Illumina HiSeq X 系统指南 测序系统 系统指南
本指南介绍了 HiSeq X 系统指南，包括仪器配置、试剂准备、测序流程以及维护信息。该指南旨在帮助您充分利用 HiSeq X 系统的功能，以实现高质量、高效的测序结果。
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HiSeq X™
系统指南
仅供研究使用， 不可用于诊断过程。
ILLUMINA
所有
材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
2015
年 12 月
使用自定义操作流程选择器定制简而全的工作流程指南 support.illumina.com/custom-protocol-selector.html
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的合同用途，不得用于其他任何目的。在未获得 Illumina 的事先书面同意的情况下，不得出于任何目的使用或分发本文档及其
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何第三方的类似权利授予任何许可。
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成损害。
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X、Infinium、iScan、iSelect、MiSeq、MiSeqDx、MiSeq FGx、NeoPrep、NextBio、Nextera、NextSeq、
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VeraCode、verifi、VeriSeq、南瓜橘色和流动底部设计均为 Illumina, Inc. 及/或其附属公司在美国和/或其他国家/地区的
商标。所有其他名称、徽标和其他商标均为其各自所有者的财产。 ii
材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
修订历史记录
文档
材料号 20002066
文档号 15050091 v01
部件号 15050091 修订版 E
部件号 15050091 修订版 D
日期
2015 年
12 月
2015 年
7 月
2015 年
1 月
更改描述
添加了输出文件的文件夹结构和有关运行文件夹的信息。
添加了有关年度预防性维护服务的建议。
更正了用于维护清洗的预期剂量。
更新了 HiSeq X 控制软件 3.3 版的软件描述：
•
更新了维护清洗操作流程。Tween 20 和 ProClin 300 清洗取代
了 3 步式 NaOH 清洗。
•
“Flow Cell Setup（流动槽设置）”屏幕上的流动槽类型
“HiSeq X HD v2”更换为“HiSeq X”。
•
添加了显示 RunCopyService 软件数据传输状态的传感器指示
器的相关信息。
添加了制备用于标签和双末端再合成的试剂和测序引物的说明。
添加了“Illumina SeqLab 在工作流程上的差别”小节，其中介绍
了使用 Illumina SeqLab 时可以从哪里找到试剂制备和测序的相
关说明。
添加了 HiSeq X v2.5 试剂盒的商品目录号并更新了再次杂化试剂
盒的商品目录号。
更新了在流动槽 A 和 B 上交错运行的说明。
将系统设置的描述替换为自定义系统设置的说明。
将有关故障诊断的信息移到了附录 A，将有关实时分析软件的信
息移到了附录 B。
从测序输出列表中删除了 offsets 文件和定相文件，因为 RTA2
不再生成这些文件。
从“更多资源”部分删除了 《HiSeq X Five 实验室设置和场地准
备指南》（部件号 15067045）。HiSeq X Ten、HiSeq X Five 和
Illumina SeqLab 的实验室设置和场地准备信息可以在 《HiSeq X
系统实验室设置和场地准备指南》（文档号 15050093） 中找到。
将前 25 次循环中所允许的纯度低于 0.6 的碱基检出数量从 2 更正
为 1。
更新了 HiSeq X 试剂盒列表，在其中添加了 HiSeq X Ten 试剂盒
和 HiSeq X Five 试剂盒。
将 20 件装试剂盒的名称更改为 10 件装试剂盒（只更改了名称，
内含物并未变动）。
在“更多资源”部分添加了 《HiSeq X Five 实验室设置和场地准
备指南》（部件号 15067045）。
HiSeq X 系统指南 iii
文档
部件号 15050091 修订版 C
部件号 15050091 修订版 B
部件号 15050091 修订版 A
日期
2014 年
10 月
2014 年
5 月
2014 年
3 月
更改描述
更新了 HiSeq X 控制软件 3.1 版的软件描述：
•
在“Flow Cell Setup（流动槽设置）”屏幕添加了流动槽类型
“HiSeq X HD v2”。
•
添加了每次运行后执行维护清洗或水洗的选项。每次运行后会
建议进行一次维护清洗，但这不再是强制性要求。每次维护时
不再强制要求更换垫片，但在每隔 10 天开始必要的维护清洗之
前，必须更换垫片。
•
添加了只清洗 SBS 试剂位置的选项。
•
从“Reagents（试剂）”屏幕删除了“Indexing Reagent Kit
ID（标签试剂盒 ID）”。因为标签试剂现在和双末端试剂一起
都装在 HiSeq X HD 试剂盒内。
•
更新了“Welcome（欢迎）”屏幕上的“Sequence（测
序）”命令。
指出了 HiSeq X HD (v1) 流动槽和 HiSeq X HD (v2) 流动槽可以像
流动槽 A 和流动槽 B 一样同时测序。
指出了即使连接到 BaseSpace 进行存储和分析也必须指定输出
文件夹。
添加了要求在更改盖子以及装入 SBS 试剂之前将试剂瓶翻转数
次的提示。
将酒精棉片的 VWR 商品目录号更新为 95041-714。
将安全数据表（safety data sheet，简称 SDS）的 URL 更新
为 support.illumina.com/sds.html。
更新了以下信息：
•
添加了基于图形化流动槽的特征对簇通过过滤的描述。
•
添加了对 Q-score 分组的描述。
•
更新了对可用磁盘空间的要求。
•
指出了仪器初始化的等待时间至少为 1 分钟。
•
添加了在每次运行后对 O:\ 盘执行快速格式化的最佳实践。
•
将工作流程图上
《HiSeq X HD 试剂盒参考指南》的部件号更正
为 15050092。
最初版本。 iv
材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
目录
修订历史记录
目录
简介
更多资源
仪器组件
测序耗材概述
启动 HiSeq X
自定义系统设置
查看和发送仪器数据
用户自备的耗材
简介
制备 SBS 试剂
制备标签和双末端试剂
简介
测序工作流程
输入运行参数
装入和填装试剂
装入测序流动槽
监控运行
取出试剂
执行水洗
对输出磁盘执行快速格式化
简介
执行维护清洗
闲置仪器
关闭仪器
日志文件
可能的运行设置问题
执行射流检查
在 HiSeq X 上暂停或结束运行
在流动槽 A 和 B 上交错运行
可能需要进行片段 1 引物再次杂化的情形
实时分析概述
实时分析工作流程
HiSeq X 系统指南
v
测序输出文件
输出文件夹结构
小区编号
vi
材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
第 1 章 概述
概述
HiSeq X 系统指南
1
简介
HiSeq X
™
系统将创新的工程与成熟的 SBS 技术和强大功能相结合，支持一定人口规模的人类
全基因组测序。
功能
} 双面成像 — HiSeq X 使用配备 2 个相机、4 个传感器并采用了尖端扫描技术的落射荧光系
统，来实现双面成像。
} 图形化流动槽 — 图形化流动槽允许按有序排列的方式生成测序簇，如此可增加输出片段和
数据。
}
大容量试剂冷却器 — 试剂仓是一个大容量冷却器，其存放的试剂足够整个测序运行之
用。
} 双末端运行的集成射流 — 集成的双末端射流可将试剂仓中的试剂提供给流动槽，以进行
片段 2 再合成和标签测序。
}
界面控制选项 — 仪器软件界面提供了一些选项，可让您通过使用触摸屏显示器或集成的键
盘来设置运行和操作仪器。
} 实时碱基检出 — 仪器软件可在仪器计算机上从图像提取强度，执行评定质量分值的碱基检
出，这可让您在运行期间监控质量指标，并在后续的数据分析期间节省时间。
可以使用 Illumina 分析软件或第三方软件在自定义基础架构上执行测序数据的下游分析。
}
BaseSpace
®
集成 — 测序工作流程与 BaseSpace 相集成，后者是 Illumina 用于数据分
析、存储和协作的基因组计算环境。当运行执行时，输出文件会实时传送到
BaseSpace。
Illumina SeqLab 在工作流程上的差别
如将 HiSeq X 用作 Illumina SeqLab 的组件，则工作流程会与本指南中介绍的有所不同，这是
由于 Clarity LIMS X 版本 带来的差异所造成的。从文库制备到测序的所有步骤均将受到影响。
请访问 Illumina 网站上的 Illumina SeqLab 支持页面，生成为您的实验量身定制的工作流程指
南。
2
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更多资源
可从 Illumina 网站下载以下文档。
资源
《HiSeq X 系统实验室设置和场地准备
指南》（文档号 15050093）
《HiSeq X 系统安全和合规性指南》
（文档号 15050094）
描述
提供实验室空间规范、电气要求和环境注意事项。
提供有关仪器标签、合规性证书和安全注意事项的信息。
访问 Illumina 网站上的 HiSeq X 支持页面，查看相应文档、软件下载、在线培训和常见问题解
答。有关 Illumina SeqLab 的特定信息，请访问 Illumina SeqLab 支持页面。
HiSeq X 系统指南
3
仪器组件
HiSeq X 系统由仪器、显示器、仪器控制计算机以及键盘、鼠标和条形码扫描仪等配件组成。
仪器包含 4 个主要仓室：光学模块、流动槽仓、射流仓和试剂仓。发光的状态栏指示仪器的运
行状态。
图 1 外部组件
A 光学模块 — 包含光学组件，可支持流动槽的双面成像，以及利用落射荧光实现 A、C、G 和 T
同时成像。激发激光束会穿过目标，同时通过这个目标收集荧光。
B 流动槽仓 — 包含真空控制的流动槽台，用于在测序运行期间固定流动槽。
C 射流仓 — 包含射流泵，用于将试剂输送给流动槽，然后再输送到废液容器。
D 状态栏 — 使用三种颜色指示仪器状态。蓝色指示仪器正在运行，橙色指示仪器需要引起注
意，绿色指示仪器已准备好可以开始下一个运行。
E 试剂仓 — 包含试剂托架，它可以存放试剂（用于测序运行）和清洗液（用于仪器清洗）。
4
材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
流动槽仓
流动槽仓中有流动槽台、热力站、真空系统以及连到每个流动槽的射流接线。
图 2 配有 2 个流动槽的流动槽台
A 流动槽 A
B 流动槽 B
C 流动槽拉杆 A
D 流动槽拉杆 B
流动槽 A 位于左边，流动槽 B 位于右边。每个流动槽都放置在流动槽台上，而流动槽台会按控
制软件的指示在光学模块中移入/移出。流动槽台必须位于最前方的位置，才能打开流动槽仓门
装入或取下流动槽。
流动槽放置在流动槽支架上，入口和出口均朝下，并在每个流动槽支架下通过真空方式紧固。
每个流动槽支架前面发光的流动槽拉杆用于控制真空开关。当真空密封紧密时，流动槽拉杆会
变成绿色。
HiSeq X 系统指南
5
试剂仓
试剂仓是一个大容量的试剂冷却器，包含 3 个试剂托架：2 个用于 SBS 试剂，1 个用于标签和
双末端试剂。吸管手柄可降低吸管以插入试剂瓶中。
}
SBS 试剂托架 — 可放置 250 毫升圆锥试剂瓶。流动槽 A 的试剂托架位于中央位置，流动
槽 B 的托架位于最右边。每个试剂托架都具有与内部试剂选择器阀上的接头对应的编号位
置。
} 标签和双末端试剂托架 — 位于左边位置。它有 2 行编号位置，用于放置内装双末端试剂
和标签试剂的 15 毫升圆锥形试管。左边一行用于流动槽 A，右边一行用于流动槽 B。
}
试剂冷却器 — 试剂冷却器中内含试剂托架，其内部温度保持在 2°C 到 8°C 之间。
图 3 试剂仓
A 吸管手柄
B 标签和双末端试剂的试剂托架
C 流动槽 A 的 SBS 试剂的试剂托架
D 流动槽 B 的 SBS 试剂的试剂托架
6
材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
HiSeq X 软件
仪器计算机中安装了以下三个软件应用程序：
}
HiSeq X 控制软件 — HiSeq 控制软件 (HCS) 界面会引导您完成测序运行设置步骤。运行
期间，控制软件会操作仪器硬件、控制射流、设置温度，以及提供质量统计信息的直观汇
总。
} 实时分析软件 — 实时分析 与控制软件相集成，可执行碱基检出，并为每次循环的每个碱
实时分析
} Sequencing Analysis Viewer 软件 — Sequencing Analysis Viewer (SAV) 可提供
详细的质量统计信息。
状态图标
状态图标位于每个屏幕的右上角，显示在运行设置期间和运行期间的状况变化、错误或警告。
状态图标 状态名称
状态正常
描述
未发生更改。系统正常。
信息
注意
警告
错误
仅供参考，无需任何操作。
可能需要注意的信息。
警告不会使运行停止，但是可能需要执行操作后运行才能继
续。
错误通常会导致运行停止，并且通常需要执行操作后运行才能
继续。
当状况发生变化时，相关图标会闪烁，以向您示警。
} 选择该图标可打开状态窗口并查看对该状况的说明。
} 选择 Acknowledge（确认）以接受消息，然后选择 Close（关闭）以关闭对话框。
活动和传感器指示器
“Welcome（欢迎）”屏幕的右下角显示了一系列图标，用于根据仪器传感器指示仪器活动以
及特定组件的状态。
图 4 活动指示器
从左到右，活动指示器分别代表 X、Y 和 Z 电机、电子功能、相机、射流系统和处理功能。
图 5 传感器指示器
从左到右，传感器指示器分别代表流动槽 A 温度、试剂冷却器温度、数据传输状态、
BaseSpace 云状态和流动槽 B 温度。
HiSeq X 系统指南
7
数据传输状态
数据传输状态指示器是一种传感器指示器，显示 Run Copy Service 的状态，该软件管理向输
出文件夹的数据传输。传输状态将影响您能否开始新运行或安全地格式化输出盘。
状态图标 描述
数据正在传输。传输完成前请勿格式化输出盘。
数据正在传输，但网络连接速度很慢。您可以在传输完成后设置测序运行，以及格
式化输出盘。
Run Copy Service 已关闭。
Run Copy Service 已开启，但未在传输数据。
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材料号 20002066
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测序耗材概述
在 HiSeq X 上测序时需要使用 Illumina 试剂盒。每个试剂盒均包含在 cBot 上使用的成簇试
剂，以及在 HiSeq X 上使用的 SBS 试剂、标签试剂和双末端试剂。
}
单件装试剂盒 — 每个试剂盒均包含测序 2 个流动槽或 1 个双流动槽运行所需的耗材。耗材
包装成两套，每套支持 1 个流动槽。
} 10 件装试剂盒 — 每个试剂盒均包含测序 20 个流动槽或 10 个双流动槽运行所需的耗材。
包装的耗材一次可支持 4 个流动槽。
HiSeq X 试剂盒名称
HiSeq X Ten 试剂盒 v2.5（300 次循环）
HiSeq X Ten 试剂盒 v2.5（300 次循环），10 件装
HiSeq X Five 试剂盒 v2.5（300 次循环）
HiSeq X Five 试剂盒 v2.5（300 次循环），10 件装
商品目录号
FC-501-2501
FC-501-2521
FC-502-2501
FC-502-2521
图形化流动槽
HiSeq X 使用的图形化流动槽带有数十亿个制作成流动槽玻璃的有序纳米井。这样的有序排列
会增加输出片段的数目和生成的测序数据量。
HiSeq X 试剂盒 中会提供图形化流动槽。
图 6 图形化流动槽上的簇示例
HiSeq X 系统指南
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第 2 章 入门
入门
HiSeq X 系统指南
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启动 HiSeq X
1 启动仪器控制计算机。
2 使用默认用户名和密码登录操作系统并等待其加载。
} 用户名：sbsuser
} 密码：sbs123
如果使用这些默认值无法登录，请联系设备管理员以获取站点特定的用户名和密码。
3 找到位于仪器左侧的电源开关，将其切换到“ON（打开）”位置。
至少等待 1 分钟，以便让仪器的各设备正确配置，仪器的 DoNotEject 驱动器进行初始
化。
4 关闭在 DoNotEject 初始化后打开的窗口。如果该窗口未打开，请使用 MyComputer 检
查 DoNotEject 驱动器。
注意
切勿弹出位于仪器机箱内部的 DoNotEject 闪存驱动器，也不要修改该驱动器上的文件。
此驱动器包含硬件配置文件，每当仪器打开时都会进行初始化。
5 为了确保有足够的磁盘空间，请将仪器计算机上先前运行的数据存档到网络位置。
6 使用计算机桌面上的快捷方式图标打开 HCS。
软件初始化完成后，将会打开 Welcome（欢迎）屏幕，并且屏幕右下角将会出现
“Initialized（已初始化）”图标。
仪器和控制计算机最佳实践
} 仪器正在运行时，请勿打开计算机。始终在打开仪器之前打开计算机。
} 仪器控制软件正在运行时，请勿关闭仪器。
}
关闭仪器后，请等待 1 分钟后再开启。
} 在打开计算机前，先将仪器、显示器和键盘的 USB 电缆连接至计算机背面。
} 将条形码扫描仪和鼠标连接至计算机正面的 USB 端口。
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材料号 20002066
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自定义系统设置
控制软件包含运行文件夹和 LIMS 首选项的可自定义系统设置。“Menu Options（菜单选
项）”窗口提供了一些设置，用于定义运行 ID 模板、默认文件夹位置、是否将仪器运行状况信
息发送至 Illumina 以及 LIMS 身份验证。
要自定义界面的视图，请选择 Menu | View（菜单|视图）。您可以选择以全屏或窗口形式查看
界面，也可以将界面最小化。
定义运行文件夹设置
1 从“Welcome（欢迎）”屏幕中，选择 Menu | Tools | Options（菜单|工具|选项）以打
开“Menu Options（菜单选项）”窗口。
2 要自定义运行文件夹名称的命名约定，请修改 Run ID Template（运行 ID 模板）字段中
的设置。选择 Reset（重置）可清除该字段中的数据。
3 要设置默认的输出位置，请输入以下各个文件夹的位置：
} Default Output Folder（默认输出文件夹） — 流动槽 A 上的运行的默认输出文件
夹。
}
Default Output Folder2（默认输出文件夹 2） — 流动槽 B 上的运行的默认输出文
件夹。
注意
Illumina 建议使用网络位置作为输出文件夹。不过，您也可以指定 O:\ 盘上 HiSeq Temp
文件夹以外的位置。不要使用 S:\ 盘或 C:\ 盘。因为 S:\ 盘专为仪器运行而保留，C:\
盘又太小。
4 要设置 LIMS 样品表的位置，请在 Run Setup Folder（运行设置文件夹）字段中输入该
位置。
5 选择 OK（确定）保存设置并关闭“Menu Options（菜单选项）”窗口。选择 Cancel
（取消）会关闭窗口而不保存设置。
设置 LIMS 首选项
1 从“Welcome（欢迎）”屏幕中，选择 Menu | Tools | Options（菜单|工具|选项）以打
开“Menu Options（菜单选项）”窗口。
2 输入以下 LIMS 设置：
} LIMS Server（LIMS 服务器） — 与受支持的 Illumina LIMS 进行交互的服务器的名
称。
}
LIMS User Name（LIMS 用户名） — 向 Illumina LIMS 验证身份时使用的用户名。
}
LIMS Password（LIMS 密码） — 向 Illumina LIMS 验证身份时使用的密码。
3 选择 OK（确定）保存设置并关闭“Menu Options（菜单选项）”窗口。选择 Cancel
（取消）会关闭窗口而不保存设置。
HiSeq X 系统指南
13
查看和发送仪器数据
“Welcome（欢迎）”屏幕上的“Menu（菜单）”按钮和“Menu Options（菜单选项）”
窗口提供了一些用于查看和发送仪器数据的选项。
} 要查看有关仪器硬件、软件版本的信息以及技术支持的联系信息，请选择 Menu | About
（菜单|关于）。
} 要允许仪器为每次运行将信息发送到 BaseSpace（建议如此），请选择 Menu | Tools |
Options（菜单|工具|选项），然后选中 Send instrument health data to Illumina to help Illumina improve its products（将仪器运行状况数据发送给 Illumina 以帮助其
改进产品）复选框。
我们会将所有信息保密。
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材料号 20002066
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用户自备的耗材
有关完整的用户自备耗材列表，请参见
《HiSeq X 系统实验室设置和场地准备指南》（文档号
15050093）
。
耗材
70% 异丙基酒精棉片
或 70% 乙醇
大玻璃瓶，至少 6 升容量
无粉手套
低尘实验棉巾纸
50 毫升 ProClin 300
250 毫升容量的离心管
15 毫升容量的圆锥形试管
100 毫升 Tween 20 粘性液体
方头塑料镊子
18 M Ohm 实验室级用水
供应商
一般实验室供应商
VWR，商品目录号 95041-714
一般实验室供应商
Corning，商品目录号 430776
一般实验室供应商
VWR，商品目录号 21905-026
Sigma-Aldrich，商品目录号
48912-U
一般实验室供应商
Corning，商品目录号 430776
一般实验室供应商
Corning，商品目录号 430052
Sigma-Aldrich，商品目录号
P7949
McMaster-Carr，商品目录号
7003A22
Millipore
用途
清洁流动槽和流动槽台。
制备维护清洗液。
一般用途。
清洁流动槽支架。
维护清洗。
仪器清洗。
SBS 试剂托架，位置中包含
PW1。
收集并称量废液。
PE 试剂托架，位置中包含
PW1。
维护清洗。
取下流动槽垫片。
水洗。
SBS 和 PE 试剂托架，位置
中包含 PW1。
HiSeq X 系统指南
15
16
材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
第 3 章 制备试剂
制备试剂
HiSeq X 系统指南
17
简介
在设置运行之前，需制备要用于测序的所有试剂：SBS 试剂、标签试剂和双末端试剂。无论使
用哪个版本的试剂盒，其试剂制备说明均相同。在运行设置期间，请根据软件提示装入所有试
剂。运行期间，不需要回到仪器以装入试剂。
可以在簇生成期间制备试剂。有关准备流动槽、制备成簇试剂和执行簇生成的说明，请参见
《cBot 系统指南》（文档号 15006165）
。
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材料号 20002066
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制备 SBS 试剂
依照以下说明解冻并检查 SBS 试剂：PSM、PIM 和 PCM。PB1 和 PB2 从存储环境中取出后
可直接使用。
准备相应数量的 SBS 试剂瓶。
试剂
PB1
PB2
PCM
PIM
PSM
1 个流动槽
（单流动槽运行）
1
1
1
3
1
2 个流动槽
（双流动槽运行）
2
2
2
6
2
4 个流动槽
（2 个双流动槽运行）
4
12
4
4
4
解冻 SBS 试剂
1 从 -25°C 到 -15°C 的存储环境中取出 PSM、PIM 和 PCM，放在 2°C 到 8°C 的环境
中解冻大约 16 个小时。
或者，将 PSM 和 PIM 放在装有室温去离子水的水槽中解冻大约 90 分钟。请在
单独
的水槽
中解冻 PCM。
注意
每次处理 PCM 后都请更换手套。
2 翻转每个试剂瓶将试剂混匀。
3 检查 PSM，确保看不到任何旋涡形状。
4 将 PSM 和 PIM 放在冰上。将 PCM
单独
放在冰上，以避免交叉污染。
HiSeq X 系统指南
19
制备标签和双末端试剂
试剂
PRM
PLM2
PAM
PPM
PDR
HP11
HP12
在双末端测序运行的片段 2 再合成步骤中会用到标签和双末端试剂。
为每个标签和双末端试剂准备相应数量的试管。
1 个流动槽所需的数量
（单流动槽运行）
1
1
1
1
1
1
1
2 个流动槽所需的数量
（双流动槽运行）
2
2
2
2
2
2
2
4 个流动槽所需的数量
（2 个双流动槽运行）
4
4
4
4
4
4
4
警告
这组试剂包含甲酰胺，这种脂肪酰胺可能是一种生殖毒素。吸入、摄取、皮肤接触和眼睛接触
都会对身体造成伤害。请穿戴防护装备，包括护目镜、手套和实验室工作服。请根据您所在地
区的政府安全标准，將废试剂作为化学废弃物处理并倒掉。有关环境、健康和安全信息，请参
见此套件的 SDS，网址为 support.illumina.com/sds.html
。
解冻标签和双末端试剂
1 从 -25°C 到 -15°C 的存储环境中取出以下试剂：PRM、PLM2、PAM、PPM、
PDR、HP11 和 HP12。
注意
对于非标签文库，不需要使用 HP12。
2 将试剂放在装有室温去离子水的水槽中解冻大约 20 分钟，或直到试剂解冻为止。
3 将 PRM、PLM2 和 PAM 放在冰上。
制备 PRM、PLM2、PAM、PPM、PDR、HP11 和 HP12
1 翻转每个试管将试剂混匀。
2 以 1000 rpm 的转速离心分离 1 分钟。
3 将 PRM、PLM2 和 PAM 放在冰上。
4 将 PPM、PDR、HP11 和 HP12 放在室温下。
20
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第 4 章 测序
测序
HiSeq X 系统指南
21
简介
要在 HiSeq X 上执行运行，请制备所有试剂，然后按照软件提示设置运行。运行设置步骤包括
输入运行参数、装入和填装试剂、装入流动槽以及执行射流检查。
运行设置步骤分配在 3 个选项卡：“Run Configuration（运行配置）”、“Pre-Run
Setup（运行前设置）”和“Initiate Run（启动运行）”。
}
“Run Configuration（运行配置）”屏幕包含用于设置运行参数的下拉列表、复选框或
文本字段。请使用手持条形码扫描仪扫描流动槽或试剂盒 ID，或者使用触摸屏键盘输入该
ID。键盘图标位于文本字段右侧。
}
选择 Next（下一步）可移至下一个屏幕，选择 Back（上一步）可返回到上一个屏幕。
} 在执行运行设置步骤期间，随时可以选择 Cancel（取消）来退出运行设置并返回到
“Welcome（欢迎）”屏幕。
请访问 Illumina 网站上的 HiSeq X 规格网页，以了解有关运行持续时间以及其他性能规格的信
息。
交错运行
当流动槽 A 或 B 上有正在进行的运行时，可以在相邻流动槽上启动新运行。有关详细信息，请
在流动槽 A 和 B 上交错运行
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测序工作流程
为运行准备流动槽并制备试剂。
根据控制软件界面上的提示输入运行参数。
装入用于片段 1 和片段 2 的 SBS 试剂、标签试剂（如适用）和双末端试剂。
借助用过的流动槽，确认流动正确与否。
填装 SBS 试剂并称重填装废液。
装入已成簇的 HiSeq X 流动槽，并确认流动正确。
开始测序运行。
[可选] 在第二次循环之后，检查第一次碱基报告，然后继续片段 1。
运行完成后，倒出试剂。
执行仪器清洗。
HiSeq X 系统指南
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输入运行参数
通过在“Run Configuration（运行配置）”选项卡上的一系列屏幕中输入运行参数来开始运
行设置。当您指定 BaseSpace 连接信息、输入耗材 ID、选择标签选项以及记录运行的其他参
数时，软件会引导您完成每个屏幕上的设置。
存储屏幕
1 从“Welcome（欢迎）”屏幕中，选择 Sequence（测序）打开“Storage（存储）”
屏幕。
2 [可选] 按如下方式连接到 BaseSpace。 a 选择 Connect to BaseSpace（连接到 BaseSpace）。 b 从下列 BaseSpace 选项中选择一项：
} Storage and Analysis（存储并分析） — 将运行数据发送到 BaseSpace 供
远程监控和数据分析。使用此选项需要有样品表。
}
Run Monitoring Only（仅限运行监控） — 仅将 InterOp 文件发送给
BaseSpace，供您远程监控运行。 c 使用您的 MyIllumina 帐户电子邮件和密码登录 BaseSpace。
3 选择 Browse（浏览）导航至首选输出文件夹位置。
4 确认缩略图设置为 Save All Thumbnails（保存所有缩略图）。
软件将自动保存所有缩略图图像。缩略图是指从每列小区（或测绘带）的许多小区中采集图
像，然后组合而成的 1 个缩略图图像。
5 选择 Next（下一步）。
流动槽设置屏幕
“Flow Cell Setup（流动槽设置）”屏幕记录为运行使用的流动槽的相关信息。所有字段都是
必填字段。
1 扫描或输入要测序的流动槽的流动槽 ID（条形码编号）。
2 确认流动槽类型为 HiSeq X 或 HiSeq X HD。
注意
HiSeq X 流动槽和 HiSeq X HD 流动槽可以像流动槽 A 和流动槽 B 一样同时测序。
3 输入将在每个屏幕上显示的实验名称，以便识别正在进行的运行。
4 输入用户名。
5 选择 Next（下一步）。
高级屏幕
1 [可选] 选中 Confirm First Base（确认第一次碱基）复选框。
在每次运行的第 2 次循环之后，都会自动生成第一次碱基报告并放置在运行文件夹的根级
别。选择此选项可让您在继续运行之前确认第一次碱基报告。否则，运行将继续进行，而不
显示确认对话框。
2 [可选] 从流动槽图像中，选择要从运行中删除的通道。
默认情况下，运行中会包括所有通道。将对所有通道执行 PhiX 比对。
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注意
不需要专用控制通道，此为可选项。
3 选择 Next（下一步）。
配方屏幕
配方根据“Recipe（配方）”屏幕上输入的信息自动生成。
1 选择“Index Type（标签类型）”选项：
} No Index（无标签） — 执行无标签的双末端运行。
} Single Index（单标签） — 使用 1 个 8 bp 标签片段执行双末端运行。
2 输入片段 1 和片段 2 的循环次数以及标签片段（如适用）。
3 确认系统根据所选标签类型自动填充的以下设置： a SBS：HiSeq X SBS — 显示用于片段 1 和片段 2 的 SBS 化学反应。 b Index（标签）：HiSeq X Sequencing Primer（HiSeq X 测序引物） — 显示用于
标签片段的化学反应（如适用）。 c PE turnaround（PE 反转）：HiSeq X PE — 显示用于双末端再合成的化学反应。
样品表屏幕
样品表仅为可选数据，只有在使用 BaseSpace 执行数据分析时才需要提供。
1 选择 Browse（浏览）导航至样品表所在位置。
2 选择 Next（下一步）。
试剂屏幕
“Reagents（试剂）”屏幕记录为运行使用的试剂盒的相关信息。
1 在“SBS Reagent Kit ID（SBS 试剂盒 ID）”字段中，扫描或输入以下任何 SBS 试剂
盒的试剂盒条形码 ID：
} 单件装试剂盒 — SBS 试剂盒 1 或 2
}
10 件装试剂盒 — SBS 试剂盒 A 到 F
2 在“PE Reagent Kit ID（PE 试剂盒 ID）”字段中，扫描或输入 PE 簇生成试剂盒的双末
端试剂盒条形码 ID：
} 单件装试剂盒 — PE 簇生成试剂盒 2
} 10 件装试剂盒 — PE 簇生成试剂盒 C
3 选择 300 Cycles（300 次循环）。剩余循环次数默认为 310 次。
注意
软件将从“Cycles Remaining（剩余循环次数）”字段中输入的循环次数开始递减。循环
次数不足时，软件会提示您装入新试剂。
4 选择 Prime SBS Reagents（填装 SBS 试剂）以填装试剂。请务必在装入成簇的流动
槽
之前
填装试剂。
5 选择 Next（下一步）。
HiSeq X 系统指南
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复查屏幕
1 在“Review（复查）”屏幕上可复查运行参数。
2 选择 Next（下一步）可继续，选择 Back（上一步）可更改参数。
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装入和填装试剂
输入运行参数之后，装入用于运行的 SBS、标签和双末端试剂，然后通过射流系统填装试剂。
软件将通过“Pre-Run Setup（运行前设置）”选项卡上的一系列屏幕引导您完成这些步骤。
装入 SBS 试剂
1 翻转每个试剂瓶几次混匀试剂。
注意
请在最后处理 PCM，即装入所有其他试剂之后处理，以避免交叉污染。处理好 PCM 试剂
瓶之后，务必丢弃旧手套，换上新的手套。
2 将每个试剂瓶的瓶盖换成漏斗盖。
3 打开试剂仓门。
4 执行以下操作提起测序试剂托架的吸管： a 将吸管手柄朝您的方向拉动，然后提起手柄。 b 松开手柄将其放到凹槽顶部的插槽中。确保手柄稳稳放置在插槽中。
5 将试剂托架滑出试剂仓。
6 将每个试剂瓶放置在托架上相应的编号位置。确保试剂瓶的圆锥形底部放置在托架基座的凹
陷处。
5
6
7
3
4
1
2
8
表 1 SBS 试剂位置
位置
试剂
PIM
PW1
PSM
PB1
PB2
PB2
PCM
PB2
描述
图形化结合混合液
25 毫升 PW1 或实验室级用水
图形化扫描混合液
图形化 SBS 缓冲液 1
图形化 SBS 缓冲液 2
图形化 SBS 缓冲液 2
图形化分裂混合液
图形化 SBS 缓冲液 2
7 戴上一副新的无粉乳胶手套。
8 将试剂托架滑入试剂仓中，并使托架对准试剂仓地板上凸起的定位点。
9 执行以下操作降低吸管以插入测序试剂瓶中： a 将吸管手柄朝您怀里拉动，然后降低手柄。 b 检查吸管，确保它们在向下插入漏斗盖时没有弯折。 c 松开手柄将其放到凹槽底部的插槽中。
装入标签和双末端试剂
1 按如下方式提起双末端试剂托架的吸管。 a 朝您怀里拉动并提起手柄。 b 松开手柄将其放到凹槽顶部的插槽中。确保手柄稳稳放置在插槽中。
2 使用托架手柄将试剂托架滑出试剂仓。
HiSeq X 系统指南
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3 将注入了 10 毫升 PW1 或实验室级用水的 15 毫升圆锥形试管放置在双末端托架的位置 12、
18 和 19 处。
4 取下每个试剂管的盖子，然后将试管放置在托架的相应编号位置处或标签颜色相匹配的位置
处。
表 2 双末端试剂位置
位置
试剂
10
11
PRM
PLM2
12
13
PW1
PAM
14
15
16
17
18
19
PPM
PDR
HP11
HP12*
PW1
PW1
描述
图形化再合成混合液
图形化线型混合液 2
10 毫升 PW1 或实验室级用水
图形化扩增混合液
图形化扩增预混液
图形化变性混合液（含有甲酰胺）
引物混合液，片段 2
引物混合液，标签 1 片段
10 毫升 PW1 或实验室级用水
10 毫升 PW1 或实验室级用水
*只有带标签的运行才需要 HP12。如未使用 HP12，请将 10 毫升 PW1 或实验室用水装入 15 毫升圆
锥形试管中。
5 将试剂托架滑入试剂仓中，并使托架对准试剂仓地板上凸起的定位点。
6 执行以下操作降低吸管以插入双末端试剂试管中： a 朝您怀里拉动并降低手柄。 b 检查吸管，确保它们在降低以插入试管时没有弯折。 c 松开手柄将其放到凹槽底部的插槽中。
7 选中 PW1 (25 ml) loaded in Position 2（25 毫升 PW1 已装入到位置 2）复选框，然后
选择 Next（下一步）。
填装试剂
填装试剂步骤包括装入填装流动槽、确认正确流动，然后开始填装。
注意
始终使用
用过的流动槽来填装试剂。可以使用上次运行所用的流动槽来为后续运行填装试剂或
用于运行后清洗。
装入填装流动槽
1 扫描或输入填装流动槽的填装流动槽 ID（条形码编号）。
2 用实验室级用水冲洗填装流动槽。用抹镜布或无绒棉巾纸擦干流动槽。
3 用酒精棉片和抹镜布清洁流动槽。
4 将流动槽放置在流动槽支架上，入口和出口朝
下
，条形码在右。确保流动槽最左端箭头
（表示流动方向）指向仪器。
5 朝上方和右方定位销的方向轻轻滑动流动槽，直到它不能滑动为止。
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图 7 定位在上方和右方定位销处的流动槽
A 上定位销
B 右定位销
6 将您的手从流动槽移开，以防一段时间后出现对准偏移。
7 慢慢将流动槽拉杆扳到位置 1，以形成真空并固定流动槽。
当流动槽拉杆呈绿色闪烁时，即表示已实现真空。如果拉杆不呈绿色，请参见
可能的运行设
置问题
图 8 流动槽拉杆位于位置 1
8 等待大约 5 秒钟，然后慢慢将流动槽拉杆扳到位置 2。
当流动槽拉杆呈绿色长亮时，即表示歧管已就位，流动槽已准备就绪。
图 9 流动槽拉杆位于位置 2
9 确保 Vacuum Engaged（真空作用中）复选框处于选中状态，然后选择 Next（下一
步）。
HiSeq X 系统指南
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确认正确流动
检查流动正确与否可确认流动槽和垫片是否安装正确以及歧管是否在作用中。
1 从下拉列表中选择溶液 2。
2 确认以下默认值：
}
Volume（剂量）： 125
} Aspirate Rate（吸入速度）： 250
} Dispense Rate（分发速度）： 2000
3 选择 Pump（抽水）。
4 检查流动槽是否有气泡通过通道以及歧管附近是否有渗漏。
5 如有过多气泡，请检查垫片上是否有阻塞物，并将吸入速度降至 100，然后另抽 125 微升水
到流动槽中。如果问题仍然存在，请取下该流动槽，重复清洁步骤，然后重新装入流动槽。
安置管线并开始填装
1 从废液容器中取下每个流动槽的废弃管线。
图 10 安置管线
30
2 将每个管线放入单独的 15 毫升空试管中。
3 选择 Start Prime（开始填装）。
4 可从填装屏幕监视填装步骤的进度。
5 填装步骤完成后，称重所收集的填装剂量并确认每个试管中的剂量为 1.75 毫升。
如果您在一个试剂瓶中为每个流动槽收集填装剂量，请确认该剂量为 14 毫升。
剂量计算方法如下所示：
} 除位置 2 外的每个 SBS 位置 250 微升（250 x 7 = 1.75 毫升）
} 每个通道 1.75 毫升（1.75 x 8 = 14 毫升）
6 将废弃管线放回废液容器。
7 选择 Next（下一步）。现在即可装入成簇的流动槽。
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装入测序流动槽
成簇的测序流动槽的装入步骤包括取下填装流动槽、清洁流动槽支架、装入成簇的流动槽以及
确认正确流动。
取出使用过的流动槽
1 慢慢地将流动槽拉杆扳到位置 1 以松开歧管。
图 11 流动槽拉杆位于位置 1
2 慢慢地将流动槽拉杆扳到位置 0 以松开真空密封并释放流动槽。
图 12 流动槽拉杆位于位置 0
3 从流动槽支架中提起使用过的流动槽。
清洁流动槽支架
1 戴上一副新的无粉乳胶手套。
2 用蘸有实验室级用水的无绒棉巾纸擦拭流动槽支架表面，以去除上面的盐分。
3 用酒精棉片或者蘸有乙醇或异丙醇的无绒棉巾纸擦拭流动槽支架表面。切勿让酒精滴入真空
孔或落在歧管周围。
4 如有必要，用低尘实验棉巾纸擦干台面。
5 检查流动槽支架，确保没有任何绒絮并且真空孔中没有阻塞物。
HiSeq X 系统指南
31
图 13 检查真空孔
装入测序流动槽
1 将流动槽放置在流动槽支架上，入口和出口朝
下
，条形码在右。确保流动槽最左端箭头
（表示流动方向）指向仪器。
2 朝上方和右方定位销的方向轻轻滑动流动槽，直到它不能滑动为止。
图 14 定位在上方和右方定位销处的流动槽
A 上定位销
B 右定位销
3 将您的手从流动槽移开，以防一段时间后出现对准偏移。
4 慢慢将流动槽拉杆扳到位置 1，以形成真空并固定流动槽。
当流动槽拉杆呈绿色闪烁时，即表示已实现真空。如果拉杆不呈绿色，请参见
可能的运行设
置问题
图 15 流动槽拉杆位于位置 1
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5 等待大约 5 秒钟，然后慢慢将流动槽拉杆扳到位置 2。
当流动槽拉杆呈绿色长亮时，即表示歧管已就位，流动槽已准备好可供使用。
图 16 流动槽拉杆位于位置 2
6 确保 Vacuum Engaged（真空作用中）复选框处于选中状态，然后选择 Next（下一
步）。
确认正确流动
检查流动正确与否可确认流动槽和垫片是否安装正确以及歧管是否在作用中。
1 从下拉列表中选择溶液 5。
2 输入以下值：
}
Volume（剂量）： 250
} Aspirate Rate（吸入速度）： 250
} Dispense Rate（分发速度）： 2000
3 选择 Pump（抽水）。
4 检查流动槽是否有气泡通过通道或者歧管附近是否有渗漏。
5 如有过多气泡，请检查歧管垫片上是否有阻塞物，然后使用溶液 6 重复该过程以免位置 5 中
的液体耗尽。将吸入速度降低到 100，然后另抽 250 微升水到流动槽中。
6 选择 Next（下一步）。
7 确保流动槽拉杆为绿色，然后关闭流动槽仓门。
8 确认已选中 Vacuum Engaged（真空作用中）和 Door Closed（门已关闭）复选框，
然后选择 Next（下一步）。
9 选择 Start（开始）以开始测序运行。
HiSeq X 系统指南
33
监控运行
在“Run Overview（运行概览）”屏幕可监控运行指标。
图 17 “运行概览”屏幕
A 进度条 — 监控已完成循环次数。
B 流动槽图像 — 监控已成像的通道。
C 射流图表 — 展开射流部分可监控化学反应步骤。
D 运行配置 — 查看当前运行的参数。
E 分析图表 — 按循环监控质量分值。
F 图像图表 — 按循环监控强度。对于每个已扫描测绘带，仅显示 1 个缩略图图像。其他所有图像
都不会出现在软件界面上。
第一次碱基报告
如果您在运行设置期间选择了 Confirm First Base（确认第一次碱基）选项，则在第二次循
环的成像完成后，将自动打开第一次碱基确认对话框。运行将在此步骤暂停。
1 在确认对话框中查看第一次碱基报告。
2 如果结果令人满意，则选择 Continue（继续）。
Sequencing Analysis Viewer
当有可用的运行指标时，SAV 会自动打开并显示测序运行期间生成的指标。指标以图表、图形
和表格的形式显示。运行期间您可以随时选择 Refresh（刷新）来查看更新的指标。
有关详细信息，请参见
《Sequencing Analysis Viewer 用户指南》（部件号 15051736）
。
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取出试剂
1 运行完成时，打开试剂仓门。
2 按以下方式提起相应 SBS 试剂托架和双末端试剂托架的吸管。 a 将吸管手柄向外拉。 b 在将吸管手柄向外拉的同时将它提起。 c 松开吸管手柄将其放到凹槽顶部的插槽中。确保吸管手柄稳稳放置在插槽中。
3 使用托架手柄将各试剂托架滑出试剂仓。
4 从各试剂托架上取出每个试剂瓶。
警告
这组试剂包含甲酰胺，这种脂肪酰胺可能是一种生殖毒素。吸入、摄取、皮肤接触和眼睛
接触都会对身体造成伤害。请穿戴防护装备，包括护目镜、手套和实验室工作服。请根据
您所在地区的政府安全标准，將废试剂作为化学废弃物处理并倒掉。有关环境、健康和安
全信息，请参见此套件的 SDS，网址为 support.illumina.com/sds.html
。
HiSeq X 系统指南
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执行水洗
每次测序运行后都需要执行水洗，可以选择用维护清洗来替代水洗（建议如此）。有关说明，
执行维护清洗
如果仪器闲置了一天或更长时间，请先执行水洗，然后再开始新的测序运行。
1 从“Welcome（欢迎）”屏幕中，选择 Wash | Water（清洗|水洗）。
2 选择 Yes（是）以清洗双末端试剂位置，然后选择 Next（下一步）。
3 在仪器中装入实验室级用水： a 分别在 8 个 SBS 试剂瓶中装入 250 毫升实验室级用水。 b 分别在 10 个 PE 试管中装入 12 毫升实验室级用水。
4 确保仪器中已装入一个使用过的流动槽。如果需要，请装入一个使用过的流动槽。
5 选择 Next（下一步）。
6 执行射流检查： a 从下拉列表中选择溶液 2。接受默认的抽液量。 b 选择 Pump（抽水）。 c 检查流动槽是否有气泡通过通道以及歧管附近是否有渗漏。
7 从废液容器中取下相应流动槽的废弃管线。
8 使用封口膜将废弃管线捆在一起。捆扎时须使所有末端对齐。
9 将捆好的管线末端放入 250 毫升洗瓶中。
10 选择 Next（下一步）以开始水洗。
位置
8 个 SBS 位置
8 个 SBS 位置和 10 个双末端位置
11 清洗完毕后，请称重输送的剂量。
大约的运行时间
20 分钟
60 分钟
位置
8 个 SBS 位置
8 个 SBS 位置和 10 个双末端位置
12 解开废弃管线并将其放回废液瓶中。
总输送量
32 ml
72 ml
每个通道的输送量
4 ml
9 ml
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对输出磁盘执行快速格式化
数据传输完成后，请对输出磁盘 (O:\) 执行快速格式化。快速格式化将清理磁盘，为后续运行
腾出空间，但不删除重要的系统或仪器维护文件。
运行开始前，至少要有 2 TB 才能进行双流动槽运行。如果磁盘空间在运行期间降至安全阈值以
下，软件会暂停运行，并将流动槽置于安全状态。当有充足的磁盘空间可用时，运行会自动恢
复。
注意
仪器维护日志存储在 C:\ 盘上。因此，在执行仪器清洗时对 O:\ 盘进行快速格式化比较安
全。
1 在 Windows 中打开“Computer（计算机）”，显示计算机上的各个磁盘。
2 右键单击 O:\ 盘并选择 Format（格式化）。
3 从“Format（格式化）”对话框中选择 Quick Format（快速格式化）复选框。
4 选择 Start（开始）。
HiSeq X 系统指南
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第 5 章 维护
维护
HiSeq X 系统指南
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简介
执行维护程序可确保维持良好的仪器性能。请在仪器处于不活动状态时将其关闭或闲置。除运
行结束时的水洗之外，还需定期执行维护清洗。
在运行结束时执行的水洗用于清洗系统和检查射流。维护清洗包括使用由 Tween 20 和
ProClin 300 制备的溶液清洗系统。定期进行仪器清洗可冲洗射流系统并防止盐分堆积及试剂交
叉污染，从而维护仪器性能。
预防性维护
Illumina 建议您每年安排一次预防性维护服务。如果您未签订服务合同，请联系您的区域客户经
理或 Illumina 技术支持部门安排预防性维护服务（收费）。
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执行维护清洗
当软件每 10 天提示一次时，或在运行后 — 此时可用维护清洗替代水洗（建议如此），需执行
一次维护清洗。
维护清洗大约要用 90 分钟的时间，包括使用由 Tween 20 和 ProClin 300 制备的溶液清洗系
统。定期进行仪器清洗可冲洗射流系统并防止盐分堆积及试剂和文库交叉污染，从而维护仪器
性能。
如果在维护清洗前系统打开了“Load Gasket（装入垫片）”屏幕，请先更换前歧管和后歧管
中的垫片再继续清洗。
制备维护清洗液
清洗一台仪器需制备 5 升维护清洗液。清洗液在室温下最长可存储 30 天，在此期间最多可使用
3 次。
请根据您所在地区的政府安全标准处置清洗液。
1 混合以下容量的溶液制备 250 毫升浓度为 10% 的 Tween 20。先加入水。
} 实验室级用水（225 毫升）
} Tween 20（25 毫升）
2 将搅拌棒放入容量至少为 6 升的空玻璃瓶中。
3 在玻璃瓶中混合以下容量的液体。先加入水。
} 实验室级用水（750 毫升）
}
10% Tween 20（250 毫升）
} ProClin 300（1.5 毫升）
混合后可得到 Tween 20 浓度约为 2.5%、ProClin 300 浓度约为 0.15% 的溶液。
4 将玻璃瓶放到搅拌盘上进行搅拌，直到溶液彻底混匀。
5 将 4 升实验室级用水加入溶液。
混合后可得到 Tween 20 浓度约为 0.5%、ProClin 300 浓度约为 0.03% 的清洗液。
6 继续搅拌，直到溶液彻底混匀。
7 将清洗液存放在室温下的密闭容器中，直到您准备要将其装入或补充到试剂瓶和试管中。
Tween 20 和 ProClin 300 清洗
1 从“Welcome（欢迎）”屏幕中，选择 Wash | Maintenance（清洗 | 维护）。
2 如果您存储了之前某次运行剩余的维护清洗液，请按如下方式准备清洗组件。 a 补充存储的溶液并翻转将其混匀。 b 将洗瓶和试管装入仪器中分配好的试剂托架位置。
3 如果要使用新鲜的维护清洗液，请按如下方式准备清洗组件。 a 分别在 8 个 SBS 瓶中装入 250 毫升维护清洗液。 b 分别在 10 个 PE 试管中装入 12 毫升维护清洗液。 c 为每个洗瓶和试管各分配一个试剂托架位置。在每次后续清洗中沿用这次的位置分配，
以防止吸管上残留的试剂导致交叉污染。
4 清空废水瓶。
5 选择 Next（下一步）。
HiSeq X 系统指南
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6 从流动槽台取下流动槽，将它置于一旁。
7 戴上一副新的无粉乳胶手套。
8 轻轻按压前垫片一侧，直到另一侧抬起为止。使用镊子夹紧并取下垫片。重复此步骤取下后
垫片。
图 18 取下使用过的歧管垫片
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9 在流动槽支架前端和后端的每个槽中放一片新垫片。轻轻按压到位。
10 重新装入之前取下的流动槽，以安装新垫片。
11 确保 Vacuum Engaged（真空作用中）复选框处于选中状态，然后选择 Next（下一
步）。
12 执行射流检查： a 从下拉列表中选择溶液 2。 b 接受默认的抽液量并选择 Pump（抽水）。 c 检查流动槽是否有气泡通过通道以及歧管附近是否有渗漏。 d 如果持续出现气泡，请更换垫片并重复射流检查。
13 从废液容器中取下相应流动槽的废弃管线。
14 使用封口膜将 8 个废弃管线捆在一起，捆扎时须使所有管线对齐。
15 将捆好的管线末端放入 250 毫升洗瓶中。
16 选择 Next（下一步）开始清洗。
17 清洗完成后，请选择 Return to Start（返回开始屏幕）。
18 称重输送的剂量。
位置
8 个 SBS 位置
10 个双末端位置
所有位置
输送剂量
74 毫升
52 毫升
每个通道 15.75 毫升
注意
所有洗瓶和试管已装入足够多的溶液，以确保吸管能够冲洗到。但是，由于每个位置的输
送剂量有所不同，因此清洗完成后每个洗瓶和试管含有的量也有所不同。
19 解开废弃管线并将它们放回废液容器中。
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闲置仪器
如果要将仪器闲置不超过 10 天的时间，请根据以下说明做好准备。如果持续时间超过 10 天，
关闭仪器
。
1
执行维护清洗
2 让流动槽留在流动槽台并将流动槽拉杆扳到位置 2。歧管保持在提升位置。
3 在试剂托架的每个位置中装入 10 毫升实验室级用水，然后降低吸管。
4
执行水洗
HiSeq X 系统指南
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关闭仪器
只有您在未来 10 天或更长时间内不打算使用仪器时，才能将其关闭。如果您在未来 10 天内打
算使用仪器，请参见
闲置仪器
。
请执行以下步骤安全地准备射流并关闭系统。
1
执行维护清洗
2 从流动槽台取下流动槽。
3 用酒精棉片或者蘸有乙醇或异丙醇的无绒棉巾纸仔细擦拭流动槽支架表面。
注意
切勿让酒精滴入真空孔或落在歧管周围。如有必要，用低尘实验棉巾纸擦干台面。
4 在试剂托架的每个位置中装入 10 毫升实验室级用水，然后降低吸管。
5 关闭仪器。
6 要重新启动仪器，请在所有试剂位置中装入清水，打开仪器，然后执行水洗。有关详细信
执行水洗
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材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
附录 A 故障诊断
故障诊断
HiSeq X 系统指南
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日志文件
日志文件列出控制软件中发生的任何错误。此文件用于故障诊断。
1 从“Welcome（欢迎）”屏幕中，选择 Menu | Tools | Show Log File（菜单|工具|显示
日志文件）。
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材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
可能的运行设置问题
问题
软件未初始化。
流动槽拉杆呈橙色。
流动槽拉杆呈橙色并闪
烁。
可能原因
软件无法初始化内部硬
件设备。
流动槽未安装到位。
真空未密封。
歧管未提起。
正在提供真空，但尚不
充分。
操作
关闭错误消息，然后重新启动仪器软件。
如果问题仍然存在，请重新启动仪器计算机。如
果您要重新启动计算机，请先关闭仪器，以确保
能够正确识别 DoNotEject 驱动器。
如果重新启动仪器计算机之后问题仍然存在，请
关闭仪器，至少等待 60 秒后再重新启动仪器。
取下流动槽并重复清洁步骤。
确保垫片存在且安装到位。
重新装入流动槽。
如果先前的步骤不起作用，请尝试更换垫片，然
后重新装入流动槽。
取下流动槽并重复清洁步骤。
确保垫片存在且安装到位。
重新装入流动槽。
如果先前的步骤不起作用，请尝试更换垫片，然
后重新装入流动槽。
将流动槽拉杆切换到位置 2。 流动槽拉杆呈绿色并闪
烁。
射流输送能力不佳。
真空压力状况良好。
系统中可能存在气泡。 重新放置流动槽并确认孔朝 下。
查看垫片周围是否有白色沉淀物。如果存在沉淀
物，请更换垫片。始终要在执行仪器维护清洗之
前更换垫片。
确认吸管组件已降低到位，并且每个吸管都与试
剂接触。
HiSeq X 系统指南
47
执行射流检查
在仪器安装期间和诊断射流问题时执行射流检查。
1 在“Welcome（欢迎）”屏幕上选择 Check（检查）。
2 扫描或输入填装流动槽的清洗流动槽 ID（条形码编号）。在此步骤中，请务必使用
用过的
流动槽。
3 将使用过的流动槽装入仪器中。
4 在 8 个 SBS 试剂瓶中注入 PW1 或实验室级用水，并将这些试剂瓶装到相应的 SBS 试剂
托架上。
5 从下拉列表中选择溶液 2。
6 确认以下默认值：
} Volume（剂量）： 250
}
Aspirate Rate（吸入速度）： 250
}
Dispense Rate（分发速度）： 2000
7 选择 Pump（抽水）。
8 检查流动槽是否有气泡通过通道以及歧管附近是否有渗漏。
9 如有过多气泡，请检查歧管垫片上是否有阻塞物，并将吸入速度降至 100，然后另抽 250 微
升水到流动槽中。
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在 HiSeq X 上暂停或结束运行
结束运行时不提供保存数据或恢复运行的选项。在检查运行组件或设置在相邻流动槽上进行的
在流动槽 A 和 B 上交错运行
。
暂停运行
在检查试剂量等运行组件时，可能需要暂停运行。在正常操作时，无需暂停运行。
通过临时暂停运行，您可以在不丢失数据的情况下恢复运行。RTA2 会在暂停的运行恢复后自
实时分析
。
1 从“Run Overview（运行概览）”屏幕中，选择 Pause（暂停）以查看暂停选项。
图 19 暂停选项
2 选择 Normal Pause（正常暂停）。
3 选择 Yes（是）进行确认。
软件会完成当前的化学反应或成像命令，然后将流动槽置于安全状态。
4 选择 Resume（恢复）可恢复运行。
运行期间更改试剂
如果您开始运行时只装入了部分试剂量，则可使用“Change Reagents（更改试剂）”功能
暂停运行并补充试剂。
注意
无需进行填装。
1 从“Run Overview（运行概览）”屏幕中，选择 Pause（暂停）打开暂停菜单。
2 选择 Change Reagents（更改试剂）。
3 选择 Yes（是）确认暂停命令。
软件会完成当前的化学反应或成像命令，将流动槽置于安全状态，然后打开“Reagents
（试剂）”屏幕。
4 输入以下参数：
} 新试剂的试剂盒 ID。
}
试剂预期可持续使用的循环次数。
5 选择 Next（下一步）继续装入试剂。
结束运行
如果 实时分析 被终止，则该软件将不会恢复处理，且不会保存运行数据。因此，运行在被停止
之后无法恢复。
注意
在 HiSeq X 上结束运行这一操作 无法撤销。
1 要结束运行，请选择 Abort（中止）。确认或取消该命令。
2 确认命令后会打开“Welcome（欢迎）”屏幕。
3 继续执行运行后步骤。
HiSeq X 系统指南
49
注意
如果在片段 1 期间停止运行，则无法在 cBot 上执行引物再次杂化。引物再次杂化后，在
HiSeq X 上可开始新运行以对流动槽进行测序。
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在流动槽 A 和 B 上交错运行
在流动槽 A 和 B 上交错运行时，可以设置新的运行，软件将根据需要自动暂停并在相邻的流动
槽上继续运行。系统将自动进入安全状态。
1 设置新运行。
注意
如果相邻运行正在完成某个成像步骤，软件将先暂停相邻流动槽，之后您方可装入并填装
试剂。
2 为新运行装入测序流动槽之后，请关闭仓门。
3 选择 Start（开始）开始新的测序运行。
HiSeq X 系统指南
51
可能需要进行片段 1 引物再次杂化的情形
如果片段 1 的运行指标指出簇的数量少、强度低或有其他问题，您可以执行片段 1 引物再次杂
化来挽救流动槽。片段 1 引物再次杂化在 cBot 上进行，不会损坏流动槽上的簇。
HiSeq X 图形化流动槽上进行的片段 1 引物杂化需要使用以下 Illumina 耗材：
}
HiSeq X HD cBot 多引物再次杂化试剂盒（商品目录号 GD-305-1001）
} HiSeq cBot 歧管（商品目录号 SY-401-2015）
有关详细信息，请参见
《HiSeq X 流动槽上的片段 1 引物再次杂化》（部件号 15053711
）。
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附录 B 实时分析
实时分析
HiSeq X 系统指南
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实时分析概述
HiSeq X 使用名为 RTA2 的 实时分析 软件实施。RTA2 在仪器计算机上运行，会从图像提取强
度、执行碱基检出，并向碱基检出分配质量分值。RTA2 和控制软件通过 Web HTTP 接口和共
享内存文件进行通信。RTA2 一旦被终止，处理过程便无法恢复，并且运行数据也不会保存下
来。
注意
RTA2 不会计算逆多路复用性能，因此将不填充 Sequencing Analysis Viewer (SAV) 中的
“Index（标签）”选项卡。
输入文件
RTA2 需要以下输入文件：
}
包含在本地系统内存中的小区图像。
} RunInfo.xml，在运行开始时由控制软件自动生成。RTA2 从此文件中读取运行名称、循环
次数、片段是否为标签片段以及流动槽上小区的数目。
} RTA.exe.config，它是 XML 格式的软件配置文件。
RTA2 接收来自控制软件的命令，这些命令包括 RunInfo.xml 文件的位置信息以及是否指定了
可选输出文件夹。
输出文件
每个通道的图像在内存中以小区的形式传递给 RTA2。RTA2 将根据这些图像生成初级输出，
即一组带有质量分值的碱基检出文件和过滤文件。其他文件支持生成初级输出文件。
} 碱基检出文件 — 对于所分析的每个小区，将为每次循环的每个小区生成一个压缩的碱基检
出 (*.bcl) 文件。碱基检出文件包含碱基检出及相关的质量分值。
}
过滤文件 — 每个小区均会生成过滤信息，该信息包含在整个运行期间每个小区的 1 个过滤
(*.filter) 文件中。该过滤文件指定簇是否通过过滤。
} 簇位置文件 — 一个簇位置 (s.locs) 文件包含流动槽上每个簇的 X、Y 坐标。
初级输出文件用于后续数据分析。请使用 bcl2fastq 转换软件进行逆多重分析和 FASTQ 转
换。要转换 HiSeq X 中的数据，请使用 bcl2fastq v2.14.03.07 或更高版本。有关最新软件版
本和下载信息，请参见 Illumina 网站上的 HiSeq X 支持页面。
RTA2 提供存储为 InterOp 文件的实时运行质量指标。InterOp 文件是二进制文件，其中包含
小区、循环和片段级别指标，需要有这些文件才能在 Sequencing Analysis Viewer 中查看指
标。要查看 RTA2 生成的指标，请使用 SAV v1.8.37 或更高版本。
测序输出文件
错误处理
RTA2 会创建日志文件并将其写入 RTALogs 文件夹。错误以 *.tsv 文件格式记录在错误文件
中。
在处理结束时，以下日志和错误文件会传送至最终输出目的地：
} *GlobalLog*.tsv 汇总重要运行事件。
} *LaneNLog*.tsv 列出每个通道的处理事件。
}
*Error*.tsv 列出在运行期间发生的错误。
} *WarningLog*.tsv 列出在运行期间发生的警告。
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材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
数据传输
在整个运行过程中，RTA2 将请求 Run Copy Service 进行数据传输，该软件管理向指定的输
出文件夹位置的传输。如果使用 BaseSpace，则将由 BaseSpace Broker 管理向
BaseSpace 的数据传输。网络连接中断时，RTA2 将继续处理并在本地写入数据。连接恢复
后，数据传输随即恢复。
注意
确保您的网络连接符合将运行数据发送到 BaseSpace 所需的最低要求。有关详细信息，请参
见适用于您的 HiSeq X 配置的实验室设置和场地准备指南。请参见 更多资源（第 3 页） 。
处理完成后，RTA2 将创建名为 RTAComplete.txt 的标记文件。此文件生成后，数据传输即
告完成。屏幕底部的传感器指示器将显示传输状态。有关详细信息，请参见
活动和传感器指示
器
HiSeq X 系统指南
55
实时分析工作流程
模板生成
配准和强度提取
颜色矩阵修正
经验定相修正
碱基检出
质量评分
映射簇位置。
记录图形化流动槽上每个簇的位置，以及确定每个簇的强度值。
修正不同通道之间的串扰。
修正定相和预定相的效果。
确定每个簇的碱基检出。
为每个碱基检出分配质量分值。
模板生成
模板生成会使用 X 和 Y 坐标定义小区中每个簇的位置。模板用作配准和强度提取的后续步骤的
参考。
由于图形化流动槽的阵列安排，根据行数、列数以及流动槽上纳米井之间的距离便可预先确定
图形化流动槽
簇位置将写入整个运行对应的一个簇位置 (s.locs) 文件。
配准和强度提取
配准和强度提取在生成簇位置的模板之后开始。
}
配准会将簇的模板位置转换为四色通道的每个通道中图像上的位置。
} 强度提取用于确定给定图像的模板中每个簇的强度值。
如果某次循环中的任何图像的配准失败，则在该循环中不会为该小区生成碱基检出。使用 SAV
可检查缩略图图像并标识配准失败的图像。
颜色矩阵修正
进行配准和强度提取之后，RTA2 会修正通道之间的串扰。例如，若某个簇在 C 通道中显示强
度，同时某些强度也显示在 A 通道中，则会发生串扰。使用 4 x 4 颜色矩阵，RTA2 可生成串扰
较少或无串扰的矩阵修正强度，从而平衡颜色通道之间的整体强度的差异。
经验定相修正
在测序反应期间，簇中的每个 DNA 链在每次循环中均会扩展一个碱基。定相和预定相在 DNA
链与当前结合循环异相时发生。
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材料号 20002066
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} 当碱基落在后面时，便会发生定相。
}
当碱基跳到前面时，便会发生预定相。
图 20 定相和预定相
A 具有定相碱基的片段
B 具有预定相碱基的片段
RTA2 将使用经验定相修正算法来修正定相和预定相的效果，这可最大限度确保整个运行期间
每次循环的数据质量。
碱基检出
为串扰、定相和预定相修正原始强度之后，强度最亮的颜色通道就是该循环中该簇的碱基检
出。使用 RTA2 的 HiSeq X 上的碱基检出在第 3 次循环之后开始。
碱基检出用于确定特定循环中给定小区的每个簇的碱基（A、C、G 或 T）。碱基检出保存到碱
基检出 (*.bcl) 文件中，这些文件是二进制文件，每个检出和质量分值 1 个字节。每个碱基检
出文件均包含碱基检出及碱基检出质量分值。要实现碱基检出，簇必须先通过纯度过滤。未通
过过滤或因无图像或图像无法配准而无法检出的簇会标记为无检出。无检出以 (N) 表示。
簇通过过滤
在对片段 1 执行前 25 次循环期间，纯度过滤会从分析结果中去除低质量簇。如果在前 25 次循
环中，纯度值低于 0.6 的碱基检出不超过 1 个，簇将通过过滤。纯度定义为最亮的碱基强度与
最亮和第二亮的碱基强度之和的比。通过过滤的簇的百分比在分析报告中以 %PF 表示。
HiSeq X 图形化流动槽含有有序排列的簇。原始簇计数中既有不含簇的空井，也有存在多个序
列的多克隆井，但它们都无法通过过滤。因此，图形化流动槽上有序排列的簇通过过滤的百分
比相对较低。
图 21 空井和多克隆井（包含在原始簇计数中）
HiSeq X 系统指南
57
图 22 包含非 PF 簇的井（显示为灰色）
质量评分
质量分值（或 Q-score）是对碱基检出不正确概率的预测。Q-score 越高，表示碱基检出的
质量越高，正确率也越高。
Q-score 可以简单地让您了解小错误的概率。质量分值以 Q(X) 表示，其中 X 是分值。下表显
示了质量分值与错误概率之间的关系。
Q-Score Q(X)
Q40
Q30
Q20
Q10
错误概率
0.0001（万分之一）
0.001（千分之一）
0.01（百分之一）
0.1（十分之一）
注意
质量评分基于 Phred 算法的修改版本进行。
质量评分会计算每个碱基检出的一组预测因素，然后使用预测因素值在质量表中查找 Qscore。创建质量表的目的是根据特定的测序平台和化学反应版本配置为生成的运行提供最准
确的质量预测。
确定 Q-score 之后，结果会记录在碱基检出 (*.bcl) 文件中。
Q-Score 分组
RTA2 会将质量分值分成几个特定范围或不同分组，并为每个范围分配值。Q-score 分组可以
在不影响下游应用程序的准确性或性能的情况下大幅降低所需的存储空间。
Q-score 分组对于分析过程的效率以及 HiSeq X 高通量模式下的数据传输要求有着积极的作
用。因为该压缩算法能够更高效地压缩文件，所以生成的 *.bcl 文件很小。写入仪器计算机并
传输到网络位置的数据变得更少，文件复制速度变得更快。
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材料号 20002066
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附录 C 输出文件和文件夹
输出文件和文件夹
HiSeq X 系统指南
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测序输出文件
文件类型
碱基检出文件
簇位置文件
过滤文件
InterOp 文件
实时分析配置文件
运行信息文件
缩略图文件
文件描述、位置和名称
所分析的每个小区均纳入一个碱基检出文件中，该文件包含碱基检出和
已编码的质量分值。
Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] — 文件存储在每个通道的各循
环文件夹中。 s_[通道]_[小区].bcl.gz
，其中通道为一位数的通道编号，小区为四位
数的小区编号。系统将使用 gzip 压缩方式来压缩碱基检出文件。
对于每个小区，1 个簇位置文件均包含每个簇的 XY 坐标。簇位置文件是
模板生成的成果。
Data\Intensities — 运行的一个文件存储在 Intensities 文件夹中。 s.locs
过滤文件指定簇是否通过过滤。过滤文件在第 26 次循环时使用前 25 次
循环的数据生成。
Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] — 对于每个通道和小区，文件
存储在对应的 1 个文件夹中。 s_[通道]_[小区].filter
用于 Sequencing Analysis Viewer 的二进制报告文件。InterOp 文件
在整个运行期间将得以更新。
InterOp 文件夹
实时分析配置文件创建于运行开始时，列出运行的设置。
[根文件夹]
RTAConfiguration.xml
列出运行名称、每个片段中的循环次数、片段是否为带标签的片段以及
流动槽上测绘带和小区的数量。运行信息文件创建于运行开始时。
[根文件夹]
RunInfo.xml
在成像期间，每次循环时每个测绘带中的各通道和小区的缩略图图像。
Thumbnail_Images\L00[X]\C[X.1] — 对于每个通道，文件存储在 1
个文件夹中，对于每次循环，文件存储在 1 个子文件夹。 s_[通道]_[小区]_[通道].jpg
— 小区以四位数编号表示，这些数字分别
。
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输出文件夹结构
Config — 运行的配置设置。
Data
Intensities
BaseCalls
L00[X] — 各通道的碱基检出文件，每次循环累积到 1 个文件中。 s.locs
Images
Focus
L00[X] — 各通道的聚焦图像。
InterOp — Sequencing Analysis Viewer 使用的二进制文件。
Logs — 描述运行事件的日志文件。
Recipe — 以试剂夹盒 ID 命名的运行特定配方文件。
RTALogs — 描述 RTA2 事件的日志文件。
Thumbnail_Images — 部分小区 9 个位置的缩略图（为每次循环和每个碱基生成）。
RTAConfiguration.xml
RunInfo.xml
RunParameters.xml
运行文件夹名称和路径
运行文件夹是存放测序运行的输出的根文件夹。在运行设置期间，软件会提示您输入运行文件
夹的路径。默认情况下，该文件夹使用以下格式命名：
YYMMDD_<计算机名称>_<运行编号>_<流动槽所处方位><流动槽 ID>
例如： 110114_SN106_0716_A90095ACXX
仪器每执行一次测序运行，运行编号便会加 1。在运行设置步骤中输入的流动槽所处方位（A 或
B）和流动槽 ID 会附加到运行文件夹名称中。
运行文件夹会写入到运行设置期间所指定的输出路径中。流动槽 A 的临时运行文件夹会写入到
D: 盘，流动槽 B 的临时运行文件夹会写入到 E: 盘。
HiSeq X 系统指南
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小区编号
每次循环中，HiSeq X 图形化流动槽会在每个通道的顶面和底面的 96 个小区内成像。8 个通道
中，每一个通道都有 2 个测绘带，每个测绘带有 24 个小区。小区根据位置编号。
注意
测绘带是流动槽通道内的一条小区。
小区名称是一个 4 位数字，代表其在流动槽上的位置。
}
第 1 位数表示表面：
}
1 表示顶面
} 2 表示底面
} 第 2 位数表示测绘带：
}
1 表示第 1 个测绘带
}
2 表示第 2 个测绘带
} 最后 2 位数表示小区，从 01 到 24。小区编号从 01 开始（位于流动槽的输出端）一直到 24
结束（位于输入端）。
图 23 小区编号
此示例中的小区指流动槽顶面第 2 个测绘带上的第 7 个小区。
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材料号 20002066
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索引
HiSeq X 系统指南
%
B
BaseSpace
C
F
帮助
I
L
P
Q
R
S
U
存储容量
帮
保
报
比
标
菜
仓
测
查
橙
63
64
纯
耗材
簇
存
错
打
登
第
垫
定
警报
放
废
关
LIMS
耗
盒
流动槽
碱
交
警
可
客
命名
流
PhiX
漏
密
命
默
清洗
配
材料号 20002066
文档号 15050091 v01 CHS
HiSeq X 系统指南
RTA2
强
清
软件
软
商品目录号
商
设置
设
射
渗
生
剩
实
试剂
试
试剂位置
输
输出文件夹
输送剂量
数据
数
水
水洗
缩
索
填
条
通道
通
同
图
65
66
托
网
维
位
位置, 试剂
温
文
无
闲
小
性
旋
循
颜
样
应
硬
用
预
预期剂量
远
运
运行概览
再
在
暂
真
质
重
转
状
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0800.451.650
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