PMN-Elastase ELISA Kit PMN
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase ELISA Kit
Zur in vitro Bestimmung der PMN-Elastase in Serum, Plasma,
Seminalplasma und Stuhl
PMN-Elastase ELISA Kit
For the in vitro determination of PMN-Elastase in serum, plasma,
seminal plasma and stool
Gültig ab / Valid from 03.01.2008
+ 8 °C
K 6840
+ 2 °C
96
Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, D 64625 Bensheim
Tel.: ++49 6251 70190-0
Fax: ++ 49 6251 849430
e.mail: [email protected]
www.Immundiagnostik.com
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
Inhalt / Content
1. Deutsch
2. English
Weitere Informationen zu unseren Produkten finden Sie auf unserer
Homepage
Additional information about our products is available on our homepage
www.immundiagnostik.com
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PMN-Elastase
1. VERWENDUNGSZWECK
Der hier beschriebene Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA) ist für
die quantitative Bestimmung von PMN-Elastase aus Serum, Plasma,
Seminalplasma und Stuhl geeignet. Nur zur in vitro Diagnostik.
2. EINLEITUNG
PMN-Elastase aus humanen polymorphkernigen Granulozyten ist ein Glykoprotein von 30 kDa und gehört zur Gruppe der Serinproteasen. Die Freisetzung aktiver PMN-Elastase erfolgt nach entsprechender Reizung aus den
azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten oder beim Zerfall dieser
Zellen. Die Bestimmung der PMN-Elastase aus Stuhl dient der Erfassung von
Entzündungsreaktionen mit Beteiligung neutrophiler Granulozyten. Insbesondere bei Morbus Crohn gehen die Entzündungsvorgänge mit einer
erhöhten Phagozytoseaktivität und dem Zerfall dieser Zellen einher und
führen somit zu einer gesteigerten Freisetzung der PMN-Elastase und
anderer lysosomaler Enzyme.
Indikationen
• Aktivitätsmarker bei Morbus Crohn
• Chronische Gelenkentzündungen
• Bakterielle Infektion, Sepsis
1
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PMN-Elastase
3. INHALT DER TESTPACKUNG
Artikel Nr.
Inhalt
Kit Komponenten
Menge
K 6840MTP
PLATE
Mikrotitermodul, vorbeschichtet
12 x 8
Vertiefungen
K 6840WP
WASHBUF
ELISA Waschpufferkonzentrat 10x
2 x 100 ml
K 6840EP
EXBUF
Extraktionspufferkonzentrat 2.5 x
2 x 100 ml
K 6840K
CONJ
Konjugat, Ziege anti- Maus-Antikörper,
Peroxidase-markiert, gebrauchsfertig
15 ml
K 6840A2
AB
Detektionsantikörper (2. Antikörper, Maus
anti-PMN-Elastase, monoklonal), Konzentrat
600 µl
K 6840ST
STD
Standard, lyophilisiert
4 vials
(Konzentrationsangabe der Spezifikation
entnehmen)
K 6840KO
CTRL
Kontrolle, lyophilisiert
(Konzentrationsbereich der Spezifikation
entnehmen)
4 vials
K 6840TMB
SUB
TMB Substrat (Tetramethylbenzidin),
gebrauchsfertig
15 ml
K 6840AC
STOP
ELISA Stopplösung, gebrauchsfertig
15 ml
4. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL
• Bidestilliertes Wasser (aqua bidest.)
• Laborwaage
• Präzisionspipetten und Pipettenspitzen für den Einmalgebrauch mit
variablen Volumina von 10 - 1000 µl
• Folie zum Abkleben der Mikrotiterplatte
• Mikrotiterplattenschüttler
• Multikanal- bzw. Multipipette
• Zentrifuge, 3000 x g
• Vortex-Mixer
• Laborübliche Glas- oder Plastikröhrchen (Einmalartikel)
• Mikrotiterplattenreader mit Filter 450 nm
2
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PMN-Elastase
5. VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN
• Bitte achten Sie bei mehrfachem Einsatz der Platte darauf, dass die
Reagenzien wie in der Vorschrift beschrieben gelagert werden und nur
die für den jeweiligen Ansatz benötigten Reagenzienmengen frisch
angesetzt werden (z. B. 2. Antikörper (AB) ist in der größten
Verdünnungsstufe nicht haltbar). Der Kit kann so bis zu 4 x je nach
Probenaufkommen innerhalb des angegebenen Verfallsdatums
verwendet werden.
• Reagenzien mit einem Volumen kleiner 100 µl sollten vor Gebrauch
kurz anzentrifugiert werden, um Volumenverluste zu vermeiden.
• Das Waschpufferkonzentrat (WASHBUF) muss vor Gebrauch 1:10 in
bidestilliertem Wasser (aqua bidest.) verdünnt werden (100 ml WASHBUF
+ 900 ml aqua bidest). Aufgrund der hohen Salzkonzentration in den
Stammlösungen kann es zu Kristallbildungen kommen. Die Kristalle
lösen sich im Wasserbad bei 37 °C auf. Das Pufferkonzentrat
(WASHBUF) kann bei 2-8°C bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum
aufbewahrt werden. Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8°C für
1 Monat in einem geschlossenen Gefäß haltbar.
• Das EXBUF (Extraktionspufferkonzentrat) muss vor Gebrauch 1:2,5 mit
bidestilliertem Wasser (aqua bidest.) verdünnt werden (90 ml Konzentrat
+ 135 ml aqua bidest.). Aufgrund der hohen Salzkonzentration in den
Stammlösungen kann es zu Kristallbildungen kommen. Die Kristalle
lösen sich im Wasserbad bei 37 °C auf. Das EXBUF (Extraktionspufferkonzentrat) kann bei 2-8°C bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum
aufbewahrt werden. Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 °C vier
Monate in einem geschlossenen Gefäß haltbar.
• Der Detektionsantikörper (2. Antikörper, AB, Maus anti-PMN-Elastase),
wird 1:20 in Waschpuffer verdünnt (z. B.: 500 µl 2. Antikörper in 9.5 ml
Waschpuffer). Der unverdünnte Antikörper (AB) kann bei
2-8 °C bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum aufbewahrt werden.
Verdünnte Antikörperlösung kann nicht aufbewahrt werden.
• Das Standardkonzentrat (STD) wird mit 0.5 ml bidestilliertem Wasser
rekonstituiert (siehe Produktspezifikation).
3
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PMN-Elastase
Aus dem Standardkonzentrat (S1) werden für die Eichkurve verdünnte
Standardlösungen wie folgt hergestellt (verdünnte Standardlösungen
sind nicht stabil):
S1
S2 = 200 µl S1 + 400 µl ELISA Waschpuffer
S3 = 200 µl S2 + 400 µl ELISA Waschpuffer
S4 = 200 µl S3 + 400 µl ELISA Waschpuffer
(Konzentrationsangabe der Spezifikation entnehmen)
Als 0 Standard wird ELISA Waschpuffer verwendet.
• Die Kontrolle (CTRL) wird mit 0,5 ml bidestilliertem Wasser
rekonstituiert
(siehe
Produktspezifikation).
Zur
vollständigen
Rekonstitution wird das Gefäß mit der Lösung mehrmals geschwenkt.
Rekonstituierte Standards und Kontrolle sind nicht stabil und
können nicht aufbewahrt werden.
• Alle anderen Testreagenzien sind bei 2-8 °C zu lagern und bei
entsprechender Lagerung bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe
Etikett) verwendbar.
6. PROBENVORBEREITUNG
Stuhlproben
Der Extraktionspuffer wird als Probenextraktionspuffer verwendet. Wir
empfehlen folgende Probenvorbereitung:
1. Es wird ein Stuhlaufarbeitungssystem (z. B. Probenvorbereitungssystem
der Fa. Roche Diagnostics/Mannheim (Best. Nr. 745 804)) verwendet, das
100 mg dosiert. In dieses Stuhlaufarbeitungssystem wird die Stuhlprobe in
5 ml Puffer suspendiert.
Puffervolumen konstant - 5 ml
Verdünnungsfaktor konstant - 1:50
2. Alternativ kann eine Stuhlprobenmasse im Bereich von 80 - 120 mg
manuell eingewogen werden. Bitte die exakte Menge für jede Probe
notieren!
4
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PMN-Elastase
a. Jede einzelne Probe wird in 5 ml Puffer unabhängig von der
eingewogenen Menge suspendiert.
Puffervolumen konstant - 5 ml
Verdünnungsfaktor variabel
Der Verdünnungsfaktor ändert sich entsprechend der folgenden Tabelle
und muss bei der Auswertung berücksichtigt werden:
Einwaage
[mg]
Verdünnungsfaktor
Einwaage
[mg]
Verdünnungsfaktor
80
62.5
102
49.0
82
60.9
104
48.1
84
59.5
106
47.2
86
58.1
108
46.3
88
56.8
110
45.5
90
55.6
112
44.6
92
54.3
114
43.9
94
53.2
116
43.1
96
52.1
118
42.4
98
51.0
120
41.6
100
50
b. Die Puffermengen für die einzelnen Proben variieren in Abhängigkeit
von den Stuhleinwaagen (siehe Tabelle). Dabei bleibt der Verdünnungsfaktor konstant.
Puffervolumen variabel
Verdünnungsfaktor konstant - 1:50
Somit kann der Verdünnungsfaktor für die Auswertung aller Proben
einheitlich verwendet werden.
Puffervolumen variabel
Verdünnungsfaktor konstant - 1:50
Somit kann der Verdünnungsfaktor für die Auswertung aller Proben
einheitlich verwendet werden.
5
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PMN-Elastase
Einwaage
[mg]
Puffervolumen
[ml]
Einwaage
[mg]
Puffervolumen
[ml]
80
4.0
102
5.1
82
4.1
104
5.2
84
4.2
106
5.3
86
4.3
108
5.4
88
4.4
110
5.5
90
4.5
112
5.6
92
4.6
114
5.7
94
4.7
116
5.8
96
4.8
118
5.9
98
4.9
120
6.0
100
5.0
Anschließend wird die Stuhlsuspension mit dem Puffer gut gemischt (z. B.
Vortexer für mindestens 30 sec. je nach Stuhlkonsistenz).
Danach wird ca. 1 ml von der Suspension in ein verschließbares Einweggefäß (z. B. von Eppendorf) überführt und für 5 Minuten bei 13000 rpm ( =
13000 g) zentrifugiert. 100 µl des Überstandes werden im Test pro
Vertiefung eingesetzt.
Die Stuhlsuspension ist nicht haltbar. Wir empfehlen für jeden Ansatz die
Probe frisch einzuwiegen.
Seminalplasma
Das Plasmamaterial sollte bei -20°C gelagert und direkt vor der Testdurchführung aufgetaut werden.
Nach dem Auftauen werden die Seminalplasmen 5 Minuten bei 10000 rpm
zentrifugiert. Die Seminalplasmen müssen vor dem Einsatz im Test - in
Abhängigkeit des Entzündungszustandes des Patienten - 1:10 bis 1:20 in
Waschpuffer verdünnt werden.
Serum- und Plasmaproben
Präanalytik
Bei den Untersuchungen von Plasma oder Serum können sich die
ermittelten PMN-Elastasewerte deutlich unterscheiden z. B. bis zu 10-fach
höhere Serumwerte im Vergleich zu den Plasma Konzentrationen. Die
Ursachen dafür sind:
6
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PMN-Elastase
Im Serum werden während des Gerinnungsprozesses die Granulozyten zur
kompletten Freisetzung der Granulozyten-Aktivierungsmarker angeregt. Die
Standzeit der Proben sowie wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen führen
zu keiner Werteverschiebung.
Anders im Plasma, je länger die Probe vor dem Zentrifugationsschritt steht
und je mehr Einfrier- und Auftauzyklen die Probe durchlebt umso höhere
PMN-Elastase Konzentrationen werden ermittelt. Bei Verwendung von
Plasma muss die Präanalytik konstant sein. Das gilt generell und unabhängig
von dem verwendeten Testsystem.
Immundiagnostik empfiehlt daher zur Bestimmung der PMN-Elastase
Konzentration Serum zu verwenden.
Frisch abgenommenes Blut wird innerhalb einer Stunde abzentrifugiert. Es
wird entweder am gleichen Tag im Test eingesetzt oder bei -20°C gelagert.
Lipämische oder hämolysierte Proben können zu fehlerhaften Ergebnissen
führen. Vor dem Einsatz im Test Proben gut mischen. Wir empfehlen, alle
Werte in Doppelbestimmungen zu ermitteln.
Serumproben müssen vor dem Einsatz im Test 1:500 mit Waschpuffer
verdünnt werden.
Plasmaproben müssen vor dem Einsatz im Test 1:100 mit Waschpuffer
verdünnt werden.
7. TESTDURCHFÜHRUNG
Testprinzip
Im ersten Inkubationsschritt wird PMN-Elastase aus den Proben von einem
immobilisierten Schaf-anti-PMN-Elastase-Antikörper gebunden. Es folgt ein
Waschschritt um alle ungebundenen Probenkomponenten zu entfernen.
Beim zweiten Inkubationsschritt wird ein monoklonaler Maus anti-PMNElastase-Antikörper dazu pipettiert, der sowohl die freie als auch die mit
ihrem spezifischen Inhibitor (α1-Proteinaseinhibitor=α1-Antitrypsin)
komplexierte PMN-Elastase Form erkennt. Die Quantifizierung erfolgt mit
Hilfe eines anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugates. Als Peroxidasesubstrat
wird Tetramethylbenzidin (TMB) eingesetzt. Die entstandene chromogene
Verbindung wird photometrisch bei 450 nm gemessen. Die Intensität der
Farbe ist dem PMN-Elastase-Gehalt direkt proportional. Parallel dazu wird
eine Kalibrationskurve – Optische Dichte (Absorption bei 450 nm) versus
Standardkonzentration erstellt.
7
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PMN-Elastase
Pipettierschema
1.
Im Test dürfen nur Reagenzien und Proben verwendet werden, welche
Raumtemperatur (18-26°C) aufweisen
2.
Positionen für STD (Standard)/PROBE/CTRL (Kontrolle) in
Doppelbestimmung am Protokollblatt markieren
3.
Benötigte PLATE (Mikrotiterstreifen) aus dem Kit nehmen. Nicht
verwendete Mikrotiterstreifen können abgeklebt bis zum angegebenen
Ablaufdatum gelagert werden.
4.
Mikrotiterstreifen 5x mit je 250 µl verdünntem Waschpuffer waschen.
Nach dem letzten Waschschritt Reste von Waschpuffer durch
Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen
5.
100 µl STD /PROBE/CTRL in Doppelbestimmung in die
Mikrotiterstreifen pipettieren.
6.
Streifen abdecken und 1 Stunde bei Raumtemperatur (18-26°C) unter
Schütteln inkubieren
7.
Inhalt der Wells verwerfen und 5x mit je 250 µl verdünntem
Waschpuffer waschen. Nach dem letzten Waschschritt Reste von
Waschpuffer durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen
8.
100 µl AB (Detektionsantikörper /2.Antikörper) in alle Wells pipettieren
8
Arbeitsanleitung/Manual
9.
PMN-Elastase
Streifen abdecken und 1 Stunde bei Raumtemperatur (18-26°C) unter
Schütteln inkubieren
10. Inhalt der Wells verwerfen und 5x mit je 250 µl verdünntem
Waschpuffer waschen. Nach dem letzten Waschschritt Reste von
Waschpuffer durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen
11. 100 µl CONJ (Konjugat) in alle Wells pipettieren
12. Streifen abdecken und 1 Stunde bei Raumtemperatur (18-26°C) unter
Schütteln inkubieren
13. Inhalt der Wells verwerfen und 5x mit je 250 µl verdünntem
Waschpuffer waschen. Nach dem letzten Waschschritt Reste von
Waschpuffer durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen
14. 100 µl SUB (Substrat) in alle Wells pipettieren
15. 5 - 20 Minuten bei Raumtemperatur (18-26°C) im Dunkeln inkubieren
16. 50 µl STOP (Stopplösung) in alle Wells pipettieren, mischen
17. Extinktion sofort im Mikrotiterplattenphotometer bei 450 nm gegen
die Referenzwellenlänge 620 nm (oder 690 nm) messen. Falls die
Extinktion des höchsten Standards den Messbereich des Photometers
übersteigt, sollte sofort bei 405 nm gegen 620 nm (690 nm) gemessen
werden.
9
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PMN-Elastase
8. ERGEBNISSE
Zur Auswertung des Tests empfehlen wir:
1. 4-Parameter-Funktion
Für die optische Dichte empfehlen wir eine lineare Ordinate und für
die Konzentration eine logarithmische Abszisse (bei einer
logarithmischen Abszisse muss für den Standard mit der
Konzentration von 0 ein Wert kleiner 1 eingegeben werden z. B. 0.01).
2. Punkt-zu-Punkt-Auswertung
Für die optische Dichte und für die Konzentration empfehlen wir eine
lineare Ordinate bzw. Abszisse.
3. Gewichtete Spline-Funktion
Für die optische Dichte empfehlen wir eine lineare Ordinate und für
die Konzentration eine logarithmische Abszisse (bei einer
logarithmischen Abszisse muss für den Standard mit der
Konzentration von 0 ein Wert kleiner 1 eingegeben werden z. B. 0.01).
Vor jeder automatischen Auswertung sollte stets eine Kontrolle der
Doppelwerte auf Plausibilität („Ausreißerkontrolle“) durchgeführt
werden; falls dies nicht durch das verwendete Programm erfolgt,
sollte die Kontrolle manuell durchgeführt werden.
Stuhlproben:
Die ermittelte PMN-Elastase Konzentration der Stuhlprobe wird auf Grund
der Probenvorbereitung wie im folgendem Beispiel berechnet:
Probenvorbereitung 1 und 2b:
Verdünnungsfaktor konstant:
50
Die ermittelte PMN-Elastase Konzentration wird mit 50 multipliziert um die
tatsächliche Konzentration im Stuhl zu bestimmen.
Probenvorbereitung 2a:
Der Verdünnungsfaktor ist variabel.
Der entsprechende Verdünnungsfaktor jeder Probe wird der Tabelle
entnommen und mit der ermittelten PMN-Elastase Konzentration
multipliziert.
Seminalplasma:
Der ermittelte PMN-Elastase-Wert wird je nach gewählter Verdünnung bei
der Probenvorbereitung mit 10 oder 20 multipliziert um die tatsächliche
Konzentration zu bestimmen.
10
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
Serumproben:
Der ermittelte PMN-Elastase-Wert wird mit 500 multipliziert um die
tatsächliche Konzentration zu bestimmen.
Plasmaproben:
Der ermittelte PMN-Elastase-Wert wird mit 100 multipliziert um die
tatsächliche Konzentration zu bestimmen.
9. EINSCHRÄNKUNGEN
Proben mit hohen PMN-Elastase Konzentrationen, die außerhalb der
Standardkurve liegen, sollten mit Waschpuffer stärker verdünnt und
nochmals bestimmt werden.
Das Vorliegen erhöhter PMN-Elastase-Konzentrationen im Seminalplasma
unterstützt die Diagnose einer akuten bzw. chronischen Adnexitis. Bei
gleichzeitig bestehender Urethritis anterior ist der Befund jedoch nicht
verwertbar, da eine Kontamination des Ejakulats mit Granulozyten
unvermeidbar ist. Eine eventuell vorliegende Urethritis anterior, die in der
Regel leicht diagnostizierbar ist, muss daher ausgeschlossen oder behandelt
werden bevor die PMN-Elastasebestimmung im Seminalplasma zu Aussagen
über eine vorhandene Adnexitis herangezogen wird.
10. QUALITÄTSKONTROLLE
Wir empfehlen die Kontrollen (wenn vorhanden auch externe) bei jedem
Testansatz mitzumessen. Die Ergebnisse der Kontrollen müssen auf
Richtigkeit überprüft werden. Liegen eine oder mehrere Kontrollen
außerhalb des angegebenen Bereiches, kann Immundiagnostik die
Richtigkeit der Proben nicht gewährleisten.
Erwartete Ergebnisse
Normwerte:
(1 g Stuhl entspricht 1ml)
PMN-Elastase-Konzentration im Stuhl gesunder Personen (n=76):
< 62ng/ml
PMN-Elastase-Konzentration im Plasma gesunder Personen (n=37):
19–78ng/ml
PMN-Elastase-Konzentration im Serum gesunder Personen (n = 52):
Mittelwert = 688ng/ml (186 – 1991ng/ml)
Wir empfehlen jedem Labor einen eigenen Normwertbereich zu etablieren.
11
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
11. TESTCHARAKTERISTIKA
Präzision und Reproduzierbarkeit
Intra-Assay (n=20)
Probe
PMN Elastase
[ng/ml]
Vk
[%]
1
2.3
14
2
0.72
4.5
Probe
PMN Elastase
[ng/ml]
Vk
[%]
1
4.9
4
2
27.8
10
Inter-Assay (n=20)
Wiederfindung
Verschiedene Proben wurden mit unterschiedlichen
Standardmengen versetzt und gemessen.
Probe
[ng/ml]
1.5
0.75
PMN-Elastase
Standard
[ng/ml]
PMN-Elastase
erwatet
[ng/ml]
PMN-Elastase
gemessen
[ng/ml]
3
4.5
4.9
6
7.5
7.7
5
5.8
5.7
1.65
2.4
2.7
0.65
1.4
1.5
12
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
Sensitivität
Der Null-Standard wurde mehrfach (n=20) vermessen. Von der ermittelten
Optischen Dichte wurde der Mittelwert und die Standardabweichung
berechnet. Die Nachweisgrenze wurde festgelegt als Null-Standard + 2
Standardabweichungen.
Probe
Blank
PMN-Elastase
Mittelwert
[OD]
Standardabweichung
0.025
0.024
Nachweisgrenze
[ng/ml]
0.12
Kreuzreaktivität
Es wurde keine Kreuzreaktivität zu anderen Plasmaproteinen im Stuhl
gefunden.
Es wurde Kreuzreaktivität mit PMN-Elastase bzw. eine gute Korrelation zum
PMN-Elastase-Gehalt im Mausserum gefunden.
Linearität
Zwei Proben mit bekannter PMN-Elastase Konzentration wurden seriell
verdünnt und vermessen. Gegenübergestellt sind die erwartete
(berechnete) und die gemessene PMN-Elastase Konzentration.
Probe
Verdünnung
Erwartet
[ng/ml]
Gemessen
[ng/ml]
A
unverdünnt
22
22
1:2
11
10.3
1:4
5.5
5.3
1:8
2.7
2.7
unverdünnt
4.6
4.6
1:2
2.3
2.4
1:4
1.2
1.3
1:8
0.6
0.9
B
13
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
12. VORSICHTSMAßNAHMEN
• Nur zur in vitro Diagnostik.
• Qualitätskontrollen sollten immer mit gemessen werden.
• Das für Kitkomponenten verwendete humane Material wurde auf HIV
und Hepatitis B und C getestet und für negativ befundet. Dennoch wird
empfohlen die Kitkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie
potentiell infektiöses Material zu behandeln.
• Die Kitkomponenten enthalten zum Schutz vor bakteriellen
Kontaminationen Natriumazid oder Thimerosal. Natriumazid bzw.
Thimerosal sind giftig. Substrate für enzymatische Farbreaktionen sind
als giftig und karzinogen beschrieben. Jeder Kontakt mit der Haut oder
der Schleimhaut ist zu vermeiden.
• Die Stopplösung besteht aus verdünnter H2SO4. H2SO4 ist eine starke
Säure und muss auch in verdünnter Form mit Vorsicht verwendet
werden. H2SO4 verursacht bei Kontakt mit der Haut Verätzungen. Es
sollte daher mit Schutzhandschuhen und Schutzbrille gearbeitet
werden. Bei Kontakt mit der Schwefelsäure muss die verätzte Stelle
sofort mit viel Wasser gespült werden.
13. TECHNISCHE MERKMALE
•
Reagenzien der Kitpackung dürfen nicht mit anderen Chargen gemischt
werden.
•
Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatums
nicht mehr verwendet werden.
•
Substratlösung muss vor Gebrauch farblos sein.
•
Mikrotiterstreifen müssen bei den Inkubationen mit Abdeckfolie
abgedeckt sein.
•
Vermeiden Sie Schaumbildung beim Mischen der Reagenzien.
•
Die Bestimmung ist immer nach der im Kit beigefügten Arbeitsanleitung durchzuführen.
•
Inkubationszeit, Temperatur und Pipettiervolumina sind vom Hersteller
festgelegt. Jegliche Abweichung der Testvorschrift, die nicht mit dem
Hersteller abgesprochen wurde, kann zu fehlerhaften Ergebnissen
führen. Immundiagnostik übernimmt keine Haftung.
14
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
14. ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST
•
Dieser Kit wurde nach der IVD Richtlinie 98/79/EG hergestellt und in den
Verkehr gebracht.
•
Alle im Kit enthaltenen Reagenzien dürfen ausschließlich zu wissenschaftlichen Zwecken oder, wenn vermerkt, zur in vitro Diagnostik
eingesetzt werden.
•
Für die Qualitätskontrolle sind die für medizinische Laboratorien
erstellten Richtlinien zu beachten.
•
Die charakteristischen Testdaten wie Inkubationszeiten, Inkubationstemperaturen und Pipettiervolumina der verschiedenen Komponenten
wurden firmenintern festgelegt. Nicht mit dem Hersteller abgesprochene
Veränderungen in der Testdurchführung können die Resultate
beeinflussen. Die Firma Immundiagnostik übernimmt für die hierdurch
entstandenen Schäden und Folgeschäden keine Haftung.
•
Bei Gewährleistungsansprüchen ist das beanstandete Material mit
schriftlicher Erklärung innerhalb von 14 Tagen zum Hersteller - der
Immundiagnostik zurück zu senden.
15. LITERATUR
1. Heinichen et al., 1995; Clin. Lab. 41, 539-545
2. Oremek et al., 1995; MTA 10, 273-278.
03.01.2008 03.01.2008_PMN-Elastase.DOC
15
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
PMN-Elastase ELISA KIT
For the in vitro determination of PMN-Elastase in serum, plasma,
seminal plasma and stool
Valid from 03.01.2008
+ 8 °C
K 6840
+ 2 °C
96
16
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
1. INTENDED USE
The described Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA) is intended
for the quantitative determination of PMN-Elastase in serum, seminal
plasma and stool. It is for in vitro diagnostic use only.
2. INTRODUCTION
PMN-Elastase from human polymorphnuclear granulocytes is a
glycoprotein of 30 kDa which belongs to the group of serine proteases.
Active PMN-Elastase is released from azurophil granula of neutrophil
granulocytes after irritation or disintegration. The determination of the
PMN-Elastase in stool is used to record inflammatory reactions in which
neutrophils are involved. Especially in Crohn´s disease the inflammatory
process goes hand in hand with an increased phagocytic activity and the
biological decay of the phagocytic cells, thus, leading to an increased release
of PMN-Elastase and other lysosomal enzymes.
Indication
• Activation marker for Morbus Crohn
• Chronic joint inflammation
• Bacterial infection, sepsis
17
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
3. MATERIAL SUPPLIED
Catalogue No
Content
Kit Components
Quantity
K 6840MTP
PLATE
Microtiter plate, precoated
12 x 8 wells
K 6840WB
WASHBUF
ELISA wash buffer concentrate 10x
2 x 100 ml
K 6840EP
EXBUF
Extraction buffer concentrate 2.5 x
2 x 100 ml
K 6840A2
AB
Detection antibody (Second antibody, mouse
anti-PMN-Elastase, monoclonal), concentrate
600 µl
K6840K
CONJ
Peroxidase-labeled antibody (goat-antimouse-POD)
15 ml
K 6840ST
STD
Calibrator, lyophilized
(see specification for amount)
4 vials
K 6840KO
CTRL
Control, lyophilized
(see specification for range)
4 vials
K 6840TMB
SUB
TMB substrate (Tetramethylbenzidine), ready
to use
15 ml
K 6840AC
STOP
ELISA stop solution, ready to use
15 ml
4. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
• Bidistilled water (aqua bidest.)
• Laboratory balance
• Precision pipettors calibrated to deliver 10-1000 µl
• Covering foil for the microtiter plate
• Horizontal microtiter plate shaker
• Multi-channel dispenser or repeating dispenser
• Centrifuge capable of 3000 x g
• Vortex-Mixer
• Standard laboratory glass or plastic vials, cups, etc.
• Microtiter plate reader 450 nm
18
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
5. PREPARATION AND STORAGE OF REAGENTS
•
To run the assay more than once, ensure that reagents are stored at
conditions stated on the label. Prepare only the appropriate amount
necessary for each assay (e.g. diluted antibody is not stable). The kit can
be used up to 4 times within the expiry date stated on the label.
•
Reagent with volumes less than 100 µl must be centrifuged before use
to avoid loss of volume.
•
The ELISA wash buffer concentrate (WASHBUF) must be diluted with
aqua bidest. 1:10 before use (100 ml WASHBUF + 900 ml aqua bidest.).
Crystals could occur due to high salt concentration in the stock solutions.
The crystals must be redissolved at 37°C using a water bath before
dilution of the buffer solutions. The buffer concentrate (WASHBUF) is
stable at 2-8°C until the expiry date stated on the label. Diluted solutions
can be stored at 2-8°C for 1 month.
•
The EXBUF (extraction buffer concentrate) should be diluted with aqua
bidest. 1:2.5 before use (90 ml concentrate + 135 ml aqua bidest.).
Crystals could occur due to high salt concentration in the stock solutions.
The crystals must be redissolved in a water bath at 37°C before dilution.
The EXBUF (extraction buffer concentrate) is stable at 2-8°C until the
expiry date stated on the label. Diluted buffer solution can be stored in a
closed flask at 2-8°C for fore months.
•
The second antibody (detection antibody, AB) must be diluted 1:20 in
ELISA wash buffer (add 500 µl AB to 9.5 ml of ELISA wash buffer). The
undiluted antibody (AB) is stable at 2-8 °C until the expiry date given on
the label. Diluted antibody solution is not stable and can not be
stored.
•
The standard (STD) must be reconstituted with 0.5 ml of aqua bidest.
(please see the product specification).
19
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
For the PMN-Elastase calibration curve dilute the concentrate (S1) as
described in the following example:
S1
S 2 = 200 µl S1 + 400 µl ELISA wash buffer
S 3 = 200 µl S2 + 400 µl ELISA wash buffer
S 4 = 200 µl S3 + 400 µl ELISA wash buffer
(See specification for range)
As zero calibrator use the ELISA wash buffer.
•
The control (CTRL) must be reconstituted with 0,5 ml of aqua bidest.
(please see the product specification). Mix thoroughly by gentle
inversion to insure complete reconstitution.
Reconstituted standards and control are not stable and can not be
stored.
•
All other test reagents are ready for use. The test reagents are stable up
to the date of expiry (see label of test package) when stored at
2-8°C.
6. SAMPLE PREPARATION
Extraction step of the stool sample
Please use the extraction buffer as a sample extraction buffer.
1. We recommend the use of a stool sample preparation kit for dosing of
100 mg of stool sample (e.g. Sample preparation kit from Roche
Diagnostics, Mannheim, Germany; cat # 745804). Add 5 ml buffer to
the stool sample in the preparation kit.
Constant buffer volume: 5 ml
Constant dilution factor: 1 : 50
2. Alternatively, stool samples can be manually weighted within the
range of 80 – 120 mg. Please note the exact sample amount!
a. Add 5 ml buffer to the stool sample independent of the sample
amount.
Constant buffer volume: 5 ml
Variable dilution factor
20
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
The dilution factor varies depending on the sample amount which must
be considered in the subsequent calculations. Please see the list of the
correction factors below:
Weight
[mg]
Buffer Volume
[ml]
Weight
[mg]
Buffer Volume
[ml]
80
62.5
102
49.0
82
60.9
104
48.1
84
59.5
106
47.2
86
58.1
108
46.3
88
56.8
110
45.5
90
55.6
112
44.6
92
54.3
114
43.9
94
53.2
116
43.1
96
52.1
118
42.4
98
51.0
120
41.6
100
50
b. The buffer volume for the individual samples varies depending on
the sample amount (see table).
Variable buffer volume
Constant dilution factor: 1 : 50
Therefore, the same dilution factor can be used for all samples in the
subsequent evaluation of the results .
21
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
Weight
[mg]
Buffer Volume
[ml]
Weight
[mg]
Buffer Volume
[ml]
80
4.0
102
5.1
82
4.1
104
5.2
84
4.2
106
5.3
86
4.3
108
5.4
88
4.4
110
5.5
90
4.5
112
5.6
92
4.6
114
5.7
94
4.7
116
5.8
96
4.8
118
5.9
98
4.9
120
6.0
100
5.0
Afterwards, mix the weighed stool sample with the buffer and vortex for 30
sec. Transfer ca. 1 ml stool suspension in an Eppendorf-cup and centrifuge
for 5 min at 13000 rpm. For analysis, pipet 100 µl of the supernatant per
well. The supernatant is not stable and can not be stored. We
recommend to weight fresh sample amount for a new assay, if the analysis
should be repeated.
Seminal plasma
Seminal plasma should be stored at -20°C and defrosted immediately before
use. Centrifuge the seminal-plasma samples for 5 minutes at 10000 rpm.
The samples should be diluted 1:10 - 1:20 in the ELISA wash buffer
depending on the inflammatory status of the patient.
Serum and Plasma samples
Preanalytic handling
Significant differences in the PMN-Elastase levels can be observed due to
different sample preparation procedures, e. g. up to 10-fold higher serum
levels compared to the plasma PMN-Elastase concentrations. The reasons
are as follows:
The granulocytes are activated during the serum clotting and release
elastase granulocyte-activating markers. The time between serum collecting
and analysis as well as repeated freeze-thaw cycles don't cause a PMNElastase concentration shift.
22
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
On the contrary, in the case of plasma samples, varying the time between
sampling and analysis or the number of freeze-thaw cycles will cause
variation in the observed PMN-Elastase levels. Therefore, the preanalytical
conditions of plasma samples should be held constant. This is a general
requirement independent of the used test-system.
Immundiagnostik recommends the use of serum samples for PMN-Elastase
determinations.
Fresh collected blood should be centrifuged within one hour. If not assayed
on the same day, it should be stored at -20 °C. Lipemic or hemolytic samples
should be not analysed. Samples should be mixed well before assaying. We
recommend to carry out duplicate analysis on each test sample.
Serum samples should be diluted 1:500 with the ELISA-wash buffer before
assaying.
Plasma samples should be diluted 1:100 with the ELISA-wash buffer before
assaying.
7. ASSAY PROCEDURE
Principle of the test
In a first incubation step, PMN-Elastase in the sample is bound to polyclonal
sheep-anti-PMN-Elastase antibodies (in excess), which are immobilized on
the surface of the microtiter wells (PLATE). To remove all unbound
substances, a washing step is carried out. In a second incubation step, a
monoclonal mouse-anti-PMN-Elastase antibody (AB) is added. This antibody
is able to detect both the free and the complexed form with the specific
inhibitor (α1-Proteinase inhibitor = α1-Antitrypsin). The quantification of the
bound PMN-Elastase is carried out by adding an anti-mouse peroxidaselabeled conjugate (CONJ). Finally, the PMN-Elastase-antigen-antibodycomplex is incubated with the peroxidase substrate, tetramethylbenzidine
(SUB). An acidic stop solution (STOP) is then added to terminate the reaction.
The color changes from blue to yellow. The intensity of the yellow color is
directly proportional to the concentration of PMN-Elastase in the sample. A
dose response curve of the absorbance unit (optical density, OD) vs.
concentration is generated, using the values obtained from the calibrators.
PMN-Elastase, present in the patient samples, is determined directly from
this curve. The combination of two specific antibodies in the PMN-Elastase
ELISA drastically reduces the possibility of false results and offers a reliable
diagnostic system to the user.
23
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
Test procedure
1.
Prior to use in the assay allow all reagents and samples to come to
room temperature and mix by gentle swirling and inversion.
2.
Mark the positions of STD (Standards)/SAMPLE/CTRL (Control) in
duplicate on a protocol sheet
3.
Take PLATE (microtiter strips) out of the kit. Store unused strips in the
original package bag at 2-8° C. Strips are stable until expiry date stated
on the label
4.
Wash the wells 5x with 250 µl of diluted wash buffer. After the last
wash, remove remaining wash buffer by hitting the plate against
paper towel
5.
Add 100 µl of STD (Standards)/SAMPLE/CTRL (Control) in duplicate
into respective well
6.
Cover the plate tightly and incubate for 1 hour at room temperature
(18-26°C) on a horizontal mixer
7.
Aspirate and wash the wells 5x with 250 µl of diluted wash buffer.
After the last wash, remove remaining wash buffer by hitting the plate
against paper towel
8.
Add 100 µl of AB (Detection antibody, 2nd Antibody) into each wells
mix gently
24
Arbeitsanleitung/Manual
9.
PMN-Elastase
Cover the plate tightly and incubate for 1 hour at room temperature
(18-26°C) on a horizontal mixer
10.
Aspirate and wash the wells 5x with 250 µl of diluted wash buffer. After
the last wash, remove remaining wash buffer by hitting the plate
against paper towel
11.
Add 100 µl of CONJ (Conjugate) into each well
12.
Cover the plate tightly and incubate for 1 hour at room temperature
(18-26°C) on a horizontal mixer
13.
Aspirate and wash the wells 5x with 250 µl of diluted wash buffer. After
the last wash, remove remaining wash buffer by hitting the plate
against paper towel
14.
Add 100 µl of SUB (Substrate) into each well
15.
Incubate for 5 - 20 minutes at room temperature (18-26°C) in the dark
16.
Add 50 µl of STOP (Stop solution) into each well, shake well
17.
Determine absorption immediately with an ELISA reader at 450 nm
against 620 nm as a reference. If no reference wavelength is available,
read only at 450 nm. If the extinction of the highest standard exceeds
the range of the photometer, absorption must be measured
immediately at 405 nm against 620 nm as a reference
25
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
8. RESULTS
The following algorithms can be used alternatively to calculate the results.
We recommend to use the "4-Parameter-algorithm".
1. 4-parameter-algorithm
It is recommended to use a linear ordinate for optical density and a
logarithmic abscissa for concentration. When using a logarithmic
abscissa, the zero calibrator must be specified with a value less than 1
(e. g. 0.01).
2. Point-to-point-calculation
We recommend a linear ordinate for optical density and a linear
abscissa for concentration.
3. Spline-algorithm
We recommend a linear ordinate for optical density and a logarithmic
abcissa for concentration. When using a logarithmic abscissa, the
zero calibrator must be specified with a value less than 1 (e. g. 0.01).
The plausibility of the pairs of values should be examined before the
automatic evaluation of the results. If this option is not available with
the used program, a control of the paired values should be done
manually.
Faeces
To obtain the PMN-Elastase concentration in fecal samples multiply the
estimated value by the dilution factor according to the sample preparation:
Sample preparation 1 and 2b:
Dilution factor constant :
1 : 50
Multiply the obtained result by 50 to get the real concentration.
Sample preparation 2a:
The dilution factor is variable,
dependent on the sample amount, and is taken from the table.
Multiply the obtained result by the corresponding dilution factor to get
the real concentration.
Seminal plasma
For the calculation of the PMN-Elastase concentration in seminal plasma, the
result has to be multiplied by 10 or 20 dependent on the sample dilution.
26
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
Serum
For the calculation of the PMN-Elastase concentration in serum, the result
has to be multiplied by 500.
Plasma
For the calculation of the PMN-Elastase concentration in plasma, the result
has to be multiplied by 100.
9. LIMITATIONS
Samples with PMN-Elastase levels greater than the highest calibrator, should
be further diluted and re-assayed.
Increased concentrations of PMN-Elastase in seminal plasma support the
diagnosis of an acute or chronical Adnexitis. In the case of simultaneous
Urethritis anterior, the obtained results are elevated due to contamination of
the ejaculate with granulocytes and can not be used. A possible presented
Urethritis anterior is easy for diagnosis. In this case, the obtained results
must be excluded or the patients treated before taking samples for PMNElastase analysis. Only such data can be used for a reliable diagnosis,
especially by existing Adnexitis.
10. QUALITY CONTROL
Immundiagnostik recommends the use of commercial control samples
for internal quality control.
Control samples or serum pools should be analyzed with each run of
calibrators and patient samples. Results, generated from the analysis of
control samples, should be evaluated for acceptability using appropriate
statistical methods. The results for the patient sample may not be valid, if
within the same assay one or more values of the quality control sample are
lying outside the acceptable limits.
Expected values
(1g stool be equivalent to 1 ml)
PMN-Elastase concentrations in faeces of a healthy person (n=76):
< 62 ng/ml
PMN-Elastase concentrations in plasma of a healthy person (n=37):
19-78 ng/ml
PMN-Elastase concentrations in serum of a healthy person (n = 52):
average = 688 ng/ml (186 – 1991ng/ml)
We recommend each laboratory to establish its own norm concentration
range.
27
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
11. PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Precision and reproducibility
Intra-Assay (n=20)
Probe
PMN Elastase
[ng/ml]
Vk
[%]
1
2.3
14
2
0.72
4.5
Probe
PMN Elastase
[ng/ml]
Vk
[%]
1
4.9
4
2
27.8
10
Inter-Assay (n=20)
Recovery
Two samples were spiked with different PMN-Elastase calibrator amounts
and measured with the assay.
Probe
[ng/ml]
1.5
0.75
PMN-Elastase
Expected
[ng/ml]
Spike
[ng/ml]
PMN-Elastase
Measured
[ng/ml]
3
4.5
4.9
6
7.5
7.7
5
5.75
5.7
1.65
2.4
2.7
0.65
1.4
1.5
28
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
Sensitivity
The sensitivity limit was set as B0 + 2 SD. The Zero-standard was measured
20 times.
Sample
PMN-Elastase
Mean value
[OD]
1
Standard variation
0.025
0.024
Detection limit
[ng/ml]
0.12
Cross reactivity
No cross reactivity to other proteins in stool and serum was observed.
Cross reactivity with PMN-elastase as well as a good correlation with PMNelastase content in mouse serum was observed.
Linearity
Two patient samples were diluted with ELISA wash buffer and analyzed with
the Immundiagnostik PMN-Elastase ELISA test.
Sample
A
B
Expected
[ng/ml]
22
Dilution
undiluted
Measured
[ng/ml]
22
1:2
11
10.3
1:4
5.5
5.3
1:8
2.7
2.7
undiluted
4.6
4.6
1:2
2.3
2.4
1:4
1.2
1.3
1:8
0.6
0.9
29
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
12. PRECAUTIONS
• For in vitro diagnostic use only.
• The quality control guidelines should be observed.
• Human material used in the kit components was tested and found to be
negative for HIV, Hepatitis B and Hepatitis C. However, for safety
reasons, all kit components should be treated as potentially infectious.
• Reagents of the kit package contain sodium azide and thimerosal as
bactericides. Sodium azide and thimerosal are toxic. The substrates for
the enzymatic color reactions are described to be also toxic and
carcinogenic. Contact with skin or mucous membranes has to be
avoided.
• Stop solution consists of sulfuric acid, a strong acid. Although diluted, it
still must be handled with care. It can cause burns and should be
handled with gloves, eye protection, and appropriate protective
clothing. Any spill should be wiped out immediately with copious
quantities of water.
13.TECHNICAL HINTS
•
Do not interchange different lot numbers of any kit component within
the same assay.
•
Reagents should not be used beyond the expiration date shown on the
kit label.
•
Substrate solution should remain colourless until added to the plate.
•
To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealers during
incubation steps is necessary.
•
Avoid foaming when mixing reagents.
•
The assay should always be performed according the enclosed manual.
•
Incubation time, incubation temperature and the volumes of the
different components are defined by the producer. Any variation of the
test procedure, which is not coordinated with the producer, may
influence the test results. Immundiagnostik can therefore not be held
responsible for any damage resulting from this.
30
Arbeitsanleitung/Manual
PMN-Elastase
14. GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE
•
This assay was produced and put on the market according to the IVD
guidelines of 98/79/EC.
•
The kit components made of human serum are tested for Hepatitis B,
Hepatitis C and HIV and found to be negative. However, since no test
method can offer complete assurance that infectious agents are absent,
these reagents should be handled as recommended for any potentially
infectious human serum or blood specimen. The normal precautions for
laboratory work should be observed.
•
All reagents in the kit package are for in vitro diagnostic use only.
•
The guidelines for medical laboratories should be observed.
•
Incubation time, incubation temperature and volumes of the different
components are defined by the producer. Any variation of the test
procedure, which is not coordinated with the producer, may influence
the results of the test. Immundiagnostik can therefore not be held
responsible for any damage resulting from this.
•
Warranty claims and complaints in respect of deficiencies must be
lodged within 14 days of received of the product. The product shall be
send to Immundiagnostik together with the complaint in writing.
15. REFERENCES
1. Heinichen et al.: 1995; Clin. Lab. 41, 539-545
2. Oremek et al.: 1995; MTA 10, 273-278.
1/3/2008 1/3/2008_PMN-E.doc
31
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