Doktorarbeit Irene Loef

Doktorarbeit Irene Loef
Auswirkungen von Nitrat auf die Blühinduktion von
Arabidopsis thaliana (L.) Heyn.
Irene Loef
( Diplombiologin)
Inaugural-Dissertation
Zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissentschafltich-Mathematischen Gesamtfakultät
der
Ruprecht-Karls-Universität
Heidelberg
vorgelegt von
Diplom-Biologin
Irene Loef
aus Andernach
Tag der mündlichen Prüfung:
Auswirkungen von Nitrat auf die Blühinduktion von
Arabidopsis thaliana (L.) Heyn.
Gutachter :
Prof. Dr. Mark Stitt
Prof. Dr. Thomas Rausch
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Seite
1.
Einleitung
1
1.1.
Die Rolle der Blühinduktion der Pflanze
1
1.1.1.
Einfluß von physiologischen oder genetischen Signalwegen auf die
Blühinduktion
1
1.1.2.
Der Einfluß des Kohlenhydratstatus auf die Blühinduktion
4
1.1.3
An der Blühinduktion beteiligte Genetischen Signalwege
4
1.2.
Biochemische und genetische Auswirkungen beim Pflanzenwachstum als
Antwort auf Veränderungen in der Nitratzufuhr
9
1.3.
Ansätze und Ziele dieser Doktorarbeit
14
2.
Material und Methoden
16
2.1.
Pflanzenmaterial
16
2.2.
Chemikalien
16
2.3
Pflanzenanzucht
16
2.3.1.
Nährmedien
16
2.3.2
Sterilisation der Samen
17
2.3.3.
Aussaat der Samen
18
2.4
Dokumentation und Ernte
18
2.4.1.
Blühverlaufsdokumentation
18
2.4.2
Ernte
18
2.4.3
Aufbereitung des Pflanzenmaterials
19
2.4.4
Ethanolische Extraktion
19
2.4.4.1
Aufbereitung des Sediments
19
2.5
Bestimmung verschiedener Inhaltsstoffe aus den ethanolischen Extrakten 20
2.5.1
Bestimmung des Gesamtaminosäuregehaltes
20
2.5.2
Bestimmung der Einzel-Aminosäuren
21
2.5.3
Bestimmung des Nitratgehaltes
22
2.5.4
Metabolitenbestimmungen mit Hilfe enzymatische gekoppelter
Meßverfahren
22
2.5.4.1
Messung der Kohlenhydrate
23
2.5.4.2
Messung von Malat
23
Inhaltsverzeichnis
3.
Ergebnisse
24
3.1
Idendifikation von Glutamin als N-Quelle
26
3.2.
Auswirkungen von unterschiedlichen Nitratkonzentrationen auf das
Blühverhalten von Arabidopsis thaliana cv Columbia bei verschiedenen
Lichtregimen
31
3.2.1.
Erhöhtes Nitratangebot führt bei Kurztagbedingungen zu einer Verzögerung
der Blühinduktion
31
3.2.2
3.2.3
Erhöhte Nitratkonzentrationen führen bei höher Blattzahl und Biomasse
zur Blühinduktion
32
3.2.3
Der interne Nitratgehaltspiegelt den externen Nitratgehalt im Medium
wieder
35
3.2.4
Die Gesamtaminosäuren reagieren stärker auf die Tageslänge als auf das
externe Nitratangebot
37
3.2.5
Malat reagiert uneinheitlich
3.2.6
Die Kohlenhydrate zeigen mit abnehmender Tageslänge eine verstärkte
Abhängigkeit vom Nitratspiegel
39
3.2.7
Einzelaminosäuren reagieren unterschiedlich auf Nitrat und Tageslängen 42
3.2.7.1
Glutamin
43
3.2.7.2
Glutamat
43
3.2.7.3
Aspartat
44
3.2.7.4
Asparagin
45
3.2.7.5
Aminosäuren aus der Photorespiration
46
3.2.7.6
Aromatische Aminosäuren
48
3.2.7.7
Alanin und aliphatische Aminosäuren
50
3.2.7.8
Von Aspartat abstammende Aminosäuren – Lysin, Methionin und Threonin
52
3.2.7.9
Aminosäuren aus dem Harnstoffzyklus – Arginin und Citrullin
38
53
Inhaltsverzeichnis
3.2.7.10
Hisitidin
55
3.2.7.11
γ-Aminobuttersäure
55
3.3
Blühinduktion bei Landsberg erecta und verschiedenene Blühmutanten unter
verschiedenenen Nitratkonzentrationen
58
3.3.1
Blühverlauf bei Landsberg erecta unter verschiedenene Nitratregminen
58
3.3.1.1
Blühverlaufskurven und Biomassen bei Landsberg erecta
59
3.3.1.2
Nitrat, Gesamtaminosäuren und Malat
61
3.3.1.3
Lösliche Zucker und Stärke
63
3.3.1.4
Glutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat
64
3.3.1.5
Aminosäuren aus der Photorespiration
65
3.3.1.6
Aromatische Aminosäuren
67
3.3.1.7
Alanin und aliphatische Aminosäuren
68
3.3.1.8
Aminosäuren aus dem Harnstoffzyklus
69
3.3.1.9
Aminosäuren, die sich von Aspartat ableiten
70
3.3.1.10
Histidin
71
3.3.1.11
γ-Aminobuttersäure
72
3.2.2.
tfl1
73
3.2.4
leafy-1
85.
3.2.5.
fd-1
95
3.2.6.
fwa-1
104
3.2.7.
fve-1
112
3.2.8.
fy-1
120
3.3
C24 und ANR1
131
Inhaltsverzeichnis
4.
Diskussion
156
4.1
Wirkung von Nitrat auf die Blühinduktion
158
4.2
Einfluß von Nitrat auf die Blühinduktion unter verschiedenen
Photoperioden
159
4.3
Die Beeinflussung der Blühinduktion durch Nitrat läuft bei verschiedenen
frühblühenden Wildtypen ähnlich ab
164
4.4
Verschiedene Blühmutanten zeigen keine Beeinflussung durch Nitrat
166
4.3.1
tfl1
167
4.3.2
lfy-1
170
4.3.3
fd-1
172
4.3.4
fwa-1
173
4.3.5
fve-1
175
4.3.6
fy-1
177
4.4
ANR1
180
4.5
Abschließende Diskussion
184
5.
Zusammenfassung
190
6.
Abkürzungen
191
7.
Literaturverzeichnis
194
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1
Die Rolle der Blühinduktion der Pflanze
Die Entwicklung der Blüte ist für die Pflanze ein fundamentaler Vorgang, da sie es dem
Organismus Pflanze ermöglicht, Genmaterial an eine nächste Generation weiterzugeben. Da
Pflanzen im Gegensatz zu Tieren ihren Standort nicht verlassen können, sind sie darauf
angewiesen, physiologische Signale zu registrieren, die darüber Auskunft geben, ob die
äußeren Umstände günstig zur Entwicklung einer Blüte sind, um die zur Verfügung stehenden
Resourcen
ausnutzen
zu
können.
Blühen
ist
dabei
zunächst
das
obligate
Entwicklungsprogramm des Apikalmeristems einer Pflanze, bis das vegetative Programm
gestartet wird (Sung et al. 1992). Dieser „default“-Vorgang wird aber zunächst von einem
Blührepressor oder einem Promotor der vegetativen Entwicklung unterdrückt (Koornneeff et
al. 1998).
1.1.1 Einfluß von physiologischen oder genetischen Signalwegen auf die Blühinduktion
Die Blühinduktion wird dabei über verschiedene Wege beeinflußt, zum einen physiologische
Faktoren, zum anderen auch genetische Signalwege. Es ist bekannt, daß sich die
Blühentwicklung
im
Sproßapikalmeristem
abspielt,
wobei
dieses
mehrere
Entwicklungsstadien durchläuft. Signale, die blühstimulierend wirken, werden dabei im Blatt
wahrgenommen, was dann zur Ausschüttung von blühfördernden Faktoren führt (Araki et al.
1998). Man geht davon aus, daß es sich um chemische Stoffe handelt, die über das Phloem
transportiert werden. Die vom Blatt abgegebenen Stoffe wirken als Blühstimulus auf den
Sproßapex ein. Zunächst muß das Meristem dabei die Kompetenz erlangen, bei Einfluß
unterschiedlicher Signale eine Blüte zu bilden und damit von der juvenilen Phase in die adulte
Phase zu gelangen (Taiz & Zaiger 1998). Läuft dann einmal das festgelegte Programm – also
Blühinduktion – ab, so ist das Meristem darauf festgelegt, selbst bei Entfernung aus den
normalen physiologischen und umweltbedingten Zusammenhang. Dies hat man mittels
Pfropfexperimente (Singer & McDaniel 1986, McDaniel 1996) herausgefunden. Singer und
McDaniel haben 1986 durch das Pfropfen von Sproßspitzen bei verschiedenen
Tabakvarietäten gezeigt, daß z.B. die Anzahl an Nodien, die ein Meristem vor der Blüte
Einleitung
2
produziert, auf der Stärke des Blühsignals aus den Blättern und der Fähigkeit des Meristems,
darauf zu antworten, beruht.
Neben der Beeinflussung, die aus den Blättern kommt, spielen wahrscheinlich auch Signale
aus der Wurzel heraus eine Rolle. Es ist zu vermuten, daß die Wurzel einen oder mehrere
Inhibitoren der Blühinduktion produziert (Taiz & Zaiger 1998). Dies läßt den Schluß zu, daß
die Signale, die vom Blatt ausgehen, während der photoperiodischen Induktion sowohl in den
Sproßapex als auch in die Wurzel transportiert werde. Als Antwort darauf produzieren die
Wurzeln chemische Signale, die die Blühinduktion modulieren (Taiz & Zaiger 1998). Dazu
gehören aber auch Blühstimulanzen aus der Gruppe der Phytohormone wie Gibberrellinsäure
und Cytokine. Lejeune et al. haben 1994 gezeigt, daß der Cytokiningehalt im Xylemexudat
aus den Wurzeln von Sinapsis alba während der photoperiodischen Blühinduktion deutlich
ansteigt.
Bei der Blühinduktion wird zum einen der Entwicklungstand der Pflanze, aber auch die
Umweltfaktoren wie Licht registriert (Koornneeff et al. 1998, Simpson et al. 1999). Bei den
entsprechenden Photoperioden wird ein Blühstimulus von den Blättern zum apikalen
Meristem transportiert und setzt dort die Blühinduktion in Gang (Bernier et al. 1993). Dabei
geht es um die Länge der Dunkelphase, die einen Einfluß zeigt (Taiz & Zaiger 1998, Hamner
& Bonner 1938), nicht um die Länge der Lichtperiode, und außerdem um die Wellenlänge des
einwirkenden Lichtes. In Arabidopsis thaliana wirken zwei Wellenlängen bei der
Blühinduktion mit. Zum einen handelt es sich um die rote (660 nm) bzw. fernrote (720 nm)
Wellenlänge, die über Phytochrome wahrgenommen wird (Clack et al. 1994), zum anderen
um die blaue Wellenlänge (520 nm), die über Cryptochrome wahrgenommen wird (Bagnall et
al. 1996, Lin et al. 1996). Für Arabidopsis hat man fünf Phytochrome-Gene gefunden, dabei
ist PHYA an der positiven Regulation der Blühinduktion beteiligt (Bagnall et al. 1995). PHYB
hemmt dagegen die Blühinduktion , phyb-Mutanten blühen früher als der Eltern-Wildtyp
(Reed et al. 1993, Bagnall et al. 1995). CRY1 und CRY2 als Vertreter der Cryptochrome
fördern die Blühinduktion bei Arabidopsis thaliana (Bagnall et al. 1996). Dabei können
Pflanzen aufgrund ihrer Antwort auf die Photoperioden in verschiedene Klassen unterteilt
werden, die tageslängenunempfindlichen Pflanzen und die Kurztag- bzw. Langtagpflanzen
(Vince-Prue 1975). Die beiden letzteren Klassen können erneut unterteilt werden in die
Pflanzen, die nur bei Kurztag oder Langtag blühen ( qualitative Kurztag/Langtag-pflanzen)
Einleitung
3
und die Pflanzen, deren Blühinduktion durch Kurztag bzw. Langtag gefördert werden
(quantitative Kurztag/Langtagpflanzen) (Taiz & Zaiger 1998).
Pflanzen reagieren sehr stark auf Umwelteinflüsse und reagieren entweder mit einer
Förderung oder einer Verzögerung der Blühinduktion (Coupland 1995). Bei Arabidopsis
thaliana handelt es sich um eine fakultative Langtagpflanze, die unter Laborbedingungen mit
einer Tageslänge von 16 h in 3 Wochen blüht, bei einer Tageslänge von 10 h jedoch
6 Wochen benötigt (Coupland 1995). Bei dieser kurzen Tageslänge kommt es zu einer
Erhöhung von Blattzahl und Biomasse, ein Hinweis darauf, daß nicht die Entwicklung
verzögert ist, sondern die vegetative Phase verlängert ist.
Auch Vernalisation = Lagerung bei niedrigen Temperaturen hat einen starken Einfluß auf das
Blühen. So ist von einigen Arabidopsis-Ecotypen, die in großen Höhen oder aus Bergregionen
stammen, bekannt, daß sie unter Laborbedingungen eine sehr späte Blühinduktion zeigen.
Werden sie jedoch über einen längeren Zeitraum hinweg niedrigen Temperaturen ausgesetzt,
so tritt die Blüte wesentlich früher ein (Reeves et al. 2000). Ein Teil der bekannten
spätblühenden
Arabidopsis-Ecotypen zeigt dominante Allele am Frigida-Locus, die zu
spätem Blühen führen, dieser Phänotyp kann durch niedrige Temperaturen aufgehoben
werden (Reeves et al. 2000). In den letzten Jahren ist klar geworden, daß das Blühzeit-Gen
Flowering Locus C eine zentrale Rolle bei der Vernalisationsantwort spielt. Bei
spätblühenden Pflanzen, die infolge Vernalisation zu früherem Blühen neigen, zeigte sich ein
hoher FLC-mRNA-Spiegel hauptsächlich in Wurzeln und in der Sproßspitze, bei
Vernalisation sind diese Spiegel niedriger. Das Gen kodiert einen MADS-BosTranskriptionsfaktor, der die Umschaltung von vegetativer zu generativer Phase unterdrückt.
Es hat sich gezeigt, daß Vernalisation zu einer Demythilierung der DNA führt, die danach
transkribiert werden kann. Vermutlich sind die Methylasen kälteempfindlich und werden
somit durch die Vernalisation inaktiviert, sodaß bei nachfolgenden DNA-Replikationen die
neusynthetisierten DNA-Stränge unmethyliert bleiben. Da die Notwendigkeit von
Vernalisation durch Gibberellin-Gabe umgangen werden kann, geht man davon aus, daß einer
der Schlüsselenzyme der Gibberrellin-Biosynthese durch Methylierung zunächst inaktivert ist
(Burn et al. 1993). Die Raktion auf Vernalisation scheint eine spezifische Anpassung zu sein
und ist bei vielen höheren Pflanzen vorzufinden (Ratcliffe 1961).
Einleitung
4
Zu den chemischen Stoffen, die die Blühinduktion beeinflussen und steuern, gehören die
Polyamine. Die photoperiodische Induktion der Langtagpflanze Sinapsis alba korreliert mit
einem Anstieg an Putrescin, einem prominenten Vertreter der Polyamine im Phloem. Im
Gegenzug bewirkt Besprühen der Blätter mit einem Inhibitor der Putrescinsynthese ein
Herabsetzen der Putrescinkonzentration im Phloem und unterbindet Blühen (Havelange et al.
1996).
1.1.2 Der Einfluß des Kohlenhydratstatus auf die Blühinduktion
Blühen wird auch durch Nährstoffversorgung beeinflußt (Marschner 1995). Stärkemutanten
wachsen im Vergleich zu ihrem Eltern-Wildtyp langsamer unter kurzen Photoperioden und
zeigen eine verzögerte Blühinduktion (Bernier et al. 1993, Corbesier et al. 1998). Mutanten
mit einem Defekt im Stärkemetabolismus wie phosphoglucomutase (pgm) (Caspar et al.
1985) und ADP glucose pyrophosphorylase 1 (adg1) (Lin et al. 1986) haben keine Stärke im
Blatt und blühen unter Kurztagbedingungen verzögert. Aber auch starch excess 1 (sex1)
(Caspar et al. 1993) und cabohydrate accumulation mutant 1 (cam1) (Eimert et al. 1995)
blühen verzögert, obwohl sie erhöhte Stärkekonzentrationen in den Blättern haben. Der
Phänotyp des Spätblühens beruht dabei nicht auf der fehlenden Stärkeakkumulation und dem
damit verbundenen langsameren Wachstum, sondern eher auf der Unfähigkeit, die
gespeicherten Kohlenhydrate zu mobilisieren (Bernier et al. 1993, Eimert et al. 1995). Der
genaue Mechanismus des Einflußes von Kohlenhydraten auf die Blühinduktion ist jedoch
noch unklar.
1.1.3
An der Blühinduktion beteiligte Genetischen Signalwege
Diese Umgebungsfaktoren wirken teilweise auf einige Signalwege, deren molekulare Genetik
bekannt ist. Bei Arabidopsis thaliana haben sich bisher drei Signalwege für Blühinduktion
ergeben. Bei einem dieser Signalwege blühen die Mutanten spät unter Langtagbedingungen,
sind aber nicht verzögert unter Kurztagbedingungen und reagieren nicht auf Vernalisation,
man zählt diese Gene zum Photoperiodengesteuerten Signalweg. Dazu gehören die Gene
CONSTANS (CO), GIGANTEA (GI), LONG HYPOCOTYL (LHY), FT, FWA, FD und FHA
(Ratcliffe et al. 2001, Koornneeff et al. 1991, Simpson et al. 1999). Gene wie FT, FWA und
FD werden mittlerweile in eine Subgruppe eingeordnet, diese Mutanten blühen spät unter
Langtagbedingungen und etwas verzögert unter Kurztagbedingungen (Araki et al. 1998,
Einleitung
5
Simpson et al. 1999). Ein zweiter Signalweg beinhaltet Mutanten, die hingegen nicht auf
Veränderungen in der Photoperiode reagieren und unter alle Tageslängen blühen, dafür aber
empfindlich gegenüber Vernalisation sind. Zu diesem autonomen Signalweg gehören Gene
wie LUMINIDEPENDENS (LD), FY,FCA und FVE (Ratcliffe et al. 2001, Koornneeff et al.
1991, Simpson et al. 1999). Ein dritter Signalweg mit Gibberrellin responsive und
Gibberrellin insensitive (GAI) ist gibberrellinabhängig und reagiert bei Mutation stärker auf
Photoperiodenveränderungen als der Wildtyp (Wilson et al. 1992, Aukerman et al. 1999,
Onouchi et al. 2000, Reeves et al. 2000). Die Mutante ga1-3 ist z.B. eine reine Langtagpflanze
(Wilson et al. 1992). Gibberrelline sind notwendig für die Blühinduktion unter
nichtinduktiven Bedingungen (Martinez-Zapater et al. 1994) und aktivieren dabei den
LEAFY-Promotor (Blazquez et al. 1998).
Bei den spätblühenden Mutanten geht man davon aus, das ein einzelner genetischer
Signalweg betroffen ist, der Blühen als Antwort auf Langtag fördert. (Reeves et al. 2000).
Durch Vergleich verschiedenener Allele bei Blühzeitgenen von Cap verde Islands und
Landsberg erecta-Ecotypen fand man einen Locus mit dem Namen EARLY DAYLENGTH
INSENSITIVE, der frühes Blühen verursacht (Reeves et al. 2000).
Bei einigen dieser Gene ist mittlerweise die Aufgabe und Struktur des Genprodukts bekannt.
So spielt GI wahrscheinlich eine Rolle bei der Kontrolle der Expression von Tagesgangregulierten Genen als Antwort auf Lichteinfluß.(Reeves et al. 2000).
CO ist ein Protein, das ein Zinkfingermotiv aufweist, ein Charakteristikum für Proteine, die
an die DNA binden (Coupland 1995, 1997). Es hat sich gezeigt, daß CO nachweisbar ist,
bevor andere Gene wie LEAFY oder APETALA1 im Blühprimordium expremiert werden
(Coupland 1997) Constitutive Expression von CO führt zu frühem Blühen und bestätigt damit
die fördernde Wirkung von CO (Simon et al. 1996).
Bei FWA geht man davon aus, daß es downstream von der Regulation des C-Transportes zum
Apex fungiert (Roldan et al. 1997). FWA agiert zusammen mit anderen Genen, unter anderem
LEAFY, redundant im Sproßapikalmeristem, um downstream-Gene wie APETALA1 zu
regulieren. Bei der Regulation des eigentlichen Blühens hat FWA weder eine positive noch
fördernde Rolle. Falls es am Blühen beteiligt ist, dann in der Hinsicht, daß es die Aktivität
von fördernden Signalwegen und/oder downstream-Komponenten während der frühen
Einleitung
6
Entwicklung oder der frühen juvenilen Phase unterdrücken oder dagegen arbeiten könnte
(Araki et al. 1998).
fve-Mutanten zeigen sowohl unter Dauerlicht wie auch unter Kurztagbedingungen eine
erhöhte Blattzahl zum Zeitpunkt der Blüte im Vergleich zum Wildtyp, was darauf hinweißt,
daß FVE unter beiden Photoperioden notwendig zur Blühförderung ist. Jedoch scheint der
FVE-Locus nicht an der Photoperiodenkontrolle der Phasenverschiebung von vegetativ nach
reproduktiv zu sein, gerade aufgrund der oben beschriebenen Photoperiodenempfindlichkeit
(Martinez-Zapater et al. 1995). Lange Photoperioden und der FVE-Locus könnten
Pflanzenentwicklung und Internodienstreckung über paralelle und additive Signalwege
fördern. Er könnte ebenso die Festlegung des Blüentwicklungprogramms in den
Lateralmeristemen fördern (Martínez-Zapater et al. 1995). Die fve-Mutanten zeigen ebenso
Symptome von reduzierten Gibberrellinkonzentrationen, aber in wesentlich geringerem
Ausmaß wie ga1- oder gai-Mutanten (Martínez-Zapater et al. 1995).
Die bisher beschriebenen Gene aus den verschiedenen Signalwegen werden als Blühzeit-Gene
beschrieben, die in zwei Klassen eingeteilt werden. Die erste Klasse dient zur Hochregulation
von „Floral meristem identity“-Genen wie LEAFY. Diese Gene stammen aus mehreren
unabhängigen Signalwegen wie dem autonomen Signalweg mit FCA/FVE, dem
Photoperioden-Signalweg mit CO/GI und dem Gibberellin-abhängigem Signalweg mit
Gibberellin responsive/Gibberellin insensitive. LFY scheint für alle drei Signalwege ein
Zielgen zu sein (Reeves et al. 2000). Man hat herausgefunden, daß LEAFY-Expression ein
neues Blühprimordium anzeigt, es unterdrückt Blattformation und Internodienstreckung und
verstärkt die Expression
von APETALA1 und CAULIFLOWER (zwei weitere „Floral
meristem identity“-Gene). Außerdem steuert es zusammen mit UNUSUAL FLOWER
ORGANS die Entwicklung von Petalen und Stamen (Pidkowitch et al. 1999).
Eine zweite Klasse von Blühzeitgenen stammt hauptsächlich aus dem PhotoperiodenSignalweg und beinhaltet Gene wie FT und FWA. Diese sind nicht an der transkriptionellen
Regulation von LEAFY beteiligt, sondern an der Antwort auf LEAFY-Aktivität (Reeves et al.
2000).
Bei Arabidopsis scheint die erste Antwort auf die Blühinduktion eine transkriptionelle
Aktivierung von „Floral meristem identity“-Genen in den Blühmeristemen zu sein, die an der
Einleitung
7
Sproßspitze gebildet werden (Weigel et al. 1995). Zu diesen Floral Meristem identity-Genen
gehören LEAFY, APEATALA1, CAULIFLOWER, APETALA2 und UNUSUAL FLOWER
ORGANS.
Bei konstitutiver Expression des LEAFY-Gens kommt es zur Umwandlung zumindest einiger
Blühstände in Infloreszensen, während Mutationen diesen Phänotyp meist nur verstärken.
Ausnahme ist APETALA1, dieses Gen kann im mutierten Zustand bei Doppelmutanten den
lfy-Phänotyp etwas unterdrücken. Dies weißt darauf hin, daß LEAFY APETALA1 induziert
und das die gemeinsamen Aktivitäten von LEAFY und APETALA1 zusammen effektiver bei
der Umwandlung von Sproßmeristemen in Blühmeristeme sind als LEAFY alleine (Weigel et
al. 1995). LEAFY wird auch von Gibberellinen beeinflußt (Blazquez et al. 1997, Blazquez et
al. 1998) wobei das Gibberellin-Signal wahrscheinlich Teil eines Signalweges ist, der Blühen
in der Abwesenheit von externen blühinduktiven Stimuli fördert. Die Gibberelline spielen
dabei nicht nur als Aktivator des LEAFY-Promotors eine Rolle, sondern beeinflussen ebenso
die Kompetenz, auf das LEAFY-Signal zu reagieren. Dabei spielen Gibberelline eine stärkere
Rolle beim Blühen unter Kurztagbedingungen als unter Langtagbedingungen.
Neben LEAFY und den oben genannten Genen gibt es auch noch TERMINAL FLOWER1, das
bei der Blühinduktion eine wichtige Rolle spielt. Durch Unterdrückung der Blühinduktion
ermöglicht es der Pflanze, zunächst eine vegetative Phase zu durchlaufen (Ratcliffe et al.
1998). Das TFL-Gen agiert im Sproßapikalmeristem und verhindert eine Umwandlung des
Sproß-Apikalmeristems zu einem Blühmeristem (Onouchi et al. 1998) und repremiert die
Transkription von LFY und AP1 im Sproßmeristem (Simon et al. 1996). Es ist damit einer der
Gene, die zur Kontrolle der Identität der Infloreszens-Meristeme im Sproßapex von
Arabidopsis thaliana notwendig sind (Ohshima et al. 1997). Während LEAFY und
APETALA1 bereits früh während der Blühentwicklung agieren (Mandel et al. 1992, Weigel et
al. 1992) und für die korerekte Entwicklung der Blütenorgane notwendig sind , wird
TERMINAL FLOWER1 während der Blüte im Sproßmeristem expremiert (Bradley et al.
1997). Damit ergibt sich eine antagonistische Wirkung zwischen TERMINAL FLOWER1
einerseits und LEAFY und APETALA1 andererseits, um die Identität von InfloerescenzMeristemen und Blühmeristemen festzulegen bzw. die Umwandlung vom einen in das andere
zu fördern (Alvarez et al. 1992, Schultz & Haughn 1993, Weigel & Nilsson 1995). Es ist
gezeigt worden, daß das TERMINAL FLOWER1-Protein Sequenzähnlichkeit zu
Einleitung
8
Phosphatidylethanolamin-bindenden
Proteinen
in
Tieren
zeigt,
die
an
Membranproteinkomplexe binden können (Bradley et al. 1996, Pidkowitch et al. 1999).
Das nachfolgende Modell soll die Interaktion der verschiedenen Gene bei der Blühinduktion
darstellen:
Floral
Repressor
Tageslängen
Wahrnehmung und
Übermittlung
PHYA / ELF3
PhotoperiodenSignalweg
CO / GI
FT / FWA /
FD
Lichtqualität
Wahrnehmung und
Übermittlung
PHYB
Konstitutiver
Signalweg
FVE / FY
FLD / FCA
?
Vernalisationssignalweg
VRN1 / VRN2
Gibberrelline
GA1 / GAI
TFL 1
?
EMF 1 /
EMF 2
LFY / AG 1
Abb 1/1: das Modell wurde aus zwei Modellen aus Simpson et al. 1998 und Koorrneeff et al 1998
zusammengesetzt. TFL beeinflußt wahrscheinlich die Aktivität eines Inibitors bzw. Blührepressors, indem es
diesem stabilisiert (Alvarez et al. 1992).. LEAFY ist ein sogenanntes Floral meristem identity“-Gen, das am
Aufbau der Blüte beteiligt ist. fwa und fd reagieren beide auf Photoperioden. Diese Mutanten reagieren mit
verzögerter Blühinduktion unter Langtagbedingnungen und etwas verzögert unter Kurztagbedingungen . und
werden deswegen nach Simpson et al. (1999) in eine Subgruppe zum photoperiodisch gesteuerten Signalweg
gestellt. da die anderen Mutanten aus diesem Signalweg nur bei Langtagbedingungen mit verzögerter
Blühinduktion reagieren. fve und fy sind spätblühende Mutanten, deren Phänotyp durch Vernalisation
aufgehoben werden kann (Koornneef et al. 1991). Weitere Erklärung siehe Einleitung und Diskussion. Der
indirekte Einfluß des Vernalisationssignalweges auf den konstitutiven bzw. Gibberrellingesteuerten Signalweges
wird von den beiden zugrundeliegenden Modellen unterschiedlich bewertet, daraus ergibt sich das Fragezeichen
bei den Pfeilen des Vernalisationsweges.
Einleitung
9
Die Rolle
von physiologischen Faktoren wie Photoperiode oder Vernalisation bei der
Blühinduktion sind gut erschlossen, es gibt aber keine physiologischen oder genetischen
Untersuchungen zum Einfluß von Nährstoffen auf die Blühinduktion. Es ist zwar bekannt,
daß Kohlenhydrate wie z.B. Stärke die Blühinduktion beeinflussen. Inwieweit das für andere
Nährstoffe wie z.B. Nitrat gilt, ist bisher noch nicht näher untersucht worden.
Da aber Nitrat eine der wichtigsten Nährstoffe ist und oftmals limitierend auf das Wachstum
einwirken kann, ist davon auszugehen, daß es eine wichtige Rolle in der Blühinduktion spielt.
Ziel der Doktorarbeit ist es, Kenntnisse der Stickstoffbeeinflussung auf die Blühinduktion am
Beispiel von Nitrat zu erarbeiten.
1.2
Biochemische und genetische Auswirkungen beim Pflanzenwachstum
als Antwort auf Veränderungen in der Nitratzufuhr
Wachstum und Entwicklung von Pflanzen wird weitgehend bestimmt durch das Angebot an
zur Verfügung stehenden Grundlagen wie Wasser, Licht und Nährstoffe. Stickstoff ist das
wichtigste mineralische Nährelement für Pflanzenwachstum und ist dabei meist in Form von
Nitrat mit Konzentrationen von 10 µM bis 100 mM für die Pflanzen verfügbar (Marschner
1995, Crawford 1995). Zusammen mit der CO2-Fixierung in der Photosynthese stellt die
Nitratassimilation für die Pflanze einen fundamentalen Prozess dar, um autotroph zu sein.
Neben den höheren Pflanzen sind auch Bakterien, Pilze und Algen zur Umwandlung
organischen Stickstoffs in eine biologisch nutzbare, organische Form fähig.
Die Nitratassimilation in Pflanzen beginnt über eine aktive Aufnahme von Nitrat mittels
Nitrat-Protonen-Symport aus dem umliegenden Bodengewebe in die Wurzel hinein. Daran
sind nieder- und hochaffine Transporter beteiligt (Crawford 1995). Nitrat wird in der Wurzel
und nach Transport im Xylem auch im Sproß reduziert. Die Reduktion läuft dabei über das
zytosolische Enzym Nitratreduktase (NR) ab, das der geschwindigkeitsbestimmende und
damit regulierende Schritt in der Nitratassimilation zu sein scheint (Beevers & Hagemann
1969, Layzell 1990).
Einleitung
10
Stehen ausreichend Nitrat und Photosyntheseprodukte zur Verfügung, so wird die NRAktivität als limitierender Faktor für Wachstum, Entwicklung sowie Proteinsynthese in
Pflanzen und weiteren nitratassimilierenden Organismen angesehen (Solomonson & Barber
1990). Die weiteren Enzmye in der Nitratassimilation wie Nitritreduktase und
Glutaminsythestase sind hingegen nicht limitierend. Dies hat seinen Grund darin, daß sowohl
Nitrit als auch Ammonium in höheren Konzentrationen toxisch wirken und somit so schnell
wie möglich abgebaut werden müssen.
Nitrat induziert und reguliert somit als Substrat durch seine Verfügbarkeit die Expression der
am Nitratassimilationsweg beteiligten Gene für Nitratreduktase, Nitritreduktase und
Nitrattransporter, dies ist für filamentöse Pilze (Crawford & Arst 1993, Marzluf 1993) und
Chlamydomonas (Fernandez & Cardenas 1989) nachgewiesen. Diese Induktion der Gene
erfordert dabei nicht die Neusynthese der Proteine, dies läßt eine konstitutive Expression des
Signalweges vermuten (Gowri et. al. 1992). Außerdem scheint es wichtig für die Stabilität
der NR-mRNA zu sein (Ferrario et al. 1995).
Neben Nitrat als Substrat hat auch Licht eine regulierende Wirkung auf die Expression von
Nitrat- und Nitritreduktase, die sich post-transkriptionell auswirkt. Dabei wird der Lichteffekt
wahrscheinlich durch Phytochrom vermittelt, zumindest ist dies für etiolierten Pflanzen
nachgewiesen (Schuster & Mohr 1990, Neininger et al. 1992). In transgenen Pflanzen mit
konstitutiv expremierter nia-mRNA sinkt die NR-Aktivität und der Gehalt an NR-Protein im
Dunkeln ab (Vincentz & Caboche 1991). Neben dieser direkten Beeinflussung durch Licht
tritt auch noch eine circadiane Kontrolle der NR-Genexpression auf. Werden Pflanzen in
kontinuirlichem Tag/Nacht-Zyklus angezogen, so variiert die nia-Transkriptmenge in diesen
Blättern sehr stark (Deng et al. 1990, Bowsher et al. 1991, Pilgrim et al. 1993). Dabei ist sie
gegen Ende der Nacht (Tabak, Tomate, Nicotiana plumbaginifolia) bzw. zu Beginn der
Photoperiode (Arabidopsis thaliana, Mais) am höchsten und fällt gegen Ende der Lichtphase
auf nicht detektierbare Mengen ab. Die tageszeitliche Fluktuationskontrolle scheint in
Nicotiana plumbaginifolia transkriptionell zu sein (Vincentz & Caboche 1991, Vaucheret et
al. 1992), in Arabidopsis thaliana hingegen posttranskriptionell (Pilgrim et al. 1993).
Licht wirkt sich nicht nur direkt auf die Induktion der NR als wichtigstes Enzym der
Nitratassimilation
aus,
sondern
auch
indirekt
über
die
Beeinflussung
Kohlenhydratstoffwechsels durch die Photosynthese. Es ist eine Induktion der NR durch
des
Einleitung
11
metabolisierbare Zucker wie Glukose, Fruktose und Saccharose nachgewiesen (Cheng et al.
1992, Vincentz et al. 1993). Mittels Expressionsstudien von Reportergenen, die unter
Kontrolle des Tabak nia1 bzw. Arabidopsis nia1-Promotors standen, konnte dies bewiesen
werden (Cheng et al. 1992, Vincentz et al. 1993).
Neben den bisher beschriebenen positiven Einflüssen auf die NR als Hauptenzym der
Nitratassimilation gibt es, dies ist zumindest bei filamentösen Pilzen gezeigt worden, auch
eine Reprimierung der NR durch Glutamin (Crawford & Arst 1993, Marzluf 1993). Bei
Tabakblättern wurde gezeigt,daß der Tagesgang der nia-Transkriptmenge negativ mit der
Glutaminkonzentration im Gewebe korreliert (Deng et al. 1991). Ebenso
unterdrücken
exogen angebotenes Glutamin oder Asparagin spezifisch Ammoniumaufnahme in Weizen
(Causin & Barnaix 1994). Glutamin gehört mit Glutamat, Aspartat und Asparagin zu den
N-Speichernden Aminosäuren und dienen als Speicher- und Transportverbindungen für
organisch gebundenen Stickstoff in der Pflanze (Lam et al. 1995). In Mais wurde gezeigt, daß
niedrige Glutamin- oder Asparaginspiegel den Netto-N-Aufnahme stimulieren (Lee et al.
1994), ebenso in Spinatzellkulturen (Shiraishi et al. 1992, Ogawa et al. 1999) Außerdem
reprimieren Glutamin und Asparagin die Induktion der Nitritreduktase (Wray 1993).
Bei limitierter externer Stickstoffversorgung kommt es häufig zu einer Änderung der
Biomasseallokation, z.B. eine Absenkung des Sproß/Wurzel-Verhältnisses (Ågren & Ingestad
1987, Rufty et al. 1990, Clarkson & Touraine 1994, Ameziane et al. 1995). Das
Wurzelwachstum wird dabei wesentlich stärker gefördert als das Sproßwachstum. Zugleich
führen hohe lokale Nitratkonzentrationen an der Wurzel zu einer Hemmung des
Wurzelwachstums, wie an Tabakpflanzen mit stark reduzierter Nitratredukase-Aktivität
nachgewiesen wurde (Scheible 1996, Scheible et al. 1997b). Lokal appliziertes Nitrat führt
zur Induktion des ANR1-Genproduktes, einem Transkriptionsfaktor, der das Wachstum von
Lateralwurzeln als Antwort auf Nitratzufuhr beeinflußt (Zhang et al. 1998).
Gesteigerte Nitratfütterung hingegen führt zu erhöhter Aufnahme von Nitrat und Amonium
(Crawford 1995, Hoff et al. 1994), erhöhten Aminosäurekonzentrationen (Ferrario et al.
1995), Veränderungen im pH und in der Ionenbalance und veränderten Konzentrationen der
organischen Säuren wie Malat, dessen Metabolismus ist eng verknüpft mit der Assimilation
von Nitrat und Ammonium (Kaiser & Förster 1989, Martinoia & Rentsch 1994) Außerdem
nehmen die Konzentrationen an Speicherkohlenhydraten wie Stärke ab (Fichtner & Schultze
Einleitung
12
1992, Stitt & Schultze 1994), während Proteinkonzentrationen steigen, zudem sind die
Phytohormone beeinflußt.
Die Beeinflussung des Pflanzenwachstums durch das externe Stickstoffangebot läßt den
Schluß zu, daß Stickstoff selbst direkt in Form des organischen Nitrats bzw. indirekt über
seine reduzierten Derivate oder auch über das C/N-Verhältnis an Wachstumsvorgängen
beteiligt ist. (Trewavas 1985, McIntrye 1997). Das Nitrat selbst als Signalgeber fungiert, läßt
sich z.B. bei der Induktion der an der Nitratassimilation beteiligten Enzyme und zugleich der
Induktion der Synthese von organischen Säuren sowie einer Inhibierung der Stärkesynthese
erkennen, die Induktion erfolgt sehr rasch innerhalb von bis zu 30 min (Scheible 1996).
Außerdem wurde anhand von NR-Tabak-Mutanten mit 50% NR-Aktivität im Vergleich zu
ihrem entsprechenden Wildtyp Nicotiana tabacum gezeigt, daß diese Mutanten genauso gut
wuchsen wie der Wildtyp (Scheible et al. 1997b) und ähnliche Protein- oder
Aminosäurespiegel wie der Wildtyp aufwiesen. Die Wuchsraten waren dabei unabhängig von
hoher oder niedriger Nitratversorgung (Scheible et a. 1997b). Erhöhte Nitratzufuhr führt zur
Inhibierung der Blühinduktion und Blattsenescenz bzw. Blattabwurfs und zur Bevorzugung
des Sproßwachstums gegenüber dem Wurzelwachstum. Umgekehrt kommt es bei verringerter
Nitratzufuhr zur Blühinduktion, außerdem treten Blattsenescenz und Blattabwurf verfrüht auf,
das Blattwachstum wird reduziert und das Wurzelwachstum wird gegenüber dem
Sproßwachstum bevorzugt (Trewavas 1983).
Stickstoffhaushalt und Kohlenhydrathaushalt sind eng miteinander gekoppelt, dies ist
notwendig, da bis zu 55% des assimilierten Kohlenstoffs zur Assimilation von Stickstoff
verwendet wird (Huppe & Turpin 1994). Der fixierte Kohlenstoff dient zum einen als
Kohlenstoffskelett, der in Form organischer Säuren für den Einbau des organischen
Stickstoffs in Aminosäuren benötigt wird. Die organischen Säuren dienen gleichzeitig zur
Erhaltung von osmotischem Potential und pH-Homeostase während der Nitratreduktion
(Davies 1986). α-Oxoglutarat dient dabei als Akzeptor für Ammonium im GOGAT-Weg,
Malat agiert als Gegenion und Ersatz für Nitrat, um Alkalisierung zu vermeiden (Ben-Zioni
1970, Stitt 1999). Die Stickstoffaufnahme und die Nitratreduktion sind zudem
enegerieverbrauchend, die Energie wird durch Respiration von Kohlenhydraten bereitgestellt
(Crawford 1995).
Einleitung
13
Auch diese enge Kopplung von Kohlenstoffmetabolismus und Nitratassimilation führt dann
auch zu bestimmten Effekten, die eine Steuerung durch Nitrat, entweder direkt oder indirekt,
vermuten lassen. So ist bekannt, daß es bei externer Nitratapplikation zu einer raschen
Zunahme der Nitrataufnahme kommt (Jackson et al. 1973, Siddiqui et al. 1990, Laine et al.
1995) und die Aktivitäten von NR (Gowri et al. 1992) und NiR (Faure et al. 1991) sich
erhöhen.
Auch
aus
den
nachfolgenden
Synthesewegen
werden
Enzyme
wie
Glutaminsynthetase und GOGAT (Hayakawwa et. al. 1992, Sakakibara et. al. 1992) in ihrer
Aktivität verstärkt.
Zwischen hohen Nitratgaben und Stärkesynthese gibt es eine negative Korrelation (Huber
1983, Chu et al. 1992, Fichtner 1993). Während der vegetativen Phase akkumuliert die
Pflanze entweder Nitrat oder Stärke (Waring et al. 1985, Fichtner 1993). Dies läßt sich damit
erklären, daß für die Nitratmetabolisdierung C-Skelette notwendig sind, zum anderen ohne
Nitrat jedoch auch die Kohlenhydrate vollständig umgesetzt werden können. So ist bisher
nachgewiesen, daß Nitrat beispielsweise die Stärkesynthese im Sproß hemmt (Scheible et al.
1997). Der Karbontransport in die Wurzel wird in Pflanzen mit hohem Nitratgehalt in den
Blättern inhibiert.
Aminosäuren und Amide sind die ersten stabilen Produkte der Assimilation von
anorganischem Stickstoff (Oaks 1994) und bilden die Grundlage der Proteine. Veränderungen
in der Konzentration bestimmter Aminosäuren oder im Gesamtaminosäurespiegel sind an der
Regulation vieler Prozesse beteiligt, die zum N-Metabolismus der Pflanze gehören (Atilio &
Causin 1996). Eine hohe Nittratzufuhr erhöht die Konzentration an freien Aminosäuren in den
Blättern vieler Pflanzenarten (Barnaix et al. 1984).
Hohe Nitratkonzentrationen führen zu einer Verzögerung der Blühinduktion (Bernier 1993),
während Nitratlimitierung das Einsetzen der Blüte fördert. Der Einfluß von Nitrat per se auf
diesen Vorgang ist bisher jedoch noch nicht näher untersucht worden, es ist also nicht
bekannt, auf welche Art und Weise Nitrat in den Mechanismus der Blühinduktion bzw. der
Blühformation eingreift.
Einleitung
1.3
14
Ansätze und Ziele dieser Doktorarbeit
Um den Einfluß von Nitrat ermitteln zu können, muß zunächst eine Strategie erarbeitet
werden, die es ermöglicht, die Signalwirkung von Nitrat zu beobachten und gleichzeitig die
klassische Problematik der Änderung vieler Parameter, die mit Pflanzendüngung
normalerweise einhergeht, zu umgehen.
Deswegen wird zunächst als N-Quelle eine Aminosäure gesucht, die an sich wenig Einfluß
auf Wachstumsparameter und Metabolitenspiegel hat, aber Nitrat als N-Quelle substituieren
kann. Mit dieser Basis kann dann der N-Spiegel in seiner Konzentration geändert werden.
Ziel dieser Doktorarbeit ist es, den Einfluß von Nitrat auf die Blühinduktion zu ermitteln.
Dazu wurden verschiedene Ansätze gewählt:
1.)
Zunächst wird eine Strategie entwickelt, die es ermöglicht, die Rolle von Nitrat als
Signalgeber bei der Blühinduktion zu ermitteln, ohne es als N-Quelle verwenden zu
müssen. Dazu werden zunächst verschiedene Aminosäuren auf ihre Qualifikation als
N-Quelle getestet. Anstelle der Verwendung von Mutanten wird damit eine
biochemische Strategie entwickelt, die den Vorteil hat, unabhängig von einem
bestimmten Genotyp zu funktionieren.
2.)
Nitrat
wird
in
unterschiedlichen
Konzentrationen
und
gleichzeitig
unter
verschiedenen Photoperioden angeboten. Es ist bekannt, daß Arabidopsis thaliana
eine fakultative Langtagpflanze ist, die unter Kurztagbedingungen eine deutliche
Verzögerung der Blühinduktion zeigt. Dies stellt eine Möglichkeit dar, das
Zusammenspiel zwischen Nitrat als Nährstoff und Licht zu ermitteln und zugleich
festzustellen, wie stark die jeweilige Gewichtung ist.
3.)
Es
werden
verschiedene
bekannte
Blühmutanten
mit
unterschiedlichen
Nitratkonzentrationen angezogen, um festzustellen, in welchem Maße Nitrat als
einer der wichtigsten Nährstoffe das Blühverhalten steuert, wenn Gene aus den
verschiedenen Signalwegen der Blühinduktion mutiert sind, bzw. ob eine Mutation
unabhängig von der externen Nitratversorgung greift. Dazu gehören tfl1 als
Einleitung
15
Blührepressor-Mutante, fwa und fd als Mutanten aus dem Photoperiodengesteuerten
Signalweg, fve und fy aus dem autonomen Signalweg und lfy als Vertreter der „floral
meristem identy“-Gene.
4.)
In einem weiteren Testansatz wird eine definierte Mutante, welche eine Mutation im
MADS-Bos
Gen
ANR1
aufweist,
ebenfalls
unter
verschiedenen
Nitratkonzentrationen angezogern, um zu sehen, in welchem Ausmaß die Mutation
in dem sogenannten ANR1-Gen, daß die Wurzelarchitektur unter verschiedene
Nährstoffangeboten bei Arabidopsis steuert (Zhang & Forde, 1998) die
Blühinduktion beeinflußt. Dieses Gen bewirkt eine Induktion der Lateralwurzeln bei
lokal begrenzten Nitratangeboten. Wie in diesem Fall der Zusammenhang zwischen
Sproß und Wurzelverhältnissen gegeben ist, sollte in dieser Testreihe ermittelt
werden.
Die Testreihen werden hauptsächlich bei drei Nitratkonzentrationen durchgeführt 1 mM
Nitrat als niedrige Nitratversorgung, 10 mM Nitrat als ausreichende und 35 mM Nitrat als
überoptimale Nitratversorgung. Um eine Signalwirkung von Nitrat ermitteln zu können, ohne
auf die N-Quelle Nitrat allein angewiesen zu sein, beinhalten die Anzuchtmedien zusätzlich
4 mM Glutamin. In Vortests hat sich gezeigt, daß Glutaminbeigabe zu einer rascheren Blühte
führt, ohne Biomasse oder wesentliche Inhaltsstoffe wie Nitratgehalt, Kohlenhydrate oder
Aminosäuren groß zu beeinflussen. Da die Tests auf Agarplatten durchgeführt werden und
damit die Gefahr des Austrocknens besteht, wird die negative Wirkung von Glutamin auf die
Nitratreduktase in Kauf genommen, wenn auf der anderen Seite eine raschere Ermittlung der
Daten möglich ist. Außerdem werden bei den Testreihen zu Punkt 3.) und 4.) zwei
Kontrollbedingungen verwendet. Zum einen ist dies eine Mangelbedingung mit 0,5 mM
Nitrat. Theoretisch sollte mit sehr niedrigen Nitratspiegeln eine rasche Blühinduktion
eintreten. Die zweite Kontrollbedingung ist 10 mM Nitrat ohne Glutaminzusatz. Dies dient
dazu, festzustellen, in welchem Maße Glutamin tatsächlich eine blühfördernde Wirkung im
gewählten System hat.
Material und Methoden
2.
Material und Methoden
2.1
Pflanzenmaterial
16
Als Pflanzenmaterial diente Arabidopsis thaliana, genauer die Ökotypen Columbia Col-0 , C24 und
Landsberg erecta (bezogen von Lehle Seeds, Texas, USA)
Die Blühmutanten mit Ler als Hintergrund wurden entweder von Nottingham Arabidopsis Stock
Centre England, oder Ohio Stock Centre, USA, bezogen. Die ANR-Mutanten wurden
freundlicherweise von Prof. Dr.Brian Forde (Universität Lancaster, Großbritannien) zur Verfügung
gestellt.
2.2
Chemikalien
Enzyme und Enzymsubstrate wurden bei der Firma Roche (vormals Boehringer) Mannheim
bezogen. Die im Aminosäurestandard eingesetzten Aminosäuren stammten von der Firma Sigma
(München). Ninhydrin wurde von der Firma J.T.Baker (Debenter, Holland) bezogen. Als Agar
wurde Agar für Zellkultur von der Firma Sigma (München) verwendet. Alle anderen Chemikalien
stammten, soweit nicht anders angegeben, von den Firmen Merck (Darmstadt) , Sigma (München)
oder Fluka (Buchs, Schweiz).
2.3 Pflanzenanzucht
2.3.1
Nährmedien
Zur Pflanzenanzucht wurden Nährmedien aus Stocklösungen verschiedener Salze hergestellt, diese
waren zuvor mit bidestilliertem Wasser angesetzt worden. Die Nährmedien wurden ebenfalls mit
bidestilliertem Wasser angesetzt. Die angesetzten Nährmedien wurden nach Zugabe von Agar,
Saccharose und Fe-EDTA autoklaviert. MES wurde als 1 M Stammlösung, Glutamin als 0,4 M
Stammlösung angesetzt, beide Lösungen wurden mit pH 5,6 eingestellt. Sowohl MES als auch
Glutamin wurden sterilfiltriert und den autoklavierten Lösungen zugegeben, nachdem diese auf ca.
60°C abgekühlt waren. Die fertigen Lösungen wurden danach zügig auf die sterilen Platten (Falcon
Petri Dish 100x15 mm, Becta Dickison Laboratories, USA/France) verteilt (33 ml/Platte).
Material und Methoden
17
Die gegossenen Platten wurden verschlossen und stehengelassen, bis der Agar ausgehärtet war.
Danach wurden sie mit halb offenem Deckel für 30 Minuten aufgestellt, um überflüssige
Flüssigkeit auszutrocknen.Die Platten wurden bis zur weiteren Verwendung kopfüber bei 4°C
gelagert, um das Ansammeln von Kondenswasser auf den gegossenen Platten zu vermeiden.
Zusammensetzung der verwendeten Medien:
End-KonzNitrat
0,5 mM
1 mM
10mM
35 mM
10 mM
KNO
MgSO4
MgCl2
KCl
KH2PO4
CaCl2
0,5 mM
5 mM
1 mM
5 mM
10 mM
1 mM
4 mM
35 mM
1 mM
10 mM
1 mM
5 mM
3 mM
2 mM
5 mM
3 mM
2 mM
3 mM
2 mM
3 mM
2 mM
3 mM
2 mM
NaFeEDTA
Saccharose
Oligoelemente
8 mg/l
1,00%
0,5 ml/l
8mg/l
1,00%
0,5 ml/l
8mg/l
1,00%
0,5 ml/l
8mg/l
1,00%
0,5 ml/l
8mg/l
1,00%
0,5 ml/l
Mes
Glutamin
Agar
3 mM
0 mM
0,8 %
3 mM
4 mM
0,8 %
3 mM
4 mM
0,8 %
3 mM
4 mM
0,8 %
3 mM
0 mM
0,8 %
Die verwendete KH2PO4-Lösung wurde mit Phosphorsäure auf pH 5,6 eingestellt.
Zusammensetzung der Oligoelemente-Lösung:
H3BO4
MnSo4
ZnSO4
CuSO4
NiCl2
HMoO4
CoCl2
2.3.2
150 mM
35 mM
2,5 mM
1,5 mM
1 mM
0,75 mM
0,05 mM
Sterilisation der Samen
Die bei 4°C gelagerten Samen wurden zunächst in entsprechender Menge abgenommen (1000
Samen wiegen ca. 20 mg) und danach sterilisiert. Dazu wurden sie 10 – 12 Minuten mit NaOCl
5,25 % (v/v) gebeizt und danach 3 – 4mal mit sterilem bidestilliertem Wasser gewaschen. Zum
Schluß wurde das Waschwasser möglichst vollständig abgenommen und steriler Agar (0,15 % (w/v
in H2O) hinzugegeben.
Material und Methoden
18
2.3.3
Aussaat der Samen
Die
Aussaat
erfolge
mit
sterilen
Pasteurpipetten,
dabei
wurden
für
die
Blühinduktionsversuche 4 Samen pro Platte ausgebracht. Die Platten wurden danach mit
Micropore-Klebeband verschlossen, um auf der einen Seite Gasaustausch mit der Umgebung zu
ermöglichen, auf der anderen Seite Kontamination von außen zu vermeiden. Die Platten
wurden kopfüber und im Dukeln für 4 – 5 Tage bei 4°C gelagert, um eine Synchronisation der
Samenkeimung zu erreichen. Danach wurden sie in horizontaler Lage in die Araschränke
ausgebracht. Die Lichtintensität betrug 100 – 120 µE (je nach Experiment) und 20°C. Die
Anzuchten erfolgten bei 8 h Licht /16 h Dunkel, 12 h Licht / 12 h Dunkel sowie 16 h Licht / 8 h
Dunkel.
Genauere
Angaben
erfolgen
im
Ergebnisteil.
Es
war
keine
zusätzliche
Luftfeuchtigkeit eingestellt.
2.4 Dokumentation und Ernte
2.4.1
Blühverlaufsdokumentation
Pro Nitratbedingung und Lichtdauer wurden 30 bis 60 Platten ausgebracht. Um eine rasche
Ergebnisdokumentation zu ermöglichen, wurden pro Bedingung Gruppen mit 8 – 16
Samen
= 3 - 4 Platten gebildet. Pflanzen, die Krüppelwachstum zeigten oder erst sehr spät mit dem
Wachstum begannen, wurden nicht in die Beobachtungen einbezogen. Die Zählung der
Blühansätze erfolgte
3 – 4 Stunden nach Lichtbeginn. Gezählt wurde ab dem ersten , mit
bloßem Auge erkennbarem Auftauchen von Knospenansätzen in der Mitte der Blattrosette.
2.4.2
Ernte
Zur Ernte (30 – 90 Minuten nach Lichtbeginn, um auch in den Mangelbedingungen Nitrat
messen zu können) wurden die zuvor ausgewählten Platten geöffnet, mit Wasser versetzt und
wieder zurück in den Araschrank gestellt, um so lange wie möglich die Licht- und
Temperaturbedingungen
aufrechtzuerhalten.
Die
Zugabe
von
Wasser
führt
zu
einer
Aufweichung des Agars sodaß bei der weiteren Ernte der Wurzelverlust gering gehalten
werden konnte.Danach wurden die Pflanzen mit Hilfe einer Pipette vorsichtig aus dem Agar
Material und Methoden
19
gezogen und zweimal in bidestilliertem Wasser gewaschen. Dabei wurde, soweit notwendig,
überschüssiger Agar aus den Wurzeln entfernt. Nach dem Waschen wurden die Pflanzen auf
Saugpapier getrocknet und die Blattanzahl ermittelt. Die Pflanzen wurden danach in Sproß
und Wurzel getrennt, beide Gewebe gewogen und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Sproßgewebe war dabei alles oberhalb des Wurzel, es wurde nicht in Rosettengewebe und
Blüte getrennt. Pro Replikat wurden 2 – 3 Pflanzen eingefroren. Das Pflanzenmaterial wurde bis zur
weiteren Bearbeitung bei – 80°C gelagert.
2.4.3 Aufbereitung des Pflanzenmaterials
Zur Vorbereitung der nachfolgenden ethanolischen Extraktion wurde das Pflanzenmaterial in
vorgekühlten Mörsern bis zur Homogene gemörsert und danach in vorgekühlten EppendorfReaktionsgefäßen (Schraubdeckel-Eppis) abgewogen (30
- 40 mg).Dabei wurde jeweils das
genaue Gewicht notiert.
2.4.4
Ethanolische Extraktion
Zur Extraktion von Aminosäuren, Zuckern, Stärke und Nitrat wurde eine ethanolische
Extraktion durchgeführt.Dabei wurde ein Teil abgewogenes Pflanzenmaterial mit 5 Teilen
ethanolischer Lösung bzw. Puffer versetzt. Die Suspension wurde 20 Minuten bei 80°C
inkubiert. Durchgeführt wurden zwei Extraktionsschritte mit 80% Ethanol in 10 mM Hepes-KOH
pH 7,5, ein Extraktionsschritt mit 50 % Ethanol in 10 mM Hepes-KOH pH 7,5 und ein weiterer
Extraktionsschritt mit 10 mM Hepes-KOH pH 7,5. Nach der Inkubation wurden die
Mikroreaktionsgefäße je 5 Minuten bei 4°C und 14 000 rpm in einer Eppendorf-Tischzentrifuge
zentrifugiert und der Überstand in einem neuen Mikroreaktionsgefäß auf Eis gesammelt. Das
Sediment wurde erneut extrahiert, bis alle Extraktionsschritte durchgeführt waren. Die so
gewonnenen Überstände wurden vereinigt und für weitere Messungen verwendet, das Pellet diente
zur Stärkebestimmung.
2.4.4.1 Aufbereitung des Sediments
Zur Bestimmung von Stärke wurde das Pellet zunächst mit bidestilliertem Wasser gewaschen
und danach 5 Minuten bei 14000 rpm in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert. Der
Material und Methoden
20
Überstand wurde möglichst vollständig abgenommen . Das Pellet wurde mit 4-5 Teilen
bidestilliertem Wasser versetzt und 3 Stunden bei 121°C autoklaviert. Nach Abkühlen der
Suspension wurde das gleiche Volumen 50 mM Natrium-Acetat-Puffer pH 5 mit 1,4 U
Amyloglukosidase aus Aspergillus niger und 2 U α-Amylase aus Schweinepankreas hinzugegeben.
Die Mischung wurde über Nacht bei 37°C inkubiert und danach für 2 Minuten bei 95°C erhitzt, um
die Enzyme abzutöten. Vor der Messung der durch die hydrolytische Spaltung entstandenen
Glukose wird die Suspension 5 Minuten bei 14000 rpm zentrifugiert.
2.5 Bestimmung verschiedener Inhaltsstoffe aus den ethanolischen Extrakten
2.5.1
Bestimmung des Gesamtaminosäuregehaltes
Zur Ermittlung des Gesamtaminosäuregehaltes wurden die im Extrakt vorhandenen Aminosäuren
mit Ninhydrin derivatisiert, die gewonnenen Verbindungen weisen ein Absorbtionsmaximum bei
570 nm auf.
Die zur Derivatisierung verwendeten Lösungen waren wie folgt zusammengesetzt:
Lösung 1: 1 % Ninhydrin in 70 % Ethanol,
Lösung 2: 0,2 % Ascorbinsäure in 1 M Citrat, pH 5,2 . Die Lösungen sind bei – 80°C längere Zeit
lagerbar. Als Standard diente Glutamin in verschiedenen Konzentrationen, in 52,5 % Ethanol
angesetzt. Diese Ethanolkonzentration ergab sich aus dem Ethanolanteil der Pflanzenproben.
Der Probenansatz setzte sich wie folgt zusammen:
- 5 – 20 µl Probe,
- 50 µl 52,5 % Ethanol,
50 µl Citrat / Ascorbinsäure,
100 µl 1% Ninhydrin in 70 % Ethanol
Der Ansatz wurde gemischt und 20 Minuten bei 95°C inkubiert. Zum Abkühlen wurden die
Mikroreaktionsgefäße auf Eis gestellt und die Proben danach in eine 96-Well-Platte pipettiert.
Gemessen wurde bei 570 nm am Anthos II-Elisareader.
Material und Methoden
2.5.2
21
Bestimmung der Einzel-Aminosäuren
Die proteinogenen Aminosäuren (mit Ausnahme von Prolin und Cystein) wurden mit Hilfe einer
reversed-phase-HPLC
(high
performance
liquid
chromatography)
aufgetrennt
und
ihre
Konzentrationen mit Hilfe von Aminosäurestandards bestimmt. Der Nachweis der Aminosäuren
beruht dabei auf der Bindung von o-Phtalsäuredialdehyd (OPA) an die primäre Aminogruppe der
Aminosäuren, wodurch ein fluoreszierendes Derivat entsteht, das mit Hilfe eines Fluorometers
(SFM 25, Kontron, München, Excitationswellenlänge 330 nm, Emissionswellenlänge 450 nm)
gemessen und mittels eines Datensystems (450 MT, Kontron, München) ausgewertet wurde. Die
Vorsäulenderivatisierung
erfolgte
automatisiert
unter
verwendung
eines
Probengebers
(Autosampler 465, Kontron) : In 35 µl Probe wurden 35 µl Derivatisierungsreagenz injiziert, 100
Sekunden bei 4°C derivatisert und 20 – 40 µl dieses Ansatzes über Vor- und Trennsäule
aufgetrennt. Die Trennung erfolgte auf einer Hypersil ODS-Säule (3 µm Partikelgröße, 150 mm
Länge, 4,6 mm Innendurchmesser, Knauer Gmbh, Berlin, Raumtemperatur). Als Probematerial
dienten dabei ethanolische Extrakte, die eingeengt wurden und in bidestilliertes Wasser
aufgenommen wurden.
Die Auftrennung erfolgte mit Hilfe eines Gradienten aus beiden Laufmitteln, der sich wie folgt
zusammensetzt:
0 – 2 Minuten
isokratische Phase mit 100 % A, 0 % B
2 – 11 Minuten
linearer Gradient von 0 % B auf 10 % B
11 – 17 Minuten
isokratische Phase mit 10 % B
17 – 27 Minuten
linearer Gradient von 10 % B auf 50 % B
27 – 38 Minuten
linearer Gradient von 50 % B auf 60 % B
38 – 44 Minuten
linearer Gradient von 60 % B auf 100 % B
44 – 46 Minuten
isokratische Phase mit 100 % B, 0 % A
46 – 48 Minuten
lineaer Gradient von 100 % B auf 0 % B
48 – 60 Minuten
isokratische Phase mit 100 % A, 0 % B
verwendete Lösungen waren dabei:
Derivatisierungsreagenz:
5 % (g/v) OPA / Methanol/ 0,8 M Borat-KOH-Puffer pH 10,4 / 3-Mercaptopropionsäure
( 10 : 90 :1, v:v:v)
Material und Methoden
22
Laufmittel A.:
1000 ml 10 mM Na-Phosphatpuffer, mit Phosphorsäure auf pH 6,8 eingestellt
2.4ml Tetrahydrofuran
Laufmittel B:
50 % Na-Phosphatpuffer 40 mM, mit Phosphorsäure auf pH 6,8 eingestellt
150 ml Methanol
100 ml Acetonitril
2.5.3 Bestimmung des Nitratgehaltes
Zur Bestimmung des Nitratgehaltes in den Proben wurde eine HPLC-Methode (high performance
liquid chromatography)verwendet. Die Auftrennung erfolgte dabei auf einer schwachen
Anionenaustauschersäule auf Silicagelbasis (VYDAC 302 IC). Als Laufmittel diente ein Puffer mit
45 mM KH2PO4 pH 2,7 . Als Standard wurde 100 µM KNO3 eingesetzt.Die Auftrennung erfolgte
bei Raumtemperatur und bei einer Flußrate von 1,6 ml/ Minuten. Die Proben wurden je nach
Nitratgehalt des Agars entweder eingeengt oder 10 – 20fach verdünnt im Autosampler
(Autosampler SA 360,Kontron, München) vorgelegt, wobei 20 µl auf der Säule aufgetrennt wurden.
Bei niedrigen Nitratgehalten im Agar war eine Einengung der betroffenen Pflanzenproben
notwendig, da sonst das enstehende Ethanolsignal das eigentliche Nitratsigal überlagert hätte. Die
Absorption bei 210 nm wurde mit einem UV-Detektor erfaßt und die sich ergebende
Absorptionsänderung mit einem Datensystem (450 MT, Kontron, München) ausgewertet.
2.5.3
Metabolitenbestimmungen mit Hilfe enzymatisch gekoppelter Meßverfahren
Die Metabolite wurden mit Hilfe enzymatischer Substratanalyse nach Lowry und Passoneau, 1972,
modifiziert nach Stitt et al., 1984 und Wirtz et al., 1980 durchgeführt. Bei Einsatz von NADH war
die Meßwellenlänge 334 nm und die Referenzwellenlänge 405 nm, bei Verwendung von APAD
war die Meßwellenlänge 570 nm. Die Reaktionen fanden in Polystyrol Microtiterplatten (Microtest
Plate mit 96 Wells, Sarstedt, USA)) statt und wurden mittels eines Microtiterplatten-Readers
(Anthos HTII, Typ 12.500, Anthos Labtec Instruments, Salzburg, Österreich) verfolgt und mit Hilfe
Material und Methoden
23
der Biolise-Software ausgewertet. Gemessen wurde die Bildung bzw. der Verbrauch von NADH /
NADPH bzw. APAD und die daraus sich ergebende Absorptionsänderung.
Die in Amoniumsulfat präzipitierten Hilfsenzyme wurden vor den Tests abzentrifugiert, der
Überstand verworfen und die Enzyme im jeweiligen Testpuffer resuspendiert.
2.5.4.1 Messung der Kohlenhydrate
Glukose, Fruktose und Saccharose wurden in einem Ansatz sukzessive nacheinander bestimmt. Als
Reaktionspuffer diente 100 mM Imidazol-HCl, pH 6,9 mit 3 mM MgCl2 versetzt. Der
Reaktionsansatz enthielt außerdem 500 µM NADP, 1,2 mM ATP und 1 U Glukose-6-PhosphatDehydrogenase.Auf 200 µl Reaktionsansatz kamen 20 µl ethanolischer Extrakt. Die Reaktion
wurde dann sukzessive gestartet durch Zugabe von 1 U Hexokinase zur Messung von Glukose, 1 U
Phosphoglukoisomerase zur Messung von Fruktose und 100 U Invertase zur Messung von
Saccharose.
Die beim Stärkeverdau entstandenen Hexoseäquivalente Glukose wurden nach dem gleichen
Prinzip bestimmt, dabei wurden 40 µl ethanolischer Extrakt eingesetzt.
2.5.4.2 Messung von Malat
Bei der Malatmessung wurde ein Hepespuffer pH 8,5 mit einer Konzentration von 100 mM , 330
µM APAD (Acetylpyridinadenindinukleotid) und 330 µM Acetyl-CoA verwendet. Zudem enthielt
der Ansatz 0,3 U Citratsynthase aus Schweineherz. Auf 200 µl Reaktionsansatz kamen 20 µl
ethanolischer Extrakt. Nach 5 minuten Preinkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,6 U
Malat-Dehydrogenase
gestartet.
Die
Messung
erfolgte
bei
366
-1
Extinktionskoeffizient von APAD liegt bei dieser Wellenlänge bei 9100 M ).
nm
(der
molare
Ergebnisse
24
3. Ergebnisse
Ziel der Doktorarbeit ist es, den Einfluß von Nitrat auf das Blühverhalten von Arabidopsis
thaliana zu untersuchen. Neben der Entwicklung einer Strategie, die es durch Substituierung
von Nitrat durch Aminosäuren ermöglicht, die Signalwirkung von Nitrat zu ermitteln, enthält
die Arbeit drei weitere Ansätze, um die Rolle von Nitrat bei der Blühinduktion zu ermitteln:
Zunächst wird jedoch eine Strategie ermittelt, die es ermöglicht, den Einfluß von Nitrat als
Signalstoff
zu ermitteln, ohne es als N-Quelle verwenden zu müssen. Dazu werden
verschiedene Aminosäuren auf ihre Qualifikation als Ersatz-N-Quelle ausgetestet. Ziel ist es,
die Stickstoffversorgung der Pflanzen sicherzustellen, ohne daß die Signalwirkung der
angewandten Nitratkonzentrationen dadurch beeinflußt wird.
Im ersten Ansatz werden Columbia-Samen auf drei verschiedenen Nitratkonzentrationen –
1 mM Nitrat als niedrige N-Versorgung, 10 mM Nitrat als ausreichende N-Versorgung und 35
mM Nitrat als hohe N-Versorgung - ausgebracht. Zusätzlich zu den Nitratkonzentrationen
enthält das Agarmedium noch jeweils 4 mM Glutamin, das die erste N-Versorgung der
keimenden Samen sicherstellt. Gln dient dabei als konstitutive Ersatz-N-Quelle, die es
ermöglicht, Nitrat spezifisch als Signalstoff zu betrachten, ohne das es als N-Quelle dienen
muß, was die Interpretation erschweren würde. Gln sichert damit das Wachstum der Pflanze
insofern, als die Wuchsrate unabhängig vom Nitrat ist. Dabei wird der Effekt von Nitrat auf
das Blühen unter drei verschiedenen Lichtregimen beobachtet, um zu sehen, wie stark
Nitratsensing von der Tageslänge beeinflußt wird.
Im zweiten Ansatz werden Landsberg erecta und verschiedene, bereits definierte
Blühmutanten
unter
einem
gegebenen
Lichtregime
bei
den
oben
genannten
Nitratbedingungen sowie 0,5 mM Nitrat ohne Glutaminbeigabe als Mangelbedingung sowie
10 mM Nitrat ohne Glutaminbeigabe als 10 mM-Bedingung ohne Gln angezogen. Dabei wird
Landsberg erecta als Wildtyp verwendet, da die meisten bekannten Mutanten Landsberg
erecta als Hintergrund haben. Die Mangelbedingung mit 0,5 mM Nitrat dient dabei als
Simulation von konventionellem Nitratmangel. Hier wird ermittelt, inwieweit sich dieser
Mangel auf das Blühverhalten auswirkt. Die letzte Bedingung dient zur Ermittlung des
Glutamineinflußes auf das Nitratsensing. Ziel ist es, inwieweit das Nitratsignal bei bekannten
Ergebnisse
25
Blühmutanten gegenüber dem Eltern-Wildtyp greift bzw. ob die Mutation unabhängig vom
Nitratsignal wirkt. Dabei wird nur ein Lichtregime verwendet, um das System nicht zu
kompliziert zu machen.
Im dritten Ansatz werden ANR1-Transformanten ebenfalls unter einem Lichtregime und fünf
verschiedenen Nitratbedingungen angezogen. ANR1 ist ein Transkriptionsfaktor, der in den
Wurzeln expremiert wird und die Entwicklung der Lateralwurzeln in Abhängigkeit von der
externen Nitratversorgung mit beeinflußt. Damit soll ermittelt werden, in welchem Maße
Vorgänge in der Wurzel die Blühinduktion beeinflußen. Dabei wirkt das Nitratsignal indirekt
über die Wurzel ein.
Bei den drei letztgenannten Ansätzen wurden im Verlaufe der Blühinduktion – es zeigten
dabei 50 – 80 % der Pflanzen einen Blühansatz, die Blüte war aber nicht geöffnet – Ernten
durchgeführt, um ethanolische Extrakte zu erhalten und daraus Metaboliten messen zu
können. Der genaue Zeitpunkt für jede Ernte wird in der Legende der einzelnen graphen
angegeben. Dabei ist zu berücksichtigen, das daß Pflanzenmaterial 30 – 90 min nach
Lichtbeginn geerntet wurde. Dies war notwendig, um auch in den Bedingungen mit niedrigen
Nitratversorgungen noch Nitrat nachweisen zu können. Da die Ernten zu Beginn der
jeweiligen Blühinduktion immer unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurden – die
Blühknospen waren sichtbar, aber Elongation des Internodiums bzw. Aufgehen der Blüte hat
noch nicht stattgefunden – waren die geernteten Pflanzen im selben physiologischem Alter.
Die Messung der Inhaltsstoffe der ethanolischen Extrakte gab Aufschluß darüber, in welchem
Maße die externe Nitratfütterung Änderungen im internen Bereich bewirkte, inwieweit also
der Nitratgehalt beeinflußt wurde, ob Gln sich als konstitutive N-Quelle eignete und wie
organische Säuren, Kohlenhydrate und Aminosäuren reagierten. Ziel dieser Ernten war es, zu
belegen, daß die Änderungen im Verlauf der Blühkurven auf einer Verschiebung des Blühens
im Vergleich zum Wachstum und zur Entwicklung der Pflanze beruht und nicht auf einem
schnelleren oder langsameren Wachstum der Pflanze. Damit können die absoluten Werte bei
den verschiedenen Behandlungen nicht miteinander verglichen werden.
Die Bezeichnung Blüte bezieht sich immer auf den Blühansatz, also die gerade sichtbaren
Blütenknospen. Pflanzen, die eine geöffnete, weiße Blüte zeigten, wurden nicht geerntet.
Glutamin wird im nachfolgenden als Gln abgekürzt.
Ergebnisse
26
3.1 Idendifikation von Glutamin als N-Quelle
45
a)
shoot FW
b)
root FW
mg
30
15
0
15
Abbildung 3/1: Die Graphen zeigen das Sproßgewicht,
Wurzelgewicht, die Gesamtbiomasse, das Sproß/WurzelVerhältnis, die Anzahl der Blätter, die Konzentration an
Protein, Aminosäuren und Nitrat bei Arabidopsis thalianaPflanzen, die 21 Tage alt waren. Angezogen wurden die
Pflanzen auf 10 mM Nitrat bzw. auf 0,2 mM Nitrat + 5 mM
Gln oder 10 mM Asparagin oder 5 mM Aspartat oder 10 mM
Alanin oder 10 mM Glutamat.
mg
10
5
0
60
Um die Rolle von Nitrat als Signalstoff auf das
c)
total biomass
Blühen testen zu können, ohne es als N-Quelle zu
benötigen, wurden zunächst mehrere Aminosäuren
20
auf ihre Eignung als alternative N-Quelle getestet.
mg
40
Dazu gehörten neben Glutamin auch Aspartat,
0
d)
shoot/root-ratio
Asparagin
und
Glutamat.
Dabei
wurden
4
Arabidopsis-Pflanzen auf Platten angezogen, die
2
ein Medium mit den betreffenden Aminosäuren
und einer niedrigen Nitratkonzentration (0,2 mM
0
e)
number of leaves
Nitrat) enthielten, um herauszufinden, ob sie ein
6
Wachstum wie bei hohen Nitratkonzentrationen
3
(10 mM Nitrat) bewirken können, ohne dabei
0
protein
µmol/g FW
12
deutliche Nebeneffekte oder Veränderungen im
f)
8
wurden im Rahmen einer Diplomarbeit von Gabi
4
Meyer zu Hörste durchgeführt. Es wurden Daten
µmol/g FW
0
45
amino
acids
g)
zu Frischgewicht (Abb. 3/1 a-c), Sproß/Wurzel-
30
Verhältnis (Abb. 3/1d), Blattanzahl (Abb. 3/1e),
15
Protein (Abb. 3/1f), den Aminosäuren (Abb. 3/1 g)
sowie die Konzentrationen von Nitrat (Abb. 3/1h)
0
18
µmol/g FW
Aussehen der Pflanzen zu bewirken. Diese Tests
nitrate
h)
und Kohlenhydraten (Abb. 3/2a-d) ermittelt.
12
6
Diese
Vortests
wurden
auf
Agarplatten
10
m
M
Ni
tra
te
5
m
10 M
m Gl
5 MAn
m
10 M sp
m As
10 M n
m Ala
M
G
lu
0
durchgeführt, bei einem Lichtregime von 12 h und
einer Lichtintensität von 80 µE/m2. Die
Ergebnisse
27
Aminosäuren wurden in Gegenwart von 0,2 mM Nitrat angeboten. Vergleicht man die Werte
der 10 mM-Bedingung ohne Gln von 10 mM Nitrat mit denen von 5 mM Gln, so zeigen sich
hierbei die meisten Übereinstimmungen. Es hat sich gezeigt, daß Gln dabei in den
Stoffwechsel einfließt und dabei sowohl die Biomassen, hierbei hauptsächlich die des
Sproßes, das Sproß/Wurzel-Verhältnis und die Konzentration der Gesamtaminosäuren
beeinflußt.
µmol/g FW
9
glucose
a)
fructose
b)
sucrose
c)
starch
d)
6
3
Abbildung 3/2: Die Graphen zeigen die Konzentrationen der
Kohlenhydrate bei Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die 21 Tage alt
waren. Angezogen wurden die Pflanzen auf 10 mM Nitrat bzw. auf
0,2 mM Nitrat + 5 mM Gln oder 10 mM Asparagin oder 5 mM
Aspartat oder 10 mM Alanin oder 10 mM Glutamat.
0
µmol/g FW
9
6
3
0
µmol/g FW
3
2
1
µmol/g FW
0
4
2
10
m
M
Ni
tr
5 ate
m
10 M
m G
5 M ln
m
10 M Asp
A
10 mM sn
m Ala
M
Gl
u
0
In einer Glutaminkonzentrationsreihe, durchgeführt in Gegenwart von 0 mM Nitrat
(die
Mediumkontamination betrug ca. 50 µM) (Abb. 3/3a) und 10 mM Gln Nitrat (Abb. 3/3b),
zeigte sich in beiden Fällen mit steigender Glutaminkonzentration eine Verschiebung der
Blühinduktion nach vorne hin im Vergleich zur 10 mM-Bedingung ohne Gln. Ohne jegliche
N-Quelle kam es dabei zu dem erwartetem Absterben der Pflanzen. Da bereits bei 5 mM Gln
in beiden Nitratkonzentrationen ein deutlicher Effekt zu sehen war, sich bei dieser
Ergebnisse
28
Konzentration in anderen Vortests aber auch einiges in Biomasse (Abb. 3/1a-c),
Sproß/Wurzel-Verhältnis (Abb. 3/1d) und Konzentration der Gesamtaminosäuren (Abb. 3/1g)
änderte, wurde die Arbeitskonzentration in den weiteren Tests auf 4 mM Gln gesenkt, um
zum einen den positiven Effekt von Glutamin auf das Blühen beizubehalten und zum anderen
die Beeinflussung der oben genannten Parameter etwas zu senken
a)
60
0 mM Glutamin
1 mM Glutamin
2 mM Glutamin
5 mM Glutamin
% Blühansatz
30
0
Abbildung 3/3: Die Graphen
zeigen die Blühverlaufs-kurven
für 0 / 1 / 2 / und 5mM Gln ,
jeweils in Gegenwart von 0 und
10 mM Nitrat bei Arabidopasis
thaliana-Pflanzen.
Die
Belichtungsdauer betrug 12 h, die
Lichtintensität 100 µE/m2 (n = 45) .
b)
10 mM Nitrat
90
0 mM Nitrat
90
60
30
0
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
Tage bis zur Blüte
Bei niedrigen Gln-Konzentrationen – 0 und 1 mM Gln – begannen die Pflanzen in Gegenwart
von 10 mM Nitrat entweder schneller oder zum gleichen Zeitpunkt zu blühen (Abb. 3/3b) wie
bei 0 mM Nitrat (Abb. 3/3a), hier förderte Nitrat die Blühinduktion.
18
0 mM Nitrat
mg Gesamtbiomasse
12
6
0
18
12
10 mM Nitrat
0 mM Glutamin
1 mM Glutamin
6
0
2 mM Glutamin
5 mM Glutamin
Abbildung 3/4: Die Graphen zeigen die Gesamtbiomassen für für 0 / 1 / 2 und 5 mM Gln von 14 Tagen alten
Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die aus den Blühverlaufskurven (Abb 3/3) stammen. Neben den verschiedenen
Gln-Konzentrationen enthielt das Medium entweder 0 mM oder 10 mM Nitrat. Die Belichtungsdauer betrug
12 h, die Lichtintensität 100 µE/m2 (n = 5-6 und die Temperatur 20°C.
Ergebnisse
29
Bei den beiden anderen Gln-Konzentrationen – 2 und 5 mM Gln – hingegen hemmt die hohe
Nitratkonzentration
(Abb. 3/3b) die Blühinduktion im Vergleich zu Gln als alleinige N-
Quelle (Abb. 3/3a). Wie sich aus den Daten ergab, hatte Glutamin in Gegenwart von 0 mM
Nitrat eine leicht fördernde Wirkung auf die Entwicklung der Biomasse, der sich vor allem ab
5 mM Gln deutlich ausprägte (Abb. 3/4a) (dabei muß berücksichtigt werden, daß die Pflanzen
ungefähr eine Woche vor dem Beginn der Blühverlaufskurven geerntet wurden). In
Gegenwart von
10 mM Nitrat zeigte sich zwischen 0 mM Gln und allen anderen
Konzentrationen
ein
leichter
Unterschied.
Dabei
differierten
die
verschiedenen
Glutaminkonzentrationen nicht sehr stark voneinander (Abb. 3/4b). Bei niedrigen
Nitratkonzentration zeigten die Pflanzen ein Verarmungswachstum, dieser N-Mangel konnte
durch Glutaminbeigabe kompensiert werden.
2
µmol/g FG Glucose
a)
µmol/g FG Fructose
b)
1
0
2
Abbildung 3/5: Die Graphen zeigen die Konzentrationen
der Kohlenhydrate, von Nitrat und Malat und die
Gesamtbiomasse von 13 Tagen alten Pflanzen, die in
Gegenwart von 10 mM Gln bzw. 10 mM Gln-Succinat
angezogen wurden. Als Nitratkonzentrationen wurden
0
mM, 1 mM und 5 mM Nitrat verwendet. Belichtungsdauer
war 12 h, Belichtungsintensität 100 µE/m2 und die
Temperatur 20°C.
1
0
2
µmol/g FG Sucrose
c)
1
0
1500
nmol/g FG Malat
d)
Um auszuschließen, daß die Wirkung von
1000
Glutamin auf einen pH-Effekt beruht und damit
500
zu Problemen im Wachstum der Pflanzen führt,
0
60
der die Blühantwort als Streßantwort auslöst,
µmol/g FG Nitrat
40
wurden Testreihen durchgeführt, bei denen neben
e)
Glutamin auch Glutamin-Succinat angeboten
20
0
10
wurde,
mg Biomasse
f)
jeweils
in
der
Gegenwart
unterschiedlicher Nitratkonzentrationen.
5
0
0 mM nitrate
beides
1 mM nitrate
10 mM Glutamine
10 mM Gln-succinate
5 mM nitrate
Ergebnisse
Es zeigte sich, daß weder die Kohlenhydrate
30
(Abb. 3/5a-c), noch Nitrat (Abb. 3/5e),
Biomasse (Abb. 3/5f) bzw. noch einzelne Aminosäuren (Daten nicht gezeigt) unterschiedlich
in Bezug auf Gln oder Gln-Succinat reagierten, lediglich Malat zeigte in Gegenwart von GlnSuccinat eine tendenzielle Zunahme (Abb. 3/5d).
Fazit:
Gln wirkt sich nicht negativ auf den internen pH-Wert der Gewebe aus, dies bedeutet, die
blühfördernde Wirkung nicht auf einer Streßantwort seitens der Pflanze beruht.
Ergebnisse
3.2
31
Auswirkung von unterschiedlichen Nitratkonzen-trationen auf das
Blühverhalten von Arabidopsis thaliana cv Columbia bei
verschiedenen Lichtregimen
3.2.1 Erhöhtes Nitratangebot führt bei Kurztagbedingungen zu einer Verzögerung der
Blühinduktion
Verwendet wurden als Nitratkonzentrationen 1 mM, 10 mM und 35 mM Nitrat mit jeweils 4
mM Glutaminbeigabe als erste N-Versorgung für die keimenden Samen. Die Lichtdauer
reichte von 8 h Licht / 16 h Dunkel als Kurztag über 12 h Licht / 12 h Dunkel als intermediäre
Tageslänge bis zu 16 h Licht / 8 h Dunkel als Langtag. Es ist bekannt, daß Arabidopsis
thaliana eine Langtagpflanze ist, deren Blühinduktion bei Kurztag stark verzögert
ist.
100
80
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
a.)
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
b.)
60
40
% Blütenansatz
20
0
100
80
60
40
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat+ 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
20
0
100
80
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
c.)
60
40
20
0
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 Tage
Abbildung 3/6: Die Graphik zeigt den Blühverlauf von Arabidopsis thaliana cv Columbia unter verschiedenen
Nitratangeboten und unterschiedenen Zeitregimen (a: 16 h Licht / 8 h Dunkel, b: 12 h Licht / 12 h Dunkel, c: 8 h
Licht / 16 h Dunkel, 20°C, ) Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 6-8) , Belichtungsintensität war
100 µE/m2.
Ergebnisse
32
Bei 16 h Licht, also Langtagbedingung trat keine deutliche Trennung der Blühverlaufskurven
für die unterschiedlichen Nitratbedingungen auf, hier war der Lichteffekt stärker als der
Nitrateinfluß auf das Blühen (Abb. 3/6a).
Bei 12 h Licht als Langtagbedingung trat eine erste Auftrennung der Blühverlaufskurven auf,
aber weitaus geringer ausgeprägt als unter den nachfolgenden Kurztagbedingungen, die
Blühverlaufskurven mit 1 mM Nitrat und 10 mM Nitrat lagen sehr eng beieinander. Die
Kurve für 35 mM Nitrat war hingegen schon deutlich abgesetzt (Abb. 3/6b).
Der Abbruch der Kurve mit 35 mM Nitrat bei 8 h Licht ergab sich aus einem Austrocknen der
Platten, d.h., hier trat ein weiterer, in diesem Fall ungewollter, Effekt auf. Es ist aber zu
erkennen, das gerade bei Kurztag eine deutliche Verzögerung der Blühinduktion mit
zunehmender Nitratkonzentration auftrat (Abb. 3/6c).
3.2.2 Erhöhte Nitratkonzentrationen führen bei höherer Blattzahl und Biomasse zur
Blühinduktion
Bei Langtagbedingungen zeigten sich zwischen den drei Nitratkonzentrationen kaum
Unterschiede in der Anzahl der Blätter (Abb. 3/7a). Bei der intermediären Tageslänge (Abb.
3/7b) traten leichte Unterschiede zwischen 1 mM Nitrat und 10 mM Nitrat, jedoch nicht
Anzahl der Blätter bei Ernte
zwischen 10 mM Nitrat und 35 mM Nitrat auf.
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
a.)
b.)
c.)
45
30
15
0
Abbildung 3/7: der Graph zeigt die Anzahl der Blätter der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. Bei a.)
liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h Licht / 16 h Dunkel. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C. Bei a.) sind die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei
1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37
Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei
35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 10 – 15).
Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Bei der Kurztagbedingung zeigte sich mit zunehmender externer Nitratkonzentration eine
Steigerung der Blattzahl (Abb. 3/7c). Aus diesen Daten ergibt sich, daß bei der Blühinduktion
mit zunehmender Nitratkonzentration eine echte Verschiebung eingetreten ist, da zum
Ergebnisse
33
jeweiligen Erntezeitpunkt sowohl die Anzahl der Blätter als auch die Biomassen (siehe
nachfolgende Graphen) angestiegen sind aufgrund einer verlängerten vegetativen Phase und
einem höheren Alter der Pflanze.
Dieser Kurvenverlauf zeigte sich auch bei der Sproßmasse. Die Biomasse stieg an, da die
Pflanzen zum Zeitpunkt der Ernte mit kürzerer Photoperiode älter waren. Beim Sproßgewicht
zeigte sich bereits bei der Langtagbedingung eine Zunahme der Biomasse zwischen 1 mM
Nitrat und den beiden höheren Nitratkonzentrationen (Abb. 3/8a). Bei dem intermediären
Tagesgang mit 12 h Licht trat diese Verteilung ebenfalls auf, wobei die Werte der Biomassen
höher lagen (Abb. 3/8b). Hier ergab sich eine Zunahme der Biomasse mit steigender
Nitratvorgung. Zwischen den beiden höheren Nitratkonzentrationen war die Steigerung
mg Biomasse Sproß
jedoch nur schwach ausgeprägt.
1200
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
a.)
b.)
c.)
900
600
300
0
Abbildung 3/8: der Graph zeigt die Biomasse des Sproßes in mg der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. Bei a.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h Licht / 16 h
Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Belichtungsintensität war 100µ E/m2. Bei a.) sind die Pflanzen
bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat +
4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75
Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind
Mittelwert und Standardfehler (n = 10 – 15).
Bei 8 h Licht waren dann die Unterschiede zwischen den verschiedenen Bedingungen am
deutlichsten, hier fand mit zunehmender Steigerung der Nitratkonzentration eine
durchgehende Zunahme der Sproßbiomasse statt (Abb. 3/8c). Es ist dabei zu beachten, daß
die Pflanzen bei 12 h und 8 h Photoperiode zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet wurden
und damit kein direkter Vergleich der absoluten Werte möglich ist.
Eine Zunahme an Biomasse mit abnehmender Tageslänge zeigte sich auch bei der Wurzelbiomasse, jedoch traten hier kaum Unterschiede zwischen den einzelnen Nitratkonzentrationen auf. Die Wurzelbiomassen stiegen von Langtagbedingungen (Abb. 3/9a) über
intermediäre Tageslänge (Abb. 3/9b) zu kurzer Photoperiode (Abb. 3/9c) deutlich an.
Ergebnisse
34
Gemessen wurden die Wurzelbiomassen, um daraus das Sproß/Wurzel-Verhältnis ermitteln
zu können.
mg Biomasse Wurzel
180
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
a.)
b.)
c.)
120
60
0
Abbildung 3/9: der Graph zeigt die Biomasse der Wurzel in mg der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. Bei a.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h Licht / 16 h
Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Belichtungsintensität war 100 µE/m2. Bei a.) sind die Pflanzen
bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat +
4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75
Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind
Mittelwert und Standardfehler (n = 10 – 15).
Die notwendigen Nitratkonzentrationen, die zu einer Hemmung der Blühinduktion führen,
sind ähnlich denen, die Änderungen im Sproß/Wurzel-Verhältnis bewirken. Aus den
gegebenen
Sproß- und Wurzelbiomassen lassen sich damit auch die Sproß/Wurzel-
Verhältnisse ermitteln. Bei 16 h Lichteinwirkung zeigte sich tendenziell ein leichter Anstieg
des Sproß/Wurzel-Verhältnisses von 1 mM Nitrat nach 10 mM Nitrat, von 10 mM Nitrat nach
Sproß/Wurzel-Verhältnis
35 mM Nitrat zeigte sich keine Veränderung (Abb. 3/10a).
9
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
a.)
b.)
c.)
6
3
0
Abbildung 3/10: der Graph zeigt das Sproß/Wurzel-Verhältnis der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
Bei a.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h Licht / 16 h Dunkel.
Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, Belichtungsintensität war 100 µE/m2. Bei a.) sind die Pflanzen bei allen
Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 33
Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt, bei 10
mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert und
Standardfehler (n = 10 – 15).
Ergebnisse
35
Dieses Bild ergab sich ebenfalls für die mittlere Photoperiode mit 12 h Licht. Dabei ergab
sich hier für die beiden höheren Nitratkonzentration, 10 mM Nitrat und 35 mM Nitrat, jedoch
eine Zunahme des Sproß/Wurzel-Verhältnisses (Abb. 3/10b), da die jeweiligen Biomassen
von Sproß und Wurzel aufgrund zunehmenden Alters der Pflanzen anstiegen. Bei
Kurztagbedingungen ergab sich eine deutliche Steigerung des Sproß/Wurzel-Verhältnisses
mit zunehmender externer Nitratversorgung (Abb. 3/10c). Damit zeigte sich insgesamt, daß
eine Zunahme mit steigender Nitratkonzentration bei Kurztagbedingungen am deutlichsten
hervortritt.
Fazit:
Die bisher gefundenen Daten zu Blattzahl, den Biomassen und dem Sproß/Wurzel-Verhältnis
zeigen, daß sich mit steigender Nitratversorgung die jeweiligen Daten ansteigen. Dabei wird
diese Tendenz mit Verkürzung der Photoperiode stärker. Der Anstieg bei Blattzahl und die
Biomassen zeigen, daß es hier zu einer Verlängerung der vegetativen Phase kommt. Die
Verschiebung der Blühinduktion mit steigendem Nitratspiegel verstärkt sich ebenfalls mit
kürzerer Photoperiode und läuft paralell mit einer Verschiebung des Sproß/Wurzel-Qotienten
als klassische Antwort auf steigende Nitratversorgung.
3.2.3 Der interne Nitratgehalt spiegelt den externen Nitratgehalt im Medium wieder
Bei Langtagbedingungen (Abb. 3/11a) spiegelte der interne Nitratspiegel die externe
Nitratversorgung wieder, je höher die externe Konzentration, desto höher war auch der interne
Nitratgehalt. Die Abwesenheit einer Hemmung der Blühinduktion bei Langtagbedingungen
beruht nicht auf einen nicht ansteigenden internen Nitratspiegel bei zunehmender externer
Nitratversorgung hier traten deutliche Unterschiede auf. Dabei war der Unterschied zwischen
1 mM Nitrat und 10 mM Nitrat größer als der Unterschied zwischen 10 mM Nitrat und 35
mM Nitrat, die Pflanzen waren bei allen drei Nitratbedingungen gleich alt zum Zeitpunkt der
Ernte. Bei der intermediären Tageslänge mit 12 h Licht zeigte sich dasselbe Bild, je höher der
externe Nitratgehalt, desto höher stiegen die internen Konzentrationen (Abb. 3/11b). Auch
hier traten zwischen 1 mM Nitrat und 10 mM Nitrat deutlichere Unterschiede auf als
zwischen 10 mM Nitrat und 35 mM Nitrat. Dabei ist zu beachten, daß der zeitliche
Ergebnisse
36
Unterschied bei 12 h Photoperiode zwischen den Ernten zwischen 1 und 10 mM Nitrat auch
größer ist als zwischen 10 mM und 35 mM Nitrat (siehe Legende).
120
a)
80
µmol/g FG Nitrat
40
0
120
b)
80
40
0
120
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
c)
80
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Wurzel
40
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
0
Abbildung 3/11: der Graph zeigt die Nitratkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. Bei
a.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 hLicht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h Licht / 16 h Dunkel. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei a.) sind die Pflanzen bei
allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM
Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt,
bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert
und Standardfehler (n = 4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Bei der Kurztagbedingung (Abb. 3/11c) nahm der interne Nitratgehalt ebenfalls entsprechend
der externen Nitratversorgung zu, hierbei traten im Gegensatz zu den beiden anderen
Photoperioden
jedoch
deutlichere
Unterschiede
zwischen
allen
drei
internen
Nitratkonzentrationen auf. Bei allen drei Nitratkonzentrationen zeigte sich im Sproß jeweils
ein höherer Gehalt als in der Wurzel, dies gilt für alle Photoperioden. Ausnahme ist die
niedrige Versorgung mit 1 mM Nitrat bei Kurztagbedingungen, hier traten zwischen Sproß
und Wurzel kaum Unterschiede auf. Bei 8 h Licht (Kurztag) ist bei 35 mM Nitrat zu
bedenken, daß die geernteten Pflanzen zwar im blühenden Stadium waren, die Ernte jedoch
zu einem sehr frühen Stadium innerhalb des Blühverlaufs stattfinden mußte, da die
Agarplatten begannen, auszutrocknen.
Fazit:
Der interne Nitratgehalt verändert sich paralell von der externen Nitratversorgung, steigende
externe Nitratversorgung führt zu zunehmenden internen Nitratspiegeln. Dabei ist dies
unabhängig von der Photoperiode, ebenso wird die Verteilung auf die Gewebe nicht
beeinflußt.
Die Tageslänge beeinflußt jedoch die hemmende Wirkung von hohen
Nitratspiegeln auf die Blühinduktion. So zeigt sich bei Langtagbedingungen kaum ein
Zusammenhang zwischen dem internen Nitratspiegeln und den Blühverlaufskurven, während
Ergebnisse
37
bei der intermediären Tageslänge bereits eine deutliche Ausprägung der Nitrathemmung bei
10 mM und 35 mM Nitrat auf die Blühinduktion zu sehen ist. Bei Kurztagbedingungen ist der
hemmende Effekt von Nitrat am deutlichsten zu sehen. Da Nitrat diese deutliche
Signalwirkung zeigt, ergibt sich daraus, daß Gln eine gute Ersatz-N-Quelle darstellt.
3.2.4
Die Gesamtaminosäuren reagieren stärker auf die Tageslänge als auf das externe
Nitratangebot
µmol/g FG Gesamtaminosäuren
40
a)
20
0
40
b)
20
0
40
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
c)
20
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Wurzel
0
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/12: der Graph zeigt die Konzentration der Gesamtaminosäuren der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. Bei a.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h
Licht / 16 h Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei
a.) sind die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei
10 mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4
mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage.
Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Bei den Gesamtaminoäuren ergab sich ein anderes Bild als bei Nitrat. Die Konzentrationen
der Gesamtaminosäuren reagierten bei Langtagbedingungen nicht auf die extern angebotenen
Nitratkonzentrationen (Abb. 3/12a). Bei niedriger Nitratversorgung (1 mM Nitrat) waren die
Konzentrationen der Gesamtaminosäuren sogar etwas höher als bei 10 mM und 35 mM Nitrat
als
externes
Nitratangebot.
Bei
dieser
Tageslänge
war
der
Konzentration
an
Gesamtaminosäuren in der Wurzel höher als im Sproß. Bei intermediärer Tageslänge zeigte
sich ebenfalls kein Zusammenhang zwischen externer Nitratversorgung und interner
Konzentration an Gesamtaminosäuren (Abb. 3/12b), hier trat jedoch kaum ein Unterschied
der Gesamtaminosäuren bei niedriger Nitratversorgung und den beiden anderen Bedingungen
auf. Die Konzentration an Gesamtaminosäuren war im Sproß höher als in der Wurzel.
Ergebnisse
38
Ausnahme war die 35 mM Nitrat-Bedingung, hier wiesen beide Gewebe die gleiche
Konzentration an Gesamtaminosäuren auf. Auch bei Kurztag zeigten die Gesamtaminosäuren
keine Abhängigkeit vom externen Nitratangebot. Der Sproß wies eine höhere Konzentration
an Gesamtaminosäuren auf als die Wurzel. Es zeigte sich insgesamt keine Abhängigkeit vom
Nitratangebot, jedoch nahmen die Spiegel der Gesamtaminosäuren mit kürzerer Photoperiode
und damit höherem Pflanzenalter insgesamt ab (Abb. 3/12c).
Fazit:
Die Gesamtaminosäuren zeigen kaum eine Abhängigkeit vom externen Nitratangebot, erhöhte
extenre Nitratversorgung bewirkt keinen Anstieg der Gesamtaminosäuren, eher eine leichte
Abnahme. Jedoch reagieren die Gesamtaminosäuren stark die Dauer der Photoperiode. Je
kürzer die Tageslänge, desto stärker sinkt der Anteil an Gesamtaminosäuren in der Pflanze.
Außerdem kommt es zu einer Verschiebung der Verhältnisse in den beiden Geweben Sproß
und Wurzel, bei Langtagbedingungen ist der Hauptanteil in den Wurzeln, bei intermediärem
und kurzem Tagesgang im Sproß zu finden.
3.2.5 Malat reagiert uneinheitlich
Malat wird als Gegenion zu Nitrat in seiner Synthese wird durch Nitrat stimuliert ( Scheible et
al. 1997a).
9
a.)
a.)
6
µmol/g FG Malat
3
0
9
b)
b.)
6
3
0
9
6
3
0
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
c)
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/13: der Graph zeigt die Malatkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. Bei
a.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h Licht / 16 h Dunkel. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei a.) sind die Pflanzen bei
allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM
Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt,
bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert
und Standardfehler (n = 4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Ergebnisse
39
Unter Langtagbedingungen (Abb. 3/13a) ergab sich keine Abhängigkeit des Malatspiegels
vom externen Nitratangebot. Der Malatgehalt lag dabei in der Wurzel höher als im Sproß. Bei
der mittleren Tageslänge mit 12 h Licht zeigte sich zunächst ein tendenzieller Anstieg der
Malatkonzentrationen von 1 mM Nitrat nach 10 mM Nitrat (Abb. 3/13b). In Gegenwart von
35 mM Nitrat setzte sich diese Tendenz jedoch nicht fort, es kam hingegen zu einem
Absinken der Malatspiegel in beiden Geweben. Auch hier wies die Wurzel eine höhere
Malatkonzentration als der Sproß vor. Bei Kurztagbedingungen nahm der Malatspiegel
paralell zum steigenden externen Nitratangebot zu, außerdem fand eine Verschiebung der
Konzentration an Malat in den Sproß statt (Abb. 3/13c).
Fazit:
Bei Langtagbedingungen und intermediärem Tagesgang ergibt sich kein direkter
Zusammenhang zwischen dem externen Nitratangebot und den internen Malatspiegeln. Bei
diesen Tageslängen fand sich der Hauptanteil in der Wurzel. Bei Kurztag zeigt sich ein
paraleller Verlauf zwischen Nitratkonzentration und Malatkonzentration, zudem kommt es
hier zu einer Umverteilung, der Hauptanteil ist bei dieser Photoperiode im Sproß zu finden.
Malat zeigt in seinen Konzentrationen keine Abhängigkeit von der Photoperiode. Allerdings
hat Malat nicht nur Pufferfunktion bei der Nitrataufnahme, sondern wird auch im GlyoxylatZyklus synthetisiert. Damit wird es nicht nur von Nitrat direkt gesteuert, sondern auch durch
andere Prozesse in der Pflanzenzelle, die eine direkte Nitratabhängigkeit verschleieren.
3.2.6 Die Kohlenhydrate zeigen mit abnehmender Tageslänge eine verstärkte
Abhängigkeit vom Nitratspiegel
Bei der nachfolgenden Besprechung der Kohlenhydrate ist zu beachten, daß die Ernte 30 – 90
min nach Lichtbeginn stattfand. Zu diesem Zeitpunkt wird die Kohlenhydratsynthese erst in
Gang gesetzt, sodaß die Zucker bzw. Stärkespiegel noch sehr niedrig liegen. Im
nachfolgenden
wurden
aber
auch
Bedingungen
mit
sehr
niedrigen
externen
Nitratkonzentrationen mit einbezogen. Nitrat steigt von Beginn der Lichtperiode an in seiner
internen Konzentration zunächst an, fällt dann aber bereits nach 3-4 h bei einer Photoperiode
von 12 h Tageslänge in Nicotiana plumbaginifolia bei einer Nitratzufuhr von 12 mM Nitrat
wieder ab (Scheible 1996). Da bei Arabidopsis thaliana die Nitrat- und Kohlenhydratspiegel
Ergebnisse
40
wesentlich niedriger liegen als bei Nicotiana plumbaginifolia, wurde dieser frühe
Erntezeitpunkt gewählt, um Nitrat messen zu können.
Betrachtet man die Konzentrationen der reduzierenden Zucker Glukose und Fruktose, so
zeigte sich bei Langtag in beiden Fällen ein hoher Kohlenhydratspiegel bei dem niedrigen
Nitratangebot von 1 mM (Abb. 3/14a+d). Mit zunehmender Nitratkonzentration nahmen
Glukose und Fruktose deutlich ab. In beiden Fällen fand sich die höhere Konzentration des
reduzierenden Zuckers in der Wurzel. Beim intermediären Teagesgang lagen die
Kohlenhydratwerte bei einer externen Nitratversorgung mit 1 mM Nitrat ebenfalls sehr hoch,
die Konzentrationen der beiden Zucker waren bei 10 mM Nitrat und 35 mM Nitrat gerade
noch meßbar (Abb. 3/14b+e), da hier die Pflanzen älter waren und damit mehr Kohlenhydrate
verbraucht wurden.
Die Verteilung der Zucker lag zugunsten der Wurzel. Bei
Kurztagbedingungen zeigte sich kaum ein Unterschied im Zuckergehalt zwischen den
verschiedenen Nitratkonzentrationen (Abb. 3/14c+f).
9
a)
6
µM/g FG Glukose
3
0
9
b)
6
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
3
0
9
c)
6
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
3
0
4,5
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
d)
3,0
µM/g FG Fruktose
1,5
0,0
4,5
e)
3,0
1,5
0,0
4,5
3,0
1,5
0,0
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
f)
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/14: der Graph zeigt die Konzentration an Glukose und Fruktose der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. Bei a+d.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b+e) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c+f)
8 h Licht / 16 h Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn.
Bei a+d) sind die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b+e) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27
Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c+f) sind sie bei 1
mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln
116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Ergebnisse
41
Bei Saccharose zeigte sich ein Abnehmen der Konzentrationen mit steigender
Nitratkonzentration unter Langtagbedingungen (Abb. 3/15a). Dies trat hauptsächlich in der
Wurzel auf, da der Sproßanteil geringer war, lagen im Sproßgewebe die Werte eher im
gleichen Bereich. Bei 12 h Tageslänge zeigte die Saccharosekonzentration von 1 mM externer
Nitratversorgung nach 10 mM Nitrat eine Abnahme, und stieg dann nach 35 mM externen
Nitratangebot wieder leicht an (Abb. 3/15b), obwohl die Pflanzen mit zunehmender externer
Nitratversorgung zu jeweils späteren Zeitpunkten geerntet wurden (siehe Legende). Dies
zeigte sich nur in der Wurzel, der Sproß wies kaum Unterschiede auf. Bei 8 h Tageslänge
nahm die Kohlenhydratkonzentration mit zunehmender Nitratkonzentration leicht zu, auch
wirkte sich dies fast auschließlich auf die Wurzel aus (Abb. 3/15c).
4,5
a)
3,0
µM/g FG Saccharose
1,5
0,0
4,5
b)
3,0
1,5
0,0
4,5
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
c)
3,0
1,5
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
0,0
µM/g FG Hexoseäquivalente Stärke
9
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
d)
6
3
0
9
e)
6
3
0
9
6
3
0
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
f)
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/15: der Graph zeigt die Konzentration an Saccharose und Stärke der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. Bei a+d) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b+e) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c+f)
8 h Licht / 16 h Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn.
Bei a+d) sind die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b+e) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27
Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c+f) sind sie bei 1
mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln
116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Ergebnisse
42
Stärke wies bei Langtagbedingungen hohe Konzentrationen bei 1 mM Nitrat auf, diese sanken
mit zunehmender Nitratversorgung ab (Abb. 3/15d). Bei der intermediären Tageslänge (12 h
Licht) lagen alle Stärkewerte recht niedrig, aber mit steigender Nitratversorgung ergab sich
auch hier eine tendenzielle Abnahme der Stärkekonzentrationen (Abb. 3/15e). Bei der kurzen
Photoperiode
ergab
sich
wiederum
eine
hohe
Stärkekonzentration
bei
geringer
Nitratversorgung, diese nahm mit steigender externer Nitratkonzentration ab (Abb. 3/15f), da
unter anderem die Pflanzen bei der Ernte verschieden alt waren und damit mehr Stärke
verbrauchten. Die Verteilung der Stärke auf die beiden Gewebe wurde weder durch Nitrat
noch durch die Photoperiode beeinflußt.
Fazit:
Mit steigender Nitratkonzentration kam es zu einer Abnahme der Kohlenhydratkonzentration
bei Langtagbedingungen. Dies zeigte sich besonders deutlich bei den reduzierenden Zuckern
und auch bei Stärke, Saccharose wurde am geringsten beeinflußt. Bei Kurztagbedingungen
ergab sich bei den reduzierenden Zuckern hingegen keine Korrelation zwischen Zuckergehalt
und
Nitratspiegel.
Saccharose
zeigte
bei
kurzer
Photoperiode
einen
leichten
Konzentrationsanstieg mit zunehmender externer Nitratversorgung, Stärke wiederum sank bei
8 h Tageslänge mit ansteigender Nitratversorgung und damit zunehmenden Alter der Pflanzen
zum Zeitpunkt der Ernte ab. Es ist nachgewiesen, daß eine Pflanze entweder Nitrat oder
Stärke akkumuliert (Scheible et al. 1997a), das zeigte sich auch hier bei einem externen
Nitratangebot von 1 mM Nitrat, dieser Effekt war bei der kurzen Photoperiode von 8 h Licht
besonders ausgeprägt. Da sich bei den niedrigen Nitratkonzentrationen (1 mM extern
angebotenes Nitrat) die Kohlenhydrate anhäufen, kann ausgeschlossen werden, daß hier die
Blühinduktion als Folge eines Kohlenhydratmangels induziert wird.
3.2.7
Einzelaminosäuren reagieren unterschiedlich auf Nitrat und Tageslängen
Bei Darstellung der Gesamtaminosäuren hat sich gezeigt, daß die Gln-Fütterung erfolgreich
war und die Gesamtaminosäuren unabhängig von der externen Nitratversorgung hoch waren.
Unabhängig davon können einzelne Aminosäuren sehr wohl stark von der externen
Nitratversorgung abhängig sein. Deswegen wurden neben den Gesamtaminosäuren auch die
einzelnen Aminosäuren mittels HPLC gemessen, um einen möglichen Zusammenhang
zwischen Aminosäurekonzentration und externer Nitratzufuhr zu ermitteln.
Ergebnisse
43
3.2.7.1 Glutamin
Glutamin zeigte bei Langtagbedingungen hohe, aber ungleichmäßig verteilte Konzentrationen
vor allem in der Wurzel auf, während der Sproß unabhängig vom externen Nitratangebot
immer gleich niedrig war (Abb. 3/16a). Dabei konnte meßtechnisch nicht berücksichtigt
werden, in welchem Maße das aufgenommene Gln diesen Spiegel beeinflußt.
24
a)
18
12
µmol/g FG Glutamin
6
0
24
b)
18
12
6
0
24
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
c)
18
12
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
6
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
0
Abbildung 3/16: der Graph zeigt die Glutaminkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
Bei a.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h Licht / 16 h Dunkel.
Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei a.) sind die Pflanzen
bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4
mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage
alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind
Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Es zeigte sich, daß der Glutamingehalt kaum durch die externe Nitratversorgung beeinflußt
wurde. Bei intermediärer Tageslänge mit 12 h Licht nahmen die Werte hingegen mit
zunehmender Nitratversorgung leicht ab. Dabei war der Sproßgehalt zunächst etwas höher als
der Wurzelgehalt, beim höchsten externen Nitratangebot war die Verteilung in den beiden
Geweben
jedoch
gleich
(Abb.
3/16b).
Bei
Kurztagbedingungen
war
die
Glutaminkonzentration unabhängig vom externen Nitratangebot in beiden Geweben sehr
niedrig (Abb. 3/16b).
3.2.7.2 Glutamat
Bei der Langtagbedingung zeigte sich kaum eine Abhängigkeit der Glutamatkonzentration
vom externen Nitratangebot, die Aminosäure war dabei gleichmäßig auf Sproß und Wurzel
verteilt (Abb. 3/17a) . Bei der mittleren Photoperiode mit 12 h Licht trat eine Aufspaltung der
Ergebnisse
44
Glutamatverteilung bezüglich der Gewebe zugunsten des Sproßes auf, jedoch keine
Abhängigkeit von der externen Nitratversorgung (Abb. 3/17b).
6
a)
4
µmol/g FG Glutamat
2
0
6
b)
4
2
0
6
c)
4
2
0
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/17: der Graph zeigt die Glutamatkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
Bei a.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h Licht / 16 h Dunkel.
Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei a.) sind die Pflanzen
bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4
mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage
alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind
Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5). Belichtungsintensität war 100µ E/m2.
Bei Kurztagbedingungen mit 8 h Licht waren die Sproßwerte bei allen Nitratangeboten
gleich; bei den Wurzelwerten lag nur der Glutamatgehalt bei 35 mM Nitrat etwas höher als
die der beiden anderen Nitratversorgungen (Abb. 3/17c).
3.2.7.3 Aspartat
Aspartat verhielt sich wie Glutamat. Bei Langtagbedingungen zeigten beide Gewebe nahezu
die gleichen Konzentrationen, es ergab sich keine Abhängigkeit vom externen Nitratspiegel
(Abb. 3/18a). Bei einer Tageslänge von 12 h sanken die Wurzelkonzentrationen im Verhältnis
zum Sproß deutlich ab, ohne daß sich eine Nitratsteuerung ergab (Abb. 3/18b). Bei kurzer
Photoperiode hatte die externe Nitratkozentration ebenfalls keinen Einfluß auf die
Aspartatkonzentration, auch hier lag die höhere Konzentration der Aminosäure im Sproß
(Abb. 3/18c).
Ergebnisse
45
a)
1,8
1,2
µmol/g FG Aspartat
0,6
0,0
1,8
b)
1,2
0,6
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
0,0
1,8
c)
1,2
0,6
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
0,0
Abbildung 3/18: der Graph zeigt die Aspartatkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
Bei a.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h Licht / 16 h Dunkel.
Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei a.) sind die Pflanzen
bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4
mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage
alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind
Mittelwert und Standardfehler (n =4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
3.2.7.4.Asparagin
3
a)
2
µmol/g FG Asparagin
1
0
3
b)
2
1
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
0
3
2
1
0
c)
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/19: der Graph zeigt die Asparaginkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
Bei a.) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b.) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c.) 8 h Licht / 16 h Dunkel.
Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei a.) sind die Pflanzen
bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b.) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4
mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c.) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage
alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind
Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Bei der Langtagbedingung zeigte sich im Asparaginspiegel keine Beeinflussung durch die
externe Nitratangebote. Der Hauptanteil an Asparagin lag in der Wurzel, die enthielt fast
doppelt so viel Asparagin wie das Sproßgewebe. Die Asparaginkonzentrationen in beiden
Geweben waren bei 35 mM Nitrat leicht erhöht gegenüber den beiden anderen externen
Ergebnisse
46
Nitratangeboten (Abb. 3/19a). Bei mittlerer Tageslänge mit 12 h Licht ergab sich tendenziell
eine leichte Konzentrationsabnahme mit zunehmender Nitratkonzentration. Der Wurzelgehalt
war niedriger als im Sproß (Abb. 3/19b). Bei Kurztagbedingungen lagen die Asparaginwerte
bei 1 mM und 10 mM externem Nitratangebot gleich niedrig, obwohl die Pflanzen
unterschiedlich alt waren, es ergab sich keine Abhängigkeit vom Nitratangebot. Bei 35 mM
Nitrat stiegen die Werte für beide Gewebe deutlich an. Der Asparagingehalt im Sproß war
höher als in der Wurzel (Abb. 3/19c). Bei kurzer Photoperiode zeigten die Asparaginwerte
keine Abhängigkeit vom externen Nitratspiegel , davon ausgenommen war die 35 mMBedingung, diese stieg deutlich an.
Fazit:
Die N-haltigen Aminosäuren zeigten keine Abhängigkeit von der externen Nitratversorgung,
sie stiegen in Gegenwart von 1 mM Nitrat als niedrige externe Nitratversorgung sogar an.
Glutamin und Asparagin wiesen unter Langtagbedingungen jeweils höhere Wurzel- als
Sproßkonzentrationen auf. Glutamat und Aspartat zeigten bei 16 h Tageslänge in beiden
Geweben gleiche Anteile auf. Bei den anderen beiden Tageslängen lag der Hauptanteil aller
vier Aminosäuren im Sproß. Die N-haltigen Aminosäuren nehmen mit kürzerer Tageslänge
und damit längerer vegetativer Phase in ihren Konzentrationen ab, sie werden „verbraucht“.
3.2.7.5 Aminosäuren aus der Photorespiration
Glycin und Serin werden während der Photorespiration im Peroxisom produziert. Dies gilt
natürlich nur für die grünen Gewebe der Pflanze, also hauptsächlich für die Blätter. Im
nichtgrünen Gewebe werden Serin und Glycin aus 3-Phosphoglycerat synthetisiert. Aus
diesem Grund werden die beiden Gewebe getrennt behandelt.
Glycin nahm unter Langtagbedingungen im Sproß nur in Gegenwart von sehr hohen
Nitratkonzentrationen gegenüber den beiden anderen Nitratangeboten ab (Abb. 3/20a). Bei
intermediärer Tageslänge ergab sich im Sproß kein Zusammenhang zwischen interner
Glycinkonzentration und externem Nitratangebot (Abb. 3/20b), dies galt auch für den Kurztag
mit 8 h Licht (Abb. 3/20c).
Ergebnisse
47
1200
a)
800
Glycin in nM/g FG
400
0
1200
b)
800
400
0
1200
c)
800
400
0
3
d)
2
Serin in µM/g FG
1
0
3
e)
2
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
1
0
3
2
1
0
f)
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/20: der Graph zeigt die Glycin- und Serinkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. Bei a+d) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b+e) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c+f) 8 h Licht / 16
h Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei a+d) sind
die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b+e) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10
mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c+f) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4
mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage.
Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n =4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Serin nahm bei 16 h Tageslänge mit ansteigender Nitratversorgung im Sproß ab (Abb. 3/20d).
Wie bei Glycin ergab sich bei eines Tageslänge von 12 h keine Korrelation zwischen
Aminosäurespiegel und externem Nitratangebot (Abb. 3/20e), dies galt auch bei der kurzen
Photoperiode (Abb. 3/20f).
Ergebnisse
48
Tabelle 1: die Tabelle zeigt das Glycin/Serin-Verhältnis der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C.Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei 16 h Licht / 8 h Dunkel
sind die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei 12 h Licht / 12 h Dunkel bei 1 mM Nitrat + 4 mM
Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei 8 h Licht /
16 h Dunkel sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei
35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
16 h
1 mM NO3/4mM Gln
Sproß
10 mM NO3/4 mM Gln
Sproß
35 mM NO3/4 mM Gln
Sproß
Glycin / Serin
Lichtdauer
12 h
8h
0,50 ± 0,03
0,13 ± 0,04
0,18 ± 0,04
0,7 ± 0,03
0,26 ± 0,07
0,28 ± 0,04
0,39 ± 0,09
0,17 ± 0,08
0,22 ± 0,07
Aufgrund dieser besprochenen Werte ergab sich auch beim Glycin/Serin-Verhältnis als Maß
für die Photorespiration bei keiner der drei Photoperioden eine Korrelation mit dem externen
Nitratspiegel. Es ergab sich auch kein direkter Zusammenhang mit der Länge der
Photoperiode, man kann aber sagen, daß bei Langtagbedingung die Glycin/Serin-Quotienten
etwas höher waren. (Tab1).
Bei den Glycin-Wurzelwerten kam es bei 16 h Tageslänge zu einer Abnahme mit
ansteigendem Nitratangebot. Beim intermediären Tagesgang ergab sich kein Zusammenhang
zwischen den beiden Parametern Aminosäurespiegel und Nitratangebot, dies galt ebenso beim
Kurztag. Dasselbe Bild ergab sich für die Serinwerte (Abb. 3/20a-f).
Fazit:
Glycin und Serin nahmen bei Langtagbedingungen mit zunehmender Nitratversorgung in
beiden Geweben ab. Es ergab sich auch eine Abnahme in Abhängigkeit von der Tageslänge.
3.2.7.6.
Aromatische Aminosäuren
Bei Langtagbedingungen nahm die Sproßkonzentration von Trypthophan mit steigendem
Nitratangebot leicht ab,der Wurzelspiegel reagierte nur bei hoher Nitratkonzentration mit
einer Abnahme (Abb. 3/21a). Bei mittlerer Tageslänge von 12 h reagierte der Sproß
uneinheitlich (Abb. 3/21b), die Wurzelkonzentration stieg mit extern ansteigender
Nitratversorgung und zunehmenden Pflanzenalter an.
Ergebnisse
150
a)
100
100
50
50
0
150
b)
100
50
0
150
c)
Tyrosin in nM/g FG
Trypthophan in nM/g FG
150
49
0
150
e)
100
50
0
150
100
100
50
50
0
0
180
d)
f)
g)
Phenylalanin in nM/g FG
120
60
0
180
h)
120
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
60
0
180
i)
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
120
60
0
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abb.ildung 3/21: der Graph zeigt die Konzentration an Trypthophan, Tyrosin und Phenylalanin der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. Bei a+d+g) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b+e+h) 12 h Licht / 12 h
Dunkel und bei c+f+i) 8 h Licht / 16 h Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90
min nach Lichtbeginn. Bei a+d+g) sind die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b+e+h) bei 1
mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37
Tage. Bei c+f+i) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und
bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n =4-5).
Belichtungsintensität war 100µ E/m2.
Bei kurzer Photoperiode zeigten sowohl Sproß als auch Wurzel keinen eindeutigen
Zusammenhang der Trypthophankonzentration mit dem Nitratangebot, die Wurzel wies
höhere Spiegel auf als der Sproß (Abb. 3/21c).
Tyrosin nahm bei 16 h Tageslänge in beiden Geweben mit steigender Nitratkonzentration ab,
die Wurzel wies höhere Konzentration auf als der Sproß (Abb. 3/21d). Bei mittlerer
Photoperiode ergab sich kein eindeutiger Zusammenhang zwischen externer Nitrat- und
Tyrosinkonzentration (Abb. 3/21e), auch die Gewebeverteilung war unregelmäßig. Das
gleiche Bild ergab sich auch für die kurze Photoperiode (Abb. 3/21f).
Bei 16 h Tageslänge nahm die Phenylalaninkonzentration in beiden Geweben mit
ansteigender Nitratversorgung ab (Abb. 3/21g), die Gewebeverteilung war jedoch nicht
durchgängig. Bei mittlerer Tageslänge war keine Steuerung durch den externen Nitratpool zu
Ergebnisse
50
erkennen (Abb. 3/21h), auch ergab sich keine klare Linie in Bezug auf die Verteilung auf
Sproß und Wurzel. Dies galt auch für die kurze Photoperiode (Abb. 3/21i).
Fazit:
Die aromatischen Aminosäuren reagieren uneinheitlich auf das zunehmende Nitratangebot.
Tyrosin
und
Phenylalanin
nehmen
unter
Langtagbedingungen
mit
ansteigendem
Nitratangebot ab. Trypthophan nimmt mit Verkürzung der Photoperiode zu. Tyrosin und
Phenylalanin verhalten sich uneinheitlich in Bezug auf die Länge der Photoperiode.
Phenylalanin weist meist einen höheren Sproßanteil auf.
3.2.7.7.
Alanin und aliphatische Aminosäuren
5,0
a)
Alanin in µM/g FG
2,5
0,0
5,0
b)
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
2,5
0,0
5,0
2,5
0,0
c)
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/22: der Graph zeigt die Konzentration an Alanin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
Bei a) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c) 8 h Licht / 16 h Dunkel. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei a) sind die Pflanzen bei
allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM
Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt,
bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert
und Standardfehler (n =4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Bei 16 h Tageslänge nahm die Wurzelkonzentration bei Alanin von 1 mM Nitrat zu den
beiden anderen Nitratkonzentrationen ab, die Sproßkonzentrationen veränderten sich kaum
(Abb. 3/22a). Bei mittlerer Photoperiode ergab sich kein Zusammenhang zwischen den
internen Alaninkonzentrationen und dem externen Nitratangebot (Abb. 3/22b), auch die
Gewebeverteilung war ungleichmäßig. Dies ergab sich auch für die kurze Photoperiode (Abb.
3/22c).
Ergebnisse
51
Valin zeigte bei Langtagbedingungen keine Abhängigkeit vom externen Nitratpool (Abb.
3/23d). Die Wurzel wies die höheren Konzentrationen auf. Diese Bild ergab sich auch für die
beiden anderen Photoperioden (Abb. 3/23b+c).
Isoleucin nahm bei 16 h Tageslänge mit ansteigenden Nitratkonzentrationen in beiden
Geweben ab, der Wurzelanteil lag über dem des Sproßes (Abb. 3/23a). Bei mittlerer
Tageslänge zeigte der Sproß uneinheitliche Isoleucinwerte, die Wurzel nahm mit
zunehmender Nitratkonzentration zu (Abb. 3/23b). Bei kurzer Photoperiode reagierten sowohl
Sproß als auch Wurzel uneinheitlich (Abb. 3/23c).
1,8
a)
120
1,2
60
0,6
0
180
b)
120
60
0
180
c)
Valin in µM/g FG
Isoleucin in nM/g FG
180
0,0
1,8
e)
1,2
0,6
0,0
1,8
120
1,2
60
0,6
0
0,0
300
d)
f)
g)
200
Leucin in nM/g FG
100
0
300
h)
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
200
100
0
300
200
100
0
i)
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/23: der Graph zeigt die Konzentration an Isoleucin, leucin und Valin der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. Bei a+d+g) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b+e+h) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei
c+f+i) 8 h Licht / 16 h Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach
Lichtbeginn. Bei a+d+g) sind die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b+e+h) bei 1 mM Nitrat
+ 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei
c+f+i) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM
Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n =4-5). Belichtungsintensität
war 100 µE/m2.
Ergebnisse
52
Leucin nahm bei Langtagbedingungen in beiden Geweben ab (Abb. 3/23d), die Wurzel wies
höhere Konzentratrionen auf. Im intermediären Tagesgang zeigte sich im Sproß keine
Abhängigkeit des Leucinspiegels vom externen Nitratpool (Abb. 3/23e), die Wurzel reagierte
tendenziell mit einer Zunahme. Die Wurzelwerte lagen höher als die Sproßwerte. Diese Bild
ergab sich auch für die kurze Photoperiode (Abb. 3/23f).
Fazit: Isoleucin und Leucin nahmen unter Langtagbedingungen ab, die anderen beiden
Photoperioden
ergaben
keinen
Zusammenhang
zwischen
Nitratangebot
und
Aminosäurekonzentration. Die besprochenen Aminosäuren nahmen mit Verkürzung der
Photoperiode und damit steigendem Pflanzenalter ab. Valin und Leucin waren hauptsächlich
im Wurzelgewebe zu finden.
3.2.7.8.
Von Aspartat abzweigende Aminosäuren – Lysin ,Methionin und Threonin
180
450 d)
300
a)
Lysin in nM/g FG
60
0
180
b)
120
60
0
180
c)
Threonin in µM/g FG
120
150
0
450 e)
300
150
0
450
120
300
60
150
0
0
50
f)
g)
Methionin in nM/g FG
25
0
50
h)
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
25
0
50
25
0
i)
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/24: der Graph zeigt die Konzentration an Lysin, Threonin und Methionin der geernteten Pflanzen
zum Zeitpunkt der Blüte. Bei a+d+g) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b+e+h) 12 h Licht / 12 h Dunkel
und bei c+f+i) 8 h Licht / 16 h Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min
nach Lichtbeginn. Bei a+d+g) sind die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b+e+h) bei 1 mM
Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei
c+f+i) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM
Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n =4-5). Belichtungsintensität
war 100 µE/m2.
Ergebnisse
53
Lysin zeigte bei 16 h Tageslänge in seinen Konzentrationen keinen Zusammenhang mit dem
externen Nitratangebot (Abb. 3/24a). Außerdem trat keine bestimmte Verteilung zwischen
Sproß und Wurzel auf. Diese Bild setzte sich bei den anderen beiden Photoperioden fort
(Abb. 3/24b+c).
Auch Methionin reagierte unter Langtagbedingungen nicht auf das ansteigende Nitratangebot,
die Wurzelkonzentration war höher als die des Sprosses (Abb. 3/24g). Auch bei intermediärer
Tageslänge zeigte sich keine Korrelation zwischen externem Nitratangebot und internen
Methioninkonzentrationen, die Verteilung zwischen Sproß und Wurzel glich sich stärker
aneinander an (Abb. 3/24h). Dasselbe galt für die kurze Photoperiode (Abb. 3/24i).
Threonin zeigte bei langer Photoperiode im Sproß keine Abhängigkeit zum externen
Nitratangebot (Abb. 3/24d), die Wurzelkonzentration nahm mit zunehmenden Nitratangebot
zu. Bei 12 h Tageslänge drehte sich das Bild, die Sproßkonzentration nahm paralell zur
Nitratkonzentration zu, die Wurzel reagierte uneinheitlich (Abb. 3/24e). Bei 8 h Tageslänge
ergab sich das gleiche Bild wie beim intermediären Tagesgang (Abb. 3/24f).
Fazit:
Die sich von Aspartat abzweigenden Aminosäuren zeigen weder in Bezug auf Nitrat noch auf
Tageslänge eine ausgeprägte Abhängigkeit.
3.2.7.9.
Aminosäuren aus dem Harnstoffzyklus – Arginin und Citrullin
Arginin zeigte unter Langtagbedingungen kaum eine Reaktion auf eine externe Veränderung
des Nitratangebotes (Abb. 3/25a). Die Verteilung war zugunsten des Sprosses. Dieses Bild
ergab sich auch für die 12 h Photoperiode (Abb. 3/25b). Unter Kurztagbedingungen nahm die
Sproßkonzentration an Arginin mit ansteigendem Nitratangebot zu, für die Wurzel ergab sich
kein
Zusammenhang
zwischen
interner
Aminosäurekonzentration
und
externer
Nitratkonzentration (Abb. 3/25c).
Unter Langtagbedingungen nahmen die Wurzelwerte von Citrullin mit ansteigendem
Nitratangebot zu, bei den Sproßwerten ergab sich kein solcher Zusammenhang (Abb. 3/25d).
Bei 12 h Tageslänge zeigte sich bei den Wurzelwerten eine Konzentrationsabnahme mit
zunehmenden Nitratpool (Abb. 3/25e). Der Sproß reagierte uneinheitlich. Unter
Kurztagbedingungen ergab sich für beide Gewebe keine externe Nitratsteuerung (Abb. 3/25f).
Ergebnisse
54
0,9 a)
0,6
Arginin in µM/g FG
0,3
0,0
0,9
b)
0,6
0,3
0,0
0,9 c)
0,6
0,3
0,0
120
d)
Citrullin in nM/g FG
80
40
0
120
80
e)
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
40
0
120
f)
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
80
40
0
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/25: der Graph zeigt die Konzentration an Arginin und Citrullin der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. Bei a+d) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b+e) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c+f)
8 h Licht / 16 h Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn.
Bei a+d) sind die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b+e) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27
Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c+f) sind sie bei 1
mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln
116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n =4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Fazit:
Die Aminosäuren aus dem Harnstoffzyklus zeigen keine Abhängigkeit vom externen
Nitratangebot. Auch die Tageslänge zeigt keinen Einfluß auf die internen Konzentrationen.
Ergebnisse
3.2.7.10.
55
Histidin
Im Langtag ergab sich kein Zusammenhang zwischen dem Nitratangebot und den
Histidinkonzentrationen in beiden Geweben (Abb. 3/26a). Bei 12 h Tageslänge stiegen die
Konzentrationen von Sproß und Wurzel tendenziell mit zunehmenden Nitratkonzentrationen
an (Abb. 3/26b). Bei Kurztag zeigte sich im Sproß eine Zunahme der Histidinkonzentration
mit ansteigendem Nitratangebot, die Wurzel zeigte keine Beeinflussung (Abb. 3/26c).
300
a)
200
Histidin in nM/g FG
100
0
300
b)
200
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
100
0
300
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
c)
200
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
100
0
Abbildung 3/26: der Graph zeigt die Konzentration an Histidin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
Bei a) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c) 8 h Licht / 16 h Dunkel. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei a) sind die Pflanzen bei
allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10 mM Nitrat + 4 mM
Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 75 Tage alt,
bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage. Dargestellt sind Mittelwert
und Standardfehler (n =4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
3.2.7.11.
δ-Aminobuttersäure = GABA
Bei 16 h Tageslänge trat kein Zusammenhang zwischen den GABA-Werten und dem
externen Nitratangebot auf, die Wurzel wies höhere Konzentrationen als der Sproß auf (Abb.
3/27a).
Bei 12 h Tageslänge nahmen Sproß und Wurzelanteile mit zunehmender
Nitratkonzentration tendenziell ab (Abb. 3/27b), die Verteilung war dieselbe wie beim
Langtag.
Unter
Kurztagbedingungen
zeigte
der
Sproß
eine
tendenzielle
Konzentrationsabnahme mit steigendem Nitratangebot, die Wurzel reagierte uneinheitlich
(Abb. 3/27c).
Ergebnisse
γ-Aminobuttersäure in µM/g FG
1,8
56
a)
1,2
0,6
0,0
1,8
b)
1,2
1 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
1mM Nitrat + 4 Gln Wurzel
0,6
0,0
1,8
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
c)
1,2
0,6
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat + 4 mM Gln Wurzel
0,0
Abbildung 3/27: der Graph zeigt die Konzentration an γ-Aminobuttersäure der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. Bei a) liegen 16 h Licht / 8 h Dunkel vor, bei b) 12 h Licht / 12 h Dunkel und bei c) 8 h Licht
/ 16 h Dunkel. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Bei a)
sind die Pflanzen bei allen Nitratbedingungen 22 Tage alt, bei b) bei 1 mM Nitrat + 4 mM Gln 27 Tage, bei 10
mM Nitrat + 4 mM Gln 33 Tage, bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 37 Tage. Bei c) sind sie bei 1 mM Nitrat + 4
mM Gln 75 Tage alt, bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln 82 Tage und bei 35 mM Nitrat + 4 mM Gln 116 Tage.
Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n =4-5). Belichtungsintensität war 100 µE/m2.
Bei δ-Aminobuttersäure wies die Wurzel immer die höhere Konzentration auf, unabhängig
vom Nitratangebot oder von der Tageslänge.
Fazit:
Die Aminosäuen zeigten kaum eine Abhängigkeit in ihrer Konzentration vom externen
Nitratangebot, die meisten der Aminosäuren reagierten aber auf kürzere Photoperioden mit
abnehmenden Konzentrationen. Ausnahme war Arginin, dieses nahm mit abnehmender
Tageslänge
zu.
Wenn
sich
ein
Zusammenhang
zwischen
der
internen
Aminosäurekonzentration und der externen Nitratversorgung ergab, dan trat dies meist bei der
Langtagsbedingung ein. Dies galt für Glycin, Serin, Tyrosin und die aliphatischen
Aminosäuren, diese nahmen bei 16 h Licht alle mit zunehmender Nitratkonzentration ab.
Ergebnisse
57
Fazit aus dem ersten Hauptversuch:
1. Nitrat führt zu einer Hemmung der Blühinduktion, dieser Effekt ist unter
Kurztagbedingungen am deutlichsten zu sehen, bei den anderen Photoperioden wirkt
die Tageslänge gegen den Nitrateinfluß. So kommt es bei Langtagbedingungen zu
einer raschen Blüte, obwohl der interne Nitratgehalt hoch ist.
2. Anhand der Daten zu Blattzahl und Biomasse wird ersichtlich, daß die Verzögerung
der Blühinduktion auf einer Verlängerung der vegetativen Phase beruht.
3. Der interne Nitratgehalt wird nur vom externen Nitratgehalt und nicht von der
Photoperiode gesteuert, hohe externe Nitratspiegel bewirken steigende interne
Nitratkonzentrationen. Bei den Gesamtaminosäuren ergibt sich keine Abhängigkeit
vom externen Nitratspiegel, wohl aber von der Tageslänge. Ebenso nehmen die
reduzierenden Zucker und Saccharose mit kürzerer Photoperiode und damit längerer
vegetativer Phase ab, während Stärke zumindest bei niedrigen Nitratkonzentrationen
zunimmt.
Matt et al. (1998) haben gezeigt, daß dies bei Kurztagbedingungen auch für Tabak gilt. Nitrat
nimmt dabei bei Tabak während der Lichtperiode ab, während die Gesamtaminosäuren
zunehmen. Die Kohlenhydrate nehmen bis auf Stärke ab, letztere nimmt zu. Dabei ist zu
beachten, daß in der vorliegenden Arbeit nur ein Zeitraum (30 – 90 min nach Lichtbeginn)
erfaßt wurde. Die einzelnen Aminosäuren zeigen keine direkte Abhängigkeit vom externen
Nitratpool. Als allgemeine Aussage gilt, daß unter Langtagbedingungen die Aminosäuren mit
steigendem Nitratangebot abnehmen, bei intermediärer Tageslänge gibt es keine einheitliche
Reaktion und bei Kurztag steigen sie in Bezug auf die Nitratkonzentrationen leicht an.
Insgesamt bestätigen die Messungen der Metaboliten, daß der interne Nitratgehalt dem
externen Nitratgehalt folgt. Weder die Gesamtaminosäuren noch die einzelnen Aminosäuren
zreagieren mit deutlichen Veränderungen, wenn die Nitratversorgung sich ändert. Dies gilt
ebenfalls für die Kohlenhydrate.
Ergebnisse
3.3
58
Blühinduktion
bei
Landsberg
erecta
und
verschiedenen
Blühmutanten unter verschiedenenen Nitratkonzentrationen
3.3.1 Blühverlauf bei Landsberg erecta unter verschiedenen Nitratregimen
In diesem Teil wird die mögliche Steuerung von Nitrat auf die Blühinduktion bereits
charakterisierter Blühmutanten, die aus verschiedenen Signalwegen stammen (siehe
Einleitung) untersucht. Das Ziel ist es, festzustellen, ob eine der getesteten Mutationen die
Hemmung der Blühinduktion durch Nitrat aufhebt, dies wäre ein Hinweis, daß Nitrat die
Blühinduktion über einen der charakterisierten Signalwege steuert. Diese Blühmutanten
haben Landsberg erecta als Hintergrund, deswegen wird zunächst eine Darstellung der Daten
zu Landsberg erecta gegeben. Neben der bereits verwendeten Hauptversuchsreihe mit 1 mM ,
10 mM und 35 mM Nitrat mit 4 mM Gln als jeweiligem Zusatz ging es um die Beantwortung
zweier weiterer Fragen:
1.) Wie beeinflußt konventioneller Nitratmangel die Blühinduktion? Dazu wird 0,5 mM
Nitrat ohne Glutaminzusatz als Mangelbedingung eingesetzt.
2.) Wirkt Glutamin selbst oder seine Derivate blühfördernd? Ein Vergleich dieser
Behandlung mit der Behandlung, die 10 mM Nitrat + 4 mM Gln beinhaltet, sollte
Aufschluß darüber geben, ob Glutamin-Fütterung selbst einen Einfluß auf die
Blühinduktion hat. Dazu wird 10 mM Nitrat ohne Glutaminzusatz verwendet.
Um das System nicht zu kompliziert zu gestalten, wurde nur ein Zeitregime – 12 h
Photoperiode
–
verwendet.
Bei
Columbia
hat
sich
gezeigt,
daß
unter
diesen
Tagesbedingungen die Hemmung durch hohe Nitratkonzentrationen bereits greift, auf der
anderen Seite umgeht man das Problem, daß die Platten aufgrund langer Versuchszeiten
austrocknen könnten.
Alle nachfolgenden Graphiken sind jeweils in der Skala angepaßt, um zum einen Ler und
Mutante miteinander vergleichen zu können, aber auch die einzelnen Mutanten untereinander.
Die Stärkegraphiken weichen davon ab, hier sind die Unterbrechungen so gewählt worden,
Ergebnisse
59
daß Wildtyp und Mutante möglichst günstig miteinander vergleichbar sind. Die Gesamtskala
wurde jedoch nicht verändert. Glutamin wird im nachfolgenden als Gln abgekürzt.
3.3.1.1 Blühverlaufskurven und Biomassen bei Landsberg erecta
In Anwesenheit von steigenden Nitratkonzenttrationen, jeweils mit Glutamin, kam es bei Ler
zu einer Verzögerung der Blühinduktion. Dabei verliefen die Kurven für 1 mM Nitrat und 10
mM Nitrat, fast paralell, während bei überoptimaler Versorgung mit 35 mM Nitrat + 4 mM
Gln die Kurve deutlich verzögert war gegenüber den anderen beiden Kurven (Abb. 3/28).
Dieser Kurvenverlauf ergab sich auch bei Col (Abb. 3/6b). Beide Ökotypen sind in der
Literatur als frühblühend beschrieben worden. Die Verzögerung der Blühinduktion bei
zunehmender Nitratkonzentration beruhte auf einer Verlängerung der vegetativen Phase. Die
Blattzahl stieg in Gegenwart von Gln mit steigender Nitratkonzentration von 1 mM Nitrat bis
nach 35 mM Nitrat an (Abb. 3/29a). Hier zeigte sich ein deutlicherer Nitrateinfluß als bei Col
(Abb. 3/7b), bei diesem waren die Unterschiede bei den Blattzahlen zwischen den einzelnen
Nitratkonzentrationen nicht so ausgeprägt bei dieser Tageslänge. Bei Col zeigte sich der
Nitrateinfluß nur zwischen 1 mM Nitrat + 4 mM Gln und 10 mM Nitrat + 4 mM Gln.
% Blühansatz
100
1 mM Nitrat / 4 mM Gln
10 mM Nitrat / 4 mM Gln
35 mM Nitrat / 4 mM Nitrat
0,5 mM Nitrat / 0 mM Gln
10 mM Nitrat / 0 mM Gln
80
60
40
20
0
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
Tage
Abbildung 3/28: Die Graphik zeigt den Blühverlauf von Arabidopsis thaliana cv Landsberg erecta unter
verschiedenen Nitratangeboten. Die Lichtintensität betrug 100 µE/m2, die Lichtdauer 12 h, die Temperatur
durchweg 20°C. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 6-8).
Die Blühverlaufskurve zur Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) war am weitesten nach hinten
verschoben, diese Kurve erweckte zuerst den Eindruck, daß hier eine Hemmung des Blühens
eintrat.
Es ist jedoch wichtig, sich daran zu erinnern, daß diese Pflanzen wesentlich
langsamer wachsen als Pflanzen, die mit einer adequaten Nitratkonzentration versorgt
werden. Unter diesen Umständen ergibt sich ein völlig anderes Bild, wenn Blühverlauf und
physiologischer Status miteinander in bezug gesetzt werden.
Sowohl Blattzahl (Abb. 3/29a) als auch die Biomassen (Abb. 3/29b+c) und das
Sproß/Wurzel-Verhältnis (Abb. 3/29d) waren bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
niedriger als bei den anderen Bedingungen, sodaß die Blühinduktion unter Berücksichtigung
Ergebnisse
60
dieser physiologischer Daten sogar verfrüht eingetreten war. Die 10 mM-Bedingung ohne Gln
zeigte eine stärkere Hemmung der Blühinduktion gegenüber der entsprechenden Bedingung
mit Gln. Grundsätzlich ergab sich auch bei Ler eine Verzögerung der Blühinduktion durch
Verlängerung der vegetativen Phase bei Steigerung der externen Nitratversorgung. Dies trat
auch ohne Glutaminzusatz auf, wurde aber durch Glutaminbeigabe deutlich sichtbar, da Nitrat
eher als Signalstoff von der Pflanze verwendet wurde. Die Blattzahl und die Biomasse wurde
durch das Weglassen von Gln kaum beeinflußt, obwohl die Pflanzen zum Zeitpunkt der Ernte
älter waren als die Pflanzen aus der vergleichbaren Ernte mit Gln, ein Hinweis darauf, daß
Gln-Zusatz nicht die vegetative Phase verkürzt, sondern das Wachstum beschleunigt.
18
Anzahl der Blätter bei Ernte
a)
12
6
0
450
mg Sproß
b)
mg Biomasse Wurzel
c)
300
150
0
90
60
30
0
6
4
2
0
Sproß/Wurzel-Verhältnis
d)
1 mM Nitrat / 4 mM Gln
10 mM Nitrat / 4 mM Gln
35 mM Nitrat / 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat / 0 mM Gln
10 mM Nitrat / 0 mM Gln
Abbildung 3/29: Der Graph zeigt die Anzahl der Blätter, die beiden Biomassen für Sproß und Wurzel sowie das
Sproß/Wurzel-Verhältnisr der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die
Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM
Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100
µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 10 – 15).
Vergleicht man die beiden Bedingungen ohne Gln, so zeigte sich, daß die Pflanzen bei
10 mM Nitrat als externe N-Versorgung im Vergleich zur Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
verspätet blühten, sie wiesen zum Zeitpunkt der Blüte ein 10-15faches Sproßgewicht auf
Ergebnisse
61
(Abb. 3/29b). Auch aus diesen beiden Bedingungen ergibt sich, daß ein Anstieg der externen
Nitratkonzentrationen zu einer Verzögerung der Blühinduktion führt.
Bei der Wurzelbiomasse ergab sich dieselbe Verteilung der Biomassen wie beim Sproß in der
Hauptversuchsreihe (Abb. 3/29c). Nur die Biomasse bei 0,5 mM Nitrat ohne Glutamin war
höher im Vergleich zu den anderen Bedingungen. Auch hier zeigte sich kein Unterschied
zwischen 10 mM Nitrat mit oder ohne Gln, beide Bedingungen wiesen die gleiche
Wurzelbiomasse auf. Die sich daraus ergebenden Folgerungen sind bereits beim
Sproßgewicht erklärt.
Da sowohl bei Sproß als auch bei Wurzel mit steigender externer Nitratkonzentration eine
Zunahme der Biomasse eintrat, kam es bei der Hauptversuchsreihe zu einer Zunahme des
Sproß/Wurzel-Verhältnisses mit steigender Nitratversorgung (Abb. 3/29d). Aus den niedrigen
Biomassewerten für Sproß und Wurzel bei Mangelernährung (0,5 mM Nitrat) ergab sich das
zu erwartende niedrige Sproß/Wurzel-Verhältnis. Die 10 mM-Bedingung ohne Gln wies in
etwa das Sproß/Wurzel-Verhältnis wie die entsprechende Bedingung mit Gln auf, hier fand
also keine Beeinflussung statt.
Fazit:
Die Blattzahl und die Biomassen sowie das Sproß/Wurzel-Verhältnis stiegen mit
zunehmender externer Nitratversorgung an. Bei niedriger externer Nitratversorgung ergaben
sich niedrige Blattzahl und niedrige Biomassen, die Pflanzen blühten damit in einem
physiologisch jüngeren Stadium als die anderen Bedingungen. Glutaminzugabe führte zwar
zu einer früheren Blüte, bewirkt aber keine verkürzte vegetative Phase, sondern ein
beschleunigtes Wachstum und wirkte sich nicht auf das Sproß/Wurzel-Verhältnis aus. Die
Veränderungen im Blühverhalten traten als Antwort auf Nitratversorgungen auf, die ebenfalls
das Sproß/Wurzel-Verhältnis beeinflussen.
3.3.1.2
Nitrat, Gesamtaminosäuren und Malat
Der interne Nitratspiegel spiegelte die externe Nitratversorgung wieder bei den drei
Hauptbedingungen – 1 mM, 10 mM und 35 mM Nitrat (jeweils mit 4 mM Gln) -, der Sproß
wies jeweils die höheren Konzentrationen auf (Abb. 3/30a). Die Konzentrationen der
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) lagen kaum unter denen der niedrigen Nitraternährung mit
Ergebnisse
1 mM Nitrat/
62
4 mM Gln, obwohl die Pflanzen bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
wesentlich älter waren als bei der niedrigen Nitraternährung. Die Nitratspiegel der 10 mMBedingung ohne Gln waren niedriger als die der vergleichbaren Bedingung mit Glutamin.
Dies kann daran liegen, die Pflanzen älter waren, als die Blühinduktion einsetzte, sodaß davon
ausgegangen werden kann, daß insgesamt mehr N verbraucht worden ist.
µM/g FG Nitrat
a)
60
30
0
40
µM/g FG Gesamtaminosäuren
b)
20
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
15
µM/g FG Malat
c)
10
5
0
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Niitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat/0 mM Gln Sproß
0,5 mM Nitrat/0 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/0 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/0 mM Gln Wurzel
Abbildung 3/30: der Graph zeigt den Nitratgehalt der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM
Nitrat/4 mM Gln sind die Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM
Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage . Die Wachstumstemperatur betrug
20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn.
Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Bei den Gesamtaminosäuren zeigte sich kein direkter Zusammenhang zwischen der internen
Konzentration und den angebotenen Nitratkonzentrationen (Abb. 3/30b). In Gegenwart von
Glutamin waren die Gesamtaminosäurespiegel in beiden Geweben hoch, sanken mit
steigender Nitratversorgung jedoch leicht ab. Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) wies
deutlich niedrigere Konzentrationen an Gesamtaminosäuren auf und zeigte eine klare
Gewebeverteilung zugunsten des Sproßes. Auch die Gesamtaminosäurespiegel der 10 mMBedingung ohne Gln lagen deutlich unter der Vergleichsbedingung mit Gln. Aus diesen
beiden Bedingungen läßt sich also erkennen, daß die Gln-Fütterung zu einem Anstieg in der
Konzentration der Gesamtaminosäuren führte.
In Gegenwart von Glutamin zeigte sich bei Malat sowohl für Sproß als auch für Wurzel bei
der überoptimalen Nitratversorgung eine höhere Konzentration im Vergleich zu den beiden
Ergebnisse
63
anderen Nitratbedingungen (Abb. 3/30c). Insgesamt ergab sich keine eindeutige
Beeinflussung durch den externen Nitratspiegel. Bei Mangelernährung zeigten sich ähnliche
Werte für Sproß und Wurzel wie für die drei Bedingungen mit Gln. Die hier vorliegenden
Malatspiegel waren höher als der vorhandene interne Nitratspiegel vermuten ließ, dies hängt
damit zusammen, daß Malat nicht nur als Gegenion zu Nitrat synthetisiert wird, sondern auch
in anderen Prozessen entsteht. Für die 10 mM-Bedingung ohne Gln ergaben sich deutlich
höhere Konzentrationen an Malat für beide Gewebe im Vergleich zur Bedingung mit Gln, die
Plfanzen sind allerdings auch älter als bei der Gln-haltigen Bedingung. Die Abwesenheit von
Gln führte zu einem Anstieg von Malat, auch dies verlief nicht paralell mit dem internen
Nitratspiegel. Bei Malat gilt unabhängig vom externen Nitratangebot und der An- bzw.
Abwesenheit von Glutamin, daß der Sproß eine niedrigere Konzentration vorwies als die
Wurzel.
3.3.1.3
Lösliche Zucker und Stärke
Bei ansteigender Nitratversorgung in Gegenwart von Gln nahmen die reduzierenden Zucker,
Saccharose und Stärke ab (Abb. 3/31 a-d). Saccharose reagierte insgesamt kaum auf eine
Veränderung im externen Nitratangebot (Abb. 3/31c). Der Hauptanteil lag bei den
reduzierenden Zuckern und Saccharose in der Wurzel, bei Stärke im Sproß. Bei
Mangelernährung (0,5 mM Nitrat) stiegen alle Kohlenhydratspiegel deutlich an und lagen
sogar höher als die Werte der niedrigen Nitraternährung mit 1 mM Nitrat/4 mM Gln, obwohl
die Pflanzen älter waren und damit theoretisch mehr Zucker hätten verbrauchen können. Bei
Glukose blieb die Gewebeverteilung gleich bei allen Bedingungen(Abb. 3/31a), bei der
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) war der Hauptanteil an Fruktose und Saccharose im Sproß
zu finden (Abb. 3/31b,c). Bei Stärke wiederum war die Verteilung in der Mangelbedingung
(0,5 mM Nitrat) gleich der in den anderen Bedingungen (Abb. 3/31d). Bei der 10 mMBedingung ohne Gln lagen die Konzentrationen für die reduzierenden Zucker und Saccharose
etwas höher als die entsprechenden Konzentrationen in Gegenwart von Nitrat und Gln. Bei
Stärke verschob sich der Hauptanteil aus dem Sproß in die Wurzel im Vergleich zur 10 mMNitrat-Bedingung mit Gln. Bei Vergleich der beiden Bedingungen ohne Gln zeigte sich mit
ansteigender Nitratkonzentration ein Abnehmen der Kohlenhydratkonzentrationen ähnlich
wie in der Hauptversuchsreihe.
Ergebnisse
15
64
µM/g FG Glukose
a)
µM/g FG Fruktose
b)
10
5
0
12
8
4
0
27
µM/g FG Saccharose
c)
18
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
9
0
36
30
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
µM/g FG Hexoseäquivalente Stärke
d)
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat/0 mM Gln Sproß
0,5 mM Nitrat/0 mM Gln Wurzel
3
10 mM Nitrat/0 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/0 mM Gln Wurzel
0
Abbildung 3/31: der Graph zeigt die Konzentrationen von Glukose, Fruktose, Saccharose sowie Stärke der
geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM
Nitrat 35 Tage . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 - 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Fazit:
Niedrige Nitratspiegel führen zu einer Anhäufung von Kohlenhydraten, dies ist bereits für
Tabak nachgewiesen (Scheible et al. 1997). Die An- oder Abwesenheit von Glutamin scheint
sich auf die Verteilung der Kohlenhydrate auszuwirken, es kommt teilweise zu einer
Umkehrung der Verteilung der Stärke auf die beiden Gewebe.
3.3.1.4
Glutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat
Diese N-haltigen Aminosäuren reagierten nicht oder nur mit einer leichten Abnahme auf
zunehmende Nitratkonzentrationen, sofern das Medium zusätzlich Gln enthielt. Die
Gewebeverteilung war ungleichmäßig. Glutamin war tendenziell stärker in der Wurzel
vertreten (Abb. 3/32a), was vermutlich auf die Gln-Fütterung zurückgeht, die anderen drei
Aminosäuren zeigten einen höheren Sproßanteil (Abb. 3/32 b-d). In der Mangelbedingung
(0,5 mM Nitrat) wiesen alle vier Aminosäuren die geringsten Konzentrationen auf, der
Mangel an Nitrat als Grundbaustoff führte zu einer Absenkung der Aminosäurespiegel.
Glutamin und Asparagin reagierten besonders stark mit niedrigen Spiegeln auf die
Ergebnisse
65
Mangelernährung, Glutamat und Aspartat wiesen höhere Spiegel als die anderen beiden
Aminosäuren auf.
10
a)
Glutamin in µM/g FG
b)
Glutamat in µM/g FG
5
0
3,0
1,5
0,0
1,5
c)
Asparagin in µM/g FG
1,0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5
0,0
d)
Aspartat in µM/g FG
1,8
1,2
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat/0 mM Gln Sproß
0,5 mM Nitrat/0 mM Gln Wurzel
0,6
10 mM Nitrat/0 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/0 mM Gln Wurzel
0,0
Abbildung 3/32: der Graph zeigt die Konzentrationen der Aminosäuren Aspartat, Asparagin, Glutamat und
Glutamin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Pflanzen 28
Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage
und bei 10 mM Nitrat 35 Tage . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die
Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler
(n = 4-5).
Bei Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) wiesen Sproß und Wurzel ähnliche Spiegel auf. Bei
der 10 mM-Bedingung ohne Gln sanken die beiden Aminosäuren Glutamin und Asparagin im
Vergleich zur Gln-haltigen Bedingung deutlich ab, die Gln-Fütterung förderte also die
Synthese dieser beiden Aminosäuren. Glutamat und Aspartat hingegen reagierten nicht auf
die Abwesenheit von Gln, ihre Synthese ist nicht direkt betroffen.
3.3.1.5
Aminosäuren aus der Photorespiration
Glycin und Serin werden im grünen Gewebe im Zusammenhang mit der Photorespiration
synthetisiert, in der Wurzel entstehen sie aus 3-Phosphoglycerat. Glycin reagierte im
Sproßgewebe tendenziell mit einer Zunahme bei ansteigendem Nitratangebot, wenn
gleichzeitig
Gln
angeboten
wurde.
Die
Wurzel
reagierte
hingegen
Konzentrationsabnahme unter den beschriebenen Bedingungen (Abb. 3/33a).
mit
einer
Ergebnisse
0,75
66
a)
Glycin in µM/g FG
0,50
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,25
0,00
0,9
b)
Serin in µM/g FG
0,6
0,3
0,0
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/33: der Graph zeigt die Konzentrationen der Aminosäuren Glycin und Serin der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35
Tage . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn.Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) wies in beiden Geweben die niedrigsten
Glycinkonzentrationen auf, mangelnde Nitratversorgung führte zu einer Inhibierung der
Glycinsynthese. Die Werte der 10 mM-Bedingung ohne Gln lagen niedriger als die
Vergleichswerte in der entsprechenden Bedingung mit Gln, aufgrund höherem Pflanzenalter
wurde die Aminosäure verbraucht. Beim Vergleich der beiden Bedingungen ohne Gln zeigte
sich kein ausgeprägter Unterschied, wohl zeigten beide Bedingungen jedoch niedrigere
Glycinspiegel als die Bedingungen mit Gln auf und zwar unabhängig vom externen
Nitratspiegel. Hier hatte weniger Nitrat einen Einfluß auf die Synthese, wohl aber die Anoder Abwesenheit von Gln.
Serin reagierte kaum auf die Zunahme der Nitratkonzentrationen in Anwesenheit von Gln,
dies betraf beide Gewebe. Auch bei Mangelernährung sind die Serinkonzentrationen
vergleichbar mit denen der anderen Nitratangebote (Abb. 3/33b). Auch die 10 mM NitratBedingung ohne Gln zeigte kaum andere Serinkonzentrationen als zum einen die
vergleichbare Bedingung mit Gln wie zum anderen die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat).
Daraus ergibt sich, daß Serin weder von der vorliegenden Nitratkonzentration noch von der
An- bzw. Abwesenheit von Gln sehr beeinflußt wird.
Ergebnisse
3.3.1.6
67
Aromatische Aminosäuren
In Gegenwart von Gln reagierte Trypthophan nicht auf das externe Nitratangebot, dies gilt für
beide Gewebe (Abb. 3/34a). Bei Mangelernährung stiegen die Konzentrationen in beiden
Geweben im Vergleich zu den anderen Nitratangeboten leicht an, beide Gewebe wiesen den
gleichen
Spiegel
auf.
Die
10
mM-Bedingung
ohne
Gln
wies
höhere
Aminosäurekonzentrationen als die Bedingung mit Gln auf. Bei den Bedingungen ohne Gln
zeigte sich eine leichte Abnahme an Trypthophan mit steigendem Nitratangebot. Tyrosin
reagierte bei Nitrat + Gln wie Trypthophan nicht auf zunehmende Nitratkonzentrationen
(Abb. 3/34b). Die Konzentrationen bei Mangelernährung lagen nur gering unter denen der
anderen Bedingungen. Bei der 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln ergab sich kein Einfluß
durch den Wegfall von Gln. Insgesamt reagierte Tyrosin weder auf das externe Nitratangebot
noch auf die An- bzw Abwesenheit von Gln.
a)
Trypthophan in nM/g FG
20
10
0
30
b)
Tyrosin in nM/g FG
15
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0
50
c)
25
0
Phenylalanin in nM/g FG
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/34: der Graph zeigt die Konzentration der Aminosäuren Trypthophan, Tyrosin und Phenylalanin
der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Pflanzen 28 Tage alt, Bei
10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10
mM Nitrat 35 Tage . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Lichdauer
12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 - 5).
Phenylalanin zeigte keine Steuerung durch das externe Nitratangebot, auch die
Gewebeverteilung wurde nicht beeinflußt.Bei Mangelernährung sanken die Konzentrationen
nur leicht ab im Vergleich zu den anderen Bedingungen, die geernteten Pflanzen waren bei
dieser Bedingung am ältesten. Auch die An- oder Abwesenheit von Gln wirkte sich nicht auf
die Phenylalaninspiegel aus (Abb. 3/34c).
Ergebnisse
3.3.1.7
68
Alanin und aliphatische Aminosäuren
Alanin zeigte tendenziell eine Konzentrationsabnahme mit steigender Nitratzufuhr in
Gegenwart von Glutamin im Wurzelgwebe, der Sproß reagierte nicht (Abb. 3/35a). Bei
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) zeigte das Sproßgewebe eine stärkere Abnahme an Alanin
als die Wurzel, die Werte lagen niedriger als bei allen anderen Bedingungen. Die Werte der
10 mM-Bedingung ohne Gln lagen unter der der Vergleichsbedingung mit Gln, zudem war
das Verhältnis in Bezug auf die Gewebe vertauscht. Mit Gln wies die Wurzel die höheren
Alaninkonzentrationen auf, ohne Gln ergab sich beim Sproß die höhere Alaninkonzentration .
Die aliphatischen Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin zeigten in Anwesenheit von Gln
keine Abhängigkeit vom externen zunehmenden Nitratangebot (Abb. 3/35 b-d).
a)
2
Alanin in µM/g FG
1
0
120
b)
Isoleucin in nM/g FG
80
40
0
90
c)
Leucin in nM/g FG
60
30
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0
1,2
0,8
0,4
0,0
d)
Valin in µM/g FG
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/35: der Graph zeigt die Konzentrationen von Alanin, Isoleucin, Leucin und Valin der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35
Tage . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 - 5).
Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) führte bei den Aliphaten zu einer etwas geringeren
Wurzelkonzentration im Vergleich zu den anderen Nitratangeboten, der Sproß zeigte keine
Beeinflussung. Die Synthese der Aliphaten wurde nicht durch Gln beeinflußt, die 10 mM-
Ergebnisse
69
Bedingung ohne Gln wies die gleichen Spiegel wie die entsprechende Bedingung mit Gln aus
der Hauptversuchsreihe auf. Bei Isoleucin und Leucin zeigte sich bei den Bedingungen ohne
Gln mit steigender Nitratversorgung eine tendezielle Zunahme der Wurzelkonzentration. Für
alle Bedingungen galt, daß die Gewebeverteilung mit der höheren Wurzelkonzentration nicht
beeinflußt wurde.
3.3.1.8
Aminosäuren aus dem Harnstoffzyklus
Arginin zeigte in seinen Konzentrationen keine Abhängigkeit vom steigenden Nitratangebot,
sofern das Medium Gln enthielt (Abb. 3/36a). Die Sproßkonzentration war bis zu 2mal so
hoch wie die Wurzelkonzentration, unabhängig vom Alter der Pflanzen. Bei 0,5 mM Nitrat
als Mangelernährung sanken die Konzentrationen beider Gewebe sehr stark ab, die Wurzel
wies hier tendenziell etwas mehr Arginin als der Sproß auf.
900
Arginin in nM/g FG a)
600
300
0
75
Citrullin in nM/g FG b)
50
25
0
40
20
0
Ornithin in nM/g FG c)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/36: der Graph zeigt die Konzentrationen von Arginin, Citrullin und Ornithin der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35
Tage . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 - 5).
Auch die 10 mM-Bedingung ohne Gln zeigte deutlich verringerte Konzentrationen im
Vergleich zur 10 mM-Nitrat-Bedingung mit Gln. Die Verteilung auf Sproß und Wurzel war
durch die Abwesenheit von Gln nicht beeinflußt. Daraus kann abgeleitet werden, daß nicht
der Mangel an Nitrat, sondern der Mangel an Gln zu einem Absenken der Spiegel führte.
Diese Bild ergab sich auch für Citrullin, wobei die Konzentrationen grundsätzlich ca. ein
Ergebnisse
70
Zehntel derer von Arginin betrugen (Abb. 3/36b). Ornithin reagierte uneinheitlich auf das
externe Nitratangebot in Gegenwart von Gln (Abb. 3/36c). Im Gegensatz zu den beiden
anderen Aminosäuren wiesen Sproß und Wurzel vergleichbare Konzentrationen auf. Bei
Mangelernährung sanken die Spiegel in Sproß und Wurzel sehr stark ab, die
Ornithinkonzentrationen nahmen jedoch im Vergleich zu den anderen Bedingungen nicht so
dramatisch ab wie bei Arginin und Citrullin. Auch die 10 mM-Bedingung ohne Gln zeigte
keinen starken Abfall im Vergleich zur Gln-haltigen Bedingung mit 10 mM Nitrat. Die
Synthese von Ornithin wurde durch die Abwesenheit von Gln nicht so stark beeinflußt wie die
Synthese von Arginin und Citrullin. Bei den beiden Bedingungen ohne Gln ergab sich ein
leichtes Ansteigen der Ornithinkonzentration mit zunehmender Nitratversorgung in beiden
Geweben.
3.3.1.9
Aminosäuren, die sich von Aspartat ableiten
Lysin zeigte mit ansteigender Nitratversorgung und Gln im Medium einen Gehaltsabfall in
beiden Geweben (Abb. 3/37a). Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) lag in ihren
Konzentrationen
150
nur
minimal
unter
denen
der
a)
Lysin in nM/g FG
b)
Methionin in nM/g FG
anderen
Nitratangebote.
100
50
0
9
6
3
0
c)
0,30
0,15
0,00
Threonin in µM/g FG
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 m Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 M Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/37: der Graph zeigt die Konzentration von Lysin, Methionin und Threonin der geernteten Pflanzen
zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln
29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C., die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 –
90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 -5).
Ergebnisse
71
Wie an der 10 mM-Bedingung ohne Gln zu erkennen ist, hatte die Ab- oder Anwesenheit von
Gln keinen Einfluß auf den Lysinspiegel. Die Wurzel wies unter allen Bedingungen die
höhere Lysinkonzentration auf. Methionin zeigte keine spezifische Abhängigkeit von der
externen Nitratversorgung, sogern Gln zusätzlich vorhanden war (Abb. 3/37b). Auch die
Gewebeverteilung war uneinheitlich. Bei 0,5 mM Nitrat sanken die Konzentrationen in Sproß
und Wurzel etwas ab im Vergleich zu den anderen Bedingungen. Bei der 10 mM-Bedingung
ohne Gln kam es in der Wurzel zu einem Anstieg der Methioninkonzentration gegenüber der
10 mM-Nitrat-Bedingung mit Gln, der Sproß verhielt sich indifferent. Bei Abwesenheit von
Gln stieg die Methioninkonzentration mit steigender externer Nitratkonzentration an, dies trat
besonders deutlich in der Wurzel auf. Threonin zeigte in der Hauptversuchsreihe keine
Abhängigkeit vom externen Nitratangebot (Abb. 3/37c). Die Wurzel wies ungefähr doppelt so
hohe Konzentrationen an Threonin wie der Sproß auf, unabhängig vom Nitratangebot und
vom Alter der Pflanzen. Bei Mangelernährung sanken die Spiegel beider Gewebe deutlich ab,
Die 10 mM-Bedingung ohne Gln wies im Vergleich zur 10 mM Nitrat-Bedingung mit Gln
eine Abnahme an Threonin nur in der Wurzel auf. Wie bei Methionin zeigte sich bei reiner
Nitratversorgung ein Ansteigen des Threoninspiegels in beiden Geweben mit zunehmender
Nitratversorgung.
3.3.1.10 Histidin
Histidin reagierte bei der Kombination Nitrat und Gln kaum auf die steigenden
Nitratkonzentrationen (Abb. 3/38). Bei Mangelernährung sank der Wurzelspiegel im
Vergleich zu den anderen Bedingungen ab, der Sproß reagierte nicht. Auch bei der 10 mMBedingung ohne Gln nahm die Wurzelkonzentration ab im Vergleich zur Gln-haltigen
Bedingung. Bei allen Bedingungen lag der Hauptanteil an Histidin in der Wurzel.
1 mM NItrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
90
60
30
0
Histidin in nM/g FG
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/38: der Graph zeigt die Konzentration von Histidin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 –
90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 - 5).
Ergebnisse
3.3.1.11
72
γ-Aminobuttersäure
γ-Aminobuttersäure (GABA) reagierte mit steigender externer Nitratversorgung in Gegenwart
von Gln mit einem Konzentrationsabfall in der Wurzel, der Sproß reagiert kaum (Abb. 3/39).
Unter Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) nahm die Konzentration in beiden Geweben ab im
Vergleich zu den anderen Bedingungen. Die 10 mM-Bedingung ohne Gln wies die gleichen
GABA-Konzentrationen wie mit Gln auf, die Synthese wird also nicht durch die An- oder
Abwesenheit von Gln beinflußt.
1 mM NItrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
1,2
0,8
0,4
0,0
γ−Aminobuttersäure in µM/g FG
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/39: der Graph zeigt die Konzentration von γ-Aminobuttersäure der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29
Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 –
90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 - 5).
Ohne Gln ergab sich eine leichte Zunahme an GABA in beiden Geweben, wenn die externen
Nitratkonzentrationen anstiegen. In der Wurzel war die Konzentration immer höher als im
Sproß.
Ergebnisse
73
3.2.2 tfl1= terminal flower 1
Bei den nachfolgenden Graphen – dies gilt für alle Mutanten – werden die Daten vom
Wildtyp Landsberg erecta den Daten der jeweiligen Mutante gegenübergestellt, Dies
ermöglicht einen direkten Vergleich der Datensätze.
Bei tfl handelt es sich um ein Genprodukt, das indirekt die Aktivität eines Inhibitors der
Blühprimordia-Induktion beeinflußt, indem es ihn stabilisiert. (Alvarez et al.1992). Fehlt
TFL, so wird der Repressor schneller abgebaut, die reproduktive Phase beginnt vorzeitig. Das
Genprodukt zeigt Ähnlichkeit zu einem tierischem Phosphatidylethanolamin-bindenden
Protein. bzw. andere Proteine, die wahrscheinlich mit Lipiden und GTP-bindenden Proteinen
assozieieren (Ohshima et al. (1997). Die mutante wird im nachfolgenden Text nur als tfl
bezeichnet.
100
Ler
a)
tfl1
b)
80
60
% Blühansatz
40
20
0
100
80
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat ohne Gln
10 mM Nitrat ohne Gln
60
40
20
0
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
Zeitverlauf in Tagen
Abbildung 3/40: Die Graphik zeigt den Blühverlauf von Arabidopsis thaliana cv Landsberg erecta und der
Blühmutante tfl-2 unter verschiedenen Nitratangeboten Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 68). Die Anzuchttemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Beim Vergleich von Mutante und Wildtyp ergab sich, daß die Blühverlaufskurven bei tfl
(Abb. 3/40b) in allen Bedingungen etwas früher starteten als bei Ler (Abb. 3/40a), die
Anordnung war aber dieselbe. Die vegetative Phase war verkürzt, sodaß auch die Werte für
Blattzahl (Abb. 3/41b), die Biomassen für Sproß und Wurzel (Abb. 3/41d+f) sowie das
Ergebnisse
74
Sproß/Wurzel-Verhältnis (Abb. 3/41h) niedriger ausfielen als bei Ler (Abb. 3741a/c/e/g). Vor
allem zeigten sich bei tfl in der Hauptversuchsreihe nicht die deutlichen Zunahmen in
Blattzahl, Sproß- und Wurzelbiomasse bis zur Blühinduktion, die sich bei Ler mit
ansteigender Nitratversorgung (in der Gegenwart von Gln) ergaben. Vielmehr zeigten sich für
die jeweiligen Parameter in der Hauptversuchsreihe sehr ähnliche Werte, obwohl die
Blühverlaufskurven deutlich voneinander abgesetzt waren.
Tabelle 3/2 zeigt die Zahlenwerte zur Abbildung 3/41 für Ler und tfl1 für Blattzahl, Sproß- und Wurzelbiomasse
und Sproß/Wurzel-Verhältnis der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind
die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln
35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei tfl-2 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4
mM Gln 22 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 23 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 24 Tage, bei 0,5 mM
Nitrat 32 Tage und bei 10 mM Nitrat 25 Tage. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100
µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert
und Standardfehler (n = 4-5).
Bedingung
Ler
Blatt
Sproß
Wurzel
Sp/Wu
1 mM Nitrat/
4 mM Gln
11,47 ± 0,51
110,13 ± 7,48
51,33 ± 5,54
2,36 ± 0,21
10 mM
Nitrat/
4 mM Gln
12,67 ± 0,37
259,13 ±
66,93 ± 5,97
4,07 ± 0,26
35 mM
Nitrat/
4 mM ln
15,36 ± 0,6
402,43 ± 35,28
77,64 ±
8,3
5,58 ± 0,45
± 0,63
34,55 ± 2,11
0,44 ± 0,02
248,67 ± 10,72
62,33 ± 3,78
4,16 ± 0,28
0,5 mM
Nitrat
7,1 ± 0,23
15,07 ± 0,29
10 mM Nitrat
tfl1
Blatt
1 mM Nitrat/
4 mM Gln
14,4
17,5
Sproß
Wurzel
Sp/Wu
10,2 ± 0,21
115,67 ± 4,94
46,33 ± 4,26
2,71 ±
10 mM
Nitrat/
4 mM Gln
10,73 ± 0,34
182,93 ± 12,87
50,13 ± 3,79
3,74 ± 0,23
35 mM
Nitrat/
4 mM Gln
10,67 ± 0,46
176,47 ± 11,99
41,73
±
4,2
4,52 ± 0,37
0,6
23,55
± 1,06
0,56 ± 0,02
117,33 ± 6,22
36,13
± 2,52
3,32 ± 0,14
0,5 mM
Nitrat
10 mM Nitrat
7,4 ± 0,19
10,87 ± 0,33
13,1 ±
0,2
Ler
a)
b)
30
20
20
10
10
0
0
900 Ler
mg Sproß
tfl1
c)
tfl1
d)
900
600
600
300
300
0
mg Sproß
Anzahl Blätter
30
75
Anzahl Blätter
Ergebnisse
0
1 mM Nitrat / 4 mM Gln
10 mM Nitrat / 4 mM Gln
35 mM Nitrat / 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
tfl1
f)
150
100
50
50
0
9
0
9
Ler
g)
tfl1
h)
6
6
3
3
0
0
mg Wurzel
e)
Sproß/Wurzel
Ler
100
Sproß/Wurzel
mg Wurzel
150
Abbildung 3/41: der Graph zeigt die Blattanzahl, Biomassen und Sproß/Wurzel-Verhältnisse der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei
10 mM Nitrat 35 Tage .Bei tfl-2 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 22 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 23 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 24 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 32 Tage und bei 10 mM Nitrat 25
Tage. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Das Sproß/Wurzel-Verhältnis nahm bei der Mutante hingegen in der Hauptversuchsreihe mit
ansteigender Nitratkonzentration noch deutlich zu (Abb. 3/41h). In der Mangelbedingung (0,5
mM Nitrat) zeigten sich kaum Unterschiede in Bezug auf Blattzahl, Biomassen und
Sproß/Wurzel-Verhältnis zwischen Wildtyp und Mutante, bei der 10 mM Nitrat-Bedingung
ohne Gln hingegen wies tfl niedrigere Werte als Ler auf, wobei zu beachten ist, daß die
Pflanzen auch zu einem wesentlich früheren Zeitpunkt geerntet worden sind (siehe Legende).
Wie der Wildtyp reagierte tfl mit einer Verzögerung der Blühinduktion bei ansteigender
Nitratversorgung in Gegenwart von Gln, die Verzögerung war jedoch wesentlich schwächer
ausgeprägt, vor allem, wenn die Blühinduktion in Relation zu Blattzahl oder Sproßgewicht
gesetzt wird. Auf der anderen Seite blieb der Anstieg des Sproß/Wurzel-Verhältnisses mit
zunehmender externer Nitratversorgung erhalten. Auch in den Bedingungen, die nur Nitrat
Ergebnisse
76
enthalten, trat bei der Mutante ein schwächerer Effekt als bei Ler ein, dies traf besonders bei
der Blattanzahl zu.
Fazit:
tfl führt , wie bereits bekannt , zu verfrühtem Blühen und überwindet damit teilweise die
hemmende Wirkung von Nitrat auf die Blühinduktion.
Beim internen Nitratspiegel traten keine Unterschiede zwischen der Mutante (Abb. 3/42b)
und Ler (Abb. 3/42a) auf. Bei den Gesamtaminosäuren hingegen wies tfl (Abb. 3/42d) bei den
Ler
a)
tfl1
b)
150
100
100
50
50
0
90
Ler
c)
tfl1
0
d) 90
60
60
30
30
0
0
µM/g FG Nitrat
150
µM/g FG
Gesamtaminosäuren
µM/g FG
Gesamtaminosäuren
µM/g FG Nitrat
Nitratmedien, die zusätzlich Gln enthielten, höhere Werte auf als der Wildtyp (Abb. 3/42c).
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/42: der Graph zeigt die Konzentrationen an Nitrat und Gesamtaminosäuren der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei
10 mM Nitrat 35 Tage .Bei tfl-2 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 22 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 23 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 24 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 32 Tage und bei 10 mM Nitrat 25
Tage. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Allerdings waren die Pflanzen auch jünger, als sie geerntet wurden, sodaß dieser Effekt auch
auf einen geringeren Verebrauch der Gesamtaminosäuren zum Zeitpunkt der Ernte
zurückzuführen ist. Dies traf für beide Gewebe zu, war im Wurzelgewebe aber besonders
deutlich ausgeprägt. Bei Mangelernährung sanken die Konzentrationen in der Mutante im
Vergleich zu Ler leicht ab, wobei die Verteilung auf die Gewebe davon unberührt blieb. Auch
in der 10 mM-Bedingung ohne Gln nahmen die Konzentrationen der Mutante gegenüber den
Werten in der 10 mM-Bedingung ohne Gln beim Wildtyp zu, Sproß und Wurzel wiesen bei
der Mutante gleich hohe Spiegel auf.
Ergebnisse
77
Beim Malatspiegel zeigte sich kein Einfluß der Mutation auf das Verhalten gegenüber den
externen Nitratkonzentrationen, lediglich bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln zeigte die Mutante in
beiden Geweben ca. 70 % der Wildtypkonzentrationen (Daten nicht gezeigt).
Die löslichen Zucker und Stärke reagierten bei der Mutante nicht anders als der dazugehörige
Wildtyp, eine Beeinflussung des Kohlenhydratstoffwechsels durch die Mutation trat nicht ein
(Daten nicht gezeigt).
Der Anstieg der Gesamtaminosäuren beruhte hauptsächlich auf einen Anstieg der
Aminosäuren wie Glutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat in der Mutante. Bei Glutamat
und Glutamin lagen in der Mutante (Abb. 3/43d,b) in Gegenwart von Glutamin im
Nährmedium sowohl Sproß als auch Wurzelkonzentration der jeweiligen Aminosäure höher
im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 3/43a,c). Vor allem Glutamin zeigte bei hoher
Nitratkonzentration (35 mM Nitrat), zusammen mit Gln angeboten, keine Abnahme wie im
Wildtyp, sondern stieg im Gegenteil im Vergleich zu den anderen beiden Bedingungen, die
Glutamin enthielten, noch an. Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mM-Bedingung
ohne Gln zeigten keine veränderten Aminosäurekonzentrationen als Folge einer Einwirkung
der Mutation auf die Aminosäuresynthese. Die Mutante reagierte also bei Anwesenheit von
Gln als zusätzliche N-Quelle mit erhöhten Aminosäurespiegeln. Glutamin wies in beiden
Geweben erhöhte Spiegel auf, Glutamat, Asparagin und Aspartat zeigten vor allem erhöhte
Wurzelkonzentrationen.
24
78
a)
Ler
b)
tfl1
24
16
16
8
8
0
4,5
0
c)
Ler
d)
tfl1
4,5
3,0
3,0
1,5
1,5
0,0
0,0
µM/g FG Glutamat µM/g FG Glutamin
µM/g FG Glutamat µM/g FG Glutamin
Ergebnisse
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
2,4
e)
Ler
f)
tfl1
2,4
1,6
1,6
0,8
0,8
0,0
1,8
0,0
g)
Ler
h)
tfl1
1,8
1,2
1,2
0,6
0,6
0,0
0,0
µM/g FG Aspartat µM/g FG Asparagin
µM/g FG Aspartat µM/g FG Asparagin
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/43: der Graph zeigt die Konzentrationen von Aspartat, Asparagin, Glutamat und Glutamin der
geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen
28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44
Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei tfl-2 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 22 Tage alt, bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 23 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 24 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 32 Tage und bei 10 mM
Nitrat 25 Tage. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer
12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 - 5).
Dies war ein Effekt der Glutaminbeigabe, da sich bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln keine
Veränderung im Vergleich zur entsprechenden Bedingung mit Gln ergaben. Bei Glutamin war
der Konzentrationsanstieg in der Wurzel wohl auch auf die Glutaminfütterung selbst
zurückzuführen.
Bei
Asparagin
stiegen
sowohl
die
Sproß-
als
auch
die
Wurzelkonzentrationen der Mutante in den Medien mit einer Kombination aus Nitrat und Gln
an (Abb. 3/43f). Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mM-Bedingung ohne Gln
reagierten in der Mutante kaum anders als im Wildtyp (Abb. 3/43e). Bei Aspartat kam es
hauptsächlich zu einem Konzentrationsanstieg in der Wurzel, wenn die Medien zusätzlich
Ergebnisse
79
noch Gln enthielten (Abb. 3/43h), die Bedingungen ohne Gln reagierten bei tfl nicht anders
als beim Wildtyp (Abb. 3/43g).
Bei den Aminosäuren aus der Photorespiration trat keine Veränderung der Nitratantwort
durch die Mutation ein, die Spiegel entsprachen denen des Wildtyp. Lediglich Glycin nahm
im Vergleich zum Wildtyp bei überoptimaler Nitratversorgung in Gegenwart von Gln im
Sproß zu und in der Wurzel von tfl ab, die Konzentrationen von Sproß und Wurzel waren
ansonsten
gleich
(Abb.
3/44b).
Dies
betraf
sowohl
die
Bedingungen
aus
der
Hauptversuchsreihe – aufsteigende Nitratkonzentrationen + Gln – sowie Mangelbedingung
(0,5 mM Nitrat) als auch 10 mM-Bedingung ohne Gln. Serin zeigte in der Mutante keine
Veränderung im Vergleich zu Ler (Daten nicht gezeigt).
0,75
Ler
a)
µM/g FG Glycin
0,50
0,25
0,25
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
0,00
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
0,00
0,75
0,50
tfl1
b)
Abbildung 3/44: der Graph zeigt die Konzentration von Glycin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
.Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29
Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei tfl-2
sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 22 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 23 Tage, bei 35 mM
Nitrat/4 mM Gln 24 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 32 Tage und bei 10 mM Nitrat 25 Tage. Die Wachstumstemperatur
betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach
Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 - 5).
Bei den aromatischen Aminosäuren trat ebenfalls keine Beeinflussung der Nitratantwort
durch die Mutation ein, lediglich Phenylalanin zeigte eine Erhöhung des Aminosäurespiegels
um ca. 30 % bei allen fünf Bedingungen im Sproß (Daten nicht gezeigt).
Alanin nahm gerade in der Wurzel bei externer Nitratversorgung zusammen mit Glutamin
sehr deutlich bei tfl (Abb. 3/45b) im Vergleich zu Ler (Abb. 3/45a) zu, wie bei den anderen
N-haltigen Aminosäuren war dies auch auf die Glutaminfütterung selbst zurückzuführen.
Auch bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) reagierte die Mutante kaum anders als der
Wildtyp. Die 10 mM-Bedingung ohne Gln wies keine erhöhten Spiegel auf.
Ergebnisse
4,5
80
a)
Ler
µM/g FG Alanin
3,0
1,5
0,0
4,5
b)
tfl1
3,0
1,5
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
0,0
Abbildung 3/45: der Graph zeigt die Konzentration von Alanin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
.Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29
Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei tfl-2
sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 22 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 23 Tage, bei 35 mM
Nitrat/4 mM Gln 24 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 32 Tage und bei 10 mM Nitrat 25 Tage. Die Wachstumstemperatur
betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach
Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 - 5).
Die aliphatischen Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin reagierten nur mit einem leichten
Konzentrationsanstieg von
ca. 30 % in den Wurzeln und zwar bei allen angebotenen
Bedingungen (Daten nicht gezeigt).
Bei den Aminosäuren aus dem Harnstoffzyklus zeigte sich kein einheitliches Bild. Arginin
und Citrullin nahmen, wenn das Medium Glutamin enthielt, in der Mutante stark zu
(Abb. 3/46b,d) und zeigten dabei auch eine leichte Korrelation zum extern ansteigenden
Nitratangebot. Bei Arginin zeigte sich dies hauptsächlich im Sproß und gering ausgeprägt
auch in der Wurzel, bei Citrullin nur im Sproß. Ornithin reagierte bei tfl in der
Hauptversuchreihe, die neben Nitrat auch Gln enthielt (Abb. 3/46f), nur bei überoptimaler
Konzentration mit einer Verschiebung der Gewebeanteile im Vergleich zu Ler. Bei Ler waren
die Konzentrationen beide im gleichen niedrigen Bereich (Abb. 3/46e), bei der Mutante wies
der Sproß höhere und die Wurzel niedrigere Konzentrationen als Ler auf.
Bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) reagierten Citrullin und Ornithin mit einer leichten
Konzentrationszunahme in der Wurzel bei tfl (Abb. 3/46d,f) gegenüber Ler (Abb. 3/46c,e).
Trotz Nitratmangel war die Synthese dieser Aminosäuren im Vergleich zum Wildtyp in tfl
gesteigert. Citrullin reagierte auch in der 10 mM-Bedingung ohne Gln mit einem leichten
Konzentrationsanstieg in beiden Geweben im Vergleich zum Wildtyp, die anderen beiden
Aminosäuren zeigten keine Veränderung im Vergleich zu Ler in der 10 mM-Bedingung ohne
Gln. Im Vergleich zwischen 10 mM-Bedingung ohne Gln und entsprechender Bedingung mit
Gln lagen alle drei Aminosäuren jedoch in der 10 mM-Bedingung ohne Gln niedriger, dies
bedeutet, daß Gln verstoffwechselt wurde und unter anderem auch die Aminosäuresynthese
Ergebnisse
81
gefördert hat. Für Ornithin ergab sich in den beiden Bedingungen ohne Gln eine
Konzentrationssteigerung im Vergleich zum Wildtyp, aber wie bei Ler trat keine Korrelation
Ler
a)
tfl1
b)
2400
1600
1600
800
800
nM/g Fg Ornithin
c)
Ler
d)
tfl1
0
300
200
200
100
100
0
90
e)
Ler
tfl1
f)
0
90
60
60
30
30
0
0
nM/g FG Citrullin
nM/g FG Citrullin
0
300
nM/g FG Arginin
2400
nM/g FG Ornithin
nM/g FG Arginin
der Ornithinspiegel zur externen Nitratversorgung auf.
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/46: der Graph zeigt die Konzentrationen von Arginin, Citrullin und Ornithin der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei
10 mM Nitrat 35 Tage .Bei tfl-2 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 22 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 23 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 24 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 32 Tage und bei 10 mM Nitrat 25
Tage. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 - 5).
Die von Aspartat abstammenden Aminosäuren Lysin, Methionin und Threonin nahmen wie
auch Aspartat leicht zu. (Daten zu Lysin und Threonin nicht gezeigt) Alle drei Aminosäuren
reagierten in der Hauptversuchsreihe mit der Kombination Nitrat und Gln bei der Mutante mit
einem leichten Anstieg der Konzentrationen in der Wurzel, Methionin zudem auch im Sproß
(Abb. 3/47b) im Vergleich zu Ler. Lysin nahm um um ca 30 % in der Mutantenwurzel zu,
Threonin um ca. 20 % gegenüber dem Wildtyp. Wie der Wildtyp ergab sich bei der Mutante
aber
auch
kein
Zusammenhang
zwischen
externem
Nitratangebot
und
Aminosäurekonzentration, sofern Gln ebenfalls im Medium vorlag. Lysin und Threonin
Ergebnisse
82
reagierten bei tfl unter Mangelernährung nicht anders als beim Wildtyp, während Methionin
im Vergleich zu Ler (Abb. 3/47a) in der Mutante in beiden Geweben leicht zunahm.
nM/g FG Methionin
20
a)
Ler
10
0
20
b)
tfl1
10
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat W urzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat W urzel
0
Abbildung 3/47: der Graph zeigt die Konzentration von Methionin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage
.Bei tfl-2 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 22 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 23 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 24 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 32 Tage und bei 10 mM Nitrat 25 Tage. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln reagierte tfl bei Lysin und Threonin nicht anders als der
Wildtyp, bei Methionin kam es im Sproß bei der Mutante zu einer leichten Erhöhung des
Spiegels gegenüber Ler. Insgesamt stiegen die Methioninkonzentrationen bei tfl in den Glnfreien Bedingungen gegenüber Ler leicht an.
Histidin nahm bei tfl (Abb. 3/48b) in den Bedingungen mit Nitrat und Gln in beiden Geweben
gegenüber Ler zu (Abb. 3/48a), in der Wurzel trat dabei sogar eine Korrelation zwischen
ansteigenden Histidinkonzentratrionen und extern angebotenen Nitratkonzentrationen auf.
nM/g FG Histidin
150
a)
Ler
100
50
0
150
100
50
0
b)
tfl1
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat W urzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat W urzel
Abb.ildung 3/48: der Graph zeigt die Histidinkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
.Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29
Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei tfl-2
sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 22 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 23 Tage, bei 35 mM
Nitrat/4 mM Gln 24 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 32 Tage und bei 10 mM Nitrat 25 Tage. Die Wachstumstemperatur
betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.. Geerntet wurde 30 – 90 min nach
Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
83
Bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) nahm die Mutante in beiden Geweben im
Vergleich zu Ler zu, d.h. trotz mangelnder externer N-Versorgung war die Synthese entweder
verstärkt oder es kam zu einem Anstau von Hsitidin, da nachfolgende Reaktionen gestoppt
waren. Auch bei der 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln zeigte die Mutante erhöhte Werte im
Vergleich zum Wildtyp. Jedoch lagen die Werte für beide Gewebe bei der 10 mM-Bedingung
ohne Gln unter den Werten der Bedingung 10 mM Nitrat + 4 mM Gln, dies entsprach der
Wildtyp-Verteilung. Bei allen Bedingungen wurde die grundsätzliche Verteilung zwischen
den Geweben nicht verändert, tfl und Ler wiesen in der Wurzel die höhere Konzentration auf.
GABA = γ-Aminobuttersäure reagierte bei tfl (Abb. 3/49b) nur im Wurzelgewebe anders als
der Wildtyp (Abb. 3/49a). In der Hauptversuchsreihe zeigte sich nicht wie bei Ler eine
Abhängigkeit vom Nitratangebot. Bei Mangelernährung ergab sich kein Unterschied im
Vergleich Wildtyp – Mutante ,auch die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln ergab keine
Unterschiede. Sowohl für Wildtyp als auch für Mutante ergab sich bei Gln-Abwesenheit ein
Anstieg der γ-Aminobuttersäurekonzentration mit zunehmender Nitratversorgung.
µM/g FG γ-Aminobuttersäure
1,5
a)
Ler
1,0
0,5
0,0
1,5
1,0
0,5
0,0
b)
tfl1
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/49: der Graph zeigt die Konzentration von γ-Aminobuttersäure der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM
Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM
Nitrat 35 Tage .Bei tfl-2 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 22 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln
23 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 24 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 32 Tage und bei 10 mM Nitrat 25 Tage. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
84
Fazit zu tfl1:
(i)
Tfl1 reagiert im Gegensatz zu Ler schwächer auf die Hemmung der Blühinduktion
durch ansteigende Nitratkonzentrationen. Die Hemmung ist jedoch vorhanden und
zeigt sich vor allem in den Behandlungen, die nur Nitrat als N-Quelle beinhalten
(ii)
Die Abschwächung der Hemmung der Blühinduktion durch ansteigende externe
Nitratversorgung beruht nicht auf veränderte Reaktion des internen Nitratgehalts
(iii)
Die Kohlenhydrate zeigen in der Mutante keinen veränderten Konzentrationen im
Vergleich zum Wildtyp
(iv)
Einige Aminosäuren (jedoch nicht alle) zeigen erhöhte Spiegel in der Mutante
gegenüber dem Wildtyp
Insgesamt zeigen die Metabolitenmessungen, das die Abschwächung des Nitrateffektes auf
die Blühinduktion nicht auf Veränderungen des internen Nitratgehaltes oder der Aminosäuren
beruht. Sie weisen jedoch darauf hin, daß das TFL1-Produkt erforderlich, aber wahrscheinlich
nicht essentiell für die Nitratantwort ist.
Ergebnisse
85
3.2.4. leafy –1
Bei LEAFY handelt es sich um ein „Floral meristem identy“-Gen (Gómez-Mena et al. 2001).
Dieser Transkriptionsfaktor ist im sich entwickelnden Primordium notwendig bei der
Promotion eines weiteren „Floral meristem identity gen“ APETATA1 (Reeves et al. 2000). Als
Resultat daraus ist die Mutante leafy-1 eine spätblühende Mutante.
100
a)
Ler
80
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat ohne Gln
10 mM Nitrat ohne Gln
% Blühansatz
60
40
20
0
100
lfy-1
b)
80
60
40
20
0
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
Zeitverlauf in Tagen
Abbildung 3/50: Die Graphik zeigt den Blühverlauf von Arabidopsis thaliana cv Landsberg erecta und der
Blühmutante lfy-1 unter verschiedenen Nitratangeboten Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 68). Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Die Blühinduktion war bei lfy (Abb. 3/50b) erwartungsgemäß verzögert im Vergleich zum
Wildtyp (Abb. 3/50a). Bei Ler liefen in der Hauptversuchsreihe die Kurven für 1 mM
Nitrat/4 mM Gln und 10 mM Nitrat/ 4 mM Gln paralell zueinander, die Kurve für die
überoptimale Nitratversorgung war zeitlich etwas versetzt. Bei lfy liefen alle drei Kurven
separat abgesetzt voneinander, zudem begannen sie zeitlich etwas später als die Kurven zum
Wildtyp. Die Kurven für die Mangelernährung starteten bei Ler und lfy zur gleichen Zeit, bei
der Mutante zeigte sich jedoch ein zeitlich verlängerter Ablauf der Blühinduktion. Auch die
10 mM-Bedingung ohne Gln blühte bei der Mutante wie beim Wildtyp etwas später als die
entsprechende Kurve mit Gln, diese zusätzliche N-Quelle hatte auch bei der Mutante eine
blühfördernde Wirkung.
Ergebnisse
86
Der verzögerte Blühverlauf zeigte sich auch in einer höheren Blattzahl und Biomasse, was auf
eine etwas verlängerte vegetative Phase hindeutet. Die Mutante wies bei der aufsteigenden
Nitratreihe mit Gln bei Blattzahl und den beiden Biomassen etwas erhöhte Werte (Abb. 3/51
b,d,f) im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 3/51a,c,e) auf, das Sproß/Wurzel-Verhältnis änderte
a)
Ler
lfy-1
b)
20
20
10
10
0
900
mg Sproß
30
0
c)
Ler
lfy-1
d)
900
600
600
300
300
0
mg Sproß
Anzahl Blätter
30
Anzahl Blätter
sich kaum.
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln
10 mM Nitrat/4 mM Gln
35 mM Nitrat/4 mM Gln
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
e)
lfy-1
f)
150
100
100
50
50
Sproß/Wurzel
0
9
Ler
g)
lfy-1
h)
mg Wurzel
Ler
0
9
6
6
3
3
0
0
Sproß/Wurzel
mg Wurzel
150
Abbildung 3/51: der Graph zeigt die Anzahl der Blätter, die beiden Biomassen für Sproß und Wurzel sowie das
Sproß/Wurzel-Verhältnis der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die
Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35
Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei lfy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4
mM Gln 29 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 38 Tage, bei 0,5 mM
Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 42 Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100
µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert
und Standardfehler (n = 4-5).
Sowohl Wildtyp als auch Mutante wiesen ähnliche Werte auch bei der Mangelbedingung (0,5
mM Nitrat) auf, in beiden Fällen kam es also zu einer verfrühten Blüte der Mangelbedingung
(0,5 mM Nitrat). Obwohl die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln bei der Mutante später
blühte als bei Ler, zeigte lfy nur bei der Blattzahl einen höheren Wert in dieser Bedingung als
Ler auf, die Biomassen und das Sproß/Wurzel-Verhältnis zeigten bei der Mutante keine
Ergebnisse
87
Veränderung. Damit war bei dieser Bedingung nicht unbedingt die vegetative Phase in lfy im
Vergleich zu Ler verlängert, sondern die Entwicklung verlangsamt.
Fazit:
Die Blühverzögerung durch Nitrat ist bei leafy-1 vollständig ausgeprägt, es zeigt sich, daß
dies sogar stärker ausgeprägt ist als beim Wildtyp. Es sind jedoch weitere Experimente
notwendig, um dies zu bestätigen.
Der interne Nitratspiegel zeigte bei der Mutante (Abb. 3/52b) bei aufsteigender Nitratreihe +
Gln eine Verlagerung aus der Wurzel in den Sproß hinein, beim Wildtyp wiesen die beiden
Gewebe fast gleiche Spiegel auf (Abb. 3/52a). Zudem zeigte sich bei der Mutante eine
deutlichere Abhängigkeit des internen Nitratspiegels vom externe Nitratangebot als beim
Wildtyp. Bei Mangelernährung waren die Mutantennitratspiegel in beiden Geweben etwas
niedriger als die Wildtyp-Werte, obwohl die Pflanzen fast zum selben Zeitpunkt geerntet
wurden. Die niedrigeren Nitratspiegel ergaben sich also nicht durch zeitliche Versetzung, die
Mutante scheint hingegen weniger aufgenommen zu haben. Bei der 10 mM-Bedingung ohne
Gln hingegen lagen bei lfy die Werte im gleichen Bereich wie bei der Bedingung mit Gln
(Abb 3/52b), bei Ler lagen sie in der 10 mM-Bedingung ohne Gln etwas niedriger als in der
Bedingung plus Gln (Abb. 3/52a).
Bei den Gesamtaminosäuren kam es bei den Bedingungen, die zusätzlich noch Glutamin
enthielten, in der Mutante (Abb. 3/52d) vor allem im Wurzelgewebe zu einem Absinken der
Konzentrationen im Vergleich zu Ler (Abb. 3/52c). Das Absinken der Gesamtaminosäuren
mit zunehmender externer Nitratversorgung war bei der Mutante nicht so klar ausgeprägt wie
bei Ler. Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) wies bei lfy eine etwas niedrigere
Sproßkonzentration auf als bei Ler, bei der Wurzel ergab sich keine Veränderung. Bei der
10 mM-Bedingung ohne Gln drehte sich bei der Mutante die Verteilung zwischen Sproß und
Wurzel zugunsten der Wurzel um, Ler wies die höhere Sproßkonzentration auf. Insgesamt
ergab sich, daß sowohl bei Wildtyp als auch bei Mutante die 10 mM-Bedingung ohne Gln
niedrigere Konzentrationen an Gesamtaminosäuren aufwies als die Vergleichsbedingung mit
Gln.
Malat nahm sowohl bei Hauptversuchsreihe – Nitrat + Gln - als auch bei Mangelbedingung
(0,5 mM Nitrat) und 10 mM-Bedingung ohne Gln in der Wurzel der Mutante (Abb. 3/52f)
Ergebnisse
88
gegenüber dem Wildtyp (Abb. 3/52e) stark ab. Bei Ler ergab sich sowohl in der
Hauptversuchsreihe als auch bei den beiden Bedingungen ohne Gln ein zunehmender
Malatspiegel in der Wurzel mit ansteigender Nitratkonzentration, bei der Mutante hingegen
Ler
b)
lfy-1
150
100
100
50
50
0
0
40
c)
Ler
d)
lfy-1
40
20
20
0
0
15
e)
Ler
lfy-1
f)
15
10
10
5
5
0
µM/g FG Nitrat
a)
µM/g FG
Gesamtaminosäuren
150
µM/g FG Malat
µM/g FG Malat
µM/g FG
Gesamtaminosäuren
µM/g FG Nitrat
zeigte sich diese Korrelation nicht.
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/52: der Graph zeigt die Konzentration von Nitrat,Gesamtaminosäuren und Malat der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei
10 mM Nitrat 35 Tage .Bei lfy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 35 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 38 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 42
Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Da sonst kaum Veränderungen im Malatspiegel auftraten, scheint dies ein Hinweis darauf,
daß die Malatsynthese in der Mutante im Wurzelbereich verändert ist. Da aber nur die
Malatspiegel und nicht entsprechende Enzymmessungen vorliegen, kann hier nicht bestimmt
werden, an welchem Punkt eine Beeinflussung des Malatmetabolismus stattgefunden hat.
Bei den löslichen Zuckern und Stärke kam es der Mutante (Abb. 3/53 b,d,f,h) beim
Hauptversuch zu erniedrigen Kohlenhydratkonznetrationen gegenüber Ler (Abb. 3753a,c,e,g).
Die Spiegel sanken mit ansteigender Nitratversorgung ab, bei überoptimaler Nitratversorgung
Ergebnisse
89
mit 35 mM Nitrat bis zu 50 %. In der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) wies lfy bei Glukose
eine wesentlich höhere Wurzelkonzentration als Ler auf, während Fruktose in beiden
Geweben im Vergleich zum Wildtyp abnahm. Die Hexosen stiegen insgesamt damit in der
Mutante an im Vergleich zu Ler. Auch Saccharose und Stärke nahmen in der Mutante in der
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) etwas ab, die Verteilung auf die Gewebe blieb aber
lfy-1
b)
30
20
20
10
10
0
0
12
µM/g FG
Fruktose
a)
Ler
c)
Ler
lfy-1
d)
µM/g FG
Glukose
30
12
8
8
4
4
0
0
µM/g FG
Fruktose
µM/g FG
Glukose
erhalten.
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
Ler
e)
lfy-1
f) 27
18
18
9
9
0
0
36
27
Ler
g)
lfy-1
h)
36
27
3
3
0
0
µM/g FG
Saccharose
27
µM/g FG Hexoseäquivalente
Stärke
µM/g Hexoseäquivalente
Stärke
µM/g FG
Saccharose
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/53: der Graph zeigt die Konzentration von Glukose, Fruktose, Saccharose und Stärkeder
geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen
28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44
Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei lfy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage alt, bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 38 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM
Nitrat 42 Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die
Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und
Standardfehler (n = 4-5).
Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln hingegen nahmen alle Zuckerspiegel bei lfy im
Vergleich zu Ler etwas ab, lagen aber ähnlich hoch wie die entsprechende Bedingung mit
Gln.
Ergebnisse
90
Die geringen Veränderungen der Gesamtaminosäuren bei lfy im Vergleich zum Wildtyp in
den Bedingungen, die zusätzlich noch Gln enthielt, beruhte vor allem auf einer Abnahme der
N-haltigen Aminosäuren (Glutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat) bei lfy. Glutamin
sank in lfy bei allen drei Bedingungen unabhängig vom externen Nitratangebot auf die
gleichen Konzentrationen ab (Abb. 3/54b), Glutamat nahm in der Wurzel ab, im Sproß jedoch
etwas zu (Abb. 3/54d). Auch bei Asparagin und Aspartat (Abb. 3/54f,h) kam es in lfy zu
niedrigeren Wurzelspiegeln im Vergleich zu Ler, Aspartat nahm dann in der Mutante wie
a)
Ler
b)
lfy-1
24
16
16
8
8
0
0
4,5
c)
Ler
d)
lfy-1
4,5
3,0
3,0
1,5
1,5
0,0
0,0
µM/g Fg Glutamin
24
µm/g FG Glutamat
µM/g FG Glutamat
µM/g FG Glutamin
Glutamat im Sproß leicht zu gegenüber Ler (Abb. 3/54g,h).
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
2,4
e)
Ler
f)
lfy-1
2,4
1,6
1,6
0,8
0,8
0,0
1,8
0,0
g)
Ler
h)
lfy-1
1,8
1,2
1,2
0,6
0,6
0,0
0,0
µM/g FG Aspartat µM/g FG Asparagin
µM/g FG Aspartat µM/g FG Asparagin
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/54: der Graph zeigt die Konzentration von Asparat, Asparagin, Glutamat und Glutamin der
geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen
28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44
Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei lfy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage alt, bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 38 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM
Nitrat 42 Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die
Belichtungsdauer 12 h Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und
Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
91
Bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) reagierten alle vier Aminosäuren mit einem Abfall
im Wurzelgewebe der Mutante, bei Glutamat und Aspartat nahmen auch die Sproßwerte in lfy
ab im Vergleich zum Wildtyp. Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln zeigte sich kein
Unterschied zwischen Wildtyp und Mutante in Bezug auf die Aminosäuren. Enthielt das
Medium also Gln oder lag ein sehr niedriger Nitratspiegel vor, so reagierte die Mutante mit
einer Konzentrationsabnahme der besprochenen Aminosäuren in der Wurzel, lag genügend
Nitrat vor, so zeigte sich kein Unterschied zwischen Wildtyp und Mutante.
Neben den bisher besprochenen Aminosäuren waren auch die Aminosäuren der
Photorespiration beeinflußt. Glycin nahm in lfy (Abb. 3/55b) in den Bedingungen, die neben
Nitrat auch Gln enthielten, in
beiden Geweben gegenüber Ler ab (Abb. 3/55a). In der
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) nahm bei der Mutante vor allem die Wurzelkonzentration
deutlich zu im Vergleich zu Ler, aber auch die Sproßkonzentration stieg bei lfy etwas an. Bei
der 10 mM-Bedingung ohne Gln hingegen nahm Glycin bei der Mutante im Sproß zu im
a)
Ler
lfy-1
b)
0,75
0,50
0,25
0,25
0,00
0,00
Ler
c)
2
1
lfy-1
d)
2
1
0
µM/g Fg Serin
0,50
µm/g FG Glycin
0,75
µM/g FG Serin
µM/g Fg Glycin
Vergleich zu Ler.
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/55: der Graph zeigt die Konzentration von Glycin und Serin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt
der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage
.Bei lfy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 38 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 42 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
92
Bei Serin hingegen kam es in der Mutante (Abb. 3/55d) gegenüber Ler zu einem Anstieg der
Sproßkonzentrationen in den Gln-haltigen Medien, die Konzentration stieg dabei mit
zunehmenden Nitratgehalt an. Im Wurzelgewebe der jeweiligen Bedingungen trat keine
Veränderung bei lfy gegenüber Ler (Abb. 3755c) ein. In der Mangelbedingung (0,5 mM
Nitrat) lagen in der Mutante im Vergleich zu Ler die Konzentrationen zu beiden Geweben
etwas höher. Die 10 mM Nitrat-Bdingung ohne Gln zeigte bei der Mutante etwas höhere
Konzentrationen im Vergleich zu Ler, damit ergab sich für die beiden Bedingungen ohne Gln
in der Mutante ein Konzentrationsanstieg im Vergleich zum Wildtyp. Es ergab sich jedoch
wie bei Ler keine Korrelation zum extern ansteigenden Nitratspiegel.
Die aromatischen Aminsäuren, Alanin und die Aliphaten zeigten sich bei lfy im Vergleich zu
Ler unbeeinflußt in ihrer Antwort auf die verschiedenen Nitratbedingungen (Daten nicht
gezeigt).
Bei der Mutante reagierte bei den Aminosäuren des Harnstoffzyklus nur Ornithin
unterschiedlich zum Wildtyp, es kam in der Mutante (Abb. 3/56b) zu einem Absinken der
Konzentrationen in den Bedingungen aus der Hauptversuchsreihe, dies betraf beide Gewebe.
90
Ler
a)
nM/g FG Ornithin
60
30
0
90
60
30
0
lfy-1
b)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/56: der Graph zeigt die Konzentration von Ornithin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage
.Bei lfy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 38 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 42 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Jedoch ergab sich wie beim Wildtyp (Abb. 3/56a) kein Zusammenhang zwischen
ansteigender Nitratkonzentration und internem Ornithinspiegel. Die Mangelbedingung (0,5
mM Nitrat) hingegen bewirkte bei der Mutante eine deutliche Zunahme an Ornithin in beiden
Geweben, vor allem in der Wurzel. Die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln wies bei der
Mutante niedrigere Spiegel als beim Wildtyp auf, lag aber vergleichbar dem Wildtyp im
gleichen Bereich wie die 10 mM Nitrat Bedingung mit Gln. Ergab sich beim Wildtyp ein
Ergebnisse
93
Ansteigen der Ornithinkonzentration mit zunehmender Nitratkonzentration, wenn kein Gln
vorlag, so zeigte sich hingegen bei der Mutante eine deutliche Abnahme an Ornithin mit
höherer Nitratversorgung, wenn das Medium kein zusätzliches Gln enthielt.
Bei den Aminosäuren, die sich von Aspartat ableiten, trat bei Lysin (Daten nicht gezeigt)
keine Veränderung aufgrund der Mutation ein. Methionin reagierte in der Mutante mit einem
Anstieg der Konzentrationen in den Gln-haltigen Bedingungen im Vergleich zum Wildtyp.
Auffällig ist der hohe Sproßwert in der Mutante bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln (Abb. 3/57b) im
Vergleich zu Ler (Abb. 3/57a). Da sonst kein anderer Wert sich so stark verändert wie dieser,
kann ein Artefakt nicht ausgeschlossen werden. Auch bei der Mangelernährung reagierte die
Mutante mit einem leichten Anstieg der Methioninspiegel im Vergleich zum Wildtyp. Die 10
mM-Bedingung ohne Gln führte zu keiner Veränderung, die Mutante wies hier niedrigere
Spiegel als in der Vergleichsbedingung mit Gln auf.
60
a)
Ler
nM/g FG Methionin
50
10
0
60
50
10
0
b)
lfy-1
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/57: der Graph zeigt die Konzentration von Methionin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage
.Bei lfy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 38 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 42 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Threonin zeigte wie Lysin keinen Unterschied zwischen Ler und Mutante (Daten nicht
gezeigt).
Histidin zeigte bei lfy eine Konzentrationszunahme im Sproß unter allen Bedingungen in der
Hauptversuchsreihe (Nitrat + Gln) (Abb. 3/58b) gegenüber Ler. Die Mangelbedingung (0,5
mM Nitrat) bewirkte in der Mutante eine deutliche Konzentrationssteigerung in beiden
Geweben. Die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln wies bei lfy höhere Spiegel als bei Ler auf.
Im Gegensatz zu Ler wies die Mutante kaum einen Unterschied zwischen 10 mM Nitrat + Gln
Ergebnisse
94
und 10 mM Nitrat ohne Gln auf. Beim Vergleich der beiden Bedingungen ohne Gln ergab
sich bei der Mutante eine leichte Abnahme der Histidinkonzentration mit steigender
Nitratversorgung im Gegensatz zum Wildtyp (Abb. 3/58a).
150
Ler
a)
nM/g FG Histidin
100
50
0
150
lfy-1
100
50
b)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
0
Abbildung 3/58: der Graph zeigt die Konzentration von Histidin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage
.Bei lfy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 38 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 42 Tage. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Fazit zu leafy-1:
(i)
Nitrat bewirkt eine Hemmung der Blühinduktion bei der Mutante, die mindestens
genauso stark ausgeprägt wie beim Wildtyp ist.
(ii)
Die Veränderungen im internen Nitratgehalt verlaufen bei der Mutante wie im
Wildtypen Ler. Es gibt konkrete Veränderungen bei den Kohlenhydraten und
Aminosäuren im Vergleich zu Ler, diese sind aber nicht sehr groß. Aus den
Resultaten ergibt sich kein Hinweis darauf, daß die Schlußfolgerung beeinflußt,
wonach bei dieser Mutante ansteigende Nitratkonzentrationen zu einer Hemmung
der Blühinduktion führen.
Ergebnisse
95
3.2.5 fd-1
Das Genprodukt gehört zu den Genen, die im photoperiodisch gesteuerten Signalweg agieren
(Burn et al. 1993).
fd wurde als spätblühende Mutante charakterisiert. Tatsächlich startete der Blühverlauf auch
um einige Tage versetzt gegenüber dem Wildtyp. Die Blühinduktionskurven zu den
Hauptbedingungen verliefen bei fd alle getrennt (Abb. 3/59b), im Gegensatz zu Ler (Abb.
3/59a), da verliefen die Kurven für die beiden niederen Nitratkurven direkt parallel
nebeneinander.
Die
Blühverlaufskurve
zur
höchsten
Nitratkonzentration
aus
der
Hauptversuchsreihe startete wie bei Ler später als die anderen beiden Bedingungen.
100
a)
Ler
80
60
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat ohne Gln
10 mM Nitrat ohne Gln
% Blühansatz
40
20
0
100
fd-1
b)
80
60
40
20
0
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
Zeitverlauf in Tagen
Abbildung 3/59: Die Graphik zeigt den Blühverlauf von Arabidopsis thaliana cv Landsberg erecta und der
Blühmutante fd-1 unter verschiedenen Nitratangeboten Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 68). . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h..
Die Kurve der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) war bei der Mutante (Abb. /3/59b) nur
wenige Tage gegenüber Ler (Abb. 3/59a) nach hinten verschoben, die Mutante reagierte also
bei Nitratmangel nicht anders als der Wildtyp. Der Einfluß der Mutation auf das
Blühverhalten greift bei mangelnder N-Versorgung kaum. Die Blühverlaufskurve zur 10 mM
Nitrat-Bedingung ohne Gln begann bei fd wie bei Ler später als die entsprechende Kurve mit
Gln. Gegen Ende überlappten beide Kurven mit 10 mM Nitrat aber einander. Der
blühfördernde Einfluß von Gln, der bei Ler sichtbar wird, greift bei der Mutante weniger
Ergebnisse
96
ausgeprägt. Möglicherweise ist dies ein Hinweis darauf, daß Gln oder seine Derivate in der
Mutante anders registriert werden als im Wildtyp oder daß die Verschiebungen der
Blühverlaufskurven weinger mit der An- bzw. Abwesenheit von Gln als mit Veränderungen
fd-1
b)
30
20
20
10
10
0
0
900
mg Sproß
a)
Ler
c)
fd-1
d)
900
600
600
300
300
0
mg Sproß
Anzahl Blätter
30 Ler
Anzahl Blätter
bei den Wachstumsraten zu tun haben.
0
1 mM Nitrat / 4 mM Gln
10 mM Nitrat / 4 mM Gln
35 mM Nitrat / 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
fd-1
f)
150
100
50
50
0
9
0
9
Ler
g)
fd-1
h)
6
6
3
3
0
0
mg Wurzel
e)
Sproß/Wurzel
Ler
100
Sproß/Wurzel
mg Wurzel
150
Abbildung 3/60: der Graph zeigt die Blattanzahl, Biomassen und Sproß/Wurzel-Verhältnisse der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei
10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fd-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 31 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 36 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 43 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 39
Tage. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Steigende Nitratkonzentrationen fürhten bei fd im Vergleich zu Ler zu einer Verzögerung der
Blühinduktion aufgrund einer Verlängerung der vegetativen Phase, die Pflanzen waren bei
Blühbeginn größer und hatten mehr Blätter (Abb 3/60b). Die Anordnung der Kurven war bei
der Mutante etwas verändert im Vergleich zum Wildtyp, aber insgesamt zeigte sich bei fd-1
eine ähnlich starke Hemmung wie bei Ler.
Ergebnisse
97
Bei der aufsteigenden Nitratkonzentration + Gln lagen die Werte zu Blattzahl und Biomasse
bei fd (Abb. 3/60b+d+f) etwas höher als bei Ler (Abb. 3/60a+c+e), ein Hinweis auf eine
verlängerte vegetative Phase. Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) wies bei fd die gleichen
Werte auf wie Ler, auch hier kam es zu einem verfrühtem Blühen der Pflanzen unter
Berücksichtigung von Blattzahl und Biomasse. Die 10 mM-Nitrat-Bedingung ohne Gln zeigte
bei Mutante und Wildtyp die gleiche Reaktion im Vergleich zur entsprechenden Bedingung
mit Gln, das Blühen trat in der Gln-haltigen Bedingung aufgrund rascheren Wachstums ein.
Die Sproß/Wurzel-Verhältnisse wurden bei fd (Abb. 3/60h) und Wildtyp (Abb. 3/60g) in der
gleichen Weise durch Nitrat beeinflußt.
Wie beim Wildtypen (Abb. 3/61a) stiegen die internen Nitratspiegel bei der Mutante mit
zunehmender externer Nitratversorgung an (Abb. 3/61b). Ausnahme ist die 10 mM NitratBedingung ohne Gln, diese wies etwas geringere Werte in der Mutante gegenüber dem
Wildtyp auf. Auch die Gesamtaminosäuren nahmen insgesamt etwas ab bei fd, wobei dies bei
fd-1
b) 150
100
100
50
50
0
90
c)
Ler
fd-1
0
d) 90
60
60
30
30
0
0
15
Ler
e)
fd-1
f)
15
10
10
5
5
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
µM/g FG Nitrat
a)
Ler
µM/g FG
Gesamtaminosäuren
150
µM/g FG Malat
µM/g FG Malat
µm/g FG
Gesamtaminosäuren
µM/g FG Nitrat
der Mutante (Abb. 3/61d) stärker ausgeprägt war als bei Ler (Abb. 3/61c).
0
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/61: der Graph zeigt die Konzentration von Nitrat, Gesamtaminosäuren und Malat der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei
10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fd-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 31 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 36 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 43 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 39
Tage. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
98
Malat zeigte bei Wildtyp und Mutante ein ähnliches Verhalten.Bei Malat zeigte die Mutante
im Wurzelgewebe geringe, aber nicht signifikante Veränderungen (Abb. 3/61f) im Vergleich
zum Wildtypen. Die Wurzelkonzentration in der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) lag
deutlich niedriger bei der Mutante als bei Ler . In der 10 mM-Bedingung ohne Gln ergab sich
bei fd in der Wurzel ein niedrigerer Spiegel als bei Ler (Abb. 3/61e), und außerdem war die
Malatkonzentration genauso hoch als in der vergleichenden Bedingung mit Gln, was bei Ler
nicht zutraf. In den beiden Bedingungen ohne Gln ergab sich für Malat wieder eine positive
Korrelation mit der zunehmenden Nitratkonzentration in der Mutante, die Hauptversuchsreihe
mit Gln als zusätzlicher N-Quelle zeigte dies im Gegensatz zu Ler nicht.
Bei den Kohlenhydraten reagierte fd (Abb. 3/62b,d,f,h) in der Hauptversuchsreihe nicht
fd-1
b)
30
20
20
10
10
0
12
µM/g FG
Fruktose
a)
Ler
c)
Ler
fd-1
d)
0
12
8
8
4
4
0
µM/g FG
Glukose
30
µm/g FG
Fruktose
µM/g FG
Glukose
anders als Ler (Abb. 3/62a,c,e,g).
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
Ler
e)
fd-1
f)
27
18
18
9
9
0
40
35
30
0
40
35
30
10
5
0
Ler
g)
fd-1
h)
10
5
0
µM/g FG
Saccharose
27
µM/g FG Hexoseäquivalente
Stärke
µM/g FG Hexoseäquivalente
Stärke
µM/g FG
Saccharose
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/62: der Graph zeigt die Konzentration von Glukose, Fruktose, Saccharose und Stärke der
geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen
28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44
Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fd-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 31 Tage alt, bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 36 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 43 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM
Nitrat 39 Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die
Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und
Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
99
Bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) sah dies anders aus, hier reagierten vor allem die
reduzierenden Zucker und Saccharose mit veränderten Spiegeln in der Mutante. Zum einen
sanken die Konzentrationen im Vergleich zum Wildtyp deutlich ab, bei Fruktose und
Saccharose veränderte sich bei fd auch die Verteilung auf die beiden Gewebe. Auch Stärke
nahm in der Mutante unter Mangelernährung im Sproß ab. Die 10 mM-Bedingung ohne Gln
wiederum zeigte kaum Unterschiede zwischen Ler und fd. Lediglich Stärke nahm bei der
Mutante in der 10 mM-Bedingung ohne Gln in der Wurzel ab und im Sproß zu gegenüber
dem Wildtyp.
Bei den N-speichernden Aminosäuren (Glutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat) nahm
Glutamin in den Bedingungen, die neben zunehmender Nitratkonzentration auch Gln
enthielten, bei fd (Abb. 3/63b) in beiden Geweben ab.Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
wies kaum einen Unterschied zwischen Wildtyp und Mutante auf, auch die Glutaminspiegel
bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln wichen kaum voneinander ab. Bei Glutamat (Abb.
3/63d) wies die Mutante lediglich bei überoptimaler N-Versorgung (35 mM Nitrat + 4 mM
Gln) einen niedrigeren Sproßwert als der Wildtyp auf, ansonsten reagierte fd kaum anders als
Ler (Abb. 3/63c). Asparagin wies bei fd (Abb. 3/63f) in den Gln-haltigen Bedingungenim
Sproß kaum Veränderungen gegenüber Ler auf (Abb. 3/63e). in der Wurzel sanken die
Konzentrationen teilweise ab, Ausnahme war die überoptimale Nitratversorgungmit 35 mM
Nitrat, hier drehte sich in der Mutante das Verhältnis zwischen Sproß und Wurzel im
Vergleich zum Wildtyp um. Bei Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mM-Bedingung
ohne Gln ergaben sich keine gravierendenVeränderungen zwischen Mutante und Wildtyp.
Auch bei Aspartat waren die Bedingungen mit der Kombination aus Nitrat und Gln bei fd
betroffen (Abb. 3/63h), die Sproßwerte stiegen leicht an, während die Wurzelkonzentrationen
im Vergleich zu Ler absanken. Auch die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) führte bei der
Mutante in beiden Geweben zu einer Absenkung der Spiegel im Vergleich zu den LerWerten, bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln hingegen reagierte die Mutante nicht anders als
der Wildtyp (Abb. 3/63g).
a)
Ler
b)
fd-1
24
16
16
8
8
0
0
4,5
c)
Ler
d)
fd-1
4,5
3,0
3,0
1,5
1,5
0,0
0,0
µM/g Fg Glutamin
24
100
µM/g Fg Glutamat
µM/g FG Glutamat
µM/g FG Glutamin
Ergebnisse
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
e)
Ler
f)
2,4
fd-1
1,6
1,6
0,8
0,8
0,0
0,0
1,8
g)
Ler
h)
fd-1
1,8
1,2
1,2
0,6
0,6
0,0
0,0
µM/g Fg Asparagin
2,4
µM/g FG Aspartat
µM/g FG Aspartat µM/g FG Asparagin
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abb.ildung 3/63: der Graph zeigt die Konzentration von Aspartat, Asparagin, Glutamat und Glutamin der
geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen
28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44
Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fd-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 31 Tage alt, bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 36 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 43 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM
Nitrat 39 Tage. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer
12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Bei den Aminosäuren aus der Photorespiration nahm Glycin bei fd in den Bedingungen mit
Gln-Zusatz in beiden Geweben deutlich ab gegenüber Ler(Abb. 3/64b), die Verteilung auf die
beiden Gewebe wurde nicht beeinflußt. Die anderen Bedingungen reagierten bei fd nicht auf
einen Mutationseinfluß, hier beeinflußte hingegen die An- bzw. Abwesenheit von Gln die
Glycinkonzentration, nicht die Veränderung der externen Nitratkonzentration. Serin zeigte
keine Veränderung (Daten nicht gezeigt).
Ergebnisse
0,75
101
Ler
a)
µM/g FG Glycin
0,50
0,25
0,00
0,75
fd-1
b)
0,50
0,25
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
0,00
Abbildung 4/64: der Graph zeigt die Glycinkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei
1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage ,
bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fd-1 sind
die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 31 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 36 Tage, bei 35 mM Nitrat/4
mM Gln 43 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 39 Tage. Die Wachstumstemperatur betrug
20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach
Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Auch die aromatischen Aminosäuren waren nur schwach beeinflußt, lediglich bei
Trypthophan (Abb. 3/65b) kam es in der Mutante im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 3/65a) zu
einer verstärkten Synthese in der Wurzel, wenn die Medien Nitrat und Gln enthielten.In der
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) stiegen die internen Spiegel in beiden Geweben der
Mutante im Vergleich zum Wildtyp leicht an. Trotz mangelnder N-Versorgung stieg hier die
Aminosäuresynthese an, allerdings nur bei Trypthophan, nicht bei den anderen aromatischen
Aminosäuren. Vergleicht man die 10 mM-Bedingung ohne Gln mit der entsprechenden
Bedingung mit Gln, so lagen in der Mutante beide Gewebe in ihren Konzentrationen bei 10
mM Nitrat alleine unter denen bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln.
60
Ler
a)
nM/g FG Trypthophan
40
20
0
60
fd-1
40
20
0
b)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/65: der Graph zeigt die Trypthophankonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage
.Bei fd-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 31 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 36 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 43 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 39 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
102
Zudem lagen die Werte bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln in der Mutante niedriger als im
Wildtyp. Bei Betrachtung der beiden Bedingungen ohne Gln ergab sich für die Mutante eine
deutliche negative Korrelation zwischen Trypthophanspiegel und externer Nitratversorgung,
dies zeigte sich beim Wildtyp in viel geringerem Ausmaß.
Alanin und die aliphatischen Aminosäuren reagierten nicht anders als im Wildtyp (Daten
nicht gezeigt).
Die Aminosäuren aus dem Harnstoffzyklus hingegen reagierten alle drei mit Veränderungen.
Bei Arginin (Abb. 3/66b) und Citrullin (Abb. 3/66d) zeigten sich bei fd Veränderungen in den
Bedingungen, die beide N-Quellen enthielten im Vergleich zu Ler. Die Mutante wies im
Sproß in den genannten Bedingungen höhere Argininspiegel auf als Ler (Abb. 3/66a,c), die
Wurzel reagierte mit leichter Abnahme oder garnicht. Bei Citrullin nahmen Sproß- und
Wurzelkonzentrationen bei fd leicht ab,bei Ornithin kam es in beiden Geweben zu deutlich
niedrigeren Spiegeln in der Mutante (Abb. 3766f) als im Wildtyp (Abb. 3/66e). Sowohl bei
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) als auch bei der 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln
reagierten Ler und Mutante gleich bei Arginn und Citrullin, Ornithin hingegen sank in der 10
mM Nitrat-Bedingung ohne Gln bei fd im Vergleich zu Ler in beiden Geweben ab.Die
Mutation hatte in diesem Fall eine Auswirkung vor allem auf die Allokation der Aminosäure
auf die Gewebe.
Ergebnisse
103
Ler
b)
fd-1
2400
1600
1600
800
800
300
0
c)
Ler
d)
fd-1
200
200
100
100
0
nM/g FG Ornithin
300
90
nm/g FG Citrullin
nm/g FG Citrullin
0
nM/g FG Arginin
a)
0
Ler
e)
f)
fd-1
90
60
60
30
30
0
0
nm/g FG Ornithin
nM/g Fg Arginin
2400
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/66: der Graph zeigt die Konzentration von Arginin, Citrullin und Ornithin der geernteten Pflanzen
zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM
Nitrat 35 Tage .Bei fd-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 31 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln
36 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 43 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 43 Tage und bei 10 mM Nitrat 39 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Fazit zu fd-1:
(i)
Nitrat führt zu einer Hemmung der Blühinduktion bei fd.
(ii)
Es git keine Veränderungen bei den gemessenen Metaboliten, die darauf
hinweisen, daß dies nicht auf Nitrat beruht.
(iii)
Auf der anderen Seite gibt es jedoch interessante kleinere Verschiebungen wie
niedrigere Kohlenhydratspiegel und niedrigere Gesamtaminosäuren, zum letzteren
gehört ein Absinken von xxx und ein Anstieg bei xxx, außerdem verändert sich die
Gewebeverteilung bei xxx
Ergebnisse
104
3.2.6 fwa-1
Das Genprodukt FWA agiert im photoperiodisch gesteuerten Signalweg (Burn et al. 1993). Es
unterdrückt bzw. wirkt entgegengesetzt zur Aktivität fördernder Signalwege bzw.
downstream-Komponenten während der frühen Entwicklung oder juveniler vegetativer Phase
(Araki et al. 1998). Diese Mutante ist als spätblühend charakterisiert worden.
Die Blühverlaufskurven für alle Nitratbedingungen waren in der Mutante (Abb. 3/67b) stark
verzögert gegenüber dem Wildtyp (Abb. 3/67a). Die Kurven für 1 mM und 10 mM Nitrat,
jeweils mit Gln, sind auch getrennt im Vergleich zu Ler. Die Kurve für 35 mM Nitrat + 4 mM
Gln startete von allen Kurven als letzte. Hier trat also bei fwa in der Hauptversuchsreihe eine
sehr deutliche Hemmung der Blühinduktion mit steigender externer Nitratversorgung auf im
Vergleich zum Wildtyp. Die Kurve für die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) startete bei fwa
im Vergleich zu den anderen Kurven nicht sehr stark verzögert, während die 10 mM NitratBedigung ohne Gln auch bei dieser Mutante später als die Vergleichsbedingung mit Gln
blühte. Dabei fiel auch auf, daß die Blühverlaufskurve zur Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
bei fwa schneller startete als die Kurve zur 10 mM-Nitrat-Bedingung ohne Gln.
100
a)
Ler
80
60
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat ohne Gln
10 mM Nitrat ohne Gln
% Blühansatz
40
20
0
100
fwa-1
80
60
40
20
b)
0
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
Zeitverlauf in Tagen
Abbildung 3/67: Die Graphik zeigt den Blühverlauf von Arabidopsis thaliana cv Landsberg erecta und der
Blühmutante fwa-1 unter verschiedenen Nitratangeboten Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 68). Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h..
Ergebnisse
105
Es zeichnete sich sowohl bei Blattzahl (Abb. 3/68b) als auch bei Biomasse (Abb. 3768d,f)
eine deutliche Zunahme bei fwa gegenüber Ler ab. Bei der Wurzelbiomasse zeigte die
Mutante in der Hauptversuchsreihe fast gar keine Veränderung (Abb. 3/67f), während bei Ler
mit ansteigender externer Nitratversorgung auch eine Zunahme des Wurzelgewichtes eintrat
(Abb.
3/67e).
Interresanterweise
zeigten
die
beiden
Bedingungen
ohne
Gln
–
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mM Nitrat-Bedingung – bei fwa kaum ein
Veränderung in Blattzahl, Biomassen und Sproß/Wurzel-Verhältnis im Vergleich zum
Wildtyp, obwohl beide Kurven bei der Mutante im Vergleich zu Ler nach hinten verschoben
waren. Eine Verzögerung der Blühinduktion durch Verlängerung der vegetativen Phase =>
dies würde sich in höherer Blattzahl bzw. Biomasse niederschlagen – kann so nicht alleine
b)
30
10
10
0
0
c)
fwa-1
d)
900
600
600
300
300
150
0
1 mM Nitrat / 4 mM Gln
10 mM Nitrat / 4 mM Gln
35 mM Nitrat / 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
Ler
e)
fwa-1
f)
150
100
50
50
0
9
0
9
Sproß/Wurzel
100
Ler
g)
fwa-1
h)
6
6
3
3
0
0
mg Wurzel
Ler
mg Sproß
fwa-1
20
0
mg Wurzel
a)
20
900
mg Sproß
Ler
Sproß/Wurzel
Anzahl Blätter
30
Anzahl Blätter
gegeben werden, hier kam es wohl auch zu einer verzögerten Entwicklung.
Abbildung 3/68: der Graph zeigt die Anzahl der Blätter, die beiden Biomassen für Sproß und Wurzel sowie das
Sproß/Wurzel-Verhältnis der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die
Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35
Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fwa-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4
mM Gln 41 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 47 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 55 Tage, bei 0,5 mM
Nitrat 50 Tage und bei 10 mM Nitrat 54 Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100
µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert
und Standardfehler (n = 4-5).
Der interne Nitratspiegel stieg bei der Hauptversuchsreihe in der Mutante (Abb. 3/69b) im
Sproß paralell zum externen Nitratangebot an, somit ergab sich für den Sproß ein deutlicher
Ergebnisse
106
Zusammenhang zwischen externem und internem Nitratgehalt, der sogar wesentlich stärker
als beim Wildtyp (Abb. 3/69a) ausgeprägt war. Dieser Zusammenhang ergab sich auch für die
Wurzelwerte von fwa, hier sanken die Konzentrationen gegenüber Ler jedoch ab. Die
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) führte bei Wildtyp und Mutante zu den gleichen
Resultaten. Dies bestätigt den Eindruck, der sich aus den Daten zu Blattzahl und Biomasse
ergibt, die Blühkurve zur Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat), das verfrühte Blühen dieser
Bedingung bei Ler ist in der Mutante etwas abgeschwächt. Bei der 10 mM-Bedingung ohne
Gln wies der Sproß in der Mutante im Vergleich zu Ler einen deutlich erhöhten Spiegel auf,
der bei Ler nicht niedriger lag als die entsprechende Bedingung mit Gln.
Die Gesamtaminosäuren nahmen bei fwa (Abb. 3/69d) insgesamt etwas ab gegenüber Ler,
dies betraf alle Bedingungen. Bei den beiden Bedingungen ohne Gln zeigte sich bei fwa nicht
dieselbe Gewebeverteilung wie beim Wildtyp, bei der Mutante wiesen beide Gewebe die
b)
60
30
30
0
90
0
90
c)
Ler
fwa-1
d)
60
60
30
30
0
15
0
Ler
e)
fwa-1
f)
15
10
10
5
5
0
µM/g FG Nitrat
fwa-1
µM/g FG
Gesamtaminosäuren
a)
Ler
60
µM/g FG Malat
µM/g FG Malat
µM/g FG
Gesamtaminosäuren
µM/g FG Nitrat
gleiche Konzentration auf.
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/69: der Graph zeigt die Konzentrationen von Nitrat, Gesamtaminosäuren und Malat der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei
10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fwa-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 41 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 47 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 55 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 50 Tage und bei 10 mM Nitrat 54
Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
107
Der Malatspiegel reagierte uneinheitlich. Bei überoptimaler N-Versogung nahm er bei fwa
(Abb. 3/69f) in der Hauptversuchsreihe im Vergleich zu Ler (Abb. 3/69e) etwas ab.
Auch bei Mangelernährung sanken die Konzentrationen in den Geweben der Mutante ab, vor
allem die Wurzel wies weniger als 1/3 des Wildtyp-Wertes auf. Dies ist teilweise mit den
niedrigeren Nitratwerten der Mutante in dieser Bedingung erklärbar.Im Gegensatz zu Ler
wies die Mutante in der 10 mM-Bedingung ohne Gln in der Wurzel einen deutlich niedrigeren
Malatspiegel auf.
Bei den Kohlenhydraten führten sowohl bei den löslichen Zuckern als auch bei Stärke die
Bedingungen mit einer Kombination aus Nitrat und Gln bei fwa zu einem Anstieg der
Konzentrationen (Abb. 3/70 b,d,f,h) gegenüber den Wildtypkonzentrationen. Besonders
deutlich war dies bei der überoptimalen Versorgung mit 35 mM Nitrat + 4 mM Gln
fwa-1
b) 30
20
20
10
10
0
12
µM/g FG
Fruktose
a)
Ler
c)
Ler
fwa-1
µM/g FG
Glukose
30
0
d) 12
8
8
4
4
0
0
µM/g FG
Fruktose
µM/g FG
Glukose
ausgeprägt
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
27
Ler
e)
fwa-1
f)
27
18
18
9
9
0
36
0
Ler
g)
fwa-1
h)
36
27
27
9
9
0
0
µM/g FG
µM/g FG
Hexoseäquivalente Saccharose
Stärke
µM/g FG
Hexoseäquivalente µM/g FG
Saccharose
Stärke
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/70: der Graph zeigt die Kohlenhydratkonzentrationen der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage
.Bei fwa-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 41 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 47 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 55 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 50 Tage und bei 10 mM Nitrat 54 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
108
Auch die Verteilung auf Sproß und Wurzel wich in der Mutante vom dem Wildtyp-Bild bei
externer Nitratversorgung mit 35 mM Nitrat (Abb. 3/70a,c,e,g) ab. Dafür sanken die
Kohlenhydratkonzentrationen in der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) drastisch ab, lediglich
Stärke wies einen ähnlich hohen Spiegel wie Ler auf. Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln
hingegen traten kaum Unterschiede zwischen Mutante und Wildtyp auf. Enthielt das Medium
also kein Gln, so zeigte sich bei der Mutante eine viel geringere Kohlenhydratabnahme mit
24
a)
Ler
b)
fwa-1
24
16
16
8
8
0
4,5
0
Ler
c)
d)
fwa-1
4,5
3,0
3,0
1,5
1,5
0,0
0,0
µM/g FG Glutamat µM/g FG Glutamin
µM/g FG Glutamat µM/g FG Glutamin
ansteigendem Nitratangebot als bei Ler, Ausnahme war Stärke.
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
e)
Ler
f)
fwa-1
2,4
1,6
1,6
0,8
0,8
0,0
1,8
0,0
g)
Ler
h)
fwa-1
1,8
1,2
1,2
0,6
0,6
0,0
0,0
µM/g FG Asparagin
2,4
µM/g FG Aspartat
µM/g FG Aspartat
µM/g FG Asparagin
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/71: der Graph zeigt die Konzentrationen von Aspartat Asparagin, Glutamat und Glutamin der
geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen
28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44
Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fwa-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 41 Tage alt, bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 47 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 55 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 50 Tage und bei 10 mM
Nitrat 54 Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die
Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und
Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
109
Bei den N-haltigen Aminosäuren (Glutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat) reagierte
Glutamin in der Mutante (Abb. 3/71b) nur mit einer allgemeinen Absenkung der Spiegel bei
allen Bedingungen. Wie beim Wildtyp (Abb. 3/71a) ergab sich jedoch bei der Mutante kaum
ein Zusammenhang zwischen externem Nitratangebot und interner Aminosäurekonzentration,
unabhängig von der An- oder Abwesenheit von Gln. Glutamat nahm bei der Mutante im
Wurzelbereich ab (Abb. 3/71d), sofern das Medium neben Nitrat noch Gln enthielt, die
höchste Nitratkonzentration war davon nicht betroffen. Bei Mangelernährung sanken die
Spiegel beider Gewebe von fwa etwas ab, die 10 mM-Bedingung ohne Gln reagierte nicht
anders als der Wildtyp (Abb. 3/71c). Asparagin wies zunächst bei aufsteigender Nitratreihe
mit Gln niedrigere Spiegel in der Mutante auf (Abb. 3/71f), bei überoptimaler
Nitratversorgung nahm der Wurzelwert bei fwa aber deutlich im Vergleich zu Ler zu, der
Sproß reagierte nicht. Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) zeigte bei der Mutante keine
Veränderung gegenüber dem Wildtyp, die 10 mM-Bedingung ohne Gln nahm bei der Mutante
in beiden Geweben etwas ab. Aspartat reagiert bei fwa nur in der Wurzel (Abb. 3/71f), dort
wies es geringere Spiegel als im Wildtyp auf. Zudem zeigte die Mangelbedingung (0,5 mM
Nitrat) in beiden Geweben etwas geringere Spiegel als beim Wildtyp auf (Abb. 3/71g), dies
traf auch auf die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln zu.
Die Aminosäuren aus der Photorespiration sowie die aromatischen Aminosäuren reagierten in
der Mutante nicht anders als wie beim Wildtyp (Daten nicht gezeigt). Bei den Aliphaten und
Alanin zeigte sich ebenfalls keine veränderte Nitratantwort, die Konzentrationen stiegen bei
der Mutante um 20 – 30 % in beiden Geweben im Vergleich zum Wildtyp an (Daten nicht
gezeigt).
Im Harnstoffzyklus stieg Arginin im Hauptversuch bei fwa vor allem bei überoptimaler NVersorgung mit 35 mM Nitrat + 4 mM Gln im Vergleich zu Ler stark an (Abb. 3/72b), dabei
war dies jedoch ungleichmäßig auf die Gewebe verteilt, Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
und 10 mM-Bedingung ohne Gln reagierten jedoch nicht. Die Anwesenheit von Gln hatte
damit in der Mutante einen Einfluß auf den Argininspiegel. Ornithin sank bei fwa in den Glnhaltigen Bedingungen wiederum ab (Abb. 3/72d). Auf der anderen Seite stieg die
Wurzelkonzentration von fwa der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) sehr stark an gegenüber
Ler . Die 10 mM-Bedingung ohne Gln reagierte mit einer leichten Abnahme in beiden
Geweben der Mutante. Bei fwa ergab sich damit eine negative Korrelation der
Ergebnisse
110
Ornithinkonzentration zum externen Nitratangebot in der Wurzel, wenn kein zusätzliches Gln
a)
Ler
b)
fwa-1
2400
1600
1600
800
800
nM/g FG Ornithin
0
90
nM/g FG Arginin
2400
0
c)
Ler
d)
fwa-1
90
60
60
30
30
0
0
nM/g FG Ornithin
nM/g FG Arginin
im Medium vorlag, dies trat beim Wildtyp nicht ein.
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/72: der Graph zeigt die Konzentrationen von Arginin und Ornithin der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM
Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM
Nitrat 35 Tage .Bei fwa-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 41 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln
47 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 55 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 50 Tage und bei 10 mM Nitrat 54 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Citrullin zeigte bei fwa keine auffälligen Veränderungen im Vergleich zu Ler (Daten nicht
gezeigt).
Bei den von Aspartat abstammenden Aminosäuren reagierte nur Lysin in der Mutante
verändert gegenüber dem Wildtyp, es kam zu einer allgemeinen Konzentrationszunahme bei
allen Bedingungen in beiden Geweben um 40 – 50 % (Daten nicht gezeigt), unabhängig von
der Nitratbedingung.
Ergebnisse
111
Fazit zu fwa-1:
(i)
Auch bei dieser Mutante führt Nitrat zu einer Verzögerung der Blühinduktion.
Dies ist stärker ausgeprägt bei der Mutante im Vergleich zum Wildtyp Ler bei
Vergleich der Blühverlaufskurven, Mutante und Wildtyp zeigen ähnliche
Ergebnisse bei Blattzahl und Sproßbiomasse. Die quantitativen Unterschiede
sollten nicht überbewertet werden, da die Verzögerung der Blühinduktion in dieser
sehr spätblühenden Mutante sehr stark ist, was unzweifelhaft auch zu anderen
Verschiebungen führen wird. Dies beeinflußt nicht die Hauptaussage, daß Nitrat
immer noch effektiv zu einer Hemmung der Blühinduktion in fwa führt.
(ii)
Die Veränderungen in den Metaboliten sind ähnlich denen beim Wildtyp,
zunehmende externe Nitratzufuhr führt steigenden internen Nitratspiegeln,
während die Aminosäuren kaum reagieren bzw. bei hohen Nitratkonzentrationen
leicht absinken und eine leichte Abnahme der Kohlenhydrate eintritt.
Ergebnisse
112
3.2.7 fve-1
Das Genprodukt FVE-1 agiert im konstitutiven Signalweg (Burn et al. 1993) und die Mutante
zeigt einen spätblühenden Phänotyp.
Bei fve (Abb. 3/73b) sah der Verlauf der Blühkurven ähnlich aus wie bei den bisherigen
Mutanten. Die ersten beiden Bedingungen, die Glutamin enthielten, waren deutlich
voneinander getrennt, bei überoptimaler Nitratkonzentration wurde die Blühinduktion
verzögert. Verliefen beim Wildtyp (Abb. 3/73a) die Kurven für 1 mM und 10 mM Nitrat
(beide mit Gln) direkt paralell nebeneinander und 35 mM Nitrat + Gln etwas abgesetzt davon,
so verliefen bei fve die Kurven für 10 mM und 35 mM Nitrat ( beide mit Gln) sehr eng
beieinander.
100
a)
Ler
80
60
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
% Blühansatz
40
20
0
100
fve-1
b)
80
60
40
20
0
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
Zeitverlauf in Tagen
Abbildung 3/73: Die Graphik zeigt den Blühverlauf von Arabidopsis thaliana cv Landsberg erecta und der
Blühmutante fve-1 unter verschiedenen Nitratangeboten. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n =
6-8).
Im Hauptversuch spiegelte sich die Verschiebung der Blühverlaufskurven auch in Blattzahl
und Biomasse wieder. Stiegen bei Ler diese Daten für die aufsteigende Nitratreihe + Gln
gleichmäßig an (Abb. 3/74a,c,e), so zeigten sie bei der Mutante (Abb. 3/74 b,d,f) einen
Sprung von 1 mM Nitrat nach 10 mM Nitrat und danach nur einen sehr leichten Anstieg nach
35 mM Nitrat (jeweils mit Gln). Dies galt sowohl für Blattzahl als auch für die Biomasse des
Sproßes. Insgesamt ergaben die Daten aus Blühverlaufskurven auf der einen Seite und
Ergebnisse
113
Blattzahl und Biomasse auf der anderen Seite, daß fve eine deutliche Hemmung der
Blühinduktion durch Nitrat aufwies.Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) startete bei der
Mutante deutlich verspätet im Vergleich zum Wildtyp, wenn man die Blühverlaufskurven
betrachtet. Bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) zeigte die Mutante nur in der Blattzahl
eine leichte Erhöhung im Vegleich zu Ler, die Biomassen veränderten sich nicht. Unter
diesen Umständen war also die Entwicklung in der Mutante beeinflußt. Auch die 10 mMBedingung ohne Gln startete bei fve im Vergleich zu Ler verspätet, zeigte aber denselben
paralellen Verlauf zur entsprechenden Bedingung mit Gln, der blühfördernde Effekt von Gln
wurde hier bei der Mutante bestätigt. Die beiden Bedingungen ohne Gln liefen bei der
Mutante fast paralell, obwohl sich bei Blattzahl und Biomasse (Abb. 3/74b+d+f) deutliche
fve-1
b)
30
20
20
10
10
0
900
mg Sproß
a)
Ler
Ler
c)
fve-1
Anzahl Blätter
30
0
d) 900
600
600
300
300
0
mg Sproß
Anzahl Blätter
Unterschiede ergaben.
0
Ler
e)
fve-1
f)
150
100
50
50
0
0
9
Ler
g)
fve-1
h)
9
6
6
3
3
0
0
Sproß/Wurzel
100
mg Wurzel
150
Sproß/Wurzel
mg Wurzel
1 mM Nitrat/4 mM Gln
10 mM Nitrat/4 mM Gln
35 mM Nitrat/4 mM Gln
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
Abbildung 3/74: der Graph zeigt die Anzahl der Blätter, die beiden Biomassen für Sproß und Wurzel sowie das
Sproß/Wurzel-Verhältnis der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die
Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35
Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fve-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4
mM Gln 35 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 43 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 44 Tage, bei 0,5 mM
Nitrat 50 Tage und bei 10 mM Nitrat 50 Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100
µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert
und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
114
Bei Ler begann die Blühverlaufskurve für die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln im
Vergleich zu der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) früher, aber die Biomassedaten zeigten,
daß die Blühinduktion in dieser Bedingung bei der Mutante tatsächlich verzögert bzw. bei
der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) verfrüht war (Abb. 3/74b+d). Bei der 10 mM NitratBedingung ohne Gln ergaben sich bei fve bei Blattzahl und Wurzelbiomasse leicht erhöhte
Werte im Vergleich zu Ler, die Sproßbiomasse reagierte kaum, damit war die Bedingung
vergleichbar mit der 10 mM Nitrat-Bedingung mit Gln. Das Sproß/Wurzel-Verhältnis stieg
bei fve (Abb. 3/74h) mit zunehmender Nitratversorgung auf ähnliche Weise oder noch stärker
als beim Wildtyp (Abb. 3774g) an.
Der interne Nitratspiegel zeigte für Wildtyp und Mutante generell dasselbe Bild, es traten aber
einige qualitative Unterschiede auf. Im Hauptversuch sank die Wurzelkonzentration bei
mittlerem Nitratangebot mit 10 mM Nitrat + Gln in fve (Abb. 3/75b) gegenüber Ler (Abb.
3/75a) ab, bei überoptimaler Nitratversorgung (35 mM Nitrat) hingegen stiegen die
Nitratspiegel beider Gewebe in der Mutante deutlich an. Dabe ist zu beachten, daß die
Pflanzen bei Wildtyp und Mutante große unterschiede im Alter aufwiesen (siehe Legende).
Insgesamt ergab sich bei fve nur im Sproß eine Korrelation zwischen externem Nitratangebot
und internem Nitratspiegel, diese war jedoch wesentlich stärker ausgeprägt als beim Wildtyp.
Bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) trat keine Veränderung Im Vergleich zu Ler auf.
Bei der 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln stieg die Nitratkonzentration im Sproß der
Mutante gegenüber dem Wildtyp deutlich an und lag etwas höher als die Konzentration in der
vergleichbaren Bedingung mit Gln. Die Mutante zeigte leicht erhöhte Nitratspiegel im
Vergleich zum Wildtyp im Sproß, während die Wurzelkonzentration leicht absank, dies war
auch bei der vergleichbaren Bedingung mit Gln zu sehen.
fve-1
b) 150
100
100
50
50
0
0
90
Ler
c)
fve-1
d) 90
60
60
30
30
0
0
e)
15 Ler
fve-1
f)
15
10
10
5
5
0
µM/g FG Nitrat
a)
Ler
µM/g Fg
Gesamtaminosäuren
150
115
µM/g FG Malat
µM/g Fg Malat
µM/g FG
Gesamtaminosäuren
µM/g FG Nitrat
Ergebnisse
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abb.ildung 3/75: der Graph zeigt die Konzentration von Nitrat, Gesamtaminosäuren und Malat der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei
10 mM Nitrat 35 Tage .Bei ve-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 43 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 44 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 50 Tage und bei 10 mM Nitrat 50
Tage. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Insgesamt zeigte sich auch bei den beiden Bedingungen ohne Gln bei fve eine viel stärker
ausgeprägte Korrelation zwischen internem Nitratgehalt und externer Nitratversorgung als bei
Ler.
Die Gesamtaminosäuren reagierten nur sehr schwach auf eine veränderte Nitratantwort
infolge der Mutation bei fve (Abb. 3/75d), dies galt für alle angewandten Bedingungen. Die
An- bzw. Abwesenheit von Gln modifizierte die Reaktion auf das externe Nitratangebot
kaum. Es ergab sich damit für Mutante und Wildtyp ein ähnliches Bild.
Beim Malatspiegel kam es in fve (Abb. 3/75f) zu einem ähnlichen Bild im Vergleich zu Ler
(Abb. 3/75e) mit einigen Unterschieden.
Zeigte sich beim Wildtyp ein Zusammenhang
zwischen ansteigender Nitratkonzentration bei den Kombinationen von Nitrat und Gln und
internem Malatspiegel, so ergab sich bei der Mutante keine Korrelation mehr. Bei der
Ergebnisse
116
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) sanken bei fve die Malatspiegel stark ab, vor allem in der
Wurzel, obwohl Wildtyp und Mutante ähnliche Nitratspiegel aufwiesen. Auch die 10 mMNitrat-Bedingung ohne Gln wies in der Mutante niedrigere Malatspiegel auf als Ler, zudem
wechselte die Verteilung in Bezug auf die Gewebe. Anhand der beiden Bedingungen ohne
Gln zeigte sich, daß die Abwesenheit von Gln auf jeden Fall im Wurzelbereich einen
hemmenden Effekt auf die Malatsynthese bei fve hatte.
Bei den reduzierenden Zuckern wies die Mutante (Abb. 3/76b,d) niedrigere Spiegel als Ler
(Abb. 3/76a,c) auf. Dies galt für beide Gewebe sowohl für die Hauptversuchsreihe als auch
für die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat). Die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln zeigte
keinen Unterschied zwischen Ler und Mutante. Bei Saccharose kam es bei fve (Abb. 3/76f) zu
einer leichten Konzentrationszunahme in der Wurzel gegenüber dem Wildtyp (Abb. 3/76e) in
der Hauptversuchsreihe, die Gewebeverteilung änderte sich nicht. Bei der Mangelbedingung
(0,5 mM Nitrat) hingegen reagierte Saccharose bei der Mutante wie die reduzierenden Zucker
in beiden Geweben mit abnehmenden Konzentrationen im Vergleich zum Wildtyp, bei der 10
mM Nitrat-Bedingung ohne Gln traten wiederum keine Unterschiede zwischen Wildtyp und
fve auf. Bei der Stärke zeigten sich kaum Unterschiede zwischen Ler (Abb. 3/76g) und fve
(Abb 3/76h) für die Hauptversuchsreihe, bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) nahm die
Sproßkonzentration der Mutante deutlich ab im Vergleich zu Ler. Dafür trat in der zweiten
Bedingung ohne Gln eine deutliche Konzentrationssteigerung im Sproß der Mutante auf.
Damit wiesen beide Bedingungen ohne Gln unabhängig vom externen Nitratangebot die
gleichen Stärkespiegel im Sproß auf, dies ergab sich nicht beim Wildtyp.
117
fve-1
b) 30
20
20
10
10
0
12
µM/g FG
Fruktose
a)
Ler
c)
Ler
fve-1
d)
0
12
8
8
4
4
0
0
µM/g Fg
Fruktose
µM/g Fg
Glukose
30
µM/g FG
Glukose
Ergebnisse
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
Ler
e)
fve-1
f) 27
18
18
9
9
0
36
18
9
0
Ler
g)
fve-1
0
h) 36
18
9
0
µM/g Fg
Saccharose
27
µM/g FG Hexoseäqivalente
Stärke
µM/g Fg Hexoseäquivalente
Stärke
µM/g Fg
Saccharose
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/76: der Graph zeigt die Kohlenhydratkonzentrationen der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage
.Bei ve-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 43 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 44 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 50 Tage und bei 10 mM Nitrat 50 Tage. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Die Einzelaminosäuren spiegeln die Nichtveränderung im Gesamtaminosäurenspiegel wieder.
Veränderten sich sonst bei den anderen besprochenen Mutanten vor allem die N-speichernden
Aminosäuren, so zeigten sie bei dieser Mutante das gleiche Verhalten wie Ler (Daten nicht
gezeigt).
Veränderungen traten bei den aromatischen Aminosäuren auf, da diese aber im nM-Bereich
lagen, hatten sie keinen nennenswerten Einfluß auf den Gesamtaminosäurenspiegel.
Trypthophan und Phenylalanin zeigten bei fve einige, wenn auch uneinheitliche,
Veränderungen gegenüber Ler mit einer leicht steigenden Tendenz. Trypthophan nahm in der
Bedingung, die 10 mM Nitrat und Gln enthielt, in beiden Mutanten-Geweben zu (Abb.
3/77b), Bei den anderen beiden Bedingungen, die eine Kombination aus Nitrat und Gln
Ergebnisse
118
enthielten, reagierte der Trypthophanspiegel in der Mutante kaum. Bei der Mangelbedingung
(0,5 mM Nitrat) zeigte die Mutante deutlich erhöhte Werte gegenüber Ler (Abb. 3/77a) .
Auch bei der 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln stiegen bei fve die Konzentrationen im
Sproß und Wurzel stark an. Die Abwesenheit von Gln führte zu wesentlich höheren
Tryptophanspiegeln bei fve als bei Ler.
b)
fve-1
40
40
20
20
0
nM/g Fg
Phenylalanin
60
120
nM/g FG
Trypthophan
a)
Ler
0
Ler
c)
fve-1
d) 120
80
80
40
40
0
nM/g FG
Phenylalanin
nM/g FG
Trypthophan
60
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/77: der Graph zeigt die Konzentration von Trypthophan und Phenylalanin der geernteten Pflanzen
zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM
Nitrat 35 Tage .Bei ve-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln
43 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 44 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 50 Tage und bei 10 mM Nitrat 50 Tage. Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Phenylalanin stieg bei der Mutante nur im Sproßgewebe der Bedingungen an (Abb. 3/77d),
die zusätzlich zu Nitrat noch Gln enthielten. Bei den Gln-freien Bedingungen trat kein
Unterschied zwischen Wildtyp und Mutante auf. Tyrosin zeigte keine Veränderung (Daten
nicht gezeigt).
Bei den Aminosäuren aus dem Harnstoffzyklus reagierte Ornithin mit Konzentrationsabnahmen ( 20 – 30 %) in beiden Geweben unter allen Bedingungen, Arginin und Citrullin
zeigten keine Veränderung (Daten nicht gezeigt).
Bei den von Aspartat abstammenden Aminosäuren zeigte lediglich Lysin bei der Mutante
(Abb. 3/78b) ein Anstieg der Konzentrationen in beiden Geweben gegenüber Ler, der
Wurzelgehalt
war
davon
besonders
deutlich
getroffen.
Dies
betraf
sowohl
die
Ergebnisse
119
Hauptversuchsreihe wie auch Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mM-Bedingung
nM/g FG Lysin
nM/g Fg Lysin
ohne Gln, die Verteilung auf die Gewebe wurde nicht verändert bei fve im Vergleich zu Ler.
240
a)
Ler
160
80
0
240
b)
160
80
0
fve-1
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/78: der Graph zeigt die Lysinkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1
mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage ,
bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei ve-1 sind
die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 43 Tage, bei 35 mM Nitrat/4
mM Gln 44 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 50 Tage und bei 10 mM Nitrat 50 Tage. Die Wachstumstemperatur betrug
20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach
Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Methionin und Threonin zeigten bei der Mutante keine nennenswerten Veränderungen im
Vergleich zu Ler (Daten nicht gezeigt).
Fazit zu fve:
(i)
Nitrat bewirkt eine deutliche Hemmung des Blühens bei fve. Diese Verzögerung
mag stärker als beim Wildtyp Ler sein. Wie bereits erwähnt, sollten die
quantitativen Unterschiede jedoch nicht überbewertet werden, die insgesamt die
Blühzeiten so stark verschoben sind.
(ii)
Auch hier zeigt sich bei der Mutante ein ähnliches Metabolitenbild wie beim
Wildtypen, wobei einige Unterschiede wie bei Nitrat, Malat, den Kohlenhydraten,
den aromatischen Aminosäuren sowie Lysin auftreten.
Ergebnisse
120
3.2.8 fy-1
Das Genprodukt FY agiert im konstitutiven Signalweg (Burn et al. 1993) und auch diese
Mutante ist spätblühend.
Bei fy (Abb. 3/79b) kam der hemmende Einfluß von Nitrat auf die Blühinduktion deutlich
zum tragen, solange das Medium als zusätzliche N-Quelle noch Gln enthielt. Bei dieser
Mutante liefen die Kurven für die drei Nitratbedingungen sehr weit auseinandergezogen, dies
ging einher mit erhöhten Werten zu Blattzahl und Biomasse zur Blütezeit (Abb. 3/80b+d+f).
Bei der Mutante zeigten Blattzahl, Biomassen und Sproß/Wurzel-Verhältnis (Abb.
3/80b+d+f) in der Hauptversuchsreihe eine viel deutlicher ausgeprägte positive Korrelation
zwischen den jeweiligen Parametern und dem externen Nitratangebot als der Wildtyp (Abb.
3/80a+c+e). Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) lief paralell zur Kurve für 35 mM Nitrat
+ 4 mM Gln, war also bei der Mutante sehr stark verzögert gegenüber Ler (Abb. 3/79a). Hier
stiegen die Biomassedeaten jedoch nicht an, die Verzögerung der Blühinduktion beruht also
nicht auf eine verlängerte vegetative Phase, sondern auf eine verzögerte Entwicklung.
100
a)
Ler
80
60
1 mM Nitrat + 4 mM Gln
10 mM Nitrat + 4 mM Gln
35 mM Nitrat + 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat ohne Gln
10 mM Nitrat ohne Gln
b)
% Blühansatz
40
20
0
100
fy-1
80
60
40
20
0
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
Zeitverlauf in Tagen
Abbildung 3/79: Die Graphik zeigt den Blühverlauf von Arabidopsis thaliana cv Landsberg erecta und der
Blühmutante fy-1 unter verschiedenen Nitratangeboten Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 6-8).
Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h..
Auch die Kurve zur 10 mM-Bedingung ohne Gln war in der Mutante verzögert, zum einen im
Vergleich zur Gln-haltigen Bedingung der Mutante selbst, zum andern gegenüber der
Ergebnisse
121
Wildtyp-Kurve. Bei fy zeigte sich jedoch ein sehr steiler Kurvenverlauf bei der Bedingung
ohne Gln, während die Kurve mit Gln langsam anstieg. Wie bei fve liefen die beiden
Bedingungen ohne Gln in dieser Mutante sehr eng beieinander, während Blattzahl und
Biomasse deutliche Unterschiede im Gegensatz zu Ler aufwiesen. Unter Berücksichtigung
von Blattzahl und Sproßbiomasse zeigte sich, daß bei fy wie bei Ler eine Verzögerung der
Blühinduktion mit steigender Nitratversorgung auftrat. Beide Mutanten – fy und fve entstammen dem gleichen Signalweg (Empfindlichkeit gegenüber Vernalisation) und
a)
fy
b)
30
20
20
10
10
0
900
mg Sproß
Ler
Ler
c)
fy
0
d) 900
600
600
300
300
0
mg Sproß
Anzahl Blätter
30
Anzahl Blätter
reagieren auf einen fehlenden Gln-Einfluß ähnlich.
0
e)
fy
f) 150
100
100
50
50
0
9
Ler
g)
fy
h)
0
9
6
6
3
3
0
0
mg Wurzel
Ler
Sproß/Wurzel
150
Sproß/Wurzel
mg Wurzel
1 mM Nitrat / 4 mM Gln
10 mM Nitrat / 4 mM Gln
35 mM Nitrat / 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
Abbildung 3/80: der Graph zeigt die Blattanzahl, Biomassen und Sproß/Wurzel-Verhältnisse der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei
10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 28 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 47 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 62 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 60 Tage und bei 10 mM Nitrat 55
Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Aber auch bei Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln
wiesen die Parameter bei fy höhere Werte als bei Ler auf. Diese Mutante reagierte in
Gegenwart von Gln sehr stark auf die hemmende Wirkung von Nitrat auf die Blühinduktion
und damit auf eine Verlängerung der vegetativen Phase, bei Abwesenheit von Gln trat
zumindest in der Blühinduktion kein Einfluß durch Nitrat auf.
Ergebnisse
122
Beim internen Nitratspiegel kam es bei der Hauptversuchsreihe in der Mutante zu erhöhten
Konzentrationen im Sproß (Abb. 3/81b), somit ergab sich für den Sproß ein deutlicher
Zusammenhang zwischen externem und internem Nitratgehalt, der wesentlich stärker als
beim Wildtyp (Abb. 3/81a) ausgeprägt war. Diese Korrelation ergab sich jedoch nicht für die
Wurzelwerte von fy. Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) führte bei Wildtyp und Mutante
zu den gleichen Resultaten. Dies bestätigte den Eindruck, der sich aus den Daten zu Blattzahl
und Biomasse ergab, die Blühkurve zur Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) war aufgrund
verzögerter Entwicklung nach hinten verschoben. Bei der
10 mM-Nitrat-Bedingung ohne
Gln wies der Sproß in der Mutante im Vergleich zu Ler einen deutlich erhöhten Spiegel auf,
der aber wie bei Ler niedriger lag als der der entsprechenden Bedingung mit Gln. Obwohl der
Unterschied im Nitratgehalt bei den beiden Bedingungen ohne Gln bei der Mutante viel
größer war als beim Wildtyp, so trat jedoch bei der Blühinduktion kaum ein Unterschied in
fy-1
b) 150
100
100
50
50
0
0
90
c)
Ler
fy-1
d)
90
60
60
30
30
0
15
0
e)
Ler
fy-1
f)
15
10
10
5
5
0
µM/g FG Nitrat
a)
Ler
µM/g FG
Gesamtaminosäuren
150
µM/g FG Malat
µM/g FG Malat
µM/g FG
Gesamtaminosäuren
µM/g FG Nitrat
der Mutante auf.
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/81: der Graph zeigt die Konzentration von Nitrat, Gesamtaminosäuren und Malat der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei
10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 28 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 47 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 62 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 60 Tage und bei 10 mM Nitrat 55
Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h.
Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
123
Die Gesamtaminosäuren reagierten in der Mutante (Abb. 3/81d) nicht anders als beim
Wildtyp (Abb. 3/81c), unabhängig vom Nitratangebot oder einem Gln-Zusatz.
Beim Malatspiegel kam es jedoch zu Verschiebungen im internen Spiegel. War beim Wildtyp
(Abb. 3/81e) ein Großteil des Malats unabhängig von der angewandten Bedingung in der
Wurzel zu finden, so fand in der Mutante (Abb. 3/81f) eine Umschichtung in Richtung Sproß
statt, sodaß sich die beiden Gewebe bei fy mehr oder weniger ähnliche Konzentrationen
ergaben. Bei der Hauptversuchsreihe stieg der Malatspiegel in beiden Geweben mit
zunehmender externer Nitratversorgungbei fy an. Auch bei den beiden Gln-freien
Bedingungen trat eine Zunahme des Malatspiegels in der Mutante mit höherer
Nitratversorgung ein im Vergleich zu Ler.
Bei den Kohlenhydratenspiegeln der Mutante fiel auf, daß in Gegenwart von ansteigenden
Nitratangebot und Gln die Konzentrationen der reduzierenden Zucker (Abb. 3/82b,d) und
fy-1
b)
30
20
20
10
10
0
12
µM/g FG
Fruktose
a)
Ler
c)
Ler
fy-1
d)
0
12
8
8
4
4
0
0
µM/g Fg
Fruktose
µM/g Fg
Glukose
30
µM/g FG
Glukose
Saccharose (Abb. 3/82f) selbst bei höheren Nitratkonzentrationen gegenüber Ler anstiegen.
Ler
e)
fy-1
f)
27
18
18
9
9
0
36
0
Ler
g)
fy-1
h)
36
18
18
9
9
0
0
µM/g FG
Saccharose
27
µM/g FG
Hexoseäquivalente
Stärke
µM/g FG
Hexoseäquivalente
Stärke
µM/g FG
Saccharose
1 m M Nitrat/4 m M Gln Sproß
1 m M Nitrat/4 m M Gln W urzel
10 m M Nitrat/4 m M Gln Sproß
10 m M Nitrat/4 m M Gln W urzel
35 m M Nitrat/4 m M Gln Sproß
35 m M Nitrat/4 m M Gln W urzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat W urzel
10 m M Nitrat Sproß
10 m M Nitrat W urzel
Abbildung 3/82: der Graph zeigt die Kohlenhydratkonzentrationen der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage
.Bei fy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 28 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 47 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 62 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 60 Tage und bei 10 mM Nitrat 55 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
124
Stärke (Abb. 3/82h) nahm hingegen wie im Wildtyp (Abb. 3/82g) ab, lag in den
Konzentrationen bei fy aber immer noch höher als die Ler-Werte. Bei 0,5 mM Nitrat im
Medium fielen auf der anderen Seite die Kohlenhydratkonzentrationen in der Mutante
drastisch ab, Ausnahme war dabei die Stärke. Dies ging nicht einher mit den niedrigen
Nitratkonzentrationen bei 0,5 mM Nitrat externem Nitratangebot. Entweder speichert eine
Pflanze Nitrat oder Stärke (Scheible et al. 1997), dies traf hier bei dieser Mutante aber nicht
zu. Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln reagierten die Zuckerspiegel bei der Mutante ähnlich
wie bei Wildtyp, die Stärke stieg in der Mutante jedoch an.
Ler
b)
fy-1
16
16
8
8
0
4,5
µM/g FG
Glutamat
24
µM/g FG
Glutamin
a)
0
c)
Ler
d)
fy-1
4,5
3,0
3,0
1,5
1,5
0,0
µM/g FG
Glutamat
µM/g FG
Glutamin
24
0,0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
f)
fy-1
2,4
1,6
0,8
0,8
0,0
0,0
g)
Ler
h)
fy-1
µM/g FG
Asparagin
Ler
1,6
1,8
µM/g FG
Aspartat
e)
1,8
1,2
1,2
0,6
0,6
0,0
0,0
µm/g FG
Aspartat
µM/g FG
Asparagin
2,4
Abbildung 3/83: der Graph zeigt die Konzentration von Aspartat, Asparagin, Glutamat und Glutamin der
geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen
28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44
Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 28 Tage alt, bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 47 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 62 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 60 Tage und bei 10 mM
Nitrat 55 Tage. . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die
Belichtungsdauer 12 h Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und
Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
125
Reagierten die Gesamtaminosäuren bei der Mutante kaum anders als im Wildtyp, so kam es
jedoch zu einer Verschiebung in der Zusammensetzung. Glutamin (Abb. 3/83b) und Glutamat
(Abb. 3/83d) zeigten bei der Mutante kaum Unterschiede gegenüber dem Wildtyp,
unabhängig von den angewandten Bedingungen. Bei Asparagin (Abb. 3/83f) nahm die
Aminosäurekonzentration mit steigendem Nitratangebot zu, sofern zusätzlich Gln im Medium
vorlag, die Gewebeverteilung war dabei in der Mutante unregelmäßig. Auch in der
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) kam es bei fy zu einer Erhöhung des internen Spiegels
gegenüber Ler, allerdings auf den Sproß beschränkt. Die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln
reagierte kaum anders in der Mutante, verglichen mit Ler. Bei Aspartat (Abb. 3/83h) verschob
sich das Gleichgewicht sehr stark in Richtung Sproß, wenn die Mutante Nitrat und Gln
zusammen angeboten bekam.
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mM Nitrat-
Bedingung reagierten bei fy ähnlich wie bei Ler.
Die Aminosäuren der Photorespiration zeigten ein uneinheitliches Verhalten. Glycin reagierte
in Gegenwart von Gln im Gegensatz zu Ler bei ansteigendem Nitratangebot in der Mutante
a)
Ler
b)
fy-1
0,75
0,50
0,25
0,25
0,00
0,00
Ler
c)
2
1
d)
fy-1
2
1
0
µM/g FG Serin
0,50
µM/g Fg Glycin
0,75
µM/g FG Serin
µM/g FG Glycin
(Abb. 3/84b) eher mit einer Abnahme der Konzentration im Sproß.
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/84: der Graph zeigt die Konzentration von Glycin und Serin der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt
der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage
.Bei fy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 28 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 47 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 62 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 60 Tage und bei 10 mM Nitrat 55 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn.Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
126
Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) zeigte bei fy im Vergleich zu Ler (Abb. 3/84a)
hingegen höhere Glycinkonzentrationen, dies betraf vor allem den Sproß. Auch die 10 mM
Nitrat-Bedingung ohne Gln zeigte bei fy höhere Konzentrationen, nicht nur im Vergleich zu
Ler, sondern auch im Vergleich zur Gln-haltigen BedingungIn Abwesenheit von Gln kam es
damit zu einen leichten Glycinkonzentrationsanstieg in der Mutante im Vergleich zu Ler.
Serin hingegen zeigte in fy in Gegenwart von Nitrat und Gln insgesamt eine Zunahme der
Konzentration (Abb. 3/84f), die sich jedoch nicht auf beide Gewebe gleich stark auswirkte,
Ler wies in allen drei Bedingungen ähnlich niedrige Werte auf. Die Mangelbedingung (0,5
mM Nitrat) bewirkte dafür bei der Mutante einen leichte Konzentrationsabnahme von Serin
im Sproß, die 10 mM-Bedingung ohne Gln wiederum zeigte in beiden Geweben im Vergleich
zu Ler einen leichten Anstieg des Serinspiegels. Hier zeigte sich bei der Mutante eine
Konzentrationssteigerung abhängig vom externen Nitratangebot, sofern kein Gln angeboten
fy-1
b)
50
50
25
25
nM/g FG Tyrosin
0
75
0
c)
Ler
fy-1
d)
75
50
50
25
25
0
nM/g FG
Phenylalanin
75
120
0
e)
Ler
fy-1
f)
120
80
80
40
40
0
nM/g FG
Trypthophan
a)
Ler
nM/g FG Tyrosin
75
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
nM/g FG
Phenylalanin
nM/g FG
Trypthophan
wurde.
0
Abbildung 3/85: der Graph zeigt die Konzentratrion der Aromaten der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .
Bei fy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 28 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 47 Tage, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 62 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 60 Tage und bei 10 mM Nitrat 55 Tage. (0,5 mM Nitrat). . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
127
Eine Veränderung in der externen Nitratversorgung beeinflußte die aromatischen
Aminosäuren bei Mutante und Ler in ähnlicher Weise, es kam grundsätzlich aber zu einer
Erhöhung der internen Spiegel bei der Mutante im Vergleich zu Ler. In der
Hauptversuchsreihe reagierte Trypthophan bei fy in beiden Geweben ungleichmäßig mit
Konzentrationssteigerung, es ergab sich kein Zusammenhang mit dem externen Nitratangebot
(Abb. 3/85b). Tyrosin nahm bei allen drei externen Nitratkonzentrationen in beiden Geweben
der Mutante gleichmäßig zu, auch hier ergab sich jedoch keine Korrelation (Abb.3/85d). Bei
Phenylalanin reagierte nur der Sproß von fy mit erhöhten Aminosäurespiegeln, der
Phenylalaningehalt nahm mit steigender externer Nitratkonzentration zu (Abb. 3/85f). Bei der
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) reagierte die Mutante nur schwach mit erhöhten Spiegeln
im Vergleich zum Wildtyp. Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln nahmen alle aromatischen
b)
fy-1
240
160
160
80
80
0
0
c)
Ler
d)
fy-1
270
180
180
90
90
0
1,8
e)
Ler
f)
fy-1
0
1,8
1,2
1,2
0,6
0,6
0,0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
nM/g FG Isoleucin
Ler
nM/g FG Leucin
a)
µM/g FG Valin
nM/g FG Isoleucin
270
µM/g FG Valin
240
nM/g FG Leucin
Aminosäuren zu bei fy gegenüber Ler, Tyrosin und Phenylalanin am stärksten.
0,0
Abbildung 3/86: der Graph zeigt die Konzentration von Alanin und den aliphatischen Aminosäuren der
geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen
28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44
Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 28 Tage alt, bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 47 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 62 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 60 Tage und bei 10 mM
Nitrat 55 Tage.. Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die
Belichtungsdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und
Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
128
Bei den aliphatischen Aminosäuren nahmen alle drei Aminosäuren Isoleucin, Leucin und
Valin in ihren Konzentrationen in der Mutante im Vergleich zum Wildtyp zu. Dabei ergab
sich für fy keine Korrelation zwischen Aminosäuregehalt und externem Nitratangebot, sofern
das Medium zusätzlich Gln enthielt (Abb. 3/86 b,d,f). Auch bei Mangelbedingung (0,5 mM
Nitrat) nahmen die Aliphaten leicht zu in der Mutante, dabei stiegen vor allem die Sproßwerte
an. Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln nahmen die Konzentrationen beider Gewebe in der
Mutante zu, die Verteilung blieb erhalten.
Alanin, das sich mit den aliphatischen Aminosäuren denselben Ursprung teilt, reagierte in der
Mutante nicht anders als der Wildtyp (Daten nicht gezeigt).
Auch die Aminosäuren aus dem Harnstoffwechsel nahmen teilweise zu. Bei Arginin ergab
sich in der Mutante dabei im Gegensatz zu Ler ein Zusammenhang zwischen
Aminosäurekonzentration und externem Nitratangebot im Sproß, sofern das Medium noch
Gln enthielt (Abb. 3/87b). Die Wurzel reagierte nur bei der höchsten Nitratkonzentration mit
a)
Ler
fy-1
b)
2400
1600
1600
800
800
nM/g FG Ornithin
0
90
nM/g FG Arginin
2400
0
c)
Ler
fy-1
d)
90
60
60
30
30
0
0
nM/g FG Ornithin
nM/g FG Arginin
einer Anhebung des Argininspiegels.
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/87: der Graph zeigt die Konzentration vo Arginin und Ornithin der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM
Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM
Nitrat 35 Tage .Bei fy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 28 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln
47 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 62 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 60 Tage und bei 10 mM Nitrat 55 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
129
Sowohl die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) als auch die 10 mM-Bedingung ohne Gln
reagierten kaum unterschiedlich beim Vergleich von Mutante und Wildtyp. Citrullin zeigte in
der Mutante dasselbe Bild wie im Wildtyp (Daten nicht gezeigt). Ornithin nahm in bei fy
hauptsächlich in Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mM-Bedingung ohne Gln zu, also
in Abwesenheit von Gln (Abb. 3/87d).
Die von Aspartat abstammenden Aminosäuren stiegen in der Mutante in ihren
Konzentrationen teilweise deutlich an, dies betraf meist beide Gewebe . Lysin reagierte in der
Hauptversuchsreihe – aufsteigende Nitratkonzentration + Gln – in den beiden extremen
Bedingungen (1mM und 35 mM Nitrat) vor allem in der Wurzel mit Anhebung des
Aminosäurespiegels, dabei ergab sich keine Korrelation zwischen Lysinspiegel und externem
Nitratangebot (Abb. 3/88b). Methionin reagierte in der Hauptversuchsreihe mit einer
nM/g FG
Methionin
fy-1
240
160
80
80
0
0
c)
Ler
d)
fy-1
20
10
10
0
0
0,9
e)
Ler
f)
fy-1
0,9
0,6
0,6
0,3
0,3
0,0
nM/g FG Lysin
b)
160
20
µM/g FG Threonin
Ler
0,0
nM/g FG
Methionin
a)
240
µM/g FG Threonin
nM/g FG Lysin
Konzentrationszunahme in beiden Geweben bei überoptimaler Nitratversorgung (Abb. 3/88d).
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat W urzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat W urzel
Abbildung 3/88: der Graph zeigt die Konzentration von Lysin, Methionin und Threonin der geernteten Pflanzen
zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10
mM Nitrat/4 mM Gln 29 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM
Nitrat 35 Tage .Bei fy-1 sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 28 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln
47 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 62 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 60 Tage und bei 10 mM Nitrat 55 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
130
Threonin stieg mit zunehmenden Nitratangebot in beiden Geweben der Mutante gegenüber
Ler an (Abb. 3/88f) im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 3/88e). Bei der Mangelbedingung (0,5
mM Nitrat) reagierte fy im Vergleich zu Ler kaum. Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln kam
es vor allem in der Wurzel der Mutante zu deutlich erhöhten Aminosäurekonzentrationen. In
der Abwesenheit von Gln führte zunehmende externe Nitratversorgung zu ansteigenden
Spiegeln der besprochenen Aminsäuren.
Histidin zeigte in der Mutante bei aufsteigender Nitratreihe mit Gln teilweise erhöhte
Konzentrationen in beiden Geweben (Abb. 3/89b). Bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
stieg Histidin bei fy im Vergleich zu Ler (Abb. 3/89a) in beiden Geweben an, dabei wies der
Sproß die höhere Konzentration auf. Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln zeigten beide
Mutantengewebe höhere Konzentrationen, die Verteilung blieb unberührt.
150
Ler
a)
nM/g FG Histidin
100
50
0
150
100
50
0
fy-1
b)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/89: der Graph zeigt die Histidinkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
.Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die Landsberg erecta - Pflanzen 28 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 29
Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 35 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 44 Tage und bei 10 mM Nitrat 35 Tage .Bei fy-1
sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 28 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 47 Tage, bei 35 mM
Nitrat/4 mM Gln 62 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 60 Tage und bei 10 mM Nitrat 55 Tage. . Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 100 µE/m2 und die Belichtungsdauer 12 h. Geerntet
wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Fazit zu fy:
(i)
Nitrat bewirkt auch bei fy eine deutliche Hemmung des Blühens. Diese
Verzögerung mag stärker als beim Wildtyp Ler sein. Wie auch bei fve gilt hier,
das die quantitativen Unterschiede jedoch nicht überbewertet werden sollten,
die insgesamt die Blühzeiten so stark verschoben sind.
Ergebnisse
3.3.
131
C24 und ANR1
ANR1 kodiert einen nitratinduzierten MADS-Box-Transkriptionsfaktor. Studien in der
Gruppe von Forde haben gezeigt, daß es nach Nitratapplikation an lokalen Bereichen der
Wurzeln induziert wird und die Entwicklung der Lateralwurzeln beeinflußt (Zhang et al.
1998). Der Nachweis seiner Funktion bei der Nitratinduktion von Lateralwurzeln wurde
erbracht, indem Antisense- und Cosupressionslinien von Arabidopsis thaliana mit
verminderter Expression von ANR1 erzeugt wurden, bei denen die Induktion der
Lateralwurzeln durch Nitrat abgeschwächt war im Vergleich zu den entsprechenden
Wildtyppflanzen.
Wir wollten testen, ob die nitratinduzierte Hemmung der Blühinduktion in diesen Pflanzen
ebenfalls beeinflußt ist. Außerdem ging es darum, erste Informationen über mögliche
Veränderungen im Metabolismus dieser Pflanzen zu erhalten. Bei den beiden getesteten
Genotypen handelt es sich um die beiden am stärksten durch Antisense (A1) oder Sense-RNA
(S10) herunterregulierten Linien.
100
a)
80
60
40
20
% Blühansatz
0
100
b)
80
60
40
20
0
100
c)
80
60
1 mM Nitrate / 4 mM Gln
10 mM Nitrate / 4 mM Gln
35 mM Nitrate / 4 mM Gln
0,5 mM Nitrate / 0 mM Gln
10 mM Nitrate / 0 mM Gln
40
20
0
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
Zeitverlauf in Tagen
Abbildung 3/90: Die Graphik zeigt den Blühverlauf von Arabidopsis thaliana cv C 24 (a) und der ANRMutantengenotypen A1 (c) und S10 (c) unter verschiedenen Nitratangeboten Dargestellt sind Mittelwert und
Standardfehler (n = 6-8). . Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 120 µE/m2 und die
Belichtungsdauer 12 h.
Ergebnisse
132
Bei den bisher besprochenen Wildtyp Col und Ler lagen die Kurven für 1 mM und 10 mM
Nitrat, jeweils + 4 mM Gln, immer dicht beieinander, bei Ler liefen dann auch die Kurven für
35 mM Nitrat + 4 mM Nitrat und für die 10 mM-Bedingung ohne Gln direkt paralell
zueinander, die Kurve für 0,5 mM Nitrat lief dann als letztes. Beim vorliegenden Ökotyp C24,
der unter 120 µE angezogen wurde, hingegen separierten sich die Kurven für 1 mM Nitrat +
4 mM Gln und 10 mM Nitrat + 4 mM Nitrat voneinander. Damit waren alle drei Kurven aus
der Haupttestreihe getrennt voneinander. Wie bei den beiden anderen Wildtypen (Col: Abb.
3/7a, Ler Abb. 3/28) stieg die Blattzahl und die Sproßbiomasse bei C24 bei zunehmender
externer Nitratversorgung in Gegenwart von Gln stetig an. Wie aus den Blühverlaufskurven
ersichtlich, waren beide Genotypen der Mutante etwas verzögert (Abb. 3/90b,c) in ihrer
Blühinduktion im Vergleich zum Wildtyp C24 (Abb. 3/90a). Beide Mutantengenotypen
starteten mit der 1 mM Nitrat / 4 mM–Bedingung ungefähr zum gleichen Zeitpunkt, 4 – 5
Tage versetzt gegenüber dem Wildtyp. Bei A1 liefen dann aber die Kurven für 1 und 10 mM
Nitrat + 4 mM Gln fast paralell, die Kurve für 35 mM Nitrat + 4 mM Gln war dann wieder
leicht abgesetzt wie beim Wildtyp. Die beim Wildtyp vorliegende Trennung war hier also
aufgehoben, der hemmende Einfluß von steigenden Nitratkonzentrationen auf die
Blühinduktion wirkt im Vergleich zum Wildtyp bei der Mutante stufenweise zwischen 1 mM
Nitrat und 10 mM Nitrat (jeweils + Gln) auf der einen Seite und 35 mM Nitrat/4 mM Gln auf
der anderen Seite. Bei S10 liefen die drei Kurven mit ansteigender Nitratkonzentration in
Gegenwart von Gln wiederum getrennt voneinander. Beim Vergleich der Blattzahl von C24
(Abb. 3/91a) und den beiden Mutanten-Genotypen (Abb. 3/91b,c) bei Einsetzen der
Blühinduktion zeigte sich, daß
beide Transformanten in Gegenwart von Gln höhere
Blattzahlen entwickelten als der Wildtyp, dies war besonders deutlich bei S10 (Abb. 3/91c).
Für alle drei Testreihen – C24 + A1 + S10 - gilt, daß die Blattzahl mit zunehmender
Nitratkonzentration anstieg. Bei der Biomasse des Wildtyps (Abb. 3/92a) ergab sich eine
deutliche Korrelation zwischen externem Nitratangebot und Biomasse, wenn Nitrat in
Gegenwart von Gln angeboten wurde. Obwohl beide Genotypen später mit der Blüte
begannen als der dazugehörige Wildtyp, zeigte sich bei der Biomasse von A1 (Abb. 3/92b)
nicht unbedingt ein Hinweis darauf, daß dies auf eine starke Verlängerung der vegetativen
Phase beruhte. Die Biomasse von A1in Gegenwart von 1 mM Nitrat/4 mM Gln war zwar
leicht erhöht, danach aber lagen beide weiteren Nitratkonzentrationen, die noch zusätzlich Gln
enthielten, niedriger als die entsprechenden Wildtyp-Werte, obwohl die Pflanzen von C24
und A1 für jede Nitratbedingung zum gleichen Zeitpunkt geerntet worden sind. Dies
Ergebnisse
133
bedeutete, daß die Korrelation zwischen Sproßbiomasse und extern ansteigendem Nitrat bei
A1 weniger stark ausgeprägt war als beim Wildtypen. Die S10-Pflanzen sind einen Tag zuvor
oder danach geerntet worden (siehe Legende zu den Graphen). Bei dieser Transformante
ergab sich eine ähnliche Steuerung der Biomasse durch extern angebotenes Nitrat in
Gegenwart von Gln wie beim Wildtyp, steigendes Nitrat führt zur Zunahme der Biomasse.
Anzahl Blätter bei Ernte
25
a)
20
15
10
5
0
25
b)
20
15
10
5
0
25
c)
20
15
10
5
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln
10 mM Nitrat/4 mM Gln
35 mM Nitrat/4 mM Gln
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
Abbildung 3/91: der Graph zeigt die Anzahl der Blätter der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1
mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35 mM
Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM
Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM
Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei
0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n = 10 – 15).
Die Kurve für die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) startete bei C24 im Verhältnis zu den
anderen Wildtyp früher und nicht als letzte Kurve, zog sich aber über einen längeren Zeitraum
hinweg. Wie bei den beiden anderen Wildtyp auch führte die Mangelbedingung (0,5 mM
Nitrat) bei C24 zu einer sehr geringen Blattzahl und Sproßbiomasse. Die Kurve für die
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) war bei A1 nur leicht verzögert gegenüber dem Wildtyp.
Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) war bei S10 zwar etwas verzögert gegenüber dem
Wildtyp, zeigte aber einen steileren Kurvenverlauf. Auch hier galt wie bei den anderen
Wildtypen und anderen Mutanten, das die Pflanzen bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
in Bezug auf Blattzahl und auch Biomasse eigentlich verfrüht blühten, auch wenn sie zeitlich
gesehen als letztes mit der Blüte begannen.
Ergebnisse
134
Die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln begann bei C24 wie bei den anderen Wildtypen später
als die entsprechenden Bedingung mit Gln, war allerdings nicht so stark zeitlich von dieser
abgesetzt. Die höhere Lichtintensität hatte vermutlich eine raschere Blühinduktion zur Folge.
Die 10 mM-Nitrat-Bedingung ohne Gln wies bei diesem Wildtypen eine ähnliche
Sproßbiomasse wie die vergleichbare Bedingung mit Gln auf. Die 10 mM-Bedingung ohne
Gln blühte ebenfalls entsprechend später bei A1, endete aber fast zum selben Zeitpunkt wie
die Bedingung mit Gln, die blühfördernde Wirkung von Gln verliert sich bei A1 etwas im
Vergleich zum Wildtyp. Die 10 mM-Bedingung ohne Gln fing bei S10 später an als die Glnhaltige Bedingung und lief bis zum Ende getrennt durch. Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln
lagen die Werte für die Blattzahl vom Wildtyp und von den beiden Genotypen ebenso hoch
wie die jeweiligte vergleichbare Bedingung mit 10 mM Nitrat, Gln beeinflußte in diesen
Transformanten damit nicht die Entwicklung der Pflanzen.
Biomasse Sproß in mg
450
a)
300
150
0
450
b)
300
150
0
450
300
c)
1 mM Nitrat/4 mM Gln
10 mM Nitrat/4 mM Gln
35 mM Nitrat/4 mM Gln
150
0
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
Abbildung 3/92: der Graph zeigt die, die Biomassen für Sproß der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
.Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM
Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM
Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei
0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n = 10 – 15).
Ergebnisse
135
Insgesamt spiegelten die Daten zu Blattzahl und Biomasse zum Zeitpunkt der Ernte bei den
Gln-freien Bedingungen sowohl beim Wildtyp C24 als auch bei beiden Transformanten
dasselbe Bild wieder, das sich aus der Hauptreihe ergab, steigende Nitratkonzentrationen
führten zu erhöhten Blattzahlen und Sproßbiomassen.
Die Wurzelbiomassen, die in der nachfolgenden Abbildung 3/93 dargestellt sind, dienen auch
hier nur zur Ermittlung des Sproß/Wurzel-Verhältnisses.
Biomasse Wurzel in mg
120
a)
80
40
0
120
b)
80
40
0
120
80
40
0
c)
1 mM Nitrat/4 mM Gln
10 mM Nitrat/4 mM Gln
35 mM Nitrat/4 mM Gln
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
Abbildung 3/93: der Graph zeigt die, die Biomasse für Wurzel der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
.Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage. Bei A1 (b) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM
Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM
Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei
0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n = 10 – 15).
C24 (Abb. 3/94a) zeigte beim Sproß/Wurzel-Verhältnis erwartungsgemäß eine Zunahme bei
ansteigender Nitratkonzentration, sowohl in der Hauptreihe in Gegenwart von Gln, als auch in
den beiden Gln-freien Bedingungen. Der Vergleich der Gln-haltigen 10 mM-NitratBedingung und der Gln-freien 10 mM-Nitrat-Bedingung zeigte, daß Gln keinen
nennenswerten Effekt auf das Sproß/Wurzel-Verhältnis hatte. Bei beiden Transformanten
(Abb. 3/94b+c) zeigte sich, daß das Sproß/Wurzel-Verhältnis in der Hauptversuchsreihe mit
Gln-Zusatz von 10 mM Nitrat nach 35 mM Nitrat nicht so stark anstieg wie beim Wildtyp.
Auch bei Vergleich der beiden Gln-freien Bedingungen zeigte sich bei A1 und S10 ein
geringerer Anstieg des Sproß/Wurzel-Verhältnisses von 0,2 mM Nitrat nach 10 mM Nitrat im
Ergebnisse
136
Vergleich zu C24, allerdings lag in den Transformanten das Verhältnis bei 0,2 mM Nitrat von
vorneherein höher als bei C24. die An- oder Abwesenheit von Gln zeigte keinen Effekt auf
das Sproß/Wurzel-Verhältnis sowohl im Wildtyp als auch in den beiden Transformanten.
Sproß/Wurzel-Verhältnis
7,5
a)
5,0
2,5
0,0
7,5
b)
5,0
2,5
0,0
7,5
c)
5,0
2,5
0,0
1 mM Nitrat/4 mM Gln
10 mM Nitrat/4 mM Gln
35 mM Nitrat / 4 mM Gln
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
Abbildung 3/94: der Graph zeigt das Sproß/Wurzel-Verhältnisr der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage ,
bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind
die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4
mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1
mM Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage,
bei 0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n = 10 – 15).
ANR1 ist als Gen identifiziert worden, daß bei der Induktion von Lateralwurzeln bei
Applikation von Nitrat an die Wurzeln einer Nitratdefizienten Pflanze beteiligt ist. Die
vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß es ebenso bei der Regulation des Sproß/WurzelVerhältnisses als Antwort auf die Nitratzufuhr beteiligt ist.
Der interne Nitratspiegel spiegelte die externe Nitratversorgung wieder. Die beiden
Transformanten zeigten dabei im Hauptversuch deutlich höhere interne Nitratkonzentrationen
als der Wildtyp (Abb. 3/95a), wenn 10 mM und 35 mM Nitrat (jeweils mit Gln) angeboten
wurden. Da die Biomassen von A1 und S10 niedriger bzw. gleich groß waren wie bei C24,
beruhte dies nicht auf einer Anhäufung infolge lagsameren Wachstums, zumindest bei S10.
Auch die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und die 10mM Nitrat-Bedingung ohne Gln wies
Ergebnisse
137
bei den Genotypen etwas erhöhte Werte gegenüber C24 auf, vor allem A1 (Abb. 3/95b) wies
dabei sogar höhere Spiegel als die andere Bedingung mit niedriger Nitratversorgung auf. Bei
der 10 mM-Bedingung ohne Gln lagen die Konzentrationen bei C24 ebenso hoch wie die
Spiegel der entsprechenden Bedingung mit Gln. Bei A1 zeigte sich ein Unterschied im
internen Nitratgehalt zwischen An- und Abwesenheit von Gln, die Bedingung ohne Gln wies
geringere Konzentrationen als ihre Vergleichsbedingung auf. Bei S10 ergab sich das gleiche
Bild wie bei C24, nur das die Konzentrationen höher lagen (Abb. 3/95c). Der erhöhte
Nitratgehalt in den Transformanten zeigt, daß die geringere Empfindlichkeit des
Sproß/Wurzel-Verhältnisses
auf
das
Nitratangebot
nicht
auf
eine
verringerte
Nitratakkumulation in den Transformanten beruhte.
150
a)
100
µM/g FG Nitrat
50
0
150
b)
100
50
0
150
100
50
0
c)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/95: der Graph zeigt die Konzentration von Nitrat der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
.Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM
Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM
Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei
0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n =4-5).
Bei Betrachtung der beiden Bedingungen ohne Gln ergab sich bei A1 ein geringerer Anstieg
des internen Nitratgehaltes mit ansteigender Nitratversorgung im Vergleich zum Wildtypen,
bei S10 hingegen ein stärkerer Abhängigkeit vom externen Nitratpool.
Bei den Gesamtaminosäuren zeigte sich, daß mit zunehmender externer Nitratversorgung in
Gegenwart von Gln bei C24 ein Abnehmen der Gesamtaminosäuren in beiden Geweben ergab
Ergebnisse
138
(Abb. 3/96a). Auch in den beiden Bedingungen ohne Gln zeigten sich im Wildtyp niedrige
Konzentrationen, wobei die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) nur geringfügig unter der 10
mM-Bedingung ohne Gln lag. Dies spiegelt die Ergebnisse wieder, die sich bereits für Col
und Ler ergaben. In allen Bedingungen wies der Sproß eine höhere Konzentration als die
Wurzel auf. Bei A1 (Abb. 3/96b) sanken alle Werte im Vergleich zu C24 ab, zudem zeigte
sich keine umgekehrte Abhängigkeit mehr vom externen Nitratspiegel, wenn die Medien
zusätzlich Gln enthielten. Vielmehr zeigte sich tendenziell eine ganz leichte Zunahme der
Gesamtaminosäuren bei zunehmender Nitratversorgung. Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
und 10 mM-Bedingung ohne Gln reagieren ähnlich wie im Wildtyp. Insgesamt zeigte sich
keine eindeutige Verteilung auf die beiden Gewebe mehr. Bei S10 (Abb. 3/96c) hingegen
kam es bei allen Bedingungen zu einer deutlichen Erhöhung der internen Spiegel, beide
Gewebe glichen sich dabei sehr aneinander an, dies trat nicht beim Wildtyp auf. Zudem trat
keine sichtbare Beeinflussung durch die angebotenen Nitratkonzentrationen mehr auf, alle
Bedingungen zeigten sehr ähnliche Konzentrationen. Auch Gln zeigte keinen Einfluß auf den
Gesamtaminosäurenspiegel.Bei A1 zeigte sich bei den Gln-freien Bedingungen ein
niedrigerer Spiegel an Gesamtaminosäuren gegenüber den entsprechenden Gln-haltigen
Bedingungen, S10 hingegen zeigte keine Abhängigkeit von der externen N-Versorgung.
60
a)
µM/g FG Gesamtaminosäuren
40
20
0
60
b)
40
20
0
60
40
20
0
c)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/96: der Graph zeigt die Konzentration der Gesamtaminosäuren der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 26 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage
.Bei A1 (b) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei
35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4
mM Gln 37 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug
20°C, die Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn.
Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n =4– 5).
Ergebnisse
139
Bei Malat zeigte sich im Wildtyp (Abb. 3/97a) keine Abhängigkeit des Malatspiegels vom
externen Nitratangwebot, sofern Gln als zusätzliche N-Quelle vorhanden war. Die
Hauptkonzentration lag dabei in der Wurzel. Nur bei überoptimaler N-Versorgung war Malat
ungefähr gleich auf beide Gewebe verteilt. Bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
verschob sich das Gleichgewicht deutlich zur Wurzel hin, hier war die Konzentration von
allen Bedingungen am höchsten. In der 10 mM-Bedingung ohne Gln lagen die
Konzentrationen höher als in der vergleichbaren Bedingung mit Gln, zudem wiesen Sproß
und Wurzel gleiche Konzentrationen auf. Damit ergab sich bei den Gln-freien Bedingungen
im Sproß ein Anstieg des Malatspiegels in Abhängigkeit vom externen Nitratangebot. Bei
beiden Genotypen zeigte sich im Gegensatz zu C24 eine leichte Tendenz eines Anstiegs der
Malatkonzentration mit zunehmender Nitratkonzentration in Anwesenheit von Gln (Abb.
3/97b,c), wobei die Verteilung auf Sproß und Wurzel beibehalten wurde. Diese Tendenz war
bei S10 stärker ausgeprägt als bei A1. In beiden Transformantengenotypen zeigte die
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) erhöhte Wurzelwerte als der Wildtyp, A1 fast dreimal so
hohe Werte, S10 einen fast doppelt so hohen Wert.
15 a)
10
µM/g FG Malat
5
0
15 b)
10
5
0
15 c)
10
5
0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/97: der Graph zeigt die Malatkonzentrationder geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1
mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35 mM
Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM
Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM
Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei
0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
140
Die 10 mM-Nitrat-Bedingung ohne Gln führte jeweils bei A1 und S10 einen erhöhten
Sproßwert gegenüber dem Wurzelgewebe des jeweiligen Transformanten, dessen Gehalt lag
im Bereich des Wildtyp. Bei den beiden Genotypen zeigte sich damit bei Abwesenheit von
Gln eine negative Korrelation für die Malatkonzentration bei ansteigendem Nitratspiegel für
das Wurzelgewebe, dies trat bei C24 nicht auf.
Bei ansteigender Nitratversorgung in Gegenwart von Gln nahmen die reduzierenden Zucker,
Saccharose und Stärke im C24-Wildtyp ab (Abb. 3/98a+d+g,99a). Dies zeigte sich vor allem
beim Vergleich von 1 mM Nitrat/4 mM Gln zu 10 mM Nitrat/4 mM Gln, die Abnahme von
10 mM Nitrat/4 mM Gln nach 35 mM Nitrat/4 mM Gln war sehr gering bzw. nicht
vorhanden. Saccharose reagierte insgesamt schwächer auf eine Veränderung im externen
Nitratangebot (Abb. 3/98g) als die reduzierenden Zucker und Stärke. Auch dies ergab sich
bereits bei den beiden anderen getesteten Wildtypen Col und Ler.
Im Vergleich zu den anderen Ökotypen Col (Abb. 3/14 b + 3/15b) und Ler (Abb. 3/31) zeigte
C24 die gleiche Verteilung der Zucker auf die beiden Geweben, unterschied sich aber in den
Konzentrationen von den beiden anderen Wildtypen. Vor allem zwischen Col und C24 traten
Unterschiede im Stärkegehalt bei aufsteigender Nitratreihe + Gln auf, die wohl auf die
unterschiedlichen Lichtintensitäten bei der Anzucht zurückgingen. Unterschiede zwischen Ler
und C24 traten vor allem in der Mangelbedingung auf, die höhere Lichtintensität führte bei
C24 zu niedrigeren Glukosekonzentrationen im Vergleich zu Ler in der Mangelbedingung,
Saccharose stieg hingegen tendenziell an. Fruktose und Stärke zeigten bei C24 hingegen
kaum veränderte Konzentrationen bei Anzucht auf einem 0,5 mM Nitratmedium.
Ergebnisse
141
30 a)
20
µM/g FG Glukose
10
0
30 b)
20
10
0
30
c)
20
10
0
9 d)
6
µM/g FG Fruktose
3
0
9
e)
6
3
0
9
f)
6
3
0
24 g)
µM/g FG Saccharose
16
8
0
24 h)
16
8
0
24
16
8
0
i)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/98: der Graph zeigt die Kohlenhydratkonzentrationen der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage ,
bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind
die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4
mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1
mM Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage,
bei 0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
142
Der Hauptanteil lag bei den reduzierenden Zuckern und Saccharose bei C24 bei 1 mM Nitrat /
4 mM Gln in der Wurzel, bei Stärke im Sproß. Ansonsten zeigten Sproß und Wurzel ähnliche
Kohlenhydratspiegel. Bei Mangelernährung (0,5 mM Nitrat) stiegen alle Kohlenhydratspiegel
des Wildtyps deutlich an und lagen sogar höher als die Werte der niedrigen Nitraternährung
mit 1 mM Nitrat/4 mM Gln. Bei Glukose blieb die Gewebverteilung gleich (Abb. 3/98a), bei
Fruktose (abb 3/98d) und Saccharose (Abb. 3/98g) war der Hauptanteil im Sproß zu finden.
Bei Stärke wiederum war die Verteilung gleich der in den anderen Bedingungen (Abb. 3/99a).
Bei der
10 mM-Bedingung ohne Gln lagen die Konzentrationen bei C24 für die
Kohlenhydrate im gleichen Bereich oder etwas höher als die Spiegel der vergleichbaren
Bedingung mit Gln.
Bei den Transformanten ergab sich das gleiche Bild, was die Reaktion auf das externe
Nitratangebot anging, nur die Konzentrationen der Kohlenhydrate lagen bei beiden
Genotypen höher als beim Wildtyp. Grundsätzliche Ausnahme war die Stärkekonzentration
bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat), diese lagen bei A1 und S10 niedriger als beim
Wildtypen. Jedoch wiesen beide Transformanten einen 4mal so hohen Stärkegehalt im Sproß
wie C24 bei einer Anzucht auf 1 mM Nitrat/4 mM Gln auf.
µM/g FG Hexoseäquivalente Stärke
15
a)
30
10
20
5
10
0
15
b)
0
30
10
20
5
10
0
15
c)
0
30
10
20
5
10
0
0
a)
b)
c)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/99: der Graph zeigt die Stärkekonzentrationen der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM
Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM
Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei
0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4 – 5).
Ergebnisse
143
Bei den N-haltigen Aminosäuren (Glutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat) reagierte
Glutamin im Gegensatz zu den anderen Wildtyp bei C24 (Abb. 3/100a) mit einer deutlicher
sichtbaren Konzentrationsabnahme bei ansteigender Nitratreihe + Gln. Der Sproß wies dabei
etwas höhere Spiegel auf als das Wurzelgewebe. Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10
mM-Bedingung ohne Gln reagierten wie bei den anderen Wildtypen, beide Bedingungen
wiesen sehr niedrige Konzentrationen auf. A1 (Abb. 3/100b) zeigte bei Glutamin keine
Abhängigkeit vom externen Nitratangebot, sofern Gln zusätzlich angeboten wurde.
Ausnahme war die Wurzel bei 10 mM Nitrat / 4 mM Gln, hier lag allerdings auch ein großer
Standardfehler vor. Bei S10 (Abb. 3/100c) stieg die Konzentration beider Gewebe bei 1 mM
Nitrat / 4 mM Gln im Vergleich zu C24 deutlich an, bei den anderen beiden Gln-haltigen
Bedingungen hingegen lagen die Spiegel beider Gewebe sehr niedrig. Bei Mangelbedingung
(0,5
mM
Nitrat)
und
10
mM
Nitrat-Bedingung
ohne
Gln
reagierten
die
Transformantengenotypen nicht anders als der Wildtyp. Glutamat zeigte bei C24 (Abb.
3/100d) im Sproß eine tendenzielle Zunahme mit ansteigendem Nitratangebot in der
Gegenwart von Gln, die Wurzel wies immer die gleichen Konzentrationen auf. Die
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) wies wie bei den anderen Wildtyp die niedrigsten
Konzentrationen auf, die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln wies ähnliche Spiegel auf wie
die entsprechende Bedingung mit Gln. A1 (Abb. 3/100e) und S10 (Abb. 3/100f) zeigten kaum
Veränderungen in den Glutamatkonzentrationen im Vergleich zu C24, lediglich S10 zeigte
bei der Hauptversuchsreihe mit der Kombination aus Nitrat und Gln im Sproß eine
tendenzielle Abnahme. Asparagin zeigte bei C24 (Abb. 3/100g) keine Beeinflussung durch
das externe Nitratangebot, wenn gleichzeitig Gln angeboten wurde. Die Mangelbedingung
(0,5 mM Nitrat) und die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln reagierten bei C24 wie bei Ler,
sie nahmen gegenüber den Gln-haltigen Bedingungen deutlich ab. A1 (Abb. 3/100h) zeigte
hingegen im Vergleich zu C24 im Sproß eine Konzentrationszunahme mit ansteigendem
Nitratangebot, sofern auch Gln im Medium enthalten war. S10 (Abb. 3/100i) zeigte bei
Asparagin im Hauptversuch die gleiche Verteilung wie Glutamin. Mangelbedingung (0,5 mM
Nitrat) und 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln wichen bei A1 und S10 in ihrer Verteilung
nicht vom Wildtyp-Bild ab. Aspartat hingegen spiegelte sowohl bei C24 (Abb. 3/100j) als
auch bei den beiden getesten Genotypen (Abb. 3/100k,l) die Anordnung von Glutamat
wieder. Alle vier Aminosäuren zeigten in den Bedingungen, die kein Gln enthielten, eine
zunehmende Konzentration bei ansteigendem externen Nitratangebot, das mehr oder weniger
stark ausgeprägt war.
Ergebnisse
144
15
2
a)
g)
10
µM/g FG Glutamin
0
15
b)
10
5
0
15
c)
µM/g FG Asparagin
1
5
0
2
h)
1
0
2
i)
10
1
5
0
0
4
1,8
d)
2
0,6
0
4
e)
2
0
4
f)
µM/g FG Aspartat
µM/g FG Glutamat
j)
1,2
0,0
1,8
k)
1,2
0,6
0,0
1,8
l)
1,2
2
0,6
0
0,0
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/100: der Graph zeigt die Konzentrationen von Aspartat, Asparagin, Glutamat und Glutamin der
geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt,
Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei
10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33
Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26
Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 –
90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Bei den Aminosäuren aus der Photorespiration zeigte sich im Wildtyp (Abb. 3/101a,d) bei
den drei Gln-haltigen Nitratangeboten im Sproß kein Unterschied zwischen den internen
Konzentrationen. Bei den Wurzeln ergab sich in C24 bei Glycin eine Abnahme mit
ansteigenden Nitratkonzentrationen, zudem lagen die Wurzelwerte unter den Sproßwerten.
Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) lag mit ihren Werten etwa zwischen Sproß- und
Wurzelwerten der anderen Bedingungen. Die 10 mM-Bedingung ohne Gln lag mit ihrer
Sproßkonzentration höher als die Vergleichsbedingung mit Gln, die Wurzel dagegen
niedriger. Bei A1 (Abb. 37101b) waren die Glycinkonzentrationen meist erhöht gegenüber
Ergebnisse
145
C24, vor allem in den Gln-haltigen Bedingungen. Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
reagierte nicht anders als im Wildtyp, bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln stieg in der
Transformantengenotype nur der Wurzelwert etwas an. Bei S10 lagen die Werte ähnlich wie
beim Wildtyp, Sproß- und Wurzelwerte glichen sich jedoch mehr an (Abb. 3/101c). Der
Wurzelwert der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) war deutlich erhöht im Vergleich zu
Wildtyp und zu A1, die 10 mM-Bedingung ohne Gln hingegen blieb unverändert. Bei den
Gln-freien Bedingungen ergab sich mit ansteigendem Nitratangebot ein Zunehmen der
Sproßkonzentrationen für beide Aminosäuren in S10 im Vergleich zum Wildtyp.
0,75
a)
0,50
µM/g FG Glycin
0,25
0,00
0,75
b)
0,50
0,25
0,00
0,75 c)
0,50
0,25
0,00
1,8
d)
1,2
µM/g FG Serin
0,6
0,0
1,8
e)
1,2
0,6
0,0
1,8
1,2
0,6
0,0
f)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat W urzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat W urzel
Abbildung 3/101: der Graph zeigt die Konzentrationen von Glycin und Serin der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 26 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage
.Bei A1 (b) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei
35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4
mM Gln 37 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug
20°C, die Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn.
Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n 4-5).
Ergebnisse
146
Auch bei Serin zeigte sich keine Abhängigkeit vom externen Nitratangebot im Wildtyp (Abb.
3/101d), wenn gleichzeitig Gln angeboten wurde. Lediglich die Mangelbedingung (0,5 mM
Nitrat) wies etwas niedrigere Werte als die anderen Bedingungen auf. Der Sproßanteil war
höher als der Wurzelanteil. Die 10 mM-Bedingung ohne Gln war vergleichbar mit der
entsprechenden Bedingung, die zusätzlich Gln enthielt. A1 (Abb. 3/101e) zeigte gegenüber
C24 etwas erhöhte Werte bis auf die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat), dies betraf die Reihe
mit Nitrat und Gln und die 10 mM-Bedingung ohne Gln. S10 (Abb. 3/101f) hingegen zeigte
ein sehr uneinheitliches Verhalten, die Konzentrationen nahmen teilweise im Vergleich zu
Wildtyp zu, während bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln kaum eine Veränderung eintrat.
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mM-Bedingung ohne Gln reagierten mit einer
leichten Konzentrationszunahme bei S10 gegenüber C24. Insgesamt ergab sich keine
Steuerung der Aminosäuren aus der Photorespiration durch das externe Nitratangebot.
Bei den aromatischen Aminosäuren zeigte sich bei allen drei Aminosäuren Trypthophan,
Tyrosin und Phenylalanin beim Wildtyp (Abb. 3/102a,d,g) immer sehr niedrige Spiegel, die
unabhängig vom externen Nitratangebot waren und kaum zwischen Sproß und Wurzel
differierten. Außnahme war die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat), hier war Zudem der
Sproßanteil höher als der Wurzelanteil. Bei A1 (Abb. 3/102b,e,h) kam es zu einer teilweisen
Konzentrationssteigerung im Vergleich zum Wildtyp. Dieses Verhalten trat bei allen drei
aromatischen Aminosäuren auf. Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) hingegen zeigte bei
A1 für Tyrosin und Phenylalanin niedrigere Werte als bei C24. Dafür stiegen die
Konzentrationen der 10 mM-Bedingung ohne Gln bei A1 im Vergleich zum Wildtyp an.. Bei
S10 zeigten sich ähnlich niedrige Werte wie bei C24, aber auch die Mangelbedingung (0,5
mM Nitrat) nahm bei Phenylalanin (Abb. 3/102i) ab, bei Trypthophan (Abb. 3/102c) und
Tyrosin (Abb. 3/102f) erhöhten sich die Spiegel. Hierbei wurde aber die Verteilung auf Sproß
und Wurzel vertauscht. In der 10 mM-Bedingung ohne Gln ergab sich kein Unterschied
zwischen C24 und S10.
Ergebnisse
90
a)
80
60
40
30
0
120
nM/g FG Tyrosin
nM/g FG Trypthophan
120
147
b)
80
40
0
120
c)
0
90
e)
60
30
0
90
80
60
40
30
0
0
180
d)
f)
g)
120
nM/g FG Phenylalanin
60
0
180
h)
120
60
0
180
120
60
0
i)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/102: der Graph zeigt die Konzentration von Trypthophan, Tyrosin und Phenylalanin der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM
Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM
Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln
26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei
S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 –
90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n =4-5).
Bei Alanin zeigte bei C24 (Abb. 3/103a) sich bei ansteigender Nitratreihe mit 4 mM Gln, eine
Umkehr der Alaninverteilung auf die Gewebe. Bei niedriger Nitratversorgung lag der
Hauptanteil an Alanin in der Wurzel, bei 10 mM Nitrat waren Sproß- und
Wurzelkonzentration gleich und bei 35 mM Nitrat lag die Sproßkonzentration höher als die
der Wurzel. Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) zeigte ähnliche Werte wie 1 mM Nitrat +
4 mM Gln, nur etwas niedriger. Die 10 mM-Bedingung ohne Gln spiegelte die Verhältnisse
bei 10 mM Nitrat + 4 mM Gln wieder, aber auch waren die Konzentrationen niedriger. Beim
Wildtypen ergab sich eine negative Korrelation für die Wurzelkonzentration an Alanin mit
ansteigender externer Nitratversorgung in Abwesenheit von Gln, für den Sproß eine geringe
Ergebnisse
148
positive Korrelation. Bei A1 (Abb. 3/103b)
und S10 (Abb. 3/103c) kam es zu sehr
uneinheitlichen Verschiebungen im Vergleich zum Wildtyp, sofern das Medium neben Nitrat
auch noch Gln enthielt, es ergab sich keine Korrelation zum externen Nitratangebot. Bei
beiden Transformantengeotypen sank der Gehalt in der Wurzel der Mangelbedingung (0,5
mM Nitrat) sehr stark ab, die 10 mM-Bedingung ohne Gln blieb unbeeinflußt. Das Abnehmen
der Wurzelkonzentration für Alanin mit zunehmender Nitratkonzentration in C24 ohne
zusätzliches Gln trat bei beiden Genotypen nicht auf.
1,5
a)
1,0
µM/g FG Alanin
0,5
0,0
1,5
b)
1,0
0,5
0,0
1,5
1,0
0,5
0,0
c)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/103: der Graph zeigt die Alaninkonzentration der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
.Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM
Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM
Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei
0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Bei den aliphatischen Aminosäuren gab es nur wenige Änderungen. Bei C24 wiesen Isoleucin
(Abb. 3/104a) und Leucin (Abb. 3/104d) in etwa die gleichen Konzentrationen auf, sofern
Nitrat zusammen mit Gln angeboten wurde, Valin lag wesentlich höher (Abb. 3/104g). Für
alle drei Aminosäuren ergab sich keine Abhängigkeit vom externen Nitratspiegel. Der
Hauptanteil der Aminosäure lag dabei jeweils in der Wurzel. Ausnahme war die
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat), Diese zeigte bei Isoleucin noch einen höheren Sproßwert,
bei Leucin und Valin war die Verteilung auf die Gewebe jedoch gleich. Die 10 mMBedingung ohne Gln zeigte kaum veränderte Konzentrationen als die Bedingung mit Gln im
Ergebnisse
149
nM/g FG Isoleucin
200
150
100
50
0
200
150
100
50
0
200
150
100
50
0
nM/g FG Leucin
Wildtypen auf. Beide Genotypen zeigten gegenüber dem Wildtyp erhöhte Aminosäurespiegel.
200
150
100
50
0
200
150
100
50
0
200
150
100
50
0
1,0
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
µM/g FG Valin
0,5
0,0
h)
1,0
0,5
0,0
1,0
0,5
0,0
i)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/104: der Graph zeigt die Konzentration der Aliphaten der geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der
Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage ,
bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind
die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4
mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1
mM Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage,
bei 0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
150
Vor allem A1 (Abb. 3/104b,e,h) wies in dieser Gln-freien Bedingung mehr als doppelt so
hohe Konzentrationen zumindest in der Wurzel auf bei aufsteigender Nitratreihe mit Gln.
Beim Sproß waren diese Zunahmen etwas schwächer. In der Mangelbedingung (0,5 mM
Nitrat) sanken bei A1 die Werte aller drei Aminosäuren zumindest im Sproß teilweise
deutlich ab im Vergleich zu C24. Die 10 mM-Bedingung ohne Gln wiederum lag bei A1 im
Bereich der Vergleichsbedingung mit Gln. Auch S10 wies im Sproß der Mangelbedingung
(0,5 mM Nitrat) niedrigere Konzentrationen als der Wildtyp auf, dafür stieg der Wurzelanteil
an. Bei der 10 mM-Bedingung ohne Gln zeigten sich bei S10 die gleichen Konzentrationen
wie bei der vergleichbaren Bedingung mit Gln.
Bei den Aminosäuren, die sich von Aspartat ableiten, zeigte sich kein ausgeprägter Einfluß
durch Nitrat. C24 (Abb. 3/105a,d,g) zeigte bei den ansteigenden Nitratkonzentrationen,die in
Gegenwart von Gln angeboten wurden, sowohl in Sproß als auch in der Wurzel tendenziell
eine leichte Abnahme.
240
30 d)
a)
160
nM/g FG Lysin
0
240
b)
160
80
0
240
c)
160
nM/g FG Methionin
15
80
0
30
e)
15
0
30
f)
15
80
0
0
0,30
g)
µM/g FG Threonin
0,15
0,00
h)
0,30
0,15
0,00
0,30
0,15
0,00
i)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/105: der Graph zeigt die Konzentration von Lysin, Methionin und Threonin der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM
Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM
Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln
26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei
S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 –
90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Ergebnisse
151
Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) wies trotz geringer Nitratversorgung ebenso
vergleichbare Konzentrationen wie die anderen Bedingungen auf. Hier war der Hauptanteil
jedoch zum Sproß hin verlagert, bei den anderen Bedingungen war es jeweils die Wurzel.
Die Konzentrationen in der 10 mM-Bedingung ohne Gln lagen nur geringfügig unter denen
der vergleichbaren Bedingung mit Gln. Die beiden Transformantengenotypen zeigten etwas
erhöhte Lysinspiegel (Abb. 3/105b,c), aber die tendenzielle Abnahme im Wildtyp bei
aufsteigender Nitratreihe trat hier nicht auf. Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) zeigte in
Bezug auf die Gewebe dieselbe Verteilung bei den Transformanten wie alle anderen
Bedingungen. Auch die 10 mM-Bedingung ohne Gln reagierte in Wildtyp und Genotypen
gleich. Bei Methionin (Abb. 3/105d+e+f) ergab sich ein ähnliches Bild wie bei Lysin, nur
waren die Spiegel etwas ein Zehntel so hoch. Threonin (Abb. 3/105h,i) zeigte dasselbe Bild
wie Lysin, nur wiesen Wildtyp und Genotypen in der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat)
immer die gleiche Verteilung auf. Insgesamt wies A1 dabei immer etwas höhere
Aminosäurespiegel auf als S10.
Bei den Aminosäuren aus dem Harnstoffwechsel zeigte sich bei Arginin zwischen C24 (Abb.
3/106a) und den beiden Transformanten (Abb. 3/106b,c)
nur in Bezug auf die
Konzentrationen ein Unterschied, nicht in Bezug auf die Verteilung. Beinhaltete das Medium
neben Nitrat auch noch Glutamin, so stiegen die Sproßkonzentrationen bei C24 sprunghaft an,
ohne Gln war der Unterschied zwischen Sproß und Wurzel kaum vorhanden. Bei A1 und S10
sanken dann diese hohen Sproßwerte deutlich ab im Vergleich zum Wildtyp in der
Hauptversuchsreihe, die Konzentrationen der Bedingungen, die kein zusätzliches Gln
beinhalteten, waren gleich bei Wildtyp und Transformanten. Bei Citrullin (Abb. 3/106d)
ergab sich für den Wildtyp mit steigender Nitratkonzentration + Gln eine leichte Abnahme
des Spiegels, der Sproß lag meist etwas über der Wurzel. Bei der Mangelbedingung (0,5 mM
Nitrat) wies die Wurzel einen mehr als doppelt so hohen Wert wie der Sproß auf. Auch in der
10 mM-Bedingung ohne Gln wies die Wurzel bei C24 die höhere Konzentration auf,
insgesamt lagen die Spiegel aber niedriger als bei der Bedingung mit Gln. Sowohl A1 (Abb.
3/106e) als auch S10 (Abb. 3/106f) wichen leicht von dieser Verteilung ab, vor allem S10
wies niedrigere Spiegel auf. In beiden Fällen glichen sich die beiden Gewebe bei S10 meist
aneinander an. Bei der Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) hingegen zeigte sich in diesem
Genotyp ein größerer Unterschied zwischen Sproß und Wurzel im Vergleich zum Wildtyp.
Bei Citrullin ergab sich in den beiden Gln-freien Bedingungen für Wildtyp und für die beiden
Ergebnisse
152
Transformantengenotypen
eine
abnehmende
Wurzelkonzentration
mit
zunehmender
Nitratkonzentration.
a)
800
120
400
60
0
b)
1200
800
400
0
c)
1200
d)
180
nM/g FG Ornithin
nM/g FG Arginin
1200
0
180
e)
120
60
0
180
800
120
400
60
0
0
f)
150 g)
100
nM/g FG Citrullin
50
0
150
h)
100
50
0
150
100
50
0
i)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/106: der Graph zeigt die Konzentration von Arginin, Citrullin und Ornithin der geernteten
Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM
Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM
Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln
26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei
S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die
Wachstumstemperatur betrug 20°C, die Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 –
90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Bei Ornithin higegen reagierten beide Transformantengenotypen deutlich anders als der
Wildtyp. Bei C24 (Abb. 3/106g) zeigten die Sproße eine höhere Konzentration als die
Wurzeln, sofern das Medium Nitrat und Gln enthielt. Eine Abhängigkeit von der angebotenen
Nitratkonzentration trat dabei aber nicht auf. Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mMBedingung ohne Gln zeigten ähnliche Werte wie die Wurzeln der anderen drei Bedingungen,
also sehr niedrig. Bei A1 (Abb. 3/106h) stieg die Konzentration in Sproß und Wurzel bei 1
mM Nitrat / 4 mM Gln um das vielfache gegenüber dem Wildtyp an, in den beiden anderen
Bedingungen mit Nitrat und Gln sanken die Spiegel dann wieder ab, lagen aber immer noch
Ergebnisse
153
über denen des Wildtyp. Auch die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und die 10 mMBedingung ohne Gln lagen über den vergleichbaren Werten des Wildtyp, zeigten dabei aber
höhere Wurzel als Sproßwerte. Bei S10 (Abb. 3/106i) hingegen zeigten die drei Bedingungen
mit Gln nur leicht erhöhte Spiegel geneüber dem Wildtyp, dabei war die Verteilung zwischen
Sproß und Wurzel zugunsten der Wurzel vertauscht. Hier zeigte die Mangelbedingung (0,5
mM Nitrat) die höchste Wurzelkonzentration, während die 10 mM-Bedingung ohne Gln nur
leicht über den C24-Werten lag.
Bei Histidin zeigte sich mit steigender Nitratversorgung und Gln eine tendenzielle Zunahme
beim Wildtyp (Abb. 3/107a), der Hauptanteil lag dabei jeweils in der Wurzel. Bei der
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat), die die höchsten Spiegel zeigte, war das Verhältnis
zwischen Sproß und Wurzel umgedreht gegenüber den anderen Bedingungen. Die 10 mMBedingung ohne Gln spiegelte die Bedingung mit Gln wieder, die Konzentrationen waren
jedoch niedriger. Bei A1 (Abb. 3/107b) zeigte sich eher eine abnehmende Konzentration mit
steigender Nitratkonzentraion, jeweils mit Gln, im Vergleich zu C24. Dies galt allerdings nur
für den Sproß, bei der Wurzel ergab sich keine klare Linien. Die Mangelbedingung (0,5 mM
Nitrat) zeigte ähnlich hohe Werte wie die anderen Bedingungen und auch die 10 mMBedingung ohne Gln war gegenüber dem Wildtyp leicht erhöht, bei den Gln-freien
Bedingungen trat also kaum eine Beeinflussung durch das externe Nitratangebot auf.
150
a)
100
nM/g FG Histidin
50
0
150
b)
100
50
0
150
100
50
0
c)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln W urzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat W urzel
Abbildung 3/107: der Graph zeigt die Histidinkonzentrationder geernteten Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte.
.Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage , bei 35
mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage .Bei A1 (b) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei 35 mM Nitrat/4 mM
Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die Pflanzen bei 1 mM
Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 37 Tage, bei
0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug 20°C, die
Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn. Dargestellt
sind Mittelwert und Standardfehler (n =4-5).
Ergebnisse
154
Bei S10 (Abb. 3/107c) hingegen kam es zu vergleichbaren Werten wie bei C24, die
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) zeigte jedoch wie A1 eine höhere Wurzelkonzentration als
im Sproß.
Bei γ-Aminobuttersäure kam es im Wildtyp (Abb. 3/108a) sowohl im Sproß als auch in der
Wurzel
zu
einer
Abnahme
der
internen
Konzentration
mit
zunehmenden
Nitratkonzentrationen, sofern noch Gln anwesend war. Die Wurzel wies dabei die höheren
Konzentrationen als der Sproß auf. Die Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) zeigte in beiden
Geweben gleich niedrige Werte, die 10 mM-Bedingung ohne Gln lag geringfügig unter den
Werten der 10 mM Nitrat + 4 mM Gln-Bedingung.
1,2
a)
µM/g FG γ-Aminobuttersäure
0,8
0,4
0,0
1,2
b)
0,8
0,4
0,0
1,2
0,8
0,4
0,0
c)
1 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
1 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
10 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
10 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
35 mM Nitrat/4 mM Gln Sproß
35 mM Nitrat/4 mM Gln Wurzel
0,5 mM Nitrat Sproß
0,5 mM Nitrat Wurzel
10 mM Nitrat Sproß
10 mM Nitrat Wurzel
Abbildung 3/108: der Graph zeigt die Konzentration von γ-Aminobuttersäure der geernteten Pflanzen zum
Zeitpunkt der Blüte. .Bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln sind die C 24 - Pflanzen 26 Tage alt, Bei 10 mM Nitrat/4 mM
Gln 26 Tage , bei 35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage
.Bei A1 (b) sind die Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage, bei
35 mM Nitrat/4 mM Gln 30 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 36 Tage und bei 10 mM Nitrat 33 Tage, bei S10 (c) sind die
Pflanzen bei 1 mM Nitrat/4 mM Gln 25 Tage alt, bei 10 mM Nitrat/4 mM Gln 26 Tage30, bei 35 mM Nitrat/4
mM Gln 37 Tage, bei 0,5 mM Nitrat 37 Tage und bei 10 mM Nitrat 32 Tage Die Wachstumstemperatur betrug
20°C, die Lichtintensität 120 µE/m2 und die Lichtdauer 12 h. Geerntet wurde 30 – 90 min nach Lichtbeginn.
Dargestellt sind Mittelwert und Standardfehler (n = 4-5).
Beide Transformantengenotypen (Abb. 3/108b,c) zeigten ein ähnliches Bild wie C24, dabei
schwankten die Konzentration in den Wurzeln der Nitrat + Gln-Bedingungen, sodaß sich
keine deutlichen Abhängigkeiten von den externen Nitratkonzentrationen ergaben.
Mangelbedingung (0,5 mM Nitrat) und 10 mM-Bedingung ohne Gln zeigten keine
Veränderungen gegenüber dem Wildtyp.
Ergebnisse
155
Fazit zu ANR1:
(i)
Die Hemmung der Blühinduktion durch hohe Nitratkonzentrationen ist in
Transformanten mit verringerter ANR1-Expression nicht aufgehoben.
(ii)
Der verspätete Beginn der Blühinduktion bei beiden Transformanten beruht
wahrscheinlich eher auf ein verlangsamtes Wachstum als auf eine direkte
Beeinflussung der ANR1-Mutantion auf die Nitratwahrnehmung.
(iii)
Beide Transformanten zeigen interresanterweise einen geringeren Einfluß der
Nitratkonzentration auf das Sproß/Wurzel-Verhältnis als der Wildtyp C24. Dies
trat vor allem beim Übergang von 10 mM Nitrat nach 35 mM Nitrat hin auf, wobei
es nicht zu einer erniedrigten Nitratakkumulation in den Transformanten kam.
Brian Forde hat die Aufgabe von ANR1 dahingehend charakterisiert, daß es
notwendig ist, eine lokale Stimulation des Wachstums von Lateralwurzeln zu
ermöglichen, wenn Nitrat lokal an einer Stelle des Wurzelsystems eine
nitratdefizienten Pflanze angeboten wird. es esgibt sich kein direkter
Zusammenhang, was dies mit der Inhibierung des Wurzelwachstums bei
Nitratakkumulation in einer Pflanze zu tun hat, außer das beide Phänomene auf
Nitrat beruhen.
Diskussion
4.
156
Diskussion
In der vorliegenden Arbeit ging es darum, den Einfluß von Nitrat auf das Blühverhalten von
Arabidopsis thaliana zu ermitteln. Es ist bekannt, daß hohe Nitratkonzentrationen die
Blühinduktion verzögern (Trewaras 1983, Bernier 1993), während es bei niedrigen
Nitratkonzentrationen zu einer raschen Blüte kommt. Die externen Nitratkonzentrationen
beeinflussen auch die Biomasseallokation (Scheible et al.. 1997), steuern das Sproß/WurzelVerhältnis und beeinflussen
viele Enzmaktivivtäten aus dem Primärstoffwechsel vom
Nitratangebot. Bisher ist keine konkrete Forschung darüber bekannt, wie genau das
Nitratangebot bzw. Nitrat das Umschalten von der vegetativen zur reproduktiven Phase bei
Arabidopsis thaliana, einer fakultativen Langtagpflanze beeinflußt.
Die vorliegende Arbeit konnte bestätigen, daß ein limitierendes Stickstoff-Angebot zu einer
verfrühten Blühinduktiojn führt, und zeigte zum erstem Mal, daß die Hemmung der
Blühregulation auf einer Regulation beruht, die durch Nitrat selbst angeregt wird und nicht
auf eine Regulation durch Metabolite aus der Nitratassimilation wie z.B. durch Aminosäuren.
Blühen ist ein sogenannter „default“-Vorgang, der zunächst unterbunden werden muß, um
der Pflanze den Durchlauf einer vegetativen Phase zu ermöglichen. Durch Signale (auch
Florigene genannt), die sowohl im Blatt produziert werden (chemische Stoffe, deren Natur
noch nicht aufgeklärt ist) als auch am Sproßapex regisitriert werden (Vernalisation), tritt
dann der Eintritt in die reproduktive Phase ein. Es ist bereits vieles darüber bekannt, in
welchem Maße die Photoperiode, Temperatur, Vernalisation oder auch Wellenlänge des
Lichtes zum Beispiel bei verschiedenen Ökotypen sowohl vegetative Phase als auch die
Umschaltung in die reproduktive Phase beeinflußt . Die unterschiedlichen Signale werden
dabei an verschiedenen Organen der Pflanze registriert. Tageslänge oder auch die
Lichtqualität wird von den Blättern wahrgenommen, die dann ein bisher noch nicht näher
charakterisiertes Signal über das Phloem zum Sproßapex hin abgeben. Vernalisation hingegen
wird direkt am Sproßapikalmeristem wahrgenommen. Auf der anderen Seite zeigt Nitrat
hingegen sehr starke Auswirkungen gerade an der Wurzel, was sich aus der Rolle als
wichtiges Nährmineral ergibt. Es ist bekannt, daß die Signale aus dem Blatt über das Phloem
auch in die Wurzeln transportiert wird, es könnte hier also eine Beeinflussung der Blühsignale
durch Nitrat stattfinden. Dies gilt jedoch auch für den Sproß, da der Nitratmetabolismus nicht
nur auf die Wurzel beschränkt ist.
Diskussion
157
Um die Signalwirkung von Nitrat testen zu können, ohne auf Nitrat als N-Quelle angewiesen
zu sein, wurden zunächst mehrere Aminosäuren auf ihre Qualitäten als Ersatz-N-Quelle
ausgetestet. Dabei wurden grundsätzliche Parameter wie Biomasse, Blattanzahl, Nitrat,
Gesamtaminosäuren und Kohlenhydrate bei Nitratanzucht und Anzucht in Gegenwart von
verschiedenen Aminosäuren gegenübergestellt, um die beste Ersatz-N-Quelle für Nitrat zu
finden. Unter Berücksichtigung aller Faktoren hat sich dabei Glutamin als guter Ersatz-NLieferant erwiesen. Das Pflanzenwachstum auf 4 mM Gln führt zu ähnlichen Ergebnissen wie
die Wachstumsraten auf hohen Nitratkonzentrationen. Des weiteren wurde die Signalwirkung
von Nitrat nicht beeinträchtigt, Nitrat führt in Anwesenheit von Gln immer noch zu einer
Inhibierung der Bildung von Lateralwurzeln (Gabi Meyer zu Hörste, eigene unveröffentlichte
Ergebnisse). Es hat sich gezeigt, daß dieses schnellere Wachstum und die damit verbundene
raschere Blühinduktion nicht auf einen pH-Effekt von Glutamin beruht. Nachdem Gln als
Ersatz-N-Quelle festgelegt war, wurden die Nitratkonzentrationen verändert, um die
Signalwirkung auf die Blühinduktion beobachten zu können.
Die Arbeit enthält vier verschiedene Ansätze, um einen möglichen Einfluß von Nitrat auf die
Blühinduktion zu ermitteln:
1.) Nitrat wurde in unterschiedlichen Konzentrationen in Gegenwart von Glutamin als
Ersatz N-Quelle angeboten, um die grundsätzlichen Frage zu klären, ob Nitrat
verzögernd auf der Blühinduktion wirkt.
2.) Nitrate wurde in unterschiedlichen Konzentration unter verschiedenen Photoperioden
angeboten. Es ist bekannt, daß Arabidopsis thaliana eine fakultative Langtagpflanze
ist, die unter Kurztagbedingungen eine deutliche Verzögerung der Blühinduktion
zeigt. Dies stellte eine Möglichkeit dar, das Zusammenspiel zwischen Nitrat als
Nährstoff und Licht zu ermitteln und zugleich festzustellen, wie stark die jeweilige
Gewichtung ist.
3.) Es
wurden
verschiedene
bekannte
Blühmutanten
mit
unterschiedlichen
Nitratkonzentrationen angezogen, um festzustellen, in welchem Maße Nitrat als einer
der wichtigsten Nährstoffe das Blühverhalten steuert, wenn Gene aus den
Diskussion
verschiedenen Signalwegen der Blühinduktion mutiert sind, bzw. ob eine Mutation
unabhängig von der externen Nitratversorgung greift.
4.) In einem weiteren Testansatz wurde eine definierte Mutante, welche eine Mutation in
einem MADS-Bos Gen aufweist, ebenfalls unter verschiedenen Nitratkonzentrationen
angezogern, um zu sehen, in welchem Ausmaß die Mutation in dem sogenannten
ANR-Gen, daß die Wurzelarchitektur unter verschiedene Nährstoffangeboten bei
Arabidopsis steuert (Zhang & Forde, 1998) die Blühinduktion beeinflußt. Dieses Gen
bewirkt eine Wurzelverlängerung bei lokal begrenzten Nitratangeboten. Die
Blühinduktion unterliegt jedoch hauptsächlich Signalen aus der Sproßregion (Araki et
al 1998). Wie in diesem Fall der Zusammenhang zwischen Sproß und
Wurzelverhältnissen gegeben ist, sollte in dieser Testreihe ermittelt werden.
Alle Versuchsreihen wurden als sterile Anzuchten auf Agarplatten durchgeführt, da dies die
Anwendung von Glutamin ermöglichte und auch eine definierte Nährstoffkonzentration
vorgegeben werden konnte, zum anderen aber auch die Anzucht unter definierten Licht- und
Temperaturverhältnissen erfolgen konnte. Solche Bedingungen hätte man auch mit einer
Sandanzucht in Klimakammern erzielen können, dies ermöglicht aber nicht die Verwendung
von Glutamin als Ersatz-N-Quelle. Außerdem dauern solche Versuchsreihen wesentlich
länger und sind auch anfälliger gegenüber Schädlingen. Auf der anderen Seite hat man dann
jedoch die Möglichkeit, die gewählte Nährstoffkonzentration jeden Tag zuzuführen, während
es bei den Agarplatten zu einem graduellen Verbrauch an Nährstoffen kommt, der nicht
ausgeglichen werden kann. Durch die Zugabe von Glutamin als Ersatz-N-Quelle und dem
damit verbundenen rascheren Wachstum wurde das Problem umgangen, daß die Platten
austrockneten und damit ein weiterer, jedoch unerwünschter Effekt die Blühinduktion
beeinflußt.
4.1 Wirkung von Nitrat auf der Blühinduktion
Als grundsätzliche Aussage aus der Doktorarbeit ist abzuleiten, daß mit zunehmender
externer Nitratversorgung eine Verzögerung der Blühinduktion eintrat. Da Biomasse und und
der Blattzahl zum Zeitpunkt der Blühinduktion mit externer Nitratzufuhr anstiegen, beruhte
die Verzögerung der Blühinduktion auf einer Verlängerung der vegetativen Phase. Die
Änderungen im externen Nitratgehalt führten zu einer entsprechenden Änderung des internen
158
Diskussion
159
Nitratgehaltes, während die Gesamtaminosäuren mit den N-speichernden Aminosäuren kaum
auf die externe Nitratversorgung reagierten, jedoch mit abnehmender Tageslänge absanken.
Malat, daß als Gegenion zu Nitrat synthetisiert wird, um eine Alkalisierung bei der
Nitratassimilation zu verhindern, mag ebenfalls von der externen Nitratkonzentration
beeinflußt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden jedoch nur zwei Gewebetypen, nämlich
Sproß und Wurzel geerntet. Diese wurden nicht weiter aufgetrennt, sodaß zum einen der
gesamte Malatgehalt der Zellen und des weiteren der Malatgehalt verschiedener
Pflanzenbereiche zusammen gemessen wurden. Somit konnte im vorliegenden Testsystem
kein direkter Zusammenhang ermittelt werden. Die Kohlenhydrate nahmen mit ansteigender
Nitratversorgung ab. Scheible et al. haben 1997(a) nachgewiesen, daß eine Pflanze entweder
Stärke oder Nitrat anhäuft, bei Arabidopsis thaliana kann dies – zumindest beim vorliegenden
Erntezeitpunkt – auf alle Kohlenhydrate ausgedehnt werden.
4.2
Einfluß von Nitrat auf die Blühinduktion unter verschiedenen
Photoperioden
Im vorliegenden Ansatz ging es um den Einfluß von Nitrat auf die Blühinduktion und in
welchem Maß die Tageslänge dies beeinflußt. Dabei ergaben sich mehrere Fragen:
Hat Nitrat einen hemmenden Einfluß auf die Blühinduktion ?
Nitrat hat einen hemmenden Einfluß auf die Blühinduktion in der Col-Varietät. Untersuchte
man dies unter dem Einfluß verschiedener Photoperioden – 8 h, 12 h und 16 h Licht, so zeigte
sich die Hemmung besonders deutlich bei der kurzen Photoperiode und und ist auch noch
beim 12 h / 12 h-Lichtregime sichtbar. Interressanterweise
ging dieser Effekt bei
Langtagbedingungen sehr stark verloren.
Der Zeitpunkt des Blühens kann zu falschen Schlußfolgerungen führen, wenn Änderungen in
der Wachstumsrate auftreten. Deswegen wird bei Beobachtungen des Blühverhaltens die
Blühzeit auch immer in Relation gesetzt zu Parameter, die Auskunft über das physiologische
Alter einer Pflanze geben, dies wären Daten zur Blattzahl oder auch Biomasse. Es hat sich
gezeigt, bei kurzer Photoperiode deutliche Unterschiede bei Blattzahl und Biomasse zwischen
den einzelnen Nitratangeboten auftraten, mit zunehmender Nitratkonzentration kam es zu
Diskussion
160
einer verlängerten vegetativen Phase. Dies ergab sich ebenfalls bei der intermediären
Tageslänge mit 12 h Licht, bei langer Photoperiode ergaben sich dagegen kaum Unterschiede
bei Blattzahl und Biomasse in Bezug auf
die verschiedenen Nitratkonzentrationen.
Grundsätzlich zeigte sich, daß Blühen durch Nitrat verzögert wird, auch wenn man es in
Bezug zu Blattzahl oder Biomasse setzt, die bei einer Blührate von ca. 80 % erreicht sind.
Die Konzentrationen an externem Nitrat, die die Blühinduktion beeinflussen, sind ähnlich
denen, welche das Sproß/Wurzel-Verhältnis beeinflussen. Das Sproß/Wurzel-Verhältnis ist
ein weiterer Parameter, bei dem bekannt ist, daß es durch Stickstoffversorgung und speziell
durch Nitrat beeinflußt wird. Daß das Sproß/Wurzel-Verhältnis von der N-Versorgung
abhängig ist, haben Scheible et al. 1997(b) bei Nicotiana plumbaginifolia gezeigt.
Um zu überprüfen, ob das externe Nitratangebot den internen Nitratspiegel beeinflußte, wurde
auch Nitrat gemessen. Dabei zeigte sich unabhängig von der Photoperiode, daß der interne
Nitratgehalt
im
angewandten
Testsystem
fast
ausschließlich
von
der
externen
Nitratversorgung abhängig war. Auch unter Langtagbedingungen kam es dabei zu einem
Anstieg des internen Nitratspiegels, wenn die externe Nitratversorgung zunahm. Die
Abwesenheit der nitratabhängigen Hemmung der Blühinduktion beruhte damit nicht auf einen
fehlenden Anstieg des internen Nitratspiegels, vielmehr wurde die Nitratinduzierte
Inhibierung durch das Photoperioden-Signal überwunden.
Die Spiegel der Aminosäuren blieben im allgemeinen konstant bzw. fielen bei ansteigenden
Nitratkonzentrationen leicht ab, die allgemeine Strategie wurde in ihrer Funktionalität
bestätigt. Die Beeinflussung des internen Nitragehaltes durch das externe Nitratangebot
spiegelte sich nicht bei den Aminosäuren – weder bei den Gesamtaminosäuren noch bei den
einzelnen Aminosäuren – wieder. Die wichtigen N-speichernden Aminosäuren Glutamin,
Glutamat, Asparagin, Aspartat und Alanin stellen den höchsten Anteil an den
Gesamtaminosäuren und sind teilweise direkte Derivate der Nitratassimilation. Die
Aminosäuren reagierten lediglich bei der höchsten Nitratkonzentration mit einer leichten
Abnahme der Konzentrationen. Auf der anderen Seite reagierten die Aminosäuren sehr stark
auf die Photoperiode; je kürzer die Tageslänge und damit desto länger die vegetative Phase,
desto mehr sanken die Aminosäurekonzentrationen ab, dies galt sowohl für die
Gesamtaminosäuren als auch für die einzelnen Aminosäuren. Ausnahme war Arginin, dieses
nahm mit abnehmender Tageslänge zu. Arginin ist Vorläufer für Putrescin, einem Polyamid,
Diskussion
dem Signalwirkung bei der Blühinduktion nachgesagt wird (Caffaro & Vincente 1995).
Leider war es technisch nicht möglich, die Polyamide zu messen, aber bei weiteren
Untersuchungen zu diesem Thema sollten sie berücksichtigt werden. Wenn sich Korrelationen
zwischen dem externen Nitratangebot und der Aminosäurekonzentration ergaben – dies traf
für Glycin und Serin aus der Photorespiration sowie Tyrosin und die aliphatischen
Aminosäuren zu – dann nur unter Langtagbedingungen. Da die aufgeführten Aminosäuren
aber keine direkten Derivate von Nitrat sind wie z.B. Glutamin und Glutamat und zudem die
Blühinduktionskurven gezeigt haben, daß bei 16 h Tageslänge das Nitratsignal nicht zum
Tragen kommt, kann eine mögliche Beteiligung dieser Aminosäuren am Nitratsignal
ausgschlossen werden.
Ebenso kam es bei ansteigenden Nitratangebot zu einer allgemeinen Abnahme der
Kohlenhydrate. Bei den Kohlehydraten hingegen ergaben sich deutliche Korrelationen
zwischen ansteigenden Nitratspiegeln und abnehmenden Zucker- und Stärkekonzentrationen.
Am geringsten betroffen hat sich dabei der Sacharosespiegel gezeigt. Saccharose steht als
Drehpunkt zwischen den reduzierenden Zuckern und Stärke, der Umbau des einen in den
anderen läuft immer über Saccharose ab, wahrscheinlich zeigt dieser Zucker daher weniger
starke Reaktionen auf Nitratveränderungen als die reduzierenden Zucker und Stärke.
Malat zeigte weder in Bezug auf die Nitratkonzentrationen noch auf die Photoperiode eine
Korelation. Malat wird als Gegenion zu Nitrat bei dessen Assimilation produziert, um eine
Alkalisierung in der Zelle zu vermeiden. Dabei wird die Synthese von Malat und weiteren
organischen Säuren durch Nitrat stimuliert (Scheible et al. 1997). Wäre Nitrat allein für den
Spiegel der organischen Säuren verantwortlich, so sollte sich eine Korrelation zwischen
externer Nitratversorgung und Gehalt an organischer Säure – hier eingeschränkt auf Malat,
andere organische Säuren sind nicht bestimmt worden – ergeben, der jedoch nicht eintrat.
Zum einen wurden nur zwei Gewebetypen geerntet, sodaß sich gewebespezifische
Unterschiede nicht ausprägen konnten, zum anderen gab es nur einen Erntezeitpunkt. Die
organischen Säuren werden außerdem nicht nur als Antwort auf Nitratassimilation
synthetisiert, sondern entstehen auch in verschiedenen Bereichen des Primärstoffwechsels
(Beispiel Zitratzyklus) als normale Zwischenprodukte. Um einen genaueren Zusammenhang
zwischen Malat und Nitrat ermitteln zu können müßte man eine feinere Gewebeeinteilung –
sink-Blatt, source-Blatt und Wurzel – durchführen, zum anderen aber auch mehrere Ernten
über den Tag hinweg durchführen. W.-R. Scheible hat in seiner Dissertation 1996 für
161
Diskussion
Nicotiana plumbaginifolia gezeigt, daß die Malatsynthese durch Nitratassimilation stimuliert
wird, dies konnte aufgrund des Versuchablaufs in dieser Arbeit nicht bestätigt werden.
Wie agiert Nitrat als Signalstoff?
Aus den Ergebnissen, die in dieser Doktorarbeit erarbeitet worden sind, ergibt sich, daß der
interne Nitratgehalt parallel zum ansteigenden externen Nitratgehalt zunimmt und das mit
zunehmender externer Nitratkonzentration zu einer Verzögerung der Blühinduktion eintritt.
Die Verzögerung der Blühinduktion bei ansteigenden Nitratkonzentrationen und parallel
zunehmenden internen Nitratkonzentrationen wird von der Tageslänge moduliert, bei 16 h
Photoperiode zeigt sich nur ein sehr schwacher, kaum signifikanter Unterschied zwischen den
Blühverlaufskurven zu den verschiedenen Nitratangeboten, obwohl die internen Nitratspiegel
dem externen Nitratangebot folgten. Bei 12 h Tageslänge zeigte sich ebenfalls eine Parallele
zwischen externem Nitratangebot und internem Nitratspiegel und es ergab sich eine
Auftrennung zwischen den verschiedenen Blühverlaufskurven, da das Photoperiodensignal
hier schwächer war als bei der langen Photoperiode. Dieser Effekt der Auftrennung des
Blühverlaufs zwischen den unterschiedlichen Nitratkonzentrationen war am deutlichsten bei
der kurzen Photoperiode mit 8 h Licht ausgeprägt. Ebenso wie bei den beiden anderen
Photoperioden zeigte sich, daß mit zunehmenden externem Nitratangebot die internen
Nitratkonzentrationen anstiegen. Dabei zog sich der Beobachtungszeitraum bei 8 h
Tageslänge so sehr in die Länge, daß die Beobachtung der Pflanzen auf 35 mM Nitrat / 4 mM
Gln nicht bis zum Ende der Blühverlaufskurve durchgeführt werden konnte, da die Platten
auszutrocknen begannen. Die Pflanzen, die von dieser Bedingung geerntet wurden, zeigten
jedoch zum Zeitpunkt der Ernte einen makroskopisch sichtbaren Blühansatz und waren daher
im physiologisch gleichen Zustand wie die bereits zuvor geernteten Pflanzen.
Glass und Siddiqi haben 1995 bei Gerste gezeigt, daß die Netto-N-Aufnahme mit der
Photosynthese und der Wachstumsrate der Pflanze korreliert und zwar unabhängig vom
externen Nitratgehalt. Dies trifft bei der vorliegenden Arbeit nur bedingt zu, der externe
Nitratgehalt steuert zumindest bei den beiden niedrigen Nitratgehalt den internen Nitratgehalt
und damit die Netto-N-Aufnahme. Bei der höchsten angebotenen Nitratkonzentration spiegelt
der interne Nitratgehalt jedoch nicht die externe Nitratkonzentration wieder, der Unterschied
im internen Nitratspiegel entspricht nicht einem Verhältnis von 10 zu 35 bzw. 1 : 3,5. Diese
162
Diskussion
hohe Nitratkonzentration wird vermutlich von der Pflanze wahrgenommen, aber nicht
aufgenommen. Auf der anderen Seite ist die Blühinduktionskurve bei der kurzen
Photoperiode zur höchsten angebotenen Nitratkonzentration am stärksten abgesetzt gegenüber
den beiden anderen Nitratkonzentrationen. Diese Aufspaltung trat bereits bei 12 h Licht auf
und ist besonders stark ausgeprägt bei der Kurztagbedingung. Dies hat sich nicht nur bei Col
gezeigt, sondern auch bei den beiden anderen verwendeten Wildtypen = Ökotypen Landsberg
erecta und C24. Diese werden später genauer miteinander verglichen. Da die auftretende
Hemmung der Blühinduktion nicht vollständig parallel mit der internen Nitratkonzentration
einherging, stellt sich die Frage, ob das Nitratsignal nicht bereits vor der Aufnahme in die
Wurzel wirkt oder wie es in der Wurzel moduliert wird. Die Pflanzen auf der hohen
Nitratkonzentration mit 35 mM Nitrat hatten gerade bei 12 h Tageslänge keine höheren
Biomassedaten als die Pflanzen bei 10 mM Nitrat in der gleichen Photoperiode, die
Blühinduktionskurve zu 35 mM Nitrat waren bei dieser Photoperiode jedoch bereits deutlich
abgesetzt. Es ist also nicht mehr Biomasse aufgebaut und damit Nitrat verbraucht worden. Um
festzustellen, ob die Signalwirkung bereits von außen wirkt, wäre es z. B. notwendig, die
Genexpression der verschiedenen Nitrattransporter zu beobachten. Es ist bekannt, daß die
Nitrattransporter durch externes Nitrat in ihrer Synthese induziert werden (Meraviglia et al.
1996, Filleur et al. 1999). Des weiteren geht man davon aus, daß das Blühinduktionssignal
aus den Blättern nicht nur zum Sproßapex, sondern auch in die Wurzel transportiert wird.
Dort wird es auf bisher unbekannte Art und Weise modifiziert und beeinflußt dann via
Phloemtransport den Sproßapex. Insgesamt ergibt sich die Frage, ob Nitrat grundsätzlich nur
in bestimmten geringen Konzentrationen zu einer Stimulation der Blühinduktion führt oder ob
das Abnehmen des Nitratgehaltes im Laufe der vegetativen Phase an sich – unabhängig von
den tatsächlichen Konzentrationen – als Signal wahrgenommen wird. Dazu wäre es jedoch
notwendig, während der Testreihe immer wieder – entweder alle zwei Tage oder jeden Tag –
Probeernten durchzuführen, um zu ermitteln, wie sich der Nitratspiegel sich im Laufe des
Pflanzenwachstums intern verändert.
Wie bereits in der Einleitung erläutert wurde, handelt es sich beim Blühen um einen
sogenannten „default“-Vorgang, dieser wird durch verschiedene Signalwege verzögert, die
die Umschaltung von der vegetativen zur reproduktiven Phase unterbinden. Die Essenz der
vorliegenden Ergebnisse zur Interaktion zwischen Nitrat und Photoperiode ist, daß der
inhibitorische Effekt von Nitrat nur sehr schwach oder gar nicht wirkt, wenn ein anderes
fördendes Signal aufgrund langer Photoperiode angeschaltet wird. Eine andere mögliche
163
Diskussion
164
Erklärung ist, daß Nitrat über einen vollständig selbstständigen Signalweg wirkt ; und daß
metabolische Veränderungen, die unter Langtagbedingungen auftreten ( z.B. höhere
Aminosäurekonzentrationen, höhere Kohlenhydrate und weitere Veränderungen) dem
hemmenden Effekt hoher Nitratkonzentrationen entgegenwirken. Eine weitere Möglichkeit
ist, daß diese veränderten Metabolitenspiegel selbst ein förderndes Signal für die
Blühinduktion darstellen und den hemmenden Effekt hoher Nitratkonzentrationen somit
überwinden.
4.3 Die Beeinflussung der Blühinduktion durch Nitrat läuft bei
verschiedenen frühblühenden Wildtypen ähnlich ab
Neben Columbia als frühblühender Ecotyp wurden auch Landsberg erecta und C24 in der
vorliegenden Arbeit verwendet. Landsberg erecta ist dabei der Wildtyp zu verschiedenen
getesteten Blühmutanten, während C24 Wildtyp zu den beiden ANR1-Genotypen ist, die
näher untersucht wurden. Beim Vergleich zeigte sich, daß für alle drei frühblühenden
Wildtypen die Reaktion der Blühinduktion auf ansteigende Nitratkonzentrationen ähnlich
war, sofern Gln als zusätzliche N-Quelle vorhanden war. Col und Ler zeigten fast die gleiche
Anordnung der Blühinduktionskurven bei den drei Nitratkonzentrationen aus der
Hauptversuchsreihe. Bei C24 kam es hingegen zu einer deutlichen Auftrennung zwischen
allen
drei
Blühinduktionskurven,
die
grundsätzliche
Antwort
auf
steigende
Nitratkonzentrationen ist hingegen die gleiche. Dabei ist zu beachten, daß bei C24 eine um 20
% höhere Lichtintensität im Vergleich zu den beiden anderen Ökotypen angewandt wurde. Es
ist daher nur eingeschränkt möglich, diese Auftrennung der Blühinduktionskurven als
Charakteristikum von C24 festzulegen, da die Lichtintensität sehr wohl einen Einfluß auf das
Wachstum der Pflanze hat. Dies wurde in der vorliegenden Arbeit aber nicht weiter
ausgetestet.
Alle drei Ökotypen zeigten in Bezug auf Biomasse und Blattzahl ein ähnliches Verhalten. Bei
einer Photoperiode von 12 h Tageslänge kam es mit ansteigenden Nitratkonzentrationen zu
einer Zunahme von Blattzahl und Biomasse zum Zeitpunkt der Blühinduktion und damit zu
einer Verlängerung der vegetativen Phase. Dies zeigte sich vordergründig am deutlichsten bei
C24, jedoch ist zu beachten, daß hier eine höhere Lichtintensität herschte als bei den beiden
anderen Ökotypen. Ob es sich bei dieser Ausprägung also um ein C24-spezifisches Phänomen
Diskussion
165
handelt oder ob dies durch die höhere Lichtintensität bedingt ist, kann durch eine
Vergleichsanzucht der beiden anderen Ökotypen bei dieser höheren Lichtintensität von 120
µE/m2 ermittelt werden. Bei den internen Nitratspiegeln lagen die Col-Werte höher als die
von Landsberg erecta und C24, das grundsätzliche Bild blieb jedoch erhalten. Auch die
anderen gemessenen Inhaltsstoffe wichen in ihrer Verteilung nicht sehr stark voneinander ab
beim Vergleich der drei Wildtypen, lediglich die Konzentrationen waren unterschiedlich. Dies
zeigt, daß bei gegebener Photoperiode von 12 h Tageslänge bei frühblühenden Ökotypen die
Hemmung der Blühinduktion durch zunehmende Nitratkonzentration sichtbar wird. Es wäre
interressant, dies mit weiteren Ökotypen, vor allem mit spätblühenden Varianten zu
vergleichen. Je nach natürlichem Standort sind Ökotypen früh- oder spätblühend und werden
teilweise durch Vernalisation in ihrer Blühinduktion gefördert. In dieser Arbeit wurde bisher
der Zusammenhang zwischen Photoperiode und Nitratkonzentration in Bezug auf
Blühinduktion ermittelt, ein anderer Aspekt wäre der Zusammenhang zwischen Vernalisation
und Nitratkonzentration.
Beim
Vergleich
der
drei
Wildtypen
wurden
nur
die
Auswirkungen
der
drei
Nitratkonzentrationen aus der Hauptversuchsreihe – 1, 10 und 35 mM Nitrat + je 4 mM Gln –
berücksichtigt, da diese immer angewendet wurden. Ber Ler und C24 wurden jedoch noch
zwei weitere Bedingungen getestet. Bei der einen handelte es sich um eine Mangelbedingung
mit 0,5 mM Nitrat, um zu ermitteln, in welchem Maße nicht nur Nitratmangel,sondern eine
allgemeine Nitratdefiziens die Blühinduktion beeinflußt, die zweite Bedingung enthielt nur 10
mM Nitrat ohne Gln-Zusatz, um zu ermitteln, wie Glutamin die Blühinduktion beeinflußt
durch Vergleich mit der entsprechenden 10 mM Nitrat-Bedingung + 4 mMGln. Beim
Vergleich von Ler und C24 war zu beachten, daß beide Wildtypen unter verschiedenen
Lichtintensitäten angezogen wurden
Nitratdefiziens führt zu verfrühtem Blühen
Beiden Wildtypen war aber gemeinsam, daß die Mangelbedingung zeitlich gesehen sehr spät
blühte. Betrachtet man aber die Daten zu Biomasse und Blattanzahl , so zeigen die sehr
niedrigen Werte für beide Wildtypen an, daß die Blüte in Bezug auf die Biomasse in beiden
Fällen verfrüht eingetreten ist.
Es ist bekannt, daß niedrige externe Nitratkonzentrationen zu einer Verschiebung des
Sproß/Wurzel-Verhältnisses in Richtung Wurzel führt. Dies haben Rufty et al. 1990 für
Diskussion
166
Nicotiana tabacum und Peuke et al. 1994 für Ricinus communis gezeigt, die vorliegende
Arbeit bestätigt dies für Arabidopsis thaliana.
Die Veränderungen im Sproß/wurzel-
Verhältnis treten in gleichen Nitratkonzentrationen auf, die die Blühinduktion beeinflussen.
Blühinduktion in Gegenwart und Abwesenheit von Glutamin
Die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln begann später mit der Blüte als die entsprechende
Bedingung aus der Hauptversuchsreihe mit Gln, die Daten zu Biomassen, Blattzahl ,
Sproß/Wurzel-Verhältnis und auch Nitrat zeigten jedoch sehr ähnliche Werte. Dies bedeutet,
daß Gln die Blühinduktion nur indirekt durch Verkürzung der vegetativen Phase bei Anzucht
der Pflanzen unter einem 12 h/12 h-Lichtregime fördert, wenn die Blühzeit in Relation zu
Biomasse und Blattzahl gesetzt wird. Die Glutaminfütterung führte zu einem Anstieg von
Glutamin und anderen Aminosäuren, sodaß ein nicht vorhandener Effekt auf die
Blühinduktion nicht auf einer fehlenden Aufnahme von Glutamin beruhte (auch wenn das
Wachstum beschleunigt wurde).
Die Ergebnisse der diskutierten Experimente schließen allerdings nicht aus, daß die
Veränderung der Aminosäurespiegel möglicherweise unter anderen Bedingungen die
Blühinduktion fördern können, z.B. in Langtagbedingungen.
4.4 Verschiedene Blühmutanten zeigen keine Beeinflussung durch Nitrat
Bei der Diskussion der Frage, wie Nitrat die Blühinduktion beeinflußt, hat sich bei
Betrachtung der Ergebnisse aus den Photoperioden-Versuchen kein klares Bild ergeben, ob
Nitrat auf den bereits bekannten Signalweg der Tageslänge wirkt oder ob es über einen
unabhängigen Signalweg die Induktion der Blüte bewirkt. Ob weitere Erkenntnisse zu dieser
Problematik zu erlangen, wurden verschiedene, bereits teilcharakterisierte Blühmutanten
unter verschiedenen Nitratkonzentrationen angezogen. Ziel war es, neue Kenntnisse über das
Zusammenspiel von Nitrat und anderen bekannten Signalwegen zu erlangen. Dabei wurden
zum einen die drei Nitratkonzentrationen aus der Hauptversuchsreihe und die beiden
Zusatzbedingungen verwendet. Die verwendeten Mutanten wurden ursprünglich in zwei
Klassen eingeteilt, frühblühende und spätblühende Mutanten. Letztere sind mittlerweile
weiter aufgespalten worden je nach Verhalten gegenüber Photoperiode, Vernalisation,
Diskussion
Interaktion mit Gibberrellinen oder Zugehörigkeit zum autonomen Signalweg. Bei
Arabidopsis thaliana führt der autonome Signalweg z.B. dann zum Blühen, wenn keine
Stimuli vorliegen und die anderen Signalwege damit ausfallen. Es gibt damit keine Mutante,
die nicht zum Blühen kommt, auch wenn dies zeitlich sehr verschoben geschieht oder die
Anatomie der Blüte stark verändert ist. Mittlerweile ist bei vielen Mutanten bereits die
genauere Wirkungsweise und die ungefähre Position im Ablauf der Blühinduktion bekannt.
Es wurden sechs verschiedene Mutanten ausgetestet. Dabei handelt es sich zum einen um ein
inhibitorisch wirkendes Protein = tfl, zum anderen um ein „floral meristem identity“-Gen =
lfy. Außerdem wurden zwei Mutanten aus dem Vernalisationssignalweg, fve und fy, und zwei
aus dem autonomen Signalweg, fd und fwa, getestet. Allen Mutanten ist gemeinsam, daß die
Auswirkung ihrer Mutation durch Nitrat nicht aufgehoben wurde.
Im nachfolgenden werden die Mutanten einzeln nach folgendem Muster besprochen:
•
zunächst werden allgemeine, bereits bekannte Informationen zu den einzelnen
Mutanten gegeben.
•
Hat Nitrat eine hemmende Wirkung auf die Blühinduktion in Bezug auf Zeit zum
einen und in Bezug zu Blattzahl und Biomasse zum anderen?
•
Veränderungen im Sproß/Wurzel-Verhältnis
•
Veränderungen in weiteren Metaboliten, um zu sehen, ob die Mutation bisher
unbekannte Effekte auf Verteilung und Metabolismus hat, um die Möglichkeit
auszuschließen, daß Veränderungen bei den Metaboliten nicht die Interpretation des
Nitrateffekts auf die Blühinduktion beeinflussen
4.3.1. tfl1-2
Bei der vorliegenden Mutante ist bisher bekannt, daß das betroffene Protein Ähnlichkeit mit
tierischen Phosphatidylethanolamin-bindenden Proteinen oder anderen Proteinen aufweist, die
mit Lipiden oder GTP-bindenden Proteinen assoziieren. Die Funktion von TFL ist es, die
reproduktive Entwicklung der Pflanze zu unterbinden, um der Pflanze zu ermöglichen,
verschiedene vegetative Stadien zu durchlaufen, bevor sie in die Blüte eintritt (Ratcliffe et al.
1998). In der Blühinduktion beeinflußt es wahrscheinlich die Aktivität eines Inhibitors, der
die Induktion von Blühprimordia inhibiert, indem es stabiliserend wirkt. Vermutlich nimmt
167
Diskussion
168
die Aktivität des Inhibitors infolge TFL1-Beeinflussung während der Entwicklung langsam ab
und fällt unter einen bestimmten Schwellenwert, sodaß sich ein Blütenprimordium ausbilden
kann. Liegt eine Mutation bei TFL vor, so nimmt die Aktivität des Inhibitors schneller ab als
im Wildtyp, das Blühprimordium bildet sich schneller aus, zudem verändert sich auch die
Morphologie der entstehenden Blüte. Das die Inhibierung de Entwicklung des
Blühprimordiums schneller beendet ist als im Wildtyp, kommt es zu einer verfrühten und
abnormen Blüte im Vergleich zum Wildtyp. Bei Blühinduktion kommt es zur Ausbildung von
Blühprimordien am Sproßapex. Die Muster, in denen diese Blühprimordia auftreten, ist durch
die Aktion sogenannter inhibitorischer Felder festgelegt. Fällt die Konzentration des
Inhibitors unter einen Schwellenwert, so können neue Primordia entstehen. Dieser Inhibitor
wird
jedesmal
neu
in
den
frisch
entstandenen
Primordienfeldern
gebildet.
Das TFL-Genprodukt hat vermutlich einen quantitativen Effekt auf diesen Inhibitor (Alvarez
et al. 1992). TFL1 interagiert mit LFY und reprimiert dessen Expression im Sproß, während
umgekehrt LFY die TFL1-Expression in der Blüte unterbindet (Alvarez et al.. 1992, Bradley
et al.. 1997). TFL1 wird sowohl in der vegetativen als auch in der reproduktiven Phase
expremiert (Bradley et al. 1997).
Der fehlende Einfluß des mutierten tfl-Genproduktes auf einen Inhibitor der Blühinduktion
zeigt sich auch bei den verschiedenen angewandten Nitratkonzentrationen. Alle Kurven waren
im Vergleich zu Ler nach vorne geschoben, die Anordnung war jedoch nicht verändert. Dabei
zeigte die Hauptversuchsreihe mit ansteigender Nitratkonzentration in Gegenwart von Gln in
der Mutante eine ähnliche Hemmung der Blühinduktion wie der Wildtyp Ler. Im Gegensatz
zu Ler ergab sich bei tfl1 keine offensichtliche Zunahme bei Blattzahl und Biomasse inBezug
auf steigende Nitratkonzentrationen. Dies lag jedoch daran, daß die Mutante sehr schnell
wuchs und damit die verschiedenen Bedingungen nicht immer zum gleichen Zeitpunkt – 50 –
60 % Blühansatz – geerntet werden konnten. Somit sind die Blattzahl und die Biomasse für
1 mM und 10 mM Nitrat aus der Hauptreihe überschätzt, da diese Bedingungen geerntet
wurden, als bereits 90 bzw. 85 % der Pflanzen blühten. Auch zeigte die Mangelbedingung mit
niedriger Blattzahl und Biomasse bei tfl1 ebenfalls verfrühtes Blühen, wie es bereits der
Wildtyp gezeigt hat. Das die Mangelbedingung verfrüht geblüht hat, zeigte sich auch bei
Vergleich der beiden Nitratbedingungen ohne Glutamin – 0,5 mM und 10 mM Nitrat. Zeitlich
gesehen begann die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln früher zu blühen als die
Mangelbedingung, aber in Bezug auf Blattzahl und Sproßgewicht zeigte die 10 mM Nitrat-
Diskussion
169
Bedingung bei der Mutante deutlich höhere Werte als die Mangelbedingung, dies ergab sich
auch im Wildtyp.
Beim Sproß/Wurzel-Verhältnis zeigten Mutante und Wildtyp ein ähnliches Bild, bei der
Hauptversuchsreihe ergab sich bei steigender Nitratkonzentration und damit verlängerter
vegetativer Phase eine Zunahme des Verhältnisses. Auch bei Mangelbedingung und der
Glutaminfreien 10 mM Nitrat-Bedingung zeigten Wildtyp und Mutante keine Unterschiede.
Dabei ist zu beachten, daß die Pflanzen zu den ersten beiden Bedingungen zu spät im
Verhältnis zu den anderen Bedingungen geerntet wurden (siehe oben), sodaß das Bild zum
Sproß/Wurzel-Verhältnis etwas verfälscht ist.
Um zu sehen, ob die Mutante anders als der Wildtyp auf die externe Nitratversorgung
reagierte, wurden Metaboliten wie Nitrat, Aminosäuren, Malat und Kohlenhydrate gemessen.
Der N-Status der Hauptversuchsreihe war in Bezug auf Nitrat bei tfl1 nicht verändert,
steigende externe Nitratversorgung führte zu erhöhten internen Nitratspiegeln. Jedoch stiegen
die N-speichernden Aminosäuren Glutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat im Vergleich
zum Wildtyp in der Wurzel stark an. Aus den bisherigen Versuchen mit Col und auch mit Ler
hat sich ergeben, daß der Nitratstatus und nicht der Anteil der Aminosäuren am Gesamt-NStatus die Blühinduktion beeinflußt. Da diese Aminosäuren unabhängig von einer externen
Gln-Zugabe erhöht sind, wie die 10 mM Nitrat-Bedingung ohne Gln zeigt, kann bei dieser
Mutante ein Einfluß der Aminosäuren auf die Blühinduktion nicht ausgeschlossen werden.
Neben den bisher besprochenen Aminosäuren stieg auch Alanin, das sich zusammen mit den
verzweigten Aminosäuren von Pyruvat ableitet, ist in seiner Konzentration an, sobald das
Medium Gln enthielt. Alanin stellt ebenfalls einen wichtigen Speicherstoff für N in der
Pflanze dar. Gerade bei der Kombination von Nitrat und Gln stieg der Gesamt-N-Status der
tfl-Mutanten deutlich an, der interne Nitratspiegel war dabei nicht verändert.
Außerdem waren die Aminosäuren aus dem Harnstoffwechsel in der Mutante verändert. Hier
führte
die
Gln-Fütterung
vor
allem
bei
Arginin
und
Citrullin
zu
deutlichen
Konzentrationsanstiegen, diesmal aber im Sproß. Es ist bekannt, daß aus den Aminosäuren
des Harnstoffzyklus Polyamine wie z.B. Putrescin synthetisiert werden, das eine induktive
Rolle in der Blühinduktion spielen soll und auch Spermin bzw. Spermidin, die als
Wachstumsfaktoren fungieren. Da diese Aminosäuren hauptsächlich im Sproß erhöht sind,
können auch die nachfolgenden Produkte vor allem im Sproß in ihren Konzentrationen erhöht
Diskussion
sein. Das Blühinduktionssignal, das bisher noch nicht näher charakterisiert worden ist, wird
aus dem Blatt heraus zum Sproßapex transportiert. Noch nicht geklärt ist, inwieweit und wie
es mit anderen Signalen interagiert, aber die vorliegenden Ergebnisse lassen vermuten, daß
eine mögliche Beschleunigung der Blühinduktion durch die besprochenen Stoffe nicht
ausgeschlossen ist. Dazu wäre es notwendig, Putrescin, Spermin und Spermidin zum einen in
ihrer Konzentration zu messen, zum anderen müßten aber auch Enzymaktivitäten bestimmt
werden, um festzulegen, ob tatsächlich ein erhöhtes Wachstum eingetreten ist.
4.3.2 lfy-1
Bei Leafy handelt es sich um ein sogenanntes „Floral meristem identity“-Gen, das zusammen
mit anderen Genen den Aufbau einer Blüte bzw. die Ausrichtung eines Blühprimordiums in
bezug auf die spätere Anordnung der einzelnen Blütenorgane steuert. Dabei hat sich gezeigt,
daß die an dieser Determination beteiligten Gene redundant arbeiten, es also auch bei Ausfall
einzelner Gene zu einer Blütenbildung kommt, die dann jedoch sich morphologisch vom
Wildtyp unterscheidet. Sowohl der autonome als auch der photoperiodengesteuerte Signalweg
sind an der Regulierung von LEAFY beteiligt (Aukerman et al. 1999, Simpson et al. 1999).
Das Genprodukt ist im Kern lokalisiert und bindet DNA auf sequenzspezifische Weise, wobei
bisher keine transkriptionelle Regulatorfunktion nachgewiesen wurde (Parcy et al. 1998).
Während der vegetativen Phase wird LEAFY in Blattprimordien expremiert und durch die
Photoperiode reguliert (Blazquez et al. 1997). Seine Expression wird durch Gibberrelline
gefördert (Blazquez et al. 1998). Es verstärkt die Expression von APETALA1 und
CAULIFOWER, zwei weitere „Floral-Meristem-identity“-Gene.
Bei dieser Mutante trat wie erwartet eine leichte Verzögerung der Blühinduktion ein, dies
betraf alle Bedingungen. Bei der Hauptversuchsreihe – aufsteigende Nitratkonzentrationen +
Gln-Zusatz - liefen die drei Kurven bei der Mutante im Gegensatz zu Ler alle separiert
voneinander, hier trat also eine deutliche Abhängigkeit der Blühinduktion von der externen
Nitratversorgung auf. Auch die beiden Glutaminfreien Bedingungen zeigten bei der Mutante
ein vergleichbares Verhalten wie beim Wildtyp.
Die Blattanzahl war stark erhöht in bei lfy im Vergleich zu Ler, dies galt für die Bedingungen
der Hauptreihe und der Gln-freien 10 mM Nitrat-Bedingung. Wildtyp und Mutante zeigten
170
Diskussion
jedoch
weniger
171
Übereinstimmung
bei
der
Sproßbiomasse
bei
ansteigenden
Nitratkonzentrationen in Gegenwart von Gln, die Mutante zeigte bei ansteigender
Nitratkonzentrationen
keine durchgehend zunehmende Biomasse, wie Ler dies tat. Die
Mangelbedingung zeigte bei der Mutante kaum einen Unterschied gegenüber dem Wildtyp,
dies gilt für Blattzahl und Sproßbiomasse. Die Kurve zur Gln-freien 10 mM-Bedingung
begann bei lfy zwar später als beim Wildtyp, dies spiegelte sich aber nicht in den
Sproßbiomassedaten wieder. Hier handelte es sich also nicht unbedingt um eine Verlängerung
der vegetativen Phase, vielmehr trat eine verzögerte Entwicklung ein. Das Fehlen von
Glutamin als Zusatz-N-Quelle führte bei dieser Mutante also zu einer Verzögerung der
Entwicklung, auch der langsamere Ablauf der Blühinduktionskurve der Mangelbedingung
deutet darauf hin. Insgesamt ist die leichte Verzögerung der Blühinduktion also auf eine
geringfügig verlängerte vegetative Phase zurückzuführen. Die Mangelbedingung zeigte keine
Verzögerung der Blühinduktion, was durch Biomassedaten bestätigt wurde, die Kurve zog
sich jedoch bei der Mutante über einen längeren Zeitraum hinweg.
Fazit: Die Blühinduktion bei lfy wird durch Nitrat verzögert.
Für das Sproß/Wurzel-Verhältnis bei der Mutante gilt bei aufsteigender Nitratreihe + Gln
dasselbe wie beim Sproßgewicht der Mutante unter den selben Bedingungen, es ergab sich
kein durchgehender Anstieg wie beim Wildtyp. Bei den Gln-freien Bedingungen ergab sich
kein Unterschied zwischen Ler und Mutante.
Auch bei lfy wurden die Metaboliten gemessen, um festzustellen, wie ansteigende externe
Nitratversorgung diese beeinflußt. Dabei ergab sich für die Mutante, daß Metaboliten wie
Nitrat und Aminosäuren und auch Malat, so fielen bei der Hauptversuchsreihe die
Wurzelkonzentrationen dieser Metaboliten in der Mutante im Vergleich zum Wildtyp deutlich
ab, während die Kohlenhydrate kaum reagierten, dies gilt für beide Gewebe. Der GesamtN-Status der Mutante stieg also im Sproßbereich im Vergleich zur Wurzel stark an. Es kam
also bei dieser Mutante zu einer Verschiebung des C/N-Verhältnisses gerade im
Wurzelbereich. Bei der Mangelbedingung traten die Hauptveränderungen nicht bei den
N-haltigen Metaboliten auf, sondern bei den Kohlenhydraten. Das C/N-Verhältnis verschob
sich damit in die entgegengesetzte Richtung im Vergleich zu den Gln-haltigen Bedingungen.
Jedoch zeigte die Mutante wie Ler eine Zunahme an Nitrat bei ansteigender externer
Diskussion
172
Nitratversorgung, während die Aminosäuren bei kaum reagierten bzw. bei hohen
Nitratkonzentrationen abnahmen.
Ebenfalls ungewöhnlich ist der hohe Methioninspiegel in der Niedrignitraternährung mit 1
mM Nitrat/4 mM Gln in der Mutante. Da sonst keine weiteren Veränderungen bei dieser
Bedingung auftraten und auch das Blühverhalten nach hinten verschoben war, sonst aber
keine weiteren Ungewöhnlichkeiten aufwies, muß dieser Wert als Artefakt betrachtet werden.
Dies wäre anders, wenn bei allen Blühverlaufskurven, die nach hinten verschoben waren, ein
deutlicher Anstieg des Methioninspiegels zu beobachten wäre, dies ließe einen Rückschluß
auf eine mögliche Signalwirkung zu.
4.3.3 fd – 1
fwa und fd auf Photoperioden. Diese Mutanten reagieren mit verzögerter Blühinduktion unter
Langtagbedingnungen und etwas verzögert unter Kurztagbedingungen . Sie werden deswegen
nach Simpson et al. (1999) in eine Subgruppe zum photoperiodisch gesteuerten Signalweg
gestellt, da die anderen Mutanten aus diesem Signalweg nur bei Langtagbedingungen mit
verzögerter Blühinduktion reagieren.
Die Mutante zeigte bei ansteigender Nitratkonzentration in Gegenwart von Gln eine
zunehmende Hemung der Blühinduktion. Alle Kurven begannen bei der Mutante deutlich
verzögert im Vergleich zum Wildtyp, es ergab sich somit für fd eine größere Nitratsensibilität
für
die
Blühinduktion,
wenn
Glutamin
anwesend
war.
Die
Verzögerung
der
Blühverlaufskurven bei Nitrat + Gln ging einher mit einer Zunahme an Blattzahl und
Biomasse, die vegetative Phase war in der Mutante deutlich verlängert im Vergleich zum
Wildtyp. Die verstärkte hemmende Wirkung von Nitrat trat in der Mutante hauptsächlich in
en Gln-haltigen Bedingungen auf. Die Kontrollbedingung mit 10 mM Nitrat ohne Gln fing
zwar um einige Tage versetzt an, endet aber fast zum gleichen Zeitpunkt wie die
entsprechende Bedingung mit Gln im Medium. Die Blühverlaufskurve für die
Mangelbedingung war bei der Mutante nur geringfügig nach hinten verschoben und endet
zum selben Zeitpunkt wie bei Landsberg erecta. Während beim Wildtyp Glutaminbeigabe zu
einem rascheren Wachstum führte, zeichnete sich bei der Mutante ein geringerer Effekt der
Glutaminbeigabe ab.
Diskussion
Die verstärkte Hemmung der Blühinduktion führte in dieser Mutante bei ansteigender
Nitratzufuhr in Gegenwart von Gln wie bei Blattzahl und Biomasse zu erhöhten
Sproß/Wurzel-Verhältnissen, dabei ergab sich wie im Wildtyp ein Antieg mit steigender
Nitratversorgung.
Der Nitratspiegel reagierte in der Mutante nicht anders als beim Wildtyp, ansteigende
Nitratkonzentrationen im Medium führen zu zunehmenden internen Nitratkonzentrationen.
Die Aminosäuren zeigten keine Veränderugen bei zunehmender externer Nitratversorgung
bzw. sanken bei hohen Nitratkonzentrationen leicht ab, dies gilt für Mutante und Wildtyp
gleichermaßen.
Der Malatspiegel sank hingegen in der Mutante in den beiden Bedingungen, die niedrige
Nitratkonzentrationen beinhalten, jeweils in der Wurzel ab, der Wildtyp wies dagegen
ähnliche Malatkonzentrationen in diesen Bedingungen wie in den anderen drei Ansätzen auf.
Die Abnahme der Gesamtaminosäuren beruhte nicht nur auf einer Veränderung der
Konzentrationen der N-speichernden Aminosäuren. Aspartat stieg sogar leicht an, während es
bei Asparagin zu einer Verschiebung des Gleichgewichtes von der Wurzel in Richtung Sproß
kommt. Glutamat reagierte nicht anders als bei Landsberg erecta, während Glutamin leicht
abnahm.
Auffällig ist, daß sich bei den Kohlenhydraten vor allem bei der Mangelernährung die
Konzentrationen verringerten, obwohl diese Bedingung sich in Blühverlauf und in den
Biomassedaten am wenigsten vom Wildtyp unterschied. Da aber alle vier Kohlenhydrate in
ihrer Konzentration abnahmen, ist bei dieser Bedingung das C/N-Verhältnis am stärksten
beeinflußt. Nichtsdestotrotz kommt es aber nicht zu einer Beeinflussung des Blühverhaltens.
4.3.4 fwa-1
fwa und fd reagieren beide auf Photoperioden. Diese Mutanten reagieren mit verzögerter
Blühinduktion unter Langtagbedingnungen und etwas verzögert unter Kurztagbedingungen .
Sie werden deswegen nach Simpson et al. (1999) in eine Subgruppe zum photoperiodisch
gesteuerten Signalweg gestellt, da die anderen Mutanten aus diesem Signalweg nur bei
Langtagbedingungen mit verzögerter Blühinduktion reagieren. Araki et al. (1998) erklären,
daß FWA wahrscheinlich keine positive oder fördernde Rolle bei der Regulation der
173
Diskussion
174
Blühinduktion hat. Eine Beteiligung von FWA könnte so aussehen, daß es die Aktivität von
blühfördernden
Signalwegen
oder
downstream-Komponenten
während
der
frühen
Entwicklung oder der frühen vegetativen Phase unterdrückt oder dagegen arbeitet. Zusammen
mit FD steht es in einer eigenen Subgruppe. Es agiert zusammen mit anderen Genen bei der
Regulation von Genen wie APETALA1. Es handelt sich um ein Protein, daß zu einer
Subfamilie von HD-ZIP-Homeodomänen-Proteinen gehört. Dabei handelt es sich um
Transkriptionsfaktoren, denen eine wichtige Rolle bei der Festlegung der Zellspezifizierung
nachgesagt wird (Soppe et al. 2000).
Diese Mutante zeigte in der Hauptversuchsreihe eine Abhängigkeit der Blühinduktion von der
externen Nitratkonzentration, wenn die Blühinduktion in Relation zur Zeit, zur Sproßgewicht
oder zur Blattzahl gesetzt wurde. Diese Abhängigkeit der Blühinduktion vom externen
Nitratangebot war in Mutante und Ler damit ähnlich. Die Kurven begannen teilweise 2
Wochen später als die vergleichbaren Kurven des Wildtyp und sie waren stärker
auseinandergezogen. Dasselbe Bild ergab sich, wenn man die beiden glutaminfreien
Bedingungen mit 0,5 mM und 10 mM Nitrat verglich. Dabei stieg die Blattzahl bei der
Mutante im Vergleich zum Wildtyp leicht an und die Biomassen reagierten bei fwa nur mit
einer geringen Zunahme, wenn das externe Nitratangebot anstieg. Daraus ergibt sich, daß die
verzögerte Blühinduktion bei den Bedingungen der Hauptversuchsreihe wahrscheinlich auf
einem leicht .verzögertem Wachstum beruhen.
Der interne Nitratgehalt zeigte bei dieser Mutante sehr niedrige Spiegel in der Wurzel, der
Sproß reagierte hingegen kaum anders als bei Ler. Damit kam es zu einem Anstieg des
internen Nitratspiegel parallel zum externen Nitratangebot.
Dafür stiegen die Kohlenhydrate bei fwa gerade in den Gln-haltigen Bedingungen stark an in
ihren Konzentrationen. Damit kam es zu einer Verschiebung des C/N-Verhältnisses in
Richtung des Kohlenstoffes. Die beiden Gln-freien Bedingungen zeigten in der Mutante keine
Veränderung in Bezug auf Nitrat, hier nahmen die Kohlenhydrate im Vergleich zu Ler ab,
sodaß sich das C/N-Verhältnis in Richtung von Stickstoff verschob. Gln hatte damit eine
starke Auswirkung auf den Kohlenhydratmetabolismus der Mutante.
Die Aminosäuren zeigten sich sich bei fwa kaum beeinflußt durch die Mutation im Vergleich
zu Ler. Bei Wildtyp und Mutante reagierten die Aminosäuren kaum auf das externe
Diskussion
175
Nitratangebot, insgesamt wies fwa aber in allen Bedingungen niedrigere Konzentrationen an
Aminosäuren auf, da die Mutantenpflanzen zum Erntezeitpunkt wesentlich älter waren als die
Ler-Pflanzen und damit mehr Aminosäuren verbraucht hatten. Arginin reagierte aber bei den
Gln-haltigen Bedingungen mit einem leichten Konzentrationsanstieg, während Ornithin
hingegen abnahm. Der Harnstoffzyklus zeigte sich bei der Mutante also verändert.
Bei
den
anderen
Aminosäuren
reagierte
Trypthophan
mit
einer
Erhöhung
der
Wurzelkonzentrationen bei allen Bedingungen, die Sproßwerte veränderten sich nur
geringfügig.. DieTrypthophandegradation führt in Richtung Auxinsynthese. Leider ergibt sich
aus den Daten nicht, ob hier ein Anstau
stattfindet, dann würde die Auxinproduktion
letztendlich herabgesetzt sein, oder ob der gesamte Shikimiweg verstärkt abläuft, was zu einer
höheren Auxinkonzentration führen würde. In diesem Fall würde das Signal aber aus dem
Wurzelbereich heraus wirken. Für das letztere spricht, daß auch die Konzentrationen der
anderen beiden Aminosäuren leicht ansteigen, wobei Tyrosin nur geringe Veränderungen
zeigt, bei Phenylalanin sind diese deutlicher.
4.3.5 fve-1
fve-1 ist als spätblühende Mutante beschrieben worden (Koornneef et al. 1991), dieser
Phänotyp kann durch Vernalisation, also durch längere Kälteeinwirkung, wobei die Samen
sich in einem feuchten Milieu befinden müssen, aufgehoben werden. Da die Platten im
vorliegenden System nur 5 Tage bei 4°C gelagert wurden, findet dadurch zwar eine
Synchronisation der Keimung statt, aber aufgrund der zu kurzen Kältebehandlung keine
Kältebeeinflussung der Entwicklung. Es ist wahrscheinlich nicht an der Phasenverschiebung
von vegetativ nach reproduktiv beteiligt (Martinez-Zapater et al. 1995). FVE könnte an der
Festlegung des Blühentwicklungsprogramms in den Lateralmersistems beteiligt sein
(Martinez-Zapater et al. 1995).
Alle Blühverlaufskurven waren wie bei den beiden zuvor besprochenen Mutanten im
Vergleich zu Ler verzögert. Dabei verliefen im Gegensatz zum Wildtyp alle drei Kurven mit
einer Kombination von Nitrat und Gln getrennt voneinander. Der Verzögerung der
Blühinduktion ging einher mit erhöhter Biomasse und Sproß/Wurzel-Verhältnis zum
Zeitpunkt der Blühinduktion. Auch die beiden Bedingungen ohne Gln waren nach hinten
Diskussion
176
verschoben in der Mutante, dabei änderten sich gerade für die 10 mM Nitrat-Bedingunge
ohne Gln die Biomassedaten kaum.
Die Veränderungen im externen Nitratgehalt wurden in den internen Nitratkonzentrationen
reflektiert. Die Mangelbedingung reagierte bei Mutante und Wildtyp ähnlich in Bezug auf
Nitrat, bei fve sanken jedoch die Kohlenhydratspiegel deutlich ab. Scheible et al. haben 1997
gezeigt, daß Nicotiana plumbaginifolia bei Mangelernährung entweder Stärke oder Nitrat
anhäuft. Die vorliegende Arbeit zeigt soweit, daß dies für Arabidopsis thaliana ebenfalls gilt
und grundsätzlich auf die Kohlenhydrate ausdehnen kann, zumindest für den gewählten
Erntezeitpunkt. Bei der hier besprochenen Mutante trat aber eine Ausnahmesituation ein, bei
einer Nitratzufuhr von 0,5 mM Nitrat sanken sowohl Nitrat als auch die Kohlenhydrate im
Vergleich zum Wildtyp deutlich ab. Es scheint so, daß bei der Mutante die Koordinierung der
verschiedenen Synthesewege blockiert ist. Um dies näher untersuchen zu können, wäre es
zum
einen
notwendig,
Enzymaktivitäten
der
Enzyme
aus
Nitrat-
und
Kohlenhydratstoffwechsel nachzuweisen, aber auch die Genexpression dieser Enzyme sollte
nachgewiesen werden.
Die Gesamtaminosäuren reagierten in der Mutante nicht anders als beim Wildtyp auf die
verschiedenen Nitratangebote. Dies spiegelt sich auch bei den einzelnen Aminosäuren bzw.
Aminosäuregruppen wieder. Bei den N-speichernden Aminosäuren stieg lediglich Aspartat
etwas in der Sproßkonzentration an und damit auch Lysin, welches sich von Aspartat ableitet.
Die anderen N-speichernden Aminosäuren reagierten nicht unterschiedlich als ber Landsberg
erecta, sie nahmen aber auch trotz einer verlängerten vegetativen Phase nicht ab, obwohl die
Biomasse anstieg.
Bei den anderen Aminosäuren kam es lediglich bei den aromatischen Aminosäuren zu
leichten Veränderungen. Trypthophan stieg dabei in den Bedingungen an, die nur Nitrat als
N-Quelle enthielten, während Phenylalanin in der Sproßkonzentration anstieg, sobald das
Medium beide N-Quellen, also Nitrat und Gln enthält. Wie bereits besprochen, führt der
Abbau von Trypthophan zu Auxin, das bekanntermaßen eine Signalwirkung bei der
Blühinduktion hat, während Phenylalanin-Degradation zu Zimtsäure und Vorstufen von
Lignin. Außerdem entstehen bei diesem Abbau Anthocyane, dabei handelt es sich um die
blauroten Blattfarbstoffe, und Tannine, das sind Stoffe mit Schutzfunktion.
Diskussion
4.3.6 fy-1
Auch fy-1 ist als spätblühende Mutante beschrieben worden, deren Phänotyp durch
Vernalisation aufgehoben werden kann. Diese Mutante wird dem konstitutiven Signalweg
zugeordnet. Zu dieser Mutante ist bisher nur bekannt, in welchen Signalweg der
Blühinduktion sie einzuordnen ist, eine weitere Charakterisierung hat bisher noch nicht
stattgefunden. Auch hier gilt dieselbe Einschränkung wie bei fve-1, die angewandte
Kältebehandlung dient nur der Synchronisation der Keimung, sie kann nicht als Vernalisation
betrachtet werden.
Die Mutante fy-1 reagierte im Gegensatz zu fve-1 viel stärker auf eine nitratgebundene
Kontrolle der Blühinduktion. Die drei Bedingungen, die Nitrat und Gln als N-Quellen
enthalten, zeigten eine sehr starke Abhängigkeit vom externen N-Spiegel. Hier kam es zu
einer sehr deutlichen Verzögerung der Blühinduktionskurven, wobei bereits die erste Kurve
mit nur 1 mM Nitrat/4 mM Gln schon leicht verzögert im Vergleich zum Wildtyp began.
Aufgrund der starken Verzögerung der Blühinduktion mit ansteigender Nitratkonzentration,
sofern Gln zusätzlich im Medium vorliegt, waren die beiden Kurven, die kein Gln enthalten,
im Vergleich zu Wildtyp in der Anordnung nach vorne verschoben, wobei auch sie zeitlich
nach hinten gelegt swaren. Die Kurve der Mangelbedingung lief hier noch vor der Kurve mit
überoptimalem Nitratangebot, and Blühen trat bei 0,5 mM Nitrat bei wesentlich niedrigerer
Blattzahl und Sproßbiomasse als bei 10 mM Nitrat auf.
Die Blattzahl und die Biomassen stiegen stark an, fy-1 ist auch bereits von Koornneef et al.
1997 als spätblühende Mutante charakterisiert worden. Die Verzögerung der Blühinduktion
ist noch auffallender, wenn die Blühzeiten für Ler und fy-1 auf der Basis von Sproßgewicht
oder Blattzahl miteinander verglichen werden.
Fazit: fy-1 zeigt Nitratsensivität bei der Blühinduktion. Die Daten deuten sogar an, , daß die
Blühinduktion bei fy-1 sogar stärker durch Nitrat beeinflußt wird als bei Ler.
fy-1 zeigt ebenfalls stärkere Veränderungen im Sproß/Wurzel-Verhältnis bei ansteigenden
Nitratkonzentrationen.
177
Diskussion
Auffallend war der erhöhte Nitratspiegel in den Bedingungen, die ausreichende bzw.
überoptimale Nitratversorgung beinhalten, dabei zeigte die Gegenwart oder Abwesenheit von
Gln keinen Einfluß. Dabei zeigte vor allem der Sproß jeweils eine Erhöhung des internen
Nitratspiegels, während der Anteil in der Wurzel absank. In den beiden Bedingungen mit
geringen externen Nitratkonzentrationen trat eher ein Absinken der Konzentration ein, hier
wurde der vorhandene N-Pool zu Aufbau von Biomasse und teilweise als Signalstoff genutzt.
Dies bedeutet, daß es unklar ist, ob die erhöhte Nitrathemmung des Blühens darauf beruht,
daß FY-1 antagonistisch zum Nitratsignal arbeitet, oder ob es sich um einen weniger direkten
Effekt handelt, daß fy-1 mehr Nitrat akkumuliert und sich damit ein stärkeres Signal von
Nitrat auf einem vorgegebenen externen Nitratgehalt ergibt. Da keine weiteren Daten zur
Verfügung stehen, ist das letztere die wohl beste Erklärung.
Bei dieser Mutante kam es beim Malatspiegel zu einer Umkehrung der Verteilung auf die
beiden Gewebe. Zeigte der Wildtyp in der Wurzel eine höhere Malatkonzentration als im
Sproß, zeigte sich bei dieser Mutante ein Verschieben der Malatkonzentration zum Sproß hin,
wobei die Unterschiede zwischen den beiden Geweben nicht sehr groß waren, Ob dies mit
einer veränderten Verteilung der Nitratassimilation oder anderen Vorgängen, die zur
Malatanhäufung führen könnten, zu tun hat, kann aus den vorhandenen Daten leider nicht
hergeleitet werden. Bei den Gesamtaminosäuren zeigte sich zunächst keine Beeinflussung,
jedoch kam es bei den einzelnen Aminosäuren teilweise zu erheblichen Verschiebungen.
Auch bei den Kohlenhydraten traten Veränderungen zwischen Wildtyp und Mutante bei den
einzelnen Bedingungen auf. Hatta sonst immer die Mangelbedingung die höchsten
Konzentrationen, so lagen sie bei dieser Mutante sehr niedrig bis auf Stärke, und das, obwohl
auch der Nitratspiegel sehr niedrig war. Grundsätzlich gilt, daß eine Pflanze entweder Nitrat
oder Stärke anhäuft, aber nicht beides (Scheible et al.. 1997a). Dies trifft jedoch nur für das
Sproßgewebe zu, die Wurzel wies kaum Stärke auf. Eine mögliche Erklärung für die anderen
niedrigen Kohlenhydratspiegel unter Mangelernährung mit 0,5 mM Nitrat könnte höchstens
sein, daß aufgrund des zeitlichen Alters die Pflanzen die Kohlenhydrate verbraucht hätten.
Betrachtet man jedoch die anderen Bedingungen, so ergibt sich hier überraschenderweise eher
eine Zunahme der Zuckerkonzentrationen, sogar Stärke stieg bei niedriger und optimaler
Nitratversorgung an. Waren bei Landsberg erecta die Zucker zum Zeitpunkt der Ernte sehr
niedrig bis auf die Bedingungen, die geringe Nitratkonzentrationen enthalten, so wies die
Mutante noch recht hohe Konzentrationen auf. Dies läßt den Schluß zu, das die Pflanze, was
178
Diskussion
179
ihren C-Status betrifft, zu früh die Blühinduktion eingetreten ist, auch wenn es sich zeitlich
gesehen um eine spätblühende Mutante handelt oder die Mutante verbraucht ihre
Kohlenhydrate nicht so rasch wie der Wildtyp.
Bei den N-speichernden Aminosäuren gab es einige Veränderungen, die jedoch kein Muster
erkennen lassen. Aspartat reagierte mit einer Gleichgewichtsverschiebung zugunsten des
Sproßes, die Anstiege bei Asparagin verliefen jedoch ungeordnet. Glutamat zeigte dasselbe
Verhalten wie Aspartat, währendhingegen Glutamin fast kaum reagierte. Der Gesamt-NStatus, der sich daraus ergibt, korreliert kaum mit dem Blühverhalten.
Auch bei den Aminosäuren der Photorespiration ergibt sich kein klares Bild. Glycin zeigte in
der Mutante keine Abhängigkeit von der externen Nitratkonzentration im Gegensatz zum
Wildtyp, währendhingegen Serin sowohl bei niedriger als auch bei überoptimaler
Nitratversorgung mit erhöhten Konzentrationen reagierte, Ler zeigt hingegen keine
Abhängigkeit vom externen Nitratangebot bei Serin. Da Serin die Vorstufe zu Cystein ist,
diese Aminosäure entsteht durch Acetylierung von Serin, ist davon auszugehen, daß auch
dieser Syntheseweg beeinflußt ist. Cystein war mit den gegebenen Meßmethoden jedoch
nicht zu erfassen, sodaß hier nur vermutet werden kann. Die Veränderungen sind bei Glycin
wesentlich niedriger als bei Serin. Glycin zeigt in der Mutante in allen Bedingungen sehr
ähnliche Konzentrationen im Gegensatz zu Ler, Serin hingegen zeigt in der Mutante eine
ungleichmäßige Verteilung in den verschiedenen Nitratbedingungen zeigt, beim Wildtyp
wiesen alle Bedingungen nahezu gleiche Konzentrationen auf.
Auch die aromatischen Aminosäuren reagierten bei der Mutante anders als im Wildtyp.
Trypthophan
reagierte
bei
niedriger
und
hoher
Nitratversorgung
mit
erhöhten
Konzentrationen vor allem in der Wurzel, aber die Mangelbedingung ist nicht verändert
gegenüber dem Wildtyp. Tyrosin stieg in allen Bedingungen an, während Phenylalanin im
Sproß mit steigender Nitratkonzentration zunahm, sofern das Medium noch zusätzlich Gln
enthielt. Trypthophan ist bekanntlich Vorläufer zu Auxin, während Tyrosin zu Plastochinon
und Tocopherol degradiert wird. Plastochinon ist an der Atmungskette beteiligt, während
Tocopherol zum Schutz von Membranlipiden, besonders ungesättigter Fettsäuren dient.
Phenylalanin ist Vorstufe von Lignin (Festigung der Zellwände), Anthocyane (blaurote
Farbstoffe, dienen zum Schutz vor UVB-Strahlung) und Tanninen (Fraßschutz).
Diskussion
Auch der Harnstoffcyclus ist verändert gegenüber dem Wildtyp. Die Argininkonzentrationen
stiegen in den Bedingungen an, die Nitrat und Gln zusammen enthielten. Arginin ist Vorstufe
zur Synthese von Ornithin, das wiederum zu Polyaminen metabolisiert wird.
4.4 ANR1
ANR1 wurde 1998 von Zhang & Forde näher charakterisiert als ein MADS-Box-Gen, daß
durch Nitrat induziert wird.. ANR1 wird dabei hauptsächlich oder ausschließlich in den
Wurzeln expremiert. ANR1 ist involviert im lokalen Stimulationseffekt von Nitrat auf die
Induktion von Lateralwurzeln und Transformanten mit einer verringerten Expression von
ANR1 zeigen eine geringerer Induktion von Lateralwurzeln als Antwort auf lokale
Nitratzufuhr.
Die Daten zeigen, dass die Blühinduktion in den Transformanten ebenfalls durch Nitrat
gehemmt ist und es gibt deutliche Hinweise, dass die Transformanten weniger empfindlich
auf Nitrat reagierten als C24. Die Blühverlaufskurven für A1 und S10 waren im Vergleich
zum Wildtyp nach hinten verschoben auf der Zeitskala und das Verhältnis von Blühverlauf in
Relation zu Sproßbiomasse oder Blattzahl war bei Transformanten und Wildtyp gleich
ausgeprägt. Obwohl es einen Trend zu leicht verzögerter Blühinduktion bei den
Transformanten mit verringerter ANR1-Expression gab, war dies nicht einheitlich. Es zeigt
sich am stärksten in den Plots, die den Blühverlauf gegen die Zeit aufgetragen enthalten (das
unzuverlässigste Parameter) und ebenso bei den Plots zur Blattzahl, sofern die Bedingungen
Glutamin enthalten, die Graphen zum Sproßgewicht geben keinen Hinweis auf eine
Verzögerung.
Fazit:
Die Daten geben keinen Hinweis, dass ANR1 an der Regulation der Blühinduktion durch
Nitrat beteiligt ist.
Die Mutation hatte jedoch eine Auswirkung auf das Sproß/Wurzel-Verhältnis (Abb. 4/1). Um
die Werte besser miteinander vergleichen zu können, wurden die Werte jeweils auf die 10
mM Nitrat-Bedingungen des Wildtyps normiert.
180
% Sproß/Wurzel-Verhältnis
Diskussion
181
150
100
50
0
1 mM Nitrat/
4 mM Gln
10 mM Nitrat/ 35 mM Nitrat/
4 mM Gln
4 mM Gln
C 24
ANR A 1
ANR S10
0,5 mM Nitrat
10 mM Nitrat
C 24
ANR A 1
ANR S 10
Abbildung 4/1: Dargestellt sind die Sproß/Wurzel-Verhältnisse von C24 und den beiden ANR-Genotypen A1 und
S10 in %. Für die Gln-haltigen Bedingungen wurde das Sproß/Wurzel-Verhältnis von C24 bei 10 mM Nitrat/4
mM Gln als Normierungsgrundlage gewählt, für die beiden Gln-freien Bedingungen das Sproß/WurzelVerhältnis von C24 bei 10 mM Nitrat.
Dabei zeigt sich, daß die beiden Genotypen ein verändertes Sproß/Wurzel-Verhältnis im
Vergleich zu ihrem Eltern-Wildtyp hatten. Bei niedriger bis ausreichender Nitratversorgung
stiegen dieSproß/Wurzel-Verhältnisse von A1 und S10 gegenüber C24 leicht an, solange
Glutamin als zusätzliche N-Quelle im Medium vorlagBei überoptimaler Nitratversorgung mit
35 mM Nitrat hingegen sanken die Verhältnisse aber stark ab im Vergleich zu C24. Bei A1
war dies vor allem auf eine geringere Sproßbiomasse im Vergleich zu C24 zurückzuführen,
während die Wurzelbiomasse bei A1 und C24 vergleichbar war,beiei S10 stiegen sowohl
Sproß- als auch Wurzelbiomasse gegenüber dem Wildtyp stark an. Beiden Genotypen ist
gemeinsam, daß sie in der Gln-freien Mangelbedingung ein höheres Sproß/Wurzel-Verhältnis
entwickeltnn als der Wildtyp, was auf eine geringere Wurzelmasse zurückzuführen ist.
Beide Genotypen zeigten bei ausreichender bzw. überoptimaler Nitratversorgung erhöhte
Nitratwerte in beiden Geweben, selbst bei der Mangelbedingung kam es zu einem geringen
Anstieg. Das die Bedingung mit 1 mM Nitrat/4 mM Gln kaum reagierte, hängt vielleicht mit
der reprimierenden Wirkung von Gln auf die Nitratreduktase zusammen. Dabei zeigte sich,
dass die veränderte Antwort des Sproß/Wurzel-Verhältnisses offensichtlich nicht durch die
Nitrataufnahme beeinträchtigt wurde. Tatsächlich zeigten die Transformanten bei hohen
externer Nitratversorgung ein niedrigeres Sproß/Wurzel-Verhältnis und niedrigere interne
Nitratspiegel als der Wildtyp. Dies geht einher mit der Tatsache, das ANR1 an der FeedbackInhibierung des Wurzelwachstums bei Nitratakkumulation in der Pflanze beteiligt ist.
Diskussion
182
Betrachtet man die Gesamtaminosäuren , so zeigten sich bei den beiden Transformanten keine
übereinstimmende Unterschiede zu C24.
Auch in den Malatspiegeln ergibt sich diese Unterschiedlichkeit, bei A1 lagen die Werte im
Bereich der Wildtyp-Werte, während bei S10 die Konzentrationen etwas anstiegen. Beiden
Genotypen ist jedoch gleich, daß vor allem in der Mangelbedingung die Wurzelwert weit
über den Wildtyp-Werten lagen, obwohl die Nitratwerte nur gering angestiegen sind.
Betrachtet man die Konzentrationen der einzelnen Kohlenhydrate, so zeigen sich bei den
reduzierenden Zuckern und bei Saccharose keine allzugroßen Unterschiede, während die
Stärkekonzentration im Sproß bei beiden Genotypen deutlich unter dem Vergleichswert lag,
während die Sproßwerte zur Bedingung mit 1 mM Nitrat/4 mM Gln gegenüber dem C24Wert ansteigen. Dies geht einher mit dem geringeren Nitratwert bei A1 und S10, Pflanzen
speichern entweder Nitrat oder Stärke, aber nicht beides (Scheible et al. 1997).
Bei den N-speichernden Aminosäuren reagierte
Aspartat in beiden Genotypen mit einer
Konzentrationszunahme im Sproß, Ausnahme ist hierbei die Mangelbedingung, Asparagin
zeigte hingegen keine einheitliche Veränderung in der Verteilung. War beim Wildtyp eine
leichte Tendenz zur Gehaltsabnahme im Sproßgewebe zu sehen, sofern das Medium Nitrat
und Gln enthielt, so zeigte sich bei A1 im selben Gewebe unter diesen Bedingungen sogar
eine leichte Zunahme. Da Aspartat und Glutamin zu Asparagin und Glutamat reagieren,
spiegelt Aspartat die Glutamat und Glutamin die Asparaginverteilung wieder, Insgesamt
stiegen diese N-speichernden Aminosäuren in ihren Konzentrationen leicht an, da auch Nitrat
als Ausgangsmaterial leicht angestiegen ist.
Beide Genotypen zeigten leichte Erhöhungen bei den Aminosäuren der Photorespiration. Dies
wäre damit erklärbar, das hier infolge eine etwas höheren Lichtintensität im Vergleich zu den
anderen Versuchsreihen (120 µE gegenüber 100 µE) es zusammen mit den Einwirkungen der
Mutation zu einer anderen Streßsituation kommt als bei der niedrigeren Lichtintensität. Hier
zeigt der Genotyp S10 sogar bei der Mangelbedingung erhöhte Konzentrationen, A1 reagierte
hier kaum.
Bei den aromatischen Aminosäuren kam es in Gegenwart von Gln zu veränderten Anteilen im
Vergleich zu Wildtyp. Trypthophan reagierte dabei in den beiden extremen Bedingungen mit
Diskussion
einem Anstieg der Konzentrationen. Die Rolle der aromatischen Aminosäuren ist bereits
zuvor mehrfach besprochen worden. Interressant ist dabei, daß A1 bei allen drei Aminosäuren
mit diesem Anstieg reagierte, was vielleicht als Streßsituation zu werten ist. S10 hingegen
reagierte nur schwach, obwohl es wie A1 in Bezug auf ANR-Expression am stärksten
reprimiert ist. Bei A1 wird diese Mutation wohl anders percepiert als bei S10.
Auch bei den aliphatischen Aminosäuren reagierte A1 bei den Nitrat und Gln enthaltenen
Bedingungen mit einer Konzentrationszunahme, S10 hingegen zeigte kaum andere Werte als
der Wildtyp.
Auch bei Lysin kam es bei A1 zu einer leichten Konzentrationssteigerung, bei Methionin und
Threonin hingegen stiegen die Werte in beiden Genotypen etwas an im Vergleich zu C24.
Arginin und Citrullin als Vertreter des Harnstoffcyclus sanken dagegen leicht ab, während
Ornithin Konzentrationszunahmen zeigte, die sich jedoch bei beiden Genotypen vollkommen
unterschieden. Beide zeigten ansteigende Spiegel der Aminosäure, die Verteilung ist aber
nicht equivalent zueinander. A1 reagierte mit einer Konzentrationsabnahme mit zunehmender
Nitratversorgung, wobei Gln keine Wirkung zeigt. Bei S10 kam es dagegen, sofern das
Medium Gln enthielt, eher zu einem leichtem Anstieg.
Beide Genotypen zeigen zwar einen ähnlich stark herunterregulierten ANR-RNA-Spiegel,
sind aber aus verschiedenen Ansätzen hervorgegangen, A1 aus einem antisense-Ansatz,
während S10 durch ein sense-Produkt heruntergeregelt wurde. Sie zeigen zwar in Bezug auf
Nitrat eine ähnliche Antwort, unterscheiden sich aber in einigen Inhaltsstoffen deutlich
voneinander. Sie weisen sehr unterschiedliche Malatspiegel auf, die aromatischen
Aminosäuren sind nicht miteinander vergleichbar und auch der Harnstoffzyklus weist
unterschiedliche Aminosäurespiegel bei beiden Genotypen auf. Diese Unterschiede könnten
zurückzuführen sein auf die unterschiedlichen methodischen Ansätze, mit denen die ANRExpression reprimiert wurde und könnten zu einer Modulation der Blühinduktion als Antwort
auf die verschiedenen Nitratbedingungen beitragen. Um dies genauer belegen zu können,
müßte jedoch zunächst bekannt sein, wie stark die Expression in den beiden
Transformantenlinien herrunterreguliert ist. Diese Angaben ergaben sich nicht aus der
Veröffentlichung von Zhang und Forde (1998).
183
Diskussion
4.5 Abschließende Diskussion
Nitrat ist zusammen mit Licht und Wasser einer der wichtigsten Bestandteile für das
Wachstum der Pflanze und kann dieses nachhaltig beeinflussen. Es ist nachgewiesen, daß die
Expression von Gegen des Nitrat- und Kohlenhydratstoffwechsels durch externes Nitrat
beeinflußt wird, die Synthese organischer Säuren, die als Gegenion bei der Assimilation von
Nitrat fungieren, wird induziert und auch das Sproß/Wurzel-Verhältnis wird durch die
Verfügbarkeit von Nitrat in der Umgebung der Pflanzenwurzel gesteuert (Scheible et al.
1997a,b).
Bisher ist jedoch noch nicht näher untersucht worden, in welchem Maße es die Blühinduktion
von Pflanzen beeinflußt. Die Einwirkung von Tageslänge, Lichtqualität, Vernalisation und
Verfügbarkeit von Nährstoffen in Form von Kohlenhydraten ist bereits hinlänglich untersucht
worden, nicht jedoch von Nitrat als einem essentiellen Nährstoff, den die Pflanze aus dem
Boden beziehen muß.
Aus den Ergebnissen, die in dieser Doktorarbeit präsentiert werden, kann man den Schluß
ziehen, daß Nitrat mit ansteigenden Konzentrationen eine hemmende Wirkung auf die
Blühinduktion hat, wobei der hemmende Effekt von Nitrat auf die Blühinduktion bei
Kurztagbedingungen deutlich sichtbar wird, während er mit zunehmender Tageslänge
überwunden wird. Interresanterweise wird der interne Nitratspiegel sehr stark vom externen
Nitratspiegel gesteuert, die Photoperiode hat nur eine untergeordnete Auswirkung auf den
Nitratgehalt.
Die Aminosäuren reagieren hingegen viel stärker auf die Photoperiode, auch diejenigen wie
Glutamin, Glutamat, Asparagin und Aspartat, die direkte Derivate des Nitratmetabolismus
sind.
Auf der anderen Seite werden die Konzentrationen der Kohlenhydrate sehr wohl durch das
externe Nitratangebot beeinflußt. Dieser Zusammenhang ergibt sich aus der Notwendigkeit
von C-Skeletten für die Metabolisierung des assimilierten Nitrates, das in Abwesenheit von
verfügbaren Kohlenhydraten auch in der pflanzlichen Vakuole gespeichert werden kann,
wenn z.B. Nitratassimilation oder Remobiliserung während der Dunkelphase auftritt. Diese
184
Diskussion
185
Verzögerung der Blühinduktion durch ansteigende Nitratkonzentrationen geht einher mit
zunehmden Biomassen, damit handelt es sich um eine Verlängerung der vegetativen Phase.
Diese Verlängerung der vegetativen Phase kann auf einer Modulierung des Blühstimulus oder
der Aktivität verschiedenster Gene beruhen, die an der Blühinduktion beteiligt sind. Die
chemische Natur des Blühstimulus ist bisher nicht bekannt, aber es wird davon ausgegangen,
daß er mehrere Komponenten umfaßt und das Kohlenhydrate daran beteiligt sind. Bei der
genetischen Steuerung der Blühinduktion in Arabidopsis thaliana hingegen ergibt sich
mittlerweile ein sehr komplexes Bild, daß im nachfolgenden Modell versucht wurde
darzustellen:
Grundsätzlich hat sich herausgestellt, daß Blühen ein „default“-Vorgang ist, der ohne weitere
Beeinflussung sofort nach dem Keimen eintreten würde. Damit ist zunächst die Aktivität
eines oder mehrerer Repressoren der Blühinduktion bzw. eines Promotors der vegetativen
Phase notwendig, damit die Arabidopsis-Pflanze zunächst wachsen und damit Biomasse
aufbauen kann, um danach in die reproduktive Phase überzugehen. Für die Hemmung der
Blühinduktion sind bei Arabidopsis thaliana Genprodukte der Gene wie Embryonic Flower
(EMF) oder Terminal Flower (TFL)
zuständig.
Bei emf-Mutanten tritt dabei die
Blühinduktion tatsächlich direkt nach der Keimung ein, nach Ausbildung zweier Kotyledonen
werden sofort Blütenstrukturen ausgebildet, bei tfl-Mutanten kommt es im Vergleich zum
Wildtyp zu einer verfrühten Blüte mit einer abnorm geformten Blüte. Die Blühinduktion
selbst beinhaltet mehrere Signalwege, den konstitutiven Signalweg, der unter allen
Umständen zur Blüte führt (man hat bisher keine Arabidopsis-Mutante gefunden, die nicht
irgendwann blüht), der Photoperiodengesteuerte Signalweg, der sowohl Tageslänge als auch
die Lichtqualität registriert und der Gibberrellingesteuerte Signalweg. Konstitutiver und
Gibberrellingesteuerter
Signalweg
zeigen
zudem
nach
eine
Beeinflussung
durch
Vernalisation, wobei die genaue Einordnung dieses Mechanismus in das Modell noch streitig
ist. In der vorliegenden Arbeit wurden aus dem konstitutiven Signalweg die fve- und fyMutanten getestet, aus dem Photoperiodengesteuerten Signalweg die fd-Mutante und die fwaMutante, wobei diese beiden Mutanten in eine Subgruppe gestellt werden. Alle Signalwege
führen zu einer Aktivierung von Floral Meristem identity Genen wie LFY und auch AG1,
diese wiederum aktivieren dann die Gene, welchen den Blütenaufbau kontrollieren.
Diskussion
Bei der Untersuchung der verschiedenen Mutanten hat sich gezeigt, daß keine Mutante unter
Nitrateinfluß anders reagiert als der Eltern-Wildtyp. Dies gilt sowohl für tfl, daß an der
Reprimierung der Blühinduktion beteiligt ist, wie auch für die getesten Mutanten aus dem
konstitutiven und aus dem photoperiodengesteuerten Signalweg. Auch das „ floral meristem
identity“-Gen lfy reagiert nicht anders als der dazugehörige Wildtyp Ler. Die beiden
Mutanten fve und fy aus dem konstitutiven Signalweg zeigen unter steigenden
Nitratkonzentrationen eine besonders starke Verzögerung der Blühinduktion, d. h., die
Nitratantwort wird durch die Mutation verstärkt. Auch fwa zeigt eine deutliche Verzögerung
der Blühinduktion mit zunehmender externer Nitratversorgung, während fd, das zusammen
mit fwa in einer Untergruppe des photoperiodisch gesteuerten Signalweges steht, schwächer
reagiert. Dem FWA-Genprodukt wird eine eher hemmende Beteiligung an der Blühinduktion
zugewiesen, dies wird durch den Einfluß von Nitrat noch verstärkt. LFY als floral meristem
identity-Gen reagiert kaum anders als der Wildtyp, Nitrat hat keinen Einfluß auf die Funktion
des Genproduktes. Blühen wird durch Stoffe, die von den Blättern abgegeben werden,
induziert. Diese Blühstimuli werden über das Phloem transportiert und gelangen damit auch
in die Wurzeln, wo sie modifiziert werden. Bei der Modifikation in der Wurzel könnte Nitrat
eine Rolle spielen, in diesem Pflanzenorgan findet die Assimilation statt. Dazu wurden
Pflanzen, die im ANR1-Gen mutiert sind, ebenfalls auf ihre Blühinduktion in Abhängigkeit
von der externen Nitratkonentration untersucht. Bei dem ANR1-Gen handelt es sich um einen
MADS-Box-Transkriptionsfaktor, der durch lokale Nitratgabe in seiner Expression induziert
wird und an der Entwicklung von Lateralwurzeln in Abhängigkeit von der externen
Nitratverfügbarkeit beteiligt ist. Fällt dieser Transkriptionsfaktor aus, so hat die Pflanze keine
Möglichkeit, bei niedriger Nitratversorgung Lateralwurzeln auszubilden, um über eine
vergrößerte aufnahmefähige Oberfläche mehr Nitrat zu erschließen. Die Mutantengenotypen
zeigten jedoch nur eine geringe Verzögerung der Blühantwort und auch die Abhängigkeit des
internen Nitratspiegels war nicht verändert gegenüber dem Eltern-Wildtyp. Die internen
Nitratspiegel stiegen bei geringen externen Nitratspiegeln sogar leicht an, obwohl die
Mutanten erwartungsgemäß niedrigere Biomassen als der Wildtyp zeigten, da sie aufgrund
der Mutation weniger Lateralwurzeln ausbilden konnten.
Betrachtet man die weiteren Ergebnisse der verschiedenen Blühmutanten, so zeigen einige
von ihnen Veränderungen in den Konzentrationen der aromatischen Aminosäuren, die im
Shikimisäureweg entstehen. Dieser Syntheseweg kommt bei Pflanzen, Bakterien und Pilzen
vor, nicht aber bei Tieren. Für diese sind damit die Aromaten essentiell, sie müssen sie mit der
186
Diskussion
Nahrung aufnehmen. Die aromatischen Aminosäuren sind Ausgangsstoff für viele
Metaboliten vor allem aus dem Sekundärmetabolismus, die wichtige Funktionen wie Schutz
vor Tierfraß haben. Von Phenylalanin leiten sich zum Beispiel die Phenylpropanoide ab,
wichtige Vertreter des Skundärmetabolismus. Einer der wichtigsten Metabolite, der sich von
Phenylpropanoid-Alkoholen ableitet, ist Lignin. Lignin ist wichtigster Bestandteil von
pflanzlichen Zellwänden, das sowohl mechanische Stützfunktion als auch Schutz vor Tierfraß
bietet.Phenylalanin ist aber auch Vorstufe für die Flavonoide. Zu diesen gehören auch die
Anthocyane, die blauroten Farbstoffe der Pflanze. Die Flavone bzw. Flavonole dienen dem
Schutz vor UVB-Strahlung, während die Isoflavonoide als Phytoalexine agieren, die bei
bakteriellem oder Pilzbefall synthetisiert werden. Tyrosin und Trypthophan bilden die
Vorstufe zu verschiedenen Alkaloiden wie Auxin, Codein, Morphin oder auch Strychnin.
Andere Aminosäuren, die in die Alkaloidsynthese eingehen sind Ornithin als Vorstufe für
Nicotin oder auch Lysin. Ornithin stammt dabei aus dem Harnstoffzyklus, während Lysin sich
von Aspartat ableitet.
Die Aminosäuren aus dem Harnstoffzyklus sind auch Vorstufen für Putrescin, das eine
blühfördernde Wirkung hat und Spermin bzw. Spermidin, die wachstumsfördernd wirken. Zu
den möglichen Auswirkungen ist bei den einzelnen Mutanten bereits eine Deutung gegeben
worden.
Vor allem fällt auf, das die Mangelbedingung zumindest in Bezug auf Blattanzahl und
Biomasse, aber auch bei den Metaboliten, meist am geringsten auf Mutationen reagiert. Auch
die Blühverlaufskurve wird teilweise weniger stark verschoben als die anderen Bedingungen.
Bei diesen Streßbedingungen kann Nitrat wahrscheinlich nicht mehr als Signalstoff agieren,
sondern wird nur als N-Quelle genutzt. Vermutlich gibt es eine Art Schwellenwert für Nitrat
als Signalstoff, der überschritten werden muß, damit eine nitratgesteuerte Antwort in der
Pflanze ablaufen kann.
Bei allen Mutanten führte Glutamin in Bezug auf die Zeitskala zu einer rascheren
Blühinduktion, dies beruhte jedoch nur auf einem etwas schnellerem Wachstum, und
Blattzahl und Sprossbiomasse zum Zeitpunkt der Blüte waren ähnlich zu denen von pflanzen,
die auf dem gleichen Nitratgehalt in der Abwesenheit von Glutamin angezogen wurden. Dies
bedeutet, daß keine der Mutanten eine veränderte Reaktion auf N-haltige Derivate im
Vergleich zum Wildtyp zeigte.
187
Diskussion
Bei den untersuchten Mutanten kam es in Abhängigkeit von der externen Nitratversorgung
nicht zu einer veränderten Blühinduktion im Vergleich zum jeweiligen Eltern-Wildtyp.
Jedoch sind nicht alle Signalwege, die an der Blühinduktion beteiligt sind, über verschiedene
Mutanten untersucht worden. Sowohl der Gibberrellingesteuerte (obwohl dieser indirekt
durch Gene wie FVE und FCA beeinflusst wird) als auch der Photoperiodengesteuerte
Signalweg könnten eine Beeinflussung durch Nitrat zeigen. Der Photoperiodengesteuerte
Signalweg enthält verschiedene Untergruppen, in einer Untergruppe reagieren die Mutanten
nur unter Langtagbedingungen mit verzögertem Blühen. Die gestesteten Mutanten fwa und fd
werden in eine eigene Untergruppe gestellt, da sie bei Langtagbedingungen mit verzögerter
Blühinduktion und bei Kurztagbedingung mit leicht verzögerter Blühinduktion reagieren.
Insgesamt ist es aber auch notwendig, neben der Metaboliten Genexpression oder auch
Enzymaktivitäten verschiedenster Proteine nachzuweisen, dazu gehören die Gene und
Enzyme aus der Nitratassimilation, aber auch aus dem Kohlenstoffmetabolismus. Es ist
gezeigt worden, dass Stärkemutanten eine verzögerte Blühinduktion aufweisen (siehe
Einleitung). Weitere Kanditaten wären die Gene und Enzyme aus der Putrescin-Synthese.
Putrescin hat laut Caffao & Vincente (1995) einen fördernden Effekt auf die Blühinduktion.
Die meisten Gene, die der Blühinduktion zugerechnet werden, sind regulative Proteine, z.B.
Transkriptionsfaktoren, die wiederum die Expression anderer Gene beeinflussen bzw. Signale
übermitteln.
Interressanter Kanditat für eine mögliche Steuerung der Blühinduktion durch Nitrat wäre z.B.
efl3, das als Zeitgeber für circadiane Rhytmik fungiert (Covington et al. 2001). Das NR einem
diurnalen Rhythmus unterliegt, ist von W.-R. Scheible erfolgreich in seiner Dissertation
untersucht worden. Um die Rolle von elf3 unter Nitrateinfluß zu ermitteln, wäre eine
Doppelmutante, die sowohl in NR als auch in elf3 mutiert ist, nützlich. Zur NR ist bekannt,
daß die NR ihren circadianen Rhythmus auch unter Dauerlichtbedingungen beibehält (Deng et
al. 1990), von elf3-Mutanten weiß man, daß Blattbewegungen und „circadian clock
regulated“ Genexpression unter Dauerlicht arythmisch sind. Aufgrund des Vergleichs von
Sequenzmustern kann davon ausgegangen werden, daß ELF3 wahrscheinlich als
Transkriptionsfaktor dient (Hicks et al. 2001). ELF3 agiert zusammen mit PHYB als
Blührepressor.
188
Diskussion
189
Ein weiterer Kanditat für eine mögliche Nitratsteuerung wäre aber auch emf1/2. Beide
Mutanten zeigen fast keine vegetative Pase, sondern beginnen nahezu sofort nach der
Keimung mit der Ausbildung einer Blüte. Würde Nitrat diesen Mutantenphänotyp aufheben,
so müßte es an der Regulation des sogenannten „Floral Repressors“ beteiligt sein, der
vielleicht von den EMF-Genen kodiert wird (Haughn et al. 1995, Martinez-Zapater et al.
1994, Sung et al. 1992). Dieser Repressor nimmt im Laufe der vegetativen Phase ab und
Nitrat könnte diese Degradation beeinflussen. Es ist jedoch davon auszugehen, daß sich keine
Nitratabhängigkeit für diese Mutante ergibt, da im allgemeinen die Mutantenscreens auf
Medien durchgeführt werden, die Nitrat enthalten.
Es hat sich gezeigt, daß der hemmende Effekt von Nitrat auf die Blühinduktion durch
Langtagbedingungen überwunden wird. Mutanten aus diesem Signalweg wie fwa und fd
zeigten jedoch keinen Verlust der Nitratsensitivität. Dies bedeutet, daß die Interaktion
zwischen Photoperioden-Wahrnehmung und Nitrat nicht darauf beruht, daß beide Faktoren in
einem Signalweg agieren, Vielmehr ist davon auszugehen, daß Nitrat über einen eigenen
Signalweg
agiert,
der
von
Signalen
aus
dem
Photoperioden-Signalweg
unter
Langtagbedingungen überwunden wird. Dabei ist zu beachten, daß die beiden Mutanten fwa
und fd zu einer Untergruppe gestellt werden. Es ist daher notwendig, weitere Mutanten aus
diesem Signalweg wie co oder gi zu testen, um festzustellen, ob die bisherigen Aussagen
grundsätzlich für diesen Signalweg gelten.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben keine Anhaltspunkte darüber, ob hohe
Nitratkonzentrationen die Blühinduktion hemmen oder niedrige Nitratkonzentrationen diese
fördern. Beides wäre möglich. Um dies wirklich festlegen zu können, müssten Mutanten mit
veränderter Nitratwahrnehmung auf Blühinduktion hin getestet werden. Tabak-Mutanten mit
verringerter NR-Aktivität (50% der Wildtyp-Aktivität) zeigen keine Veränderung im
Wachstum im Vergleich zum Wildtyp und wiesen ähnliche Aminosäurekonzentrationen wie
der Wildtyp auf (?)
Die Möglichkeit, das hohes oder niedriges Nitrat ein hemmendes bzw. förderndes Signal für
die Blühinduktion darstellt, beeinflusst die Planung und Interpretation der weiteren
Experimente. W.-R. Scheible hat in seiner Dissertation 1996 gezeigt, dass in WildtypPflanzen der Nitratgehalt gegen Ende der Nacht hoch ist und im Verlauf des Tages abfällt.
Daher sollten weitere Experimente mehrere Erntezeitpunkte über den Tag hinweg beinhalten,
um circadiane Rhythmen bestimmen zu können.
Diskussion
5.
Zusammenfassung
Nitrat spielt eine wichtige Rolle in der pflanzlichen Entwicklung und beeinflußt maßgeblich
die Biomasseallokation, das Sproß/Wurzel-Verhältnis und Enzymaktivitäten aus dem
Kohlenstoff- und Nitratassimilationsmetabolismus. Aufgrund dieser Faktoren ist auch eine
maßgebliche Rolle bei der Blühinduktion von Arabidopsis thaliana zu vermuten. Bei der
Blühinduktion spielen mehrere Signalwege zusammen, die zum einen verschiedene Faktoren
aus der Umgebung wie Tageslänge oder Temperatur registrieren. Aber auch interne Stoffe
wie Gibberrelline oder auch Kohlenhydrate haben durch ihre Verfügbarkeit einen Einfluß auf
die Blühinduktion. In der vorliegenden Arbeit hat sich gezeigt, daß es mit zunehmender
externer Nitraversorgung zu einer Verzögerung der Blühinduktion kommt, dies hat sich bei
verschiedenen frühblühenden Wildtypen gezeigt. Diese Reaktion wird durch die Länge der
Photoperiode moduliert, je kürzer die Photoperiode, desto stärker zeigt sich der Nitrateinfluß
auf die Blühinduktion. Der interne Nitratgehalt wird dabei fast ausschließlich vom externen
Nitratangebot gesteuert, nur sehr kurze Photoperioden von 8 h Licht führen zu einer
allgemeinen Absenkung der internen Nitratspiegel. Die Aminosäuren hingegen reagieren
hauptsächlich auf die Tageslänge und nicht kaum auf das externe Nitratangebot, die
Kohlenhydrate werden von beiden Faktoren beeinflußt. Es hat sich erwiesen, daß die
getesteten Mutanten, tfl1 als Blührepressor, , fwa und fd als Mutanten aus dem
Photoperiodengesteuerten Signalweg, fve und fy aus dem autonomen Signalweg und lfy als
Vertreter der „floral meristem identy“-Gene. keine veränderte Blühinduktion infolge
ansteigender Nitratkonzentrationen zeigten, sie reagieren wie der Wildtyp mit verzögerter
Blühinduktion bei ansteigenden Nitratkonzentrationen. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben
auch gezeigt, dass ANR1, ein MADS-Box-Transkriptionsfaktor, der an der Kontrolle der
Wurzelarchitektur durch Nitrat beteiligt ist nicht beteiligt ist an der Regulation der
Blühinduktion durch Nitrat.
Aus versuchstechnischer Hinsicht hat sich Glutamin als gute Ersatz-N-Quelle erwiesen, die
kaum einen Einfluß auf Biomasse oder wichtige Inhaltsstoffe wie Nitratspiegel oder
Kohlenhydrate zeigt. Damit ist möglich, auch bei niedrigen Nitratkonzentrationen die
Signalwirkung von Nitrat zu beobachten, ohne das dieses als N-Quelle verbraucht wird.
Glutamin und die sich daraus ergebenden Veränderungen in den nachfolgenden Aminosäuren
hatten keinen sichtbaren Effekt auf den zeitlichen Verlauf der Blühinduktion.
190
Abkürzungsverzeichnis
6.
191
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
adp1
ADP glucose pyrophosphorylase 1 (Arabidopsis-Gen)
Ala
Alanin
AP1
APETALA1 (Arabidopsis-Gen)
Asn
Asparagin
Asp
Aspartat
bzw.
beziehungsweise
C
Kohlenstoff
ca.
circa
cam 1
carbohydrate accumluation mutant 1 (Arabidopsis-Gen)
Col
Columbia
CO
CONSTANS (Arabidopsis-Gen)
CRY1 /2
CRYPTOCHROME 1/ 2
d. h.
das heißt
DNA
Desoxyribonukleinsäure (englisch)
E
Extinktion
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA
Ethylenglykol-bis-(ß-aminoethyl-)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure
EMF
EMBRYONIC FLOWER (Arabidopsis-Gen)
Fd
Ferredoxin
FG
Frischgewicht
Fru
Fruktose
GABA
γ-Aminobuttersäure
GAI
GIBBERRELLIN INSENSITIVE (Arabidopsis-Gen)
GI
GIGANTEA (Arabidopsis-Gen)
g
Gramm
Glc
Glukose
Gln
Glutamin
Glu
Glutamat
GOGAT
Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase
h
Stunde (englisch: hour)
(Arabidopsis-Gen)
Abkürzungsverzeichnis
Hepes
N-(-2-hydroxyethyl)piperazin-N’-(2-ethanolsulfonsäure)
HPLC
High-Performance liquid chromatography
192
(Hoch auflösende Flüssigkeitschromatographie)
LD
LUMINIDEPENDENS (Arabidopsis-Gen)
LHY
LONG HYPOCOTYL (Arabidopsis-Gen)
LFY
LEAFY (Arabidopsis thaliana-Mutante)
Ler
Landsberg erecta
M
Molar
MADS
zusammengesetzt aus: MCM1 / Agamous /Deficiens / fos , diese zuerst
identifizierten Transkriptionsfaktoren gehören zu den homeotischen
Genen und gaben dieser Gruppe von Genen ihren Namen
Mes
2-(N-Morpholino)ethanolsulfonsäure
min
Minute
ml
Milliliter
mM
Minimolar
mRNA
messenger- Ribonukleinsäure (englisch)
N
Stickstoff
n
Anzahl der Replikate pro Meßpunkt
NAD(P)(H)
Nicotinamid-adenin-dinukleotid-(phosphat)(reduziert)
NR
Nitratreduktase
pH
negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
pgm
phosphoglucomutase (Arabidopsis-Gen)
PHYA /PHYA
PHYTOCHROM A / B (Arabidopsis-Gen)
rpm
Umdrehungen pro Minute (englisch: rounds per minute)
sex1
starch excess 1 (Arabidopsis-Gen)
TFL1
TERMINAL FLOWER1 (Arabidopsis thaliana-Mutante)
U
Unit ( Einheit der Enzymaktivität, 1 U = 1 µmol umgesetztes
Substrat*min-1 = 1,67 * 10-8 katal)
UDP
Uridin-5’-diphosphat
UDP-Glc
Uridin-5’-diphosphoglukose
Upm
Umdrehungen pro Minute
UTP
Uridin-5’-triphosphat
w/v
Gewicht je Volumen
Abkürzungsverzeichnis
z.B.
193
zum Beispiel
Zu allen anderen Mutanten wurde nur die Abkürzung gefunden, sodaß der volle Name nicht
angegeben werden kann.
Dies betrifft folgende Mutanten: FCA, FVE, FT, FWA, FD, FY, FLD, VRN
Glutamin wird im Text als Gln abgekürzt.
Literarurverzeichnis
194
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Hiermit erkläre ich, daß ich diese Arbeit selbstständig
verfaßt und keine anderen als die von mir angegebenen
Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Ferner erkläre ich, daß ich nicht versucht habe, weder
An der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg noch an
einer anderen Universität eine Dissertation einzureichen
oder mich einer Doktorprüfung zu unterziehen.
Heidelberg, Februar 2002
Mein besonderer Dank gilt:
Herrn Professor Dr. Mark Stitt für die Überlassung des Themas, seine große
Diskussionsbereitschaft und seine motivierende Betreuung beim Fortgang der Arbeit.
Herrn Professor Dr. Thomas Rausch für die Übernahme des Korreferats.
Frau. Dr. A. Krapp für die erfolgte Betreuung.
Heike Weiner für Rat und Tat bei vielen technischen und auch persönlichen Fragen.
Regina Feil für die Unterstützung und vielen Tips bei den HPLC-Messungen.
Emilia Sancho-Vargas und Norbert Giermann für die netten Gespräche beim Mittagessen und
die gegenseitige Unterstützung.
Manuela und Inge für die Versorgung mit Kaffee.
Norbert, Tanja und Jolanta für die gute Stimmung im kleinen Labor.
Den Ökofuzzis für Hilfe in letzter Minute.
Den Mitgliedern der AG Stitt für die Atmosphäre im Labor.
Dem Thermalbad Heidelberg für die Möglichkeit, was gutes für meinen Rücken zu tun.
Meiner Mutter und dem Rest der Familie für die Unterstützung und den Rückhalt, den ich
manchmal sehr nötig hatte.
Und zum Schluß und ausnahmsweise mir selbst, daß ich diese Doktorarbeit tatsächlich zu
einem Ende gebracht habe.
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Thank you for your participation!

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