ELPHA SL
[ES]
ELPHA SL
Juego de microplacas de ensayo / Juego de cebadores
Tamaño de kit
ELPHA HLA-AB SL LowRes 48
ELPHA HLA-C SL LowRes 16
ELPHA DRB SL LowRes 16
[REF] 826 603
[REF] 826 621
[REF] 826 641
| 0197
|
| 0197
ELPHA DQB SL LowRes 16
[REF] 826 681
|
ELPHA Primer HLA-AB LowRes
ELPHA Primer HLA-C SL LowRes
ELPHA Primer DRB SL LowRes
ELPHA Primer DRB HiRes
ELPHA Primer DQB SL LowRes
[REF] 826 604
[REF] 826 624
[REF] 826 644
[REF] 826 674
[REF] 826 684
| 0197
|
| 0197
| 0197
|
Manual resumido
Antes de usar al juego de reactivos ELPHA SL, por favor, leer
el manual disponible en http://www.bio-rad.com!
[BUF|__A10x]
[SSC|__20x]
[SDS|__1%]
[BLOC__ _ REA]
[CONJ|__FITC]
[SUBS|__TMB]
[MT_P]
[PRIMER]
Buffer A concentrado 10x
Tampón 20xSSC
Solución 1% SDS
Reactivo blocqueante
Conjugado (FITC)
Solución substrato
Placa microtest
Mezcla cebadores
[BUF|__A]
[BUF|__SSC/SDS]
[NEUTRAL]
[DENAT]
[CONJDIL|__FITC]
[BUF|__B]
[PCR__ _BUF|_ABC]
[PCR___BUF|_DR]
Buffer A, solución de trabajo
Tampón 2xSSC/ 0,1%SDS
Solución para la naturalizacion
Solución para la desnaturalizacion
Solución diluída del conjugado)
Buffer de dilción del conjugado
PCR buffer para el tipaje de HLA-ABC
PCR buffer para el tipaje de HLA-DRB/DQB
Ámbito de aplicación
El ensayo ELPHA SL (Ensayo de hibridización de sonda ligada a enzimas del
inglés Enzyme Linked Probe Hybridization Assay Single Labeled) consiste
en un ensayo de hibridización de ADN para determinar los alelos del
antígeno HLA Clase I o Clase II.
Material
Composición del juego de microplacas ELPHA SL
•
MTP, Por cada placa hay 12 tiras con 8 cavidades marcadas con
números en negro. Las cavidades contienen diferentes sondas secas de
oligonucleótidos.
•
[PCR__BUF|ABC] contiene 500 mM Tris/HCl, 150 mM (NH4)2SO4, 15 mM
MgCl2.
•
[PCR__BUF|DR] contiene 100 mM Tris/HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2.
•
Mezclas de cebadores (primer) para conseguir la amplificación genérica:
[PRIMER|HLA-A] contiene 2 pares de cebadores genéricos que
amplifican el exón 2 y el exón 3 completos del gen HLA-A.
[PRIMER|HLA-B] contiene 2 pares de cebadores genéricos que
amplifican el exón 2 y el exón 3 completos del gen HLA-B.
[PRIMER|HLA-C] contiene 2 pares de cebadores genéricos que
amplifican el exón 2 y el exón 3 completos del gen HLA-B.
[PRIMER|C] contiene 1 par de cebadores genérico que amplifica el exón
2 completo del gen HLA-DRB y un par de cebadores específico DR2 con
el que se amplifica un fragmento de 339bp de longitud del primer intrón.
Dentro de este intrón existen secuencias específicas DR15 y DR16 que
en caso del ADN positivo DR2 reaccionan con las sondas específicas
D3 y E3 permitiendo de este modo la tipificación de DR15 y DR16.
[PRIMER|A] contiene 1 par de cebadores genérico para determinar los
alelos DQB1*05 y *06 que amplifica el exón 2 completo del gen HLADQB.
[PRIMER|B] contiene 1 par de cebadores para determinar los alelos
DQB1*02, *03 y *04 que amplifica el exón 2 completo del gen HLA-DQB.
[PRIMER|G] amplifica alelos del gen HLA-DRB que codifican una glicina
en la posición 86.
[PRIMER|T] amplifica alelos del gen HLA-DRB que codifican una valina
en la posición 86.
Los [PRIMER|A], [PRIMER|B], [PRIMER|G] y [PRIMER|T] contienen
además de los pares de cebadores específicos un par de cebadores de
control con el que se amplifica un fragmento de 422 bp de longitud de la
hormona de crecimiento humana (HGH). Esta amplificación sirve para
controlar el proceso de PCR y se debería de poder determinar en las
pruebas en las que no existe ningún producto de PCR específico.
Para realizar el tipaje se necesita adicionalmente al juego de reactivos
ELPHA Reagent ([REF] 826 503), Taq ADN polimerasa, dNTPs y Cover
MTP96 ([REF] 826 550).
Avisos generales
Reactivos de uso exclusivo en el diagnóstico in vitro. IVD
Cuidado: El ensayo se debe realizar exclusivamente por personal
especializado instruido y autorizado.
Cuidado: Emplee los reactivos y el material correspondiente a los pacientes
respetando las medidas de seguridad habituales en laboratorios.
No pipetee con la boca.
Cuidado: No emplee ningún reactivo una vez pasada la fecha de caducidad
señalada en la etiqueta.
Cuidado: No emplee ningún reactivo que sospeche que pueda estar
contaminado con microbios.
Cuidado: Las pipetas procedentes de la zona Post-PCR no se deben usar
en la zona Pre-PCR.
Cuidado: El bromuro de etidio que se emplea para colorear el ADN en la
electroforesis de gel es potencialmente cancerígeno. Utilice
siempre guantes de protección cuando trabaje con geles
coloreados. Elimine los residuos quemándolos.
Cuidado: Todos los productos sanguíneos se deben manejar como
sustancias potencialmente infecciosas y, por lo tanto, se deben
adoptar las medidas de precaución pertinentes.
Cuidado: Las microplacas de ensayo usadas se deben manejar como
elementos potencialmente infecciosos y, por lo tanto, se tienen
que eliminar según las directrices nacionales vigentes
correspondientes.
Cuidado: Al valorar las bandas de ADN en el gel no mire directamente
hacia la luz ultravioleta. ¡Emplee una protección en la cara que
bloquee la radiación UVA!
Puede solicitar a Bio-Rad los pliegos de datos de seguridad de todos los
reactivos.
Almacenamiento y Conservación
La temperatura de almacenamiento está comprendida entre los 2ºC y los 8ºC
para todos los reactivos y componentes de juegos. En la etiqueta exterior
figura la fecha de caducidad. Después de abrir las microplacas por primera
bez, se deben utilizar antes de 6 semanas.
Material de ensayos
Cantidad del ADN
El ensayo de ADN empleado se debe volver a suspender en agua destilada
estéril y regular a una concentración de aprox. 50-200 ng/µl. El ADN no se
debe resuspender en soluciones que contengan quelantes, como por
ejemplo EDTA, en una concentración DNA > 0,5 mM.
Calidad del ADN
El ADN empleado en el ensayo debe presentar un cociente A260/A280 de 1,7 o
superior.
 La pureza y concentración del ADN empleado son fundamentales
para lograr un resultado de ensayo óptimo.
Realización
Elaboración de una solución primaria de nucleótidos (dNTPs)
Las soluciones de nucleótidos de 10 mM se diluyen para conseguir una
solución primaria lista para su uso:
400 µl agua destilada se mezclan con 100 µl dATP (10 mM), 100 µl dGTP
(10 mM), 100 µl dCTP (10 mM) y 100 µl dTTP (10 mM).
En soluciones de nucleótidos de 100 mM se modifican los volúmenes
respectivamente como figura a continuación: 10 µl dATP, 10 µl dGTP, 10 µl
dCTP y 10 µl dTTP se mezclan en 760 µl de agua destilada.
La solución primaria de nucleótidos (1,25 mM) se conserva a una
temperatura mínima de – 20ºC.
Elaboración de mezclas maestras de PCR (Mastermix)
De cada preparación de ADN a analizar se precipitan 1 mezcla maestra (HLA-C
SL LowRes, DRB SL LowRes) o 2 mezclas maestras diferentes (HLA-AB SL
LowRes, DRB SL HiRes, DQB SL LowRes) para las reacciones de PCR. En la
tabla 1 figuran los esquemas de pipeteado de las diferentes mezclas maestras.
Tabla 1
HLA-AB
SL LowRes
Reactivos
dH2O
[PCR__ _BUF|ABC]
[PCR__BUF|_DR]
dNTPs (1,25 mM)
[PRIMER]
Taq ADN
polimerasa
Ensayos ADN
93,2 µl
15 µl
24 µl
HLA-A
9 µl
0,8 µl
Volumen total
93,2 µl
15 µl
24 µl
HLA-B
9 µl
0,8 µl
HLA-C
SL
Low
Res
DRB
SL
LowRes
64,5 µl
10 µl
16 µl
HLA-C
5 µl
0,5 µl
60,5 µl
10 µl
16 µl
C
8 µl
0,5 µl
DRB
SL HiRes
74 µl
12 µl
19 µl
G
9,5 µl
0,5 µl
74 µl
12 µl
19 µl
T
9,5 µl
0,5 µl
DQB
SL LowRes
32,5 µl
5 µl
8 µl
A
2 µl
0,5 µl
32,5 µl
5 µl
8 µl
B
2µl
0,5 µl
8 µl
8 µl
4 µl
5 µl
5 µl
5 µl
2 µl
2 µl
150 µl
150 µl
100 µl
100 µl
120 µl
120 µl
50 µl
50 µl
En caso de realizar varias tipificaciones simultáneamente, recomendamos
que precipite varias veces la mezcla maestra para garantizar las mismas
condiciones en todos los precipitados. La mezcla maestra se debe precipitar
siempre de nuevo.
Programe el termorregulador de la manera siguiente:
Temp.
⎡
95° C
⎣ → 95° C
↓
55° C
↓
⎡
72° C
⎣→ 72° C
4° C
Electroforesis de gel
La calidad y la cantidad de
de agarosa al 1%.
Tiempo
5 min.
15 seg.
15 seg.
15 seg.
6 min.
∞
Ciclos
1x
⎤
⎢
⎢
⎢
⎦
30 x
1x
1x
los productos PCR se deben controlar en un gel
189779001/04 – 06/2010
Se elabora un gel de agarosa al 1% en el que 1 g de agarosa se calienta
hasta que hierva en 100 ml 1xTBE hasta que la solución se vuelva
transparente. Se enfría la solución a < 60° C y se mezcla con 4 µl de solución
de bromuro de etidio. En el vehículo de gel estanco se introduce la solución
de agarosa en la medida de lo posible sin burbujas y un peine para elaborar
bolsas de aprox. 10 μl. Una vez polimerizado el gel (aprox. 30 minutos a
temperatura ambiente) se introduce en la cámara de gel rellena con 1xTBE.
Se retira el peine y las bolsas de gel se tienen que cubrir con un buffer. 5 µl
de cada precipitado de PCR se mezclan con 2 µl de buffer de carga y se
pipetean en las bolsas de gel. Para realizar el control de tamaño de los
productos PCR, recomendamos introducir un estándar adecuado de peso
molecular (por ejemplo, marcadores de 50-1000 bp) en la electroforesis. La
electroforesis se efectúa a 8 V/cm (distancia entre electrodos) durante 15-20
minutos. Las bandas de ADN se pueden observar en un transiluminador UV
(llevando una protección en la cara adecuada contra rayos UVA). Para
documentar el ensayo se puede fotografiar el gel con una cámara Polaroid.
La amplificación de HLA-A proporciona productos de 359 bp y 317 bp y la
amplificación de HLA-B productos de 424 bp y 438 bp.
De la amplificación HLA-C se obtienen productos de 418 bp y 468 bp.
La amplificación DRB LowRes facilita un producto de 277 bp. En la
actualidad, en el ADN DR2 positivo aparece un producto adicional de 339 bp.
De la amplificación de HiRes DRB se obtiene un producto de 268 bp y una
banda de control a una longitud de 422 bp para la amplificación G y T
respectivamente.
Las amplificaciones DQB suministran un producto de 246 bp (Q1) y de 231
bp (Q2) así como una banda de control cada una de 422 bp.
ELPHA SL (ENZYME LINKED PROBE HYBRIDISATION ASSAY SINGLE LABELED)
Elaboración de reactivos
La elaboración de reactivos se describe en las instrucciones de uso del juego
de reactivos ELPHA REF 826 503.
Realización de ensayo de una tipificación ELPHA SL
Previamente al inicio del ensayo deben estar todos los reactivos a
temperatura ambiente.
(1) En la Tabla 2 figura el número de tiras necesario para cada tipificación.
(2) Vierta el producto PCR x µl en un tubo de reacción y añadir x µl
[DENAT].
Los productos de PCR de doble cadena se transfieren a cadenas
simples.
(3) Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.
En caso de que no se vaya a continuar trabajando, recomendamos que
coloque los ensayos en hielo para evitar la renaturalización de la doble
cadena.
(4) Añada x µl [NEUTRAL].
(5) Añada x µl de agua destilada y mezcle.
 El volumen necesario (x µl) para cada tipificación figura en la tabla
2.
(6) Pipetee 50 µl del producto PCR diluido (pipeta combinada Eppendorf
con 2,5 ml de adaptador) en las cavidades correspondientes a cada
ensayo de [MTP]. Para la disposición de las tiras véase la tabla 2.
Tabla 2
Tiras por ensayo
Productos PCR
diluídos
pipeteados
50 µl en:
Producto PCR
[DENAT]
[NEUTRAL]
Agua destilada
HLA-AB SL
LowRes
12 Tiras
HLA-A
en tiras
A1 – A5;
HLA-C SL
LowRes
4 Tiras
C1 – C4
DRB SL
LowRes
3 Tiras
1–3
HLA-B
en tiras
B1 – B7
135 µl
750 µl
750 µl
1500 µl
DRB SL
HiRes
12 Tiras
„G“ en tiras
G1 – G6;
„T“ en tiras
T1 – T6
80 µl
480 µl
480 µl
960 µl
90 µl
400 µl
400 µl
800 µl
112 µl
570 µl
570 µl
1250 µl
DQB SL
LowRes
3 Tiras
„A“ en
tiras 1 + 2
(Pos. A1 –
E2);
„B“ en
tiras 2 + 3
(Pos. G2 –
H3)
40 µl
200 µl
200 µl
400 µl
(7) Cierre las tiras con lámina autoadhesiva e incúbelas durante 45 minutos
al baño maría a 46 ± 1° C.
Las placas se tienen que incubar exactamente en agua temperada.
Dado que la temperatura para la hibridización y el posterior paso de
lavado de precisión (stringency) se tiene que mantener exacta,
consideramos imprescindible que controle la temperatura con un
termómetro calibrado colocado en el agua.
Â
Durante el periodo de incubación, suelte BLOC REA (=[BUF|__B]). El
[BUF|__B] que no se necesite, consérvelo a –20°C o incluso a una
temperatura más fría.
(8) Extraiga MTP del baño maría y retire la lámina.
Continúe con el paso de lavado inmediatamente. Un descenso
prolongado de la temperatura puede originar una hibridización
inespecífica y / o un fondo aumentado.
Descarte la solución de hibridización y lave [MTP] dos veces con 200 µl
[BUF|__SSC/SDS] por cada cavidad. Después de cada paso de lavado
retire los restos de líquido sacudiéndolos ligeramente en un un papel
absorbente. Una vez efectuado el segundo paso de lavado introduzca
200 µl de [BUF|__SSC/SDS] en cada cavidad.
En este paso de lavado se retiran las sondas no ligadas.
De manera alternativa se puede proceder al lavado con el Elisa Washer
III. Al aplicar esta lavador (washer) se puede introducir el [MTP]
Â
Â
directamente en el lavador (washer) una vez incubado al baño maría e
iniciar el programa „ELPHA_SSC“.
(9) Pegue el [MTP] a una nueva lámina e incúbelo durante 15 minutos a 46
± 1° C al baño maría.
En este paso de lavado de precisión (stringency) no se liberan las
suficientes sondas homólogas del ADN. Por esta razón, resulta decisivo
mantener la temperatura exacta. Por lo tanto, contrólela de nuevo.
(10) Una vez transcurrido el periodo de incubación, elimine el
[BUF|__SSC/SDS] y lave tres veces el [MTP] con 200 µl [BUF|__A] por
cavidad siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.
 El enfriamiento de las placas puede provocar una hibridización
inespecífica (reacciones positivas falsas) y/o un fondo aumentado.
Por lo tanto, si va a trabajar con varias placas realice los
pocedimientos de modo escalonado.
 De manera alternativa se puede proceder al lavado con el Elisa
Washer III. Al aplicar esta lavador (washer) se puede introducir el
[MTP] directamente en el lavador (washer) una vez incubado al
baño maría e iniciar el programa „ELPHA_A“.
(11) Añada 50 µl por cavidad del [CONJDIL|__FITC] preparado fresco con una
pipeta multicanal e incúbelos durante 30 minutos a temperatura
ambiente.
En las sondas ligadas, marcadas con FITC se conservan los anticuerpos
FITC copulados con POD.
(12) Descarte el [CONJDIL|__FITC] y lave tres veces el [MTP] con 200 µl
[BUF|__A] por cavidad.
De manera alternativa se puede proceder al lavado con el Elisa
Washer III. Se inicia directamente con el programa „ELPHA_A“.
(13) Añada 50 µl de [SUBS|__TMB] por cavidad con una pipeta multicanal e
incúbelos durante 15 minutos a temperatura ambiente en un lugar
oscuro.
La enzima (POD) copulada con los anticuerpos transforma el sustrato
(TMB): cambia de incoloro a azul.
 El [SUBS|__TMB] se debe calentar a temperatura ambiente. Los
restos de [SUBS|__TMB] no los devuelva al frasco. Evite pipetear con
frecuencia del frasco (riesgo de contaminación).
(14) Añada 50 µl por cavidad de 1 N ácido sulfúrico con una pipeta
multicanal.
La reacción se interrumpe y el color cambia de azul a amarillo.
(15) Los resultados del ensayo se valoran fotométricamente en el lector
ELISA midiendo la absorción en 450 nm (con un filtro de referencia en
620 nm)
Evaluation
Todos los valores DO superiores a 0,200 se deben considerar como
resultados positivos. La interpretación de los resultados se puede llevar a
cabo utilizando el software HLA Typing ([REF] 847 070) o realizando una
comparación del modelo de reacción con los esquemas de valoración.
Mediante el internet se puede desplegar el software de valoración de carga
dependiente. Algunas sondas indican un cut-off que se desvía de 0,200. Este
cut-off se debe deducir a partir de la hoja de información de carga y se
despliega automáticamente al aplicar el software de tipificación HLA
mediante el internet (www.bio-rad.com).
 Los componentes de ensayo están ajustados de tal modo que todos los
valores DO superiores a 0,200 se deben valorar por regla general como
resultados positivos. No obstante, dado que la intensidad de señal
dependede una serie de parámetros que no están influenciados por los
reactivos incluidos en el juego (por ejemplo, aislamiento de ADN,
realización de PCR), no se debe descartar el hecho de que se originen
variaciones en la intensidad. En caso de existir un fondo lo
suficientemente bajo (por ejemplo, DO < 0,090), las señales positivas de
amplificados más débiles (por ejemplo, DO ≥ 0,130) se pueden
reconocer incluso más nítidamente que otras señales. Para las
evaluaciones automáticas se puede variar el valor de corte en el
software para cada sonda ó se puede utilizar la función valor de corte
automática (descrita en el manual del sofware para tipaje HLA).
Indicaciones de realización
1. La intensidad de las reacciones positivas depende directamente de la
calidad (contenido) del producto PCR. En caso de que se produzca una
amplificación muy débil (cutt off en varias posiciones <0,200) se debe
repetir el ensayo.
2. El ADN que se haya almacenado durante más de 1 semana a una
temperatura comprendida entre los 2ºC y los 8ºC puede estar degradada
y, por lo tanto, no se puede amplificar lo suficiente.
3. La prolongación del periodo de incubación del sustrato (>15 minutos)
conlleva un foco aumentado (véase el apartado 5. Búsqueda de
errores).
4. La exactitud de los resultados sólo se puede garantizar si se respetan
estrictamente las instrucciones de uso.
Controles de calidad
En cada ensayo hay una sonda de control positiva. El control positivo
reacciona con una secuencia existente en todos los alelos del locus
correspondiente. La posición exacta figura en el modelo de reacción adjunto.
El control positivo tiene que reaccionar positivamente, de lo contrario, se
deberá repetir el ensayo.
Como control de calidad de cada carga, se efectúan tipificaciones con células
conocidas que garantizan que cada oligosonda en el juego reacciona
correctamente.
Â
MBio-Rad Medical Diagnostics GmbH
Industriestr. 1, D-63303 Dreieich, Germany
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
www.bio-rad.com, techsupport.bmd@bio-rad.com
189779001/04 – 06/2010
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