PMN-Elastase ELISA - IBL international

PMN-Elastase ELISA - IBL international
Arbeitsanleitung
PMN-Elastase ELISA
Enzymeimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von humanem PMN
Elastase in EDTA- oder Citrat-Plasma, Exsudat, Bronchiallavage, Liquor
und Seminalplasma.
BE59311
12x8
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
[email protected]
www.IBL-International.com
PMN-Elastase ELISA (BE59311)
1
1.1
DEUTSCH
EINLEITUNG
VERWENDUNG
Der PMN-Elastase ELISA ist ein Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von PMN Elastase in
EDTA- oder Citrat-Plasma, Exsudat, Bronchiallavage, Liquor und Seminalplasma.
1.2
ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG
Der menschliche Organismus reagiert auf Attacken durch eingedrungene Krankheitserreger (Mikroorganismen, Viren) oder auf absterbendes Gewebe (nach Unfällen oder Operationen) mit einer Entzündungsreaktion. Im Rahmen dieser Entzündungsreaktion spielen neutrophile Granulozyten als primäre Abwehrzellen
eine besondere Rolle. Sie werden durch verschiedene Mediatoren (Zytokine, Leukotriene, Komplementfaktoren, Bakterien-Endotoxine, Faktoren des Gerinnungs- und Fibrinolyse-systems) aus der Blutbahn angelockt und zur Beseitigung körperfremder Stoffe stimuliert.
Die neutrophilen Granulozyten benutzen Proteinasen, um diese körperfremden Stoffe oder Gewebetrümmer zu verdauen. Eine dieser Proteinasen ist die PMN Elastase, die in den azurophilen Granula der
polymorphkernigen (PMN) Granulozyten lokalisiert ist. Während dieses Verdauungsvorganges werden die
Enzyme auch partiell extrazellulär sezerniert.
Die extrazelluläre Aktivität der PMN Elastase wird durch Inhibitoren (v.a. durch den α1-Proteinase-Inhibitor =
α1-PI) reguliert. Bei starker Stimulation der Granulozyten und einer damit verbundenen übermäßigen Freisetzung der Elastase kann das Hemmpotential des α1- PI überschritten werden. Die nicht-inhibierte PMN
Elastase löst dann zusammen mit den gleichzeitig gebildeten Oxidantien (O2-Radikale, H2O2. OH-Radikale
etc.) Gewebeschäden aus. Da über das Blut und die Lymphgefäße jedoch α1-Proteinase-Inhibitor nachgeliefert wird, wird in der Zirkulation schließlich alle freigesetzte Elastase gebunden. Die Konzentration des
PMN Elastase/Inhibitor-Komplexes korreliert mit der Menge an freigesetzter PMN Elastase und ist somit ein
Maß für die Aktivität der Granulozyten im Entzündungsgeschehen.
Der Nachweis der PMN Elastase findet seinen Einsatz somit hauptsächlich zur Verlaufsbeurteilung bei
Trauma, Schock und Sepsis. Weitere Indikationsgebiete stellen die Bereiche Hämodialyse, Infektionen bei
Geburtshilfe, Gelenkerkrankungen, Ergüsse bei Sportverletzungen, Darmerkrankungen, Pankreatitis, zystische Fibrose und Adnexaffektionen des Mannes dar.
2
METHODIK UND TESTPRINZIP
Der vorliegende Test ist ein Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) zur quantitativen Bestimmung des
Komplexes aus humaner PMN Elastase und dem α1-Proteinase-Inhibitor (α1-PI) im Plasma. Die Festphase
ist mit einem ersten polyklonalen Antikörper gegen humane PMN Elastase (Antigen) beschichtet.
Standards, Kontrollen und Patientenproben werden in die mit Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte pipettiert. In der Probe vorhandene PMN Elastase bindet während der ersten 60-minütigen Inkubation an den
Antikörper, der an der inneren Oberfläche der Vertiefung gebunden vorliegt. Nicht gebundende Probenkomponenten werden durch einen Waschschritt entfernt.
Anschließend wird ein zweiter polyklonaler Antikörper zugegeben, der gegen α1-PI gerichtet und mit Meerrettichperoxidase markiert ist. Während einer 60-minütigen Inkubation wird der an den ersten Antikörper
gebundene PMN Elastase/α1-PI Komplex von dem enzymmarkierten Antikörper spezifisch erkannt und es
bildet sich ein Sandwich-Komplex aus. Überschüssiges Enzymkonjugat wird durch erneutes Waschen eliminiert.
Ein chromogenes Substrat, 3,3',5,5'-Tetra-Methyl-Benzidin (TMB) wird zugegeben. Während einer 20minütigen Inkubation wird das Substrat vom gebundenen Enzym zu einem farbigen Endprodukt (blau) umgesetzt. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von Salzsäure beendet (Farbumschlag blau → gelb). Die
Farbintensität ist zu der Konzentration an PMN Elastase in den Proben direkt proportional.
Die optische Dichte der Farblösung wird mit einem Mikrotiterplatten-Meßgerät bei 450 nm gemessen. Bichromatische Messung mit einer Referenzfilter-Wellenlänge im Bereich von 600 - 690 nm ist empfehlenswert.
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DEUTSCH
HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
1. Dieser Kit ist nur zum in vitro diagnostischen Gebrauch geeignet und sollte nur von medizinischem
Fachpersonal durchgeführt werden.
2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden.
3. Die Mikrotiterplate hat abbrechbare Streifen. Ungenutzte Wells müssen bei 2 °C bis 8 °C im verschlossenen Folienbeutel gelagert und im mit gelieferten Rahmen verwendet werden.
4. Das Pipettieren von Proben und Reagenzien muss so schnell wie möglich und in derselben Folge für
jeden Schritt durchgeführt werden.
5. Verwenden Sie Reservoire nur für einzelne Reagenzien. Dies gilt besonders für die Substratsreservoire.
Es kann sein, dass ein Reservoir welches zuvor für die konjugierte Lösung verwendet wurde, und nun
zur Abgabe einer Substratslösung verwendet wird, die, Lösung färbt. Keine Reagenzien zurück in die
Fläschchen geben, da es sonst zu einer kontamination der Reagenzien kommen kann.
6. Mischen Sie den Inhalt der Wells gründlich, um gute Testergebnisse sicherzustellen. Die Mikrowells
nicht wiederverwenden.
7. Die Wells während des Tests nicht austrocknen lassen; die Reagenzien sofort nach dem waschen zugeben.
8. Die Reagenzien vor Testbeginn auf Raumtemperatur (21-26 °C) bringen. Die Temperatur beeinflusst
die Messung des Absorptionsvermögens im Assay. Die Werte der Patientenproben werden dadurch jedoch nicht beeinflusst.
9. Nicht mit dem Mund pipettieren und den Kontakt von Kitbestandteilen und Proben mit Haut und
Schleimhäuten vermeiden.
10. In den Bereichen, in denen Proben oder Kitbestandteile verwendet werden, nicht rauchen, essen oder
Kosmetika verwenden.
11. Beim Umgang mit Proben oder Reagenzien Einweg-Latexhandschuhe tragen. Die Verunreinigung von
Reagenzien oder Proben mit Mikroben kann zu falschen Ergebnissen führen.
12. Der Gebrauch sollte gemäß der Vorschriften einer entsprechenden nationalen GefahrenstoffSicherheitsrichtlinie erfolgen.
13. Reagenzien nicht nach dem auf dem Kit-Etikett angegebenen Verfallsdatum verwenden.
14. Alle im Kit-Protokoll angegebenen Mengen müssen genau eingehalten werden. Optimale Ergebnisse
können nur durch Verwendung kalibrierter Pipetten und Mikrotiterplatten-Lesegeräte erreicht werden.
15. Komponenten von Kits mit unterschiedlichen Lotnummern nicht untereinander vertauschen. Es wird
empfohlen, keine Wells von verschiedenen Platten zu verwenden, auch nicht, wenn es sich um das
gleiche Lot handelt. Die Kits können unter anderen Bedingungen gelagert oder versendet worden sein,
so dass die Bindungscharakteristik der Platten leicht unterschiedlich ausfällt.
16. Kontakt mit der Stop Solution sollte vermieden werden, da sie Hautreizungen und Verbrennungen verursachen kann.
17. TMB-Substrat hat eine Reizwirkung auf Haut und Schleimhaut. Im Falle von möglichem Kontakt waschen die Augen mit einem reichlichlich Wasser und die Haut mit Seife und reichlichlich Wasser waschen. Kontaminierte Gegenstände vor dem Wiedergebrauch waschen. Wenn die Substanz eingeatmet
wurde, sofort an die frische Luft gehen.
18. Chemikalien und zubereitete oder bereits benutzte Reagenzien müssen gemäß den nationalen Gefahrenstoffvorschriften wie gefährlicher Abfall behandelt werden.
19. Information über die im Kit enthalten gefährlichen Stoffe finden sie im Sicherheitsdatenblatt.
20. Materialsicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf Anfrage direkt von der Firma IBL International erhältlich. Die Materialsicherheitsdatenblätter entsprechen den Verordnungen der EU-Richtlinie
2001/58/EC.
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DEUTSCH
KITBESTANDTEILE
4.1
MITGELIEFERTE KOMPONENTEN
MTP
Mikrotiterplatte, 12 x 8 (einzeln brechbare) Mikrotiterstreifen mit 96 Vertiefungen;
beschichtet mit polyklonalem Antikörper gegen humane PMN Elastase.
ENZCONJ
HRP-Konjugat, 1 Fl., 16 mL, gebrauchsfertig;
Enzym-markierter anti-α1 PI Antikörper, enthält polyklonalen Antikörper, markiert mit Meerrettichperoxidase
CAL LYO
Standard, 1 Fl. (2 µg), lyophilisiert;
in Serumpuffermatrix, enthält aufgereinigten PMN Elastase/α1-PI Komplex
Konzentrationen: 1000 - 500 - 250 - 125 - 62.5 - 31.3 und 15.6 ng/mL
siehe “Vorbereitung der Reagenzien”.
SUBS
Substrat-Lösung, 1 Fl., 22 mL, gebrauchsfertig
Tetramethylbenzidine (TMB).
WASHBUF CONC
Waschlösung, 1 Fl, 50 mL (10X konzentriert);
siehe “Vorbereitung der Reagenzien”.
SAMPLEDIL
Standard-/Probenverdünnungspuffer, 1 Fl., 50 mL, gebrauchsfertig
1.
2.
3.
4.
5.
6.
STOP
Stopp-Lösung, 1 Fl., 7 mL, gebrauchsfertig
enthält 2N Salzsäure
8. CONTROL LOW CONC
Kontrolle Low
7.
CONTROL HIGH CONC
Kontrolle High in Serum/Puffer-Matrix, 2 Fl., lyophilisiert;
Kontrollwerte und –bereiche entnehmen Sie bitte dem QC-Datenblatt.
siehe “Vorbereitung der Reagenzien”.
4.2
ERFORDERLICHE HILFSMITTEL
• Mikrotiter-Platten-Photometer mit optischem Filter für 450 nm
•
•
•
•
•
•
•
•
(optional mit Referenzwellenlänge von 600 - 690 nm)
Wirbelmischer (Vortex)
Mikrotiterplatten-Schüttler (350 – 400 rpm)
destilliertes Wasser
Messzylinder für 100 - 1000 mL
Plastikgefäße zur Aufbewahrung des Waschpuffers
Mikropipetten für 10 und 100 µL
variable Mikropipette für bis zu 1000 µL
Dispenser bzw. Mehrkanalpipette für 10 µL, 50 µL, 100 µL und 1000 µL
4.3
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
Standard:
Den lyophilisierten Standard mit 2 mL Standard-/Probenverdünnungspuffer 30 min. vor Gebrauch auflösen (Endkonzentration: 1000 ng/mL); Verdünnungsreihe ansetzen, um Standards mit 1000; 500; 250; 125;
62.5; 31.3 und 15.6 ng/mL zu erhalten.
Kontrollen:
Die lyophilisierten Kontrollen mit 1 mL Standard-/Probenverdünnungspuffer 30 min. vor Gebrauch auflösen.
Waschlösung:
Mit 450 mL dest. Wasser auf 500 mL auffüllen.
ACHTUNG: Zur Bestimmung der PMN Elastase in Seminalplasma ist ein separates Protokoll mit weiteren
Details zur Vorbereitung der Reagenzien in Kapitel 13 aufgeführt.
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4.4
DEUTSCH
LAGERUNG DER KOMPONENTEN
Bei einer Lagerung bei 2 °C bis 8 °C sind alle Komponenten bis zum angegebenen Verfallsdatum oder 30
Tage nach dem Öffnen haltbar.
Die Waschlösung ist bis zu 3 Monate nach der Verdünnung oder bis zum Verfallsdatum haltbar.
Lagern Sie die Standards und Kontrollen aliquotiert bei -20 °C, nach dem Auflösen sind diese 30 Tage oder
bis zum Verfallsdatum haltbar.
Schützen Sie die Mikrotiterplatte vor Feuchtigkeit. Zusammen mit dem Trocknungsmittel in dem verschließbaren Beutel aufbewahren.
Schützen Sie die TMB-Substrat-Lösung vor Licht.
5
PROBENENTNAHME UND –VORBEREITUNG
Die Bestimmung der PMN Elastase wird vor allem mit EDTA- oder Citrat-Plasma durchgeführt. Exsudate,
Bronchiallavage, Liquor und Seminalplasma kann ebenfalls verwendet werden. Zur Bestimmung der PMN
Elastase in Seminalplasma ist in Kapitel 13 (siehe Seite 26) ein separates Protokoll aufgeführt. Serum ist
nicht verwendbar, da Elastase während der Serumgewinnung aus PMN Zellen in-vitro freigesetzt werden
kann. Kulturüberstände sind auch nicht für die Verwendung geeignet; der Grund ist, dass der Test nur den
PMN Elastase/α1-PI-Komplex erfasst und normalerweise kein α1-PI in Kulturmedien vorhanden ist.
Die Plasmaproben werden vor der Messung 1:100 mit Standard-/Probenverdünnungspuffer verdünnt. Dazu
wird beispielsweise 10 µL Probe zu 990 µL Puffer gegeben.
Es ist keine Nüchtern-Blutentnahme oder spezielle Vorbehandlung erforderlich. Blut durch Venenpunktion
entnehmen, gerinnen lassen und das Serum durch Zentrifugation bei Raumtemperatur abtrennen. Plasmaproben können gekühlt bei 2 - 8 °C bis zu fünf Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 °C tiefgefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden.
Patientenproben, deren Konzentration an PMN Elastase höher als der höchste Kalibratorwert (1000 ng/mL)
liegen könnte, sollten vor der Abarbeitung im Standard-/Probenverdünnungspuffer vorverdünnt werden. Die
zusätzliche Verdünnungsstufe ist bei der Auswertung der Ergebnisse zu berücksichtigen.
6
TESTDURCHFÜHRUNG
6.1
ALLGEMEINE ANMERKUNGEN
-
Die Komponenten aus Testbestecken verschiedener Chargen nicht austauschen.
Alle Komponenten auf Raumtemperatur (18 – 28 °C) bringen.
Die als Konzentrat gelieferten Reagenzien müssen mindestens 30 Minuten vor Gebrauch auf ihre
Endkonzentration verdünnt werden. Gut mischen, aber Schaumbildung vermeiden.
Zum Vorlegen der Plasmaproben sollten Pipetten mit Einmalspitzen verwendet werden. Direkt auf
den Boden der Vertiefungen pipettieren. Für jede Probe die Spitzen wechseln, um Verschleppungen
zu vermeiden.
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1.
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3.
4.
5.
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8.
9.
10.
11.
12.
13.
6.3
DEUTSCH
TESTDURCHFÜHRUNG
Vorbereitung der Standards:
Sechs Röhrchen beschriften: G (500 ng/mL), F (250 ng/mL), E (125 ng/mL), D (62.5 ng/mL), C (31.3
ng/mL), and B (15.6 ng/mL). 0.5 mL des Standard-/Probenverdünnungspuffers in alle Röhrchen pipettieren. 0.5 mL des rekonstituierten PMN Elastase Standards in Röhrchen G (500 ng/mL) pipettieren
und sorgfältig mischen. 0.5 mL aus dem Röhrchen G (500 ng/mL) in Röhrchen F (250 ng/mL) pipettieren und sorgfältig mischen. Diesen Vorgang schrittweise bis zur kompletten 1:2 Verdünnungsreihe wiederholen. Der rekonstituierte PMN Elastase Standard dient als höchster Standard H (1000 ng/mL). Der
Standard-/Probenverdünnungspuffer dient als Null-Standard A (0 ng/mL).
Alle Patientenproben vor Testbeginn 1:100 mit Standard-/Probenverdünnungspuffer verdünnen. Dazu
10 µL Probe in einem Reagenzröhrchen vorlegen und 990 µL Standard-/ Probenverdünnungspuffer
hinzupipettieren. Standards und Kontrollen sind gebrauchsfertig und müssen nicht verdünnt werden.
Eine ausreichende Anzahl an Vertiefungen der Mikrotiter-Platte zum Ansatz von Standards, Kontrollen
und vorverdünnten Patientenproben in Doppelbestimmung vorbereiten.
Zur Bestimmung von PMN Elastase jeweils 100 µL Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung auf den Boden der Vertiefungen pipettieren.
60 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 28 °C) auf einem Schüttler (350 – 400 rpm) inkubieren.
Dekantieren und 4 mal jeweils mit 300 µL Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit sorgfältig durch
Ausklopfen der Platte entfernen.
150 µL Enzymkonjugat zu jeder Vertiefung zugeben.
60 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 28 °C) auf einem Schüttler (350 – 400 rpm) inkubieren.
Erneut dekantieren und 4 mal jeweils mit 300 µL Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit sorgfältig
durch Ausklopfen der Platte entfernen.
200 µL TMB-Substratlösung in jede Vertiefung pipettieren.
20 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 28 °C) im Dunkeln inkubieren.
50 µL Stopp-Lösung in jede Vertiefung pipettieren und vorsichtig mischen.
Optische Dichte bei 450 nm messen. Bi-chromatische Messung mit einer Referenz-filterwellenlänge im
Bereich von 600 - 690 nm ist empfehlenswert.
Die Färbung der Lösung ist mindestens 15 Minuten stabil. In dieser Zeit sollte gemessen werden.
AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
Zur Auswertung des PMN-Elastase ELISA ist eine 4-Parameter Logistik mit lin-log-Koordinaten für die optischen Dichte (lineare Achse) und für die Konzentration (logarithmische Achse) die Kurvenanpassung der
Wahl.
Eine geglättete Spline-Funktion mit lin-log- oder log-log-Koordinaten ist ebenso möglich.
6.4
AUSWERTUNGSBEISPIEL
Die folgenden Tabellen zeigen typische Meßwerte am Beispiel des PMN-Elastase ELISA. Die Daten dienen
nur der Illustration und sind nicht dazu bestimmt, die Ergebnisse eines anderen Testansatzes danach zu
berechnen.
Calibrator
OD (450 nm)
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Calibrator A
0.0 ng/mL
0.098
Calibrator B
15.6 ng/mL
0.187
Calibrator C
31.3 ng/mL
0.292
Calibrator D
62.5 ng/mL
0.441
Calibrator E
125 ng/mL
0.699
Calibrator F
250 ng/mL
1.231
Calibrator G
500 ng/mL
1.916
Calibrator H
1000 ng/mL
2.751
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DEUTSCH
NORMALWERTE
Im Rahmen einer Normbereichsstudie anhand von Blutspender-Plasmen (n = 57) wurden mit dem PMNElastase ELISA die folgenden Werte ermittelt:
Häufigkeitsverteilung von PMN Elastase
im Citrat-Plasma gesunder Blutspender (Median = 35 ng/mL, 95 % Percentile = 64.9 ng/mL)
Positive Ergebnisse sollten hinsichtlich der klinischen Situationen kontrolliert werden, wobei im individuellen
Einzelfall entschieden werden sollte, wann und wie eine Therapie notwendig erscheint. Es wird empfohlen,
daß jeder Anwender seinen eigenen Normalbereich bezüglich seines Patientenkollektivs festlegt. Die angegebenen Normalwerte dienen zur Orientierung.
8
TESTCHARAKTERISTIKA
8.1
SENSITIVITÄT
Die untere Nachweisgrenze wurde für PMN Elastase mit 0.2 ng/mL ermittelt.
8.2
SPEZIFITÄT
Der PMN-Elastase ELISA erfaßt nur humane PMN Elastase bzw. den PMN Elastase/α1-PI-Komplex.
8.3
REPRODUZIERBARKEIT
Nachfolgende Variationskoeffizienten (VK) wurden für die Intra-Assay-Varianz auf der Basis einer
10-fachen Bestimmung dreier Proben ermittelt; für die Inter-Assay-Varianz wurden die Ergebnisse aus 10
Assays für vier Proben herangezogen:
Intra-Assay
Probe Nr.
Mittelwert
(ng/mL)
1
2
3
80
241
358
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Inter-Assay
Variationskoeffizient VK
(%)
5.2
4.7
4.6
Probe Nr.
Mittelwert
(ng/mL)
1
2
3
4
128
216
346
681
Variationskoeffizient VK
(%)
5.7
6.4
4.4
5.7
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8.4
DEUTSCH
WIEDERFINDUNG
Dem Standard/Probenverdünnungspuffer wurden drei unterschiedliche Mengen PMN Elastase zugegeben
(922. 615 und 478 ng/mL). 50 µL jeder Lösung wurden zu je 950 µL drei verschiedener Plasmaproben von
Patienten hinzugefügt (Verdünnungsverhältnis von 1:20), um die Plasma-Matrix der Proben möglichst intakt zu
lassen. Alle Proben wurden dann mit dem PMN-Elastase ELISA gemessen.
Lösung
Probe
1
A
B
C
A
B
C
A
B
C
2
3
8.5
Gemessene
Konzentration
Erwartete
Werte
Wiederfindung
[%]
[ng/mL]
23.2
72.4
59.3
49.6
30.6
73.4
59.3
56.8
61.7
118.0
100.8
94.8
[ng/mL]
69.4
54.1
47.2
76.7
61.4
54.4
107.8
92.5
85.6
104
109
101
96
97
104
109
109
110
LINEARITÄT
In Verdünnungsexperimenten wurden Plasmaproben mit hohen PMN Elastase Konzentrationen unverdünnt
und verdünnt mit Standard-/Probenverdünnungspuffer getestet. Der Assay ist über den gesamten Messbereich linear.
Sample
No.
Verdünnungsfaktor
1
1:1
1:2
1:4
1:8
1:1
1:2
1:4
1:8
2
9
Gemessene
Konzentration
[ng/mL]
250.1
145.2
75.3
37.1
465.5
209.2
111.1
58.7
Erwartete
Werte
[ng/mL]
125.1
62.5
31.3
232.8
116.4
58.2
Wiederfindung
[%]
116
120
119
90
95
101
EFFEKTE VON BILIRUBIN UND HÄMOLYSE
Um unterschiedlich schwere Gelbsuchterkrankungen vorzutäuschen, wurden 100 bzw. 200 mg/l Bilirubin zu
vier Proben hinzugegeben. Alle Proben wurden pur und gespikt mit dem PMN-Elastase ELISA untersucht;
dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:
Probe
1
2
3
4
Unverdünnt
100 mg/L Bilirubin
200 mg/L Bilirubin
100
249
572
903
[ng/mL]
106
245
575
964
[ng/mL]
104
261
534
910
Die Ergebnisse zeigen, daß schwere Gelbsucht (bis zu 200 mg/L Bilirubin) den Test nicht beeinflußt.
Im Normalfall können hämolytische Proben eingesetzt werden. In Einzelfällen kann die Hämolyse zu einer
Erhöhung der Werte führen (gleichzeitiger Zerfall von Granulozyten in vitro).
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DEUTSCH
10 RECHTLICHE GRUNDLAGEN
10.1 ZUVERLÄSSIGKEIT DER ERGEBNISSE
Der Test muss exakt gemäß der Testanleitung des Herstellers abgearbeitet werden. Darüber hinaus muss
der Benutzer sich strikt an die Regeln der GLP (Good Laboratory Practice) oder andere eventuell anzuwendende Regeln oder nationale gesetzliche Vorgaben halten. Dies betrifft besonders den Gebrauch der Kontrollreagenzien. Es ist sehr wichtig, bei der Testdurchführung stets eine ausreichende Anzahl Kontrollen zur
Überprüfung der Genauigkeit und Präzision mitlaufen zu lassen.
Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn alle Kontrollen in den vorgegebenen Bereichen liegen, und wenn
alle anderen Testparameter die vorgegebenen Spezifikationen für diesen Assay erfüllen. Wenn Sie bezüglich eines Ergebnisses Zweifel oder Bedenken haben, setzen Sie sich bitte mit der Firma IBL in Verbindung.
10.2 THERAPEUTISCHE KONSEQUENZEN
Therapeutische Konsequenzen sollten keinesfalls nur aufgrund von Laborergebnissen erfolgen, selbst dann
nicht, wenn alle Testergebnisse mit den in 10.1. genannten Voraussetzungen übereinstimmen. Jedes Laborergebnis ist nur ein Teil des klinischen Gesamtbildes eines Patienten.
Nur in Fällen, in denen die Laborergebnisse in akzeptabler Übereinstimmung mit dem allgemeinen klinischen Bild des Patienten stehen, sollten therapeutische Konsequenzen eingeleitet werden.
Das Testergebnis allein sollte niemals als alleinige Grundlage für die Einleitung therapeutischer Konsequenzen dienen.
10.3 HAFTUNG
Jegliche Veränderungen des Testkits und/oder Austausch oder Vermischung von Komponenten unterschiedlicher Chargen von einem Testkit zu einem anderen, können die gewünschten Ergebnisse und die
Gültigkeit des gesamten Tests negativ beeinflussen. Solche Veränderungen und/oder Austausch haben den
Ausschluss jeglicher Ersatzansprüche zur Folge. Reklamationen, die aufgrund von Falschinterpretation von
Laborergebnissen durch den Kunden gemäß Punkt 10.2. erfolgen, sind ebenfalls abzuweisen. Im Falle jeglicher Reklamation ist die Haftung des Herstellers maximal auf den Wert des Testkits beschränkt. Jegliche
Schäden, die während des Transports am Kit entstanden sind, unterliegen nicht der Haftung des Herstellers.
11 LITERATUR
1.
2.
3.
4.
5.
Jochum M., Machleidt, W., Neuhof, H., and Fritz, H.
Proteinases. In: Schlag G, Redl H (eds), Pathophysiology of Shock, Sepsis, and Organ Failure. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1993: 46-60.
Jochum M., Machleidt, W., and Fritz, H.
Proteolytic Enzyme Systems. In: Schlag G, Redl H (eds), Pathophysiology of Shock, Sepsis, and Organ
Failure.
Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1993: 531-548.
Elastase
In: Thomas, L. (Hrsg.) Labor und Diagnose
Die Medizinische Verlagsgesellschaft, 4. Auflage, 1992: 795 - 801
Elastase, Elastase-α1-Proteinase Inhibitor Complex
In: Friedman, R.B., Young, D.S (Eds.) Effects of Disease on Clinical Laboratory Tests
AACC Press, Washington, 3rd Edition, 1997: 3-161
Reinhardt, A., Haidl, G., and Schill, W-B.
Granulocyte elastase indicates silent male genital tract inflammation and appropriate anti-inflammatory
treatment.
Andrologia 29, 1996: 187 – 192
Version 2-10/12
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DEUTSCH
12 KURZANLEITUNG
(alle Volumenangaben in µL)
MT-Platten-Well
A
ng/mL
0
B
C
D
E
F
G
H
15.6 31.3 62.5 125
250
500 1000
Kontrolle Probe
1/2
Schritte
Lösung
Pipettieren
Pipettieren
Standard
100
100
100
100
100
100
100
100
Kontrolle
-
-
-
-
-
-
-
-
100
-
Pipettieren
verdünnte
Probe
-
-
-
-
-
-
-
-
-
100
150
150
150
150
150
150
150
150
-
60 min bei RT auf einem Schüttler inkubieren
Dekantieren 4x mit 300 µL Wasch-lösung waschen
Pipettieren
EnzymKonjugat
150
150
60 min bei RT auf einem Schüttler inkubieren
Dekantieren 4x mit 300 µL Wasch-lösung waschen
Pipettieren
SubstratLösung
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
50
50
50
50
50
50
50
50
50
20 min bei RT im Dunkeln inkubieren
Pipettieren
StoppLösung
50
Messen bei λ = 450 nm
Vgl. auch 6. TESTDURCHFÜHRUNG für eine detaillierte Beschreibung der Durchführung.
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PMN-Elastase ELISA (BE59311)
DEUTSCH
13 PROTOKOLL FÜR SEMINALPLASMA
Ejakulat in Eppendorfgefäßen durch Zentrifugation (5 min) trennen.
Überstand abnehmen und das Seminalplasma gegebenenfalls bei –20°C einfrieren.
Vorbereitung der Standards und Kontrollen
1. PMN Elastase Standard mit 1 mL Standard-/Probenpuffer 30 min vor Gebrauch auflösen und
gut mischen. Dieser Standard H entspricht einer Konzentration von 2000 ng/mL.
Zur Lagerung portioniert bei –20°C einfrieren. Sechs Röhrchen beschriften, A-G.
Geometrische Verdünnungsreihe ansetzen. Dazu 0.5 mL Standard-/Probenpuffer in jedes Röhrchen vorlegen und 0.5 mL des Standards H in Röhrchen G (1000 ng/mL) pipettieren. Sorgfältig
mischen. 0.5 mL von G in F (500 ng/mL) pipettieren, mischen.
Den Vorgang bis zur Verdünnung 1:64 (Std. B, 31.3 ng/mL) fortführen.
G = 1000 ng/mL
F = 500 ng/mL
E=
250 ng/mL
D=
125 ng/mL
C=
B=
62.5 ng/mL
31.3 ng/mL
A=
0 ng/mL (Standard-/Probenpuffer)
2. Kontrollen mit 1 mL Standard-/Probenpuffer 30 min vor Gebrauch auflösen und gut mischen. Zur
Lagerung portioniert bei –20°C wegfrieren.
3. Die Seminalplasmen 1:100 mit Standard-/Probenpuffer verdünnen (z.B. 10 µL Seminalplasma +
990 µL Puffer)
4. Zur Bestimmung von PMN Elastase jeweils 100 µL Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung auf den Boden der Vertiefungen pipettieren.
5. 60 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 28 °C) auf einem Schüttler (350 – 400 rpm) inkubieren.
6. Dekantieren und 4 mal jeweils mit 300 µL Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit sorgfältig
durch Ausklopfen der Platte entfernen.
7. 150 µL Enzymkonjugat zu jeder Vertiefung zugeben.
8. 60 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 28 °C) auf einem Schüttler (350 – 400 rpm) inkubieren.
9. Erneut dekantieren und 4 mal jeweils mit 300 µL Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit sorgfältig durch Ausklopfen der Platte entfernen.
10. 200 µL TMB-Substratlösung in jede Vertiefung pipettieren.
11. 20 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 28 °C) im Dunkeln inkubieren.
12. 50 µL Stopp-Lösung in jede Vertiefung pipettieren und vorsichtig mischen.
13. Optische Dichte bei 450 nm messen. Bi-chromatische Messung mit einer Referenzfilterwellenlänge im Bereich von 600 - 690 nm ist empfehlenswert.
Die Färbung der Lösung ist mindestens 15 Minuten stabil. In dieser Zeit sollte gemessen werden.
Interpretation der Ergebnisse:
Befund
Messergebnis
keine Entzündung
0 - 250 ng/mL
mäßig gradige Entzündung
> 250 – 1000 ng/mL
massive Entzündung
> 1000 ng/mL
Positive Ergebnisse sollten hinsichtlich der klinischen Situationen kontrolliert werden, wobei im individuellen
Einzelfall entschieden werden sollte, wann und wie eine Therapie notwendig erscheint. Es wird empfohlen,
daß jeder Anwender seinen eigenen Normalbereich bezüglich seines Patientenkollektivs festlegt. Die angegebenen Werte dienen zur Orientierung.
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REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
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Χρησιµοποιείται από:
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CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
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LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance
and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These
cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit.
Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
Symbols Version 3.5 / 2012-01-20
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