findet man zwei verschiedene
Anordnungen, die sogenannte D- bzw. L-Glukose, beide sind in Abb. 2.1-1 in der nach
Fischer benannten Projektion gegenübergestellt.
Abb.2.1-1: Fischer-Projektion von D- und L-Glukose aus [Reg07]
Wie aus den Abbildungen ersichtlich, liegt nur ein Unterschied am fünften C-Atom (gezählt
von der Aldehyd-Gruppe) vor. Bei der L-Konfiguration befindet sich die Hydroxy-Gruppe in
dieser Projektion links und bei der D-Glukose auf der rechten Seite.
Liegt Glukose in einer Lösung vor, dann existieren neben der linearen offenkettigen AldehydForm der Glukose ebenso zwei verschiedene ringförmige Konfigurationen. Dabei resultiert
die Ringbildung aus einer Addition der OH-Gruppe des 5. C-Atoms mit der Aldehyd-Gruppe
des ersten. Die ringförmigen Anordnungen sind mit Hilfe der Haworth-Projektion in
Abb.2.1-2 dargestellt. Diese Projektionsform ersetzt die reale Anordnung durch ein planares
10
Sechseck, was die Unterschiede zwischen den beiden Konfigurationen besser verdeutlicht.
Der signifikante Unterschied zwischen der α- und β-Form liegt dabei in der Orientierung der
entstandenen OH-Gruppe. Befindet sie sich in dieser Darstellungsform unten, so handelt es
sich um die α-Form, ist sie oben, so liegt der β-Typ vor.
Abb. 2.1-2: Haworth-Projektion von α-Glukose (links) und β-Glukose (rechts) aus [Gfe07]
2.2. Wärmeübertragung
Da es sich bei der hier durchgeführten Messung im wesentlichen um Signale thermischen
Ursprungs handelt, soll kurz auf die hier wichtigen Prozesse für die Wärmeübertragung
eingegangen werden, die den genutzten Gradienten und die erhaltenen Signale erklären.
2.2.1. Wärmeleitung
Wärmeleitung ist nur mittels eines Überträgermaterials möglich, hierbei ist jedoch keine
makroskopische Bewegung von Teilchen involviert. Die Energie wird direkt durch Moleküle
oder Atomstöße übertragen. Der Energiefluss geht von Teilchen mit höherer thermischer
Energie in Richtung der Teilchen niedriger thermischer Energie bis ein Temperaturausgleich
erfolgt ist. Existieren zusätzliche Wärmequellen im thermischen System, so stellt sich nach
einer entsprechenden Einschwingzeit eine stationäre Temperaturverteilung ein, die sich mit
folgender Gleichung beschreiben lässt:
r
η
∆T (r ) = −
λ
(2.2-1)
Darin sind T(r) die räumliche Temperaturverteilung, λ die Wärmeleitfähigkeit und η die
Wärmeerzeugung pro Volumen einer Wärmequelle.
11
2.2.2. Infrarotstrahlung
Infrarotstrahlung resultiert aus der Strahlungsabgabe durch spontane und stimulierte
Emission, die maßgeblich von der Temperatur des Körpers abhängen.
Die Wärmestrahlung ist im Gegensatz zu den anderen Übertragungsformen nicht an Materie
gebunden, was einen Energietransport über weite Strecken möglich macht. Trifft die
Strahlung wiederum auf andere Materie, so findet Reflexion, Transmission und Absorption
statt, wobei letztere zur Erwärmung dieses Körpers führt. Bei der Abstrahlung spielt der
Emissionsgrad eine wichtige Rolle, der im allgemeinen von der Temperatur und ebenso von
Material- und Oberflächeneigenschaften abhängt. Bei organischen Substanzen mit
Körpertemperatur kann er jedoch in der Regel durch eins angenähert und einem schwarzen
Strahler gleichgesetzt werden. Ein schwarzer Strahler hat das Strahlungsverhalten eines
Lambert-Strahlers, d.h. seine Strahlungsdichte ist in allen Richtungen identisch. Dies hat für
die späteren Optiksimulationen Bedeutung. Die spektrale Strahlungsdichte in Abhängigkeit
der Temperatur beschreibt das Planck-Gesetz
[s.Ger03]. Schematisch für verschiedene
Temperaturen ist diese Funktion in Abb. 2.2-1 aufgetragen.
Abb. 2.2-1: Planck-Kurve für verschiedene Temperaturen [Hau97]
12
Wie aus dem Graphen ersichtlich, besitzt die Funktion ein temperaturabhängiges Maximum,
welches sich für höhere Temperaturen zu kürzeren Wellenlängen verschiebt. Materie, die
Raum- oder Körpertemperatur besitzt, strahlt vorwiegend im Infraroten bei etwas weniger als
10µm ab und kann somit hervorragend als Strahlungsquelle für die hier durchgeführten
Messungen genutzt werden.
2.2.3. Wärmeübertragung in realen Systemen
Betrachtet man reale Systeme, so ist häufig nicht nur die Übertragung von einem Körper auf
einen zweiten interessant, sondern ebenso der Durchgang der Wärme durch bestimmte
Materialien. Dabei ist ein typischer Fall zwei angrenzende Schichten an eine Wand (der in
dieser Arbeit verwendete Temperaturgradient in einem Mäuseschwanz ist nahezu äquivalent
dazu; ebenso wie die Abschirmung der hier entwickelten Messeinheit gegen die
Umgebungstemperatur), den man im Prinzip für beliebig viele Schichten hochrechnen kann.
Dabei spielen in der Regel zwei oder gar alle drei der genannten WärmeübertragungsMechanismen zusammen, was eine Rechnung deutlich schwieriger werden lässt.
Üblicherweise nutzt man in diesem Fall eine vereinfachte Form der Berechnung, die alle
unbekannten Größen in einem Wärmeübergangskoeffizienten k zusammenfasst. [Bae04].
Der Wärmestrom kann auf diese Weise einfach als lineare Abhängigkeit der
Temperaturdifferenz, der Fläche A und besagten Koeffizienten k ausgedrückt werden:
Q& = kA ⋅ (ϑ1 − ϑ2 )
(2.2-2)
Zur Veranschaulichung kann man ein Diagramm der Temperatur in Abhängigkeit des Ortes
in Abb. 2.2-2 sehen. Dieses zeigt beschriebene Anordnung für ebene Wände. Ist die
Geometrie komplizierter, findet das in variablen Flächengrößen für die einzelnen „Schichten“
Berücksichtigung.
13
Abb. 2.2-2: Temperaturgefälle beim Wärmedurchgang durch eine Wand [Bio07]
Rechnet man zurück auf die einzelnen Schichten, wie sie in der Haut vorkommen, so kann
man,
vorausgesetzt
die
einzelnen
Wärmeleitfähigkeiten
sind
bekannt,
lineare
Temperaturverläufe in den Schichten annähern.
2.3. Spektroskopie
2.3.1 Grundlagen der Infrarot-Spektroskopie
Für spektroskopische Untersuchungen biologischer Moleküle (und somit auch für Glukose)
sind die sich an das Optische anschließenden Bereiche der Infrarotstrahlung und der
Mikrowellen wichtig. Diese sollen im folgenden Unterkapitel etwas genauer beschrieben
werden.
Besteht ein Molekül aus N verschiedenen Teilchen, so können sich diese prinzipiell in alle
drei möglichen Ortskoordinaten bewegen, wodurch das Molekül 3N verschiedene
Freiheitsgrade besitzt. Sechs der Freiheitsgrade entfallen auf Translation und Rotation des
Moleküls, der Rest sind Schwingungen der Atome gegeneinander. Die formelle Beschreibung
dieser Schwingungen kann bei Raumtemperatur mittels Schrödinger-Gleichung und der
Annahme eines harmonischen Oszillators stattfinden [s.Atk87]. Die Intensitäten der aus den
Übergängen resultierenden Spektrallinien hängt außer von der Größe der Besetzungszahlen
14
weiterhin noch von dem Betragsquadrat des Übergangsdipolmomentes ab. Das impliziert
gleichzeitig, dass ein Molekül, um mit einem Photon bestimmter Frequenz wechselzuwirken
zumindest vorübergehend ein Dipolmoment haben muss, dass mit dieser speziellen Frequenz
schwingt. Besitzt es kein Dipolmoment, so findet auch kein Übergang statt und die
Spektrallinie gilt als „verboten“.
Außer der Intensität der Spektrallinien ist auch deren Breite für eine mögliche Detektion von
Bedeutung. Theoretisch müssten die Spektrallinien eines Überganges lediglich eine Frequenz
besitzen, was jedoch in der Praxis unmöglich ist, da zumindest zwei Phänomene für eine
Verbreiterung
der
Linien
unvermeidbar
sind.
Neben
der
natürlichen
Lebensdauerverbreiterung, sorgt hierbei die thermische Bewegung der Teilchen für einen
breiteren Absorptionspeak. Dabei spielt hier nicht nur die Temperatur, sondern auch die
Beweglichkeit der Teilchen eine Rolle. Dies führt dazu, dass Absorptionspeaks in
Flüssigkeiten deutlich breiter erscheinen als in festen Proben, was für spätere Messungen an
flüssigem Blut wichtig ist.
Tabelle 2.3-1 zeigt eine Übersicht über die charakteristischen Schwingungsbanden
verschiedener Bindungen, die in organischen Molekülen häufig anzutreffen sind.[Atk87]
Tab. 2.3-1: Übersicht der charakteristischen Schwingungsbanden organischer funktioneller
Gruppen [Bor74]
15
Rotationsspektren sowie gemischte Rotations-Schwingungsspektren spielen in dieser Arbeit
aufgrund ihrer zu geringen Energie keine weitere Rolle, daher soll hier von weiteren mehr
detaillierten Angaben abgesehen werden. [Atk87]
2.3.2. Infrarot-Detektoren
Infrarot-Detektoren lassen sich nach ihrem Funktionsprinzip in vier verschiedene Gruppen
einteilen: Thermosäulen, Bolometer, pyroelektrische Detektoren (alle drei sind wellenlängenunabhängige thermische Detektoren) und Halbleiterdetektoren.
In dieser Arbeit wurden ausschließlich pyroelektrische Detektoren verwendet, daher soll für
eine Beschreibung der anderen Typen nur auf [Ger03] verwiesen werden.
Pyroelektrische Detektoren basieren auf der Grundlage des pyroelektrischen Effektes. Die
Sensoren
sind
aufgebaut
aus
ferroelektrischen
Kristallen
oder
Keramiken
mit
unsymmetrischem Gitteraufbau. Folge der Unsymmetrie ist, dass solche Kristalle ein
elektrisches Dipolmoment und somit eine permanente Polarisation besitzen. Bei Einfall von
Infrarotstrahlung verändern sich die Gitterkonstanten und damit auch die Dipolmomente und
die Polarisation. Resultierend entstehen Ladungen auf der Oberfläche, die als elektrisches
Signal gemessen werden können. Dieses elektrische Signal ist proportional zur Änderung der
Strahlungsleistung bzw. zur Änderung der Temperatur.
Der Vorteil dieser Detektorvariante ist der verhältnismäßig moderate Preis bei einem
inzwischen sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis. Desweiteren ist auch hier lediglich eine
besonders konstante Detektortemperatur erforderlich und keine aufwendige Kühlung
[Köh04]. Nachteil dieser Detektorgruppe ist die relativ lange Reaktionszeit auf
Veränderungen. Normalerweise werden diese Detektoren mit Frequenzen von einigen Hertz
bis maximal zum Kilohertz-Bereich betrieben.
2.3.3. FTIR-Spektroskopie mit ATR-Aufbau
Der für die Infrarot-Spektroskopie am häufigsten verwendete Aufbau ist das FTIRSpektrometer. Da es sich hier um ein gängigen Spektrometertyp handelt, soll zu dessen
16
grundlegender Funktion nur auf das Buch „Infrared spectroscopy“ von B. Stuart [Stu04]
verwiesen werden. An dieser Stelle soll nur auf die spezielle Anordnung der Abgeschwächten
Totalreflexion (ATR) eingegangen werden, da diese zur Bestimmung der Blutglukosespektren
Anwendung fand. ATR ist besonders für flüssige oder feste Proben mit hoher Absorption
geeignet.
Das
einfallende
Lichtbündel
trifft
senkrecht,
auf
eine
trapezförmigen,
infrarotdurchlässigen Kristall und gelangt so unverändert ins Innere des Kristalls. An dieser
Stelle trifft es dann einfach oder mehrfach unter einem Totalreflexionswinkel an den Rand des
Kristalls auf dem die Probe sitzt. Da an Grenzflächen die Parallelkomponente des
elektromagnetischen Feldes stetig sein muss, kann das Feld an dieser Stelle nicht sofort
verschwinden. Es bildet sich eine Welle mit abklingender Intensität aus, ein sogenanntes
evaneszentes Feld, das in die Probe eindringen kann.
Durch Eindringen des Feldes in die Probe findet eine Absorption statt, die sich aus EnergieErhaltungsgründen ebenso vermindernd auf das reflektierte Lichtbündel auswirken muss. Die
Totalreflexion ist somit in Abhängigkeit des Probenmaterials leicht abgeschwächt. Eine
tiefergehende Beschreibung der Vorgänge bei der ATR-Spektroskopie findet man bei Harrick
[Har87].
Ist der Wirkungsquerschnitt σ für eine Wellenlänge bekannt, so kann mittels Lambert-BeerGesetz ebenfalls eine effektive Dicke bestimmt werden und damit ein Spektrum unbekannter
Dicke (wie die hier erhaltenen Blutspektren) darauf geeicht werden.
2.3.4. Temperaturgradienten Spektroskopie
Die in dieser Arbeit hauptsächlich genutzte Form der Spektroskopie ist die sogenannte
Temperaturgradienten-Infrarot-Spektroskopie. Die Funktionsweise dieser Methode beruht auf
einem Temperaturgradienten zwischen einer Wärmequelle und dem Messpunkt. Dabei wird
an jedem Punkt innerhalb dieses Gradienten entsprechend der dort vorhandenen Temperatur
eine Wärmestrahlung gemäß dem Planckschen Gesetz abgestrahlt. Schematisch ist dies in
Abb.2.3-1 verdeutlicht.
17
Abb. 2.3-1:Schema des Strahlungsverhaltens in einer Temperatur-Gradienten-Region [Lae06]
Auf diese Weise entsteht ein Strahlungsungleichgewicht innerhalb der Gradientenregion, in
dem die kälteren Bereiche stärker durchstrahlt werden, als das sie selbst abstrahlen. Diese
Tatsache entspricht im Grunde genommen einer ganz normalen Durchstrahlung einer Probe,
verursacht durch eine Strahlungsquelle.
Wichtig ist in diesem Zusammenhang das Signal-Hintergrund-Verhältnis. Es gibt das
Verhältnis zwischen der Absorption aller in der Gradientenregion befindlicher Materialien
und der Absorption der detektierten Einzelsubstanz an. Aus [Gau94] lässt sich das zu
erwartende Signal-Hintergrund-Verhältnis wie folgt abschätzen:
S hω ∆T τ G
=
⋅
⋅
B kT T τ 2
(2.3-1)
Hierbei sind hω die Photonenenergie, k die Boltzmann-Konstante, T die Temperatur und ∆T
die Größe des Temperaturgradienten. Die Parameter τ und τG sind die Extinktion der
Gesamtmaterie innerhalb der Temperaturgradientenregion und die Extinktion, die nur durch
die Glukose verursacht wurde. Unter Verwendung des Lambert-Beerschen Gesetzes kann
man τ auch schreiben als:
τ = ε ⋅ c ⋅ d = n ⋅σ ⋅ d
(2.3-2)
Da das in dieser Arbeit benutzte Verfahren nicht wie einige spektroskopische Verfahren im
Vakuum stattfindet und die Signale, wie später in dieser Arbeit noch abgeschätzt wird, auch
18
eher niedrig sind, stellt sich die Frage welche optischen Bereiche für eine eventuelle Messung
durch Luft zu bevorzugen sind. Um den Einfluss der Luft zu verdeutlichen, die die Strahlung
vor der Messung durchlaufen muss, ist in Abb.2.3-2 ihre Absorption in Abhängigkeit der
Wellenlänge anhand einer Atmosphären-Durchstrahlung dargestellt.
Wie man gut daraus erkennt, sind außer dem Anteil bis 1,3 µm noch die Bereich zwischen
3-4,2 µm und zwischen 8 –12 µm gut im Infraroten durchlässig. Diese Tatsache wird bereits
bei allen gängigen Infrarot-Kameras berücksichtigt und genutzt [Haa03] und soll hier ebenso
die möglichen Messbereiche eingrenzen.
Abb.2.3-2: Infrarot-Absorptionsspektren der Erdatmosphäre [Ebs05]
2.3.5. Spektrum von Glukose
Die von Glukose in Kap. 2.1. beschriebene Struktur beinhaltet im wesentlichen C-C-, C-Ound O-H-Bindungen. Die meisten organischen Substanzen haben molekülspezifische
Bindungen
oder
funktionelle
Gruppen,
die
Schwingungen
in
bestimmten
Wellenlängenbereichen absorbieren. Solche Bereiche nennt man Fingerprint-Region der
jeweiligen Substanz oder Molekülgruppe. In der Glukose sind vor allem die C-O-Bindungen
auffällig, die typische Absorptionsmaxima zwischen 8,5 und 10 µm haben [Mal02]. Um die
spezifischen Absorptionen von Glukose zu verifizieren und deren Unabhängigkeit vom Rest
der
anderen
Blutkomponenten
aufzuzeigen,
19
sind
in
den
Abb.2.3-3a
und
b
Transmissionsspektren mit hohem Glukoseniveau (a) und mit niedrigem Glukoseniveau (b)
gegenübergestellt.
Abb. 2.3-3c zeigt die Differenz aus beiden Spektren, was einem Absorptionsspektrum
entspricht. Hier ist zwischen 8 und 10 µm ein deutliches Maximum zu erkennen, das
ausschließlich auf Glukose zurückzuführen ist. Abb. 2.3-4 zeigt diesen Bereich besser
aufgelöst für Glukosekonzentrationen zwischen 100-500 mg/dl in einer Wasserlösung. Es sind
zwei Maxima bei etwa 9,3 und 9,7 µm ersichtlich. Die Absorption bei diesen Wellenlängen
wird bei den Vorversuchen mit flüssigem Blut noch eingehender untersucht.
Abb. 2.3-3:
Transmission durch getrocknetes Blut mit a) hoher Glukosekonzentration und
b) niedriger Glukosekonzentration, c) Differenzspektrum zwischen a) und b) [Buc97]
20
Abb.2.3-4: Detaillierte Absorptionsspektren verschiedener Glukosekonzentrationen
in Wasserlösung aus [Ber02]
Dem Spektrum der Glukose überlagert sind zum einen das Spektrum des Wassermoleküls und
zum anderen alle Alkoholverbindungen (Methanol, Ethanol etc.). Das Wassermolekül sollte,
da es eine breite Absorptionsbande besitzt und somit bei den gemessenen Wellenlängen
überall im wesentlichen gleich absorbiert, keine Einfluss auf die Messungen haben. Die
Alkoholverbindungen, die selektiv bei den Glukosemaxima absorbieren, würden jedoch eine
Messung verfälschen. Normalerweise kommen solche Verbindungen in Organismen jedoch
nicht vor, es sei denn man führt sie künstlich von außen zu. Diese Tatsache spielt
insbesondere bei Narkosemitteln und Beruhigungsmitteln eine Rolle, auf die aber in dieser
Arbeit letztendlich verzichtet wurde.
21
2.4.Biologische Aspekte
2.4.1. Das Versuchstier
Die Arbeit mit Kaninchen, Ratten und andere Nagern gewinnt in der biologischen und in der
medizinischen Forschung zunehmend an Bedeutung. Die preiswerte, unkomplizierte Haltung
und kurze Reproduktionszyklen machen Nagetiere zum „idealen“ Versuchstier für viele
wissenschaftliche Fragestellungen[Röm03]. Dabei ist in Deutschland die Maus mit einem
Anteil von 48,8% an der Gesamtmenge aller Versuchstiere mittlerweile das wichtigste Tier in
der Forschung [Bme01]. Die während dieser Arbeit durchgeführte Kooperation mit dem
Jackson Laboratory, welches als einer der bedeutendsten Lieferanten für genmanipulierte
Mäuse weltweit gilt, legt ebenso die Nutzung von Mäusen nahe, zumal eine Nachfrage des
geplanten Messgerätes direkt an diesem Institut vorhanden ist.
Abb. 2.4-1:
Verschiedene Phänotypen der Maus (aus [Bip07], [Gen07])
Mäuse gehören zur Klasse der Säugetiere (mammalia) und zur Ordnung der Nagetiere
(rodentia) und sind nachtaktiv. Ihr Rumpf hat je nach Alter und Stamm eine Länge von
22
4-10 cm und ihr Schwanz zwischen 5-10 cm. Das Gewicht ist ebenfalls stark von Alter und
Stamm abhängig und befindet sich in der Regel zwischen 20 und 40 g, kann aber zum
Beispiel bei diabetischen Mäusen auch deutlich mehr betragen. Die Phänotypen der Mäuse
sind recht vielfältig. Allein die Fellfarbe kann das volle Spektrum von weiß über Dutzende
verschiedene Grautöne bis schwarz einnehmen und bei manchen Arten sogar ausgefallenere
Farben annehmen, die beispielsweise leicht ins rötliche gehen.
Die natürliche Lebenserwartung beträgt zwischen zwei bis vier Jahre, die jedoch bei vielen
genmanipulierten Mäusen aufgrund der gezüchteten Defekte für gewöhnlich nicht mehr
erreichbar ist. Sie reproduzieren sich im Schnitt vier bis sechs mal pro Jahr und haben in der
Regel zwischen zwei und neun Junge.
Mäuse haben einen sehr hohen Stoffwechselumsatz, der entscheidend von Faktoren, wie z.B.
dem Mäusestamm, der Umgebungs- und der Körpertemperatur sowie der Tageszeit und der
Aktivität beeinflusst wird [Kap83].
Großen Einfluss auf den Stoffwechsel hat dabei die Körpertemperatur, die sehr stark mit der
Umgebungstemperatur korreliert. So erhöht sich beispielsweise der Stoffwechsel der Maus
nach Lindstedt und Schaeffer bei niedrigen Raumtemperaturen [Lin02]. Aus diesem Grund
findet
man
für
die
Maus
auch
sehr
unterschiedliche
physiologische
Körpertemperaturbereiche.
Nach Arras et al. [Arr01] liegt die physiologische Körperkerntemperatur im Wachzustand bei
ungefähr 36,3°C. Kreislaufparameter wie Blutdruck (zw. 61-127mmHg) und Herzfrequenz
(349-694/min) variieren bei der Maus ebenfalls und können sich innerhalb kürzester Zeit
verändern, so z.B. ist der Blutdruck der Maus am Nachmittag höher ist als am Morgen
[Röm03]. Eine weitere Besonderheit der Maus ist, dass eine Körpertemperatursteigerung im
Gegensatz zu einer Ratte keine Erhöhung des Blutdruckes nach sich zieht. Außerdem kommt
es bei manchen Mäusestämmen mit zunehmenden Alter zu einer Blutdruckerhöhung [Kap83].
Das Blutvolumen der Maus steht wie auch das Gewicht der Organe im Verhältnis zum
Körpergewicht. Dabei liegt das Gesamtblutvolumen bei 6,6 % des Körpergewichtes, beträgt
also bei einer Maus nur einige Milliliter [Lin02]. Diese Tatsache ist vor allem wichtig, da sie
die mögliche Anzahl von Glukose-Messungen mit Blutabnahme begrenzt. Unter Nutzung von
herkömmlichen Methoden sollten daher nicht mehr als vier oder fünf Messungen pro Tag
gemacht werden und anschließend einige Tage zur Regeneration des Blutvolumens ohne
Versuche abgewartet werden.
23
Für die in dieser Arbeit angestrebten Infrarot-Messungen ist es nötig die möglichen
Messstellen zu lokalisieren. Um Störungsfreie und möglichst hohe Emission zu
gewährleisten, bieten sich hier die Körperpartien an, die nicht behaart sind. Im Fall der Maus
sind diese Stellen zum einen die Ohren und zum anderen der Schwanz. Als zweites Kriterium
muss nun die abstrahlende Fläche gelten, die am Schwanz eindeutig größer ist und daher
dessen Strahlung besser messbar sein sollte.
2.4.2. Hautschichten
Um nun die genaue Quelle der Strahlung herauszufinden, ist es nötig sich den Aufbau der
verschiedenen Hautschichten anzuschauen. Die Haut unterteilt sich zunächst in drei
Hauptschichten, die regional verschiedene Dicken aufweisen können. Von außen nach innen
findet man die Epidermis, die Dermis und schließlich die Subkutis (Abb.2.4-2). Alle drei sind
dabei in Aufbau und Eigenschaften sehr verschieden und erfüllen entsprechend auch
verschiedene Funktionen.
Abb.2.4-2: Lage der drei Haupthautschichten [Net97]
Die Epidermis oder auch Oberhaut dient als äußerste Schicht vor allem der mechanischen
Widerstandsfähigkeit der Haut. Die Epidermis kann ihrerseits wiederum in vier Schichten
unterteilt werden, die verschiedenen Eigenschaften besitzen. Erläutert ist dies ausführlicher in
24
[Lan06]. Sieht man von besonders verhornten Stellen der Haut ab, so hat die menschliche
Epidermis eine Dicke von etwa 75µm. Im gleichen Bereich findet man auch Werte für
Nagetiere, wie beispielsweise rund 32µm für eine Ratte [Rie03]. Der durchschnittliche
Wassergehalt in der Epidermis liegt zwischen 10 und 20% und ist im Verhältnis zu den
anderen Schichten am niedrigsten. Entscheidend bei dieser Hautschicht ist allerdings, das sie
keine Blutgefäße enthält und somit nicht blutdurchflossen ist. Folglich ist diese Hautschicht
für eine Blutglukosebestimmung ungeeignet und die nutzbaren Signale müssen aus tiefer
liegenden Regionen kommen.
Unter der Epidermis trifft man auf die Dermis oder auch Corium oder Lederhaut. Die
Funktion der Dermis ist neben der Ernährung der Epidermis ebenso die Wärmeregulation und
die mechanische Festigkeit. [Net97]
Es lassen sich zwei Schichten unterscheiden: ein dünnes, zell- und gefäßreiches,
subepidermales Stratum papillare und ein dickes, faserreiches Stratum reticulare [Smo98].
Das Stratum papillare grenzt an die Epidermis an. In ihr befinden sich Haare, Talg- und
Schweißdrüsen als Abkömmlinge der Epidermis [Lie99]. Das Stratum reticulare stellt ein
Netz aus gröberen und elastischen Fasern dar, das mechanisch hoch belastbar ist [Ric98].
Diese Schicht ist relativ arm an Zellen und Gefäßen, vorzugsweise kleinere Arterien und
Venen von und zu den oberflächlichen Hautschichten passieren diese Bindegewebslagen
[Lie99].
Die Dicke der Dermis ist recht unterschiedlich, sowohl zwischen den einzelnen Körperstellen
als auch zwischen den Tierarten. Bei Menschen liegt sie im Regelfall zwischen 1000 µm und
4000 µm, sie ist also deutlich dicker als die Epidermis. Die Dermis ist sehr gut durchblutet,
was auch den Wassergehalt in ihr deutlich höher werden lässt als in den anderen
Hautschichten. Er beträgt im Mittel etwa 70%, wobei jedoch die an die Epidermis
angrenzenden Lagen meist etwas weniger feucht sind. Da Wasser der Hauptabsorber
infraroter Strahlung im Bereich um 10 µm ist, kann aufgrund der Dicke und des hohen
Wassergehalt der Dermis nahezu keine Strahlung diese Hautschicht durchdringen. Dies ist
auch der Grund, weshalb diese Hautschicht als Wärmeregulation fungieren kann. Ist die
Körpertemperatur zu hoch, so wird mehr Blut an die Hautoberfläche geleitet, wo die Wärme
besser abfließen kann. Ist die Körpertemperatur zu niedrig, ist die Durchblutung geringer und
es wird weniger Wärme abgegeben. Dies führt sogar soweit, dass im körperbedrohlichen Fall
der Unterkühlung, einzelne Gliedmaßen nahezu gar nicht mehr durchblutet werden und vom
Organismus aufgegeben werden, um die wesentlichen Körperfunktionen aufrecht zu erhalten.
25
Da die Infrarotstrahlung diese Hautschicht nicht durchqueren kann, sie aber im Gegenzug gut
durchblutet ist, kann diese Region als Quelle des glukoseabhängigen Infrarotspektrums
lokalisiert werden.
Die unter der Dermis liegende Subkutis (Unterhautfettgewebe) hat daher keinerlei Einfluss
mehr auf die von außen messbare Infrarotabstrahlung und ist in ihren genaueren Details für
diese Arbeit unbedeutend.
2.4.4. Glukose-Toleranz-Test
Um bei Versuchstieren eine eventuelle Erkrankung festzustellen, ist es üblich einen
sogenannten Glukosetoleranztest durchzuführen. Hierbei wird das Versuchstier vor dem
Versuch
zwischen
8-12 Stunden
ausgenüchtert.
Anschließend
findet
eine
Blutzuckerbestimmung statt. Direkt danach bekommt das Tier Glukose verabreicht, die im
Körper recht rasch für einen starken Anstieg des Blutzuckers führen sollte. Nun werden
weitere
Blutzuckermessungen
durchgeführt,
um
den
zeitlichen
Verlauf
der
Blutglukoseentwicklung zu beurteilen. Gängige Zeitpunkte sind dafür nach 15 Minuten, nach
45 Minuten sowie nach zwei Stunden. Diese Zeitpunkte können jedoch an die für den
Beobachter interessanten Zeitraum angepasst werden. In der Regel beinhaltet ein solcher Test
somit vier zeitabhängige Glukosewerte, deren Verlauf und Höhe Aufschluss über eine
mögliche Erkrankung mit Diabetes mellitus geben kann. Als Orientierung kann man
diesbezüglich für Menschen sowie Mäuse einen Normalblutzuckerbereich von 80-120 mg/dl
angeben.
2.4.5. Herkömmliche Glukosemessungsverfahren
Neben dem in dieser Arbeit vorgestellten nicht-invasiven Verfahren gibt es in der Medizin
diverse invasive Verfahren, die die Blutglukose unter Nutzung des Gesamtblutes oder von
Blutbestandteilen, wie z.B. dem Plasma, bestimmen.
Weit verbreitet unter Diabetikern sind Glukoseteststreifen, die sich der Methode der GlukoseDehydrogenase bedienen. Dabei wird die Glukose mittels einer Glukoseoxidase oxidiert und
es entstehen freie Ladungsträger, deren Menge proportional zur Glukosemenge ist [Tho06].
26
Im Falle des in dieser Arbeit benutzten Accu-Check (Fa. Roche) kann diese Reaktion
folgendermaßen formuliert werden:
Glukose + [Fe(CN)6]3- + H2O
Glukonolakton + 2H+ + [Fe(CN)6]4-
→
Die erhaltenen Ladungen werden dann mit Hilfe einer Spannung zu zwei Elektroden geleitet,
zwischen denen dann ein Ausgleichsstrom fließen kann. Dieser kann auf herkömmliche
Weise gemessen werden und ist ebenso dem Blutglukosegehalt proportional.
Ähnlich funktioniert auch der in dieser Arbeit verwendete Glucose-Analyzer 2 der Firma
Beckman Coulter, bei dem lediglich das abzentrifugierte Blutplasma genutzt wird. In ihm
reagiert die vorhandene Glukose mit Sauerstoff zu Glukonsäure und Wasserstoffperoxid unter
Verwendung von Wasser und Glukoseoxidase. Die Sauerstoffkonzentration wird dabei
kontinuierlich ermittelt, wobei das Maximum der Abnahmegeschwindigkeit der PlasmaGlukosekonzentration direkt proportional ist[Kem01].
Die Genauigkeitsansprüche für Glukosemesseräte im klinischen Einsatz sind sehr hoch,
weswegen auch zahlreiche neuartige Geräte, invasive, wie auch nicht-invasive, längere Testund Entwicklungsphasen durchleben, bevor sie erfolgreich auf den Markt kommen.
Abb.2.4-3: Genauigkeitsbeurteilung von Glukose-Messern durch Clarke-Error-Grid [Kub05]
27
Die Richtlinien der Genauigkeit resultieren aus dem von Clarke entwickelten Fehler-Raster
[Cla89] (Abb.2.4-3). Dabei ist Zone-A der Bereich mit Übereinstimmung bzw. einer
Abweichung von weniger als 20%, in ihm sollten mindestens 67% der gemessenen Werte
anzutreffen sein. Zone-B ist der Bereich mit einer Abweichung von über 20%. In dieser Zone
dürfen sich nach Clarke weniger als 30% der Werte befinden. Zone-C entspricht
Glukosewerten, die, wenn sie von Patienten fälschlicherweise gemessen würden, eine
Überkorrektur nach sich gezogen hätte. Werte in diesem Bereich sollten seltener als in einem
Prozent der Fälle auftreten. Befinden sich die Werte in den Zonen D und E können sehr
gefährliche Behandlungsfehler resultieren. Der Anteil dieser Messpunkte darf für die Zone-D
2% nicht übersteigen und Messpunkte in Zone-E sind sogar ganz verboten. Die zur Erfüllung
dessen nötige Messpunkteverteilung im Vergleich zu heutigen höheren Richtlinien [Con00]
zeigt Tab. 2.4-1:
Tab.2.4-1:Vergleich der von Clarke erwarteten Genauigkeit und der
Consensusmeinung heute [Kub05]
28
3. Vorversuche
Um ein nicht-invasives Blutzucker-Messgerät sinnvoll zu realisieren, müssen zunächst die
optischen Grundgegebenheiten genauer untersucht werden. Hierbei sind zwei Faktoren noch
nicht
ausreichend
geklärt.
Zum
einen
sind
die
glukosespezifischen
Infrarot-
Absorptionsbanden bisher nur in getrocknetem Blut und in wässriger Lösung bekannt und
zum anderen wird noch eine fokussierende Optikanordnung aus Linsen und Spiegeln gesucht,
die für die Geometrie eines Mäuseschwanzes optimiert ist.
3.1. Infrarot Untersuchungen von Glukose in flüssigem Blut
Im Kapitel zur Spektroskopie wurden bereits Glukosespektren für getrocknetes Blut und für
Glukose in einer Wasserlösung gezeigt. Eine Messung der Glukose in flüssigem Blut und die
exakte Auswertung dieses Spektrums stehen noch aus und sollen hier besprochen werden.
Bei Blut handelt es sich um eine im Infraroten stark absorbierende Flüssigkeit, die mittels
Transmissions- und Reflexionsspektroskopie nur schwierig messbar ist. Aus diesem Grund
wurde hier die Methode des ATR-Messung angewendet. Problem bei dieser Messung ist es,
eine geeignete Referenz zu finden. Diese muss der zu messenden Probe zum einen ähnlich
genug sein, damit keine störenden Banden das Glukosespektrum überlagern. Zum anderen
muss sie sich aber im Bereich zwischen 9 und 10µm deutlich von der Probe unterscheiden.
Benutzt wurde dazu das FTIR-Spektrometer FTS-175C der Firma Biorad und für die ATRAnordnung ein 45°-angeschliffener Germanium-Einkristall, in dem durch MehrfachReflexion zehn aktive Absorptionen stattfinden.
Das untersuchte Blut wurde von einem nicht-diabetischen Patienten einen Tag vor der
Infrarot-Messung gewonnen und kühl in einem Heparinröhrchen gelagert, damit sich die
biologischen Eigenschaften nicht ändern und das Blut weiterhin flüssig bleibt.
Bei Heparin handelt es sich jedoch auch um eine Art von Zucker, was für eine herkömmliche
Glukosemessung, wie in Kap. 2.4.5. beschrieben, zwar keine Rolle spielt, aber bei
Infrarotmessungen aufgrund der Strukturähnlichkeit nicht vernachlässigt werden kann.
Um nun dennoch Infrarot-Messungen von Blutglukose in flüssigem Blut durchführen zu
können, kommen nur noch Differenzmessungen in Frage. Zu diesem Zwecke wurde die
29
Blutprobe mit einer Konzentration von 100 mg/dl Glukose angereichert und gegen eine nicht
angereicherte Referenz gemessen. Der Heparin-Anteil wurde somit bei beiden als gleich
angenommen. Das Resultat dieser Messung ist in Abb. 3.1-1 dargestellt.
Abb. 3.1-1:
Differenzspektrum zwischen einer Blutprobe angereichert mit 100 mg/dl
Glukose und einer nichtangereicherten Probe
Das Spektrum der Glukose im Blut zeigt offensichtlich zwei starke Maxima bei 9,25 µm und
9,65 µm, welche wie erwartet jedoch in der Breite stark zugenommen haben und dadurch
bereits ineinander laufen. Geht man von dem in der Literatur für Glukose angegebenen
Wirkungsquerschnitt von 2 ⋅ 10 −18 cm2 bei einer Wellenlänge von 9,7 µm aus [Klo98], so kann
man die auf der Ordinate befindliche Extinktion absolut quantifizieren. Der so errechnete
Extinktionskoeffizient für das stärkste Maximum liegt dabei bei 9,1 cm-1. Die erhaltenen
Wellenlängen maximaler Absorption werden später bei der Auswahl der Filter für das Gerät
noch eine bedeutende Rolle spielen.
30
Um die Absorption des gesamten Blutes zu bestimmen, wurde das Absorptionsspektrum von
Blut gegen Luft gemessen. Die effektive Dicke der Probe (d.h. die Dicke, die einer
Transmissionsmessung entspricht und bei ATR von dem Benetzungsgrad des Kristalls
abhängt) kann dabei über die bereits bekannte Glukose-Absorption und Konzentration
mithilfe des Lambert-Beer-Gesetzes zurückgerechnet werden. Das komplette InfrarotBlutspektrum ist in Abb. 3.1-2 ersichtlich.
Abb. 3.1-2:
Infrarot-Spektrum menschlichen Blutes
Aus diesem Spektrum kann nun die Absorption von Blut bei der Wellenlänge maximaler
Glukosekonzentration (9,25 µm) auf 340,3 cm-1 bestimmt werden.
Weiterhin sind zwei recht starke Maxima zu erkennen. Das erste Maximum zwischen etwa
2,9-3,4 µm resultiert aus C-H-Schwingungen und der Absorption von Wasser. Das zweite
Maximum zwischen 5,8-6,7 µm wird durch die Absorption von Proteinen und Wasser
hervorgerufen (s.Tab.2.3-1). Auch im Bereich zwischen 9 und 10 µm hat H2O starken
Einfluss auf das Spektrum und kann als mit Abstand wichtigste Störsubstanz für die Messung
eines Glukosespektrums gewertet werden.
31
3.2. Optische Simulationen
Versucht man die diffus abgestrahlte Infrarot-Strahlung effektiv zu messen, so ist eine
Optimierung der Optik auf die vorhandene Geometrie des Objektes unerlässlich. Im
vorliegenden Fall eines Mäuseschwanzes ist die Geometrie ein leicht konisch zulaufender
Zylinder, der wie der bereits beschriebene Lambert-Strahler angesehen werden kann. Der
Emissionsgrad der Haut kann dabei ohne größeren Fehler mit eins identisch gesetzt werden,
da nahezu alle organischen Gewebe schwarzen Strahlern in ihrem optischen Verhalten recht
ähnlich sind. Die Problemstellung lautet in diesem Fall also, die Strahlung eines
zylinderförmigen, gleichmäßig in alle Richtung abstrahlenden Körper unter Nutzung von
Spiegeln und Linsen auf eine vorzugsweise quadratische Grundfläche zu fokussieren.
Da aufgrund hoher Kosten der optischen Komponenten ein realer Test nicht möglich ist,
wurde zum Zwecke der Optimierung das Optik-Simulationsprogramm OSLO (Education
Version: 6.3.1. , Fa. Lambda Research Corporation) verwendet. Dieses Programm verfügt
über eine Ray-Tracing-Simulation und bereits über einige gängige Strahlungsquellen. Eine
zylinderförmige Strahlungsquelle mit Lambert-Strahler Eigenschaften wurde dabei unter
Nutzung der Geometrie einer Bogenentladungslampe und der Strahlungseigenschaften einer
Lambert-Fläche neu programmiert und somit dem Programm für Simulationen zur Verfügung
gestellt. Abb. 3.2-1 gibt einen Eindruck über die programmierte Strahlungsquelle mit ihrer
Abstrahlcharakteristik:
Abb.3.2-1: Abstrahlverhalten der simulierten Mäuseschwanz-Strahlungsquelle
32
Um nun den Weg zur optimalen Anordnung möglichst systematisch zu beschreiten, wurde
dabei von relativ einfachen zu zunehmend komplizierteren Optiken übergegangen. Die
Ansätze gingen dabei über Anordnungen aus zwei plan-konvexen Sammellinsen
(Effektivität = 0,1%)
über
Anordnungen
mit
Ellipsoidspiegel
und
Sammellinse
(Effektivität = 0,43%) bis zu der schließlich eingesetzten Optik aus drei Zylinderlinsen und
einem zylinderförmigen Ellipsoidspiegel (Abb.3.3-2). Die Strahlungsquelle wurde mit einem
Durchmesser von 3 mm und einer Länge von 3 cm angesetzt und die Detektorfläche mit einer
Fläche von 5 mm x 5 mm. (Da räumlich ausgedehnte Quellen leider nicht bei der Darstellung
von OSLO sichtbar sind, wurde der Mäuseschwanz durch einen Kreis symbolisiert.)
Simuliert wurden von der Oberfläche dieser Geometrie ausgehende zufällig erzeugte Strahlen
und
die
Linsendurchmesser,
-lage
und
–brennweite wurden auf größtmöglichen
„Strahlungseinfang“ optimiert. Der bei den stattfindenden Simulationen relativ weitläufige
Parameterbereich wurde zuerst durch optische Überlegungen stark eingeengt und
anschließend mit zunächst 100.000 zufälligen Strahlen auf die Größenordnung abgeschätzt,
wodurch eine weitere starke Einengung des optimalen Bereichs möglich ist. Der zweite
Schritt sah dann eine Optimierung mit Simulationen mit zehn Millionen Strahlen vor.
Bei dem optimierten Aufbau befindet sich der Mäuseschwanz in der Brennlinie des Spiegels.
Durch den Spiegel und eine der zylindrischen Plan-Konvex-Linsen wird die Ebene senkrecht
zur Brennlinie in den Detektor fokussiert, was in der zweidimensionalen Abb. 3.2-3 der
Ebene ersichtlich wird (Schwanz steht senkrecht aus der Fläche heraus).
Abb. 3.2-2:
Aufbau der verwendeten Anordnung mit zylindrischem Ellipsoidspiegel und
drei zylindrischen Plan-Konvex-Linsen (Abstände nicht maßstabsgetreu)
33
Abb. 3.2-3: Finaler Aufbau in Vorderansicht
In der Ebene senkrecht zu eben beschriebener Ebene und senkrecht zur Ebene der
Spiegelöffnung wirken die beiden anderen zylinderförmigen Plan-Konvex-Linsen. Sie
sammeln die Anteile der Strahlung, die aus der länglichen Ausdehnung des Schwanzes
resultiert. Um diesen Sachverhalt verständlicher zu verdeutlichen ist in Abb. 3.2-4 die Ebene
der Anordnung dargestellt.
Abb. 3.2-4: Finaler Aufbau in der Draufsicht
34
Durch die Wahl von zylindrischen Linsen und dem zylindrischen Ellipsoidspiegel ist es somit
zumindest teilweise möglich die Strahlung in beiden dieser Ebenen zu sammeln und dadurch
verwertbar zu machen. Das Ergebnis dieser Simulationen brachte einen Wert von 4,87%
hervor, was um einen Faktor zehn effektiver als die vorhergehende Variante ist. Die meisten
Verluste resultieren hier vor allen durch den seitlichen Austritt der Photonen aus der
Anordnung.
Um diesen Effekt in dem späteren Geräteaufbau einzudämmen, wurden an den seitlichen
Spiegelöffnungen Randstücken angebracht, die mit hochreflektierendem Gold beschichtet
wurden. Auf diese Weise werden die dort auftreffenden Photonen wieder in die Anordnung
zurückgebracht und können mit gemessen werden. Die Simulation der Randflächen war mit
der vorhandenen Software nicht möglich. Aus diesem Grund konnte auch der Einfluss der
Randflächen auf das Endsignal nicht bestimmt werden.
Die in dem praktischen Aufbau verwendeten Daten sind in Tab. 3.2.-1 zu sehen. Dabei
nummeriert OSLO die einzelnen optischen Flächen einfach nacheinander durch. Die mit AST
bezeichnete Oberfläche ist der Ellipsoidspiegel und die letzte angegebene Oberfläche
entspricht hierbei dem Ort des Detektors. Die thickness gibt den Abstand der optischen
Flächen zueinander an, d.h. die Dicke der Linsen oder den Abstand der Randflächen
voneinander. Um welches Material es sich zwischen den Flächen handelt wird unter glass
angegeben. Die Oberflächen, die eine Krümmung besitzen, zeigen den entsprechenden Wert
bei radius, alle anderen sind nicht gekrümmt. Da im Kapitel über die Einzelkomponenten
noch genauer auf den Spiegel und die Linsen eingegangen wird, sind in dieser Tabelle
hauptsächlich die Abstände der Anordnung von Bedeutung. Diese werden bei der
Gehäusekonstruktion später genauestens beachtet und umgesetzt.
Tab.3.2-1: Im Gerät verwendete Daten der Optikanordnung
35
4. Aufbau und gewählte Komponenten
4.1. Gesamter Aufbau und geplante Funktionsweise
An dieser Stelle sollen kurz der allgemeine Aufbau und dessen erwünschte Funktionsweise
erklärt werden. Aus ihm können dann recht einsichtig erste Grundkriterien und
Anforderungen für die einzelnen Komponenten hergeleitet werden.
Ziel dieser Arbeit war es, ein möglichst tragbares Gerät zu konzipieren, aufzubauen und zu
testen, das eine nicht-invasive Blutglukosebestimmung bei Mäusen möglich macht. Genutzt
wurde dazu die Methode der Temperaturgradientenspektroskopie in der Fingerprint-Region
der Glukose im mittleren Infraroten. Die Funktion des Messgerätes besteht somit in der
Detektion, Verarbeitung und Auswertung der von der Maus kommenden Infrarotstrahlung.
Am überschaubarsten ist die Funktionsweise zu erklären, wenn man dem Strahlengang in der
Messung betrachtet. Ursprung der Infrarot-Strahlung ist, wie bereits beschrieben, die
Temperaturstrahlung innerhalb der Dermis. Beim Verlassen der Dermis erfährt das Spektrum
aufgrund des Temperaturgradienten nach außen und der in der Dermis befindlichen Glukose
neben der Absorption durch das Gewebe eine glukoseabhängige Absorption (s. Kap.3.1.).
Nach der glukoseunabhängigen Absorption in der weiter außen liegenden Epidermis verlässt
die Strahlung die Maus und ist somit einer Messung zugänglich. Diese Strahlung befindet sich
nun in dem optischen Aufbau der in Kapitel 3.2. herausgefunden wurde. Von da aus gelangt
ein Anteil der Infrarot-Strahlung direkt oder indirekt über Spiegel oder Reflexion an den
Außenwänden durch die drei Linsen und wird dabei in Richtung Detektor gelenkt. Um das
Umgebungsrauschen zu minimieren muss sie nach den Linsen zunächst ein Chopperrad
passieren, welches eine Modulation des Signals nach sich zieht. Diese Frequenz liegt bei den
Messungen in der Regel je nach Wahl zwischen 12 und 17 Hz und kann später bei der
Auswertung der Signale unabhängig vom Rauschen bei anderen Frequenzen analysiert
werden.
Bevor nun die Strahlung in den Detektor gelangt, ist es sinnvoll durch optische Filter die zu
messenden Spektralbereiche von denen zu trennen, die nur als Störung auftreten würden. Mit
dem Ziel möglichst viele spektrale Informationen über die gegebene Infrarot-Strahlung zu
bekommen, wurde ein Vierfach-Detektor verwendet, der durch vier verschiedene Filter vier
Bereiche
gleichzeitig
erfassen
kann.
36
Als
Bereiche
wurden
dabei
die
Glukoseabsorptionsmaxima und einer Referenz gewählt. Bei der Detektion werden die vier
Photonenflüsse durch den pyroelektrischen Detektor in vier Spannungssignale umgewandelt,
die mittels einer Verstärkerschaltung um den Faktor 2001 vergrößert werden. Anschließend
werden die Signale unter Nutzung einer Analog/Digital-Messkarte in digitale Signale
umgewandelt und über USB an den Computer weitergegeben. Dort findet dann die digitale
Filterung der Signale und die Verarbeitung zum Endresultat statt, welches im wesentlichen
auf einer Differenzbildung zwischen den glukoseabhängigen Kanälen und der Referenz
besteht.
Um eine temperaturstabile und von der Umgebungstemperatur unabhängige Messung zu
erzielen, wurde bei der Messung sowohl das Gerät mit dem Detektor als auch der Spiegel auf
einer Temperatur von 15°C konstant gehalten. Dazu wurde neben der aktiven Kühlung mit
Peltier-Elementen ebenso ein doppelwandiges Gehäuse genutzt.
Zum besseren Verständnis des Aufbaus befindet sich in der Abb.4.1-1 eine Außenansicht des
Messgerätes und in Abb. 4.1-2 eine technische Zeichnung des Längsquerschnittes.
Abb.4.1-1: Außenansicht des nicht-invasiven Infrarot-Emissions-Glukometers
37
Abb.4.1-2: Längsquerschnitt des nicht-invasiven Glukometers (maßstabsgetreu)
38
Am einfachsten ist der Überblick über dieses Gerät in der technischen Zeichnung zu
gewinnen. Das äußere Kunststoff-Gehäuse ist hierbei schwarz dargestellt, während das innere
Aluminium-Gehäuse hellgrau gehalten ist. Der Mäuseschwanz verläuft hier senkrecht zur
Zeichenebene und ist mithilfe eines blauen Punktes dargestellt. Er befindet sich in dem
dunkelgrau schattierten Spiegel, dessen thermoelektrische Kühlung (Peltier, Kühlkörper,
Lüfter) sich weiter rechts befindet. Auf dessen linker Seite befinden sich wiederum die orange
dargestellten IR-Linsen, welche die Strahlung in Richtung Detektor lenken, der seinerseits mit
Verstärker- und Messkarte verbunden ist. Direkt vor dem Detektor ist das Chopperrad
positioniert. Um ein Gefühl für die Dimensionen zu bekommen, sind die wichtigsten
Abmessungen in mm angegeben. Die Breite der Apparatur beträgt 226 mm.
Das Gerät benötigt zu seiner Versorgung und Kühlungsregelung noch folgende
Peripheriegeräte, die hier nur kurz erwähnt werden sollen: Ein Kühlungsregler für Gerät und
Spiegel, ein Multimeter zum Ablesen und Einstellen der Temperaturen, das Netzteil für die
Verstärkerkarte (wurde aus Rauschgründen außerhalb des Gerätes positioniert), ein
Spannungskonverter für das amerikanische Stromnetz, sowie die Stromversorgung des
Choppers.
Da die prinzipielle Funktionsweise des Gerätes beschrieben wurde, soll jetzt im einzelnen auf
die benutzten und gewählten Komponenten genauer eingegangen werden.
4.2. Spiegel und Halterung
Dem Spiegel stehen innerhalb dieses Messgerätes gleich zwei Bedeutungen zu. Zum einen
verhindert er, wie in Kap. 3.2. beschrieben, dass große Anteile der Strahlung für die Messung
verloren gehen und zum anderen ist an ihm die Halterung für die Probe
(also der
Mäuseschwanz) verankert, die innerhalb dieses Kapitels noch genauer erklärt wird.
Die Herstellung dieses Spiegels war eine Zusammenarbeit der Werkstätten des PhysikalischChemischen und des Physikalischen Instituts. Dabei wurde in den aus Stahl bestehenden
Grundkörper unter Nutzung des Drahterodierverfahrens die Halbellipse „hineingeschnitten“.
Die Oberflächenrauhigkeit ist nach dem Erodieren mit einer im günstigsten Fall zu
erreichenden Größenordnung von 200-300 nm sehr niedrig. Im Anschluss an das Erodieren
wurde die so erzeugte elliptische Spiegeloberfläche mittels herkömmlicher Polierpasten
weiter poliert. Dadurch vermindert sich die Rauhigkeit weiter und der Reflexionsgrad wird
39
somit erhöht. Da Gold ein sehr guter Reflektor im Infraroten ist und außerdem eine gute
chemische Beständigkeit gegen äußere Umweltbedingungen aufweist, wurde die erhaltene
Oberfläche mit einer 3-4 µm dicken Goldschicht bedampft. Die Oberflächenrauhigkeit wird
durch Bedampfungsprozess nur unwesentlich verändert. Nach der Herstellung des Spiegels
wurde die Oberflächenqualität (eines ebenen Referenzstückes) zunächst mittels AFM
vermessen. Obwohl die Oberfläche scheinbar noch deutliche Strukturen aufzuweisen scheint,
liefert die topographische Analyse eine Rauhigkeit im Bereich zwischen 10-17 nm, was einen
Faktor zehn glatter als die unbehandelte Metalloberfläche und deutlich kleiner als die
Infrarotwellenlänge ist.
Der spektrale Reflexionsgrad einer glatten elektrolytischen Goldschicht beträgt etwa 95% im
Bereich von 8-10µm Wellenlänge [Gie54]. Um den Einfluss der Rauhigkeit der hier
vorliegenden
Oberfläche
auf
das
Reflexionsvermögen
zu
erfahren,
wurde
die
Spiegeloberfläche mittels Infrarot-Reflexionsspektroskopie (IRRAS) vermessen. Als Referenz
diente dabei eine nahezu atomar glatte Goldschicht auf einen Siliziumwafer. Das Spektrum ist
in Abb. 4.2-1 dargestellt. Die linke Ordinate ist dabei die Effizienz im Verhältnis zu der
Goldschicht auf dem Siliziumwafer und die rechte entspricht dem absoluten Reflexionsgrad.
Abb. 4.2-1: Spektrales Reflexionsvermögen der Spiegeloberfläche
40
Der Aufbau des Spiegelgrundkörpers ist in Abb. 4.2-2 dargestellt. Da die elliptische Form des
Spiegels die Fokussierung der Strahlung des in dem erstem Brennpunktes liegenden
Mäuseschwanzes in den zweiten Brennpunkt verursachet, mussten die Größenordnung und
die Form des Spiegels den biologischen Gegebenheiten angepasst werden. Die Halbachsen
der Ellipse haben dabei in Richtung Detektor eine Länge von 25 mm und senkrecht dazu
15 mm, was einen Brennpunkt im Abstand von 5 mm zum Ellipsenscheitelpunkt nach sich
zieht. Die Spiegel entspricht dabei exakt einer Halbellipse, damit ein möglichst hoher
Raumwinkel der Reflexion erzielt werden kann.
Abb. 4.2-2: Technische Zeichnung des Ellipsoidspiegels
Um den Mäuseschwanz einfacher in den Spiegel einführen zu können, besteht dieser aus drei
Teilen. Zwei sind direkt mit dem Gerät verbundene Randstücke des Spiegels und ein drittes
abnehmbares Teil beinhaltet den Scheitelpunkt des Spiegels. Der Schnitt des Spiegels
befindet sich dabei ebenfalls in dessen Brennpunkt, was das Positionieren der Probe
vereinfacht. Das Fixieren des Mäuseschwanzes selbst findet unter Verwendung sogenannter
Spannbuchsen statt. Diese verlaufen außen konisch und haben innen einen konstanten
Durchmesser, der dem Schwanzdurchmesser angepasst werden kann. (Zu diesem Zweck
wurden mehrere verschiedene Größen dieser Spannbuchsen angefertigt.) Die Gegenlöcher
der
Spannbuchsen
befinden
sich
dabei
an
den
ebenfalls
goldbedampften
Abschirmungsstücken an den offenen Enden der zylindrischen Ellipsenform.
Soll nun eine Messung durchgeführt werden, wird zuerst der obere Spiegelteil, der nur mittels
Bolzen mit dem Rest des Spiegels verbunden ist, abgezogen. Dadurch ist die Spiegelkammer
41
offen und einer Einführung der Probe zugänglich. Anschließend werden zwei passende
Spannbuchsen über den Mäuseschwanz gezogen, wobei die konisch zulaufenden Spitzen
zueinander zeigen. Nun wird der Schwanz mit den Buchsen in die Löcher der Abschirmstücke
gebracht und der Spiegel durch Anbringung des abgenommenen Teils geschlossen. Zuletzt
werden zwei Schranken heruntergedrückt, welche die Spannbuchsen unter Vermeidung eines
zu starken Drucks in den Spiegel pressen und somit deren Verengung bewirken. Auf diese
Weise ist eine genaue Fixierung verschieden dicker Schwänze exakt im Brennpunkt des
Spiegels möglich. Beim Einspannen des Schwanzes wird dieser gestreckt, so dass der zu
messende Schwanzabschnitt keine nennenswerte Krümmung aufweist. Nach Beendigung der
Messung wird derselbe Ablauf in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt, um die Maus
wieder aus der Apparatur herauszunehmen. Abbildung 4.2-3 zeigt ein Foto des abnehmbaren
Spiegelteils mit den einführten Spannbuchsen. Als Mäuseschwanzersatz dient hier ein
Teflonschlauch.
Abb. 4.2-3: Abnehmbares Spiegelstück inkl. Spannbuchsen (schwarz) und deren Befestigung
Da sich die Tiere im Normalfall gegen diese Prozedur wehren und sofort versuchen würden,
den Schwanz wieder zu befreien, ist es nötig die Maus während der Versuchszeit in einem
42
sogenannten Mouse-Restrainer (PLASLABS, Lansing, MI, USA, Part#:551-BSRR) zu
platzieren. Dieser ist ähnlich einer Tube und es ist möglich mit einer Art Stempel den genauen
Bewegungsraum der Maus festzulegen. Da eine möglichst stressarme Situation für die Maus
erzeugt werden sollte, wurde der Restrainer außerdem schwarz gefärbt, damit sich die Maus
in einer dunklen Umgebung sicherer fühlen kann.
4.3. Linsen
Die Fokussierung der Strahlung in den Detektor findet zusätzlich zum Spiegel noch mit drei
Linsen statt, deren Anordnung bereits im Kapitel über die Optiksimulationen gezeigt wurde.
Das wichtigste Kriterium zur Wahl der Linsen ist der Transmissionskoeffizient. In Abbildung
4.3-1 ist das Spektrum von ZiSe dargestellt, welches als optimales Material für diese
Anwendung ausgewählt wurde. In diesem Spektrum ist der Reflexionskoeffizient für den
Übergang zwischen Luft und Linsenmaterial bereits beinhaltet.
Abb. 4.3-1: Transmissionsspektren von Zinkselenid im Infraroten [Lot05]
Zinkselenid ist ein klassischer II-VI-Halbleiter, der die meiste Strahlung unterhalb der
Bandlückenenergie durchlässt. Der Transmissionsgrad dieses Materials liegt daher bei sehr
niedrigen 0,005cm-1. Sein Reflexionsgrad liegt bei einer Brechzahl von 2,4 bei einem Wert
von etwa 17%, kann aber mittels Antireflex-Schichten deutlich reduziert werden. Der
Hersteller der sonderangefertigten Linsen (Laser Components Gmbh, Olching) beziffert den
Transmissionsgrad unter Verwendung der AR-Schicht auf mindestens 99,4%. Die Geometrie
der plankonvexen Linsen ist quadratisch mit jeweils nur einer ausgewölbten Seite, es handelt
43
sich also um Zylinderlinsen. Die Größe der quadratischen Grundfläche wurde entsprechend
der Spiegelöffnung ebenso auf 30x30 mm2 festgesetzt bzw. anhand der Simulationen als
sinnvoll erachtet. Die Randdicken sind bei allen aus Stabilitätsgründen auf 3 mm festgesetzt.
Da es deutlich preisgünstiger war und die Simulationen keine starken negativen Folgen
zeigten, wurden zwei der drei Linsen (die Linsen 1 und 3 in der optischen Abfolge) identisch
hergestellt. Sie haben den Krümmungsradius 40,5 mm und somit eine Brennweite von
28,9 mm. Die Fokussierung in der anderen Ebene ist deutlich stärker. Die verbleibende Linse
hat einen Krümmungsradius von 20 mm und darausfolgend eine Brennweite von nur
14,3 mm.
4.4. Chopper
Da das gemessene Infrarot-Signal zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses
moduliert werden soll, ist der Einsatz einer Modulationsquelle nötig. Zu diesem Zweck wurde
ein mechanischer Chopper verwendet. Die Wahl wurde dabei hauptsächlich nach Größe und
möglichen Frequenzen getroffen, da es sich ja um ein kompaktes tragbares Gerät handeln soll.
Die Entscheidung fiel dabei zugunsten des „360C Ultra Miniture Rotating Optical Chopper“
der Firma Scitec Instruments (Cornwell, Großbritannien). Dieser Chopper-Typ besticht vor
allem durch seinen kleinen, effektiven Aufbau und seine unkomplizierte Ansteuerung. In
Abb. 4.4-1 ist eine technische Zeichnung des Choppers dargestellt.
Abb. 4.4-1: Technische Zeichnung der Choppereinheit [Sci05]
44
Die Höhe beträgt ohne Rad lediglich 43 mm, die Breite 14 mm und die Länge 29 mm. Das
Chopperrad hat einen Durchmesser von 30 mm und zwei Flügel. Der daraus resultierende
maximale Durchmesser des modulierten Strahlenbündels ist 9 mm und es sind Frequenzen
zwischen 10 und 350 Hz damit möglich. Die Steuerung der Frequenz ist über ein Trimmrad
auf der Steuer-Leiterplatte direkt möglich, oder mithilfe einer externen Spannung, die mittels
Klinkenstecker auf die Leiterplatte übertragen wird. Auf diese Weise besteht auch nach dem
Einbau des Choppers eine Möglichkeit seine Frequenz den äußeren Bedingungen anzupassen.
Vor
Verwendung
des
Choppers
wurden
seine
Laufeigenschaften
getestet.
Die
Fouriertransformierte eines mit 100 s Messzeit relativ kurzen Messzeitraums, erlaubt eine
Aussage über die kurzfristige Laufgenauigkeit und die verschiedenen Frequenzanteile des
Modulationssignals. Da es sich bei dem vom Chopper erzeugtem Signal um ein
Rechtecksignal handelt, existieren neben dem Hauptmaximum noch Nebenmaxima, die aber
aufgrund späterer Filterung hier keine Rolle spielen.
In Abb. 4.4-2 wurde nun der Hauptpeak deutlich aufgelöst. Hier ist um die Mittenfrequenz
eine Verteilung der Frequenzen zu sehen, die sich im wesentlichen im Bereich von ±0,1 Hz
um die Mittenfrequenz befindet. Da die gewählte Mittenfrequenz in ähnlicher Größe in allen
Versuchen Verwendung fand, soll dieser Bereich daher in allen zukünftigen Betrachtungen
als absoluter Fehler der Chopper-Laufgenauigkeit angesehen werden.
Abb.4.4-2: Laufgenauigkeit des Choppers über 100 s Messzeit
45
Neben der kurzfristigen Laufstabilität des Choppers ist außerdem sein Verhalten über längere
Zeiträume interessant, da so eventuelle Unregelmäßigkeiten und ein mögliches Driften der
Mittenfrequenz deutlicher wird. Zu diesem Zweck wurde eine Messung über etwa 20 Minuten
durchgeführt und alle zehn Sekunden mittels Frequenzmesser (Philips PM 6654C) die
Frequenz bestimmt. Der zeitliche Verlauf der Frequenz wurde in Abb. 4.4-3 dargestellt.
Abb. 4.4-3: Langzeitgenauigkeit des Choppers
Wertet man die Daten statistisch aus, so erhält man bereits eine Standardabweichung σ der
Frequenz von 0,18 Hz. Da die Standardabweichung nur 66% der Werte beinhaltet, muss man
den Absolutfehler bei langen Laufzeiten also noch deutlich höher wählen (≥3σ wären
angebracht).
Hervorgerufen
wurde
dieser
hohe
Fehlerwert
offenbar
durch
ein
kurzfristiges
„Hängenbleiben“ des Rades, was eine Leistungserhöhung nach sich zog und nach diesem
„Zwischenfall“ eine höhere Frequenz verursachte. Der Grund für solch ein Fehlverhalten liegt
offenbar darin begründet, dass mit einer Frequenz von 10 Hz der minimale Grenzwert des
Choppers sehr nahe liegt und in diesem Bereich nicht mehr hundertprozentig zuverlässig
gearbeitet wird. In den späteren Messungen wird daher die Frequenz etwas höher gewählt, sie
liegt meist zwischen 12 Hz und 17 Hz (abhängig von Hintergrundrauschen des jeweiligen
Messortes).
46
4.5. Filterfenster
Obwohl die verwendeten optischen Filterfenster bereits bei Lieferung fest in den Detektor
eingebaut waren, sollen sie hier dennoch einzeln behandelt werden. Wie bereits beschrieben,
orientieren sich die gewählten Wellenlängen an den in den Vorsuchen ermittelten
Absorptionsmaxima. Außerdem spielten auch die praktischen Herstellungsmöglichkeiten eine
Rolle, da Einzelanfertigungen dieser Art teuer sind. Gewählt wurden Filter mit den
Mittenwellenlängen von 9,26 µm, 9,6 µm, 10,24 µm (Messkanal 0, 1 und 2) und einen breiten
Bandpassfilter zwischen 8,6-10,3 µm (Messkanal 4), die von der Firma Dias Infrared
(Dresden) zur Verfügung gestellt wurden. Die Mittenwellenlängen haben dabei eine Toleranz
zwischen 0,5 und 1% und die Halbwertsbreiten betragen weniger als 5%. Die Wellenlänge
bei 10,24 µm diente als Referenzwellenlänge.
Da die Filter bereits in den Detektor eingebaut waren, konnte ihr Transmissionsverhalten nur
mit den von der Firma gelieferten Bruchstücken vermessen werden, die vom selben Wafer
wie die Filter stammen. Leider wurden nur Bruchstücke der Filter mit den Wellenlängen
9,26 µm sowie 10,24 µm von der Firma zur Verfügung gestellt, die jedoch auch repräsentativ
für die Qualität der anderen Filter sind. Die Transmissionskurven der selbst vermessenen
Filter sind in den Abbildungen 4.5-1 und 4.5-2 dargestellt.
Abb. 4.5-1: Transmission eines glukoseempfindlichen Filters mit 9.26 µm Mittenwellenlänge
47
Abb. 4.5-2: Transmissionskurve des Referenzfilters (10.24 µm)
4.6. Detektor
Um die Qualität von Detektoren vergleichen zu können, müssen Messgrößen eingeführt
werden, die unabhängig von der jeweiligen Funktionsweise des Detektors sind. Wichtige
relative Parameter, die direkt zum Vergleichen der Detektoren eingeführt wurden, sind die
Rausch-Äquivalente Leistung (NEP: Noise equivalent power) und die spezifische Detektivität
D*.
Die NEP gibt dabei den Wert an, bei dem die Signalstärke der Rauschspannung
entspricht. Das heißt also, es ist die Signalstärke, ab der man das Signal nicht mehr vom
Rauschen unterscheiden kann. Die Ursachen für das interne Rauschen der Detektoren können
vielfältig sein. Die wichtigsten Rauscharten sind das Johnson Rauschen, das 1/f-Rauschen,
das
Schrot-Rauschen,
Generations-
und
Rekombinationsrauschen
sowie
das
Temperaturrauschen. Dabei sind die ersten beiden vor allem bei thermischen, die dritte und
vierte Rauschart nur bei Halbleiterdetektoren vertreten.
Das aus diesen Rauscharten folgende Gesamtrauschen UR ist die Wurzel aus der Summe der
quadratischen Einzelbeiträge. Um nun die NEP zu berechnen, ist es weiterhin wichtig, die
Empfindlichkeit R des Detektors zu kennen. Diese Größe gibt an, welche Spannung (bzw. bei
48
stromerzeugenden Detektoren welchen Strom) der Detektor ausgibt, wenn er eine bestimmte
Eingangsstrahlungsleistung erfährt. Kennt man alle diese Eigenschaften des Detektors so
ergibt sich die NEP aus der Gleichung [Kin78]:
NEP =
UR
R
(4.6-1)
Da die Rausch-Äquivalente Leistung meist noch nicht die Bandbreite B berücksichtigt (je
nach Definition etwas verschieden) und der Detektor verschiedene Flächengrößen A haben
kann, die sich seinerseits wieder auf dessen Rauschintensität auswirken können, muss noch
eine zusätzliche Größe definiert werden, die diesen beiden Faktoren Rechnung trägt. Aus
diesem Grunde wurde die spezifische Detektivität eingeführt, die sich wie folgt berechnen
lässt:
D∗ =
A⋅ B
NEP
(4.6-2)
Mit der spezifischen Detektivität hat man nun eine Größe erlangt, mit der man die Detektoren
direkt vergleichen kann. Eine Übersicht für die verschiedenen Detektoren und ihr
Einsatzgebiet vermittelt Abb.4.6-1:
Abb.4.6-1: Übersichtsdiagramm über die Einsatzbereiche möglicher IR-Detektoren [Win04]
49
In den letzten Jahren wurde vor allem im Bereich der pyroelektrischen Detektoren die
spezifische Detektivität gesteigert, wodurch sie den Quantendetektoren nahezu ebenbürtig
und den anderen thermische Detektoren bei Detektivität und Geschwindigkeit überlegen
geworden sind.
Nachteil der Quantendetektoren ist dabei neben der meist benötigten Kühlung mit flüssigem
Stickstoff, wie bei HgCdTe, eine Wellenlängenabhängigkeit der Detektivität. Diese ist im Fall
von HgCdZnTe im Bereich zwischen 9 und 10 µm so stark, das auch dieses Material für
Glukosemessungen eher ungeeignet ist.
Da bei Messungen in biologischen Laboren ferner nicht von einer ständig verfügbaren Quelle
an flüssigen Stickstoff ausgegangen werden kann, wurde hier ein pyroelektrischer Detektor
eingesetzt. Die für diese Detektoren nötige Temperaturkonstanz wird mithilfe einer
thermoelektrischen Kühlung erzielt, die in Anhang noch genauer beschrieben werden soll.
Der schließlich genutzte Detektor ist der Quadcell-Detektor 4LTAI G2 der Firma Dias
Infrared. Die Größe der vier Einzelelemente ist, wie in der optischen Simulation
angenommen, 2x2 mm2. Diese liegen jedoch aus technischen Gründen (Abschirmung) etwas
weiter auseinander. Der Aufbau dieser vier Sensoren wurde in einem normgerechten TO 8
durchgeführt, welches in Abb.4.6-2 mit seinen Abmaßen ersichtlich ist.
Abb.4.6-2:Pyroelektrischer Quadcell-Detektor: Links Draufsicht, rechts Seitenansicht [Dia07]
Montiert wird der Detektor auf einem Sockel unter Nutzung seiner 12 PINs, über die
außerdem seine Versorgungsspannung von 12 V eingespeist wird. Ein konstanter
Versorgungsstrom (etwa 0,19 mA) fließt dabei zwischen den Drain- und den Source-PINs,
während das Signal über die Source- und Ground-Pins abgegriffen wird. Die spezifische
50
Detektivität des Detektors wurde vom Hersteller mit 5 ⋅ 108 cm Hz W angegeben. Seine
Rauschspannung bei der gewählten Modulationsfrequenz liegt unter 100 nV und die
Empfindlichkeit bei etwa 320 V/W. Bei höheren Modulationsfrequenzen verschlechtern sich
alle drei dieser Eigenschaften stark, so dass Messungen mit Frequenzen von über 20 Hz bei
diesem Detektortyp nicht empfehlenswert sind
Um die Funktion des Detektors zu testen, wurde ein herkömmlicher Widerstand durch
elektrische Leistung auf verschiedene Temperaturen zwischen 35 und 50°C erwärmt und mit
den vier Kanälen detektiert. Da sich die Geometrie und das Strahlverhalten des Widerstandes
sehr von dem eines Mäuseschwanzes unterscheidet, macht es an dieser Stelle keinen Sinn, die
Daten über der Temperatur aufzutragen. Aus diesem Grunde wurden die Signale der Kanäle
eins bis drei über dem Signal des Kanals null aufgetragen, wodurch deren Korrelation schnell
deutlich werden sollte. Da dieser Vortest eher prinzipieller Art war und zum Zeitpunkt dieses
Tests weder die Software noch die Koordination zwischen Soft- und Hardware, sprich die
Synchronisierung der Kanäle, zur Verfügung stand, wurden die Ergebnisse in diesem
speziellen Fall nur manuell aufbereitet. Dabei wurde, um die Signalgröße zu bestimmen, der
konstante Anteil der modulierten Signale eliminiert und das Integral über die
Fouriertransformierte berechnet. Auf diese Weise erhält man einen Wert, der unabhängig von
der Größe der Chopperschwankungen ist, bei dem jedoch auch alle Rauschanteile enthalten
sind. Da es sich hier jedoch nur um einen Funktionstest handelte, ist diese Vorgehensweise
ein durchaus hinreichend gutes Verfahren. Die Ergebnisse sind in Abb. 4.6-3 und 4.6-4
dargestellt.
Abb.4.6-3: Proportionalität der Kanal 1 (links) und 2 (rechts) zu Kanal 0 bei Änderung der
Einstrahlungsintensität
51
Abb.4.6-4: Proportionalität des Kanals 3 zu Kanal 0 bei Änderung der Einstrahlungsintensität
In allen drei Fällen ist die lineare Abhängigkeit gut sichtbar, was die grundlegende Funktion
aller Kanäle gut bestätigt. Die schlechteste Korrelation ist die zu dem breiten Bandpass.
Ursache ist, dass dieser aufgrund seines deutlich weniger selektiven Detektierens auch mehr
Umgebungseinflüsse und Rauschen misst. Ebenso wird aus den Diagrammen deutlich, dass es
sich hier um winzige Signalgrößen handelt, deren Auswertung ohne eine zusätzliche
Verstärkereinheit unmöglich ist (auch beim Erstellen dieser Diagramme wurde die
Verstärkereinheit
bereits
genutzt,
die
Signale
jedoch
auf
ihre
Ursprungsgröße
zurückgerechnet). Aus diesem Grund soll im nächsten Abschnitt auf die Verstärkerschaltung
eingegangen werden.
4.7. Verstärkerschaltung
Die verwendete Schaltung ist eine vierfache Verstärkerschaltung, die darauf ausgelegt wurde,
besonders rauscharm zu verstärken. Die Schaltung wurde entwickelt in Kooperation mit der
Firma Dias Infrared und realisiert von der Elektronikabteilung des Instituts für Angewandte
Physikalische Chemie der Universität Heidelberg. Die exakte Funktionsweise soll aufgrund
der vielen technischen Details hier nicht ausführlich besprochen werden, sondern ist
zusammen mit der wesentlichen Schaltung in Anhang zu finden.
Das vom Detektor ausgegebene Signal wird zunächst durch einen Hochpass geleitet, wodurch
niederfrequente Signale unter 1 Hz unterdrückt werden. Die Wahl des Source-Widerstandes
ist hier von besonderer Bedeutung, da er direkt mit dem Eingang des OPV verbunden ist und
52
sich aus diesem Grunde auch deutlich auf die Größe und die Qualität des Signals auswirken
kann. Wird er zu hoch gewählt, so geht sein Rauschen (berechenbar aus: U r = 4kTRB )
direkt in die Signalaufnahme des OPV ein und verschlechtert das Signal. Wird er zu tief
gewählt, dann wird das Signal über ihn zum größten Teil kurzgeschlossen und ist einer
Verstärkung nicht mehr zugänglich. Da der OPV besonders rauscharm zur Verfügung stand
und eine hohe mögliche Verstärkung liefern kann, wurde dieser Widerstand mit 4 kΩ relativ
niedrig angesetzt. Zu diesem Widerstand wurde der OPV LT1007 (Fa.Linear Technology)
gewählt, der sich für diesen Schaltungsaufbau durch besonders rauscharme Verstärkung
anbot. Der Hersteller gibt das spektrale Rauschen mit einer garantierten Größe von maximal
4,5 nV
Hz an. Die Response-Zeit des OPVs ist für eine Anwendung mit wenigen Hertz
ebenfalls hinreichend gut. Ein Offsetabgleich seines Gleichspannungsanteils wurde zusätzlich
integriert, da bei Rauschmessungen gezeigt werden konnte, dass sich die Größe des Offsets
auch direkt auf das Rauschverhalten aller anderen Frequenzen auswirkt. (Bei der
Durchführung wurden die Eingänge der Verstärkerplatine sowie der Eingangskondensator
kurzgeschlossen.) Das Ergebnis ist in Abb.4.7-1 zu sehen. Zu erkennen ist hier deutlich, dass
bei einem Offset im mV-Bereich das Rauschen um mehrere Größenordnungen höher liegt, als
wenn der Offset nur im µm-Bereich liegt.
Abb. 4.7-1: Abhängigkeit des Rauschen vom Offset des OPV
53
Bei Beginn des Schaltplanentwurfes stand hierbei noch nicht fest, welche tatsächlich
Signalgröße zu erwarten war. Aus diesem Grund wurde als weitere Wahlmöglichkeit eine
mögliche Einstellung der Verstärkung auf 101, 501, 2001 und 7501 mit eingeplant. Nach
ersten Tests unter Zuhilfenahme der im nächsten Kapitel erklärten Analog/Digitalkarte wurde
die Verstärkung an dieser Stelle zunächst auf 2001 eingestellt.
Misst man nun die Rauschpegel bei den verschiedenen Verstärkungen, so erhält man
logischerweise eine Rauschhöhe in Abhängigkeit der Verstärkung, da ja das Rauschen auf
gleiche Weise verstärkt wird (Abb.4.7-2). Der Nutzen einer solchen Messung besteht jedoch
darin, dass bei sehr großen Verstärkungen das Rauschsignal eine solche Größenordnung
annimmt, dass der Rauschpegel der nachgeschalteten Messkarte vernachlässigt werden kann.
Auf diesem Weg kann man also anschließend den nahezu unverfälschten Rauschpegel der
Verstärkerplatine selbst rückrechnen. Das Ergebnis ist dabei ein Rauschpegel von 2 nV bei
10 Hz und einer angesetzten Messzeit von 60 s.
4.7-2: Abhängigkeit der Rauschspannung der Verstärkerplatine von der Höhe der Verstärkung
54
Der Einbau der Verstärkerplatine, auf dem der Detektor mit seinen zwölf PINs direkt
aufgesteckt ist, wurde unter Verwendung eines zusätzlichen Messingabschirm-Gehäuses
durchgeführt. Auf der Rückseite der Platine findet die Datenübertragung mithilfe ein
Flachbandkabel zum Deckel des Abschirmgehäuses statt, wo es in einem festmontierten, nach
außen gerichteten Sub-D-37-Stecker mündet. Auf diese Weise ist die Platine zusätzlich vor
äußeren Rauschquellen geschützt und kann mithilfe des Sub-D-37-Steckers mit der im
folgenden beschriebenen Analog/Digital-Messkarte verbunden werden.
4.8. Analog/Digital-Messkarte
Die Analog/Digital-Messkarte dient als Verbindung zwischen der Messtechnik der Apparatur
und der Software bzw. der Datenverarbeitung und –analyse. Dabei besteht ihre Hauptaufgabe
darin, die in der Verstärkerschaltung vergrößerten Signale nun möglichst rauschfrei und
zeitkorrekt einzulesen und in digitale Daten umzuwandeln. Aus dieser Aufgabe resultieren
dann auch die Grundkriterien bei der Auswahl der Karte. Zum einen müssen die vier Signale
gut in digitale Daten überführt werden, was durch eine hohe digitale Auflösung realisiert wird
und zum anderen muss die Karte eine Modulationsfrequenz von mehr als 10 Hz sehr gut
abtasten können, damit der zeitliche Verlauf für eine Weiterverarbeitung gut genug erfasst
wird. Ein weiterer praktischer Aspekt ist die verwendete Verbindung zur Recheneinheit.
Diese sollte eine gängige Schnittstelle sein, die auf allen Rechnern benutzbar ist und somit das
Gerät unabhängig vom verwendeten Computer macht. Gewählt wurde hier eine
herkömmliche USB-Verbindung. Desweiteren ist natürlich das übertragene Datenformat
wichtig. Dieses Problem ist aber in der Regel bereits von den Kartenherstellern gelöst, da
diese meist eine entsprechende Software zur Messkarte anbieten.
Alle aufgelisteten Kriterien zu Grunde gelegt, wurde die A/D-Messkarte DT9822 der Firma
Datatranslation (Marlboro, MA, USA) gewählt. Sie besitzt eine 24-Bit Auflösung und ist mit
USB ansteuerbar, wodurch sie gleichzeitig auch ihre 5 V Betriebsspannung bezieht. Die
maximale Abtastrate beträgt 800 Hz. Die Höhe der Abtastrate beeinflusst dabei die Auflösung
der Karte.
Bei den durchgeführten Messungen wurde in der Regel eine Rate von 100 Hz oder 200 Hz
gewählt, da bei ihr ein etwa zehn- bis zwanzigfaches Oversampling stattfindet, was die
zeitliche Entwicklung der Signale hinreichend genau für weitere Berechungen beschreibt. Die
Auflösung liegt dabei zwischen 20,9 und 17,5 Bit, wodurch die hohe Auflösung der Karte
55
dennoch genutzt wurde. Da die gewählte Karte zum Zeitpunkt des Erwerbs die führende
USB-Karte hinsichtlich Geschwindigkeit und Auflösung war, war bei solchen Abtastraten
leider keine höhere Auflösung realisierbar. Das Rauschverhalten bei den verschiedenen
Abtastraten ist für eine Messzeit von 60 s in Abb.4.8-1 dargestellt. Die Eingänge wurden bei
dieser Messung kurzgeschlossen. Das Rauschsignal befand sich bei 10 Hz Modulation und
unter Verwendung einer Abtastrate von 200 Hz bei 6.8 ⋅ 10 −8V und bei 100 Hz bei
3.6 ⋅ 10 −8V .
Abb.4.8-1: Rauschspannung der Messkarte als Funktion der Frequenz und Abtastrate
Die Messkarte besitzt vier analoge Eingänge, die zeitgleich erfasst werden können. Weiterhin
verfügt sie über zwei analoge 16Bit Ausgänge, wovon einer die Geschwindigkeit des
Choppers steuern kann. Neben den analogen Eingängen stellt die Karte außerdem digitale
Ein- und Ausgänge zur Verfügung, die zum Beispiel die Synchronisierung der Kanäle steuern
können.
Intern in der Karte können zusätzlich noch Verstärkungsbereiche eingestellt werden, die von
einfach, d.h. unverstärkt, bis auf 64-fach (in Größen der Zweierpotenzen) reichen. Dabei
findet
im
eigentlichen
Sinn
allerdings
56
keine
Verstärkung
statt,
sondern
die
Digitalisierungstiefe wird auf einen engeren Bereich angewendet und die Messung wird daher
genauer. Der Grundbereich ist hier ±2,5 V und verringert sich entsprechend des
Vergrößerungsfaktors. Der Hersteller empfiehlt in diesem Zusammenhang einen Bereich zu
wählen, in dem das Signal gerade noch enthalten ist.
Die mechanischen Eigenschaften passen ebenfalls zu der hier geplanten Anwendung. Mit den
Abmaßen 151,5 x 106 x 36,7 mm3 ist sie recht einfach in jedes Gerät einbaubar und das
Gewicht von weniger als 260 g ist tolerierbar.
Die Signalverarbeitung findet nun mit der zur Karte mitgelieferten Software statt.
Ausführlichere Erläuterungen zur Vorbehandlung der Signale sowie zur Realisierung des
benutzten Software-Lock-ins befinden sich im Anhang. Dort werden außerdem die für die
Detektion weniger wichtigen Komponenten wie die Kühlung und das Gehäuse ergänzend
beschrieben.
57
5. Abschätzung des zu erwartenden Messsignals
Um einen kostenaufwendigen Aufbau eines nicht funktionierenden Gerätes vorzubeugen, soll
vor der Konstruktion des Messgerätes eine Abschätzung der zu erwartenden Messsignale
stattfinden, die nach Auswahl der möglichen Komponenten mit deren Rauschverhalten
verglichen werden soll. In diesem Zusammenhang spielen zum einen die Größe des
glukoseabhängigen Anteils im Verhältnis zur Gesamtstrahlung eine Rolle, und zum anderen
die Größe der Gesamtstrahlung selbst.
5.1. Berechnung des Signal-Hintergrund-Verhältnisses
Zunächst soll der Anteil der Strahlung abgeschätzt werden, der direkt von der Konzentration
der Glukose und deren Absorption im Temperaturgradientenbereich abhängt.
Aus den gemessenen Glukose-Spektren erhält man für die Wellenlänge der maximalen
Absorption der Glukose den Wert 9,25 µm. Bei dieser Wellenlänge haben 100 mg/dl Glukose
eine Extinktion von 9,1 cm-1. Der Wert für Blut bei dieser Wellenlänge liegt bei 340,3 cm-1.
Aus diesen Messergebnissen folgt mit der Formel für ein Strahlungsgebiet mit Temperaturgradienten:
S hν ∆T α G
=
⋅
⋅
= 4,3 ⋅ 10 − 4
B
k T 2 α B 2d
mit:
(5.1)
d ≈ 150µm
∆T ≈ 5K
… Länge des Temperaturgradienten
T ≈ 310K
… Temperatur
αG = 9,1cm−1
… Extinktion von Glucose mit einer
… Temperaturunterschied
Konzentration
von
100 mg/dl
bei
9,25 µm
α B = 340,3cm−1 … Extinktion von Blut bei 9.25 µm
Hierbei wurde die angesetzte Größe für die Länge des Temperaturgradienten aus der
Veröffentlichung von Klonoff [Klo98] genommen. Der gewählte Temperaturunterschied
58
resultiert aus einer Kerntemperatur des Schwanzes von etwa 35°C und einer außen
gemessenen Temperatur von etwa 30°C. Das erhaltene Resultat von 0,43‰ gibt dabei die
Genauigkeit an, mit der der im nächsten Kapitel ermittelte Gesamtfluss gemessen werden
muss, um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten.
5.2. Berechnung der Signalstärke
Zweiter Schritt dieser Vorbetrachtung ist die Abschätzung der gesamten Strahlung, die von
der genutzten Mäuseschwanzpartie abgegeben wird und durch die Optik zum Detektor
gelangt. Geht man davon aus, dass die Maus ein nahezu schwarzer Strahler ist, so ist der
Ausgangspunkt für die Abschätzung das Planck-Gesetz:
⎞
2hc 2 ⎛
1
⎟ ⋅ ∆λ
⋅ ⎜⎜
P (λ , T ) =
⎟
5
hc
k
λ
T
−1⎠
λ
⎝e
(5.2)
Daraus folgt mit der Relation für den Photonenfluss:
j0 =
λ
hc
⋅ P (λ , T )
(5.3)
mit:
T=310 K ,
λ=10 µm,
∆λ=0,5 µm
der Ursprungsfluss von:
j0 = 2.9 ⋅ 10 20
Die
gewählte
1
(5.4)
sm 2 sr
Wellenlängenbandbreite
wurde
absorptionsspektren festgelegt.
59
dabei
ebenfalls
aus
den
Glukose-
Anschließend folgt die Abschwächung des Signals durch die verschiedenen Hautschichten,
welche mit dem Lambert-Beer-Gesetz berechnet wird:
j = j0 ⋅ e −σ ⋅ N A ⋅c ⋅d
mit Wasser als Hauptabsorber:
(5.5)
σ = 2 ⋅ 10 − 20 cm 2
c Dermis = 27.8
und
mmol
cm3
d Dermis = 150 µm
c Epidermis = 11.1
für die äußeren Schichten der Dermis und für die Epidermis:
mmol
cm3
d Epidermis = 50 µm
Aus der Haut kommt somit ein Photonenfluss von:
j Epidermis = 9.8 ⋅ 1017
1
(5.6)
sm 2 sr
Darauffolgend findet nun eine Schwächung des Signals beim Durchgang durch die
Zinkselenid-Linsen statt. Diese haben folgende Parameter:
µ = 0.005cm −1
…Absorption
R = 0.006
… Reflektivität
d = 2.2cm
… Gesamtdicke der Linsen
Die Reflektivität der Linsen muss hier entsprechend der Anzahl der Linsen dreimal
berücksichtigt werden und die hier angegebene Gesamtdicke ist als die maximale Dicke der
Linsen zu verstehen.
Dies führt zu einem Fluss von:
j Linse = (0.994) 3 ⋅ j Epidermis e − µd = 9.5 ⋅ 1017
60
1
sm 2 sr
(5.7)
Um nun den absoluten Photonenfluss am Detektor zu bestimmen ist es notwendig, die
Geometrie des Systems zu betrachten. Zu diesem Zwecke wurden bereits die
Optiksimulationen durchgeführt, welche als Effektivität den Wert von 4,87% lieferten.
Bedenkt man nun noch, dass sich der gewählte Detektor etwas von der gewünschten
Geometrie unterscheidet und zwischen den Detektoren Strahlung am Gehäuse verloren geht,
so erhält man eine Effektivität von 2,85%. Die Strahlungsfläche entspricht hier bei einer
angenommenen Mäuseschwanzdicke von 5 mm und einer Fläche von 471 mm2. Der
komplette Raumwinkel ist bekanntermaßen 4π. Der Photonenfluss, der in Richtung Detektor
geht, beträgt somit:
j D = 1.6 ⋅ 1014
1
s
(5.8)
Dieser Fluss verringert sich nunmehr noch dadurch, dass er sich auf die vier einzelnen
Sensoren verteilt. Es bleibt ein effektiver Fluss pro Einzeldetektor von:
1
jeff = 4 ⋅ 1013 .
s
(5.9)
Dieser Fluss gilt natürlich nur für die schmalen Einzeldetektoren, bei dem Bandpassfilter ist
die auftreffende Photonenzahl etwa um einen knappen Faktor 4 größer.
5.3. Vergleich des Signals mit bekannten Rauschquellen
Um nun den Aussagegehalt der Signalstärke beurteilen zu können, ist es wichtig diese mit den
verschiedenen Rauschquellen zu vergleichen. Einen Überblick über die Rauschquellen gibt
Abb.5.3-1.
61
Abb.5.3-1: Übersichtsschema über mögliche Rauschquellen bei der Detektion
Größte Rauschquelle ist bei Messungen im Infraroten in der Regel die thermische
Hintergrundstrahlung. Diese lässt sich auch im eigentlichen Sinne nicht vermeiden, da ja
jedes Objekt entsprechend seiner Temperatur Strahlung abgibt. In dem in dieser Arbeit
gebauten Messgerät soll diesem Rauschen durch eine Differenzbildung von Messsignal und
Referenzkanal Rechnung getragen werden, so dass die Verminderung dessen hauptsächlich
von einer guten Kalibrierung der Kanäle untereinander abhängt.
Eine weitere nicht zu beeinflussende Rauschart ist das sogenannte Photonenrauschen, was
durch eine statische Schwankung des Photonenflusses erzeugt wird. Seine Größenordnung
entspricht dabei gerade der Wurzel der Anzahl der Photonen. Setzt man eine Messzeit von
einer Sekunde an, so ergibt sich durch das Photonenrauschen ein Verhältnis von Rauschen zu
Signal von:
N 6.3 ⋅ 10 6 ⋅
= 1.6 ⋅ 10 − 7
=
13
S
4 ⋅ 10
(5.10)
Dieses Verhältnis ist deutlicher niedriger als das in Gleichung 5.1 abgeschätzte SignalHintergrund-Verhältnis von 4.3 ⋅ 10−4 und spielt somit für die Messung keine entscheidende
Rolle.
62
Die nächsten Rauschquelle, die sich mit dem Signal vermischt, ist das Rauschen des
Detektors selbst. Dieses Rauschen ist als Leistung direkt in Form der reziproken spezifischen
Detektivität gegeben. Aus diesem Grund muss der ankommende Photonenfluss zunächst in
eine Strahlungsleistung umgerechnet werden.
1 hc
P = 4 ⋅ 1013 ⋅
= 7.9 ⋅ 10 − 7 W
s λ
(5.11)
Beim Detektorrauschen hat die Rauschbandbreite ∆f einen entscheidenden Einfluss. Diese
wurde, da es sich hier um eine Größtfehlerabschätzung handeln soll, bei der Berechnung mit
der Chopperungenauigkeit (±0,1Hz) gleichgesetzt.
Setzt man das Rauschsignal mit dem Messsignal ins Verhältnis, so ergibt sich:
* −1
2 ⋅ 10 − 9 W / cm Hz ⋅ 0.2cm ⋅ 0.2 Hz
N ( D ) ⋅ A ⋅ ∆f
= 2.2 ⋅ 10 − 4
=
=
−
7
S
P
7.9 ⋅ 10 W
(5.12)
Das hier erhaltene Ergebnis entspricht etwa der Hälfte des Signal-Hintergrundverhältnisses
und muss daher als kritisch für die Messung eingestuft werden. Da jedoch durch den Lock-in
eine deutliche Verringerung der Rauschbandbreite zu erwarten ist und bei zunehmender
Messzeit die Rauschgröße um einen Faktor mit der Größe der Wurzel der Messzeit absinkt,
sollte eine Messung dennoch möglich sein.
Eine ähnliche Abschätzung kann für den Verstärker gemacht werden. Dazu muss die den
Detektor erreichende Leistung anhand der Empfindlichkeit des Detektors in die daraus
resultierende Spannung berechnet werden:
U = 7.9 ⋅ 10 − 7 W ⋅ 320
V
= 2.5 ⋅ 10 − 4 V
W
(5.13)
Der Wert für das Rauschen der Verstärkerschaltung wurde in Kap. 4.7. zu 2 nV während einer
60 s Messung bestimmt, d.h. also bei einer Messung über eine Sekunde muss mit der Wurzel
63
dieser Messzeit multipliziert werden. Auch bei der Verstärkerschaltung hat die
Rauschbandbreite Einfluss.
Das Verhältnis von Rauschen zu Signal entspricht daher:
N 2 ⋅ 10 −9 V ⋅ 60 s ⋅ 0.2 Hz
= 2.8 ⋅ 10 − 5
=
−
4
S
2.5 ⋅ 10 V
(5.14)
Die Größenordnung der Verstärkerschaltung liegt somit deutlich unter den Rauschwerten des
Detektors und ist mit einem maximalen Fehler von etwa 6,5% eher minder kritisch für die
Machbarkeit einer Messung.
Der Verstärkerkarte folgt die A/D-Messkarte, bei der jedoch bereits das um den Faktor 2001
erhöhte Signal anliegt. In Kap. 4.8. wurde für das Rauschen der Messkarte bei 200 Hz
Abtastrate und einer Messzeit von einer Minute ein Wert von 6.8 ⋅ 10 −8V gefunden. Es ergibt
sich für N/S folgende Abschätzung:
N 6.8 ⋅ 10 −8 V ⋅ 60 s ⋅ 0.2 Hz
= 4.7 ⋅ 10 − 7
=
−4
S
2.5 ⋅ 10 V ⋅ 2001
(5.15)
Mit dieser Größenordnung des Rauschens an der Messkarte kann diese also getrost gegenüber
den anderen Fehlerquellen vernachlässigt werden.
Nach Abschätzung aller möglichen Rauschquellen kommt man folglich zu dem Schluss, dass
eine Messung mit dem in dieser Arbeit beschriebenen Gerät zwar nicht einfach aber dennoch
gut möglich sein sollte.
64
6. Messungen und Ergebnisse
6.1. Vergleich des realen Signals mit der Abschätzung
Zunächst sollen die gemessenen Signale mit den vorher durchgeführten Abschätzungen
verglichen werden. Hierzu wurde der Mittelwert der jeweils ersten Messpunkte (entspricht
Messzeit von etwa 10 s) von acht Messungen gebildet. Die durchschnittliche Signalgröße
betrug dabei 0,11 V und hat somit die gleiche Größenordnung wie die Abschätzung (0,5 V),
liegt allerdings etwas niedriger. Dieser Umstand kann mehrere Ursachen besitzen. Neben
einer niedrigeren Abstrahlung der Maus durch etwas geringere Außenkörpertemperatur oder
kleinere Geometrie als angenommen, kann er auch aus der etwas geringeren Transmission der
Filter stammen (die zur Rechnung benutzten Werte beziehen sich auf ein Band mit 100%
Transmission in 0,5 µm). Viel wahrscheinlicher ist in diesem Zusammenhang allerdings, dass
durch die reflektierte Strahlung des Choppers (die eigene Emission ist durch eine Goldschicht
auf ein Minimum reduziert) das Differenzsignal zwischen offenem und geschlossenem
Chopper verringert wurde. Da diese Reflexion jedoch von der auf konstant 15°C gehaltenen
Zwischenwand herrührt, wird durch diese Tatsache nahezu kein zusätzliches Rauschen
hervorgerufen.
6.2. Qualität der Signale nach der Software-Bearbeitung
Da die Durchführung des Lock-in Effekts im konzipierten Gerät doch eher unkonventionell
ist, soll zu Beginn die Qualität des hier verwendeten Programms überprüft werden. Bei den
Einzeldetektoren wurden bereits die Kanäle übereinander aufgetragen. Dort wurden dazu die
Integrale über die Fouriertransformierten Signale genutzt. An dieser Stelle soll nun das
gleiche noch einmal durchgeführt werden, jedoch unter Nutzung der mittels Software
erzielten Werte. Da die Software der vorherigen Berechnung überlegen sein sollte, müssten
nun die Geraden deutlich bessere Qualität besitzen als mit dem vorhergehenden Verfahren.
Genutzt wurde hierbei eine sich ändernde Temperaturquelle mit Mausgeometrie. Trägt man
nun die Kanäle über dem Referenzkanal auf, so ergeben sich folgende Verläufe (Abb.6.2-1
bis 6.2-3):
65
Abb. 6.2-1: Ankommendes Signal am Kanal 0 als Funktion des Referenzkanals
Abb. 6.2-2: Ankommendes Signal am Kanal 1 als Funktion des Referenzkanals
66
Abb. 6.2-3: Ankommendes Signal am Kanal 3 als Funktion des Referenzkanals
Die erhaltenen Regressionskoeffizienten liegen zwischen 0,99953 und 0,999842 sind also
extrem hoch.
Bedenkt man, dass alle vier Detektoren unterschiedlich Rauschen können und ebenso die vier
Verstärkereinheiten verschieden starke Rauschanteile hinzufügen, so kann man bei dieser
hohen Konstanz der Ergebnisse zueinander auf ein sehr niedriges Rauschverhalten schließen.
6.3. Zeitlicher Verlauf der Signale und dessen Ursachen
Als nächster Schritt wurde ein Mäuseschwanz in der Apparatur fixiert und der zeitliche
Verlauf der Signale untersucht.
Bei diesen Messungen wurde recht schnell beobachtet, dass ein Mittelwert der Messungen
innerhalb der ersten Minuten nicht für eine aussagekräftige Messung verwendbar ist, weil die
gemessenen Werte bei allen Detektoren mit der Zeit absinken. Dieses Verhalten deutet direkt
auf eine Temperaturveränderung im vorderen Strahlengang also zwischen Strahlungsquelle
und dem Detektor hin.
Um diesen Sachverhalt zu überprüfen, wurde anstatt eines Mäuseschwanzes als Probe ein
Plastikstab mit ähnlicher Geometrie und Raumtemperatur verwendet. In den Abb.6.3-1 und
6.3-2 sind beide Messungen zum Vergleich gegenübergestellt:
67
Abb. 6.3-1: Typisches detektiertes Spannungssignal am Kanal 0 bei einem Mäuseschwanz
Abb.6.3-2: Detektiertes Spannungssignal am Kanal 0 beim Plastikstab mit Raumtemperatur
68
Die Diagramme demonstrieren deutlich, dass es sich bei dem abfallenden Signal um ein
Abkühlen des Mäuseschwanzes während der ersten Messminuten handelt. Analysiert man die
abklingende Kurve des Mäuseschwanzes, findet man eine Funktion des Typs:
y = Ae− x / B + C . Der Ursprung der abfallenden Schwanztemperatur kann wahrscheinlich auf
ein teilweises Abschneiden der Blutzirkulation oder auf die straffe und somit bewegungslose
Einspannung des Schwanzes in der Spiegeleinheit zurückgeführt werden.
Um zu entscheiden, welche der beiden Möglichkeiten wahrscheinlicher ist, wurde eine
Heizplattform hinzugezogen, die eigens von der Firma Hatteras Instruments für
Mäuseexperimente konzipiert wurde. Dabei sitzt die Maus in einer verdunkelten
Metallkammer, die über eine mit Magneten verbundene Bodenplatte auf einer konstanten
Temperatur gehalten wird. Nun wurde einmal mit einem sehr fest eingespannten und einmal
mit einem weniger fest eingespannten Mäuseschwanz gemessen. Beide Messungen sind in
den Diagrammen in Abb. 6.3-3 und 6.3-4 dargestellt.
Abb.6.3-3: Maus auf einer Heizplattform, sehr stark fixiert
69
Abb.6.3-4: Maus auf einer Heizplattform, weniger stark fixiert
In Abb.6.3-3 zeigt der Graph, wie in den vorhergehenden Messungen einen Abfall der
Temperatur. Dieser Prozess ist allerdings aufgrund der äußeren Wärmezufuhr langsamer als
ohne Heizplattform. In Abb.6.3-4 hingegen ist die Spannung zwar leicht schwankend, aber es
ist kein so deutlicher Trend gegeben wie vorher (die Schwankungen resultieren hier aus der
Bewegung des Schwanzes, da dieser nicht stark genug fixiert ist). Der Mittelwert würde daher
kaum noch vom Zeitpunkt der Messung abhängen, es kann in einem bestimmten
Fehlerbereich von einer konstanten Messung ausgegangen werden. Es ist folglich aus den
Diagrammen ablesbar, dass die Stärke der Einspannung des Schwanzes einen entscheidenden
Einfluss auf die Messdaten hat.
Außerdem kann man aus dieser Tatsache ebenso eine Schlussfolgerung für die Parameter in
der oben erwähnten Exponentialgleichung ziehen. Der Parameter B, der den Abfall der
Funktion beschreibt, hängt somit auch von der Einspannung ab und sollte daher für weitere
Berechungen nicht genutzt werden. Der Parameter C spiegelt die Endtemperatur des durch
das Einspannen bewirkten Temperaturabfalls wieder. Da auch diese von der Stärke des
Einspannens abhängig ist, sollte auch C nicht für weitere Berechnungen verwendet werden.
Folglich ist es nur noch bei Parameter A empfehlenswert, ihn zur Glukosebestimmung zu
verwenden, da nur er unabhängig vom Einspannen sein sollte.
70
6.4. Glukosetoleranztests
Der Großteil der Test-Messungen des Gerätes wurde an NOD/Lt-Mäusen (männlich, 6-12
Wochen alt) im Jackson Laboratory in Bar Harbor, Maine, USA, durchgeführt. Bei diesem
Mäusestamm ist ein Gendefekt so gezüchtet worden, das ein verändertes Protein das
Sättigungsgefühl des Tieres verhindert. Folge ist, dass die Tiere zunehmend Probleme mit
dem Glukosehaushalt bekommen und dadurch recht bald Diabetes Typ 1 ausbricht. Beim LtUntertyp hat dieses Verhalten kaum Einfluss auf das Körpergewicht, d.h. sie werden nicht
fettleibig (lt = light).
Typischerweise bricht Diabetes bei den weiblichen Tieren nach etwa vier Wochen aus, die
Tieren stellen sich aber nach einer gewissen Zeit (meist um die 7. Lebenswoche) auf die
Krankheitssituation ein und leben normal weiter. Bei männlichen Tieren hingegen, bricht der
Diabetes meist etwas später aus und die Tiere regulieren sich meist überhaupt nicht mehr auf
diese Situation ein. Sie gehen nach Erkrankung in der Regel ziemlich bald daran zugrunde.
Da es sich bei Diabetes um eine Autoimmunreaktion handelt, spielt die biologische Reinheit
des Haltungsraumes für den Zeitpunkt des Ausbruches von Diabetes eine Rolle. Je reiner
daher ein Raum, umso schneller beginnt statistisch die Erkrankung an Diabetes. Aus diesem
Grund werden besonders Mäuse dieses Stammes häufig auf erhöhte Glukosewerte untersucht.
Das hier realisierte Gerät wurde ursprünglich aus der Motivation entwickelt darüber Auskunft
zu geben, ob bei Mäusen dieses Stammes Diabetes vorliegt oder nicht
Für die Experimente in Bar Harbor wurden nichtdiabetische und nichtbetäubte NOD-Mäuse
18 Stunden gefastet und anschließend im Restrainer festgehalten, um den Schwanz in der
gebauten Apparatur zu messen. Auf diese Weise wurde ein erster Wert mit einer besonders
niedriger Glukose fünf Minuten lang gemessen. Die darauffolgende Messung mit dem
herkömmlichen Plasma-Glukose-Messer wurde im Anschluss an die nicht-invasive mittels
Blut aus dem Augenlid durchgeführt. Der Zeitabstand zwischen dem Ende der nicht-invasiven
Messung und der Blutnahme liegt circa bei drei Minuten. Das Blut wurde zentrifugiert und
somit vom Plasma getrennt. Der Glukosewert des separierten Plasmas wurde nun mit dem
Beckman Coulter Glucose Analyzer bestimmt. Nach diesem ersten Wertepaar wurde eine
Glukose-Injektion von 2 g/kg Körpergewicht in den Bauch durchgeführt, um so den GlukoseSpiegel zu erhöhen und anschließend mit beiden Messverfahren nach 20, 45 und 90 Minuten
nach der Injektion den Verlauf der Glukosekonzentration zu dokumentieren.
71
Zwischen den Messungen wurde die Maus in einem gewöhnlichen Käfig positioniert, in dem
Wasser, aber kein Futter zur Verfügung stand (dies sollte eine Beeinflussung des
Blutzuckerwertes verhindern).
Es wurden an dieser Stelle zwei nichtdiabetische NOD/Lt-Mäuse an jeweils drei
verschiedenen Tagen einem Glukosetoleranztest unterzogen, um genügend Messpunkte
verschiedener Glukosekonzentration zu sammeln. Dabei wurden die Daten der beiden Mäuse
separat ausgewertet, um biologische Einflüsse auf das Ergebnis zu minimieren.
Zur Auswertung der nicht-invasiven Messung wurden nun die Differenz der A-Parameter der
Glukose-Frequenzen und der Referenz-Frequenz gebildet und diese über den mit der
Beckman Coulter Glucose Analyzer 2 bestimmten Werten aufgetragen. Die Ergebnisse sind
für Kanal 0 in den Abbildungen 6.4-1 und 6.4-2 zu sehen. Die stets zuerst gemessene Maus
soll hier als Maus 1 und die zweite als Maus 2 bezeichnet werden.
.
Abb.6.4-1:Differenz der A-Parameter in Abhängigkeit des Glukosewertes bei Maus1
72
Abb.6.4-2:Differenz der A-Parameter in Abhängigkeit des Glukosewertes bei Maus2
Vergleicht man die Abbildungen, so findet man zwei recht verschiedene Aussagen. Abb.6.4-1
zeigt eine klare lineare Abhängigkeit vom Glukosewert. Es liegen lediglich drei der
Messpunkte abseits einer sich recht klar abzeichnenden Regressionsgeraden. Alle drei dieser
Werte wurden direkt nach der Injektion gemessen, so dass davon ausgegangen werden kann,
dass während der fünfminütigen Messzeit eine doch deutlich spürbare Änderung des
Glukoselevels stattgefunden hat. Der Mittelwert, der durch eine Messung dieser Art über den
Messzeitraum einer stark ansteigenden Kurve gebildet wird, korreliert nun mal mehr und mal
weniger mit dem erst später genommenen Blutplasmawert. Eine Schwankung dieser Werte ist
also durchaus plausibel.
Benutzt man die erhaltene Regressionsgerade als Eichung der Signale auf den
Blutglukosewert,
so
kann
man
eine
mit
anderen
Messmethoden
vergleichbare
Standardabweichung berechnen. Diese Standardabweichung beträgt hier 50,4 mg/dl.
Berücksichtigt man die Werte nach der Injektion nicht, dann sinkt die Standardabweichung
auf 19,8 mg/dl.
Leider zeigt Maus 2 in Abb.6.4-2 ein völlig anderes Verhalten. Hier ist eine Korrelation zur
Glukose, wenn überhaupt vorhanden, höchstens zu erahnen. Die Ursachen für dieses
unterschiedliche Messverhalten sind bis jetzt unklar. (Bei beiden Mäusen fand die gleiche
Messprozedur statt, die zweite wurde jedoch stets nach der ersten gemessen.) Von einem
73
mathematischen
Sichtwinkel
aus
beinhaltet
der
A-Parameter
ebenso
eventuelle
Zeitverzögerungen zwischen der Positionierung des Schwanzes in der Apparatur und dem
Start der Messung. Berücksichtigt man eine solche Verzögerung in der obigen Gleichung
(z.B. durch Ersetzen von x durch x+x0 ), so ergibt sich ein zusätzlicher Faktor, der bereits mit
A multipliziert ist. Auch die Differenzbildung kann diese Fehlerquelle nicht verhindern, da
man diesen Faktor in beiden A Parametern gleichermaßen erhält und dieser sich somit
ausklammern lässt. Das die Zeitverzögerungen verschieden sein könnten, könnte seinerseits
aus Problemen beim Fixieren bei Maus 2 resultieren, die sichtlich nervöser als Maus 1 auf die
Apparatur reagierte.
Da die Berechnung den kompletten Zeitraum der Messung berücksichtigt, können ebenfalls
Bewegungen der Maus eine weitere Fehlerquelle darstellen. Unregelmäßigkeiten dieser Art
konnten zwar an dem resultierenden nicht ganz regelmäßigen exponentiellen Abfall
beobachtet werden, eine sinnvolle Korrektur deren wäre jedoch nur willkürlich gewesen und
wurde daher nicht durchgeführt. Eine weitere Ungenauigkeit könnte aus der Tatsache folgen,
dass nicht exakt der gleiche Schwanzabschnitt im Spiegel eingespannt war. Auf die Weise
wäre die Strahlungsgeometrie leicht verändert und daher mit den anderen Werten nicht exakt
vergleichbar.
6.5. Intravenöse Glukose-Injektionen
Um den Einfluss der geometrischen und biologischen Faktoren zu reduzieren, sind
Messungen interessant, bei denen sich der Mäuseschwanz fixiert in der Probenkammer
befindet und gleichzeitig eine Änderung des Blutzuckers herbeigeführt wird. Da die Maus in
dem Restrainer schwer zugänglich ist, wurde mittels mikroskopischer Chirurgie eine Kanüle
in die Jugularvene im Hals implantiert. Auf die Weise ist es möglich, nachdem sich die
Schwanztemperatur konstant eingestellt hat, eine Injektion durchzuführen und somit eine
schnelle Änderung des Glukoseniveaus herbeizuführen. Diese Messungen wurden mit
Glukoseinjektionen und einfachen Salzlösungsinjektionen durchgeführt und die Auswertung
der Ergebnisse fand wie folgt statt:
Aufgrund des verschiedenen Transmissionsverhaltens der einzelnen Filter und der sich
ändernden Geometrie in der Apparatur
(durch verschiedenartige und verschieden
eingespannte Mäuseschwänze) wurden die Signale der Signalkanäle linear gegen den
74
Referenzkanal kalibriert. Dazu eignet sich hervorragend die Zeitperiode, in der der Schwanz
abkühlt, da man darin die Linearität bei verschiedenen Temperaturen am einfachsten
aufzeigen kann und sich die Maus dabei bereits in der später zu vermessenden Geometrie
befindet. Als zweiter Schritt wurde eine Normierung der Ergebnisse vorgenommen, um
unabhängig von den Absolutwerten der Messkanäle zu werden und diese direkt vergleichen
zu können. Dabei wurde die Differenz zwischen den Messkanälen 0 und 1 und der Referenz
(Kanal 2) durch die Summe beider Werte geteilt und diese über der Zeit aufgetragen. Bedenkt
man nun noch, dass mit zunehmender Glukose deren Absorption zunimmt und dadurch die
Größe des Messsignals abnimmt, dann muss die Polarität des erhaltenen Resultats gewechselt
werden,
um
bei
steigender
Glukose
einen
steigenden
Wert
zu
erhalten.
Der
Injektionszeitpunkt wurde der Übersicht wegen zeitlich sowie in der Normierung auf Null
gesetzt. Die Ergebnisse sind für die Glukoseinjektion in der Abb. 6.5-1 und für die
Salzlösungsinjektion in der Abb. 6.5-2 dargestellt.
Abb. 6.5-1:
Veränderung der Messsignale der Kanäle 0 (links) und 1 (rechts) nach
IV-Glukoseinjektion
Abb.6.5-2:
Veränderung der Messsignale der Kanäle 0 (links) und 1 (rechts) nach
IV-Salzlösungsinjektion
75
Es ist hier recht schnell ersichtlich, dass direkt nach der intravenösen Injektion ein starkes
Absinken der Signale sowohl bei der Salzlösung als auch bei der Glukoselösung stattfindet.
Ursache dessen kann hierbei nicht das tatsächliche Absinken der Glukose sein, weil die
injizierte Dosis den Blutzucker deutlich anreichern sollte. Die Ursache ist hier vielmehr in
dem offenbar sehr starken Eingriff in den Blutkreislauf durch die direkte Injektion in die Vene
zu suchen. Genauere Erklärungen zu diesem Sachverhalt stehen noch offen, denkbar wäre
jedoch, dass durch die Injektion eine Blutdruckerhöhung stattfindet und folgende deutlich
anwachsende Abstrahlung die hier aufgetragene Kurve zunächst nach unten versetzt. Wurde
nun eine Salzlösung injiziert, bleibt die Funktion auf diesem niedrigen Niveau. Bei den
Glukoseinjektionen hingegen überlagert sich das Anwachsen der Glukose mit dem eben
erwähnten Absinken der Kurve. Aus diesen Messungen ist folglich ersichtlich, dass die
Änderung der Glukose einen klaren Einfluss auf das Messsignal besitzt, jedoch ist dessen
Größe und zeitliches Verhalten wegen der Überlagerung der Einflüsse noch unklar.
Ebenso wird aus dem Vergleich der Kanäle miteinander deutlich, dass beide
Filterwellenlängen den selben Trend nahezu identisch abbilden. Ableitend aus der Größe des
Glukoseeinflusses und der Qualität der Signale hinsichtlich Konstanz wurde für weitere
Experimente zunehmend der Kanal 0, d.h. eine Wellenlänge von 9,26µm bevorzugt. Ein
weiteres Argument für diesen Messkanal ist die etwa gleiche Breite der Transmissionspeaks
im Vergleich zur Referenz, der eine Kalibrierung zu dieser genauer werden lässt.
Natürlich wurden die Messungen auch mit dem Breitbandfilter begutachtet. Das Ergebnis
entsprach dabei den Erwartungen. Da der Filter einen breiteren Wellenlängebereich
durchlässt, ist der Anteil der Glukoseabsorption im Verhältnis zur Gesamttransmission
geringer und somit der normierte Anstieg der Kurve ebenso geringer (<0,3%).
6.6. Vergleichende Messungen mit einem implantierten Sensor
Um einen besseren Zugang zur Genauigkeit und Aussagekräftigkeit des hier entwickelten
Messsystems bei Glukoseschwankungen zu bekommen, war eine kontinuierliche Messung
des aktuellen Glukosewertes im Vergleich mit einem zweiten Sensor wünschenswert. Um
dies zu realisieren wurden zusätzliche Versuche am Health Center der University of
Connecticut in Farmington durchgeführt. Dort war die Beobachtung des aktuellen
Glukosewertes
mittels
eines
neuentwickelten
76
implantierten
Sensors
(Fa.
Abbott
Pharmaceuticals) möglich. Dieser ist zur Zeit noch nicht am Markt erhältlich, wird jedoch von
der Arbeitsgruppe von Don Kreutzer und Ulrike Klüh in Farmington zu Testmessungen
bereits erfolgreich verwendet. Strebt man einen Vergleich mit diesem Sensor an, so ist an
dieser Stelle die Tatsache von Bedeutung, dass der mit dem Sensor gemessene Wert genau
genommen nicht der Blutglukosewert, sondern der Glukosewert in der interstitiellen
Flüssigkeit (Flüssigkeit in den Zellzwischenräumen) ist. In diesem Zusammenhang ist
bekannt, dass besonders bei sich schnell ändernder Blutglukose, der Glukosewert in den
Zellzwischenräumen meist zeitlich etwas nachläuft.
Die Sensoren werden subkutan in den Rücken der Maus implantiert und können dort einige
Tage gelassen werden. Die Langzeitgenauigkeit der Sensoren beträgt dabei einige Tage,
anschließend driftet das Signal dann zunehmend. Diese Sensoren legen dabei am Gewebe eine
Spannung von 40 mA an, die von einem mit Kabel angeschlossenen Potentiometer
(Bioanalytical Systems Inc.,W. Lafayette, IN, Model LC-3E) zur Verfügung gestellt wird.
Durch die angelegte Spannung findet unter Nutzung des Enzyms Glukoseoxidase eine
chemische Reaktion im Gewebe um den Sensor statt, die einen glukoseabhängigen Strom in
der Größenordung von nA erzeugt. Dieser Strom wird nun mit einer A/D-Messkarte (National
Instruments, Model: SCB-68) bestimmt. Die Implantation des Sensors wurde etwa 24
Stunden vor der ersten Messung mit ihm durchgeführt. Das Potentiometerkabel wurde dabei
durch den oberen Schlitz des Restrainers geführt und blieb auch während der nicht-invasiven
Messung innerhalb dessen. Der normale Aufbau mit dem implantierten Sensor ist in Abb.
6.6-1 zu sehen [Klü06]:
Abb.6.6-1: A: Sensor, B: Aufbau des Sensors, C: Sensor mit Kabel an Maus befestigt [Klü06]
Für die Experimente in Farmington wurden weibliche, 8 Monate alte CD-1TM –Mäuse (diese
Mäuse besitzen ein bestimmtes immunphänotysches Oberflächenmerkmal
77
an den
Thymozyten bzw. dendritische Zellen, ist jedoch für die hier durchgeführte Messung nicht
weiter von Belang) verwendet. Ein Fasten fand vorher nicht statt.
Da am Beginn jeder Messung ein temperaturbedingter Abfall des Signals stattfindet, wurden
die ersten Minuten der Messung erneut abgewartet bis sich eine konstante Temperatur
eingestellt hat. Außerdem wurde beim Einspannen der Maus beim implantierten Sensor ein
vorübergehendes Ansteigen des Glukoseniveaus registriert, welches wahrscheinlich durch
Nervosität der Mäuse hervorgerufen wurde. Dieses Ansteigen wurde anfangs immer sehr
ausgeprägt, später weniger ausgeprägt beobachtet. Es ist an dieser Stelle anzunehmen, dass
bei den Mäusen ein Gewöhnungseffekt an die Prozedur einsetzt. Auch hier wurde gewartet
bis der entsprechende Peak vorüber war und die Maus sich beruhigt hatte, d.h. eine konstante
Basislinie zu beobachten war. Diese Vorgehensweise sollte eine Überlagerung mit einer
tatsächlichen Glukoseveränderung vermeiden und die erzielten Resultate aussagekräftiger
machen. Aus diesen Gründen fand die Injektion erst 30 bis 40 Minuten, nachdem der
Schwanz eingespannt wurde, statt.
Ein typischer Verlauf einer solchen Prozedur ist in Abb. 6.6-2 am Messwert des implantierten
Sensors zu sehen. Am Beginn der Messung, also beim Einspannen des Mäuseschwanzes, geht
die Glukosekurve (gemessen mit dem implantierten Sensor) zunächst leicht nach oben, bis der
Wert etwa nach 15 Minuten ein erstes Maximum erreicht. Nach 30 Minuten Messzeit hat sich
die Maus wieder beruhigt und ihr Glukosewert hat sich normalisiert. Nach circa 75 Minuten
fand die Injektion statt, resultierend bildet sich ein deutlich höheres Maximum bei etwa 90
Minuten. Bei 120 Minuten ist diese wieder abgeklungen, die injizierte Glukose wurde
verarbeitet.
Die Dosis entsprach den Injektionen der Versuche in Bar Harbor, war also etwa 2 g/kg
Körpergewicht. Die Injektion fand diesmal allerdings subkutan statt, da sich die Maus zum
Zeitpunkt der Injektion ja bereits im Restrainer befand und dieser nur durch den Schlitz auf
der Oberseite zugänglich ist. (Die Haut wurde hierbei leicht an einer Rückenstelle, an der der
Sensor nicht störend war, mit einer Pinzette angehoben und möglichst ohne das sich die Maus
bewegt hat injiziert.)
78
Abb.6.6-2: Typischer Glukoseverlauf bei den Vergleichsmessungen
Am Messzeitpunkt kann also davon ausgegangen werden, dass der Schwanz eine konstante
Temperatur hatte und sich die Maus in einem beruhigten Zustand mit normaler
Blutglukosekonzentration von etwa 100 mg/dl befand. Die Berechnung der Ergebnisse fand
hier genauso wie bei den IV-Messungen statt. Einer linearen Kalibrierung zum Referenzkanal
folgte eine Normierung der Kanäle. Zur Auswertung wurde außerdem das Ergebnis der nichtinvasiven Messung zusätzlich mit den durch den Sensor erhaltenen Werten einmalig
kalibriert. Diese einmalige Kalibrierung des linearen Anstiegs wurde bei allen im folgenden
gezeigten Diagrammen (außer Abb. 6.6-5) gleichermaßen verwendet.
Die Ergebnisse von drei derartigen Messungen sind in den Abb. 6.6-3 bis 6.6-5 dargestellt.
Die rote Linie entspricht dabei dem Signal des implantierten Sensors und der schwarze
Verlauf der nicht-invasiven Infrarot-Messung. Die Zeit Null entsprich hierbei dem Zeitpunkt
der Einspannung des Mäuseschwanzes, der Injektionszeitpunkt befindet sich direkt vor dem
Beginn des Anstiegs der roten Kurve.
79
Abb. 6.6-3
Abb. 6.6-4
80
Abb. 6.6-5
Abb. 6.6-3 bis 6.6-5: Vergleich des Glukosetrends zwischen nicht-invasiven Glukometer und
einem implantierten Sensor nach einer subkutanen Glukoseinjektion
In allen drei Diagrammen ist der Trend nahezu identisch in beiden Methoden. Dabei wird
besonders im letzten Diagramm offensichtlich, dass der Zeitrahmen beider Messungen absolut
identisch ist. Das schließt ein zufälliges Verhalten der nicht-invasiv gemessenen Kurve aus.
Ebenso kann im Prinzip ausgeschlossen werden, dass hier andere Faktoren das Maximum
hervorriefen, da diese sich ja auf absolut die selbe Weise verhalten müssten wie die
Blutglukose. Auffallend ist in dem ersten und dritten Diagramm, dass der nicht-invasiv
gemessene Wert zeitlich dem mit implantiertem Sensor bestimmten Wert leicht hinterherläuft.
Die Ursache dessen ist darin zu suchen, dass bei zu starker Fixierung unter Umständen der
Nährstoffstrom verringert wird und das zu Verzögerungen und zur Abschwächung des
genannten Messsignals führen kann [Kre06]. In den späteren Messungen wurde folglich
besonders darauf geachtet, dass die Spannbuchse am Beginn des Schwanzes keinem zu
starkem Druck ausgesetzt war, während die eigentliche Fixierung hauptsächlich mit der am
Schwanzende befindlichen Buchse erzielt wurde. Nun stellt sich nur noch die Frage, ob das
Maximum wirklich durch die Glukose hervorgerufen wurde oder eventuell durch eine
Erhöhung der Durchblutung bzw. des Blutdrucks durch die injizierte Flüssigkeit. Aus diesem
81
Grund wurden weitere Messungen durchgeführt, bei denen dieselbe Menge an KochsalzLösung (150 µL) verwendet wurde, jedoch keine Glukose zugesetzt war. Die Ergebnisse für
alle Kanäle sind in der Abb.6.6-6 dargestellt.
Abb. 6.6-6:
Alle detektierten Kanäle des Glukometers und das Signal des implantierten
Sensors nach einer Salzlösungsinjektion
Da in diesen Diagrammen keinerlei Veränderungen im Signalverlauf sichtbar sind, kann
davon ausgegangen werden, dass die in den Abb. 6.6-3 bis 6.6-5 observierten Signalverläufe
wirklich nur aus der Glukose resultieren können. Somit ist der Beweis für die prinzipielle
Funktionsweise des hier entwickelten Gerätes erbracht worden.
Auch bei der Injektion der Salzlösung wurde bei manchen Versuchen ein Stresseinfluss durch
die Injektion selbst beobachtet, weil diese durch den Schlitz des Restrainers durchaus
schwierig und zum Teil auch langwierig war. Ein mit beiden Methoden vermessener
Glukosewert bei einem solchen nervositätsbedingten Glukoseanstieg ist in Abb. 6.6-7 zu
beobachten:
82
Abb. 6.6-7: Auswirkungen eines starken Stresseinflusses auf die Maus
Deutlich wird auch hier, dass beide Messmethoden diesen etwas geringeren Einfluss zeigen.
Auffallend ist dabei jedoch, das zum Zeitpunkt der Injektion, die nicht-invasive Kurve etwas
stärker ausschlägt. Da der implantierte Sensor über längere Zeiträume (1 min) mittelt, ist es
hier durchaus denkbar, dass das Glukometer an dieser Stelle ein Signal registriert hat, welches
dem implantierten Sensor aufgrund der Messung in der interstitiellen Flüssigkeit und seines
Messintervalls nicht mehr zugänglich war. Diese Tatsache ist nicht nur als Fortschritt
bezüglich der zeitlichen Auflösung des hier entwickelten Messaufbaus zu werten, sondern
deutet ebenso darauf hin, dass hier tatsächlich eine Messung der Blutglukose und nicht der
zwischenzellularen Flüssigkeit stattfindet. Weitere Untersuchungen zu diesem Sachverhalt
stehen jedoch noch aus.
83
7. Zusammenfassung
Das Ziel der Arbeit war die Konzeption, der Aufbau und die Erprobung eines nicht-invasiven
Temperatur-Gradienten-Infrarot-Emissions-Glukometers für Mäuse.
Nach Vortests zum Glukose-Spektrum im Blut und optischen Simulationen zur Anordnung
und Gestalt der Linsen und Spiegel, sowie nach kompletter Durchplanung der
Messkomponenten wurde das Gerät erfolgreich in Heidelberg aufgebaut.
Zur Messung des Mäuseblutzuckers wurde die aus dem Schwanz kommende Infrarot
Emission mittels pyroelektrischen Detektor, entsprechenden Filtern und einer modulierten
Verstärkereinheit gemessen. Dabei wurden die Einzelkomponenten auf Qualität und
Rauschverhalten eingehend überprüft, um eine Abschätzung der Machbarkeit eines derartigen
Messgerätes durchführen zu können.
Die Signalabschätzung und die tatsächlich erzielten Signalstärken stimmen dabei in der
Größenordnung überein und deuten darauf hin, dass das geplante Gerät für Messzeiten im
Minutenbereich funktionieren sollte.
Die Erprobung des Gerätes fand im Jackson Laboratory in Bar Harbor/ Maine (USA) und am
Health Center der Universität von Connecticut in Farmington (USA) statt.
Bereits erste Experimente an Mäusen zeigten, dass mit der hier entwickelten Anordnung
durch Fixieren der Maus im Brennpunkt eines Ellipsoidspiegels ein Temperaturabfall im
Schwanz einhergeht. Dieser Abfall hängt von der Stärke der Fixierung ab und kann mithilfe
einer exponentiellen Funktion beschrieben und mit einer Heizplattform an der Maus
verlangsamt werden.
Anschließend wurden mehrere Glukosetoleranztests mit Mäusen durchgeführt und deren
Ergebnisse mit einem herkömmlich Plasmaglukosemesser verglichen. Bei einer Messdauer
von etwa fünf Minuten und einer Auswertung des Streckungsfaktors der abfallenden
Exponential-Funktion (der als einzigster nicht von der Stärke der Fixierung abhängt) wurde
ein inkonsistentes Ergebnis erhalten.
Die Messserie einer ersten Maus zeigte eine gute Korrelation zwischen nicht-invasiver
Messmethode und der herkömmlichen Messung, bei einer zweiten, jeweils direkt im
Anschluss gemessenen Maus wurde hingegen nahezu keine Korrelation festgestellt. Die
Gründe dafür sind immer noch unbekannt.
84
Um die biologischen und geometrischen Einflüsse der Mäuse zu reduzieren, wurde diesen
eine Kanüle in die Halsvene gelegt, um während der Messung problemfrei über eine
intravenöse Injektion das Glukoseniveau zu ändern. Kalibriert wurden die Messkanäle der
jeweiligen Mausgeometrie mittels einer linearen Regression über dem Referenzkanal am
Beginn der Messung. In diesem Zeitraum ändert sich die Temperatur und die Eichung kann
über einen weiteren Bereich daher genauer erfolgen.
Die Ergebnisse zeigten auffällige Unterschiede zwischen einer Glukose- und einer
Salzlösungsinjektion, sind jedoch von dem starken Einfluss der injizierten Flüssigkeitsmenge
und deren Auswirkung auf den Blutdruck und den Kreislauf der Maus überlagert.
Für eine klarere Darstellung des Glukoseverlaufes wurde in einer weiteren Messkampagne ein
neuentwickelter Glukosesensor in den Rücken der Mäuse implantiert. Dieser konnte während
der Messung kontinuierliche Vergleichswerte liefern. Hierbei wurde nach Einstellung einer
konstanten Schwanztemperatur und eines gleichbleibenden Glukoselevels wiederum durch
eine Glukoseinjektion (sc), der Blutzuckerspiegel verändert und mit beiden Methoden
simultan aufgezeichnet.
Der erhaltene Peak erfolgte nahezu zeitgleich und hatte für die verschiedenen durchgeführten
Messungen eine konsistente ähnliche Höhe. Die Gegenprobe mit einer Salzlösung verursachte
hier bei der nicht-invasiven Messung ein konstantes Signal. Auf diese Weise konnte eine
deutliche Korrelation beider Messmethoden gezeigt werden, was die korrekte Funktion des
hier gebauten Gerätes endgültig belegt.
Vergleicht man die Standardabweichung von 19,8 mg/dl des ersten Glukosetoleranztests mit
anderen nicht-invasiven Geräten, so findet man dort eine ähnliche Abweichung. Bei Studien
zum bereits beschriebenen Gerät von Braig [Bra97, Klo98] wurde eine Standardabweichung
von 24,7 mg/dl ermittelt. In der gleichen Größenordnung befindet sich das Messgerät von
Buchert [Buc97], das bei einer Studie von Malchoff [Mal02] eine Standardabweichung von
27 mg/dl zeigte.
Systematische Fehler der hier entwickelten Messanordnung werden vor allem durch die
Temperaturveränderung des Schwanzes verursacht. Dabei spielt bei der Bestimmung des
genutzten Streckungsfaktors vor allem dessen Abhängigkeit vom Startzeitpunkt der Messung
eine Rolle.
85
Ein weiterer systematische Fehler dieser Messmethode ist der durch das Einspannen der Maus
entstehende Stress, der seinerseits die Glukose erhöht. Dieses Problem ist mit einer
Anordnung wie dieser kaum zu umgehen, ist jedoch bei anderen Messmethoden, die durch
invasives Vorgehen meist noch mehr Stress auslösen, ebenso zu beachten. Zur Optimierung
sollte der Versuchsaufbau so verändert werden, dass die Maus größtmöglichen Komfort
genießt und sich in der Messsituation nicht unwohl fühlt.
Desweiteren ist es nicht auszuschließen, dass das Infrarotstrahlungsverhalten der Mäuse an
sich schon so verschieden ausgeprägt sein kann, dass eine separate Eichung für jede einzelne
Maus stattfinden muss. In den hier durchgeführten Versuchen wurde aus diesem Grund in der
Regel davon abgesehen, die absoluten Messsignale von verschiedenen Mäuse miteinander zu
vergleichen.
Bei dem Aufbau eines komplexen Messgerätes wie diesem, muss nach der ersten Erprobung
des Prototyps natürlich im Anschluss über Verbesserungsmöglichkeiten des Aufbaus
nachgedacht werden.
Ein entscheidender Faktor für reproduzierbare Daten wird dabei die Entwicklung einer
besseren Mäuseeinspannungseinrichtung sein. Dabei darf der Blutzufluss in den Schwanz
nicht eingeschränkt werden, wodurch auch kein Temperaturabfall stattfinden würde. Die
Signale wären somit nicht mehr zeitabhängig und würden durch die Abkühlung auch nicht
schwächer. Eine weitere Veränderung des Designs sollte ferner das akkurate Fixieren des
gleichen Schwanzabschnittes bei allen Mäusen sein. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine
einzige geometrische Eichung der vier Kanäle nötig ist. Eine Verfälschung durch verschieden
gemessene und verschieden dicke Schwanzabschnitte wird somit verringert und
Kurzzeitmessungen würden ohne separate Eichung auskommen.
Zusätzliche Verbesserungsmöglichkeit besteht in diesem Zusammenhang in der Integration
einer Heizplattform, die neben der Komforterhöhung ebenfalls eine Vergrößerung des
Messsignals nach sich ziehen kann.
Ebenso ist die hier verwendete Lösung des Lock-in nicht optimal. Es sollte, da jetzt die
Verwendbarkeit der Einzelkanäle feststeht, unter Nutzung eines der vier analogen Kanäle auf
die herkömmliche Variante mit direkter Rückkopplung des Choppersignals umgestellt
werden.
86
Da es sich hier um eine komplexe und auch noch bewegliche Probengeometrie handelt, sollte
an dieser Stelle vielleicht darüber nachgedacht werden, von den vier lokal getrennten
Detektoren Abstand zu nehmen. Alternative wäre ein Chopperrad zu konzipieren, in dem
zumindest zwei Filter bereits integriert sind. Auf diese Weise würden viele der geometrisch
bedingten Probleme von vornherein wegfallen, und eine Kalibrierung der Kanäle
untereinander hätte einen durch die Transmission der Filter gegebenen konstanten Wert.
Ferner würde es dadurch möglich, an der Messkarte das Signal des Choppers analog anstatt
digital einzulesen, um den Lock-in-Effekt noch besser zu nutzen und die Software zu
vereinfachen.
Möglicherweise würde auch die Wahl eines stickstoffgekühlten HgCdTe eine Verbesserung
der Detektivität und somit rauschärmere Messsignale des Gerätes hervorrufen. In den
Patenten von Buchert und Malchoff wurde jedoch berichtet, dass beide Detektorarten für
Emissionsmessungen dieser Art möglich sind. Eine genauere Untersuchung dieser Thematik
steht allerdings noch aus.
Alles in allem ist mit dem hier realisierten Messgerät ein guter Anfang in Richtung nichtinvasiver Blutzuckermessung bei Mäusen gemacht worden, es sind jedoch weitere
Verfeinerungen der Apparatur aufgrund der gemachten Messerfahrung nötig, um ein
verlässliches und praktisch einsetzbares Messgerät zu erreichen.
87
8. Anhang
Der Anhang dieser Arbeit beinhaltet ergänzend zu dem bereits beschriebenen Aufbau
zusätzliche Informationen über den Detektor und die Verstärkerschaltung, sowie Erklärungen
zur exakten Funktionsweise der Software, der Kühlung und des Gehäuses.
8.1. Daten und elektrische Funktionsweise des Detektors
Die Anordnung der PINs sowie wie der interne Schaltungsaufbau dieses niederohmigen
Bauteils ist in Abb.A.1-1 und Abb.A.1-2 dargestellt. Ein konstanter Versorgungsstrom (etwa
0,19mA) fließt dabei zwischen den Drain- und den Source-PINs, während das Signal über die
Source- und Ground-Pins abgegriffen wird. Trifft nun Strahlung auf den Detektor, so ändert
dieser seinen Widerstand und beeinflusst dadurch die Gate-Spannung des FeldeffektTransistors. Die Spannung am Gate wiederum regelt den Widerstand des gesamten
Transistors, der sich in Reihe zu den anderen Widerständen in der Masche mit Source und
Ground befindet und so den Spannungsabfall dort steuert. Durch die Nutzung des Gates des
Feldeffekt-Transistors wird dabei schon eine erste Verstärkung des Signals im Detektor
durchgeführt.
Abb. A.1-1: Anschlüsse des Detektors [Dia07]
88
Abb.A.1-2: Interne Schaltung des Detektors [Dia07]
In der Abbildung A.1-3 ist die genaue Frequenz-Abhängigkeit der Detektorgrößen dargestellt.
Es ist bei allen drei Parametern ein starker Abfall mit steigender Frequenz zu beobachten,
wodurch die mögliche Modulation im wesentlichen auf weniger als 20 Hz eingeschränkt wird.
Abb.A.1-3:
Typische Detektorgrößen in Abhängigkeit der Frequenz [Dia07]
(von links nach rechts: Empfindlichkeit, Rauschspannung und Detektivität)
8.2. Schaltung und Erläuterung der Verstärkerelektronik
Die Funktionsweise und die Besonderheiten der Schaltung sollen stellvertretend anhand eines
der vier Verstärkerkreise erläutert werden, der in Abb. A.2-1 zu sehen ist.
Den Überblick über die Schaltung gewinnt man am besten, wenn man bei der Betrachtung
direkt am Detektor beginnt. Dieser befindet sich links in der Mitte der Schaltung und benötigt,
89
wie bereits erklärt, einen konstanten Stromfluss (der Bereich links über dem Detektor stellt
dabei eine rauscharme Spannung zur Verfügung). Das Einstellen des Stromflusses findet
dabei mithilfe des Transistors Q101 und der Leuchtdiode LED101 statt.
Das nun vom Detektor ausgegebene Signal wird zunächst durch einen Kondensator (C102)
geleitet, der hier zusammen mit dem Widerstand R104 als Hochpass fungiert und somit
niederfrequente Signale unterdrückt. Seine Kapazität ist mit 10 µF sehr hoch und wirkt sich
hauptsächlich auf Frequenzen bis maximal 1 Hz bedeutsam aus.
Abb. A.2-1: Verstärkerschaltung anhand eines Kanals
90
Beim Entwerfen der Schaltung wurde die Möglichkeit vorgesehen zwei verschiedene OPV zu
nutzen, nämlich den LT1007 und den LT1028 der Firma Linear Technology. Damit beide
ohne Probleme austauschbar sind, findet man im oberen Teil der Schaltung eine
Offsetabgleich für beide Möglichkeiten, die unter Nutzung eines Jumpers wählbar sind. Der
Offsetabgleich ist nötig, um den Gleichspannungsanteil des OPVs zu reduzieren, da dieser
sonst mit seiner Größe das eigentliche Messsignal überlagern würde und so die weitere
Verarbeitung von im verhältnismäßig geringen Änderungen ungenauer wäre.
Die Eigenschaften des OPV LT1007 sind in den Diagrammen in Abb. A.2-3 vom Hersteller
gegeben.
Abb.A.2-2: Eigenschaften des OPVs:Links:Spannungsrauschen als Funktion der Frequenz
Mitte:Spannungsrauschen als Funktion der Temperatur
Rechts: Verstärkung als Funktion der Frequenz
(Herstellerdaten)
Bei Beginn des Schaltplanentwurfes stand hierbei noch nicht fest, welche tatsächlich
Signalgröße zu erwarten war. Aus diesem Grund wurde als weitere Wahlmöglichkeit eine
mögliche Änderung der Verstärkung mit eingeplant. Ersichtlich ist das in den durch einen
Jumper wählbaren Rückkopplungswiderstand R105 bis R109. Die Verstärkung ist dabei im
wesentlichen das Verhältnis von eben genannten Widerständen zum Widerstand R106 und
kann somit auf die Werte 101, 501, 2001 und 7501 eingestellt werden.
91
8.3. Software
Die gelieferte Software zu der Karte nennt sich Data Measury Foundry 4.0.7. und ist eine
typische Benutzeroberfläche für Messanwendungen, ähnlich dem weitverbreiteten LabView.
Mit ihr wurden die einkommenden Signale und jeder der Verarbeitungsschritte der Daten
überwacht
und
kontrolliert.
Dazu
gehört
vor
allem
die
Kontrolle
über
die
Choppergeschwindigkeit, die Abtastrate der Signale und der Verstärkungsbereich, sowie die
Speicherung der Daten. Neben den eingestellten Messbedingungen findet innerhalb der
Software bereits eine Vorbehandlung der Signale statt, welche die spätere Auswertung
deutlich einfacher und kürzer gestaltet. Solche Signalverarbeitungsschritte werden der
Software über ein dafür vorgesehenes Eingabefenster unter Verwendung einer nahezu rein
mathematischen Programmiersprache vorgegeben. Das dafür entwickelte Programm unterlag
während der Erprobungsphase des Gerätes einer ständigen Weiterentwicklung. Aus diesem
Grund soll hier nur die letzte Version anhand eines Kanals und ohne die nur zur Kontrolle
verwendeten Schritte vorgestellt und erläutert werden. Der Übersichtlichkeit wegen befindet
sich das Programm geschlossen nach den entsprechenden Erklärungen und ist mit
Zeilennummern versehen, um auf die einzelnen Abschnitte besser eingehen zu können. Zu
Beginn des Programms werden dabei zunächst diverse Variablen festgelegt, wie die
Abtastrate (Z.2) und die Anzahl der für Fouriertransformationen genutzten Datenpunkte (Z.1).
Diese ist bei der digitalen schnellen Fouriertransformation (FFT) genauso groß, wie die Zahl
der Punkte des ursprünglichen Signals, welches als A0 eingelesen und dementsprechend
dimensioniert wurde (Z.3-4). Die Variable StepVal (Z.5) entspricht als Verhältnis von
Abtastrate zu Datenanzahl der reziproken Messzeit und somit der Frequenzauflösung, d.h.
dem Frequenzabstand der Datenpunkte der Fouriertransformierten. Es wurde hier eine
Messzeit von circa zehn Sekunden gewählt, da diese Zeit ausreichend ist, um genug Perioden
zu messen und außerdem kurz genug um den zeitlichen Verlauf des Signals beobachten zu
können.
Als erster Schritt wird nun das Einganssignal fouriertransformiert (Z.6) und vorgefiltert, um
unnötiges Rauschen von vornherein von Nutzsignal zu trennen. Dies wird mittels zweier
Schleifen realisiert, die nur ein 4Hz schmales Band der Fouriertransformierten von null
verschieden lässt (Z.7-20). Es handelt sich bei diesem Filter also um einen klassischen
Rechteckfilter. Nach der Rücktransformation der gefilterten Signale (Z.21), beschäftigt sich
der nächste Abschnitt des Programms mit einer verbesserten Synchronisierung und
Datenverarbeitung der Einzelsignale (Z.22-47). Denn obwohl der Start der Messung durch
92
den Chopper synchron für alle Kanäle stattfindet, so sind doch einerseits aufgrund der
Chopperbewegung die Signale leicht zeitversetzt und andererseits befinden sich innerhalb des
Messzeitraums am Anfang und Ende verschiedengroße „Bruchstücke“ von Perioden. Zur
Lösung dieser beiden Probleme wurden innerhalb des Messintervalls jeweils benachbarte
Werte miteinander verglichen und auf diese Weise die Nullstellen einer ansteigenden Flanke
gefunden (Z.25-30). Nun wurden entsprechend der Größe des Intervalls eine bestimmte
Anzahl von ganzen Perioden zur weiteren Berechnung genutzt (Z.40-47). Durch diese
Maßnahme verringert sich der Fehler von im schlechtmöglichsten Fall einer überschüssigen
Halbperiode bis auf die Genauigkeit, mit der die Nullstellen gefunden werden. Diese ist bei
etwa 20 Punkten pro Periode logischerweise ein zwanzigstel einer Periode. Veränderungen
dieser Art bei den Signalen bewirken natürlich nur geringe Unterschiede, dennoch sollten bei
der Verbesserung hin zu präziseren Messungen solche Feinkorrekturen nicht unterschätzt
werden.
Da sich bei dieser Korrektur der Mittelwert von Null weg verschoben haben könnte, wird
dieser vom eigentlichen Signal nochmals abgezogen (Z.48-49). Nach all den Vorkorrekturen
der Signale geht es nun nur noch darum, dass Signal möglichst präzise, rauschfrei und
unabhängig von der exakten Chopperfrequenz zu bestimmen. Zu diesem Zweck wird
normalerweise ein herkömmliches Lock-in Verfahren verwendet. Dies beinhaltet die
Gewinnung eines Referenzsignals von der Modulationsquelle, Multiplikation dieser Referenz
mit dem Originalsignal und die Bildung des Mittelwertes des erhaltenen Produkts.
Auf das Ergebnis können somit alle Frequenzen einwirken, da es sich mathematisch
betrachtet hier um eine Faltung beider Frequenzräume handelt. Das heißt rein praktisch, dass
alle Frequenzanteile, die sowohl im Signal als auch in der Referenz vorkommen, einen
konstanten Anteil im Produktsignal liefern. Aus diesem Grund ist es an der Stelle von großer
Bedeutung, dass die Referenz möglichst rauschfrei ist oder zumindest bei anderen Frequenzen
rauscht als das Messsignal.
Wie sich nun im Verlauf der Arbeit herauskristallisierte, ist eine hardwaretechnische
Synchronisierung der Eingangssignale mit dem über den digitalen Eingang der Karte
gewonnenen Choppersignal nicht möglich. Der Hersteller hat bei den digitalen Eingängen
keinerlei Echtzeit-Aufnahme der Daten zur Verfügung gestellt. Aufgrund dieser Tatsache ist
ein Lock-in im herkömmlichen Sinn hier nicht durchführbar und es muss nach einer
Alternative gesucht werden. Eine annähernd gute Alternative wurde mithilfe der hier
verfügbaren Programmiermittel gefunden.
93
Das eigentliche Problem der Software-Variante ist dabei, ein geeignetes Referenzsignal zu
bekommen. Da dieses nicht von außen zur Verfügung steht, muss es auf irgendeine Weise
kreiert werden. Die Schwankungen des Choppers sollen dabei allerdings möglichst genau
miterfasst werden, d.h. das ursprüngliche Messsignal muss diesem Signal zugrunde liegen, da
es als einziges die Information über die Chopperbewegung beinhaltet. Desweiteren darf dieses
Referenzsignal allerdings nicht dieselben Rauschanteile wie das Messsignal haben, da es
sonst zu einer Verfälschung der Messung kommen kann. Rein mathematisch gibt es zu
diesem Problem keine Lösung, weil eine Umrechnung des Einganssignals in eine andere
Funktion ebenso alle Informationen über dessen Rauschen weiter übertragen würde. Es
musste
also
ein
Weg
gefunden
werden,
bei
dem
die
Information
über
die
Modulationsfrequenz vom Rest des Signals getrennt werden kann. Diese Aufgabe kann man
wiederum mithilfe von Schleifen und den gemessenen Nullstellen lösen. Dabei wird, wie im
letzten Abschnitt des Programms durchgeführt (Z.50-66), ein Wert der über Null liegt gleich
eins gesetzt und ein Wert der unter Null liegt gleich minus eins (Z.55-58). Da so nur
konstante Werte in dieser Funktion vorkommen, fällt jegliche Art von Rauschen aus diesem
Signal heraus. Einzige Fehlerquelle liegt hier erneut bei der Bestimmung der Nullstellen, die
aber an dieser Stelle nicht so schlimm ist, weil das Messsignal ja die Punkte exakt an der
selben zeitlichen Position hat. Es würden hier also nur Probleme auftreten, wenn durch das
Rauschen Messpunkte ihr Vorzeichen ändern würden. Diese gefundene Lösung kommt
selbstverständlich an die Qualität eines herkömmlichen Lock-in nicht heran, ist aber ihrerseits
deutlich besser als jeder Bandpass. Die restlichen Schritte des Programms sind dann nur noch
die Multiplikation (Z.64) und die Mittelwertfindung des Produktes (Z.65), welches über einen
Output-Befehl an den Benutzer ausgegeben (Z.66) und gleichzeitig gespeichert wird.
Quellcode des auf einen Kanal vereinfachten und verkürzten Programms:
FFTSize := 2048
SampleFreq := 200
VectorSetSize(Analog_Input__DT9822_02_.A_D0.Channel_0, FFTSize)
A0:=Analog_Input__DT9822_02_.A_D0.Channel_0
StepVal := SampleFreq / FFTSize
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
A0FT:=RealFFT( A0, 0, 1, phasevectorA0 )
\\ filter out anything below cutoff freq
j := 0
(6)
(7)
(8)
94
j0:= cutofffreq0/stepval
while (j < j0)
VectorSetValue( A0FT, j, 0)
j := j+1
wend
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
\\ filter out anything above cutoff freq
k := FFTSize
k0:= (cutofffreq0+4)/stepval
while (k > k0)
VectorSetValue( A0FT, k, 0)
k := k-1
wend
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
A0IFT:=RealInverseFFT( A0FT, phasevectorA0, 0)
(21)
iA:=0
PNrA:=0
while (iA < FFTSize)
(22)
(23)
(24)
Ai:= VectorGetValue(A0IFT, iA)
Aj:= VectorGetValue(A0IFT, iA+1)
ResA:= (Ai<0) and (Aj>0)
(25)
(26)
(27)
if (ResA=1)
PNrA:= PNrA+1
Endif
(28)
(29)
(30)
if (PNrA=4)
Astart:=iA+1
Endif
(31)
(32)
(33)
Ende:= trunc(FFTSize/SampleFreq*Frequenz*1000)
(34)
if (PNrA=Ende-4)
Aende:=iA
Endif
(35)
(36)
(37)
iA:=iA+1
wend
(38)
(39)
DimA:= Aende-Astart+1
VectorSetSize(Acut,DimA)
nA:=Astart
(40)
(41)
(42)
while (nA<Aende+1)
yA:=VectorGetValue(A0IFT,nA)
VectorSetValue(Acut, nA-Astart,yA)
nA:=nA+1
wend
(43)
(44)
(45)
(46)
(47)
95
Acutmean:=VectorGetmean(Acut)
Acutkor:=Acut-Acutmean
(48)
(49)
Ecut:=Acutkor
(50)
m:=0
(51)
while (m<FFTSize)
(52)
x1:=VectorGetValue( Ecut, m)
(53)
If (x1<0)
x1:=-1
(54)
(55)
else
(56)
(57)
(58)
x1:=1
EndIf
VectorSetValue ( Ecut, m, x1)
m:=m+1
wend
(59)
(60)
(61)
Ecutmean:=VectorGetmean(Ecut)
Ecutkor:=Ecut-Ecutmean
A:=Acutkor*Ecutkor
ADir:=VectorGetMean(A)
Out.Output_Channel_14:=Adir
(62)
(63)
(64)
(65)
(66)
Die mit diesem Programm gefundenen Rohdaten können nun mittels gängiger
Datenbearbeitungssoftware weiter geeicht und berechnet werden. Dabei spielen nun noch die
Eichung der Kanalbreiten und die Bildung der Differenz eine entscheidende Rolle. Die
genaue Vorgehensweise wurde im Kapitel Auswertung bereits ausführlich beschrieben.
8.4. Gehäuse
Alle bereits erwähnten Komponenten werden in einem doppelwandigen Gehäuse platziert,
dessen innere Wand aus 5 mm starkem Aluminium besteht, was für die Wärmeleitung und
-verteilung im Innengehäuse sorgt und so die Kühlung erleichtert. Durch die Verwendung von
Aluminium wird zusätzlich das Gewicht niedrig gehalten und durch seine Dicke Stabilität
erlangt. Neben dem quaderförmigen Außengerüst des Gehäuses befindet sich an der
Frontseite ein ebenso quaderförmiger Schnabel, in dem die Linsen und die fixen Spiegelteile
96
mittels Schrauben befestigt sind. Zusätzlich wurde senkrecht zum Strahlengang in Höhe des
Detektors eine Trennwand eingezogen. Diese verhindert einen Strahlungsaustausch zwischen
der Elektronik, die einer gewissen Erwärmung unterliegt, und dem Detektor.
Die einzelnen Bauteile sind zum einen direkt miteinander verbunden und zum anderen mittels
Winkeln, die eine Art Schiene bilden, und Schrauben fixiert.
Das äußere Gehäuse besteht aus 5 mm dicken PVC-Platten, deren Abstand vom Innengehäuse
ebenfalls 5 mm beträgt. Auf diese Weise ist eine Luftdämmung zwischen den Gehäusen
realisiert, die verhindert, dass Wärmeleistung von außen in das Gerät eindringt.
8.5. Kühlung
Die Kühlung des Gerätes ist thermoelektrischer Natur und wird über zwei unabhängige
Regelkreisläufe gesteuert. Hierbei wurden Peltier-Elemente als Wärmepumpen genutzt, deren
heiße Seite von außen mittels Kühlkörpern und Lüftern abgekühlt wurde. Die Größen von
Kühlkörper und Lüfter wurden dabei der entsprechende Peltier-Größe angepasst.
Die Kühlung des Gehäuses erfolgt über zwei Peltier-Elemente. Diese (Typ: TB-125-1,42,5CH) wurden von der Firma Kryotherm (St.Petersburg, Russland) hergestellt und über
AMS Technologies (Martinsried) vertrieben. Sie haben einen 40x40 mm2 Grundriss und eine
Höhe 4,7 mm. Bei einem maximalen Strom von 3,7 A und einer maximalen Spannung von
16 V können sie eine optimale Kühlungsleistung von 36,8 W erzeugen.
Es wurde hierbei von einer Temperatur der heißen Seite von 303 K und einer
abzutransportierenden Wärmeleistung von 1,8 W ausgegangen.
Die elektrisch in Reihe geschalteten Peltier-Elemente sind an den Seiten des Innengehäuses
angebracht, das wiederum mittels Aluminium Stangen an diesen Stellen mit dem Detektor
verbunden ist. Dadurch kann unter Nutzung eines Temperaturreglers die Temperatur im
Gehäuse und vor allem am Detektor eingestellt und konstant gehalten werden. Dies verhindert
eine Varianz der Detektortemperatur, die ihrerseits ein Signal erzeugen würde, was einem
zusätzlichen Rauschen entspricht. Die erforderliche Kühlleistung wurde mit dem Programm
Aztec (Fa. Melcor) ermittelt, das unter Berücksichtigung der inneren Wärmeproduktion
(Chopper: 1,2 W, Maus: 0,06 W, restliche Elektronik ≤0,5 W) und der bereits beschriebenen
Isolierung einen Wert von etwa 7 W berechnete.
97
Zur Kühlung und Wärmeregulierung des Spiegels ist an diesem ein eigenes Peltier-Element
(Typ:TB-119-1,0-2,0CH, Fa. Kryotherm) angebracht, was jedoch mit einer Geometrie von
30x30x4,3 mm3 und einer maximalen Kühlungsleistung von 21,4 W (IMax=2,3 A und
UMax=14,9 V) etwas niedriger dimensioniert ist als die anderen. Die Temperatur der heißen
Seite wurde hier mit 320 K angesetzt, die Wärmeleistung des Spiegels mit null.
.
Die Regelung der Kühlkreise wird mit PID-Temperaturreglern (MPT2500) der Firma
Wavelength-Electronics durchgeführt, die eigens für thermoelektrische Anwendungen
konzipiert
sind.
Sie
besitzen
mit <0,008°C Schwankung eine sehr gute 24h-
Temperaturstabilität und sind bis zu einer Stromstärke von 2,5 A einsetzbar. Der relativ hohe
nötige Strom der Peltiers wird hierbei ebenfalls durch die Regler geleitet und dort gesteuert.
Die Anschlüsse dieser Regler fanden entsprechend Abb. 4.11-1 statt.
Abb.A.5-1: Prinzipieller Aufbau der Kühlkreisläufe [Mpt05]
Die Stromversorgung beider Kühlkreisläufe war das Netzteil SWS150-15 der Firma
LAMBDA (San Diego, USA), das bei einer Spannung zwischen 13,5-16,5 V einen
maximalen Strom von bis zu 10 A liefert.
98
Zu dieser Anordnung hinzu kommen noch Thermistoren (TCS-610, Fa. Wavelength
electronics), die im Fall der Gerätekühlung innerhalb einer der Aluminiumstreben zum
Detektor und im Fall des Spiegels direkt in dessen Begrenzungsstück mit Wärmeleitkleber in
dafür vorgefertigte Löcher eingeklebt wurden. Die mit den Thermistoren erfassbare
Temperatur liegt zwischen –8°C (≅ 4,967 V) und 50°C (≅ 0,360 V) und deren Spannung wird
mit einem herkömmlichen Multimeter gemessen.
Da die Abschirmung des Spiegels mit dem doppelwandigen Gehäuse nicht mit erfasst wird,
wurde bei vielen der späteren Messungen eine Styropor-Box über die Maus und die
Spiegeleinheit gestülpt (der Kühlkörper sowie der Lüfter befanden sich dabei natürlich
außerhalb
dieser
Box).
Auf
diese
Weise
konnten
zusätzlich
Wind
und
Temperaturschwankungen an der sehr sensitiven Messstelle vermindert werden.
Die mit diesem Kreislauf eingestellte Temperatur lag bei Spiegel und Gerät bei 15°C und
unterschied sich somit deutlich von der Raumtemperatur.
Alles in allem wurden mit dieser Kühlung Gerätetemperaturschwankungen von < ±7 mK und
Spiegeltemperaturschwanken von ±14 mK erzielt, was mit einem derartigen Aufbau sehr gute
Werte darstellen. (Leider gab es bei der Konstanz jedoch diverse Probleme, da insbesondere
bei dem Spiegeloberteil durch die ständige Bewegung vor und nach der Messung einige
Kontakte schlechter wurden und somit Schwankungen hervorriefen.)
99
9. Abbildungsverzeichnis
Abb. 2.1-1: Fischer-Projektion von D- und L-Glukose
10
Abb. 2.1-2: Haworth-Projektion von α-Glukose (links) und β-Glukose (rechts)
11
Abb. 2.2-1: Planck-Kurve für verschiedene Temperaturen
13
Abb. 2.2-2: Temperaturgefälle beim Wärmedurchgang durch eine Wand
14
Abb. 2.3-1: Schema des Strahlungsverhaltens in einer Temperatur-Gradienten-Region
18
Abb. 2.3-2: Infrarot-Absorptionsspektren der Erdatmosphäre
19
Abb. 2.3-3: Transmission durch getrocknetes Blut mit a) hoher Glukosekonz.
und b) niedriger Glukosekonz., c) Differenzspektrum zwischen a) und b)
20
Abb. 2.3-4: Detaill. Glukose-Absorptionsspektrum für verschiedene Konzentrationen
21
Abb. 2.4-1: Versuchstier Maus in verschiedenen Phänotypen
22
Abb. 2.4-2: Lage der drei Haupthautschichten
24
Abb. 2.4-3: Genauigkeitsbeurteilung von Glukose-Messern durch Clarke-Error-Grid
27
Abb. 3.1-1: Differenzspektrum zwischen einer Blutprobe angereichert mit 100mg/dl
Glukose und einer nichtangereicherten Probe
30
Abb. 3.1-2: Infrarot-Spektrum menschlichen Blutes
31
Abb. 3.2-1: Abstrahlverhalten der simulierten Mäuseschwanz-Strahlungsquelle
32
Abb. 3.2-2: Aufbau der verwendeten Anordnung mit zylindrischem Ellipsoidspiegel
und 3 zylindrischen Plan-Konvex-Linsen (Abstände nicht maßstabsgetreu) 33
Abb. 3.2-3: Finaler Aufbau in Vorderansicht
34
Abb. 3.2-4: Finaler Aufbau in der Draufsicht
34
Abb. 4.1-1: Außenansicht des nicht-invasiven Infrarot-Emissions-Glukometers
37
Abb. 4.1-2: Längsquerschnitt des nicht-invasiven Glukometers (maßstabsgetreu)
38
Abb. 4.2-1: Spektrales Reflexionsvermögen der Spiegeloberfläche
40
Abb. 4.2-2: Technische Zeichnung des Ellipsoidspiegels
41
Abb. 4.2-3: Abnehmbares Spiegelstück inkl. Spannbuchsen und deren Befestigung
42
Abb. 4.3-1: Transmissionsspektren von Zinkselenid im Infraroten
43
Abb. 4.4-1: Technische Zeichnung der Choppereinheit
44
Abb. 4.4-2: Laufgenauigkeit des Choppers über 100s Messzeit
45
Abb. 4.4-3: Langzeitgenauigkeit des Choppers
46
Abb. 4.5-1: Transmission eines glukoseempfindl. Filters mit 9.26µm Mittenwellenlänge 47
Abb. 4.5-2: Transmissionskurve des Referenzfilters (10.24µm)
100
48
Abb. 4.6-1: Übersichtsdiagramm über die Einsatzbereiche möglicher IR-Detektoren
49
Abb. 4.6-2: Pyroelektrischer Quadcell-Detektor: Links Draufsicht, rechts Seitenansicht 50
Abb. 4.6-3: Proport. Kanal1 und 2 zu Kanal0 bei Änderung der Einstrahlungsintensität 51
Abb. 4.6-4: Proportionalität Kanal3 zu Kanal0 bei Änderung der Einstrahlungsintensität 52
Abb. 4.7-1: Abhängigkeit des Rauschen vom Offset des OPV
53
Abb. 4.7-2: Abhängigkeit der Rauschspannung der Verstärkerplatine von der Höhe
der Verstärkung
54
Abb. 4.8-1: Rauschspannung der Messkarte als Funktion der Frequenz und Abtastrate
56
Abb. 5.3-1: Übersichtsschema über mögliche Rauschquellen bei der Detektion
62
Abb. 6.2-1: Ankommendes Signal am Kanal 0 als Funktion des Referenzkanals
66
Abb. 6.2-2: Ankommendes Signal am Kanal 1 als Funktion des Referenzkanals
66
Abb. 6.2-3: Ankommendes Signal am Kanal 3 als Funktion des Referenzkanals
67
Abb. 6.3-1: Typ. detektiertes Spannungssignal am Kanal 0 bei einem Mäuseschwanz
68
Abb. 6.3-2: Detektiertes Spannungssignal am Kanal 0 beim Plastikstab mit Raumtemp. 68
Abb. 6.3-3: Maus auf einer Heizplattform, sehr stark fixiert
69
Abb. 6.3-4: Maus auf einer Heizplattform, weniger stark fixiert
70
Abb. 6.4-1:Diff. der A-Parameter in Abhängigkeit des realen Glukosewertes bei Maus1 72
Abb. 6.4-2:Diff. der A-Parameter in Abhängigkeit des realen Glukosewertes bei Maus2 73
Abb. 6.5-1: Veränderung der Messsignale der Kanäle 0 und 1 nach IV-Glukoseinjektion 75
Abb. 6.5-2: Veränderung der Messsignale der Kanäle 0 und 1 nach IV-Salzlös.-Injekt.
75
Abb. 6.6-2: A: Sensor, B: Aufbau des Sensors, C: Sensor mit Kabel an Maus befestigt
77
Abb. 6.6-3: Typischer Glukoseverlauf bei den Vergleichsmessungen
79
Abb. 6.6-4 bis 6.6-6: Vergleich des Glukosetrends zw. nicht-invasiven Glukometer
und einem implantierten Sensor nach einer subkutanen Glukoseinjektion 80
Abb. 6.6-7: Alle detektierten Kanäle des Glukometers und das Signal des implantierten
Sensors nach einer Salzlösungsinjektion
82
Abb. 6.6-8: Auswirkungen eines starken Stresseinflusses auf die Maus
83
Abb. A.1-1: Anschlüsse des Detektors
88
Abb. A.1-2: Interne Schaltung des Detektors
89
Abb. A.1-3: Typische Detektorgrößen in Abhängigkeit der Frequenz
89
Abb. A.2-1: Verstärkerschaltung anhand eines Kanals
90
Abb. A.2-2: Eigenschaften des OPVs
91
Abb. A.5-1: Prinzipieller Aufbau der Kühlkreisläufe
98
101
10. Tabellenverzeichnis
Tab. 2.3-1: Übersicht über die Hauptabsorptionen für organische funktionelle Gruppen 15
Tab. 2.4-1: Vergleich der von Clarke erwarteten Genauigkeit und der Consensusmeinung heute
28
Tab. 3.2-1: Im Gerät verwendeten Daten der Optikanordnung
102
35
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Vorlesung, Fachhochschule München, 2004
109
12. Danksagung
Herrn Prof. Michael Grunze möchte ich für dieses überaus spannende und fordernde Thema,
sowie für eine sehr konstruktive Betreuung danken. In kritischen Zeiten konnte erst stets mit
Tipps aufwarten, die das Gelingen dieser Arbeit deutlich voranbrachten bzw. diese erst
ermöglichten. Vielen Dank dafür.
Ebenso möchte ich meinem physikinternen Betreuer, Prof. Christoph Cremer danken, der mit
seinem Interesse an der Arbeit und seiner umkomplizierten Organisation die Durchführung
dieser externen Arbeit sehr vereinfacht hat.
Dank steht weiterhin Dr. Ed Leiter zu, der mich in seine Arbeitsgruppe im Jackson Lab in Bar
Harbor/Maine nett aufgenommen hat und mir bei biologischen Fragen immer zur Seite stand.
Ebenfalls möchte ich Dr. Angelika Bierhaus und ihrer Gruppe recht herzlich danken, die die
Vorversuche in Heidelberg und damit eine erste Einschätzung der Funktion des Gerätes
ermöglichten.
Großer Dank gebührt außerdem der Arbeitsgruppe um Don Kreutzer und Ulrike Klüh, die mir
bei den Messungen in Farmington/ Conn. selbstlos zwei Wochen zur Seite standen und mir
zur Gewinnung der überzeugendsten Ergebnisse dieser Arbeit verhalfen.
Desweiteren danke ich Dr. Michael Himmelhaus und David Baddaley für verbessernde
Vorschläge bzgl. der optischen Anordnung innerhalb des gebauten Messgerätes.
Bei nahezu allen Mäuseversuchen im Jackson Lab hat mir Peter Reifsnyder geholfen. Ohne
seine Hilfe wären fast alle dieser Versuche unmöglich gewesen. Recht herzlichen Dank dafür.
Sehr wichtig für die Erschaffung eines solchen Messgerätes ist natürlich die Elektronik-Crew,
Peter Jeschka und Günther Meinusch. Für Ihre Hilfe bei der Planung und Erstellung der
Schaltung sowie bei allen elektronischen und informatischen Fragen möchte ich mich zutiefst
bedanken. Zusätzlich soll in diesem Zusammenhang noch Jeff Forthofer erwähnt werden, der
110
die technische Betreuung im Jackson Lab übernahm. Vielen Dank für die technische
Unterstützung und das Verständnis elektrischer Probleme.
Neben den elektronischen Fragen gab es ebenso ingeneurtechnische Fragen zu lösen. Bei
Problemen dieser Art konnte ich immer auf Reinhold Jehle zählen. Vielen Dank.
Weiterhin wäre diese Arbeit unmöglich gewesen ohne eine entsprechende mechanische
Umsetzung des Aufbaus des Messgerätes. Hierfür gebührt der Dank der Werkstatt des
Physikalisch-Chemischen-Instituts der Uni-Heidelberg um Meister Weiss und Meister
Schmidt, sowie in besonderen Maße Herrn Neuwirth, der nahezu alle Teile angefertigt hat.
Ergänzend gebührt Berhard Haaf und Steffen Welz Dank für das Herstellen des Spiegels
mittels Drahterosion.
Die Bedampfung des Spiegels übernahm Georg Albert, dafür und für Tipps zur
Oberflächenbehandlung vielen Dank.
Für die intravenösen Versuche war ein chirurgischer Eingriff bei den Mäusen nötig, wofür ich
Andrée Lapierre danken möchte.
Außerdem möchte ich Andrea Seehuber für jegliche Hilfe mit der IR- und ATRSpektroskopie danken. Ferner möchte ich ihr für die moralische Unterstützung und ihren
Beistand besonders an den sehr langen Arbeitstagen danken, das weiß ich sehr zu schätzen.
Auch möchte ich Sören Schilp für die Hilfe bei den AFM-Messungen und für die lustigen
Pizzaabende im Institut danken.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei Dr. Reiner Dahint bedanken, der mir bei vielen
organisatorischen und physikalischen Problemen helfen konnte und Fragen aller Art jederzeit
offen gegenüberstand.
Desweiteren möchte ich mich bei allen bedanken, die das Arbeitsklima und somit meinen
Alltag in Heidelberg positiv beeinflusst haben und für lustige Gespräche jederzeit zu haben
waren.
111
Auch soll die Gruppe in Maine mit F.Scheuplein, J. Driver, L. Bogdanik, C. Bradley, S.
Maas, K. Jäger und Q. Hudson hier gesondert genannt werden. Sie sorgten dafür, dass ich
mich dort in kürzester Zeit heimisch fühlte. Vielen lieben Dank für Eure Offenheit..
Am Schluss gebührt natürlich immenser Dank meinen Eltern, die mir in all den Jahren der
Ausbildung jederzeit beistanden und geholfen haben. Diesen sicheren Rückhalt weiß ich
wirklich sehr zu schätzen.
Ebenso möchte ich mich bei meiner restlichen Familie bedanken, die es immer wieder schafft
mich aus meinen Alltag herauszulösen und die mich in allen Lebenslagen immer unterstützt
hat.
Abschließend möchte ich noch allen recht herzlich danken, die zum Gelingen dieser
komplexen Arbeit beigetragen haben, die ich jedoch bis jetzt nicht separat erwähnt habe.
112
Ich erkläre hiermit, dass ich vorliegende Dissertation selbst verfasst und mich keiner anderen
als der von mir bezeichneten Quellen und Hilfsmittel bedient habe. Ich habe an keiner
anderen Stelle ein Prüfungsverfahren beantragt bzw. die Dissertation in dieser oder anderer
Form bereits anderweitig als Prüfungsarbeit verwendet oder einer anderen Fakultät als
Dissertation vorgelegt.
Marcel Müller,
Heidelberg, den 7.5.2007
113
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Thank you for your participation!

* Your assessment is very important for improving the work of artificial intelligence, which forms the content of this project

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