Dokument 1 - Zur Giessener Elektronischen Bibliothek

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édition scientifique
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
STAUFENBERGRING 15
D-35396 GIESSEN
Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890
[email protected]
9
www.doktorverlag.de
ISBN: 978-3-8359-5924-8
7 8 3 8 3 5
DANIELA KLAUS
FLÜSSIGKONSERVIERUNG VON CANINEM SPERMA
EVALUIERUNG VERSCHIEDENER VERDÜNNER
ZUR FLÜSSIGKONSERVIERUNG
VON CANINEM SPERMA
DANIELA KLAUS
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet.
beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen
9 5 9 2 4 8
édition scientifique
Cover photo front: © biglama; cover photo back: © Kitty - Fotolia.com
VVB
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
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Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors
oder des Verlages unzulässig. Das gilt insbesondere für
Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen
und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch
elektronische Systeme.
1. Auflage 2012
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reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted,
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photocopying, recording, or otherwise, without the prior
written permission of the Author or the Publishers.
1st Edition 2012
© 2012 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen
Printed in Germany
édition scientifique
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN
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email: [email protected]
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Aus dem Klinikum Veterinärmedizin, Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und
Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz
der Justus-Liebig-Universität Gießen
Betreuer: Prof. Dr. A. Wehrend
EVALUIERUNG VERSCHIEDENER VERDÜNNER
ZUR FLÜSSIGKONSERVIERUNG
VON CANINEM SPERMA
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Dr. med. vet.
beim Fachbereich Veterinärmedizin
der Justus-Liebig-Universität Gießen
eingereicht von
Daniela Klaus
Tierärztin aus Weinheim
Gießen 2012
Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin
der Justus-Liebig-Universität Gießen
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h.c. Martin Kramer
Gutachter:
Prof. Dr. A. Wehrend
Prof. Dr. M. Bergmann
Tag der Disputation:
06.07.2012
Meinen Eltern
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits in Form von zwei Abstracts
auf der „44. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung“,
gleichzeitig
„36.
Veterinär-Humanmedizinische
Gemeinschaftstagung“
vom
16. - 18. Februar 2011 in Hannover
und dem „57. Jahreskongress der Deutschen Gesellschaft für Kleintiermedizin
(DGK-DVG)“ vom 10. - 13. November 2011 in Berlin publiziert:
Klaus, D., Wehrend, A., Goericke-Pesch, S. (2011)
Comparison of two different extenders for chilling of canine semen
Reprod. Dom. Anim. 46, Suppl. 1, 23 [Abstract]
Goericke-Pesch, S., Klaus, D., Wehrend, A. (2011)
Vergleich zweier verschiedener Verdünner zur Flüssigkonservierung von caninem
Sperma
in: Proceedings des 57. Jahreskongresses der Deutschen Gesellschaft für
Kleintiermedizin (DGK-DVG); Berlin, 2011; 368-369 [Abstract]
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung und Fragestellung ............................................................................1
2
Literatur................................................................................................................3
2.1 Bedeutung der künstlichen Besamung für die Hundezucht .........................3
2.1.1 Vor- und Nachteile .............................................................................3
2.1.2 Technik der Samenübertragung ........................................................6
2.1.3 Besamungsdosis ...............................................................................9
2.1.4 Erfolgsraten .......................................................................................9
2.2 Gewinnung des Ejakulates.........................................................................12
2.2.1 Indikationen für die Spermagewinnung ...........................................12
2.2.2 Voraussetzungen und Methoden ....................................................12
2.3 Spermauntersuchung .................................................................................15
2.3.1 Konventionelle Spermauntersuchung .............................................16
2.3.1.1 Makroskopische Untersuchung ..........................................16
2.3.1.2 Chemisch-physikalische Untersuchung .............................18
2.3.1.3 Mikroskopische Untersuchung ...........................................18
2.3.2 Hypoosmotischer Schwelltest (HOS-Test) ......................................23
2.3.3 Computer-assisted sperm analysis (CASA) ....................................25
2.3.3.1 Konzentrationsbestimmung ................................................28
2.3.3.2 Motilitätsanalyse .................................................................29
2.3.3.3 Viabilitätsanalyse ................................................................32
2.4 Spermakonservierung ................................................................................33
2.4.1 Flüssigkonservierung.......................................................................35
2.4.1.1 Herstellung von flüssigkonserviertem Sperma ...................36
2.4.1.2 Lagerung bzw. Versand ......................................................37
2.4.1.3 Überlebensdauer ................................................................39
2.4.2 Kryokonservierung...........................................................................42
2.4.3 Vergleich von Flüssig- und Kryokonservierung ...............................44
2.5 Verdünner zur Flüssigkonservierung von caninem Sperma ......................46
2.5.1 Anforderungen an einen Verdünner ................................................46
2.5.2 Inhaltsstoffe .....................................................................................48
2.5.2.1 Zuckerkomponenten ...........................................................48
2.5.2.2 Puffer ..................................................................................50
2.5.2.3 Membranprotektiva .............................................................51
Inhaltsverzeichnis
2.5.2.3.1 Eigelb ...................................................................53
2.5.2.3.2 Milch ....................................................................56
2.5.2.4 Kryoprotektiva .....................................................................56
2.5.2.5 Antibiotika ...........................................................................58
2.5.2.6 Sonstige Inhaltsstoffe .........................................................58
2.5.2.6.1 Antioxidantien ......................................................58
2.5.2.6.2 Natriumdodecyl(lauryl)sulfat
(sodiumdodecyl(lauryl)sulfate, SDS) ...................60
2.5.3 Einzelne Verdünner .........................................................................62
2.5.3.1 Milchverdünner ...................................................................63
2.5.3.2 TRIS-gepufferte Eigelb-Verdünner .....................................64
2.5.3.3 Sonstige Verdünner ............................................................65
2.5.3.4 Kommerzielle Verdünner ....................................................65
2.5.3.5 Vergleichende Untersuchungen .........................................65
3
Material und Methoden .....................................................................................75
3.1 Probanden ..................................................................................................75
3.2 Spermagewinnung .....................................................................................76
3.3 Spermabeurteilung .....................................................................................77
3.3.1 Klassische Spermatologie ...............................................................78
3.3.1.1 Makroskopische Untersuchung ..........................................78
3.3.1.2 Chemisch-physikalische Untersuchung .............................78
3.3.1.3 Mikroskopische Untersuchung ...........................................78
3.3.2 Spermac®-Färbung .........................................................................82
3.3.3 HOS-Test .........................................................................................82
3.3.4 Computer-assisted sperm analysis (CASA) ....................................83
3.3.4.1 Aufbau und Funktionsweise des SpermVision™-Systems 83
3.3.4.2 Probenvorbereitung und Befüllung der Messkammer ........85
3.3.4.3 Motilitätsanalyse .................................................................86
3.3.4.4 Viabilitätsanalyse ................................................................88
3.4 Weiterverarbeitung des Spermas
(Aufbereitung mit den verschiedenen Verdünnern) ...................................90
3.4.1 Herstellung der Verdünner ..............................................................90
3.4.2 Aliquotierung und Verdünnung des Spermas .................................91
3.5 Untersuchung des verdünnten Spermas ...................................................93
Inhaltsverzeichnis
3.6 Untersuchung der Halteproben ..................................................................94
3.7 Statistische Methoden ................................................................................96
4
Ergebnisse .........................................................................................................99
4.1 Untersuchungsergebnisse der Nativejakulate ...........................................99
4.1.1 Makroskopische Untersuchung .......................................................99
4.1.2 Chemisch-physikalische Untersuchung ..........................................99
4.1.3 Mikroskopische Untersuchung ........................................................99
4.1.4 Spermac®-Färbung .......................................................................100
4.1.5 HOS-Test .......................................................................................100
4.1.6 Computer-assisted sperm analysis (CASA) ..................................100
4.1.6.1 Motilitätsanalyse ...............................................................100
4.1.6.2 Viabilitätsanalyse ..............................................................101
4.2 Ergebnisse der weiterverarbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem
Verdünnen an Tag 0.................................................................................101
4.2.1 Dichten der verdünnten Ejakulate .................................................102
4.2.1.1 Neubauer-Zählkammer .....................................................102
4.2.1.2 CASA ................................................................................102
4.2.2 Einfluss der Verdünner auf die Motilität an Tag 0 .........................102
4.2.2.1 Subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit....................103
4.2.2.2 Mittels CASA gemessene Gesamtmotilität.......................104
4.2.2.3 Mittels CASA gemessene Vorwärtsbeweglichkeit ............105
4.2.2.4 Weitere mittels CASA bestimmte Motilitätsparameter .....106
4.2.3 Einfluss der Verdünner auf die Viabilität an Tag 0 ........................113
4.2.3.1 Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich ..............113
4.2.3.2 Mittels CASA gemessene Viabilität ..................................114
4.2.4 Einfluss der Verdünner auf den Anteil an morphologisch
veränderten Samenzellen an Tag 0 ..............................................116
4.2.5 Einfluss
der
Verdünner
auf
den
Anteil
an
akrosomalen
Veränderungen bzw. auf den Anteil an abgelösten Akrosomen an
Tag 0 ..............................................................................................118
4.2.6 Einfluss der Verdünner auf den Anteil an membrandefekten
Samenzellen im HOS-Test an Tag 0.............................................120
4.3 Ergebnisse der Halteproben im Zeitverlauf..............................................122
4.3.1 Einfluss der Verdünner auf die Motilität im Zeitverlauf ..................122
Inhaltsverzeichnis
4.3.1.1 Subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit....................123
4.3.1.2 Mittels CASA gemessene Gesamtmotilität.......................125
4.3.1.3 Mittels CASA gemessene Vorwärtsbeweglichkeit ............127
4.3.1.4 Weitere mittels CASA bestimmte Motilitätsparameter .....129
4.3.2 Einfluss der Verdünner auf die Viabilität im Zeitverlauf ................136
4.3.2.1 Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich ..............136
4.3.2.2 Mittels CASA gemessene Viabilität ..................................138
4.3.3 Einfluss der Verdünner auf den Anteil an morphologisch
veränderten Samenzellen im Zeitverlauf .......................................140
4.3.4 Einfluss
der
Verdünner
auf
den
Anteil
an
akrosomalen
Veränderungen im Zeitverlauf .......................................................144
4.4 Korrelationen der untersuchten Parameter ..............................................147
4.4.1 Zusammenhang zwischen den mittels Neubauer-Zählkammer
bestimmten und den durch CASA gemessenen Dichten ..............147
4.4.1.1 Korrelationen nach Verdünnern getrennt .........................147
4.4.1.2 Korrelation ohne Trennung nach Verdünnern ..................148
4.4.2 Zusammenhang zwischen der subjektiv geschätzten und der
mittels CASA gemessenen Vorwärtsbeweglichkeit.......................149
4.4.2.1 Korrelationen nach Verdünnern getrennt .........................149
4.4.2.2 Korrelationen ohne Trennung nach Verdünnern ..............150
4.4.3 Zusammenhang zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten
Anteil an lebenden Spermien und der durch CASA ermittelten
Viabilität .........................................................................................150
4.4.3.1 Korrelationen nach Verdünnern getrennt .........................151
4.4.3.2 Korrelationen ohne Trennung nach Verdünnern ..............151
4.4.4 Zusammenhänge zwischen verschiedenen Spermaparametern ..152
4.4.4.1 Korrelationen nach Verdünnern getrennt .........................152
4.4.4.2 Korrelationen ohne Trennung nach Verdünnern ..............154
5
Diskussion .......................................................................................................156
5.1 Diskussion der Fragestellung ...................................................................156
5.2 Diskussion der Methodik ..........................................................................158
5.2.1 Auswahl der Probanden ................................................................158
5.2.2 Spermagewinnung.........................................................................160
5.2.3 Verwendete spermatologische Untersuchungsmethoden ............161
Inhaltsverzeichnis
5.2.3.1 Klassische Spermatologie ................................................161
5.2.3.2 Computer-assisted sperm analysis (CASA) .....................163
5.2.3.2.1 Konzentrationsbestimmung ...............................168
5.2.3.2.2 Motilitätsanalyse ................................................168
5.2.3.2.3 Viabilitätsanalyse ...............................................169
5.2.4 Verdünner ......................................................................................170
5.2.4.1 Inhaltsstoffe ......................................................................171
5.2.4.2 Unterschiede bezüglich der Aufarbeitung ........................174
5.3 Diskussion der Ergebnisse.......................................................................176
5.3.1 Nativejakulate ................................................................................176
5.3.1.1 Klassische Spermatologie ................................................176
5.3.1.2 CASA ................................................................................176
5.3.2 Ergebnisse der weiterverarbeiteten Ejakulate unmittelbar nach
dem Verdünnen an Tag 0 ..............................................................179
5.3.2.1 Dichten ..............................................................................179
5.3.2.2 Motilität..............................................................................180
5.3.2.3 Viabilität ............................................................................186
5.3.2.4 Pathomorphologie.............................................................187
5.3.2.5 Akrosomale Veränderungen .............................................189
5.3.2.6 Funktionelle Integrität der Plasmamembran.....................192
5.3.3 Ergebnisse der Halteproben im Zeitverlauf ...................................193
5.3.3.1 Motilität..............................................................................194
5.3.3.2 Viabilität ............................................................................202
5.3.3.3 Pathomorphologie.............................................................204
5.3.3.4 Akrosomale Veränderungen .............................................208
5.3.4 Korrelationen der untersuchten Parameter ...................................211
5.3.4.1 Dichten ..............................................................................211
5.3.4.2 Motilität..............................................................................213
5.3.4.3 Viabilität ............................................................................214
5.3.4.4 Spermaparameter .............................................................215
5.4 Schlussbetrachtung und Fazit für die Praxis............................................217
5.5 Offene Fragestellungen ............................................................................219
6
Zusammenfassung .........................................................................................221
7
Summary ..........................................................................................................224
Inhaltsverzeichnis
8
Literaturverzeichnis ........................................................................................227
9
Anhang .............................................................................................................250
9.1 Geräte.......................................................................................................250
9.2 Analyseeinstellungen des SpermVision™-Systems ................................251
9.3 Verbrauchsmaterialien .............................................................................252
9.4 Chemikalien ..............................................................................................253
9.5 Rezepte der verwendeten Medien ...........................................................254
9.5.1 Rezepte der Verdünner .................................................................254
9.5.1.1 TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner .....................................254
9.5.1.2 Uppsala-Verdünner (Uppsala Equex-2 System) ..............254
9.5.2 Zusammensetzung des Verdünners CaniPRO™ Chill 10 ............255
9.5.3 Rezepte diverser Gebrauchslösungen ..........................................255
9.5.3.1 Eosin-Färbelösung............................................................255
9.5.3.2 Hypoosmotische Lösung ..................................................255
9.5.3.3 Färbelösung für die Viabilitätsanalyse..............................256
9.6 Herstellerangaben ....................................................................................256
9.7 Verdünner zur Flüssigkonservierung von caninem Sperma ....................261
9.7.1 Milchverdünner ..............................................................................261
9.7.2 TRIS-gepufferte Eigelb-Verdünner ................................................261
9.7.3 Sonstige Verdünner .......................................................................264
9.7.4 Kommerzielle Verdünner ...............................................................265
9.8 Ergebnistabellen.......................................................................................267
9.9 Abbildungsverzeichnis..............................................................................284
9.10 Tabellenverzeichnis..................................................................................286
10 Danksagung ....................................................................................................291
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
AI
Artifizielle Insemination
ALH
amplitude
of
lateral
durchschnittliche
head
displacement,
seitliche
engl.
Kopfauslenkung
für
der
Samenzellen [µm]
AOC
average orientation change (of the head), engl. für
durchschnittlicher Richtungswechsel des Spermienkopfes
[Grad]
Aqua dest.
Aqua destillata, lat. für destilliertes Wasser
Aqua bidest.
Aqua bidestillata, lat. für bidestilliertes Wasser
AR
Akrosomreaktion
BCF
beat cross frequency, engl. für Anzahl der seitlichen
oszillatorischen Bewegungen des Spermienkopfes um die
mittlere Bahn [Hz]
BES
N,N-bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure
°C
Grad Celsius
Ca2+
zweifach positiv geladene Calciumionen
Carboxy-SNARF
Carboxy-Seminaphthorhodafluor
CASA
Computer-assisted sperm analysis, engl. für Computergestützte Spermienanalyse
CFDA
Carboxyfluoresceindiacetat
CP
Verdünner CaniPRO™ Chill 10
DAP
distance average path, engl. für Durchschnittsstrecke [µm]
DCL
distance curved line, engl. für Kurvenstrecke [µm]
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
deoxyribonucleic acid, engl. für Desoxyribonukleinsäure
DSL
distance straight line, engl. für geradlinige Strecke [µm]
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure / Ethylendiamintetraacetat
et al.
et alii, lat. für und andere
Equex
Equex STM Paste
EthD-1
Ethidiumhomodimer
FITC-PNA
Fluoresceinisothiocyanat Peanut Agglutinin
FITC-PSA
Fluoresceinisothiocyanat Pisum Sativum Agglutinin
Abkürzungsverzeichnis
g
g-Kraft / g-Beschleunigung
H2O2
chemische Summenformel für Wasserstoffperoxid
HCl
chemische Summenformel für Salzsäure
HEPES
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HOS-Test
hypoosmotischer Schwelltest
HTR Ceros 12.1
Hamilton-Thorne sperm analyzer Ceros Version 12.1
HTR IVOS 12.21
Hamilton-Thorne sperm analyzer IVOS Version 12.21
i. d. R.
in der Regel
Kap.
Kapitel
KB
Künstliche Besamung
KGGA
Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der
Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz der
Justus-Liebig-Universität Gießen
LDL
Low-density-Lipoprotein
LIN
(VSL/VCL) linearity, engl. für Linearität [%]
Max.
Maximum
Min.
Minimum
Mio.
Millionen
mM
mmol/Liter
Mrd.
Milliarden
n
Anzahl
NFDMS-G-Verdünner Non Fat Dried Milk Solid-Glucose-Verdünner
Nr.
Nummer
n. s.
nicht signifikant
O2-
Hyperoxidanionen (einfach negativ geladene, radikalische
Sauerstoffionen)
p
p-value von probability, engl. für Wahrscheinlichkeit;
p-Wert (Signifikanzwert)
pVerd
p-Wert für „Haupteffekt Verdünner“
pZeit
p-Wert für „Haupteffekt Zeit“
pW
p-Wert für „Wechselwirkung“
PBS
phosphate buffered saline, engl. für phosphatgepufferte
Salzlösung
pH
negativer dekadischer Logarithmus der WasserstoffionenKonzentration
Abkürzungsverzeichnis
PI
Propidiumiodid
pK
negativer dekadischer Logarithmus der Säurekonstante
r
Korrelationskoeffizient nach Pearson
ROS
reactive oxygen species, engl. für reaktive oxidative
Substanzen bzw. reaktive Sauerstoffspezies
SD
standard deviation, engl. für Standardabweichung
SDS
sodiumdodecyl(lauryl)sulfate,
engl. für Natriumdodecyl(lauryl)sulfat
SF
Streufaktor
SGZ
Spermiengesamtzahl
STR
(VSL/VAP) straightness, engl. für Geradlinigkeit [%]
Tab.
Tabelle
TALP
Tyrode's Albumin Lactat Pyruvat
TES
N-[Tris(hydroxymethyl)-methyl]-2-aminoethansulfonsäure
TG-Sperma
Tiefgefriersperma
TRIS
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
TE
TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner
Up 1
Uppsala Equex-2 System (nur Verdünner 1)
Up 1 + 2
Uppsala Equex-2 System (Verdünner 1 und Verdünner 2)
VAP
velocity
average
path(way),
engl.
für
mittlere
Geschwindigkeit (Geschwindigkeit über die gemittelte
Bahn) [µm/sec]
VCL
velocity curved line (velocity curvilinear), engl. für
kurvilineare Geschwindigkeit (Geschwindigkeit über die
tatsächlich zurückgelegte Bahn) [µm/sec]
% Vol.
Volumenprozent
VSL
velocity straight line, engl. für lineare Geschwindigkeit
(Geschwindigkeit über eine gerade Linie vom Anfang zum
Ende) [µm/sec]
WOB
(VAP/VCL)
wobble,
engl.
für
Schwankung
(der
kurvilinearen Strecke um die mittlere Strecke) [%]
arithmetischer Mittelwert
g
geometrischer Mittelwert
r
„modifizierter Mittelwert“ (rücktransformierter Mittelwert)
ZP
Zona pellucida
Einleitung und Fragestellung
1
Einleitung und Fragestellung
Nachdem die künstliche Besamung bei vielen Nutztierarten bereits seit langer Zeit
ein wichtiges Zuchtinstrument darstellt, gewinnt sie auch in der Hundezucht immer
mehr an Bedeutung. Bei Verwendung von Sperma guter Qualität und einem
optimalen
Besamungsregime
können
mit
der
künstlichen
Besamung
Trächtigkeitsergebnisse und Wurfgrößen erzielt werden, die denen eines
natürlichen Deckaktes entsprechen. Dabei haben insbesondere die Wahl des
geeigneten Besamungszeitpunktes sowie die korrekte Deponierung des Spermas
im weiblichen Genitale einen entscheidenden Einfluss auf den Erfolg dieser
Reproduktionstechnik.
Neben
Frischsperma
kommen
bei
der
künstlichen
Besamung flüssigkonserviertes Sperma sowie Tiefgefriersperma zum Einsatz,
wobei mit flüssigkonserviertem Sperma deutlich bessere Konzeptionsraten und
höhere Wurfgrößen erreicht werden können als mit kryokonserviertem Sperma.
Daher ist in der klinischen Praxis die Nachfrage nach flüssigkonserviertem
Hundesperma steigend, zudem im Vergleich mit tiefgefrorenem Sperma auch die
Herstellung und der Versand von flüssigkonserviertem Sperma einfacher und
kostengünstiger sind. Problematisch bei der Flüssigkonservierung ist allerdings die
begrenzte Überlebensdauer der Samenzellen, welche eine gutes Zeitmanagement
hinsichtlich Samengewinnung und Besamungszeitpunkt erfordert. Ungeklärt ist
dabei, wie lange die Befruchtungsfähigkeit der flüssigkonservierten Spermien
konkret aufrechterhalten werden kann.
In bisherigen Untersuchungen zur Konservierung von caninem Sperma wurden
hauptsächlich Verdünner für die Kryokonservierung getestet. In den weniger
zahlreichen Arbeiten, die sich mit Verdünnern für die Flüssigkonservierung
beschäftigen, wurde die Spermaqualität zum Teil nur über einen Zeitraum von
wenigen Tagen untersucht, da generell davon ausgegangen wurde, dass die
Fertilität des Spermas nur für eine relativ kurze Zeitspanne aufrechterhalten
werden kann. Es wurden jedoch auch Studien durchgeführt, die längere
Untersuchungszeiträume aufwiesen und somit darauf hindeuten, dass die
Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen über eine längere Zeitspanne konserviert
werden kann. Des Weiteren wurden Versuche unternommen, die Lebensspanne
der Spermien durch den Zusatz verschiedener Antioxidantien oder anderer Stoffe
bzw. durch das Auswechseln des Verdünners zu verlängern.
1
Einleitung und Fragestellung
Für die Flüssigkonservierung von caninem Sperma bei 4°C wird eine Vielzahl
verschiedener Verdünner eingesetzt. Dabei können grundsätzlich kommerzielle
und
nichtkommerzielle,
d.
h.
selbst
im
Labor
hergestellte,
Verdünner
unterschieden werden. In beiden Gruppen handelt es sich meist um TRIS- oder
milchbasierte Verdünner.
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Splitsample-Verfahren drei verschiedene
Verdünner
für
die
Flüssigkonservierung
von
caninem
Sperma
bei
4°C
vergleichend untersucht. Dabei handelte es sich um den kommerziellen Verdünner
CaniPRO™ Chill 10 (Minitüb GmbH, Tiefenbach) und zwei nichtkommerzielle
Verdünner (TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner und Uppsala Equex-2 System).
Diese Verdünner wurden ausgewählt, da sie kommerziell erworben werden
können bzw. einfach herzustellen sind und deshalb in der klinischen Praxis
weitverbreitet eingesetzt werden. Das Uppsala Equex-2 System, bei dem es sich
eigentlich um einen gebräuchlichen Verdünner für die Kryokonservierung von
Hundesperma handelt, wurde in diese Arbeit mit aufgenommen, da es bei der
Kryokonservierung gute Auftauergebnisse liefert und geprüft werden sollte,
inwieweit dies auch für die Flüssigkonservierung zutrifft.
Ziel der vorliegenden Untersuchungen war somit zum einen die Klärung der
Frage, welcher der drei genannten Verdünner am besten zur Flüssigkonservierung
von caninem Sperma bei 4°C geeignet ist und zum anderen, wie lange eine
akzeptable Spermaqualität in den flüssigkonservierten Ejakulaten aufrechterhalten
werden
kann.
Als
Beurteilungsparameter
wurden
dazu
verschiedene
Spermaparameter, welche über einen Zeitraum von zehn Tagen für drei Tage im
24-Stunden-Rhythmus und anschließend im 48- bzw. 72-Stunden-Rhythmus
vergleichend untersucht wurden, herangezogen. Hierbei kamen sowohl die
Methoden der klassischen Spermatologie als auch die Computer-gestützte
Spermienanalyse (System SpermVision™ der Minitüb GmbH, Tiefenbach) zur
Anwendung. Daher bestand ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit darin, zu
überprüfen, ob mit beiden Untersuchungsmethoden gleichwertige Ergebnisse
erzielt werden können.
2
Literatur
2
Literatur
2.1 Bedeutung der künstlichen Besamung für die Hundezucht
Die künstliche Besamung (KB) oder artifizielle Insemination (AI) stellt die
Einführung von Sperma in den weiblichen Reproduktionstrakt ohne das Stattfinden
eines natürlichen Deckaktes dar (England und Millar, 2008). Sie kann intravaginal,
intrauterin oder intratubal mit frischem, flüssigkonserviertem oder tiefgefrorenem
Sperma durchgeführt werden (Pinto et al., 1999; Farstad, 2000; England und
Millar, 2008; Thomassen und Farstad, 2009).
Der erste wissenschaftliche Bericht über eine erfolgreiche KB beim Säugetier
stammt aus Italien aus dem Jahr 1780 und beschreibt die AI einer Barbet-Hündin
durch Abbé Spallanzani, die nach einer Trächtigkeitsdauer von 62 Tagen zur
Geburt von drei Welpen führte (Heape, 1897). Diese KB war jedoch eher
experimenteller Natur und erst seit 1940 wird diese Reproduktionstechnik beim
Hund angewendet, um Anpaarungen zu erreichen, die auf natürliche Weise
unmöglich gewesen wären (Harrop, 1956). Die erste Beschreibung einer
erfolgreichen KB mit flüssigkonserviertem Sperma beim Hund stammt aus dem
Jahr 1954 (Harrop, 1954), mit Tiefgefriersperma (TG-Sperma) aus dem Jahr 1969
(Seager, 1969).
Während die KB bei einigen Haustierspezies, insbesondere Rind und Schwein,
seit langer Zeit ein wichtiges Instrument der modernen Tierzucht darstellt
(Andersen, 1980), kam der Durchbruch dieser Reproduktionstechnologie beim
Hund erst in den letzten 20 Jahren, was auch an der Anzahl der Publikationen und
Inseminationen deutlich wird (Linde-Forsberg, 1991; Farstad, 2000; Wilson, 2001;
Peña et al., 2006; England und Millar, 2008). Während die Nachfrage für
Reproduktionstechnologien generell signifikant gestiegen ist (Peña et al., 2006),
gibt es dennoch nationale Unterschiede in den ethischen und gesetzlichen
Rahmenbedingungen, die den Einsatz der KB beim Hund regeln (Pesch et al.,
2007; England und Millar, 2008).
2.1.1 Vor- und Nachteile
Als Vorteile der KB können folgende Aspekte angesehen werden:
3
Literatur
- Zuchtnutzung von Rüden oder Hündinnen, die aus physischen Gründen
(anatomische Abweichungen oder pathologische Zustände) nicht natürlich
miteinander verpaart werden können (Harrop, 1956; Kibble, 1969; Christiansen,
1984a; Silva et al., 1996; England und Millar, 2008)
- Möglichkeit zur Kreuzung von Tieren, die auf natürliche Weise aufgrund von
Größenunterschieden nicht ohne Schwierigkeiten miteinander verpaart werden
könnten
(Heape,
1897;
Kibble,
1969)
bzw.
von
Tieren
mit
leicht
unterschiedlicher Saisonalität (Thomassen und Farstad, 2009)
- Zuchtnutzung von Tieren, die aus verhaltensbedingten Gründen nicht zur Zucht
eingesetzt werden können (Kibble, 1969; England und Millar, 2008)
- Möglichkeit der Aufteilung eines Ejakulates, sodass mehrere Hündinnen (1-5)
mit dem Ejakulat eines Rüden besamt werden können (Heape, 1897; Rota et
al., 1999a; England und Millar, 2008; Thomassen und Farstad, 2009)
- hocheffiziente Vereinfachung des genetischen Fortschritts (England und Millar,
2008)
- günstige und schnelle Zuchtmethode (England und Millar, 2008)
- Erhöhung der Zuchthygiene (Thomassen und Farstad, 2009) und Kontrolle
einiger infektiöser Krankheiten durch die Vermeidung des physischen Kontaktes
zwischen den Tieren bzw. durch die Möglichkeit zur Behandlung des Spermas
vor der Insemination (Harrop, 1956; Seager und Platz, 1977a; Christiansen,
1984a; Silva et al., 1996; England und Millar, 2008)
- Möglichkeit zur Untersuchung der Spermaqualität vor der Besamung und somit,
falls nötig, die Auswahl eines alternativen Zuchtrüden (England und Millar,
2008)
- Verhinderung von Inzucht in kleinen Populationen (England und Millar, 2008)
- Steigerung und Ausweitung der Zuchtnutzung bewährt wertvoller Vatertiere
(Harrop, 1956; Seager und Platz, 1977a; Christiansen, 1984a)
In Kombination mit der Spermakonservierung ergeben sich weitere Vorteile:
- durch Kryokonservierung die Möglichkeit zur Konservierung und Lagerung
wertvoller Gene männlicher Tiere für nahezu unendliche Zeit (England und
Millar, 2008)
- Möglichkeit zur Zuchtnutzung eines Rüden über dessen Tod hinaus
(Christiansen, 1984a; Kutzler, 2005; England und Millar, 2008)
4
Literatur
- Möglichkeit zum Transport von Sperma, sodass genetisches Material auch
außerhalb einer Zuchtkolonie verfügbar ist (England und Millar, 2008) bzw.
sodass geographische Barrieren kein Hindernis mehr darstellen (Harrop, 1956;
Kibble, 1969; Günzel, 1986; Pinto et al., 1999)
- Möglichkeit zur Überwindung von Quarantänerestriktionen (Christiansen,
1984a; Linde-Forsberg und Forsberg, 1989; England und Millar, 2008)
- der
Transport
von
Tieren
wird
unnötig,
wodurch
Transportstress,
Krankheitsrisiken (Linde-Forsberg und Forsberg, 1989; Silva et al., 1996;
England und Millar, 2008) und Transportkosten (Seager und Platz, 1977a;
Kutzler, 2005) reduziert bzw. eliminiert werden
- Etablierung von Samenbanken, die einen genetischen Pool anbieten, der für
geographisch isolierte, kleine Populationen von Hunden genutzt werden kann,
um Inzucht zu vermeiden, und der bei der Eliminierung von Erbkrankheiten hilft
(Morton und Bruce, 1989) bzw. der eine Erhaltung des genetischen Potenzials
von gefährdeten Rassen sichert (Thomassen und Farstad, 2009)
- den Züchtern von Diensthunden, wie Sprengstoffspür-, Drogenspür- und
Blindenbegleithunden etc., ermöglicht die Kryokonservierung von Sperma die
Kastration der männlichen Tiere in einem frühen Alter, während die
Verfügbarkeit ihrer Gene erhalten bleibt, bis ihre Leistung getestet wurde
(England und Millar, 2008)
- Möglichkeit zur Bergung genetischen Materials vor einer medizinischen
Behandlung bei einem kranken männlichen Tier (Thomassen und Farstad,
2009)
- die Notwendigkeit, Rüden in Zuchtzwingern zu halten, wird reduziert, wodurch
Kosten gesenkt werden können (England und Millar, 2008)
Trotz der vielen Vorteile gibt es jedoch auch einige mögliche Nachteile der KB.
Dazu zählen folgende Punkte:
- Verursachen eines physischen oder psychischen Traumas während der
Durchführung der KB (England und Millar, 2008)
- Ausführung einer KB aus unangemessenen Gründen (z. B. wenn der
Zuchtausschluss eines Tieres aufgrund einer erblichen Krankheit, wie
Hüftgelenksdysplasie oder anatomischer Anomalität des Reproduktionstraktes,
erfolgte) (England und Millar, 2008)
5
Literatur
- potenzielle Einschleppung von Erbkrankheiten oder Anomalien in die
Population (England und Millar, 2008)
- mögliche Überbeanspruchung einzelner Rüden in einem Zuchtprogramm oder
innerhalb einer bestimmten Rasse (England und Millar, 2008)
- Möglichkeit der Verwechslung der Abstammung (England und Millar, 2008)
2.1.2 Technik der Samenübertragung
Für die erfolgreiche Anwendung der KB ist es wichtig, diese zum optimalen
Zeitpunkt durchzuführen, Sperma guter Qualität zu verwenden und dieses an der
idealen Stelle für die Befruchtung zu deponieren (Linde-Forsberg, 1991;
Thomassen und Farstad, 2009).
Zur Bestimmung des optimalen Besamungszeitpunktes kommen mehrere
Verfahren in Betracht, wobei die Messung der Serum-Progesteronkonzentration
und die Vaginalzytologie die relevantesten sind (Morton und Bruce, 1989; Peña et
al., 2006).
Der Reproduktionstrakt der Hündin weist im Vergleich zu anderen Haustierspezies
einige Besonderheiten auf, deren ausführliche Darstellung bei Wilson (2001) zu
finden ist. Zusammenfassend gestaltet sich die Katheterisierung der Zervix beim
Hund durch die lange Vagina, den aufgrund der dorsomedialen Falte engen
parazervikalen Raum, die Position des externen Ostiums und die Winkelung sowie
den schmalen Durchmesser des Zervikalkanals als relativ schwierig (Wilson,
2001).
Es gibt verschiedene Techniken für die künstliche Samenübertragung beim Hund,
wobei das Sperma entweder tief intravaginal oder intrauterin deponiert wird. Bei
der
intrauterinen
Samendeponierung
sind
die
transzervikale-intrauterine
Besamung mithilfe eines starren Katheters („Norwegischer Katheter“) bei
transabdominaler
Fixation
der
Zervix,
die
transzervikale-intrauterine
endoskopische Besamung sowie die chirurgische intrauterine Besamung zu
unterscheiden (Pesch et al., 2007). Ferner besteht im Rahmen der chirurgischen
Besamung
die
Möglichkeit,
das
Sperma
direkt
in
die
Eileiterampullen
einzubringen, was als intratubale Besamung bezeichnet wird (Tsutsui et al.,
2003a).
Bei der intravaginalen Besamung wird das Sperma mit einem Uterus-EinwegPlastikkatheter für Rinder (Seager und Fletcher, 1972), dem Norwegischen
6
Literatur
Katheter (Farstad, 1984) oder dem sog. Osiris-Katheter (Theret et al., 1987) in die
kraniale Vagina eingebracht (Seager und Fletcher, 1972; Linde-Forsberg und
Forsberg, 1989). Das Anheben des Hinterteils der Hündin während der
Samendeponierung und für die darauffolgenden zwei bis zehn Minuten in einem
Winkel von 60-80° verhindert einen Rückfluss des Spermas (Seager und Fletcher,
1972; 1973; Seager und Platz, 1977a; Linde-Forsberg und Forsberg, 1989), wobei
aber auch ein kürzeres Hochhalten nicht zu einer Verschlechterung der
Konzeptionsraten führt (Pinto et al., 1998).
Die intravaginale Technik ist nichtinvasiv, einfach durchzuführen (Silva et al.,
1996) und bei Verwendung von nativem bzw. flüssigkonserviertem Sperma,
jedoch nicht bei TG-Sperma, geeignet, gute Trächtigkeitsergebnisse zu erzielen
(England und Millar, 2008; Thomassen und Farstad, 2009).
Die Technik der transzervikalen-intrauterinen Besamung mit transabdominaler
Fixation der Zervix, oft als Norwegische oder Skandinavische Methode bezeichnet
(Thomassen et al., 2001), wurde ursprünglich für die Besamung des Blaufuchses
entwickelt (Fougner et al., 1973) und beim Hund erstmals von Andersen (1975)
beschrieben. Der Metallkatheter („Norwegischer Katheter“) (Andersen, 1975),
welcher in drei Größen (Längen von 20 bis 50 cm) verfügbar ist (Linde-Forsberg,
1991), wird an der stehenden Hündin unter manueller Kontrolle durch das externe
Ostium zur Samendeponierung in den Uteruskörper vorgeschoben (Andersen,
1975; Günzel, 1986; Linde-Forsberg, 1991). Das Hochhalten des Hinterteils der
Hündin ist auch hier im Anschluss üblich (Linde-Forsberg, 1991).
Mit einiger Übung kann diese Technik bei den meisten Hündinnen schnell, einfach
und ohne Sedation durchgeführt werden (Linde-Forsberg et al., 1999; Thomassen
und Farstad, 2009). Bei nervösen oder adipösen Tieren ist diese Methode
allerdings unpraktisch, da die Manipulation der Zervix durch das Abdomen
schwierig oder gar unmöglich sein kann (Silva et al., 1995).
Bei der transzervikalen-intrauterinen endoskopischen Besamung, welche auch als
Neuseeländische endoskopische Methode bezeichnet wird (Wilson, 2001), handelt
es sich um eine Weiterentwicklung der vorgenannten Methode durch Wilson
(1993). Die Ausrüstung besteht aus einem starren Zystourethroskop mit einer 30°
Winkeloptik, einem Adapter mit Arbeitskanal, durch welchen der Katheter geführt
wird, einer Kaltlichtquelle und optional einem Monitor. Für das Einbringen des
Spermas wird ein feiner semiflexibler Harnkatheter aus Kunststoff verwendet
7
Literatur
(Wilson, 2001). Das Endoskop wird an der stehenden Hündin in die Vagina
eingeführt und unter Sichtkontrolle bis zum externen Ostium vorgeschoben. Dann
wird der Katheter in die Öffnung eingeführt und unter ständigen Drehbewegungen
durch den Zervikalkanal bis in den Uterus vorwärts bewegt, wo schließlich das
Sperma deponiert wird (Wilson, 2001).
Vorteile dieser Methode sind insbesondere die Visualisierung, aber auch die
Möglichkeit zur intrauterinen Untersuchung und Probenentnahme (Wilson, 2001;
Thomassen und Farstad, 2009). Auch die Anwendung dieser Technik ist nach
einiger Übung bei Hündinnen in Standhitze i. d. R. ohne Sedierung möglich
(Wilson, 2001). Nachteilig sind vor allem die hohen Anschaffungskosten für das
Equipment. Wie einfach das externe Ostium einer Hündin zu katheterisieren ist,
hängt von der Länge der Vagina, der Weite des parazervikalen Bereiches und der
Lage der externen Zervikalöffnung ab (Wilson, 1993; 2001).
Bei der chirurgischen Besamung lassen sich die laparoskopische und die
laparotomische intrauterine Besamung unterscheiden.
Die Technik der laparoskopischen intrauterinen Besamung wurde beim Hund
erstmals von Silva et al. (1995) beschrieben. Das genutzte Laparoskop hat einen
Durchmesser von 8 mm, besteht aus einer 0° Winkeloptik und ist mit einer
elektrischen Lichtquelle sowie einer Kamera verbunden. Das Sperma wird bei
dieser Methode mittels eines Katheters, der proximal der Bifurkation in Richtung
des Ovars eingeführt wird, in den Uterus eingebracht (Silva et al., 1995). Diese
Technik ist im Vergleich zur laparotomischen intrauterinen Besamung weniger
traumatisierend, hat ein geringeres Infektionsrisiko, da die Bauchhöhle nicht
vollständig geöffnet wird, und ermöglicht eine schnellere Erholung der Patienten
(Silva et al., 1995).
Bei der laparotomischen intrauterinen Besamung wird das Sperma nach Inzision
des Uteruskörpers über einen Katheter in Richtung des Ovars im Uteruslumen
deponiert (Brittain et al., 1995).
Die Methoden der chirurgischen Besamung sind invasiv und verlangen eine
Allgemeinanästhesie der Hündin, weswegen sie häufig kontrovers diskutiert
werden. In einigen Ländern, vor allem in den USA (Farstad, 2000; Thomassen und
Farstad, 2009), werden sie jedoch trotzdem weitläufig eingesetzt, wohingegen sie
in anderen Ländern, wie z. B. Schweden und Niederlande, verboten sind (England
und Millar, 2008). Nachteilig bei diesen Methoden sind das damit verbundene
8
Literatur
Narkose- und Operationsrisiko sowie die Tatsache, dass nur eine einmalige
Besamung realistisch und ethisch vertretbar ist (Wilson, 2001).
2.1.3 Besamungsdosis
Gill et al. (1970) sehen bei Verwendung von nativem, von frisch-verdünntem und
von
verdünntem,
gelagertem
Sperma
zur
intrauterinen
Besamung
eine
Besamungsdosis von 200 Mio. Spermien pro Insemination als geeignet an,
während hingegen bei 50 Mio. Spermien die Konzeptionsraten signifikant niedriger
sind (20 % versus 80 %). Bei Verwendung von TG-Sperma zur intrauterinen
Besamung empfehlen Andersen (1975), Farstad und Andersen Berg (1989) und
Rota et al. (1999a) eine Gesamtzahl von 150-200 x 106 Spermien pro
Besamungsdosis, um eine Konzeption und normale Wurfgrößen zu erzielen, den
optimalen Zeitpunkt für die Besamung vorausgesetzt. Rijsselaere et al. (2002a)
inseminieren bei Nutzung von frischem, gekühltem Samen ein Minimum von
150 x 106 motilen Spermien und empfehlen bei Verwendung von gefrorenem
Sperma sogar eine Gesamtzahl von 300 x 106 Spermien.
Generell wird empfohlen, mindestens 150-200 Mio. motile und morphologisch
normale Samenzellen pro Insemination zu verwenden (Linde-Forsberg, 2001;
Peña et al., 2006); eine zweimalige KB erscheint sinnvoll (Linde-Forsberg, 2001).
Eine unterdurchschnittliche Spermaqualität sollte durch eine Erhöhung der
Spermienanzahl pro Besamungsdosis kompensiert werden (Linde-Forsberg,
2001).
Das finale Inseminationsvolumen sollte, abhängig von der jeweiligen Rasse und
Größe der Hündin, bei intrauterinen Besamungen eine Menge von 1-3 ml (LindeForsberg, 2005) bzw. 2 ml (Cain, 2001; Pesch et al., 2007) und bei intravaginalen
Besamungen eine Menge von 3-5 ml (Soderberg, 1986; Linde-Forsberg, 2005)
nicht überschreiten, da das Uteruslumen bei der Hündin klein ist (Linde-Forsberg,
1991; 1995; 2005) und größere Volumina zu einem Verlust von Spermien
aufgrund des Rückflusses aus Uterus oder Vagina führen (Linde-Forsberg, 2001).
Entsprechend der Größe der Hündin sollte jedoch ein Volumen von 2-4 ml auch
nicht unterschritten werden (Peña et al., 2006).
2.1.4 Erfolgsraten
Der Erfolg der KB bei der Hündin ist von zahlreichen Faktoren abhängig. So
haben der Zeitpunkt der Besamung, die Qualität des inseminierten Spermas, der
9
Literatur
Ort der Samendeponierung, die Anzahl der Besamungen, die Fertilität von Hündin
und Rüde sowie die verwendete Besamungsdosis einen Einfluss auf die erzielten
Konzeptionsraten (Wilson, 1993; England und Millar, 2008).
Insbesondere bei Verwendung von TG-Sperma ist die Wahl des korrekten
Besamungszeitpunktes von entscheidender Bedeutung, was wahrscheinlich auf
die reduzierte Überlebensdauer von kryokonservierten Spermien zurückzuführen
ist (Farstad und Andersen Berg, 1989). Bei Raumtemperatur konnte für aufgetaute
Spermien eine Überlebensdauer von sechs bis sieben Stunden ermittelt werden;
allerdings ist in vivo von einer längeren Lebensspanne auszugehen (Seager und
Fletcher, 1973). Frische Spermien haben im Uterus der Hündin hingegen eine
Lebensdauer von mindestens vier bis sechs Tagen (Doak et al., 1967).
Die intrauterine KB führt zu deutlich besseren Konzeptionsraten als die
intravaginale Insemination (Fontbonne und Badinand, 1993; Linde-Forsberg et al.,
1999).
Unabhängig
von
der
Inseminationstechnik
verbessert
sich
die
Konzeptionsrate mit steigender Anzahl an Besamungen (Günzel, 1986; LindeForsberg und Forsberg, 1989; 1993; Thomassen et al., 2001), sodass Günzel
(1986) eine zweimalige Besamung im Abstand von 48 Stunden bei Verwendung
von Frischsperma bzw. im Abstand von 24 Stunden bei flüssig- oder
kryokonserviertem Sperma empfiehlt. Bei zweimaliger Insemination am optimalen
Besamungszeitpunkt unterscheiden sich die Konzeptionsraten nicht signifikant
(79,3% versus 76,8%); allerdings ist die Wurfgröße bei zweimaliger Besamung
höher (Thomassen et al., 2006).
Die Erfolgsquoten der KB beim Einsatz von frischem oder flüssigkonserviertem
Sperma können denen eines natürlichen Deckaktes entsprechen (Pinto et al.,
1999),
was
auch
aus
der
nachfolgenden
tabellarischen
Übersicht
der
Konzeptionsraten ersichtlich wird (Tab. 1). Zudem ist erkennbar, dass mit
flüssigkonserviertem Sperma auch bei vaginaler Deponierung des Samens die
Trächtigkeitsraten akzeptabel bleiben (Rota et al., 1995).
Wichtig ist, bei der Interpretation der Daten zu beachten, dass es zwischen den
einzelnen
Studien
signifikante
Samenübertragungstechnik,
der
Unterschiede
bezüglich
der
verwendeten
Besamungsdosis
eingesetzten
sowie
der
Häufigkeit der Inseminationen gibt (Silva et al., 1996; England und Millar, 2008)
und in vielen Arbeiten nur eine geringe Anzahl an Hündinnen verwendet wurde
(England und Millar, 2008).
10
Literatur
Tab. 1:
Vergleichende
Darstellung
der
Konzeptionsraten
und
der
durchschnittlichen Wurfgrößen bei natürlicher Paarung, künstlicher
Besamung (KB) mit Frischsperma, KB mit flüssigkonserviertem Sperma
und KB mit Tiefgefriersperma (TG-Sperma)
Konzeptionsraten Durchschnittliche Quellen
Wurfgrößen
Gill et al., 1970; Seager et al.,
Natürliche
78,3 % bis 92 %
4,9 bis 6,9
1975; Farstad, 1984; Tsutsui et
Paarung
al., 2003b
KB mit
Frischsperma
- intravaginal
25 % bis 94 %
5,0 bis 7,2 ± 0,5
Seager und Fletcher, 1972;
Seager et al., 1975; Farstad,
1984;
Linde-Forsberg
und
Forsberg, 1989; 1993; Mickelsen
et al., 1993; Pinto et al., 1999;
Niżański, 2006
- intrauterin
70 % bis 100 %
5,1 bis 5,6
Gill et al., 1970; Farstad, 1984;
Silva et al., 1996
KB mit flüssigkonserviertem
Sperma (24 h)
- intravaginal
53 % bis 90 %
3,4 ± 0,6
bis 7,2 ± 0,6
Seager und Fletcher,
Goodman und Cain, 1993;
Forsberg und Forsberg,
Pinto et al., 1999; Tsutsui
2003b
1972;
Linde1993;
et al.,
- intrauterin
KB mit
TG-Sperma
- intravaginal
80 % (Wurfrate)
4,2
Gill et al., 1970
10 % bis 65,8 %
3,9 ± 1,2 bis 6,0
Seager et al., 1975; Fontbonne
und Badinand, 1993; Silva et al.,
1996; Linde-Forsberg et al., 1999;
Thomassen et al., 2001; 2006;
Niżański, 2006
- intrauterin
51,1 % bis 89,4%
4,1 ± 2,4
bis 6,9 ± 2,7
Farstad, 1984; Farstad und
Andersen Berg, 1989; LindeForsberg und Forsberg, 1989;
1993; Fontbonne und Badinand,
1993; Wilson, 1993; Silva et al.,
1996; Linde-Forsberg et al., 1999;
Thomassen et al., 2001; 2006;
Pretzer et al., 2006
11
Literatur
2.2 Gewinnung des Ejakulates
2.2.1 Indikationen für die Spermagewinnung
Die Spermagewinnung beim Hund kann aus verschiedenen Indikationen erfolgen:
1) zur Verwendung für die KB oder zur Herstellung von konserviertem Sperma,
2) im Rahmen von Zuchttauglichkeitsuntersuchungen oder 3) als Untersuchungsgrundlage für diagnostische Zwecke aufgrund von andrologischen Erkrankungen
(Johnston, 1991; Kutzler, 2005). Die Spermagewinnung im Rahmen einer
andrologischen Untersuchung dient dabei sowohl zur Beurteilung der Potentia
coeundi (Begattungsfähigkeit) als auch der Gewinnung eines vollständigen
Ejakulates,
das
als
Beurteilungsgrundlage
für
die
Potentia
generandi
(Befruchtungsfähigkeit) genutzt wird (Günzel, 1986).
2.2.2 Voraussetzungen und Methoden
Die Spermagewinnung sollte in ungestörter Umgebung, ggf. ohne weißen Kittel,
mit einer minimalen Anzahl an Personen und unter ruhiger Handhabung der Tiere
weitgehend ohne Zwangsmaßnahmen stattfinden (Macpherson und Penner, 1967;
Seager und Platz, 1977b; Christiansen, 1984b; Günzel, 1986; Linde-Forsberg,
1991; Kutzler, 2005).
Die Anwesenheit einer läufigen Hündin während der Spermagewinnung ist nicht
erforderlich, verbessert aber die Erfolgschancen (Seager und Platz, 1977b;
Günzel, 1986) vor allem bei nervösen oder unerfahrenen Rüden (Kutzler, 2005)
und führt zu einer Verbesserung der Qualität (Seager und Platz, 1977b; Peña et
al., 2006), insbesondere der Spermiengesamtzahl (SGZ) im Ejakulat (Boucher et
al., 1958). Die verwendete Hündin muss sich nicht zwangsläufig im Östrus
befinden. Auch die Anwesenheit einer unterwürfigen Hündin in einem beliebigen
Zyklusstadium oder sogar die eines kastrierten Rüden kann nützlich sein (Kutzler,
2005). Weiterhin besteht die Möglichkeit, die Hündin mit synthetischen
Pheromonen (Methyl-p-hydroxybenzoat; Aldrich Chemical, Milwaukee, WI, USA)
zu präparieren oder Vaginalsekret von gesunden, Brucella-negativen östrischen
Hündinnen aus früheren Untersuchungen auf Gazetupfern aufzufangen und in
einem handelsüblichen Gefrierschrank bei - 20°C für den zukünftigen Gebrauch
aufzubewahren (Kutzler, 2005). Im Idealfall sollte die verwendete Hündin
annähernd die Größe des Rüden besitzen (Freshman, 2002).
12
Literatur
Hinsichtlich der Absamungsfrequenz empfehlen Boucher et al. (1958) und
Christiansen (1984b) eine Spermagewinnung maximal jeden zweiten Tag, Olar et
al. (1983) sogar nur alle vier bis fünf Tage, da bei einer höheren Frequenz durch
eine Depletion der epididymalen Spermareserven die SGZ im Ejakulat vermindert
sein kann (Boucher et al., 1958). Allerdings kann zur Vermehrung der
Spermaausbeute an einem bestimmten Tag um bis zu 70 % eine zweite
Absamung vorgenommen werden, wobei nur Volumen, Konzentration und SGZ
geringere Werte zeigen, während Motilität und Morphologie der Samenzellen
unbeeinflusst bleiben (England, 1999).
Nach Fielden (1971), Christiansen (1984b) und Günzel (1986) sind die drei
wichtigsten Methoden zur Spermagewinnung beim Hund die digitale Manipulation
(manuelle Penismassage; siehe unten), die künstliche Vagina (Macpherson und
Penner, 1967; Fielden, 1971; Christiansen, 1984b; Johnston, 1991; Yamashiro et
al., 2007) und die Elektroejakulation (Macpherson und Penner, 1967; Seager und
Platz, 1977b; Christiansen, 1984b; Ohl et al., 1994; Pesch et al., 2007;
Thomassen und Farstad, 2009). Eine weitere Alternative ist die Nutzung
pharmakologischer Methoden (Kutzler, 2005). Darüber hinaus besteht die
Möglichkeit, Samenzellen direkt aus dem Epididymis zu gewinnen, was sowohl
intra-vitam nach Kastration als auch post-mortem erfolgen kann (Thomassen und
Farstad, 2009).
Die manuelle Stimulation ist die gebräuchlichste Methode der Spermagewinnung
beim Hund (Kutzler, 2005). Es werden ausschließlich vorgewärmte, graduierte
Glas- oder vorzugsweise Plastikgefäße mit einer weiten Öffnung und einem
verjüngten Ende benötigt (Seager und Fletcher, 1972; Günzel, 1986; LindeForsberg, 1991; Freshman, 2002). Vor der Absamung sollte zur Entfernung von
Präputialkatarrh die Präputialöffnung mit Zellstoff trocken gereinigt werden
(Hoffmann, 2003a). Die Spermagewinnung sollte mit behandschuhten Händen
durchgeführt werden (Seager und Fletcher, 1972; Linde-Forsberg, 1991), wobei
anstatt von Latex- aufgrund des nachteiligen Effektes auf die Spermienmotilität
besser Vinylhandschuhe verwendet werden (Althouse et al., 1991).
Zunächst wird der Penis im Bereich des Bulbus glandis (Bulbusschwellkörper)
durch das Präputium hindurch kräftig massiert, bis es zu einer partiellen Erektion,
dem sogenannten Aufknoten des Bulbus, kommt. Nun wird das Präputium zügig
hinter den Bulbus verlagert und weiterhin ein konstanter, fester Druck auf den
13
Literatur
Penis ausgeübt, indem dieser hinter dem Bulbus zwischen Zeigefinger und
Daumen ringförmig umschlossen wird. Sofort nach Beginn des Ausübens von
Druck an dieser Stelle setzt die Ejakulation ein. Während der darauffolgenden
Entwicklung
einer
vollständigen
Erektion
können
minimale
bis
starke
Friktionsbewegungen auftreten. Wenn der Hund versucht umzusteigen, indem er
sein Bein über den Arm des Untersuchers hebt, kann der Penis um 180° nach
kaudal abgelenkt werden (Kutzler, 2005). Auf diese Weise wird das Hängen
imitiert (Hoffmann, 2003a). Das Ende der Ejakulation wird durch das plötzliche
Erschlaffen des Penis angekündigt, woraufhin dessen Fixation gelöst wird.
Allerdings kann die Reflexkette auch schon vorzeitig durch Lösen der Fixation des
Penis abgebrochen werden (Hoffmann, 2003a).
Nach der Samengewinnung sollte der Hund nicht unbeaufsichtigt gelassen werden
bis die Erektion vollständig zurückgegangen ist und sich der Penis wieder komplett
in der Präputialhöhle befindet (Johnston, 1991). Zur Infektionsprophylaxe kann
zuvor noch eine geeignete keimhemmende Salbe (z. B. Akridinsalbe) auf die
Penisschleimhaut aufgetragen werden (Pesch et al., 2007). Kutzler (2005)
empfiehlt das Auftragen eines nichtspermiziden, wasserlöslichen Gleitgels auf die
Penisschleimhaut, insbesondere im Bereich hinter dem Bulbus glandis, um einer
Inversion des Präputiums vorzubeugen.
Die manuelle Stimulation induziert sowohl die Paarungsreflexe als auch einen
geordneten Ejakulationsablauf (Günzel, 1986). Die einzelnen Fraktionen können
hierbei durch Auswechseln der Samenauffanggläser bei makroskopisch sichtbarer
Konsistenz- und Farbänderung des Sekrets einfach und präzise getrennt werden
(Christiansen, 1984b; Günzel, 1986).
Das Ejakulat des Hundes besteht aus drei Fraktionen: Erste (spermienarme)
Fraktion, zweite (spermienreiche) Fraktion und dritte Fraktion (Prostatasekret)
(Seager und Platz, 1977b; Christiansen, 1984b; Kutzler, 2005). Die erste Fraktion
ist wässrig, stammt von der Prostata und hat i. d. R. ein Volumen von 1-5 ml. Ihre
Abgabe dauert etwa 0,5 bis 1 Minute. Die zweite Fraktion ist milchig-weiß, misst 13 ml, enthält den Hauptanteil an Spermien und wird innerhalb von 1 bis 2 Minuten
abgegeben. Die dritte Fraktion kommt von der Prostata und stellt den Hauptanteil
des Ejakulates dar. Ihr Volumen kann bei großen Rassen bis zu 30-40 ml
betragen. Dieses wird innerhalb von 5 Minuten bis zu 1 Stunde abgegeben (LindeForsberg, 1991; 1995). Für die KB und die Konservierung des Spermas ist nur die
14
Literatur
zweite Fraktion von Interesse (Fielden, 1971; Linde-Forsberg, 1991; 1995), da das
Seminalplasma einen nachteiligen Effekt auf die Überlebensdauer sowie die
Kältetoleranz der Samenzellen besitzt (Andersen, 1980).
Das
gewonnene
Sperma
sollte
vor
abrupten
Temperaturänderungen,
übermäßigem Schütteln, Wasser, Desinfektions- und Reinigungsmitteln geschützt
werden. Obwohl canines Sperma nicht so kälteempfindlich ist wie das Sperma
anderer Haustierspezies, wie beispielsweise das von Rind oder Pferd, ist es
jedoch sehr empfindlich gegenüber Hitze, sodass bis zur Weiterverarbeitung eine
Aufbewahrung zwischen Körper- (37°C) und Raumtemperatur (20°C) empfohlen
wird (Kutzler, 2005).
2.3 Spermauntersuchung
Ziel einer Spermauntersuchung ist die Voraussage der Befruchtungsfähigkeit einer
Spermaprobe (Peña Martínez, 2004), weshalb sie integraler Bestandteil der
Untersuchung auf Zuchttauglichkeit und auch im Rahmen der Herstellung von
flüssig- oder kryokonserviertem Sperma (Riesenbeck et al., 2001) oder der KB
(Peña et al., 2006) unerlässlich ist.
Zweck der Untersuchung von nativem Sperma ist es, die normale Funktion von
Hoden und Nebenhoden zu beurteilen, wohingegen die Untersuchung von
kryokonserviertem
Sperma
eher
dahin
gerichtet
ist,
den
Grad
an
Zellschädigungen, der durch die Kryokonservierung verursacht wurde, zu ermitteln
(Peña Martínez, 2004) und somit zu bestimmen, ob ein individuelles gefrorenes
Ejakulat eine akzeptable Fertilität aufweist (Eilts, 2005a). Dennoch kann eine
Samenuntersuchung nicht die Potentia generandi garantieren, sondern lediglich
infertile Tiere und solche mit herabgesetzter Fertilität identifizieren, um sie von der
Nutzung zur Spermagewinnung oder zur Zucht auszuschließen (Amann und
Hammerstedt, 1993; Riesenbeck et al., 2001). Die Bestätigung der Fertilität kann
nur durch einen Nachweis der Konzeption oder durch einen eingetretenen
Zuchterfolg erbracht werden (Riesenbeck et al., 2001). Nach Amann und
Hammerstedt (1993) ist die Fertilität von Sperma sehr hoher oder sehr niedriger
Qualität relativ voraussagbar, wohingegen es bei Sperma mittlerer Qualität
schwieriger ist, da es keine einzelnen Spermieneigenschaften gibt, die hoch und
präzise mit der Fertilität in vivo korreliert sind. Erschwerend ist, dass jede
15
Literatur
Spermaprobe
zudem
eine
heterogene
Population
an
Samenzellen
(Subpopulationen) enthält, die nicht dasselbe Befruchtungspotenzial besitzen.
Traditionelle Annäherungen an die Untersuchung der Spermaqualität ignorieren
diese Heterogenität und betrachten eher den Mittelwert eines jeden Merkmals
(Amann und Hammerstedt, 1993). Hinzu kommt, dass basierend auf einer großen
Anzahl
von
Verpaarungen
eine
schlechte
Spermaqualität
zwar
die
durchschnittlichen Trächtigkeitsraten und die durchschnittliche Anzahl an Welpen
beeinflusst, aber auf individueller Ebene dennoch zu Trächtigkeiten und normalen
Wurfgrößen führen kann (Linde-Forsberg, 1991).
Subjektive Schätzungen von Spermaparametern sind durch zahlreiche Faktoren
beeinflusst, unter denen die Erfahrung der Untersucher eine wichtige Rolle spielt
(Verstegen et al., 2002). Diese Subjektivität der Analyse bei der konventionellen
mikroskopischen Untersuchung, insbesondere bei der Bestimmung der Motilität
und der Pathomorphologie (Amann, 1989), macht den Vergleich von Ergebnissen
aufgrund hoher Variabilität zwischen verschiedenen Laboren und Untersuchern
schwierig (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001a; 2001c).
Zusammenfassend ist die begrenzte Aussagekraft der mittels konventioneller
lichtmikroskopischer Untersuchungstechniken gewonnenen Ergebnisse durch
deren Subjektivität, Variabilität, der geringen Anzahl an untersuchten Samenzellen
und der niedrigen Korrelation mit dem Befruchtungspotenzial bedingt, was die
Notwendigkeit
neuer,
ergänzender
in
vitro
Untersuchungstechniken,
wie
Computer-gestützten Methoden zur Beurteilung von Motilität und Morphologie
sowie Durchflusszytometrie, erläutert (Peña Martínez, 2004; Rijsselaere et al.,
2005).
2.3.1 Konventionelle Spermauntersuchung
Üblicherweise erfasste Ejakulatparameter sind Volumen, Aussehen, pH-Wert,
Dichte,
SGZ,
Bewegungsaktivität
der
Samenzellen
sowie
die
Anteile
eosingefärbter und morphologisch abweichender Samenzellen (Günzel, 1986).
2.3.1.1
Makroskopische Untersuchung
Einleitend erfolgt die makroskopische Untersuchung. Hierbei werden Volumen,
Farbe, Konsistenz, Geruch und etwaige Beimengungen beurteilt (Hoffmann,
2003b).
16
Literatur
a) Volumen
Volumen und SGZ der spermienreichen Fraktion sind von der Körpergröße des
Rüden abhängig (Günzel, 1986). Das Volumen des Gesamtejakulates variiert
beim Hund von 0,5 bis 30 ml und ist abhängig von der Menge an aufgefangenem
Prostatasekret (Soderberg, 1986). Das Volumen ist bei dieser Spezies nicht mit
der Spermaqualität (Johnston, 1991; Root Kustritz, 2007) oder der Fertilität
(Soderberg, 1986) korreliert. Die Messung des Volumens ist Bestandteil der
Berechnung der SGZ im Ejakulat, welche ihrerseits einen Indikator der
Spermaqualität darstellt (Root Kustritz, 2007).
b) Farbe
Physiologischerweise ist Hundesperma weiß (Seager und Platz, 1977b;
Soderberg, 1986; Johnston, 1991). Sperma mit gelber Färbung deutet i. d. R. auf
eine Verunreinigung mit Urin hin (Seager und Platz, 1977b; Soderberg, 1986),
welcher toxisch für die Spermien ist (Soderberg, 1986). Auch Kontamination mit
Eiter kann eine gelbliche Farbe verursachen (Freshman, 2002). Eine grüne
Färbung kann durch Kontamination mit Eiter (Seager und Platz, 1977b) oder
entzündlichem Exsudat (Johnston, 1991) zustande kommen. Sperma mit roter
Färbung deutet im Allgemeinen auf frische Blutbeimengungen hin (Seager und
Platz, 1977b; Freshman, 2002), während braune Färbung hämolysiertes Blut
anzeigt (Freshman, 2002). Die häufigsten Gründe für Blut im Ejakulat sind
Prostataleiden
und
traumatische
Schädigung
der
stark
vaskularisierten
Schleimhautoberfläche des Penis (Soderberg, 1986; Freshman, 2002). Klare und
farblose Ejakulate lassen sich bei Azoospermie finden (Johnston, 1991; Root
Kustritz, 2007).
c) Konsistenz
Die physiologische Konsistenz bzw. Trübung von Hundesperma ist milchig bis
sahnig (Seager und Fletcher, 1972; Seager und Platz, 1977b). Allerdings können
auch Eiter, Akkumulation von Proteinen oder übermäßig viele Epithelzellen ein
verdicktes Seminalplasma verursachen und dessen Lichtdurchlässigkeit mindern.
In physiologischem Sperma ist die Trübung ein direkter Indikator der
Spermienkonzentration (Seager und Fletcher, 1972), wobei eine undurchsichtige
Probe i. d. R. auf eine hohe Spermienkonzentration hindeutet (Seager und Platz,
1977b).
17
Literatur
d) Geruch
Bei der Beurteilung des Geruchs ist unter physiologischen Bedingungen allenfalls
ein „geschlechtsspezifischer“ Geruch wahrzunehmen. Geruchliche Abweichungen
können in Verbindung mit Blut- oder Eiterbeimengungen im Ejakulat auftreten
(Hoffmann, 2003b).
e) Etwaige Beimengungen
Makroskopische Beimengungen in Form von Partikeln sind physiologischerweise
nicht im Ejakulat erkennbar. Das Vorhandensein von Schmutzpartikeln deutet auf
eine
sekundäre
Verunreinigung
durch
unsaubere
Samengewinnung
hin
(Hoffmann, 2003b).
2.3.1.2
Chemisch-physikalische Untersuchung
Die chemisch-physikalische Untersuchung des Ejakulates besteht aus der
Messung des pH-Wertes. Dieser wird mithilfe von Indikatorpapier bestimmt
(Freshman, 2002). Alternativ kann auch ein pH-Meter verwendet werden (Bartlett,
1962b). Als physiologisch wird ein pH-Wert im Gesamtejakulat zwischen 6,3 und
6,6 (Seager und Platz, 1977b) bzw. 6,7 (Johnston, 1991) angesehen. In der ersten
Fraktion liegt der mittlere pH-Wert bei 6,4, in der zweiten bei 6,2 und in der dritten
bei 6,5 (Bartlett, 1962b). Bei Hunden mit bakterieller Infektion der Prostata können
abweichende Werte gefunden werden, wobei der pH-Wert i. d. R. saurer wird. Dies
kann für die Wahl des Antibiotikums von entscheidender Bedeutung sein, da sich
beispielsweise in saurem Seminalplasma eher basische Antibiotika besser
anreichern (Johnston, 1991). Im Falle einer Infektion stellt der pH-Wert also eine
nützliche Hilfe bei der Auswahl eines geeigneten antibakteriellen Wirkstoffes dar
(Freshman, 2002).
2.3.1.3
An
die
Mikroskopische Untersuchung
makroskopische
Untersuchung
schließt
sich
die
mikroskopische
Untersuchung des Spermas an. Diese umfasst die Beurteilung der Motilität der
Samenzellen, der Intaktheit der Plasmamembran und des qualitativen und
quantitativen Vorkommens morphologisch veränderter Samenzellen sowie die
Bestimmung der Dichte und der SGZ. Weiterhin wird auf sonstige mikroskopische
Beimengungen geachtet (Hoffmann, 2003b).
18
Literatur
a) Motilität
Die Beurteilung der Motilität sollte sofort im Anschluss an die Spermagewinnung
erfolgen (Johnston, 1991; Freshman, 2002). Flüssig- bzw. kryokonserviertes
Sperma sollte vor der Untersuchung immer mindestens auf Raumtemperatur,
besser
jedoch
auf
Unterschieden
37°C,
werden
angewärmt
werden
Massenbewegung,
(Linde-Forsberg,
deren
Nachweis
1991).
von
der
Spermiendichte und der Motilität der einzelnen Samenzellen abhängig ist
(Soderberg, 1986), sowie Einzelmotilität, bei deren Beurteilung es sich um eine
subjektive Schätzung des Prozentsatzes an motilen Samenzellen handelt
(Freshman, 2002).
Obwohl die Motilität nur eines der Merkmale eines fertilen Spermiums ist (Peña
Martínez, 2004), stellt sie einen wichtigen sowie einfach und schnell zu
ermittelnden Parameter bei der Beurteilung der caninen Spermaqualität dar
(Johnston, 1991; Linde-Forsberg, 1991) und ist nach wie vor der am häufigsten
genutzte Indikator für eine normale Spermienfunktion (Peña Martínez, 2004).
Motilität ist ein Ausdruck der strukturellen und funktionellen Intaktheit der
Samenzellen. Daher ist der Prozentsatz vorwärtsbeweglicher Samenzellen
üblicherweise positiv korreliert mit dem Anteil an Samenzellen mit normaler
Plasmamembranintegrität und normaler Morphologie (Ellington et al., 1993; KumiDiaka, 1993). In einer anormalen Bewegung spiegeln sich oft die strukturellen
Defekte wieder, die bei der morphologischen Beurteilung gefunden werden. Eine
schnelle Abnahme der Motilität nach der Spermagewinnung kann ein Anzeichen
für geringe Fertilität des Spermas sein (Soderberg, 1986).
I. d. R. weisen Rüden mit hoher Fertilität > 80 % progressiv bewegliche
Samenzellen
auf
(Soderberg,
1986),
wobei
mindestens
70-75 %
vorwärtsbewegliche Samenzellen als Referenzwert angesehen werden (Fielden,
1971; Johnston, 1991; Linde-Forsberg, 1991; Freshman, 2002; Hoffmann, 2003b).
Eine Verminderung der Spermienmotilität ist eine häufige, frühzeitig eintretende,
nichtspezifische Veränderung, die bei Hunden mit einer Infektion oder anderen
Erkrankungen gefunden werden kann (Johnston, 1991). Motile Spermien sind
jedoch nicht zwangsläufig auch fertil, da z. B. nach der Kryokonservierung und
dem
Auftauen
akrosomale
Schädigungen
und
Veränderungen
der
Plasmamembran auftreten können, die zwar die Fertilität aber nicht die Motilität
beeinflussen (Eilts, 2005a).
19
Literatur
b) Lebend-Tot-Färbung
Zur Differenzierung von lebenden und toten Samenzellen kann eine NigrosinEosin-Färbung genutzt werden. Nach Anfertigung des Ausstriches werden zur
Beurteilung mindestens 200 Spermien ausgezählt, indem ungefärbte als lebend
und gefärbte als tot gewertet werden. Nachteilig an dieser Untersuchungsmethode
ist, dass die Interpretation von ungefärbt und gefärbt zwischen verschiedenen
Untersuchern variieren kann (Campbell et al., 1956).
Riesenbeck et al. (2001) und Hoffmann (2003b) empfehlen im Gegensatz zur
vorgenannten Methode zur Beurteilung des Anteils an lebenden Samenzellen die
Supravitalfärbung mit Eosin als alleinigem Farbstoff. Bei toten Samenzellen ist die
Plasmamembran permeabel für den Farbstoff Eosin, weshalb im Eosinausstrich
rotgefärbte Spermien zum Zeitpunkt der Färbung tot waren (Hoffmann, 2003b).
Der
Prozentsatz
an
„toten“
(eosingefärbten)
Spermien
im
Ejakulat
bei
Raumtemperatur variiert von 15 % in der zweiten Fraktion bis 20 % im
Gesamtejakulat (Bartlett, 1962a; Christiansen, 1984b). Seager und Fletcher
(1972) konnten Prozentsätze von 61 bis 99 % lebenden Spermien mit einem
Mittelwert von 84,3 % ermitteln und auch nach Morton und Bruce (1989) beträgt
die durchschnittliche Anzahl lebender Spermien 88 ± 9 %. Ein gesunder Rüde
sollte daher über 84 % lebende Spermien aufweisen (Seager und Fletcher, 1972).
c) Morphologie
Die Morphologie der Samenzellen kann mittels konventioneller Lichtmikroskopie
oder Phasenkontrastmikroskopie mit oder ohne Färbung untersucht werden (Root
Kustritz et al., 1998). Grundsätzlich kommen für die morphologische Untersuchung
von Hundespermien folgende Färbungen in Betracht: Färbung nach Papanicolaou
(Seager und Platz, 1977b), Eosin (Hoffmann, 2003b), Eosin-Nigrosin (Seager und
Platz, 1977b), Toluidinblau (Seager und Platz, 1977b), Diff-Quick (Johnston, 1991;
Freshman, 2002), Spermac® (Oettlé und Soley, 1988; Oettlé, 1993; Riesenbeck et
al., 2001; Hoffmann, 2003b) und Formolzitrat (Riesenbeck et al., 2001; Hoffmann,
2003b). Üblicherweise wird die Eosin-Nigrosin-Färbung verwendet; die Beurteilung
der Spermiendefekte erfolgt bei 1000-facher Vergrößerung mit Ölimmersion
(Soderberg, 1986).
Morphologische Veränderungen der Samenzellen können nach ihrem Ursprung in
primäre, sekundäre und tertiäre Veränderungen (Christiansen, 1984b; Oettlé und
Soley, 1988; Hoffmann, 2003c), in Haupt- (Major) und Nebendefekte (Minor)
20
Literatur
(Oettlé und Soley, 1988) sowie nach ihrer Lokalisation in Kopf-, Mittelstück- und
Schwanzveränderungen eingeteilt werden (Morton und Bruce, 1989):
Primäre Veränderungen entstehen während der Spermatogenese im Keimepithel
der Hoden (Christiansen, 1984b; Hoffmann, 2003c). Die häufigste primäre
Veränderung stellen proximale Zytoplasmatropfen dar (Morton und Bruce, 1989).
Als sekundäre Veränderungen, welche nach dem Vorgang der Spermiation, d. h.
nach Abgabe der Spermien in das Lumen der Tubuli seminiferi contorti, entstehen
(Hoffmann, 2003c), können geknickte oder gekrümmte Schwänze, abgelöste
Köpfe, distale Zytoplasmatropfen und abgelöste Akrosome angesehen werden
(Johnston, 1991; Hoffmann, 2003c). Tertiäre Veränderungen entstehen nach
Abgabe
der
Samenzellen
aus
dem
männlichen
Genitale
und
ähneln
weitestgehend den sekundären Veränderungen (Hoffmann, 2003c).
Hauptdefekte sind erwiesenermaßen mit einer verminderten Fertilität assoziiert,
während Nebendefekte erst zu einer herabgesetzten Fertilität führen, wenn sie in
großer Anzahl auftreten (Oettlé und Soley, 1988).
Es gibt verschiedene Klassifikationsmöglichkeiten für das Spermiogramm des
Hundes. Beispielhaft sei das Klassifikationsschema von Oettlé (Oettlé und Soley,
1988; Oettlé, 1993) angeführt:
1.
Akrosomale Veränderungen:
- Hauptdefekte: lippenartig, zystisch, anormale Verteilung
- Nebendefekte: akrosomreagiert, geschwollen, schwere
Schädigung,
abgelöst
2.
Kopfveränderungen:
- Hauptdefekte: makrozephal, mikrozephal, pyriform, Kranzdefekte, andere
Kernvakuolen, gefurchte Spermien, Doppelformen, starke Pleiomorphie/
bizarre Formen
- Nebendefekte: schmale Köpfe, schmale Kopfbasis aber nicht pyriform,
andere
Kopfbasisdefekte,
abaxiale
Implantation,
abgelöste
Köpfe,
nukleare Kondensation
3.
Mittelstückveränderungen:
- Hauptdefekte:
Zytoplasmatropfen,
gebrochene
Pseudoplasmatropfen, abgeknickte Mittelstücke
- Nebendefekte: distale Zytoplasmatropfen
21
Mittelstücke,
Literatur
4.
Schwanzveränderungen:
- Hauptdefekte: „dag“-Defekt, Doppelschwänze
- Nebendefekte: einfach gekrümmte oder aufgerollte Schwänze, terminal
aufgerollte Schwänze
5.
Andere Zellen:
Leukozyten, Spermienvorstufen
6.
Spermienagglutination:
Kopf an Kopf, Kopf an Schwanz, Schwanz an Schwanz, Agglutination an
andere Zellen
Ein Nachteil dieses und anderer Schemata ist die Unfähigkeit zur Erfassung
multipler Defekte einer Samenzelle (Oettlé, 1993). Wenn eine Samenzelle mehr
als einen Defekt aufweist, wird sie entsprechend der wichtigsten Veränderung
kategorisiert, oder aber entsprechend der dominierenden Veränderung, wenn die
Defekte von gleicher Bedeutung sind (Oettlé und Soley, 1988; Oettlé, 1993).
Der Gesamtanteil an morphologisch veränderten Samenzellen sollte bei
Normospermie einen Wert von 20 % nicht überschreiten (Seager und Platz,
1977b; Johnston, 1991; Riesenbeck et al., 2001; Hoffmann, 2003b).
Hunde können jedoch trotz einer Vielfalt „anormaler“ Spermien fertil sein, d. h. in
den vergangenen zwölf Monaten einen Wurf gezeugt haben (Morton und Bruce,
1989). Die Beziehung zwischen Spermienmorphologie und Fertilität (Soderberg,
1986) bzw. die jeweilige Bedeutung von verschiedenen Arten von Defekten in
Bezug auf die Fertilität (Linde-Forsberg, 1991) wurden beim Hund noch nicht
ausreichend untersucht. Allerdings konnte Oettlé (1993) feststellen, dass der
Grenzwert an morphologisch normalen Spermien, unter welchem die Fertilität
nachteilig beeinflusst wird, bei 60 % liegt (61 % versus 13 % Fertilität). Während
distale Plasmatropfen von Linde-Forsberg (1991) als unbedeutend für die Fertilität
angesehen werden, konnten Nöthling et al. (1997) jedoch eine negative
Korrelation von proximalen oder distalen Zytoplasmatropfen und der Motilität nach
dem Auftauen nachweisen.
d) Dichte und SGZ
Die Dichte eines Ejakulates kann mittels Hämozytometer, Spektrophotometer,
automatischem Zellzähler (Seager und Platz, 1977b; Christiansen, 1984b),
Durchflusszytometrie oder Computer-gestützter Spermienanalyse (Kuster, 2005)
bestimmt werden, wobei das Hämozytometer die gebräuchlichste Methode ist
22
Literatur
(Seager und Platz, 1977b) und als Golden Standard angesehen werden kann
(Hansen et al., 2006; Root Kustritz, 2007).
Da die Spermienkonzentration bzw. die Dichte im Wesentlichen von der Quantität
des ejakulierten Prostatasekrets abhängt, ist die SGZ der entscheidende
Parameter zur Beurteilung der Spermaqualität (Soderberg, 1986; Johnston, 1991).
Die SGZ ist positiv korreliert mit der Körpergröße des Hundes und der daraus
resultierenden Größe der Hoden (Olar et al., 1983; Günzel, 1986; Johnston, 1991;
Freshman, 2002). Auch die Frequenz der Ejakulationen beeinflusst die SGZ pro
Ejakulat (Boucher et al., 1958; Olar et al., 1983; England, 1999; Freshman, 2002).
Die SGZ kann durch mangelhafte Stimulation (keine Hündin anwesend), Stress,
Schmerzen oder andere Umweltfaktoren vermindert sein (Peña Martínez, 2004).
Als Referenzbereich gilt eine SGZ im Ejakulat von 300 Mio. bis 2 Mrd. (Johnston,
1991). Ein Rüde durchschnittlicher Größe sollte mindestens 250-300 Mio.
Samenzellen pro Ejakulat aufweisen (Freshman, 2002; Root Kustritz, 2007).
e) Mikroskopische Beimengungen
Während der mikroskopischen Untersuchung wird auf das Vorhandensein von
Fremdbeimengungen geachtet. Es können weiße und rote Blutzellen, epitheliale
Zellen
von
der
inneren
Auskleidung
des
Reproduktionstraktes
und
im
Zusammenhang mit Infektionen zellulärer Debris gefunden werden (Johnston,
1991). Auch primäre
Spermatozyten,
welche
auf eine
Malfunktion
des
Spermatogeneseprozesses hindeuten, können vorkommen (Seager und Platz,
1977b).
Des Weiteren sollten auch Spermienagglutinationen berücksichtigt werden. Diese
betreffen allerdings nicht das Anhaften an Eigelbpartikeln des Verdünners, an
Debris oder an Luftblasen (Freshman, 2002).
2.3.2 Hypoosmotischer Schwelltest (HOS-Test)
Dieser ursprünglich von Jeyendran et al. (1984) für die Humanmedizin entwickelte
Test untersucht die funktionale Integrität der Spermienplasmamembran, indem
deren Reaktion unter hypoosmotischen Bedingungen beobachtet wird (Jeyendran
et al., 1992). England und Plummer (1993) sowie Kumi-Diaka (1993) wendeten ihn
erstmals für die Untersuchung von caninem Sperma an. Im hypoosmotischen
Milieu kommt es über die intakte Zellmembran zu einem Flüssigkeitstransport bis
ein Gleichgewicht zwischen dem Inneren der Zelle und der Umgebung erreicht ist.
23
Literatur
Aufgrund des Einstroms von Flüssigkeit vergrößert sich die Zelle, wodurch eine
Auswölbung der Plasmamembran verursacht wird. Die Fibers (axonemaler
Komplex) des Spermienschwanzes sind normalerweise von der Plasmamembran
eng umschlossen. Wenn die Plasmamembran nun unter hypoosmotischen
Bedingungen anschwillt, so tritt ein Einrollen und Verbiegen der Schwanzfibers
innerhalb der Plasmamembran ein. Diese Schwanzveränderungen können mithilfe
eines
Phasenkontrastmikroskops
einfach
sichtbar
gemacht
werden.
Der
Spermienschwanz erscheint dabei aufgerollt (Jeyendran et al., 1992). Dieses
Phänomen wird als „tail curling“ (Jeyendran et al., 1992) oder „curled tail“
(Riesenbeck et al., 2001) bezeichnet. Die Ausprägung der typischen Aufrollung
des Schwanzes kann unterschiedlich sein (siehe Abb. 1), wird aber trotzdem
einheitlich als „curled tail“ benannt (Riesenbeck et al., 2001). Nur Samenzellen mit
einer
chemisch
und
physikalisch
intakten
Plasmamembran
zeigen
im
hypoosmotischen Milieu „tail curling“. Obwohl der HOS-Test also in erster Linie
nur die Integrität der Schwanzmembran erfasst, kann davon ausgegangen
werden, dass eine funktionell intakte Schwanzmembran einen guten Indikator
dafür darstellt, dass auch die Plasmamembran des Kopfes intakt ist. Die
biochemische Integrität der Plasmamembran ist essentiell für die normale
Spermienfunktion. Nicht nur die metabolischen Prozesse, die während der
Spermienbewegung ablaufen, sondern auch die Vorgänge, die während der
Befruchtung stattfinden, wie z. B. die Kapazitation, die Akrosomreaktion (AR) und
die Bindung der Spermien an die Eizelloberfläche, sind auf die biochemische
Integrität der Plasmamembran angewiesen (Jeyendran et al., 1992).
Als geeignet für den HOS-Test erwiesen sich 150 mosmol Natriumzitrat-FruktoseLösung (Jeyendran et al., 1984; England und Plummer, 1993; Riesenbeck et al.,
2001), 60 mosmol Fruktose-Lösung (Kumi-Diaka, 1993) sowie 100 mmol
Saccharose-Lösung (Pinto und Kozink, 2008). Der vorläufige Referenzbereich für
normosperme Rüden liegt bei 80 bis 96 % aufgerollten Schwänzen („curled tail“)
(Riesenbeck et al., 2001).
24
Literatur
Abb. 1: Schematische
Darstellung
der
Schwanzveränderungen
von
Rüdenspermien beim hypoosmotischen
hypoosmotischen Schwelltest (HOS-Test);
(HOS
Spermien mit Schwanzveränderungen im Stadium 1-4
1 4 (schwarz): intakte
Zellmembran; Spermien mit Schwanzveränderungen im Stadium 5 und
not curled (nc) (grau): defekte Plasmamembran (Riesenbeck et al., 2001)
Der HOS-Tes
Testt ist simpel, ökonomisch, klinisch leicht anwendbar und schnell
durchzuführen, weshalb er eine nützliche Ergänzung zur StandardspermaStandardsperma
untersuchung darstellt (Jeyendran et al., 1992; Pinto und Kozink, 2008).
2008) Im
Gegensatz zu den gebräuchlichen Färbungen für die Untersuchung
ntersuchung der Membran,
wie z. B.
B. der Eosin-Nigrosin-Färbung,
Eosin
Färbung, die nur die strukturelle Integrität der
Membran anzeigen, kann mit dem HOS-Test
HOS Test der funktionelle Status der
Plasmamembran untersucht werden. Funktionelle und strukturelle Integrität der
Plasmamembran
asmamembran sind entscheidend für die Viabilität der Spermien (Lechniak et
al., 2002).. Mithilfe
Mithilfe dieses Tests können Rüden identifiziert werden, die trotz eines
normalen Spermiogramms subfertil sind (Kumi-Diaka, 1993).
2.3.3 Computer-assisted
Computer
sperm analysiss (CASA)
Die Abkürzung
kürzung CASA steht für Computer
Computer-aided semen analysis (Iguer-Ouada
(Iguer
und
Verstegen, 2001a) bzw. für Computer-assisted
assisted sperm analysis (Verstegen et al.,
2002) und beschreibt ein automatisiertes System aus HardHard und Software zur
Visualisierung und Digitalisierung sukzessiver Bilder von Spermien sowie zu deren
Prozesssierung und der folgenden Analyse der Informationen (Amann und Katz,
2004).. Basierend auf der Untersuchung
Untersuchung individueller Samenzellen ermöglicht
CASA
eine
Konzentration,
objektive
Motilität,
Beurteilung
verschiedener
Geschwindigkeit
25
und
Spermaparameter
Morphologie,
bei
wie
letzterer
Literatur
insbesondere die Morphologie des Spermienkopfes (Verstegen et al., 2002). Mit
dem Ziel, die Genauigkeit und die Geschwindigkeit der Untersuchung zu
optimieren und auch kleinste Veränderungen der Spermienbewegung zu erfassen
(Ellington et al., 1993; Amann und Katz, 2004; Peña Martínez, 2004), dabei aber
die Subjektivität menschlicher Untersucher zu vermeiden, wird die computerisierte
Spermaanalyse immer häufiger routinemäßig in verschiedenen human- und
veterinärmedizinischen
Forschungs-
sowie
Diagnostiklaboren
eingesetzt
(Rijsselaere et al., 2003; Amann und Katz, 2004; Beletti et al., 2005).
Die erste Beschreibung eines Computer-gestützten Systems zur Verfolgung der
Spermienbewegung stammt aus dem Jahr 1979 (Dott und Foster); die
Erstbeschreibung des Einsatzes beim Hund erfolgte 1993 (Günzel-Apel et al.).
Trotz aller Objektivität ist es problematisch, dass die verschiedenen Systeme
unterschiedliche Terminologien und Berechnungsformeln und auch verschiedene
Softwareparameter/Einstellungen für die Spermienerkennung verwenden, was
einen direkten Vergleich der numerischen Werte schwierig bzw. unmöglich macht
(Amann und Katz, 2004; Hoogewijs et al., 2011). Gerade diese technischen
Einstellungen sind aber wichtig, um die Bewegungsbahnen der einzelnen
Spermien zu identifizieren und zu rekonstruieren (Rijsselaere et al., 2003), und sie
beeinflussen daher die Datenausgabe in kritischer Weise (Ellington et al., 1993;
Smith und England, 2001; Amann und Katz, 2004). Ohne Rücksicht auf die
technischen Einstellungen, das verwendete System, die betreffende Spezies und
die Spermabehandlung können CASA-Systeme irreführende oder fehlerhafte
Daten liefern (Ellington et al., 1993; Smith und England, 2001; Verstegen et al.,
2002; Rijsselaere et al., 2003).
Parallel zur Entwicklung der CASA-Systeme wurden spezielle Messkammern mit
einer fixen Tiefe von 20 µm entwickelt, die es ermöglichten, alle Zellen
ausreichend scharf darzustellen, um deren Digitalisierung zu erreichen (Amann
und Katz, 2004). Die Qualität der Zählkammern beeinflusst die Ergebnisse
deutlich (Hoogewijs et al., 2011) und ist daher, ebenso wie bei der manuellen
Spermabeurteilung, eine der Fehlerquellen bei CASA-Systemen (Verstegen et al.,
2002). Zudem hat auch die Beschickungstechnik der Kammern einen großen
Einfluss auf die Motilitätsparameter und die ermittelten Konzentrationen
(Hoogewijs et al., 2011).
Weitere wichtige Aspekte bei der Verwendung von CASA-Systemen sind die
Temperaturkontrolle, die Nutzung eines geeigneten Phasenkontrastmikroskops,
26
Literatur
die Probenvorbereitung (Amann und Katz, 2004) und die Analysezeit/-periode
(Smith
und
England,
2001).
Empfohlen
werden
eine
konstante
Untersuchungstemperatur von 37-38°C entsprechend der caninen Körper- und
Uterustemperatur (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001a; Amann und Katz, 2004)
und Inkubationszeiten ≤ 1 Minute (Smith und England, 2001). Niedrigere
Temperaturen sowie längere Inkubationszeiten führen zu einer negativen
Beeinflussung der Spermaqualität bzw. der Motilität (Iguer-Ouada und Verstegen,
2001a; Smith und England, 2001).
Aufgrund der hohen Dichte der zweiten Fraktion caniner Ejakulate ist für die
Untersuchung
mittels
CASA
üblicherweise
eine
Verdünnung
notwendig
(Verstegen et al., 2002; Rijsselaere et al., 2003; Schäfer-Somi und Aurich, 2007).
Hier werden Konzentrationen von 50 x 106 Spermien pro ml (Rijsselaere et al.,
2003) bzw. von 100 x 106 Spermien pro ml (Günzel-Apel et al., 1993; Iguer-Ouada
und Verstegen, 2001a; Schäfer-Somi und Aurich, 2007) oder eine Verdünnung
von 1 : 20 (Smith und England, 2001) empfohlen. Durch die Verdünnung des
Spermas werden verschiedene Motilitätsparameter (Smith und England, 2001;
Rijsselaere
et
al.,
2003;
Schäfer-Somi
und
Aurich,
2007)
und
die
Membranintegrität (Schäfer-Somi und Aurich, 2007) in Abhängigkeit vom Grad der
Verdünnung und der Zusammensetzung des verwendeten Verdünnermediums
signifikant beeinflusst (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001a; Smith und England,
2001; Amann und Katz, 2004). Das Verdünnermedium sollte keine Partikel
enthalten, die eine ähnliche Größe wie die Spermienköpfe besitzen (z. B. nichtgeklärtes
Eigelb
oder
Vollmilch-Verdünner),
da
diese
sonst
nicht
von
unbeweglichen Samenzellen unterschieden werden können (Verstegen et al.,
2002). Demnach kommen
Seminalplasma, physiologische
Kochsalzlösung
(isoosmolar mit dem Seminalplasma), Methylcellulose 0,3 mg (isoviskös mit dem
Seminalplasma), PBS, autologes oder gepooltes Prostatasekret, TRIS-Verdünner,
HEPES-TALP Medium, Eigelb-TRIS-Glukose-Verdünner, gefilterter Eigelb-TRISFruktose-Verdünner oder gefilterter Magermilch-Verdünner in Frage (Günzel-Apel
et al., 1993; Smith und England, 2001; Rijsselaere et al., 2003; Schäfer-Somi und
Aurich, 2007).
Zusammenfassend
kann
gesagt
werden,
dass
die
ausgewählten
Computerparameter, die genutzte Software, die mikroskopischen Bedingungen
und die Behandlung des Spermas zu einer neuen Quelle der Subjektivität führen
können (Rijsselaere et al., 2003). Eine Standardisierung der technischen
27
Literatur
Einstellungen wäre wünschenswert (Rijsselaere et al., 2003), da die Nutzung von
CASA-Systemen nach Standardisierung theoretisch einen Vergleich zwischen
verschiedenen Laboren ermöglicht (Günzel-Apel et al., 1993; Iguer-Ouada und
Verstegen, 2001c; Amann und Katz, 2004).
Entscheidender Nachteil der CASA-Systeme sind die hohen Anschaffungskosten
(Verstegen et al., 2002). Weitere nachteilige Auswirkungen sind, dass die
Untersucher dazu neigen, die lebenden Spermien während der klinischen
Untersuchung nicht kritisch zu betrachten und die vorbehaltslose Akzeptanz, dass
CASA einen „Golden Standard“ der Spermienbewegung darstellt (Amann und
Katz, 2004).
Das CASA-System SpermVision (Minitüb, Germany) ist im Vergleich zu anderen
CASA-Systemen in der Lage, zusätzlich zu den Motilitätsparametern die
Zellmembranintegrität objektiv zu beurteilen (Schäfer-Somi und Aurich, 2007).
Zudem konnte während der Evaluation dieses CASA-Systems bei standardisierten
Bedingungen eine hohe Genauigkeit und Wiederholbarkeit für fast alle
untersuchten Parameter erzielt werden (Schäfer-Somi und Aurich, 2007).
2.3.3.1
Konzentrationsbestimmung
Die exakte Bestimmung der Spermienkonzentration mithilfe von CASA-Systemen
stellt sich bei allen Spezies, bei denen dieser Parameter untersucht wurde, als
problematisch dar. Meist wird die Spermienkonzentration überschätzt. Eine
mögliche Erklärung hierfür ist das Phänomen der Kollision von Samenzellen mit
nachfolgender
mehrfacher
Zählung
derselben
individuellen
Zellen.
Die
Überschätzung der Spermienkonzentration nimmt mit steigender Verdünnung zu
(Iguer-Ouada und Verstegen, 2001a). Abweichungen zwischen den durch
konventionelle
Zählkammern
und
den
mittels
CASA
bestimmten
Spermienkonzentrationen können auch durch Verdünnerpartikel mit Spermienähnlicher Form und Größe verursacht werden, wenn die Verdünnermedien vor der
Zugabe zum Sperma nicht gefiltert wurden (Günzel-Apel et al., 1993).
Nach Schäfer-Somi und Aurich (2007) korrelieren jedoch die Ergebnisse für die
Konzentrationsbestimmung mit SpermCue, Thoma-Zählkammer und SpermVision
signifikant miteinander und auch Rijsselaere et al. (2003) konnten hohe positive
Korrelationen zwischen den mittels CASA (HTR Ceros 12.1) und den mittels
Bürker-Zählkammer bestimmten Spermienkonzentrationen ermitteln. Bei letzteren
28
Literatur
ließ sich im Allgemeinen allerdings eine Unterschätzung der Konzentration durch
CASA beobachten, welche mit steigenden Spermienkonzentrationen größer
wurde.
2.3.3.2
Motilitätsanalyse
Allgemein verwendete CASA-Parameter zur Beschreibung der Spermienmotilität
sind:
- die Gesamtmotilität, ausgedrückt als Prozentsatz der Spermien mit VCL
(velocity curvilinear) > 15 µm/s (Rigau et al., 2001)
- der Prozentsatz an vorwärtsbeweglichen Spermien, welche durch eine VAP
(velocity average pathway) > 50 µm/s und eine STR (straightness) > 70 %
definiert sind (Rijsselaere et al., 2003) bzw. der Prozentsatz an progressiven
schnellen Spermien, welche durch eine minimale STR von 90 % definiert sind
(Peña et al., 2003a)
- die kurvilineare Geschwindigkeit (VCL, velocity curvilinear), welche die mittlere
Geschwindigkeit gemessen über die tatsächlich zurückgelegte Punkt-zu-Punkt
Bahn der Samenzelle in µm/s darstellt (Verstegen et al., 2002; Rijsselaere et
al., 2003)
- die mittlere Geschwindigkeit (VAP, velocity average pathway), welche der
mittleren Geschwindigkeit über die geglättete Bahn in µm/s entspricht
(Verstegen et al., 2002; Rijsselaere et al., 2003)
- die
lineare
Geschwindigkeit
(VSL,
velocity straight
line),
welche
die
durchschnittliche Geschwindigkeit gemessen über eine gerade Linie vom
Anfang zum Ende der Bahn in µm/s repräsentiert (Verstegen et al., 2002;
Rijsselaere et al., 2003)
- die kurvilineare Strecke (DCL, distance curved line), welche die tatsächliche
Distanz ist, die das Spermium während der Analyseperiode zurückgelegt hat, in
µm (Schäfer-Somi und Aurich, 2007)
- die
Durchschnittsstrecke
(DAP,
distance
average
path),
welches
die
gemessene Distanz ist, wenn eine geglättete Linie als Referenz genutzt wird, in
µm (Schäfer-Somi und Aurich, 2007)
- die geradlinige Strecke (DSL, distance straight line), welche die Distanz von
dem Punkt, an dem sich die Samenzelle zu Beginn der Analyse befand, zu der
Lokalisation der Zelle im letzten Bild der Analyse in einer geraden Linie
darstellt, in µm (Schäfer-Somi und Aurich, 2007)
29
Literatur
- die durchschnittliche seitliche Kopfauslenkung (ALH, amplitude of lateral head
displacement), welche die mittlere Weite der Kopfoszillation der Spermien
während des Schwimmens angibt, in µm (Verstegen et al., 2002; Rijsselaere et
al., 2003)
- die beat cross frequency (BCF), welches die Frequenz in Hertz (Hz) ist, mit der
die Köpfe der Samenzellen die gemittelte Bahn der Spermien kreuzen
(Verstegen et al., 2002; Rijsselaere et al., 2003)
- der durchschnittliche Richtungswechsel des Kopfes (AOC, average orientation
change), welches die durchschnittliche Gradzahl ist, die der Spermienkopf sich
während der Analyse von links nach rechts bewegt hat; AOC < 9,5° zeigt an,
dass Spermien passiv bewegt werden oder immotil sind (Schäfer-Somi und
Aurich, 2007)
- die Geradlinigkeit (STR, straightness), welche der durchschnittliche Wert des
Verhältnisses VSL/VAP in Prozent ist (diese Geradlinigkeit schätzt die Nähe
des zurückgelegten Weges der Samenzelle zu einer geraden Linie mit dem
Hintergrund, dass 100 % die optimale Geradlinigkeit darstellen) (Verstegen et
al., 2002; Rijsselaere et al., 2003)
- die
Linearität (LIN, linearity),
welche
der
durchschnittliche Wert des
Verhältnisses VSL/VCL in Prozent ist (die Linearität beschreibt die Nähe der
Bewegungsbahn zu einer geraden Linie) (Verstegen et al., 2002; Rijsselaere et
al., 2003)
Die Parameter DCL/VCL, DAP/VAP, DSL/VSL, ALH, BCF und AOC sind
nachfolgend zum besseren Verständnis schematisch dargestellt (Abb. 2).
30
Literatur
Abb. 2: Schematische Abbildung der verschiedenen durch Computer-assisted
Computer
sperm
analysis Systeme
analysis-Systeme
gemessenen
Motilitätsparameter;
die
fortlaufend nummerierten Punkte stellen die einzelnen Positionen des
Spermiums zu den verschiedenen Zeitpunkten während der
Analyseperiode
dar;
DSL = geradlinige
DSL = geradlinige
Strecke,
VSL = lineare
VSL = Geschwindigkeit,
DAP =
DAP =
Durchschnittsstrecke,
VAP = mittlere
VAP
Geschwindigkeit, DCL = kurvilineare
DCL = kurvilineare (tatsächlich zurückgelegte)
zurückgelegte) Strecke,
VCL = kurvilineare Geschwindigkeit, ALH = durchschnittliche seitliche
VCL = kurvilineare
Kopfauslenkung, BCF = beat
BCF = beat cross frequency, AOC = durchschnittlicher
Richtungswechsel des Kopfes (nach Eder et al., 2009,, modifiziert)
Der
Prozentsatz
vorwärtsbeweglicher
vorwärtsbeweglicher
Samenzellen,
der
sich
in
der
Geschwindigkeit (VAP) und der Geradlinigkeit
Geradlinigkeit (STR) der Motilität widerspiegelt,
widerspiegelt, ist
einer der wichtigsten Parameter (Iguer-Ouada
(Iguer Ouada und Verstegen, 2001a).
2001a) Die
Amplitude (ALH) und die Frequenz (BCF) der Kopfauslenkung der Spermien sind
ebenso von Bedeutung, insbesondere für die Penetration der Zona pellucida
(Iguer-Ouada
Ouada und Verstegen, 2001a; Verstegen et al., 2002).
2002). Der Parameter ALH
ist dabei so definiert,
definiert, dass ein steigender Wert für ALH in einer steigenden
kurvilinearen Geschwindigkeit (VCL) resultiert (Wijchman et al., 2001).
2001) An
humanem Sperma konnte festgestellt werden, dass die Parameter VCL und ALH
für ein bestimmtes Ejakulat charakteristisch sind und
und dessen Identifizierung
ermöglichen (Wijchman et al., 2001).
Insgesamt besteht bei humanen Ejakulaten eine positive Korrelation zwischen
einer hohen Gesamtmotilität und hohen Spermiengeschwindigkeiten (Wijchman et
al., 2001).. Ebenso sind die Parameter Gesamtmotilität,
Gesamtmotilität, VCL und BCF hoch
31
Literatur
korreliert mit der Penetrationsrate humaner Oozyten (Fetterolf und Rogers, 1990).
Bei Untersuchungen an bovinem Sperma konnten bei kollektiver Korrelation
verschiedener Parameter mit der Fertilität, definiert als Non-Return-Rate von 59
Tagen, signifikante Zusammenhänge ermittelt werden. Die engste Korrelation
bestand dabei für die Parameterkombination ALH, BCF, LIN, VAP und VSL. Diese
Zusammenhänge lassen den Schluss zu, dass die potentielle Fertilität eines
Bullen auf Basis der Bewegungsqualität der Spermien abgeschätzt werden kann
(Farrell et al., 1998).
2.3.3.3
Viabilitätsanalyse
Die Integrität der Plasmamembran ist essentiell für die Befruchtungsfähigkeit von
Spermien. In letzter Zeit wurden verschiedene Fluoreszenzfärbungen für die
Untersuchung der Spermienmembranintegrität bei Hunden genutzt und validiert
(Rijsselaere et al., 2005):
- Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) in Kombination mit Propidiumiodid (PI)
(Rota et al., 1995; Peña et al., 1998b; Hermansson und Linde-Forsberg, 2006)
- SYBR-14 in Kombination mit PI (Rijsselaere et al., 2002a; Yu und Leibo, 2002;
Niżański, 2006; Schäfer-Somi und Aurich, 2007)
- Carboxy-Seminaphthorhodfluor (Carboxy-SNARF) in Kombination mit PI (Peña
et al., 1999)
- Calcein-AM in Kombination mit Ethidiumhomodimer (Calcein-AM/EthD-1)
(Sirivaidyapong et al., 2000)
- Hoechst 33258 (Hewitt et al., 2001)
Aufgrund des weitverbreiteten Einsatzes soll im Folgenden ausschließlich auf die
SYBR-14/PI-Färbung eingegangen werden:
SYBR-14 ist ein fluoreszierender, membranpenetrierender Nukleinsäure-Farbstoff,
der bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 488 nm maximal absorbiert und
bei 518 nm emittiert, wenn er an die DNA gebunden ist. Mikroskopische
Untersuchungen haben ergeben, dass SYBR-14 die Zellkerne lebender Zellen
hellgrün färbt, was durch simultane Untersuchung von Fluoreszenz und Motilität
bestimmt werden konnte. Im Gegensatz dazu färbt der Farbstoff PI nur nichtmotile
Spermien,
die
ihre
Membranintegrität
verloren
haben,
da
er
membranimpermeabel ist und somit nur in geschädigte (permeable) Zellen
eindringen kann. PI bindet ebenfalls an die zelluläre DNA und emittiert bei
32
Literatur
Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 488 nm rote Fluoreszenz (Harrison und
Vickers, 1990; Garner und Johnson, 1995).
Vorteil von SYBR-14 gegenüber den enzymbasierten Färbungen ist zum einen,
dass die Färbungszeit nicht so kritisch ist und zum anderen, dass eine
Hintergrundfärbung so gut wie nicht existent ist (Garner und Johnson, 1995).
Die Auswertung der Fluoreszenzfärbungen erfolgt entweder flowzytometrisch oder
fluoreszenzmikroskopisch durch Auszählen der Spermien (Waberski et al., 1999),
wobei Letzteres mühsam, zeitbeanspruchend und subjektiv ist und zudem nur
eine geringe Anzahl an Zellen pro Probe untersucht werden kann (Peña et al.,
1998b). Die Möglichkeit, eine große Anzahl an fluoreszenzmarkierten Spermien
mittels
Durchflusszytometrie
zu
analysieren,
ist
als
größter
Vorteil
der
Fluoreszenzfärbetechniken anzusehen (Peña et al., 1998b; Waberski et al., 1999;
Rijsselaere
et
al.,
2005).
Ein
weiterer
Vorteil
besteht
darin,
dass
fluorenzenzgefärbte Spermien auf ihre funktionellen und morphologischen
Aspekte hin untersucht werden können, ohne dass es zu einer Interferenz mit
extrazellulären Medien kommt, was insbesondere bei konserviertem Sperma von
Bedeutung ist (Peña Martínez, 2004).
Garner und Johnson (1995) konnten mittels SYBR-14/PI-Färbung folgende drei
Spermienpopulationen beobachten: lebende Spermien - SYBR-14-gefärbt, tote
Spermien - PI-gefärbt und moribunde Spermien - doppelt gefärbt, da die
Membranintegrität schwindet.
Beim Vergleich der Ergebnisse der Fluoreszenzfärbung mit SYBR-14 und PI mit
den Ergebnissen einer konventionellen Eosin-Nigrosin-Färbung stellte die
Fluoreszenzfärbung die sensitivere Methode dar, da auch kleinste, durch die
Zentrifugation verursachte Membranschäden erkannt werden konnten, welche bei
der Eosin-Nigrosin-Färbung nicht gefunden wurden (Rijsselaere et al., 2002a).
2.4 Spermakonservierung
Bei der Spermakonservierung unterscheidet man die Flüssigkonservierung für
eine kurzzeitige Lagerung durch Verdünnung und Kühlung auf 5°C und die
Kryokonservierung, welche eine zeitlich unbegrenzte Konservierung bei - 196°C in
flüssigem Stickstoff ermöglicht (Günzel, 1986). Eine weitere Möglichkeit zur
Konservierung von Hundesperma ist die Mikroeinkapselung des Spermas in Gel33
Literatur
Mikrokapseln (0,75 % oder 1 % Natriumalginat) oder polykationische Mikrokapseln
(zusätzlich Poly-L-Lysin) und deren anschließende Lagerung bei 4°C. Bei
polykationischer Mikroeinkapselung mit einer Alginatkonzentration von 1 % lässt
sich canines Sperma erfolgreich kühl lagern und erhält seine Motilität und Viabilität
für
bis
zu
sieben
Konservierungsform
Tage
(Shah
et
al.,
2010).
Auf
die
letztgenannte
wird im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht weiter
eingegangen.
Unabhängig davon, welche Konservierungsform angestrebt wird, sollte das
Sperma nach der Gewinnung so schnell wie möglich weiterverarbeitet werden
(Kibble, 1969).
Während die Initialmotilität in unverdünntem Sperma annähernd identisch mit der
in verdünntem Sperma ist (Günzel, 1986), sinkt bei unverdünntem Sperma, das
bei 4°C aufbewahrt wird, die durchschnittliche Motilität nach einer Lagerungsdauer
von zwei Tagen auf Werte < 20 %, wobei der Anteil an Samenzellen mit
morphologischen Veränderungen rapide ansteigt (Tsutsui et al., 2003b). Im
Vergleich hierzu reduziert sich die erzielte Konzeptionsrate von 80 % nach einem
Tag Lagerung auf 30 % nach zwei Tagen, was durch eine Verdopplung der
Inseminationsdosis von 200 auf 400 x 106 Spermien kompensiert werden kann
(Konzeptionsrate 70 %) (Tsutsui et al., 2003b). Generell ist die Nutzung von
unverdünntem Sperma nicht so erfolgreich wie die von verdünntem, was auf die
schädlichen Eigenschaften des Prostatasekretes oder anderer Komponenten des
Seminalplasmas zurückzuführen ist (Concannon und Battista, 1989).
Da bei der Spermakonservierung auch bei optimaler Methodik ein gewisser
Vitalitätsverlust
der
Samenzellen
unvermeidbar
ist,
müssen
an
das
Ausgangsmaterial besonders hohe Anforderungen gestellt werden. Daher sollten
für die Flüssig- und Kryokonservierung ausschließlich Ejakulate verwendet
werden, die den Anforderungen in Tab. 2 genügen (Pesch et al., 2007).
Tab. 2:
Qualitätskriterien für Rüdenejakulate (Pesch et al., 2007)
Kriterium
Referenzwert
vorwärtsbewegliche Spermien (%)
≥ 75
morphologisch veränderte Spermien (%)
≤ 20
pH-Wert
6,2-7,2
9
Gesamtspermienzahl (x 10 )
≥ 0,3-1,01
Volumen spermienreiche Fraktion (ml)
0,5-2,0
1
abhängig von der Körpergröße; z. B. Dackel ≥ 0,3, Dobermann > 1,0
34
Literatur
2.4.1 Flüssigkonservierung
Ziel dieser Art der Spermakonservierung ist es, die Befruchtungsfähigkeit der
Spermien über einen möglichst langen Zeitraum zu erhalten (Hoffmann, 2003d),
indem die Keimzellen bei niedrigen Temperaturen aufbewahrt werden, ohne dass
der Gefrierpunkt erreicht wird (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b; Lopes et al.,
2008), da dies intrazelluläre Schädigungen verursachen würde, welche die
Viabilität und die Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen beeinflussen können
(Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b). Bereits durch die Zugabe eines geeigneten
Verdünners zum Ejakulat wird eine Verlängerung der Lebensspanne der
Samenzellen erreicht (Hoffmann, 2003d). Der Verdünner stellt Energie bereit, hält
den pH-Wert und die Osmolarität aufrecht und schützt die Plasmamembran sowie
das
Akrosom
vor
Schädigungen
durch
Temperaturschwankungen
und
Erschütterungen beim Transport (Linde-Forsberg, 1991; Shahiduzzaman und
Linde-Forsberg, 2007). Eine darüber hinausgehende Konservierung ergibt sich
aus der Abkühlung des Spermas auf 4-5°C, welche den Metabolismus der
Samenzellen
herabsetzt
(Linde-Forsberg,
1995;
Hoffmann,
2003d;
Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007) und dadurch deren Langlebigkeit
erhöht (Linde-Forsberg, 1995). Der Erhalt der Befruchtungsfähigkeit der Spermien
in verdünntem und gekühltem Sperma basiert somit auf drei Faktoren:
1) geringerer Metabolismus der Spermien bei niedrigerer Temperatur, 2) Schutz
vor Kälteschock durch den Verdünner und 3) inhärente Resistenz von
Hundespermien gegen Kälteschock (Bouchard et al., 1990).
Zu Beginn der KB beim Hund wurde der Verdünnung und Konservierung von
Sperma wenig Aufmerksamkeit geschenkt (Harrop, 1956). In letzter Zeit ist die KB
mit flüssigkonserviertem Sperma jedoch zu einem interessanten Instrument in der
Hundezucht geworden (Rota et al., 1995; Peña et al., 2006; Kmenta et al., 2011).
Dieser Erfolg kann durch viele Gründe erklärt werden: Zum einen ist es relativ
einfach, flüssigkonserviertes Sperma herzustellen (Peña et al., 2006), da keine
besonderen Einrichtungen erforderlich sind (Pesch et al., 2007), zum anderen
können durch den verbreiteten Gebrauch der Serum-Progesteronbestimmung mit
flüssigkonserviertem Sperma gute Trächtigkeitsraten und optimale Wurfgrößen
erzielt werden (Peña et al., 2006). Außerdem hat die Entwicklung der Rassezucht
eine steigende Nachfrage nach Spermaimport und -export verursacht (Peña et al.,
2006) und gerade bei der Flüssigkonservierung sind die Versandkosten (one way)
gering (Linde-Forsberg, 2001). Allerdings erfordert die Verwendung von
35
Literatur
flüssigkonserviertem
Sperma
neben
der
kurzfristigen
Verfügbarkeit
des
Spenderrüden einen schnellen Samentransport (Pesch et al., 2007). Das größte
Problem bei der Flüssigkonservierung von Sperma stellt jedoch die begrenzte
Überlebensdauer der konservierten Samenzellen dar (Ponglowhapan et al., 2004;
Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007).
2.4.1.1
Herstellung von flüssigkonserviertem Sperma
Grundlage für die Herstellung von flüssigkonserviertem Sperma ist die zweite,
spermienreiche Fraktion des Ejakulates (Brochart und Coulomb, 1952; Seager
und Fletcher, 1972; Andersen, 1980; Peña et al., 2006). Ob Seminalplasma
enthalten sein darf oder nicht, wird aufgrund der zahlreichen positiven
(antioxidativ, höhere Osmotoleranz, erhöhte Membranstabilität) und negativen
Eigenschaften (reaktive Sauerstoffspezies, reduzierte Überlebensdauer und
Gefriertoleranz) kontrovers diskutiert (Andersen, 1980; Sirivaidyapong et al., 2001;
Rijsselaere et al., 2002a; Peña et al., 2006; Koderle et al., 2009; Strzeżek und
Fraser, 2009). Die Gegner der Prostatabeimengungen postulieren verschiedene
Zentrifugationsprotokolle zur Entfernung des Prostatasekrets (Rota et al., 1995;
Linde-Forsberg, 2001; Sirivaidyapong et al., 2001; Rijsselaere et al., 2002a;
Ponglowhapan et al., 2004; Hermansson und Linde-Forsberg, 2006; Günzel-Apel,
2007; Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007; Beccaglia et al., 2009a; Lopes
et al., 2009a; Niżański et al., 2009; Michael et al., 2010; Shah et al., 2010).
Ein Nachteil des Zentrifugierens von verdünntem Sperma ist, dass ein Teil der
Samenzellen
im
Überstand
verloren
geht,
wenn
relativ
niedrige
Zentrifugationsgeschwindigkeiten von 180 x g oder 720 x g verwendet werden
(Rijsselaere et al., 2002a). Tendenziell nimmt der Anteil an verlorenen Spermien
mit
steigender
Zentrifugationsgeschwindigkeit
und
steigender
initialer
Spermienkonzentration ab; jedoch führen zu hohe Geschwindigkeiten wie 1620 x g
und
2880 x g
zu einer
Schädigung
der Spermienmembran,
sodass
ein
Zentrifugationsprotokoll von fünf Minuten bei 720 x g als optimal angesehen wird
(Rijsselaere et al., 2002a). Obwohl nach Günzel (1986) und Rijsselaere et al.
(2002a)
die
Zentrifugation
weder
auf
die
Gesamtmotilität
und
die
Vorwärtsbeweglichkeit noch auf die akrosomale Integrität einen nachteiligen
Einfluss besitzt, konnten Koderle et al. (2009) infolge der Zentrifugation eine
Reduktion der Motilität nach dem Auftauen und eine Erhöhung des Prozentsatzes
an
morphologisch
anormalen
Spermien
36
sowie
des
Grades
der
Literatur
Chromatindenaturierung der Spermien im Zeitverlauf nachweisen, sodass
zumindest vor der Kryokonservierung das Zentrifugieren nicht länger per se
empfohlen werden kann.
Die Zugabe des Verdünners zum Sperma sollte umgehend nach der Gewinnung
(Foote und Leonard, 1964) tropfenweise unter leichtem Schwenken erfolgen
(Pesch et al., 2007), wobei Verdünner und Sperma die gleiche Temperatur, ca.
35°C (Andersen, 1980; Nishiyama et al., 1999), haben sollten (Linde-Forsberg,
1991; 1995).
Die Verdünnungsrate (Verhältnis von Ejakulat zu Verdünner) variiert von 1 : 1 bis
1 : 20 (Foote, 1964a; Foote und Leonard, 1964; Andersen, 1980; Christiansen,
1984a; Linde-Forsberg, 1991; Nishiyama et al., 1999; Pinto et al., 1999; IguerOuada und Verstegen, 2001b; Peña et al., 2006; Pesch et al., 2007), wobei
üblicherweise Verdünnungen zwischen 1 : 3 und 1 : 5 eingesetzt werden (Günzel,
1986; Linde-Forsberg, 1991; 1995; Peña et al., 2006). Andere Autoren empfehlen
eine Verdünnung auf eine Dichte von 100-200 bzw. 300 x 106 Samenzellen pro ml
(Tsutsui et al., 2003b; Ponglowhapan et al., 2004; Shahiduzzaman und LindeForsberg, 2007; Lopes et al., 2009a; Niżański et al., 2009). Optimalerweise ist die
Verdünnung von der initialen Spermienkonzentration, der Anzahl der zu
besamenden Hündinnen oder der Größe der Hündinnen abhängig (Peña et al.,
2006). Eine zu hohe Verdünnung kann die Motilität negativ beeinflussen (LindeForsberg, 1995).
2.4.1.2
Lagerung bzw. Versand
Üblicherweise erfolgt die Lagerung des flüssigkonservierten Spermas bei 4°C
(Andersen, 1980; Rota et al., 1995; Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b;
Hermansson und Linde-Forsberg, 2006; Pesch et al., 2007; Michael et al., 2010)
bzw. bei 5°C (Foote, 1964a; Foote und Leonard, 1964; Province et al., 1984;
Kumi-Diaka und Badtram, 1994; Linde-Forsberg, 2001; Ponglowhapan et al.,
2004; Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007; Beccaglia et al., 2009a;
Niżański et al., 2009), da diese Temperaturen höheren Lagerungstemperaturen
überlegen
sind
(Bouchard
et
al.,
1990).
Einzig
auf
den
Anteil
an
akrosomreagierten Spermien wirkt sich die Temperatur von 5°C nachteilig aus
(Kumi-Diaka und Badtram, 1994). Beim Versand ist nach Linde-Forsberg (1991)
für die meisten Transportdistanzen jedoch eine Temperatur von 10 bis 15°C
ausreichend.
37
Literatur
Für die Aufbewahrung kann ein steriles Plastikröhrchen mit Schraubverschluss
(Linde-Forsberg, 1991; 2001; Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b; Peña et al.,
2006; Pesch et al., 2007) oder eine Spritze (Lopes et al., 2008) verwendet werden,
welche, verglichen mit Glasröhrchen (Tsutsui et al., 2003b), beim Transport nicht
zerbrechen können (Linde-Forsberg, 1991; 2001). Das verdünnte Sperma sollte
im Dunkeln gelagert werden (Nishiyama et al., 1999; Peña et al., 2006).
Um eine zu schnelle Abkühlung zu vermeiden, wird das Röhrchen in einem mit
Wasser von Raumtemperatur gefüllten Glas platziert und mit diesem zusammen
für eine halbe bis vier Stunden (Andersen, 1980; Linde-Forsberg, 1991; Peña et
al., 2006) in den Kühlschrank gestellt, bevor es versandfertig gemacht wird (Peña
et al., 2006). Das Wasser im Becherglas verhindert einen Kälteschock während
des
Kühlungsprozesses
(Rijsselaere
et
al.,
2002a)
und
vermindert
Temperaturvariationen während des Aufbewahrungszeitraumes (Linde-Forsberg
und Forsberg, 1993). Eine weitere Möglichkeit zur Herunterkühlung des Samens
auf 5°C besteht darin, das verdünnte Sperma für zwei Stunden in eine
Styroporbox im Kühlschrank zu verbringen (Pesch et al., 2007). Um die
Temperatur auf 4°C abzusenken, kann auch ein programmiertes NiedrigTemperatur-Bad (UH-JF, Chino Ltd., Japan) eingesetzt werden, welches das
Sperma innerhalb einer Periode von einer Stunde auf die gewünschte Temperatur
abkühlt (Tsutsui et al., 2003b). Unabhängig von der Methode ist das Ziel des
langsamen
Abkühlens
(Ponglowhapan
et
al.,
eine
2004;
Reduktion
der
Hermansson
Effekte
und
des
Kälteschocks
Linde-Forsberg,
2006;
Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007; Niżański et al., 2009); am geringsten
werden Gesamtmotilität und Vorwärtsbeweglichkeit bei Kühlraten von - 0,3 bis
- 1°C pro Minute beeinflusst (Bouchard et al., 1990). Um Temperaturen unter 0°C
zu umgehen, sollte das das Sperma enthaltende Gefäß vor direktem Kontakt mit
Eiswürfeln oder Kühlakkus geschützt werden, was beispielsweise durch
Einwickeln in ein Stück Stoff erreicht werden kann, bevor es in das
Versandbehältnis verbracht wird (Linde-Forsberg, 2001).
Als Versandbehältnis können eine Thermosflasche, vorzugsweise mit weiter
Öffnung (Linde-Forsberg, 1991), eine Styroporbox mit einem Kühlakku (LindeForsberg, 2001) oder der Equitainer® (Lopes et al., 2009a) zum Einsatz kommen.
Lopes et al. (2009a) verglichen drei verschiedene Transportcontainer zum
Versand von flüssigkonserviertem Hundesperma: eine Styroporbox (Minitüb), eine
mit crushed Eis gefüllte Thermosflasche und den Equitainer® (Minitüb). Während
38
Literatur
nach 24 Stunden Lagerung alle drei Behältnisse ähnliche Ergebnisse bezüglich
der Erhaltung der Spermaqualität lieferten, war
nach 72 Stunden die
Spermaqualität der Proben, die im Equitainer® gelagert wurden, deutlich besser.
Eine tierärztliche Bescheinigung, die alle nötigen Informationen über den
Zuchtrüden einschließlich Gesundheitsstatus, Qualität und Charakteristika des
Spermas enthält, sollte dem Sperma beim Versand beigefügt werden (Peña et al.,
2006).
Vor der Verwendung zur KB sollte das flüssigkonservierte Sperma langsam auf
Raumtemperatur angewärmt werden (Linde-Forsberg, 1995).
2.4.1.3
Überlebensdauer
Wie bereits zu Beginn dieses Kapitels erwähnt, liegt das größte Problem bei der
Flüssigkonservierung von Sperma in der begrenzten Überlebensdauer der
konservierten Samenzellen (Ponglowhapan et al., 2004; Shahiduzzaman und
Linde-Forsberg, 2007). Die Zugabe des Verdünners verursacht zwar keine
signifikanten ultrastrukturellen Veränderungen an den Spermien, die Kühlung aber
resultiert in einem unmittelbaren Anstieg des Prozentsatzes an akrosomalen
Schädigungen und einem darauffolgenden Abfall der Viabilität. Die Auswirkungen
der Kühlung auf die Ultrastruktur der Spermien können unmittelbar oder verzögert
auftreten.
Die
unmittelbaren
Effekte
führen
zum
Tod
oder
zur
Befruchtungsunfähigkeit der Samenzellen durch akrosomale Schädigungen, die
verzögerten Effekte reduzieren die Langlebigkeit der Spermien durch eine
Veränderung der Plasmamembranstruktur (Burgess et al., 2001).
Nach Linde-Forsberg (1991) kann flüssigkonserviertes Hundesperma, eine gute
Ausgangsqualität vorausgesetzt, seine Befruchtungsfähigkeit für mindestens 12
bis 24 Stunden erhalten, gewöhnlich auch deutlich länger, sodass es für nationale
sowie für viele internationale Transporte genutzt werden kann. Allerdings lassen
sich hinsichtlich der genauen Dauer der Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit in der
Literatur keine konkreten Angaben finden. Es besteht jedoch kein Zweifel daran,
dass die Qualität von gekühltem Sperma mit steigender Lagerungsdauer abnimmt
(England und Ponzio, 1996; Ponglowhapan et al., 2004) und auch die
Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen aufgrund oxidativer Schädigung verringert
wird (Lopes et al., 2008). Die zeitliche Abnahme der Befruchtungsfähigkeit von
flüssigkonserviertem
Sperma
ist
aber
schwierig
einzuschätzen,
da
sie
offensichtlich nur bedingt mit der Abnahme der Motilität korreliert (Pesch et al.,
39
Literatur
2007). So sinkt das Befruchtungspotential von Spermien bereits circa eine Woche
vor einem zu beobachtenden Motilitätsabfall deutlich ab (Peña et al., 2006). Aus
diesem Grund wird trotz Erhalt von Motilität und Membranintegrität über
mindestens
fünf
bis
sieben
Tage
(Peña
et
al.,
2006)
empfohlen,
flüssigkonserviertes Sperma innerhalb von zwei bis drei Tagen nach der
Gewinnung zu verwenden (Günzel, 1986; Peña et al., 2006; Pesch et al., 2007).
Bei
Nutzung
von
länger
gelagertem
Flüssigsperma
sinken
die
Befruchtungschancen, da sich die Anzahl fertiler Samenzellen mit zunehmender
Lagerungsdauer rasch reduziert (Günzel, 1986).
Nach Niżański (2009) bleibt die Befruchtungsfähigkeit von flüssigkonserviertem
Sperma für mehrere Tage erhalten und die mit diesem Sperma erzielten
Trächtigkeitsraten sind zufriedenstellend, aber abhängig von der Lagerungsdauer.
Tsutsui et al. (2003b) konnten nach einer Lagerungsdauer von vier Tagen in
einem TRIS-Fruktose-Eigelb-Zitrat-Verdünner bei intravaginaler Besamung mit
einer Besamungsdosis von 4 x 108 Samenzellen eine Konzeptionsrate von 83,3 %
(mittlere Wurfgröße 3,2 ± 1,3) erzielen. Verstegen et al. (2005) konnten zeigen,
dass sogar nach einer mittleren Lagerungsdauer von 9 ± 1,8 Tagen mit
flüssigkonserviertem Sperma noch akzeptable Trächtigkeitsraten erreicht werden
können.
Bei
einmaliger
intravaginaler
Besamung
erzielten
sie
eine
Trächtigkeitsrate von 50 % mit einer durchschnittlichen Wurfgröße von 2,3 ± 1,4
Welpen, bei zweimaliger intravaginaler Besamung eine Trächtigkeitsrate von 70 %
mit durchschnittlich 4,6 ± 2,8 Welpen pro Wurf. Dies deutet darauf hin, dass die
Befruchtungsfähigkeit der Spermien für mindestens zehn Tage aufrechterhalten
werden kann (Verstegen et al., 2005).
In
mit
TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünner
verdünntem
Sperma
zeigen
noch
mindestens 50 % der Spermien nach 13 ± 1 Tagen Lagerung eine gute Motilität
und auch nach 16 Tagen kann noch eine geringe Anzahl an motilen Samenzellen
nachgewiesen werden (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b). Diese Ergebnisse
machen deutlich, dass mit einem TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünner eine gute
Spermaqualität über bis zu zehn (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b) bzw.
vierzehn Tage (Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007) konserviert werden
kann und auch die Befruchtungsfähigkeit erhalten bleibt (Shahiduzzaman und
Linde-Forsberg, 2007). Allerdings sind Untersuchungen in vivo notwendig, um
diese Schlussfolgerung zu bestätigen (Shahiduzzaman und Linde-Forsberg,
2007).
40
Literatur
Eine Möglichkeit zur Untersuchung der Befruchtungsfähigkeit von Samenzellen in
vitro bietet der Zona pellucida (ZP)-Bindungstest, welcher die Fähigkeit der
Spermien, an eine homologe Eizelle zu binden, misst (Ström Holst et al., 2000).
Mittels dieses Tests konnte festgestellt werden, dass die Flüssigkonservierung bei
4°C für vier Tage die ZP-Bindungsfähigkeit der Samenzellen tendenziell reduziert,
wenngleich die mittlere Anzahl der an die ZP gebundenen Spermien nach einem
Tag Lagerungsdauer sich nicht signifikant von der nach vier Tagen unterscheidet.
Dennoch sprechen die Ergebnisse für einen negativen Effekt der längeren
Flüssigkonservierung auf die ZP-Bindungsfähigkeit von caninen Spermien (Ström
Holst et al., 2000) bzw. deuten darauf hin, dass mit steigender Lagerungsdauer
die
ZP-Bindungsfähigkeit
der
flüssigkonservierten
Samenzellen
abnimmt
(Ponglowhapan et al., 2004). Auch Hermansson et al. (2006) bestätigen dies,
indem sie zeigen konnten, dass nach einer Stunde Inkubation die ZPBindungsfähigkeit von für einen Tag gelagerten Spermien besser ist als die von für
zwei Tage gelagerten.
Bei einer vergleichenden Untersuchung der Penetration der ZP von in vitro
gereiften Oozyten durch frische und flüssigkonservierte Spermien zeigen frische
Spermien eine höhere mittlere Penetrationsrate. Allerdings kann während der
ersten Stunde der Ko-Inkubation von Spermien und Eizellen bei gekühlten
Spermien ein höherer Prozentsatz an Penetration gesehen werden als bei frischen
Spermien (De los Reyes et al., 2009). Dies deutet darauf hin, dass durch
Konservierungsmaßnahmen
kapazitationsartige
Veränderungen
initiiert
und
beschleunigt werden (Rota et al., 1999b). Auch nach Kumi-Diaka und Badtram
(1994) ist es wahrscheinlich, dass die Lagerung von Sperma bei 5°C die AR
initiiert bzw. triggert. Dabei hat die Zusammensetzung des Verdünnermediums,
insbesondere dessen Ca2+-Konzentration, einen entscheidenden Einfluss auf die
Inzidenz der AR; hohe Ca2+-Konzentrationen fördern die AR, während niedrige sie
verzögern (Sirivaidyapong et al., 2000). Im Gegensatz dazu konnten Hermansson
et al. (2006) feststellen, dass sowohl nach einer als auch nach vier Stunden KoInkubation die Anzahl der an die ZP gebunden Spermien pro Eizelle bei frischem
Sperma höher ist als bei flüssigkonserviertem Sperma.
Ponglowhapan et al. (2004) konnten eine Überlebensdauer der bei 5°C gelagerten
Samenzellen von 23 Tagen beobachten.
41
Literatur
Die Langlebigkeit der Samenzellen kann durch neues Substrat, d. h. durch
Zentrifugieren des gekühlten, verdünnten Samens, Entfernen des Überstandes
und Zusatz von frischem Verdünner, gesteigert werden. So verlängert die Zugabe
von frischem Verdünner an Tag 11 der Lagerung den Erhalt der Motilität der
Samenzellen bis zu Tag 21, verglichen mit Tag 16 bei Proben ohne
Mediumaustausch. Erfolgt an Tag 21 ein zweiter Austausch des Substrates, so
kann die Konservierung der Motilität bis Tag 27 ausgedehnt werden. Durch einen
weiteren Mediumaustausch an Tag 27 ist jedoch keine Motilitätsstimulation mehr
möglich (Verstegen et al., 2005). Die Mechanismen, welche die Reaktivierung und
Verlängerung der Motilität bewirken, sind möglicherweise durch den erneuten
Zusatz von Glukose und frischem Eigelb sowie durch die Entfernung schädlicher
Metaboliten aus dem Medium bedingt (Verstegen et al., 2005). Zusammenfassend
besteht durch Verdünneraustausch also die Möglichkeit, die Konservierung der
Motilität von Flüssigsperma auf bis zu drei Wochen auszudehnen (Verstegen et
al., 2005). Inwieweit dies auch auf die Befruchtungsfähigkeit zutrifft, ist unbekannt.
Allerdings konnte eindeutig gezeigt werden, dass offensichtliche Motilität oder
Immotilität kein verlässliches Kriterium zur Einschätzung des Fertilitätspotenzials
von caninem Sperma darstellt, da nicht-motile Spermien durch Hinzufügen eines
adäquaten Mediums ihre Motilität wiedererlangen und fertil bleiben können
(Verstegen et al., 2005).
Interessant ist zudem die Option, Hundesperma nach einer Kühllagerung für die
Dauer von ein oder zwei Tagen zu kryokonservieren, ohne signifikante
Verschlechterung der Motilität nach dem Auftauen und der akrosomalen bzw. der
Plasmamembranintegrität, verglichen mit der Kryokonservierung unmittelbar nach
der Spermagewinnung. Für diese Vorgehensweise ist der Uppsala Equex-2Verdünner besser geeignet als der TRIS-Eigelb-Verdünner (Hermansson und
Linde-Forsberg, 2006).
2.4.2 Kryokonservierung
Bedingt durch die Lagerung in flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von
- 196°C, wird der Stoffwechsel der Samenzellen stillgelegt, wodurch diese in den
Zustand der Anabiose eintreten (Hoffmann, 2003d) und nahezu unbegrenzt
lagerbar
werden
(England
und
Millar,
2008).
Dadurch
ermöglicht
die
Kryokonservierung den internationalen Handel mit Sperma und es können
42
Literatur
Samenbanken von Rüden herausragenden genetischen Wertes errichtet werden
(Peña et al., 2006).
Für die Kryokonservierung ist die Qualität des Ausgangsmaterials noch
entscheidender als bei der Flüssigkonservierung. Es sollten nur Ejakulate
verwendet werden, die in allen Parametern den geforderten Ansprüchen (siehe
Tab. 2) genügen (Pesch et al., 2007). Das Sperma mancher Rüden lässt sich
besser tiefgefrieren als das anderer Rüden (Seager und Fletcher, 1973; Eilts,
2005b; Farstad, 2009), was auf genetische Unterschiede bezüglich der
Zusammensetzung der zellulären Membranen zurückzuführen sein könnte, welche
in einer unterschiedlichen Wasserpermeabilität der Zellmembranen resultieren
(Eilts, 2005b). Individuelle Unterschiede hinsichtlich der Gefriertauglichkeit sind
auch von anderen Haustierspezies und vom Menschen bekannt (Seager und
Fletcher, 1973).
Da Hundesperma physiologischerweise weniger konzentriert ist als z. B.
Wiederkäuersperma, wird es vor der Weiterverarbeitung häufig zentrifugiert und
das gewonnene Pellet nach Verwerfung des Überstandes in Abhängigkeit von der
enthaltenen Spermienzahl mit einem Verdünner resuspendiert (Günzel, 1986). Die
Verdünner für die Kryokonservierung ähneln in ihrer Zusammensetzung denen für
die Flüssigkonservierung (Concannon und Battista, 1989; Pesch et al., 2007),
enthalten aber immer zusätzlich ein Kryoprotektivum (Linde-Forsberg, 1991;
Pesch
et
al.,
Kryokonservierung
Zitronensäure,
2007).
Üblicherweise
setzen
von
Hundesperma
aus
Glukose
oder
Fruktose
als
sich
TRIS
Verdünner
als
für
die
Puffersubstanz,
Energiequelle,
Eigelb
als
Membranprotektivum und Glycerol als Kryoprotektivum zusammen (Peña et al.,
2006), wobei gerade der Zusatz eines Kryoprotektivums essentiell ist (LindeForsberg, 1991; Pesch et al., 2007).
Die Aufarbeitung kann nach einer Vielzahl ein- oder zweistufiger (Zugabe von zwei
verschiedenen Verdünnern mit zwischenzeitlicher Äquilibrierung) Protokolle
erfolgen; allen gemeinsam ist eine initiale Abkühlung auf 4°C bzw. 5°C, bevor das
Sperma zunächst über Stickstoffdampf und dann in flüssigem Stickstoff gelagert
wird (Gill et al., 1970; Silva und Verstegen, 1995; England und Ponzio, 1996;
Linde-Forsberg et al., 1999; Rota et al., 1999a; Peña und Linde-Forsberg, 2000;
Linde-Forsberg, 2001; Eilts, 2005b; Hermansson und Linde-Forsberg, 2006;
Martins-Bessa et al., 2006; Peña et al., 2006; Pesch et al., 2007). Hinsichtlich der
Konfektionierung werden Glasampullen, Röhrchen mit einem Volumen von
43
Literatur
0,25 bis 1 ml und Pellets unterschieden (Seager und Platz, 1977a; Günzel, 1986).
Üblicherweise werden 0,5 ml-Pailletten, welche auch als Midi-Pailletten (Minitüb,
84184 Tiefenbach, Deutschland) bezeichnet werden, verwendet (Andersen, 1980;
Linde-Forsberg, 1991; Pesch et al., 2007).
Nach frühestens zwölf Stunden sollte von jeder einzelnen Charge eine
Samenprobe auf ihre Qualität untersucht werden. Dazu wird eine Paillette im
Wasserbad bei 37°C über 20 Sekunden aufgetaut und direkt im Anschluss werden
die in Tab. 2 genannten Parameter bewertet. Der prozentuale Verlust an
vorwärtsbeweglichen Samenzellen sollte 20 % nicht überschreiten (Pesch et al.,
2007). Der Anteil an morphologisch veränderten Spermien kann durch das
Auftreten zusätzlicher tertiärer Veränderungen, welche insbesondere lose Köpfe
darstellen, bis auf 30 % erhöht sein (Hoffmann, 2003d). Generell sollte das
Sperma immer in der Weise aufgetaut werden, wie sie von der herstellenden
Person empfohlen wird, da die Methode des Auftauens von der Methode des
Einfrierens abhängig ist. Schnelles Einfrieren erfordert schnelles Auftauen und
umgekehrt (Linde-Forsberg, 1991).
2.4.3 Vergleich von Flüssig- und Kryokonservierung
Das gesteigerte Interesse an flüssigkonserviertem Sperma ist auf die besseren
Erfolgsraten der KB mit flüssigkonserviertem Sperma im Vergleich zu gefrorenem
Sperma zurückzuführen (Concannon und Battista, 1989) (siehe Tab. 1, Kap.
2.1.4). Gründe hierfür sind: 1) Schädigungen durch Kryokonservierung entfallen
(Concannon und Battista, 1989), 2) die Zervix stellt eine kleinere Barriere dar
(Concannon und Battista, 1989), da flüssigkonservierte Samenzellen eine
ausreichend hohe Motilität zur Überwindung der Zervixbarriere aufweisen (Pesch
et al., 2007), 3) die Anzahl an zu inseminierenden Spermien ist i. d. R. höher
(Concannon und Battista, 1989) und 4) die Lebensdauer der Spermien im
Reproduktionstrakt der Hündin ist länger, wodurch die Notwendigkeit einer
präzisen Bestimmung des Besamungszeitpunktes weniger kritisch ist als bei TGSperma (Concannon und Battista, 1989; Pinto et al., 1999).
Gerade bei Kurzzeitlagerung ist flüssigkonserviertes Sperma kryokonserviertem
Sperma stets deutlich überlegen. Die durchschnittliche Zeit, die es dauert, bis die
Qualität von flüssigkonserviertem Sperma der von kryokonserviertem entspricht,
beträgt
im
Mittel
circa
118,7 ± 25,9
44
Stunden.
Sollte
die
angestrebte
Literatur
Lagerungsdauer diese Zeitspanne von 4,9 Tagen überschreiten, so ist eine
Kryokonservierung des Spermas vorzuziehen (England und Ponzio, 1996).
Auf die Vorteile der Flüssigkonservierung hinsichtlich Herstellung und Versand
wurde bereits zuvor hingewiesen (Ponglowhapan et al., 2004; Verstegen et al.,
2005; Peña et al., 2006; Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007). Häufig sind
auch die rechtlichen Bestimmungen für Import und Export weniger kompliziert als
die für gefrorenes Sperma (Ponglowhapan et al., 2004).
Nachteilig
bei
flüssigkonserviertem
Sperma
ist
neben
der
begrenzten
Lebensdauer der konservierten Samenzellen (England und Ponzio, 1996;
Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007; Niżański, 2009) vor allem der
organisatorische Aufwand (Linde-Forsberg, 1991). So müssen kurzfristig der
Rüdenbesitzer,
der
die
Spermagewinnung
durchführende
Tierarzt,
der
Hündinnenbesitzer und der die KB ausführende Tierarzt verfügbar sein (LindeForsberg, 1991).
Ein entscheidender Vorteil der Kryo- gegenüber der Flüssigkonservierung ist darin
zu sehen, dass durch das Tiefgefrieren von Sperma die Möglichkeit der
Konservierung und Lagerung wertvoller Gene männlicher Tiere in Form von
Samenbanken für nahezu unendliche Zeit besteht (Linde-Forsberg, 1991; Peña et
al., 2006; England und Millar, 2008).
Nachteilig an der Kryokonservierung ist der erhöhte materielle und personelle
Aufwand, der die Durchführung der Kryokonservierung auf eine limitierte Anzahl
an
Tierärzten
begrenzt
(Linde-Forsberg,
1991).
Die
Tatsache,
dass
kryokonservierter Samen in flüssigem Stickstoff als Gefahrengut transportiert
werden muss, kann durch Nutzung eines sogenannten Dry-Shippers, dessen
Containerwände den Stickstoff absorbieren und so ein Austreten unmöglich
machen, umgangen werden (Linde-Forsberg, 1991). Ein weiterer Nachteil ist, dass
die Besamungstechnik, die bei gefrorenem Samen angewendet wird, wesentlich
schwieriger ist als die, die bei frischem Samen genutzt wird (Linde-Forsberg,
1991).
Zusammenfassend ist die Verwendung von flüssigkonserviertem Sperma i. d. R.
die Methode der Wahl, da sie einfacher und günstiger ist und bessere Ergebnisse
liefert (Linde-Forsberg, 1991). Mit guter Planung, die bereits dann beginnen sollte,
wenn die Hündin in den Östrus kommt, sollte das Problem der Organisation der
Spermagewinnung und des Samentransportes nicht allzu schwierig zu überwinden
sein (Linde-Forsberg, 1991). Im Gegensatz dazu sollte TG-Sperma empfohlen
45
Literatur
werden, wenn lange Transportzeiten zu erwarten sind, Sperma für mehrere
Hündinnen gefragt ist, die Personen, die in den Prozess involviert sind, am
geeigneten Tag für die Besamung einer bestimmten Hündin nicht greifbar sind und
natürlich wenn eine Sameneinlagerung für einen zukünftigen Gebrauch angestrebt
wird (Linde-Forsberg, 1991).
2.5 Verdünner zur Flüssigkonservierung von caninem Sperma
Durch die Zugabe eines geeigneten Verdünners zum Ejakulat kann die
Lebensdauer der Samenzellen verlängert werden (Hoffmann, 2003d). Der
Verdünner stabilisiert die Zellmembran (Eilts, 2005b), wodurch diese vor
Schädigungen durch Temperaturveränderungen und Erschütterungen beim
Transport geschützt wird (Linde-Forsberg, 1995). Gleichzeitig stellt er Energie
bereit und hält den pH-Wert sowie den osmotischen Druck konstant (LindeForsberg, 1995; Farstad, 1996). Üblicherweise finden als Verdünnerbestandteile
Nähr-, Puffer- und Schutzsubstanzen Verwendung (Günzel, 1986).
Die beste Methode, um die Eignung von Verdünnern für die Spermakonservierung
zu bewerten, ist der Vergleich der Konzeptionsraten nach KB. Allerdings ist dies
unter experimentellen Bedingungen bei Hunden üblicherweise nicht möglich;
deshalb werden für die Befruchtungsfähigkeit wichtige Spermienmerkmale wie
Motilität, Membranstatus und akrosomale Integrität nach längerer Lagerungsdauer
untersucht
(Rota
et
al.,
1995),
wobei
insbesondere
die
geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit seit langer Zeit zur Beurteilung der Verdünnerqualität
herangezogen wird (Schäfer et al., 1997). Durch Kombination von zwei oder
mehrerer dieser Tests sollte es möglich sein, eine signifikante Korrelation mit der
Fertilität zu erreichen (Rota et al., 1995).
2.5.1 Anforderungen an einen Verdünner
Folgende Ansprüche werden an einen Verdünner für die Spermakonservierung
gestellt:
- Bereitstellung von Nährstoffen als Energiequelle (Concannon und Battista,
1989; Hoffmann, 2003d)
- ausreichende Pufferkapazität (Concannon und Battista, 1989; Weitze, 2001;
Hoffmann,
2003d)
gegenüber
aeroben
46
und
anaeroben
toxischen
Literatur
Abbauprodukten der Spermien (Weitze, 2001) in einem pH-Wert-Bereich von
6,0-7,0 (Weitze, 2001; Hoffmann, 2003d), wobei gewöhnlich ein pH-Wert von
6,5-6,6 (Foote und Leonard, 1964; Hoffmann, 2003d) angestrebt wird; bei pHWerten > 7,0 erhöht sich die Stoffwechselaktivität der Samenzellen, was mit
einem raschen Verlust der Energiereserven verbunden ist; bei pH-Werten < 5,2
kommt es zu einer deutlichen Minderung der Motilität (Hoffmann, 2003d)
- Isotonie zum Seminalplasma (250-300 mosm/l) (Farstad, 1996; Hoffmann,
2003d), um einen physiologischen osmotischen Druck bzw. das osmotische
Gleichgewicht aufrechtzuerhalten (Concannon und Battista, 1989; Hoffmann,
2003d); isotone und leicht hypertone Verdünnermedien bieten bessere
Konservierungsbedingungen
als
hypotone
Medien
mit
gleicher
Zusammensetzung (Wales und White, 1958; Weitze und Petrunkina, 2007)
- physiologische Elektrolytkonzentration (Concannon und Battista, 1989)
- Schutz
der
Samenzellen
vor
einem
Kälteschock
während
des
Kühlungsprozesses (Concannon und Battista, 1989) durch Schutzkolloide
(Hoffmann, 2003d); dieser Zusatz ist bei Langzeitkonservierung oder im
Rahmen der Flüssigkonservierung bei 4°C notwendig und hat zum Ziel,
Schäden
an
der
Spermienmembran
durch
den
Aufbereitungsprozess
weitestgehend zu vermeiden (Hoffmann, 2003d)
- Vermeidung von Gefrierschädigungen der Samenzellen bei der Langzeitkonservierung durch den Zusatz von Kryoprotektiva (Concannon und Battista,
1989; Hoffmann, 2003d)
- Verhinderung des Wachstums von Bakterien (Concannon und Battista, 1989)
durch den Zusatz von Antibiotika (Hoffmann, 2003d)
- Verhütung von akrosomalen Veränderungen; dabei sollte die Fähigkeit der
Spermien, zum geeigneten Zeitpunkt eine physiologische AR zu durchlaufen,
erhalten bleiben; die Konzentrationen von Ca2+ und anderer Komponenten des
Verdünnermediums
beeinflussen den
akrosomalen Status;
hohe Ca2+-
Konzentrationen fördern die AR, niedrige hemmen sie (Sirivaidyapong et al.,
2000).
47
Literatur
2.5.2 Inhaltsstoffe
2.5.2.1
Zuckerkomponenten
Zuckerkomponenten gehören zu den Hauptbestandteilen von Verdünnern zur
Spermakonservierung (Ponglowhapan et al., 2004) und erfüllen verschiedene
Funktionen: In glykolisierbarer Form (Glukose, Fruktose, Mannose oder
Arabinose) dienen sie den Spermien als Energiesubstrat (Weitze, 2001), indem
sie in Glykolyse und Krebszyklus verstoffwechselt werden (Rigau et al., 2001).
Außerdem werden sie in Form von Glykogen gespeichert, um eine mittel- bis
langfristige Energiereserve für die Erhaltung der Motilität aufzubauen, für den Fall,
dass keine externen Energiequellen verfügbar sind (Rigau et al., 2001). Des
Weiteren tragen die Zuckerkomponenten wesentlich zur Osmolarität des
Verdünnermediums bei (Weitze, 2001). Der letztgenannte Punkt ist abhängig von
der Fähigkeit der Zucker, die Zellmembran zu durchdringen, welche wiederum
temperaturabhängig ist. Aus diesem Grund werden einige Zucker bei höheren,
andere bei tieferen Temperaturen bevorzugt (z. B. sind Glukose, Fruktose,
Mannose und Sukrose zur Konservierung von Schafspermien besser geeignet bei
37°C, hingegen Ribose, Xylose, Arabinose und Galaktose bei 5°C) (Weitze, 2001).
Weiterhin können Zucker eine kryoprotektive Wirkung entfalten (Weitze, 2001).
Der wichtigste Effekt von Zuckerkomponenten in Verdünnern zur Flüssigkonservierung ist die Aufrechterhaltung der Spermienmotilität (Ponglowhapan et
al., 2004). Zucker sind als externe Energiequelle essentiell für die Erhaltung der
Motilität, weshalb die Motilität einen bedeutenden Indikator für die Zuckernutzung
durch die Spermien darstellt (Ponglowhapan et al., 2004). Werden Spermien in
Abwesenheit jeglicher externer Energiequellen inkubiert, so können sie ihre
Motilität bis zu 60 Minuten erhalten, wobei sich allerdings die Motilitätsmuster
verändern. Die interne Energiequelle, die dabei genutzt wird, könnte Glykogen
sein, welches in caninen Spermien in erheblichen Mengen vorhanden ist (Rigau et
al., 2001). Zuckerzusatz in Form von Glukose (1 %) zu einem Eigelb-Zitrat-GlycinVerdünner erhöht die Motilität nach einer Lagerungsdauer von 13 Tagen
signifikant, verglichen mit einer Kontrolle ohne Glukose (40 % versus 28 %) (Foote
und Leonard, 1964). In Verdünnern mit Zuckerzusatz in einer Konzentration von
70 mM
sind
die
durchschnittliche
Gesamtmotilität,
der
Anteil
an
vorwärtsbeweglichen Spermien und die Werte des Motilitätsparameters VAP
signifikant erhöht und es können Werte von ≥ 70 % Gesamtmotilität über eine
48
Literatur
Lagerungsdauer von bis zu acht Tagen aufrechterhalten werden (Ponglowhapan
et al., 2004). Die mittleren Werte für VAP, VSL und VCL steigen im Vergleich zu
frischem Sperma in der ersten Lagerungsperiode nach Verdünnung signifikant an,
was
darauf
hindeutet,
dass
Zuckerzusätze
in
Verdünnern
die
Spermiengeschwindigkeit anregen (Ponglowhapan et al., 2004).
Canines
Sperma
ist
durch
eine
sehr
niedrige
Fruktosekonzentration
charakterisiert; trotzdem können Hundespermien zugesetzte Fruktose unter
anaeroben Bedingungen in gleichem Ausmaß nutzen wie Spermien von Spezies,
die ein fruktosereiches Ejakulat produzieren (Bartlett, 1962b).
Generell können als Zuckerkomponenten Fruktose, Galaktose, Glukose, Xylose
(Monosaccharide), Laktose, Trehalose, Maltose, Sukrose (Disaccharide) oder
Raffinose (Trisaccharid) eingesetzt werden (Yildiz et al., 2000).
Die am häufigsten genutzten Zucker in Verdünnern für die Flüssigkonservierung
von caninem Sperma sind Glukose und Fruktose, welche von frisch ejakulierten
Hundespermien
in
separaten
Stoffwechselwegen
metabolisiert
werden
(Ponglowhapan et al., 2004). Letzteres bedingt, dass sich die Effekte von Glukose
und Fruktose auf den Energiestatus der Zellen voneinander unterscheiden,
wodurch gleichzeitig die Motilitätsmuster verschieden sind. Fruktose führt zu
einem schnelleren und mehr linearen Bewegungsmuster, während Glukose eine
mehr oszillatorische Bewegung verursacht. Allerdings wird weder durch Fruktose
noch durch Glukose der Prozentsatz an motilen Spermien verändert (Rigau et al.,
2001). Welcher Zucker (Fruktose oder Glukose) als Energiezusatz besser
geeignet ist, wird kontrovers diskutiert (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b;
Ponglowhapan et al., 2004). Allerdings ist der Glukoseverbrauch stets höher als
der Fruktoseverbrauch, wenn beide Zucker in gleichen Mengen vorhanden sind
(Ponglowhapan et al., 2004), was darauf hindeutet, dass Hundespermien
vorzugsweise
Glukose
nutzen
(Iguer-Ouada
und
Verstegen,
2001b;
Ponglowhapan et al., 2004). Eine mögliche Erklärung für die Präferenz von
Glukose könnte die höhere Kapazität an Glukosetransportsystemen sein
(Ponglowhapan et al., 2004). Untersuchungen beim Mann ergaben sogar, dass
humane Spermien Glukose im Seminalplasma selbst dann bevorzugt verwenden,
wenn die Fruktosekonzentration 50-fach höher ist (Martikainen et al., 1980).
In einer vergleichenden Untersuchung verschiedener Zuckerzusätze (70 mM) zu
einem TRIS-Zitrat-Verdünner mit 8 % Glycerol und 20 % Eigelb hinsichtlich ihres
Einflusses auf Motilität, Viabilität und akrosomale Integrität während Verdünnung,
49
Literatur
Äquilibrierung und Kryokonservierung konnten Yildiz et al. (2000) feststellen, dass
die verwendete Zuckerart die genannten Parameter während der Äquilibrierung
und der Kryokonservierung signifikant beeinflusst. So reduziert der Zusatz von
Galaktose, Laktose, Trehalose, Maltose und Sukrose bei äquilibrierten Proben
signifikant den Prozentsatz geschädigter Akrosome. Disaccharidzusatz (mit
Ausnahme von Laktose) vermindert den Anteil an toten Spermien nach dem
Auftauen und/oder den Prozentsatz geschädigter Akrosome ohne die Motilität
nach dem Auftauen zu fördern, wohingegen der Zusatz von Monosacchariden,
insbesondere Fruktose und Xylose, Motilität, Viabilität und akrosomale Integrität
nach dem Auftauen verbessert (Yildiz et al., 2000).
Die Zuckerkomponenten werden vermutlich in Milchsäure umgewandelt, was
einen stärkeren Abfall des pH-Wertes während der Lagerung bedingt (Foote,
1964b).
Die
eingesetzten
Monosaccharidkonzentrationen
in
den
gebräuchlichen
Verdünnern für die Flüssigkonservierung von Hundesperma reichen von 5 bis
120 mM (Foote, 1964a; Gill et al., 1970; Province et al., 1984; Rota et al., 1995;
Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b; Ponglowhapan et al., 2004; Verstegen et al.,
2005). Ponglowhapan et al. (2004) konnten eine Überlegenheit höherer
Konzentrationen (70 mM) gegenüber niedrigen (10 mM) feststellen. Sie sehen
einen TRIS-Eigelb-Verdünner mit einer Fruktosekonzentration von 70 mM als am
geeignetsten für die Langzeitkonservierung von Flüssigsperma an. Abweichend
davon sind Rigau et al. (2001) der Ansicht, dass der Einsatz hoher
Zuckerkonzentrationen die Konservierung nicht begünstigen kann, da die
Samenzellen einer Umgebung ausgesetzt werden, welche ihre Energiegewinnenden
Mechanismen
Zuckerkonzentrationen
positivere
sättigt.
Effekte
Deshalb
ausüben,
könnten
weil
sie
niedrigere
zu
einem
physiologischeren Energiestatus der Hundespermien führen (Rigau et al., 2001).
2.5.2.2
Puffer
Hundespermien sind in einem pH-Bereich von 5,0 bis 10,0 beweglich, mit einem
pH-Optimum zwischen 7,0 und 8,5, innerhalb dessen sie maximale Motilität zeigen
(Wales und White, 1958). Die metabolische Aktivität der Samenzellen resultiert in
einer Anhäufung von Wasserstoffionen. Gibt es keine Mechanismen für die
Entfernung dieser Ionen, so sinkt der pH-Wert des Verdünners, was eine
Reduktion der Langlebigkeit der Spermien und ihrer Fertilität zur Folge hat. Um
50
Literatur
dies zu vermeiden, kommen Puffersysteme zum Einsatz (England, 1993). Dabei
können Puffer entweder in geringer Konzentration zur Aufrechterhaltung eines
bestimmten pH-Wertes oder als Hauptkomponente des Verdünners (Zitrat, TRIS)
verwendet werden, um Tonizität und Pufferkapazität zu gewährleisten (Weitze,
2001). Die meisten Verdünner puffern in einem pH-Wert-Bereich von 6,9 bis 7,1
(England, 1993).
Beispielsweise werden Bikarbonat und Zitrat, welche dem Verdünner in Form von
Natriumbikarbonat und/oder Natriumzitrat zugesetzt werden, als Puffer verwendet
(Weitze und Petrunkina, 2007). Beim Vergleich von Zitrat-, Phosphat- und GlycinPuffer, stellte sich der Zitrat-Puffer (Natriumzitrat) als überlegen dar, wobei
Konzentrationen von 1,16 % oder 1,45 % Natriumzitrat besser geeignet waren als
niedrigere Konzentrationen (Foote und Leonard, 1964).
Neuere Verdünner basieren auf organischen Zwitterionen-Puffern (England, 1993;
Weitze, 2001; Weitze und Petrunkina, 2007), wie TES und HEPES, die
Schwermetalle binden und den pH-Wert kontrollieren (Weitze und Petrunkina,
2007). Auch die Verwendung von TRIS eröffnete neue Möglichkeiten (Weitze,
2001). Nachteilig an TRIS ist jedoch, dass es bei einem pH-Wert von 7,0 nur eine
relativ geringe Pufferkapazität besitzt (England, 1993; Weitze, 2001), während
TES und HEPES bei 20°C einen pK-Wert von 7,15-7,55 aufweisen (Weitze, 2001).
Die Puffersubstanzen müssen vor der Verwendung mit Alkali oder Säure auf den
entsprechenden pH-Wert titriert werden; TRIS-HCl, TRIS-Zitronensäure oder TESTRIS sind oder waren wichtige Kombinationen (Weitze, 2001).
Des Weiteren haben auch Proteine frischer oder gefriergetrockneter Magermilch
eine zufriedenstellende Pufferkapazität. Ihr Gebrauch beschränkt sich allerdings
auf die Tierarten Schaf, Ziege und Pferd (Weitze, 2001).
2.5.2.3
Membranprotektiva
Die Spermienplasmamembran reagiert auf Temperaturschwankungen durch
Änderungen ihres physikalischen Status. Innerhalb eines Temperaturbereiches
von ca. 17 bis 36°C können Temperaturschwankungen im Hinblick auf die
Intaktheit der Plasmamembran aufgefangen werden. Bei weiter abfallenden
Temperaturen treten Plasmamembranschäden auf, welche sich in Kühl- und
Gefrierschäden unterteilen lassen (Hoffmann, 2003d).
Die Kühlschäden ergeben sich aus dem sog. „Kälteschock“ (Watson und Morris,
1987; Weitze, 2001; Hoffmann, 2003d) bzw. „Kühlschock“ (Weitze und Petrunkina,
51
Literatur
2007), einem Phänomen, welches bei Temperaturabsenkungen in den Bereich
von ca. + 17 bis + 4°C eintritt (Hoffmann, 2003d). Als primäre Ursache hierfür
werden Fluiditätsveränderungen in der Plasmamembran verantwortlich gemacht
(Hoffmann, 2003d), welche durch eine Veränderung der Lipidzusammensetzung
des Membranbilayers entstehen (Hammerstedt et al., 1990; Weitze und
Petrunkina, 2007). Eine Temperaturerniedrigung fördert die Verschiebung von
einer Flüssigphase zu einem Gelzustand (Hammerstedt et al., 1990; Hoffmann,
2003d; Weitze und Petrunkina, 2007) durch Verminderung der Lateralbewegung
von Membranphospholipiden (Weitze und Petrunkina, 2007) bzw. durch
Zusammenlagerung von nicht-bilayer Lipiden (Hammerstedt et al., 1990). Die
Membranen verlieren ihre selektive Permeabilität, was in einer Freisetzung vieler
zellulärer Komponenten (Lipide, Proteine, Ionen) resultiert und zusätzlich den
Einstrom von Natrium- und Calciumionen in das Zellinnere ermöglicht. In Folge
nimmt die metabolische Aktivität ab und weitere sekundäre Veränderungen
entstehen (Watson und Morris, 1987). Die Viabilität von Zellen nach einer
Temperaturveränderung ist von der Schnelligkeit der Temperaturerniedrigung, der
finalen Temperatur und der Zeitdauer der Inkubation bei reduzierter Temperatur
vor der Wiedererwärmung abhängig; mit zunehmender Inkubationszeit steigt der
Verlust an Viabilität (Watson und Morris, 1987).
Der Kälteschock ist je nach Spezies verschieden ausgeprägt (Weitze, 2001;
Hoffmann, 2003d); Hundespermien reagieren relativ unempfindlich, während
beispielsweise Schweinespermien sehr empfindlich sind (Hoffmann, 2003d).
Wichtige Effekte des Kälteschocks sind: Verminderung der Motilität (Weitze und
Petrunkina, 2007), Freisetzung von Enzymen (Watson und Morris, 1987; Weitze
und Petrunkina, 2007), Ionentransporte über die Membran (Watson und Morris,
1987; Weitze und Petrunkina, 2007) und Verlust von Membranlipiden (Weitze und
Petrunkina,
2007).
Die
Membranpermeabilität
wird
erhöht,
sodass
Phasenveränderungen und der damit verbundene Einstrom von freien Ca2+-Ionen
aus der Umgebung in die Zelle calciumabhängige Vorgänge auslösen, die zu
kapazitationsähnlichen Phänomenen führen (kühlabhängige „Kapazitierung“;
Weitze, 2001), die Zellmembran fusiogener und somit instabiler machen (Weitze
und Petrunkina, 2007) und damit die Überlebensfähigkeit der Samenzellen im
Hinblick auf ihre Befruchtungsfähigkeit begrenzen (Weitze, 2001). Ein großer
Anteil der Spermien zeigt nach einem Kälteschock geschädigte akrosomale
Membranen (Watson und Morris, 1987).
52
Literatur
Unreife Spermien aus den oberen oder mittleren Regionen des Epididymis sind
weitaus weniger empfindlich gegenüber Kälteschockschäden, was auf die sich
ändernde Lipidzusammensetzung der Membranen während der Spermienreifung
zurückzuführen sein könnte (Watson und Morris, 1987).
2.5.2.3.1 Eigelb
Um die durch das Phänomen des „Kälteschocks“ induzierten Schäden an der
Plasmamembran möglichst gering zu halten, hat sich der Zusatz von Eigelb zum
Verdünner als Schutzkolloid über alle Spezies hinweg bewährt (Hoffmann, 2003d)
und ist weitverbreitet (Beccaglia et al., 2009a; Farstad, 2009). Die Mehrheit der
Verdünner enthält Eigelb als Haupt-Membranprotektivum (Kmenta et al., 2011).
Eigelb ist keine definierte Substanz, sondern ein komplexes biologisches Produkt
(Beccaglia et al., 2009a; Farstad, 2009), welches durch eine extrem hohe
Variabilität in seiner Zusammensetzung gekennzeichnet ist (Bergeron und
Manjunath, 2006; Beccaglia et al., 2009a). Es enthält Proteine, Vitamine,
Phospholipide, Glukose, antibakterielle Stoffe und Antioxidantien, welche alle
potentiell nützlich für die Integrität der Zellmembran sind (Farstad, 2009). Eigelb ist
eine Quelle für Lipoproteine und Komponenten mit hohem Molekulargewicht
(Beccaglia et al., 2009a), welche die Samenzellen bzw. deren Zellmembranen
gegen einen Kälteschock schützen (Beccaglia et al., 2009a; Farstad, 2009) bzw.
diesen reduzieren (Concannon und Battista, 1989). Die Antioxidantien schützen
die
Zellen
vor
oxidativen
Schädigungen
durch
die
Bildung
reaktiver
Sauerstoffspezies (Farstad, 2009).
Die Mechanismen, durch die das Eigelb den Schutz gegen Kälteschockschäden
vermittelt, sind nicht genau bekannt (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b). Es wird
angenommen,
dass
die
aktiven
Schutzkomponenten
des
Eigelbs
die
Phospholipide einer Low-density-Lipoprotein (LDL)-Fraktion sind (Watson und
Morris, 1987; Weitze und Petrunkina, 2007), wobei insbesondere dem
Phosphatidylcholin eine große Bedeutung zukommt (Watson und Morris, 1987).
Eine mögliche Erklärung ist, dass diese Phospholipide an die Spermienmembran
binden und so deren Schutz bewirken (Weitze und Petrunkina, 2007).
Phosphatidylcholin scheint seine Wirkung über eine Membranstabilisierung
auszuüben, wobei es die Membranzusammensetzung allerdings nicht permanent
modifiziert (Watson und Morris, 1987). Weiterhin könnten die Phospholipide den
53
Literatur
Phospholipidverlust aus der Membran verhindern oder die bereits verloren
gegangenen Phospholipide ersetzen (Farstad, 2009).
Ein anderer Erklärungsansatz wird von Bergeron und Manjunath (2006) postuliert:
LDL im Eigelb schützt beim Bullen die Spermienfunktion, indem es die Bindung
der Spermien an die Hauptseminalplasmaproteine und dadurch gleichzeitig die
von letzteren modulierte Stimulation des Lipidverlustes aus der Plasmamembran
verhindert. LDL bildet dabei mit den Seminalplasmaproteinen stabile Komplexe,
wobei seine Bindungskapazität sehr hoch ist. Da diese Seminalplasmaproteine bei
Säugern ubiquitär vorkommen und homologe Proteine ebenfalls an LDL binden,
könnten auch die Mechanismen der protektiven Funktion von Eigelb bei allen
Säugern die gleichen sein (Bergeron und Manjunath, 2006).
Iguer-Ouada und Verstegen (2001b) konnten zeigen, dass Eigelb einen positiven
Effekt auf die Konservierung der Spermienmotilität sowie einen schützenden
Effekt gegen spontane AR besitzt bzw. die akrosomale Integrität positiv
beeinflusst. Die Stabilisierung des Akrosoms könnte durch einen direkten
schützenden Effekt auf die akrosomale Membran vermittelt werden (Iguer-Ouada
und Verstegen, 2001b).
Während einer viertägigen Lagerung von flüssigkonserviertem Sperma bei 5°C
steigt der Prozentsatz kapazitierter Spermien signifikant an, wenn ein TRISZitronensäure-Fruktose-Verdünner ohne Eigelbzusatz verwendet wird, verglichen
mit der Konservierung in demselben Verdünner mit Eigelbzusatz (Schäfer-Somi,
2009). Daher wird angenommen, dass Eigelb die hauptsächliche Komponente für
die Verhinderung der Kapazitation ist (Schäfer-Somi, 2009; Witte et al., 2009),
weshalb es in Verdünnern für die Flüssigkonservierung immer enthalten sein sollte
(Schäfer-Somi, 2009).
Für
die
Konservierung
Eigelbkonzentrationen
von
Hundesperma
eingesetzt
(England,
wurden
1993),
bisher
wobei
verschiedene
die
üblichen
Konzentrationen zwischen 15 und 30 % Vol. liegen (Weitze und Petrunkina, 2007);
Konzentrationen darunter oder darüber führen zu einer Verringerung des Anteils
motiler Spermien (Weitze und Petrunkina, 2007). Auch Foote und Leonard (1964)
konnten eine Überlegenheit von 20 % Eigelbzusatz gegenüber 50 % zeigen.
Das Eigelb sollte vorsichtig vom Eiweiß getrennt werden, indem es auf ein
Filterpapier gegeben und so lange behutsam abgerollt wird, bis das Eiweiß sich
abgelöst hat. Um das genaue Volumen an Eigelb zu bestimmen, kann eine
Einwegspritze verwendet werden (Linde-Forsberg, 1991).
54
Literatur
Unglücklicherweise ist Eigelb ein biologisch riskantes Produkt tierischen
Ursprungs (Bergeron und Manjunath, 2006; Farstad, 2009), dem ein potentielles
Risiko mikrobieller Kontamination innewohnt (Hoffmann, 2003d; Bergeron und
Manjunath, 2006; Beccaglia et al., 2009b), welche für eine anschließende
Endotoxinproduktion mit Schädigung der Befruchtungsfähigkeit der Spermien
verantwortlich sein kann (Beccaglia et al., 2009a) und wodurch die Möglichkeit
einer Krankheitsübertragung besteht (Farstad, 1996; Beccaglia et al., 2009a). Dies
kann insbesondere beim internationalen Handel mit Sperma ein Problem
darstellen (Farstad, 1996; Beccaglia et al., 2009b), weshalb Eigelb von spezifisch
pathogenfreien
Hühnern
(Farstad,
1996)
oder
aus
Eigelb
gewonnene
Phospholipide oder Lecithin zum Ersatz genutzt werden (Farstad, 2009; SchäferSomi, 2009).
Varela Junior et al. (2009) setzten aus Hühnereiern gewonnenes, gereinigtes LDL
bei der Konservierung von Hundesperma ein und konnten zeigen, dass LDL in
einem TRIS-Glukose-Verdünner das Eigelb ersetzen kann und es dadurch zu
einer Verbesserung der Spermienmotilität und der Membranintegrität kommt.
Dabei konnte kein signifikanter Effekt der LDL-Konzentration beobachtet werden;
sogar die geringste getestete Konzentration (6 %) schützt flüssigkonserviertes
Hundesperma gegen einen Kälteschock. Allerdings deuten die Ergebnisse der
Studie darauf hin, dass LDL in einer Konzentration von 8 % am wirksamsten ist.
Eine weitere Alternative zu Eigelb, die frei von tierischen Eiweißen ist, ist die
Verwendung von Sojabohnen-Lecithin (Beccaglia et al., 2009a; Schäfer-Somi,
2009; Kmenta et al., 2011) in einer Konzentration von 0,04 % (Beccaglia et al.,
2009a) bzw. 0,8 % (Kmenta et al., 2011) in einem TRIS-Verdünner.
Nachteilig an der Verwendung von Eigelb als Verdünnerbestandteil ist, dass Eier
relativ teuer sind und ihre Handhabung bei der Herstellung des Verdünners
mühsam und zeitaufwändig ist (Thacker und Almquist, 1953). Weiterhin ist zu
beachten, dass Eigelb Partikel enthält, die in ihrer Größe ähnlich den Dimensionen
der Spermienköpfe sind, was bei Anwendung von CASA-Systemen zu einer
Überschätzung des Anteils an immotilen Spermien führen kann. Um dies zu
vermeiden, sollte der Verdünner durch Zentrifugation bei 3,310 x g für 20 Minuten
von den Partikeln befreit werden (Ponglowhapan et al., 2004).
55
Literatur
2.5.2.3.2 Milch
Milch
enthält
ebenfalls
Faktoren,
die
fähig
sind,
die
Bindung
der
Seminalplasmaproteine an Bullenspermien zu verhindern und so den Lipidverlust
aus der Membran zu reduzieren. Da aber auch Magermilch, die keine Lipide
enthält, die Spermien schützt, scheinen andere Faktoren als Lipide oder
Lipoproteine für den protektiven Effekt verantwortlich zu sein (Bergeron und
Manjunath, 2006; Bergeron et al., 2007). Wahrscheinlich interagieren Caseine, die
Hauptproteine der Milch, mit den Seminalplasmaproteinen (Bergeron und
Manjunath, 2006; Bergeron et al., 2007). Während es sich bei der Bindung von
LDL aus Eigelb an die Seminalplasmaproteine um eine Protein-LipoproteinInteraktion
handelt,
Seminalplasmaproteine
fangen
ab,
in
was
der
eine
Milch
die
Caseinmicellen
Protein-Protein-Interaktion
die
darstellt
(Bergeron et al., 2007). Außerdem scheint auch Laktose in den Prozess der
Spermienprotektion durch Milch involviert zu sein. Sie scheint die Effektivität des
Verdünners zu verbessern, ist alleine aber nicht ausreichend zum Schutz der
Spermien (Bergeron und Manjunath, 2006).
Wie Eigelb ist auch Milch ein Produkt tierischen Ursprungs, das in seiner
Zusammensetzung
nicht
konstant
ist
und
das
potentielle
Risiko
einer
Spermakontamination in sich birgt (Bergeron und Manjunath, 2006).
2.5.2.4
Kryoprotektiva
Der Zusatz von Kryoprotektiva zu Spermaverdünnern reduziert Gefrierschäden
(Concannon und Battista, 1989) und verbessert so das Überleben der
Samenzellen nach dem Einfrierprozess (England, 1993). Die Tiefgefrierung von
Hundespermien in Abwesenheit eines Kryoprotektivums resultiert in einer starken
Reduktion der Anzahl an überlebenden, motilen Spermien nach dem Auftauen
(Concannon und Battista, 1989).
Kryoprotektive
Substanzen
lassen
sich
in
zwei
Gruppen
einteilen:
1) zellpenetrierende Substanzen, wie Glycerol, Dimethylsulfoxid (DMSO) und
Methanol und 2) die Zellmembran nicht penetrierende Substanzen, wie Proteine,
verschiedene Zucker und Polyvinylpyrrolidone (England, 1993; Weitze, 2001).
Der Zusatz kryoprotektiver Agentien bringt die Zellen in Kontakt mit einer
hypertonen Umgebung. Anfangs verursacht dies, dass die Zellen schrumpfen.
Wenn das Kryoprotektivum dann aber in die Zellen eindringt, gewinnen sie ihr
normales Volumen wieder. Beim Vorgang des Einfrierens schrumpfen die Zellen
56
Literatur
erneut, während Wasser aus ihrem Inneren ausströmt und sich im extrazellulären
Raum Eiskristalle bilden. Abhängig von der Kühlrate können sich auch innerhalb
der Zellen Eiskristalle bilden. Intrazelluläre Eisbildung führt üblicherweise zu
Schädigungen der Zellmembran, welche ihre semipermeablen Eigenschaften
verliert, was wiederum zum Zelltod führt (Eilts, 2005b).
Glycerol ist das am häufigsten verwendete Kryoprotektivum für Hundesperma
(Concannon und Battista, 1989; Martins-Bessa et al., 2006; Rota et al., 2006;
Futino et al., 2010). Es handelt sich um ein intrazelluläres Kryoprotektivum (Silva
et al., 2002), das den Gefrierpunkt in einer glycerolhaltigen Lösung herabsetzt,
was zu höheren Anteilen der nichtgefrorenen Fraktion in der Lösung und zu einer
niedrigeren Salzkonzentration führt (Weitze und Petrunkina, 2007). Glycerol
vermindert Zellschäden, indem es die Hyperosmolarität im umgebenden Medium
reduziert (Weitze und Petrunkina, 2007).
Trotz
seiner
protektiven
Effekte
kann
Glycerol
Veränderungen
in
der
Lipidpackungsstruktur der Spermienmembran induzieren. Infolgedessen können
sich Stabilität und Wasserpermeabilität der Zelle ändern, was zu einer reduzierten
Lebensdauer der Spermien führen kann (Silva et al., 2006). Daher stellt die
optimale Konzentration von Glycerol die Balance zwischen seinen toxischen und
seinen schützenden Effekten dar (England, 1993). Beim Hund variieren die
genutzten Glycerolkonzentrationen in Abhängigkeit von der Zusammensetzung
des Verdünners und dem verwendeten Puffer zwischen 1 und 16 % Vol.
(Concannon und Battista, 1989; England, 1993; Farstad, 1996; Futino et al.,
2010). Rohloff et al. (1978) konnten optimale Konzentrationen von 4 bis 8 %
ermitteln. Rota et al. (1999a; 2006) verwenden eine Endkonzentration von 5 %
Glycerol im Verdünner, Silva et al. (2006) 6 % und Tsutsui et al. (2000) 7 %. Nach
Peña et al. (2006) tolerieren Hundespermien dagegen nur eine Glycerolkonzentration von 4-5 %. Province et al. (1984) konnten zeigen, dass ein Zusatz
von 6 % Glycerol zum Verdünner die Motilität von flüssigkonservierten
Hundespermien herabsetzt, während ein Zusatz von 3 % keine Auswirkungen auf
die Motilität besitzt. Günzel-Apel et al. (1993) konnten ebenfalls eine abnehmende
Tendenz der durchschnittlichen Bewegungsgeschwindigkeit der Spermien nach
dem Zusatz von Glycerol beobachten und auch nach Foote und Leonard (1964) ist
die Überlebensrate der Spermien in Verdünnern, die Glycerol enthalten, etwas
geringer. Während kurzer Lagerungsperioden führen bis zu 8 % Glycerolzusatz zu
57
Literatur
einem Eigelb-Zitrat-Glycin-Verdünner allerdings nur zu einer leichten Reduktion
der Motilität (Foote und Leonard, 1964). Dennoch sprechen sich Province et al.
(1984) gegen die Verwendung von Glycerol zur Flüssigkonservierung von
Hundesperma aus, da der Zusatz von Glycerol keinen vorteilhaften Effekt auf die
Motilität ausübt.
Neben Glycerol werden in der Literatur weitere Gefrierschutzsubstanzen wie
DMSO (Rohloff et al., 1978), Ethylenglycol (Martins-Bessa et al., 2006; Rota et al.,
2006; 2010) und Methylformamid bzw. Dimethylformamid (Lopes et al., 2009b;
Futino et al., 2010) zur Kryokonservierung von Rüdensperma beschrieben. Da
diese im Versuchsaufbau der vorliegenden Arbeit nicht von Bedeutung sind, soll
hier nicht weiter auf ihre Eignung eingegangen werden.
2.5.2.5
Antibiotika
Die Vermehrung von Bakterien ist im Verlauf der Konservierung ein zu
beachtender Faktor, weshalb der Zusatz von Antibiotika zum Verdünner
unerlässlich erscheint. Dieser Zusatz kann die Konservierung zweifellos noch
verbessern (Brochart und Coulomb, 1952) und ist insbesondere bei der
Flüssigkonservierung
(Hoffmann,
2003d)
bzw.
bei
der
Verwendung
von
eigelbhaltigen Verdünnern angebracht, da Eigelb das bakterielle Wachstum
begünstigt (Linde-Forsberg, 1995). Bei der Langzeitkonservierung, bei der mit der
Vermehrung eventuell im Ejakulat vorhandener oder eingebrachter Keime nicht zu
rechnen ist, könnte wahrscheinlich auf diesen Zusatz verzichtet werden
(Hoffmann, 2003d). Zudem können Antibiotika möglicherweise die Verbreitung von
Infektionen verhindern (Linde-Forsberg, 2001). I. d. R. werden den verschiedenen
Verdünnern Penicillin und Streptomycin zugesetzt (Foote, 1964a; Foote und
Leonard, 1964; Andersen, 1980; Concannon und Battista, 1989; Linde-Forsberg,
1995). Dieser Antibiotikazusatz ist für die Spermien nicht schädlich und hilft, das
Wachstum kontaminierender Organismen zu kontrollieren (Foote und Leonard,
1964).
2.5.2.6
Sonstige Inhaltsstoffe
2.5.2.6.1 Antioxidantien
Samenzellen besitzen in ihrer Plasmamembran einen relativ hohen Gehalt an
mehrfach ungesättigten Fettsäuren, welche leicht oxidiert werden können,
58
Literatur
wodurch die Samenzellen besonders empfindlich gegenüber oxidativem Stress
sind (Beccaglia et al., 2009a; Michael et al., 2010). Hinzu kommt, dass die
Samenzellen nur einen begrenzten Gehalt an Antioxidantien besitzen (Michael et
al., 2010).
Im Ejakulat werden durch die Spermien selbst sowie durch enthaltene Leukozyten
reaktive oxidative Substanzen (ROS) produziert (Griveau et al., 1995), welche in
niedrigen Konzentrationen als Mediatoren der normalen Spermienfunktion
agieren, während sie, wenn sie im Übermaß produziert werden, hoch toxisch für
die Samenzellen sind (Michael et al., 2010). Wasserstoffperoxid (H2O2), welches
durch spontane Dismutation aus Hyperoxidanionen (O2-) entsteht, scheint dabei
aufgrund seiner Fähigkeit, Membranen frei zu überqueren und Enzymaktivitäten
sowie zelluläre Funktionen zu hemmen, die toxischste Substanz zu sein (Griveau
et al., 1995). Durch den Einfluss von ROS kommt es über die Peroxidation von
Membranphospholipiden zu einer Erhöhung der Lipidhydroperoxidkonzentration,
einer Verminderung der Fähigkeit zur Ionophor-induzierten AR, einer Reduktion
der Motilität und einem Verlust von mehrfach ungesättigten Fettsäuren aus der
Membran (Griveau et al., 1995). Eine Inhibition des Energiemetabolismus durch
H2O2 könnte die reversible Immobilisation der Samenzellen erklären (Griveau et
al., 1995).
Um sich gegen Schädigungen durch ROS zu schützen, besitzen die Spermien
folgende drei antioxidative enzymatische Systeme: Superoxiddismutase, Katalase
und das Glutathionperoxidase/Reduktase-System (Griveau et al., 1995; Farstad,
2009). Diese Verteidigungssysteme kontrollieren in vivo das Gleichgewicht
zwischen ROS-Produktion und -Neutralisierung (Farstad, 2009).
Während einer längeren Lagerung können die endogenen antioxidativen
Kapazitäten des Spermas jedoch ungenügend sein (Ceylan und Serin, 2007). Ein
Anstieg der Konzentration von ROS im Seminalplasma oder im Verdünner
während der Lagerung ist verantwortlich für Zellmembranschäden und für die
Verschlechterung der Spermaqualität (Beccaglia et al., 2009a). Zusätzlich können
ROS indirekt oxidativen Stress verursachen, indem sie die enzymatische Abwehr
der Samenzellen herabsetzen (Michael et al., 2010). Um den oxidativen Stress zu
vermeiden und das Überleben und die funktionale Integrität der Samenzellen zu
verbessern, sollte die Verwendung von Antioxidantien im Verdünner in Erwägung
gezogen werden (Beccaglia et al., 2009a). Die Ergänzung des Verdünners mit
bestimmten Antioxidantien kann, verglichen mit einer Kontrollgruppe, die
59
Literatur
Spermaqualitätsparameter nach 24 und/oder 72 Stunden Lagerung signifikant
verbessern (Michael et al., 2009).
Es wurde bereits eine Vielzahl an Substanzen bzw. Substanzkombinationen
hinsichtlich ihrer antioxidativen Wirkung bei der Flüssigkonservierung von caninem
Sperma getestet. Darunter die Thiole Cystein, N-Acetylcystein und Glutathion
(Michael et al., 2009; 2010), die Vitamine Vitamin B16 (Pyridoxin) (Michael et al.,
2009), Vitamin C (Ascorbinsäure) (Ceylan und Serin, 2007; Michael et al., 2008;
2009) und Vitamin E (α-Tocopherol) (Michael et al., 2009), das Enzym Katalase
(Beccaglia et al., 2009a; Michael et al., 2009) und die Aminosulfonsäure Taurin
(Michael et al., 2009).
Zusammenfassend zeigten von allen getesteten Antioxidantien Vitamin B16- und
Vitamin E-Zusätze zu Verdünnern für die Flüssigkonservierung hinsichtlich der
Erhaltung der Spermaqualität sowie der Hemmung von ROS die ausgeprägtesten
positiven Effekte (Michael et al., 2009).
2.5.2.6.2 Natriumdodecyl(lauryl)sulfat (sodiumdodecyl(lauryl)sulfate, SDS)
SDS ist ein wasserlösliches, anionisches Detergens und Benetzungsmittel, das
genutzt wird, um Proteine aufzuschließen (Rota et al., 1997). Es ist die aktive
Komponente der Equex STM Paste (Nova Chemical Sales, Scituate, Inc., MA,
USA) (Rota et al., 1997; 1999a; Peña und Linde-Forsberg, 2000; Ström Holst et
al., 2000; Peña et al., 2003b; Hermansson und Linde-Forsberg, 2006; Alhaider
und Watson, 2009; Bencharif et al., 2010), einem kommerziell erhältlichen
Zusatzstoff zur Anwendung in Spermaverdünnern (Rota et al., 1999a). Weitere
Verdünnerzusätze, die SDS enthalten, sind Equex Pasta (Minitüb, Tiefenbach,
Germany) (Peña et al., 2003b; Niżański et al., 2009), Orvus ES Paste (Nova
Chemical Sales, Scituate, Inc., MA, USA) (Tsutsui et al., 2000; Hori et al., 2006)
und Orvus ES Paste (Proctor and Gamble, Cincinnati, OH, USA) (Peña et al.,
2003b), wobei der genaue Gehalt an SDS meist unbekannt ist (Peña et al., 2003b;
Hori et al., 2006). SDS ist auch als Einzelkomponente auf dem Markt erhältlich
(SDS; Schwarz/Mann Biotech, Division of ICN Biomedicals. Inc., Cleveland, OH,
USA) (Peña et al., 1998a; Hori et al., 2006).
SDS wird dem Verdünner zugesetzt, um den membranprotektiven Effekt des
Eigelbs zu maximieren (Peña et al., 2003b; 2006). Dabei übt es seinen positiven
Einfluss durch die Veränderung von Eigelbbestandteilen aus (Pursel et al., 1978;
Niżański et al., 2009). Wahrscheinlich werden die aktiven Moleküle des Eigelbs
60
Literatur
aufgeschlossen und die Plasmamembran direkt beeinflusst (Niżański et al., 2009).
Aus diesem Grund muss SDS immer zusammen mit Eigelb verwendet werden,
damit es seine Wirkung ausüben kann (Pursel et al., 1978; Bencharif et al., 2010).
Weiterhin ist die protektive Wirkung von SDS größer, wenn die Samenzellen erst
unmittelbar vor dem Einfrieren mit dem Detergens in Kontakt gebracht werden,
anstatt bereits während der Äquilibrierungsperiode (Peña und Linde-Forsberg,
2000), was darauf hindeutet, dass SDS einen nachteiligen Effekt besitzt, wenn die
Kontaktdauer zu lange ist (Bencharif et al., 2010).
Bezüglich der Effekte des Zusatzes von Equex STM Paste bzw. Orvus ES Paste
zu Verdünnern für die Kryokonservierung von caninem Sperma lässt sich in der
Literatur eine Vielzahl von Untersuchungen finden (Rota et al., 1997; 1999a;
Ström Holst et al., 2000; 2001; Tsutsui et al., 2000; Hermansson et al., 2006; Hori
et al., 2006; Alhaider und Watson, 2009). Zusammenfassend verbessert der
Zusatz von Equex STM Paste zu einem konventionellen TRIS-Gefrierverdünner
die Viabilität und die Langlebigkeit der Spermien nach dem Auftauen (Rota et al.,
1997), führt zu einer höheren Gesamt- und Vorwärtsbeweglichkeit nach dem
Auftauen (Rota et al., 1999a; Alhaider und Watson, 2009) und hat eine positive
Auswirkung auf die ZP-Bindungsfähigkeit von kryokonservierten Spermien (Ström
Holst et al., 2000; 2001).
Über die Auswirkungen des Zusatzes von Equex STM zu Verdünnern für die
Flüssigkonservierung ist in der Literatur nur eine Arbeit zu finden (Niżański et al.,
2009). In dieser wurde die Verwendung von Equex STM (Minitüb GmbH,
Tiefenbach, Germany) in einem TRIS-Eigelb-Verdünner zur Flüssigkonservierung
von caninem Sperma bei 5°C getestet. Dabei konnte gezeigt werden, dass der
Zusatz von Equex STM die Lebensdauer der Spermien bei Inkubation bei 5°C
verkürzt. Der zugrunde liegende Mechanismus ist eine initiale Aktivierung gefolgt
von einem schnellen Abfall der Motilität (Niżański et al., 2009). CASA-Messungen
zeigen deutlich, dass der Zusatz von Equex STM die Spermienmotilitätsparameter
in einer ähnlichen Weise verändert, wie sie bei der Hyperaktivierung von
Samenzellen gesehen werden kann, welche mit dem Kapazitationsprozess, der im
weiblichen Eileiter induziert wird, assoziiert ist. Die Hyperaktivierung wird als
kräftige, nicht progressive, nicht lineare Spermienbewegung, verbunden mit der
Kapazitation beschrieben. Es ist wahrscheinlich, dass aus der in vitro
Hyperaktivierung eine Erschöpfung der Energiereserven, eine Akkumulation von
61
Literatur
Metaboliten im Verdünner und schließlich der Zelltod resultiert (Niżański et al.,
2009).
2.5.3 Einzelne Verdünner
Es wurden bereits viele verschiedene Verdünner für die Flüssigkonservierung von
caninem Sperma getestet (Concannon und Battista, 1989; Linde-Forsberg, 1991;
Peña et al., 2006). Dabei sind die am häufigsten verwendeten Medien milch- oder
eigelbbasierte Verdünner mit unterschiedlichen Variationen (Pinto et al., 1999).
Der erste erfolgreich eingesetzte Verdünner war pasteurisierte und für zehn
Minuten auf 92-94°C erhitzte Milch (Harrop, 1954; 1956). Heutzutage ist einer der
gebräuchlichsten Verdünner ein TRIS-gepufferter Eigelb-Verdünner mit 20 %
Eigelb und entweder Glukose- oder Fruktosezusatz (Günzel, 1986; Concannon
und Battista, 1989; Linde-Forsberg, 1995; Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b;
Hermansson und Linde-Forsberg, 2006; Günzel-Apel, 2007; Pesch et al., 2007).
Ein
weiterer
gängiger
Verdünner
besteht
aus
80 %
homogenisierter,
pasteurisierter Sahne (12 % Fett) und 20 % Eigelb (Linde-Forsberg, 1991).
Grundsätzlich können kommerzielle und nichtkommerzielle, d. h. selbst im Labor
hergestellte, Verdünner unterschieden werden.
Die
quantitative
Zusammensetzung
kommerzieller
Verdünner
ist
oftmals
unbekannt, da sie von den Herstellern nicht offengelegt wird (Linde-Forsberg,
1995; Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b). Dies, in Kombination mit dem Fehlen
von
objektiven
wissenschaftlichen
Trächtigkeitsraten,
macht
einen
Studien
Vergleich
hinsichtlich
mit
den
der
gut
resultierenden
dokumentierten,
nichtkommerziellen Verdünnern schwierig oder gar unmöglich (Linde-Forsberg,
1995). Umgekehrt betrachtet ist die Verfügbarkeit von gebrauchsfertigen
Verdünnern
allerdings interessant, da
sie vergleichende
Untersuchungen
zwischen verschiedenen Laboren erlauben und konstantere Ergebnisse liefern
könnte, als sie mit selbst hergestellten Verdünnern erreicht werden können (Silva
und Verstegen, 1995).
Die Herstellung der Verdünner im eigenen Labor ist zeitaufwändig (Pinto et al.,
1999) und ggf. fehleranfällig, da es durch die Rezeptangabe in Gramm zu Fehlern
beim finalen pH-Wert und/oder der Osmolarität kommen kann (Peña et al., 2006).
Durch Angabe der millimolaren Mengen im Rezept können solche Arten von
Fehlern vermieden werden (Peña et al., 2006).
62
Literatur
Hinsichtlich der Konzeptionsraten, die bei Verwendung der verschiedenen
Verdünner erzielt werden können, lassen sich in der Literatur nur wenige Angaben
finden. Die nachfolgende Tabelle (Tab. 3) gibt die Trächtigkeitsergebnisse für
verschiedene Verdünner wieder (Linde-Forsberg, 1995). Hieraus ist ersichtlich,
dass die besten Trächtigkeitsraten mit TRIS-basierten Verdünnern (62,5 % und
57,1 %) und mit dem Sahne-Eigelb-Verdünner (51,1 %) erreicht werden konnten,
wenngleich die Anzahl an KBs deutlich variierte (Linde-Forsberg, 1995).
Tab. 3: Trächtigkeitsergebnisse für verschiedene Verdünner zur Flüssigkonservierung von Hundesperma von 1990 bis 1993
(Linde-Forsberg, 1995)
Verdünner
Anzahl an KBs
Trächtigkeiten
Anzahl
Prozentsatz
Sahne/Eigelb
137
70
51,1%
unbekannt
44
16
36,4 %
Sahne
26
12
46,2 %
kein Verdünner
17
5
29,4 %
TRIS/Eigelb
16
10
62,5 %
TRIS
7
4
57,1 %
Milch
7
2
28,6 %
Kenney’s
5
3
60,0 %
andere Verdünner
10
4
40,0 %
Gesamt
269
126
47,3 %
2.5.3.1
Milchverdünner
Als Verdünner auf Milchbasis für die Flüssigkonservierung von Hundeejakulaten
kommen gekochte Magermilch (Thacker und Almquist, 1953; Foote, 1964b;
Christiansen, 1984a; Province et al., 1984; Weitze, 2001), homogenisierte,
sterilisierte Milch mit 2 % Fett (Christiansen, 1984a), homogenisierte, gekochte
Vollmilch (Thacker und Almquist, 1953; Harrop, 1954; Bartlett, 1962a; Foote,
1964b; Weitze, 2001) und sterilisierte Sahne mit 9 % Fett (Foote und Leonard,
1964) in Frage. Ebenso können Kombinationen aus Milch und anderen
Komponenten (z. B. Milch-Zitrat und Milch-Eigelb) (Weitze, 2001) oder eine
Mischung aus 80 % homogenisierter, pasteurisierter Sahne (12 % Fett) und 20 %
Eigelb (Linde-Forsberg, 1991) eingesetzt werden. Das vorherige Aufkochen für
zehn Minuten bei 92-94°C (Harrop, 1954; Province et al., 1984) dient der
Zerstörung toxischer Substanzen (Weitze, 2001).
63
Literatur
Als kommerzieller Verdünner auf Milchbasis ist der NFDMS-G-(Non Fat Dried Milk
Solid-Glucose)-Verdünner, welcher bereits 1975 von Kenney beschrieben wurde,
zu nennen (Bouchard et al., 1990). Der Kenney-Verdünner (Fa. Hamilton Thorn
Research, Beverly, MA, USA), der zur Kurzzeitkonservierung von Hengstsperma
routinemäßig verwendet wird, stellt eine Lösung aus Trockenmagermilch, Glukose
und Natriumbikarbonat dar (Schäfer et al., 1997) und enthält entweder Ticarcillin
oder Gentamicin (Magermilch-Verdünner Kenney-Typ; Lane Manufacturing Inc.,
Denver, CO) (Pinto et al., 1999).
Die Rezepte einiger Verdünner auf Milchbasis sowie (falls bekannt) deren pHWerte und Osmolaritäten sind in Tab. A1 (Kap. 9.7.1) wiedergegeben.
Bullenspermien können ihre Motilität in gekochter Magermilch sowie in gekochter,
homogenisierter Vollmilch während der Lagerung bei 4°C für zehn Tage erhalten,
was sich nicht signifikant von der Lebensdauer in Eigelb-Zitrat-Verdünnern
unterscheidet (Thacker und Almquist, 1953). Die Ergebnisse beim Rüden sind
dagegen kontrovers. Während Milchverdünner (erhitzte Magermilch bzw. erhitzte,
homogenisierte Vollmilch) bei Foote und Leonard (1964) und Foote (1964b)
gegenüber
den
Eigelb-Zitrat-Glycin-Verdünnern
mit
20 %
Eigelb
deutlich
unterlegen waren, war bei Bouchard et al. (1990) der milchhaltige Verdünner
(NFDMS-G-Verdünner) dem Eigelb-Zitrat-Verdünner mit 3,5 % Eigelb (Fresh Plus
Extender, Edwards Agri-Sales Inc., Baraboo, WI) hinsichtlich der Konservierung
der Gesamtmotilität und der Vorwärtsbeweglichkeit über den Beobachtungszeitraum von fünf Tagen deutlich überlegen. Allerdings war der Anteil an
Spermienagglutinationen im NFDMS-G-Verdünner größer (Bouchard et al., 1990).
2.5.3.2
TRIS-gepufferte Eigelb-Verdünner
Da einer der derzeit gebräuchlichsten Verdünner ein TRIS-Eigelb-Verdünner mit
20 % Eigelb und entweder Glukose- oder Fruktosezusatz ist, werden in Tab. A2
(Kap. 9.7.2) die Rezepte verschiedener TRIS-gepufferter Eigelb-Verdünner
dargestellt. Der größte Unterschied zwischen den einzelnen Verdünnern besteht in
den eingesetzten Zuckerkomponenten und deren Konzentrationen. Die diversen
Effekte
von
Glukose
und
Fruktose
sowie
der
Einfluss
verschiedener
Zuckerkonzentrationen wurden bereits in Kap. 2.5.2.1 beschrieben. Ein weiterer
Unterschied ist beim Zusatz von Glycerol zu erkennen: Nur wenige der
64
Literatur
dargestellten Verdünner enthalten Glycerol, da Glycerol zur Flüssigkonservierung
von Hundesperma normalerweise nicht empfohlen wird (Province et al., 1984).
2.5.3.3
Sonstige Verdünner
In Tab. A3 (Kap. 9.7.3) werden die Rezepte verschiedener sonstiger Verdünner
wiedergegeben, welche sich nicht in die Kategorien „Milchverdünner“ oder „TRISgepufferte Eigelb-Verdünner“ einreihen lassen. Hier sind insbesondere die TRISLecithin-Verdünner hervorzuheben, da diese als einzige der genannten Verdünner
keine Substanzen tierischer Herkunft enthalten (Beccaglia et al., 2009a; Kmenta et
al., 2011).
2.5.3.4
Kommerzielle Verdünner
Es gibt eine Vielzahl kommerziell erhältlicher Verdünner zur Flüssigkonservierung
von caninem Sperma. Allerdings ist deren quantitative Zusammensetzung oftmals
unbekannt, da sie von den Herstellern nicht offengelegt wird (Linde-Forsberg,
1995; Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b). In Tab. A4 (Kap. 9.7.4) erfolgt die
Darstellung verschiedener kommerzieller Verdünner zur Flüssigkonservierung von
Hundesperma. Zu einigen der genannten Verdünner (Biladyl, CLONE Chilled
Semen Kit, Fresh-phos-Verdünner, Fresh Plus Verdünner, Green-Verdünner,
Kenney-Verdünner) gibt es wissenschaftliche Untersuchungen bezüglich ihrer
Eignung zur Flüssigkonservierung caniner Spermien (siehe Kap. 2.5.3.5), zu den
anderen nicht. Des Weiteren ist anzumerken, dass es sich bei manchen der
Verdünner eigentlich um Tiefgefrierverdünner, teilweise auch ursprünglich für
andere Spezies entwickelt, handelt, welche von den jeweiligen Autoren jedoch
trotzdem zur Flüssigkonservierung von Hundesperma eingesetzt wurden.
2.5.3.5
Vergleichende Untersuchungen
In diesem Kapitel erfolgt eine Darstellung von Studien, in denen verschiedene
Verdünner für die Flüssigkonservierung von caninem Sperma über variierende
Untersuchungszeiträume miteinander verglichen wurden.
Bartlett (1962a) verglich einen Eigelb-Phosphat-Verdünner (pH 6,75), einen
Eigelb-Zitrat-Verdünner (pH 7,0) und einen Sterilmilch-Verdünner über einen
Untersuchungszeitraum von 32 Stunden.
Bei diesem Vergleich konnte beobachtet werden, dass, wenn die Samenzellen im
Eigelb-Phosphat-Verdünner
bereits
vollständig
65
immotil
geworden
sind,
Literatur
Samenzellen derselben Spermaprobe im Eigelb-Zitrat- sowie im SterilmilchVerdünner noch ihre initiale Motilität aufweisen. Im Eigelb-Zitrat-Verdünner
erhielten vier von siebzehn verdünnten Proben ihre initiale Motilität über 24
Stunden Lagerung bei Raumtemperatur. Die längste Konservierung eines
gewissen Maßes an Vorwärtsbeweglichkeit betrug 32 Stunden und konnte mit
dem Eigelb-Zitrat-Verdünner erzielt werden. Zusammenfassend wurde die Motilität
der Samenzellen bei Raumtemperatur im Eigelb-Zitrat- und im SterilmilchVerdünner besser erhalten als im Eigelb-Phosphat-Verdünner (Bartlett, 1962a).
Von Foote und Leonard (1964) wurden verschiedene Verdünner mit variierenden
Gehalten an Natriumzitrat, Natriummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Glycin und Eigelb untersucht und außerdem die Auswirkung eines
Zusatzes von 8 % Glycerol und diverser Glukosekonzentrationen zu den
unterschiedlichen Verdünnern getestet. Zusätzlich erfolgte ein Vergleich zwischen
einem
Vollmilch-Verdünner
und
den
Zitrat-Glycin-Verdünnern
mit
20 %
Eigelbzusatz bzw. zwischen einem Sahne-Verdünner mit 9 % Fett und einem
Zitrat-Glycin-Glukose-Verdünner
mit
ebenfalls
20 %
Eigelbzusatz.
Der
Untersuchungszeitraum betrug 8 bzw. 13 Tage.
Glycerol führte zu einer geringgradig reduzierten Überlebensdauer der Spermien.
Der Zitrat-Puffer war dem Phosphat-Puffer und dem Glycin überlegen und 20 %
Eigelb dem Zusatz von 50 % Eigelb. Der Zusatz von Glycin zum Zitrat-Puffer
erschien nützlich und ein weiterer Zusatz von Glukose zum Verdünner führte zu
einer signifikant längeren Erhaltung der Motilität der Spermien. Der VollmilchVerdünner lieferte schlechtere Resultate als die Zitrat-Glycin-Verdünner mit 20 %
Eigelbzusatz (5 % Gesamtmotilität an Tag 8 versus durchschnittlich 30 %) und
auch der Sahne-Verdünner war dem Zitrat-Glycin-Glukose-Verdünner mit 20 %
Eigelbzusatz deutlich unterlegen (6 % Gesamtmotilität an Tag 8 versus 56 %).
Nach 13-tägiger Lagerung bei 5°C konnten in mit Zitrat-Glycin-Glukose-Verdünner
mit 20 % Eigelbzusatz konservierten Ejakulaten noch 40 % motile Samenzellen
beobachtet werden (Foote und Leonard, 1964).
Province et al. (1984) untersuchten vergleichend sechs verschiedene Verdünner
für die Flüssigkonservierung von Hundesperma bei 5°C solange, bis in zwei
aufeinanderfolgenden Untersuchungen im Abstand von 24 Stunden keine Motilität
mehr nachweisbar war. Dabei handelte es sich um einen Eigelb-TRIS-, einen
66
Literatur
Eigelb-Bikarbonat-, den Beltsville F-3-, den Cornell University-, den Caprogenund einen Magermilch-Verdünner.
Es konnte gezeigt werden, dass der Beltsville F-3- und der Eigelb-BikarbonatVerdünner, welche ursprünglich für die Konservierung von Ebersperma entwickelt
wurden, toxisch für Hundespermien waren. Der Caprogen-Verdünner war
hingegen zu fast jedem Untersuchungszeitpunkt allen anderen Verdünnern
überlegen, obwohl die Gesamtmotilität im Cornell University-Verdünner für die
ersten 72 Stunden gleich gut konserviert wurde. Im Caprogen-Verdünner
konserviertes Sperma hatte über den Lagerungszeitraum von 240 Stunden eine
mittlere Gesamtmotilität von 52 %, verglichen mit 47 % in mit Cornell UniversityVerdünner konserviertem Sperma. Daher empfehlen Province et al. (1984) den
Caprogen-Verdünner für die Flüssigkonservierung von Hundesperma bei 5°C.
Bouchard et al. (1990) verglichen einen NFDMS-G-(Non Fat Dried Milk SolidGlucose)-Verdünner
(Kenney-Verdünner)
mit
einem
Eigelb-Zitrat-Verdünner
(Fresh Plus Verdünner) über einen Untersuchungszeitraum von fünf Tagen.
Der NFDMS-G-Verdünner war zur Konservierung der Spermamotilitätsparameter
(gemessen als Gesamtmotilität und Vorwärtsbeweglichkeit) dem Eigelb-ZitratVerdünner während des gesamten Beobachtungszeitraumes deutlich überlegen.
Während im NFDMS-G-Verdünner eine Gesamtmotilität von ca. 50 % über einen
Zeitraum von 72 Stunden aufrechterhalten werden konnte, betrug diese
Zeitspanne im Eigelb-Zitrat-Verdünner lediglich 12 Stunden. Jedoch konnten im
NFDMS-G-Verdünner, insbesondere nach einer Lagerungsdauer von mehr als 72
Stunden, häufiger Agglutinationen beobachtet werden als im Eigelb-ZitratVerdünner (Bouchard et al., 1990).
Von Rota et al. (1995) wurden drei verschiedene Verdünner (Eigelb-TRIS-, EigelbMilch- und Eigelb-Sahne-Verdünner) für die Flüssigkonservierung von caninem
Sperma bei 4°C über einen Zeitraum von vier Tagen vergleichend untersucht.
Der Eigelb-TRIS-Verdünner war den anderen Verdünnern bezüglich der Erhaltung
der Motilität überlegen. An Tag 4 lag die Motilität im Eigelb-TRIS-Verdünner bei
53,6 % verglichen mit 30,4 % im Eigelb-Milch-Verdünner und 14,1 % im EigelbSahne-Verdünner. Zusätzlich wiesen die Samenzellen im Eigelb-TRIS-Verdünner
die höchsten Spermiengeschwindigkeiten auf. Hinsichtlich des Akrosomstatus
(beurteilt anhand Spermac®-Färbung) und der Plasmamembranintegrität (beurteilt
anhand Fluoreszenzfärbung mit CFDA/PI und HOS-Test) waren jedoch keine
67
Literatur
Unterschiede zwischen den Verdünnern nachweisbar. Zusammenfassend scheint
der Eigelb-TRIS-Verdünner für die Konservierung von caninem Sperma bei 4°C
besser geeignet zu sein als die anderen getesteten Verdünner (Rota et al., 1995).
Iguer-Ouada und Verstegen (2001b) verglichen in ihren Untersuchungen die drei
kommerziellen Verdünner Green-Verdünner, Fresh-phos-Verdünner und BiladylVerdünner
jeweils
nichtkommerziellen
Verdünner,
ohne
und
Verdünner
mit
hinsichtlich
ihrer
Eigelbzusatz
sowie
TRIS-Fruktose-Verdünner,
TRIS-BES-Verdünner
Eigelbzusatz)
20 %
und
EDTA-Verdünner
Eignung
zur
die
vier
TRIS-Glukose(alle
mit
Flüssigkonservierung
20 %
von
Hundesperma bei 4°C. Die Untersuchungen wurden solange durchgeführt, bis
keine Motilität mehr nachweisbar war.
Unterschiede zwischen den kommerziellen Verdünnern ohne und mit Eigelbzusatz
waren
hinsichtlich
Gesamtmotilität
und
anderen
Motilitätsparametern
(Vorwärtsbeweglichkeit, VAP, VSL, VCL) erst ab Tag 1 feststellbar, wobei die
eigelbhaltigen Verdünner überlegen waren. Von letzteren war der BiladylVerdünner überlegen; ab Tag 5 war die Gesamtmotilität signifikant höher und nach
8,3 ± 0,2 Tagen waren 50 % der Spermien durch gute Motilitätsparameter
charakterisiert; insgesamt konnte die Motilität für 10 Tage erhalten werden.
Während der TRIS-BES- und der EDTA-Verdünner einen unmittelbaren
depressiven Effekt auf die verschiedenen Motilitätsparameter hatten, waren der
TRIS-Fruktose-
und
der
TRIS-Glukose-Verdünner
gut
geeignet,
die
Motilitätsparameter zu konservieren. Der TRIS-Glukose-Verdünner war ab Tag 4
(Vorwärtsbeweglichkeit) bzw. Tag 8 (Gesamtmotilität) dem TRIS-FruktoseVerdünner signifikant überlegen. Dieser Unterschied ist vermutlich auf das
Energiesubstrat (Glukose anstelle von Fruktose) zurückzuführen, wobei Glukose
einen positiveren Effekt auf die Erhaltung der Motilität ausübt als Fruktose. Im
TRIS-Fruktose-Verdünner zeigten nach einer Lagerungsdauer von 9,7 ± 0,6 Tagen
noch 50 % der Spermien gute Motilitätsparameter, während dies im TRISGlukose-Verdünner nach 13,1 ± 1,1 Tagen der Fall war. Insgesamt konnte die
Motilität im TRIS-Glukose-Verdünner für 16 Tage erhalten werden.
Zusammenfassend war unter den kommerziellen Verdünnern der BiladylVerdünner der beste der getesteten Verdünner und unter den im Labor
hergestellten Verdünnern der TRIS-Glukose-Verdünner. Durch die Verlängerung
der Konservierung der Spermaqualität auf etwa 13 Tage im Vergleich zu circa 8,5
68
Literatur
Tagen im Biladyl-Verdünner erscheint der TRIS-Glukose-Verdünner jedoch
überlegen. Die Autoren postulierten außerdem einen protektiven Effekt von Eigelb
auf die AR; das Eigelb schien die Samenzellen gegen spontane AR zu schützen
(Prozentsatz
an
akrosomreagierten
Spermien
beurteilt
anhand
des
Chlortetracyclin-Assays). Wenngleich dieser Effekt bei den kommerziellen sowie
bei den im Labor hergestellten Verdünnern zu beobachten war, erwies sich
bezüglich der akrosomalen Integrität jedoch erneut der TRIS-Glukose-Verdünner
als am geeignetsten (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b).
Tsutsui et al. (2003b) beurteilten einen Eigelb-Zitrat-Glycin-Glukose-, einen EigelbTRIS-Fruktose-Zitrat- und einen Eigelb-Natriumzitratdihydrat-Verdünner über
einen Untersuchungszeitraum von zwölf Tagen.
Beim Vergleich der drei Verdünner konnte festgestellt werden, dass der EigelbNatriumzitratdihydrat-Verdünner
für
die
Flüssigkonservierung
von
caninem
Sperma aufgrund mangelhafter Motilitätskonservierung nicht geeignet ist. Im
Eigelb-Zitrat-Glycin-Glukose- sowie im Eigelb-TRIS-Fruktose-Zitrat-Verdünner
betrug die Motilität dagegen noch mindestens 60 % nach einer Lagerungsdauer
von sechs Tagen und mindestens 20 % nach zwölf Tagen. An Tag 12 war der
Eigelb-TRIS-Fruktose-Zitrat-Verdünner hinsichtlich Motilität, Viabilität (beurteilt
anhand Eosin-Nigrosin-Färbung) und Akrosomintegrität (beurteilt mit der TripleFärbetechnik) überlegen. Der Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen
war jedoch im Eigelb-TRIS-Fruktose-Zitrat-Verdünner geringfügig höher als in den
anderen Verdünnern.
Besamungsversuche mit einer Besamungsdosis von 4 x 108 Samenzellen haben
gezeigt, dass mit Eigelb-TRIS-Fruktose-Zitrat-Verdünner konserviertes canines
Sperma vier Tage lang für intravaginale Besamungen genutzt werden kann
(Konzeptionsrate nach viertägiger Lagerung 83,3 %, mittlere Wurfgröße 3,2 ± 1,3)
(Tsutsui et al., 2003b).
Hermansson und Linde-Forsberg (2006) untersuchten mit Uppsala Equex-2Verdünner (UE-2/1 und UE-2/2) und mit TRIS-Eigelb-Fruktose-Verdünner (EYT/1
und EYT/2) konserviertes canines Sperma über einen Zeitraum von zwei Tagen.
Das Ziel dieser Studie bestand darin, herauszufinden, ob flüssigkonserviertes
Sperma nach ein bis zwei Tagen Lagerungsdauer bei 4°C noch erfolgreich
kryokonserviert werden kann. Aufgrund der verwendeten Verdünner erscheint eine
Darstellung der Ergebnisse vor dem Einfrieren jedoch trotzdem interessant, da die
69
Literatur
Verdünner denen der eigenen Untersuchungen entsprechen. Dabei besteht der
einzige Unterschied zwischen den beiden Verdünnern im Glycerolgehalt; der
Uppsala Equex-2-Verdünner enthält Glycerol (UE-2/1 mit 3 % Glycerol, UE-2/2 mit
7 % Glycerol), der TRIS-Eigelb-Fruktose-Verdünner nicht bzw. erst im zweiten
„Teilverdünner“ (EYT/1 mit 0 % Glycerol, EYT/2 mit 10 % Glycerol).
Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass flüssigkonservierte Hundespermien
nach einer Lagerungsdauer von ein oder zwei Tagen kryokonserviert werden
können, ohne dass es zu einer signifikanten Verschlechterung der Motilität
(subjektive Schätzung unter dem Phasenkontrastmikroskop nach der Gewinnung
und vor dem Einfrieren; Messung mit CASA nach dem Auftauen), der
akrosomalen
Integrität
(FITC-PNA
(Fluoresceinisothiocyanat
Peanut
Agglutinin)/PI-Färbung) oder der Plasmamembranintegrität (CFDA/PI-Färbung;
nur nach dem Auftauen) nach dem Auftauen kommt, verglichen mit der
Kryokonservierung unmittelbar nach der Samengewinnung, wobei der Uppsala
Equex-2-Verdünner dem TRIS-Eigelb-Fruktose-Verdünner überlegen ist.
Betrachtet man die Motilität der Proben vor dem Einfrieren im Uppsala Equex-2Verdünner (nur UE-2/1), so verschlechtert sich diese von 81,7 ± 2,9 % unmittelbar
nach der Verdünnung auf 60,0 ± 10,0 % nach 24 Stunden Lagerung und auf
30,0 ± 17,3 % nach 48 Stunden. Im TRIS-Eigelb-Fruktose-Verdünner (nur EYT/1)
liegt die Motilität nach 24 Stunden bei 60,0 ± 0 % und nach 48 Stunden bei
40,0 ± 17,3 %. Der Anteil an intakten Akrosomen beträgt im Uppsala Equex-2Verdünner (nur UE-2/1) unmittelbar nach dem Verdünnen 96,5 ± 1,6 % und sinkt
nach 24 Stunden auf 91,2 ± 2,5 % im Uppsala Equex-2-Verdünner (nur UE-2/1)
bzw. auf 84,7 ± 4,1 % im TRIS-Eigelb-Fruktose-Verdünner (nur EYT/1) und nach
48 Stunden auf 86,5 ± 0,58 % im Uppsala Equex-2-Verdünner (nur UE-2/1) bzw.
auf 89,2 ± 5,5 % im TRIS-Eigelb-Fruktose-Verdünner (nur EYT/1) (Hermansson
und Linde-Forsberg, 2006). Für die Flüssigkonservierung über zwei Tage scheint
nach diesen Ergebnissen also der TRIS-Eigelb-Fruktose-Verdünner (nur EYT/1)
etwas besser geeignet zu sein als der Uppsala Equex-2-Verdünner (nur UE-2/1).
In einer weiteren Studie untersuchten Hermansson et al., 2006 die Auswirkungen
der Lagerung von mit Uppsala Equex-2-Verdünner (nur UE-2/1) konserviertem
Sperma auf die ZP-Bindungsfähigkeit nach ein und zwei Tagen Lagerungsdauer
bei 4°C. Die Ergebnisse für die Parameter Motilität (subjektive Schätzung und
Messung
mit
CASA),
akrosomale
Integrität
70
(FITC-PNA/PI-Färbung)
und
Literatur
Plasmamembranintegrität (CFDA/PI-Färbung) sind in der folgenden Tabelle (Tab.
4) dargestellt.
Tab. 4:
Motilität, akrosomale Integrität und Plasmamembranintegrität im
Nativsperma und in mit UE-2/1 („Teilverdünner 1“ des Uppsala Equex-2Verdünners) für ein oder zwei Tage bei 4°C flüssigkonserviertem Sperma
(Hermansson et al., 2006)
Spermabehandlung
Motilität (%)
intakte
intakte
Akrosome (%) Plasmamembranen (%)
Nativsperma
91,5 ± 2,6
93,7 ± 3,8
84,2 ± 3,0
1 Tag flüssigkonserviert
84,8 ± 8,7
94,0 ± 2,0
72,6 ± 11,2
2 Tage flüssigkonserviert
78,5 ± 5,8
92,8 ± 1,0
72,2 ± 11,2
Hieraus ist ersichtlich, dass bei Flüssigkonservierung mit dem Uppsala Equex-2Verdünner (nur UE-2/1) über zwei Tage zufriedenstellende Ergebnisse erzielt
werden können.
Shahiduzzaman und Linde-Forsberg (2007) verglichen den kommerziellen CLONE
Chilled Semen-Verdünner mit einem nichtkommerziellen TRIS-Eigelb-GlukoseVerdünner über einen Untersuchungszeitraum von 23 Tagen.
Die genaue Zusammensetzung des CLONE Chilled Semen-Verdünners ist
unbekannt.
Prinzip
im
CLONE
Chilled
Semen-Verdünner
ist,
dass
die
Samenzellen immotil werden und dies über die Dauer der Lagerung bei 5°C
bleiben. Erst nach Zusatz des Aktivators aus dem CLONE Chilled Semen Kit und
Wiedererwärmung bei 37°C für 8-10 Minuten kommt es dann zu einer
Reaktivierung der Motilität, wobei deren genaue Mechanismen unbekannt sind.
Allerdings
erlangen
in
CLONE
Chilled
Semen-Verdünner
konservierte
Samenzellen, wenn auch langsamer, ihre Motilität auch ohne den Zusatz des
Aktivators zurück, wenn sie Raumtemperatur oder 37°C ausgesetzt werden. Im
Gegensatz dazu behalten mit TRIS-Eigelb-Glukose-Verdünner konservierte
Spermien ihre Motilität während der Lagerung bei 5°C bei.
Alle untersuchten Parameter (Gesamtmotilität, Integrität der Plasmamembran und
des Akrosoms) wurden im Zeitverlauf im TRIS-Eigelb-Glukose-Verdünner besser
konserviert als im CLONE Chilled Semen-Verdünner, was die Hypothese
widerlegt, dass die durch den CLONE Chilled Semen-Verdünner induzierte
Immotilität einen positiven Einfluss auf die Langlebigkeit der Spermien hat. Bei
Lagerung bei 5°C im TRIS-Eigelb-Glukose-Verdünner scheint Hundesperma guter
71
Literatur
Qualität für bis zu 14 Tage konserviert werden zu können (Shahiduzzaman und
Linde-Forsberg, 2007).
Beccaglia et al. (2009a) untersuchten vergleichend einen TRIS-Eigelb- und einen
TRIS-Lecithin-Verdünner für die Flüssigkonservierung von caninem Sperma über
einen Zeitraum von vier Tagen.
Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass Lecithin als eine geeignete Alternative zu
Eigelb bei der Flüssigkonservierung von caninem Sperma angesehen werden
kann. Der TRIS-Eigelb- und der TRIS-Lecithin-Verdünner lieferten ähnliche Werte
hinsichtlich der gemessenen Motilitätsraten, der Anzahl an nicht kapazitierten
Spermien und der Anzahl an Samenzellen, die an die ZP der Eizelle binden,
sodass der TRIS-Lecithin-Verdünner für die Konservierung des Spermas über vier
Tage eingesetzt werden kann (Beccaglia et al., 2009a).
Kmenta et al. (2011) verglichen einen TRIS-Eigelb-, einen TRIS-Lecithin-, einen
TRIS-Lecithin-Katalase- und einen TRIS-Lecithin-Katalase-Tyrosin-Verdünner
über einen Untersuchungszeitraum von acht Tagen.
Neben dem Vergleich der vier genannten Verdünner wurden in dieser Studie die
Auswirkungen
konservierten
verschiedener
Sperma
nach
„Enhancer“-Zusätze,
der
welche
Wiedererwärmung
dem
(unmittelbar
flüssigvor
der
Beurteilung) im Verhältnis 1 : 1 zugegeben wurden, untersucht. Bei den
„Enhancern“ handelte es sich um TRIS-Puffer, TRIS-Puffer mit 0,02 mg
Acetylcarnitin/ml, TRIS-Puffer mit 0,1 mg Acetylcarnitin/ml und TRIS-Puffer mit 0,2
mg Acetylcarnitin/ml. Die Verwendung eines „Enhancers“ erwies sich bei allen
getesteten Verdünnern als nützlich; durch dessen Zusatz konnte in allen
Verdünnern die mittels CASA bestimmte Vorwärtsbeweglichkeit nach der
Wiedererwärmung verbessert werden.
Im TRIS-Eigelb-Verdünner wurde die höchste Vorwärtsbeweglichkeit an Tag 8 mit
dem
TRIS-Puffer
als
„Enhancer“
erzielt,
während
sich
bezüglich
der
Vorwärtsbeweglichkeit im TRIS-Lecithin-, im TRIS-Lecithin-Katalase- und im
TRIS-Lecithin-Katalase-Tyrosin-Verdünner keine Unterschiede zwischen den
verschiedenen „Enhancern“ zeigten. Die Viabilität an Tag 8 konnte im TRISLecithin- und im TRIS-Lecithin-Katalase-Tyrosin-Verdünner durch den Zusatz von
TRIS-Puffer mit 0,2 mg Acetylcarnitin/ml als „Enhancer“ gesteigert werden.
Insgesamt wurden durch die Zugabe von TRIS-Puffer unmittelbar vor der
Untersuchung des flüssigkonservierten Spermas sowohl die Motilität als auch die
72
Literatur
Viabilität in allen Proben signifikant verbessert. Der Zusatz von Acetylcarnitin zum
„Enhancer“ brachte keine weitere Verbesserung der Spermaqualität.
Nach 3-tägiger Flüssigkonservierung bei 4°C war die mittels CASA bestimmte
Vorwärtsbeweglichkeit im TRIS-Lecithin-Katalase-Verdünner (mit TRIS-Puffer als
„Enhancer“) signifikant höher als in den anderen getesteten Verdünnern und auch
nach 8-tägiger Lagerung konnten im TRIS-Lecithin-Katalase- und im TRISLecithin-Katalase-Tyrosin-Verdünner noch eine Vorwärtsbeweglichkeit > 70 %
(jeweils mit TRIS-Puffer als „Enhancer“) und eine Viabilität > 80 % beobachtet
werden, wohingegen die Werte im TRIS-Eigelb- und im TRIS-Lecithin-Verdünner
an Tag 8 bereits signifikant geringer waren. Der Prozentsatz an morphologisch
veränderten Samenzellen war sowohl an Tag 0 als auch an Tag 8 im TRIS-EigelbVerdünner am höchsten. Der TRIS-Lecithin-Katalase-Verdünner war zudem
aufgrund der signifikant höheren ZP-Bindungsfähigkeit der Samenzellen an den
Tagen 0 und 3, insbesondere gegenüber dem TRIS-Eigelb-Verdünner, überlegen.
Insgesamt konservierte der TRIS-Lecithin-Katalase-Verdünner die Vorwärtsbeweglichkeit und die Viabilität während der Flüssigkonservierung bei 4°C über
acht Tage besser als der TRIS-Eigelb-Verdünner; allerdings nur, wenn ein
„Enhancer“ verwendet wurde. Daher kamen die Autoren zu dem Schluss, dass der
TRIS-Lecithin-Katalase-Verdünner mit 0,8 % Lecithin und 150 U/ml Katalase
besser zur Flüssigkonservierung von caninem Sperma geeignet ist als der
konventionelle TRIS-Eigelb-Verdünner (Kmenta et al., 2011).
Zusammenfassend lässt sich bei Betrachtung aller genannten Studien feststellen,
dass die besten Konservierungsergebnisse für canines Flüssigsperma mit Zitratund/oder TRIS-gepufferten, eigelbhaltigen Verdünnern erzielt werden können
(Foote und Leonard, 1964; Province et al., 1984; Rota et al., 1995; Iguer-Ouada
und Verstegen, 2001b; Tsutsui et al., 2003b; Shahiduzzaman und Linde-Forsberg,
2007). Die akzeptablen Motilitätsergebnisse schwanken je nach Autor zwischen
einer Dauer von vier und bis zu mehr als zehn Tagen. Glukose scheint als
Energiesubstrat besser geeignet zu sein als Fruktose, da mit Glukose über etwa
13 (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b) bzw. 14 Tage (Shahiduzzaman und
Linde-Forsberg, 2007) akzeptable Motilitätswerte erzielt wurden, im Vergleich zu
etwa zehn Tagen mit Fruktose (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b). Inwieweit
dies auf eine Präferenz von Hundespermien für die Metabolisierung von Glukose
anstelle von Fruktose hindeutet (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b), bleibt
73
Literatur
unbeantwortet. Lecithin scheint eine geeignete Alternative zu Eigelb zu sein, da
die Konservierungsergebnisse vergleichbar (Beccaglia et al., 2009a) oder sogar
überlegen sind (Kmenta et al., 2011).
74
Material und Methoden
3
Material und Methoden
3.1 Probanden
Das für die Untersuchungen genutzte Sperma wurde im Zeitraum von April bis
Juni 2010 in der Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und
Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz der Justus-Liebig-Universität Gießen
(KGGA) von 30 gesunden und zuchttauglichen Rüden 16 verschiedener Rassen
im Alter von ein bis neun Jahren (3,4 ± 2,2 Jahre) gewonnen. Die Rasseverteilung
innerhalb des Probandenkollektivs sowie weitere Angaben zu den einzelnen
Hunden sind in Tab. 5 wiedergegeben.
Tab. 5:
Angaben zu den einzelnen Hunden (n = 30)
Nr. Rasse
Alter
(in Jahren)
1 Neufundländer
3
2 Neufundländer
8
3 Rhodesian Ridgeback
3
4 Beagle
1,5
5 Beagle
2
6 Gordon Setter
2,5
7 Rottweiler
7
8 Rottweiler
1,5
9 Presa Canario
3
10 Labrador Retriever
1,5
11 Labrador Retriever
1,5
12 Rhodesian Ridgeback
6
13 Border Collie-Mischling
1,5
14 Deutscher Schäferhund
4
15 Riesenschnauzer
1,5
16 Bullmastiff
3
17 Rottweiler
2
18 Bernhardiner
3
19 Bernhardiner
1
20 Bullmastiff
3
21 Bearded Collie
2
22 Labrador Retriever
6,5
23 Rhodesian Ridgeback
7
24 Rhodesian Ridgeback
9
25 Golden Retriever
4
26 Golden Retriever
2
27 Deutscher Schäferhund
2
28 Belgischer Schäferhund
2
29 Deerhound
4
30 Neufundländer
3
75
bisherige
Zuchtnutzung
Ja
Ja
Ja
Nein
Nein
Ja
Ja
Nein
Ja
Nein
Nein
Ja
Nein
Ja
Nein
Ja
Nein
Ja
Nein
Nein
Ja
Nein
Ja
Ja
Ja
Nein
Nein
Nein
Ja
Ja
Material und Methoden
Die Hunde stammten mit Ausnahme der zwei Beagle-Rüden, die Eigentum der
Klinik für Kleintiere (Innere Medizin) der Justus-Liebig-Universität Gießen sind, aus
privaten Haltungen. Der aufgenommene Vorbericht beschränkte sich auf das Alter
der Tiere, die bisherige Zuchtnutzung und den Gesundheitsstatus.
Zum Zeitpunkt der Untersuchungen zeigten alle Probanden ein ungestörtes
Allgemeinbefinden und auch die Vitalparameter lagen bei den einzelnen Rüden
stets im Normbereich. Der Ernährungs- ebenso wie der Pflegezustand war bei
allen Tieren als gut zu beurteilen. Mit Ausnahme eine Hundes (Nr. 24;
Hodentumor rechts) wiesen die Probanden keine adspektorisch oder palpatorisch
nachweisbaren Erkrankungen der äußeren Geschlechtsorgane auf.
3.2 Spermagewinnung
Von jedem der 30 Rüden wurde jeweils ein Ejakulat gewonnen. Die
Samengewinnung fand immer in gleicher Weise in einem separaten Raum in
Anwesenheit einer läufigen bzw. einer mit synthetischem Pheromon (Methyl-4hydroxybenzoat in alkoholischer Lösung, Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH,
Seelze) präparierten Beagle-Hündin zur sexuellen Stimulation statt (Ausnahmen:
Hund Nr. 3: keine Hündin; Hund Nr. 22: läufige Rhodesian Ridgeback-Hündin). Sie
erfolgte mit behandschuhten Händen durch manuelle Stimulation des Penis. Die
Hunde wurden dabei aufgrund ihrer Größe auf dem Boden belassen. Zunächst
wurde der Bulbusschwellkörper durch das Präputium hindurch kräftig massiert, bis
es zu einer partiellen Erektion kam, die am beginnenden „Aufknoten“ des Bulbus
glandis zu erkennen war. Nun wurde der Penis zügig aus der Präputialhöhle
vorgelagert und mit Zeigefinger und Daumen der linken Hand hinter dem
Bulbusschwellkörper ein Ring gebildet, wobei der Handrücken zur Bauchwand des
Hundes zeigte. In der rechten Hand wurde das Tulpenglas zum Auffangen des
Sekrets gehalten und mit der linken Hand erfolgte eine rhythmische Massage des
Penis. Den Umsteigeversuchen des Rüden wurde entgegengekommen, indem der
Penis um 180° nach kaudoventral gedreht wurde, um so das Hängen zu imitieren.
Nach der Abgabe einer ausreichenden Menge an Prostatasekret wurde die
Stimulation durch Lösen der Fixation des Penis beendet und die Rüden wurden
noch solange beobachtet, bis der Penis wieder vollständig eingeschachtet war
(Hoffmann, 2003a; Kutzler, 2005).
76
Material und Methoden
Die Ejakulate wurden fraktioniert
fraktioniert in sterilen, auf 37°C
37
angewärmten, graduierten
Tulpengläsern
(Minitüb
Untersuchung
ntersuchung
im
GmbH,
Wasserbad
Tiefenbach)
bei
37
37°C
aufgefangen
aufbewahrt.
Die
und
bis
zur
Trennung
der
verschiedenen Ejakulatfraktionen erfolgte durch
durch Gläserwechsel bei makroskopisch
sichtbarer FarbFarb und Konsistenzänderung des Sekrets in Vorsekret (Fraktion 1;
klar), spermienreiche Fraktion (Fraktion 2; trüb, milchig) und Nachsekret (Fraktion
3/spermienarme Fraktion/Prostatasekret; klar, wässrig) (Linde-Forsberg,
Forsberg, 1991;
Kutzler, 2005).
2005)
Im Anschluss an die Samengewinnung wurde das Ejakulat unverzüglich ins Labor
gebracht, wo eine Beurteilung des gewonnenen Spermas sowie dessen
Weiterverarbeitung erfolgte.
3.3 Spermabeurteilung
Das gewonnene Sperma wurde sowohl nach den Methoden der klassischen
Spermatologie als auch mittels CASA (SpermVision™-System)
(
untersucht. Eine
graphische Übersicht der Vorgehensweise ist in Abb. 3 dargestellt.
Alle verwendeten Geräte, Verbrauchsmaterialien, Chemikalien, Rezepte
Rezep sowie die
Herstellerangaben sind dem Anhang (Kap. 9) zu entnehmen.
Abb. 3: Vorgehensweise bei der Spermabeurteilung
77
Material und Methoden
3.3.1 Klassische Spermatologie
3.3.1.1
Makroskopische Untersuchung
Die makroskopische Untersuchung stand am Anfang der Spermabeurteilung. Von
jedem gewonnenen Ejakulat wurden dabei für alle drei Fraktionen Volumen,
Farbe, Geruch, Konsistenz und etwaige Beimengungen (z. B. Blut oder Eiter)
erfasst (Hoffmann, 2003b). Das Volumen wurde durch Ablesen der Graduierung
an den Samenauffanggläsern festgestellt und in Millilitern (ml) angegeben.
3.3.1.2
Chemisch-physikalische Untersuchung
Bei allen drei Fraktionen wurde eine pH-Wert-Messung mittels Indikatorpapier (pH
5,4-7,0 Spezialindikator; Merck KGaA, Darmstadt) durchgeführt (Freshman, 2002),
indem ein 10 µl großer Tropfen der entsprechenden Fraktion mittels EppendorfPipette (Eppendorf AG, Hamburg) auf das Indikatorpapier gegeben und das
Ergebnis (Farbänderung des Indikatorpapiers) mithilfe einer Referenzfarbskala
abgelesen wurde.
3.3.1.3
Die
Mikroskopische Untersuchung
mikroskopische
Untersuchung
beinhaltete
die
Schätzung
der
Vorwärtsbeweglichkeit der Samenzellen, die Ermittlung des Verhältnisses
lebender
zu
toter
Samenzellen
und
des
qualitativen
und
quantitativen
Vorkommens morphologisch veränderter Samenzellen mittels Eosinausstrich, die
Bestimmung der Dichte mit der Neubauer-Zählkammer sowie den Nachweis von
Agglutinationen oder etwaiger sonstiger mikroskopischer Beimengungen (z. B.
Fremdzellen)
im
Ejakulat
(Hoffmann,
2003b).
Sie
wurde
mit
einem
Phasenkontrastmikroskop (Objektive: 10x/0,25; 20x/0,35; 40x/0,65; 100x/1,25
(Oel)) mit auf 37°C beheizbarem Objektträgertisch (hund H 500; Helmut Hund
GmbH, Wetzlar) durchgeführt. Die Auswertung der Eosinausstriche erfolgte zum
Teil an einem Phasenkontrastmikroskop (Objektive: E2 PLAN 4x/0,10; E2 PLAN
PH 10x/0,25; E2 PLAN PH 40x/0,65) ohne beheizbaren Objektträgertisch (Leica
CM E; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar). Zum Auszählen der verschiedenen
Parameter wurde ein elektronisches Zählgerät („Assistent“ Counter 345/15, Typ
AC-15 PC; Karl Hecht GmbH & Co KG, Sondheim) verwendet.
78
Material und Methoden
a) Vorwärtsbeweglichkeit
Die
Schätzung
der
Vorwärtsbeweglichkeit
der
Samenzellen
erfolgte
am
Deckglaspräparat bei 400-facher Vergrößerung mit positivem Phasenkontrast. Zur
Herstellung des Deckglaspräparates wurde nach mehrmaligem Schwenken des
Tulpenglases mithilfe einer Eppendorf-Pipette (Eppendorf AG, Hamburg) ein 10 µl
großer Tropfen Sperma auf einen vorgewärmten Objektträger (37°C) gegeben und
dieser dann mit einem Deckglas (18 x 18 mm) abgedeckt. Ein Spermium galt als
vorwärtsbeweglich, wenn es mindestens zwei Drittel des Gesichtsfeldes mehr
oder weniger linear durchquerte (Hoffmann, 2003b). Es wurden mehrere
Gesichtsfelder im Zentrum des Spermatropfens beurteilt und anschließend der
prozentuale Anteil vorwärtsbeweglicher Samenzellen an der Gesamtheit der
Samenzellen geschätzt.
Für alle weiteren Untersuchungen fand nur die zweite, spermienreiche Fraktion
Verwendung, während die erste sowie die dritte Fraktion verworfen wurden.
Ausnahmen bildeten die Hunde Nr. 5 und Nr. 10, bei denen aufgrund ungenauer
Fraktionierung und zwecks Volumenvergrößerung die erste und die zweite
Fraktion gepoolt und dann zusammen weiterverarbeitet wurden.
b) Lebend-Tot-Färbung
Die Lebend-Tot-Färbung (Supravitalfärbung) zur Ermittlung des Verhältnisses
lebender zu toter Samenzellen erfolgte mittels Eosinausstrich. Dazu wurde mithilfe
einer Eppendorf-Pipette (Eppendorf AG, Hamburg) ein 10 µl großer Tropfen
Sperma auf einen auf 37°C vorgewärmten Objektträger gegeben, dann ein doppelt
so großer Tropfen der Eosin-Färbelösung (Rezept siehe Kap. 9.5.3.1) daneben
gegeben, durch mehrmaliges, vorsichtiges Hin-und-her-Schwenken für 20
Sekunden miteinander vermischt und dann auf einem weiteren, ebenfalls
angewärmten Objektträger in einem Zug ausgestrichen. Der Ausstrich wurde
anschließend luftgetrocknet. Bei toten Spermien ist die Plasmamembran
permeabel für den Farbstoff Eosin. Im Eosinausstrich rotgefärbte Spermien waren
demnach zum Zeitpunkt der Färbung tot (Hoffmann, 2003b). Insgesamt wurden
pro Ejakulat je 200 Spermien bei 400-facher Vergrößerung mit negativem
Phasenkontrast ausgezählt. Die ungefärbten Samenzellen (weiße Köpfe) wurden
als lebend, die gefärbten (rote Köpfe) als tot bewertet.
79
Material und Methoden
c) Pathomorphologie
Die Beurteilung der morphologisch veränderten Samenzellen erfolgte an
demselben Eosinausstrich. Hierzu wurden ebenfalls 200 Spermien bei 400-facher
Vergrößerung und negativem Phasenkontrast ausgezählt. Es spielte dabei keine
Rolle, ob die ausgezählten Spermien lebend oder tot waren. Die morphologischen
Veränderungen wurden aufgegliedert in primäre Veränderungen (Kopfkappen-,
Kopf-, Hals- und Schwanzveränderungen), sekundäre/tertiäre Veränderungen und
Plasmatropfen
(Tab.
6)
und
als
prozentualer
Anteil
an
der
Gesamtspermienpopulation angegeben. Waren an einer Samenzelle mehrere
morphologische Abweichungen zu erkennen, so wurde nur die Schwerwiegendste
unter ihnen beachtet.
Tab. 6:
Einteilung der morphologischen Veränderungen nach Hoffmann (2003c),
modifiziert
I. d. R. primäre Veränderungen
1. Kopfkappenveränderungen
- abgelöst
- schief
- sonstiges
2. Kopfveränderungen
- schmal
- lanzenförmig
- Zwergköpfe
- Riesenköpfe
- sonstiges (z. B. Doppelkopf)
3. Halsveränderungen
- abaxialer Schwanzansatz
- paraaxialer Schwanzansatz
- retroaxialer Schwanzansatz
- sonstiges (Halsbruch)
4. Schwanzveränderungen
- schleifenförmig
- aufgerollt
- um den Kopf gerollt
- abgeknickt
- sonstiges (z. B. Doppelschwanz, Auffransung des Mittelstückes)
I. d. R. sekundäre/tertiäre Veränderungen
1. lose Köpfe
2. Krümmlinge
3. sonstiges
Plasmatropfen im Bereich von
- Hals
- Mittelstück
- Endstück
80
Material und Methoden
d) Dichtebestimmung
Die
Dichtebestimmung
(Hämozytometer;
Tiefe
erfolgte
mithilfe
0,100 mm,
Fläche
einer
Neubauer-Zählkammer
0,0025 mm²;
Heinz
Herenz
Medizinalbedarf GmbH, Hamburg). Bei der Vorbereitung der Zählkammer wurde
darauf geachtet, dass das Deckglas (Gerhard Menzel, Glasbearbeitungswerk
GmbH & Co. KG, Braunschweig) so fest an die Zählkammer angedrückt wurde,
bis es an den Haftstellen auf den Seitenstegen der Zählkammer zur Bildung von
Newton’schen Ringen kam. Das Sperma wurde nach behutsamem Mischen in
einer
Erythrozytenmischpipette
nach
Thoma
bis
zur
Marke
1
(zweite
Markierungslinie) aufgezogen, danach die Pipette von außen mit einem
Wattetupfer abgewischt und anschließend Leitungswasser bis zur Marke 101
(dritte Markierungslinie) nachgezogen, wodurch eine 100-fache Verdünnung
entstand. Nach Schwenken der Pipette zur Durchmischung und Verwerfen der
ersten Tropfen wurde mit der Pipette je ein Tropfen des Sperma/WasserGemisches an den beiden Rändern des Deckglases aufgebracht, von wo aus das
Gemisch dann durch Kapillarkräfte eingesogen wurde. Es wurden bei 400-facher
Vergrößerung mit positivem Phasenkontrast fünf Erythrozytenzählfelder mit jeweils
16 Kleinstquadraten ausgezählt. Dabei wurden nur Spermien gezählt, deren Köpfe
innerhalb
der
Kleinstquadrate
oder
auf
deren
linken
oder
unteren
Begrenzungslinie lagen. Zur Berechnung der Dichte fand die Formel nach
Neubauer Anwendung (siehe Formel 1). Aus der so bestimmten Dichte wurde in
Verbindung mit dem bereits zuvor bestimmten Ejakulatvolumen die SGZ
berechnet (siehe Formel 2) (Christiansen, 1984b; Hoffmann, 2003b).
Formel 1: Dichteberechnung
N = (Z x 4000 x V) / 80
N = Dichte; durchschnittliche Spermienzahl pro µl Sperma
Z = Gesamtzahl der ausgezählten Spermien in 80 Kleinstquadraten
1/4000 µl = Referenzvolumen (Tiefe 0,1 mm x Fläche 0,0025 mm2)
V = Verdünnungsfaktor
Formel 2: Berechnung der SGZ im Ejakulat
SGZ = N x Ejakulatvolumen in µl
81
Material und Methoden
3.3.2 Spermac®-Färbung
Zur Beurteilung der akrosomalen Integrität (Kopfkappe) wurde eine Spermac®Färbung (FertilPro N. V., Beernem, Belgien) angefertigt. Bei dieser Färbung
handelt es sich um ein kommerziell erhältliches Färbeset zur selektiven Anfärbung
der
Bestandteile
einer
Samenzelle
einschließlich
des
Akrosoms.
Die
Färbemethode stammt aus der Humanmedizin und besteht aus einer Fixierlösung
und drei Farblösungen, deren genaue Zusammensetzung jedoch unbekannt ist.
Zunächst wurde ein 10 µl großer Tropfen Sperma auf einen angewärmten
Objektträger (37°C) gegeben und mit einem weiteren Objektträger ausgestrichen.
Dieser Ausstrich wurde ca. fünf Minuten luftgetrocknet und dann in der
Fixierlösung (Fixans) für fünf bis zehn Minuten fixiert. Danach erfolgte ein
Waschen des Objektträgers durch mehrfaches Eintauchen und Schwenken in
einem Becherglas mit Leitungswasser bevor für zwei Minuten mit Färbelösung A
(Reagenz A, rot) gefärbt wurde. Anschließend wurde der Objektträger zweimal wie
oben beschrieben gewaschen und in Färbelösung B (Reagenz B, blassgrün)
überführt, in der er für eine Minute verblieb. Nach nochmaligem Waschen wurde
er dann für eine Minute in Färbelösung C (Reagenz C, dunkelgrün) gegeben und
im Anschluss ein letztes Mal gewaschen. Das Wasser zum Waschen der
Objektträger wurde nach jedem Waschvorgang ausgetauscht und nach jedem
Waschen wurde der Objektträger mit der schmalen unteren Seite auf saugfähiges
Zellstoffpapier gedrückt, um restliches Wasser zu entfernen. Nach dem letzten
Waschen wurde der gefärbte Ausstrich luftgetrocknet und im Anschluss wurden
200 Spermien bei 1000-facher Vergrößerung mit Ölimmersion und negativem
Phasenkontrast beurteilt. Die verschiedenen Spermienanteile stellten sich wie folgt
dar: Akrosom (Kopfkappe) - grün, Kern - rot, äquatoriales Band - blassgrün,
Mittelstück und Schwanz - grün. Bei Normospermie sollte der Anteil an
akrosomgeschädigten Spermien im Gesamtejakulat 5 % nicht übersteigen und der
Anteil pathologisch veränderter Samenzellen sollte maximal 20 % betragen
(Riesenbeck et al., 2001). Es wurden nur die Kopfkappenveränderungen beachtet
und diese in abgelöste Kopfkappen, schiefe Kopfkappen und sonstige
Veränderungen (z. B. geschwollene Kopfkappen) differenziert.
3.3.3 HOS-Test
Zur Beurteilung des Funktionszustandes der Plasmamembran wurde der HOSTest eingesetzt. Hierbei zeigen intakte Spermien unter hypoosmotischen
82
Material und Methoden
Bedingungen infolge von Wasseraufnahme eine Anschwellung, die sich in einem
charakteristischen Aufrollen des Schwanzes äußert („curled tail“), während
membrandefekte Spermien dieses Phänomen nicht erkennen lassen („not curled“)
(Riesenbeck et al., 2001). Die hypoosmotische Lösung wurde im Vorherein nach
Rezept (siehe Kap. 9.5.3.2) hergestellt und in Portionen von 100 µl in EppendorfReaktionsgefäßen (1,5 ml; Eppendorf AG, Hamburg) im Gefrierfach bei - 21°C
gelagert. Vor Gebrauch wurde sie aufgetaut und auf 37°C angewärmt. Für die
Untersuchung wurden in die 100 µl hypoosmotische Lösung mithilfe einer
Eppendorf-Pipette (Eppendorf AG, Hamburg) 10 µl Sperma eingebracht. Das
Gemisch wurde kurz geschwenkt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert
(Riesenbeck et al., 2001). Im Anschluss wurde aus 10 µl dieses Gemisches ein
Deckglaspräparat
hergestellt,
welches
nach
fünfminütiger
Absenkungszeit
ausgezählt wurde, indem 200 Spermien bei 400-facher Vergrößerung und
positivem Phasenkontrast beurteilt wurden und der Anteil an Samenzellen mit
nicht aufgerollter Geißel („not curled“) angegeben wurde.
3.3.4 Computer-assisted sperm analysis (CASA)
Die Samenbeurteilung mittels CASA erfolgte mit dem Messsystem SpermVision™
(Minitüb GmbH, Tiefenbach). Parallel zur Schätzung der Spermienbeweglichkeit
am
Lichtmikroskop
wurde
eine
computergestützte
Motilitätsanalyse
mit
SpermVision™ durchgeführt. Des Weiteren erfolgte eine Viabilitätsanalyse.
3.3.4.1
Aufbau und Funktionsweise des SpermVision™-Systems
Das genutzte SpermVision™-System bestand aus einem Mikroskop (StandardLabormikroskop BX 41; Olympus Deutschland GmbH, Hamburg) mit negativem
Phasenkontrast
Olympus
(Negativ-Hoch-Kontrast-Objektiv;
UPlanFINH
Deutschland GmbH, Hamburg) und beheizbarem,
20x/0,50 Ph 1;
motorisierten
Mikroskop-Kreuztisch (ScanStage), welches über eine HochgeschwindigkeitsSchwarz/Weiß-Digitalkamera mit hoher Auflösung (60 Frames/Sekunde) mit TVAdapter mit einem Rechner verbunden war. Auf dem Rechner (Pentium® 4D
(Dual Core) Computer mit 3.0 GHz Prozessor und Betriebssystem Microsoft
Windows XP Professional, Vista comp. Grafikkarte, 19“ TFT-Monitor) war das
SpermVision™-Softwarepaket (Version 3.5.6.2. - Juli 2009) installiert. Weiterhin
gehörten eine Heizplatte (HT 200; Minitüb GmbH, Tiefenbach), die in das
Steuergerät für den Mikroskopheiztisch integriert war, sowie ein Joystick zur
83
Material und Methoden
manuellen Steuerung des Mikroskop-Kreuztisches zur Ausstattung. Für das
Viabilitätsmodul
kamen
des
Weiteren
eine
Farbbildkamera,
ein
Fluoreszenzmikroskop (Standard-Labormikroskop BX 41 mit Auflicht-FluoreszenzSystem; Olympus Deutschland GmbH, Hamburg) mit Filtermodul für BreitbandBlauanregung (115-230 V/ 50-60 Hz) und ein Quecksilber-Hochdruckbrenner mit
Quecksilberdampflampe (Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe HBO®, 50 W/AC L1;
Osram GmbH, München) zum Einsatz.
Die Messungen erfolgten in Leja-Messkammern (Leja® Standard Count 4
Chamber Slide; Leja Products B. V., Nieuw Vennep, Niederlande), welche aus
einem Objektträger mit jeweils vier Kammern (A-D) mit einer standardisierten Tiefe
von 20 µm bestehen.
Nach Beschickung einer Messkammer (siehe unten) bewegte das SpermVision™System das Präparat zur Beurteilung unter dem Mikroskopobjektiv auf
vordefinierte Positionen (Motilitätsanalyse) bzw. es wurden mittels Joystick die
entsprechenden Positionen eingestellt (Viabilitätsanalyse). Diese Positionen
befanden sich auf der Längsachse genau entlang der Mittellinie im Zentrum der
Messkammer. Ziel war es, nicht in den verjüngten Kammerbereichen am hinteren
und vorderen Kammerende sowie in den seitlichen Randbereichen zu messen.
Das Messsystem nahm pro Gesichtsfeld innerhalb von 0,5 Sekunden eine Serie
von 30 Bildern auf und beurteilte in jedem Bild die Partikel, die der voreingestellten
Definition der Spermien (Fläche von 20 bis 60 µm2) entsprachen. Pro Probe
wurden jeweils mindestens 4000 Spermien beurteilt. Die gewählten Einstellungen
zur Spermienerkennung und zu den Zählkriterien sind dem Anhang (Kap. 9.2) zu
entnehmen. Durch Vergleich der 30 Bilder einer Serie wurden die von den
Spermien
zurückgelegten
Wegstrecken
erkannt
und
hieraus
die
Motilitätsparameter berechnet. Die Spermienkonzentration wurde vom System
anhand der erkannten Spermien während der Motilitätsanalyse, des beurteilten
Messvolumens und der eventuellen Verdünnung bestimmt. Das Ergebnis der
Messung stellte einen Mittelwert aller Motilitäts- und Konzentrationsdaten der
einzelnen Gesichtsfelder dar. Die Analyseergebnisse wurden auf dem Bildschirm
sowohl graphisch als auch in Zahlenwerten dargestellt. Gleichzeitig erfolgte eine
Speicherung der Ergebnisse in den Datenbanken des SpermVision™-Systems.
84
Material und Methoden
3.3.4.2
Probenvorbereitung und Befüllung der Messkammer
Vor Beginn der Messung wurden alle Daten des Samenspenders in das
SpermVision™-System eingegeben und das Analysefenster geöffnet. Mittels
Dropdown-Liste wurden Tierart und Verdünnung ausgewählt. Zur Befüllung der
Messkammern wurde eine Pipette (Pipet-Lite® mit LTS®; Rainin Instrument LLC,
Oakland, USA) mit einem eingestellten Volumen von 2,5 µl verwendet. Die
Pipettenspitzen (bioclean™ Precision Pipette Tips; Rainin Instrument LLC,
Oakland, USA) wurden, ebenso wie die Messkammern selbst, vor Gebrauch auf
der Heizplatte auf 37°C angewärmt.
Das Gefäß mit dem Sperma wurde vor Entnahme der Probe zur Messung
mehrmals geschwenkt, um eine Sedimentation der Spermien auszuschließen. Des
Weiteren wurde darauf geachtet, die Probe zentral zu entnehmen. Das vorab
eingestellte Volumen wurde entsprechend entnommen und die Messkammer
direkt auf dem Mikroskoptisch befüllt. Dazu wurde das in der Pipettenspitze
befindliche
Sperma
kurz
vor
der
zu
beschickenden
Kammer
aus
der
Pipettenspitze ausgedrückt, sodass sich an der Spitze ein kleiner Tropfen bildete.
Dieser wurde dann auf der markierten Eingangsposition der jeweiligen Kammer so
abgelegt, dass die Spitze der Pipette solange auf dem Objektträger aufsaß, bis die
Kammer vollständig gefüllt war. Die Kammer musste in einem Zug komplett befüllt
werden, wobei anschließend keine Flüssigkeit am Ein- und Ausgang überstehen
durfte. Ziel war eine Befüllung der Kammer ausschließlich durch Kapillarkräfte.
Durch Über- oder Unterfüllung der Messkammer, z. B. durch Injizieren der
Probenflüssigkeit schräg unter den Deckglasrand, kann es zu Abweichungen bei
der Konzentrationsberechnung kommen. Die vollständige und korrekte Befüllung
der Kammer wurde sofort überprüft; Luftblasen oder eine unvollständige Füllung
der Kammer führten zum Ausschluss und zur Befüllung einer neuen Kammer.
Um eine Wanderung der Spermien an die Grenzen der Kammer und damit eine
Inhomogenität der Probe in der Messkammer zu vermeiden, wurde die Messung
innerhalb von 20 Sekunden nach Beschickung der Kammer begonnen und war
circa innerhalb von 60 Sekunden nach Kammerbeschickung abgeschlossen.
Bei hoher Dichte des Ejakulates musste dieses für die Messung verdünnt werden.
Dazu wurden 10 µl des Spermas in 90 µl auf 37°C angewärmtes Auftaumedium
(Rezept siehe Kap. 9.5.1.2) gegeben, woraus sich eine Verdünnung von
1 : 9 ergab. Diese Verdünnung musste dann vor der Messung in das
85
Material und Methoden
SpermVision™-System eingegeben werden, um eine korrekte Berechnung der
Dichte zu gewährleisten.
Vor Beginn der Messung musste noch die Lichtstärke des Mikroskops eingestellt
werden. Hierzu wurde der im SpermVision™-System integrierte Lichtmesser
verwendet.
Die
Zahl
unter
dem
Lichtmesser
sollte
für
eine
optimale
Spermienerkennung im Bereich zwischen 95 und 100 liegen.
Vor und während der Messung wurden die Probengefäße in einem Thermoblock
auf der Heizplatte bei 37°C aufbewahrt.
3.3.4.3
Motilitätsanalyse
Durch den negativen Phasenkontrast erschienen die Spermien weiß auf
schwarzem Hintergrund. Die Messung erfolgte bei 200-facher Vergrößerung.
Agglutinierte Spermien wurden von der Beurteilung ausgeschlossen. Die
beurteilten Samenzellen wurden durch das Messsystem als unbewegliche,
lokalbewegliche oder vorwärtsbewegliche Spermien klassifiziert und mittels
Overlay farblich markiert (Level 1-Klassifizierung; siehe Kap. 9.2). In einer zweiten
Beurteilungsstufe
(Level 2-Klassifizierung;
Teilpopulationen
der
siehe
vorwärtsbeweglichen
Kap.
Spermien
9.2)
nach
wurden
ihren
Bewegungsmerkmalen wie Hyperaktivität und Linearität unterteilt und die
zurückgelegten Wegstrecken ebenfalls farblich markiert. Die Messwerte selbst
erschienen auf dem Bildschirm neben dem Mikroskopbild und wurden zugleich in
der Datenbank des Systems gespeichert, von wo aus sie später zur weiteren
Bearbeitung nach Microsoft Excel exportiert werden konnten. Das vorangehend
beschriebene Monitorbild ist in Abb. 4 zu sehen.
86
Material und Methoden
Abb. 4: Monitorbild des Programms SpermVision™ nach der Motilitätsanalyse;
links ist das Mikroskopbild des zuletzt beurteilten Gesichtsfeldes zu
erkennen, rechts die gewählten Einstellungen, die numerischen
Ergebnisse der Messung für das aktuelle Feld und die durchschnittlichen
numerischen Ergebnisse aller gemessenen Felder
SpermVision™ berechnete die Samendichte und analysierte die Beweglichkeit der
Samenzellen mithilfe einer großen Anzahl von Motilitätsparametern. Folgende
Parameter wurden von SpermVision™ gemessen bzw. errechnet (Verstegen et
al., 2002; Rijsselaere et al., 2003; Schäfer-Somi und Aurich, 2007; SpermVision™Benutzerhandbuch 12049/0586):
a) Primäre Parameter:
- Spermienkonzentration in 109 Spermien pro ml
- Anteil motiler Spermien in % (Gesamtmotilität; Summe lokalbeweglicher und
vorwärtsbeweglicher Spermien)
- Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien in % (Progressive Motilität)
- Anteil lokalbeweglicher Spermien in %
- Anteil unbeweglicher Spermien in %
87
Material und Methoden
- DCL (distance curved line) = Kurvenstrecke in µm (tatsächlich zurückgelegte
Strecke)
- DAP (distance average path) = durchschnittliche Strecke in µm (Strecke in
geglätteter Linie)
- DSL (distance straight line) = gradlinige Strecke in µm
- VCL
(velocity
curved
line) = Geschwindigkeit
Kurvenstrecke
in
µm/s
(Geschwindigkeit über die tatsächlich zurückgelegte Bahn)
- VAP (velocity average path) = Geschwindigkeit durchschnittliche Strecke in
µm/s (Geschwindigkeit über die gemittelte Bahn)
- VSL (velocity straight line) = Geschwindigkeit gradlinige Strecke in µm/s
(Geschwindigkeit über eine gerade Linie vom Anfang bis zum Ende)
- ALH (amplitude of lateral head displacement) = durchschnittliche seitliche
Kopfauslenkung in µm
- BCF (beat cross frequency, frequency of head displacement) = Frequenz der
seitlichen oszillatorischen Bewegungen des Spermienkopfes um die mittlere
Bahn in Hz
- AOC
(average
orientation
change
of
the
head) = durchschnittlicher
Richtungswechsel des Kopfes in °
b) Sekundäre Parameter:
- LIN (linearity, VSL/VCL) = Linearität in % (Gradlinigkeit)
- STR (straightness, VSL/VAP) = Gradlinigkeit in % (Kräftige Gradlinigkeit)
- WOB (wobble, VAP/VCL) = Schwankung der kurvilinearen Strecke um die
mittlere Strecke in %
Die
Parameter
„Anteil
lokalbeweglicher
Spermien“,
„Anteil
unbeweglicher
Spermien“ und „AOC“ wurden in der Datenbearbeitung dieser Arbeit nicht erfasst.
3.3.4.4
Viabilitätsanalyse
Die Viabilitätsanalyse basierte auf einer Fluoreszenzfärbung der Spermien. Dafür
wurde das LIVE/DEAD® Sperm Viability Kit (Invitrogen™ - Molecular Probes™,
Eugene, Oregon, USA) eingesetzt, welches aus den Fluoreszenzfarbstoffen
SYBR-14 und PI besteht. Beide Farbstoffe binden an die DNA der Zellen und
reagieren auf eine Anregung mit sichtbarem Licht mit einer Wellenlänge von
488 nm durch Fluoreszenzemission. SYBR-14 ist membranpermeabel, penetriert
die Membranen von lebenden und toten Zellen und dient als Marker für Zellen mit
88
Material und Methoden
einer intakten Plasmamembran. Wenn der Farbstoff an die DNA gebunden ist,
liegt das Maximum seiner Fluoreszenzemission bei 516 nm, die Fluoreszenz ist
hellgrün. PI wurde für die Gegenfärbung eingesetzt. Es handelt sich hierbei um
einen membranimpermeablen Farbstoff, der nur defekte Zellmembranen von
geschädigten oder toten Zellen durchdringen kann und in diesen Zellen dann so
stark fluoresziert, dass die hellgrüne Fluoreszenz von SYBR-14 nicht mehr
sichtbar ist. Sein Maximum der Fluoreszenzemission liegt in an die DNA
gebundenem Zustand bei 617 nm, es wird eine starke Rotfluoreszenz abgegeben.
Beide Farbstoffe färben nur die Samenzellen an und keine anderen Zellreste.
Grün fluoreszierende Spermien stellen somit intakte Spermien dar, während rot
fluoreszierende
Spermien
geschädigt
sind
(Garner
und
Johnson,
1995;
Produktinformation des Herstellers).
a) Färbung der Proben
Für die Färbung der Proben wurden im Vorfeld der Untersuchungen braune
Eppendorf-Reaktionsgefäße (Safe-Lock Tubes 0,5 ml; Eppendorf AG, Hamburg)
mit je 2,5 µl der Färbelösung (Herstellungsanleitung siehe Kap. 9.5.3.3) gefüllt und
diese bei - 21°C im Gefrierfach gelagert. Vor Gebrauch wurde die Lösung
aufgetaut und auf 37°C angewärmt. Zu den 2,5 µl Färbelösung wurden dann
mithilfe einer Eppendorf-Pipette (Eppendorf AG, Hamburg) 10 µl Sperma
hinzugegeben.
Nach
kräftigem
Schütteln
des
Reaktionsgefäßes
erfolgte
anschließend eine Inkubation der Proben für zehn Minuten bei 37°C.
b) Messung
Nach zehnminütiger Inkubationszeit wurde die Leja-Messkammer für die Messung
mit SpermVision™ wie oben beschrieben befüllt und dann durch manuelle
Steuerung mittels Joystick unter das Mikroskopobjektiv gebracht. Am zuvor auf
Fluoreszenzmikroskopie umgestellten Mikroskop (200-fache Vergrößerung) wurde
die Blende geöffnet, sodass das Fluoreszenzlicht (sichtbares Licht mit einer
Wellenlänge von 488 nm) auf das Präparat fiel. Das Mikroskopbild wurde auf den
Monitor übertragen. Für die Messung der verschiedenen Felder musste das
Präparat mittels Joystick vom Untersucher auf die verschiedenen Positionen
bewegt werden. Es wurde immer die gleiche Positionsreihenfolge eingehalten.
Das Messsystem erkannte grüne Spermien als intakt und rote als defekt. Es
erfolgte eine farbliche Identifizierung der Samenzellen mittels Overlay und die
Messwerte selbst (Anteile an intakten und geschädigten Spermien in Prozent)
89
Material und Methoden
erschienen auf dem Bildschirm neben dem Mikroskopbild und wurden zugleich in
der Datenbank des Systems gespeichert, von wo aus sie später zur weiteren
Bearbeitung nach Microsoft Excel exportiert werden konnten.
3.4 Weiterverarbeitung des Spermas
(Aufbereitung mit den verschiedenen Verdünnern)
Es wurden nur Ejakulate weiterverarbeitet, die eine subjektiv geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit von mindestens 50 % aufwiesen.
3.4.1 Herstellung der Verdünner
Es kamen zwei nichtkommerzielle Verdünner (TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner
und Uppsala Equex-2 System) sowie ein kommerzieller Verdünner (CaniPRO™
Chill 10; Minitüb GmbH, Tiefenbach) zum Einsatz. Alle Verdünner waren
eigelbhaltig. Die zur Herstellung verwendeten Geräte und Chemikalien sind dem
Anhang (Kap. 9) zu entnehmen.
a) Der TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner (TE) wurde gemäß Rezept (siehe Kap.
9.5.1.1) hergestellt und portioniert in 5 ml Spritzen (B. Braun Melsungen AG,
Melsungen) verschlossen mit Parafilm® (Pechiney Plastic Packaging, Menasha,
USA) im Gefrierfach bei - 21°C gelagert. Allerdings wurde abweichend vom
Rezept auf den Zusatz antibiotischer Wirkstoffe verzichtet. Vor Gebrauch wurde
die entsprechende Menge Verdünner aufgetaut und auf der Heizplatte auf 37°C
angewärmt.
b) Beim Uppsala Equex-2 System handelte es sich um ein Verdünnersystem aus
zwei Bestandteilen (zweiphasig; Verdünner 1 und 2). Beide Verdünner wurden
nach Rezept (siehe Kap. 9.5.1.2) hergestellt und portioniert in 5 ml Spritzen (B.
Braun Melsungen AG, Melsungen) verschlossen mit Parafilm® (Pechiney Plastic
Packaging, Menasha, USA) im Gefrierfach bei - 21°C gelagert. Allerdings wurde
auch hier abweichend vom Rezept auf den Zusatz antibiotischer Wirkstoffe
verzichtet. Vor Gebrauch wurde die entsprechende Menge Verdünner aufgetaut
und auf der Heizplatte auf 37°C angewärmt (Verdünner 1) bzw. im Kühlschrank
auf eine Temperatur von 4°C (Verdünner 2) gebracht.
90
Material und Methoden
c) Der Verdünner CaniPRO™ Chill 10 (Minitüb GmbH, Tiefenbach;
Tiefenbach CP) wurde
gemäß der mitgelieferten Anleitung mit der entsprechenden Menge an Eigelb
Eige
versetzt und
d anschließend portioniert in 5 ml
5 ml Spritzen (B. Braun Melsungen AG,
Melsungen) verschlossen mit Parafilm® (Pechiney Plastic Packaging, Menasha,
Menas
USA) im Gefrierfach bei - 21°C gelagert. Vor Gebrauch wurde die entsprechende
Menge Verdünner aufgetaut
aufgetaut und auf der Heizplatte auf 37°C
37
angewärmt. Die
Zusammensetzung des Verdünners, wie sie in der Anleitung aufgeführt ist, ist dem
Anhang (Kap. 9.5.2) zu entnehmen.
3.4.2 Aliquotierung und Verdünnung des Spermas
Eine graphische Übersicht der Vorgehensweise bei der Aliquotierung und
Verdünnung des Spermas ist in der Schemazeichnung
Schemazeichnung (Abb. 5) dargestellt.
dargestellt
Abb. 5:
5 Vorgehensweise bei der Weiterverarbeitung des Spermas
Die spermienreiche Fraktion wurde im Splitsample-Verfahren
Splitsample Verfahren in drei gleichgroße
Volumenanteile (Aliquote 1, 2 und 3) aufgeteilt, welche in auf 37°C
37 vorgewärmte,
unten spitz zulaufende Zentrifugenröhrchen aus Glas gegeben wurden. Aliquot 1
wurde entsprechend der Dichte des Nativspermas mit der entsprechenden Menge
an CP verdünnt, Aliquot 2 mit der entsprechenden Menge an TE und Aliquot 3
91
Material und Methoden
wurde zunächst zentrifugiert, um es dann nach dem Uppsala-Verfahren (Rota et
al., 1997; Linde-Forsberg, 2001) aufzuarbeiten.
Für das Uppsala Equex-2 System konnten zwei verschiedene Versuchsteile
unterschieden werden: In Versuchsteil I erfolgte die Verdünnung mit dem
kompletten Uppsala Equex-2 System, d.h. es wurde dem Sperma erst Verdünner
1 zugesetzt und nach der Äquilibrierungszeit noch Verdünner 2 (Up 1 + 2; n = 12).
In Versuchsteil II erfolgte die Verdünnung nur mit Verdünner 1 des Uppsala
Equex-2 Systems (Up 1; n = 18).
Die Zentrifugation (Zentrifuge: Heraeus Christ, Labofuge I) erfolgte bei 700 x g
(~2000 U/min) für sechs Minuten, der Überstand (das Seminalplasma) wurde
vorsichtig abpipettiert und verworfen und das Sediment (Spermienpellet) im Konus
des Röhrchens wurde mit auf 37°C angewärmtem Uppsala Equex-2 System
Verdünner 1 im Verhältnis 1 : 2 (ein Anteil Sperma zu zwei Anteilen Verdünner)
resuspendiert (Versuchsteile I und II). Darauf folgte eine Äquilibrierung für die
Dauer einer Stunde bei 4°C im Kühlschrank in einer Styroporbox. Nach dieser
Äquilibrierungsperiode wurde die gleiche Menge an Uppsala Equex-2 System
Verdünner 2 (auf 4°C gekühlt) hinzugegeben (Versuchsteil I), wodurch eine
Endverdünnung im Verhältnis 1 : 4 entstand.
Für die Verdünner CP und TE galt, dass bei einer Dichte des Nativspermas von
bis zu 100.000 Spermien/µl das Aliquot 1 : 2 verdünnt wurde (n = 1), bei einer
Dichte von 100.000 bis 650.000 Spermien/µl 1 : 3 (n = 22), bei einer Dichte von
650.000 bis 1.000.000 Spermien/µl 1 : 4 (n = 3) und bei einer Dichte größer als
1.000.000 Spermien/µl 1 : 5 (n = 5). Angestrebt wurde dabei immer eine
Endkonzentration im verdünnten Sperma von etwa 100.000 Spermien pro
Mikroliter.
Die entsprechende Menge an Verdünner wurde immer in einem gleichmäßigen
Strahl an der Innenseite des Zentrifugenröhrchens ablaufen gelassen, wobei das
Zentrifugenröhrchen
langsam
gedreht
und
geschwenkt
wurde,
um
eine
gleichmäßige Durchmischung von Sperma und Verdünner zu erhalten.
Nach der Verdünnung wurden alle Proben für den weiteren Verlauf der
Untersuchungen identisch behandelt.
Die verdünnten Spermaproben wurden nach mehrmaligem Schwenken aus den
Zentrifugenröhrchen aus Glas in Plastikröhrchen aus Zellkultur-geeignetem
Kunststoff mit Schraubverschluss (BD Falcon™, Konisches Röhrchen, 15 ml; BD,
Franklin Lakes, USA) überführt, in denen die Lagerung im Kühlschrank bei 4°C
92
Material und Methoden
erfolgte. Zur langsameren Temperaturanpassung an die Kühlschranktemperatur
sowie zur Vermeidung von Temperaturschwankungen durch Öffnen des
Kühlschrankes während der Lagerung wurden die Plastikröhrchen in ein
Becherglas (250 ml, Duran®; Schott, Elmsford, USA) mit Leitungswasser von
Raumtemperatur verbracht, welches dann in den Kühlschrank gestellt wurde.
Dabei wurden die drei zusammengehörigen Röhrchen mit dem Sperma eines
Rüden zusammen in einem Becherglas gelagert. Die Röhrchen waren mit dem
entsprechenden Verdünner, dem Namen des Rüden und dem Datum der
Herstellung beschriftet.
Der Kühlschrank (Typ KD 14505; Miele & Cie. KG, Gütersloh) war auf eine
Temperatur von 4°C eingestellt. Für die Dauer der Untersuchungen wurde die
Temperatur täglich mittels Thermometer kontrolliert. Die gemessenen Werte
schwankten zwischen 3 und 5°C.
3.5 Untersuchung des verdünnten Spermas
Eine graphische Übersicht der Vorgehensweise bei der Untersuchung des
verdünnten Spermas ist in Abb. 6 dargestellt.
Das verdünnte Sperma wurde unmittelbar nach der Herstellung (Tag 0)
untersucht. Folgende Parameter wurden dabei bestimmt:
- Vorwärtsbeweglichkeit im Deckglaspräparat
- Verhältnis lebender zu toter Spermien (Eosinausstrich)
- Pathomorphologie (Eosinausstrich)
- Anteil an Kopfkappenveränderungen (Spermac®-Färbung)
- Anteil an membrandefekten Samenzellen (HOS-Test)
- Dichte des verdünnten Spermas
Des Weiteren erfolgten eine Motilitäts- sowie eine Viabilitätsanalyse mithilfe des
SpermVision™-Systems.
93
Material und Methoden
Abb. 6:
6 Vorgehensweise bei der Beurteilung des verdünnten Spermas
3.6 Untersuchung der Halteproben
Eine graphische Übersicht der Vorgehensweise bei der Untersuchung der
Halteproben ist in der Schemazeichnung
Schemazeichnung (Abb. 7) dargestellt.
dargestellt
Die Untersuchung der Halteproben erfolgte nach Anwärmen
Anwärmen eines Aliquotes der
jeweiligen Probe im Wasserbad (Typ WNB 45; Memmert GmbH & Co. KG,
Schwabach) für fünf Minuten bei 37°C.
37 . Dazu wurden nach mehrmaligem
Schwenken der Plastikröhrchen mit einer Eppendorf-Pipette
Eppendorf Pipette (Eppendorf
(Epp
AG,
Hamburg) jeweils 100 µl
100 des verdünnten Spermas entnommen und in beschriftete
Eppendorf-Reakt
Reaktionsgefäße (1,5 ml;
ml; Eppendorf AG, Hamburg) überführt. Die
Eppendorf-Reaktionsgefäße
Reaktionsgefäße wurden dann in einen Ständer im Wasserbad
verbracht und dort für fünf Minuten belassen. Die so erwärmten Proben
Proben wurden für
die Dauer der Untersuchungen
Untersuchungen auf der Heizplatte bei 37°C
37 gelagert.
94
Material und Methoden
Abb. 7:
7 Vorgehensweise bei der Untersuchung der Halteproben
Die Untersuchungen der Halteproben erfolgten nach 24 Stunden (Tag 1), nach 48
Stunden (Tag 2), nach 72 Stunden (Tag 3), nach 120 Stunden (Tag 5), nach 168
Stunden (Tag 7) und nach 240 Stunden (Tag 10) nach Herstellung des verdünnten
Spermas.
Folgende Parameter wurden dabei bestimmt:
- Vorwärtsbeweglichkeit im Deckglaspräparat
- Verhältnis lebender zu toter Spermien (Eosinausstrich)
- Pathomorphologie (Eosinausstrich)
- Anteil an Kopfkappenveränderungen (Spermac®-Färbung)
(Spermac®
95
Material und Methoden
Des Weiteren erfolgten eine Motilitäts- sowie eine Viabilitätsanalyse mithilfe des
SpermVision™-Systems.
3.7 Statistische Methoden
Die Datensätze wurden unter Verwendung des Tabellenkalkulationsprogramms
Microsoft® Office Exel 2007 (Microsoft Corporation) verwaltet. Die statistische
Auswertung der Daten erfolgte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe
Biomathematik und Datenverarbeitung des Fachbereichs Veterinärmedizin der
Justus-Liebig-Universität Gießen. Dabei wurden folgende Programme des
Statistikprogrammpaketes BMDP/Dynamic, Release 8.1 (1993; BMDP Statistical
Software Inc.) verwendet: BMDP1D (einfache Datenbeschreibung), BMDP1R
(Wahrscheinlichkeitsplots zur Prüfung auf Normalverteilung), BMDP2V (ein- bzw.
zweifaktorielle
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen)
und
BMDP6D
(Korrelationsanalysen). Des Weiteren kam für den Student-Newman-Keuls-Test
ein Eigenprogramm der Arbeitsgruppe Biomathematik und Datenverarbeitung des
Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen zum Einsatz.
Die graphischen Abbildungen der gewonnenen Daten wurden ebenfalls mit dem
Programm Microsoft® Office Exel 2007 (Microsoft Corporation) erstellt.
Bei
qualitativen Merkmalen
(Farbe, Geruch, Konsistenz, makroskopische
Beimengungen, Agglutinationen, mikroskopische Beimengungen) wurde die
Merkmalsausprägung als prozentualer Anteil bezogen auf alle Nativejakulate und
als totale Anzahl (n) angegeben.
Bei quantitativen, annähernd normalverteilten Merkmalen (Volumen, pH-Wert,
subjektiv
geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit,
CASA-Gesamtmotilität,
CASA-
Vorwärtsbeweglichkeit, DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL, ALH, BCF, STR, LIN,
WOB) erfolgte die einfache Datenbeschreibung anhand des arithmetischen
Mittelwertes (), der Standardabweichung (SD), des Minimums (Min.) und des
Maximums (Max.) in der Form ± SD (Min., Max.).
Zur Prüfung, ob ein quantitatives Merkmal über die zu vergleichenden
Messwiederholungen
hinweg
annähernd
normalverteilt
ist,
wurden
unter
Verwendung des Programms BMDP1R die Residuen berechnet, welche dann
mittels des Wahrscheinlichkeitsplots auf Normalverteilung überprüft wurden. Lag
keine Normalverteilung vor, wurden die Originaldaten numerisch transformiert, um
96
Material und Methoden
dann mit diesen transformierten Werten die gleiche Prozedur zu wiederholen. Auf
diese Art konnten die am besten geeigneten Datentransformationen identifiziert
werden. Zum Einsatz kamen die Wurzeltransformation, die Arcus-SinusTransformation und die logarithmische Transformation der Daten.
Bei nicht-normalverteilten Merkmalen, bei denen die Originaldaten durch die
Wurzeltransformation
numerisch
transformiert
wurden
(Dichte
Neubauer-
Zählkammer, CASA-Dichte), sowie bei nicht-normalverteilten Merkmalen, bei
denen die Originaldaten durch die Arcus-Sinus-Transformation numerisch
transformiert wurden (Anteil lebender Spermien im Eosinausstrich, CASAViabilität),
Mittelwert“),
wurden
die
die
rücktransformierten
rücktransformierten
Mittelwerte
Mittelwerte
minus
(r;
„modifizierter
bzw.
plus
der
Standardabweichung vor Rücktransformation (( – SD)r, ( + SD)r; „modifizierter 1s-Bereich“), Minimum (Min.) und Maximum (Max.) in der Form r (( – SD)r - ( +
SD)r; Min., Max.) dargestellt.
Bei positiven quantitativen Merkmalen mit rechtsschiefer Verteilung, bei denen die
Originaldaten logarithmisch transformiert wurden (Gesamtanteil morphologisch
veränderter Samenzellen, Kopf-, Hals-, Schwanzveränderungen, lose Köpfe und
Plasmatropfen im Eosinausstrich, Gesamtanteil an Kopfkappenveränderungen
und abgelöste Kopfkappen in der Spermac®-Färbung, Anteil an nicht aufgerollten
Geißeln im HOS-Test), erfolgte die einfache Datenbeschreibung durch Angabe
von geometrischem Mittelwert (g), Streufaktor (SF), Minimum (Min.) und
Maximum (Max.) in der Form g (SF; Min., Max.). Bei graphischen Abbildungen
wurden diese in Form von Intervallen (g x SF; g/SF) dargestellt (g (SF)).
Zur Beurteilung der morphologischen Veränderungen wurden folgende Gruppen
zusammengefasst: Kopf-, Hals-, Schwanzveränderungen, lose Köpfe und
Plasmatropfen.
Aus
der
Summe
aller
Veränderungen
wurde
der
Gesamtprozentsatz morphologisch veränderter Samenzellen ermittelt.
Zur
statistischen
Prüfung
des
Verdünnereinflusses
der
drei
bzw.
vier
verschiedenen Verdünner auf die untersuchten Spermaparameter (im Vergleich
mit Nativsperma an Tag 0) auf Signifikanz wurden einfaktorielle Varianzanalysen
mit Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Verdünner“ durchgeführt. Bei
signifikanten Ergebnissen wurden die Werte im Anschluss an die Varianzanalyse
paarweise mit dem Student-Newman-Keuls-Test (paarweiser Mittelwertvergleich
nach Student-Newman-Keuls) verglichen.
97
Material und Methoden
Zur statistischen Prüfung des Verdünner- und Zeiteinflusses auf die untersuchten
Spermaparameter während des Untersuchungszeitraumes von zehn Tagen auf
Signifikanz wurden zweifaktorielle Varianzanalysen mit Messwiederholungen
bezüglich der Faktoren „Verdünner“ (drei bzw. vier verschiedene Verdünner) und
„Zeit“ (Untersuchungszeitpunkte: Tage 0, 1, 2, 3, 5, 7 und 10) eingesetzt. Es
wurden alle Verdünner jeweils paarweise miteinander verglichen. Dabei prüft der
„Haupteffekt Verdünner“ (pVerd), ob hinsichtlich der untersuchten Parameter
zwischen den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten
gemittelt über alle Mittelwerte ein Niveauunterschied besteht und der „Haupteffekt
Zeit“ (pZeit), ob insgesamt ein Zeiteinfluss nachgewiesen werden kann, oder
anders ausgedrückt, ob im Durchschnitt über alle verdünnten Ejakulate die
Mittelwerte der untersuchten Parameter konstant bleiben. Darüber hinaus prüft die
„Wechselwirkung“ (pW), ob die Zeitverläufe zwischen den mit den verschiedenen
Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten parallel bzw. gleichsinnig sind.
Zur Beurteilung der Zusammenhänge zwischen den subjektiv bestimmten und den
objektiv
mittels
CASA
gemessenen
durchgeführt.
Hierbei
wurden
geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit
Werten
alle
wurden
zeitgleichen
und
Korrelationsanalysen
Variablenpaare
mittels
CASA
(subjektiv
bestimmte
Vorwärtsbeweglichkeit; Anteil lebender Spermien im Eosinausstrich und mittels
CASA
gemessene
Viabilität
nach
SYBR-14/PI-Färbung)
zunächst
nach
Verdünnern getrennt und dann ohne Trennung nach Verdünnern (explorativ)
vergleichend
untersucht.
Zusammenhänge
Weiterhin
wurden
zwischen
auch
verschiedenen
zur
Beurteilung
der
Spermaparametern
Korrelationsanalysen durchgeführt. Auch hier erfolgten die Analysen zunächst
nach Verdünnern getrennt und dann ohne Trennung nach Verdünnern (explorativ).
Der durch die Korrelationsanalysen ermittelte Korrelationskoeffizient nach Pearson
(r) stellt eine Maßzahl für die Straffheit des linearen Zusammenhangs zwischen
zwei quantitativen Merkmalen dar, oder anders formuliert eine Maßzahl, die
angibt, wie eng der lineare Zusammenhang zwischen den Messwerten ist.
Die Bewertung der statistischen Signifikanzen erfolgte unter Zugrundelegung des
Signifikanzniveaus α = 0,05, was bedeutet, dass Ergebnisse mit p ≤ 0,05 als
statistisch signifikant angesehen wurden.
98
Ergebnisse
4
Ergebnisse
4.1 Untersuchungsergebnisse der Nativejakulate
In diesem Kapitel werden die Untersuchungsergebnisse der Nativejakulate (n = 30)
wiedergegeben. Dabei bezieht sich die Bezeichnung „Ejakulat“ auf die
spermienreiche Fraktion.
4.1.1 Makroskopische Untersuchung
Das mittlere Volumen der spermienreichen Fraktion betrug 2,9 ± 1,3 ml (Min.
1,5 ml, Max. 7,0 ml). Die Farbe der Ejakulate war zu 73,3 % (n = 22) weiß, zu
23,3 % (n = 7) weißlich und zu 3,3 % (n = 1) weißlich-rötlich. Alle Ejakulate wiesen
einen tierartspezifischen Geruch ohne besonderen Befund auf. Die Konsistenz der
spermienreichen Fraktion war bei 10,0 % (n = 3) der Proben sahnig, bei 50,0 %
(n = 15) milchig, bei 36,7 % (n = 11) molkig und bei 3,3 % (n = 1) wässrig. Im
Ejakulat eines Rüden (3,3 %) ließ sich eine Beimengung in Form von Blut finden.
4.1.2 Chemisch-physikalische Untersuchung
Der
pH-Wert
lag
bei
allen
untersuchten
Ejakulaten
innerhalb
des
Referenzbereiches von 6,2 bis 7,2 (Hoffmann, 2003d) und betrug im Durchschnitt
6,4 ± 0,1 (Min. 6,2, Max. 6,7).
4.1.3 Mikroskopische Untersuchung
Die geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit der Ejakulate lag im Mittel bei 80,8 ± 9,5 %
(Min. 50,0 %, Max. 90,0 %).
Der prozentuale Anteil lebender Spermien im Ejakulat betrug nach Anwendung
der Arcus-Sinus-Transformation im Mittel 87,4 % (80,6-92,9 %; Min. 70,0 %, Max.
96,0 %). Durchschnittlich wurden 10,3 % (SF = 1,66; Min. 4,0 %, Max. 37,0 %)
morphologisch veränderte Samenzellen gefunden. Hierbei handelte es sich bei
0,3 % (SF = 1,52; Min. 0,0 %, Max. 1,5 %) um Kopfveränderungen, bei 0,4 %
(SF = 1,96; Min. 0,0 %, Max. 2,5 %) um Halsveränderungen, bei 5,9 % (SF = 2,09;
Min. 1,5 %, Max. 34,5 %) um Schwanzveränderungen, bei 1,8 % (SF = 2,57; Min.
0,0 %, Max. 8,5 %) um lose Köpfe und bei 0,6 % (SF = 2,30; Min. 0,0 %, Max.
5,0 %) um Plasmatropfen.
99
Ergebnisse
Die mittlere Dichte der spermienreichen Fraktion lag nach Anwendung der
Wurzeltransformation bei 496,6 Mio. Spermien/ml (230,6-863,5 Mio./ml, Min. 60,0
Mio./ml, Max. 1450,0 Mio./ml).
Eine Agglutination der Spermien konnte in einem Ejakulat (3,3 %) nachgewiesen
werden. Mikroskopische Beimengungen wurden bei 13,3 % der Ejakulate (n = 4)
gefunden. Dabei handelte es sich in einer Probe (3,3 %) um Zellen der
Spermatogenese (+) und in drei Proben (10,0 %) um Prostasomen (+: n = 1; ++:
n = 1; +++: n = 1).
4.1.4 Spermac®-Färbung
Der Anteil an Samenzellen mit Kopfkappenveränderungen betrug 2,7 %
(SF = 2,63; Min. 0,0 %, Max. 13,5 %). Hierbei konnte bei 1,4 % (SF = 2,67; Min.
0,0 %, Max. 5,0 %; n = 22) der Samenzellen ein Verlust des Akrosoms (abgelöste
Kopfkappe) nachgewiesen werden.
4.1.5 HOS-Test
Der HOS-Test zeigte bei 3,1 % (SF = 2,34; Min. 0,5 %, Max. 16,5 %) der Spermien
eine nicht aufgerollte Geißel („not curled“).
4.1.6 Computer-assisted sperm analysis (CASA)
Die durchschnittliche Dichte der spermienreichen Fraktion lag nach Anwendung
der Wurzeltransformation bei 171,9 Mio. Spermien/ml (60,4-340,4 Mio./ml, Min.
10,9 Mio./ml, Max. 615,4 Mio./ml).
4.1.6.1
Motilitätsanalyse
Mittels CASA wurden eine durchschnittliche Gesamtmotilität von 70,9 ± 18,1 %
(Min. 30,7 %, Max. 95,6 %) und eine durchschnittliche Vorwärtsbeweglichkeit von
65,0 ± 19,9 % (Min. 22,1 %, Max. 89,5 %) ermittelt. Die Messergebnisse weiterer
durch CASA bestimmter Motilitätsparameter (Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis) sind in der folgenden Tabelle (Tab. 7) aufgeführt.
100
Ergebnisse
Tab. 7:
Messergebnisse der einzelnen durch CASA (SpermVision™-System)
bestimmten Motilitätsparameter in den Nativejakulaten (n = 30);
dargestellt durch Angabe von arithmetischem Mittelwert (),
Standardabweichung (SD), Minimum (Min.) und Maximum (Max.)
Parameter
± SD
Min.
Max.
DAP (µm)
41,6 ± 8,7
23,7
53,9
DCL (µm)
61,9 ± 11,6
42,6
85,1
DSL (µm)
35,1 ± 9,1
14,9
50,0
VAP (µm/s)
97,4 ± 20,4
55,2
123,7
VCL (µm/s)
144,9 ± 27,5
97,9
199,9
VSL (µm/s)
82,5 ± 21,3
33,9
112,9
ALH (µm)
5,7 ± 1,0
3,5
7,9
BCF (Hz)
26,2 ± 3,4
20,5
34,5
STR (VSL/VAP) (%)
83,4 ± 8,1
61,0
92,0
LIN (VSL/VCL) (%)
56,6 ± 11,6
27,0
76,0
WOB (VAP/VCL) (%)
67,0 ± 8,4
45,0
82,0
4.1.6.2
Viabilitätsanalyse
Die nach SYBR-14/PI-Färbung gemessene Viabilität der Spermien in den
Nativejakulaten betrug nach Anwendung der Arcus-Sinus-Transformation im
Durchschnitt 82,7 % (71,0-91,9 %; Min. 57,4 %, Max. 97,1 %).
4.2 Ergebnisse der weiterverarbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem
Verdünnen an Tag 0
Voraussetzung für die Weiterverarbeitung der spermienreichen Fraktion war eine
geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit von mindestens 50 % (siehe Kap. 3.4), die von
allen 30 Probanden erfüllt wurde.
Nach vollständiger Aufarbeitung des Spermas mit den verschiedenen Verdünnern
erfolgte vor der endgültigen Kühlung eine Untersuchung der verdünnten Ejakulate.
Diese diente der Erfassung der durch das Verdünnen auftretenden Effekte. Die
unmittelbar nach dem Verdünnen der spermienreichen Fraktion untersuchten
Parameter waren die gleichen wie bei Untersuchung der Nativejakulate. Dadurch
wurde ein direkter Vergleich zwischen den verschiedenen Verdünnern hinsichtlich
ihres Einflusses auf die Spermaqualität möglich.
101
Ergebnisse
4.2.1 Dichten der verdünnten Ejakulate
4.2.1.1
Neubauer-Zählkammer
Die durchschnittlichen mittels der Neubauer-Zählkammer bestimmten Dichten der
verdünnten Ejakulate sind in Tab. 8 wiedergegeben.
Tab. 8:
Durchschnittliche mittels Neubauer-Zählkammer bestimmte Dichten der
mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate nach
Anwendung der Wurzeltransformation; dargestellt durch Angabe von
„modifiziertem Mittelwert“ (r), „modifiziertem 1-s-Bereich“ (1-s-Bereich),
Minimum (Min.) und Maximum (Max.)
Verdünner
n
r
1-s-Bereich
Min.
Max.
6
6
6
(x 10 /ml)
(x 10 /ml)
(x 10 /ml) (x 106/ml)
CP
30
76,0
43,0-118,3
20,0
150,0
TE
30
80,6
45,3-126,0
25,0
160,0
Up 1 + 2
12
84,7
52,2-125,1
35,0
135,0
Up 1
18
127,3
86,1-176,6
60,0
205,0
4.2.1.2
CASA
Die durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Dichten der verdünnten Ejakulate
sind in Tab. 9 wiedergegeben.
Tab. 9:
Durchschnittliche mittels CASA (SpermVision™-System) bestimmte
Dichten der mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulate nach Anwendung der Wurzeltransformation; dargestellt durch
Angabe von „modifiziertem Mittelwert“ (r), „modifiziertem 1-s-Bereich“
(1-s-Bereich), Minimum (Min.) und Maximum (Max.)
Verdünner
n
r
1-s-Bereich
Min.
Max.
6
6
6
(x 10 /ml)
(x 10 /ml)
(x 10 /ml) (x 106/ml)
CP
30
71,8
37,6-117,0
19,8
177,6
TE
30
77,7
40,5-126,7
24,8
205,4
Up 1 + 2
12
66,8
40,9-99,1
25,5
115,3
Up 1
18
127,9
80,0-187,1
53,6
227,9
4.2.2 Einfluss der Verdünner auf die Motilität an Tag 0
Nach Zugabe der verschiedenen Verdünner zu den Nativejakulaten konnte eine
tendenzielle Abnahme fast aller untersuchten Motilitätsparameter beobachtet
werden.
102
Ergebnisse
4.2.2.1
Die
Subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
durchschnittliche
subjektiv
geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit
der
Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulate unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0) ist in Tab. 10 dargestellt.
Durch alle Verdünner kam es, verglichen mit dem Nativsperma, zu einer leichten
Reduktion
der
im
Mittel
geschätzten
Motilitätswerte.
Die
geringsten
Motilitätsabnahmen unmittelbar nach dem Verdünnen waren in den mit CP und TE
aufgearbeiteten Ejakulaten zu beobachten, die stärksten in den mit Up 1 + 2
aufgearbeiteten Ejakulaten, wenn auch der Unterschied sich als nicht signifikant
erwies.
Tab. 10: Subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit (n, ± SD, Min., Max.) im
Nativsperma und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0
Verdünner
n
± SD (%)
Min. (%)
Max. (%)
keiner (Nativsperma)
30
80,8 ± 9,5
50,0
90,0
CP
30
77,8 ± 11,4
50,0
90,0
TE
30
77,2 ± 14,3
40,0
90,0
Up 1 + 2
12
73,8 ± 18,0
40,0
90,0
Up 1
18
75,8 ± 13,8
40,0
90,0
An Tag 0, unmittelbar nach dem Verdünnen, konnte in der einfaktoriellen
Varianzanalyse mit Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Verdünner“ bei
Betrachtung der subjektiv geschätzten Vorwärtsbeweglichkeit kein signifikanter
Unterschied
zwischen
dem
Nativsperma,
den
mit
CP,
TE
sowie
Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden (n = 12; p = 0,43). Auch
zwischen dem Nativsperma, den mit CP und den mit TE verdünnten Proben ließ
sich kein signifikanter Unterschied nachweisen (n = 30; p = 0,084). Lediglich
zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten
konnte ein signifikanter Unterschied bezüglich der mittleren subjektiv geschätzten
Vorwärtsbeweglichkeit beobachtet werden (n = 18; p = 0,03). Beim anschließenden
paarweisen Vergleich der Mittelwerte (Student-Newman-Keuls-Test) zeigte sich,
dass sich nur die geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit in den mit Up 1 verdünnten
Ejakulaten signifikant von der in den Nativejakulaten unterschied (p < 0,05). Die
Unterschiede der anderen Verdünner zum Nativsperma und auch der Verdünner
untereinander waren nicht signifikant.
103
Ergebnisse
4.2.2.2
Mittels CASA gemessene Gesamtmotilität
Die durchschnittliche mittels CASA bestimmte Gesamtmotilität der Ejakulate vor
und unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0) ist in Abb. 8 dargestellt. Im
Gegensatz zur subjektiv geschätzten Vorwärtsbeweglichkeit, bei der es durch alle
Verdünner zu einer Motilitätsabnahme unmittelbar nach dem Verdünnen kam,
konnte bei der CASA-Gesamtmotilität beim Vergleich der Messwerte der
verdünnten Ejakulate mit denen des Nativspermas nur bei den mit CP und
Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten eine Reduktion der Motilität beobachtet werden.
Der Motilitätsabfall war in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten am stärksten
ausgeprägt. In den mit TE verdünnten Ejakulaten blieb die durchschnittliche
CASA-Gesamtmotilität nahezu konstant und in den mit Up 1 verdünnten Proben
konnte sogar eine Zunahme der mittleren CASA-Gesamtmotilität festgestellt
werden. Allerdings konnte für keine der genannten Veränderungen eine
CASA-Gesamtmotilität in %
statistische Signifikanz belegt werden.
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
Nativsperma (n = 30)
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
Abb. 8: Prozentsatz an motilen Samenzellen (mittels Computer-assisted sperm
analysis (CASA; SpermVision™-System) gemessene Gesamtmotilität;
± SD) im Nativsperma und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0;
CP = Verdünner CaniPRO™ Chill 10, TE = TRIS-Fruktose-EigelbVerdünner, Up 1 + 2 = Uppsala Equex-2 System (Verdünner 1 und
Verdünner 2), Up 1 = Uppsala Equex-2 System (nur Verdünner 1),
n = Probenanzahl
Unmittelbar nach dem Verdünnen konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit
Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Verdünner“ kein signifikanter
Unterschied
der
durchschnittlichen
CASA-Gesamtmotilität
zwischen
dem
Nativsperma, den mit CP, TE sowie Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt
werden (n = 12; p = 0,12). Auch zwischen dem Nativsperma, den mit CP und den
104
Ergebnisse
mit TE verdünnten Proben ließ sich kein signifikanter Unterschied nachweisen
(n = 30; p = 0,41). Zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE und Up 1
verdünnten
Ejakulaten
konnte
jedoch
ein
signifikanter
Unterschied
der
durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Gesamtmotilität verifiziert werden
(n = 18; p = 0,036). Der folgende paarweise Vergleich nach Student-NewmanKeuls ergab einen signifikanten Unterschied zwischen den mittleren CASAGesamtmotilitäten in den mit CP und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten (p < 0,05),
wobei der Mittelwert in Up 1 (75,5 ± 11,8 %) höher lag als in CP (68,3 ± 13,7 %).
Zwischen den Nativejakulaten und den verschiedenen Verdünnern sowie
zwischen den Verdünnern CP und TE bzw. TE und Up 1 ließen sich keine
weiteren signifikanten Unterschiede feststellen.
4.2.2.3
Die
Mittels CASA gemessene Vorwärtsbeweglichkeit
durchschnittliche
mittels
CASA
bestimmte
Vorwärtsbeweglichkeit
der
Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulate unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0) ist in Abb. 9 dargestellt. Wie
bei der CASA-Gesamtmotilität kam es auch bei der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
beim Vergleich der Messwerte der verdünnten Ejakulate mit denen des
Nativspermas in den mit CP und Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten zu einer
Reduktion der Motilität. Ebenso konnte in den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten
ein Motilitätsabfall unmittelbar nach dem Verdünnen beobachtet werden. Die
stärkste Abnahme der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit fand in den mit Up 1 + 2
verdünnten Ejakulaten statt. In den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten ließ sich
dagegen eine tendenzielle Zunahme der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit feststellen.
Auch hier konnten jedoch keine statistischen Signifikanzen für die beobachteten
Veränderungen nachgewiesen werden.
105
CASAVorwärtsbeweglichkeit in %
Ergebnisse
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
Nativsperma (n = 30)
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
Abb. 9: Prozentsatz an vorwärtsbeweglichen Samenzellen (mittels Computerassisted sperm analysis (CASA; SpermVision™-System) gemessene
Vorwärtsbeweglichkeit; ± SD) im Nativsperma und in den
verschiedenen Verdünnern an Tag 0; CP = Verdünner CaniPRO™ Chill
10, TE = TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner, Up 1 + 2 = Uppsala Equex-2
System (Verdünner 1 und Verdünner 2), Up 1 = Uppsala Equex-2 System
(nur Verdünner 1), n = Probenanzahl
An Tag 0 konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen
bezüglich des Faktors „Verdünner“ bei Betrachtung der durchschnittlichen CASAVorwärtsbeweglichkeit kein signifikanter Unterschied zwischen dem Nativsperma,
den mit CP, TE sowie Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden (n = 12;
p = 0,12). Auch zwischen dem Nativsperma, den mit CP und den mit TE
verdünnten Proben ließ sich kein signifikanter Unterschied nachweisen (n = 30;
p = 0,15). Zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE und Up 1 verdünnten
Ejakulaten konnte ein signifikanter Unterschied der im Mittel durch CASA
gemessenen Vorwärtsbeweglichkeit nachgewiesen werden (n = 18; p = 0,022). Der
im Anschluss an die Varianzanalyse durchgeführte paarweise Vergleich nach
Student-Newman-Keuls zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den
mittleren CASA-Vorwärtsbeweglichkeiten in den mit CP und Up 1 verdünnten
Ejakulaten auf (p < 0,05), wobei der Mittelwert in Up 1 (68,2 ± 13,7 %) über dem in
CP (59,8 ± 17,1 %) lag. Zwischen den Nativejakulaten und den verschiedenen
Verdünnern sowie zwischen den Verdünnern CP und TE bzw. TE und Up 1 ließen
sich keine weiteren signifikanten Unterschiede feststellen.
4.2.2.4
Weitere mittels CASA bestimmte Motilitätsparameter
Im Folgenden werden weitere durch CASA (SpermVision™-System) bestimmte
Motilitätsparameter
(Abkürzungen
siehe
106
Abkürzungsverzeichnis)
der
Ergebnisse
Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulate unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0) dargestellt. Da das
SpermVision™-System
eine
Vielzahl
an
Motilitätsparametern
misst
bzw.
errechnet, sollen hier nur die Messergebnisse für einige ausgewählte Parameter
(VAP, VCL, VSL, ALH, BCF, LIN) wiedergegeben werden. Eine ausführliche
Darstellung der Messergebnisse für alle CASA-Motilitätsparameter (DAP, DCL,
DSL, VAP, VCL, VSL, ALH, BCF, STR, LIN, WOB) der Nativejakulate und der mit
den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem
Verdünnen (Tag 0) findet sich im Anhang (Tab. A5, Kap. 9.8).
Bei den Streckenparametern (DAP, DCL, DSL) war im Vergleich mit dem
Nativsperma in allen verdünnten Ejakulaten unmittelbar nach Zugabe der
Verdünner eine Abnahme der durchschnittlich bestimmten Messwerte zu
beobachten. Dabei zeigten sich in mit CP verdünnten Proben für alle drei
Streckenparameter die geringsten und in mit Up 1 + 2 verdünnten Proben für alle
drei Parameter die stärksten Abnahmen.
Für die Geschwindigkeitsparameter (VAP, VCL, VSL) konnten die gleichen
Beobachtungen gemacht werden. Die nachstehenden Tabellen (Tab. 11-13)
geben
die
durchschnittlichen
mittels
CASA
bestimmten
Werte
der
Motilitätsparameter VAP, VCL und VSL der Ejakulate vor und unmittelbar nach
dem Verdünnen (Tag 0) wieder.
Aus Tab. 11 ist ersichtlich, dass die verdünnten Ejakulate im Vergleich mit dem
Nativsperma alle eine Abnahme der Mittelwerte des Motilitätsparameters VAP
zeigten. Dabei konnte in den mit CP verdünnten Proben die geringste Abnahme
beobachtet werden und in den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben die stärkste.
Tab. 11: CASA-Motilitätsparameter VAP (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0
Verdünner
n ± SD (µm/s) Min. (µm/s) Max. (µm/s)
keiner (Nativsperma) 30
97,4 ± 20,4
55,2
123,7
CP
30
90,9 ± 16,0
54,1
113,0
TE
30
87,8 ± 15,4
51,2
119,5
Up 1 + 2
12
72,2 ± 12,6
52,7
89,5
Up 1
18
83,8 ± 10,4
53,9
94,6
107
Ergebnisse
Unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0) konnte in der einfaktoriellen
Varianzanalyse mit Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Verdünner“ für
VAP ein signifikanter Unterschied zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE
sowie Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden (n = 12; p = 0,0004).
Beim paarweisen Vergleich mit dem Student-Newman-Keuls-Test ergaben sich
hinsichtlich des Parameters VAP signifikante Unterschiede zwischen dem
Nativsperma und den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten (p < 0,01), zwischen den
mit CP und den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben (p < 0,01) und zwischen den mit
TE und den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten (p < 0,01) (siehe Tab. A6,
Kap. 9.8).
Auch zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten
konnte unmittelbar nach dem Verdünnen in der einfaktoriellen Varianzanalyse ein
signifikanter Unterschied für VAP nachgewiesen werden (n = 18; p < 0,0001). Der
folgende paarweise Vergleich nach Student-Newman-Keuls ergab signifikante
Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit den Verdünnern CP, TE
und Up 1 verdünnten Ejakulaten (jeweils mit p < 0,01). Ebenso unterschieden sich
bei Betrachtung des Parameters VAP die Verdünner CP und Up 1 (p < 0,01) und
die Verdünner TE und Up 1 (p < 0,01) signifikant voneinander. Zwischen den
Verdünnern CP und TE konnte mit dem Student-Newman-Keuls-Test kein
signifikanter Unterschied ermittelt werden (siehe Tab. A7, Kap. 9.8).
Weiterhin ließ sich unmittelbar nach dem Verdünnen mittels der einfaktoriellen
Varianzanalyse ein signifikanter Unterschied für VAP zwischen dem Nativsperma,
den mit CP und den mit TE verdünnten Proben nachweisen (n = 30; p = 0,0001).
Der im Anschluss durchgeführte paarweise Vergleich nach Student-NewmanKeuls zeigte signifikante Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit CP
verdünnten Proben (p < 0,01) und zwischen dem Nativsperma und den mit TE
verdünnten Proben (p < 0,01) auf. Die mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulate
unterschieden sich bezüglich des Parameters VAP nicht signifikant voneinander
(siehe Tab. A8, Kap. 9.8).
Die durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Werte des Motilitätsparameters
VCL der Ejakulate vor und unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0) werden in
Tab. 12 dargestellt. Auch hier ließ sich im Vergleich mit dem Nativsperma in allen
verdünnten Ejakulaten unmittelbar nach Zugabe der Verdünner eine Abnahme der
Mittelwerte des Motilitätsparameters VCL beobachten. In den mit CP und mit TE
108
Ergebnisse
verdünnten Ejakulaten war die Reduktion am geringsten ausgeprägt, in den mit
Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten am stärksten.
Tab. 12: CASA-Motilitätsparameter VCL (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0
Verdünner
n ± SD (µm/s) Min. (µm/s) Max. (µm/s)
keiner (Nativsperma) 30 144,9 ± 27,5
97,9
199,9
CP
30 127,0 ± 16,5
90,2
153,7
TE
30 126,8 ± 18,7
85,8
167,8
Up 1 + 2
12 109,1 ± 13,8
90,3
131,4
Up 1
18 123,1 ± 15,7
79,4
144,9
In den einfaktoriellen Varianzanalysen und den paarweisen Vergleichen nach
Student-Newman-Keuls konnten für VCL signifikante Unterschiede zwischen dem
Nativsperma und den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulaten nachgewiesen werden (jeweils mit p < 0,05 bzw. p < 0,01). Auch
zwischen den mit CP und den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben sowie zwischen
den mit TE und den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben konnten signifikante
Unterschiede ermittelt werden (jeweils mit p < 0,01). Zwischen den übrigen
Verdünnerpaaren zeigten sich keine signifikanten Unterschiede (Tab. A6-A8, Kap.
9.8).
Tab. 13 zeigt die durch CASA bestimmten Mittelwerte des Motilitätsparameters
VSL
der
Nativejakulate
und
der
mit
den
verschiedenen
Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0). Verglichen
mit den Nativejakulaten kam es durch die Zugabe der Verdünner in allen
verdünnten Ejakulaten zu einer Reduktion der durchschnittlich gemessenen VSL.
In den mit CP verdünnten Proben war die Abnahme am geringsten und in den mit
Up 1 + 2 verdünnten Proben am stärksten.
Tab. 13: CASA-Motilitätsparameter VSL (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0
Verdünner
n ± SD (µm/s) Min. (µm/s) Max. (µm/s)
keiner (Nativsperma) 30
82,5 ± 21,3
33,9
112,9
CP
30
76,2 ± 15,7
39,2
101,7
TE
30
71,8 ± 14,8
40,3
105,5
Up 1 + 2
12
60,7 ± 13,1
40,9
82,5
Up 1
18
66,3 ± 9,4
45,8
79,7
109
Ergebnisse
In den einfaktoriellen Varianzanalysen und den paarweisen Vergleichen nach
Student-Newman-Keuls konnten für VSL signifikante Unterschiede zwischen dem
Nativsperma und den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulaten nachgewiesen werden (jeweils mit p < 0,05 bzw. p < 0,01). Die
verdünnten Ejakulate untereinander unterschieden sich bezüglich des CASAMotilitätsparameters VSL nur teilweise. So waren lediglich die Unterschiede
zwischen den mit CP und den mit Up 1 verdünnten Proben (p < 0,01) sowie die
zwischen den mit TE und den mit Up 1 verdünnten Proben (p < 0,01) als signifikant
zu bewerten (Tab. A6-A8, Kap. 9.8).
Die folgende Tabelle (Tab. 14) gibt die durchschnittlichen mittels CASA
bestimmten Werte des Motilitätsparameters ALH der Ejakulate vor und unmittelbar
nach dem Verdünnen (Tag 0) wieder. Auch bei diesem Parameter fiel auf, dass es
in den verdünnten Ejakulaten im Vergleich mit dem Nativsperma stets zu einer
Abnahme der Mittelwerte kam. Hier konnte allerdings in den mit Up 1 verdünnten
Proben die geringste Reduktion gesehen werden und aber wieder in den mit
Up 1 + 2 verdünnten Proben die stärkste.
Tab. 14: CASA-Motilitätsparameter ALH (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0
Verdünner
n
± SD (µm)
Min. (µm)
Max. (µm)
keiner (Nativsperma) 30
5,7 ± 1,0
3,5
7,9
CP
30
5,2 ± 0,8
3,6
6,8
TE
30
5,4 ± 0,9
3,4
7,5
Up 1 + 2
12
4,4 ± 0,6
3,4
5,4
Up 1
18
5,5 ± 0,8
3,8
6,7
In den einfaktoriellen Varianzanalysen und den paarweisen Vergleichen nach
Student-Newman-Keuls bestanden bezüglich des Parameters ALH signifikante
Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit CP (p < 0,05) sowie den mit
Up 1 + 2 (p < 0,01) aufgearbeiteten Ejakulaten. Auch zwischen den mit CP und den
mit Up 1 + 2 verdünnten Proben sowie zwischen den mit TE und den mit Up 1 + 2
verdünnten Proben konnten signifikante Unterschiede ermittelt werden (jeweils mit
p < 0,01). Die mit den Verdünnern CP und TE aufgearbeiteten Ejakulate zeigten
keine signifikanten Unterschiede (Tab. A6-A8, Kap. 9.8).
110
Ergebnisse
Die durchschnittlichen mittels CASA bestimmten Werte des Motilitätsparameters
BCF
der
Nativejakulate
und
der
mit
den
verschiedenen
Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0) werden in
Tab. 15 wiedergegeben. Verglichen mit dem Nativsperma konnte unmittelbar nach
Zugabe der Verdünner in allen verdünnten Ejakulaten eine Abnahme der
Mittelwerte beobachtet werden. Dabei war die Abnahme, im Gegensatz zu allen
anderen Motilitätsparametern, in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten am
geringsten ausgeprägt und in den mit TE verdünnen Proben am stärksten.
Tab. 15: CASA-Motilitätsparameter BCF (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0
Verdünner
n
± SD (Hz)
Min. (Hz)
Max. (Hz)
keiner (Nativsperma) 30
26,2 ± 3,4
20,5
34,5
CP
30
24,0 ± 2,7
19,7
30,6
TE
30
23,1 ± 2,4
19,7
29,7
Up 1 + 2
12
24,9 ± 3,1
21,2
31,2
Up 1
18
23,6 ± 2,7
19,5
29,1
In den einfaktoriellen Varianzanalysen und den paarweisen Vergleichen nach
Student-Newman-Keuls konnten für BCF signifikante Unterschiede zwischen dem
Nativsperma und den mit CP, TE sowie Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt
werden
(jeweils
mit
p < 0,01).
Die
mit
den
verschiedenen
Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulate untereinander zeigten keine signifikanten Unterschiede
(Tab. A6-A8, Kap. 9.8).
Bei den durch CASA berechneten Motilitätsparametern (STR, LIN, WOB) war im
Vergleich mit dem Nativsperma bei den verdünnten Ejakulaten teils eine Zunahme
und teils eine Abnahme der Mittelwerte feststellbar. Für alle drei Parameter konnte
in den mit CP verdünnten Proben eine Zunahme bzw. Konstanz der
durchschnittlichen Werte gesehen werden. In den mit TE verdünnten Proben kam
es, verglichen mit den Nativejakulaten, bei den Parametern STR und LIN zu einer
Abnahme der Durchschnittswerte und beim Parameter WOB zu einer Zunahme. In
den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten kam es beim Parameter STR zu
keiner Änderung durch die Zugabe des Verdünners und bei den Parametern LIN
und WOB zu einer Abnahme der Mittelwerte gegenüber dem Nativsperma. In den
mit Up 1 verdünnten Proben konnte bezüglich der Parameter STR und LIN eine
111
Ergebnisse
Abnahme der Mittelwerte gesehen werden und bezüglich des Parameters WOB
eine Zunahme.
Die
durchschnittlichen
mittels
CASA
berechneten
Werte
für
den
Motilitätsparameter LIN (VSL/VCL) der Ejakulate vor und unmittelbar nach dem
Verdünnen (Tag 0) sind in Tab. 16 dargestellt. Beim Vergleich mit dem
Nativsperma konnte in den mit CP verdünnten Proben eine Zunahme der
Linearität festgestellt werden und in den mit TE, Up 1 + 2 sowie Up 1 verdünnten
Proben eine Abnahme. Die stärkste Abnahme der Linearität war in den mit Up 1
verdünnten Proben zu erkennen.
Tab. 16: CASA-Motilitätsparameter LIN (VSL/VCL; n, ± SD, Min., Max.) im
Nativsperma und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0
Verdünner
n
± SD (%)
Min. (%)
Max. (%)
keiner (Nativsperma) 30
56,6 ± 11,6
27,0
76,0
CP
30
59,3 ± 9,2
39,0
77,0
TE
30
56,2 ± 9,4
37,0
69,0
Up 1 + 2
12
55,0 ± 8,5
42,0
68,0
Up 1
18
53,8 ± 6,4
43,0
65,0
Den Parameter LIN betreffend konnte in den einfaktoriellen Varianzanalysen mit
Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Verdünner“ und den paarweisen
Vergleichen nach Student-Newman-Keuls einzig zwischen den mit CP und den mit
Up 1 verdünnten Ejakulaten ein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden
(p < 0,01) (Tab. A6-A8, Kap. 9.8).
Insgesamt
ließen
sich
in
der
einfaktoriellen
Varianzanalyse
mit
Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Verdünner“ zum Vergleich der
Verdünner CP, TE und Up 1 + 2 mit dem Nativsperma (n = 12) unmittelbar nach
dem Verdünnen an Tag 0 für die CASA-Motilitätsparameter DAP, DCL, VAP, VCL,
VSL und ALH signifikante Unterschiede nachweisen (Tab. A6, Kap. 9.8). In der
einfaktoriellen Varianzanalyse zum Vergleich der Verdünner CP, TE und Up 1 mit
dem Nativsperma (n = 18) unmittelbar nach dem Verdünnen an Tag 0 konnten für
alle CASA-Motilitätsparameter mit Ausnahme von ALH signifikante Unterschiede
ermittelt werden (Tab. A7, Kap. 9.8) und auch in der einfaktoriellen Varianzanalyse
zum Vergleich der Verdünner CP und TE mit dem Nativsperma (n = 30)
unmittelbar nach dem Verdünnen an Tag 0 ließen sich für alle CASA112
Ergebnisse
Motilitätsparameter mit Ausnahme von STR und LIN signifikante Unterschiede
feststellen (Tab. A8, Kap. 9.8).
4.2.3 Einfluss der Verdünner auf die Viabilität an Tag 0
Unmittelbar nach der Aufarbeitung der Nativejakulate mit den verschiedenen
Verdünnern konnten weder im Eosinausstrich noch mittels CASA (nach SYBR14/PI-Färbung) beim Vergleich mit dem Nativsperma signifikante Veränderungen
der Viabilität in den verdünnten Ejakulaten beobachtet werden. Auch zwischen
den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten untereinander
bestanden keine signifikanten Unterschiede.
4.2.3.1
Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich
Der durchschnittliche Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich in der
spermienreichen Fraktion vor und unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0) mit
den verschiedenen Verdünnern ist in Abb. 10 dargestellt. Nach Zugabe der
verschiedenen Verdünner zu den Nativejakulaten blieben die im Eosinausstrich
bestimmten prozentualen Anteile an lebenden Spermien beim Vergleich mit dem
Nativsperma im Durchschnitt relativ konstant. In den mit CP, TE und Up 1 + 2
aufgearbeiteten Ejakulaten war keine deutliche Verringerung des Anteils an
lebenden Spermien im Eosinausstrich zu erkennen und in den mit Up 1
verdünnten Proben zeigte sich im Mittel sogar eine Verschiebung des Lebend-TotVerhältnisses zugunsten des Anteils an lebenden Samenzellen. Keine der
Veränderungen war als signifikant zu bewerten.
113
Anteil lebender Samenzellen
(Eosinausstrich) in %
Ergebnisse
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
Nativsperma (n = 30)
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
Abb. 10: Prozentualer Anteil lebender Samenzellen (Eosinausstrich) im
Nativsperma und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0; dargestellt
als rücktransformierter Mittelwert (r; „modifizierter Mittelwert“) mit
negativem und positivem Fehlerbalken („modifizierter 1-s-Bereich“);
CP = Verdünner CaniPRO™ Chill 10, TE = TRIS-Fruktose-EigelbVerdünner, Up 1 + 2 = Uppsala Equex-2 System (Verdünner 1 und
Verdünner 2), Up 1 = Uppsala Equex-2 System (nur Verdünner 1),
n = Probenanzahl
Unmittelbar nach dem Verdünnen an Tag 0 konnte in der einfaktoriellen
Varianzanalyse mit Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Verdünner“ kein
signifikanter Unterschied des durchschnittlichen prozentualen Anteils an lebenden
Samenzellen im Eosinausstrich zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE sowie
Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden (n = 12; p = 0,14). Auch
zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten
(n = 18; p = 0,19) und zwischen dem Nativsperma, den mit CP und den mit TE
verdünnten Proben (n = 30; p = 0,64) ließ sich bei Betrachtung des prozentualen
Anteils an lebenden Spermien im Eosinausstrich kein signifikanter Unterschied
nachweisen.
4.2.3.2
Mittels CASA gemessene Viabilität
Die durchschnittliche mittels CASA bestimmte Viabilität nach SYBR-14/PI-Färbung
der Nativejakulate und der mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulate unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0) ist in Abb. 11 dargestellt. Nach
Aufarbeitung des Nativspermas mit den verschiedenen Verdünnern konnte nur in
den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten eine Verringerung der CASA-Viabilität im
Vergleich mit den Nativejakulaten gesehen werden. Bei den mit CP, TE und Up 1
aufgearbeiteten Ejakulaten ließ sich im Vergleich mit der durchschnittlichen CASA114
Ergebnisse
Viabilität der Nativejakulate hingegen sogar eine leichte Zunahme der Mittelwerte
unmittelbar nach Verdünnung feststellen. Die beobachteten Veränderungen waren
CASA-Viabilität in %
jedoch nicht signifikant.
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
Nativsperma (n = 30)
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
Abb. 11: Prozentsatz an lebenden Samenzellen (mittels Computer-assisted sperm
analysis (CASA; SpermVision™-System) gemessene Viabilität nach
SYBR-14/PI-Färbung) im Nativsperma und in den verschiedenen
Verdünnern an Tag 0; dargestellt als rücktransformierter Mittelwert (r;
„modifizierter Mittelwert“) mit negativem und positivem Fehlerbalken
(„modifizierter 1-s-Bereich“); CP = Verdünner CaniPRO™ Chill 10,
TE = TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner,
Up 1 + 2 = Uppsala
Equex-2
System (Verdünner 1 und Verdünner 2), Up 1 = Uppsala Equex-2 System
(nur Verdünner 1), n = Probenanzahl
Unmittelbar nach dem Verdünnen konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit
Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Verdünner“ kein signifikanter
Unterschied der im Durchschnitt mittels CASA bestimmten Viabilität zwischen dem
Nativsperma, den mit CP, TE sowie Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt
werden (n = 12; p = 0,6). Auch zwischen dem Nativsperma, den mit CP und den
mit TE verdünnten Ejakulaten konnte bei Betrachtung der CASA-Viabilität kein
signifikanter Unterschied nachgewiesen werden (n = 30; p = 0,5). Zwischen dem
Nativsperma, den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten ließ sich hingegen
ein signifikanter Unterschied der durchschnittlichen mittels CASA bestimmten
Viabilität nachweisen (n = 18; p = 0,021). Im anschließenden Student-NewmanKeuls-Test konnte diese Signifikanz jedoch nicht bestätigt werden. Hier zeigte
keines der vergleichend getesteten Paare einen signifikanten Unterschied.
115
Ergebnisse
4.2.4 Einfluss der Verdünner auf den Anteil an morphologisch veränderten
Samenzellen an Tag 0
Der durchschnittliche Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen im
Eosinausstrich in der spermienreichen Fraktion vor und unmittelbar nach dem
Verdünnen (Tag 0) mit den verschiedenen Verdünnern ist in Tab. 17 dargestellt.
Durch die Verdünnung des Nativspermas mit den verschiedenen Verdünnern kam
es zu keiner Zunahme des im Mittel bestimmten Anteils an morphologisch
veränderten Samenzellen. Im Gegenteil war der im Nativsperma ausgezählte
mittlere Anteil höher als in den verdünnten Ejakulaten.
Tab. 17: Prozentualer Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen
(Eosinausstrich; n, g, SF, Min., Max.) im Nativsperma und in den
verschiedenen Verdünnern an Tag 0
Verdünner
n
g (%)
SF Min. (%) Max. (%)
keiner (Nativsperma) 30
10,3
1,66
4,0
37,0
CP
30
7,4
2,21
0,5
30,5
TE
30
8,2
1,93
2,5
35,0
Up 1 + 2
12
7,9
2,08
3,0
26,0
Up 1
18
9,3
1,72
6,0
30,0
Unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0) konnte in der einfaktoriellen
Varianzanalyse mit Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Verdünner“ ein
signifikanter Unterschied hinsichtlich des Anteils an morphologisch veränderten
Samenzellen im Eosinausstrich zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE sowie
Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden (n = 12; p = 0,041). Beim
anschließenden paarweisen Vergleich mit dem Student-Newman-Keuls-Test
stellte sich dieser als signifikanter Unterschied zwischen dem Nativsperma und
den mit CP verdünnten Proben heraus (p < 0,05). Dabei lag der in den mit CP
verdünnten
Proben
bestimmte
durchschnittliche
Anteil
an
morphologisch
veränderten Samenzellen unter dem Anteil, der im Nativsperma bestimmt wurde
(Tab. 17). Die anderen paarweisen Vergleiche lieferten keine weiteren
signifikanten Differenzen.
Getrennt nach den einzelnen auftretenden morphologischen Veränderungen
ließen sich in der einfaktoriellen Varianzanalyse zwischen dem Nativsperma, den
mit CP, TE sowie Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten signifikante Unterschiede für
den Anteil an Schwanzveränderungen (n = 12; p = 0,047), für den Anteil an
116
Ergebnisse
Knickschwänzen (n = 12; p = 0,0047) und für den Prozentsatz an Plasmatropfen
(n = 12; p = 0,011) feststellen. Hierbei unterschieden sich im Student-NewmanKeuls-Test bezüglich der Schwanzveränderungen die mit CP verdünnten
Ejakulate signifikant vom Nativsperma (p < 0,05). Bezüglich der Knickschwänze
unterschieden sich ebenfalls die mit CP verdünnten Ejakulate signifikant vom
Nativsperma (p < 0,05) und bezüglich der Plasmatropfen unterschieden sich die
mit allen drei Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate signifikant vom Nativsperma
(CP mit p < 0,05; TE mit p < 0,05; Up 1 + 2 mit p < 0,01), jedoch nicht
untereinander. Für alle genannten morphologischen Veränderungen waren die
Prozentsätze in den verdünnten Ejakulaten geringer als im Nativsperma.
Zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten
konnte mittels einfaktorieller Varianzanalyse kein signifikanter Unterschied des
prozentualen Anteils an morphologisch veränderten Spermien nachgewiesen
werden (n = 18; p = 0,18).
Bei Betrachtung der einzelnen auftretenden morphologischen Veränderungen
konnten in der einfaktoriellen Varianzanalyse jedoch signifikante Unterschiede
zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten
bezüglich des Anteils an Knickschwänzen (n = 18; p = 0,0001) und des Anteils an
schleifenförmigen Schwänzen (n = 18; p = 0,012) ermittelt werden. Diese erwiesen
sich im Student-Newman-Keuls-Test als signifikante Unterschiede zwischen dem
Nativsperma und den mit CP, den mit TE sowie den mit Up 1 verdünnten Proben
für den Anteil an Knickschwänzen (jeweils mit p < 0,01) und als signifikante
Unterschiede zwischen dem Nativsperma und den mit CP, den mit TE sowie den
mit Up 1 verdünnten Proben für den Anteil an schleifenförmigen Schwänzen
(jeweils mit p < 0,05). Dabei war der Prozentsatz an Knickschwänzen in den
verdünnten Ejakulaten stets geringer als im Nativsperma, der Anteil an
schleifenförmigen Schwänzen jedoch stets höher. Bei keiner der genannten
pathologischen Veränderungen konnte ein signifikanter Unterschied zwischen den
Verdünnern untereinander nachgewiesen werden.
In der einfaktoriellen Varianzanalyse zum Vergleich der mit CP und TE
aufgearbeiteten Ejakulate mit dem Nativsperma ließ sich hinsichtlich des Anteils
an morphologisch veränderten Samenzellen im Eosinausstrich ein signifikanter
Unterschied ermitteln (n = 30; p = 0,0022). Der daraufhin durchgeführte paarweise
Vergleich nach Student-Newman-Keuls zeigte signifikante Unterschiede zwischen
dem Nativsperma und den mit CP verdünnten Proben (p < 0,01) und zwischen
117
Ergebnisse
dem Nativsperma und den mit TE verdünnten Proben (p < 0,05) auf. Die mit CP
und die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich bezüglich des Anteils
an morphologisch veränderten Samenzellen nicht signifikant voneinander.
Getrennt nach den einzelnen beobachteten morphologischen Veränderungen
ließen sich in der einfaktoriellen Varianzanalyse zwischen dem Nativsperma, den
mit CP und den mit TE aufgearbeiteten Proben signifikante Unterschiede für den
Anteil an Knickschwänzen (n = 30; p < 0,0001) und für den Prozentsatz an
Plasmatropfen (n = 30; p = 0,0005) feststellen. Der anschließende paarweise
Vergleich nach Student-Newman-Keuls zeigte für beide Parameter signifikante
Unterschiede sowohl zwischen dem Nativsperma und den mit CP verdünnten
Ejakulaten (jeweils mit p < 0,01) als auch zwischen dem Nativsperma und den mit
TE verdünnten Ejakulaten (jeweils mit p < 0,01). Dabei war die Anteile an
Knickschwänzen und Plasmatropfen in den mit CP und TE verdünnten Ejakulaten
niedriger als im Nativsperma. Die Verdünner untereinander zeigten keinen
signifikanten Unterschied.
4.2.5 Einfluss der Verdünner auf den Anteil an akrosomalen Veränderungen bzw.
auf den Anteil an abgelösten Akrosomen an Tag 0
Der durchschnittliche Anteil an akrosomalen Veränderungen (Kopfkappenveränderungen) der Samenzellen bzw. an abgelösten Akrosomen in der
Spermac®-Färbung in den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen
Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0)
ist in Tab. 18 dargestellt. Tendenziell war in mit CP, TE und Up 1 + 2 verdünnten
Ejakulaten eine Zunahme des Anteils an Kopfkappenveränderungen der
Samenzellen nach der Verdünnung zu erkennen, während in mit Up 1 verdünnten
Proben der Anteil an Kopfkappenveränderungen nahezu konstant blieb. Ebenso
verhielt es sich für den Anteil an abgelösten Akrosomen. Auch hier konnte in den
mit CP, TE und Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten eine tendenzielle Zunahme
festgestellt werden, während in mit Up 1 verdünnten Ejakulaten der Anteil an
abgelösten Akrosomen konstant blieb. Für beide Untersuchungsparameter wurden
die stärksten Zunahmen in den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten
beobachtet, die geringsten in den mit Up 1 bzw. in den mit TE verdünnten Proben.
118
Ergebnisse
Tab. 18: Prozentsatz an Kopfkappenveränderungen bzw. an abgelösten
Akrosomen (Werte in Klammern) in der Spermac®-Färbung im
Nativsperma und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0 (n, g, SF,
Min., Max.)
Verdünner
n
g (%)
SF
Min. (%) Max. (%)
keiner (Nativsperma) 30
2,7
2,63
0,0
13,5
(22) (1,4) (2,67)
(0,0)
(5,0)
CP
30
4,2
2,43
0,0
25,0
(22) (2,1) (2,05)
(0,0)
(7,0)
TE
30
3,9
2,67
0,0
24,5
(22) (1,8) (2,28)
(0,0)
(8,0)
Up 1 + 2
12
6,6
2,18
1,5
24,0
(4) (2,7) (1,55)
(1,5)
(4,0)
Up 1
18
2,8
2,34
0,0
9,0
(18) (1,4) (2,42)
(0,0)
(4,0)
Unmittelbar nach dem Verdünnen an Tag 0 konnte in der einfaktoriellen
Varianzanalyse mit Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Verdünner“ kein
signifikanter
Unterschied
des
Kopfkappenveränderungen
in
durchschnittlichen
der
prozentualen
Spermac®-Färbung
Anteils
zwischen
an
dem
Nativsperma, den mit CP, TE sowie Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt
werden (n = 12; p = 0,076). Auch bei gesonderter Betrachtung der einzelnen
auftretenden
Kopfkappenveränderungen
Kopfkappen,
sonstige
Veränderungen)
(abgelöste
konnten
Kopfkappen,
durch
die
schiefe
einfaktoriellen
Varianzanalysen keine signifikanten Unterschiede verifiziert werden.
Zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten war
in der einfaktoriellen Varianzanalyse kein signifikanter Unterschied bezüglich des
mittleren Anteils an Kopfkappenveränderungen zu beobachten (n = 18; p = 0,14).
Allerdings
ließ
sich
hier
bei
getrennter
Betrachtung
der
einzelnen
Kopfkappenveränderungen in den einfaktoriellen Varianzanalysen ein signifikanter
Unterschied bezüglich des Anteils an sonstigen Veränderungen ermitteln (n = 18;
p = 0,043). Im anschließenden paarweisen Vergleich nach Student-Newman-Keuls
erwies sich dieser ausschließlich als signifikanter Unterschied zwischen dem
Nativsperma und den mit Up 1 verdünnten Proben (p < 0,05), wobei der Anteil an
sonstigen Veränderungen in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten höher war als im
Nativsperma.
In der einfaktoriellen Varianzanalyse zum Vergleich der mit CP und der mit TE
aufgearbeiteten Ejakulate mit dem Nativsperma an Tag 0 ließ sich hinsichtlich des
119
Ergebnisse
Anteils an Kopfkappenveränderungen der Samenzellen in der Spermac®-Färbung
ein signifikanter Unterschied beobachten (n = 30; p = 0,017). Der im Anschluss
durchgeführte Student-Newman-Keuls-Test zeigte einen signifikanten Unterschied
zwischen dem Nativsperma und den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten sowie
zwischen dem Nativsperma und den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten (jeweils
mit
p < 0,05).
Wie
aus
Tab.
18
ersichtlich,
war
der
Anteil
an
Kopfkappenveränderungen in den mit CP und TE verdünnten Ejakulaten höher als
im Nativsperma. Zwischen den mit CP und den mit TE verdünnten Proben
untereinander
Betrachtung
gab
der
es
keinen
einzelnen
signifikanten
Unterschied.
Kopfkappenveränderungen
Bei
konnten
getrennter
in
den
einfaktoriellen Varianzanalysen keine weiteren signifikanten Unterschiede ermittelt
werden.
4.2.6 Einfluss der Verdünner auf den Anteil an membrandefekten Samenzellen
im HOS-Test an Tag 0
Der durchschnittliche Anteil an membrandefekten Samenzellen im HOS-Test in
der spermienreichen Fraktion der Nativejakulate und der mit den verschiedenen
Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0)
ist in Abb. 12 dargestellt. In allen verdünnten Proben konnte im Vergleich zum
Nativsperma ein signifikanter Anstieg des Prozentsatzes an Samenzellen mit nicht
aufgerolltem Schwanz („not curled“) beobachtet werden. Dabei zeigte sich der
geringste Anstieg in mit Up 1 verdünnten Ejakulaten, der größte in mit Up 1 + 2
verdünnten Proben.
120
Anteil an Samenzellen mit
nicht aufgerolltem Schwanz
("not curled")
Ergebnisse
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Nativsperma (n = 30)
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
Abb. 12: Prozentsatz an Samenzellen mit nicht aufgerolltem Schwanz („not
curled“) im HOS-Test im Nativsperma und in den verschiedenen
Verdünnern an Tag 0; dargestellt als geometrischer Mittelwert und
Streufaktor [g (SF)]; CP = Verdünner CaniPRO™ Chill 10, TE = TRISFruktose-Eigelb-Verdünner,
Up 1 + 2 = Uppsala
Equex-2
System
(Verdünner 1 und Verdünner 2), Up 1 = Uppsala Equex-2 System (nur
Verdünner 1), n = Probenanzahl
An Tag 0 konnte in der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen
bezüglich
des
Faktors
„Verdünner“
ein
signifikanter
Unterschied
des
durchschnittlichen Anteils an membrandefekten Samenzellen im HOS-Test
zwischen dem Nativsperma, den mit CP, TE sowie Up 1 + 2 aufgearbeiteten
Ejakulaten ermittelt werden (n = 12; p < 0,0001). Der im Anschluss durchgeführte
Student-Newman-Keuls-Test zeigte signifikante Unterschiede zwischen dem
Nativsperma und den mit CP, TE sowie Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten (jeweils
mit
p < 0,01).
aufgearbeiteten
Beim
Vergleich
Ejakulate
der
mit
untereinander
den
ließen
verschiedenen
sich
keine
Verdünnern
signifikanten
Unterschiede erkennen.
Auch zwischen dem Nativsperma und den mit CP, TE sowie Up 1 verdünnten
Proben ließ sich bezüglich des Anteils an membrandefekten Samenzellen im
HOS-Test in der einfaktoriellen Varianzanalyse ein signifikanter Unterschied
nachweisen (n = 18; p = 0,027). Im anschließenden paarweisen Vergleich nach
Student-Newman-Keuls
ergab
sich
allerdings
lediglich
ein
signifikanter
Unterschied zwischen dem Nativsperma und den mit Up 1 aufgearbeiteten
Ejakulaten (p < 0,05).
Weiterhin konnte unmittelbar nach dem Verdünnen in der einfaktoriellen
Varianzanalyse ein signifikanter Unterschied zwischen dem Nativsperma, den mit
CP und den mit TE verdünnten Ejakulaten festgestellt werden (n = 30; p = 0,0002).
121
Ergebnisse
Der im Anschluss an die Varianzanalyse durchgeführte paarweise Vergleich nach
Student-Newman-Keuls zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen dem
Nativsperma und den mit CP verdünnten Proben sowie zwischen dem
Nativsperma und den mit TE verdünnen Proben auf (jeweils mit p < 0,01).
Zusammenfassend konnte mit dem HOS-Test nachgewiesen werden, dass der
Anteil an Samenzellen mit einer defekten Plasmamembran in allen verdünnten
Ejakulaten signifikant höher ist verglichen mit den Nativejakulaten. Beim Vergleich
der mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate untereinander
konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden.
4.3 Ergebnisse der Halteproben im Zeitverlauf
In diesem Kapitel erfolgt die Darstellung der Untersuchungsergebnisse nach
Flüssigkonservierung über einen Zeitraum von zehn Tagen. Mit Ausnahme des
HOS-Testes wurden an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7 und 10 die gleichen
Spermaparameter untersucht wie an Tag 0 und wie bei der Untersuchung der
Nativejakulate. Somit konnten die Einflüsse der verschiedenen Verdünner auf die
einzelnen Parameter über den gesamten Untersuchungszeitraum verfolgt werden.
4.3.1 Einfluss der Verdünner auf die Motilität im Zeitverlauf
Die Motilität der mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate
verminderte sich während der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn Tage, was
sowohl mit den Methoden der klassischen Spermatologie als auch mittels CASA
verifiziert werden konnte.
Bei Betrachtung der subjektiv geschätzten Vorwärtsbeweglichkeit, der CASAGesamtmotilität und der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit unterschieden sich die mit
Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulate am deutlichsten von den mit den anderen
Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten. Im Durchschnitt lagen die Motilitätswerte
der mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulate an nahezu jedem Untersuchungstermin
merklich niedriger als die Werte der mit den anderen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulate. Dieser Unterschied war bei fast allen genannten Parametern als
signifikant zu beurteilen.
122
Ergebnisse
4.3.1.1
Subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
Die durchschnittliche subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit der mit den
verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate bei Flüssigkonservierung bei
4°C für zehn Tage ist in Abb. 13 und Tab. 19 dargestellt. An Tag 0 unmittelbar
nach
dem
Verdünnen
konnte
bezüglich
der
subjektiv
geschätzten
Vorwärtsbeweglichkeit kein signifikanter Unterschied zwischen den mit den
verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden
(siehe Kap. 4.2.2.1). Erst im weiteren Zeitverlauf zeigten sich signifikante
Unterschiede zwischen den einzelnen Verdünnern, welche insbesondere gegen
Ende des Untersuchungszeitraumes deutlich zu erkennen waren. Insgesamt
wurde die subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit in den mit CP verdünnten
Ejakulaten über den Untersuchungszeitraum hinweg am besten konserviert. In
den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten war ab Tag 2 ein drastischer
Motilitätsabfall zu beobachten; die durchschnittliche Vorwärtsbeweglichkeit betrug
an Tag 2 60,4 ± 28,0 % und an Tag 3 sogar nur noch 47,9 ± 30,0 %, verglichen mit
durchschnittlich > 75 % an Tag 2 und > 70 % an Tag 3 in den mit den anderen
Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten. Eine ähnliche Abnahme der subjektiv
geschätzten Vorwärtsbeweglichkeit wie in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten
konnte in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten ab Tag 5 bzw. ab Tag 7 gesehen
werden. Hier betrug die subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit an Tag 5
durchschnittlich 65,3 ± 11,7 % und an Tag 7 durchschnittlich 44,9 ± 17,4 %,
während sie im Gegensatz dazu in den mit CP und TE verdünnten Ejakulaten an
Tag 5 noch rund 70 % und an Tag 7 noch etwa 60-65 % betrug. An Tag 10 war in
den
mit
CP
verdünnten
Ejakulaten
im
Mittel
noch
eine
geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit von 58,2 ± 22,1 % und in den mit TE verdünnten Ejakulaten
von 49,3 ± 23,9 % vorhanden.
123
Ergebnisse
geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit
in %
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
0
1
2
3
4
5
6
Tage
7
8
9
10
Abb. 13: Veränderungen
der
Mittelwerte ± SD
des
Prozentsatzes
an
vorwärtsbeweglichen Samenzellen (subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
unter
dem
Phasenkontrastmikroskop)
in
den
verschiedenen Verdünnern im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei
4°C über zehn Tage; CP = Verdünner CaniPRO™ Chill 10, TE = TRISFruktose-Eigelb-Verdünner,
Up 1 + 2 = Uppsala
Equex-2
System
(Verdünner 1 und Verdünner 2), Up 1 = Uppsala Equex-2 System (nur
Verdünner 1), n = Probenanzahl
In allen verdünnten Ejakulaten kam es im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung zu
einer signifikanten Reduktion der durchschnittlichen subjektiv geschätzten
Vorwärtsbeweglichkeit (jeweils mit pZeit < 0,0001). Die mit CP verdünnten Ejakulate
zeigten über den gesamten Untersuchungszeitraum signifikant höhere Werte für
die subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit als die mit TE, Up 1 + 2 und Up 1
verdünnten Ejakulate (jeweils mit pVerd < 0,0001) und auch der Zeitverlauf der mit
CP verdünnten Ejakulate unterschied sich signifikant von den Zeitverläufen der mit
TE, Up 1 + 2 und Up 1 verdünnten Ejakulate (jeweils mit pW < 0,0001). In den mit
TE aufgearbeiteten Ejakulaten ließen sich bezüglich der subjektiv geschätzten
Vorwärtsbeweglichkeit über den Untersuchungszeitraum wiederum signifikant
höhere Werte feststellen als in den mit Up 1 + 2 und Up 1 aufgearbeiteten
Ejakulaten (jeweils mit pVerd < 0,0001) und auch der Zeitverlauf der mit TE
aufgearbeiteten Ejakulate unterschied sich signifikant von den Zeitverläufen der
mit Up 1 + 2 und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulate (jeweils mit pW < 0,0001).
Eine ausführliche Darstellung der Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalysen
mit Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“, in denen
jeweils zwei Verdünner bezüglich der subjektiv geschätzten Vorwärtsbeweglichkeit
miteinander verglichen wurden, ist dem Anhang zu entnehmen (Tab. A10-A14,
Kap. 9.8).
124
Ergebnisse
Tab. 19: Motilitätswerte (subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit, CASAGesamtmotilität,
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit)
bei
4°C
flüssigkonservierter Hundespermien in den verschiedenen Verdünnern
im Zeitverlauf über zehn Tage; angegeben als Veränderungen der
Mittelwerte ± SD
Verdünner
n
Tag subjektiv geschätzte
CASACASA-VorwärtsVorwärtsGesamtmotilität
beweglichkeit
beweglichkeit (%)
(%)
(%)
CP
30
0
77,8 ± 11,4
68,3 ± 13,7
59,8 ± 17,1
1
81,0 ± 12,8
72,5 ± 13,5
64,4 ± 16,3
2
79,3 ± 12,3
71,5 ± 14,5
63,6 ± 17,0
3
76,5 ± 13,8
70,4 ± 14,6
61,2 ± 18,2
5
73,0 ± 17,7
68,9 ± 16,8
59,4 ± 20,2
7
66,2 ± 18,7
65,3 ± 18,6
56,0 ± 20,5
10
58,2 ± 22,1
59,1 ± 21,7
48,2 ± 23,3
TE
30
0
77,2 ± 14,3
71,0 ± 13,3
61,1 ± 18,6
1
80,2 ± 12,1
73,8 ± 13,3
64,0 ± 17,6
2
76,7 ± 13,2
71,9 ± 14,2
61,6 ± 18,7
3
74,0 ± 15,9
70,3 ± 15,9
60,1 ± 18,2
5
69,2 ± 18,4
67,6 ± 17,6
57,4 ± 20,8
7
60,7 ± 20,3
62,9 ± 19,4
52,1 ± 21,9
10
49,3 ± 23,9
54,5 ± 22,1
42,7 ± 23,5
Up 1 + 2
12
0
73,8 ± 18,0
63,5 ± 16,5
52,6 ± 20,5
1
73,3 ± 22,0
62,7 ± 19,4
52,2 ± 23,3
2
60,4 ± 28,0
52,6 ± 24,4
42,3 ± 25,0
3
47,9 ± 30,0
46,7 ± 25,8
36,3 ± 27,7
5
34,5 ± 30,3
38,9 ± 21,6
27,9 ± 21,8
7
13,5 ± 14,3
22,2 ± 13,9
10,8 ± 12,5
10
3,5 ± 4,6
12,1 ± 5,6
2,5 ± 4,0
Up 1
18
0
75,8 ± 13,8
75,5 ± 11,8
68,2 ± 13,7
1
77,8 ± 10,9
79,3 ± 9,5
70,8 ± 12,6
2
77,5 ± 8,8
74,6 ± 14,6
65,1 ± 18,0
3
72,2 ± 11,4
69,9 ± 12,2
58,4 ± 16,0
5
65,3 ± 11,7
62,9 ± 10,0
52,7 ± 11,8
7
44,9 ± 17,4
49,2 ± 15,5
37,4 ± 16,4
10
16,2 ± 12,1
24,2 ± 11,5
12,3 ± 10,1
4.3.1.2
Mittels CASA gemessene Gesamtmotilität
Abb. 14 und Tab. 19 zeigen den Prozentsatz an motilen Samenzellen (CASAGesamtmotilität) in den verschiedenen Verdünnern bei Flüssigkonservierung bei
4°C für zehn Tage. An Tag 0 unmittelbar nach dem Verdünnen konnte bezüglich
der CASA-Gesamtmotilität bereits ein signifikanter Unterschied zwischen den mit
CP und den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten festgestellt werden (siehe Kap.
125
Ergebnisse
4.2.2.2), wobei der Mittelwert in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten über dem in
den mit CP verdünnten Ejakulaten lag. Die mit den anderen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich an Tag 0 nicht signifikant
voneinander. Wie auch in der graphischen Darstellung (Abb. 14) erkennbar, war
die durchschnittliche CASA-Gesamtmotilität in den mit Up 1 verdünnten Proben bis
einschließlich Tag 2 höher als die mittlere CASA-Gesamtmotilität in den übrigen
Proben. An Tag 3 zeigten die mit CP, TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulate
nahezu gleiche Mittelwerte. Nur in den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben ließ sich
bereits ab Tag 1 ein starker Abfall der CASA-Gesamtmotilität beobachten, sodass
der Mittelwert an Tag 3 bereits deutlich unter dem der mit den anderen
Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate lag. Im weiteren Zeitverlauf war auch in den
mit Up 1 verdünnten Proben ein deutlicher Motilitätsabfall zu erkennen, welcher
zur Folge hatte, dass an Tag 10 nur noch eine CASA-Gesamtmotilität von
durchschnittlich 24,2 ± 11,5 % gemessen werden konnte. Im Vergleich dazu war
die Abnahme der CASA-Gesamtmotilität in den mit CP und TE verdünnten Proben
nur gering. Hier war an Tag 10 noch eine CASA-Gesamtmotilität von 59,1 ± 21,7 %
CASA-Gesamtmotilität in %
(CP) bzw. 54,5 ± 22,1 % (TE) vorhanden.
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
0
1
2
3
4
5
6
Tage
7
8
9
10
Abb. 14: Veränderungen der Mittelwerte ± SD des Prozentsatzes an motilen
Samenzellen (mittels Computer-assisted sperm analysis (CASA;
SpermVision™-System)
gemessene
Gesamtmotilität)
in
den
verschiedenen Verdünnern im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei
4°C über zehn Tage; CP = Verdünner CaniPRO™ Chill 10, TE = TRISFruktose-Eigelb-Verdünner,
Up 1 + 2 = Uppsala
Equex-2
System
(Verdünner 1 und Verdünner 2), Up 1 = Uppsala Equex-2 System (nur
Verdünner 1), n = Probenanzahl
126
Ergebnisse
In allen verdünnten Ejakulaten kam es im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung zu
einer signifikanten Abnahme der durchschnittlichen mittels CASA bestimmten
Gesamtmotilität (jeweils mit pZeit < 0,0001). Die mit CP verdünnten Ejakulate
zeigten über den Untersuchungszeitraum bezüglich der CASA-Gesamtmotilität
keinen signifikanten Niveauunterschied zu den mit TE verdünnten Ejakulaten,
jedoch zu den mit Up 1 + 2 und Up 1 verdünnten Ejakulaten (jeweils mit
pVerd < 0,0001). Der Zeitverlauf der mit CP verdünnten Ejakulate unterschied sich
signifikant von den Zeitverläufen der mit TE, Up 1 + 2 und Up 1 verdünnten
Ejakulate (jeweils mit pW < 0,0001). Bis einschließlich Tag 2 ließen sich in den mit
Up 1 verdünnten Proben höhere Werte ermitteln als in den übrigen Proben.
Weiterhin lag die durchschnittliche CASA-Gesamtmotilität in den mit TE
verdünnten Proben bis einschließlich Tag 3 über der in den mit CP und Up 1 + 2
verdünnten Proben. Ab Tag 3 konnten dann in den mit CP verdünnten Proben
stets höhere Werte bestimmt werden als in den mit TE, Up 1 + 2 und Up 1
verdünnten Proben. Die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate wiesen bezüglich der
CASA-Gesamtmotilität ebenso einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit
Up 1 + 2 (pVerd < 0,0001) und Up 1 (pVerd = 0,0003) aufgearbeiteten Ejakulaten auf
und auch der Zeitverlauf der mit TE aufgearbeiteten Ejakulate unterschied sich
signifikant von den Zeitverläufen der mit Up 1 + 2 und Up 1 aufgearbeiteten
Ejakulate (jeweils mit pW < 0,0001). Ab Tag 3 waren die Mittelwerte in den mit TE
verdünnten Proben stets höher als die in den mit Up 1 + 2 und Up 1 verdünnten
Proben.
Eine ausführliche Darstellung der Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen
mit Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“, in denen
jeweils
zwei
Verdünner
bezüglich
der
CASA-Gesamtmotilität
miteinander
verglichen wurden, ist dem Anhang zu entnehmen (Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
4.3.1.3
Mittels CASA gemessene Vorwärtsbeweglichkeit
Abb. 15 und Tab. 19 zeigen den Prozentsatz an vorwärtsbeweglichen
Samenzellen (CASA-Vorwärtsbeweglichkeit) in den verschiedenen Verdünnern
bei Flüssigkonservierung bei 4°C für zehn Tage. Wie bei Betrachtung der CASAGesamtmotilität konnte auch bezüglich der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit bereits
unmittelbar nach dem Verdünnen ein signifikanter Unterschied zwischen den mit
CP und den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten festgestellt werden (siehe Kap.
4.2.2.3). Auch hier lag der in den mit Up 1 verdünnten Proben bestimmte
127
Ergebnisse
Mittelwert über dem, der in den mit CP verdünnten Proben bestimmt wurde. Die
mit den anderen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich an Tag
0 nicht signifikant voneinander. Ebenfalls wie schon bei der CASA-Gesamtmotilität
beobachtet, lag die durchschnittliche CASA-Vorwärtsbeweglichkeit in den mit Up 1
verdünnten Proben bis einschließlich Tag 2 über der mittleren CASAVorwärtsbeweglichkeit der restlichen Proben. An Tag 3 zeigten die mit CP, TE und
Up 1 verdünnten Ejakulate dann ähnliche Mittelwerte (rund 60 %), während die
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten an Tag 3
bereits auf 36,3 ± 27,7 % abgesunken war. Ab Tag 5 war auch in den mit Up 1
verdünnten Ejakulaten ein stärkerer Abfall der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
erkennbar als in den mit CP und TE verdünnten Ejakulaten, sodass in den mit
Up 1 verdünnten Proben an Tag 10 nur noch eine durchschnittliche CASAVorwärtsbeweglichkeit von 12,3 ± 10,1 % vorhanden war, während in den mit CP
und TE verdünnten Proben nach zehn Tagen Flüssigkonservierung noch Werte
von > 40 % (CP: 48,2 ± 23,3 %; TE: 42,7 ± 23,5 %) beobachtet werden konnten.
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
in %
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
0
1
2
3
4
5
6
Tage
7
8
9
10
Abb. 15: Veränderungen
der
Mittelwerte ± SD
des
Prozentsatzes
an
vorwärtsbeweglichen Samenzellen (mittels Computer-assisted sperm
analysis (CASA; SpermVision™-System) gemessene Vorwärtsbeweglichkeit) in den verschiedenen Verdünnern im Zeitverlauf der
Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn Tage; CP = Verdünner
CaniPRO™
Chill
10,
TE = TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner,
Up 1 + 2 = Uppsala Equex-2 System (Verdünner 1 und Verdünner 2),
Up 1 = Uppsala Equex-2 System (nur Verdünner 1), n = Probenanzahl
Im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung konnte in allen verdünnten Ejakulaten
eine signifikante Reduktion der durchschnittlichen mittels CASA bestimmten
Vorwärtsbeweglichkeit nachgewiesen werden (jeweils mit pZeit < 0,0001). Die mit
128
Ergebnisse
CP aufgearbeiteten Ejakulate zeigten über den Untersuchungszeitraum bezüglich
der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit einen signifikanten Niveauunterschied zu den
mit TE
(pVerd = 0,011), Up 1 + 2 (pVerd < 0,0001)
und
Up 1 (pVerd = 0,0001)
aufgearbeiteten Ejakulaten und auch der Zeitverlauf der mit CP aufgearbeiteten
Ejakulate unterschied sich signifikant von den Zeitverläufen der mit TE, Up 1 + 2
und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulate (jeweils mit pW < 0,0001). In den mit TE
verdünnten Ejakulaten konnte wiederum ein signifikanter Niveauunterschied zu
den mit Up 1 + 2 (pVerd < 0,0001) und Up 1 (pVerd = 0,0045) verdünnten Ejakulaten
nachgewiesen werden. Weiterhin zeigte der Zeitverlauf der mit TE verdünnten
Ejakulate einen signifikanten Unterschied zu den Zeitverläufen der mit Up 1 + 2
und Up 1 verdünnten Ejakulate (jeweils mit pW < 0,0001). Insgesamt war die
durchschnittliche
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
in
den
mit
CP
und
TE
aufgearbeiteten Ejakulaten stets signifikant höher als in den mit Up 1 + 2
aufgearbeiteten Ejakulaten. Im Vergleich mit den mit Up 1 aufgearbeiteten
Ejakulaten ließen sich für die durchschnittliche CASA-Vorwärtsbeweglichkeit in
den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten anfangs niedrigere, ab Tag 3
jedoch höhere Werte nachweisen. Die mit CP aufgearbeiteten Ejakulate zeigten
über den Zeitverlauf im Mittel signifikant höhere Werte für die CASAVorwärtsbeweglichkeit als die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate.
Eine ausführliche Darstellung der Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalysen
mit Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“, in denen
jeweils zwei Verdünner bezüglich der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit miteinander
verglichen wurden, ist dem Anhang zu entnehmen (Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
4.3.1.4
Weitere mittels CASA bestimmte Motilitätsparameter
Die Messergebnisse für weitere durch CASA (SpermVision™-System) bestimmte
Motilitätsparameter (DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL, ALH, BCF, STR, LIN,
WOB) in den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten bei
Flüssigkonservierung bei 4°C für zehn Tage werden im Anhang tabellarisch
dargestellt (Tab. A9, Kap. 9.8). Ebenso lässt sich dort eine ausführliche
Darstellung
der
Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“, in denen
jeweils zwei Verdünner bezüglich der genannten CASA-Motilitätsparameter
miteinander verglichen wurden, finden (Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
129
Ergebnisse
Bei Betrachtung der Streckenparameter (DAP, DCL, DSL) konnten im Zeitverlauf
in allen verdünnten Ejakulaten Abnahmen der Mittelwerte beobachtet werden.
Dabei waren die Differenzen zwischen Tag 0 und Tag 10 in den mit Up 1 + 2
verdünnten Ejakulaten für alle drei Parameter am größten, gefolgt von den mit
Up 1 verdünnten Ejakulaten. Demgegenüber kam es in den mit CP und TE
verdünnten Ejakulaten über den Untersuchungszeitraum hinweg nur zu einer
geringen Reduktion der Mittelwerte. Insgesamt lagen die in den mit CP und TE
verdünnten Proben gemessenen Werte deutlich über denen in mit Up 1 + 2 und
nur mit Up 1 verdünnten Proben. Dabei waren die Mittelwerte in den mit CP
verdünnten
Ejakulaten
für
alle
drei
Parameter
über
den
gesamten
Untersuchungszeitraum stets leicht höher als in den mit TE verdünnten
Ejakulaten.
Die im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung beobachteten Abnahmen der
Mittelwerte für die Parameter DAP, DCL und DSL waren in allen verdünnten
Ejakulaten als signifikant zu beurteilen (pZeit = 0,0021 bis < 0,0001). In den mit CP
aufgearbeiteten Ejakulaten konnten über den Untersuchungszeitraum bezüglich
der Parameter DAP, DCL und DSL signifikante Niveauunterschiede zu den mit TE
(pVerd = 0,011 bis < 0,0001), Up 1 + 2 (jeweils mit pVerd < 0,0001) und Up 1 (jeweils
mit pVerd < 0,0001) aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden. Die
Zeitverläufe unterschieden sich zwischen den mit CP und TE aufgearbeiteten
Ejakulaten für den Parameter DCL signifikant (pW = 0,037), zwischen den mit CP
und Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten für alle drei Parameter signifikant (jeweils
mit pW < 0,0001) und zwischen den mit CP und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten
ebenfalls für alle drei Parameter signifikant (pW = 0,0013 bis < 0,0001). Die mit TE
verdünnten Ejakulate zeigten bezüglich der drei genannten Parameter signifikante
Niveauunterschiede zu den mit Up 1 + 2 (jeweils mit pVerd < 0,0001) sowie zu den
mit Up 1 (pVerd = 0,0004 bis < 0,0001) verdünnten Ejakulaten und auch die
Zeitverläufe zwischen den mit TE und den mit Up 1 + 2 sowie mit Up 1 verdünnten
Ejakulaten unterschieden sich für alle drei Parameter signifikant (pW = 0,0007 bis
< 0,0001) (Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
Für die Geschwindigkeitsparameter (VAP, VCL, VSL) galt Ähnliches wie für die
Streckenparameter. Auch hier waren im Zeitverlauf in allen verdünnten Ejakulaten
Abnahmen der durchschnittlichen Messwerte zu beobachten und die Differenzen
zwischen Tag 0 und Tag 10 waren für die Parameter VCL und VSL in den mit
130
Ergebnisse
Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten am größten, gefolgt von den mit Up 1 verdünnten
Ejakulaten. Lediglich für den Parameter VAP war die Differenz zwischen Tag 0
und Tag 10 in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten am größten, unterschied sich
aber nur geringfügig von der in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten. In den mit
CP und TE verdünnten Ejakulaten waren die Differenzen und damit die Reduktion
der Mittelwerte im Zeitverlauf wesentlich geringer. Auch insgesamt lagen die in
den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten gemessenen Werte wieder deutlich
über denen in den mit Up 1 + 2 sowie nur mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten.
Dabei waren die Mittelwerte für die Parameter VAP und VCL in den mit CP und TE
aufgearbeiteten Ejakulaten sogar an Tag 10 noch höher als in die in den mit
Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten an Tag 0. Für den Parameter VSL galt
Letzteres nur in den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten. Generell konnten in den
mit CP verdünnten Ejakulaten für alle drei Parameter über den gesamten
Untersuchungszeitraum stets geringgradig höhere Mittelwerte beobachtet werden
als in den mit TE verdünnten Ejakulaten.
Im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung waren in allen verdünnten Ejakulaten
signifikante Abnahmen der Mittelwerte für die Geschwindigkeitsparameter VAP,
VCL und VSL nachzuweisen (pZeit = 0,0012 bis < 0,0001). Die mit CP verdünnten
Ejakulate
zeigten
über
den
Untersuchungszeitraum
bezüglich
aller
Geschwindigkeitsparameter signifikante Niveauunterschiede zu den mit TE
(pVerd = 0,033 bis < 0,0001), Up 1 + 2 (jeweils mit pVerd < 0,0001) und Up 1 (jeweils
mit pVerd < 0,0001) verdünnten Ejakulaten. Während sich dabei die Zeitverläufe der
mit CP und der mit TE verdünnten Ejakulate für keinen der genannten Parameter
signifikant unterschieden, konnten zwischen den Zeitverläufen der mit CP und der
mit Up 1 + 2 sowie zwischen den Zeitverläufen der mit CP und der mit Up 1
verdünnten Ejakulate für alle drei Parameter signifikante Unterschiede ermittelt
werden (pW = 0,0019 bis < 0,0001). In den mit TE verdünnten Ejakulaten ließen
sich bezüglich der Parameter VAP, VCL und VSL signifikante Niveauunterschiede
zu den mit Up 1 + 2 (jeweils mit pVerd < 0,0001) sowie zu den mit Up 1
(pVerd = 0,0002 bis < 0,0001) verdünnten Ejakulaten nachweisen und auch die
Zeitverläufe zwischen den mit TE und den mit Up 1 + 2 sowie zwischen den mit TE
und den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten unterschieden sich für alle drei Parameter
signifikant (pW = 0,0007 bis < 0,0001) (Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
131
Ergebnisse
Bezüglich des Motilitätsparameters ALH konnten im Zeitverlauf in den mit CP, TE
und Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten nur geringfügige Veränderungen beobachtet
werden. Einzig in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten kam es über den
Untersuchungszeitraum zu einer deutlichen Abnahme der Mittelwerte. Insgesamt
waren die in den mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulaten gemessenen Werte
einander sehr ähnlich und lagen während des gesamten Zeitverlaufs über denen
in den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten. Die Mittelwerte in den mit Up 1
aufgearbeiteten Ejakulaten entsprachen zu Beginn des Untersuchungszeitraumes
bis einschließlich Tag 5 annähernd den Werten in den mit CP und TE
aufgearbeiteten Ejakulaten und lagen somit bis dahin auch über denen in den mit
Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten. Zwischen Tag 7 und Tag 10 kam es dann
jedoch zu einer deutlichen Abnahme der Mittelwerte in den mit Up 1
aufgearbeiteten Ejakulaten, sodass die Werte an Tag 10 eher denen in den mit
Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten entsprachen als denen in den mit CP und TE
aufgearbeiteten Ejakulaten.
Obwohl die beobachteten Veränderungen des Parameters ALH z. T. nur
geringfügig erschienen, konnten im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung in allen
verdünnten Ejakulaten signifikante Abnahmen bezüglich dieses Parameters
nachgewiesen werden (pZeit = 0,0014 bis < 0,0001). In den mit CP verdünnten
Ejakulaten konnten über den Untersuchungszeitraum für ALH signifikante
Niveauunterschiede zu den mit TE (pVerd = 0,0007) und Up 1 + 2 (pVerd = 0,0001)
aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden. Die Zeitverläufe unterschieden
sich zwischen den mit CP und den mit TE verdünnten Ejakulaten nicht signifikant
und auch zwischen den mit CP und den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten konnte
für ALH kein signifikanter Unterschied der Zeitverläufe ermittelt werden. Allerdings
unterschied sich der Zeitverlauf der mit CP verdünnten Ejakulate signifikant von
dem der mit Up 1 verdünnten Ejakulate (pW < 0,0001). Die mit TE verdünnten
Ejakulate zeigten bezüglich des Parameters ALH signifikante Niveauunterschiede
zu den mit Up 1 + 2 (pVerd = 0,0001) sowie zu den mit Up 1 (pVerd = 0,028)
verdünnten Ejakulaten und auch die Zeitverläufe zwischen den mit TE und den mit
Up 1 verdünnten Ejakulaten unterschieden sich für ALH signifikant (pW = 0,0006).
Zwischen den Zeitverläufen der mit TE und Up 1 + 2 verdünnten Ejakulate konnte
kein signifikanter Unterschied verifiziert werden (Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
132
Ergebnisse
Bei
Betrachtung
des
Parameters
BCF
zeigten
sich
über
den
Untersuchungszeitraum in allen verdünnten Ejakulaten tendenzielle Abnahmen
der Mittelwerte. Dabei war die Differenz zwischen Tag 0 und Tag 10 in den mit
Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten am größten. Im Gegensatz dazu kam es in
den
mit
CP,
TE
und
Up 1
aufgearbeiteten
Ejakulaten
über
den
Untersuchungszeitraum hinweg nur zu einer geringen Reduktion der Mittelwerte.
Insgesamt waren die in den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten
gemessenen Werte ab Tag 2 stets höher als die in den mit Up 1 + 2 verdünnten
Ejakulaten. Die mit CP und TE verdünnten Ejakulate zeigten an Tag 10 leicht
höhere Mittelwerte als die mit Up 1 verdünnten Ejakulate.
Die im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung beobachteten Reduktionen der
Mittelwerte des Parameters BCF waren in den mit Up 1 + 2 (pZeit = 0,0003) und in
den mit Up 1 (pZeit = 0,0092) verdünnten Ejakulaten als signifikant zu beurteilen. In
den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten konnten über den Untersuchungszeitraum
für BCF signifikante Niveauunterschiede zu den mit TE (pVerd = 0,0006) und den
mit Up 1 + 2 (pVerd = 0,021) aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden. Die
Zeitverläufe unterschieden sich zwischen den mit CP und den mit TE sowie
zwischen den mit CP und den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten für den
Parameter BCF nicht signifikant. Die mit CP aufgearbeiteten Ejakulate
unterschieden
sich
bezüglich
BCF
nicht
signifikant
von
den
mit
Up 1
aufgearbeiteten Ejakulaten. Die mit TE verdünnten Ejakulate zeigten bezüglich
BCF einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up 1 + 2 verdünnten
Ejakulaten (pVerd = 0,042) und auch die Zeitverläufe zwischen den mit TE und den
mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten unterschieden sich signifikant (pW = 0,012).
Zwischen den mit TE und den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten bestand kein
signifikanter Unterschied (Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
Bezüglich des Parameters STR konnten im Zeitverlauf in den mit TE, Up 1 + 2 und
Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten keine wesentlichen Veränderungen beobachtet
werden. Lediglich in den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten kam es über den
Untersuchungszeitraum zu einer tendenziellen Reduktion der Mittelwerte.
Insgesamt lagen die Werte für STR in den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten nah beieinander. Der geringste Wert an Tag 10 konnte
in den mit CP verdünnten Proben nachgewiesen werden, gefolgt von den mit Up 1
133
Ergebnisse
und den mit TE verdünnten Proben. Der höchste Wert an Tag 10 war in den mit
Up 1 + 2 verdünnten Proben zu beobachten.
Im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung ließen sich in allen verdünnten Ejakulaten
keine signifikanten Veränderungen für STR nachweisen. Die mit CP verdünnten
Ejakulate zeigten über den Untersuchungszeitraum für STR einen signifikanten
Niveauunterschied zu den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten (pVerd = 0,0097) und
auch die Zeitverläufe der mit CP und der mit Up 1 verdünnten Ejakulate
unterschieden sich signifikant voneinander (pW = 0,012). Mit Ausnahme von Tag
10 waren in den mit CP verdünnten Proben stets höhere Werte zu beobachten als
in den mit Up 1 verdünnten Proben. Zu den mit TE und Up 1 + 2 verdünnten
Ejakulaten konnte in den mit CP verdünnten Ejakulaten kein signifikanter
Unterschied ermittelt werden. Auch die mit TE verdünnten Ejakulate zeigten
bezüglich des Parameters STR einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit
Up 1 verdünnten Ejakulaten (pVerd = 0,042), während sich die Zeitverläufe
allerdings nicht signifikant voneinander unterschieden. Hier waren in den mit TE
verdünnten Proben zu jedem Untersuchungszeitpunkt höhere Werte nachweisbar
als in den mit Up 1 verdünnten Proben. Zu den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten
konnte in den mit TE verdünnten Ejakulaten kein signifikanter Unterschied
verifiziert werden (Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
Für den Parameter LIN konnten im Zeitverlauf in den mit CP, TE und Up 1
aufgearbeiteten Ejakulaten tendenzielle Abnahmen der durchschnittlichen Werte
festgestellt werden, während es in den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten im
Mittel zu einer tendenziellen Zunahme kam. Die größte Differenz zwischen Tag 0
und Tag 10 konnte in den mit CP verdünnten Proben beobachtet werden, wobei
die Werte bis einschließlich Tag 7 in den mit CP verdünnten Proben jedoch
trotzdem höher lagen als in den mit TE, Up 1 + 2 und Up 1 verdünnten Proben. Die
Mittelwerte in den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten lagen zu fast jedem
Untersuchungstermin über denen in den mit Up 1 + 2 und Up 1 aufgearbeiteten
Ejakulaten. Jedoch zeigte sich an Tag 10 der höchste durchschnittliche Wert für
LIN in den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten.
Die im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung erkennbaren Abnahmen der
Mittelwerte des Parameters LIN waren in den mit CP, TE und Up 1 verdünnten
Ejakulaten als signifikant zu beurteilen (pZeit = 0,0044 bis < 0,0001). In den mit CP
verdünnten Ejakulaten konnten über den Untersuchungszeitraum für LIN
134
Ergebnisse
signifikante Niveauunterschiede zu den mit TE (pVerd = 0,016) und den mit Up 1
(pVerd = 0,0015) verdünnten Ejakulaten nachgewiesen werden. Die Zeitverläufe
unterschieden sich bezüglich LIN zwischen den mit CP und den mit TE
verdünnten Ejakulaten signifikant (pW = 0,0012) und auch zwischen den mit CP
und den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten konnte ein signifikanter Unterschied
der Zeitverläufe ermittelt werden (pW = 0,0092). Die mit TE aufgearbeiteten
Ejakulate
zeigten
bezüglich
des
Parameters
LIN
einen
signifikanten
Niveauunterschied zu den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten (pVerd = 0,016),
wobei sich kein signifikanter Unterschied der Zeitverläufe ermitteln ließ (Tab. A10A14, Kap. 9.8).
Bei Betrachtung des Parameters WOB war Ähnliches zu beobachten wie beim
Parameter LIN. Im Zeitverlauf konnten ebenfalls in den mit CP, TE und Up 1
aufgearbeiteten Ejakulaten tendenzielle Abnahmen der durchschnittlichen Werte
festgestellt werden, während es in den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten im
Mittel zu einer tendenziellen Zunahme kam. Ebenso konnte wieder in den mit CP
verdünnten Ejakulaten die größte Differenz zwischen Tag 0 und Tag 10
festgestellt werden, wobei die Mittelwerte bis einschließlich Tag 7 in den mit CP
verdünnten Ejakulaten jedoch trotzdem höher lagen als in den mit TE, Up 1 + 2
und Up 1 verdünnten Ejakulaten. Die durchschnittlichen Werte in den mit TE
verdünnten Ejakulaten lagen bis einschließlich Tag 3 über denen in den mit
Up 1 + 2 und Up 1 verdünnten Ejakulaten, an den Tagen 5 und 7 nur über denen in
mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten und an Tag 10 nur über dem in mit Up 1
verdünnten Ejakulaten. Der höchste durchschnittliche Wert für WOB an Tag 10
konnte ebenfalls wieder in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten beobachtet
werden.
Im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung waren in den mit CP, TE und Up 1
aufgearbeiteten Ejakulaten signifikante Abnahmen der Mittelwerte des Parameters
WOB nachweisbar (jeweils mit pZeit < 0,0001). Die mit CP verdünnten Ejakulate
zeigten im Zeitverlauf bezüglich WOB einen signifikanten Niveauunterschied zu
den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten (pVerd = 0,0005). Die Zeitverläufe ließen
zwischen den mit CP und den mit TE (pW = 0,0035) sowie zwischen den mit CP
und
den
mit
Up 1 + 2
(pW = 0,0099)
verdünnten
Ejakulaten
signifikante
Unterschiede erkennen. Die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate zeigten für WOB
einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten
135
Ergebnisse
(pVerd = 0,0078), wobei kein signifikanter Unterschied der Zeitverläufe ermittelt
werden konnte (Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
4.3.2 Einfluss der Verdünner auf die Viabilität im Zeitverlauf
Die Viabilität der mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate
verminderte sich während der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn Tage. Dies
konnte sowohl mit den Methoden der klassischen Spermatologie (Eosinausstrich)
als auch mittels CASA (nach SYBR-14/PI-Färbung) nachgewiesen werden, wobei
im Durchschnitt jedoch die mittels CASA gemessenen Werte, insbesondere gegen
Ende des Untersuchungszeitraumes, deutlich niedriger waren als die durch
Auszählung des Eosinausstrichs ermittelten Werte. Für den Anteil an lebenden
Samenzellen im Eosinausstrich wie auch für die CASA-Viabilität nach SYBR14/PI-Färbung galt tendenziell, dass in den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten
über den gesamten Zeitverlauf die höchsten Mittelwerte beobachtet werden
konnten und die mit CP und TE aufgearbeiteten Ejakulate einen einander
ähnlichen Verlauf aufwiesen, wobei die Mittelwerte leicht unter denen in den mit
Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten lagen. Die Mittelwerte in den mit Up 1 + 2
aufgearbeiteten Ejakulaten waren über den gesamten Untersuchungszeitraum
deutlich niedriger.
4.3.2.1
Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich
Abb. 16 zeigt den prozentualen Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich in
den verschiedenen Verdünnern bei Flüssigkonservierung bei 4°C für zehn Tage.
Während an Tag 0 unmittelbar nach dem Verdünnen bezüglich des Anteils an
lebenden Samenzellen kein signifikanter Unterschied zwischen den mit den
verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten festgestellt werden konnte
(siehe Kap. 4.2.3.1), zeigten sich im weiteren Zeitverlauf dagegen deutliche
Niveauunterschiede zwischen den verdünnten Ejakulaten. Über den gesamten
Untersuchungszeitraum hinweg lag der Anteil lebender Samenzellen in den mit
Up 1 aufgearbeiteten Proben über dem in mit den anderen Verdünnern
aufgearbeiteten Proben und betrug an Tag 10 noch durchschnittlich 84,6 %. In den
mit CP und TE verdünnten Ejakulaten konnte ein annähernd identischer Verlauf
des Anteils lebender Samenzellen über die Zeit hinweg beobachtet werden. Hier
lag der Anteil an Tag 10 im Mittel noch bei 80,0 % (CP) bzw. 79,6 % (TE). Der
Anteil an lebenden Samenzellen in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten lag ab
136
Ergebnisse
Tag 1 zu jedem Untersuchungszeitpunkt unter dem Anteil in den mit den anderen
Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten und betrug an Tag 10 durchschnittlich nur
Anteil lebender Samenzellen
(Eosinausstrich) in %
noch 71,5 %.
100,0
90,0
80,0
CP (n = 30)
70,0
TE (n = 30)
60,0
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
50,0
40,0
0
1
2
3
4
5
6
Tage
7
8
9
10
Abb. 16: Veränderungen des prozentualen Anteils lebender Samenzellen
(Eosinausstrich) in den verschiedenen Verdünnern im Zeitverlauf der
Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn Tage; dargestellt als
rücktransformierter Mittelwert (r; „modifizierter Mittelwert“) mit negativem
und positivem Fehlerbalken („modifizierter 1-s-Bereich“); CP = Verdünner
CaniPRO™
Chill
10,
TE = TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner,
Up 1 + 2 = Uppsala Equex-2 System (Verdünner 1 und Verdünner 2),
Up 1 = Uppsala Equex-2 System (nur Verdünner 1), n = Probenanzahl
In allen verdünnten Ejakulaten kam es im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung zu
einer signifikanten Abnahme des Anteils lebender Samenzellen im Eosinausstrich
(jeweils mit pZeit < 0,0001). Die mit CP verdünnten Ejakulate zeigten über den
Untersuchungszeitraum bezüglich des Anteils lebender Samenzellen keinen
signifikanten Niveauunterschied zu den mit TE oder Up 1 + 2 verdünnten
Ejakulaten und auch der Zeitverlauf der mit CP verdünnten Ejakulate unterschied
sich nicht signifikant von dem der mit den übrigen Verdünnern verdünnten
Ejakulate. Lediglich zwischen den mit CP und den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten
konnte bezüglich des Anteils an lebenden Samenzellen ein signifikanter
Niveauunterschied ermittelt werden (pVerd = 0,019), wobei die durchschnittlichen
Werte in den mit CP verdünnten Proben stets niedriger waren als in den mit Up 1
verdünnten Proben. Auch für die mit TE aufgearbeiteten Ejakulate ließ sich kein
signifikanter Niveauunterschied zu den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten
nachweisen, wobei sich jedoch die Zeitverläufe der beiden Verdünner signifikant
unterschieden (pW = 0,045). Dabei war die Abnahme des Anteils lebender
137
Ergebnisse
Samenzellen in den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben zwischen Tag 0 und Tag 1
stärker ausgeprägt als in den mit TE verdünnten Proben. Zwischen den mit TE
und
den
mit
Up 1
aufgearbeiteten
Ejakulaten
konnte
ein
signifikanter
Niveauunterschied ermittelt werden (pVerd = 0,033), wobei die durchschnittlichen
Werte auch hier in den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten stets niedriger waren als
in den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten. Die Zeitverläufe zwischen den mit TE
und den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten unterschieden sich nicht signifikant
(Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
4.3.2.2
Mittels CASA gemessene Viabilität
Die durchschnittliche mittels CASA bestimmte Viabilität nach SYBR-14/PI-Färbung
in den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten bei
Flüssigkonservierung bei 4°C für zehn Tage ist in Abb. 17 dargestellt. Während an
Tag 0, wie bereits auch schon für den Anteil an lebenden Samenzellen im
Eosinausstrich beobachtet, bezüglich der CASA-Viabilität noch kein signifikanter
Unterschied zwischen den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulaten festgestellt werden konnte (siehe Kap. 4.2.3.2), waren im weiteren
Zeitverlauf deutliche Unterschiede zwischen den verdünnten Ejakulaten zu
erkennen. Zwar zeigten die mit CP, TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulate von
Tag 0 bis einschließlich Tag 3 einen ähnlichen Verlauf der durchschnittlichen
CASA-Viabilität, während die mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulate bereits zu
Beginn und auch bis Ende des Untersuchungszeitraumes deutlich niedrigere
Werte erkennen ließen. Im weiteren Zeitverlauf lagen die Mittelwerte in den mit
Up 1 aufgearbeiteten Proben dann jedoch stets über denen, die in den mit den
anderen Verdünnern aufgearbeiteten Proben bestimmt wurden, während die mit
CP und TE verdünnten Ejakulate weiterhin einen ähnlichen Verlauf zeigten. An
Tag 10 konnte in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten nur noch eine
durchschnittliche CASA-Viabilität von 37,7 % bestimmt werden, während in den
mit den anderen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten die mittlere CASAViabilität noch rund 60 % (CP: 58,8 %; TE: 59,7 %) bzw. fast 70 % (Up 1: 68,0 %)
betrug.
138
CASA-Viabilität in %
Ergebnisse
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
0
1
2
3
4
5
6
Tage
7
8
9
10
Abb. 17: Veränderungen des Prozentsatzes an lebenden Samenzellen (mittels
Computer-assisted sperm analysis (CASA; SpermVision™-System)
gemessene Viabilität nach SYBR-14/PI-Färbung) in den verschiedenen
Verdünnern im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn
Tage; dargestellt als rücktransformierter Mittelwert (r; „modifizierter
Mittelwert“) mit negativem und positivem Fehlerbalken („modifizierter 1-sBereich“); CP = Verdünner CaniPRO™ Chill 10, TE = TRIS-FruktoseEigelb-Verdünner, Up 1 + 2 = Uppsala Equex-2 System (Verdünner 1 und
Verdünner 2), Up 1 = Uppsala Equex-2 System (nur Verdünner 1),
n = Probenanzahl
Im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung kam es in allen verdünnten Ejakulaten zu
einer signifikanten Reduktion der mittels CASA gemessenen Viabilität (jeweils mit
pZeit < 0,0001). In den mit CP aufgearbeiteten Ejakulaten konnte über den
Untersuchungszeitraum
bezüglich
der
CASA-Viabilität
kein
signifikanter
Niveauunterschied zu den mit TE aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt werden und
auch die Zeitverläufe zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen den
Verdünnern CP und TE. Hingegen konnte ein signifikanter Niveauunterschied
zwischen den mit CP und den mit Up 1 + 2 (pVerd < 0,0001) sowie zwischen den mit
CP und den mit Up 1 (pVerd = 0,019) aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen
werden. Auch die Zeitverläufe unterschieden sich signifikant zwischen den mit CP
und den mit Up 1 + 2 (pW = 0,019) sowie zwischen den mit CP und den mit Up 1
(pW = 0,042) aufgearbeiteten Ejakulaten. Dabei konnten in den mit Up 1 + 2
verdünnten Proben über den gesamten Untersuchungszeitraum durchschnittlich
niedrigere Werte für die CASA-Viabilität und in den mit Up 1 verdünnten Proben ab
Tag 5 durchschnittlich höhere Werte als in den mit CP verdünnten Proben
beobachtet werden. In den mit TE verdünnten Ejakulaten konnte ein signifikanter
Niveauunterschied zu den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten ermittelt werden
(pVerd = 0,0001); die Zeitverläufe zeigten jedoch keinen signifikanten Unterschied.
139
Ergebnisse
Dabei waren die Mittelwerte in den mit TE verdünnten Proben stets höher als in
den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben. Zwischen den mit TE und den mit Up 1
verdünnten Ejakulaten konnte weder ein signifikanter Niveauunterschied noch ein
signifikanter Unterschied im Zeitverlauf nachgewiesen werden (Tab. A10-A14,
Kap. 9.8).
4.3.3 Einfluss der Verdünner auf den Anteil an morphologisch veränderten
Samenzellen im Zeitverlauf
Abb. 18 zeigt den mittleren prozentualen Anteil an morphologisch veränderten
Samenzellen im Eosinausstrich in den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten bei Flüssigkonservierung bei 4°C für zehn Tage. Es ist
ersichtlich, dass sich die Verläufe der mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulate zu Beginn des Untersuchungszeitraumes bis Tag 3
stärker unterschieden als über den restlichen Untersuchungszeitraum. Ab Tag 3
zeigten die mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulate sehr ähnliche Verläufe,
während sich im Vergleich dazu in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten im
Mittel stets leicht niedrigere Anteile an morphologisch veränderten Samenzellen
feststellen ließen. Insgesamt stieg der Anteil an morphologisch veränderten
Samenzellen während der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn Tage in allen
verdünnten Ejakulaten leicht an. Der geringste Anstieg war dabei in den mit Up 1
aufgearbeiteten Proben zu erkennen, wobei hier allerdings der Ausgangswert an
Tag 0 unmittelbar nach dem Verdünnen höher lag als in den mit den anderen
Verdünnern aufgearbeiteten Proben. Schließlich konnte an Tag 10 in den mit
Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten der geringste Anteil an morphologisch
veränderten Samenzellen beobachtet werden (9,8 %), während dieser in den mit
den anderen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten 10,7 % (CP, TE) bzw. 10,6 %
(Up 1) betrug.
140
Anteil morphologisch
veränderter Samenzellen
(Eosinausstrich) in %
Ergebnisse
24,0
22,0
20,0
18,0
16,0
14,0
12,0
10,0
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
0
1
2
3
4
5
6
Tage
7
8
9
10
Abb. 18: Veränderungen des prozentualen an Anteils morphologisch veränderten
Samenzellen (Eosinausstrich) in den verschiedenen Verdünnern im
Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn Tage; dargestellt
als geometrischer Mittelwert und Streufaktor [g (SF)]; CP = Verdünner
CaniPRO™
Chill
10,
TE =
TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner,
Up 1 + 2 = Uppsala Equex-2 System (Verdünner 1 und Verdünner 2),
Up 1 = Uppsala Equex-2 System (nur Verdünner 1), n = Probenanzahl
Im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung kam es in fast allen verdünnten Ejakulaten
zu einem signifikanten Anstieg des Anteils an morphologisch veränderten
Samenzellen im Eosinausstrich (pZeit = 0,0007 bis < 0,0001). Die mit CP
verdünnten Ejakulate zeigten über den Untersuchungszeitraum bezüglich des
Anteils
an
morphologisch
veränderten
Samenzellen
einen
signifikanten
Niveauunterschied zu den mit TE verdünnten Ejakulaten (pVerd = 0,015), jedoch
unterschieden sich die Zeitverläufe nicht signifikant voneinander. Bis einschließlich
Tag 3 war der Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen in den mit CP
verdünnten Proben niedriger als in den mit TE verdünnten Proben. Von Tag 5 bis
Tag 10 unterschieden sich die Anteile morphologisch veränderter Samenzellen in
den mit CP und TE verdünnten Proben dann kaum noch. Zwischen den mit CP
und den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten ließ sich kein signifikanter
Niveauunterschied ermitteln. Allerdings unterschieden sich die Zeitverläufe
zwischen den Verdünnern CP und Up 1 + 2 signifikant (pW = 0,032). Dabei war der
Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen in den mit Up 1 + 2 verdünnten
Proben bis einschließlich Tag 2 höher als in den mit CP verdünnten Proben. An
den Tagen 3 und 5 kam es dann in den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben zu einer
Verringerung des durchschnittlichen Anteils an morphologisch veränderten
Samenzellen, während dieser in den mit CP verdünnten Proben jedoch weiter
anstieg. An den Tagen 7 und 10 war der Anteil an morphologisch veränderten
141
Ergebnisse
Samenzellen schließlich in den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben niedriger als in
den mit CP verdünnten Proben. Zwischen den mit CP und Up 1 verdünnten
Ejakulaten konnte über den Untersuchungszeitraum kein signifikanter Unterschied
ermittelt werden. Auch zwischen den mit TE und Up 1 + 2 aufgearbeiteten
Ejakulaten sowie zwischen den mit TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten ließen
sich keine signifikanten Unterschiede verifizieren.
Bei getrennter Betrachtung der einzelnen morphologischen Veränderungen fiel
auf, dass für die Anteile an Kopf- und Halsveränderungen weder signifikante
Zunahmen im Zeitverlauf noch signifikante Unterschiede zwischen den mit den
verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten nachgewiesen werden
konnten.
Hingegen zeigte der Anteil an Schwanzveränderungen im Zeitverlauf in fast allen
verdünnten Ejakulaten einen signifikanten Anstieg (pZeit = 0,0082 bis < 0,0001).
Zudem konnte bezüglich dieses Anteils ein signifikanter Niveauunterschied
zwischen den mit CP und den mit TE verdünnten Ejakulaten ermittelt werden
(pVerd = 0,012); die Zeitverläufe ließen keinen signifikanten Unterschied erkennen.
In den mit TE verdünnten Proben konnte bis einschließlich Tag 7 stets ein höherer
Anteil an Schwanzveränderungen beobachtet werden als in den mit CP
verdünnten
Proben.
An
Tag
10
war
jedoch
der
mittlere
Anteil
an
Schwanzveränderungen in den mit CP verdünnten Proben (7,5 %, SF = 2,24)
höher als in den mit TE verdünnten Proben (7,1 %, SF = 2,65). Auch zwischen den
mit CP und den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten konnte bezüglich des Anteils
an Schwanzveränderungen ein signifikanter Niveauunterschied ermittelt werden
(pVerd = 0,032) und ebenso ein signifikanter Unterschied der Zeitverläufe
(pW = 0,0034). Hier war der Anteil an Schwanzveränderungen über den
Untersuchungszeitraum in den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben im Mittel geringer
als in den mit CP verdünnten Proben und betrug an Tag 10 durchschnittlich 6, 1 %
(SF = 2,76). Weiterhin konnte auch zwischen den mit TE und den mit Up 1 + 2
verdünnten Ejakulaten ein signifikanter Niveauunterschied (pVerd = 0,0028) sowie
ein signifikanter Unterschied der Zeitverläufe (pW = 0,028) nachgewiesen werden,
wobei der Anteil an Schwanzveränderungen über den Untersuchungszeitraum
wieder in den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben durchschnittlich geringer war als in
den mit TE verdünnten Proben. Zwischen den mit CP und Up 1 sowie zwischen
142
Ergebnisse
den mit TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten bestanden hinsichtlich des Anteils
an Schwanzveränderungen keine signifikanten Unterschiede.
Innerhalb der Schwanzveränderungen konnten über den Untersuchungszeitraum
in
allen
verdünnten
Ejakulaten
signifikante
Zunahmen
des
Anteils
an
schleifenförmigen Schwänzen beobachtet werden (pZeit = 0,0003 bis < 0,0001),
während die Anteile an aufgerollten Schwänzen und an Knickschwänzen nur
teilweise signifikant zunahmen. Bezüglich des Anteils an schleifenförmigen
Schwänzen konnten zwischen den mit CP und TE (pVerd = 0,014), zwischen den
mit CP und Up 1+ 2 (pVerd = 0,0103), zwischen den mit TE und Up 1 + 2
(pVerd = 0,0022) sowie zwischen den mit TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten
(pVerd = 0,045)
signifikante
Niveauunterschiede
nachgewiesen
werden;
die
Zeitverläufe unterschieden sich jedoch nicht signifikant. Dabei war der
durchschnittliche Anteil an schleifenförmigen Schwänzen im Zeitverlauf in den mit
CP verdünnten Proben geringer als in den mit TE verdünnten Proben, aber höher
als in den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben. Auch in den mit TE verdünnten Proben
war der mittlere Prozentsatz an schleifenförmigen Schwänzen im Zeitverlauf höher
als in den mit Up 1 + 2 verdünnten Proben und lag ebenso über dem in den mit
Up 1 verdünnten Proben.
Bei Betrachtung des Anteils an losen Köpfen konnten in den mit TE und Up 1
aufgearbeiteten Ejakulaten signifikante Abnahmen im Zeitverlauf nachgewiesen
werden (pZeit = 0,0004). Zwischen den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten untereinander bestanden bezüglich des Anteils an
losen Köpfen keine signifikanten Unterschiede.
Der Prozentsatz an Plasmatropfen zeigte über den Untersuchungszeitraum in den
mit Up 1 verdünnten Ejakulaten eine signifikante Zunahme (pZeit = 0,013). Zudem
bestand ein signifikanter Niveauunterschied zwischen den mit CP und den mit
Up 1 verdünnten Ejakulaten (pVerd = 0,032), wobei die Zeitverläufe sich allerdings
nicht signifikant unterschieden. Dabei war der durchschnittliche Prozentsatz an
Plasmatropfen in den mit CP verdünnten Proben niedriger als in den mit Up 1
verdünnten Proben.
Eine ausführliche Darstellung der Ergebnisse der zweifaktoriellen Varianzanalysen
mit Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“, in denen
jeweils zwei Verdünner bezüglich des Anteils an morphologisch veränderten
Samenzellen im Eosinausstrich bzw. bezüglich der einzelnen morphologischen
143
Ergebnisse
Veränderungen miteinander verglichen wurden, ist im Anhang zu finden (Tab.
A10-A14, Kap. 9.8).
4.3.4 Einfluss der Verdünner auf den Anteil an akrosomalen Veränderungen im
Zeitverlauf
Der im Durchschnitt mittels Spermac®-Färbung ermittelte Anteil an Samenzellen
mit akrosomalen Veränderungen (Kopfkappenveränderungen) in den mit den
verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten bei Flüssigkonservierung
bei 4°C für zehn Tage ist in Abb. 19 dargestellt. Tendenziell war in den mit CP, TE
und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten im Zeitverlauf ein Anstieg des mittleren
Anteils an Samenzellen mit Kopfkappenveränderungen zu erkennen, während
diese Tendenz in den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten nicht zu beobachten
war. Die Verläufe der mit CP und TE verdünnten Ejakulate unterschieden sich
dabei
kaum
und
an
Tag
10
konnte
ein
durchschnittlicher
Anteil
an
Kopfkappenveränderungen von 7,6 % (CP) bzw. 8,5 % (TE) ermittelt werden. Im
Gegensatz dazu konnten zwischen den mit Up 1 +2 und den mit Up 1 verdünnten
Ejakulaten
gerade
zu
Beginn
des
Untersuchungszeitraumes
deutliche
Unterschiede gesehen werden. Der Durchschnitt an Samenzellen mit veränderter
Kopfkappe war dabei an Tag 0 in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten wesentlich
geringer (2,8 %) verglichen mit dem in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten
(6,6 %) und lag auch unter den in den mit CP (4,2 %) und TE (3,9 %) verdünnten
Ejakulaten
ermittelten
Werten.
Ab
Tag
3
lag
der
mittlere
Anteil
an
Kopfkappenveränderungen in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten stets unter
dem Anteil in den mit den anderen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten und
betrug an Tag 10 durchschnittlich 4,0 %.
144
Anteil an
Kopfkappenveränderungen
(Spermac®-Färbung) in %
Ergebnisse
20,0
18,0
16,0
14,0
12,0
10,0
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
CP (n = 30)
TE (n = 30)
Up 1 + 2 (n = 12)
Up 1 (n = 18)
0
1
2
3
4
5
6
Tage
7
8
9
10
Abb. 19: Veränderungen des prozentualen Anteils an Samenzellen mit
Kopfkappenveränderungen (Spermac®-Färbung) in den verschiedenen
Verdünnern im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn
Tage; dargestellt als geometrischer Mittelwert und Streufaktor [g (SF)];
CP = Verdünner CaniPRO™ Chill 10, TE = TRIS-Fruktose-EigelbVerdünner, Up 1 + 2 = Uppsala Equex-2 System (Verdünner 1 und
Verdünner 2), Up 1 = Uppsala Equex-2 System (nur Verdünner 1),
n = Probenanzahl
In den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten kam es im Zeitverlauf der
Flüssigkonservierung zu einem signifikanten Anstieg des Anteils an Samenzellen
mit Kopfkappenveränderungen (pZeit = 0,0006 bis < 0,0001). In den mit CP
aufgearbeiteten Ejakulaten konnten über den Untersuchungszeitraum bezüglich
des Anteils an Samenzellen mit Kopfkappenveränderungen keine signifikanten
Unterschiede zu den mit TE und Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelt
werden. Hingegen ließ sich zwischen den mit CP und den mit Up 1
aufgearbeiteten Ejakulaten ein signifikanter Niveauunterschied nachweisen
(pVerd = 0,021), auch wenn die Zeitverläufe keinen signifikanten Unterschied
zeigten. Dabei konnten in den mit CP verdünnten Proben bis einschließlich Tag 3
höhere durchschnittliche Anteile an Samenzellen mit Kopfkappenveränderungen
beobachtet werden als in den mit Up 1 verdünnten Proben. Ab Tag 5 waren dann
die durchschnittlichen Anteile in den mit CP verdünnten Proben stets niedriger als
in den mit Up 1 verdünnten Proben. Zwischen den mit TE und Up 1 + 2 sowie
zwischen den mit TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten konnten bezüglich des
Anteils an Kopfkappenveränderungen keine signifikanten Unterschiede ermittelt
werden.
Bei
gesonderter
veränderungen
Betrachtung
(abgelöste
der
einzelnen
Kopfkappen,
145
auftretenden
schiefe
Kopfkappen-
Kopfkappen,
sonstige
Ergebnisse
Veränderungen) konnten für den Anteil an abgelösten Kopfkappen über den
Untersuchungszeitraum in den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten
signifikante Zunahmen nachgewiesen werden (pZeit = 0,0018 bis < 0,0001). Zudem
unterschieden sich die Zeitverläufe zwischen den mit CP und den mit TE
verdünnten Ejakulaten (pW = 0,0068) sowie zwischen den mit CP und den mit Up 1
verdünnten Ejakulaten (pW = 0,038) bezüglich des Anteils an abgelösten
Kopfkappen signifikant. Dabei war der Anteil an abgelösten Akrosomen in den mit
CP verdünnten Proben ab Tag 2 stets niedriger als der in den mit TE verdünnten
Proben und betrug an Tag 10 durchschnittlich 3,1 % (SF = 2,73) gegenüber 5,4 %
(SF = 1,94) in den mit TE verdünnten Proben. Bis einschließlich Tag 3 war der
Anteil an abgelösten Kopfkappen in den mit Up 1 verdünnten Proben niedriger als
in den mit CP verdünnten Proben, ab Tag 5 dann jedoch stets höher, sodass an
Tag 10 ein mittlerer Anteil von 3,7 % (SF = 1,81) beobachtet werden konnte. Der
Anteil an abgelösten Akrosomen in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten
veränderte sich im Zeitverlauf nur geringfügig und betrug an Tag 10
durchschnittlich 3,0 % (SF = 3,55).
Für den Anteil an schiefen Kopfkappen waren im Zeitverlauf in den mit CP, TE und
Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten ebenfalls signifikante Zunahmen zu beobachten
(pZeit = 0,012 bis < 0,0001). Die mit CP verdünnten Ejakulate zeigten bezüglich
dieses Anteils einen signifikanten Niveauunterschied zu den mit Up 1 verdünnten
Ejakulaten (pVerd = 0,043), wobei die durchschnittlichen Werte in den mit CP
verdünnten Proben im Mittel höher waren als in den mit Up 1 verdünnten Proben,
auch wenn die Werte an Tag 10 sich nicht voneinander unterschieden (CP: 1,3 %,
SF = 2,78; Up 1: 1,3 %, SF = 2,14).
Auch für den Anteil an sonstigen Kopfkappenveränderungen konnten in den mit
CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten im Zeitverlauf signifikante Zunahmen
ermittelt werden (jeweils mit pZeit < 0,0001). In den mit CP verdünnten Ejakulaten
konnte bezüglich des Anteils an sonstigen Kopfkappenveränderungen ein
signifikanter Niveauunterschied zu den mit TE (pVerd = 0,031) sowie zu den mit
Up 1 (pVerd = 0,0025) verdünnten Ejakulaten nachgewiesen werden und auch die
Zeitverläufe der mit CP und der mit Up 1 verdünnten Ejakulate unterschieden sich
signifikant (pW = 0,03). Dabei war den Anteil an sonstigen akrosomalen
Veränderungen
in
den
mit
CP
aufgearbeiteten
Proben
im
Zeitverlauf
durchschnittlich höher als in den mit TE aufgearbeiteten Proben und niedriger als
in den mit Up 1 aufgearbeiteten Proben. In den mit CP verdünnten Ejakulaten
146
Ergebnisse
konnte an Tag 10 ein durchschnittlicher Anteil von 1,3 % (SF = 5,03), in den mit TE
verdünnten Ejakulaten von 1,1 % (SF = 4,19) und in den mit Up 1 verdünnten
Ejakulaten von 2,2 % (SF = 3,08) bestimmt werden. In den mit Up 1 + 2 verdünnten
Ejakulaten veränderte sich der Anteil an sonstigen Kopfkappenveränderungen
über den Untersuchungszeitraum kaum und betrug an Tag 10 im Durchschnitt
0,2 % (SF = 1,0).
Eine ausführliche Darstellung der Resultate der zweifaktoriellen Varianzanalysen
mit Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“, in denen
jeweils
zwei
Verdünner
bezüglich
Kopfkappenveränderungen
des
bzw.
Anteils
an
bezüglich
Samenzellen
der
mit
einzelnen
Kopfkappenveränderungen miteinander verglichen wurden, ist dem Anhang zu
entnehmen (Tab. A10-A14, Kap. 9.8).
4.4 Korrelationen der untersuchten Parameter
In diesem Kapitel werden zum einen die Zusammenhänge zwischen den subjektiv
bestimmten und den objektiv mittels CASA (SpermVision™-System) gemessenen
Werten und zum anderen die Zusammenhänge zwischen verschiedenen
ausgewählten
Spermaparametern
dargestellt.
Dabei
wurden
zunächst
Korrelationsanalysen nach Nativsperma und nach den einzelnen Verdünnern
getrennt durchgeführt, bei denen aber alle Untersuchungstermine gemeinsam
betrachtet wurden und des Weiteren Korrelationsanalysen, bei denen die
Nativejakulate
und
alle
Verdünner
sowie
alle
Untersuchungszeitpunkte
einbezogen wurden (explorativ).
4.4.1 Zusammenhang zwischen den mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten
und den durch CASA gemessenen Dichten
4.4.1.1
Die
Korrelationen nach Verdünnern getrennt
Ergebnisse
der
Korrelationsanalysen
zur
Untersuchung
des
Zusammenhanges zwischen den mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten und
den durch CASA gemessenen Dichten sind in Tab. 20 dargestellt.
147
Ergebnisse
Tab. 20: Korrelationen zwischen den mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten
und den durch CASA (SpermVision™-System) gemessenen Dichten in
den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten; n = Anzahl der getesteten (zeitgleichen)
Variablenpaare, r = Korrelationskoeffizient nach Pearson, p = p-Wert
Verdünner
n
r
p
keiner (Nativsperma)
30
0,539
0,002
CP
30
0,880
< 0,001
TE
30
0,861
< 0,001
Up 1 + 2
12
0,798
0,002
Up 1
18
0,943
< 0,001
Sowohl in den Nativejakulaten als auch in den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten konnten statistisch signifikante Zusammenhänge
zwischen den mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten und den durch CASA
gemessenen Dichten ermittelt werden.
4.4.1.2
Korrelation ohne Trennung nach Verdünnern
Der Zusammenhang zwischen den mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten und
den durch CASA ermittelten Dichten wird durch die nachfolgende Punktwolke
CASA-Dichte nach Wurzeltransformation
(Abb. 20) veranschaulicht.
Regressionsgerade: y = 0,40013x + 0,15647
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,5
1
mittels Neubauer-Zählkammer bestimmte Dichte nach
Wurzeltransformation
Abb. 20: Korrelation zwischen den mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten und
den durch Computer-assisted sperm analysis (CASA; SpermVision™System) gemessenen Dichten in den Nativejakulaten und in allen
verdünnten Ejakulaten; n (zeitgleiche Variablenpaare) = 120
148
Ergebnisse
Die Korrelationsanalyse ergab einen Korrelationskoeffizienten von r = 0,708 bei
einer Signifikanz von p < 0,001. Die Korrelation zwischen den mit den
verschiedenen Methoden bestimmten Werten war somit als statistisch signifikant
zu
beurteilen. Im
Durchschnitt waren
die
mittels
Neubauer-Zählkammer
bestimmten Dichten jedoch höher als die durch CASA gemessenen Dichten.
4.4.2 Zusammenhang zwischen der subjektiv geschätzten und der mittels CASA
gemessenen Vorwärtsbeweglichkeit
Die Vorwärtsbeweglichkeit der Samenzellen wurde in den einzelnen (verdünnten)
Ejakulaten zu jedem Untersuchungstermin unter dem Phasenkontrastmikroskop
subjektiv geschätzt und daneben mittels CASA gemessen.
4.4.2.1
Die
Korrelationen nach Verdünnern getrennt
Ergebnisse
der
Korrelationsanalysen
zur
Untersuchung
des
Zusammenhanges zwischen der subjektiv geschätzten und der mittels CASA
bestimmten Vorwärtsbeweglichkeit sind in Tab. 21 dargestellt.
Tab. 21: Korrelationen zwischen subjektiv geschätzter und mittels CASA
(SpermVision™-System) gemessener Vorwärtsbeweglichkeit in den
Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten; n = Anzahl der getesteten (zeitgleichen)
Variablenpaare, r = Korrelationskoeffizient nach Pearson, p = p-Wert
Verdünner
n
r
p
keiner (Nativsperma)
30
0,564
0,001
CP
210
0,862
< 0,001
TE
210
0,860
< 0,001
Up 1 + 2
84
0,946
< 0,001
Up 1
126
0,871
< 0,001
Es ließen sich sowohl in den Nativejakulaten als auch in den mit den
verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten statistisch signifikante
Zusammenhänge zwischen der subjektiv geschätzten und der mittels CASA
bestimmten Vorwärtsbeweglichkeit nachweisen.
149
Ergebnisse
4.4.2.2
Korrelation ohne Trennung nach Verdünnern
Der Zusammenhang zwischen der subjektiv geschätzten und der mittels CASA
bestimmten Vorwärtsbeweglichkeit wird durch die nachfolgenden Punktwolke
(Abb. 21) dargestellt.
Regressionsgerade: y = 0,90903x + 17,431
geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
(Phasenkontrastmikroskop) in %
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit in %
90
100
Abb. 21: Korrelation zwischen der geschätzten Vorwärtsbeweglichkeit unter dem
Phasenkontrastmikroskop und der mittels Computer-assisted sperm
analysis (CASA; SpermVision™-System) gemessenen Vorwärtsbeweglichkeit in den Nativejakulaten und in allen verdünnten Ejakulaten
zu allen Untersuchungszeitpunkten; n (zeitgleiche Variablenpaare) = 660
Die Korrelationsanalyse ergab einen Korrelationskoeffizienten von r = 0,885 bei
einer Signifikanz von p < 0,001. Somit konnte ein statistisch signifikanter
Zusammenhang zwischen der subjektiv geschätzten Vorwärtsbeweglichkeit und
der mittels CASA gemessenen Vorwärtsbeweglichkeit nachgewiesen werden,
wobei die subjektiv geschätzten Mittelwerte durchschnittlich jedoch 12,5 ± 11,5 %
über den mittels CASA bestimmten Werten lagen.
4.4.3 Zusammenhang zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil an
lebenden Spermien und der durch CASA ermittelten Viabilität
Der Anteil lebender Spermien wurde in den einzelnen (verdünnten) Ejakulaten zu
jedem
Untersuchungstermin
durch
Auszählung
von
200
Spermien
im
Eosinausstrich bestimmt. Daneben wurde nach SYBR-14/PI-Färbung die Viabilität
durch CASA ermittelt.
150
Ergebnisse
4.4.3.1
Korrelationen nach Verdünnern getrennt
Tab. 22 gibt die Resultate der Korrelationsanalysen zur Untersuchung des
Zusammenhanges zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender
Spermien und der durch CASA ermittelten Viabilität nach SYBR-14/PI-Färbung
wieder.
Tab. 22: Korrelationen zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil
lebender Spermien und der mittels CASA (SpermVision™-System)
ermittelten Viabilität nach SYBR-14/PI-Färbung in den Nativejakulaten
und in den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulaten; n = Anzahl der getesteten (zeitgleichen) Variablenpaare,
r = Korrelationskoeffizient nach Pearson, p = p-Wert
Verdünner
n
r
p
keiner (Nativsperma)
30
0,476
0,008
CP
210
0,778
< 0,001
TE
210
0,740
< 0,001
Up 1 + 2
84
0,778
< 0,001
Up 1
126
0,612
< 0,001
In den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten konnten statistisch signifikante Zusammenhänge
zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender Spermien und der
durch CASA ermittelten Viabilität nach SYBR-14/PI-Färbung nachgewiesen
werden.
4.4.3.2
Korrelation ohne Trennung nach Verdünnern
Der Zusammenhang zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender
Spermien und der durch CASA ermittelten Viabilität nach SYBR-14/PI-Färbung
wird durch die nachfolgenden Punktwolke (Abb. 22) veranschaulicht.
151
Ergebnisse
Regressionsgerade: y = 0,56802x + 0,59747
Anteil lebender Samenzellen
(Eosinausstrich) nach Arcus-SinusTransformation
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
CASA-Viabilität nach Arcus-Sinus-Transformation
Abb. 22: Korrelation zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil lebender
Spermien und der durch Computer-assisted sperm analysis (CASA;
SpermVision™-System) ermittelten Viabilität nach SYBR-14/PI-Färbung
in den Nativejakulaten und in allen verdünnten Ejakulaten zu allen
Untersuchungszeitpunkten; n (zeitgleiche Variablenpaare) = 660
Die Korrelationsanalyse ergab einen Korrelationskoeffizienten von r = 0,743 bei
einer Signifikanz von p < 0,001. Die Korrelation zwischen den mit den
verschiedenen Methoden bestimmten Werten war somit als statistisch signifikant
zu beurteilen. Der mittels Eosinausstrich bestimmte Anteil lebender Samenzellen
war im Mittel 12,5 ± 10,8 % höher als die durch CASA gemessene Viabilität.
4.4.4 Zusammenhänge zwischen verschiedenen Spermaparametern
4.4.4.1
Korrelationen nach Verdünnern getrennt
Die Ergebnisse der Korrelationsanalysen zur Untersuchung der Zusammenhänge
zwischen verschiedenen ausgewählten Untersuchungsparametern sind in Tab. 23
dargestellt.
152
Ergebnisse
Tab. 23: Korrelationen zwischen verschiedenen Untersuchungsparametern in den
Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten; n = Anzahl der getesteten (zeitgleichen)
Variablenpaare, r = Korrelationskoeffizient nach Pearson, p = p-Wert
Parameter
Verdünner
n
r
p
subjektiv geschätzte
keiner (Nativsperma)
30 - 0,499
0,005
Vorwärtsbeweglichkeit
versus CP
210 - 0,717 < 0,001
Anteil
an
morphologisch TE
210 - 0,643 < 0,001
veränderten Samenzellen (nach Up 1 + 2
84 - 0,488 < 0,001
logarithmischer Transformation)
Up 1
126 - 0,390 < 0,001
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
keiner (Nativsperma)
30 - 0,487
0,006
versus Anteil an morphologisch CP
210 - 0,708 < 0,001
veränderten Samenzellen (nach TE
210 - 0,672 < 0,001
logarithmischer Transformation)
Up 1 + 2
84 - 0,547 < 0,001
Up 1
126 - 0,366 < 0,001
Anteil lebender Samenzellen im keiner (Nativsperma)
30 - 0,430
0,018
Eosinausstrich
(nach
Arcus- CP
210 - 0,696 < 0,001
Sinus-Transformation)
versus TE
210 - 0,697 < 0,001
Anteil
an
morphologisch Up 1 + 2
84 - 0,824 < 0,001
veränderten Samenzellen (nach Up 1
126 - 0,653 < 0,001
logarithmischer Transformation)
CASA-Viabilität (nach Arcus- keiner (Nativsperma)
30 - 0,449
0,013
Sinus-Transformation)
versus CP
210 - 0,653 < 0,001
Anteil
an
morphologisch TE
210 - 0,582 < 0,001
veränderten Samenzellen (nach Up 1 + 2
84 - 0,532 < 0,001
logarithmischer Transformation)
Up 1
126 - 0,567 < 0,001
subjektiv geschätzte Vorwärts- keiner (Nativsperma)
30 - 0,518
0,003
beweglichkeit versus Anteil an CP
30 - 0,380
0,038
Samenzellen
mit
nicht TE
30 - 0,509
0,004
aufgerollter Geißel im HOS-Test Up 1 + 2
12 - 0,847 < 0,001
(nach logarithmischer
Up 1
18 - 0,560
0,016
Transformation)
CASA-Gesamtmotilität
versus keiner (Nativsperma)
30 - 0,464
0,010
Anteil an Samenzellen mit nicht CP
30 - 0,401
0,028
aufgerollter Geißel im HOS-Test TE
30 - 0,521
0,003
(nach logarithmischer
Up 1 + 2
12 - 0,881 < 0,001
Transformation)
Up 1
18 - 0,674
0,002
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
keiner (Nativsperma)
30 - 0,508
0,004
versus Anteil an Samenzellen mit CP
30 - 0,400
0,029
nicht aufgerollter Geißel im HOS- TE
30 - 0,513
0,004
Test
(nach
logarithmischer Up 1 + 2
12 - 0,875 < 0,001
Transformation)
Up 1
18 - 0,668
0,002
153
Ergebnisse
Anteil lebender Samenzellen im
Eosinausstrich
(nach
ArcusSinus-Transformation)
versus
Anteil an Samenzellen mit nicht
aufgerollter Geißel im HOS-Test
(nach logarithmischer
Transformation)
CASA-Viabilität (nach ArcusSinus-Transformation)
versus
Anteil an Samenzellen mit nicht
aufgerollter Geißel im HOS-Test
(nach logarithmischer
Transformation)
Anteil
an
morphologisch
veränderten Samenzellen (nach
logarithmischer Transformation)
versus Anteil an Samenzellen mit
nicht aufgerollter Geißel im HOSTest (nach logarithmischer
Transformation)
keiner (Nativsperma)
CP
TE
Up 1 + 2
Up 1
30
30
30
12
18
- 0,385
- 0,613
- 0,582
- 0,786
- 0,513
0,036
< 0,001
< 0,001
0,002
0,030
keiner (Nativsperma)
CP
TE
Up 1 + 2
Up 1
30
30
30
12
18
- 0,756
- 0,733
- 0,781
- 0,795
- 0,624
< 0,001
< 0,001
< 0,001
0,002
0,006
keiner (Nativsperma)
CP
TE
Up 1 + 2
Up 1
30
30
30
12
18
0,331
0,495
0,668
0,673
0,808
0,074
0,005
< 0,001
0,016
< 0,001
Mit Ausnahme der Kombination Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen
versus Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Geißel im HOS-Test, bei
welcher sich für die Nativejakulate keine statistisch signifikante Korrelation
nachweisen
ließ,
zeigten
alle
signifikanten
Zusammenhang.
getesteten
Die
Parameterkombinationen
höchsten
Korrelationen
konnten
einen
dabei
zwischen der CASA-Viabilität und dem Anteil an Samenzellen mit nicht
aufgerollter Geißel im HOS-Test beobachtet werden (siehe Tab. 23); diese
Parameter waren negativ miteinander korreliert.
4.4.4.2
Korrelation ohne Trennung nach Verdünnern
Tab. 24 zeigt die Resultate der Korrelationsanalysen zur Untersuchung der
Zusammenhänge
zwischen
verschiedenen
ausgewählten
Untersuchungs-
parametern, in die sowohl die Nativejakulate als auch alle verdünnten Ejakulate zu
allen Untersuchungsterminen einbezogen wurden.
154
Ergebnisse
Tab. 24: Korrelationen zwischen verschiedenen Untersuchungsparametern in den
Nativejakulaten und in allen verdünnten Ejakulaten zu allen
Untersuchungszeitpunkten; n = Anzahl der getesteten (zeitgleichen)
Variablenpaare, r = Korrelationskoeffizient nach Pearson, p = p-Wert
Parameter
n
r
p
subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit versus Anteil 660 - 0,501 < 0,001
an morphologisch veränderten Samenzellen (nach
logarithmischer Transformation)
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
versus
Anteil
an 660 - 0,538 < 0,001
morphologisch
veränderten
Samenzellen
(nach
logarithmischer Transformation)
Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich (nach 660 - 0,672 < 0,001
Arcus-Sinus-Transformation)
versus
Anteil
an
morphologisch
veränderten
Samenzellen
(nach
logarithmischer Transformation)
CASA-Viabilität
(nach
Arcus-Sinus-Transformation) 660 - 0,535 < 0,001
versus Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen
(nach logarithmischer Transformation)
subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit versus Anteil 120 - 0,525 < 0,001
an Samenzellen mit nicht aufgerollter Geißel im HOSTest (nach logarithmischer Transformation)
CASA-Gesamtmotilität versus Anteil an Samenzellen mit 120 - 0,523 < 0,001
nicht aufgerollter Geißel im HOS-Test
(nach logarithmischer Transformation)
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
versus
Anteil
an 120 - 0,552 < 0,001
Samenzellen mit nicht aufgerollter Geißel im HOS-Test
(nach logarithmischer Transformation)
Anteil lebender Samenzellen im Eosinausstrich (nach 120 - 0,522 < 0,001
Arcus-Sinus-Transformation)
versus
Anteil
an
Samenzellen mit nicht aufgerollter Geißel im HOS-Test
(nach logarithmischer Transformation)
CASA-Viabilität
(nach
Arcus-Sinus-Transformation) 120 - 0,724 < 0,001
versus Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Geißel
im HOS-Test (nach logarithmischer Transformation)
Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen (nach 120 0,446
< 0,001
logarithmischer Transformation) versus Anteil an
Samenzellen mit nicht aufgerollter Geißel im HOS-Test
(nach logarithmischer Transformation)
Für alle getesteten Parameterkombinationen konnten statistisch signifikante
Zusammenhänge nachgewiesen werden. Die engste (negative) Korrelation
bestand auch hier wieder zwischen der CASA-Viabilität und dem Anteil an
Samenzellen mit nicht aufgerollter Geißel im HOS-Test.
155
Diskussion
5
Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Splitsample-Verfahren drei verschiedene
Verdünner
für
die
Flüssigkonservierung
von
caninem
Sperma
bei
4°C
vergleichend untersucht. Hierbei handelte es sich um den kommerziellen
Verdünner CaniPRO™ Chill 10 (Minitüb GmbH, Tiefenbach; CP), einen selbst
hergestellten TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner (TE) und den zweiphasigen
Uppsala Equex-2 System-Verdünner, der ebenfalls selbst hergestellt wurde. Bei
Letzterem ließen sich zwei Versuchsteile unterscheiden (siehe Kap. 3.4.2). In
Versuchsteil I erfolgte die Verdünnung mit dem kompletten Uppsala Equex-2
System, d. h. mit den Verdünnern 1 und 2 (Up 1 + 2), und in Versuchsteil II nur mit
Verdünner 1 (Up 1). Ziel der Untersuchungen war es, die Auswirkungen der
verschiedenen
Verdünner
auf
die
Spermaqualität
während
der
Flüssigkonservierung bei 4°C für zehn Tage zu testen und so die Eignung der
verschiedenen Verdünner zu überprüfen. Die Beurteilung der Spermaqualität
erfolgte mithilfe klassischer und moderner spermatologischer Untersuchungsmethoden.
Daher
konnte
zusätzlich
geprüft
werden,
inwieweit
beide
Untersuchungsverfahren gleichwertige Ergebnisse liefern.
5.1 Diskussion der Fragestellung
Die KB mit flüssigkonserviertem Sperma ist in der Hundezucht weitverbreitet
(Kmenta et al., 2011) und gerade in den letzten Jahren deutlich angestiegen
(Concannon und Battista, 1989; Pinto et al., 1999; Peña et al., 2006). Ein Grund
für das gesteigerte Interesse an der Flüssigkonservierung sind die besseren
Konzeptionsraten bei KB mit flüssigkonserviertem Sperma im Vergleich zur KB mit
kryokonserviertem Sperma (Concannon und Battista, 1989). Zudem ist die
Herstellung von flüssigkonserviertem Sperma, verglichen mit der von TG-Sperma,
einfacher und kostengünstiger (Linde-Forsberg, 1991; 2001; Peña et al., 2006).
Die Literaturrecherche hat gezeigt, dass bereits viele verschiedene Verdünner für
die Flüssigkonservierung von caninem Sperma getestet wurden (Concannon und
Battista, 1989; Linde-Forsberg, 1991; Peña et al., 2006). Dabei sind die am
häufigsten verwendeten Medien milch- oder eigelbbasierte Verdünner mit
unterschiedlichen Variationen (Pinto et al., 1999). In vergleichenden Studien
wurden verschiedene nichtkommerzielle (selbst im Labor hergestellte) und z. T.
156
Diskussion
auch
kommerzielle
Verdünner
hinsichtlich
ihrer
Eignung
für
die
Flüssigkonservierung von Hundesperma untersucht (Bartlett, 1962a; Foote und
Leonard, 1964; Province et al., 1984; Bouchard et al., 1990; Rota et al., 1995;
Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b; Tsutsui et al., 2003b; Hermansson und LindeForsberg, 2006; Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007; Beccaglia et al.,
2009a; Kmenta et al., 2011). In vielen der genannten Publikationen fanden TRISgepufferte Eigelb-Verdünner Verwendung, was auf die Bedeutung dieser
Verdünner hinweist. Tatsächlich ist einer der derzeit gebräuchlichsten Verdünner
ein TRIS-gepufferter Eigelb-Verdünner mit 20 % Eigelb und entweder Glukoseoder Fruktosezusatz (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b; Hermansson und
Linde-Forsberg, 2006; Günzel-Apel, 2007; Pesch et al., 2007). Neuere Arbeiten
beschäftigen sich hingegen mit TRIS-Lecithin-Verdünnern (Beccaglia et al.,
2009a;
Kmenta
et
al.,
2011),
da
es
Bestrebungen
gibt,
Eigelb
als
Verdünnerbestandteil zu ersetzen, weil es sich bei letzterem um ein biologisch
riskantes Produkt tierischen Ursprungs handelt, dem ein potentielles Risiko
mikrobieller
Kontamination
innewohnt
(Hoffmann,
2003d;
Bergeron
und
Manjunath, 2006; Beccaglia et al., 2009b; Farstad, 2009) und weil dessen
Zusammensetzung extrem variabel ist (Bergeron und Manjunath, 2006; Beccaglia
et al., 2009a).
Hauptgründe für die Auswahl des kommerziellen Verdünners CP waren seine
schnelle Verfügbarkeit und die einfache Handhabung. Der Verdünner TE wurde
aufgrund seines weitverbreiteten Einsatzes bei der Flüssigkonservierung von
caninem Sperma - auch in der KGGA - ausgewählt. Der Uppsala Equex-2 SystemVerdünner, bei welchem es sich eigentlich um einen zweiphasigen Verdünner für
die Kryokonservierung von Hundesperma handelt, wurde mit in diese Arbeit
aufgenommen, da er nach der Kryokonservierung gute Auftauergebnisse liefert
(Martins-Bessa et al., 2006), und getestet werden sollte, ob dies auch für die
Messergebnisse nach Flüssigkonservierung zutrifft. Zur Verwendung dieses
Verdünners für die Kryokonservierung von caninem Sperma liegen in der Literatur
zahlreiche Arbeiten vor (z. B. Hermansson und Linde-Forsberg, 2006; MartinsBessa et al., 2006; Schäfer-Somi et al., 2006) und auch in der KGGA wird er zur
Kryokonservierung von Hundesperma eingesetzt. Bezüglich des Einsatzes des
Uppsala Equex-2 System-Verdünners zur Flüssigkonservierung gibt es nur wenige
Publikationen (Hermansson und Linde-Forsberg, 2006; Hermansson et al., 2006).
157
Diskussion
Bisher lässt sich in der Literatur keine Untersuchung finden, welche die drei
genannten Verdünner miteinander vergleicht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es
daher, die drei Verdünner hinsichtlich ihrer Eignung zur Flüssigkonservierung von
caninem Sperma bei 4°C vergleichend zu überprüfen und so den am besten
geeigneten Verdünner für die Flüssigkonservierung von Hundesperma im
klinischen Alltag auszuwählen, um diese Informationslücke zu füllen.
Die verschiedenen Spermaparameter, welche als Beurteilungsgrundlage dienten,
wurden z. T. sowohl mit den Methoden der klassischen Spermatologie als auch
mittels CASA (System SpermVision™ der Minitüb GmbH, Tiefenbach) untersucht.
In der Literatur werden hohe Korrelationen zwischen der subjektiv geschätzten
Motilität und der mittels CASA bestimmten Motilität (Günzel-Apel et al., 1993;
Rijsselaere et al., 2002b; 2003; Schäfer-Somi und Aurich, 2007) sowie zwischen
der subjektiv bestimmten Konzentration und der mittels CASA gemessenen
Spermienkonzentration (Günzel-Apel et al., 1993; Rijsselaere et al., 2003)
beschrieben. Deshalb bestand ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit darin, zu
überprüfen, ob sich mit beiden Untersuchungsmethoden gleichwertige Ergebnisse
erzielen lassen und somit die in der Literatur gefundenen Aussagen bestätigt
werden können.
5.2 Diskussion der Methodik
5.2.1 Auswahl der Probanden
Das für die Untersuchungen genutzte Sperma wurde von einem heterogenen
Probandenkollektiv aus 30 Rüden gewonnen, um eine für den klinischen Alltag
repräsentative Stichprobe und zudem unabhängige Proben zu erhalten. Die
Möglichkeit individueller Effekte wurde dabei zugunsten der Unabhängigkeit der
Proben in Kauf genommen. Von der ausschließlichen Nutzung der klinikseigenen
Rüden wurde abgesehen, da Ergebnisse erzielt werden sollten, die auf die
Situation in der klinischen Praxis übertragen werden können.
Die Rüden unterschieden sich hinsichtlich der Rassen, des Alters und der
bisherigen Zuchtnutzung. Alle Faktoren zusammen sollten gewährleisten, dass
das Probandenkollektiv die Situation im klinischen Alltag widerspiegelt. Des
Weiteren wurden die insgesamt 16 verschiedenen Rassen gewählt, um eine
Rassediversität sicherzustellen und damit einen wie von England (1999)
158
Diskussion
beschriebenen Einfluss der Rasse auf die Spermaqualität auszuschließen. Die
Bevorzugung von Rüden mittlerer bis großer Hunderassen geschah vor dem
Hintergrund, dass die Untersuchungen mittels Splitsample-Verfahren durchgeführt
wurden, weshalb möglichst volumenreiche Ejakulate benötigt wurden und
Volumen und SGZ der spermienreichen Fraktion von der Körpergröße des Rüden
abhängig sind (Günzel, 1986). Dabei ist die SGZ positiv korreliert mit der
Körpergröße des Hundes und der daraus resultierenden Größe der Hoden (Olar et
al., 1983; Günzel, 1986; Johnston, 1991; Freshman, 2002). Bezüglich des Alters
wurde darauf geachtet, keine Rüden, die jünger als ein Jahr waren, zur
Spermagewinnung heranzuziehen, da aufgrund von Untersuchungen an BeagleRüden erst ab circa diesem Zeitpunkt von einem vollständigen Erreichen der
Geschlechtsreife auszugehen ist (Christiansen, 1984b). Etwa die Hälfte der Rüden
(16 von 30) wurde vorher bereits zur Zucht eingesetzt. Jedoch wurde der
Zuchterfolg nicht weiter erfragt, da dies für die Untersuchungen nicht relevant
erschien. Die Rüden sollten bewusst nicht nach ihrer Spermaqualität ausgewählt
werden, was zu einer individuellen Variation der Spermaparameter führte, wie es
auch im klinischen Alltag der Fall ist. Da die vorliegende Arbeit primär die
Haltbarkeit des flüssigkonservierten Spermas betrachtete, war es zu vertreten,
auch Sperma zu verwenden, das den Mindestanforderungen nicht entsprach.
Allerdings wurde darauf geachtet, dass die letzte Zuchtnutzung (natürlicher
Deckakt oder manuelle Spermagewinnung) länger als mindestens zwei Tage
zurücklag, da bei einer höheren Absamungsfrequenz durch eine Erschöpfung der
epididymalen Spermareserven die SGZ im Ejakulat vermindert sein kann (Boucher
et al., 1958; England, 1999).
Die spermienreiche Fraktion eines Rüden (Nr. 20) wies eine Beimengung in Form
von Blut auf. Das betreffende Ejakulat wurde trotzdem für die Versuche
verwendet, da die Blutbeimengung als gering einzustufen war und des Weiteren
geprüft werden sollte, ob die in der Literatur gefundenen Aussagen bezüglich
Blutbeimengungen bei Flüssigkonservierung bestätigt werden können. Nach
Seager und Fletcher (1972) kann Blut ein Medium für bakterielles Wachstum
bieten und so die Spermaqualität nachteilig beeinflussen. Diese nachteiligen
Effekte treten allerdings erst nach längerer Inkubationsdauer auf (England und
Allen, 1992). Rijsselaere et al. (2004b) konnten keine negativen Effekte von
Blutbeimengungen (Zusatz von ≤ 10 Vol. % venösem Vollblut) auf die funktionellen
Merkmale von für vier Tage flüssigkonserviertem Sperma nachweisen, wohl aber
159
Diskussion
eine signifikante Qualitätsreduktion nach Kryokonservierung und Auftauen bei
Blutbeimengungen ≥ 2 Vol. % venösem Vollblut. Als Ursache hierfür ist die nach
Kryokonservierung im Vergleich zur Flüssigkonservierung wesentlich stärkere
Hämolyse anzusehen und insbesondere das freigesetzte Hämoglobin (Rijsselaere
et al., 2004b).
Bei Hund Nr. 24 fiel während der speziellen andrologischen Untersuchung eine
derb-knotige Konsistenz des rechten Hodens auf, bei welcher es sich um einen
Hodentumor handelte. Die bei der Spermauntersuchung erfassten Parameter
lagen mit Ausnahme der SGZ des Ejakulates im Normbereich. Die verminderte
Gesamtzahl der Spermien im Ejakulat (Oligozoospermie) stand vermutlich in
Zusammenhang mit dem am Hoden erhobenen Befund. Da jedoch alle anderen
untersuchten Parameter der Norm entsprachen, wurde das Ejakulat in der
vorliegenden Studie verwendet. Zudem handelte es sich hierbei um einen Fall, der
durchaus auch in der Praxis auftreten kann und, wie zu Beginn dieses Abschnittes
erwähnt, sollte in der vorliegenden Arbeit die Situation im klinischen Alltag
widergespiegelt werden.
5.2.2 Spermagewinnung
Die Methodik der Spermagewinnung durch manuelle Stimulation entspricht der
üblichen Verfahrensweise beim Hund (Günzel, 1986; Linde-Forsberg, 1991;
Freshman, 2002; Hoffmann, 2003a; Kutzler, 2005). Bei Rüden kleiner Rassen
kann die Spermagewinnung auf einem Tisch erfolgen (Freshman, 2002), bei
großen Rüden wird sie vorzugsweise auf dem Fußboden durchgeführt (LindeForsberg, 1991). Letzteres war aufgrund der ausschließlichen Verwendung
mittlerer und großer Hunderassen bei der vorliegenden Untersuchung die übliche
Vorgehensweise. Die Anwesenheit einer läufigen bzw. einer mit synthetischem
Pheromon präparierten Hündin zur sexuellen Stimulation, welche nach Günzel
(1986) die Erfolgschancen verbessert und gleichzeitig zu einer Steigerung der
Spermaqualität führt (Seager und Platz, 1977b; Peña et al., 2006), war in der
vorliegenden Studie mit einer Ausnahme (Hund Nr. 3) durch die klinikseigenen
Hündinnen immer gewährleistet. Dies kann in der Praxis z. T. jedoch nicht immer
sichergestellt werden. Allerdings ist eine Spermagewinnung auch ohne die
Anwesenheit einer Hündin möglich (Günzel, 1986), was durch Hund Nr. 3 bestätigt
werden konnte. Da es sich bei diesem Hund jedoch um einen erfahrenen
Zuchtrüden handelte, bleibt offen, inwieweit die Spermagewinnung bei einem
160
Diskussion
unerfahrenen Rüden ohne die Anwesenheit einer Hündin erfolgreich durchgeführt
werden kann.
5.2.3 Verwendete spermatologische Untersuchungsmethoden
Die Ejakulate wurden sowohl nach den Methoden der klassischen Spermatologie
als auch mittels CASA (System SpermVision™ der Minitüb GmbH, Tiefenbach)
untersucht.
5.2.3.1
Klassische Spermatologie
Die Methodik der einzelnen Untersuchungen stimmte mit den in der Literatur für
die Standardspermatologie beschriebenen Untersuchungsmethoden überein
(Günzel, 1986; Johnston, 1991; Freshman, 2002; Hoffmann, 2003b).
Die Beurteilung der Motilität in den Nativejakulaten erfolgte, wie von Johnston
(1991)
und
Freshman
(2002)
empfohlen,
sofort
im
Anschluss
an
die
Spermagewinnung, um einer zeitverzögerungsbedingten Abnahme der Motilität
und
damit
einer
Verfälschung
der
Ausgangswerte
vorzubeugen.
Das
flüssigkonservierte Sperma wurde, wie von Linde-Forsberg (1991) empfohlen, vor
der Untersuchung immer auf 37°C angewärmt. Dies geschah vor dem
Hintergrund, dass die Körpertemperatur der Hündin und somit auch die
Temperatur im Uterus etwa 38°C beträgt (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001a)
und zudem bekannt ist, dass Untersuchungen bei 30°C signifikant niedrigere
Motilitätswerte ergeben als Untersuchungen bei 38°C (Iguer-Ouada und
Verstegen, 2001a). Die Motilitätsbeurteilung in den Nativejakulaten sowie in den
flüssigkonservierten Ejakulaten unmittelbar nach deren Herstellung wurde stets
von zwei Personen durchgeführt, wobei es sich bei einer Person um einen
erfahrenen Untersucher handelte. Dieses Vorgehen sollte die Subjektivität der
Motilitätsschätzung reduzieren.
Der Anteil an lebenden Samenzellen wurde nach Supravitalfärbung mit Eosin als
alleinigem Farbstoff beurteilt (Riesenbeck et al., 2001; Hoffmann, 2003b). Ebenso
wurden die morphologischen Veränderungen der Samenzellen nach Färbung mit
Eosin bestimmt (Hoffmann, 2003b). Diese Färbung wurde gewählt, da sie eine
ausreichend gute Differenzierung der morphologischen Veränderungen gestattet
und einfach sowie schnell durchzuführen ist und daher auch in der Routinepraxis
gut eingesetzt werden kann. Nachteilig an der Eosinfärbung ist, dass die in der
Färbelösung
enthaltenen
Salze
in
161
den
getrockneten
Ausstrichen
zu
Diskussion
Kristallbildungen neigen, welche die Samenzellen verdecken und so deren
Beurteilung verhindern (Peña Martínez, 2004). In der vorliegenden Arbeit konnten
Kristallbildungen in den Ausstrichen jedoch nur gelegentlich und auch nur in
geringem Ausmaß beobachtet werden, sodass eine Beurteilung der Samenzellen
immer möglich war.
Zur Beurteilung der akrosomalen Integrität wurde die Spermac®-Färbung
eingesetzt, welche sich beim Rüden für diesen Zweck bereits bewährt hat
(Riesenbeck et al., 2001). Ebenso erwies sich die Spermac®-Färbung für die
Erfassung
von
Veränderungen
am
Akrosom,
welche
während
des
Verarbeitungsprozesses bei der Konservierung von caninem Sperma auftreten
können, als vorteilhaft (Oettlé, 1986). Bei dieser Färbung handelt es sich um ein
kommerziell erhältliches Färbeset zur selektiven Anfärbung der Bestandteile einer
Samenzelle einschließlich des Akrosoms. Durch die selektive Anfärbung des
Akrosoms konnten Veränderungen an letzterem gezielt beurteilt werden, was im
Eosinausstrich nicht möglich gewesen wäre. Daher stellte die Spermac®-Färbung
eine geeignete Ergänzung zur Färbung mit Eosin dar. Nachteilig war allerdings,
dass die Beurteilung der mit Spermac® gefärbten Ausstriche bei den
flüssigkonservierten Ejakulaten teilweise durch störende Überlagerungen mit grün
gefärbten Partikeln erschwert wurde. Vermutlich handelte es sich hierbei um
angefärbte Eigelbpartikel aus den verschiedenen Verdünnern, obwohl nach Oettlé
(1986) der Verdünner die Farbaffinität der Spermac®-Färbung nicht zu
beeinflussen scheint. Zudem war die Auszählung der mit Spermac® gefärbten
Ausstriche bei stark verdünnten Ejakulaten sehr zeitaufwendig.
Zusätzlich wurde der HOS-Test durchgeführt, um die funktionale Integrität der
Spermienplasmamembran
zu
untersuchen.
Zwar
untersucht
auch
die
Supravitalfärbung (Lebend-Tot-Färbung) die Membranintegrität, jedoch werden
durch Supravitalfärbung und HOS-Test verschiedene Aspekte des Verhaltens der
Spermienmembran erfasst. Erstere misst, ob die Membran physikalisch
geschädigt ist, was ein Zeichen für Zelltod darstellt. Durch letzteren wird bestimmt,
ob eine intakte Membran biochemisch aktiv ist. Verschiedene Vorgänge während
der Befruchtung, wie z. B. Kapazitation, AR und Gamentenfusion, setzen eine
aktive Spermienmembran voraus, sodass die Befruchtung nicht stattfinden kann,
wenn die Membran zwar physikalisch intakt, aber biochemisch inaktiv ist. Deshalb
liefert der HOS-Test aussagekräftigere Ergebnisse als die Supravitalfärbung
(Correa und Zavos, 1994; Kumi-Diaka und Badtram, 1994). Weiterhin ist der HOS162
Diskussion
Test simpel, ökonomisch, klinisch leicht anwendbar und schnell durchzuführen,
weshalb er eine nützliche Ergänzung zur Standardspermauntersuchung darstellt
(Jeyendran et al., 1992; Pinto und Kozink, 2008) und daher auch in der
vorliegenden Studie eingesetzt wurde.
Die klassische Spermatologie gestattet eine relativ schnelle Beurteilung der
Spermaqualität und ist für den Praxisalltag gut geeignet, da sie mit einfacher
Laborausstattung durchgeführt werden kann. Allerdings ist die konventionelle
mikroskopische Untersuchung, insbesondere bei der Beurteilung der Motilität und
der Pathomorphologie, sehr subjektiv (Amann, 1989) und wird stark von der
Erfahrung des Untersuchers beeinflusst (Verstegen et al., 2002). Um diese
Subjektivität zumindest bei einzelnen Parametern (Motilität und Viabilität) zu
umgehen, wurden die Ejakulate in der vorliegenden Studie zusätzlich mittels
CASA
untersucht.
Dies
ist
in
der
Routinepraxis
aufgrund
der
hohen
Anschaffungskosten für CASA-Systeme jedoch nicht möglich.
5.2.3.2
Computer-assisted sperm analysis (CASA)
Für die CASA-Untersuchungen kam das System SpermVision™ zum Einsatz,
welches die Beurteilung einer großen Anzahl an Samenzellen in relativ kurzer Zeit
ermöglichte. Nach Rijsselaere et al. (2003) sind insbesondere die technischen
Einstellungen wichtig, um die Bewegungsbahnen der einzelnen Spermien zu
identifizieren und zu rekonstruieren. Sie beeinflussen die Datenausgabe von
CASA-Systemen in kritischer Weise (Ellington et al., 1993; Smith und England,
2001; Amann und Katz, 2004). Daher wurden in der vorliegenden Arbeit die vom
Hersteller empfohlenen Analyseeinstellungen für das SpermVision™-System
gewählt
und
nicht
weiter
modifiziert.
Diese
Einstellungen
waren
z. T.
übereinstimmend mit den von Schäfer-Somi und Aurich (2007) für das
SpermVision™-System verwendeten Einstellungen (siehe Tab. 25 und Tab. 26),
welche auch bereits mehrfach eingesetzt wurden (Eulenberger et al., 2009;
Koderle et al., 2009; Witte et al., 2009; Kmenta et al., 2011). Die Unterschiede in
den technischen Einstellungen könnten durch unterschiedliche Versionen des
SpermVision™-Systems oder durch eine benutzerdefinierte Modifikation der
Einstellungen bedingt sein.
Die gewählten Einstellungen wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl für die
Messung der Nativejakulate als auch für die Messung des flüssigkonservierten
Spermas verwendet. Dadurch war ein direkter Vergleich der Messergebnisse vor
163
Diskussion
und nach Flüssigkonservierung möglich, ohne dass eine Beeinflussung durch
verschiedene Einstellungen auftreten konnte.
Tab. 25: Vergleichende Darstellung der verwendeten technischen Einstellungen
für die Motilitätsanalyse mit den von Schäfer-Somi und Aurich (2007)
genutzten Einstellungen (Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis)
Parameter
verwendete Einstellung
Schäfer-Somi und
Aurich, 2007
Probenschichtdicke
20 µm
20 µm
Pixel zu µm Verhältnis
168 zu 100
keine Angabe
2
Spermienerkennung
20-60 µm
35 µm2
Zählkriterien
4000 Spermien oder
7 Felder mit 100 Zellen
8 Felder
pro Feld
Punkte bei der
11
keine Angabe
Spermienbewegung
Gesamtmotilität
Die Gesamtmotilität ergibt
VCL > 15 µm/s
sich aus der Summe der
lokal- und der vorwärtsbeweglichen Spermien.
unbewegliche Spermien
AOC < 9,5°
AOC < 9,5°
lokalbewegliche Spermien
DSL < 6,0 µm
keine Angabe
vorwärtsbewegliche
Jede Zelle, die nicht als
VCL > 15 µm/s,
Spermien
„unbeweglich“ oder
STR > 0,9 (schnell
„lokalbeweglich“
vorwärtsbewegliche
eingestuft wurde.
Spermien)
hyperaktive Spermien
VCL > 118 µm/s,
VCL > 118 µm/s,
ALH > 6,5 µm und
ALH > 6,5 µm und
LIN < 0,5
LIN < 0,5
lineare Spermien
STR > 0,9 und LIN > 0,5
STR > 0,9 und LIN > 0,5
nicht lineare Spermien
STR ≤ 0,9 und LIN ≤ 0,5
keine Angabe
kurvilineare Spermien
DAP/Radius ≥ 3 und
keine Angabe
LIN < 0,5
Die Einstellungen zur Spermienerkennung für die Motilitätsanalyse (Tab. 25)
entsprachen den vom Hersteller empfohlenen Analyseeinstellungen. Die Definition
von
Größenwerten
ist
essentiell,
um
eine
Unterscheidung
zwischen
Spermienköpfen und anderen Zellen, welche eventuell im untersuchten Ejakulat
vorhanden sind, zu gewährleisten (Verstegen et al., 2002). Der spezifizierte
Flächenbereich
zur
Spermienerkennung
betrug
in
den
vorliegenden
Untersuchungen 20 bis 60 µm2. Dies entspricht den in der Literatur gefundenen
Größenangaben für canine Spermien, nach denen die Dimensionen von lebenden,
164
Diskussion
physiologisch geformten Samenzellen folgende sind: Gesamtlänge ca. 68 µm,
Kopflänge ca. 7 µm, Kopfbreite ca. 4-5 µm, Mittelstücklänge ca. 11 µm und
Schwanzlänge ca. 50 µm (Bartlett, 1962a; Christiansen, 1984b; Dahlbom et al.,
1997; Rijsselaere et al., 2004a). Daraus ergibt sich eine Kopffläche von etwa 2835 µm2, welche somit innerhalb der Grenzen des spezifizierten Flächenbereichs
lag. Nach Dahlbom et al. (1997) und Rijsselaere et al. (2004a) beträgt die
durchschnittliche Kopffläche caniner Spermien sogar nur etwa 20 µm2, was die
untere Grenze des spezifizierten Flächenbereichs zur Spermienerkennung bei der
Motilitätsanalyse darstellte. Obgleich die Einstellungen zur Spermienerkennung
gemessen anhand der in der Literatur gefundenen Angaben zur Spermiengröße
realistisch erscheinen, konnte in einigen Fällen dennoch eine schlechte
Spermienerkennung während der Motilitätsanalyse beobachtet werden.
Bei den vom Hersteller empfohlenen und daher auch in der vorliegenden Arbeit
verwendeten Analyseeinstellungen für die Viabilitätsanalyse (siehe Kap. 9.2)
betrug der spezifizierte Flächenbereich zur Spermienerkennung für die grüne
Fläche 20 bis 600 µm2 (maximale Fläche der einzelnen Zelle 150 µm2) und für die
rote Fläche 10 bis 800 µm2 (maximale Fläche der einzelnen Zelle 200 µm2). Es ist
ersichtlich, dass die Untergrenzen gleich bzw. niedriger waren, verglichen mit den
Einstellungen für die Motilitätsanalyse, während die Obergrenzen deutlich höher
lagen. Der Grund für diese unterschiedlichen Einstellungen ist unbekannt. Bei den
vorliegenden Untersuchungen fiel allerdings auf, dass die Spermienerkennung bei
der Viabilitätsmessung im Vergleich zur Motilitätsmessung z. T. als schlechter zu
beurteilen war. Ob und inwieweit dies jedoch auf die unterschiedlichen
Einstellungen hinsichtlich der Spermienerkennung zurückzuführen war, blieb
ungeklärt. Insgesamt wurde aber deutlich, dass die CASA-Einstellungen eventuell
verbesserungswürdig sind, um die Spermienerkennung zu maximieren.
165
Diskussion
Tab. 26: Vergleichende Darstellung der sonstigen verwendeten technischen
Einstellungen mit den von Schäfer-Somi und Aurich (2007) genutzten
Einstellungen (Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis)
Parameter
verwendete Einstellung
Schäfer-Somi und
Aurich, 2007
Lichteinstellung bei
80-110
96-104
Motilitätsanalyse
Volumen pro
2,5 µl
3,0 µl
Messkammer
Analysetemperatur
37°C
37°C
Framerate (Bildfrequenz)
60 Frames/s
60 Frames/s
Volumen von SYBR-14/PI
2,5 µl
3,0 µl
pro Tube
(+ 10 µl Sperma)
(+ 100 µl Sperma)
Inkubationszeit
10 Minuten
10 Minuten
Wie aus Tab. 26 ersichtlich wurde in der vorliegenden Arbeit, übereinstimmend mit
Schäfer-Somi und Aurich (2007), mit einer Framerate von 60 Frames/s gearbeitet,
was ebenso den Empfehlungen anderer Autoren entsprach (Iguer-Ouada und
Verstegen, 2001a; Rijsselaere et al., 2003; Amann und Katz, 2004). Die
Framerate
ist
für
die
genaue
Identifizierung
und
Rekonstruierung
der
Bewegungsbahnen der einzelnen Samenzellen von Bedeutung und beeinflusst
daher die verschiedenen Motilitätsparameter (Verstegen et al., 2002; Rijsselaere
et al., 2003; 2005; Schäfer-Somi und Aurich, 2007).
Neben den technischen Einstellungen sind auch die verwendeten Messkammern
und insbesondere deren Tiefe von Bedeutung, da durch sie die Motilität der
Samenzellen beeinflusst wird (Verstegen et al., 2002). In Übereinstimmung mit
Rijsselaere et al. (2003) kamen in der vorliegenden Arbeit sog. LejaMesskammern, welche aus einem Objektträger mit jeweils vier Kammern mit einer
standardisierten Tiefe von 20 µm bestehen, zum Einsatz. Dies entsprach dem vom
Hersteller empfohlenen Zubehör für die Nutzung des SpermVision™-Systems;
auch von anderen Autoren werden 20 µm tiefe Messkammern verwendet
(Schäfer-Somi et al., 2006; Schäfer-Somi und Aurich, 2007).
Weiterhin ist die Einhaltung einer konstanten Analysetemperatur von 37°C ein zu
beachtender Faktor (Amann und Katz, 2004), auf dessen Bedeutung bereits zuvor
eingegangen wurde (Kap. 5.2.3.1). Ferner wurde darauf geachtet, die Messung
innerhalb einer Minute nach Beschickung der Messkammer abzuschließen, da
nach Smith und England (2001) Inkubationszeiten von mehr als einer Minute zu
einer negativen Beeinflussung der Spermaqualität führen.
166
Diskussion
Aufgrund der hohen Dichte der zweiten Ejakulatfraktion ist für die Untersuchung
mittels CASA üblicherweise eine Verdünnung notwendig (Verstegen et al., 2002;
Rijsselaere et al., 2003; Schäfer-Somi und Aurich, 2007). In der vorliegenden
Arbeit wurden jedoch nur die Nativejakulate verdünnt, bei denen das
SpermVision™-System wegen zu hoher Dichte eine Fehlermeldung machte.
Besser wäre es allerdings gewesen, alle Ejakulate auf eine einheitliche
Konzentration (50-100 x 106 Spermien pro ml) zu verdünnen, wie es auch in der
Literatur empfohlen wird (Günzel-Apel et al., 1993; Iguer-Ouada und Verstegen,
2001a; Rijsselaere et al., 2003; Schäfer-Somi und Aurich, 2007), um eine bessere
Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, da durch die Verdünnung die
Motilität und die Membranintegrität der Spermien beeinflusst werden (SchäferSomi und Aurich, 2007). Diese Beeinflussung ist abhängig vom Grad der
Verdünnung und dem
verwendeten
Verdünnermedium
(Iguer-Ouada
und
Verstegen, 2001a; Smith und England, 2001; Amann und Katz, 2004). Das
Verdünnermedium sollte keine Partikel enthalten, die in ihrer Größe ähnlich den
Dimensionen der Spermienköpfe sind (z. B. nicht-geklärtes Eigelb oder VollmilchVerdünner), da diese bei Anwendung von CASA-Systemen sonst nicht von
unbeweglichen Samenzellen unterschieden werden können (Verstegen et al.,
2002), was zu einer Überschätzung des Anteils an immotilen Spermien führen
kann (Ponglowhapan et al., 2004). Bei der Verdünnung der Nativejakulate für die
Messungen mittels CASA wurde diese Forderung eingehalten, indem auf 37°C
angewärmtes Auftaumedium verwendet wurde, welches keine Partikel enthielt.
Die flüssigkonservierten Ejakulate, die für die CASA-Messungen nur vereinzelt
verdünnt werden mussten (einige Halteproben von mit Up 1 verdünnten
Ejakulaten), enthielten hingegen von vornherein alle Eigelb, da alle getesteten
Verdünner
eigelbhaltig
waren.
Allerdings
war
die
Unterscheidung
des
SpermVision™-Systems zwischen Eigelbpartikeln und Spermienköpfen bei allen
Messungen als gut zu beurteilen, sodass hieraus vermutlich keine Überschätzung
des Anteils an unbeweglichen Samenzellen resultierte. Fraglich ist jedoch, ob und
wie das für die Verdünnung der Nativejakulate verwendete Auftaumedium die
gemessenen Motilitätswerte beeinflusst hat. Im Vergleich zu physiologischer
Kochsalzlösung, welche keine Energiesubstrate enthält (Rijsselaere et al., 2003),
beinhaltete das Auftaumedium Fruktose als Energiesubstrat. Andererseits wird
Auftaumedium normalerweise kryokonserviertem Sperma nach dem Auftauen
zugesetzt, um dessen Motilität zu steigern und es kann auch frischem oder
167
Diskussion
flüssigkonserviertem Sperma vor der Verwendung zur KB beigegeben werden, um
dort den gleichen Effekt zu erzielen. Vor diesem Hintergrund ist der Einsatz von
Auftaumedium
zur
Verdünnung
der
Ejakulate
für
die
CASA-Messungen
praxisorientiert und daher auch in der vorliegenden Arbeit zu vertreten.
5.2.3.2.1 Konzentrationsbestimmung
Nach Iguer-Ouada und Verstegen (2001a) kommt es durch CASA-Systeme meist
zu einer Überschätzung der Spermienkonzentration, welche mit steigender
Verdünnung zunimmt. Im Gegensatz dazu konnten Rijsselaere et al. (2003) eine
Unterschätzung der Spermienkonzentration durch CASA beobachten, welche mit
steigenden Spermienkonzentrationen größer wurde. In der vorliegenden Arbeit
wurde die Konzentration der Ejakulate durch das SpermVision™-System während
der Motilitätsanalyse bestimmt. Tendenziell war übereinstimmend mit Rijsselaere
et al. (2003) eher eine Unterschätzung der Spermienkonzentration (im Vergleich
mit den durch die Neubauer-Zählkammer bestimmten Werten) festzustellen. Diese
war insbesondere bei den Nativejakulaten stark ausgeprägt (siehe Kap. 4.1.3 und
Kap. 4.1.6), konnte in geringerem Maße jedoch auch bei den verdünnten
Ejakulaten beobachtet werden (siehe Kap. 4.2.1). Die größeren Abweichungen bei
den Nativejakulaten unterstützen die Aussage von Rijsselaere et al. (2003), dass
die Unterschätzung der Spermienkonzentration mit steigenden Spermienkonzentrationen zunimmt. Auf die statistisch ermittelten Zusammenhänge
zwischen beiden Methoden der Konzentrationsbestimmung wird in Kap. 5.3.4.1
näher eingegangen.
5.2.3.2.2 Motilitätsanalyse
Grundsätzlich fiel bei der Motilitätsanalyse durch das SpermVision™-System auf,
dass es bei subjektiv als gut bewerteten Ejakulaten bei Messung durch
SpermVision™ zu einer Unterschätzung der Motilität kam und bei subjektiv als
eher schlecht beurteilten Ejakulaten zu einer Überschätzung der Motilität. Dies war
sowohl
bei
der
Motilitätsanalyse
der
Nativejakulate
als
auch
bei
der
Motilitätsanalyse der flüssigkonservierten Ejakulate zu beobachten. Aufgrund
dessen scheint eine kritische Beurteilung der gemessenen Motilitätswerte
erforderlich. Ebenso kann jedoch auch an der Aussagekraft der subjektiven
Motilitätsschätzung gezweifelt werden, zudem in der Literatur für die subjektive
mikroskopische Untersuchung über hohe Variationen bei der Beurteilung der
168
Diskussion
Motilitätsparameter derselben Ejakulate durch verschiedene Untersucher berichtet
wird (Dunphy et al., 1989).
Eine Überschätzung der Motilität durch CASA bei subjektiv als schlecht beurteilten
Ejakulaten konnte in ähnlicher Weise auch von Amann und Hammerstedt (1980)
beobachtet werden: Bei Proben, die nur tote Bullenspermien enthielten, wurden
durch CASA trotzdem 31 % bewegliche Spermien ermittelt. Daher sind die Autoren
der Ansicht, dass CASA-Untersuchungen nur für Ejakulate, die einen hohen
Prozentsatz an motilen Spermien aufweisen (> 50 %), genaue und verlässliche
Ergebnisse liefern, welche auch mit den Ergebnissen subjektiver Schätzungen gut
übereinstimmen. Bei Ejakulaten, die nur wenige bewegliche Spermien enthalten
(< 25 %), sind CASA-Untersuchungen jedoch ungenau (Amann und Hammerstedt,
1980).
Insgesamt betrachtet war die Übereinstimmung der durch das SpermVision™System ermittelten Motilitätswerte mit den subjektiv geschätzten Werten trotz
einiger Ausnahmen jedoch als zufriedenstellend zu beurteilen, wobei die durch
SpermVision™
gemessenen
Werte
im
Durchschnitt
unter
den
subjektiv
bestimmten Werten lagen (siehe Kap. 4.4.2.2). Auf die statistisch ermittelten
Zusammenhänge zwischen beiden Methoden wird in Kap. 5.3.4.2 näher
eingegangen.
5.2.3.2.3 Viabilitätsanalyse
Das CASA-System SpermVision™ ist im Vergleich zu anderen CASA-Systemen in
der Lage, zusätzlich zu den Motilitätsparametern die Zellmembranintegrität
objektiv zu beurteilen (Schäfer-Somi und Aurich, 2007). Diese Viabilitätsanalyse
basiert auf einer Fluoreszenzfärbung der Spermien mit SYBR-14/PI. Abweichend
von Schäfer-Somi und Aurich (2007), die 3,0 µl des SYBR-14/PI-Gemisches mit
100 µl Sperma inkubieren, wurden in der vorliegenden Arbeit 2,5 µl SYBR-14/PI
mit 10 µl Sperma inkubiert. Die Inkubationszeit von zehn Minuten war jedoch
übereinstimmend mit der von Schäfer-Somi und Aurich (2007) (siehe Tab. 26).
Weitere die Viabilitätsanalyse betreffende Einstellungen können nicht miteinander
verglichen werden, da hierzu von Schäfer-Somi und Aurich (2007) keine Angaben
gemacht werden.
Fluoreszenzgefärbte Spermien können auf ihre funktionellen und morphologischen
Aspekte hin untersucht werden, ohne dass es zu einer Interferenz mit
extrazellulären Medien kommt, was insbesondere bei konserviertem Sperma von
169
Diskussion
Bedeutung ist (Peña Martínez, 2004). SYBR-14/PI färbt selektiv nur die
Samenzellen an, wodurch eine Differenzierung von anderen im Medium
enthaltenen Partikeln möglich wird (Peña et al., 2006). Aus diesem Grund stellten
in der vorliegenden Arbeit die Eigelbpartikel in den flüssigkonservierten Ejakulaten
kein Problem für die Spermienerkennung dar. Allerdings kam es - subjektiv
betrachtet - bei einigen Messungen durch eine schlechte Spermienerkennung zu
einer Unterschätzung der Viabilität durch das SpermVision™-System. Teilweise
war dies durch eine schwache Fluoreszenz der Samenzellen bedingt, welche auch
durch erneute Färbung und Inkubation nicht verbessert werden konnte. Eine
sukzessive Abnahme der Intensität der grünen Fluoreszenz in mit TRIS-GlukoseEigelb-Verdünner mit Zusatz von 1 % Equex STM aufgearbeiteten Ejakulaten
konnte während fortschreitender Inkubationsdauer bei 5°C auch von Niżański und
Klimowicz
(2005)
beobachtet
werden.
Jedoch
wurden
in
den
eigenen
Untersuchungen bei einigen Messungen auch bei ausreichender Fluoreszenz der
Samenzellen nicht alle Spermien vom SpermVision™-System als solche
identifiziert.
Der in der vorliegenden Studie durchgeführte Vergleich der Ergebnisse der
Viabilitätsanalyse mittels CASA nach SYBR-14/PI-Färbung mit denen der
konventionellen Beurteilung des Lebend-Tot-Anteils im Eosinausstrich lieferte eine
akzeptable Übereinstimmung zwischen beiden Methoden (siehe Kap. 4.4.3),
welche in Kap. 5.3.4.3 näher beschrieben wird.
5.2.4 Verdünner
Die in der vorliegenden Arbeit getesteten Verdünner wurden ausgewählt, da sie
kommerziell erworben werden können bzw. einfach herzustellen sind und deshalb
in der klinischen Praxis z. T. weitverbreitet eingesetzt werden.
Der kommerzielle Verdünner CP bietet die Vorteile, dass er schnell verfügbar und
einfach anzuwenden ist. Zudem ist eine Vorratshaltung möglich. Bei kühler,
trockener und dunkler Lagerung zwischen + 2°C und + 8°C können die den
Verdünner enthaltenden Flaschen über ein Jahr lang gelagert werden. Vor
Gebrauch muss lediglich die entsprechende Menge an Eigelb zugesetzt werden,
was die Handhabung dieses Verdünners leicht macht, da keine Herstellung nach
Rezept mit Abwiegen einzelner Komponenten nötig ist.
Im Gegensatz zum vorgenannten Verdünner handelte es sich beim Verdünner TE
und beim Uppsala Equex-2 System-Verdünner um nichtkommerzielle Verdünner,
170
Diskussion
welche im eigenen Labor selbst hergestellt wurden. Hierzu müssen die benötigten
Geräte und Chemikalien vorhanden sein, was einen Hinderungsgrund für den
Einsatz
in
der
tierärztlichen
Praxis
darstellen
könnte.
Zudem
ist
der
arbeitstechnische Aufwand im Vergleich zu kommerziellen Verdünnern wesentlich
höher und zeitintensiver. Allerdings ist die eigene Herstellung bei häufiger
Nachfrage günstiger als der kommerzielle Erwerb – vorausgesetzt, die nötigen
Geräte stehen zur Verfügung und müssen nicht extra gekauft werden.
5.2.4.1
Inhaltsstoffe
Zwischen den drei untersuchten Verdünnern existierten bezüglich der Inhaltsstoffe
neben einigen Gemeinsamkeiten auch wesentliche Unterschiede, welche bei der
Interpretation der Versuchsergebnisse berücksichtigt werden müssen.
Da es sich bei dem Verdünner CP um einen kommerziellen Verdünner handelte,
war seine genaue Zusammensetzung nicht bekannt. Es lagen lediglich die
Herstellerangaben vor. Demnach enthielt der Verdünner neben dem zugesetzten
Eigelb Reinstwasser, Natriumzitrat, TRIS, Glukose, Fruktose, herstellereigene
Bestandteile und Gentamicin. Was unter den herstellereigenen Bestandteilen zu
verstehen war, blieb offen. Auch gab es keine exakten Mengenangaben zu den
einzelnen Inhaltsstoffen. Nur die Menge des Eigelbs war bekannt (20 %), da
dieses selbst hinzugefügt werden musste. Aufgrund dessen können hinsichtlich
der Effekte der einzelnen Inhaltsstoffe auf die Versuchsergebnisse nur begrenzt
Aussagen gemacht werden.
Eine Gemeinsamkeit der drei getesteten Verdünner bestand in den verwendeten
Puffersubstanzen. Alle drei Verdünner enthielten TRIS; der Verdünner TE und der
Uppsala Equex-2 System-Verdünner in gleichen Mengen. Beim Verdünner CP
konnte, wie oben bereits erwähnt, bezüglich der enthaltenen Menge an TRIS
keine Aussage gemacht werden. Der Verdünner TE und der Uppsala Equex-2
System-Verdünner beinhalteten zusätzlich Zitronensäure (ebenfalls in gleichen
Mengen), wohingegen im Verdünner CP Natriumzitrat als zweite Puffersubstanz
Verwendung fand.
Weiterhin waren alle drei Verdünner eigelbhaltig und besaßen einen Eigelbanteil
von 20 %. Nachteilig an Eigelb ist, dass es sich um ein biologisch riskantes
Produkt tierischen Ursprungs handelt (Bergeron und Manjunath, 2006; Farstad,
2009), dessen Zusammensetzung extrem variabel ist (Bergeron und Manjunath,
2006; Beccaglia et al., 2009a). Daher kann die Gleichförmigkeit der mit
171
Diskussion
Eigelbzusatz hergestellten Verdünner nicht sicher gewährleistet werden, was den
Bestrebungen, vorzugsweise definierte Medien zu verwenden, um möglichst
standardisiert zu arbeiten, widerspricht. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht,
dieses Problem zu umgehen, indem alle Verdünner im Vorhinein mit Eiern
derselben Herkunft hergestellt und bis zur Verwendung portioniert bei - 21°C
gelagert wurden. So konnte für den Vergleich der getesteten Verdünner
untereinander eine annähernde Konsistenz bezüglich der Zusammensetzung des
Eigelbs sichergestellt werden.
Die Zuckerkomponente in den drei untersuchten Verdünnern war Fruktose. Dabei
enthielten der Verdünner TE und der Uppsala Equex-2 System-Verdünner die
gleiche Menge an Fruktose. Im Verdünner CP war neben Fruktose auch Glukose
enthalten. Glukose und Fruktose sind die am häufigsten genutzten Zucker in
Verdünnern für die Flüssigkonservierung von caninem Sperma (Ponglowhapan et
al., 2004). Glukose bedingt eine mehr oszillatorische Bewegung, während
Fruktose ein schnelleres und mehr lineares Bewegungsmuster verursacht.
Allerdings verändert sich der Prozentsatz an motilen Spermien weder durch
Fruktose noch durch Glukose (Rigau et al., 2001). Welcher Zucker (Fruktose oder
Glukose) als Energiezusatz besser geeignet ist, wird kontrovers diskutiert (IguerOuada und Verstegen, 2001b; Ponglowhapan et al., 2004). Übereinstimmend mit
Ponglowhapan et al. (2004), welche einen TRIS-Eigelb-Verdünner mit einer
Fruktosekonzentration
von
70 mM
als
am
besten
geeignet
für
die
Langzeitkonservierung von Flüssigsperma ansehen, wurden in der vorliegenden
Arbeit Verdünner mit einer Fruktosekonzentration von etwa 70 mM (Verdünner TE,
Uppsala Equex-2 System-Verdünner) gewählt.
Ein wesentlicher Unterschied zwischen den drei getesteten Verdünnern bestand
im Zusatz von Glycerol. Während die Verdünner CP und TE kein Glycerol
enthielten, war im Uppsala Equex-2 System-Verdünner Glycerol enthalten. Dies
ließ sich dadurch erklären, dass es sich bei diesem Verdünner eigentlich um einen
Verdünner für die Kryokonservierung von caninem Sperma handelt und daher der
Zusatz eines Kryoprotektivums essentiell ist. Glycerol ist das am häufigsten
verwendete Kryoprotektivum für Hundesperma (Concannon und Battista, 1989;
Martins-Bessa et al., 2006; Rota et al., 2006; Futino et al., 2010). Verdünner 1 des
Uppsala Equex-2 System-Verdünners enthielt 3 % Glycerol und Verdünner 2 einen
Anteil von 7 %, was eine Endkonzentration von 5 % Glycerol im Uppsala Equex-2
System-Verdünner ergab. Diese Konzentration entspricht den in der Literatur
172
Diskussion
verwendeten Endkonzentrationen in Verdünnern für die Kryokonservierung von
caninem Sperma (Rota et al., 1999a; 2006). Allerdings wird Glycerol üblicherweise
nicht in Verdünnern für die Flüssigkonservierung von Hundesperma eingesetzt, da
es in niedrigen Konzentrationen (3 %) keinen vorteilhaften Effekt auf die Motilität
ausübt und in höheren Konzentrationen (6 %) sogar zu einer Reduktion der
Motilität von flüssigkonservierten Hundespermien führt (Province et al., 1984).
Diese in der Literatur gefundene Aussage konnte in der vorliegenden Arbeit durch
die beim Uppsala Equex-2 System-Verdünner erfolgte Aufteilung in die
Versuchsteile I und II gut verifiziert werden (siehe Kap. 5.3.2.2 und Kap. 5.3.3.1).
Weiterhin unterschieden sich die drei untersuchten Verdünner bezüglich des
Antibiotikazusatzes. Im Verdünner CP war Gentamicin enthalten, während bei der
Herstellung des Verdünners TE und des Uppsala Equex-2 System-Verdünners
abweichend vom Rezept bewusst auf den Zusatz von Penicillin und Streptomycin
verzichtet wurde. Obwohl nach Hoffmann (2003d) bei der Flüssigkonservierung
der Zusatz von Antibiotika generell angebracht erscheint und auch nach LindeForsberg (1995) insbesondere bei der Verwendung von eigelbhaltigen Verdünnern
Antibiotika zugesetzt werden sollten, da Eigelb das bakterielle Wachstum
begünstigt, wurden in der vorliegenden Arbeit bei den selbst hergestellten
Verdünnern keine Antibiotikazusätze verwendet. Es sollte gezeigt werden, dass
auch ohne den Einsatz von Antibiotika eine angemessene Spermaqualität über
einen längeren Zeitraum aufrecht erhalten werden kann. Dies entspricht dem
derzeitigen Bestreben in der Veterinärmedizin, den Einsatz von Antibiotika auf das
notwendige Minimum zu beschränken. Allerdings wurden keine mikrobiologischen
Untersuchungen der Ejakulate durchgeführt, sodass keine Aussagen darüber
gemacht werden können, ob und wie stark sich eventuell in den Ejakulaten
vorhandene Keime während des Untersuchungszeitraumes vermehrt haben.
Dieser Unterschied bezüglich des Antibiotikazusatzes muss bei der Interpretation
der Versuchsergebnisse Beachtung finden.
Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen den drei untersuchten Verdünnern
bestand im Zusatz von Equex STM Paste (Equex), welche nur im Verdünner 2 des
Uppsala Equex-2 System-Verdünners enthalten war. Der Zusatz von Equex zu
einem konventionellen TRIS-Gefrierverdünner verbessert die Viabilität und die
Langlebigkeit der Spermien nach dem Auftauen (Rota et al., 1997), führt zu einer
höheren Gesamt- und Vorwärtsbeweglichkeit nach dem Auftauen (Rota et al.,
1999a; Alhaider und Watson, 2009) und besitzt eine positive Auswirkung auf die
173
Diskussion
ZP-Bindungsfähigkeit von kryokonservierten Spermien (Ström Holst et al., 2000;
2001). Im Gegensatz dazu konnten Niżański et al. (2009) zeigen, dass durch den
Zusatz von Equex zu einem TRIS-Eigelb-Verdünner zur Flüssigkonservierung von
caninem Sperma bei 5°C die Lebensdauer der Spermien verkürzt wird. Sie sehen
den Zusatz von Equex zu Verdünnern für die Flüssigkonservierung als ungeeignet
an,
da
der
Prozentsatz
an
motilen
Samenzellen
nur
für
drei
Tage
zufriedenstellende Werte zeigt, während bei Proben ohne Equex-Zusatz über
sieben Tage gute Werte erzielt werden können. Auch diese in der Literatur
gefundene Aussage konnte in der vorliegenden Arbeit durch die beim Uppsala
Equex-2 System-Verdünner erfolgte Aufteilung in die Versuchsteile I und II gut
überprüft werden (siehe Kap. 5.3.2 und Kap. 5.3.3), da nur Verdünner 2 des
Uppsala Equex-2 System-Verdünners Equex enthielt und somit nur in Versuchsteil
I Effekte eines Zusatzes von Equex auftreten konnten.
5.2.4.2
Unterschiede bezüglich der Aufarbeitung
Die Aufarbeitung der Nativejakulate mit den drei verschiedenen Verdünnern
erfolgte im Anschluss an die Spermauntersuchung parallel. Dabei wurde für die
Verdünner CP und TE stets nach dem gleichen Schema verfahren (siehe Kap.
3.4.2): Die entsprechenden Aliquote wurden je nach der Dichte des Nativspermas
ohne weitere Vorbehandlung mit den einphasigen Verdünnern versetzt und
anschließend im Kühlschrank auf 4°C abgekühlt. Im Gegensatz dazu wurde für die
Aufarbeitung mit dem zweiphasigen Uppsala Equex-2 System-Verdünner das
gleiche Protokoll verwendet, wie es in der Literatur für den Kryokonservierungsprozess beschrieben wird (Rota et al., 1997; 1999a; Peña und Linde-Forsberg,
2000; Linde-Forsberg, 2001; Peña et al., 2003b; Hermansson und Linde-Forsberg,
2006), nur ohne folgende Kryokonservierung (siehe Kap. 3.4.2). Wesentliche
Unterschiede, verglichen mit der Aufarbeitung der Ejakulate mit den anderen
beiden
(einphasigen)
Verdünnern,
waren
dabei
die
Zentrifugation
der
Nativejakulate mit folgendem Abpipettieren des Seminalplasma-Überstandes
(Versuchsteile I und II) und die einstündige Äquilibrierung bei 4°C nach dem
Zusatz von Verdünner 1 bzw. vor dem Zusatz von Verdünner 2 (nur Versuchsteil
I). Diese Unterschiede bezüglich der Aufarbeitung müssen bei der Interpretation
der
Versuchsergebnisse
Berücksichtigung
finden,
da
insbesondere
die
Auswirkungen von Seminalplasma auf den Konservierungserfolg und die Effekte
der Zentrifugation auf die Samenzellen in der Literatur kontrovers diskutiert
174
Diskussion
werden (siehe Kap. 2.4.1.1). Weiterhin ist zu beachten, dass in Versuchsteil I,
bedingt durch die einstündige Äquilibrierung bei 4°C, die Untersuchung der mit
Up 1 + 2 aufgearbeiteten Aliquote nicht zeitgleich mit der Untersuchung der mit CP
und der mit TE aufgearbeiteten Aliquote erfolgte. Letztere wurden unmittelbar
nach dem Verdünnen untersucht, während die mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten
Aliquote erst nach vorheriger Abkühlung auf 4°C und anschließendem
Wiedererwärmen auf 37°C untersucht wurden.
Durch die unterschiedliche Aufarbeitung mit den verschiedenen Verdünnern kam
es auch zu Unterschieden in den Endverdünnungen der flüssigkonservierten
Ejakulate. Die mit CP und die mit TE aufgearbeiteten Aliquote hatten aufgrund des
gleichen Aufarbeitungsschemas annähernd die gleichen Endkonzentrationen. Für
die mit dem Uppsala Equex-2 System-Verdünner aufgearbeiteten Aliquote galt
dies nur in Versuchsteil I (Endverdünnung 1 : 4), wobei auch hier mittels
Neubauer-Zählkammer teilweise höhere Spermienkonzentrationen bestimmt
werden konnten als in den mit CP und in den mit TE verdünnten Aliquoten, was
vermutlich durch die Zentrifugation der Nativejakulate vor der Aufarbeitung bedingt
war. In Versuchsteil II (Endverdünnung 1 : 2) hatten die mit dem Uppsala Equex-2
System-Verdünner aufgearbeiteten Aliquote sowohl bei Bestimmung mit der
Neubauer-Zählkammer als auch bei Messung mittels CASA deutlich höhere
Endkonzentrationen als die mit CP und die mit TE aufgearbeiteten Aliquote. Dies
war durch die Änderung im Versuchsaufbau bedingt. Während in Versuchsteil I
Verdünner 1 und Verdünner 2 des Uppsala Equex-2 Systems zum Einsatz kamen
(Up 1 + 2), wurde in Versuchsteil II nur Verdünner 1 verwendet (Up 1). Grund für
diese
Modifikation
im
Versuchsaufbau
waren
die
schlechten
Konservierungsergebnisse bei Verdünnung der Ejakulate mit dem kompletten
Uppsala Equex-2 System (siehe Kap. 4.3). Um nicht zu stark vom UppsalaVerfahren abzuweichen, wurden die entsprechenden Aliquote in Versuchsteil II
jedoch trotzdem nur im Verhältnis 1 : 2 verdünnt. Dies geschah auch im Hinblick
darauf, dass in der Praxis nur mit Verdünner 1 des Uppsala Equex-2 Systems
aufgearbeitete Ejakulate nach der Flüssigkonservierung noch mit Verdünner 2
versetzt und anschließend kryokonserviert werden könnten. So könnten
beispielsweise in der Praxis Ejakulate gewonnen und mit Verdünner 1
aufgearbeitet werden, um sie im Anschluss in flüssigkonserviertem Zustand an
eine Einrichtung zu versenden, die dann die weitere Aufarbeitung und
Kryokonservierung durchführt. Vor diesem Hintergrund wurden die Aliquote in
175
Diskussion
Versuchsteil
II
nur
mit
Verdünner
1
des
Uppsala
Equex-2
Systems
flüssigkonserviert. Nachteilig an dieser Vorgehensweise war, dass die verdünnten
Ejakulate, wie bereits in Kap. 5.2.3.2 erwähnt, für die CASA-Messungen z. T.
nochmals verdünnt werden mussten. Insgesamt müssen diese Unterschiede in
den Endverdünnungen der flüssigkonservierten Ejakulate insbesondere für die
Interpretation der durch CASA bestimmten Messwerte berücksichtigt werden, da
bekannt ist, dass verschiedene Motilitätsparameter in Abhängigkeit vom Grad der
Spermaverdünnung beeinflusst werden (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001a;
Smith und England, 2001).
5.3 Diskussion der Ergebnisse
5.3.1 Nativejakulate
5.3.1.1
Klassische Spermatologie
Die in den Nativejakulaten untersuchten Spermaparameter variierten zwischen
den verschiedenen Rüden, so wie es auch im klinischen Alltag der Fall ist,
entsprachen dabei aber größtenteils den in der Literatur beschriebenen
physiologischen Referenzwerten für Rüdensperma (Günzel, 1986; England, 1999;
Riesenbeck et al., 2001; Hoffmann, 2003b; Günzel-Apel, 2007). Ausnahmen
bildeten einzelne Parameter in den Ejakulaten der Hunde Nr. 1, 2, 6, 7, 9, 11 und
24, wobei es sich meist um einen leicht erhöhten Anteil an Samenzellen mit
Kopfkappenveränderungen in der Spermac®-Färbung handelte (Nr. 1, 2, 6, 7, 9
und 11). Bei Hund Nr. 7 war zusätzlich ein erhöhter Anteil an morphologisch
veränderten Samenzellen und bei Hund Nr. 24 eine verminderte SGZ im Ejakulat
zu beobachten. Die genannten Abweichungen von den physiologischen
Referenzbereichen waren jedoch für die vorliegenden Untersuchungen nicht
weiter relevant, da die Proben vor und nach der Flüssigkonservierung individuelle
Berücksichtigung fanden.
5.3.1.2
CASA
Für die mittels CASA bestimmten Motilitätsparameter sowie für die mittels CASA
nach SYBR-14/PI-Färbung bestimmte Viabilität ließen sich in der Literatur keine
Referenzbereiche für Rüdensperma finden. Daher konnten die vorliegenden
176
Diskussion
Ergebnisse nur mit denen anderer Veröffentlichungen verglichen werden. Hierbei
muss jedoch beachtet werden, dass es z. T. Unterschiede bezüglich der genutzten
CASA-Systeme und der eingesetzten Verdünnungen bzw. Verdünnermedien gibt.
In der Literatur konnten nur wenige Arbeiten gefunden werden, in denen die
CASA-Messungen ohne vorherige Verdünnung der Nativejakulate erfolgten, so
wie es in der vorliegenden Arbeit größtenteils der Fall war. Auf die Problematik
hinsichtlich der Verdünnung der Nativejakulate für die Beurteilung mittels CASA
bei den vorliegenden Untersuchungen wurde bereits in Kap. 5.2.3.2 hingewiesen.
Verglichen mit den von Schäfer-Somi und Aurich (2007) mittels SpermVision™
und verschiedenen Verdünnermedien bestimmten Motilitätswerten, waren die in
der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse zwar für einige Motilitätsparameter
ähnlich, überwiegend jedoch niedriger; insbesondere die Gesamtmotilität und die
Vorwärtsbeweglichkeit lagen deutlich niedriger als bei Schäfer-Somi und Aurich
(2007). Ausnahmen bildeten die Parameter ALH und WOB, welche geringgradig
höhere Werte zeigten. Ebenso war die durch CASA bestimmte Viabilität in der
vorliegenden Arbeit deutlich niedriger als bei Schäfer-Somi und Aurich (2007).
Insgesamt sprach dies für eine tendenziell geringere Spermaqualität der
Nativejakulate in der vorliegenden Untersuchung, welche jedoch wahrscheinlich
durch das größere und heterogene Probandenkollektiv bedingt war, wohingegen
Schäfer-Somi und Aurich (2007) ausschließlich Ejakulate von sechs klinikseigenen
Beagle-Rüden im Alter von zwei bis vier Jahren verwendeten. Bezüglich der
Viabilität muss zudem der Unterschied in der Methodik sowie die teils schlechte
Spermienerkennung durch das SpermVision™-System berücksichtigt werden
(siehe Kap. 5.2.3.2.3).
Im Vergleich mit den mittels SpermVision™ gemessenen Ergebnissen von
Schäfer-Somi et al. (2006), Eulenberger et al. (2009) und Koderle et al. (2009)
waren die in der vorliegenden Arbeit gemessenen Werte für die Nativejakulate
zwar
für
viele
Motilitätsparameter
ähnlich,
jedoch
zeigten
auch
hier
Gesamtmotilität, Vorwärtsbeweglichkeit und Viabilität immer geringere Messwerte
als bei den genannten Autoren. Auch verglichen mit den Ergebnissen weiterer
Autoren (Günzel-Apel et al., 1993; Rijsselaere et al., 2003; Verstegen et al., 2005;
Niżański, 2006; Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007; Pinto und Kozink,
2008) waren die in der vorliegenden Studie ermittelten Messwerte für die
Gesamtmotilität deutlich niedriger, unabhängig davon, welches CASA-System
177
Diskussion
(HTR Ceros 12.1, HTR IVOS 10 und 12 bzw. 12.21, Strömberg-Mika Cell Motion
Analyzer) von den genannten Autoren genutzt wurde.
Hingegen entsprach die in der vorliegenden Arbeit mittels CASA nach SYBR14/PI-Färbung bestimmte Viabilität in den Nativejakulaten annähernd den bei
Rijsselaere et al. (2002a) und Niżański (2006) gefundenen Werten für canines
Nativsperma, welche allerdings nach Verdünnung durch manuelles Auszählen der
mit SYBR-14/PI gefärbten Proben unter dem Fluoreszenzmikroskop (Rijsselaere
et al., 2002a) bzw. flowzytometrisch (Niżański, 2006) ermittelt wurden. Weiterhin
konnten bei Iguer-Ouada und Verstegen (2001a), welche mit dem HTR IVOS 10
arbeiteten,
ähnliche
Werte
für
die
Vorwärtsbeweglichkeit
und
weitere
Motilitätsparameter, bei Rigau et al. (2001), welche den Sperm Class Analyzer
einsetzten, ein nahezu identischer Wert für die Gesamtmotilität und bei Ellington et
al. (1993), welche den Hamilton-Thorne Motility Analyzer nutzten, ähnliche Werte
für die Gesamtmotilität, die Vorwärtsbeweglichkeit und andere Motilitätsparameter
gefunden werden. Bei Smith und England (2001) ließen sich für die mittels
Hobson Sperm Tracker in verdünnten Nativejakulaten ermittelten Motilitätsparameter den in der vorliegenden Arbeit bestimmten Werten ähnliche oder
niedrigere Werte finden.
Wie bereits erwähnt, konnten nur wenige Arbeiten gefunden werden, in denen die
Motilitätsparameter in den Nativejakulaten ohne vorherige Verdünnung gemessen
wurden: Bei Mogas et al. (1998) kam hierfür der Sperm Class Analyzer zum
Einsatz. Die ermittelten Werte waren mit Ausnahme der Gesamtmotilität jedoch
deutlich niedriger als die in der vorliegenden Arbeit bestimmten Messwerte. Ob
und inwieweit dies im Zusammenhang mit der nicht erfolgten Verdünnung vor den
CASA-Messungen
zu
sehen
ist,
bleibt
offen,
da
auch
eine
geringere
Spermaqualität der genutzten Rüden in Betracht gezogen werden muss, wogegen
allerdings die gute Gesamtmotilität der Ejakulate spricht. Bei Rota et al. (2001)
erfolgte die Motilitätsmessung in den Nativejakulaten mit dem Hamilton-Thorne
Motility Analyzer ebenfalls ohne vorherige Verdünnung. Die ermittelten Werte für
die Gesamtmotilität und die Vorwärtsbeweglichkeit waren annähernd identisch mit
den in der vorliegenden Arbeit bestimmten Werten. Dagegen zeigten die von
Ponglowhapan et al. (2004) in gepooltem, unverdünntem Sperma mittels
Strömberg-Mika Cell Motion Analyzer gemessenen Motilitätsparameter tendenziell
höhere Werte für die Gesamtmotilität, die Vorwärtsbeweglichkeit und die
178
Diskussion
Parameter VAP und VSL als in der vorliegenden Arbeit. Lediglich beim Parameter
VCL wurden ähnliche Werte ermittelt.
Insgesamt schienen die mittels CASA bestimmten Untersuchungsergebnisse der
Nativejakulate bezüglich der Gesamtmotilität und der Vorwärtsbeweglichkeit zwar
unter den in der Literatur beschriebenen Durchschnittswerten zu liegen, was
jedoch für die vorliegenden Untersuchungen nicht weiter von Bedeutung war, da
sie lediglich als Ausgangswerte hinsichtlich der zeitbedingten Veränderungen der
verschiedenen Parameter dienten.
5.3.2 Ergebnisse der weiterverarbeiteten Ejakulate unmittelbar nach dem
Verdünnen an Tag 0
Während unmittelbar nach dem Verdünnen in den weiterverarbeiteten Ejakulaten
im Vergleich zum Nativsperma bezüglich der Motilität (subjektiv geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit, CASA-Gesamtmotilität, CASA-Vorwärtsbeweglichkeit) und
der Viabilität nur wenige signifikante Veränderungen nachgewiesen werden
konnten, gab es bei Betrachtung der verschiedenen CASA-Motilitätsparameter,
der Pathomorphologie, der akrosomalen Veränderungen und der mittels HOS-Test
bestimmten Plasmamembranintegrität einige signifikante Unterschiede zwischen
den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten und dem
Nativsperma. Insgesamt waren die Effekte der Verdünner an Tag 0 jedoch als
gering
zu
beurteilen.
untereinander
konnten
Auch
mit
zwischen
Ausnahme
den
verschiedenen
der
Verdünnern
verschiedenen
CASA-
Motilitätsparameter kaum signifikante Unterschiede nachgewiesen werden. Daher
konnte an Tag 0 keiner der getesteten Verdünner statistisch abgesichert als bester
Verdünner identifiziert werden. Es waren lediglich tendenzielle Aussagen möglich,
nach welchen sich unmittelbar nach dem Verdünnen der Verdünner Up 1 als der
am besten geeignetste Verdünner unter den geprüften Verdünnern und der
Verdünner Up 1 + 2 als der am schlechtesten geeignetste Verdünner darstellten.
Bezüglich der CASA-Motilitätsparameter erwiesen sich hingegen die Verdünner
CP und TE an Tag 0 als signifikant überlegen.
5.3.2.1
Dichten
Die Spermienkonzentrationen (Dichten) der mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulate entsprachen nur teilweise dem angestrebten Wert von
100.000 Spermien pro µl bzw. 100 x 106 Spermien pro ml. In den mit CP, TE und
179
Diskussion
Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten lagen die durchschnittlichen Dichten sowohl bei
manueller Bestimmung mit der Neubauer-Zählkammer als auch bei Bestimmung
mittels CASA unter dem angestrebten Wert. In den mit Up 1 aufgearbeiteten
Ejakulaten konnten dagegen mit beiden Methoden höhere Werte für die mittleren
Dichten ermittelt werden. Letzteres ließ sich durch die in Versuchsteil II erfolgte
Änderung im Versuchsaufbau erklären, wonach nur noch Verdünner 1 des
Uppsala Equex-2 Systems zum Einsatz kam und daher die Ejakulate
grundsätzlich nur noch im Verhältnis 1 : 2 verdünnt wurden (siehe Kap. 5.2.4.2).
Grund für die Abweichungen der Dichten der mit CP, TE und Up 1 + 2
aufgearbeiteten Ejakulate vom angestrebten Wert war möglicherweise ein zu
hohes Verdünnungsverhältnis bei der Herstellung der flüssigkonservierten
Ejakulate aufgrund einer Überschätzung der Spermienkonzentration in den
Nativejakulaten bei der manuellen Dichtebestimmung. Als andere denkbare
Ursache könnte eine Sedimentation der Spermien in den Nativejakulaten vor
Entnahme der entsprechenden Aliquote zur Herstellung der flüssigkonservierten
Ejakulate in Frage kommen. Dagegen spricht allerdings, dass das Gefäß mit dem
Sperma vor Entnahme der zu verdünnenden Aliquote stets mehrmals geschwenkt
wurde, um eben eine solche Sedimentation der Samenzellen auszuschließen.
Weiterhin könnte auch eine Sedimentation der Spermien in den verdünnten
Ejakulaten vor der Entnahme des Spermas zur Dichtebestimmung und somit eine
fehlerhafte
Unterschätzung
der
Spermienkonzentration
ursächlich
für
die
geringeren Dichten sein. Auch hiergegen spricht jedoch das mehrmalige
Schwenken der Gefäße vor der Entnahme des Spermas. Letztlich blieb der Grund
für die abweichenden Werte ungeklärt, was für die vorliegenden Untersuchungen
auch nicht weiter von Bedeutung war. Aufgrund dieser Beobachtungen sollte aber
in der Praxis bei der Herstellung von flüssigkonserviertem Sperma, welches zur
Verwendung bei mehreren Hündinnen aliquotiert werden soll, verstärkt auf die
korrekte Verdünnung der Ejakulate geachtet werden, da die daraus resultierende
Spermiendichte und somit auch die SGZ in den flüssigkonservierten Ejakulaten
von
entscheidender
Bedeutung
für
die
Kalkulation
der
benötigten
Besamungsdosis bei Verwendung zur KB ist.
5.3.2.2
Motilität
Unmittelbar nach Zugabe der verschiedenen Verdünner zu den Nativejakulaten
konnte bezüglich der subjektiv geschätzten Vorwärtsbeweglichkeit in allen
180
Diskussion
verdünnten Ejakulaten eine tendenzielle Motilitätsreduktion beobachtet werden,
welche jedoch nur bei den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten als signifikant zu
beurteilen war (p < 0,05). Zwischen den verschiedenen Verdünnern untereinander
gab es keine signifikanten Unterschiede bezüglich der subjektiv geschätzten
Vorwärtsbeweglichkeit.
Bei Betrachtung der CASA-Gesamtmotilität ließ sich nur in den mit CP und
Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten eine tendenzielle Abnahme beobachten, während
der durchschnittliche Wert in den mit TE verdünnten Ejakulaten nahezu konstant
blieb und in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten im Vergleich mit dem
Nativsperma sogar anstieg. Bezüglich der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit konnte in
den mit CP, TE und Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten eine Reduktion der Motilität
gesehen werden und in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten wiederum eine
Zunahme. Verglichen mit den Nativejakulaten erwies sich keine der genannten
Veränderungen als signifikant. Jedoch ließen sich hinsichtlich der CASAGesamtmotilität und der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit signifikante Unterschiede
zwischen den Verdünnern CP und Up 1 ermitteln (jeweils mit p < 0,05), wobei in
Up 1 durchschnittlich höhere Motilitätswerte ermittelt werden konnten.
Im Gegensatz zur CASA-Gesamtmotilität und zur CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
konnten unmittelbar nach Zugabe der verschiedenen Verdünner zu den
Nativejakulaten einheitlich in allen verdünnten Ejakulaten signifikante Abnahmen
der durchschnittlichen Werte für die Geschwindigkeitsparameter VAP, VCL und
VSL nachgewiesen werden (jeweils mit p < 0,05 bzw. p < 0,01). Dabei waren die
Reduktionen für alle genannten Parameter in den mit CP verdünnten Ejakulaten
am geringsten und in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten am stärksten
ausgeprägt. Die mit CP aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich bezüglich
der Geschwindigkeitsparameter an Tag 0 nicht signifikant von den mit TE
aufgearbeiteten Ejakulaten. Hingegen waren die in den mit CP und TE verdünnten
Proben ermittelten Werte für VAP signifikant höher als die in den mit Up 1 + 2 und
Up 1 verdünnten Proben, für VCL signifikant höher als in den mit Up 1 + 2
verdünnten Proben und für VSL signifikant höher als in den mit Up 1 verdünnten
Proben (jeweils mit p < 0,01). Auch bei Betrachtung des Parameters ALH konnte in
allen verdünnten Ejakulaten unmittelbar nach dem Verdünnen eine tendenzielle
Reduktion der Mittelwerte im Vergleich mit dem Nativsperma gesehen werden;
allerdings erwies sich diese nur in den mit CP (p < 0,05) und Up 1 + 2 (p < 0,01)
verdünnten Ejakulaten als signifikant. Ungeachtet dessen konnten in den mit CP
181
Diskussion
und TE aufgearbeiteten Ejakulaten auch für ALH signifikant höhere Werte
nachgewiesen werden als in den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten (jeweils
mit p < 0,01). Bezüglich des Parameters BCF konnte erneut in allen verdünnten
Ejakulaten eine tendenzielle Reduktion der Mittelwerte unmittelbar nach der
Verdünnung beobachtet werden, welche in den mit CP, TE und Up 1
aufgearbeiteten Ejakulaten als signifikant zu beurteilen war (jeweils mit p < 0,01).
Die mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate untereinander
zeigten für BCF jedoch keine signifikanten Unterschiede.
Die Motilitätsreduktion nach Zugabe der verschiedenen Verdünner zu den
Nativejakulaten
ist zwar
übereinstimmend
mit den
Ergebnissen anderer
Veröffentlichungen (Province et al., 1984; Oettlé, 1986; Rota et al., 1995; Yildiz et
al., 2000; Beccaglia et al., 2009a; Varela Junior et al., 2009), allerdings kommt es
nach Meinung anderer Autoren durch die Verdünnung der Ejakulate zu keiner
Beeinflussung der Motilität (Rota et al., 1997; Sirivaidyapong et al., 2001).
Nach Oettlé (1986) nimmt die Motilität durch die Verdünnung mit einem TRISZitrat-Eigelb-Verdünner bereits um etwa 4 % ab und durch die anschließende
Kühlung nochmals um ca. 12 %. Die Reduktion der Motilität verläuft also
progressiv, wobei, relativ gesehen, nach der Kühlung mehr Schäden auftreten als
nach der Verdünnung (Oettlé, 1986). Gleiche Beobachtungen konnten von Yildiz
et al. (2000) gemacht werden. Hier kam es durch die Zugabe eines
glycerolhaltigen TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünners zum Nativsperma zu einer
geringen Reduktion der Motilität, welche sich durch die nachfolgende Kühlung
deutlich verstärkte. Im Gegensatz dazu konnten Schäfer-Somi et al. (2006)
feststellen, dass es durch die Verdünnung mit glycerolhaltigen TRIS-FruktoseEigelb-Verdünnern mit oder ohne Equex STM Paste zu keiner Beeinflussung der
geschätzten Motilität kam. Andererseits konnte in derselben Untersuchung ein
signifikanter Abfall der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit nach Verdünnung mit den
gleichen Verdünnern nachgewiesen werden (Schäfer-Somi et al., 2006). Nach
Rota et al. (1997) haben weder die Verdünnung mit einem glycerolhaltigen TRISGlukose-Eigelb-Verdünner mit oder ohne Equex noch die Äquilibrierung bei 4°C
einen Einfluss auf die subjektiv geschätzte Motilität und auch nach Sirivaidyapong
et al. (2001) beeinflussen die Zugabe eines TRIS-Eigelb-Verdünners und die
anschließende Kühlung auf 4°C die Motilität der Samenzellen nicht.
182
Diskussion
Sowohl für die subjektiv bestimmte Vorwärtsbeweglichkeit als auch für die CASAGesamtmotilität und die CASA-Vorwärtsbeweglichkeit konnten die stärksten
Abnahmen der durchschnittlichen Motilitätswerte in den mit Up 1 + 2 verdünnten
Ejakulaten beobachtet werden; jedoch waren die Abnahmen nicht signifikant, was
den Beobachtungen von Koderle et al. (2009) entspricht. Im Gegensatz dazu kam
es jedoch in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten zu einer signifikanten Reduktion
der
subjektiv
geschätzten
Vorwärtsbeweglichkeit
im
Vergleich
mit
dem
Nativsperma.
Die in allen verdünnten Ejakulaten unmittelbar nach dem Verdünnen beobachteten
signifikanten Abnahmen der Mittelwerte für die Geschwindigkeitsparameter VAP,
VCL und VSL sowie für den Parameter ALH waren ebenfalls in den mit Up 1 + 2
verdünnten Ejakulaten am stärksten ausgeprägt. Zudem konnten in den mit
Up 1 + 2 verdünnten Proben signifikant niedrigere Werte für VAP, VCL und ALH
gemessen werden als in den mit CP und TE verdünnten Proben.
Eine mögliche Erklärung für die (tendenziell) stärkeren Motilitätsabnahmen im
Verdünner Up 1 + 2 im Vergleich zu den anderen Verdünnern ist, dass die mit
Up 1 + 2 verdünnten Proben vor der Beurteilung der Motilität im Rahmen der
Äquilibrierungsphase bereits auf 4°C abgekühlt worden waren, was zu
Kühlschäden, verursacht durch den sog. „Kälteschock“ (Hoffmann, 2003d), geführt
haben könnte, welche sich zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits in einer
Motilitätsreduktion widerspiegelten. Dies ist übereinstimmend mit Weitze und
Petrunkina (2007), welche die Verminderung der Motilität als einen wichtigen
Effekt des Kälteschocks ansehen, und mit Oettlé (1986), nach dem durch die
Kühlung relativ mehr Schäden an den Samenzellen auftreten als durch die
Verdünnung.
Weiterhin kommt auch das im Verdünner Up 1 + 2 enthaltene Glycerol (5 %) als
Ursache für den stärkeren Motilitätsabfall in Frage, da bekannt ist, dass Glycerol
einen depressiven Effekt auf die Motilität von flüssigkonservierten Samenzellen
ausübt (Günzel-Apel et al., 1993) und es daher üblicherweise nicht zur
Flüssigkonservierung von Hundesperma verwendet wird (Province et al., 1984).
Ein weiterer Inhaltstoff, der den Verdünner Up 1 + 2 von den anderen Verdünnern
unterschied, war das Equex. In der Literatur konnten jedoch keine Berichte über
einen möglichen durch Equex verursachten unmittelbaren Motilitätsabfall von
flüssigkonserviertem Sperma gefunden werden. Im Gegensatz zum hier
beobachteten Motilitätsabfall der mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulate unmittelbar
183
Diskussion
nach dem Verdünnen, konnten Niżański et al. (2009) sogar eine initiale
Aktivierung der Motilität durch den Zusatz von Equex zum Verdünner beobachten,
was in der vorliegenden Arbeit folglich nicht bestätigt werden konnte.
Ein unmittelbarer nachteiliger Effekt der Zentrifugation auf die Motilität konnte
ausgeschlossen werden, da sowohl die mit Up 1 + 2 als auch die nur mit Up 1
verdünnten Ejakulate vor der Aufarbeitung zentrifugiert wurden und somit auch die
Motilitätswerte der mit Up 1 verdünnten Ejakulate betroffen sein müssten. Daher
können die Aussagen von Günzel (1986) und Rijsselaere et al. (2002a), dass die
Zentrifugation weder auf die Gesamtmotilität noch auf die Vorwärtsbeweglichkeit
einen nachteiligen Einfluss besitzt, bestätigt werden. Auch Koderle et al. (2009)
konnten bei mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten keine signifikanten Unterschiede
bezüglich der Motilität zwischen zentrifugierten und nicht zentrifugierten Proben
finden, was ebenso gegen einen unmittelbaren Effekt durch die Zentrifugation
spricht. Bei Schäfer-Somi et al. (2006) kam es durch die Zentrifugation zwar zu
keiner Beeinflussung der geschätzten Motilität, jedoch war der ohnehin
beobachtete
signifikante
Abfall
der
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
nach
Verdünnung noch stärker ausgeprägt, wenn die Ejakulate vor der Verdünnung
zentrifugiert worden waren, was in den vorliegenden Untersuchungen, zumindest
an Tag 0, jedoch nicht nachgewiesen werden konnte.
Nach Rota et al. (1995) ist Seminalplasma für die Konservierung von caninem
Sperma bei 4°C ungeeignet. Durch die vorliegenden Ergebnisse ließ sich jedoch
kein unmittelbarer nachteiliger Effekt von Seminalplasma auf die Motilität von
flüssigkonservierten
Samenzellen
nachweisen,
da
die
flüssigkonservierten
Ejakulate, welche nicht zentrifugiert wurden (CP, TE), teils sogar bessere
Motilitätswerte
zeigten
als
die
zuvor
zentrifugierten
Ejakulate.
Dies
ist
übereinstimmend mit Sirivaidyapong et al. (2001), nach denen Prostatasekret
zwar die Qualität von kryokonserviertem Sperma negativ beeinflusst, nicht jedoch
die Motilität von flüssigkonserviertem Sperma.
Der im Verdünner Up 1 unmittelbar nach dem Verdünnen erkennbare Anstieg der
Motilität war nicht zu erwarten und konnte nur mittels CASA (Gesamtmotilität und
Vorwärtsbeweglichkeit), nicht aber durch die subjektive Schätzung nachgewiesen
werden. Dies könnte möglicherweise dadurch bedingt sein, dass die CASAMessungen genauer waren, da CASA-Systeme selbst feine Veränderungen in der
Spermienbewegung erkennen können (Ellington et al., 1993; Amann und Katz,
2004), welche für den menschlichen Untersucher nicht sichtbar sind. Dagegen
184
Diskussion
spricht allerdings, dass bezüglich der CASA-Motilitätsparameter VAP, VCL, VSL,
ALH und BCF in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten keine Zunahmen beobachtet
werden konnten. Zudem waren solch initiale Zunahmen der Vorwärtsbeweglichkeit
auch bei Günzel (1986) und Tsutsui et al. (2003b) zu finden, welche ohne CASA
arbeiteten. Weiterhin konnte auch bei Schäfer-Somi und Aurich (2007) verglichen
mit der geschätzten Motilität der Nativejakulate eine signifikante Zunahme der
CASA-Gesamtmotilität durch Zugabe von TRIS-Fruktose-Puffer gesehen werden.
Ebenso ließ sich bei Niżański et al. (2009) eine initiale Zunahme fast aller durch
CASA bestimmten Motilitätsparameter unmittelbar nach dem Verdünnen mit
einem TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünner finden. Zur Ursache für diese initialen
Motilitätssteigerungen wurden jedoch keine Angaben gemacht. Ein denkbarer
Erklärungsansatz ist, dass es bedingt durch die Substratzufuhr über den
Verdünner zu einer Stoffwechselsteigerung der Spermien (Schäfer et al., 1997)
und somit auch zu einer Steigerung der Motilität kam. Auch nach Weitze und
Petrunkina (2007) reagieren Säugersamenzellen nach Verdünnung mit einer
gesteigerten Aktivität. Dagegen spricht allerdings, dass in den anderen
Verdünnern eine solche Motilitätszunahme nicht zu beobachten war, obwohl auch
hier Energiesubstrate enthalten waren.
Obwohl Glycerol üblicherweise nicht zur Flüssigkonservierung von Hundesperma
eingesetzt wird (Province et al., 1984), schien das im Verdünner Up 1 enthaltene
Glycerol
(3 %)
nachteiligen
in
Effekt
der
auf
vorliegenden
die
Untersuchung
Motilität
keinen
unmittelbaren
(CASA-Gesamtmotilität,
CASA-
Vorwärtsbeweglichkeit) auszuüben. Dies bestätigt die Aussage von Province et al.
(1984), dass der Zusatz von 3 % Glycerol keine Auswirkungen auf die Motilität
besitzt. Im Gegenteil kam es im Verdünner Up 1 zu einer initialen Steigerung der
CASA-Gesamtmotilität und der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit. Betrachtet man
allerdings die subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit sowie die CASAMotilitätsparameter VAP, VCL, VSL und BCF, so kam es im Verdünner Up 1 zu
einer signifikanten Motilitätsreduktion gegenüber dem Nativsperma, wodurch die
von Province et al. (1984) getroffene Aussage nicht mehr bestätigt werden kann.
Ob jedoch das Glycerol ursächlich für die Motilitätsreduktion war, bleibt offen,
zumal die subjektiv und die mittels CASA bestimmten Werte z. T. konträre
Ergebnisse lieferten.
185
Diskussion
5.3.2.3
Viabilität
Unmittelbar nach der Aufarbeitung mit den verschiedenen Verdünnern zeigten
weder die im Eosinausstrich bestimmte Viabilität noch die mittels CASA nach
SYBR-14/PI-Färbung
gemessene
Viabilität
signifikante
Veränderungen
im
Vergleich zum Nativsperma und auch zwischen den verschiedenen Verdünnern
untereinander
konnten
bezüglich
beider
Parameter
keine
signifikanten
Unterschiede ermittelt werden. Die im Eosinausstrich bestimmten Werte blieben in
den Verdünnern CP, TE und Up 1 + 2 relativ konstant, während sich im Verdünner
Up 1 tendenziell sogar durchschnittlich mehr lebende Samenzellen nachweisen
ließen als in den Nativejakulaten. Bei Bestimmung der Viabilität mittels CASA
zeigte sich im Verdünner Up 1 + 2 unmittelbar nach dem Verdünnen eine
tendenzielle Reduktion und in den Verdünnern CP, TE und Up 1 tendenzielle
Zunahmen gegenüber dem Nativsperma.
Diese Ergebnisse bestätigen die Aussagen von Burgess et al. (2001), nach denen
die Zugabe des Verdünners (glycerolhaltiger TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner)
und die Kühlung keine signifikanten unmittelbaren Effekte auf den nach NigrosinEosin-Färbung ermittelten Prozentsatz an lebenden Samenzellen ausüben. Auch
die Inkubation von verdünntem Sperma bei 39°C verursachte keine signifikanten
Veränderungen der Anzahl an lebenden Spermien, was bedeutet, dass die
Zugabe des Verdünners ebenso keinen verzögerten Effekt auf die Viabilität
bewirkt. Lediglich die Inkubation nach Kühlung resultierte in einer signifikanten
Abnahme des Prozentsatzes an lebenden Spermien, wodurch von einem
verzögerten Effekt der Kühlung auf die Viabilität ausgegangen werden kann
(Burgess et al., 2001). Auch nach Sirivaidyapong et al. (2001) beeinflussen die
Zugabe von TRIS-Eigelb-Verdünner und die Kühlung auf 4°C die Viabilität der
Samenzellen nicht.
Nach Koderle et al. (2009) verursachte die Zugabe von Up 1 + 2 keinen
signifikanten Abfall der Viabilität der Samenzellen vor dem Einfrieren. Auch dies
konnte in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden.
Zum einen scheint Prostatasekret die Viabilität von flüssigkonserviertem Sperma
zwar nicht zu beeinflussen (Sirivaidyapong et al., 2001), zum anderen übt jedoch
auch die Zentrifugation keinen negativen Einfluss auf die Viabilität der
Samenzellen aus (Koderle et al., 2009). Dadurch, dass in der vorliegenden Arbeit
keine signifikanten Unterschiede zwischen den zentrifugierten und den nicht
186
Diskussion
zentrifugierten flüssigkonservierten Ejakulaten nachgewiesen werden konnten,
können für die Ergebnisse an Tag 0 auch diese Aussagen bekräftigt werden.
Das Phänomen, dass sich in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten im
Eosinausstrich tendenziell mehr lebende Samenzellen nachweisen ließen als in
den Nativejakulaten, konnte in ähnlicher Weise auch bei Burgess et al. (2001)
gefunden werden. Hier enthielten die verdünnten Proben nach Nigrosin-EosinFärbung ebenfalls immer einen leicht höheren Anteil an lebenden Spermien als
die Nativejakulate. Nach Ansicht der Autoren ist dies vermutlich auf eine durch
Verdünnerbestandteile (insbesondere Eigelb) verursachte Agglutination der
Spermien in den mit Nigrosin-Eosin gefärbten Ausstrichen zurückzuführen, da
agglutinierte Spermien von der Beurteilung ausgeschlossen wurden, weil die
einzelnen Spermienköpfe schwierig zu erkennen waren. Zudem neigen gerade
unbewegliche und tote Samenzellen eher zu Agglutinationen (Campbell et al.,
1956), was letztlich in einer Unterschätzung ihrer Anzahl resultierte (Burgess et
al., 2001). Diese Theorie könnte auch die in der vorliegenden Arbeit ermittelten
Ergebnisse erklären. Weiterhin lässt sie sich auch auf die tendenziellen Zunahmen
der mittels CASA nach SYBR-14/PI-Färbung gemessenen Viabilität in den
Verdünnern CP, TE und Up 1 anwenden, da das SpermVision™-System
agglutinierte Spermien ebenfalls automatisch von der Beurteilung ausschließt.
5.3.2.4
Pathomorphologie
Der Gesamtanteil an morphologisch veränderten Samenzellen in den mit den
verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten zeigte unmittelbar nach
dem Verdünnen in den Verdünnern CP und TE signifikante Unterschiede zum
Nativsperma, wobei der Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen in den
mit CP und TE verdünnten Ejakulaten niedriger war als im Nativsperma.
Tendenziell
war
in
allen
verdünnten
Ejakulaten
eine
Verringerung
des
Gesamtanteils an morphologisch veränderten Spermien im Vergleich mit dem
Nativsperma
zu
beobachten.
Zwischen
den
verschiedenen
Verdünnern
untereinander konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden.
Die beobachteten Abnahmen des Gesamtanteils an morphologisch veränderten
Samenzellen in den verdünnten Ejakulaten unmittelbar nach dem Verdünnen
waren nicht nachvollziehbar. Gegen eine zufallsbedingte Beobachtung spricht die
Tatsache, dass es in allen verdünnten Ejakulaten unabhängig vom Verdünner zu
einer Verringerung des durchschnittlichen Anteils an morphologisch veränderten
187
Diskussion
Spermien kam. Möglicherweise können diese Abnahmen ebenfalls durch eine
Agglutination der Spermien im Eosinausstrich erklärt werden (Burgess et al.,
2001), da auch hier agglutinierte Spermien nicht zur Beurteilung herangezogen
wurden. Eine andere Ursache könnte die Sedimentation von morphologisch
veränderten Spermienformen in den verdünnten Proben vor der Entnahme des
Spermas zur Anfertigung der Eosinausstriche und somit eine fehlerhafte
Unterschätzung der morphologisch veränderten Samenzellen sein. Dagegen
spricht jedoch das mehrmalige Schwenken der Gefäße vor der Entnahme des
Spermas. Weiterhin ist denkbar, dass die Abnahme an morphologisch veränderten
Samenzellen in den verdünnten Ejakulaten durch die Milieuverbesserung aufgrund
der Verdünnerzugabe verursacht wurde. Hierfür kommt insbesondere eine
Abnahme der Geißelveränderungen in Frage.
Bei
getrennter
Betrachtung
der
einzelnen
auftretenden
morphologischen
Veränderungen waren die Anteile der entsprechenden Veränderungen in den
verdünnten Ejakulaten an Tag 0 (mit Ausnahme des Anteils an schleifenförmigen
Schwänzen in den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten) ebenfalls stets
geringer als in den Nativejakulaten, was übereinstimmend mit den Beobachtungen
für den Gesamtanteil an morphologisch veränderten Samenzellen war (siehe
oben).
Die in den mit CP, TE und Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten ermittelte
signifikante Verringerung des Anteils an Samenzellen mit Plasmatropfen im
Vergleich mit dem Nativsperma fiel jedoch in ähnlicher Weise bereits während der
Untersuchungen
aller
verdünnten
Ejakulate
auf:
Während
bei
der
Motilitätsbeurteilung unter dem Phasenkontrastmikroskop in den entsprechenden
Nativejakulaten noch (viele) Spermien mit Plasmatropfen zu erkennen waren,
ließen sich später im Eosinausstrich des Nativspermas sowie im Eosinausstrich
des verdünnten Spermas wesentlich weniger Samenzellen mit Plasmatropfen
nachweisen. Dies könnte darauf hindeuten, dass es durch das Ausstreichen
und/oder die Färbung der Spermien möglicherweise zu einer Ablösung der
Plasmatropfen kommen kann und somit der Anteil an Spermien mit Plasmatropfen
fälschlicherweise unterschätzt wird. Ähnliche Beobachtungen konnten auch von
Root Kustritz et al. (1998) gemacht werden. Nach deren Meinung können
offensichtlich erkennbare Abnahmen bestimmter morphologischer Veränderungen
entweder durch eine Maskierung oder durch eine Entfernung des Defektes durch
188
Diskussion
die entsprechende Technik verursacht werden. Jedoch können offensichtlich
erkennbare Zunahmen bestimmter Veränderungen auch entweder durch eine
Betonung oder durch eine Erzeugung des Defektes durch die entsprechende
Methode bedingt sein (Root Kustritz et al., 1998).
Die in den mit CP, TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten im Vergleich zum
Nativsperma
beobachtete
Zunahme
des
Anteils
an
Samenzellen
mit
schleifenförmigem Schwanz könnte einerseits eventuell ein Hinweis darauf sein,
dass es durch die Verdünnerzugabe bevorzugt zu eben diesen Veränderungen an
den Samenzellen kommt, andererseits jedoch auch eine zufällige Beobachtung
sein. Möglicherweise verursacht die Zugabe des Verdünners eine Zunahme des
Anteils an Samenzellen mit schleifenförmigem Schwanz, indem sie ähnliche
Reaktionen der Samenzellen auslöst, wie sie auch beim HOS-Test gesehen
werden können. Dies würde bedeuten, dass die entsprechenden Verdünner nicht
isoton zum Seminalplasma waren. Da die Osmolarität der Verdünner in der
vorliegenden Arbeit jedoch nicht bestimmt wurde, bleibt Letzteres ungeklärt. Für
eine zufällige Beobachtung spricht die Tatsache, dass es in den mit Up 1 + 2
aufgearbeiteten Ejakulaten nicht zu einem Anstieg des Anteils an Samenzellen mit
schleifenförmigem Schwanz kam. Zudem spiegelte sich die Zunahme des Anteils
an schleifenförmigen Schwänzen auch im Gesamtanteil an morphologisch
veränderten Samenzellen nicht wider, weshalb von einer untergeordneten
Bedeutung auszugehen ist.
Auf Basis des Gesamtanteils an morphologisch veränderten Samenzellen kann in
jedem Fall bestätigt werden, dass die Zugabe eines Verdünners keine
signifikanten ultrastrukturellen Veränderungen der Samenzellen verursacht
(Burgess et al., 2001). Eine mögliche Beeinflussung der Spermienmorphologie
durch die Zentrifugation (WHO, 2010) konnte in der vorliegenden Arbeit nicht
nachgewiesen werden, da sich der Anteil an morphologisch veränderten
Samenzellen
in
zentrifugierten
Proben
nicht
signifikant
von
dem
in
unzentrifugierten Proben unterschied.
5.3.2.5
Vor
Akrosomale Veränderungen
der
Gamenteninteraktion
müssen
die
Samenzellen
im
weiblichen
Reproduktionstrakt die Kapazitation, welche hyperaktive Motilität und die AR
einschließt, durchlaufen (De los Reyes et al., 2009). Das Akrosom ist ein
sekretorisches Vesikel, das etwa zwei Drittel der nukleären Oberfläche bedeckt
189
Diskussion
und zahlreiche Enzyme enthält, die dazu dienen, der Samenzelle die Penetration
der ZP der Eizelle zu ermöglichen. Die Sekretion dieser Enzyme aus dem
Akrosom wird als AR bezeichnet. Die AR findet nur an der Oberfläche der ZP statt.
So erlangen die Spermien die Fähigkeit, diese Barriere zu durchdringen. Während
der AR werden inaktive Enzymformen wie Proakrosin zur aktiven Form
umgewandelt. Daher ist der Anteil an Spermien, denen Proakrosin bzw. Akrosin
fehlt und/oder das Ausmaß der Proakrosinaktivierung ein akkurater Indikator für
die AR. Eine prämature AR kann die Befruchtungsrate vermindern (Cortes et al.,
2006). Durch Zentrifugation und Verdünnung mit einem TRIS-Eigelb-Verdünner
werden
weder
der
durchschnittliche
Gehalt
an
Proakrosin
noch
die
durchschnittliche Akrosinaktivität verändert. Kühlung des verdünnten Spermas
führt hingegen zu einer signifikanten Reduktion des Gehaltes an Proakrosin,
jedoch ohne signifikante Verminderung der Akrosinaktivität. Deshalb wird
vermutet, dass die Kühlung die Autoaktivierung eines Teils des Proakrosins
induziert, das so gebildete Akrosin aber im Akrosom verbleibt (Froman et al.,
1984). Nach Sirivaidyapong et al. (2000) hat auch die Zusammensetzung des
Verdünnungsmediums und insbesondere dessen Ca2+-Konzentration einen
deutlichen Einfluss auf die AR caniner Spermien; hohe Ca2+-Konzentrationen
fördern die AR, während niedrige sie verzögern. Das in vielen Verdünnern
enthaltene Eigelb verhindert einen signifikanten Anstieg kapazitierter Samenzellen
während der Flüssigkonservierung (Witte et al., 2009) und schützt die Spermien
somit gegen spontane AR (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b).
Die Beurteilung des akrosomalen Status der Samenzellen erfolgte in der
vorliegenden Arbeit nach Spermac®-Färbung. Diese erwies sich nach Oettlé
(1986) als vorteilhaft, um Veränderungen am Akrosom zu erfassen, welche
während des Verarbeitungsprozesses bei der Konservierung von caninem Sperma
auftreten können. Tendenziell war in den mit CP, TE und Up 1 + 2 verdünnten
Ejakulaten eine Zunahme des Anteils an Kopfkappenveränderungen sowie des
Anteils an abgelösten Akrosomen zu erkennen, während in den mit Up 1
verdünnten Ejakulaten beide Anteile nahezu konstant blieben. Signifikante
Unterschiede der einzelnen Verdünner zum Nativsperma ließen sich nur für die
Verdünner CP und TE bezüglich des Anteils an Kopfkappenveränderungen
nachweisen (jeweils mit p < 0,05). Zwischen den verschiedenen Verdünnern
untereinander konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden.
190
Diskussion
Tendenzielle Zunahmen des Anteils an akrosomalen Veränderungen durch die
Verdünnerzugabe konnten auch von Rota et al. (1995) nachgewiesen werden.
Nach Burgess et al. (2001) verursacht die Zugabe eines glycerolhaltigen TRISFruktose-Eigelb-Verdünners
jedoch
keine
signifikanten
unmittelbaren
oder
verzögerten ultrastrukturellen Veränderungen der Samenzellen, wohingegen die
anschließende Kühlung in einem unmittelbaren Anstieg der Anzahl an
transmissionselektronenmikroskopisch erkennbaren akrosomalen Veränderungen
resultiert. Weitere Inkubation des zuvor gekühlten Spermas bei 39°C führt nur zu
einem leichten Anstieg der akrosomalen Veränderungen (Burgess et al., 2001),
was gegen einen verzögerten Effekt der Kühlung auf die akrosomale Integrität
spricht. Nach Sirivaidyapong et al. (2001) wird die akrosomale Integrität weder
durch die Verdünnung mit einem TRIS-Eigelb-Verdünner noch durch die Kühlung
auf 4°C beeinflusst und auch Prostatasekret hat keine negativen Effekte auf das
Akrosom. Dies steht im Gegensatz zu den Aussagen von Oettlé (1986), nach
denen akrosomale Schäden während der Verdünnung und der Kühlung auftreten.
So kommt es bereits durch die Verdünnung mit einem TRIS-Zitrat-EigelbVerdünner zu einer Reduktion des Anteils an Samenzellen mit normalem Akrosom
um ca. 11 % und durch die Kühlung auf 5°C nochmals zu einer Verminderung um
etwa 17 %. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass ein signifikanter Anteil der
akrosomalen Schäden in gleichem Maße durch die Verdünnung und die Kühlung
verursacht wird und nicht erst durch das Einfrieren (Oettlé, 1986).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen zum einen die Aussage, dass
es bereits durch die Verdünnung zu einer Zunahme des Anteils an akrosomalen
Veränderungen kommt (Oettlé, 1986), wobei allerdings eine statistische
Signifikanz nur für die Verdünner CP und TE nachgewiesen werden konnte. Auf
der anderen Seite kann auch die Aussage von Burgess et al. (2001) bestätigt
werden, da der Anteil an akrosomalen Veränderungen durch die Verdünnung mit
Up 1 nahezu unverändert blieb. Der tendenziell stärkste Anstieg an akrosomalen
Veränderungen wurde im Verdünner Up 1 + 2 nachgewiesen, auch wenn dieser
sich als nicht signifikant erwies. Möglicherweise könnte dies durch die bereits
erfolgte Kühlung auf 4°C bedingt sein, wodurch die in der Literatur gefundenen
Aussagen von Burgess et al. (2001) und Oettlé (1986) bezüglich des Einflusses
der Kühlung auf die akrosomale Integrität untermauert werden könnten.
Dass
die
Zentrifugation
keinen
nachteiligen
Effekt
auf
den
Anteil
an
akrosomintakten Samenzellen hat (Günzel, 1986), konnte durch die vorliegenden
191
Diskussion
Ergebnisse bestätigt werden, da der Anteil an akrosomalen Veränderungen in den
zentrifugierten Proben im Vergleich zum Nativsperma nicht signifikant anstieg und
auch
zwischen
zentrifugierten
und
nicht
zentrifugierten
Ejakulaten
kein
signifikanter Unterschied nachgewiesen werden konnte. Allerdings kann ebenso
ein negativer Einfluss von Prostatasekret auf die akrosomale Integrität nicht
ausgeschlossen werden, da gerade die nicht zentrifugierten und somit
Prostatasekret enthaltenden Proben (CP, TE) verglichen mit dem Nativsperma
signifikante Zunahmen des Anteils an akrosomalen Veränderungen zeigten.
5.3.2.6
Funktionelle Integrität der Plasmamembran
Die Untersuchung der funktionellen Integrität der Plasmamembran erfolgte mithilfe
des HOS-Tests. Dabei kam es in allen verdünnten Ejakulaten im Vergleich zu den
Nativejakulaten zu einem signifikanten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit
nicht-intakten bzw. biochemisch nicht-aktiven Membranen (CP, TE, Up 1 + 2 mit
p < 0,01; Up 1 mit p < 0,05). Dies ist übereinstimmend mit Rota et al. (1995), bei
deren Untersuchungen es durch die Zugabe verschiedener Verdünner ebenfalls
zu einer tendenziellen Zunahme des Anteils an Samenzellen mit nicht-intakter
Plasmamembran kam, wenn auch dieser nicht als signifikant zu beurteilen war.
Der geringste Anstieg war in mit Up 1 verdünnten Ejakulaten zu beobachten, der
stärkste in mit Up 1 + 2 verdünnten Proben, jedoch konnten keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Verdünnern untereinander ermittelt werden. Diese
Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass es bereits durch die Verdünnung an
sich zu einer Beeinflussung der funktionellen Merkmale der Samenzellen kommt
und nicht erst durch die nachfolgende Kühlung. In jedem Fall wurden die
Membranen bereits durch die Verdünnung geschädigt oder inaktiviert. Allerdings
muss beachtet werden, dass die mit Up 1 + 2 verdünnten Proben, welche den
stärksten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit nicht aufgerolltem Schwanz
zeigten, zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits für eine Stunde bei 4°C gekühlt
worden waren. Dadurch lässt sich eine kühlungsbedingte Verstärkung des durch
die Verdünnung entstandenen Effektes nicht ausschließen. Des Weiteren muss
auch
die
Zusammensetzung
der
Verdünner
Berücksichtigung
finden.
Möglicherweise ist ein Zusammenhang zwischen dem in Up 1 + 2 enthaltenen
Glycerol oder dem Equex und dem stärkeren Anstieg in den entsprechenden
Proben vorhanden. Gegen Glycerol als verantwortliche Substanz spricht allerdings
die Tatsache, dass in Up 1 auch Glycerol enthalten ist und in den mit Up 1
192
Diskussion
verdünnten Proben der geringste Anstieg zu beobachten war. Jedoch ist in Up 1
die Glycerolkonzentration wesentlich geringer.
Die vorliegenden Ergebnisse widersprechen den von Kumi-Diaka und Badtram
(1994) gemachten Beobachtungen, dass die Verdünnung mit TRIS-DextroseEigelb-Verdünner und die anschließende Flüssigkonservierung bei 5°C für 24
Stunden die physikalischen und funktionellen Eigenschaften caniner Spermien
nicht signifikant beeinflussen. Bereits ohne Kühlung kam es bei den vorliegenden
Untersuchungen schon zu signifikanten Zunahmen des Anteils an Samenzellen
mit nicht-intakten Membranen. Möglicherweise waren jedoch auch methodische
Unterschiede für diese konträren Ergebnisse verantwortlich. Zum einen setzten
Kumi-Diaka und Badtram (1994) einen anderen Verdünner ein und zum anderen
besaß auch die verwendete hypoosmotische Lösung eine andere Osmolarität und
die
für
den
Test
eingesetzte
Spermamenge
sowie
die
Inkubationszeit
unterschieden sich.
Interessant wäre gewesen, den HOS-Test zu ausgewählten Zeitpunkten während
des Zeitraums der Flüssigkonservierung bei 4°C zu wiederholen, da nach KumiDiaka (1993) die Spermakonservierung die Reaktion der Samenzellen auf den
HOS-Test nachteilig beeinflusst. Während der Lagerung in ICG-Verdünner
(International
Canine
Genetics)
bei
5°C
für
72
Stunden
konnte
eine
kontinuierliche, signifikante Abnahme des Anteils an Samenzellen mit aufgerollter
Geißel im HOS-Test nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass die
Lagerung bei 5°C Schäden der Spermienmembran verursacht, welche zur Folge
haben, dass die Samenzellen ihre Fähigkeit, mit einer Aufrollung der Geißel auf
die hypoosmotische Lösung zu reagieren, verlieren (Kumi-Diaka, 1993).
Tendenzen zur Unterstützung dieser These konnten in der vorliegenden Arbeit
bereits an Tag 0 gesehen werden, da die mit Up 1 + 2 verdünnten Proben, welche
den stärksten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit nicht aufgerollter Geißel
zeigten, zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits für eine Stunde bei 4°C gekühlt
worden waren.
5.3.3 Ergebnisse der Halteproben im Zeitverlauf
Die Flüssigkonservierung caniner Ejakulate führt nicht zur Verbesserung der
Spermaqualität, sondern es wird lediglich über einen zu definierenden Zeitraum
die
Ausgangsqualität
aufrechterhalten
(Kumi-Diaka
und
Badtram,
1994).
Unumstritten ist, dass die Spermaqualität bei Flüssigkonservierung bei 4 bzw. 5°C
193
Diskussion
im Zeitverlauf stetig abnimmt (England und Ponzio, 1996; Ponglowhapan et al.,
2004; Michael et al., 2008; 2009), wie es auch in der vorliegenden Arbeit
beobachtet wurde. Parallel zur Qualitätsreduktion der flüssigkonservierten
Ejakulate kommt es zu einem Anstieg des Anteils an ROS, was vermuten lässt,
dass dies in kausalem Zusammenhang zur Verminderung der caninen
Spermaqualität steht (Michael et al., 2009).
Bei gesonderter Betrachtung der flüssigkonservierten Proben des Rüden Nr. 20,
dessen Ejakulat eine geringe Blutbeimengung aufwies, war im Vergleich zu den
übrigen Proben keine Tendenz für eine zusätzliche nachteilige Beeinflussung der
Spermaqualität durch Blut zu erkennen. Dies bekräftigt die bei Rijsselaere et al.
(2004b) gefundene Aussage, dass Blutbeimengungen ≤ 10 Vol. % keine negativen
Effekte auf die funktionellen Charakteristika von bei 4°C flüssigkonservierten
caninen Spermien ausüben. Während Rijsselaere et al. (2004b) dies für eine
Lagerungsdauer von vier Tagen nachweisen konnten, waren in der vorliegenden
Arbeit auch über zehn Tage keine Tendenzen für negative Effekte durch die
Blutbeimengung festzustellen. Es ist davon auszugehen, dass Blut im Ejakulat die
Befruchtungsfähigkeit caniner Spermien nicht beeinflusst (Linde-Forsberg, 1995).
5.3.3.1
Motilität
Obwohl die Motilität nur eine von vielen wichtigen Eigenschaften eines fertilen
Spermiums darstellt, ist sie der am häufigsten genutzte Indikator für eine normale
Spermienfunktion (Peña Martínez, 2004) und auch einer der wichtigsten
Parameter für die Beurteilung der Spermaqualität (Rigau et al., 2001). Motilität ist
ein Ausdruck für die strukturelle und funktionelle Kompetenz (Peña Martínez,
2004) sowie für die Viabilität der Samenzellen (Verstegen et al., 2002). Aufgrund
der Tatsache, dass die Motilität nicht immer gut mit der akrosomalen Integrität
korreliert, sind jedoch weitere Untersuchungsparameter zur Beurteilung der
Spermaqualität nötig (Oettlé, 1986).
Verglichen mit der Untersuchung unmittelbar nach dem Verdünnen ließ sich in den
Verdünnern CP, TE und Up 1 sowohl bei subjektiver Beurteilung als auch bei
Messung mittels CASA nach 24 Stunden ein tendenzieller Anstieg der Motilität
nachweisen. Die im Vergleich zu Tag 0 höheren Motilitätswerte konnten in den
verschiedenen Verdünnern für mindestens einen Tag (CP, TE, Up 1) und für
längstens fünf Tage (CASA-Gesamtmotilität und CASA-Motilitätsparameter DCL
194
Diskussion
und VCL im Verdünner CP, CASA-Motilitätsparameter DCL und VCL im
Verdünner TE) aufrechterhalten werden. Eine tendenzielle Motilitätssteigerung 24
Stunden nach Verdünnerzugabe über ca. zwei Tage konnte auch bei Verstegen et
al. (2005) beobachtet werden. Möglicherweise bewirkte die Substratzufuhr durch
die Verdünner eine Stoffwechselsteigerung der Spermien (Schäfer et al., 1997)
und somit eine Steigerung der Motilität. Auch nach Weitze und Petrunkina (2007)
reagieren Säugersamenzellen nach Verdünnung mit einer gesteigerten Aktivität.
Eine hohe Stoffwechselaktivität der Samenzellen während der ersten 24 Stunden
der Lagerung und somit ein erhöhter Glukoseverbrauch wird auch von Verstegen
et al. (2005) als Grund für den von ihnen beobachteten raschen initialen Abfall der
Glukosekonzentration in den flüssigkonservierten Ejakulaten angesehen. Ebenso
konnten
Ponglowhapan
et
al.
(2004)
im
ersten
Zeitabschnitt
der
Flüssigkonservierung (Tag 1 bis 3) einen signifikant höheren Zuckerverbrauch
ermitteln als in den folgenden Zeitabschnitten. Die mittleren Werte für VAP, VSL
und VCL stiegen dabei im Vergleich zum gepoolten Nativsperma in den ersten
drei Tagen nach der Verdünnung und Kühlung signifikant an, was darauf
hindeutet, dass Zuckerzusätze in Verdünnern die Spermiengeschwindigkeit
anregen (Ponglowhapan et al., 2004). Zwar konnte in der vorliegenden Arbeit
verglichen mit dem Nativsperma kein unmittelbarer Anstieg der durchschnittlichen
Spermiengeschwindigkeiten beobachtet werden, dafür jedoch nach 24 Stunden für
die Parameter VAP (im Verdünner TE) und VCL (in den Verdünnern CP, TE und
Up 1). Der durch die Stoffwechselsteigerung erhöhte Verbrauch an Sauerstoff,
Nährstoffen und Energie sowie die Anhäufung von Laktat und das Absinken des
pH-Wertes könnten dann den sich anschließenden Motilitätsabfall verursachen
(Schäfer et al., 1997). Im Verdünner Up 1 + 2 konnte trotz Substratzufuhr keine
Zunahme der Motilität beobachtet werden. Ursächlich hierfür könnte die im
Vergleich zu Up 1 höhere Glycerolkonzentration des Verdünners sein, da bekannt
ist,
dass
Glycerol
einen
depressiven
Effekt
auf
die
Motilität
von
flüssigkonservierten Samenzellen ausübt (Günzel-Apel et al., 1993).
Nach Rijsselaere et al. (2004b) induziert eine viertägige Flüssigkonservierung bei
4°C keine signifikante Reduktion der Gesamtmotilität oder der Vorwärtsbeweglichkeit und auch nach Verstegen et al. (2005) unterscheiden sich die
Gesamtmotilität und die Vorwärtsbeweglichkeit in mit TRIS-Glukose-EigelbVerdünner
flüssigkonservierten
Ejakulaten
195
während
der
ersten
zehn
Diskussion
(Gesamtmotilität) bzw. fünf Tage (Vorwärtsbeweglichkeit) der Lagerung nicht
signifikant von den initialen Motilitätswerten. Im Gegensatz dazu kam es in der
eigenen Arbeit in allen verdünnten Ejakulaten während der Flüssigkonservierung
bei 4°C über zehn Tage zu einer signifikanten Reduktion der Motilität (p < 0,0001),
was sowohl mit den Methoden der klassischen Spermatologie als auch mittels
CASA verifiziert werden konnte. Auch für die mittels CASA bestimmten
Streckenparameter DAP, DCL und DSL, für die Geschwindigkeitsparameter VAP,
VCL und VSL sowie für den Parameter ALH ließen sich im Zeitverlauf in allen
verdünnten Ejakulaten signifikante Abnahmen nachweisen. Bezüglich des
Parameters BCF konnten in allen verdünnten Ejakulaten tendenzielle Abnahmen
beobachtet werden, welche jedoch nur in den mit Up 1 + 2 und Up 1 verdünnten
Ejakulaten als signifikant zu beurteilen waren. Die Parameter LIN und WOB ließen
im Zeitverlauf in den mit CP, TE und Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten signifikante
Abnahmen erkennen. Lediglich für den Parameter STR waren über den
Untersuchungszeitraum keine signifikanten Veränderungen nachweisbar. Eine
Motilitätsabnahme war zu erwarten und wurde für Lagerungszeiträume von 2 bis
23 Tagen bereits von verschiedenen anderen Autoren gezeigt (Foote und
Leonard, 1964; Province et al., 1984; Günzel, 1986; Bouchard et al., 1990; KumiDiaka, 1993; Rota et al., 1995; England und Ponzio, 1996; Iguer-Ouada und
Verstegen, 2001b; Rijsselaere et al., 2002a; Tsutsui et al., 2003b; Ponglowhapan
et al., 2004; Niżański und Klimowicz, 2005; Verstegen et al., 2005; Hermansson
und Linde-Forsberg, 2006; Hermansson et al., 2006; Shahiduzzaman und LindeForsberg, 2007; Beccaglia et al., 2009a; Niżański et al., 2009; Michael et al., 2009;
2010; Kmenta et al., 2011). Die Verminderung der Motilität ist ein wichtiger Effekt
des Kälteschocks (Weitze und Petrunkina, 2007). Nach Ponglowhapan et al.
(2004) könnte sie durch verschiedene Subpopulationen unter den Samenzellen
mit unterschiedlich ausgeprägter Sensitivität für Umgebungsveränderungen,
insbesondere für reduzierte Temperaturen, verursacht werden.
Das
Ausmaß
der
Motilitätsreduktion
variiert
allerdings
zwischen
den
verschiedenen Literaturquellen: Während einige Autoren nach drei Tagen
Flüssigkonservierung
in
TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünnern
bereits
Motilitäts-
abnahmen auf etwa 20 % (Province et al., 1984) bzw. etwa 40-55 % (Michael et
al., 2009; 2010) der Ausgangswerte beobachten konnten, waren ähnliche
Motilitätsreduktionen bei Tsutsui et al. (2003b) und Niżański et al. (2009) erst nach
zehn Tagen in TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünnern nachweisbar. Demgegenüber
196
Diskussion
stehen Publikationen, in denen nach zehn Tagen Lagerungsdauer bei 4 bzw. 5°C
in TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünnern noch annähernd 80-90 % der Initialmotilität
festgestellt werden konnten (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b; Ponglowhapan
et al., 2004; Verstegen et al., 2005; Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007).
Während dann bei Iguer-Ouada und Verstegen (2001b) an Tag 15 schließlich nur
noch etwa 17 % und bei Verstegen et al. (2005) sogar nur noch circa 3 % der
Ausgangsmotilität nachgewiesen werden konnten, waren bei Ponglowhapan et al.
(2004) zum gleichen Zeitpunkt immer noch rund 50 % und bei Shahiduzzaman
und Linde-Forsberg (2007) sogar noch etwa 75 % der Initialmotilität zu
beobachten. Erst nach 23 Tagen Lagerungsdauer war die Gesamtmotilität auf
etwa 23 % (Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007) bzw. circa 2 %
(Ponglowhapan et al., 2004) des Ausgangswertes abgesunken.
Diese Variationen der Motilitätsraten können durch verschieden Faktoren bedingt
sein:
1)
Unterschiedliche
Ausgangsmotilität
in
den
Nativejakulaten;
2) Unterschiedliche Verdünnerzusammensetzung; 3) Unterschiede bezüglich der
Konservierungstechnik
(Kühlungsrate,
Entfernung
von
Prostatasekret,
Spermienkonzentration); 4) Unterschiedliche Methoden zur Motilitätsbeurteilung
(subjektiv oder objektiv) (Ponglowhapan et al., 2004). Zudem ist bei einigen
Publikationen
nicht
deutlich
erkennbar,
ob
eine
Anwärmung
der
flüssigkonservierten Ejakulate vor der Motilitätsbeurteilung, wie sie von LindeForsberg (1991) empfohlen wird und wie sie auch in der vorliegenden Arbeit
erfolgte, durchgeführt wurde.
In den eigenen Untersuchungen war das Ausmaß der Motilitätsreduktion (gemittelt
über die subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit, die CASA-Gesamtmotilität
und
die
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit)
je nach
Verdünner
unterschiedlich
ausgeprägt: An Tag 3 konnte in den mit CP verdünnten Ejakulaten eine Abnahme
auf durchschnittlich 96 %, in den mit TE verdünnten Ejakulaten auf durchschnittlich
94 %, in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten auf rund 60 % und in den mit Up 1
verdünnten
Ejakulaten
auf
durchschnittlich
93 %
der
Ausgangsmotilität
nachgewiesen werden. An Tag 10 betrug die Motilität in den mit CP verdünnten
Ejakulaten noch rund 77 %, in den mit TE verdünnten Ejakulaten noch
durchschnittlich 68 %, in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten noch etwa 8 %
und in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten noch durchschnittlich 24 % des
Initialwertes. Insgesamt war somit die Konservierung der Motilität an Tag 3 in den
Verdünnern CP, TE und Up 1 als gut zu bewerten. Lediglich im Verdünner Up 1 + 2
197
Diskussion
kam es, verglichen mit der Ausgangsmotilität, schon nach drei Tagen Lagerung zu
einer deutlichen Reduktion der Motilität. An Tag 10 lieferten nur noch die
Verdünner CP und TE zufriedenstellende Werte, während demgegenüber die
Konservierung der Motilität in den Verdünnern Up 1 + 2 und Up 1 wesentlich
schlechter war.
Die hinsichtlich der Motilitätskonservierung ermittelten Ergebnisse machen
deutlich, warum nach zwölf Probanden der Versuchsplan geändert und der
Verdünner Up 1 + 2 durch den Verdünner Up 1 ersetzt wurde. Der Verdünner
Up 1 + 2 lieferte nur für die ersten 24 Stunden der Flüssigkonservierung
zufriedenstellende
Konservierungsergebnisse.
Danach
kam
es
zu
einem
drastischen Motilitätsabfall, wie er in ähnlicher Weise von Niżański et al. (2009) in
einem TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünner mit 1 % Equex, jedoch ohne Glycerol,
beobachtet wurde: Nach einer initialen Aktivierung kam es nach 96 Stunden zu
einem schnellen Abfall der Motilität, was die Autoren auf den Zusatz von Equex
zurückführen. Die initiale Aktivierung der Motilität konnte in der vorliegenden
Untersuchung bei mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten zwar nicht festgestellt
werden, dafür aber der drastische Motilitätsabfall, allerdings bereits nach 48
Stunden. Möglicherweise führte insbesondere der Zusatz von Glycerol, wie in
ähnlicher Weise auch von Günzel-Apel et al. (1993) beschrieben, zum früheren
Motilitätsabfall in den eigenen Untersuchungen. Unabhängig vom Glycerol
bestätigte
sich,
dass
die
Zugabe
von
Equex
zu
Verdünnern
für
die
Flüssigkonservierung von caninem Sperma ungeeignet ist (Niżański et al., 2009).
Die von Niżański et al. (2009) durch den Equex-Zusatz beobachteten
Veränderungen der Motilitätsparameter in Richtung einer Hyperaktivierung
(signifikante Erhöhung von VAP, VCL, VSL und ALH in den ersten drei Tagen der
Flüssigkonservierung bei gleichzeitiger Verminderung von LIN) konnten in der
vorliegenden Arbeit jedoch nicht nachgewiesen werden. Im Gegenteil kam es in
den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten ab Tag 0 zu einer kontinuierlichen
Abnahme aller Geschwindigkeitsparameter, während die Parameter ALH und LIN
sich nur geringfügig veränderten.
Die Hyperaktivierung tritt physiologischerweise während des Prozesses der
Kapazitation im weiblichen Eileiter auf (Rota et al., 1999b; Niżański et al., 2009)
und wird als eine kräftige, nicht progressive und nicht lineare Spermienbewegung
beschrieben (Verstegen et al., 2002). Während der Hyperaktivierung kommt es zu
drastischen Veränderungen des Bewegungsmusters der Spermien, welches dann
198
Diskussion
durch eine große Amplitude der lateralen Bewegungen des Kopfes und des
Schwanzes verbunden mit einer langsamen oder nicht progressiven Motilität
sowie einem Flagellenschlag mit niedriger Frequenz charakterisiert ist (Verstegen
et al., 2002). Im Allgemeinen werden signifikante Zunahmen der Parameter VCL
und ALH sowie eine gleichzeitige Abnahme des Parameters LIN im Vergleich mit
den initialen Werten als bezeichnend für die Hyperaktivierung angesehen (Rota et
al., 1999b; Verstegen et al., 2002; Peña Martínez, 2004). Rota et al. (1999b)
konnten in flüssigkonservierten Ejakulaten anhand von Chlortetracyclinfärbung
und
Analyse
der
Bewegungsmuster
der
Samenzellen
kapazitationsartige
Veränderungen nachweisen, was darauf hindeutet, dass die Flüssigkonservierung
kapazitationsartige
Veränderungen
initiiert
und
beschleunigt.
Eine
Hyperaktivierung in vitro resultiert wahrscheinlich in einer Erschöpfung der
Energiereserven der Spermien, Akkumulation von Metaboliten im Verdünner und
folgendem Zelltod (Niżański et al., 2009). Auf Basis der SpermVision™-Kriterien
zur Klassifizierung als hyperaktive Samenzellen (VCL > 118 µm/s, ALH > 6,5 µm
und LIN < 0,5) sowie nach den von Verstegen et al. (2002) genannten
Kennzeichen für eine Hyperaktivierung (VCL ≥ 70 µm/s, ALH > 7 µm und niedrige
LIN) ergaben sich in der vorliegenden Arbeit in den mit den verschiedenen
Verdünner aufgearbeiteten Ejakulaten jedoch zu keinem Zeitpunkt Hinweise auf
ein hyperaktives Motilitätsmuster.
Die in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten bestimmten Motilitätswerte waren zu
Beginn des Untersuchungszeitraums gut und auch besser als die in den mit
Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten, jedoch zeigte sich hier ab Tag 5 ebenfalls ein
drastischer Motilitätsabfall, sodass die Konservierungsergebnisse von Tag 5 an
nicht mehr zufriedenstellend waren. Die anfangs gute Motilität in den mit Up 1
flüssigkonservierten Ejakulaten entspricht den Beobachtungen von Hermansson et
al. (2006). Als Ursache für den anschließenden Motilitätsabfall kommen sowohl
- wie bereits zuvor diskutiert - das im Verdünner enthaltene Glycerol (3 %) als
auch die Zentrifugation der Proben in Frage. Allerdings übt der Zusatz von 3 %
Glycerol zum Verdünner nach Province et al. (1984) keinen Einfluss auf die
Motilität aus. Die Aussagen zum Einfluss der Zentrifugation reichen von „keine
ungünstige Auswirkung“ (Günzel, 1986) bzw. „keine Beeinflussung“ (Rijsselaere et
al., 2002a) bis „motilitätsreduzierend“ (Schäfer-Somi et al., 2006). Während
Koderle et al. (2009) bei verdünnten Ejakulaten vor dem Einfrieren keine
signifikanten Unterschiede bezüglich der Motilität zwischen zentrifugierten und
199
Diskussion
nicht zentrifugierten Proben finden konnten, wiesen sie jedoch nach dem Auftauen
eine signifikant stärkere Motilitätsreduktion infolge der Zentrifugation nach.
Aufgrund dessen lassen sich auch bei der Flüssigkonservierung verzögerte
Effekte der Zentrifugation auf die Motilität nicht ausschließen. Ursachen für den
nachteiligen Einfluss der Zentrifugation auf die Spermaqualität nach dem Auftauen
könnten die mit der Zentrifugation einhergehende Entfernung von protektiven
Seminalplasmaproteinen aus den Ejakulaten oder mechanische Schädigungen
durch die Zentrifugationskraft an sich sein (Koderle et al., 2009). In dieser Arbeit
waren nicht zentrifugierte Ejakulate den Proben nach Zentrifugation überlegen.
Letztlich blieb jedoch unbeantwortet, ob und inwieweit das Glycerol, die
Zentrifugation
oder
andere
unbekannte
Faktoren
für
den
beobachteten
Motilitätsabfall verantwortlich waren. Allerdings konnte durch die Überlegenheit
der
nicht
zentrifugierten
Ejakulate
bestätigt
werden,
dass
Prostatasekret(beimengungen) die Motilität von flüssigkonserviertem Sperma nicht
negativ beeinflussen (Sirivaidyapong et al., 2001).
Während an Tag 0 der Verdünner Up 1 bezüglich der CASA-Gesamtmotilität und
der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit dem Verdünner CP noch signifikant überlegen
war
und
die
Verdünner
CP
und
TE
lediglich
bezüglich
der
CASA-
Motilitätsparameter signifikant bessere Werte lieferten (siehe Kap. 5.3.2.2), so
änderte sich dies im weiteren Zeitverlauf deutlich. Insgesamt wurde die Motilität
über den gesamten Untersuchungszeitraum in den mit CP verdünnten Ejakulaten
am besten konserviert, was im Vergleich mit den mit Up 1 + 2 verdünnten
Ejakulaten für die subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit, die CASAGesamtmotilität, die CASA-Vorwärtsbeweglichkeit und verschiedene CASAMotilitätsparameter (DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL, ALH, BCF), im Vergleich
mit
den
mit
Up 1
Vorwärtsbeweglichkeit,
verdünnten
die
Ejakulaten
für
die
CASA-Gesamtmotilität,
subjektiv
die
geschätzte
CASA-Vorwärts-
beweglichkeit und verschiedene CASA-Motilitätsparameter (DAP, DCL, DSL, VAP,
VCL, VSL, STR, LIN, WOB) und im Vergleich mit den mit TE verdünnten
Ejakulaten für die subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit, die CASAVorwärtsbeweglichkeit sowie die CASA-Motilitätsparameter DAP, DCL, DSL, VAP,
VCL, VSL, BCF und LIN auch statistisch signifikant belegt werden konnte.
Weiterhin zeigte sich jedoch auch in den mit TE verdünnten Ejakulaten eine gute
Konservierung der Motilität, welche ebenfalls im Vergleich mit den mit Up 1 + 2
200
Diskussion
verdünnten Ejakulaten für die subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit, die
CASA-Gesamtmotilität, die CASA-Vorwärtsbeweglichkeit sowie verschiedene
CASA-Motilitätsparameter (DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL, ALH, BCF) und im
Vergleich mit den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten für die subjektiv geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit,
die
CASA-Gesamtmotilität,
die
CASA-Vorwärts-
beweglichkeit sowie verschiedene CASA-Motilitätsparameter (DAP, DCL, DSL,
VAP, VCL, VSL, ALH, STR, LIN, WOB) signifikant besser war.
Ein Unterschied zwischen den Verdünnern CP und TE, der möglicherweise für die
bessere Konservierung der Motilität in den mit CP verdünnten Ejakulaten
verantwortlich war, könnte die im Verdünner CP zusätzlich zur Fruktose
enthaltene Glukose sein. Allerdings wird nach Rigau et al. (2001) in frischem
Sperma durch die Zuckerkomponente lediglich das Bewegungsmuster der
Samenzellen beeinflusst, während der Prozentsatz an motilen Spermien weder
durch Fruktose noch durch Glukose verändert wird. Dies steht im Gegensatz zu
den Beobachtungen von Iguer-Ouada und Verstegen (2001b), welche beim
Vergleich
von
TRIS-Fruktose-Eigelb-
und
TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünner
signifikant bessere Motilitätsergebnisse für den TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünner
feststellen konnten. Die Autoren vermuten, dass die bessere Erhaltung der
Motilität im TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünner durch das Energiesubstrat (Glukose
anstelle von Fruktose) bedingt war, da dies den einzigen Unterschied zwischen
den Verdünnern darstellte. Die Ergebnisse deuten möglicherweise auf eine
Präferenz von Hundespermien, Glukose anstelle von Fruktose zu metabolisieren,
hin
(Iguer-Ouada
und
Verstegen,
2001b).
Letzteres
konnte
auch
von
Ponglowhapan et al. (2004) beobachtet werden. Ein denkbarer Erklärungsansatz
für die Glukosepräferenz ist die höhere Kapazität des Glukosetransportsystems
(Ponglowhapan et al., 2004). Im Gegensatz zu Iguer-Ouada und Verstegen
(2001b) ermittelten Ponglowhapan et al. (2004) dennoch in fruktosehaltigen TRISEigelb-Verdünnern höhere Gesamtmotilitätswerte als in glukosehaltigen oder in
Fruktose und Glukose enthaltenden TRIS-Eigelb-Verdünnern. Da in der
vorliegenden Arbeit der Glukose und Fruktose enthaltende Verdünner CP
signifikant bessere Ergebnisse lieferte als der fruktosehaltige Verdünner TE,
können die Beobachtungen von Ponglowhapan et al. (2004) nicht bestätigt
werden. Da im Verdünner CP jedoch auch herstellereigene, unbekannte
Bestandteile enthalten waren, könnten auch diese ursächlich zum besseren Erhalt
der Motilität beigetragen haben.
201
Diskussion
Einen weiteren Unterschied zwischen den Verdünnern CP und TE, der eventuell
als ursächlich für die bessere Konservierung der Motilität in den mit CP
verdünnten Ejakulaten in Betracht zu ziehen ist, stellt der Antibiotikazusatz
(Gentamicin) im Verdünner CP dar. Aurich und Spergser (2007) konnten zum
einen
zeigen,
dass
bestimmte
Bakterien
gemessen
an
Motilität,
Spermiengeschwindigkeit und Membranintegrität schädliche Effekte auf die
Qualität von flüssigkonserviertem Hengstsperma ausüben können. Diese Effekte
wurden durch den Zusatz von Gentamicin nicht reduziert. Zum anderen wurde
jedoch auch durch Gentamicin die Spermienfunktion in flüssigkonserviertem
Sperma negativ beeinflusst (Aurich und Spergser, 2007). Untersuchungen, ob
diese Beobachtungen auch für canines Sperma zutreffend sind, konnten in der
Literatur nicht gefunden werden. Trotzdem können sowohl negative bakterielle
Effekte
als
auch
negative
Effekte
durch
den
Antibiotikazusatz
auf
flüssigkonserviertes Hundesperma nicht ausgeschlossen werden. Es ist denkbar,
dass es in der vorliegenden Arbeit in den verdünnten Ejakulaten ohne
Antibiotikazusatz (TE, Up 1, Up 1 + 2) zu einer Vermehrung von eventuell
enthaltenen Bakterien kam, welche zur Verminderung der Spermaqualität im
Zeitverlauf der Flüssigkonservierung beigetragen hat und dass eben diese
Vermehrung in den mit CP verdünnten Ejakulaten durch das Gentamicin gehemmt
wurde, was die bessere Konservierung der Motilität erklären könnte. Letztlich
können über die Wirksamkeit von Gentamicin gegen schädliche bakterielle Effekte
jedoch
keine
Aussagen
gemacht
werden,
da
keine
mikrobiologischen
Untersuchungen der Ejakulate erfolgten. Eine negative Beeinflussung der
Spermienfunktion durch Gentamicin (Aurich und Spergser, 2007) konnte in der
vorliegenden Arbeit jedoch nicht beobachtet werden; die Gentamicinkonzentration
im Verdünner CP war allerdings unbekannt. Ebenso konnte anhand der mit TE
verdünnten
Ejakulate
jedoch
gezeigt
werden,
dass
eine
akzeptable
Spermaqualität über einen längeren Zeitraum auch ohne den Einsatz von
Antibiotika aufrecht erhalten werden kann.
5.3.3.2
Viabilität
Nach Burgess et al. (2001) hat die Zugabe von TRIS-basierten Verdünnern zu den
Ejakulaten keine unmittelbaren oder verzögerten signifikanten Effekte auf den
Anteil an lebenden Samenzellen. Auch die anschließende Kühlung übt keinen
unmittelbaren signifikanten Effekt auf diesen Anteil aus, jedoch kann von einem
202
Diskussion
verzögerten negativen Effekt der Kühlung auf den Anteil an lebenden
Samenzellen ausgegangen werden (Burgess et al., 2001).
In der vorliegenden Untersuchung kam es in allen verdünnten Ejakulaten während
der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn Tage zu einer signifikanten Abnahme
der Viabilität (p < 0,0001), was sowohl mit den Methoden der klassischen
Spermatologie als auch mittels CASA verifiziert werden konnte. Eine Reduktion
der Viabilität war absehbar und wurde für Lagerungszeiträume von 2 bis 23 Tagen
bereits von verschiedenen anderen Autoren nachgewiesen (Rota et al., 1995;
England und Ponzio, 1996; Rijsselaere et al., 2002a; Tsutsui et al., 2003b;
Ponglowhapan et al., 2004; Niżański und Klimowicz, 2005; Hermansson et al.,
2006; Shahiduzzaman und Linde-Forsberg, 2007; Michael et al., 2009; 2010;
Kmenta et al., 2011).
An Tag 0 konnten hinsichtlich der Viabilität keine signifikanten Unterschiede
zwischen den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten
ermittelt werden (siehe Kap. 5.3.2.3). Demgegenüber war der Anteil an lebenden
Samenzellen im Eosinausstrich in den mit Up 1 aufgearbeiteten Ejakulaten über
den gesamten Untersuchungszeitraum jedoch signifikant höher als in den mit den
anderen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulaten. Die mit CP, TE und Up 1 + 2
aufgearbeiteten Ejakulate unterschieden sich bezüglich des Anteils an lebenden
Samenzellen nicht signifikant voneinander. Auch bei Betrachtung der CASAViabilität waren die mit Up 1 verdünnten Ejakulate den mit CP verdünnten
Ejakulaten im Zeitverlauf signifikant überlegen, nicht jedoch den mit TE
verdünnten Ejakulaten. Die mit CP und die mit TE verdünnten Ejakulate
unterschieden sich bezüglich der CASA-Viabilität nicht signifikant voneinander,
zeigten aber beide über den gesamten Untersuchungszeitraum signifikant höhere
Messwerte für die CASA-Viabilität als die mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulate.
Auf Basis dieser Ergebnisse war bezüglich der Erhaltung der Viabilität in den
flüssigkonservierten Ejakulaten der Verdünner Up 1 als bester unter den
getesteten Verdünnern zu beurteilen. Jedoch konnten auch mit den Verdünnern
CP und TE gute Ergebnisse erzielt werden. Lediglich der Verdünner Up 1 + 2
lieferte Ergebnisse, die, im Vergleich zu denen der anderen Verdünner, als nicht
zufriedenstellend anzusehen waren, worin ebenfalls die erfolgte Änderung des
Versuchsplans (Ersatz von Up 1 + 2 durch Up 1) begründet lag. Ein negativer
Einfluss der Zentrifugation auf die Viabilität der Samenzellen konnte in diesem
Zusammenhang ausgeschlossen werden. In Übereinstimmung mit den vorherigen
203
Diskussion
Aussagen erwies sich der Zusatz von Glycerol (5 %) und Equex im Verdünner
Up 1 + 2 erneut als nachteilig. Dies bestätigt die Aussage von Foote und Leonard
(1964), nach denen die Überlebensrate der Spermien in Verdünnern, die Glycerol
enthalten, etwas geringer ist und die von Niżański et al. (2009), dass der Zusatz
von Equex die Lebensdauer der Spermien bei Inkubation bei 5°C verkürzt.
Grundsätzlich war zu beobachten, dass die Viabilität der Samenzellen über den
gesamten Zeitverlauf deutlich höher war als deren Motilität. Insbesondere gegen
Ende des Untersuchungszeitraumes wurde die Diskrepanz immer größer. Dies ist
jedoch übereinstimmend mit den Ergebnissen anderer Autoren. Beispielsweise
konnten Kmenta et al. (2011) nach acht Tagen Flüssigkonservierung bei 4°C in
einem TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner eine CASA-Viabilität (nach SYBR-14/PIFärbung) von 76,0 ± 13,5 % ermitteln, während die CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
nur noch etwa 38 % betrug. Diese Beobachtungen machen deutlich, dass
unbewegliche Samenzellen nicht zwangsläufig auch tot sind. Dass eine
Reaktivierung der Motilität von offensichtlich unbeweglichen Spermien durch
Zusatz von frischem Verdünner möglich ist, konnte bereits von Verstegen et al.
(2005) gezeigt werden. Inwieweit es im weiblichen Reproduktionstrakt zu einer
Reaktivierung der Motilität kommen kann, ist jedoch unklar.
5.3.3.3
Pathomorphologie
Die Morphologie der Samenzellen, welche teilweise durch die Motilität
ausgedrückt wird und direkt mit den physiologischen Vorgängen während der
Befruchtung
in
Zusammenhang
steht,
ist
folgerichtig
auch
mit
dem
Reproduktionsergebnis direkt korreliert (Verstegen et al., 2002), was die
Bedeutung ihrer Beurteilung erklärt.
Nach England und Ponzio (1996) ist die Morphologie der Samenzellen der
Qualitätsparameter,
der
sich
bei
Flüssigkonservierung
am
schnellsten
verschlechtert. Dies konnte in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden.
Während unmittelbar nach der Aufarbeitung mit den verschiedenen Verdünnern in
allen verdünnten Ejakulaten eine tendenzielle bzw. in den mit CP und TE
verdünnten Ejakulaten sogar eine signifikante Verringerung des Gesamtanteils an
morphologisch veränderten Spermien im Vergleich mit dem Nativsperma zu
beobachten
war
(siehe
Kap.
5.3.2.4),
kam
es
über
den
gesamten
Untersuchungszeitraum gesehen dennoch in fast allen verdünnten Ejakulaten zu
einer signifikanten Zunahme des Gesamtanteils an morphologisch veränderten
204
Diskussion
Samenzellen im Eosinausstrich (pZeit = 0,0007 bis < 0,0001). Dies entspricht den
Ergebnissen von Tsutsui et al. (2003b) und Kmenta et al. (2011), die mittels RoseBengal-Färbung bzw. nach Fixation in Hancock-Lösung über eine Lagerungsdauer
von
zwölf
bzw.
acht
flüssigkonservierten
Tagen
Ejakulaten
in
mit
einen
TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünnern
ähnlichen
Anstieg
des
Anteils
an
morphologisch veränderten Samenzellen nachweisen konnten, und ist sinngemäß
übereinstimmend
mit
den
Resultaten
weiterer
Autoren,
welche
nach
Flüssigkonservierung für eine Lagerungsdauer von drei bis zehn Tagen in TRISGlukose-Eigelb-Verdünnern
mittels
bzw.
Nigrosin-Eosin-Färbung
in
Trockenmagermilch-Glukose-Verdünner
signifikante
Reduktionen
des
Anteils
an
Samenzellen mit normaler Morphologie nachweisen konnten (England und
Ponzio, 1996; Rijsselaere et al., 2004b; Michael et al., 2009; 2010).
Nach Burgess et al. (2001) verursacht zwar die Zugabe eines glycerolhaltigen
TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünners keine transmissionselektronenmikroskopisch
erkennbaren ultrastrukturellen Veränderungen der Samenzellen, wohl aber die
nachfolgende Kühlung. Letztere hat möglicherweise sowohl sofortige als auch
verzögerte Effekte auf die Ultrastruktur der Spermien. Die sofortigen Effekte
können die Spermien entweder töten oder sie durch Schädigung des Akrosoms
befruchtungsunfähig
Modifikation
machen,
wohingegen
der Plasmamembranstruktur
die
verzögerten
Effekte
durch
die Langlebigkeit der Spermien
reduzieren können (Burgess et al., 2001). Demgegenüber wird nach Rijsselaere et
al. (2002a) die Prävalenz von morphologischen Veränderungen in der NigrosinEosin-Färbung in mit TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner aufgearbeiteten Proben
durch eine dreitägige Lagerung bei 4°C nicht beeinflusst.
Bezüglich des Einflusses der Zentrifugation auf die Pathomorphologie der
Samenzellen lassen sich in der Literatur kontroverse Aussagen finden: Nach
Koderle et al. (2009) ist in vor dem Einfrieren zentrifugierten Proben der
Prozentsatz an morphologisch veränderten Spermien (bestimmt nach Fixation in
Hancock-Lösung) nach dem Auftauen signifikant höher als in nicht zentrifugierten
Proben und auch nach WHO (2010) kann es durch die Zentrifugation zu einer
Beeinflussung der Spermienmorphologie kommen. Daher muss auch bei der
Flüssigkonservierung eine Beeinflussung der Pathomorphologie durch die
Zentrifugation in Betracht gezogen werden. Während nicht ausgeschlossen
werden kann, dass die nachteiligen Effekte der Zentrifugation durch mechanische
Schädigungen, welche durch die Zentrifugationskraft verursacht werden, zustande
205
Diskussion
kommen (Koderle et al., 2009), konnten Rijsselaere et al. (2002a) bezüglich der
Pathomorphologie keine signifikanten Unterschiede zwischen verschiedenen
Zentrifugationsgeschwindigkeiten finden. In der vorliegenden Arbeit konnte eine
nachteilige
Beeinflussung
der
Morphologie
der
Samenzellen
durch
die
Zentrifugation nicht nachgewiesen werden, da der Anteil an morphologisch
veränderten Samenzellen in zentrifugierten Proben nicht signifikant höher war als
in nicht zentrifugierten Proben.
Während in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der Pathomorphologie unmittelbar
nach
dem
Verdünnen
keine
signifikanten
Unterschiede
zwischen
den
verschiedenen Verdünnern bestanden (siehe Kap. 5.3.2.4), war dies wohl aber bei
Betrachtung des gesamten Zeitverlaufs der Flüssigkonservierung der Fall. Hier
unterschieden sich die Verdünner CP und TE signifikant voneinander, wobei im
Verdünner TE bis einschließlich Tag 3 ein höherer Anteil an morphologisch
veränderten Spermien beobachtet werden konnte als im Verdünner CP, während
die Zeitverläufe über den restlichen Untersuchungszeitraum sehr ähnlich waren.
Des Weiteren konnte zwischen den mit CP und den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten
Ejakulaten ein signifikanter Unterschied der Zeitverläufe ermittelt werden. Dabei
war zunächst in den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten bis einschließlich Tag
2 ein höherer Anteil an morphologisch veränderten Spermien festzustellen und im
Anschluss ab Tag 3 dann stets ein niedrigerer Anteil als in den mit CP
aufgearbeiteten Ejakulaten.
Insgesamt war der Gesamtanteil an morphologisch veränderten Samenzellen über
den Untersuchungszeitraum ab Tag 3 in den mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten
niedriger als in den übrigen Proben. Die Zeitverläufe der mit CP, TE und Up 1
verdünnten Ejakulate unterschieden sich ab Tag 3 kaum voneinander. Daher
konnte bezüglich der Pathomorphologie der Verdünner Up 1 + 2 als bester unter
den getesteten Verdünnern angesehen werden, wenn auch ein statistisch
signifikanter Unterschied nur zum Verdünner CP, nicht aber zum Verdünner TE,
nachgewiesen werden konnte. Jedoch waren die Ergebnisse auch in den übrigen
Verdünnern als gut zu bewerten. Dabei war der Verdünner CP dem Verdünner TE
bis Tag 3 signifikant überlegen.
Gleiche Tendenzen wie für den Gesamtanteil an morphologisch veränderten
Samenzellen
ließen
sich
bei
getrennter
Betrachtung
der
einzelnen
morphologischen Veränderungen beobachten. Auch hier war der Verdünner
206
Diskussion
Up 1 + 2 im Zeitverlauf den anderen Verdünnern überlegen. Statistische
Signifikanzen konnten für den Anteil an Schwanzveränderungen sowie für den
Anteil an schleifenförmigen Schwänzen ermittelt werden. Ebenso war der
Verdünner CP im Zeitverlauf wieder dem Verdünner TE überlegen. Auch hier
konnten statistische Signifikanzen für den Anteil an Schwanzveränderungen sowie
für den Anteil an schleifenförmigen Schwänzen nachgewiesen werden.
Ebenso wie die beobachteten Abnahmen des Gesamtanteils an morphologisch
veränderten Samenzellen in den verdünnten Ejakulaten unmittelbar nach dem
Verdünnen (siehe Kap. 5.3.2.4), waren auch die weitere Abnahme in den mit Up 1
verdünnten Proben bis einschließlich Tag 2 und die zwischenzeitliche Abnahme in
den mit Up 1 + 2 aufgearbeiteten Ejakulaten zwischen Tag 2 und Tag 5 nicht
nachvollziehbar. Jedoch konnte eine zwischenzeitliche Verringerung des Anteils
an morphologisch veränderten Spermien (zwischen Tag 4 und Tag 6) bei
Flüssigkonservierung in einem TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner auch bei Tsutsui
et
al.
(2003b)
gefunden
werden. Wie
bereits
zuvor
diskutiert,
könnte
möglicherweise eine Agglutination der Spermien im Eosinausstrich (Burgess et al.,
2001) oder eine Sedimentation morphologisch veränderter Spermienformen für
diese Ergebnisse verantwortlich sein. Auffällig war allerdings, dass es in den mit
CP und TE verdünnten Ejakulaten im Zeitverlauf zu keiner Verringerung des
Anteils an morphologisch veränderten Spermien kam. Daher müssen zum einen
fehlerhafte Messungen in den mit Up 1 + 2 und Up 1 verdünnten Ejakulaten in
Betracht gezogen werden, zum anderen könnte jedoch auch die unterschiedliche
Zusammensetzung der Verdünner ursächlich für die gemachten Beobachtungen
sein, da nur in den glycerolhaltigen Verdünnern Up 1 + 2 und Up 1 Abnahmen des
Anteils an morphologisch veränderten Spermien im Zeitverlauf nachgewiesen
wurden. Es ist denkbar, dass es, bedingt durch die höhere Viskosität der
glycerolhaltigen Verdünner, zu einer vermehrten Agglutination der Spermien im
Eosinausstrich, wie sie von Burgess et al. (2001) beschrieben wurde, kam.
Bei getrennter Betrachtung der einzelnen morphologischen Veränderungen fiel
auf, dass es im Zeitverlauf in fast allen verdünnten Ejakulaten zu einem
signifikanten Anstieg des Anteils an Schwanzveränderungen kam. Dies ist z. T.
übereinstimmend mit Tsutsui et al. (2003b), welche mittels Rose-Bengal-Färbung
nachweisen konnten, dass in verdünntem Sperma vor allem die Veränderungen
an Mittelstück und Schwanz der Samenzellen ansteigen. Während an Tag 0
207
Diskussion
bereits in den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten eine signifikante
Zunahme des Anteils an Samenzellen mit schleifenförmigen Schwänzen im
Vergleich zum Nativsperma zu erkennen war (siehe Kap. 5.3.2.4), so konnte im
Zeitverlauf dann in allen verdünnten Ejakulaten eine signifikanten Zunahme des
Anteils an schleifenförmigen Schwänzen beobachtet werden. Die Anteile an
aufgerollten Schwänzen und an Knickschwänzen zeigten demgegenüber nur
teilweise einen signifikanten Anstieg. Diese Beobachtungen könnten darauf
hindeuten,
dass
es
durch
die
Flüssigkonservierung
bevorzugt
zu
Schwanzveränderungen in Form von schleifenförmigen Schwänzen kommt.
5.3.3.4
Akrosomale Veränderungen
Die Integrität des Akrosoms ist wesentlich für den Befruchtungsvorgang (IguerOuada und Verstegen, 2001b). In flüssigkonserviertem Sperma erreicht der
Prozentsatz an akrosomreagierten Spermien in caninem Kapazitationsmedium
sein Maximum früher als in nativem Sperma, weshalb es wahrscheinlich ist, dass
die Spermalagerung bei 5°C die AR initiiert bzw. triggert, was jedoch nicht auf eine
Beeinträchtigung der Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen hinausläuft (KumiDiaka und Badtram, 1994). Demgegenüber kann nach Iguer-Ouada und
Verstegen (2001b) eine Aktivierung der AR während der Flüssigkonservierung zu
einer schnellen Verminderung der Fertilität des Spermas führen. Eigelb als
Verdünnerbestandteil scheint die Samenzellen gegen eine spontane AR zu
schützen, wobei der Mechanismus, durch den Eigelb das Akrosom stabilisiert
unklar ist. Möglicherweise handelt es sich um einen direkten protektiven Effekt auf
die akrosomale Membran (Iguer-Ouada und Verstegen, 2001b). Aufgrund des
fehlenden Zusammenhangs zwischen Motilität und akrosomaler Integrität in
verdünnten Ejakulaten (Oettlé, 1986), sollte letztere zur Beurteilung der Qualität
von flüssigkonserviertem Sperma stets gesondert untersucht werden.
Während der Anteil an Samenzellen mit abgelöstem Akrosom in unverdünntem
Sperma bei einer Lagerung bei 4°C rapide ansteigt und nach vier Tagen einen
durchschnittlichen Wert von 17,8 % erreicht, kommt es in verdünntem Sperma nur
zu einem allmählichen Anstieg; nach zwölf Tagen Flüssigkonservierung in TRISFruktose-Eigelb-Verdünner beträgt der mittels Triple-Färbetechnik bestimmte
Anteil an Samenzellen mit Verlust des Akrosoms etwa 11 % (Tsutsui et al.,
2003b).
208
Diskussion
Auch in der vorliegenden Untersuchung kam es in den mit CP, TE und Up 1
verdünnten Ejakulaten im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn
Tage zu signifikanten Zunahmen des mittels Spermac®-Färbung bestimmten
Anteils
an
Samenzellen
mit
Kopfkappenveränderungen
(pZeit = 0,0006
bis < 0,0001). Ebenso konnten bei getrennter Betrachtung der einzelnen
Kopfkappenveränderungen in den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten
signifikante Zunahmen der Anteile an abgelösten Kopfkappen, an schiefen
Kopfkappen und an sonstigen Veränderungen ermittelt werden. Dies ist
sinngemäß übereinstimmend mit den Ergebnissen anderer Autoren, welche nach
Flüssigkonservierung für eine Lagerungsdauer von 3 bis 23 Tagen in TRISGlukose-Eigelb-Verdünnern
mittels
Spermac®-,
bzw.
in
Trockenmagermilch-Glukose-Verdünner
Nigrosin-Eosin-
oder
FITC-PNA-Fluoreszenzfärbung
signifikante Abnahmen des Anteils an Samenzellen mit intakten Akrosomen
nachweisen konnten (England und Ponzio, 1996; Shahiduzzaman und LindeForsberg, 2007; Michael et al., 2009; 2010). Allerdings war, verglichen mit den
Zunahmen des Anteils an Samenzellen mit akrosomalen Veränderungen in den
eigenen
Untersuchungen,
das
Ausmaß
der
Abnahmen
des
Anteils
an
Samenzellen mit intakten Akrosomen bei einigen der genannten Autoren
wesentlich höher: Michael et al. konnten nach drei Tagen Flüssigkonservierung
nur noch einen Anteil von etwa 38 % (2009) bzw. rund 24 % (2010) beobachten
und England und Ponzio (1996) nach zehn Tagen einen Anteil von 18-33 %.
Dagegen wiesen bei Shahiduzzaman und Linde-Forsberg (2007) nach zehn
Tagen noch etwa 53 % der Samenzellen intakte Akrosome auf und nach 23 Tagen
noch rund 20 %. Wie bereits zuvor erwähnt, müssen bei solch einem Vergleich
jedoch Abweichungen bezüglich der Zusammensetzung der Verdünner und
Unterschiede in der Methodik berücksichtigt werden.
Nach Burgess et al. (2001) verursacht zwar die Verdünnerzugabe keine
signifikanten ultrastrukturellen Veränderungen der Samenzellen, wohingegen aber
die anschließende Kühlung, verglichen mit dem Nativsperma, in einem sofortigen
(nicht signifikanten) Anstieg der Anzahl an transmissionselektronenmikroskopisch
erkennbaren
akrosomalen
Veränderungen
resultiert.
Dieser
Anstieg
wird
hauptsächlich durch Schwellung und Wellung der Akrosome verursacht. Durch die
Inkubation des zuvor gekühlten Spermas bei 39°C kommt es zu keinem
nennenswerten weiteren Anstieg (Burgess et al., 2001). Demgegenüber kommt es
bei Oettlé (1986) sowohl durch die Verdünnung des Spermas als auch durch die
209
Diskussion
nachfolgende Kühlung zu einer Zunahme der akrosomalen Veränderungen in der
Spermac®-Färbung, wobei die Kühlung relativ mehr Schäden am Akrosom
verursacht als die Verdünnung.
Im Gegensatz zu den mit CP, TE und Up 1 verdünnten Ejakulaten konnte in den
mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulaten über den Untersuchungszeitraum keine
signifikante Zunahme des Anteils an Spermien mit akrosomalen Veränderungen
nachgewiesen werden; hier war der durchschnittliche prozentuale Anteil an Tag 10
(4,0 %) sogar niedriger als an Tag 0 (6,6 %). Letzteres war, ebenso wie die
zwischenzeitlichen Abnahmen in den mit CP verdünnten Ejakulaten an den Tagen
3 und 5, in den mit TE verdünnten Ejakulaten an Tag 3 und in den mit Up 1 + 2
verdünnten Ejakulaten an den Tagen 2, 3, 5 und 10, nicht nachvollziehbar. Einzig
in den mit Up 1 verdünnten Ejakulaten waren keine zwischenzeitlichen Abnahmen
zu beobachten.
Nach Sirivaidyapong et al. (2001) wird die akrosomale Integrität weder durch die
Verdünnung noch durch die Kühlung auf 4°C beeinflusst. Auch Rota et al. (1995)
konnten in mit TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner flüssigkonservierten Ejakulaten
über einen Untersuchungszeitraum von vier Tagen mittels Spermac®-Färbung
keine signifikanten Zunahmen des Anteils an akrosomalen Veränderungen in
Form von vesikulierten oder geschwollenen Akrosomen sowie Verlust des
Akrosoms nachweisen. Dies entspricht den Ergebnissen von Rijsselaere et al.
(2002a; 2004b), nach denen eine drei- bzw. viertägige Flüssigkonservierung bei
4°C
in
TRIS-Fruktose-Eigelb-
bzw.
TRIS-Glukose-Eigelb-Verdünner
keine
signifikante Reduktion des Prozentsatzes an Samenzellen mit intaktem Akrosom
(bestimmt nach Fluoreszenzfärbung mit FITC-PSA) induziert. Ebenso kam es bei
Iguer-Ouada und Verstegen (2001b) während der Flüssigkonservierung in TRISGlukose-Eigelb- und TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünnern nur zu einer leichten
Zunahme des Prozentsatzes an Samenzellen mit Verlust des Akrosoms (bestimmt
nach Chlortetracyclinfärbung); nach neun Tagen lagen die durchschnittlichen
Werte in beiden Verdünnern unter 10 %. Auch bei Ponglowhapan et al. (2004) war
in mit TRIS-Eigelb-Verdünnern mit Glukose- oder Fruktosezusatz flüssigkonservierten Ejakulaten in den ersten drei Tagen nach Herstellung kein
signifikanter Anstieg des Prozentsatzes an Samenzellen mit Verlust des Akrosoms
(bestimmt nach FITC-PNA-Fluoreszenzfärbung) nachweisbar; meist kam es erst
nach mindestens zehn Tagen zu einem signifikanten Anstieg. Es konnten weder
zwischen den verschiedenen Zuckerkomponenten (Glukose oder Fruktose) noch
210
Diskussion
zwischen verschiedenen Zuckerkonzentrationen (10 mM oder 70 mM) signifikante
Unterschiede bezüglich des Prozentsatzes an Spermien mit Akrosomverlust
nachgewiesen werden (Ponglowhapan et al., 2004).
Insgesamt machen die vorliegenden Ergebnisse deutlich, dass im Verlauf der
Flüssigkonservierung mit einer Zunahme akrosomaler Veränderungen gerechnet
werden muss. Allerdings ist deren Ausmaß in den ersten Lagerungstagen als
gering zu beurteilen, was sich mit den oben beschriebenen Beobachtungen
anderer Autoren deckt. In der vorliegenden Arbeit kam es insbesondere zwischen
Tag 7 und Tag 10 zu einem Anstieg der akrosomalen Veränderungen (CP, TE,
Up 1). Daher ist davon auszugehen, dass auf Basis der akrosomalen Integrität in
flüssigkonservierten Ejakulaten eine gute Spermaqualität für mindestens sieben
Tage aufrechterhalten werden kann. Jedoch waren auch die durchschnittlichen
Werte nach zehn Tagen in allen getesteten Verdünnern als gut zu bewerten:
Während in den Verdünnern CP, TE und Up 1 im Mittel 7,6 %, 8,5 % und 8,2 % der
Samenzellen akrosomale Veränderungen aufwiesen, war dies im Verdünner
Up 1 + 2 nur bei 4,0 % der Samenzellen der Fall.
Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann zum einen bestätigt werden, dass die
Zentrifugation keine ungünstigen Auswirkungen auf den Anteil an akrosomintakten
Samenzellen hat (Günzel, 1986) und zum anderen dass durch Prostatasekret die
akrosomale Integrität von flüssigkonservierten Samenzellen auch über eine
Lagerungsdauer von zehn Tagen nicht nachteilig beeinflusst wird (Sirivaidyapong
et al., 2001). Letzteres widerlegt die für Tag 0 aufgestellte Hypothese (siehe Kap.
5.3.2.5) und widerspricht den Aussagen von Rijsselaere et al. (2002a) und Rota et
al. (1995), dass Prostatasekret/Seminalplasma für die Flüssigkonservierung von
Hundesperma bei 4 °C ungeeignet ist.
5.3.4 Korrelationen der untersuchten Parameter
5.3.4.1
Dichten
Nach Günzel-Apel et al. (1993) sind die mittels konventioneller Zählkammer
bestimmten Spermienkonzentrationen signifikant mit den mittels Cellsoft Computer
Videomicrography System gemessenen Konzentrationen korreliert. Ebenso
konnten Rijsselaere et al. (2003) eine signifikante Korrelation zwischen der
konventionellen Konzentrationsbestimmung mittels Bürker-Zählkammer und der
Konzentrationsmessung durch den HTR Ceros 12.1 ermitteln, wobei die
211
Diskussion
Unterschätzung durch den HTR Ceros 12.1 durchschnittlich 14,8 % betrug. Auch
Schäfer-Somi et al. (2006) konnten in nativem Sperma eine signifikante
Korrelation zwischen der Konzentrationsbestimmung mittels Thoma-Zählkammer
und der mittels SpermVision nachweisen.
Auch in der vorliegenden Arbeit konnte eine signifikante Korrelation zwischen den
mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten und den durch CASA (SpermVision™System) gemessenen Dichten ermittelt werden (r = 0,708, p < 0,001), wobei die
mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten Mittelwerte fast immer über den durch
CASA gemessenen Mittelwerten lagen. Lediglich für die mit Up 1 verdünnten
Ejakulate konnte mittels CASA eine leicht höhere durchschnittliche Dichte ermittelt
werden als mittels Neubauer-Zählkammer. Im Gegensatz zu den verdünnten
Ejakulaten war die Abweichung zwischen den mit beiden Methoden bestimmten
Mittelwerten bei den Nativejakulaten stärker ausgeprägt, was sich auch bei den
Korrelationsanalysen nach Nativsperma und nach den einzelnen Verdünnern
getrennt deutlich am Korrelationskoeffizienten zeigte (r = 0,539, p = 0,002). Die
mittels CASA gemessenen Spermienkonzentrationen lagen in den Nativejakulaten
stets weit unter den mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten Werten. Dies ist
übereinstimmend
mit
der
von
Rijsselaere
et
al.
(2003)
beschriebenen
Unterschätzung der Spermienkonzentration durch CASA-Systeme, welche mit
steigenden
Spermienkonzentrationen
zunimmt.
Eine
Unterschätzung
der
Spermienkonzentration konnte in weit geringerer Ausprägung jedoch auch bei den
verdünnten Ejakulaten festgestellt werden. Dass die Unterschätzung der
Spermienkonzentration durch CASA in der vorliegenden Arbeit mit steigenden
Spermienkonzentrationen zunahm bzw. dass die Abweichungen zwischen beiden
Methoden mit steigenden Spermienkonzentrationen größer wurden, ist auch
deutlich in der graphischen Darstellung des Zusammenhang zwischen den mittels
Neubauer-Zählkammer bestimmten und den durch CASA ermittelten Dichten zu
erkennen (siehe Abb. 20, Kap. 4.4.1.2).
Nach Kuster (2005) sind die bei der Konzentrationsbestimmung auftretenden
Unterschiede zwischen CASA-Systemen, welche mit Zählkammern von 20 µm
Tiefe arbeiten, und Hämozytometern durch den Segre-Silberberg-Effekt bedingt,
welcher während des „Poiseuille Flusses“ in dünnen und sich durch Kapillarkräfte
füllenden Zählkammern auftritt. Durch diesen Effekt ist die Spermienkonzentration
in den Messbereichen der 20 µm-Zählkammern niedriger als die wahre Spermienkonzentration der Proben. Dagegen scheint dieser Effekt in Hämozytometern, die
212
Diskussion
mit 100 µm wesentlich tiefer sind als die meisten Einweg-Zählkammern, keine
Rolle zu spielen. Folglich bleibt die Hämozytometrie der Golden Standard für die
Bestimmung der Spermienkonzentration (Kuster, 2005).
5.3.4.2
Motilität
In der vorliegenden Arbeit konnte eine signifikante Korrelation der subjektiv
geschätzten
Vorwärtsbeweglichkeit
mit
der
mittels
CASA
gemessenen
Vorwärtsbeweglichkeit nachgewiesen werden (r = 0,885; p < 0,001), wobei die
subjektiv geschätzten Mittelwerte durchschnittlich 12,5 ± 11,5 % über den mittels
CASA bestimmten Werten lagen. Bei getrennter Betrachtung der Nativejakulate
und der mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate fiel auf,
dass in den verdünnten Ejakulaten engere Korrelationen beobachtet werden
konnten als in den Nativejakulaten (siehe Kap. 4.4.2.1), was jedoch durch die im
Vergleich zum Nativsperma höhere Anzahl an getesteten Variablenpaaren bei den
verdünnten Proben oder durch die Verdünnung auf annähernd optimale
Konzentrationen für die CASA-Messungen (50-100 x 106 Spermien pro ml) bedingt
sein könnte. Die ermittelten Korrelationen sind übereinstimmend mit den
Aussagen in der Literatur (Günzel-Apel et al., 1993; Rijsselaere et al., 2003;
Schäfer-Somi et al., 2006; Schäfer-Somi und Aurich, 2007). Fraglich ist jedoch, ob
niedrige Motilitätsraten höhere Abweichungen zwischen der durch CASA
bestimmten und der geschätzten Motilität bedingen (Günzel-Apel et al., 1993).
Im Gegensatz zu den eigenen Ergebnissen lag die durch SpermVision ermittelte
Gesamtmotilität bei Schäfer-Somi und Aurich (2007) immer über der geschätzten
Motilität. Übereinstimmend mit den eigenen Untersuchungen wiesen auch
Gröpper (2004) und Rota et al. (2001) niedrigere Motilitätswerte mittels CASA im
Vergleich mit der subjektiven Beurteilung nach.
Möglicherweise kommen Unterschiede der mit den verschiedenen Methoden
bestimmten Motilitätswerte durch eine schlechte Unterscheidung zwischen
Eigelbpartikeln aus den Verdünnern und unbeweglichen Samenzellen seitens des
CASA-Systems zustande, wenn die Partikel eine ähnliche Größe besitzen wie die
Spermienköpfe (Verstegen et al., 2002). So könnte es zu einer Erhöhung des
gemessenen Anteils an unbeweglichen Samenzellen gekommen sein, was
letztlich in einer Unterschätzung der wahren Motilität resultierte. Allerdings wurde
die Spermienerkennung während der CASA-Messungen in der vorliegenden
Untersuchung stets verfolgt und es konnten kaum Fehlerkennungen beobachtet
213
Diskussion
werden. Eine vorherige Filtration der Verdünner zur Eliminierung der Eigelbpartikel
kann diese Fehlerquelle ausschließen (Günzel-Apel et al., 1993).
5.3.4.3
Viabilität
Die vorliegenden Ergebnisse zeigten eine signifikante Korrelation des mittels
Eosinausstrich bestimmten Anteils an lebenden Samenzellen mit der mittels CASA
gemessenen
Viabilität
(r = 0,743;
p < 0,001),
wobei
der
Anteil
lebender
Samenzellen durchschnittlich 12,5 ± 10,8 % höher war als die CASA-Viabilität. Bei
getrennter Betrachtung der Nativejakulate und der mit den verschiedenen
Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate konnten, wie auch schon bei der Motilität
beobachtet, in den verdünnten Ejakulaten engere Korrelationen nachgewiesen
werden als in den Nativejakulaten (siehe Kap. 4.4.3.1).
In der Literatur konnten bezüglich der Viabilität weitere Übereinstimmungen
zwischen konventionellen und modernen spermatologischen Analysemethoden
gefunden werden. Peña et al. (1998b; 2001) konnten beim Vergleich von
durchflusszytometrischer
Untersuchung
CFDA/PI-gefärbter
Proben,
mikroskopischer Beurteilung CFDA/PI-gefärbter Proben unter Epifluoreszenzbeleuchtung
und
Untersuchung
Eosin/Nigrosin-gefärbter
Proben
mittels
Phasenkontrastmikroskop für frisch verdünntes Sperma hohe Korrelationen
zwischen allen drei Methoden nachweisen. Auch Schäfer-Somi und Aurich (2007)
konnten in mit TRIS-Puffer verdünnten Ejakulaten eine signifikante Korrelation der
mittels SpermVision nach SYBR-14/PI-Färbung gemessenen Membranintegrität
und der nach CFDA-Färbung mittels fluoreszenzmikroskopischer Auszählung
bestimmten Membranintegrität nachweisen.
Beim Vergleich der SYBR-14/PI-Färbung (Beurteilung unter dem Fluoreszenzmikroskop) mit der Nigrosin/Eosin-Färbung sehen Rijsselaere et al. (2002a) die
Färbung mit SYBR-14/PI als die sensitivere Methode an, da durch diese
Fluoreszenztechnik
selbst
kleinste,
durch
die
Zentrifugation
verursachte
Membranschäden erkannt werden können, indem drei Zellpopulationen (lebende,
tote und moribunde Samenzellen) identifiziert werden. Letztere lassen sich durch
die konventionelle Nigrosin-Eosin-Färbung nicht nachweisen (Rijsselaere et al.,
2002a).
Niżański und Klimowicz (2005) wiesen in nativem Sperma signifikante
Korrelationskoeffizienten
zwischen
dem
durchflusszytometrisch
bestimmten
Prozentsatz an grün und rot fluoreszierenden Spermien nach SYBR-14/PI214
Diskussion
Färbung und dem mikroskopisch ermittelten Prozentsatz an lebenden oder toten
Spermien in Nigrosin-Eosin-Ausstrichen nach. In flüssigkonserviertem Sperma
waren die Korrelationskoeffizienten niedriger. Während der Flüssigkonservierung
bei 5°C für zehn Tage war der Prozentsatz an grün fluoreszierenden Spermien
nach SYBR-14/PI-Färbung stets niedriger als der Prozentsatz an lebenden
Spermien in den Nigrosin-Eosin-Ausstrichen (Niżański und Klimowicz, 2005).
Letzteres war in ähnlicher Weise auch in den vorliegenden Untersuchungen zu
beobachten. Möglicherweise kann auch hierfür der von Rijsselaere et al. (2002a)
beschriebene Erklärungsansatz herangezogen werden (siehe oben).
5.3.4.4
Spermaparameter
Die Berechnung verschiedener Korrelationen sollte zur Aufklärung möglicher
Zusammenhänge zwischen einzelnen Parametern beitragen.
Sowohl für die subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit (r = - 0,501; p < 0,001)
und die CASA-Vorwärtsbeweglichkeit (r = - 0,538; p < 0,001) als auch für den
Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich (r = - 0,672; p < 0,001) und die
CASA-Viabilität (r = - 0,535; p < 0,001) konnten signifikante negative Korrelationen
mit dem Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen nachgewiesen
werden. Die negative Korrelation zwischen der CASA-Vorwärtsbeweglichkeit und
dem Anteil an morphologisch veränderten Samenzellen war vergleichbar mit der
von Ellington et al. (1993) ermittelten signifikanten positiven Korrelation zwischen
dem Prozentsatz an vorwärtsbeweglichen Samenzellen (CASA) und dem
Prozentsatz an Samenzellen mit normaler Morphologie (Wright-Giemsa-Färbung).
Hingegen ist nach Kumi-Diaka (1993) die subjektiv geschätzte Motilität weder mit
dem Anteil an Mittelstückveränderungen der Samenzellen noch mit dem Anteil an
Schwanzveränderungen signifikant korreliert.
Weiterhin
waren
subjektiv
geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit
(r = - 0,525;
p < 0,001), die CASA-Gesamtmotilität (r = - 0,523; p < 0,001) sowie die CASAVorwärtsbeweglichkeit (r = - 0,552; p < 0,001) negativ korreliert mit dem Anteil an
Samenzellen mit nicht aufgerollter Geißel im HOS-Test. Dieser Zusammenhang
erscheint plausibel, da die Motilität teils von Transportmechanismen der Membran
und somit von der Integrität der Plasmamembran und teils von anderen
biochemischen Aktivitäten des Spermienmetabolismus abhängig ist (Jeyendran et
al., 1984; Kumi-Diaka, 1993). Obwohl England und Plummer (1993) keine
Korrelation zwischen dem HOS-Test und der Motilität verifizieren konnten, gelang
215
Diskussion
der Nachweis signifikanter positiver Korrelationen zwischen dem HOS-Test und
der Spermienmotilität (subjektiv geschätzte Gesamtmotilität und subjektiv
geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit bzw.
CASA-Gesamtmotilität
und
CASA-
Vorwärtsbeweglichkeit) zahlreichen Autoren in nativem (Kumi-Diaka, 1993; KumiDiaka und Badtram, 1994; Rodríguez-Gil et al., 1994; Pinto und Kozink, 2008), in
24 Std. bei 4°C gelagertem unverdünntem (Rodríguez-Gil et al., 1994), in
verdünntem (Kumi-Diaka und Badtram, 1994) und in aufgetautem TG-Sperma
(Rota et al., 2006; Pinto und Kozink, 2008).
Auch der Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich (r = - 0,522;
p < 0,001) und die CASA-Viabilität (r = - 0,724; p < 0,001) waren negativ korreliert
mit dem Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter Geißel im HOS-Test. Dies
bestätigt sinngemäß die Ergebnisse von Rodríguez-Gil et al. (1994), welche für
natives Sperma sowie für 24 Stunden bei 4°C gelagertes, unverdünntes Sperma
signifikante positive Korrelationen zwischen dem HOS-Test (Prozentsatz an
geschwollenen Spermienschwänzen) und der Viabilität (Färbung mit Trypanblau
und Giemsa) nachweisen konnten und ebenso die Ergebnisse von Pinto und
Kozink (2008), welche für natives sowie für aufgetautes Sperma eine signifikante
positive Korrelation zwischen dem HOS-Test (Anteil an Spermien mit aufgerollter
Geißel) und der Spermienviabilität (Eosin-Nigrosin-Färbung) ermitteln konnten.
Auch Jeyendran et al. (1984) konnten für humanes Sperma eine signifikante
positive Korrelation zwischen dem HOS-Test (Prozentsatz an geschwollenen
Spermienschwänzen) und dem Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich
verifizieren. Im Gegensatz dazu, konnten England und Plummer (1993) keine
Korrelation zwischen dem HOS-Test und der Vitalfärbung finden und auch nach
Kumi-Diaka und Badtram (1994) besteht zwischen dem HOS-Test und der
Lebend-Tot-Färbung keine signifikante Korrelation.
Die bislang publizierten Zusammenhänge zwischen Pathomorphologie und HOSTest sind kontrovers: Während England und Plummer (1993) keine Korrelation
zwischen der Morphologie und dem HOS-Test nachweisen konnten und auch
nach
Kumi-Diaka
(1993)
der
HOS-Test
weder
mit
dem
Anteil
an
Mittelstückveränderungen noch mit dem Anteil an Schwanzveränderungen
signifikant korreliert ist, konnte in den eigenen Untersuchungen sinngemäß
übereinstimmend mit Jeyendran et al. (1984) und Pinto und Kozink (2008) eine
signifikante
positive
Korrelation
zwischen
216
dem
Anteil
an
morphologisch
Diskussion
veränderten Samenzellen und dem Anteil an Samenzellen mit nicht aufgerollter
Geißel im HOS-Test ermittelt werden (r = 0,446; p < 0,001).
5.4 Schlussbetrachtung und Fazit für die Praxis
Die Flüssigkonservierung bei 4°C für zehn Tage bewirkte in der vorliegenden
Untersuchung in allen verdünnten Ejakulaten eine signifikante Abnahme der
Motilität, eine signifikante Verlangsamung der Spermiengeschwindigkeit und eine
signifikante Verminderung der Viabilität, während für die Pathomorphologie und
den Anteil an Samenzellen mit akrosomalen Veränderungen in fast allen
verdünnten
Ejakulaten
signifikante
Zunahmen
nachgewiesen
wurden.
Demgegenüber veränderten sich die Gradlinigkeit der Spermienbewegung (STR)
sowie die Anteile an Kopf- und Halsveränderungen der Samenzellen durch die
Flüssigkonservierung nicht signifikant. Eine zusätzliche nachteilige Beeinflussung
der Spermaqualität in den flüssigkonservierten Ejakulaten durch geringe
Blutbeimengungen war, übereinstimmend mit Rijsselaere et al. (2004b), nicht zu
beobachten.
Insgesamt konnte in den flüssigkonservierten Ejakulaten beurteilt anhand der
Motilität je nach Verdünner eine akzeptable Spermaqualität über mindestens ein
bis zwei (Up 1 + 2) bzw. fünf (Up 1) bzw. zehn Tage (CP, TE) aufrechterhalten
werden. Hingegen ließ sich hinsichtlich der Viabilität, der Pathomorphologie und
des Anteils an Samenzellen mit akrosomalen Veränderungen in fast allen
verdünnten Ejakulaten (CP, TE, Up 1) bis Tag 10 eine akzeptable Spermaqualität
konservieren. Dieser Zeitraum erscheint, ein gutes Besamungsmanagement
vorausgesetzt, ausreichend für den nationalen sowie für den internationalen
Versand des flüssigkonservierten Spermas und für die anschließende Lagerung
am Bestimmungsort bis zur Verwendung zur KB. Auch eine zweimalige KB im
Abstand von 24 bzw. 48 Stunden sollte in diesem Zeitraum möglich sein.
Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, den am besten geeigneten
Verdünner für die Flüssigkonservierung von caninem Sperma bei 4°C über eine
Lagerungsdauer von zehn Tagen zu bestimmen.
Bezüglich der Erhaltung der Motilität erwies sich der Verdünner CP den übrigen
Verdünnern eindeutig als signifikant überlegen. Der Verdünner TE zeigte
wiederum eine signifikante Überlegenheit gegenüber den Verdünnern Up 1 + 2 und
217
Diskussion
Up 1. Im Verdünner Up 1 + 2 wurde eine gute Motilität lediglich über 24 Stunden
erhalten, im Verdünner Up 1 dagegen bis einschließlich Tag 5. Hinsichtlich der
Konservierung der Viabilität war der Verdünner Up 1 den anderen Verdünnern
signifikant überlegen. Die Verdünner CP und TE zeigten wiederum eine
tendenziell (Anteil an lebenden Samenzellen im Eosinausstrich) bzw. eine
signifikant (CASA-Viabilität) bessere Konservierung der Viabilität als der
Verdünner Up 1 + 2. Bezüglich der Pathomorphologie erschien der Verdünner
Up 1 + 2 den übrigen Verdünnern tendenziell überlegen. Eine statistische
Signifikanz ließ sich jedoch nur im Vergleich zum Verdünner CP ermitteln. Der
Verdünner CP war hinsichtlich der Pathomorphologie wiederum dem Verdünner
TE signifikant überlegen.
Insgesamt betrachtet war der Verdünner CP der am besten geeignete Verdünner
für die Flüssigkonservierung von caninem Sperma bei 4°C über eine
Lagerungsdauer von zehn Tagen, was insbesondere durch die gute Erhaltung der
Motilität zum Ausdruck kam. Jedoch erwies sich auch der Verdünner TE für die
Flüssigkonservierung von Hundesperma über einen Zeitraum von zehn Tagen als
brauchbar. Eindeutige Vorteile des Verdünners CP gegenüber dem Verdünner TE
sind seine schnelle Verfügbarkeit und die einfache Handhabung.
Die Flüssigkonservierung mit dem Verdünner Up 1 + 2 kann aufgrund der
vorliegenden Ergebnisse nicht empfohlen werden, da die Resultate für die Motilität
und die Viabilität absolut nicht zufriedenstellend waren. Im Gegensatz dazu muss
von der Verwendung von Verdünner Up 1 zur Flüssigkonservierung caniner
Ejakulate nicht prinzipiell abgeraten werden, da mit diesem Verdünner über
mindestens fünf Tage durchaus gute Ergebnisse erzielt werden konnten. Eine
Kryokonservierung
entsprechend
aufgearbeiteter
Ejakulate
nach
Flüssig-
konservierung für ein oder zwei Tage ohne signifikanten Qualitätsverlust nach
dem Auftauen, verglichen mit der sofortigen Kryokonservierung, ist möglich
(Hermansson und Linde-Forsberg, 2006).
Da für die Auswahl von geeigneten Verdünnern für die Flüssigkonservierung die
objektive
Beurteilung
der
Spermaqualitätsparameter
von
entscheidender
Bedeutung ist, kam in der vorliegenden Arbeit, zusätzlich zu den subjektiven,
konventionellen Untersuchungsmethoden, das CASA-System SpermVision™ zum
Einsatz.
Die
mit
beiden
Methoden
bestimmten
Ergebnisse
für
die
Spermienkonzentration, die Motilität sowie die Viabilität waren größtenteils als
218
Diskussion
annähernd gleichwertig anzusehen, was sich auch in den ermittelten Korrelationen
widerspiegelte.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die KB beim Hund von
zunehmender Bedeutung ist. Daher sollten Praktiker, die diese Dienstleistung
anbieten wollen, sowohl mit den Techniken zur Bestimmung des optimalen
Besamungszeitpunktes und zur Samenübertragung als auch mit den Methoden
der Spermakonservierung vertraut sein. Für die Flüssigkonservierung caniner
Ejakulate kann auf Basis der vorliegenden Arbeit der kommerzielle Verdünner CP
empfohlen werden. Dieser zeichnet sich durch eine gute Erhaltung der
Spermaqualität über mindestens zehn Tage, eine schnelle Verfügbarkeit und eine
einfache Handhabung aus, wodurch er für den Einsatz in der Praxis gut geeignet
erscheint. Weiterhin scheint unter Praxisbedingungen die Beurteilung nativer
sowie flüssigkonservierter Ejakulate mittels konventioneller Methoden ausreichend
zu sein, da eine gute Übereinstimmung zu den objektiven Methoden besteht.
5.5 Offene Fragestellungen
Obwohl nach Verstegen et al. (2005) flüssigkonserviertes Sperma für mindestens
elf Tage fertil zu bleiben scheint, sind weiterführende Studien notwendig, um die
Fertilität des mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Spermas zu
untersuchen. Für die Beurteilung der Befruchtungsfähigkeit von Spermien in vitro
kommen mehrere Tests in Frage: Hier sind der ZP-Bindungstest, der HemizonaBindungstest, der ZP-Penetrationstest sowie die IVF zu nennen (Ström Holst et
al., 2000; 2001; Rijsselaere et al., 2005). Allerdings lassen in vitro Tests die
Interaktion zwischen den Spermien und dem weiblichen Genitale außer Acht.
Daher ist der beste Weg zur Untersuchung der Fertilität bzw. zur Untersuchung
von Verdünnern für die Spermakonservierung der Vergleich von Konzeptionsraten
nach KB (Oettlé, 1993; Rota et al., 1995). Da dies unter experimentellen
Bedingungen beim Hund normalerweise nicht möglich ist, werden, wie auch in
vorliegenden
Arbeit,
Spermiencharakteristika,
die
wichtig
für
die
Befruchtungsfähigkeit sind, in vitro untersucht (Rota et al., 1995). Vor allem der
Motilität wird bei der vergleichenden Untersuchung von Verdünnern viel
Bedeutung zugemessen (Tsutsui et al., 2003b) und in einigen Untersuchungen
wird sogar ausschließlich die Motilität beurteilt (Foote und Leonard, 1964;
219
Diskussion
Province et al., 1984; Bouchard et al., 1990). Verstegen et al. (2005) konnten
jedoch deutlich zeigen, dass offensichtlich erkennbare Motilität oder Immotilität
kein verlässliches Kriterium ist, um das Fertilitätspotenzial von caninem Sperma
zu beurteilen. Deshalb sollte in zukünftigen Untersuchungen bestimmt werden,
welche Spermaparameter für die Vorhersage der in vivo Fertilität am nützlichsten
sind. Für bovines Sperma konnten beispielsweise zwischen den kombinierten
Prozentsätzen von Motilität und Geschwindigkeit und der Fertilität hohe
Korrelationen ermittelt werden (Farrell et al., 1998). Für canines Sperma ist jedoch
noch immer unklar, welche der CASA-Motilitätsparameter von klinischem Wert für
die Vorrausage der Fertilität einer gegebenen Spermaprobe sind (Verstegen et al.,
2002). Zudem erschienen in der vorliegenden Arbeit auch die CASA-Einstellungen
an sich teilweise als verbesserungswürdig, was ebenfalls weiterführender
Untersuchungen bedarf.
220
Zusammenfassung
6
Zusammenfassung
Evaluierung
verschiedener
Verdünner
zur
Flüssigkonservierung
von
caninem Sperma
Die künstliche Besamung gewinnt in der Hundezucht immer mehr an Bedeutung.
Dabei können durch die Verwendung von flüssigkonserviertem Sperma selbst bei
vaginaler Deponierung des Samens i. d. R. deutlich bessere Trächtigkeitsraten
und höhere Wurfgrößen erzielt werden als mit kryokonserviertem Sperma, ein
optimales
Besamungsmanagement
vorausgesetzt.
Zudem
ist
die
Flüssigkonservierung von Sperma hinsichtlich Herstellung und Versand einfacher
und kostengünstiger als die Kryokonservierung. Limitierend beim Einsatz von
flüssigkonserviertem Sperma ist jedoch die begrenzte Überlebensdauer der
Samenzellen.
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Splitsample-Verfahren drei verschiedene
Verdünner
für
die
Flüssigkonservierung
von
caninem
Sperma
bei
4°C
vergleichend untersucht. Dabei handelte es sich um den kommerziellen Verdünner
CaniPRO™ Chill 10 (CP) und zwei nichtkommerzielle Verdünner (TRIS-FruktoseEigelb-Verdünner (TE) und Uppsala Equex-2 System). Beim zweiphasigen
Uppsala Equex-2 System waren zwei Versuchsteile zu unterscheiden: In
Versuchsteil I erfolgte die Verdünnung mit Verdünner 1 und Verdünner 2 des
Uppsala Equex-2 Systems (Up 1 + 2), in Versuchsteil II nur mit Verdünner 1 (Up 1).
Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es, den am besten geeigneten
Verdünner für die Flüssigkonservierung von Hundesperma bei 4°C über einen
Lagerungszeitraum von zehn Tagen zu bestimmen. Zudem sollte geprüft werden,
wie lange eine akzeptable Spermaqualität in den verdünnten Ejakulaten
aufrechterhalten werden kann. Dazu wurde von 30 Rüden jeweils ein Ejakulat
fraktioniert gewonnen und die spermienreiche Fraktion mittels klassischer und
moderner
spermatologischer
Untersuchungsmethoden
(CASA-System
SpermVision™) hinsichtlich Motilität (subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
(VW), CASA-Gesamtmotilität (GMCASA), CASA-Vorwärtsbeweglichkeit (VWCASA)),
Viabilität (Lebend-Tot-Anteil im Eosinausstrich (Lebende), CASA-Viabilität nach
SYBR-14/PI-Färbung
(ViaCASA)),
Pathomorphologie
(Eosinausstrich;
Patho),
akrosomaler Veränderungen (Spermac®-Färbung; AV) und funktioneller Integrität
der Plasmamembran (Anteil an membrandefekten Samenzellen im HOS-Test;
HOS) beurteilt. Im Anschluss wurden die Ejakulate in drei Aliquote geteilt und es
221
Zusammenfassung
erfolgte die Aufarbeitung mit den verschiedenen Verdünnern. Unmittelbar nach der
Herstellung (Tag 0) wurden in den verdünnten Ejakulaten die gleichen
Beurteilungsparameter untersucht wie in den Nativejakulaten. Nach 1, 2, 3, 5, 7
und 10 Tagen Lagerung bei 4°C wurden 100 µl-Aliquote der verdünnten Ejakulate
für fünf Minuten im Wasserbad auf 37°C angewärmt und anschließend hinsichtlich
VW, GMCASA, VWCASA, Lebende, ViaCASA, Patho und AV beurteilt.
Die in den Nativejakulaten untersuchten Spermaparameter variierten zwischen
den verschiedenen Rüden. Die durchschnittlich ermittelten Werte waren: VW
80,8 ± 9,5 %, GMCASA 70,9 ± 18,1 %, VWCASA 65,0 ± 19,9 %, Lebende 87,4 % (80,692,9 %), ViaCASA 82,7 % (71,0-91,9 %), Patho 10,3 % (SF = 1,66), AV 2,7 %
(SF = 2,63) und HOS 3,1 % (SF = 2,34). Durch die Verdünnung mit den
verschiedenen Verdünnern wurden die untersuchten Parameter mit Ausnahme
von HOS (CP: 5,0 % (SF = 2,23); TE: 4,7 % (SF = 2,12); Up 1 + 2: 8,0 %
(SF = 2,16); Up 1: 4,3 % (SF = 1,69) nicht wesentlich beeinflusst (Tag 0).
Insgesamt nahm die Spermaqualität über den Untersuchungszeitraum von zehn
Tagen
jedoch
in
allen
verdünnten
Ejakulaten
kontinuierlich
ab.
Die
Flüssigkonservierung bewirkte in allen verdünnten Ejakulaten eine signifikante
Reduktion der Motilität (VW, GMCASA, VWCASA), eine signifikante Verlangsamung
der Spermiengeschwindigkeit und eine signifikante Verminderung der Viabilität
(Lebende, ViaCASA), wohingegen es in fast allen verdünnten Ejakulaten zu einer
geringgradigen, aber signifikanten Zunahme der Pathomorphologie und zu einem
signifikanten Anstieg des Anteils an Samenzellen mit akrosomalen Veränderungen
kam. Ausgehend von einer initialen VW von 77,8 ± 11,4 % (CP) / 77,2 ± 14,3 %
(TE) / 73,8 ± 18,0 % (Up 1 + 2) / 75,8 ± 13,8 % (Up 1) unmittelbar nach der
Herstellung (Tag 0) war nach zehn Tagen noch eine VW von 58,2 ± 22,1 % (CP) /
49,3 ± 23,9 % (TE) / 3,5 ± 4,6 % (Up 1 + 2) / 16,2 ± 12,1 % (Up 1), nachweisbar. Die
ViaCASA an Tag 0 betrug 84,3 % (71,4-93,8 %) (CP) / 83,6 % (69,6-93,9 %) (TE) /
75,2 % (57,0-89,6 %) (Up 1 + 2) / 85,1 % (76,5-92,0 %) (Up 1) und verminderte sich
über den Untersuchungszeitraum auf 58,8 % (41,7-74,9 %) (CP) / 59,7 % (40,877,3 %) (TE) / 37,7 % (22,2-54,6 %) (Up 1 + 2) / 68,0 % (57,6-77,5 %) (Up 1) an
Tag 10. Demgegenüber nahm die Patho zwischen Tag 0 (CP: 7,4 % (SF = 2,21);
TE: 8,2 % (SF = 1,93); Up 1 + 2: 7,9 % (SF = 2,08); Up 1: 9,3 % (SF = 1,72)) und
Tag 10 (CP: 10,7 % (SF = 2,04); TE: 10,7 % (SF = 2,19); Up 1 + 2: 9,8 %
(SF = 2,26); Up 1: 10,6 % (SF = 1,96)) zu und auch für die AV konnte mit
Ausnahme der mit Up 1 + 2 verdünnten Ejakulate ein Anstieg zwischen Tag 0 (CP:
222
Zusammenfassung
4,2 % (SF = 2,43); TE: 3,9 % (SF = 2,67); Up 1 + 2: 6,6 % (SF = 2,18); Up 1: 2,8 %
(SF = 2,34)) und Tag 10 (CP: 7,6 % (SF = 2,57); TE: 8,5 % (SF = 2,14); Up 1 + 2:
4,0 % (SF = 2,72); Up 1: 8,2 % (SF = 1,78)) beobachtet werden. Die vorliegenden
Ergebnisse zeigen, dass in den mit CP und TE verdünnten Ejakulaten für eine
Lagerungsdauer von zehn Tagen eine akzeptable Spermaqualität aufrechterhalten
werden
konnte.
Die
Motilität
(VW,
GMCASA,
VWCASA)
sowie
die
Spermiengeschwindigkeit waren über den Untersuchungszeitraum im Verdünner
CP signifikant höher als in den anderen getesteten Verdünnern. Bezüglich der
Viabilität (Lebende, ViaCASA) erwies sich im Zeitverlauf der Verdünner Up 1 als
signifikant überlegen. Bei Betrachtung der Pathomorphologie war der Verdünner
Up 1 + 2 signifikant besser als der Verdünner CP und Letzterer wiederum
signifikant besser als
der Verdünner
TE. Hinsichtlich
der
akrosomalen
Veränderungen konnten mit dem Verdünner Up 1 signifikant bessere Ergebnisse
erzielt werden als mit dem Verdünner CP. Insgesamt betrachtet wurde die
Spermaqualität und insbesondere die Motilität jedoch im Verdünner CP am besten
konserviert, auch wenn die Unterschiede zu den anderen getesteten Verdünnern
nicht für alle Parameter signifikant waren. Aufgrund dessen scheint der Verdünner
CP den anderen getesteten Verdünnern überlegen und wird daher für die
Flüssigkonservierung von caninem Sperma bei 4°C empfohlen.
Da in der vorliegenden Arbeit allerdings ungeklärt bleibt, inwieweit sich die
Fertilität des flüssigkonservierten Spermas im Zeitverlauf verändert und welche
Auswirkungen die getesteten Verdünner auf den Erhalt der Befruchtungsfähigkeit
der Samenzellen haben, sind weitere Studien notwendig, um den Erhalt der
Befruchtungsfähigkeit während der Langzeit-Flüssigkonservierung in vivo und in
vitro näher zu charakterisieren.
223
Summary
7
Summary
Evaluation of different extenders for chilling of canine semen
The importance of artificial insemination in dog breeding has significantly
increased during the last decade. Using chilled semen, higher pregnancy rates
and litter sizes can be achieved compared to the use of cryopreserved semen,
even after vaginal deposition, provided that there is an optimal insemination
management. Furthermore, with regard to production and shipping, chilling of
semen is easier to perform and cheaper than cryopreservation. However, the
limited life span of sperm cells after chilling is limiting the use of extended semen.
In the present study, three different extenders were compared using split-sample
technique for chilling of canine semen and storage at 4°C. It concerned the
commercial extender CaniPRO™ Chill 10 (CP) and two non-commercial extenders
(TRIS-fructose-egg yolk extender (TE) and Uppsala Equex-2 system). With the
two-phase Uppsala Equex-2 system, two test parts have to be distinguished: In
part I of the experiment, both extenders (Up 1 + 2) were used for dilution; whereas
in part II of the experiment only extender 1 was used (Up 1). The aim of this study
was to determine the most suitable extender for chilling of dog semen over a
storage period of ten days at 4°C. In addition, it should be tested how long an
acceptable semen quality can be maintained in the diluted samples. Therefore,
from each of 30 males one fractionated ejaculate was collected and the sperm rich
fraction was examined by means of classical and modern spermatological
investigation methods (CASA-system SpermVision™) for motility (subjectively
estimated progressive motility (VW), total motility determined by CASA (GMCASA),
progressive motility determined by CASA (VWCASA)), viability (live-dead ratio in
eosin-stained smears (Lebende), viability determined by CASA after staining with
SYBR-14/PI
(ViaCASA)),
pathomorphology
(eosin-stained
smears;
Patho),
acrosomal changes (staining with Spermac®; AV) and functional integrity of the
plasma membrane (percentage of sperm cells with membrane defects in the HOS
test; HOS). Subsequently, the sperm rich fractions were divided into three equal
aliquots and processed with the different extenders. Immediately after dilution (day
0) the same parameters were examined in the diluted ejaculates as in the native
semen samples. After 1, 2, 3, 5, 7 and 10 days of storage at 4°C, aliquots of 100 µl
of the diluted ejaculates were pre-warmed at 37°C in the water bath for five
224
Summary
minutes and subsequently examined for VW, GMCASA, VWCASA, Lebende, ViaCASA,
Patho and AV.
In the fresh ejaculates, the investigated parameters varied between different
males. The average values were: VW 80.8 ± 9.5 %, GMCASA 70.9 ± 18.1 %, VWCASA
65.0 ± 19.9 %, Lebende 87.4 % (80.6-92.9 %), ViaCASA 82.7 % (71.0-91.9 %), Patho
10.3 % (DF = 1.66), AV 2.7 % (DF = 2.63) and HOS 3.1 % (DF = 2.34). With the
exception of HOS (CP: 5.0 % (DF = 2.23); TE: 4.7 % (DF = 2.12); Up 1 + 2: 8.0 %
(DF = 2.16); Up 1: 4.3 % (DF = 1.69)), the investigated parameters were not
substantially influenced by the dilution with the different extenders (day 0).
However, overall semen quality of the diluted semen samples decreased
continuously during the observation period of ten days. Chilling of ejaculates
caused a significant reduction of motility (VW, GMCASA, VWCASA), a significant
slowing down of sperm velocity and a significant decrease in viability (Lebende,
ViaCASA), whereas in almost all diluted ejaculates there was a slight, but significant
increase in pathomorphology and a significant augmentation in the proportion of
sperm cells with acrosomal changes. Starting from an initial VW of 77.8 ± 11.4 %
(CP) / 77.2 ± 14.3 % (TE) / 73.8 ± 18.0 % (Up 1 + 2) / 75.8 ± 13.8 % (Up 1)
immediately after dilution (day 0), after ten days there was still a VW of
58.2 ± 22.1 % (CP) / 49.3 ± 23.9 % (TE) / 3.5 ± 4.6 % (Up 1 + 2) / 16.2 ± 12.1 %
(Up 1). ViaCASA on day 0 was 84.3 % (71.4-93.8 %) (CP) / 83.6 % (69.6-93.9 %)
(TE) / 75.2 % (57.0-89.6 %) (Up 1 + 2) / 85.1 % (76.5-92.0 %) (Up 1) and decreased
during the observation period to 58.8 % (41.7-74.9 %) (CP) / 59.7 % (40.8-77.3 %)
(TE) / 37.7 % (22.2-54.6 %) (Up 1 + 2) / 68.0 % (57.6-77.5 %) (Up 1) on day 10. In
contrast, Patho increased from day 0 (CP: 7.4 % (DF = 2.21); TE: 8.2 %
(DF = 1.93); Up 1 + 2: 7.9 % (DF = 2.08); Up 1: 9.3 % (DF = 1.72)) to day 10 (CP:
10.7 % (DF = 2.04); TE: 10.7 % (DF = 2.19); Up 1 + 2: 9.8 % (DF = 2.26); Up 1:
10.6 % (DF = 1.96)) and also for AV, there was with the exception of the ejaculates
diluted with Up 1 + 2 an increase from day 0 (CP: 4.2 % (DF = 2.43); TE: 3.9 %
(DF = 2.67); Up 1 + 2: 6.6 % (DF = 2.18); Up 1: 2.8 % (DF = 2.34)) to day 10 (CP:
7.6 % (DF = 2.57); TE: 8.5 % (DF = 2.14); Up 1 + 2: 4.0 % (DF = 2.72); Up 1: 8.2 %
(DF = 1.78)). These results show that in the ejaculates diluted with CP and TE, an
acceptable semen quality could be maintained for a storage period of ten days.
During the observation period, motility (VW, GMCASA, VWCASA) and sperm velocity
were significantly higher in samples extended with CP than in samples extended
with the other extenders tested. Regarding viability (Lebende, ViaCASA) over time,
225
Summary
the Up 1 extender proved to be significantly superior to the other extenders.
Concerning pathomorphology, the Up 1 + 2 extender was significantly better than
the CP extender and the latter in turn significantly better than the TE extender.
With regard to the acrosomal changes, significantly better results could be
obtained with the Up 1 extender than with the CP extender. However, overall
semen quality and in particular motility was best preserved in the CP extender,
even if the differences to the other extenders tested were not significant for all the
parameters. Due to these results, the extender CP seems to be superior to the
other extenders tested and is therefore recommended for chilling of canine semen
at 4°C.
However, as in the present study it remained unclear to what extent the fertility of
the chilled, extended semen changes over time and what effects the extenders
tested have on preservation of the fertilizing capacity of the sperm cells, further
studies are necessary to characterize the preservation of the fertilizing capacity in
vivo and in vitro.
226
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Tierärztl. Prax. 29 (K), 116-120
zur
Beurteilung
von
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Effects of glucose and fructose on motility patterns of dog spermatozoa from fresh
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Theriogenology 56 (5), 801-815
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Effect of centrifugation on in vitro survival of fresh diluted canine spermatozoa
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Effect of technical settings on canine semen motility parameters measured by the
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Theriogenology 60 (8), 1553-1568
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Automated sperm morphometry and morphology analysis of canine semen by the
Hamilton-Thorne analyzer
Theriogenology 62 (7), 1292-1306
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Effect of blood admixture on in vitro survival of chilled and frozen-thawed canine
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In vitro capacitation of fresh, chilled and frozen-thawed dog spermatozoa
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Effect of the inclusion of skimmed milk in freezing extenders on the viability of
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Pregnancy and conception rate after two intravaginal inseminations with dog
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Untersuchungen
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Transmigrationsrate
Hundesperma
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Use of chilled semen in dogs
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Recovery of motile, membrane-intact spermatozoa from canine epididymides
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249
Anhang
9
Anhang
9.1 Geräte
- Waage:
Mettler-Toledo GmbH, Typ PJ 300
- Magnetrührer:
Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Typ MR 2000
- Wärmeschrank:
Memmert GmbH & Co. KG
- Wärmebad:
Memmert GmbH & Co. KG, Typ WNB 45
- Wärmeplatte:
Helmut Hund GmbH, Typ HT 200
- Heiztisch:
Minitüb GmbH, Typ HT 200
(beheizte Arbeitsplatte und Mikroskopiertisch)
- Zentrifuge:
Heraeus Christ, Labofuge I
- Kühlschränke:
- Miele & Cie. KG, Typ KD 14505
- Bauknecht Hausgeräte GmbH, Typ Bauknecht ***
- Bechergläser:
Schott North America, Inc.
- Tulpengläser:
Minitüb GmbH
- Erythrozytenmischpipette nach Thoma: MAGV GmbH
- Neubauer-Zählkammer: Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH
- Deckgläser, optisch plan geschliffen, für Hämozytometer, 20 x 26 mm:
Gerhard Menzel, Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG (Menzel-Gläser®)
- Zentrifugenröhrchen:
Schott North America, Inc.
- Pipetten:
- Eppendorf AG, Eppendorf-Pipette 20 µl
- Eppendorf AG, Eppendorf-Pipette 100 µl
- Eppendorf AG, Eppendorf-Pipette 1000 µl
- Rainin Instrument LLC, Pipet-Lite LTS 0,5 - 10 µl
- Mikroskope:
- Leica Microsystems GmbH, Leica CM E
- Helmut Hund GmbH, hund H 500
(Phasenkontrastmikroskop mit Heiztisch)
- Zählgerät:
Karl Hecht GmbH & Co KG, „Assistent“ Counter 345/15,
Typ AC-15 PC
- SpermVision™:
- Mikroskop: Olympus Deutschland GmbH StandardLabormikroskop BX 41
- Hochgeschwindigkeits-schwarz/weiß-Digitalkamera,
Farbbildkamera
250
Anhang
- Rechner: Pentium® 4D (Dual Core) Computer mit 3.0
GHz
Prozessor
und
Betriebssystem
Microsoft
Windows XP Professional, Vista comp. Grafikkarte,
19“ TFT-Monitor
- SpermVision™-Softwarepaket (Version 3.5.6.2. – Juli
2009)
9.2 Analyseeinstellungen des SpermVision™-Systems
SpermVision™ Version 3.5.6.2. – Juli 2009,
Benutzerhandbuch Manual 12049/0586
Einstellung: RUDE TG
Motilitätsanalyse
- Probenschichtdicke:
20 µm
- Pixel zu µm Verhältnis:
168 zu 100
- Spermienerkennung:
Fläche von 20 bis 60 µm2
- Zählkriterien:
4000 Spermien oder 8 Felder
(Konzentrationsmessung: 8 Felder)
- Punkte bei der Spermienbewegung:
11
- Level 1-Klassifizierung:
- unbewegliche Spermien:
AOC < 9,5°
(Darstellungsfarbe rotbraun)
- lokalbewegliche Spermien:
DSL < 6,0 µm
(Darstellungsfarbe gelb)
- vorwärtsbewegliche Spermien:
AOC ≥ 9,5° und DSL ≥ 6,0 µm, d. h.
jede
Zelle,
die
nicht
als
„unbeweglich“ oder „lokalbeweglich“
eingestuft wurde.
(Darstellungsfarbe hellgrün)
- Level 2-Klassifizierung:
Die Level 2-Klassifizierung wird bei der Untersuchung der vorwärtsbeweglichen
Spermien angewendet.
- hyperaktive Spermien:
VCL > 118 µm/s, ALH > 6,5 µm und
LIN < 0,5 (Darstellungsfarbe blau)
251
Anhang
- lineare Spermien:
STR > 0,9 und LIN > 0,5
(Darstellungsfarbe hellgrün)
- nicht lineare Spermien:
STR ≤ 0,9 und LIN ≤ 0,5
(Darstellungsfarbe hellblau)
- kurvilineare Spermien:
DAP/Radius ≥ 3 und LIN < 0,5
(Darstellungsfarbe weiß)
Viabilitätsanalyse
- Probenschichtdicke:
20 µm
- Pixel zu µm Verhältnis:
108 zu 100
- Spermienerkennung:
grüne Fläche: 20 bis 600 µm2
rote Fläche: 10 bis 800 µm2
- Maximale Fläche der einzelnen Zelle:
grün: 150 µm2
rot: 200 µm2
- Zählkriterien:
4000 Spermien oder 30 Felder
- Darstellungsfarbe intakte Spermien:
hellblau
- Darstellungsfarbe geschädigte Spermien:
gelb
Sonstige Einstellungen
- erlaubte Standardabweichung:
15 %
- Lichteinstellung bei Motilitätsanalyse:
80 bis 110
- Volumen pro Messkammer:
2,5 µl
- Analysetemperatur:
37°C
- Framerate (Bildfrequenz):
60 Frames/s
- Volumen von SYBR-14/PI pro Tube:
2,5 µl
- Inkubationszeit:
10 Minuten
9.3 Verbrauchsmaterialien
- Leja® Standard Count 4 Chamber Slide, 20 µm:
Leja Products B. V.
- Pipettenspitzen 10 µl, farblos:
Sarstedt AG & Co.
- Pipettenspitzen 200 µl, gelb:
Sarstedt AG & Co.
- Pipettenspitzen 1000 µl, blau:
Sarstedt AG & Co.
- bioclean™ Precision Pipette Tips:
Rainin Instrument LLC
252
Anhang
- Objektträger, 76x26x1 mm, Kanten geschnitten, ohne Mattrand:
Interessengemeinschaft der Laborfachhändler GmbH & Co KG
- Deckgläser, 18x18 mm:
Karl Hecht GmbH & Co KG
- pH-Indikatorpapier, pH 5,4 - 7,0 Spezialindikator: Merck KGaA
- Parafilm®:
Pechiney Plastic Packaging
- Safe-Lock Tubes à 0,5 ml, braun:
Eppendorf AG
- Eppendorf-Reaktionsgefäße à 1,5 ml:
Eppendorf AG
- BRAUN Injekt® 5 ml Einwegspritzen:
B. Braun Melsungen AG
- BD Falcon™ Konisches Röhrchen, 15 ml,:
BD
9.4 Chemikalien
- Citronensäure-Monohydrat, krist. Reinst
C6H8O7*H2O
Merck KGaA
M = 210,14 g/mol
- D(-)-Fruktose, > 99,5 %, für die Biochemie
C6H12O6
- Eosin B (bläulich)
C20H6Br2N2Na2O9
Carl Roth GmbH & Co. KG
M = 180,16 g/mol
(Art.-Nr.: 4981.1)
(C. I. 45400)
Merck KGaA
M = 624,10 g/mol
- Equex
Tierarztpraxis
Dr. K. & C. Blendinger
- Frische Eier aus Freilandhaltung, Güteklasse A
Gut Frielingshof,
Inter-ovo GmbH
- Glycerol ReagentPlus™, ≥ 99 %, G7757 – 500 ml Sigma-Aldrich Chemie GmbH
- LIVE/DEAD® Sperm Viability Kit (L 7011)
Invitrogen™ - Molecular
Probes™
COMPONENT A: SYBR® 14 dye reagent (100 µl)
1 mM solution in DMSO
COMPONENT B: propidium iodide (5 ml)
2,4 mM solution in water
- Spermac Stain™, Sperm Morphology Kit
FertilPro N. V.
50 ml Fixative, 3 x 50 ml Stain A, B, C
- TRIS Ultra Qualität, PUFFERAN® ≥ 99,9 %
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
C4H11NO3
Carl Roth GmbH & Co. KG
(Art.-Nr.: 5429.3)
M = 121,14 g/mol
253
Anhang
9.5 Rezepte der verwendeten Medien
9.5.1 Rezepte der Verdünner
9.5.1.1
TRIS-Fruktose-Eigelb-Verdünner für flüssigkonservierten Hundesamen
(Linde-Forsberg, 2001)
9.5.1.2
TRIS
3,025 g
Zitronensäure
1,7 g
Fruktose
1,25 g
Aqua dest.
ad 100 ml
Eigelb
20 ml
Benzylpenicillin
1 mg/ml
Dihydrostreptomycinsulfat
1 mg/ml
Uppsala-Verdünner für die Kryokonservierung von Hundesamen
(Linde-Forsberg, 2001)
Uppsala Equex-2 System
Verdünner 1
TRIS
3,025 g
Zitronensäure
1,7 g
Fruktose
1,25 g
Streptomycin
0,1 g
Aqua dest.
ad 77 ml
Benzylpenicillin
0,06 g (in 0,3 ml Aqua dest.)
Glycerol
3 ml
Eigelb
20 ml
Die Osmolarität beträgt 865 mOsm, der pH 6,72.
Verdünner 2
TRIS
3,025 g
Zitronensäure
1,7 g
Fruktose
1,25 g
Streptomycin
0,1 g
Aqua dest.
ad 72 ml
Benzylpenicillin
0,06 g (in 0,3 ml Aqua dest.)
254
Anhang
Glycerol
7 ml
Equex
1 ml
Eigelb
20 ml
Die Osmolarität beträgt 1495 mOsm, der pH 6,74.
Auftaumedium
TRIS
3,025 g
Zitronensäure
1,7 g
Fruktose
1,25 g
Streptomycin
0,1 g
Aqua dest.
ad 100 ml
Benzylpenicillin
0,06 g (in 0,3 ml Aqua dest.)
Die Osmolarität beträgt 324 mOsm, der pH 6,76.
9.5.2 Zusammensetzung des Verdünners CaniPRO™ Chill 10
(Manual CaniPRO™ Chill 10, Minitüb)
-
Reinstwasser
-
Natriumzitrat
-
TRIS
-
Glukose
-
Fruktose
-
Herstellereigene Bestandteile
-
Gentamicin
9.5.3 Rezepte diverser Gebrauchslösungen
9.5.3.1
9.5.3.2
Eosin-Färbelösung (Hoffmann, 2003b)
-
2 g Eosin-B
-
3 g Natriumzitrat
-
ad 100 ml Aqua dest.
Hypoosmotische Lösung (150 mosmol)
(Jeyendran et al., 1984; Riesenbeck et al., 2001; Hoffmann, 2003b)
-
0,735 g Natriumzitrat
-
1,351 g Fruktose
-
ad 100 ml Aqua dest.
255
Anhang
9.5.3.3
Färbelösung für die Viabilitätsanalyse
LIVE/DEAD® Sperm Viability Kit (Invitrogen™ - Molecular Probes™)
Herstellungsanleitung (nach Minitüb):
Die Komponenten der Färbelösung sind lichtempfindlich. Darauf sollte während
der Herstellung und auch während der Lagerung Rücksicht genommen werden.
2,5 µl der Färbelösung bestehen aus:
-
1,2 µl Androhep®-Verdünner
-
0,05 µl SYBR-14
-
1,25 µl PI
Für die Herstellung werden 0,12 ml Androhep®-Verdünner mit 5 µl SYBR-14 und
0,125 ml PI gemischt. Das daraus entstehende Volumen von 0,25 ml wird
anschließend auf 100 braune Eppendorf-Reaktionsgefäße (Safe-Lock Tubes
0,5 ml; Eppendorf AG, Hamburg) aufgeteilt, sodass sich in jedem Gefäß 2,5 µl der
Färbelösung befinden. Bis zum Gebrauch sollte die Färbelösung bei -20°C
aufbewahrt werden.
9.6 Herstellerangaben
Bauknecht Hausgeräte GmbH
Tel.: 0711 / 81071-0
Industriestr. 48
Fax: 0711 / 81071-3333
70565 Stuttgart, Deutschland
E-Mail:
[email protected]
Webseite: www.bauknecht.de
BD (Becton, Dickinson and Company)
(Becton Dickinson GmbH
One Becton Drive
Tullastr. 8 – 12
Franklin Lakes, NJ 07417, USA
69126 Heidelberg, Deutschland
Tel.: +49 (0) 6221 / 305-0
Fax: +49 (0) 6221 / 305-216)
Webseite: www.bd.com
Tierarztpraxis Dr. K. & C. Blendinger
Tel.: 06122 / 535868-0
Robert-Bosch-Str. 12
Fax: 06122 / 535868-45
65719 Hofheim-Wallau, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.blendivet.de
256
Anhang
B. Braun Melsungen AG
Postfach 1120
Carl-Braun-Str. 1
34209 Melsungen, Deutschland
34212 Melsungen, Deutschland
Tel.: 05661 / 71-0
Fax: 05661 / 71-4567
Webseite: www.bbraun.de
Eppendorf AG
Tel.: +49 (0) 40 / 53801-0
Barkhausenweg 1
Fax: +49 (0) 40 / 53801-556
22331 Hamburg, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.eppendorf.de
FertilPro N. V.
Tel.: +32 50 791805
Industriepark Noord 32
Fax: +32 50 791799
8730 Beernem, Belgien
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.fertipro.com
Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG
Tel.: +49 (0) 9779 / 808-0
Stettener Str. 22-24
Fax: +49 (0) 9779 / 808-88
97647 Sondheim, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.hecht-assistent.de
Heidolph Instruments GmbH & Co.KG
Tel.: +49 (0) 9122 / 9920-0
Walpersdorfer Str. 12
Fax: +49 (0) 9122 / 9920-65
91126 Schwabach, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.heidolphinstruments.de
Heraeus Holding GmbH
Tel.: +49 (0) 6181 / 35-0
Heraeusstr. 12-14
Fax: +49 (0) 6181 / 35-35 50
Postfach 1561
E-Mail: [email protected]
63450 Hanau, Deutschland
Webseite: www.heraeus.de
Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH
Tel.: +49 (0) 40 / 739204-0
Rudorffweg 10
Fax: +49 (0) 40 / 7304148
21031 Hamburg, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.herenz.de
257
Anhang
Helmut Hund GmbH
Tel.: +49 (0) 6441 / 2004-0
Wilhelm-Will-Str. 7
Fax: +49 (0) 6441 / 2004-44
35580 Wetzlar, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.hund.de
Interessengemeinschaft der
Tel.: 06187 / 93900
Laborfachhändler GmbH & Co KG
Robert-Bosch-Str. 3
61130 Nidderau, Deutschland
Inter-ovo GmbH
Tel.: 07146 / 28386
Am Schloss 3
71686 Remseck, Deutschland
Invitrogen™ - Molecular Probes™
Tel.: (541) 465-8300
29851 Willow Creek Road
Fax: (541) 335-0504
Eugene, OR 97402, USA
Webseite: probes.invitrogen.com
Leica Microsystems GmbH
Tel.: +49 (0) 6441 / 29-0
Ernst-Leitz-Str. 17-37
Fax: +49 (0) 64 41 / 29-2590
35578 Wetzlar, Deutschland
Webseite: www.leicamicrosystems.com
Leja Products B. V.
Tel.: +31 (0) 252-621848
Luzernestraat 10
Fax: +31 (0) 252-621806
2153 GN Nieuw-Vennep, Niederlande
Webseite: www.leja.nl
MAGV GmbH
Tel.: 06407 / 90388
Laborbedarf und Laborgeräte
Fax: 06407 / 8727
Gießener Str. 48
E-Mail: [email protected]
35466 Rabenau, Deutschland
Webseite: www.magv-gmbh.de
Memmert GmbH & Co. KG
Tel.: +49 (0) 9122 / 925-0
Äußere Rittersbacher Str. 38
Fax: +49 (0) 9122 / 14585
91126 Schwabach, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.memmert.com
258
Anhang
Gerhard Menzel,
Tel.: +49 (0) 531 / 590080
Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG
Fax: +49 (0) 531 / 509799
Saarbrückener Str. 248
Webseite: www.menzel.de
38116 Braunschweig, Deutschland
Merck KGaA
Tel.: +49 (0) 6151 / 72-0
Frankfurter Str. 250
Fax: +49 (0) 6151 / 72-2000
64293 Darmstadt, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.merck.de
Mettler-Toledo GmbH
Tel.: +49 (0) 641 / 5070
Ockerweg 3
Fax: +49 (0) 641 / 52951
Postfach 110840
Webseite: de.mt.com
35353 Gießen, Deutschland
Miele & Cie. KG
Tel.: 05241 / 89-0
Carl-Miele-Str. 29
Fax: 05241 / 89-2090
33332 Gütersloh, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Postfach 33325 Gütersloh
Webseite: www.miele.de
Minitüb GmbH
Tel.: +49 (0) 8709 / 9229-0
Hauptstr. 41
Fax: +49 (0) 8709 / 9229-39
84184 Tiefenbach, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.minitube.de
Olympus Deutschland GmbH
Tel.: +49 (0) 40 / 23773-0
Wendenstr. 14–18
Fax: +49 (0) 40 / 230817
20097 Hamburg, Deutschland
E-Mail: [email protected]
[email protected]
Webseite: www.olympus.de
Osram GmbH
Tel.: +49 (0) 89 / 6213-0
Hellabrunner Str. 1
Fax: +49 (0) 89 / 6213-2020
81543 München, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.osram.de
259
Anhang
Pechiney Plastic Packaging
Tel.: 920-727-6188
289 River St
Webseite: www.pechineyplastic
Menasha, WI 54952, USA
packaging.com
Rainin Instrument LLC
Ordering: 800-472-4646
7500 Edgewater Drive
Tel: 510-564-1600
P.O. Box 2160
Fax: 510-564-1727
Oakland, CA 94621-3027, USA
Webseite: www.rainin.com
Carl Roth GmbH & Co. KG
Tel.: +49 (0) 721 / 5606-0
Schoemperlenstr. 1-5
Fax: +49 (0) 721 / 5606-149
76185 Karlsruhe, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Postfach 100121, 76231 Karlsruhe
Webseite: www.carlroth.de
Sarstedt AG & Co.
Tel.: +49 (0) 2293 / 305-0
Sarstedtstraße
Fax: +49 (0) 2293 / 305-282
Postfach 1220
E-Mail: [email protected]
51582 Nümbrecht, Deutschland
Webseite: www.sarstedt.com
Schott North America, Inc., Corporate Office
Tel.: +1 (914) 831-2200
555 Taxter Road
Fax: +1 (914) 831-2201
Elmsford, NY 10523, USA
Webseite: www.us.schott.com
Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH
Tel.: 05137 / 8238-0
Wunstorferstr. 40
Fax: 05137 / 8238-120
30926 Seelze, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.sigmaaldrich.com
Sigma-Aldrich Chemie GmbH
Tel.: 07329 / 97-0
Riedstr. 2
Fax: 07329 / 97-2160
89555 Steinheim, Deutschland
E-Mail: [email protected]
Webseite: www.sigmaaldrich.com
260
Anhang
9.7 Verdünner zur Flüssigkonservierung von caninem Sperma
9.7.1 Milchverdünner
Tab. A1: Name, Zusammensetzung, pH-Wert und Osmolarität von milchbasierten
Verdünnern für die Flüssigkonservierung von Hundesperma
Verdünner
Zusammensetzung
pH-Wert
MagermilchVerdünner
100 ml Magermilch, erhitzt auf
92-95°C für 10 Minuten und
abgekühlt;
Penicillin 500-1000 IU/ml;
Streptomycin 1 mg/ml
(Antibiotikazusatz nur bei
Foote, 1964b und Province et
al., 1984)
homogenisierte, sterilisierte
Milch mit 2 % Fett
homogenisierte, pasteurisierte
Vollmilch, erhitzt auf 92-94°C
für 10 Minuten und abgekühlt;
Penicillin 1000 IU/ml;
Dihydrostreptomycin
1000 µg/ml (Antibiotikazusatz
nur bei Foote und Leonard,
1964 und Foote, 1964b)
sterilisierte Sahne mit 9 % Fett
6,46 ± 0,02
pasteurisierte Milch (0,1 %
Fett); Eigelb 20 %;
Benzylpenicillin 1 mg/ml;
Dihydrostreptomycinsulfat
1 mg/ml
ultrahocherhitzte Sahne (12 %
Fett); Eigelb 20 %;
Benzylpenicillin 1 mg/ml;
Dihydrostreptomycinsulfat
1 mg/ml
homogenisierte, pasteurisierte
Sahne (12 % Fett) 80 %;
Eigelb 20 %;
Benzylpenicillin 1000 IU/ml;
Dihydrostreptomycin 1 mg/ml
Trockenmagermilch 24 g;
Glukose 49 g;
Natriumbikarbonat 13 g;
Aqua bidest. ad 1000 ml
6,56 ± 0,04
297 ± 3,35
6,40 ± 0,02
308 ± 4,3
Niedrig-FettMilchverdünner
VollmilchVerdünner
Sahne-Verdünner
Eigelb-MilchVerdünner
Eigelb-SahneVerdünner
Sahne-EigelbVerdünner
Kenney-Verdünner
bzw. NFDMS-G(Non Fat Dried Milk
Solid-Glucose)Verdünner
9.7.2 TRIS-gepufferte Eigelb-Verdünner
261
Osmolarität
(mOsmol/l)
277 ± 4
Quellen
Foote, 1964b;
Seager und
Fletcher, 1972;
Christiansen,
1984a;
Province et al.,
1984
Christiansen,
1984a
Harrop, 1954;
1956;
Bartlett,
1962a; Foote,
1964b; Foote
und Leonard,
1964
Foote und
Leonard, 1964
Rota et al.,
1995
Rota et al.,
1995
LindeForsberg,
1991
6,6
340
Bouchard et
al., 1990;
England und
Ponzio, 1996;
Schäfer et al.,
1997
1,4 g
1,36 g
2,4 g
2,44 g
1,7 g
60 mM
(BSA 3 %)
63 mM
1,3 g
1,7 g
1,7 g
3,025 g
200 mM
200 mM
3,0 g
3,025 g
2,4 g
1,7 g
3,025 g
3,025 g
1,7 g
Zitronensäuremonohydrat
1,3 g
Grundlage
3,025 g
2,4 g
TRIS
1,7 g
Natriumzitratmonohydrat
70 mM
(DGlukose)
1,261 g
(DGlukose)
1,275 g
50 mM
1,25 g
0,82 g
0,8 g
Glukose
1,25 g
1,25 g
1,0 g
1,25 g
1,0 g
Fruktose
Dextrose
ad
100 ml
ad
100 ml
(bidest.)
80 ml
ad
100 ml
ad
100 ml
ad
100 ml
ad
100 ml
100 ml
ad
77 ml
80 ml
Aqua
dest.
72,2 ml
262
8 %
3 ml
8,8 ml
Glycerol
20 %
20 %
20 ml
20 %
20 %
20 %
20 %
20 %
20 %
20 ml
20 %
20 ml
20 ml
Eigelb
Penicillin 1000 IU/ml;
Dihydrostreptomycin 1 mg/ml
Penicillin G-Kalium
100000 IU;
Streptomycinsulfat 0,1 g
Benzylpenicillin 100 IU/ml;
Dihydrostreptomycinsulfat
100 µg/ml
Benzylpenicillin 1 mg/ml;
Dihydrostreptomycinsulfat
1 mg/ml
Na-Benzylpenicillin 0,1 g;
Streptomycinsulfat 0,1 g
Benzylpenicillin 0,06 g;
Dihydrostreptomycin 0,1 g
Benzylpenicillin 0,06 g;
Streptomycin 0,1 g
Na-Benzylpenicillin
100000 IU;
Streptomycinsulfat 0,1 g
Penicillin 500 IU/ml;
Streptomycinsulfat 1 mg/ml
Benzylpenicillin 100 mg;
Dihydrostreptomycinsulfat
100 mg
Penicillin 1000 IU/ml;
Dihydrostreptomycin 1 mg/ml
Antibiotika
6,68 ± 0,04
6,05
6,8
6,82
6,55 ± 0,02
6,72
pH-Wert
320,7 ± 28,3
330
326
381
301 ± 0,2
865
Osmolarität
(mOsmol/l)
Rota et al., 1995;
Linde-Forsberg,
2001; Beccaglia et
al., 2009a
Nishiyama et al.,
1999
Tsutsui et al., 2003b
Peña et al., 2006
Niżański et al., 2009
Ponglowhapan et al.,
2004
Iguer-Ouada und
Verstegen, 2001b;
Verstegen et al.,
2005; Varela Junior
et al., 2009
Shahiduzzaman und
Linde-Forsberg, 2007
Province et al., 1984
Christiansen, 1984a
Hermansson und
Linde-Forsberg, 2006
Michael et al., 2008;
2009; 2010
Gill et al., 1970
Quellen
Tab. A2: Zusammensetzung, pH-Wert und Osmolarität verschiedener TRIS-gepufferter Eigelb-Verdünner für die Flüssigkonservierung
von Hundesperma
Anhang
1,7 g
3,025 g
1,7 g
1,78 g
5,76 g
3,025 g
3,028 g
12,10 g
3,025 g
1,7 g
3,025 g
1,7 g
(DFruktose)
1,275 g
1,25 g
1,25 g
1,25 g
1,25 g
4,5 g
(bidest.)
ad
100 ml
ad
100 ml
100 ml
ad 80 ml
(bidest.)
ad
100 ml
263
Anhang
20 %
20 %
20 %
20 %
20 ml
20 %
Natriumpenicillin
100000 IU;
Streptomycin 200 g
Streptomycin 0,1 g
Benzylpenicillin 100 mg;
Dihydrostreptomycinsulfat
100 mg
Na-Benzylpenicillin 0,1 g;
Streptomycinsulfat 0,1 g
Benzylpenicillin 0,06 g;
Streptomycin 0,1 g
Gentamicin 0,2 g
6,06
6,84
TRISPuffer:
6,7
Eigelb:
6,2
6,78
332
364
TRISPuffer:
324
Eigelb:
297
325
Günzel, 1986;
Günzel-Apel et al.,
1993; Pesch et al.,
2007
Kumi-Diaka und
Badtram, 1994
Ponglowhapan et
al., 2004
Hermansson und
Linde-Forsberg,
2006
Iguer-Ouada und
Verstegen, 2001b
Kmenta et al.,
2011
Anhang
9.7.3 Sonstige Verdünner
Tab. A3: Name, Zusammensetzung, pH-Wert und Osmolarität
Verdünner für die Flüssigkonservierung von Hundesperma
Verdünner
Zusammensetzung in g/100 ml
pH-Wert
CaprogenVerdünner
Natriumzitratdihydrat 1,56 g;
Glycin 0,78 g; Glukose 0,23 g;
N-Kapronsäure (2,5 %ige Lsg.)
1,0 ml; Katalase (45 mg/100 ml
Lsg.) 1,0 ml; Eigelb 20 ml;
Penicillin 500 IU/ml; Streptomycinsulfat 1 mg/ml; unmittelbar
vor dem Gebrauch für 15-20 Min.
bei 5°C mit Stickstoffgas begast
Natriumzitrat (2,9 % ige Lsg.)
80 %; Eigelb 20 %
Zitronensäure 1,16 g;
Glycin 0,75 g; Glukose 1,0 g;
Eigelb 20 ml; Aqua bidest. 80 ml;
Penicillin G-Kalium 100000 IU;
Streptomycinsulfat 0,1 g
Natriumzitratdihydrat 1,45 g;
Glycin 0,937 g; Glukose 1,25 g;
Aqua bidest. ad 100 ml; Eigelb
20 %; Penicillin 1000 IU/ml;
Dihydrostreptomycin 1000 µg/ml
Natriumzitratdihydrat 3,0 g;
Eigelb 20 ml; Aqua bidest. 80 ml;
Penicillin G-Kalium 100000 IU;
Streptomycinsulfat 0,1 g
Zitronensäuremonohydrat 0,07 g;
Natriumbikarbonat 0,17 g;
Natriumzitratdihydrat 1,16 g;
Kaliumchlorid 0,03 g; Glycin
0,75 g; Glukose 0,24 g; Eigelb
20 ml; Penicillin 500 IU/ml;
Streptomycinsulfat 1 mg/ml
TRIS 0,43 g; BES 1,49 g;
Laktose 3,4 g; Glukose 0,59 g;
Aqua dest. 100 ml; Eigelb 20 %;
Benzylpenicillin 100 mg;
Dihydrostreptomycinsulfat 100 mg
EDTA 0,37 g; Natriumbikarbonat
0,12 g; Glukose 6 g; Aqua dest.
100 ml; Eigelb 20 %;
Benzylpenicillin 100 mg;
Dihydrostreptomycinsulfat 100 mg
TRIS 3,025 g; Zitronensäure
1,7 g; Fruktose 1,25 g; Aqua dest.
ad 100 ml; Sojabohnen-Lecithin
0,04 %; Benzylpenicillin 1 mg/ml;
Dihydrostreptomycinsulfat 1mg/ml
TRIS 3,025 g; Zitronensäure
1,7 g; Fruktose 1,25 g; Aqua
bidest. ad 100 ml; Lecithin 0,8 %;
Gentamicin 0,2 g
6,97 ± 0,02
Zitrat-EigelbVerdünner
Eigelb-ZitratGlycin-GlukoseVerdünner
Eigelb-ZitratGlycin-GlukoseVerdünner
EigelbNatriumzitratdihy
drat-Verdünner
Cornell
University
(ZitratBikarbonatEigelbVerdünner)
TRIS-BESVerdünner
EDTAVerdünner
TRIS-LecithinVerdünner
TRIS-LecithinVerdünner
264
Osmolarität
(mOsmol/l)
326 ± 0,02
sonstiger
Quellen
Province et al.,
1984
Christiansen,
1984a
Tsutsui et al.,
2003b
6,6-6,8
Foote, 1964a;
1964b; Foote
und Leonard,
1964
Tsutsui et al.,
2003b
6,75 ± 0,02
308 ± 5
Province et al.,
1984
6,81
310
Iguer-Ouada
und
Verstegen,
2001b
6,81
464
Iguer-Ouada
und
Verstegen,
2001b
Beccaglia et
al., 2009a
TRISPuffer:
6,7
Lecithin:
6,6
TRISPuffer:
324
Lecithin:
337
Kmenta et al.,
2011
Anhang
9.7.4 Kommerzielle Verdünner
Tab. A4: Name, Zusammensetzung, pH-Wert und Osmolarität einiger
kommerzieller Verdünner für die Flüssigkonservierung von Hundesperma
Verdünner
Biladyl
(Tiefgefrierverdünner
für Bullen-,
Schafbock- und
Ziegenbocksamen)
CaniPRO™ Chill 5
(20 ml)
CaniPRO™ Chill 10
(20 ml)
Zusammensetzung
(soweit bekannt)
Reinstwasser;
Natriumzitrat; TRIS;
Glukose; Fruktose;
herstellereigene
Bestandteile;
Gentamicin
Reinstwasser;
Natriumzitrat; TRIS;
Glukose; Fruktose;
herstellereigene
Bestandteile;
Gentamicin;
erfordert den Zusatz
von 4 ml frischem
Eigelb
CaninePro®
Canine-EXT™ Chilled
Semen Extender
Pulver in Aqua
bidest. auflösen und
20 ml Eigelb
hinzufügen
CLONE (Cryogenetic
Laboratory Of New
England) Chilled
Semen Kit
Glukose, keine
Fruktose und
wahrscheinlich
Eigelb und
Antibiotika;
Semen Enhancer
und Semen
Activator
Fresh Express®
(10 ml)
patentrechtlich
geschützt
Fresh-phosVerdünner
Hersteller
pH-Wert
Minitüb
GmbH,
Tiefenbach,
Germany
6,77
(6,66 mit
20 %
Eigelbzusatz)
Osmolarität
(mOsmol/l)
418
(408 mit
20 % Eigelbzusatz)
Quellen
Iguer-Ouada und
Verstegen, 2001b
www.minitube.de
Minitüb
GmbH,
Tiefenbach,
Germany
www.minitube.de
Minitüb
GmbH,
Tiefenbach,
Germany
www.minitube.de
Minitüb
GmbH,
Tiefenbach,
Germany
Peña et al., 2006;
Günzel-Apel,
2007
Livestock
Concepts,
Inc.,
Hawarden,
Iowa, USA
CLONE
(Cryogenetic
Laboratory of
New
England)
Inc.,
Chester
Springs, PA,
USA
Synbiotics
Corporation,
San Diego,
CA, USA
www.livestockcon
cepts.com
IMV
Technologies
L’Aigle,
France
265
6,9
6,82
(6,69 mit
20 %
Eigelbzusatz)
268
1220
(1156 mit
20 % Eigelbzusatz)
Linde-Forsberg,
2001;
Shahiduzzaman
und LindeForsberg, 2007
www.cloneusa.co
m
Goodman und
Cain, 1993;
Nishiyama et al.,
1999;
Linde-Forsberg,
2001
www.synbiotics.co
m
Iguer-Ouada und
Verstegen, 2001b
Anhang
Fresh Plus Verdünner
Edwards Agri
Sales Inc.,
Baraboo, WI,
USA
6,3
255
Bouchard et al.,
1990
Green-Verdünner
IMV
Technologies
L’Aigle,
France
6,77
(6,84 mit
20 %
Eigelbzusatz)
425
(392 mit
20 % Eigelbzusatz)
Iguer-Ouada und
Verstegen, 2001b
INSEMIN-AID Semen
Extender
Camelot
Farms,
College
Station,
Texas, USA
IVT (Illinois Variable
Temperature)Verdünner
Kenney-Verdünner
bzw.
NFDMS-G-(Non Fat
Dried Milk SolidGlucose)-Verdünner
Eigelb-ZitratVerdünner;
kommerzielles
Puder aufgelöst in
dest. Wasser und
3,5 % frischem
Eigelb
www.camelotfarm
s.com
Christiansen,
1984a
Trockenmagermilch
24 g; Glukose 49 g;
Natriumbikarbonat
13 g; Aqua bidest.
ad 1000 ml
Fa. Hamilton
Thorn
Research,
Beverly, MA,
USA
Magermilch
Verdünner (KenneyTyp) für Pferde
mit Ticarcillin oder
Gentamicin
Lane Manufacturing Inc.,
Denver, CO,
USA
MagermilchVerdünner
Trockenmagermilch
2,4 g; Glukose
4,9 g; Natriumhydrogencarbonat
(8,4 %ige Lsg.)
1,6 ml; Aqua bidest.
ad 100 ml
6,6
340
Bouchard et al.,
1990; England
und Ponzio, 1996;
Schäfer et al.,
1997
Pinto et al., 1999
Günzel-Apel et al.,
1993; GünzelApel, 2007
Kenney Skim Milk
Canine Semen
Extender Kit without
antibiotics
Jeffers, Inc.,
Dothan, AL,
USA
www.jefferspet.co
m
Canine Kenney
Extender
(10 ml, 100 ml)
Hamilton
Research,
Inc.,
South
Hamilton,
MA, USA
www.equitainer.co
m
Canine Semen
Extender with
Gentamicin
(Kenney Magermilchverdünner)
Veterinary
Concepts™
www.veterinaryco
ncepts.com
Canine Semen
Extender without
Antibiotics (Kenney
Magermilchverdünner)
Veterinary
Concepts™
www.veterinaryco
ncepts.com
Next Generation Dr.
Kenney Canine
Semen Extender
Exodus
Breeders
Corporation,
York, PA,
USA
www.exodusbreed
ers.com
266
Anhang
Next Generation®
Velocity™ Canine
Semen Extender
enthält Eigelb
Next Generation
Universal Canine
Semen Extender
Triladyl Canine®
(45 ml)
(Tiefgefrierverdünner)
TRIS-gepufferter
Verdünner; vor
Gebrauch müssen
10 ml Eigelb
zugegeben werden
Exodus
Breeders
Corporation,
York, PA,
USA
www.exodusbreed
ers.com
Exodus
Breeders
Corporation,
York, PA,
USA
Minitüb
GmbH,
Tiefenbach,
Germany
www.exodusbreed
ers.com
Günzel-Apel,
2007
www.minitube.de
9.8 Ergebnistabellen
Tab. A5: CASA-Motilitätsparameter DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL, ALH, BCF,
STR, LIN und WOB (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma und in den
verschiedenen Verdünnern an Tag 0
Verdünner
Parameter
± SD
Min.
Max.
DAP (µm)
41,6 ± 8,7
23,7
53,9
keiner
(Nativsperma) DCL (µm)
61,9 ± 11,6
42,6
85,1
(n = 30)
DSL (µm)
35,1 ± 9,1
14,9
50,0
VAP (µm/s)
97,4 ± 20,4
55,2
123,7
VCL (µm/s)
144,9 ± 27,5
97,9
199,9
VSL (µm/s)
82,5 ± 21,3
33,9
112,9
ALH (µm)
5,7 ± 1,0
3,5
7,9
BCF (Hz)
26,2 ± 3,4
20,5
34,5
STR (VSL/VAP) (%)
83,4 ± 8,1
61,0
92,0
LIN (VSL/VCL) (%)
56,6 ± 11,6
27,0
76,0
WOB (VAP/VCL) (%)
67,0 ± 8,4
45,0
82,0
CP
DAP (µm)
38,8 ± 6,8
23,2
48,9
(n = 30)
DCL (µm)
54,4 ± 6,9
39,6
65,6
DSL (µm)
32,4 ± 6,8
16,8
44,6
VAP (µm/s)
90,9 ± 16,0
54,1
113,0
VCL (µm/s)
127,0 ± 16,5
90,2
153,7
VSL (µm/s)
76,2 ± 15,7
39,2
101,7
ALH (µm)
5,2 ± 0,8
3,6
6,8
BCF (Hz)
24,0 ± 2,7
19,7
30,6
STR (VSL/VAP) (%)
82,9 ± 5,3
72,0
94,0
LIN (VSL/VCL) (%)
59,3 ± 9,2
39,0
77,0
WOB (VAP/VCL) (%)
70,9 ± 7,3
54,0
82,0
TE
DAP (µm)
37,3 ± 6,5
22,6
51,0
(n = 30)
DCL (µm)
54,0 ± 7,7
36,9
70,3
DSL (µm)
30,4 ± 6,3
17,4
44,9
VAP (µm/s)
87,8 ± 15,4
51,2
119,5
VCL (µm/s)
126,8 ± 18,7
85,8
167,8
267
Anhang
Up 1 + 2
(n = 12)
Up 1
(n = 18)
VSL (µm/s)
ALH (µm)
BCF (Hz)
STR (VSL/VAP) (%)
LIN (VSL/VCL) (%)
WOB (VAP/VCL) (%)
DAP (µm)
DCL (µm)
DSL (µm)
VAP (µm/s)
VCL (µm/s)
VSL (µm/s)
ALH (µm)
BCF (Hz)
STR (VSL/VAP) (%)
LIN (VSL/VCL) (%)
WOB (VAP/VCL) (%)
DAP (µm)
DCL (µm)
DSL (µm)
VAP (µm/s)
VCL (µm/s)
VSL (µm/s)
ALH (µm)
BCF (Hz)
STR (VSL/VAP) (%)
LIN (VSL/VCL) (%)
WOB (VAP/VCL) (%)
71,8 ± 14,8
5,4 ± 0,9
23,1 ± 2,4
81,1 ± 6,1
56,2 ± 9,4
68,6 ± 7,4
31,5 ± 5,4
47,7 ± 5,6
26,5 ± 5,8
72,2 ± 12,6
109,1 ± 13,8
60,7 ± 13,1
4,4 ± 0,6
24,9 ± 3,1
83,2 ± 5,6
55,0 ± 8,5
65,5 ± 6,4
35,4 ± 4,6
52,2 ± 6,7
28,0 ± 4,3
83,8 ± 10,4
123,1 ± 15,7
66,3 ± 9,4
5,5 ± 0,8
23,6 ± 2,7
78,8 ± 4,9
53,8 ± 6,4
67,7 ± 4,1
40,3
3,4
19,7
68,0
37,0
53,0
23,8
41,1
17,4
52,7
90,3
40,9
3,4
21,2
73,0
42,0
57,0
22,7
33,5
19,2
53,9
79,4
45,8
3,8
19,5
71,0
43,0
60,0
105,5
7,5
29,7
90,0
69,0
79,0
40,3
56,5
37,2
89,5
131,4
82,5
5,4
31,2
92,0
68,0
74,0
40,3
60,9
34,8
94,6
144,9
79,7
6,7
29,1
86,0
65,0
75,0
Tab. A6: Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen
bezüglich des Faktors „Verdünner“ zum Vergleich der Verdünner CP (1),
TE (2) und Up 1 + 2 (3) mit dem Nativsperma (0) unmittelbar nach dem
Verdünnen (Tag 0); n = 12; bei signifikantem Resultat wurde
anschließend ein Student-Newman-Keuls-Test zum paarweisen
Vergleich der Mittelwerte durchgeführt; die Ergebnisse werden getrennt
nach den jeweils getesteten Paaren angegeben; n. s. = nicht signifikant,
p < 0,01 = signifikant mit p < 0,01, p < 0,05 = signifikant mit p < 0,05
Parameter
Haupteffekt (pStudent-Newman-Keuls-Test
Wert)
Verdünner
0 – 1: n. s.
DAP
0,0017
0 – 2: n. s.
0 – 3: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 3: p < 0,05
2 – 3: p < 0,05
268
Anhang
DCL
0 – 1: p < 0,05
0,0001
0 – 2: p < 0,05
0 – 3: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 3: p < 0,05
2 – 3: p < 0,05
DSL
VAP
0,1
0,0004
0 – 1: n. s.
0 – 2: n. s.
0 – 3: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 3: p < 0,01
2 – 3: p < 0,01
VCL
0 – 1: p < 0,05
< 0,0001
0 – 2: p < 0,05
0 – 3: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 3: p < 0,01
2 – 3: p < 0,01
VSL
0 – 1: n. s.
0,04
0 – 2: n. s.
0 – 3: p < 0,05
1 – 2: n. s.
1 – 3: n. s.
2 – 3: n. s.
ALH
0 – 1: n. s.
0,0001
0 – 2: n. s.
0 – 3: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 3: p < 0,01
2 – 3: p < 0,01
BCF
0,065
STR
0,27
LIN
0,68
WOB
0,74
269
Anhang
Tab. A7: Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen
bezüglich des Faktors „Verdünner“ zum Vergleich der Verdünner CP (1),
TE (2) und Up 1 (4) mit dem Nativsperma (0) unmittelbar nach dem
Verdünnen (Tag 0); n = 18; bei signifikantem Resultat wurde
anschließend ein Student-Newman-Keuls-Test zum paarweisen
Vergleich der Mittelwerte durchgeführt; die Ergebnisse werden getrennt
nach den jeweils getesteten Paaren angegeben; n. s. = nicht signifikant,
p < 0,01 = signifikant mit p < 0,01, p < 0,05 = signifikant mit p < 0,05
Parameter Haupteffekt (p-Wert)
Student-Newman-Keuls-Test
Verdünner
0 – 1: p < 0,01
DAP
< 0,0001
0 – 2: p < 0,01
0 – 4: p < 0,01
1 – 2: p < 0,05
1 – 4: p < 0,01
2 – 4: p < 0,01
DCL
0 – 1: p < 0,01
< 0,0001
0 – 2: p < 0,01
0 – 4: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 4: n. s.
2 – 4: n. s.
DSL
0 – 1: p < 0,05
< 0,0001
0 – 2: p < 0,01
0 – 4: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 4: p < 0,01
2 – 4: p < 0,01
VAP
0 – 1: p < 0,01
< 0,0001
0 – 2: p < 0,01
0 – 4: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 4: p < 0,01
2 – 4: p < 0,01
VCL
0 – 1: p < 0,01
< 0,0001
0 – 2: p < 0,01
0 – 4: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 4: n. s.
2 – 4: n. s.
270
Anhang
VSL
0 – 1: p < 0,05
< 0,0001
0 – 2: p < 0,01
0 – 4: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 4: p < 0,01
2 – 4: p < 0,01
ALH
BCF
0,18
< 0,0001
0 – 1: p < 0,01
0 – 2: p < 0,01
0 – 4: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 4: n. s.
2 – 4: n. s.
STR
0 – 1: n. s.
0,0006
0 – 2: n. s.
0 – 4: p < 0,01
1 – 2: n. s.
1 – 4: p < 0,01
2 – 4: p < 0,05
LIN
0 – 1: n. s.
0,0019
0 – 2: n. s.
0 – 4: n. s.
1 – 2: n. s.
1 – 4: p < 0,01
2 – 4: n. s.
WOB
0 – 1: p < 0,01
0,0003
0 – 2: n. s.
0 – 4: n. s.
1 – 2: n. s.
1 – 4: p < 0,01
2 – 4: p < 0,05
271
Anhang
Tab. A8: Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen
bezüglich des Faktors „Verdünner“ zum Vergleich der Verdünner CP (1)
und TE (2) mit dem Nativsperma (0) unmittelbar nach dem Verdünnen
(Tag 0); n = 30; bei signifikantem Resultat wurde anschließend ein
Student-Newman-Keuls-Test zum paarweisen Vergleich der Mittelwerte
durchgeführt; die Ergebnisse werden getrennt nach den jeweils
getesteten
Paaren
angegeben;
n.
s. = nicht
signifikant,
p < 0,01 = signifikant mit p < 0,01, p < 0,05 = signifikant mit p < 0,05
Parameter Haupteffekt (p-Wert)
Student-Newman-Keuls-Test
Verdünner
0 – 1: p < 0,01
DAP
0,0002
0 – 2: p < 0,01
1 – 2: n. s.
DCL
0 – 1: p < 0,01
< 0,0001
0 – 2: p < 0,01
1 – 2: n. s.
DSL
0 – 1: p < 0,05
0,0026
0 – 2: p < 0,01
1 – 2: n. s.
VAP
0 – 1: p < 0,01
0,0001
0 – 2: p < 0,01
1 – 2: n. s.
VCL
0 – 1: p < 0,01
< 0,0001
0 – 2: p < 0,01
1 – 2: n. s.
VSL
0 – 1: p < 0,05
0,0022
0 – 2: p < 0,01
1 – 2: n. s.
ALH
0 – 1: p < 0,05
0,024
0 – 2: n. s.
1 – 2: n. s.
BCF
0 – 1: p < 0,01
< 0,0001
0 – 2: p < 0,01
1 – 2: n. s.
STR
LIN
WOB
0,25
0,21
0,0094
0 – 1: p < 0,01
0 – 2: n. s.
1 – 2: n. s.
272
Anhang
Tab. A9: CASA-Motilitätsparameter DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL, ALH, BCF,
STR, LIN und WOB (n, ± SD, Min., Max.) in den verschiedenen
Verdünnern im Zeitverlauf
Parameter
Verdünner
n
Tag
± SD
Min.
Max.
DAP (µm)
CP
30
0
38,8 ± 6,8
23,2
48,9
1
38,5 ± 5,6
26,0
45,7
2
38,2 ± 6,0
22,5
46,7
3
37,1 ± 5,7
22,8
44,6
5
36,9 ± 5,1
23,4
42,7
7
35,6 ± 4,6
25,3
42,2
10
32,3 ± 7,8
0,0
40,8
TE
30
0
37,3 ± 6,5
22,6
51,0
1
37,5 ± 5,6
24,2
46,3
2
36,8 ± 5,5
22,2
44,8
3
35,9 ± 5,1
23,5
44,3
5
35,8 ± 4,4
22,4
43,4
7
33,7 ± 6,1
10,3
40,5
10
31,0 ± 6,7
9,0
38,8
Up 1 + 2
12
0
31,5 ± 5,4
23,8
40,3
1
30,5 ± 4,7
22,7
37,5
2
29,0 ± 4,5
21,5
35,7
3
25,6 ± 5,7
17,5
33,0
5
24,7 ± 5,4
12,8
29,3
7
18,6 ± 6,7
0,0
24,2
10
13,3 ± 3,2
7,5
19,3
Up 1
18
0
35,4 ± 4,6
22,7
40,3
1
35,4 ± 6,3
21,6
54,0
2
33,3 ± 7,2
17,2
51,6
3
34,2 ± 10,1
15,3
57,4
5
33,7 ± 9,4
20,8
53,8
7
29,0 ± 8,9
19,6
47,3
10
18,9 ± 4,6
11,1
28,3
DCL (µm)
CP
30
0
54,4 ± 6,9
39,6
65,6
1
55,8 ± 5,2
41,7
63,5
2
55,3 ± 6,1
37,8
64,3
3
54,4 ± 6,4
38,0
69,2
5
54,5 ± 7,4
31,7
71,6
7
54,1 ± 5,9
37,3
70,0
10
53,1 ± 12,1
0,0
70,9
TE
30
0
54,0 ± 7,7
36,9
70,3
1
56,0 ± 4,9
42,8
64,7
2
55,1 ± 6,3
37,6
66,9
3
54,1 ± 5,9
32,8
65,6
5
54,4 ± 5,8
39,6
65,9
7
52,5 ± 10,0
12,7
73,3
10
50,3 ± 11,8
8,9
73,5
Up 1 + 2
12
0
47,7 ± 5,6
41,1
56,5
1
46,4 ± 4,4
38,7
52,5
2
43,8 ± 5,1
35,3
51,6
3
40,0 ± 6,5
29,3
48,8
273
Anhang
DSL (µm)
VAP (µm/s)
Up 1
18
CP
30
TE
30
Up 1 + 2
12
Up 1
18
CP
30
TE
30
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
274
39,1 ± 10,4
30,0 ± 11,8
19,9 ± 6,9
52,2 ± 6,7
53,5 ± 6,1
51,3 ± 8,4
51,1 ± 9,0
50,7 ± 11,4
44,5 ± 11,0
32,9 ± 8,2
32,4 ± 6,8
31,5 ± 5,9
31,4 ± 6,0
30,5 ± 5,4
30,6 ± 4,7
29,4 ± 4,7
26,4 ± 7,0
30,4 ± 6,3
30,2 ± 6,1
29,8 ± 5,6
29,2 ± 4,9
29,4 ± 4,4
27,6 ± 5,6
25,3 ± 5,8
26,5 ± 5,8
24,8 ± 4,6
23,9 ± 4,1
20,6 ± 5,1
20,1 ± 4,5
15,0 ± 5,3
10,8 ± 2,1
28,0 ± 4,3
27,6 ± 7,2
25,8 ± 7,3
28,1 ± 10,9
27,9 ± 10,3
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15,1 ± 3,9
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90,2 ± 13,6
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88,1 ± 13,2
86,2 ± 12,9
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0,0
9,7
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19,7
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20,0
0,0
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17,6
18,8
20,0
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17,4
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0,0
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17,0
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0,0
51,2
55,7
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25,6
51,7
41,8
34,4
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66,9
63,2
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79,8
71,3
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44,6
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43,2
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37,8
36,0
44,9
42,0
40,6
39,4
38,7
35,2
33,9
37,2
32,5
31,0
28,1
25,0
19,3
14,5
34,8
51,8
48,2
53,9
49,6
43,6
24,0
113,0
106,5
105,0
103,1
99,3
97,1
94,7
119,5
105,4
102,3
104,5
98,3
92,3
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VCL (µm/s)
VSL (µm/s)
Up 1 + 2
12
Up 1
18
CP
30
TE
30
Up 1 + 2
12
Up 1
18
CP
30
TE
30
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1
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1
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0
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0
1
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7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
275
73,1 ± 14,1
72,2 ± 12,6
70,4 ± 11,1
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59,6 ± 13,0
57,2 ± 12,4
43,7 ± 15,8
34,7 ± 6,3
83,8 ± 10,4
83,6 ± 13,9
78,5 ± 16,6
80,1 ± 22,6
79,1 ± 20,9
68,1 ± 19,1
45,4 ± 10,1
127,0 ± 16,5
130,3 ± 13,1
129,0 ± 14,8
127,4 ± 15,7
127,3 ± 18,5
126,4 ± 13,9
123,8 ± 28,5
126,8 ± 18,7
131,2 ± 12,6
128,8 ± 15,2
126,5 ± 14,4
127,1 ± 14,5
123,0 ± 23,4
117,9 ± 26,8
109,1 ± 13,8
106,8 ± 10,8
100,5 ± 13,2
92,6 ± 15,1
90,0 ± 23,9
69,6 ± 27,4
50,9 ± 14,5
123,1 ± 15,7
126,2 ± 14,2
120,7 ± 20,6
119,6 ± 20,2
118,9 ± 25,5
104,2 ± 23,6
77,9 ± 17,3
76,2 ± 15,7
74,1 ± 13,8
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71,8 ± 12,7
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61,8 ± 16,0
71,8 ± 14,8
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52,9
50,4
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26,4
0,0
23,0
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51,5
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34,3
49,3
47,1
30,9
90,2
94,4
87,2
87,5
69,3
86,1
0,0
85,8
97,9
87,8
77,5
87,4
32,1
31,5
90,3
89,9
79,8
68,6
28,2
0,0
28,9
79,4
91,0
61,8
86,9
92,7
79,8
35,5
39,2
43,2
44,1
45,6
47,1
48,4
0,0
40,3
88,4
89,5
85,2
82,5
76,6
66,6
55,8
45,5
94,6
123,8
117,0
131,0
126,5
107,4
66,1
153,7
151,7
152,2
164,6
171,5
165,5
168,2
167,8
152,7
159,2
156,5
155,6
176,2
177,0
131,4
122,5
120,0
114,2
116,1
94,3
80,5
144,9
154,4
147,2
168,5
182,5
162,4
102,8
101,7
96,0
97,1
94,5
88,0
86,3
84,9
105,5
Anhang
ALH (µm)
BCF (Hz)
Up 1 + 2
12
Up 1
18
CP
30
TE
30
Up 1 + 2
12
Up 1
18
CP
30
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
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10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
276
71,3 ± 14,2
70,0 ± 12,8
68,5 ± 11,7
68,9 ± 10,1
64,9 ± 12,4
59,8 ± 12,2
60,7 ± 13,1
57,2 ± 10,7
55,1 ± 9,7
48,0 ± 11,7
46,7 ± 10,2
35,2 ± 12,4
28,5 ± 3,7
66,3 ± 9,4
65,4 ± 15,9
61,1 ± 16,4
65,8 ± 24,4
65,7 ± 23,1
56,4 ± 19,4
36,5 ± 8,5
5,2 ± 0,8
5,5 ± 0,8
5,4 ± 0,8
5,4 ± 0,7
5,3 ± 0,9
5,3 ± 0,9
5,2 ± 1,3
5,4 ± 0,9
5,7 ± 0,8
5,6 ± 0,8
5,4 ± 0,8
5,4 ± 0,8
5,3 ± 1,0
5,2 ± 0,9
4,4 ± 0,6
4,8 ± 0,6
4,6 ± 0,6
4,6 ± 0,5
4,6 ± 0,4
4,0 ± 1,4
4,2 ± 0,8
5,5 ± 0,8
5,7 ± 0,8
5,5 ± 1,1
5,2 ± 0,8
5,2 ± 0,5
4,9 ± 0,5
4,3 ± 0,7
24,0 ± 2,7
22,3 ± 3,0
22,6 ± 3,0
41,0
43,6
45,4
45,2
22,8
27,9
40,9
38,7
38,1
30,2
21,1
0,0
21,2
45,8
40,6
29,4
26,4
38,1
37,1
26,2
3,6
3,5
3,5
3,5
3,0
3,1
0,0
3,4
3,7
3,9
3,2
3,5
1,9
3,4
3,4
3,6
3,2
3,9
3,6
0,0
2,7
3,8
3,4
2,2
2,9
4,3
4,2
2,4
19,7
18,7
18,8
95,4
92,7
91,9
87,9
80,6
77,4
82,5
73,9
71,4
63,8
56,0
43,8
34,2
79,7
118,6
109,4
123,2
116,7
98,5
55,9
6,8
7,1
7,0
7,1
7,3
7,6
7,5
7,5
7,1
7,4
7,2
7,3
7,5
7,5
5,4
5,7
5,4
5,4
5,2
5,9
5,6
6,7
6,8
7,0
6,0
5,9
6,0
5,3
30,6
31,3
32,8
Anhang
STR (%)
TE
30
Up 1 + 2
12
Up 1
18
CP
30
TE
30
Up 1 + 2
12
Up 1
18
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
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10
0
1
2
3
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10
0
1
2
3
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7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
277
22,8 ± 2,9
23,1 ± 2,8
23,0 ± 2,8
22,2 ± 4,7
23,1 ± 2,4
21,8 ± 2,6
22,3 ± 2,8
22,6 ± 2,9
23,2 ± 3,4
22,3 ± 3,6
22,2 ± 3,7
24,9 ± 3,1
21,8 ± 1,4
21,5 ± 1,5
20,3 ± 1,7
20,0 ± 6,4
18,6 ± 7,9
15,9 ± 6,0
23,6 ± 2,7
21,8 ± 3,2
21,7 ± 2,7
22,9 ± 4,0
23,1 ± 3,2
22,7 ± 2,8
20,7 ± 4,7
82,9 ± 5,3
81,4 ± 6,0
81,8 ± 5,4
81,8 ± 5,0
82,7 ± 5,8
82,4 ± 5,9
78,5 ± 15,9
81,1 ± 6,1
80,0 ± 6,7
80,5 ± 5,8
81,0 ± 4,9
81,8 ± 5,6
81,6 ± 5,5
81,5 ± 5,9
83,2 ± 5,6
80,6 ± 4,2
81,8 ± 4,8
79,7 ± 3,8
81,0 ± 3,0
73,9 ± 23,5
82,6 ± 8,1
78,8 ± 4,9
77,1 ± 6,4
76,9 ± 6,1
80,2 ± 7,2
81,0 ± 6,9
18,6
18,8
18,9
0,0
19,7
18,7
18,7
19,0
19,4
7,5
6,3
21,2
20,1
20,0
16,6
0,0
0,0
6,1
19,5
19,7
19,5
19,7
20,0
18,5
10,2
72,0
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70,0
70,0
68,0
67,0
0,0
68,0
64,0
69,0
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69,0
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64,0
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73,0
75,0
72,0
77,0
0,0
65,0
71,0
68,0
68,0
73,0
72,0
30,4
31,0
31,9
29,9
29,7
29,7
31,7
32,3
35,4
29,2
28,6
31,2
24,4
24,5
22,1
24,0
29,9
24,8
29,1
33,0
28,7
34,7
30,5
29,3
33,0
94,0
93,0
92,0
92,0
94,0
93,0
92,0
90,0
93,0
91,0
91,0
91,0
90,0
90,0
92,0
88,0
93,0
88,0
87,0
86,0
93,0
86,0
95,0
93,0
96,0
94,0
Anhang
LIN (%)
WOB (%)
CP
30
TE
30
Up 1 + 2
12
Up 1
18
CP
30
TE
30
Up 1 + 2
12
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10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
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7
10
0
1
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10
0
1
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10
0
1
2
3
5
7
10
0
1
2
3
5
7
10
278
81,3 ± 5,2
79,8 ± 4,5
59,3 ± 9,2
56,6 ± 9,5
56,8 ± 9,1
56,0 ± 8,5
56,6 ± 8,9
54,5 ± 8,8
48,2 ± 12,8
56,2 ± 9,4
53,8 ± 10,5
54,0 ± 9,1
54,0 ± 8,8
54,1 ± 7,8
53,1 ± 8,9
51,8 ± 11,1
55,0 ± 8,5
52,9 ± 6,2
54,2 ± 5,8
50,9 ± 6,1
53,1 ± 8,5
47,2 ± 16,7
58,1 ± 11,1
53,8 ± 6,4
50,9 ± 9,0
50,1 ± 9,7
53,4 ± 12,6
54,0 ± 9,8
52,8 ± 8,3
47,6 ± 10,5
70,9 ± 7,3
68,7 ± 7,7
68,7 ± 7,6
68,0 ± 7,3
67,7 ± 6,8
65,7 ± 6,9
58,8 ± 13,5
68,6 ± 7,4
66,6 ± 8,1
66,4 ± 7,3
66,1 ± 7,6
65,7 ± 6,2
64,4 ± 7,5
63,1 ± 10,1
65,5 ± 6,4
65,1 ± 5,3
65,9 ± 4,5
63,5 ± 5,6
65,1 ± 10,5
58,3 ± 19,9
69,6 ± 8,2
73,0
71,0
39,0
33,0
37,0
40,0
36,0
33,0
0,0
37,0
32,0
37,0
37,0
36,0
33,0
29,0
42,0
43,0
46,0
43,0
40,0
0,0
41,0
43,0
40,0
38,0
27,0
38,0
37,0
32,0
54,0
50,0
52,0
52,0
52,0
50,0
0,0
53,0
50,0
52,0
52,0
52,0
49,0
46,0
57,0
57,0
58,0
54,0
51,0
0,0
56,0
92,0
91,0
77,0
73,0
76,0
70,0
76,0
68,0
70,0
69,0
74,0
73,0
72,0
67,0
71,0
88,0
68,0
62,0
66,0
61,0
74,0
71,0
74,0
65,0
76,0
76,0
77,0
73,0
69,0
79,0
82,0
81,0
84,0
80,0
80,0
78,0
79,0
79,0
81,0
79,0
80,0
77,0
79,0
100,0
74,0
71,0
71,0
70,0
93,0
84,0
80,0
Anhang
Up 1
18
0
1
2
3
5
7
10
67,7 ± 4,1
65,5 ± 6,4
64,4 ± 7,5
65,7 ± 10,6
65,7 ± 7,4
64,5 ± 6,6
59,0 ± 10,1
60,0
56,0
53,0
36,0
52,0
51,0
40,0
75,0
80,0
81,0
81,0
77,0
76,0
86,0
Tab. A10: Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“
zum Vergleich der Verdünner CP und TE im Zeitverlauf (Tag 0-10) der
Flüssigkonservierung bei 4°C für 10 Tage; n = 30
Parameter
Haupteffekte
Wechselwirkung
(p-Wert)
(p-Wert)
Verdünner x Zeit
Verdünner
Zeit
geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
CASA-Gesamtmotilität
0,32
< 0,0001
< 0,0001
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
0,011
< 0,0001
< 0,0001
DAP
< 0,0001
< 0,0001
0,89
DCL
0,011
0,0021
0,037
DSL
< 0,0001
< 0,0001
0,7
VAP
< 0,0001
< 0,0001
0,88
VCL
0,033
0,0012
0,059
VSL
< 0,0001
< 0,0001
0,72
ALH
0,0007
< 0,0001
0,062
BCF
0,0006
0,054
0,35
STR
0,24
0,28
0,073
LIN
0,016
< 0,0001
0,0012
WOB
0,094
< 0,0001
0,0035
Lebende Eosinausstrich
0,97
< 0,0001
0,41
CASA-Viabilität
0,2
< 0,0001
0,24
Pathomorphologie (gesamt)
0,015
< 0,0001
0,26
- Kopfveränderungen
0,68
0,92
0,4
- Halsveränderungen
0,19
0,47
0,34
- Schwanzveränderungen
0,012
< 0,0001
0,43
- aufgerollte Schwänze
0,33
0,0072
0,72
- Knickschwänze
0,99
0,03
0,85
- schleifenförmige Schwänze
0,014
< 0,0001
0,27
- lose Köpfe
0,75
0,23
0,67
- Plasmatropfen
0,83
0,72
0,7
Kopfkappenveränderungen (gesamt)
0,66
0,0006
0,81
- abgelöste Kopfkappen
0,14
0,001
0,0068
- schiefe Kopfkappen
0,14
0,0013
0,11
- sonstige Veränderungen
0,031
< 0,0001
0,91
279
Anhang
Tab. A11: Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“
zum Vergleich der Verdünner CP und Up 1 + 2 im Zeitverlauf (Tag 0-10)
der Flüssigkonservierung bei 4°C für 10 Tage; n = 12
Parameter
Haupteffekte
Wechselwirkung
(p-Wert)
(p-Wert)
Verdünner x Zeit
Verdünner
Zeit
geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
CASA-Gesamtmotilität
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DAP
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DCL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DSL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
VAP
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
VCL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
VSL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
ALH
0,0001
0,0014
0,68
BCF
0,021
0,0003
0,066
STR
0,94
0,70
0,27
LIN
0,96
0,51
0,0092
WOB
0,83
0,30
0,0099
Lebende Eosinausstrich
0,57
< 0,0001
0,42
CASA-Viabilität
< 0,0001
< 0,0001
0,019
Pathomorphologie (gesamt)
0,53
0,0007
0,032
- Kopfveränderungen
0,24
0,53
0,73
- Halsveränderungen
0,83
0,84
0,48
- Schwanzveränderungen
0,032
0,0082
0,0034
- aufgerollte Schwänze
0,2
0,018
0,46
- Knickschwänze
0,85
0,62
0,26
- schleifenförmige Schwänze
0,0103
< 0,0001
0,12
- lose Köpfe
0,45
0,63
0,58
- Plasmatropfen
0,16
0,42
0,95
Kopfkappenveränderungen (gesamt)
0,99
0,062
0,35
- abgelöste Kopfkappen
0,59
0,29
0,77
- schiefe Kopfkappen
0,0997
0,14
0,99
- sonstige Veränderungen
0,22
0,18
0,065
280
Anhang
Tab. A12: Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“
zum Vergleich der Verdünner CP und Up 1 im Zeitverlauf (Tag 0-10) der
Flüssigkonservierung bei 4°C für 10 Tage; n = 18
Parameter
Haupteffekte
Wechselwirkung
(p-Wert)
(p-Wert)
Verdünner x Zeit
Verdünner
Zeit
geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
CASA-Gesamtmotilität
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DAP
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DCL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DSL
< 0,0001
< 0,0001
0,0013
VAP
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
VCL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
VSL
< 0,0001
< 0,0001
0,0019
ALH
0,17
< 0,0001
< 0,0001
BCF
0,41
0,0092
0,14
STR
0,0097
0,11
0,012
LIN
0,0015
< 0,0001
0,054
WOB
0,0005
< 0,0001
0,26
Lebende Eosinausstrich
0,019
< 0,0001
0,23
CASA-Viabilität
0,019
< 0,0001
0,042
Pathomorphologie (gesamt)
0,17
< 0,0001
0,85
- Kopfveränderungen
0,98
0,096
0,93
- Halsveränderungen
0,13
0,054
0,98
- Schwanzveränderungen
0,75
< 0,0001
0,44
- aufgerollte Schwänze
0,45
0,74
0,81
- Knickschwänze
0,24
0,0010
0,85
- schleifenförmige Schwänze
0,82
< 0,0001
0,52
- lose Köpfe
0,59
0,1005
0,31
- Plasmatropfen
0,032
0,013
0,18
Kopfkappenveränderungen (gesamt)
0,021
< 0,0001
0,92
- abgelöste Kopfkappen
0,80
0,0018
0,038
- schiefe Kopfkappen
0,043
< 0,0001
0,30
- sonstige Veränderungen
0,0025
< 0,0001
0,03
281
Anhang
Tab. A13: Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“
zum Vergleich der Verdünner TE und Up 1 + 2 im Zeitverlauf (Tag 0-10)
der Flüssigkonservierung bei 4°C für 10 Tage; n = 12
Parameter
Haupteffekte
Wechselwirkung
(p-Wert)
(p-Wert)
Verdünner x Zeit
Verdünner
Zeit
geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
CASA-Gesamtmotilität
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DAP
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DCL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DSL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
VAP
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
VCL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
VSL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
ALH
0,0001
0,0003
0,70
BCF
0,042
0,0024
0,012
STR
0,95
0,69
0,092
LIN
0,70
0,51
0,17
WOB
0,84
0,36
0,38
Lebende Eosinausstrich
0,38
< 0,0001
0,045
CASA-Viabilität
0,0001
< 0,0001
0,063
Pathomorphologie (gesamt)
0,096
0,13
0,24
- Kopfveränderungen
0,24
0,94
0,40
- Halsveränderungen
0,50
0,78
0,76
- Schwanzveränderungen
0,0028
0,30
0,028
- aufgerollte Schwänze
0,098
0,13
0,32
- Knickschwänze
0,18
0,25
0,42
- schleifenförmige Schwänze
0,0022
< 0,0001
0,26
- lose Köpfe
0,13
0,41
0,83
- Plasmatropfen
0,37
0,44
0,16
Kopfkappenveränderungen (gesamt)
0,16
0,057
0,56
- abgelöste Kopfkappen
0,84
0,62
0,21
- schiefe Kopfkappen
0,97
0,14
0,50
- sonstige Veränderungen
0,64
0,73
0,37
282
Anhang
Tab. A14: Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“
zum Vergleich der Verdünner TE und Up 1 im Zeitverlauf (Tag 0-10) der
Flüssigkonservierung bei 4°C für 10 Tage; n = 18
Parameter
Haupteffekte
Wechselwirkung
(p-Wert)
(p-Wert)
Verdünner x Zeit
Verdünner
Zeit
geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
CASA-Gesamtmotilität
0,0003
< 0,0001
< 0,0001
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit
0,0045
< 0,0001
< 0,0001
DAP
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DCL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
DSL
0,0004
< 0,0001
0,0007
VAP
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
VCL
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
VSL
0,0002
< 0,0001
0,0007
ALH
0,028
< 0,0001
0,0006
BCF
0,64
0,022
0,078
STR
0,042
0,063
0,13
LIN
0,016
0,0044
0,32
WOB
0,0078
< 0,0001
0,53
Lebende Eosinausstrich
0,033
< 0,0001
0,91
CASA-Viabilität
0,54
< 0,0001
0,13
Pathomorphologie (gesamt)
0,63
0,0003
0,57
- Kopfveränderungen
0,75
0,55
0,95
- Halsveränderungen
0,061
0,15
0,48
- Schwanzveränderungen
0,46
0,0064
0,43
- aufgerollte Schwänze
0,11
0,076
0,75
- Knickschwänze
0,13
0,0015
0,82
- schleifenförmige Schwänze
0,045
0,0003
0,55
- lose Köpfe
0,96
0,0004
0,90
- Plasmatropfen
0,48
0,0059
0,22
Kopfkappenveränderungen (gesamt)
0,10
< 0,0001
0,57
- abgelöste Kopfkappen
0,08
< 0,0001
0,40
- schiefe Kopfkappen
0,55
0,012
0,16
- sonstige Veränderungen
0,087
< 0,0001
0,14
283
Anhang
9.9 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:
Schematische
Darstellung
Rüdenspermien
beim
der
Schwanzveränderungen
hypoosmotischen
Schwelltest
von
(HOS-Test)
(Riesenbeck et al., 2001) ...................................................................... 25
Abb. 2:
Schematische Abbildung der verschiedenen durch Computer-assisted
sperm analysis-Systeme gemessenen Motilitätsparameter (nach Eder
et al., 2009, modifiziert) ......................................................................... 31
Abb. 3:
Vorgehensweise bei der Spermabeurteilung ........................................ 77
Abb. 4:
Monitorbild des Programms SpermVision™ nach der Motilitätsanalyse
............................................................................................................... 87
Abb. 5:
Vorgehensweise bei der Weiterverarbeitung des Spermas ................. 91
Abb. 6:
Vorgehensweise bei der Beurteilung des verdünnten Spermas........... 94
Abb. 7:
Vorgehensweise bei der Untersuchung der Halteproben ..................... 95
Abb. 8:
Prozentsatz an motilen Samenzellen (mittels Computer-assisted sperm
analysis (CASA; SpermVision™-System) gemessene Gesamtmotilität;
± SD) im Nativsperma und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0
............................................................................................................. 104
Abb. 9:
Prozentsatz an vorwärtsbeweglichen Samenzellen (mittels Computerassisted sperm analysis (CASA; SpermVision™-System) gemessene
Vorwärtsbeweglichkeit;
± SD)
im
Nativsperma
und
in
den
verschiedenen Verdünnern an Tag 0.................................................. 106
Abb. 10: Prozentualer
Anteil
lebender
Samenzellen
(Eosinausstrich)
im
Nativsperma und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0 .......... 114
Abb. 11: Prozentsatz an lebenden Samenzellen (mittels Computer-assisted
sperm analysis (CASA; SpermVision™-System) gemessene Viabilität
nach SYBR-14/PI-Färbung) im Nativsperma und in den verschiedenen
Verdünnern an Tag 0 .......................................................................... 115
Abb. 12: Prozentsatz an Samenzellen mit nicht aufgerolltem Schwanz („not
curled“) im HOS-Test im Nativsperma und in den verschiedenen
Verdünnern an Tag 0 .......................................................................... 121
284
Anhang
Abb. 13: Veränderungen
der
Mittelwerte ± SD
vorwärtsbeweglichen
des
Samenzellen
Prozentsatzes
(subjektiv
an
geschätzte
Vorwärtsbeweglichkeit unter dem Phasenkontrastmikroskop) in den
verschiedenen Verdünnern im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei
4°C über zehn Tage ............................................................................ 124
Abb. 14: Veränderungen der Mittelwerte ± SD des Prozentsatzes an motilen
Samenzellen (mittels Computer-assisted sperm analysis (CASA;
SpermVision™-System)
gemessene
Gesamtmotilität)
in
den
verschiedenen Verdünnern im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei
4°C über zehn Tage ............................................................................ 126
Abb. 15: Veränderungen
der
Mittelwerte ± SD
des
Prozentsatzes
an
vorwärtsbeweglichen Samenzellen (mittels Computer-assisted sperm
analysis
(CASA;
SpermVision™-System)
gemessene
Vorwärts-
beweglichkeit) in den verschiedenen Verdünnern im Zeitverlauf der
Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn Tage ................................... 128
Abb. 16: Veränderungen des prozentualen Anteils lebender Samenzellen
(Eosinausstrich) in den verschiedenen Verdünnern im Zeitverlauf der
Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn Tage ................................... 137
Abb. 17: Veränderungen des Prozentsatzes an lebenden Samenzellen (mittels
Computer-assisted sperm analysis (CASA; SpermVision™-System)
gemessene Viabilität nach SYBR-14/PI-Färbung) in den verschiedenen
Verdünnern im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn
Tage .................................................................................................... 139
Abb. 18: Veränderungen
des
prozentualen
Anteils
an
morphologisch
veränderten Samenzellen (Eosinausstrich) in den verschiedenen
Verdünnern im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn
Tage .................................................................................................... 141
Abb. 19: Veränderungen
des
prozentualen
Anteils
an
Samenzellen
mit
Kopfkappenveränderungen (Spermac®-Färbung) in den verschiedenen
Verdünnern im Zeitverlauf der Flüssigkonservierung bei 4°C über zehn
Tage .................................................................................................... 145
285
Anhang
Abb. 20: Korrelation zwischen den mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten
und
den
durch
Computer-assisted
sperm
analysis
(CASA;
SpermVision™-System) gemessenen Dichten in den Nativejakulaten
und in allen verdünnten Ejakulaten ..................................................... 148
Abb. 21: Korrelation zwischen der geschätzten Vorwärtsbeweglichkeit unter dem
Phasenkontrastmikroskop und der mittels Computer-assisted sperm
analysis
(CASA;
SpermVision™-System)
gemessenen
Vorwärts-
beweglichkeit in den Nativejakulaten und in allen verdünnten Ejakulaten
zu allen Untersuchungszeitpunkten .................................................... 150
Abb. 22: Korrelation zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil
lebender Spermien und der durch Computer-assisted sperm analysis
(CASA; SpermVision™-System) ermittelten Viabilität nach SYBR-14/PIFärbung in den Nativejakulaten und in allen verdünnten Ejakulaten zu
allen Untersuchungszeitpunkten ......................................................... 152
9.10
Tabellenverzeichnis
Tab. 1:
Vergleichende
Darstellung
der
Konzeptionsraten
und
der
durchschnittlichen Wurfgrößen bei natürlicher Paarung, künstlicher
Besamung (KB) mit Frischsperma, KB mit flüssigkonserviertem Sperma
und KB mit Tiefgefriersperma (TG-Sperma) ......................................... 11
Tab. 2:
Qualitätskriterien für Rüdenejakulate (Pesch et al., 2007) ................... 34
Tab. 3:
Trächtigkeitsergebnisse für verschiedene Verdünner zur Flüssigkonservierung von Hundesperma von 1990 bis 1993 (Linde-Forsberg,
1995) ..................................................................................................... 63
Tab. 4:
Motilität, akrosomale
Integrität und
Plasmamembranintegrität im
Nativsperma und in mit UE-2/1 („Teilverdünner 1“ des Uppsala Equex2-Verdünners) für ein oder zwei Tage bei 4°C flüssigkonserviertem
Sperma (Hermansson et al., 2006) ....................................................... 71
Tab. 5:
Angaben zu den einzelnen Hunden (n = 30) ......................................... 75
Tab. 6:
Einteilung
der
morphologischen
Veränderungen
nach
Hoffmann
(2003c), modifiziert................................................................................ 80
Tab. 7:
Messergebnisse der einzelnen durch CASA (SpermVision™-System)
bestimmten Motilitätsparameter in den Nativejakulaten (n = 30) ........ 101
286
Anhang
Tab. 8:
Durchschnittliche mittels Neubauer-Zählkammer bestimmte Dichten der
mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten Ejakulate nach
Anwendung der Wurzeltransformation................................................ 102
Tab. 9:
Durchschnittliche mittels CASA (SpermVision™-System) bestimmte
Dichten der mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulate nach Anwendung der Wurzeltransformation ....................... 102
Tab. 10:
Subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit (n, ± SD, Min., Max.) im
Nativsperma und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0 .......... 103
Tab. 11:
CASA-Motilitätsparameter VAP (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0................................ 107
Tab. 12:
CASA-Motilitätsparameter VCL (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0................................ 109
Tab. 13:
CASA-Motilitätsparameter VSL (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0................................ 109
Tab. 14:
CASA-Motilitätsparameter ALH (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0................................ 110
Tab. 15:
CASA-Motilitätsparameter BCF (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0................................ 111
Tab. 16:
CASA-Motilitätsparameter LIN (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma
und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0................................ 112
Tab. 17:
Prozentualer
Anteil
an
morphologisch
veränderten
Samenzellen
(Eosinausstrich; n, g, SF, Min., Max.) im Nativsperma und in den
verschiedenen Verdünnern an Tag 0.................................................. 116
Tab. 18:
Prozentsatz
an
Kopfkappenveränderungen
bzw.
an
abgelösten
Akrosomen (Werte in Klammern) in der Spermac®-Färbung im
Nativsperma und in den verschiedenen Verdünnern an Tag 0 (n, g, SF,
Min., Max.)........................................................................................... 119
Tab. 19:
Motilitätswerte (subjektiv geschätzte Vorwärtsbeweglichkeit, CASAGesamtmotilität,
CASA-Vorwärtsbeweglichkeit)
bei
4°C
flüssig-
konservierter Hundespermien in den verschiedenen Verdünnern im
Zeitverlauf über zehn Tage ................................................................. 125
287
Anhang
Tab. 20:
Korrelationen zwischen den mittels Neubauer-Zählkammer bestimmten
und den durch CASA (SpermVision™-System) gemessenen Dichten in
den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten ................................................................. 148
Tab. 21:
Korrelationen zwischen subjektiv geschätzter und mittels CASA
(SpermVision™-System) gemessener Vorwärtsbeweglichkeit in den
Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten ................................................................. 149
Tab. 22:
Korrelationen zwischen dem im Eosinausstrich bestimmten Anteil
lebender Spermien und der mittels CASA (SpermVision™-System)
ermittelten Viabilität nach SYBR-14/PI-Färbung in den Nativejakulaten
und in den mit den verschiedenen Verdünnern aufgearbeiteten
Ejakulaten............................................................................................ 151
Tab. 23:
Korrelationen zwischen verschiedenen Untersuchungsparametern in
den Nativejakulaten und in den mit den verschiedenen Verdünnern
aufgearbeiteten Ejakulaten ................................................................. 153
Tab. 24:
Korrelationen zwischen verschiedenen Untersuchungsparametern in
den Nativejakulaten und in allen verdünnten Ejakulaten zu allen
Untersuchungszeitpunkten ................................................................. 155
Tab. 25:
Vergleichende Darstellung der verwendeten technischen Einstellungen
für die Motilitätsanalyse mit den von Schäfer-Somi und Aurich (2007)
genutzten Einstellungen ...................................................................... 164
Tab. 26:
Vergleichende Darstellung der sonstigen verwendeten technischen
Einstellungen mit den von Schäfer-Somi und Aurich (2007) genutzten
Einstellungen ....................................................................................... 166
Tab. A1: Name,
Zusammensetzung,
milchbasierten
pH-Wert
Verdünnern
für
die
und
Osmolarität
von
Flüssigkonservierung
von
Hundesperma ...................................................................................... 261
Tab. A2: Zusammensetzung, pH-Wert und Osmolarität verschiedener TRISgepufferter
Eigelb-Verdünner
für
die
Flüssigkonservierung
von
Hundesperma ...................................................................................... 262
Tab. A3: Name,
Zusammensetzung,
pH-Wert
und
Osmolarität
sonstiger
Verdünner für die Flüssigkonservierung von Hundesperma .............. 264
288
Anhang
Tab. A4: Name,
Zusammensetzung,
kommerzieller
Verdünner
pH-Wert
für
die
und
Osmolarität
Flüssigkonservierung
einiger
von
Hundesperma ...................................................................................... 265
Tab. A5: CASA-Motilitätsparameter DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL, ALH, BCF,
STR, LIN und WOB (n, ± SD, Min., Max.) im Nativsperma und in den
verschiedenen Verdünnern an Tag 0.................................................. 267
Tab. A6: Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen
bezüglich des Faktors „Verdünner“ zum Vergleich der Verdünner CP,
TE und Up 1 + 2 mit dem Nativsperma unmittelbar nach dem Verdünnen
(Tag 0); n = 12; bei signifikantem Resultat wurde anschließend ein
Student-Newman-Keuls-Test zum paarweisen Vergleich der Mittelwerte
durchgeführt ........................................................................................ 268
Tab. A7: Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen
bezüglich des Faktors „Verdünner“ zum Vergleich der Verdünner CP,
TE und Up 1 mit dem Nativsperma unmittelbar nach dem Verdünnen
(Tag 0); n = 18; bei signifikantem Resultat wurde anschließend ein
Student-Newman-Keuls-Test zum paarweisen Vergleich der Mittelwerte
durchgeführt ........................................................................................ 270
Tab. A8: Resultate der einfaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen
bezüglich des Faktors „Verdünner“ zum Vergleich der Verdünner CP
und TE mit dem Nativsperma unmittelbar nach dem Verdünnen (Tag 0);
n = 30; bei signifikantem Resultat wurde anschließend ein StudentNewman-Keuls-Test
zum
paarweisen
Vergleich
der
Mittelwerte
durchgeführt ........................................................................................ 272
Tab. A9: CASA-Motilitätsparameter DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL, ALH, BCF,
STR, LIN und WOB (n, ± SD, Min., Max.) in den verschiedenen
Verdünnern im Zeitverlauf ................................................................... 273
Tab. A10: Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“
zum Vergleich der Verdünner CP und TE im Zeitverlauf (Tag 0-10) der
Flüssigkonservierung bei 4°C für 10 Tage; n = 30 .............................. 279
289
Anhang
Tab. A11: Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“
zum Vergleich der Verdünner CP und Up 1 + 2 im Zeitverlauf (Tag 0-10)
der Flüssigkonservierung bei 4°C für 10 Tage; n = 12 ........................ 280
Tab. A12: Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“
zum Vergleich der Verdünner CP und Up 1 im Zeitverlauf (Tag 0-10) der
Flüssigkonservierung bei 4°C für 10 Tage; n = 18 .............................. 281
Tab. A13: Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“
zum Vergleich der Verdünner TE und Up 1 + 2 im Zeitverlauf (Tag 0-10)
der Flüssigkonservierung bei 4°C für 10 Tage; n = 12 ........................ 282
Tab. A14: Resultate
der
zweifaktoriellen
Varianzanalysen
mit
Messwiederholungen bezüglich der Faktoren „Verdünner“ und „Zeit“
zum Vergleich der Verdünner TE und Up 1 im Zeitverlauf (Tag 0-10) der
Flüssigkonservierung bei 4°C für 10 Tage; n = 18 .............................. 283
290
Danksagung
10
Danksagung
An erster Stelle danke ich Herrn Prof. Dr. A. Wehrend für die Überlassung des
interessanten Themas und für das entgegengebrachte Vertrauen.
Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. S. Goericke-Pesch für die gute und
freundliche Betreuung während aller Phasen der Dissertation, insbesondere aber
für ihre tatkräftige Unterstützung bei der Durchführung der Versuche, für ihre
unermüdlichen Hilfestellungen bei der Anfertigung dieser Arbeit, für ihre guten
Ratschläge und für die vielen motivierenden Worte.
Auch allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Klinik für Geburtshilfe,
Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz
der Justus-Liebig-Universität Gießen, die stets hilfsbereit waren, möchte ich
danken.
Ebenso danke ich meinen Mitdoktorandinnen für die gegenseitigen Hilfen und
Aufmunterungen während der vielen gemeinsamen Laborstunden.
Herrn Dr. K. Failing und Frau M. Sparenberg von der Arbeitsgruppe
Biomathematik und Datenverarbeitung des Fachbereichs Veterinärmedizin der
Justus-Liebig-Universität Gießen danke ich für ihre Mithilfe bei der statistischen
Auswertung meiner Ergebnisse und für die Betreuung bei statistischen Fragen.
Außerdem möchte ich mich bei allen Rüdenbesitzern für die geduldige
Bereitstellung ihrer Hunde ganz herzlich bedanken.
Bei
meiner
Freundin
Jule
möchte
ich
mich
ganz
besonders für
ihre
freundschaftliche Hilfe, für ihr immer offenes Ohr, für ihre konstruktive Kritik und
für die vielen schönen gemeinsamen Stunden während der gesamten Zeit des
Studiums und der Doktorarbeit bedanken.
Ebenfalls danke ich meinem Freund Beni für alles Verständnis, für das geduldige
Zuhören und für die technische Unterstützung bei diversen Computerproblemen.
Auch bei allen anderen Freundinnen und Freunden, die hier aus Platzgründen
keine Erwähnung fanden, möchte ich mich für ihre Unterstützung bedanken.
Zuletzt danke ich von ganzem Herzen meiner Mutter, die mir durch ihre
umfassende Unterstützung in allen Bereichen meines bisherigen Weges mein
Studium und diese Arbeit ermöglicht hat.
291
Ich erkläre:
Ich habe die vorgelegte Dissertation selbständig und ohne unerlaubte fremde Hilfe
und nur mit den Hilfen angefertigt, die ich in der Dissertation angegeben habe. Alle
Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nicht
veröffentlichten Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen
Auskünften beruhen, sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir
durchgeführten und in der Dissertation erwähnten Untersuchungen habe ich die
Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis, wie sie in der „Satzung der JustusLiebig-Universität
Gießen
zur
niedergelegt sind, eingehalten.
Daniela Klaus
Sicherung
guter
wissenschaftlicher
Praxis“
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VVB LAUFERSWEILER VERLAG
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D-35396 GIESSEN
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VON CANINEM SPERMA
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