Zigen | HX-44 | Untersuchungen zum Mechanismus und zur Regulation der

Aus der
Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik Tübingen
Abteilung Innere Medizin I
Ärztlicher Direktor: Professor Dr. M. Gregor
Untersuchungen zum Mechanismus und zur
Regulation der intestinalen Anionensekretion im
Duodenum des Kaninchens
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät
der Eberhard-Karls-Universität
zu Tübingen
vorgelegt von
Stefanie Spiegel, geb. Christiani
aus Aachen
2003
Dekan:
1. Berichterstatter:
2. Berichterstatter:
Professor Dr. C. D. Claussen
Frau Professor Dr. U. Seidler
Privatdozent Dr. M. Sessler
meinen Eltern gewidmet
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:
Jacob P., Christiani S., Rossmann H., Lamprecht G., Vieillard B., Muller R., Gregor
M. & Seidler U. (2000): Role of Na+ HCO3- -cotransporter NBC1, Na+/H+ exchanger
NHE1, and carbonic anhydrase in rabbit duodenal bicarbonate secretion.
Gastroenterology, 119, 406-419
Spiegel S., Phillipper M., Rossmann H., Riederer B., Gregor M. & Seidler U. (2003):
Independence of apical Cl-/HCO3--exchange and anion conductance in duodenal HCO3-secretion. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., im Druck
Inhalt
1
Einleitung ................................................................................................................ 1
1.1
Schutzmechanismen des Duodenums............................................................... 1
1.1.1
Die duodenale Mukusschicht ................................................................... 1
1.1.2
Die duodenale Bikarbonatsekretion.......................................................... 2
1.1.2.1
Allgemeines .......................................................................................... 2
1.1.2.2
Regulation............................................................................................. 3
1.2
Transportproteine des Duodenozyten............................................................... 5
1.2.1
Allgemeines .............................................................................................. 5
1.2.2
Apikal lokalisierte Transportproteine....................................................... 7
1.2.2.1
Apikaler Anionenaustausch.................................................................. 7
1.2.2.2
Das CFTR-Protein .............................................................................. 10
1.2.2.2.1
Zystische Fibrose.......................................................................... 10
1.2.2.2.2
Eigenschaften des CFTR-Proteins................................................ 10
1.2.3
1.2.3.1
Der basolateral lokalisierte Na+/HCO3--Kotransporter....................... 12
1.2.3.2
Die Rolle der Karboanhydrase ........................................................... 13
1.2.3.3
Intestinaler Na+/H+-Austausch ........................................................... 13
1.2.3.4
Basolateral lokalisierter Cl--Import .................................................... 15
1.3
2
Die Bikarbonat-Bereitstellung durch den Duodenozyten....................... 12
Fragestellung .................................................................................................. 16
Material und Methoden ....................................................................................... 17
2.1
Material........................................................................................................... 17
2.1.1
Chemikalien und Abkürzungen .............................................................. 17
2.1.2
Verwendete Geräte ................................................................................. 20
2.1.3
Versuchstiere .......................................................................................... 20
2.2
Methoden........................................................................................................ 21
2.2.1
Das Kurzschlussstromexperiment .......................................................... 21
2.2.2
pH-stat-Titration ..................................................................................... 22
Inhalt
II
2.2.3
Aufbau des Ussing-Kammer-Setups ...................................................... 24
2.2.4
Transepitheliale Fluxmessungen ............................................................ 25
2.2.5
Operation des Kaninchens ...................................................................... 25
2.2.6
Präparation des Duodenums ................................................................... 26
2.2.7
Verwendete Reagenzien ......................................................................... 27
2.2.8
Versuchsschemata .................................................................................. 29
2.2.8.1
Allgemeines Vorgehen ....................................................................... 29
2.2.8.2
Veränderung der ionalen Zusammensetzung des Perfusats ............... 29
2.2.8.3
Hemmung einzelner Ionentransportmechanismen ............................. 30
2.2.8.3.1
Blockade des serosal lokalisierten Na+K+2Cl--Kotransporters
(NKCC)
...................................................................................................... 30
2.2.8.3.2
Blockade des Cl-/HCO3--Austausches und des Na+/HCO3--
Kotransports durch DIDS ............................................................................... 30
2.2.8.3.3 Hemmung der Karboanhydrase durch Azetazolamid................... 30
2.2.8.3.4
Blockade des zellulären Na+/H+ -Austausches ............................. 31
2.2.8.3.5 Hemmung der Na+/K+-ATPase .................................................... 31
2.2.8.3.6
2.2.8.4
Durchführung der radioaktiven 3H-Mannitol, 36Chlorid und 22Natrium-
Fluxe
............................................................................................................ 32
2.2.9
3
Hemmung neuronaler Natriumkanäle .......................................... 32
Auswertung und Statistik ....................................................................... 34
Ergebnisse ............................................................................................................. 35
3.1
Grundprinzipien der Versuchsdurchführung .................................................. 35
3.2
Messungen der Bikarbonatsekretion und des Kurzschlussstromes ................ 36
3.2.1
Verlauf der Bikarbonatsekretion und des Isc nach Stimulation mit 8-Br-
cAMP, Bumetanid und Ouabain............................................................................. 36
3.2.2
Verlauf von Bikarbonatsekretion und Isc unter luminal Cl--freien
Bedingungen........................................................................................................... 38
3.2.3
Effekt von luminal appliziertem DIDS [1 mM] auf die Stimulation mit 8-
Br-cAMP ................................................................................................................ 40
3.2.4
Verlauf von Bikarbonatsekretion und Isc unter bilateral Cl--freien
Bedingungen........................................................................................................... 42
Inhalt
III
3.2.5
Stimulation mit 8-Br-cAMP in bilateraler Abwesenheit von Cl--Ionen
und luminaler Anwesenheit von DIDS [1 mM] ..................................................... 44
3.2.6
Auswirkungen der Stimulation durch 8-Br-cAMP [1 mM] auf die
Bikarbonatsekretion und den Isc in serosaler Anwesenheit von Bumetanid
[0,5 mM] ................................................................................................................ 46
3.2.7
Effekt serosaler Abwesenheit von CO2/HCO3- auf Bikarbonatsekretion
und Isc
................................................................................................................ 47
3.2.8
Auswirkung der serosalen Anwesenheit von DIDS [1 mM] auf die 8-Br-
cAMP-stimulierte Bikarbonatsekretion und den Isc .............................................. 48
3.2.9
Effekt von serosal appliziertem DIDS [3 mM] auf die 8-Br-cAMP-
mediierte Bikarbonatsekretionsantwort und den Isc .............................................. 50
3.2.10
Hemmung
der
Karboanhydrase
durch
Azetazolamid
[1
mM]:
Auswirkung auf die 8-Br-cAMP-stimulierte Bikarbonatsekretion und den Isc ..... 51
3.2.11
Effekt von serosal appliziertem DIDS [1 mM] und Azetazolamid [1 mM]
auf die 8-Br-cAMP-mediierte Bikarbonatsekretionsantwort und den Isc .............. 53
3.2.12
Selektive Hemmung des NHE1 durch Hoechst 642 [1 µM]: Auswirkung
auf die 8-Br-cAMP-stimulierte Bikarbonatsekretion und den Isc.......................... 54
3.2.13
Effekt von Hoechst 642 [1 µM] und DIDS [1 mM] serosal auf die 8-Br-
cAMP mediierte Bikarbonatsekretionsantwort und den Isc ................................... 56
3.2.14
Die 8-Br-cAMP-mediierte Bikarbonatsekretionsantwort und der Isc-
Verlauf nach serosaler Applikation von DIDS [1 mM], Hoechst 642 [1µM] und
DMA [0,5 mM] ...................................................................................................... 57
3.2.15
Effekt von serosal appliziertem Hoechst 642 [1 µM] und bilateral
appliziertem
Azetazolamid
[1
mM]
auf
die
8-Br-cAMP-mediierte
Bikarbonatsekretionsantwort und den Isc............................................................... 58
3.3
Radioaktive Fluxmessungen........................................................................... 59
3.3.1
3.3.1.1
Bidirektionale 3H Mannitol Fluxe .......................................................... 60
Änderung des transepithelialen duodenalen 3H-Mannitolfluxes von
serosal nach mukosal nach Stimulation mit 8-Br-cAMP [1m M] ...................... 60
3.3.1.2
3
Vergleich der Bikarbonatsekretionsrate und des transepithelialen
H- Mannitol-Fluxes unter basalen Bedingungen und nach Stimulation mit 8-Br-
cAMP
........................................................................................................ 61
Inhalt
IV
3.3.2
Bidirektionale 36Cl--Fluxe ...................................................................... 62
3.3.2.1
Effekt von 8-Br-cAMP [1 mM], Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain
[0,5 mM] auf den duodenalen bidirektionalen
36
Cl--Flux unter „open-circuit-
current“-Bedingungen ........................................................................................ 63
3.3.2.2
Effekt von 8-Br-cAMP [1 mM], Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain
[0,5 mM] auf den duodenalen bidirektionalen
36
Cl--Flux unter „short-circuit-
current“-Bedingungen ........................................................................................ 65
3.3.3
Bidirektionale 22Na+ Fluxe ..................................................................... 66
3.3.3.1
Bidirektionaler
22
Na+-Flux unter basalen Bedingungen und unter
Einwirkung von 8-Br-cAMP [1 mM], Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain
[0,5 mM]
4
........................................................................................................ 66
Diskussion.............................................................................................................. 69
4.1
Methode .......................................................................................................... 69
4.1.1
Grundsätzliches ...................................................................................... 69
4.1.2
Mukosapräparation ................................................................................. 69
4.1.3
Durchgeführte Messungen an der Ussingkammer.................................. 70
4.2
4.1.3.1
pH-stat-Titration ............................................................................. 70
4.1.3.2
Kurzschlussstromexperiment ......................................................... 70
4.1.3.3
Radioaktive Fluxmessungen........................................................... 71
Durchgeführte Versuche................................................................................. 71
4.2.1
Allgemeines ............................................................................................ 71
4.2.2
Funktionelle Differenzierung der elektrogenen und elektroneutralen
duodenalen Bikarbonatsekretion ............................................................................ 72
4.2.2.1
Kontrollversuch .............................................................................. 72
4.2.2.2
Inhibition des apikalen Anionenaustauschers ................................ 74
4.2.2.2.1
Das DRA-Protein ........................................................................ 74
4.2.2.2.2
Hemmung des apikalen Anionenaustausches durch luminalen Cl--
Ersatz
..................................................................................................... 75
4.2.2.2.3
Hemmung des apikalen Anionenaustausches durch DIDS......... 77
4.2.2.2.4
Die Rolle einer Leitfähigkeit für Cl--Ionen in der basalen und
stimulierten Bikarbonatsekretion.................................................................... 78
Inhalt
V
4.2.2.3
Bilaterale Hemmung Cl--abhängiger Transportmechanismen ....... 80
4.2.2.4
Blockade des basolateral gelegenen NKCC ................................... 82
4.2.2.5
Bidirektionale Fluxstudien für 3H-Mannitol,
36
Cl- und
22
Na+ unter
Kontrollbedingungen .......................................................................................... 83
4.2.3
Untersuchung unterschiedlicher Systeme zur duodenalen epithelialen
Bikarbonatbereitstellung und deren Regulation ..................................................... 85
4.2.3.1
Versuchsdurchführung in serosaler Abwesenheit von CO2/HCO3- 92
4.2.3.2
Inhibition des basolateral gelegenen Na+/HCO3--Kotransporters .. 93
4.2.3.3
Hemmung der intrazellulären Karboanhydrase.............................. 94
4.2.3.4
Selektive
Blockade
verschiedener
Isoformen
des
Na+/H+-
Austauschers....................................................................................................... 96
5
Zusammenfassung .............................................................................................. 100
6
Abbildungen und Tabellen ................................................................................ 103
7
Literatur .............................................................................................................. 108
8
Danksagung......................................................................................................... 121
9
Lebenslauf ........................................................................................................... 123
1 Einleitung
1.1
Schutzmechanismen des Duodenums
Die gastroduodenale Mukosa verteidigt sich äußerst effektiv gegen die vielfältigen täglich auf sie einwirkenden exogenen und körpereigenen Noxen wie die Magensäure und
das Pepsin. Schon seit rund 200 Jahren erforscht man die Schutzmechanismen, die verhindern, dass sich der Magen und das Duodenum selbst verdauen. Pavlov schlug bereits
1898 vor, dass die luminale Magensäure durch eine alkalisierte Schleimschicht neutralisiert wird. Als weitverbreitete Folge einer Störung der gastroduodenalen Verteidigungsmechanismen ist das Magen- bzw. Duodenalulkus zu nennen, dessen Ätiologie in
den vergangenen 25 Jahren Gegenstand intensiver Forschung war. Besonders die letzten
Jahre haben durch die Entdeckung der entscheidenden Rolle des Helicobacter pylori
(103) in der Pathogenese der Ulkuserkrankung großen Erkenntnisgewinn erbracht.
Einige Autoren teilen die duodenale Abwehr gegen schädigende Einflüsse in drei Phasen ein: zum einen in die präepithelialen (alkalinisierte Mukusschicht) und die epithelialen (tight junctions sowie plasmamembranärer Ionentransport), zum anderen in die
postepithelialen Faktoren (Mikrozirkulation, Entzündungszellen und nervale Regulation) (6). Auf einige dieser Faktoren soll hier näher eingegangen werden.
1.1.1 Die duodenale Mukusschicht
Eine hochvisköse, zu 95% aus Wasser und zu 3-5% aus charakteristischen Glykoproteinen bestehende Schleimschicht, die auch geringe Mengen an Lipiden, Nukleinsäuren
und andere Proteine enthält und von den Becherzellen und Brunner´schen Drüsen hergestellt wird (41), bedeckt die Gesamtoberfläche der intestinalen Mukosa und damit
auch das Duodenalepithel, das seinerseits HCO3--Ionen in diese hinein sezerniert. Sie
wird auch als „unstirred layer“ oder „strömungsfreie Schicht“ bezeichnet, dient als
Gleitschicht für den Nahrungsbrei und stellt zusammen mit dem vom Duodenalepithel
sezernierten Bikarbonat eine wirksame Barriere gegen die luminale Säure, Verdauungs-
1 Einleitung
2
enzyme und exogenen Noxen dar. Auf diese Weise wird ein pH-Gradient zwischen Epithelzelloberfläche und Magen- bzw. Darmlumen geschaffen (87). Am Duodenum der
Ratte ist gezeigt worden, dass sie den Durchtritt von bestimmten Makromolekülen wie
zum Beispiel bakteriellen Toxinen (41;79) und auch das Eindringen einer Vielzahl
chemischer Substanzen (7) verhindern kann. Sogenannte von den Epithelzellen produzierte „Kleeblatt-Peptide“ scheinen an der Stabilität der Mukusschicht maßgeblich beteiligt zu sein (79). Die Intaktheit dieser Schleimschicht zählt zusammen mit der epithelialen Bikarbonatsekretion zu den wichtigsten Schutzmechanismen des Duodenalepithels. Die für die vorliegende Arbeit durchgeführten Experimente sollten von diesen
Mechanismen die duodenale Bikarbonatsekretion näher charakterisieren.
1.1.2 Die duodenale Bikarbonatsekretion
1.1.2.1 Allgemeines
Die Duodenalmukosa wird durch 4 verschiedene Zelltypen repräsentiert: den hochprismatischen Enterozyten, die am apikalen Zellpol durch einen Schlussleistenkomplex fest
miteinander verbunden sind, den muzinsezernierenden Becherzellen (die im Duodenum
eine nur geringe Dichte aufweisen), den hormonproduzierenden enteroendokrinen Zellen, und den Paneth´schen Körnerzellen, die sowohl bakteriostatische als auch digestive
Funktionen ausüben zu scheinen Die zu Plicae circulares aufgeworfene Dünndarmmukosa besitzt zusätzlich dicht stehende Villi intestinales. An der Basis der Villi oder Zotten münden kurze, schlauchförmige Darmdrüsen, die Krypten. Dementsprechend unterscheidet man im Dünndarm Villus- und Kryptenzellen, wobei ersteren hauptsächlich
resorptive und letztgenannten sekretorische Funktionen zugeschrieben werden. Insgesamt bedeutet diese Schleimhautanordnung eine enorme, für die Funktion des Dünndarms erforderliche Oberflächenvergrößerung. In der Submukosa des Duodenums befinden sich die sogenannten „Brunner´schen Drüsen“, die teilweise die Lamina muscularis mucosae durchbrechen und ein muzin- und bikarbonatreiches, alkalisches Sekret
ins Lumen abgeben (35). Sie liegen proximal in höherer Dichte als distal vor und wurden in früheren Arbeiten oft alleine für die Bikarbonatsekretion im Duodenum verantwortlich gemacht, unter anderem deshalb, weil im proximalen Duodenum in mehreren
1 Einleitung
3
Arbeiten eine höhere Bikarbonatsekretionsrate als im distalen Duodenum gefunden
wurde (71). Diese nach distal hin abnehmende Sekretion weisen jedoch auch Spezies
auf, deren Duodenum keine Brunner´schen Drüsen besitzt (39). Ainsworth et al.
schließlich konnten beweisen, dass die duodenale Bikarbonatsekretion von den Oberflächenepithelzellen und nicht von den Epithelien der Brunner´schen Drüsen ausgeht (4).
1.1.2.2 Regulation
Die Regulation der duodenalen Bikarbonatsekretion in vivo beinhaltet ein teilweise noch
nicht verstandenes komplexes Zusammenspiel unterschiedlicher Neurotransmitter und
Hormone (57). Bereits gut untersucht ist die Wirkung einiger Substanzen auf die Bikarbonatsekretion sowohl in vitro als auch in vivo, wobei hier auf einige Sachverhalte kurz
eingegangen werden soll. Es ist schon seit längerem bekannt, dass sich die elektrogene
Bikarbonatsekretion durch cAMP-, cGMP- und Ca2+-abhängige Analoga steigern lässt
(59;137). Der second messenger cAMP entsteht durch die Katalyse des Enzyms Adenylatzyklase, welches ein Membranenzym darstellt, das über große G- Proteine mit aktivierenden und inhibierenden Hormonrezeptoren verknüpft ist. Die Steigerung der intestinalen Bikarbonatsekretion durch cAMP- Analoga oder Stimulantien, die zur Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration führen (wie z.B. Forskolin, VIP,
Prostaglandine, Glukagon, Phosphodiesteraseinhibitoren, welche die cAMP-abbauende
Phosphodiesterase hemmen, und Sekretin) wurde in mehreren Arbeiten nachgewiesen
(7;158). Dieser Signaltransduktionsweg läuft unabhängig von intrazellulärem Ca2+ ab
(57). Das hitzestabile E.coli Enterotoxin STa und das 1992 von Currie et al (32) im
Dünndarm der Ratte beschriebene Peptid Guanylin stimulieren im Dünndarm als endogene Liganden am STa-Rezeptor eine elektrogene Cl--Sekretion, ein Vorgang, an dem
das „cystic fibrosis transmembrane conductance regulator“ (CFTR)-Protein offenbar
beteiligt ist. Der Signaltransduktionsweg beinhaltet die Erhöhung des second messenger
cGMP (zyklisches cGMP) durch die an der luminalen Membran des Enterozyten lokalisierte Guanylatzyklase GK-C (48;98). Ebenfalls beschrieben wurde eine durch Guanylin
bzw. STa ausgelöste elektrogene Bikarbonatsekretion im Duodenum der Ratte, die
wahrscheinlich ebenfalls durch das CFTR-Protein vermittelt wird (28;33;54). Das zyklische GMP aktiviert seinerseits eine cGMP-abhängige Proteinkinase, die in nahezu allen
Zellen als PKGI und ausschließlich in den Enterozyten als PKG II vorkommt. Über die-
1 Einleitung
4
sen Signaltransduktionsweg kommt es schließlich zur Aktivierung des CFTR Kanals.
Carbachol führt ebenfalls zu einer Erhöhung der intestinalen Cl--Sekretion, allerdings
über einen Ca2+-abhängigen Signaltransduktionsweg (34). Auch die Bikarbonatsekretion im Duodenum des Kaninchens (60) und im Jejunum der Maus (137) wird hierdurch
gesteigert. Intrazelluläres Ca2+ scheint demnach ein wichtiger Mediator der intestinalen
Bikarbonatsekretion zu sein.
Einen weiteren wichtigen Faktor zur Steigerung der duodenalen Bikarbonatsekretion
stellt die luminale Ansäuerung dar. Dieser Effekt wurde in vitro und in vivo an verschiedenen Spezies, der menschlichen eingeschlossen, gezeigt (57). CFTR scheint ebenfalls an der säurestimulierten Bikarbonatsekretion beteiligt zu sein (58).
Zu den inhibitorischen Faktoren, die experimentell in verschiedenen Spezies in vivo
oder in vitro zu einer Verminderung der duodenalen Bikarbonatsekretion führten, zählen unter anderem Anoxie (141;142), Azidose (151), Atropin, Zyklooxigenaseinhibitoren, DIDS, Ethanol, Indometazin und Ouabain (39;57;108). Außerdem wurde bei Patienten mit Duodenalulkus eine verminderte basale und säurestimulierte Bikarbonatsekretion gefunden (73).
Da sie für die vorliegende Arbeit nur von geringer Bedeutung ist, soll hier auf die nervale Regulation nicht näher eingegangen werden, erwähnt sei nur am Rande, dass es in der
Literatur viele Hinweise darauf gibt, dass die autonome Innervation durch Sympathikus
und Parasympathikus sowie das intrinsische Nervensystem des Darmes eine wichtige
Rolle in der duodenalen Bikarbonatsekretion spielen (7;14;42;44;56;61;94;109). In der
vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß des Nervensystems auf die Bikarbonatsekretion
und den Isc durch die Mukosapräparation und die Zugabe von TTX [10-6 M] weitestgehend ausgeschaltet.
1 Einleitung
1.2
5
Transportproteine des Duodenozyten
1.2.1 Allgemeines
Die Erkenntnisse über die molekularen Transportmechanismen in den verschiedenen
organspezifischen Epithelien haben in den letzten Jahren einen enormen Zuwachs erfahren. Molekularbiologische Daten zu einzelnen Transportproteinen ermöglichen es, genauere Schlussfolgerungen aus rein funktionellen Daten zu ziehen. Abbildung 1 zeigt
ein aktuelles Modell eines duodenalen Enterozyten. Dargestellt sind sowohl in der
Membran befindliche Transportproteine als auch stark vereinfachte Schemata bestimmter für die Bikarbonatsekretion relevanter Signaltransduktionswege.
HCO3HCO3-
HCO 3-/Cl-
Cl-
Ta
ClCl-
CFTR
Cl-
HCO3-
CFTR
HCO3-
cGMP
PKG II
CO 2 + H2O
3
+
HCO + H
PKA
HCO
3
Na
+
H+
K+
cAMP
K+
IP3
ATP
-
Cl
K
+
Na+
HCO3PGE2
VIP
Carbachol
Na+/ HCO 3- Na+/K+/2Cl-
Abbildung 1: Schemazeichnung eines Duodenozyten
Grundsätzlich muss die aktive, über transzelluläre Mechanismen mediierte Bikarbonatsekretion von der parazellulären, passiven Diffusion, über die HCO3--Ionen von der
Blutseite ins Lumen gelangen, unterschieden werden. Je nach Spezies stehen diese Anteile in einem bestimmten Verhältnis zueinander.
1 Einleitung
6
Bereits vor zwanzig Jahren beobachteten Simson et al., die Ussingkammer-Experimente
an isolierten Duodenalepithelien des Ochsenfrosches (einer Spezies, deren Duodenum
keine Brunner´schen Drüsen besitzt) durchführten, dass die epitheliale Bikarbonatsekretion auf die Erhöhung entweder des CO2-Partialdruckes oder der HCO3--Konzentration
im serosalen Perfusat mit einem in eine Sättigung mündenden Anstieg reagierte, dieser
jedoch unter Anoxie-Bedingungen erheblich geringer ausfiel, was sie auf die Beteiligung aktiver Transportprozesse an der Sekretion schließen ließ. Sie schlugen vor, dass
abhängig von der Anwesenheit von HCO3--Ionen im serosalen Perfusat 50-60% des
Bikarbonats aktiv sezerniert werden, 30-40% durch passive Diffusion entlang eines
Konzentrationsgradienten ins Lumen gelangen, und die restlichen 10% der zelleigenen
HCO3--Produktion, die durch die Karboanhydrase katalysiert wird, entstammen (141).
Dass HCO3--Ionen nicht alleine durch passive Diffusion von der Blutseite ins Darmlumen gelangen, zeigten auch Odes et al. 1990 (114). Simson et al. zeigten weiterhin, dass
der transzelluläre, also aktive HCO3--Transport im Froschduodenum unter Basalbedingungen elektrogen, von serosal befindlichem Na+ abhängig, jedoch Cl--unabhängig und
Ouabain-sensitiv ist (142). Aufgrund der erhobenen Daten schlugen sie zwei Modelle
für den duodenalen Bikarbonattransport hinsichtlich der HCO3--Aufnahme und Sekretion vor. Das erste beinhaltet die Aufnahme des HCO3--Ions über einen elektroneutralen,
an der basolateralen Zellmembran lokalisierten Na+/HCO3--Kotransporter. Das entlang
seines elektrochemischen Gradienten mitaufgenommene Na+ verlässt die Zelle wieder
über die ebenfalls basolateral befindliche Ouabain-sensitive Na+/K+-ATPase, die unter
Energieverbrauch gegen den (von extra- nach intrazellulär gerichteten) Na+-Gradienten
arbeitet. Das HCO3--Ion wird über die apikale Zellmembran elektrogen sezerniert. Im
zweiten vorgeschlagenen Modell verlässt das durch die Dissoziation von Wasser entstandene H+-Ion über einen basolateral lokalisierten Na+/H+-Austauscher, der über den
Na+-Gradienten betrieben wird, die Zelle, vereinigt sich im Blut mit dem dort vorhandenen HCO3--Ion, wobei CO2 entsteht, das seinerseits in die Zelle diffundiert und dort
in Anwesenheit der Karboanhydrase wieder zum HCO3--Ion wird. Messungen an Duodenozyten, die 1993 von Isenberg et al. durchgeführt worden waren, ergaben Hinweise
auf die entscheidende Rolle dreier Säure-Basen-Transporter in der duodenalen Bikarbonatsekretion (72). Die Autoren definierten einen Amilorid-sensitiven Na+/H+Austauscher, der Säureäquivalente aus der Zelle befördert (Amilorid hemmt bestimmte
1 Einleitung
7
Isoformen aus der Familie der Na+/H+-Austauscher), einen DIDS-sensitiven Cl-/HCO3-Austauscher, der basische Äquivalente hinaustransportiert und einen ebenfalls DIDSsensitiven Na+/HCO3--Kotransporter, der als „base loader“ fungiert, also Basenäquivalente aus dem Blut in die Zelle aufnehmen kann. Da intakte Zellen für die Messungen
herangezogen worden waren, konnten die Autoren keine experimentell belegte Aussage
hinsichtlich der Lokalisation der funktionell charakterisierten Transportproteine machen, sie schlugen jedoch folgendes Modell vor: Die basolaterale Zellmembran nimmt
HCO3--Ionen über den Na+/HCO3--Kotransporter auf, zusätzlich diffundiert es in Form
von CO2 frei über die Zellmembran und wird (katalysiert durch die Karboanhydrase)
intrazelluär zu HCO3- und H+ umgewandelt. HCO3- wird über die apikale Zellmembran
sowohl über elektroneutralen Cl-/HCO3--Austausch als auch über eine Anionenleitfähigkeit transportiert. Die anfallenden H+-Ionen werden über einen in der basolateralen
Zellmembran lokalisierten Na+/H+-Austauscher aus der Zelle hinaus befördert. Diese
Daten, die an der Ratte erhoben wurden, konnten später auch am Kaninchen (2) und am
Menschen (3)von der gleichen Arbeitsgruppe experimentell nachvollzogen werden, was
für einen ähnlichen Mechanismus in allen drei Spezies spricht.
1.2.2 Apikal lokalisierte Transportproteine
1.2.2.1 Apikaler Anionenaustausch
Obwohl im Duodenum von Amphibien im Rahmen von Untersuchungen der Bikarbonatsekretion in der Ussingkammer kein Hinweis auf Cl-/HCO3--Austausch gefunden
worden war (141), mehrten sich, wie bereits im letzten Kapitel beschrieben, wenige
Jahre später Hinweise, dass Säugetier-Enterozyten einen apikal lokalisierten Anionenaustauscher, der extrazelluläre Cl--Ionen gegen intrazelluläre HCO3--Ionen austauscht,
besitzen müssen. Untersuchungen an apikalen Membranvesikeln aus Ratten-Dünndarm
ließen Liedtke et al. 1982 vermuten, dass die NaCl-Rückresorption hier über eine Zusammenarbeit eines Na+/H+- und eines Cl-/HCO3--Austauscherprotein zustande kommt.
Der von ihnen funktionell charakterisierte Anionenaustauscher wies eine Hemmbarkeit
durch SITS (4-Acetamino-4´-Isothiocyanostilben-2,2´-Disulfonat), einem schon seit
Jahrzehnten bekannten Hemmstoff des Anionenaustausches (24), und auch durch Furo-
1 Einleitung
8
semid, einem Schleifendiuretikum, das bekanntlich den Na+K+2Cl--Kotransporter
hemmt, auf. Außerdem vermuteten sie aufgrund ihrer Ergebnisse eine apikale Leitfähigkeit für Cl- (99). Brown et al. untersuchten 1989 ebenfalls den Anionenaustausch in
apikalen Membranvesikeln aus dem Duodenum der Ratte. Sie fanden ebenfalls eine
SITS-sensitive 36Cl--Aufnahme, die durch einen pH- und HCO3--Gradienten angetrieben
wurde und elektroneutral ablief. Außerdem fanden sie eine SITS-insensitive
36
Cl-
Aufnahme, die durch den Cl--Kanal-Blocker DPC gehemmt wurde und schlossen aus
diesen Daten auf das Vorhandensein einer apikalen elektrogenen Cl--Leitfähigkeit im
Duodenum (21). Untersuchungen an apikalen Membranvesikeln aus unterschiedlichen
Darmabschnitten verschiedener Spezies bestätigten in späteren Jahren das dortige
Vorhandensein eines apikalen Cl-/HCO3--Austauschers (25;125).
Inzwischen gilt es als gesichert, dass Cl-/HCO3--Austauscher, oft gekoppelt mit der
Funktion von Na+/H+-Austauschern, wichtige Funktionen wie zum Beispiel pHi- und
Volumenhomöostase sowie die NaCl-Rückresorption im Dünndarm, Dickdarm (134)
und in der Gallenblase (31) ausüben. Das Modell der NaCl-Rückresorption in den genannten Organen beinhaltet den Austausch von extrazelluärem Cl- gegen intrazelluläres
HCO3- durch einen in der apikalen Zellmembran befindlichen Cl-/HCO3--Austauscher,
dessen Aktivität an die Funktion eines ebenfalls am apikalen Zellpol lokalisierten
Na+/H+-Austauschers, der extrazelluläres Na+ gegen intrazelluläres H+ austauscht, gebunden ist (88;89)
Die molekulare Identität der am duodenalen apikalen Anionenaustausch beteiligten
Transportproteine ist zur Zeit noch umstritten. Die Genfamilie der Anionenaustauscher
AE umfasst bisher drei bekannte Isoformen, den AE1, den AE2 und den AE3. Sie werden in vielen Organen und Zelltypen des Körpers exprimiert, sind stilbenempfindlich,
tauschen unter physiologischen Bedingungen Na+-unabhängig extrazelluläres Cl- gegen
intrazelluläres HCO3- im Verhältnis 1:1 aus und agieren somit elektroneutral. Die Isoform AE1 wurde Mitte der 80er Jahre von Kopito et al. kloniert (96). AE1 wird hauptsächlich in Erythrozyten, wo er in Zusammenarbeit mit der Karboanhydrase die Transportkapazität des Blutes für CO2 deutlich steigert (152), und in den Organen Milz und
Niere exprimiert (97). Der AE2 dagegen wird in vielen epithelialen und nichtepithelialen Geweben des Organismus gefunden, wo er einerseits eine Art „housekeeping“-Rolle übernimmt und andererseits an unterschiedlichen transepithelialen
1 Einleitung
9
Sekretions- und Absorptionsvorgängen beteiligt ist (8). Die Isoform AE3 schließlich
wird in erregungsleitenden Geweben wie dem Herzen und dem Gehirn, jedoch auch in
geringen Mengen im Intestinum exprimiert (95;97).
Als Kandidat für den apikalen Cl-/HCO3--Austausch im Ileum des Kaninchens wurde
der AE2 vorgeschlagen (26). Jedoch findet sich dieses Protein in vielen Geweben in
basolateraler Position (9;10;147;148). Alper et al. fanden sehr niedrige AE2-mRNA
Expressionslevel in Duodenal- und Ileal-Mukosa der Maus. Weiterhin detektierten sie
unter Verwendung eines anti-AE2-Antikörpers eine basolaterale Lokalisation des AE2
im Maus-Intestinum (8). Diese Daten unterstützen die Theorie, dass dem AE2 im Enterozyten lediglich eine „house keeping“-Funktion zukommt, den apikale Anionenaustausch jedoch ein anderes Protein übernimmt.
Im Jahr 1993 identifizierten Schweinfest et al. ein Gen in der menschlichen Kolonmukosa, dessen Expression in Kolonadenomen und -adenokarzinomen herunterreguliert
war. Sie nannten es dra („down regulated in adenoma“) (136). Inzwischen sind mehrere
Arbeiten erschienen, die belegen, dass es sich bei dem Protein DRA um einen membranären Anionenaustauscher handelt, der Sulfat, Oxalat, Chlorid und Bikarbonat transportiert und durch DIDS hemmbar ist (105;106;140). Die autosomal rezessiv vererbte,
u.a. in Finnland aufgrund eines Gründereffekts endemisch vorkommende ChloridDiarrhoe, die sich durch Cl--reiche Stühle bei gleichzeitiger metabolischer Alkalose
manifestiert (66;111), wurde auf einen Defekt des enteralen apikalen Cl-/HCO3-Austauschers zurückgeführt, da die Patienten im Ileum und Kolon keine apikale Cl/HCO3--Austauschaktivität aufweisen (67;82). Der dazugehörige Gendefekt konnte auf
dem Chromosom 7q31 lokalisiert werden (85). Höglund et al. stellten im Jahre 1996
fest, dass das dra-Gen im genannten Abschnitt des Chromosoms 7 liegt (63). In weiteren Arbeiten konnte die Arbeitsgruppe daraufhin zeigen, dass Mutationen des dra-Gens
zur genannten angeborenen Chlorid-Diarrhoe führen (62;64). DRA kommt somit als
mögliches Transportprotein für den apikal lokalisierten Anionenaustausch im Duodenum in Betracht.
1 Einleitung
10
1.2.2.2 Das CFTR-Protein
1.2.2.2.1 Zystische Fibrose
Die zystische Fibrose oder Mukoviszidose stellt die häufigste autosomal rezessiv vererbte Krankheit in der kaukasischen Bevölkerung dar (46). Das 1989 entdeckte cftrGen, welches für das CFTR-Protein kodiert, befindet sich auf dem langen Arm von
Chromosom 7 (86;126;130)und weist im Falle von CF unterschiedliche Mutationen auf,
von denen am häufigsten die Mutation ∆F508 angetroffen wird. Die Krankheit manifestiert sich vor allem im Respirations- und Gastrointestinaltrakt, wobei nur homozygote
Genträger erkranken. Die pulmonale Symptomatik beruht auf einer durch den pathologisch zähen Schleim bedingten fortschreitenden Obstruktion der peripheren Atemwege
mit der Folge von Atelektasen, Lungenemphysem und der Ansiedelung verschiedener
bakterieller Erreger. Der gesamte Gastrointestinaltrakt weist pathologische Veränderungen auf: Als häufige klinische Manifestationen sind beispielsweise das Malabsorptionssyndrom, der Mekoniumileus und das distale Obstruktionssyndrom anzutreffen. Die
Obstruktion der kleinen Pankreasgänge mündet meist in eine exokrine Pankreasinsuffizienz. Als weitere durch die Erkrankung in Mitleidenschaft gezogene Organe sind die
Leber (135), die Gallenblase (117) und der Urogenitaltrakt zu nennen. Trotz heutzutage
üblicher intensiver symptomatischer Therapie besitzen die Patienten eine deutlich verkürzte Lebenserwartung.
1.2.2.2.2 Eigenschaften des CFTR-Proteins
CFTR ist ein Mitglied der ABC-Membrantransporter-Genfamilie, deren Mitglieder
meist ATP-getriebene Transportproteine darstellen (5). Im Falle des CFTR-Proteins
handelt es sich um das einzige bekannte Kanalprotein dieser Familie. Die das CFTRProtein bildende Polypeptidkette besteht aus 1480 Aminosäuren und weist zwei gleichartige Hälften auf. Diese bestehen aus jeweils sechs transmembranären Domänen, die
das eigentliche Kanalprotein bilden, zwei Nukleotid-bindenden (NBD1 und NBD2) und
einer regulatorischen (R-) Domäne, welche die beiden Hälften miteinander verbindet
und mehrere Phosphorylierungsstellen für die PKA, die PKC und die Ca2+-CalmodulinKinase aufweist (46;93). Der Einzelkanal weist unter Anwesenheit von 150 mmol/l Cl-
1 Einleitung
11
eine Leitfähigkeit von 8-10pS bei Raumtemperatur auf, besitzt eine lineare StromSpannungskurve und die Leitfähigkeitsequenz Br->Cl->I->F- (104).
Für das CFTR-Protein war anfangs wegen seiner Ähnlichkeit mit dem MDR-Protein,
das ebenfalls der Genfamilie der ABC-Membrantransporter angehört, eine mögliche
Funktion als ATP-getriebene Pumpe angenommen worden. In der aktuellen Diskussion
setzt sich jedoch die Annahme, dass es sich hierbei um einen durch die cAMPabhängige Proteinkinase A regulierten Cl--Kanal handelt, immer mehr durch (12;53). Es
wird angenommen, dass für die Kanalöffnung zum einen die PKA-abhängige Phosphorylierung der R-Domäne und zum anderen die Bindung und anschließende Hydrolyse
von ATP an der nukleotidbindenden Domäne NBD1 notwendig ist (93). CFTR kann
durch Stilbenderivate wie z.B. DIDS oder SITS nicht gehemmt werden, hingegen stellt
5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)Benzoat (NPPB) eine bekannte inhibitorische Substanz dar (28).
Der gesamte Intestinaltrakt weist mit Ausnahme des Magens hohe CFTRExpressionslevel auf, die im Duodenum am höchsten sind und im Verlauf der einzelnen
Darmabschnitte nach distal hin abnehmen (37;126). Die Lokalisation am luminalen
Zellpol wurde im Darm mit Hilfe der Immunhistochemie nachgewiesen (30). Die bedeutsame Rolle des CFTR als intestinale apikale Cl--Leitfähigkeit wurde bereits in vielen Arbeiten bestätigt (101). Über seine Beteiligung an der intestinalen und besonders
an der duodenalen Bikarbonatsekretion wurden einige Arbeiten veröffentlicht. Mehrere
Arbeitsgruppen haben den Kanal auf seine HCO3--Leitfähigkeit hin untersucht und diese bestätigt. Die Angaben über das Verhältnis von HCO3-- zur Cl--Durchlässigkeit
schwanken je nach Autor zwischen 1:8 (50) bis 1:4 (51;52;70;120). Untersuchungen an
trachealen Epithelzellen belegen ebenfalls eine Transportfähigkeit des CFTR-Proteins
für HCO3--Ionen (121;144). Seidler et al. haben 1997 anhand von pH-stat-Messungen
am Dünndarm von CFTR-knockout-Mäusen und deren gesunden Geschwistern in der
Ussingkammer gezeigt, dass ein funktionierendes CFTR-Protein in allen untersuchten
Segmenten für eine normal hohe basale Bikarbonatsekretion und für die Agonistenstimulierte elektrogene Bikarbonatsekretion über die drei Signaltransduktionswege, die
cAMP, cGMP und Ca2+ als second messenger beinhalten, unabdingbare Vorraussetzung
ist (137). Ähnliche Ergebnisse erhielten Hogan et al. bei Untersuchungen am Duodenum von CFTR-knockout-Mäusen in vivo: Sie fanden ebenfalls eine signifikant ernied-
1 Einleitung
12
rigte basale Bikarbonatsekretion und eine fehlende Bikarbonatsekretionssteigerung nach
Forskolin- oder Carbachol-Stimulation (59). Davon abweichend zeigten Pratha et al.
einen stimulatorischen Effekt von STa und Carbachol für die Bikarbonatsekretion an
menschlichem Duodenalbiopsien von CF-Patienten (die in speziellen Ussingkammern
gemessen worden waren), während die basale und die db-cAMP-stimulierte Sekretion
gegenüber der Kontrolle erniedrigt war (123). In der Literatur gibt es einige Hinweise
darauf, dass CFTR an der Regulation verschiedener Ionenkanäle in der Zellmembran
beteiligt ist: Es wurde beispielsweise postuliert, dass der auswärts gerichtete Cl--Kanal
(ORCC) durch CFTR über eine ATP-Freisetzung gesteuert wird (36;47;59). Weiterhin
wurde gezeigt, dass die cAMP-abhängige Aktivierung von CFTR epitheliale Na+Kanäle (EnaC) inhibiert (19;59;78;149). Außerdem scheinen auch ORCC Kanäle
permeabel für das HCO3--Ion zu sein (150).
1.2.3 Die Bikarbonat-Bereitstellung durch den Duodenozyten
1.2.3.1 Der basolateral lokalisierte Na+/HCO3--Kotransporter
Na+/HCO3--Kotransport ist als erstes im proximalen Tubulus der Niere beschrieben
worden, wo er in der basolateralen Zellmembran lokalisiert ist und für die elektrogene
Rückresorption von Na+ und HCO3- ins Blut verantwortlich ist (18). Was den Gastrointestinaltrakt betrifft, wurde bisher an Duodenozyten des Kaninchens und des Menschen
Na+/HCO3--Kotransport funktionell nachgewiesen (2;3;80); eine andere Arbeit hält die
basolaterale Aufnahme des HCO3--Ions über diesen Weg zumindest für sehr wahrscheinlich (72). In der Literatur sind bereits mehrere NBC-Isoformen bekannt. Romero
et al klonierten 1997 einen Na+/HCO3--Kotransporter aus der Niere des Salamanders
(129). Schnell wurde diese Isoform auch in anderen Spezies nachgewiesen (22;128).
Die Klonierung der Isoform NBC2 gelang 1998 aus der menschlichen Retina (74), woraufhin die zuerst entdeckte Isoform die Bezeichnung NBC1 erhielt. Zwei weitere Isoformen wurden im Jahr darauf von zwei unterschiedlichen Arbeitsgruppen kloniert,
welche die Namen mNBC3 (124) und kNBC3 (11) erhielten. Während NBC1 elektrogen transportiert (das Verhältnis Na+:HCO3- beträgt entweder 1:3 oder 1:2), konnte für
den kNBC3 mittlerweile gezeigt werden, dass er Na+ und HCO3- im gleichen Verhältnis
1 Einleitung
13
transportiert, also elektroneutral arbeitet. Deswegen wird kNBC3 in neueren Arbeiten
als NBCn1 bezeichnet. Inzwischen sind aus verschiedenen Geweben und Spezies weitere NBC-Varianten kloniert worden. Da die vielverzweigte Datenlage keine Relevanz für
die vorliegende Arbeit besitzt, soll hier nicht näher auf diese Thematik eingegangen
werden.
1.2.3.2 Die Rolle der Karboanhydrase
Von den sieben bekannten Isoenzymen der Karboanhydrase CA I bis CA VII spielt im
Gastrointestinaltrakt die CA II die bedeutenste Rolle, wo sie in den Epithelzellen für die
Katalyse der Reaktion [H2O + CO2 ↔ HCO3- + H+] zuständig ist und somit neben einem Na+/HCO3--Kotransportsystem für die HCO3--Bereitstellung des Duodenozyten in
Frage kommt. Azetazolamid gilt bereits ab einer Konzentration von 0,1 mM als potenter
Inhibitor der CA (118). Er kam in der vorliegenden Arbeit mit dem Ziel der weiteren
Abklärung der Rolle der Karboanhydrase in der duodenalen Bikarbonatbereitstellung
zum Einsatz. Im Diskussionsteil (Abschnitt 4.2.3.3) wird auf die Eigenschaften dieses
Inhibitors näher eingegangen werden.
1.2.3.3 Intestinaler Na+/H+-Austausch
Zellulärer Na+/H+-Austausch ist bereits vor über zwanzig Jahren an Nieren- und Dünndarmvesikeln nachgewiesen worden (107). Inzwischen ist bekannt, dass dieser Transportmechanismus an vielen zellulären Funktionen wie Regulation des pHi des Zellvolumens, des Salz- und Wasserhaushaltes, sowie der Zellproliferation und -migration
grundlegend beteiligt ist. Auf eine bedeutsame Rolle dieses Transportmechanismus bei
der duodenalen Bikarbonatsekretion wiesen Untersuchungen an Duodenozyten des Kaninchens, der Ratte und des Menschen hin (2;3;72). Auf molekularer Ebene stellen
Na+/H+-Austauscher Transportproteine dar, die intrazelluläre H+- gegen extrazelluläre
Na+-Ionen mit einer 1:1-Stöchiometrie austauschen und damit elektroneutral arbeiten.
Die Aktivität wird durch den Abfall des pHi gesteigert, eine Umkehr der Transportrichtung ist möglich. Bekannt sind bisher die 6 Isoformen: NHE1 bis NHE6, wobei NHE1
bis NHE4 in Epithelzellen exprimiert werden, NHE5 und NHE6 dagegen nicht (29). Für
den Gastrointestinaltrakt bedeutsam scheinen die Isoformen NHE1-4 zu sein. Über die
funktionelle Bedeutung der genannten Isoformen im Duodenum ist bisher wenig be-
1 Einleitung
14
kannt. Untersuchungen an Maus-Duodenozyten, die sich mit der Na+-abhängigen Erholung des pHi befassten, gaben Hinweise darauf, dass die Isoformen NHE1-NHE3 an der
duodenalen pHi-Regulation zumindest in der Maus beteiligt sind (122). Ein großer Teil
der intestinalen NaCl-Resorption wird über die gekoppelte Funktion von Cl-/HCO3Austausch und Na+/H+-Austausch in der apikalen Membran erreicht, wobei die NHEIsoformen NHE2 und NHE3 involviert sind (134;138;157).
NHE1 ist in allen untersuchten Säugetierzellen basolateral zu finden und in der Funktion eines sogenannten „house keeping“ Transportproteins unter anderem an der intrazellulären pH- und Volumen-Homöostase beteiligt. NHE1ist durch das Amilorid-Derivat
DMA mit bedeutend höherer Spezifität hemmbar als durch Amilorid selber (29). Neuere
kompetitive Inhibitoren sind die Substanzen HOE 694 und HOE 642, wovon letzteres in
einer Konzentration von 1µM ausschließlich den NHE1 inhibiert (133).
NHE2 wird hauptsächlich in der Niere und im Gastrointestinaltrakt exprimiert (115). In
der Literatur werden sowohl (im menschlichen Jejunum, Ileum und Kolon sowie im
Jejunum und Ileum des Kaninchens) eine apikale (68) als auch (im Sammelrohr der
Niere der Maus) eine basolaterale Lokalisation (146) diskutiert. Auch NHE2 ist durch
Amilorid, DMA und Hoechst 642 konzentrationsabhängig hemmbar. Über seine Funktion ist wenig bekannt, eine Arbeit zeigt jedoch, dass sich NHE2 in solchermaßen transfizierten ursprünglich NHE-defizienten Zellen an der Volumen- und pHi-Regulation
beteiligt (84). Experimente, die an NHE2-knockout-Mäusen durchgeführt wurden, gaben Hinweise darauf, dass NHE2 für eine normale Funktion von Parietalzellen notwendig zu sein scheint, so wurde an einem NHE2-knock-out-Mausmodell eine reduzierte
Anzahl von Parietalzellen im Magen beobachtet (138).
NHE3 wurde von Brant et al kloniert (20). Die Arbeitsgruppe fand diese Isoform in
Niere, Magen, Jejunum, Ileum und Colon ascendens, jedoch nicht im Duodenum und
Colon descendens des Kaninchens (159;160). Praetorius et al. wiesen jedoch im Jahr
2000 mit Hilfe von RT-PCR und Western Blot NHE3-mRNA auch im Mäuseduodenum
nach (122). Sowohl im proximalen Tubulus der Niere des Kaninchens (15) als auch im
Ileum und Kolon der Ratte (16) wurde eine apikale Lokalisation des Transporters nachgewiesen. Auch hier besteht eine konzentrationsabhängige Hemmbarkeit durch Amilorid und DMA. NHE3-knockout-Mäuse weisen eine schwere intestinale Absorptionsstö-
1 Einleitung
15
rung begleitet von Diarrhöen und eine mäßige Hochregulation von DRA im Kolon auf
(105).
NHE 4 wurde im Magen, Dünndarm, Kolon, Niere, Gehirn und einigen weiteren Organen nachgewiesen, über seine Funktion ist nicht viel bekannt. Immunhistochemische
Untersuchungen sprechen eher für eine Lokalisation in der basolateralen Zellmembran
(119). NHE4 ist Amilorid-insensitiv, lässt sich in transfizierten Fibroblasten jedoch
durch das Amilorid-Derivat DMA [0,5 mM] hemmen (17).
1.2.3.4 Basolateral lokalisierter Cl--Import
Die zelluläre Aufnahme von Cl--Ionen ist für die intestinale Bikarbonatbereitstellung
und -sekretion von großer Bedeutung, da der Transport dieser beiden Ionen oft direkt
oder indirekt gekoppelt vonstatten geht. Der Na+K+2Cl--Kotransporter (NKCC) gehört
zur Familie der Kation-gekoppelten Cl--Kotransporter und spielt eine ganz entscheidende Rolle in unterschiedlichsten epithelialen Absorptions- und Sekretionsvorgängen
(138). Bis heute sind zwei Isoformen des Transportproteins bekannt geworden: NKCC1
und NKCC2. Cl--absorbierende Zellen zeigen eine Lokalisation des NKCC2 in ihrer
apikalen Membran, NKCC1 hingegen findet sich in der basolateralen Membran Cl-sezernierender Zellen, worunter die Darmepithelien fallen. Der Transport ist elektroneutral: die Stöchiometrie beträgt 1:1:2. Das Schleifendiuretikum Bumetanid hemmt
den NKCC1 konzentrationsabhängig und reversibel mit einer halbmaximalen Hemmkonzentration von ca. 10-7 M (132). In dieser Arbeit sollte die funktionelle Bedeutung
dieses Transportmechanismus bei der duodenalen Bikarbonatsekretion näher eingegrenzt werden, jedoch lag der Schwerpunkt der Arbeit auf der Charakterisierung der
bereits oben aufgeführten Transportproteine.
Am Rande sei noch erwähnt, dass sich auf der basolateralen Zellmembran des Duodenozyten ebenfalls ein Anionenaustauscher befindet, der Cl- im Austausch gegen HCO3in die Zelle einschleust und stilbenempfindlich ist. Er ist im Dünndarm bereits vor längerer Zeit funktionell charakterisiert worden (90;116;156). Vor kurzem konnten Petra
Jacob und Manuela Nader aus unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass auch im Duodenum
des Kaninchens basolateraler Anionenaustausch stattfindet. Dieser Transportmechanismus weist die funktionellen Eigenschaften eines AE2 auf und spielt im Duodenum des
Kaninchens wahrscheinlich eine untergeordnete Rolle (79;131).
1 Einleitung
1.3
16
Fragestellung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen und die Regulation der Bikarbonatsekretion im Duodenum des Kaninchens unter basalen und stimulierten Bedingungen näher zu charakterisieren. Folgende Fragen sollten beantwortet werden:
1. Welche am apikalen Zellpol befindlichen elektroneutral oder elektrogen arbeitenden
Transportmechanismen sind an der basalen und stimulierten Bikarbonatsekretion im
Duodenum des Kaninchens beteiligt und in welcher Beziehung stehen sie zueinander?
2. Welche basolateral befindlichen zellulären Transportmechanismen sind in die Bikarbonatbereitstellung durch den Duodenozyten unter basalen und stimulierten Bedingungen involviert? Spielt auch die intrazelluläre Generierung von Bikarbonat eine Rolle? Inwieweit können sich diese Mechanismen gegenseitig beeinflussen?
Zur Klärung dieser Fragen wurde proximales Duodenum des Kaninchens von Serosaund Muskelschichten freipräpariert und die Bikarbonatsekretion und der Kurzschlussstrom in der Ussingkammer unter Einsatz geeigneter stimulatorischer und inhibitorischer Substanzen untersucht.
2 Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1 Chemikalien und Abkürzungen
In Tabelle 1 sind in alphabetischer Reihenfolge die in den Experimenten angewandten
chemischen Substanzen sowie deren Bezugsquellen und ihre in der vorliegenden Arbeit
verwendeten Abkürzungen enthalten. Alle Substanzen sind von analytischer Reinheit
bzw. dem höchsten erhältlichen Reinheitsgrad.
Tabelle 1: Verwendete Chemikalien, deren Abkürzung und jeweilige Bezugsquelle; bei
den mit * gekennzeichneten Substanzen ist unter „Abkürzung“ der Handelsname angegeben.
Reagenz
gelöst in
Abkürzung
Agarose Type III High KCl [3M] bzw. Agarose
EEO
KNO3 [3 M]
(3-[Aminosulfonyl]-5-
DMSO
Bumetanid
Bezugsquelle
Sigma
Sigma
[butylamino]-4phenoxybenzoic acid)
Atropinsulfat
H2O
Sigma
Azetazolamid
H2O
Sigma
Bariumhydroxid-
H20
Ba(OH)2 x H20
Merck
H2O
8-Br-cAMP
Sigma
HCl 0.1M
36
Amersham
Octahydrat
8-Bromoadenosin- 3'-5'zyklisches Monophosphat
36
Chlorid
Cl-
2 Material und Methoden
18
DMSO
Ouabain
Sigma
H2O
Dextrose
Merck
Rompun®
Bayer
DIDS
Sigma
Dimethyl-Sulfoxyd
DMSO
Sigma
5- (N,N-Dimethyl-) Ami- H2O
DMA
Sigma
H2O
HOE 642
Aventis Pharma
H2O
HEPES
Roth
Na2HPO4
Indomethazin
Sigma
Kaliumchlorid
H2O
KCl
Merck
Kaliumdihydro-
H2O
KH2PO4
Merck
Kaliumglukonat
H2O
K-Glc
Merck
Kaliumnitrat
H2O
KNO3
Roth
Kalziumchloriddihydrat
H2O
CaCl2 x 2 H20
Merck
Ketanest®
Parke-Davis
(4ß,20[22]-Cardenolid1β,3β,5α,11α,14,19hexol-3[6-deoxy-α-Lmannopyranosyl)]
D(+)-Glukose
5,6-Dihydro-2-(2,6Xylidino)4H-1,3-Thiazin*
4,4'-
H2O
Diisothiocyanostilben2',2'-Disulfonsäure
lorid
4-Isopropyl-3methylsulfonylBenzoylguanidinmethanSulfonat
Hydroxy-EthylPiperazinylEthan-Sulfonsäure
(1-[p-Chlorobenzoyl]-5methoxy-2-methylindole3-acetic acid)
genphosphat
Ketamin*
2 Material und Methoden
19
Kalziumglukonat
H2O
C12H22CaO14xH2O Merck
Magnesiumsulfat-
H2O
MgSO4 x 7 H2O Merck
Heptahydrat
Mannitol
3
H-Mannitol
22
Natrium
Merck
Ethanol
3
NaCl
22
H-Mannitol
Na+
NEN DuPont
Amersham
Natriumhydrogenkarbonat H2O
NaHCO3
Merck
Natriumchlorid
H2O
NaCl
Merck
Natriumglukonat
H2O
Na-Glc
Merck
Natriumpyruvat
NaCl 0.9%
Pyruvat
Sigma
Natriumzitrat
H2O
NaCitrat
Merck
Natronlauge
H2O
NaOH
Merck
100% Sauerstoff
100% O2
95% Sauerstoff/
95% O2/
5%Kohlendioxid
5%CO2
Salzsäure
Schwefelsäure
Linde
Carbogen
AGA Gas GmbH
H2O
HCl
Merck
H2O
H2SO4
Merck
Quicksafe A Liquid Szin-
Zinsser-Analytik
tillator
Tetrodotoxin
NaCitrat 10 mM TTX
Sigma
2 Material und Methoden
20
2.1.2 Verwendete Geräte
Tabelle 2: Auflistung der für die durchgeführten Experimente verwendeten Geräte.
Als standardisiert geltende Geräte sind nicht enthalten.
Gerät
Hersteller
Autobürette
Radiometer Copenhagen
Betacounter
Wallac 1409
DVC-1000 Dual Voltage Clamp
World Precision Instruments
Preamplifier
World Precision Instruments
Stereomikroskop
World Precision Instruments
Lichtquelle
World Precision Instruments
pH-Meter mit pH-Glaselektrode
Radiometer Copenhagen
Titrator
Radiometer Copenhagen
Wärmeumwälzpumpe
Haake
Osmometer
Roebling
2.1.3 Versuchstiere
Für sämtliche Versuche werden männliche Kaninchen der Rasse „New Zealand White
Rabbit“ mit einem Gewicht von 2500 bis 3000 Gramm verwendet, die unter Standardbedingungen bezüglich der Raumtemperatur (21-22°C), eines Hell-Dunkelzyklus von je
12 Stunden, des Futters und der Käfiggröße gehalten worden sind. Die Tiere werden
erst nach einer Eingewöhnungsphase von mindestens 24 Stunden nach Ankunft für die
Versuche herangezogen.
2 Material und Methoden
2.2
21
Methoden
2.2.1 Das Kurzschlussstromexperiment
Der dänische Physiologe Hans Peter Ussing etablierte in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts das nach ihm benannte Kurzschlussstromexperiment an Froschhautepithelien
(153). Der Versuchsaufbau erlaubt es, experimentell die Formen des aktiven epithelialen Ionentransportes von denen des passiven abzugrenzen. Wenn alle äußeren Gradienten für passiven Ionentransport ausgeschaltet werden, kann der danach verbleibende
messbare Transport nur noch primärer, sekundärer oder tertiärer Natur sein.
Das interessierende Epithelstück wird in eine Polyacrylkammer eingespannt, die es somit in 2 Kompartimente teilt. Auf beiden Seiten werden nun identische Volumina isoosmolarer Elektrolytlösung in zwei 15 ml fassende Reservoire eingefüllt, somit sind
sowohl der hydrostatische Druckgradient als auch der Konzentrationsgradient ausgeschaltet.
Auch der elektrische Gradient für passive Ionenbewegungen kann beseitigt werden.
Folgende Überlegungen sind hierfür wichtig: Unter der Vielzahl der aktiven epithelialen
Ionentransportmechanismen sind einige elektrogen, das heißt, sie erzeugen gemäß dem
Ohmschen Gesetz eine sich über das Epithel einstellende Potentialdifferenz bzw. Spannung. Ein Beispiel hierfür ist der Na+Glukose-Kotransport. Die einseitige Bewegung
von Kationen in die eine Richtung muss entweder den passiven Mittransport von Anionen in die gleiche Richtung und/oder von Kationen in die Gegenrichtung zur Folge haben. Der spezielle Ussingkammer-Aufbau (siehe Abbildung 1) erlaubt es nun, von außen einen Strom auf das Epithel zu applizieren, der entgegengesetzt gerichtet und genau
so eingeregelt wird, dass er gleich groß ist wie der durch den aktiven Transport erzeugte
Strom. Der elektrische Gradient ist somit ausgeschaltet. Dieser sogenannte Kurzschlussstrom (short circuit current oder Isc) stellt ein Maß für den aktiven Ionentransport dar.
Man kann an der Ussingkammer auch noch einen zweiten Messmodus, den des “open
circuit current“, schaffen, der im Versuchsaufbau der vorliegenden Arbeit mit einer einzigen Ausnahme (siehe Abschnitt 3.3.2.3) zur Anwendung kommt. Unter physiologischen Bedingungen stellt sich über das Epithel spontan eine charakteristische Potentialdifferenz ein, die in diesem Modus nicht ausgeglichen, sondern nur gemessen wird. Der
2 Material und Methoden
22
transepitheliale elektrische Gradient bleibt also erhalten. Eine in einem bestimmten zeitlichen Intervall erfolgende epithelferne Applikation eines geeigneten Stromstoßes führt
zur Änderung der Potentialdifferenz ∆PD (=∆U). Dies ermöglicht die Berechnung des
epithelialen Widerstandes mit Hilfe des Ohmschen Gesetzes:
R=∆U/I (1)
Demnach ergibt sich für den durch Ionenbewegung am Epithel verursachten Strom (Ic):
Ic=U/R (2)
Da das Duodenalepithel durch seine gut durchlässigen tight junctions ein so genanntes
„leaky epithelium“ darstellt, kann man es als annähernd kurzgeschlossen betrachten.
Hierbei gilt :
Ic ≈ Isc (3)
Im vorliegenden Versuchsaufbau wird die Potenzialdifferenz (PD) über zwei epithelnah
angebrachte Elektroden (3M KCl-Agar- bzw. in den Cl--freien Versuchen 3M KNO3Agar-Brücken) kontinuierlich aufgezeichnet und mit Hilfe eines voltage clamp Gerätes
alle 300 Sekunden ein Stromstoß von 40 µA/cm2 über die beiden epithelfernen Elektroden appliziert. Mit Hilfe der Formeln 1 und 2 wird der Ic bzw. Isc, der ein Maß für die
elektrogene Nettosekretion von Anionen und Resorption von Kationen darstellt, ausgerechnet.
2.2.2 pH-stat-Titration
Die Messung der duodenalen Bikarbonatsekretion (JHCO3-) erfolgt mit der hierfür geeigneten Methode der pH-stat-Titration, deren Prinzip auf der kontinuierlichen Gegentitration der ins Lumen sezernierten Basen-Äquivalente mittels einer starken Säure beruht
und somit der Aufrechterhaltung eines bestimmten pH-Wertes dient.
Die zwei in Abbildung 2 dargestellten jeweils 15 ml fassenden Reservoire, die einzeln
begast werden können, sind für die Perfusion der das Epithel enthaltenden Kammer
verantwortlich. Die physiologische Temperatur von 37° C wird mittels einer Wärme-
2 Material und Methoden
23
umwälzpumpe, die das erwärmte Wasser durch ein die beiden Reservoire zusätzliches
ummantelndes Hohlraumsystem pumpt, erreicht.
Die Nährlösung auf der serosalen Seite wird mit Carbogen, die ungepufferte pysiologische NaCl-Lösung (0,9%) der mukosalen bzw. luminalen Seite mit 100% O2 begast.
Die gepufferte serosale Lösung weist einen pH-Wert von 7,4±0,03 bei 37°C auf, der
pH-Wert von 7,4 des luminalen Perfusates wird durch eine den gesamten Versuch bestehende pH-stat-Titration aufrechterhalten. Somit wird ein pH-Gefälle zwischen den
beiden Seiten und ein steigend unphysiologischer pH-Wert vermieden.
Das vom Duodenum kontinuierlich sezernierte Bikarbonat wird mit einer starken Säure,
vertreten durch HCl beziehungsweise H2SO4, titriert. Es ist nun möglich, die Menge an
verbrauchter Säure mit der Bikarbonatsekretion gleichzusetzen, da das Reaktionsgleichgewicht der Reaktion HCO3- + H+ ↔ H2O + CO2↑ überwiegend auf der rechten Seite
liegt. Bei den Cl--freien Versuchen wird HCl durch H2SO4 ersetzt und die Bikarbonatsekretion entsprechend der zweiwertigen Säure ermittelt. Die Stärke der Säure wird so
eingestellt, dass ein optimaler Kompromiss zwischen Genauigkeit der Bikarbonatsekretionsmessung und möglichst geringer Volumenbelastung des luminalen Kompartimentes zustande kommt, im vorliegenden Fall wird eine Konzentration von 20 mmol/l gewählt. Die verbrauchte Menge an titrierter Säure wird durch ein spezielles Computerprogramm registriert, über eine Zeiteinheit von 5 min gemittelt und in der Einheit
µmol/(h x cm2) ausgegeben.
2 Material und Methoden
24
2.2.3 Aufbau des Ussing-Kammer-Setups
pH-Elektrode
und Autotitrator
(c )
(d)
O2/CO2
O2
(e)
(b)
(f)
(a)
V
(k)
(g)
(i)
I
(h)
Abbildung 2: Ussingkammer-Setup
Das Epithel (a) wird in eine Polyacrylkammer (b) mit einer Fläche von 0,636 cm2 eingespannt. Im luminalen Kompartiment (c) erfolgt die pH-stat-Titration mit Hilfe einer
pH-Elektrode, einer Autobürette und eines Titrators. Die Begasung erfolgt hier mit
100% igem O2. Die Lösung im serosalen Kompartiment (d) wird mit Carbogen begast.
Beide Kompartimente sind zusätzlich durch ein Wasserreservoir (e) ummantelt, durch
das Wasser mit einer Temperatur von 37°C zirkuliert.
Dargestellt sind die beiden epithelfernen Elektroden (f) mit Stromquelle (g) und Ampèremeter (h), weiterhin die beiden epithelnahen Elektroden (i) mit Voltmeter (k), die
der Messung der Potentialdifferenz dienen.
2 Material und Methoden
25
2.2.4 Transepitheliale Fluxmessungen
Ionen bewegen sich durch passive Diffusion und durch primär, sekundär und tertiär
aktive Transportprozesse der Zelle sowohl von serosal nach mukosal als auch in umgekehrter Richtung. Da der Isc nur die Summe der Ionenbewegungen über das Epithel
wiederspiegelt und somit nur allgemeine Aussagen zulässt, kann man die Bewegungen
bestimmter Ionenarten mit Hilfe geeigneter Nuklide messen. Im vorliegenden Fall werden das Cl--Isotop
36
Cl- und das Na+-Isotop
22
Na+ als Tracer zur Aufklärung der Rolle
des Cl- beziehungsweise Na+ verwendet, wobei der Netto Cl-- bzw. Na+-Flux die Summe sämtlicher Bewegungen des jeweiligen Ions über das Epithel, seien sie passiv, aktiv,
elektrogen oder elektroneutral, darstellt. Um die Veränderung der parazellulären Permeabilität unter bestimmten Versuchsbedingungen zu messen, wird der 3H-markierte Zucker Mannitol, der von der Zelle nicht verstoffwechselt werden kann, verwendet.
2.2.5 Operation des Kaninchens
Die Prämedikation des Kaninchens wird mittels einer intramuskulären Injektion von 0,5
mg/kg Atropin, 100 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Rompun erreicht. Darauffolgend wird
eine Ohrvene des Tieres kanüliert und die Narkose mit einem Ketamin/RompunGemisch in 0,9%iger NaCl-Lösung weitergeführt. Nach ausreichender Narkotisierung
des Tieres wird das Abdomen entlang der Linea alba eröffnet, das Duodenum aufgesucht und stumpf vom Mesenterium abpräpariert. Der Darm wird am Pylorus des Magens und 6cm weiter distal durchtrennt. Das so gewonnene Stück, das dem proximalen
Duodenum entspricht, wird entnommen. Die Tötung des Tieres erfolgt unmittelbar darauf mittels einer Überdosis des genannten Ketamin/Rompun-Gemisches. Das entnommene Darmstück wird sofort mit eiskalter voroxygenierter und zuvor mit Indometazin
[50 µM] versetzter Ringer-Lösung mehrfach zwecks Entfernung von Chymusresten
durchspült. Bis zur Präparation des Gewebes, die sich sofort an diese Prozedur anschließt, wird das Duodenum in der beschriebenen Ringer-Lösung aufbewahrt. Die
Temperatur von 4°C hindert Proteasen vorerst an der Zersetzung des Gewebes und
durch den Sauerstoffgehalt der Lösung wird die zwangsläufig eintretenden Ischämie des
2 Material und Methoden
26
Gewebes vermindert. Der Indometazinzusatz führt zu einer Hemmung der endogenen
Prostaglandinsynthese. Prostaglandine führen zu einer Steigerung der Cl--und HCO3-Sekretion im Dünndarm, was das Versuchsergebnis verfälschen könnte.
2.2.6 Präparation des Duodenums
Unmittelbar hinter dem Bulbus duodeni wird ein 4 cm langes Stück abgeschnitten und
noch einmal in zwei Stücke von 2 cm geteilt, die jeweils für einen Versuch herangezogen werden. Der Rest des Duodenums wird verworfen.
Das Darmstück wird nun entlang des Mesenterialansatzes mit einer Schere in Längsrichtung eröffnet und die mukosale Seite noch einmal mehrfach mit der oben beschriebenen eiskalten Ringer-Lösung abgespült.
Als Präparationsvorrichtung dient eine Kunststoffschale, die bis auf halbe Höhe mit
Paraffin ausgegossen ist und in der Seite Löcher zwecks der Anbringung von fünf Glasfaserkabeln aufweist, die wiederum von einer Lichtquelle ausgehen. Die Paraffinoberfläche besitzt eine Vertiefung, über die das Darmstück mit Hilfe von Stecknadeln straff
mit der serosalen Seite nach oben gerichtet aufgespannt wird; dies verhindert ein Druckschädigung der empfindlichen Mukosa. Die Präparation findet in frischer voroxygenierter eiskalter und zuvor mit Indometazin [50 µM] versetzten Ringer-Lösung statt. Unter
einem Stereomikroskop wird nun die Tunica serosa und die Tunica muscularis, Stratum
longitudinale und circulare in dieser Reihenfolge mit Hilfe einer spitzen Pinzette abpräpariert. Auch die Tela submucosa wird vorsichtig so weit wie möglich abgetragen, bis
die Zottenstruktur der Tunica mucosa deutlich erkennbar ist. Daraufhin kann das präparierte Darmstück zwischen den beiden Hälften der in Abbildung 2(a) dargestellten Plexiglaskammer aufgespannt werden; diese Kammer wird nun in die Haltevorrichtung des
Ussingkammeraufbaus eingespannt, jeweils mit den beiden Perfusionskammern und den
Elektroden verbunden und der Versuch unmittelbar daraufhin gestartet.
2 Material und Methoden
27
2.2.7 Verwendete Reagenzien
Die Lösungen und Puffer werden mit Hilfe von deionisiertem und zusätzlich durch eine
Milli-Q-Plus Filtrieranlage (Millipore) gereinigtem Wasser hergestellt. Die Zubereitung
der Lösungen erfolgt entweder am Versuchstag oder an dessen Vorabend. Die Osmolarität (Sollwert 308 mosm/l) und der pH-Wert (Sollwert 7,4±0.03) werden überprüft und
die Lösungen bei 4°C aufbewahrt. Tabelle 3 gibt die Ionenzusammensetzung und die
Osmolarität im einzelnen wieder.
2 Material und Methoden
28
Tabelle 3: Ionale Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Lösungen
Ion/
Modifizierte 0.9%ige
Substanz Krebs Rin[mmol/l]
NaCl Lö-
ger (serosale sung lumi-
Cl--freie
Cl--freie Lö-
Ringer-
HCO3--freie
Lösung lu-
sung serosal
Lösung
Lösung se-
minal
rosal (HEPES)
Nährlösung) nal
Na+
140
K+
Ca2+
Mg
2+
Cl-
140
145,5
140
4,5
4,5
4
4,5
2
2
3
2
1,3
1,3
115
154
154
154
Glukonat
1,3
155,5
154
123
115
SO42-
1,3
1,3
HCO3-
22
22
1,3
HEPES
24
HPO42-
1,5
1,5
1,5
Dextrose
10,4
10,4
10,4
Mannitol
*
Indo-
0,03
0,03
0,03
Pyruvat
10
10
Theo-
308 (*310)
*
metazin
308 (*310)
308
308
308
308
retische
Osmolarität
*Zusatz von 2mmol/l Mannitol bilateral bei der Fluxbestimmung für 3H-Mannitol zur
Vermeidung eines Konzentrationsgradienten für Mannitol
2 Material und Methoden
29
2.2.8 Versuchsschemata
2.2.8.1
Allgemeines Vorgehen
Kurz nach dem Einspannen des zu messenden Gewebestückes in die Ussingkammer
werden Tetrodotoxin [10-6 M] zwecks Hemmung schneller Na+-Kanäle verbliebener
Neurone des Plexus submucosus, Indometazin [30 µM] zur Verhinderung endogener
Prostaglandinsynthese und NaPyruvat [10mM], das die sekretorische Leistung der Epithelzellen fördern soll, in das serosale Perfusat appliziert. Mit der Applikation der eigentlichen Testsubstanzen wird stets mindestens 10 Minuten nach Erreichen stabiler
Basalparameter betreffend der PD, des Isc und der Bikarbonatsekretion begonnen. Um
hydrostatische und osmotische Druckdifferenzen und dadurch entstehende Störfaktoren
zu vermeiden, werden alle Substanzen in einem Volumen von maximal 1% des entsprechenden Perfusat-Volumens zugesetzt und, wenn es die chemischen Eigenschaften bezüglich der Hydrophilie der Substanz zulassen, in Aqua bidest. gelöst. Wenn sich die
entsprechende Substanz nur in DMSO lösen lässt, wird nur 0,1% des PerfusatVolumens appliziert, da DMSO seinerseits die elektrischen Verhältnisse an der Zellmembran verändern kann und in möglichst geringer Konzentration verwendet werden
muss. Alle angegebenen Substanzkonzentrationen stellen die Endkonzentrationen am
Epithel dar.
2.2.8.2
Veränderung der ionalen Zusammensetzung des Perfusats
Durch die Entfernung bestimmter Ionenarten aus dem luminalen und/oder serosalen
Kompartiment lassen sich verschiedene Transportmechanismen wie zum Beispiel Ionenaustausch, Kotransport oder auch auf Konzentrationsgradienten beruhende Prozesse
hemmen (siehe Tabelle 3).
In der vorliegenden Arbeit werden folgende Variationen durchgeführt: die Entfernung
des Cl--Ions aus dem luminalen Perfusat zwecks Hemmung des apikalen Anionenaustauschers wird durch den Ersatz der 0,9%igen NaCl-Lösung durch eine isoosmolare
Natriumglukonat-Lösung erreicht, im serosalen Kompartiment durch den Ersatz der Cl-haltigen durch entsprechende das Glukonat-Ion enthaltende Verbindungen. Zusätzlich
werden die Elektroden mit Hilfe von Kaliumnitrat [3 M] hergestellt und der Titrant HCl
durch H2SO4 ersetzt. Die Entfernung des Bikarbonat-Ions aus dem serosalen Perfusat
2 Material und Methoden
30
wird durch den isoosmolaren Ersatz des NaHCO3 durch HEPES-Puffer und einer Begasung durch 100% O2 anstelle von Carbogen erreicht und erlaubt somit eine Aussage
über die Bedeutung der serosalen Bikarbonat-Aufnahmemechanismen für dessen Sekretion.
2.2.8.3
2.2.8.3.1
Hemmung einzelner Ionentransportmechanismen
Blockade des serosal lokalisierten Na+K+2Cl--Kotransporters
(NKCC)
Das Schleifendiuretikum Bumetanid hemmt in einer Konzentration von 0,5 mM selektiv
die beiden Isoformen des NKCC (NKCC1 und NKCC2). Von funktioneller Bedeutung
im Dünndarm ist die Isoform NKCC1, die basolateral exprimiert wird. Durch den Einsatz von Bumetanid wird ein wichtiger Teil der zellulären Cl--Aufnahme gehemmt.
2.2.8.3.2
Blockade
des
Cl-/HCO3--Austausches
und
des
Na+/HCO3--
Kotransports durch DIDS
Serosal appliziert hemmt DIDS konzentrationsabhängig den an dieser Stelle lokalisierten Cl-/HCO3--Austauscher sowie den Na+/HCO3--Kotransporter, die jeweils unterschiedliche Empfindlichkeit auf die Substanz aufweisen. Die apikale Applikation von
DIDS führt zur Hemmung des hier befindlichen Cl-/HCO3--Austauschers. In der vorliegenden Arbeit wird DIDS in einem einzelnen Versuchansatz in einer Konzentration von
3 mM, in allen anderen in einer Konzentration von 1 mM verwendet. Hierdurch wird
eine nähere Charakterisierung der funktionellen Bedeutung dieser Transportmechanismen für die HCO3--Sekretion und -Aufnahme möglich.
2.2.8.3.3
Hemmung der Karboanhydrase durch Azetazolamid
Eine Blockade des sich in den Enterozyten befindlichen Enzyms Karboanhydrase II, das
die Gleichgewichtseinstellung der Reaktion H2O+CO2 ↔ H2CO3 ↔ HCO3- + H+ beschleunigt, wird zu 99,9% durch Applikation von Azetazolamid ab einer Konzentration
von 0,5 mM erreicht. Da die intrazelluläre Bikarbonatherstellung dadurch faktisch zum
2 Material und Methoden
31
Erliegen kommt, lassen sich hier differenziertere Aussagen über verschiedene Wege der
Bikarbonatgewinnung der Zelle ableiten.
2.2.8.3.4
Blockade des zellulären Na+/H+ -Austausches
Die Mitglieder der Genfamilie der Na+/H+-Austauscher lassen sich durch geeignete
Pharmaka in bestimmten Konzentrationen selektiv hemmen. Das PhenylacylguanidinDerivat Hoechst 642 hemmt in einer Konzentration von 1 µM selektiv den NHE1 und in
einer Konzentration von 25 µM zusätzlich den NHE2 (133); die Substanz wird in der
vorliegenden Arbeit in der erstgenannten Konzentration eingesetzt.
Das Amilorid-Derivat DMA hemmt ab einer Konzentration von 0,5 mM sämtliche Isoformen NHE1-NHE4 (17;110).
2.2.8.3.5
Hemmung der Na+/K+-ATPase
Das Herzglykosid Strophantin (Ouabain) in einer Konzentration von 0,5 mM (serosal
appliziert) hemmt selektiv und irreversibel die sich auf der Innenseite der serosalen
Zellmembran befindliche Na+/K+-aktivierbare ATPase, indem es an die in den extrazellulären Raum ragende α-Untereinheit dieses Enzyms bindet (45). Die Na+/K+-ATPase,
die nach dem Prinzip des primär aktiven Transportes, also unter Energieverbrauch, arbeitet, ist hauptverantwortlich für die Erhaltung eines stabilen Membranpotentials und
Zellvolumens. Ihre uneingeschränkte Funktion bildet die Grundlage aller sekundär und
tertiär aktiven zellulären Transportprozesse. Die Blockade der Na+/K+-ATPase führt
zum Erliegen sämtlicher aktiver Ionentransport-Mechanismen und zum Abfall sämtlicher Messparameter. Somit ist dies ein geeignetes Mittel, über den Anteil der aus aktivem Transport hervorgehenden Bikarbonatsekretion eine Aussage zu treffen, im Folgenden wird auch von „Ouabain-sensitiver Bikarbonatsekretion“ gesprochen. Ouabain
[0,5 mM] wird in der vorliegenden Arbeit am Ende jedes durchgeführten Versuches
serosal appliziert.
2 Material und Methoden
2.2.8.3.6
32
Hemmung neuronaler Natriumkanäle
Nach dem Einspannen der präparierten Epithelien in die Ussingkammer wird bei jedem
Versuch serosal Tetrodotoxin in einer Konzentration von 6µM appliziert. Tetrodotoxin
ist das Gift des Kugelfisches und hemmt in dieser Konzentration schnelle Na+-Kanäle
neuronaler Zellen. Dadurch werden die Neuronen des durch die Präparation nicht vollständig entfernten Plexus submucosus ausgeschaltet, deren Signale PD- und IscSchwankungen verursachen können.
2.2.8.4
Durchführung der radioaktiven 3H-Mannitol,
36
Chlorid und
22
Natrium-
Fluxe
Die Durchführung der radioaktiven Fluxbestimmungen erfolgt am oben beschriebenen
Ussingkammer-Aufbau, wobei im Falle der
36
Cl-- und 3H-Mannitol-Fluxe eine Ab-
schirmung aus Plexiglas gegen die β-Strahlung und bei der Durchführung der
22
Natrium-Fluxe als Schutz gegen die hierbei zusätzlich zur β-Strahlung auftretende γ-
Strahlung eine Bleiabschirmung verwendet wird.
Zur Kontrolle wird vor der Zugabe der Aktivität bilateral eine Leerabnahme durchgeführt. Die Zugabe von jeweils 74 kBq/ml des entsprechenden Isotops entweder in das
luminale oder serosale Kompartiment erfolgt nach Erreichen stabiler elektrophysiologischer Parameter und konstanter Bikarbonatsekretionsraten. Kurz vor der Zugabe des
Isotops 36Cl-, das in 0,1 M HCl vorliegt, werden beide Perfusionskammern abgeklemmt
und der pH-Wert der jeweiligen Perfusionsflüssigkeit, die mit der Aktivität versetzt
worden ist, mit Hilfe von NaOH [154 mM] auf pH 7,4±0,03 korrigiert. Beim Versuchsschema „DIDS mukosal“ wird die Substanz DIDS [1mM] nach Erreichen der oben genannten stabilen Parameter und 10 min vor der Aktivitätszugabe luminal appliziert. Die
erste Abnahme erfolgt nach einer Äquilibrierungszeit von 30 min ab Zugabe der Aktivität, wobei bilateral jeweils drei mal 100µl entnommen und in 5 ml fassende Szintillationsgefäße überführt werden. Die entnommenen Volumina werden nicht ersetzt. Die
folgenden Abnahmen finden in gleicher Weise wie die Erstabnahme im 15-min-Takt
statt. Dabei werden die Parameter Isc und Bikarbonatsekretion fortlaufend aufgezeichnet.
In die Szintillationsgefäße werden jeweils 5 ml Szintillationscocktail gegeben, der Inhalt gründlich mittels Vortexer durchmischt und die Gefäße am nächsten Tag zur Ra-
2 Material und Methoden
33
dioaktivitätsmessung in einen β-Counter überführt, wo bei einem 36Cl-, 3H- bzw. 22Na+Fenster bei 5-320 eV bei 5 min Messzeit die Counts der jeweils 3 Proben pro Abnahme
und Kompartiment bestimmt werden. Die Berechnung des Fluxes für 36Cl- von serosal
nach mukosal (J36Cl- se→mu), für 22Na+ (J22Na+ se→mu) und für 3H-Mannitol (J3H Mannitol
se→mu)
ergibt sich über die folgende Formel:
∆cts (t1 – t0) x cm
J36Cl- se→mu =
ctsh x ∆t x A x Vp
∆cts
Differenzcounts von jeweils zwei aufeinanderfolgenden Abnahmen
t1 – t0 Abnahmeintervall, wobei t1 immer der Zeitpunkt der zweiten der beiden
interessierenden Abnahmen ist
cm
Konzentration des kalten (nichtmarkierten) Ions
∆t
Abnahmeintervall [h]
A
Epithelfläche
ctsh
Counts der heißen Seite zum Zeitpunkt t0 [counts per minute]
Vp
Probenvolumen
2 Material und Methoden
34
2.2.9 Auswertung und Statistik
Die Ergebnisse werden, falls nicht anders angegeben, als Mittelwerte ± Standardfehler
(SEM) dargestellt, n ist die Anzahl der untersuchten Proben (Epithelstücke), pro Tier
werden maximal zwei Stücke des proximalen Duodenums verwendet und parallel gemessen. Die letzten 10 min vor Zugabe der ersten Substanz gemessenen Werte werden
gemittelt. Zur besseren Vergleichbarkeit mit den Sekretions- und Fluxraten wird der Isc
von der Einheit µA/cm2 mit Hilfe des Faktors 0,03744 auf µEq/(cm2 x h) umgerechnet
(1 µA entspricht dem Netto-Flux von 10,4 pmol/s eines univalenten Ions).
Die Auswertung der Rohdaten erfolgt mit Hilfe der Software MicrocalTM OriginTM 5.0
und Microsoft® Excel 97 SR-2.
Die statistische Signifikanz wird mithilfe des Einstichproben-t-Tests berechnet. Das
Signifikanzniveau liegt bei p < 0,01, wobei ein zweiseitiger Test durchgeführt wird.
3 Ergebnisse
3.1
Grundprinzipien der Versuchsdurchführung
Da es zur Erhöhung des Ischämietoleranz und zur Verminderung von Autolyse wichtig
war, das Gewebe nach Entnahme und während der Präparation auf 4°C herunter zu kühlen und der in die Ussingkammer eingespannte Darm anderen Perfusionslösungen, die
eine Temperatur von 37°C aufwiesen, ausgesetzt war, wurde dem Gewebsstück vor
Beginn des eigentlichen Versuches in der Ussingkammer eine Regenerationszeit von 30
min zugestanden. Im Verlauf dieses Zeitabschnittes sollten die in Tabelle 4 aufgelistetem Parameter eine Stabilität erreicht haben, auf deren Grundlage mit der Durchführung
des eigentlichen Versuchsschemas begonnen werden konnte. Gewebe, die nach dieser
Zeit keine adäquaten Messparameter aufwiesen, wurden nicht zum Versuch herangezogen. Der in Kapitel 2 beschriebene Ussingkammeraufbau erlaubt sowohl die Bestimmung elektrophysiologischer Parameter als auch die Bikarbonatsekretionsmessung mittels der pH-stat-Methode. Tabelle 4 zeigt die in dieser Arbeit am Duodenum des Kaninchens erhobenen Daten, im Vergleich dazu sind Werte für die Ratte (54) und die Maus
(137) aufgelistet.
Tabelle 4: Basalparameter des Duodenums verschiedener Spezies, Daten an der Ussingkammer erhoben.
Spezies
Ratte
Maus
Kaninchen
1,25 ± 0,05
1,12 ± 0,11
3,75 ± 0,12
1,9 ± 0,04
1,76 ± 0,52
1,08 ± 0,16
Bikarbonatsekretion
(JHCO3-)
[µEq x cm-2 x h-1]:
Kurzschlussstrom
(Isc)
-2
-1
[µEq x cm x h ]:
3 Ergebnisse
36
Im Folgenden werden in den Abbildungen 3 bis 17 die epitheliale Bikarbonatsekretion
JHCO3- [µEq x cm-2 x h-1] und der Kurzschlusstrom Isc [µEq x cm-2 x h-1] dargestellt,
Abbildungen 18 bis 22 zeigen die bilateralen Fluxraten [µmol x cm-2 x h-1] für die jeweils angegebenen Ionen. Testsubstanzen wurden immer nach Erreichen eines stabilen
Plateaus der Messparameter appliziert. Die Endkonzentration am Epithel der zugegebenen Testsubstanzen ist für jeden Versuch angegeben. Die Substanzen 8-Br-cAMP, Bumetanid, DMA, Hoechst 642, Natriumpyruvat, Ouabain und Tetrodotoxin wurden
grundsätzlich basolateral appliziert. Im Falle des Azetazolamid wurde 15 min nach der
bilateralen Applikation luminal ein Mediumswechsel vorgenommen; DIDS wurde je
nach Fragestellung basolateral oder luminal appliziert, was in den gezeigten Versuchen
jeweils angegeben ist.
3.2
Messungen der Bikarbonatsekretion und des Kurzschlussstromes
3.2.1 Verlauf der Bikarbonatsekretion und des Isc nach Stimulation mit 8Br-cAMP, Bumetanid und Ouabain
Die im folgenden Abschnitt dargestellte Versuchsreihe diente als Kontrolle, auf die sich
alle späteren Abwandlungen des Versuchsschemas beziehen. Näher untersucht werden
sollte durch diese Versuchskonstellation, wie das Epithel hinsichtlich der Veränderungen seiner Bikarbonatsekretionsraten und einer Kurzschlussstromabweichung auf Stimulation durch 8-Br-cAMP und damit auf cAMP-abhängige Agonisten reagieren würde.
Um die Rolle des basolateral lokalisierten Na+K+2Cl--Kotransporters (NKCC), der offenbar einen erheblichen Anteil an der Cl--Aufnahme der Enterozyten hat, funktionell
näher zu charakterisieren, wurde 30 Minuten nach Applikation von 8-Br-cAMP das
Schleifendiuretikum Bumetanid, das beide Isoformen des NKCC (NKCC1 und 2) inhibiert, serosal in einer Konzentration von 0,5 mM zugesetzt.
Das Herzglykosid Ouabain, das die basolateral lokalisierte Na+/K+-ATPase hemmt und
somit zu einem Erliegen sämtlicher aktiver Transportvorgänge an der Zellmembran
führt, wurde in der Kontrolle wie auch in allen gezeigten Versuchen grundsätzlich 15
3 Ergebnisse
37
min nach Bumetanid-Gabe in einer Konzentration von 0,5 mM ins serosale Perfusat
gegeben, um anhand des dadurch erreichten Abfalles der Messparameter Bikarbonatsekretion und Isc zum einen die Vitalität des Gewebes zu beurteilen und zum anderen zwischen aktiver und passiver Bikarbonatsekretion zu differenzieren, wobei davon ausgegangen wurde, dass die nach Erreichen eines neuen Plateaus verbleibende Bikarbonatsekretion hauptsächlich auf passiver Diffusion von HCO3--Ionen entlang des bestehenden HCO3--Konzentrationsgradienten von serosal nach mukosal beruhen muss. In den
Kurven angegeben ist jeweils die tatsächlich titrierte bzw. gemessene Menge an Bikarbonat, die auf die Fläche der Messkammer (0,636 cm2) und die Zeiteinheit (1 h) umgerechnet wurde.
JHCO
Isc
3
2
5
-2
-1
3
4
1
Bumetanid 0,5 mM
Ouabain 0,5 mM
-1
2
-2
0
3
Isc [µEq x cm x h ]
JHCO3- [µEq x cm x h ]
6
8-Br-cAMP 1 mM
-1
-2
1
0
20
40
60
80
100
120
Zeit [min]
Abbildung 3: Reaktion des Duodenalepithels auf Stimulation mit 8-Br-cAMP [1 mM]
(serosal appliziert) hinsichtlich der Bikarbonatsekretions- () und der Isc-Veränderung
(∆), nach 40 min Bumetanid-Applikation [0,5 mM] (serosal appliziert) und nach 55 min
Zugabe von Ouabain [0,5 mM] (serosal appliziert); n=14.
3 Ergebnisse
38
Die basale Bikarbonatsekretionsrate des Duodenalepithels betrug unter den beschriebenen Versuchsbedingungen im Mittel 3,75 ± 0,12 SEM µEq x cm-2 x h-1. Der Isc wies
einen Basalwert von 1,08 ± 0,16 SEM µEq x cm-2 x h-1 auf. Auf die Zugabe von 8-BrcAMP [1 mM] ins serosale Perfusat reagierte das Epithel in den ersten 15 min mit einer
signifikanten mittleren Bikarbonatsekretionssteigerung von ∆ 1,74 ± 0,15 SEM µEq x
cm-2 x h –1; der Isc stieg ebenfalls signifikant an, wobei ein Peakwert von 2,92 ± 0,2
SEM µEq x cm-2 x h-1 erreicht wurde. Nach Erreichen eines neuen Plateaus der Bikarbonatsekretion mit einem mittleren Wert von 5,31 ± 0,26 SEM µEq x cm-2 x h-1 wurde
serosal
Bumetanid
in
einer
Konzentration
von
0,5
mM
zugegeben.
Die
Bikarbonatsekretion wurde hierdurch nicht signifikant beeinflusst, der Isc wies einen
leichten initialen, jedoch nicht anhaltenden Abfall auf. Die Zugabe von Ouabain
bewirkte innerhalb von 60 min stets einen Abfall der Bikarbonatsekretion auf ein
Plateau, das sich auf Werte einpendelte, die im Mittel noch 43% des Basalwertes
betrugen. Der Isc fiel nach der Ouabain-Applikation auf Werte unter dem Nullniveau,
um sich auf ein Plateau von -22,38 ± 8,08 SEM µA x cm-2 oder 0,84 ± 0,3 SEM µEq x
cm-2 x h-1 einzustellen. Dass der Isc am Schluss negative Werte aufwies, bedeutet, dass
sich die Ladungsverhältnisse im Vergleich zum Zustand bei Versuchsbeginn an den
beiden Seiten des Epithels umgedreht hatten.
3.2.2 Verlauf von Bikarbonatsekretion und Isc unter luminal Cl--freien Bedingungen
Mit Hilfe des Ersatzes der luminalen NaCl-Lösung durch Na+Glukonat sollte die Reaktion des Gewebes auf 8-Br-cAMP, Bumetanid und Ouabain unter Cl--freien Bedingungen an der epithelialen Mukosa überprüft werden. Hierbei werden alle am luminalen
Zellpol befindlichen Cl--abhängigen Ionentransportmechanismen, seien sie aktiver oder
passiver Natur, annähernd geblockt, so dass man anhand dieser Versuchskonstellation
verschiedene Aussagen über die Cl--unabhängige Bikarbonatsekretion und des Anteiles
dieser Transportmechanismen am Kurzschlussstromverlauf treffen kann.
3 Ergebnisse
JHCO
Isc
3
5
4
4
3
3
2
2
1
8-Br-cAMP
1 mM
Ouabain 0,5 mM
Bumetanid 0,5 mM
1
Isc [µEq x cm-2 x h-1]
JHCO3- [µEq x cm-2 x h-1]
5
39
0
0
-
Cl -freies luminales Perfusat
-1
-1
0 10 40
60
80
100
120
140
Zeit [min]
Abbildung 4: Reaktion des Duodenalepithels hinsichtlich der Bikarbonatsekretion ()
und des Kurzschlussstromverlaufes (∆) auf verschiedene Stimulantien unter luminal Cl-freien Bedingungen. Zugabe von 8-Br-cAMP [1 mM] serosal 50 min nach Erreichen
stabiler Messparameter bzw. 40 min nach Umstellen des luminalen Perfusats auf eine
Cl--freie Lösung. Bumetanid wurde wie unter Kontrollbedingungen 30 min nach Zugabe
von 8-Br-cAMP in einer Konzentration von 0,5 mM serosal zugegeben, und nach weiteren 15 Minuten Wartezeit Ouabain [0,5 mM] serosal appliziert; n=5.
Wie bereits oben erwähnt, führt der Ersatz der sonst luminal verwendeten NaCl-Lösung
durch NaGlukonat zum Erliegen dort befindlicher Cl--abhängiger Transportprozesse.
Nach dem Austausch des luminalen Perfusates war zuerst eine initial gesteigerte Bikarbonatsekretionsrate zu verzeichnen (nicht gezeigt), kurz darauf erfolgte ein starker Abfall der Sekretionsraten um durchschnittlich 60%, um sich auf ein neues Plateau von
durchschnittlich 2.41 ± 0.18 SEM µEq x cm-2 x h-1 einzustellen. Der Kurzschlussstrom
fiel unmittelbar nach Austausch der Lösungen bis knapp unter das Nullniveau, um sich
dort auf einem neuen Plateau zu stabilisieren.
3 Ergebnisse
40
Die Zugabe von 8-Br-cAMP verursachte in den ersten 10 min einen Anstieg der Bikarbonatsekretion von ∆1,9 ± 0,24 SEM µEq x cm-2 x h-1 auf einen Peak von 4,35 ± 0,4
SEM µEq x cm-2 x h-1. Der Anstieg war damit gegenüber dem im Kontrollversuch gemessenen leicht erhöht. Danach stellte sich die Sekretion auf ein neues Plateau ein. Der
Kurzschlussstrom reagierte auf die 8-Br-cAMP Gabe mit einem sofort erfolgenden Anstieg auf einen Peak 3,02 ± 0,34 SEM µEq x cm-2 x h-1. Ein ähnlicher Peakwert war
auch im Kontrollversuch aufgetreten, allerdings von einem deutlich höheren Plateau
aus, so dass der Nettoanstieg in diesem Versuch deutlich höher ausfiel. Die Applikation
von Bumetanid führte zu einem leichten Anstieg der Bikarbonatsekretion, der jedoch
nicht signifikant war. Der Kurzschlussstrom reagierte hierbei mit einem leichten Abfall,
begann aber bereits im Mittel nach 5 Minuten wieder zu steigen. Die Applikation von
Ouabain führte zu einem kontinuierlichen Abfall der Bikarbonatsekretion, die sich auch
hier nach 40 Minuten Wartezeit auf ein Plateau von durchschnittlich 2,58 ± 0,22 SEM
µEq x cm-2 x h-1 einstellte, woraufhin der Versuch beendet wurde. Der Isc stieg weiterhin kontinuierlich an und stellte sich auch nicht auf ein Plateau ein, bedingt war dies
wahrscheinlich durch den hohen Cl--Gradienten von serosal nach mukosal und die dadurch bedingte Triebkraft für die sich nur serosal befindlichen Cl--Ionen.
3.2.3 Effekt von luminal appliziertem DIDS [1 mM] auf die Stimulation mit
8-Br-cAMP
Das Stilbenderivat DIDS hemmt konzentrationsabhängig unterschiedliche epitheliale
Ionentransportmechanismen
wie
z.B.
Ca2+-abhängige
Cl--Kanäle,
Na+/HCO3--
Kotransport und den Cl-/HCO3--Austausch. In den im folgenden dargestellten Versuchen wurde DIDS in einer Konzentration von 1 mM, in der es offenbar zu einer annähernd vollständigen Hemmung des apikal lokalisierten Cl-/HCO3--Austauschers kommt,
luminal appliziert, wobei das durch diese Substanz angesäuerte Perfusat erst wieder mit
dem Epithel in Berührung kam, nachdem der pH-Wert erneut auf 7,4 ± 0,03 eingestellt
worden war.
3 Ergebnisse
41
6
JHCO
Isc
3
-1
4
Ouabain
0,5 mM
3
2
2
1
1
Bumetanid 0,5 mM
8-Br-cAMP 1 mM
0
-1
DIDS 1mM luminal
-1
0
40
60
80
100
120
140
-1
0
-2
JHCO3- [µEq x cm x h ]
3
5
Isc [µEq x cm x h ]
4
-2
5
6
160
Zeit [min]
Abbildung 5: Bikarbonatsekretion () und Isc (∆) in Anwesenheit von DIDS [1 mM]
(appliziert nach 10 min stabil gemessenen Basalparametern) im luminalen Perfusat.
Applikation der übrigen Substanzen wie in den vorangegangenen Versuchen (n=6).
Nach Erreichen stabiler Basalparameter wurde DIDS [1 mM] ins luminale Perfusat gegeben, worauf die Bikarbonatsekretion absank, um sich auf ein neues Plateau einzustellen, das noch ca. 60% der ursprünglichen Sekretionsrate betrug. Im Falle des Isc ließ
sich ein Anstieg verzeichnen, auch er erreichte ein neues Plateau. Stimulation mit 8-BrcAMP ergab eine Bikarbonatsekretionssteigerung von ∆2,12 ± 0,49 SEM µEq x cm-2 x
h-1auf 4,71 ± 0,48 SEM µEq x cm-2 x h-1in den ersten 15 min, analog zum vorangegangenen Versuch (siehe Abbildung 4) war diese Steigerung auch hier im Vergleich zur
Kontrolle sogar etwas erhöht.
Der 8-Br-cAMP-mediierte Isc-Anstieg fiel sowohl zur Kontrolle als auch zum Versuch,
bei dem unter luminal Cl--freien Bedingungen gearbeitet worden war, geringer aus.
Zieht man jedoch im vorliegenden Versuch den initialen Basalwert vom Peakwert nach
8-Br-cAMP Stimulation ab, so erhält man eine Differenz, die dem stimulierten Anstieg
3 Ergebnisse
42
des Isc unter Kontrollbedingungen sehr ähnlich ist (hier: 1,94 SEM µEq x cm-2 x h-1;
Kontrolle: 1,84 SEM µEq x cm-2 x h-1).
Nach Applikation von Bumetanid [0,5 mM] basolateral fielen die beiden Messparameter ab; der Abfall war jedoch zu leicht ausgeprägt, um ihn sinnvoll interpretieren zu
können. Dass nach der Zugabe von Ouabain [0,5 mM] ins basolaterale Perfusat sowohl
die Bikarbonatsekretion als auch der Isc stark abfielen, um sich letztendlich auf ein Plateau einzupendeln, zeigt, dass die gemessenen Transportvorgänge aktiver Natur waren.
3.2.4 Verlauf von Bikarbonatsekretion und Isc unter bilateral Cl--freien
Bedingungen
Bei der im folgenden gezeigten Versuchsreihe wurde bilateral unter Cl--freien Bedingungen gearbeitet. Auf der basolateralen Seite wurde die in Kapitel 1, Tabelle 3 aufgeführte Cl--freie Lösung verwendet, das luminale Perfusat bestand analog zur Versuchsreihe in 3.2.2 aus NaGlukonat [154 mM]. Die Agarosebrücken der Elektroden waren
hierfür mit Kaliumnitrat [3 M] statt Kaliumchlorid [3 M] hergestellt worden, um die
Konzentration der Cl--Ionen während des Versuches im System möglichst gering zu
halten.
3 Ergebnisse
43
-2
-1
5
Ouabain
0,5 mM
8-Br-cAMP
1 mM
4
6
J HCO
Isc
3
5
Bumetanid 0,5 mM
4
3
2
2
-2
3
Isc [µEq x cm x h ]
1
1
-
Cl -freies Perfusat bilateral
0
20
40
60
-1
JHCO3- [µEq x cm x h ]
6
80
100
120
Zeit [min]
Abbildung 6: Duodenale Bikarbonatsekretion () und Isc (∆) unter bilateral Cl--freien
Bedingungen. Die beiden Cl--freien Perfusionslösungen (basolateral und luminal) wurden von Versuchsbeginn an verwendet. Die Stimulantien wurden entsprechend dem bereits beschriebenen Versuchsschema der Kontrolle appliziert; n=5.
Da im Rahmen dieses Versuchsschema bereits von Versuchbeginn an unter bilateral Cl-freien Bedingungen gearbeitet wurde, fielen die Basalparameter für die Bikarbonatsekretion und den Kurzschlussstrom von Anfang an unterschiedlich zur Kontrolle aus.
Zu Versuchsbeginn pendelte sich die Bikarbonatsekretion auf einen Basalwert von 2,4 ±
0,25 SEM µEq x cm-2 x h-1 ein, der gemessene Isc betrug im Mittel 2,1 ± 0,37 SEM µEq
x cm-2 x h-1. Die Sekretionsrate für Bikarbonat war also niedriger als unter Kontrollbedingungen, der Kurzschlussstrom fiel in diesem Fall jedoch höher aus.
Nach der üblichen Stimulation mit 8-Br-cAMP [1 mM] basolateral 10 Minuten nach
Erreichen stabiler Basalparameter war eine Bikarbonatsekretionssteigerung auf 5,32 ±
0,17 SEM µEq x h-1 x cm-2 zu verzeichnen, die insgesamt langsamer vonstatten ging als
unter Konrollbedingungen und noch 30 min nach Stimulation anhielt. Der Kurzschlussstrom stieg ebenfalls an: der Peak lag bei 4,08 ± 0,8 SEM µEq x cm-2 x h-1.
Sowohl die Bikarbonatsekretion als auch der Isc fielen auf die Applikation von Bumetanid und Ouabain unter dem auch in den vorhergegangenen Versuchen verwendeten
3 Ergebnisse
44
Versuchsschema hin kontinuierlich ab. Nach 100 Minuten wurde der Versuch beendet,
weder Bikarbonatsekretion noch Isc hatten nach dieser Zeit ein Plateau erreicht, was
hier auch nicht angestrebt worden war.
3.2.5 Stimulation mit 8-Br-cAMP in bilateraler Abwesenheit von Cl--Ionen
und luminaler Anwesenheit von DIDS [1 mM]
JHCO
Isc
3
-2
-1
5
8-Br-cAMP
1 mM
3
5
Bumetanid
0,5 mM
4
DIDS 1 mM
luminal
6
4
3
-2
Isc [µEq x cm x h ]
2
2
Ouabain 0,5 mM
1
-1
JHCO3- [µEq x cm x h ]
6
1
-
Cl -freies Perfusat bilateral
0
40
60
80
100
120
140
160
Zeit [min]
Abbildung 7: Verlauf der Bikarbonatsekretion () und des Kurzschlussstromes (∆) unter bilateral Cl--freien Bedingungen. Nach Erreichen stabiler Basalparameter Applikation von DIDS [1 mM] ins luminale Perfusat. Stimulation mit 8-Br-cAMP [1 mM] 10
min nach Einstellung eines neuen Plateaus (45 min nach Applikation von DIDS). Stimulation mit Bumetanid [0,5 mM] 85 min und Ouabain [0,5 mM] 100 min nach Versuchsbeginn; n=4.
Die annähernde Abwesenheit von Cl--Ionen sowohl in der basolateralen als auch in der
luminalen Badlösung hatte folgende Auswirkungen auf das Epithel: Wie schon im vo-
3 Ergebnisse
45
rangehend gezeigten Versuch (siehe Abbildung 6) war die basale Bikarbonatsekretion
stark vermindert und auch der gemessene Kurzschlussstrom zeigte dem vorangegangenen Versuch ähnliche Werte. Die luminale Applikation von DIDS [1 mM] ließ sowohl
die Bikarbonatsekretion als auch den Kurzschlussstrom noch einmal abfallen, die sich
beide auf einem neuen Plateau einpendelten. Dieser Abfall war jedoch nicht signifikant
(p=0,22 für JHCO3- und p=0,46 für ∆Isc). Er lässt sich mit der Annahme einer Restaktivität von Cl--abhängigen Transportmechanismen, insbesondere der des apikal lokalisierten Cl-/HCO3- Austauschers, die auf Gabe von DIDS erloschen sein muss, vereinbaren.
Die Bikarbonatsekretionssteigerung, die auf die Gabe von 8-Br-cAMP erfolgte, fiel
zwar circa doppelt so hoch aus wie in der Kontrolle (vergleiche Abbildung 3), der maximal erreichte Absolutwert war jedoch mit 5,42 ± 0,48 SEM µEq x cm-2 x h-1 beinahe
identisch mit dem Peakwert nach Stimulation mit 8-Br-cAMP unter Kontrollbedingungen. Der Isc-Anstieg nach Stimulation wies mit ∆1,87 ± 0,35 SEM µEq x cm-2 x h-1
keinen signifikanten Unterschied zur Kontrolle auf. Auf die Gabe von Bumetanid fielen
sowohl Bikarbonatsekretion als auch Isc ab; da jedoch kurz darauf Ouabain zugegeben
wurde, lässt sich über das Ausmaß dieses Abfalls keine sichere Aussage machen. Auf
Gabe von Ouabain fiel sowohl die Bikarbonatsekretion als auch der Isc stark ab, um
sich in den letzten 20 min des Versuches auf einem neuen Plateau einzupendeln.
Die verschiedenen Ansätze, den apikal lokalisierten Cl-/HCO3--Austausch zu hemmen,
haben in jedem Fall zu dem Ergebnis geführt, dass die durch cAMP-abhängige Analoga
stimulierte Bikarbonatsekretion im Verglich zur Kontrolle nicht beeinträchtigt, wenn
nicht sogar gesteigert war. Dass die Sekretionsantworten zum großen Teil aktiver Natur
waren, zeigt der in jedem Versuch beobachtete Abfall der Sekretionsraten nach der Applikation von Ouabain.
Inwieweit der basolateral lokalisierte Na+ K+ 2Cl-Kotransporter (NKCC) in den apikalen Transport von Bikarbonat und Chlorid involviert ist, lässt sich aus den dargestellten
Versuchen nicht sicher ableiten. Um der Frage nach seiner (direkte oder indirekte) Beteiligung zumindest an der Bikarbonatsekretion nachzukommen, wurde im folgenden
Versuchsansatz der NKCC-Hemmstoff Bumetanid vor der Stimulation mit 8-Br-cAMP
zugegeben.
3 Ergebnisse
46
3.2.6 Auswirkungen der Stimulation durch 8-Br-cAMP [1 mM] auf die Bikarbonatsekretion und den Isc in serosaler Anwesenheit von Bumetanid [0,5 mM]
7
JHCO
Isc
3
3
-2
-1
2
5
1
4
0
-1
Bumetanid
0,5 mM
2
0
20
-1
3
-2
Ouabain
8-Br-cAMP 0,5 mM
1 mM
Isc [µEq x cm x h ]
JHCO3- [µEq x cm x h ]
6
-2
40
60
80
100
120
Zeit [min]
Abbildung 8: Effekt von 8-Br-cAMP[1 mM] und Ouabain [0,5 mM] auf die Bikarbonatsekretion () und den Isc (∆) in Anwesenheit von Bumetanid [0,5 mM] im basolateralen
Perfusat; n=6.
Durch die Blockierung des basolateral gelegenen NKCC durch Bumetanid [0,5 mM]
sollte die funktionelle Rolle dieses Transportproteins in Hinblick auf die basale und die
stimulierte Bikarbonatsekretion untersucht werden. Nach der Bumetanid-Applikation
fiel die HCO3--Basalrate leicht ab, um sich nach einiger Zeit wieder auf ihrem Ausgangsniveau einzupendeln, wobei der Abfall nicht signifikant war (p=0,18); der Isc veränderte sich nicht. Die Stimulation mit 8-Br-cAMP bewirkte einen etwas geringeren
Anstieg der Bikarbonatsekretion als unter Kontrollbedingungen, der Anstieg des Isc war
beinahe identisch zur Kontrolle.
3 Ergebnisse
47
Um die bis hier hin erhobenen Daten zum apikalen Ionentransport des Duodenozyten
besser interpretieren zu können, wurden nun Versuche durchgeführt, welche die duodenalen Aufnahmemechanismen für Bikarbonat und ihre Bedeutung für die Bikarbonatsekretion funktionell näher charakterisieren sollten.
3.2.7 Effekt serosaler Abwesenheit von CO2/HCO3- auf Bikarbonatsekretion und Isc
1,0
JHCO
Isc
3
4
3
0,6
2
Bumetanid 0,5 mM
0,4
0,2
0,0
1
Ouabain 0,5 mM
0
8-Br-cAMP
1 mM
CO2 /HCO3 freies Perfusat serosal
0
20
40
60
80
Isc [µEq x cm-2 x h-1]
JHCO3- [µEq x cm-2 x h-1]
0,8
-1
100
120
Zeit [min]
Abbildung 9: Verlauf von Bikarbonatsekretion () und Isc(∆) unter serosal CO2/HCO3freien Bedingungen. Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] 10 min nach Erreichen stabiler Basalparameter. Zugabe von Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM] nach
weiteren 30 bzw. 45 min; n=5.
Das Entfernen von CO2/HCO3- aus dem serosalen Perfusat bewirkte eine auf ca. 90%
reduzierte basale Bikarbonatsekretionsrate, die Antwort auf den 8-Br-cAMP Stimulus
3 Ergebnisse
48
betrug nur noch ca. 20% der unter Kontrollbedingungen gemessenen. Der Isc wies im
Basalzustand mit 2,84 ± 0,2 SEM µEq x cm-2 x h-1 im Vergleich zur Kontrolle erhöhte
Werte auf, jedoch ließ sich durch Stimulation mit 8-Br-cAMP nur ein minimaler Anstieg provozieren. Auf Bumetanid-Applikation reagierte die Bikarbonatsekretion mit
einem leichten Abfall; der Isc veränderte sich nicht nennenswert; die Zugabe von Ouabain führte zum bereits bekannten Abfall der beiden gemessenen Parameter.
3.2.8 Auswirkung der serosalen Anwesenheit von DIDS [1 mM] auf die 8Br-cAMP-stimulierte Bikarbonatsekretion und den Isc
JHCO
Isc
3
4
6
4
-2
-1
8-Br-cAMP
1 mM
3
2
-2
Bumetanid
0,5 mM
2
0
-1
Ouabain
0,5 mM
1
Isc [µEq x cm x h ]
JHCO3- [µEq x cm x h ]
5
-2
DIDS 1 mM serosal
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Zeit [min]
Abbildung 10: 8-Br-cAMP stimulierte Bikarbonatsekretion () und Isc (∆) in Anwesenheit von DIDS [1 mM] im basolateralen Perfusat; anschließende Applikation von Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM]; n=3.
3 Ergebnisse
49
DIDS [1 mM] basolateral appliziert bewirkte initial einen Anstieg sowohl der Bikarbonatsekretion als auch des Isc, die daraufhin jedoch beide abfielen, um sich auf einem
Plateau einzupendeln, das im Falle der Bikarbonatsekretion mit über 30% Reduktion
deutlich unter dem Niveau der Basalsekretion lag; der Isc hatte ca. 30 min nach DIDSApplikation Werte im Bereich des ursprünglichen Zustandes erreicht. Die 8-Br-cAMPinduzierte maximale Bikarbonatsekretionssteigerung von 1,81 ± 0,49 SEM µEq x cm-2 x
h-1 lag im Bereich des Anstiegs unter Kontrollbedingungen (vergleiche Abbildung 3);
trotz der Blockierung eines wichtigen Weges der Bikarbonataufnahme war das Gewebe
offenbar immer noch in der Lage, mit einer (im Vergleich zur Kontrolle) uneingeschränkten Sekretionssteigerung für Bikarbonat zu reagieren. Der starke Abfall der
beiden gemessenen Parameter nach der Applikation von Ouabain belegt, dass auch hier
eine aktive Sekretionsleistung des Duodenalepithels vorgelegen haben muss. Dass die
Werte bereits auf die Gabe von Bumetanid hin anfingen abzufallen, liegt wahrscheinlich
daran, dass die Applikation der Substanz in den Zeitbereich fiel, in dem die cAMPinduzierte Aktivierung bereits nachließ; der Abfall des Isc wurde bereits im Kontrollversuch beobachtet und hängt wahrscheinlich mit den durch die Hemmung des NKCC
veränderten Konzentrationsverhältnissen für Cl-, das einen maßgeblichen Einfluss auf
den Isc hat, zusammen.
3 Ergebnisse
50
3.2.9 Effekt von serosal appliziertem DIDS [3 mM] auf die 8-Br-cAMPmediierte Bikarbonatsekretionsantwort und den Isc
JHCO
Isc
3
6
5
-1
-2
5
3
4
2
3
2
1
0
-1
DIDS 3 mM Bumetanid
0,5 mM
-2
1
Isc [µEq x cm x h ]
JHCO3- [µEq x cm x h ]
4
-1
8-Br-cAMP 1 mM
Ouabain 0,5 mM
-2
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Zeit [min]
Abbildung 11: Stimulation des Duodenalepithels mit 8-Br-cAMP und darauffolgende
serosale Applikation von DIDS [3 mM]. Vor Zugabe von Bumetanid 1h Wartezeit. Ouabain-Applikation nach weiteren 15 min. Verlauf von Bikarbonatsekretion () und Isc
(∆); n=4.
Die basale Bikarbonatsekretionsrate betrug, da zunächst gleiche Bedingungen wie im
Kontrollversuch herrschten, erwartungsgemäß 3,74 ± 0,12 SEM µEq x cm-2 x h-1. Auf
die 8-Br-cAMP Stimulation reagierte das Gewebe in den ersten 15 min mit einer mittleren Bikarbonatsekretionssteigerung von ∆ 1,79 ± 0,29 SEM µEq x cm-2 x h-1. Die Zugabe von DIDS [3mM] ins serosale Perfusat ergab eine Abnahme der Bikarbonatsekretion, die sich auf einem neuen Plateau einpendelte, das in den letzten 15 min vor Bumetanid-Applikation durchschnittlich 3,67 ± 0,42 SEM µEq x cm-2 x h-1 betrug, also deutlich über den Werten lag, welche die Versuchsreihe ergeben hatte, bei der DIDS [1 mM]
3 Ergebnisse
51
vor der 8-Br-cAMP Gabe appliziert worden war (siehe Abbildung 10). Der Isc reagierte
auf die serosale Gabe von DIDS [3 mM] mit einem Anstieg, der auch schon bei der Applikation dieser Substanz vor Stimulation beobachtet worden war (siehe Abbildung 10),
dort allerdings in einem kürzeren Zeitabschnitt erfolgend. Die Bumetanid-Gabe führte
zu keiner Veränderung hinsichtlich der Bikarbonatsekretion, jedoch kam es zu einem
leichten Absinken des Kurzschlussstromes. Nach Ouabain-Applikation sanken beide
Messparameter ab; nach ca. 1 h hatten sie sich auf ein neues Plateau eingependelt, wobei die erreichten Werte mit den in Abbildung 10 gezeigten vergleichbar waren.
3.2.10 Hemmung der Karboanhydrase durch Azetazolamid [1 mM]: Auswirkung auf die 8-Br-cAMP-stimulierte Bikarbonatsekretion und den
Isc
5
J HCO
Isc
3
-1
3
3
-2
2
1
2
0
0
Azetazolamid 1 mM
-1
Ouabain 0,5 mM
-2
-1
0
20
40
60
80
Zeit [min]
100
120
140
-1
8-Br-cAMP 1 mM
-2
Bumetanid 0,5 mM
1
Isc [µEq x cm x h ]
JHCO3- [µEq x cm x h ]
4
4
3 Ergebnisse
52
Abbildung 12: Effekt von bilateral appliziertem Azetazolamid [1 mM] auf die 8-BrcAMP-stimulierte Bikarbonatsekretion () und Isc (∆). Applikation von 8-Br-cAMP,
Bumetanid und Ouabain im selben zeitlichen Schema wie in den vorangegangenen Versuchen. Mediumswechsel luminal 15 min nach Azetazolamid- Applikation; n=3.
Die Azetazolamid-vermittelte Hemmung der zellulären Karboanhydrase führt zum Erliegen der intrazellulären Generierung von HCO3--Ionen. Nach der bilateralen Applikation von Azetazolamid wurde eine Reduktion der basalen Bikarbonatsekretion beobachtet, die nach Erreichen eines neuen Plateaus nach 35 min noch ungefähr 65% der ursprünglichen Sekretionsrate betrug. Der Isc sank hierbei geringfügig ab. Die 8-BrcAMP-mediierte Bikarbonatsekretionssteigerung war mit 1,67 ± 0,36 SEM µEq x cm-2
x h-1 vergleichbar mit dem Anstieg unter Kontrollbedingungen. Die Bumetanid-Gabe
hatte keine nennenswerte Auswirkung auf die Bikarbonatsekretion, der Isc sank jedoch
geringfügig ab. Nach Ouabain-Gabe sank der Isc nach einer initialen Steigerung gegen
den Nullpunkt, die Bikarbonatsekretion erreichte ebenfalls Werte, die deutlich unter
dem nach der Azetazolamid- Inkubation erreichten Plateau lagen. Das Absinken beider
Parameter weist darauf hin, dass das Epithel auch nach Azetazolamid- Applikation aktive Ionentransportprozesse unterhielt.
3 Ergebnisse
53
3.2.11 Effekt von serosal appliziertem DIDS [1 mM] und Azetazolamid
[1 mM] auf die 8-Br-cAMP-mediierte Bikarbonatsekretionsantwort
und den Isc
JHCO
Isc
3
-2
-1
4
2
2
0
-2
DIDS 1 mM
Azetazolamid 1 mM
0
40
60
0
-1
8-Br-cAMP 1mM
-2
Bumetanid
0,5 mM
Isc [µEq x cm x h ]
JHCO3- [µEq x cm x h ]
4
Ouabain
0,5 mM
-2
80
100
120
140
Zeit [min]
Abbildung 13: Effekt der serosalen Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] , Bumetanid
[0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM] auf den Verlauf von Bikarbonatsekretion () und Isc
(∆) unter Einwirkung von serosal appliziertem DIDS [1 mM] und bilateral appliziertem
Azetazolamid [1 mM]. Mediumswechsel luminal 15 min nach Azetazolamid- und DIDS Applikation. Achse ist von 10 bis 35 min unterbrochen; n=4.
Durch die gleichzeitige Applikation von DIDS und Azetazolamid wurden sowohl der
basolateral lokalisierte Na+/HCO3--Kotransport als auch die Karboanhydrase und damit
die zwei Hauptwege der zellulären HCO3- Bereitstellung blockiert. Auf die Stimulation
mit 8-Br-cAMP [1 mM] ließ sich eine im Vergleich zur Kontrolle stark reduzierte als
auch in ihrer Dauer verkürzte Bikarbonatsekretionsantwort beobachten, die in den ersten 10 min nach Stimulation bereits ihren Peakwert erreicht hatte; die Steigerung betrug
3 Ergebnisse
54
im Mittel ∆ 1,24 ± 0,18 SEM µEq x cm-2 x h-1 und damit nur noch ca. 70% des unter
Kontrollbedingungen gemessenen Anstiegs. Die Bumetanid-Applikation bewirkte ein
Absinken des Kurzschlussstromes, die Bikarbonatsekretion war dadurch nicht beeinflussbar. Ouabain schließlich hatte ein Absinken beider gemessenen Parameter zur Folge, was ein Hinweis darauf ist, dass auch nach der Inkubation mit den Substanzen DIDS
und Azetazolamid zusammen immer noch eine aktive Sekretion stattfand.
3.2.12 Selektive Hemmung des NHE1 durch Hoechst 642 [1 µM]: Auswirkung auf die 8-Br-cAMP-stimulierte Bikarbonatsekretion und den
Isc
JHCO
Isc
3
6
5
-1
-2
5
3
4
2
3
1
0
-1
Bumetanid 0,5 mM
2
-2
1
Isc [µEq x cm x h ]
JHCO3- [µEq x cm x h ]
4
8-Br-cAMP 1 mM
Hoechst 642 1 µM
0
20
40
-1
Ouabain 0,5 mM
60
80
100
120
140
Zeit [min]
Abbildung 14: Effekt von serosal appliziertem Hoechst 642 [1 µM] auf die 8-Br-cAMPstimulierte Bikarbonatsekretion () und Isc (∆). Applikation von 8-Br-cAMP, Bumetanid
und Ouabain nach dem bereits beschriebenen Schema; n=3.
3 Ergebnisse
55
Hoechst 642 gilt in einer Konzentration von 1 µM als selektiver Hemmstoff der basolateral lokalisierten Isoform NHE1 aus der Genfamilie der Na+/H+-Austauscher. Im
Gegensatz zur Wirkung von DIDS [1 mM] serosal und Azetazolamid [1 mM] bilateral
hatte die Applikation von Hoechst 642 [1 µM] im vorliegenden Versuchsansatz keine
Hemmung der basalen Bikarbonatsekretion zur Folge, der leichte Anstieg ist nicht signifikant. In den ersten 15 min nach 8-Br-cAMP-Applikation erreichte die Sekretionsantwort von ∆ 1,52 ± 0,29 SEM µEq x cm-2 x h-1 beinahe den Anstieg, der unter Kontrollbedingungen gemessen worden war. Die Isc-Antwort auf den 8-Br-cAMP-Stimulus
fiel mit einem Anstieg von ∆1,36 ± 0,82 SEM µEq x cm-2 x h-1 im Vergleich zur Kontrolle geringer aus. Die Bumetanid-Applikation hatte weder auf die Bikarbonatsekretion
noch auf den Isc eine erkennbare Auswirkung. Nach der Gabe von Ouabain fielen die
beiden Messparameter in gewohnter Weise ab, demzufolge hatte auch in diesem Versuch vorher eine aktive Sekretion stattgefunden.
Trotz der Hemmung des NHE1 war das Epithel offenbar in der Lage, sowohl eine uneingeschränkte basale als auch stimulierte Bikarbonatsekretionsrate zu unterhalten. Die
Hemmung eines wichtigen Weges der H+-Extrusion beeinträchtigt auch gleichzeitig die
Karboanhydrasereaktion, da die anfallenenden sauren Valenzen schlechter aus der Zelle
transportiert werden können, was jedoch offenbar voll kompensiert wurde.
3 Ergebnisse
56
3.2.13 Effekt von Hoechst 642 [1 µM] und DIDS [1 mM] serosal auf die 8-BrcAMP mediierte Bikarbonatsekretionsantwort und den Isc
4,0
JHCO
Isc
3
3
2
3,0
1
2,5
Bumetanid
0,5 mM
2,0
DIDS 1 mM
1,5
1,0
Hoechst 642 1 µM
0
20
40
Ouabain
0,5 mM
8-Br-cAMP 1 mM
60
80
0
100
120
Isc [µEq x cm-2 x h-1]
JHCO3- [µEq x cm-2 x h-1]
3,5
-1
140
Zeit [min]
Abbildung 15: Effekt der serosalen Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] , Bumetanid
[0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM] auf den Verlauf von Bikarbonatsekretion () und Isc
(∆) unter serosaler Einwirkung von Hoechst [1 µM] und DIDS [1 mM] (n=4).
Die serosale Applikation von Hoechst 642 [1µM] führte, wie bereits im vorangegangenen Versuch beobachtet, zu keiner signifikanten Veränderung der Basalsekretion. Nach
der serosalen Applikation von DIDS [1 mM] war ein starker Abfall der Bikarbonatsekretionsrate zu verzeichnen, der sich in vergleichbarer Weise auch schon in dem in Abbildung 10 dargestellten Versuch gezeigt hatte. Die 8-Br-cAMP-Applikation 60 min
nach Versuchsbeginn ergab eine im Vergleich zur Kontrolle verminderte Bikarbonatsekretionsantwort von ∆ 0,68 ± 0,08 SEM µEq x cm-2 x h-1, dies entspricht einer Verminderung um ca. 60%. Die Bumetanid-Gabe führte zu einem Abfall des Isc, jedoch
nicht der Bikarbonatsekretionsrate. Nach Applikation von Ouabain fielen die beiden
Parameter Bikarbonatsekretion und Isc stark ab, um sich ab ca. 130 min nach Versuchs-
3 Ergebnisse
57
beginn auf einem neuen Plateau einzupendeln, was für die vorhandene Fähigkeit der
untersuchten Epithelien, unter den beschriebenen Bedingungen eine aktive Sekretionsleistung zu erbringen, spricht.
3.2.14 Die 8-Br-cAMP-mediierte Bikarbonatsekretionsantwort und der IscVerlauf nach serosaler Applikation von DIDS [1 mM], Hoechst 642
[1µM] und DMA [0,5 mM]
4,5
2
JHCO
Isc
3
1
3,5
0
3,0
DMA 0,5 mM
-1
8-Br-cAMP 1 mM
2,5
DIDS 1 mM
-2
2,0
1,5
Hoechst 642 1µM
0
20
40
60
80
100
Ouabain 0,5 mM
120
140
160
Isc [µEq x cm-2 x h-1]
JHCO3- [µEq x cm -2 x h-1]
4,0
-3
180
Zeit [min]
Abbildung 16: Zeitverlauf der Bikarbonatsekretion () und des Isc (∆) unter der serosalen Einwirkung von nacheinander appliziertem DIDS [1 mM], Hoechst 642 [1 µM] und
DMA [0,5 mM], anschließend serosale Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] und Ouabain [0,5 mM]; n=4.
Durch die serosale Applikation von DIDS [1 mM] und Hoechst 642 [1µM] wurde, wie
bereits oben beschrieben, der basolateral lokalisierte Na+/HCO3--Kotransporter und die
3 Ergebnisse
58
Isoform NHE1 (entspricht ca. 80% der Hemmung des basolateral lokalisierten Na+/H+Austausches) gehemmt. In diesem Versuchsschema wurde zusätzlich DMA, ein in der
eingesetzten Konzentration von 0,5 mM unspezifischer Hemmstoff sämtlicher im
Dünndarm funktionell bedeutsamer Isoformen des Na+/H+-Austauschers, serosal appliziert. Nach Erreichen eines neuen Plateaus zeigte die Bikarbonatsekretion ähnliche
Werte, die schließlich bei Versuchsende (nach Ouabain-Gabe) gemessen wurden, das
heißt, dass die aktive Basalsekretion zum Erliegen gekommen war. Die 8-Br-cAMPstimulierte Sekretionsantwort lag im Bereich der in serosaler Abwesenheit von
CO2/HCO3- gemessenen Antwort (siehe Abbildung 9) und auch der stimulationsbedingte Anstieg des Isc zeigte sich, verglichen mit dem unter Kontrollbedingungen gemessenen, deutlich vermindert.
3.2.15 Effekt von serosal appliziertem Hoechst 642 [1 µM] und bilateral appliziertem Azetazolamid [1 mM] auf die 8-Br-cAMP-mediierte Bikarbonatsekretionsantwort und den Isc
JHCO
Isc
3
5
4
4
3
3
2
2
1
0
-1
1
Bumetanid 0,5 mM
0
8-B-cAMP 1 mM
-1
Hoechst 642 1 µM
Ouabain 0,5 mM
-2
-2
0
60
80
100
Zeit [min]
120
140
160
Isc [µEq x cm-2 x h-1]
JHCO3- [µEq x cm-2 x h-1]
5
3 Ergebnisse
59
Abbildung 17: Effekt der serosalen Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] , Bumetanid
[0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM] auf den Verlauf von Bikarbonatsekretion () und Isc
(∆) unter der Einwirkung von serosal appliziertem Hoechst [1µM] und bilateral appliziertem Azetazolamid [1 mM]. Mediumswechsel luminal 15 min nach Applikation von
Hoechst 642 und Azetazolamid; n=4.
Mit Hilfe dieses Versuchansatzes sollte untersucht werden, ob das gleichzeitige Einwirken von serosal appliziertem Hoechst 642 [1µM] und bilateral appliziertem Azetazolamid [1 mM] einen additiven Effekt hervorrufen würde und eventuell eine stärkere
Hemmung der 8-Br-cAMP-induzierten Bikarbonatsekretionsantwort (verglichen mit der
Antwort unter der alleinigen Einwirkung der jeweiligen Einzelsubstanz) zur Folge hätte.
Die mittlere Sekretionssteigerung auf den 8-Br-cAMP-Stimulus betrug ∆ 1,5 ± 0,11
SEM µEq x cm-2 x h-1, war damit vergleichbar mit den Sekretionssteigerungen, die nach
alleiniger Applikation von Azetazolamid (siehe Abbildung 12) und Hoechst 642 (siehe
Abbildung 14) jeweils erreicht worden waren, und lag nur geringfügig unter dem entsprechenden mittleren Anstieg unter Kontrollbedingungen.
Da im vorliegenden Versuchsansatz zwei verschiedene Systeme, nämlich sowohl die
Karboanhydrase selber als auch der wichtigste Eliminationsweg der dadurch anfallenden Protonen, gehemmt wurden, die 8-Br-cAMP-induzierte Sekretionsantwort im Vergleich zur alleinigen Applikation der jeweiligen Substanzen jedoch nicht nennenswert
schwächer wurde, liegt der Schluss nahe, dass die intrazelluläre Generierung von HCO3mittels der Karboanhydrase eng an den basolateral lokalisierten Na+/H+-Austausch gekoppelt ist.
3.3
Radioaktive Fluxmessungen
Wie bereits oben erwähnt, stellt die gemessene Veränderung des Kurzschlussstromes
immer nur die Summe aller elektrischen Vorgänge am Epithel dar. Eine Aussage über
die Einzelrolle von Kationen oder Anionen lässt sich nur schwer treffen. Eine Möglichkeit, das Verhalten unterschiedlicher Ionenarten in der Ussingkammer näher zu beschreiben, ist die Durchführung von Fluxmessungen mit Hilfe radioaktiver Isotope des
3 Ergebnisse
60
jeweils interessierenden Ions. In der vorliegenden Arbeit wurden Versuche mit den Isotopen 3H,
36
Cl- und 22Na+ durchgeführt. Alle Versuche wurden, mit einer Ausnahme,
analog zur angewandten Methode in Kapitel 3.2 im „open-circuit-current“-Modus und
unter pH-stat-Titration durchgeführt; die Bikarbonatsekretion und der Isc wurden dabei
fortlaufend aufgezeichnet.
3.3.1 Bidirektionale 3H Mannitol Fluxe
Jeder epitheliale Zellverband weist einen, je nach Gewebe unterschiedlich ausgeprägten,
parazellulären Shunt auf. Das Mannitol-Molekül kann von der Zelle nicht verstoffwechselt werden und verbleibt somit im Extrazellulärraum. Um den parazellulären Ionentransport näher zu charakterisieren, wurde der bidirektionale 3H-Mannitol-Flux am
Duodenalepithel in der Ussingkammer unter bestimmten Vorraussetzungen bestimmt.
3.3.1.1 Änderung des transepithelialen duodenalen 3H-Mannitolfluxes von serosal nach mukosal nach Stimulation mit 8-Br-cAMP [1m M]
3
Bumetanid 0,5 mM
H Mannitol Flux
Ouabain 0,5 mM
-1
Flux s>m [ µmol x cm x h ]
0,10
8-Br-cAMP 1 mM
-2
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
15
30
45
60
Zeit [min]
75
90
3 Ergebnisse
61
Abbildung 18: Effekt von 8-Br-cAMP [1 mM] auf den mittleren 3H-Mannitol-Flux ±
SEM von serosal nach mukosal; Applikation von Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain
[0,5 mM] nach 60 bzw. 75 min; n=3.
Die Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] ins serosale Perfusat ergab eine Steigerung
des 3H-Mannitol-Fluxes, wobei der Flux in der zweiten Hälfte des Messintervalls von
30 min nach Stimulation stärker anstieg als in der ersten; damit deutet dieses Ergebnis
auf eine Erhöhung des parazellulären Shunts unter der Einwirkung cAMP-abhängiger
Agonisten hin. Die Applikation von Bumetanid [0,5 mM] ins serosale Perfusat hatte
eine Abnahme des 3H-Mannitol-Fluxes von serosal nach mukosal zur Folge, ein noch
deutlicherer Abfall war nach Ouabain-Applikation zu verzeichnen.
3.3.1.2 Vergleich der Bikarbonatsekretionsrate und des transepithelialen 3HMannitol-Fluxes unter basalen Bedingungen und nach Stimulation mit
8-Br-cAMP
Flux s>m [ µmol x cm-2 x h-1 ]
6,0
5,5
3
H Mannitol Flux
JHCO3-
5,0
4,5
8-Br-cAMP 1 mM
4,0
3,5
3,0
0,075
0,050
0,025
15
30
Zeit [min]
45
3 Ergebnisse
62
Abbildung 19: Quantitativer Vergleich des Effektes von 8-Br-cAMP [1 mM] auf den
mittleren 3H-Mannitol-Flux ± SEM von serosal nach mukosal (schwarze Balken) und
die mittlere Bikarbonatsekretion ± SEM (graue Balken). Messung im Zeitintervall von
15 min; n=3.
Die gemessene Bikarbonatsekretion war im Schnitt hundertfach höher als der gleichzeitig stattfindende 3H-Mannitol-Flux, was gut zu der Annahme passt, dass sich Mannitol
nur parazellulär von der einen auf die andere Seite des Epithels bewegen kann. Die Bikarbonatsekretion nahm bereits im ersten Messintervall nach Stimulation mit 8-BrcAMP zu, wogegen die Steigerung des 3H-Mannitol-Fluxes nach mukosal erst im zweiten Messintervall, nämlich ab 15 min nach Stimulation eintrat.
3.3.2 Bidirektionale 36Cl--Fluxe
Das radioaktive Chlorid-Isotop 36Cl- wurde eingesetzt, um die Sekretion und Absorption
dieses Anions sowohl unter „open-circuit-current“- als auch unter „short-circuitcurrent“-Bedingungen zu quantifizieren und der Frage nachzugehen, ob die im vorangegangenen Versuch beobachtete Zunahme des parazellulären Shunts unter Stimulation
mit cAMP-abhängigen Analoga auch eine Zunahme der transepithelialen Anionenleitfähigkeit zur Folge hat. Es wurden der 36Cl--Flux von serosal nach mukosal und umgekehrt bestimmt.
3 Ergebnisse
63
3.3.2.1 Effekt von 8-Br-cAMP [1 mM], Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5
mM] auf den duodenalen bidirektionalen
36
Cl--Flux unter „open-circuit-
current“-Bedingungen
Flux 36Cl- [ µmol x cm-2 x h-1 ]
52
48
44
Flux s m
Flux m s
Ouabain
0,5 mM
40
36
8-Br-cAMP
1 mM
32
Bumetanid
0,5 mM
28
24
20
16
12
8
4
0
15
30
45
60
75
90
Zeit [min]
Abbildung 20A: Aufzeichnung der bidirektionalen Fluxraten für 36Cl- ± SEM von serosal nach mukosal (schwarze Balken) und von mukosal nach serosal (graue Balken) unter basalen Bedingungen und nach basolateraler Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM],
Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM]; n=5.
-2
-1
Flux 36Cl- [ µmol x cm x h ]
3 Ergebnisse
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
-2
-4
-6
-8
64
36
-
Cl Nettoresorption
Ouabain 0,5 mM
Bumetanid
0,5 mM
8-Br-cAMP
1 mM
45
15
60
30
75
90
Zeit [min]
Abbildung 20B: Aufzeichnung der duodenalen 36Cl--Nettoresorption ± SEM unter Verwendung der in Abbildung 20A gezeigten Messwerte.
Der in Abbildung 20A und 20B gezeigte Versuch wurde unter den gleichen Bedingungen wie der initial beschrieben Kontrollversuch (siehe Abbildung 3) durchgeführt, mit
dem Unterschied, dass das Isotop
36
Cl- zugegeben wurde und nach einer Äquilibrie-
rungszeit von 30 min bilaterale Abnahmen im 15-min-Takt erfolgten.
Unter Basalbedingungen war eine Nettoresorption für Cl- zu beobachten, die sich nach
der Stimulation mit 8-Br-cAMP in eine Nettosekretion umwandelte und durch eine
gleichzeitige signifikante Zunahme des
36
Cl--Fluxes nach mukosal und schwache Ab-
nahme des 36Cl--Fluxes nach serosal zustande kam (vergleiche Abbildung 20A). Auf die
Applikation von Bumetanid [0,5 mM] war eine starke Zunahme der Nettoresorptionsrate zu beobachten, die auf die Gabe von Ouabain [0,5 mM] wieder abnahm, insgesamt
fand dabei immer noch eine Nettoresorption statt.
3 Ergebnisse
65
3.3.2.2 Effekt von 8-Br-cAMP [1 mM], Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5
mM] auf den duodenalen bidirektionalen
36
Cl--Flux unter „short-circuit-
current“-Bedingungen
Flux 36Cl- [ µmol x cm-2 x h-1 ]
24
36
Cl--Nettosekretion
Ouabain
0,5 mM
20
16
12
8-Br-cAMP
1 mM
8
4
0
0-30
30-60
120-180
Zeit [min]
Abbildung 21: Effekt von 8-Br-cAMP [1 mM] auf den mittleren bidirektionalen
36
Cl--
Flux ± SEM; dargestellt ist der Nettoflux. Applikation von Ouabain [0,5 mM] 30 min
nach Stimulation mit 8-Br-cAMP, nach 1h Wartezeit ohne Abnahmen erfolgten die letzten vier Abnahmen; n=3.
Unter „short-circuit-current“-Bedingungen hatte sich die ursprünglich unter „opencircuit-current“-Bedingungen beobachtete Nettoresorption für Cl--Ionen in eine Nettosekretion umgewandelt. Die Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] erbrachte jedoch eine
Sekretionssteigerung für Cl-, die vergleichbar war mit derjenigen unter „open-circuitcurrent“-Bedingungen gemessenen (vergleiche Abbildung 20B). Auf die Gabe von
Bumetanid wurde in diesem Versuchansatz verzichtet. Um die Langzeitauswirkungen
von Ouabain zu testen, wurde hier erst 1 h nach Applikation der Substanz mit den
Abnahmen fortgefahren. Die verbleibende Nettosekretion zeigte ähnliche Werte wie
3 Ergebnisse
66
men fortgefahren. Die verbleibende Nettosekretion zeigte ähnliche Werte wie diejenigen, die kurz nach Stimulation gemessen worden waren.
3.3.3
Bidirektionale 22Na+ Fluxe
Das radioaktive Natrium-Isotop 22Na+ wurde eingesetzt, um die Sekretion und Absorption dieses Kations zu quantifizieren und um der Frage nachzugehen, ob die im vorangegangenen Versuch beobachtete Zunahme des parazellulären Shunts unter Stimulation
mit cAMP-abhängigen Analoga eine Zunahme der transepithelialen Kationenleitfähigkeit zur Folge hat, was wiederum bei der Beurteilung des Isc-Anstiegs unter Stimulationsbedingungen zu bedenken ist. Es wurden der
22
Na+-Flux von serosal nach mukosal
und umgekehrt bestimmt.
3.3.3.1 Bidirektionaler
22
Na+-Flux unter basalen Bedingungen und unter Einwir-
kung von 8-Br-cAMP [1 mM], Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5
mM]
44
Flux 22Na+ [ µmol x cm-2 x h-1 ]
40
Flux s
Flux m
36
m
Bumetanid
s 8-Br-cAMP
0,5 mM
1 mM
Ouabain
0,5 mM
32
28
24
20
16
12
8
4
0
15
30
45
60
Zeit [min]
75
90
3 Ergebnisse
67
Abbildung 22A: Aufzeichnung der bidirektionalen Fluxraten für 22Na+ ± SEM im Duodenum von serosal nach mukosal (schwarze Balken) und von mukosal nach serosal
(graue Balken) unter basalen Bedingungen und nach basolateraler Applikation von 8Br-cAMP [1 mM], Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM]; n=5.
22
26
+
Na Nettoresorption
Ouabain
0,5 mM
-2
-1
Flux 22Na+ [ µmol x cm x h ]
24
22
20
Bumetanid
0,5 mM
8-Br-cAMP
1 mM
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
15
30
45
60
75
90
Zeit [min]
Abbildung 22B: Aufzeichnung der duodenalen
22
Na+-Nettoresorption ± SEM unter
Verwendung der in Abbildung 22A gezeigten Messwerte.
Während der gesamten Dauer des in Abbildung 22A und 22B gezeigten Versuches fand
eine Nettoresorption für Na+-Ionen statt. Verglichen mit der Nettoresorption von Cl-Ionen im Basalzustand unter „open-circuit-current“-Bedingungen (siehe Figur 20B) war
die hier gemessene Na+-Rückresorption ca. doppelt so hoch. Nach Stimulation mit 8-BrcAMP [1 mM] nahm die Na+-Nettoresorption durch einen signifikanten Anstieg des
22
Na+-Fluxes nach mukosal ab. Die serosale Applikation von Bumetanid [0,5 mM] hatte
einen starken Anstieg der Nettoresorption von Na+ zur Folge. Nach der Gabe von Ouabain [0,5 mM] ins serosale Perfusat war die Na+-Nettoresorption zwar noch höher als im
3 Ergebnisse
68
Basalzustand, jedoch im Vergleich zum gemessenen Wert 15 min nach Applikation von
Bumetanid wieder abgefallen.
Tabelle 5: Vergleich von Bikarbonatsekretion, Isc und bilateralen Fluxraten für
und
22
36
Cl-
Na+ im Duodenalepithel des Kaninchens im Basalzustand und nach Stimulation
mit 8-Br-cAMP [1 mM].
Messparameter
Basalwert
Messwert nach
Messwert nach
dem ersten 15-min- dem zweiten 15-
JHCO3-
Intervall nach Sti-
min- Intervall nach
mulation**
Stimulation
3,75 ± 0,12 SEM
5,48 ± 0,18 SEM
5,3 ± 0,25 SEM
1,08 ± 0,16 SEM
2,92 ± 0,2 SEM
2,56 ± 0,18 SEM
16,1 ± 1,96 SEM
24,68 ± 2,49 SEM
24,32 ± 3,26 SEM
20,18 ± 1,31 SEM
17,83 ± 1,39 SEM
21,83 ± 0,56 SEM
-5,27 ± 0,91 SEM
6,57 ± 3,71 SEM
0,51 ± 3,48 SEM
20,94 ± 0,63 SEM
27,51 ± 2,42 SEM
25,24 ± 1,9 SEM
32 ± 3,13 SEM
31,56 ± 2,07 SEM
32 ± 3,35 SEM
11,06 ± 3,29 SEM
4,05 ± 2,52 SEM
6,76 ± 3,05 SEM
[µEq x cm-2 x h-1]
Isc
[µEq x cm-2 x h-1]
JCl-
s>m
[µEq x cm-2 x h-1]*
JCl-
m>s
[µEq x cm-2 x h-1]*
Netto JCl- s>m
[µEq x cm-2 x h-1]*
JNa+ s>m
[µEq x cm-2 x h-1]*
JNa+ m>s
-2
-1
[µEq x cm x h ] *
Netto JNa+ m>s
[µEq x cm-2 x h-1] *
*
1 µEq entspricht 1 µmol eines univalenten Ions.
** Im Falle des Isc ist der Peakwert, der unmittelbar nach Stimulation gemessen worden war, angegeben.
4 Diskussion
4.1
Methode
4.1.1 Grundsätzliches
Die Messung zellulärer Funktionen in der Ussingkammer bezieht sich immer auf den
Gewebeverband mit allen darin enthaltenen Zellspezies. Neben den Epithelzellen
zwangsläufig mituntersucht werden bei der Präparation des Duodenums für die Ussingkammer Krypten-, Villus- und Enterochromaffine Zellen wie auch gleichermaßen submukosal gelegene Zellen wie zum Beispiel Teile von Brunner´schen Drüsen, die durch
die Präparation nicht immer vollständig entfernt werden können. Ein wertvoller Vorteil
der Ussingkammertechnik gegenüber verschiedenen Methoden der Einzelzelluntersuchung besteht jedoch in der erhaltenen Möglichkeit, parazellulärer Transportwege eines
Nativgewebes unter annähernd physiologischen Bedingungen zu beurteilen.
4.1.2 Mukosapräparation
Das „stripping“ eines Darmstückes, also das Entfernen der bindegewebigen Serosa und
der beiden Muskelzellschichten mittels geeigneter Präparationstechnik, stellt eine etablierte Methode dar, das Gewebe optimal für eine Messung in der Ussingkammer vorzubereiten. Während der Präparation des Gewebes unter dem Stereomikroskop ließen sich
die einzelnen Schichten beim Ablösen erkennen, womit das Präparationsergebnis gut zu
kontrollieren war. Nur Gewebe, die nach einer Regenerationszeit von 30 min nach dem
Einspannen in die Ussingkammer stabile elektrophysologische Parameter und eine stabile Bikarbonatsekretionsrate aufwiesen, wurden zum Versuch herangezogen. Durch die
am Ende jeden Versuches stattfindende Applikation von Ouabain ins serosale Perfusat
wurde die Vitalität des Gewebes überprüft, die durch den darauf folgenden Abfall der
Bikarbonatsekretion und der elektrophysiologischen Parameter als vorher gegeben angenommen wurde.
4 Diskussion
70
4.1.3 Durchgeführte Messungen an der Ussingkammer
4.1.3.1 pH-stat-Titration
Prinzipiell existieren mehrere Möglichkeiten, die gastroduodenale Bikarbonatsekretion
zu messen (57). Da sie auch die Bikarbonatsekretion im luminal sauren Milieu zu messen erlaubt, eignet sich zur Bestimmung der gastralen Bikarbonatsekretion besonders
die pH/PCO2 Methode, die auf der Messung der Bikarbonatkonzentration mit Hilfe der
Henderson-Hasselbalch-Gleichung [pH=pKa+log(HCO3- /(αPCO2)] beruht.
Die Methode der Rücktitration wird häufig zur Messung der pankreatischen Bikarbonatsekretion in vivo angewendet, da diese ausreichend hoch ist, um ein befriedigendes
Ergebnis hinsichtlich der Genauigkeit zu erlangen. Für säuresezernierende Epithelien ist
sie ungeeignet, zudem wird sie beim Einsatz an Epithelien, die vergleichsweise wenig
Bikarbonat sezernieren, wie es beim Duodenum der Fall ist, zu ungenau.
Eine weitere Methode zur Messung ausschließlich der gastralen Bikarbonatsekretion
stellt die Osmolarität-[H+]-Methode dar, die auf der Annahme beruht, dass in der Anwesenheit von H+- Ionen für jedes sezernierte Mol HCO3- im Verlaufe seiner Dissoziation
eine lineare Abnahme der Osmolalität erfolgt. Gemessen wird hierbei nicht das sezernierte HCO3-, sondern die Osmolalität und H+-Ionen-Konzentration.
Zur Bestimmung der duodenalen Bikarbonatsekretion an der Ussingkammer hat sich die
gleichzeitige Durchführung der kontinuierlichen Basentitration zusammen mit dem
Kurzschlussstromexperiment als Standardmethode etabliert (141-143). Das Prinzip der
pH-stat-Titration besteht darin, den durch die epitheliale Bikarbonatsekretion ansteigenden luminalen pH-Wert durch kontinuierliche Gegentitration mit einer starken Säure
wie zum Beispiel HCl auf einem gewünschte Sollwert, meist pH 7 bis pH 8,5, zu halten.
In der Annahme, dass ein zugegebenes Säureäquivalent ein Basenäquivalent neutralisiert, kann nun unter Kenntnis der Normalität der verwendeten Säure durch eine geeignete Umrechnung die epithelial sezernierte Bikarbonatmenge ermittelt werden. Das dabei entstehende CO2, das einen ansäuernden Effekt hat, muss durch geeignete Begasung
des luminalen Kompartiments entweder durch CO2- freies O2 oder N2 entfernt werden.
4 Diskussion
71
4.1.3.2 Kurzschlussstromexperiment
Grundsätzlich kann das Kurzschlussstromexperiment nach H. P. Ussing in zwei verschiedenen Messmodi, die im Methodenteil (Kapitel 2.2.2.1) erläutert werden, durchgeführt werden. Wenn neben der Messung des Kurzschlussstromes gleichzeitig die Bikarbonatsekretion durch die pH-stat-Titration bestimmt werden soll, muss im „open circuit
current“-Modus gemessen werden, da die Titration eine ungepufferte luminale Perfusatflüssigkeit erfordert, wie sie nur hier vorliegt; der Messmodus des „short circuit current“ hingegen verlangt bilateral identische, gepufferte Perfusatlösungen, was wiederum
die Möglichkeit der pH-stat-Titration ausschließt.
Da die Fragestellung der vorliegenden Arbeit die gleichzeitige Bestimmung von Bikarbonatsekretion und Isc fordert, wurden sämtliche Versuche, von einer Ausnahme abgesehen, unter „open circuit current“-Bedingungen durchgeführt.
4.1.3.3 Radioaktive Fluxmessungen
Die Basentitration wie auch die Kurzschlussstrommessung sind lediglich dazu geeignet,
eine Aussage über Nettoänderungen der transportierten Basenäquivalente beziehungsweise des Ionenfluxes zu treffen; einen Schluss auf die Richtung und Ladung einzelner
Ionen lassen sie nicht zu. Um die Rolle bestimmter Ionen beim epithelialen Transport
näher charakterisieren zu können, muss auf radioaktive Fluxmessungen für definierte
Ionen zurückgegriffen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Isotope 3H, 36Clund 22Na+ gewählt.
4.2
Durchgeführte Versuche
4.2.1 Allgemeines
Das Kaninchen gehört zu den Spezies, die relativ hohe Bikarbonatsekretionsraten im
Duodenum aufweisen und somit an die Verhältnisse im menschlichen Duodenum heranreichen (40;114), weshalb dieses Versuchstier für die vorliegende Arbeit ausgewählt
wurde. Wie bereits oben erwähnt, setzt sich die duodenale Bikarbonatsekretion aus aktiver Sekretion und passiver Diffusion ins Darmlumen zusammen. Untersuchungen, die
4 Diskussion
72
das Vorhandensein aktiver Bikarbonatsekretion ins Lumen des Dünndarms zeigten,
wurden in verschiedenen Arbeiten sowohl unter einem HCO3--Diffusionsgradienten
(wie er auch in der Versuchsanordnung der vorliegenden Arbeit bestand) von serosal
nach mukosal als auch unter Bedingungen, in denen bilateral die gleiche HCO3-- Konzentration herrschte, durchgeführt (114;141). In der vorliegenden Arbeit wurde die Bikarbonatsekretion, die nach einer entsprechend langen Wartezeit nach Applikation von
Ouabain noch verblieb, als passive Diffusion angesehen, da der aktive Transport durch
diese Maßnahme weitgehend zum Erliegen gekommen sein musste.
4.2.2 Funktionelle Differenzierung der elektrogenen und elektroneutralen
duodenalen Bikarbonatsekretion
4.2.2.1 Kontrollversuch
Das cAMP-Analogon 8-Br-cAMP stimulierte erwartungsgemäß die Bikarbonatsekretion, die sofort nach Applikation anstieg und ihren Peakwert nach 15 Minuten erreichte
(siehe Abbildung 3). Auch der Kurzschlussstrom (Isc) reagierte mit einem deutlichen
Anstieg, der steiler als die Steigerung der Bikarbonatsekretion ausfiel und seinen Peak
noch früher erreichte. Zum Verständnis dieses Anstiegs sind einige Überlegungen notwendig: ein Ausstrom von Anionen aus dem Epithelzellverband verursacht eine transepitheliale Ladungsverschiebung. Jede Ladungsverschiebung über das Epithel wird durch
die Isc-Veränderung angezeigt, allerdings handelt es sich hierbei immer um die Summe
aller Ladungsverschiebungen über das Epithel. Gemessen wird folglich immer nur ein
Nettoanstieg bzw. -abfall des Isc. Deshalb müssen folgende Möglichkeiten bei der Interpretation des Isc bedacht werden: Wenn eine Anionensekretion durch eine Leitfähigkeit, z.B. einen Cl--Kanal, stattfindet, wird der Isc geringer ausfallen, als es die Cl-Verschiebung eigentlich erwarten ließe, wenn gleichzeitig eine parazelluläre Kationenbewegung von serosal nach mukosal erfolgt. Auch ist es anhand dieser Messmethode
nicht möglich, im Falle einer Koppelung eines elektrogenen mit einem elektroneutralen
Transportmechanismus das Verhältnis, in dem beide zueinander stehen, zu ermitteln.
Wenn allerdings unter stimulierten Bedingungen der Isc-Anstieg den der Bikarbonatsekretion übertrifft, kann man davon ausgehen, dass gleichzeitig eine elektrogene Cl--
4 Diskussion
73
Sekretion stattgefunden hat, da im Dünndarm hauptsächlich Cl-- und HCO3--Ionen als
sezernierte Anionen in Frage kommen. Der Anstieg der Bikarbonatsekretion und des Isc
erfolgten simultan (siehe Abbildung 3). Daraus kann man zwar nicht ableiten, dass die
stimulierte Bikarbonatsekretion ausschließlich elektrogener Natur sein muss, da sich der
Isc, wie bereits angesprochen, aus mehreren Komponenten zusammensetzen kann; man
kann jedoch davon ausgehen, dass ein elektrogener Mechanismus involviert ist, da es zu
einer Ladungsverschiebung über das Epithel gekommen ist. Da sich aus dem Anstieg
des Isc alleine nicht ableiten lässt, ob es sich hierbei um sezernierte HCO3-- oder Cl-Ionen (oder beide Ionenarten zusammen) handelt, besteht die Möglichkeit, dass durch
cAMP-Analoga ein elektroneutraler Transportvorgang für Bikarbonat stimuliert wird
und der Isc-Anstieg aus einer stimulierten Cl--Sekretion herrührt. Ein zu dieser Hypothese passendes gängiges Modell, allerdings im Zusammenhang mit der Bikarbonatsekretion pankreatischer Duktuszellen, wurde als erstes von Novak et al 1988 vorgeschlagen (112) und auch von weiteren Arbeitsgruppen unterstützt (145). Es beinhaltet folgende Überlegungen: aus dem Blut stammendes CO2 diffundiert über die basolaterale
Zellmembran, intrazellulär entsteht HCO3- im Rahmen der Karbonanhydrasereaktion.
Durch einen stimulationsbedingten Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration
(z.B. durch die Hormone Sekretin oder VIP) wird das CFTR-Protein, das in pankreatischen Duktuszellen exprimiert wird (69), aktiviert; dadurch kommt es zu einem Anstieg
des Cl--Ausstroms nach luminal. Diese Ionen rezirkulieren über einen apikal befindlichen Cl-/HCO3--Austauscher nach intrazellulär, durch dessen Austauschaktivität auch
mehr Bikarbonat im Sinne einer gesteigerten Bikarbonatsekretion die Zelle verlässt. Das
Ergebnis des durchgeführten Kontrollversuchs widerspricht diesem Modell nicht,
schließt jedoch andere Möglichkeiten nicht aus.
Das Schleifendiuretikum Bumetanid, das in der angewendeten Konzentration von 0,5
mM den basolateral lokalisierten NKCC zuverlässig hemmt, hatte im Kontrollversuch
(siehe Abbildung 3) keinen signifikanten Einfluss auf die Bikarbonatsekretion, jedoch
sank der Isc ab, es muss folglich zu einer transepithelialen Ladungsverschiebung gekommen sein, verursacht durch den Wegfall eines wichtigen Weges des Cl--Imports
durch die Zelle (132). Die gleiche Beobachtung haben Clarke et al. im Rahmen von pHstat-Messungen an Mäuseduodena gemacht: Bumetanid, das ebenfalls nach der Stimulation mit Forskolin (die Substanz führt zu einer intrazellulären cAMP-Erhöhung) appli-
4 Diskussion
74
ziert wurde, zeigte keinen signifikanten Effekt auf die Bikarbonatsekretion, der Isc jedoch sank signifikant ab (28). Im Rahmen der Kommentierung eines später gezeigten
Versuchs, bei dem die Bumetanid-Gabe vor der Stimulation durch 8-Br-cAMP erfolgte,
wird noch einmal auf die mögliche Bedeutung des basolateral lokalisierten NKCC bei
der duodenalen Bikarbonatsekretion eingegangen werden. Die Tatsache, dass präpariertes Duodenum aus dem Kaninchen unter den oben geschilderten Messbedingungen in
der Lage war, über einen längeren Zeitraum hinweg sowohl eine gleichbleibende Bikarbonatsekretionsrate als auch eine konstante PD und Resistance aufrecht zu erhalten, und
dass es auf einen 8-Br-cAMP-Stimulus mit einer simultanen Steigerung der Bikarbonatsekretion und des Isc bzw. auf die Ouabain-Gabe mit einen zuverlässigen Abfall aller
Messparameter reagierte, stellte sicher, dass es sich hierbei um einen geeigneten Versuchsaufbau handelte, auf dessen Grundlage nun einzelne Transportvorgänge mit Hilfe
der Applikation geeigneter Hemmstoffe und/oder Variation der ionalen Zusammensetzung der Perfusatlösungen untersucht werden konnten.
4.2.2.2 Inhibition des apikalen Anionenaustauschers
4.2.2.2.1 Das DRA-Protein
Bevor auf die im folgenden beschriebenen Versuche eingegangen wird, sollen einige
neue Erkenntnisse zum apikal lokalisierten Anionenaustauscher vorangestellt werden.
Wie bereits in der Einleitung erwähnt, spielt das 1993 von Schweinfest et al. (136) entdeckte Membranprotein DRA als Anionenaustauscher im Darm offenbar eine wichtige
Rolle. Untersuchungen mehrerer Arbeitsgruppen haben ergeben, dass DRA in der Lage
ist, die Anionen SO42-, Oxalat, Cl- und HCO3- zu transportieren, ein Vorgang, der sich
durch DIDS hemmen ließ (105;106;140). Auch über die Membranlokalisation des Proteins gibt es inzwischen Untersuchungen: Byeon et al. wiesen 1996 DRA im Kolon am
apikalen Zellpol nach (23). Experimente, die sich ebenfalls auf die Membranlokalisation
und zusätzlich auf die Expression und auf funktionelle Aspekte des Proteins beziehen,
wurden im Jahr 2001 von Jacob et al. an Gewebe von Ratte, Kaninchen und Mensch
durchgeführt (81). Die mRNA-Expressionslevel für DRA, die mit Hilfe einer semiquantitativen RT-PCR-Technik bestimmt worden waren, lagen im Verlauf des Gastrointestinaltraktes beim Kaninchen im Ileum, bei Ratte und Mensch hingegen im Kolon am
höchsten. Das Duodenum aller untersuchten Spezies wies ebenfalls hohe Expressions-
4 Diskussion
75
level auf. Die Autoren vermuten, dass diese Tatsache mit den hohen Bikarbonatsekretionsraten des Duodenums im Basalzustand der genannten Spezies zusammenhängt, und
dass weiterhin die hohen DRA-Expressionslevel im Kolon funktionelle Bedeutung für
die NaCl-Resorption haben, da NHE3 ebenfalls hoch exprimiert ist. Die Kopplung von
Cl-/HCO3-- bzw. Na+/H+-Austausch bei diesem Vorgang war zuvor in mehreren Arbeiten nachgewiesen worden. Dagegen fand sich beim Kaninchen eine niedrige AE2Expression im Duodenum und im Ileum, was entgegen früherer Annahmen nicht für
eine entscheidende Bedeutung des AE2 bei der Bikarbonatsekretion spricht. WesternBlot-Untersuchungen, die mit Hilfe eines polyklonalen Anti-DRA-Antikörper aus dem
Kaninchen durchgeführt worden waren, zeigten spezifische DRA-Banden in der Bürstensaummembran-Fraktion von Duodenum, Ileum und Kolon des Kaninchens, in der
Basolateralmembran-Fraktion war hingegen kein Signal detektierbar. Mit Hilfe eines
polyklonalen anti-AE2-Antikörper konnte in der Bürstensaummembran-Fraktion aus
dem Duodenum und Ileum des Kaninchens kein AE2-Protein nachgewiesen werden.
Immunhistochemische Experimente an verschiedenen Segmenten des Rattendarms zeigten eine apikale Lokalisation von DRA, wobei das Signal im Kolon am stärksten war.
Studien an Basolateralmembran-Vesikeln aus dem Duodenum der Ratte und des Kaninchens zeigten einen DIDS-sensitiven Austausch von Cl-/Cl-, HCO3-/Cl-, SO42-i/Cl-o, und
Cl-i/SO42-o. Insgesamt kann man aus dieser Datenkonstellation auf eine bedeutende Rolle des DRA-Proteins im apikalen elektroneutralen Anionenaustausch des Säugetierduodenums schließen, während AE2 als möglicher Kandidat in den Hintergrund tritt . Zur
Interaktion von DRA mit anderen membranären Transportproteinen ist wenig bekannt,
jedoch stellten Wheat et al im Jahr 2000 während Untersuchungen an trachealen Epithelzellen fest, dass CFTR die mRNA-Expression von DRA hochreguliert und die apikale Cl-/HCO3--Austauschaktivität steigert (155).
4.2.2.2.2 Hemmung des apikalen Anionenaustausches durch luminalen Cl-Ersatz
Zwar gab es nun überzeugende Hinweise darauf, dass es sich beim apikalen Anionenaustauscher im Duodenum sehr wahrscheinlich um das Protein DRA handelt (im folgenden wird weiterhin vom „apikalen Anionenaustauscher“ die Rede sein), jedoch gab
es nach wie vor wenig Erkenntnisse über seine Rolle unter physiologischen Bedingun-
4 Diskussion
76
gen, sieht man einmal davon ab, dass bei fehlender DRA-Funktion die bereits in der
Einleitung beschriebene schwere Symptomatik der kongenitalen Chlorid-Diarrhoe auftritt. Wir fragten uns nun, welche Bedeutung ein elektroneutraler Anionenaustauscher
für die Bikarbonatsekretion im Duodenum bei der in vitro-Untersuchung eines zusammenhängenden Zellverbandes unter basalen und stimulierten Bedingungen haben könnte, und inwieweit er mit einer Anionenleitfähigkeit gekoppelt ist. Folgende Überlegungen führten zu den im weiteren Verlauf durchgeführten Versuchen: da ein Cl-/HCO3-Austauscher an der apikalen Zellmembran des Duodenozyten offenbar eine funktionelle
Bedeutung besitzt, muss unter luminaler Cl--Freiheit, die im vorliegenden Fall durch die
theoretisch komplette Entfernung aller Cl--Ionen aus dem luminalen Kompartiment erreicht wurde, die Bikarbonatsekretion abfallen. Dies war auch tatsächlich der Fall: nach
Austausch der genannten Perfusatlösung fielen sowohl der Isc als auch die Bikarbonatsekretion dramatisch ab, um sich auf einem neuen Plateau zu stabilisieren, welches im
Falle der Bikarbonatsekretion in seinem Niveau unter dem lag, das am Ende des Versuchs nach Ouabain-Applikation erreicht wurde (siehe Abbildung 4). Somit war nach
Entfernung der luminalen Cl--Ionen die Ouabain-sensitive bzw. aktive Sekretion erloschen. Damit war gezeigt, dass der aktive Anteil der duodenalen Basalsekretion von der
Anwesenheit von Cl--Ionen im luminalen Perfusat abhängt. Das Ergebnis passt zu der
Annahme einer funktionellen Bedeutung des apikalen Anionenaustauschers unter basalen Bedingungen. Interessanterweise zeigte sich jedoch die 8-Br-cAMP stimulierte Sekretionsantwort gegenüber der Kontrolle nicht vermindert, sie war im Gegenteil sogar
leicht erhöht. Unter Berücksichtigung des gleichzeitig erfolgenden Isc-Anstiegs, der den
der Kontrolle noch übertraf, lässt dies vermuten, dass die stimulierte Bikarbonatsekretion im Gegensatz zur basalen hauptsächlich durch einen elektrogenen, Cl--unabhängigen
Transportmechanismus bewerkstelligt wird. Der von uns beobachtete im Vergleich zur
Kontrolle bedeutend stärkere Isc-Anstieg unter luminal Cl--freien Bedingungen hängt
wahrscheinlich mit dem starken Cl--Gradienten von serosal nach mukosal zusammen.
Der Anstieg wird, wie bereits erwähnt, hauptsächlich von Cl-- und HCO3--Ionen getragen, wobei zusätzlich die Möglichkeit der parazellulären Bewegung von Na+ in die
gleiche Richtung in Betracht gezogen werden muss, was einen entsprechend kleineren
Anstieg zur Folge hätte. Das Verhältnis der genannten Ionen kann aus der reinen Mes-
4 Diskussion
77
sung des Isc nicht abgeleitet werden; bei der Besprechung der Fluxbestimmungen wird
darauf zurückgekommen werden.
4.2.2.2.3 Hemmung des apikalen Anionenaustausches durch DIDS
Die Hemmung des apikalen Anionenaustauschers lässt sich auch durch die Applikation
des Stilbenderivates DIDS erreichen. Die Substanz ist als Hemmstoff einiger Transportmechanismen bekannt geworden, wobei die erreichte maximale Hemmung von der
Konzentration abhängig ist. Es handelt sich hierbei um mehrere Cl--Kanäle (wie z.B.
den DIDS- bzw. SITS -sensitiven auswärts rektifizierenden ORCC (83), den Na+/HCO3-Kotransporter und mehrerer für den Cl-/HCO3--Austausch zuständige Transportproteine. Vesikelstudien, die Petra Jacob aus unserer Arbeitsgruppe an apikalen und basolateralen Membranen aus dem Duodenum des Kaninchens durchgeführte, haben eine Zunahme der Hemmbarkeit in Abhängigkeit von steigenden DIDS-Konzentrationen ergeben: Eine maximale Hemmung des apikalen Anionenaustauschers konnte erst durch
DIDS- Konzentrationen von 10-2 bis 10-3M erreicht werden. Er weist demnach, verglichen mit dem basolateralen Anionenaustauscher der Parietalzelle, bei dem es sich
nachweislich um einen AE2 handelt (131), nur eine mäßige DIDS-Empfindlichkeit auf
(79;81). Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde in der vorliegenden Arbeit mit einer
DIDS- Konzentration von 10-3M gearbeitet, um den vermuteten apikalen Anionenaustauscher zuverlässig zu hemmen. Das Absinken der Basalsekretion nach der luminalen
Applikation von DIDS [1mM] (siehe Abbildung 5) wie auch die Sekretionsantwort auf
8-Br-cAMP [1mM] ist vergleichbar mit dem Ergebnis des vorangegangenen Versuchs,
der unter luminal Cl--freien Bedingungen durchgeführt wurde (siehe Abbildung 4). Der
Kurzschlussstromverlauf verhielt sich jedoch nach luminaler Cl--Entfernung bzw. luminaler Applikation von DIDS gegensätzlich, was erklärbar wird durch die Tatsache, dass
im Cl--freien Versuch völlig andere Ionenverhältnisse in Hinsicht auf die Verteilung der
Cl--Ionen vorlag, die einen wesentlichen Einfluss auf die Höhe des Kurzschlussstromes
haben und DIDS sowohl Auswirkungen auf den intrazellulären pH als auch auf das
Membranpotential zu haben scheint (6). Der Versuch zeigt, dass während der Hemmung
des apikalen Anionenaustauschers durch DIDS die cAMP-induzierte Bikarbonatsekretionssteigerung nicht beeinträchtigt ist. Da DIDS auch ein bekannter Hemmstoff des
ORCC ist, kann dieser Kanal unter der Voraussetzung, dass die angewandte DIDS-
4 Diskussion
78
Konzentration von 1 mM zu seiner Hemmung geführt hat, während der stimulierten
Bikarbonatsekretion nur eine untergeordnete Rolle spielen. Obwohl aufgrund dieser
Ergebnisse die Vermutung nahe liegt, dass durch die beiden unterschiedlichen Ansätze
(luminale
Cl--Freiheit
gegenüber
luminaler
DIDS-Applikation)
derselbe
Io-
nentransportmechanismus, nämlich der apikale Cl-/HCO3--Austausch gehemmt wurde,
muss die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass das luminal applizierte DIDS
auf die Gegenseite des Epithels diffundiert sein und dort zusätzlich den basolateral befindlichen Na+/HCO3--Kotransport gehemmt haben könnte, was, wie später noch gezeigt werden wird, ebenfalls ein Absinken der Basalsekretion zur Folge hat.
Zu den im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen passt auch folgende Beobachtung, die Ishiguro et al. 1998 an interlobulären pankreatischen Duktuszellen des
Meerschweinchens machten: Die basale (spontane) Bikarbonatsekretion ließ sich durch
Verwendung einer Cl--freien Lösung, mit der die präparierten Pankreasgänge perfundiert wurden, deutlich reduzieren, ähnliche Ergebnisse ergab die Zugabe von DIDS [0,5
mM] zur Cl--haltigen Perfusatlösung. Hingegen zeigte sich die cAMP- bzw. Sekretinstimulierte Sekretion weder DIDS- noch Cl--abhängig (75). Mit dem oben beschriebenen Modell der pankreatischen Bikarbonatsekretion (112) lassen sich diese Ergebnisse
(und damit auch die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen) nicht mehr vereinbaren. An
dieser Stelle soll erwähnt sein, dass in der Literatur die Mechanismen der Bikarbonatsekretion im Pankreas betreffend kontroverse Standpunkte eingenommen werden, auf
die in der vorliegenden Arbeit nur zum Teil eingegangen werden kann.
4.2.2.2.4 Die Rolle einer Leitfähigkeit für Cl--Ionen in der basalen und stimulierten Bikarbonatsekretion
An dieser Stelle kann man nun für das Duodenum postulieren, dass unter basalen Bedingungen ein apikaler Anionenaustauscher zumindest einen Großteil der aktiven Bikarbonatsekretion übernimmt, für die Agonisten-stimulierte, elektrogene Bikarbonatsekretion jedoch in erster Linie eine apikale Leitfähigkeit für HCO3-Ionen in Frage
kommt. Die Vermutung, dass die cAMP-stimulierte Bikarbonatsekretion zumindest
teilweise über eine apikale Leitfähigkeit für HCO3--Ionen stattfindet, wurde bereits von
mehreren Autoren geäußert (7;72). Ob der CFTR- Kanal selber als funktionell bedeut-
4 Diskussion
79
samer Durchlass für die HCO3--Ionen dient oder nur in die Regulation der Bikarbonatsekretion involviert ist, bleibt Gegenstand kontroverser Diskussion. Dass er jedoch im
Rahmen der Agonisten-stimulierten Bikarbonatsekretion sowohl im Dünndarm als auch
im Pankreas eine zentrale Rolle spielt, wird aus den Ergebnissen mehrerer Arbeitsgruppen ersichtlich (77;137). Die hohe CFTR-Expression im Duodenum weist zusätzlich auf
seine offenbar funktionell bedeutsamen Rolle hin (37;126). Von Clarke et al im Jahre
1998 durchgeführte pH-stat-Messungen an Duodena von CFTR (+/+) und CFTR (-/-)Mäusen haben zum einen die bereits bekannte Tatsache, dass der CFTR-Kanal für die
cAMP-stimulierte Bikarbonatsekretion notwendig ist, ergeben, und zum andern, dass
CFTR den apikalen Cl-/HCO3--Austausch während der Stimulation erleichtert. Folgende
Versuchsergebnisse ließen sie darauf schließen: Die Applikation von Forskolin führte
zwar in den Kontroll (+/+)-Duodena, jedoch weder in den CFTR (-/-)-Duodena, noch
unter der Blockade des CFTR-Proteins durch den bekannten CFTR-Hemmstoff NPPB,
in CFTR (+/+)-Duodena zu einem Anstieg der Bikarbonatsekretionsrate oder des Isc,
was die oben beschriebene Theorie bestätigt. Zusätzlich stellten die Autoren fest, dass
unter luminaler Abwesenheit von Cl--Ionen bzw. luminaler Anwesenheit von DIDS
[0,03 M] sich die Bikarbonatsekretionssteigerung nur geringfügig erniedrigt zeigte, unter basolateraler Abwesenheit von CO2/HCO3- und luminaler Abwesenheit von Cl-Ionen bzw. Anwesenheit von DIDS die Bikarbonatsekretionssteigerung hingegen aufgehoben war, während der Isc-Anstieg nicht beeinträchtigt war. Daraus schlossen sie,
dass das Duodenum unter Stimulationsbedingungen fähig ist, die Sekretion von HCO3-,
das durch Katalyse des Enzyms Karboanhydrase entstanden ist, über durch CFTR erleichterten Cl-/HCO3- Austausch zu steigern (28), analog zu dem Bikarbonatsekretionsmodell von Novak et al. halten sie also den elektroneutralen Cl-/HCO3-Austausch auch
unter stimulierten Bedingungen für funktionell bedeutsam. Die von Clarke et al. formulierte Schlussfolgerung lässt jedoch die Möglichkeit, dass die duodenale Bikarbonatsekretion auch durch basolaterale HCO3--Aufnahmemechanismen limitiert werden könnte
(siehe Abschnitt 4.2.3), unberücksichtigt. Dies könnte ein Grund sein, warum sich diese
Versuchsergebnisse nur zum Teil mit den von uns erhobenen Daten, die eine Beteiligung des apikalen Anionenaustauschers während der Agonisten-stimulierten Bikarbonatsekretion unwahrscheinlich machen, vereinbaren lassen.
4 Diskussion
80
Wie bereits in der Einleitung erwähnt, wird auch die Beteiligung auswärts gerichteter
Cl--Kanäle (ORCC) an der epithelialen Bikarbonatsekretion diskutiert: zum einen wurde
eine HCO3--Permeabilität dieser Kanäle festgestellt (150), und zum anderen ist gezeigt
worden, dass funktionell exprimiertes CFTR einen regulatorischen Einfluß auf ORCC
besitzt (36;47). Das CFTR-Protein selber wird wahrscheinlich auch von extrazellulär
her reguliert: O´Reilly et al veröffentlichten im Jahr 2000 eine Arbeit, die zeigt, dass
extrazellulär vorhandene HCO3--Ionen offenbar in der Lage sind, die vom CFTR (und
einer weiteren Cl--Leitfähigkeit) getragenen cAMP-aktivierten Auswärts- und Einwärtsströme (wobei der Auswärtsstrom einem Cl--Influx entspricht und umgekehrt)
deutlich zu reduzieren (113). Gemessen wurden Einzelzellströme an isolierten intraund interlobulären Pankreasgängen des Meerschweinchens. Die pankreatischen Mechanismen der Bikarbonatsekretion lassen sich, wie bereits oben beschrieben, aufgrund
ähnlicher Beobachtungen mit den Verhältnissen am Dünndarm vergleichen. Die Autoren vermuten aufgrund ihrer Ergebnisse eine direkte Interaktion des HCO3--Ions mit
dem CFTR-Protein und schlagen vor, dass die Inhibition den physiologischen Zweck
erfüllt, als negativer Feedbackmechanismus die nach Aktivierung des CFTR-Kanals
erfolgende Membrandepolarisation in Grenzen zu halten und eine gleichbleibende
Triebkraft für die Bikarbonatsekretion aufrecht zu erhalten.
4.2.2.3 Bilaterale Hemmung Cl--abhängiger Transportmechanismen
Es stellte sich nun die Frage, ob die zusätzliche Entfernung auch der basolateralen Cl- Ionen eine Auswirkung auf die basale und stimulierte Bikarbonatsekretion haben kann.
Die theoretisch völlige Abwesenheit aller extrazellulären Cl--Ionen muss zu einem Erliegen des Cl--Transportes durch unterschiedliche Mechanismen nach intrazellulär führen, gleichzeitig besteht durch den hohen Cl--Gradienten von intra- nach extrazellulär
eine Erhöhung der Triebkraft für diese Ionen.
Analog zum Ergebnis des Versuches, bei dem unter luminal Cl--freien Bedingungen
gearbeitet worden war, fiel die basale Bikarbonatsekretion entsprechend tief aus (siehe
Abbildung 6), was wiederum als Hinweis auf die funktionelle Bedeutung des apikalen
Anionenaustauschers für die Bikarbonatsekretion im Basalzustand zu werten ist. Erneut
war die Bikarbonatsekretionsantwort auf den 8-Br-cAMP-Stimulus hin gegenüber der
Kontrolle nicht vermindert, in diesem Fall ließ sich sogar eine Erhöhung feststellen.
4 Diskussion
81
Offenbar ist die stimulierte Bikarbonatsekretion weder von luminalem noch von serosal
befindlichen Cl--Ionen abhängig. Das Epithel hatte aufgrund der veränderten ionalen
Zusammensetzung beider Perfusatlösungen eine vom Kontrollversuch abweichende
Potentialdifferenz aufgebaut, infolgedessen fiel der Isc höher aus. Wenn luminales
DIDS [1mM] und die Entfernung von Cl--Ionen aus beiden Perfusatlösungen zum gleichen Effekt, nämlich dem der Hemmung hauptsächlich des apikalen Anionenaustauschers führen, so muss das Ergebnis aus Abbildung 6 auch unter Anwesenheit von
DIDS [1mM] im luminalen Kompartiment bei gleichzeitiger bilateraler Abwesenheit
von Cl--Ionen in dieser Form reproduzierbar sein. Abbildung 7 zeigt den dazu durchgeführten Versuch. Zwar führte die luminale DIDS-Applikation zu einem weiteren Abfall
sowohl der Bikarbonatsekretion als auch des Kurzschlussstromes, was jedoch in keinem
der beiden Fälle signifikant war und auf eine Restaktivität des apikalen Anionenaustauschers unter nur theoretisch bilateral Cl--freien Bedingungen hinweist. In beiden Versuchsansätzen (Abbildung 6 und 7) hatte die Applikation von 8-Br-cAMP eine im Vergleich zur Kontrolle stark erhöhte Bikarbonatsekretionsantwort zur Folge. Eine Erklärung für diese Beobachtung lässt sich aus den vorliegenden Versuchen nicht ableiten, da
mehrere, nur mit Hilfe des Ussingkammer-Experimentes nicht weiter differenzierbare
Mechanismen dafür verantwortlich sein können. Durch das (theoretisch) völlige Fehlen
von extrazellulären Cl--Ionen und die Anwesenheit von DIDS verändern sich die Verhältnisse an der Zellmembran, was zu einer Involvierung auch Cl--unabhängiger Transportmechanismen führen kann. Festzuhalten wäre hierzu noch, dass die Cl--freien Versuche vor Stimulation im Vergleich zur Kontrolle stark erniedrigte basale Bikarbonatsekretionsraten aufwiesen, und der erreichte Peakwert letztendlich in allen drei Versuchen (Kontrolle, bilateral Cl--frei und bilateral Cl--frei plus DIDS luminal, vergleiche
Abbildungen 3, 6 und 7) sehr ähnlich ausfiel. In allen Versuchen, in denen bilateral Cl-frei gearbeitet worden war, fiel die erhöhte Restsekretion nach Ouabain-Gabe (gleichbedeutend mit passiver Diffusion) auf; welche die Sekretionsraten unter luminal Cl-freien Bedingungen bzw. luminal Cl--freien Bedingungen plus DIDS in ihrer Höhe übertraf. Da sich das durch passive Diffusion auf die andere Seite des Epithels gelangte
Bikarbonat zu dem aktiv sezernierten addiert, musste es im Verlauf des Versuches zu
einer deutlichen Erhöhung der parazelluären Permeabilität gekommen sein. Guba et al
stellten 1996 anhand von Ussingkammer-Untersuchungen am Duodenum der Ratte fest,
4 Diskussion
82
dass nach einem PGE2- bzw. 8-Br-cAMP-Stimulus der Netto-3H-Mannitol-Flux zunahm, ein Effekt, der durch Guanylin, STa und 8-Br-cAMP nicht auszulösen war. Die
Autoren schlossen daraus, dass cAMP- im Gegensatz zu cGMP-Stimuli in der Lage
sind, die parazelluläre Permeabilität zu erhöhen (54). In jedem der von uns durchgeführten Versuche war das untersuchte Epithel einem 8-Br-cAMP-Stimulus ausgesetzt worden, doch sank die Bikarbonatsekretion außer in den Versuchen, in denen Cl--frei gearbeitet worden war, immer entweder auf das Ausgangsniveau vor Stimulation oder sogar
weit unter die initial gemessene Basalsekretion. Damit müssen bei den Versuchen, in
denen mit Cl--freien Lösungen gearbeitet worden war, zusätzliche Faktoren, die einen
weit größeren Einfluss als cAMP-Agonisten auf die parazelluäre Permeabilität hinsichtlich einer Erhöhung besitzen könnten, eine Rolle spielen.
4.2.2.4 Blockade des basolateral gelegenen NKCC
Inwieweit spielt die basolaterale Cl--Aufnahme des Duodenozyten eine Rolle in der
Bikarbonatsekretion? Dies sollte durch die Bumetanid [0,5 mM]-induzierte Blockade
des basolateral gelegenen NKCC , dessen Funktion im Darm als einer der Hauptaufnahmemechanismen für Cl- gilt (132), und die anschließende Stimulation durch 8-BrcAMP [1 mM] geklärt werden. Der Duodenozyt muss nach Hemmung des genannten
Transportmechanismus intrazellulär an Cl--Ionen verarmen. Er könnte diesen Mangel
durch eine Stimulation des apikal gelegenen Anionenaustausches ausgleichen, was zu
einer Zunahme der Bikarbonatsekretion führen müsste. Clarke et al. stellten 1992 fest,
dass Bumetanid den cAMP-stimulierten Isc im Darm von Normalmäusen signifikant
reduzierte, die Substanz jedoch im Darm von CFTR (-/-) Mäusen keinen Effekt hervorrief, woraus sie eine wichtige Rolle des NKCC in der cAMP-stimulierten
Anionensekretion via CFTR-Kanal ableiten (27). Michael Walter aus unserer
Arbeitsgruppe hat mit Hilfe von Ussingkammer-Experimenten am Duodenum der Ratte
gezeigt, dass eine Reduktion der intrazellulären Cl--Konzentration durch Hemmung des
basolateral lokalisierten NKCC mittels Bumetanid [0,5mM] zu einer Zunahme der
basalen Bikarbonatsekretion führt; dieser Effekt war unter luminal Cl--freien
Bedingungen aufgehoben. Auf die Stimulation mit Forskolin (führt zu einer Erhöhung
des intrazellulären cAMP) unter basolateraler Anwesenheit von Bumetanid und
luminaler Cl--haltiger Lösung reagierte das Duodenum mit einer 20-30% höheren
Bikarbonatsekretionsrate, während der Isc nur um die Hälfte des Anstiegs in der Kon-
4 Diskussion
83
Isc nur um die Hälfte des Anstiegs in der Kontrolle stieg. Aus diesen Ergebnissen leitete
er ab, dass die Zelle unter der Blockade des NKCC versucht, vermehrt Cl- über eine
gesteigerte Aktivität des apikalen Cl-/HCO3--Austauschers zu importieren (154). In den
von uns durchgeführten Experimenten zeigte sich, dass der oben beschriebene Mechanismus in der Spezies Kaninchen wahrscheinlich keine Rolle spielt, da die basale Bikarbonatsekretionsrate durch die Blockade des basolateral gelegenen NKCC nicht steigerbar war und die Anstiege der Messparameter nach Stimulation vergleichbar waren
mit denen, die unter Kontrollbedingungen gemessen worden waren (siehe Abbildung 8).
Hier müssen offenbar noch andere Transportmechanismen, die für die intrazelluläre Cl-Homöostase verantwortlich sind, funktionell bedeutsam sein.
4.2.2.5 Bidirektionale Fluxstudien für 3H-Mannitol,
36
Cl- und
22
Na+ unter Kon-
trollbedingungen
Da es die Fragestellung erforderte, die Bikarbonatsekretion und die Fluxraten parallel zu
messen, wurden zunächst Fluxe für die genannten Ionen unter „open circuit current“Bedingungen durchgeführt. Unvermeidbar waren damit Ionengradienten, die durch die
Notwendigkeit des Einsatzes einer ungepufferten Lösung (0,9%ige NaCl) auf der luminalen Seite entstanden. In die Interpretation der Fluxe muss besonders der vorhandene
Cl--Gradient von mukosal (154 mmol/l) nach serosal (115mmol/l) einbezogen werden.
Der Gradient für Na+ fiel etwas geringer aus (serosal 140 mmol/l gegenüber luminal
154 mmol/l). So fällt bei Betrachtung sowohl der
36
Cl--Fluxe, die unter „open circuit
current“-Bedingungen gemessen worden waren (siehe Abbildung 20A, B), als auch der
22
Na+-Fluxe (siehe Abbildung 22A, B) eine Nettoresorption unter basalen Bedingungen
auf, die, quanitiativ betrachtet, im Falle der Cl--Ionen höher lag als im Falle der Na+Ionen.
Nach Stimulation schlug die Nettoresorption für die Cl--Ionen in eine Nettosekretion
um, was bedeutet, dass das Epithel nun gegen einen Konzentrationsgradienten Cl- transportierte. Gleichzeitig erfolgte der bereits besprochene Isc-Anstieg. Es ist bekannt, dass
die intrazelluläre Konzentrationserhöhung von cAMP zu einer elektrogenen Cl-- und
HCO3--Sekretion und einer nachfolgenden Depolarisation der Zellmembran führt (145),
eine Tatsache, die wir nun für beide genannten Anionen experimentell nachvollzogen
hatten. Größenordnungsmäßig lag der Nettotransport für Cl- nach Stimulation mit 8-Br-
4 Diskussion
84
cAMP um ein Vielfaches über dem Anstieg des Isc (siehe Abbildung 3 und 20A), was
nur bedeuten kann, dass der Isc nicht das wahre Ausmaß der elektrogen transportierten
Anionen wiederspiegelt. Die naheliegenste Möglichkeit für diese „Maskierung“ des Isc
ist ein gleichzeitig erfolgendes, aus Gründen der Elektroneutralität verstärktes Mitgehen
von Kationen in die gleiche Richtung, wobei an einen parazellulären Shunt von Na+Ionen am ehesten in Frage kommt. Um diese Möglichkeit zu überprüfen, wurden für das
Isotop
22
Na+ bilaterale Fluxstudien unter „open circuit current“-Bedingungen durchge-
führt. Wahrscheinlich aufgrund des oben beschriebenen Konzentrationsgradienten war
in allen Phasen des Versuchs eine Na+-Nettoresorption zu verzeichnen. Wenn man jedoch die einzelnen Fluxraten (das heißt den Flux von serosal nach mukosal bzw. den
Flux von mukosal nach serosal) betrachtet, ist ein Zunahme des 22Na+-Fluxes von serosal nach mukosal auf Stimulation hin zu verzeichnen(siehe Abbildung 22A). Auf die
Berechnung des Netto-22Na+-Fluxes wirkte sich diese Zunahme insofern aus, als die
Nettoresorption nach Stimulation abnahm (siehe Abbildung 22B). Man kann davon
ausgehen, dass die Zunahme des 22Na+-Fluxes nach Stimulation über eine Erhöhung der
parazellulären Permeabilität zustande kommt. Da Enterozyten über keinen aktiven
Transportmechanismus für den Zucker Mannitol verfügen, wurden zur Überprüfung der
parazellulären Permeabilität Fluxstudien für 3H-Mannitol durchgeführt. Wie bereits im
Abschnitt 4.2.2.3 beschrieben, hatten Guba et al 1996 eine Zunahme der parazellulären
Permeabilität im Duodenum der Ratte nach einem PGE2- bzw. 8-Br-cAMP-Stimulus
festgestellt (54). Dieses Ergebnis ließ sich von uns insofern nachvollziehen, als der 3HMannitol-Flux im Duodenum des Kaninchens von serosal nach mukosal nach dem 8Br-cAMP-Stimulus zunahm, allerdings erst im zweiten 15-min-Intervall nach Applikation der Substanz. Wenn man die Bikarbonatsekretionsrate mit dem 3H-Mannitol-Flux
von serosal nach mukosal vergleicht (siehe Abbildung 19), so fällt auf, dass erstere den
3
H-Mannitol-Flux um mehr als das hundertfache übertrifft. Daraus kann man ableiten,
dass die Bikarbonatsekretion zum großen Teil transzellulär (und damit über aktiven
Transport) stattfindet und vergleichsweise wenig HCO3--Ionen über parazellulären
Shunt (und damit über passive Diffusion) auf die entgegengesetzte Seite gelangen.
Um schließlich abzuschätzen, welchen Einfluss der stärkste Ionengradient unter „open
circuit current“-Bedingungen, nämlich der für die Cl--Ionen, auf deren Nettobewegung
hat, wurde eine Versuchsreihe für den
36
Cl--Flux unter „short circuit current“-
4 Diskussion
85
Bedingungen durchgeführt (siehe Abbildung 21). Da unter diesen Messbedingungen
bilateral die gleiche Lösung (Basallösung unter Carbogen-Begasung, siehe Abschnitt
2.3 7, Tabelle 3) vorliegt, existieren hier keinerlei Ionengradienten. Unter Basalbedingungen war nun eine Nettosekretion für Cl- zu verzeichnen. Erwartungsgemäß kam es
nach Stimulation mit 8-Br-cAMP zu einem Anstieg der Nettosekretion, die in ihrer
Größenordnung ungefähr dem stimulationsbedingten Anstieg der Cl--Sekretion unter
„open circuit current“-Bedingungen entsprach. Aus diesem Ergebnis kann man ableiten,
dass ein vorhandener Konzentrationsgradient für Cl- einen Einfluss auf die Nettobewegung dieser Ionen im Basalzustand besitzt, wobei passive Ionenbewegungen beteiligt
sein dürften, dass jedoch unter Stimulationsbedingungen Cl- unabhängig vom Konzentrationsgradienten und auch gegen ihn in einer bestimmten Größenordnung sezerniert
wird, was als Indiz dafür zu werten ist, dass es sich um aktiven Transport handelt.
Sowohl bei dem 36Cl--Flux unter „open circuit current“-Bedingungen (siehe Abbildung
20A, B) als auch dem
22
Na+-Flux (siehe Abbildung 22A, B) war eine bedeutende Zu-
nahme der Nettoresorption für die untersuchten Ionen nach Bumetanid-Applikation aufgefallen. In beiden Fällen hatte der Flux von mukosal nach serosal stark zugenommen.
Der Flux von serosal nach mukosal zeigte sich im Falle des
36
Cl- unverändert und im
Falle des 22Na+ hatte er bereits im zweiten 15-min-Messintervall abgenommen, was sich
nach Bumetanid-Gabe fortsetzte. Obwohl es nahe liegt anzunehmen, dass die Zelle, die
durch Hemmung des NKCC auf einen Hauptmechanismus für den basolateralen Cl-Import verzichten muss, den entstehenden intrazellulären Cl--Mangel durch erhöhte
Aktivität apikaler Mechanismen für den Cl--Import auszugleichen versucht, kann man
aufgrund dieser Beobachtung auf diese Annahme nicht schließen, da die Fluxbestimmungen an der Ussingkammer allenfalls geeignet ist, transepitheliale Ionenverschiebungen und keinesfalls intrazelluläre Konzentrationsveränderungen zu erfassen.
4.2.3 Untersuchung unterschiedlicher Systeme zur duodenalen epithelialen Bikarbonatbereitstellung und deren Regulation
Die Ergebnisse der vorangegangenen Experimente haben gezeigt, dass an der duodenalen Bikarbonatsekretion unterschiedliche, am apikalen Zellpol befindliche Transportme-
4 Diskussion
86
chanismen beteiligt sind. Als nächstes interessierten uns die Wege der Bikarbonatbereitstellung des Duodenozyten und ihre Verknüpfung mit der basalen und stimulierten Bikarbonatsekretion. Mehrere Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie zu einer pathologischen Bikarbonatsekretionsverminderung im Duodenum führen, bedingen andererseits die Ausschüttung sekretionssteigernder Substanzen durch den Organismus, was
jedoch das Endergebnis der verminderten Bikarbonatsekretion nicht zu beeinflussen
scheint. Diese Tatsache weist auf die Möglichkeit hin, dass unter derartigen pathophysiologischen Bedingungen das Ausmaß der zellulären Bereitstellung von HCO3-- Ionen
die zelluläre Fähigkeit der Sekretionssteigerung limitieren könnte. Für diese Bereitstellung in Frage kommen zum einen das zelleigene Enzym Karboanhydrase (im Gastrointestinaltrakt hauptsächlich durch die Isoform CA II vertreten), welches die Reaktion
[H2O + CO2 ↔ HCO3- + H+] katalysiert und im Konzert mit dem basolateral lokalisiertem Na+/H+-Austausch arbeitet, zum anderen basolateral lokalisierte HCO3-Aufnahmemechanismen, insbesondere der Na+/HCO3--Kotransporter. In Abbildung 1
(Abschnitt 1.2.1 in der Einleitung) sind die heute bekannten Transporter der basolateralen Zellmembran und einige für die Bikarbonatsekretion wichtige intrazelluläre Vorgänge stark vereinfacht dargestellt.
Anhand der durchgeführten Ussingkammer-Untersuchungen sollte nun geklärt werden,
ob die angeführten Mechanismen, isoliert oder im Zusammenspiel betrachtet, einen limitierenden Faktor für die Bikarbonatsekretion darstellen. Zu dieser Thematik waren in
unserer Arbeitsgruppe mit Hilfe von Vesikelstudien und molekularbiologischer Experimenten wertvolle Erkenntnisse gewonnen worden (80), auf die im folgenden näher
eingegangen werden soll.
Vesikelpräparationen aus Epithelzellen sind geeignet, die Lokalisation und Funktion
einzelner Transporter zu untersuchen. Bei dieser Methode werden die Zellen mechanisch aufgebrochen, wobei sich Vesikel aus den apikalen (BBM) und dem basolateralen
Membranen (BLM) bilden. Um zwischen dem Ausschleusen von H+ durch einen
Na+/H+-Austauscher zum einen und der Aufnahme von HCO3- durch den Na+/HCO3-Kotransporter zum anderen zu differenzieren, wurde die pH-getriebene Aufnahme von
22
Na+ in BLM-Vesikel aus dem Duodenum des Kaninchens in An- und Abwesenheit
eines einwärts gerichteten Bikarbonatgradienten und dessen Hemmbarkeit durch DMA
[0,5 mM] und DIDS [3 mM] überprüft. Als Negativkontrolle wurde die
22
Na+-
4 Diskussion
87
Aufnahme in die BLM-Vesikel unter gleichem pH-Wert von Außen- und Innenpuffer
bestimmt. Die Experimente ergaben, dass eine intravesikale Ansäuerung die Aufnahme
von
22
Na+ sowohl in An- als auch in Abwesenheit von HCO3- stark stimulierte. Diese
Stimulation ließ sich in Abwesenheit von HCO3- durch DMA komplett inhibieren, was
dafür spricht, dass sie durch Na+/H+-Austausch zustande gekommen war. Unter Anwesenheit von HCO3- im Außenpuffer zeigte sich eine DMA-insensitive zusätzliche Aufnahme von
22
Na+ in die Vesikel, was eine Aufnahme durch einen Na+/HCO3--
Kotransporter wahrscheinlich macht (siehe Abbildung 23A). Wie bereits in der Einleitung beschrieben, ist im Darm der Spezies Kaninchen und Mensch ein Na+/HCO3-Aufnahmemechanismus beschrieben worden. Um den vermuteten Na+/HCO3-Kotransport-Mechanismus im Duodenum des Kaninchens näher zu beleuchten, wurde
DIDS [3 mM] dem Außenpuffer zugegeben und die 22Na+-Aufnahme in An- und Abwesenheit von HCO3- gemessen. Die
22
Na+-Aufnahme war unter DIDS-Einwirkung in
Anwesenheit von HCO3- im Außenpuffer deutlich gehemmt (siehe Abbildung 23B),
hingegen ließ sich unter Abwesenheit von HCO3- keine Inhibition erkennen (nicht gezeigt). Damit war gezeigt worden, dass sich auf der Basolateralmembran des Duodenozyten tatsächlich ein funktionell bedeutsamer Na+/HCO3--Kotransporter befindet.
500
pmol Na/
mg protein
Bic
400
Glc
300
Bic+DMA
200
Glc+DMA
100
no pH-gradient
0
0
60
120
180
Zeit (sec)
240
300
2h
4 Diskussion
88
Abbildung 23A: Zeitverlauf der pH-getriebenen Aufnahme von
22
Na+ in BLM-Vesikel
aus dem Duodenum in An- und Abwesenheit eines einwärts gerichteten HCO3-Gradienten und der Einfluss von DMA [0,5 mM]; n=5.
pmol Na/
mg protein
Bic
20000
15000
Bic+DIDS
10000
5000
0
0
60
120
180
240
300
2h
Zeit (sec)
Abbildung 23B: Zeitverlauf der pH-getriebenen Aufnahme von
22
Na+ in BLM-Vesikel
aus dem Duodenum in Anwesenheit eines einwärts gerichteten Bikarbonat-Gradienten
und der Einfluss von DIDS [3 mM]; n=2.
Um festzustellen, welche NHE-Isoform an dem gemessenen DMA-inhibierbaren
Na+/H+-Austausch beteiligt ist, wurde nachfolgend die pH-Gradienten-getriebene
Aufnahme von
22
Na+ in An- und Abwesenheit von Hoechst 642 jeweils in
Konzentrationen von 1 µM (hemmt selektiv den NHE1) und 25 µM (hemmt NHE1 und
NHE2) sowie von DMA in einer Konzentration von 0,5 mM (Inhibition von NHE1NHE4) in BLM-Vesikel bestimmt. Dabei stellte sich heraus, dass sich die Aufnahme
von
22
Na+ durch DMA [0,5 mM] bzw. Hoechst 642 [25 µM] komplett inhibieren ließ;
Hoechst 642 [1 µM] alleine hingegen hemmte über 80% der pH-Gradienten-getriebenen
bzw. DMA-sensitiven
22
Na+-Aufnahme (siehe Abbildung 23C). Damit war gezeigt
4 Diskussion
89
sensitiven 22Na+-Aufnahme (siehe Abbildung 23C). Damit war gezeigt worden, dass die
Isoform NHE1 hauptverantwortlich für den duodenalen basolateralen Na+/H+Austausch ist.
500
pmol Na/
mg protein
400
Glc
300
200
Hoe 1µM
100
Hoe 25µM
DMA
0
0
60
120
Abbildung 23C: Zeitverlauf der pH-getriebenen Aufnahme von
2h
22
Na+ in BLM-Vesikel
aus dem Duodenum, der Einfluss von DMA [0,5 mM] und von Hoechst 642 [1 µM] bzw.
[25 µM]; n=2.
Die obenstehenden Vesikelstudien hatten gezeigt, dass sich auf der Basolateralmembran
von Duodenozyten des Kaninchens ein Na+/HCO3--Kotransporter mit ungeklärter molekularer Identität sowie die Isoform NHE1 aus der Genfamilie der Na+/H+-Austauscher
befinden, die dort eine funktionell bedeutsame Rolle im Basenimport und der H+Extrusion spielen. Im Pankreas, in dem ebenfalls basolateraler Na+/HCO3--Import mittels fluorometrischer Messungen funktionell charakterisiert worden ist (76), ist die Isoform NBC1 aus der Genfamilie der Na+/HCO3--Kotransporter hoch exprimiert (1). Um
zu überprüfen, ob dies im Gastrointestinaltrakt und insbesondere im Duodenum ebenfalls zutrifft, wurde der NBC1 des Kaninchens aus dem Duodenum kloniert und die
mRNA-Expression in verschiedenen Abschnitten des Gastrointestinaltraktes mittels
4 Diskussion
90
Northern-Blot und semiquantitativer RT-PCR überprüft. Es zeigte sich eine starke
NBC1-Expression im Duodenum, Kolon und Niere. Ein weiterer Northern-Blot zur Überprüfung der Expression von NHE1 ergab eine starke Expression in Magen, Duode-
ga
st
du ric
od mu
ile ena cos
al l m a
co mu uc
lo co os
ni sa a
c
m
uc
os
a
num und Kolon (siehe Abbildung 24)
rte
co
NBC1
autoradiography
24 h
x
y
ne
d
ki
kb
9.3
7.4
NHE1
autoradiography
20 h
4.6
GAPDH
autoradiography
6h
1.4
Abbildung 24: Poly (A)+-RNA Northern Blot: Expression des NBC1 und NHE1 in Magen, Duodenum, Ileum, Kolon und Nierenrinde des Kaninchens.
Diese Ergebnisse konnten mit Hilfe der semiquantitativen RT-PCR bestätigt werden:
Abbildungen 25 und 26 zeigen die mRNA-Expression von NBC1 und NHE1 im Magen,
unterschiedlichen Abschnitten des Intestinaltraktes und der Nierenrinde des Kaninchens
im Verhältnis zum Histon 3.3a, das als interne Kontrolle diente.
4 Diskussion
A
91
Duodenum
B
2,6
ODI
NBC1 / Histon 3.3a
2,4
NBC1
Histon 3.3a
10000
20
22
24
26
28
30
20 22
24
26
28
30
32
20 22
24
26
28
30
32
32
36
38
n Zyklen
34
Histon
3.3a
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
NBC1
0,0
Magen- Duodenal- IleumMukosa Mukosa Mukosa
Kolon- NierenMukosa rinde
Abbildung 25: Semiquantitative RT-PCR von NBC1. Parallele Kurven für NBC1 (263
bp) und Histon 3.3a (523 bp). Das Verhältnis von NBC1 zu Histon 3.3a wurde während
der exponentiellen Phase beider Reaktionen bestimmt (A). Relative Expressionslevel
von NBC1 versus Histon 3.3a in Magen, Duodenum, Ileum, Kolon und Nierenrinde des
Kaninchens; n=3.
B
NHE1 / Histon 3.3a
Duodenum
ODI
A
Histon 3.3a
NHE1
20
28
n Zyklen
22
30
24
32
26
34
28
30
36
38
2,0
1,5
1,0
0,5
Histon
3.3a
NHE1
0,0
Magen- Duodenal- IleumMukosa Mukosa Mukosa
Kolon- NierenMukosa rinde
Abbildung 26: Semiquantitative RT-PCR von NHE1. Parallele Kurven für NHE1 (356
bp) und Histon 3.3a (523 bp). Das Verhältnis von NHE1 zu Histon 3.3a wurde während
der exponentiellen Phase beider Reaktionen bestimmt (A). Relative Expressionslevel
von NHE1 versus Histon 3.3a in Magen, Duodenum, Ileum, Kolon und Nierenrinde des
Kaninchens (B); n=3.
4 Diskussion
92
NBC1 ist im Duodenum, Kolon und in der Niere, NHE1 im Duodenum und im Magen
hoch exprimiert. Die Durchführung der gleichen Experimente unter Nutzung von
18sRNA anstelle von Histon 3.3a als Kontrollgen hatten vergleichbare Ergebnisse ergeben. Die auf molekularbiologischem Wege gewonnenen Erkenntnisse unterstreichen
somit noch einmal die Hypothese, dass NBC1 und NHE1 für den Basenimport des Duodenozyten des Kaninchens eine tragende Rolle spielen. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse konnten die erhobenen Ussingkammerdaten, die nun im folgenden diskutiert
werden sollen, zu einer weiteren Klärung der funktionellen Rolle der untersuchten
Transportproteine beitragen.
4.2.3.1 Versuchsdurchführung in serosaler Abwesenheit von CO2/HCO3Zunächst einmal stellte sich die Frage, in wieweit die Anwesenheit von CO2/HCO3- im
serosalen Perfusat für eine unverminderte basale und stimulierte Bikarbonatsekretion
notwendig ist. An Ochsenfroschduodena ist ein Erlöschen der Bikarbonatsekretion und
eine Umkehr der PD unter Abwesenheit von CO2/HCO3- und Na+ im serosalen Perfusat
beschrieben worden (141). Die in Abbildung 9 gezeigte starke Reduktion der HCO3-Basalsekretion auf ca. 10% und der stimulierten Sekretion auf 20% der unter Kontrollbedingungen gemessenen Werte weist darauf hin, dass das sezernierte Bikarbonat nur
zu maximal 20% aus der intrazellulären CO2-Hydratation stammen kann. Der hier gemessene Isc war mehr als doppelt so hoch wie in der Kontrolle (siehe Abbildung 3),
was sich mit der von Macherey et al. (100) gefundenen höheren Leitfähigkeit des Duodenums des Kaninchens unter Abwesenheit von HCO3- vereinbaren lässt. Die im Vergleich zur Kontrolle kürzer dauernde und kleinere Isc-Antwort auf den 8-Br-cAMPStimulus lässt den bereits oben erwähnten Schluss zu, dass unter Normalbedingungen
ein großer Teil der messbaren Isc-Antwort von sezerniertem HCO3- getragen wird. Unter Normalbedingungen wird im basalen und stimulierten Zustand erheblich mehr Clals HCO3- sezerniert (siehe Tabelle 5). Diese Cl--Sekretion wird jedoch nur zu einem
kleinen Anteil durch den Isc gezeigt, da wahrscheinlich gleichzeitig parazelluläres Na+
nach mukosal gelangt und auf diese Weise diese Ladung neutralisiert (vergleiche die
Bemerkungen zu den 22Na+-Fluxen in Abschnitt 4.2.2.5). Zusammenfassend ist zu diesem Versuchsergebnis zu bemerken, dass die basale Bikarbonatsekretion im Duodenum
des Kaninchens zum Großteil von der Anwesenheit von CO2/HCO3- im serosalen Perfu-
4 Diskussion
93
sat abhängt. Die geringe Isc-Antwort auf Stimulation impliziert, dass ein Großteil der
Isc-Antwort unter Stimulation durch ausströmende HCO3--Ionen getragen wird.
4.2.3.2 Inhibition des basolateral gelegenen Na+/HCO3--Kotransporters
Die oben gezeigten Studien an BBM-Vesikeln aus dem Duodenum des Kaninchens und
die Ergebnisse der molekularbiologischen Experimente deuten darauf hin, dass für den
duodenalen Basenimport NBC1 und NHE1 hauptverantwortlich sind. NBC1 transportiert elektrogen Na+ und HCO3- in die Zelle hinein und ist durch die Stilbenderivate
DIDS und SITS inhibierbar (127). Zu der in der vorliegenden Arbeit erfolgten Anwendung von DIDS mit dem Ziel der Blockade des Na+/HCO3--Kotransporters ist folgendes
zu bemerken: Studien aus unserer Arbeitsgruppe an basolateralen Duodenalvesikeln
haben eine inkomplette Hemmbarkeit des Na+/HCO3-- Kotransports durch DIDS [1mM]
gezeigt, die optimale Hemmkonzentration betrug 3 mM und bei höheren DIDSKonzentrationen (ab 5 mM) nahm die Hemmung sogar wieder ab (79). Die Konzentration wurde für die folgenden Versuche mit einer Ausnahme (siehe Abbildung 11) jedoch trotzdem nicht höher gewählt, um unerwünschte toxische Effekte möglichst gering
zu halten. Die Tatsache, dass die Bikarbonatsekretion unter der basolateralen Einwirkung von DIDS [1mM] deutlich reduziert wurde, weist darauf hin, dass im Basalzustand ein großer Teil des aktiv sezernierten HCO3- vom Na+/HCO3--Kotransporter
aufgenommen wird (siehe Abbildung 10). Man würde nun erwarten, dass die Sekretionsrate auch unter stimulierten Bedingungen kleiner ausfiele; dies war jedoch nicht der
Fall: der Anstieg der Bikarbonatsekretion nach Stimulation durch 8-Br-cAMP war mit
dem unter Kontrollbedingungen gemessenen vergleichbar. Offenbar werden unter stimulierten Bedingungen andere Mechanismen der Bikarbonatbereitstellung aktiviert.
Darauf weist ebenfalls das Ergebnis des in Abbildung 11 gezeigten Versuchs hin: selbst
eine DIDS-Konzentration von 3 mM, zugegeben nach der Stimulation mit 8-Br-cAMP,
vermochte die HCO3-- Sekretion nicht auf das Plateau abzusenken, das bei dem in Abbildung 10 gezeigten Versuch erreicht worden war, es lag deutlich höher. Hier muss
also ein weiterer Mechanismus der Bikarbonatbereitstellung aktiviert worden sein. Aus
der Tatsache, dass die jeweils am Ende dieser beiden Versuchsreihen (Abbildung 10
und 11) gemessenen Bikarbonatsekretionswerte, die an dieser Stelle ein Plateau erreicht
hatten, sehr ähnlich waren, kann man zum einen ableiten, dass nach Applikation von
4 Diskussion
94
DIDS sogar in einer Konzentration von 3 mM immer noch eine aktive Sekretion vorlag,
zum anderen sind die beiden Versuchsansätze durch die fast identische Restsekretion
unter Ouabain-Einwirkung gut vergleichbar.
4.2.3.3 Hemmung der intrazellulären Karboanhydrase
Die nach der Entfernung von CO2/HCO3- aus dem basolateralen Perfusat verbleibende
aktive Bikarbonatsekretion muss aus intrazellulären Quellen stammen (siehe Abbildung
9). In Frage hierfür kommt die durch die Karbonanhydrase katalysierte Reaktion [H2O +
CO2 ↔ HCO3- + H+] und die anschließende Extrusion der anfallenden H+-Ionen durch
basolateralen Na+/H+-Austausch. Azetazolamid, ein nicht kompetitiver Inhibitor der
Karboanhydrase, hemmt das Enzym in einer Konzentration von 1 mM komplett. Die
Literatur ist sich uneins über die Bedeutung der Karboanhydrase für die duodenale Bikarbonatsekretion. Auf Amphibienduodena hatte Azetazolamid in vitro keinen signifikanten Effekt (141). Messungen an menschlichem proximalem Duodenum ergaben hingegen eine durch Azetazolamid hervorgerufene Senkung der basalen und der PGE2stimulierten, jedoch nicht der durch einen Säurereiz induzierten Bikarbonatsekretionssteigerung (91;92). Flemström et al. hatten 1983 ähnliches an Rattenduodena gemessen:
Hier hemmte Azetazolamid ebenfalls sowohl die basale als auch die PGE2- und säurestimulierte Bikarbonatsekretion in vivo (43). Auch an Duodena von Kaninchen wurde
gezeigt, dass die Karboanhydrasereaktion bei der Bikarbonatsekretion eine bedeutende
Rolle spielt Im Rahmen dieser Arbeit war ebenfalls mit dem Inhibitor Azetazolamid in
vivo gearbeitet worden (65).
Im nächsten Versuch sollten die Auswirkungen der Hemmung der Karboanhydrase unter basalen und 8-Br-cAMP-stimulierten Bedingungen untersucht werden (siehe Abbildung 12). Die Substanz Azetazolamid wurde bilateral appliziert, nach 15 min jedoch
luminal ein Mediumswechsel vorgenommen, um mögliche toxische Effekte zu vermeiden. Die Basalsekretion senkte sich auf ganz ähnliche Werte wie nach der serosalen
Applikation von DIDS [1mM] ab (siehe Abbildung 10). Entgegen den oben erwähnten
Erkenntnissen aus der Literatur zeigt sich hier die 8-Br-cAMP-stimulierte Sekretionsantwort (wie auch schon in dem Versuch, in dem DIDS basolateral appliziert worden
war, beobachtet) unvermindert gegenüber der Kontrolle. Da im Prinzip nur zwei Wege
der Bikarbonatbereitstellung durch den Duodenozyten in Frage kommen, impliziert die-
4 Diskussion
95
ses Ergebnis, dass unter Hemmung der intrazellulären Karboanhydrasereaktion durch
Azetazolamid eine Hochregulierung des durch den Na+/HCO3--Kotransporter mediierten basolateral lokalisierten Na+/HCO3--Imports während der 8-Br-cAMP-Stimulation
stattfindet, die theoretisch auf unterschiedliche Art und Weise zustande kommen kann:
zum einen durch eine veränderte Triebkraft von extra- nach intrazellulär für HCO3-Ionen (da durch die fehlende Herstellung die intrazelluläre HCO3--Konzentration abnimmt), zum anderen durch einen vermehrten Einbau von NBC-Proteinen in die Zellmembran infolge eines cAMP-abhängigen Signaltransduktionsmechanismus. Natürlich
können auch beide Mechanismen gleichzeitig eine Rolle spielen. Shumaker et al. führten 1999 Untersuchungen an den menschlichen pankreatischen Duktus-Zelllinien CAPAN-1 (aus humanem pankreatischen Adenokarzinom), CFPAC-1 (aus humanem
pankreatischem Adenokarzinom eines CF- Patienten mit der Mutation F508) und
CFPAC-WT (stabil mit CFTR transfizierte CFPAC-1 Zelllinie) durch. Sie stellten fest,
dass sich auf der basolateralen Zellmembran der pankreatischen Duktuszelle ein elektrogen arbeitender Na+/HCO3--Kotransporter befindet, dessen Aktivität sich durch
cAMP-Analoga steigern lässt, allerdings nur in Zellen mit intakter und funktionell bedeutsamer CFTR-Expression. Der vermutete Mechanismus ist eine Aktivierung des CFKanals via cAMP mit nachfolgender Depolarisation der Zellmembran, was die Aktivität
des NBC durch Veränderung der Triebkraft steigert. Aus ihren Untersuchungen leitet
die Arbeitsgruppe ab, dass die pathologisch veränderte Bikarbonatsekretion im pankreatischen Gangsystem des CF-Patienten nicht durch einen aufgrund des Defektes in der
Cl--Sekretion beeinträchtigten Cl-/HCO3--Austausch zustande kommt, sondern eine Folge des gestörten HCO3--Importes durch die basolaterale Zellmembran aufgrund der fehlenden CFTR-Funktion ist (139). Da unsere Daten implizieren, dass unter cAMPstimulierten Bedingungen und gleichzeitiger Hemmung der Karboanhydrase eine Hochregulierung des Na+/HCO3--Kotransportes stattfindet und die entscheidende Rolle der
CFTR-Funktion in der Bikarbonatsekretion im Duodenum schon seit längerem feststeht
(siehe Abschnitt 4.2.2), wäre die von Shumaker et al. gestellte Forderung einer Beteiligung des CFTR-Proteins an diesem Hochregulationsmechanismus auch für das Duodenum denkbar. Während der in unserer Arbeitsgruppe durchgeführten molekularbiologischen Charakterisierung des NBC1-Proteins hatte sich herausgestellt, dass der intestinale Subtyp vom NBC1 des Menschen und des Kaninchens eine Konsensussequenz für
4 Diskussion
96
die Proteinkinase A besitzt , was einen Hinweis auf ein strukturelles Korrelat für eine
cAMP-mediierte Aktivierung des Proteins darstellt. Wurden nun im Rahmen der von
uns durchgeführten Ussingkammer-Versuche die Substanzen DIDS und Azetazolamid
gleichzeitig appliziert (Abbildung 13), senkte sich die Basalsekretion wie erwartet ab,
wobei das erreichte Plateau wieder vergleichbar war mit dem, das auch bei Einzelgabe
der jeweiligen Substanz DIDS oder Azetazolamid gemessen worden war. Offenbar hatte
die Hemmung beider Systeme der Bikarbonatbereitstellung keinen additiven Effekt auf
die Basalsekretion. Ganz anders stellte sich die Sekretionsantwort nach 8-Br-cAMPApplikation dar: sie fiel im Vergleich zur Kontrolle sowohl in ihrer Höhe als auch in der
Dauer deutlich geringer aus. Die gleichzeitige Inhibition beider Bikarbonatbereitstellungssysteme hatte sich nun auf die stimulierte Sekretionsleistung ausgewirkt, was noch
einmal die Hypothese unterstreicht, dass diese beiden Mechanismen den Hauptanteil der
zellulären Bikarbonatbereitstellung im Duodenum sowohl unter basalen als auch unter
stimulierten Bedingungen tragen.
Die Tatsache, dass das Epithel trotz Hemmung unterschiedlicher Mechanismen zur
HCO3--Aufnahme oder seiner Herstellung durch die Karboanhydrase in der Lage war,
auf einen Stimulus mit 8-Br-cAMP mit einer im Vergleich zur Kontrolle uneingeschränkten Bikarbonatsekretionssteigerung zu reagieren, spricht für eine unabhängige
und starke Hochregulation für den jeweiligen Mechanismus der zellulären Bikarbonatbereitstellung während der Stimulation.
4.2.3.4 Selektive Blockade verschiedener Isoformen des Na+/H+- Austauschers
Während der Karboanhydrasereaktion entsteht für jedes HCO3--Ion entsprechend ein
H+-Ion, das für jedes sezernierte HCO3--Ion über die basolaterale Zellmembran zur Erhaltung des pHi der Zelle abgegeben werden muss. Die vermuteten Mechanismen hierfür sind entweder Na+/H+-Austausch über die basaolaterale Zellmembran und/oder eine
H+-ATPase (7).
Es liegt nahe anzunehmen, dass der Na+/H+-Austausch und die Karboanhydrasereaktion
in ihrer Funktion voneinander abhängig sind, da die Zelle ihren pHi aufrecht erhalten
muss. Demzufolge müssten die Ergebnisse einer Hemmung des Na+/H+-Austausches
mit dem Effekt der Hemmung der Karbonanhydrase vergleichbar sein. Da die bedeutsame Rolle der Isoform NHE1 aus der Familie der Na+/H+-Austauscher gezeigt worden
4 Diskussion
97
war (siehe Abbildungen 23A, 23C, 24, 26), wurde der in Abbildung 14 gezeigte Versuch unter Einsatz der Substanz Hoechst 642 in einer Konzentration von 1 µM, in der
dieser Hemmstoff selektiv die genannte Isoform hemmen soll, durchgeführt. Eine Verminderung der basalen und stimulierten Bikarbonatsekretionsrate gegenüber der Kontrolle ließ sich nicht feststellen. Ob die weitgehend fehlende Beeinträchtigung der Sekretionsleistung während der Hemmung des NHE1 durch seine fehlende funktionelle
Bedeutung oder durch kompensatorische Mechanismen von seiten der Zelle verursacht
war, sollte durch die nun folgenden Versuche abgeklärt werden. Mit dem Ziel, sowohl
NHE1 als auch den basolateral lokalisierten Na+/HCO3--Kotransporter zu inhibieren,
wurde nun nach der Applikation von Hoechst 642 [1 µM] zusätzlich DIDS [1mM] ins
serosale Perfusat gegeben (Abbildung 15). Wie auch schon im vorangegangenen Versuch beobachtet (siehe Abbildung 14), reagierte das Epithel auf die alleinige Gabe von
Hoechst 642 mit einer nicht signifikant veränderten HCO3--Sekretionsrate. Auch der
Abfall der Sekretionsleistung nach serosaler Applikation von DIDS [1mM] trat erwartungsgemäß so ein, wie er bereits in einem früheren Versuch beobachtet worden war
(siehe Abbildung 10). Erst nach Stimulation mit 8-Br-cAMP machte sich die gleichzeitige Hemmung von NHE1 und Na+/HCO3--Kotransport bemerkbar: die Sekretionsantwort war um ca. 60% gegenüber der Kontrolle vermindert. Der Hemmung dieser beiden
Wege zur duodenalen Bikarbonatbereitstellung hatten die Zellen keinen Kompensationsmechanismus mehr entgegenzusetzen. Dass diese Verminderung der Sekretionsantwort nicht etwa auf eine verminderte aktive Sekretionsleistung beispielsweise als Folge
einer Schädigung zurückzuführen war, zeigte der starke Abfall der beiden Messparameter Bikarbonatsekretion und Kurzschlussstrom nach serosaler Applikation von Ouabain.
Das am Ende des Versuchs erreichte Plateau war mit dem vergleichbar, das unter Kontrollbedingungen gemessen worden war.
Die in Abbildung 16 gezeigte gleichzeitige Hemmung von Na+/HCO3--Kotransport
durch DIDS [1mM] und des gesamten basolateral befindlichen Na+/H+- Austausches
durch Hoechst 642 [1µM], welches durch die selektive Hemmung von NHE1 am Duodenozyten des Kaninchens ca. 80% des gesamten hier gelegenen Na+/H+- Austausches
hemmt, und DMA [0,5 mM], welches den verbleibenden nicht durch NHE1 mediierten
Na+/H+-Austausch inhibiert, hatte dramatische Auswirkungen auf die basale und stimulierte Bikarbonatsekretion: Die Basalsekretion fiel in den Bereich, der unter Ouabain-
4 Diskussion
98
Einwirkung nach Erreichen des Plateaus gemessen worden war, das heißt, die Ouabainsensitive bzw. aktive Sekretion war zum Erliegen gekommen. Die durch 8-Br-cAMP
stimulierte Sekretionsantwort war mit der unter serosal CO2/HCO3--freien Bedingungen
gemessenen vergleichbar (siehe Abbildung 9). Zusammen mit den Beobachtungen aus
dem in Abbildung 15 dargestellten Versuch impliziert dieses Ergebnis, dass basolateraler Na+/H+-Austausch, für den zu einem erheblichen Anteil die Isoform NHE1 verantwortlich ist, eine entscheidende Komponente der HCO3--Generierung durch die Karboanhydrase-Aktivität darstellt. Wenn die beiden Systeme Karboanhydrasereaktion und
basolateral lokalisierte Na+/H+-Austausch so eng wie vermutet zusammenarbeiten, so
darf ihre gleichzeitige Hemmung keinen Unterschied zum Ergebnis nach ihrer jeweils
einzelnen Inhibition im Sinne eines additiven Effektes ergeben. Um dies zu überprüfen,
wurde die basale und stimulierte Bikarbonatsekretion unter der gleichzeitigen Hemmung von Karboanhydrase und der NHE1-Isoform gemessen (Abbildung 17). Wie erwartet, war kein zusätzlicher Effekt im Vergleich zu den in Abbildungen 12 und 14 dargestellten Versuchen zu erkennen.
Die Versuchsergebnisse zur duodenalen Bikarbonatbereitstellung implizieren nicht nur,
dass während der cAMP-stimulierten Bikarbonatsekretionssteigerung bei gleichzeitiger
Hemmung des Karboanhydrasesystems der Na+/HCO3--Kotransport hochreguliert wird,
sondern auch, dass im umgekehrten Fall unter Stimulationsbedingungen nach Applikation von cAMP-Analoga bei gleichzeitiger Hemmung des Na+/HCO3--Kotransporters
offenbar das Karboanhydrasesystem hochreguliert wird. Für die Organe Gehirn (38),
Knochen (55) und für Erythrozyten (49) ist eine cAMP-abhängige Karboanhydraseaktivierung beschrieben worden. Eine Arbeit beschreibt die cAMP-induzierte Aktivitätssteigerung des Promoters für das CAII-Gen (102). Natürlich stellt die Hochregulation
der Karboanhydrase nur eine von mehreren denkbaren Möglichkeiten dar, wie cAMP
die intrazelluläre Generierung von HCO3--Ionen steigern könnte. Denkbar wäre auch
eine cAMP-induzierte Steigerung H+-Extrusion während der Bikarbonatsekretion.
Bachmann et al. beschrieben 1998 eine cAMP-induzierte NHE1-Aktivierung (neben
einer NHE4-Aktivierung) für die Parietalzelle des Kaninchenmagens (13;102). Da die
am Anfang des Kapitels 4.2.3 vorgestellten Daten aus unserer Arbeitsgruppe und die im
Rahmen der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten darauf hinweisen, dass NHE1 hauptverantwortlich für die H+-Extrusion während der Bikarbonatsekretion ist, wäre eine
4 Diskussion
99
solche Aktivierung auch im Duodenum denkbar. Welche Mechanismen nun tatsächlich
bei der Hochregulierung der beiden beschriebenen Wege (Na+/HCO3--Kotransport und
Na+/H+-Austausch) der Bikarbonatbereitstellung durch den Duodenozyten eine Rolle
spielen, wird in Zukunft weiterer Abklärung bedürfen.
5 Zusammenfassung
Die Bikarbonatsekretion zählt zu den wichtigsten Schutzmechanismen der duodenalen
Mukosa gegen die luminale Säurebelastung. Ihr ungestörtes Funktionieren ist eine unabdingbare Vorraussetzung für eine intakte Schleimhautoberfläche und ein gesundes
Organ.
Ziel der Arbeit war es, die an der Bikarbonatsekretion beteiligten zellulären Ionentransportmechanismen funktionell näher zu charakterisieren und Aspekte ihrer Regulation zu klären. Zu diesem Zweck wurde proximales Kaninchenduodenum, das zuvor von Serosa- und Muskelschichten befreit worden war, in einen UssingkammerAufbau verbracht und simultan mit dem Kurzschlussstromexperiment die Messung der
Bikarbonatsekretion unter Anwendung der pH-stat-Methode durchgeführt.
Im ersten Teil der Arbeit sollte geklärt werden, welche am apikalen Zellpol lokalisierten
Transportproteine unter basalen und stimulierten Bedingungen für die Bikarbonatsekretion eine Rolle spielen und in welcher funktionellen Beziehung sie zueinander stehen.
Das untersuchte Gewebe zeigte unter basalen Bedingungen konstante Bikarbonatsekretionsraten und elektrophysiologische Parameter. Die Stimulation mit 8-Br-cAMP hatte
eine signifikante Steigerung sowohl der Bikarbonatsekretionsrate als auch des Kurzschlussstromes zur Folge. Der Abfall sämtlicher Messparameter nach OuabainApplikation zeigte zum einen die vorher vorhandene Vitalität des Gewebes und zum
anderen das Ausmaß der aktiven Sekretionsleistung an. Die Hemmung des apikalen
Anionenaustauschers, von dem bekannt ist, dass er eine funktionelle Bedeutung im Duodenum besitzt, entweder durch Ersatz der Cl--Ionen des luminalen Perfusates oder
durch die Applikation von DIDS [1 mM], führte zu einem deutlichen Abfall der basalen
Bikarbonatsekretion, die durch 8-Br-cAMP hervorgerufene Sekretionsantwort zeigte
sich jedoch nicht beeinträchtigt. Bilateraler Ersatz der Cl--Ionen in luminaler Ab- und
Anwesenheit von DIDS [1 mM] führte zu vergleichbaren Ergebnissen hinsichtlich der
Bikarbonatsekretion. Die Hemmung des basolateral lokalisierten NKCC wirkte sich
nicht auf das Ausmaß der Bikarbonatsekretionssteigerung nach Stimulation aus. Die
durchgeführten radioaktive Fluxstudien ergaben einen erhöhten 3H-Mannitol, 36Cl--und
22
Na+-Flux von serosal nach mukosal unter Stimulationsbedingungen durch 8-Br-
5 Zusammenfassung
cAMP. Insgesamt lagen die Fluxraten für
101
36
Cl- und
22
Na+ um ein Vielfaches höher als
die Bikarbonatsekretion, die Fluxraten für 3H-Mannitol betrugen hingegen nur ca. 1/100
der Bikarbonatsekretion.
Zusammengefasst haben die Experimente des ersten Teils der Arbeit gezeigt, dass ein
apikaler Anionenaustauscher im Duodenum des Kaninchens einen deutlichen Anteil an
der aktiven basalen Bikarbonatsekretion besitzt, die HCO3--Ionen nach Stimulation
durch cAMP-Analoga jedoch über eine Leitfähigkeit sezerniert werden, wobei der Anionenaustauscher in den Hintergrund tritt. Aufgrund der allgemeinen Erkenntnisse über
das CFTR-Protein muss dieses entweder in die cAMP-gesteuerte Regulation einer solchen Leitfähigkeit involviert sein oder sogar selber als cAMP-regulierter Cl-- und
HCO3--Kanal fungieren.
Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit den Mechanismen der duodenalen Bikarbonatbereitstellung, die wahrscheinlich einen limitierenden Faktor für die Bikarbonatsekretion darstellt. Die Entfernung von CO2/HCO3- aus dem serosalen Perfusat reduzierte
die basale und stimulierte Bikarbonatsekretion auf 10 bzw. 20 % der Kontrolle. Die
Hemmung des Na+/HCO3--Kotransporters durch serosale Anwesenheit von DIDS [1
mM] führte zwar zu einem deutlichen Absinken der basalen, jedoch zu keiner Beeinträchtigung der 8-Br-cAMP-stimulierten Bikarbonatsekretion. Ein vergleichbares Ergebnis hinsichtlich der Bikarbonatsekretion erbrachte die Hemmung der Karboanhydrase mittels Azetazolamid [1 mM]. Wurden nun die beiden Systeme Na+/HCO3-Kotransport und Karboanhydrase gleichzeitig gehemmt, zeigte sich neben der schon bei
den vorangegangenen Versuchen beobachtete Rückgang der Basalsekretion zusätzlich
eine in ihrem Ausmaß verringerte und in ihrer Dauer verkürzte Bikarbonatsekretionsantwort auf den 8-Br-cAMP-Stimulus. Die selektive Hemmung der Isoform NHE1 aus
der Genfamilie der Na+/H+-Austauscher, für die eine bedeutende Rolle im Duodenalepithel des Kaninchens beschrieben worden ist, mittels der Substanz Hoechst 642 [1
µM], hatte weder auf die basale noch auf die stimulierte Bikarbonatsekretion einen signifikanten Effekt, wurde jedoch in einem anderen Versuchansatz nach der HoechstApplikation dem serosalen Perfusat die Substanz DIDS [1 mM] zugesetzt, sank zum
einen die basale Bikarbonatsekretionsrate ab, zum andern zeigte sich die stimulierte
Sekretionsantwort deutlich reduziert. Wirkten nun die Substanzen DIDS [1 mM],
5 Zusammenfassung
102
Hoechst 642 [1 µM] und DMA [0,5 mM] gleichzeitig auf das Epithel ein, was bedeutet,
dass sowohl der Na+/HCO3--Kotransport als auch sämtliche im Dünndarm funktionell
bedeutsame Isoformen des Na+/H+-Austauschers gehemmt waren, erlosch die Ouabainsensitive bzw. aktive Basalsekretion; die 8-Br-cAMP-induzierte Sekretionsantwort lag
größenordnungsmäßig in dem Bereich der in serosaler Abwesenheit von CO2/HCO3gemessenen Sekretionsantwort. Wurde schließlich die Karboanhydrase (mittels Azetazolamid [1 mM]) gleichzeitig mit der Isoform NHE1 (mittels Hoechst 642 [1 µM]) gehemmt, ließ sich aus dem Versuchsergebnis kein additiver Effekt auf die basale und
stimulierte Bikarbonatsekretion, verglichen mit der alleinigen Verwendung der genannten Substanzen, erkennen.
Zusammengefasst haben die Experimente des zweiten Teils der Arbeit folgendes gezeigt: Im Duodenalepithel des Kaninchens sind unter nicht-stimulierten Bedingungen
sowohl basolateral lokalisierter Na+/HCO3--Kotransport als auch intrazelluläre HCO3-Generierung (die über die Karboanhydrasereaktion gekoppelt mit Na+/H+-Austausch
zustande kommt), für die Bereitstellung von HCO3--Ionen, die ins Darmlumen sezerniert werden, verantwortlich. Die Anwesenheit von CO2/HCO3- im serosalen Perfusat
ist dabei unbedingt erforderlich. Diese beiden Wege der Bikarbonatbereitstellung können während einer Stimulation durch cAMP-Analoga unter Hemmung jeweils deseinen
Weges so wirksam hochreguliert werden, dass die Sekretionsantwort nicht beeinträchtigt ist.
6 Abbildungen und Tabellen
Abbildung 1: Schemazeichnung eines Duodenozyten
Abbildung 2: Ussingkammer-Setup
Abbildung 3: Reaktion des Duodenalepithels auf Stimulation mit 8-Br-cAMP [1 mM]
(serosal appliziert) hinsichtlich der Bikarbonatsekretions- () und der Isc-Veränderung
(∆), nach 40 min Bumetanid-Applikation [0,5 mM] (serosal appliziert) und nach 55 min
Zugabe von Ouabain [0,5 mM] (serosal appliziert); n=14.
Abbildung 4: Reaktion des Duodenalepithels hinsichtlich der Bikarbonatsekretion ()
und des Kurzschlussstromverlaufes (∆) auf verschiedene Stimulantien unter luminal Cl-freien Bedingungen. Zugabe von 8-Br-cAMP [1 mM] serosal 50 min nach Erreichen
stabiler Messparameter bzw. 40 min nach Umstellen des luminalen Perfusats auf eine
Cl--freie Lösung. Bumetanid wurde wie unter Kontrollbedingungen 30 min nach Zugabe von 8-Br-cAMP in einer Konzentration von 0,5 mM serosal zugegeben, und nach
weiteren 15 Minuten Wartezeit Ouabain [0,5 mM] serosal appliziert; n=5.
Abbildung 5: Bikarbonatsekretion () und Isc (∆) in Anwesenheit von DIDS [1 mM]
(appliziert nach 10 min stabil gemessenen Basalparametern) im luminalen Perfusat.
Applikation der übrigen Substanzen wie in den vorangegangenen Versuchen; n=6.
Abbildung 6: Duodenale Bikarbonatsekretion () und Isc (∆) unter bilateral Cl--freien
Bedingungen. Die beiden Cl--freien Perfusionslösungen (basolateral und luminal) wurden von Versuchsbeginn an verwendet. Die Stimulantien wurden entsprechend dem
bereits beschriebenen Versuchsschema der Kontrolle appliziert; n=5.
Abbildung 7: Verlauf der Bikarbonatsekretion () und des Kurzschlussstromes (∆) unter bilateral Cl--freien Bedingungen. Nach Erreichen stabiler Basalparameter Applikati-
6 Abbildungen und Tabellen
104
on von DIDS [1 mM] ins luminale Perfusat. Stimulation mit 8-Br-cAMP [1 mM] 10
min nach Einstellung eines neuen Plateaus (45 min nach Applikation von DIDS). Stimulation mit Bumetanid [0,5 mM] 85 min und Ouabain [0,5 mM] 100 min nach Versuchsbeginn; n=4.
Abbildung 8: Effekt von 8-Br-cAMP[1 mM] und Ouabain [0,5 mM] auf die Bikarbonatsekretion () und den Isc (∆) in Anwesenheit von Bumetanid [0,5 mM] im basolateralen Perfusat; n=6.
Abbildung 9: Verlauf von Bikarbonatsekretion () und Isc(∆) unter serosal CO2/HCO3freien Bedingungen. Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] 10 min nach Erreichen stabiler Basalparameter. Zugabe von Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM] nach weiteren 30 bzw. 45 min; n=5.
Abbildung 10: 8-Br-cAMP stimulierte Bikarbonatsekretion () und Isc (∆) in Anwesenheit von DIDS [1 mM] im basolateralen Perfusat; anschließende Applikation von
Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM]; n=3.
Abbildung 11: Stimulation des Duodenalepithels mit 8-Br-cAMP und darauffolgende
serosale Applikation von DIDS [3 mM]. Vor Zugabe von Bumetanid 1h Wartezeit. Ouabain-Applikation nach weiteren 15 min. Verlauf von Bikarbonatsekretion () und Isc
(∆); n=4.
Abbildung 12: Effekt von bilateral appliziertem Azetazolamid [1 mM] auf die 8-BrcAMP-stimulierte Bikarbonatsekretion () und Isc (∆). Applikation von 8-Br-cAMP,
Bumetanid und Ouabain im selben zeitlichen Schema wie in den vorangegangenen
Versuchen. Mediumswechsel luminal 15 min nach Azetazolamid- Applikation; n=3.
Abbildung 13: Effekt der serosalen Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] , Bumetanid
[0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM] auf den Verlauf von Bikarbonatsekretion () und Isc
(∆) unter Einwirkung von serosal appliziertem DIDS [1 mM] und bilateral appliziertem
6 Abbildungen und Tabellen
105
Azetazolamid [1 mM]. Mediumswechsel luminal 15 min nach Azetazolamid- und DIDS
-Applikation. Achse ist von 10 bis 35 min unterbrochen; n=4.
Abbildung 14: Effekt von serosal appliziertem Hoechst 642 [1 µM] auf die 8-BrcAMP- stimulierte Bikarbonatsekretion () und Isc (∆). Applikation von 8-Br-cAMP,
Bumetanid und Ouabain nach dem bereits beschriebenen Schema; n=3.
Abbildung 15: Effekt der serosalen Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] , Bumetanid
[0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM] auf den Verlauf von Bikarbonatsekretion () und Isc
(∆) unter serosaler Einwirkung von Hoechst [1 µM] und DIDS [1 mM]; n=4.
Abbildung 16: Zeitverlauf der Bikarbonatsekretion () und des Isc (∆) unter der serosalen Einwirkung von nacheinander appliziertem DIDS [1 mM], Hoechst 642 [1 µM] und
DMA [0,5 mM], anschließend serosale Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] und Ouabain [0,5 mM]; n=4.
Abbildung 17: Effekt der serosalen Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM] , Bumetanid
[0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM] auf den Verlauf von Bikarbonatsekretion () und Isc
(∆) unter der Einwirkung von serosal appliziertem Hoechst [1µM] und bilateral appliziertem Azetazolamid [1 mM]. Mediumswechsel luminal 15 min nach Applikation von
Hoechst 642 und Azetazolamid; n=4.
Abbildung 18: Effekt von 8-Br-cAMP [1 mM] auf den mittleren 3H-Mannitol-Flux ±
SEM von serosal nach mukosal; Applikation von Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain
[0,5 mM] nach 60 bzw. 75 min; n=3
Abbildung 19: Quantitativer Vergleich des Effektes von 8-Br-cAMP [1 mM] auf den
mittleren 3H-Mannitol-Flux ± SEM von serosal nach mukosal (dunkle Balken) und die
mittlere Bikarbonatsekretion ± SEM (helle Balken). Messung im Zeitintervall von 15
min; n=3.
6 Abbildungen und Tabellen
106
Abbildung 20A: Aufzeichnung der bidirektionalen Fluxraten für 36Cl- ± SEM von serosal nach mukosal (schwarze Balken) und von mukosal nach serosal (graue Balken) unter
basalen Bedingungen und nach basolateraler Applikation von 8-Br-cAMP [1 mM], Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM]; n=5.
Abbildung 20B: Aufzeichnung der duodenalen
36
Cl--Nettoresorption ± SEM unter
Verwendung der in Abbildung 20A gezeigten Messwerte.
Abbildung 21: Effekt von 8-Br-cAMP [1 mM] auf den mittleren bidirektionalen 36Cl-Flux ± SEM; dargestellt ist der Nettoflux. Applikation von Ouabain [0,5 mM] 30 min
nach Stimulation mit 8-Br-cAMP, nach 1h Wartezeit ohne Abnahmen erfolgten die letzten vier Abnahmen; n=3.
Abbildung 22A: Aufzeichnung der bidirektionalen Fluxraten für 22Na+ ± SEM im Duodenum von serosal nach mukosal (schwarze Balken) und von mukosal nach serosal
(graue Balken) unter basalen Bedingungen und nach basolateraler Applikation von 8Br-cAMP [1 mM], Bumetanid [0,5 mM] und Ouabain [0,5 mM]; n=5.
Abbildung 22B: Aufzeichnung der duodenalen
22
Na+ Nettoresorption ± SEM unter
Verwendung der in Abbildung 22A gezeigten Messwerte.
Abbildung 23A: Zeitverlauf der pH-getriebenen Aufnahme von 22Na+ in BLM-Vesikel
aus dem Duodenum in Anwesenheit eines einwärts gerichteten HCO3--Gradienten und
der Einfluss von DMA [0,5 mM]; n=5.
Abbildung 23B: Zeitverlauf der pH-getriebenen Aufnahme von 22Na+ in BLM-Vesikel
aus dem Duodenum in Anwesenheit eines einwärts gerichteten Bikarbonat-Gradienten
und der Einfluss von DIDS [3 mM]; n=2.
Abbildung 23C: Zeitverlauf der pH-getriebenen Aufnahme von 22Na+ in BLM-Vesikel
aus dem Duodenum, der Einfluss von DMA [0,5 mM] und von Hoechst 642 [1 µM]
bzw. [25 µM]; n=2.
6 Abbildungen und Tabellen
107
Abbildung 24: Poly (A)+-RNA Northern Blot: Expression des NBC1 und NHE1 in
Magen, Duodenum, Ileum, Kolon und Nierenrinde des Kaninchens.
Abbildung 25: Semiquantitative RT-PCR von NBC1. Parallele Kurven für NBC1 (263
bp) und Histon 3.3a (523 bp). Das Verhältnis von NBC1 zu Histon 3.3a wurde während
der exponentiellen Phase beider Reaktionen bestimmt (A). Relative Expressionslevel
von NBC1 versus Histon 3.3a in Magen, Duodenum, Ileum, Kolon und Nierenrinde des
Kaninchens; n=3.
Abbildung 26: Semiquantitative RT-PCR von NHE1. Parallele Kurven für NHE1 (356
bp) und Histon 3.3a (523 bp). Das Verhältnis von NHE1 zu Histon 3.3a wurde während
der exponentiellen Phase beider Reaktionen bestimmt (A). Relative Expressionslevel
von NHE1 versus Histon 3.3a in Magen, Duodenum, Ileum, Kolon und Nierenrinde des
Kaninchens (B); n=3.
Tabelle 1: Verwendete Chemikalien, deren Abkürzung und jeweilige Bezugsquelle; bei
den mit * gekennzeichneten Substanzen ist unter „Abkürzung“ der Handelsname angegeben.
Tabelle 2: Auflistung der für die durchgeführten Experimente verwendeten Geräte. Als
standardisiert geltende Geräte sind nicht enthalten.
Tabelle 3: Ionale Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Lösungen.
Tabelle 4: Basalparameter des Duodenums verschiedener Spezies, Daten an der Ussingkammer erhoben.
Tabelle 5: Vergleich von Bikarbonatsekretion, Isc und bilateralen Fluxraten für
und
22
36
Cl-
Na+ im Duodenalepithel des Kaninchens im Basalzustand und nach Stimulation
mit 8-Br-cAMP [1 mM].
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8 Danksagung
Mein Dank gilt allen, die zum Gelingen dieser Arbeit und ihrem erfolgreichen Abschluss beigetragen haben.
An erster Stelle möchte ich Frau Prof. Dr. Ursula Seidler – ehemals Abteilung für
Innere Medizin I der Eberhard-Karls-Universität Tübingen, nun Zentrum Innere
Medizin, Abteilung IV der Medizinischen Hochschule Hannover – ganz herzlich
danken, die mir das interessante Thema überlassen hat und mich die ganze Zeit über
hervorragend betreut hat. Sie hatte immer Zeit für Fragen und Probleme und half mir
mit konstruktiver Kritik und tatkräftiger Hilfe über manche „Krisen” hinweg.
Herrn Prof. Dr. M. Gregor, Ärztlicher Direktor der Abteilung Innere Medizin I der
Eberhard-Karls-Universität Tübingen, danke ich für die Möglichkeit, eine wissenschaftliche Arbeit in seiner Abteilung durchzuführen.
Herrn Prof. Dr. Wahl, Leiter des Isotopenlabors der Medizinischen Klinik der Universität Tübingen, und Frau Benz danke ich für die Möglichkeit der Nutzung von Räumen
im Isotopenlabor und für die Unterstützung, die sie mir zukommen ließen.
Allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe, die durch ihre Freundlichkeit, Kooperativität und
nicht zuletzt tatkräftige Hilfe am Gelingen der Doktorarbeit einen großen Anteil hatten,
möchte ich an dieser Stelle meinen herzlichen Dank aussprechen. Frau Dr. Heidi Roßmann und Frau Dr. Irina Blumenstein danke ich für ihre große Hilfsbereitschaft in allen
fachlichen und allen anderen erdenklichen Fragen und insbesondere für das engagierte
Korrekturlesen der Arbeit. Herrn Dr. Georg Lamprecht danke ich für die große Zeitinvestition, ein später von mir genutztes Messprogramm am Computer zu programmieren. Erwähnt sein sollen auch Frau Dr. Petra Jacob und Herr Dr. Oliver Bachmann,
die mir sehr oft bei unterschiedlichsten Problemen zur Seite standen und mir halfen,
Anfangshürden im Labor zu überwinden.
8 Danksagung
122
Meinem Mann Dr. Martin Spiegel danke ich für seine immerwährende Aufmunterung
und tatkräftige Hilfe sowie für seine moralische und computertechnische Unterstützung
besonders während der Endphase der Arbeit.
Mein ganz besonderer Dank gilt jedoch meinen Eltern, die mir mein Studium ermöglicht haben und mir zu jeder Zeit unterstützend zur Seite standen.
9 Lebenslauf
Name
Stefanie Spiegel, geb. Christiani
Geburtsdatum
12. August 1976
Geburtsort
Aachen
Familienstand
verheiratet mit Dr. rer. nat. Martin Spiegel
Eltern
Dr. ing. Peter Christiani, Diplom-Ingenieur,
und Ulrike Christiani, Bewegungsfachkraft
Schulbildung
1984-1987
Grund- und Hauptschule Neuffen
1987-1996
Hölderlin-Gymnasium Nürtingen, Abitur
Studium
WS 1996/97 SS 1998
Vorklinischer Studienabschnitt des Studiums
der Humanmedizin an der Universität Rostock
4. September 1998
Ärztliche Vorprüfung
WS 1998/99 WS 2001/02
Klinischer Studienabschnitt an der EberhardKarls-Universität Tübingen
23. März 2000
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
28. März 2002
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
SS 2002 WS 2002/03
Praktisches Jahr am Diakonie-Krankenhaus
Freiburg (Lehrkrankenhaus der Universität
Freiburg)
6. Mai 2003
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Gesamtnote „sehr gut“
Stipendien
1999 - 2000
Stipendiatin des Graduiertenkollegs
„Zellbiologie in der Medizin“ der Universität
Tübingen
Wissenschaftliche
Tätigkeit
November 1998
Beginn der Labortätigkeit im Labor von
Dr. U. Seidler, Abteilung I der Medizinischen
Universitätsklinik Tübingen, Ärztlicher
Direktor: Prof. Dr. M. Gregor
April 1999
Beginn der experimentellen Doktorarbeit im
Labor von Dr. U. Seidler
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