tacconi stefano tesi

tacconi stefano tesi
Alma Mater Studiorum – Università di Bologna
DOTTORATO DI RICERCA
Ecologia Microbica e Resistenza Indotta agli Agenti
Fitopatogeni
Ciclo XXI Settore/i scientifico disciplinari di afferenza: AGR/16
Rapporti fra fattori ambientali e proteine di
parete in Bifidobacterium
Presentata da: Stefano Tacconi Coordinatore Dottorato
Relatore
Prof. Paolo Bertolini
Biavati
Prof.
Esame finale anno 2009 1
Bruno
Abstract
The normal gut microbiota has several important functions in host physiology and
metabolism, and plays a key role in health and disease. Bifidobacteria, which are
indigenous components of gastrointestinal microbiota, may play an important role in
maintaining the well-being of the host although its precise function is very difficult
to study. Its physiological and biochemical activities are controlled by many factors,
particularly diet and environment.
Adherence and colonization capacity are considered as contributing factors for
immune modulation,
pathogen exclusion, and enhanced contact with the mucosa. In this way,
bifidobacteria would fortify the microbiota that forms an integral part of the mucosal
barrier and colonization resistance against pathogens.
Bifidobacteria are not only subjected to stressful conditions in industrial processes,
but also in nature, where the ability to respond quickly to stress is essential for
survival. Bifidobacteria, like other microorganisms, have evolved sensing systems
for/and defences against stress that allow them to withstand harsh conditions and
sudden environmental changes.
Bacterial stress responses rely on the coordinated expression of genes that alter
various cellular processes and structures (e.g. DNA metabolism, housekeeping genes,
cell-wall proteins, membrane composition) and act in concert to improve bacterial
stress tolerance. The integration of these stress responses is accomplished by
regulatory networks that allow the cell to react rapidly to various and sometimes
complex environmental changes. This work examined the effect of important
stressful conditions, such as changing pH and osmolarity, on the biosynthesis of cell
wall proteins in B. pseudolongum subsp. globosum. These environmental factors all
influence heavily the expression of BIFOP (BIFidobacterial Outer Proteins) in the
cell-wall and can have an impact in the interaction with host. Also evidence has been
collected linking the low concentration of sugar in the culture medium with the
presence or absence of extracromosomal DNA.
2
INDICE
INTRODUZIONE
PAG.
CAPITOLO 1
IL MICROBIOTA INTESTINALE
2
1.1
LA BIODIVERSITÀ DEL MICROBIOTA INTESTINALE
3
1.2
COLONIZZAZIONE
3
DEL
TRATTO
GASTROINTESTINALE DELL’UOMO
1.3
ATTIVITÀ FUNZIONALE DEL MICROBIOTA
7
1.3.1 Funzioni metaboliche
7
1.3.2 Funzione protettiva del microbiota intestinale
10
1.3.2.1 Inibizione dei patogeni
10
1.3.2.2 Effetto protettivo sulle malattie intestinali [intestinal bowel
11
disease (IBD)] e nervose
CAPITOLO 2
IL GENERE BIFIDOBACTERIUM
2.1
EVOLUZIONE
DEGLI
14
STUDI
SUL
GENERE
14
BIFIDOBACTERIUM
2.2
Biologia del genere Bifidobacterium
15
2.2.1 Caratteri morfologici
18
2.2.2 Composizione della parete
19
2.2.3 La membrana citoplasmatica
20
2.2.4 Struttura del citoplasma
20
2.3
CARATTERISTICHE FISIOLOGICHE
21
2.3.1
Temperatura e pH
21
2.3.2 Sensibilità all’ossigeno
21
2.3.3 Agenti antimicrobici (antibiotici e oli essenziali)
21
2.4
22
METABOLISMO
3
2.4.1 Fermentazione del glucosio
22
2.4.2 Fermentazione di carboidrati semplici, complessi e mucine
24
2.4.3 Enzimi
25
2.4.4 Fisiologia e metabolismo
27
2.4.5 Caratteristiche nutrizionali
28
2.4.6 Terreni di coltura
29
2.5
30
CARATTERISTICHE DEL GENOMA
2.5.1 Composizione delle basi del DNA
30
2.5.2 Ibridazione DNA-DNA
30
2.5.3 Plasmidi
31
2.6
31
ECOLOGIA
2.6.1. Habitat umano
32
2.6.2 Habitat animale e extracorporeo
33
2.7
34
SPECIE PROBIOTICHE
CAPITOLO 3
CARATTERISTICHE DELLA SPECIE OGGETTO DI STUDIO
37
3.1.
37
BIFIDOBACTERIUM
PSEUDOLONGUM
SUBSP.
GLOBOSUM
CAPITOLO 4
L’ADESIONE MICROBICA
40
4.1 MECCANISMO GENERALE DELL’ADESIONE
40
4.2
MACROMOLECOLE
DI
SUPERFICIE
COINVOLTE
42
NELL’ADESIONE
4.3 LIGANDI DI SUPERFICIE NEI BIFIDOBATTERI
43
4.4
45
EFFETTO
DELLE
CONDIZIONI
AMBIENTALI
SULL’ESPRESSIONE DELLE PROTEINE
CAPITOLO 5
I PROBIOTICI
48
5.1
IL TERMINE “PROBIOTICO”
48
5.2
EFFETTI BENEFICI DEI PROBIOTICI
50
CAPITOLO 6
4
MATERIALI E METODI
54
6.1
CEPPI UTILIZZATI
54
6.2.
TERRENI DI COLTURA
54
6.3
CONDIZIONI DI INCUBAZIONE
54
6.4
CONSERVAZIONE DELLE COLTURE
54
6.5
DOCUMENTAZIONE FOTOGRAFICA
56
6.6
CRESCITA ALLE DIVERSE CONDIZIONI AMBIENTALI
56
6.6.1 Coltura a pH costante
55
6.6.2 Coltura in NaCl.
56
6.6.3 Coltura in TPY diluito
56
6.6.4 Coltura in Desferal
56
6.6.5 Coltura a diverse concentrazioni di glucosio.
56
6.6.6 Coltura in diversi zuccheri
57
6.7
PREPARAZIONE
DEGLI
ESTRATTI
CELLULARI
57
TOTALI, DEGLI ESTRATTI CELLULARI CITOPLASMATICI E
DELLE PARETI CELLULARI.
6.8 DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELLE PROTEINE
57
6.9
59
ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMIDE IN
GRADIENTE LINEARE (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970).
6.10
TRASFERIMENTO SU FILTRI DI NITROCELLULOSA
59
6.11
PREPARAZIONE
59
DEGLI
ANTISIERI
POLICLONALI
(ANTICORPI II)
6.12
ANALISI
IMMUNOLOGICA
DELLE
PROTEINE
60
BLOTTATE.
6.13
SAGGI DI IDROFOBICITÀ
60
6.14
TRATTAMENTO CON TRIPSINA
61
6.15
ELETTROFORESI DELLE PROTEINE NATIVE:
62
CAPITOLO 7
RISULTATI E DISCUSSIONE
65
7.1
Coltura a pH costante
65
7.1.1 Effetto pH sulle BIFOP C e H
65
5
7.1.2 Prove di idrofobicità a diversi pH
68
7.2
68
Coltura in NaCl
7.2.1 Effetto NaCl sullo sviluppo di Ru 809/1 e Ru 809/8.
68
7.2.2 Effetto NaCl sulle proteine di parete
69
7.2.3 Effetto NaCl sull’idrofobicità
73
7.3
Coltura in TPY diluito
73
7.4
Coltura in Desferal
73
7.5
Coltura in diversi zuccheri.
74
7.5.1 Effetto della coltura in diversi zuccheri sul’espressione delle
74
BIFIOP C e H.
7.5.2 Effetto coltura in diversi zuccheri sull’idrofobicità
81
7.5.2 Effetto trispsina sulle cellule maggiormente idrofobiche
81
coltivate nei diversi zuccheri
7.6
Coltura a diverse concentrazioni di glucosio
82
7.8
Coltura alle condizioni ambientali che inducono la maggior
86
espressione quantitativa di BIFOP C e H (prova MWP, Maximum
Wheight Protein)
7.8.1 Effetto della somma delle condizioni ambientali che inducono
86
overespressione delle BIFOP C e H sull’espressione delle BIFOP C e
H.
7.8.2
Prove di idrofobicità MWP
89
7.9
Effetto condizioni colturali su mantenimento plasmide
90
7.10
Effetto concentrazione dello 0.15 % di diversi zuccheri sul
90
mantenimento del plasmide.
7.11
CONCLUSIONI
91
BIBLIOGRAFIA
93
6
CAPITOLO 1
7
IL MICROBIOTA INTESTINALE
1.2
LA BIODIVERSITÀ DEL MICROBIOTA INTESTINALE
Il grande intestino ospita un microbiota che comprende centinaia di diversi tipi di
batteri. Le nostre conoscenze sulla sua struttura e funzione sono drasticamente
cambiate nell’ultimo decennio, soprattutto a causa dell’introduzione dei metodi
molecolari per lo studio delle comunità microbiche. Stime attuali, basate sulla
sequenza dei geni del 16S rRNA nel DNA estratto da feci, indicano che sono presenti
800–1000 diverse specie microbiche e circa un numero >7000 di diversi ceppi
(Backhead et al., 2005) e che la maggioranza di questi (>80%) non è stato ancora
isolato o caratterizzato (Eckburg et al., 2005). Inoltre è presente un’ampia
biodiversità microbica con funzioni sconosciute che deve essere studiata.
Sebbene il microbiota intestinale sembri stabile a lungo termine ed ampiamente
simile in diversi individui, significative differenze possono essere rilevate a livello di
specie e ceppi mentre una grande variabilità può verificarsi di giorno in giorno in
alcune popolazioni microbiche. I fattori ecologici che controllano le attività
metaboliche e la composizione del microbiota sono ben conosciuti. E’ noto, per
esempio, che un elevata biodiversità di specie è necessaria per il mantenimento
dell’omeostasi e per la stabilità strutturale della comunità microbica: la diminuzione
delle specie microbiche a causa di un trattamento antibiotico o dell’età diminuisce la
capacità dell’ecosistema di “opporsi” ai microrganismi patogeni (Jernberg et al.,
2007). Numerose evidenze scientifiche suggeriscono che la composizione del
microbiota è legata a malattie infiammatorie del tratto gastrointestinale (Peterson et
al., 2008), come il morbo di Chron (Dicksved et al., 2008), e può influenzare la
propensione all’obesità (Ley et al., 2006).
Il ruolo chiave del microbiota nella salute dell’ospite, pertanto, è stato confermato
largamente nel corso degli ultimi anni. La comunità del microbiota dell’intestino
influenza numerosi processi biologici come la maturazione dell’intestino e
l’angiogenesi (Stappenbeck et al., 2002), lo sviluppo della immunità innata of innate
immunity (Mazmanian et al., 2005), la produzione di vitamine (Hill, 1997), la
biotrasformazione di composti esogeni ed endogeni (Blaut and Clavel, 2007), dietary
8
energy harvest, and recently, regulation of the host fat storage (Bäckhed et al., 2004).
Particolare interesse è attribuito allo studio dell’influenza della dieta sia sulla
composizione sia sul metabolismo del microbiota intestinale. La trasformazione di
composti della dieta da parte dei batteri intestinali determina la formazione di una
ampia varietà di composti con effetti positivi o negativi sulla salute dell’ospite. Una
dieta ricca di carboidrati può avere un effetto significativo sul numero dei batteri che
producono
butirrato
come
Ruminococcus/Faecalibacterium
and
Roseburia/Eubacterium. Il butirrato è la sorgente energetica preferita per le cellule
epiteliali del colon e si suppone che svolga un importante ruolo nel mantenimento
della salute del colon attivando l’apoptosi e l’arresto del ciclo cellulare (Roediger,
1982; Heerdt et al., 1994). Le fibre non digeribili, inoltre, possono stimolare
selettivamente la crescita dei bifido batteri che svolgono effetti benefici per la salute
(Lee et al., 1993; Gibson and Wang, 1994; Jiang et al., 1996; Schiffrin et al.,1995;
Singh et al.,1997; Marteau et al., 2002; Rayment et al., 2002). Plant lignans e
flavonoidi, generalmente considerate sostanze non nutritrive, possono essere
trasformati dai batteri intestinali in composti simili agli estrogeni con effetti
antiossidanti. Ad esempio, l’attività di degradazione dei lignani è stata attribuita a
ceppi dei generi Bacteroides, Clostridium, Eggerthella, Eubacterium, and
Ruminococcus isolati dalle feci (Blaut and Clavel, 2007).
1.2
COLONIZZAZIONE
DEL
TRATTO
GASTROINTESTINALE
DELL’UOMO
La composizione della normale flora del tratto gastrointestinale dell’uomo è
influenzata da diversi fattori (età, sesso, dieta, temperatura) ed è stato
sperimentalmente dimostrato che alcune specie batteriche possono essere
regolarmente presenti, mentre altre possono comparire solo occasionalmente o in
alcune fasi della vita (Stark et al., 1982).
Alla nascita il canale digerente è sterile, ma viene rapidamente colonizzato da
numerosi microrganismi provenienti sia dal microbiota fecale e vaginale materno,
che dall’ambiente (Zoetendal et al., 2001; Fanaro et al., 2003; Woodmansey et al.,
2004). La colonizzazione microbica incomincia fin dalle prime ore di vita ed è
caratterizzata da una regolare successione di specie. (Figura 1)
9
Figura 1: Rappresentazione della variazione quantitativa nel tempo dei principali
gruppi microbici intestinali.
Lo stomaco dell’uomo è la porzione del tratto gastrointestinale meno colonizzata
(101-103 CFU/ml), a causa del pH estremamente acido che lo caratterizza. Le specie
fino ad ora isolate sono state Helicobacter pylori, Lactobacillus spp., e Streptococcus
spp. (Brandi et al., 2006).
Allo stomaco segue l’intestino tenue che è suddiviso in tre parti: duodeno, digiuno ed
ileo ed è rivestito da una mucosa sollevata in estroflessioni, note come villi
intestinali. A causa dell’azione combinata dei succhi gastrici e della bile, il duodeno
contiene pochi microrganismi, mentre nel diguno e nell’ileo il loro numero aumenta
(104-108 CFU/ml). I generi microbici che sono stati isolati fino ad ora nel digiuno e
nell’ileo dell’uomo sono specie appartenenti ai generi Streptococcus, Lactobacillus,
Bifidobacterium, Bacteroides, Fusobacterium e coliformi (Simon and Ghorbac,
1984; Guarner and Malagelada, 2003).
All’intestino tenue segue l’intestino crasso, che è un lungo tubo suddiviso in cieco
(rappresentato da una breve espansione terminante nell’appendice vermiforme) colon
e retto, la cui mucosa è solitamente più spessa di quella dell’intestino tenue, priva di
villi ed è la porzione di tratto gastrointestinale maggiormente colonizzata.
Entro le prime ore di vita, il colon contiene circa 103-104 CFU/g, rappresentate
prevalentemente da specie appartenenti ai generi Streptococcus spp., Lactobacillus
spp., Bacteroides, Eubacterium spp., Peptococcus ed E.coli (Aggett et al., 2003;
Ward et al., 2006). Già durante la prima settimana di vita il numero dei
microrganismi aumenta fino a 109 CFU/g, ed è rappresentato da specie microbiche
10
diverse nei neonati allattati al seno o con latte artificiale (Biavati et al., 1985). Nei
neonati allattati al seno, infatti, si osserva un precoce insediamento di E. coli e
Streptococcus spp. e Lactobacillus spp., ma già dopo 2-5 giorni i bifidobatteri
prendono il sopravvento e, secondo la maggior parte dei ricercatori, il loro
insediamento avviene attraverso la vagina della madre l’ambiente circostante anche
se recenti studi hanno messo in evidenza la presenza di bifido batteri nella ghiandola
mammaria e nel latte materno (Martin et al., 2009; Liepke et al., 2002). Dopo la
prima settimana di vita la microflora di questi neonati è costituita prevalentemente da
bifidobatteri, che divengono i microrganismi predominanti nella flora fecale (Favier
et al., 2002; Penders et al., 2006), forse perchè il latte umano contiene fattori
indispensabili per il loro sviluppo (Liepke et al., 2002; Grönlund et al., 2007;
Gueimonde et al., 2007). Le specie appartenenti ai generi Streptococcus spp.,
Lactobacillus spp, E.coli ed altri anaerobi sono regolarmente presenti, seppur in
proporzioni minori, mentre Bacteroides spp., Eubacterium spp., Clostridium spp. e
Peptococcus spp. sono praticamente assenti.
Nei neonati alimentati con latti diversi, la microflora risulta più diversificata ed
accanto ad E.coli si trovano Streptococcus spp. ed altri anaerobi stretti in proporzioni
molto maggiori che non nei neonati allattati al seno, Bifidobacterium spp. è presente
in proporzioni uguali o solo leggermente inferiori e solo Lactobacillus spp. è
presente in proporzioni molto minore (Hopkins et al., 2005; Penders et al., 2005)
(Fig. 2).
11
Bifidobacteria species in feces samples
100%
14%
90%
38%
80%
70%32%
60%
29%
23%
50%
B. breve
6%
30%
3%
20%
22%
absence of bifidobacteria
12%
40%
2%
10% 2%
12%
B. infantis
B. longum
2%
B. bifidum
B. pseudocatenulatum
4%
B. catenulatum
B.dentium
1%
0%
breast-fed [n=128]
bottle-fed [n=70]
Fig. 2. Distribuzione delle specie di bifidobatteri nelle feci di neonati allattati al seno
ed artificialmente. Dati da Biavati et al., 1986.
Dopo lo svezzamento (circa attorno ai due anni di vita) la flora fecale cambia per
l’assunzione di cibi solidi ed assume le caratteristiche di quella dell’adulto in cui
diminuiscono i batteri anaerobi facoltativi ed aumentano progressivamente gli
anaerobi stretti (Tannock, 1999). In questa fase della vita, infatti, E.coli e
Streptococcus spp. diminuiscono molto e raggiungono un livello che si mantiene poi
costante nell’adulto, i bifidobatteri ed i lattobacilli subiscono solo una leggera
flessione, mentre Bacteroides spp., Eubacterium spp., Peptostreptococcus spp. e
Clostridium
perifringens
compaiono
solo
in
questa
progressivamente di numero (Benno et al., 1984) (Fig. 3 )
12
fase
ed
aumentano
100
90
20%
80
absence of bifidobacteria
70
B. pseudocatenulatum
B. longum
60
B. adolescentis
52%
50
B. catenulatum
B. bifidum
40
30
20
12%
10
8%
0
5%
3%
1
Fig. 3. Distribuzione delle specie di bifidobatteri nelle feci dell’adulto. Dati da
Biavati et al. (1984).
Dopo i 65 anni d’età, poi, Bacteroides, Eubacterium e Peptostreptococcus
rimangono in numero pressochè costante, i bifidobatteri diminuiscono, mentre E.coli,
Streptococcus spp, Lactobacillus spp. e Clostridium perifringens aumentano
progressivamente (Fig. 1).
1.3
ATTIVITÀ FUNZIONALE DEL MICROBIOTA
1.3.1 Funzioni metaboliche
Il microbiota gastrointestinale svolge numerosissime funzioni che sono il risultato
delle interazioni tra batteri, epitelio intestinale ed ospite (Drasar and Hill, 1974;
Nicholson et al., 2005) (Fig. 4).
13
Fig. 4. Schema della trasformazione cui il cibo viene sottoposto.
La principale funzione metabolica svolta dal microbiota intestinale è costituita dalla
fermentazione di residui della dieta non digeribili e/o di muco endogeno prodotto
dall’epitelio. Il muco dell’ospite, infatti, oltre a fornire protezione contro l’adesione e
l’invasione di microrganismi patogeni, costituisce una riserva consistente di glicani,
mucina, glicosfingolipidi, acido ialuronico ed eparina (Hooper et al., 2002), e
permette, quindi, di mitigare gli effetti relativi a drastici cambiamenti nella
disponibilità di polisaccaridi della dieta (Bäckhed et al., 2005).
La biodiversità della comunità microbica garantisce la presenza di numerosi enzimi e
pathway biochimici diversi da quelli costitutivi dell’ospite. Nell’uomo e nel topo
l’analisi metagenomica del microbioma intestinale ed il confronto tra diversi
ecosistemi microbici ha evidenziato, infatti, l’arricchimento in geni appartenenti alle
categorie e pathway KEGG [Kyoto Enciclopedia of Genes and Genomes (Kanehisa
et al., 2004)] relativi a metabolismo di carboidrati e glicani. B. longum e Bacteroides
thetaiotaomicron dedicano circa l’8% del loro genoma a funzioni di trasporto
degradazione di carboidrati (Schell et al., 2002; Xu et al., 2003).
Il genoma umano da 2.85 Gb contiene solamente 98 note o probabili idrolasi
glicosidiche, e manca delle attività enzimatiche necessarie per la degradazione di
polisaccaridi contenenti xilani, pectine e arabinosio, componenti comuni delle fibre
assunte con la dieta.
L’attività metabolica del microbiota determina il recupero di energia e di substrati
assorbibili per l’ospite, ed il rifornimento di energia e prodotti nutritivi per la crescita
dei batteri intestinali. Nel colon, la maggior fonte di energia microbica è la
14
fermentazione di carboidrati non digeribili, quali polisaccaridi (amido, cellulosa,
emicellulosa, inulina, pectine e gomme), oligosaccaridi, ed alcoli con la conseguente
generazione di acidi grassi a corta catena (SCFA), H2 e CO2.
Il metabolismo anaerobico di peptidi e proteine (putrefazione) ad opera del
microbiota intestinale, determina la produzione di SCFA ma, allo stesso tempo,
comporta la produzione di una serie di substrati potenzialmente tossici, quali
ammonio, ammine, fenoli, tioli e indoli (Smith and Macfarlane, 1996). Le fonti
proteiche disponibili includono elastina e collagene provenienti da fonti alimentari,
enzimi pancreatici, cellule epiteliali morte e batteri lisati (Salminen et al., 1998). La
disponibilità giornaliera di substrati nel colon umano adulto è di circa 20-60 g di
carboidrati e 5-20 g di proteine (Silvester et al., 1995); la produzione giornaliera di
SCFA si aggira sui 400 mM. A livello di cieco e colon ascendente, una
fermentazione saccarolitica intensa determina una produzione consistente di SCFA e
si accompagna a valori acidi di pH (5-6) e ad una rapida crescita batterica
(Fallingborg, 1999). Al contrario, la disponibilità di substrato diminuisce nel colon
discendente, il pH si avvicina alla neutralità, i processi putrefattivi diventano
quantitativamente più importanti e le popolazioni batteriche appaiono statiche. Gli
SCFA svolgono un’importante funzione a livello della fisiologia dell’ospite. In
particolare, il butirrato rappresenta la principale sorgente energetica delle cellule
epiteliali del colon (circa il 70% dell’intake energetico), che lo consumano quasi
interamente (Cummings et al., 1987). Acetato e propionato, invece, sono in grado di
modulare il metabolismo del glucosio; il loro assorbimento determina una minore
risposta glicemica dopo ingestione di glucosio orale o di un pasto standard. Un basso
indice glicemico è stato, infatti, riportato per numerosi cibi caratterizzati da alte
percentuali di carboidrati non digeribili. I microrganismi del colon esercitano un
ruolo fondamentale anche nella sintesi di vitamine, quali B12 e K e
nell’assorbimento di ioni calcio, magnesio e ferro.
ƒ
Al microbiota intestinale sono state, inoltre, attribuite;
ƒ
funzioni bioremediation-like, quale la detossificazione di carcinogeni,
il che potrebbe modulare la suscettibilità dell’ospite a differenti tipi di neoplasma, sia
all’interno che all’esterno dell’intestino;
15
ƒ
la degradazione dell’ossalato, i cui livelli sono stati correlati alla
predisposizione allo sviluppo di calcoli renali;
ƒ
la modificazione degli acidi biliari con conseguenti alterazioni del
metabolismo lipidico dell’ospite.
Sulla base delle funzioni metaboliche esercitate dalla microflora intestinale, appare
evidente come il valore nutritivo e/o energetico del cibo non sia, quindi, un valore
assoluto ma largamente influenzato dalle capacità digestive del microbiota del
singolo individuo (Martin et al., 2007). Lo studio del profilo microbico di individui
sani e con patologie potrebbe fornire importanti indicazioni per formulare diete
personalizzate al fine di modulare la composizione del microbiota verso lo stato di
salute.
1.3.2 FUNZIONE PROTETTIVA DEL MICROBIOTA INTESTINALE
1.3.2.1 Inibizione dei patogeni
L’epitelio mucoso intestinale, che separa il milieu interno dall’ambiente luminale,
svolge una funzione di barriera contro i patogeni.
Tale protezione è modulata in modo importante anche dal microbiota che anch’esso
svolge un importante funzione contro la colonizzazione dei microrganismi patogeni.
Animali germ-free, infatti, risultano più sensibili alle infezioni. I meccanismi
implicati nell’effetto barriera sono numerosi. In vitro, i batteri competono per siti
d’attacco a livello dell’orlo a spazzola delle cellule dell’epitelio intestinale,
prevenendo l’adesione ed impedendo la successiva penetrazione di microrganismi
enteroinvasivi (Bernet et al., 1994). Anche l’affinità per i nutrienti può essere un
fattore di competizione per la colonizzazione microbica. Infine, i batteri possono
inibire la crescita di eventuali patogeni mediante produzione di sostanze
antimicrobiche, le batteriocine (Lievin et al., 2000). L’ospite può controllare la
produzione di tali sostanze, poiché la maggior parte di esse sono proteine,
degradabili da proteasi digestive.
Il microbiota intestinale è paragonabile, quindi, ad un efficiente e stabile bioreattore
naturale, che oppone resistenza alla colonizzazione di subpopolazioni patogene che
16
potrebbero danneggiare ma soprattutto ridurre significativamente il benessere
dell’ospite.
La barriera mucosa separa il milieu interno dall’ambiente luminale. La funzione
barriera dipende dall’integrità della mucosa e dalla reattività di fattori dinamici di
difesa,
quali
flusso
sanguigno
mucosale,
secrezioni
epiteliali,
e
cellule
immunocompetenti.
1.3.2.2 Effetto protettivo sulle malattie intestinali [intestinal bowel disease
(IBD)] e nervose
Sono state osservate differenze nella composizione microbica fra individui sani e
individui con colite ulcerativa o malattia di Chron: una significativa diminuzione di
lattobacilli è stata rilevata in pazienti con IBD. Ci sono evidenze scientifiche che le
IBD siano una conseguenza di una risposta immunitaria cellula-mediata eccessiva:
fra i possibili induttori di questo stato patologico sono compresi i batteri commensali.
E’ noto che le IBD siano legate ad un aumento dell’infiammazione che causa un
incremento della risposta immunitaria (Sartor, 2000). In condizioni patologiche,
infatti, come infiammazione acuta o cronica e danneggiamento di tessuti, il sistema
immunitario è attivato e viene aumentata l’attività dei macrofagi che determinano a
loro volta la produzione e il rilascio di citochine, come interleukin (1L-1b e IL-6),
tumour necrosis factor (TNFa) e interferon (INF). E’ noto da tempo che le citochine
prodotte e rilasciate durante malattie sistemiche agiscano come neuromodulatori.
Esse rappresentano il fattore chiave nella mediazione centrale delle caratteristiche
comportamentali, neuroendocrine e neurochimiche dei disordini depressivi e
determinano numerosi sintomi strettamente simili a quelli osservati nella
depressione: è stato riportato che malattie sistemiche caratterizzate da infiammazioni
croniche, come l’artrite reumatoide e le IBD, siano accompagnate da depressione
(Miller and O'Callaghan, 2005; Schiepers et al., 2005).
Ci sono, quindi, evidenze scientifiche della relazione fra malattie intestinali e
presenza di stati depressivi ma non ci sono a tutt’oggi studi sull’ecologia microbica
dell’intestino in individui con IBD depressi. Circa il 30% degli individui con
depressione hanno una IBD diagnosticata. Pazienti con IBD hanno un microbiota
intestinale con un accresciuto numero di aerobi e con una riduzione del rapporto
17
normale fra anaerobi e aerobi. La modulazione del microbiota intestinale con il
ripristino delle condizioni di equilibrio fra i gruppi microbici potrebbe indurre una
diminuzione dei fenomeni infiammatori con miglioramento sia delle malattie
gastrointestinali sia dei disordini depressivi ad esse collegate.
18
CAPITOLO 2
19
IL GENERE BIFIDOBACTERIUM
2.1
EVOLUZIONE DEGLI STUDI SUL GENERE BIFIDOBACTERIUM
Nel 1900, all’Istituto Pasteur di Parigi, Tissier osservò e isolò per la prima volta,
dalle feci di neonati allattati al seno, un batterio con un’insolita e caratteristica forma
a “Y” (Fig. 5). Questo batterio, che era anaerobio stretto, Gram-positivo e non
produceva gas durante la crescita, per le sue caratteristiche morfologiche venne da lui
chiamato Bacillus bifidus communis (Tissier, 1900).
Fig. 5. Microfotografia al microscopio elettronico di Bifidobacterium spp.
Più o meno nello stesso periodo furono condotte estese ricerche sui batteri produttori
di acido lattico e furono isolati ceppi batterici con morfologia simile, che vennero
classificati fra i lattobacilli e denominati Lactobacillus bifidus (Holland, 1920). Nel
1924 Orla-Jensen e coll. approfondirono gli studi sui batteri lattici e proposero di
classificare B.bifidus communis come specie a sè all’interno del genere
Lactobacillus, indicandolo come possibile anello di collegamento fra i batteri lattici e
i batteri propionici e proponendo un nome più appropriato: Bacterium bifidum (OrlaJensen et al., 1924).
Fino alla metà degli anni cinquanta, però, gli studi sui bifidobatteri furono solo
sporadici e la maggior parte di questi erano casuali, all’interno di studi molto più
ampi sui lattobacilli, la cui classificazione veniva costantemente revisionata. Questi
studi preliminari, infatti, pur mostrando che i due generi microbici erano separati,
non erano ancora completamente convincenti (Sharpe, 1955).
20
Il primo tentativo per riclassificare i bifidobatteri coronato da successo fu compiuto
solo più tardi da Dehnert, che separò i bifidobatteri isolati dalle feci di lattanti
allattati al seno in cinque “gruppi”, sulla base delle loro caratteristiche morfologiche,
sierologiche e fermentative (Dehnert, 1957).
Successivamente Lerche e Reuter condussero uno studio sui bifidobatteri isolati dalle
feci di adulti e sulle basi della morfologia cellulare e dell’aspetto delle colonie
distinsero tre “tipi” (Lerche and Reuter, 1961). Uno studio ancora più approfondito
sui bifidobatteri e sulla loro tassonomia fu condotto successivamente sempre da
Reuter su ceppi isolati dalle feci sia di lattanti allattati al seno che di adulti (Reuter,
1963). Questo studio permise di modificare la precedente classificazione dei
bifidobatteri, introducendo la designazione di “specie” al posto dei termini “tipi” o
“gruppi” e, sulla base delle caratteristiche delle colonie, della morfologia e degli
studi di fermentazione, vennero aggiunte a B.bifidum altre sette specie distinte:
B.adolescentis,
B.breve,
B.infantis,
B.lactentis,
B.liberorum,
B.longum
e
B.parvulorum.
Il lavoro di Reuter venne, poi, confermato e revisionato in Giappone da Mitsuoka, il
cui maggior contributo all’avanzamento delle ricerche, fu la scoperta di nuove specie
di bifidobatteri nelle feci di animali. Egli, inoltre, dimostò che le specie trovate nelle
feci umane non si ritrovavano negli animali e descrisse tre nuove specie
esclusivamente di origine animale: B.longum var. animalis (diversa da B.longum var.
longum di origine umana), B.pseudolongum e B.thermophilum (Mitsuoka, 1969).
Nello stesso periodo, anche in Italia, furono isolate ed identificate molte nuove
specie di bifidobatteri da animali, utilizzando metodologie del tutto innovative,
perchè non erano più basate solo su criteri morfologici, fisiologici (attività catalasica
e capacità di ridurre il nitrato), sierologici e sulla fermentazione degli zuccheri, ma
sull’identificazione di un enzima caratteristico dei bifidobatteri. Questo enzima, la
fruttosio-6-fosfato-fosfochetolasi, che permetteva una particolare fermentazione del
glucosio ad acido acetico e lattico nella proporzione approssimativa di 1,5:1,0 senza
produzione di gas (Scardovi and Trovatelli, 1965; De Vries et al., 1967), permise a
Scardovi e coll. di isolare cinque nuove specie di bifidobatteri. Due di queste vennero
isolate dal rumine bovino e vennero denominate B.globosum e B.ruminale (Scardovi
et al, 1969), le altre tre, che presentavano una morfologia abbastanza diversa dai
21
bifidobatteri fino ad allora conosciuti, vennero isolate dall'intestino di ape (Apis
mellifica e Apis indica), e vennero denominate B.asteroides, B.coryneforme (per la
morfologia simile a quella dei corinebatteri) e B.indicum (Scardovi and Trovatelli,
1969).
Poichè vari ricercatori isolavano un sempre crescente numero di ceppi di
bifidobatteri da diverse fonti, divenne necessario individuare altri metodi per una
corretta collocazione tassonomica dei nuovi isolati.
Uno dei nuovi criteri utilizzato a tale scopo, fu la valutazione della composizione del
DNA (GC%), che permise di confermare la separazione netta dei bifidobatteri dai
lattobacilli, dai corinebatteri e dai propionibatteri (Sebald et al., 1965; Werner et al.,
1966).
Negli anni settanta, è stata applicata estesamente la tecnica di ibridazione del DNADNA, sia per verificare la validità delle specie precedentemente proposte, che per
riconoscere nuovi gruppi di omologia tra i ceppi che si stavano via via isolando
(Scardovi et al., 1970). Così, ad esempio, B. lactentis, B. liberorum e B.infantis,
vennero raggruppate nell’unica specie B. infantis (oggi riclassificata come B .longum
subsp. infantis (Mattarelli et al., 2008); le due “biovars” di B. longum, proposte da
Mitsuoka, furono considerate specie distinte e denominate rispettivamente B.
animalis e B. longum e le due specie B.ruminale e B.thermophilum vennero unite
come B. thermophilum.
Grazie a queste nuove tecniche di identificazione, vennero isolate numerose altre
specie di bifidobatteri da habitat diversi: B.suis (Matteuzzi et al., 1971),
B.angulatum, B.catenulatum, B.dentium (Scardovi and Crociani, 1974), B.magnum
(Scardovi and Zani, 1974), B.minimum (Scardovi and Trovatelli, 1974), B.pullorum
(Trovatelli et al, 1974), B.boum, B.choerinum, B.cuniculi e B.pseudocatenulatum
(Scardovi et al., 1979).
Sempre negli anni settanta venne, poi, introdotta negli studi tassonomici dei batteri
l’analisi della sequenza delle basi dell’rRNA (Fox et al., 1980), che portò
all’assegnazione dei bifidobatteri alla famiglia delle Actinomycetaceae anche se la
struttura della mureina della parete cellulare, dimostrava che essi fossero più vicini
alle Lactobacillaceae che alle Actinomycetaceae (Kandler and Lauer, 1974).
22
Altri
ritocchi
alla
classificazione
vennero
apportati
dopo
l’introduzione
dell’elettroforesi delle proteine cellulari solubili su gel di poliacrilamide, come
criterio di identificazione delle specie (Biavati et al., 1982). Mediante questo tipo di
elettroforesi venne, infatti, evidenziata una banda che compariva in tutti i profili
elettroforetici dei bifidobatteri e che migrava nella stessa posizione per tutte le specie
esaminate, ad eccezione di B.boum per cui poteva essere un’utile indicazione di
appartenenza al genere per quei microrganismi ancora sconosciuti. Inoltre, venne
riconosciuta un’eccellente rispondenza con i dati ottenuti mediante la tecnica di
ibridazione del DNA-DNA. . Nell’8th edizione del Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology i bifidobatteri sono stati classificati per la prima volta
come genere Bifidobacterium comprendente 8 specie; esso era incluso nella famiglia
Actinomycetaceae dell’ordine Actinomycetales. La descrizione di nuove specie e il
riarrangiamento della precedente classificazione ha portato alla descrizione delle 24
specie riportate nella prima edizione del Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology. Successivamente la descrizione di altre 8 specie ha aumentato il
numero delle specie a 32. Nel 1997, Stackebrand et al. attraverso l’analisi 16S rRNA
hanno proposto una nuova struttura gerarchica che ha riunito il genere Gardnerella
col genere Bifidobacterium nella singola famiglia delle Bifidobacteriaceae (Biavati
and Mattarelli, 2007). Attualmente la famiglia Bifidobacteriaceae comprende i
generi
Bifidobacterium,
Aeriscardovia,
Parascardovia e Scardovia (Fig. 6).
23
Alloscardovia,
Metascardovia,
Domain
Bacteria
Lineage
Firmicutes
Class
Actinobacteria
Subclass
Actinobacteridae
Order
Bifidobacteriales
Family
Bifidobacteriaceae
Genera
B ifidobac terium (32 s pec ie)
A eris c ardovia
(1 s pec ie)
A llos c ardovia
(1 s pec ie)
Metas c ardovia
(1 s pec ie)
P aras c ardovia
(1 s pec ie)
S c ardovia
(1 s pec ie)
Fig. 6. Filogenesi della famiglia Bifidobacteriaceae
Tutti i generi suddetti comprendono un’unica specie, mentre il genere
Bifidobacterium include 32 specie.
2.2. BIOLOGIA DEL GENERE BIFIDOBACTERIUM
I bifidobatteri sono batteri anaerobi, anche se la loro sensibilità all’ossigeno è diversa
fra le varie specie e fra i ceppi delle singole specie (Prévot et al., 1967). Sono batteri
Gram-positivi, asporigeni, immobili, con cellule bastoncellari incurvate, a contorni
irregolari. Generalmente sono catalasi negativi e solo le specie aerotolleranti
(B.indicum e B.asteroides) possono diventare catalasi-positive quando crescono in
presenza di aria, con o senza l’aggiunta di emina (Scardovi and Trovatelli, 1969);
sono indolo negativi, non riducono i nitrati a nitriti, nè i solfati a solfuri.
La sopravvivenza delle colture va da tre settimane a un mese, se conservate a 4°C e
può raggiungere diversi anni dopo liofilizzazione.
2.2.1. Caratteri morfologici
24
La morfologia particolare dei bifidobatteri permise a Tissier di isolare dalle feci di
neonati allattati al seno batteri a forma di “Y” o “V”, definiti “bifidobatteri” proprio
per la loro forma (Tissier, 1900).
Generalmente, questi batteri hanno cellule lunghe circa 2-5 µm, di forma
bastoncellare, quasi sempre con estremità bifide, ramificazioni, rigonfiamenti e
protuberanze (figura 1). Anche se le forme a “Y” e a “V” sono le più frequenti, non
sono insolite forme più regolari e coccoidi, specialmente in relazione alla vicinanza
con altre specie o in particolari condizioni di coltura (Reuter, 1963; Scardovi and
Trovatelli, 1969). Già lo stesso Tissier aveva notato che i batteri da lui isolati
assumevano forme rigonfie in risposta all’acidità, alle temperature estreme o alle
inadeguate fonti di azoto nel substrato (Tissier, 1900). Successivamente questo
aspetto fu riscontrato anche da Gyllemberg che notò che dopo ripetuti trapianti
B.bifidum modificava la sua morfologia, passando da cellule regolari a irregolari e
rigonfie (Gyllemberg, 1955). Glick et al. (1960), invece, avevano dimostrato che
quando B.bifidum var. pennsylvanicus veniva fatto crescere in terreni di coltura privi
di N-acetil-glucosamina, il costituente principale del peptidoglicano, modificava la
sua morfologia da bifida a ramificata, ma se si aggiungevano al terreno alcuni
aminoacidi (serina, alanina, acido aspartico, acido glutamico), le cellule passavano
dalla forma ramificata a quella curva (Husain et al., 1972). Contemporaneamente
Kojima e coll. notarono che anche le concentrazioni di sali sodici e di ioni calcio
influivano sulla formazione delle ramificazioni (Kojima et al., 1970).
A questo proposito, sorprendente risultò la scoperta di Biavati e coll. sulle frequenti
variazioni di fasi nell’aspetto delle colonie e nella morfologia cellulare che
B.animalis assumeva quando veniva coltivato in diverse condizioni di anaerobiosi
(Biavati et al., 1992).
2.2.2. Composizione della parete
La struttura del peptidoglicano dei bifidobatteri è stata studiata da Kandler e Lauer
(Kandler and Lauer, 1974; Veerkamp et al., 1971).
Questi autori hanno dimostrato che come in tutte le specie Gram-positive, anche nei
bifidobatteri la parete cellulare è formata principalmente da un unico strato
omogeneo di peptidoglicano: un polimero costituito da acido N-acetil-muramico
25
(NAM) e N-acetil-glucosamina (NAG), legati tramite un legame glicosidico β-(1,4).
Al gruppo carbossilico del NAM, poi, è attaccata una catena peptidica di tre
aminoacidi (L-alanina, D-acido glutamico, L-lisina o L-ornitina), che nell’insieme
rappresenta la parte comune a tutti i bifidobatteri. Le catene delle subunità
peptidoglicaniche adiacenti sono, poi, unite le une alle altre da una sequenza di
aminoacidi diversa nelle diverse specie (parte variabile) che può essere utilizzabile
nella classificazione (Kandler and Lauer, 1974; Weiss and Biavati, 1994)
Anche se il peptidoglicano è sicuramente il componente principale della parete,
Kandler e Lauer hanno dimostrato che essa contiene pure grandi quantità di
polisaccaridi: normalmente glucosio e galattosio, spesso associati al ramnosio. La
presenza di acidi lipoteicoici (polimeri di alcoli polivalenti legati ai lipidi della
membrana plasmatica) sulla parete di B.bifidum è stata mostrata per la prima volta da
Veerkamp e coll. (Veerkamp et al., 1983) e studi immunoistochimici successivi
hanno mostrato che questi acidi lipoteicoici, da soli o associati a proteine, sono
responsabili dell’idrofobicità della superficie batterica (Op Den Camp et al., 1985).
2.2.3 La membrana citoplasmatica
La membrana citoplasmatica dei bifidobatteri è stata studiata dettagliatamente su
B.bifidum. Essa appare come una struttura di 9 nm di spessore, costituita da un
doppio strato di lipidi a cui è frapposto un singolo strato di proteine. Come in tutte le
cellule procariotiche, anche nei bifidobatteri i lipidi di membrana sono rappresentati
nella
quasi
totalità
da
fosfolipidi:
fosfatidilglicerolo,
difosfatidilglicerolo,
poligicerolfosfolipidi (Exterkate et al., 1971). Gli acidi grassi che più frequentemente
costituiscono i fosfolipidi delle membrane sono: l’acido miristico, l’acido palmitico,
l’acido stearico e l’acido oleico (Ballongue, 1993). Le proteine che costituiscono la
membrana non sono glicosilate e possono essere integrali o periferiche.
All’interno del citoplasma, la membrana plasmatica dà origine a numerose
invaginazioni, dette mesosomi, a cui sono stati attribuiti ruoli diversi e la cui
presenza sembra dipendere dalla specie e dalle condizioni di cultura.
2.2.4 Struttura del citoplasma
26
Come in tutte le cellule procariotiche, anche nel citoplasma nei bifidobatteri non
sono mai stati rinvenuti complicati sistemi di membrane paragonabili a quelli delle
cellule eucariotiche. Attualmente sono state rinvenute solo inclusioni che contengono
materiale nutritivo di riserva (polisaccaridi o polifosfati), proteine solubili, ribosomi
ed altre molecole di piccole dimensioni.
2.3
CARATTERISTICHE FISIOLOGICHE
2.3.1 Temperatura e pH
La temperatura ottimale di sviluppo dei bifidobatteri è compresa fra 37°C e 41°C,
con limiti a temperature inferiori a 20°C e superiori a 46°C (Gavini et al., 1991).
Il pH ottimale di sviluppo è compreso tra 5,0 e 7,0, con limiti a pH inferiori a 4,5 e
superiori a 8,0. I bifidobatteri sono microrganismi acido-tolleranti, ma non acidofili
(Scardovi, 1986).
2.3.2 Sensibilità all’ossigeno
I bifidobatteri sono microrganismi anaerobi anche se la loro sensibilità all’ossigeno
varia da specie a specie e da ceppo a ceppo. Anche se i meccanismi che sono alla
base dell’aerotolleranza non sono ancora del tutto noti, è stato ipotizzato che
l’ossigeno atmosferico possa interferire sullo sviluppo di alcuni ceppi o aumentando
il potenziale di ossido-riduzione (Rasic and Kurmann, 1983), o producendo H2O2,
inibitore
della
fruttosio-6-fosfato-fosfochetolasi,
l’enzima
indispensabile
ai
bifidobatteri per il metabolismo dei polisaccaridi. La tolleranza all’ossigeno può,
quindi, essere spiegata come la capacità che alcuni ceppi hanno di degradare H2O2 o
di impedirne la formazione.
2.3.3 Agenti antimicrobici (antibiotici e oli essenziali)
E’ stata saggiata la sensibilità agli antibiotici in 15 specie di bifidobatteri con il
metodo delle diluizioni (Matteuzzi et al., 1983). I composti più attivi sono risultati la
bacitracina, la clindamicina, il cloramfenicolo, l’eritromicina, la lincomicina, la
vancomicina e la penicillina G. Al contrario, i ceppi saggiati sono risultati resistenti
verso l’acido nalidixico, la kanamicina, la gentamicina, il metronidazolo e la
27
polimixina B. Neomicina, streptomicina e tetraciclina hanno dimostrato attività
variabile. Per l’isolamento e l’identificazione dei bifidobatteri in prodotti caseari è
risultato particolarmente efficace l’utilizzo della dicloxacillina (Sozzi et al., 1990).
Risultati incoraggianti sono stati, inoltre, ottenuti con l’uso di oli essenziali come
agenti antimicrobici verso dieci specie di bifidobatteri di origine umana. Da questo
studio è emerso che gli oli più efficaci sono risultati la cannella, il garofano, il
geranio, l’origano, l’origano di Spagna, la santoreggia e il timo (Biavati et al., 1997).
2.4. METABOLISMO
2.4.1 Fermentazione del glucosio
Nel genere Bifidobacterium il D-glucosio ed il D-galattosio non vengono fermentati
mediante la caratteristica via dei pentosi, ma mediante una via metabolica
caratteristica, detta via della fruttosio-6-fosfato-fosfochetolasi (F6PPK). Questo
enzima, considerato l’enzima chiave dei bifidobatteri, è in grado di scindere il
fruttosio-6-fosfato, derivato dalla demolizione del glucosio, in eritrosio-4-fosfato e
acetil-fosfato. Mediante trasformazioni enzimatiche successive, l’eritrosio-4-fosfato
così ottenuto può essere ulteriormente trasformato dalla transaldolasi e transchetolasi
in xilulosio-5-fosfato, che a sua volta darà origine ad acido lattico, mentre l’acetilfosfato darà origine ad acido acetico (Fig. 7).
28
2 glucose
2 ATP
2 ADP
fructose-6-P
2
1
fructose-6-P
Pi
F- 6 - PPK
erythrose-4-P
3ATP
3 ADP
glyceraldehyde-3-P
sedoheptulose-3-P
acetyl-P
2 acetyl-P
7
3 acetate
3
ribose-5-P
4
ribulose-5-P
1=
4=
6=
8=
2 Pi
xylulose-5-P
xylulose-5-P
2 glyceraldehyde-3-P
2 NAD
8
2 NADH 2
pyruvic acid
9
6
5
hexocinase and glucose-6-phosphate isomerase; 2 = transaldolase; 3 = transketola se;
ribose-5-phosphate isomerase; 5 = ribulose-5-phosphate epimerase;
xylulose-5-phosphate phosphoketola se; 7 = acetate kinase;
homofermentative pathway enzymes; 9 = L(+) lactate dehydrogenase
2 NADH 2
2 NAD
4 ADP
4 ATP
2 L(+) lactate
Fig. 7. Metabolismo del glucosio nei bifidobatteri
L’equazione globale della reazione può essere così schematizzata:
2 glucosio + 5 ADP + 5 P → 3 acetato + 2 lattato + 5 ATP
Nelle condizioni ottimali il rapporto teorico di acido lattico:acido acetico è 1,0:1,5 e
la resa energetica è di 2,5 molecole di ATP, per ogni molecola di glucosio degradata
(Scardovi and Trovatelli, 1965).
In certe condizioni, però, il bilancio della reazione può essere alterato per la
produzione di altri metaboliti. L’acido piruvico, per esempio, può non essere
totalmente convertito in acido lattico, ma dare origine ad acido formico e ad
acetilCoA, che verrà ulteriormente convertito in etanolo ed acido acetico (Lauer and
Kandler, 1976).
29
L’equazione globale di questa reazione alternativa può essere così schematizzata:
2 glucosio → 4 acetato + 1 etanolo + 2 formiato
Alcuni ceppi di bifidobatteri, inoltre, possono produrre scarse quantità di acido
succinico, mentre l’acido butirrico e l’acido propionico non vengono mai prodotti.
2.4.2 Fermentazione di carboidrati semplici, complessi e mucine
Oltre al glucosio, le diverse specie di bifidobatteri sono in grado di fermentare
numerosi altri zuccheri semplici e questa loro capacità è un test che potrebbe essere
utilizzato per la loro identificazione a livello di specie (Tabella 1).
Substrates
B
v
v
v
v
c
+
v
+
v
v
b
-
+
b
-
c
+
c
+
v
v
b
+
+
c
+
v
v
v
v
+
+
c
+
c
+
-
b
v
v
v
b
-
b
v
v
v
c
+
c
+
-
arabic
ghatti
guar
locust bean
v
v
v
b
v
-
C
porcine gastric mucin
b
+
c
+
v
amylopectin
amylose
arabinogalactan
pectin
xylan
dextran
Species
B. adolescentis
B. angulatum
B. bifidum
B. breve
B. catenulatum
B. denticolens
B. dentium
B. gallicum
B. infantis
B. inopinatum
B. longum
B. pseudocatenulatum
alpha-L-fucose
D-galactosamine
D-glucosamine
D-glucuronate
A
+
-
v
v
-
b
v
v
+
-
+
b
-
a
,Symbols: +,90% or more of strains are positive; -, 90% or more of strains are neg
b
c
v, 11-89% of strains are positive. , a few strains ferment this sugar; , a few strains
do not ferment this sugar. Substrates not fermented by any of the strains tested: a
bovine submaxillary mucin, chondroitin sulfate, alpha-D-fucose, D-galacturonate, g
karaya, heparin, hyaluronate,laminarin, ovomucoid, polygacturonate.
A, monosaccharides; B, polysaccharides; C, gums
Tabella 1. Degradazione di carboidrati complessi da parte di bifidobatteri.
30
Come si può osservare dalla Tabella 1, a parte il saccarosio, che viene fermentato da
tutte le specie fino ad ora identificate, alcuni altri zuccheri (raffinosio, fruttosio,
galattosio, maltosio), vengono metabolizzati da molte specie, mentre altri (sorbitolo,
melicitosio, gluconato, trealosio, mannitolo) solo da poche. Anche se non è ancora
stato dimostrato con certezza, sembra che queste differenze siano dovute al fatto che
alcune specie non possiedono i sistemi di trasporto specifici per tali zuccheri.
Oltre agli zuccheri semplici, molte specie di bifidobatteri sono in grado di fermentare
alcuni zuccheri complessi (Crociani et al., 1994). Questa capacità riveste una
notevole importanza se si pensa che le principali fonti di carboidrati degradabili
presenti nel colon sono generalmente polisaccaridi complessi, che vengono ingeriti
dall’uomo e dagli animali con la dieta. Da uno studio condotto sulla fermentazione
una serie di carboidrati semplici, complessi e gomme è stato possibile costruire una
chiave per l’identificazione di alcune specie del genere Bifidobacterium.
2.4.3 Enzimi
Oltre all’enzima F6PPK, che fino a qualche tempo fa si riteneva fosse esclusivo dei
bifidobatteri, mentre recentemente è stato riscontrato anche in altri generi, fra cui
Gardnerella vaginalis (Gavini et al., 1996), nei bifidobatteri sono state identificate
numerose glicosidasi, enzimi in grado di idrolizzare gli oligosaccaridi a
monosaccaridi: α e β-D-galattosidasi, α e β-D-glucosidasi, β-D-fruttofuranosidasi,
β-glucuronidasi,
N-acetil-D-glucosaminidasi,
α-L-arabinopiranosidasi,
arabinogalattanasi, α-D-neuraminidasi. Il complesso di questi enzimi non si esprime
in tutte le specie ed alcuni enzimi possono essere indotti ad esprimersi solo in
presenza dello specifico carboidrato. Studi sperimentali condotti da Crociani e coll.
hanno dimostrato che solo la specie Bifidobacterium bifidum è in grado di degradare
la mucina gastrica intestinale (Crociani et al., 1994). I bifidobatteri possiedono,
inoltre , numerose proteasi, che permettono loro di trasformare i polipeptidi in singoli
aminoacidi più facilmente utilizzabili. Scardovi et al. (1979) misero in evidenza che
la transaldolasi (che interviene nella via metabolica del fruttosio-6-fosfato) e la 6fosfogluconato-deidrogenasi (che interviene nella via metabolica degli esosi
monofosfati), presentando isoenzimi, sono molto importanti per lo studio
31
tassonomico del genere Bifidobacterium. La maggior parte delle specie di
bifidobatteri esaminate mediante elettroforesi su amido, infatti, possiedono una sola
banda per ciascun enzima e quando le bande sono molteplici, tale molteplicità è
risultata caratteristica della specie (Fig. 7).
+
a
Distance from the origin (cm)
1 - B. pseudocatenulatum B 1279T
2 - B. subtile F 395T
3 - B. pseudocatenulatum B 1880
20
4 - B. cuniculi RA 93T
5 - B. angulatum F 677T
6 - B. pseudolongum subsp. globosum RU 230
7 - B. breve S 1T
8 - B. boum RU 917T
9 - B. thermophilum RU 326T
15
10 - B. asteroides C 69
11 - B. asteroides C 33
+
Distance from the origin (cm)
b
1 - B. cuniculi RA 93T
20
2 - B. pseudolongum subsp. globosum RU 230
3 - B. subtile F 395T
4 - B. pseudocatenulatum B 1279T
5 - B. angulatum B 677T
6 - B. boum RU 917T
7 - B. bifidum ATCC 15696
8 - B. thermophilum RU 326
15
9 - B. indicum C 410T
10 - B. minimum F 392T
Fig. 7. Migrazione coelettroforetica su gel di amido di reference strains di
Bifidobacterium. (a), 11 ceppi dopo colorazione con 6-phosphogluconato
deidrogenasi e (b), 10 ceppi dopo colorazione con transaldolasi.
Studi compiuti sull’attività ureasica di 21 specie di bifidobatteri hanno dimostrato
che solo la specie B.suis manifesta una marcata attività ureolitica , mentre le specie
B.breve, B.magnum, B.pseudocatenulatum e B.subtile presentano questa attività solo
in un numero limitato di ceppi. Gli alti livelli di ureasi trovati anche in assenza di
urea hanno, poi, suggerito che questo enzima non possa essere indotto (Crociani and
Matteuzzi, 1982).
32
Hatanaka et al. (1987) hanno dimostrato che gli enzimi glutamato-deidrogenasi e
glutamina-sintetasi, riscontrati solo nelle specie B. adolescentis, B.bifidum, B. breve,
B. infantis, B. longum, B. pseudocatenulatum e B. thermophilum, possono essere
coinvolti nell’assimilazione dell’ammoniaca.
2.4.4 Fisiologia e metabolismo
I bifidobatteri sono microrganismi anaerobi, la cui sensibilità all’ossigeno cambia a
seconda delle specie ed anche all’interno delle diverse specie a seconda dei ceppi. I
bifidobatteri sono catalasi-negativi.
La temperatura ottimale per la crescita è 30-41°C, ma per le specie umane è 36-38°C.
Non si ha crescita sotto i 20°C, ad eccezione della specie B. psycroaerophilum,e
sopra i 46°C. La crescita a 45°C sembra discriminare fra le specie di origine umana
ed animale in quanto solo queste ultime sono in grado di crescere a questa
temperatura.
Il pH ottimale è fra 6.5 e 7.0 e non si ha crescita sotto pH 4.5. I bifidobatteri sono
infatti acido tolleranti ma non sono acidofili.
Il G+C% varia da 47 a 67%, con differenze fra le varie specie..
Una particolarità del genere Bifidobacterium è il suo metabolismo degli esosi
cosiddetto “fructose-6-phosphate shunt” o “bifidus shunt”. L’enzima chiave di
questo metabolismo è la fruttosio-6-fosfato fosfochetolasi, che scinde l’esoso fosfato
in eritrosio-4-fosfato e acetil-fosfato. Dal tetroso e dall’esoso fosfato attraverso la
successiva azione di transaldolasi e transchetolasi, sono formati i fosfati pentosi che
attraverso la scissione 2-3, producono acido lattico e addizionali quantità di acido
acetico nel rapporto teorico finale di 1.0:1.5. La formazione di acido formico ed
etanolo può alterare il bilancio della fermentazione. Le specie differiscono tra loro
per la produzione di quantità variabili di acetato, lattato, etanolo e formiato pur
crescendo nelle stesse condizioni.
I bifidobatteri utilizzano una grande varietà di mono e disaccaridi come sorgenti di
carbonio e sono in grado di metabolizzare anche i carboidrati complessi che
normalmente non sono digeriti nel piccolo intestino. Questa caratteristica conferisce
un vantaggio ecologico a chi colonizza l’intestino dove i carboidrati complessi sono
presenti o a causa della produzione da parte dell’epitelio dell’ospite, come al mucina,
33
o perché introdotti con la dieta. I bifidobatteri, infatti, possiedono un’ampia varietà di
enzimi che si adattano ai cambiamenti intestinali essendo inducibili in presenza delle
sostanze specifiche.
I bifidobatteri, inoltre, sono importanti per la produzione di vitamine nell’uomo
(Tabella 2).
B. breve
B. infantis
B. longum
B. bifidum
B. adolescentis
Tiamina (B1)
+
+++
+
+++
+
Riboflavina (B2)
+
+
+++
++
+
Piridossina (B6)
++
++
+++
+
++
Acido folico (B9)
+
+++
+
++
+
Cobalamina (B12)
+
++
+++
+
+
Acidi ascorbico (C)
++
++
+++
++
+
Acido niocotinico (PP)
+++
+++
+
+++
+
Biotina (H)
++
+++
++
++
++
Tabella 2. Produzione di vitamine in Bifidobacterium spp. (Ballongue, 1993).
2.4.5 Caratteristiche nutrizionali
Dal punto di vista nutrizionale, i bifidobatteri sono batteri molto esigenti. La maggior
parte delle specie sono in grado di utilizzare sali di ammonio come unica fonte di
azoto, ad eccezione delle specie B.choerinum, B.cuniculi, B.magnum e B.suis, che
richiedono azoto organico (Hassinen et al., 1951). In un terreno di coltura privo di
azoto organico è stato, però, riscontrato che alcune specie di bifidobatteri
(B.adolescentis, B.animalis, B.dentium, B.infantis, e B.thermophilum) sono in grado
di sintetizzare considerevoli quantità di aminoacidi, fra cui i principali sono: alanina,
valina e acido aspartico (Matteuzzi et al., 1978).
Fra i sali minerali richiesti dai bifidobatteri per lo sviluppo, i più importanti sono
magnesio, calcio, zinco, manganese e soprattutto ferro.
Per quanto riguarda le vitamine, la loro presenza nel mezzo di coltura non è
indispensabile alla crescita dei bifidobatteri, anche se esiste molta eterogeneità fra le
specie, poichè alcune di esse sono capaci di sintetizzare tiamina, acido nicotinico,
acido folico, piridoxina, vitamina B12 (Deguchi et al., 1985) e biotina (Noda et al.,
1994).
34
Alcune specie richiedono, poi, la presenza di fattori di crescita noti come fattori
bifidogenici. Attualmente i fattori bidogenici studiati su B.bifidum sono il lattulosio
(che però permette lo sviluppo anche di E.coli ed è attivo solo in vivo), il fattore BF1
(rappresentato da un insieme di oligosaccaridi presenti nel latte di molti mammiferi),
il fattore BF2 (che è un proteolisato specifico della caseina bovina), le glicoproteine
del colostro del latte e gli oligosaccaridi (raffinosio, inulina, frutto-oligosaccaridi,
oligosaccaridi di sintesi, gluco-oligosaccaridi) (Ballongue, 1993).
2.4.6 Terreni di coltura
Per isolare i bifidobatteri dai loro habitat naturali sono stati utilizzati, nel tempo,
numerosi terreni di coltura, contenenti componenti atte ad assicurarne lo sviluppo ed
il mantenimento.
Molte specie di bifidobatteri sono in grado di crescere in terreni di coltura complessi,
contenenti estratto di fegato (o carne), peptone, estratto di lievito, succo di
pomodoro, sangue di pecora (o cavallo), latte umano e sostanze che ne abbassano il
potenziale di ossidoriduzione. Una buona parte di questi ingredienti sono presenti nel
terreno BL, descritto da Ochi e coll. (Ochi et al., 1964) e nel terreno TPY
(Trypticase, Phytone, Yeast extract), descritto da Scardovi (Scardovi, 1986).
Nessuno di questi terreni è, però, selettivo e permette la crescita anche di altre forme
batteriche, fra cui streptococchi e lattobacilli, le cui colonie non sono distinguibili da
quelle dei bifidobatteri.
Per ovviare a queste problematiche, sono stati messi a punto diversi altri terreni, fra
cui possiamo ricordare quello denominato YN-6, impiegato da Resnik e Levin, per
isolare specie appartenenti al genere Bifidobacterium da ambienti acquatici naturali.
In questo terreno la selettività è data dalla neomicina, dall’acido nalidixico e dal
verde bromocresolo, aggiunti per inibire la crescita rispettivamente dei
microrganismi Gram-positivi e Gram-negativi (Resnik and Levin, 1981a). Qualche
tempo dopo, Mara e Oragui, modificarono il terreno YN-6, cercando di renderlo più
selettivo e lo denominarono YN-17 (Mara and Oragui, 1983). Presto, però ci si
accorse che entrambi questi terreni non risultavano particolarmente efficaci, perchè
inibivano una parte della popolazione vitale dei bifidobatteri e non consentivano una
35
facile identificazione delle loro colonie, per cui queste dovevano essere esaminate
una per una (Carrillo et al., 1985).
Sonoike et al. (1986), basandosi sul fatto che i bifidobatteri sono in grado di
metabolizzare frutto-oligosaccaridi e galatto-oligosaccaridi, svilupparono un terreno
contenente
oligosaccaridi
trans-galattosilati,
come
fonti
di
carbonio.
Successivamente Munoa e Peres, svilupparono un nuovo terreno selettivo, definito
Bifidobacterium Iodoacetate Medium 25 (BIM-25), utilizzando come agenti selettivi
antibiotici (acido nalidixico, polimixina B e kanamicina), acido iodoacetico (che
inibisce l’enzima gliceraldeide-3-fosfato-deidrogenasi) e 2,3,5-trifenil-tetrazoliocloride (TTC) (che permette di differenziare le colonie dei bifidobatteri da quelle
delle altre specie) (Munoa and Peres, 1988). Più di recente, Bereens ha proposto un
terreno la cui selettività non era più data dalla presenza di antibiotici, bensì dalla
contemporanea azione dell’acido propionico (0,5%) e dal basso pH (5,0).
Sperimentalmente, egli notò che queste condizioni incrementavano lo sviluppo dei
bifidobatteri, inibendo quello di microrganismi appartenenti ad altri generi (Bereens,
1990). La selettività del mezzo ottenuta da Bereens venne, poi, confermata da
Kaneko e coll. che, a loro volta, osservarono una buona crescita dei bifidobatteri ad
alte concentrazioni di acido propionico (Kaneko et al., 1994).
Più recentemente, Hartemink e coll., hanno descritto un nuovo terreno selettivo
denominato Raffinose-Bifidobacterium (RB), i cui componenti vennero scelti sulla
base delle proprietà fisiologiche dei bifidobatteri (Hartemink et al., 1996).
2.5. CARATTERISTICHE DEL GENOMA
2.5.1 Composizione delle basi del DNA
Il DNA dei bifidobatteri ha un contenuto in Guanina-Citosina (GC%) variabile da 55
a 67 Tm (valore ottenuto col metodo spettrofotometrico), tranne che per
B.inopinatum, che ha un GC% di 45 Tm (Crociani et al., 1996).
2.5.2 Ibridazione DNA-DNA
La classificazione del genere Bifidobacterium basata sulla percentuale di omologia
DNA-DNA di diverse specie è stata realizzata, per la prima volta, da Scardovi e coll.
36
(Scardovi et al., 1970). Questa tecnica, che ha permesso di suddividere una specie in
più specie o di raggruppare più specie in una sola ed è attualmente la più affidabile
dal punto di vista tassonomico, richiede che per appartenere alla stessa specie due
ceppi debbano presentare una percentuale di omologia DNA-DNA maggiore o
uguale al 70% (Wayne et al., 1987).
2.5.3 Plasmidi
Sono stati trovati plasmidi soltanto nelle specie B.asteroides, B.breve, B.indicum,
B.longum e B.globosum, anche se sembra che nessun carattere fenotipico sia
correlato alla loro presenza (Sgorbati et al., 1982). In nessuna delle altre specie di
bifidobatteri descritte successivamente sono mai stati riscontrati plasmidi.
2.6
ECOLOGIA
Le specie descritte fino ad oggi sono raggruppate in tre nicchie ecologiche:
- l’intestino umano, la vagina e la cavità orale;
- l’intestino animale;
- l’intestino degli insetti (intestino delle api e dei bombi);
Fra le 11 specie di Bifidobacterium trovate nelle acque reflue, sei sono isolate da
uomo e cinque da animali.
In generale, le specie di Bifidobacterium sono tipiche o dell’uomo o degli animali,
con l’eccezione di alcune specie isolate sia nel microbiota intestinale dei vitelli sia
nei neonati allattati al seno.
Le diverse specie che si trovano nel corpo umano mostrano un diverso adattamento
ai cinque habitat del corpo umano: intestino dei neonati, intestino degli adulti,
vagina, carie dentarie e stomaco ipocloridrico.
Numerosi studi hanno dimostrato una successione di specie di bifidobatteri dal
neonato, all’adulto e all’anziano (Fig. 3). La presenza di bifidobatteri nel tratto
gastrointestinale di adulti e bambini ha stimolato l’interesse di molti batteriologi e
nutrizionisti. Nel tratto intestinale di animali e uomo, i bifidobatteri coesistono con
una grande varietà di batteri, la maggioranza dei quali sono anaerobi obbligati, e
esiste una rete di interrelazioni gli uni con gli altri.
37
2.6.1. Habitat umano
I bifidobatteri colonizzano il tratto intestinale fin dalla nascita. Essi compaiono fra il
secondo e il quinto giorno e divengono dominanti una settimana dopo la nascita. I
bifidobatteri di origine umana sono stati ritrovati, principalmente, nelle feci di
infanti, di adulti (Biavati et al., 1984-1986), nella vagina umana (Crociani et al.,
1973) e nella cavità orale (Scardovi and Crociani, 1974). In questi habitat le specie
B.bifidum e B.longum sono ubiquitarie, mentre le altre sono presenti solo in alcuni
degli habitat studiati.
Essi sono anche normalmente presenti nella cavità orale dei bambini e possono
diventare successivamente organismi autoctoni della placca dentaria degli adulti. Le
specie isolate dalla cavità dentale in associazione con la carie sono: B. dentium, B.
inopinatum e B. denticolens (ora B. inopinatum e B. denticolens sono stati ridescritti
come Scardovia inopinata e Parascardovia denticolens). Non è chiaro se queste
specie svolgano un ruolo nell’eziologia della carie.
E’ possibile ritrovare particolari specie di bifidobatteri in periodi particolari della
vita, cioè esiste una successione di specie nell’arco della vita, a seconda dell’età. B.
breve e B. infantis sono specie tipiche del neonato, in particolare con allattamento al
seno. Nei bambini sotto i sette anni di età sono stati isolati anche B. longum e B.
bifidum. D’altra parte B. adolescentis è la specie caratteristica del microbiota
dell’adulto con B. longum, B. bifidum, B. catenulatum e B. pseudocatenulatum.
Con l’avanzare dell’età, il numero di bifidobatteri diminuisce significativamente,
probabilmente a causa della riduzione della secrezione gastrica negli anziani.
Esistono inoltre diversi fattori che influenzano il microbiota dei bifidobatteri come:
dieta, ambiente, stile di vita, stress ed anche malattie seguite da trattamenti
antibiotici.
Il tratto urogenitale femminile è colonizzato da una popolazione di microrganismi fra
cui i lattobacilli sono numericamente quelli dominanti. Essi favoriscono
l’abbassamento del pH e così favoriscono lo sviluppo di microrganismi acido
tolleranti come i lattobacilli e i bifidobatteri stessi (Biavati and Mattarelli, 2007).
L’elenco delle specie che sono state isolate da habitat umano è descritto nella Fig. 8.
38
2.6.2 Habitat animale ed extracorporeo
Numerose specie sono state isolate dall’intestino degli animali (coniglio, pollo,
vitello, suino e ratto) e dal rumine bovino (Scardovi et al., 1969) (Fig. 8). Studi sulla
distribuzione di queste specie, in questi habitat, hanno mostrato che alcune di esse
sembrano essere “ospite-specifiche”: B. cuniculi, B. magnum e B. saeculare, per
esempio, sono stati isolati unicamente dalle feci di coniglio (Scardovi and Zani,
1974), B. gallinarum e B. pullorum, unicamente dall’intestino di pollo (Trovatelli et
al., 1974) e B. longum subsp. suis, unicamente dall’intestino di suino (Matteuzzi et
al., 1971). Dall’intestino delle api sono state isolate unicamente tre specie: B.
asteroides e B. coryneforme (da Apis mellifera) e B. indicum (da Apis cerana e Apis
dorsata) (Scardovi and Trovatelli, 1969). Dall’intestino del bombo è stata isolata B.
bombi (Killer et al., 2009)
B. minimum e B. subtile che erano le uniche specie ad esser state isolate dalle acque
luride (Biavati et al., 1982), suggerendo la possibilità che i bifidobatteri si possano
sviluppare anche in nicchie ecologiche extracorporee, sono recentemente stae isolate
da intestino di maiale (Simpson et al., 2003) e dalla cavità orale dell’uomo
(Mantzourani et al., 2009).
Coniglio
B. cuniculi
B. magnum
B. saeculare
B. animalis subsp. lactis
Uomo
B. adolescentis
B. angulatum
B. bifidum
B. breve
B. catenulatum
B. dentium
B. gallicum
B. longum subsp. longum
B. longum subsp. infantis
B. pseudocatenulatum
B. scardovii
B. subtile
B. tsurumiense
Rumine bovino
B. boum
B. merycicum
B. ruminantium
Pollo
B. gallinarum
B. Pullorum
B. animalis subsp. lactis
Vitello
B. bifidum
B. breve
B. longum subsp. infantis
B. longum subsp. longum
Maiale
B. choerinum
B. psychraerophilum
Topo
B. longum subsp. suis
B. animalis subsp. animalis
B. minimum
B. thermacidophilum subsp. porcinum
Specie presenti in diversi habitat
B. pseudolongum subsp. globosum
B. pseudolongum subsp. pseudolongum
B. thermophilum
Apidae (api e bombi)
B. asteroides
B. bombi
B. coryneforme
B. indicum
39
Fig. 8. Le specie del genere Bifidobacterium e il loro habitat.
2.7 Specie probiotiche
I bifido batteri unitamente ai lattobacilli sono considerati generi probiotici. Rispetto
alle specie di Lactobacillus, le specie di bifidobatteri probiotiche sono meno
numerose (Tabella 3), e spesso le prove cliniche sono condotte con probiotici
multiceppo dove i bifidobatteri sono in combinazione con i lattobacilli.
SPECIE
HABITAT
B. bifidum
Human gastrointestinal tract
B. adolescentis
Human gastrointestinal tract
B. animalis subsp.lactis
Chicken gastrointestinal tract
B. breve
Human gastrointestinal tract
B. longum subsp. infantis
Human gastrointestinal tract
B. longum subsp. longum
Human gastrointestinal tract
Tabella 3. Elenco specie di bifidobatteri probiotici e loro habitat di origine.
I principali criteri che definiscono l’efficacia della potenzialità vantaggiosa dei
probiotici sono:
- vitalità e riproducibilità su larga scala
- vitalità e stabilità durante l’uso e il confezionamento
- capacità di sopravvivenza nell’ecosistema intestinale
- effetti benefici sull’ospite.
Il meccanismo probiotico che previene i disturbi gastrointestinali non è ancora
definitivamente o completamente conosciuto nonostante siano stati compiuti molti
studi negli ultimi vent’anni.
I principali meccanismi includono l’antagonismo verso batteri e virus nocivi, la
stimolazione dell’immunità locale e sistemica, e la modificazione dell’attività
metabolica del microbiota intestinale.
Le caratteristiche essenziali per un probiotico, sono:
40
- adesione alle cellule intestinali umane
- stabilità all’acidità gastrica e biliare
- produzione di sostanze antimicrobiche
- attività contro i batteri patogeni.
L’adesione alle cellule intestinali è il primo passo nel meccanismo di azione
probiotica. Infatti, i microrganismi probiotici sono testati per la loro capacità di
colonizzare l’epitelio intestinale e, sebbene il meccanismo molecolare di adesione
non sia conosciuto, le cellule batteriche idrofobe sono in grado di aderire alla
superficie del tessuto.
41
CAPITOLO 3
42
3. CARATTERISTICHE DELLA SPECIE OGGETTO DI STUDIO
3.1. BIFIDOBACTERIUM PSEUDOLONGUM SUBSP. GLOBOSUM
Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum (ex Bifidobacterium globosum)
(Scardovi et al., 1969; Biavati et al., 1982) è la specie del genere Bifidobacterium più
ampiamente diffusa negli animali ed è stata isolata da feci di suinetto, vitello, ratto,
coniglio e agnello; acque luride; rumine bovino e feci di bambino.
Lauer e Kandler hanno dimostrato che B. globosum presentava molte similitudini con
B.pseudolongum, in particolare per quanto riguardava la morfologia, il tipo di
mureina, la fermentazione dei carboidrati, il patterns elettroforetico degli enzimi, la
distribuzione ecologica e solo i profili delle proteine cellulari ottenute con la PAGE
erano distinguibili da quelli di B.pseudolongum (Lauer and Kandler, 1983).
Viste queste numerose similitudini Lauer e Kandler proposero di considerare queste
due specie identiche anche se, ancora oggi, esse sono classificate come indipendenti.
Recentemente, comunque, uno studio di confronto compiuto sulla composizione di
basi del DNA e sulle caratteristiche fenotipiche di ceppi appartenenti alle due specie
ha confermato questa similitudine ed è stata per loro proposta una nuova
classificazione in due sottospecie: B.pseudolongum sottospecie pseudolongum e
B.pseudolongum sottospecie globosum (Yaeshima et al., 1992).
Morfologicamente Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum presenta cellule
isolate, bastoncellari, sottili, incurvate, corte, con le estremità arrotondate e affusolate
(Fig. 9).
Fig. 9. B. pseudolongum subsp. globosum. Microfotografia al microscopio ottico.
Barra = 10 μm
43
Cresce, in infissione, in assenza di CO2 ed in aerobiosi solo in presenza di CO2.
Fermenta amido, arabinosio, destrina, fruttosio, galattosio, glicogeno, glucosio,
lattosio, maltosio, melibiosio, raffinosio, ribosio, saccarosio, xilosio; non fermenta
amigdalina,
cellobiosio,
esculina,
inositolo,
inulina,
mannitolo,
mannosio,
melecitosio, ramnosio, salicina, sodio-gluconato, sorbitolo, trealosio.
Non cresce in assenza di zuccheri fermentabili, nè in presenza di sodio malato al
4,5%, a 30°C.
Presenta un ottimo di temperatura fra 39°C e 40°C e non cresce nè a 20°C, nè a
46°C, il pH ottimale è fra 6,5 e 7,0 e non cresce a pH 8,0.
Il contenuto di G+C% del DNA è 64,1±0,7 (Tm) ed è una delle quattro specie di
bifidobatteri provvista di strutture plasmidiali (Sgorbati et al, 1982), la cui presenza
può essere messa in relazione con la capacità di Bifidobacterium pseudolongum
subsp. globosum di esprimere macromolecole di superficie potenzialmente coinvolte
nei meccanismi di adesione. Studi condotti sulla superficie cellulare di 147 ceppi di
Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum isolati da diversi habitat hanno,
infatti, dimostrato che circa il 40% di questi ceppi presentavano proteine di parete
(chiamate BIFOP = bifidobacterial outer protein), dal peso molecolare compreso fra
94,5 e 34 KDa, che non venivano espresse allo stesso modo su tutti i ceppi, ma
presentavano differenze in relazione all’habitat da cui i ceppi erano stati isolati
(Mattarelli et al., 1993).
44
CAPITOLO 4
45
L’ADESIONE MICROBICA
L’adesione alla mucosa intestinale è considerata un prerequisito per la
colonizzazione e un importante caratteristica relativa alla capacità dei ceppi
microbici di modulare il sistema immunitario. Pertanto l’adesione è uno dei criteri
principali richiesti ad un probiotico. Numerosi modelli di mucosa intestinale sono
stati utilizzati per lo studio dell’adesione dei probiotici: fra questi l’adesione al muco
intestinale umano è uno dei maggiormente studiati e presenta una buona correlazione
con latri modelli (Vesterlund, et al., 2005). Il livello di adesione dei probiotici e dei
patogeni manifesta una grande variabilità e dipende dal ceppo, della specie e dal
genere microbico (Collado et al., 2006, Aissi et al., 2001; Lee et al., 2003). La
capacità di adesione dei probiotici è in stretta relazione alò ceppo e e la presenza di
un’elevata capacità adesiva in un ceppo non sempre garantisce in vivo la persistenza
e l’effetto protettivo: sono quindi necessari studi in vivo in modelli animali e umani
(Gueimonde et al., 2006). Talvolta la combinazione di più ceppi probiotici promuove
migliori proprietà adesive (Collado et al., 2003).
4.1
Meccanismo generale dell’adesione
Gli ambienti naturali contengono un enorme numero di superfici a cui i
microrganismi possono aderire.
Dal punto di vista generale, l’adesione è un fenomeno vario e complesso, che
coinvolge sia la natura della superficie sulla quale i microrganismi andranno ad
aderire, che le caratteristiche fisiologiche, biochimiche e genetiche dei microrganismi
interessati. Siccome sia le cellule microbiche che le superfici da colonizzare sono
rivestite da uno strato di complesse macromolecole che si estendono nell’ambiente
circostante, perchè l’adesione si possa verificare occorre che le macromolecole di
entrambe le superfici possano interagire, ma queste interazioni sono possibili solo se
le cellule batteriche riescono a vincere le numerose forze repulsive che le separano
dalle superfici da colonizzare. Come si può osservare dallo schema 2 sottostante,
l’adesione dei microrganismi alle superfici consiste in diversi passaggi sequenziali ed
è notevolmente influenzato dalle condizioni ambientali.
46
Il primo dei passaggi che permettono l’adesione batterica è “l’avvicinamento” dei
microrganismi alle superfici da colonizzare (riquadro 1). Questo avvicinamento è
determinato dal movimento delle cellule batteriche, che può essere dovuto solo a
movimenti passivi (sedimentazione, moto Browniano), se i microrganismi sono
immobili, o anche a movimenti attivi (trasporto attivo, azione di flagelli o pili), se i
microrganismi sono mobili (van Loosdrecht et al., 1990). Per potere aderire alla
superficie, comunque, un certo numero di cellule microbiche devono riuscire a
superare una barriera energetica (energia di Gibbs), la cui intensità è dovuta
all’azione combinata di forze elettrostatiche (Ge), che dipendono dalla carica elettrica
del doppio strato ionico che si forma fra le superfici coinvolte e forze
elettrodinamiche di van der Waals (Ga), che dipendono dalla dimensione delle cellule
batteriche. Mentre le prime sono sempre repulsive, poichè entrambe le superfici sono
cariche negativamente, le seconde diventano attrattive quando emergono dalla
superficie appendici o macromolecole. L’abbassamento dell’intensità dell’energia di
Gibbs è favorito dal carattere ibrofobico della cellula microbica che, a sua volta,
dipende dal tipo di macromolecole presenti sulla superficie. Quando le superfici
cellulari hanno carattere idrofobico, generalmente, l’intenità dell’energia di Gibbs è
bassa e le cellule microbiche riescono a raggiungere la superficie da colonizzare più
agevolmente, mentre quando le cellule hanno carattere idrofilico, l’intensità
dell’energia di Gibbs è più alta e le cellule raggiungono la superficie da colonizzare
con maggiore difficoltà. Quando le cellule microbiche riescono ad avvicinarsi alla
superficie da colonizzare, la colpiscono e vi aderiscono, alcune solo per un attimo
(adesione reversibile), mentre altre vi rimangono attaccate per un maggiore periodo
di tempo (attaccamento irreversibile) (riquadri 2 e 3). La reversibilità o irreversibilità
dell’adesione è notevolmente influenzata sia dal tipo di superficie, che dalle forze
coinvolte. L’adesione reversibile, infatti è favorita se le superfici sono liscie e sono
coinvolte solo forze aspecifiche, a corto raggio, relativamente deboli (interazioni
idrofobiche); se le superfici, invece, sono irregolari vengono coinvolte sia forze
aspecifiche che forze specifiche, rappresentate da un saldo legame fra
macromolecole presenti sulla superficie dei microrganismi, cioè ligandi, e
macromolecole presenti sulla superficie da colonizzare, cioè recettori, è favorita
l’adesione irreversibile (Ofek et al., 1978; Verran et al., 1991).
47
L’instaurarsi dei legami irreversibili permette alle cellule batteriche di aderire sempre
più saldamente alle superfici, determinandone la colonizzazione vera e propria,
nell’ambito della quale le cellule batteriche continuano a crescere, si moltiplicano e
producono esopolimeri che si estendono all’esterno delle cellule, formando una
matrice di fibre che porta alla formazione di microcolonie e biofilm (Costerton et al.,
1987).
4.2 Macromolecole di superficie coinvolte nell’adesione
L’adesione reversibile dei microrganismi alle superfici diventa irreversibile quando
si instaurano specifiche interazioni ligando-recettore fra macromolecole presenti
sulla superficie delle cellule batteriche (proteine, acidi lipoteicoici e polisaccaridi) e
macromolecole presenti sulla superficie da colonizzare.
Studi sperimentali condotti da Selinger e Reed hanno dimostrato che, affinchè i
legandi possano riconoscere il loro specifico recettore, non basta che essi siano
sintetizzati dalle cellule microbiche, ma occorre anche che siano espressi in una
configurazione accessibile ai recettori (Selinger and Reed, 1979).
Le proteine coinvolte come legandi nei processi di adesione irreversibile vengono
generalmente definite adesine. Nei batteri Gram-negativi esse sono comunemente
localizzate a livello delle fimbrie, che sono appendici filiformi, brevi e sottili, che si
estendono dalla superficie della cellula batterica verso le superfici da colonizzare
dove riconoscono specifici recettori generalmente costituiti da carboidrati o
glicoproteine, mentre nei batteri Gram-positivi, che non possiedono queste
appendici, sono localizzate all’esterno della cellula batterica e possono essere
proteine di membrana o proteine che vengono secrete dagli stessi batteri e che
rimangono associate alla superficie cellulare.
Le caratteristiche strutturali dei legandi proteici identificati fino a questo momento
sono stati studiati utilizzando tecniche di biologia molecolare. I risultati di questi
studi hanno dimostrato che l’espressione di queste proteine è controllata
geneticamente e che tutte le adesine presentano all’estremo N-terminale più o meno
la stessa sequenza aminoacidica (Jones and Isaacson, 1983). Le adesine, inoltre, sono
risultate composte da un numero variabile di subunità identiche, disposte in sequenza
e unite fra loro da legami idrogeno ed idrofobici. Solitamente esse sono inserite in
48
determinati punti della parete cellulare o della membrana plasmatica, conferiscono
proprietà idrofobiche alle cellule e durante l’adesione irreversibile si attaccano a
specifici recettori presenti sulla superficie da colonizzare.
Fra i batteri Gram-negativi, le fimbrie del tipo 1 di Escherichia coli sono attualmente
le più studiate: esse appaiono come sottili strutture tubulari, formate da subunità
proteiche dal peso molecolare relativamente basso (20kDa), disposte con simmetria
elicoidale a formare una struttura cilindrica. Oltre ad E.coli, le proteine fimbriali
sono state identificate anche in alcuni ceppi di molti altri batteri Gram-negativi fra
cui Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria
gonorrhoeae. Nella maggior parte dei batteri Gram-positivi e solo in un limitato
numero di batteri Gram-negativi, invece, sono stati identificati ligandi proteici
afimbriali, rappresentati da proteine di membrana. Fra i batteri Gram-negativi,
ligandi proteici di questo tipo, la cui espressione è indotta o repressa dalle diverse
condizioni di coltura sono stati identificati in alcuni ceppi di E.coli enteroaggreganti
(Spencer et al., 1998) mentre fra i batteri Gram-positivi sono stati identificati in
alcuni ceppi di Staphylococcus aureus, in ceppi di molte specie di Streptococcus
(S.pyogenes, S.pneumoniae) e in alcuni ceppi di Lactobacillus (L.acidophilus LB,
L.casei GG) e Bifidobacterium. Questi ligandi proteici riconoscono generalmente
recettori costituiti da fibrinogeno, fibronectina o carboidrati.
Oltre ai ligandi proteici, l’adesione irreversibile può essere determinata anche da
altre macromolecole sempre presenti sulla superficie esterna delle cellule
microbiche. In alcuni generi Gram-positivi, infatti, sono stati identificati come
ligandi gli acidi lipoteicoici. Queste molecole sono costituite da ripetizioni di
glicerol-fosfato e da catene laterali che possono contenere alanina, glucosio o da altre
molecole diverse e sono ancorate alla superficie cellulare da legami covalenti con i
glicolipidi o le proteine della membrana. Rispetto alle proteine non subiscono
particolari variazioni strutturali al variare delle condizioni ambientali e sono
considerati i componenti responsabili dell’idrofobicità di superficie di nimerose
specie microbiche, fra cui gli streptococchi appartenenti al gruppo A (S.salivarius,
S.mutans) (Ofek et al., 1983), in alcuni ceppi di lattobacilli e bifidobatteri.
Nei batteri Gram-negativi, dove gli acidi lipoteicoici mancano, altre macromolecole
con funzione di ligandi sono state identificate nei polisaccaridi che si dispongono in
49
strati sovrapposti all’esterno della cellula batterica. L’adesione mediante carboidrati
è stata identificata in ceppi mucosi di Pseudomonas aeruginosa nei quali, quando
non sono presenti le fimbrie, l’adesione è assicurata proprio dall’esopolisaccaride
mucoso del glicocalice, in alcuni ceppi di Bacteroides fragilis, oltre che in batteri
Gram-positivi come Lactobacillus (alcuni ceppi di L.jensenii, L.plantarum).
4.3
LIGANDI DI SUPERFICIE NEI BIFIDOBATTERI
I bifidobatteri sono uno dei gruppi microbici più rappresentativi del tratto
gastrointestinale dell’uomo e degli animali, ma per colonizzare questo habitat
devono essere in grado di interagire con la superficie intestinale. Pur esistendo
ancora pochi studi sperimentali condotti fino a questo momento sui meccanismi e le
strutture coinvolte sull’adesione dei bifidobatteri, tutti i dati fino ad ora raccolti
dimostrano che non tutti i ceppi appartenenti ad una determinata specie manifestano
capacità adesive ma quei ceppi in grado di aderire lo devono a ligandi di natura
proteica o ad acidi lipoteicoici. Ligandi proteici, che possono essere presenti sulla
superficie delle cellule e/o nel mezzo di coltura, sono stati identificati da Bernet e
coll. in alcuni ceppi di bifidobatteri di origine umana (Bifidobacterium breve,
B.longum, B.bifidum e B.infantis). Questi studi hanno dimostrato che ceppi diversi
appartenenti alla stessa specie esprimono capacità adesive diverse nei confronti delle
cellule intestinali della linea Caco-2 e HT29MTX (Bernet et al, 1993).
Successivamente Fujiwara e coll. hanno identificato fattori proteici presenti nel
terreno di coltura di alcuni ceppi di B.longum, B.breve, B.infantis e B.bifidum che
permettono a questi ceppi di aderire a recettori presenti sulla mucosa intestinale
umana (Fujiwara et al., 1997); Mukai e coll hanno dimostrato la presenza di proteine
del peso molecolare di 36 kDa e 52 kDa sulla superficie di B.adolescentis (ceppo
BB119), ritenute responsabili dell’adesione (Mukai et al, 1997) e Wagner e coll.
hanno studiato la capacità di B.animalis di colonizzare e persistere nel tratto
gastrointestinale di ratti sempre mediante ligandi proteici (Wagner et al., 1997). Altri
studi compiuti sul coinvolgimento dei ligandi proteici nell’adesione dei bifidobatteri
sono stati effettuati da Fontaine e coll. che hanno dimostrato che B.bifidum
(DSM20082) possiede glicosidasi in grado di riconoscere specifiche glicoproteine
presenti nel muco (Fontaine et al., 1997). Più recentemente Perez e coll. hanno
50
studiato la capacità adesiva di alcuni ceppi di origine umana dimostrando che in
molti casi l’adesione era correlata alla capacità autoagglutinante di questi ceppi:
ceppi
con
una
buona
capacità
autoagglutinante
erano
anche
positivi
all’emoagglutinazione e manifestavano un’alta idrofobicità di superficie. Anche in
questo caso il trattamento delle cellule con enzimi proteolitici fa perdere le proprietà
adesive, dimostrando che i legandi sono anche per questi ceppi di natura proteica
(Perez et al., 1998).
Il possibile ruolo degli acidi lipoteicoici nell’adesione è stato studiato da Op den
Camp e coll. in B.bifidum subsp pennsylvanicum. I dati ottenuti da questo studio
suggeriscono che sia le proteine che gli acidi lipoteicoici siano coinvolti
nell’incrementare l’idrofobicità delle cellule e quindi l’adesione alle cellule epiteliali
del colon umano (Op den Camp, 1985a).
4.4 EFFETTO DELLE CONDIZIONI AMBIENTALI SULL’ESPRESSIONE
DELLE PROTEINE
I microrganismi (Brown et al., 1990) sono in grado di rispondere ai cambiamenti
delle condizioni ambientali, modificando la struttura e la composizione della loro
cellula. I fattori ambientali che maggiormente inducono una risposta da parte dei
microrganismi sono variazioni nella disponibilità di nutrienti, nel pH, nella
temperatura e nella concentrazione di ossigeno dell’ambiente naturale o del mezzo di
coltura (Fletcher, 1984).
Fra i vari fattori abiotici sopracitati, la temperatura è sicuramente quello che
maggiormente condiziona la vita e lo sviluppo dei microrganismi, poichè la loro
temperatura riflette direttamente quella dell’ambiente da cui sono circondati.
Eccessivi aumenti della temperatuta ambientale possono risultare estremamente
dannosi per i microrganismi, poichè hanno ripercussioni sulla componente proteica
delle cellule, provocando la denaturazione degli enzimi, dei vettori di trasporto, delle
altre proteine cellulari, oltre che sulla membrana plasmatica. Il sorprendente
rinvenimento di microrganismi in grado di crescere e riprodursi in ambienti a
temperature elevatissime, richiede che le loro proteine e membrane rimangano stabili
al calore e questa stabilità può essere la conseguenza di successivi cambiamenti
mutazionali della struttura primaria delle proteine cellulari. A differenza di quanto
51
succede alle alte temperature, alle basse temperature le proteine risultano tutte
soggette a modificazioni conformazionali, dovute all’indebolimento dei legami
idrofobi che determinano la loro struttura terziaria, che le rendono meno stabili.
52
CAPITOLO 5
53
I PROBIOTICI
5.1
IL TERMINE “PROBIOTICO”
Il termine ‘probiotico’ deriva dal greco: “pro-bios” che significa ‘per la vita’ (a
beneficio della vita). Gli antenati dei batteri probiotici sono stati studiati per la prima
volta da E. Metchnikoff (1845-1916) (Fig. 10), un personaggio importante nel campo
della scienza.
Fig. 10. E. Metchnikoff
Nel 1882 egli ha lasciato il suo paese d’origine, l’Ucraina, per lavorare a Parigi
all’Istituto Pasteur. Ha incentrato i suoi studi sui processi d’invecchiamento ed ha
pubblicato lavori sulle sue idee riguardanti l’intestino crasso come fonte di sostanze
tossiche (ammine, ammonio), le quali danneggerebbero il sistema nervoso e
vascolare nel momento in cui sono assorbite dall’intestino e circolano nel sangue. I
microrganismi della flora ‘putrefattiva’ (batteri che digeriscono le proteine), che
vivono nell’intestino crasso sono i produttori di quelle sostanze tossiche e sono
responsabili della “autointossicazione”. Metchnikoff ha sottolineato l’importanza di
un corretto bilanciamento dei vari tipi di microrganismi nell’intestino crasso ed ha
notato che latti fermentati con batteri acido lattici possono inibire la crescita dei
batteri ‘putrefattivi’. Egli ha posto in rilievo in generale l’azione positiva di quei
prodotti caseari nella microflora intestinale dell’uomo. Metchnikoff ha supposto nel
suo trattato “The prolongation of life” (“Il prolungamento della vita”) (Metchnikoff,
1908) che la longevità dei pastori del Caucaso era attribuibile in parte al consumo di
elevate quantità di latte fermentato, grazie alla presenza di lattobacilli. Le scoperte
54
riguardanti il metabolismo di questi batteri e la loro azione antagonistica nei
confronti di microrganismi nocivi spiegano il forte interesse in entrambi i campi,
scientifico e commerciale. Nel 1906 una società francese “Le Ferment” ha iniziato a
commercializzare un latte fermentato chiamato “Lactobacilline”. Questo prodotto
caseario conteneva i ceppi batterici che Metchnikoff aveva selezionato durante le sue
ricerche; qualche anno più tardi il termine “youghourt” apparse nel dizionario “Petit
Larousse”. Oggi possiamo dire che Metchnikoff è stato praticamente il precursore
dell’era dei probiotici, dei prebiotici e dei cibi funzionali. Grazie alle sue ricerche, la
conoscenza dei fermenti lattici si è diffusa in occidente. I fermenti lattici sono
preparazioni contenenti batteri vivi che riequilibrano il microbiota intestinale. Dal
punto di vista scientifico, da questi prodotti ci spostiamo nel concetto della probiosi,
che è un insieme di azioni benefiche per l’intestino grazie all’attività di colture
batteriche vive selezionate.
La definizione di “probiotico” ha subito alcune variazioni, da quando è stata
utilizzata, la prima volta, da Lilly e Stillwell, per descrivere sostanze prodotte da un
organismo, che permettevano lo sviluppo di altri organismi Lilly and Stillwell,
1965). Successivamente, Parker utilizzò questo termine per descrivere organismi e
sostanze che avevano effetti benefici sull’ospite e contribuivano al mantenimento del
suo equilibrio microbico intestinale (Parker, 1974), ma questa definizione presto si
rivelò non adatta, perchè con il termine “sostanza” potevano essere intesi anche
supplementi chimici come gli antibiotici. Nel 1989, allora, Fuller ridefinì i probiotici
come “supplementi alimentari microbici vivi, che agiscono beneficamente
sull’ospite, con il miglioramento del suo equilibrio microbico intestinale” (Fuller,
1989), sottolineando l’importanza della vitalità ed escludendo dalla definizione gli
antibiotici ed i composti ad essi analoghi. Ancora più di recente, Huis in’t Veld e
Havenaar hanno ridefinito i probiotici come “mono- o pluricolture di microrganismi
vitali, che quando vengono somministrati all’uomo o agli animali apportano loro
benefici, migliorando le proprietà della microflora indigena” (Huis in’t Veld and
Havenaar, 1991).
Sulla base di questa definizione e delle conoscenze acquisite circa le complesse
attività della micropopolazione intestinale, la comunità scientifica internazionale ha
55
recentemente stabilito quali debbano essere i criteri di selezione per la scelta di
microrganismi ad uso probiotico:
1. devono potere essere preparati in modo utilizzabile e su larga scala;
2. devono rimanere vitali e stabili durante l’uso e l’immagazzinamento;
3. devono essere in grado di sopravvivere al passaggio attraverso il tratto
gastrointestinale, resistendo all’azione degli acidi gastrici e biliari, per arrivare
nell’intestino in numero sufficiente (106 CFU/gr) (Samona and Robinson, 1991);
4. devono aderire alla mucosa intestinale, in modo da persistere nel grosso intestino
almeno il tempo sufficiente per potere esercitare i propri effetti benefici sull’ospite
(O’Sullivan, 1992);
5. non devono avere effetti tossici.
Per l’uomo vengono normalmente utilizzati come probiotici i lattobacilli
(Lactobacillus acidophilus, L.casei e L.delbruekii), da soli o in coltura con altri
batteri, come i bifidobatteri (Bifidobacterium animalis, B.adolescentis, B.bifidum,
B.breve, B.longum, B.infantis) e gli streptococchi (Streptococcus salivarius subsp.
thermophilus, S.lactis) (Tamine et al., 1995).
Anche se sono ancora pochi gli studi relativi alla farmaco-cinetica dei probiotici, la
maggior parte di questi mostra che i batteri dello yogurt (Lactobacillus delbrueckii
spp bulgaricus e Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) hanno una limitata
resistenza ai succhi gastrici e alla bile, mentre ceppi di Lactobacillus acidophilus e
Bifidobacterium spp. sono più resistenti (Marteau et al, 1993).
Il primo a suggerire l’effetto probiotico dei bifidobatteri fu Tissier, che
raccomandava la somministrazione di questi microrganismi a infanti affetti da
diarrea, affermando che i bifidobatteri inibissero l’azione dei batteri putrefattivi
responsabili dei disordini intestinali (Tissier, 1906). Significativo è, poi, il fatto che
bifidobatteri ingeriti con prodotti alimentari vengano rinvenuti nelle feci di volontari,
anche qualche tempo dopo avere interrotto la somministrazione, dimostrando che
essi sono in grado di persistere nel tratto gastrointestinale per un periodo più lungo
che non il normale transito (Biavati et al., 1995).
5.2
EFFETTI BENEFICI DEI PROBIOTICI
56
• Miglioramento della morfologia e la fisiologia delle pareti del tratto digestivo: i
bifidobatteri sembrano influenzare la maturazione ed il turnover degli eritrociti e
favorire la degradazione ed il ricambio delle mucine intestinali (Ballonge, 1993).
Inibizione dello sviluppo di batteri patogeni indesiderati: grazie alla loro presenza
nell’intestino, i bifidobatteri sono in grado di prevenire la colonizzazione di altri
batteri patogeni, enterici, indesiderati (Salmonella typhimurium, Escherichia coli,
Shigella, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Campylobacter jejuni e
Listeria) (Gibbson and Wang, 1994). I meccanismi mediante i quali i bifidobatteri
possono esplicare tale inibizione possono essere: la competizione per i nutrienti e/o
per i recettori presenti sulla superficie delle cellule da colonizzare (Rasic, 1983) o la
produzione di composti antimicrobici primari (acido acetico e lattico, con piccole
quantità di acido formico) e secondari (H2O2 e batteriocine) con azione inibitoria.
Studi sperimentali hanno evidenziato che Bifidobacterium breve e B.longum
somministrati oralmente, possono avere effetti benefici nel trattamento della diarrea
nei bambini, la diarrea del viaggiatore e la diarrea indotta da una terapia antibiotica
(Salminen et al., 1991)
• Miglioramento della tolleranza al lattosio contenuto nei prodotti del latte.
L’intolleranza al lattosio può essere dovuta sia ad una mancanza dell’enzima ###galattosidasi, nella mucosa intestinale, che ad una riduzione dell’attività dell’enzima
lattasi. Studi sperimentali hanno dimostrato che prodotti alimentari a base di latte
fermentato possono essere facilmente digeriti da individui intolleranti al lattosio, per
via della parziale fermentazione di questo zucchero ad opera delle galattosidasi
microbiche, che suppliscono alle carenze dell’ospite (Jiang and Savaiano, 1997).
Inoltre, l’utilizzo di preparati a base di bifidobatteri da parte di pazienti affetti dalla
malattia di Crohn, in cui si denotano bassi livelli di β-D-galattosidasi, hanno
evidenziato miglioramenti nel quadro clinico (Faver et al., 1997).
• Attività antitumorale. Le azioni antimutagenica o anticarcinogenica dei
bifidobatteri possono essere dovute, sia all’inibizione degli enzimi che convertono i
procarcinogeni in carcinogeni (β-glucuronidasi, azoreduttasi e nitroreduttasi) (Goldin
and Gorbach, 1984), che alla sintesi di specifici metaboliti che inibiscono i
procarcinogeni (nitriti, nitrosamine e amine eterocicliche) assunti con la dieta (Chung
57
et al., 1992; Renner and Munzner, 1991). Pur essendoci molti studi sperimentali
condotti su animali che dimostrano l’effetto dei bifidobatteri sulla rimozione dei
procancerogeni: B.longum, per esempio, è in grado di ridurre lo sviluppo di tumori al
fegato nei ratti (Singh et al., 1997), i dati clinici disponibili sull’uomo sono ancora
troppo limitati.
• Riduzione dei livelli di colesterolo nel sangue. L’effetto dei bifidobatteri
sull’abbassamento del livello del colesterolo nel sangue è ancora oggi difficile da
dimostrare con certezza. L’ipotesi attualmente più accreditata è quella che la
riduzione del livello del colesterolo nel sangue sia dovuta alla produzione da parte
dei bifidobatteri di acidi organici, che inibiscono la sintesi del colesterolo. Studi
sperimentali compiuti in vitro hanno, inoltre, dimostrato che alcuni ceppi di
bifidobatteri sono in grado di deconiugare gli acidi biliari, ma questi studi non hanno
ancora avuto conferme in vivo (Gilliland, 1990).
• Stimolazione del sistema immunitario dell’ospite. I bifidobatteri sembrano in
grado di stimolare il sistema immunitario dell’ospite agendo sui macrofagi, sui
linfociti, sulle immunoglobuline A e sull’interferone-γ (Fernandes et al., 1990;
Perdigon et al., 1990; de Simone, 1986).
• Sintetisi di vitamine del complesso B (tiamina, riboflavina, vitamina B6 ) e K,
aminoacidi (alanina, valina, acido aspartico e treonina) e acido lattico solo nella
forma L(+).
• Aumento dell’assorbimento del calcio.
58
CAPITOLO 6
59
MATERIALI e METODI
6.1
Ceppi utilizzati
Nell’ambito di questo lavoro sono stati utilizzati ceppi appartenenti alla specie
Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum, isolati dal tratto gastrointestinale
del rumine bovino: Ru 809/1, plasmide positivo e Ru 809/8, plasmide negativo.
6.2. Terreni di coltura
I ceppi di Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum sono stati coltivati
utilizzando il substrato base Tryptone-Phytone-Yeast Extract liquido (TPY),
suggerito da Scardovi (1986) così modificato: 10 g/l triptone (Triptone Peptone Bios
D-Biolife); 5g/l peptone (Soy Peptone-Biolife); 15 g/l glucosio; 2,5 g/l estratto di
lievito (Biolife); 0,5 ml/l Tween 80 (Merck); 0,5 g/l cisteina cloridrata (Merck);
1,5g/l K2HPO4 (Merck); 0,5 g/l MgCl2 x 6H2O (Merck). Il substrato è stato portato
a pH finale 6,5 e sterilizzato a 110°C per 30’.
6.3 CONDIZIONI DI INCUBAZIONE
Le colture dei ceppi di bifidobatteri sono state incubatea 37°C in giare per
anaerobiosi BBL Gas Pack (Bekton Dickinson Microbiology System, Cokeyville
MD, USA), con il sistema Anaerocult A (Merck), per 24 ore.
Le colture di E.coli sono state incubate in termostato a 37°C, in leggera agitazione.
6.4 CONSERVAZIONE DELLE COLTURE
Per potere disporre dei ceppi per l’intera durata della ricerca, essi sono stati
conservati a -135°C. Le colture sono state centrifugate a 12000 x g per 10’, private
del sopranatante e risospese in 1ml di crioprotettore così composto: per 100ml di
soluzione: 10g skim milk (Biolife); 3g lattosio; 0,3g estratto di lievito (Biolife);
sterilizzato a 110°C per 30’. Dopo la sterilizzazione è stata aggiunta al crioptotettore
la vitamina C (10%). Le sospensioni cellulari sono state dispensate in cryovials sterili
da 3ml (1ml per ciascuno) e conservate a -135°C.
60
Oltre al congelamento è stata assicurata anche la conservazione a lungo termine,
mediante liofilizzazione. Come per la conservazione a -135°C, le colture sono state
centrifugate, private del sopranatante e risospese in 1ml dello stesso tipo di
crioprotettore. Le sospensioni cellulari sono state dispensate in fialette di vetro, che
sono state mantenute a -135°C fino al momento della liofilizzazione. Questa è stata
eseguita mediante uno strumento Speedi VAC Model 5PS Edwards High Vacuum
LTD.
Al bisogno, la coltura congelata o liofilizzata, è stata utilizzata inoculando
sterilmente una piccola quantità di preparato in un tubo con 10ml di substrato
liquido, poi messo ad incubare.
6.5 DOCUMENTAZIONE FOTOGRAFICA
I preparati fotografici sono stati allestiti prelevando 1 ml di liquido colturale, che poi
è stato centrifugato in “eppendorf”. Il deposito cellulare è stato adeguatamente
spatolato sulla superficie di un vetrino copri-oggetto in una microgoccia di acqua
distillata. I preparati sono stati fissati mediante tre successivi rapidi passaggi sulla
parte più alta di una fiamma ad alcool. Le microfotografie sono state ottenute
mediante un apparato fotografico Contax, collegato al microscopio, utilizzando una
pellicola 35mm AGFA COPE Repoid A.H.U. Le stampe sono state fatte su carta
ILFO SPEED RCIS5 1M RC de Luxe (ILFORD).
6.6 CRESCITA ALLE DIVERSE CONDIZIONI AMBIENTALI
6.6.1 Coltura a pH costante
Colture da 100 ml di TPY con 0.5% di glucosio cresciute per 12 ore sono inoculate
in 1000 ml di TPY sempre allo 0.5% portate a pH 4.6, 5.5, 6.0 addizionandole con 6
ml, 3.5 ml, e 2.0 ml, rispettivamente, di acido lattico al 30%. Viene allestita anche
una coltura da 1000 ml di TPY con 0.5% di glucosio a pH 7.5 portato a pH con
NaOH 1M. Le colture sono state incubate a 37°C per 10 ore mantenendo il ph
iniziale costante tramite addizione di NaOH 1M mediante pH control Unit LKB
(Biotech Lp-100-3)che regolava l’immisisione di NaOH 1M in base al’aumento di
acidità prodotta durante la crescita batterica. Ogni coltura è stata addizionata anche di
61
2.5 ml di NaHCO3. per favorire l’anaerobiosi. Le colture sono mantenute in debole
agitazione per favorire la miscelazione omogenea della NAOH addizionata. Al
termine dell’incubazione le colture sono rapidamente raffreddate in bagno di
ghiaccio e centrifugate a 2000 x g per 10 min. Le cellule sono state lavate in BRIDE
e sonicate per ottenere gli estratti cellulari (vedi 6.7 Preparazione pareti).
6.6.2 Coltura in NaCl.
E’ stato utilizzato il substrato TPY che contiene una quantità di NaCl pari allo
0.12%. TPY (tryptone cod. N. 412290; soy peptone cd. N. 412325, yeast extract cod.
N. 412220, Biolife s.r.l. Milano, Italy). Le cellule di Ru 809/1 e Ru 809/8 sono state
coltivate in TPY addizionato di quantità crescenti di NaCl (0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,
1.5, 1.75, 2.5, 3.2, 6.4 %) a 37°C in anaerobiosi. Lo sviluppo delle colture è stato
valutato mediante lettura spettrofotometrica.
6.6.3 Coltura in TPY diluito
Le cellule sono state coltivate in TPY diluito 1:10. 2:10,3:10, 4:10, 6:10.
6.6.4 Coltura in Desferal
6.6.5 Coltura a diverse concentrazioni di glucosio.
I ceppi sono stati coltivati in 1l di TPY addizionato con 0.25 ml di NaHCO3 al 10%
e con diverse concentrazioni di glucosio in diverse concentrazioni di glucosio (0.1,
0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.25, 1.5, 3.6, 5.4, 7.2,9.0, 10.8, 12.6, 16.2, 18.0 e 36.0 %).
L’inoculo iniziale corrispondente al 10 % derivava da una coltura già cresciuta nello
zucchero corrispondente. Le beute sono poi state incubate a 37°C per 24 ore. La
coltura nei diversi zuccheri è stata ripetuta per 3 volte.
6.6.6 Coltura in diversi zuccheri
I ceppi sono stati coltivati in 1l di TPY addizionato con 0.25 ml di una soluzione di
NaHCO3 al 10% (sterilizzata per filtrazione)e con i diversi zuccheri (fruttosio,
galattosio, glucosio, lattosio, maltosio, melibiosio, raffinosio, ribosio, saccarosio e
xilosio) all’1.5 %. L’inoculo iniziale corrispondente al 10 % derivava da una coltura
62
già cresciuta nello zucchero corrispondente. Le beute sono poi state incubate a 37°C
per 24 ore. La coltura nei diversi zuccheri è stata ripetuta per 3 volte.
6.7 Preparazione degli estratti cellulari totali, degli estratti cellulari
citoplasmatici e delle pareti cellulari.
Le cellule dei campioni di Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum, derivate
da almeno 0,5 l di coltura cellulare liquida, cresciute alle diverse temperature, sono
state raccolte per centrifugazione e lavate per tre volte in tampone fosfato salino
(PBS: Na2HPO4 x 12 H2O 8mM, KH2PO4 2mM, NaCl 0,14mM, KCl 3mM, pH 7,0).
Le cellule sono, poi, state sospese sempre in PBS, nel rapporto di 1gr di cellule per
2ml di tampone e sono state rotte, utilizzando un sonicatore Braun Labsonic 1510,
con tre colpi di 40 secondi, intervallati da pause di 120 secondi. La rottura delle
cellule è stata verificata mediante osservazione microscopica. L’estratto cellulare
sonicato è, poi, stato suddiviso in tre frazioni di circa 1ml ciascuna: una frazione è
stata conservata come estratto cellulare totale; la seconda frazione è stata centrifugata
a 55000 x g, per 30’ ed è stata conservata come estratto cellulare citoplasmatico; la
terza frazione è stata diluita 1:4 in PBS e sottoposta a ripetute centrifugazioni a 2000
x g, per 5’-6’. Dopo ognuna di queste è stato conservato il supernatante ed il pellet è
stato risospeso in tampone e ricentrifugato. Il “pool” dei sopranatanti ottenuti da
queste ripetute centrifugazioni è stato, quindi, a sua volta ricentrifugato a 55000 x g
ed il pellet ottenuto è stato lavato con PBS e risospeso in 0,25-0,5 ml dello stesso
tampone, costituendo il preparato delle pareti cellulari.
6.8
Determinazione quantitativa delle proteine La determinazione delle
proteine è stata effettuata mediante il metodo di Lowry et al., 1951.
6.9
Elettroforesi su gel di poliacrilamide in gradiente lineare (SDS-PAGE)
(Laemmli, 1970).
a) Preparazione dei reagenti:
1. Gel di separazione con gradiente 8-20%.
63
Soluzione con acrilamide al 20%: acrilamide 20% (p/v) (BIORAD) e N-N’metilen-bis-acrilamide 0,5% (p/v) (BIORAD) sono state sciolte in tampone Tris-HCl
0,37M (pH 8,8). Alla soluzione è stato aggiunto SDS 0,1% (p/v) (BIORAD),
TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamine) 0,025% (v/v) (BIORAD) e ammonio
persolfato 0,05% (p/v) (BIORAD).
Soluzione con acrilamide all’8%: acrilamide 8% (p/v) (BIORAD) e N-N’-metilenbis-acrilamide 0,21% (p/v) (BIORAD) sono state sciolte in tampone Tris-HCl 0,37M
(pH 8,8). Alla soluzione è stato aggiunto SDS 0,1% (p/v) (BIORAD), TEMED
0,025% (v/v) (BIORAD) e ammonio persolfato 0,05% (p/v) (BIORAD).
Le due soluzioni sono state miscelate all’uscita di un apparecchio “Gradient
Former” (modello 385, BIO-RAD) e sono state convogliate, nell’interspazio posto
fra due lastre di vetro, precedentemente montate (16X20 cm), alla velocità di 2,5
ml/min, mediante una pompa peristaltica “Multiperpex” (modello 2115, LKB),
collegata ad un tubicino dal diametro interno di 3mm, terminante con un ago. Il gel
di separazione è stato, poi, ricoperto in superficie con 3ml di una soluzione di SDS
0,1% (p/v) che, a polimerizzazione avvenuta, è stata sostituita con il gel di avvio.
2. Gel di avvio.
Acrilamide 3% (p/v) (BIORAD) e N-N’-metilen-bis-acrilamide 0,08% (p/v)
(BIORAD) sono state sciolte in tampone Tris-HCl 0,1M (pH 6,8). Alla soluzione è
stato aggiunto SDS 0,1% (p/v) (BIORAD), TEMED 0,05% (v/v) (BIORAD) ed
ammonio persolfato 0,2% (p/v) (BIORAD).
3. Tampone di corsa: Tris-HCl 0,017M, glicina 0,192M (BIORAD), SDS 0,1% (p/v)
(BIORAD); pH 8,3.
4. Soluzione di fissaggio: acido tricloroacetico 12% (p/v) e acido solfosalicilico
3,5% (p/v).
5. Soluzione decolorante: etanolo 25% (v/v) ed acido acetico 8% (v/v).
6. Soluzione colorante: etanolo 25% (v/v), acido acetico 8% (v/v), Coomassie
Brillant blue (R-250) 0,10% (p/v) (BIORAD).
b) Procedura:
I campioni (estratti cellulari totali, estratti citoplasmatici e preparati di parete), sono
stati diluiti nelle proporzioni 1:1 in tampone Tris-HCl (pH 6,8), contenente: SDS 8%
(p/v) (BIORAD), glicerolo 33% (v/v) (BIORAD), 2-mercaptoetanolo 10% (v/v)
64
(BIORAD), blu bromofenolo 0,05% (BIORAD) e sono stati bolliti per 6’-8’. A
questo punto, sono stati caricati direttamente nei pozzetti del gel di avvio (50μg
proteine/pozzetto).
La migrazione elettroforetica è stata eseguita a 4-5°C, a corrente costante di 60 mA,
in tampone di corsa, in una cella elettroforetica “Protean II” (BIORAD), utilizzando
come standard l’SDS-PAGE Molecular Weight Standard, Hight, Low and Broad
Range (BIORAD).
A corsa ultimata il gel è stato trattato mediante bagni successivi in diverse soluzioni:
prima è stato messo nella soluzione di fissaggio per 30’-60’; quindi è stato lavato
nella soluzione decolorante, per 5’ e successivamente è stato posto nella soluzione
colorante, per 20’-30’. Il gel è, poi, stato decolorato mediante numerosi passaggi
nella soluzione decolorante, fotograto e conservato in buste di plastica sigillate.
6.10
Trasferimento su filtri di nitrocellulosa
Le proteine, separate mediante elettroforesi SDS-PAGE, sono state trasferite su
membrane di nitrocellulosa “Millipore GS” (MILLIPORE), con pori del diametro di
22μm.
Il gel è stato lavato per 30’ in tampone di blottaggio (Tris-HCl 25mM, glicina
192mM (BIORAD), metanolo 20% (v/v), pH 8,3), poi è stato posto a contatto con la
membrana di nitrocellulosa, facendo attenzione ad allontanare tutte le bolle di aria. Il
tutto è stato collocato, in posizione verticale, all’interno di una cella “Trans-Blot”
(BIORAD) ed è stato coperto con il tampone di blottaggio. Il trasferimento delle
proteine, dal gel alla membrana di nitrocellulosa, è stato eseguito a 7°-8°C, mediante
un alimentatore modello 160/1,6 (BIORAD), a voltaggio variabile: inizialmente a
30V, per tutta la notte, poi a 90V, per due ore. A trasferimento avvenuto, le
membrane blottate sono state asciugate all’aria e conservate in contenitori con CaCl2,
a 4°C.
6.11
Preparazione degli antisieri policlonali (anticorpi Ii)
Gli antisieri policlonali sono stati prodotti in conigli di razza New Zealand, mediante
8-10 successive iniezioni intradermiche sulla schiena (100μl). Ogni iniezione
65
conteneva 100-150μg di antigene, mescolati all’adiuvante di Freund. Dopo 8-10
settimane, i conigli sono stati dissanguati ed il sangue è stato centrifugato, per
ottenere l’antisiero contenente gli anticorpi desiderati. L’antisiero così ottenuto è
stato fatto precipitare con ammonio solfato e conservato come liofilizzato, o
congelato a -20°C, in presenza di azide allo 0,02%.
6.12
Analisi immunologica delle proteine blottate.
Per individuare il legame antigene-anticorpo è stato utilizzato il kit “Immuno-Blot
GAR-AP”(BIORAD). La membrana è stata immersa in TBSG (20mM Tris, 500mM
NaCl, 3% gelatina, pH 7,5), a temperatura ambiente, per 30’-60’, in leggera
agitazione. Dopo successivi lavaggi di 5’, a temperatura ambiente, in tampone TTBS
(20mM Tris, 500mM NaCl, 0,05% Tween-20, pH 7,5), la membrana è stata incubata
con l’anticorpo primario specifico (diluito 1:2500-1:15000 in TTBS, contenente
gelatina all’1%), per tutta la notte, a temperatura ambiente. Dopo due lavaggi di 10’
ciascuno in TTBS, la membrana è stata incubata per 1 ora, a temperatura ambiente,
in leggera agitazione, con l’anticorpo secondario (Goat anti-Rabbit IgG - Alkaline
Phosphatase Conjugate - BIORAD), diluito 1:3000 in TTBS, contenente gelatina
all’1%. Dopo due ulteriori lavaggi: uno in TTBS, per 10’ ed uno in TBS, per 5’, la
membrana è stata incubata nella soluzione di sviluppo HRP, allestita secondo le
indicazioni allegate al kit GAR-HRP (Immun-Blot-Goat Anti-Rabbit-Horseradish
Peroxidase BIORAD), per 30’-40’. La reazione è stata bloccata immergendo la
membrana in H2O distillata per 10’. Le proteine legate all’anticorpo sono state
evidenziate come macchie violacee. Le membrane sono poi state fotografate,
asciugate e conservate al buio.
6.13 Saggi di idrofobicità
• Cromatografia ad interazione idrofobica (HIC) (Smyth et al., 1978 e Faris et al.,
1981)
Preparazione dei campioni: le cellule, derivate da colture liquide, cresciute alle
diverse temperature, sono state raccolte per centrifugazione, lavate in tampone PBS e
risospese in tampone ammonio solfato (BAS: ammonio solfato 1M in tampone
fosfato di sodio 10mM; pH 6,8), fino ad ottenere una OD550 di 0,5.
66
Preparazione delle colonne: le colonne sono state allestite utilizzando siringhe di
plastica da 1ml e dal diametro interno di 5mm, tagliate all’altezza di 35mm e chiuse
nella parte inferiore con uno strato di materiale inerte poroso. Gli spezzoni delle
siringhe sono stati impaccati con 150μl di resina Octil-sefarosio CL-4B (PharmaciaLKB) (40μmol/ml) e lavati con 3ml di tampone BAS.
Procedura: 100μl di sospensione cellulare, diluita in 3ml di BAS, sono stati introdotti
molto lentamente in ogni colonnina e l’eluato è stato letto allo spettrofotometro
(OD550). L’idrofobicità è stata valutata in base alla quantità di cellule trattenute dal
gel, che è data dalla diminuzione percentuale della densità ottica dell’eluato rispetto a
quella del campione iniziale (maggiore era la diminuzione dell’OD, maggiore era
l’idrofobicità delle cellule).
• Agglutinazione con ammonio solfato (SAT) (Lindahl et al., 1981).
Preparazione dei campioni: le cellule, derivate da colture liquide, cresciute alle
diverse temperature, sono state raccolte per centrifugazione, lavate in tampone PBS
0,002M (pH 6,8) e risospese nello stesso tipo di tampone, fino ad ottenere una
concentrazione finale di circa 108 cellule/ml.
Reagenti: sono state preparate una serie di soluzioni stock di PBS + ammonio
solfato, a diverse concentrazioni comprese fra 0,02M e 4,0M, con intervalli di
0,025M.
Procedura: aliquote di 25μl di sospensione cellulare sono state mescolate,
separatamente, ad uguali volumi delle diverse soluzioni stock di PBS + ammonio
solfato. La mescolanza è stata allestita su vetrini da microscopio con un
avvallamento centrale, mantenuti in agitazione manualmente per 1’-2’. Il grado di
agglutinazione è stato valutato osservando la sospensione su uno sfondo nero. Come
controllo negativo è stata utilizzata un’aliquota di sospensione cellulare, mescolata al
tampone PBS senza ammonio solfato. La più bassa concentrazione di soluzione stock
in grado di determinare l’agglutinazione batterica è stata indicata come valore del
livello di idrofobicità.
6.14
Trattamento con tripsina
67
Le cellule, derivate da colture liquide, cresciute alle diverse temperature, sono state
raccolte per centrifugazione e lavate in tampone Tris-HCl 0,01M (pH 7,5). Due
aliquote di 100 μl ciascuna di sospensione cellulare sono state risospese in 200μl
dello stesso tipo di tampone, con 2mg/ml (circa 220 unità totali) di tripsina
(Boehringer). Come controllo negativo due aliquote di 100μl di sospensione batterica
sono state mantenute nello stesso tipo di tampone, ma senza l’aggiunta della tripsina.
Dopo incubazione a 37°C, per 2 ore, le cellule di ogni aliquota sono state lavate due
volte in tampone PBS e risospese, un’aliquota, in 100μl di BAS, per la valutazione
dell’HIC e l’altra aliquota in 100μl di PBS + ammonio solfato, per la valutazione del
SAT.
6.15
Elettroforesi delle proteine native:
• Analisi elettroforetica delle proteine cellulari totali (Moore et al.,1980)
a) Preparazione dei reagenti:
1. Gel di separazione (8,5%): 24,4g acrilamide (BIORAD) e 0,64g N-N’-metilenbis-acrilamide (BIORAD) sono stati sciolti in 250ml di tampone TRIS-HCl 0,4M
(pH 8,8) e dopo filtrazione e raffreddamento, sono stati aggiunti 250μl di TEMED
(BIORAD) e la soluzione è stata conservata, al buio, a 4°C. Al momento della
preparazione del gel, a 45ml della soluzione sono stati aggiunti 0,35ml di ammonio
persolfato 10% (p/v) (BIORAD) e la soluzione è stata aspirata in una siringa,
degasata manualmente per due volte e versata fra le lastre di vetro precedentemente
montate.
2. Gel di avvio (4,7%): 3,5g acrilamide (BIORAD) e 0,1g N-N’-metilen-bisacrilamide (BIORAD), sono stati sciolti in 70ml di tampone TRIS-HCl 0,2M (pH
7,0) e dopo filtrazione e raffreddamento, sono stati aggiunti 2,5ml di blu di
bromofenolo 0,25% (p/v) (BIORAD) e la soluzione è stata conservata al buio a 4°C.
Al momento della preparazione del gel, a 10ml della soluzione sono stati aggiunti
10µl di TEMED (BIORAD) e 0,25ml di ammonio persolfato al 10% (p/v)
68
(BIORAD) e la soluzione è stata aspirata in una siringa, degasata manualmente e
versata fra le lastre di vetro, sopra il gel di separazione, già polimerizzato.
3. Tampone di corsa: 3gr/l TRIS; 15gr/l glicina (BIORAD).
4. Soluzione di fissaggio: acido tricloroacetico 12% (p/v).
5. Soluzione decolorante: etanolo 25% (v/v) ed acido acetico 10% (v/v)
6. Soluzione colorante: metanolo 25% (v/v), acido acetico 10% (v/v), Coomassie
Brillant blue R-250 0,10% (p/v) (BIORAD)
b) Procedura:
Le cellule, derivate da colture di 24 ore, cresciute in 10ml di TPY, in anaerobiosi,
sono state raccolte per centrifugazione e sono state risospese in 0,15ml di TRIS-HCl
0,2M (pH 7,0). Alla sospensione sono state aggiunte circa 0,15g di sferette di vetro
dal diametro variabile da 75 a 110µm e le cellule sono state rotte, per 6’, utilizzando
un agitatore meccanico. Le pareti cellulari e le eventuali cellule residue sono state
fatte sedimentare mediante centrifugazione ed il sopranatante, addizionato di circa
20mg di saccarosio, è stato caricato nei pozzetti del gel di avvio (40µl/pozzetto).
La migrazione elettroforetica è stata eseguita a 15°C, a voltaggio costante di 200V, in
tampone di corsa, in una cella elettroforetica “Protean II” (BIORAD), utilizzando
come standard il ceppo R101-8T (ATCC 25527).
A corsa ultimata il gel è stato trattato mediante bagni successivi in diverse soluzioni:
prima è stato messo nella soluzione di fissaggio per 30’, quindi è stato lavato nella
soluzione decolorante, per 5’ e successivamente è stato posto nella soluzione
colorante, per 30’. Il gel è, poi, stato decolorato mediante numerosi passaggi nella
soluzione decolorante, fotograto e conservato in buste di plastica sigillate.
69
CAPITOLO 7
70
7. RISULTATI e DISCUSSIONE
7.1
Coltura a pH costante
7.1.1 Effetto pH sulle BIFOP C e H
Nella prova di influenza del pH sull’espressione delle proteine di parete, BIFOP C e
H, le cellule sono state coltivate in TPY con una concentrazione di glucosio dello 0.5
% rispetto allo 1.5% normalmente utilizzato. Questa concentrazione di glucosio è già
stata studiata con colture a pH non costante e non ha messo in evidenza variazioni
dei profili proteici di parete. Inoltre dai dati stechiometrici di produzione di acido
lattico e acetico nel metabolismo dei bifidi si avrebbe ogni 500 ml di substrato
contenente 0.5 % di glucosio un consumo di circa 33 ml di NaOH 1 M (= 0.7 g di Na
TOTALE in 500 ml) che quindi sarebbe la quantità di NaOH da utilizzare per
neutralizzare l’acidità prodotta e quindi per mantenere un pH costante.
Considerando 500 ml di substrato con concentrazioni di glucosio normale (1.5 %) il
mantenimento a pH costante richiederebbe un’addizione di quasi 100 ml di NaOH
1M: l’aggiunte di un tale volume di NaOH comporterebbe un aumento di volume
totale con diluizione del substrato con anche un aumento del Na che potrebbe avere
effetti sull’espressione delle proteine parietali ancora non noti. Nello studio
dell’influenza dell’NaCl in quantità variabili, infatti, è stato osservato che esso
determina variazioni a livello di proteine di parete: ad esempio 33 ml di NaOH 1 M
aggiunti a 500 ml di substrato corrispondono (come Na e non come NaCl) allo 0.4 %
di NaCL e lo 0.4 % di NaCl (è dovuto al Na+ ol al Cl- ?) ha già un effetto notevole
sulla proteina LMW. (in realtà già lo 0.1 % di NaCl ha effetto sulla BIFOP H)
Le colture hanno richiesto le seguenti quantità di NaOH 1 M addizionate per il
mantenimento del pH costante e le quantità di masse cellulari ottenute sono descritte
in Tabella 4.
Tabella 4. pH iniziali e finali, quantità di NaOH 1 mM addizionata e masse cellulari
delle colture del ceppo Ru 809/1.
pH iniziale
pH finale dopo 10 Consumo
ore di coltura
NaOH
4.6
4.8-4.9
10 ml
5.5
5.7-5.8
34
(corrisponde
71
di Massa cellulare valutata
come peso umido
1.2 g
ml 2.5 g
a
circa 700 mg di
NaOH per 500
ml)
6.0
6.3-6.4
33 ml
3.9 g
7.5
7.3-7.4
34 ml
5.4 g
La crescita a pH controllato ha messo in evidenza che l’effetto non è sulla quantità
totale delle proteine BIFOP C o H che sono circa uguali nel preparato dell’estratto
totale ma sulla traslocazione in parete come è messo in evidenza nel gel PAGE
colorato con Coomassie (Fig. 11).
Fig. 11. PAGE (13 % gradiente) colorata con Coomassie. Estratti totali (1, 3, 5 e 7) e
preparati parietali (2, 4, 6 e 8) di Ru 809/1 coltivato ia diversi pH. 1 e 2, pH 4.8-4.9;
3 e 4, pH 5.7-5.9; 5 e 6, pH 6.3-6.4; 7 e 8, pH 7.4-7.5.
72
Data la minore sensibilità della rivelazione delle proteine della colorazione
Coomassie dei gel PAGE, la presenza di proteine di parete si mette in evidenza solo
nelle cellule cresciute a pH 5.7-5.8 nel gel elttroforetico mentre con la rivelazione
immunologica si osserva che in realtà le proteine di parete sono presenti a tutti i pH
saggiati ma con minore quantità rispetto al pH 5.7-5.8 (Fig. 12).
Fig. 12. Western blot decorato con anti BiFOP C e anti-BIFOP H. Preparati di parete
di Ru 809/1 coltivato a diversi pH. 1 e 5, pH 4.8-4.9; 2 e 6, pH 5.7-5.8; 3 e 7, pH 6.36.8; 4 e 8, pH 7.3-7.4. Profili 1-4, 20 μg di proteina/ 5 μl; profili 5-8, 5 μg di
proteine/5 μl.
Le frazioni di parete di BIFOP C e H sono influenzate entrambe e nello stesso modo
da variazioni di pH. Come messo in evidenza dalla Fig. (PImm 117) se poniamo la
BIFOP C e la BIFOP H prodotte a 5.7-5.8 come il 100% avremo nelle cellule
cresciute a differenti pH, le percentuali espresse in Tabella 5.
pH 4.8-4.9
pH 5.7-5.8
pH 6.3-6.4
pH 7.3-7.4
BIFOP C
20
100
50
10-20
BIFOP H
5-10
100
40
5
Tabella 5. Valutazione quantitativa dell BIFOP H e C determinata mediante analisi
desitometrica.
73
Ponendo 100 % la BIFOP C nel preparato di parete si deve porre 700 % la sua
quantità nell’estratto totale.
7.1.2 Prove di idrofobicità a diversi pH
Il saggio SAT TEST per valutare l’idrofobicità delle cellule non mette in evidenza
una correlazione fra presenza quantitativamente elevata di BIFOP C ed H sulle pareti
e valori di idrofobicità: infatti le cellle cresciute a pH 5.5 che esprimono la massima
quantità di BIFOP hanno la stessa idtrofobicità di quelle cresciute a pH 7.5 che
invece rivelno scarsa quantità di BIFOP sulle pareti. Le cellule cresciuteapH 4.6 che
presentano anch’esse acrse BIFOP sono addirittura autoaggglutinanti rivelando cioè
una idrofobicità molto elevata (Tabella 6).
Concentrazioni molari di NH4(SO)4
pH
0.5
0.6
0.7
0.8
1.0
1.5
1.6
1.7
1.8
2.0
4.6
autoagglutina
5.5
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
6.0
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
7.5
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Tabella 6. SAT test del ceppo Ru 809/1 coltivato a diversi pH.
7.2
Coltura in NaCl
7.2.1 Effetto NaCl sullo sviluppo di Ru 809/1 e Ru 809/8.
Sono state saggiate le concentrazioni di NaCl allo 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5,
1.75, 2.5, 3.2, 6.4 %. Considerando che la concentrazione di NaCl presente nel TPY
normale è di 0.12 % in base alla somma del NaCl presente nei vari costituenti del
TPY calcolata in base ai valori espressi nei foglietti illustrativi relativi, tale
concentrazione è stata considerata normale. La concentrazione di NaCl influisce
sullo sviluppo delle colture di Ru 809/1 e Ru 809/8 che sono completamente inibite
alla concentrazione di 6.4 %; dopo 24 ore di incubazione a 37°C in anaerobiosi a 3.2
% Ru 809/8 raggiunge uno sviluppo inferiore a quello di Ru 809/1 (lettura a 600 nm
0.840 e 1.140, rispettivamente). Ru 809/1 è pertanto più osmofilo di Ru 809/8.
A concentrazioni minori di NaCl, 1.8 e 2.4 %, lo sviluppo di Ru 809/8 è più lento di
quello di Ru 809/1 ma raggiunge livelli uguali a quello di Ru 809/1.
74
L’aumentata concentrazione di NaCl da 0.12 a 1.5 % non altera la curva di sviluppo
dei due ceppi rispetto ai controlli.
7.2.2 Effetto NaCl sulle proteine di parete
In Ru 809/8 cresciuto alle diverse concentrazioni di NaCl si mette in evidenza
l’assenza di proteine parietali e la presenza della BIFOP B sia nel sovranante sia nel
totale. Non sono stati ossevvati, pertanto, cambiamenti rispetto alla coltura in
condizioni normali.
In Ru 809/1 è stata messa in evidenza nel saggio immunologico una progressiva
diminuzione fino alla scomparsa della BIFOP H nella parete dalle cellule coltivate
dalle concentrazioni di 0.12 % a quelle di 1.75 % di NaCl ed ad un suo
corrispondente aumento nel sovranatante (Fig. 13). Anche la BIFOP C decresce fino
a scomparire nella parete delle cellule coltivate a 1.75% di NaCl mentre aumenta nel
sovranante (Fig. 13).
Fig. 13. Western blot decorato con anti BiFOP C e anti-BIFOP H. Sovranante (1, 3,
5, 7, 9, 11, 13, 15) e preparati di parete (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16) di Ru 809/1
coltivato a diverse concentrazioni di NaCl: 1, 2, 0.12 %; 3 e 4, 0.2 %; 5 e 6, 0.4 %; 7
75
e 8, 0.5 %; 9 e 10, 0.8 %; 11 e 12, 1.0 %; 13 e 14, 1.25 %; 15 e 16, 1.75 %. Ogni
profilo contiene 10 mg di proteine/5 ml.
Alle concentrazioni di 2.5 e 3.2 % di Na Cl non sono presenti le BIFOP C ed H come
messo in evidenza dal saggio immunologico in Fig. 14.
Fig. 14. Western blot decorato con anti BIFOP C e anti-BIFOP H. Estratti totali (1, 4
e 7), sovranante (2, 5 e 8) e preparati di parete (3, 6 e 9) di Ru 809/1 coltivato a
diverse concentrazioni di NaCl: 1, 2 e 3, 1.75 %; 4, 5 e 6, 2.5 %; 7, 8 e 9, 3.2 %.
Ogni profilo contiene 50 μg di proteine/10 μl.
La BIFOP C aumenta come quantità totale nelle cellule coltivate fino alla
concentrazione dello 1.75 % di NaCl, poi si stabilizza fino alla concentrazione di 3.2
%; anche la BIFOP H aumenta come quantità totale nelle cellule coltivate fino alla
concentrazione dello 1.75 % di NaCl (Fig. 13 e 15), poi diminuisce leggermente alle
concentrazioni di 2.4 e 3.2 % (Fig. 14 e 16).
76
Fig. 15. Western blot decorato con anti-BIFOP C e anti-BIFOP H. Estratti totali (1,
4, 7, 10, 13, 16,), sovranatante (2, 5, 8, 11, 14, 17) e preparati di parete (3, 6, 9, 12,
15, 18) di Ru 809/1 coltivato a diverse concentrazioni di NaCl: 1, 2 e 3, 0.12 %; 4, 5
e 6, 0.2 %; 7, 8 e 9, 0.6 %; 10, 11 e 12, 1.0%; 13, 14 e 15, 1.5 %; 16, 17 e 18, 0.12 %.
Ogni profilo contiene 10 mg di proteine/5 ml.
77
Fig. 16. PAGE (13 % gradiente) colorata con Coomassie. Preparati parietali di Ru
809/1 coltivato a diverse concentrazioni di NaCl: 1, 0.6 %; 2, 1.75 %; 3, 3.2 %; 4,
0.12 % (TPY normale). Ogni profilo contiene 50 mg di proteine/10 ml.
78
7.2.3 Effetto NaCl sull’idrofobicità
L’idrofobicità valutata mediante SAT test aumenta con l’aumentare della
concentrazione di NaCl quindi non è certamente in rapporto con le proteine di parete
che invece scompaiono dalla parete all’aumentare della concentrazione di NaCl
(Tabella 7).
ammonio NH4SO4 %
0.75
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
0.12
-
-
-
-
-
+
+
1.2
-
-
-
+
+
+
+
0.4
-
-
+
+
+
+
+
0.6
-
-
+
+
+
+
+
0.8
-
-
+
+
+
+
+
1.0
-
+
+
+
+
+
+
1.25
-
+
+
+
+
+
+
1.5
autoagglutina
NaCl %
1.75
autoagglutina
Tabella 7. SAT test del ceppo Ru 809/1 coltivato a diverse concentrazioni di NaCl.
7.3
Coltura in TPY diluito
Le cellule sono state coltivate in TPY diluito 1:10. 2:10,3:10, 4:10, 6:10. Da questa
prova sono emersi interessanti risultati: infatti la quantità di proteina BIFOP C
nell’estratto totale non viene modificata dalla diluizione del TPY rispetto al TPY
normale. La BIFOP C in parete invece non viene modificata alle diluizioni minori
cioè 4:10 e 6:10 mentre nelle diluizioni 3:10 e 4:10 si osserva una quantità di
proteina BIFOP C in parete molto abbondante. Nella maggiore diluizione (1:10) si
osserva una situazione intermedia con una quantità di BIFOP C in parete minore
rispetto alle diluizioni 3:10 e 4:10 , ma maggiore rispetto al controllo.
7.4
Coltura in Desferal
79
Saggi condotti in B. bifidum hanno dimostrato che il ferro è necessario per la sua
crescita (Bezkorovainy et al. 1983). Nello studio quindi del rapporto fra fattori di
crescita limitanti e espressione di proteine di parete è stato utilizzato il composto
desferrioxamine mesylate (Desferal, ciba-geigy) che agendo come chelante del ferro,
determina una carenza di ferro del substrato.
Il desferal è un composto chelante il ferro. Un substrato contenente Desferal è quindi
carente di ferro e può essere utilizzato per saggi di Fe starvation. Alle concentrazioni
di 20-21.5 microM rallenta lo sviluppo mentre a 23 microM è già inibente.
La crescita di RU 809/1 non è influenzata da Desferal anche alle concentrazioni che
dovrebbero essere inibenti quindi il ferro non è un fattore limitante per questo ceppo.
Non essendo influenzata la crescita anche le proteine di parete come è prevedibile
non presentano differenze rispetto al controllo.
Le differenze di espressioni delle proteine in relazione ai diversi fattori ambientali
riscontrabili in vitro possono essere presenti anche in vivo rivestendo così un
importante ruolo nel successo o meno del microrganismo di sopravvivere e
colonizzare un habitat.
7.5
Coltura in diversi zuccheri.
7.5.1 Effetto della coltura in diversi zuccheri sul’espressione delle BIFIOP C e
H.
Le cellule di Ru 809/1 sono state coltivate in TPY addizionato di diversi zuccheri
(fruttosio, galattosio, glucosio, lattosio, maltosio, melibiosio, raffinosio, ribosio,
saccarosio e xilosio) all’1.5 %. L’inoculo iniziale (10 %) derivava da una coltura già
nello zucchero corrispondente. La coltura nei diversi zuccheri è stata ripetuta per 3
volte.
E’ stata considerata la variabilità nell’espressione delle due BIFOP C e H di Ru
809/1 coltivato nei diversi zuccheri. La quantità di BIFOP C varia considerevolmente
a seconda del tipo di zucchero. La BIFOP C è presente in maggior quantità
(considerata come il 100 %) nelle cellule cresciute in raffinosio e glucosio e in
quantità decrescenti in lattosio e saccarosio (75 % rispetto a raffinosio e glucosio),
80
ribosio (45 %), maltosio e melibiosio (35 %), fruttosio e xilosio (30 %), mannosio e
galattosio (25 %). Alcuni confronti immunologici sono evidenziati in Fig. 17 e 18.
Fig. 17. Western blot decorato con antiisero anti-BIFOP C. Preparati di parete di RU
809/1 coltivato allo 1.5 % dei diversi zuccheri: 1, galattosio; 2, mannosio; 3,
preparato diluito al 50 % di saccarosio; 4, maltosio; 5, ribosio; 6, saccarosio; 7,
lattosio; 8, glucosio. Quantità di proteine per ogni lane: 13.5 μg/5μl.
Fig. 18. Western blot decorato con antisiero anti-BIFOP C e anti -IFOP H . Preparati
di parete di RU 809/1 coltivato in diversi zuccheri all’ 1.5 %: 1, maltosio ; 2,
raffinosio; 3, lattosio; 4, saccarosio; 5, galattosio; 6, ribosio; 7 mannosio. Quantità di
proteine per ogni lane: 50 μg/10 μl.
81
La quantità di BIFOP H in parete è abbastanza simile nelle cellule coltivate in
presenza dei diversi zuccheri. La minor quantità è presente nelle cellule coltivate in
mannosio e poco di più in quelle coltivate in galattosio.
Alcuni confronti sono evidenziati nel saggio immunologico in Fig. 19.
Fig. 19. Western blot decorato con antiisero anti-BIFOP C. RU 809/1 : 1, 3, 5, 7, 9,
11 preparati da sovranatante; 2, 4, 6, 8, 10, 12, preparati da pareti cellulari. Coltura
in: 1 e 2, glucosio (1.5 %); 3 e 4, xilosio (1.5 %); 5 e 6, fruttosio (1.5 %); 7 e 8,
melibiosio (1.5 %); 9 e 10, raffinosio (1.5 %); 11 e 12, raffinosio (4.6%). Quantità di
proteine per ogni lane: 10 μg/5μl.
La quantità di BIFOP C ed H negli estratti totali è molto simile: infatti come
evidenziato dal paragone delle diluizioni di estratti cellulari di cellule cresciute in
raffinosio e saccarosio, dove le BIFOP C e H sono maggiormente espresse, blottati e
82
decorati con anti BIFOP C ed H le quantità alle diverse diluizioni sono molto simili
con valori leggermente maggiori per il saccarosio rispetto al glucosio: attribuendo al
saccarosio il valore del 100 %, per il glucosio si ha il 95 % come valutato al
viseosensitometro (Fig. 20).
Fig. 20. Western blot decorato con anti-BIFOP C e anti-BIFOP H. Preparati parietali
da cellule di RU 809/1 coltivate in raffinosio (sezione A) e saccarosio (sezione B)
all’1.5%: diluizioni da 1, 100%, 2, 75%; 3, 50%; 4, 25%, 5, 15%; 6, 10%; 7, 7.5%;
8, 5.0%; 9,1.0%. Quantità di proteine per ogni profilo: 10 mg/5ml.
83
Nell’elettroforesi dell’estratto totale delle cellule cresciute in ribosio è presente una
nuova proteina (Fig. 21) mentre nell’elettroforesi dei preparati di parete delle cellule
cresciute in galattosio sono presenti due nuove proteine (Fig. 22 e 23).
Fig. 21. PAGE (13 % gradiente) colorata con Coomassie di estratti proteici totali di
Ru 809/1 coltivato in diversi zuccheri all’1.5 %. 1, maltosio; 2, raffinosio; 3,
lattosio; 4, saccarosio; 5, galattosio; 6, ribosio; 7, mannosio. Quantità di proteine per
ogni profilo: 50 μg/5μl.
84
Fig. 22. PAGE (13 % gradiente) colorata con Coomassie di preparati di parete di Ru
809/1 coltivato in diversi zuccheri all’1.5 %. 1, maltosio; 2, raffinosio; 3, lattosio; 4,
saccarosio; 5, galattosio; 6, ribosio; 7, mannosio. Quantità di proteine per ogni
profilo: 50 mg/10 ml.
85
Fig. 23. PAGE (13 % gradiente) colorata con Coomassie. 1 e 2, estratti totali e
preparati parietali di RU 809/1 coltivato in galattosio 1.5%. 3 e 4, estratti totali e
preparati parietali di RU 809/1 coltivato in ribosio 1.5%. ●, nuove proteine.
La variazione quantitativa delle BIFOP C ed H è stata messa in evidenza già dalla
prima coltura e confermata nel secondo e terzo trapianto: la modifica quindi del
substrato sembra avere un effetto immediato sull’espressione
86
Dato che il raffinosio ha un effetto positivo nell’espressione della BIFOP C, le
cellule del ceppo RU 809/1 sono state coltivate in una concentrazione di 4.5 % di
raffinosio: le cellule cresciute in raffinosio presentano un’elevata quantità di BIFOP
C.
7.5.2 Effetto coltura in diversi zuccheri sull’idrofobicità
Il SAT test condotto per valutare l’idrofobicità delle cellule di Ru 809/1 coltivato nei
diversi zuccheri ha rivelato che non esiste correlazione fra quantità di proteine
parietali e idrofobicità: infatti le cellule coltivate negli zuccheri che determinano la
maggiore espressione di proteine parietali, contrariamente a quanto prevedibile, non
sono le più idrofobiche.
Le cellule maggiormente idrofobiche sono quelle coltivate in saccarosio, xilosio,
fruttosio, maltosio e mannosio oltre al raffinosio che è quello che determina in RU
809/1 la maggior prouzione di proteine parietali, sono state coltivate anche le cellule
di RU 809/8 . Tale ceppo come detto in precedenza è un clone curato di RU 809/1
che rispetto al ceppo selvaggio ha perso il plasmide.. Tale clone oltre ad essere
plasmide negativo non presenta alcuna proteina parietale mediante PAGE colorata
con Coomasssie. Il fatto che l’isdrofobicità sia elevata anche nelle cellule di Ru
809/8 coltivate in saccarosio e mannosio , come era stato messo in evidenza in RU
809/1, è una conferma che l’idrofobicità non è determi nata dalle proteine parietali
ma da altri fattori.
7.5.2 Effetto trispsina sulle cellule maggiormente idrofobiche coltivate nei
diversi zuccheri
E’ stata inoltre valutata la sensibilità alla tripsina delle cellule che mostrano
maggiore idrofobicità. Il trattamento con tripsina sembra non aver effetto
sull’idrofobicità.
La
riduzione
dell’idrofobicità
sembra
piuttosto
legata
all’esposizione a 37 °C cui si sottopongono le cellule nel saggio con tripsina. Le
cellule infatti mantenute a 37° C per 30 min senza tripsina diminuiscono
drasticamente la loro idrofobicità. Le cellule coltivate in mannosio mantengono
un’elevata idrofobicità anche dopo il trattamento sia a 37°C, sia a 37°C con tripsina.
87
L’elettroforesi dei preparati parietali delle cellule trattate con tripsina mostra la netta
riduzione di quantità della BIFOP C e la totale scomparsa della BIFOP H nelle
cellule trattate con trispsina, mentre le proteine parietali delle cellule non trattate
sono uguali a quelle delle cellule mantenute a 37° C per 30 min ma non trattete con
trispina (Fig. 24).
Fig. 24. Western blot decorato con anti-BIFOP C e anti-BIFOP H. Preparati parietali
da cellule dei RU 809/1 coltivate in glucosio allo 1.5%: 1, cellule non trattate; 2,
cellule esposte a 37°C per 30 min.; 3, cellule esposte a 37°C per 30 min. in presenza
di tripsina.
7.6
Coltura a diverse concentrazioni di glucosio
88
Il ceppo Ru 809/1 è stato coltivato in diverse concentrazioni di glucosio (0.1, 0.2,
0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.25, 1.5, 3.6, 5.4, 7.2,9.0, 10.8, 12.6, 16.2, 18.0 e 36.0 %). Alla
concentrazione del 36 % Ru 809/1 non sviluppa. La BIFOP C non è influenzata dalle
diverse concentrazioni di glucosio mantenendosi presente in quantità più elevate nel
sovranante ma in quantità abbondante anche nei preparati di parete a tutte le
concentrazioni di glucosio saggiate. La BIFOP H invece varia considerevolmente
come quantità presente nel sovranante e nei preparati di parete alle diverse
concentrazioni di glucosio: a 0.1 e 0.2 % di glucosio si osserva una percentuale del
100 % nei preparati di parete e del 30 e 10 %, rispettivamente, nel sovranante (Fig.
25).
Fig. 25. Western blot decorato con anti-BiFOP C e anti-BIFOP H . 1 e 3, preparati da
sovranatante; 2e 4, preparati da pareti cellulari. RU 809/1 coltivato in : 1 e 2, 0.1 %
di glucosio; 3 e 4, 0.2 % di glucosio; 5 e 6, 0.4 % di glucosio; 7 e 8, 0.6 % di
glucosio; 9 e 10, 0.8 % di glucosio; 11 e 12, 1.0 % di glucosio; 13 e 14, 1.25 % di
glucosio; 15 e 16, 1.5 % di glucosio. Quantità di proteine per ogni profilo: 10
mg/5ml.
Questo rapporto è invertito nelle concentrazioni da 0.4 a 1.5 % di glucosio con
quantità di BIFOP H maggiori nel sovranatante rispetto ai preparati di parete con
valori del 100 % nel sovranante e del 10-20 % nei preparati di parete dalle
concentrazioni di 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 e 1.25 % di glucosio e del 40 % a 1.5 % di
glucosio. Dalle concentrazioni di 3.6 a 18 % di glucosio si mette in evidenza di
nuovo il rapporto quantitativo della BIFOP H presente alle concentrazioni di 0.1, 0.2
89
% di glucosio con concentrazioni maggiori di BIFOP H nei preparati di parete
rispetto al sovranante (Fig. 26).
Fig. 26. Western blot decorato con anti BiFOP C e anti-BIFOP H. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13
e 15, preparati da sovranatante; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16, preparati da pareti
cellulari. RU 809/1 coltivato in : 1 e 2, 3.6 % di glucosio; 2 e 3, 5.4 % di glucosio; 5
e 6, 7.2 %; 7 e 8, 9.0 % di glucosio; 9 e 10, 10.8 % di glucosio; 11 e 12, 12.6 % di
glucosio; 13 e 14, 16.2 % di glucosio; 15 e 16, 18.0 % di glucosio. Quantità di
proteine per ogni profilo: 10 μg/5μl.
La somma della quantità di BIFOP H presente nel sovranante e nei preparati di
parete decresce all’aumento delle concentrazioni di glucosio da 3.6 % al 18 % (Fig.
27).
90
Fig. 27. Western blot decorato con anti BiFOP C (sezione A) e anti-BIFOP H
(sezione B). 1,e 3, preparati da sovranatante; 2 e 4, preparati da pareti cellulari. RU
809/1 coltivato in : 1 e 2, 3.6 % di glucosio; 3 e 4, 18 % di glucosio. Quantità di
proteine per ogni profilo: 10 μg/5μl.
91
Anche nel saggio di PAGE colorato con Coomassie si osserva una diminuzione di
proteine di parete dal ceppo RU 809/1 coltivato a 3.6 % rispetto al 18 % di glucosio
(Fig. 28).
Fig. 28. PAGE (13 % gradiente) colorata con Coomassie. Preparati parietali di Ru
809/1 coltivato in 1, 3.6 % di glucosio; 2, coltivato in 18 % di glucosio.
7.8
Coltura alle condizioni ambientali che inducono la maggior espressione
quantitativa di BIFOP C e H (prova MWP, Maximum Wheight Protein)
7.8.1 Effetto della somma delle condizioni ambientali che inducono
overespressione delle BIFOP C e H sull’espressione delle BIFOP C e H.
Dai risultati delle prove precedenti si deduce che i fattori ambientali “singoli” che
hanno indotto la massima quantità di proteine parietali (BIFOP C e H) sono stati: 1)
92
tsar diluito 100 ml (TPY normale – Tryptone, Phytone e Yeast Extract - + 350 ml
H2O – gli altri componenti uguali -; 2) temperatura a 40° C (questo dato è stato
suggerito da Mattarelli et al., 1999 e confermato dalla ripetizione dell’esperimemento
in cui è stata messa in evidenza la maggiore espressione di BIFOP H se i ceppi sono
coltivati a 40 °C rispetto alle temperature di 37° C e 43 e 45° C (Fig. 29); 3) pH
costante a 5.7-5.8 rispetto ai pH costanti a 7.5, 6.5 e 4.5; 4) raffinosio alla
concentrazione dell’1.5 %. E’ stata pertanto allestita una prova coltivando i ceppi Ru
809/1 e Ru 809/8 unendo i singoli fattori ambientali in una unica prova MWP di
coltura.
Fig. 29. PAGE (13 % gradiente) colorata con Coomassie. Preparati parietali di Ru
809/1 coltivato alle diverse temperature 1, 30° C; 2, 40 ° C; 3, 45 ° C; 4, 37 ° C.
Come messo in evidenza in Fig. 30 alle condizioni della prova MWP, le BIFOP C e
H sono “sopraespresse” in Ru 809/1 mentre in Ru 809/8, che non ha proteine BIFOP
C e H anche in condizioni di coltura in condizioni “normali”, non si assiste a
variazioni. La BIFOP B, presente nella parete di Ru 809/8 che ha un peso molecolare
93
maggiore della BIFOP C ma che reagisce con lo stesso antisiero della BIFOP C, e
che nel saggio al Coomassie non si mette neanche in evidenza.
Fig. 30. Western blot decorato con anti-BIFOP C e anti-BIFOP H. Prova MWP. 1, 2
e 3, preparati da estratto totale, sovranatante e preparati di parete di Ru 809/1,
rispettivamente; 4, 5 e 6, preparati da estratto totale, sovranatante e preparati di
parete di Ru 809/8, rispettivamente.
La Fig. 31 mette in evidenza l’influenza dei singoli fattori ambientali, delle
condizioni standard e delle condizioni MWP sull’espressione delle BIFOP C e H. La
maggiore espressione delle BIFOP C e H è ben visibile alle condizioni della prova
MWP rivelando che l’effetto dei singoli fattori si somma per conferire la maggior
espressione quantitativa di queste BIFOP rispetto a tutte le altre condizioni di coltura.
94
Fig. 31. Western blot decorato con anti BiFOP C e anti-BIFOP H . Ru 809/1
coltivato alle diverse condizioni colturali descritte nella parte bassa della figura. 1, 4,
7, 10, 13 e 16, estratti totali; 2, 5, 8, 11, 14 e 17, sovranatanti; 3, 6, 9, 12, 15 e 18,
preparati di parete.
7.8.2
Prove di idrofobicità MWP
Il saggio SAT test condotto con le cellule di Ru 809/1 e Ru 809/8 coltivati nella
prova MPW ha ancora una volta dimostrato l’assenza di correlzion fra idrofobicità e
presenza di proteine parietali. I valori di idrofobicità sono infatti più elevati per le
cellule di Ru 809/8 che non presenta espressione elevata di proteine parietali e sono
invece bassi per REu 809/1 che esprime la massima quantità di proteine parietali in
parete (Tabella 9)
95
Concentrazioni molari di NH4(SO)4
0.25
0.5
1.0
1.5
2.0
3.0
4.0
Ru 809/1
-
-
-
-
-
+
+
Ru 809/8
-
+
+
+
+
+
+
Tabella 9. SAT test dei ceppi Ru 809/1 e Ru 809/8 cresciuti nella prova MWP.
7.9
Effetto condizioni colturali su mantenimento plasmide
Gli effetti delle differenti condizioni colturali sulla quantità delle proteine parietali
potrebbero essere dovuti alla perdita del plasmide. Il ceppo RU 809/8, infatti, che è
un clone del ceppo RU 809/1 che è stato curato dal plasmide ed è pertanto plasmide
negativo non possiede proteine parietali visibili al Coomasssie. La coltura del ceppo
Ru 809/1 a diverse concentrazioni di glucosio (0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0 e 1.5%) ha
rivelato che il plasmide è assente alla concentrazione di 0.1 e appena visibile alla
concentrazione dello 0.2% mentre è ben visibile a tutte le altre concentrazioni.
Sono state saggiate anche alte condizioni colturali per valutare l’influenza sul
plasmide. La coltura a pH costante di 5.5, 6.0 e 7.5 e in presenza di desferal non ha
rivelato influenza sul plasmide che è presente in tutte le cellule sottoposte alle varie
condizioni colturali.
7.10
Effetto concentrazione dello 0.15 % di diversi zuccheri sul mantenimento
del plasmide.
Il ceppo RU 809/1 viene coltivato in presenza dello 0.15 % di diversi zuccheri poiché
è stato rivelato che RU 809/1 cresciuto allo 0.1 % di glucosio perde il plasmide. Sono
stati saggiati i seguienti zuccheri: amido, arabinosio, fruttosio, galattosio, glucosio,
lattosio, maltosio, mannosio, melibiosio, raffinosio, ribosio, saccarosio, xilosio allo
0.15% utilizzando come controllo positivo il ceppo cresciuto allo 1% di glucosio.
96
7.11
CONCLUSIONI
In generale la crescita in condizioni ambientali limitanti determina la repressione o
aumenta la sintesi di proteine di membrana o di parete (Dones et al., 1992). Tali
proteine sono spesso coinvolte in fenomeni di adesione e colonizzazione che sono
fattori con un importante ruolo nella relazione microrganismo-ospite.
In precedenti studi era stata messa in evidenza la relazione fra temperatura e
espressione di proteine parietali in Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum
(Mattarelli et al., 1999). Altri importanti fattori di stress per i batteri intestinali sono
il cambiamento di pH e l’osmolarità. Sono stati pertanto studiati numerosi fattori di
stress e la loro influenza nella specie Bifidobacterium pseudolongum subsp.
globosum sull’espressione di alcune proteine parietali del ceppo Ru 809/1 plasmide
positivo. Oltre al ceppo Ru 809/1 è stato studiato il ceppo Ru 809/8 che deriva dal
precedente ma, in seguito a cura, è plasmide negativo. Lo studio dell’influenza dei
diversi fattori di stress sullo sviluppo e sull’espressione delle proteine parietali ha
riguardato diversi pH, diverse concentrazioni di NaCl, diverse concentrazioni di
zuccheri, diverse concentrazioni di glucosio, substrato diluito, presenza di sostante
chelanti il ferro. Tutti questi singoli fattori di stress inducono variazioni quantitative
nelle BIFOP C ed H in diverso grado rimarcando quindi la preponderante influenza
dell’ambiente sullo sviluppo e sull’espressione delle proteine parietali. E’ stato
inoltre valutata l’influenza della coltura dei diversi zuccheri sul plasmide. E’ stato
osservato che concentrazioni dello 0.15 % dei numerosi zuccheri saggiati inducono
la perdita del plasmide agendo quindi come fattori di cura del plasmide. I dati
ottenuti hanno una grande rilevanza anche per quanto riguiarda il rapporto fra
ambiente e bifidobatteri ornendo importanti conoscenza per quanto riguarda
l’impiego probiotico di tale gruppo microbico.
97
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