QIAGEN prueba digene HPV Genotyping PS, prueba digene HC2 High-Risk HPV DNA, digene HC2 DNA Collection Device, digene HC2 Sample Conversion Instrucciones de uso de la prueba

Instrucciones de uso de la prueba

digene

®

HPV Genotyping PS

Para la detección cualitativa de los tipos 16, 18 y 45 del virus del papiloma humano (VPH). Para utilizar con la prueba

digene

HC2

High-Risk HPV DNA.

613615

QIAGEN

19300 Germantown Road

Germantown, MD 20874

Estados Unidos www.qiagen.com

QIAGEN GmbH

QIAGEN Strasse 1

40724 Hilden

ALEMANIA

1058098ES Rev. 02

96

Sample & Assay Technologies

Índice

Uso previsto

Resumen y explicación

Principio del procedimiento

Desnaturalización

Hibridación

Captura de los híbridos

Detección de los híbridos

Lavado

Amplificación de la señal

Materiales suministrados

Contenido del kit

Materiales necesarios pero no suministrados

Equipo y materiales disponibles a través de QIAGEN

Equipo y materiales adicionales para la preparación de muestras recogidas en PreservCyt

Advertencias y precauciones

Advertencias

Precauciones

Almacenamiento y manipulación de los reactivos

Componentes del kit

Reactivos preparados

Recogida y preparación de las muestras

Muestras del cuello del útero en STM

Muestras del cuello del útero en solución PreservCyt

Procedimiento

Preparación de los reactivos

Preparación de las muestras


digene

HPV Genotyping PS

16

18

18

18

13

13

13

19

19

19

21

23

29

8

8

7

7

6

6

7

10

10

11

11

8

8

3

4

Protocolo 1: Desnaturalización

Protocolo 2: Adición de la mezcla de la sonda

Protocolo 3: Hibridación y captura de los híbridos

Protocolo 4: Detección de los híbridos

Protocolo 5: Lavado

Protocolo 6: Amplificación de la señal

Protocolo 7: Medición de la microplaca de captura y generación de resultados

Interpretación de los resultados

Resultados de la prueba

Guía para la resolución de problemas

Control de calidad

Verificación de la calibración del ensayo

Controles de calidad específicos de la sonda

Limitaciones

Características del rendimiento

Concordancia entre la prueba

digene

HPV Genotyping PS y una prueba validada de genotipificación del VPH mediante PCR cuantitativa

Especificidad analítica

Reproducibilidad

Recuperación de ADN para muestras recogidas en STM y para muestras recogidas en PreservCyt

Reactividad cruzada

Efecto de la sangre y de otras sustancias sobre las muestras recogidas en STM

Efecto de la sangre y de otras sustancias sobre las muestras recogidas en PreservCyt

61

63

64

60

60

61

44

45

45

45

57

57

38

40

43

30

32

36

65

65

67

67


digene

HPV Genotyping PS

Bibliografía

Referencias citadas

Símbolos

Información de contacto

Apéndice A: Procedimientos para la evaluación de la contaminación

Reactivo de detección 2

Aparato de lavado y/o fuente de agua

Automated Plate Washer

Apéndice B: Hoja de trabajo para el registro de datos de la prueba

Información para pedidos

71

72

72

74

75

68

68

70

70

71


digene

HPV Genotyping PS 5

6

Uso previsto

La prueba

digene

HPV Genotyping PS es una prueba refleja indicada para la detección cualitativa de los tipos de alto riesgo 16, 18 y 45 del VPH después de un resultado positivo en la prueba

digene

HC2 High-Risk HPV DNA

(detección cualitativa de 13 tipos de alto riesgo). La identificación de los tipos de alto riesgo 16, 18 y 45 del VPH proporciona información adicional como ayuda para la atención clínica de las mujeres en los programas de cribado del cáncer de cuello de útero.

Las muestras del cuello del útero que pueden analizarse con la prueba

digene

HPV Genotyping PS son las siguientes:



Muestras recogidas con el dispositivo de recogida

digene

HC2 DNA

Collection Device.



Muestras recogidas con un dispositivo de recogida de tipo cepillo o con un dispositivo de recogida combinado de escobillón/espátula y posteriormente colocadas en solución PreservCyt ® .

Resumen y explicación

La presencia de ciertos tipos de VPH en el tracto genital femenino se asocia a diversas enfermedades, tales como el condiloma, la papulosis bowenoide y los carcinomas y neoplasias intraepiteliales de cuello de útero, vaginales y vulvares (1–3). Generalmente se acepta que estos virus se transmiten principalmente por contacto sexual y que los tipos de alto riesgo del VPH son el factor de riesgo conocido principal del desarrollo del cáncer de cuello de

útero (4–8).

Los virus del papiloma humano están compuestos por una partícula viral icosahédrica (virión) que contiene una molécula de ADN circular bicatenario de

8.000 pares de bases rodeada de una cápside proteínica. Tras la infección de las células epiteliales, el ADN viral se establece en todo el espesor del epitelio, pero únicamente hay viriones intactos en las capas superiores del tejido. Por tanto, puede encontrarse ADN viral en los viriones o en forma de secuencias episomales o integradas del VPH, según el tipo y el grado de lesión.


digene

HPV Genotyping PS

Pueden obtenerse indicios indirectos de infección anogenital por el VPH mediante la exploración física y por la presencia de alteraciones celulares características asociadas a replicación viral en muestras de biopsia o de citología vaginal. También pueden analizarse las muestras de biopsia mediante hibridación de ácidos nucleicos para detectar directamente la presencia de

ADN del VPH.

Las mujeres que tienen una citología normal y una prueba concomitante positiva para el VPH 16 o 18 tienen una probabilidad estimada del 26,7% y del 19,1%, respectivamente, de presentar neoplasia intraepitelial cervical

(NIC) de grado 3 o superior en un plazo de seguimiento de 12 años (9).

Además, los tipos 16, 18 y 45 del VPH fueron los tres genotipos más frecuentes identificados en el carcinoma espinocelular, en el adenocarcinoma y en el carcinoma adenoescamoso. Los tres tipos de VPH en conjunto constituían el

75% de los casos de carcinoma espinocelular y el 94% de los casos de adenocarcinoma (10). También se ha demostrado que los tumores que contienen los tipos 18 o 45 del VPH tienen una probabilidad más de dos veces mayor de causar la muerte en comparación con los tumores que contienen otros tipos de VPH (11).

Principio del procedimiento

La prueba

digene

HPV Genotyping PS, que utiliza la tecnología Hybrid

Capture

®

2 (HC2), es un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos

in vitro

que utiliza oligorribonucleótidos específicos del tipo, la captura de anticuerpos y la detección cualitativa de señales quimioluminiscentes. La prueba, realizada por triplicado para cada muestra del cuello del útero, genotipifica el ADN de tres tipos de alto riesgo (16, 18 y 45) del VPH en muestras del cuello del útero.

Desnaturalización

Las muestras del cuello del útero se tratan con una solución básica, que altera el virus y libera el ADN diana.

Hibridación

El ADN diana del VPH se hibrida con sondas de ARN específicas creando híbridos de ADN-ARN.


digene

HPV Genotyping PS 7

Captura de los híbridos

Los anticuerpos, que son específicos de los híbridos de ADN-ARN y que recubren la superficie de un pocillo de una microplaca, capturan los híbridos de ADN-ARN.

Detección de los híbridos

Con la adición del reactivo de detección 1 (DR1,

Detection Reagent 1

), los híbridos de ADN-ARN inmovilizados reaccionan con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina específicos de los híbridos de ADN-ARN. Se conjugan varias moléculas de fosfatasa alcalina con cada anticuerpo y se unen varios anticuerpos a cada híbrido de ADN-ARN inmovilizado, lo cual da lugar a una amplificación considerable de la señal.

Lavado

El complejo del híbrido de ADN-ARN se lava para eliminar el material no unido.

Amplificación de la señal

Con la adición del reactivo de detección 2 (DR2) se produce una reacción quimioluminiscente en la que el sustrato es escindido por la fosfatasa alcalina unida. La luz emitida se mide como unidades relativas de luz (RLU,

relative light units

) en un instrumento DML. La intensidad de la luz emitida indica la presencia de ADN diana en la muestra.

8 Instrucciones de uso de la prueba

digene

HPV Genotyping PS

Flujo de trabajo de la captura de híbridos

Desnaturalización

Hibridación

Sonda de ARN

ADN monocatenario

Híbrido de ADN-ARN

Captura de los híbridos

Detección de los híbridos

Lavado

Amplificación de la señal


digene

HPV Genotyping PS 9

10

Materiales suministrados

Contenido del kit

digene

HPV Genotyping PS Test

N.º de referencia

Número de pruebas*

HPV Negative Control 1 (control negativo 1 del VPH)

HPV Positive Control 1 (control positivo 1 del VPH)

HPV Negative Control 2 (control negativo 2 del VPH)

HPV Positive Control 2 (control positivo 2 del VPH)

Denaturation Reagent (reactivo de desnaturalización)

Indicator Dye (tinte indicador)

Probe Diluent (diluyente de sonda)

Detection Reagent 1 (reactivo de detección 1)

Detection Reagent 2 (reactivo de detección 2)

(96)

613615

96

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

12 ml

0,35 ml

5,5 ml

12 ml

12 ml

* El número de resultados de la prueba variará según el número de usos por kit, ya que se requieren controles para cada ejecución de la prueba. El número de ciclos permitidos de congelación/descongelación de los controles desnaturalizados también puede influir en el número de usos por kit. Consulte “Punto de detención opcional” en la página 31 si desea obtener más información.


digene

HPV Genotyping PS

Wash Buffer x15 (tampón de lavado x15)

HPV 16 Probe ASR (reactivo específico del analito (ASR) de sonda del VPH 16)



5.5% NP-40 (NP-40 al 5,5%)

Capture Microplate (microplaca de captura)

2 x 100 ml

110 µl

100 µl

100 µl

2 x 1,5 ml

1

Materiales necesarios pero no suministrados

Cuando trabaje con productos químicos, use siempre una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas de protección. Para obtener más información, consulte las fichas de datos de seguridad (SDS,

safety data sheets

) correspondientes, que podrá adquirir a través del proveedor del producto.

Equipo y materiales disponibles a través de QIAGEN



Sistema

digene

Hybrid Capture 2 (“sistema

digene

HC2”), formado por un luminómetro aprobado por QIAGEN (“instrumento DML”), un ordenador personal aprobado por QIAGEN y dispositivos periféricos informáticos

(monitor, teclado, ratón, impresora y cable de la impresora),

digene

HC2

System Software(“software de análisis de ensayos

digene

”), software

LumiCheck Plate y el manual del usuario del

digene

HC2 System Software

(digene

HC2 System Software User Manual

).



Hybrid Capture System Rotary Shaker I



Hybrid Capture System Automated Plate Washer



Hybrid Capture System Multi-Specimen Tube (MST) Vortexer 2 (opcional)



Microplacas de hibridación


digene

HPV Genotyping PS 11

12



Tapas para microplacas



Puntas de pipeta extralargas



Depósitos desechables para reactivos



Lámina selladora de tubos DuraSeal TM



Selladores de placas

Equipo y accesorios generales para uso en el laboratorio



Agitador incubador capaz de mantener una temperatura de 55 ± 2 °C y de agitar a 1.100 ± 100 rpm



Microcentrífuga



Agitador vorticial con accesorio cóncavo.



Pipeta de un canal (monocanal); ajustes variables para volúmenes de 20 a

200 µl y de 200 a 1.000 µl



Pipeta repetidora de desplazamiento positivo, como la pipeta Eppendorf

®

Repeater

®



Pipeta de ocho canales (multicanal); ajustes variables para volúmenes de

25 a 200 µl



Reloj temporizador



Solución de hipoclorito sódico al 0,5% v/v



Parafilm

®

o equivalente



Puntas de pipeta desechables resistentes a aerosoles para pipeta monocanal (de 20 a 200 µl y de 200 a 1.000 µl)



Puntas desechables para pipeta repetidora de desplazamiento positivo

(12,5, 5, 2,5 y 1,25 ml)



Puntas desechables para pipeta de ocho canales (de 25 a 200 µl)



Toallitas KimTowels ® u hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes



Toallitas con alcohol



Funda desechable para la mesa de trabajo



Guantes desechables no empolvados


digene

HPV Genotyping PS



Tubos de polipropileno de fondo redondo de 1,5 ml y/o de 5 ml



Gradilla flotante para tubos de microcentrífuga

Equipo y materiales adicionales para la preparación de muestras recogidas en PreservCyt

Consulte las instrucciones de uso del kit

digene

HC2 Sample Conversion.

Advertencias y precauciones

Para uso en diagnóstico

in vitro

.

Advertencias

Cuando trabaje con productos químicos, use siempre una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas de protección. Para obtener más información, consulte las fichas de datos de seguridad (SDS,

safety data sheets

) correspondientes. Dichas fichas están disponibles online en un formato PDF cómodo y compacto en www.qiagen.com/safety, donde podrá encontrar, ver e imprimir la ficha de datos de seguridad de cada kit de QIAGEN y de cada componente del kit.

Muestras

ATENCIÓN: Las muestras pueden contener agentes infecciosos y deben manipularse consecuentemente. Considere todas las muestras como potencialmente infecciosas.

Ningún método de análisis conocido puede ofrecer una garantía completa de que las muestras no transmitirán ninguna infección. Se recomienda manipular las muestras humanas conforme a las directrices nacionales y locales pertinentes en materia de bioseguridad. Siga estas directrices sobre bioseguridad con los materiales que contengan o que se sospeche que contienen agentes infecciosos.

Estas precauciones son, entre otras, las siguientes:



No pipetee con la boca.


digene


14



No fume, coma ni beba en áreas en las que se manipulen reactivos o muestras.



Use guantes desechables no empolvados al manipular reactivos o muestras.

Lávese bien las manos después de realizar la prueba.



Limpie y desinfecte todos los derramamientos de muestras con un desinfectante tuberculicida, como el hipoclorito sódico al 0,5% v/v, u otro desinfectante adecuado (12, 13).



Descontamine y deseche todas las muestras, todos los reactivos y todos los demás materiales potencialmente contaminados conforme a la normativa local y nacional.

Tras la desnaturalización y la incubación, las muestras dejan de considerarse infecciosas (14); no obstante, el personal del laboratorio deberá seguir cumpliendo las precauciones nacionales y locales.

Azida sódica

Algunos reactivos contienen azida sódica. Se ha informado de que la azida sódica forma azida de plomo o de cobre en las tuberías de los laboratorios.

Estas azidas pueden explotar si son sometidas a percusión, como al martillear.

Para impedir la formación de azida de plomo o de cobre, vierta abundante agua en los desagües después de desechar por ellos soluciones que contengan azida sódica. Para eliminar la contaminación de desagües antiguos en los que se sospeche la acumulación de azida, la U.S. Occupational Safety and Health

Administration recomienda lo siguiente:

1. Drene el líquido del colector utilizando un tubo de goma o de plástico.

2. Llene con una solución de hidróxido de sodio al 10% v/v.

3. Deje reposar durante 16 horas.

4. Vierta abundante agua.

Frases sobre seguridad y riesgo en relación con los componentes

Las siguientes frases sobre riesgo y seguridad son aplicables a los componentes del kit de la prueba

digene

HPV Genotyping PS:


digene

HPV Genotyping PS

5.5% NP-40

Contiene: Ethoxylated nonylphenol. Atención! Provoca una leve irritación cutánea. Nocivo para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos.

Evitar su liberación al medio ambiente. Eliminar el contenido/ el recipiente en una planta de eliminación de residuos aprobada.

Denaturation Reagent

Contiene: sodium hydroxide. Peligro! Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves. Puede ser corrosivo para los metales. Eliminar el contenido/ el recipiente en una planta de eliminación de residuos aprobada. EN CASO DE CONTACTO

CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo):

Quitarse inmediatamente las prendas contaminadas. Aclararse la piel con agua o ducharse. Llamar inmediatamente a un CENTRO DE

INFORMACION TOXICOLOGICA o a un médico. Guardar bajo llave. Llevar guantes/ prendas/ gafas/ máscara de protección.

Detection Reagent 1

Nocivo para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos. Evitar su liberación al medio ambiente.

HPV Negative Control 1

Atención! Provoca una leve irritación cutánea. En caso de irritación cutánea:

Consultar a un médico.

HPV Positive Control 1



HPV Positive Control 2



HPV Negative Control 2




digene


16

Probe Diluent

Contiene: acetic acid; Polyacrylic acid. Peligro! Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves. Eliminar el contenido/ el recipiente en una planta de eliminación de residuos aprobada. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. EN CASO DE

CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quitarse inmediatamente las prendas contaminadas. Aclararse la piel con agua o ducharse.

Llamar inmediatamente a un CENTRO DE INFORMACION

TOXICOLOGICA o a un médico. Guardar bajo llave. Llevar guantes/ prendas/ gafas/ máscara de protección.

Wash Buffer, 15x

Contiene: Sodium azide. Atención! Nocivo en caso de ingestión.

Provoca una leve irritación cutánea. Nocivo para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos. Evitar su liberación al medio ambiente. Eliminar el contenido/ el recipiente en una planta de eliminación de residuos aprobada. En caso de irritación cutánea: Consultar a un médico. EN CASO DE INGESTIÓN: Llamar inmediatamente a un CENTRO DE INFORMACIÓN

TOXICOLÓGICA o a un médico. Llevar guantes/ prendas/ gafas/ máscara de protección.

Información adicional

Fichas de datos de seguridad: www.qiagen.com/safety

Precauciones

El usuario debe seguir siempre las siguientes precauciones al realizar la prueba

digene

HPV Genotyping PS:



No use los reactivos después de la fecha de caducidad indicada junto al símbolo en la etiqueta de la caja externa o después de la fecha de caducidad de los reactivos preparados.



Si se realiza la prueba fuera de los plazos de tiempo y de los intervalos de temperatura indicados, pueden obtenerse resultados no válidos. Las pruebas no realizadas dentro de los plazos de tiempo y de los intervalos de temperatura establecidos no son válidas y deben repetirse.


digene

HPV Genotyping PS



Deben seguirse meticulosamente el procedimiento, la calibración del ensayo, el control de calidad y la interpretación de los resultados de la prueba

digene

HPV Genotyping PS para obtener resultados fiables.



Es importante pipetear el volumen exacto de reactivos indicado y mezclar bien después de cada adición de reactivo. De lo contrario, los resultados de la prueba podrían ser erróneos. Comprobar que tienen lugar los cambios de color señalados confirmará que se han cumplido estas condiciones.



Los componentes del kit se han comprobado como conjunto. No intercambie componentes de otras fuentes o de lotes diferentes.



Los ácidos nucleicos son muy sensibles a la degradación por las nucleasas ambientales. Las nucleasas están presentes en la piel humana y en superficies y materiales manipulados por el ser humano. Limpie y cubra las superficies de trabajo con una funda desechable para la mesa de trabajo y use guantes desechables no empolvados al realizar todos los pasos de la prueba.



Las muestras del cuello del útero pueden contener sangre u otros materiales biológicos que pueden enmascarar los cambios de color de las muestras.

Las muestras que presentan un color oscuro pueden no mostrar el cambio de color descrito. En estos casos, la imposibilidad de visualizar el cambio de color no afectará a los resultados de la prueba. Compruebe que el mezclado es correcto observando el cambio de color de los controles.



Asegúrese de prevenir la contaminación de la microplaca de captura y del

DR2 con fosfatasa alcalina exógena durante la realización de la prueba.

Las sustancias que pueden contener fosfatasa alcalina son, entre otras, el

DR1, bacterias, la saliva, el pelo y la grasa de la piel. Es especialmente importante cubrir la microplaca de captura después del paso de lavado y durante la incubación con el DR2 debido a que la fosfatasa alcalina exógena puede reaccionar con el DR2 y producir resultados positivos falsos.



Proteja el DR2 de una exposición prolongada a la luz directa. Use el DR2 justo después de dispensarlo y evite su exposición a la luz directa del sol.



Cebe la pipeta repetidora de desplazamiento positivo antes de la dispensación del reactivo y compruebe periódicamente si hay burbujas


digene


18 grandes de aire. Una cantidad excesiva de burbujas grandes de aire en la punta de la pipeta podría causar una dispensación incorrecta; esto puede evitarse llenando la pipeta, dispensando todo el líquido y llenándola de nuevo. Consulte el manual del usuario de la pipeta si desea obtener instrucciones de uso específicas.



Dispense el DR1 y el DR2 con la pipeta multicanal utilizando la técnica de pipeteo inverso (consulte “Protocolo 4: Detección de los híbridos” en la página 38). Compruebe que el ajuste y el llenado de todas las puntas de pipeta de la pipeta multicanal son correctos.



Asegúrese de lavar minuciosamente cada pocillo de la microplaca de captura (consulte “Protocolo 5: Lavado” en la página 40). Un lavado insuficiente causará un aumento del fondo y podría provocar resultados positivos falsos. La presencia de tampón de lavado residual en los pocillos de la microplaca de captura puede causar una reducción de la señal o una reproducibilidad deficiente.

Almacenamiento y manipulación de los reactivos

Componentes del kit

Una vez recibido el kit, consérvelo a 2–8 °C. El tampón de lavado x15, el reactivo de desnaturalización y el tinte indicador pueden conservarse a temperatura ambiente (15–30 °C), según se desee. Todos los reactivos se suministran listos para usar, excepto el reactivo de desnaturalización (DNR,

denaturation reagent

), las mezclas de las sondas y el tampón de lavado.

Reactivos preparados

Una vez preparado, el DNR es estable durante 3 meses a 2–8 °C.

Una vez preparado, el tampón de lavado es estable durante 3 meses a

2–30 °C.


digene

HPV Genotyping PS

Recogida y preparación de las muestras

Recoja y transporte las muestras del cuello del útero para analizarlas con la prueba

digene

HPV Genotyping PS utilizando uno de los siguientes dispositivos de recogida de muestras:



digene

HC2 DNA Collection Device (formado por un cepillo cervical y un medio de transporte de muestras [Sample Transport Medium

,

STM]).



Un dispositivo de recogida de tipo cepillo o un dispositivo de recogida combinado de escobillón/espátula colocado en solución PreservCyt.

No se han validado para el uso con esta prueba las muestras obtenidas utilizando otros dispositivos de recogida de muestras ni las transportadas en otros medios de transporte. Las características de rendimiento de esta prueba se establecieron únicamente con los dispositivos de recogida indicados.

Consulte las instrucciones de uso del

digene

HC2 DNA Collection Device para obtener información sobre procedimientos adicionales para la recogida y la manipulación de las muestras.

Muestras del cuello del útero en STM

Las muestras del cuello del útero recogidas en STM no requieren preparación antes analizarlas con la prueba

digene

HPV Genotyping PS.

Dado que la prueba

digene

HPV Genotyping PS es una prueba refleja para la prueba

digene

HC2 High-Risk HPV DNA, las muestras recogidas en STM se habrán desnaturalizado previamente y estarán listas para la realización del

“Protocolo 2: Adición de la mezcla de la sonda” de la prueba. Debe disponerse de al menos 225 µl de cada muestra recogida en STM desnaturalizada para realizar la prueba

digene

HPV Genotyping PS.

Muestras del cuello del útero en solución PreservCyt

Las muestras recogidas en PreservCyt requieren preparación antes de su análisis con la prueba

digene

HPV Genotyping PS.

Recoja las muestras de la manera habitual y prepare las extensiones de la prueba para citología vaginal ThinPrep

®

conforme a las instrucciones facilitadas por el fabricante. Tras su recogida, conserve las muestras recogidas en


digene


PreservCyt durante un máximo de 3 meses a 2–30 °C antes de preparar las muestras para la prueba

digene

HPV Genotyping PS. Las muestras recogidas en

PreservCyt no pueden congelarse.

El resultado de la preparación de las muestras con el kit

digene

HC2 Sample

Conversion es una muestra desnaturalizada lista para la realización del

“Protocolo 2: Adición de la mezcla de la sonda” de la prueba.


digene

HPV Genotyping PS

Procedimiento

Antes de comenzar



Deje transcurrir al menos 60 minutos para que el agitador incubador se estabilice a 55 °C ± 2 °C desde un inicio en frío. Si no se deja tiempo para este período de calentamiento, los resultados de la prueba podrían ser inexactos.



Asegúrese de que el baño María está a 65 °C y de que el nivel de agua es suficiente para sumergir todo el volumen de líquido de los tubos.



Imprima una nueva “Hoja de trabajo para el registro de datos de la prueba” y anote la siguiente información (consulte “Apéndice B: Hoja de trabajo para el registro de datos de la prueba” en la página 74):



Lugar de la prueba



Fecha de la prueba



Identificador del operador



Temperatura ambiente



Número de lote del kit de la prueba

digene

HPV Genotyping PS



Los controles y las muestras se procesan en una configuración de columnas de ocho pocillos de la microplaca. Cumplimente la “Hoja de trabajo para el registro de datos de la prueba” anotando los identificadores de todos los controles y las muestras necesarios en las posiciones de pocillos de la microplaca. Para cada prueba, los controles deben analizarse en las siguientes posiciones de la microplaca (consulte la Figura 1 más adelante):



Duplicaciones del control negativo 1 (NC1,

Negative Control 1

) en los pocillos A1, B1 y C1 de la microplaca.



Duplicaciones del control positivo 1 (PC1,

Positive Control 1

) en los pocillos D1, E1 y F1 de la microplaca.



Control negativo 2 (NC2) con la mezcla de la sonda 16 en el pocillo

G1 de la microplaca.



NC2 con la mezcla de la sonda 18 en el pocillo H1 de la microplaca.



NC2 con la mezcla de la sonda 45 en el pocillo A2 de la microplaca.


digene




Control positivo 2 (PC2) con la mezcla de la sonda 16 en el pocillo B2 de la microplaca.



PC2 con la mezcla de la sonda 18 en el pocillo C2 de la microplaca.



PC2 con la mezcla de la sonda 45 en el pocillo D2 de la microplaca.

22

Muestra

Figura 1. Posición de los controles y de las muestras en la microplaca.


digene

HPV Genotyping PS

Preparación de los reactivos

Cuestiones importantes antes de comenzar



Prepare las muestras recogidas en PreservCyt antes de estabilizar los reactivos y las muestras previamente desnaturalizadas a temperatura ambiente.



Extraiga de su lugar de almacenamiento las muestras y todos los reactivos necesarios antes de comenzar la prueba. Deje que alcancen una temperatura de 20–25 °C durante 15–30 minutos.



Deseche todos los reactivos preparados (a menos que se indique lo contrario) y las porciones de reactivos al final de la prueba.



Utilice la Tabla 1, presentada más adelante, para determinar el volumen necesario para cada reactivo en función del número de pruebas.

Tabla 1. Volúmenes necesarios de reactivos preparados y listos para usar.

Número de pruebas/tiras

*

4/5

Mezcla de la sonda del

VPH 16


VPH 18


VPH 45

Tampón de lavado DR1 DR2

0,77 ml 0,56 ml 0,56 ml > 1 litro 2,55 ml 2,55 ml

8/5 0,91 ml 0,70 ml 0,70 ml > 1 litro 3,45 ml 3,45 ml

12/8

16/8

20/11

24/11

28/12

1,05 ml 0,84 ml 0,84 ml > 1 litro 4,35 ml

1,19 ml 0,98 ml 0,98 ml > 1 litro 5,25 ml

1,33 ml 1,12 ml 1,12 ml > 1 litro 6,15 ml

1,47 ml 1,26 ml 1,26 ml > 1 litro 7,05 ml

4,35 ml

5,25 ml

6,15 ml

7,05 ml

1,61 ml 1,40 ml 1,40 ml > 1 litro 7,95 ml 7,95 ml

* El número de pruebas/tiras se basa en el análisis de una muestra para los tipos 16, 18 y

45 del VPH e incluye la cantidad de reactivo necesaria para los controles.


digene


24

Microplaca de captura

La microplaca de captura contiene doce tiras de ocho pocillos de captura en un bastidor de placa. Los pocillos de la microplaca de captura no usados deben extraerse del bastidor de placa, devolverse al envase de aluminio y conservarse para su uso en otras pruebas.

1.

Rotule la microplaca de captura con un identificador apropiado utilizando un rotulador.

2.

Determine el número de pocillos de la microplaca de captura necesarios conforme a la Hoja de trabajo para el registro de datos de la prueba cumplimentada.

3.

Coloque la microplaca de captura en posición invertida sobre una toallita

KimTowels limpia o sobre una hoja de papel absorbente de poca pelusa equivalente.

4.

Utilizando un dedo enguantado, o el borrador de un lápiz, empuje las tiras de pocillos de la microplaca de captura que no vayan a utilizarse para extraerlos del bastidor de placa.

5.

Devuelva las tiras de pocillos de la microplaca de captura extraídas al envase de aluminio, cierre el envase y guárdelo.

Nota : La microplaca de captura se almacena a 2–8 °C.

Reactivo de desnaturalización

Tenga cuidado al manipular el reactivo de desnaturalización. Consulte la página 13 si desea ver las advertencias y precauciones correspondientes.

1.

Añada 2 gotas de tinte indicador al frasco de reactivo de desnaturalización.

2.

Mezcle bien el DNR.

El DNR debe presentar un color morado oscuro uniforme.

3.

Rotule el DNR con la nueva fecha de caducidad.

Notas :



Una vez preparado, el DNR es estable durante 3 meses a 2–8 °C.



Si el color se desvanece, añada 1 gota más de tinte indicador y mezcle bien la solución antes de utilizarla.


digene

HPV Genotyping PS

Mezclas de las sondas

El análisis de cada muestra con respecto a los tipos 16, 18 y 45 del VPH requiere una mezcla de la sonda específica para cada tipo, con un total de tres mezclas de sondas por muestra. Se requiere una cantidad adicional de la mezcla de la sonda del VPH 16, ya que se utiliza para ocho pocillos de control de la microplaca. Se requiere una cantidad adicional de las mezclas de las sondas del VPH 18 y del VPH 45, ya que cada una de ellas se utiliza para dos pocillos de control de la microplaca.

Prepare cada mezcla de la sonda individualmente tal como se indica a continuación.




Prepare las mezclas de las sondas durante el

“Protocolo 1: Desnaturalización” (consulte la página 30).



Tenga extremo cuidado para impedir la contaminación con ARNasa. Utilice puntas de pipeta con barrera contra aerosoles para pipetear la sonda.



El diluyente de sonda es viscoso. Asegúrese de conseguir un vórtice visible al preparar las mezclas de las sondas; un mezclado incompleto puede reducir la señal.

1.

Para evitar el atrapamiento de la sonda en la tapa del vial, centrifugue brevemente cada vial de sonda para llevar el líquido al fondo del vial.

2.

Golpee suavemente el vial para mezclar el contenido.

3.

Determine los volúmenes necesarios para una dilución de 1:24:10 de sonda, diluyente de sonda y NP-40 al 5,5%, respectivamente, para preparar la mezcla de la sonda.

Nota : Se requieren 35 µl de mezcla de la sonda por pocillo de la microplaca.

Recomendación : Prepare una cantidad adicional de mezcla de la sonda para tener en cuenta el volumen que puede perderse en las puntas de pipeta o en la pared del vial. Utilice los volúmenes recomendados (consulte la Tabla 1 en la página 23), que incluyen el volumen adicional recomendado.


digene


4.

Rotule debidamente un nuevo recipiente desechable.

Según el número de pruebas, se recomienda usar un tubo de polipropileno de fondo redondo de 1,5 ml o de 5 ml.

5.

Pipetee la cantidad necesaria de diluyente de sonda (consulte la Tabla 2 más adelante) en el tubo rotulado.

6.

Pipetee la cantidad necesaria de la sonda en el diluyente de sonda (consulte la Tabla 2 más adelante) colocando la punta de pipeta en contacto con la pared interna del tubo justo por encima del menisco y expulsando el contenido.

Importante : No sumerja la punta de pipeta en el diluyente de sonda.


digene

HPV Genotyping PS

7.

Pipetee la cantidad necesaria de NP-40 al 5,5% (consulte la Tabla 2 más adelante) en el tubo rotulado.

Tabla 2. Preparación de la mezcla de la sonda.

Volumen de mezcla de la sonda necesario

0,56 ml

0,70 ml

0,77 ml

0,84 ml

0,91 ml

0,98 ml

1,05 ml

1,12 ml

1,19 ml

1,26 ml

1,33 ml

1,40 ml

1,47 ml

1,61 ml

Volumen de diluyente de sonda

384 µl

480 µl

528 µl

576 µl

624 µl

672 µl

720 µl

768 µl

816 µl

864 µl

912 µl

960 µl

1.008 µl

1.056 µl

Volumen de sonda

16 µl

Volumen de NP-

40 al 5,5%

160 µl

20 µl

22 µl

24 µl

200 µl

220 µl

240 µl

26 µl

28 µl

30 µl

32 µl

34 µl

36 µl

38 µl

40 µl

42 µl

44 µl

260 µl

280 µl

300 µl

320 µl

340 µl

360 µl

380 µl

400 µl

420 µl

440 µl

8.

Agite durante 5 segundos como mínimo a velocidad máxima para mezclar bien.

Debe generarse un vórtice visible.


digene


28

Tampón de lavado




Prepare el tampón de lavado durante el “Protocolo 3: Hibridación y captura de los híbridos” (consulte la página 36).



Para el método de lavado manual de la microplaca, prepare tres litros de tampón de lavado en el aparato de lavado.

Recomendación : Cada tres meses, limpie el aparato de lavado y los tubos con una solución de hipoclorito sódico al 0,5% y enjuáguelos bien con agua destilada o desionizada para prevenir una posible contaminación por la fosfatasa alcalina presente en bacterias y mohos.



Para el Automated Plate Washer, prepare el tampón de lavado y consérvelo en un recipiente tapado o prepare un litro y colóquelo en el depósito de lavado del lavador automático de placas.

1.

Mezcle bien el tampón de lavado x15 y añada el volumen necesario de tampón de lavado x15 (consulte la Tabla 3 más adelante) al recipiente especificado.

2.

Añada el volumen necesario de agua destilada o desionizada (consulte la

Tabla 3 más adelante) al recipiente especificado.

Tabla 3. Preparación del tampón de lavado.

Volumen de tampón de lavado necesario

1 litro

1,5 litros

2 litros

3 litros

Volumen de tampón de lavado x15

67 ml

100 ml

Volumen de agua destilada o desionizada

933 ml

1.400 ml

133 ml

200 ml

1.867 ml

2.800 ml

3.

Coloque una hoja limpia de papel absorbente de poca pelusa sobre las aberturas del recipiente y mezcle bien.


digene

HPV Genotyping PS

4.

Selle el recipiente o colóquelo en el instrumento correspondiente, según proceda.

5.

Rotule el tampón de lavado con la nueva fecha de caducidad.

Nota : Una vez preparado, el tampón de lavado es estable durante 3 meses a 2–30 °C.


Las muestras recogidas en PreservCyt requieren preparación antes de su análisis con la prueba

digene

HPV Genotyping PS. La prueba

digene

HPV

Genotyping PS requiere 225 µl de muestra preparada para realizar el análisis de los tipos 16, 18 y 45 del VPH. Para realizar esta prueba pueden utilizarse muestras recogidas en PreservCyt previamente preparadas y correctamente conservadas. Si queda una cantidad insuficiente de muestra recogida en

PreservCyt preparada, deben prepararse al menos 6 ml de muestra recogida en PreservCyt para realizar la prueba.

Consulte las instrucciones de uso del kit

digene

HC2 Sample Conversion para obtener información sobre la preparación manual de muestras recogidas en PreservCyt.

El resultado de la preparación de las muestras con el kit

digene

HC2 Sample

Conversion es una muestra desnaturalizada lista para la realización del

“Protocolo 2: Adición de la mezcla de la sonda” de la prueba (consulte la página 32). Prepare los controles por separado conforme al

“Protocolo 1: Desnaturalización” (consulte la página 30).


digene


30

Protocolo 1: Desnaturalización

Los controles necesarios con la prueba

digene

HPV Genotyping PS se desnaturalizan conforme a las instrucciones presentadas a continuación.




No desnaturalice las muestras recogidas en STM conforme al

“Protocolo 1: Desnaturalización”. Las muestras recogidas en STM se desnaturalizaron previamente a consecuencia del análisis con la prueba

digene

HC2 High-Risk HPV DNA y están listas para la realización del

“Protocolo 2: Adición de la mezcla de la sonda” de la prueba.



No desnaturalice las muestras recogidas en PreservCyt conforme al

“Protocolo 1: Desnaturalización”. La desnaturalización de las muestras recogidas en PreservCyt se realiza como parte de la preparación de las muestras. Las muestras recogidas en PreservCyt preparadas están listas para la realización del “Protocolo 2: Adición de la mezcla de la sonda” de la prueba.



Asegúrese de no derramar los controles ni salpicar el DNR al realizar este protocolo. La adición de DNR al tubo de control llena el tubo de manera que el líquido casi alcanza el borde superior. Consulte la página 13 si desea ver las advertencias y precauciones correspondientes.

Antes de comenzar



Asegúrese de que hay suficiente agua en el baño María para sumergir todo el volumen de los tubos.



Para evitar resultados positivos falsos, es fundamental que todo el material de control entre en contacto con el DNR.

1.

Rotule las tapas del NC1, PC1, NC2 y PC2.

Las tapas se reutilizarán para cerrar los tubos de control.

2.

Retire las tapas del NC1, PC1, NC2 y PC2 y colóquelas alejadas de posibles fuente de contaminación.

3.

Utilizando una pipeta monocanal con una punta de pipeta nueva para cada adición, pipetee 500 µl del DNR en cada tubo de control colocando la punta de pipeta por debajo de la superficie del líquido y dispensando el reactivo.


digene

HPV Genotyping PS

4.

Devuelva las tapas a los controles correspondientes y cierre los tubos.

Asegúrese de enroscar las tapas hasta que estén bien apretadas para evitar la contaminación o un derramamiento.

5.

Mezcle bien cada tubo de forma individual mediante agitación vorticial con sacudidas a alta velocidad durante al menos 30 segundos.

Importante : El mezclado tras la adición del DNR es un paso crítico.

6.

Incube los tubos en una gradilla flotante para tubos de microcentrífuga en un baño María a 65 ± 2 °C durante 45 ± 5 minutos.

Prepare las mezclas de las sondas necesarias durante esta incubación

(consulte “Preparación de los reactivos” en la página 23).

7.

Extraiga los tubos del baño María tras la incubación.

Los controles desnaturalizados pueden ser:



Analizados inmediatamente (continúe en “Protocolo 2: Adición de la mezcla de la sonda” en la página 32).



Almacenados (consulte “Punto de detención opcional” en la página 31).

Punto de detención opcional

Importante : No almacene ni envíe en nieve carbónica controles o muestras desnaturalizados.

Los controles desnaturalizados pueden conservarse a 2–8 °C hasta el día siguiente o a –20 °C conforme a las siguientes condiciones:



Puede realizarse un máximo de un ciclo de congelación/descongelación para conservación durante un máximo de 4 semanas.



Puede realizarse un máximo de tres ciclos de congelación/descongelación para conservación durante un máximo de 9 días.

Para cada ciclo de congelación/descongelación, se permite un máximo de

2 horas a temperatura ambiente durante el ciclo de descongelación.


digene


32

Protocolo 2: Adición de la mezcla de la sonda




La mezcla de la sonda es viscosa. Asegúrese de que la mezcla de la sonda está bien mezclada y de que se ha dispensado completamente la cantidad necesaria en cada pocillo de la microplaca de hibridación.



Al transferir los controles y las muestras a la microplaca de hibridación, siga estas indicaciones:



No toque la pared de los pocillos de la microplaca de hibridación, ya que pueden producirse resultados positivos falsos si no se transfieren las muestras con cuidado.



Limite la formación de burbujas de aire.



Utilice una punta de pipeta extralarga limpia para cada transferencia para evitar una contaminación cruzada.

Antes de comenzar



Si se han conservado muestras o controles desnaturalizados, déjelos estabilizarse a 20–25 °C.



Si las muestras recogidas en STM o en PreservCyt se han conservado en una gradilla de muestras y se va a utilizar el agitador vorticial MST

Vortexer 2 para el mezclado, retire y deseche las tapas de los tubos.

1.

Obtenga una microplaca de hibridación y rotúlela.

2.

Mezcle mediante agitación vorticial los tubos de control y de muestras utilizando uno de los métodos siguientes:

Cualquier tipo de muestra con un agitador vorticial

Agite cada tubo individualmente durante al menos 5 segundos a la velocidad máxima.


digene

HPV Genotyping PS

Muestras recogidas en STM con el MST Vortexer 2 a.

Según proceda, tape los tubos con una lámina selladora de tubos

DuraSeal y fije la tapa de la gradilla a la gradilla de muestras. b.

Agite la gradilla de muestras durante al menos 5 segundos a la velocidad máxima. c.

Coloque la gradilla de muestras inmediatamente sobre la mesa de trabajo y abra los cierres. Levante la tapa de la gradilla aproximadamente 1 cm y desplácela con cuidado hacia la izquierda y hacia la derecha para soltar los tubos que se hayan podido adherir a la lámina selladora de tubos DuraSeal. Retire la tapa de la gradilla levantándola verticalmente hasta desprenderla de la gradilla de muestras. d.

Retire con cuidado la lámina selladora de tubos DuraSeal de la tapa de la gradilla y deséchela.

Muestras recogidas en PreservCyt con el MST Vortexer 2 a.

Según proceda, tape los tubos con una lámina selladora de tubos

DuraSeal y fije la tapa de la gradilla a la gradilla de muestras. b.

Agite la gradilla de muestras durante al menos 10 segundos a la velocidad máxima. c.

Coloque la gradilla de muestras inmediatamente sobre la mesa de trabajo y abra los cierres. Levante la tapa de la gradilla aproximadamente 1 cm y desplácela con cuidado hacia la izquierda y hacia la derecha para soltar los tubos que se hayan podido adherir a la lámina selladora de tubos DuraSeal. Retire la tapa de la gradilla levantándola verticalmente hasta desprenderla de la gradilla de muestras. d.

Retire con cuidado la lámina selladora de tubos DuraSeal de la tapa de la gradilla y deséchela.


digene


34

3.

Utilizando una pipeta monocanal con puntas de pipeta extralargas, transfiera 75 µl de cada control o muestra al fondo del pocillo vacío de la microplaca de hibridación conforme a la Hoja de trabajo para el registro de datos de la prueba.

Según proceda, almacene el volumen restante siguiendo las instrucciones indicadas a continuación:



Tape los controles desnaturalizados con las tapas originales y almacénelos conforme a los límites indicados en “Punto de detención opcional” en la página 31.



Tape las muestras recogidas en STM con tapas de rosca nuevas para tubos de recogida de muestras y almacénelas conforme a las indicaciones descritas en las instrucciones de uso de la prueba

digene

HC2 High-Risk HPV DNA.



Tape las muestras recogidas en PreservCyt con una tapa nueva y almacénelas conforme a las indicaciones descritas en las instrucciones de uso del kit

digene

HC2 Sample Conversion.

4.

Una vez transferida la última muestra, cubra la microplaca de hibridación con una tapa para microplaca e incube la microplaca durante 10 minutos a

20–25 °C.

5.

Mezcle bien las mezclas de las sondas.

6.

Pipetee con cuidado 35 µl de la mezcla de la sonda apropiada en cada pocillo de la microplaca de hibridación utilizando una pipeta repetidora de desplazamiento positivo o monocanal y una punta nueva para cada adición de mezcla de la sonda.

Evite salpicar y tocar la pared de los pocillos de la microplaca de hibridación.

7.

Tape la microplaca de hibridación con una tapa para microplaca o con un sellador de placas y agítela durante 3 ± 2 minutos en el Rotary Shaker I configurado a 800 ± 100 rpm.


digene

HPV Genotyping PS

8.

Extraiga la microplaca de hibridación del Rotary Shaker I.

Retire la tapa para microplaca y colóquela sobre una superficie limpia.

Tras la agitación, los controles y las muestras recogidas en STM deben adquirir un color amarillo y las muestras recogidas en PreservCyt deben adquirir un color rosa.

Las muestras que se mantengan moradas pueden no haber recibido la cantidad apropiada de mezcla de la sonda. Añada 35 µl más de la mezcla de la sonda apropiada a las muestras que permanezcan moradas y agítelas de nuevo durante 3 ± 2 minutos en el Rotary Shaker I configurado a 800 ± 100 rpm.

Si una muestra permanece morada después de seguir este procedimiento, analice de nuevo la muestra.

9.

Continúe en “Protocolo 3: Hibridación y captura de los híbridos” en la página 36.


digene


Protocolo 3: Hibridación y captura de los híbridos

1.

Coloque la microplaca de hibridación junto a la microplaca de captura.

2.

Utilizando una pipeta de ocho canales, transfiera todo el contenido (unos

110 µl) de los pocillos de la microplaca de hibridación al fondo de los pocillos correspondientes de la microplaca de captura.

Utilice puntas de pipeta nuevas para cada transferencia y deje que escurra cada punta de pipeta para asegurarse de transferir completamente la muestra. Si lo desea, estabilice la pipeta apoyando la parte media de las puntas de pipeta sobre el borde superior de los pocillos de la microplaca de captura (consulte la Figura 2 más adelante).

Nota : Si el número de muestras es pequeño, puede utilizarse una pipeta monocanal con puntas de pipeta de 20–200 µl en lugar de una pipeta de ocho canales. Utilice puntas de pipeta nuevas para cada transferencia.

36

Correcto No pipetee verticalmente para evitar salpicaduras

No permita que la punta de pipeta toque la pared del pocillo de la microplaca

Figura 2. Técnica de pipeteo correcta.

3.

Tape la microplaca de captura con un sellador de placas nuevo e incube la microplaca de captura durante 120 ± 5 minutos a 1.100 ± 100 rpm en el agitador incubador estabilizado a 55 ± 2 °C.

4.

Una vez finalizada la incubación, extraiga la microplaca de captura del agitador incubador y extraiga con cuidado el sellador de placas.


digene

HPV Genotyping PS

5.

Decante el líquido de los pocillos de la microplaca de captura en una pila; invierta totalmente la microplaca de captura sobre la pila y agítela enérgicamente con un movimiento descendente.

Importante : No vuelva a invertir la placa.

Asegúrese de no salpicar decantando demasiado cerca del fondo de la pila.

6.

Seque dando firmemente 2–3 golpes suaves sobre toallitas KimTowels limpias o sobre hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes.

Asegúrese de eliminar todo el líquido de los pocillos de la microplaca de captura y de que la parte superior de la microplaca de captura está seca.

7.

Continúe en “Protocolo 4: Detección de los híbridos” en la página 38.


digene


38

Protocolo 4: Detección de los híbridos




Añada los reactivos a la microplaca de captura de izquierda a derecha utilizando una pipeta de ocho canales. Limpie las puntas de pipeta sobre el depósito desechable para reactivos para eliminar el exceso de reactivo antes dispensarlo a la microplaca de captura.



Si no se utiliza una pipeta de ocho canales, puede usarse en su lugar una pipeta repetidora de desplazamiento positivo apropiada. Dispense el DR1 en un tubo de polipropileno del tamaño suficiente para contener el volumen necesario.



Se recomienda utilizar la técnica de pipeteo inverso para mejorar la uniformidad de la dispensación del reactivo. El procedimiento se describe a continuación.



Si lo desea, puede estabilizarse la pipeta apoyando la parte media de las puntas de pipeta sobre el borde superior de los pocillos de la microplaca de captura. Asegúrese de no tocar la pared de los pocillos de la microplaca de captura, ya que podría producirse una contaminación cruzada de las muestras (consulte la Figura 2 en la página 36).

1.

Mezcle bien el DR1, mida con cuidado el volumen apropiado (consulte la

Tabla 1 en la página 23) y dispénselo en un depósito desechable para reactivos limpio.

2.

Pipetee con cuidado 75 µl de DR1 en cada pocillo de la microplaca de captura utilizando la técnica de pipeteo inverso, tal como se indica a continuación: a.

Acople puntas a una pipeta de ocho canales; asegúrese de que todas las puntas están firmemente ajustadas. b.

Presione el émbolo de la pipeta más allá del primer tope hasta el segundo tope. c.

Sumerja las puntas en el reactivo. d.

Suelte el émbolo lentamente y deje que el reactivo llene las puntas.


digene

HPV Genotyping PS

e.

Dispense el reactivo en los pocillos de la microplaca presionando el

émbolo hasta el primer tope. No suelte el émbolo hasta que las puntas de pipeta se hayan sumergido de nuevo en el reactivo. f.

Vuelva a llenar las puntas y repita el proceso hasta que todos los pocillos de la microplaca estén llenos.

Compruebe que se han llenado todos los pocillos de la microplaca de captura observando la intensidad del color rosa. Todos los pocillos de la microplaca de captura deben tener un color rosa de intensidad similar.

3.

Tape la microplaca de captura con una tapa para microplaca, Parafilm limpio o un elemento equivalente e incúbela durante 30–35 minutos a 20–25 °C.

4.

Continúe en “Protocolo 5: Lavado” en la página 40.


digene


40

Protocolo 5: Lavado

Lave la microplaca de captura utilizando uno de los métodos indicados a continuación.

Método con el Automated Plate Washer

Mantenga siempre encendido el Automated Plate Washer. El lavador automático de placas enjuagará sistemáticamente el sistema para limpiarlo.

Consulte el

Manual del usuario del Automated Plate Washer

si desea obtener más instrucciones.

Antes de comenzar



Compruebe que el depósito de lavado contiene al menos un litro de tampón de lavado. Si no es así, prepare el tampón de lavado (consulte

“Preparación de los reactivos” en la página 23).



Compruebe que el depósito de enjuague está rellenado con agua desionizada o destilada.



Compruebe que el depósito de residuos está vacío y que la tapa está bien ajustada.



El Automated Plate Washer realiza automáticamente un cebado antes de cada lavado y un enjuague después de cada lavado.



El Automated Plate Washer únicamente lava tiras completas y no puede saltarse pocillos o tiras. Si únicamente se está utilizando una tira parcial de pocillos de la microplaca de captura, coloque pocillos de microplaca vacíos en el bastidor de placa para completar la tira antes del lavado.

Todas las tiras lavadas deben tener pocillos de microplaca.

1.

Retire la tapa de la microplaca de captura, el Parafilm limpio o el elemento equivalente y coloque la microplaca de captura sobre la plataforma del

Automated Plate Washer.

2.

Compruebe que Automated Plate Washer está encendido y que la pantalla indica “Digene Wash Ready” (lavado de

digene

listo) o “P1”.

3.

Seleccione el número de tiras que van a lavarse pulsando la tecla “Rows”

(filas) y, a continuación, las teclas “+” o “–” para ajustar el valor.


digene

HPV Genotyping PS

4.

Pulse la tecla “Rows” para volver a la pantalla “Digene Wash Ready” o

“P1”.

5.

Pulse “Start/Stop” (iniciar/parar) para comenzar.

El Automated Plate Washer realizará seis ciclos de llenado y aspiración, con una duración aproximada de 10 minutos por cada ciclo. Tendrá lugar una breve pausa durante el programa; no extraiga la microplaca de captura antes de tiempo.

Cuando el Automated Plate Washer haya finalizado el lavado, se mostrará el mensaje “Digene Wash Ready” o “P1”.

6.

Retire la microplaca de captura de la plataforma del Automated Plate

Washer cuando haya finalizado el programa.

Los pocillos de la microplaca de captura deben tener un color blanco, y no debe quedar líquido residual rosa en los pocillos de la microplaca de captura.

7.

Continúe en “Protocolo 6: Amplificación de la señal” en la página 43.

Lavado manual de las placas

Antes de comenzar : Compruebe que el aparato de lavado contiene al menos un litro de tampón de lavado.

1.

Retire la tapa de la microplaca de captura, el Parafilm limpio o el elemento equivalente.

2.

Coloque toallitas KimTowels limpias u hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes sobre la microplaca de captura.

3.

Asegúrese de que las hojas de papel absorbente están en contacto con toda la superficie de la microplaca de captura y, a continuación, invierta con cuidado la microplaca de captura.

4.

Deje que la microplaca de captura escurra durante 1–2 minutos.

5.

Seque la microplaca de captura sobre toallitas KimTowels limpias u hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes.

Deseche con cuidado las hojas de papel absorbente usadas para evitar la contaminación con fosfatasa alcalina.


digene


6.

Utilizando el aparato de lavado, lave manualmente la microplaca de captura seis veces.

Para lavarla correctamente, haga rebosar cada pocillo de la microplaca de captura con tampón de lavado. De esta forma se eliminará el DR1 de los bordes superiores de los pocillos de la microplaca de captura. El lavado comienza en el pocillo A1 de la microplaca de captura y continúa de forma serpenteante hacia la derecha y hacia abajo. Una vez llenados todos los pocillos de la microplaca de captura, decante el líquido en la pila con un movimiento descendente enérgico. El segundo lavado se inicia en el pocillo H12 de la microplaca de captura con un movimiento serpenteante hacia la izquierda y hacia arriba.

Esta secuencia de dos lavados se repite dos veces más para un total de seis lavados de la microplaca de captura.

7.

Después del lavado, seque la microplaca de captura invirtiéndola sobre toallitas KimTowels limpias u hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes y dándole firmemente 3–4 golpes suaves. Sustituya las hojas de papel absorbente y seque la microplaca de nuevo.

8.

Deje invertida la microplaca de captura y deje que escurra durante

5 minutos. Sustituya las hojas de papel absorbente y seque la microplaca de nuevo.

La microplaca de captura debe tener un color blanco, y no debe quedar líquido residual rosa en los pocillos de la microplaca de captura.

9.

Continúe en “Protocolo 6: Amplificación de la señal” en la página 43.


digene

HPV Genotyping PS

Protocolo 6: Amplificación de la señal




Utilice un par de guantes desechables no empolvados nuevos para manipular el DR2.



Añada los reactivos a la microplaca de captura de izquierda a derecha utilizando una pipeta de ocho canales.



Si no se utiliza una pipeta de ocho canales, puede usarse en su lugar una pipeta repetidora de desplazamiento positivo apropiada. Dispense el DR2 en un tubo de polipropileno del tamaño suficiente para contener el volumen necesario.



Añada el DR2 sin interrupción. El tiempo de incubación de todos los pocillos de la microplaca de captura debe ser lo más parecido posible.



Asegúrese de no tocar la pared de los pocillos de la microplaca de captura ni salpicar el reactivo sobre las puntas de pipeta, ya que podría producirse una contaminación cruzada de las muestras (consulte la Figura 2 en la página 36).

1.

Mezcle bien el DR2, mida el volumen apropiado (consulte la Tabla 1 en la página 23) y dispénselo en un depósito desechable para reactivos limpio.

2.

Pipetee 75 µl de DR2 en cada pocillo de la microplaca de captura utilizando la técnica de pipeteo inverso previamente descrita (consulte

“Protocolo 4: Detección de los híbridos” en la página 38).

Compruebe que se han llenado con exactitud todos los pocillos de la microplaca de captura observando la intensidad del color amarillo; todos los pocillos de la microplaca de captura deben tener un color amarillo de intensidad similar.

3.

Tape la microplaca de captura con una tapa para microplacas e incube la microplaca a 20–25 °C durante 15 minutos (y no más de 30 minutos de incubación).

Evite la luz directa del sol.

4.

Continúe en “Protocolo 7: Medición de la microplaca de captura y generación de resultados” en la página 44.


digene


Protocolo 7: Medición de la microplaca de captura y generación de resultados

1.

Una vez finalizada la incubación, mida la microplaca de captura utilizando la función de medición de datos sin procesar de un instrumento DML.

Consulte el manual del usuario del software correspondiente para obtener información detallada sobre la medición de una microplaca de captura.

2.

Imprima el informe de datos sin procesar.

Importante : El informe de daros sin procesar debe imprimirse tras la medición. El informe de datos sin procesar no puede guardarse con el software de análisis de ensayos

digene

.

3.

Rotule debidamente el informe de datos sin procesar con la información especificada en la Hoja de trabajo para el registro de datos de la prueba.

4.

Si no se ha utilizado una microplaca de captura completa, retire del bastidor de placa los pocillos usados de la microplaca de captura, enjuague bien el bastidor de placa con agua desionizada o destilada, séquelo y resérvelo para la siguiente prueba.

5.

Deseche todas las porciones de reactivos y los reactivos preparados a menos que se especifique lo contrario.


digene

HPV Genotyping PS

Interpretación de los resultados

El valor de corte (CO,

cutoff

) de la prueba

digene

HPV Genotyping PS corresponde a 5.000 copias de plásmidos del VPH 16, 18 y 45.

Importante : Antes de interpretar los resultados de la prueba, complete todos los requisitos de verificación del control de calidad y de la calibración del ensayo

(consulte “Control de calidad” en la página 57).

Resultados de la prueba

El valor de corte para determinar muestras positivas es la media del PC1.

Utilizando la media calculada del PC1 durante la verificación de la calibración del ensayo, determine el cociente valor de RLU/valor de corte para cada muestra. Los resultados de la prueba se determinan tal como se indica a continuación:



Las muestras con un cociente valor de RLU/valor de corte ≥ 2,0 se consideran “positivas” para ese tipo de VPH.



Las muestras con un cociente valor de RLU/valor de corte < 2,0 se consideran “negativas” o “sin detección de ADN del VPH” para ese tipo de

VPH. No hay secuencias de ADN del VPH o los niveles de ADN del VPH son inferiores al límite de detección de la prueba.

Guía para la resolución de problemas

Comentarios y sugerencias

Se observa un cambio de color inapropiado o no se observa un cambio de color durante la desnaturalización de los controles a) Preparación incorrecta del DNR

Compruebe que el DNR contiene el tinte indicador y que tiene un color morado oscuro.


digene


46 b) No se ha añadido el

DNR a los controles.


Compruebe que se ha añadido el DNR a los controles midiendo el volumen en la microplaca. El volumen debe ser de 75 µl.

Si el volumen indica que no se ha añadido el

DNR, añada el volumen apropiado de DNR, mezcle y realice la prueba si se observa el cambio de color apropiado.

Los controles de calidad generan resultados incorrectos

Colocación incorrecta de los controles en la microplaca

Ajuste el procedimiento de verificación de la calibración del ensayo para que coincida con la “Hoja de trabajo para el registro de datos de la prueba”.

Asegúrese de que los resultados coincidan con los criterios apropiados de verificación de la calibración del ensayo.

Se observa un cambio de color inapropiado durante la adición de la mezcla de la sonda a) Mezclado insuficiente de la mezcla de la sonda con los controles y/o las muestras o adición de un volumen incorrecto de mezcla de la sonda.

Agite la microplaca de hibridación durante dos minutos más.

Si hay muestras que permanecen moradas, añada 35 µl más de la mezcla de la sonda apropiada y mezcle bien mediante agitación durante 3 minutos a 800 ± 100 rpm.

Si tras la adición y el remezclado de la mezcla de la sonda no tiene lugar el cambio de color apropiado y la muestra no contenía sangre ni otros materiales, vuelva a analizar la muestra.


digene

HPV Genotyping PS

b) La muestra contiene sangre u otros materiales que enmascaran el cambio de color.


No se espera el cambio de color descrito con estas muestras; los resultados de la prueba no deben verse afectados negativamente.

La prueba no supera la verificación de la calibración del ensayo; ausencia de señal en los controles o en las muestras a) La mezcla de la sonda se preparó sin la sonda.

Consulte “Preparación de los reactivos” en la página 23 si desea obtener instrucciones acerca de la preparación de la mezcla de la sonda. b) Contaminación de la mezcla de la sonda con ARNasa durante la preparación.

Use guantes desechables no empolvados y puntas de pipeta con barrera contra aerosoles para pipetear la sonda y la mezcla de la sonda. Prepare la mezcla de la sonda en recipientes estériles. c) Mezclado insuficiente durante la preparación de la mezcla de la sonda.

Después de añadir la sonda a la mezcla de la sonda, mezcle bien mediante agitación vorticial a alta velocidad durante al menos

5 segundos. Debe generarse un vórtice visible. d) Tiempo o temperatura incorrectos durante el

“Protocolo 3: Hibrida ción y captura de los híbridos”.

Vuelva a analizar las muestras. e) No se ha añadido la cantidad correcta de

DR1 o no se ha incubado durante el tiempo especificado.

Pipetee 75 µl del DR1 en cada pocillo de la microplaca utilizando una pipeta de ocho canales. Incube a 20–25 °C durante

30–35 minutos.


digene


f) No se ha añadido la cantidad correcta de

DR2 o no se ha incubado durante el tiempo especificado.


Pipetee 75 µl de DR2 en cada pocillo de la microplaca utilizando una pipeta de ocho canales. Incube a 20–25 °C durante

15–30 minutos. g) El instrumento DML no funciona bien.

Consulte los apartados de mantenimiento, servicio técnico y resolución de problemas del manual del usuario correspondiente si desea obtener instrucciones, o póngase en contacto con el servicio técnico de QIAGEN.

Valor elevado de RLU (≥ 200 RLU) de controles y/o muestras; es posible que la prueba no cumpla los criterios de verificación de la calibración del ensayo a) Adición de un volumen incorrecto de

DNR o mezclado insuficiente

Compruebe que la pipeta repetidora de desplazamiento positivo dispensa la cantidad exacta antes de añadir el DNR. Es esencial que las pipetas estén calibradas.

Añada un semivolumen de DNR a cada pocillo de la microplaca y mezcle bien. Para evitar resultados positivos falsos, asegúrese de que el líquido lave toda la superficie interna del pocillo de la microplaca. Los controles deben adquirir un color morado tras la adición del DNR.


digene

HPV Genotyping PS

b) Fuga de luz en el instrumento DML c) Contaminación del

DR2 o de los controles negativos con DR1 o fosfatasa alcalina exógena d) Contaminación del tampón de lavado


Realice una lectura de fondo (medición de datos sin procesar) del instrumento DML leyendo una microplaca vacía. Una lectura superior a 50 RLU indica que puede existir una fuga de luz.

Consulte los apartados de mantenimiento, servicio técnico y resolución de problemas del manual del usuario correspondiente si desea obtener instrucciones, o póngase en contacto con el servicio técnico de QIAGEN.

Consulte “Apéndice A: Procedimientos para la evaluación de la contaminación” en la página 71. e) Contaminación del

Automated Plate

Washer f) Lavado insuficiente de los pocillos de la microplaca de captura tras la incubación con el

DR1

Consulte “Apéndice A: Procedimientos para la evaluación de la contaminación” en la página 71.


Lave bien los pocillos de la microplaca con el tampón de lavado seis veces, haciendo rebosar los pocillos de la microplaca cada vez, o utilice el Automated Plate Washer. No debe verse ningún líquido rosa residual en los pocillos de la microplaca tras el lavado.

Consulte el

Manual del usuario del

Automated Plate Washer

si desea obtener instrucciones para comprobar si existen contaminación o fallos de funcionamiento.


digene


Comentarios y sugerencias g) Contaminación de los controles negativos con el DR1

Asegúrese de que todas las superficies de trabajo están limpias y secas. Tenga cuidado al usar el DR1. Evite generar aerosoles. h) Contaminación de la microplaca de captura durante la decantación y el secado i) Uso de hojas de papel absorbente de secado incorrectas j) Se ha usado material

PC2 como PC1 o la prueba no ha superado la verificación del ensayo con respecto a la razón

PC1/NC1.

Seque siempre la microplaca de captura sobre toallitas KimTowels limpias u hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes nuevas.

No seque la microplaca de captura sobre hojas de papel absorbente previamente usadas, ya que podría producirse una contaminación cruzada.

Use toallitas KimTowels u hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes para el secado.

Repita la prueba y asegúrese de que se usen los controles apropiados.


digene

HPV Genotyping PS


Razón PC/NC baja o número alto (> 20%) de muestras con resultados positivos bajos; es posible que la prueba no cumpla los criterios de verificación de la calibración del ensayo a) Preparación inadecuada de las muestras

Durante la desnaturalización, asegúrese de añadir el volumen correcto del DNR a cada muestra. Mezcle bien mediante agitación vorticial. Para evitar resultados positivos falsos, asegúrese de que el líquido lave toda la superficie interna del tubo.

Durante la preparación de las muestras recogidas en PreservCyt, asegúrese de que la muestra se mezcle correctamente y de que la resuspensión del sedimento celular haya finalizado antes de la incubación de desnaturalización. Consulte las instrucciones de uso del kit

digene

HC2 Sample

Conversion si desea obtener más información.

La muestra debe experimentar un cambio de color evidente a morado oscuro. Incube durante 45 ± 5 minutos a 65 ± 2 °C. b) Desnaturalización insuficiente de los controles

Asegúrese de que la temperatura del baño

María es exacta y de que hay suficiente agua en el baño María para sumergir todo el volumen de los tubos.

Asegúrese de que se mezclen bien los controles tras la adición del DNR.


digene


52 c) Mezclado insuficiente de la mezcla de la sonda o adición de un volumen insuficiente de la mezcla de la sonda a los controles y/o las muestras


Durante la preparación de la mezcla de la sonda, mezcle bien la mezcla de la sonda mediante agitación vorticial y asegúrese de que se ve un vórtice. La mezcla de la sonda debe añadirse a los pocillos de la microplaca con una pipeta repetidora de desplazamiento positivo o con una pipeta multicanal para garantizar una dispensación exacta.

Consulte “Preparación de los reactivos” en la página 23 si desea obtener más instrucciones. d) Adición de un volumen insuficiente de la mezcla de la sonda a los controles y/o las muestras e) Pérdida de actividad del DR1

Compruebe que la pipeta dispensa la cantidad exacta antes de añadir la mezcla de la sonda a los controles y/o las muestras. f) Captura insuficiente de los híbridos de

ADN-ARN

Asegúrese de conservar el DR1 a la temperatura especificada (consulte

“Almacenamiento y manipulación de los reactivos” en la página 18).

Asegúrese de que el agitador incubador funciona correctamente y de que está calibrado. g) Lavado insuficiente Lave bien los pocillos de la microplaca con el tampón de lavado seis veces, haciendo rebosar los pocillos de la microplaca cada vez, o utilice el Automated Plate Washer. h) Contaminación del tampón de lavado



digene

HPV Genotyping PS


Serie de muestras positivas con valores de RLU aproximadamente iguales a) Contaminación de los pocillos de la microplaca de captura

Tape la microplaca de captura durante todas las incubaciones. Evite exponer los reactivos y la microplaca de captura a la contaminación por aerosoles durante la realización de la prueba.

Use guantes no empolvados al realizar la prueba. b) Contaminación del

DR2 c) Fallo de funcionamiento del

Automated Plate

Washer

Asegúrese de no contaminar el DR2 al pipetearlo en los pocillos de la microplaca de captura. Evite la contaminación del DR2 por aerosoles.

Consulte el

Manual del usuario del

Automated Plate Washer

si desea obtener instrucciones para comprobar si existen contaminación o fallos de funcionamiento.

CV alto de las duplicaciones de los controles a) Pipeteo inexacto durante la realización de la prueba

Asegúrese de que la pipeta dispensa la cantidad exacta. Calibre sistemáticamente las pipetas usadas. b) Mezclado insuficiente durante la realización de la prueba

Asegúrese de mezclar bien en todos los pasos, especialmente durante la desnaturalización y tras la adición de la mezcla de la sonda.


digene


c) Transferencia incompleta del líquido desde los pocillos de la microplaca de hibridación a los pocillos de la microplaca de captura


Asegúrese de que tiene lugar una transferencia completa de líquido desde los pocillos de la microplaca de hibridación a los pocillos de la microplaca de captura. d) Lavado inapropiado de los pocillos de la microplaca

Lave bien los pocillos de la microplaca con el tampón de lavado seis veces, haciendo rebosar los pocillos de la microplaca cada vez, o utilice el Automated Plate Washer.

No debe verse ningún líquido rosa residual en los pocillos de la microplaca tras el lavado. e) Contaminación de los pocillos de la microplaca con el

DR1.

Asegúrese de que todas las superficies de trabajo están limpias y secas. Tenga cuidado al usar el DR1. Evite generar aerosoles.


digene

HPV Genotyping PS


Obtención de resultados positivos falsos en muestras negativas conocidas a) Preparación inadecuada de las muestras

Asegúrese de añadir el volumen correcto del

DNR a cada control y a cada muestra.

Mezcle bien mediante agitación vorticial.

Para evitar resultados positivos falsos, asegúrese de que el líquido lave toda la superficie interna del tubo.

Durante la preparación de las muestras recogidas en PreservCyt, asegúrese de que la muestra se mezcle correctamente y de que la resuspensión del sedimento celular haya finalizado antes de la incubación de desnaturalización. Consulte las instrucciones de uso del kit

digene

HC2 Sample

Conversion si desea obtener más información.

Debe observarse un cambio de color evidente a morado oscuro. Incube durante

45 ± 5 minutos a 65 ± 2 °C. b) Contaminación de la punta de pipeta con material desnaturalizado durante la transferencia de la muestra al pocillo de la microplaca de hibridación

Un mezclado insuficiente puede causar una desnaturalización incompleta de híbridos de

ADN-ARN inespecíficos propios de las muestras del cuello del útero.

En particular, es probable que las muestras recogidas en PreservCyt tengan estos híbridos presentes en la pared del tubo de muestras.

Para prevenir un posible arrastre de este material celular desnaturalizado, no deje que la punta de pipeta entre en contacto con la pared del tubo de muestras durante la transferencia de la muestra al pocillo de la microplaca de hibridación.


digene


56

Comentarios y sugerencias c) Contaminación de los pocillos de la microplaca con el

DR1


No debe verse ningún líquido rosa residual en los pocillos de la microplaca tras el lavado. d) Contaminación de la microplaca de captura durante la decantación y el secado

Seque siempre la microplaca de captura sobre toallitas KimTowels limpias u hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes nuevas.

No seque la microplaca de captura sobre hojas de papel absorbente previamente usadas, ya que podría producirse una contaminación cruzada. e) Lavado inapropiado de los pocillos de la microplaca de captura f) Contaminación del

DR2


No debe verse ningún líquido rosa residual en los pocillos de la microplaca tras el lavado.

Asegúrese de que no se produzca una contaminación cruzada de las muestras al añadir el DR2 a estas.

Si se utiliza parte de un kit, dispense el volumen necesario de DR2 para esa prueba en un depósito desechable para reactivos limpio antes de llenar la pipeta.


digene

HPV Genotyping PS


Valores elevados de RLU del NC1 (> 150 RLU) con una prueba con el rendimiento previsto a) La incubación de la microplaca de captura con el DR2 se ha realizado fuera del período de tiempo o del intervalo de temperatura especificados

Los resultados de la prueba no son válidos.

Repita la prueba y asegúrese de que la microplaca de captura se incuba durante el período de tiempo apropiado a la temperatura especificada. b) Contaminación del

DR2 o del tampón de lavado con fosfatasa alcalina o DR1


Control de calidad

Verificación de la calibración del ensayo

La verificación de la calibración del ensayo se realiza para confirmar que los reactivos, los calibradores y los controles de calidad funcionan correctamente y permiten la determinación exacta del valor de corte del ensayo. La prueba

digene

HPV Genotyping PS requiere la calibración del ensayo con cada prueba; por consiguiente, es necesario verificar cada prueba. Este procedimiento de verificación de la calibración del ensayo no está destinado a reemplazar a la prueba de control de calidad interno. Se han establecido intervalos aceptables para la verificación de la calibración del ensayo

únicamente para instrumentos DML aprobados por QIAGEN.

La prueba debe cumplir los criterios especificados de verificación de la calibración del ensayo. Si alguno de los criterios indicados a continuación no es válido, los resultados de la prueba no son válidos.


digene


58

Control negativo 1

El NC1 debe analizarse por triplicado con cada prueba utilizando la mezcla de la sonda del VPH 16. Realice los siguientes pasos para verificar la calibración del ensayo de las duplicaciones del NC1.

1.

Calcule la media y el coeficiente de variación (CV) de las tres duplicaciones del NC1.

Una media válida del NC1 es ≥ 10 y ≤185 RLU y el CV es ≤ 35%. Haga lo siguiente:



Si se cumplen los criterios de verificación de la calibración del ensayo necesarios para el NC1, realice la verificación de la calibración del ensayo del PC1.



Si no se cumplen los criterios de verificación de la calibración del ensayo necesarios para el NC1, continúe con este procedimiento.

Nota

: La fórmula para calcular el CV es la siguiente: (desviación estándar/media) x 100 = CV%

2.

Elimine como valor atípico la duplicación del NC1 que tenga el valor de RLU más alejado de la media previamente calculada.

3.

Calcule la media y el CV con las dos duplicaciones del NC1 restantes.

Si la media y el CV cumplen los criterios de verificación de la calibración del ensayo necesarios para el NC1, realice la verificación de la calibración del ensayo del PC1.

Si no se cumplen los criterios de verificación de la calibración del ensayo necesarios para el NC1, la calibración del ensayo no es válida y la prueba debe repetirse para todas las muestras. En consecuencia, no elabore un informe de los resultados de la prueba

digene

HPV Genotyping PS.

Control positivo 1

El PC1 debe analizarse por triplicado con cada prueba utilizando la mezcla de la sonda del VPH 16. Realice los siguientes pasos para verificar la calibración del ensayo de las duplicaciones del PC1.


digene

HPV Genotyping PS

1.

Calcule la media y el CV de las tres duplicaciones del PC1.

Un CV válido del PC1 es ≤ 25%. Haga lo siguiente:



Si se cumple el criterio de verificación de la calibración del ensayo necesario para el PC1, realice la verificación de la calibración del ensayo de la media de PC1/NC1.



Si no se cumple el criterio de verificación de la calibración del ensayo necesario para el PC1, continúe con este procedimiento.

2.

Elimine como valor atípico la duplicación del PC1 que tenga el valor de RLU más alejado de la media previamente calculada.

3.

Calcule la media y el CV con las dos duplicaciones del PC1 restantes.

Si el CV cumple el criterio de verificación de la calibración del ensayo necesario para el PC1, realice la verificación de la calibración del ensayo de la media de PC1/NC1.

Si no se cumple el criterio de verificación de la calibración del ensayo necesario para el PC1, la calibración del ensayo no es válida y la prueba debe repetirse para todas las muestras. En consecuencia, no elabore un informe de los resultados de la prueba

digene

HPV Genotyping PS.

Media del control positivo 1/media del control negativo 1

Utilizando la media del PC1 y la media del NC1 previamente calculadas, calcule la razón PC1/NC1.

Una razón PC1/NC1 válida es ≥ 2,0 y ≤ 15,0. Haga lo siguiente:



Si se cumple el criterio de verificación de la calibración del ensayo necesario para la razón PC1/NC1, realice la verificación de la calibración del ensayo de los controles de calidad específicos de la sonda.



Si no se cumple el criterio de verificación de la calibración del ensayo necesario para la razón PC1/NC1, la calibración del ensayo no es válida y la prueba debe repetirse para todas las muestras. En consecuencia, no elabore un informe de los resultados de la prueba

digene

HPV

Genotyping PS.


digene


60

Controles de calidad específicos de la sonda

Con la prueba

digene

HPV Genotyping PS se suministran muestras de control de calidad que deben usarse para el control de calidad interno de cada ejecución de la prueba. Los controles de calidad suministrados son dianas de

ADN del VPH clonadas y no proceden de VPH natural. Es el mismo tipo de material usado para el NC1 y para el PC1. Pueden analizarse controles de calidad adicionales conforme a las directrices o requisitos de las normativas locales o nacionales o de los organismos de acreditación. Los controles de calidad suministrados no servirán como control de calidad apropiado para el procesamiento de la solución PreservCyt.

Para que un ensayo sea válido, el cociente valor de RLU/valor de corte de cada control de calidad debe encontrarse dentro de los intervalos definidos en los criterios especificados en la Tabla 4 más adelante.

Si algún control de calidad no está dentro de estos intervalos, la prueba no es válida y debe repetirse para todas las muestras. En consecuencia, no elabore un informe de los resultados de la prueba

digene

HPV Genotyping PS.

Tabla 4. Criterios de validez del ensayo de los controles de calidad.

Control de calidad

NC2

PC2

Mínimo (RLU/CO)

0,001

2,0

Máximo (RLU/CO)

0,999

10,0

Limitaciones



La detección del VPH con la prueba

digene

HPV Genotyping PS no descarta una infección por más de un tipo de VPH.



El ensayo únicamente detecta los tipos de alto riesgo 16, 18 y 45 del VPH.

La muestra puede contener otros tipos de VPH de alto riesgo y de bajo riesgo.



Las muestras que contengan más de un 1,25% (v/v) de sangre pueden dar un resultado negativo falso en la prueba.


digene

HPV Genotyping PS



La infección por el VPH no es un indicador definitivo de que exista una lesión de cérvix de alto grado ni implica en todos los casos que se desarrollará una lesión de cérvix de alto grado o un cáncer.

Características del rendimiento

Concordancia entre la prueba

digene

HPV Genotyping PS y una prueba validada de genotipificación del VPH mediante PCR cuantitativa

Se realizó una evaluación del rendimiento en QIAGEN para determinar la concordancia del resultado de la prueba para la identificación de los tipos 16,

18 y 45 del VPH utilizando la prueba

digene

HPV Genotyping PS en comparación con una prueba cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR,

quantitative polymerase chain reaction

) validada.

Se obtuvo un total de 287 muestras del cuello del útero en PreservCyt y

290 muestras del cuello del útero en STM archivadas de una población de cribado de rutina. Se determinó el resultado de la prueba

digene

HC2 High-

Risk HPV DNA para cada muestra antes de la inclusión en el estudio. Los resultados de la prueba

digene

HC2 High-Risk HPV DNA fueron los siguientes:



238 muestras positivas recogidas en STM



52 muestras negativas recogidas en STM



237 muestras positivas recogidas en PreservCyt



50 muestras negativas recogidas en PreservCyt

Para cada tipo de VPH (16, 18 y 45), se analizó cada muestra por triplicado con la prueba

digene

HPV Genotyping PS y con el método de análisis qPCR para la detección del tipo de VPH respectivo con un total de 1.731 resultados de la prueba para cada método de análisis. Tras la resolución de los resultados discordantes, seguía habiendo 11 resultados discordantes (consulte la Tabla 5 más adelante).

La concordancia de la prueba

digene

HPV Genotyping PS con la qPCR fue del

99,4% (1.720/1.731) con un intervalo de confianza (IC) del 95% de

98,9–99,6%.


digene


62

Tabla 5. Concordancia del resultado de la prueba

digene

HPV Genotyping PS con el resultado de la prueba de qPCR.

Resultado de la prueba de qPCR

+

–

Resultado de la prueba

digene

HPV

Genotyping PS

+

110

7

–

4

1.610

Concordancia en la detección de genotipos específicos del VPH

La concordancia del resultado de la prueba

digene

HPV Genotyping PS con el de la prueba de qPCR se determinó según el genotipo del VPH (consulte la

Tabla 6 más adelante).


digene

HPV Genotyping PS con el resultado de la prueba de qPCR para el genotipo del VPH.

Genotipo

VPH 16

VPH 18

VPH 45

Concordancia (%)

(n/N)

IC del 95%

99,1

(572/577)

98,0-99,6

99,7

(575/577)

98,7-99,9

99,3

(573/577)

98,2-99,7


digene

HPV Genotyping PS

Concordancia de los resultados de la prueba según el tipo de muestra

La concordancia del resultado de la prueba

digene

HPV Genotyping PS con el de la prueba de qPCR se determinó según el tipo de muestra (consulte la

Tabla 7 más adelante).


digene

HPV Genotyping PS con el resultado de la prueba de qPCR para el tipo de muestra.

Tipo de muestra

Muestras recogidas en STM

Muestras recogidas en PreservCyt

Concordancia (%)

(n/N)

IC del 95%

99,8

(868/870)

99,2-99,9

99,0

(852/861)

98,0-99,4%

Especificidad analítica

Se analizó un panel no clínico de ADN plasmídico de VPH clonado a una concentración de 1E+7 copias por ensayo con cada una de las tres mezclas de las sondas del VPH (16, 18 y 45) usadas en la prueba

digene

HPV

Genotyping PS. El análisis determinó que no existía reactividad cruzada entre las tres mezclas de las sondas del VPH y el siguiente ADN plasmídico del VPH:



Tipos de VPH de alto riesgo 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53,

56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82



Tipos de VPH de bajo riesgo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 30, 34, 34, 40,

42, 43, 44, 67, 69, 70 y 71


digene


64

Reproducibilidad

Se determinó la reproducibilidad global de la prueba

digene

HPV

Genotyping PS. El análisis se realizó en las instalaciones de QIAGEN utilizando tres lotes diferentes del kit, siendo la prueba realizada por tres operadores diferentes en tres laboratorios diferentes. Cada operador analizó los mismos componentes del panel por triplicado durante un mínimo de 5 días.

Reproducibilidad con muestras recogidas en STM

El panel para la reproducibilidad con muestras recogidas en STM estaba formado por soluciones plasmídicas para cada tipo de VPH analizado

(VPH 16, 18 y 45) a las siguientes concentraciones:



0 pg/ml (negativo)



0,5 pg/ml (negativo alto)



1,5 pg/ml (positivo bajo)



10 pg/ml (positivo alto)

Los resultados observados de la prueba mostraron una concordancia del 100% con los resultados previstos de la prueba. Según los resultados del análisis de reproducibilidad con muestras recogidas en STM, la prueba

digene

HPV

Genotyping PS presenta una reproducibilidad alta con muestras recogidas en

STM.

Reproducibilidad con muestras recogidas en PreservCyt

El panel para la reproducibilidad con muestras recogidas en PreservCyt estaba formado por células SiHa con positividad para el VPH 16 a las siguientes concentraciones:



0 células/ensayo (negativo)



250–750 células/ensayo (negativo alto)



1.000–5.000 células/ensayo (positivo bajo)



> 5.000 células/ensayo (positivo alto)

Los resultados observados de la prueba mostraron una concordancia del 95,3%

(103/108) con los resultados previstos de la prueba. Según los resultados del


digene

HPV Genotyping PS

análisis de reproducibilidad con muestras recogidas en PreservCyt, la prueba

digene

HPV Genotyping PS presenta una reproducibilidad alta con muestras recogidas en PreservCyt.

Recuperación de ADN para muestras recogidas en STM y para muestras recogidas en PreservCyt

Se examinaron muestras recogidas en STM y muestras recogidas en PreservCyt para la recuperación de ADN del VPH 16. Se añadieron células SiHa al STM y a la solución PreservCyt a las siguientes concentraciones:



500 células/ensayo (negativo alto)



2.000 células/ensayo (positivo bajo)



5.000 células/ensayo (positivo alto)

Cada tipo de muestra se procesó conforme a sus respectivos procedimientos de preparación y desnaturalización de las muestras tal como se describe en las instrucciones de uso correspondientes y se analizó con la prueba

digene

HPV

Genotyping PS utilizando la mezcla de la sonda del VPH 16.

Los resultados demostraron que la recuperación de ADN del VPH 16 a partir de células de carcinoma humano es equivalente con los dos medios y que la preparación de las muestras recogidas en PreservCyt no afecta a la sensibilidad analítica de la prueba

digene

HPV Genotyping PS.

Reactividad cruzada

Panel de reactividad cruzada

Se analizó un panel de microorganismos presentes habitualmente en el tracto anogenital femenino para determinar si se produciría reactividad cruzada con la prueba

digene

HPV Genotyping PS. Todos los microorganismos se analizaron a concentraciones de 10

5

a 10

7

microorganismos por mililitro.

Se analizaron los siguientes microorganismos, que no mostraron reactividad cruzada con la prueba

digene

HPV Genotyping PS:



Acinetobacter anitratus

(ATCC 49139)



Acinetobacter lwoffi

(ATCC 17925)


digene


66



Bacteroides fragilis

(ATCC 25285)



Bacteroides melaninogenicus

(ATCC 25845)



Candida albicans

(ATCC 10231)



Chlamydia trachomatis

(ATCC VR-878)



Enterobacter cloacae

(ATCC 13047)



Escherichia coli

HB101 (ATCC 33694)



Escherichia coli

(ATCC 25922)



Fusobacterium nucleatum

(ATCC 25586)



Gardnerella vaginalis

(ATCC 49145)



Haemophilus ducreyi

(ATCC 700724)



Klebsiella pneumonia

(ATCC 13883)



Lactobacillus acidophilus

(ATCC 4356)



Mobiluncus curtisii

(ATCC 35241)



Mobiluncus mulieris

(ATCC 35243)

Reactividad cruzada determinada mediante análisis de secuencias

Para asegurarse de que ninguna secuencia superpuesta presentaría reactividad cruzada con los oligonucleótidos utilizados en las mezclas de las sondas de la prueba

digene

HPV Genotyping PS, se realizó un análisis de secuencias

(BLAST) frente a los siguientes virus:



Adenovirus 2



Citomegalovirus



Virus de Epstein-Barr



Suero con positividad para el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B



Virus del herpes simple 1



Virus del herpes simple 2



Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH, RT-ADN)


digene

HPV Genotyping PS

 pBR322



Virus simio de tipo 40 (SV40)

Los resultados del análisis de secuencias mostraron que sería improbable que las mezclas de las sondas de la prueba

digene

HPV Genotyping PS presentaran hibridación cruzada con los virus indicados y que causaran un resultado positivo falso de la prueba.

Efecto de la sangre y de otras sustancias sobre las muestras recogidas en STM

Se evaluó el efecto de la sangre y de otras sustancias potencialmente interferentes definidas en la prueba

digene

HPV Genotyping PS. Se añadieron sangre completa, jalea anticonceptiva, espermicida, humectante, anestésico hemorroidal, aceite corporal, crema antimicótica y lubricante vaginal (agentes que pueden estar presentes habitualmente en las muestras del cuello del útero) al STM a concentraciones a las que pueden estar presentes en las muestras de cuello de útero.

No se observaron resultados positivos falsos con ninguno de estos agentes a ninguna concentración. Sin embargo, se observaron resultados negativos falsos en el análisis con sangre a la concentración de entrada deseada más baja de

2 pg/ml. Con una concentración deseada de 2 pg/ml, se observó interferencia en la detección con concentraciones de sangre iguales o superiores a

17,5 μl/ml (1,75% v/v). No se observó interferencia con concentraciones de sangre de 12,5 μl/ml (1,25% v/v). No se observaron resultados negativos falsos con ninguno de los demás agentes analizados.

Efecto de la sangre y de otras sustancias sobre las muestras recogidas en PreservCyt

Se evaluó el efecto de la sangre y de otras sustancias potencialmente interferentes definidas en la prueba

digene

HPV Genotyping PS. Se añadieron sangre completa, jalea anticonceptiva, espermicida, humectante, anestésico hemorroidal, aceite corporal, crema antimicótica y lubricante vaginal (agentes que pueden estar presentes habitualmente en las muestras del cuello del útero) a la solución PreservCyt a concentraciones a las que pueden estar presentes en


digene


68 las muestras del cuello del útero. No se observaron resultados positivos falsos ni negativos falsos con ninguno de estos agentes a ninguna de las concentraciones analizadas.

Bibliografía

QIAGEN mantiene online una extensa base de datos actualizada de publicaciones científicas en las que se utilizan los productos de QIAGEN. Las exhaustivas opciones de búsqueda permiten al usuario encontrar los artículos que necesita, ya sea mediante una búsqueda sencilla con una palabra clave o especificando la aplicación, el área de investigación, el título, etc.

Si desea obtener una lista bibliográfica completa, visite la base de datos bibliográfica online de QIAGEN en www.qiagen.com/RefDB/search.asp o póngase en contacto con el servicio técnico de QIAGEN o con su distribuidor local.

Referencias citadas

1.

Broker, T. R. and Botchan, M. (1986) Papillomaviruses: retrospectives and prospectives. In: Botchan, M., Grodzicker, T., and Sharp, P., eds.

DNA Tumor Viruses: Control of Gene Expression and Replication.

Cold

Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 17-36.

From the 1985 Cancer Cells Conference at Cold Spring Harbor.

2.

Lorincz, A.T. and Reid, R. (1989) Association of human papillomavirus with gynecologic cancer. Curr. Opin. Oncol. 1, 123.

3.

Jenson, A.B., Kurman, R.J., and Lancaster, W.D. (1984) Human papillomaviruses. In: Belshe, R.B.

Textbook of Human Virology.

Littleton,

MA: PSG-Wright, p 951.

4.

Becker, T.M., Stone, K.M., and Alexander, E.R. (1987) Genital human papillomavirus infection: a growing concern. Obstet. Gynecol. Clin.

North Am. 14(2) , 389.

5.

McCance, D.J., Walker, P.G., Dyson, J.L., Coleman, D.V., and Singer, A.

(1983) Presence of human papillomavirus DNA sequences in cervical intraepithelial neoplasia. Br. Med. J. 287 , 784.


digene

HPV Genotyping PS

6.

Naghashfar, Z. et. al. (1985) Identification of genital tract papillomaviruses HPV-6 and HPV-16 in warts of the oral cavity. J. Med.

Virol. 17 , 313.

7.

Gissmann, L., Wolnik, L., Ikenberg, H., Koldovsky, U., Schnurch, H.G., and zur Hausen, H. (1983) Human papillomavirus types 6 and 11 DNA sequences in genital and laryngeal papillomas and in some cervical cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 , 560.

8.

Munoz, N., Bosch, F.X., Shah, K.V., and Meheus, A., eds. (1992)

IARC

Scientific Publications no. 119: The Epidemiology of Cervical Cancer and

Human Papillomavirus

. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer.

9.

Kjaer, S.K., Frederiksen, K., Munk, C., and Iftner, T. (2010) Long-term absolute risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 or worse following human papillomavirus infection: role of persistence. J. Natl.

Cancer Inst. 102 , 1478.

10.

de Sanjose, S. et al. (2010) Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study. Lancet Oncol. 11 , 1048.

11.

Wright J.D. et al. (2005) Human papillomavirus type and tobacco use as predictors of survival in early stage cervical carcinoma. Gynecol. Oncol.

98(1) , 84.

12.

Centers for Disease Control (1987) Recommendations for prevention of

HIV transmission in health-care settings. MMWR Morb. Mortal. Wkly.

Rep.

36(Suppl 2)

, 3S.

13.

Sehulster, L.M., Hollinger, F.B., Dreesman, G.R., and Melnick, J.L. (1981)

Immunological and biophysical alteration of hepatitis B virus antigens by sodium hypochlorite disinfection. Appl. Environ. Microbiol. 42(5) , 762

14.

Martin, L.S., McDougal, J.S., and Loskoski, S.L. (1985) Disinfection and inactivation of the human T lymphotropic virus type III/lymphadenopathy-associated virus. J. Infect. Dis. 152(2) , 400.


digene


70

Símbolos

En estas instrucciones de uso se utilizan los siguientes símbolos:

Símbolo Definición del símbolo

Contenido suficiente para < n > pruebas

Producto sanitario para diagnóstico

in vitro

Número de referencia

Numero mundial de articulo comercial

Fabricante

Representante autorizado en la Comunidad Europea

Fecha de caducidad

Consultar instrucciones de uso

Información de contacto

Para recibir asistencia técnica y solicitar más información, consulte nuestro

Centro de Asistencia Técnica en www.qiagen.com/Support o póngase en contacto telefónico con uno de los departamentos de servicio técnico de

QIAGEN o distribuidores locales (consulte la contraportada o visite www.qiagen.com).


digene

HPV Genotyping PS

Apéndice A: Procedimientos para la evaluación de la contaminación

Si la prueba no tiene el rendimiento previsto, la causa puede ser la contaminación. Para evaluar si es posible que se haya producido contaminación, realice el siguiente proceso de evaluación para cada reactivo.

Reactivo de detección 2

Notas :



Para evitar contaminar el DR2, use guantes desechables no empolvados y no permita que las puntas de pipeta entren en contacto con ninguna superficie de trabajo.



Cuando trabaje con el DR2, evite hacerlo bajo la luz directa del sol.

1.

Obtenga una tira de pocillos de microplaca de captura limpia y colóquela en un bastidor de placa.

2.

Pipetee 75 µl del vial de DR2 distribuido, residual u original en un pocillo de la microplaca de captura.

Nota : Analice el DR2 por triplicado para proporcionar una evaluación

óptima del rendimiento.

3.

Incube a 20–25 °C durante 15 minutos. Evite la luz directa del sol.

4.

Mida la microplaca de captura utilizando un instrumento DML.

El valor del control del DR2 debe ser < 50 RLU.

Si los valores del DR2 son < 50 RLU, puede usarse el DR2 para repetir la prueba.

Si el DR2 está contaminado (> 50 RLU), obtenga un kit nuevo y repita la prueba.


digene


72

Aparato de lavado y/o fuente de agua

1.


2.

Rotule los pocillos del 1 al 4. Pipetee 75 µl del DR2 en cuatro pocillos de la microplaca de captura diferentes.

El pocillo 1 sirve como control del DR2.

3.

Pipetee 10 µl del tampón de lavado desde el frasco de tampón de lavado al pocillo 2 de la microplaca.

4.

Deje que el tampón de lavado fluya a través del tubo del aparato de lavado. Pipetee 10 µl del tampón de lavado desde el tubo al pocillo 3 de la microplaca de captura.

5.

Obtenga una porción del agua usada para preparar el tampón de lavado.

Pipetee 10 µl del agua en el pocillo 4 de la microplaca de captura.

6.

Incube a 20–25 °C durante 15 minutos. Evite la luz directa del sol.

7.


El valor del control del DR2 (pocillo 1) debe ser < 50 RLU.

Compare el valor de RLU de los pocillos 2, 3 y 4 con el valor de RLU del control del DR2. El valor individual de RLU de los pocillos 2, 3 y 4 no debe superar en más de 50 RLU el valor de RLU del control del DR2.

Los valores que sean más de 50 RLU superiores al valor del control del DR2 indican contaminación. Consulte “Tampón de lavado” en la página 28 si desea obtener instrucciones acerca de la limpieza y el mantenimiento del aparato de lavado.


1.


2.

Rotule los pocillos del 1 al 5. Pipetee 75 µl del DR2 en cinco pocillos de la microplaca de captura.

El pocillo 1 sirve como control del DR2.

3.

Pipetee 10 µl del tampón de lavado desde el frasco de tampón de lavado para el lavador de placas al pocillo 2 de la microplaca.


digene

HPV Genotyping PS

4.

Pipetee 10 µl del líquido de enjuague desde el frasco de líquido de enjuague para el lavador de placas al pocillo 3 de la microplaca.

5.

Pulse la tecla “Prime” (cebar) en el teclado del lavador de placas, dejando que el tampón de lavado fluya a través de las vías. Pipetee 10 µl del tampón de lavado desde la cubeta al pocillo 4 de la microplaca.

6.

Pulse la tecla “Rinse” (enjuagar) en el teclado del lavador de placas, dejando que el líquido de enjuague fluya a través de las vías. Pipetee 10 µl del tampón de lavado desde la cubeta al pocillo 5 de la microplaca.

7.

Tape e incube a 20–25 °C durante 15 minutos. Evite la luz directa del sol.

8.


El valor del control del DR2 (pocillo 1) debe ser < 50 RLU.

Compare el valor de RLU de los pocillos 2, 3, 4 y 5 con el valor de RLU del control del DR2. El valor individual de RLU de los pocillos 2, 3, 4 y 5 no debe superar en más de 50 RLU superior el valor de RLU del control del

DR2.

Los valores que sean más de 50 RLU superiores al valor del control del DR2 indican contaminación del lavador de placas.

Consulte el

Manual del usuario del Automated Plate Washer

si desea obtener información sobre el procedimiento de descontaminación.


digene


Apéndice B: Hoja de trabajo para el registro de datos de la prueba


digene

HPV Genotyping PS

Información para pedidos

Producto

digene

HPV Genotyping PS

Test

Sistema Hybrid Capture 2 Modular System

DML 2000 Luminómetro para microplacas, 240 V

DML 3000

Contenido

Para 96 reacciones: reactivos, disoluciones amortiguadoras

(tampones), 4 controles y microplaca de captura

LumiCheck Plate User

Package

Luminómetro para microplacas,

120 V/240 V

Placa y software para uso con el DML 2000 o con el

DML 3000

Rotary Shaker I


MST Vortexer 2

Agitador rotatorio, 240 V

Lavador de placas de 96 pocillos, 240 V

Agitador vorticial para múltiples tubos de muestras, 240 V

Accesorios

Hybridization Microplates Microplacas de poliestireno de 96 pocillos transparentes (100)

N.º de referencia

613615

5000-1020

5000-00031

6000-5023

6000-2240E

6000-00175

6000-5022

6000-1203


digene


Microplate Lids

Extra-long Pipet Tips

Disposable Reagent

Reservoirs

DuraSeal tube sealer film

Plate sealers

Tapas para microplacas de poliestireno transparentes (100)

Puntas de pipeta, 6 envases/caja

Unidades de plástico para almacenamiento de reactivos con una capacidad de 25 ml (100)

Lámina selladora

Selladores de placas adhesivos (100)

6000-5001

5075-1011

5090-1010

6000-5003

5070-1010


digene

HC2 Sample

Conversion Kit

5127-1220 Para la conversión de hasta 250 muestras recogidas en PreservCyt: tampón para conversión de muestras, medio de transporte de muestras

(STM), reactivo de desnaturalización y tinte indicador

Para obtener información actualizada sobre licencias y sobre exenciones de responsabilidad específicas del producto, consulte el manual del usuario o el documento de instrucciones de uso del kit de QIAGEN correspondiente. Los manuales del usuario y los documentos de instrucciones de uso de los kits de

QIAGEN están disponibles en www.qiagen.com o pueden solicitarse al servicio técnico de QIAGEN o a su distribuidor local.


digene

HPV Genotyping PS

Esta página se ha dejado intencionadamente en blanco.


digene


Esta página se ha dejado intencionadamente en blanco.


digene

HPV Genotyping PS

Marcas comerciales: QIAGEN

®

,

digene

®

, Hybrid Capture

®

, (QIAGEN); DuraSeal

TM

(Diversified

Biotech); Eppendorf

®

, Repeater

®

(Eppendorf AG); KimTowels

®

(Kimberly-Clark Corporation); Parafilm

®

(BEMIS Company, Inc.); ThinPrep

®

, PreservCyt

®

(Hologic, Inc.).

Acuerdo de licencia limitada

La utilización de este producto implica por parte de cualquier comprador o usuario de la prueba

digene

HPV Genotyping PS la aceptación de los siguientes términos:

1. La prueba

digene

HPV Genotyping PS puede utilizarse únicamente conforme a las instrucciones de uso facilitadas y exclusivamente con los componentes contenidos en la prueba

digene

HPV

Genotyping PS. QIAGEN no otorga ninguna licencia bajo ninguno de sus derechos de propiedad intelectual para usar o incorporar los componentes incluidos en esta prueba

digene

HPV

Genotyping PS con componentes no incluidos en esta prueba

digene

HPV Genotyping PS, salvo por lo descrito en las instrucciones de uso de la prueba

digene

HPV Genotyping PS y en otros protocolos disponibles en www.qiagen.com.

2. Aparte de las licencias expresamente especificadas, QIAGEN no garantiza que esta prueba

digene

HPV Genotyping PS ni su(s) uso(s) no infrinjan los derechos de terceros.

3. La prueba

digene

HPV Genotyping PS y sus componentes tienen licencia para un solo uso y no pueden ser reutilizados, reacondicionados ni revendidos.

4. QIAGEN niega específicamente cualquier otra licencia, explícita o implícita, distinta de las licencias expresamente especificadas.

5. El comprador y el usuario de la prueba

digene

HPV Genotyping PS aceptan no realizar ni permitir a otros realizar ningún paso que pueda conducir a acciones que hayan sido prohibidas en las especificaciones anteriores o que pueda facilitarlas. QIAGEN se reserva el derecho de emprender acciones legales ante cualquier tribunal para el cumplimiento de las prohibiciones especificadas en este Acuerdo de Licencia Limitada y recuperará todos los gastos derivados de la investigación y de los costes del juicio, incluidos los honorarios de abogacía, en cualquier acción emprendida para hacer cumplir este Acuerdo de Licencia Limitada o cualquier otro derecho de propiedad intelectual en relación con la prueba

digene

HPV Genotyping PS y/o sus componentes.

Para obtener los términos actualizados de la licencia, visite www.qiagen.com.

© 2012-2015 QIAGEN, reservados todos los derechos.


digene


www.qiagen.com

Australia



[email protected]

Austria



[email protected]

Belgium



[email protected]

Brazil



[email protected]

Canada



[email protected]

China



[email protected]

Denmark



[email protected]

Finland



[email protected]

France



[email protected]

Germany



[email protected]

Hong Kong



[email protected]

India



[email protected]

Ireland



[email protected]

Italy



[email protected]

Japan



[email protected]

Korea (South)



[email protected]

Luxembourg



[email protected]

Mexico



[email protected]

The Netherlands



[email protected]

Norway



[email protected]

Singapore



[email protected]

Sweden



[email protected]

Switzerland



[email protected]

UK



[email protected]

USA



[email protected]

Sample & Assay Technologies

QIAGEN prueba digene HPV Genotyping PS, prueba digene HC2 High-Risk HPV DNA, digene HC2 DNA Collection Device, digene HC2 Sample Conversion Instrucciones de uso de la prueba

Asistente Bot

Instrucciones de uso de la prueba

digene

®

HPV Genotyping PS

Para la detección cualitativa de los tipos 16, 18 y 45 del virus del papiloma humano (VPH). Para utilizar con la prueba

digene

HC2

High-Risk HPV DNA.

96

Sample & Assay Technologies

Índice

Uso previsto

Resumen y explicación

Principio del procedimiento

Desnaturalización

Hibridación

Captura de los híbridos

Detección de los híbridos

Lavado

Amplificación de la señal

Materiales suministrados

Contenido del kit

Materiales necesarios pero no suministrados

Equipo y materiales disponibles a través de QIAGEN

Equipo y accesorios generales para uso en el laboratorio

Equipo y materiales adicionales para la preparación de muestras recogidas en PreservCyt

Advertencias y precauciones

Advertencias

Muestras

Azida sódica

Frases sobre seguridad y riesgo en relación con los componentes

Información adicional

Precauciones

Almacenamiento y manipulación de los reactivos

Componentes del kit

Reactivos preparados

Recogida y preparación de las muestras

Muestras del cuello del útero en STM

Muestras del cuello del útero en solución PreservCyt

Procedimiento

Muestra

Preparación de los reactivos

Microplaca de captura

Reactivo de desnaturalización

Mezclas de las sondas

Tampón de lavado

Preparación de las muestras

Protocolo 1: Desnaturalización

Punto de detención opcional

Protocolo 2: Adición de la mezcla de la sonda

Protocolo 3: Hibridación y captura de los híbridos

Protocolo 4: Detección de los híbridos

Protocolo 5: Lavado

Método con el Automated Plate Washer

Lavado manual de las placas

Protocolo 6: Amplificación de la señal

Protocolo 7: Medición de la microplaca de captura y generación de resultados

Interpretación de los resultados

Resultados de la prueba

Guía para la resolución de problemas

Control de calidad

Verificación de la calibración del ensayo

Control negativo 1

Control positivo 1

Media del control positivo 1/media del control negativo 1

Controles de calidad específicos de la sonda

Limitaciones

Características del rendimiento

Concordancia entre la prueba

digene

HPV Genotyping PS y una prueba validada de genotipificación del VPH mediante PCR cuantitativa

Concordancia en la detección de genotipos específicos del VPH

Concordancia de los resultados de la prueba según el tipo de muestra

Especificidad analítica

Reproducibilidad

Reproducibilidad con muestras recogidas en STM

Reproducibilidad con muestras recogidas en PreservCyt

Recuperación de ADN para muestras recogidas en STM y para muestras recogidas en PreservCyt