Determinación estructural de un analito en baja

Determinación estructural de un analito en baja
RIAIDT
Rede de Infraestruturas de Apoio á Investigación
e ao Desenvolvemento Tecnolóxico
Vicerrectorado de investigación
http://www.usc.es/gl/investigacion/riaidt/
Titulo del estudio:
Determinación estructural de un analito en baja resolución en Ionización Química (IQ)
Conceptos clave:
Equipo Magnético, Geometría trisector (EBE), Ionización química (IQ), sonda sólidos, masa monoisotópica, masa
promedia.
Test realizado por:
Unidade de Masas e Proteómica
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TABLA DE CONTENIDOS
PÁGINA
1. INTRODUCCIÓN: Espectrometría de masas ............................................................................................... 3
2. OBJETIVO................................................................................................................................................. 4
3. MATERIALES, MÉTODOS........................................................................................................................... 4
3.1 Conceptos: Masa promedio y monoisotópica ...................................................................................... 4
3.2 Ionización Química ............................................................................................................................. 4
3.3 Condiciones de la muestra .................................................................................................................. 5
3.4 Instrumentación ................................................................................................................................. 5
4. RESULTADOS ............................................................................................................................................ 6
4.1 Determinación de espectros moleculares ............................................................................................ 6
4.2 Conceptos clave ................................................................................................................................. 8
5. STATEMENT OF OWNERSHIP ...................................................................................................................... 8
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1. INTRODUCCIÓN: ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La Espectrometría de Masas es una técnica microanalítica que requiere solamente unos pocos nanomoles de
muestra para obtener información característica de la estructura e de la masa molecular del compuesto a estudiar.
Es una técnica destructiva en la que la muestra es consumida durante el análisis.
En todas las técnicas usadas en espectrometría de masas, alguna forma de energía es transferida a la molécula
dando lugar la ionización de la misma. En la mayoría de los casos, el ion molecular (Ion resultante de la ionización de
la molécula que representa a la misma y que es la precursora de todos los fragmentos que componen el espectro de
masas) de la muestra “explota” en una variedad de fragmentos (Patrón de Fragmentación). Los productos que se
forman son iones en fase gas en los que sus masas y abundancias relativas constituyen el espectro de masas.
Dependiendo del tipo de analizador empleado, la espectrometría de masas puede realizarse en baja o en alta
resolución. Con analizadores como el cuadrupolo o la trampa de iones se trabaja en baja resolución, y con
analizadores magnéticos o TOF se trabaja en alta resolución. En analizadores de alta resolución, podemos separar
mucho mejor los picos. La resolución viene definida por:
Donde R es la Resolución y AM Es el poder resolutivo
Cuanta mayor resolución nos de un analizador, mejor separación de picos espectrales. De esta forma se puede
emplear esta alta resolución para realizar medidas de masa exacta, enfrentando el valor teórico del analito en
cuestión con la medida experimental realizada con el espectrómetro de masas.
Existen diferentes modos de ionización en Espectrometría de masas, que se utilizan en función del tipo de
muestra y polaridad. Entre los más importantes y recurridos tenemos: Impacto Electrónico (EI), Ionización Química
(CI), FAB ( Fast Atom Bombardment) o L-SIMS (Liquid-Secondary Ions Mass Spectrometry), MALDI (Matrix Assisted
Laser Desorption ), ESI Electrospray), APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization).
Con estas técnicas de ionización en el espectrómetro de masas y con acoplamientos a cromatografía de Gases o
Líquidos, se pueden realizar diferentes tipos de análisis:
-
Análisis cualitativo
-
Análisis cuantitativo
-
Elucidación estructural
-
Determinación de masa exacta
-
Estudios de fragmentación selectiva por MS/MS
El análisis por espectrometría de masas se emplea en muestras que estén en estado sólido o líquido. Dependiendo
de la técnica a emplear y las características del analito a medir, se emplea un sistema de introducción de líquidos o
sólidos determinado.
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2. OBJETIVO
El objetivo de este estudio es realizar una determinación estructural por Ionización Química (IQ) utilizando un
equipo magnético con fuente de ionización IQ. El espectro de masas nos daría información estructural de la molécula
a medir. Con esta técnica, que es más blanda que Impacto Electrónico, podríamos conseguir un espectro del ion
molecular intacto con menos fragmentación que el conseguido en IE. Puede ser interesante en los casos en los que
el ion molecular no se aprecia por Impacto.
3. MATERIALES, METODOS
3.1 Conceptos: Masa promedio y monoisotópica.
Masa Promedio: Es aquella que se puede obtener en base al carbono 12. El C12 se usa como patrón de la masa
atómica de los distintos nucleídos que existen en la naturaleza, dado que la masa atómica del 12C es por
definición 12 umas (Unidades de Masa atómica). Basándonos en este concepto, masa promedio es la suma
de la media química de las masas de sus componentes considerando su abundancia.
Masa Monoisotópica: La masa monoisotópica es la suma de las masas monoisotópicas de cada
elemento del analito. Es la que se emplea cuando se hacen medidas en alta resolución.
3.2
Ionización química (CI = Chemical Ionisation)
La técnica de Impacto Electrónico es una técnica muy agresiva, ya que provoca mucha fragmentación del ion
molecular, dándonos mucha información estructural y muy poca (o ninguna) información molecular. Esto conlleva la
dificultad de interpretar el espectro. En los casos que interesa tener más información del ion molecular y menos de
la fragmentación es mejor recurrir a otras técnicas de ionización menos agresivas como es el caso de Ionización
Química (Técnica de ionización blanda.- llamada así, debido al poco “exceso” de energía que es depositada en las
moléculas cuando son ionizadas).
La Ionización Química se realiza mediante la reacción de las moléculas neutras de muestra problema con iones
procedentes de la previa ionización (por impacto electrónico) de un gas reactivo.
En el caso de usar metano como gas reactivo, estos iones son: CH5+ (m/z 17); C2H5+ (m/z 29); C2H3+ (m/z 27); C3H5+
(m/z 41).
Las reacciones que tienen lugar entre los iones reactivos cargados positivamente y las moléculas de muestra
pueden ser agrupadas principalmente en 4 categorías: Transferencia protónica, Intercambio de carga, Adición
electrofílica y Abstracción aniónica. Por ejemplo los iones CH5+ e C2H5+ formados a partir del metano reaccionan con
moléculas de la muestra por transferencia protónica:
M + C2H5+ ------------------------------- MH+ + C2H4+
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3.3
Condiciones de la muestra para Ionización Química
Condiciones de almacenaje: dependiendo del tipo de muestra puede almacenarse a temperatura
ambiente, en la nevera (4-7°C), o en congelador (-20°C), protegidas con viales suministrados por el solicitante.
Cuidados de manipulación: Con muestras líquidas se emplea campana de extracción, guantes de látex,
gafas de protección. En el caso de sólidos, mascarilla de protección contra polvo.
Tipo de muestra para ionización química: Es la técnica usada como alternativa al Impacto Electrónico para visualizar
el ion molecular. Se emplea en análisis de compuestos orgánicos relativamente lábiles, como en productos
farmacéuticos, metabolitos, esteroides, carbohidratos, lípidos, pesticidas, etc.
3.4
Instrumentación
El equipo magnético de alta resolución utilizado es el modelo AUTOSPEC de la casa comercial Micromass
(Actualmente Waters). Las características de este equipo son:

Geometría trisector EBE patentada por Micromass y que proporciona un instrumento compacto, con
alta sensibilidad y alta resolución, libre de metastables en espectros normales y barridos enlazados libres
de artefactos.

El rango de masas es variable dependiendo de la técnica de ionización empleada.

El voltaje de aceleración es de 8 kv.

Posibilidad de ionizar muestras por las técnicas de impacto electrónico, ionización química y L-SIMS.

Sonda de introducción directa para la medida de muestras sólidas y líquidas, con la posibilidad de
calentar hasta 650ºC, con control tanto automático como manual por el operador.

Reservorio de referencia para estándares conocidos.

Cañón de cesio de 35kv para realización de L-SIMS líquido.

Sonda para medidas exactas usando compuestos de referencias externos.
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4. RESULTADOS
4.1
Determinación de espectros moleculares
Comparativa de un analito medido en Impacto electrónico y en Ionización Química, donde se
observa el ion molecular protonado (M+H+) más claramente en Ionización Química. Dependiendo de la
presión en el gas seleccionado (Metano, en este caso) se puede conseguir más o menos fragmentación.
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C17H24O3
Exact Mass: 276.2
Mol. Wt.: 276.4
O
O
CH3
CH3
H2C
O
Espectro de masas en Ionización química de baja resolución. El pico que en este caso buscaríamos es el 276 + H⁺ (por
la presencia del gas metano, siempre sale protonada la masa) que tiene una intensidad relativa del 10%.
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4.3 Conceptos Clave





Masa monoisotópica: La masa monoisotópica es la suma de las masas monoisotópicas de cada elemento del
analito.
La precisión de masa es un porcentaje de la masa medida y se mide tanto en tanto por ciento como en
partes por millón.
Relación masa/carga (m/z), es la relación del número de masa (m) de una partícula dada entre el número
(z) de unidades cargadas electrostáticamente que posee la partícula. Así, m/z es una relación adimensional
que es el parámetro medido por el analizador de masas.
Definición de ion molecular o progenitor y de pico base. El ion molecular resulta de la ionización de la
molécula a analizar. Este ion representa la molécula intacta y es el último precursor de todos los iones
fragmentados que componen el espectro de masas. El pico del ion molecular aparece a un valor m/z
numéricamente igual al peso molecular del compuesto. El pico base es el pico más intenso en el espectro de
masas. Es usado como base para normalizar las intensidades de los otros picos. Al pico base se le asigna una
intensidad relativa de 100%(en el caso de que la muestra que se analiza sea pura)
Gas reactivo. El método de la IQ implica la mezcla de la muestra (aproximadamente 10-4Torr) con un gas
reactivo en alta presión (1 Torr) en la fuente de ionización de los iones. Los gases reactivos, comúnmente
usados, son: metano, Isobutano y amonio.
5. STATEMENT OF OWNERSHIP
Este informe contiene un estudio realizado por “Unidad de Masas” en la “Universidad de Santiago de
Compostela”, en nombre del sponsor MMMMM.
Todos los resultados e interpretaciones son propiedad del patrocinador. Bajo ninguna circunstancia se
mencionara a cualquier dato sin conocimiento del patrocinador. Las muestras serán devueltas al propietario.
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