Zanussi | ZCO 99/4 W | Einfluss von Erhitzung und Gefriertrocknung auf die Lutein

FORSCHUNGSBERICHT AGRARTECHNIK
des Fachausschusses Forschung und Lehre der
Max-Eyth-Gesellschaft Agrartechnik im VDI (VDI-MEG)
540
Severin Ramona Thierau
Einfluss von Erhitzung und Gefriertrocknung
auf die Lutein- und Zeaxanthin-Konzentrationen
in Eigelb
Dissertation
Witzenhausen/Fulda 2014
II
Universität Kassel
Fachbereich Ökologische Agrarwissenschaften
Fachgebiet Agrartechnik
Prof. Dr. Oliver Hensel
Hochschule Fulda
Fachbereich Lebensmitteltechnologie
Fachgebiet Ernährungswissenschaften
Prof. Dr. Ingrid Seuß-Baum
Einfluss von Erhitzung und Gefriertrocknung
auf die Lutein- und Zeaxanthin-Konzentrationen in Eigelb
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Agrarwissenschaften (Dr. agr.)
Vorgelegt im Fachbereich Ökologische Agrarwissenschaften
der Universität Kassel
Von M. Sc. Severin Ramona Thierau
aus Herborn/Dillenburg
2014
Die vorliegende Arbeit wurde am 16.09.2014 vom Fachbereich für Ökologische Agrarwissenschaften, Fachgebiet Agrartechnik der Universität Kassel als Dissertation zur Erlangung
des Grades einer Doktorin der Agrarwissenschaften angenommen.
Tag der mündlichen Prüfung: 04.12.2014
Hauptberichter:
Prof. Dr. Oliver Hensel
Mitberichter:
Prof. Dr. Ingrid Seuß-Baum
Mündliche Prüfung:
Prof. Dr. Oliver Hensel
Prof. Dr. Ingrid Seuß-Baum
Prof. Dr. Angelika Ploeger
Prof. Dr. Stefan Schildbach
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in elektronischen Systemen.
© 2014.
Im Selbstverlag:
Severin Ramona Thierau
Bezugsquelle:
Universität Kassel
Fachbereich Ökologische Agrarwissenschaften
Fachgebiet Agrartechnik
Nordbahnhofstraße 1a
37213 Witzenhausen
Hochschule Fulda
Fachbereich Lebensmitteltechnologie
Fachgebiet Ernährungswissenschaften
Marquardstraße 35
36039 Fulda
II
Vorwort
Die vorliegende Arbeit entstand während meiner Tätigkeit als wissenschaftliche Mitarbeiterin
am Fachbereich Lebensmitteltechnologie der Hochschule Fulda.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Oliver Hensel und Frau Prof. Dr. Ingrid SeußBaum für die wissenschaftliche Betreuung der Arbeit und die bereichernden und hilfreichen
Anregungen und Diskussionen sowie Herrn Prof. Dr. Stefan Schildbach für seine Unterstützung und die Durchsicht der Arbeit.
Bei Frau Dr. Stefanie Retz bedanke ich mich herzlich für die konstruktive und freundliche
Beratung und Hilfe bei wissenschaftlichen und organisatorischen Fragen, die Durchsicht der
Arbeit sowie ihre moralische Unterstützung.
Ich danke Herrn Dr. Michael Wenzel für die Hilfestellung bei der Einarbeitung in das gerätetechnische Equipment, Frau Dipl.-Chem. Karin Fischer, die stets bei allen analytischen Problemen hilfsbereit zur Seite stand, Frau M. Sc. Désirée Schneider für die wertvollen wissenschaftlichen Diskussionen, besonders hinsichtlich der statistischen Auswertungen, und Frau
M. Sc. Helena Keil, die mich im Rahmen ihrer Master-Thesis bei den DSC-Messungen unterstützte, für die gute Zusammenarbeit.
Herzlich möchte ich mich auch bei Frau M. Sc. Lena Schäfer für die Durchsicht der Arbeit
und besonders die unermüdliche und geduldige Unterstützung in allen persönlichen Belangen bedanken, die stets mit liebevoll hartnäckigem Bestreben die work-life-balance wiederherstellte.
Ein ganz besonders herzlicher Dank gilt meiner Mutter Iris und meiner Schwester Jacqueline, die immer für mich da sind und deren Unterstützung und Liebe die beste Motivation für
mich sind.
Im Dezember 2014
Severin Ramona Thierau
Für Mogli
IV
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung und Hypothesenformulierung...................................................................... 1
2. Stand der Forschung ..................................................................................................... 4
2.1 Das Lebensmittel Ei und die Zusammensetzung des Eigelbs ......................... 4
2.2 Einfluss von Erhitzung und Gefriertrocknung auf die Proteine und
Lipoproteine in Eigelb ......................................................................................... 8
2.2.1 Erhitzung ................................................................................................... 9
2.2.2 Gefriertrocknung .......................................................................................11
2.3 Chemisch-physikalische Eigenschaften von Carotinoiden .............................15
2.3.1 E/Z-Isomerisation .....................................................................................16
2.3.2 Degradation ..............................................................................................18
2.4 Vorkommen von Carotinoiden in natürlichen Matrizes ...................................20
2.4.1 Aggregation und Kristallisation .................................................................20
2.4.2 Membrane ................................................................................................20
2.4.3 Proteine ....................................................................................................21
2.5 Metabolismus von Carotinoiden .......................................................................22
2.6 Carotinoide in Lebensmitteln ............................................................................24
2.6.1 Carotinoide in Eigelb ................................................................................25
2.6.2 Einflüsse auf den Carotinoid-Gehalt .........................................................26
2.7 Bioverfügbarkeit .................................................................................................28
2.8 Physiologische Wirkungen von Carotinoiden ..................................................30
2.9 Analytik von Carotinoiden .................................................................................32
2.9.1 Probenaufbereitung und Extraktion ..........................................................33
2.9.2 Chromatographische Trennung mittels HPLC...........................................34
2.9.3 Identifizierung ...........................................................................................37
2.9.4 Quantifizierung .........................................................................................44
2.10 Analytische Methodenvalidierung ...................................................................44
3. Material und Methoden..................................................................................................47
3.1 Vorbereitung des Eigelbs ..................................................................................49
3.2 Fraktionierung von Eigelb in Plasma und Granula ..........................................49
3.3 Bestimmung der Trockenmasse (TM) ...............................................................49
3.4 Differential Scanning Calorimetry (DSC) ..........................................................50
I
3.5 Bestimmung von Lutein und Zeaxanthin ..........................................................51
3.5.1 HPLC-PDA-Analyse .................................................................................51
3.5.2 Extraktion .................................................................................................52
3.5.3 Richtigkeit und Wiederholpräzision der Bestimmungsmethode .................53
3.5.4 Identifizierung von Lutein und Zeaxanthin ................................................54
3.6 Erhitzung.............................................................................................................54
3.7 Gefriertrocknung ................................................................................................55
3.8 Statistische Auswertung der Messergebnisse .................................................55
4. Ergebnisse .....................................................................................................................57
4.1 Fraktionierung von Eigelb in Plasma und Granula ..........................................57
4.2 Bestimmung der Trockenmasse (TM) ...............................................................57
4.3 Bestimmung von Lutein und Zeaxanthin ..........................................................59
4.3.1 HPLC-PDA-Analyse .................................................................................59
4.3.2 Extraktion .................................................................................................63
4.3.3 Richtigkeit und Wiederholpräzision der Bestimmungsmethode .................67
4.3.4 Identifizierung von Lutein und Zeaxanthin ................................................69
4.3.5 Berechnung der Massenkonzentrationen von Lutein und Zeaxanthin .......80
4.3.6 Zusammenfassung zur Optimierung der Bestimmungsmethode ...............80
4.4 Erhitzung und Gefriertrocknung .......................................................................82
4.4.1 Nativzustand ............................................................................................83
4.4.2 Erhitzung ..................................................................................................84
4.4.3 Gefriertrocknung .......................................................................................95
5. Diskussion ...................................................................................................................103
5.1 Nativzustand .....................................................................................................103
5.2 Diskussion zum Einfluss der Erhitzung .........................................................108
5.3 Diskussion zum Einfluss der Gefriertrocknung .............................................125
5.4 Zusammenfassende Diskussion .....................................................................136
5.4.1 Modell zur Beeinflussung der Xanthophyll-Massenkonzentrationen .......136
5.4.2 Evaluation der Ergebnisse im Kontext der formulierten Hypothesen .......140
5.4.3 Methodische Aspekte .............................................................................145
6. Ausblick .......................................................................................................................146
Zusammenfassung ...........................................................................................................147
Summary ...........................................................................................................................149
Literatur............................................................................................................................. XIII
Anhang .......................................................................................................................... XXXV
II
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1-1:
Darstellung des Studiendesigns zum Einfluss von Erhitzung und Gefriertrocknung auf
die Xanthophyll-Konzentrationen in Eigelb
Abb. 2-1:
Schematischer Aufbau der core-shell-Struktur der LDL [modifiziert nach Forti und
Diament 2006]
Abb. 2-2:
Domänenorganisation des HDL-Monomers (links) und X-förmige Struktur des HDLDimers (rechts) [modifiziert nach Anderson et al. 1998]
Abb. 2-3:
Zusammensetzung von Eigelb, Plasma und Granula [modifiziert nach Li-Chan und
Kim 2008; Belitz et al. 2008; Anton 2007; Moussa et al. 2002; Li-Chan et al. 1995;
Ternes et al. 1995; Dyer-Hurdon und Nnanna 1993; Itoh et al. 1986; Powrie und Nakai
1986; McBee und Cotterill 1979; Evans et al. 1968; Martin et al. 1964]
Abb. 2-4:
Temperaturabhängiger Viskositätsverlauf von Eigelb [modifiziert nach Ternes 2008b]
Abb. 2-5:
Modell der Hydrathülle des LDL-Moleküls [modifiziert nach Wakamatu 1993]
Abb. 2-6:
Bezifferung des Carotinoid-Moleküls am Beispiel der Strukturformel von Lycopin (,Carotin) [Weedon und Moss 1995]
Abb. 2-7:
Molekülstrukturen von all-E-Lutein (links) und all-E-Zeaxanthin (rechts)
Abb. 2-8:
E-Konfiguration (Priorität Substituent a > b und d > c; links) und Z-Konfiguration (Priorität Substituent a > b und c > d; rechts) [modifiziert nach Weedon und Moss 1995]
Abb. 2-9:
Stereoisomerentrennung eines Lutein-Zeaxanthin-Standardgemischs auf einer C30Phase ohne (links) und mit (rechts) Endcapping [Glaser 2001]
Abb. 2-10:
Vergleich der Filmdicke einer C18- und einer C30-Phase mit der Moleküllänge von Carotin (links) [modifiziert nach YMC 2011] und Stereoisomerentrennung von Lutein,
Zeaxanthin und -Carotin mit einer C30-Phase bei Spinat-Extrakt (rechts) [Dachtler
2000]
Abb. 2-11:
Ermittlung der Schwingungsfeinstruktur (%III/II) bei all-E-Lutein mit Kennzeichnung
der Absorptionsmaxima (I, II, III)
Abb. 2-12:
Bestimmung der relativen Intensität (%AB/AII) der Z-Bande bei 13-Z-Zeaxanthin
Abb. 2-13:
Aufbau eines Massenspektrometers (oben) und Ionisierung bei der APCI (unten links)
[modifiziert nach University of Bristol 2005] basierend auf den Prinzipien nach Tab. 2.2
Abb. 2-14:
Fragmentierungsschema von Lutein und Zeaxanthin [modifiziert nach Dachtler 2000]
Abb. 3-1:
Vorbereitung (1), Behandlung (2) und Analytik (3) von Eigelb, Plasma und Granula
Abb. 3-2:
Auswertung der DSC-Thermogramme
Abb. 4-1:
Verdünnte Plasmafraktion (1:1 destilliertes Wasser; links) und hochmolekulares Granula-Sediment (rechts)
Abb. 4-2:
Elution der alle-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin bei nativem Eigelb
Abb. 4-3:
5-Punkt-Kalibrierung (0,10 - 2,50 µg/mL) der all-E-Isomere von Lutein und Zeaxanthin
Abb. 4-4:
Probenaufbereitung und -analyse zur Bestimmung der Massenkonzentrationen der allE- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in Granula, Plasma und Eigelb
Abb. 4-5:
Elutionsreihenfolge der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin am Beispiel von gefriergetrocknetem Plasma
Abb. 4-6:
Elution der Lutein- und Zeaxanthin-Isomere auf einer C30-Phase mit Endcapping –
Chromatogrammausschnitt einer sprühgetrockneten Eigelbprobe (links) [Wenzel
2010]; Standardgemisch von Lutein und Zeaxanthin (rechts) [Glaser 2001]
Abb. 4-7:
Standardsubstanzen – Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande (422/444/473)
mit Schwingungsfeinstruktur (64 %III/II) von all-E-Lutein (links) und Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande (430/451/477) mit Schwingungsfeinstruktur (38 %III/II)
von all-E-Zeaxanthin (rechts)
III
Abb. 4-8:
Standardstammlösung (100 µg/mL) – Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande
(412/440/470) mit Schwingungsfeinstruktur (36 %III/II) von 13-Z-Lutein (links) und Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande (421/445/471) mit Schwingungsfeinstruktur (16 %III/II) und Z-Bande (336 nm, 57 %AB/AII) von 13-Z-Zeaxanthin (rechts)
Abb. 4-9:
Gefriergetrocknetes Plasma – Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande
(415/440/471) mit Schwingungsfeinstruktur (28 %III/II) und Z-Bande bei 329 nm (40
%AB/AII) von 13-Z-Lutein (links) und Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande
(421/446/471) mit Schwingungsfeinstruktur (19 %III/II) und Z-Bande bei 336 nm (52
%AB/AII) von 13-Z-Zeaxanthin (rechts)
Abb. 4-10:
TIC am Peakmaximum von all-E-Lutein
Abb. 4-11:
Parameteroptimierung (corona 2,9 kV, cone 30 V) bei Zeaxanthin – Chromatogramm
(oben) und TIC-Messung von Zeaxanthin (unten)
Abb. 4-12:
DSC-Thermogramme der nativen Proben von Granula (links), Plasma (Mitte) und
Eigelb (rechts)
Abb. 4-13:
DSC-Thermogramme nativer und erhitzter Granula der Chargen 1 und 2
Abb. 4-14:
DSC-Thermogramme nativen und erhitzten Plasmas der Chargen 1 und 2
Abb. 4-15:
DSC-Thermogramme nativen und erhitzten Eigelbs der Chargen 1 und 2
Abb. 4-16:
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativer und erhitzter Granula
von Charge 1 (grau) und Charge 2 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Abb. 4-17:
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativen und erhitzten Plasmas
von Charge 1 (grau) und Charge 2 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Abb. 4-18:
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativen und erhitzten Eigelbs
von Charge 1 (grau) und Charge 2 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Abb. 4-19:
DSC-Thermogramme nativer, rehydrierter und gefriergetrockneter Granula der
Chargen 3 und 4
Abb. 4-20:
DSC-Thermogramme nativen, rehydrierten und gefriergetrockneten Plasmas der
Chargen 3 und 4
Abb. 4-21:
DSC-Thermogramme nativen, rehydrierten und gefriergetrockneten Eigelbs der
Chargen 3 und 4
Abb. 4-22:
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativer und gefriergetrockneter
Granula von Charge 3 (grau) und Charge 4 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben
kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Abb. 4-23:
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativen und gefriergetrockneten
Plasmas von Charge 3 (grau) und Charge 4 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben
kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Abb. 4-24:
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativen und gefriergetrockneten
Eigelbs von Charge 3 (grau) und Charge 4 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben
kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Abb. 5-1:
Thermoinduzierte Strukturveränderungen der Livetine, LDL, HDL und von Phosvitin in
Eigelb [nach Jaekel und Ternes 2009; Li-Chan und Kim 2008; Ternes 2008b; Bircan
und Barringer 2002; Le Denmat et al. 1999; Acker und Ternes 1994; Ternes und
Acker 1994a und 1994c; Mohr und Simon 1992]
Abb. 5-2:
Einflüsse der Erhitzung auf die Massenkonzentrationen der Xanthophylle – Kennzeichnung von Erhöhung (grüner Pfeil) oder Verminderung (roter Pfeil) der Extrahierbarkeit, 13-Z-Isomerisierung und oxidativen Degradation der Xanthophylle
IV
Abb. 5-3:
Hitzeinduzierte Strukturveränderungen der Livetine, LDL und HDL [in Einklang mit
Jaekel und Ternes 2009; Ternes 2008b, Bircan und Barringer 2002, Le Denmat et al.
1999; Acker und Ternes 1994; Ternes und Acker 1994a und 1994c; Mohr und Simon
1992]
Abb. 5-4:
Hitzeinduzierte Massenkonzentrationsänderungen der Xanthophylle
Abb. 5-5:
Einflüsse der Gefriertrocknung auf die Massenkonzentrationen der Xanthophylle –
Kennzeichnung von Erhöhung (grüner Pfeil) oder Verminderung (roter Pfeil) der
Extrahierbarkeit, 13-Z-Isomerisierung und oxidativen Degradation der Xanthophylle
Abb. 5-6:
Einflüsse von Erhitzung und Gefriertrocknung auf die Massenkonzentrationen der
Xanthophylle gegliedert nach der Makro-, Meta- und Mikroebene – Kennzeichnung
von Erhöhung (grüner Pfeil) oder Verminderung (roter Pfeil) der Extrahierbarkeit, 13Z-Isomerisierung und oxidativen Degradation der Xanthophylle
V
Tabellenverzeichnis
Tab. 2-1:
Gehalte an Lutein und Zeaxanthin [µg/100 g] in Eigelb in Abhängigkeit der Haltungsform (Klasse 0 - 3) [Schlatterer und Breithaupt 2006] sowie in den Futterpflanzen
[USDA 2014; Gregory et al. 1986]
Tab. 2-2:
Ionisierung bei der Chemischen Ionisation [modifiziert nach Lehmann 1996; Schröder
1991]
Tab. 3-1:
Bio-Eier-Chargen für die Versuchsreihen zur Ermittlung des Erhitzungs- und Gefriertrocknungseffekts – Angabe von Erzeugercode, Packstellen-Nummer (PN) und Mindest-Haltbarkeits-Datum (MHD)
Tab. 3-2:
Parameter der statistischen Auswertung der Daten
Tab. 4-1:
Trockenmassen [%] nativer und erhitzter Proben von Granula, Plasma und Eigelb
Tab. 4-2:
Trockenmassen [%] nativer und gefriergetrockneter Proben von Granula, Plasma und
Eigelb
Tab. 4-3:
Analyseparameter der optimierten HPLC-Trennmethode
Tab. 4-4:
Steigung, Verfahrensvariationskoeffizient und Geradengleichung der linearen Regression von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin bei Auswertung von Peakfläche und
Peakhöhe
Tab. 4-5:
LOD und LOQ von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin im Vergleich zu Wenzel et al.
(2010)
Tab. 4-6:
Optimierung der Flüssig-Flüssig-Extraktion durch Variation des Extraktionslösungsmittels und der Ultraschallbehandlungszeit unter Bestimmung der Wiederfindungsraten
von Lutein und Zeaxanthin
Tab. 4-7:
Konzentrationsabhängige Wiederfindungsraten von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin
Tab. 4-8:
Variationskoeffizienten [%] der Mess- und Methodenpräzision (Wiederholbarkeit) von
all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin (Sechsfachbestimmung)
Tab. 4-9:
Vergleich der Retentionszeiten von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin in einer Kalibrierlösung und unter Einfluss von Eigelbmatrix (Probenextrakt)
Tab. 4-10:
Literaturwerte der Absorptionsmaxima I/II/III der Hauptabsorptionsbande sowie der
Schwingungsfeinstruktur (%III/II) der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin
Tab. 4-11:
Vergleich der Absorptionsmaxima (I/II/III) und der Schwingungsfeinstruktur (%III/II) der
all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin unter Matrixeinfluss und in Standardlösung
Tab. 4-12:
Optimierte Analyseparameter der Massenspektrometrie
Tab. 4-13:
Mittelwerte des Onsets, der Td und von H ± SD der DSC-Peaks der nativen Proben
von Granula, Plasma und Eigelb (berechnet aus Tab. 4-14 bis 4-17 und 4-24 bis 4-26)
Tab. 4-14:
Onsets, Td und H ± SD des DSC-Peaks nativer und erhitzter Granula der Chargen 1
und 2
Tab. 4-15:
Onsets, Td und H ± SD von Peak 1 nativen und erhitzten Plasmas der Chargen 1
und 2
Tab. 4-16:
Onsets, Td und H ± SD von Peak 2 nativen und erhitzten Plasmas der Chargen 1
und 2
Tab. 4-17:
Onsets, Td und H ± SD des DSC-Peaks nativen und erhitzten Eigelbs der Chargen 1
und 2
Tab. 4-18:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativer und erhitzter Granula – Charge 1 (oben) und Charge 2 (unten)
Tab. 4-19:
Massenkonzentrationsänderungen [%] von all-E-Lutein, all-E-Zeaxanthin und 13-ZLutein erhitzter Granula – Charge 1 (links) und Charge 2 (rechts)
VI
Tab. 4-20:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativen und erhitzten Plasmas – Charge 1 (oben) und Charge 2 (unten)
Tab. 4-21:
Massenkonzentrationsänderungen [%] von 13-Z-Lutein erhitzten Plasmas – Charge 1
(links) und Charge 2 (rechts)
Tab. 4-22:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativen und erhitzten Eigelbs – Charge 1 (oben) und Charge 2 (unten)
Tab. 4-23:
Massenkonzentrationsänderungen [%] von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin erhitzten
Eigelbs – Charge 1 (links) und Charge 2 (rechts)
Tab. 4-24:
Onsets, Td und H ± SD des DSC-Peaks nativer, rehydrierter und gefriergetrockneter
Granula der Chargen 3 und 4
Tab. 4-25:
Onsets, Td und H ± SD des DSC-Peaks nativen, rehydrierten und gefriergetrockneten Plasmas der Chargen 3 und 4
Tab. 4-26:
Onsets, Td und H ± SD des DSC-Peaks nativen, rehydrierten und gefriergetrockneten Eigelbs der Chargen 3 und 4
Tab. 4-27:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativer und gefriergetrockneter Granula der Chargen 3 und 4
Tab. 4-28:
Massenkonzentrationsänderungen [%] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin gefriergetrockneter Granula der Chargen 3 und 4
Tab. 4-29:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativen und gefriergetrockneten Plasmas der Chargen 3 und 4
Tab. 4-30:
Massenkonzentrationsänderungen [%] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin gefriergetrockneten Plasmas der Chargen 3 und 4
Tab. 4-31:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativen und gefriergetrockneten Eigelbs der Chargen 3 und 4
Tab. 4-32:
Massenkonzentrationsänderungen [%] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin gefriergetrockneten Eigelbs der Chargen 3 und 4
Tab. 5-1:
Vergleich der Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin in nativem Eigelb mit Literaturangaben nach Wenzel (2010) und Schlatterer und Breithaupt (2006)
Tab. 5-2:
Prozentuale Anteile an 13-Z-Lutein und 13-Z-Zeaxanthin an der Gesamt-XanthophyllMassenkonzentration in Eigelb, Plasma und Granula im Nativzustand im Vergleich zu
Wenzel (2010)
Tab. 5-3:
Signifikante Veränderungen der Xanthophyll-Massenkonzentrationen bei Granula,
Plasma und Eigelb bei der Erhitzung
VII
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
ARMD
ANOVA
APCI
AU
DSC
EFSA
ESI
HDL
HPLC
IUPAC
KHK
LDL
LLE
LOD
LOQ
MHD
MS
MSPD
MTBE
n. b.
n. d.
PDA
RC
PN
RP
SD
SLAMENGHI




























SPE
Tab.
THF
TIC
TM
VLDL
WR







VIII
Abbildung
Age-Related Macula Degeneration
Analysis of Variance (Varianzanalyse)
Atmospheric Pressure Chemical Ionization
Absorption Unit
Differential Scanning Calorimetry
Eurpean Food Safety Authority
Electrospray Ionization
High-Density Lipoprotein
High Performance/Pressure Liquid Chromatography
International Union of Pure and Applied Chemistry
Koronare Herzkrankheit
Low-Density Lipoprotein
Liquid-Liquid-Extraction (Flüssig-Flüssig-Extraktion)
Limit of Detection
Limit of Quantification
Mindest-Haltbarkeits-Datum
Massenspektrometrie
Matrix Solid Phase Dispersion
Methyl-tert-butylether
nicht bestimmbar
nicht detektiert
Photodiodenarray
Regenierte Cellulose
Packstellen-Nummer
Reversed Phase
Standard Deviation (Standardabweichung)
Species of carotenoid
Linkages at the molecular level
Amount of carotenoids
Matrix
Effectors
Nutrient status
Genetic
Host-related factors
Interactions among these variables
Solid Phase Extraction
Tabelle
Tetrahydrofuran
Total Ion Current
Trockenmasse
Very-Low-Density Lipoprotein
Wiederfindungsrate
Formelzeichenverzeichnis

b

CHCl3
CHOOH

∆̅
E
EtOH
Fcritical
H2O
H0
H1
H
max
m
m/z
M
+
[M+H]
MeOH
µU
µB
µB1 bis µBn
N2
r
RT (RT,min/RT,max)
sx
Td
u
VK
Vx0
w
x
xR
+
+
X /XH
̅
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y

ø
Signifikanzniveau
Achsenabschnitt/Ordinatenschnittpunkt
Konzentration Xanthophyll
Trichlormethan (Chloroform)
Methansäure
Differenz
gemittelte Differenz
Einwaage
Ethanol
Durchmesser
kritischer F-Wert
Wasser
Nullhypothese
Alternativhypothese
normierte Gesamtenthalpie
Hauptabsorptionsmaximum II (Wellenlänge mit maximaler Absorption)
Steigung
Masse-zu-Ladungs-Verhältnis
Analytmoleküle
Molekülion
Methanol
unbehandelte Proben
behandelte (erhitzte und gefriergetrocknete) Proben
unterschiedlich behandelte Proben
Stickstoff
Korrelationskoeffizient
Retentionszeit (minimal/maximal)
abgeschätzte Standardabweichung der normalverteilten Messwerte
Temperatur am Peakmaximum (Peak-Temperatur)
-27
unit/atomare Masseneinheit (1 u = 1,660539∙10 kg)
Variationskoeffizient
Verfahrensvariationskoeffizient
Massenkonzentration Xanthophyll
Bestimmungsgröße
theoretisch richtige Analyt-Konzentration
Sekundärreaktantgasionen
abgeschätzter Mittelwert der normalverteilten Messwerte/Mittelwert
der gemessenen Analyt-Konzentration
Messgröße/Signal
IX
X
Kurzfassung
Veränderungen der Matrixbindung und der molekularen Struktur der antioxidativ wirkenden
Carotinoide können die Bioakzessibilität dieser Substanzen beeinflussen. Die vorliegende
Studie untersuchte die Einflüsse von Erhitzung und Gefriertrocknung auf die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in Eigelb und dessen
Fraktionen Plasma und Granula. Dabei wurden die Strukturveränderungen der Lipoproteine,
mit deren Lipiden die Eigelb-Xanthophylle assoziiert sind, betrachtet. Die Strukturentfaltungen der Low-Density und High-Density Lipoproteine (LDL und HDL) erhöhten die Extrahierbarkeit sowie Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle, die der
Temperatureinfluss und Reaktanten katalysierten. Die Extrahierbarkeit, Z-Isomerisierungen
und oxidative Degradationen der Xanthophylle waren durch den Aufschluss, die Gelbildung,
die Oberflächenvergrößerung und die Erhöhung des Trockenmassegehalts der Matrix beeinflusst. Die Strukturentfaltung der in hohen Mengen in Plasma enthaltenen LDL findet bei geringeren Temperaturen (ca. 65 - 76 °C) als die der in Granula dominanten HDL (ca. 75 84 °C) statt. Zudem schien die gefriertrocknungsinduzierte Strukturentfaltung der LDL im
Gegensatz zu HDL und Granula durch Rehydratation nicht vollständig reversibel zu sein.
Daher wies Plasma eine geringere Stabilität bei der Erhitzung und Gefriertrocknung als Eigelb und Granula auf. Die Entfaltung von Lipoproteinstrukturen und die thermisch katalysierte Z-Isomerisierung sind wahrscheinlich für die signifikante 13-Z-Lutein-Zunahme nach Erhitzung von Plasma und Granula bei 82 und 87 °C sowie von Granula bei 77 °C verantwortlich.
Der signifikante Verlust der all-E-Isomere der bei 87 °C erhitzten Proben von Eigelb und
Granula war vermutlich durch 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle bedingt. Marginale Veränderungen der Xanthophylle basierten vermutlich darauf,
dass die multifaktoriellen Einflüsse bei der Erhitzung einander kompensierten. Die Erhitzung
bei 67 °C bedingte zudem aufgrund der weitgehenden Erhaltung der Lipoproteine ähnliche
Xanthophyll-Gehalte wie bei den unerhitzten Proben. Bei der Gefriertrocknung führten die
Strukturentfaltung der Lipoproteine unter Abspaltung der Lipide und die abtrocknungsbedingte Oberflächenvergrößerung zu signifikanten Zunahmen der Xanthophylle bei Plasma und
Granula. Dies bestätigte sich für gefriergetrocknetes Eigelb vermutlich aufgrund von oxidativen Degradationen und Aggregationen der Xanthophylle nicht. Unterschiedliche Massenkonzentrationsänderungen der Xanthophylle im Vergleich der beiden Chargen wurden mit unterschiedlichen Anteilen an ungesättigten Fettsäuren erklärt. Die charakteristischen Anteile an
Proteinen und Lipoproteinen, deren Gelbildungseigenschaften und die Lipidkomposition der
Lipoproteine sowie die methodisch bedingte Verdünnung von Plasma waren vermutlich für
die bei Granula, Plasma und Eigelb differierenden Massenkonzentrationsänderungen der
Xanthophylle verantwortlich. Die Ergebnisse ließen eine höhere 13-Z-Isomerisierungsneigung von all-E-Lutein im Vergleich zu all-E-Zeaxanthin vermuten.
XI
Abstract
Modifications of the matrix association and the molecular structure of antioxidative-acting
carotenoids can influence the bioaccessibility of these substances. The present study investigated the influences of heating and freeze-drying on the mass concentrations of the all-Eand 13-Z-isomers of lutein and zeaxanthin in egg yolk and its plasma and granule fractions.
Concomitantly, structural modifications of the lipoproteins were examined because egg yolk
xanthophylls are associated with the lipids of lipoproteins. Structural unfolding of low-density
and high-density lipoproteins (LDL and HDL, respectively) increased the extractability, and Zisomerization and oxidative degradation of the xanthophylls, which were catalyzed by heating
and the presence of reactants. The extractability, Z-isomerization and oxidative degradation
of the xanthophylls were influenced by disintegration, gelling, surface enlargement and a
higher dry matter content of the matrix. The unfolding of the structure of the LDL, which account for high amounts in plasma, occurred at lower temperatures (approximately 65 76 °C) than that of the HDL (approximately 75 - 84 °C), which are contained in high amounts
in granules. Furthermore, adverse to HDL and granules the structural unfolding of the LDL
induced by freeze-drying did not appear to be completely reversible upon rehydration. Therefore, plasma was less stable during heating and freeze-drying than the egg yolk or granules.
The unfolding of lipoprotein structures and the thermally catalyzed Z-isomerization are most
likely responsible for the significant increase of 13-Z-lutein after heating the plasma and
granules to 82 and 87 °C or the granules to 77 °C. The significant decrease of the all-Eisomers in egg yolk and granules heated to 87 °C was presumably caused by 13-Zisomerization and oxidative degradation of the xanthophylls. Marginal changes in the xanthophylls were most likely due to the compensation of the multifactorial influences upon heating. In addition, the considerable preservation of the lipoproteins in the samples heated to
67 °C accounted for similar mass concentrations of the xanthophylls compared with the unheated samples. During freeze-drying the unfolding of the lipoprotein structures with separation of the lipids and the enlarged sample surface in consequence of the drying caused significant increases in the xanthophylls for plasma and granules. This was not confirmed by
freeze-dried egg yolk most likely because of the oxidative degradation and aggregation of the
xanthophylls. Different changes in the mass concentrations of the xanthophylls of the two
individual batches were explained by differences in the unsaturated fatty acid content. The
characteristic contents of proteins and lipoproteins, their gelling properties, the lipid composition of the lipoproteins and the dilution of plasma due to methodical reasons presumably
caused the different changes in the mass concentrations of the xanthophylls among granules, plasma and egg yolk. The results indicated a higher potential for all-E-lutein to 13-Zisomerization than of all-E-zeaxanthin.
XII
Einleitung und Hypothesenformulierung
1. Einleitung und Hypothesenformulierung
Zahlreiche Studien lassen gesundheitliche Vorteile hinsichtlich der Verminderung des Risikos degenerativer Erkankungen durch die Aufnahme von hohen Mengen an antioxidativ wirkenden Carotinoiden mit der Nahrung vermuten [Stracke et al. 2009; Watzl und Bub 2001;
Castenmiller und West 1998]. Dabei spielt neben der Anwesenheit von Carotinoiden nach
Art und Menge in Lebensmitteln deren Matrixassoziation für die Bioakzessibilität eine Rolle.
Technologische Einflüsse während der Lebensmittelverarbeitung können die Matrixassoziation der Carotinoide sowie deren chemisch-physikalischen Eigenschaften und biologischen
Funktionen durch Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen verändern.
Die in Carotine und die sauerstoffhaltigen Xanthophylle eingeteilten Carotinoide werden in
Pflanzen de novo synthetisiert. Daher weisen pflanzliche Nahrungsmittel ein breites Spektrum an Carotinoiden auf [Rodriguez-Amaya 2001]. In tierischen Lebensmitteln sind die Carotinoid-Konzentrationen meist geringer, da Tiere Carotinoide aufgrund der fehlenden enzymatischen Ausstattung zur Biosynthese über die Nahrung aufnehmen müssen [RodriguezAmaya 2003]. Wichtige tierische Carotinoid-Quellen sind Eier, Milchprodukte, Fische und
Meeresfrüchte [Britton und Khachik 2009]. Eigelb ist eine gute Lutein- und ZeaxanthinQuelle, da die beiden lipophilen Xanthophylle aufgrund ihrer Assoziation mit den Lipiden der
Low-Density- und High-Density-Lipoproteine (LDL und HDL) im Vergleich zu pflanzlichen
Matrizes besser bioverfügbar sind [Ternes 2008a; Greene et al. 2006; Chung et al. 2004;
Handelman et al. 1999]. Zudem werden bei der Fütterung der Hühner xanthophyllreiche
Pflanzen wie Tagetes-Arten, Erbsen, Spinat und Mais eingesetzt.
Neben der Farb- und Aromagebung ist Eigelb aufgrund der durch Proteine und Lipoproteine
vermittelten Emulgierfähigkeit, Schaumbildung und Koagulierbarkeit ein wichtiger Rohstoff
bei der Lebensmittelherstellung. Die zentrifugale Trennung von Eigelb in die Fraktionen
Plasma (78 %) und Granula (22 %), die sich in ihrer Protein- und Lipoprotein-Zusammensetzung unterscheiden, ist aufgrund ihrer technofunktionellen Potentiale von Interesse für die
Lebensmittelindustrie [Kulozik und Strixner 2011; Powrie und Nakai 1986]. Granula enthalten
neben 12 % an LDL hauptsächlich HDL (70 %), die mit Phosvitin (16 %) über Phosphocalciumbrücken die komplexe Granulastruktur bilden [Anton 2007]. Plasma zeichnet sich durch
seinen hohen LDL-Anteil (85 %) aus und enthält zudem 15 % Livetine [Anton 2007]. Bei der
industriellen Verarbeitung von Eigelb spielen Temperatureinwirkungen beim Erhitzen, Gefrieren und Auftauen und Dehydrierungen bei der Herstellung pulverförmiger Produkte durch
Sprüh- und Gefriertrocknung eine Rolle. Dabei bedingen hitzeinduzierte Strukturentfaltungen
sowie die Entfernung der strukturstabilisierenden Hydrathülle bei der Abtrocknung Veränderungen der originären Strukturen der Proteine und Lipoproteine.
1
Hohe Temperaturen, Licht, Säure, Metallkationen und Enzyme katalysieren Z-Isomerisierungen und Degradationen der Carotinoide, wobei Degradationen zudem unter Sauerstoffeinfluss und durch Radikale initiiert werden [Shen et al. 2009; Belitz et al. 2008; Schiedt und
Liaaen-Jensen 1995]. Stereochemisch und thermodynamisch basiert entstehen bei der ZIsomerisierung bevorzugt 13-Z-Isomere [Britton und Khachik 2009]. Z-Isomere sind aufgrund
ihrer geringeren Aggregationsneigung besser löslich und bioverfügbar als all-E-Isomere [Britton und Khachik 2009; Liaaen-Jensen und Lutnœs 2008].
Aufgrund der geringen Anzahl an Studien zum Einfluss verarbeitungstechnologischer Faktoren auf die Eigelb-Xanthophylle werden in der vorliegenden Arbeit die nach Erhitzung und
Gefriertrocknung extrahierbaren Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von
Lutein und Zeaxanthin untersucht. Dabei erfolgt die Betrachtung im Kontext der Strukturveränderungen der Lipoproteine bei Granula, Plasma und Eigelb, da die Xanthophylle mit den
Lipiden der LDL und HDL assoziiert sind. Zur Absicherung der Ergebnisse und zur Berücksichtigung des Einflusses der Biodiversität hinsichtlich der Matrixkomposition werden je zwei
Chargen von Bio-Eiern untersucht. Die Erhitzung und Gefriertrocknung von Granula, Plasma
und Eigelb sowie die anschließende Analyse der Strukturveränderungen der Proteine und
Lipoproteine und der Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin werden dabei jeweils in einer Doppelbestimmung durchgeführt.
Mittels der Versuchsreihen zum Einfluss der Erhitzung und Gefriertrocknung auf die Konzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in Granula, Plasma und
Eigelb sollen die folgenden Hypothesen untersucht werden:
1. Die Erhitzung und Gefriertrocknung induzieren Veränderungen der Strukturen der
Proteine und Lipoproteine. Da die Xanthophylle mit den Lipiden der LDL und HDL assoziiert sind, kommt es daher auch zu Veränderungen der Xanthophyll-Gehalte. Dabei unterscheiden sich die unbehandelten und behandelten Proben hinsichtlich der
Protein- und Lipoproteinstrukturen sowie der Xanthophyll-Massenkonzentrationen
komplementär zur Nullhypothese (H0: µU = µB und µB1 = µB2 = ….. = µBn) gemäß der
Alternativhypothese (H1: µU ≠ µB und µB1 ≠ µB2 ≠ ….. ≠ µBn)1 signifikant.
2. Eigelb und dessen Fraktionen Plasma und Granula sind durch die charakteristischen
Gehalte an Proteinen und Lipoproteinen gekennzeichnet. Damit sind unterschiedliche
Matrixeigenschaften im Nativzustand und Veränderungen infolge von Erhitzung und
Gefriertrocknung verbunden, welche die Xanthophyll-Gehalte von Granula, Plasma
und Eigelb beeinflussen.
1
µU = unbehandelte Proben; µB = behandelte (erhitzte und gefriergetrocknete) Proben; µB1 bis µBn =
unterschiedlich behandelte Proben
2
Einleitung und Hypothesenformulierung
3. Biodiversitätsbedingt werden Unterschiede im Ausmaß oxidativer Degradationen und
damit hinsichtlich der Veränderungen der Xanthophyll-Gehalte infolge von Erhitzung
und Gefriertrocknung bei den untersuchten Chargen, die aus unterschiedlichen Legebetrieben stammen, erwartet.
4. Aufgrund der Unterschiede in der Molekülstruktur ist das während der Erhitzung und
Gefriertrocknung induzierte Ausmaß der 13-Z-Isomerisierung von all-E-Lutein und allE-Zeaxanthin unterschiedlich.
Die Studie ermöglicht die Betrachtung der durch Erhitzung und Gefriertrocknung veränderten
Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin im Kontext
der Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine bei Granula, Plasma und Eigelb
(Abb. 1-1). Die Extrahierbarkeit und die resultierende Bioakzessibilität werden dabei durch
die veränderte Matrixassoziation sowie die Bildung besser löslicher 13-Z-Isomere beeinflusst, was aufgrund der antioxidativen Eigenschaften der Eigelb-Xanthophylle ernährungsphysiologische Vorteile bieten könnte. In diesem Zusammenhang könnten weiterführende
Studien die gastrointestinale Resorptionsverfügbarkeit der Lutein- und Zeaxanthin-Isomere
bei erhitzten und gefriergetrockneten Proben von Granula, Plasma und Eigelb untersuchen.
Abb. 1-1:
Darstellung des Studiendesigns zum Einfluss von Erhitzung und Gefriertrocknung auf die
Xanthophyll-Konzentrationen in Eigelb
3
2. Stand der Forschung
2.1 Das Lebensmittel Ei und die Zusammensetzung des Eigelbs
Das Hühnerei hat aufgrund seiner hohen Dichte an vielfältigen, leicht resorbierbaren Nährstoffen wie essentiellen Aminosäuren, Fettsäuren, Vitaminen (K, A, D, E und verschiedene
B-Vitamine), Mineralien und Spurenelementen und des relativ geringen kalorischen Beitrags
einen hohen nutritiven Wert [Hatta et al. 2008; Seuß-Baum 2005; Ternes et al. 2005; Vaghefi
2002; Hasler 2000; McNamara 2000]. Zudem enthält das Eigelb Substanzen mit potenziell
antibakterieller, antioxidativer, entzündungshemmender und immunverstärkender Wirkung
[Hatta et al. 2008]. Hinsichtlich des mit ca. 215 mg/Ei hohen Cholesterin-Gehalts und dessen
möglichem Beitrag bei der Entstehung der koronaren Herzkrankheit ist zu beachten, dass
beim Gesunden durch Nahrungscholesterin nur marginale Veränderungen des Plasmacholesterins induziert werden [McNamara 2000; Howell et al. 1997]. Die Gehalte einzelner Nährstoffe sind durch deren Anteile im Futter aber auch durch physiologische Faktoren (Alter,
Rasse, Belastung) beeinflusst [Stadelman und Schmieder 2002; Kuksis 1992]. Aufgrund der
höheren Aufnahme von Grünfutter durch die Tiere enthalten Bio-Eier meist hohe Mengen an
mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wobei sich das günstige Verhältnis an -6- und -3Fettsäuren in den Eiern [Grashorn und Grimrath 2005] positiv auf die Inzidenz kardiovaskulärer und entzündungsinduzierter Krankheiten auswirken kann [Li-Chan und Kim 2008]. Neben
ihren nutritiven Vorteilen haben Eier aufgrund ihrer technologischen und sensorischen Eigenschaften einen hohen ökonomischen Wert [Vaghefi 2002].
Eier bestehen aus Eiklar (ca. 57 %), Eigelb (ca. 33 %) und der Kalkschale (ca. 10 %) und
enthalten 65,6 % Wasser, 12,1 % Proteine, 10,5 % Fett, 10,9 % Mineralstoffe und 0,9 % an
Kohlenhydraten [Ternes et al. 2005]. Proteine sind in Eiklar und Eigelb enthalten, Fette fast
ausschließlich im Eigelb und Mineralien hauptsächlich in der Schale [Li-Chan und Kim 2008].
Das von einer Vitellin-Membran umgebene Eigelb enthält Wasser (ca. 50 %), Proteine (ca.
15,7 - 16,6 %), Fett (ca. 32 - 35 %) und geringe Mengen an Kohlenhydraten und Mineralstoffen (ca. 1 %) [Ternes 2008a; Ternes et al. 2005]. Bezogen auf die Trockenmasse besteht
Eigelb zu ca. 64 % aus Lipiden und 32 % aus Proteinen [Powrie und Nakai 1986]. Die größtenteils als Lipoprotein-Aggregate vorliegenden Eigelblipide setzen sich aus Triglyceriden
(ca. 62 %), Phospholipiden (ca. 33 %) und Cholesterin und Cholesterinestern (ca. 5 %) zusammen, wobei ca. 30 - 35 % gesättigte (Myristin-, Palmitin-, Stearinsäure), 40 - 45 % einfach (Palmitolein-, Ölsäure) und 20 - 25 % mehrfach ungesättigte Fettsäuren (-3: Linolen-,
Eicosapentaen-, Docosahexaensäure; -6: Linol-, Arachidonsäure) vorkommen [Anton
2007]. Carotinoide sind zu weniger als 1 % in den Eigelb-Lipiden enthalten [Anton 2007].
4
Stand der Forschung
Neben 10 % an globulären, wasserlöslichen -, - und -Livetinen [Ternes 2008a], 4 % an
Phosvitin und 2 % an Minorproteinen, die keine Lipide enthalten, bestehen die Eigelbproteine
zu 68 % aus Low-Density Lipoproteinen (LDL) und 16 % aus High-Density Lipoproteinen
(HDL) [Powrie und Nakai 1986]. Phosvitin ist ein wasserlösliches Glycophosphoprotein mit
hohem Phosphoranteil (10 %), das antioxidativ wirkt, da die Phosphatgruppe mit zwei- und
dreiwertigen Metallkationen Chelatkomplexe bildet, was die metallionenkatalysierte Bildung
von Radikalen und die Oxidation der Phospholipide verhindert [Hatta et al. 2008; Li-Chan
und Kim 2008; Ternes 2008a]. Phosvitin bindet 95 % der Eisenionen in Eigelb als Fe3+ und
zeichnet sich daher durch seine hohe Bindungskapazität für Eisenionen aus [Ternes 2008a].
Phosvitin ist widerstandsfähig gegenüber enzymatischer Proteolyse [Juneja und Kim 1997]
und thermischer Denaturierung [Anton et al. 2000]. Daher ist die Komplexierung der Metallkationen bis über 100 °C hitzestabil [Li-Chan und Kim 2008; Ternes 2008a; Acker und Ternes 1994].
Die LDL (Lipovitellenine) bestehen aus den beiden Unterfraktionen LDL1 und LDL2 [Hatta et
al. 2008] und weisen eine core-shell-Struktur auf (Abb. 2-1), die ihre amphiphilen Eigenschaften bedingt. Der lipophile Triglyceridkern mit Cholesterinestern ist von einer hydrophilen
unilamellaren Schicht aus amphiphilen Apoproteinen, Phospholipiden und Hydroxygruppen
unveresterten Cholesterins umgeben [Anton 2007; Anton et al. 2003; Holdsworth und Finean
1972]. Wechselwirkungen zwischen apolaren Aminosäureseitenketten der Proteine und Acylresten der Lipide sowie geladenen Aminosäureseitenketten und den Kopfgruppen der Phospholipide bedingen die Stabilität der LDL [Belitz et al. 2008].
Apoprotein
Phospholipid
Apoprotein
Cholesterinester
Triglycerid
freies Cholesterin
Apoprotein
Abb. 2-1:
Phospholipid
Schematischer Aufbau der core-shell-Struktur der LDL [modifiziert nach Forti und Diament 2006]
Die LDL bestehen zu 88 % aus Lipiden und zu 10 % aus Proteinen [Powrie und Nakai 1986]
und bilden in Eigelb sphärische Mizellen (ø = 25 - 60 nm) [Ternes 2008a]. LDL fungieren als
grenzflächenaktive Substanzen bei der Emulsionsbildung, da die bei der Abspaltung des
Lipidanteils oberhalb von 75 °C freigesetzten Phospholipide [Ternes 2008a] zusammen mit
den Apoproteinen, die eine hohe Adsorptionskapazität an Grenzflächen aufweisen, emulsionsstabilisierende Grenzflächenfilme bilden [Anton 2007; Anton et al. 2003].
5
Die HDL (Lipovitelline) bestehen aus den - und -HDL-Untereinheiten, die sich in ihrer Zusammensetzung an Aminosäuren, Phosphor und Oligosacchariden unterscheiden. Das HDLMonomer bilden fünf Hauptapoproteine, deren Wechselwirkungen die dreidimensionale Molekülorganisation ergeben (Abb. 2-2, links) [Anton 2007]. Die helikale Domäne ist eine aus
einem Band von -Helices bestehende Supersekundärstruktur, während -Faltblatt-Strukturen die Domänen des N- (grün), A- (blau) und C- (rot) Sheets kennzeichnen. Als Lipidliganden enthält das HDL-Monomer ein Molekül Phosphatidylcholin (L1) und eine aus 13 CAtomen bestehende Kohlenwasserstoffkette (L2; Abb. 2-2, links).
Lipid-Kavität
Abb. 2-2:
Domänenorganisation des HDL-Monomers (links) und X-förmige Struktur des HDLDimers (rechts) [modifiziert nach Anderson et al. 1998]
Im Zentrum des HDL-Monomers bilden hauptsächlich -Faltblattstrukturen der A- und CSheets und ein kleiner Bereich der helikalen Domäne eine lipidbindende Kavität, die durch
hydrophobe Reste der Aminosäuren ausgekleidet ist [Anton 2007; Anderson et al. 1998]. Die
Öffnung der Kavität ist von einem Ring aus polaren Aminosäureseitenketten umgeben, mit
dem der hydrophile Phosphatrest von Phosphatidylcholin über H-Brücken interagiert, während die Fettsäuren des Phosphatidylcholin-Moleküls über Van-der-Waals-Kräfte mit den
Aminosäureseitenketten der A- und C-Sheets wechselwirken [Anderson et al. 1998]. Die
Phospholipide bilden die Grenzfläche zur wässrigen Phase, was die Inkorporation von Lipiden in die Kavität ermöglicht [Anton 2007; Anderson et al. 1998]. Durch die Wechselwirkungen zwischen den Apoproteinen und den Lipiden ist die Lipidkavität stabilisiert [Anderson et
al. 1998], und die Abschirmung der hydrophoben Acylketten im Kern der Lipidkavität stabilisiert den Lipoproteinkomplex [Banaszak 1991]. Der Lipidanteil des HDL-Monomers ähnelt
einer Mikrodomäne innerhalb des Polypeptidgerüsts [Kuksis 1992] und ist aufgrund der an
beiden Enden zugänglichen Lipidkavität mittels organischer Lösungsmittel leicht extrahierbar
[Anderson et al. 1998].
6
Stand der Forschung
In der Oozyte entstehen die HDL durch hydrolytische Spaltungen des Vitellogenin-Dimers
[Anderson et al. 1998; Banaszak 1991]. In Eigelb sind daher zwei HDL-Monomere durch
Wechselwirkungen der Apoproteine symmetrisch als Dimer in einer globulären, X-förmigen
Struktur organisiert, deren Diagonalen je einem HDL-Monomer entsprechen (Abb. 2-2,
rechts) [Anton 2007; Anderson et al. 1998]. Die HDL bestehen zu 25 % aus Lipiden und zu
75 % aus Proteinen [Powrie und Nakai 1986] und weisen Partikeldurchmesser von 7 - 20 nm
auf [Anton 2007]. Aus der Komplexierung der HDL-Dimere mit Phosvitin über Phosphocalciumbrücken resultiert die mikrokristalline, wasserunlösliche Granulastruktur (ø = 1 - 1,3 µm)
[Belitz et al. 2008; Li-Chan und Kim 2008; Ternes 2008a]. Bei hoher Ionenstärke ersetzt das
einwertige Natrium das zweiwertige Calcium, was die HDL-Phosvitin-Komplexe destabilisiert
[Ternes 2008a; Anton 2007]. Bei Zugabe acider oder alkalischer Agenzien werden Granula
aufgrund des positiven oder negativen Ladungsüberschusses durch elektrostatische Abstoßungen und Bindungsbrüche zerstört [Anton 2007].
Rohes Eigelb ist eine pseudoplastische2 Nicht-Newtonsche Flüssigkeit mit einem pH-Wert
von 6,0 [Belitz et al. 2008; Ternes und Acker 1994a], die neben einer Fett-in-WasserEmulsion und einer echten Lösung als polydisperse, kolloidale Lösung mit komplexen, supramolekularen Assoziationen3 von Fetten und Proteinen beschrieben werden kann. Eigelb
besteht aus membranumhüllten polyedrischen Körnern (ø = 50 - 70 µm), die leicht durch
mechanische Bearbeitung wie Rühren oder Verdünnen zerstörbar und für die mehlige Struktur gekochten Dotters verantwortlich sind [Ternes 2008a; Ternes et al. 2005]. Zusammen mit
den Dottertröpfchen (ø = 15 - 45 µm) sind die LDL-Mizellen und Granula in die polyedrischen
Körner eingebunden [Ternes 2008a].
Mittels Zentrifugation können aus Eigelb aufgrund der Dichteunterschiede der LDL (0,98
g/mL) und HDL (1,12 g/mL), unterstützt durch die Viskositätsverringerung mittels Verdünnung (1:1 oder 1:2) mit einer gering molaren isotonischen Salzlösung oder destilliertem
Wasser, die beiden Hauptfraktionen Plasma und Granula separiert werden (Abb. 2-3). Diese
unterscheiden sich in ihren charakteristischen Anteilen an Lipiden, Proteinen und Lipoproteinen [Li-Chan und Kim 2008; Moussa et al. 2002; Ternes et al. 1995; Dyer-Hurdon und
Nnanna 1993; Itoh et al. 1986; McBee und Cotterill 1979; Evans et al. 1968; Martin et al.
1964]. Der fast klare, gelborangefarbene wässrige Überstand ist Plasma, das bezogen auf
die Trockenmasse zu 73 % aus Lipiden und zu 25 % aus Proteinen besteht [Anton 2007; LiChan et al. 1995; Powrie und Nakai 1986].
2
Kleine Schergeschwindigkeit: Verhalten als Newton´sches Fluid
Überschreiten der kritischen Schergeschwindigkeit: Abnahme der Viskosität (Strukturviskosität)
3
Selbstassemblierung durch nichtkovalente Bindungen (H-Brücken, Van-der-Waals-Kräfte)
7
Die sich als dichtgepacktes blasses Sediment ansammelnden hochmolekularen Granula
zeichnen sich durch einen Lipidgehalt von 31 % und einen Proteinanteil von 64 % aus [Anton
2007; Powrie und Nakai 1986; Dyer-Hurdon und Nnanna 1993].
Abb. 2-3:
Zusammensetzung von Eigelb, Plasma und Granula [modifiziert nach Li-Chan und Kim
2008; Belitz et al. 2008; Anton 2007; Moussa et al. 2002; Li-Chan et al. 1995; Ternes et
al. 1995; Dyer-Hurdon und Nnanna 1993; Itoh et al. 1986; Powrie und Nakai 1986;
McBee und Cotterill 1979; Evans et al. 1968; Martin et al. 1964]
Plasma besteht neben Livetinen (15 %) hauptsächlich aus LDL (85 %) und zeichnet sich
daher durch sein hohes Emulgiervermögen aus [Anton 2007; Anton et al. 2003]. Die Granula
enthalten neben LDL (12 %) und Phosvitin (16 %) als Hauptlipoprotein 70 % HDL [Belitz et
al. 2008; Anton 2007]. Aufgrund der Strukturbildungseigenschaften fungieren sprühgetrocknete Granula als Stabilisator in Mayonnaise [Kulozik und Strixner 2011]. Während die polyedrischen Körner und Dottertröpfchen bei der Zentrifugation zerfallen, bleiben die LDLMizellen und Granula-Partikel erhalten [Ternes 2008a].
2.2 Einfluss von Erhitzung und Gefriertrocknung auf die Proteine und Lipoproteine in Eigelb
In der Lebensmittelindustrie wird Eigelb aufgrund seiner Emulgatorfunktion, der Gel- und
Schaumbildungseigenschaften sowie zur Farbgebung vielseitig in Back- und Teigwaren,
Suppen, Speiseeis, Mayonnaise, Saucen und Dressings eingesetzt [Belitz et al. 2008]. Bei
der Verarbeitung beeinflussen besonders Temperatureinwirkungen während der Erhitzung,
des Gefrierens und des Auftauens sowie Dehydrierungen bei der Sprüh- und Gefriertrocknung die Strukturen der Proteine und Lipoproteine in Eigelb und die durch sie induzierten
technofunktionellen Eigenschaften.
8
Stand der Forschung
2.2.1 Erhitzung
Um von der Eischale übertragene pathogene Keime (Salmonellen, coliforme Bakterien,
Staphylokokken) zu inaktivieren ist bei Verarbeitungsprozessen für Eiprodukte meist eine
Pasteurisierung vorgeschaltet. Zur Vermeidung von Denaturierungen der Proteine ist dabei
die geeignete Kombination von Temperatur und Erhitzungszeit wichtig. Die industrielle Pasteurisation von Eigelb findet bei Temperaturen im Bereich von 61 - 68 °C und Heißhaltezeiten von 30 - 120 s [Ternes 2008b] bzw. 3 bis 10 min [Kulozik und Daimer 2007] mittels Platten- oder Röhrenwärmetauschern [Foissy 2005] statt. Im Vergleich zu nativem Eigelb sind
die Schaumstabilität und die Stärke des hitzeinduziert gebildeten Gels bei industriell hergestelltem Flüssigeigelb deutlich geringer [Jaekel et al. 2008]. Gefriergetrocknetes Eigelb, das
zuvor oberhalb 64 °C pasteurisiert wurde, weist keine Schaumbildungskapazität mehr auf
[Jaekel et al. 2008]. Da zudem oberhalb 63 °C die Emulsionskapazität sinkt und eine Erhitzung bei 68 °C zu Veränderungen der Proteine führen kann, wird eine Pasteurisation bei 61
bis 62,3 °C über 3,5 bis 4 min oder 63 °C über 2 min empfohlen [Ternes 2008b; Ros 1994].
Aufgrund der hitzeinduzierten Strukturentfaltungen der Proteine und Lipoproteine zeigt Eigelb einen typischen Viskositätsverlauf bestehend aus dem Viskositätsanstieg bis zum ersten Viskositätsmaximum, der folgenden Viskositätsabnahme bis zum Viskositätsminimum
und dem erneuten Viskositätsanstieg bis zum zweiten Viskositätsmaximum (Abb. 2-4).
Viskosität [Pa∙s]
1. Viskositätsmaximum
2. Viskositätsmaximum
Viskositätsminimum
Temperatur [°C]
Abb. 2-4:
Temperaturabhängiger Viskositätsverlauf von Eigelb [modifiziert nach Ternes 2008b]
Die Denaturierung der Livetine, vor allem von -Livetin, beginnt bei 60 °C, wobei - und Livetin bis ca. 69 °C in nativem Eigelb stabil sind [Ternes und Acker 1994c, Mohr und Simon
1992]. Die -Livetine sind bei 81 °C denaturiert [Ternes und Acker 1994c]. Nach den elektrophoretischen Untersuchungen von Le Denmat et al. (1999) nimmt die Intensität der oberhalb
69 °C fehlenden -Livetin-Bande nach der Erhitzung bei 62 °C ab. Während die -LivetinBande nach der Erhitzung bei 76 °C fehlt, zeigt sich bereits bei 72 °C eine schwächere Bande [Le Denmat et al. 1999].
9
Gemäß der Intensitätsabnahme und dem Verschwinden der elektrophoretischen LDL-Bande
bei 72 und 76 °C [Le Denmat et al. 1999] findet die Strukturentfaltung der LDL hauptsächlich
zwischen 70 und 75 °C statt, wobei partielle Strukturentfaltungen und thermoinduzierte Aggregierungen bereits oberhalb 65 °C auftreten [Acker und Ternes 1994]. Die frei werdenden
Proteinketten der entfalteten Livetine und LDL vernetzen durch hydrophobe Wechselwirkungen, was zusammen mit vorzeitigen Thermoaggregierungen der LDL den Viskositätsanstieg
und die Entstehung des ersten Viskositätsmaximums zwischen 75 und 80 °C (Abb. 2-4) erklärt [Jaekel und Ternes 2009; Ternes 2008b]. Diese auch als „Punkt der Rose“4 bezeichnete
fließfähige, gelähnliche Struktur zeichnet sich durch eine hohe Schaumstabilität aus [Ternes
2008a]. Dabei sind die weitgehend erhaltenen Granula zusammen mit Fetttröpfchen in das
Netzwerk inkorporiert [Ternes 2008a].
Am ersten Viskositätsmaximum ist der Lipidanteil der LDL noch fast vollständig an das Protein gebunden [Ternes 2008a]. Bei weiterer Temperaturerhöhung kommt es unter Kollabierung des Gels zur Delipidation, d. h. der Freisetzung von Neutrallipiden aus dem Inneren der
LDL-Mizellen, und zur Viskositätsabnahme bis zum Viskositätsminimum bei ca. 82 - 83 °C
(Abb. 2-4) [Jaekel und Ternes 2009; Ternes 2008b] sowie zur Aggregierung der Plasmaproteine [Ternes und Acker 1994a].
Die HDL entfalten ihre Struktur oberhalb 75 °C [Ternes und Acker 1994c, Mohr und Simon
1992], wobei sich die Intensität der -HDL-Bande bei der Elektrophorese nach der Erhitzung
bei 72 und 76 °C zunehmend verringert, während die der -HDL-Bande unverändert bleibt
[Le Denmat et al. 1999]. Nach DSC-Messungen von Bircan und Barringer (2002) ist die HDLStruktur bei 84,3 °C entfaltet.
Dem Viskositätsminimum folgt daher ein zweiter Viskositätsanstieg, der durch die Auflösung
der Granula und die Strukturentfaltung der HDL dominiert wird, und durch fortschreitende,
irreversible Aggregierungen der Lipoproteine bestimmt ist [Ternes und Acker 1994a]. Die auf
kovalenten Disulfidbrücken basierende Aggregierung erfolgt unter Ausbildung eines kompakten, dreidimensional vernetzten, schnittfesten Gels, in dem Wasser und Ionen gebunden
sind, was die Entstehung des zweiten Viskositätsmaximums oberhalb 85 °C erklärt (Abb. 24) [Jaekel und Ternes 2009; Jaekel et al. 2008]. Das hitzestabile Phosvitin wird bei der Aggregierung der Lipoproteine in die Koagulate eingeschlossen [Ternes 2008a].
Aufgrund der auf Phosphocalciumbrücken basierenden HDL-Phosvitin-Komplex-Struktur
sind Granula hitzestabiler gegenüber Eigelb und Plasma, die eine vergleichbare hitzeinduzierte Denaturierungsempfindlichkeit aufweisen [Le Denmat et al. 1999].
4
Beim Anblasen der Masse bilden sich filigrane Linien, die an eine geöffnete Rosenblüte erinnern.
10
Stand der Forschung
2.2.2 Gefriertrocknung
Aufgrund der Haltbarkeit von mindestens einem Jahr [Ros 1994], der mikrobiellen Sicherheit
(aW-Wert ca. 0,4 ≅ ca. 5 % Restwassergehalt) [Foissy 2005; Fehlhaber 1994] sowie des einfachen und wirtschaftlichen Transports sind getrocknete Eiprodukte bedeutende Ingredienzen in der Lebensmittelindustrie.
Die kontinuierlich mit hohen Durchsätzen betriebene Sprühtrocknung zur konvektiven Abtrocknung von Flüssigeigelb mittels trockener Heißluft (165 °C) erlaubt eine gezielte Steuerung der Produktparameter (Partikelgröße und -form, Restfeuchte, Schüttvolumen, Fließeigenschaften) und ist das industriell übliche Herstellungsverfahren [Belitz et al. 2008; Ros
1994]. Neben der Temperierung bei 63 °C zur Keimreduktion [Belitz et al. 2008] kann nach
der Abtrocknung der Oberflächenfeuchte die über die Kühlgrenztemperatur hinausgehende
Produkterwärmung (> 54 °C) zu Proteindenaturierungen führen [Jaekel et al. 2008], weshalb
gefrorenes Eigelb ein besserer Emulgator für Mayonnaise als sprühgetrocknetes Eigelb ist
[Conrad et al. 1993]. Trotz der hohen Trocknungsgeschwindigkeit bei der Sprühtrocknung ist
die thermische Belastung daher gegenüber der Gefriertrocknung (Lyophilisation) höher.
Die Gefriertrocknung basiert auf der Sublimation des gefrorenen Wassers während der
Haupttrocknung, der sich die Desorption des nicht ausgefrorenen Wassers auf höherem
Temperaturniveau bei der Nachtrocknung anschließt. Während durch Proteine und im Glaszustand gebundenes Wasser bis zu einer Restfeuchte von 2 % zügig entfernt wird, benötigen höhere Trockenmassen längere Nachtrocknungszeiten, da die Diffusion der Wassermoleküle mit zunehmendem Abtrocknungsgrad erschwert ist [Roy und Gupta 2004]. Hier spielt
die Einfriergeschwindigkeit, welche die Eiskristallgröße und damit die Trocknungsgeschwindigkeit sowie die Produkteigenschaften (Struktur, Porosität, Rekonstituierbarkeit, Farbe) beeinflusst, eine Rolle. Eine hohe Einfriergeschwindigkeit korreliert mit der Bildung kleiner Eiskristalle und deren zügiger Sublimation während der Haupttrocknung [Roy und Gupta 2004].
Die entstehenden feinen Poren bedingen eine verzögerte Diffusion der Wassermoleküle zur
Produktoberfläche bei der Nachtrocknung und eine gute Erhaltung der Produktstruktur. Aus
der Zuführung von Schmelz- und Verdampfungsenthalpie zum Gut, der Druckabsenkung in
der Gefriertrocknungskammer und dem Betrieb des tiefgekühlten Kondensators resultieren
die hohen Energiekosten bei der Gefriertrocknung.
Aufgrund der geringen thermischen Beanspruchung und der Stabilisierung der Matrix im
Glaszustand ist die Gefriertrocknung von Eigelb für die Erhaltung der Proteine und Lipoproteine und deren technofunktionellen Eigenschaften vorteilhaft [Ternes 2008b].
11
Einfrierprozess
Natives Eigelb gefriert bei ca. -0,601 °C [Ternes und Acker 1994a]. Beim Einfrieren führt die
Eiskristallbildung zur Aufkonzentrierung gelöster Stoffe, z. B. einer fünffach höheren Salzkonzentration in der wässrigen Phase des Eigelbs bei -6 °C [Ternes und Acker 1994b]. Der
Entzug der strukturstabilisierenden Hydrathülle und die veränderten physikochemischen Eigenschaften der flüssigen Phase (pH-Wert, Ionenstärke, Redoxpotential) erklären gefrierinduzierte Strukturentfaltungen der Proteine und Lipoproteine [Arakawa et al. 2001]. Das Gelierungsphänomen gefriergetauten Eigelbs basiert auf der Neuanordnung der mizellären
LDL-Struktur zwischen -7 und -18 °C [Ternes 2008b; Telis und Kieckbusch 1998; Powrie et
al. 1963]. Dabei entsteht ein dreidimensional perlschnurartig aggregiertes Netzwerk grober
Struktur und hochviskoser, gelähnlicher Konsistenz [Ternes 2008a]. Nach dem Hydrierungsmodell der LDL (Abb. 2-5) beträgt der bei -55 °C nicht ausfrierbare, sich aus der Addition der
monolamellaren (0,04 g/g TM) und multilamellaren (0,06 g/g TM) Hydrathülle ergebende
Wasseranteil der LDL 0,10 g/g TM [Wakamatu 1993]. Zur Stabilisierung der Struktur und
Erhaltung der Löslichkeit benötigen die LDL einen Mindestwassergehalt von 0,11 - 0,16 g/g
TM (Abb. 2-5) [Wakamatu et al. 1982]. Wird diese kritische Restfeuchte unterschritten und
der nicht ausfrierbare Wasseranteil nicht erreicht, kommt es zur Strukturentfaltung und Aggregierung der LDL, was den Schlüsselfaktor der Gelierung während des Einfrierens und
Auftauens darstellt [Wakamatu 1993; Wakamatu et al. 1983, 1982].
-
-
-
Abb. 2-5:
-
-
- - - - LDL
- - - - - -
-
-
-
-
-
Monolamellare Hydrathülle
(0,04 g/g TM)
Multilamellare Hydrathülle
(0,06 g/g TM)
Nicht ausfrierbares Wasser
(0,10 g/g TM)
Kritische Restfeuchte
(0,11 – 0,16 g/g TM)
Kapillarkondensiertes
Wasser
Freies Wasser
Modell der Hydrathülle des LDL-Moleküls [modifziert nach Wakamatu 1993]
Bei Verdünnung von Eigelb mit Wasser sinkt die Gelbildungsrate aufgrund der geringeren
Konzentration an LDL und Salzen [Chang et al. 1977b]. Infolge der LDL-Strukturentfaltung
weist gefriergetautes Eigelb eine geringere Stärke des bei Erhitzung gebildeten Gels auf als
natives Eigelb [Jaekel et al. 2008].
Die hohen Gehalte nicht ausfrierbaren Wassers der Granula (0,29 g/g TM) und der Livetine
(0,38 g/g TM) bedingen eine nahezu restfeuchteunabhängige Löslichkeit [Wakamatu et al.
1982], wobei die gefrierbedingte höhere Salzkonzentration und der veränderte pH-Wert die
Granulastruktur destabilisieren können [Anton 2007].
12
Stand der Forschung
Die nicht ausfrierbaren Wasseranteile des Plasmas (0,15 g/g TM) und Eigelbs (0,16 g/g TM)
sind im Vergleich zu den Granula geringer, was in dem geringen Anteil nicht ausfrierbaren
Wassers der LDL (0,10 g/g TM), die in Plasma mit 85 % und in Eigelb mit 68 % in hohen
Mengen enthalten sind, begründet liegt [Wakamatu et al. 1982]. Nach Riedel (1972) sind
87 % des Wassergehalts von Eigelb bei -20/-30 °C ausfrierbar. Mit dem Anteil nicht ausfrierbaren Wassers korreliert die maximale Gefrierkonzentration einer thermodynamisch instabilen, übersättigten Flüssigkeit am sog. Glasübergang [Roy und Gupta 2004].
Um die für die Proteinstabilisierung kritischen Temperatur- und Konzentrationsbereiche
durch eine rasche und vollständige Eiskristallbildung zügig zu durchschreiten werden bei der
Herstellung gefrorener Eiprodukte Schnellgefrierverfahren bei -40 °C eingesetzt [Belitz et al.
2008]. Nach Lea und Hawke (1952) bleibt die Löslichkeit suspendierter Eigelb-HDL durch
schnelles Einfrieren (-65/-183 °C) in Kombination mit schnellem Auftauen (37 °C) weitgehend
erhalten. Da Proteine ihren Ionisierungszustand während des Einfrierens beibehalten („pHmemory“-Effekt) [Roy und Gupta 2004], führt trotz pH-Änderungen ein optimal stabilisierender Anfangs-pH-Wert beim Gefriertauprozess von Proteinlösungen gegenüber einem ungünstigen Ausgangs-pH-Wert zu einer besseren Proteinerhaltung [Arakawa et al. 2001]. Daher ist die Menge extrahierbarer Lipide einer gefriergetauten HDL-Suspension mit pH 6,8 (2
% Lipide) deutlich geringer als bei einem den isoelektrischen Punkt (ca. pH 5,5) unterschreitenden pH-Wert von 5,2 (40 % Lipide), bei dem die HDL-Struktur weniger stabilisiert ist [Lea
und Hawke 1952]. Zudem können während des Einfrierens aufkonzentrierte Aminosäuren,
Zucker und Salze kryoprotektive Eigenschaften aufweisen, wenn sie nach dem Theorem der
„preferential exclusion“ von Timasheff (2002) von der Proteinoberfläche vorzugsweise ausgeschlossen sind, was die Proteine durch die begünstigte Hydrierung stabilisiert. Zur Hemmung der gefrierinduzierten Gelbildung bei Eigelb werden daher kryoprotektive Additive wie
Natriumchlorid, Saccharose oder Glycerol eingesetzt [Ternes und Acker 1994b].
Sublimations- und Desorptionstrocknung
Im Nativzustand werden auf Van-der-Waals-Kräften und H-Brücken basierende intra- und
intermolekulare Wechselwirkungen von Aminosäureseitenketten durch die von den Wassermolekülen gebildeten H-Brücken kompensiert [Finney und Poole 1985]. Da die Hydrathülle
demnach ein stabilisierender, integraler Bestandteil der Proteinstruktur ist, resultiert ihre Entfernung bei der Sublimations- und Desorptionstrocknung in Strukturentfaltungen, besonders
von -Helices unter verstärkter Bildung von -Faltblattstrukturen, was die Hauptursache für
Denaturierungen der Proteine während der Gefriertrocknung ist [Roy und Gupta 2004; Arakawa et al. 2001; Finney und Poole 1985].
13
Der gefriertrocknungsinduzierte Strukturverlust der Eigelb-HDL zeigt sich durch den höheren
extrahierbaren Lipidanteil (24,5 %) im Vergleich zum Nativzustand (ca. 6 %) [Lea und Hawke
1952].
Im dehydrierten Zustand sind die molekulare Mobilität, Wechselwirkungen der Polypeptidketten sowie die Diffusion von Reaktanten und damit strukturelle Veränderungen und chemische Degradationen der Proteine eingeschränkt [Arakawa et al. 2001; Finney und Poole
1985; Rupley et al. 1983]. Daher steigt die Thermostabilität der Proteine mit Abnahme des
Wassergehaltes, während die Denaturierungstemperatur mit zunehmendem Hydratationsgrad sinkt. Dabei besteht eine hohe Abhängigkeit bei Wassergehalten zwischen 0 - 0,35 g/g
Protein [Westphal et al. 2003].
Basierend auf der restfeuchteabhängigen Strukturentfaltung der Proteine und Lipoproteine
im dehydrierten Zustand korreliert die Stärke des bei Erhitzung gebildeten Gels von rehydriertem Eigelb negativ mit dem Restwassergehalt im getrockneten Zustand [Jaekel et al.
2008]. Da nach Powrie et al. (1963) ein Wasseranteil von 5,8 % vollständig matrixgebunden
ist und die Proteine damit während des Auftauens im Glaszustand stabilisiert sind, wird ein
Restwassergehalt unterhalb 6 % empfohlen [Jaekel et al. 2008]. Nach Ternes (2008b) muss
der Restwassergehalt der Eigelbmatrix geringer als 4 % sein um die Gelbildung beim Auftauen zu unterbinden und so durch Stabilisierung der Eigelbproteine im Glaszustand die
technofunktionellen Eigenschaften zu erhalten.
Da der Wasseranteil in Proteinen und Lipoproteinen ein stabilisierender Strukturbestandteil
ist, können gefriertrocknungsinduzierte Strukturveränderungen, vor allem der Abbau -helikaler Strukturbereiche, durch Rehydrierung reversibel sein, während Aggregierungen meist
irreversibel sind [Roy und Gupta 2004; Arakawa et al. 2001; Finney und Poole 1985]. Bei der
Hydrierung von Proteinen kommt es zunächst zu Wechselwirkungen der Wassermoleküle mit
den geladenen Gruppen im Proteinmolekül unter Ausbildung einzelner Hydrierungsstellen
gefolgt von der Bildung von H-Brücken zwischen den Wassermolekülen [Rupley et al. 1983].
Die entstehenden „cluster“ bedecken durch ihr Zusammenwachsen unter Bildung mono- und
multilamellarer Schichten die Moleküloberfläche bis schließlich das gesamte Molekül bei Erreichen des Sättigungsdampfdrucks durch Kapillarkondensation infolge der Oberflächenspannung umhüllt ist [Rupley et al. 1983].
Aufgrund des marginal höheren extrahierbaren Lipidanteils bei rehydrierten gefriergetrockneten (8 - 9 %) gegenüber nativen Eigelb-HDL (ca. 6 %) ist der Strukturverlust der HDL unter
beinahe völliger Wiederherstellung der nativen Löslichkeit durch Rehydratation größtenteils
reversibel [Lea und Hawke 1952]. Auch Jaekel et al. (2008) berichten von einer Rekonstitution der Lipoproteinstrukturen gefriergetrockneten Eigelbs durch Rehydrierung.
14
Stand der Forschung
Neben der Optimierung der Einfriergeschwindigkeit, Restfeuchte, Trocknungszeit und Temperatur und der Zugabe kryoprotektiver Additive werden zur Erhaltung der nativen Struktur
und biologischen Aktivität der Proteine bei der Gefriertrocknung Lyoprotektanten wie Kohlenhydrate verwendet. Dabei basiert die Strukturstabilisierung während des Abtrocknens auf
der Bindung der Lyoprotektanten, die als Substitut der Hydrathülle fungieren, durch HBrücken an die polaren Gruppen des Proteinmoleküls [Crowe et al. 1990].
Zur Herstellung gefriergetrockneten Eigelbs ohne Additive, das bei Rehydratation mit den
technofunktionellen Eigenschaften von gekühltem Flüssigeigelb vergleichbar sein sollte, eignet sich im Anschluss an die Pasteurisation (64 °C/2 min) ein Prozess aus Vorkristallisation
(-6,3 °C/mind. 2 h) und Schockfrostung (-45 °C/1 min). Dies erlaubt ein Durchschreiten des
Temperaturbereichs der LDL-Gelierung in weniger als fünf Sekunden. Anschließend erfolgt
die Gefriertrocknung (5 h, 2,7 % Restfeuchte). [Jaekel et al. 2008]
2.3 Chemisch-physikalische Eigenschaften von Carotinoiden
Lebensmittel, die aufgrund ihres Gehaltes an funktionellen Inhaltsstoffen eine gesundheitsfördernde Wirkung zeigen, sind für den Verbraucher interessant. Darum sind die antioxidativen Eigenschaften der Carotinoide in Lebensmitteln zunehmend zum Forschungsgegenstand geworden. Synthetisch hergestellte oder als Extrakte aus natürlichen Quellen gewonnene Carotinoide werden zudem aufgrund ihrer lichtabsorbierenden Eigenschaften in Lebens-, Futter- und Nahrungsergänzungsmitteln sowie der kosmetischen und pharmazeutischen Industrie als farbgebende und funktionelle Supplemente eingesetzt [Breithaupt 2008].
Die zu den Tetraterpenen gehörenden Carotinoide sind methylsubstituierte Polyene, die als
charakteristisches Strukturelement die zentrale Polyenkette aufweisen [Britton et al. 2004].
Aus der sich im Molekülzentrum umkehrenden Anordnung der Isopreneinheiten ergibt sich
die Bezifferung des Carotinoid-Moleküls. Dabei werden nach der Nomenklatur der International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) die linksseitigen ungestrichenen vor den
rechtsseitigen gestrichenen Lokanten angegeben (Abb. 2-6).
Abb. 2-6:
Bezifferung des Carotinoid-Moleküls am Beispiel der Strukturformel von Lycopin (,Carotin) [Weedon und Moss 1995]
15
Die mehr als 700 bekannten Carotinoide leiten sich aus der C40H56-Grundstruktur des Lycopins (Abb. 2-6) durch Hydrierung, Dehydrierung, Substitution, Eliminierung, Addition, Cyclisierung, Isomerisierung, Verschiebung von Doppelbindungen, Oxidation und Neuanordnung
ab [Rodriguez-Amaya 2001; Britton et al. 1995]. Carotinoide werden in die aus Kohlenstoff
und Wasserstoff aufgebauten Carotine und die sauerstoffhaltigen Xanthophylle mit endständigen Hydroxyl-, Aldehyd-, Carbonyl-, Epoxy-, Carboxyl- oder Ester-Gruppen eingeteilt. Das
sich von -Carotin ableitende Lutein (3,3´-Dihydroxy--carotin) und das -Carotin-Derivat
Zeaxanthin (3,3´-Dihydroxy--carotin) sind Stereoisomere (C40H56O2; 568,87 g/mol), die sich
durch die endständigen Iononringe und die Anzahl konjugierter Doppelbindungen unterscheiden. Lutein besitzt einen - und einen -Iononring sowie zehn konjugierte Doppelbindungen und Zeaxanthin zwei -Iononringe und 11 konjugierte Doppelbindungen (Abb. 2-7).
-Iononring
-Iononring
-Iononring
-Iononring
Abb. 2-7:
Molekülstrukturen von all-E-Lutein (links) und all-E-Zeaxanthin (rechts)
Das konjugierte Doppelbindungssystem der Polyenkette bedingt neben der E/Z-Isomerisation die lipophilen, farbgebenden und antioxidativen Eigenschaften sowie die für ihre biologischen Funktionen wichtige chemische Reaktivität der Carotinoide [Britton et al. 2009a].
2.3.1 E/Z-Isomerisation
Das konjugierte Doppelbindungssystem der Carotinoidstruktur bedingt die Vielzahl möglicher
geometrischer Isomere. Dabei kann mit Ausnahme von Ring-Doppelbindungen wie in den
Iononringen von Lutein und Zeaxanthin jede der di- und trisubstituierten Doppelbindungen in
E- oder Z-Konfiguration vorkommen. Substituenten höherer Priorität sind bei der E-Konfiguration (entgegen) auf gegenüberliegenden Seiten und bei der Z-Konfiguration (zusammen)
auf der gleichen Seite der C=C-Achse angeordnet (Abb. 2-8) [Weedon und Moss 1995].
a
b
Abb. 2-8:
16
C=C
c
a
d
b
C=C
c
d
E-Konfiguration (Priorität Substituent a > b und d > c; links) und Z-Konfiguration (Priorität
Substituent a > b und c > d; rechts) [modifiziert nach Weedon und Moss 1995]
Stand der Forschung
Die Anzahl möglicher E/Z-Isomere im stereochemischen Set eines Carotinoids errechnet
sich in Abhängigkeit der Molekülsymmetrie und der Anzahl der Doppelbindungen [Weedon
und Moss 1995]. Mit der gleichen Anzahl von neun konjugierten Doppelbindungen umfasst
das stereochemische Set bei Zeaxanthin aufgrund des symmetrischen Molekülaufbaus 272
und bei Lutein mit asymmetrischer Struktur 512 E/Z-Isomere [Watzl und Bub 2001].
Z-Isomere weisen aufgrund der sterischen Hinderung zwischen Methylgruppen und H-Atomen eine geringere Stabilität auf, weshalb Carotinoide in natürlichen Matrizes überwiegend
in der thermodynamisch stabilen all-E-Konfiguration vorliegen [Rodriguez-Amaya 2001]. Da
der Hinderungseffekt bei trisubstituierten Doppelbindungen wie an C13 und C9 und der disubstituierten Doppelbindung in der 15,15´-Position (Abb. 2-6) geringer ist, kommen in natürlichen Matrizes am häufigsten 9-/9´-Z- und 13-/13´-Z-Isomere und in geringerem Maße 15-ZKonfigurationen vor [Britton und Khachik 2009]. Neben einem deutlich höheren Anteil der allE-Isomere ist bei Spinat-Extrakt ein natürliches Stereoisomeren-Muster aus 9-Z-/9´-Z- und
13-Z/13´-Z-Lutein sowie 9-Z- und 13-Z-Zeaxanthin identifizierbar [Dachtler 2000]. Bei nativem Eigelb beträgt der 13-Z-Luteinanteil am Gesamtluteingehalt ca. 3 - 4 % und der Anteil
von 13-Z-Zeaxanthin am Gesamtzeaxanthingehalt 17 % [Wenzel 2010].
Aufgrund ihrer biologischen Funktionen werden Z-Isomere in tierischen Geweben durch endogene Stoffwechselprozesse gebildet. Die in vivo-Stereomutation von Lycopin bedingt das
Vorkommen verschiedener Z-Isomere in Humanserum und im Prostatagewebe mit hohen
Anteilen von 50 und 80 % des Gesamtlycopins [Liaaen-Jensen und Lutnœs 2008].
Zudem wird die bereits bei Raumtemperatur stattfindende endotherme Z-Isomerisierung
durch hohe Temperaturen, Licht, Säure, Metallkationen und Enzyme katalysiert [LiaaenJensen und Lutnœs 2008]. Da die Z-Isomerisierung an der C13-Doppelbindung einer geringen Aktivierungsenergie bedarf, sollte die Bildung des 13-Z-Isomers besonders bei geringen
Temperaturen dominieren [Britton und Khachik 2009], während bei intensiverer Erhitzung
aus den mono-Z-Isomeren die stärker sterisch gehinderten di-Z-Isomere entstehen können
[Chen et al. 1995]. Metallkationen katalysieren die Stereomutation der all-E-Form zu ZIsomeren durch die Absenkung des Aktivierungspotentials. Die durch zweiwertige Eisenionen induzierte Isomerisierung von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin zu 13-Z-/13´-Z-Lutein
und 13-Z-Zeaxanthin ist bei einem Massenverhältnis größer 8:1 (Fe(II):Xanthophylle) signifikant [Li und Han 2008].
In Lösung treten Stereoisomerisierungen leicht auf [Schiedt und Liaaen-Jensen 1995]. Aus
diesen Gründen werden Z-Isomere häufig während der Verarbeitung und Herstellung von
Lebens- und Futtermitteln sowie der Probenaufbereitung bei der Analytik gebildet [Aman et
al. 2005; Watzl und Bub 2001].
17
Neben den chemisch-physikalischen und strukturellen Eigenschaften der Carotinoide bestimmen Matrixeinflüsse, Bindungs-, Aggregations- und Kristallisationsmechanismen das
Isomerisierungsverhalten [Aman et al. 2005, van het Hof et al. 1998]. Liegen die all-EIsomere molekular assembliert in Aggregaten vor, ist die Z-Isomerisierungsneigung gering
[Britton und Khachik 2009; Aman et al. 2005].
Z-Isomerisierungen bedingen Veränderungen von biologischen Funktionen, im Metabolismus
und hinsichtlich der Bioverfügbarkeit. Die Einführung einer Z-Doppelbindung resultiert in der
Bildung eines gewinkelten Moleküls geringerer Gesamtlänge, was die Aggregations- und
Kristallisationsneigung vermindert und die Löslichkeit verbessert [Britton und Khachik 2009].
Dies erleichtert die Inkorporation in Mizellen und Chylomikronen sowie den intra- und interzellulären Transport und erhöht die Bioverfügbarkeit [Liaaen-Jensen und Lutnœs 2008].
2.3.2 Degradation
Die Anfälligkeit der elektronenreichen Polyenkette der Carotinoide für elektrophile Stoffe wie
Peroxid-Radikale bedingt die Oxidationsempfindlichkeit und bildet die Basis für die antioxidativen und prooxidativen Eigenschaften der Carotinoide [Schiedt und Liaaen-Jensen 1995].
Durch den Transfer von Elektronen und H-Atomen und die radikalische Addition können Carotinoide freie Radikale, die unter Licht-, Temperatur- und Sauerstoffeinfluss, durch Enzyme
wie Lipoxygenasen und katalytisch aktive Metallkationen entstehen, abfangen. Dabei entstehen stabilisierte Carotinoid-Radikale. [El-Agamey und McGarvey 2008; Liaaen-Jensen 2008;
Schiedt und Liaaen-Jensen 1995]
Da die Additionsrate der Radikale mit der Anzahl konjugierter Doppelbindungen korreliert,
sind Carotinoide mit konjugierten Carbonyl- oder Carboxylgruppen wie Astaxanthin,
Canthaxanthin oder Bixin effizientere Radikalfänger als Lutein, -Carotin und Lycopin [Ternes 2008a]. Lycopin ist trotz der gleichen Anzahl von 11 konjugierten Doppelbindungen ein
effizienteres Antioxidanz als -Carotin [Rodriguez-Amaya 2003], da die Doppelbindungen
der -Iononringe bei -Carotin durch die sterische Hinderung zwischen der Methylgruppe am
C5-Atom des Ringes und dem H-Atom am C8-Atom der Kette nicht optimal konjugiert sind.
Aggregationen der Carotinoide vermindern das antioxidative Potential [El-Agamey und
McGarvey 2008]. Mit anderen Antioxidantia wirken Carotinoide synergistisch [Lai et al. 1996;
Terao et al. 1980]. Carotinoide mit mehr als sieben konjugierten Doppelbindungen können
die Energie angeregter Moleküle aufnehmen, wobei die Anregungsenergie der Carotinoide in
Form von Wärme an die Umgebung abgegeben wird [Britton et al. 2009a; Su et al. 2002].
18
Stand der Forschung
Das antioxidative Potential erklärt das Vorkommen von Carotinoiden in oxidativ belasteten
biologischen Systemen wie dem Photosyntheseapparat [Palozza et al. 2009]. Zudem verringern Carotinoide oxidativen Stress5, der in den frühen Stadien der Pathogenese chronisch
degenerativer Krankheiten eine Rolle spielen kann [Palozza et al. 2009].
Bei hoher Sauerstoffspannung und in hohen Konzentrationen neigen die beim Abfangen
radikalischer Spezies gebildeten Carotinoid-Radikale zur Degradation unter Bildung prooxidativer Derivate, wie z. B. Carotinoid-Peroxylradikale und zytotoxische Aldehyde [Palozza et
al. 2009; Yeum et al. 2009; Wang 2009].
Beim oxidativen Abbau von Carotinoiden entstehen Epoxy- und Apocarotinoide (weniger als
40 C-Atome), die enzymatisch und nicht-enzymatisch zu Substanzen geringen Molekulargewichts wie Aldehyden und Ketonen sowie einer Vielzahl an Nebenprodukten wie Toluol, Xylol
und Dimethylcyclodecapentaen gespalten werden [Fleischmann und Zorn 2008; Aman et al.
2005; Pérez-Galvez et al. 2005; Rodriguez-Amaya 2001, van het Hof et al. 1998].
Zudem basieren Degradationen auf der durch Säure sowie durch Wärme und Licht induzierten Epoxid-Furanoid-Neuanordnung von 5,6-Epoxy-Carotinoiden zur furanoiden 5,8-EpoxyIsomerenform [Britton und Khachik 2009]. Xanthophylle mit allylischer6 OH-Gruppe wie
Lutein dehydrieren in acidem Milieu zu Anhydroxanthophyllen [Britton und Khachik 2009].
Obwohl die meisten Carotinoide gegenüber Laugen stabil sind, kann es unter dem Einfluss
von hohen Temperaturen, Licht und Sauerstoff bei der alkalischen Hydrolyse (Verseifung)
auch zu Degradationen kommen [Khachik 2009; Britton et al. 2004]. Zudem ist die Degradationsneigung von Xanthophyllen gegenüber Carotinen meist höher [Watzl und Bub 2001].
Die Abbauprodukte der Carotinoide weisen Veränderungen des Absorptionsmaximums, der
Polarität, der Löslichkeit und der biologischen Funktionen auf [Rodriguez-Amaya 2003]. Der
hohe Carotinoidverlust in erhitztem Karottensaft zeichnet sich durch einen Farbwechsel von
orange nach gelb aus [Chen et al. 1995], und die Epoxid-Furanoid-Neuanordnung resultiert
in einem Verlust der Farbintensität [Britton und Khachik 2009]. Bei der Metabolisierung von
Carotinoiden entstehen Abbauprodukte mit antioxidativen Eigenschaften sowie signalvermittelnden und regulatorischen Funktionen [Wang 2009; Breithaupt 2008; Fleischmann und
Zorn 2008]. Durch die enzymatische Spaltung von Vitamin A-Carotinoiden entstehen bei
Säugetieren Retinoide [Parker 1996]. In Pflanzen werden Carotinoide mittels Carotinasen
unter Bildung aromaaktiver Fragmente wie -Ionon und -Damascenon gespalten, die als
sensorische Signale für Insekten und Vögel fungieren [Britton et al. 2008; Fleischmann und
Zorn 2008].
5
Dysbalance zwischen Oxidation und Reduktion zugunsten der Oxidation
Ungesättigter Kohlenwasserstoffrest der Formel H2C=CH–CH2– (2-Propenyl-Gruppe)
6
19
2.4 Vorkommen von Carotinoiden in natürlichen Matrizes
In natürlichen Matrizes sind die hydrophoben Carotinoide mit der lipophilen Umgebung wie in
Mizellen, Öltröpfchen oder dem lipophilen Kern von Lipoproteinen und Membranen assoziiert. Aggregationen, Wechselwirkungen mit Proteinen und Lipiden und die Orientierung in
zellulären und molekularen Strukturen korrelieren mit der Molekülstruktur der Carotinoide
und beeinflussen deren chemisch-physikalische Eigenschaften, Bioverfügbarkeit, Transport
und biologische Aktivität [Britton et al. 2008].
2.4.1 Aggregation und Kristallisation
Aufgrund ihrer stabähnlichen Molekülform neigen Carotinoide in wässrigen Medien, besonders an Grenzflächen und in Lipiddoppelschichten, zur molekularen Selbstassemblierung
basierend auf H-Brücken-Bindungen, Dipol- und Van-der-Waals-Kräften [Köhn et al. 2008].
Wechselwirkungen der in Aggregaten nah beeinanderliegenden Chromophore bedingen Veränderungen beim Energie- und Elektronentransfer und damit der lichtabsorbierenden Eigenschaften der Carotinoide. Aufgrund der verminderten Kontaktgrenzfläche weisen aggregierte
Carotinoide eine geringere Löslichkeit und Bioverfügbarkeit auf [Britton et al. 2008]. Zudem
reduziert die Aggregation die antioxidativen Effekte [El-Agamey und McGarvey 2008] und die
Z-Isomerisierungsneigung der Carotinoide [Britton und Khachik 2009; Aman et al. 2005].
Aufgrund der hydroxylierten Iononringe bilden Lutein und Zeaxanthin bevorzugt auf HBrücken basierende Aggregate. Zudem steigt die Aggregationsneigung mit Zunahme der
Carotinoid-Konzentration aufgrund der räumlichen Nähe der Moleküle. [Köhn et al. 2008]
Die Aggregation ist häufig die Vorstufe zur Kristallisation. Infolge der aktiven CarotinoidBiosynthese kann bei der Reifung in den Chromoplasten die Carotinoid-Konzentration so
stark ansteigen, dass es zu aggregationsbedingten Kristallisationen wie von -Carotin in Karottenwurzeln und all-E-Lycopin in Tomaten kommt [Britton 2008a; Köhn et al. 2008].
2.4.2 Membrane
Als integraler Bestandteil des hydrophoben Lipidkerns beeinflussen Carotinoide aufgrund der
Van-der-Waals-Wechselwirkungen der Polyenkette mit den Acylketten der Lipide ähnlich wie
Cholesterol die Fluidität, Permeabilität und Stabilität von Phospholipiddoppelmembranen
sowie die rezeptorvermittelte Signaltransduktion [Widomska et al. 2009; Britton et al. 2008,
Britton und Helliwell 2008; Wisniewska et al. 2006; Kostecka-Gugala et al. 2003].
20
Stand der Forschung
Zudem können die antioxidativen Carotinoide die membranzerstörende Lipidperoxidation der
ungesättigten Acylketten vermindern [Britton 2008a; El-Agamey und McGarvey 2008]. Unpolare Carotine interagieren mit dem inneren, hydrophoben Bereich der Membran [Britton
2008a]. Bei dipolaren Xanthophyllen wie Lutein und Zeaxanthin sind die endständigen Hydroxylgruppen auf beiden Seiten mit der hydrophilen Kopfgruppenregion der Membran assoziiert, woraus ein transmembraner Einbau resultiert [Widomska et al. 2009; Britton 2008a;
Wisniewska et al. 2006; Korger 2005; Lazrak et al. 1987].
2.4.3 Proteine
Da Carotinoide in wässrigen physiologischen Medien zur Erhöhung der Löslichkeit und Stabilität mit Proteinen assoziiert sind, werden sie zusammen mit Lipiden in Lipoproteinen im
Blut zu Geweben transportiert. Lipoproteine bestehen aus einem unpolaren Kern aus Triglyceriden und Cholesterinestern, der von einer hydrophilen Schicht aus amphiphilen Apoproteinen, Phospholipiden und Hydroxygruppen von unverestertem Cholesterin umhüllt ist. Carotine befinden sich bevorzugt im lipophilen Kern und Xanthophylle nahe der Oberflächenschicht [Greene et al. 2006; Parker 1996]. Im Humanserum sind Carotinoide zu 75 % in LDL
und zu 25 % in HDL enthalten [Clevidence und Bieri 1993]. Bezogen auf den Lipidanteil sind
die Carotinoid-Konzentrationen in den Lipoproteinen des Humanplasmas gleich [Ternes et
al. 1995].
Zur Erfüllung ihrer lichtabsorbierenden und photoprotektiven Funktionen bei der Photosynthese sind Carotinoide in Chloroplasten als Pigment-Protein-Komplexe mit Chlorophyll in der
Thylakoid-Membran gebunden [Britton 1995]. Die spezifische Orientierung der Carotinoide
zu Chlorophyll ermöglicht den effizienten Energietransfer bei der Lichtabsorption. Zudem
fangen Carotinoide reaktive Sauerstoffspezies ab und reduzieren deren Bildung durch die
Aufnahme überschüssiger Anregungsenergien. [Britton und Helliwell 2008; Britton 2008a;
Frank und Christensen 2008; Britton et al. 1995]
Bei Lachsfischen sind Canthaxanthin und Astaxanthin, die für die rote Färbung verantwortlich sind, durch H-Brücken an den Actomyosin-Komplex der Muskelfasern gebunden. In Vogelfedern interagieren Carotinoide mit den Keratin-Filamenten [Britton und Helliwell 2008].
Carotinoid-Protein-Komplexe denaturieren in Anwesenheit von Säuren, Basen, hohen Salzkonzentrationen, organischen Lösungsmitteln und beim Erhitzen. Wechselwirkungen mit Proteinen können die chemisch-physikalischen Eigenschaften der Carotinoide verändern. Zum
Beispiel bedingt die Komplexierung in Crustacyanin beim Hummer die Verschiebung der
Absorption des Astaxanthins in den blauen Spektralbereich, während bei der Denaturierung
des Carotinoproteins beim Kochen das orangerote Astaxanthin frei wird.
21
2.5 Metabolismus von Carotinoiden
Entsprechend der Ernährungsgewohnheiten ist -Carotin das Hauptcarotinoid in Humanplasma, da es von den ca. 50 in der Nahrungskette vorkommenden Carotinoiden am weitesten in
Lebensmitteln verbreitet ist [Canene-Adams und Erdman 2009; Rodriguez-Amaya 2003;
Kasper 2004; Su et al. 2002; Watzl und Bub 2001; Bendich und Olson 1989].
Zur Erfüllung ihrer biologischen Funktionen müssen Carotinoide aus der Nahrung freigesetzt
und vom Körper resorbiert, transportiert und akkumuliert werden. Beim Huhn erfolgen die
Resorption und der Lipoprotein-Transport von Carotinoiden analog zum Menschen.
Durch die mechanische Zerkleinerung im Mund, die Peristaltik des Magens sowie die Wirkung der Magensäure und der Verdauungsenzyme werden Carotinoide partiell aus der Nahrung freigesetzt. In Abhängigkeit der chemisch-physikalischen Eigenschaften und der Art der
Bindung in der Lebensmittelmatrix werden die Carotinoide durch die Magenperistaltik in die
mit Nahrungsfett emulgierte Phase transferiert. Im Dünndarm induziert das Fett die Sekretion
von Gallensalzen und Pankreaslipasen zur Spaltung der Nahrungslipide in Glycerin, Monoacylglyceride und Fettsäuren, wobei Carotinolacylester hydrolysiert werden [Khachick 2009].
In den gebildeten gemischten Mizellen aus Gallensalzen, Fettsäuren, Monoacylglyceriden,
Phospholipiden, Cholesterin und fettlöslichen Vitaminen ordnen sich Carotine bevorzugt im
hydrophoben Kern und Xanthophylle nahe der Mizellenoberfläche an [Kasper 2004; Parker
1996].
Neben der Fettsäurezusammensetzung und den chemisch-physikalischen Eigenschaften der
Carotinoide beeinflusst besonders die Art der Bindung in der Lebensmittelmatrix die mizelläre Inkorporation der Carotinoide [Canene-Adams und Erdman 2009; Parker 1996].
Nach dem Zerfall der Mizellen am Bürstensaum der Dünndarmmukosazellen werden die
lipidlöslichen Substanzen durch passiven Transport in die Enterozyten aufgenommen und
zusammen mit Apolipoproteinen als Chylomikronen verpackt. Carotinoide mit Vitamin AAktivität wie -Carotin werden in der Dünndarmmukosa in Abhängigkeit des Bedarfs zu Vitamin A metabolisiert [Parker 1996].
Beim Menschen gelangen die Chylomikronen durch Exocytose in die Lymphbahnen und anschließend ins Blut, wo sie durch Lipoproteinlipase abgebaut werden [Kasper 2004]. Aus den
verbleibenden triglyceridarmen Chylomikronenresten können die Carotinoide mittels spezifischer Rezeptoren in extrahepatische Gewebe oder zusammen mit den Chylomikronenresten
rezeptorvermittelt von der Leber aufgenommen werden. Aufgrund des bei Hühnern unterentwickelten Lymphsystems gelangen die Chylomikronen direkt ins Blut und werden von dort
zur Leber transportiert.
22
Stand der Forschung
Neben der Akkumulation werden Carotinoide in der Leber an Lipoproteine gebunden und in
dieser wasserlöslichen Form ins Blut sezerniert [Bortolotti et al. 2003; Furr und Clark 1997].
Von dort erfolgt der Transport von Carotinoiden zu den Geweben meist indirekt über die Aufnahme der Lipoproteine, die basierend auf den Apoproteinstrukturen mittels spezifischer
membranintegrierter Rezeptorproteine stattfindet [Clevidence und Bieri 1993]. Viele Gewebe
zeigen charakteristische Carotinoid-Muster, die spezifische biologische Funktionen und selektive Absorptionsmechanismen vermuten lassen. Das beim Menschen im Hodengewebe
akkumulierte Lycopin soll zur Verminderung des Prostatakrebsrisikos beitragen [Stahl et al.
1992]. Aufgrund ihrer photoprotektiven Eigenschaften werden Lutein und Zeaxanthin in der
Retina [Canene-Adams und Erdman 2009; Schalch et al. 2009] durch spezifische stereochemische Wechselwirkungen mit dem membranassoziierten Makula-Rezeptorprotein Glutathion-S-Transferase akkumuliert [Köhn et al. 2008; Bhosale et al. 2004].
Durch die Magensäure und während der Stoffwechselprozesse können aus den all-E-Konfigurationen der Carotinoide Z-Isomere gebildet werden, deren systemischer Transport aufgrund der höheren Löslichkeit und geringeren Aggregationsneigung begünstigt ist. Dies erklärt die hohen Anteile von 9-Z, 13-Z und 15-Z-Lycopin von mehr als 50 % des Gesamtlycopins im Blut und mehr als 75 % im Gewebe. Dagegen enthalten tomatenbasierte Lebensmittel zu mehr als 95 % das all-E-Isomer. [Canene-Adams und Erdman 2009]
Beim Menschen und bei Geflügel werden Carotinoide hauptsächlich in Leber, Fettgewebe
und Haut sowie Reproduktionsgeweben wie Prostata und Ovarien akkumuliert [Bendich und
Olson 1989].
Die hohen Mengen an Carotinoiden in den LDL und HDL des Eigelbs sind durch die in der
Leber stattfindende östrogenstimulierte Synthese von Vitellogenin und Very-Low-Density
Lipoproteinen (VLDL) unter Beladung mit Lipiden und lipophilen Substanzen wie Carotinoiden und Cholesterin bedingt. Die Lipoproteine werden anschließend rezeptorvermittelt durch
Endocytose aus dem Blut von der Oozyte aufgenommen [Britton 2008a; Anton 2007; Jolivet
et al. 2006; Anderson et al. 1998; Kuksis 1992]. Aus den VLDL, die hauptsächlich aus den
beiden Apoproteinen Apovitellenin I und Apoprotein-B bestehen, bilden sich Eigelb-LDL
durch die partielle enzymatische Proteolyse von Apoprotein-B während der Endocytose [LiChan und Kim 2008; Anton 2007; Jolivet et al. 2006; Moussa et al. 2002; Itoh et al. 1986].
Das als Dimer organisierte Vitellogenin besteht aus zwei Polypeptiden unterschiedlicher
Aminosäurezusammensetzung und fungiert als Vorläuferprotein für -Livetin, HDL und
Phosvitin. Die Reifung von Vitellogenin zu HDL in der Oozyte erfolgt durch hydrolytische Abspaltungen von Aminosäuresequenzen unter Bildung von - und -HDL und Phosvitin. Da
die Dimer-Struktur und die Lipidbindung dabei unverändert bleiben [Banaszak 1991], sind
Vitellogenin und HDL strukturell ähnlich [Anderson et al. 1998].
23
Da -Carotin neben dem Umbau zu aktivem Vitamin A häufig zu Xanthophyllen oxidiert wird,
ist dessen Transport in das Eigelb weniger effizient [Anton 2007]. Xanthophyll-Fettsäureester werden vor der Deposition im Eigelb durch eine lipasekatalysierte Hydrolyse im Darmlumen deacetyliert [Breithaupt et al. 2003; Lai et al. 1996; Philip et al. 1976], weshalb Lutein
und Zeaxanthin im Eigelb zu 90 % unverestert vorliegen [Handelmann et al. 1999].
Durch die Akkumulation von Carotinoiden im Eigelb wird eine antioxidative Schutzwirkung
während der embryonalen und postnatalen Entwicklung gewährleistet, wobei die maternale
Carotinoid-Versorgung die Embryonensterblichkeit und Entwicklungs- und Lebensfähigkeit
der Brut beeinflusst [Karadas et al. 2005]. Vom Eigelb aus werden Carotinoide über die Dottersackmembran mittels Lipoproteinen in den Blutkreislauf und von dort zur Akkumulation in
die Leber des Embryos transportiert. Die fütteringsinduzierte Anreicherung von Carotinoiden
im Eigelb verringert daher die Anfälligkeit der Eigelblipide sowie der Gewebe des Embryos
und des Kükens gegenüber Lipidperoxidationen [Blount und McGraw 2008: Karadas et al.
2005; Surai et al. 2003; Surai und Speake 1998]. Aufgrund der immunmodulierenden Wirkung von Carotinoiden [Breithaupt 2008; Karadas et al. 2005] wird über die Futtersupplementierung mit Lutein bei gegen infektiöse Bronchitis geimpften Legehennen die sekundäre
Antikörperresponse verstärkt [Bédécarrats und Leeson 2006].
2.6 Carotinoide in Lebensmitteln
Carotinoide werden in Pilzen, Algen, Bakterien und den Chromo- und Chloroplasten bei
Pflanzen durch die enzymkontrollierte Carotinogenese de novo synthetisiert [Britton et al.
2004]. Daher weisen pflanzliche Nahrungsmittel ein breites Spektrum an Carotinoiden auf
[Rodriguez-Amaya 2001]. Bei der Reifung werden Xanthophylle mit Fettsäuren verestert
[Britton und Khachik 2009; Rodriguez-Amaya 2001]. Daher existieren Lutein und Zeaxanthin
in Tagetes-Arten (Studentenblume) hauptsächlich als Mono- und Diester gesättigter Fettsäuren [Boonnoun et al. 2012; Khachik 2001; Delgado-Vargas und Paredes-López 1996; Gregory et al. 1986]. Da Lutein mit einem Anteil von 40 - 45 % das Hauptcarotinoid in Chloroplasten ist [Britton 2008a], dominiert es im Extrakt von Tagetes-erecta mit Anteilen von ca. 88 bis
93 %. Dagegen beträgt der Anteil an Zeaxanthin nur ca. 5 %, da es leicht zu Epoxyxanthophyllen wie Violaxanthin umgebaut wird. [Rodriguez-Amaya 2003; Khachik 2001; Hadden et
al. 1999; Gregory et al. 1986].
Rotes und gelbes Gemüse enthält hauptsächlich Carotine und grünblättriges Gemüse Xanthophylle. Der Carotinoidgehalt in Gemüse ist ca. zehnfach höher als bei Früchten [Watzl
und Bub 2001].
24
Stand der Forschung
Aufgrund der fehlenden enzymatischen Ausstattung zur Biosynthese sind die CarotinoidMengen in tierischen Lebensmitteln meist geringer als in pflanzlichen [Rodriguez-Amaya
2003], wobei aber Eier, Milchprodukte, Fische und Meeresfrüchte wichtige Quellen sind [Britton und Khachik 2009].
2.6.1 Carotinoide in Eigelb
Die chemisch-physikalischen Eigenschaften der Carotinoide, die Nahrungsaufnahme und
Haltungsform sowie genetische und physiologische Faktoren beeinflussen den Gehalt und
die Zusammensetzung der Eigelb-Carotinoide. Die natürlich vorkommenden Hauptcarotinoide des Eigelbs sind Lutein (ca. 292 µg/Eigelb) und Zeaxanthin (ca. 213 µg/Eigelb), welche
die typische Färbung bedingen [Greene et al. 2006]. Mit ca. 65 % des Eigelb-CarotinoidGehalts dominiert dabei Lutein, was durch dessen ubiquitäres Vorkommen in Pflanzen bedingt ist [Hammershoj et al. 2010]. Aufgrund der intestinalen Metabolisierung ist -Carotin mit
ca. 8 % des Carotinoid-Gehalts [Hammershoj et al. 2010] bzw. ca. 10 µg/Eigelb [Li-Chan und
Kim 2008] ein Minorcarotinoid in Eigelb.
Da die Konzentrationen an Lutein und Zeaxanthin bezogen auf den Lipidanteil in LDL und
HDL weitgehend gleich sind [Ternes et al. 1995], findet sich im Plasma, das 93 % der EigelbLipide enthält [Powrie und Nakai 1986], fast der gesamte Carotinoid-Gehalt [Anton 2007].
Die Lipid-Assoziation der Xanthophylle bedingt eine hohe Bioverfügbarkeit, weshalb Eigelb
als eine gute Lutein- und Zeaxanthin-Quelle angesehen wird [Ternes 2008a; Greene et al.
2006; Handelman et al. 1999]. Da Lutein aus Eigelb eine um den Faktor drei höhere Bioverfügbarkeit zeigt als aus pflanzlichen Matrizes [Ternes 2008a; Handelman et al. 1999], ist die
Serum-Lutein-Response nach dem Verzehr luteinangereicherter Eier signifikant höher als bei
Spinat [Chung et al. 2004].
Zur Eigelb-Pigmentierung werden bei der Boden- und Freilandhaltung Xanthophylle7 in Form
von Extrakten aus natürlichen Quellen oder als synthetische Supplemente [BVL 2011] und
bei der ökologischen Haltung xanthophyllreiche Pflanzen wie Mais, Erbsen, Spinat und Tagetes-Arten (Tab. 2-1) im Futter eingesetzt. Da in den Futterpflanzen Lutein dominiert, das
im gelben Spektralbereich absorbiert, ist Eigelb aus ökologischer Haltung heller als bei konventionell erzeugten Eiern [Grashorn und Grimrath 2005].
7
Lutein, Zeaxanthin, -Apo-8´-Carotinal, -Apo-8´-Carotinsäureethylester (445 - 450 nm; gelb);
Capsanthin, Canthaxanthin, -Cryptoxanthin, Citranaxanthin (465 - 480 nm; rot)
25
Die hohen Gehalte an Lutein und Zeaxanthin in den Futterpflanzen erklären die hohen Mengen in Eigelb bei ökologischer und Freiland-Haltung [Hamulka et al. 2005; Majchrzak und
Elmadfa 1997]. Dabei wurde nach Schlatterer und Breithaupt (2006) eine signifikant höhere
Konzentration bei ökologisch erzeugten Eiern gegenüber der Freiland-, Boden- und Käfighaltung festgestellt (Tab. 2-1).
Tab. 2-1:
Gehalte an Lutein und Zeaxanthin [µg/100 g] in Eigelb in Abhängigkeit der Haltungsform
(Klasse 0 - 3) [Schlatterer und Breithaupt 2006] sowie in den Futterpflanzen [USDA 2014;
Gregory et al. 1986]
Haltungsform
Gehalt [µg/100 g Eigelb]
Futterpflanze
Lutein
Zeaxanthin
1.764
1.021
Tagetes erecta*
383 - 79.109 µg Luteinester/100 g**
Freiland (1)
749
325
Grüne Erbsen
2.477 µg (Lutein + Zeaxanthin)/100 g
Boden (2)
541
222
Gelber Mais
1.355 µg (Lutein + Zeaxanthin)/100 g
Käfig (3)
411
398
Spinat
12.198 µg (Lutein + Zeaxanthin)/100 g
Ökologisch (0)
* Ringelblume: grün-gelb bis orange-braun
** Summe der Dimyristat-, Myristat-Palmitat-, Dipalmitat- und Palmitat-Stearat-Ester
2.6.2 Einflüsse auf den Carotinoid-Gehalt
Die Selbstassemblierung in Aggregaten und Kristallen, die Assoziation mit Membranen, Proteinen, Lipiden und Lipoproteinen sowie der Schutz durch physikalische Barrieren wie Zellmembranen und antioxidative Inhaltsstoffe und Enzyme bedingen eine höhere Stabilität der
Carotinoide in natürlichen Matrizes gegenüber ihrem Vorliegen in Lösung nach der Isolierung
[Belitz et al. 2008; Watzl und Bub 2001]. Entsprechend der Matrixeigenschaften sowie der
Wechselwirkung mit Matrixkomponenten ist die Stabilität der Carotinoide lebensmittelspezifisch [Aman et al. 2005; van het Hof et al. 1998].
Bei der Verarbeitung tragen Zerkleinerungs-, Erhitzungs- und Trocknungsverfahren zur Zerstörung des Gewebes und von Assoziationen zwischen Carotinoiden und Matrixkomponenten bei. Durch die Einflüsse von Temperatur, Licht, Säuren, Enzymen und aktiven Metalloberflächen werden dabei Isomerisierungen und Degradationen der Carotinoide katalysiert,
wobei Degradationen zudem unter Sauerstoffeinfluss und durch Radikale initiiert werden
[Shen et al. 2009; Belitz et al. 2008; Schiedt und Liaaen-Jensen 1995]. Dies verändert die
Bioverfügbarkeit, den Metabolismus und die biologischen Funktionen der Carotinoide sowie
die Farbe und das Aroma der Lebensmittel [Britton 2008b; Rodriguez-Amaya 2003].
Aufgrund der Radikalbildung bei der Lipidperoxidation erhöht das Vorhandensein von mehrfach ungesättigen Fettsäuren in der Matrix die oxidative Degradation der Carotinoide [PérezGalvez et al. 2000].
26
Stand der Forschung
Freigesetzte Pflanzensäuren induzieren die Epoxid-Furanoid-Neuanordnung von 5,6-EpoxyCarotinoiden sowie aufgrund der pH-Absenkung die Dehydrierung von Xanthophyllen mit
allylischer OH-Gruppe [Britton und Khachik 2009].
Zudem steigt mit höherem Zerkleinerungsgrad das Ausmaß der durch Enzyme und Sauerstoff katalysierten Degradationen der Carotinoide [Rodriguez-Amaya 1997]. Beim Gefrieren
beeinflusst die Einfriergeschwindigkeit die Zellzerstörung und damit die Zugänglichkeit der
Carotinoide für Enzyme, Radikale und Sauerstoff. Die große Oberfläche und Porosität gefriergetrockneter Lebensmittel erhöhen Aromaverluste und Oxidationen [Rodriguez-Amaya
1997]. Obwohl Carotinoide bei -20 °C unter Ausschluss von Licht und Sauerstoff gut erhalten
bleiben [Britton und Khachik 2009], zeigt die Lagerung gefriergetrockneten Eigelbs daher bei
-18 °C keinen protektiven Effekt auf die Xanthophyllretention gegenüber 20 °C [Wenzel
2010].
In Abhängigkeit der Erhitzungsintensität kommt es zu Z-Isomerisierungen und oxidativen
Degradationen der Carotinoide [Liaaen-Jensen und Lutnœs 2008; Aman et al. 2005; van het
Hof et al. 1998]. Bei der Konservenherstellung von Früchten und Gemüsen kann der ZIsomerenanteil bis zu 40 % zunehmen [Britton und Khachik 2009; Lessin et al. 1997]. Bedingt durch die geringe Aktivierungsenergie zur Isomerisierung der C13-Doppelbindung dominieren bei mäßiger Erhitzung dabei die 13-Z-Isomere [Britton und Khachik 2009]. Eine intensive Erhitzung induziert dagegen die Bildung stärker sterisch gehinderter Z-Isomere wie z. B.
von 13,15-di-Z--Carotin in Karottensaft (121 °C, 30 min) aus dem zuvor bei milderer Behandlung (110/120 °C, 30 s) dominierenden 13-Z--Carotin [Chen et al. 1995]. Der gleichzeitig höhere Carotinoid-Verlust [Chen et al. 1995] basiert auf der zunehmenden oxidativen Degradation mit der Erhitzungsintensität. Daher sinkt die Retention an Carotinoiden mit Vitamin
A-Aktivität von der Mikrowellengarung über das Dämpfen bis zum Kochen, wobei sich deutliche Verluste beim Frittieren, Backen und Braten ergeben [Rodriguez-Amaya 1997]. Bei der
Zubereitung von Rührei sind nach zehn Minuten keine Carotinoide mehr analysierbar
[Hesterberg 2006]. Aufgrund der geringen oxidativen Degradation bei geringer Erhitzungsintensität [Rodriguez-Amaya 1997] sind die Xanthophyll-Gehalte in pasteurisiertem Eigelb
(61,5 °C, 3,5 min) gegenüber dem unbehandelten nicht signifikant verändert [Wenzel 2010].
Bei der Lebensmittelverarbeitung erhöhen der Abbau physikalischer Barrieren beim Matrixaufschluss, die Zunahme der Permeabilität pflanzlicher Zellwände, die Auflösung von Assoziationen der Carotinoide mit Matrixkomponenten und die erhitzungsbedingte Löslichkeit
von Aggregaten der Carotinoide deren Bioverfügbarkeit [Britton und Khachik 2009]. Da bei
der Strukturentfaltung der Eigelb-Lipoproteine Fette und assoziierte Carotinoide freigesetzt
werden, sind die Gehalte der Xanthophylle bei sprüh- und gefriertrocknetem Eigelb signifikant höher als bei unbehandeltem [Wenzel 2010].
27
2.7 Bioverfügbarkeit
Die Bioverfügbarkeit ist ein Maß für die im Metabolismus, zur Akkumulation und zur Nutzung
in physiologischen Funktionen verfügbare Menge eines Nahrungsmittelbestandteils und umfasst dessen Freisetzung aus der Matrix, Absorption, Transport und gewebespezifische Akkumulation [Canene-Adams und Erdman 2009]. Neben der Art, der Menge und der spezifischen Bindung der Carotinoide im Lebensmittel wird die Bioverfügbarkeit durch die Eigenschaften der Matrix, Nahrungsbestandteile, genetische und wirtsspezifische physiologische
Faktoren sowie die Nährstoffversorgung des Organismus beeinflusst, wobei diese SLAMENGHI-Faktoren8 interdependent sind [Canene-Adams und Erdman 2009].
Bedingt durch die strukturellen und chemisch-physikalischen Eigenschaften werden je nach
Carotinoid (Species of carotenoid) maximal 50 - 70 % der über die Nahrung zugeführten
Menge vom Körper resorbiert [Watzl und Bub 2001]. Bei Hühnern werden Xanthophylle aufgrund der höheren Polarität effizienter ins Blut absorbiert und im Eigelb deponiert als Carotine [Karadas et al. 2005; Na et al. 2004; Nys 2000]. Daher ist die Depositionseffizienz von
Lutein und Zeaxanthin im Eigelb mit je ca. 23 % deutlich höher als bei - und -Carotin (je
ca. 0,5 %) [Hammershoj et al. 2010]. Ihre geringere Aggregationsneigung und bessere Löslichkeit im Vergleich zu all-E-Isomeren führen dazu, dass Z-Isomere bevorzugt in Mizellen
und Chylomikronen inkorporiert und leichter absorbiert und transportiert werden [CaneneAdams und Erdman 2009; Boileau et al. 1999]. Nach Hencken (1992) absorbieren Legehennen freies Lutein effizienter als dessen Mono- und Diester. Vermutlich aufgrund der höheren
Aggregationsneigung ist aber die Absorption unveresterten Luteins geringer im Vergleich zu
den hydrophoberen Luteinestern [Philip et al. 1976], die in den Futterpflanzen vorkommen.
In natürlichen Matrizes beeinflussen Aggregierungen, Kristallisationen und Wechselwirkungen mit Matrixkomponenten (Linkages) die Carotinoid-Bioverfügbarkeit. Letztere ist daher
im Vergleich zu Extrakten und synthetischen Formulierungen aus natürlichen Matrizes meist
geringer [Canene-Adams und Erdman 2009; van het Hof et al. 2000]. Da Carotinoide in
Chloroplasten mit Chlorophyll als Pigment-Protein-Komplexe gebunden sind [Britton 1995],
ist die Bioverfügbarkeit von -Carotin bei grünem Blattgemüse geringer als bei Karotten, bei
denen es in den Chromoplasten gelöst und kristallin vorliegt [van het Hof et al. 2000].
Entsprechend dem Konzentrationsgradienten zwischen den Gallensäure-Mizellen und der
Enterozyten-Membran gelangen Carotinoide durch passive Diffusion in die Mukosazellen.
Bei hohen Mengen (Amount of carotenoids) kommt es zu einem carotinoidspezifischen
Sättigungseffekt der Membran. [Parker 1996]
8
Species of carotenoid; Linkages at the molecular level; Amount of carotenoids; Matrix; Effectors;
Nutrient status; Genetic; Host-related factors; Interactions among these variables
28
Stand der Forschung
Daher sinkt die Lutein-Depositionsrate aus dem Futter ins Eigelb bei vierfach höherer Supplementierung von 10 % auf 2 bis 3 % [Hammershoj et al. 2010; Leeson und Caston 2004; Na
et al. 2004]. Zudem beeinflussen Carotinoide einander bei der Mizellen-Inkorporation, der
Absorption, dem Transport und der Akkumulation [Su et al. 2002; van het Hof et al. 2000;
Furr und Clark 1997; Gärtner et al. 1996]. Aufgrund inhibitorischer Effekte bei der Inkorporation in Mizellen und Chylomikronen ist die humane Plasmaresponse von Canthaxanthin um
fast 40 % [White et al. 1994] und die Lutein-Konzentration im Blut um 54 - 61 % bei gleichzeitiger Gabe einer äquivalenten Menge an -Carotin verringert [Kostic et al. 1995].
Die Veränderung der Lebensmittelstruktur (Matrix) durch Reifungsprozesse, mechanische
und thermische Einflüsse, die Zerkleinerung im oberen Verdauungstrakt, die Magensäure
und die enzymatische Zersetzung beeinflusst die Carotinoid-Bioverfügbarkeit [Ternes 2008a;
Watzl und Bub 2001]. Die verbesserte Bioverfügbarkeit aus verarbeiteten Lebensmitteln ist
durch den Gewebeaufschluss, die verringerte Partikelgröße, die Oberflächenvergrößerung
und die Freisetzung der Carotinoide aus intrazellulären Organellen, Bindungen und Komplexierungen mit anderen Matrixbestandteilen wie Proteinen, Lipiden und Membranen bedingt.
Daher ist die Lycopin-Bioverfügbarkeit bei Tomatenpaste, Tomatensaft oder Ketchup höher
als bei rohen Tomaten. [Canene-Adams und Erdman 2009]
Matrixbestandteile (Effectors) beeinflussen die Mizellen-Inkorporation und Absorption von
Carotinoiden. Einfach ungesättigte Fettsäuren können die Absorption im Gegensatz zu
mehrfach ungesättigten verbessern, und Phytosterole konkurrieren mit Carotinoiden bei der
Mizellen-Inkorporation [Canene-Adams und Erdman 2009]. Ballaststoffe können die Mizellenbildung durch die Adsorption von Gallensalzen und Carotinoiden und die Bildung kolloidaler Gelphasen stören, die zudem den Kontakt der Mizellen mit der Mukosa und damit die
Carotinoid-Absorption vermindern [Parker 1996]. Daher sind die Lutein-Gehalte in Eigelb bei
hohen Weizenanteilen im Futter gering [Hammershoj et al. 2010].
Die Biokonversion von Carotinoiden mit Vitamin A-Aktivität in der Dünndarmmukosa und
deren Deposition im Eigelb korrelieren neben spezies- und wirtsspezifischen Faktoren mit
der Vitamin A-Versorgung (Nutrient status) [Hammershoj et al. 2010].
Aufgrund des genetisch bedingt (Genetic) effizienten Carotinoid-Metabolismus [Britton et al.
2009b] akkumulieren Hühner bei gleicher Futtergabe im Vergleich zu Enten, Gänsen und
Truthähnen ca. die doppelte Menge an Carotinoiden im Eigelb und in der Leber [Surai et al.
1998]. Bedingt durch den speziesspezifischen Transport aus dem Dünndarm in die Ovarien
[Hammershoj et al. 2010] akkumulieren Wildvögel-Carotin in höherem Ausmaß im Eigelb
(25 - 29 % des Gesamtcarotinoidgehalts) als Hühner (ca. 8 % des Gesamtcarotinoidgehalts)
[Surai et al. 2003, 2001].
29
Auch wirtsspezifische Faktoren (Host-related factors) wie der Gesundheitszustand haben
einen Einfluss auf die Carotinoid-Bioverfügbarkeit. Verursacht durch die gestörte gastrointestinale Funktion und eine Konkurrenzbeziehung verringern parasitäre Infektionen meist die
Ingestion und Deposition von Carotinoiden [Canene-Adams und Erdman 2009] wie bei der
durch Kokzidien9 bedingten Gewebeentfärbung, dem sog. pale-bird-Syndrom [Blount und
McGraw 2008].
2.8 Physiologische Wirkungen von Carotinoiden
Für die Humangesundheit sind die Vitamin A-Aktivität einiger Carotinoide und deren antioxidative Eigenschaften von Bedeutung. Die biologischen Wirkungen der Carotinoide werden
nach Funktionen, Aktionen und Assoziationen unterschieden [Britton 2008a]. Funktionen
sind für die Gesundheit essentielle Eigenschaften der Carotinoide wie z. B. die Vitamin AAktivität. Aktionen wie die antioxidative Wirkung basieren auf einer applikationsinduzierten
biologischen Response [Bendich und Olson 1989]. Bei Assoziationen wie inversen Korrelationen zwischen der Carotinoid-Aufnahme und dem Risiko spezifischer Krankheiten besteht
wahrscheinlich kein kausaler physiologischer Effekt [Bendich und Olson 1989].
In Säugetieren dienen ca. 50 Carotinoide als Vorläufersubstanzen für Vitamin A [RodriguezAmaya 1997], wobei ernährungsbedingt vor allem - und -Carotin und -Cryptoxanthin von
Bedeutung sind [Watzl und Bub 2001]. Zur Umwandlung durch die zentrale Spaltung mittels
-Carotin-15,15´-Oxygenase oder die exzentrische Spaltung mittels -Carotin-9,10-Oxygenase [Britton 2008b; Wyss und von Lintig 2008] müssen Carotinoide einen unsubstituierten Iononring mit einer C11-Polyenkette aufweisen, weshalb die Vitamin-A-Aktivität von -Carotin
mit zwei -Iononringen am höchsten ist [Rodriguez-Amaya 2001]. Vitamin A und die Retinoide 11-Z-Retinal, all-E- und 9-Z-Retinolsäure sind für den Sehprozess, das Wachstum, die
Zelldifferenzierung, die reproduktive Effizienz, die Embryonalentwicklung, die Regulation der
Genexpression sowie die Integrität des Epithelgewebes wichtig [EFSA 2010a; Chew und
Soon Park 2009; Tang und Russell 2009; Britton 2008b; EFSA 2008; Kasper 2004].
Da Carotinoide freie Radikale abfangen, angeregte Moleküle in den energetischen Grundzustand bringen und kurzwellige Strahlung absorbieren, dient die Akkumulation von Lutein und
Zeaxanthin in der Makula lutea (Gelber Fleck) dem Schutz der Photorezeptormembranen vor
Oxidationen [Schalch et al. 2009; Britton 2008a].
9
Wirtsspezifische einzellige Darmparasiten
30
Stand der Forschung
Eine reduzierte makulare Pigmentdichte stellt daher den Hauptrisikofaktor der genetisch disponierten, altersbedingten Makuladegeneration (ARMD, Age-Related Macula Degeneration)
dar. Eine Anreicherung an Lutein und Zeaxanthin in der Netzhaut kann die ARMDPathogenese positiv beeinflussen [Beatty et al. 2001]. Daher korrelieren hohe Plasmakonzentrationen an Lutein und Zeaxanthin signifikant mit einem geringeren Risiko einer altersbedingten Makulopathie10 [POLA 2006], und die infolge der Lutein-Zufuhr erhöhte makulare
Pigmentdichte verbessert die Sehfunktion bei ARMD-Patienten signifikant [Stringham und
Hammond 2008; LAST 2004; Wooten und Hammond 2002].
In den frühen Stadien der Pathogenese von Tumorerkrankungen spielen oxidative Schädigungen auf molekularer Ebene eine Rolle, die durch Reaktionen der Carotinoide mit Radikalen reduziert werden [Palozza et al. 2009]. Zudem wird der karzinoprotektive Effekt einiger
Carotinoide mit der Erhöhung der Gap-Junctions-Kommunikation durch Stimulation der mRNA-Expression des Proteins Connexin 43 erklärt, das als kanalartige Verbindung zwischen
den Zellen die Signalübertragung reguliert [Wang 2009; Watzl und Bub 2001; Zhang et al.
1991]. Studien zeigen inverse Korrelationen zwischen dem Bronchialkarzinom-Risiko und
der Aufnahme von -Cryptoxanthin, Lutein, Lycopin, - und -Carotin [Rock 2009] sowie der
Lycopin-Aufnahme und der Schädigung der Leukozyten-DNA bei ProstatakarzinomPatienten [Yeum et al. 2009].
Neben der antioxidativen Schutzwirkung bei Immunzellen werden immunstimulierende Wirkungen von Carotinoiden im Kontext der Proliferation und Aktivierung von Lymphozyten, der
phagozytotischen Zellaktivität und der Bildung von Zytokinen11 diskutiert [Chew und Soon
Park 2009; Castenmiller und West 1998; Stracke et al. 2009]. Mit einem hohen Plasma-Carotinstatus korrelieren ein erhöhter Anteil an T-Lymphozyten [Watson et al. 1991], eine
gesteigerte Aktivität der T-Killerzellen bei älteren Männern (65 - 86 Jahre) [Santos et al.
1996] und eine verringerte Inzidenz akuter Atemwegsinfektionen bei älteren Menschen (60
Jahre und älter) [van der Horst-Graat et al. 2004].
Carotinoide können Lipoproteine vor Oxidationen schützen [Johnson und Krinsky 2009]. Dies
ist hinsichtlich der LDL-Oxidation von Bedeutung, die zusammen mit Verletzungen der vaskulären Endothelzellen zu arteriosklerotischen Veränderungen der Intima und einem gesteigerten Herzinfarktrisiko führt. Daher sind die Intima-Media-Verdickung12 und die PlasmaLutein-Konzentration invers assoziiert [LAAS 2001]. Zudem verringert die Supplementierung
von Lycopin durch eine tomatenbasierte Diät bei Patienten der Koronaren Herzkrankheit
(KHK) die Lipidperoxidationsrate [Bose und Agrawal 2007].
10
Makulaveränderung, bei der ein fortschreitender Gewebeabbau zur Makuladegeneration führt
Peptidbasierte Botenstoffe wie Interleukine und Interferone
12
Zunahme der inneren und mittleren Schicht der Arteriengefäßwand
11
31
Durch ihre antioxidativen Eigenschaften und die verminderte Penetration kurzwelliger Strahlung schützen in der Epidermis akkumulierte Carotinoide die Haut vor Photoschäden [Goralczyk und Wertz 2009; Wingerath et al. 1998]. Eine ausreichende Aufnahme an -Carotin und
Lycopin vermindert daher die Lipidperoxidation und erhöht die minimale zur Bildung von
Hautrötungen nötige UVB-Dosis [Sies und Stahl 2004; Césarini et al. 2003].
Die Wirkungen von Carotinoiden auf die Humangesundheit sind aufgrund inkonsistenter Ergebnisse und der unzureichenden Kausalität der meist epidemiologischen Studien von der
European Food Safety Authority (EFSA) nicht anerkannt [EFSA 2012; EFSA 2011a,b,c,d;
EFSA 2010a,b]. Die kontrollierte Supplementierung bei Interventionsstudien erlaubt eine
kausale Aussage zum physiologischen Effekt einer Substanz, wobei die Ergebnisse aufgrund der meist höheren Bioverfügbarkeit und höheren Mengen der Carotinoide bei Supplementen nicht direkt auf Lebensmittel übertragbar sind [Schalch et al. 2009].
2.9 Analytik von Carotinoiden
Die chemisch-physikalischen Eigenschaften der Carotinoide bestimmen die Vorgehensweise
bei der Probenaufbereitung und -analyse, was Schutzmaßnahmen zur Vermeidung von ZIsomerisierungen und oxidativen Degradationen wie die Verminderung von Einflüssen durch
Licht und Sauerstoff, den Zusatz von Antioxidantien und säureneutralisierenden Agenzien,
die Einhaltung geringer Temperaturen und die Vermeidung metallischer Materialien einschließt [Rodriguez-Amaya 2001; Hart und Scott 1995]. Grundsätzlich reduziert eine schonende Probenaufbereitung mit wenigen Arbeitsschritten Fehler- und Verlustquellen.
Um Degradationen der Carotinoide durch freigesetzte Radikale zu verringern, sollte die Homogenisierung der Matrix direkt vor der Extraktion erfolgen [Rodriguez-Amaya 2001; Schiedt
und Liaaen-Jensen 1995]. Die alkalische Hydrolyse (Verseifung) dient dem Aufschluss komplexer fett- und proteinhaltiger Matrizes, in denen die Penetration des Extraktionslösungsmittels vermindert ist, und der Freisetzung von Carotinoiden aus Assoziationen mit lipophilen
Matrixkomponenten [Yue et al. 2006; Rodriguez-Amaya 2001; Schiedt und Liaaen-Jensen
1995]. Da Lutein in der Eigelb-Matrix stark gebunden ist und diese durch das Lösungsmittel
nicht vollständig aufgeschlossen wird, erhöht die Verseifung die Lutein-Ausbeute bei der Extraktion [Yue et al. 2006]. Gleichzeitig induzieren hohe Temperaturen und Einflüsse durch
Licht und Sauerstoff besonders bei Dihydroxycarotinoiden wie Lutein und Zeaxanthin Isomerisierungen und Degradationen [Khachik 2009; Britton et al. 2004; Schiedt und LiaaenJensen 1995]. Bei der Zugabe hoher Mengen an 10 %iger (w/v) Natriumhydroxid-Lösung
verringert sich daher die Extraktionsausbeute von Lutein aus Eigelb [Yue et al. 2006].
32
Stand der Forschung
2.9.1 Probenaufbereitung und Extraktion
In der Carotinoid-Analytik erfolgt die Probenaufbereitung traditionell mit Hilfe der FlüssigFlüssig-Extraktion (LLE, Liquid-Liquid-Extraction), bei der die Wahl des Lösungsmittels mit
den Eigenschaften der Analyten und des Probenmaterials in Zusammenhang steht. Die lipophilen Carotinoide sind gut mit organischen Lösungsmitteln extrahierbar, wobei sich für Xanthophylle Ethanol, Methanol und Aceton und für schwerlösliche, kristalline Carotinoide Toluol
und Dichlormethan eignen [Belitz et al. 2008]. Zur Extraktion unterschiedlich polarer Carotinoide dienen Lösungsmittelgemische, wobei der Einsatz wassermischbarer organischer
Lösungsmittel bei wässrigen Proben die Extraktion der Carotinoide aus der Matrix erhöht
[Khachick 2009; Schiedt und Liaaen-Jensen 1995]. Gemäß dem nach Nernst für ein bestimmtes Phasensystem spezifischen Verteilungsgleichgewicht des Analyten zwischen dem
Extraktionslösungsmittel und der Probe ist die mehrmalige Extraktion mit geringen Lösungsmittelmengen effizient, wobei sich zur Extraktion von Carotinoiden eine dreifache Wiederholung bis zur Farblosigkeit von Extrakt und Raffinat bewährt hat [Rodriguez-Amaya 2001;
Schiedt und Liaaen-Jensen 1995].
Die Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD) ist ein etabliertes Extraktionsverfahren in der Lebensmittel-, Naturstoff-, Rückstands- und klinischen Analytik, das sich durch eine schnelle
und schonende Aufbereitung fester, hochviskoser und komplexer, schwer zugänglicher Matrizes auszeichnet [Karasová et al. 2003]. Die MSPD eignet sich daher zur Extraktion von
Lutein und Zeaxanthin aus Spinat und Retina [Glaser 2001; Dachtler 2000].
Bei der MSPD werden die Proben mit einem Sorbens ca. 30 bis 60 s homogenisiert, wobei
die Matrix aufgeschlossen wird und die Matrixbestandteile in Abhängigkeit ihrer Polarität
über die Sorbensoberfläche verteilt und unter Bildung einer chromatographischen Phase
gebunden werden [Karasová et al. 2003]. Zur Isolierung lipophiler Stoffe dienen als Sorbens
meist Feststoffe auf Kieselgelbasis mit gebundenen C18- oder C30-Phasen. Die zu einem homogenen Säulenbett komprimierte chromatographische Phase wird zur Entfernung polarer
Verunreinigungen mit Wasser oder Puffern gewaschen. Mit geringen Mengen unterschiedlich
polarer Lösungsmittel werden die Matrixkomponenten anschließend entsprechend ihrer chemisch-physikalischen Eigenschaften selektiv eluiert. [Barker 2000] Das Sorbens sollte eine
Kohlenstoffbeladung zwischen 8 - 18 % und eine Partikelgröße zwischen 40 - 60 µm aufweisen, da Partikeldurchmesser unterhalb 20 µm die Flussrate bei der Elution verringern [Karasová et al. 2003].
Gegenüber der Solid Phase Extraction (SPE, Festphasenextraktion), die auf der Einstellung
des stoffspezifischen Adsorptionsgleichgewichts des Analyten zwischen der stationären
Phase und dem eluierenden Lösungsmittel basiert, zeichnet sich die MSPD durch eine höhere Extraktionseffizienz aus.
33
2.9.2 Chromatographische Trennung mittels HPLC
In der Analytik von Carotinoiden wird aufgrund der guten Trennergebnisse und der hohen
Reproduzierbarkeit bevorzugt die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC, High
Performance/Pressure Liquid Chromatography) eingesetzt [Pfander und Riesen 1995]. Bei
der HPLC werden die Analyten basierend auf der Adsorption an der meist festen stationären
Phase und der Desorption durch Wechselwirkungen mit der mobilen Phase (Eluent) entlang
der Chromatographiestrecke transportiert (Elution). Die temperatur- und zeitabhängige Einstellung des Adsorptionsgleichgewichts ist durch die chemisch-physikalischen Eigenschaften
der stationären und mobilen Phase sowie des Analyten und dessen Konzentration und die
Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase beeinflusst und bedingt die Trennung der Analyten
[Gottwald und Stieglitz 1996].
Da die Säulenstrecke, über die sich das Adsorptionsgleichgewicht einstellt, einer theoretischen Trennstufe entspricht, korreliert die Trennleistung mit den Säulenabmessungen.
Die Polarität, Partikelgröße, Partikelgrößenverteilung, Kohlenstoffbeladung und der Porendurchmesser beeinflussen die Aktivität der stationären Phase bei der Adsorption der Analyten. Die Verringerung des Porendurchmessers und der Partikelgröße erhöht die Trennleistung aufgrund der größeren Oberfläche zur Einstellung der Adsorptionsgleichgewichte. Der
gleichzeitige Druckanstieg und die verlängerte Retention bedingen dabei eine Peakverbreiterung, welche die Auflösung verringern kann. Die Trennleistung ist umso reproduzierbarer, je
enger die Partikelgrößenverteilung ist.
In der Carotinoid-Analytik eignen sich stationäre Phasen mit 200 Å Porendurchmesser und
einer Oberfläche von 200 m2/g, wobei bevorzugt Kieselgele eingesetzt werden, deren Silanol-Gruppen durch Bindung von Octyl-, Octadecyl- oder Triacontyl-Alkylresten modifiziert
sind [Sander et al. 2000; Pfander 1995]. Die Silanisierung der polaren Kieselgeloberfläche
führt zur Umkehrung der Polarität. Da unpolare Analyten stärker von den unpolaren RPPhasen (Reversed Phase) retardiert werden, eluieren die Carotinoide mit abnehmender Polarität [Khachik 2009; Rodriguez-Amaya 2001; Gottwald und Stieglitz 1996]. Die chemische
Inertheit von RP-Phasen vermeidet Degradationen der Carotinoide bei der chromatographischen Trennung weitgehend [Pfander 1995].
Bei den mit Monochlorsilan hergestellten monomeren RP-Phasen ist die Reproduzierbarkeit
höher als bei den mittels Trichlorsilan synthetisierten polymeren RP-Phasen, die aufgrund
des größeren Porendurchmessers und der daher verringerten Retention eine höhere Selektivität bei der Trennung geometrischer Isomere aufweisen [Rodriguez-Amaya 2001; Sander et
al. 2000; Pfander 1995; Epler und Sander 1992].
34
Stand der Forschung
Da die Modifizierung der Silanol-Gruppen aus sterischen Gründen nur an der Oberfläche
möglich ist, weist die RP-Phase polare und unpolare Bereiche auf. Das Ausmaß der Alkylierung beeinflusst die Retentionsstärke der stationären Phase und damit die Auflösung bei der
Trennung der Analyten und wird durch die Kohlenstoffbeladung ausgedrückt [Sander et al.
2000; Pfander 1995]. Die Oberflächenvergrößerung mit zunehmender Kohlenstoffbeladung
erhöht die Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase und verlängert die Retention. Für polare Carotinoide sollte die Kohlenstoffbeladung mindestens 18 % betragen
[Sander et al. 2000]. Bei der Nachbehandlung der RP-Phasen durch Endcapping (sekundäre
Alkylierung) werden freie Silanolgruppen mittels Trimethylchlorsilan methyliert. Dies verringert polare Wechselwirkungen mit dem Analyten und beschleunigt die Elution, was die Säulenreproduzierbarkeit und Peaksymmetrie verbessert, aber die Auflösung verringern kann
[Khachik 2009; Rodriguez-Amaya 2001].
Bei der Elution eines Lutein-Zeaxanthin-Standardgemischs auf einer C30-Säule ohne Endcapping (Abb. 2-9, links) bedingen die Wechselwirkungen freier Silanolgruppen mit den Hydroxylgruppen von Lutein und Zeaxanthin mit Ausnahme der Überlagerung von 13-ZZeaxanthin durch all-E-Lutein eine Basislinientrennung der Stereoisomere [Glaser 2001].
Das Endcapping (Abb. 2-9, rechts) führt zur retardierten Elution der 13-Z-Isomere, Coelution
der all-E-Isomere und hochselektiven Trennung der 13-Z- und 9-Z-Isomere [Glaser 2001].
1 = 13-Z-Lutein
2 = 13`-Z-Lutein
3 = 13-Z-Zeaxanthin
4 = all-E-Lutein
5 = all-E-Zeaxanthin
6 = 9-Z-Lutein
7 = 9´-Z-Lutein
8 = 9-Z-Zeaxanthin
Abb. 2-9:
Stereoisomerentrennung eines Lutein-Zeaxanthin-Standardgemischs auf einer C 30-Phase
ohne (links) und mit (rechts) Endcapping [Glaser 2001]
Aufgrund der langen Polyenkette der Carotinoide spielt für die Selektivität bei der Trennung
auf der stationären Phase die Länge der gebundenen Alkylkette eine Rolle. Im Gegensatz zu
Triacontyl-Phasen (C30-Phase) ist die Selektivität von Octadecylsilan-Phasen (C18-Phasen),
die zur Trennung verschiedenartiger Carotinoide geeignet sind, bei den strukturell ähnlichen
Carotinoid-Stereoisomeren häufig nicht ausreichend [Khachik 2009; Dachtler 2000; Pfander
und Riesen 1995; Sander et al. 1994]. Die hohe Selektivität der C30-Phase basiert auf der
größeren Filmdicke und den dadurch intensiveren Wechselwirkungen mit der Polyenkette
der Carotinoide im Vergleich zur C18-Phase (Abb. 2-10, links) [Sander et al. 2000].
35
Daher eignen sich C30-Phasen zur Trennung hydrophober, langkettiger Moleküle, die sich in
ihrer räumlichen Struktur unterscheiden, wie der all-E- und Z-Isomere von Lutein, Zeaxanthin
und -Carotin bei Spinat-Extrakt (Abb. 2-10, rechts) [Glaser 2001; Dachtler 2000].
-Carotin
C30
C18
Abb. 2-10:
Vergleich der Filmdicke einer C18- und einer C30-Phase mit der Moleküllänge von Carotin (links) [modifiziert nach YMC 2011] und Stereoisomerentrennung von Lutein, Zeaxanthin und -Carotin mit einer C30-Phase bei Spinat-Extrakt (rechts) [Dachtler 2000]
Zur Beeinflussung des Adsorptionsgleichgewichts können die Säulentemperatur und die Zusammensetzung und Fließgeschwindigkeit des Eluenten variiert werden.
Aufgrund der höheren Beweglichkeit der Triacontylketten und der exothermen Adsorption der
Analyten begünstigt eine höhere Säulentemperatur die Desorption, was die Retentionszeiten
der Analyten verringert [Sander et al. 2000]. Da die stoffspezifischen Adsorptionsgleichgewichte in unterschiedlichem Ausmaß durch Temperaturveränderungen beeinflusst sind, kann
eine Variation der Säulentemperatur die Auflösung und Selektivität beeinflussen. Aufgrund
von Isomerisierungen und Degradationen der Carotinoide und der Flüchtigkeit von Komponenten der mobilen Phase dürfen die Säulentemperaturen nicht zu hoch sein.
Die Elutionskraft der mobilen Phase korreliert mit der Aktivität der stationären Phase und der
Polarität des Analyten. Bei der RP-HPLC sinkt die Elutionskraft mit steigender Polarität der
mobilen Phase. Daher führt ein zunehmender Wassergehalt des Eluenten zu längeren Retentionszeiten [Dachtler 2000; Gottwald und Stieglitz 1996], was bei zu früh eluierenden und
schlecht getrennten Analyten von Vorteil ist. Als primäres Lösungsmittel des Eluenten eignet
sich in der Carotinoid-Analytik Methanol in Kombination mit Modifiern geringerer Polarität wie
Tetrahydrofuran (THF), Methyl-tert-butylether (MTBE), Hexan, Ethylacetat oder Aceton, deren Anteil zur Benetzung der C30-Phasen mindestens 20 % betragen sollte. Bei der Trennung
unterschiedlich polarer Carotinoide ist der Eluent meist ein Lösungsmittelgemisch oder die
Elution erfolgt gradientisch mit sich ändernder Eluentenzusammensetzung. Während sich die
gradientische Elution durch eine hohe Auflösung bei der Trennung auszeichnet, resultiert
aus der konstanten Eluentenkomposition bei der isokratischen Elution eine höhere Reproduzierbarkeit.
36
Stand der Forschung
Eine verringerte Flussrate verlängert die Retention der Analyten, was das Peakprofil zu Lasten der Auflösung und Selektivität verbreitert. Aufgrund der zunehmenden strömungs- und
pumpenbedingten Pulsationen ist zudem ein erhöhtes Grundrauschen bei geringen Flussraten unvermeidbar. Eine hohe Flussrate kann aufgrund der verkürzten Retention der Analyten
die Peaksymmetrie verbessern und die Peakformen schmälern, was die Auflösung und Selektivität erhöhen kann. Da sich eine Veränderung der Flussrate in unterschiedlichem Ausmaß auf die spezifischen Adsorptionsgleichgewichte der Analyten auswirkt, können die Auflösung und Selektivität höher oder geringer werden.
Bei der Entwicklung einer für das Trennproblem geeigneten HPLC-Analyse-Methode wird
häufig Bezug zu Vorgehensweisen ähnlicher Fragestellungen und Matrizes in der Literatur
genommen [Rodriguez-Amaya 2001]. Dabei zielt die Optimierung der Analyseparameter auf
die Gewährleistung einer ausreichend hohen Selektivität bei der chromatographischen Trennung um Fehler bei der Identifikation und Quantifizierung zu vermeiden.
2.9.3 Identifizierung
Zur Identifizierung von Carotinoiden wird die Überprüfung der Kriterien Chromatographie,
UV/Vis-Spektralphotometrie und Massenspektrometrie empfohlen [Rodriguez-Amaya 2001].
Chromatographisches Verhalten
Das chromatographische Verhalten korreliert mit den chemisch-physikalischen und strukturellen Eigenschaften der Carotinoide und der stationären Phase [Rodriguez-Amaya 2001].
Bei der Stereoisomerentrennung von Lutein und Zeaxanthin auf einer C30-Säule ohne Endcapping eluieren die 13-Z-Isomere vor der all-E-Konfiguration, gefolgt von den 9-Z-Isomeren,
und die Lutein-Isomere eluieren stets vor Zeaxanthin (Abb. 2-9, links und 2-10) [Glaser 2001;
Dachtler 2000]. Bei einer C30-Säule mit Endcapping eluieren die 13-Z- und 9-Z-Isomere von
Lutein und Zeaxanthin nach den all-E-Isomeren (Abb. 2-9, rechts) [Glaser 2001], was sich für
die all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in Eigelb bei Wenzel (2010) bestätigt.
Aufgrund der Systemabhängigkeit sind in der Literatur beschriebene Elutionssequenzen mittels Standardsubstanzen zu prüfen [Khachik 2009]. Zur Erfassung von Veränderungen bei
der Elution durch Wechselwirkungen mit Matrixkomponenten müssen die Retentionszeiten
der Carotinoide im Probenextrakt mit denen in Standardlösungen verglichen werden. Zudem
darf es bei Proben, die mit der Standardsubstanz des Analyten aufgestockt sind, nicht zur
Auftrennung des Peakprofils kommen.
37
UV-Vis-Spektralphotometrie
Da Carotinoide mit ähnlichen chemisch-physikalischen Eigenschaften coeluieren können,
basiert die Identifizierung zusätzlich auf den UV/Vis-Absorptionsspektren, die das Chromophor13 anhand der Absorptionsmaxima und der Schwingungsfeinstruktur repräsentieren und
durch den Vergleich mit der Standardsubstanz zu bestätigen sind.
Das delokalisierte -Elektronensystem der Polyenkette bedingt die farbgebenden Eigenschaften der Carotinoide, für die mindestens sieben konjugierte Doppelbindungen nötig sind
[Rodriguez-Amaya 2001; Kohler 1995]. Durch Absorption von Lichtenergie gehen -Elektronen aus dem elektronischen Grundzustand, d. h. der Elektronenstruktur geringster Energie, in die Anregungskonfiguration geringster Energie über [Frank und Christensen 2008;
Britton 1995; Kohler 1995], was die Hauptabsorptionsbande im Spektrum der Carotinoide
verursacht.
Da die für die Elektronenübergänge benötigte Anregungsenergie aufgrund der langen konjugierten Doppelbindungssysteme der Carotinoide gering ist, tritt die Hauptabsorptionsbande
im gelben bis roten Spektralbereich zwischen 400 und 500 nm auf.
Die Hauptabsorptionsbande zeigt ein 3-Finger-Spektrum, das aus dem mittleren, der Wellenlänge maximaler Absorption (max) entsprechenden Hauptmaximum II und den beiden Nebenmaxima (I) und (III) besteht. Die entsprechenden Wellenlängen korrelieren mit der Anzahl
konjugierter Doppelbindungen [Belitz et al. 2008]. Die Schwingungsfeinstruktur (spektrale
Feinstruktur, %III/II) beschreibt das prozentuale Verhältnis der Höhen der Absorptionsmaxima III/II (Abb. 2-11). Die Absorptionsintensität korreliert mit der Carotinoid-Konzentration und
bildet die Basis für die Quantifizierung.
LUTKalib a Tuning Dez2011-MSTUne1
Test00617 3398 (5.763)
06-Dec-2011
00:44:57
II = max
444.25
Absorption
1.0e-1
[AU]
2: Diode Array
1.126e-1
III
1.1e-1
473.25
9.0e-2
422.25
8.0e-2
I
AU
7.0e-2
6.0e-2
5.0e-2
4.0e-2
I
3.0e-2
2.0e-2
1.0e-2
0.0
Abb. 2-11:
13
all-trans-Lutein
275
300
325
350
375
400
425
450
475
500
525
550
575
nm
600
Wellenlänge [nm]
Ermittlung der Schwingungsfeinstruktur (%III/II) bei all-E-Lutein mit Kennzeichnung der
Absorptionsmaxima (I, II, III)
Konjugierter, ungesättigter Molekülteil, der die Lichtabsorption im sichtbaren Bereich bedingt
38
Stand der Forschung
Die lichtabsorbierenden Eigenschaften der Carotinoide werden durch Endgruppen, funktionelle Gruppen, geometrische Isomerisierungen, Lösungsmittel, die Temperatur und Bindungsmechanismen beeinflusst. Dabei kommt es zu Verschiebungen der Absorptionsmaxima zu längeren (bathochrom) oder kürzeren (hypsochrom) Wellenlängen sowie Zunahmen
(hyperchrom) oder Abnahmen (hypochrom) der Absorptionsintensität.
Bei -Ring-Carotinoiden ist die konjugierte endozyklische 5,6-Doppelbindung aufgrund der
sterischen Hinderung zwischen dem Methylsubstituenten am C5-Atom des Ringes und dem
H-Atom am C8-Atom der Kette nicht coplanar mit der Polyenkette [Britton 1995]. Daraus resultiert neben dem hypochromen Effekt und der verringerten Schwingungsfeinstruktur eine
hypsochrome Verschiebung der Absorptionsmaxima im Vergleich zu azyklischen Carotinoiden mit gleicher Anzahl konjugierter Doppelbindungen wie am Beispiel von -Carotin
(max,Hexan 450 nm) und Lycopin (max,Hexan 470 nm) deutlich wird [Belitz et al. 2008; Rodriguez-Amaya 2001; Kohler 1995]. Aufgrund der isolierten Doppelbindung in -Ringen ist max
von -Carotin und Lutein gegenüber -Carotin und Zeaxanthin in Abhängigkeit des Lösungsmittels um ca. 3 - 7 nm hypsochrom verschoben [Britton et al. 2004; Britton 1995]. Zudem ist die Schwingungsfeinstruktur bei Zeaxanthin (25 bzw. 26 %III/II in Leichtpetroleum
bzw. Ethanol) aufgrund der symmetrischen Struktur geringer ausgeprägt als bei dem asymmetrischen Lutein-Molekül (60 %III/II). Dies gilt gleichermaßen für -Carotin (25 %III/II in Hexan bzw. Leichtpetroleum) und -Carotin (55 %III/II) [Glaser 2001; Britton 1995].
Mit der Polyenkette konjugierte Carbonylgruppen verlängern das Chromophor, wobei die
bathochrome Verschiebung von einer Verringerung der Schwingungsfeinstruktur begleitet
sein kann [Rodriguez-Amaya 2001; Britton 1995]. Da Hydroxylgruppen das Chromophor
nicht verändern, sind die Absorptionsspektren von Carotinen und deren Hydroxyderivaten
wie von -Carotin und Zeaxanthin sowie -Carotin und Lutein identisch [Britton 1995]. Die
Addition einer Epoxy-Gruppe an eine konjugierte Ring-Doppelbindung verkürzt das Chromophor, weshalb 5,6-Monoepoxide 5 nm und 5,6,5´,6´-Diepoxide 10 nm unterhalb des Absorptionsmaximums des Vorläufercarotinoids absorbieren [Rodriguez-Amaya 2001].
Gegenüber den all-E-Konfigurationen weisen die Absorptionsspektren der Z-Isomere aufgrund der geringeren molaren Extinktionskoeffizienten einen hypochromen Effekt und eine
verringerte Schwingungsfeinstruktur auf. Zudem treten in Abhängigkeit der Chromophorlänge hypsochrome Verschiebungen des Absorptionsmaximums max auf, die bei mono-ZFormen meist 2 - 6 nm betragen. Der Symmetrieverlust der Elektronenstruktur bei ZIsomeren resultiert in der zusätzlichen charakteristischen Absorption als sog. Z-Bande in der
Nähe des UV-Bereichs, die ca. 142 nm unterhalb des in Hexan gemessenen Absorptionsmaximums III des all-E-Isomers auftritt. [Liaaen-Jensen und Lutnœs 2008; Britton 1995]
39
Die relative Intensität der Z-Bande (%AB/AII) entspricht deren prozentualem Anteil an der
Absorptionsintensität des Hauptabsorptionsmaximums II (Abb. 2-12) und ist am größten,
wenn sich die Z-Doppelbindung nahe des Molekülzentrums befindet [Rodriguez-Amaya
2001; Liaaen-Jensen 1995]. Mit zunehmender Anzahl an Z-Bindungen sinkt die Intensität der
Z-Bande.
Zeaxanthin-Stammloesung 1
QLC 9094
11-Jan-2012
08:38:04
Test00738 14226 (23.810)
1.3e-2
Absorption
[AU]
1.2e-2
445.25
1.1e-2
471.25
421.25
1.0e-2
Z-Bande
9.0e-3
336.25
AU
8.0e-3
7.0e-3
2: Diode Array
1.331e-2
260.25
6.0e-3
5.0e-3
4.0e-3
3.0e-3
AB
2.0e-3
250
Abb. 2-12:
300
350
AII
400
450
504.25
500
nm
600
Wellenlänge [nm]
550
Bestimmung der relativen Intensität (%AB/AII) der Z-Bande bei 13-Z-Zeaxanthin
Das Lösungsmittel beeinflusst die stoffspezifischen molaren Extinktionskoeffizienten der Carotinoide und damit die Lage der Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande. Während
bei Aceton (2 - 6 nm), Chloroform und Dichlormethan (10 - 20 nm), Benzol, Toluol und Pyridin (18 - 24 nm) sowie Kohlenstoffdisulfid (30 - 40 nm) bathochrome Verschiebungen auftreten, sind die Absorptionsmaxima in Hexan, Diethylether, Ethanol, Leichtpetroleum, Methanol
und Acetonitril ähnlich [Britton 1995].
Bei geringen Temperaturen können bathochrome Verschiebungen unter Zunahme der
Schwingungsfeinstruktur auftreten [Britton 1995].
Aggregierungen und Wechselwirkungen von Carotinoiden mit Proteinen und Lipiden verändern die Absorption wie z. B. bei den bathochromen Verschiebungen der blauen und violetten Carotinoproteine [Britton 1995]. Die Absorptionsspektren einer Carotinoid-StandardLösung und eines Probenextrakts können sich daher unterscheiden [Britton et al. 2009a].
40
Stand der Forschung
Massenspektrometrie
Aufgrund der identischen Absorptionsspektren verschiedener Carotinoide mit gleichem
Chromophor [Britton 1995] kann eine massenspektrometrische Analyse die Identifizierung
absichern. Bei der Massenspektrometrie (MS) werden Ionen charakteristischer MasseLadungs-(m/z)-Verhältnisse erzeugt und mittels eines Elektrodenpotentials aus der Ionenquelle beschleunigt. Fokussiert durch elektrische Linsen (Skimmers) werden die Ionen zur
Trennung nach den m/z-Verhältnissen in das Hochvakuum des Massenanalysators geleitet,
dessen physikalisches Prinzip den Gerätetyp bestimmt [Universität Stuttgart 2004].
Beim Quadrupol-Massenfilter werden die Ionen in hochfrequenten elektrischen Wechselfeldern der Quadrupolstäbe durch Variation der Gleich- und Wechselspannung in Abhängigkeit
des m/z-Verhältnisses und der Ionengeschwindigkeit zu oszillierenden Schwingungen und
sinusförmigen Trajektorien (Flugbahnen) angeregt. Bei der Massenanalyse (Scan) passieren
je nach Wechselfeld nur Ionen bestimmter m/z-Verhältnisse, die auf stabilen Flugbahnen
oszillieren, den Massenfilter und gelangen zum Detektor.
Bei der HPLC-MS-Kopplung werden zur positiven Ionisierung meist Spray-Techniken wie die
Chemische Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionization) und die Elektrospray-Ionisierung (ESI, Electrospray Ionization) eingesetzt. Das HPLCEluat wird bei der APCI durch eine Kapillare pneumatisch in einen Stickstoffstrom zerstäubt
und das entstehende Aerosol (Spray) verdampft und mittels einer unter Hochspannung stehenden Koronanadel in ein Plasma überführt (Abb. 2-13).
Corona discharge
Analyte (M) and
solvent vapour
Tab. 2-2: Ionisierung bei der Chemischen Ionisation [modifiziert nach Lehmann
1996; Schröder 1991]
Protonierung
Hydridabstraktion
Abb. 2-13:
 + +  →  + 
+ +  →  − 
+
+
+
+ +
Anlagerung
+ +  →  + 
+
Ladungsaustausch
 + +  → +∎ + 
Aufbau eines Massenspektrometers (oben) und Ionisierung bei der APCI (unten links)
[modifiziert nach University of Bristol 2005] basierend auf den Prinzipien nach Tab. 2.2
41
Bei der Koronaentladung (corona discharge) entstehen positive Stickstoffionen (Primärionen), die mit den verdampften Lösungsmittelmolekülen kollidieren und Sekundärreaktantgasionen (X+/ XH+) wie H3O+ bilden (Abb. 2-13). Die Ionisierung der Analytmoleküle (M) basiert auf stoßinduzierten Wechselwirkungen mit den Sekundärreaktantgasionen (Tab. 2-2),
wobei hauptsächlich protonierte Molekülionen [M+H]+ entstehen [Lehmann 1996]. Da zur
Ionisierung polare Eluenten mit Wasser oder Methanol ausreichen, eignet sich die APCI zur
Ionisierung unpolarer Analyten wie von Carotinoiden. Die ESI, bei der die Ionisierung durch
ein elektrisches Feld induziert wird, sollte bevorzugt bei Analyten mit polaren, leicht ionisierbaren Gruppen eingesetzt werden [Glaser 2001; Dachtler 2000].
Die Überschussenergie der protonierten Molekülionen [M+H]+ verursacht Fragmentierungen
durch Umlagerungen und Bindungsspaltungen [Budzikiewicz 1998; Gottwald und Stieglitz
1996; Lehmann 1996]. Dabei steht das Molekülion mit dem Fragmentierungsmuster durch
spezifische Massendifferenzen in Zusammenhang [Lohninger et al. 2003; Schröder 1991],
wobei Schlüsselbruchstücke auf funktionelle Gruppen und Verbindungsklassen hinweisen
[Gottwald und Stieglitz 1996]. Die Art der Fragmentierung des Molekülions wird durch die
Lage der Atome im Molekül, deren Bindungsenergien, das Ionisierungspotential, die Stabilität der Fragmente und die Geschwindigkeitskonstante beeinflusst. Umlagerungen basieren
auf Spaltungen und Neubildungen von Bindungen und bedingen daher eine räumliche Nähe
der beteiligten Molekülbereiche. Da die Bindungsenthalpien weitgehend neutral sind, konkurrieren Umlagerungen häufig mit den endothermen Bindungsspaltungen und dominieren besonders bei niedrigen Überschussenergien [Budzikiewicz 1998].
Bei Carotinoiden entstehen infolge der Spaltung von Doppelbindungen in der Polyenkette
Fragmente wie Toluol (92 u), Xylol (106 u) und Dimethylcyclodecapentaen (158 u) [LiaaenJensen und Lutnœs 2008]. Ein Massenverlust des Molekülions von 56 u ist charakteristisch
für -Ring-Carotinoide wie Lutein. Endgruppen mit 5,6-Doppelbindungen wie in -Iononringen
verursachen häufig Ionen hoher Massen durch Bindungsspaltungen in der Polyenkette, während in Anwesenheit einer Hydroxyl-Gruppe wie bei Lutein und Zeaxanthin typische Massenverluste von 18 und 60 u auftreten [Enzell und Back 1995].
42
Stand der Forschung
Bei der Fragmentierung von Lutein und Zeaxanthin entstehen identische diagnostische Ionen
in unterschiedlichen Intensitäten. Die Zerfallssequenzen sind durch die Skelettumlagerung
gekennzeichnet, bei der neutrale Strukturteile eliminiert werden [Enzell und Back 1995]. Zu
Beginn spaltet dabei das an der Hydroxylgruppe protonierte Molekülion [M+H]+ m/z 569,5
das H2O-Massenäquivalent (18 u) ab. (Abb. 2-14) [Dachtler 2000].
m/z 569,5
- 18 (H2O)
m/z 551,5
- 18 (H2O)
m/z 533,5
Abb. 2-14:
585,5
- 18 (H2O)
567,5
- 18 (H2O)
549,5
601,5
- 18 (H2O)
583,5
- 18 (H2O)
565,5
Fragmentierungsschema von Lutein und Zeaxanthin [modifiziert nach Dachtler 2000]
Da die Hydroxyl-Gruppe im -Iononring bei Lutein allylisch (Abb. 2-7) gebunden ist und daher
mit den -Orbitalen der Doppelbindung des benachbarten Kohlenstoffatoms interagiert, erhöht die Allylspannung den Energiegehalt des Moleküls. Dies bedingt, dass bei Lutein die
H2O-Eliminierung des protonierten Molekülions dominiert. Daher zeigt sich im Massenspektrum von Lutein ein charakteristischer Basispeak (100 % Intensität) mit m/z 551,5 [M+HH2O]+. Dagegen weist das Molekülion [M+H]+ m/z 569,5 mit 14 % eine geringe Intensität auf
[Breithaupt 2008; Schlatterer und Breithaupt 2006; Glaser 2001; Dachtler 2000].
Bei Zeaxanthin tritt das Fragmention m/z 551,5 nur mit 15 %iger Intensität auf [Schlatterer
und Breithaupt 2006], und die protonierte Molekülmasse m/z 569,5 bildet den Basispeak
[Glaser 2001; Dachtler 2000].
Das inverse Verhalten der Intensitäten des Molekülions m/z 569,5 und des Fragmentions
m/z 551,5 und die spezifischen Intensitäten der diagnostischen Ionen bei Lutein und Zeaxanthin sind stereochemisch bedingt. Demnach sind Stereoisomere durch ihre charakteristischen Massenfragmente unterscheidbar [Liaaen-Jensen und Lutnœs 2008].
43
2.9.4 Quantifizierung
Die hohen, charakteristischen molaren Extinktionskoeffizienten der Carotinoide erlauben
deren spektralphotometrische Bestimmung mit hoher Empfindlichkeit. Zudem absorbieren
Carotinoide im Gegensatz zu den meisten anderen Matrixbestandteilen im Nah-UV bis visuellen Bereich, sodass die Detektion weitgehend unbeeinflusst ist [Glaser 2001]. Zusammen
mit der hohen Selektivität und Robustheit gegenüber Temperaturschwankungen [Pfander
und Riesen 1995] stellt die UV-Vis-Detektion daher eine geeignete Qualifizierungs- und
Quantifizierungs-Methode dar [Belitz et al. 2008].
Da sich die molaren Extinktionskoeffizienten auf das lösungsmittelabhängige Absorptionsmaximum beziehen, erfolgt die Quantifizierung von Carotinoiden durch die Kalibrierung des
Messsystems mit Standardlösungen. Das zugrundeliegende Lambert-Beer-Gesetz setzt eine
lineare Korrelation zwischen der Absorption am Absorptionsmaximum und der Konzentration
voraus. Dabei ist die Linearität auf einen bestimmten Konzentrationsbereich beschränkt. Bei
niedrigen Konzentrationen ist die Signaldetektion durch das Grundrauschen limitiert, was
qualitativ der Nachweisgrenze und quantitativ der Bestimmungsgrenze entspricht (Kapitel
2.10). Bei zu hohen Konzentrationen behindern sich die Moleküle bei der Absorption. Nach
Schiedt und Liaaen-Jensen (1995) ist die Detektion bei Absorptionswerten im Bereich von
0,3 - 0,7 exakt.
2.10 Analytische Methodenvalidierung
Zuverlässige Analysedaten basieren auf der Untersuchung repräsentativer Proben und der
Anwendung von Bestimmungsmethoden, deren Eignung anhand von Kenngrößen nachgewiesen ist [Gottwald und Stieglitz 1996]. Dabei sind die am häufigsten untersuchten Parameter bei der Validierung von Methoden nach Kromidas (1999), dessen Literatur den folgenden
Ausführungen zugrundeliegt, die Selektivität, Spezifität, Linearität, Richtigkeit und Präzision.
Die Selektivität beschreibt die Fähigkeit der Methode, die Analyten ohne gegenseitige Störung zu bestimmen.
Bei der Spezifität ist eine Erfassung der Analyten ohne Verfälschung durch andere Komponenten der Probe gewährleistet.
44
Stand der Forschung
Die Linearität/Kalibrierung beschreibt die Korrelation zwischen Messgröße/Signal y (Absorption) und Bestimmungsgröße x (Konzentration/Menge), die meist auf einem linearen
Regressionsmodell ( =  ∙  + ) basiert. Eine Methode ist umso leistungsfähiger und empfindlicher, je größer die Steigung m und je kleiner der Verfahrensvariationskoeffizient Vx0
der Regression sind [Gottwald und Stieglitz 1996]. Bei der Linearitätsüberprüfung werden
zwischen drei und zehn Konzentrationsniveaus untersucht.
Der Korrelationskoeffizient r beschreibt den Anpassungsgrad der Regression und die Interdependenz von Mess- und Bestimmungsgröße. Bei einer linearen Regression sollte der Korrelationskoeffizient größer 0,999 sein.
Die Nachweisgrenze (LOD, Limit of Detection) entspricht der Analyt-Konzentration, die mit
einer 50 %igen Irrtumswahrscheinlichkeit vom Untergrundsignal unterschieden werden kann.
Die Bestimmungsgrenze (LOQ, Limit of Quantification) ist die geringste Analyt-Konzentration, die mit einer definierten Richtigkeit und Präzision quantifizierbar ist. In der Chromatographie werden LOD und LOQ meist über das Signal/Rausch-Verhältnis ermittelt, wobei
LOD der drei- bis fünffachen und LOQ der neun- bis zehnfachen Signalhöhe des
maximalen Rauschpeaks entspricht [Meyer 1999].
Anhand der Linearität und der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wird der Kalibrierbereich (Arbeitsbereich der Messmethode) definiert.
Die Robustheit beschreibt die Störanfälligkeit der Methode durch variierende Bedingungen
wie verschiedene Messgeräte, Zeitpunkte, Bearbeiter, Reagenzien oder Raumtemperaturen.
Die durch die systematische Messunsicherheit (z. B. fehlerhafte Kalibrierung) beeinflusste
Richtigkeit entspricht der Übereinstimmung des Messwertes mit einem als fehlerfrei geltenden Wert (z. B. zertifiziertes Referenzmaterial). Da für carotinoidhaltige Lebensmittel häufig
kein Referenzmaterial verfügbar ist, wird die Richtigkeit anhand der Wiederfindungsrate WR
untersucht, indem die Proben vor der Aufbereitung und Analyse mit einer definierten Menge
an Standardsubstanz aufgestockt/dotiert werden [Rodriguez-Amaya 2001; Gottwald und
Stieglitz 1996]. Die Wiederfindungsrate entspricht dem Verhältnis der gemessenen AnalytKonzentration zum theoretisch richtigen Wert (s. Formel).
̅
 =  ∙ 100 %

WR
̅
xR
=
=
=
Wiederfindungsrate [%]
Mittelwert der gemessenen Analyt-Konzentration
theoretisch richtige Analyt-Konzentration
45
Bei hohen Wiederfindungsraten sind Verluste der dotierten Carotinoide durch Isomerisierungen und Degradationen während der Probenaufbereitung und -analyse gering. Unter Berücksichtigung möglicher Wechselwirkungen mit Komponenten der Lebensmittelmatrix sind
bei Analyt-Konzentrationen unterhalb von 1 % Wiederfindungsraten zwischen 95 und 105 %
akzeptabel. Die Richtigkeit der Methode gewährleistet gleichzeitig deren Selektivität und Robustheit [Gottwald und Stieglitz 1996].
Die Präzision beschreibt die zufällige Streuung der Messergebnisse bei Mehrfachbestimmungen und gewährleistet gleichzeitig die Robustheit der Methode [Gottwald und Stieglitz
1996]. Die Methodenpräzision umfasst die Aufbereitung und Analyse der Proben und
schließt damit die Messpräzision des Analysesystems ein. Die anhand des Variationskoeffizienten VK (s. Formel) bewertete Wiederholpräzision, bei der die Probe von derselben Person am selben Gerät mit identischen Reagenzien in kurzen Zeitabständen analysiert wird,
basiert auf einer Sechsfachbestimmung [Gottwald und Stieglitz 1996].
 =
VK
sx
̅

̅
∙ 100 %
=
=
=
Variationskoeffizient (%)
abgeschätzte Standardabweichung der normalverteilten Messwerte
abgeschätzter Mittelwert der normalverteilten Messwerte
Da sich die Genauigkeit einer Methode aus der Richtigkeit, Präzision und Robustheit ergibt,
beschreibt sie die gesamte Messabweichung des bestimmten Ergebnisses vom wahren Wert
[Rodriguez-Amaya 2001; Gottwald und Stieglitz 1996].
46
Material und Methoden
3. Material und Methoden
Bei den Versuchsreihen zum Einfluss der Erhitzung und der Gefriertrocknung auf die Massenkonzentrationen der Eigelb-Xanthophylle Lutein und Zeaxanthin im Kontext der Strukturveränderungen der Lipoproteine wurden je zwei Chargen von Bio-Eiern (Güteklasse A, Gewichtsklasse L) untersucht. Dies sollte die Ergebnisse absichern und den Einfluss der Biodiversität hinsichtlich der Matrixkomposition berücksichtigen. Da die Eier der jeweiligen
Chargen aufgrund identischer Erzeugercodes aus demselben Legebetrieb stammten, wurde
eine einheitliche Futterzusammensetzung der Hühner-Kohorte angenommen [Wenzel 2010].
Die Untersuchung der aus Eigelb separierten Fraktionen Plasma und Granula sollte Interdependenzen zwischen den extrahierbaren Xanthophyll-Gehalten und den jeweiligen dominierenden Lipoproteinen aufzeigen. Abbildung 3-1 veranschaulicht die Vorgehensweise bei der
Vorbereitung, Behandlung und Analyse der Proben, die in den folgenden Kapiteln beschrieben ist.
Trennung Eigelb von Eiklar
 Homogenisation von Eigelb
1
natives Eigelb
Fraktionierung von Eigelb
(30 min, 14.972 x g, +4 °C)
2
Eigelb
Plasma
Erhitzung
(67, 72 , 77, 82 , 87 °C , 5 min)
Analytik
Trockenmasse
[BVL 1991]
Granula
Gefriertrocknung
(0,37 hPa, 15 h)
3
Differential Scanning Calorimetry
 (Lipo)Protein-Strukturveränderungen
Eigelb, Plasma, Granula
(nativ, erhitzt, gefriergetrocknet)
Flüssig-Flüssig-Extraktion
XanthophyllMassenkonzentrationen
HPLC-PDA-(APCI+)-MS
Identifizierung und Quantifizierung
Abb. 3-1:
Vorbereitung (1), Behandlung (2) und Analytik (3) von Eigelb, Plasma und Granula
47
Mittels Differential Scanning Calorimetry (DSC; Kapitel 3.4) wurden die erhitzungs- und gefriertrocknungsinduzierten Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine in Doppelbestimmungen untersucht. Die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von
Lutein und Zeaxanthin der Proben wurden ebenfalls in Doppelbestimmungen mittels eines
Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahrens und anschließender HPLC-PDA-(APCI)-MS-Analyse,
bei der die Prüflösungen jeweils zweimal injiziert wurden, ermittelt (Kapitel 3.5).
Eine Auflistung der verwendeten Geräte und Materialien und der eingesetzten Software ist in
Anhang 1 zu finden.
Unbehandeltes Eigelb sowie die ebenfalls unbehandelten aus Eigelb abzentrifugierten Fraktionen Granula und Plasma werden im Folgenden als native Proben oder Nativzustände bezeichnet. Da das Eigelb vor der Fraktionierung im Verhältnis 1:1 mit destilliertem Wasser
versetzt wurde, war die Plasma-Fraktion ebenfalls im Verhältnis 1:1 verdünnt.
Die Probenaufbereitung sollte das qualitative und quantitative Profil der all-E- und 13-ZIsomere von Lutein und Zeaxanthin der nativen sowie der erhitzten und gefriergetrockneten
Proben nicht beeinflussen. Da bereits bei Raumtemperatur Z-Isomerisierungen und bei höherer Erhitzung zusätzlich oxidative Degradationen der Xanthophylle auftreten [Aman et al.
2005; van het Hof et al. 1998], erfolgten die Zentrifugationsschritte bei 4 °C, und auf einen
Matrixaufschluss durch Verseifung wurde verzichtet. Zur Vermeidung lichtinduzierter Z-Isomerisierungen und oxidativer Degradationen der Xanthophylle wurden die Proben mit Alufolie abgedeckt sowie bei +5 bis +7 °C in Braunglasbehältnissen gelagert. Zudem wurde möglichst unter Lichtausschluß gearbeitet. Zur Vermeidung von durch Metalloberflächen katalysierten Z-Isomerisierungen und oxidativen Degradationen der Xanthophylle wurden weitgehend Glasmaterialien verwendet. Da Carotinoide in Lösung leicht isomerisieren und degradieren [Liaaen-Jensen und Lutnœs 2008; Britton 1995], wurden die Probenextrakte direkt
mittels der HPLC-PDA-(APCI)-MS-Methode analysiert.
Zur Überprüfung des Unterschieds zwischen den unbehandelten und behandelten Proben
hinsichtlich der Protein- und Lipoproteinstrukturen sowie der Xanthophyll-Massenkonzentrationen nach der ersten Hypothese (Kapitel 1) erfolgte die statistische Auswertung der erhaltenen Daten mittels der einfaktoriellen univariaten Varianzanalyse (ANOVA, Analysis of Variance) basierend auf einem Signifikanzniveau  von 0,05 [Rudolf und Kuhlisch 2008].
48
Material und Methoden
3.1 Vorbereitung des Eigelbs
Für eine optimale Trennung von Eiklar und Eigelb sollten Eier ca. zwei Tage bei +15 °C gelagert werden [Ros 1994]. Bei je 110 Eiern der Chargen der Versuchsreihe zum Erhitzungseffekt und je 170 Eiern der Chargen der Versuchsreihe zum Gefriertrocknungseffekt (Tab. 31) wurden Eiklar und Eigelb mit einem löffelförmigen Dotterfänger aus Kunststoff getrennt.
Tab. 3-1:
Bio-Eier-Chargen für die Versuchsreihen zur Ermittlung des Erhitzungs- und Gefriertrocknungseffekts – Angabe von Erzeugercode, Packstellen-Nummer (PN) und MindestHaltbarkeits-Datum (MHD)
Versuchsreihe
Erzeugercode
PN
MHD
Erhitzung
Charge 1
0-NL-4235301
DE-051528
01.04.2012
Charge 2
0-NL-4044501
DE-051528
18.04.2012
Gefriertrocknung
Charge 3
0-NL-4207104
DE-051528
05.08.2012
Charge 4
0-NL-4369601
DE-051528
17.08.2012
Nach dem Abziehen der Chalazen wurde die Dotterkugel auf Filterpapier abgerollt um an der
Vitellin-Membran haftende Eiklarreste zu entfernen [Hammershoj et al. 2010; Moussa et al.
2002]. Das Eigelb wurde manuell unter Zerstörung der Vitellin-Membran durch Rühren homogenisiert. Bei der Versuchsreihe zum Erhitzungseinfluss wurden 90 g und bei der Versuchsreihe zum Gefriertrocknungseinfluss 150 g des nativen Eigelbs separiert.
3.2 Fraktionierung von Eigelb in Plasma und Granula
Gemäß der Ergebnisse aus Vorversuchen und in Anlehnung an das Verfahren nach Ternes
et al. (1995)14 erfolgte die Fraktionierung des zuvor zur Erleichterung der Granula-Sedimentation im Verhältnis 1:1 mit destilliertem Wasser verdünnten Eigelbs bei einer Zentrifugalbeschleunigung von 14.972 x g über 30 min bei +4 °C. Die klaren, gelben Plasma-Überstände
wurden dekantiert und vereinigt. Die dichtgepackten, hochmolekularen, blassgelben Granula-Sedimente wurden zur Entfernung von Plasma-Resten zweimal mit je 5 mL destilliertem
Wasser versetzt und erneut je 5 min bei den angegebenen Bedingungen zentrifugiert. Nach
der Entfernung des wässrigen Überstands wurden die Granula-Fraktionen vereinigt.
3.3 Bestimmung der Trockenmasse (TM)
Die Wassergehalte in Eigelb schwanken natürlicherweise. Zudem veränderten die Erhitzung
und die Gefriertrocknung die Wasseranteile in Granula, Plasma und Eigelb. Eine zweifache
Trockenmassebestimmung nach BVL (1991) diente der Normierung der XanthophyllMassenkonzentrationen auf den Trockenmassegehalt.
14
Zweimalige Zentrifugation von Eigelb (1:1 destilliertes Wasser; 15.000 U/min / 14.310 x g, 3 min)
49
3.4 Differential Scanning Calorimetry (DSC)
Zur Bestimmung der erhitzungs- und gefriertrocknungsinduzierten Strukturveränderungen
der Proteine und Lipoproteine wurde eine DSC-Methode in Bezug auf die Proteinkonzentration, Einwaage und Heizrate für natives Eigelb optimiert. Dabei wurden getrocknete Luft als
Trockengas (50 mL/min) und Spülgas (200 mL /min) und ein Aluminium-Tiegel (40 µL) als
Referenz verwendet.
Entscheidende Faktoren für die Festlegung des Messbereichs auf 15 bis 110 °C waren anfängliche Messschwankungen, die ab ca. 60 °C beginnende Denaturierung der Livetine [Le
Denmat et al. 1999] und die HDL-Strukturentfaltung bei 84,3 °C [Bircan und Barringer 2002].
Die Ausprägung des endothermen Messkurvenverlaufs wurde bei unverdünntem Eigelb, einer Probeneinwaage von 30 + 2 mg und einer Heizrate von 8 °C/min als optimal angesehen.
[Thierau et al. 2014; Keil 2013]
Die Auswertung der DSC-Thermogramme erfolgte anhand des Temperaturbereichs, des
Onsets (Schnittpunkt der Tangente des Peaks mit der Basislinie) und des Maximums (PeakTemperatur Td) sowie der normierten Gesamtenthalpie H des Peaks.
Basislinie
Abb. 3-2:
Auswertung der DSC-Thermogramme
Zur Untersuchung der möglichen Wiederherstellung der Protein- und Lipoproteinstrukturen
durch Rehydratation wurden die gefriergetrockneten Proben vor der DSC-Analyse auf die
nativen Trockenmassen von Granula (46,08 % TM), Plasma (26,05 % TM) und Eigelb (51,18
% TM) rekonstituiert.
50
Material und Methoden
3.5 Bestimmung von Lutein und Zeaxanthin
Zur Bestimmung der Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin wurden in Anlehnung an Publikationen mit ähnlicher Fragestellung eine HPLCPDA-Analyse-Methode sowie die Probenaufbereitung hinsichtlich des Extraktionsverfahrens
optimiert und anschließend validiert. Dies erfolgte mit nativem Eigelb aufgrund der repräsentativen Komposition aus 78 % Plasma und 22 % Granula [Powrie und Nakai 1986]. Die Bestimmungsmethode umfasste demnach die Probenaufbereitung bei der Extraktion und die
HPLC-PDA-Analyse.
Die Identifizierung der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin erfolgte anhand
der charakteristischen Retentionszeiten bei der chromatographischen Elution sowie der spezifischen UV-Vis-Absorptionsspektren und der Massenspektren. Die Quantifizierung basierte
auf der charakteristischen Absorption von Lutein und Zeaxanthin bei 450 nm.
3.5.1 HPLC-PDA-Analyse
Die HPLC-PDA-Analyse wurde in Anlehnung an die für ähnliche chromatographische Trennprobleme beschriebenen Methoden nach YMC (2011), Hammershoj et al. (2010), Wenzel
(2010), Schlatterer und Breithaupt (2006), Breithaupt et al. (2003), Glaser (2001) sowie
Dachtler (2000) optimiert. Als stationäre Phase wurde eine polymere C30-Säule (250 x 4,6
mm) mit Endcapping verwendet. Eine C30-Vorsäule (10 x 4,0 mm) diente der Entfernung von
Verunreinigungen der Probenextrakte. Die Optimierung der Analyseparameter basierte auf
Messungen einer äquimolaren Standard-Stammlösung aus je 0,5 mg Lutein, Zeaxanthin und
-Carotin in 5 mL eines Ethanol-Methanol-THF-Lösungsmittelgemischs (750:200:50, v/v/v),
das die Polaritätsunterschiede abdeckte und damit die Löslichkeit der Carotinoide gewährleistete. Bei jeder Versuchsdurchführung wurde ein definierter Analyseparameter variiert und
dessen Einfluss auf die Trenneffizienz interpretiert. Neben verschiedenen isokratischen und
gradientischen Eluentenzusammensetzungen wurden die Säulentemperatur (20 bis 40 °C)
und die Flussrate (0,4 bis 1,1 mL/min) verändert.
Mit den optimierten Analyseparametern erfolgte die Validierung der HPLC-PDA-Methode, die
eine Linearitätsüberprüfung, Korrelationsanalyse und die Ermittlung der xanthophyllspezifischen Nachweis- und Bestimmungsgrenzen umfasste. Auf diese Weise konnte der Kalibrierbereich zur Quantifizierung der Xanthophylle festgelegt werden.
51
Bei Konzentrationen unterhalb 0,02 µg/mL zeigten die Chromatogramme ein hohes Untergrundrauschen. Zur Festlegung des Konzentrationsbereichs der all-E-Isomere von Lutein
und Zeaxanthin, der einen proportionalen und linearen Kontext zur Absorption am Absorptionsmaximum bei 450 nm gewährleistet, wurden daher zehn äquidistante Standardlösungen
im Bereich von 0,02 bis 20 µg/mL (Anhang 2, Tab. 1b-1) je dreimal analysiert und die Werte
gemittelt. Als Kenngrößen der xanthophyllspezifischen, linearen Regressionsgeraden wurden die Steigung m, der Korrelationskoeffizient r und der Verfahrensvariationskoeffizient Vx0
ermittelt. Anhand dieser Kenngrößen wurde die Eignung der Auswertung über die Peakfläche oder die Peakhöhe beurteilt.
Für Eigelb existiert kein Referenzmaterial ohne Carotinoide. Daher wurde zur Ermittlung der
Nachweis- (LOD) und Bestimmungsgrenzen (LOQ) das Ethanol-Methanol-THF-Lösungsmittelgemisch, das zudem der Probenextraktion diente, als Blank (Leerprobe) sechsmal injiziert
und das auf zufälligen Systemschwankungen basierende Grundrauschen des Analysesystems detektiert. Im Elutionsbereich der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin (5
- 10 min) wurden die drei höchsten Rauschpeakhöhen der Basislinie gemittelt und LOD als
dreifache sowie LOQ als zehnfache Signalhöhe dieses Wertes festgelegt [Kromidas 1999;
Meyer 1999]. Die damit korrelierenden Konzentrationen der all-E-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin wurden anhand der spezifischen Linearitäts-Regressionsgeraden der Peakhöhen
(0,2 - 0,02 µg/mL) berechnet.
3.5.2 Extraktion
Die chemisch-physikalischen Eigenschaften von Lutein und Zeaxanthin berücksichtigend
erfolgte die Optimierung des Extraktionsverfahrens in Anlehnung an in der Literatur beschriebene Methoden der Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD) sowie der Flüssig-FlüssigExtraktion (LLE, Liquid Liquid Extraction). Da kein Referenzmaterial für Eigelb verfügbar war,
basierte die Optimierung des Extraktionsverfahrens auf der Ermittlung der Wiederfindungsrate (Kapitel 2.10) durch Dotierung nativen Eigelbs mit der Standard-Stammlösung von all-ELutein und all-E-Zeaxanthin (je 100 µg/mL). Bezogen auf das jeweilige Probenendvolumen
lagen die Konzentrationen der Aufstockung bei der MSPD (0,3 µg/mL) und bei der LLE (0,5
µg/mL) im mittleren Kalibrierbereich. Zur Absicherung der Ergebnisse erfolgte eine Doppelbestimmung der dotierten und undotierten Proben bei Anwendung des jeweiligen Extraktionsverfahrens und der optimierten HPLC-PDA-Analyse-Methode. Die Wiederfindungsrate
der Bestimmungsmethode sollte zwischen 95 und 105 % liegen [Kromidas 1999]. Zur Einschränkung aufbereitungsbedingter Fehler- und Verlustquellen sowie von Z-Isomerisierungen und Degradationen der Xanthophylle sollte sich das optimierte Extraktionsverfahren
durch wenige Arbeitsschritte und eine schonende Vorgehensweise auszeichnen.
52
Material und Methoden
Für die MSPD-Extraktion von Lutein und Zeaxanthin wurde die Methode nach Glaser (2001)
modifiziert. Als Sorbens dienten 1,5 g einer C18-Phase, die mit 0,5 g des nativen Eigelbs
[Glaser 2001] in einer Spritzenkartusche ca. 1 min zu einer chromatographischen Phase
homogenisiert wurden. Zur Erhöhung der Extraktionseffizienz durch mehrmalige Einstellung
des Adsorptionsgleichgewichts wurden die Xanthophylle in 1 mL-Schritten mit insgesamt
6 mL eines CHCl3-THF-Gemisches (70:30, v/v) eluiert. Nach der Filtration (0,45 µm RCMembran) wurde das gelbe Eluat mit der HPLC-PDA-Methode analysiert. Zur Bestimmung
der Wiederfindungsrate erfolgte eine Aufstockung mit 0,02 mL der Stammlösung der Luteinund Zeaxanthin-Standards direkt nach der Einwaage von Eigelb und Sorbens.
Die LLE-Extraktion von Lutein und Zeaxanthin wurde in Anlehnung an das Extraktionsverfahren von Wenzel (2010) unter Variation des Lösungsmittelgemischs und der Ultraschallbehandlungszeit optimiert. Die mit dem Extraktionslösungsmittel (15 mL) versetzte Probe wurde zum Matrixaufschluss eine Minute im Ultraschallbad behandelt und anschließend mit einem Ultra-Turrax (9500 U/min, 1 min) homogenisiert, wobei das Probenmaterial mit 5 mL
des Extraktionslösungsmittels quantitativ überführt wurde. Nach 20 minütiger Extraktion unter Schütteln (Mini-Kreisschüttler Orbital) wurde zur Abtrennung von Zellbestandteilen und
denaturierten Proteinen zentrifugiert (4500 U/min, 5 min, 4 °C) und der klare, gelbe Extrakt
nach einer Filtration (0,45 µm RC-Membran) mit der HPLC-PDA-Methode analysiert. Zur
Bestimmung der Wiederfindungsrate wurden die Proben mit 0,1 mL der Standard-Stammlösung von Lutein und Zeaxanthin nach Zugabe des Lösungsmittelgemischs aufgestockt.
3.5.3 Richtigkeit und Wiederholpräzision der Bestimmungsmethode
Die Validierung der hinsichtlich des Extraktionsverfahrens und der HPLC-PDA-Analyse optimierten Bestimmungsmethode erfolgte anhand einer Überprüfung der Richtigkeit und der
Wiederholpräzision. In einer Sechsfachbestimmung wurden die Massenkonzentrationen an
all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin in nativem Eigelb vom selben Anwender mit identischen
Chemikalien und mit demselben Gerät bestimmt, sodass aus den Messergebnissen der Variationskoeffizient zur Beurteilung der Wiederholpräzision ermittelt werden konnte. Anschließend wurde natives Eigelb mit der Stammlösung (je 100 µg/mL) der Standards von all-ELutein und all-E-Zeaxanthin nach der Zugabe des Extraktionslösungsmittels dotiert und erneut der Gehalt der all-E-Isomere bestimmt. Zur Gewährleistung gleicher Volumina wurden
die undotierten Proben mit einer dem dotierten Stammlösungsvolumen äquivalenten Menge
des Ethanol-Methanol-THF-Gemischs versetzt. Unter Berücksichtigung der nativen Massenkonzentrationen und der dotierten Menge der Standards konnten die Wiederfindungsraten
anhand der bestimmten Massenkonzentrationen von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin errechnet und so die Richtigkeit der Bestimmungsmethode bewertet werden.
53
3.5.4 Identifizierung von Lutein und Zeaxanthin
Die Identifizierung der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin basierte auf dem
chromatographischen, spektralphotometrischen und massenspektrometrischen Verhalten
[Rodriguez-Amaya 2001].
Die Elutionsreihenfolge wurde mittels der Standards und anhand des Vergleichs mit Literaturmethoden bestimmt. Zur Erfassung möglicher Veränderungen bei der Elution durch Matrixeinflüsse wurden die Retentionszeiten der all-E-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in den
Probenextrakten mit denen der Standards verglichen und die Proben zudem mit den Standards von Lutein und Zeaxanthin dotiert.
Die UV-Vis-Absorptionsspektren der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin
konnten hinsichtlich der Absorptionsmaxima und der Schwingungsfeinstruktur der Hauptabsorptionsbande basierend auf Literaturangaben interpretiert werden, wobei die Identifizierung der Xanthophylle in den Probenextrakten durch den Vergleich mit den Absorptionsspektren der Standards von Lutein und Zeaxanthin abgesichert wurde.
Anhand der charakteristischen Intensitäten der Molekül- und Fragmentionen-Peaks in den
Massenspektren wurden die Stereoisomerensets von Lutein und Zeaxanthin unterschieden.
Die Optimierung der massenspektrometrischen Analyse-Methode erfolgte in Anlehnung an
Wenzel (2010) und Schlatterer und Breithaupt (2006). Dabei wurden unter Variation der cone- und corona-Spannungen Standardlösungen von Lutein und Zeaxanthin zur Identifizierung der charakteristischen Molekülionen- und Fragmentionen-Peaks gemessen. Um die
geeigneten cone- und corona-Spannungen zur massenspektrometrischen Identifizierung von
Lutein und Zeaxanthin unter Matrixeinfluss zu bestätigen wurden Probenextrakte analysiert.
3.6 Erhitzung
Entsprechend der temperaturabhängigen Strukturentfaltungen der Proteine und Lipoproteine
des Eigelbs (Kapitel 2.2.1) wurden Granula (30 g), Plasma (45 g) und Eigelb (15 g) bei fünf
Temperaturniveaus (67, 72, 77, 82, 87 °C) in Probenbeuteln in einem Schüttelwasserbad zur
gleichmäßigen Temperaturverteilung erhitzt. Die Probenmengen ergaben sich über die notwendigen Einwaagen für die Analytik (DSC, HPLC-PDA, Trockenmasse). Nach Erreichen
des jeweiligen Temperaturniveaus bei einer zusätzlichen Probe zur Temperaturkontrolle
wurde über fünf Minuten erhitzt. Die Erhitzungszeit basierte auf Literaturangaben zu temperaturabhängigen Pasteurisationszeiten im Bereich von zwei bis zehn Minuten [Wenzel 2010;
Jaekel et al. 2008; Ternes 2008b; Kulozik und Daimer 2007; Le Denmat et al. 1999]. Anschließend wurden die Proben im Wasserbad auf Raumtemperatur abgekühlt.
54
Material und Methoden
3.7 Gefriertrocknung
Zur Minimierung der gefrierinduzierten Strukturentfaltung der LDL wurden Granula (60 g),
Plasma (240 g) und Eigelb (30 g) in Anlehnung an Wenzel (2010) und Jaekel et al. (2008) in
dünnen Schichten (ca. 3 mm) bei -40 °C auf vorgefrosteten Edelstahlschalen (-30 °C) schnell
eingefroren und für ein bis zwei Stunden bei -40 °C temperiert. Die Probenmengen ergaben
sich über die notwendigen Einwaagen für die Analytik (DSC, HPLC-PDA, Trockenmasse),
wobei die Abtrocknung der Proben berücksichtigt wurde. Entsprechend der Korrelation von
Temperatur und Sublimationsdruck15 und bei Annahme einer initialen Probentemperatur von
ca. -30 °C erfolgte die separate Gefriertrocknung von Granula, Plasma und Eigelb in Anlehnung an Wenzel (2010) bei 0,37 hPa und 5 °C Stellflächentemperatur zur Erreichung einer
maximalen Trockenmasse über 15 Stunden. Im Anschluss wurden die Proben in Probenbeuteln vakuumiert um Einflüsse durch Sauerstoff zu minimieren. Zur Gewährleistung reproduzierbarer umgebungsbedingter Einflüsse auf die Trocknungskinetik wurde die Behausung
des Probentrays auf 5 °C temperiert.
3.8 Statistische Auswertung der Messergebnisse
Aus den homogenen Grundgesamtheiten von Granula, Plasma und Eigelb wurden die Stichproben zur Untersuchung des Einflusses der Faktoren Erhitzung sowie Gefriertrocknung
(unabhängige qualitative Variable) auf die normierte Gesamtenthalpie H des DSC-Peaks
sowie die Xanthophyll-Massenkonzentrationen als Merkmalsausprägungen (abhängige
quantitative Variable) zufällig ohne gegenseitige Beeinflussung genommen.
Da es sich demnach um unabhängige Stichproben handelte und der Einfluss eines Faktors
auf eine Merkmalsausprägung betrachtet wurde, eignete sich die einfaktorielle univariate
Varianzanalyse (ANOVA) zur Überprüfung der Unterschiedshypothese (Hypothese 1; Kapitel
1). Dabei werden die Gruppenmittelwerte der Merkmalsausprägung einzelner Faktorstufen
hinsichtlich signifikanter Unterschiede bei den Varianzen verglichen. Aus dem Verhältnis der
zufälligen Varianz der Einzelwerte innerhalb der Gruppen und der systematischen, durch den
Faktor induzierten Varianz der Gruppenmittelwerte ergibt sich der F-Wert.
Überschreitet dieser den kritischen Wert Fcritical, wird anstelle der Nullhypothese (H0), die von
identischen Gruppenmittelwerten ausgeht, die Alternativhypothese (H1), gleichbedeutend mit
verschiedenen Gruppenmittelwerten, akzeptiert.
15
Wasserdampfdruck über Eis (-40 °C/0,13 hPa, -30 °C/0,38 hPa, -20 °C/1,03 hPa)
55
Die Ermittlung des F-Wertes und des kritischen F-Wertes (SPSS bzw. Excel®) erfolgte basierend auf dem Signifikanzniveau  = 0,05 [Rudolf und Kuhlisch 2008] zur Limitierung der
Wahrscheinlichkeit des Auftretens des Fehlers 1. Art (falsches Akzeptieren der Alternativhypothese bzw. falsche Ablehnung der Nullhypothese).
Der für die Anzahl der Vergleiche der Gruppenmittelwerte geeignete Tukey-B-Test (SPSS)
diente der Identifizierung der signifikant differierenden Faktorstufen.
Voraussetzungen zur Anwendung der einfaktoriellen ANOVA sind neben der Unabhängigkeit
der Stichproben die Normalverteilung der Messdaten, die mittels des Kolmogorov-SmirnovTests (SPSS) geprüft wurde, sowie die Varianzhomogenität der Gruppen, die durch den
Zweistichproben-F-Test (Excel®) untersucht wurde.
Die statistische Auswertung der H-Werte und Xanthophyll-Massenkonzentrationen erfolgte
basierend auf den Parametern in Tabelle 3-2.
Tab. 3-2:
Parameter der statistischen Auswertung der Daten
Testmodell
Einfaktorielle univariate
ANOVA* und Tukey-B-Test
Kolmogorov-Smirnov-Test
Zweistichproben-F-Test
p-Wert
p > Akzeptanz von H0
p <  Ablehnung von H0
identische Gruppenmittelwerte
verschiedene Gruppenmittelwerte
Normalverteilung
Varianzhomogenität
keine Normalverteilung
keine Varianzhomogenität
* oder: F < Fcritical: Akzeptanz von H0;
56
F > Fcritical: Ablehnung von H0
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1 Fraktionierung von Eigelb in Plasma und Granula
Zur Untersuchung der Abtrennung der hochmolekularen Granula (Abb. 4-1, rechts) wurde
der 1:1 verdünnte Plasma-Überstand (Abb. 4-1, links) in einer Sechsfachbestimmung zentrifugiert (14.972 x g, 45 min, 4 °C). Da der über Differenzwägung ermittelte Anteil an GranulaSediment nur 2,6 % betrug, gewährleistete die Zentrifugation von Eigelb (14.972 x g, 30 min,
4 °C) eine sorgfältige Trennung von Granula und Plasma.
Abb. 4-1:
Verdünnte Plasmafraktion (1:1 destilliertes Wasser; links) und hochmolekulares GranulaSediment (rechts)
4.2 Bestimmung der Trockenmasse (TM)
Neben biodiversitätsbasierten Schwankungen des Wasseranteils in nativem Eigelb verändern Wasserverluste bei der Probenbehandlung die Trockenmasse, wie z. B. bei der geringfügig höheren Trockenmasse von Eigelb nach der Pasteurisation bei Wenzel (2010). Bei der
Erhitzung und Gefriertrocknung vermindern Strukturentfaltungen der Proteine und Lipoproteine das Wasserbindevermögen, was infolge der LDL-Entfaltung bei den ab 77 °C erhitzten
Plasma-Proben anhand der separierten Flüssigkeit deutlich wurde. Zudem waren die Wassergehalte durch die Gefriertrocknung verringert. Aufgrund der natürlicherweise und behandlungsbedingt variierenden Wassergehalte der Proben wurden die Xanthophyll-Massenkonzentrationen auf den Trockenmassegehalt normiert.
Mit einem Variationskoeffizienten von 0,4 % zeichnete sich das Trockenmassebestimmungsverfahren [BVL 1991] durch eine hohe Präzision aus. Da der Feststoffanteil von Granula (ca.
44 %) [Anton 2007; Le Denmat et al. 1999; Dyer-Hurdon und Nnanna 1993] und Eigelb (ca
50 %) ähnlich ist, wurden bei der Trockenmassebestimmung der Granula wie bei Eigelb 2 g
Probe eingewogen. Die 1:1-Verdünnung, die für die zentrifugale Trennung des Eigelbs notwendig war, wirkte sich auf die Plasmafraktion und damit die Einwaage bei der Trockenmassebestimmung aus. Um Messungenauigkeiten mit zunehmender Probeneinwaage zu
minimieren wurden 8 g des wässrig verdünnten Plasmas eingewogen.
57
Bei den Bio-Eiern wurden für eine Charge Trockenmassen von 46,24 % bei Granula und
26,01 % bei Plasma sowie 51,11 % bei Eigelb ermittelt (Tab. 4-2). Entsprechend der Anteile
von Granula (22 %) und Plasma (78 %) in Eigelb [Powrie und Nakai 1986] errechnete sich
über das gewichtete Mittel eine Trockenmasse des Plasmas von 52,48 %. Bei einer theoretischen Trockenmasse von 26,24 % des verdünnten Plasmas ergab sich eine gute Übereinstimmung mit dem ermittelten Wert (26,01 % TM), was die Eignung der Einwaagen zur Trockenmassebestimmung bestätigte.
Die Trockenmassen der erhitzten Proben differierten geringfügig in einem Bereich von 0,2 1,6 % (Tab. 4-1).
Tab. 4-1:
Trockenmassen [%] nativer und erhitzter Proben von Granula, Plasma und Eigelb
Erhitzung
Granula
Plasma
Eigelb
Charge 1
Charge 2
Charge 1
Charge 2
Charge 1
Charge 2
Nativ
67 °C
45,44
44,60
46,27
45,42
24,27
23,90
24,25
23,82
51,85
51,42
51,99
51,23
Trockenmasse [%]
72 °C
77 °C
46,28
46,07
45,75
45,01
24,35
24,34
23,89
23,88
51,47
51,53
51,46
51,61
82 °C
87 °C
46,72
45,14
47,04
45,52
24,12
24,14
24,29
25,30
52,77
51,78
52,53
51,85
Bei den gefriergetrockneten Proben waren die Trockenmassen der beiden untersuchten
Chargen nahezu identisch (Granula = 0,32 %, Plasma = 0,21 %, Eigelb = 0,58 %) und lagen im
Bereich von 98,57 bis 100,11 % (Tab. 4-2).
Tab. 4-2:
Gefriertrocknung
Charge 3
Charge 4
Trockenmassen [%] nativer und gefriergetrockneter Proben von Granula, Plasma und
Eigelb
Nativ
Granula
Gefriergetrocknet
45,92
46,24
100,11
99,79
Trockenmasse [%]
Plasma
Nativ Gefriergetrocknet
26,08
99,28
26,01
99,07
Nativ
51,24
51,11
Eigelb
Gefriergetrocknet
99,15
98,57
Da der Haupttrocknungsabschnitt bei der Gefriertrocknung durch die Sublimation des gefrorenen Wassers charakterisiert ist, korrelieren mit den nicht ausfrierbaren Wasseranteilen, die
den Glasübergang widerspiegeln, die maximalen Trockenmassen während dieser Trocknungsphase von 71 % bei Granula, 85 % bei Plasma und 84 % bei Eigelb (Kapitel 2.2.2)
[Wakamatu et al. 1982]. Höhere Trockenmassen basieren auf der anschließenden Desorption des nicht ausgefrorenen, gebundenen Wasseranteils infolge eines Temperaturanstiegs.
Dabei wurden aufgrund der erschwerten Diffusion der Wassermoleküle mit zunehmender
Abtrocknung [Roy und Gupta 2004] die Trockenmassen oberhalb von 98 % (Tab. 4-2) erst
nach 15 Stunden Gefriertrocknung erreicht.
58
Ergebnisse
4.3 Bestimmung von Lutein und Zeaxanthin
4.3.1 HPLC-PDA-Analyse
Optimierung
Die selektive Trennung der strukturell ähnlichen all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin war das Effizienzkriterium bei der Optimierung der chromatographischen Trennmethode.
Aufgrund intensiver Wechselwirkungen zwischen den Triacontyl-Resten der stationären
Phase und den Polyenketten gelingt die Trennung von Carotinoid-Stereoisomeren mit gebundenen C30-Phasen, deren Herstellung durch polymere Synthese eine höhere Selektivität
als monomere stationäre Phasen gewährleistet [Rodriguez-Amaya 2001; Sander et al. 2000].
Da meist Methanol als primäres Lösungsmittel des Eluenten dient und sich in Kombination
mit polymeren Phasen hohe Wiederfindungsraten bei Carotinoiden ergeben [Epler und Sander 1992], wurden eine polymere C30-Phase und ein methanolbasierter Eluent verwendet.
Zur Erhöhung der Elutionsstärke diente in Anlehnung an Wenzel (2010) als Modifier MTBE.
Da sich der Modifier neben einer verbesserten Peaksymmetrie auf die Auflösung und Selektivität auswirken kann, war der MTBE-Anteil bei der Elution von Lutein und Zeaxanthin mit
6,5 % gering, wobei zur Verbesserung der Trenneffizienz ein Wasseranteil von 0,5 % diente
[Wenzel 2010]. Der Zusatz von 0,1 % Methansäure erhöhte die Protonierung der Xanthophylle in der APCI-Ionenquelle zur Bildung von Molekülionen [M+H]+ und damit die Empfindlichkeit bei der massenspektrometrischen Detektion. Aufgrund der anfänglich isokratischen
Zusammensetzung der mobilen Phase war die Elution der Lutein- und Zeaxanthin-Isomere
durch eine hohe Reproduzierbarkeit gekennzeichnet. Entsprechend der Mischbarkeitszahlen
[Waters 2004] konnten Entmischungen zwischen dem Extraktionslösungsmittel (EthanolMethanol-THF) und dem Eluenten (Methanol-MTBE-H2O-CHOOH) ausgeschlossen werden.
Während geringe Flussraten (0,4 und 0,5 mL/min) zu einer nicht ausreichenden Trennung
führten, erwies sich eine hohe Flussrate (1,1 mL/min) aufgrund der kürzeren Verweilzeit der
Analyten im chromatographischen System und der resultierenden schmaleren Peakform und
verbesserten Peaksymmetrie für die Trenneffizienz als optimal. Zudem war sie in Bezug auf
strömungs- und pumpenbedingte Schwankungen bei der Förderung des Eluenten von Vorteil, was sich im geringen Grundrauschen der Basislinie zeigte. Die Trennung der Isomere
von Lutein und Zeaxanthin war bei einer Säulentemperatur von 30 °C optimal. Bei höheren
und niedrigeren Temperaturen sank die Auflösung deutlich, und bei 40 °C coeluierten die allE-Isomere.
59
Da Carotinoide in organischen Lösungsmitteln für Isomerisierungen und Degradationen, die
bereits bei Raumtemperatur auftreten können, anfälliger sind als in der Lebensmittelmatrix
[Aman et al. 2005; van het Hof et al. 1998], wurden die Probenlösungen im Autosampler bei
15 °C temperiert. Tabelle 4-3 zeigt die Analyseparameter der HPLC-Methode.
Tab. 4-3:
Analyseparameter der optimierten HPLC-Trennmethode
Stationäre Phase
polymere C30-Phase (5 µm, 250 x 4,6 mm, endcapped) mit Vorsäule (10 x 4,0 mm)
Eluent
A = MeOH/H2O/CHOOH; 994:5:1 (v/v/v); B = MTBE/MeOH/CHOOH; 930:69:1 (v/v/v)
Zeit [min]
A:B (v/v)
Flussgeschwindigkeit [mL/min]
0
15
15 - 20
20 -30
30 -40
93:7
93:7
50:50 (linear)
50:50
93:7 (linear)
1,1
0,5
0,5
0,5
0,5
Gradient
Injektionsvolumen
40 µL
Säulentemperatur
30 °C
Mit den optimierten Analyseparametern ergab sich die am Beispiel von nativem Eigelb dargestellte Elutionsreihenfolge der Lutein- und Zeaxanthin-Isomere (Abb. 4-2). Da das Endcapping polare Wechselwirkungen zwischen Silanolgruppen und den Xanthophyllen verringert und dies neben einer verbesserten Peaksymmetrie und Säulenreproduzierbarkeit mit
einer verringerten Auflösung einhergehen kann [Khachik 2009], coeluieren all-E-Lutein und
all-E-Zeaxanthin zugunsten einer erhöhten Selektivität bei den Z-Isomeren [Glaser 2001].
Daher wurde keine Basislinientrennung bei der Elution der all-E- und 13-Z-Isomere von
Lutein und Zeaxanthin erreicht. Die analytische Berücksichtigung des nach ca. 33 min ähnlich wie bei Breithaupt et al. (2003) (27 min, Methanol-MTBE-H2O-Eluent) eluierenden Carotins (Anhang 2, Abb. 1a) gewährleistete die Elution unpolarer Probenbestandteile und
die Säulenkonditionierung und Reequilibrierung vor der nächsten Probeninjektion.
Eigelb-1-2 Ausgangsgehalt
10-Dec-2011
08:48:35
Test00659-4
all-E-Lutein
all-E-Lutein
2.0e-2
all-E-Zeaxanthin
1.5e-2
AU
2: Diode Array
450
Range: 2.669e-2
5.63
5.63
5.86
5.86
all-E-Zeaxanthin
13-Z-Lutein
1.0e-2
13-Z-Zeaxanthin
unknown
5.0e-3
2.43
0.0
2.00
Abb. 4-2:
60
5.13
2.87
4.00
6.61
6.61
6.25
6.00
8.00
10.00
12.00
Time
Elution der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin bei nativem Eigelb
Ergebnisse
Die auf dem Lambert-Beer-Gesetz basierende Quantifizierung setzt eine lineare, proportionale Korrelation zwischen der Absorption am Absorptionsmaximum und der Konzentration
voraus. Die Linearitätsüberprüfung der HPLC-PDA-Analyse-Methode zur Festlegung der
Nachweis- und Bestimmungsgrenzen und des Kalibrierbereichs war daher die Basis für die
Quantifzierung der Xanthophylle. Aufgrund des ähnlichen, leicht hypsochrom verschobenen
Chromophors von Lutein konnte am selben Absorptionsmaximum wie bei Zeaxanthin gemessen werden. Entsprechend der lösungsmittelabhängigen Absorptionsmaxima und der bei
450 nm bestimmten Reinheit der Standards von all-Lutein und all-E-Zeaxanthin [ChromaDex
2011] erfolgte die quantitative Bestimmung der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin anhand der Absorption bei 450 nm. Nach Herstellerangaben des PDA-Detektors
sind bei Absorptionswerten unterhalb 1 AU wie bei den vorliegenden Messungen geringfügige Abweichungen zur Linearität des Lambert-Beer-Gesetzes zu erwarten [Waters 2011].
Linearität
Mit zunehmender Konzentration von Lutein und Zeaxanthin stieg die anhand der Peakfläche
und Peakhöhe erkennbare Absorptionsintensität bei 450 nm. Die gute Interdependenz zeigte
sich durch die für die Peakfläche und die Peakhöhe vergleichbar hohen Korrelationskoeffizienten (r > 0,999). Das positive Steigungsmaß der linearen Regression war bei den Peakhöhen bei beiden all-E-Isomeren höher als bei den Peakflächen, weshalb die Auswertung
über die Peakhöhen eine höhere Empfindlichkeit der Analyse-Methode gewährleistete. Die
geringen Verfahrensvariationskoeffizienten belegten eine hohe Güte und Robustheit der linearen Regression, wobei sich die Auswertung über die Peakhöhe, besonders für all-ELutein, erneut als günstiger erwies. (Tab. 4-4)
Tab. 4-4:
Steigung, Verfahrensvariationskoeffizient und Geradengleichung der linearen Regression
von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin bei Auswertung von Peakfläche und Peakhöhe
Linearität (0,02 - 20,00 µg/mL )
Peakfläche
Peakhöhe
m
Vxo [%]
Lineare Regression
m
Vxo [%]
Lineare Regression
Lutein
5.992,3
1,60
y = 5.992,3*x + 374,3
28.780,9
0,56
y = 28.780,9*x - 1.361,7
Zeaxanthin
9.432,6
1,77
y = 9.432,6*x - 586,2
40.954,3
1,60
y = 40.954,3*x - 1.357,4
Innerhalb des Konzentrationsbereichs von 0,02 - 20,00 µg/mL war die Linearität der Absorption von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin bei 450 nm mit hoher Empfindlichkeit, Güte und
Robustheit und damit die Eignung der HPLC-PDA-Analyse-Methode zur Quantifzierung der
Xanthophylle gewährleistet. Aufgrund des höheren Steigungsmaßes und der geringeren Verfahrensvariationskoeffizienten sowie unter Berücksichtigung der partiellen Überlappung der
chromatographischen Profile der Isomere von Lutein und Zeaxanthin (Abb. 4-2) erwies sich
die Auswertung über die Peakhöhen wie bei Wenzel (2010) als günstiger.
61
Nachweis- und Bestimmungsgrenzen (LOD, LOQ)
Anhand der gemittelten drei höchsten Peakhöhen des Grundrauschens im Elutionsbereich
der Xanthophylle (134 counts) wurden LOD (402 counts) und LOQ (1340 counts) ermittelt.
Die mit der Regressionsgeraden der Peakhöhen berechneten Konzentrationen für all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin zeigten eine hohe Übereinstimmung mit LOD und LOQ von Wenzel
et al. (2010) (Tab. 4-5), der LOD und LOQ mit dem gleichen Gerät bei ähnlichen Analyseparametern ebenfalls über das Signal-Rauschverhältnis ermittelte. Das von Breithaupt et al.
(2003) bei ähnlichen Analysebedingungen für Lutein und Zeaxanthin nach dem Eichkurvenverfahren [DFG 1991] ermittelte LOD (11,4 ∙10-3 µg/mL) war ebenfalls vergleichbar.
Tab. 4-5:
LOD und LOQ von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin im Vergleich zu Wenzel et al. (2010)
LOD [µg/mL]
HPLC-PDA-Analyse
Wenzel et al. (2010)
-3
Lutein
15,3 ∙10
Zeaxanthin
10,3 ∙10-3
LOQ [µg/mL]
13,9 ∙10
HPLC-PDA-Analyse
-3
46,4 ∙10-3
39,7 ∙10-3
33,7 ∙10-3
52,8 ∙10
10,1 ∙10-3
Wenzel et al. (2010)
-3
Kalibrierung
Da eine Quantifizierung nur oberhalb der Bestimmungsgrenze möglich ist, wurde die untere
Grenze des Kalibrierbereichs basierend auf dem LOQ von Lutein (Tab. 4-5) auf 0,10 µg/mL
festgelegt. Vorversuche ergaben Konzentrationen von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin im
Bereich von 0,57 - 1,65 µg/mL in nativem Eigelb. Zur Absicherung höherer Konzentrationen
wurde die höchste Kalibrierkonzentration bei erhitzten Proben auf 2,50 µg/mL und bei gefriergetrockneten aufgrund der höheren Trockenmassen auf 5,00 µg/mL festgelegt. Die 5Punkt-Kalibrierung zur Bestimmung der Xanthophyll-Gehalte in den erhitzten Proben umfasste daher den Konzentrationsbereich zwischen 0,10 - 2,50 µg/mL (Abb. 4-3), während für
die gefriergetrockneten Proben eine 6-Punkt-Kalibrierung (0,10 - 5,00 µg/mL) vorgenommen
wurde (Anhang 2, Tab. 1b-2).
90000
75000
75000
Peakhöhe [counts]
Peakhöhe [counts]
Kalibrierung all-E-Lutein
90000
60000
45000
30000
15000
0
60000
45000
30000
15000
0
0,00
Abb. 4-3:
62
Kalibrierung all-E-Zeaxanthin
0,40
0,80
1,20
1,60
2,00
2,40 2,80
[µg/mL]
0,00
0,40
0,80
1,20
1,60
2,00
2,40 2,80
[µg/mL]
5-Punkt-Kalibrierung (0,10 - 2,50 µg/mL) der all-E-Isomere von Lutein und Zeaxanthin
Ergebnisse
Da die mittleren und damit am häufigsten erwarteten Konzentrationen von all-E-Lutein und
all-E-Zeaxanthin des in Vorversuchen untersuchten nativen Eigelbs (̅all-E-Lutein: 1,05 µg/mL;
̅all-E-Zeaxanthin: 0,78 µg/mL) im mittleren Kalibrierbereich (0,50 bis 1,25 µg/mL) lagen, war von
einer hohen Präzision der Messergebnisse auszugehen [Gottwald und Stieglitz 1996].
Da für geometrische Isomere die Extinktionskoeffizienten häufig unbekannt sind, erfolgte die
Quantifizierung der 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin wie bei Wenzel (2010) über die
Kalibriergerade des jeweiligen all-E-Isomers, wobei eine systematische Über- oder Unterschätzung in Kauf genommen wird.
4.3.2 Extraktion
Bei der Solid Phase Extraction (SPE) ist die Retention von Lutein mit einer C18-Phase stärker
als bei einer C30-Phase, die hydrophobere Eigenschaften aufweist [Shen et al. 2009]. Auch
Glaser (2001) verwendet zur Extraktion von Lutein und Zeaxanthin aus Spinat und Retina bei
der MSPD eine C18-Phase als Sorbens. Die Probenaufbereitung zur Extraktion der Luteinund Zeaxanthin-Isomere aus Eigelb mittels MSPD erfolgte daher unter Verwendung einer
C18-Phase. Die SPE-Methode wurde nicht getestet, da sie bei der Extraktion von Lutein aus
Humanserum und Muttermilch nach Shen et al. (2009) keine Vorteile gegenüber der FlüssigFlüssig-Extraktion bieten soll. Die geringen Wiederfindungsraten von all-E-Lutein (WR =
77,55 %) und all-E-Zeaxanthin (WR = 52,39 %), die verschobenen Retentionszeiten bei der
HPLC-PDA-Analyse sowie das hochpreisige Sorbensmaterial bedingten, dass die MSPDExtraktionsmethode nicht weiter optimiert wurde.
Die Optimierung der Flüssig-Flüssig-Extraktion nach Wenzel (2010) erfolgte zunächst durch
Variation des Lösungsmittelgemischs unter Ultraschallbehandlung (1 min). Letztere verbessert den Matrixaufschluss, die Vermischung von Extraktionslösungsmittel und Probe und
damit die Extraktionseffizienz. Bei der Extraktion von Lutein aus Eigelb mittels Hexan ist die
Extraktionseffizienz bei Ultraschallanwendung daher um den Faktor 3,6 höher [Yue et al.
2006]. Ebenso führt die Ultraschallanwendung (1 min) bei der Extraktion von all-E-Lutein und
all-E-Zeaxanthin aus Eigelb mittels Methanol zu einer höheren Ausbeute als eine einmalige
oder zweimalige Extraktion ohne Ultraschallbehandlung [Wenzel 2010]. Im Vergleich zum
Matrixaufschluss durch Verseifung unter dem Einfluss von Erhitzung und alkalischen Chemikalien ist das Ausmaß aufbereitungsinduzierter Isomerisierungen und Degradationen der
Carotinoide bei der Ultraschallbehandlung geringer. Bei der Extraktion von Lutein aus Eigelb
mittels Hexan ist die Ausbeute bei Ultraschallanwendung daher um den Faktor 3,6 und bei
Verseifung nur 2,6-mal höher [Yue et al. 2006].
63
Die Flüssig-Flüssig-Extraktion (Kapitel 3.5.2) erfolgte mit fünf, nach Literaturangaben zur
Extraktion von Lutein und Zeaxanthin [Hammershoj et al. 2010; Wenzel 2010; Schlatterer
und Breithaupt 2006; Breithaupt et al. 2003; Handelmann et al. 1999; Majchrzak und Elmadfa 1997; Ternes et al. 1995] modifizierten Lösungsmittelgemischen (Tab. 4-6). Aufgrund des
ca. 50 %igen Wasseranteils von Eigelb enthielten die Lösungsmittelgemische zur Verbesserung der Extraktionseffizienz mindestens ein wassermischbares organisches Lösungsmittel
[Khachick 2009; Schiedt und Liaaen-Jensen 1995]. Entsprechend der Mischbarkeitszahlen
[Waters 2004] konnten Entmischungen dabei ausgeschlossen werden.
Die höchsten, innerhalb des Sollbereichs (95 - 105 %) [Kromidas 1999] liegenden Wiederfindungsraten von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin ergaben sich bei Einsatz des MethanolMTBE-Gemischs. Bei Verwendung des Ethanol-Methanol-THF-Gemischs war die Wiederfindungsrate von all-E-Zeaxanthin (92,8 %) im Gegensatz zu all-E-Lutein (97,3 %) zu gering.
Neben der Kompatibilität mit dem HPLC-Eluenten gewährleisteten die beiden Lösungsmittelgemische bei der chromatographischen Trennung der all-E-und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin eine hohe Selektivität. Die anderen Lösungsmittelgemische eigneten sich aufgrund deutlich geringerer Wiederfindungsraten nicht zur quantitativen Extraktion der dotierten Standards von all-E-Lutein- und all-E-Zeaxanthin. Im Falle des n-Hexan/THF-Gemischs
könnte dies auf die Unmischbarkeit mit dem Eluenten zurückzuführen sein. Bei den Methanol-Ethylacetat-Leichtpetroleumether- und CHCl3/Methanol-Gemischen war die Selektivität
bei der chromatographischen Elution der Xanthophylle geringer als bei den Methanol-MTBEund Ethanol-Methanol-THF-Gemischen. (Tab. 4-6)
Tab. 4-6:
Optimierung der Flüssig-Flüssig-Extraktion durch Variation des Extraktionslösungsmittels
und der Ultraschallbehandlungszeit unter Bestimmung der Wiederfindungsraten von
Lutein und Zeaxanthin
Wiederfindungsrate [%]
Lutein
Zeaxanthin
Ultraschallbehandlungszeit
Extraktionslösungsmittel
1 min
MeOH/MTBE (80:20, v/v)
CHCl3/MeOH (60:40, v/v)
n-Hexan/THF (90:10, v/v)
MeOH/Ethylacetat/Leichtpetroleumether (1:1:1, v/v/v)
EtOH/MeOH/THF (75:20:5, v/v/v)
98,8
64,6
17,3
47,9
97,3
96,9
50,2
17,2
41,1
92,8
2 min
MeOH/MTBE (80:20, v/v)
EtOH/MeOH/THF (75:20:5, v/v/v)
101,9
97,3
99,4
95,3
3 min
EtOH/MeOH/THF (75:20:5, v/v/v)
99,4
99,6
Neben einer erhöhten Extraktionseffizienz sind mit Zunahme der Intensität der Ultraschallbehandlung mögliche Isomerisierungen und Degradationen der Xanthophylle zu berücksichtigen [Zhao et al. 2006]. Zur Erhaltung des nativen bzw. durch Erhitzung und Gefriertrocknung
veränderten qualitativen und quantitativen Xanthophyll-Musters in den Proben wurde daher
die Ultraschallbehandlungszeit optimiert.
64
Ergebnisse
Die Extraktion nativen Eigelbs mit den Methanol-MTBE- und Ethanol-Methanol-THF-Gemischen unter Verdoppelung der Ultraschallbehandlungszeit (2 min) resultierte erneut in höheren Wiederfindungsraten bei Verwendung des Methanol-MTBE-Gemischs. Dabei waren die
Wiederfindungsraten bei beiden Lösungsmittelgemischen im Sollbereich und für all-EZeaxanthin um gemittelt 2,5 % höher im Vergleich zur Ultraschallbehandlung für eine Minute.
Für all-E-Lutein ergab sich eine identische Wiederfindungsrate beim Ethanol-Methanol-THFGemisch und eine um 3,1 % höhere Wiederfindungsrate beim Methanol-MTBE-Gemisch.
Demnach schien die längere Ultraschallbehandlung die Extraktionseffizienz der Xanthophylle
zu verbessern. (Tab. 4-6)
Daher und aufgrund der besseren Löslichkeit von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin wurde
eine Probenaufbereitung mit dem Ethanol-Methanol-THF-Gemisch mit einer Ultraschallbehandlung von drei Minuten durchgeführt. Dies erhöhte erneut die Extraktionseffizienz, denn
die Wiederfindungsraten waren gegenüber der Ultraschallbehandlung von zwei Minuten um
2,1 % bei all-E-Lutein und 4,3 % bei all-E-Zeaxanthin höher (Tab. 4-6). Es ist also davon
auszugehen, dass ultraschallinduzierte Isomerisierungen und Degradationen der Xanthophylle unter diesen Bedingungen vernachlässigbar sind. Mit Wiederfindungsraten oberhalb
von 99 % erwies sich die nach Wenzel (2010) modifizierte Bestimmungsmethode, welche die
Extraktion und die HPLC-PDA-Analytik umfasste (Abb. 4-4), als optimal.
Einwaage
8 g Granula, 8 g Plasma, 1,5 g Eigelb
15 mL Ethanol-Methanol-THF (75:20:5, v/v/v)-Gemisch
®
und Abdichtung mittels Parafilm
Matrix-Aufschluss
3 min (Ultraschallbad)
Homogenisation
1 min bei 9500 U/min (Ultra-Turrax)
5 mL Ethanol-Methanol-THF (75:20:5, v/v/v)-Gemisch
Extraktion
20 min (Mini-Kreisschüttler Orbital)
Zentrifugation
4500 U/min, 5 min, +4 °C
Phasentrennung
Rückstand (weiß-opakes Sediment)
Entsorgung
Eluat (gelber, klarer Überstand)
Filtration (0,45 µm-RC-Spritzenvorsatzfilter)
Analytik
HPLC-PDA-(APCI)-MS-Messung
Abb. 4-4:
Probenaufbereitung und -analyse zur Bestimmung der Massenkonzentrationen der all-Eund 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in Granula, Plasma und Eigelb
65
Im Vergleich zu den mit Methanol bei Ultraschallbehandlung für eine Minute erreichten Wiederfindungsraten bei all-E-Lutein (95,3 %) und all-E-Zeaxanthin (95,0 %) von Wenzel (2010)
ergaben sich durch die Extraktion mit dem Ethanol-Methanol-THF-Gemisch und die längere
Ultraschallbehandlungszeit von drei Minuten um 4,1 % bei all-E-Lutein und um 4,6 % bei allE-Zeaxanthin höhere Wiederfindungsraten.
Mit den Probeneinwaagen von Granula (8 g), Plasma (8 g) und Eigelb (1,5 g; Abb. 4-4) korrelierten Konzentrationen von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin, deren UV-Vis-Absorptionen
im mittleren Kalibrierbereich (0,50 bis 1,25 µg/mL) liegende Signalhöhen [counts] ergaben,
was eine hohe Präzision der Messergebnisse bedeutet [Gottwald und Stieglitz 1996].
Das nach der Extraktion nativen Eigelbs abzentrifugierte weiß-opake Sediment aus Zellbestandteilen und denaturierten Proteinen wies auf eine quantitative Extraktion der dotierten
Standards und des matrixassoziierten Luteins und Zeaxanthins hin. Die gelben Sedimente
nativer Plasma- und Granula-Proben sowie einiger erhitzter und gefriergetrockneter Proben
zeigten, dass eine Reextraktion notwendig war (Abb. 4-4). Dies beeinträchtigte jedoch die
anhand der Linearität (Kapitel 4.3.1) sowie der Wiederfindung und Präzision (Kapitel 4.3.3)
nachgewiesene Eignung der Bestimmungsmethode nicht, da vor allem matrixspezifische
Eigenschaften und deren erhitzungs- und gefriertrocknungsinduzierte Modifikationen die
Xanthophyll-Extrahierbarkeit beeinflussen. Die Extraktionseffizienz korreliert mit dem Wasseranteil der Proben. Deshalb war bei Eigelb und Granula mit ähnlichen nativen Trockenmassen eine zweimalige Extraktion bis zur Entfärbung der Sedimente ausreichend, während
bei Plasma, das nativ aufgrund der methodisch bedingten Verdünnung eine ca. um den Faktor zwei geringere Trockenmasse aufweist, eine dreimalige Extraktion nötig war.
Mit den Xanthophyll-Massenkonzentrationen von Plasma und Granula wurden diejenigen
nativen Eigelbs über das gewichtete Mittel berechnet und mit den ermittelten Werten verglichen. Dabei ergab sich eine maximale Differenz von ca. 10 % (Anhang 2, Tab. 2-1). Die
Messergebnisse schwankten gemäß der Methodenpräzision um ca. 2 % (Kapitel 4.3.3). Zudem beeinflussen die Matrixeigenschaften (Viskosität, Wassergehalt) von Granula, Plasma
und Eigelb die Extraktionseffizienz. Die entsprechend der in der Umweltanalytik erlaubten
Variationskoeffizienten (10 - 15 %) [Kromidas 1999] daher vertretbare Abweichung der berechneten und ermittelten Xanthophyll-Gehalte bestätigte die Eignung der mit nativem Eigelb
optimierten Bestimmungsmethode für Plasma und Granula.
66
Ergebnisse
4.3.3 Richtigkeit und Wiederholpräzision der Bestimmungsmethode
Die Untersuchung der Probenextrakte aus dotiertem nativem Eigelb diente der Erfassung
von Matrix- sowie Aufbereitungs- und Analyse-Einflüssen auf die Richtigkeit der Bestimmungsmethode bei der Ermittlung der Massenkonzentrationen der Xanthophylle.
Da im Handel kein Eigelb-Referenzmaterial verfügbar war und sich die dotierten Standards
von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin gegenüber ihrem matrixassoziierten Pendant bei der
Extraktion anders verhalten, war die Wiederfindungsrate kein Maß für die Extrahierbarkeit
der nativen Eigelb-Xanthophylle.
Unter der Maßgabe, dass die Wiederfindungsrate mit der Konzentration des Analyten korreliert [Kromidas 1999], wurde natives Eigelb in je einer Dreifachbestimmung mit 0,1 und
0,25 mL der Stammlösung (100 µg/mL) von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin nach der Zugabe des Extraktionslösungsmittels zur Einwaage aufgestockt. Unter Berücksichtigung des
Probenvolumens von 20 mL ergaben sich die dotierten Konzentrationen von 0,50 und
1,25 µg/mL, was den mittleren Kalibrierbereich abdeckte. Die Soll-Konzentrationen [µg/mL]
an all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin in der aufgestockten Probe errechneten sich aus den
bestimmten Konzentrationen der unaufgestockten Proben, zu denen die jeweilige Dotierungs-Konzentration addiert wurde. Die berechneten Soll-Massenkonzentrationen [µg/100 g]
an all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin (Kapitel 4.3.5) wurden zur Bestimmung der Wiederfindungsrate mit den in den aufgestockten Proben analysierten Xanthophyll-Gehalten prozentual in Relation gesetzt.
Das Extraktionsverfahren (Abb. 4-4) und die HPLC-PDA-Analyse-Methode zeichneten sich
durch hohe Wiederfindungsraten von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin oberhalb von 99 und
unterhalb von 102 % aus. Bezogen auf die jeweilige Aufstockungskonzentration waren die
Wiederfindungsraten von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin identisch. Bei höherer Dotierung
(1,25 µg/mL) waren die Wiederfindungsraten von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin gemittelt
um 1,9 % geringer als bei der Dotierung mit 0,50 µg/mL. (Tab. 4-7)
Tab. 4-7:
Konzentrationsabhängige Wiederfindungsraten von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin
Aufstockung
Wiederfindungsrate WR [%]
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
0,50 µg/mL
101,2
101,3
1,25 µg/mL
99,5
99,3
Die innerhalb des Sollbereichs (95 bis 105 %) liegenden Wiederfindungsraten von all-ELutein und all-E-Zeaxanthin waren ein Nachweis für die Richtigkeit, Robustheit und Selektivität der Bestimmungsmethode [Kromidas 1999].
67
Das Extraktionsverfahren und die HPLC-PDA-Analyse sowie mögliche Matrixeinflüsse gewährleisten damit ein geringes Ausmaß an Verlusten der dotierten Standards von all-ELutein und all-E-Zeaxanthin durch die Probenaufbereitung sowie Isomerisierungen und Degradationen der Xanthophylle.
Da die Richtigkeit nicht gleichzeitig präzise Messergebnisse gewährleistet [Kromidas 1999;
Gottwald und Stieglitz 1996], wurde die Bestimmungsmethode hinsichtlich ihrer Präzision
validiert, die ebenfalls mit der Analytkonzentration korreliert. Daher wurden zur Bestimmung
der Messpräzision des Analyse-Systems die den mittleren Kalibrierbereich umfassenden
beiden Konzentrationen an all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin (0,50 und 1,25 µg/mL) je
sechsmal analysiert und die Variationskoeffizienten der Peakhöhen [counts] berechnet. Anhand der bei der Überprüfung der Richtigkeit sechsfach bestimmten Massenkonzentrationen
an all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin [µg/100 g] in nativem Eigelb wurden die Variationskoeffizienten der Methodenpräzision des Extraktionsverfahrens und der HPLC-PDA-Analyse ermittelt. Dabei waren die Peakhöhen und Massenkonzentrationen bei  = 0,05 normalverteilt
(David-Test) und ausreißerfrei (Dixon-Test). (Tab. 4-8)
Tab. 4-8:
Variationskoeffizienten [%] der Mess- und Methodenpräzision (Wiederholbarkeit) von allE-Lutein und all-E-Zeaxanthin (Sechsfachbestimmung)
Variationskoeffizient VK [%]
Messpräzision
Methodenpräzision
0,50 µg/mL
1,25 µg/mL
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
1,4
1,5
1,5
1,6
2,3
2,0
Die bei beiden Konzentrationen und bei beiden all-E-Isomeren ähnlichen Variationskoeffizienten der Messpräzision basierten auf zufälligen Schwankungen der HPLC-PDA-Analyse.
Aufgrund der zusätzlichen Einflüsse durch die Eigelbmatrix und das Extraktionsverfahren
waren die erneut bei beiden all-E-Isomeren ähnlichen Variationskoeffizienten der Methodenpräzision höher. (Tab. 4-8)
Nach den in der Pharma-Qualitätskontrolle (1 - 2 %) und der Umweltanalytik (10 - 15 %) erlaubten Variationskoeffizienten der Methodenpräzision [Kromidas 1999] war die zufällige
Streuung der Messwerte bei all-E-Lutein (2,3 %) und bei all-E-Zeaxanthin (2,0 %; Tab. 4-8)
und damit die Störanfälligkeit der Bestimmungsmethode gering. Dies gewährleistet eine präzise und robuste Ermittlung der Xanthophyll-Massenkonzentrationen.
68
Ergebnisse
4.3.4 Identifizierung von Lutein und Zeaxanthin
Carotinoide mit ähnlichen chemisch-physikalischen Eigenschaften wie Stereoisomere können gleichzeitig eluieren. Die UV-Vis-Absorptionsspektren repräsentieren ausschließlich das
bei Lutein und Zeaxanthin ähnliche Chromophor des Moleküls [Britton 1995]. Coeluierende
Matrixbestandteile können die Empfindlichkeit bei der massenspektrometrischen Analyse
von Analyten, die in geringen Konzentrationen enthalten sind, vermindern [Dachtler 2000].
Aus diesen Gründen basierte die Identifizierung der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin auf der Überprüfung des chromatographischen, spektralphotometrischen und
massenspektrometrischen Verhaltens [Rodriguez-Amaya 2001].
Chromatographisches Verhalten
Aufgrund der identischen gerätetechnischen Ausstattung und chromatographischen Bedingungen hinsichtlich der verwendeten C30-Säule mit Endcapping und der Eluentenzusammensetzung stimmten die Elutionsreihenfolge und die korrelierenden Retentionszeiten der
all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin (Abb. 4-5) mit Wenzel (2010) überein
(Abb. 4-6, links). Dabei eluierte all-E-Lutein vor all-E-Zeaxanthin, was gleichermaßen für die
anschließend detektierten 13-Z-Isomere galt (Abb. 4-5).
Plasma A 1 -1
07-Aug-2012
16:06:09
6.64
6.64
Test012073-2
1.3e-1
all-E-Lutein
1.2e-1
2: Diode Array
450
Range: 1.309e-1
Area, Height
23478
130961
6.92
21522
108593
6.92 all-E-Zeaxanthin
1.1e-1
1.0e-1
9.0e-2
AU
8.0e-2
7.0e-2
6.0e-2
13-Z-Zeaxanthin
5.0e-2
13-Z-Lutein
unknown
4.0e-2
3.0e-2
2.0e-2
5.07
4.00
Abb. 4-5:
4.50
5.00
7.47
6.01
6.01
2770
5.07
1078
2306
1.0e-2
7.47
3335
11744
7.93
5822
19497
7.93
unknown
6163
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
8.00
8.50
9.00
9.50
Time
Elutionsreihenfolge der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin am Beispiel
von gefriergetrocknetem Plasma
Zusätzlich bestätigte sich die Elutionsreihenfolge bei einem Vergleich mit Glaser (2001). Bei
dieser Trennung eines Lutein-Zeaxanthin-Standardgemischs auf einer C30-Säule mit Endcapping eluieren die Z-Isomere nach den all-E-Isomeren, die 13-Z-Isomere vor den 9-ZIsomeren und das jeweilige Lutein-Isomer vor dem Zeaxanthin-Isomer (Abb. 4-6, rechts).
69
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
13-Z-Lutein
unknown
1 = 13-Z-Lutein
2 = 13`-Z-Lutein
3 = 13-Z-Zeaxanthin
4 = all-E-Lutein
5 = all-E-Zeaxanthin
6 = 9-Z-Lutein
7 = 9´-Z-Lutein
8 = 9-Z-Zeaxanthin
13-Z-Zeaxanthin
unknown
Abb. 4-6:
Elution der Lutein- und Zeaxanthin-Isomere auf einer C30-Phase mit Endcapping – Chromatogrammausschnitt einer sprühgetrockneten Eigelbprobe (links) [Wenzel 2010]; Standardgemisch von Lutein und Zeaxanthin (rechts) [Glaser 2001]
Zur Erfassung von Matrixeinflüssen auf die chromatographische Trennung der Xanthophylle
wurden die Retentionszeiten der beiden all-E-Isomere von Lutein und Zeaxanthin unter Einfluss von Eigelbmatrix (Probenextrakte) mit denen der Standards (Kalibrierlösung) verglichen. Weder im Rahmen der Spannweiten (RT,min bis RT,max) noch bei den gemittelten Retentionszeiten der beiden all-E-Isomere ergab sich ein Unterschied zwischen den Kalibrierlösungen und den Probenextrakten (Tab. 4-9).
Tab. 4-9:
Vergleich der Retentionszeiten von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin in einer Kalibrierlösung und unter Einfluss von Eigelbmatrix (Probenextrakt)
all-E-Isomer
Lutein
Zeaxanthin
Retentionszeit RT [min]
Kalibrierlösung
Eigelbmatrix (Probenextrakt)
̅ = 5.81
RT,min = 5.66 / RT,max = 5.84
̅ = 6.06
̅ = 5.77
RT,min = 5.60 / RT,max = 5.92
̅ = 6.01
RT,min = 5.89 / RT,max = 6.09
RT,min = 5.84 / RT,max = 6.17
Zudem wurde natives Eigelb mit den Standards von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin aufgestockt. Bei der chromatographischen Trennung nahmen die Peakhöhen im Verhältnis zur
Aufstockung ohne Auftrennung zu, und die Retentionszeiten korrelierten mit denen der Standards.
Die Chromatogramme separater Standardlösungen von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin
(Anhang 2, Abb. 3a) bestätigten die Elutionsreihenfolge und die Identifizierung der Xanthophylle anhand der Retentionszeiten.
Da die Eigelbmatrix keinen Einfluss auf die Elution der Xanthophylle hatte, eignen sich die
charakteristischen Retentionszeiten der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin
bei den beschriebenen chromatographischen Bedingungen zur Identifizierung.
70
Ergebnisse
Unterschiedliche Partikelgrößenverteilungen und Porendurchmesser und damit für den Adsorptionsprozess bei der chromatographischen Trennung verfügbare Oberflächen der stationären Phase beeinflussen die Anzahl theoretischer Trennstufen. Letztere ist daher selbst bei
gleicher Säulenart desselben Herstellers säulenspezifisch. Geringe Unterschiede in den Retentionszeiten der Xanthophylle können daher durch einen Säulenwechsel bedingt sein.
Aufgrund der spezifischen Eigenschaften chromatographischer Systeme sind von anderen
Autoren beschriebene Elutionssequenzen zu überprüfen [Khachik 2009]. Trotz der Übereinstimmung der Elutionsreihenfolge mit der bei Wenzel (2010) und Glaser (2001) und der Bestätigung anhand des Retentionszeitenvergleichs mit den Standards, wurden zur Absicherung der Identifizierung der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin die UV-VisAbsorptions- und APCI-Massenspektren interpretiert.
UV-Vis-Spektralphotometrie
Die Interpretation der am Peakmaximum betrachteten Absorptionsspektren der all-E- und 13Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin basierte auf einem Vergleich der Absorptionsmaxima I,
II und III der Hauptabsorptionsbande, der Schwingungsfeinstruktur und bei den 13-Z-Isomeren der Z-Bande mit Literaturwerten. Gemäß den Absorptionsspektren der Standards von allE-Lutein und all-E-Zeaxanthin (Abb. 4-7) waren die Absorptionsmaxima bei all-E-Lutein aufgrund der isolierten Doppelbindung des -Rings und der damit verringerten Chromophorlänge um 8 nm (I), 7 nm (II) und 4 nm (III) gegenüber all-E-Zeaxanthin hypsochrom verschoben.
LUTKalib a Tuning Dez2011-MSTUne1
Test00617 3398 (5.763)
all-E-Lutein
06-Dec-2011
00:44:57
2: Diode Array
1.126e-1
444
444.25
1.1e-1
ZEAKalib a Tuning Dez2011MSTUne1
Test00621 3574 (6.057)
all-E-Zeaxanthin
220.25
451
1.1e-1
473
06-Dec-2011
03:38:30
2: Diode Array
1.129e-1
451.25
473.25
1.0e-1
1.0e-1
9.0e-2
9.0e-2
422.25
422
7.0e-2
6.0e-2
6.0e-2
5.0e-2
5.0e-2
4.0e-2
4.0e-2
3.0e-2
3.0e-2
2.0e-2
2.0e-2
1.0e-2
0.0
Abb. 4-7:
300
325
350
375
400
425
422
450
475
273.25
1.0e-2
all-trans-Lutein
275
430
430.25
8.0e-2
7.0e-2
AU
AU
8.0e-2
477
477.25
all-trans-Zeaxanthin
500
525
550
575
nm
600
0.0
250
300
350
400
450
500
550
nm
600
Standardsubstanzen – Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande (422/444/473)
mit Schwingungsfeinstruktur (64 %III/II) von all-E-Lutein (links) und Absorptionsmaxima
der Hauptabsorptionsbande (430/451/477) mit Schwingungsfeinstruktur (38 %III/II) von
all-E-Zeaxanthin (rechts)
71
Da die Eluentenzusammensetzung an Wenzel (2010), Schlatterer und Breithaupt (2006) sowie Breithaupt et al. (2003) angelehnt war, sind die Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande der all-E-Isomere von Lutein und Zeaxanthin vergleichbar (Tab. 4-10). Die Angaben von Glaser (2001) basieren auf Messungen in Aceton-Wasser-Gemischen, die zu bathochromen Verschiebungen der Absorptionsmaxima um 2 bis 6 nm führen [Britton 1995].
Daher ergaben sich gegenüber Glaser (2001) hypsochrome Wellenlängenverschiebungen
der Absorptionsmaxima von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin zwischen 0 und 4 nm.
Tab. 4-10:
Literaturwerte der Absorptionsmaxima I/II/III der Hauptabsorptionsbande sowie der
Schwingungsfeinstruktur (%III/II) der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin
Isomer
all-E-Lutein
13-Z-Lutein
all-EZeaxanthin
13-ZZeaxanthin
Absorptionsmaxima I/II/III der Hauptabsorptionsbande [nm]
Schwingungsfeinstruktur [%III/II]
Wenzel
Glaser
(2010)
(2001)
Wenzel
(2010)
Schlatterer und
Breithaupt (2006)
Breithaupt
et al. (2003)
Glaser
(2001)
420/443/474
417/441/472
420/446/472
/
420/446/474
/
426/447/476
422/441/468
61
30
61
30
420/446/475
426/452/478
428/452/480
430/454/481
23
24
416/442/473
/
/
426/447/474
11
12
Mit 64 %III/II war die Schwingungsfeinstruktur des asymmetrischen all-E-Luteinmoleküls
ausgeprägter als bei all-E-Zeaxanthin (38 %III/II; Abb. 4-7), was auf der symmetrischen
Grundstruktur von Zeaxanthin und der damit beidseitigen sterischen Hinderung zwischen
dem Methylsubstituenten am C5-Atom des -Rings und dem H-Atom am C8-Atom der Kette
basiert. Auch bei Wenzel (2010) und Glaser (2001) ist das Höhenverhältnis des dritten und
zweiten Absorptionsmaximums bei all-E-Zeaxanthin mit 23 und 24 % geringer als bei all-ELutein mit 61 % (Tab. 4-10), wobei die ermittelte Schwingungsfeinstruktur von all-E-Lutein
(64 %III/II) mit diesen Literaturwerten übereinstimmte.
Zur Identifzierung der 13-Z-Isomere wurden separate Stammlösungen (100 µg/mL) der
Standards von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin gemessen, wobei es konzentrationsbedingt
zur retardierten Elution der Isomere kam (Abb. 4-8). Wie bei den all-E-Isomeren waren die
Absorptionsmaxima bei 13-Z-Lutein gegenüber 13-Z-Zeaxanthin hypsochrom um 9 nm (I), 5
nm (II) und 1 nm (III) verschoben, und die Schwingungsfeinstruktur von 13-Z-Lutein (36
%III/II) war ausgeprägter als die von 13-Z-Zeaxanthin (16 %III/II; Abb. 4-8). Im Vergleich zu
ihren all-E-Konfigurationen ergaben sich hypsochrome Verschiebungen von 10 nm (I), 4 nm
(II) und 3 nm (III) bei 13-Z-Lutein und 9 nm (I), 6 nm (II) und 6 nm (III) bei 13-Z-Zeaxanthin
(Abb. 4-7 und 4-8). In Bezug auf das Absorptionsmaximum II (max) stimmte dies mit der Literaturangabe zu dessen hypsochromer Verschiebung bei den mono-Z-Isomeren zwischen 2
und 6 nm überein [Britton 1995].
72
Ergebnisse
13-Z-Lutein
QLC 9094
Lutein-Stammloesung 1
Test00734 13621 (22.802)
11-Jan-2012
04:31:54
2: Diode Array
6.188e-3
440
326.25
440.25
435.25
445
1.2e-2
5.6e-3
1.1e-2
415.25
412
5.4e-3
409.25
5.2e-3
471.25
471
421.25
421
1.0e-2
470
470.25
Z-Bande
9.0e-3
5.0e-3
4.8e-3
11-Jan-2012
08:38:04
2: Diode Array
1.331e-2
445.25
1.3e-2
446.25
5.8e-3
336
336.25
8.0e-3
374.25
AU
AU
QLC 9094
Test00738 14226 (23.810)
337.25
6.0e-3
13-Z-Zeaxanthin
Zeaxanthin-Stammloesung 1
4.6e-3
7.0e-3
260.25
4.4e-3
6.0e-3
4.2e-3
4.0e-3
5.0e-3
3.8e-3
4.0e-3
3.6e-3
3.0e-3
3.4e-3
2.0e-3
3.2e-3
325
Abb. 4-8:
350
375
400
425
450
475
500
525
550
575
nm
504.25
250
300
350
400
450
500
550
nm
600
Standardstammlösung (100 µg/mL) – Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande
(412/440/470) mit Schwingungsfeinstruktur (36 %III/II) von 13-Z-Lutein (links) und Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande (421/445/471) mit Schwingungsfeinstruktur
(16 %III/II) und Z-Bande (336 nm, 57 %AB/AII) von 13-Z-Zeaxanthin (rechts)
Im Absorptionsspektrum von 13-Z-Zeaxanthin trat in Einklang mit der Literatur [LiaaenJensen und Lutnœs 2008] 141 nm unterhalb des Absorptionsmaximums III von all-EZeaxanthin eine mit 57 %AB/AII ausgeprägte Z-Bande bei 336 nm auf.
Aufgrund der geringeren molaren Extinktionskoeffizienten der 13-Z-Isomere [Liaaen-Jensen
und Lutnœs 2008] waren, zusammen mit dem hypochromen Effekt, die Schwingungsfeinstrukturen bei 13-Z-Lutein (1,8-fach) und 13-Z-Zeaxanthin (2,4-fach) geringer ausgeprägt als
bei deren all-E-Konfigurationen. Auch nach Wenzel (2010) und Glaser (2001) sind die
Schwingungsfeinstrukturen der 13-Z-Isomere um den Faktor zwei geringer, während diejenigen der 9-Z-Isomere im Vergleich zum jeweiligen all-E-Isomer stärker ausgeprägt sind [Glaser 2001]. Dies bestätigte die Identifizierung der 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin,
deren Schwingungsfeinstrukturen und Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande auch
mit den Literaturwerten vergleichbar waren. (Abb. 4-8, Tab. 4-10)
Die Absorptionsmaxima I/II/III (412/432/459 nm) des direkt vor all-E-Lutein eluierenden Analyten (unknown; Anhang 2, Abb. 3a) waren im Vergleich zu all-E-Lutein um 10 nm (I), 12 nm
(II) und 14 nm (III) hypsochrom verschoben. Dies war deutlich höher als die Verschiebung
des Absorptionsmaximums max bei mono-Z-Isomeren um 2 bis 6 nm [Britton 1995]. Aufgrund der geringen Schwingungsfeinstruktur (22 %III/II) und der um 9 nm (I), 11 nm (II) und
12 nm (III) hypsochrom verschobenen Absorptionsmaxima konnte es sich bei dem Analyten
auch nicht um 9-Z-Lutein (65 %III/II) handeln [Glaser 2001]. Möglicherweise war der unbekannte Analyt ein Poly-Z-Isomer, das sich gegenüber der all-E-Konfiguration durch eine stark
hypsochrome Verschiebung der Hauptabsorptionsbande und verringerte Schwingungsfeinstruktur auszeichnen kann [Britton 1995]. Der vor all-E-Lutein eluierende Analyt war demnach nicht identifizierbar und blieb bei der Spektrenauswertung unberücksichtigt.
73
Zur Untersuchung von Matrixeinflüssen auf die Absorption der all-E- und 13-Z-Isomere von
Lutein und Zeaxanthin wurden die Spektren der Xanthophyll-Isomere des Probenextrakts
nativen Eigelbs mit denen der Standardlösungen verglichen (Tab. 4-11).
Tab. 4-11:
Vergleich der Absorptionsmaxima (I/II/III) und der Schwingungsfeinstruktur (%III/II) der
all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin unter Matrixeinfluss und in Standardlösung
Xanthophyll-Isomer
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
13-Z-Lutein
13-ZZeaxanthin
Absorptionsmaxima I/II/III [nm]
Standard
422/444/473
430/451/477
412/440/470
421/445/471
Eigelb
421/444/471
431/448/476
n. b.*/440/470
n.b.*/447/476
Schwingungsfeinstruktur %III/II
Standard
64
38
36
16
Eigelb
62
43
n. b.*
n. b.*
*Aufgrund der geringen Intensität der Hauptabsorptionsbande nicht bestimmbar
Neben identischen Wellenlängen bei 13-Z-Lutein waren die Absorptionsmaxima von all-ELutein, all-E-Zeaxanthin und 13-Z-Zeaxanthin um maximal 2, 3 und 5 nm im Vergleich zur
Standardlösung verschoben (Tab. 4-11).
Die Schwingungsfeinstrukturen von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin waren unter Matrixeinfluss und in Standardlösung ähnlich. Aufgrund der geringen Intensität der Hauptabsorptionsbande konnten das Absorptionsmaximum I und die Schwingungsfeinstruktur der 13-Z-Isomere bei nativem Eigelb nicht ermittelt werden, was aber infolge der höheren Massenkonzentrationen bei gefriergetrocknetem Plasma möglich war (Abb. 4-9).
Plasma A 1 -1
QLC 9094
Test012073-2 4428 (7.480)
07-Aug-2012
16:06:09
13-Z-Lutein
2: Diode Array
1.753e-2
Plasma A 1 -1
QLC 9094
Test012073-2 4699 (7.932)
471.25
471
1.0e-2
1.5e-2
Z-Bande
329
329.25
336
336.25
7.5e-3
5.0e-3
2.5e-3
300
74
Z-Bande
1.25e-2
1.0e-2
8.0e-3
Abb. 4-9:
421
1.75e-2
415
AU
AU
1.2e-2
2: Diode Array
2.303e-2
471.25
471
2.0e-2
1.4e-2
446
446.25
2.25e-2
440
440.25
07-Aug-2012
13-Z-Zeaxanthin 16:06:09
350
400
450
500
550
nm
0.0
300
350
400
450
500
nm
Gefriergetrocknetes Plasma – Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande
(415/440/471) mit Schwingungsfeinstruktur (28 %III/II) und Z-Bande bei 329 nm (40
%AB/AII) von 13-Z-Lutein (links) und Absorptionsmaxima der Hauptabsorptionsbande
(421/446/471) mit Schwingungsfeinstruktur (19 %III/II) und Z-Bande bei 336 nm (52
%AB/AII) von 13-Z-Zeaxanthin (rechts)
Ergebnisse
Dabei waren die Absorptionsmaxima I und die Schwingungsfeinstrukturen von 13-Z-Lutein
und 13-Z-Zeaxanthin denen der Standardlösung ähnlich. Zudem wies die Z-Bande von 13-ZLutein (329 nm) mit 40 %AB/AII eine geringere Intensität als die von 13-Z-Zeaxanthin (336
nm) auf16 (52 %AB/AII), deren Intensität in der Standardlösung ähnlich war (57 %AB/AII). (Abb.
4-9, Tab. 4-11)
Im Vergleich zur Standardlösung und zu den Literaturangaben [Wenzel 2010; Glaser 2001]
waren die Absorptionsmaxima und die Schwingungsfeinstrukturen der Xanthophyll-Isomere
in den Probenextrakten ähnlich. Da keine bathochrom oder hypsochrom verschobenen sowie hyperchrom oder hypochrom beeinflussten Absorptionsmaxima und keine Veränderungen der Schwingungsfeinstruktur auftraten, war die Identifizierung der Xanthophylle anhand
der Absorptionsspektren unter Matrixeinfluss gewährleistet.
Coeluierende Matrixbestandteile vermindern die Empfindlichkeit bei der massenspektrometrischen Analyse [Dachtler 2000] der ohnehin mit maximal 8,2 % der Gesamt-XanthophyllMassenkonzentration in geringen Mengen enthaltenen 13-Z-Isomere (Anhang 3). Da die
Absorptionsspektren selektiv die Absorption der Xanthophylle bei 450 nm unter weitgehendem Ausschluss von Matrixbestandteilen darstellen, dienten sie besonders der Identifizierung der 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin.
Zur Identifizierung ist das Absorptionsspektrum allein nicht ausreichend, da es nur Informationen über das Chromophor enthält [Britton 1995]. Da Letzteres durch Hydroxylgruppen
nicht verändert wird, weisen -Carotin und dessen Hydroxyderivat Lutein mit jeweils 10 konjugierten Doppelbindungen sowie Zeaxanthin und dessen Vorläufercarotinoid -Carotin mit
jeweils 11 konjugierten Doppelbindungen dieselben Chromophore und damit Absorptionsspektren auf [Britton 1995]. Die Identifizierung der Xanthophylle wurde daher zusätzlich zu
den chromatographischen Retentionszeiten und Absorptionsspektren durch die massenspektrometrische Analyse abgesichert.
16
144 nm bzw. 141 nm unterhalb des Absorptionsmaximums III von all-E-Lutein bzw. all-E-Zeaxanthin
75
Massenspektrometrie
Die all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein können von denen des strukturell ähnlichen
Zeaxanthins anhand der in spezifischem Ausmaß gebildeten charakteristischen Molekül- und
Fragmentionen bei der massenspektrometrischen Analyse unterschieden werden. Dazu
wurde das HPLC-System neben dem PDA-Detektor an ein Quadrupol-Massenspektrometer
gekoppelt. Zur Ionisierung wurde das APCI(+)-Sprayverfahren eingesetzt, wobei die Anteile
an Methanol (92,9 %), Wasser (0,5 %) und Methansäure (0,1 %) im Eluenten zum Elutionszeitpunkt der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin eine gute Ionisierung gewährleisteten.
Bei der massenspektrometrischen Identifizierung der Isomere von Lutein und Zeaxanthin
wurden am Peakmaximum im Chromatogramm, d. h. bei der charakteristischen Retentionszeit des Xanthophyll-Isomers, die Totalionenströme (TIC17) interpretiert, die neben dem Molekülionenpeak das Fragmentierungsmuster darstellen. Zudem wurden über den Elutionsbereich von all-E- und 13-Z-Lutein (5.00 bis 6.50 min) die charakteristischen Massenladungsverhältnisse m/z 551 und 569 und für die Zeaxanthin-Isomere zwischen 5.00 und 7.00 min
die Massenspur m/z 569 selektiv betrachtet.
Bei der Optimierung der Analyseparameter wurden separate Standardlösungen von all-ELutein und all-E-Zeaxanthin unter Variation der cone-Spannung (30, 35, 40 V) und der
corona-Spannung (2,9 kV bis 3,3 kV in 0,1 kV-Schritten) in Anlehnung an Wenzel (2010)18
sowie Schlatterer und Breithaupt (2006)19 gemessen. Einstellungen mit 20 V cone-Spannung
und 3,1 kV corona-Spannung sowie mit cone-Spannungen von 30 V bzw. 35 V und 2,8 kV
corona-Spannung erwiesen sich in Vortests als ungeeignet. Neben dem TIC am Peakmaximum und der Selektion der Massenspuren über den Elutionsbereich des all-E-Isomers basierte die Auswahl der geeigneten cone- und corona-Spannungen auf der Betrachtung der
Ionensignale bei der TIC-Messung.
Aufgrund der hohen Flussrate und der kurzen Kapillarverbindung zwischen dem PDA-Detektor und dem Massenspektrometer war ein der Retentionszeit im Chromatogramm entsprechendes Signal im Massenspektrum zu erwarten. Der zeitliche Vergleich der massenspektrometrischen Signale mit der Retentionszeit wurde daher ebenfalls bei der Auswahl der geeigneten cone- und corona-Spannungen berücksichtigt.
17
Total Ion Current = Summe aller pro Zeiteinheit gebildeten Ionen
cone = 35 V; corona = 3,1 kV
19
cone = 30 V; corona = 3,2 kV
18
76
Ergebnisse
Zur Identifizierung von Lutein erwiesen sich eine corona-Spannung von 3,0 kV und eine cone-Spannung von 35 V als am besten geeignet. Während im Elutionsbereich von all-E-Lutein
kein Signal detektiert wurde, zeigte der TIC am Peakmaximum von all-E-Lutein (RT = 5.76
min) neben dem Basispeak m/z 551 [M+H-H2O]+ mit gleicher Intensität das Fragmention m/z
449, das aus der sukzessiven Eliminierung zweier Masseneinheiten von 60 u, ausgehend
vom protonierten Molekülion, resultieren könnte (Abb. 4-10). Der Massenverlust des protonierten Molekülions m/z 569 von 60 u kann dabei durch die Hydroxyl-Gruppe im -Ring des
Luteinmoleküls induziert werden [Enzell und Back 1995]. Daher war im Massenspektrum
auch ein Signal m/z 509 (ca. 25 %) detektierbar. Ein diagnostisches Ion mit ca. 17 % Intensität zeigte sich bei m/z 565 [Dachtler 2000]. Das Fragment m/z 410 (ca. 10 %) könnte durch
die Abspaltung einer Dimethylcyclodecapentaen-Einheit von 158 u des Molekülions bedingt
sein [Liaaen-Jensen und Lutnœs 2008].
LUTKalib a Tuning Dez2011-MSTUne1
QLC 9094
1: Scan AP+
3.85e4
551.62
%
100
06-Dec-2011
00:44:57
551
449
449.11
Test00617 311 (5.735)
359.84
378.63
509
509.88
402.82
565
408.59
392.87
410
489.25
410.43
423.69
0
360
Abb. 4-10:
380
400
420
565.98
494.78
546.95
626.63
471.08
440
460
480
500
520
540
560
580
600
620
640
m/z
TIC am Peakmaximum von all-E-Lutein
Die Selektion der für Lutein typischen m/z-Verhältnisse 551 und 569 im Elutionsbereich (5.00
bis 6.50 min) und die zeitliche Verschiebung zum Peakmaximum (RT = 5.76 min) von all-ELutein bestätigten die Eignung der gewählten cone- und corona-Spannungen. Der m/zBasispeak 551 trat nach 5.74 min und damit geringfügig vor dem Peakmaximum aber innerhalb des Elutionsprofils von all-E-Lutein auf (Anhang 2, Abb. 3b-1). Gleiches galt für das Molekülion m/z 569, das mit ca. 41 % Intensität nach 5.84 min mit leichter Verzögerung zum
Peakmaximum detektiert wurde. Unterschiede im Gerätetyp, in den Messparametern20 und
der Eluentenzusammensetzung bedingten die geringere Intensität des Lutein-Molekülions
[M+H]+ (14 %) bei Schlatterer und Breithaupt (2006).
20
Schlatterer und Breithaupt (2006): corona = 3,2 kV / cone = 30 V / High Voltage lens = 0,5 kV / scan
range = m/z 300 - 700 / scan time = 2,0 s
77
Bei den Zeaxanthin-Isomeren war der TIC am Peakmaximum bei allen cone- und coronaSpannungen durch Fragmentionen als Basispeaks gekennzeichnet. Dabei wurden mit hoher
oder 100 % Intensität die diagnostischen Massenspuren m/z 583 und m/z 565 identifiziert
[Dachtler 2000]. Im Gegensatz zu Schlatterer und Breithaupt (2006) trat das typische durch
die Eliminierung von Wasser bedingte Fragmention m/z 551 [M+H-H2O]+ nicht auf. Unter
Berücksichtigung der Intensität des Grundrauschens und des Signals bei der TIC-Messung
war eine corona-Spannung von 2,9 kV in Kombination mit cone-Spannungen von 40 oder
30 V zur Identifizierung der Zeaxanthin-Isomere geeignet. Bei 30 V cone-Spannung waren
das Ionensignal bei der TIC-Messung (5,91 min; Abb. 4-11) und der m/z 569 Basispeak im
Elutionsbereich (5,93 min; Anhang 2, Abb. 3b-2) fast identisch mit der Retentionszeit am
Peakmaximum (RT = 5.92 min).
ZEA Stammloesung Tuning 17
09-Dec-2011
05:01:46
all-E-Zeaxanthin
Test00656
2: Diode Array
450
Range: 5.762e-1
5.92
AU
4.0e-1
2.0e-1
13-Z-Zeaxanthin
6.65
Test00656
3.00
4.00
5.00
6.00
%
2
3.00
Abb. 4-11:
4.17
4.00
9.00
10.00
1: Scan AP+
TIC
3.68e6
corona = 2,9 kV
5.97
cone = 30 V
5.42
3.89
8.00
5.91
TIC-Messung
3.45
7.00
6.59
6.77
4.35 4.884.94
5.00
6.00
7.00
8.11 8.33
7.49 7.56
8.00
8.51
9.08 9.32
9.00
9.82
Time
10.00
Parameteroptimierung (corona 2,9 kV, cone 30 V) bei Zeaxanthin – Chromatogramm
(oben) und TIC-Messung von Zeaxanthin (unten)
Bei höherer cone-Spannung (40 V) war das Signal bei der TIC-Messung (5,94 min) ebenfalls
fast identisch mit dem Peakmaximum (RT = 5,93 min), während der stärker verschobene
Basispeak des selektierten Molekülions m/z 569 (6,03 min) anhand des Elutionsprofils zugeordnet werden konnte. Aufgrund des fast zeitgleichen Signalauftretens in Chromatogramm
und Massenspektrum wurden die corona- und cone-Spannungen bei der massenspektrometrischen Identifizierung der Zeaxanthin-Isomere mit 2,9 kV und 30 V eingestellt.
Tabelle 4-12 zeigt die mit Standardlösungen optimierten Analyseparameter für die massenspektrometrische Identifizierung der Isomere von Lutein und Zeaxanthin. Der gegenüber
Schlatterer und Breithaupt (2006) (m/z 300 - 700) eingeschränkte Massenscanbereich (m/z
350 - 650) diente der Empfindlichkeitssteigerung bei der Detektion sowie der Erleichterung
der Spektren-Interpretation und ähnelte dem von Wenzel (2010) (m/z 400 – 600).
78
Ergebnisse
Tab. 4-12:
Optimierte Analyseparameter der Massenspektrometrie
Parameter
Einstellung
Modus
APCI(+)
Temperatur APCI-Quelle (Source Block) und APCI-Probe +150 °C und +450 °C
Spannung der Coronanadel
Lutein: 3,0 kV / Zeaxanthin: 2,9 kV
Spannung der Rangefinder-Linse
0,1 kV
Zerstäubungsgas N2 (Nebulizer)
150 L/h
Trocknungsgas N2 (Desolvation)
800 L/h
Massenbereich (TIC)
350 - 650 m/z
cone-Spannung
Lutein: 35 V / Zeaxanthin: 30 V
Extractor
3V
Scanzeit
1,00 s
Zeitversatz der Scans
0,10 s
Infolge der Messung gefriergetrockneten Eigelbs (corona 3,0 kV, cone 35 V) konnte nach der
Selektion des charakteristischen m/z-Bereichs am Peakmaximum von all-E-Lutein das diagnostische Ion m/z 551 als Basispeak detektiert werden (Anhang 2, Abb. 3b-3). Bei 13-ZLutein war dieses charakteristische Massenverhältnis um eine Masseneinheit verschoben
und trat bei m/z 552 auf (Anhang 2, Abb. 3b-3). Bei der massenspektrometrischen Identifizierung von Zeaxanthin (corona 2,9 kV, cone 30 V) zeigte die Selektion der Massenspuren an
den Peakmaxima von all-E- und 13-Z-Zeaxanthin neben dem Molekülion m/z 569 (Basispeak) weitere Fragmente mit höherer Masse (Anhang 2, Abb. 3b-4). Bei beiden Zeaxanthin-Isomeren trat außerdem mit geringer Intensität das diagnostische Ion m/z 565 und
bei all-E-Zeaxanthin zusätzlich m/z 567 auf [Dachtler 2000] (Anhang 2, Abb. 3b-4).
Aufgrund der matrixbedingten Untergrundsignale war der TIC an den Peakmaxima der
Lutein- und Zeaxanthin-Isomere bei den Probenextrakten komplex (Anhang 2, Abb. 3b-5).
Zudem erlaubten matrixbedingte Verschiebungen und Überlagerungen der Signale bei der
TIC-Messung keine eindeutige Zuweisung zu den Retentionszeiten der Isomere von Lutein
und Zeaxanthin (Anhang 2, Abb. 3b-6). Im TIC an den jeweiligen Peakmaxima der Xanthophylle wurde als Basispeak meist m/z 588 detektiert, bei dem es sich um das diagnostische
Ion m/z 585 [Dachtler 2000] handeln könnte. Die bei den Lutein-Isomeren detektierte Massenspur m/z 561 sowie das bei 13-Z-Lutein auftretende Fragmention m/z 554 könnten mit
m/z 565 sowie m/z 551 zusammenhängen. Bei all-E-Zeaxanthin erschien m/z 530, welches
das diagnostische Ion m/z 533,5 darstellen könnte [Dachtler 2000]. Das Fragmention m/z
437 bei 13-Z-Zeaxanthin könnte durch Massenverluste von zweimal 60 u, die von der Hydroxyl-Gruppe der -Ringe induziert wurden, und die Eliminierung eines H2O-Massenäquivalents (18 u) [Enzell und Back 1995] bedingt sein. Ausgehend vom Molekülion m/z 569 würde
dabei ein Fragmention mit m/z 431 entstehen. (Anhang 2, Abb. 3b-5)
79
Die mit Standardlösungen von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin optimierten massenspektrometrischen Analyseparameter erlaubten bei den Probenextrakten trotz Matrixeinflüssen
durch Selektion der charakteristischen m/z-Verhältnisse im jeweiligen Elutionsbereich von
Lutein und Zeaxanthin eine Unterscheidung der Xanthophylle von Matrixbestandteilen sowie
der Lutein-Isomere von den Zeaxanthin-Isomeren.
4.3.5 Berechnung der Massenkonzentrationen von Lutein und Zeaxanthin
Mit Hilfe der Kalibriergeraden von all-E-Lutein wurden aus den Peakhöhen von all-E- und 13Z-Lutein die Konzentrationen ( bestimmt und diese anhand des Probenvolumens nach der
Extraktion (20 mL), der Einwaage (E) und der Trockenmasse (TM) als normierte Massenkonzentrationen (w) berechnet (s. Formel). Gleiches gilt für die beiden Zeaxanthin-Isomere.
 /  =

E
TM
w
=
=
=
=
 / ∙   ∙ . 
  ∙ 
Konzentration Xanthophyll [µg/mL]
Einwaage [g]
Trockenmasse [%]
Massenkonzentration Xanthophyll [µg/100 g]
4.3.6 Zusammenfassung zur Optimierung der Bestimmungsmethode
Die HPLC-PDA-Analyse wurde hinsichtlich der Selektivität bei der chromatographischen
Trennung der Xanthophyll-Isomere mittels einer C30-Säule mit Endcapping durch Variation
der Eluentenzusammensetzung, der Flussrate und der Säulentemperatur optimiert. Die anschließende Linearitätsüberprüfung bestätigte die Eignung der HPLC-PDA-Methode zur
Quantifzierung der Xanthophylle über deren Absorption mittels der gemessenen Peakhöhen.
Dabei wurde anhand der ermittelten Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der Kalibrierbereich festgelegt. Basierend auf der nachgewiesenen Linearität war die Selektivität bei der
chromatographischen Trennung der Lutein- und Zeaxanthin-Isomere trotz der Peakinterferenz ausreichend.
Basierend auf der Wiederfindungsrate wurde die Probenaufbereitung optimiert. Die hinsichtlich des Extraktionslösungsmittels und der Ultraschallbehandlungszeit modifizierte FlüssigFlüssig-Extraktion gewährleistete hohe Wiederfindungsraten von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin zwischen ca. 99 und 102 % und bedurfte keiner weiteren Optimierung.
80
Ergebnisse
Die mittels Eigelb optimierte Bestimmungsmethode eignete sich auch für Plasma und Granula, da die anhand der Ergebnisse bei Plasma und Granula nach dem gewichteten Mittel berechneten mit den ermittelten Xanthophyll-Gehalten bei nativem Eigelb übereinstimmten.
Die hohen Wiederfindungsraten und geringen Variationskoeffizienten von all-E-Lutein und
all-E-Zeaxanthin belegten einen geringen systematischen und zufälligen Fehler der Bestimmungsmethode und somit deren Richtigkeit, Präzision, Robustheit und Selektivität bei der
Bestimmung der Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin. Da sie als Summe aus systematischer und zufälliger Messunsicherheit die gesamte Messabweichung beschreibt [Rodriguez-Amaya 2001; Kromidas 1999, Gottwald und
Stieglitz 1996], wurde daher gleichzeitig die Genauigkeit der Bestimmungsmethode nachgewiesen. Die Zuverlässigkeit der Messergebnisse war damit gewährleistet.
Die charakteristischen Retentionszeiten bei der chromatographischen Elution erlaubten zusammen mit den Absorptionsspektren und Massenspektren eine eindeutige Identifizierung
der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin auch unter Matrixeinfluss.
Neben der Übereinstimmung der Elutionsreihenfolge mit der Literatur [Wenzel 2010; Glaser
2001] bestätigten sich die Retentionszeiten bei Vergleich mit den Standards von all-E-Lutein
und all-E-Zeaxanthin. Da die Elution der Xanthophylle unter Matrixeinfluss nicht verändert
war, eigneten sich die charakteristischen Retentionszeiten der all-E- und 13-Z-Isomere von
Lutein und Zeaxanthin zur Identifizierung.
Auch die gegenüber den Literaturangaben sowie den Standards unveränderten Absorptionsspektren bei den Probenextrakten gewährleisteten eine eindeutige Identifizierung der all-Eund 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin unter Matrixeinfluss. Da die Absorptionsspektren selektiv die Absorption der Xanthophylle bei 450 nm unter weitgehendem Ausschluss
möglicher Absorptionen von Matrixbestandteilen darstellen, dienten sie besonders zur Identifizierung der geringanteiligen 13-Z-Isomere.
Die hinsichtlich der cone- und corona-Spannungen optimierte massenspektrometrische Analyse erlaubte die Unterscheidung der Xanthophylle von Matrixbestandteilen und der LuteinIsomere von den Zeaxanthin-Isomeren anhand der charakteristischen Molekül- und Fragmentionen sowie des Totalionenstroms an den Peakmaxima.
Die spektralphotometrische Bestimmung von Carotinoiden ist spezifisch, da die Absorption
von anderen Matrixbestandteilen weitgehend unbeeinflusst ist [Glaser 2001]. Aufgrund der
zudem empfindlichen UV-Vis-Detektion von Carotinoiden erfolgte die Quantifizierung der
Lutein- und Zeaxanthin-Isomere über deren Absorption bei 450 nm. Basierend auf der Mehrpunktkalibrierung nach der Methode des externen Standards korrelierten dabei die gemessenen Peakhöhen linear mit der Konzentration.
81
Die Xanthophyll-Massenkonzentrationen wurden anhand der spezifischen Kalibriergeradenfunktionen von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin berechnet, wobei die systematische Überoder Unterschätzung bei den 13-Z-Isomeren aufgrund der Betrachtung relativer Veränderungen der Massenkonzentrationen toleriert werden konnte.
4.4 Erhitzung und Gefriertrocknung
Im Folgenden sind die Ergebnisse der Versuchsreihen zum Einfluss von Erhitzung und Gefriertrocknung dargestellt. Dabei wurden zunächst die Fraktionen Granula und Plasma und
anschließend Eigelb beschrieben um den logischen Kontext der Ergebnisse zu verifizieren.
Die DSC-Messkurven zeigten endotherme Strukturentfaltungen nativer Proteine und Lipoproteine. Bei den Versuchsreihen zur Erhitzung und Gefriertrocknung kam es infolge der Behandlung von Granula, Plasma und Eigelb zu Strukturentfaltungen der Proteine und Lipoproteine. Daher unterschieden sich die DSC-Peaks der nativen Proben von denen der erhitzten
und gefriergetrockneten Proben. Als Messgrößen des DSC-Peaks wurden der Onset, die
Peak-Temperatur und die normierte Gesamtenthalpie betrachtet. Zudem wurden die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in den nativen,
erhitzten und gefriergetrockneten Proben von Granula, Plasma und Eigelb bestimmt. Bei den
Messgrößen des DSC-Peaks und den Xanthophyll-Massenkonzentrationen wurde der Mittelwert der Doppelbestimmung zusammen mit der Standardabweichung (+ SD) angegeben.
Bei der Erhitzung wurden die behandelten Proben mit dem Nativzustand und untereinander
hinsichtlich signifikanter Unterschiede der normierten Gesamtenthalpie des DSC-Peaks sowie der Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin verglichen. Bei der Gefriertrocknung wurden die DSC-Peaks der nativen und rehydrierten Proben verglichen, da im gefriergetrockneten Probenzustand lediglich der DSC-Peak der Lipide
messbar war. Außerdem wurden die Xanthophyll-Massenkonzentrationen der gefriergetrockneten Proben mit dem Nativzustand verglichen. Demnach waren bei der Gefriertrocknung zwei Faktorstufen auswertbar. Gleiches galt für den die LDL-Strukturentfaltung repräsentierenden DSC-Peak bei Plasma, der nur nativ und bis zur Erhitzung bei 67 °C messbar
war. Die ANOVA-Methode eignet sich auch für den Vergleich von nur zwei Gruppenmittelwerten, da sie eine Erweiterung von Zweistichprobentests darstellt.
82
Ergebnisse
Die normierte Gesamtenthalpie wird bei der folgenden Darstellung und Diskussion der Ergebnisse mit H und die Peak-Temperatur mit Td abgekürzt. Die Angaben zu den Veränderungen der Onsets, Td und H in den behandelten Proben beziehen sich auf die für beide
Chargen gemittelten Werte gemäß den Tabellen 4-14 bis 4-17 und 4-24 bis 4-26.
Bei der in Anhang 4 zusammengefassten statistischen Auswertung gemäß Tabelle 3-2 wurde die Normalverteilung der H-Werte und der Xanthophyll-Massenkonzentrationen nachgewiesen. Die zwischen einzelnen Faktorstufen nicht bestehende Varianzhomogenität war
aufgrund der Robustheit der ANOVA-Methode bei gleichen Stichprobenumfängen und normalverteilten Messwerten vertretbar [Motulsky 2007].
4.4.1 Nativzustand
Das Thermogramm nativer Granula zeigte einen symmetrischen Peak zwischen ca. 68 und
97 °C. Bei Plasma ging der bei ca. 69/70 °C beginnende Peak 1, der die LDL-Strukturentfaltung repräsentierte, bei ca. 81 °C in einen stärker ausgeprägten Peak 2 der HDL-Entfaltung
über, der bei ca. 95/96 °C endete. Basierend auf der Zusammensetzung aus 22 % Granula
und 78 % Plasma [Powrie und Nakai 1986] stand der DSC-Peak nativen Eigelbs (ca. 60 bis
98 °C) in Einklang mit den Thermogrammen von Granula und Plasma. (Abb. 4-12)
Granula
Plasma
Peak 1
Abb. 4-12:
Eigelb
Peak 2
DSC-Thermogramme der nativen Proben von Granula (links), Plasma (Mitte) und Eigelb
(rechts)
In Tabelle 4-13 sind die aus den vier untersuchten Chargen im Nativzustand gemittelten Onsets, Td und H der DSC-Peaks von Granula, Plasma und Eigelb dargestellt.
Tab. 4-13:
Mittelwerte des Onsets, der Td und von H ± SD der DSC-Peaks der nativen Proben von
Granula, Plasma und Eigelb (berechnet aus Tab. 4-14 bis 4-17 und 4-24 bis 4-26)
Granula
Plasma
Eigelb
LDL (Peak 1)
HDL (Peak 2)
Onset [°C]
Td [°C]
H [J/g]
75,2 ± 0,2
71,3 ± 0,1
79,1 ± 0,1
73,1 ± 0,4
83,5 ± 0,1
75,8 ± 0,1
86,0 ± 0,2
84,1 ± 0,1
-2,93 ± 0,09
-0,05 ± 0,00
-0,32 ± 0,01
-1,49 ± 0,02
83
4.4.2 Erhitzung
Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine
Granula
Die symmetrischen Peaks (ca. 68 bis 97 °C) und die Onsets (Nativ: 74,9 °C / 67 °C: 75,5 °C)
und Td (Nativ: 83,5 °C / 67 °C: 83,6 °C) der nativen und der bei 67 °C erhitzten Granula waren identisch. Auch H des Peaks zeigte sich infolge der Erhitzung bei 67 °C nicht signifikant
verändert. (Abb. 4-13, Tab. 4-14)
Charge 1
Abb. 4-13:
Charge 2
DSC-Thermogramme nativer und erhitzter Granula der Chargen 1 und 2
Infolge der Erhitzung bei 72 °C lag der Onset (76,9 °C) des DSC-Peaks (ca. 71 bis 98 °C)
gegenüber dem Nativzustand und der Erhitzung bei 67 °C höher ( ca. 1,6 °C), während Td
(83,7 °C) identisch war. Die im Vergleich zum Nativzustand und zur Erhitzung bei 67 °C nach
einer Erhitzung bei 72 °C signifikant geringere H (-2,43 J/g;  ca. 0,7 J/g) des Peaks wird
durch dessen geringere Ausprägung deutlich. (Abb. 4-13, Tab. 4-14)
84
Ergebnisse
Tab. 4-14:
Onsets, Td und H ± SD des DSC-Peaks nativer und erhitzter Granula der Chargen 1
und 2
Granula
Charge 1
Charge 2
Onset [°C]
Td [°C]
H [J/g]
Nativ
67 °C
72 °C
77 °C
75,2 ± 0,2
75,5 ± 0,0
77,1 ± 0,1
79,9 ± 0,2
83,7 ± 0,1
83,6 ± 0,4
83,3 ± 0,2
87,1  0,3
-3,18 ± 0,01a
-3,09 ± 0,05a
-2,43 ± 0,15b
-0,67 ± 0,04c
Nativ
74,7 ± 0,1
83,3 ± 0,1
-3,16 ± 0,09a
67 °C
75,5 ± 0,0
83,6 ± 0,1
-3,05 ± 0,06a
72 °C
76,6 ± 0,1
84,2 ± 0,2
-2,42 ± 0,01b
77 °C
80,6 ± 0,0
87,6 ± 0,3
-0,50 ± 0,03c
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede von H ( = 0,05)
Im Vergleich zu den anderen Proben war der Peak der bei 77 °C erhitzten Granula (ca. 77
bis 97 °C) deutlich geringer ausgeprägt, weshalb auch eine signifikant geringere H
(-0,59 J/ g;  ca. 1,8 - 2,7 J/g) bestimmt wurde. Der Onset des Peaks war mit 80,2 °C zu höherer Temperatur verschoben ( ca. 2,8 - 5,9 °C). Gegenüber der gemittelten Td (83,6 °C)
der anderen Proben war Td des Peaks der bei 77 °C erhitzten Granula (87,4 °C) um 3,8 °C
höher. (Abb. 4-13, Tab. 4-14)
Plasma
Wie bei den Granula war der Temperaturbereich des DSC-Peaks des bei 67 °C erhitzten
Plasmas (ca. 69/70 bis 95/96 °C) dem Nativzustand nahezu identisch, was auch für den Onset (Nativ: 71,2 °C / 67 °C: 71,4 °C) und Td (Nativ: 75,6 °C / 67 °C: 75,4 °C) von Peak 1 (ca.
69/70 bis 81 °C) galt. Auch bei Peak 2 (ca. 81 bis 95/96 °C) ergaben sich für das bei 67 °C
erhitzte Plasma und im Nativzustand identische Onsets (Nativ: 79,3 °C / 67 °C: 79,2 °C) und
Td-Werte (Nativ: 85,7 °C / 67 °C: 86,1 °C). Die H von Peak 1 (LDL-Strukturentfaltung) war
bei 67 °C (-0,03 J/g) gegenüber dem Nativzustand -0,05 J/g) signifikant verringert. Bei Peak
2 war H identisch mit dem Nativzustand (je -0,30 J/g). (Abb. 4-14, Tab. 4-15 und 4-16)
Tab. 4-15:
Onsets, Td und H ± SD von Peak 1 nativen und erhitzten Plasmas der Chargen 1 und 2
Peak 1 (LDL)
Plasma
Onset [°C]
Td [°C]
H [J/g]
Charge 1
Nativ
67 °C
71,1 ± 0,0
71,5 ± 0,3
75,7 ± 0,1
75,7 ± 0,6
-0,05 ± 0,00a
-0,03 ± 0,00b
Charge 2
Nativ
67 °C
71,2 ± 0,1
71,2 ± 0,1
75,4 ± 0,1
75,1 ± 0,2
-0,04 ± 0,00a
-0,03 ± 0,00b
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede von H ( = 0,05)
85
Nach der Erhitzung bei 72 °C war nur noch ein Peak (ca. 75 bis 95/96 °C) mit einem höheren
Onset (79,9 °C;  ca. 0,6 °C) und einer höheren Td (87,2 °C;  ca. 1,3 °C) messbar. Während H des Peaks im Vergleich zum Nativzustand marginal differierte und dies auch für
Charge 1 bezüglich des Vergleichs mit der Erhitzung bei 67 °C galt, ergab sich bei Charge 2
eine signifikant geringere H des Peaks infolge der Erhitzung bei 72 °C gegenüber 67 °C (
= 0,09 J/g). (Abb. 4-14, Tab. 4-16)
Charge 1
Peak 1
Peak 1
Charge 2
Peak 2
Peak 1
Peak 2
Peak 2
Peak 1
Abb. 4-14:
Peak 2
DSC-Thermogramme nativen und erhitzten Plasmas der Chargen 1 und 2
Auch der Peak des bei 77 °C erhitzten Plasmas (ca. 79/80 bis 95/96 °C) wies einen höheren
Onset (81,3 °C;  ca. 1,9 °C) und eine höhere Td (88,3 °C;  ca. 0,9 - 3,0 °C) auf. In Einklang
mit der geringeren Ausprägung des Peaks war H gegenüber dem Nativzustand und den bei
67 und 72 °C erhitzten Proben ca. um 0,12 J/g signifikant geringer. (Abb. 4-14, Tab. 4-16)
Tab. 4-16:
Onsets, Td und H ± SD von Peak 2 nativen und erhitzten Plasmas der Chargen 1 und 2
Peak 2 (HDL)
Plasma
Charge 1
Charge 2
Onset [°C]
Td [°C]
H [J/g]
Nativ
79,1 ± 0,3
85,5 ± 0,5
-0,30 ± 0,01a
67 °C
79,6 ± 0,5
86,1 ± 0,2
-0,27 ± 0,01a
72 °C
79,6 ± 0,0
87,2 ± 0,5
-0,29 ± 0,04a
77 °C
81,1 ± 0,1
88,5 ± 0,4
-0,18 ± 0,01b
Nativ
79,4 ± 0,1
85,9 ± 0,0
-0,29 ± 0,02ab
67 °C
78,8 ± 0,2
86,0 ± 0,0
-0,33 ± 0,01a
72 °C
80,1 ± 0,1
87,2 ± 0,4
-0,24 ± 0,01b
77 °C
81,5 ± 0,3
88,1 ± 1,5
-0,16 ± 0,01c
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede von H ( = 0,05)
86
Ergebnisse
Eigelb
Der Beginn des DSC-Peaks des bei 67 °C erhitzten Eigelbs war im Vergleich zum Nativzustand (60 °C) auf ca. 67/68 °C verschoben. Das Ende des Peaks (ca. 98 °C) zeigte sich unverändert. Auch der Onset und Td (73,5 und 84,0 °C) des Peaks waren mit dem Nativzustand
(73,3 und 84,1 °C) identisch. Dagegen wies der Peak zwischen 68 und 79/80 °C eine geringere Ausprägung auf, wobei H gegenüber dem Nativzustand nur bei Charge 2 signifikant
vermindert war ( = 0,18 J/g). (Abb. 4-15, Tab. 4-17)
Der Peak des bei 72 °C erhitzten Eigelbs (ca. 72/73 °C bis 98 °C) wies einen deutlich höheren Onset (77,6 °C;  ca. 4,3 °C) und eine marginal höhere Td (84,8 °C,  ca. 0,7 °C) auf.
Zudem war der die LDL-Entfaltung repräsentierende Peak-Bereich zwischen ca. 72/73 und
79/80 °C gegenüber dem Nativzustand und der Erhitzung bei 67 °C deutlich geringer ausgeprägt, weshalb H (-0,84 J/g) des Peaks signifikant geringer war ( ca. 0,56 J/g). (Abb. 4-15,
Tab. 4-17)
Charge 1
Abb. 4-15:
Charge 2
DSC-Thermogramme nativen und erhitzten Eigelbs der Chargen 1 und 2
Aufgrund der im Vergleich zu den anderen Proben geringen Ausprägung war der Peak des
bei 77 °C erhitzten Eigelbs (ca. 77 bis 98 °C) nur bei Charge 2 auswertbar. Entsprechend
war H des Peaks signifikant verringert ( ca. 0,76 - 1,40 J/g). Mit 81,3 °C war der Onset
gegenüber dem Nativzustand und der Erhitzung bei 67 °C um ca. 7,8 °C sowie im Vergleich
zur Erhitzung bei 72 °C um 3,8 °C höher. Die Td (89,0 °C) war um ca. 4,8 °C höher.
87
Tab. 4-17:
Onsets, Td und H ± SD des DSC-Peaks nativen und erhitzten Eigelbs der Chargen 1
und 2
Eigelb
Charge 1
Charge 2
Onset [°C]
Td [°C]
H [J/g]
Nativ
67 °C
72 °C
77 °C
73,3 ± 0,6
73,2 ± 0,0
77,8 ± 0,4
n. b.
84,4 ± 0,2
84,1 ± 0,0
84,8 ± 0,2
n. b.
-1,35 ± 0,01a
-1,30 ± 0,00a
-0,75 ± 0,08b
n. b.
Nativ
73,3 ± 0,1
83,9 ± 0,1
-1,56 ± 0,01a
67 °C
73,7 ± 0,2
83,9 ± 0,1
-1,38 ± 0,06b
72 °C
77,5 ± 0,3
84,8 ± 0,3
-0,92 ± 0,02c
77 °C
81,3 ± 0,2
89,0 ± 0,1
-0,16 ± 0,03d
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede von H ( = 0,05)
n. b. = nicht bestimmbar
Nach der Erhitzung bei 82 und 87 °C war in den Thermogrammen kein Peak messbar (Abb.
4-13 bis 4-15). Die erhitzungsbedingte Ausdehnung der Proben führt zur Verringerung der
Dichte und damit der Wärmeleitfähigkeit. Die daher zur Erhaltung der konstanten Heizrate
(8 °C/min) benötigte höhere Wärmeleistung erklärt die endotherme Drift der Basislinie mit
Zunahme der Messtemperatur der bei 82 und 87 °C erhitzten Proben. In Abhängigkeit des
messbaren Wärmestroms war die bei den Granula (5 mW) angedeutete Kurvendrift bei Eigelb (2 mW) geringer ausgeprägt als bei Plasma (0,5 mW).
Xanthophyll-Massenkonzentrationen
Bei der Versuchsreihe zur Erhitzung wurden die bei beiden Chargen signifikant veränderten
Xanthophyll-Massenkonzentrationen betrachtet. Für 13-Z-Zeaxanthin konnten keine signifikanten Differenzen in den Massenkonzentrationen infolge der Erhitzung bestimmt werden.
Granula
Tabelle 4-18 zeigt die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativer und erhitzter Granula und die signifikanten Veränderungen beim Vergleich der Temperaturniveaus untereinander und mit dem Nativzustand.
88
Ergebnisse
Tab. 4-18:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativer und erhitzter Granula – Charge 1 (oben) und Charge 2 (unten)
Massenkonzentrationen [µg/100 g]
Granula
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
13-Z-Lutein
Nativ
2495,3 ± 98,7
1706,4 ± 45,9
a
2098,4 ± 84,5
0999,3 ± 34,6
a
296,5 ± 10,3
192,3 ± 06,3
67 °C
2464,4 ± 28,3
1701,3 ± 42,0
a
2071,0 ± 27,3
0999,3 ± 21,8
a
72 °C
2430,9 ± 31,0
1668,2 ± 06,4
77 °C
13-Z-Zeaxanthin
a
393,0 ± 11,7
195,7 ± 06,4
a
304,9 ± 02,1
198,6 ± 02,6
ab 405,9 ± 02,6
201,7 ± 01,7
a
ab 2040,3 ± 28,3
0980,3 ± 04,2
ab 316,3 ± 05,8
204,3 ± 04,8
abc 413,1 ± 05,2
203,6 ± 04,2
a
2477,5 ± 08,6
1667,1 ± 27,4
ab 2091,9 ± 08,3
0983,3 ± 10,9
ab 325,6 ± 04,5
209,1 ± 02,5
b 426,7 ± 04,3
206,2 ± 02,0
a
82 °C
2399,5 ± 38,9
1684,3 ± 65,1
ab 2027,7 ± 33,0
0995,6 ± 37,1
ab 318,8 ± 06,8
218,8 ± 08,5
c
401,7 ± 11,5
210,4 ± 08,6
a
87 °C
2343,2 ± 17,7
1569,5 ± 08,2
b 1990,1 ± 12,9
0932,4 ± 04,6
b 333,4 ± 04,5
217,7 ± 01,8
d 399,6 ± 06,4
201,7 ± 01,5
a
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Für die sich signifikant unterscheidenden Proben nach Tabelle 4-18 wurden die prozentualen
Massenkonzentrationsänderungen der Xanthophylle berechnet (Tab. 4-19).
Tab. 4-19:
Massenkonzentrationsänderungen [%] von all-E-Lutein, all-E-Zeaxanthin und 13-Z-Lutein
erhitzter Granula – Charge 1 (links) und Charge 2 (rechts)
Massenkonzentrationsänderungen [%]
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
13-Z-Lutein
Granula
Nativ vs. 77 °C
Nativ vs. 82 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 82 °C
67 °C vs. 87 °C
72 °C vs. 87 °C
n. d.
n. d.
-6,1
n. d.
n. d.
-8,0
-5,2
-7,8
-3,9
n. d.
-4,9
-6,7
n. d.
n. d.
-6,7
n. d.
0+9,8
0+7,5
+12,5
0+4,5
0+9,3
0+5,4
+8,7
+13,8
+13,2
+10,2
+9,7
+6,6
n. d. = nicht detektiert
Nach einer Erhitzung bei 67 und 72 °C waren die Xanthophyll-Gehalte nicht signifikant verändert. Auch infolge der Erhitzung bei 77 °C waren die Massenkonzentrationen der all-EIsomere marginal unterschiedlich, während sich für 13-Z-Lutein im Vergleich zum Nativzustand bei beiden Chargen eine ähnlich ausgeprägte signifikante Zunahme ergab. Infolge der
Erhitzung bei 82 °C war die 13-Z-Lutein-Konzentration signifikant gegenüber dem Nativzustand sowie im Vergleich zu 67 °C erhöht, wobei die Zunahme bei Charge 2 deutlicher war
als bei Charge 1 ( ca. 6,0 %). (Tab. 4-18 und 4-19)
Infolge der Behandlung bei 87 °C kam es zu signifikant reduzierten Massenkonzentrationen
der all-E-Isomere gegenüber dem Nativzustand und der Erhitzung bei 67 °C. Dies zeigte sich
bei Charge 2 stärker ausgeprägt als bei Charge 1 (ca. 1,5 - 2,9 %). (Tab. 4-18 und 4-19)
89
Die Verluste an all-E-Lutein bei 87 °C gegenüber dem Nativzustand und der Erhitzung bei
67 °C wurden von signifikanten Zunahmen an 13-Z-Lutein begleitet, die bei beiden Chargen
ähnlich ausgeprägt waren. Zudem ergaben sich bei 87 °C bei beiden Chargen signifikant
höhere Werte für 13-Z-Lutein in ähnlicher Ausprägung gegenüber der Erhitzung bei 72 °C.
(Tab. 4-18 und 4-19)
Jeweils in Bezug zum Nativzustand sowie zur Erhitzung bei 67 °C waren bei Charge 1 die
13-Z-Lutein-Zunahmen infolge der Erhitzung bei 87 °C höher als nach Erhitzung bei 82 °C (
ca. 4,9 %). Dagegen war bei Charge 2 die prozentuale Steigerung an 13-Z-Lutein bei 87 °C
marginal geringer als bei den bei 82 °C erhitzten Proben ( ca. 0,6 %). (Tab. 4-19)
Für native und erhitzte Granula sind die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere
von Lutein und Zeaxanthin (Tab. 4-18) in Abbildung 4-16 graphisch dargestellt.
µg/100 g
2500
a
all-E-Lutein
a
ab
ab
ab
b
2500
2000
2000
1500
1500
1000
1000
500
500
0
Nativ
67 °C
72 °C
77 °C
87 °C
13-Z-Lutein
µg/100 g
400
320
82 °C
a
ab
abc
b
c
d
0
400
160
160
80
80
Abb. 4-16:
90
67 °C
72 °C
77 °C
82 °C
a
ab
ab
ab
b
Nativ
67 °C
72 °C
77 °C
82 °C
87 °C
13-Z-Zeaxanthin
a
a
a
a
a
a
Nativ
67 °C
72 °C
77 °C
320
240
Nativ
a
µg/100 g
240
0
all-E-Zeaxanthin
µg/100 g
87 °C
0
82 °C
87 °C
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativer und erhitzter Granula von
Charge 1 (grau) und Charge 2 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben kennzeichnen
signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Ergebnisse
Plasma
Tabelle 4-20 zeigt die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativen und erhitzten Plasmas und die signifikanten Veränderungen im Vergleich
der Temperaturniveaus untereinander und mit dem Nativzustand.
Tab. 4-20:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativen und erhitzten Plasmas – Charge 1 (oben) und Charge 2 (unten)
Massenkonzentrationen [µg/100 g]
Plasma
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Nativ
4177,1 ± 084,4
2707,4 ± 027,0
a 3747,8 ± 078,8
1711,3 ± 019,4
a
410,1 ± 06,6
308,2 ± 06,9
a 709,8 ± 08,5
323,6 ± 09,1
a
67 °C
4189,5 ± 045,0
2721,4 ± 072,0
a 3742,5 ± 015,7
1711,0 ± 036,4
a
425,2 ± 08,9
320,8 ± 02,5
ac 734,0 ± 15,7
336,4 ± 02,8
a
72 °C
4084,5 ± 129,9
2738,0 ± 084,5
a 3665,5 ± 126,2
1731,6 ± 058,6
a
491,7 ± 13,3
319,6 ± 07,5
ac 734,0 ± 17,3
333,2 ± 09,1
a
77 °C
4068,5 ± 347,2
2664,6 ± 108,3
a 3653,9 ± 329,8
1681,9 ± 056,1
a
435,7 ± 21,6
328,0 ± 07,4
abc 727,7 ± 33,6
336,8 ± 08,5
a
82 °C
4211,9 ± 043,4
2726,8 ± 046,7
a 3784,8 ± 028,0
1717,9 ± 027,3
a
516,4 ± 03,7
342,7 ± 07,1
b 754,9 ± 08,4
339,9 ± 01,7
a
87 °C
4119,0 ± 113,2
2646,9 ± 129,6
a 3720,6 ± 081,5
1666,9 ± 075,7
a
533,2 ± 10,5
337,7 ± 04,9
bc 743,4 ± 19,1
330,9 ± 05,4
a
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Infolge der Erhitzung des Plasmas bei 67, 72 und 77 °C waren die Xanthophyll-Massenkonzentrationen nicht signifikant verändert. Auch bei 82 und 87 °C ergaben sich für die all-EIsomere nur marginal veränderte Werte. (Tab. 4-20)
Entsprechend Tabelle 4-20 wurden die prozentualen Veränderungen der Massenkonzentrationen von 13-Z-Lutein der sich signifikant unterscheidenden Proben berechnet (Tab. 4-21).
Tab. 4-21:
Massenkonzentrationsänderungen [%] von 13-Z-Lutein erhitzten Plasmas – Charge 1
(links) und Charge 2 (rechts)
Massenkonzentrationsänderungen [%]
von 13-Z-Lutein
Plasma
Nativ vs. 82 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 82 °C
72 °C vs. 82 °C
+25,9
+30,0
+21,5
+5,0
+11,2
+9,6
+6,8
+7,2
Die signifikanten Zunahmen an 13-Z-Lutein bei 82 °C gegenüber dem Nativzustand und der
Erhitzung bei 67 °C waren bei Charge 1 höher als bei Charge 2 (= 14,7 %), während die
signifikante 13-Z-Lutein-Zunahme bei 82 °C gegenüber dem bei 72 °C erhitzten Plasma bei
beiden Chargen ähnlich war. (Tab. 4-20 und 4-21)
91
Auch bei 87 °C war die signifikante Erhöhung an 13-Z-Lutein im Vergleich zum Nativzustand
bei Charge 1 deutlicher als bei Charge 2, wobei die Differenz von 20,4 % ausgeprägter war
als infolge der Erhitzung bei 82 °C. (Tab. 4-20 und 4-21)
In Bezug zum Nativzustand war bei Charge 1 die 13-Z-Lutein-Steigerung bei 87 °C um 4,1 %
höher als infolge der Erhitzung bei 82 °C. Bei Charge 2 wurde, verglichen mit dem Nativzustand, ein inverses Ergebnis mit einer etwas geringeren 13-Z-Lutein-Zunahme bei 87 °C als
nach Erhitzung bei 82 °C ( = 1,6 %) beobachtet. (Tab. 4-21)
Abbildung 4-17 veranschaulicht die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von
Lutein und Zeaxanthin (Tab. 4-20) nativen und erhitzten Plasmas.
µg/100 g
a
a
a
a
all-E-Lutein
a
a
4000
4000
3200
3200
2400
2400
1600
1600
800
800
0
Nativ
67 °C
72 °C
77 °C
82 °C
750
a
ac
ac
abc
b
bc
150
150
Abb. 4-17:
92
67 °C
72 °C
77 °C
a
Nativ
67 °C
72 °C
a
a
a
77 °C
82 °C
87 °C
a
a
a
a
Nativ
67 °C
72 °C
77 °C
13-Z-Zeaxanthin
a
a
450
300
Nativ
a
600
300
0
a
µg/100 g
750
600
450
0
87 °C
13-Z-Lutein
µg/100 g
all-E-Zeaxanthin
µg/100 g
82 °C
87 °C
0
82 °C
87 °C
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativen und erhitzten Plasmas von
Charge 1 (grau) und Charge 2 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben kennzeichnen
signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Ergebnisse
Eigelb
Tabelle 4-22 zeigt die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativen und erhitzten Eigelbs und die signifikanten Veränderungen im Vergleich
der Temperaturniveaus untereinander und mit dem Nativzustand.
Tab. 4-22:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativen und erhitzten Eigelbs – Charge 1 (oben) und Charge 2 (unten)
Massenkonzentrationen [µg/100 g]
Eigelb
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Nativ
3928,4 ± 039,1
2557,5 ± 028,2
a
3591,3 ± 033,7
1668,4 ± 027,6
a
374,0 ± 02,2
311,4 ± 02,8
a
579,7 ± 01,8
318,4 ± 07,8
a
67 °C
3919,6 ± 035,6
2571,4 ± 038,0
a
3585,4 ± 043,9
1674,7 ± 028,7
a
389,1 ± 01,1
324,2 ± 09,5
a
598,0 ± 01,5
329,1 ± 10,6
a
72 °C
3808,4 ± 080,2
2547,3 ± 084,4
ab 378,3 ± 08,2
323,3 ± 07,9
a
577,8 ± 04,2
318,4 ± 05,5
a
77 °C
3861,9 ± 037,6
2475,4 ± 017,1
3540,6 ± 032,1
1614,4 ± 018,6
ab 388,4 ± 06,6
318,2 ± 01,4
a
586,7 ± 09,1
317,2 ± 00,6
a
82 °C
3702,6 ± 259,2
2453,7 ± 102,4
ab 3423,5 ± 240,5
1603,7 ± 074,2
ab 381,5 ± 24,7
323,5 ± 12,0
a
550,7 ± 25,6
307,2 ± 10,8
a
87 °C
3698,3 ± 054,7
2353,9 ± 056,6
b 3435,0 ± 052,0
1550,2 ± 035,4
b 421,8 ± 06,9
320,3 ± 12,1
a
576,2 ± 10,2
300,9 ± 07,9
a
ab 3493,2 ± 076,3
1662,0 ± 058,2
a
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Die Hitzebehandlungen bei 67, 72, 77 und 82 °C führten zu keinen signifikant veränderten
Xanthophyll-Massenkonzentrationen. Gleiches gilt für 13-Z-Lutein bei 87 °C. (Tab. 4-22)
In Tabelle 4-23 wurden die prozentualen Veränderungen der Massenkonzentrationen der allE-Isomere der sich signifikant unterscheidenden Proben berechnet (Tab. 4-22).
Tab. 4-23:
Massenkonzentrationsänderungen [%] von all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin erhitzten
Eigelbs – Charge 1 (links) und Charge 2 (rechts)
Massenkonzentrationsänderungen [%]
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
Eigelb
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 87 °C
77 °C vs. 87 °C
-5,9
-5,7
-4,2
-8,0 -4,4
-8,5 -4,2
-4,9
-7,1
-7,4
n. d.
n. d. = nicht detektiert
Bei den all-E-Isomeren ergaben sich infolge der Erhitzung bei 87 °C, wie schon bei den Granula, signifikante Verringerungen gegenüber dem Nativzustand und der Erhitzung bei 67 °C.
Diese waren bei Charge 2 stärker ausgeprägt als bei Charge 1 ( ca. 2,1 - 3,2 %). Der signifikante Verlust von all-E-Lutein nach Erhitzung bei 87 °C im Vergleich zu 77 °C war bei beiden Chargen ähnlich. (Tab. 4-22 und 4-23)
93
Abbildung 4-18 zeigt die Xanthophyll-Massenkonzentrationen (Tab. 4-22) nativen und erhitzten Eigelbs.
µg/100 g
a
a
ab
a
all-E-Lutein
ab
b
3500
3500
2800
2800
2100
2100
1400
1400
700
700
0
Nativ
67 °C
72 °C
77 °C
82 °C
600
480
360
0
87 °C
13-Z-Lutein
µg/100 g
a
a
a
a
a
ab
ab
ab
b
Nativ
67 °C
72 °C
77 °C
82 °C
87 °C
13-Z-Zeaxanthin
a
a
a
a
Nativ
67 °C
72 °C
77 °C
a
a
82 °C
87 °C
360
240
120
120
Nativ
Abb. 4-18:
94
a
480
240
0
a
µg/100 g
600
a
all-E-Zeaxanthin
µg/100 g
67 °C
72 °C
77 °C
82 °C
87 °C
0
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativen und erhitzten Eigelbs von
Charge 1 (grau) und Charge 2 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben kennzeichnen
signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Ergebnisse
4.4.3 Gefriertrocknung
Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine
Granula
Die DSC-Peaks der Proben von nativen und rehydrierten Granula waren hinsichtlich des
Temperaturbereichs (ca. 68 bis 97 °C), der Onsets und Td (Nativ: 75,4 und 83,5 °C, Rehydriert: 75,2 und 83,4 °C) sowie H (Nativ: -2,68 J/g, Rehydriert: -2,69 J/g) identisch (Abb. 419, Tab. 4-24).
Charge 4
Charge 3
Nativ
Wärmestrom
Nativ
Gefriergetrocknet
Abb. 4-19:
Rehydriert
Wärmestrom
Rehydriert
Gefriergetrocknet
DSC-Thermogramme nativer, rehydrierter und gefriergetrockneter Granula der Chargen 3
und 4
Der DSC-Peak der gefriergetrockneten Granula wies deutlich geringere Werte für den
Temperaturbereich (ca. 38/42 bis 79 °C), den Onset und die Td (44,3 und 64,0 °C) als im
Nativzustand auf, was ebenso für den H-Wert (-1,11 J/g) und die Ausprägung des Peaks
galt (Abb. 4-19, Tab. 4-24).
Tab. 4-24:
Onsets, Td und H ± SD des DSC-Peaks nativer, rehydrierter und gefriergetrockneter
Granula der Chargen 3 und 4
Granula
Charge 3
Charge 4
Onset [°C]
Td [°C]
H [J/g]
Nativ
75,5 ± 0,2
83,7 ± 0,1
-2,61 ± 0,11a
Rehydriert
75,6 ± 0,1
83,6 ± 0,1
-2,54 ± 0,07a
Gefriergetrocknet
43,7 ± 0,4
64,8 ± 0,5
-1,20 ± 0,00
Nativ
75,3 ± 0,3
83,4 ± 0,1
-2,75 ± 0,13a
Rehydriert
74,7 ± 0,0
83,1 ± 0,1
-2,84 ± 0,08a
Gefriergetrocknet
44,9 ± 0,1
63,2 ± 0,2
-1,02 ± 0,04
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede von H ( = 0,05)
95
Plasma
Wie bei den Granula zeichnete sich der DSC-Peak des gefriergetrockneten Plasmas durch
deutlich geringere Werte beim Temperaturbereich (ca. 40/42 bis 72 °C), beim Onset und der
Td (42,6 und 56,1 °C) als im Nativzustand aus (Abb. 4-20, Tab. 4-25).
Bei den nativen und rehydrierten Plasma-Proben wurden die Peaks der Strukturentfaltung
der LDL (Peak 1: ca. 69/70 bis 81 °C) und der HDL der Granula-Reste (Peak 2: ca. 81 °C bis
95/96 °C) detektiert. Der Onset (Nativ: 71,4 °C, Rehydriert: 71,1 °C) und Td (Nativ: 76,0 °C,
Rehydriert: 75,9 °C) von Peak 1 waren bei nativem und rehydriertem Plasma identisch. Gleiches gilt für Peak 2 (Onset = Nativ: 78,9 °C, Rehydriert: 77,6 °C / Td = Nativ: 86,3 °C, Rehydriert: 86,7 °C). Zudem war H von Peak 2 bei nativem und rehydriertem Plasma identisch
(je -0,34 J/g). (Abb. 4-20, Tab. 4-25)
Charge 4
Charge 3
Nativ
Peak 1
Peak 2
Rehydriert
Gefriergetrocknet
Abb. 4-20:
Peak 1
Peak 2
Rehydriert
Peak 1
Peak 2
Wärmestrom
Wärmestrom
Peak 1
Wärmestrom
Nativ
Peak 2
Gefriergetrocknet
DSC-Thermogramme nativen, rehydrierten und gefriergetrockneten Plasmas der Chargen 3 und 4
Bei rehydriertem Plasma war Peak 1 geringer ausgeprägt als im Nativzustand, wobei H von
Peak 1 bei Charge 3 signifikant ( = 0,02 J/g) und bei Charge 4 nur marginal geringer war.
(Abb. 4-20, Tab. 4-25)
96
Ergebnisse
Tab. 4-25:
Onsets, Td und H ± SD des DSC-Peaks nativen, rehydrierten und gefriergetrockneten
Plasmas der Chargen 3 und 4
Plasma
Charge 3
Charge 4
Onset [°C]
Td [°C]
H [J/g]
Nativ
Peak 1
Peak 2
71,6  0,1
78,6  0,1
76,2  0,1
86,5  0,2
-0,05  0,00a
-0,35  0,01a
Rehydriert
Peak 1
Peak 2
70,8 ± 0,3
77,6 ± 0,0
75,5 ± 0,3
86,4 ± 0,4
-0,03 ± 0,00b
-0,32 ± 0,04a
Gefriergetrocknet
42,6  2,1
57,1  0,9
-0,42  0,07
Nativ
Peak 1
Peak 2
71,3  0,1
79,2  0,1
75,7  0,0
86,1  0,0
-0,05  0,00a
-0,32  0,01a
Rehydriert
Peak 1
Peak 2
71,4 ± 0,0
77,6 ± 0,2
76,3 ± 0,8
86,9 ± 1,1
-0,04 ± 0,02a
-0,35 ± 0,05a
Gefriergetrocknet
42,6  0,0
55,2  0,5
-0,44  0,12
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede von H ( = 0,05)
Eigelb
Wie bei Granula und Plasma unterschied sich der DSC-Peak des gefriergetrockneten Eigelbs mit einem geringeren Temperaturbereich (ca. 38/39 bis 70/81 °C), Onset (42,6 °C) und
geringerer Td (58,0 °C) sowie einer verminderten H (-0,76 J/g) deutlich vom Nativzustand.
(Abb. 4-21, Tab. 4-26)
Charge 3
Gefriergetrocknet
Abb. 4-21:
Wärmestrom
Rehydriert
Nativ
Wärmestrom
Nativ
Charge 4
Rehydriert
Gefriergetrocknet
DSC-Thermogramme nativen, rehydrierten und gefriergetrockneten Eigelbs der Chargen
3 und 4
97
Bei rehydriertem Eigelb wurde wie bei der nativen Probe der typische, die Strukturentfaltung
der Livetine, LDL und HDL repräsentierende Peak (ca. 60 bis 98 °C) detektiert. Die Onsets
und Td des Peaks rehydrierten (71,1 und 83,9 °C) und nativen Eigelbs (72,8 und 84,1 °C)
waren ähnlich. Im Vergleich zum Nativzustand war H des Peaks rehydrierten Eigelbs ( ca.
0,07 J/g) nicht signifikant vermindert. In Einklang mit Plasma war die Ausprägung des Peaks
rehydrierten Eigelbs im Bereich der LDL-Entfaltung (68 bis 79/80 °C) geringer als im Nativzustand. (Abb. 4-21, Tab. 4-26)
Tab. 4-26:
Onsets, Td und H ± SD des DSC-Peaks nativen, rehydrierten und gefriergetrockneten
Eigelbs der Chargen 3 und 4
Eigelb
Charge 3
Charge 4
Onset [°C]
Td [°C]
H [J/g]
Nativ
72,6 ± 0,8
84,0 ± 0,0
-1,55 ± 0,04a
Rehydriert
71,0 ± 0,3
83,9 ± 0,3
-1,45 ± 0,06a
Gefriergetrocknet
43,4  0,4
61,3  0,9
-0,89  0,03
Nativ
73,0 ± 0,1
84,3 ± 0,2
-1,49 ± 0,01a
Rehydriert
71,3 ± 0,0
83,9 ± 0,0
-1,46 ± 0,02a
Gefriergetrocknet
41,7  0,1
54,8  0,0
-0,63  0,01
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede von H ( = 0,05)
Xanthophyll-Massenkonzentrationen
Granula
Tabelle 4-27 zeigt die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativer und gefriergetrockneter Granula und die signifikanten Veränderungen
beim Vergleich mit dem Nativzustand.
Tab. 4-27:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativer und gefriergetrockneter Granula der Chargen 3 und 4
Massenkonzentrationen [µg/100 g]
Granula
Charge 3
Charge 4
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
a
1769,8 ± 45,8
b
2065,3 ± 48,8
a
1285,7 ± 52,0
b
1487,6 ± 30,2
Nativ
2808,6 ± 88,3
Gefriergetrocknet
3158,6 ± 42,6
Nativ
1626,7 ± 75,1
Gefriergetrocknet
1830,8 ± 41,4
264,8 ± 6,3
b
308,5 ± 6,0
a
157,2 ± 5,3
b
180,6 ± 6,2
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
98
13-Z-Lutein
a
13-Z-Zeaxanthin
a
341,6 ± 12,8
b
376,2 ± 05,5
a
272,1 ± 09,3
b
293,2 ± 07,7
a
b
a
b
Ergebnisse
Die bei gefriergetrockneten Granula signifikanten Zunahmen der all-E- und 13-Z-Isomere von
Lutein und Zeaxanthin (Tab. 4-27) sind als prozentuale Massenkonzentrationssteigerung in
Tabelle 4-28 dargestellt. Zusammen mit den identischen Zunahmen an all-E-Lutein waren
die Steigerungen der 13-Z-Isomere und von all-E-Zeaxanthin bei Charge 3 um 1,0 - 2,3 %
und damit nur marginal höher als bei Charge 4 (Tab. 4-28).
Tab. 4-28:
Massenkonzentrationsänderungen [%] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin gefriergetrockneter Granula der Chargen 3 und 4
Granula
all-E-Lutein
Massenkonzentrationsänderungen [%]
all-E13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Zeaxanthin
Charge 3
+12,5
+16,7
+16,5
+10,1
Charge 4
+12,6
+15,7
+14,9
+7,8
Gegenüber all-E-Lutein waren die prozentualen Zunahmen an all-E-Zeaxanthin um ca. 3,7 %
höher, und die 13-Z-Lutein-Zunahme war um ca. 6,8 % höher als die von 13-Z-Zeaxanthin
(Tab. 4-28).
Abbildung 4-22 veranschaulicht die Änderungen der Xanthophyll-Massenkonzentrationen
(Tab. 4-27 und 4-28) im Vergleich nativer und gefriergetrockneter Granula.
µg/100 g
3000
b
a
all-E-Lutein
3000
2400
b
a
1800
2400
1800
1200
1200
600
600
0
Nativ
13-Z-Lutein
µg/100 g
a
240
a
160
320
b
Abb. 4-22:
Nativ
b
Gefriergetrocknet
13-Z-Zeaxanthin
b
a
a
b
240
160
80
0
a
µg/100 g
400
b
b
a
0
Gefriergetrocknet
400
320
all-E-Zeaxanthin
µg/100 g
80
Nativ
Gefriergetrocknet
0
Nativ
Gefriergetrocknet
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativer und gefriergetrockneter
Granula von Charge 3 (grau) und Charge 4 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben
kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
99
Plasma
Den Einfluss der Gefriertrocknung auf die Massenkonzentrationen der all-E- und 13-ZIsomere von Lutein und Zeaxanthin in Plasma zeigen Tabelle 4-29 und Tabelle 4-30.
Tab. 4-29:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativen und gefriergetrockneten Plasmas der Chargen 3 und 4
Massenkonzentrationen [µg/100 g]
Plasma
Charge 3
Charge 4
all-EZeaxanthin
all-E-Lutein
13-Z-Lutein
a
3014,2 ± 83,5
b
3618,7 ± 60,0
a
2155,0 ± 32,8
b
2676,1 ± 49,1
Nativ
4468,6 ± 143,4
Gefriergetrocknet
5238,2 ± 208,5
Nativ
2537,5 ± 021,5
Gefriergetrocknet
3050,2 ± 070,8
a
386,4 ± 11,4
b
506,5 ± 10,3
a
236,2 ± 04,4
b
305,1 ± 03,7
13-ZZeaxanthin
a
635,3 ± 20,0
a
b
658,2 ± 14,9
a
a
440,3 ± 08,7
a
b
525,3 ± 04,5
b
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Wie bei den Granula wurden signifikant höhere Massenkonzentrationen an all-E-Lutein, allE-Zeaxanthin und 13-Z-Lutein in gefriergetrocknetem Plasma beobachtet. Für all-E-Lutein (
= 3,0 %) und all-E-Zeaxanthin ( = 4,1 %) waren die Zunahmen bei Charge 4 deutlicher. Dagegen war die Steigerung an 13-Z-Lutein bei Charge 3 etwas ausgeprägter ( = 1,9 %). Ein
deutlicher Unterschied zwischen den Chargen zeigte sich bei 13-Z-Zeaxanthin, da die Zunahme bei Charge 4 mit +19,3 % signifikant und bei Charge 3 mit +3,6 % nur marginal ausgeprägt war. (Tab. 4-29 und 4-30)
Tab. 4-30:
Plasma
Massenkonzentrationsänderungen [%] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin gefriergetrockneten Plasmas der Chargen 3 und 4
all-E-Lutein
Massenkonzentrationsänderungen [%]
all-E13-Z-Lutein
Zeaxanthin
13-Z-Zeaxanthin
Charge 3
+17,2
+20,1
+31,1
+3,6
Charge 4
+20,2
+24,2
+29,2
+19,3
Wie bei den Granula schon beobachtet, waren die Zunahmen an all-E-Zeaxanthin gegenüber all-E-Lutein etwas höher ( ca. 3,5 %), während die Steigerungen an 13-Z-Lutein höher
als die von 13-Z-Zeaxanthin waren (Charge 3:  = 27,5 %; Charge 4:  = 9,9 %; Tab. 4-30).
100
Ergebnisse
Abbildung 4-23 veranschaulicht die Xanthophyll-Gehalte (Tab. 4-29) nativen und gefriergetrockneten Plasmas.
µg/100 g
5000
b
all-E-Lutein
a
5000
4000
3000
4000
b
a
2000
1000
1000
Nativ
13-Z-Lutein
µg/100 g
600
480
360
240
Abb. 4-23:
µg/100 g
Gefriergetrocknet
13-Z-Zeaxanthin
a
a
b
a
480
a
b
360
240
120
0
Nativ
600
b
a
b
a
0
Gefriergetrocknet
b
a
3000
2000
0
all-E-Zeaxanthin
µg/100 g
120
Nativ
0
Gefriergetrocknet
Nativ
Gefriergetrocknet
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativen und gefriergetrockneten
Plasmas von Charge 3 (grau) und Charge 4 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben
kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Eigelb
Die Xanthophyll-Gehalte gefriergetrockneten Eigelbs differierten im Vergleich zum Nativzustand bei Charge 3 marginal, was ebenso für 13-Z-Lutein bei Charge 4 galt (Tab. 4-31).
Tab. 4-31:
Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin nativen und gefriergetrockneten Eigelbs der Chargen 3 und 4
Massenkonzentrationen [µg/100 g]
Eigelb
Charge 3
Charge 4
all-EZeaxanthin
all-E-Lutein
13-Z-Lutein
13-ZZeaxanthin
Nativ
4112,3 ± 105,4
a
2842,3 ± 79,8
a
372,0 ± 03,3
a
532,5 ± 23,7
a
Gefriergetrocknet
3936,7 ± 128,8
a
2736,8 ± 73,7
a
365,7 ± 06,3
a
476,3 ± 04,0
a
Nativ
2429,1 ± 001,1
a
2146,8 ± 04,8
a
235,1 ± 13,1
a
424,2 ± 11,4
a
Gefriergetrocknet
2320,6 ± 014,9
b
2049,2 ± 22,3
b
221,3 ± 03,3
a
375,5 ± 03,2
Abweichende Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
b
101
Die all-E-Isomere und 13-Z-Zeaxanthin waren bei Charge 4 infolge der Gefriertrocknung signifikant verringert, wobei die Verminderungen gemäß den prozentualen Veränderungen bei
Charge 4 nur marginal höher waren als bei Charge 3 ( ca. 0,2 - 0,9 %). Der Verlust an 13-ZLutein war bei Charge 4 um 4,2 % höher als bei Charge 3. (Tab. 4-31 und 4-32)
Tab. 4-32:
Massenkonzentrationsänderungen [%] der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin gefriergetrockneten Eigelbs der Chargen 3 und 4
Eigelb
Massenkonzentrationsänderungen [%]
all-E13-Z-Lutein
Zeaxanthin
all-E-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Charge 3
-4,3
-3,7
-1,7
-10,6
Charge 4
-4,5
-4,6
-5,9
-11,5
Bei gefriergetrocknetem Eigelb waren die Massenkonzentrationen von all-E-Lutein und all-EZeaxanthin gemittelt um 4,3 % geringer als im Nativzustand. Gegenüber dem maximalen
Verlust an 13-Z-Lutein bei Charge 4 (-5,9 %) waren die Konzentrationen an 13-Z-Zeaxanthin
nach der Gefriertrocknung deutlich stärker verringert (-11,1 %). (Tab. 4-32)
Anhand von Abbildung 4-24 sind die Änderungen der Xanthophyll-Gehalte (Tab. 4-31 und 432) bei gefriergetrocknetem Eigelb im Vergleich zum Nativzustand erkennbar.
µg/100 g
all-E-Lutein
a
a
4000
4000
3200
3200
a
2400
b
1600
800
800
Nativ
13-Z-Lutein
600
480
480
a
a
a
240
a
Abb. 4-24:
102
b
Gefriergetrocknet
13-Z-Zeaxanthin
a
a
360
120
0
Nativ
µg/100 g
600
360
a
a
0
Gefriergetrocknet
µg/100 g
a
2400
1600
0
all-E-Zeaxanthin
µg/100 g
a
b
240
120
Nativ
Gefriergetrocknet
0
Nativ
Gefriergetrocknet
Xanthophyll-Massenkonzentrationen + SD [µg/100 g] nativen und gefriergetrockneten
Eigelbs von Charge 3 (grau) und Charge 4 (schraffiert) – Abweichende Buchstaben
kennzeichnen signifikante Unterschiede ( = 0,05)
Diskussion
5. Diskussion
Einleitend zur Diskussion sind grundlegende Aspekte zur Interpretation der DSC-Thermogramme und der Xanthophyll-Massenkonzentrationen darzustellen.
Die DSC-Thermogramme der nativen, erhitzten und gefriergetrockneten Proben von Granula, Plasma und Eigelb wurden ausgewertet basierend auf den temperaturabhängigen Strukturentfaltungen der Livetine, LDL und HDL, die aus den Literaturangaben (Kapitel 2.2.1)
nach Abbildung 5-1 abgeleitet wurden.
-Livetin (69-81 °C)
-Livetin (60-69 °C)
Phosvitin (> 100 °C)
-Livetin (69-76 °C)
Temperatur [°C]
60
65
70
80
75
85
LDL-Delipidation (82-83 °C)
LDL (> 65-76 °C)
HDL (> 75-84 °C)
Abb. 5-1:
Thermoinduzierte Strukturveränderungen der Livetine, LDL, HDL und von Phosvitin in
Eigelb [nach Jaekel und Ternes 2009; Li-Chan und Kim 2008; Ternes 2008b; Bircan und
Barringer 2002; Le Denmat et al. 1999; Acker und Ternes 1994; Ternes und Acker 1994a
und 1994c; Mohr und Simon 1992]
Bei Plasma wurde der Einfluss der nur zu 2,6 % enthaltenen Granula-Reste auf die Xanthophyll-Massenkonzentrationen aufgrund der Geringfügigkeit nicht berücksichtigt.
5.1 Nativzustand
Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine
Den symmetrischen Peak des DSC-Thermogramms nativer Granula (ca. 68 bis 97 °C; Abb.
4-12, Tab. 4-13) dominierte die Strukturentfaltung der zu 70 % enthaltenen HDL gegenüber
derjenigen der LDL, da deren Anteil mit 12 % deutlich geringer ist [Anton 2007]. Aufgrund der
Entfaltung der LDL, die hauptsächlich zwischen 70 und 75 °C stattfindet, und der oberhalb
75 °C beginnenden Strukturentfaltung der HDL zeigte sich der Onset des Peaks bei 75,2 °C,
und die Td bei 83,5 °C stimmte mit Literaturangaben zur vollständigen HDL-Strukturentfaltung bei 84,3 °C [Bircan und Barringer 2002] überein.
103
Eine verminderte Intensität der elektrophoretischen -HDL-Bande zwischen 72 und 76 °C bei
gleichbleibender Intensität der -HDL-Bande [Le Denmat et al. 1999] und ein um den Faktor
1,5 höherer Anteil an -HDL in den Granula [Anton 2007] weisen darauf hin, dass das detektierte Peakmaximum überwiegend auf der Entfaltung der -HDL-Struktur basierte. Der PeakBereich zwischen 68 °C und 77 °C lässt sich mit partiellen Strukturentfaltungen von -HDL
und hauptsächlich der LDL, die oberhalb 65 °C beginnen und bei 76 °C abgeschlossen sind,
erklären.
Bei nativem, verdünntem Plasma waren zwischen ca. 69/70 bis 95/96 °C (Abb. 4-12, Tab. 413) zwei Peaks identifizierbar. Peak 1 (ca. 69/70 °C bis 81 °C) wies einen Onset von 71,3 °C
und Td bei 75,8 °C auf. Neben der Denaturierung von-Livetin (69 bis 76 °C) und von Livetin (69 bis 81 °C) repräsentiert Peak 1 daher überwiegend die zwischen 70 und 76 °C
konstatierte Strukturentfaltung der LDL, die in Plasma dominieren. Der stärker ausgeprägte
Peak 2 zwischen 81 und 95/96 °C mit einem Onset von 79,1 °C und Td von 86,0 °C ist auf
die oberhalb von 75 °C beginnende und bei ca. 84 °C abgeschlossene HDL-Strukturentfaltung der zentrifugationsbedingten Granula-Reste (2,6 %) zurückzuführen. Hierbei basiert das
Peakmaximum wie bei den Granula hauptsächlich auf der Strukturentfaltung von -HDL.
Gegenüber Peak 1 war H von Peak 2 um den Faktor 6,6 höher. Dies könnte auf die mit
Phosvitin über Phosphocalciumbrücken komplexierte HDL-Dimer-Struktur der Granula zurückzuführen sein.
Da sich die Messkurve mit Zunahme der Heizrate zu höheren Temperaturen verschob [Keil
2013], basieren der im Vergleich zu den Granula höhere Onset und die höhere Td von Peak
2 des Plasmas (Tab. 4-13) vermutlich auf dem ca. um den Faktor zwei höheren Wasseranteil
des Plasmas, der eine höhere Wärmeleitfähigkeit bedingt. Aufgrund der geringen GranulaReste und der 1:1-Verdünnung des Plasmas war H des die HDL-Entfaltung repräsentierenden Peaks 2 (-0,32 J/g) deutlich geringer als bei den Granula (-2,93 J/g).
In Vorversuchen zeigte das DSC-Thermogramm nativen, unverdünnten Plasmas zwischen
ca. 60 und 68 °C die Denaturierung von -Livetin. Diese war bei einer Verdünnung des
Plasmas von 3,5:1 schwächer ausgeprägt und bei der 1:1-Verdünnung daher nicht mehr
detektierbar. [Keil 2013]
Bei Eigelb zeigte sich ein Peak, der als Denaturierung der Livetine und Strukturentfaltung
der Lipoproteine interpretiert wird (ca. 60 bis 98 °C; Abb. 4-12, Tab. 4-13). Die geringe Ausprägung des Peaks zwischen 60 und 68 °C weist auf die ab 60 °C beginnende Denaturierung der zu 10 % enthaltenen Livetine hin [Powrie und Nakai 1986]. Dabei spielt besonders
die bei 62 °C fortgeschrittene und bei 69 °C vollständige Denaturierung von -Livetin eine
Rolle, da - und -Livetin bis ca. 69 °C stabil sind.
104
Diskussion
Der Peak-Bereich ab ca. 68 bis 79/80 °C könnte wie Peak 1 des Plasmas auf Denaturierungen der - und -Livetine und überwiegend der Entfaltung der zu 68 % enthaltenen LDL
[Powrie und Nakai 1986] basieren. Der hier ermittelte Onset des DSC-Peaks bei Eigelb von
73,1 °C stimmte mit dem Onset von Peak 1 des Plasmas (71,3 °C) und des Peaks der Granula (75,2 °C; Tab. 4-13) sowie mit dem über das gewichtete Mittel entsprechend der EigelbKomposition (78 % Plasma, 22 % Granula) [Powrie und Nakai 1986] errechneten Onset
(72,2 °C) überein. Die zwischen ca. 79/80 bis 98 °C starke Ausprägung des Peaks bei Eigelb
stand in Einklang mit Peak 2 des Plasmas (ca. 81 °C bis 95/96 °C; Abb. 4-12). Auch die Td
(84,1 °C) des Peaks bei Eigelb stimmte mit derjenigen bei Peak 2 des Plasmas (86,0 °C) und
des Peaks der Granula (83,5 °C; Tab. 4-13) sowie dem errechneten gewichteten Mittel von
85,5 °C überein. Wie bei Plasma wird der Peak-Bereich zwischen ca. 79/80 bis 98 °C bei
Eigelb daher auf die Strukturentfaltung der HDL zurückgeführt, wobei diejenige von -HDL
am Peakmaximum dominierte.
In Eigelb ist der Anteil an HDL (16 %) deutlich geringer als der LDL-Anteil (68 %) [Powrie
und Nakai 1986]. Dennoch dominiert die Strukturentfaltung der thermostabilen HDL die Lage
und Form des DSC-Peaks von Eigelb, was vermutlich in der höheren benötigten normierten
Gesamtenthalpie gegenüber den LDL begründet liegt. Dabei war H (-1,49 J/g) des Peaks
bei Eigelb geringer als H des Granula-Peaks (-2,93 J/g) und höher als H von Peak 1 der
LDL-Strukturentfaltung (-0,05 J/g) bei Plasma (Tab. 4-13). Der ermittelte Messwert stimmte
nicht mit dem anhand der Eigelb-Komposition unter Berücksichtigung der Verdünnung bei
Plasma berechneten gewichteten Mittel (-0,72 J/g) überein. Neben Messunsicherheiten infolge des geringen H-Wertes von Peak 1 bei Plasma könnte dies in den spezifischen Matrixeigenschaften von Granula, Plasma und Eigelb, besonders hinsichtlich der durch die Trockenmasse beeinflussten Wärmeleitfähigkeit, begründet liegen.
Xanthophyll-Massenkonzentrationen
Der geringe sterische Hinderungseffekt bei trisubstituierten Doppelbindungen bedingt eine
hohe Stabilität der Z-Isomere und eine geringe Aktivierungsenergie der Z-Isomerisierung der
all-E-Isomere [Britton und Khachik 2009]. Daher wurden in den nativen, erhitzten und gefriergetrockneten Proben von Granula, Plasma und Eigelb wie auch bei Wenzel (2010) die
13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin detektiert.
Basierend auf der Futteraufnahme schwankten die Konzentrationen der all-E- und 13-ZIsomere von Lutein und Zeaxanthin der aus unterschiedlichen Legebetrieben und damit
Hühner-Kohorten stammenden vier untersuchten Chargen von Bio-Eiern im Nativzustand bei
Granula, Plasma und Eigelb um Faktoren im Bereich von 1,6 - 2,2 (Anhang 2, Tab. 2-1).
105
Der hohe Lipidgehalt von Plasma (73 %) ist durch den Anteil an LDL von 85 % und wiederum deren hohen Lipidgehalt von 88 % bedingt, während Granula (31 % Lipide) neben 12 %
an LDL zu 70 % HDL mit einem relativ geringen Lipidanteil von 25 % enthalten [Anton 2007;
Powrie und Nakai 1986]. Damit ist der Lipidgehalt des Plasmas ca. 2,4-mal höher als der von
Granula. Die Konzentrationen an Lutein und Zeaxanthin sind bezogen auf den Lipidanteil in
den Lipoproteinen gleich [Ternes et al. 1995]. Daher sollten die Xanthophyll-Gehalte in
Plasma ungefähr doppelt so hoch sein wie in den Granula, was Testmessungen in Vorversuchen bestätigten. In nativem, 1:1-verdünntem Plasma mit einem theoretischen Lipidgehalt
von ca. 37 % waren die Xanthophyll-Konzentrationen ca. 1,4- bis 1,9-fach höher als bei den
Granula (Anhang 2, Tab. 2-1).
Die ökologische Haltungsform von Hühnern verbietet den Einsatz synthetisierter Supplemente oder mittels organischer Lösungsmittel gewonnener Pflanzenextrakte der bei der Bodenhaltung für die Geflügelfütterung in der EU zugelassenen Xanthophylle [BVL 2011]. In den
Futterpflanzen wie Mais, Erbsen, Spinat und Tagetes-Arten sind Lutein und Zeaxanthin in
hohen Mengen enthalten und fast ausschließlich mit Fettsäuren verestert, was die Fettlöslichkeit und Absorptionseffizienz erhöht [Boonnoun et al. 2012; Khachik 2001; DelgadoVargas und Paredes-López 1996; Gregory et al. 1986; Philip et al. 1976]. Daher dominieren
in Eiern aus ökologischer Haltung Lutein und Zeaxanthin im Vergleich zu anderen Haltungsformen [Schlatterer und Breithaupt 2006]. Zudem neigen unveresterte Xanthophylle in Supplementen zur Aggregation [Köhn et al. 2008], was deren Bioverfügbarkeit verringern kann
[Britton et al. 2008]. Im Eigelb sind Lutein und Zeaxanthin hauptsächlich unverestert [Handelman et al. 1999; Lai et al. 1996; Philip et al. 1976], da Xanthophyll-Ester durch eine lipasekatalysierte Hydrolyse im Darmlumen deacetyliert werden [Breithaupt et al. 2003].
Die genannten Gründe erklären die deutlich höheren Xanthophyll-Gehalte in nativem Eigelb
aus ökologischer Haltung im Vergleich zu Eiern aus Bodenhaltung (all-E-Lutein und 13-ZZeaxanthin: 5,1-fach; all-E-Zeaxanthin: 5,7-fach; 13-Z-Lutein: 13,5-fach; Tab. 5-1). Dabei
scheint besonders 13-Z-Lutein in den Futterpflanzen in hohen Mengen vorzukommen.
Tab. 5-1:
Vergleich der Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin in nativem Eigelb mit Literaturangaben nach Wenzel (2010) und Schlatterer
und Breithaupt (2006)
Massenkonzentrationen
[µg/100 g]
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Ökologische Haltung
HPLC-PDA-Analyse*
3256,8 ± 43,5
2562,2 ± 36,5
0323,1 ± 05,4
0463,7 ± 11,2
* Mittelwerte der untersuchten Chargen
106
Schlatterer und
Breithaupt (2006)
1764,1 ± 430,0
1021,4 ± 199,5
Keine Angaben
Bodenhaltung
Wenzel (2010)*
639,1 ± 25,3
450,0 ± 23,7
023,9 ± 05,3
090,4 ± 04,8
Diskussion
Die gegenüber Schlatterer und Breithaupt (2006) festgestellten höheren Gehalte an all-ELutein (Faktor 1,8) und all-E-Zeaxanthin (Faktor 2,5; Tab. 5-1) sind vermutlich durch
Schwankungen der Futterzusammensetzung bei der ökologischen Haltung bedingt.
Wie bei Wenzel (2010) und Schlatterer und Breithaupt (2006) dominierte all-E-Lutein gegenüber all-E-Zeaxanthin (Tab. 5-1). Dies liegt vermutlich darin begründet, dass Lutein als
Hauptcarotinoid in den Chloroplasten [Britton 2008a] vorkommt und Zeaxanthin aufgrund des
leichten Umbaus zu Epoxyxanthophyllen häufig ein Minorcarotinoid in den Futterpflanzen ist
[Rodriguez-Amaya 2003; Khachik 2001; Hadden et al. 1999; Gregory et al. 1986].
Die Anteile an 13-Z-Isomeren an der Gesamt-Xanthophyll-Massenkonzentration im Nativzustand waren sowohl bei beiden Chargen als auch bei Granula, Plasma und Eigelb ähnlich,
wobei der Anteil von 13-Z-Zeaxanthin, vergleichbar mit Wenzel (2010), höher als der von 13Z-Lutein lag (Tab. 5-2; Anhang 3). Im Vergleich zu Wenzel (2010) waren die 13-Z-IsomerenAnteile bei Eigelb aus ökologischer Haltung höher (Tab. 5-2), was in der unterschiedlichen
Futterzusammensetzung im Vergleich zur Bodenhaltung begründet liegen könnte. Vermutlich
sind die 13-Z-Isomere in den Futterpflanzen, die besonders in der ökologischen Haltung eingesetzt werden, in hohen Mengen enthalten, wobei deren Bioverfügbarkeit zudem aufgrund
der Veresterung verbessert ist.
Tab. 5-2:
Prozentuale Anteile an 13-Z-Lutein und 13-Z-Zeaxanthin an der Gesamt-XanthophyllMassenkonzentration in Eigelb, Plasma und Granula im Nativzustand im Vergleich zu
Wenzel (2010)
[%] an der Gesamt-Xanthophyll-Massenkonzentration
HPLC-PDA-Analyse
Wenzel (2010)
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Eigelb
4,4 - 6,4
6,6 - 8,1
0,6 - 1,0
2,8 - 3,4
Plasma
4,4 - 6,1
6,4 - 8,2
Granula
4,7 - 6,2
6,3 - 8,1
Nicht untersucht
107
5.2 Diskussion zum Einfluss der Erhitzung
Die fünf Erhitzungstemperaturen wurden entsprechend der temperaturabhängigen Strukturentfaltungen der Livetine, LDL und HDL nach Abbildung 5-1 gewählt.
Die industrielle Pasteurisation von Eigelb findet zwischen 61 und 68 °C statt [Ternes 2008b].
Dabei beginnt die Denaturierung der Livetine bei 60 °C, und partielle Strukturentfaltungen
sowie Aggregierungen der LDL treten oberhalb 65 °C auf. Eine Erhitzung bei 67 °C wurde
demnach gewählt um den Einfluss hoher Pasteurisationstemperaturen auf die Strukturen der
Proteine und Lipoproteine und die Xanthophyll-Massenkonzentrationen zu untersuchen. Die
nativen und die bei 67 °C erhitzten Proben wiesen keine erkennbaren Unterschiede in der
Konsistenz auf.
Die Hitzebehandlung bei 72 °C wurde gewählt, da die LDL-Entfaltung größtenteils zwischen
70 und 75 °C stattfindet. Zudem berichten Le Denmat et al. (1999) von einer Intensitätsverringerung der -Livetin-Bande bei 72 °C, und -Livetin denaturiert zwischen 69 und 81 °C.
Die auf hydrophoben Wechselwirkungen basierende dreidimensionale Vernetzung der entfalteten LDL- und Livetin-Strukturen führt zur Gelbildung, was sich anhand der haptisch höheren Viskosität des bei 72 °C erhitzten Plasmas und Eigelbs zeigte.
Dies gilt ebenso für die bei 77 °C erhitzten Proben von Eigelb und Plasma, wobei die Vernetzung der bei 76 °C vollständig entfalteten -Livetine und LDL sowie Thermoaggregierungen der LDL die Entstehung des ersten Viskositätsmaximums zwischen 75 und 80 °C bedingen [Jaekel und Ternes 2009; Jaekel et al. 2008; Ternes 2008b]. Aufgrund der Strukturentfaltung und Aggregierung der LDL und Livetine war das Wasserbindevermögen von Plasma
infolge der Erhitzung bei 77 °C vermindert. Zudem beginnt oberhalb 75 °C die Entfaltung der
HDL in Eigelb und Granula [Ternes und Acker 1994c; Mohr und Simon 1992]. Nach der Erhitzung bei 72 und 77 °C wiesen die Granula eine haptisch feste und wenig kohäsive Konsistenz auf. Dies lag vermutlich darin begründet, dass Granula nur 12 % LDL und keine Livetine enthalten, deren thermoinduzierte Entfaltungen bei der Ausbildung des dreidimensionalen Gelnetzes eine Rolle spielen [Powrie und Nakai 1986].
Neben der Denaturierung von -Livetin bei 81 °C [Ternes und Acker 1994c] kommt es unter
Freisetzung von Neutrallipiden zwischen 82 und 83 °C zur durch das Viskositätsminimum
gekennzeichneten LDL-Delipidation und Aggregierung der Plasma-Proteine [Jaekel und Ternes 2009; Ternes 2008b; Ternes und Acker 1994a]. Bedingt durch den hohen LDL-Anteil
dieser Proben betraf dies besonders das bei 82 °C erhitzte Eigelb und Plasma, die eine
haptisch weiche Konsistenz aufwiesen. Durch die oben schon beschriebene fortschreitende
Aggregierung der LDL war das Wasserbindevermögen des bei 82 und 87 °C erhitzten Plasmas gegenüber der Erhitzung bei 77 °C geringer.
108
Diskussion
Die Erhitzung bei 87 °C sollte der Darstellung der vollständigen Strukturentfaltung der Proteine und Lipoproteine dienen. Die Auflösung der Granula und Entfaltung der HDL bedingen
zusammen mit fortschreitenden irreversiblen Aggregierungen der Lipoproteine, die auf kovalenten Disulfidbrücken basieren, den zweiten Viskositätsanstieg oberhalb von 85 °C. Dies ist
verbunden mit der Ausbildung eines kompakten, dreidimensional vernetzten, schnittfesten
Gels, in dem Wasser und Ionen gebunden sind [Jaekel und Ternes 2009; Jaekel et al. 2008].
Die bei 82 und 87 °C erhitzten Granula zeigten erneut eine haptisch feste und wenig kohäsive Konsistenz. Dies ist bedingt durch die Aggregierung denaturierter Lipoproteine, welche
die konsistenzvermindernde Delipidation der nur zu 12 % enthaltenen LDL überlagerte. Auch
die beobachtete hohe Festigkeit des bei 87 °C erhitzten Eigelbs basierte auf der Aggregierung der Lipoproteine [Jaekel und Ternes 2009; Jaekel et al. 2008].
Die Massenkonzentrationen der Xanthophylle waren bei der Erhitzung multifaktoriell beeinflusst. Durch hitzeinduzierte Entfaltungen der LDL- und HDL-Strukturen erhöhte sich die
Extrahierbarkeit der Xanthophylle. Aufgrund des Verlusts der schützenden Lipoproteinstruktur kam es dabei in Abhängigkeit der Temperatur zu Z-Isomerisierungen und oxidativen Degradationen der Xanthophylle, die auch durch Reaktanten katalysiert sind. Dabei könnte das
Ausmaß oxidativer Degradationen durch den Gehalt an ungesättigten Fettsäuren beeinflusst
sein. Parallel dazu verringerten thermoinduzierte dreidimensionale Vernetzungen und Aggregierungen entfalteter Proteine und Lipoproteine durch die Einbettung der Xanthophylle
deren Extrahierbarkeit. Zudem war durch die Gelbildung die Diffusion von Reaktanten verzögert, was das Ausmaß an 13-Z-Isomerisierungen und oxidativen Degradationen der Xanthophylle verminderte. (Abb. 5-2)
Erhitzung
Änderung der Xanthophyll-Gehalte
13-Z-Isomerisierung
Extrahierbarkeit
Oxidative
Degradation
Vernetzung und Aggregierung
entfalteter Proteine und Lipoproteine
Strukturentfaltung der
Lipoproteine
Kein Effekt
Reaktanten
Kein Effekt
Ungesättigte Fettsäuren
Abb. 5-2:
Kein Effekt
Einflüsse der Erhitzung auf die Massenkonzentrationen der Xanthophylle – Kennzeichnung von Erhöhung (grüner Pfeil) oder Verminderung (roter Pfeil) der Extrahierbarkeit,
13-Z-Isomerisierung und oxidativen Degradation der Xanthophylle
109
Die Komplexierung zwei- und dreiwertiger Metallkationen durch die Phosphatgruppe des
Phosvitins ist über 100 °C hitzestabil [Li-Chan und Kim 2008; Le Denmat et al. 1999]. Dabei
ist die hohe Bindungskapazität von Phosvitin für Eisenionen von Bedeutung [Ternes 2008a],
die bei einem Massenverhältnis größer 8:1 (Fe(II):Xanthophylle) die 13-Z-Isomerisierung von
Lutein und Zeaxanthin signifikant induzieren [Li und Han 2008]. Zudem katalysieren Metallkationen durch die Bildung von Radikalen oxidative Degradationen der Xanthophylle. Erhitzungsbedingt erhöhte Metallkationenkonzentrationen als Ursache für 13-Z-Isomerisierungen
und oxidative Degradationen der Xanthophylle scheinen aufgrund der hitzestabilen Bindung
durch Phosvitin vernachlässigbar.
Granula, Plasma und Eigelb sind durch ihre Gehalte an Proteinen und Lipoproteinen charakterisiert (Abb. 2-3). Diese beeinflussen die Matrixeigenschaften, da die hitzeinduzierte Gelbildung auf dreidimensionalen Vernetzungen und Aggregierungen der entfalteten Proteine
und Lipoproteine basiert. Bei Plasma erhöhte zudem der durch die Zentrifugation bedingte
höhere Wasseranteil die Wärmeleitfähigkeit. Daher könnten das Ausmaß der Entfaltung der
Lipoproteine und damit die Extrahierbarkeit sowie 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle bei Plasma höher sein.
Infolge der Hitzebehandlung waren die Massenkonzentrationen an 13-Z-Zeaxanthin im Gegensatz zu den signifikanten Zunahmen an 13-Z-Lutein nur marginal verändert. Dies lag
vermutlich neben der Kompensation der multifaktoriellen Einflüsse bei der Erhitzung in der
geringeren 13-Z-Isomerisierungsneigung von all-E-Zeaxanthin gegenüber all-E-Lutein begründet. Die höhere Reaktionsfreudigkeit von all-E-Lutein ist stereochemisch mit der allylisch
gebundenen Hydroxyl-Gruppe im -Iononring erklärbar, da die resultierende Allylspannung
einen höheren Energiegehalt gegenüber dem sich durch zwei hydroxylierte -Iononringe
auszeichnenden Zeaxanthin bedingt (Abb. 2-7).
67 °C – Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine
Im Vergleich zum Nativzustand waren der Temperaturbereich, der Onset und Td des symmetrischen DSC-Peaks der bei 67 °C erhitzten Granula identisch. Die H war nach der Erhitzung marginal geringer. Dies deutet auf eine weitgehende Erhaltung der HDL-PhosvitinKomplexstruktur der Granula und deren Lipoproteinkomponente hin und steht in Einklang mit
der erst oberhalb 75 °C beginnenden HDL-Entfaltung. Die kleineren H-Werte waren vermutlich durch geringfügige Strukturveränderungen der Granula-LDL (12 %), die oberhalb 65 °C
auftreten können, bedingt. Dies liegt nach Anton et al. (2000) darin begründet, dass die LDL
durch eine Einbindung in die HDL-Phosvitin-Komplex-Struktur bei der hitzeinduzierten Entfaltung nicht stabilisiert werden. (Abb. 4-13, Tab. 4-14)
110
Diskussion
Da - und -Livetin bis ca. 69 °C stabil sind und die LDL-Strukturentfaltung hauptsächlich
zwischen 70 und 75 °C stattfindet, waren der Onset und Td von Peak 1 des nativen und des
bei 67 °C erhitzten Plasmas identisch. Die signifikant geringere H ( = 0,02 J/g) von Peak 1
und dessen geringere Ausprägung bei der erhitzten Probe basierten auf partiellen Entfaltungen der LDL. Da das Ergebnis vermutlich zudem durch Messunsicherheiten aufgrund der
geringen H-Werte beeinflusst war, wurde eine weitgehende Erhaltung der LDL-Strukturen
bei 67 °C angenommen. In Einklang mit den Ergebnissen der Granula waren die Messkurven, der Onset, Td und H von Peak 2 des nativen und des bei 67 °C erhitzten Plasmas
identisch. Im Nativzustand war H von Peak 2 um den Faktor 6,6 höher als H von Peak 1.
Die partielle LDL-Strukturentfaltung infolge der Erhitzung bei 67 °C bedingte die um den Faktor zehn höhere H von Peak 2 als von Peak 1 bei der hitzebehandelten Probe. (Abb. 4-14,
Tab. 4-15 und 4-16)
Aufgrund der fortgeschrittenen Denaturierung von -Livetin war eine entsprechende endotherme Reaktion (60 bis 68 °C) nach der Erhitzung von Eigelb bei 67 °C nicht mehr
messbar. Daher begann der DSC-Peak im Thermogramm dieser Probe erst bei ca. 67/68 °C.
Wie im Nativzustand waren aber die Strukturentfaltungen der LDL und - und -Livetine (68
bis 79/80 °C) und der HDL (79/80 °C bis 98 °C) zu erkennen. Infolge des dominanten Einflusses der LDL (68 %) und HDL (16 %) waren der Onset und Td des DSC-Peaks des bei
67 °C erhitzten Eigelbs mit dem Nativzustand identisch. Die bei Charge 2 signifikant verringerte H ( = 0,18 J/g) und die bei beiden Chargen geringere Ausprägung des Peaks zwischen 68 und 79/80 °C deuteten auf eine partielle Entfaltung der LDL hin. Dies stand in Einklang mit einem entsprechenden Ergebnis für Peak 1 bei Plasma. Bei Charge 1 der EigelbProben war H des Peaks bei 67 °C dagegen nahezu identisch mit dem Nativzustand. In
Einklang mit Granula und Plasma bestätigten der identische Onset und die identische Td des
Peaks verglichen mit dem Nativzustand bei Eigelb die vermutete Erhaltung der Strukturen
der Granula und HDL bei 67 °C. Demnach sind bei hohen Pasteurisationstemperaturen partielle Strukturveränderungen der Livetine und LDL zu erwarten. (Abb. 4-15, Tab. 4-17)
67 °C – Xanthophyll-Massenkonzentrationen
Aufgrund der weitgehenden Erhaltung der Lipoproteine mit Ausnahme partieller LDL-Strukturentfaltungen und der geringen Hitzebelastung bei 67 °C differierten die Xanthophyll-Massenkonzentrationen im Vergleich zum Nativzustand marginal. Um die Veränderungen der
Xanthophyll-Gehalte infolge der Hitzebehandlung bei 67 °C zu verdeutlichen, müssen höhere
Erhitzungen betrachtet werden.
111
Bei Plasma und Granula führte die Erhitzung bei 82 °C im Vergleich zu 67 °C zu geringeren
13-Z-Lutein-Zunahmen als im Vergleich zum Nativzustand (∆̅ = 3,9 %). Ebenso war die 13-ZLutein-Zunahme der bei 87 °C erhitzten Granula verglichen mit 67 °C geringer als im Vergleich zum Nativzustand ( = 3,4 %). Neben einer besseren Extrahierbarkeit von 13-Z-Lutein
aus der Matrix durch partielle LDL-Strukturveränderungen deutet dies auf die 13-Z-Isomerisierung von all-E-Lutein bei 67 °C hin. Dabei sind die Veränderungen der XanthophyllGehalte in Granula, Plasma und Eigelb durch Pasteurisation nicht quantitativ bedeutend.
(Tab. 4-18 bis 4-22)
72 °C – Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine
Bei 72 °C Erhitzungstemperatur wiesen der höhere Onset ( ca. 1,6 °C) und die signifikant
geringere H des DSC-Peaks der Granula ( ca. 0,7 J/g) auf Strukturveränderungen der
Lipoproteine, vor allem der LDL, hin. Bei elektrophoretischen Untersuchungen von Eigelb,
Plasma und Granula beobachteten Le Denmat et al. (1999) zwischen 72 und 76 °C eine verringerte Intensität der -HDL-Bande. Daher war auch von partiellen -HDL-Strukturentfaltungen auszugehen. Dies erklärt die geringere Ausprägung des Peaks im Bereich der LDL(ca. 71 bis 77 °C) und HDL-Strukturentfaltung (ca. 77 bis 97 °C). Gemäß den Anteilen von
LDL (12 %) und HDL (70 %) in den Granula [Anton 2007] überlagerte die Strukturentfaltung
der HDL, die zudem aufgrund der höheren Thermostabilität einer höheren normierten Gesamtenthalpie bedarf, diejenige der LDL. Daher war der Onset des Peaks im Vergleich zum
Nativzustand und der Erhitzung bei 67 °C nur geringfügig höher. Wie beim Nativzustand bereits erklärt wurde, basierte das Peakmaximum überwiegend auf der Entfaltung der -HDLStruktur, die im Vergleich zu -HDL thermostabiler ist [Le Denmat et al. 1999]. Daher war Td
des Peaks der erhitzten Probe nicht verändert. (Abb. 4-13, Tab. 4-14)
Nach der Erhitzung des Plasmas bei 72 °C war ein hohes Ausmaß der LDL-Strukturentfaltung, die hauptsächlich zwischen 70 und 75 °C stattfindet, zu erkennen. Dabei wurde bei
diesen Proben nur ein Peak detektiert. Da die LDL-Struktur erst bei 76 °C vollständig entfaltet ist, deutet die geringe Ausprägung des Peaks ab ca. 75 °C auf eine geringe Menge nativer LDL-Strukturen des bei 72 °C erhitzten Plasmas hin. Zudem war infolge der Hitzebehandlung bei 72 °C von Denaturierungen der bis 69 °C stabilen - und -Livetine auszugehen. Die dreidimensionale Vernetzung der entfalteten LDL- und Livetin-Strukturen unter Gelbildung bedingte vermutlich eine verzögerte Wärmeleitfähigkeit. Daher war Td (87,2 °C) gegenüber dem Nativzustand und der Erhitzung bei 67 °C höher ( ca. 1,3 °C).
112
Diskussion
Die normierte Gesamtenthalpie der anhand von Peak 2 repräsentierten HDL-Strukturentfaltung ist deutlich höher als diejenige der LDL-Strukturentfaltung. Daher beeinflussten die nach
der Erhitzung bei 72 °C nativen Strukturen der LDL und - und -Livetine den Onset des
Peaks nur marginal  ca. 0,6 °C). Trotz der zudem partiellen -HDL-Strukturentfaltung war
die H des Peaks des bei 72 °C erhitzten Plasmas gegenüber dem Nativzustand nahezu
identisch. Diese im Widerspruch zu dem Ergebnis bei den Granula stehende Beobachtung
könnte darin begründet liegen, dass durch die Zentrifugation nur ein geringer Anteil an HDL
in der Plasmafraktion enthalten war. Auch im Vergleich mit der Erhitzung bei 67 °C war H
des Peaks des bei 72 °C erhitzten Plasmas bei Charge 1 nahezu identisch. Die dagegen bei
Charge 2 um 0,09 J/g signifikant geringere H war vermutlich durch geringfügig variierende
Anteile an Granula-Resten in den Plasmaproben bedingt. (Abb. 4-14, Tab. 4-16)
Bei 72 °C erhitztes Eigelb zeigte zusätzlich zur geringen Ausprägung des Peaks im Bereich
der LDL-Strukturentfaltung (ca. 72/73 bis 79/80 °C) höhere Temperaturen für den Beginn
(ca. 72/73 °C) und den Onset ( ca. 4,3 °C) des DSC-Peaks. Wie bei Plasma war dies vermutlich durch Strukturentfaltungen der LDL und der - und -Livetine bedingt. Zudem haben
wahrscheinlich partielle Entfaltungen der -HDL die verminderte Ausprägung zwischen 79/80
und 98 °C und die signifikant verringerte H des Peaks ( ca. 0,56 J/g) verursacht. Dies
wurde schon bei Plasma und Granula beobachtet. Aufgrund der weitgehenden Erhaltung der
HDL-Strukturen bei 72 °C war Td (84,8 °C) nur marginal höher als bei der nativen und der bei
67 °C erhitzten Eigelbprobe ( ca. 0,7 °C), was mit der verzögerten Wärmeleitfähigkeit infolge der beobachteten Viskositätserhöhung erklärbar ist. (Abb. 4-15, Tab. 4-17)
Bei verdünntem Plasma war die LDL-Strukturentfaltung infolge der Erhitzung bei 72 °C am
deutlichsten erkennbar, da der die Entfaltung der LDL repräsentierende Peak 1 nicht mehr
messbar war. Entsprechend der LDL-Anteile war die Messkurve bei Eigelb (68 % LDL) und
Granula (12 %) [Powrie und Nakai 1986] im Bereich der LDL-Entfaltung geringer ausgeprägt, und die Onsets waren höher (Eigelb: ca. 4 °C, Granula: ca. 2 °C).
72 °C – Xanthophyll-Massenkonzentrationen
Die partiellen Entfaltungen der -HDL und signifikanten LDL-Strukturentfaltungen bei 72 °C
erhöhten die Extrahierbarkeit sowie 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der
Xanthophylle, die durch die Erhitzung und das Vorhandensein von Reaktanten katalysiert
wurden. Dagegen verminderten dreidimensionale Vernetzungen und Aggregierungen entfalteter Proteine und Lipoproteine die Extrahierbarkeit der Xanthophylle sowie deren 13-ZIsomerisierungen und oxidative Degradationen. (Abb. 5-2)
113
Die marginalen Veränderungen der Xanthophyll-Massenkonzentrationen (Tab. 4-18, 4-20
und 4-22) könnten in der gegenseitigen Kompensation dieser multifaktoriellen Einflüsse und
der moderaten Erhitzung bei 72 °C begründet liegen.
Die Betrachtung höherer Erhitzungen verdeutlicht erneut Veränderungen der XanthophyllGehalte infolge der Hitzebehandlung bei 72 °C. Die signifikante 13-Z-Lutein-Zunahme der
bei 87 °C erhitzten Granula ist im Vergleich zur Erhitzung bei 72 °C geringer als verglichen
mit dem Nativzustand ( = 6,9 %; Tab. 4-19). Auch bei dem bei 82 °C erhitzten Plasma sind
die signifikanten 13-Z-Lutein-Zunahmen im Vergleich zum Nativzustand um 20,9 % (Charge
1) und 4,0 % (Charge 2; Tab. 4-21) höher als verglichen mit der Erhitzung bei 72 °C. Dies
bestätigte die mit einer erhöhten Extrahierbarkeit der Xanthophylle einhergehenden Strukturveränderungen der LDL und -HDL infolge der Erhitzung bei 72 °C. Zudem war das Ausmaß
der thermoinduzierten 13-Z-Isomerisierung von all-E-Lutein bei 72 °C Erhitzung höher als im
Nativzustand.
77 °C – Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine
Aufgrund der bei LDL vollständigen und bei HDL, besonders bei -HDL, fortgeschrittenen
Strukturentfaltung waren der Beginn (ca. 77 °C) und der Onset ( ca. 2,8 - 5,9 °C) des Peaks
der bei 77 °C erhitzten Granula zu höheren Temperaturen verschoben. Zudem war H signifikant geringer ( ca. 1,8 - 2,7 J/g). (Abb. 4-13, Tab. 4-14)
Bei einer Erhitzung bei 77 °C sind die Strukturen von LDL und -Livetin vollständig entfaltet,
und die Denaturierung von -Livetin ist fortgeschritten. Daher entsprach der bei ca. 80 °C
beginnende DSC-Peak des bei 77 °C erhitzten Plasmas Peak 2, der auf der HDL-Strukturentfaltung der zentrifugationsbedingten Granula-Reste basierte. Im Vergleich zu den anderen Proben bedingte das höhere Ausmaß der HDL-Entfaltung infolge der Erhitzung bei 77 °C
wie bei den Granula eine verminderte Ausprägung und signifikant geringere H (ca. 0,12
J/g) und einen höheren Onset ( ca. 1,9 °C) von Peak 2. (Abb. 4-14, Tab. 4-16)
Die signifikant verringerte H ( ca. 0,76 - 1,40 J/g), die verminderte Ausprägung und der
höhere Onset ( ca. 3,8 - 8,0 °C) des erst bei ca. 77 °C beginnenden und nur bei Charge 2
auswertbaren Peaks des bei 77 °C erhitzten Eigelbs waren durch die Denaturierung von Livetin und die vollständige Strukturentfaltung der LDL und von -Livetin bedingt. Dies stand
in Einklang zu den Ergebnissen bei Granula und Plasma. Zudem erklären der geringe Anteil
an HDL (16 %) und deren Strukturentfaltung infolge der Erhitzung bei 77 °C die geringe Ausprägung des Peaks. (Abb. 4-15, Tab. 4-17)
114
Diskussion
Nach der Hitzebehandlung bei 77 °C ist von einer weitgehenden Erhaltung der -HDLStruktur auszugehen, deren Entfaltung am Maximum des DSC-Peaks überwiegt [Le Denmat
et al. 1999]. Die gegenüber den anderen Proben höhere Td der bei 77 °C erhitzten Proben
von Granula (87,4 °C; Tab. 4-14), Plasma (88,3 °C; Tab. 4-16) und Eigelb (89,0 °C; Tab. 417) basierte daher vermutlich neben HDL-Strukturentfaltungen auf einer verzögerten Wärmeleitung durch die haptisch ermittelte höhere Viskosität und Festigkeit der Proben.
77 °C – Xanthophyll-Massenkonzentrationen
Mit einer vollständigen Strukturentfaltung der LDL und der fortgeschrittenen sowie partiellen
Entfaltung der - und -HDL bei 77 °C korrelierte eine verbesserte Extrahierbarkeit der Xanthophylle. Aufgrund des stärkeren Temperatureinflusses im Vergleich zu den vorher beschriebenen Proben war gleichzeitig ein höheres Ausmaß an 13-Z-Isomerisierungen und
oxidativen Degradationen der Xanthophylle zu erwarten. Die auf hydrophoben Wechselwirkungen basierende dreidimensionale Vernetzung entfalteter Livetine und LDL bei Eigelb und
Plasma verringerte sowohl die Extrahierbarkeit als auch 13-Z-Isomerisierungen und oxidative
Degradationen der Xanthophylle. Ähnliches gilt für Granula, deren haptisch festgestellter
Viskositätsanstieg aufgrund des Fehlens von Livetinen auf Thermoaggregierungen entfalteter Lipoproteinstrukturen, die über kovalente Disulfidbrücken stabilisiert sind, basiert. Die
Lipoproteinstrukturveränderungen und erkennbaren Viskositätserhöhungen, welche die Extrahierbarkeit, 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle gleichzeitig erhöhten und verminderten, sollten infolge der Erhitzung bei 77 °C stärker ausgeprägt
sein als bei 72 °C. (Abb. 5-2)
Dennoch bedingte die Kompensation der multifaktoriellen Einflüsse bei Plasma und Eigelb,
dass nur marginale Veränderungen der Xanthophylle zu beobachten waren (Tab. 4-20 und
4-22).
Bei den Granula wurde nach der Erhitzung bei 77 °C eine signifikant höhere 13-Z-LuteinKonzentration im Vergleich zum Nativzustand beobachtet (Tab. 4-19). Dies war bei Eigelb
und Plasma nicht der Fall. Vermutlich waren die Xanthophylle bei den Granula, basierend
auf der oben beschriebenen Art der Gelbildung, in geringerem Ausmaß in die Matrix eingebettet und die Diffusion an Reaktanten weniger verzögert als bei Plasma und Eigelb. Daher
war die Extrahierbarkeit der Xanthophylle verbessert und gleichzeitig die 13-Z-Isomerisierung von all-E-Lutein bei den Granula bei 77 °C stärker ausgeprägt als bei Plasma und Eigelb.
115
82 °C – Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine
Aufgrund der bei den LDL und Livetinen vollständigen und bei den HDL, besonders bei HDL, fortgeschrittenen Strukturentfaltung war nach der Erhitzung der Proben bei 82 °C kein
DSC-Peak messbar (Abb. 4-13 bis 4-15). Die Ergebnisse der DSC-Messung basierten auf
der Gegenläufigkeit endothermer Strukturentfaltungen nativer Proteine und Lipoproteine und
der Auswirkung exothermer Aggregierungen der entfalteten Strukturen. Die Entfaltung der
nach der Erhitzung bei 82 °C nativ vorhandenen HDL wurde also vermutlich von Thermoaggregierungen entfalteter Lipoproteine überlagert. Aufgrund der wahrscheinlich für die Sensorempfindlichkeit zu geringen H war daher infolge der Hitzebehandlung bei 82 °C keine
HDL-Strukturentfaltung mehr messbar.
82 °C – Xanthophyll-Massenkonzentrationen
Nach der Hitzebehandlung bei 82 °C war die Extrahierbarkeit der Xanthophylle infolge der
bei LDL vollständigen und bei HDL fortgeschrittenen Strukturentfaltung sowie aufgrund der
Abspaltung des Lipidanteils der LDL (Delipidation) zwischen 82 und 83 °C [Jaekel und Ternes 2009; Ternes 2008b] verbessert. Durch den Verlust der schützenden Lipoproteinstruktur
ist ein katalysierender Effekt der hohen Erhitzung und von Reaktanten auf 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle zu erwarten. Vernetzungen und Aggregierungen entfalteter Proteine und Lipoproteine verminderten die Extrahierbarkeit der
Xanthophylle sowie deren 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen. (Abb. 5-2)
Infolge der Kompensation dieser Einflüsse waren die Massenkonzentrationen der beiden allE-Isomere bei 82 °C bei Granula, Plasma und Eigelb nur marginal verändert.
Die überwiegende verbesserte Extrahierbarkeit der Xanthophylle und eine 13-Z-Isomerisierung von all-E-Lutein erklären die signifikanten Zunahmen an 13-Z-Lutein der bei 82 °C erhitzten Proben von Granula und Plasma im Vergleich zum Nativzustand und verglichen mit
der Erhitzung bei 67 °C. Gleiches gilt für die signifikante Steigerung der 13-Z-Lutein-Konzentration des bei 82 °C erhitzten Plasmas im Vergleich zur Erhitzung bei 72 °C. Diese trat bei
den Granula nicht auf, was vermutlich in der Verdünnung und der daraus resultierenden höheren Wärmeleitfähigkeit des Plasmas begründet liegt. Zudem könnten die mit den Proteinund Lipoprotein-Anteilen zusammenhängenden unterschiedlichen Gelbildungseigenschaften
eine Rolle gespielt haben. Aus denselben Gründen kompensierten die multifaktoriellen Einflüsse einander bei Eigelb vermutlich, was die nur marginal veränderten 13-Z-Lutein-Gehalte
im Gegensatz zu Granula und Plasma erklärt. (Tab. 4-18 bis 4-22)
116
Diskussion
Die Fettsäurezusammensetzung des Futters beeinflusst das Fettsäuremuster der Eigelblipide, was besonders hinsichtlich der Anteile an mehrfach ungesättigten Fettsäuren gilt [Ternes
2008a]. Letztere können durch die Bildung von Radikalen bei der Lipidperoxidation das
Ausmaß oxidativer Degradationen der Xanthophylle erhöhen [Pérez-Galvez et al. 2000]. Die
in unterschiedlichem Ausmaß ausgeprägten signifikanten Zunahmen an 13-Z-Lutein zwischen Charge 1 und 2 könnten daher in unterschiedlichen Gehalten an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren der Lipide begründet liegen.
Bezogen auf den Nativzustand und die Erhitzung bei 67 °C war bei Plasma die prozentuale
Zunahme an 13-Z-Lutein nach Erhitzung bei 82 °C bei Charge 1 um 14,7 % und damit deutlich höher als bei Charge 2 (Tab. 4-21). Nach Pérez-Galvez et al. (2000) sollte demnach der
Anteil ungesättigter Fettsäuren bei Charge 2 höher sein. Dies würde ein höheres Ausmaß an
oxidativen Degradationen der Xanthophylle und somit eine gegenüber Charge 1 geringer
ausgeprägte Zunahme an 13-Z-Lutein bedingen. Dagegen war die 13-Z-Lutein-Zunahme in
den Granula bei Charge 2 um ca. 6,0 % höher als bei Charge 1 (Tab. 4-19). Diese widersprüchliche Beobachtung kann nicht mit dem Fettsäuremuster der LDL und HDL erklärt werden. Unverdünntes Plasma weist einen LDL-Anteil von 85 % auf, während Granula nur 12 %
an LDL und 70 % HDL enthalten [Anton 2007]. Der mit 88 % hohe Lipidanteil der LDL zeigt
im Vergleich zu dem mit 25 % niedrigen Lipidanteil der HDL nur einen um ca. 6 % höheren
Gehalt an ungesättigten Fettsäuren (LDL: ca. 63,5 %, HDL: ca. 57,3 %) [Anton 2007; Acker
und Ternes 1994; Powrie und Nakai 1986; Evans et al. 1977]. Errechnet entsprechend der
Lipoprotein-Zusammensetzung zeichnet sich auch Plasma nur durch einen um ca. 6 % höheren Gehalt an ungesättigten Fettsäuren (ca. 54,0 %) gegenüber den Granula (ca. 47,7 %)
aus. Durch die methodisch bedingte 1:1-Verdünnung der Plasmafraktion ist der Anteil ungesättigter Fettsäuren sogar ca. zweifach geringer im Vergleich zu den Granula. Für die bei
Plasma bei Charge 1 und bei den Granula bei Charge 2 stärker ausgeprägte Zunahme an
13-Z-Lutein infolge der Erhitzung bei 82 °C kann daher keine schlüssige Erklärung gefunden
werden.
Im Vergleich zur Hitzebehandlung bei 72 °C war die 13-Z-Lutein-Zunahme des bei 82 °C
erhitzten Plasmas bei Charge 1 und 2 ähnlich ausgeprägt (Tab. 4-21), was vermutlich in den
schon beschriebenen Kompensationseffekten der multifaktoriellen Einflüsse auf die Xanthophylle begründet liegt.
117
87 °C – Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine
In Einklang mit den temperaturabhängigen Strukturentfaltungen der Proteine und Lipoproteine in Eigelb und dessen Fraktionen Plasma und Granula nach Abbildung 5-1 war bei den bei
87 °C erhitzten Proben aufgrund der vollständigen Strukturentfaltung der Livetine, LDL und
HDL kein DSC-Peak mehr messbar (Abb. 4-13 bis 4-15).
87 °C – Xanthophyll-Massenkonzentrationen
Die vollständige Entfaltung der Lipoproteinstrukturen bei 87 °C erhöhte und die parallel dazu
erfolgende Aggregierung entfalteter Proteine und Lipoproteine verminderte die Extrahierbarkeit, die 13-Z-Isomerisierung und die oxidative Degradation der Xanthophylle (Abb. 5-2).
Wie bei der Erhitzung bei 82 °C erklären die erhöhte Extrahierbarkeit der Xanthophylle und
die 13-Z-Isomerisierung von all-E-Lutein die signifikanten Zunahmen an 13-Z-Lutein der bei
87 °C erhitzten Proben von Granula und Plasma im Vergleich zum Nativzustand (Tab. 4-19
und 4-21). Zudem ergaben sich bei den Granula signifikant höhere Massenkonzentrationen
an 13-Z-Lutein im Vergleich zur Erhitzung bei 67 und 72 °C (Tab. 4-19). Dies war bei Plasma
vermutlich aufgrund der methodisch bedingten Verdünnung und der damit einhergehenden
höheren Wärmeleitfähigkeit nicht der Fall. Außerdem sind die Anteile an Proteinen und Lipoproteinen und die resultierenden Gelbildungseigenschaften bei Plasma und Granula unterschiedlich. In dem aus Plasma und Granula bestehenden Eigelb waren die Gehalte an
13-Z-Lutein dagegen nur marginal verändert (Tab. 4-22). Dies wurde bereits nach der Erhitzung bei 82 °C beobachtet und kann ebenfalls mit der Kompensationswirkung der multifaktoriellen Einflüsse auf die Xanthophylle im Zusammenhang mit unterschiedlichen Gelbildungseigenschaften bei Granula, Plasma und Eigelb erklärt werden.
Die vollständige Strukturentfaltung der Lipoproteine infolge der Erhitzung bei 87 °C begünstigte die Extrahierbarkeit der Xanthophylle verglichen mit 82 °C. Unter dem Einfluss der höheren Hitzebehandlung bei 87 °C war aber neben der 13-Z-Isomerisierung das Ausmaß der
Lipidperoxidation, der Radikalbildung und damit der oxidativen Degradation der Xanthophylle
wahrscheinlich höher. Daher ergaben sich bei Charge 2, jeweils in Bezug zum Nativzustand,
für Plasma und Granula etwas geringer ausgeprägte Zunahmen an 13-Z-Lutein nach der
Erhitzung bei 87 °C als infolge derjenigen bei 82 °C. Dagegen war bei Charge 1 die 13-ZLutein-Zunahme, verglichen mit dem Nativzustand, nach der Erhitzung bei 87 °C bei Granula (12,5 %) und Plasma (30,0 %) höher als bei 82 °C (Granula: 7,5 %, Plasma: 25,9 %).
(Tab. 4-19 und 4-21)
118
Diskussion
Vermutlich basierte die zwischen den beiden Chargen widersprüchliche Beobachtung hinsichtlich der 13-Z-Lutein-Zunahme nach den Erhitzungen bei 82 und 87 °C auf unterschiedlichen Gehalten an ungesättigten Fettsäuren. Nach Pérez-Galvez et al. (2000) sollte dabei,
wie schon bei der Erhitzung bei 82 °C vermutet, basierend auf den Ergebnissen der Anteil
ungesättigter Fettsäuren und damit das Ausmaß an oxidativen Degradationen der Xanthophylle bei Charge 2 höher sein. Dafür spricht auch, dass bei Charge 2 des Plasmas die prozentuale Steigerung an 13-Z-Lutein infolge der Erhitzung bei 87 °C im Vergleich zum Nativzustand um 20,4 % geringer war als bei Charge 1. Bei den Granula waren die im Vergleich
zum Nativzustand beobachteten Zunahmen an 13-Z-Lutein infolge der Erhitzung bei 87 °C
bei beiden Chargen ähnlich. (Tab. 4-19 und 4-21)
Bei den bei 87 °C erhitzten Proben von Granula und Eigelb waren die Massenkonzentrationen der all-E-Isomere im Vergleich zum Nativzustand und zur Erhitzung bei 67 °C signifikant
verringert. Dies war vermutlich durch 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen
sowie die aufgrund der Gelbildung beeinträchtigte Extrahierbarkeit der Xanthophylle bedingt.
Da keine signifikanten Zunahmen an 13-Z-Zeaxanthin auftraten, mussten überwiegend oxidative Degradationen für die Verluste an all-E-Zeaxanthin verantwortlich sein. Gleiches galt
für die Verluste an all-E-Lutein bei Eigelb, da bei diesen Proben keine signifikant höheren
13-Z-Lutein-Konzentrationen analysiert wurden. Die Reduzierung der all-E-Lutein-Gehalte
bei den Granula könnte neben oxidativen Degradationen auf 13-Z-Isomerisierungen von allE-Lutein basiert haben, da begleitend signifikante 13-Z-Lutein-Zunahmen auftraten. (Tab. 418, 4-19, 4-22 und 4-23)
Die Verluste an all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin waren bei Charge 2 der bei 87 °C erhitzten
Proben von Granula und Eigelb um ca. 1,5 - 3,2 % höher als bei Charge 1. Dies basierte
wahrscheinlich erneut auf dem höheren Ausmaß an oxidativen Degradationen der Xanthophylle, das durch den vorher schon als Begründung herangezogenen höheren Anteil an ungesättigten Fettsäuren bei Charge 2 bedingt sein könnte. (Tab. 4-19 und 4-23)
Im Gegensatz zu Granula und Eigelb waren die Konzentrationen der all-E-Isomere des bei
87 °C erhitzten Plasmas nur geringfügig verändert (Tab. 4-20). Die offensichtliche Kompensation der unterschiedlichen Einflüsse auf die Xanthophyll-Gehalte könnte in der methodisch
bedingten Verdünnung und der damit höheren Wärmeleitfähigkeit sowie der spezifischen
Protein- und Lipoprotein-Zusammensetzung bei Plasma begründet liegen.
119
Nach einer Hitzebehandlung von Eigelb bei 87 °C war die Massenkonzentration an all-ELutein im Vergleich zur Erhitzung bei 77 °C signifikant verringert (Tab. 4-23). Hierfür war aufgrund der vollständigen Entfaltung der schützenden Lipoproteinstrukturen vermutlich hauptsächlich der bei 87 °C hohe Temperatureinfluss verantwortlich, der 13-Z-Isomerisierungen
und besonders oxidative Degradationen der Xanthophylle katalysiert. Zudem könnte die unterschiedliche Art der Gelbildung bei den beiden Viskositätsmaxima von Eigelb eine Rolle
gespielt haben.
Das erste Viskositätsmaximum (77 °C) ist bedingt durch dreidimensionale Vernetzungen
entfalteter Livetin- und LDL-Strukturen, die auf hydrophoben Wechselwirkungen basieren,
und Aggregierungen der LDL [Jaekel und Ternes 2009; Jaekel et al. 2008]. Das zweite Viskositätsmaximum entsteht durch die Auflösung der Granula, die Entfaltung der HDL sowie
Thermoaggregierungen entfalteter Lipoproteine, die auf kovalenten Disulfidbrücken basieren
[Jaekel und Ternes 2009; Jaekel et al. 2008]. Beide Viskositätsmaxima führen zu einer Verminderung der Extrahierbarkeit der Xanthophylle sowie deren 13-Z-Isomerisierung und oxidativen Degradation. Dies steht zum einen mit der Einbettung der Xanthophylle im Gelnetz
und zum anderen mit der durch die Gelbildung verzögerten Diffusion von Reaktanten in Zusammenhang. Eine schwächere Matrixeinbettung der Xanthophylle im Gelnetz des bei 87 °C
erhitzten Eigelbs könnte deren Extrahierbarkeit, 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen, die aufgrund der stärkeren Temperaturbelastung bei 87 °C vermutlich in hohem
Ausmaß stattfanden, gegenüber dem bei 77 °C erhitzten Eigelb begünstigt haben. Dies
könnte die signifikanten Verluste an all-E-Lutein gegenüber den bei 77 °C erhitzten Proben
erklären.
Bei den Granula ist die hitzeinduzierte Gelbildung allein durch Thermoaggregierungen entfalteter Lipoproteine bedingt. Zudem beeinflussen der im Vergleich zu Eigelb (68 %) geringere Anteil an LDL (12 %) und der fehlende Livetin-Gehalt die Gelbildung bei den Granula. Daher führte die Erhitzung bei 87 °C gegenüber derjenigen bei 77 °C nur zu geringen Unterschieden der all-E-Lutein-Gehalte bei den Granula (Tab. 4-18). Gleiches gilt aus den oben
genannten Gründen auch für Plasma (Tab. 4-20).
120
Diskussion
Zusammenfassung der Diskussion zum Einfluss der Erhitzung
Die aus den DSC-Ergebnissen in Einklang mit der Literatur abgeleiteten thermoinduzierten
Strukturveränderungen der Livetine, LDL und HDL sind in Abbildung 5-3 zusammengefasst.
Temperatur [°C]
67 °C
72 °C
77 °C
82 °C
87 °C
-Livetin
ausgeprägte
Denaturierung
-Livetin
vollständige
Denaturierung
-Livetin, LDL
vollständige
Strukturentfaltung
-Livetin
vollständige
Denaturierung
HDL
vollständige
Strukturentfaltung
LDL
partielle
Strukturentfaltung
- und -Livetin, LDL
-Livetin
ausgeprägte
Denaturierung
HDL
ausgeprägte
Strukturentfaltung
fortgeschrittene
Strukturentfaltung
-HDL
beginnende
Strukturentfaltung
Abb. 5-3:
HDL
fortgeschrittene
(-HDL) und partielle
(-HDL)
Strukturentfaltung
Hitzeinduzierte Strukturveränderungen der Livetine, LDL und HDL [in Einklang mit Jaekel
und Ternes 2009; Ternes 2008b, Bircan und Barringer 2002, Le Denmat et al. 1999;
Acker und Ternes 1994; Ternes und Acker 1994a und 1994c; Mohr und Simon 1992]
Die Entfaltung der core-shell-Struktur der LDL und der HDL-Dimer-Struktur erhöhte die
Extrahierbarkeit der Xanthophylle, was in Abhängigkeit des Temperatureinflusses 13-ZIsomerisierungen der all-E-Isomere und oxidative Degradationen der Xanthophylle induzierte. Vernetzungen und Thermoaggregierungen der entfalteten Proteine und Lipoproteine führten zur Gelbildung und Einbettung der Xanthophylle in die Matrix, was deren Extrahierbarkeit
verminderte. Dabei waren auch 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der
Xanthophylle verringert, da die Gelbildung die Diffusion möglicher isomerisierungs- und oxidationsfördernder Reaktanten verzögerte. Die in Abbildung 5-4 zusammengefassten hitzeinduzierten signifikanten Veränderungen der Xanthophyll-Gehalte in Granula, Plasma und Eigelb waren daher von multifaktoriellen Einflüssen (Abb. 5-2) geprägt.
Temperatur [°C]
67 °C
72 °C
77 °C
82 °C
87 °C
keine
signifikanten
Massenkonzentrationsänderungen
keine
signifikanten
Massenkonzentrationsänderungen
Granula
13-Z-Lutein 
Granula
13-Z-Lutein 
Granula
all-E-Isomere 
13-Z-Lutein 
Plasma
13-Z-Lutein 
Plasma
13-Z-Lutein 
Eigelb
all-E-Isomere 
Abb. 5-4:
Hitzeinduzierte Massenkonzentrationsänderungen der Xanthophylle
121
Metallkationen können Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle
katalysieren. Da der Chelatbildner Phosvitin eine über die Erhitzung bei 87 °C hinausgehende Thermostabilität aufweist [Li-Chan und Kim 2008; Le Denmat et al. 1999; Acker und Ternes 1994], war die Komplexierung der Metallkationen von den hier angewendeten Temperatureinflüssen weitgehend unbeeinflusst. Die aufgrund der sterischen Hinderung zwischen
Methylgruppen und H-Atomen endotherme Z-Isomerisierung der all-E-Isomere sowie die
oxidative Degradation der Xanthophylle waren daher hauptsächlich vom Temperatureinfluss
geprägt.
Die bei trisubstituierten Doppelbindungen geringe sterische Hinderung bedingt neben der
hohen Stabilität der Z-Isomere eine geringe Aktivierungsenergie bei der Z-Isomerisierung der
all-E-Isomere [Britton und Khachik 2009]. Aufgrund der stereochemisch und thermodynamisch begünstigten 13-Z-Isomerisierung wurden daher, vergleichbar mit den Ergebnissen
von Wenzel (2010), in den nativen und erhitzten Proben die 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin detektiert.
Die Erhitzung bei 67 °C verursachte eine Denaturierung von -Livetin, partielle Strukturentfaltungen der LDL und nicht signifikante Unterschiede in den Xanthophyll-Gehalten. Hohe Pasteurisationstemperaturen bis zu 68 °C [Ternes 20008b] führen demnach nur zu geringen
Veränderungen der Proteine und Lipoproteine sowie der Xanthophyll-Konzentrationen.
Neben partiellen HDL-Entfaltungen, besonders von -HDL, kam es infolge der Erhitzung bei
72 °C zu signifikanten LDL-Strukturentfaltungen. Dies verbesserte die Extrahierbarkeit der
Xanthophylle. Dabei war aufgrund der moderaten Erhitzung von einem geringen Ausmaß an
13-Z-Isomerisierungen und oxidativen Degradationen der Xanthophylle auszugehen. Gleichzeitig waren die Extrahierbarkeit sowie 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen
aufgrund der Einbettung der Xanthophylle in die Gelmatrix sowie der durch die Gelbildung
verzögerten Diffusion von Reaktanten verringert. Diese verschiedenen Einflussfaktoren müssen einander kompensiert haben, was die marginal veränderten Xanthophyll-Massenkonzentrationen der bei 72 °C erhitzten Proben erklärt.
Trotz der bei LDL vollständigen und bei HDL fortgeschrittenen Strukturentfaltung infolge der
Erhitzung bei 77 °C kam es bei Eigelb und Plasma erneut nur zu unwesentlichen Veränderungen der Xanthophyll-Gehalte, die sich ebenfalls durch den beschriebenen Kompensationseffekt erklären lassen. Dagegen war bei den bei 77 °C erhitzten Granula die 13-ZLutein-Konzentration im Vergleich zum Nativzustand signifikant höher, was mit der erhöhten
Extrahierbarkeit der Xanthophylle infolge der Lipoprotein-Strukturentfaltung und der 13-Z-Isomerisierung von all-E-Lutein sowie unterschiedlichen Gelbildungseigenschaften bei Granula,
Plasma und Eigelb erklärbar ist.
122
Diskussion
Aufgrund der Strukturentfaltungen der Livetine, LDL und HDL (Abb. 5-3) wurde nach der Erhitzung bei 82 °C ein geringer Anteil nativer HDL vermutet, während die Proteine und Lipoproteine bei 87 °C vollständig entfaltet sein sollten. Daher war bei den Proben mit einer
Hitzebehandlung bei 82 und 87 °C kein DSC-Peak mehr detektierbar. Bei dem bei 82 °C
erhitzten Eigelb waren die Xanthophyll-Gehalte nicht signifikant verändert. Dies basierte
vermutlich auf den oben beschriebenen Kompensationswirkungen der verschiedenen Einflussfaktoren. Gleiches gilt für die nur marginal veränderten Massenkonzentrationen der allE-Isomere des bei 82 und 87 °C erhitzten Plasmas sowie der bei 82 °C erhitzten Granula.
Eine Erhitzung bei 87 °C führte dagegen zu signifikanten Verlusten der all-E-Isomere bei
Eigelb und Granula. Dies war durch die vollständige HDL-Strukturentfaltung und das hohe
Ausmaß an 13-Z-Isomerisierungen und oxidativen Degradationen der Xanthophylle unter der
starken Hitzebelastung bedingt. Im Gegensatz zu Eigelb ergaben sich signifikante 13-ZLutein-Zunahmen bei den bei 82 und 87 °C erhitzten Proben von Granula und Plasma, die
neben der verbesserten Extrahierbarkeit der Xanthophylle aufgrund der Entfaltung der Lipoproteine durch die 13-Z-Isomerisierung von all-E-Lutein bedingt waren.
(Abb. 5-3 und 5-4, Tab. 5-3)
Tab. 5-3:
Signifikante Veränderungen der Xanthophyll-Massenkonzentrationen bei Granula, Plasma und Eigelb bei der Erhitzung
Granula
Plasma
Eigelb
Nativ vs. 77 °C
13-Z-Lutein 
Keine Signifikanz
Keine Signifikanz
Nativ vs. 82 °C
13-Z-Lutein 
13-Z-Lutein 
Keine Signifikanz
Nativ vs. 87 °C
13-Z-Lutein 
all-E-Isomere 
13-Z-Lutein 
all-E-Isomere 
67 °C vs. 82 °C
13-Z-Lutein 
13-Z-Lutein 
Keine Signifikanz
67 °C vs. 87 °C
13-Z-Lutein 
all-E-Isomere 
Keine Signifikanz
all-E-Isomere 
72 °C vs. 82 °C
Keine Signifikanz
13-Z-Lutein 
Keine Signifikanz
72 °C vs. 87 °C
13-Z-Lutein 
Keine Signifikanz
Keine Signifikanz
77 °C vs. 87 °C
Keine Signifikanz
Keine Signifikanz
all-E-Lutein 
Die im Vergleich von Granula, Plasma und Eigelb unterschiedlichen signifikanten Veränderungen der Xanthophyll-Massenkonzentrationen (Abb. 5-4, Tab. 5-3) basierten auf den spezifischen Matrixeigenschaften. Diese resultierten aus den unterschiedlichen Anteilen an Proteinen und Lipoproteinen und deren Strukturveränderungen und Gelbildungseigenschaften.
Bei Plasma spielte zusätzlich die methodisch bedingte Verdünnung und die damit höhere
Wärmeleitfähigkeit eine Rolle, da hierdurch das Ausmaß der Entfaltung der Lipoproteine und
damit die Extrahierbarkeit sowie 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der
Xanthophylle höher gewesen sein könnten.
123
Da die Gelbildung ausschließlich auf Aggregierungen der Lipoproteine basiert, war die Einbettung der Xanthophylle in die Matrix bei den Granula vermutlich schwächer und die Diffusion von möglichen Reaktanten weniger verzögert als bei Eigelb und Plasma. Dies kann die
nur bei Granula beobachtete signifikante 13-Z-Lutein-Zunahme bei 77 °C im Vergleich zum
Nativzustand erklären. Bei Eigelb wurde infolge der Erhitzung bei 87 °C ein signifikanter
Verlust an all-E-Lutein im Vergleich zu 77 °C beobachtet, da die Gelbildung bei 77 °C zusätzlich zu Aggregierungen auf Vernetzungen entfalteter Livetine und LDL basiert. Dabei können
eine schwächere Matrixeinbettung, die vollständige Entfaltung der Lipoproteine sowie die
stärkere Hitzebelastung am zweiten Viskositätsmaximum bei 87 °C im Vergleich zum ersten
Viskositätsmaximum bei 77 °C als Begründung dienen.
Die geringfügigen hitzeinduzierten Veränderungen der 13-Z-Zeaxanthin-Massenkonzentrationen und die signifikanten 13-Z-Lutein-Zunahmen bis zur Erhitzung bei 87 °C waren ein
Indiz für eine stärkere 13-Z-Isomerisierungsneigung von all-E-Lutein im Vergleich zu all-EZeaxanthin. Dies könnte in dem die Reaktionsfreudigkeit steigernden Einfluss der allylisch
gebundenen Hydroxylgruppe bei all-E-Lutein begründet liegen.
Da der Onset, die Td und die H-Werte der DSC-Peaks bei beiden untersuchten Chargen
ähnlich waren, sollten unterschiedliche Matrixkompositionen einen vernachlässigbaren Einfluss auf die hitzeinduzierte Strukturentfaltung der Proteine und Lipoproteine haben.
Aufgrund der matrixunabhängigen und charakteristischen Entfaltung der Lipoproteine waren
die bei gleicher Hitzebehandlung unterschiedlich ausgeprägten Änderungen der XanthophyllKonzentrationen der beiden untersuchten Chargen wahrscheinlich durch verschiedene Fettsäuremuster der Matrizes bedingt. Dabei erhöht ein bspw. fütterungsbedingt höherer Anteil
an ungesättigten Fettsäuren das Ausmaß der Lipidperoxidation und Radikalbildung, was die
oxidative Degradation der Xanthophylle begünstigt.
Auf einen höheren Anteil an ungesättigten Fettsäuren bei Charge 2 deuten die gegenüber
Charge 1 höheren Verluste der all-E-Isomere der bei 87 °C erhitzten Proben von Granula
und Eigelb hin. Dagegen war das Ausmaß an oxidativen Degradationen der Xanthophylle
bei Charge 1 offensichtlich aufgrund eines günstigeren Fettsäureprofils geringer. Daher war
bei Charge 1 die Zunahme an 13-Z-Lutein, jeweils bezogen auf den Nativzustand, infolge der
Erhitzung bei 87 °C bei Granula und Plasma höher als diejenige nach Erhitzung bei 82 °C.
Bei Charge 2 bewirkten der vermutete höhere Anteil an ungesättigten Fettsäuren und das
resultierende höhere Ausmaß an oxidativen Degradationen der Xanthophylle dagegen, dass
die Zunahme an 13-Z-Lutein bei dem höheren Temperaturniveau (87 °C) etwas geringer
ausgeprägt war als bei 82 °C. In Einklang hierzu waren bei Charge 2 des Plasmas die prozentualen Steigerungen an 13-Z-Lutein, jeweils in Bezug zum Nativzustand, infolge der Erhitzungen bei 82 und 87 °C deutlich geringer als bei Charge 1. (Tab. 4-19, 4-21 und 4-23)
124
Diskussion
5.3 Diskussion zum Einfluss der Gefriertrocknung
Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine
Beim Einfrieren wurde der kritische Restfeuchtebereich (0,11 bis 0,16 g/g TM), der für eine
LDL-Strukturstabilisierung notwendig ist, unterschritten. Dies führt zu einer Entfaltung und
Aggregierung der LDL, die als Gelbildung erkennbar wird [Wakamatu et al. 1983, 1982]. Mit
der Vorfrostung der Edelstahlschalen bei -30 °C und der geringen Probenschichtdicke von
ca. 3 mm gewährleistete der Einfrierprozess bei -40 °C ein zügiges Durchschreiten des für
die LDL-Gelierung kritischen Temperaturbereichs (-7 bis -18 °C) [Belitz et al. 2008; Ternes
2008a; Telis und Kieckbusch 1998; Powrie et al. 1963]. Dabei könnte auch die mit einer guten Wärmeleitfähigkeit einhergehende Verdünnung des Plasmas von Vorteil gewesen sein.
Darüber hinaus könnten gefrierinduzierte LDL-Strukturentfaltungen bei dem verdünnten
Plasma in geringerem Ausmaß aufgetreten sein. Dies könnte in der sinkenden LDL-Gelbildungsrate bei verminderter Konzentration an LDL und Salzen [Chang et al. 1977b] begründet liegen.
Aufgrund der durch den hohen Anteil nicht ausfrierbaren Wassers (0,29 g/g TM) bedingten
restfeuchteunabhängigen Löslichkeit [Wakamatu et al. 1982] und der HDL-Phosvitin-Komplexstruktur wurden nur marginale gefrierinduzierte Strukturveränderungen der Granula und
damit der HDL vermutet.
Da die Proben im Nativzustand eingefroren wurden, waren die pH-Bedingungen (6,0) optimal
zur Proteinstabilisierung [Arakawa et al. 2001].
Die gefrierbedingte Erhöhung der Konzentration gelöster Stoffe kann eine kryoprotektive
Wirkung auf die Proteine haben [Timasheff 2002]. Dagegen vermindern einwertige Metallkationen die Stabilität der HDL-Phosvitin-Komplexe der Granula [Anton 2007].
Nach Strambini und Gabellieri (1996) sind gefrierinduzierte Strukturverluste globulärer Proteine in wässriger Lösung beim Auftauen größtenteils reversibel.
Bei Eigelb sind 87 % des Wassergehalts bei -20/-30 °C ausgefroren [Riedel 1972], was dem
sog. Glasübergang entspricht [Wakamatu et al. 1982].
Aus diesen Gründen sollten gefrierinduzierte Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine unwesentlich sein.
Da Livetine keine Xanthophylle assoziieren und aufgrund der restfeuchteunabhängigen Löslichkeit, die durch den hohen Anteil nicht ausfrierbaren Wassers (0,38 g/g TM) bedingt ist
[Wakamatu et al. 1982], waren Denaturierungen der Livetine beim Einfrieren und bei der Abtrocknung vernachlässigbar.
125
In den gefriergetrockneten Proben waren die Proteine und Lipoproteine bei Trockenmassen
oberhalb von 98 % (Tab. 4-2) und damit Restwassergehalten unterhalb von 4 % nach Ternes
(2008b) im Glaszustand stabilisiert. Gemäß den nicht ausfrierbaren Wasseranteilen von
Granula (0,29 g/g TM), Plasma (0,15 g/g TM) und Eigelb (0,16 g/g TM) [Wakamatu et al.
1982] waren die Trockenmassen durch eine intensive Desorptionstrocknung erreichbar, die
sich der Sublimation des gefrorenen Wassers anschloss.
Basierend auf der monolamellaren Hydrathülle der LDL (0,04 g/g TM) wiesen die Proteine
und Lipoproteine bei Restwassergehalten von maximal 1,43∙10-2 g/g TM einzelne Hydrierungsstellen auf [Rupley et al. 1983; Wakamatu et al. 1982]. Die Hydrathülle kompensiert
intra- und intermolekulare Wechselwirkungen der Aminosäureseitenketten, die zu Strukturveränderungen führen können. Der Wasseranteil stellt daher einen integralen, stabilisierenden Strukturbestandteil von Proteinen dar [Roy und Gupta 2004; Finney und Poole 1985;
Rupley et al. 1983]. Das aus der geringen Hydratation resultierende hohe Ausmaß intra- und
intermolekularer Wechselwirkungen der Aminosäureseitenketten erklärt die Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine in den gefriergetrockneten Proben.
Bei der HDL-Dimer-Struktur stabilisiert die Hydrathülle die Orientierung des Lipidanteils zur
Lipidkavität im Molekülinneren. Nach Lea und Hawke (1952) ist der Anteil extrahierbarer Lipide bei gefriergetrockneten HDL-Proben aus Eigelb daher aufgrund des Strukturverlusts
deutlich höher (24,5 %) als bei unbehandelten Proben (ca. 6 %).
Die durch Dehydrierung induzierte Strukturentfaltung der Granula und Lipoproteine war daher von der Abspaltung des Lipidanteils begleitet. Dies zeigte sich anhand der DSC-Peaks
der gefriergetrockneten Proben, die gegenüber dem Nativzustand in einem geringeren Temperaturbereich detektiert wurden (Granula: ca. 38/42 bis 79 °C, Plasma: ca. 40/42 bis 72 °C,
Eigelb: ca. 38/39 bis 70/81 °C). Zudem zeichneten sich die Peaks durch deutlich verminderte
Onsets (Granula: 44,3 °C, Plasma: 42,6 °C, Eigelb: 42,6 °C) und Peak-Temperaturen Td
(Granula: 64,0 °C, Plasma: 56,1 °C, Eigelb: 58,0 °C) aus. In den Granula ist der Anteil an
Lipiden um den Faktor zwei geringer als derjenige an Proteinen (Abb. 2-3) [Powrie und Nakai
1986]. Trotz der trocknungsbedingten Aufkonzentrierung der Matrixkomponenten war H des
Peaks bei gefriergetrockneten Granula ungefähr um den Faktor zwei geringer als im Nativzustand, was ebenso bei gefriergetrocknetem Eigelb beobachtet wurde. Diese Ergebnisse
bestätigten die Vermutung, dass der im Vergleich zum Nativzustand in allen Messparametern abweichende DSC-Peak durch eine Abspaltung der Lipide aus den Lipoproteinen bedingt war. Bei gefriergetrocknetem Plasma war H des Peaks (0,43 J/g) marginal höher als
die summierte H von Peak 1 und Peak 2 des verdünnten Nativzustands (0,39 J/g), was
vermutlich in der trocknungsbedingten Aufkonzentrierung der Matrixkomponenten begründet
liegt. (Abb. 4-19 bis 4-21, Tab. 4-24 bis 4-26)
126
Diskussion
Mit zunehmenden Anteilen an Wasser und ungesättigten Fettsäuren verschiebt sich der
DSC-Peak hin zu geringeren Temperaturen [Smith und Back 1975]. Gegenüber den Granula
waren der Onset, die Td sowie das Ende des DSC-Peaks bei gefriergetrocknetem Plasma
geringer. In Einklang hierzu war auch H des Peaks bei Plasma geringer als bei den Granula
(Faktor 2,6). Aufgrund der fast identischen Trockenmassen der gefriergetrockneten Proben
von Granula und Plasma ( = 0,78 %) sollte dies in dem höheren Anteil an ungesättigten
Fettsäuren, besonders an zweifach ungesättigter Linolsäure, von Plasma gegenüber den
Granula begründet liegen. Dies wiederum kann mit dem Fettsäuremuster der LDL und HDL
erklärt werden. Der mit 88 % hohe Lipidanteil der LDL zeichnet sich durch einen geringfügig
( ca. 6 %) höheren Anteil an ungesättigten Fettsäuren gegenüber dem mit 25 % niedrigen
Lipidanteil der HDL aus [Anton 2007; Acker und Ternes 1994; Powrie und Nakai 1986;
Evans et al. 1977]. Dabei ist der Anteil der zweifach ungesättigten Linolsäure mit 13,4 % in
den LDL ungefähr um den Faktor zwei höher als in den HDL (6,0 %) [Acker und Ternes
1994; Evans et al. 1977]. Errechnet entsprechend der Lipoprotein-Zusammensetzung (Abb.
2-3) [Anton 2007] zeichnet sich auch Plasma durch einen um ca. 6 % und damit geringfügig
höheren Anteil an ungesättigten Fettsäuren und einen ungefähr zweifach höheren Anteil an
Linolsäure (11,4 %) gegenüber den Granula (5,8 % Linolsäure) aus. Besonders der höhere
Anteil an Linolsäure erklärt die zu geringeren Werten verschobenen Messparameter bei gefriergetrocknetem Plasma gegenüber den Granula. (Abb. 4-19 und 4-20, Tab. 4-24 und 4-25)
Der Peak im Thermogramm gefriergetrockneten Eigelbs stimmt mit denen von Plasma und
Granula hinsichtlich des Temperaturbereichs und der ermittelten (Onset: 42,6 °C, Td: 58,0
°C, H: 0,76 J/g) und nach dem gewichteten Mittel berechneten (Onset: 43,0 °C, Td: 57,8 °C,
H: 0,58 J/g) Messparameter überein. Bei rehydriertem Eigelb differierten die Thermogramme beider Chargen nicht. Im gefriergetrockneten Probenzustand ergaben sich bei Charge 3
neben dem um 11 °C zu höherer Temperatur verschobenen Ende des Peaks auch höhere
Werte beim Onset ( = 1,7 °C), der Td ( = 6,5 °C) und von H ( = 0,26 J/g) gegenüber
Charge 4 (Abb 4-21, Tab. 4-26). Dies könnte auf Messschwankungen zurückgeführt werden.
Die bei Charge 4 in den gefriergetrockneten Proben beobachtete endotherme Reaktion (Abb.
4-19 bis 4-21) mit Td bei 35,9 °C (Granula), 34,0 °C (Plasma) und 33,2 °C (Eigelb) ist wahrscheinlich durch Lecithine bedingt. Deren DSC-Peak tritt bei 97 % Trockenmasse zwischen
ca. 20 und 35 °C auf [Smith und Back 1975]. Bei Charge 3 war der Peak vermutlich aufgrund
eines geringeren Lecithin-Anteils nicht messbar.
Die auf identischen Trockenmassen (Tab. 4-2) beruhenden ähnlichen DSC-Peaks der abgespaltenen Lipide der beiden Chargen deuten auf eine matrixunabhängige, gefriertrocknungsinduzierte Entfaltung der Lipoproteinstrukturen hin.
127
Das Thermogramm der rehydrierten Probe war dem des Nativzustands hinsichtlich des
Temperaturbereichs, des Onsets und Td ähnlich (Abb. 4-19 bis 4-21, Tab. 4-24 bis 4-26).
Zusammen mit der geringfügig veränderten H des Peaks bei Granula und Eigelb sowie
von Peak 2 bei Plasma deutet dies auf die Wiederherstellung der Strukturen der Proteine,
Lipoproteine und Granula durch Rehydratation hin. Dies steht in Einklang mit Jaekel et al.
(2008), die beschreiben, dass bis in den Glaszustand unterhalb von 6 % Restfeuchte gefriergetrocknetes, rehydriertes Eigelb keine signifikanten Unterschiede bei den funktionellen Eigenschaften gegenüber dem Nativzustand aufweist. Zudem ist die HDL-Struktur nach Lea
und Hawke (1952), basierend auf dem marginal höheren Anteil an extrahierbaren Lipiden (2
- 3 %) und einer ähnlichen Löslichkeit im Vergleich zu unbehandelten HDL-Suspensionen
aus Eigelb, durch Rehydrierung nach der Gefriertrocknung fast vollständig rekonstituierbar.
Die Reversibilität der dehydrierungsinduzierten Strukturveränderungen der Proteine, Lipoproteine und Granula durch Rehydratation ist durch die stabilisierende Funktion der strukturintegralen Hydrathülle bedingt, die Wechselwirkungen der Aminosäureseitenketten kompensieren kann [Roy und Gupta 2004; Finney und Poole 1985; Rupley et al. 1983].
Trotz identischer Onsets und Td war die Ausprägung von Peak 1 des rehydrierten Plasmas
gegenüber dem Nativzustand geringer. Bei Charge 3 ging damit eine signifikant geringere
H von Peak 1 ( = 0,02 J/g) einher. Bei Charge 4 war H nicht signifikant verringert, was
vermutlich in den geringen Messwerten von H begründet lag. Da auch der DSC-Peak rehydrierten Eigelbs eine marginal geringere H und eine verminderte Ausprägung im Temperaturbereich der LDL-Strukturentfaltung (68 bis 79/80 °C) zeigte, wurden irreversible LDLStrukturveränderungen während der Abtrocknung der strukturstabilisierenden Hydrathülle
angenommen. Mögliche LDL-Entfaltungen beim Einfrieren sollten wie anfänglich beschrieben eine geringe Bedeutung gehabt haben. Bei rehydrierten Granula waren die irreversiblen
gefriertrocknungsinduzierten Strukturentfaltungen der LDL anhand des DSC-Peaks nicht
erkennbar. Dies liegt darin begründet, dass die Entfaltung der mit 70 % dominierenden HDLStruktur, die aufgrund der höheren Thermostabilität einer höheren normierten Gesamtenthalpie bedarf, diejenige der LDL (12 %) überlagerte [Anton 2007]. Dies begründet auch die
bei rehydriertem Eigelb mit einem HDL-Anteil von 16 % nur marginal verringerte H des
Peaks [Powrie und Nakai 1986]. (Abb. 4-19 bis 4-21, Tab. 4-24 bis 4-26)
Demnach war die gefriertrocknungsinduzierte Entfaltung der LDL-Struktur durch Rehydratation im Gegensatz zur HDL-Dimer- und Granula-Struktur nicht vollständig reversibel. Auch
die rehydrierungsinduzierte Wiederherstellung der biologischen Aktivität von Lysozym aus
Hühnereiweiß [Finney und Poole 1985] im Gegensatz zu dem Aktivitätsverlust bei Actin
[Strambini und Gabellieri 1996] belegt spezifische irreversible gefriertrocknungsinduzierte
Strukturveränderungen von Proteinen.
128
Diskussion
Xanthophyll-Massenkonzentrationen
Wie schon beschrieben, führte die Entfernung der strukturstabilisierenden Hydrathülle bis auf
einzelne Hydrierungsstellen während der Gefriertrocknung zu einem hohen Ausmaß an intraund intermolekularen Wechselwirkungen der Aminosäureseitenketten und damit zur Strukturentfaltung der Lipoproteine unter Abspaltung des Lipidanteils. Dies verbesserte die Extrahierbarkeit der Xanthophylle. Gleiches gilt für die abtrocknungsbedingte Oberflächenvergrößerung, die zudem in den Proben die Oxidationsanfälligkeit steigert [Rodriguez-Amaya
1997]. Aufgrund des Verlusts der schützenden Lipoproteinstruktur kam es zu 13-Z-Isomerisierungen und oxidativen Degradationen der Xanthophylle, die durch Reaktanten katalysiert
sind. Dabei könnte das Ausmaß an oxidativen Degradationen der Xanthophylle durch den
Gehalt an ungesättigten Fettsäuren in der Matrix beeinflusst sein. Die hohe Trockenmasse
und damit geringe Restfeuchte erhöhte vermutlich die Aggregationsneigung der Xanthophylle, was deren Extrahierbarkeit sowie Z-Isomerisierung [Britton und Khachik 2009; Aman et al.
2005] und oxidative Degradation [El-Agamey und McGarvey 2008] verringerte. Die Xanthophylle unterlagen daher den in Abbildung 5-5 veranschaulichten multifaktoriellen Einflüssen.
Gefriertrocknung
Änderung der Xanthophyll-Gehalte
Extrahierbarkeit
13-Z-Isomerisierung
Oberflächenvergrößerung
Oxidative
Degradation
Kein Effekt
Erhöhung der Trockenmasse
Strukturentfaltung der Lipoproteine
unter Abspaltung der Lipide
Kein Effekt
Reaktanten
Kein Effekt
Ungesättigte Fettsäuren
Kein Effekt
Abb. 5-5: Einflüsse der Gefriertrocknung auf die Massenkonzentrationen der Xanthophylle – Kennzeichnung von Erhöhung (grüner Pfeil) oder Verminderung (roter Pfeil) der Extrahierbarkeit, 13-Z-Isomerisierung und oxidativen Degradation der Xanthophylle
Bei -20 °C und unter Ausschluss von Licht und Sauerstoff ist die Retention der Carotinoide
besonders gut [Britton und Khachik 2009]. Der Gefrierprozess erfolgte bei den vorliegenden
Untersuchungen bei -40 °C unter Lichtausschluss. Darüber hinaus wurden die gefriergetrockneten Proben vakuumiert um den Sauerstoffeinfluss möglichst gering zu halten.
129
Aufgrund der abtrocknungsbedingten Aufkonzentrierung an Matrixkomponenten waren ZIsomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle in den gefriergetrockneten
Proben vermutlich durch endogene Reaktanten begünstigt. Bei Eigelb und Granula könnte
zudem die gefriertrocknungsinduzierte Strukturentfaltung von Phosvitin isomerisierungsfördernde und prooxidative Metallkationen aus der Komplexierung mit der Phosphatgruppe freigesetzt haben. Aufgrund der hohen Bindungskapazität von Phosvitin für Eisenionen [Ternes
2008a] spielt hierbei vor allem die bei einem Massenverhältnis oberhalb von 8:1 (Fe(II):Xanthophylle) signifikante, durch zweiwertige Eisenionen induzierte 13-Z-Isomerisierung von
Lutein und Zeaxanthin eine Rolle [Li und Han 2008]. Dagegen war die Diffusion von Reaktanten aufgrund der Immobilisierung der Matrix der bis in den Glaszustand gefriergetrockneten Proben eingeschränkt [Arakawa et al. 2001]. Insgesamt wurde daher ein geringes Ausmaß an endogen induzierten Z-Isomerisierungen und oxidativen Degradationen der Xanthophylle erwartet.
Infolge der stereochemisch und thermodynamisch begünstigten 13-Z-Isomerisierung [Britton
und Khachik 2009] wurden, wie bei Wenzel (2010) und den vorliegenden Untersuchungen
zum Einfluss der Erhitzung, die 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in den nativen und
gefriergetrockneten Proben von Granula, Plasma und Eigelb detektiert.
Bei gefriergetrockneten Granula waren die Xanthophyll-Konzentrationen, bezogen auf den
Trockenmassegehalt, gegenüber dem Nativzustand signifikant erhöht (Tab. 4-27 und 4-28).
Auch bei gefriergetrocknetem Plasma kam es zu signifikanten Zunahmen an 13-Z-Lutein,
der all-E-Isomere und bei Charge 4 von 13-Z-Zeaxanthin (Tab. 4-29 und 4-30). Dies kann
damit begründet werden, dass die Entfaltung der LDL- und HDL-Strukturen unter Abspaltung
des Lipidanteils und die Oberflächenvergrößerung bei den gefriergetrockneten Proben die
Extrahierbarkeit der Xanthophylle erhöhten. Oxidative Degradationen und die möglicherweise verringerte Extrahierbarkeit der Xanthophylle aufgrund deren Aggregation infolge der
geringen Restfeuchte hatten demnach nur einen geringen Einfluss auf die XanthophyllGehalte. Die signifikanten Erhöhungen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und
Zeaxanthin bei Plasma und Granula standen in Einklang mit denen bei gefriergetrocknetem
Eigelb bei Wenzel (2010).
Aufgrund der identischen Trockenmassen (Tab. 4-2) und einer matrixunabhängigen, gefriertrocknungsinduzierten Entfaltung der Lipoproteinstrukturen differierten die Zunahmen der
Xanthophylle beider Chargen bei den Granula nur unwesentlich um maximal 2,3 % (Tab. 428). In Einklang hierzu war bei Plasma die signifikante Zunahme an 13-Z-Lutein bei Charge
3 nur geringfügig höher als bei Charge 4 ( = 1,9 %; Tab. 4-30).
130
Diskussion
Dagegen war die 13-Z-Zeaxanthin-Zunahme bei gefriergetrocknetem Plasma nur bei Charge
4 signifikant und deutlich höher als bei Charge 3 ( = 15,7 %), und die signifikanten Zunahmen an all-E-Lutein ( = 3,0 %) und all-E-Zeaxanthin ( = 4,1 %; Tab. 4-30) waren ebenfalls
bei Charge 4 höher als bei Charge 3. Diese Ergebnisse könnten in einem niedrigeren Gehalt
an ungesättigten Fettsäuren und einem damit geringeren Ausmaß an oxidativen Degradationen der Xanthophylle bei Charge 4 begründet liegen.
Die Ergebnisse lassen auch vermuten, dass Unterschiede im Fettsäuremuster der beiden
untersuchten Chargen bei Plasma einen höheren Einfluss auf das Ausmaß oxidativer Degradationen der Xanthophylle als bei den Granula hatten. Dies könnte darin begründet liegen, dass in Einklang mit Yamamoto und Omori (1994) der um den Faktor zwei höhere Anteil an Linolsäure der LDL eine geringere oxidative Stabilität gegenüber HDL bedingt [Anton
2007; Acker und Ternes 1994; Powrie und Nakai 1986; Evans et al. 1977]. Entsprechend der
Lipoprotein-Zusammensetzung gilt dies gleichermaßen für Plasma gegenüber den Granula.
Zudem zeichnen sich Granula durch ihre antioxidativen Eigenschaften aus, die in der Anwesenheit von Phosvitin, das Chelatkomplexe mit prooxidativen bi- und trivalenten Kationen wie
Fe2+, Fe3+, Ca2+ und Cu2+ bildet, begründet liegen [Ternes 2008a]. Aus diesen Gründen könnte Plasma eine höhere Oxidationsanfälligkeit als Granula aufweisen. Dies erklärt, warum die
Zunahmen der Xanthophyll-Gehalte der beiden untersuchten Chargen bei Plasma stärker
differierten als bei den Granula. (Tab. 4-28 und 4-30)
Bei den gefriergetrockneten Proben von Granula und Plasma waren die Zunahmen an all-ELutein geringer im Vergleich zu all-E-Zeaxanthin (∆̅ = 3,6 %). In Einklang hierzu und wie bei
Wenzel (2010) auch beschrieben waren die Zunahmen an 13-Z-Lutein deutlich höher als die
von 13-Z-Zeaxanthin ( ca. 6,4 - 9,9 %)21. Dies deutet auf die stereochemisch basierte höhere 13-Z-Isomerisierungsneigung von all-E-Lutein gegenüber all-E-Zeaxanthin hin. (Tab. 4-28
und 4-30)
Anders als bei Plasma und Granula dominierten bei gefriergetrocknetem Eigelb vermutlich
oxidative Degradationen sowie Aggregationen der Xanthophylle, welche die Extrahierbarkeit
vermindern. Der Einfluss von Entfaltungen der LDL- und HDL-Strukturen unter Delipidation
und der Oberflächenvergrößerung, welche die Extrahierbarkeit der Xanthophylle erhöhen,
schien geringer zu sein. Dies erklärt die im Vergleich zum Nativzustand verminderten Konzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin. (Tab. 4-31 und 4-32)
21
Bezogen auf signifikante Änderungen der Konzentrationen an 13-Z-Lutein und 13-Z-Zeaxanthin
131
Die Verluste waren bei Charge 3 nicht signifikant ausgeprägt, da die verschiedenen Einflüsse einander vermutlich kompensierten. Bei Charge 4 waren die Massenkonzentrationen von
all-E-Lutein, all-E- und 13-Z-Zeaxanthin signifikant geringer als im Nativzustand, obwohl die
Verluste nur geringfügig höher waren als bei Charge 3 ( ca. 0,2 - 0,9 %). Dagegen war der
gegenüber Charge 3 um 4,2 % höhere Verlust an 13-Z-Lutein bei Charge 4 nicht signifikant.
(Tab. 4-31 und 4-32)
Für 13-Z-Lutein ergab sich vermutlich aufgrund der höheren 13-Z-Isomerisierungsneigung
von all-E-Lutein gegenüber all-E-Zeaxanthin ein deutlich geringerer Verlust als bei 13-ZZeaxanthin ( = 7,3 %; Tab. 4-32).
Die durch die Gefriertrocknung induzierten Verluste der Xanthophylle bei Eigelb stehen in
Widerspruch zu den Zunahmen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin bei
Plasma und Granula, die in Bezug auf gefriergetrocknetes Eigelb auch von Wenzel (2010)
beobachtet wurden. Veränderungen der Lipoproteinstrukturen während der Zentrifugation
zur Fraktionierung des Eigelbs, die eine erhöhte Extrahierbarkeit der Xanthophylle und damit
deren signifikante Zunahmen bei Plasma und Granula im Gegensatz zu Eigelb bedingen
könnten, sind vermutlich nicht aufgetreten. Dies liegt darin begründet, dass die LDL-Mizellen
des Plasmas und die Granula-Partikel nach Ternes (2008a) bei der Ultrazentrifugation erhalten bleiben. Dafür spricht auch die Übereinstimmung der über die Konzentrationen in Plasma
und Granula errechneten und der analysierten Massenkonzentrationen der Xanthophylle in
nativem Eigelb (Anhang 2, Tab. 2-1). Für die differierende Beobachtung hinsichtlich der Xanthophyll-Verluste bei gefriergetrocknetem Eigelb im Gegensatz zu Plasma und Granula kann
daher keine schlüssige Erklärung gefunden werden.
132
Diskussion
Zusammenfassung der Diskussion zum Einfluss der Gefriertrocknung
Mit einem Restfeuchtegehalt von maximal 1,43∙10-2 g/g TM (Tab. 4-2) zeichneten sich die im
Glaszustand stabilisierten gefriergetrockneten Proben durch einen Hydratationszustand der
Proteine und Lipoproteine aus, der auf einzelnen Hydrierungsstellen basierte [Wakamatu et
al. 1982; Rupley et al. 1983]. Dies resultiert in einem hohen Ausmaß an intra- und intermolekularen Wechselwirkungen der Aminosäureseitenketten, die nativ durch die strukturintegrale
Hydrathülle kompensiert werden. Neben marginalen gefrierinduzierten Strukturveränderungen, besonders der LDL, spielten daher vor allem die Strukturentfaltungen der Proteine und
Lipoproteine eine Rolle, die auf der Entfernung der strukturstabilisierenden Hydrathülle bei
der Abtrocknung basieren.
Nach der Gefriertrocknung zeigte sich die Abspaltung des Lipidanteils infolge der Entfaltung
der Lipoproteine im Thermogramm durch einen zu deutlich niedrigeren Temperaturen verschobenen DSC-Peak bei Granula, Plasma und Eigelb. Aufgrund gleicher Trockenmassen
(Tab. 4-2) waren die Temperaturbereiche, Onsets, Td sowie H der Peaks bei den beiden
untersuchten Chargen ähnlich. Gleiches gilt in Bezug auf die DSC-Peaks der rehydrierten
Proben. Dies ist ein Indiz für matrixunabhängige, gefriertrocknungsinduzierte Entfaltungen
der Proteine und Lipoproteine und deren Reversibilität.
Bezogen auf die Trockenmasse war die Konzentration der Lipide in den gefriergetrockneten
Proben höher. Zudem liegen die Lipide nativ größtenteils als Lipoprotein-Aggregate vor [Anton 2007]. Dies wird daran deutlich, dass die Phasenübergänge der Lipide in den Thermogrammen der nativen und rehydrierten Proben im Gegensatz zu den gefriergetrockneten
Proben nicht sichtbar werden.
Da die Thermostabilität von Proteinen mit Abnahme des Wassergehaltes aufgrund der eingeschränkten Beweglichkeit der Polypeptidketten steigt [Westphal et al. 2003], könnten Denaturierungen der Apoproteine der LDL und HDL außerhalb des festgelegten Messbereichs
gelegen haben.
Die DSC-Peaks der rehydrierten und nativen Proben von Granula und Eigelb waren hinsichtlich des Temperaturbereichs, des Onsets, der Td und H ähnlich. Gleiches gilt für Peak
2 bei Plasma. In Einklang mit der Literatur [Jaekel et al. 2008; Lea und Hawke 1952] ließ
dies eine Rekonstitution der HDL-Dimer- und Granula-Struktur durch Rehydratation der gefriergetrockneten Proben auf die native Trockenmasse vermuten. Demnach führten weder
das Gefrieren und Auftauen noch die Sublimations- und Desorptionstrocknung während der
Gefriertrocknung zu irreversiblen Strukturveränderungen der HDL und der Granula.
133
Dagegen waren bei rehydriertem Plasma sowohl die Ausprägung als auch H von Peak 1
gegenüber dem Nativzustand geringer, wobei H bei Charge 3 signifikant vermindert war.
Dies deutet auf partiell irreversible gefriertrocknungsinduzierte Entfaltungen der LDL-Struktur
hin. Auch bei rehydriertem Eigelb zeigten sich die irreversiblen LDL-Strukturentfaltungen
infolge der Gefriertrocknung durch eine geringere Ausprägung des Peaks im Temperaturbereich der LDL-Strukturentfaltung. Dabei war H des DSC-Peaks nur marginal verringert, was
durch die Anteile an Plasma und Granula in Eigelb bedingt ist. (Abb. 4-19 bis 4-21, Tab. 4-24
bis 4-26)
Bereits bei den Untersuchungen zum Einfluss der Erhitzung wurde eine geringere Stabilität
der core-shell-Struktur der LDL gegenüber dem HDL-Dimer sowie des Plasmas gegenüber
der HDL-Phosvitin-Struktur der Granula festgestellt. Dies bestätigt sich hinsichtlich der Gefriertrocknung, da die Strukturveränderungen der LDL infolge der Entfernung der strukturstabilisierenden Hydrathülle partiell irreversibel zu sein schienen.
Die gefriertrocknungsinduzierte Strukturentfaltung der Lipoproteine unter Abspaltung des
Lipidanteils und die Oberflächenvergrößerung verbesserten die Extrahierbarkeit der Xanthophylle. Daher waren die Xanthophyll-Gehalte der gefriergetrockneten Proben von Plasma
und Granula gegenüber dem Nativzustand signifikant höher (Tab. 4-27 bis 4-30). Bei gefriergetrocknetem Eigelb waren die Massenkonzentrationen der Xanthophylle im Vergleich
zum Nativzustand dagegen vermindert (Tab. 4-31 und 4-32). Dies basiert vermutlich auf
gleichzeitig induzierten oxidativen Degradationen der Xanthophylle infolge der abtrocknungsbedingten Oberflächenvergrößerung. Zudem könnten mögliche Aggregationen der
Xanthophylle, die durch die geringe Restfeuchte bedingt waren, die Extrahierbarkeit verringert haben. Die Verluste der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin bei gefriergetrocknetem Eigelb waren nicht bei beiden untersuchten Chargen signifikant.
Gegenüber den Ergebnissen bei Plasma und Granula sowie den Untersuchungen von Wenzel (2010) war das Resultat bei gefriergetrocknetem Eigelb widersprüchlich. Bei der Erklärung dieser Beobachtung ist zu berücksichtigen, dass Veränderungen der LDL und HDL bei
der Zentrifugation, welche die Extrahierbarkeit erhöhen und damit die Zunahmen der Xanthophylle bei Plasma und Granula erklären können, vermutlich entsprechend der Literatur
[Ternes 2008a] auszuschließen sind. Dafür spricht auch, dass die für natives Eigelb analysierten Xanthophyll-Gehalte mit den anhand von Plasma und Granula errechneten Werten
übereinstimmen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen in Anlehnung an die Literatur
[siehe Causeret et al. 1991; Chang et al. 1977a; Chang et al. 1977b] könnten die Intaktheit
der LDL- und HDL-Strukturen in Plasma und Granula nach der Zentrifugation absichern.
134
Diskussion
Für das differierende Resultat bei gefriergetrocknetem Eigelb gegenüber den Ergebnissen
bei Plasma und Granula sowie von Wenzel (2010) kann daher keine schlüssige Erklärung
gefunden werden.
Aufgrund der matrixunabhängigen, gefriertrocknungsinduzierten Entfaltungen der Lipoproteine und der identischen Trockenmassen waren die Massenkonzentrationsänderungen der
Xanthophylle in den beiden untersuchten Chargen bei den gefriergetrockneten Proben von
Granula und Eigelb ähnlich ausgeprägt (Tab. 4-28 und 4-32).
Entsprechend der Literaturangaben [Anton 2007; Acker und Ternes 1994; Yamamoto und
Omori 1994; Powrie und Nakai 1986; Evans et al. 1977] wurde aufgrund des um den Faktor
zwei höheren Anteils an Linolsäure eine geringere Oxidationsstabilität von Plasma gegenüber den Granula vermutet. Die Granula weisen zudem, bedingt durch die Anwesenheit von
Phosvitin, antioxidative Eigenschaften auf [Ternes 2008a]. Biodiversitätsbedingte Unterschiede im Fettsäuremuster der beiden untersuchten Chargen, die bspw. mit der Futterzusammensetzung zusammenhängen können [Ternes 2008a], hatten bei Plasma demnach
wahrscheinlich einen höheren Einfluss auf das Ausmaß an oxidativen Degradationen der
Xanthophylle als bei den Granula. Daher waren die Unterschiede zwischen den Chargen
hinsichtlich der signifikanten Zunahmen der Xanthophylle bei gefriergetrocknetem Plasma
deutlicher ausgeprägt als bei den Granula. (Tab. 4-28 und 4-30)
Bei Charge 4 des gefriergetrockneten Plasmas waren die Zunahmen der all-E-Isomere höher, und die Steigerung an 13-Z-Zeaxanthin war im Gegensatz zu Charge 3 signifikant ausgeprägt. Hierfür war vermutlich ein höherer Anteil an ungesättigten Fettsäuren und damit ein
höheres Ausmaß an oxidativen Degradationen der Xanthophylle bei Charge 3 verantwortlich.
(Tab. 4-30)
Bei den gefriergetrockneten Proben von Plasma und Granula waren die Zunahmen an all-ELutein im Vergleich zu all-E-Zeaxanthin geringer und die Steigerungen an 13-Z-Lutein deutlich höher als die von 13-Z-Zeaxanthin (Tab. 4-28 und 4-30). In Einklang hierzu war bei gefriergetrocknetem Eigelb der Verlust an 13-Z-Zeaxanthin deutlich höher als der von 13-ZLutein (Tab. 4-32). Diese Ergebnisse resultieren vermutlich aus der höheren 13-Z-Isomerisierungsneigung von all-E-Lutein gegenüber all-E-Zeaxanthin. Diese liegt in der höheren
Reaktionsfreudigkeit des Luteinmoleküls begründet, die durch die allylisch gebundene Hydroxyl-Gruppe im -Iononring bedingt ist.
135
5.4 Zusammenfassende Diskussion
Bei der Erhitzung und Gefriertrocknung unterlagen die Xanthophyll-Gehalte multifaktoriellen
Einflüssen, die anhand der Abbildungen 5-2 und 5-5 dargestellt sind. Darauf basierend widmet sich dieses Kapitel zunächst der Beschreibung eines Modells, das diese verschiedenen
Einflüsse strukturiert. Danach werden die Ergebnisse im Kontext der in Kapitel 1 formulierten
Hypothesen evaluiert. Abschließend werden Aspekte der angewandten Methoden, die Einfluss auf die Ergebnisse haben könnten, diskutiert.
5.4.1 Modell zur Beeinflussung der Xanthophyll-Massenkonzentrationen
Strukturentfaltungen der Lipoproteine bei der Erhitzung und Gefriertrocknung erhöhten die
Extrahierbarkeit sowie 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle. Dabei spielen vermutlich isomerisierungs- und oxidationsfördernde Reaktanten und das
Fettsäureprofil der Matrix eine Rolle. Das Ausmaß an 13-Z-Isomerisierungen und oxidativen
Degradationen sowie die Extrahierbarkeit der Xanthophylle waren zudem durch die Beschaffenheit der Matrix beeinflusst. Demnach unterliegen die Massenkonzentrationen der all-Eund 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in Granula, Plasma und Eigelb bei der Erhitzung und Gefriertrocknung multifaktoriellen Einflüssen, die modellhaft in eine Makro-, Metaund Mikroebene gegliedert werden können (Abb. 5-6).
Erhitzung und Gefriertrocknung
Änderung der Xanthophyll-Gehalte
Extrahierbarkeit
MAKROEBENE
13-Z-Isomerisierung
Oxidative
Degradation
Matrixaufschluss
Vernetzung und Aggregierung
entfalteter (Lipo)Proteine
Oberflächenvergrößerung
Kein Effekt
Erhöhung der Trockenmasse
METAEBENE
Lipoprotein-Strukturentfaltung
MIKROEBENE
Abb. 5-6:
136
Kein Effekt
Reaktanten
Kein Effekt
Ungesättigte Fettsäuren
Kein Effekt
Einflüsse von Erhitzung und Gefriertrocknung auf die Massenkonzentrationen der Xanthophylle gegliedert nach der Makro-, Meta- und Mikroebene – Kennzeichnung von Erhöhung (grüner Pfeil) oder Verminderung (roter Pfeil) der Extrahierbarkeit, 13-Z-Isomerisierung und oxidativen Degradation der Xanthophylle
Diskussion
Makroebene
Die Makroebene ist gekennzeichnet durch den Aufschluss, die hitzeinduzierte Vernetzung
und Aggregierung entfalteter Proteine und Lipoproteine unter Gelbildung, die Oberflächenvergrößerung und die Erhöhung des Trockenmassegehalts der Matrix (Abb. 5-6).
Nativ vorhandene physikalische Barrieren wie Zellverbände, Granulastrukturen und Zellmembranen werden bei der Erhitzung und Gefriertrocknung aufgeschlossen, was die Extrahierbarkeit der Xanthophylle verbesserte. Gleichzeitig führte der Matrixaufschluss durch den
Verlust des Schutzeffekts der Matrix und die damit verbundene leichtere Diffusion von Reaktanten auch zu 13-Z-Isomerisierungen und oxidativen Degradationen der Xanthophylle.
Bei der Erhitzung bedingten Vernetzungen und Aggregierungen entfalteter Proteine und
Lipoproteine die Ausbildung dreidimensionaler Gelnetze und eine daraus resultierende Einbettung der Xanthophylle in diese neuformierte Matrix. Dies verringerte die Extrahierbarkeit
der Xanthophylle. Zudem waren 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der
Xanthophylle vermutlich aufgrund der verzögerten Diffusion an möglichen isomerisierungsund oxidationsfördernden Reaktanten vermindert. Bei Eigelb und Plasma führen auf hydrophobe Wechselwirkungen zurückzuführende Vernetzungen entfalteter Livetine und LDL zusammen mit LDL-Aggregierungen zur Gelbildung am ersten Viskositätsmaximum bei ca.
77 °C. Die Auflösung der Granula, die HDL-Strukturentfaltung und auf kovalenten Disulfidbrücken basierende Aggregierungen entfalteter Lipoproteine erklären die Entstehung des
zweiten Viskositätsmaximums oberhalb 85 °C bei Eigelb [Jaekel und Ternes 2009; Jaekel et
al. 2008]. Im Vergleich zu Eigelb (68 %) und Plasma (85 %) enthalten Granula einen deutlich
geringeren LDL-Anteil (12 %) und zudem keine Livetine, was die Gelbildung wesentlich beeinflusst. Daher basiert die thermoinduzierte Gelbildung bei den Granula auf Aggregierungen entfalteter LDL- und HDL-Strukturen, die über kovalente Disulfidbrücken stabilisiert sind.
Bei der Gefriertrocknung erhöhte die abtrocknungsbedingte Oberflächenvergrößerung die
Extrahierbarkeit sowie oxidative Degradationen der Xanthophylle [Rodriguez-Amaya 1997].
Aufgrund der bei Trockenmassen oberhalb von 98 % im Glaszustand immobilisierten Probenmatrizes [Jaekel et al. 2008; Ternes 2008b; Powrie et al. 1963] waren Veränderungen
der Lipoproteinstrukturen sowie die Diffusion von Reaktanten in den gefriergetrockneten
Proben eingeschränkt [Arakawa et al. 2001]. Trotz der abtrocknungsbedingten Aufkonzentrierung der Reaktanten wurden daher geringfügige endogen induzierte 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle erwartet. Die geringe Restfeuchte der
Proben nach der Gefriertrocknung könnte Aggregationen der Xanthophylle erhöht und damit
die Extrahierbarkeit, 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen vermindert haben
[Britton und Khachik 2009; El-Agamey und McGarvey 2008; Aman et al. 2005].
137
Metaebene
Aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften sind die Xanthophylle mit dem Lipidzentrum der
core-shell-Struktur der LDL und der Lipidkavität der HDL-Dimer-Komplexe assoziiert. Daher
verbesserten die erhitzungs- und gefriertrocknungsinduzierten Strukturentfaltungen der Lipoproteine auf der Metaebene die Extrahierbarkeit der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein
und Zeaxanthin. Der Verlust des Schutzes durch die Lipoproteinstruktur erhöhte 13-Z-Isomerisierungen der all-E-Isomere und oxidative Degradationen der all-E- und 13-Z-Isomere von
Lutein und Zeaxanthin. (Abb. 5-6)
Trotz der partiellen LDL-Strukturentfaltung und der ausgeprägten Denaturierung von -Livetin
bei 67 °C ist bei hohen Pasteurisationstemperaturen bis zu 68 °C [Ternes 2008b] von einer
weitgehenden Erhaltung der Strukturen der Proteine und Lipoproteine auszugehen. Die Erhitzung bei 72 °C führte dagegen zu signifikanten Strukturveränderungen der LDL, der vollständigen Denaturierung von -Livetin, fortgeschrittenen Strukturentfaltungen der - und Livetine und partiellen Veränderungen der -HDL-Struktur. Eine Hitzebehandlung bei 77 °C
resultierte in der vollständigen Entfaltung von -Livetin und der LDL sowie ausgeprägten
Strukturentfaltungen von -Livetin und der HDL, besonders von -HDL. Nach den Erhitzungen bei 82 und 87 °C trat kein Peak mehr im DSC-Thermogramm auf, da die Strukturentfaltung der HDL bei 82 °C ausgeprägt und bei 87 °C vollständig ist. Folglich findet die Entfaltung der core-shell-Struktur der LDL (ca. 65 bis 76 °C) bei geringeren Temperaturen statt als
die der HDL-Dimer-Struktur (ca. 75 bis 84 °C). (Abb. 5-3)
In den Granula sind die HDL mit Phosvitin über Phosphocalciumbrücken komplexiert. Dies
ist eine mögliche Erklärung für eine höhere Thermostabilität der Granula im Vergleich zu
Plasma und Eigelb. Diese Interpretation steht in Einklang mit der Literatur [Anton et al. 2000;
Le Denmat et al. 1999].
Mit Restfeuchtegehalten von maximal 1,43∙10-2 g/g TM wiesen die Proteine und Lipoproteine
in den gefriergetrockneten Proben lediglich einzelne Hydrierungsstellen auf [Rupley et al.
1983; Wakamatu et al. 1983]. Die Entfaltung der Lipoproteine unter Abspaltung des Lipidanteils basierte daher auf einem hohen Ausmaß an strukturverändernden intra- und intermolekularen Wechselwirkungen der Aminosäureseitenketten, die im nativen Zustand durch die
strukturstabilisierende Hydrathülle kompensiert werden [Roy und Gupta 2004; Finney und
Poole 1985; Rupley et al. 1983]. Aufgrund der Matrixstabilisierung der Proben im Glaszustand bei Trockenmassen oberhalb von 98 % [Jaekel et al. 2008; Ternes 2008b; Powrie et
al. 1963] waren Entfaltungen der Proteine und Lipoproteine im gefriergetrockneten Zustand
und während des Auftauens vernachlässigbar.
138
Diskussion
Die hohe Einfriergeschwindigkeit bei -40 °C, der zur Proteinstabilisierung optimale pH-Wert
(6,0) beim Einfrieren [Arakawa et al. 2001] und mögliche kryoprotektive Effekte durch aufkonzentrierte Kosolute [Timasheff 2002] könnten für nur geringe gefrierinduzierte Entfaltungen der Proteine, Lipoproteine und Granula verantwortlich sein (Kapitel 5.3).
In Einklang mit Angaben in der Literatur [Jaekel et al. 2008; Lea und Hawke 1952] waren die
Strukturen der HDL und Granula durch Rehydratation rekonstituierbar, während gefriertrocknungsinduzierte Entfaltungen der LDL partiell irreversibel zu sein scheinen.
Die geringere Stabilität der core-shell-Struktur der LDL gegenüber dem HDL-Dimer sowie
von Plasma im Vergleich zur HDL-Phosvitin-Komplex-Struktur der Granula bei der Hitzebehandlung bestätigte sich auch hinsichtlich der gefriertrocknungsinduzierten Strukturveränderungen. Basierend auf den Anteilen an LDL war die Stabilität von Plasma gegenüber Eigelb
und Granula daher bei der Erhitzung und Gefriertrocknung geringer.
Die bei den untersuchten Chargen ähnlichen Peaks im DSC-Thermogramm bei den erhitzten
und gefriergetrockneten Proben belegen matrixunabhängige, erhitzungs- und gefriertrocknungsinduzierte und damit charakteristische Entfaltungen der Proteine und Lipoproteine.
Mikroebene
Veränderungen der Xanthophyll-Gehalte durch 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen unterliegen neben dem Temperatureinfluss, der Beschaffenheit der Matrix (Makroebene) und den Strukturentfaltungen der Lipoproteine (Metaebene) dem Einfluss von isomerisierungs- und oxidationsfördernden Reaktanten und des Fettsäureprofils der Matrix, da dieses das Ausmaß an oxidativen Degradationen beeinflussen kann (Abb. 5-6).
Phosvitin kann mit prooxidativen Metallkationen Chelate bilden und besitzt eine besonders
hohe Bindungskapazität für Eisenionen [Ternes 2008a], durch die eine 13-Z-Isomerisierung
von Lutein und Zeaxanthin signifikant erhöht sein kann [Li und Han 2008]. Aufgrund der über
100 °C hinausgehenden Thermostabilität von Phosvitin [Li-Chan und Kim 2008; Le Denmat
et al. 1999; Acker und Ternes 1994] wurde eine hitzestabile Bindung der Metallkationen in
den Chelatkomplexen angenommen. Bei der Erhitzung ist demnach hauptsächlich der Temperatureinfluss ursächlich für 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle.
139
Bei der Gefriertrocknung könnte es zu dehydrierungsbedingten Strukturentfaltungen von
Phosvitin unter Freisetzung von prooxidativen und isomerisierungsfördernden Metallkationen
gekommen sein. Zudem führte die Entfernung der Gutsfeuchte bei der Gefriertrocknung zu
einer Aufkonzentrierung solcher Reaktanten. Deren Diffusion war aber aufgrund der Immobilisierung der Matrix im Glaszustand gleichzeitig eingeschränkt [Arakawa et al. 2001]. Endogen induzierte 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle sollten
daher in deutlich geringem Ausmaß stattfinden.
5.4.2 Evaluation der Ergebnisse im Kontext der formulierten Hypothesen
In den folgenden Ausführungen werden die erhaltenen Ergebnisse in Bezug auf die in Kapitel 1 formulierten Hypothesen betrachtet.
Nach der ersten Hypothese kommt es infolge der Erhitzung und Gefriertrocknung zu Veränderungen der Strukturen der Proteine und Lipoproteine (s. Kapitel 5.4.1, Abschnitt „Metaebene“). Wie vermutet beeinflusste dies die Xanthophyll-Gehalte entsprechend der verschiedenartigen Einflussfaktoren nach Abbildung 5-6.
Bei der Versuchsreihe zum Einfluss der Erhitzung kam es infolge der Behandlung bei
67 °C aufgrund des geringen Temperatureinflusses nur zu partiellen LDL-Strukturveränderungen und vermutlich geringfügigen Z-Isomerisierungen und oxidativen Degradationen der Xanthophylle. Daher waren die Konzentrationen der Xanthophylle nur marginal verändert. Bei hohen Pasteurisationstemperaturen sind Veränderungen der Xanthophyll-Gehalte somit nicht quantitativ bedeutend.
Trotz der für LDL signifikanten und bei HDL partiellen Strukturentfaltungen bei der Erhitzung bei 72 °C kompensierten die multifaktoriellen Einflüsse vermutlich auftretende
Effekte auf die Xanthophylle. Dies würde die nur geringfügig veränderten Massenkonzentrationen der Xanthophylle erklären.
Gleiches konnte nach der Hitzebehandlung bei 77 °C bei Eigelb und Plasma beobachtet werden. Dagegen führten bei gleicher Temperatur bei den Granula die für LDL abgeschlossene und bei HDL fortgeschrittene Strukturentfaltung sowie der starke Temperatureinfluss zu einer signifikanten Zunahme an 13-Z-Lutein. Eine Ursache dafür könnte in der unterschiedlichen Art der Gelbildung bei den Granula im Vergleich zu Plasma
und Eigelb liegen (s. zweite Hypothese).
140
Diskussion
Die infolge der Erhitzung bei 82 °C noch nicht abgeschlossene Strukturentfaltung der
HDL war nach der Hitzebehandlung bei 87 °C vollständig. Marginale Änderungen der
Xanthophyll-Konzentrationen bei diesen Temperaturstufen können ebenfalls auf die
Kompensation der multifaktoriellen Einflüsse zurückgeführt werden. Die signifikanten
Zunahmen an 13-Z-Lutein der bei 82 und 87 °C erhitzten Proben von Granula und
Plasma basierten vermutlich auf einer erhöhten Extrahierbarkeit der Xanthophylle aufgrund der Lipoprotein-Strukturentfaltung sowie der 13-Z-Isomerisierung von all-ELutein. Gleichzeitig führten die hohe Temperaturbelastung bei 87 °C und der Verlust
der schützenden Lipoproteinstruktur zu signifikanten Verlusten beider all-E-Isomere bei
Granula und Eigelb infolge von 13-Z-Isomerisierungen und überwiegend oxidativen
Degradationen. (Abb. 5-2)
Bei der Gefriertrocknung erhöhte neben den erwarteten geringen gefrierinduzierten
Strukturveränderungen [Timasheff 2002; Arakawa et al. 2001; Strambini und Gabellieri
1996; Wakamatu et al. 1982; Chang et al. 1977b; Riedel 1972] und der abtrocknungsbedingten Oberflächenvergrößerung vor allem die Entfaltung der Lipoproteine unter
Abspaltung der Lipide die Extrahierbarkeit der Xanthophylle. Dies erklärt die signifikanten Zunahmen der Xanthophylle in den gefriergetrockneten Proben von Granula und
Plasma. Dagegen waren die Xanthophyll-Konzentrationen bei gefriergetrocknetem Eigelb geringer als im Nativzustand. Ursachen dafür könnten oxidative Degradationen
der Xanthophylle sein, die durch die Oberflächenvergrößerung begünstigt waren. Daneben könnte auch eine verminderte Extrahierbarkeit der Xanthophylle aufgrund von
Aggregationen bei geringer Restfeuchte eine Rolle spielen.
Die Verluste der Xanthophylle bei gefriergetrocknetem Eigelb stehen in Widerspruch zu
den Zunahmen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin bei Plasma und
Granula sowie zu den Ergebnissen bei gefriergetrocknetem Eigelb von Wenzel (2010).
Da die LDL-Mizellen des Plasmas und die Granula-Partikel bei der Zentrifugation erhalten bleiben [Ternes 2008a], basiert diese differierende Beobachtung vermutlich nicht
auf strukturellen Veränderungen der Lipoproteine durch die Zentrifugation, die eine erhöhte Extrahierbarkeit der Xanthophylle bei Plasma und Granula bedingen könnten.
Dafür spricht auch, dass die anhand der Gehalte in Plasma und Granula errechneten
und die analysierten Massenkonzentrationen der Xanthophylle in nativem Eigelb übereinstimmten. Für die Xanthophyll-Verluste bei gefriergetrocknetem Eigelb kann daher
keine schlüssige Erklärung gefunden werden.
Da die Veränderungen der Xanthophyll-Gehalte in den erhitzten und gefriergetrockneten
Proben von Granula, Plasma und Eigelb im Zusammenhang mit den Strukturentfaltungen
der Proteine und Lipoproteine stehen, kann die erste Hypothese angenommen werden.
141
Entsprechend der zweiten Hypothese resultieren aus den charakteristischen Gehalten an
Proteinen und Lipoproteinen in Granula, Plasma und Eigelb (Abb. 2-3) unterschiedliche Matrixeigenschaften im Nativzustand und in den behandelten Proben. Dies hat vermutlich Einfluss auf die Xanthophyll-Massenkonzentrationen. Daher waren die Veränderungen der Xanthophyll-Gehalte bei Granula, Plasma und Eigelb unterschiedlich.
Bei der Untersuchung zum Einfluss der Erhitzung ist zu beachten, dass mit den spezifischen Anteilen an Proteinen und Lipoproteinen und deren hitzeinduzierten Wechselwirkungen unterschiedliche Gelbildungseigenschaften bei Granula, Plasma und Eigelb
verbunden sind. Diese wurden bei der Beschreibung der Makroebene (s. Kapitel 5.4.1)
erläutert.
Demnach waren die Xanthophylle bei den Granula vermutlich in geringerem Ausmaß in
die Matrix eingebettet und die Diffusion von Reaktanten weniger verzögert als bei Eigelb und Plasma. Dies könnte die nur bei Granula beobachtete signifikante 13-ZLutein-Zunahme bei 77 °C im Vergleich zum Nativzustand erklären.
Bei Eigelb traten bei allen Temperaturniveaus keine signifikanten Zunahmen an 13-ZLutein auf, während dies bei den bei 82 und 87 °C erhitzten Proben von Plasma und
Granula der Fall war. Hierfür waren vermutlich auch die unterschiedlichen Gelbildungseigenschaften verantwortlich.
Der signifikante Verlust an all-E-Lutein des bei 87 °C erhitzten Eigelbs im Vergleich zu
77 °C kann mit der Gelbildung am ersten und zweiten Viskositätsmaximum (s. Kapitel
5.4.1, Abschnitt „Makroebene“) sowie dem Temperatureinfluss erklärt werden. Gegenüber dem ersten Viskositätsmaximum (77 °C) könnten eine schwächere Matrixeinbettung und die vollständige Entfaltung der Lipoproteine am zweiten Viskositätsmaximum
(87 °C) die Extrahierbarkeit der Xanthophylle begünstigt haben. Unter dem starken
Temperatureinfluss ist gleichzeitig ein hohes Ausmaß an 13-Z-Isomerisierungen und
überwiegend oxidativen Degradationen zu erwarten. Vermutlich war aufgrund der
schwächeren Matrixeinbettung zudem die Diffusion von Reaktanten bei 87 °C weniger
verzögert als bei 77 °C, was 13-Z-Isomerisierungen und besonders oxidative Degradationen der Xanthophylle verstärkt haben könnte. Demnach war die all-E-Lutein-Konzentration infolge der Erhitzung von Eigelb bei 87 °C signifikant geringer als bei 77 °C.
Dagegen unterschieden sich die Gehalte an all-E-Lutein in den bei 77 und 87 °C erhitzten Granula nur marginal, da die Gelbildung hier ausschließlich auf Aggregierungen
der Lipoproteine basiert.
Für die im Vergleich zu Eigelb und Granula unterschiedlichen Signifikanzen bei Plasma war neben den spezifischen Anteilen an gelbildenden Proteinen und Lipoproteinen
vermutlich die methodisch bedingte 1:1-Verdünnung verantwortlich, die eine höhere
Wärmeleitfähigkeit bewirkt.
142
Diskussion
Daher könnten das Ausmaß der Entfaltung der Lipoproteine und damit die Extrahierbarkeit sowie 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle bei
Plasma ausgeprägter gewesen sein als bei Granula und Eigelb.
Die infolge der Gefriertrocknung bei Plasma stärker im Vergleich der beiden untersuchten Chargen differierenden Xanthophyll-Zunahmen als bei den Granula können
auf die Zusammensetzung der Lipoproteine zurückgeführt werden. Wie bei LDL im
Vergleich zu HDL ist auch bei Plasma gegenüber den Granula ein um den Faktor zwei
höherer Anteil an Linolsäure und damit eine höhere Oxidationsanfälligkeit zu erwarten
[Anton 2007; Acker und Ternes 1994; Powrie und Nakai 1986; Evans et al. 1977]. Darüber hinaus weisen Granula aufgrund der Bindungskapazität von Phosvitin für prooxidative Metallkationen antioxidative Eigenschaften auf [Ternes 2008a]. Demnach hatten
unterschiedliche Fettsäuremuster der beiden untersuchten Chargen bei dem oxidationsanfälligeren Plasma vermutlich einen höheren Einfluss auf das Ausmaß oxidativer
Degradationen der Xanthophylle als bei den Granula. Dies erklärt, warum die Zunahmen der Xanthophylle bei den beiden Chargen bei gefriergetrocknetem Plasma stärker
differierten als bei den Granula.
Neben der methodisch bedingten Verdünnung des Plasmas erklären die spezifischen Anteile
an Proteinen und Lipoproteinen und deren Gelbildungseigenschaften sowie die charakteristischen Fettsäureprofile der LDL und HDL die unterschiedlichen Änderungen der XanthophyllMassenkonzentrationen bei Granula, Plasma und Eigelb infolge der Erhitzung und Gefriertrocknung. Die zweite Hypothese kann somit bestätigt werden.
____________________
Die dritte Hypothese erwartet bei den aus verschiedenen Legebetrieben stammenden untersuchten Chargen biodiversitätsbedingte Unterschiede hinsichtlich der Veränderungen der
Xanthophyll-Gehalte infolge von Erhitzung und Gefriertrocknung. Dabei wird ein unterschiedliches Ausmaß an oxidativen Degradationen vermutet.
Für oxidative Degradationen der Xanthophylle sind Reaktanten wie Radikale verantwortlich, die bspw. bei der Lipidperoxidation gebildet werden. Unterschiedliche Gehalte
an ungesättigten Fettsäuren der beiden untersuchten Chargen, verursacht bspw. durch
die Futterzusammensetzung, können daher das Ausmaß oxidativer Degradationen der
Xanthophylle beeinflussen. Dies kann die Unterschiede bei den Änderungen der Xanthophyll-Gehalte im Vergleich der beiden untersuchten Chargen erklären.
143
Die bei Charge 2 gegenüber Charge 1 höheren Verluste an all-E-Lutein und all-EZeaxanthin infolge der Erhitzung von Eigelb und Granula bei 87 °C waren vermutlich
durch einen höheren Anteil an ungesättigten Fettsäuren bei Charge 2 bedingt. Dies erklärt auch, dass bei Plasma die Zunahmen an 13-Z-Lutein nach den Erhitzungen bei
82 und 87 °C bei Charge 2 deutlich geringer als bei Charge 1 waren. Zudem waren bei
Charge 2 die 13-Z-Lutein-Konzentrationen in den bei 82 und 87 °C erhitzten Granula
ähnlich. Dies galt gleichermaßen für das bei 82 und 87 °C erhitzte Plasma. Dagegen
war bei Charge 1 die Zunahme an 13-Z-Lutein bei den bei 87 °C erhitzten Proben von
Plasma und Granula, bezogen auf den Nativzustand, höher als bei 82 °C. Dies könnte
auch mit dem vermutlich höheren Anteil an ungesättigten Fettsäuren bei Charge 2 erklärt werden, der die Lipidperoxidation, die resultierende Radikalbildung und demnach
das Ausmaß oxidativer Degradationen der Xanthophylle unter dem Temperatureinfluss
bei 87 °C verstärkt haben könnte.
Die nach der Gefriertrocknung höheren Zunahmen beider all-E-Isomere und von 13Z-Zeaxanthin bei Charge 4 des Plasmas basierten vermutlich auf einem niedrigeren
Gehalt an ungesättigten Fettsäuren und einem damit geringeren Ausmaß an oxidativen
Degradationen der Xanthophylle bei Charge 4 im Vergleich zu Charge 3.
Die unterschiedlichen erhitzungs- und gefriertrocknungsinduzierten Änderungen der Xanthophyll-Konzentrationen im Vergleich der beiden Chargen wurden auf verschiedene Gehalte an
ungesättigten Fettsäuren und deren Einfluss auf das Ausmaß an oxidativen Degradationen
der Xanthophylle zurückgeführt. Daraus resultiert die Annahme der dritten Hypothese.
____________________
Die vierte Hypothese stellt dar, dass das während der Erhitzung und Gefriertrocknung induzierte Ausmaß der 13-Z-Isomerisierung bei all-E-Lutein und all-E-Zeaxanthin unterschiedlich
ausgeprägt sein könnte, was auf Unterschiede in der Molekülstruktur zurückzuführen ist.
Die Ergebnisse lassen eine höhere 13-Z-Isomerisierungsneigung von all-E-Lutein gegenüber all-E-Zeaxanthin vermuten. Dies kann darauf zurückgeführt werden, dass infolge der Erhitzung nur signifikante Zunahmen an 13-Z-Lutein, nicht aber an 13-ZZeaxanthin auftraten. In Einklang hierzu waren bei der Gefriertrocknung die bei
Plasma und Granula signifikanten Zunahmen an 13-Z-Lutein deutlich höher als die von
13-Z-Zeaxanthin. Die höhere 13-Z-Isomerisierungsneigung von all-E-Lutein kann mit
der allylisch gebundenen Hydroxyl-Gruppe des -Iononrings erklärt werden, da aus der
Allylspannung ein höherer Energiegehalt und damit eine höhere Reaktionsfreudigkeit
des Luteinmoleküls resultiert. Demnach kann die vierte Hypothese bestätigt werden.
144
Diskussion
5.4.3 Methodische Aspekte
In diesem Kapitel werden methodische Aspekte, die einen wesentlichen Einfluss auf die Ergebnisse haben könnten, abschließend diskutiert.
Die Zentrifugation des 1:1 mit destilliertem Wasser verdünnten Eigelbs gewährleistete eine
gute Fraktionierung von Plasma und Granula, was durch den geringen Anteil an GranulaSediment (2,6 %) im Plasma-Überstand gezeigt werden konnte.
Die Eignung der Flüssig-Flüssig-Extraktionsmethode und des HPLC-PDA-(APCI)-MS-Analyseverfahrens zur richtigen, präzisen und zuverlässigen Ermittlung der Xanthophyll-Massenkonzentrationen wurde anhand der hohen Wiederfindungsraten (ca. 99 bis 101 %) und der
geringen Variationskoeffizienten (ca. 2 %) bei der Bestimmung der all-E-Isomere nachgewiesen. Die qualitative und quantitative Analyse der Xanthophylle war daher zudem robust, selektiv und insgesamt genau [Kromidas 1999; Gottwald und Stieglitz 1996]. Trotz der partiellen Überlagerung der Peakprofile war folglich die Selektivität bei der chromatographischen
Trennung der all-E und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin ausreichend.
Nach dem gewichteten Mittel wurden anhand der Gehalte in Plasma und Granula die Xanthophyll-Konzentrationen im Nativzustand für Eigelb errechnet und mit den bei Eigelb analysierten Konzentrationen verglichen. Die Übereinstimmung der Werte belegte die Eignung
des repräsentativ mittels Eigelb optimierten Extraktionsverfahrens für Plasma und Granula.
Die Spezifität der spektralphotometrischen Detektion der Xanthophylle war aufgrund der charakteristischen Absorption im sichtbaren Bereich sichergestellt. Neben den Absorptionsspektren basierte die Identifizierung der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin auf
den charakteristischen Retentionszeiten und Massenspektren. Dabei kam es unter Matrixeinfluss zu keinen Veränderungen gegenüber den Standardsubstanzen und den Literaturangaben [Wenzel 2010; Glaser 2001; Dachtler 2000].
Bei der Quantifizierung der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin durch Mehrpunktkalibrierung des HPLC-PDA-Analysesystems mit Standardlösungen der all-E-Isomere
korrelierte die Absorptionsintensität bei 450 nm linear mit der Konzentration. Die 13-ZIsomere von Lutein und Zeaxanthin wurden wie bei Wenzel (2010) über die Kalibrierfunktion
des jeweiligen all-E-Isomers quantifiziert, da keine Standardsubstanzen verfügbar waren.
Dies beeinflusste die Ergebnisse nicht, da die erhitzungs- und gefriertrocknungsinduzierten
Veränderungen der Xanthophyll-Konzentrationen betrachtet wurden. Zur exakten Quantifizierung von 13-Z-Lutein und 13-Z-Zeaxanthin über deren spezifische Kalibrierfunktionen könnten die all-E-Standardsubstanzen mittels der iodkatalysierten Photo-Umwandlung Z-isomerisiert werden [Molnár und Szabolcs 1993], wobei das erhaltene Z-Isomerengemisch chromatographisch aufzutrennen ist [Widomska et al. 2009; Widomska und Subczynski 2008].
145
6. Ausblick
Bei der Erhitzung und Gefriertrocknung wirkten die verschiedenen Einflüsse der Makro-, Meta- und Mikroebene auf die Massenkonzentrationen der Xanthophylle in Granula, Plasma
und Eigelb. Aus den Ergebnissen resultieren weitere Fragestellungen, die der Absicherung
der vermuteten sowie der Ermittlung neuer Erkenntnisse dienen können.
- Die im Vergleich der untersuchten Chargen unterschiedlichen Massenkonzentrationsänderungen der Xanthophylle wurden auf verschiedene Fettsäuremuster zurückgeführt.
Weitere Versuche könnten unter Bestimmung der antioxidativen Kapazität der Matrix (z.
B. photometrischer Assay) und des Fettsäurespektrums (z. B. gaschromatographische
Analyse) den Einfluss der Matrixzusammensetzung bei den erhitzungs- und gefriertrocknungsbedingten Veränderungen der Xanthophylle darstellen.
- Aufgrund der vollständigen Strukturentfaltung der Lipoproteine lag die maximale Erhitzung
bei 87 °C, bei der signifikante Zunahmen an 13-Z-Lutein und Verluste der all-E-Isomere
auftraten. Höhere Erhitzungen könnten klären, welche Temperatur zu einem vollständigen
Xanthophyll-Verlust führen würde.
- Zum Nachweis des stereochemisch erklärbaren höheren Z-Isomerisierungspotentials von
all-E-Lutein gegenüber all-E-Zeaxanthin könnten separate Standard-Lösungen der beiden
all-E-Isomere bei unterschiedlichen Temperaturen erhitzt und die Konzentrationen der allE- und Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin bestimmt werden. Dabei könnte gleichzeitig
die oxidative Degradationsneigung der Xanthophylle betrachtet werden.
- Elektronenmikroskopische Untersuchungen in Anlehnung an die Literatur [siehe Causeret
et al. 1991; Chang et al. 1977a; Chang et al. 1977b] sollten absichern, dass die Zentrifugation keinen Einfluss auf die Intaktheit der Lipoproteinstrukturen [Ternes 2008a] und damit die Extrahierbarkeit der Xanthophylle in Plasma und Granula hat.
- Eine Verbesserung der Bestimmungsmethode könnte durch die Kalibrierung des HPLCPDA-Analyse-Systems mit selbst hergestellten Standards der 13-Z-Isomere von Lutein
und Zeaxanthin erreicht werden.
- Eine weiterführende Studie könnte die gastrointestinale Resorptionsverfügbarkeit der allE- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin aus erhitzten und gefriergetrockneten
Proben von Granula, Plasma und Eigelb über in vitro-Versuche bestimmen. Dies könnte
die Aussagen über eine mögliche Verbesserung der Bioakzessibilität der Eigelb-Xanthophylle und den gesundheitlichen Nutzen, der sich aus den antioxidativen Eigenschaften
der Carotinoide ergibt, präzisieren.
146
Zusammenfassung
Um den gesundheitlichen Nutzen eines Lebensmittels im Hinblick auf natürliche funktionelle
Inhaltsstoffe zu bewerten, muss die Bioakzessibilität, die durch die Bindung des Nahrungsmittelbestandteils in der Matrix und deren Struktur und Zusammensetzung beeinflusst ist
[Canene-Adams und Erdman 2009], untersucht werden. In Eigelb sind die antioxidativen
Xanthophylle Lutein und Zeaxanthin besser bioverfügbar als in pflanzlichen Matrizes, da sie
aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften mit dem Lipidkern der core-shell-Struktur der LowDensity Lipoproteine (LDL) und der Lipidkavität der Dimer-Struktur der High-Density Lipoproteine (HDL) assoziiert sind [Ternes 2008a; Greene et al. 2006; Chung et al. 2004; Handelman et al. 1999]. Durch Zentrifugation ist Eigelb in Granula und Plasma fraktionierbar, die
durch ihre spezifischen Gehalte an Proteinen und Lipoproteinen charakterisiert sind.
Hohe Temperaturen, Licht, Säure, Metallkationen und Enzyme katalysieren Z-Isomerisierungen und Degradationen von Carotinoiden, wobei Degradationen zudem unter Sauerstoffeinfluss und durch Radikale initiiert werden [Belitz et al. 2008]. Stereochemisch und thermodynamisch bedingt entstehen bei der Z-Isomerisierung bevorzugt 13-Z-Isomere [Britton und
Khachik 2009]. Z-Isomere sind aufgrund ihrer geringeren Aggregationsneigung besser löslich
und bioverfügbar als all-E-Isomere [Liaaen-Jensen und Lutnœs 2008]. Dies ist auch hinsichtlich der antioxidativen Effekte von Carotinoiden von Vorteil, die durch die Aggregation reduziert werden [El-Agamey und McGarvey 2008]. Mit Zunahme der Erhitzungsintensität steigt
das Ausmaß oxidativer Degradationen der Carotinoide [Schiedt und Liaaen-Jensen 1995].
In dieser Studie wurden die durch Erhitzung und Gefriertrocknung veränderten Massenkonzentrationen der all-E- und 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin in Granula, Plasma und
Eigelb untersucht. Da die Xanthophylle mit den Lipiden der LDL und HDL assoziiert sind,
wurden dabei die Strukturveränderungen der Proteine und Lipoproteine betrachtet.
In Einklang mit der Literatur erfolgte die Entfaltung der core-shell-Struktur der LDL in einem
niedrigeren Temperaturbereich (ca. 65 bis 76 °C) als die der Dimer-Struktur der HDL (ca. 75
bis 84 °C). Zudem war die HDL-Phosvitin-Komplexstruktur der Granula thermostabiler als
Eigelb und Plasma. Die gefriertrocknungsinduzierte Strukturentfaltung der HDL und Granula
war durch Rehydratation rekonstituierbar, während Veränderungen der LDL-Struktur nicht
vollständig reversibel zu sein scheinen. Aufgrund des hohen LDL-Anteils wies Plasma eine
geringere Stabilität bei der Erhitzung und Gefriertrocknung auf als Eigelb und Granula.
Die Xanthophyll-Gehalte waren bei der Erhitzung und Gefriertrocknung multifaktoriell durch
den Aufschluss, die hitzeinduzierte Gelbildung, die Oberflächenvergrößerung und die Erhöhung des Trockenmassegehalts der Matrix (Makroebene), die Strukturveränderungen der
Lipoproteine (Metaebene) sowie isomerisierungs- und oxidationsfördernde Reaktanten und
das Fettsäureprofil der Matrix (Mikroebene) beeinflusst.
147
Die infolge der Erhitzungen bei 82 und 87 °C stark ausgeprägte bzw. vollständige Strukturentfaltung der Lipoproteine verbesserte die Extrahierbarkeit und die hohe Temperatur katalysierte 13-Z-Isomerisierungen und oxidative Degradationen der Xanthophylle. Dies erklärt die
signifikanten Verluste der all-E-Isomere in den bei 87 °C erhitzten Proben von Eigelb und
Granula und die signifikanten Zunahmen an 13-Z-Lutein der bei 82 und 87 °C erhitzten Proben von Granula und Plasma. Aufgrund der bei LDL vollständigen und bei HDL fortgeschrittenen Strukturentfaltung bedingte eine Erhitzung bei 77 °C eine signifikante 13-Z-LuteinZunahme bei den Granula. Vernetzungen und Aggregierungen entfalteter Proteine und Lipoproteine verringerten jedoch die Extrahierbarkeit, 13-Z-Isomerisierungen und oxidative
Degradationen der Xanthophylle. Bei einer moderaten Erhitzung bei 72 °C kompensierten
die verschiedenen Einflussfaktoren einander. Daher waren trotz der ausgeprägten LDLStrukturentfaltung nur marginale Veränderungen der Xanthophylle beobachtet worden. Nach
einer Erhitzung bei 67 °C blieben die Lipoproteine bis auf partielle Entfaltungen der LDLStruktur erhalten, was die Xanthophyll-Gehalte nicht beeinflusste.
Die Gefriertrocknung bewirkte eine Entfaltung der Lipoproteine unter Abspaltung der Lipide
und eine Vergrößerung der Probenoberfläche, was die Extrahierbarkeit der Xanthophylle
verbesserte. Daher waren die Xanthophyll-Gehalte in den gefriergetrockneten Proben von
Granula und Plasma signifikant erhöht. Dagegen waren die Massenkonzentrationen der Xanthophylle bei gefriergetrocknetem Eigelb gegenüber dem Nativzustand wahrscheinlich aufgrund von oxidativen Degradationen vermindert. Zudem wurden Aggregationen der Xanthophylle aufgrund der geringen Restfeuchte vermutet, da die Aggregation die Extrahierbarkeit
vermindert. Für die im Widerspruch zu den Ergebnissen bei Plasma und Granula stehende
Beobachtung bei gefriergetrocknetem Eigelb konnte keine schlüssige Erklärung gefunden
werden.
Die zwischen Granula, Plasma und Eigelb differierenden signifikanten Änderungen der Xanthophyll-Massenkonzentrationen wurden mit der methodisch bedingten Verdünnung des
Plasmas, den spezifischen Anteilen an Proteinen und Lipoproteinen und deren Gelbildungseigenschaften sowie den unterschiedlichen Fettsäureprofilen der Lipoproteine erklärt. Unterschiede bei den Änderungen der Xanthophyll-Konzentrationen im Vergleich der beiden untersuchten Chargen waren vermutlich durch variierende Gehalte an ungesättigten Fettsäuren
und das resultierende Ausmaß an oxidativen Degradationen der Xanthophylle bedingt.
Aus den Massenkonzentrationsänderungen der Xanthophylle wurde abgeleitet, dass die 13Z-Isomerisierungsneigung von all-E-Lutein stereochemisch bedingt höher ist als bei all-EZeaxanthin.
148
Summary
To evaluate the nutritional benefit of food with regard to natural functional substances, the
bioaccessibility, which is influenced by the linkage of the food component in the matrix and
the structure and composition of the matrix [Canene-Adams and Erdman 2009], must be investigated. In egg yolk, the antioxidative xanthophylls, lutein and zeaxanthin, are more bioavailable than in vegetable matrices because of their lipophilic properties; they are associated with the lipid center of the core-shell structure of low-density lipoproteins (LDL) and with
the lipid cavity of the dimer structure of high-density lipoproteins (HDL) [Ternes 2008a;
Greene et al. 2006; Chung et al. 2004; Handelman et al. 1999]. By centrifugation egg yolk is
separable into granules and plasma, which are characterized by their specific contents of
proteins and lipoproteins.
High temperatures, light, acid, metal cations, and enzymes catalyze Z-isomerization and
degradation of carotenoids; moreover oxygen and radicals initialize degradation [Belitz et al.
2008]. Due to stereochemical and thermodynamic factors the formation of 13-Z-isomers is
favored during Z-isomerization [Britton and Khachik 2009]. Z-isomers show higher solubility
and bioavailability than all-E-isomers because their affinity for aggregation is lower [LiaaenJensen und Lutnœs 2008]. This is also advantageous for the antioxidative effects of carotenoids, because the latter are reduced by aggregation [El-Agamey and McGarvey 2008]. Oxidative degradation of carotenoids is more pronounced with intensified heating [Schiedt and
Liaaen-Jensen 1995].
In this study, the changes in the mass concentrations of the all-E- and 13-Z-isomers of lutein
and zeaxanthin induced by heating and freeze-drying were investigated in granules, plasma
and egg yolk. Because the xanthophylls are associated with the lipids of LDL and HDL the
structural modifications of the proteins and lipoproteins were examined concomitantly.
Consistent with the literature, the unfolding of the core-shell structure of the LDL occurred at
a lower temperature (approximately 65 to 76 °C) than that of the dimer structure of the HDL
(approximately 75 to 84 °C). Furthermore, the HDL-phosvitin-complex structure of the granules was more thermostable compared to egg yolk or plasma. The unfolding of HDL and
granules induced by freeze-drying was reversible upon rehydration, whereas changes in the
LDL-structure did not appear to be completely reversible. Due to the high LDL-content, plasma exhibited lower stability during heating and freeze-drying than egg yolk or granules.
During heating and freeze-drying, the concentrations of the xanthophylls were dependent on
multiple factors such as the disintegration, the heat-induced gelling, the surface enlargement
and the higher dry matter content of the matrix (macro-level), the structural modifications of
the lipoproteins (meta-level), the reactants that catalyze isomerization and oxidative degradation, and the fatty acid profile of the matrix (micro-level).
149
Distinctive and respectively complete unfolding of the lipoproteins when heated to 82 and
87 °C increased the extractability and the high temperature catalyzed 13-Z-isomerization and
oxidative degradation of the xanthophylls. This accounted for the significant decrease in the
concentrations of the all-E-isomers in egg yolk and granules when these were heated to
87 °C, and the significant increase in the 13-Z-lutein concentrations in granules and plasma
that were heated to 82 and 87 °C. Because the unfolding of LDL was complete and the unfolding of HDL was advanced, heating to 77 °C led to a significant increase in 13-Z-lutein in
granules. However, cross-linking and aggregation of unfolded proteins and lipoproteins decreased the extractability, 13-Z-isomerization and oxidative degradation of the xanthophylls.
Upon moderate heating at 72 °C, the different influences compensated for each other. This
resulted in marginal changes of the xanthophylls despite the distinct unfolding of the LDL.
After heating at 67 °C, the lipoproteins were preserved except for a partial unfolding of the
LDL structure, which did not influence the xanthophyll mass concentrations.
Freeze-drying caused unfolding of the lipoproteins with separation of the lipids and an enlarged sample surface, which both increased the extractability of the xanthophylls. This resulted in a significant increase in the concentrations of the xanthophylls in freeze-dried granules and plasma. In contrast, the mass concentrations of the xanthophylls in freeze-dried
egg yolk decreased compared with the untreated sample. This was most likely due to the
oxidative degradation of the xanthophylls. Furthermore, aggregations of the xanthophylls in
consequence of the low residual moisture content were assumed because aggregation lowers the extractability. No convincing explanation could be given for the conflicting result for
freeze-dried egg yolk when compared to the results for plasma or granules.
Differences in the significant changes in the mass concentrations of the xanthophylls among
granules, plasma and egg yolk were explained by the dilution of the plasma due to methodical reasons, the specific contents of proteins and lipoproteins and their gelling properties,
and the different fatty acid profiles of the lipoproteins. Different changes in the concentrations
of the xanthophylls of the two batches likely resulted from differences in unsaturated fatty
acid content and the resulting intensity of oxidative degradation of the xanthophylls.
The changes in the mass concentrations of the xanthophylls indicated a higher potential for
13-Z-isomerization of all-E-lutein compared to all-E-zeaxanthin, which is due to stereochemical factors.
150
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Opinion on the substantiation of health claims related to lycopene and protection of
DNA, proteins and lipids from oxidative damage (ID1608, 1609, 1611, 1662, 1663,
1664, 1899, 1942, 2081, 2082, 2142, 2374), protection of the skin from UV-induced
(including photo-oxidative) damage (ID1259, 1607, 1665, 2143, 2262, 2373), contribution to normal cardiac function (ID1610, 2372), and maintenance of normal vision (ID
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XXXIV
Anhang
Anhang 1:
Geräte und Materialien
Anhang 2:
Bestimmung von Lutein und Zeaxanthin
Anhang 3:
Prozentuale Anteile an 13-Z-Lutein und 13-Z-Zeaxanthin an der GesamtXanthophyll-Massenkonzentration
Anhang 4:
Statistische Auswertung (= 0,05) der Versuchsreihen zum Einfluss der Erhitzung und Gefriertrocknung auf die Protein- und Lipoproteinstrukturen und
Massenkonzentrationen der Xanthophylle in Granula, Plasma und Eigelb
XXXV
Anhang 1
Geräte und Materialien
1. Allgemein
-
Analysenwaage AT 261 Delta Range® (Mettler Toledo GmbH, Gießen, Deutschland)
-
Ultraschallbad Sonorex Super RK 510H, 35 kHz (Bandelin electronic GmbH & Co.
KG, Berlin, Deutschland)
-
Wasseraufreinigungssystem arium 611UV (Sartorius Stedim Biotech S. A., Aubagne,
Frankreich)
2. Vorbereitung, Behandlung und Extraktion der Proben; Trockenmassebestimmung
-
Cellulose-Rundfilter Rotilabo® Typ 111A, Ø = 125 mm (Carl Roth GmbH & Co. KG,
Karlsruhe, Deutschland)
-
Gefriertrockner beta 2-16 (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode
am Harz, Deutschland)
-
IKA-Ultra-Turrax T25 (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland)
-
Labofuge 400R mit Hämatokrit-Teller (Heraeus Instruments GmbH, Osterode,
Deutschland)
-
Mini-Kreisschüttler Orbital (VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland)
-
MSPD Sorbens: Reprosil-Pur-Basic C18-HD, Partikelgröße 10 µm, Kohlenstoffbeladung 25 % (Dr. Maisch HPLC GmbH, Ammerbuch-Entringen, Deutschland)
-
Multifuge X1R mit Rotor FIBERLite® F15-6x 100 y (Heraeus Instruments GmbH,
Osterode, Deutschland)
-
RC-Spritzenvorsatzfilter PERFECT-Flow, Ø = 25 mm, Porengröße = 0,45 µm
(WICOM Germany GmbH, Heppenheim, Deutschland)
-
Schockkühler BCF15A 110721 (Zanussi Professional/Electrolux Professional GmbH,
Herborn, Deutschland)
-
Schüttelwasserbad Typ 1083, Temperaturgenauigkeit ± 0,5 K (Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel, Deutschland)
-
Seesand reinst, Partikelgröße = 0,1 - 0,3 mm (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
-
Trockenschrank Kelvitron® t (Heraeus Instruments GmbH, Osterode, Deutschland)
-
Vakuumverpackungsmaschine A 300/16 MC (MULTIVAC Sepp Haggenmüller GmbH
& Co. KG, Wolfertschwenden, Deutschland)
3. Differential Scanning Calorimetry (DSC)
- Kalorimeter Typ DSC 1 (Mettler Toledo, Schwerzenbach, Schweiz)
XXXVI
4. HPLC-PDA-MS-Analyse
-
Druckluft: DK50-2x2V/110 (ekom, Pieštany, Slowakei)
-
HPLC-Anlage: Waters Alliance 2695 Separations Module mit Entgaser, Pumpe, Autosampler und Photodiodenarray-Detektor Waters PDA 996 (Waters GmbH, Eschborn, Deutschland)
-
HPLC-Trennsäule: Stability 100 C30 (ST 15.30.S2546, Batch 260210506202 und
140508506210), endcapped, 5 µm, 250 x 4,6 mm, Porendurchmesser 100 Å, Oberfläche 350 m2/g, 25 % Kohlenstoffbeladung, polymere Synthese (Dr. Maisch HPLC
GmbH, Ammerbuch-Entringen, Deutschland)
-
HPLC-Vorsäule: Stability C30, endcapped, 5 µm, 10 x 4,0 mm (Dr. Maisch HPLC
GmbH, Ammerbuch-Entringen, Deutschland)
-
Säulenofen: Gynkotek STH 585 (Gynkotek Gesellschaft für den Bau wissenschaftlich-technischer Geräte mbH, Germering, Deutschland)
-
Stickstoff-Generator: LC-MS NGM-11 (CMC Instruments GmbH, Eschborn,
Deutschland)
-
Triple-Quadrupol-Massenspektrometer: Quattro LC (Micromass UK Limited, Manchester, Großbritannien)
-
Wasserkühlung: WK 500 (Lauda, Lauda-Königshofen, Deutschland)
Standardsubstanzen (LGC Promochem, Wesel, Deutschland & ChromaDex, Inc., Irvine,
Kalifornien, USA)
-
Lutein
5 mg, expiration date: 04/2013, Lot number: 00012453-0549 /
CDXA-08-0549, Reinheit (HPLC): 95,9 %
-
Zeaxanthin
5 mg, expiration date: 08/2013, Lot number: 00026504-5426 /
CDXA-10-5426, Reinheit (HPLC): 98,6 %
-
-Carotin
5 mg, expiration date: 01/2013, Lot number: 00003211-316 /

CDXA-10-0385, Reinheit (HPLC): 95,4 %
Lösungsmittel HPLC-Grade (LGC Promochem, Wesel, Deutschland)
-
Methanol, Ethanol, Methansäure, Methyl-tert-butylether (MTBE), Tetrahydrofuran
(THF), Chloroform, Heptan, Ethylacetat, Leichtpetroleumether
5. Software
-
Kalorimeter (DSC 1):
STARe Evaluation Software, Version 11.00a
-
HPLC-PDA-MS-Analysesystem:
MassLynx 4.0
-
Statistik:
IBM® SPSS® Statistics, Version 20 und Excel®
XXXVII
Anhang 2
Bestimmung von Lutein und Zeaxanthin
1. HPLC-PDA-Analyse
a) Optimierung
Kalib z-2 28.10.
Test00437
29-Oct-2011
05:02:52
all-E-Lutein
2: Diode Array
450
Range: 1.093e-1
7.54
7.01
1.0e-1
all-E-Zeaxanthin
8.0e-2
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
AU
6.0e-2
all-E-b-Carotin
all-E--Carotin
4.0e-2
32.81
2.0e-2
cis-b-Carotin
1.68 3.08
32.03
0.0
5.00
Abb. 1a:
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
Time
40.00
Chromatogramm des äquimolaren Standardgemischs aus Lutein, Zeaxanthin und Carotin (je 5 µg/mL)
b) Linearität, LOD und LOQ sowie Kalibrierung
Tab. 1b-1:
Konzentrationsniveaus bei der
Linearitätsüberprüfung
Konzentration
[µg/mL]
Volumen Stammlösung ad
Endvolumen [mL]
20,00
1,000 mL ad 005 mL
10,00
0,500 mL ad 005 mL
05,00
02,50
Tab.1b-2:
Kalibrierbereich der HPLC-PDAAnalysemethode
0,250 mL ad 005 mL
Konzentration
[µg/mL]
Volumen Stammlösung ad
Endvolumen [mL]
0,125 mL ad 005 mL
5,00
0,250 mL ad 05 mL
01,25
0,125 mL ad 010 mL
2,50
0,125 mL ad 05 mL
00,50
0,050 mL ad 010 mL
1,25
0,125 mL ad 10 mL
00,20
0,020 mL ad 010 mL
0,50
0,050 mL ad 10 mL
00,10
0,025 mL ad 025 mL
0,20
0,020 mL ad 10 mL
00,05
0,025 mL ad 050 mL
0,10
0,025 mL ad 25 mL
00,02
0,020 mL ad 100 mL
XXXVIII
2. Extraktionsmethode
Tab. 2-1:
Vergleich der im Nativzustand ermittelten (a) und anhand der Ergebnisse bei Plasma und
Granula nach dem gewichteten Mittel errechneten (b) Massenkonzentrationen + Standardabweichung [µg/100 g] von Lutein und Zeaxanthin bei Eigelb
Xanthophyll-Massenkonzentrationen [µg/100 g]
Granula
Plasma
Eigelb (a)
Gewichtetes
Mittel
Eigelb (b)
Differenz aus
a und b
[%]
2495,3 ± 98,7
4177,1 ± 084,4
3928,4 ± 039,1
3807,1 ± 087,6
0+3,1
Nativzustand
all-E-Lutein
all-E-Zeaxanthin
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
1706,4 ± 45,9
2707,4 ± 027,0
2557,5 ± 028,2
2487,2 ± 031,2
0+2,8
2808,6 + 88,3
4468,6 + 143,4
4112,3 + 105,4
4103,4 + 131,2
0+0,2
1626,7 + 75,1
2537,5 + 021,5
2429,1 + 001,1
2337,1 + 033,3
0+3,8
2098,4 ± 84,5
3747,8 ± 078,8
3591,3 ± 033,7
3384,9 ± 080,1
0+5,8
0999,3 ± 34,6
1711,3 ± 019,4
1668,4 ± 027,6
1554,7 ± 022,7
0+6,8
1769,8 + 45,8
3014,2 + 083,5
2842,3 + 079,8
2740,4 + 075,2
0+3,6
1285,7 + 52,0
2155,0 + 032,8
2146,8 + 004,8
1963,8 + 037,0
0+8,5
0296,5 ± 10,3
0410,1 ± 006,6
0374,0 ± 002,2
0385,1 ± 007,4
0-3,0
0192,3 ± 06,3
0308,2 ± 006,9
0311,4 ± 002,8
0282,7 ± 006,8
0+9,2
0264,8 + 06,3
0386,4 + 011,4
0372,0 + 003,3
0359,6 + 010,2
0+3,3
0157,2 + 05,3
0236,2 + 004,4
0235,1 + 013,1
0218,9 + 004,6
0+6,9
0393,0 ± 11,7
0709,8 ± 008,5
0579,7 ± 001,8
0640,1 ± 009,3
-10,4
0195,7 ± 06,4
0323,6 ± 009,1
0318,4 ± 007,8
0295,4 ± 008,5
0+7,2
0341,6 + 12,8
0635,3 + 020,0
0532,5 + 023,7
0570,7 + 018,5
0-7,2
0272,1 + 09,3
0440,3 + 008,7
0424,2 + 011,4
0403,3 + 008,8
0+4,9
3. Identifizierung von Lutein und Zeaxanthin
a) Chromatographisches Verhalten
LUTKalib a Tuning Dez2011-MSTUne1
Test00617
5.76
5,76
1.0e-1
all-E-Lutein
all-trans-Lutein
ZEAKalib a Tuning Dez2011MSTUne1
Test00621
8.0e-2
8.0e-2
6.0e-2
6.0e-2
4.0e-2
all-E-Zeaxanthin
all-trans-Zeaxanthin
4.0e-2
2.0e-2
cis-Lutein
unknown
5.00
Abb. 3a:
06-Dec-2011
03:38:30
2: Diode Array
450
Range: 1.059e-1
6,06
6.06
1.0e-1
AU
AU
06-Dec-2011
00:44:57
2: Diode Array
450
Range: 1.024e-1
5.50
cis-Lutein
6,35
6.00
6.50
13-Z-Zeaxanthin
2.0e-2
13-Z-Lutein
6,79
6.79
7.00
7.50
Time
5.00
5.50
6.00
6.50
cis-Zeaxanthin
7.00
7.50
8.00
8.50
Time
Chromatogramme der separaten Standardlösungen (2,5 µg/mL) von Lutein (links) und
Zeaxanthin (rechts)
XXXIX
b) Massenspektrometrie
LUTKalib a Tuning Dez2011-MSTUne1
00:44:57
Test00617
1: Scan AP+
551.5
3.85e4
5.74
100
LUTKalib a Tuning Dez2011-MSTUne1
00:44:57
Test00617
6.14
100
1: Scan AP+
569
6.57e3
m/z 569
%
%
m/z 551
5.84
5.17
6.29
5.26
5.53
5.17
0
5.00
5.50
Abb. 3b-1:
1: Scan AP+
569
1.26e4
6.96
%
6.55
XL
m/z 569
5.60 5.73
6.41
Abb. 3b-2:
Time
6.50
09-Dec-2011
05:01:46
5.93
5.36
0
5.00
6.00
+
Test00656
5.14
5.50
Standardlösung – Selektion des Fragmentions m/z 551 [M+H-H2O] (links) und des Mole+
külions m/z 569 [M+H] (rechts) im Elutionsbereich der Lutein-Isomere
ZEA Stammloesung Tuning 17
100
0
5.00
Time
6.50
6.00
5.50
6.00
6.50
6.70
Time
7.00
+
Standardlösung – Selektion des Molekülions m/z 569 [M+H] im Elutionsbereich der
Zeaxanthin-Isomere
QLC 9094
all-E-Lutein
Eigelb C 1 -2
Test012016 355 (6.540)
29-Jul-2012
04:48:21
1: Scan AP+
6.40e3
551.49
QLC 9094
13-Z-Lutein
29-Jul-2012
04:48:21
Test012016 402 (7.404)
552.35
100
1: Scan AP+
7.25e3
%
%
100
Eigelb C 1 -2
550.51
0
550
551
Abb. 3b-3:
m/z
553
552
0
550
551
m/z
553
552
Eigelb – Selektion des charakteristischen m/z-Bereichs am Peakmaximum von all-ELutein (links) und 13-Z-Lutein (rechts) mit corona 3,0 kV und cone 35 V
QLC 9094
all-E-Zeaxanthin
Eigelb C 1 -3
Test012017 369 (6.791)
100
29-Jul-2012
05:29:19
1: Scan AP+
2.30e4
568.93
QLC 9094
13-Z-Zeaxanthin
Eigelb C 1 -4
Test012018 424 (7.807)
100
29-Jul-2012
06:10:19
1: Scan AP+
1.13e4
568.80
573.84
574.21
%
%
574.08
572.73
565.61
567.70
566
Abb. 3b-4:
574.70
572.00
573.22
565.98
0
571.75
568
570
572
574
m/z
0
566
568
570
572
574
m/z
Eigelb – Selektion des charakteristischen m/z-Bereichs am Peakmaximum von all-EZeaxanthin (links) und 13-Z-Zeaxanthin (rechts) mit corona 2,9 kV und cone 30 V
XLI
Eigelb natur 1 -1
QLC 9094
Test012010 363 (6.688)
29-Jul-2012
00:41:00
1: Scan AP+
1.59e5
561.07
100
Eigelb C 1 -1
QLC 9094
29-Jul-2012
04:06:43
Test012015 407 (7.497)
587.83
100
all-E-Lutein
13-Z-Lutein
554.32
1: Scan AP+
1.15e5
585.75
402.69
562.30
614.35
%
%
361.93
367.82
529.64
514.30
408.59
564.14
432.28
473.78
0
350
400
475.87
579.36
500
550
471.82
29-Jul-2012
02:03:23
Test012012 378 (6.963)
588.08
100
all-E-Zeaxanthin
0
350
m/z
650
600
QLC 9094
616.56
481.76
610.05 647.62
450
Eigelb natur 1 -3
527.80
434.99
363.89
1: Scan AP+
8.10e5
400
450
Eigelb C 1 -3
640.87
500.30
500
550
QLC 9094
29-Jul-2012
05:29:19
Test012017 429 (7.891)
588.32
100
13-Z-Zeaxanthin
586.24
1: Scan AP+
3.85e5
586.24
589.31
614.60
614.84
%
%
437.44
616.93
530.26
427.13
472.92
408.71 466.91
504.35
0
350
400
Abb. 3b-5:
639.15
617.67
360.82
450
500
400.73
636.94
561.81
473.05
474.03
640.87
550
0
350
m/z
650
600
400
450
AU
500
550
600
m/z
650
2: Diode Array
450
Range: 3.136e-2
all-E-Zeaxanthin
all-E-Lutein 6.67
3.0e-2
6.97
2.0e-2
13-Z-Lutein
unknown
1.0e-2
7.53
5.00
Test012010
6.00
7.00
13-Z-Zeaxanthin
8.03
8.00
9.00
8.52
8.49
%
6.98 7.07
4.39
Abb. 3b-6:
531.36
29-Jul-2012
00:41:00
Test012010
5
640.26
581.57
Eigelb – TIC am Peakmaximum von all-E-Lutein (oben links) und 13-Z-Lutein (oben
rechts) und TIC am Peakmaximum von all-E-Zeaxanthin (unten links) und 13-ZZeaxanthin (unten rechts)
Eigelb natur 1 -1
XLII
m/z
650
600
6.71
4.98
5.00
5.83
6.12 6.23
6.00
6.93
8.41
7.24 7.29
8.58
8.71
9.08 9.31
7.61 7.94 8.08
7.00
8.00
10.00
1: Scan AP+
TIC
1.58e7
9.00
9.94 9.99
Time
10.00
Eigelb – Chromatogramm (oben) und TIC-Messung (unten; corona 3,0 kV und cone 35 V)
Anhang 3
Prozentuale Anteile an 13-Z-Lutein und 13-Z-Zeaxanthin an der Gesamt-Xanthophyll-Massenkonzentration
1. Versuchsreihe zum Einfluss der Erhitzung
Tab.:
Prozentuale Anteile der 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin an der Gesamt-Xanthophyll-Massenkonzentration in nativen und erhitzten Proben von Granula, Plasma und Eigelb (Charge 1 / Charge 2)
Anteile der 13-Z-Isomere an der Gesamt-Xanthophyll-Massenkonzentration [%]
Granula
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Nativ
5,6 / 6,2
7,4 / 6,3
67 °C
5,8 / 6,4
7,7 / 6,5
72 °C
6,1 / 6,7
7,9 / 6,7
77 °C
6,1 / 6,8
8,0 / 6,7
82 °C
6,2 / 7,0
7,8 / 6,8
87 °C
6,6 / 7,5
7,9 / 6,9
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Nativ
4,5 / 6,1
7,9 / 6,4
67 °C
4,7 / 6,3
8,1 / 6,6
72 °C
5,5 / 6,2
8,2 / 6,5
77 °C
4,9 / 6,5
8,2 / 6,7
82 °C
5,6 / 6,7
8,1 / 6,6
87 °C
5,9 / 6,8
8,2 / 6,6
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Nativ
4,4 / 6,4
6,8 / 6,6
67 °C
4,6 / 6,6
7,0 / 6,7
72 °C
4,6 / 6,7
7,0 / 6,6
77 °C
4,6 / 6,7
7,0 / 6,7
82 °C
4,7 / 6,9
6,8 / 6,6
87 °C
5,2 / 7,1
7,1 / 6,7
Plasma
Eigelb
XLIII
2. Versuchsreihe zum Einfluss der Gefriertrocknung
Tab.:
Prozentuale Anteile der 13-Z-Isomere von Lutein und Zeaxanthin an der Gesamt-Xanthophyll-Massenkonzentration in nativen und gefriergetrockneten Proben von Granula, Plasma und Eigelb bei Charge 3 und 4
Anteile der 13-Z-Isomere an der Gesamt-Xanthophyll-Massenkonzentration [%]
Granula
Charge 3
Charge 4
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Nativ
5,1
6,6
Gefriergetrocknet
5,2
6,4
Nativ
4,7
8,1
Gefriergetrocknet
4,8
7,7
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Nativ
4,5
7,5
Gefriergetrocknet
5,1
6,6
Nativ
4,4
8,2
Gefriergetrocknet
4,7
8,0
13-Z-Lutein
13-Z-Zeaxanthin
Nativ
4,7
6,8
Gefriergetrocknet
4,9
6,3
Nativ
4,5
8,1
Gefriergetrocknet
4,5
7,6
Plasma
Charge 3
Charge 4
Eigelb
Charge 3
Charge 4
XLIV
Anhang 4
Statistische Auswertung (= 0,05) der Versuchsreihen
zum Einfluss der Erhitzung und Gefriertrocknung auf
die Protein- und Lipoproteinstrukturen und Massenkonzentrationen der Xanthophylle in Granula, Plasma und
Eigelb
Bedingungen
Erhitzung
Xanthophyll-Massenkonzentrationen
einfaktorielle univariate ANOVA
Fcrit = 4,39
Gefriertrocknung
H und Xanthophyll-Massenkonzentrationen
einfaktorielle univariate ANOVA
Fcrit = 18,51
XLV
1. Erhitzung
Normierte Gesamtenthalpie H
Granula
Charge 1
Charge 2
KolmogorovSmirnov-Test
p = 0,72
p = 0,49
ZweistichprobenF-Test
einfaktorielle
univariate ANOVA
p>
p = 1,97E-05
Ausnahme
Nativ / 72 °C
F = 409,70
(Fcrit = 6,59)
p>
p = 4,04E-06
Ausnahme
F = 906,36
(Fcrit = 6,59)
Nativ / 72 °C
Nativ vs. 72 °C
Nativ vs. 77 °C
67 °C vs. 72 °C
67 °C vs. 77 °C
72 °C vs. 77 °C
Nativ vs. 72 °C
Nativ vs. 77 °C
67 °C vs. 72 °C
67 °C vs. 77 °C
72 °C vs. 77 °C
Peak 1
Plasma
Peak 1
Charge 1
Tukey-B
p = 6,85E-03
p = 0,91
p>
F = 144,52
(Fcrit = 18,51)
Nativ vs. 67 °C
p = 1,53E-03
Charge 2
p = 0,88
p > 
Peak 2
Charge 2
Nativ vs. 67 °C
Peak 2
Plasma
Charge 1
F = 653,90
(Fcrit = 18,51)
p = 0,54
p = 0,99
p>
p = 1,29E-02
Ausnahme
67 °C / 77 °C
F = 14,54
(Fcrit = 6,59)
p>
p = 9,80E-04
Ausnahme
F = 56,78
(Fcrit = 6,59)
67 °C / 77 °C
Nativ vs. 77 °C
67 °C vs. 77 °C
72 °C vs. 77 °C
Nativ vs. 77 °C
67 °C vs. 72 °C
67 °C vs. 77 °C
72 °C vs. 77 °C
Eigelb
p>
Charge 1
p = 0,37
Ausnahmen
Nativ / 67 °C
67 °C / 72 °C
Charge 2
p = 0,82
F = 92,63
(Fcrit = 9,55)
p>
p = 8,41E-06
Ausnahme
F = 628,16
(Fcrit = 6,59)
Nativ / 72 °C
XLVI
p = 2,01E-03
Nativ vs. 72 °C
67 °C vs. 72 °C
Nativ vs. 67 °C
Nativ vs. 72 °C
Nativ vs. 77 °C
67 °C vs. 72 °C
67 °C vs. 77 °C
72 °C vs. 77 °C
all-E-Lutein
Granula
Charge 1
KolmogorovSmirnov-Test
p = 0,96
ZweistichprobenF-Test
p = 4,96E-03
p>
F = 11,50
p>
Charge 2
einfaktorielle
univariate ANOVA
p = 0,54
Ausnahme
77 °C / 82 °C
p = 2,58E-02
F = 5,91
Tukey-B
Nativ vs. 82 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 87 °C
72 °C vs. 87 °C
77 °C vs. 87 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 87 °C
82 °C vs. 87 °C
Plasma
p = 0,16
Charge 1
p = 0,92
Charge 2
p = 0,99
p>
F = 2,38
/
p = 0,24
p>
/
F = 1,86
Eigelb
p>
Ausnahmen
Charge 1
Charge 2
p = 0,61
Nativ / 77 °C
72 °C / 77 °C
77 °C / 82 °C
77 °C / 87 °C
p = 3,53E-03
F = 13,09
p = 4,74E-03
p = 0,93
p>
F = 11,70
Nativ vs. 82 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 82 °C
67 °C vs. 87 °C
77 °C vs. 82 °C
77 °C vs. 87 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 87 °C
72 °C vs. 87 °C
77 °C vs. 87 °C
XLVII
all-E-Zeaxanthin
Granula
KolmogorovSmirnov-Test
ZweistichprobenF-Test
Charge 1
p = 0,99
p>
p = 1,28E-02
p>
Charge 2
einfaktorielle
univariate ANOVA
p = 0,80
Ausnahme
77 °C / 82 °C
F = 7,92
p = 3,15E-02
F = 5,41
Tukey-B
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 87 °C
77 °C vs. 87 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 87 °C
82 °C vs. 87 °C
Plasma
p>
Charge 1
p = 0,96
Ausnahme
82 °C / 87 °C
p>
Charge 2
p = 0,78
Ausnahme
72 °C / 77 °C
p = 0,10
F = 3,10
/
p = 0,21
/
F = 1,99
Eigelb
p>
Ausnahmen
Charge 1
Charge 2
XLVIII
p = 0,85
Nativ / 77 °C
72 °C / 77 °C
77 °C / 82 °C
77 °C / 87 °C
p = 1,05E-02
F = 8,59
p = 1,28E-02
p = 0,94
p>
F = 7,93
Nativ vs. 82 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 82 °C
67 °C vs. 87 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 87 °C
72 °C vs. 87 °C
13-Z-Lutein
Granula
KolmogorovSmirnov-Test
ZweistichprobenF-Test
einfaktorielle
univariate ANOVA
p>
Charge 1
p = 0,99
Ausnahmen
Nativ / 72 °C
Nativ / 87 °C
Charge 2
p = 5,46E-05
F = 57,57
p = 1,94E-03
p = 1,00
p>
F = 16,35
Tukey-B
Nativ vs. 67 °C
Nativ vs. 72 °C
Nativ vs. 77 °C
Nativ vs. 82 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 72 °C
67 °C vs. 77 °C
67 °C vs. 82 °C
67 °C vs. 87 °C
72 °C vs. 77 °C
72 °C vs. 87 °C
82 °C vs. 87 °C
Nativ vs. 77 °C
Nativ vs. 82 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 82 °C
67 °C vs. 87 °C
72 °C vs. 82 °C
72 °C vs. 87 °C
Plasma
p > 
Ausnahmen
Charge 1
Charge 2
p = 0,68
Nativ / 67 °C
Nativ / 82 °C
67 °C / 72 °C
67 °C / 77 °C
67 °C / 87 °C
72 °C / 82 °C
77 °C / 82 °C
82 °C / 87 °C
p = 5,65E-06
F = 124,46
p = 6,17E-03
p = 0,99
p>
F = 10,57
Nativ vs. 72 °C
Nativ vs. 77 °C
Nativ vs. 82 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 72 °C
67 °C vs. 82 °C
67 °C vs. 87 °C
72 °C vs. 77 °C
72 °C vs. 82 °C
72 °C vs. 87 °C
77 °C vs. 82 °C
77 °C vs. 87 °C
Nativ vs. 82 °C
Nativ vs. 87 °C
67 °C vs. 82 °C
72 °C vs. 82 °C
Eigelb
p>
Charge 1
p = 0,92
Ausnahme
67 °C / 82 °C
Charge 2
p = 0,63
p>
p = 4,61E-02
Nativ vs. 87 °C
F = 4,56
p = 0,69
F = 0,63
/
XLIX
13-Z-Zeaxanthin
Granula
KolmogorovSmirnov-Test
ZweistichprobenF-Test
p>
Charge 1
p = 0,87
Ausnahme
77 °C / 87 °C
Charge 2
einfaktorielle
univariate ANOVA
p = 4,29E-04
F = 28,13
Tukey-B
Nativ vs. 67 °C
Nativ vs. 72 °C
Nativ vs. 77 °C
67 °C vs. 77 °C
72 °C vs. 77 °C
72 °C vs. 82 °C
72 °C vs. 87 °C
77 °C vs. 82 °C
77 °C vs. 87 °C
p = 8,52E-02
p = 0,67
p>
/
F = 3,38
Plasma
Charge 1
p = 0,98
Charge 2
p = 0,86
p>
p>
p = 3,68E-02
F = 5,05
p = 7,98E-02
F = 3,49
Nativ vs. 82 °C
/
Eigelb
p>
Charge 1
p = 0,67
Ausnahmen
Nativ / 82 °C
67 °C / 82 °C
p = 8,36E-02
F = 3,41
/
p>
Charge 2
L
p = 0,89
Ausnahmen
Nativ / 77 °C
67 °C / 77 °C
77 °C / 82 °C
77 °C / 87 °C
p = 0,11
F = 3,03
/
2. Gefriertrocknung
Rehydrierte Proben
Normierte Gesamtenthalpie H
Granula
Kolmogorov-Smirnov-Test
Zweistichproben-F-Test
Charge 3
p = 1,00
p>
Charge 4
p = 0,54
p>
Charge 3
p = 0,89
p>
Charge 4
p = 0,74
p>
F = 0,52
p = 0,43
F = 0,99
p = 3,68E-03
F = 270,37
p = 0,40
F = 1,12
Peak 2
Plasma
Charge 4
p = 0,55
Peak 1
Plasma
Charge 3
einfaktorielle
univariate ANOVA
p = 0,70
p>
p = 0,66
p>
Charge 3
p = 1,00
p>
Charge 4
p = 0,99
p>
p = 0,50
F = 0,68
p = 0,49
F = 0,72
Eigelb
p = 0,15
F = 5,41
p = 0,19
F = 3,77
LI
Gefriergetrocknete Proben
all-E-Lutein
Granula
Kolmogorov-Smirnov-Test
Zweistichproben-F-Test
Charge 3
p = 0,94
p>
Charge 4
p = 0,89
p>
Charge 3
p = 0,93
p>
Charge 4
p = 0,88
p>
Charge 3
p = 1,00
p>
Charge 4
p = 0,86
einfaktorielle
univariate ANOVA
p = 1,34E-02
F = 73,20
p = 3,97E-02
F = 23,72
Plasma
p = 3,70E-02
F = 25,53
p = 9,73E-03
F = 101,32
Eigelb
LII
p = 0,21
F = 3,25
p<
p = 9,27E-03
Keine Varianzhomogenität
F = 106,36
all-E-Zeaxanthin
Granula
Kolmogorov-Smirnov-Test
Zweistichproben-F-Test
Charge 3
p = 0,89
p>
Charge 4
p = 0,87
einfaktorielle
univariate ANOVA
p = 1,40E-02
F = 70,02
p<
p = 2,52E-02
Keine Varianzhomogenität
F = 38,21
Plasma
Charge 3
p = 0,93
p>
Charge 4
p = 0,88
p>
Charge 3
p = 0,95
p>
Charge 4
p = 0,90
p>
p = 1,02E-02
F = 96,65
p = 4,99E-03
F = 199,08
Eigelb
p = 0,25
F = 2,59
p = 2,61E-02
F = 36,81
LIII
13-Z-Lutein
Granula
Kolmogorov-Smirnov-Test
Zweistichproben-F-Test
Charge 3
p = 0,87
p>
Charge 4
p = 0,90
p>
Charge 3
p = 0,92
p>
Charge 4
p = 0,85
einfaktorielle
univariate ANOVA
p = 5,38E-03
F = 184,34
p = 1,29E-02
F = 75,75
Plasma
p = 8,08E-03
F = 122,25
p<
p = 1,49E-04
Keine Varianzhomogenität
F = 6720,67
Eigelb
Charge 3
p = 0,85
p>
Charge 4
p = 0,76
p>
LIV
p = 0,34
F = 1,54
p = 0,29
F = 2,07
13-Z-Zeaxanthin
Granula
Kolmogorov-Smirnov-Test
Zweistichproben-F-Test
Charge 3
p = 0,88
p>
Charge 4
p = 0,89
einfaktorielle
univariate ANOVA
p = 1,27E-02
F = 77,28
p<
p = 4,32E-02
Keine Varianzhomogenität
F = 21,64
Plasma
Charge 3
p = 0,98
p>
Charge 4
p = 0,90
p>
Charge 3
p = 0,95
p>
Charge 4
p = 0,92
p>
p = 0,27
F = 2,33
p = 6,57E-03
F = 150,78
Eigelb
p = 8,06E-02
F = 10,93
p = 2,83E-02
F = 33,85
LV
LVI
ISSN 0931-6264
LVII
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