MiSeqDx Diagnose-Assay für zystische Fibrose - Support

MiSeqDx Diagnose-Assay für zystische Fibrose - Support

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

FÜR IN-VITRO-DIAGNOSTIK

Katalognummer DX-102-1001: 6 Läufe, bis zu 48 Proben pro Kit

Verwendungszweck

Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose ist ein In-vitro-Diagnostiksystem für die gezielte Sequenzierung, das die proteincodierenden Regionen und Intron-Exon-Grenzen des CFTR-Gens in genomischer DNA, die aus in K

2

EDTA gesammelten menschlichen peripheren Blutproben isoliert wurde, resequenziert. Der Test erkennt einzelne Nukleotidvarianten und kleine Indels innerhalb der sequenzierten Region und meldet zudem zwei tiefe intronische Mutationen und zwei große Deletionen. Der Test muss auf dem Illumina

MiSeqDx-Gerät durchgeführt werden.

Der Test ist zur Unterstützung der Diagnose von Personen mit Verdacht auf zystische Fibrose (CF) vorgesehen. Dieser

Assay ist am besten geeignet, wenn der Patient eine atypische oder nicht klassische Form von CF aufweist oder wenn andere Mutationspanels die beiden verursachenden Mutationen nicht nachweisen konnten. Die Ergebnisse des Tests sollten von einem zertifizierten klinischen Molekulargenetiker oder einem gleichwertig qualifizierten Kollegen interpretiert werden und in Verbindung mit anderen verfügbaren Informationen, wie z. B. klinischen Symptomen, anderen Diagnostiktests und der Krankheitsgeschichte der Familie, verwendet werden.

Dieser Test ist nicht für unabhängige Diagnosezwecke, die pränatale Diagnostik, Präimplantationstests, Träger-

Screenings, Neugeborenen-Screenings oder Bevölkerungs-Screenings vorgesehen.

Zusammenfassung und Erläuterung des Assay

Klinische Beschreibung

Die Mukoviszidose (oder zystische Fibrose, ZF) ist eine der häufigsten genetischen Erkrankungen der westlichen Welt und die am häufigsten auftretende lebensbedrohliche autosomal-rezessive Erkrankung in der nicht-hispanischen weißen Bevölkerung

1-5

. ZF wirkt sich auf die Viskosität der Schleimsekrete aus und befällt die Epithelien der

Atemwege, die Bauchspeicheldrüse, den Darm, das hepatobiliäre System, den männlichen Genitaltrakt und die

Schweißdrüsen, was zu einer komplexen Multiorgan-, Multisystemerkrankung führt

2-4

, wobei die Lunge das primäre

Organ bezüglich Morbidität und Mortalität ist

6

. In vielen Fällen sind eine Mangelernährung oder

Verdauungsstörungen Vorboten von durch ZF verursachten Lungenerkrankungen. Ein Schwerpunkt der aktuellen interventionellen Anstrengungen liegt daher in der Früherkennung der Erkrankung durch ein Neugeborenen-

Screening

5

, wodurch die frühzeitige lebenswichtige medizinische Versorung sichergestellt und für Menschen mit dieser Erkrankung das bestmögliche Ergebnis erzielt werden soll

2,5

. Obwohl es bei der Lebenserwartung geschlechtliche Unterschiede gibt – die mittlere Lebenserwartung ist bei Männern höher als bei Frauen – liegt die allgemeine Lebenserwartung in den USA bei 38,3 Jahren

6

.

CFTR-Varianten und Inzidenz

Das Gen „Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator“ ( CFTR) wurde 1989 identifiziert. Es befindet sich am langen Arm des Chromosoms 7 und enthält 27 kodierende Exons, verteilt über 230 kb 2 . Eine 6,5-kb-mRNA, die von dem normalen Allel produziert wird, kodiert CFTR, ein 1490-Aminosäure-haltiges Membranprotein, das als regulierter

Chlorid-Kanal in den Epithelzellen mehrerer Organe fungiert 2,3 . Derzeit sind über 1.900 Varianten des CFTR-Gens beschrieben, wobei die Mehrheit davon Punktmutationen sind 7 . Die häufigste CFTR-Variante ist das F508del-Allel 3 ,

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MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose das fast 70 % aller

CFTR-Varianten ausmacht

1 . Allerdings resultieren die anderen häufig auftretenden

CFTR-Varianten oft in einem CF-Phänotyp und anderen auf CFTR zurückzuführenden Erkrankungen

1-3

.

Die Mukoviszidose hat eine geschätzte Erkrankungshäufigkeit von einer in 2.000 bis 4.000 Lebendgeburten und eine

Prävalenz von rund 30.000 Personen in der US-Bevölkerung 2 . Sie tritt in allen ethnischen Gruppierungen mit unterschiedlicher Häufigkeit auf: 1:3.000 bei Weißen, 1:9.200 bei Hispanoamerikanern, 1:10.900 bei amerikanischen

Ureinwohnern, 1:15.000 bei Afroamerikanern und 1:31.000 bei der asiatisch-amerikanischen Bevölkerung 2,4 . Allerdings wird die Zuweisung einer Ethnie auf eine betroffene Person immer schwieriger 8 . Aktuelle Schätzwerte der Häufigkeit der Träger der CFTR-Mutation nach Ethnizität in den USA auf Basis einer Kohorte von 364.890 Personen, die zum

Trägertest überwiesen wurden und bezüglich Mukoviszidose nicht familiär vorbelastet sind, werden in

Tabelle 1

angegeben.

Tabelle 1 Allgemeine Trägerhäufigkeit von Mukoviszidose-Mutationen in den verschiedenen ethnischen Gruppen in den

USA 9

Ethnische Gruppe

Beobachtete Trägerhäufigkeit

Afroamerikanisch

Aschkenasi Jüdisch

1 aus 84

1 aus 29

Asiatisch

Weiß

Hispanoamerikanisch

Jüdisch

Nahöstlich

Ureinwohner

Nordamerikas

1 aus 242

1 aus 28

1 aus 59

1 aus 32

1 aus 91

1 aus 70

1 aus 118

1 aus 111

Südasiatisch

Sonstige ethnische

Gruppe

> 1 ethnische Gruppe

Teilweise afroamerikanisch

Teilweise weiß

Teilweise hispanoamerikanisch

Keine Angabe

Alle Personen

1 aus 34

1 aus 56

1 aus 32

1 aus 51

1 aus 37

1 aus 38

Assay-Design

Alle proteincodierenden Regionen im

CFTR-Gen einschließlich 10 nt flankierender intronischer Sequenz werden für alle außer drei Exons (Exon 7, 10 und 20) nachgewiesen. Bei Exon 7 und Exon 10 werden nur 5 nt flankierende intronische Sequenz am 5'-Ende des Exons einbezogen, um proximale homopolymere Indels zu vermeiden. Bei Exon

20 werden 30 nt flankierender intronischer Sequenz am 5'-Ende des Exons einbezogen, um den Nachweis der Mutation

3272-26A>G zu ermöglichen. Darüber hinaus weist der Assay ca. 100 nt flankierender Sequenz an den 5'- und 3'-UTRs, zwei tiefe intronische Mutationen (1811+1.6kbA>G, 3489+10kbC>T), zwei große Deletionen (CFTRdele2,3,

CFTRdele22,23) und die PolyTG/PolyT-Region nach. Die komplette Abdeckung des Assays wird in den Positionen der genomischen Koordinaten in

Tabelle 2

gezeigt.

2

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Tabelle 2 MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose – Abdeckung der genomischen Koordinaten

hg19 Anfang der genomischen Koordinate

(chr7) hg19 Ende der genomischen Koordinate

(chr7)

Länge (Basenpaar)

CFTR_Exon 1

117120041 117120211 171

CFTR_Exon 2

117144297 117144427 131

CFTR_Exon 3

117149078 117149206 129

CFTR_Exon 4

117170943 117171178 236

CFTR_Exon 5

117174320 117174429 110

CFTR_Exon 6

117175292 117175475 184

CFTR_Exon 7^

117176597 117176737 141

CFTR_Exon 8

117180144 117180410 267

CFTR_Exon 9

117182060 117182172 113

CFTR_Exon 10^

117188690 117188887 198

CFTR_Exon 11

117199508 117199719 212

CFTR_Exon 12

117227783 117227897 115

CFTR_Intron 12*

117229516 117229526 11

CFTR_Exon 13

117230397 117230503 107

CFTR_Exon 14

117231978 117232721 744

CFTR_Exon 15

117234974 117235122 149

CFTR_Exon 16

117242870 117242927 58

CFTR_Exon 17

117243576 117243846 271

CFTR_Exon 18

117246718 117246817 100

CFTR_Exon 19

117250563 117250733 171

CFTR_Exon 20 #

117251605 117251872 268

CFTR_Exon 21

117254657 117254777 121

CFTR_Exon 22

117267566 117267834 269

CFTR_Intron 22*

117280010 117280020 11

CFTR_Exon 23

117282482 117282657 176

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CFTR_Exon 24

CFTR_Exon 25

CFTR_Exon 26

CFTR_Exon 27

Summe Basen hg19 Anfang der genomischen Koordinate

(chr7)

117292886

117304732

117305503

117306952

hg19 Ende der genomischen Koordinate

(chr7)

117292995

117304924

117305628

117307262

Länge (Basenpaar)

110

193

126

311

5203**

^ Bei Exon 7 und Exon 10 werden nur 5 nt flankierende intronische Sequenz stromaufwärts vom Exon einbezogen. Dies dient der

Vermeidung homopolymerer Abschnitte in diesen Regionen. Im Falle von Exon 10 ist dies die PolyT/Poly TG-Region in Intron 9.

Diese Region wird speziell und separat behandelt.

#

* Bei den tiefen intronischen Mutationen werden 5 die SNV auf beiden Seiten flankierende Nukleotide einbezogen.

Bei Exon 20 werden 30 nt flankierende intronische Sequenz am 5'-Ende des Exons einbezogen, um den Nachweis der Mutation

3272-26A>G zu ermöglichen.

** Mit den zwei großen Deletionen und den PolyTG/PolyT-Regionen gibt es insgesamt 5206 Positionen/Regionen.

Verfahrensprinzipien

Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose umfasst zwei Hauptverfahren. Das erste

Verfahren, die Bibliotheksvorbereitung, besteht im manuellen Vorbereiten der Proben für die Sequenzierung. Die

Bibliotheksvorbereitung besteht aus vier wichtigen Schritten: Hybridisierung, Extension-Ligation, PCR-Amplifikation und Bibliotheksnormalisierung. Das zweite Verfahren ist das Sequenzieren der vorbereiteten Probe mithilfe der SBS-

Chemie (Sequencing by Synthesis) auf dem MiSeqDx-Gerät.

Bibliotheksvorbereitung

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A Hybridisierung – Im ersten Schritt, der Hybridisierung, wird ein Pool von Upstream- und Downstream-

Oligonukleotiden, der spezifisch für den MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose ist, in die genomische DNA-Probe hybridisiert. Am Ende des Vorgangs entfernt ein Waschlauf in drei Schritten anhand eines Filters, der eine Größenauswahl vornehmen kann, ungebundene Oligonukleotide aus der genomischen

DNA.

B Extension-Ligation – Im zweiten Schritt, der Extension-Ligation, werden die hybridisierten Upstream- und

Downstream-Oligonukleotide verbunden. Eine DNA-Polymerase erstreckt sich von den Upstream-

Oligonukleotiden über die Zielregion hinaus, gefolgt von der Ligation mit dem 5'-Ende des Downstream-

Oligonukleotids mittels DNA-Ligase. Das Ergebnis besteht in der Bildung von Produkten, die die CF-spezifischen

Oligonukleotide enthalten, flankiert von Sequenzen, die für die Amplifikation benötigt werden.

C PCR-Amplifikation – Im dritten Schritt, der PCR-Amplifikation, werden die Extension-Ligation-Produkte unter

Verwendung von Primern, die Indexsequenzen für die Proben-Multiplexierung hinzufügen, sowie von gängigen

Adaptern, die für die Clusterbildung auf dem MiSeqDx-Gerät erforderlich sind, amplifiziert. Am Ende dieses

Vorgangs reinigt ein PCR-Reinigungsverfahren die PCR-Produkte (die als Bibliothek bezeichnet werden).

D Bibliotheksnormalisierung – Im letzten Schritt, der Bibliotheksnormalisierung, wird die Quantität jeder

Bibliothek normalisiert, um eine einheitlichere Bibliotheksdarstellung in der endgültigen Pool-Bibliothek sicherzustellen. Am Ende dieses Vorgangs wird die Pool-Bibliothek zur Sequenzierung mit der SBS-Chemie auf das MiSeqDx-Gerät geladen.

Sequenzierung

Die SBS-Chemie verwendet eine Methode mit reversiblen Terminatoren, um einzelne Nukleotidbasen zu erkennen, die in wachsende DNA-Stränge eingebaut sind. Während eines Sequenzierungszyklus wird ein einzelnes, mit

Fluoreszenzfarbstoff markiertes Desoxynukleotid-Triphosphat (dNTP) zur Nukleotid-Säurekette hinzugefügt. Die

Nukleotid-Kennzeichnung dient als Terminator für die Polymerisation, d. h. nach jeder dNTP-Inkorporation wird der

Fluoreszenzfarbstoff bildlich erfasst, um die Base zu identifizieren, und dann enzymatisch gespalten, um die

Inkorporation des nächsten Nukleotids zu ermöglichen. Da alle vier an reversible Terminatoren gebundenen dNTPs

(A, G, T, C) als einzelne, separate Moleküle vorhanden sind, werden Integrationsfehler durch natürliche

Wettbewerbsmechanismen minimiert. Base-Calls erfolgen bei jedem Sequenzierungszyklus direkt anhand von

Signalstärkemessungen. Das Endergebnis ist eine Base für Base erfolgende Sequenzierung.

Datenanalyse

MiSeq Reporter verarbeitet die im Rahmen der Primäranalyse generierten Base-Calls und liefert basierend auf den

Angaben im Probenblatt Informationen zu jeder Probe. Dieser Schritt wird Sekundäranalyse genannt. Die Sekundäranalyse umfasst die Demultiplexierung, die FASTQ-Dateigenerierung, das Alignment, das Varianten-Calling und das Generieren von VCF-Dateien, die Informationen zu CFTR-Varianten enthalten, die an speziellen Positionen im Referenzgenom gefunden wurden.

Demultiplexierung – Dies ist der erste Schritt der Sekundäranalyse, wenn im Probenblatt mehrere Proben aufgelistet sind und der Lauf über Index-Reads verfügt. Die Demultiplexierung trennt Daten aus zusammengefassten Proben auf der Basis der eindeutigen Sequenzindizes, die während der PCR-

Amplifikation hinzugefügt wurden.

Generieren von FASTQ-Dateien – Nach der Demultiplexierung generiert MiSeq Reporter temporäre Dateien im FASTQ-Dateiformat, dem Textformat für die Darstellung von Sequenzen. FASTQ-Dateien enthalten die

Reads für jede Probe sowie die Qualitäts-Scores (ausgenommen Reads von Clustern, die den Filter nicht passiert haben.

Alignment – Beim Alignment werden Sequenzen mit der Referenz verglichen, um eine Beziehung zwischen den Sequenzen zu identifizieren. Außerdem wird ein Score basierend auf Ähnlichkeitsregionen zugewiesen.

Ausgerichtete Reads werden in Dateien im BAM-Format gespeichert. MiSeq Reporter verwendet einen

„banded“ Smith-Waterman-Algorithmus, der lokale Sequenz-Alignments durchführt, um ähnliche Regionen zwischen zwei Sequenzen zu ermitteln.

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Varianten-Calling – Bei diesem Schritt werden einzelne Nukleotidvarianten (SNVs), Insertionen und

Deletionen (Indels) und weitere strukturierte Varianten in einer standardisierten und analysierbaren Textdatei mit dem Namen MiSeqDxCFClinicalSequencingAssay.txt aufgezeichnet. Weitere Informationen hierzu finden

Sie im Abschnitt „Analyseberichtsdatei“ im MiSeq Reporter – Benutzerhandbuch (Teile-Nr. 15038356_DEU).

Einschränkungen des Verfahrens

1 Die Assay-Sequenzen der folgenden Regionen im CFTR-Gen: a Alle proteincodierenden Regionen im CFTR-Gen über 27 Exone hinweg b Zwischen 5 und 10 Basen flankierender intronischer Sequenz c Hundert Nukleotide intronischer Sequenz an den 5’- und 3’-UTRs (untranslatierte Regionen) d Zwei tiefe intronische Mutationen (1811+1.6kbA>G, 3489+10kbC>T) e Die PolyTG/PolyT-Sequenz in Intron 9 f Insgesamt 5206 Positionen/Regionen von den möglichen 188.702 Basenpaaren im Gen.

2 Für In-Vitro-Diagnostik: Die mit dem Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische

Fibrose erzielten Ergebnisse sollten im Kontext einer vollständigen klinischen Bewertung verwendet und interpretiert werden.

3 Der Assay ist für das Sequenzieren der Protein-kodierenden Regionen und der Intron/Exon-Übergänge des

CFTR-Gens konzipiert. Er enthält nicht alle intronischen Regionen und großen Deletionen. Daher ist auch bei einem „Wildtyp“-Gesamtergebnis nicht auszuschließen, dass die analysierten Proben andere

Mutationen/Varianten des Gens „Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator“ (CFTR) enthalten.

— Der Assay dient dem Erkennen von zwei spezifischen großen Deletionen: CFTRdele2,3 und

CFTRdele22,23. Andere große Deletionen werden nicht ermittelt oder protokolliert. Dieser Assay ist nur für Insertionen und Deletionen einer Größe von maximal 3 bp validiert.

4 Die Häufigkeit der von diesem Assay ermittelten Varianten ist je nach Bevölkerungsgruppe unterschiedlich.

Es ist nicht möglich, alle Variantenkombinationen zu validieren, die dieser Assay im CFTR-Gen nachweisen könnte. Es wird empfohlen, neue und seltene Varianten mit einer validierten Referenzmethode zu bestätigen.

5 Wie bei jedem auf Hybridisierung basierenden Assay können zugrundeliegende Polymorphismen oder

Mutationen in Oligonukleotid-bindenden Regionen die untersuchten Allele und somit die Anzahl der Calls beeinträchtigen.

6 Wenn mehr als zwei Varianten in einer Probe identifiziert werden, sollte der Benutzer das Ergebnis verifizieren, indem er die Probe unter Verwendung des Gerätesystem mit einem frischen gDNA-Extrakt wiederholt, um eine Kreuzkontamination der Probe auszuschließen.

HINWEIS: Es sollte eine Haplotyp-Phasierung in Betracht gezogen werden, wenn zwei oder mehr Varianten nachgewiesen werden. Dieser Assay kann nicht feststellen, ob sich Varianten in cis/trans-Ausrichtung zu anderen Varianten befinden.

7 In der MiSeq Reporter-Software werden alle Insertionen/Deletionen in Homopolymer-Regionen linksbündig ausgewiesen. Beispielsweise wird die Variante 444delA als eine GA-TC-Deletion identifiziert, während die

Deletion in dbSNP als eine G-ATC-Deletion angegeben wird. Eine Ausnahme hiervon bilden die 135 CF-

Variationen, die in der CFTR2-Datenbank als krankheitsverursachend aufgeführt sind (basierend auf einer

Variantenliste vom September 2013). Alle Indels in Homopolymer-Regionen innerhalb dieser Gruppe von

Variationen stimmen mit den erwarteten Variantennachweisen gemäß CFTR2

10

überein.

8 Der Assay kann nicht feststellen, ob die Ausrichtung der PolyTG/PolyT-Variante cis/trans zu anderen

Varianten ist. Bei Patienten mit einer R117H-Variante sollten weitere Tests durchgeführt werden, um festzustellen, ob sich eine PolyTG/PolyT-Variante, die den klinischen Phänotyp [z. B. 12-13 (TG) oder 5T] beeinflussen kann, in cis/trans-Ausrichtung befindet.

— PolyTG/PolyT sind Homopolymer-Regionen, die aufgrund des Verrutschens der DNA-Polymerase

(Slippage) bekanntermaßen schwer zu sequenzieren sind.

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9 Dieser Assay wird ausschließlich in einem 8-Plex-Format ausgeführt. Wenn keine sechs klinische Proben verfügbar sind, ausgenommen die positive und die negative Kontrollprobe, müssen andere Proben menschlicher genomischer DNA für den Lauf verwendet werden.

Produktkomponenten

Die Illumina MiSeqDx-Plattform umfasst folgende Komponenten:

• MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose (Katalog-Nr. DX-102-1001)

• MiSeqDx-Gerät (Katalognummer DX-410-1001)

Reagenzien

Bereitgestellte Reagenzien

Reagenzien für den Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose (Katalognummer DX-102-

1001) werden von Illumina bereitgestellt. Dieses Kit wurde für sechs Läufe mit maximal acht Probem pro Lauf

(insgesamt bis zu 48 Proben) konfiguriert.

MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose, Karton 1

Tabelle 3 Karton 1A Voramplifikationsreagenzien

Komponente Menge

Füllmenge

Wirkstoffe

1 Röhrchen

600 µl

Oligo-Pool für den klinischen CF-

Sequenzierungs-Assay

Hybridisierungspuffer

Extension-Ligation-

Mischung

Index-Primer C (A503), D

(A504) und E (A505)

Index-Primer 1 (A701), 2

(A702) und 10 (A710)

PCR-Polymerase

PCR-Master-Mischung

1 Röhrchen

1 Röhrchen

1 Röhrchen pro Primer

1 Röhrchen pro Primer

1 Röhrchen

1 Röhrchen

4,32 ml

4,8 ml

192 µl

128 µl

56 µl

2,8 ml

Gepufferte wässrige Lösung mit

Oligonukleotiden, die auf das CFTR-Gen abzielen

Gepufferte wässrige Lösung mit Salzen und Formamid

Gepufferte wässrige Lösung mit einer proprietären Mischung aus DNA-

Polymerasen, DNA-Ligasen und dNTPs

PCR-Primer mit Indexsequenzen und

Sequenzierungsadaptern

PCR-Primer mit Indexsequenzen und

Sequenzierungsadaptern

Proprietäre DNA-Polymerase

Gepufferte wässrige Lösung mit Salzen und dNTPs

Lagerung

-25 °C bis -15 °C

-25 °C bis -15 °C

-25 °C bis -15 °C

-25 °C bis -15 °C

-25 °C bis -15 °C

-25 °C bis -15 °C

-25 °C bis -15 °C

Tabelle 4 Karton 1B Nachamplifikationsreagenzien

Komponente Menge

Bibliotheksnormalisierungsverdünner 1 Röhrchen

Bibliothek-Verdünnungspuffer

Interne PhiX-Kontrolle

1 Röhrchen

1 Röhrchen

Füllmenge Wirkstoffe

4,6 ml

4,5 ml

10 µl

Gepufferte wässrige Lösung mit genomischer PhiX-DNA

Lagerung

Gepufferte wässrige Lösung mit Salzen,

2-Mercaptoethanol und

Formamid

-25 °C bis -15 °C

Gepufferte wässrige Lösung -25 °C bis -15 °C

-25 °C bis -15 °C

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MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose, Karton 2

Tabelle 5 Karton 2 Nachamplifikationsreagenzien

Komponente Menge Inhalt

MiSeqDx-

Reagenzienkartusche -

Klinischer CF-

Sequenzierungs-Assay

6 Kartuschen Einweg-Kartusche mit Clusterbildungs- und

Sequenzierungsreagenzien für die Verwendung mit dem MiSeqDx-Gerät, einschließlich Formamid,

2-Mercaptoethanol und 2 % DMSO

Lagerung

-25 °C bis -15 °C

MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose, Karton 3

Tabelle 6 Karton 3A Voramplifikationsreagenzien

Komponente Menge

Füllmenge

Wirkstoffe

Stringenter Wasch-Puffer 1 Flasche

Universeller Wasch-

Puffer

1 Röhrchen

24 ml

4,8 ml

Gepufferte wässrige Lösung mit Salzen,

2-Mercaptoethanol und Formamid

Gepufferte wässrige Lösung mit Salzen

Lagerung

2 °C bis 8 °C

2 °C bis 8 °C

Tabelle 7 Karton 3B Nachamplifikationsreagenzien

Komponente Menge Füllmenge Wirkstoffe

PCR-Reinigungs-Beads 1 Röhrchen

Bibliotheksnormalisierungs-

Wasch-Puffer

Bibliothek-Beads

MiSeqDx-Fließzelle -

Klinischer CF-

Sequenzierungs-Assay

2 Röhrchen

1 Röhrchen

6 Behälter

5 ml

4,8 ml

Gepufferte wässrige Lösung mit festphasigen paramagnetischen Beads und Polyethylenglykol

Gepufferte wässrige Lösung mit

Salzen, 2-Mercaptoethanol und

Formamid

1,2 ml

Gepufferte wässrige Lösung mit festphasigen paramagnetischen Beads

1 Fließzelle

Glassubstrat mit kovalent gebundenen Oligonukleotiden

Lagerung

2 °C bis 8 °C

2 °C bis 8 °C

2 °C bis 8 °C

2 °C bis 8 °C

MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose, Karton 4

Tabelle 8 Karton 4 Nachamplifikationsreagenzien

Komponente Menge

Füllmenge

Wirkstoffe

MiSeqDx-SBS-Lösung

(PR2) - Klinischer CF-

Sequenzierungs-Assay

6 Flaschen

353,1 ml

Gepufferte wässrige Lösung

MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose, Karton 5

Tabelle 9 Karton 5 Voramplifikationsreagenzien

Komponente Menge

Füllmenge

Wirkstoffe

Filterplatte 6 Platten

N/A

Polypropylen-Mikrotiterplatte mit einer modifizierten Polyethersulfonmembran

Tabelle 10 Karton 5 Nachamplifikationsreagenzien

Komponente Menge Füllmenge Wirkstoffe

Elutionspuffer

Bibliothek-

Lagerungspuffer

1 Röhrchen

1 Röhrchen

4,8 ml

3,5 ml

Gepufferte wässrige Lösung

Gepufferte wässrige Lösung

Lagerung

2 °C bis 8 °C

Lagerung

15 °C bis 30 °C

Lagerung

15 °C bis 30 °C

15 °C bis 30 °C

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MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Erforderliche, jedoch nicht bereitgestellte Reagenzien

Voramplifikationsreagenzien

• 10 N NaOH (aus Tabletten herstellen oder Standardlösung verwenden)

• TE-Puffer

• DNase- und RNase-freies Wasser

Nachamplifikationsreagenzien

• 10 N NaOH (aus Tabletten herstellen oder Standardlösung verwenden)

• Ethanol absolut für die Molekularbiologie

• TE-Puffer

• DNase- und RNase-freies Wasser

Lagerung und Handhabung

1 Die Raumtemperatur ist mit 15 °C bis 30 °C definiert.

2 Die folgenden Reagenzien werden gefroren ausgeliefert und sind stabil, wenn sie bis zum angegebenen

Verfallsdatum bei -25 °C bis -15 °C gelagert werden.

— Oligo-Pool für den klinischen CF-Sequenzierungs-Assay

— Hybridisierungspuffer

— Extension-Ligation-Mischung

— Index-Primer C (A503), D (A504) und E (A505)

— Index-Primer 1 (A701), 2 (A702) und 10 (A710)

— PCR-Polymerase

— PCR-Master-Mischung

— Bibliotheksnormalisierungsverdünner

— Bibliothek-Verdünnungspuffer

— Interne PhiX-Kontrolle

— MiSeqDx-Reagenzienkartusche - Klinischer CF-Sequenzierungs-Assay

Mit Ausnahme der Reagenzienkartusche sind die Reagenzien für maximal 6 vor dem angegebenen

Verfallsdatum durchgeführte Gefrier/Auftau-Zyklen stabil.

Frieren Sie die Reagenzienkartusche nicht mehr ein, nachdem sie aufgetaut wurde. Sie kann bei 2 °C bis 8 °C bis zu sechs Stunden lang gelagert werden.

3 Die folgenden Reagenzien werden gekühlt ausgeliefert und sind stabil, wenn sie bis zum angegebenen

Verfallsdatum bei 2 °C bis 8 °C gelagert werden.

— Stringenter Wasch-Puffer

— Universeller Wasch-Puffer

— PCR-Reinigungs-Beads

— Bibliothek-Beads

— Bibliotheksnormalisierungs-Wasch-Puffer

— MiSeqDx-SBS-Lösung (PR2) - Klinischer CF-Sequenzierungs-Assay

— MiSeqDx-Fließzelle - Klinischer CF-Sequenzierungs-Assay

4 Die folgenden Reagenzien werden in Umgebungstemperatur ausgeliefert und sind stabil, wenn sie bei

Raumtemperatur bis zum angegebenen Verfallsdatum gelagert werden.

— Elutionspuffer

— Filterplatte

— Bibliothek-Lagerungspuffer

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5 Änderungen an der physischen Struktur der bereitgestellten Reagenzien kann auf eine Schädigung der

Materialien hindeuten. Verwenden Sie die Reagenzien nicht, wenn Änderungen an der physischen Struktur auftreten (z. B. offensichtliche Veränderungen der Reagenzienfarbe oder Eintrübung mit offenkundiger

Keimkontamination).

6 Die Reagenzien Hybridisierungspuffer, Stringenter Wasch-Puffer und Bibliotheksnormalisierungsverdünner können sichtbare Ausfällungen oder Kristalle bilden. Mischen Sie vor der Verwendung kräftig mit dem

Vortexer und stellen Sie anschließend visuell sicher, dass keine Ausfällungen vorhanden sind.

7 Beachten Sie die folgenden Best Practices beim Umgang mit PCR-Reinigungs-Beads und Bibliothek-Beads:

— Die Beads dürfen niemals eingefroren werden.

— Die Beads sollten Raumtemperatur haben.

— Mischen Sie die Beads unmittelbar vor der Verwendung mit dem Vortexer, bis sie gut suspendiert sind und die Farbe homogen erscheint.

— Mischen Sie die Probe nach dem Hinzufügen der Beads gründlich, indem Sie zehnmal auf- und abpipettieren. Die Proben können auch mit einem Schüttler sorgfältig gemischt werden.

— Inkubieren Sie die Bead/Probenmixtur bei Raumtemperatur für die gesamte angegebene Dauer.

— Folgen Sie den Anweisungen, wenn Sie das Magnetstativ verwenden. Warten Sie, bis die Lösung klar ist, bevor Sie aspirieren. Belassen Sie die Platte auf dem Magnetstativ, wenn Sie den Überstand langsam aspirieren. Achten Sie dabei darauf, dass die separierten Beads nicht durcheinandergebracht werden.

8 Die PCR-Amplifikationsplatte kann über Nacht auf dem Thermocycler bleiben oder bei 2 °C bis 8 °C bis zu zwei Tage lang gelagert werden. Versiegeln Sie vor dem Lagern der Platte bei 2 °C bis 8 °C den Platten-Well.

9 Frieren Sie die Bibliothek-Beads nicht ein bzw. vermischen Sie sie nicht mit dem

Bibliotheksnormalisierungsverdünner-Reagenz, wenn sie nicht sofort verwendet werden.

10 Die vollständige Bibliotheksnormalisierungsplatte kann bei -25 °C bis -15 °C bis zu 3 Tage lang gelagert werden.

11 Die Pooled Amplicon Library (PAL) kann bei -25 °C bis -15 °C bis zu 3 Tage lang gelagert werden.

12 Laden Sie den frisch vorbereiteten, verdünnten Amplikon-Pool sofort in die Reagenzienkartusche. Die

Lagerung des verdünnten Amplikon-Pools kann zu einer signifikanten Verringerung der Clusterdichte führen.

Geräte und Materialien

Bereitgestellte, separat erhältliche Geräte und Materialien

1 MiSeqDx-Gerät, Katalognummer DX-410-1001

2 TruSeq-Indexplattenvorrichtungs-Kit, Katalognummer FC-130-1005

3 TruSeq-Indexplattenvorrichtungs- und -Kranz-Kit, Katalognummer FC-130-1007

4 Ersatzverschlüsse für Indexadapter, Katalognummer DX-502-1003

Erforderliche, jedoch nicht bereitgestellte Geräte und Materialien

Geräte und Materialien für die Voramplifikation

1 Hitzeblock – Es wird ein Hitzeblock für eine 96-Well-Platte benötigt. Der Hitzeblock muss den folgenden

Leistungsspezifikationen entsprechen. Hitzeblöcke mit beheizten Deckeln sind zur Verwendung akzeptabel.

— Temperaturbereich: Umgebung +5 °C bis 99 °C

— Temperatursteuerung: ±0,1 °C bei 37 °C; ±0,4 °C bei 60 °C

2 Probeninkubator – Es wird ein Inkubator (Hybridisierungsofen) benötigt. Der Inkubator muss den folgenden

Leistungsspezifikationen entsprechen.

— Temperaturbereich: 10 bis 100 °C

— Temperatursteuerung: ±0,2°C

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3 Tischzentrifuge – Es wird eine Tischzentrifuge benötigt, die die Temperatur von 20 °C halten kann. (Es wird eine separate Zentrifuge im Nachamplifikationsbereich benötigt.) Es kann jede Plattenzentrifuge verwendet werden, die die vorgesehenen Geschwindigkeiten des Protokolls erreicht (280 bis 2400 x g).

4 Präzisionspipetten – Es wird ein Satz Präzisionspipetten benötigt. (Es wird ein separater Satz im

Nachamplifikationsbereich benötigt.) Die Verwendung von Präzisionspipetten ist notwendig, um eine genaue

Reagenz- und Probenabgabe zu gewährleisten. Es können Einzel- oder Mehrkanalpipetten verwendet werden, wenn sie regelmäßig kalibriert werden und ihre Genauigkeit innerhalb von 5 % des angegebenen Volumens liegt.

5 Verbrauchsmaterialien – Die folgenden Verbrauchsmaterialien werden benötigt.

— 96-Well-PCR-Platten mit Rahmen, 0,2 ml, Polypropylen oder vergleichbar

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die 96-Well-Platte zum Magnetstativ passt.

— 96-Well-Lagerungsplatten, 0,8 ml (MIDI-Platten)

— Lösungsbecken, PVC, DNase-/RNase-frei (Bottich)

— Klebende Aluminiumfolienversiegelung

— Entsprechende PCR-Plattenversiegelung

— Aerosol-resistente Pipettenspitzen

Geräte und Materialien für die Nachamplifikation

1 Thermocycler – Es wird ein Thermocycler benötigt. Der Thermocycler muss einen beheizbaren Deckel besitzen und den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen:

— Temperatursteuerungsbereich: 4 °C bis 99 °C

— Steuerungsgenauigkeit: ±0,25 °C von 35 °C bis 99 °C

2 Mikroplattenschüttler – Es wird ein Mikroplattenschüttler im Nachamplifikationsbereich des Labors benötigt.

Der Plattenschüttler muss den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen:

— Maximale Mischgeschwindigkeit: 3.000 rpm

— Mischgeschwindigkeitsbereich: 200 bis 3.000 rpm

3 Tischzentrifuge – Es wird eine Tischzentrifuge benötigt, die die Temperatur von 20 °C halten kann. (Es wird eine separate Zentrifuge im Voramplifikationsbereich benötigt.) Es kann jede Plattenzentrifuge verwendet werden, die die vorgesehenen Geschwindigkeiten des Protokolls erreicht (280 bis 2400 x g).

4 Hitzeblock – Es wird ein Hitzeblock für Röhrchen benötigt. Der Hitzeblock muss den folgenden

Leistungsspezifikationen entsprechen.

— Temperaturbereich: Umgebung +5 °C bis 99 °C

— Temperatursteuerung: ±0,1 °C bei 37 °C; ±0,4 °C bei 60 °C

5 Magnetstativ – Es wird ein Magnetstativ für eine 96-Well-Platte benötigt. Die Leistung ist besser, wenn sich die Magnete an der Seite des Stativs und nicht am Boden befinden.

6 Präzisionspipetten – Es wird ein Satz Präzisionspipetten benötigt. (Es wird ein separater Satz im

Voramplifikationsbereich benötigt.) Die Verwendung von Präzisionspipetten ist notwendig, um eine genaue

Reagenz- und Probenabgabe zu gewährleisten. Es können Einzel- oder Mehrkanalpipetten verwendet werden, wenn sie regelmäßig kalibriert werden und ihre Genauigkeit innerhalb von 5 % des angegebenen Volumens liegt.

7 Verbrauchsmaterialien – Die folgenden Verbrauchsmaterialien werden benötigt.

— 96-Well-PCR-Platten mit Rahmen, 0,2 ml, Polypropylen oder vergleichbar

— 96-Well-Lagerungsplatten, 0,8 ml (MIDI-Platten)

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die 96-Well-Platte zum Magnetstativ passt.

— Konische 15-ml-Röhrchen

— Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen (Schraubverschluss empfohlen)

— PCR-8-fach-Röhrchenstreifen

— Lösungsbecken, PVC, DNase-/RNase-frei (Bottich)

— Klebende Aluminiumfolienversiegelungen

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— Klebende Plattenversiegelungen

— Aerosol-resistente Pipettenspitzen

Probenerfassung, Transport und Lagerung

ANMERKUNG

Behandeln Sie alle Proben wie potenzielle Infektionserreger.

1 Vollblutproben, die in K

2

EDTA-Röhrchen gesammelt wurden, können verwendet werden.

2 Vollblutproben können bei Raumtemperatur maximal sieben Tage, bis zu 30 Tage bei 2 °C bis 8 °C oder gefroren bei -25 °C bis -15 °C bis zu 30 Tage lang gelagert werden.

3 Transportieren Sie Vollblut bei Raumtemperatur maximal sieben Tage lang, bei 2 °C bis 8 °C maximal

30 Tage lang oder gefroren bei -25 °C bis -15 °C maximal 30 Tage lang. Beim Transport von Vollblut müssen die länderspezifischen, Bundes-, staatlichen und regionalen Vorschriften für den Transport von

Krankheitserregern eingehalten werden.

4 Nach dem sechsmaligen Einfrieren und Auftauen von genomischer DNA wurden keine negativen

Auswirkungen auf die Assay-Leistung beobachtet.

5 Bei Vollblutproben mit erhöhten Bilirubin-, Cholesterin-, Hämoglobin-, Triglycerid- bzw. EDTA-Werten wurden keine negativen Auswirkungen auf die Assay-Leistung beobachtet.

Warn- und Vorsichtshinweise

ACHTUNG!

Gemäß geltenden Gesetzen ist der Verkauf oder die Nutzung dieses Geräts nur über einen Arzt bzw.

im Auftrag eines Arztes oder einer anderen Fachperson mit entsprechender Lizenz zulässig.

1 Einige Komponenten dieses Assays enthalten Formamid, ein aliphatisches Amid, das in Verdacht steht, ein

fortpflanzungsgefährdendes Toxin zu sein. (Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Reagenzien auf

Seite 7 .) Es kann daher durch Inhalation oder orale Aufnahme, Kontakt mit der Haut oder den Augen zu

einer Verletzung von Personen kommen. Behälter und nicht verwendeter Inhalt müssen gemäß den geltenden

Sicherheitsvorschriften Ihrer Region entsorgt werden. Wenn Sie weitere Informationen benötigen, wenden Sie sich bitte an den technischen Support von Illumina.

2 Einige Komponenten dieses Assays enthalten das Reduktionsmittel 2-Mercaptoethanol. (Weitere

Informationen hierzu finden Sie unter

Reagenzien auf Seite 7 .) Es kann daher durch Inhalation oder orale

Aufnahme, Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen. Die

Verwendung muss in einem gut belüfteten Bereich stattfinden und alle Behälter und nicht verwendeten

Inhalte müssen gemäß den geltenden Sicherheitsvorschriften Ihrer Region entsorgt werden. Wenn Sie weitere

Informationen benötigen, wenden Sie sich bitte an den technischen Support von Illumina.

3 Behandeln Sie alle Proben wie potenzielle Infektionserreger.

4 Wenn die beschriebenen Verfahren nicht eingehalten werden, kann dies zu fehlerhaften Ergebnissen oder einer wesentlichen Abnahme der Probenqualität führen.

5 Wenden Sie die routinemäßigen Vorsichtsmaßnahmen für das Labor an. Pipettieren Sie nicht mit dem Mund.

Essen, trinken oder rauchen Sie nicht in ausgewiesenen Arbeitsbereichen. Tragen Sie bei der Handhabung von Proben und Assay-Reagenzien Einweg-Handschuhe und einen Laborkittel. Waschen Sie sich nach der

Handhabung von Proben und Assay-Reagenzien gründlich die Hände.

6 Verwenden Sie Assay-Komponenten nicht mehr nach ihrem auf dem Etikett des Assay-Kartons angegebenen

Verfallsdatum. Tauschen Sie Assay-Komponenten aus unterschiedlichen Assay-Chargen nicht gegeneinander aus. Beachten Sie, dass die Assay-Charge auf dem Etikett des Assay-Kartons angegeben ist.

7 Lagern Sie die Assay-Komponenten bei der angegebenen Temperatur in ausgewiesenen Voramplifikationsund Nachamplifikationsbereichen.

8 Ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen (bis zu sechsmal) der Komponenten aus Karton 1 beeinträchtigt die Integrität des Assays nicht.

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9 Um eine Zersetzung der Proben oder Reagenzien zu verhindern, stellen Sie sicher, dass alle

Natriumhypochloritdämpfe vollständig abgeführt wurden, bevor Sie das Protokoll starten.

10 Ordnungsgemäße Laborpraktiken und eine gute Laborhygiene sind unerlässlich, um eine Kontaminierung von Reagenzien, Instrumenten und genomischen DNA-Proben durch PCR-Produkte zu verhindern. Eine

Kontaminierung durch PCR-Produkte kann zu falschen und unzuverlässigen Ergebnissen führen.

11 Stellen Sie zur Verhinderung einer Kontaminierung sicher, dass die Voramplifikations- und

Nachamplifikationsbereiche über eigene Geräte (z. B. Pipetten, Pipettenspitzen, Vortexer und Zentrifuge) verfügen.

12 Vermeiden Sie eine Kreuzkontaminierung. Verwenden Sie nach jeder Probe und nach der Abgabe von

Reagenzien jeweils frische Pipettenspitzen. Mischen Sie Proben mit einer Pipette und zentrifugieren Sie die

Platte, wenn dies angegeben ist. Mischen Sie die Platten nicht mit dem Vortexer. Die Verwendung von

Aerosol-resistenten Spitzen verringert das Risiko einer Amplikon-Übertragung und einer

Kreuzkontaminierung von Probe zu Probe.

13 Die Index-Proben-Paarung muss genau dem Probenblatt entsprechen. Abweichungen zwischen dem

Probenblatt und dem Plattenlayout führen zu einem Verlust der positiven Probenidentifikation und fehlerhaften Ergebnisberichten.

14 Bereiten Sie stets frisches 80%iges Ethanol für die Schritte des Waschlaufs zu. Ethanol kann Wasser aus der

Luft aufnehmen, was die Ergebnisse verfälscht.

15 Stellen Sie sicher, dass während der Waschschritte das gesamte Ethanol vom Boden der Wells entfernt wird.

Ethanolreste können die Ergebnisse beeinträchtigen.

16 Halten Sie nach dem Magnetstativ-Schritt die angegebene Trockenzeit ein, um eine vollständige Evaporation sicherzustellen. Ethanolreste können den Ablauf nachfolgender Reaktionen beeinträchtigen.

17 Mischen Sie den Oligo-Pool für den klinischen CF-Sequenzierungs-Assay und den Hybridisierungspuffer nicht zum Lagern. Wenn diese vermischt werden, wird der Oligo-Pool für den klinischen CF-Sequenzierungs-

Assay selbst bei Gefrierlagerung instabil.

18 Die Verwendung von Thermocyclern mit aktiver Abkühlung (z. B. Peltier, thermoelektrisch gekühlt) wird für den Hybridisierungsschritt nicht empfohlen. Der Schritt der passiven Abkühlung ist für eine ordnungsgemäße Hybridisierung ausschlaggebend.

19 Fügen Sie PCR-Polymerase immer erst direkt vor dem Gebrauch zur PCR-Master-Mischung hinzu. Bewahren

Sie die kombinierte Gebrauchslösung niemals auf.

20 Während des Bibliotheksnormalisierungsschritts ist es äußerst wichtig, das Bibliothek-Bead-Pellet vollständig zu resuspendieren. Dies ist unerlässlich, um eine konsistente Clusterdichte auf der MiSeqDx-Fließzelle zu erzielen.

21 Halten Sie beim Bibliotheksnormalisierungsschritt die angegebenen Inkubationszeiten ein. Eine unsachgemäße Inkubation kann die Bibliotheksdarstellung und die Clusterdichte beeinträchtigen.

22 Aufgrund der Anzahl an Plattenübertragungen und dem sich daraus ergebenden Kontaminierungspotenzial müssen Sie äußerste Vorsicht walten lassen, um sicherzustellen, dass der Well-Inhalt vollständig im Well verbleibt. Passen Sie auf, dass der Inhalt nicht verspritzt wird.

23 Die Empfehlung zur Zugabe von 250 ng DNA ermöglicht die DNA-Mengenvariation. Die Leistung des

Assays wird durch diese Zugabestufe erhöht.

Verfahrenshinweise

1 Illumina verlangt, dass jeder Lauf, der als parallel zu verarbeitender Satz an Proben definiert ist, eine positive

Kontroll-DNA-Probe und eine negative Kontrollprobe (NTC oder No Template Control) enthält. Die positive

Kontroll-DNA-Probe muss eine gut charakterisierte Probe mit einer oder mehreren bekannten CFTR-Varianten sein. Illumina empfiehlt die Verwendung einer Wildtyp-Kontrollprobe. Die Wildtyp-Kontrollprobe sollte als eine Probe ausgeführt werden und nicht die positive oder negative Kontrollprobe ersetzen.

2 Bevor Sie mit dem MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose beginnen, extrahieren und quantifizieren Sie die DNA.

3 Sie können hierfür ein beliebiges validiertes DNA-Extraktionsverfahren verwenden.

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4 Quantifizieren Sie die DNA mit einem Spektralphotometer. Vergewissern Sie sich, dass das A260/A280-

Verhältnis der DNA-Probe > 1,5 ist. Normalisieren Sie die DNA-Probe auf 50 ng/µl. Jede Probe muss 5 µl genomische DNA (insgesamt 250 ng) enthalten.

Probendurchsatz und Indexdarstellung

Beim Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose beträgt der Probendurchsatz pro

MiSeqDx-Lauf 8 Proben. Die während der PCR-Amplifikation verwendeten Index-Primer müssen auf Basis des gewünschten endgültigen Probendurchsatzes ausgewählt werden, damit Diversität in der Indexsequenz sichergestellt ist.

MiSeqDx verwendet eine grüne LED zum Sequenzieren von G/T-Basen und eine rote LED zum Sequenzieren von

A/C-Basen. Um eine ordnungsgemäße Registrierung sicherzustellen, muss in jedem Zyklus mindestens eines der zwei

Nukleotide für jeden Farbkanal gelesen werden. Es ist wichtig, die Farbbalance für jede Base des sequenzierten Index-

Reads zu halten. Anderenfalls kann bei der Sequenzierung des Index-Reads ein Registrierungsfehler auftreten.

Verwenden Sie den folgenden minimalen Satz an Indizes mit Farbbalance für Sequenzierungsläufe mit acht Proben:

Tabelle 11 Index-Primer-Kombinationen für 8-Proben-Sequenzierungsläufe

Index-Primer 1 (A701) Index-Primer 2 (A702)

Index-Primer C (A503)

Probe 1 Probe 2

Index-Primer D (A504)

Probe 4 Probe 5

Index-Primer E (A505)

Probe 7 Probe 8

Index-Primer 10 (A710)

Probe 3

Probe 6

--

Wenn keine sechs eindeutigen Proben (ausgenommen die positiven und negativen Kontrollen) verfügbar sind, ist es akzeptabel, den Lauf mit Replikaten von humangenomischen DNA-Proben aufzufüllen.

Gebrauchsanweisung

MiSeqDx-Probenblattvorbereitung

1 Wählen Sie im Begrüßungsbildschirm von Illumina Worklist Manager (IWM) die Option Create Worklist

(Arbeitsliste erstellen).

2 Wählen Sie im Feld „Test Type“ (Testtyp) die Option Klinischer CF-Sequenzierungs-Assay aus.

3 Geben Sie im Feld „Worklist Name“ (Name der Arbeitsliste) einen Namen für das Probenblatt ein.

— Wenn für den Namen des Probenblatts die alphanumerische Barcode-ID der Reagenzienkartusche verwendet wird, findet die MiSeq Operating Software (MOS) das Probenblatt automatisch.

— Wenn ein anderer Name für das Probenblatt verwendet wird, kann die Schaltfläche Browse

(Durchsuchen) in der MiSeq Operating Software (MOS) verwendet werden, um das entsprechende

Probenblatt zu finden.

4 [Optional] Geben Sie eine Beschreibung für den Lauf ein.

5 Stellen Sie sicher, dass das Datum mit dem Startdatum des Laufs übereinstimmt.

6 Wählen Sie Next (Weiter).

Eingeben von Probeninformationen

1 Geben Sie auf der Registerkarte „Table“ (Tabelle) oder „Plate“ (Platte) für jeden Probenwell folgende

Informationen ein: a Sample ID (Proben-ID) – Geben Sie eine eindeutige Proben-ID ein.

b Index 1 and Index 2 (Index 1 und Index 2) – Geben Sie den Indexadapter an, der für jedes Index-Read verwendet werden soll.

2 [Optional] Um detailliertere Informationen zu den Proben aufzuzeichnen, geben Sie einen Probennamen und eine Beschreibung ein.

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3 [Optional] Wählen Sie zum Angeben von Kontrollen auf der Platte im Dropdown-Menü Control (Kontrolle)

„Negative“ (Negativ) bzw. „Positive“ (Positiv) aus.

4 Wechseln Sie zur Registerkarte „Plate Graphic“ (Plattengrafik) und verwenden Sie die Option Copy to

Clipboard (In Zwischenablage kopieren) oder Print (Drucken), um ein Bild der Probenplatte zu erfassen.

5 Wählen Sie Finish (Fertig stellen).

Hybridisierung des Oligonukleotid-Pools

Vorbereitung

1 Bringen Sie den Oligo-Pool für den klinischen CF-Sequenzierungs-Assay, den Hybridisierungspuffer, die genomischen DNA-Proben und die positive Kontrollprobe auf Raumtemperatur.

2 Mischen Sie den Oligo-Pool für den klinischen CF-Sequenzierungs-Assay und den Hybridisierungspuffer kräftig, um sicherzustellen, dass sich alle Ablagerungen vollständig aufgelöst haben. Zentrifugieren Sie dann kurz die Röhrchen, um Flüssigkeit zu sammeln.

3 Erhitzen Sie einen 96-Well-Hitzeblock auf 95 °C.

4 Erwärmen Sie einen Inkubator auf 37 °C.

5 Erstellen Sie die Probenplatte entsprechend der von IWM ausgedruckten Plattengrafik.

Verfahren

1 Stellen Sie eine neue 96-Well-PCR-Platte (nachstehend als HYB-Platte bezeichnet) bereit.

2 Fügen Sie 5 µl Probe oder Kontrolle bei 50 ng/µl (250 ng insgesamt) zu den entsprechenden Wells in der

HYB-Platte hinzu. Folgen Sie dem generierten Plattenlayout, um eine korrekte Well-Auswahl vorzunehmen.

3 Fügen Sie 5 µl Oligo-Pool für den klinischen CF-Sequenzierungs-Assay zu allen Wells hinzu, die genomische

DNA enthalten.

4 Fügen Sie 40 µl Hybridisierungspuffer zu jeder Probe in der HYB-Platte hinzu. Pipettieren Sie drei- bis fünfmal leicht auf und ab, um zu mischen.

5 Verschließen Sie die HYB-Platte und zentrifugieren Sie 1000 × g eine Minute lang bei 20 °C.

6 Legen Sie die HYB-Platte in dem mit 95 °C vorgeheizten Block ab und inkubieren Sie sie eine Minute lang.

7 Verringern Sie die Temperatur des Hitzeblocks auf 40 °C und fahren Sie mit der Inkubation fort, bis der

Hitzeblock 40 °C erreicht (etwa 80 Minuten).

Die allmähliche Abkühlung ist für eine ordnungsgemäße Hybridisierung kritisch. Deshalb werden PCR-

Thermocycler mit aktiver Kühlung (z. B. Peltier, thermoelektrisch gekühlt) für diesen Vorgang nicht empfohlen.

SICHERER HALTEPUNKT

Nachdem der Hitzeblock 40 °C erreicht hat, bleibt die HYB-Platte zwei Stunden lang bei 40 °C stabil.

Entfernen von ungebundenen Oligonukleotiden

Vorbereitung

1 Bringen Sie die Extension-Ligation-Mischung, den stringenten Wasch-Puffer und den universellen Wasch-

Puffer auf Raumtemperatur und mischen Sie diese dann kurz mit dem Vortexer.

2 Fügen Sie die Filterplatten-Assembly-Einheit (nachfolgend FPU bezeichnet) in der entsprechenden Reihenfolge von oben nach unten zusammen: Deckel, Filterplatte, Adapterkranz und MIDI-Platte.

3 Waschen Sie die Filterplattenmembran vorab wie folgt: a Fügen Sie 45 µl stringenten Wasch-Puffer zu jedem Well hinzu.

b Verschließen Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 2400 x g und 20 °C.

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Verfahren

1 Entfernen Sie die HYB-Platte aus dem Hitzeblock und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 1.000 x g und 20 °C.

2 Übertragen Sie das gesamte Volumen (etwa 55 µl) jeder Probe in die entsprechenden Wells der Filterplatte.

3 Verschließen Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 2400 x g und 20 °C.

4 Waschen Sie die Filterplatte wie folgt: a Geben Sie 45 µl stringenten Wasch-Puffer in jeden Probe-Well.

b Verschließen Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 2400 x g und 20 °C.

5 Wiederholen Sie den Waschvorgang, wie im vorherigen Schritt beschrieben.

HINWEIS

Wenn der Wasch-Puffer nicht vollständig abläuft, zentrifugieren Sie erneut bei 2400 × g und 20° C, bis die gesamte Flüssigkeit durchgelaufen ist (weitere fünf bis zehn Minuten).

6 Entsorgen Sie den gesamten Durchfluss (der Formamid enthält) und setzen Sie dann die FPU wieder zusammen.

7 Geben Sie 45 µl universellen Wasch-Puffer in jeden Probe-Well.

8 Verschließen Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie zehn Minuten lang bei 2400 x g und 20 °C.

HINWEIS

Stellen Sie sicher, dass die gesamte Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren abgelaufen ist. Wiederholen

Sie das Zentrifugieren bei Bedarf.

Extension-Ligation von gebundenen Oligonukleotiden

Verfahren

1 Fügen Sie 45 µl Extension-Ligation-Mischung zu jedem Probe-Well der Filterplatte hinzu.

2 Verschließen Sie die Filterplatte mit klebbarer Aluminiumfolie und decken Sie sie dann mit dem Deckel zu.

3 Inkubieren Sie die FPU im vorab erwärmten Inkubator 45 Minuten lang bei 37 °C.

PCR-Amplifikation

Vorbereitung

1 Bereiten Sie frisches 0,05 N NaOH vor.

2 Ermitteln Sie anhand des Plattengrafikausdrucks von Illumina Worklist Manager die zu verwendenden

Index-Primer.

3 Bringen Sie die PCR-Master-Mischung und die entsprechenden Index-Primer auf Raumtemperatur. Mischen

Sie mit dem Vortexer alle aufgetauten Röhrchen und zentrifugieren Sie sie anschließend kurz.

4 Stellen Sie eine neue 96-Well-PCR-Platte (nachstehend als AMP-Platte bezeichnet) bereit.

5 Fügen Sie anhand des Probenblatts Index-Primer wie folgt zur AMP-Platte hinzu: a Fügen Sie 4 µl der Index-Primer C (A503), D (A504) und E (A505) zu den entsprechenden Wells in einer

Spalte der AMP-Platte hinzu.

b Entsorgen Sie die ursprünglichen weißen Verschlüsse und bringen Sie neue weiße Verschlüsse an.

c Fügen Sie 4 µl der ausgewählten Index-Primer 1 (A701), 2 (A702) and 10 (A710) zu den entsprechenden

Wells in einer Reihe der AMP-Platte hinzu. Die Spitzen müssen nach jeder Reihe ausgetauscht werden, um

eine Index-Kreuzkontaminierung zu vermeiden.

d Entsorgen Sie die ursprünglichen orangefarbenen Verschlüsse und bringen Sie neue orangefarbene

Verschlüsse an.

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6 Bereiten Sie die PCR-Gebrauchslösung aus PCR-Master-Mischung/PCR-Polymerase wie folgt vor: a Fügen Sie 5,6 µl PCR-Polymerase zu 280 µl PCR-Master-Mischung hinzu.

b Invertieren Sie die vorbereitete PCR-Gebrauchslösung zum Mischen 20-mal.

Verfahren

1 Entnehmen Sie die FPU aus dem Inkubator und entfernen Sie die Aluminiumfolieversiegelung.

2 Verschließen Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang bei 2400 x g und 20 °C.

3 Fügen Sie 25 µl 0,05 N NaOH zu jedem Probe-Well der Filterplatte hinzu. Pipettieren Sie das NaOH 5- bis 6mal auf und ab.

4 Decken Sie die Filterplatte ab und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

5 Übertragen Sie während der Inkubation der Filterplatte 22 µl der PCR-Gebrauchslösung in jeden Well der

AMP-Platte mit Index-Primern.

6 Übertragen Sie die vom Filter eluierten Proben wie folgt zur AMP-Platte: a Pipettieren Sie die Proben in der ersten Spalte der Filterplatte 5- bis 6-mal auf und ab.

b Übertragen Sie 20 µl von der Filterplatte zur entsprechenden Spalte der AMP-Platte.

c Pipettieren Sie leicht 5- bis 6-mal auf und ab, um die DNA mit der PCR-Gebrauchslösung gründlich zu mischen.

d Übertragen Sie in ähnlicher Weise die verbleibenden Spalten von der Filterplatte zur AMP-Platte. Die

Spitzen müssen nach jeder Spalte ausgetauscht werden, um Index- und Probenkreuzkontaminierungen zu vermeiden.

7 Versiegeln Sie die AMP-Platte und sichern Sie den Verschluss mit einer Gummiwalze.

8 Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1000 × g und 20 °C.

9 Übertragen Sie die AMP-Platte in den Nachamplifikationsbereich.

10 Führen Sie mithilfe des folgenden Programms auf einem Thermocycler eine PCR durch:

— 95 °C für 3 Minuten

— 25 Zyklen von:

— 95 °C für 30 Sekunden

— 62 °C für 30 Sekunden

— 72 °C für 60 Sekunden

— 72 °C für 5 Minuten

— Halten Sie die Temperatur konstant bei 10 °C

SICHERER HALTEPUNKT

Falls Sie nicht gleich mit der PCR-Reinigung fortfahren, kann die AMP-Platte über Nacht auf dem

Thermocycler bleiben oder sie kann bei 2 °C bis 8 °C bis zu 48 Stunden aufbewahrt werden.

PCR-Reinigung

Vorbereitung

1 Bringen Sie die PCR-Reinigungs-Beads auf Raumtemperatur.

2 Bereiten Sie frisches 80%iges Ethanol aus reinem Ethanol zu.

Verfahren

1 Zentrifugieren Sie die AMP-Platte eine Minute lang bei 1000 x g und 20 °C.

2 Stellen Sie eine neue MIDI-Platte (nachstehend als CLP-Platte bezeichnet) bereit.

3 Invertieren Sie die PCR-Reinigungs-Beads 10-mal. Mischen Sie kräftig mit dem Vortexer und invertieren Sie erneut 10-mal. Inspizieren Sie die Lösung visuell, um sicherzugehen, dass die Beads resuspendiert sind.

4 Fügen Sie 45 µl PCR-Reinigungs-Beads zu jedem Well der CLP-Platte hinzu.

5 Übertragen Sie das vollständige PCR-Produkt von der AMP- zur CLP-Platte.

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6 Versiegeln Sie die CLP-Platte und schütteln Sie sie auf einem Mikroplattenschüttler zwei Minuten lang bei

1800 rpm.

7 Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, ohne zu schütteln.

8 Platzieren Sie die Platte mindestens zwei Minuten bzw. so lange auf einem Magnetstativ, bis der Überstand klar ist.

9 Lassen Sie die CLP-Platte auf dem Magnetstativ, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn.

10 Lassen Sie die CLP-Platte auf dem Magnetstativ und waschen Sie die Beads wie folgt: a Fügen Sie jedem Probe-Well 200 µl frisch zubereitetes 80%iges Ethanol hinzu.

b Inkubieren Sie die Platte auf dem Magnetstativ mindestens 30 Sekunden bzw. so lange, bis der Überstand klar ist.

c Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn.

11 Wiederholen Sie den Waschvorgang, wie im vorherigen Schritt beschrieben.

12 Verwenden Sie eine auf 20 µl eingestellte P20-Mehrkanalpipette, um überflüssiges Ethanol zu entfernen.

13 Entfernen Sie die CLP-Platte vom Magnetstativ und lassen Sie die Beads 10 Minuten lang an der Luft trocknen.

14 Fügen Sie 30 µl Elutionspuffer zu jeder Probe hinzu und mischen Sie dies dann kurz mit dem Vortexer.

15 Versiegeln Sie die CLP-Platte und schütteln Sie sie auf einem Mikroplattenschüttler zwei Minuten lang bei

1800 rpm. Überprüfen Sie nach dem Schütteln, ob die Proben resuspendiert sind. Wiederholen Sie diesen

Schritt, wenn dies nicht der Fall ist.

16 Inkubieren Sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur.

17 Platzieren Sie die CLP-Platte mindestens zwei Minuten bzw. so lange auf dem Magnetstativ, bis der

Überstand klar ist.

18 Stellen Sie eine neue MIDI-Platte (nachstehend als LNP-Platte bezeichnet) bereit.

19 Übertragen Sie 20 µl des Überstands von der CLP-Platte auf die LNP-Platte.

20 [Optional] Übertragen Sie die verbleibenden 10 µl Überstand von der CLP-Platte auf eine neue Platte und beschriften Sie diese Platte mit einem Laufnamen und Datum. Lagern Sie diese Platte bis zum Ende des

Sequenzierungslaufs und der Datenanalyse bei -25 °C bis -15 °C. Die gereinigten PCR-Produkte können im

Falle von Probenfehlern zur Fehlerbehebung verwendet werden.

SICHERER HALTEPUNKT

Wenn Sie den Vorgang an diesem Punkt beenden, versiegeln Sie die LNP-Platte und zentrifugieren

Sie sie eine Minute lang bei 1000 × g und 20 °C. Die Platte ist bis zu drei Stunden lang bei 2 °C bis

8 °C stabil.

Bibliotheksnormalisierung

Vorbereitung

1 Bereiten Sie frisches 0,1N NaOH vor.

2 Bringen Sie den Bibliotheksnormalisierungsverdünner, die Bibliothek-Beads und den

Bibliotheksnormalisierungs-Wasch-Puffer auf Raumtemperatur.

3 Mischen Sie den Bibliotheksnormalisierungsverdünner kräftig mit dem Vortexer und stellen Sie sicher, dass alle Ausfällungen vollständig aufgelöst wurden.

4 Mischen Sie die Bibliothek-Beads kräftig eine Minute lang mit dem Vortexer (zeitweilig mit Inversion), bis die

Beads resuspendiert sind und sich kein Pellet im unteren Bereich des Röhrchens befindet, wenn das

Röhrchen invertiert wird.

Verfahren

1 Mischen Sie den Bibliotheksnormalisierungsverdünner und die Bibliothek-Beads in einem frischen 1,5-ml-

Röhrchen wie folgt: a Fügen Sie 394 µl Bibliotheksnormalisierungsverdünner hinzu.

b Pipettieren Sie die Bibliothek-Beads 10-mal auf und ab, um zu resuspendieren.

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HINWEIS

Es ist äußerst wichtig, das Bibliothek-Bead-Pellet im unteren Bereich des Röhrchens vollständig zu resuspendieren. Durch die Verwendung einer P1000 wird sichergestellt, dass die Beads homogen resuspendiert werden und sich keine Bead-Masse im unteren Bereich des Röhrchens befindet. Dies ist unerlässlich, um eine einheitliche Clusterdichte auf der Fließzelle zu erzielen.

c Geben Sie mit einer Pipette 72 µl Bibliothek-Beads in das Röhrchen mit

Bibliotheksnormalisierungsverdünner.

d Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen 15- bis 20-mal invertieren.

2 Geben Sie 45 µl der kombinierten Bibliotheksnormalisierungsverdünner/Bibliothek-Beads-Gebrauchslösung in jeden Well der LNP-Platte mit den Bibliotheken.

3 Versiegeln Sie die LNP-Platte und schütteln Sie sie auf einem Mikroplattenschüttler 30 Minuten lang bei

1800 rpm.

4 Platzieren Sie die Platte mindestens zwei Minuten bzw. so lange auf einem Magnetstativ, bis der Überstand klar ist.

5 Lassen Sie die LNP-Platte auf dem Magnetstativ, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn.

6 Entfernen Sie die LNP-Platte vom Magnetstativ und waschen Sie die Beads mit Bibliotheksnormalisierungs-

Wasch-Puffer wie folgt: a Geben Sie 45 µl Bibliotheksnormalisierungs-Wasch-Puffer in jeden Probe-Well.

b Versiegeln Sie die LNP-Platte und schütteln Sie sie auf einem Mikroplattenschüttler fünf Minuten lang bei 1800 rpm.

c Platzieren Sie die Platte mindestens zwei Minuten bzw. so lange auf dem Magnetstativ, bis der

Überstand klar ist.

d Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn.

7 Wiederholen Sie den Bibliotheksnormalisierungs-Waschvorgang, wie im vorherigen Schritt beschrieben.

8 Verwenden Sie eine auf 20 µl eingestellte P20-Mehrkanalpipette, um überflüssigen

Bibliotheksnormalisierungs-Wasch-Puffer zu entfernen.

9 Entfernen Sie die LNP-Platte vom Magnetstativ und fügen Sie 30 µl 0,1 N NaOH zu jedem Well hinzu.

10 Versiegeln Sie die LNP-Platte und schütteln Sie sie auf einem Mikroplattenschüttler fünf Minuten lang bei

1800 rpm.

11 Stellen Sie während der fünfminütigen Elution eine neue 96-Well-PCR-Platte (nachstehend als SGP-Platte bezeichnet) bereit.

12 Fügen Sie 30 µl Bibliothek-Lagerungspuffer zu jedem Well hinzu, der in der SGP-Platte verwendet werden soll.

13 Stellen Sie nach Beendigung der fünfminütigen Elution sicher, dass alle Proben in der LNP-Platte vollständig resuspendiert sind. Falls die Proben nicht vollständig resuspendiert sind, pipettieren Sie diese Proben behutsam auf und ab oder klopfen Sie die Platte leicht gegen die Bank, um die Beads zu resuspendieren, und schütteln Sie sie für weitere 5 Minuten.

14 Platzieren Sie die LNP-Platte mindestens zwei Minuten lang auf dem Magnetstativ.

15 Übertragen Sie den Überstand von der LNP- auf die SGP-Platte. Pipettieren Sie leicht 5-mal auf und ab, um zu mischen.

16 Verschließen Sie die SGP-Platte und zentrifugieren Sie sie anschließend eine Minute lang bei 1000 × g und

20 °C.

SICHERER HALTEPUNKT

Wenn Sie nicht gleich mit dem Bibliotheks-Pooling und der anschließenden Sequenzierung auf dem MiSeqDx fortfahren, bewahren Sie die versiegelte SGP-Platte bis zu 3 Tage bei -25 °C bis -15 °C auf.

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Bibliotheks-Pooling

Vorbereitungen für Bibliotheks-Pooling

1 Erhitzen Sie einen für 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen passenden Hitzeblock auf 96 °C.

2 Bereiten Sie in einem Eiskübel ein Eiswasserbad vor. Kühlen Sie den Bibliothek-Verdünnungspuffer im

Eiswasserbad.

3 Beginnen Sie mit dem Auftauen der MiSeqDx-Reagenzienkartusche.

Vorbereiten einer frischen Verdünnung von NaOH

ACHTUNG!

Die Verwendung von frisch verdünntem NaOH ist notwendig, um die Proben für die Clusterbildung auf dem MiSeqDx vollständig zu denaturieren.

1 Mischen Sie die folgenden Volumina in einem Mikrozentrifugenröhrchen:

— DNase-, RNase-freies Wasser (900 µl)

— Stock 1.0 N NaOH (100 µl)

2 Invertieren Sie das Röhrchen zum Mischen mehrmals.

Interne PhiX-Kontrolle denaturieren und verdünnen

1 Mischen Sie folgende Volumina, um die Interne PhiX-Kontrolle-Bibliothek auf 2 nM zu verdünnen:

— 10 nM Interne PhiX-Kontrolle-Bibliothek (2 µl)

— 1X TE-Puffer (8 µl)

2 Mischen Sie folgende Volumina, um eine 1 nM Interne PhiX-Kontrolle-Bibliothek zu erhalten:

— 2 nM Interne PhiX-Kontrolle-Bibliothek (10 µl)

— 0,1 N NaOH (10 µl)

3 Mischen Sie die Lösung mit 1 nM Interne PhiX-Kontrolle kurz mit dem Vortexer.

4 Zentrifugieren Sie die Matrizenlösung eine Minute lang bei 280 x g und 20 °C.

5 Inkubieren Sie die Lösung 4,5 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Interne PhiX-Kontrolle-Bibliothek in

Einzelstränge zu denaturieren.

6 Geben Sie das folgende Volumen von vorgekühltem Bibliothek-Verdünnungspuffer in das Röhrchen mit denaturierter Interne PhiX-Kontrolle-Bibliothek, um eine 20 pM Interne PhiX-Kontrolle-Bibliothek zu erhalten.

— Denaturierte Interne PhiX-Kontrolle-Bibliothek (20 µl)

— Vorgekühlter Bibliothek-Verdünnungspuffer (980 µl)

Vorbereiten der Reagenzienkartusche

1 Tauen Sie die MiSeqDx-Reagenzienkartusche - Klinischer CF-Sequenzierungs-Assay in einem Wasserbad auf, das ausreichend raumtemperiertes deionisiertes Wasser enthält, um die Basis der Reagenzienkartusche bis zur auf der Reagenzienkartusche aufgedruckten Wasserlinie einzutauchen. Das Wasser darf die maximale

Wasserlinie nicht übersteigen.

2 Lassen Sie die Reagenzienkartusche im raumtemperierten Wasserbad etwa eine Stunde oder so lange auftauen, bis sie vollständig aufgetaut ist.

3 Nehmen Sie die Kartusche aus dem Wasserbad und klopfen Sie sie vorsichtig auf dem Tisch ab, um das

Wasser von der Basis der Kartusche zu entfernen. Trocknen Sie die Basis der Kartusche ab. Stellen Sie sicher, dass kein Wasser auf die Oberseite der Reagenzienkartusche gespritzt ist.

Überprüfen der Reagenzienkartusche

1 Invertieren Sie die Reagenzienkartusche zehnmal, um die aufgetauten Reagenzien zu mischen, und

überprüfen Sie anschließend visuell, ob alle Positionen aufgetaut sind.

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HINWEIS

Es ist äußerst wichtig, dass die Reagenzien in der Kartusche vollständig aufgetaut und gemischt sind, damit eine ordnungsgemäße Sequenzierung sichergestellt werden kann.

2 Überprüfen Sie visuell das Reagenz in Position 1, um sicherzustellen, dass es vollständig gemischt ist und keine Ausfällungen enthält.

3 Klopfen Sie die Kartusche vorsichtig auf dem Tisch ab, um Luftblasen in den Reagenzien zu entfernen.

ANMERKUNG

Die MiSeqDx-Sipper-Röhrchen reichen bis zum Boden der einzelnen Behälter, um die Reagenzien zu aspirieren. Deshalb ist es wichtig, dass sich keine Luftblasen in den Behältern befinden.

4 Lagern Sie die Reagenzienkartusche auf Eis bzw. lagern Sie sie bei 2 °C bis 8 °C (bis zu sechs Stunden), bis

Sie den Lauf konfigurieren können. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie direkt mit dem Laden der

Probe und dem Konfigurieren des Laufs fortfahren.

Vorbereiten von Proben für die Sequenzierung

1 Bringen Sie den Bibliothek-Verdünnungspuffer auf Raumtemperatur. Mischen Sie den Bibliothek-

Verdünnungspuffer kräftig mit dem Vortexer und stellen Sie sicher, dass alle Ausfällungen vollständig aufgelöst wurden.

2 Wenn die SGP-Platte gefroren gelagert wurde, tauen Sie die SGP-Platte bei Raumtemperatur auf.

3 Zentrifugieren Sie die SGP-Platte eine Minute lang bei 1000 x g und 20 °C.

4 Stellen Sie ein neues Eppendorf-Gefäß (nachfolgend als PAL-Röhrchen bezeichnet) bereit.

5 Wenn die SGP-Platte gefroren gelagert wurde, mischen Sie jede zu sequenzierende Bibliothek, indem Sie 3bis 5-mal auf- und abpipettieren.

6 Übertragen Sie 5 µl jeder zu sequenzierenden Bibliothek von der SGP-Platte auf einen PCR-8-fach-

Röhrchenstreifen. Verschließen Sie die SGP-Platte mit einer klebenden Plattenversiegelung und legen Sie sie beiseite.

HINWEIS

Bewahren Sie die versiegelte SGP -Platte bei -25 °C bis -15 °C auf. Die versiegelte SGP-Platte kann maximal

3 Tage lang aufbewahrt werden.

7 Kombinieren und übertragen Sie den Inhalt des PCR-8-fach-Röhrchenstreifens in das PAL-Röhrchen. Mischen

Sie das PAL-Röhrchen gründlich mit dem Vortexter.

8 Stellen Sie ein neues Eppendorf-Gefäß (nachfolgend als DAL-Röhrchen bezeichnet) bereit.

9 Geben Sie 585 µl Bibliothek-Verdünnungspuffer in das DAL-Röhrchen.

10 Geben Sie 6 µl von 20 pM Interne PhiX-Kontrolle in das DAL-Röhrchen. Pipettieren Sie 3- bis 5-mal auf und ab, um die Spitze zu spülen und eine vollständige Übertragung sicherzustellen.

11 Übertragen Sie 9 µl PAL in das DAL-Röhrchen, das Bibliothek-Verdünnungspuffer enthält. Pipettieren Sie 3bis 5-mal auf und ab, um die Spitze zu spülen und eine vollständige Übertragung sicherzustellen.

12 Mischen Sie das DAL-Röhrchen mit dem Vortexer bei höchster Geschwindigkeit.

13 Zentrifugieren Sie das DAL-Röhrchen eine Minute lang bei 1000 x g und 20 °C.

14 Inkubieren Sie das DAL-Röhrchen bei 96 °C zwei Minuten lang auf einem Hitzeblock.

15 Invertieren Sie das DAL-Röhrchen nach der Inkubation ein- bis zweimal, um es gut zu mischen, und legen

Sie es dann sofort in das Eiswasserbad.

16 Belassen Sie das DAL-Röhrchen fünf Minuten lang im Eiswasserbad.

Laden der Probenbibliotheken in eine Kartusche

1 Verwenden Sie eine separate, saubere und leere 1-ml-Pipettenspitze, um die Verschlussfolie über dem mit

Load Samples (Proben laden) bezeichneten Behälter auf der Reagenzienkartusche zu durchstechen.

2 Geben Sie mit der Pipette 600 µl der Probenbibliotheken in den Behälter Load Samples (Proben laden).

Achten Sie beim Zuführen der Probe darauf, die Verschlussfolie nicht zu berühren.

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Überprüfen Sie nach dem Laden der Probe, ob sich Luftblasen im Behälter befinden. Falls Luftblasen vorhanden sind, klopfen Sie die Kartusche vorsichtig auf den Tisch, damit die Blasen entweichen.

3 Fahren Sie mit den Schritten zum Einrichten des Laufs unter Verwendung der MiSeq Operating Software

(MOS)-Benutzeroberfläche fort.

Interpretation der Ergebnisse

Der Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose ist für die Sequenzierung aller proteincodierenden Regionen im CFTR-Gen über die 27 Exone zwischen 5 und 30 Basen flankierender intronischer

Sequenz, ca. 100 nt flankierender Sequenz an den 5’- und 3’-UTRs und zwei tiefen intronischen Mutationen (1811+1.6kbA>G, 3489+10kbC>T) konzipiert. Die genauen sequenzierten Regionen sind in

Tabelle 2

aufgeführt. Außerdem liefert der Assay Ergebnisse über die PolyTG/PolyT-Variante und zwei große Deletionen (CFTRdele2,3, CFTRdele22,23).

1 Der Assay-Bericht listet die Probennamen und den Genotyp für jede in einer Probe nachgewiesene Variante auf.

— Es werden für jede Variante die genomische Koordinate, der cDNA-Name der Human Genome Variation

Society (HGVS) und der Proteinname (sofern verfügbar) angegeben.

— Beim Varianten-Typ handelt es sich um eine einzelne Nukleotidvariante (Single Nucleotide Variant,

SNV), eine Deletions-/Insertionsvariante (DIV), eine PolyTG/PolyT-Variante (PolyTGPolyT) oder eine große Deletion (DEL).

— Der Genotyp-Call (heterozygot oder homozygot) kann der Referenzbaseninformation entnommen werden, die die Referenzsequenz an dieser genomischen Koordinate angibt, sowie der Ergebnisbeschreibung, die die beiden Allele an der genomischen Position in der Probe bereitstellt. Wenn beispielsweise die Referenz

„G“ und das Ergebnis „A/G“ ist, weist dies auf eine G>A-Änderung an dieser genomischen Koordinate hin und bedeutet, dass der Genotyp des Variantenallels heterozygot ist. Wenn die Referenz „G“ und das

Ergebnis „T/T“ ist, weist dies auf eine G>T-Änderung an dieser genomischen Koordinate hin und bedeutet, dass der Genotyp des Variantenallels homozygot ist.

— Die Sequenzierungstiefe an der Variantenposition wird im Feld „Depth“ (Tiefe) und die Allelhäufigkeit wird im Abschnitt „Frequency“ (Häufigkeit) angegeben.

2 Der Assay-Bericht enthält Informationen zur Proben-Call-Rate für jede Probe. Die Call-Rate wird berechnet als die Anzahl der Variantenpositionen/-regionen, die einen vordefinierten Konfidenzschwellenwert erreichen, geteilt durch die Gesamtzahl der untersuchten Positionen/Regionen.

— Die genomische Koordinate einer Position oder Region, bei der der Konfidenzwert unter dem

Schwellenwert liegt, wird separat im Abschnitt „Coordinates not called“ (Koordinaten ohne Call) aufgeführt. Benutzer sollten die Positionen, bei denen kein Call erfolgte, anhand der jeweiligen

Varianteninformationen prüfen, um möglicherweise nicht entdeckte Varianten zu identifizieren, sowie die entsprechenden Bevölkerungshäufigkeiten, um festzustellen, ob eine Probe wiederholt werden muss.

3 Ein Probenergebnis wird nur dann als gültig betrachtet, wenn die Call-Rate mindestens 99 % beträgt. Wenn die Call-Rate unter 99 % beträgt, wird die Leistung als „Fail“ (Fehlgeschlagen) angegeben und die Probe muss wiederholt werden.

4 Es wird empfohlen, alle Varianten, die sich außerhalb dessen befinden, was in der Genauigkeitsstudie validiert wird (siehe

Genauigkeit auf Seite 24 ), mithilfe einer validierten Referenzmethode zu verifizieren,

bevor ein Bericht über das erste Patientenergebnis mit diesen Varianten erstellt wird.

HINWEIS: Es sollte eine Haplotyp-Phasierung in Betracht gezogen werden, wenn zwei oder mehr Varianten nachgewiesen werden.

5 Alle Varianteninterpretationen sollten von einem zertifizierten klinischen Molekulargenetiker oder einem

äquivalenten Spezialisten gemäß lokalen Verfahren und Richtlinien durchgeführt werden

11

. Zu den potenziellen Interpretationsreferenzen gehören unter anderem: CFTR2-Datenbank

12,13

, Sosnay-Papier

10

, ACMG-

Richtlinien von 2004

14 und die Committee Opinion des ACOG von 2011

8

.

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Informationen zur Berechnung und Darstellung der Ergebnisse bzw. zur Beschreibung des Inhalts in einem

Bericht im Textdateiformat finden Sie unter MiSeq Reporter – Benutzerhandbuch (Teile-Nr. 15038356_DEU).

6 Der Genetiker hat die Möglichkeit, in einem Dropdown-Menü der MiSeq Reporter-Software einen

Interpretationswert für jede Variante einzugeben, die für eine Probe gemeldet wurde. Es stehen folgende

Interpretationswerte zur Auswahl: CF-verursachend, Mutation von variierender klinischer Konsequenz,

Mutation von unbekannter Signifikanz oder nicht CF-verursachend. Der eingegebene Wert wird an die

Ergebnisdatei angehängt und in der Interpretationsspalte im Bericht des klinischen Sequenzierungs-Assays angezeigt.

Verfahren zur Qualitätskontrolle

Die guten Laborpraktiken schreiben vor, dass Kontrollproben evaluiert werden müssen, um Unterschiede bei der

Blutverarbeitung und bei technischen Verfahren im Labor des Benutzers zu erkennen, die zu signifikanten

Schwankungen bei den Ergebnissen führen können.

1 Positive Kontrollproben – Eine positive DNA-Kontrollprobe ist bei jedem Lauf erforderlich. Die positive

Kontroll-DNA-Probe muss eine gut charakterisierte Probe mit mindestens einer bekannten CFTR-Variante sein

15

. Illumina empfiehlt die Verwendung rotierender positiver Kontrollproben, die den technischen

Standards und Richtlinien des ACMG von 2008 für CF-Mutationstests

16 und den klinischen Laborstandards für die Sequenzierung der nächsten Generation des ACMG aus dem Jahr 2013 entsprechen

17

. Die positive

Kontrollprobe muss den erwarteten Genotyp generieren. Wenn die positive Kontrollprobe einen anderen als den erwarteten Genotyp generiert, ist möglicherweise ein Fehler bei der Probenverfolgung oder eine fehlerhafte Aufzeichnung von Index-Primern aufgetreten. Der gesamte Assay muss wiederholt werden, angefangen mit der Bibliotheksvorbereitung.

2 Negative Kontrollprobe (Keine Matrize/Keine DNA) – Die Verwendung einer negativen Kontrollprobe

(keine Matrize/keine DNA) ist bei jedem Lauf erforderlich, um mögliche Kontaminationsvorkommnisse zu entdecken. Die Call-Rate sollte bei der negativen Kontrollprobe weniger als 10 % betragen. Wenn eine negative Kontrollprobe eine Call-Rate von mehr als 10 % generiert, ist während der Assay-Verarbeitung möglicherweise eine Kontamination aufgetreten. Der Assay wird als fehlgeschlagen angesehen und der gesamte Assay muss wiederholt werden, angefangen mit der Bibliotheksvorbereitung.

3 Wildtyp-Kontrollprobe – Die Wildtyp-DNA-Kontrollprobe wird bei jedem Lauf empfohlen. Die Wildtyp-

Kontrollprobe muss eine gut charakterisierte Probe sein, die keine CFTR-Varianten enthält. Die Wildtyp-

Kontrollprobe muss den erwarteten Genotyp generieren. Wenn die Wildtyp-Kontrollprobe einen anderen als den erwarteten Genotyp generiert, ist möglicherweise ein Fehler bei der Probenverfolgung oder eine fehlerhafte Aufzeichnung von Index-Primern aufgetreten. Der gesamte Assay muss wiederholt werden, angefangen mit der Bibliotheksvorbereitung.

4 Vor der anfänglichen Verwendung dieses Produkts im Labor des Benutzers sollte die Leistung des Assays durch das Testen mehrerer positiver und negativer Kontrollproben mit bekannten Leistungsmerkmalen verifiziert werden.

5 Alle Qualitätskontrollen sollten in Übereinstimmung mit den lokalen, bundes- und/oder landesweiten

Vorschriften oder Zulassungsanforderungen durchgeführt werden.

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Leistungsmerkmale

Genauigkeit

Die Genauigkeit des Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose ergab sich aus der Auswertung von 500 Proben, die eine Vielzahl von

CFTR-Varianten aus vier verschiedenen Quellen repräsentieren. Die primäre Quelle der Genauigkeitsdaten war eine klinische Genauigkeitsstudie, die mit einem

Panel aus 366 Proben durchgeführt wurde. Die Mehrzahl (n = 355) der Proben bestand aus archivierten, anonymisierten klinischen gDNA-Proben, die aus menschlichem Blut isoliert wurden. Die restlichen 11 Proben wurden aus im Handel erhältlichen Zelllinienproben gewonnen.

Die Daten dieser Studie wurden durch Genauigkeitsdaten von 68 Zelllinienproben, die in der Reproduzierbarkeitsstudie untersucht wurden, 14 klinischen Proben aus der analytischen Studie zur Auswertung der Extraktionsmethode sowie 52 synthetischen Plasmidproben ergänzt. Die synthetischen Plasmide wurden so konstruiert, dass sie den genomischen Kontext seltener Varianten enthielten, und umfassten zwischen einer bis zehn Varianten innerhalb desselben Konstrukts. Sie wurden linearisiert, auf der genomischen DNA mit entsprechenden Kopienzahlen verdünnt und mit menschlichen genomischen DNA-Proben des Wildtyp-Genotyps bei äquivalenten Kopienzahlen gemischt, um eine heterozygote Probe zu imitieren.

Beim MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose wurden insgesamt 5.206 Positionen mit den Referenzmethoden der bidirektionalen Sequenzierung nach Sanger und den PCR-Tests verglichen. Die Genotypisierungsergebnisse für SNV- und kleine InDel-Stellen einschließlich der PolyTG/PolyT-Region wurden mit der bidirektionalen Sanger-Sequenzanalyse verglichen.

Zwei validierte PCR-basierte Assays wurden als Referenzmethode für die beiden großen Deletionen im Panel verwendet. Jeder doppelte PCR-Assay nutzte zwei

Primer-Sätze, um zwischen Wildtyp-, heterozygoten und homozygoten Genotypen zu unterscheiden. Einer der Primer-Sätze diente dazu, die Deletionshaltepunkte zu flankieren, während der andere Satz eine in der Deletion befindliche Region amplifizierte. Die zwei Produkte wurden anhand von Größentrennung auf einem

Agarosegel nachgewiesen. Die PCR-Assays wurden anhand eines Panels aus insgesamt 28 Proben (22 Proben für jede Deletion) validiert, die aus Zelllinien und aus

Blut gewonnenen genomischen DNA-Proben sowie synthetischen Plasmiden bestanden, die den WT-, HET- und HOM-Genotyp für jede große Deletion umfassten.

Anhand der Untersuchung der PCR-Produkte auf einem Agarosegel wurde bestätigt, dass die PCR-Assays eine 100%ige Spezifität und Reproduzierbarkeit für alle getesteten Proben aufwiesen. Die Genauigkeit der PCR-Assays wurde anhand der Sanger-Sequenzierung bestätigt und für 100 % aller Proben nachgewiesen.

Für jeden Genotyp wurde die Genauigkeit anhand von drei statistischen Messgrößen ermittelt. Die positive Übereinstimmung (Positive Agreement, PA) wurde für jede Genotyp-Variante berechnet, indem die Anzahl der Proben mit übereinstimmenden Varianten-Calls durch die Gesamtzahl der Proben mit dieser Variante, wie anhand der Referenzmethoden ermittelt, dividiert wurde. Die negative Übereinstimmung (Negative Agreement, NA) wurde über alle Wildtyp(WT)-Positionen hinweg berechnet, indem die Anzahl der konkordanten WT-Positionen durch die Gesamtzahl der WT-Positionen, wie in den Referenzmethoden ermittelt, dividiert wurde. Die allgemeine Übereinstimmung (Overall Agreement, OA) wurde über alle berichteten Positionen hinweg berechnet, indem die Anzahl der konkordanten

WT- und Varianten-Positionen durch die Gesamtzahl der berichteten Positionen, wie in den Referenzmethoden ermittelt, dividiert wurde.

Der MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose hatte einen PA von 99,66 % auf Genotypebene, einschließlich PolyTG/PolyT-Varianten (100 % ohne PolyTG/PolyT-Varianten). Der NA-Wert für alle WT-Positionen war > 99,99 % und der OA-Wert für alle gemeldeten Positionen war ebenfalls > 99,99 %.

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Tabelle 12 Gesamt-Genauigkeit des MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate) cDNA-

Name

Variantentyp

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Klinische

Proben

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

Synthetische

Proben

117120141 c.-8G>C^

SNV Exon1 25 3 0

117120145 c.-4G>C^

SNV Exon1 3 2 0

M1V c.1A >G

SNV Exon1 0 0 1

CFTR dele2, 3

R31C c.54-5940_

273+10250 del21kb c.91C >T

DEL

SNV

Intron1

Exon2

4

3

1

1

0

0

Q39X

E60X

P67L c.115C >T c.178G >T c.200C >T

SNV

SNV

Exon2

Exon3

0

6

0

1

1

0

R74W

R74Q c.220C >T c.221G >A

SNV

SNV

SNV

Exon3

Exon3

Exon3

1

0

2

0

2

0

1

0

0

R75X

R75Q

G85E c.223C >T c.224G>A c.254G >A

SNV

SNV

SNV

Exon3

Exon3

Exon3

3

20

6

1

1

2

0

0

0

394delTT

405+1G>A c.262_263

delTT c.273+1G >A

DIV

SNV

Exon3

Intron3

3

0

1

0

0

1

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

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D110H

R117C

R117H

Y122X

F143LfsX10

574delA

Q151K

621+1G>T

621+3A>G

663delT

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

406-1G>A

E92K

E92X

Q98X

444delA

457TAT>G

cDNA-

Name

c.274-1G >A c.274G >A c.274G >T c.292C >T c.312delA

c.325_327

delTAT insG c.328G >C c.349C >T c.350G >A c.366T>A c.425delT

c.442delA

c.451C >A c.489+1G >T c.489+3A>G c.531delT

Variantentyp

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

DIV

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon4

Exon4

Exon4

Exon4

Exon4

Exon4

Klinische

Proben

4

0

0

0

0

0

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

0

0

1

0

2

0

Synthetische

Proben

0

1

1

2

0

1

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

DIV

SNV

SNV

SNV

DIV

Exon4

Exon4

Exon4

Exon4

Exon4

Exon4

Exon4

Intron4

Intron4

Exon5

1

4

17

0

0

0

1

7

1

1

0

0

2

1

1

0

0

5

0

0

0

0

0

1

1

0

0

0

0

2

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

26

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

G178R

711+1G>T

711+3A>G

711+5

G>A

712-1

G>T

H199Y

P205S

L206W

A209S

Q220X

L227R

852del22

E279D

R297Q

cDNA-

Name

c.532G >A c.579+1G >T c.579+3A >G c.579+5G >A c.580-1G >T c.595C >T c.613C >T c.617T >G c.625G>T c.658C >T c.680T >G c.720_741

delAGGG

AGAATG

ATGATG

AAGTAC c.837A >T c.890G >A

Variantentyp

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV Exon6

Exon6

Exon6

Exon6

Exon6

Exon6

Exon6

Exon6

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon5

Intron5

Intron5

Intron5

Klinische

Proben

1

3

0

0

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

1

1

0

0

Synthetische

Proben

0

0

1

1

0

8

0

0

0

1

0

0

0

1

1

0

0

0

0

0

1

0

0

1

1

1

1

1

Exon7

Exon8

1

2

0

0

0

0

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0**

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

27

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

1078delT

L320V

G330X

R334W

I336K

T338I

1154insTC

S341P

R347H

R347P

R352Q

Q359K/

T360K

1213delT

1248+1G>A

1259insA

cDNA-

Name

c.948delT

c.958T >G c.988G >T c.1000C >T c.1007T >A c.1013C >T c.1022_10

23insTC c.1021T >C c.1040G >A c.1040G>C c.1055G >A c.[1075C>A

;1079C>A] c.1081delT

c.1116+1G

>A c.1127_11

28insA

DIV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

SNV

DIV

Variantentyp

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon8

Exon8

Exon8

Exon8

Exon8

Exon8

Exon8

Klinische

Proben

1

1

1

0

0

6

0

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

1

0

1

1

1

0

1

Synthetische

Proben

0

0

0

1

0

0

0

Exon8

Exon8

Exon8

Exon8

Exon8

3

5

0

0

6

2

0

0

0

1

0

0

1

1

1

Exon8

Intron8

Exon9

0

0

0

0

0

0

1

1

2

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

28

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

A455E

1525-1G>A

S466X

(C>A)

S466X

(C>G)

L467P

V470M

1548delG

P477S

S485T

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

W401X(c.1202G>A)

W401X(c.1203G>A)

1341+1G>A

PolyTGPolyT

cDNA-

Name

c.1202G >A c.1203G >A c.1209+1G

>A

N/A

1461ins4 c.1329_

1330ins

AGAT c.1364C >A c.1393-1G

>A c.1397C >A c.1397C >G c.1400T >C c.1408G>A c.1418delG

c.1429C >T c.1454G >C

Variantentyp

SNV

SNV

SNV

PolyTG

PolyT

DIV

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon9

Exon9

Intron9

Klinische

Proben

0

0

0

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

0

0

0

Synthetische

Proben

1

1

2

Intron9 369 79 52

Exon10 0 0 1

No

Calls*

0

0

0

3

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

4

0

#

100

100

100

98,60

100

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

SNV

SNV

Exon10

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

4

0

0

1

0

311

1

0

1

2

0

0

0

0

71

0

1

0

0

1

1

1

1

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

29

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

S489X

S492F

Q493X

I506V

I507del

F508del

I507V

F508C

1677delTA

V520F

Q525X

E527E

E528E

1717-8G>A

1717-1G>A

cDNA-

Name

c.1466C >A c.1475C >T c.1477C >T c.1516A >G c.1519_1521

delATC c.1521_1523

delCTT c.1519A>G c.1523T >G c.1545_1546

delTA c.1558G >T c.1573C >T c.1581A >G c.1584G>A c.1585-8G>A c.1585-1G

>A

Variantentyp

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

DIV

SNV

SNV

DIV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Klinische

Proben

0

0

4

7

4

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

0

0

2

0

2

Synthetische

Proben

2

1

0

0

0

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Exon11

Intron11

Exon12

84

0

1

1

2

0

3

6

0

4

29

1

1

0

0

0

2

2

0

1

0

0

0

0

0

0

1

0

1

0

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

30

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Q552X

R553X

I556V

L558S

A559T

R560K

R560T

1811+1.6kb

A>G

1812-1

G>A

A561T

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

G542X

S549R

(c.1645A>C)

S549N

S549R

(c.1647T>G)

G551D

cDNA-

Name

c.1624G>T c.1645A >C c.1646G >A c.1647T >G c.1652G>A c.1654C >T c.1657C>T c.1666A >G c.1673T >C c.1675G >A c.1679G >A c.1679G>C c.1679+1.6

kbA>G c.1680-1G

>A c.1681G >A

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

Variantentyp

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon12

Exon12

Klinische

Proben

12

0

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

3

0

Synthetische

Proben

0

1

Exon12

Exon12

Exon12

Exon12

Exon12

Exon12

Exon12

Exon12

Exon12

Exon12

Intron12

Exon13

Exon13

2

3

8

0

8

1

0

4

0

6

0

0

1

2

1

3

0

2

0

0

1

0

0

0

2

0

0

0

1

0

1

0

1

1

0

1

0

1

0

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

31

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

V562I

Y569D

P574H

G576A

D579G

E585X

1898+1G>A

1898+3A>G

H609R

D614G

R668C

R668H

2143delT

K684TfsX4

2183AA>G

cDNA-

Name

c.1684G >A c.1705T >G c.1721C >A c.1727G >C c.1736A >G c.1753G >T c.1766+1G

>A c.1766+3A

>G c.1826A >G c.1841A >G c.2002C>T c.2003G >A c.2012delT

c.2046_2047

delAA c.2051_2052

delAAinsG

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

DIV

DIV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

Variantentyp

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon13

Exon13

Exon13

Exon13

Exon13

Exon13

Intron13

Klinische

Proben

1

0

0

0

2

4

0

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

0

0

1

1

0

0

1

Synthetische

Proben

0

1

0

1

0

0

1

Intron13

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

0

5

1

2

0

0

0

3

0

2

0

1

1

0

0

1

1

0

0

0

0

2

1

0

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

32

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

L732X

2347delG

P750L

V754M

R764X

2585delT

E822X

2622+1G>A

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

2184delA

2184insA

S686Y

R709X

K710X

E725K

2307insA

E831X

cDNA-

Name

c.2052delA

c.2052_2053

insA c.2057C >A c.2125C >T c.2128A >T c.2173G >A c.2175_2176

insA c.2195T >G c.2215delG

c.2249C>T c.2260G >A c.2290C >T c.2453delT

c.2464G >T c.2490+1G

>T c.2491G >T

SNV

DIV

SNV

SNV

SNV

DIV

SNV

SNV

SNV

DIV

DIV

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

Variantentyp

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon14

Exon14

Klinische

Proben

1

3

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

1

0

Synthetische

Proben

0

1

2

1

0

0

0

0

0

1

3

2

0

1

3

0

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Exon14

Intron14

Exon15

1

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

2

2

2

2

2

2

0

0

0

0

2

2

1

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

33

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Q890X

A923A

L927P

S945L

M952T

3007delG

T966T

G970R

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

D836Y

W846X

R851X

T854T

2711delT

V868V c.2657+2_

2657+3insA

2789+5G>A

cDNA-

Name

c.2506G >T c.2537G >A c.2551C >T c.2562T>G c.2583delT

c.2604A >G c.2657+2_

2657+3insA c.2657+5G

>A c.2668C >T c.2769C>T c.2780T >C c.2834C >T c.2855T >C c.2875delG

c.2898G >A c.2908G >C

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

SNV

DIV

SNV

Variantentyp

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon15

Exon15

Exon15

Exon15

Exon15

Exon15

Intron16

Klinische

Proben

0

0

0

212

0

2

0

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

1

1

0

44

0

0

0

Synthetische

Proben

0

0

1

0

1

0

1

Intron16

Exon17

Exon17

Exon17

Exon17

Exon17

Exon17

Exon17

Exon17

9

0

0

1

1

1

0

5

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

1

0

0

0

1

0

1

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

34

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

F1052V

L1065P

R1066C

R1066H

G1069R

R1070W

R1070Q

L1077P

W1089X

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

S977F

3120G>A

3120+1G>A

3121-1G>A

L997F

I1027T

3272-26A>G

cDNA-

Name

c.2930C >T c.2988G >A c.2988+1G

>A c.2989-1G

>A c.2991G >C c.3080T>C c.3140-

26A>G c.3154T >G c.3194T >C c.3196C >T c.3197G >A c.3205G >A c.3208C >T c.3209G >A c.3230T >C c.3266G >A

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

Variantentyp

SNV

SNV

SNV

SNV

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon18

Exon18

Intron18

Klinische

Proben

0

1

7

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

0

0

1

Synthetische

Proben

1

0

0

Exon19

Exon19

Exon19

Intron19

0

2

1

0

0

1

2

1

1

0

0

0

Exon20

Exon20

Exon20

Exon20

Exon20

Exon20

Exon20

Exon20

Exon20

0

0

6

1

0

0

0

0

4

1

0

0

0

1

2

1

0

0

0

0

0

1

0

0

1

0

1

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

¥

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

35

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

Y1092X

(C>A)

Y1092X

(C>G)

T1095T

M1101K

E1104X c.3368-2A >T

D1152H

V1153E

R1158X

R1162X

R1162L

3659delC

S1196X

W1204X

(c.3611G>A)

W1204X

(c.3612G>A)

cDNA-

Name

c.3276C >A c.3276C >G c.3285A >T c.3302T>A c.3310G >T c.3368-2A >T c.3454G >C c.3458T >A c.3472C>T c.3484C >T c.3485G >T c.3528delC

c.3587C >G c.3611G >A c.3612G >A

Variantentyp

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon20

Klinische

Proben

3

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

1

Synthetische

Proben

0

Exon20

Exon20

Exon20

Exon20

Intron20

Exon21

Exon21

Exon22

Exon22

Exon22

Exon22

Exon22

Exon22

Exon22

0

0

4

1

1

7

5

0

7

2

0

0

10

0

0

2

1

0

0

1

1

0

0

2

0

1

1

0

1

0

0

0

0

0

0

1

0

0

1

0

0

1

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

36

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

3791delC

I1234V

S1235R

3849+10 kbC>T

G1244E

3876delA

S1251N

3905insT

D1270N

W1282X

P1290P

4005+1G>A

4016insT

T1299T

N1303K

cDNA-

Name

c.3659delC

c.3700A >G c.3705T >G c.3717+

12191C>T c.3731G >A c.3744delA

c.3752G >A c.3773_3774

insT c.3808G >A c.3846G >A c.3870A >G c.3873+1G

>A c.3884_3885

insT c.3897A >G c.3909C >G

SNV

SNV

SNV

SNV

SNV

DIV

SNV

DIV

DIV

SNV

SNV

Variantentyp

DIV

SNV

SNV

SNV

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon22

Exon22

Exon22

Intron22

Klinische

Proben

2

1

9

11

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

0

0

1

2

Synthetische

Proben

0

1

0

0

Exon23

Exon23

Exon23

Exon23

Exon23

Exon23

Exon23

Intron23

Exon24

Exon24

Exon24

0

6

1

3

0

9

10

0

0

3

9

0

1

0

1

2

1

3

0

0

0

1

0

1

0

0

1

0

1

0

1

0

0

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Miscalls

Positive

Übereinstimmung

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

37

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Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Genotyp

(Allgemeiner

Name/cDNA-

Name/Koordinate)

Q1313X

G1349D

4209TG

TT>AA

CFTR dele22,23

4382delA

Y1424Y

Q1463Q

cDNA-

Name

c.3937C >T c.4046G >A c.4077_4080

delTGTT insAA c.3964-78_

4242+577del c.4251delA

c.4272C>T c.4389G>A

Variantentyp

Alle Varianten (PA) insgesamt†

Alle WT (NA) insgesamt

Gesamtzahl aller WT und Varianten (OA)

SNV

SNV

DIV

DEL

DIV

SNV

SNV

CFTR-

Gen-

Region

(hg19)

Exon24

Exon25

Exon25

Intron24

Exon27

Exon27

Exon27

Klinische

Proben

0

0

0

1

0

6

150

Positive Calls (Varianten)

Zelllinienproben

0

1

0

0

0

2

32

2072

2600928

2603000

Synthetische

Proben

1

0

1

1

1

0

0

No

Calls*

0

0

0

0

0

0

0

3

1

4

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

4

2

6

§

Positive

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

99,66

> 99,99

> 99,99

DIV ist ein Akronym für Deletions-/Insertions-Variante.

* Proben wurden nicht erneut getestet.

^ Software gibt nicht den cDNA-Namen für diese genomische Koordinate an.

** Im Sanger-Bericht wurde die P205S-Variante für die klinische Probe als heterozygot aufgeführt. Eine Prüfung der Sanger-Daten zeigte jedoch, dass die Variante homozygot war und

# falsch gemeldet wurde. MiSeqDx meldete die Variante als homozygot.

Eines der diskordanten Ergebnisse stammte aus der Reproduzierbarkeitsstudie. Das PolyTG/PolyT-Ergebnis der Probe war bei allen 18 Replikaten konkordant, bei der bidirektionalen

¥

Sanger-Sequenzierung jedoch diskordant.

Bei der ursprünglichen synthetischen heterozygoten Probe wurde festgestellt, dass diese nicht korrekt vorbereitet wurde. Als sie nach der erneuten Vorbereitung mit demselben Plasmid getestet wurde, wurde sie nachgewiesen.

† PA ohne PolyTG/PolyT-Calls betrug 100 %.

§ Eine synthetische, für Exon8 heterozygote Probe wurde für die Variante CFTR dele22, 23 als heterozygot gemeldet. Weitere Untersuchungen ergaben, dass dieses Ergebnis wahrscheinlich von einer geringfügigen Kontamination herrührte. Außerdem konnten bei einer zweiten Probe die Sanger-Primer die Variante Q1463Q aufgrund von Indels sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der Variantenstelle nicht vollständig nachweisen.

38

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Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Tabelle 13 Genauigkeit der PolyTG/PolyT-Variante für den MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

PolyTGPolyT-Genotyp

Anzahl der klinischen

Proben

Anzahl der

Zelllinienproben

Anzahl der synthetischen

Proben

Anzahl der

Miscalls

(TG)9(T)7/(TG)11(T)7

(TG)9(T)9/(TG)10(T)7

2

1

0

0

0

0

0

0

(TG)9(T)9/(TG)11(T)7

(TG)9(T)9/(TG)11(T)9

(TG)10(T)7/(TG)10(T)7

5

1

1

0

0

0

0

0

(TG)10(T)7/(TG)10(T)9

(TG)10(T)7/(TG)11(T)5

25

39

2

8

16

0

0

0

0

0

0

0

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)12(T)5

(TG)10(T)7/(TG)12(T)7

72

1

10

11

0

1

0

0

0

0

0

0

(TG)10(T)9/(TG)10(T)9

(TG)10(T)9/(TG)11(T)5

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

7

5

6

0

0

0

0

0

(TG)10(T)9/(TG)11(T)9

(TG)10(T)9/(TG)12(T)5

76

3

3

20

0

2

0

0

0

0

0

0

(TG)10(T)9/(TG)12(T)7

(TG)11(T)5/(TG)11(T)7

(TG)11(T)7/(TG)11(T)7

13

6

52

0

0

8

0

0

0

0

1

0

1

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

Anzahl der „No

Calls“*

1

0

0

0

0

0

0

100

100

100

92,31

83,33

100

100

100

90,91

100

100

%

Genauigkeit

50,00

100

100

100

100

100

100

39

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Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

PolyTGPolyT-Genotyp

(TG)11(T)7/(TG)11(T)9^

(TG)11(T)7/(TG)12(T)5

(TG)11(T)7/(TG)12(T)7

(TG)11(T)9/(TG)12(T)7

(TG)12(T)7/(TG)12(T)7

Summe

Anzahl der klinischen

Proben

2

2

37

3

2

Anzahl der

Zelllinienproben

1

0

3

0

2

448

Anzahl der synthetischen

Proben

0

0

0

0

0

Anzahl der

Miscalls

3

0

0

0

0

4

Anzahl der „No

Calls“*

0

0

0

0

0

3

%

Genauigkeit

0

100

100

100

100

98,44

* Proben wurden nicht erneut getestet.

^ Eines der diskordanten Ergebnisse stammte aus der Reproduzierbarkeitsstudie. Das PolyTG/PolyT-Ergebnis der Probe war bei allen 18 Replikaten konkordant, bei der bidirektionalen

Sanger-Sequenzierung jedoch diskordant.

Reproduzierbarkeit

Die Reproduzierbarkeit des MiSeqDx-Systems für zystische Fibrose wurde anhand einer Blindstudie an drei Teststandorten und mit zwei Bedienern an jedem

Standort ermittelt. Zwei gut charakterisierte Panels mit jeweils 46 Proben wurden an jedem Standort von beiden Bedienern getestet. Daraus ergaben sich 276

Probenergebnisse pro Bediener. Die Panels enthielten eine Mischung aus genomischer DNA aus lymphoblastoiden Zelllinien mit bekannten Mutationen im CFTR-

Gen sowie leukozytenbereinigte Blutproben, die mit lymphoblastoiden Zelllinien mit bekannten Mutationen im CFTR-Gen versetzt wurden. Die Blutproben wurden bereitgestellt, um die Inkorporation der Extraktionsschritte zum Vorbereiten der gDNA zu ermöglichen, die als primäre Zugabe für den Assay-Workflow dient.

Die Proben-First-Pass-Rate, definiert als die Anzahl der Proben, die beim ersten Versuch den QC-Kennzahlen entsprechen, betrug 99,7%. Alle Ergebnisse basieren auf anfänglichen Tests.

Der PA auf Genotypebene betrug für alle Varianten einschließlich der PolyTG/PolyT-Variante 99,22 % und ohne die PolyTG/PolyT-Variante 99,60 %. Der NA-Wert für alle WT betrug 99,70 % und der OA-Wert für alle gemeldeten Positionen betrug ebenfalls 99,70 %. Der PA-Wert für die PolyTG/PolyT-Variante betrug 97,83 %.

40

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Tabelle 14 Reproduzierbarkeit des MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose (ohne PolyTG/PolyT-Varianten)

Probe

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

Varianten-

Name

Ergebnisse gesamt

Pro

Standort

Alle

Standorte

Standort

1

Übereinstimmende Calls

Standort

2

Standort

3

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

1

c.1408G>A V470M

6 18 6 6 6 0 0

1

c.1646G >A S549N

6 18 6 6 6 0 0

1

c.2562T>G T854T

6 18 6 6 6 0 0

2

c.1408G>A V470M

6 18 6 6 6 0 0

2

c.1581A >G E527E

6 18 6 6 6 0 0

2

c.1680-1G >A 1812-1 G>A

6 18 6 6 6 0 0

2

c.2562T>G T854T

6 18 6 6 6 0 0

2

c.312delA

444delA

6 18 6 6 6 0 0

2

c.3870A >G P1290P

6 18 6 5 6 0 1

2

c.4389G>A Q1463Q

6 18 6 6 6 0 0

3

c.1408G>A V470M

6 18 6 6 6 0 0

3

c.1477C >T Q493X

6 18 6 6 6 0 0

3

c.1521_1523delCTT

F508del

6 18 6 6 6 0 0

3

c.2562T>G T854T

6 18 6 6 6 0 0

3

c.4389G>A Q1463Q

6 18 6 6 6 0 0

4

c.1408G>A V470M

6 18 5 6 6 1 0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

94,44

100

94,44

100

100

100

100

100

100

100

100

100

41

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

7

8

7

7

8

6

6

5

6

5

5

5

5

4

4

5

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.1521_1523delCTT

c.2052delA

c.1408G>A c.224G>A c.2562T>G c.3472C>T c.366T>A c.625G>T c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.2051_2052delAAinsG

c.1408G>A c.223C >T c.2562T>G c.1408G>A c.1519_1521delATC

Varianten-

Name

F508del

2184delA

V470M

R75Q

T854T

R1158X

Y122X

A209S

V470M

F508del

2183AA>G

V470M

R75X

T854T

V470M

I507del

Ergebnisse gesamt

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

1

5

5

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

5

5

Standort

2

6

6

5

5

5

5

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

3

6

6

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

1^

1^

1^

1^

1^

1^

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

1

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

94,44

94,44

94,44

94,44

94,44

94,44

94,44

94,44

42

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

9

10

10

10

10

10

11, 39

11, 39

11, 39

9

9

9

9

8

8

8

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.1521_1523delCTT

c.2562T>G c.4389G>A c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.2562T>G c.3846G >A c.4389G>A c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.2562T>G c.3140-26A>G c.4389G>A c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.2002C>T

Varianten-

Name

F508del

T854T

Q1463Q

V470M

F508del

T854T

W1282X

Q1463Q

V470M

F508del

T854T

3272-26A>G

Q1463Q

V470M

F508del

R668C

Ergebnisse gesamt

6

12

6

6

12

12

6

6

6

6

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

18

18

18

36

18

18

18

18

36

36

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

12

6

6

12

12

6

6

6

6

Standort

1

6

6

6

6

6

6

6

12

6

5

12

12

6

6

5

6

Standort

2

6

6

6

6

6

6

6

12

6

6

12

12

6

6

6

6

Standort

3

6

6

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1*

0

0

0

0

1*

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

94,44

100

100

94,44

100

100

100

100

100

43

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

13

14

14

14

14

12, 40

13

13

13

11, 39

11, 39

11, 39

12, 40

12, 40

12, 40

12, 40

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.2562T>G c.3717+12191C>T c.4389G>A c.1408G>A c.2562T>G c.2988+1G >A c.4389G>A c.489+1G >T c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.178G >T c.4389G>A c.1408G>A c.1584G>A c.2562T>G c.3302T>A

Varianten-

Name

621+1G>T

V470M

F508del

E60X

Q1463Q

V470M

E528E

T854T

M1101K

T854T

3849+10kbC>T

Q1463Q

V470M

T854T

3120+1G>A

Q1463Q

Ergebnisse gesamt

6

6

6

6

6

6

6

6

12

12

Pro

Standort

12

12

12

12

12

12

18

18

18

18

36

36

18

18

18

18

Alle

Standorte

36

36

36

36

36

36

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

6

6

6

6

12

12

Standort

1

12

12

12

12

12

12

6

6

6

6

6

6

6

6

12

12

Standort

2

12

12

12

12

12

12

6

6

6

6

6

6

6

6

12

12

Standort

3

12

12

12

12

12

12

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

44

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

17, 41

17, 41

17, 41

18, 42

18, 42

18, 42

18, 42

19

19

15

16

16

16

15

15

15

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.1408G>A c.1584G>A c.2562T>G c.3302T>A c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.3080T>C c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.3528delC

c.-4G >C c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.350G >A c.1408G>A c.489+1G >T

Varianten-

Name

V470M

E528E

T854T

M1101K

V470M

F508del

I1027T

V470M

F508del

3659delC

117120145

V470M

F508del

R117H

V470M

621+1G>T

Ergebnisse gesamt

12

12

12

12

6

6

6

12

12

12

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

36

36

36

36

18

36

36

36

18

18

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

12

12

12

12

6

6

6

12

12

12

Standort

1

6

6

6

6

6

6

12

12

12

12

6

6

6

12

12

12

Standort

2

6

6

6

6

6

6

12

12

12

12

6

6

6

12

12

12

Standort

3

6

6

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

45

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

22

22

22

22

22

23

23

23

24, 45

19

20, 43

20, 43

20, 43

21, 44

21, 44

21, 44

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.579+1G >T c.1408G>A c.254G >A c.489+1G >T c.1364C >A c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.1679G>C c.2562T>G c.4389G>A c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.3276C >A c.1408G>A

Varianten-

Name

711+1G>T

V470M

G85E

621+1G>T

A455E

V470M

F508del

V470M

F508del

R560T

T854T

Q1463Q

V470M

F508del

Y1092X(C>A)

V470M

Ergebnisse gesamt

6

6

6

6

6

6

12

6

6

12

Pro

Standort

6

12

12

12

12

12

18

18

18

18

36

18

18

18

18

36

Alle

Standorte

18

36

36

36

36

36

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

6

6

12

6

6

12

Standort

1

6

12

12

12

12

12

6

6

6

6

6

6

12

6

6

12

Standort

2

6

12

12

12

12

12

6

6

6

6

6

6

12

6

6

12

Standort

3

6

12

12

12

12

12

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

46

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

27, 46

27, 46

27, 46

27, 46

27, 46

28

28

28

28

25

26

26

26

24, 45

24, 45

25

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.3909C >G c.4046G >A c.1408G>A c.1624G>T c.-8G >C c.1408G>A c.1624G>T c.1408G>A c.1652G>A c.1657C>T c.2562T>G c.4389G>A c.1408G>A c.2562T>G c.3717+12191C>T c.4389G>A

Varianten-

Name

N1303K

G1349D

V470M

G542X

117120141

V470M

G542X

V470M

G551D

R553X

T854T

Q1463Q

V470M

T854T

3849+10kbC>T

Q1463Q

Ergebnisse gesamt

6

6

12

12

6

6

6

12

12

12

Pro

Standort

12

12

6

6

6

6

36

36

18

18

18

36

36

36

18

18

Alle

Standorte

36

36

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

6

12

12

6

6

6

12

12

12

Standort

1

12

12

6

6

6

6

6

6

12

12

6

6

6

12

12

12

Standort

2

12

12

6

6

6

6

6

6

12

12

6

6

6

12

12

12

Standort

3

12

12

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

47

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

31

32

32

32

32

30

31

31

31

30

30

30

30

29

29

29

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.1408G>A c.2562T>G c.91C >T c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.2562T>G c.3485G >T c.4389G>A c.1408G>A c.1585-1G >A c.2562T>G c.4389G>A c.1408G>A c.2562T>G c.3484C >T c.4389G>A

Varianten-

Name

V470M

T854T

R31C

V470M

F508del

T854T

R1162L

Q1463Q

V470M

1717-1G>A

T854T

Q1463Q

V470M

T854T

R1162X

Q1463Q

Ergebnisse gesamt

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

1

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

2

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

3

6

6

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

48

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

37

37

37

37

38

34

35

36

36

33

33

33

34

33

33

33

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.1040G>C c.1408G>A c.1652G>A c.2562T>G c.4272C>T c.4389G>A c.1000C >T c.3368-2A >T c.1523T >G c.254G >A c.3454G >C c.1007T >A c.1408G>A c.2562T>G c.3705T >G c.1408G>A

Varianten-

Name

R347P

V470M

G551D

T854T

Y1424Y

Q1463Q

R334W c.3368-2A >T

F508C

G85E

D1152H

I336K

V470M

T854T

S1235R

V470M

Ergebnisse gesamt

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

1

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

2

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

3

6

6

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

49

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

38

38

38

38

38

47, 85

47, 85

47, 85

47, 85

48, 86

48, 86

48, 86

49, 87

49, 87

49, 87

50, 88

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.1727G >C c.2002C>T c.2057C >A c.2562T>G c.4389G>A c.1408G>A c.2562T>G c.2657+5G >A c.4389G>A c.54-5940_

273+10250del21kb c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.1766+1G >A c.1408G>A

Varianten-

Name

G576A

R668C

S686Y

T854T

Q1463Q

V470M

T854T

2789+5G>A

Q1463Q

CFTRdele2,3

V470M

F508del

V470M

F508del

1898+1G>A

V470M

12

12

12

12

12

12

Ergebnisse gesamt

Pro

Standort

6

6

6

12

6

6

12

12

12

12

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

36

36

36

36

36

Übereinstimmende Calls

Standort

1

6

6

6

12

6

6

12

12

12

12

Standort

2

6

6

6

6

6

12

12

12

12

11

Standort

3

6

6

6

12

6

6

12

12

12

12

36

36

36

36

36

36

12

12

12

12

12

12

12

12

12

11

11

12

12

12

12

12

12

12

0

0

0

1

1

0

0

1

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

97,22

0

0

0

0

0

0

97,22

97,22

100

100

100

100

50

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

53, 90

54, 91

54, 91

55, 92

55, 92

55, 92

55, 92

55, 92

55, 92

50, 88

50, 88

50, 88

51, 89

51, 89

51, 89

52

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.220C >T c.2562T>G c.3808G >A c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.2012delT

c.3744delA

c.3773_3774insT

c.1408G>A c.262_263delTT

c.1408G>A c.1519A>G c.1521_1523delCTT

c.2562T>G c.3080T>C c.4389G>A

Varianten-

Name

R74W

T854T

D1270N

V470M

F508del

2143delT

3876delA

3905insT

V470M

394delTT

V470M

I507V

F508del

T854T

I1027T

Q1463Q

Ergebnisse gesamt

12

12

12

12

6

12

12

12

12

12

Pro

Standort

12

12

12

12

12

12

36

36

36

36

18

36

36

36

36

36

Alle

Standorte

36

36

36

36

36

36

Übereinstimmende Calls

12

12

12

12

6

12

12

12

12

12

Standort

1

12

12

12

12

12

12

12

12

12

12

6

12

12

12

12

12

Standort

2

12

12

12

12

12

12

12

12

12

12

6

12

12

12

12

12

Standort

3

12

12

12

12

12

12

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

51

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

59

59

59

60

60

57

58

58

58

56

57

57

57

56

56

56

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.1408G>A c.2562T>G c.3154T >G c.4389G>A c.-8G >C c.1408G>A c.2562T>G c.3209G >A c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.2991G >C c.1408G>A c.2562T>G c.3205G >A c.1408G>A c.2562T>G

Varianten-

Name

V470M

T854T

F1052V

Q1463Q

117120141

V470M

T854T

R1070Q

V470M

F508del

L997F

V470M

T854T

G1069R

V470M

T854T

Ergebnisse gesamt

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

1

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

2

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

3

6

6

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

52

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

64

65

66

66

66

62

64

64

64

61

61

62

62

60

60

61

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.4389G>A c.617T >G c.1408G>A c.2260G >A c.4389G>A c.1408G>A c.2562T>G c.988G >T c.1040G >A c.1408G>A c.2562T>G c.4389G>A c.948delT

c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.532G >A

Varianten-

Name

Q1463Q

L206W

V470M

V754M

Q1463Q

V470M

T854T

G330X

R347H

V470M

T854T

Q1463Q

1078delT

V470M

F508del

G178R

Ergebnisse gesamt

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

1

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

2

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

3

6

6

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

53

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

67

67

70

70

71

71

71

71

69

69

70

70

68

68

68

68

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.1408G>A c.1647T >G c.1408G>A c.1646G >A c.2562T>G c.4389G>A c.2506G >T c.2537G >A c.1408G>A c.2562T>G c.3485G >T c.4389G>A c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.2562T>G c.274G >T

Varianten-

Name

V470M

S549R

(c.1647T>G)

V470M

S549N

T854T

Q1463Q

D836Y

W846X

V470M

T854T

R1162L

Q1463Q

V470M

F508del

T854T

E92X

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Ergebnisse gesamt

Pro

Standort

6

6

Alle

Standorte

18

18

Übereinstimmende Calls

Standort

1

6

6

Standort

2

6

6

Standort

3

6

6

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

54

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

74

75

75

75

76

73

73

74

74

72

72

72

73

71

72

72

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.4389G>A c.1022_1023insTC

c.1408G>A c.2562T>G c.4389G>A c.489+1G >T c.1408G>A c.1624G>T c.1826A >G c.1408G>A c.1429C >T c.1521_1523delCTT

c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.1721C >A c.1408G>A

Varianten-

Name

Q1463Q

1154insTC

V470M

T854T

Q1463Q

621+1G>T

V470M

G542X

H609R

V470M

P477S

F508del

V470M

F508del

P574H

V470M

Ergebnisse gesamt

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

1

6

6

6

6

6

6

5

5

6

6

5

6

6

6

6

6

Standort

2

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

5

6

6

Standort

3

6

5

5

5

5

5

1^

1^

0

0

1^

0

0

0

0

0

1

1

1

1

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

%

Übereinstimmung

94,44

94,44

94,44

100

100

94,44

100

100

94,44

94,44

100

100

100

94,44

94,44

94,44

55

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

78

78

78

79

79

78

78

78

78

76

77

77

77

76

76

76

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.1521_1523delCTT

c.2562T>G c.425delT

c.4389G>A c.1364C >A c.1408G>A c.489+1G >T c.1408G>A c.1581A >G c.1680-1G >A c.2562T>G c.312delA

c.3870A >G c.4389G>A c.1408G>A c.220C >T

Varianten-

Name

F508del

T854T

F143LfsX10

Q1463Q

A455E

V470M

621+1G>T

V470M

E527E

1812-1 G>A

T854T

444delA

P1290P

Q1463Q

V470M

R74W

Ergebnisse gesamt

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

1

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

2

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

3

6

6

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

56

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

81

82

82

82

82

81

81

81

81

80

80

80

80

79

79

80

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

c.2562T>G c.3808G >A c.-8G >C c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.1657C>T c.2562T>G c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.1652G>A c.2562T>G c.4389G>A c.1040G>C c.1408G>A c.1521_1523delCTT

c.4272C>T

Varianten-

Name

T854T

D1270N

117120141

V470M

F508del

R553X

T854T

V470M

F508del

G551D

T854T

Q1463Q

R347P

V470M

F508del

Y1424Y

Ergebnisse gesamt

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

1

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

2

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

3

6

6

6

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

57

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Probe

HGVS-Name (oder

Standort wenn kein

HGVS)

Varianten-

Name

83

c.-4G >C 11720145

83

83

c.1408G>A c.1521_1523delCTT

V470M

F508del

83

84

c.350G >A c.1408G>A

R117H

V470M

84

84

c.1519_1521delATC

c.2562T>G

I507del

T854T

84

c.4389G>A Q1463Q

Alle Varianten (PA) insgesamt** (einschließlich

PolyTG/PolyT-Daten in

Tabelle 15

)

Alle WT (NA) insgesamt

Gesamtzahl aller WT und Varianten (OA)

Ergebnisse gesamt

Pro

Standort

6

6

6

6

6

6

6

6

2580

2871132

2873712

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

18

18

7740

8613396

8621136

Übereinstimmende Calls

Standort

1

6

6

6

6

6

6

6

6

2562

2865930

2868492

Standort

2

6

6

6

6

6

6

6

6

2553

2855526

2858079

Standort

3

6

6

6

6

6

6

6

6

2565

2865932

2868497

0

0

0

0

Summe* (Alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

37

26006

26043

0

0

0

0

0

0

23

2

25

%

Übereinstimmung

100

100

100

100

99,22

100

100

100

100

99,70

99,70

€ Proben wurden nicht neu getestet.

^ Je ein Replikat der Proben 5 und 75 hatte eine Call-Rate von 0 %. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Proben vor der Bibliotheksvorbereitung wahrscheinlich nicht zur Probenplatte hinzugefügt wurden.

* Untersuchungen zeigten, dass die Proben 9 und 10 vor der Bibliotheksvorbereitung wahrscheinlich vom Bediener vertauscht wurden.

** Ohne PolyTG/PolyT-Varianten betrug der PA 99,60 %.

58

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

A

A

A

A

A

A

A

A

A

Tabelle 15 PolyTG/PolyT-Reproduzierbarkeit für das MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Anzahl Ergebnisse Übereinstimmende Calls

Panel Probe Genotyp

Pro

Standort

Alle

Standorte

Standort

1

Standort

2

Standort

3

A 1 (TG)12(T)7/(TG)12(T)7

6 18 6 6 6

A

A

A

2

3

4

(TG)10(T)9/(TG)10(T)7

(TG)10(T)7/(TG)10(T)9

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

6

6

18

18

6

6

6

6

6

6

A

A

5

6

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)10(T)7

6

6

6

18

18

18

5

6

6

6

5

6

6

6

6

7

8

9

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)10(T)9

(TG)10(T)9/(TG)10(T)7

6

6

6

18

18

18

6

6

6

6

6

6

6

6

6

10

11, 39

12, 40

(TG)10(T)9/(TG)10(T)7

(TG)10(T)9/(TG)10(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

6

12

18

36

6

12

6

12

6

12

A

A

13

14

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

12

6

6

36

18

18

12

6

6

12

6

6

12

6

6

15

16

17, 41

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)10(T)9

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

6

6

12

18

18

36

6

6

12

5

6

12

6

6

12

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

1

0

0

Summe (alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100%

100%

100%

94,44%

94,44%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

94,44%

100%

100%

59

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Panel

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

Probe

18, 42

19

20, 43

21, 44

22

23

24, 45

25

26

27, 46

28

32

33

34

29

30

31

Genotyp

(TG)10(T)9/(TG)12(T)5

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)10(T)9

(TG)10(T)9/(TG)10(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)10(T)9

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)10(T)7

(TG)10(T)7/(TG)12(T)7

(TG)10(T)9/(TG)10(T)7

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)10(T)7

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)11(T)7/(TG)12(T)7

Anzahl Ergebnisse

6

6

6

6

12

6

6

6

6

12

6

6

12

6

Pro

Standort

12

6

12

18

18

18

18

36

18

18

18

18

36

18

18

36

18

Alle

Standorte

36

18

36

Übereinstimmende Calls

6

6

6

6

11

6

6

5

6

12

6

6

12

6

Standort

1

12

6

12

4

6

6

6

12

6

6

6

6

12

6

6

12

6

Standort

2

12

6

12

4

6

6

6

12

6

6

6

6

12

6

6

12

6

Standort

3

12

6

12

4

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Summe (alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100%

97,22%

100%

77.78%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

94,44%

100%

60

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Panel

B

B

B

B

B

A

B

B

A

A

A

B

B

B

B

B

B

Probe

35

36

37

38

47, 85

48, 86

49, 87

50, 88

51, 89

52

53, 90

57

58

59

54, 91

55, 92

56

Genotyp

(TG)11(T)7/(TG)11(T)7

(TG)11(T)7/(TG)11(T)7

(TG)11(T)7/(TG)12(T)7

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)10(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)10(T)9

(TG)11(T)7/(TG)11(T)7

(TG)11(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)10(T)7

(TG)10(T)7/(TG)10(T)9

(TG)12(T)7/(TG)12(T)7

(TG)10(T)9/(TG)10(T)9

(TG)11(T)7/(TG)12(T)7

Anzahl Ergebnisse

12

12

6

12

6

12

6

6

6

6

12

12

12

12

Pro

Standort

6

6

6

36

36

18

36

18

36

18

18

18

18

36

36

36

36

Alle

Standorte

18

18

18

Übereinstimmende Calls

12

12

6

12

6

12

6

6

5

6

12

11

12

12

Standort

1

6

6

6

12

12

6

12

6

12

6

6

6

6

12

11

12

12

Standort

2

6

6

6

12

12

6

12

6

12

6

6

6

6

12

12

12

12

Standort

3

6

6

6

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

2

0

0

0

0

0

Summe (alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

94,44%

100%

100%

100%

100%

94,44%

61

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Panel

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

Probe

66

67

68

63

64

65

69

70

60

61

62

74

75

76

71

72

73

Genotyp

(TG)9(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)11(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)11(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)11(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)11(T)7/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)10(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)10(T)9

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)7/(TG)10(T)9

(TG)10(T)7/(TG)10(T)9

Anzahl Ergebnisse

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Pro

Standort

6

6

6

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

18

Alle

Standorte

18

18

18

Übereinstimmende Calls

6

5

6

6

6

6

6

6

6

6

5

6

6

6

Standort

1

6

6

5

6

6

6

6

6

6

6

5

6

6

6

6

6

6

Standort

2

6

6

6

6

5

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

Standort

3

6

6

6

0

2

0

0

0

0

0

1

0

0

1

0

0

0

0

0

1

Summe (alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

%

Übereinstimmung

100%

100%

100%

100%

88.89%

100%

100%

100%

94,44%

100%

94,44%

100%

100%

100%

100%

94,44%

100%

62

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Panel Probe Genotyp

B

B

B

B

B

B

B

B

77

78

79

80

81

82

83

84

(TG)10(T)9/(TG)10(T)9

(TG)10(T)7/(TG)10(T)9

(TG)10(T)7/(TG)11(T)7

(TG)11(T)7/(TG)11(T)9

(TG)10(T)7/(TG)10(T)9

(TG)10(T)9/(TG)11(T)7

(TG)10(T)9/(TG)12(T)5

(TG)10(T)7/(TG)10(T)7

PolyTG/PolyT-Varianten (PA) insgesamt

Anzahl Ergebnisse

Pro

Standort

6

6

552

6

6

6

6

6

6

Alle

Standorte

18

18

18

18

18

18

18

18

1656

* Alle 18 Proben waren miteinander konkordant, aber nicht mit der bidirektionalen Sequenzierung nach Sanger.

Übereinstimmende Calls

Standort

1

6

5

6

6

6

537

0

6

6

Standort

2

6

6

6

0

6

6

6

6

540

Standort

3

6

6

6

6

6

543

0

6

6

0

0

17

0

0

0

0

1

0

Summe (alle

Standorte)

No

Calls

Miscalls

0

0

0

0

0

19

18*

0

0

%

Übereinstimmung

100%

94,44%

100%

0%

100%

100%

100%

100%

97.83%

63

|

Teile-Nr. 15038344 Rev. A DEU

April 2014

MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

DNA-Extraktion

Drei häufig verwendete, im Handel erhältliche Extraktionsmethoden, die magnetische Bead-Extraktion, die

Alkoholpräzipitation und die Isolation mittels Kieselgelsäule, wurden unter Verwendung von mit K

2

EDTA antikoaguliertem Vollblut geprüft. Bei der Studie wurden insgesamt 14 Blutproben verwendet. Zwei davon waren

Wildtypproben, die übrigen enthielten eindeutige Genotypen, die neun verschiedene Varianten darstellten, darunter sowohl häufige als auch seltene Varianten. Für die polyTG/polyT-Variation wurden Proben mit (T)5-9 und (TG)10-12 berücksichtigt. Die drei DNA-Extraktionsmethoden wurden von zwei verschiedenen Bedienern unabhängig getestet, von denen jeder drei Läufe pro Extraktionsmethode durchgeführt hat. Jede Extraktion wurde vom jeweiligen Bediener an unterschiedlichen Tagen durchgeführt. Die DNA-Konzentration und das A260/A280-Verhältnis der extrahierten gDNA-Proben wurden mithilfe der Spektralfotometrie ermittelt. Die Gesamtzahl der Proben für jede

Extraktionsmethode der Studie ist 168 (14 Proben x 2 Bediener/Extraktionsmethode x 3 Läufe/Bediener x 2

Replikate/extrahierte gDNA-Probe).

Extraktionsmethode

Alkoholpräzipitation

Kieselsäurefiltersäulen-Isolation

Extraktion des magnetischen Bead

Anzahl der getesteten

Proben

168

168

168

Call-Rate

> 99,99%

> 99,99%

> 99,99%

Genauigkeit

> 99,99%

> 99,99%

> 99,99%

Proben-First-

Pass-Rate*

100%

100%

100%

* Prozent der Proben mit einer Call-Rate von über 99 % im ersten Lauf

DNA-Zugabe

Der DNA-Zugabebereich des Illumina MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose wurde untersucht, indem eine Studie zur seriellen Verdünnung mit 14 repräsentativen DNA-Proben durchgeführt wurde, die

16 eindeutige CF-Varianten enthielt. Jede Probe wurde bei 9 DNA-Zugabestufen von 1250 ng bis 1 ng (1250 ng, 500 ng,

250 ng, 100 ng, 50 ng, 25 ng, 10 ng, 5 ng und 1 ng) doppelt getestet. Zur Ermittlung der Genauigkeit wurden Genotyp-

Proben mit bidirektionalen Sequenzierungsdaten nach Sanger und die Deletionen mit einem PCR-Assay verglichen.

1250 ng und 25 ng wurden als Ober- und Untergrenze für die DNA-Zugabe identifiziert, da sie eine Proben-First-Pass-

Rate von ≥ 95 % ohne falsche Calls (100 % Genauigkeit und Call-Rate) hatten.

Die DNA-Zugaben von 1250 ng, 250 ng und 100 ng wurden mit vier repräsentativen DNA-Proben und mindestens

20 Replikaten pro DNA-Zugabestufe für jede Probe (n=4x20=80 Proben) weiter getestet, während die Untergrenze von

25 ng mit 14 Proben und 20 Replikaten für jede Probe (n=14x20=280 Proben) getestet wurde. Die Genauigkeit und die

Proben-First-Pass-Rate betrugen bei allen DNA-Zugabestufen 100 %.

Störende Substanzen

Um die Auswirkungen störender Substanzen auf das Illumina MiSeqDx-System für zystische Fibrose zu untersuchen, wurde die Leistung des Assays mit und ohne potenzielle Störsubstanzen überprüft. In dieser Studie wurden sechzehn

Vollblutproben mit eindeutigen CF-Genotypen getestet. Vier körpereigene störende Substanzen (Bilirubin, Cholesterin,

Hämoglobin und Triglyceride) wurden getestet, indem die Blutproben vor der DNA-Extraktion mit diesen versetzt wurden. Die Konzentrationsgrenzen für jede Substanz sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt. Um darüber hinaus die Störungen aufgrund der Blutentnahme (geringe Menge) zu untersuchen, wurden die Blutproben mit EDTA versetzt, und um die Störungen aufgrund der Probenvorbereitung zu untersuchen, wurde der endgültige

Wasch-Puffer aus einer Kieselgelsäulen-Isolationsmethode zur bereinigten genomischen DNA zugefügt.

Der MiSeqDx Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose erzielte mit und ohne störende Substanzen eine

Call-Rate von 100 % bei allen Proben und eine Reproduzierbarkeit von 100 % in Genotyp-Calls zwischen Proben. Es wurden keine Störungen durch eine der endogenen oder exogenen Störsubstanzen beobachtet.

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MiSeqDx™ Klinischer Sequenzierungs-Assay für zystische Fibrose

Um die Auswirkungen der Multiplexierung von Index-Primer-Störungen zu untersuchen, wurde eine

Kreuzkontaminationsstudie mit zwei Proben, von der jede eindeutige homozygote Genotypen an vier unterschiedlichen genomischen Positionen aufwies, und zwei entsprechenden Index-Primern durchgeführt. Es wurde keine Änderung beim Varianten-Calling bei Kontaminationsgraden von unter 40 % beobachtet. Der Probengenotyp wurde heterozygot, wenn der Kontaminationsgrad mindestens 40 % betrug.

Testsubstanz

Bilirubin

Cholesterin

Hämoglobin

Triglycerid

EDTA

Gesamtzahl der

Replikate

16

16

16

16

16

Im Blut getestete

Konzentration

(Obergrenze)

684 µmol/L

13 mmol/L

2 g/L

37 mmol/L

7,0 mg/ml

Im Blut getestete

Konzentration

(Untergrenze)

137 µmol/L

2,6 mmol/L

0,4 g/L

7,4 mmol/L

2,8 mg/ml

Call-Rate

100%

100%

100%

100%

100%

Quellen

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