Auswirkung von Hyperglykämie und Osmolarität auf die

Auswirkung von Hyperglykämie und Osmolarität auf die
Aus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Nephrologie und
Internistischer Intensivmedizin
der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
Auswirkung von Hyperglykämie und Osmolarität auf die
Zytokinproduktion und Phagozytose von mononukleären Zellen aus
peripherem Blut
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät
Charité – Universitätsmedizin Berlin
von
Natalie Maureen Otto
aus Rio de Janeiro, Brasilien
Seite 2
Gutachter/in:
1. Prof. Dr. med. R. Schindler
2. Prof. Dr. med. Dr. h. c. U. Heemann
3. Prof. Dr. med. N. Marx
Datum der Promotion: 30.11.2012
2
Widmung
Für meine Eltern
3
Inhaltsverzeichnis
Widmung ..............................................................................................................................3
Abbildungsverzeichnis .........................................................................................................7
Tabellenverzeichnis ..............................................................................................................9
Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................................10
1
Einleitung......................................................................................................................12
1.1 Definition und Epidemiologie der Sepsis ................................................................12
1.2 Hyperglykämie als Risikofaktor bei intensivpflichtigen und septischen Patienten ...16
1.3 Zytokinfreisetzung unter hyperglykämischen Bedingungen ....................................18
1.4 Hyperglykämie und Phagozytose ............................................................................21
1.5 Hypothese...............................................................................................................23
1.6 Ziele und Fragestellungen .......................................................................................23
2
Material und Methoden................................................................................................25
2.1 Material ..................................................................................................................25
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
Chemikalien ...............................................................................................25
Labormaterialien ........................................................................................26
Puffer .........................................................................................................26
Enzyme, Kits und Sonstiges .......................................................................28
2.2 Geräte.....................................................................................................................29
2.3 Methoden ...............................................................................................................30
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
2.3.5
2.3.6
2.3.7
2.3.8
2.3.9
Probanden ..................................................................................................30
Zellpräparation...........................................................................................30
Separation von mononukleären Zellen (PBMC)..........................................30
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ........................................31
Durchflusszytometrie .................................................................................34
Phagozytose-Assay ....................................................................................35
Oxidativer Burst.........................................................................................37
Durchführung einer FACS-Analyse............................................................38
Immunohistochemie – Nachweis von p38...................................................39
2.4 Limulus-Lysat-Test (LAL-Test)..............................................................................40
4
2.5 Statistische Auswertung..........................................................................................40
3
Ergebnisse .....................................................................................................................42
3.1 Stimulationsstufen von mononukleären Zellen mit LPS ..........................................42
3.2 Hohe Glukosekonzentrationen steigern die Zytokinproduktion ...............................43
3.3 Insulin führt zu keiner relevanten Änderung der Zytokinfreisetzung .......................45
3.4 Insulin führte zu einer Reduktion der anfänglich gesteigerten Zytokinfreisetzung
nach Glukoseexposition ..........................................................................................46
3.5 Stimulation der Zytokinproduktion durch D- und L-Glukose ..................................47
3.6 Effekt von Mannitol auf die Zytokinfreisetzung ......................................................48
3.7 Hyperosmolare Bedingungen führen zu einer erhöhten Zytokinfreisetzung .............50
3.8 Auswirkung von Glukose, Rapamycin und dem p38-MAP-Kinase-Inhibitor SB
203580 auf die Zytokinproduktion..........................................................................51
3.9 Charakterisierung der Auswirkung von Glukose und der p38-MAP-Kinase auf die
Zytokinproduktion mittels Immunhistologie ...........................................................54
3.10 Auswirkungen der Hyperglykämie und der Hyperosmolarität auf den oxidativen
Burst und die Phagozytose......................................................................................55
4
Diskussion .....................................................................................................................58
4.1 Erhöhte Glukosekonzentrationen steigern die Zytokinproduktion............................58
4.2 Wirkt Insulin als antiinflammatorisches Hormon?...................................................58
4.3 Bedeutung der Glukose und Osmolarität für die Zytokinproduktion........................59
4.4 Der Zytokinproduktion zugrunde liegenden Regulationsmechanismen....................62
4.5 Klinische Studien zur intensivierten Insulintherapie................................................66
4.6 Oxidativer Burst und Phagozytose – die nicht adaptive Immunabwehr der
Granulozyten und Makrophagen .............................................................................67
4.7 Kritikpunkte der Methodik......................................................................................70
4.8 Mögliche Auswirkungen der glukoseassozierten Zytokinmodulation bei anderen
Krankheitsbildern ...................................................................................................72
5
4.8.1 Die Rolle der Hyperglykämie bei Arteriosklerose und koronaren
Gefäßerkrankungen....................................................................................72
4.8.2 Einfluss der Hyperglykämie auf das akute Nierenversagen............................74
5
Zusammenfassung ........................................................................................................76
6
Literatur........................................................................................................................78
7
Danksagung ..................................................................................................................89
8
Erklärung an Eides Statt..............................................................................................90
9
Lebenslauf.....................................................................................................................91
6
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Der Zusammenhang zwischen dem systemischen inflammatorischen
Response-Syndrom (SIRS), Sepsis und Infektion (aus Bone et al. 1992)
7
.......................................................................................................... 12
Abbildung 1.2: Ablauf der Lymphozytenstimulation (aus Wheeler u. Bernard 1999)16.14
Abbildung 2.1: Separation mononukleärer Zellen nach Dichtegradientenzentrifugation.30
Abbildung 2.2: 96-well-ELISA-Mikrotitrierplatte....................................................... 32
Abbildung 2.3: Durchflusszytometrie, Argon-Laser (aus BD LSRII Benutzerhandbuch
2003).................................................................................................. 35
Abbildung 3.1:
LPS-Stimulationsstufen...................................................................... 43
Abbildung 3.2:
Glukose führte zu einer dosisabhängigen Erhöhung der Zytokinproduktion.
44
Abbildung 3.3:
Auswirkung von Insulin auf die Zytokinfreisetzung von IL-6 und IL-1ß.45
Abbildung 3.4: Die Zugabe von Insulin zu Glukose führte zu einer Reduktion der
Zytokinkonzentration. ........................................................................ 46
Abbildung 3.5:
IL-6- (A) und IL-1ß- (B) Produktion durch PBMC nach Zugabe von L- und
D-Glukose.......................................................................................... 47
Abbildung 3.6: Induktion der IL-6- (A) und IL-1ß-Freisetzung (B) durch PBMC innerhalb
von 24 Stunden. ................................................................................. 49
Abbildung 3.7: IL-6- (A) und IL-1ß-Freisetzung (B) durch LPS-stimulierte PBMC nach
Zugabe von Urea................................................................................ 50
Abbildung 3.8.1: IL-6- (A) und IL-1ß-Freisetzung (B) durch PBMC nach Inkubation mit
Glukose, Rapamune und dem p38-MAP-Kinase-Inhibitor SB 203580.52
Abbildung 3.8.2: IL-1ß- (A) und IL-6-Freisetzung (B) durch PBMC nach Zugabe von
Glukose und dem PKCß-Inhibitor. ..................................................... 53
Abbildung 3.9: Immunhistochemischer Nachweis der p38-MAP-Kinase bei verschiedenen
Glukose- und LPS-Konzentrationen. .................................................. 54
Abbildung 3.10: Oxidative Burst-Aktivität. .................................................................. 56
7
Abbildung 3.11: Phagozytotische Aktivitätsbestimmung bei verschiedenen osmotischen
Stimuli. .............................................................................................. 57
8
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1.1: Die SIRS-Kriterien............................................................................................. 13
Tabelle 1.2: Klinische Schweregrade der Sepsis .................................................................... 13
Tabelle 1.3: Übersicht der Zytokine: Immunregulation durch die Produktion von
antiinflammatorischen und proinflammatorischen Zytokinen. ....................... 15
Tabelle 1.4: In vivo- und In vitro- Studienübersicht von Zelllinien und Tiermodellen unter
hyperglykämischen Bedingungen.................................................................. 19
Tabelle 1.5: In vivo- und In vitro- Studienübersicht von Zelllinien und Tiermodellen unter
hyperglykämischen, hyperosmolaren und normoglykämischen
Bedingungen ................................................................................................. 20
Tabelle 2.1: Schema für das Auftragen des Standards............................................................ 33
Tabelle 4.1: Studienübersicht der Intensivierten Insulintherapie (IIT) mit Auswirkung auf
Morbidität und Mortalität.............................................................................. 66
9
Abkürzungsverzeichnis
Ag
Antigen
ANV
Akutes Nierenversagen
bp
Basenpaar(e)
C
Celsius
CAPD
Continuous ambulatory peritoneal dialysis
CD
Cluster of differentiation
CO2
Kohlenstoffdioxid
CRP
C-reaktives Protein
DHR
Dihydrorhodamin
DIGAMI
Diabetes mellitus Insulin-Glucose Infusion on Acute Myocardial
Infarction
E. coli
Escherichia coli
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EPRR
Endocytic pattern recognition receptors
ERK
Extracellular-signal regulated kinase
FACS
Fluorescence activated cell sorting
FITC
Fluorescein isothiocyanate
fMLP
N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine
FSC
Forward scatter
g
Fallbeschleunigung (= 9,80665 m/s2)
GFR
Glomeruläre Filtrationsrate
G6PD
Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase
HLA
Human leucocyte antigen
HG
Hyperglykämie
IIF
Immunfluoreszenz
IIT
Intensivierte Insulintherapie
IL-1
Interleukin-1
IL-10
Interleukin-10
IL-1ß
Interleukin-1 beta
IL-6
Interleukin-6
IL-8
Interleukin-8
10
LAL
Limulus-Lysat
LPS
Lipopolysaccharide
MAP-Kinase
Mitogenaktivierte Proteinkinase
MHC
Major histocompatibility complex
ml
Mililiter
mRNA
Messenger Ribonukleinsäure (Ribonucleic acid)
mTOR
Mammalian target of Rapamycin
NaCl
Natriumchlorid
NF-κB
Nekrosefaktor-Kappa-B
p38-MAPK
p38-mitogenaktivierte Proteinkinase
PAMP
Pathogen-associated molecular patterns
PBMC
Peripheral blood mononuclear cells
PBS
Phosphate buffered saline
PCR
Polymerasekettenreaktion
pH
potentia Hydrogenii
PKC-ß
Proteinkinase-C beta
PMA
Phorbol-12-myristate-13-acetate
PMN
Polymorphonukleär
PRR
Pattern recognition receptors
ROS
Reactive oxygen species
rpm
Rounds per minute
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
RVD
Regulatory volume decrease
SEM
Standard error of the mean
SIRS
Systemisches inflammatorisches Response-Syndrom
SSC
Sideward scatter
SPE
Solid phase extraction
TLR
Toll-like-Rezeptor
TNF-α
Tumor-Nekrose-Faktor-α
TRP
Transient receptor potential
vs.
Versus
VSMC
Vascular smooth muscle cells
ZNS
Zentrales Nervensystem
11
1
Einleitung
1.1
Definition und Epidemiologie der Sepsis
Von einer Sepsis sind allein in den USA pro Jahr annähernd 700.000 Personen betroffen; davon
sterben 210.000 Menschen1-3. Dies entspricht einer geschätzten Inzidenz von 1,5 bis 8 % im Jahr
in den vergangenen Jahren trotz des medizinischen Fortschritts in Diagnostik und Therapie. In
Deutschland liegt die Anzahl neu diagnostizierter schwerer Sepsisfälle bei 76–110 pro 100.000
Einwohner pro Jahr 4. Sepsis verursacht 10 % aller Todesfälle im Jahr. Diese Rate überschreitet
die der an akutem Myokardinfarkt Verstorbenen 5. Septische Patienten haben eine erhöhte
Gesamtliegedauer in Krankenhäusern mit einer mittleren Verweildauer auf Intensivstationen von
zwei bis drei Wochen. Die durch Sepsis verursachten Kosten für das Gesundheitswesen sind
erheblich; so lagen sie z. B. für das US-amerikanische Gesundheitssystem bei etwa 16,7
Milliarden USD pro Jahr 2, 5.
Über mehrere Jahrzehnte hinweg verstand man die Sepsis als systemische Antwort auf eine
Infektion. Sie wurde mit dem Vorhandensein von Bakterien im Blut (Bakteriämie) assoziiert und
die Begriffe „Sepsis“ und „Septikämie“ wurden im klinischen Alltag synonym verwendet. Im
Jahr 1989 publizierten Bone et al. eine einfache Definition der Sepsis, die auf spezifischen
klinischen Symptomen und einem nachweislichen Infektfokus beruht (Abb. 1.1) 6.
Abbildung 1.1: Der Zusammenhang zwischen dem systemischen inflammatorischen ResponseSyndrom (SIRS), Sepsis und Infektion (aus Bone et al. 1992) 7
Die klinischen Symptome der Sepsis zeigen sich jedoch auch bei Patienten ohne Bakteriämie.
Diese Diskrepanz wurde in der ersten Konsensuskonferenz der Society of Critical Care Medicine
12
und des American College of Chest Physicians (1992) im Begriff „SIRS“ berücksichtigt, der
somit ohne den quantifizierbaren Nachweis von bakterieller Infektion auskommt 7. Eine
systemische inflammatorische Reaktion liegt vor, wenn zwei oder mehr der vier SIRS-Kriterien
zutreffend sind. In den darauf folgenden Konferenzen wurde die Definition der Sepsis
weiterentwickelt 8, 9. Ihre Kriterien sind in den Tabellen 1.1 und 1.2 ersichtlich.
Kriterium
Interpretation
Körper(kern)temperatur
Fieber ≥ 38 °C oder Hypothermie ≤ 36 °C
Tachykardie
Herzfrequenz ≥ 90/min, bei Patienten unter Betablockertherapie auch ≤ 90/min
Tachypnoe
Atemfrequenz ≥ 20 Atemzüge/min oder paCO2 ≤ 33 mmHg,
maschinelle Beatmung erfüllt das Kriterium ebenfalls
Leukozytenzahl
Leukozytose ≥ 12 Gpt/l oder Leukopenie ≤ 4 Gpt/l oder ≥
10 % unreife Neutrophile im Differenzialblutbild
Tabelle 1.1: Die SIRS-Kriterien
Kriterien
der
systemischen
inflammatorischen
Antwortreaktion
(systemisches
inflammatorisches Response-Syndrom = SIRS). Eine systemische inflammatorische
Reaktion liegt vor, wenn ≥ 2 der 4 SIRS-Kriterien zutreffend sind 9.
Die SIRS-Kriterien als Ausdruck der Inflammation enthalten neben den rasch reagierenden
klinischen Parametern, wie Tachypnoe und Tachykardie, die weniger schnell auftretenden
klinischen Parameter Temperatur und den Laborparameter der Leukozytenanzahl.
Schweregrad
Befunde
Sepsis
≥ 2 von 4 SIRS-Kriterien + Infektion
Schwere Sepsis
Sepsis + ≥ 1 Organdysfunktion
Septischer Schock
schwere Sepsis + Katecholaminpflicht bei ausreichender
Volumenzufuhr
Tabelle 1.2: Klinische Schweregrade der Sepsis
Die meisten deutschen Kliniken nutzen das C-reaktive Protein (CRP), das das Produkt der durch
Zytokine stimulierten Hepatozyten ist, als Parameter für den Schweregrad der Entzündung 10.
Somit gehört es in die Gruppe der Akut-Phase-Proteine, die als Indikatoren der Ausprägung der
13
Inflammation
sowie
des
Zellschadens
gewertet
werden
können 11,
12
.
Die
exakte
Pathophysiologie von CRP im Entzündungsprozess bedarf noch weiterer Abklärung. Sie umfasst
die Bindung an Liganden, wie Polysacchariden auf Bakterienoberflächen oder nekrotischem
Gewebe, eine Aktivierung von Leukozyten und des Komplementsystems13.
Abbildung 1.2: Ablauf der Lymphozytenstimulation
Ein initialer toxischer Stimulus (z. B. Endotoxin) induziert die Produktion proinflammatorischer Zytokine. Diese Zytokine ermöglichen die Adhäsion der
Neutrophilen am Endothel, die Aktivierung der Blutplättchen sowie weiterer
multipler sekundärer Inflammationsmediatoren (Prostaglandine, Leukotriene,
Proteasen etc.) (aus Wheeler u. Bernard 1999)14.
Bakterien werden in gramnegative oder grampositive Spezies unterschieden. Jede Art besitzt
unterschiedliche Membranmoleküle, die zur Aktivierung des Immunsystems führen. Diese
speziellen Strukturen, sogenannte PAMP (pathogen-associated molecular patterns) 15, beinhalten
eine große Vielfalt und fungieren u.a. als Aktivatoren des Immunsystems. Ihr potentester
Vertreter ist das Lipopolysaccharidmolekül (LPS); es ist in allen gramnegativen Bakterien
lokalisiert und dient als Stabilisator ihrer äußeren Zellmembran. Die Aktivierung des
Abwehrsystems erfolgt nach Interaktion der PAMP mit den Toll-like-Rezeptoren (TLR)16. TLR
sind transmembranöse Proteine auf der Zelloberfläche von Abwehrzellen. Aktuell sind mehr als
10 verschiedene Rezeptoren aus der Familie der TLR bekannt. TLR-4 und TLR-2 spielen eine
bedeutende Rolle in der Sepsis: TLR-4 ist der Rezeptor für das Lipopolysaccharid (LPS) und
TLR-2 bindet Lipoproteine, Lipopeptide und Peptidoglykane grampositiver Bakterien17. LPS
bindet an das extrazelluläre LPS-binding Protein (LBP) und wird von CD14, das auf einem
Zelloberflächenmolekül auf Makrophagen, Monozyten und Neutrophilen exprimiert wird,
14
gebunden.
Diese
Bindung
führt
über
mehrere
Kaskaden
zur
Freisetzung
von
Transkriptionsfaktoren, die die Transkription von Genen der Immunantwort und somit u. a. die
Produktion von Zytokinen regulieren18.
Im Rahmen der Inflammationsreaktion steht die Aktivierung und Regulation des Monozyten-/Makrophagensystems im Vordergrund, die über die Freisetzung von Zytokinen, wie IL-1,
IL-6 und TNF-α, die proinflammatorische Antwort des Immunsystems auslösen (Abb. 1.2)19.
Essenziell ist hierbei die Steuerung der Entzündungsreaktion durch gleichzeitige Produktion der
antiinflammatorischen sowie proinflammatorischen Zytokine (Tab. 1.3).
antiinflammatorische Zytokine
IL-10, TGF-ß, IL-1Ra, sTNFR-I/-II, IL-1RII
proinflammatorische Zytokine
TNF-α, IL-1α, IL-1ß, IL-6, LIF
Tabelle 1.3: Übersicht
der
Zytokine:
Immunregulation
durch
die
Produktion
von
antiinflammatorischen und proinflammatorischen Zytokinen.
Das Zytokin Interleukin-1ß ist ein Bestandteil der Interleukin-1-Familie. Es wird primär von
Monozyten synthetisiert. IL-1ß ist ein hochwirksames Zytokin: Wenige Nanogramm reichen aus,
um Fieber, einen Anstieg der Zahl der neutrophilen Granulozyten, der Thrombozyten oder der
Akute-Phase-Proteine zu induzieren 20. Des Weiteren führt es zur Interleukin-6-Freisetzung. IL-6
bewirkt eine vermehrte Synthese von Akute-Phase-Proteinen in den Hepatozyten. Pro- und
antiinflammatorische Effekte dieses Zytokins werden evaluiert. Sezerniert wird IL-6 von
Monozyten und Makrophagen, aber auch von Epithel- und Endothelzellen. IL-6 ist ein
Schlüsselzytokin in der Sepsis.
Die Folgen des Erliegens der Regel- und Kompensationsmechanismen der inflammatorischen
Reaktion sind Immunparalyse, Multiorganversagen und Tod. Dieser Vorgang hängt von einer
Reihe von Faktoren ab, wie Ausmaß der Schädigung, genetische Prädisposition sowie
Immunstatus. Die Immunparalyse wird definiert als „generelle Insuffizienz der zellvermittelten
T-Lymphozyten-abhängigen Immunantwort“ 21. Sie ist erkennbar an einer Deaktivierung der
Monozyten, die eine verminderte HLA-Expression aufweisen. HLA-DR dient als Aktivierungsund Maturationsmarker professioneller antigenpräsentierender Zellen. Ein Abfall der HLA-DRExpression unterhalb 80 % des Normbereichs kennzeichnet eine Immunparalyse. Die
Arbeitsgruppe um Volk et al. definiert bereits eine Unterschreitung von 30 % unterhalb des
Normbereichs als ausreichend 22. Die Makrophagen befinden sich an der Schaltstelle zwischen
angeborener und erworbener Immunität. Somit kommt diesen Zellen eine entscheidende Rolle
15
zu, da im Zusammenhang der Immunparalyse über eine reduzierte HLA-DR-Expression keine
Aktivierung des adaptiven Immunsystems erfolgen kann 22-25.
1.2
Hyperglykämie als Risikofaktor bei intensivpflichtigen und septischen
Patienten
Bereits 1878 beschrieb Claude Bernard erstmalig in seinem Werk „Leçons sur les phénomènes
de la vie communes aux animaux et aux végétaux“ das Vorkommen von Hyperglykämien
während eines klinischen Schocks, in diesem Fall während des hämorrhagischen Schocks
(Volume 1, J. B. Baillière et Fils. Paris, Fance, 564 pp.). Die Hyperglykämie ist ein sehr häufig
gesehenes Phänomen bei intensivtherapiepflichtigen Patienten und wird mittlerweile u. a. einer
Freisetzung
von
Stresshormonen,
einer
peripheren
Insulinresistenz
und
einigen
Medikamentenwirkungen und -Nebenwirkungen zugeschrieben. Sie ist ein unabhängiger
Risikofaktor
und
sogar
ein
Prädiktor
der
Morbidität
und
Mortalität
in
dieser
Patientenpopulation 26-30.
Im Vergleich zu bekannten diabetischen und normoglykämischen Patienten führt das akute
Auftreten von Hyperglykämien im Krankenhaus zu einem schlechteren klinischen Verlauf und
einer erhöhten Mortalität 28. Bei Patienten mit schwerster Hirnschädigung besteht unter
hyperglykämischen
Bedingungen
Krankenhausaufenthalt,
einem
ein
Zusammenhang
schlechteren
neurologischen
zwischen
Ergebnis,
einem
einem
längeren
erhöhten
intrakraniellen Druck und einer insgesamt reduzierten Überlebensrate 31-33.
In einer prospektiven, randomisierten Studie mit insgesamt 1.548 erwachsenen Patienten einer
chirurgischen Intensivstation zeigten van den Berghe et al. (2001)29, dass die intensivierte
Insulintherapie (IIT) mit Zielblutzuckerwerten zwischen 80 und 110 mg/dl im Vergleich zur
konventionellen Insulintherapie mit Zielblutzuckerwerten zwischen 180 und 200 mg/dl die
Mortalität während des Aufenthalts auf der Intensivstation von 8 % auf 4,6 % sowie bei einer
Verweildauer von mehr als fünf Tagen auf der Intensivstation von 20,2 % auf 10,6 % senkte. Die
größte Reduktion der Mortalität erzielte die Kohorte der Patienten mit Multiorganversagen und
nachgewiesenem septischem Fokus. Zusammenfassend zeigte die Studie von van den Berghe et
al.25 in der untersuchten Patientenpopulation, dass
− die intensivierte Insulintherapie Blutinfektionen (mit Nachweis positiver Blutkulturen) um
46 %,
16
− das Vorkommen von akutem Nierenversagen mit konsekutivem Nierenersatzverfahren um
41 %,
− die Notwendigkeit von Bluttransfusionen um 50 %,
− die Critically-Illness-Polyneuropathie um 44 % und somit
− die Krankenhausmortalität um 34 %
senken konnte.
In einer weiteren Studie derselben Arbeitsgruppe 34 (2006) mit insgesamt 1.200 Patienten
erhielten 605 Patienten die konventionelle Insulintherapie und 595 Patienten die intensivierte
Insulintherapie. Hier konnte die Mortalität der Patienten mittels der IIT nicht signifikant
verringert werden (40 % in der konventionellen Therapie vs. 37,3 % in der IIT, p = 0,33). Jedoch
verminderte sich die Morbidität der Patienten, u. a. durch Prävention des akuten
Nierenversagens, Verkürzung der Langzeitbeatmung und schnellere Entlassung von der
Intensivstation.
Diese Effekte konnten durch eine weitere Studie dieser Arbeitsgruppe mit Patienten einer
internistischen Intensivstation über die intensivierte Insulintherapie mit Zielblutzuckerwerten
von 80–110 mg/dl vs. konventionelle Insulintherapie mit Zielblutzuckerwerten von 180–
200 mg/dl reproduziert werden 34.
Weitere Untersuchungen hinsichtlich der Risikokonstellation der Krankenhausmortalität führten
Hansen et al. (2003) 35 durch. Hansen et al. quantifizierten die Ausprägung der Inflammation
durch die Messung von CRP im Serum von intensivtherapiepflichtigen Patienten. Ihre Studie
weist eine deutliche Reduktion des CRP-Serumspiegels unter der IIT im Vergleich zur
konventionellen Insulintherapie nach; dabei wird das verbesserte Patientenüberleben einer
Reduktion der Bildung von Akut-Phase-Proteinen unter der IIT zugeschrieben.
Zusammenfassend zeigt sich somit bei intensivtherapiepflichtigen Patienten durch die intensivierte Insulintherapie (IIT) eine Verbesserung des klinischen Verlaufs und der Überlebenszeit.
Die
genauen
Pathomechanismen
der
schädigenden
Auswirkungen
von
erhöhten
Blutzuckerwerten im Vergleich zu den positiven Effekten der intensivierten Insulintherapie sind
noch nicht hinreichend geklärt. Eine mögliche Erklärung beruht jedoch auf Alterationen der
Inflammation und der Immunantwort 36, z. B. durch Induktion oder Suppression von pro- oder
antiinflammatorischen Zytokinen, Produktion von Akut-Phase-Proteinen, Freisetzung sekundärer
Immunmediatoren oder Veränderungen der Neutrophilenfunktion.
17
1.3
Zytokinfreisetzung unter hyperglykämischen Bedingungen
Die bereits erwähnte Studie von van den Berghe et al. (2001) 29 mit 1.548 beatmungspflichtigen
Patienten von chirurgischen Intensivstationen weist eine signifikante Senkung der Mortalität und
Morbidität unter intensivierter Insulintherapie (IIT) nach. Hierbei wurden jedoch keine
Messungen von Entzündungsmediatoren, z. B. des CRP, durchgeführt.
Ohne Marker für die Entzündungsaktivität zu bestimmen, ging die Arbeitsgruppe um Wasmuth
et al.30 von einem Zusammenhang zwischen der Zytokinfreisetzung und der GlukoseSerumkonzentration
der
Patienten
aus.
Ihre
Untersuchung
ergab
bei
75
intensivtherapiepflichtigen Patienten, dass hyperglykämische Bedingungen zu einer Erhöhung
der Zytokinkonzentration von IL-6 führten. Ähnliches zeigte sich im Serum gesunder
Probanden. Hyperglykämische Bedingungen erhöhten den Plasmaspiegel von Interleukin-6 (IL6) und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α)37, 38. Die Zugabe von Insulin, um normoglykämische
Blutzuckereinstellungen einzuhalten, beeinflusste die Zytokinfreisetzung nicht.
Weitere experimentelle in vivo- und in vitro-Studien untersuchten den Einfluss von Glukose,
Insulin und anderen hyperosmolaren Substanzen auf die Zytokinproduktion durch das
Monozyten-/Makrophagensystem.
Der
Einfluss
der
Hyperglykämie
(HG)
auf
die
Zytokinfreisetzung ist aus der Studienübersicht in Tabelle 1.4 und der Einfluss der
hyperosmolaren Bedingungen aus der Studienübersicht in Tabelle 1.5 ersichtlich.
18
Modell
Studie
Studienmodell
Parameter
In vitro
Igarashi et al. 39
Rat SMC-Zelllinie p38
Ergebnis
HG
führt
zur
Erhöhung von p38
Shanmugam
THP-1-Zelllinie
et al. 40
Devaraj et al. 41
THP-1-Zelllinie
TNF-α,
IL-1b, HG
erhöht
die
p38, NF-κB
Zytokinkonzentration
IL-6, p38
HG,
nicht
aber
Mannitol erhöht die
Zytokinkonzentration
und induziert p38
Morohoshi
humane PBMC
IL-6, TNF
HG erhöht die IL-6-
et al. 42
Konzentration
Dasu et al. 43
THP-1-Zelllinie
IL-1,
p38, HG
NADPHOxidase,
erhöht
die
Zytokinkonzentration
NF-
κB, ERK 1/2
Wen et al. 44
Maus-
IL-1, -6, -12, HG,
Makrophagen
TNF-α, p38
nicht
aber
Mannitol erhöht die
Zytokinkonzentration
und p38-Expression
Ling et al. 45
Rattenmodell
IL-1ß, TNF-α
HG
erhöht
die
Zytokinkonzentration
Vanhorebeek
et Hasenmodell
–
al. 46
In vivo
chondrialem Schaden
Krogh-Madsen et humane Zellen
IL-6, TNF-α
al. 37
Esposito et al. 38
HG führt zu mito-
HG erhöht die Zytokinkonzentration
humane Zellen
IL-6, TNF-α
HG erhöht die Zytokinkonzentration
Tabelle 1.4: In vivo- und in vitro- Studienübersicht von Zelllinien und Tiermodellen unter
hyperglykämischen Bedingungen
19
Studie
Studiensetup
Shapiro
u. humane PBMC
Parameter
Ergebnis
IL-1, IL-8
NaCl-Lösungen
Dinarello 47
erhöht
die
Zytokinkonzentration
Németh et al. 48
humane
intestinale IL-8, NF-κB
Epithelzellen
hypertone NaCl- und MannitolLösungen
führen
zu
einer
Erhöhung von IL-8, NF-κB
Zhang et al. 49
gastrische
Epithel- IL-1ß
zellen von Mäusen
hypertone NaCl-Lösung führt zu
einer Erhöhung von IL-1ß
Tabelle 1.5: In vivo- und in vitro- Studienübersicht von Zelllinien und Tiermodellen unter
hyperglykämischen, hyperosmolaren und normoglykämischen Bedingungen
In THP-1-Zellen (humane monozytische leukämische Zelllinie) führte die Steigerung der
Glukosekonzentration im Zellkulturmedium zu einer Erhöhung der Zytokinexpression von TNFα und zur Produktion von NF-κB in vitro 40. In einem ähnlichen THP-1-Zellmodell ergab die
Zugabe von Glukose, jedoch nicht von Mannitol, eine Erhöhung der Zytokinexpression von IL6. Dasu et al.
43
wiesen in ihrer Studie mit THP-1-Zellen nach, dass die Zugabe von Glukose in
erhöhten Konzentrationen (15 mmol/l und 25 mmol/l) eine dosisabhängige Induktion von IL-1
erreicht. Diese Studie vertiefte die möglichen zugrunde liegenden Regulationsmechanismen für
die Expression der Proteinkinase-C, der MAP-Kinasen p38, ERK 1/2, NF-κB und NADPHOxidase 44.
Tiermodelle bestätigten die bereits festgestellten begünstigenden Effekte der Glukoseeinstellungen, indem die strikte Glukosekontrolle und -einstellung die angeborene Immunfunktion
verbesserte und damit Morbidität und Mortalität senkte. Eine engmaschige Glukosekontrolle und
-einstellung mittels Insulin im Hasenmodell zeigte eine Verbesserung der angeborenen
Immunfunktion, insbesondere eine Erhöhung der phagozytotischen Aktivität und somit die
Verhinderung einer möglichen Exazerbation der Inflammation 50. Nach der Endoxin-Injektion
bei Schweinen führte die Behandlung mit Insulin zu einer Reduktion des Zytokingehalts von
TNF-α in diversen Organen (z. B. Myokard) und somit zu einer antiinflammatorischen Wirkung 50,
51
. Bei Mäusen resultierte unter hyperglykämischen Bedingungen eine Erhöhung der
mRNA-Expression der Zytokine IL-1, -6, -12 und TNF-α. Dabei führte die Nutzung von
Mannitol
zu
keiner
Steigerung
der
Zytokinsynthese 44.
Bei
Ratten
verursachten
hyperglykämische Bedingungen eine erhöhte Produktion von TNF-α und IL-1ß 45.
20
Die Applikation von Verbrennungswunden bei Hasen simulierte ein Krankheitsbild intensivpflichtiger Patienten. Die Hyperglykämie verursachte in diesem Versuchsmodell erhöhte
Plasmakreatininspiegel und morphologische Veränderungen an der Niere. Die Kontrollgruppe
hingegen zeigte unter normoglykämischen Bedingungen eine geringere Ausprägung der
Schädigung als Hasen unter hyperglykämischen Bedingungen. Eine erhöhte Insulinkonzentration
schien hierbei jedoch nicht protektiv zu sein 46.
In weiteren experimentellen Untersuchungen führten nicht nur Bedingungen unter erhöhten
Glukosekonzentrationen zu einem nachweislichen Anstieg der Zytokinproduktion, sondern auch
die Zugabe von hypertonen Medien bzw. die Steigerung der Osmolarität (per se) 47, 52. Shapiro
und Dinarello zeigten eine Verstärkung der Synthese von IL-1 und IL-8 durch humane PBMC
unter hyperosmolaren Bedingungen mit einer maximalen Osmolarität von 375 mOsmol, erzielt
durch die Zugabe unterschiedlich molarer NaCl-Lösungen 47. Eine weitere Studie wies durch die
Beimischung von hypertoner NaCl-, Mannitol- und Saccharoselösung zu humanen intestinalen
Epithelzellen eine Erhöhung der IL-8-Konzentration sowie des Transkriptionsfaktors NF-κB
nach 48. In einem Tiermodell mit gastrischen Epithelzellen von Mäusen wurde eine Erhöhung der
IL-1ß-Konzentration nach Zugabe einer hypertonen NaCl-Lösung bestätigt 49. Diese Versuche
belegen, dass nicht nur eine Steigerung der Glukosekonzentration, sondern auch hyperosmolare
Substanzen über eine Veränderung der Osmolarität zu einer Alteration der Zytokinproduktion
und somit einer Beeinträchtigung der Immunfunktion führen können.
1.4
Hyperglykämie und Phagozytose
Im Vordergrund der Infektabwehr steht jedoch nicht nur die durch Zytokine vermittelte
Entzündungsreaktion. Neutrophile Granulozyten sind kleine, 12 µm große Mikrophagen, deren
Funktion folgende Schritte beinhaltet: Adhäsion am Endothel, Chemotaxis, Phagozytose und
Produktion reaktiver Sauerstoffverbindungen (reactive oxygen species = ROS). Die Phagozytose
löst eine Zunahme der ROS-Produktion aus. Dies wird auch als oxidativen Burst bezeichnet.
Dieser ist gekennzeichnet durch einen erhöhten Sauerstoffkonsum, Glykogenolyse und
Glukoseoxidation über den oxidativen Pentosephosphatweg. Hieraus erfolgt die Gewinnung von
NADPH für die Produktion von ROS. Essenziell ist eine Aktivierung der phagozytären NADPHOxidase, bestehend aus den membranständigen Untereinheiten gp91PHOX und p22PHOX sowie den
zytosolischen Untereinheiten p67PHOX, p47PHOX, p40PHOX und Rac1 bzw. Rac2 53, 54. Stimuliert
wird sie u. a. durch LPS, Lipoproteine oder Zytokine.
21
Ein Schlüsselenzym des Pentosephosphatwegs ist die Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase 55.
Diese ist beteiligt an der Produktion von NADPH. Hohe Konzentrationen an Glukose inhibieren
die Funktion der Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD) mit folglicher Reduktion der
intrazellulären Konzentration an NADPH 56,
57
. Hieraus resultiert eine weitere schädliche
Auswirkung der hyperglykämischen Stoffwechsellage, da u.a. humane Zellen auf ein adäquates
Angebot an NADPH als primären intrazellulären Reduktor des antioxidativen Systems
angewiesen sind. Eine Reduktion der G6PD hat somit eine Abnahme von NADPH, eine
Erniedrigung der Redoxreaktion mit gleichzeitiger Erhöhung des oxidativen Stresses und
vermehrten Zelluntergang zur Folge 58.
Eine
Korrektur
des
hyperglykämischen
Milieus
führt
zu
einer
Steigerung
der
Neutrophilenfunktion und somit zu einer Verbesserung der Phagozytose 59.
Feijorová et al. untersuchten den respiratorischen Burst und die Phagozytose an gesunden
Probanden unter den Auswirkungen der Hyperglykämie und Hyperinsulinämie 60. Hierbei ließen
sich keine Veränderungen der Immunabwehr nachweisen. Im Gegensatz hierzu stehen die
Studien von Nielson und Hindson61, Cendoroglo et al.62 und Liberek et al.63, die Veränderungen
der phagozytotischen Aktivität sowie des respiratorischen Bursts nach Glukoseexposition
nachweisen
konnten.
Nielson
und
Hindson
bewiesen
bei
erhöhten
extrazellulären
Glukosekonzentrationen (L- sowie D-Glukose) eine Abnahme der Superoxid-(O2--)Freisetzung
und somit eine Abnahme der Phagozytose 61. Als mögliche Ursache für diese Beobachtungen
konnte die Arbeitsgruppe um Perner et al. anhand frisch isolierten humanen Neutrophilen eine
Reduktion der Superoxid-(O2--)Produktion durch hohe Konzentrationen an extrazellulärer
Glukose (5, 10 oder 25 mmol) und durch die Inhibition der Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase
nachweisen. Eine Inkubation der Neutrophilen mit einem extrazellulären Zusatz aus Mannitol
zeigte in dieser Untersuchung keine Auswirkung auf die Reduktion der Superoxid-(O2--)
Produktion 64. Zhang et al. untersuchten Patienten mit Typ-II-Diabetes mellitus und wiesen
hierbei eine Hemmung der G6PD durch die hohen Glukosekonzentrationen mit konsekutiven
Zelluntergang sowie eine Erhöhung der ROS-Produktion nach 65. Besonders bedeutsam war
hierbei eine Steigerung der ROS-Freisetzung unter erhöhten extrazellulären Blutzuckerwerten 65,
66
.
In den Arbeiten von Walrand et al. zeigten sich hierzu unterschiedliche Ergebnisse. Bei humanen
Probanden ergab die Insulingabe zur Erhaltung der Normoglykämie eine Aktivitätssteigerung
der humanen polymorphonukleären Zellen 67, 68.
22
Weitere Untersuchungen hinsichtlich der Auswirkung einer Veränderung der ROS-Produktion
im Sinne des oxidativen Bursts sowie eine Änderung der Phagozytose hervorgerufen durch
hyperglykämische Bedingungen ließen im klinischen Alltag eine zentrale Bedeutung in der
Pathologie des Diabetes mellitus, des arteriellen Hochdrucks, der Arteriosklerose sowie der
chronischen Niereninsuffizienz erkennen 69.
1.5
Hypothese
Hyperglykämie führt über eine Alteration der Immunantwort zur Erhöhung der Morbidität und
Mortalität aufgrund einer gesteigerten Prädisposition für Infektionen.
1.6
Ziele und Fragestellungen
Die genauen molekularen Mechanismen der Hyperglykämie, Hyperosmolarität und der Therapie
mit Insulin sind noch nicht vollständig geklärt. Multipel interagierende Systeme erschweren
häufig die Untersuchung von Pathomechanismen in vivo. Insbesondere die protektiven Effekte
der Insulintherapie könnten aufgrund der Wirkung des Insulins sowohl als endokriner Effekt
oder als direkte Folge der Insulinwirkung im Rahmen der Glukosemetabolisierung oder aber
auch der damit verbundenen Senkung der Osmolarität auftreten. Die bereits erwähnten
schädlichen Auswirkungen von erhöhten Blutzuckerwerten sind nicht hinreichend geklärt,
beruhen jedoch überwiegend auf Veränderungen der Inflammation und Immunantwort, z. B.
durch Induktion oder Suppression von pro- oder antiinflammatorischen Zytokinen, Produktion
von Akut-Phase-Proteinen, Freisetzung sekundärer Immunmediatoren und Veränderungen der
Neutrophilenfunktion sowie der Phagozytoseaktivität.
Zum weiteren Verständnis dieser Mechanismen soll die Auswirkung von Glukose und Insulin
sowie die Veränderung der Osmolarität durch Mannitol und Harnstoff (Urea) auf die Zytokinproduktion sowie Phagozytose in vitro mit folgenden Fragestellungen untersucht werden:
1. Führt eine Erhöhung der Glukosekonzentration zu einem dosisabhängigen Anstieg der
Zytokinproduktion und welche Pathomechanismen liegen der Zytokinproduktion von IL-1ß
und IL-6 in vitro zugrunde?
2. Hat Insulin antiinflammatorische Wirkungen durch Modifikation der Zytokinproduktion von
IL-1ß und IL-6 in vitro und übt es somit einen protektiven Effekt auf die Reaktion der
Inflammations aus?
23
3. Wirken hyperosmolare Substanzen wie Mannitol und Harnstoff auch wie Glukose und
welche Auswirkungen haben sie auf die Zytokinproduktion von IL-1ß und IL-6 in vitro?
4. Welche Auswirkungen haben erhöhte Glukose- und Mannitolkonzentrationen auf den
oxidativen Burst und die Phagozytose humaner Granulozyten in vitro?
24
2
Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1 Chemikalien
Alle verwendeten Chemikalien wurden mit dem Reinheitsgrad pro analysi verwendet.
Acetonitril
(J.T. Baker B.V., Deventer, Holland)
Ammonuimacetat
(SIGMA® , Steinheim, Deutschland)
Casein
(C-7078, SIGMA® , St. Louis, MO, USA)
CSPD®
(Roche Diagnostic
GmbH,
Mannheim,
Deutsch-
land/Warenzeichen der Firma Tropix Inc., Bedford,
MA, USA)
E. Coli 055B5-LPS
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
EDTA
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
Ethanol 96 %
(Herbeta Arzneimittel, Berlin, Deutschland)
Ficoll Typ 400
(SIMGA®, Steinheim, Deutschland)
Isotone NaCl 0,9 %
(B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland)
L-Glutamin
(Biochrom AG seromed®, Berlin, Deutschland)
LiCl
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
Methanol
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
MgCl2
(Gibco, Life Technologies, Paisley, Schottland)
Penicillin
(Biochrom AG seromed®, Berlin, Deutschland)
Polyoxyethylenesorbitan (Tween 20)
(SIGMA®, St. Louis, MO, USA)
RPMI-Medium 1640 (1x)
(PAA Laboratories GmbH, Linz, Österreich SB 203580
in Solution
(Calbiochem,
Merck
KGaA,
Darmstadt, Deutschland)
Schwefelsäure
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
Sodium-Diatrizoat
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
Streptavidin-Peroxidase-Komplex
(Amersham, Braunschweig, Deutschland)
Streptavidin-biotin loaded
Horseradish-Peroxidase Komplex
Streptomycin
(Biochrom AG seromed®, Berlin, Deutschland)
25
ultrafiltriertes Milipore-Wasser®
(hergestellt durch Benutzung von Polyfluxfiltern, um
zytokininduzierte Substanzen zu entfernen)
Phagoburst®
(Orpegen Pharma, Heidelberg, Deutschland)
Oxidativer Burst®
(Orpegen Pharma, Heidelberg, Deutschland)
®
Glucosteril 50 %
(Fresenius Kabi Deutschland GmbH, Bad Homburg,
Deutschland)
D-(+)-Glukose
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
L-Glukose
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
Insuman Rapid 40 I.E./ml
(Aventis Pharma Deutschland GmbH, Frankfurt am
Main, Deutschland)
Heparin-Rotexmedica
(Rotexmedica GmbH, Trittau, Deutschland)
Mannitol
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
Urea, 98 %
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
2.1.2 Labormaterialien
ELISA-Platten
(Nunc-Immuno Module, Nunc A/S, Roskilde,
Dänemark)
®
Falcon -Röhrchen (50 ml)
(Becton Dickinson Labware, New Jersey, USA)
Falcon®-Röhrchen (14 ml)
(Becton Dickinson Labware, New Jersey, USA)
Falcon®-Röhrchen (6 ml)
(Becton Dickinson Labware, New Jersey, USA)
Gewebekulturfilter 0,45 µm, 250 ml
(Nalge Company, New York, NY, USA)
PARAFILM®„M“ Laboratory Film
(American CAN COMPANY, Greenwich, CT,
USA)
Polyfluxfilter PF14S
(Gambro, Hechingen, Deutschland)
Polyfluxfilter F60S
(Fresenius
Medical
Care,
Bad
Homburg,
Deutschland)
Sep-Pak®Vac RC (500 mg) C18-Cartriges
®
(Waters Corporation, Milford, MA, USA)
Sep-Pak Light C18-Cartriges
(Waters Corporation, Milford, MA, USA)
24-well-Platten
(Nunc, Roskilde, Dänemark)
12-well-Platten
(Nunc, Roskilde, Dänemark)
2.1.3 Puffer
Blotting Buffer (20 x SSC):
175,3 g/l Natriumchlorid (58,44 g/mol)
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
26
88,2 g/l Sodiumcitrat
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
10 N NaOH zur pH Einstellung von 7,0
Coatingpuffer:
5,52 g/l Natriumkarbonat (105,99 g/mol)
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
5,03 g/l Natriumhydrogenkarbonat (84,01 g/mol) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
Detektionspuffer:
78,5 g/l Tris-HCl (157,6 g/mol)
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
29 g/l Natriumchlorid (58,44 g/mol)
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
4 N Kaliumhydroxid zur pH-Einstellung von 9,5
Gallati-Puffer:
42 g/l Zitronensäure-Monohydrat (210,14 g/mol) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
4 N Kaliumhydroxid (zur pH-Einstellung von 3,95) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
Wasserstoffperoxid 30%(34µl/100 mlGallati-Lsg.) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
Loading Buffer (Ansatz für 50 ml):
28,7 ml Glycerol 87 %
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
0,25 g Bromphenolblau
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
16,3 ml Aqua bidest.
PBS-Puffer:
2,1 g/l Kaliumhydrogenphosphat (174,18 g/mol)
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
90 g/l Natriumchlorid (58,44 g/mol)
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
7,26 g/l Natriumhydrogenphosphat (142 g/mol)
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
PBS-Tween:
100µl Tween 20 auf 1Liter PBS-Puffer
TMB-Lösung:
240 mg Tetramethylbenzidin
(Fuke, Buchs, Deutschland)
5 ml Dimethylsulfoxid
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
5 ml Ethanol (100 %)
(Herbeta, Arzneimittel, Berlin, Deutschland)
27
10 x Blocking Stock Solution:
100 g/l Blocking Stock
(Roche
Diagnostics
GmbH,
Mannheim,
Deutschland)
1.000 ml 1x Waschpuffer
10 x PCR-Buffer:
200 mM Tris-HCl (pH 8,4)
(Gibco,
Life
Technologies,
Paisley,
Schottland)
500 mM KCl
10 x TBE:
108 g/l Tris-Base
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
55 g/l Boric Acid
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
9 g/l EDTA
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
1 x Waschpuffer:
8,7 g/l Natriumchlorid (58,44 g/mol)
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
11,6 g/l Maleinsäure (116,1 g/mol)
(SIGMA®, Steinheim, Deutschland)
4 N Kaliumhydroxid zur pH-Einstellung auf 7,5
2.1.4 Enzyme, Kits und Sonstiges
Antikörper IL-1ß für den ELISA:
(Endogen, Woburn, MA, USA)
1. Antikörper IL-1ß
(Anti-human IL-1ß Monoclonal, M-421B)
2. Antikörper IL-1ß
(Biotin-Labeld Anti-human IL-1ß Monoclonal,
M-420 B-B)
Antikörper IL-6 für den ELISA:
(R&D, Minneapolis, MN, USA)
1. Antikörper IL-6
(Recombinant human IL-6, Monoclonal, rh IL6)
2. Antikörper IL-6
(anti-r IL-6, detection antibody, BAF 206)
Interleukin Standards:
IL-1ß
(Human
Recombinant
IL-1ß,
CLBm
Amsterdam, Holland)
28
IL-6
(Recombinant Human, R&D, Minneapolis,
USA)
Monoclonal Anti-human/mouse/Rat
(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)
p38a Antibody
Affinitiy-Purified Rabbit
(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)
Anti-phospho-p38-MAPK
(T180/Y182) Antibody
2.2
Geräte
Elutionsgerät
(VAC ELUTE SPS24, VARIAN® sample preparation products,
Habor City, CA)
Speed Vac
(HETOVAC VR-1, Heto Lab, Equipment)
Kühlfalle
(Centrivac, Recker Victor, Deutschland)
Pumpe
(Recker Victor, Deutschland)
UV-Kamera
(Biometra, biomed. Analytik GmbH, Göttingen, Deutschland)
Fotoentwickler
(Protec45-compact, Protec, Protec Gerätebau GmbH, Deutschland)
ELISA-Photometer
(MR 5000, Dynatech, Denkendorf, Deutschland)
FACScanTM
(FACScan, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)
Leica-DMRB-Mikroskop
(Leica, Bensheim, Deutschland)
29
2.3
Methoden
2.3.1 Probanden
In diese Versuchsreihen wurden 4–12 gesunde Probanden (überwiegend Kommilitonen, Laborund Krankenhauspersonal) einbezogen. Das Alter lag zwischen 24 und 46 Jahren. Zum
Zeitpunkt der Blutentnahme waren bei keinem der Spender gesundheitliche Bedenken,
Autoimmun-, Infektions- oder sonstige Erkrankungen bekannt.
2.3.2 Zellpräparation
Zur Gewinnung von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC) für ELISA und für
die Immunhistologie sowie von Vollblut für die FACSscan-Analyse wurde eine 20-ml-Spritze
mit 25.000 IE Heparin benetzt und nach sorgfältiger Desinfektion Blut aseptisch aus der Vena
cubitalis gewonnen. Die Weiterverarbeitung und Kultivierung erfolgte unter sterilen
Bedingungen.
2.3.3 Separation von mononukleären Zellen (PBMC)
Die Separation von mononukleären Zellen aus Vollblut erfolgte über einen Dichtegradienten
durch Zentrifugation. Als Dichtegradient diente das Trennmedium Ficoll.
Das den Probanden abgenommene Blut wurde zu je 10 ml in zwei sterile 50-ml-Falcon®-Röhrchen (Abb. 2.1) gefüllt und anschließend durch Zugabe von 35 ml steriler 0,9 %-Kochsalzlösung
verdünnt, durchmischt und mit 12,5 ml Ficoll-Trennmedium unterschichtet.
Anschließend erfolgte eine 30-minütige Zentrifugation bei 25 °C und 1.400 U/min (rpm).
4
3
2
1
Abbildung 2.1: Separation mononukleärer Zellen nach Dichtegradientenzentrifugation.
30
Nach der Zentrifugation zeichneten sich vier Schichten in dem Falcon®-Röhrchen ab (Abb. 2.1):
1.
ein Sediment aus Erythrozyten und Granulozyten,
2.
eine 2 cm breite Ficollschicht,
3.
ein Zellring aus Lymphozyten und Monozyten und
4.
eine 4 cm breite Schicht aus Plasma und Thrombozyten.
Der mononukleäre Zellring (60–70 % Lymphozyten, 30–40 % Monozyten) wurde mittels einer
Pipette vorsichtig entnommen und in ein weiteres, mit 30 ml serumfreiem RPMI-Medium
gefülltes, steriles 50-ml-Falcon®-Röhrchen überführt. Daraufhin erfolgte eine 15-minütige
Zentrifugation bei 25 °C und 2.000 U/min (rpm). Nach Verwerfen des Überstands wurde das
Sediment aus PBMC mit 6 ml serumfreiem RPMI-Medium unter Zugabe von 100 U/ml
Penicillin, 2 mmol/L L-Glutamin und 100 µg/ml Streptomycin resuspendiert.
Zur Bestimmung der Zellzahl erfolgte die Entnahme von 50 µl der Zellsuspension. Dieses
Aliquot wurde in 1%iger Essigsäure zur Darstellung der Zellkerne durch Auflösen der Zellstruktur resuspendiert. Die Zählung erfolgte in einer Neubauer-Zählkammer. Daraufhin wurden
die mononukleären Zellen im Medium für die PBMC-Kultur aufgenommen und auf 5 x 106
Zellen/ml eingestellt.
Die separierten Zellen wurden mit den jeweiligen Proben im Verhältnis 1:1 (jeweils 500 µl) auf
12-Well-Platten aufgetragen und für drei Stunden in einem CO2-Inkubator unter befeuchteter
Atmosphäre, die 5 % CO2 enthielt, bei 37 °C präinkubiert. Anschließend wurden die Proben
mittels 0,5 bzw. 1 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert und für weitere 24 Stunden unter
identischen Bedingungen inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch Lysieren der Zellen bei
-80 °C im Gefrierschrank beendet. Die Zytokinfreisetzung konnte nun mittels ELISA
quantifiziert werden.
2.3.4 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Als ELISA definiert man ein immunologisches Nachweisverfahren (Assay) zur quantitativen
Proteinbestimmung, dass auf einer enzymatischen Farbreaktion beruht. Die Eigenschaft
spezifischer Antikörper wird dabei genutzt, um eine Bindung an den nachzuweisenden Stoff
(Antigen) zu erzielen. Der Antikörper oder das Antigen sind durch ein Enzym gekennzeichnet.
Die durch das Enzym katalysierte Reaktion fungiert als Nachweis für das Antigen.
Ein für das gesuchte Protein spezifischer Antikörper wurde zuerst an eine Mikrotitrierplatte
gebunden, die zu untersuchende Probe auf die Platte gegeben und inkubiert. Ein zweiter,
31
spezifisch gegen das Protein gerichteter, biotinylierter Antikörper wurde dazugegeben. Die
Detektion erfolgte mittels entsprechender Farbreaktion durch Extinktionsmessung in einem
Spektralphotometer zur Bestimmung der Menge des gesuchten Proteins.
Die Auswertung erfolgte anhand einer Standardkurve (x-Achse: natürlicher Logarithmus der
Konzentration; y-Achse: Extinktion = OD = optische Dichte = Absorption), die durch eine
Verdünnungsreihe des gesuchten Proteinstandards ermittelt wurde.
2.3.4.1 Durchführung des Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA)
Der erste Schritt dieses Assays bestand in der Beschichtung einer 96-well-ELISA-Mikrotitrierplatte (Abb. 2.2) mit einem monoklonalen 1. Antikörper.
Abbildung 2.2: 96-well-ELISA-Mikrotitrierplatte.
Im konkreten Fall wurde der IL-1ß-Antikörper (R&D, Minneapolis, MN, USA) in einer
Verdünnung in Coatingpuffer (s. u.) von 1:200 (50 µl pro Napf) und der IL-6-Antikörper (R&D,
Minneapolis, MN, USA) in der Verdünnung von 1:500 (100 µl pro Napf) aufgetragen. Die
beschichtete Platte wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert und am nächsten Tag weiterverarbeitet
(Tab. 2.1). Ein zweiter biotinylierter Antikörper wurde auf die Platte gegeben und für eine
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach mehreren Waschschritten wurde in jeden Napf 50µl
Streptavidien-Peroxidase-Komplex gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Erneute Waschschritte folgten. Durch Hinzugabe von 150 µl aus einem Gemisch aus GallatiPuffer und TMB-Lösungen erfolgte die Farbreaktion. Eine Abstoppung der Reaktion gelang
durch Addition von 50 µl Schwefelsäure (4N) pro Napf. Die Extinktionsmessung im Photometer
ergab die Bestimmung der Zytokine IL-1ß und IL-6.
32
A1 + A2
1. Standard 100 µl
50 µl davon ↓
B1 + B2
2. Standard + 50 µl PBS-Tween
50 µl davon ↓
C1 + C2
3. Standard + 50 µl PBS-Tween
50 µl davon ↓
D1 + D2
4. Standard + 50 µl PBS-Tween
50 µl davon ↓
E1 + E2
5. Standard + 50 µl PBS-Tween
50 µl davon ↓
F1 + F2
6. Standard + 50 µl PBS-Tween
50 µl davon ↓
G1 + G2
7. Standard + 50 µl PBS-Tween
50 µl davon ↓
H1 + H2
8. Standard + 50 µl PBS-Tween
50 µl davon verwerfen
Tabelle 2.1: Schema für das Auftragen des Standards
Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Proben (s. o.) mittels ELISA für die Quantifizierung
der Zytokine IL-1ß und IL-6 nach der Stimulation mit LPS durchgeführt:
1. Proben bestehend aus einem Gemisch von 500 ml PBMC und 500 ml Glukose in
unterschiedlichen Konzentrationen (250, 500, 1.000 mg/dl)
2. Proben bestehend aus einem Gemisch von 500 ml PBMC und 500 ml Insulin in
unterschiedlichen Konzentrationen (10, 100, 1.000 IE)
3. Proben bestehend aus einem Gemisch von 500 ml PBMC und 500 ml einer Kombinationslösung von Glukose und Insulin (1.000 mg/dl Glukose + 10 IE Insulin sowie 1.000 mg/dl
Glukose + 100 IE Insulin)
4. Proben bestehend aus einem Gemisch von 500 ml PBMC und 500 ml D-Glukose
(1.000 mg/dl) oder L-Glukose (1.000 mg/dl)
33
5. Proben bestehend aus einem Gemisch von 500 ml PBMC und 500 ml Mannitol
(1.000 mg/dl)
6. Proben bestehend aus einem Gemisch von 500 ml PBMC und 500 ml Harnstoff (136, 327,
654 mg/dl)
7. Proben bestehend aus einem Gemisch von 500 ml PBMC und 500 ml Glukose (1.000 mg/dl)
mit dem mTOR-Inhibitor Rapamycin
8. Proben bestehend aus einem Gemisch von 500 ml PBMC und 500 ml Glukose (1.000 mg/dl)
mit dem p38-MAP-Kinase-Inhibitor SB 203580
9. Proben bestehend aus einem Gemisch von 500 ml PBMC und 500 ml Glukose (1.000 mg/dl)
mit dem Proteinkinase-C-beta-Inhibitor
Als Kontrollgruppe wurde in jeder Versuchsreihe eine Probe mit 500 ml PBMC und dem
äquimolaren Anteil an RPMI-Medium ohne Zusatz sowie mit und ohne LPS-Stimulation
untersucht.
2.3.5 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie, auch FACS (fluorescence activated cell sorting) genannt, dient der
Analyse
und
Quantifizierung
physikalischer
und
molekularer
Eigenschaften,
wenn
fluoreszenzmarkierte Zellen in einem Flüssigkeitsstrom einen gebündelten Laserstrahl passieren
(Longobardi Givan, Flow Cytometry, 2001). Die Fluoreszenzmarkierung einer Zelle erfolgt über
Fluorochrom-gekoppelte Antikörper, die an bestimmte Antigene der Zelle binden. Dabei beruht
das Prinzip der Untersuchung auf der Emission von optischen Signalen seitens des verwendeten
Fluorochroms.
In unseren Untersuchungen diente ein monochromatischer kohärenter Argon-Laser als
Laserquelle. Aufgrund der Intensitätsminderung des Laserstrahls, ähnlich der Gauß’schen
Normalverteilung (Verteilungskurvenprinzip) mit Abnahme der Intensität an den Rändern des
Lichtstrahls, ist eine Fokussierung der Zellen in der Mitte des Laserstrahls für eine maximale
Extinktion der Fluorochrome essenziell. Dies wird anhand einer Einzelzellsuspension durch
hydrodynamische Fokussierung der Zellen erreicht.
Durch den monochromatischen Laserstrahl erfolgt eine Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes.
Dieser wird hierdurch auf ein höheres Energieniveau gehoben. Unter Abgabe von Energie (in
Form
von
Photonen)
gelangt
der
Fluoreszenzfarbstoff
auf
sein
Ursprungsniveau.
Durchflusszytometer besitzen unterschiedliche Fluroeszenzkanäle (Fl-Channels), die das
emittierte Signal mittels Detektoren, sogenannten Photomultipliern (PMT photomultiplier tubes),
34
messen und in elektrische Signale umwandeln. Das elektrische Signal ist proportional zum
emittierten Lichtsignal. Durch eine lineare oder logarithmische Umwandlung wird dieses Signal
graphisch dargestellt. Die emittierte Photonenzahl, die durch einen Photomultiplier registriert
wird, verhält sich proportional zur Menge gebundener Antikörper pro Zelle und erlaubt somit
z. B. eine Aussage über Expression von Oberflächenmolekülen.
Durch Lichtbeugung und -streuung erfolgt die Gewinnung zusätzlicher Informationen über die
Zelle wie Zellgröße und Granularität: Das nach vorne gestreute Licht, auch Vorwärtsstreulicht
(FSC = forward scatter) genannt, ist ein Maß für die Beugung des Lichtes im flachen Winkel,
bei 3–10° und bedingt durch das Volumen der Zelle. Das Seitwärtsstreulicht (SSC = sidewards
scatter), verstreut in einem 90°-Winkel vom Laserstrahl, ergibt eine Aussage über die
Granularität der Zelle. Die Dosis des vorwärts gestreuten Lichtes entspricht der Größe der
Zellen, das seitwärts gestreute Licht ihrer Komplexität. So verteilen Granulozyten, die eine
„raue“ Oberfläche und in ihrem Inneren viele Vesikel haben, mehr Licht als die „glatten“ TZellen.
Bestimmte Zellarten haben eine typische FSC sowie SSC Konfiguration. Die Untersuchung der
physikalischen und molekularen Eigenschaften der einzelnen Zellen erfolgt aus den einzelnen
Streuungsdaten mittels FSC, SSC sowie der Emission.
Sideward scatter (SSC)
→ Granulärität
Laser
Forward scatter (FSC)
→ Zellgröße
Abbildung 2.3: Durchflusszytometrie, Argon-Laser (aus BD LSRII Benutzerhandbuch 2003).
2.3.6 Phagozytose-Assay
Granulozyten, Monozyten und dendritische Zellen haben phagozytotische Eigenschaften. Die
Phagozytose (aus dem Griechischen, phagein = essen) ist einer der bedeutsamsten
Abwehrmechanismen des Körpers gegen mykotische und bakterielle Infektionen. Der
Phagozytoseprozess wird in mehrere Abschnitte eingeteilt:
35
− Chemotaxis,
− Anlagerung von Partikeln an die Zelloberfläche der Phagozyten,
− Aufnahmephase (Phagozytose) und
− intrazelluläre Vernichtung durch sauerstoff(un)abhängige Reaktionen.
In Rahmen dieser Arbeit wurde eine quantitative Bestimmung der Leukozytenphagozytose
(Aufnahme von Bakterien) durch die Durchflusszytometrie mittels des PHAGOTESTS®
(ORPEGEN Pharma, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt. Des Weiteren konnte der
prozentuale Anteil der Phagozyten, die Bakterien aufgenommen haben, bestimmt und deren
Aktivität aufgrund der Anzahl der aufgenommenen Bakterien pro Zelle gemessen werden.
Hierfür wurde heparinisiertes Vollblut mit FITC-markierten E.-coli-Bakterien bei 37 °C
inkubiert. Durch Zugabe von eiskalter „Quench“-Lösung wurde die Phagozytose unterbrochen.
Zur Entfernung von Erythrozyten wurde die Probe in mehreren Waschschritten mit dafür
vorgesehenen Waschlösungen gereinigt. Kurz vor der durchflusszytometrischen Messung
erfolgte die Färbung der DNA mittels DNA-Färbelösung, die zusätzliche Aggregationsartefakte
von Bakterien oder Zellen ausschließt. Ein Kontrollansatz verweilte während des gesamten
Versuchsaufbaus bis kurz vor der durchflusszytometrischen Messung auf Eis.
Die FITC-markierten E.-coli-Bakterien wurden mit Antikörpern und Komplement opsoniert. Die
Zellen des phagozytären Systems (Monozyten, neutrophile Granulozyten) besitzen Rezeptoren
für eine Komplementkomponente (C 3b) und für den konstanten Teil des ImmunglobulinMoleküls (Fc) des Antikörpers, die eine Anheftung der Bakterien an die Zelle vermitteln. Durch
Verwendung von opsonierten und nicht opsonierten Bakterien können gleichzeitig die
Opsonierungsfähigkeit und Phagozytoserate bestimmt werden. So lässt sich ermitteln, ob ein
Opsonierungs- oder Aufnahmedefekt Ursache für die verminderte Phagozytoseleistung ist.
Kritische Faktoren waren in dieser Versuchsreihe der Grad der Opsonierung, die Temperatur, die
Inkubationszeit und das Verhältnis von Bakterien zu Leukozyten.
2.3.6.1 Phagozytoseansatz im Detail
1. Aliquotieren: Heparinisiertes Vollblut wurde auf 5-ml-Probenröhrchen aliquotiert, bestehend
aus 100 µl pro Ansatz. Die Blutproben wurden vor Zugabe der Bakterien 10 Minuten im
Eiswasserbad inkubiert um eine Abkühlung auf 0 °C zu erzielen.
2. Aktivierung: Pro Ansatz erfolgte die Zugabe von 20 µl der vorgekühlten und gemischten
FITC-markierten E.-coli-Bakterien zur Vollblutprobe.
36
3. Inkubation: Die Röhrchen mit Kontrollansätzen verweilten bis zu ihrer Messung auf Eis. Die
Röhrchen mit den Testansätzen wurden 10 Minuten bei 37,0 °C im Wasserbad inkubiert.
4. Abstoppen bzw. „Quenchen“: Zum Ende der Inkubationszeit wurden alle Proben (gleichzeitig im Reagenzgestell) aus dem Wasserbad genommen und auf Eis gestellt. Zu jedem
Ansatz wurden 100 µl eiskalte „Quench“-Lösung gegeben. Alle Proben wurden anschließend
gut vermischt.
5. Waschen: Pro Probenansatz wurden danach 3 ml Waschlösung hinzugefügt und vermischt.
Die Röhrchen wurden 5 Minuten bei 250 x g und 4 °C zentrifugiert, der Überstand
dekantiert. Im Anschluss erfolgte ein erneuter Waschschritt mit Zugabe von 3 ml Waschlösung zur Zellsuspension und die Zentrifugation über 5 Minuten bei 250 x g und 4 °C.
6. Lyse und Fixierung: Die Vollblutproben wurden bei Raumtemperatur durch Zugabe von je 2
ml Lysing-Lösung (bereits vorgewärmt auf Raumtemperatur) lysiert, fixiert, für 20 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend zentrifugiert (5 Minuten, 250 x g, 4 °C). Der
Überstand wurde erneut dekantiert.
7. Waschen: Proben wurden noch einmal mit je 3 ml Waschlösung gewaschen (5 Minuten,
250 x g , 4 °C).
8. DNA-Färbung: Nach Zugabe von je 200 µl DNA-Färbelösung erfolgte nach kurzem Mischen
der Suspension eine 10-minütige Inkubation auf Eis in einem lichtgeschützten Wasserbad.
Die Zellsuspension wurde innerhalb von 60 Minuten gemessen.
2.3.7 Oxidativer Burst
In Granulozyten wurde die Bildung von ROS durch nicht markierte opsonisierte E.-coliBakterien als partikulärer Stimulus, der Proteinkinase-C-Liganden Phorbol-12-myristate-13acetate (PMA) als „high stimulus“, das chemotaktische Peptid N-formyl-MetLeuPhe (fMLP) als
physiologischer „low stimulus“ und Dihydrorhodamin (DHR) 123 als fluorogenes Substrat
hervorgerufen.
Heparinisiertes Vollblut wurde mit den unterschiedlichen Stimuli bei 37 °C inkubiert. Als
Negativkontrolle fungierte eine Probe ohne Stimulus. Granulozyten und Monozyten produzieren
nach der Stimulation reaktive Sauerstoffmetabolite (Superoxid-Anionen, Wasserstoffperoxid).
Die Bildung der reaktiven Sauerstoffradikale wurde durch Addition und Oxidation von DHR 123
beobachtet. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität korreliert mit der NADPH-OxidaseAktivität. Die Lysing-Lösung beendete die Reaktion und entfernte überschüssige Erythrozyten.
Die Zugabe von Waschlösung und die anschließende DNA-Färbung diente dem Ausschluss von
37
Bakterien-
oder
Prozentsatzes
Zellaggregationsartefakten.
oxidierender
Umwandlungsfähigkeit
von
Zellen
Anschließend
(Monozyten
DHR 123
in
die
und
erfolgte
Granulozyten)
hydroxylierte
die
Messung
des
entsprechend
der
Form
R 123
mittels
Durchflusszytometrie. Die Dehydroxy- und Hydroxy-Formen, des Rhodamin-Derivats als
Zeichen der ROS-Bildung, emittieren unterschiedliche Emissionsspektren und können im FACS
unterscheiden werden.
2.3.7.1
Messung des oxidativen Bursts im Einzelnen
1. Aliquotieren: Heparinisiertes Vollblut wurde in 5-ml-Probenröhrchen aliquotiert; 100 µl pro
Ansatz. Proben wurden vor Zugabe der Stimulanzien ca. 10 Minuten im Eiswasserbad
inkubiert, um auf 0 °C abzukühlen.
2. Aktivierung: Pro Ansatz wurden 20 µl der vorgekühlten und vermischten Bakterien zur
Vollblutprobe hinzugefügt (Röhrchen #1). Als Negativkontrolle fungierte ein weiteres
Röhrchen, in das statt der Bakterien 20 µl Waschlösung beigemischt wurde (Röhrchen #2).
Die Zugabe von 20 µl fMLP-Arbeitslösung zur Vollblutprobe erfolgte in einem 3. Röhrchen
(„low control“, Röhrchen #3). In einem 4. Röhrchen wurden 20 µl PMA-Arbeitslösung zur
Vollblutprobe hinzugefügt („high control“, Röhrchen #4). Alle Proben wurden für 10
Minuten bei 37 °C im lichtgeschützten Wasserbad inkubiert.
3. Oxidation: Nach der Inkubation wurden pro Probe 20 µl der Oxidationssubstratlösung
beigemischt. Eine Messung der Proben erfolgte innerhalb von 60 Minuten.
2.3.8 Durchführung einer FACS-Analyse
Eine Analyse der Zellen erfolgt im Durchflusszytometer bei blaugrüner Lichtanregung.
In unserer Versuchsreihe wurden folgende Untersuchungen zur quantitativen Bestimmung der
oxidativen Burst-Aktivität durchgeführt:
1. Vollblut wurde mittels 500 mg/dl Glukose und 500 mg/dl Mannitol inkubiert und mit PMA
als „high stimulus“ stimuliert. Hierzu wurde die entsprechende Leukozytenpopulation
(Monozyten bzw. Granulozyten) im Streulichtdiagramm (lin FSC gegen lin SSC)
eingegrenzt und mit deren Grünfluoreszenz im FL-1-Histogramm analysiert.
2. Vollblut wurde mittels 500 mg/dl Glukose und 500 mg/dl Mannitol inkubiert und mit fMLP
als „low stimulus“ stimuliert. Hierzu wurde die entsprechende Leukozytenpopulation
(Monozyten bzw. Granulozyten) im Streulichtdiagramm (lin FSC gegen lin SSC)
eingegrenzt und mit deren Grünfluoreszenz im FL-1-Histogramm analysiert.
38
3. Vollblut wurde mittels 500 mg/dl Glukose und 500 mg/dl Mannitol inkubiert und mit E. coli
stimuliert. Hierzu wurde die entsprechende Leukozytenpopulation (Monozyten bzw.
Granulozyten) im Streulichtdiagramm (lin FSC gegen lin SSC) eingegrenzt und mit deren
Grünfluoreszenz im FL-1-Histogramm analysiert.
2.3.9 Immunohistochemie – Nachweis von p38
Die Immunhistochemie ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von Proteinen im Rahmen der Antigen-Antikörper-Reaktion durch die spezifische Affinität von Antikörpern zu
Antigenen bzw. Epitopen. Der Antikörper ist an ein Detektionssystem gebunden, das den
Nachweis des Antikörpers in der Probe ermöglicht. Als Primärantikörper wird der Antikörper
bezeichnet, der gegen das zu untersuchende Epitop gerichtet ist, sich durch eine hohe Affinität
und Spezifität auszeichnet und zu keiner Kreuzreaktionen führt.
In der direkten Immunhistochemie wird das zu untersuchende Antigen an einen spezifischen
Antikörper gebunden, der mit einem Enzym oder Fluorophor, wie Rhodamin oder Fluorescein,
konjugiert ist. Der konjugierte Antikörper bindet an das Antigen. Alle nicht gebundenen
Antikörper werden in anschließenden Waschschritt abgewaschen. Durch Zusatz eines Substrats
generiert das Enzym dort einen Farbstoff, wo die immunhistochemische Reaktion stattgefunden
hat und die gesamte Reaktion wird sichtbar.
Die indirekte Immunfluoreszenz (IIF) unterscheidet sich von der direkten Immunfluoreszenz,
indem neben der Zugabe eines spezifisches Antikörpers (Primärantikörper) auf die zu
untersuchenden Zellen im ersten Schritt, in einem weiteren Schritt ein zweiter Antikörper
aufgetragen wird. Dieser Antikörper richtet sich gegen den ersten Antikörper und wird als
Sekundärantikörper bezeichnet. Dieser ist mit einem Enzym verbunden, das zu einer
Farbentstehung im Rahmen der Enzym-Substrat-Reaktion führt.
2.3.9.1 Durchführung der Immunohistochemie
Zur Gewinnung der einzelnen Proben wurden PBMC aus Vollblut isoliert. Präinkubiert wurden
die Proben mit und ohne Glukose für drei Stunden bei 37 °C, anschließend mit unterschiedlichen
LPS-Konzentrationen (0, 0,5 und 50 ng/ml) stimuliert und für weitere 24 Stunden bei 37 °C im
Brutschrank inkubiert. Nach Abschluss der Inkubationszeit wurde ein Aliquot der
Zellsuspension anhand einer Zytospin-Zentrifuge auf einen Objektträger übertragen und mit
Formaldehyd fixiert.
39
Die Objektträger wurden mit 3-Aminopropyltriethoxysylane beschichtet. Zur Detektion der p38MAP-Kinase wurden konjugierte Antikörper benutzt. Die Antigenerkennung wurde in einer
erhitzten Dako-Lösung in einer Druckkammer durchgeführt. Nach der Färbung wurden die
Objektträger mit 1,5 % Glutaraldehyd und 1 % OsO4 behandelt. Alle Inkubationen wurden in
einer humidifizierten Kammer durchgeführt. Zwischen den Inkubationen wurden 2–4
Waschschritte mit folgenden Lösungen durchgeführt: 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 0,1 %
Tween-20 bei einem pH von 7,6.
2.3.9.2 Signalanalyse
Die immunhistochemischen Signale wurden mit einem Leica-DMRB-Mikroskop (Leica,
Bensheim, Deutschland) durch einen Differenzialinterferenzkontrast dargestellt. Die Bilder
wurden anhand des Visitron-Systems (Visitron, Puchheim, Deutschland) digital aufgenommen
und verarbeitet.
2.4
Limulus-Lysat-Test (LAL-Test)
Der Endoxingehalt (LPS) wurde mittels LAL-Tests festgestellt (QCL 1000, BioWhittaker,
Walkersville, MD). Die Sensitivität lag zwischen 0,01 und 0,02 U/ml; der Testbereich lag
zwischen 0,02 und 1 U/ml. Die Messung der Proben erfolgte in zwei Verdünnungsansätzen, bis
ihre Konzentrationen im linearen Teil der Standardkurve lagen. Eine Verdünnung der Proben
und Standards gelang mit destilliertem Wasser.
2.5
Statistische Auswertung
Die Werte wurden mittels des Shapiro-Wilks- sowie des D’Agostino- und Pearson-omnibusTests auf Normalverteilung untersucht.
Im Falle der Normalverteilung wurden die Signifikanzen der Gruppen durch einen „repeatedmeasure-one-way“ ANOVA mit Bonferroni Post-hoc-Tests getestet. Die Daten wurden jeweils
als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (mean ± SEM = standard error of the mean)
angegeben und in Säulendiagrammen oder Kurvendiagramm dargestellt.
Falls keine Normalverteilung in den Gruppen auftrat, wurden die Daten anhand eines
nonparametrischen „repeated-measure-one-way“ ANOVA mit Dunn’s Post-hoc-Test untersucht.
40
Die Daten, die keiner Normalverteilung unterlagen wurden mittels eines Box-Whisker-Plots
Diagram dargestellt unter Verwendung des Median und der Interquartilrange (25. – 75.
Perzentile). Ein p-Wert von 0,05 oder weniger wurde als signifikant betrachtet. Eine Analyse
und Darstellung der Daten erfolgte mithilfe des Computerprogramms Prism 5 (Graphpad
Software Inc.).
41
3
Ergebnisse
Die Auswirkungen der Hyperglykämie, Hyperosmolarität und der Therapie mit Insulin auf die
Inflammationsreaktion und deren Folgen sind unzureichend geklärt. Die protektiven Effekte der
Insulintherapie sind aufgrund der Wirkung des Insulins als endokriner Effekt oder als Folge der
Insulinwirkung im Rahmen der Glukosemetabolisierung oder aber auch der damit verbundenen
Senkung der Osmolarität zu erklären. Zum weiteren Verständnis dieser Mechanismen sollte die
Auswirkung von Glukose, Insulin sowie die Veränderung der Osmolarität durch Mannitol und
Harnstoff auf die Zytokinproduktion von PBMC (peripheral blood mononuclear cells) sowie der
Phagozytose und des oxidativen Burstes in vitro untersucht werden:
Führt eine Erhöhung der Glukosekonzentration zu einem dosisabhängigen Anstieg der
Zytokinproduktion und welche Pathomechanismen liegen der Zytokinproduktion von IL-1ß und
IL-6 in vitro zugrunde?
Wirken hyperosmolare Substanzen wie Mannitol und Harnstoff wie Glukose und welche
Auswirkungen haben sie auf die Zytokinproduktion von IL-1ß und IL-6 in vitro? Welche
Auswirkungen haben erhöhte Glukose- und Mannitolkonzentrationen auf den oxidativen Burst
und die Phagozytose humaner Granulozyten in vitro?
3.1
Stimulationsstufen von mononukleären Zellen mit LPS
In Vorversuchen erfolgte die Ermittlung der benötigten LPS-Konzentration zur Erlangung einer
submaximalen Stimulation der Zytokinproduktion durch PBMC. Hieraus resultierte eine DosisWirkungskurve mit den zu nutzenden LPS-Konzentrationen von 0,5 bis 1 ng/ml in den weiteren
Folgeversuchen (Abb. 3.1).
42
Abbildung 3.1: LPS-Stimulationsstufen.
Steigende Konzentrationen von LPS und Messung der IL-6 Zytokinproduktion
(n=2).
3.2
Hohe Glukosekonzentrationen steigern die Zytokinproduktion
In der ersten Versuchsreihe zur Analyse der Zytokinfreisetzung nach Glukosezugabe zeigte sich
nach der Kultivierung von PBMC in RPMI (Roswell Park Memorial Institute)-Medium durch
die Addition von Glukose eine Induktion der IL-1ß- sowie IL-6-Zytokinfreisetzung in einem
konzentrationsabhängigen Verhältnis, verglichen zu PBMC kultiviert im Zellkulturüberstand in
einem nicht supplementierten (isoosmolaren) Medium.
Aus den Abbildungen 3.2 A und 3.2 B ist ersichtlich, dass die Produktion der Zytokine IL-1ß
und IL-6 signifikant unter Erhöhung der Glukosekonzentration nach LPS-Stimulation stieg (* =
p < 0,05). Bei den Proben mit den geringsten Glukosekonzentrationen von 250 mg/dl Glukose
und einer Osmolarität von 295 mOsmol/l kam es bereits zu einem signifikanten Anstieg der IL6-Konzentration verglichen mit dem Kontrollmedium ohne Zusatz (Abb. 3.2A, * = p < 0,05).
Im Versuch zeigte sich eine dosisabhängige Wirkung: Mit zunehmender Glukosekonzentration
war eine ausgeprägtere Stimulation der Zytokinproduktion nachweisbar. Eine statistisch
signifikante Erhöhung der Zytokinfreisetzung von IL-1ß konnte erst ab der höchsten
Glukosekonzentration von 1.000 mg/dl entsprechend einer Osmolarität von 337 mOsmol/l erzielt
werden (Abb. 3.2 B, * = p < 0,05).
Verglichen mit den Proben, die mit LPS stimuliert wurden, konnte ohne die zusätzliche Gabe
von LPS trotz steigender Konzentration von Glukose (250, 500, 1.000 mg/dl) keine signifikante
Erhöhung der IL-1ß- sowie IL-6-Zytokinfreisetzung nachgewiesen werden. Für IL-1ß zeigten
sich bei dem isoosmolaren Medium ohne Addition von LPS und Glukose Zytokinwerte von
43
7,7 pg/ml ± 14,4 pg/ml. Bei Zugabe von 250 mg/dl Glukose, weiterhin ohne LPS-Stimulation,
lag der Wert bei 7,3 pg/ml ± 12,3 pg/ml, bei 500 mg/dl Glukose ohne LPS bei 5,9 pg/ml ± 9,8
pg/ml und bei Ergänzung von 1.000 mg/dl Glukose ohne Zusatz von LPS bei 19,4 pg/dl ± 37,5
pg/ml.
Ähnliche Konzentrationen ergaben die Messungen der Zytokinfreisetzung von IL-6 ohne die
Supplementierung von LPS. Im isoosmolaren Medium ohne Zugabe von Glukose und LPS
betrug die Zytokinkonzentration 23,4 pg/ml ± 18,45 pg/ml, bei der Addition von 250 mg/dl
Glukose ohne LPS betrug die Konzentration 30,0 pg/ml ± 21,2 pg/ml, bei der Beimischung von
500 mg/dl Glukose betrug die Zytokinkonzentration 53,1 pg/ml ± 57,3 pg/ml und bei Zusatz von
1.000 mg/dl Glukose ohne LPS betrug die IL-6-Konzentration 53,2 pg/ml ± 99,9 pg/ml.
Abbildung 3.2: Glukose führte zu einer dosisabhängigen Erhöhung der Zytokinproduktion.
Nach
LPS-Stimulation
mit
0,5
ng/ml
erfolgte
die
Quantifizierung
der
Zytokinproduktion von IL-6 (A) und IL-1ß (B). Eine initiale Präinkubation von
drei Stunden bei 37 °C, 5 % CO2 der PBMC ohne Zusatz (= Kontrollprobe) mit
250, 500, 1.000 mg/dl Glukose entsprechend einer Osmolarität von 295, 309 und
337 mOsmol/l (A + B) im Verhältnis 1:1 mit anschließender LPS-Stimulation und
konsekutiver Fortführung der Inkubation für weitere 24 Stunden ermöglichte die
Bestimmung der Zytokinfreisetzung mittels ELISA im Anschluss (n = 11,
Mittelwert ± SEM, * = p < 0,05 vs. ohne Zusatz).
44
3.3
Insulin führt zu keiner relevanten Änderung der Zytokinfreisetzung
Besitzt Insulin oder die durch Zugabe von Insulin indirekt erreichte Normoglykämie
antiinflammatorische Wirkungen durch Modifikation der Zytokinproduktion von IL-6 und IL-1ß
und ergibt sich somit ein protektiver Effekt auf die Entzündungsreaktion? Zur Klärung dieser
Fragestellung erfolgte zuerst eine Inkubation der PBMC mit steigenden Insulinkonzentrationen
und konsekutiver LPS-Stimulation.
Der Effekt von Insulin auf die Zytokinproduktion von IL-6 wurde durch die Inkubation mit
verschiedenen Insulinkonzentrationen untersucht. Hier zeigte sich, dass es durch die Zugabe von
Insulin, trotz Erhöhung der Konzentration, zu keiner signifikanten Veränderung der IL-6Zytokinfreisetzung kam (Abb. 3.3 A, p = nicht signifikant (n.s.)). Bei der Analyse der
Auswirkungen von Insulin auf die Zytokinproduktion von IL-1ß erbrachte lediglich die höchste
Insulinkonzentration von 1.000 IU einen signifikanten Anstieg der IL-1ß-Freisetzung (Abb. 3.3
B, * = p < 0,05 vs. ohne Zusatz).
Abbildung 3.3: Auswirkung von Insulin auf die Zytokinfreisetzung von IL-6 und IL-1ß.
Nach LPS-Stimulation mit 0,5 ng/ml erfolgte die Quantifizierung der Zytokinproduktion von IL-6 (A) und IL-1ß (B). Eine initiale Präinkubation von drei
Stunden bei 37 °C, 5 % CO2 der PBMC ohne Zusatz (= Kontrollprobe) mit 10, 100,
1.000 IU Insulin (A + B) im Verhältnis 1:1 mit anschließender LPS-Stimulation und
konsekutiver Fortführung der Inkubation für weitere 24 Stunden ermöglichte die
Bestimmung der Zytokinfreisetzung mittels ELISA (n = 11, Mittelwert ± SEM, * =
p < 0,05 vs. ohne Zusatz).
45
3.4
Insulin führte zu einer Reduktion der anfänglich gesteigerten
Zytokinfreisetzung nach Glukoseexposition
Eine Untersuchung der Reversibilität der anfänglich erhöhten Zytokinproduktion nach
Glukoseexposition durch Addition von Insulin führte zur Durchführung einer Inkubation der
PBMC mit einem Medium bestehend aus einer Kombination von Glukose und Insulin (Abb.
3.4).
1. Auch hier zeigte sich der bereits in der oben dargestellten Versuchsreihe statistisch
signifikante Effekt der Steigerung der IL-1ß- und IL-6-Zytokinfreisetzung durch die Zugabe
von Glukose (Abb. 3.4 A und 3.4 B, * = p < 0,05 vs. ohne Zusatz).
2. Die Addition von Insulin zu einer hoch hyperglykämischen Lösung ergab eine partielle
Erniedrigung der initial erhöhten Zytokinkonzentration. Statistisch signifikant zeigte sich
dieses Ergebnis nur bei der höchsten Glukosekonzentration (1.000 mg/dl = 337 mOsmol/l) in
Kombination mit Insulin (100 IU) für die Messung der IL-1ß-Zytokinfreisetzung (Abb. 3.4
B, δ = p < 0,05 vs. 1.000 mg/dl oder 337 mOsmol/l Glukose).
Abbildung 3.4: Die Zugabe von Insulin zu Glukose führte zu einer Reduktion der Zytokinkonzentration.
Produktion von IL-6 (A) und IL-1ß (B) durch PBMC nach LPS-Stimulation.
PBMC wurden ohne Zusatz mit Glukose (1.000 mg/dl entsprechend 337 mOsmol/l)
und einer Kombination aus Glukose und Insulin (1.000 mg/dl entsprechend 337
mOsmol/l Glukose sowie 10 IU Insulin oder 100 IU Insulin) im Verhältnis 1:1 für
drei Stunden bei 37 °C, 5 % CO2 präinkubiert. Nach einer Inkubation von 24
Stunden unter denselben Bedingungen erbrachte das ELISA-Verfahren im
Anschluss die Quantifizierung der Zytokinkonzentration (n = 9, Mittelwert ±
SEM, * = p < 0,05 vs. ohne Zusatz, δ = p < 0,05 vs. 1.000 mg/dl oder 337 mOsmol/l
Glukose).
46
3.5
Stimulation der Zytokinproduktion durch D- und L-Glukose
Zur weiteren Differenzierung der Auswirkung von Glukose (Hyperglykämie) auf die
Zytokinfreisetzung erfolgte eine Inkubation von PBMC im RPMI-Medium und einem Zusatz
von D-Glukose mit einer Konzentration von 1.000 mg/dl entsprechend einer Osmolarität von
337 mOsmol/l . Das Enantiomer der D-Glukose, die L-Glukose, wurde mit einer Konzentration
von 1.000 mg/dl (= 337 mOsmol/l) zu den Proben hinzugefügt.
Unter Addition beider Glukosevarianten stieg die Zytokinfreisetzung. Lediglich durch die
Zugabe von D-Glukose zeigte sich eine statistisch signifikante Induktion der IL-6Zytokinausschüttung (Abb. 3.5 A, * = p < 0,05 vs. ohne Zusatz). Für das Zytokin IL-1ß konnte
durch beide Enantiomere eine Erhöhung der Zytokinkonzentration nachgewiesen werden (Abb.
3.5 B). Diese war jedoch statistisch nicht signifikant. Zwischen den beiden Enantiomeren
bestand in Bezug auf die Zytokinproduktion kein Unterschied, weder für IL-1ß noch für IL-6.
Abbildung 3.5: IL-6- (A) und IL-1ß- (B) Produktion durch PBMC nach Zugabe von L- und DGlukose.
PBMC wurden mit L-Glukose in einer Konzentration von 1.000 mg/dl entsprechend einer Osmolarität von 337 mOsmol/l und D-Glukose gemäß einer Konzentration von 1.000 mg/dl und einer Osmolarität von ebenfalls 337 mOsmol/l für
drei Stunden bei 37 °C, 5 % CO2 präinkubiert, danach mit 0,5 ng/ml LPS
stimuliert. Nach einer Inkubation von 24 Stunden unter denselben Bedingungen
erbrachte
das
ELISA-Verfahren
im
Anschluss
die
Quantifizierung
der
Zytokinkonzentration (n = 10, Median (25. - 75. Perzentile), * = p < 0,05 vs. ohne
Zusatz).
47
3.6
Effekt von Mannitol auf die Zytokinfreisetzung
Um die Auswirkung eines anderen osmotisch wirksamen Stoffes aus der Gruppe der
Kohlenhydrate zu nutzen, erfolgte die Inkubation der PBMC erneut mit einem Medium aus
RPMI und einem Zusatz aus dem Diastereomer der Glukose: Mannitol. Proben wurden mit
Mannitol und Glukose entsprechend einer Osmolarität von 337 mOsmol/l in einem RPMIMedium versetzt.
Die Quantifizierung der Zytokinkonzentration von IL-1ß und IL-6 vollzog sich nach einer Inkubationszeit von 3, 6, 9, 12 und 24 Stunden, wie in Abbildung 3.6 dargestellt. Bereits nach 6
Stunden Inkubationszeit konnte ein deutlicher, nach 9 Stunden ein statistisch signifikanter
Anstieg der Zytokinfreisetzung von IL-1ß und IL-6 nachgewiesen werden. Nach 12-stündiger
Inkubationszeit konnte keine weitere statistisch signifikante Erhöhung der Produktion im
Vergleich zu den Vorwerten erreicht werden (= Plateauphase).
Die Zugabe von Glukose mit einer konsekutiven Erhöhung der Gesamtosmolarität auf
337 mOsmol/l führte zu einem signifikanten und anhaltenden Anstieg der Zytokinkonzentration
verglichen mit den Proben ohne Zusatz (Abb. 3.6 A und B; * = p < 0,05 vs. ohne Zusatz). Die
Addition von Mannitol mit derselben Gesamtosmolarität von 337 mOsmol/l führte auch zu einer
Erhöhung der Zytokinproduktion. Diese war jedoch deutlich geringer als bei den Proben mit dem
Zusatz aus Glukose und statistisch nicht signifikant (Abb. 3.6 A und B; p = n. s.). Dies konnte
sowohl für IL-6 als auch für IL-1ß nachgewiesen werden.
48
Abbildung 3.6: Induktion der IL-6- (A) und IL-1ß-Freisetzung (B) durch PBMC innerhalb von 24
Stunden.
PBMC wurden mit Glukose und Mannitol entsprechend einer Osmolarität von
337 mOsmol/l im Verhältnis 1:1 für drei Stunden bei 37 °C, 5 % CO2 präinkubiert,
daraufhin mit 0,5 ng/ml LPS stimuliert. Die Proben wurden unter denselben
Bedingungen für weitere 24 Stunden inkubiert. Innerhalb dieses Zeitraums wurden
in einem Abstand von 3, 6, 9, 12 und 24 Stunden jeweils die Zytokinkonzentration
von IL-6 und IL-1ß via ELISA bestimmt (n = 4–5, Mittelwert ± SEM, * = p < 0,05
Glukose vs. ohne Zusatz).
49
3.7
Hyperosmolare
Bedingungen
führen
zu
einer
erhöhten
Zytokinfreisetzung
Um eine Aussage bezüglich der Auswirkung von hyperosmolaren Bedingungen auf die
Zytokinproduktion zu erhalten und eine Substanz zu wählen, die einen direkten Einfluss auf die
Osmolarität im physiologischen Milieu ausübt, aber die Tonizität des Milieus nicht beeinflusst,
wurden PBMC mit Harnstoff, einer frei durch die Zellmembran diffundierenden Substanz,
inkubiert (Abb. 3.7). Auch in dieser Versuchsreihe wurde eine Induktion der Zytokinfreisetzung
durch die Addition von Harnstoff in das RPMI-Medium nach LPS-Stimulation erzielt.
Für die Produktion der Zytokine IL-1ß und IL-6 zeigte sich ein statistisch signifikanter
Zusammenhang zwischen der Konzentrationserhöhung von Harnstoff und der Zytokinfreisetzung. Dieser war statistisch signifikant sowohl für IL-6 (Abb. 3.7 A) als auch für IL-1ß
(Abb. 3.7 B) bei der höchsten Harnstoffkonzentration von 654 mg/dl gemäß 2.000 mg/dl
Glukose und einer Osmolarität von 392 mOsmol/l im Vergleich zu den niedrigeren
Harnstoffkonzentrationen (163, 327 mg/dl) entsprechend einer Osmolarität von 309 und 337
mOsmol/l (δ = p < 0,05 vs. ohne Zusatz). Vorzufinden war ein weiterer statistisch signifikanter
Unterschied bezüglich der Zytokinproduktion zwischen der höchsten Harnstoffkonzentration von
392 mOsmol/l und der Probe mit der geringsten Harnstoffkonzentration von 163 mg/dl,
entsprechend einer umgerechneten Glukosekonzentration von 500 mg/dl und einer Osmolarität
von 309 mOsmol/l (Abb. 3.7 A, B; * = p < 0,05 vs. 392 mOsmol/l). Für das Zytokin IL-6 zeigte
sich dies auch für die Probe mit der mittleren Harnstoffkonzentration im Medium von 327mg/dl
und einer Osmolarität von 337 mOsmol/l (Abb. 3.7 A, * = p < 0,05 vs. 392 mOsmol/l).
Abbildung 3.7: IL-6- (A) und IL-1ß-Freisetzung (B) durch LPS-stimulierte PBMC nach Zugabe
von Urea.
50
PBMC wurden mit Urea (163, 327, 654 mg/dl) in der Konzentration 1:1 für drei
Stunden bei 37 °C, 5 % CO2 präinkubiert, daraufhin mit 0,5 ng/ml LPS stimuliert
und weitere 24 Stunden bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Die jeweiligen UreaKonzentrationen
entsprachen:
163 mg/dl
Urea
=
500
mg/dl
Glukose
=
309 mOsmol/l; 327 mg/dl Urea = 1.000 mg/dl Glukose = 337 mOsmol/l; 654 mg/dl
Urea = 2.000 mg/dl Glukose = 392 mOsmol/l (n = 10, Mittelwert ± SEM, * = p < 0,05
vs. ohne Zusatz, δ = p < 0,05 vs. 309 mg/dl und 337 mg/dl Urea).
3.8
Auswirkung von Glukose, Rapamycin und dem p38-MAP-KinaseInhibitor SB 203580 auf die Zytokinproduktion
Wie aus den bereits durchgeführten Versuchen ersichtlich, fördern hyperglykämische sowie
hyperosmolare Bedingungen die Zytokinfreisetzung in einem konzentrationsabhängigen
Verhältnis. Um grundlegende Mechanismen der durch diese Bedingungen hervorgerufenen
Regulationen der Zytokinproduktion zu untersuchen, erfolgte eine selektive Blockierung
möglicher
auf
unterschiedlichen
Ebenen
interagierender
Kinasen
und
weiterer
Regulationsmechanismen. Insbesondere scheinen die in der nächsten Versuchsreihe untersuchten
Kinasen, wie die PKC-ß-, die p38-MAP-Kinasen und der Regulationsmechanismus über die
Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3)/Akt-Signalkaskade mittels Selektierung von mTOR (=
mammalian target of Rapamyicn), von Bedeutung zu sein.
Es erfolgte daher
− die Blockierung des mTOR-Pathways durch den mTOR-Inhibitor Rapamycin (Abb. 3.8.1),
− die weitere Blockierung der durch die p38-MAP-Kinase übermittelten Kaskade durch den
p38-MAP-Kinase-Inhibitor SB 203580 (Abb. 3.8.1 und Abb. 3.8.2) und
− die Inhibition der Proteinkinase-C-beta durch den spezifischen Inhibitor (Abb. 3.8.2).
Die freigesetzten Zytokine IL-1ß und IL-6 zeigten nach der Inkubation mit Glukose
(1.000 mg/dl), entsprechend einer Osmolarität von 337 mOsmol/l und nachfolgender LPSStimulation, eine signifikante Erhöhung der Zytokinproduktion (Abb. 3.8.1 A, B; * = p < 0,05
vs. ohne Zusatz). Auch in den mit derselben Konzentration von Glukose versetzten Proben,
jedoch mit der Beimischung des mTOR-Inhibitors Rapamune, war ein signifikanter Anstieg der
Zytokinkonzentration im Vergleich zu den Proben ohne Zusatz zu messen (Abb. 3.8.1 A, B; * =
p < 0,05 vs. ohne Zusatz). Durch die weitere Addition von Rapamune zu den Glukosemedien
sank die Zytokinfreisetzung im Vergleich zu den Proben, die nur mit Glukose inkubiert wurden,
51
allerdings nicht signifikant (p > 0,05 oder p = nicht signifikant Glukose vs. Glukose/Rapamune).
Nach der Inkubation mit dem p38-MAP-Kinase-Inhibitor SB 203580 zeigte sich trotz Zugabe
von Glukose zu den Proben in einem äquimolaren Verhältnis eine deutlich signifikante Abnahme
der Zytokinfreisetzung im Vergleich zu den Proben mit dem Zusatz aus Glukose (δ = p < 0,05
vs. Glukose und Glukose/Rapamune). Dies traf für das Zytokin IL-6 (Abb. 3.8.1 A) und für das
Zytokin IL-1ß gleichermaßen zu (Abb. 3.8.1 B).
Abbildung 3.8.1: IL-6- (A) und IL-1ß-Freisetzung (B) durch PBMC nach Inkubation mit Glukose,
Rapamune und dem p38-MAP-Kinase-Inhibitor SB 203580.
PBMC wurden ohne Zusatz, mit Glukose (1.000 mg/dl) entsprechend einer
Osmolarität von 337 mOsmol/l, einer Kombination aus Glukose (1.000 mg/dl) und
Rapamune sowie der Kombination aus Glukose (1.000 mg/dl) und dem p38MAPK-Inhibitor SB 203580 in der Konzentration 1:1 für drei Stunden bei 37 °C,
5 % CO2 präinkubiert. Nach einer Inkubation von 24 Stunden unter denselben
Bedingungen erbrachte im Anschluss das ELISA-Verfahren die Bestimmung der
Zytokinkonzentration (n = 9, Mittelwert ± SEM,* = p < 0,05 vs. ohne Zusatz, δ = p
< 0,05 vs. Glukose).
Durch die Addition von Glukose kam es erneut zu einem Anstieg der Zytokinkonzentration von
IL-1ß und IL-6 (Abb. 3.8.2 A, B). Die Zugabe des Proteinkinase-C-beta-Inhibitors mit Glukose
führte zu einem weiteren Anstieg der Zytokinausschüttung im Vergleich zu den Proben, die nur
mit dem Zusatz aus Glukose inkubiert wurden. Wie schon in den Abbildungen 3.8.1 A und 3.8.1
B beschrieben, kam es auch in dieser Versuchsreihe zu einer signifikanten Reduktion der
52
Zytokinproduktion von IL-1ß und IL-6 durch die Beimischung von SB 203580 zu den Proben
mit und ohne Glukose.
*
A
b
b
i
l
d
u
n
g
*3
.
7
:
I
L
Abbildung 3.8.2: IL-1ß- (A) und IL-6-Freisetzung (B) durch- PBMC nach Zugabe von Glukose und
6
dem PKCß-Inhibitor.
PBMC wurden ohne Zusatz, mit Glukose (1.000 mg/dl) entsprechend einer
(
Osmolarität von 337 mOsmol/l, einer Kombination
aus Glukose (1.000 mg/dl) und
A
dem Proteinkinase-C-beta-Inhibitor sowie) der Kombination aus Glukose (1.000
mg/dl) und dem p38-MAPK-Inhibitor SB 203580 in der Konzentration 1:1 für
u
drei Stunden bei 37 °C, 5 % CO2 präinkubiert
und im Anschluss mit 0,5 ng/ml
n
LPS stimuliert. Nach einer Inkubation vond 24 Stunden unter denselben Bedingungen erbrachte im Anschluss das ELISA-Verfahren
die Quantifizierung der
I
Zytokinkonzentration (n = 4, Mittelwert L± SEM, * = p < 0,05 vs. ohne Zusatz,
PKCß-Inhibitor).
1
ß
(
B
)
53
F
r
3.9
Charakterisierung der Auswirkung von Glukose und der p38-MAPKinase auf die Zytokinproduktion mittels Immunhistologie
Zur Bestätigung der Expression und der Beteiligung der MAP-Kinase p38 gelang dieser
Nachweis in der anschließenden Versuchsreihe durch eine immunhistologische Färbung. PBMC
wurden zum Einen mit RPMI ohne Zusatz (isoosmolares Medium) und zum Anderen mit RPMI
und einer Addition von 1.000 mg/dl Glukose entsprechend einer Osmolarität von 337 mOsmol/l
versetzt (Abb. 3.9). Eine Stimulation erfolgte durch steigende Konzentration von LPS (ohne
Zusatz, 0,5 ng/ml, 50 ng/ml). Es schloss sich eine immunhistologische Färbung der p38-MAPKinase mittels des p38-MAP-Kinase-Antikörpers an.
Abbildung 3.9: Immunhistochemischer Nachweis der p38-MAP-Kinase bei verschiedenen Glukoseund LPS-Konzentrationen.
PBMC wurden drei Stunden mit und ohne Zusatz von Glukose (1.000 mg/dl)
entsprechend einer Osmolarität von 337 mOsmol/l bei 37 °C und 5 % CO2-Gehalt
inkubiert. Es folgte im Anschluss eine Stimulation mit 0,5 und 50 ng/ml LPS, zudem
54
eine weitere Inkubation für 24 Stunden. Proben ohne den Zusatz von LPS dienten
sowohl mit als auch ohne Addition von Glukose als Kontrollen. Die im Anschluss
durchgeführte Färbung der p38-MAP-Kinase erfolgte durch den p38-Antikörper
(n = 2).
Ohne Beimischung von LPS und ohne Zugabe von Glukose und somit bestehend aus einer
Zusammensetzung eines isoosmolaren RPMI-Mediums ließ sich kaum eine Anfärbung der p38MAP-Kinase nachweisen (Abb. 3.9 A). Der Zusatz von 1.000 mg/dl Glukose entsprechend einer
Osmolarität von 337 mOsmol/l, weiterhin ohne LPS-Stimulation, erbrachte eine geringe
Intensitätssteigerung der p38-MAP-Kinase-Färbung (Abb. 3.9 B). Die Ausprägung der Färbung
nahm bei zunehmender LPS-Konzentration deutlich zu (Abb. 3.9 D, F). Eine alleinige Zunahme
der Nachweisintensität von p38-MAP-Kinase durch eine Steigerung der LPS-Konzentration
konnte ohne Addition von Glukose im Vergleich zu den mit Glukose und LPS versetzten Proben
nicht erzielt werden (Abb. 3.9 A, C, E).
3.10 Auswirkungen der Hyperglykämie und der Hyperosmolarität auf den
oxidativen Burst und die Phagozytose
Eine Untersuchung der Effekte auf die Phagozytose und den oxidativen Burst nach Addition von
Glukose und Mannitol (zur Erzeugung eines weiteren hyperosmolaren Kulturmediums) ergab
einen Einblick in ein weiteres Teilgebiet der unspezifischen, angeborenen Immunantwort.
Hierfür wurde Vollblut im RPMI-Medium entweder ohne Zusatz oder mit Beimischung von
Glukose (500 mg/dl) entsprechend einer Osmolarität von 309 mOsmol/l als auch mit Zugabe von
Mannitol (500 mg/dl oder 309 mOsmol/l) inkubiert.
Unter den hyperglykämischen Bedingungen war die oxidative Burst-Aktivität der Granulozyten
in den Proben mit PMA als starker („high“) Stimulus (Abb. 3.10 A) und in den Proben mit E.
coli als schwacher („low“) Stimulus (Abb. 3.10 B) signifikant reduziert (* = p < 0,05). Als
Negativkontrolle (Null-Probe) dienten Vollblutproben, die nur in RPMI-Medium ohne Zusatz
analysiert wurden. Die mit Mannitol versetzten Medien derselben Osmolarität wie die mit
Glukose inkubierten Proben zeigten eine Abnahme der oxidativen Burst-Aktivität. Die
Aktivitätsreduktion unter Mannitol war geringer ausgeprägt als unter Zugabe von Glukose. Eine
statistisch signifikante Veränderung der oxidativen Burst-Aktivität durch Inkubation mit
Mannitol konnte nur für die Proben nachgewiesen werden, die mit PMA als starkem Stimulus
versetzt wurden (Abb. 3.10 A, * = p < 0,05 vs. ohne Zusatz).
55
Abbildung 3.10: Oxidative Burst-Aktivität.
Vollblut wurde ohne Zusatz, mit Mannitol (500 mg/dl) und Glukose (500 mg/dl)
entsprechend einer Osmolarität von 309 mOsmol/l für drei Stunden bei 37 °C,
5 % CO2 inkubiert und im Anschluss entweder mit PMA (A) als „high“-Stimulus
oder E. coli (B) als „low“-Stimulus aktiviert (n = 10, * = p < 0,05 vs. ohne Zusatz).
Die Zugabe eines hyperglykämischen Mediums entsprechend einer Osmolarität von
309 mOsmol/l zu den Vollblutproben erbrachte auch in dieser Versuchsreihe eine signifikante
Aktivitätsabnahme der Phagozytose (Abb. 3.11, * = p < 0,05) verglichen mit den Vollblutproben
ohne Zusatz. Eine Erhöhung der Osmolarität auf 309 mOsmol/l durch Mannitol führte ebenfalls
zu einer signifikanten Reduktion der phagozytotischen Aktivität (Abb.3.11, * = p < 0,05).
56
Hyperglykämische Bedingungen scheinen hier, wie auch bei der Versuchsreihe zur
Quantifizierung der oxidativen Burst-Aktivität, einen deutlich ausgeprägteren Effekt auf die
Herabsetzung der Phagozytose zu haben als hyperosmolare Veränderungen isoliert betrachtet.
Dies ist jedoch statistisch nicht signifikant zu belegen.
Abbildung 3.11: Phagozytotische Aktivitätsbestimmung bei verschiedenen osmotischen Stimuli.
Vollblutproben wurden ohne Zusatz, mit Mannitol (500 mg/dl) und Glukose (500
mg/dl) entsprechend einer Osmolarität von 309 mOsmol/l für drei Stunden bei
37 °C, 5 % CO2 inkubiert (n = 10, * = p < 0,05 vs. ohne Zusatz).
57
4
Diskussion
Die Hyperglykämie ist ein sehr häufig gesehenes Phänomen bei intensivpflichtigen Patienten
und ein Prädiktor für Morbidität und Mortalität in dieser Patientenpopulation 26-30. Ziel unserer
Untersuchungen war es, die Modulation der Immunantwort in einem Sepsismodell unter
hyperglykämischen und hyperosmolaren Bedingungen zu analysieren, um die Ursachen der
Morbiditäts- und Mortalitätssteigerung bei septischen und intensivpflichtigen Patienten zu
eruieren.
4.1
Erhöhte Glukosekonzentrationen steigern die Zytokinproduktion
In den in dieser Dissertation durchgeführten Versuchsreihen zeigte sich nach Zugabe von LPS zu
humanen PBMC von gesunden Probanden unter steigenden hyperglykämischen Bedingungen
ein proportionaler Anstieg der Zytokinfreisetzung von IL-1ß sowie IL-6. Diese beobachtete
Steigerung der Zytokinproduktion bestätigte die Arbeit von Esposito et al.38, die unter
experimentellen hyperglykämischen Bedingungen bei gesunden Probanden sowie bei
diabetischen Patienten eine Erhöhung der Zytokinkonzentration nachwiesen. Weiterhin ergab
sich in dieser Studie, dass die diabetischen Patienten einen signifikant höheren Zytokinspiegel
unter normoglykämischer Stoffwechsellage hatten als Patienten ohne Diabetes 38. Nach
Endotoxinstimulation führte die Zugabe von Glukose zu den Proben gesunder Probanden zu
einer Erhöhung der IL-6-Freisetzung 37. Dies bestätigte sich auch bei intensivtherapiepflichtigen
Patienten durch den Nachweis eines Anstieges der IL-6-Konzentration unter hyperglykämischen
Konditionen 30. Ähnliche Daten ergaben sich in einer weiteren Studie, in der es auch zu einer
Erhöhung der IL-6- und TNF-α-Freisetzung nach Exposition mit LPS unter erhöhten
Glukosekonzentrationen kam 70. In Tiermodellen konnten diese Ergebnisse ebenfalls
nachgewiesen werden 51, 50, 44.
4.2
Wirkt Insulin als antiinflammatorisches Hormon?
Die Insulintherapie, intensiviert (Zielblutzuckerwerte: 80–110 mg/dl) oder mit konservativer
Dosierung (Zielblutzuckerwerte: 180–200 mg/dl), ist eine einfache und kostengünstige
Intervention, die das klinische Ergebnis von intensivpflichtigen29,
neurologischen32,
34
, kardiologischen71-74,
33
, diabetischen und dialysepflichtigen75-77 Patienten verbessert 78. Sie kann
unter einfachen und unkomplizierten Bedingungen im klinischen Alltag nach entsprechender
58
Einführung, Übung und Überwachung eingesetzt werden 79. Insulin scheint teilweise die
metabolischen Entgleisungen bei kritisch kranken Patienten revidieren zu können. Nach
Endotoxin-Injektion bei Schweinen erzielte die Gabe von Insulin eine Abnahme der initial
erhöhten Zytokinproduktion nach Glukoseexposition. Die Autoren formulierten hieraus die
Hypothese, Insulin als antiinflammatorisches Hormon zu betrachten 51. Im Hasenmodell zeigte
sich nach Addition von Insulin zur Erhaltung der Normoglykämie (3,3–6,1 mmol/l oder 59,5–
109,9 mg/dl) das Eintreten einer Inflammationsreduktion bereits innerhalb von drei Tagen nach
Applikation von Verbrennungswunden verglichen mit Hasen, die weiterhin einen erhöhten Blutzuckerspiegel (13,8–16,6 mmol/l oder 249–299,1 mg/dl) hatten. Diese waren gekennzeichnet
durch eine deutlich prolongierte Krankheitsdauer sowie einen schlechteren klinischen Verlauf
unter hyperglykämischen Bedingungen 50.
In unserer Versuchsreihe zeigte die Inkubation von humanen PBMC nach LPS-Stimulation mit
unterschiedlichen Insulinkonzentrationen (10, 100, 1.000 IE) keinen signifikanten Einfluss auf
die Zytokinsynthese von IL-1ß und IL-6. Lediglich unter der höchsten Konzentration von 1.000
IE Insulin kam es zu einer Erhöhung der IL-1ß-Zytokinproduktion.
Unsere Daten weisen somit keinen direkten Effekt der isolierten Gabe von Insulin auf die LPSstimulierte Zytokinausschüttung nach. Eine Kombination aus der Beimischung von
unterschiedlichen Konzentrationen von Glukose und Insulin zu den humanen PBMC erbrachte
einen initialen Anstieg der Zytokinfreisetzung unter alleiniger Zugabe von Glukose. Durch die
Addition von Insulin konnte dieser Anstieg partiell revidiert werden. Dies ist jedoch als
zusätzliches Argument dafür zu werten, dass Insulin einen knapp signifikanten Effekt auf die
Zytokinantwort ausübt. Weiterhin bleibt jedoch zu klären, ob es bei den beschriebenen
klinischen Studien durch die Gabe von Insulin zur Erzielung der Normoglykämie und hierdurch
zu einer Abnahme der Osmolarität kam und dies zu den beschriebenen klinischen
Verbesserungen der Patientenpopulation führte. Unser etabliertes Zellkulturmodell konnte diese
Fragestellung nicht hinreichend beantworten, da die vielschichtigen physiologischen
Interaktionsmechanismen in diesem Versuchsaufbau nicht ausreichend widergespiegelt werden
konnten.
4.3
Bedeutung der Glukose und Osmolarität für die Zytokinproduktion
Zusammenfassend erbrachten unsere Daten den Nachweis einer signifikanten Erhöhung der
Zytokinfreisetzung durch Zugabe von Glukose. Studien berichteten jedoch zusätzlich über eine
59
Steigerung der Zytokinproduktion durch Veränderung des osmotischen Milieus, bezogen auf
diese Versuchsreihe also durch eine Steigerung der Osmolarität durch das Hinzufügen von
Glukose. Zur genaueren Differenzierung, ob die von uns beschriebenen Veränderungen der
Zytokinfreisetzung durch die alleinige Beimischung von Glukose bzw. die konsekutive
Veränderung der Osmolarität erzielt wurden, erfolgte die Inkubation der humanen PBMC mit
unterschiedlichen osmotisch wirksamen Substanzen.
Eine Studie von Taubert et al. untersuchte die endotheliale NO-vermittelte Vasodilatation an
Koronargefäßen von Schweinen nach Addition von D-Glukose sowie dessen Enantiomer, der LGlukose. Die Ergänzung von D-Glukose zu den Proben erbrachte die Messung eines
konzentrationsabhängigen Anstiegs der NO-Freisetzung. Nur die Proben versetzt mit D-Glukose
zeigten einen Zusammenhang mit einem verstärkten Kalziuminflux über die Plasmamembran in
die Zelle und konsekutiv die Aktivierung der NO-Synthese (eNOS). Der Zusatz von L-Glukose
erzielte in dieser Versuchsreihe keine Veränderungen auf die NO-Formation 80. Unsere
Versuchsreihe untersuchte entsprechend dieser Anordnung die Zytokinkonzentration nach
Beimischung von L- und D-Glukose. Unsere Daten führten zu einem Anstieg der
Zytokinproduktion von IL-1ß und IL-6 sowohl durch Addition von D-Glukose als auch durch
Zugabe von L-Glukose. Statistisch signifikant war dies nur für die Addition von D-Glukose bei
dem Nachweis von IL-6. Insgesamt zeigte sich jedoch kein statistisch signifikanter Unterschied
zwischen den beiden Enantiomeren in Bezug auf die Zytokinfreisetzung. Dies könnte auf einen
Mechanismus der Zytokininduktion hinweisen, der nicht unbedingt auf die isolierte Zugabe der
biologisch frei verfügbaren D-Glukose angewiesen ist.
Zhang et al. 49 stellten in ihrer Studie durch Beimischung von hypertoner NaCl-Lösung und
Mannitol ein hyperosmolares Milieu mit einer Osmolarität zwischen 300 und 350 mOsmol/l her.
Dieses Medium wurde in einem weiteren Schritt mit gastrischen Epithelzellen inkubiert. Unter
den erzeugten hyperosmolaren Bedingungen kam es zu einer Zunahme der mRNA-Expression
von IL-1ß durch gastrische Epithelzellen. Die Zugabe von hyperosmolarer NaCl-Lösung mit
einer Endosmolarität von 375 mOsmol/l zu PBMC zeigte auch in anderen Studien eine
Erhöhung der Zytokinkonzentration, in diesem Falle von IL-8 47, 81. Diese Ergebnisse konnten in
der Studie von Németh et al. 48 bestätigt werden. Unter Zufuhr von hypertoner NaCl-Lösung
sowie von Mannitol kam es hierbei zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der IL-8Freisetzung von humanen intestinalen Epithelzellen. Die Arbeitsgruppe postulierte Hinweise für
zugrunde liegende Mechanismen im Sinne einer Aktivierung der p38- und p42/44-MAP-Kinasen
60
unter
hyperosmolaren
Bedingungen.
Ein
Tierversuch
konnte
eine
Erhöhung
der
Zytokinfreisetzung durch Zugabe von Mannitol zu den Proben nicht bestätigen 44.
Unsere Untersuchungen zeigten ähnliche Ergebnisse wie die von Németh und Zhang et al. In
unserer Versuchsreihe erfolgte die Inkubation frisch isolierter humaner PBMC mit der
Beimischung von Mannitol und einer Zielosmolarität von 337 mOsmol/l. Anschließend erfolgte
die Stimulation mit LPS. Die Messung der Zytokine IL-6 und IL-1ß zeigte auch hier einen
konzentrationsabhängigen Anstieg der Zytokinproduktion nach Exposition mit Mannitol. Im
Vergleich dazu ergab der Zusatz von Glukose mit derselben Endosmolarität von 337 mOsmol/l
auch eine Erhöhung der Zytokinkonzentration von IL-6 und IL-1ß. Jedoch war dieser durch
Glukose induzierte Effekt deutlich ausgeprägter als der Anstieg, der durch die Gabe von
Mannitol erzielt wurde.
Dies weist zum einen auf einen durch die Veränderung des osmotischen Milieus erreichten
Einfluss hin, zum anderen auf eine darüber hinausgehende additive Auswirkung der
Glukosezugabe auf die Zytokinfreisetzung.
Hatanaka et al. 82 zeigten gegenteilige Ergebnisse. Frisch isolierte humane mononukleäre Zellen
gesunder Probanden wurden mit hypertoner NaCl-Lösung inkubiert. Im Anschluss wurde die
Zytokinkonzentration von IL-8, TNF-α und dem IL-1-Rezeptor-Antagonisten der Neutrophilen
sowie IL-8 und IL-1ß von Monozyten nach der LPS-Stimulation gemessen. Die gemessenen
Zytokinkonzentrationen waren nach Beimischung der hypertonen NaCl-Lösung gesunken. Als
Ursache hierfür sahen die Autoren Elektrolytveränderungen induziert durch den Zusatz der
hypertonen NaCl-Lösung, die im Rahmen der Entzündungsreaktion Auswirkungen auf die
Leukozytenfunktion hatten.
Zur weiteren Differenzierung der Auswirkung der Osmolarität auf die Zytokinfreisetzung wurde
in einer zusätzlichen Versuchsreihe frisch isolierte PBMC mit Urea inkubiert. Hierbei wurde die
Dosierung entsprechend der Osmolarität vorgegeben:
− 163 mg/dl Urea gemäß einer Konzentration von 500 mg/dl Glukose und einer Osmolarität
von 309 mOsmol/l;
− 327 mg/dl Urea entsprechend einer Konzentration von 1.000 mg/dl Glukose und einer
Osmolarität von 337 mOsmol/l;
− 654 mg/dl Urea entsprechend einer Konzentration von 2000 mg/dl Glukose und einer
Osmolarität von 392 mOsmol/l.
61
Die Zugabe von Harnstoff in einem konzentrationsabhängigen Verhältnis ergab eine Steigerung
der Zytokinproduktion.
Harnstoff diffundiert frei durch die Zellmembran, ist also nicht an Transportmechanismen
gebunden, führt weiterhin zu einer Änderung der Tonizität im Kulturmedium und umgeht somit
eine Veränderung der Zelloberfläche (Zellschwellung) im Vergleich zum hypersomolaren Milieu
erzielt durch die Gabe von Mannitol oder Glukose. Harnstoff führte ebenfalls zu einer Erhöhung
der Zytokinfreisetzung.
Zusammenfassend zeigen die Versuchsdaten dieser Arbeit, dass die Veränderung des
osmotischen Milieus und der Tonizität einen Einfluss auf die Induktion sowie die
konzentrationsabhängige Produktion der Zytokine IL-6 und IL-1ß nach LPS-Stimulation ausübt.
Die Erhöhung der Osmolarität ist hierbei der entscheidende Mechanismus.
4.4
Der Zytokinproduktion zugrunde liegenden Regulationsmechanismen
Mögliche der Erhöhung der Zytokininduktion durch Hyperglykämie und Hyperosmolarität
zugrunde liegende Pathomechanismen wurden bereits in der Studie von Németh et al. 48 nach
Exposition von humanen intestinalen Epithelzellen mit hypertoner NaCl-Lösung sowie von
Mannitol nach einer konzentrationsabhängigen Steigerung der IL-8-Freisetzung untersucht.
Postuliert wurde hierbei, dass es durch die Syntheseleistung von proinflammatorischen
Zytokinen zu einer Aktivierung von MAP-Kinasen, insbesondere der p38- und p42/44-MAPKinasen, unter hyperosmolaren Bedingungen kommt 48, 52.
Mitogen-activated-Proteinkinasen (MAP-Kinasen) sind kleine Proteine mit einer mittleren
Molekülmasse um 36.000–44.000 Dalton, die andere Proteine an spezifischen Threonin- bzw.
Serin-Resten phosphorylieren und somit mehrstufige Signaltransduktionswege regulieren 83, 84.
Unter anderem erfolgt über diese Transduktionswege eine Regulation der Embryogenese, der
Zelldifferenzierung, des Zellwachstums und des programmierten Zelltods.
Die Aktivierung der Makrophagen und Monozyten scheint durch LPS über CD14 und TLR
mittels dem MAP-Kinase-System vermittelt zu sein 85. Hervorzuheben ist hier die p38-MAPKinase, die im Nukleolus sowie im Zytoplasma aktivierter Zellen vorkommt. Eine Aktivierung
der Zelle kommt durch die duale Phosphorylierung an Threonin Thr-180 und Tyrosin Tyr-182
zustande und wird u. a. durch hyperosmolaren Stress getriggert, mit dem Resultat einer
Aktivierung der p38-MAP-Kinase, gefolgt von Zytokinen wie IL-1ß, TNFα und NF-κb86 . Unter
62
hyperosmolaren Bedingungen kommt es zu einer Phosphorylierung von Proteinen, u. a. der p38 MAP-Kinasen 43, 87,31.
In einer der ersten Studien, die den Signalkaskadenweg der p38-MAP-Kinase und der
Proteinkinase C untersuchte, zeigten Shanmugam et al. nach der Exposition mit erhöhten
Glukosekonzentrationen zu Endothelzellen und Monozyten, dass es zu einer Steigerung der
TNF-α-Konzentration kam und diese über die p38-MAP-Kinase und die Proteinkinase C
vermittelt wurde 40. Devaraj et al. wiesen die Proteinkinase-C-vermittelte Zytokinproduktion der
PBMC nach 41. Dasu et al. 43 zeigten wie Shanmugam et al. eine Induktion der
Zytokinfreisetzung von IL-1 nach Exposition mit steigender Glukosekonzentration, eine
Aktivierung der Proteinkinase C-alpha durch Phosphorylierung von p38 sowie eine Stimulation
von NF-κb durch Phosphorylierung von ERK 1/2. Dies führte insgesamt zu einer Zunahme der
IL-1-ß-mRNA-Expression. Weitere beobachtete Mechanismen waren die durch NADPHOxidase vermittelte p-47-phox-Aktivierung von NF-κb und die resultierende Verstärkung der
IL-1ß-Sekretion 43. Igarashi et al.39 zeigten unter diabetischen Bedingungen in VSMC (vascular
smooth muscle cells) der Rattenaorta eine gesteigerte MAP-Kinase-Aktivierung, hauptsächlich
der ERK und p38-MAP-Kinase 39. Im Rahmen einer Studie von CAPD-Patienten (continuous
ambulatory peritoneal dialysis) konnte weiterhin in von diesen Patienten kultivierten humanen
HPMC (peritonealen Mesothelialzellen), die konstant einer erhöhten Glukosekonzentration
aufgrund des Peritonealdialysates ausgesetzt sind, eine Aktivierung des p38-MAP-KinaseSignalwegs nachgewiesen werden 88.
In einem Tierversuch konnten Sherry et al. die LPS-induzierte TNF-α-Produktion peritonealer
Makrophagen durch Blockierung der p38-MAP-Kinase bei diabetischen Mäusen inhibieren 89.
Durch Applikation eines p38-Inhibitors wurde in humanen Lungenmakrophagen und Monozyten
die Expression von TNF-α und teilweise von IL-8 unterdrückt 90. Hervorzuheben ist weiterhin
die unterschiedliche Auswirkung auf Aktivierung, Inhibition und Expression der einzelnen
Zytokine sowie MAP-Kinasen, abhängig vom Zelltypus. So wurden z. B. zwischen
Makrophagen oder Monozyten Unterschiede in der Aktivierung der MAP-Kinasen und der
resultierenden Zytokinexpression gemessen 91.
Lee et al.92 zeigten, dass die Substanz SB203580 (MAPK-Inhibitor) spezifisch an p38-MAPK
bindet und diese inaktiviert. Yamakawa et al. bestätigten diese Ergebnisse, indem sie die durch
LPS getriggerte Phosphorylierung von p42/44-MAPK und p38-MAPK nachwiesen und belegten,
dass die Zugabe von SB 203580 zu VSMC von Ratten (vascular smooth muscle cells) die
Induktion von TNF-α hemmt 93.
63
Die Addition von Glukose und dem p38-MAP-Kinase-Inhibitor SB 203580 zu PBMC erbrachte
in den vorliegenden Experimenten eine deutliche Abnahme der Zytokinproduktion im Vergleich
zu den nur mit Glukose inkubierten Proben. Dies konnte sowohl für IL-1ß als auch für IL-6
nachgewiesen werden. Die Zugabe des mTOR-Inhibitors Rapamycin zu den Zellen versetzt mit
Glukose zeigte im Vergleich zu den nur mit Glukose inkubierten Proben ebenfalls eine
Verminderung der Zytokinfreisetzung. Dieser Abfall war jedoch nicht so ausgeprägt wie nach
Blockade von p38. Immunhistochemisch zeigten wir in unserer Arbeit eine Intensitätssteigerung
der p38-MAP-Kinasenexpression durch LPS-Stimulation und steigende Glukosekonzentration
mit konsekutiver Erhöhung der Osmolarität. Dies belegt die zentrale Rolle der MAP-Kinase p38
in der Zytokinexpression und die aus ihrer Inhibition resultierende deutlich ausgeprägte
Einschränkung der Zytokinsynthese. Nishikawa et al. wiesen weiterhin eine erhöhte Aktivität der
Proteinkinase C unter hyperglykämischen Bedingungen nach 94. Weitere in vivo- sowie in vitroStudien bestätigten die Aktivierung der Proteinkinase C unter diabetischen Bedingungen 95, 96.
Eine weitere Studie von Wiliams et al. untersuchte mögliche pathogenetische Mechanismen
glomerulärer hämodynamischer Veränderungen, die eine Rolle in der Entwicklung diabetischer
Glomerulopathien spielen. Sie zeigten anhand von kultivierten glomerulären Mesangialzellen
eine Erhöhung der Proteinkinase-C-Aktivität, die spezifisch durch die Zugabe von Glukose
erzielt wurde. Eine Addition von L-Glukose und/oder Mannitol konnte dies in der beschriebenen
Versuchsreihe nicht hervorrufen 97.
Der Zusatz eines Proteinkinase-C-beta-Inhibitors in unserer Versuchsreihe konnte keine
Abnahme der Zytokinausscheidung in humanen PBMC nachweisen: Die Zytokinproduktion
wurde nicht unterdrückt, sondern eher nach der Beimischung von Glukose verstärkt. Ohne die
zusätzliche Zugabe von Glukose zeigten sich kaum Unterschiede zu den Proben, die mit oder
ohne Zusatz des Proteinkinase-C-Inhibitors inkubiert wurden.
Nicht nur unter hyperglykämischen Bedingungen konnte eine Aktivierung der p38-MAP-Kinase
nachgewiesen werden. In Studien, die durch die Ergänzung von Substanzen wie Mannitol oder
NaCl-Lösungen Veränderungen der Osmolarität erzielten, wurde ebenfalls eine Aktivierung der
MAP-Kinasen beobachtet. In kultivierten Säugetierzellen war ein Anstieg der p38-MAP-Kinase
nach
Veränderung
des
osmotischen
Milieus
nachweisbar 81.
Die
Induktion
von
hyperosmotischem Stress zur Evaluierung der mRNA-Expression sowie zur Quantifizierung der
Synthese
von
proinflammatorischen
Zytokinen
frisch
isolierter
humaner
peripherer
Blutmonozyten in vitro wurde von Shapiro und Dinarello 52 untersucht. Hier zeigte sich unter
isoosmolaren/euglykämischen
Bedingungen
kein
Nachweis
einer
gesteigerten
IL-8-
64
Genexpression. Ganz im Gegensatz hierzu kam es im hyperosmolaren Milieu (330–410
mOsmol/l), bedingt durch die Zugabe von NaCl-Lösungen zum Kulturmedium, zu einer
Erhöhung der Genexpression für IL-1α, IL-1β und IL-8 der humanen PBMC. Zu
berücksichtigen ist weiterhin, dass Standard-Zellkulturmedien verglichen mit humanem Plasma
(280–295 mOsmol/l) eher hyperosmotisch (305 mOsmol/l) sind. Dieser Versuch demonstriert
auch, dass eine Reduktion der Osmolarität in das normophysiologische Milieu mit einer
50%igen Abnahme der IL-8-Synthese einhergeht 52. Veränderungen des osmotischen Milieus in
hypoosmotischen Bereichen führen auch zu einer Änderung der MAP-Kinasen-Aktivität 98.
Beobachtungen an renalen Epithelialzellen ergaben, dass durch eine Umstellung der Osmolarität
in hypoosmolare Bereiche eine rasche, maximal sechs Minuten andauernde Zellschwellung folgt,
die nach wenigen Minuten durch RVD (regulatory volume decrease) bereits reversibel ist, und
dass es somit kurzzeitig zu einer Modulation der Membranoberflächenspannung kommt. Dies
führt u. a. zu Änderungen von Zelloberflächenrezeptoren 98,
99
sowie zur Aktivierung von
intrazellulären Signalkaskaden, wie p38, EKR 1/2. Die Senkung der physiologischen IsoOsmoralität von 225 mOsmol/l auf hypoosmolare Werte um 135 mOsmol/l führte in einer Studie
von Taruno et al. 100 zu einer Erhöhung der Phosphorylierung und somit zum Anstieg der MAPKinase-Aktivität von ERK 1/2 und JNK/SAPK, aber nicht von p38 100. Sadoshima et al. zeigten,
dass nicht die Hyperosmolarität allein, sondern auch eine Hypotonizität im Zellmedium zu einer
Anregung von ERK und JNK, aber nicht zur Aktivierung der p38-MAP-Kinase in
Kardiomyozyten führte 101.
Chlorpromazin – ein Phenothiazid-Derivat – generiert ähnlich wie hypoosmolare Bedingungen
eine Zellmembrandeformation durch Zellschwellung. Niisato et al. machten sich diesen Effekt in
ihren Versuchen zunutze und zeigten, dass es wie bei der Senkung der physiologischen
Osmolarität unter der Gabe von Chlorpromazin zu einer Aktivierung von MAP-Kinasen, auch
der p38-MAP-Kinase, durch Zellschwellung und nicht unbedingt direkt durch eine Änderung der
Osmolarität kam 102.
In diesem Kontext wurden in unserem Versuchsaufbau frisch isolierte humane PBMC mit
Harnstoff inkubiert. Durch die Beimischung von Harnstoff zu den PBMC kam es zu einer
Steigerung der Osmolarität, jedoch zu kaum einer Veränderung der Tonizität. Hieraus resultierte
eine signifikante dosisabhängie Zytokinproduktion. Zusammenfassend besteht hier also ein
ausgeprägter Unterschied zwischen Hypotonizität und hyperosmolarem Stress, wobei es über
beide Wege zu einer Aktivierung der Signalkaskaden durch direkte und indirekte Mechanismen,
wie u. a. Zellschwellung, kommen kann.
65
4.5
Klinische Studien zur intensivierten Insulintherapie
Wie bereits erwähnt, belegte eine große prospektive randomisierte Studie bereits 2001 mit
insgesamt 1.548 erwachsenen Patienten einer chirurgischen Intensivstation, dass eine
intensivierte Insulintherapie (IIT) mit Zielblutzuckerwerten zwischen 80 und 110 mg/dl im
Vergleich zu einer konventionellen Insulintherapie mit Zielblutzuckerwerten zwischen 180 und
200 mg/dl die Mortalität während des Intensivstationsaufenthalts von 8 % auf 4,6 % senkte und
die Mortalität von 20,2 % auf 10,6 % bei einer Verweildauer länger als fünf Tage 103.
In der NICE-Sugar-Studie wurden zwischen 2004 und 2008 insgesamt 6.104 Patienten
eingeschlossen und randomisiert: 3.054 erhielten eine engmaschige Blutzuckerkontrolle mit
Blutzuckerzielwerten zwischen 81 und 108 mg/dl (4,5–6,0 mmol/l) und 3.050 eine
konventionelle Blutzuckerkontrolle mit Blutzuckerzielwerten ≤ 180 mg/dl (≤ 8,0 mmol/l)104.
Zusammenfassend zeigte sich in dieser randomisierten multizentrischen Interventionsstudie, im
Gegensatz zu den ursprünglichen Erstbeobachtungen der Arbeitsgruppe um van den Berghe et
al. 29, 78, nicht nur ein fehlender Vorteil für die engmaschige Glukosekontrolle und Einstellung
(häufig als intensivierte Insulintherapie bezeichnet), sondern sogar eine Erhöhung der Mortalität
(siehe Tabelle 4.1).
Studie & Autor
Patientenanzahl
Ergebnis
Van den Berghe et al. (2001)29 1.548 Patienten
IIT verbessert Mortalität und Morbidität
Van den Berghe et al. (2006)34 1.200 Patienten
IIT verbessert Morbidität, Mortalität wird
nicht signifikant verbessert
NICE Sugar (2009)104
6.104 Patienten
IIT erhöht Mortalität
Tabelle 4.1: Studienübersicht der Intensivierten Insulintherapie (IIT) mit Auswirkung auf
Morbidität und Mortalität
Hierbei stellt sich die Frage, warum es bei dieser Patientenpopulation zu einer Erhöhung der
Mortalität kam. Die Hauptrisiken und - Nebenwirkungen der Insulintherapie sind
Hypoglykämien. Diese traten in der NICE-Sugar-Studie unter der IIT bei 206 von 3.016 Patienten (6,8 %) und unter konventioneller Blutzuckereinstellung bei 15 von 3.014 Patienten (0,5 %)
auf. Schwerste Hypoglykämien wurden definiert als Blutzuckerwerte unter 40 mg/dl. Folgen
hiervon sind Störungen des ZNS, hypoxische Hirnschädigungen, Schlaganfälle und
Herzrhythmusstörungen. Symptome der Hypoglykämie können bei intensivtherapiepflichtigen
66
Patienten teilweise aufgrund der Begleiterkrankungen oder Behandlungen, wie Analgosedation
oder maschinelle Beatmung, maskiert sein. In der Originalarbeit von van den Berghe et al. waren
insgesamt 39 Patienten hypoglykämisch und nur zwei von ihnen (5,2 %) zeigten physiologisch
korrespondierende Zeichen einer Hypoglykämie wie Schwitzen und Agitiertheit 29. Keiner der
Patienten hatte neurologische Defizite. In der Folgestudie aus dem Jahr 2006 hatten 111
Patienten (18,7 %) unter der IIT je eine Episode von hypoglykämischen Beschwerden, jedoch
ohne schädliche Folgen 34. Patienten mit akutem Nierenversagen und Dialysepflicht zeigten in
dieser Gruppe einen unabhängigen Risikofaktor für die Entwicklung von Hypoglykämien. Am
ehesten wurde hierfür der zu 30 % stattfindende Insulinmetabolismus über die Niere verantwortlich gemacht.
In einer Metaanalyse von Griesdale et al. wurden 26 Studien mit insgesamt 13.567 Patienten
untersucht. In dieser Analyse zeigte sich ein erhöhtes Risiko für Hypoglykämien; weiterhin
konnten die positiven Auswirkungen der IIT auf die Mortalität internistischer intensivpflichtiger
Patienten nicht nachvollzogen werden 105. Arabi et al. beobachteten bei einer Patientenpopulation
von 523 Patienten, dass durch die intensivierte Insulintherapie mit Zielblutzuckerwerten
zwischen 80 und 110 mg/dl vs. konventionelle Intensivtherapie mit Zielblutzuckerwerten
zwischen 180 und 200 mg/dl häufiger Hypoglykämien eintraten, und folgerten daraus, dass
deshalb die IIT nicht zu empfehlen sei 106. Zusammenfassend sind die kontroversen Daten der
NICE-Sugar-Studie am ehesten als Folge der durch die intensivierte Insulintherapie verursachten
Hypoglykämien und deren schädlichen Auswirkungen zu erklären.
4.6
Oxidativer Burst und Phagozytose – die nicht adaptive Immunabwehr
der Granulozyten und Makrophagen
Die Funktion der neutrophilen Granulozyten lässt sich im Ablauf der Infektionsabwehr in
folgende Schritte einteilen: Adhäsion am Endothel, chemotaktische Migration, Phagozytose,
Bereitstellung abbauender Enzyme sowie reaktiver Sauerstoff-Verbindungen (reactive oxygen
species, ROS) und Abtöten von in den Körper eingedrungenen Erregern 107.
Der Prozess der Phagozytose beinhaltet folgende Schritte:
1. Erkennen und Anhaften der Phagozyten am jeweiligen Mikroorganismus,
2. Aufnahme in eine Vakuole (Phagozytose) sowie
3. Abtöten und Abbau der phagozytierten Substanz.
67
Die Adhäsion der Leukozyten an den Endothelzellen gelingt erst durch die Expression der
Adhäsionsmoleküle auf der Zelloberfläche, die durch bakterielles Antigen, wie Lipopolysaccharide, oder durch Zytokine, wie IL-1α, IL-1β oder TNF-α, angeregt werden 108, 109. Das Erkennen
der mikrobiellen molekularen Muster auf den Zelloberflächen der Erreger geschieht durch EPRR
(endocytic pattern-recognition receptors), die für den gegebenen Zelltyp, z. B. Makrophagen,
spezifisch sind, oder über Toll-like-Rezeptoren (TLR) 110. Werden durch die EPRR bakterielle
Antigenmuster erkannt, folgt die Endozytose und Aufnahme der Bakterien in die Lysosomen.
Die resultierenden Proteinreste werden prozessiert und mittels MHC-Molekülen an der
Oberfläche des Makrophagen an T-Zellen präsentiert. Die TLR lösen über einen anderen Mechanismus die Immunantwort auf die Erkennung der pathogenen Antigene aus. Die Aktivierung von
TLR-4 durch Lipopolysaccharide stimuliert die Expression von proinflammatorischen Zytokinen
und weiteren kostimulatorischen Molekülen, die für die Immunantwort essenziell sind.
Wie in unseren Versuchen gezeigt, kommt es durch eine Erhöhung der Osmolarität sowie unter
hyperglykämischen
Bedingungen
zu
einer
vermehrten
Zytokinfreisetzung.
Unter
hyperglykämischen Konditionen sowie bei inadäquat eingestelltem Diabetes mellitus scheint es
auch zu Veränderungen der phagozytotischen Aktivität zu kommen. Klinische Studien zeigen
eine direkte Korrelation zwischen der diabetologischen Einstellung und der phagozytotischen
Aktivität von polymorphonukleären (PMN) Zellen. Erhöhte Blutzuckerwerte von schlecht
eingestellten Diabetikern gehen mit einer deutlich eingeschränkten phagozytotischen Aktivität
einher 111. Diese Ergebnisse werden in diversen Tiermodellen bestätigt. In der bereits erwähnten
Studie an einem Hasenmodell 50, die sich in einer iatrogenen diabetischen Stoffwechsellage
befanden
und
eine
30%ige
Körperoberflächenverbrennung
aufwiesen,
erfolgte
eine
Randomisierung in zwei Gruppen: in eine mit Insulinbehandlung zur Erhaltung der Euglykämie
und eine ohne Insulintherapie mit hyperglykämischer Stoffwechsellage als Vergleichsgruppe.
Nicht nur die Zytokinsynthese wurde hier untersucht, sondern auch Teile des angeborenen
Immunsystems. In der normoglykämischen Gruppe verbesserte sich die phagozytotische
Aktivität um 150 %. Der oxidative Burst verdoppelte sich. Nielson und Hindson 61 konnten in
ihren in vitro Untersuchungen eine Abnahme der PMN-Funktion gesunder Probanden bereits
nach einer 30-minütigen Inkubations in einem Glukosemedium größer als 200 mg/dl
(= 11 mmol/l und 56 mmol/l) nachweisen. Hierbei war die Wahl des Stimulus ohne
Auswirkungen auf die phagozytotische Aktivität. Die Wahl des Mediums jedoch, unabhängig ob
L- oder D-Glukose, spielte keine Rolle, da beide gleichwertige Ergebnisse erzielten. Nur die
Zugabe von Mannitol zu den Proben konnte keine Veränderungen der phagozytotischen
68
Aktivität herbeiführen. Auch hier wurde, wie in der Studie von Marhoeffer111, als mögliche
Ursache eine Glykolisierung der Proteine aufgrund der hyperglykämischen Bedingungen
gesehen. Liberek et al. 63 wiesen jedoch auch durch die Modifikation der Osmolarität mit anderen
Substanzen als Glukose einen erheblichen Effekt auf Änderungen der phagozytotischen Aktivität
nach.
Dementsprechend verdeutlichen weitere Studien 49, 112, 113, dass nicht nur die Hyperglykämie an
sich, sondern auch die Veränderungen der Osmolarität einen Einfluss auf die PMN-Funktion
ausüben.
Unsere Daten zeigten unter hyperglykämischen Bedingungen bei der Addition von 500 mg/dl
Glukose entsprechend einer Osmolarität von 309 mOsmol/l eine statistisch signifikante
Abnahme der phagozytotischen Aktivität. Dieser Effekt konnte ebenfalls durch Beimischung
von 500 mg/dl Mannitol entsprechend derselben Osmolarität von 309 mOsmol/l erzielt werden.
Hervorzuheben ist, dass es bei der Zugabe von Glukose einen deutlichen Trend zu einer
stärkeren Depression der phagozytotischen Aktivität gab. Die Untersuchungen des oxidativen
Bursts ergaben ähnliche Ergebnisse. Durch Zusatz von 500 mg/dl Glukose (= 309 mOsmol/l)
konnte ein statistisch signifikanter Abfall des oxidativen Bursts nachgewiesen werden, sowohl
unter dem primären Stimulus PMA als auch nach der Inkubation mit E. coli. Die Zugabe von
500 mg/dl Mannitol (309 mOsmol/l) ergab erneut eine Reduktion des oxidativen Bursts,
wiederum geringer als bei der isolierten Beimischung von Glukose.
Zusammenfassend lässt sich aus unseren Daten schließen, dass analog zu unseren Beobachtungen der Zytokinproduktion die Einschränkung der Phagozytose sowie des oxidativen Bursts
einerseits durch eine Erhöhung der Osmolarität bedingt wird, andererseits zu einem geringeren
Anteil jedoch direkt durch die Glukoseaddition vermittelt ist. Diese Effekte scheinen zum
größeren Teil durch Osmolaritätsveränderungen zustande zu kommen und zu einem geringen
Teil aus glukosespezifischen Mechanismen zu resultieren.
Die Abnahme der phagozytotischen Aktivität sowie des oxidativen Bursts kann unterschiedliche
Ursachen haben. Beispielweise können die intrazelluläre Destruktion und die Phagozytose
partiell zumindest durch die Formation von Sauerstoffverbindungen und Radikalen (reactive
oxygen species = ROS) gekennzeichnet sein. Hyperglykämische Stoffwechsellagen wurden in
mehreren Studien mit einer Veränderung der ROS-Formation in Verbindung gebracht 114-116.
Alexiewicz et al. 117 zeigten eine Korrelation zwischen der intrazellulären Kalziumkonzentration
mit der Ausprägung der Hyperglykämie und konsekutiven Folgen für die Phagozytoseaktivität.
Für sie besteht ein glukoseinduzierter Kalziuminflux in die Zelle, der mit einer Erhöhung der
69
Proteinkinase C einhergeht und somit aufgrund des akuten intrazellulären Kalziumanstiegs zu
einer Depletion von Adenosintriphosphat führt, der für die Konformationsänderung der Zelle
während der Phagozytose nötig ist 52, 118. In der Literatur zeigen sich diskrepante Ergebnisse 60, 67
bezüglich der Auswirkung von Glukose und Insulin auf die PMN-Funktion im Vergleich zu
unseren Ergebnissen. Dies lässt sich u. a. den unterschiedlichen Untersuchungsmethoden
zuschreiben, wie der Untersuchung der ROS-Formation und -Produktion.
Es bleibt weiterhin zu hinterfragen, ob die klinischen Studien und unsere in vitro Daten
bezüglich der Auswirkungen der hyperglykämischen und hyperosmolaren Bedingungen auf den
klinischen Verlauf der intensivierten Insulintherapie ausreichend Aufschluss geben. Walrand et
al. 67 führten an acht gesunden Probanden einen in vivo-Versuch durch, bei dem durch Insulinund Glukoseinfusionen über vier Stunden erhöhte Insulinkonzentrationen im Blut und
euglykämische Bedingungen hervorgerufen wurden. Unter den Insulininfusionen zeigte sich eine
Erhöhung der Phagozytoseaktivität und somit ein insgesamt günstigerer Effekt als die direkte
Auswirkung der Insulingabe.
In einer weiteren Studie 60 mit zwölf gesunden Probanden, die sich einem vierstündigen
hyperglykämischen oder hyperinsulinämischen, euglykämischen in vivo Infusionsversuch
unterzogen, zeigten sich keine signifikanten Veränderungen der PMN-Funktion. Eine mögliche
Ursache für diese Diskrepanz könnte die relativ kurze Infusionszeit
bzw. kurze
Hyperglykämiedauer von vier Stunden sein, da diese nicht ausreichend für eine ausgeprägte
Änderung der PMN-Funktion ist. In unseren Kinetikversuchen zeigte sich erst ein signifikanter
Anstieg der Zytokinfreisetzung nach bereits dreistündiger Präinkubation sowie nachfolgender
sechsstündiger Inkubation. Eine Plateauphase der Zytokinproduktion wurde nach zwölf Stunden
erreicht. Eine Messung der Zytokinkonzentration erfolgte deswegen in unserem Versuchsaufbau
erst nach 24 Stunden Inkubation.
4.7
Kritikpunkte der Methodik
Ein Kritikpunkt an der Durchführung dieser Untersuchungen ist u. a. der Gebrauch hoher
Konzentrationen von Glukose zwischen 500 und 1.000 mg/dl für den Nachweis von
Veränderungen in der Zytokinproduktion. Es handelt sich in unserer Versuchsreihe um in vitro
Daten, wobei in diesem Kontext hohe Konzentrationen tolerabel sind, um einen erzielten Effekt
eindeutig
nachweisen
zu
können.
Die
initial
unphysiologisch
scheinenden
hohen
70
Glukosekonzentrationen sind umgerechnet in die entsprechende Osmolarität durchaus
nachvollziehbare Werte in unserem klinischen Alltag.
Aufgrund der Versuchsbedingungen, der erhöhten Osmolarität und Glukosekonzentrationen
ließe sich eine Beeinflussung der Zellvitalität und entsprechenden Zytokinproduktion
postulieren. Die Zytokinfreisetzung wäre somit als Folge eines toxischen Zelluntergangs zu
werten. Zytokine werden nicht gespeichert, sondern durch die bereits beschriebenen
Pathomechanismen nach vorausgegangenem Stimulus neu synthetisiert 119-121, 85. Zytokinfreisetzende Zellen sind somit insofern als vitale Zellen einzuschätzen, als sie in der Lage sind,
die energieintensiven Prozesse der Proteinbiosynthese aufrechtzuerhalten.
Des Weiteren zeigen sich in dieser Arbeit eine Variabilität der unterschiedlichen IL-1ß-und IL-6Ausschüttungen unter den gleichen Versuchsbedingungen und -durchführungen. Mögliche
Ursachen hierfür wären Unterschiede der einzelnen gesunden Spender in Bezug auf Gender,
Hormone, tageszeitliche Abnahmeunterschiede sowie die im Laufe der Versuchsreihe genutzten
LPS-Chargen.
Die unterschiedlichsten Zelllinien von Menschen und Tieren führten unter erhöhten
Glukosekonzentrationen zu einer nachweislichen Erhöhung der Zytokinproduktion. Die
Mehrzahl der Studien nutzte Zelllinien. Nur die Minderheit der Daten wurde an frisch isolierten
humanen Immunzellen generiert. Unsere Daten wurden von frisch isolierten humanen PBMC
gewonnen, die aufgrund der Vermeidung der künstlichen Kondition der Zellkultur und der
Lagerung qualitativ überlegen sind und aufgrund ihrer Differenzierung geeignete Rückschlüsse
auf die in vivo Situation erlauben.
Die immunhistochemische Untersuchung evaluierte nur die p38-Färbung zweier Probanden nach
Glukosexposition und LPS-Stimulation. Die Beteiligung der p38-MAP-Kinase in der
Zytokinexpression wurde in den Versuchen durch die Zugabe des MAP-Kinase-Inhibitors
SB 203580 gezeigt. Für eine ergänzende qualitative Aussage ist
somit auch die
Immunhistochemie von nur zwei Probanden tolerabel.
Ohne Zugabe des Lipopolysaccharids konnte die Zytokinfreisetzung nicht ausreichend quantifiziert werden. Es wurde ein zweiter Stimulus nach der Zugabe von Glukose oder den anderen
hyperosmolaren Medien als Sensitizer benötigt. Schindler et al. zufolge setzen nicht stimulierte
PBMC keine nachweislich messbaren Konzentrationen von IL-1ß frei. Nach LPS-Stimulation
konnten signifikante Konzentrationen von IL-ß nachgewiesen werden. Ähnliche Effekte konnten
71
durch Addition des Komplementfaktors rC5a erzielt werden, der als Sensitizer bzw. Induktor für
die Zytokinfreisetzung von IL-1 fungierte 122.
In unserem Versuchsaufbau erfolgte die Isolation frischer humaner PBMC von gesunden
Normprobanden sowie eine konsekutive in vitro Stimulation mit Lipopolysaccharid und
Kultivierung der Zellen. Auf die Untersuchung frisch isolierter PBMC septischer Patienten
wurde aus folgendem Grund verzichtet: In von uns durchgeführten Vorversuchen an septischen
Patienten der internistischen Intensivstation zeigten sich bereits in der Isolation der PBMC
erhebliche Schwankungen an Zellmenge und -konzentrationen. Nach Stimulation mit LPS sowie
Messung der Zytokinkonzentrationen ergaben sich äußerst diskrepante Befunde. Der Zeitpunkt
bzw. die Dauer der septischen Episode konnte zum Zeitpunkt der Blutuntersuchung bei den
meisten Patienten nicht genau festgestellt werden und somit ergaben sich auch hier bereits erste
Abweichungen. Der Schweregrad sowie der Fokus des septischen Geschehens waren
unterschiedlich. Einige Patienten befanden sich bereits in der Phase der möglichen
Immunparalyse. Die Zytokinbestimmung war unter den in vivo Bedingungen vielen Störfaktoren
ausgesetzt (Erreger, Dauer der Sepsis, Medikamentenwirkungen, -nebenwirkung etc.). Daher
wäre eine Untersuchung der hyperglykämischen, hyperosmotischen Bedingungen schwierig zu
interpretieren gewesen, dies gilt auch für die Erfassung der Auswirkungen von Insulin auf die
Veränderungen der Inflammation und Immunantwort, wie die Induktion von pro- oder
antiinflammatorischen Zytokinen, die Produktion von Akute-Phase-Proteinen, die Freisetzung
sekundärer Immunmediatoren, die Veränderungen der Neutrophilenfunktion und Phagozytoseaktivität. Eine Untersuchung der septischen Patientenpopulation wäre anhand von hohen
Einschlusszahlen (n > 100) mit einem sehr hohen Aufwand verbunden, jedoch prinzipiell
möglich.
4.8
Mögliche Auswirkungen der glukoseassozierten Zytokinmodulation bei
anderen Krankheitsbildern
4.8.1
Die
Rolle
der
Hyperglykämie
bei
Arteriosklerose
und
koronaren
Gefäßerkrankungen
Die Veränderung der Osmolarität ist ein entscheidender Mechanismus und hat Konsequenzen
weit über die Auswirkung der Glukose im Sepsismodel hinaus. Sie ist für alle Umstände von
Bedeutung , in denen Hyperosmolarität herrscht, wie z. B. bei akutem Nierenversagen und somit
72
Notwendigkeit der Einleitung einer frühen Dialysebehandlung aus diesen Gründen, der
Arteriosklerose, koronaren Gefäßerkrankung oder z. B. in der parenteralen Ernährung.
Die vorliegenden Daten führen im klinischen Alltag zu einem besseren Verständnis der
Auswirkungen erhöhter Blutzuckerwerte auf assoziierte medizinische Komplikationen durch die
Erkenntnisse der gesteigerten Zytokinfreisetzung und reduzierten phagozytotischen Aktivität
unter hyperglykämischen Bedingungen.
Patienten mit Diabetes mellitus haben ein erhöhtes arteriosklerotisches und kardiovaskuläres
Risiko im Vergleich zu Patienten ohne Diabetes mellitus 123-127. Nach akuten Myokardinfarkten
zeigte sich ein erhöhtes Risiko für die Sterblichkeit stationär behandelter Patienten mit und ohne
Diabetes mellitus 71, 73, 128, 129. In einer Studie der Arbeitsgruppe um Malmberg et al. wurde eine
Verbesserung des Langzeitüberlebens auf 3,5 Jahre durch eine Insulin-Glukose-Infusion mit
subkutanen Insulin-Applikationen zur Einstellung des Blutzuckers bei diabetischen Patienten
nach Myokardinfarkt nachgewiesen sowie eine hiermit verbundene Senkung der Mortalität um
11 % verzeichnet 72. Malmberg et al. belegten in der DIAGMI-Studie (Diabetes mellitus InsulinGlucose Infusion in Acute Myocardial Infarction), dass die Langzeitmortalität von Patienten
durch intensivierte Insulintherapie mit Blutzuckerzielwerten kleiner als 200 mg/dl um 30 % in
einem Zeitraum von 3,5 Jahren gesenkt werden konnte. Dies traf auch auf Patienten mit erhöhten
Blutzuckerwerten und erhöhtem HbA1c zum Zeitpunkt der Krankenhausaufnahme zu 27.
Nach herzchirurgischen Interventionen wiesen Patienten mit hyperglykämischen Blutzuckerwerten eine erhöhte Inzidenz an postoperativen Komplikationen nach 130. Lazar et al.
untersuchten
in
Glukoseeinstellung.
einer
Sie
prospektiven
konnten
Studie
in
der
die
Auswirkungen
Patientengruppe
einer
mit
der
engmaschigen
niedrigeren
Blutzuckereinstellung von 138 ± 4 mg/dl vs. höhere Blutzuckereinstellung von 260 ± 6 mg/dl
eine Abnahme der Häufigkeit von Vorhofflimmern, Ischämien und Wundinfektionen sowie eine
Verbesserung der Überlebensrate um zwei Jahre nach kardiochirurgischer Intervention
nachweisen 131. In einer weiteren Studie zeigten sich nach akuten Myokardinfarkten und
folgendem Nachweis von Stress-Hyperglykämien erhöhte Inflammationslevel durch verstärkte
Expression von T-Zellen und zytotoxischen T-Zellen, die mit einem reduzierten Überleben der
oben genannten Patientenpopulation assoziiert wurde 73. Hierbei ergab sich eine Assoziation
zwischen akuten Myokardinfarkten, erhöhten Blutzuckerspiegeln und einer Erhöhung von Creaktivem Protein (CRP) und dem IL-8-Spiegel im Serum 73.
73
In einem Rattenmodell wurde nach intravenöser Applikation von LPS und somit Induktion einer
systemischen Entzündung die Herzfunktion untersucht 132. Zu verzeichnen war eine ausgeprägte
Verschlechterung der kardialen Funktion unter hyperglykämischen Blutzuckerwerten, die sich
durch die Zugabe von Insulin deutlich besserte 132. Kado et al. zeigten eine Assoziation zwischen
hyperglykämischen Bedingungen bei Diabetikern mit erhöhten zirkulierenden Spiegeln von IL-6
und folglich einer Erhöhung von Fibrinogen, das ein bekannter Risikofaktor der Arteriosklerose
ist 133.
4.8.2 Einfluss der Hyperglykämie auf das akute Nierenversagen
Unter klinischen Bedingungen spielt die Hyperglykämie insbesondere in Hinblick auf die
Entwicklung eines akuten Nierenversagens bei Intensivpatienten sowie bei der chronischen
Niereninsuffizienz eine bedeutende Rolle. Wie bereits in der Studie von Vanhorebeek et al.
erwähnt, zeigte sich unter hyperglykämischen Bedingungen im Tiermodell eine Einschränkung
der Nierenfunktion. Die Applikation von Verbrennungswunden bei Hasen simulierte in ihrer
Studie ein Krankheitsbild intensivpflichtiger Patienten. Die Hyperglykämie verursachte in
diesem Versuchsmodell erhöhte Plasmakreatininspiegel und morphologische Veränderungen an
der Niere. Die Kontrollgruppe hingegen zeigte unter normoglykämischen Bedingungen eine
geringere Ausprägung der Schädigung als Hasen unter hyperglykämischen Bedingungen 46.
Die Entwicklung eines akuten Nierenversagens bei intensivpflichtigen Patienten ist eine häufig
gesehene Komplikation in der Intensivmedizin. Patienten mit akutem oder chronischem
Nierenversagen haben erhöhte Morbiditäts- und Mortalitätsraten
134, 135, 136-138
. Etwa 13 % der
amerikanischen Bevölkerung leiden unter einer chronischen Niereninsuffizienz 139. In
Deutschland beträgt die Anzahl der hämodialysepflichtigen Patienten 67.000, etwa 24.000
Patienten sind nierentransplantiert140.
Akutes Nierenversagen aggraviert das Stadium der intensivpflichtigen Patienten und führt
dadurch zu einer Erhöhung der Mortalität 141-143. In einer großen multinationalen Studie hatten
5,7 % der intensivpflichtigen Patienten ein akutes Nierenversagen (ANV). Verteilt über
verschiedene Zentren betrifft dies zwischen 1,4–25,9 % der Patienten auf Intensivstationen 141,
144
. Die Mortalität von Patienten mit akutem Nierenversagen, die ein Nierenersatzverfahren
benötigen und an einer Sepsis leiden, liegt in den USA bei 70 % 145. Durch die RIFLEKlassifikation (Risk of renal dysfunction, Injury to the kidney, Failure of kidney function, Loss
of kidney function and End-stage kidney disease) zur Stadieneinteilung des akuten
74
Nierenversagens 143 zeigte sich eine Korrelation zwischen Krankenhausmortalität, Dauer des
Intensivstationsaufenthalts und des Gesamtkrankenhausaufenthalts 146.
Zwei Komponenten scheinen von essenzieller Bedeutung für die eingeschränkte glomeruläre
Filtrationsrate bei akutem Nierenversagen zu sein:
− die vaskuläre Komponente im Rahmen der Vasokonstriktion und des endothelialen Schadens
und
− die tubuläre Komponente, bestehend aus dem Tubuluszellschaden und der tubulären
Obstruktion.
Insbesondere der proximale Tubulus scheint sehr empfindlich gegenüber dem mitochondrialen
Schaden zu sein 147.
Die Gabe von Insulin zeigte in einigen Studien einen protektiven Effekt auf das vaskuläre
Endothelium und auf (hepatische) Mitochondrien von intensivpflichtigen Patienten 148,
149
. Die
Hälfte aller Patienten mit Nierenversagen hat eine gestörte Glukosetoleranz 150. Krinsley et al.
zeigten eine Reduktion des akuten Nierenversagens von 75 % unter IIT 76. Eine Analyse von
zwei großen randomisierten Studien mit insgesamt 2.707 Patienten zeigte, dass die IIT mit dem
Ziel der Normoglykämie die Nierenfunktion von intensivpflichtigen Patienten schützt. Die
Inzidenz des akuten Nierenversagens wurde von 7,6 % auf 4,5 % sowie die Anwendung von
Nierenersatzverfahren von 7,4 % auf 4 % gesenkt 77.
Eine intensivierte Insulintherapie ist nicht nur im klinischen Kontext von intensivpflichtigen
Patienten relevant, sondern auch für Patienten mit akutem oder chronischem Nierenversagen 75.
75
5
Zusammenfassung
Eine Hyperglykämie ist bei unterschiedlichen Patientengruppen mit einer schlechteren Prognose
verbunden. Erhöhte Glukosewerte korrelieren bei diabetischen, neurologischen, nephrologischen
und kardiologischen Erkrankungen mit einer gesteigerten Morbidität und Mortalität. Auch bei
schwer erkrankten, intensivpflichtigen Patienten ist eine Hyperglykämie ein unabhängiger
Risikofaktor für Mortalität. Demgegenüber senkt eine intensivierte Insulintherapie (IIT) die
Mortalität von Intensivpatienten.
Diese klinischen Beobachtungen führten im Rahmen der vorliegenden Arbeit zur Untersuchung
folgender Fragestellungen:
− Führen hyperglykämische Bedingungen in vitro zu einer Modulation des Immunsystems
bzw. zu veränderten Zellfunktionen von PBMC mit möglicherweise gesteigerter
Prädisposition für Infektionen?
− Führt die Zugabe von Glukose zum PBMC-Zellkulturmedium zu einer Alteration der
Zytokinausschüttung von IL-1ß und IL-6?
− Übt Insulin durch direkte und sekundäre Mechanismen im Rahmen einer Erniedrigung des
Glukosespiegels einen protektiven Effekt auf die Immunantwort aus?
− Welche Auswirkung hat die Veränderung der Osmolarität auf die Immunantwort?
− Beeinflusst die Addition weiterer hyperosmotischer Substanzen, wie Mannitol, Harnstoff
oder das Enantiomer der Glukose, die L-Glukose, zum Zellmedium die Zytokinproduktion ?
− Welche Bedeutung hat der Zusatz aus Glukose und anderen hyperosmotisch wirksamen
Substanzen, wie Mannitol, auf die Phagozytose und den oxidativen Burst?
− Welche Pathomechanismen liegen der Zytokinfreisetzung unter hyperglykämischen und
hyperosmolaren Bedingungen zugrunde und welche Funktionen haben hierbei die MAPKinasen?
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass erhöhte Glukosekonzentrationen die LPS-stimulierte
Zytokinproduktion von humanen PBMC dosisabhängig signifikant steigern. Die Zugabe des
Enantiomers L-Glukose bewirkt eine Zunahme der Zytokinfreisetzung für IL-1ß und IL-6,
allerdings weniger ausgeprägt als bei der physiologisch vorkommenden D-Glukose. Die
Resultate dieser Arbeit belegen, dass die Aktivierung der p38-MAP-Kinase unter hyperglykämischen Bedingungen für die Steuerung der Zytokinfreisetzung verantwortlich ist. Insulin
76
allein führt lediglich zu einer signifikanten Steigerung der IL-1ß-, nicht jedoch der IL-6Produktion, und dies ausschließlich bei höchster Insulinkonzentration. Die Kombination von
Insulin mit Glukose im Zellmedium reduziert die Produktion beider Zytokine signifikant
verglichen mit Glukose allein. Dieser Effekt weist einen protektiven Einfluss von Insulin auf die
Entzündungsreaktion im Rahmen einer reduzierten proinflammatorischen Zytokinausschüttung
durch Senkung der Hyperglykämie im Zellmilieu nach.
Weitere Versuche belegten, dass die Zugabe von Mannitol und Harnstoff zum Zellmedium
ebenfalls eine Steigerung der Zytokinproduktion hervorruft. Es zeigte sich allerdings, dass bei
gleicher Osmolarität im Zellmedium, abhängig von der jeweils hinzugefügten Substanz, die
Zytokinfreisetzung unterschiedlich ausgeprägt war. Die Zytokinausschüttung erzielte unter
Glukosezugabe im Vergleich zu den anderen Substanzen die höchste Wirkung. Gemeinsamer
Mechanismus für die zytokinsteigernden Effekte scheint also die Steigerung der Osmolarität zu
sein.
In Vollblutproben bewirkt die Addition von Glukose eine Suppression der Phagozytose und des
oxidativen Bursts. Dieser Effekt war nicht spezifisch für Glukose, da die Zugabe von Mannitol
ebenfalls zu einer Abnahme der Phagozytose und des oxidativen Bursts führt, wenn auch in
geringerem Ausmaß als nach Glukosebeimischung. Demzufolge bewirken hyperglykämische
Bedingungen eine weitere Einschränkung der Immunantwort.
Eine Übertragung dieser Laborergebnisse auf die klinische Situation von Intensivpatienten lässt
folgende Hypothese zu: Hyperglykämie führt bei intensivpflichtigen Patienten zu einer
Stimulation von IL-1ß und IL-6 sowie zu einer Erniedrigung der Phagozytose und des oxidativen
Bursts. Dies könnte zu einer gesteigerten Prädisposition für Infektionen in dieser
Patientenpopulation führen. Unter der IIT bzw. bei Aufrechterhaltung der Normoglykämie im
Patientenblut kommt es zu einer Verbesserung bzw. Normalisierung der Immunantwort. Die
Daten dieser Arbeit bieten eine Erklärung für die Assoziation zwischen IIT und Mortalität bei
intensivpflichtigen Patienten.
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88
7
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei all denen Bedanken, die mich bei der Anfertigung dieser
Arbeit unterstützt haben.
Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Betreuer und Doktorvater Herrn Prof. Dr. med. Ralf
Schindler für die Bereitstellung dieser Arbeit. Danke für die Ruhe, Unterstützung,
Diskussionsbereitschaft und Geduld bei der Verwirklichung dieser Dissertation.
Besonderer Dank geht an Wolfgang Böhmerle, Christian Storm und Jan Hendrik Roosen für Ihre
stetige Hilfsbereitschaft, gute Laune, Ermutigungen und Bereitschaft ohne Scheu jeglicher
Mühen und Strapazen mir während der vergangenen Jahre zur Seite zu stehen.
Zudem möchte ich mich bei den Mitgliedern der Arbeitsgruppe, insbesondere bei Adelheid
Wilde und Daniel Zickler für Ihre Hilfsbereitschaft während meiner Laborarbeit bedanken.
Ich danke meinen Eltern und meinen Geschwistern, Jill und Philip Otto, für Ihre Unterstützung
und Zuneigung, die es mir ermöglicht haben mein Ziel zu erreichen.
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Erklärung an Eides Statt
„Ich, Natalie Maureen Otto, erkläre, dass ich die vorgelegte Dissertation mit dem Thema:
Auswirkung von Hyperglykämie und Osmolarität auf die Zytokinproduktion und Phagozytose
von mononukleären Zellen aus peripherem Blut, selbst verfasst und keine anderen als die
angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt, ohne die (unzulässige) Hilfe Dritter verfasst und
auch in Teilen keine Kopien anderer Arbeiten dargestellt habe.“
Datum
Unterschrift
90
9
Lebenslauf
“Mein Lebenslauf wird aus datenschutzrechtlichen Gründen in der elektronischen Version
meiner Arbeit nicht veröffentlicht.”
91
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Thank you for your participation!

* Your assessment is very important for improving the work of artificial intelligence, which forms the content of this project

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