“Kits” HISTO SPOT ® SSO
Instrucciones de uso
“Kits” HISTO SPOT® SSO
Kits de ensayo para tipificación tisular de alelos HLA sobre una base genético-molecular
IVD
C
0123
®
Versión: 11 / 2013
®
Envío: 2013-11
REF 726010: HISTO SPOT A 4D (96 det.)
REF 726020: HISTO SPOT B 4D (96 det.)
®
REF 726030: HISTO SPOT C 4D (96 det.)
®
REF 726040: HISTO SPOT DRB1 4D (96 det.)
®
REF 726045: HISTO SPOT DRB3/4/5 (24 det.)
®
REF 726050: HISTO SPOT DQB1 4D (96 det.)
®
REF 726051: HISTO SPOT DQB1 4D / DQA1 (96 det.)
®
REF 726060: HISTO SPOT DPB1 (96 det.)
®
REF 726061: HISTO SPOT DPB1 (24 det.)
®
REF 726098: HISTO SPOT Reagent Kit
Contenido
1.
2.
3.
DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO ....................................................................................................... 2
PRINCIPIO DE LA PRUEBA ................................................................................................................ 2
MATERIAL ............................................................................................................................................ 3
3.1.
3.2.
3.3.
Reactivos suministrados con los kits de tipificación locus-específicos HISTO SPOT® ......... 3
Reactivos proporcionados con el HISTO SPOT® Reagent kit. ............................................ 3
Reactivos y equipamientos necesarios, pero no proporcionados ......................................... 3
4.
5.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD ................................................................................................ 4
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO ....................................................................................................... 4
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
5.4.1.
5.4.2.
5.4.3.
5.4.4.
Condiciones de seguridad y observaciones especiales ....................................................... 4
Purificación de ADN ............................................................................................................ 4
Amplificación ....................................................................................................................... 5
Ensayo de hibridación automatizado en el procesador MR.SPOT®. .................................... 6
Preparación de reactivos ..................................................................................................... 6
Configuración del procesador MR.SPOT® ........................................................................... 7
Transferencia de resultados a un PC para la interpretación ................................................ 7
Interpretación de los resultados ........................................................................................... 7
6.
7.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES................................................................................................. 8
CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE FUNCIONAMIENTO ........................................................... 8
7.1.
7.2.
7.3.
Evaluación ........................................................................................................................... 8
Reacción de amplificación PCR ........................................................................................... 9
Resolución del ensayo......................................................................................................... 9
8.
9.
10.
11.
12.
LIMITACIONES DEL MÉTODO ............................................................................................................ 9
CONTROL DE CALIDAD INTERNO .................................................................................................... 9
SOLUCIÓN DE PROBLEMAS ............................................................................................................ 10
MARCAS COMERCIALES UTILIZADAS EN ESTE DOCUMENTO/PRODUCTO ............................ 10
EXPLICACIÓN DE LOS SÍMBOLOS UTILIZADOS EN EL ETIQUETADO ....................................... 11
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Instrucciones para el uso de los kits HISTO SPOT® SSO
1.
Versión: 11 / 2013
DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO
El sistema HISTO SPOT SSO es un ensayo diagnóstico in vitro para la tipificación tisular de
alelos HLA sobre una base genético molecular y proporciona resultados de tipificación de baja a
media resolución. Este consta del kit de tipificación HISTO SPOT, el kit de reactivo HISTO
SPOT, el procesador MR.SPOT y el software de interpretación HISTO MATCH.
El kit de tipificación HISTO SPOT contienen todos los componentes necesarios para la reacción
de PCR y los pocillos de ensayo con sondas de oligonucleótido específico de secuencias
inmovilizadas, para la detección de los productos de PCR. El kit de reactivo HISTO SPOT
contiene los reactivos para la hibridación y detección y puede utilizarse en combinación con todos
los kits de tipificación HISTO SPOT. El procesador MR.SPOT está diseñado específicamente
para utilizarse con los kits HISTO SPOT con el fin de procesar entre 1 y 96 muestras,
automatizar el proceso de hibridación, detección e interpretación de los resultados. Para
interpretar los resultados se requiere el software HISTO MATCH.
2.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
La prueba incluye cuatro pasos básicos:
- Aislamiento de ADN
- Amplificación por PCR
- Hibridación y detección
- Interpretación de los datos
Se purifica el ADN a partir de la muestra clínica, utilizando el método de purificación de ADN
establecido en el laboratorio o mediante kits comerciales. A continuación, el ADN se amplifica en
una reacción de PCR locus específica utilizando el Master Mix y la solución de MgCl2 que se
proporcionan con el kit. La especificidad de la amplificación se rige por un conjunto de cebadores
biotinilados que se han diseñado para amplificar de manera exclusiva los locus de HLA escogidos.
Después del proceso de amplificación PCR, la placa de PCR conteniendo los amplicones
marcados con biotina se transfiere al procesador MR.SPOT. MR.SPOT añade tampón de
hibridación a cada pocillo y transfiere cada amplicón más el tampón de hibridación a un pocillo de
ensayo que contiene una matriz de sondas de oligonucleótidos específicos de secuencia (SSO)
inmovilizados. Estas sondas son lo mismo una sonda de un único oligonucleótido o una
combinación de 2 o más sondas individuales, inmovilizadas en el mismo "spot" (mosaico de
sondas) se han diseñado para mejorar la identificación de polimorfismos localizados en cis.
El amplicón marcado con biotina se une a aquellas sondas SSO que contienen una secuencia
diana complementaria y, a continuación, se puede detectar por medio de una reacción
colorimétrica. Con el fin de prevenir la unión no específica del amplicón en la superficie de los
pocillos de ensayo MR.SPOT bloquea los pocillos con un tampón de bloqueo antes de transferir
el amplicón.
Después de un paso de lavado astringente para eliminar los amplicones no unidos, se añade a los
pocillos un conjugado estreptavidina-fosfatasa alcalina que se une al amplicón marcado con
biotina capturado por la sonda SSO. Tras otros pasos de lavado, se añade el sustrato BCIP/NBT
que produce un color azul-violeta cuando es transformado por la fosfatasa alcalina. Los puntos de
color que se forman en el fondo de los pocillos son fotografiados por MR.SPOT y la imagen se
transfiere al software HISTO MATCH instalado en el PC del usuario. El programa de análisis de
imagen del software HISTO MATCH determina la intensidad de cada "spot" de la matriz y la
compara con la intensidad del fondo. A partir de estos datos se calculan las reacciones positivas y
negativas. El programa de coincidencia de patrones del software HISTO MATCH determina el tipo
de HLA de la muestra basado en el patrón de hibridación específica.
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Instrucciones para el uso de los kits HISTO SPOT® SSO
Versión: 11 / 2013
3.
MATERIAL
3.1.
Reactivos suministrados con los kits de tipificación locus-específicos HISTO SPOT®
Testwells l X
Mastermix l X
MgCl2
Pocillos de ensayo, envasados individualmente, cada tira que contiene 8
pruebas, posee inmovilizadas sondas de oligonucleótidos específicas de
secuencia
Master mix, listo para usar, contiene cebadores biotinilados para el locus
escogido, dNTPs, Taq polimerasa, tampón de reacción y azida sódica al 0,05%.
Cloruro de magnesio, 6 mM, listo para usar, contiene 0,001% de Proclin® 300
X = A, B, C, DRB1, DRB3/4/5, DQB1, DQ o DPB1
Con cada kit viene un CD que contiene el archivo de proceso por lotes que se tiene que
almacenar dentro de la base de datos del software de interpretación HISTO MATCH (para más
detalles, véase: Instrucciones de uso de HISTO MATCH) . Para cada kit hay lotes y sublotes:
•
•
•
Kit: p. ej. el HISTO SPOT® A, define el locus probado
Lote: p. ej., A084, A085, define el diseño y la especificidad de las sondas que vienen en el
kit. Un único lote puede contener muchos sublotes diferentes.
Sublote: p. ej., A085-1, A085-2, A085-3, define cómo reacciona una sonda en
comparación con las sondas de control (valores del punto de corte), y define la fecha de
producción y caducidad de las tiras. Sondas concretas pueden estar desactivadas in
algunos sublotes del mismo lote. Esta información se encuentra en el CD específico de lote
que viene con los kits (Tabla de dianas – Fichero Excel).
3.2.
Reactivos proporcionados con el HISTO SPOT® Reagent kit.
Los reactivos incluidos en un kit son suficientes para 96 pruebas. Cada “kit” de reactivos contiene:
BLOCKBUF
tampón de bloqueo, listo para usar, contiene 0,001% de Proclin® 150
HYBBUF
tampón de hibridación, listo para usar, contiene 0.001% de colorante, 0,1%
de dodecilsulfato sódico y 0,001% de Proclin® 150
Tampón de lavado astringente, listo para usar, contiene 0.001% de
colorante, 0,1% de dodecilsulfato sódico y 0,001% de Proclin® 150
Tampón de lavado TBS (Tampón salino con Tris), listas para usar contiene
20mM de Tris, 0,003% de colorante y 0,001% Proclin® 150
BCIP® / NBT sustrato, listo para usar (5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato /
cloruro de nitroblue tetrazolium)
Conjugado, fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina, concentrado
contiene < 0,1% azida de sodio (que se diluye 1:1666 en tampón de bloqueo)
STRGWASH
TBSWASH
SUBS
CONJ
3.3.
•
•
•
•
•
•
•
Reactivos y equipamientos necesarios, pero no proporcionados
Procesador MR.SPOT, incluyendo el software HISTO MATCH, REF 726100
Puntas de pipetas para el procesador MR.SPOT®, 1000 µl REF 726099 y 200 µl REF
726097
Reactivo de extracción de ADN (no utilizar el método salino)
Placas PCR con faldilla, con tapas o película adhesiva (HISTO SPOT® PCR Frameplates
REF 726220, tapones para PCR HISTO SPOT® REF 726090, láminas para PCR HISTO
SPOT® REF 726089)
Termociclador
Agua desionizada
Pipetas automáticas (0,5 - 1000 µl) y puntas desechables
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Instrucciones para el uso de los kits HISTO SPOT® SSO
4.
Versión: 11 / 2013
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Todos los reactivos y componentes de los kits se deben almacenar entre 2 - 8ºC. La fecha de
caducidad viene indicada en la etiqueta de cada reactivo y es válida para los reactivos sellados.
La fecha de caducidad indicada en la etiqueta de la caja exterior se refiere al reactivo del kit con
menor estabilidad. Se pueden abrir las tiras de 8 pocillos, separar los pocillos necesarios para el
ensayo y los que no se utilicen se devuelven a guardar en la bolsa para utilizarse con el kit en el
futuro. Los pocillos conservados en una bolsa ya abierta, se deben utilizar durante los siguientes
30 días. Los otros reactivos una vez abiertos se deben utilizar dentro de un período de 3 meses.
El conjugado diluido se debe preparar fresco cada vez que se realice una prueba.
5.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
5.1.
Condiciones de seguridad y observaciones especiales
Las técnicas de genética molecular son métodos particularmente sensibles y deben ser realizadas
por personal capacitado, con experiencia en técnicas de genética molecular y pruebas de
histocompatibilidad. Los resultados de estas pruebas no se deben utilizar como el único factor
determinante para tomar decisiones clínicas.
Se deben seguir las directrices de trasplante, así como las normas EFI a fin de reducir al mínimo
el riesgo de falsa tipificación, particularmente en el caso de discrepancias entre los métodos
serológicos y de genética molecular.
Se deben tener condiciones especiales de seguridad para evitar contaminación y, por tanto, falsas
reacciones:
•
•
•
•
•
5.2.
Use guantes durante el trabajo (sin polvo, si es posible).
Utilizar puntas nuevas en cada paso de pipeteo (con filtro integrado).
Utilice áreas de trabajo diferentes para la preamplificación (purificación de ADN y
preparación de las reacciones) y postamplificación (hibridación y detección).
Preferiblemente utilice dos habitaciones separadas.
El amplicón no debe llevarse al área de realización del PCR.
Utilice dispositivos y otros materiales sólo en los lugares respectivos y no cambiarlos.
Purificación de ADN
Preparar el ADN de la muestra según el método estándar del laboratorio para la purificación de
ADN para PCR (preferiblemente un método no salino).
Métodos de extracción de ADN validados:
•
Columnas de QIAGEN
Métodos probados satisfactoriamente sobre el terreno:
•
•
•
EZ-1 / Geno M6 (QIAGEN bolas magnéticas)
Promega Maxwell 16
QuatroProbe (BeeRobotics)
La heparina potencialmente inhibe la PCR. Por lo tanto, para el tipado se recomienda muestras de
sangre en EDTA o citrato. La muestra de ADN debe tener una concentración de 15-30 ng/µl.
Los índices de pureza deben ser los siguientes:
•
•
coeficiente de extinción OD260/OD280: >1,5 y <2,0.
Valores más altos indican la existencia de ARN, y valores más bajos significan
contaminación con proteínas.
coeficiente de extinción OD260/OD230: >1,8.
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Instrucciones para el uso de los kits HISTO SPOT® SSO
Versión: 11 / 2013
Valores más bajos indican una posible contaminación con carbohidratos, sales o solventes
orgánicos.
5.3.
Amplificación
Para la amplificación utilice placas de PCR con faldilla, porque el procesador MR.SPOT® utiliza
esos rebordes para fijar la placa. Las placas de PCR HISTO SPOT® se han validado para esta
aplicación, cualquier otra placa de otros proveedores tienen que ser validados por el usuario. A
cada muestras a amplificar agregar al tubo de PCR los siguientes reactivos:
10 µl de Master Mix
5 µl de MgCl2
5 µl de muestra de ADN (15-30 ng/µl)
El volumen total de cada reacción de amplificación es de 20 µl.
Mezcla previa para varias
muestras:
nº de muestras+2
nº de muestras+2
x 10 µl de Master mix
x 5 µl MgCl2
Utilizar 15 µl de
mezcla previa por
muestra
Nota: Es importante que la concentración del ADN este en el rango de 15 a 30 ng/µl.
Concentraciones más altas puede provocar falsos positivos en las reacciones de las sondas y
concentraciones más bajas pueden causar fallos de amplificación.
Si se debe incluir un control negativo, preparar una reacción de PCR con agua destilada en vez
de muestra de ADN.
Sellar los tubos de amplificación con tapones o película adhesiva y centrifugar brevemente para
llevar el líquido al fondo de los tubos. Colocar los tubos en el termociclador y amplificar bajo las
siguientes condiciones:
Paso del programa
Tiempo
Temperatura
Nº de ciclos
2 Min
96°C
1 Ciclo
Desnaturalización
Anillamiento + extensión
15 Seg.
60 Seg.
96°C
65°C
10 Ciclos
Desnaturalización
Anillamiento
Extensión
10 Seg.
50 Seg.
30 Seg.
96°C
61°C
72°C
20 Ciclos
∞
22°C
Primera desnaturalización
Mantener
Las condiciones son las mismas para todos los termocicladores sin embargo el tiempo total
necesario para esta etapa variará según la velocidad de rampa específica del termociclador.
Los siguientes modelos de termociclador se han validado con HISTO SPOT® SSO:
Applied Biosystems: PE 9600, PE 9700 (usando la velocidad de rampa del PE 9700), VeritiTM
Biorad: PTC 100 / 200 PTC, Mycycler
Eppendorf: Mastercycler EP Gradient S
Si se utilizan otros termocicladores, el usuario deberá hacer la validación. Se recomienda como
norma general usar una velocidad de rampa de 1 – 2ºC/seg.
Una vez completado el paso de amplificación, las muestras se pueden analizar inmediatamente o
almacenarlas entre 2 - 8ºC hasta 5 días.
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5.4.
5.4.1.
Versión: 11 / 2013
Ensayo de hibridación automatizado en el procesador MR.SPOT®.
Preparación de reactivos
Sacar los reactivos y los pocillos de ensayo HISTO SPOT® de la nevera y dejar que alcancen la
temperatura ambiente.
En el tampón de hibridación y en la solución de lavado astringente se pueden observar cristales
de sal. Si hay cristales, calentar los reactivos hasta 30°C para disolver las sales. Calentar todo el
contenido de la botella, no una alícuota.
El conjugado ha de diluirse 1:1666 en tampón de bloqueo. El conjugado diluido se debe preparar
fresco cada vez que se realice un ensayo.
El conjugado se tiene que agitarse en vortex y centrifugarse antes del paso de dilución!
El Volumen de reactivos necesarios variarán en función del número de tiras del ensayo.
MR.SPOT® muestra los volúmenes requeridos para el número de tiras elegidas. Rellenar con los
volúmenes necesarios de reactivos los pocillos correspondientes de la cubeta de reactivos
Coloque los pocillos de prueba y la placa de PCR en el bloque apropiado del procesador
MR.SPOT®. Compruebe que quede bien colocada la placa de PCR.
Asegúrese que no hay suciedad o partículas de plástico en el soporte de la placa de reacción,
porque podría interferir en la transmisión del calor durante la hibridación.
Las tiras de pruebas pueden separarse en pocillos individuales como se indica en la Figura 1, si
se van a realizar menos de 8 pruebas. Si se usan pocillos separados prestar atención para
colocarlas adecuadamente en el soporte de reacción y que no estén giradas unas contra otras.
Separe los pocillos de ensayo
ejerciendo presión sobre ellos
apoyados sobre un borde recto.
Romper los
extremos con el
pulgar.
No rompa el pocillos
de ensayo
presionando hacia
arriba o hacia abajo
y no tuerza los
pocillos.
Figura 1: Separación de los pocillos de ensayo en pocillos individuales.
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Instrucciones para el uso de los kits HISTO SPOT® SSO
Versión: 11 / 2013
Configuración del procesador MR.SPOT®
5.4.2.
Encienda en procesador MR.SPOT. Aparecerá la pantalla de inicio. Seguir el proceso como se
indica en la pantalla. Los detalles se describen en el manual de usuario del procesador
MR.SPOT®.
Nota: El Procesador MR.SPOT® y los reactivos no deben exponerse directamente a la luz solar.
5.4.3.
Transferencia de resultados a un PC para la interpretación
La transferencia de datos al software HISTO MATCH a través de una red o utilizando una
memoria USB viene descrita en el manual de HISTO MATCH.
5.4.4.
Interpretación de los resultados
Abrir el software HISTO MATCH (si aun no esta instalado, se
puede instalar desde el CD suministrado con el procesador
MR.SPOT®) e interpretar los datos como se describe en el
manual del software HISTO MATCH.
Las imágenes deben parecerse al ejemplo mostrado en la
figura 2, y la figura 3 muestra una ilustración esquemática de
los resultados y las funciones de las diferentes sondas.
El color de los círculos que rodean las sondas indica su
función (ver manual del Software HISTO MATCH para más
detalles).
Figura 2: Imagen de un resultado de HLA-A
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: Sondas de Posicionamiento: Reaccionan
con los primers de amplificación presentes
en la mastermix e indican que la mastermix
se ha añadido y que todos los reactivos
durante el proceso de tipaje SSO se han
añadido correctamente. Además, permiten al
software localizar y orientar la imagen. El
patrón es específico para cada sublote
(“batch”).
+: Controles de amplificación para el
Exón 2 y el Exón 3 por duplicado. Estas
sondas son universales para todos los alelos
del locus respectivo y muestran que la PCR
ha funcionado correctamente, También
funcionan como referencia para las sondas
específicas de alelo.
: Sonda específica de alelo Positiva.


: Sonda específica de alelo Negativa.


Figura 3: Ilustración esquemática del resultado y función de las sondas.
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Instrucciones para el uso de los kits HISTO SPOT® SSO
6.
Versión: 11 / 2013
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
HISTO SPOT® está diseñado para el diagnóstico "in vitro y lo debe utilizar personal cualificado con
la formación adecuada. Todo trabajo se debe realizar utilizando buenas prácticas de laboratorio.
El material biológico que se utiliza para la extracción de ADN, p. ej., sangre o tejidos humanos, se
deben tratar como potencialmente infecciosos. Cuando se manipula material biológico se
recomienda observar las debidas medidas de seguridad (no pipetear con la boca; usar guantes
desechables durante la manipulación material biológico y la realización de la prueba; desinfectar
las manos cuando haya terminado la prueba).
El material biológico se debe desactivar antes de desechar (por ejemplo en un autoclave). Los
materiales desechables se deben esterilizar o incinerar después de utilizarlos.
Los derrames de materiales potencialmente infecciosos se deben eliminar inmediatamente con
papel absorbente y limpiar las zonas contaminadas con un desinfectante estándar adecuado o de
alcohol al 70%.
Los materiales que se usan para limpiar derrames, incluyendo guantes, se deben desactivar antes
de desecharlos (p. ej. en una autoclave).
La solución de bloqueo, el tampón de hibridación, el tampón de lavado astringente y el tampón de
lavado TBS contienen ProClin®150 y la solución de cloruro de magnesio contiene ProClin®300.
Los reactivos sólo contienen 0.001% de conservante, no obstante se debe evitar el contacto con la
piel y las membranas mucosas.
La Master mix y el conjugado contienen el conservante azida de sodio. Los reactivos contienen
<0,1% azida de sódica que no se consideran concentraciones peligrosas. No obstante evitar el
contacto con la piel y las membranas mucosas. La azida sódica puede reaccionar con las cañerías
de plomo y cobre formando azidas metálicas explosivas. Cuando se desecha soluciones que
contienen azida sódica en el laboratorio, se debe enjuagar las cañerías con mucha agua para
prevenir la acumulación de azida.
Todo el trabajo con los reactivos se deben realizar con las debidas precauciones. Cuando se
manipulan reactivos se debe utilizar protección para los ojos, batas de laboratorio y guantes
desechables. Evitar el contacto de estos materiales con la piel, los ojos o las membranas
mucosas. Si se produce el contacto, lavar inmediatamente con abundante agua. Sin tratamiento
se pueden producir quemaduras.
Si se producen derrames de reactivos, diluir con agua antes de secarle. No exponga el sustrato a
los metales, contiene agentes oxidantes.
La eliminación de las muestras, los reactivos sin utilizar y los residuos debe estar en conformidad
con las regulaciones locales, estatales y federales del país.
Evitar la contaminación microbiana de los reactivos al extraer alícuotas de las botellas. Se
recomienda utilizar pipetas desechables estériles y puntas de pipeta. No utilizar reactivos con
pruebas de turbidez o contaminación microbiana.
En la página www.bag-healthcare.com hay disponibles para descargar Hojas de Datos de
Seguridad de Materiales (MSDS).
7.
CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE FUNCIONAMIENTO
7.1.
Evaluación
A todos los kits HISTO SPOT® SSO se le han realizado estudios de evaluación con muestras de
ADN pre-tipificadas. Los resultados se compararon con otros métodos de tipificación (p. ej. SSP,
Secuenciación). No se observaron diferencias entre los métodos de tipificación. Para cada lote se
verificó la especificidad de cada sonda con ADN de muestras de referencia.
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Instrucciones para el uso de los kits HISTO SPOT® SSO
7.2.
Versión: 11 / 2013
Reacción de amplificación PCR
En la información específica de cada lote se incluye los alelos amplificados con cada kit HISTO
SPOT® SSO, la nomenclatura HLA liberada a que se refiere y los exones que se amplifican. Esta
se encuentra en un CD en cada kit.
7.3.
Resolución del ensayo
La sistema de tipificación HISTO SPOT® SSO está diseñado para proporcionar resultados no
ambiguos al menos a nivel de grupo de alelos, es decir de dos dígitos. Diferentes combinaciones
de alelos que cruzan grupos de alelos pero tienen el mismo patrón de sonda positiva son
consideradas como ambigua.
Los kits de tipificación HISTO SPOT® 4D normalmente dan resultados a nivel de alelos (4 dígitos)
si se utilizan filtros de alelos comunes. Los criterios para ese filtro de alelo común son los
siguientes: frecuencia del alelo ≥0,5% por lo menos en una población con un tamaño de muestra
de al menos 1000 muestras en el sitio web www.allelefrequencies.net.
8.
LIMITACIONES DEL MÉTODO
Debido a la alta susceptibilidad del método de PCR a las variaciones de concentración y calidad
del ADN, sólo se debe utilizar muestras de ADN que tengan una concentración entre 15 y 30 ng/µl
y una índice de pureza (coeficiente de extinción DO260/DO280: entre 1,5 y 2,0 / coeficiente de
extinción DO260/DO230: >1,8).
Debe tener sumo cuidado para evitar la contaminación de los reactivos del kit y otros materiales
de laboratorio y equipos con amplicones o ADN. Se recomiendan encarecidamente pruebas de
limpieza regulares (p. ej. BAG Wipetest, REF 7091) y controles negativos con cada ensayo.
El ensayo de hibridación es un muy sensible a la temperatura de proceso. Por eso, los kits HISTO
SPOT® SSO sólo se debe utilizar en combinación con el procesador MR.SPOT® para asegurar la
correcta temperatura y tiempo de incubación.
Todos los instrumentos (p. ej. pipetas, termocicladores, bloques de calor; el procesador
MR.SPOT®) se deben calibrar de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. La precisión y
uniformidad de temperatura del termociclador se puede comprobar con el BAG CyclerCheck (REF
7104).
9.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO
El control de la calidad interno de nuevos lotes de kits HISTO SPOT® SSO se puede realizar
utilizando una combinación de muestras de ADN con tipo HLA conocido.
En cada pocillo de ensayo hay controles positivos internos para garantizar el éxito de la
amplificación y la hibridación.
Se recomiendan controles negativos para detectar posibles contaminaciones. Utilizar una reacción
de PCR sin ADN en el posterior ensayo de hibridación como un control negativo.
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Instrucciones para el uso de los kits HISTO SPOT® SSO
10.
SOLUCIÓN DE PROBLEMAS
Síntoma
Mal funcionamiento del
Instrumento
Mensaje de Error durante la
transferencia de datos
Sin resultado
Posible problema(s)
Numerosos
No hay spots en el pocillo
Fallo al añadir la Master Mix a
la PCR.
Sólo spots control positivo
Fallo al añadir el ADN a la
PCR o fallo de amplificación
Sondas falso positivo
Se ha utilizado demasiado
ADN o una concentración
excesiva del conjugado (no
centrifugado).
Concentración del ADN
demasiado alta o ADN
degradado
Error de dilución del conjugado
o mala amplificación.
Mal funcionamiento del
Instrumento
Pérdida de exones
Ningún resultado / resultado
no concluyente debido a las
señales débiles
11.
Versión: 11 / 2013
Fallo en la transferencia de
datos
Fallo al cuadricular la imagen
Posible solución(es)
Consulte el manual de
MR.SPOT®
Transferir manualmente los
datos utilizando unidad USB
Realizar un cuadriculado
manual
Repetir todo el ensayo y
verificar el producto del PCR
en gel
Repetir todo el ensayo y
verificar el producto del PCR
en gel
Compruebe la concentración
de ADN Centrifugue el
conjugado antes de utilizar.
Comprobar la concentración
del ADN, correr un gel con el
ADN
Repita el ensayo.
Comprobar la temperatura de
hibridación en el instrumento
MARCAS COMERCIALES UTILIZADAS EN ESTE DOCUMENTO/PRODUCTO
Proclin® es una marca registrada de la compañía Rohm and Haas.
BCIP® es una marca registrada de Sigma Aldrich Co.
VeritiTM es una marca registrada de Applied Biosystems.
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Instrucciones para el uso de los kits HISTO SPOT® SSO
12.
Versión: 11 / 2013
EXPLICACIÓN DE LOS SÍMBOLOS UTILIZADOS EN EL ETIQUETADO
IVD
Para diagnóstico in vitro
Temperatura de almacenamiento
LOT
Código de Sublotes
Usar antes de
REF
Referencia
Consulte las Instrucciones de uso
TIPAJE HLA
Finalidad: Tipaje HLA
Mastermix | A
Master mix para la amplificación del locus HLA-A
Mastermix | B
Master mix para la amplificación del locus HLA-B
Mastermix | C
Master mix para la amplificación del locus HLA-C
Mastermix | DRB1
Master mix para la amplificación del locus HLA-DRB1
Mastermix | DQB1
Master mix para la amplificación del locus HLA-DQB1
Mastermix | DQ
Master mix para la amplificación del locus HLA-DQB1 y DQA1
Mastermix | DPB1
Master mix para la amplificación del locus HLA-DPB1
Mastermix | DRB3/4/5 Master mix para amplificación del loci HLA-DRB3/4/5
Testwells | A
Pocillos de ensayo con sondas para el tipaje del locus HLA-A
Testwells | B
Pocillos de ensayo con sondas para el tipaje del locus HLA-B
Testwells | C
Pocillos de ensayo con sondas para el tipaje del locus HLA-C
Testwells | DRB1
Pocillos de ensayo con sondas para el tipaje del locus HLA-DRB1
Testwells | DQB1
Pocillos de ensayo con sondas para el tipaje del locus HLA-DQB1
Testwells | DQ
Pocillos de ensayo con sondas para el tipaje del locus HLA-DQB1 y DQA1
Testwells | DPB1
Pocillos de ensayo con sondas para el tipaje del locus HLA-DPB1
Testwells | DRB3/4/5
Pocillos de ensayo con sondas para el tipaje del loci HLA-DRB3/4/5
MgCl2
Cloruro de magnesio
BLOCKBUF
Tampón de bloqueo
HYBBUF
Tampón de hibridación
STRGWASH
Solución de lavado astringente
TBS
Solución salina tamponada con TRIS
SUBS
Sustrato
CONJ
Conjugado con Fosfatasa alcalina con estreptavidina
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Instrucciones para el uso de los kits HISTO SPOT® SSO
Instrucciones de uso en otros idiomas, consultar:
http://www.bag-healthcare.com
http://service.bag-healthcare.com
Teléfono +49 (0)6404-925-125
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Versión: 11 / 2013
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