DEASP01 Aspergillus fumigatus IgG ELISA 161128 m

DEASP01 Aspergillus fumigatus IgG ELISA 161128 m
Product information
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Userś Manual
Aspergillus fumigatus IgG
ELISA
Enzyme immunoassay for the detection and quantitative
determination of human IgG antibodies against Aspergillus
fumigatus in serum and plasma
DEASP01
96 wells
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Demeditec Aspergillus fumigatus IgG ELISA DEASP01
CONTENTS / INHALTSVERZEICHNIS
1. INTENDED USE .................................................................................................................................. 3
2. GENERAL INFORMATION .................................................................................................................. 3
3. PRINCIPLE OF THE TESTS ............................................................................................................... 3
4. LIMITATIONS, PRECAUTIONS AND GENERAL COMMENTS ......................................................... 4
5. REAGENTS PROVIDED...................................................................................................................... 4
6. MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED ................................................................................ 5
7. SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING ...................................................................................... 6
8. ASSAY PROCEDURE ......................................................................................................................... 6
9. EVALUATION ...................................................................................................................................... 7
10. ASSAY CHARACTERISTICS ............................................................................................................ 7
11. REFERENCES ................................................................................................................................... 8
1. VERWENDUNGSZWECK ................................................................................................................... 9
2. KLINISCHE BEDEUTUNG................................................................................................................... 9
3. TESTPRINZIP ...................................................................................................................................... 9
4. HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN ................................................................................... 10
5. INHALT DES TESTBESTECKS ........................................................................................................ 10
6. ERFORDERLICHE GERÄTE UND HILFSMITTEL ........................................................................... 11
7. GEWINNUNG, VORBEREITUNG UND AUFBEWAHRUNG DER PROBEN ................................... 12
8. TESTDURCHFÜHRUNG ................................................................................................................... 12
9. AUSWERTUNG ................................................................................................................................. 13
10. TESTCHARAKTERISTIKA .............................................................................................................. 13
11. LITERATUR ..................................................................................................................................... 14
SYMBOLS USED WITH DEMEDITEC ASSAYS ................................................................................... 16
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1. INTENDED USE
The Aspergillus fumigatus IgG Antibody ELISA Test Kit has been designed for the detection and the
quantitative determination of specific IgG antibodies against Aspergillus fumigatus in serum and
plasma. Further applications in other body fluids are possible and can be requested from the
Technical Service of DEMEDITEC.
Laboratory results can never be the only base of a medical report. The patient history and further tests
have additionally to be taken into account.
2. GENERAL INFORMATION
Aspergillus species of known pathogenicity to man are Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, A.
terreus and A. nidulans. The most common pathogen of this genus is A. fumingatus which occurs in
hay, grain, rotten plants and birds faeces. The main opportunistic invasive fungial infections are the
candidal mycosis followed by aspergillosis. Generally infections with Aspergillus spp. are airborne.
Because of the ubiquity of Aspergillus species it renders more difficult to decide between
contamination by commensals or a serious infection. Usually infection in man occurs in already
damaged tissues only. Aspergillus spp. can cause a chronical infection of paranasal sinus, eyes or
lungs.
Three types of lung-aspergillosis can be distinguished:
a. Acute infection (bronchial pneumonia; pneumonia)
Aspergillus pneumonia is mostly found in patients with neutropenia (decrease of neutrophil
granulocytes), after a long-time therapy with glucocorticoids, in immunosuppressed patients (after
organ transplantation) and in alcoholics.
b. Saprophytic aspergillom (compact reticulum of hyphae in the lungs)
Preformed caves in the lung due to a previous tuberculosis give place to a colonisation of
Aspergillus species.
c. Allergic bronchopulmonal aspergillosis
This clinical picture is not due to an infectious disease but a hypersensitive reaction of the
bronchial system (mediated by IgE) after inhalation of aspergillus spores. Subsequently the
bronchial system produces highly viscous secretions, that may block the bronchial lumen. The
patient develops difficulties of breathing and a fibrosis.
Next to ELISA the indirect Aspergillus hemagglutination test (Aspergillus HAT) can be performed to
detect specific IgG and IgM antibodies. The HAT is not suitable as a screening test, however, because
of its low sensitivity. In some high-risk patients it shows only low antibody titers. For a better diagnosis
of invasive aspergillosis the brain or lung of these patients should be examined by a biopsy.
3. PRINCIPLE OF THE TESTS
The Aspergillus fumigatus IgG antibody test kit is based on the principle of the enzyme immunoassay
(EIA). Aspergillus antigen is bound on the surface of the microtiter strips. Diluted patient serum or
ready-to-use standards are pipetted into the wells of the microtiter plate. A binding between the IgG
antibodies of the serum and the immobilized Aspergillus antigen takes place. After a one hour
incubation at room temperature, the plate is rinsed with diluted wash solution, in order to remove
unbound material. Then ready-to-use anti-human-IgG peroxidase conjugate is added and incubated
for 30 minutes. After a further washing step, the substrate (TMB) solution is pipetted and incubated for
20 minutes, inducing the development of a blue dye in the wells. The color development is terminated
by the addition of a stop solution, which changes the color from blue to yellow. The resulting dye is
measured spectrophotometrically at the wavelength of 450 nm. The concentration of the IgG
antibodies is directly proportional to the intensity of the color.
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4. LIMITATIONS, PRECAUTIONS AND GENERAL COMMENTS
• Only for in-vitro use! Do not ingest or swallow! The usual laboratory safety precautions as well as
the prohibition of eating, drinking and smoking in the lab have to be followed.
• All sera and plasma or buffers based upon, have been tested respective to HBsAg, HIV and HCV
with recognized methods and were found negative. Nevertheless precautions like the use of latex
gloves have to be taken.
• Serum and reagent spills have to be wiped off with a disinfecting solution (e.g. sodium hypochlorite,
5%) and have to be disposed of properly.
• All reagents have to be brought to room temperature (18 to 25 °C) before performing the test.
• Before pipetting all reagents should be mixed thoroughly by gentle tilting or swinging. Vigorous
shaking with formation of foam should be avoided.
• It is important to pipet with constant intervals, so that all the wells of the microtiter plate have the
same conditions.
• When removing reagents out of the bottles, care has to be taken that the stoppers are not
contaminated. Further a possible mix-up has to be avoided. The content of the bottles is usually
sensitive to oxidation, so that they should be opened only for a short time.
• In order to avoid a carry-over or a cross-contamination, separate disposable pipet tips have to be
used.
• All reagents have to be used within the expiry period.
• In accordance with a Good Laboratory Practice (GLP) or following ISO9001 all laboratory devices
employed should be regularly checked regarding the accuracy and precision. This refers amongst
others to microliter pipets and washing or reading (ELISA-Reader) instrumentation.
• The contact of certain reagents, above all the stopping solution and the substrate with skin, eye
and mucosa has to be avoided, because possible irritations and acid burns could arise, and there
exists a danger of intoxication.
5. REAGENTS PROVIDED
Symbol
SORB MT
CAL A
CAL B
CAL C
CAL D
ENZ CONJ
SUB TMB
STOP SOLN
SAM DIL
WASH SOLN 10x
-
Components
Aspergillus fumigatus antigen coated microtiter strips
Calibrator A (Negative Control)
Calibrator B (Cut-Off Standard)
Calibrator C (Weak Positive Control)
Calibrator D (Positive Control)
Enzyme Conjugate
Substrate
Stop Solution
Sample Diluent
Washing Buffer (10×)
Plastic bag
Volume / Qty.
12
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
15 mL
15 mL
15 mL
60 mL
60 mL
1
Storage and Stability (refer to the expiry date on the outer box label)
o
Store kit components at 2-8 C and do not use after the expiry date on the box outer label. Before use,
o
all components should be allowed to warm up to ambient temperature (18-25 C). After use, the plate
o
should be resealed, the bottle caps replaced and tightened and the kit stored at 2-8 C. After the first
opening the kit should be used within 3 months, the diluted wash buffer can be kept for 4 weeks at
2-8°C.
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5.1. Microtiter Strips
12 strips with 8 breakable wells each, coated with Aspergillus fumigatus antigen. Ready-to-use.
5.2. Calibrator A (Negative Control)
2 mL, protein solution diluted with PBS, contains no IgG antibodies against Aspergillus. Addition of
0.01% methylisothiazolone and 0.01% bromonitrodioxane. Ready-to-use.
5.3. Calibrator B (Cut-Off Standard)
2 mL human serum diluted with PBS, contains a low concentration of IgG antibodies against
Aspergillus. Addition of 0.01 % methylisothiazolone and 0.01 % bromonitrodioxane. Ready-to-use.
5.4. Calibrator C (Weak Positive Control)
2 mL, human serum diluted with PBS, contains a medium concentration of IgG antibodies against
Aspergillus. Addition of 0.01 % methylisothiazolone and 0.01 % bromonitrodioxane. Ready-to-use.
5.5. Calibrator D (Positive Control)
2 mL, human serum diluted with PBS, contains a high concentration of IgG antibodies against
Aspergillus. Addition of 0.01% methylisothiazolone and 0.01% bromonitrodioxane. Ready-to-use.
5.6. Enzyme Conjugate
15 mL, anti-human-IgG-HRP (rabbit), in protein-containing buffer solution. Addition of 0.01 %
TM
methylisothiazolone and 0.01 % bromonitrodioxane and 5 mg/L Proclin . Ready-to-use.
5.7. Substrate
15 mL, TMB (tetramethylbenzidine). Ready-to-use.
5.8. Stop Solution
15 mL, 1 N acidic solution. Ready-to-use.
5.9. Sample Diluent
60 mL, PBS/BSA buffer. Addition of 0.095 % sodium azide. Ready-to-use.
5.10. Washing Buffer
60 mL, PBS + Tween 20, 10x concentrate. Final concentration: dilute 1+9 with deionized water. If
during the cold storage crystals precipitate, the concentrate should be warmed up at 37°C for
15 minutes.
5.11. Plastic Bag
Resealable, for the dry storage of non-used strips.
6. MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
•
•
•
•
•
•
5 µL-, 100 µL- and 500 µL micro- and multichannel pipets
Microtiter Plate Reader (450 nm)
Microtiter Plate Washer
Reagent tubes for the serum dilution
Deionized water
Re-usable black lid for covering (Available upon request at Demeditec Diagnostics GmbH)
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7. SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING
Principally serum or plasma (EDTA, heparin) can be used for the determination. Serum is separated
from the blood, which is aseptically drawn by venipuncture, after clotting and centrifugation. The
serum or plasma samples can be stored refrigerated (2-8°C) for up to 7 days. For a longer storage
they should be kept at -20°C. The samples should not be frozen and thawed repeatedly. Lipemic,
hemolytic or bacterially contaminated samples can cause false positive or false negative results.
For the performance of the test the samples (not the standards) have to be diluted 1:101 with ready-touse sample diluent (e.g. 5 µL serum + 500 µL sample diluent).
8. ASSAY PROCEDURE
8.1. Preparation of Reagents
Washing Solution: dilute before use 1+9 with deionized water. If during the cold storage crystals
precipitate, the concentrate should be warmed up at 37°C for 15 minutes.
• Strict adherence to the protocol is advised for reliable performance. Any changes or modifications
are the responsibility of the user.
• All reagents and samples must be brought to room temperature before use, but should not be left
at this temperature longer than necessary.
• A standard curve should be established with each assay.
• Return the unused microtiter strips to the plastic bag and store them dry at 2-8°C.
8.2. Assay Steps
1. Prepare a sufficient amount of microtiter wells for the standards, controls and samples as well as
for a substrate blank.
2. Pipet 100 µL each of the diluted (1:101) samples and the ready-to-use standards and controls
respectively into the wells. Leave one well empty for the substrate blank.
3. Cover plate with the re-usable plate cover and incubate at room temperature for 60 minutes.
4. Empty the wells of the plate (dump or aspirate) and add 300 µL of diluted washing solution. This
procedure is repeated totally three times. Rests of the washing buffer are afterwards removed by
gentle tapping of the microtiter plate on a tissue cloth.
5. Pipet 100 µL each of ready-to-use conjugate into the wells. Leave one well empty for the substrate
blank.
6. Cover plate with the re-usable plate cover and incubate at room temperature for 30 minutes.
7. Empty the wells of the plate (dump or aspirate) and add 300 µL of diluted washing solution. This
procedure is repeated totally three times. Rests of the washing buffer are afterwards removed by
gentle tapping of the microtiter plate on a tissue cloth.
8. Pipet 100 µL each of the ready-to-use substrate into the wells. This time also the substrate blank is
pipetted.
9. Cover plate with the re-usable plate cover and incubate at room temperature for 20 minutes in the
dark (e.g. drawer).
10. To terminate the substrate reaction, pipet 100 µL each of the ready-to-use stop solution into the
wells. Pipet also the substrate blank.
11. After thorough mixing and wiping the bottom of the plate, perform the reading of the absorption at
450 nm (optionally reference wavelength of 620 nm). The color is stable for at least 60 minutes.
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9. EVALUATION
Example
Substrate Blank
Negative Control
Cut-Off Standard
Weak Positive Control
Positive Control
OD Value
0.018
0.041
0.507
0.918
2.356
Corrected OD
0.023
0.489
0.900
2.338
The above table contains only an example, which was achieved under arbitrary temperature and
environmental conditions. The described data constitute consequently no reference values which
have to be found in other laboratories in the same way.
9.1. Qualitative Evaluation
The calculated absorptions for the patient sera, as mentioned above, are compared with the value for
the cut-off standard. If the value of the sample is higher, there is a positive result. For a value below
the cut-off standard, there is a negative result. It seems reasonable to define a range of +/-20 %
around the value of the cut-off as a grey zone. In such a case the repetition of the test with the same
serum or with a new sample of the same patient, taken after 2-4 weeks, is recommended. Both
samples should be measured in parallel in the same run.
The positive control must show at least the double absorption compared with the cut-off standard.
9.2. Quantitative Evaluation
The ready-to-use standards and controls of the Aspergillus fumigatus IgG antibody kit are defined and
expressed in arbitrary units (U/mL). This results in an exact and reproducible quantitative evaluation.
Consequently for a given patient follow-up controls become possible. The values for controls and
standards in units are printed on the QC data sheet.
For a quantitative evaluation the absorptions of the standards and controls are graphically drawn
point-to-point against their concentrations. From the resulting reference curve the concentration values
for each patient sample can then be extracted in relation to their absorptions. It is also possible to use
automatic computer programs. As curve fit point-to-point has to be chosen.
Calibrator B with its concentration of 10 U/mL serves as cut-off standard. Analogous to the qualitative
evaluation a range of +/-20% around the cut-off is defined as a grey zone. Thus results between 8 and
12 U/mL are reported as borderline.
10. ASSAY CHARACTERISTICS
Aspergillus fumigatus ELISA
Intra-Assay-Precision
Inter-Assay-Precision
Inter-Lot-Precision
Analytical Sensitivity
Recovery
Linearity
Cross-Reactivity
Interferences
Clinical Specificity
Clinical Sensitivity
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IgG
9.9 %
11.1 %
3.5 – 16.4 %
1.08 U/mL
87 – 97 %
74 – 114 %
No cross-reactivity to Candida albicans
No interferences to bilirubin up to 0.3 mg/mL,
hemoglobin up to 8.0 mg/mL and
triglycerides up to 5.0 mg/mL
81 %
100 %
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11. REFERENCES
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Bodey GP. Eur. J. Clin Microbiol. Infect., 8: 413 (1989).
Boeckh M, Höffgen G, Lode H. Dtsch. med. Wschr., 114: 1706 (1989).
Kurup VP, Kumar A. Clin. Microbiol. Rev., 4: 439 (1991).
Patterson R, Greenberger PA, Halwig JM, Liotta L, Roberts M. Arch. intern. Med., 146: 986
(1986).
Rosenberg M, Pattersom R, Mintzer R, Cooper BJ, Roberts M, Harris KE. Ann. intern. Med., 86:
405 (1977).
Rüchel R. Annals of Hematology 67: 1 (1993).
Schaberg T, Mauch H, Lode H. Dtsch. med. Wschr., 117: 1681 (1992).
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1. VERWENDUNGSZWECK
Der Aspergillus fumigatus-IgG-ELISA dient dem Nachweis und der quantitativen Bestimmung von
humanen IgG-Antikörpern gegen Aspergillus im Serum oder Plasma ohne vorhergehende Extraktion.
Weitere Anwendungen in anderen Körperflüssigkeiten sind möglich und können beim Technischen
Service von DEMEDITEC erfragt werden.
Laborergebnisse können nie allein die Grundlage eines medizinischen Befundes bilden. Es müssen
immer das klinische Bild sowie weitere Untersuchungen mit berücksichtigt werden.
2. KLINISCHE BEDEUTUNG
Zu den humanpathogenen Aspergillus-Arten zählen Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, A.
terreus und A. nidulans. Der weitaus häufigste Erreger ist Aspergillus fumigatus, der vor allem Heu,
Getreide, verrottende Pflanzen und Vogelfäkalien besiedelt. Nach den Candidosen nehmen
Aspergillosen die zweite Stelle unter den opportunistischen invasiven Mykosen ein. Die meisten
Aspergillus-Infektionen werden durch die Luft übertragen. Die ubiquitäre Verbreitung von Aspergillus
species machen eine Differenzierung zwischen Kontamination durch kommensale Flora und Infektion
schwierig. Als Krankheitserreger des Menschen befallen sie meist nur vorgeschädigtes Gewebe.
Aspergillen können die Nasennebenhöhlen, die Augen und die Lunge chronisch infizieren. Hinsichtlich
der Aspergillus-Infektion der Lunge lassen sich drei Krankheitsbilder unterscheiden:
a. Akute Infektion (Bronchopneumonie oder Pneumonie)
Aspergillus-Pneumonien treten besonders häufig bei Patienten mit einer Neutropenie
(Verminderung der neutrophilen Granulozyten), nach einer Langzeittherapie mit Glukokortikoiden,
bei intensiver Immunsuppression nach Organtransplantationen und bei chronischen Alkoholikern
auf.
b. Saprophytäres Aspergillom (dichtes Hyphengeflecht in der Lunge)
Hierbei findet sich oft eine Kolonisation in präformierten Höhlen, die als Defektheilung nach einer
Tuberkulose entstanden sind.
c. Allergische bronchopulmonale Aspergillose (ABPA)
Bei diesem Krankheitsbild handelt es sich nicht um eine Infektionskrankheit sondern um eine IgEvermittelte Hypersensivitätsreaktion des Bronchialsystems nach Inhalation von AspergillusSporen. Als Folge bilden sich hochvisköse Sekrete, die die Bronchiallumina verschließen können.
Klinisch entwickeln sich oft Atembeschwerden und Fibrose.
Neben einem ELISA kann zur Erfassung spezifischer IgG- und IgM-Antikörper auch ein indirekter
Aspergillus-Hämagglutinationstest (Aspergillus-HAT) durch-geführt werden. Allerdings ist dieses
Verfahren aufgrund seiner geringen Sensitivität nicht als Screening-Test geeignet. Bei Risikopatienten
werden oft nur geringe Antikörpertiter nachgewiesen. Zur genauen Diagnose invasiver Aspergillosen
bei solchen Patienten sollten Gehirn oder Lunge mittels Biopsie auf mögliche Schäden untersucht
werden.
3. TESTPRINZIP
Der Aspergillus-IgG-Antikörper-Test basiert auf dem Prinzip des Enzymimmunoassays (EIA). Auf der
Oberfläche der Mikrotiterstreifen ist Aspergillus fumigatus-Antigen gebunden. Verdünntes Patientenserum bzw. gebrauchsfertige Standards werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Es
findet eine Bindung zwischen den IgG-Antikörpern aus dem Serum und dem immobilisierten
Aspergillus-Antigen statt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Platte mit
verdünnter Waschlösung gewaschen, um nichtgebundenes Material zu entfernen. Danach wird
gebrauchsfertiges Anti-human-IgG-Peroxidase Konjugat zugegeben und 30 Minuten inkubiert. Nach
einem weiteren Waschschritt wird eine Substratlösung (TMB) pipettiert und 20 Minuten inkubiert,
wodurch in den Vertiefungen ein blauer Farbstoff entsteht. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe
einer Stopp-Lösung beendet, wobei ein Farbumschlag von blau nach gelb stattfindet. Die resultierende Farbe wird spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen. Die Konzentration der IgG-Antikörper ist
der Intensität der Färbung direkt proportional.
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4. HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
• Nur für in-vitro Anwendung! Nicht schlucken oder einnehmen! Die laborüblichen Sicherheitsvorschriften sowie die Verbote von Essen, Trinken und Rauchen im Labor sind zu beachten.
• Alle Seren oder Plasmen oder darauf basierenden Puffer wurden nach anerkannten Methoden auf
HBsAg, HIV und HCV getestet und dabei als negativ befunden. Trotzdem sollten
Vorsichtsmaßnahmen wie die Benutzung von Latexhandschuhen ergriffen werden.
• Serum- und Reagenzienreste sollten mit einer desinfizierenden Lösung (z.B. Natrium-hypochlorit,
5 %) aufgewischt und vorschriftsgemäß entsorgt werden.
• Alle Reagenzien müssen vor der Testdurchführung auf Raumtemperatur (18 - 25°C) gebracht
werden.
• Vor dem Pipettieren sollten alle Reagenzien durch leichtes Kippen oder Schwenken gemischt
werden. Heftiges Schütteln mit Schaumbildung sollte vermieden werden.
• Wichtig ist die Einhaltung des Zeittaktes beim Pipettieren, so dass alle Ansätze in den Vertiefungen
der Mikrotiterplatte den gleichen Bedingungen unterliegen.
• Bei der Entnahme der Reagenzien aus den Flaschen ist darauf zu achten, dass die Stopfen nicht
kontaminiert werden. Außerdem ist auf eine mögliche Verwechslung zu achten. Der Inhalt der
Fläschchen ist in der Regel oxidationsempfindlich, so dass sie nur für kurze Zeit geöffnet werden
sollten.
• Zur Vermeidung einer Verschleppung oder Kreuzkontamination müssen separate EinmalPipettenspitzen verwendet werden.
• Alle Reagenzien sind innerhalb der Verfallszeit zu benutzen.
• In Übereinstimmung mit einer guten Laborpraxis (GLP) bzw. nach ISO9001 sollten regelmäßig alle
verwendeten Laborgeräte auf Richtigkeit und Präzision überprüft werden. Dies betrifft u.a.
Mikroliterpipetten sowie Wasch- und Messgeräte (ELISA-Reader).
• Der Kontakt vor allem der Stopp-Lösung und des Substrats mit Haut, Auge und Schleimhäuten ist
zu vermeiden, da mögliche Reizungen, Verätzungen oder Vergiftungsgefahr bestehen.
5. INHALT DES TESTBESTECKS
Symbol
SORB MT
CAL A
CAL B
CAL C
CAL D
ENZ CONJ
SUB TMB
STOP SOLN
SAM DIL
WASH SOLN 10x
-
Komponenten
Aspergillus-Antigen beschichtete Mikrotiterstreifen
Kalibrator A (Negative Kontrolle)
Kalibrator B (Cut-Off Standard)
Kalibrator C (Schwach Positive Kontrolle)
Kalibrator D (Positive Kontrolle)
Anti-human-IgG-Enzymkonjugat
Substratlösung
Stopp-Lösung
Probenverdünner
Waschpuffer (10×)
Plastikbeutel
Volumen / Menge
12
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
15 mL
15 mL
15 mL
60 mL
60 mL
1
Lagerung und Aufbrauchsfristen (Angabe der Verfallsdaten auf den Etiketten)
Lagern Sie die Komponenten des Kits bei 2-8°C. Nach dem Gebrauch sollten die Platten verpackt, die
Flaschen mit den zugehörigen Deckeln verschlossen und das Kit wieder bei 2-8°C gelagert werden.
Der angebrochene Kit sollte innerhalb von drei Monaten verbraucht werden, der endverdünnte
Waschpuffer hält 4 Wochen bei 2-8°C.
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5.1. Mikrotiterstreifen
12 Streifen mit je 8 abbrechbaren Vertiefungen, beschichtet mit Aspergillus fumigatus-Antigen.
Gebrauchsfertig.
5.2. Kalibrator A (Negative Kontrolle)
2 mL, menschliches mit PBS verdünntes Serum, enthält keine Antikörper gegen Aspergillus. Zusatz
von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig.
5.3. Kalibrator B (Cut-Off-Standard)
2 mL, menschliches mit PBS verdünntes Serum, mit niedriger Konzentration an IgG-Antikörpern
gegen Aspergillus. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig.
5.4. Kalibrator C (Schwach Positive Kontrolle)
2 mL, menschliches mit PBS verdünntes Serum, mit mittlerer Konzentration an IgG-Antikörpern gegen
Aspergillus. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig.
5.5. Kalibrator D (Positive Kontrolle)
2 mL, menschliches mit PBS verdünntes Serum, mit hoher Konzentration an IgG-Antikörpern gegen
Aspergillus. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig.
5.6. Anti-human-IgG-Enzymkonjugat
15 mL, Anti-human-IgG-POD (Kaninchen), in proteinhaltiger Pufferlösung. Zusatz von 0,01 %
TM
Methylisothiazolon, 0,01 % Bromonitrodioxan und 5 mg/l Proclin . Gebrauchsfertig.
5.7. Substratlösung
15 mL, TMB (Tetramethylbenzidin). Gebrauchsfertig.
5.8. Stopp-Lösung
15 mL, 1 N saure Lösung. Gebrauchsfertig.
5.9. Probenverdünner
60 mL, PBS/BSA Puffer. Zusatz von 0,095 % Natriumazid. Gebrauchsfertig.
5.10. Waschpuffer
60 mL, PBS + Tween 20, als 10x Konzentrat. Gebrauchslösung: 1+9 mit dest. Wasser verdünnen.
Falls bei der gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad
(37°C) erwärmen.
5.11. Plastikbeutel
Verschließbar, für die trockene Lagerung der nichtbenutzten Streifen.
6. ERFORDERLICHE GERÄTE UND HILFSMITTEL
•
•
•
•
•
•
5 µL-, 100 µL- und 500 µL-Mikro- bzw. Mehrkanalpipetten
Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm)
Mikrotiterplatten-Waschgerät
Reagenzgläser für die Serumverdünnung
Bidestilliertes Wasser
Wieder verwendbare schwarze Mikrotiterplattendeckel (Auf Anfrage bei Demeditec Diagnostics
GmbH erhältlich)
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7. GEWINNUNG, VORBEREITUNG UND AUFBEWAHRUNG DER PROBEN
Grundsätzlich kann für die Bestimmung Serum oder Plasma (EDTA, Heparin) verwendet werden. Aus
dem aseptisch durch Venenpunktion gewonnenen Blut wird nach der Gerinnung das Serum durch
Zentrifugation abgetrennt. Die Serum- bzw. Plasma-Proben sind bis zu 7 Tagen gekühlt (2-8°C)
haltbar; bei längerer Aufbewahrung sollten sie bei -20°C gelagert werden. Die Proben sollten nicht
mehrmals eingefroren und aufgetaut werden. Lipämische, hämolytische, oder bakteriell kontaminierte
Proben können zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen.
Für die Durchführung des Tests werden die Proben (nicht die Standards) mit gebrauchsfertigem
Probenverdünner 1:101 verdünnt (z.B. 5 µL Serum + 500 µL Probenverdünner).
8. TESTDURCHFÜHRUNG
8.1. Vorbereitung der Reagenzien
Waschlösung: vor der Benutzung 1:10 (1+9) mit bidest. Wasser verdünnen. Falls bei der gekühlten
Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad (37°C) erwärmen.
•
•
•
•
Die Reihenfolge der Pipettierschritte muss strikt eingehalten werden.
Vor dem Pipettieren müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden.
Mit jedem Test muss eine Standardkurve erstellt werden.
Nicht benötigte Antigen-beschichtete Mikrotiterstreifen sofort nach Entnahme der erforderlichen
Menge wieder im verschließbaren Beutel mit Trockenmittel in den Kühlschrank stellen.
8.2. Einzelne Assay-Schritte
1. Für die Standards und die Proben sowie für einen Substratleerwert eine ausreichende Anzahl an
Mikrotitervertiefungen vorbereiten.
2. Je 100 µL der verdünnten (1:101) Proben bzw. der gebrauchsfertigen Standards in die
Vertiefungen pipettieren. Eine Vertiefung für den Substrat-Leerwert freilassen.
3. Platte mit dem Mikrotiterplattendeckel abdecken und bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubieren.
4. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µL endverdünnte Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt. Waschpufferreste
werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf einem Zellstofftuch
entfernt.
5. Je 100 µL des gebrauchsfertigen Konjugats in die Vertiefungen geben. Eine Vertiefung für den
Substrat-Leerwert freilassen.
6. Platte mit dem Mikrotiterplattendeckel abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.
7. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µL endverdünnte
Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt. Waschpufferreste
werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf einem Zellstofftuch
entfernt.
8. Je 100 µL des gebrauchsfertigen Substrats in die Vertiefungen geben. Diesmal auch den Substrat-Leerwert pipettieren.
9. Platte mit dem Mikrotiterplattendeckel abdecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln (z.B.
Schublade) 20 Minuten inkubieren.
10. Zur Beendigung der Substratreaktion je 100 µL der gebrauchsfertigen Stopp-Lösung in die Vertiefungen geben. Auch den Substrat-Leerwert pipettieren.
11. Nach sorgfältigem Mischen und Abwischen des Plattenbodens erfolgt die Messung der Extinktion
bei 450 nm (evtl. Referenzwellenlänge 620 nm). Die Farbe ist maximal 60 Minuten stabil.
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9. AUSWERTUNG
Beispiel
Substrat-Leerwert
Negativ-Kontrolle
Cut-Off Standard
schwach Positiv-Kontrolle
Positiv-Kontrolle
Messwerte (OD)
0,018
0,041
0,507
0,918
2,356
korr. Messwerte (OD)
0,023
0,489
0,900
2,338
Es handelt sich um ein Beispiel, das unter zufälligen Temperatur- und Umgebungsbedingungen erstellt wurde. Die obige Tabelle enthält demnach keine Sollwerte, die in anderen Laboratorien in
gleicher Art wiedergefunden werden müssen.
9.1. Qualitative Auswertung
Die o.g. berechneten Extinktionen für die Patientenproben werden mit dem Wert für den Cut-Off
Standard verglichen. Liegt das Ergebnis der Probe höher, handelt es sich um ein positives Resultat.
Bei einem Wert unterhalb des Cut-Off Standards liegt ein negatives Resultat vor. Es hat sich als
sinnvoll erwiesen, einen Bereich von +/- 20% um den Wert des Cut-Offs als Grauzone zu definieren.
Liegt ein solcher Fall vor, ist eine Wiederholung des Tests mit dem gleichen Serum oder mit einer
nach 2-4 Wochen neu abgenommenen Probe des Patienten zu empfehlen. Beide Proben sollten
parallel in einem Testansatz gemessen werden.
Die positive Kontrolle muss mindestens die doppelte Extinktion verglichen mit dem Cut-Off Standard
zeigen.
9.2. Quantitative Auswertung
Die gebrauchsfertigen Standards und Kontrollen des Aspergillus IgG Antikörper-Kits sind auf Units
(U/mL) eingestellt worden. Dies ermöglicht eine exakte und reproduzierbare quantitative Auswertung.
Auch Verlaufskontrollen für einen gegebenen Patienten sind hiermit möglich. Die Werte für Kontrollen
und Standards sind auf dem QC Datenblatt angegeben.
Zur Auswertung werden die Extinktionen der Standards bzw. Kontrollen gegen ihre Konzentrationen
Punkt-zu-Punkt graphisch aufgetragen. Aus der resultierenden Eichkurve kann dann für die Extinktion
jeder Patientenprobe das entsprechende Konzentrations-Ergebnis abgelesen werden. Es können
auch automatische Rechnerprogramme eingesetzt werden. Hierbei sollte als Kurvenfitting Punkt-zuPunkt eingestellt werden.
Kalibrator B mit einer Konzentration von 10 U/ml fungiert als Cut-Off Standard. Analog zur qualitativen
Auswertung wird ein Bereich von +/- 20% um den Wert des Cut-Offs als Grauzone definiert. Folglich
werden Resultate zwischen 8 und 12 U/ml als grenzwertig befundet.
10. TESTCHARAKTERISTIKA
Aspergillus fumigatus ELISA
Intra-Assay-Präzision
Inter-Assay-Präzision
Inter-Lot-Präzision
Analytische Sensitivität
Wiederfindung
Linearität
Kreuzreaktivität
Interferenzen
Klinische Spezifizität
Klinische Sensitivität
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IgG
9,9 %
11,1 %
3,5 – 16,4 %
1,08 U/mL
87 – 97 %
74 – 114 %
Keine Kreuzreaktivität gegen Candida albicans
Keine Interferenz mit Bilirubin bis zu 0,3 mg/mL,
Hämoglobin bis zu 8,0 mg/mL und
Triglyzeriden bis zu 5,0 mg/mL
81 %
100 %
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11. LITERATUR
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Número de catálogo
No. di Cat.
Lot. No. / Batch code
Chargen-Nr.
No. de lot
Número de lote
Lotto no
Contains sufficient for
<n> tests/
Ausreichend
Ansätze
”n”
Contenu suffisant pour
”n” tests
Contenido
suficiente
para <n> ensayos
Contenuto sufficiente
per ”n” saggi
Note warnings
precautions
Warnhinweise
und
Vorsichtsmaßnahmen
beachten
Avertissements
et
mesures de précaution
font attention
Tiene
en
advertencias
precauciones
cuenta
y
Annoti avvisi
precauzioni
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Lagerungstemperatur
Temperature
conservation
Temperatura
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