PapilloCheck - Greiner Bio-One

PapilloCheck - Greiner Bio-One
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
HPV DNA-Chip
PapilloCheck®
Gebrauchsanweisung
Diagnostik Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ 6, 11,
16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Deutschland
Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
SYMBOLGLOSSAR
de
Im
Dunkeln
lagern
Mindestens
haltbar bis
Vor
Gebrauch
Anweisung
lesen
Katalognummer
Hersteller
In-VitroDiagnostika Medizinprodukt
Temperaturbegrenzung
Inhalt
ausreichend für
<n> Tests
H P VChargenD N A - CWichtiger
hip
Reizend
bezeichHinweis
nung
en
Store in
the dark
Use by
Consult
Instructions For
Use
Catalog
Number
Manufacturer
In Vitro
Dianostic
Medical
Device
Temperature
limitation
contains
sufficient
for <n>
tests
Irritant
Batch
code
Important
Note
fr
À stocker
à l‘abri de
la lumière
Date
limite de
conservation
jusqu’au
Lire les instructions
avant
utilisation
Numéro
de référence
Fabricant
Produit
médical de
diagnostic
in-vitro
Limite de
température
Contenu
suffisant
pour <n>
tests
irritant
Code du
lot
Note importante
es
Conservar en
un lugar
oscuro
A utilizar
preferiblemente
antes de
Antes
de usar,
lea las
instrucciones
Número
de catálogo
Fabricante
Producto
medicinal
de
diagnóstico in vitro
Limitación
de
temperatura
Contenido
suficiente
para <n>
ensayos
Irritante
Código de
lote
Nota importante
it
Conservare al buio
Da
utilizzare
entro e
non oltre
Leggere
le istruzioni prima
dell’uso
Numero
catalogo
Produttore
Dispositivo
medicodiagnostico in-vitro
Limitazione temperatura
Contenuto
sufficiente
per test
<n>
Irritante
Codice
del lotto
Nota importante
pt
Conservar
num local
escuro
A utilizar
preferívelmente
antes de
Antes de
usar, leia
as instruções
Número
de catálogo
Fabricante
Producto
medicinal
de
diagnóstica in vitro
Limitação
de
temperatura
Conteúdo
suficiente
para <n>
ensaios
irritante
Código do
lote
Aviso importante
nl
Donker
bewaren
Tenminste
houdbaar
tot
Gebruiksaanwijzing lezen
Catalogusnummer
PapilloCheck
Fabrikant
In vitro
diagnostisch
medisch
product
Temperatuurbeperking
Voldoende inhoud
voor <n>
tests
Irriterend
Lot
nummer
Belangrijke opmerking
da
Gebrauchsanweisung
Anvendes
senest
Læs
brugsanvisningen
Katalognummer
Producent
In vitro
meskdicin
doagnoseapparat
Temperaturbegraensær
Indeholder nok til
<n> test
Lokalirriterende
Lotnummer
Vigtig
henvisning
sv
Förvaras
mörkt.
Sista förbrukningsdag
Läs bruksanvisningen före
användning
Katalognummer
Tillverkare
In vitromedicinsk
doagnostisk
apparatur
Temperatur-begränsning
Innehållet
räcker till
<n> tester
irriterande
Lot
nummer
Viktigt
meddelande
pl
Przechowywa ć w
ciemności
Termin
zydatności
no
el
Przed
Numer
Producent DiagOgraniZawartość drażniący Kod partii Ważne
użyciem
katalonostyka
czenie
wystarcza
przeczytać gowy
in vitro
temperana <n>
Kit
für die Genotypbestimmung
instrukcję
Produkt von
tury humanen
testów Papillomaviren vom Typ
yw 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55,
Diagnostisches
6, 11, 16, 18, 31,
Oppbevaholdbar til Les
in
Zervikalproben
res mørkt
REF 465 060
DANGER
®
Opbevares mørkt
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
!
bruksanvisning før
bruk
katalognummer
produsent
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
Αποθηκεύεται
το λιγότερο
πριν την
Αριθμός
Παραγωγός
In vitro
durch
geschultes
Laborpersonal
στα σκοτεινά
διατηρείται
χρήση
Καταλόγου
διαγνωστικά
διαβάστε τις
οδηγίες
tr
in vitro-diagnostisk
medisinsk
utstyr
Karanlık
yerde
saklayınız
Son
kullanma
tarihi:
Kullanma- Katalog
Üretici
dan önce
numarası
firma
talimatı
Greinerokuyun
Bio-One GmbH
ιατρικά
προϊόντα
In vitro
diagnostik
tıbbi tanı
ürünü
temperaturbegrensning
Innhold
tilstrekkelig for <n>
tester
irriterende
περιoριoμός
θερμοκραο
ίας
Περιεχόμενο
αροκετό για
<n> τεοτ
ερεθιστικό
Sıcaklık
sınırlaması
İçeriği
<n> test
için yeterlidir
Tahriş
edici
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
batch nr.
Viktig
merknad
Revision: BQ-013-08
κωδικός
Σημαντική
παρτίδας
υπόδειξη
Mai 2015
Parti kodu
Önemli
Not
2
INHALTSVERZEICHNIS
1. INHALT DES KITS ......................................................................................................... 5
H P V D N A - C h i p6
2. VERBRAUCHSMATERIALIEN UND EQUIPMENT .......................................................
3. VERSAND UND LAGERUNG........................................................................................ 8
4. SICHERHEITSHINWEISE.............................................................................................. 8
5. ENTSORGUNG .............................................................................................................. 9
6. EINLEITUNG ................................................................................................................ 10
6.1 Zweckbestimmung ......................................................................................................................... 10
6.2 Mit PapilloCheck® nachweisbare HVP-Typen ............................................................................... 10
6.3 Testprinzip ...................................................................................................................................... 11
6.4 Design des PapilloCheck® DNA-Chips .......................................................................................... 13
6.4.1 PapilloCheck® Chip-Layout ................................................................................................. 13
6.4.2 On-Chip-Kontrollen .............................................................................................................. 14
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
7. ANLEITUNGEN FÜR DEN PAPILLOCHECK® ARBEITSABLAUF ............................. 15
7.1 Allgemeine Hinweise ..................................................................................................................... 15
7.2 Raumaufteilung .............................................................................................................................. 15
7.3 Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen ................................................................................... 16
®
7.3.1 Vermeidung von Kontaminationen ....................................................................................... 16
7.3.2 Anleitung zur Handhabung der DNA-Chips ......................................................................... 16
7.3.3 Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen ....................................................................................... 16
7.3.4 Sichere Arbeitsweise............................................................................................................ 17
PapilloCheck
Gebrauchsanweisung
8. PAPILLOCHECK® VERFAHREN ................................................................................. 18
8.1 Probenentnahme und DNA-Extraktion......................................................................................... 18
8.1.1 Probenentnahme ................................................................................................................. 18
8.1.2 DNA-Extraktion .................................................................................................................... 20
DANGER
8.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) ................................................................................................. 21
8.2.1 Einstellen des Thermocyclers .............................................................................................. 21
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
8.2.2
Behandlung
mit 39,
Uracil-N-Glycosylase
(UNG)
.....................................................................
6, 11,
16, 18,
31, 33, 35,
40, 42, 43, 44/55,
45, 51,
52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 22
8.2.3 Ansatz der PCR-Reaktion .................................................................................................... 23
in Zervikalproben
8.3 Hybridisierung und Waschen........................................................................................................ 25
REF 465 060
8.3.1 Vorbereitung......................................................................................................................... 25
Nur8.3.2
zur Verwendung
die In-Vitro-Diagnostik
Revision: BQ-013-08
Hybridisierungfür
......................................................................................................................
27
durch
geschultes
Laborpersonal
Mai
8.3.3 Waschen und Trocknen .......................................................................................................
29 2015
8.4 Scannen und Auswertung des PapilloCheck® Chips .................................................................. 31
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
3
9. FEHLERBEHEBUNG................................................................................................... 32
10. TECHNISCHER SUPPORT ......................................................................................... 33
11. LEISTUNGSMERKMALE VON PAPILLOCHECK® .................................................... 34
HPV DNA-Chip
11.1 Analytische Leistungsbewertung von PapilloCheck® ................................................................
34
11.1.1 Analytische Sensitivität ........................................................................................................ 34
11.1.2 Analytische Spezifität – HPV-Typen..................................................................................... 35
11.1.3 Analytische Spezifität – Nicht-HPV-Organismen ................................................................. 35
11.2 Wiederholpräzision ........................................................................................................................ 36
11.3 Vergleichspräzision ....................................................................................................................... 37
11.4 Robustheit ...................................................................................................................................... 38
11.5 Klinische Leistungsbewertung von PapilloCheck® .................................................................... 39
12. PAPILLOCHECK® KURZPROTOKOLL ....................................................................... 41
12.1 Raum 2: PCR - Ansatz des Reaktionsgemisches........................................................................ 41
12.2 Raum 2: PCR - Zugabe von DNA-Template / PCR-Reaktion....................................................... 42
12.3 Raum 3: Hybridisierung - Vorbereitung / Hybridisierungsreaktion ........................................... 43
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
12.4 Raum 3: Waschen & Trocknen/ Scannen & Auswertung ........................................................... 44
PapilloCheck®
Gebrauchsanweisung
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
Greiner Bio-One GmbH
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
4
1. INHALT DES KITS
1
2
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
3
PapilloCheck® Testkit1
Inhalt
Menge
PCR MasterMix
5 x PapilloCheck®
PCR MasterMix2
5 x 300 µl
Slidebox, 5 x 12 Arrays
1 x PapilloCheck® Slidebox
mit 5 PapilloCheck® Chips3
5 x 12 Arrays
Hybridisierungspuffer
2 x PapilloCheck®
Hybridisation Buffer
2 x 1.000 µl
Puffer A Konzentrat
2 x PapilloCheck® BUF A conc.
2 x 40 ml
Puffer B Konzentrat
1 x PapilloCheck® BUF B conc.
1 x 15 ml
HPV DNA-Chip
Ein PapilloCheck® Testkit ist ausreichend für die Analyse von 60 Proben.
Enthält alle für die PCR benötigten Komponenten, außer der Taq-DNA-Polymerase und der Uracil-N-Glycosylase.
Ein PapilloCheck® Chip enthält 12 PapilloCheck® Microarrays.
PapilloCheck®
Gebrauchsanweisung
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
Greiner Bio-One GmbH
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
5
2. VERBRAUCHSMATERIALIEN UND EQUIPMENT
PapilloCheck® sollte nur zusammen mit dem aufgeführten Verbrauchsmaterial und Equipment und
nur von Fachpersonal angewendet werden.
Verbrauchsmaterialien
Greiner Bio-One Kat.- Nr.
Menge
HPV DNA-Chip
PapilloCheck® Testkit
465 060
Testkit für 60
Reaktionen
PapilloCheck® Probenentnahmeset
465 075
50 Proben
oCheck® DNA-Extraktionskit /
Einzelsäulenaufreinigung
515 040
Testkit für 50
Aufreinigungen
765 288
774 288
772 288
739 288
750 288
96/960
96/960
96/960
96/960
60/600
1,5 ml Reaktionsgefäße
0,2 ml Reaktionsgefäße2
8 x 0,2 ml PCR-Streifen
Deckelketten für 8 x 0,2 ml PCR-Streifen
616 201
683 201
673 210
373 270
500/4000
500/1000
125/1250
125/1250
50 ml Polypropylengefäße3
210 261
25/450
607 180 oder 607 160
760 180 oder 760 160
786 180 oder 768 160
1/200
1/200
1/200
Sterile, DNase-freie Mikropipettor-Filterspitzen1
0,5-10 µl Filterspitzen
0,5-20 µl Filterspitzen
10-100 µl Filterspitzen
10-200 µl Filterspitzen
100-1000 µl Filterspitzen
Made in Austria
IVD
DNase-freie Reaktionsgefäße
PapilloCheck®
Kunststoffpipetten für Pipettor
4 °C
8 °C
10 ml Pipette
25 ml Pipette
50 ml Pipette
Gebrauchsanweisung
1
2
3
Einige der genannten Spitzengrößen sind optional, je nachdem, welche Mikropipetten zur Verfügung stehen.
Prinzipiell wird die Verwendung von PCR 8er-Streifen empfohlen. Wenn keine PCR-Streifen zur Verfügung stehen,
können auch Einzelreaktionsgefäße (0,2 ml) verwendet werden.
Nur erforderlich, wenn keine Objektträgerzentrifuge zur Verfügung steht.
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
6
Equipment
Greiner Bio-One Kat.- Nr.
Menge
CheckScannerTM
862 070
1
CheckReportTM Software Basisversion
862 080
1
CheckReportTM Software PapilloCheck® Plugin
862 081
1
oCheck® Hybridisierungskammer mit Objektträgerhalter
447 070
Computer für CheckScanner™ und
CheckReportTMSoftware
862 900
1
Griff für Objektträgerhalter
447 001
1
oCheck® Waschbehälter4
447 020
1
H P V D1N A - C h i p
Benötigte Enzyme
• Taq Polymerase: HotStarTaq® DNA-Polymerase 5 U/µl (Qiagen; 203203, 203205, 203207, 203209)
• Uracil-N-Glycosylase: Uracil-DNA Glycosylase 1 U/µl (Fermentas; EN0361, EN0362)
Zusätzliche Verbrauchsmaterialien
• PCR-Wasser
• Destilliertes oder entionisiertes Wasser
• Einmalhandschuhe
Zusätzliches Equipment
Made in Austria
IVD
• Tischzentrifuge für 1,5 und 2 ml Reaktionsgefäße
• Zentrifuge für 50 ml Polypropylengefäße (z. B. BeckmanCoulter; Zentrifuge Allegra X-22; Festwinkelrotor C0650)
oder Objektträgerzentrifuge (z. B. Labnet: Slide Spinner; VWR International: Galaxy MiniArray-Zentrifuge)
• Tischzentrifuge für einzelne 0,2 ml Reaktionsgefäße oder PCR 8er-Streifen (z. B. Labnet: SpectrafugeMinizentrifuge)
• PCR-Thermocycler:
GeneAmp® PCR-System 9700 (Applied Biosystems)
Veriti™ 96-Well-Thermocycler (Applied Biosystems)
®
peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnology GmbH)
• Wasserbad (50 °C)
• Mikropipetten (verschiedene Volumenbereiche von 1 - 1000 µl)
• 8-Kanal-Multipipette (Volumenbereich: 5 - 50 µl), z. B. Brand Transferpette®-8 (Brand)
• Pipettor für Glas- und Kunststoffpipetten
• Vortex-Mixer
• Ständer für verschiedene Reaktionsgefäße
8 °C
PapilloCheck
4 °C
Gebrauchsanweisung
Zusätzliches Equipment
• Computer (hinsichtlich der Systemanforderungen sind die Gebrauchsanweisungen des CheckSannerTM und der
CheckReportTM Software zu beachten)
4
Für die PapilloCheck®-Waschschritte werden drei oCheck® Waschbehälter benötigt.
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Deutschland
Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
7
3. VERSAND UND LAGERUNG
Das PapilloCheck® Testkit wird bei Raumtemperatur versendet. Dennoch muss das Kit nach Erhalt
umgehend bei 4-8 °C und lichtgeschützt aufbewahrt werden. Bei sachgemäßer Aufbewahrung
können das PapilloCheck® Testkit und seine Komponenten bis zum angegebenen Verfallsdatum
verwendet werden. Unter diesen Aufbewahrungsbedingungen entspricht das Haltbarkeitsdatum
HPV DNA-Chip
auch nach dem ersten Öffnen des Kits und seiner Komponenten dem Verfallsdatum.
4. SICHERHEITSHINWEISE
Das PapilloCheck® Testkit ist nur für die Verwendung im Labor und nicht als Arzneimittel, für den
Gebrauch zu Hause oder für andere Zwecke bestimmt. Tragen Sie stets einen geeigneten Laborkittel,
Einmalhandschuhe und Schutzbrille und beachten Sie die in diesem Abschnitt aufgeführten
Sicherheitshinweise.
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
Die folgenden Komponenten des PapilloCheck® Testkits enthalten gesundheitsschädliche oder
gefährliche Substanzen.
Kitkomponentenmenge
Gefährliche
Substanzen
(Menge)
PapilloCheck®
Hybridisierungspuffer
Guanidinthiocyanatlösung,
25-60 %,
CAS-Nr.
593-84-0
Klassifizierung
gemäß Verordnung (EG)
Nr. 1272/2008
GHS-Piktogramm
und Signalwort
H- und P-Sätze
Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
Gesundheitsschädlich beim EinatH332
men.
Verursacht schwere Verätzungen
Akute inhalative
H314
GEFAHR
der Haut und schwere AugenschäToxizität
den.
(Kategorie 4)
Schädlich für Wasserorganismen,
H412
mit langfristiger Wirkung.
Chronische
Freisetzung in die Umwelt vermeiaquatische
P273
®
den.
Toxizität
Schutzhandschuhe / Schutzkleidung
(Kategorie 3)
P280
/ Augenschutz/ Gesichtsschutz
tragen.
Hautätzend
(Kategorie 1c)
P305+P351+ BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN:
Einige Minuten
P338
lang behutsam mit Wasser spülen.
Vorhandene Kontaktlinsen nach
Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. Unverzüglich ein GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder einen
Arzt anrufen.
Ergänzende Angaben zu GefahrstofEUH032
fen (EU):
Entwickelt bei Berührung mit Säure
für die Genotypbestimmung von humanen
Papillomaviren vom Typ
sehr giftige Gase.
Akute orale
Toxizität
(Kategorie 4)
H302
PapilloCheck
Gebrauchsanweisung
Diagnostisches Kit
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
PapilloCheck® NatriumdoHautreizend
H315
Verursacht Hautreizungen.
in Zervikalproben
(Kategorie 2)
H318
Verursacht schwere Augenschäden.
Puffer B
decylsulfatP280
Schwere AuGEFAHR
Nur zur Verwendung genschäden
für die In-Vitro-Diagnostik
(Kategorie
1)
CAS-Nr.
P305+P351+
durch geschultes Laborpersonal
151-21-3
P338
DANGER
lösung
REF 465 060
<20 %,
Schutzhandschuhe / Schutzkleidung
/ Augenschutz/ Gesichtsschutz
tragen.
Revision: BQ-013-08
BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN:
Einige Minuten lang behutsam mitMai 2015
Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen.
Die aktuelle Version des Sicherheitsdatenblatts für dieses Produkt kann von der Greiner Bio-One
Website heruntergeladen
werden:GmbH
www.gbo.com/bioscience/biochips_download
Greiner Bio-One
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Deutschland
Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
8
5. ENTSORGUNG
Nach dem Waschen und Trocknen des PapilloCheck® Chips können die Waschlösungen I, II und III
ohne weitere besondere Vorsichtsmaßnahmen entsorgt werden. Den gebrauchten PapilloCheck®
Chip, unbenutzte Kitkomponenten und unbenutzten Hybridisierungsmix im Labormüll entsorgen.
Befolgen Sie die national und regional geltenden Richtlinien zur Abfallentsorgung.
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
HPV DNA-Chip
PapilloCheck®
Gebrauchsanweisung
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Deutschland
Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
9
6. EINLEITUNG
In praktisch allen Fällen von Gebärmutterhalskrebs, der zweithäufigsten Krebserkrankung bei Frauen
weltweit, liegt eine persistierende Infektion mit einem karzinogenen humanen Papillomavirus (HPV)
vor.1 Bislang sind über 100 HPV-Typen identifiziert worden, von denen etwa 40 sexuell übertragen
werden und die Genitalschleimhaut infizieren. Zervikale HPV-Typen werden in eine Hochrisikogruppe
HPV DNA-Chip
(high-risk HPV, hrHPV) und eine Niedrigrisikogruppe (low-risk HPV, lrHPV) eingeteilt. Die HochrisikoHPV-Typen werden generell mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung eines Zervikalkarzinoms
in Verbindung gebracht, wohingegen die HPV-Typen in der Niederrisikogruppe überwiegend
gutartige Genitalwarzen hervorrufen.2 Doch auch innerhalb der Hochrisikogruppe ist das relative
Risiko der Entwicklung von Krebs bzw. zervikalen intraepithelialen Läsionen (CIN) vom Virustyp
abhängig.3 Etwa 70 % aller Zervikalkarzinome werden mit einer persistierenden Infektion mit
HPV 16 oder 18 in Zusammenhang gebracht. Unter den Niedrigrisiko-Typen haben HPV 6 und
11 die höchste Prävalenz. Aufgrund einer fast 100%igen ätiologischen Verknüpfung zwischen
karzinogenem HPV und Zervikalkarzinom werden Tests auf hrHPV inzwischen im Rahmen der
primären Gebärmutterhalskrebsvorsorge in Betracht gezogen.4
6.1
Zweckbestimmung
8 °C
Made in Austria
IVD
Bei PapilloCheck® handelt es sich um ein diagnostisches Kit für den qualitativen Nachweis und
die Genotypisierung von 24 Typen des humanen Papillomavirus in DNA-Aufreinigungen aus
menschlichen Zervikalabstrichen. Das Kit ist nur zur Verwendung durch qualifiziertes Personal
bestimmt.
PapilloCheck® entspricht den Anforderungen der Richtlinie über In-Vitro-Diagnostika (98/79/
EG) und ist folglich mit der CE-Kennzeichnung versehen. Alle mit PapilloCheck® erhaltenen
Diagnostikergebnisse sollten in Verbindung mit anderen klinischen oder Laborbefunden ausgewertet
®
werden.
PapilloCheck
4 °C
6.2
Mit PapilloCheck® nachweisbare HPV-Typen
Gebrauchsanweisung
PapilloCheck® ermöglicht die Identifizierung von 18 Hochrisikohumanen Papillomavirus (HPV) (Tabelle 1).
und 6 Niedrigrisikotypen
des
Tabelle 1: Mit PapilloCheck® nachweisbare HPV-Typen
HPV 16
HPV 45
HPV 59
HPV 6
HPV 18
HPV 51
HPV 66
HPV 11
HPV 56
HPV 73
HPV 43
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
HPV
31 16, 18, 31,HPV
HPV43,
68 44/55, 45,
HPV
6, 11,
33,52
35, 39, 40, 42,
51,4052, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
HPV
33
HPV 53
HPV 70
HPV 42
DANGER
REF35465
HPV
060
Nur39
zur
HPV
Verwendung
HPV 58 für die In-Vitro-Diagnostik
HPV 82
HPV 44 / HPV 55*
durch geschultes Laborpersonal
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
* PapilloCheck® ist nicht zur Differenzierung zwischen HPV 44 und HPV 55 geeignet.
1
2
3
4
Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol.
189(1):12-9.
Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1–17.
Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specific
Greiner Bio-One GmbH
implications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K1-16.
Maybachstr.
2 • 72636
Frickenhausen
• Deutschland
Meijer, C.J. et al. (2009).
Guidelines
for human
papillomavirus
DNA test requirements for primary cervical cancer
7022
• Fax
+49 (0) 7022 948-514
screening in womenTelefon:
30 years+49
and(0)
older.
Int 948-0
J Cancer.
124(3):516-20.
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
10
6.3
Testprinzip
PapilloCheck® ist ein Microarray-basiertes Testkit für den Nachweis und die Genotypisierung eines
Fragments des E1-Gens im Genom des humanen Papillomavirus (HPV). Das Testprotokoll ist in
Abbildung 1 im Überblick dargestellt.
HPV DNA-Chip
extrahiert
Vor der PapilloCheck® Analyse muss zunächst DNA aus einer zervikalen Abstrichprobe
®
werden. Probenentnahme und DNA-Extraktion sind nicht Teil des PapilloCheck Testkits. Speziell
vorgesehene Produkte für die Probenentnahme (PapilloCheck® Probenentnahmeset) und die
DNA-Extraktion (oCheck® DNA-Extraktionskit) sind separat von Greiner Bio-One erhältlich
(Bestellinformationen finden Sie in Kapitel 2).
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
Nach der Extraktion von viraler und menschlicher genomischer DNA aus einer zervikalen Probe wird
ein 350 bp-Fragment des viralen E1-Gens mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) in Gegenwart
eines Sets HPV-spezifischer Primer amplifiziert. In derselben Reaktion wird ein Fragment des
menschlichen Single-Copy-Gens ADAT1 (humane tRNA-spezifische Adenosindeaminase1)
amplifiziert, um das Vorhandensein von menschlichem Probenmaterial in der zervikalen Probe zu
überwachen (Probenkontrolle). Außerdem wird zur Kontrolle der PCR ein im PapilloCheck® PCR
MasterMix vorhandenes internes Kontroll-Template amplifiziert (PCR-Kontrolle). Der PapilloCheck®
PCR MasterMix enthält zudem dUTP. Mit einer Uracil-N-Glycosylase (UNG)-Behandlung lässt sich
so eine mögliche Kontamination mit PCR-Produkten aus vorherigen PCR-Reaktionen verhindern
(siehe Kapitel 8.2.2).
Anschließend werden die PCR-Produkte an spezifische DNA-Sonden und On-Chip-Kontrollen auf
der PapilloCheck® Chip-Oberfläche hybridisiert. Jeder Chip enthält 12 DNA-Microarrays, sodass
12 zervikale Proben gleichzeitig analysiert werden können. Während der Hybridisierung wird die
gebundene DNA fluoreszenzmarkiert und ungebundene DNA wird in anschließenden Waschschritten
entfernt. Die Effizienz der Hybridisierung wird überwacht (Hybridisierungskontrolle).
PapilloCheck®
Abschließend wird der PapilloCheck® Chip automatisch mithilfe des CheckScannerTM gescannt
und mit der CheckReportTM Software analysiert und ausgewertet (Bestellinformationen finden Sie
in Kapitel 2). Der CheckScannerTM ist ein Zweifarben-Laserscanner (Anregungswellenlängen: 532
und 635 nm), mit dem die von den vorhandenen HPV-spezifischen Amplifikationsprodukten und
den Kontrollen erzeugten Fluoreszenzsignale erfasst werden können (siehe Kapitel 6.4.2). Die
CheckReportTM Software ermöglicht die Visualisierung, Analyse und Auswertung der Ergebnisse
und fasst die Werte der erfassten HPV-Typen und der Kontrollen automatisch in einem Bericht
zusammen.
Gebrauchsanweisung
Der Bericht enthält übersichtliche Angaben darüber, ob einer oder mehrere der 24 nachweisbaren
HPV-Typen vorhanden sind und um welche(n) Typ(en) es sich dabei handelt. Dank der umfassenden
On-Chip-Kontrollen
ist die
darüber hinaus in höchstem
Maße zuverlässig.
Diagnostisches
Kit Analyse
für die Genotypbestimmung
von humanen
Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Deutschland
Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
11
1. PCR-Reaktion
HPV DNA-Chip
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
2. Hybridisierung
3. Waschen und Trocknen
PapilloCheck®
oder
Gebrauchsanweisung
4. Scannen und Auswertung
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes
Laborpersonal
®
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
Abbildung 1: PapilloCheck Testprotokoll
1. PCR-Reaktion: Nach der DNA-Extraktion werden ein 350 bp-Fragment des viralen E1-Gens und Fragmente der beiden
Kontroll-Targets mittels PCR amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte werden anschließend an komplementäre DNASonden auf dem Chip hybridisiert.
2. Hybridisierung: Jeder HPV-Typ wird von einer spezifischen, in fünf Replikaten vorhandenen DNA-Sonde erfasst.
Während der Hybridisierung wird die gebundene DNA fluoreszenzmarkiert.
3. Waschen und Trocknen: Ungebundene DNA wird anschließend durch mehrmaliges Waschen entfernt.
Greiner Bio-One
GmbH ® Chip wird mit dem CheckScannerTM und der CheckReportTM Software
4. Scannen und Auswertung:
Der PapilloCheck
Maybachstr.
2 • 72636
Frickenhausen
Deutschland Angaben darüber erstellt, ob einer oder
gescannt, analysiert
und ausgewertet.
Es wird
ein Bericht mit• übersichtlichen
mehrere der 24 nachweisbaren
vorhanden
und
welche(n)
Typ(en) es sich dabei handelt.
Telefon: +49HPV-Typen
(0) 7022 948-0
• Faxsind
+49
(0)um
7022
948-514
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
12
6.4
Design des PapilloCheck® DNA-Chips
6.4.1
PapilloCheck® Chip-Layout
Jeder PapilloCheck® Chip enthält 12 Microarrays mit der Bezeichnung Well A1 - B6. Jeder
PapilloCheck® Mikroarray enthält 28 verschiedene Sonden und ist von einem erhöhten Rand
H P V D N A - C h i p®
umgeben. Jede Sonde wird in fünf Replikaten aufgetragen (Spots). Das Layout des
PapilloCheck
Mikroarray ist in Abbildung 2 gezeigt, und die On-Chip-Kontrollen sind in Kapitel 6.4.2 näher
erläutert.
roter Kanal (635 nm)
Orientierungskontrolle
b)
PapilloCheck
grüner Kanal (532 nm)
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
a)
®
Gebrauchsanweisung
c)
PCR-Kontrolle
HPV 6
HPV 45
HPV 11
HPV 51
HPV 16
HPV 52
HPV 18
HPV 53
HPV 31
HPV 56
HPV 33
HPV 58
HPV 35
HPV 59
HPV 39
HPV 66
HPV 40
HPV 68
HPV 42
HPV 70
HPV 43
HPV 73
HPV 44/55
HPV 82
Hybridisierungskontrolle
Probenkontrolle
Orientierungskontrolle
PCR-Kontrolle
HPV 6
HPV 45
HPV 11
HPV 51
HPV 16
HPV 52
HPV 18
HPV 53
HPV 31
HPV 56
HPV 33
HPV 58
HPV 35
HPV 59
HPV 39
HPV 66
HPV 40
HPV 68
HPV 42
HPV 70
HPV 43
HPV 73
HPV 44/55
HPV 82
Hybridisierungskontrolle
Probenkontrolle
DANGER
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
®
Abbildung 2: Aufbau des PapilloCheck Chips
®
a) Schema
PapilloCheck
Chips. b) und c) Von der CheckReportTM Software angezeigte Bilder bei den beiden beim
REFdes
465
060
Scannen verwendeten, unterschiedlichen Anregungswellenlängen (b) roter Kanal: 635 nm; c) grüner Kanal: 532 nm)
®
Nur zur Verwendung
für die
In-Vitro-Diagnostik
und Layout-Schema
des PapilloCheck
Mikroarrays.
Es sind HPV-Typen-spezifische Sonden und Revision:
On-Chip-Kontrollen
BQ-013-08
dargestellt.
durch geschultes Laborpersonal
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13
6.4.2
On-Chip-Kontrollen
Das Design des PapilloCheck® DNA-Chips umfasst zahlreiche On-Chip-Kontrollen. Mehrere
Kontrollsysteme überwachen alle kritischen Schritte des Tests und der Chip-Verarbeitung,
einschließlich der Probenqualität und der DNA-Extraktion (Probenkontrolle), der Qualität der
PCR-Reaktion (PCR-Kontrolle), der Effizienz der Hybridisierung (Hybridisierungskontrolle) sowie
HPV DNA-Chip
der Spot-Homogenität der aufgetragenen Sonden und der Druckqualität (Orientierungskontrolle
und Druckkontrolle). Die CheckReport™ Software zeigt nicht nur das Vorhandensein bzw.
Nichtvorhandensein von HPV-Typen an, sondern fasst auch automatisch die entsprechenden
Werte der Kontrollen in einem ausführlichen Bericht zusammen. Zum Auslesen der verschiedenen
Kontrollen werden beide Anregungswellenlängen des CheckScanner™ verwendet. Der rote
Kanal (Anregungswellenlänge: 635 nm) dient der Kontrolle der Qualität der Analyse (Proben- und
PCR-Kontrolle), der grüne Kanal (Anregungswellenlänge: 532 nm) der Kontrolle der Qualität der
Hybridisierung und des Chips (Hybridisierungs-, Orientierungs- und Druckkontrolle).
Probenkontrolle
PapilloCheck® überwacht die Qualität der Proben und/oder der DNA-Extraktion durch Amplifikation
des menschlichen Single-Copy-Gens ADAT1 (humane tRNA-spezifische Adenosindeaminase1).
Wenn in der extrahierten DNA aus der zervikalen Probe eine ausreichende Menge an menschlicher
DNA vorhanden ist, wird auf den Spots der Probenkontrolle ein Fluoreszenzsignal erzeugt.
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
Wenn keine oder eine unzureichende ADAT1-Amplifikation stattfindet, gibt die CheckReport™ Software
die Probenkontrolle als „failed“ (fehlgeschlagen) an und die Analyse muss wiederholt werden, weil
entweder zu wenig Zellen in der Zervikalprobe vorhanden sind und/oder die Extraktionsqualität
ungenügend ist (siehe Kapitel 9).
PCR-Kontrolle
PapilloCheck® überwacht auch die Qualität der PCR-Reaktion. Bei Amplifikation eines im
internen Kontroll-Template wird auf den Spots der PCRPapilloCheck® PCR-MasterMix vorhandenen
®
®
Kontrolle auf dem PapilloCheck Chip ein Signal erzeugt. Die Qualität der Amplifikationsreaktion
wird von der CheckReport™ Software automatisch überwacht. Wenn die PCR-Qualität einen
vordefinierten Schwellenwert unterschreitet, gibt die CheckReport™ Software die PCR-Kontrolle als
„failed“ (fehlgeschlagen) an und die Analyse muss wiederholt werden (siehe Kapitel 9).
PapilloCheck
Gebrauchsanweisung
Auch wenn in der Probe sehr viel HPV-DNA vorhanden ist, kann das Fluoreszenzsignal der PCRKontrolle sehr schwach sein oder sogar ganz fehlen, weil es während der PCR-Reaktion zu einer
Kompetition kommt. In diesem Fall muss das Fluoreszenzsignal mindestens einer HPV-spezifischen
Sonde einen vordefinierten Schwellenwert überschreiten, damit der Test gültig ist.
DANGER
Hybridisierungskontrolle
PapilloCheck® überwacht die Effizienz der Hybridisierung mithilfe einer fluoreszenzmarkierten
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
Sonde im PapilloCheck® Hybridisierungspuffer, die an spezifische DNA-Sequenzen auf dem
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
PapilloCheck® Chip hybridisiert. Bei einer ausreichenden Hybridisierungseffizienz wird auf jedem
in Zervikalproben
Spot ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Die Ergebnisse der fünf Hybridisierungskontrollspots auf dem
REF 465® Chip
060 werden ebenfalls von der CheckReportTM Software ausgewertet.
PapilloCheck
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
Revision: BQ-013-08
Orientierungsund Druckkontrolle
durch geschultes
Laborpersonal
Mai 2015
Die Spots mit der Orientierungskontrolle auf dem PapilloCheck® Chip erzeugen Fluoreszenzsignale
unabhängig von der Effizienz des Hybridisierungsvorgangs. Diese Spots dienen der
CheckReportTM Software als Richtpunkte für das präzise Auffinden der Spots, einer Voraussetzung
für die korrekte Analyse der Signale. Darüber hinaus wird die Qualität des Druckvorgangs durch
Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals an jedem Spot (Druckkontrolle) überwacht.
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14
7. ANLEITUNGEN FÜR DEN PAPILLOCHECK®
ARBEITSABLAUF
7.1
Allgemeine Hinweise
Bei der Etablierung von modernsten molekularbiologischen Methoden müssen folgende
H P V D NHinweise
A-Chip
genau befolgt werden, um eine maximale Sicherheit für das Laborpersonal zu gewährleisten und
qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erreichen.
Molekularbiologische Prozesse, wie DNA-Extraktion, Amplifikation und Nachweis von DNA müssen
von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Darüber hinaus ist ein sauberer und
gut strukturierter Arbeitsablauf von entscheidender Bedeutung als Vorbeugemaßnahme gegen
falsche Ergebnisse, die durch Abbau der Proben-DNA oder Kontamination mit Amplifikaten entstehen
könnten. Dazu ist es erforderlich, die Laborbereiche für Extraktion, Amplifikation und Detektion wie
in Kapitel 7.2 beschrieben voneinander zu trennen.
In jedem Bereich sollten separate Ausrüstung, Verbrauchsmaterialien, Laborkittel und Handschuhe
vorhanden sein. Überführen Sie niemals Laborkittel, Handschuhe oder Equipment von einem
Bereich in einen anderen.
Raumaufteilung
Abbildung 3 zeigt beispielhaft eine Aufteilung eines Labors in drei separate Bereiche. Ein Bereich
wird nur zur DNA-Extraktion verwendet, ein anderer ist zum Ansetzen und zur Durchführung von
PCR-Reaktionen bestimmt und im letzten Bereich erfolgen Hybridisierung und Analyse. Jeder
Raum ist ausschließlich für die zweckbestimmte Anwendung oder Technik zu verwenden, um eine
Kontamination der Proben zu verhindern.
Um die versehentliche Verwendung von Ausrüstungen
®
und Verbrauchsmaterialien in mehreren Bereichen zu vermeiden, wird eine Kennzeichnung mit
unterschiedlicher Farbcodierung empfohlen.
PapilloCheck
Gebrauchsanweisung
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
7.2
Raum 1
Raum 2
Raum 3
DANGER
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
Abbildung 3: Raumaufteilung
REF
465 060
Raum 1:
In diesem
Raum wird die komplette DNA-Extraktion durchgeführt.
Raum 2:
In
Raum
2
wird der Reaktionsmix
die PCR hergestellt und aufgeteilt (optimal ist die Verwendung einer PCRNur zur Verwendung
für die für
In-Vitro-Diagnostik
Revision:
Hood). Die Zugabe der in Raum 1 extrahierten DNA-Proben muss in einem separaten Bereich in Raum
2 erfolgen.BQ-013-08
durch
geschultes
Laborpersonal
Mai 2015
Raum 3: Im dritten Laborraum werden die Hybridisierungsreaktion, die Waschschritte und die Trocknung des Chips
durchgeführt. Zudem befindet sich hier der CheckScannerTM in Verbindung mit der CheckReportTM Software für die
abschließende Analyse des PapilloCheck® Tests.
!
Weder Equipment/Ausrüstung noch Verbrauchsmaterialien sollten zwischen den verschiedenen Laborräumen
und -bereichen
ausgetauscht
werden. Daher ist die Bereitstellung von Ausrüstungsgegenständen und
Greiner
Bio-One GmbH
Verbrauchsmaterialien in jedem Laborraum unabdingbar und sollte bei der Ausstattung des Labors
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Deutschland
einkalkuliert werden.
Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
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15
7.3
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
7.3.1
Vermeidung von Kontaminationen
• Laborkittel müssen bei allen Arbeitsschritten getragen werden; dabei sind für jeden Laborraum
eigene Laborkittel erforderlich.
HPV DNA-Chip
• Handschuhe müssen bei jedem Analyseschritt getragen und häufig gewechselt werden, vor allem
während der DNA-Extraktion.
• Der Arbeitsplatz muss mit einer geeigneten Reinigungslösung dekontaminiert werden.
• Berühren Sie niemals die Innenseite des Deckels des Reaktionsgefäßes. Öffnen Sie zur
Vermeidung einer Kreuzkontamination jeweils nur ein Gefäß.
• Es müssen geeignete Filterspitzen mit Aerosolbarriere verwendet werden (frei von DNase, RNase
und humaner DNA). Die Pipettenspitzen sollten zwischen Flüssigkeitstransfers stets gewechselt
werden.
7.3.2
Anleitung zur Handhabung der DNA-Chips
• DNA-Chips sollten in einer staubfreien Umgebung verwendet werden. Die Ablagerung von Staub
und anderen Partikeln auf der Chip-Oberfläche ist zu vermeiden.
• Die Hybridisierungszone auf der Chip-Oberfläche darf nicht berührt werden.
• Für die Hybridisierung ist nur die mit einem Barcode gekennzeichnete Seite des Chips bestimmt.
8 °C
Made in Austria
IVD
• Beschriften Sie die DNA-Chips nicht. Markerstifte können unspezifische Fluoreszenz auf dem
Chip erzeugen.
• Die DNA-Arrays sind nur für den Einmalgebrauch bestimmt. Hybridisierte Chips können nicht
wiederverwendet werden.
• Bewahren Sie unbenutzte Chips in der Originalkunststoffbox (Slidebox) auf. Diese sollte im
®
verschlossenen Folienbeutel mit Trockenmittel aufbewahrt werden.
PapilloCheck
4 °C
7.3.3
Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen
Gebrauchsanweisung
• Dieses Kit ist nur zur In-Vitro-Diagnostik vorgesehen und sollte ausschließlich von Personal
verwendet werden, das in den Laborpraktiken für die In-Vitro-Diagnostik geschult wurde.
• Überprüfen Sie die Kitkomponenten bei Lieferung auf etwaige Beschädigungen. Sollte eine der
Komponenten (z. B. Pufferflaschen) beschädigt sein, setzen Sie sich mit dem Greiner Bio-One
Vertriebshändler vor Ort in Verbindung. Verwenden Sie keine beschädigten Kitkomponenten, da
dies zu Leistungseinbußen des Kits führen kann.
DANGER
• Verwenden Sie das PapilloCheck® Testkit nicht nach dem Verfallsdatum.
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
• Verwenden
abgelaufenen
Reagenzien.
6, 11, 16,Sie
18,keine
31, 33,
35, 39, 40, 42,
43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
• Mischen
Sie keine Reagenzien aus verschiedenen Chargen.
in Zervikalproben
• Verwenden
REF 465Sie
060nur Reagenzien/Ausrüstung, die mit dem Kit geliefert wurden bzw. vom Hersteller
empfohlen werden.
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
Revision:
BQ-013-08
• Die Mikropipetten, das Wasserbad und der Heizblock müssen regelmäßig geeicht
bzw. gewartet
durch geschultes Laborpersonal
Mai 2015
werden.
• Das Pipettieren von kleinen Flüssigkeitsmengen im Mikroliterbereich erfordert Übung. Achten Sie
daher darauf, dass Sie die benötigten Volumina mit den Mikropipettoren so präzise wie möglich
pipettieren.
• Verhindern Sie
die Kontamination
Greiner
Bio-One GmbH von Reagenzien bei der Entnahme von Aliquots aus
Reagenzgefäßen.
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Deutschland
Telefon: +49 (0)
7022 bei
948-0
• Fax +49 (0) 7022
948-514
• Alle Zentrifugationsschritte
sollten
Raumtemperatur
(18-25
°C) durchgeführt werden.
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
16
7.3.4
Sichere Arbeitsweise
• Gehen Sie bei der Handhabung biologischer Proben, die humanes potenziell infektiöses Material
enthalten, mit äußerster Vorsicht vor. Zur Verringerung der Infektionsgefahr wird empfohlen, in
einer Sterilbank zu arbeiten, bis die Proben vollständig lysiert wurden. Handhaben und entsorgen
Sie alle biologischen Proben so, als ob diese infektiöse Erreger übertragen könnten.
• Pipettieren Sie niemals mit dem Mund.
HPV DNA-Chip
• Essen, Trinken, Rauchen und das Auftragen von Kosmetika sind in den Arbeitsbereichen
untersagt.
• Vermeiden Sie den direkten Kontakt mit den biologischen Proben sowie ein Verspritzen oder
Versprühen der Proben.
• Tragen Sie bei der Arbeit mit humanen Proben stets einen Laborkittel, Handschuhe und eine
Schutzbrille.
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
• Waschen Sie Ihre Hände nach der Handhabung von Proben und Reagenzien gründlich.
PapilloCheck®
Gebrauchsanweisung
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Deutschland
Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
17
8. PAPILLOCHECK® VERFAHREN
Das folgende Kapitel enthält eine ausführliche Beschreibung der verschiedenen Arbeitsschritte, die
zur Erstellung eines detaillierten Berichts führen. In diesem Bericht ist übersichtlich und für jede
analysierte Zervikalprobe angegeben, ob darin einer oder mehrere der 24 nachweisbaren HPVTypen vorhanden ist/sind und um welche(n) Typ(en) es sich dabei handelt. Abbildung 4 zeigt eine
Übersicht über die verschiedenen durchzuführenden Arbeitsschritte. Außerdem ist angegeben, in
welchem Unterkapitel der jeweilige Schritt des Testprotokolls beschrieben wird. Die Arbeitsschritte
müssen in der in diesem Kapitel aufgeführten Reihenfolge durchgeführt werden. Jeder spezifische
Arbeitsschritt ist mit einem blauen Pfeil  gekennzeichnet.
!
Die Probenentnahme, die DNA-Extraktion und die Analyse mit der CheckReportTM Software sind nicht Teil
des PapilloCheck® Testkits. Daher ist die Beschreibung dieser Arbeitsschritte in diesem Kapitel abgekürzt.
Ausführliche Informationen finden Sie in der jeweiligen Gebrauchsanweisung, z. B. des PapilloCheck®
Probenentnahmesets, des oCheck® DNA-Extraktionskits und der CheckReportTM Software.
8.1
Probenentnahme und DNA-Extraktion
8.1.1
Probenentnahme
Die Probenentnahme ist nicht Teil des PapilloCheck® Testkits. Ein Probenentnahmeset für
zervikale Proben ist ebenfalls von Greiner Bio-One erhältlich (PapilloCheck® Probenentnahmeset)
(Bestellinformationen finden Sie in Kapitel 2).
PapilloCheck® wurde validiert mit DNA, die mit dem oCheck® DNA-Extraktionskit aus menschlichen
zervikalen Abstrichen gewonnen wurde, welche mit einem der folgenden Probenentnahme-Systeme
bzw. -Medien vorgenommen wurde:
• PapilloCheck® Probenentnahmeset (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland)
• PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, USA)
• Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, USA)
• STMTM (Qiagen, Hilden, Deutschland)
• Easyfix (Labonord, Templemars, Frankreich)
• Cyt-All (Alphapath, Mauguio, Frankreich).
Weitere Informationen über geeignete Transportmedien oder DNA-Extraktionssysteme erhalten Sie
von Ihrem Greiner Bio-One Vertriebshändler vor Ort oder auf der Website von Greiner Bio-One:
www.gbo.com/bioscience/biochips_download
18
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Kapitel 8.1.2 DNA-Extraktion
Kapitel 8.2 PCR
Kapitel 8.3.2 Hybridisierung
Kapitel 8.3.3 Waschen & Trocknen
oder
Kapitel 8.4. Scannen & Auswertung
Abbildung 4: Übersicht über die verschiedenen PapilloCheck® Arbeitsschritte
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
8.1.2
DNA-Extraktion
Die DNA-Extraktion ist nicht Teil des PapilloCheck® Testkits. Die Extraktion von DNA vor der
PapilloCheck® Analyse muss mit dem oCheck® DNA-Extraktionskit durchgeführt werden, das
ebenfalls von Greiner Bio-One erhältlich ist (Bestellinformationen finden Sie in Kapitel 2). Bitte halten
Sie sich beim Gebrauch des oCheck® DNA-Extraktionskits genau an die Gebrauchsanweisung.
Für die DNA-Extraktion mit dem oCheck® DNA-Extraktionskit werden 250 µl Probenlösung benötigt.
Proben von humanen zervikalen Abstrichen, die mit dem
• PapilloCheck® Probenentnahmeset (Greiner Bio-One; Kat.-Nr. 465 070)
• in PreservCyt® Probenentnahmemedium (Hologic, Bedford, MA, USA)
entnommen bzw. aufgenommen werden, können direkt verarbeitet werden.
Proben von zervikalen Abstrichen, die in dem
• SurepathTM Probenentnahmemedium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) aufgenommen werden,
müssen vor Gebrauch gewaschen werden: Zentrifugieren Sie 250 µl der Probe für 5 Minuten
bei 11.000 g und resuspendieren Sie das Pellet in 250 µl destilliertem Wasser. Anschließend
können diese 250 µl mit dem oCheck® DNA-Extraktionskit aufgereinigt werden.
Proben von zervikalen Abstrichen, die in dem
• STMTM Probenentnahmemedium (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgenommen werden, müssen
verdünnt werden: hierfür zu 100 µl Probe 150 µl destilliertes Wasser geben. Die 250 µl verdünnte
Probe können mit dem oCheck® DNA-Extraktionskit aufgereinigt werden.
Wenn die Probe eines zervikalen Abstrichs stark konzentriert und bereits aggregiert zu sein scheint,
muss die Probe im Allgemeinen vor Beginn der DNA-Extraktion verdünnt und homogenisiert werden!
Proben von zervikalen Abstrichen, die stark verdünnt sind und keine sichtbaren Zellen aufweisen,
sollten konzentriert werden, um zur DNA-Extraktion eine höhere Zellausbeute zu erzielen:
Zentrifugieren Sie 1000 µl der Probe für 5 Minuten bei 11.000 g und resuspendieren Sie das Pellet
in 250 µl destilliertem Wasser. Anschließend können die 250 µl mit dem oCheck® DNA-Extraktionskit
aufgereinigt werden.
!
Dieser Konzentrationsschritt ist nur für zervikale Abstrichproben geeignet, die mit dem PapilloCheck®
Probenentnahmeset, in PreservCyt® Probenentnahmemedium oder in SurepathTM Probenentnahmemedium
entnommen/aufgenommen worden sind. Wurde das STMTM Probenentnahmemedium verwendet, ist eine
Konzentration durch Zentrifugation nicht möglich.
20
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
8.2
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Bei der PCR handelt es sich um ein sehr empfindliches Verfahren, mit dem sich äußerst kleine DNAMengen nachweisen lassen. Zur Vermeidung einer Kontamination der Reaktion müssen besondere
Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden (siehe Kapitel 7). Die für die PCR erforderlichen Enzyme
HotStarTaq® Polymerase und Uracil-N-Glycosylase sind im PapilloCheck® Testkit nicht enthalten
und müssen separat erworben werden (siehe Kapitel 2).
!
Das PapilloCheck® Testkit wurde mit der HotStarTaq® Polymerase von Qiagen und der Uracil-N-Glycosylase
von Fermentas validiert (Bestellinformationen in Kapitel 2). Die Verwendung dieser Enzyme ist eine
Voraussetzung dafür, die angegebenen Leistungsparameter zu erfüllen.
8.2.1
Einstellen des Thermocyclers
Das PapilloCheck® Testkit ist mit den folgenden Thermocyclern validiert worden:
• GeneAmp® PCR-System 9700 (Applied Biosystems)
• Veriti™ 96-Well-Thermocycler (Applied Biosystems)
• peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH)
!
Es muss unbedingt einer der vorstehend genannten Thermocycler verwendet werden, um die angegebenen
Leistungsparameter zu erfüllen.
Das Thermocycler-Programm für die PapilloCheck® PCR ist in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Thermocycler-Programm für die PapilloCheck® PCR
Zeit
Temp. °C
Anzahl der Zyklen
20 min
37 °C
1
15 min
95 °C
1
30 s
25 s
45 s
95 °C
55 °C
72 °C
40
30 s
45 s
95 °C
72 °C
15
Halten (Hold)
10 °C
Zusätzlich müssen bei jedem Thermocycler die folgenden Reaktionsparameter eingestellt werden.
Eine Beschreibung der Vorgehensweise zum Einstellen dieser Parameter finden Sie in der
Gebrauchsanweisung des jeweiligen Thermocyclers.
GeneAmp® PCR-System 9700 (Applied Biosystems)
Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 26 µl, die Geschwindigkeit der Temperaturerhöhung (ramp
speed) auf „9600” und die Deckeltemperatur auf 103 °C ein.
Veriti™ 96-Well-Thermocycler (Applied Biosystems)
Verwenden Sie das Hilfsprogramm zur Methodenkonvertierung (Convert Method) des Veriti™
96-Well-Thermocyclers, um das PapilloCheck® PCR-Programm einzugeben, und wählen Sie den
„9600 Emulation Mode”. Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 26 µl und die Deckeltemperatur auf
103 °C ein.
21
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH)
Verwenden Sie das vorpgrogrammierte PapilloCheck(R) PCR Programm „PapilloCheck.js“
gemeinsam mit dem Thermocycler. Für gewöhnlich kann das Programm unter folgendem Pfad
aufgerufen werden: local/Scripts/GreinerBioOne/PapilloCheck.js.
8.2.2
Behandlung mit Uracil-N-Glycosylase (UNG)5
Der PapilloCheck® PCR MasterMix enthält dUTP, das während der PapilloCheck® PCR in die
Amplifikationsprodukte eingebaut wird und so den Abbau der PCR-Produkte durch UNG ermöglicht.
UNG spaltet das PCR-Produkt an den Stellen, an denen ein Desoxyuridylat-Rest eingebaut worden
ist. Gespaltene PCR-Produkte werden anschließend nicht mehr amplifiziert. Eine UNG-Behandlung
kann daher zur Eliminierung einer Kontamination mit Amplifikaten aus vorherigen PCR-Reaktionen
verwendet werden.6
¯¯ Verdünnen Sie die Uracil-N-Glycosylase 1:200 in PCR-Wasser. Verwenden Sie für jeden
PapilloCheck® PCR-Reaktionsansatz eine frische UNG-Verdünnung (siehe Kapitel 8.2.3). Die
verdünnte UNG darf nicht wiederverwendet werden.
¯¯ Mischen Sie die UNG-Verdünnung sorgfältig, indem Sie sie entweder 2 Sekunden vortexen und
anschließend zentrifugieren oder mehrmals auf und ab pipettieren.
Die Ausgangskonzentration der Uracil-N-Glycosylase beträgt 1 U/µl. Die Konzentration nach
Verdünnung beträgt demnach 0,005 U/µl.
!
Das PapilloCheck® Testkit wurde mit der Uracil-N-Glycosylase von Fermentas validiert (siehe Kapitel 2).
Die Verwendung dieses Enzyms ist eine Voraussetzung dafür, die angegebenen Leistungsparameter zu
erfüllen.
¯¯ Geben Sie 1 µl dieser Verdünnung zu jeder PapilloCheck® PCR-Reaktion (siehe Kapitel 8.2.3,
Tabelle 3).
Diese Menge ist ausreichend, um eine Kontamination der PCR zu eliminieren. Achten Sie darauf,
keine höher konzentrierte UNG-Lösung zu verwenden, da sich dies negativ auf die PCR-Effizienz
auswirken könnte und so die Empfindlichkeit des PapilloCheck® reduziert wird.
Das PCR-Reaktionsgemisch wird für die UNG-Behandlung 20 Minuten bei 37 °C inkubiert.
Anschließend wird die UNG in einem weiteren 15-minütigen Inkubationsschritt bei 95 °C inaktiviert.
Diese beiden Schritte sind bei der PapilloCheck® PCR bereits berücksichtigt und entsprechen den
ersten beiden Schritten des Thermocycler-Programms (siehe Tabelle 2). Bei dem zweiten Schritt
(15 Minuten bei 95 °C) wird einerseits die Uracil-N-Glycosylase inaktiviert und andererseits die
HotStarTaq® Polymerase aktiviert.
!
Das UNG-System der PapilloCheck® PCR eliminiert nur Kontaminationen mit PCR-Produkten aus
vorherigen PCR-Reaktionen. Andere Kontaminationen, beispielsweise solche, die während der
Probenvorbereitung, der DNA-Extraktion oder der Zugabe von PCR-Template stattfinden, lassen sich
damit nicht eliminieren. Es müssen daher nach wie vor die in Kapitel 7 beschriebenen Anweisungen und
besonderen Vorsichtsmaßnahmen zur Verhinderung von Kontaminationen befolgt werden.
Der Kauf des PapilloCheck® beinhaltet eine eingeschränkte Lizenz im Rahmen der US-Patente 5.035.996, 5.683.896,
5.945.313, 6.287.823 und 6.518.026 und entsprechender ausländischer Patente.
6
Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions,
Gene, 93, 125-128, 1990.
5
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
22
8.2.3
Ansatz der PCR-Reaktion
Mit Ausnahme der HotStarTaq® Polymerase und der Uracil-N-Glycosylase enthält der PapilloCheck®
PCR MasterMix bereits alle Komponenten, die für die Durchführung der PCR-Reaktion benötigt
werden (PCR-Puffer, MgCl2, dNTPs, Primer, PCR-Kontroll-Template).
!
Das PapilloCheck® Testkit wurde mit der HotStarTaq® Polymerase von Qiagen validiert (siehe Kapitel 2).
Die Verwendung dieses Enzyms ist eine Voraussetzung dafür, die angegebenen Leistungsparameter zu
erfüllen
Das Reaktionsgemisch wird optimalerweise in einer geschützten Umgebung angesetzt, z. B. einer
PCR-Hood, um eine Kontamination der Reaktion zu vermeiden.
¯¯ Setzen Sie das Reaktionsgemisch (bestehend aus PapilloCheck® PCR MasterMix, HotStarTaq®
Polymerase und Uracil-N-Glycosylase) für die erforderliche Anzahl an PCR-Reaktionen
entsprechend den Angaben in Tabelle 3 an.
Wenn mehrere Proben analysiert werden, sollte das Reaktionsgemisch in einem Ansatz (Batch) (in der
für alle Analysen benötigten Menge) angesetzt werden. Zum Ausgleich von Volumenschwankungen
beim Pipettieren empfiehlt es sich, die Anzahl der Reaktionen (n) für jeden Chip um 1 zu erhöhen (=n+1),
d. h. es wird ein für 13 Amplifikationsreaktionen ausreichendes Volumen des Reaktionsgemisches
angesetzt, wenn 12 Proben getestet werden sollen (siehe Tabelle 3). Verwenden Sie pro Chip
jeweils eines der 5 MasterMix-Röhrchen des Kits.
!
Es wird empfohlen, bei jedem PapilloCheck® PCR MasterMix-Ansatz eine Negativkontrolle mitzuführen. Als
Negativkontrolle eignet sich der DNA-Elutionspuffer des jeweiligen DNA-Extraktionskits oder PCR-Wasser.
¯¯ Mischen Sie das Reaktionsgemisch gründlich, indem Sie es entweder 2 Sekunden vortexen und
anschließend zentrifugieren oder mehrmals auf und ab pipettieren.
¯¯ Aliquotieren Sie das Reaktionsgemisch, indem Sie pro PCR-Reaktion 21 µl des
Reaktionsgemisches in ein dünnwandiges 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäß pipettieren.
Die DNA-Template-Zugabe sollte in einem separaten Arbeitsbereich durchgeführt werden (siehe
Kapitel 7.2).
¯¯ Geben Sie jeder PCR-Reaktion 5 µl DNA-Extrakt zu und mischen Sie den Reaktionsansatz,
indem Sie ihn entweder 2 Sekunden vortexen und anschließend zentrifugieren oder mehrmals
auf und ab pipettieren. Das Gesamtvolumen einer PCR-Reaktion beträgt 26 µl.
¯¯ Stellen Sie die Reaktionsgefäße in den Thermocycler und starten Sie die PCR-Reaktion mit dem
in Kapitel 8.2.1 beschriebenen Thermocycler-Programm (Tabelle 2).
!
Nach Abschluss der PCR sollten die Amplifikationsprodukte entweder sofort für die Hybridisierung verwendet
oder bis zu eine Woche im Dunkeln bei -20 °C aufbewahrt werden.
23
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Tabelle 3: Ansetzen der PapilloCheck® PCR-Reaktion
1 Reaktion
13 Reaktionen
(1 Chip)
26 Reaktionen
(2 Chips)
39 Reaktionen
(3 Chips)
52 Reaktionen
(4 Chips)
PapilloCheck®
PCR MasterMix
19,8 µl
257,4 µl
514,8 µl
772,2 µl
1029,6 µl
HotStarTaq® Polymerase
(5 E/µl)
0,2 µl
2,6 µl
5,2 µl
7,8 µl
10,4 µl
Uracil-N-Glycosylase
(1:200 verdünnt,
(0,005 E/µl)
1 µl
13 µl
26 µl
39 µl
52 µl
Gesamtvolumen vor
Zugabe von Proben-DNA
21 µl
273 µl
546 µl
819 µl
1092 µl
DNA-Extrakt aus zervikaler
Probe (DNA-Template)
5 µl
Gesamtvolumen pro
Reaktion
26 µl
24
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
8.3
Hybridisierung und Waschen
8.3.1
Vorbereitung
Die Hybridisierung muss bei Raumtemperatur (20-25 °C) durchgeführt werden. Beginnen Sie mit den
erforderlichen Vorbereitungen für die Hybridisierung und die Waschschritte spätestens 30 Minuten
vor Beginn der Hybridisierung.
¯¯ Lassen Sie die Hybridisierungs- und Waschpuffer 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 °C)
stehen, damit sich etwaige Niederschläge lösen können, und mischen Sie sie vor Gebrauch
gründlich.
Die Aufbewahrung des PapilloCheck® Testkit bei 4-8 °C kann dazu führen, dass das SDS im
Hybridisierungspuffer und in Puffer B ausfällt. Lassen Sie die Lösungen Raumtemperatur annehmen
und vortexen bzw. schütteln Sie anschließend das Gefäß bzw. die Flasche, bis sich der Niederschlag
vollständig gelöst hat.
¯¯ Bereiten Sie die oCheck® Hybridisierungskammer vor: Legen Sie ein frisches feuchtes Papiertuch
in die Hybridisierungskammer und schließen Sie den Deckel, damit eine mit Feuchtigkeit
gesättigte Atmosphäre entsteht.
Die Hybridisierung muss in einer mit Feuchtigkeit gesättigten Atmosphäre stattfinden, um eine
Verdunstung des geringen Volumens auf dem Chip zu vermeiden. Von Greiner Bio-One ist eine
spezielle Hybridisierungskammer für die PapilloCheck® Analyse erhältlich (siehe Kapitel 2).
¯¯ Inkubieren Sie die erforderliche Anzahl an PapilloCheck® Chips mindestens 10 Minuten lang bei
Raumtemperatur (20-25 °C) in der vorbereiteten Hybridisierungskammer.
!
Der magnetische Objektträgerhalter der Hybridisierungskammer enthält nur auf einer Seite einen Magneten.
Wenn weniger als vier PapilloCheck® Chips parallel hybridisiert werden sollen, müssen Sie darauf achten,
den Objektträgerhalter von der dem Magneten gegenüber liegenden Seite aus mit PapilloCheck® Chips
zu bestücken. Andernfalls sind die PapilloCheck® Chips während der Waschschritte nicht mit Flüssigkeit
bedeckt.
¯¯ Setzen Sie die Waschlösungen I, II und III nach der folgenden Anleitung an.
Ansetzen der Waschlösungen I, II und III:
¯¯ Bereiten Sie so viel Waschlösung für die Waschlösungen I, II und III vor, wie Sie für die zu
analysierende Anzahl an PapilloCheck® Chips benötigen (siehe Tabelle 4).
¯¯ Aliquotieren Sie drei gleiche Volumina der Waschlösung in drei separate oCheck® Waschbehälter
und beschriften Sie diese als Waschlösung I, II und III. Jeder oCheck® Waschbehälter ist mit
einer eingravierten Skala versehen, welche die korrekte Menge an Waschlösung für bis zu 4
Chips anzeigt. Bitte verwenden Sie diese Skala zur Überprüfung des Waschlösungsvolumens.
¯¯ Wärmen Sie Waschlösung II vor dem Gebrauch mindestens 20 Minuten bei 50 °C in einem
temperaturgeregelten Wasserbad vor. Achten Sie darauf, dass der Füllstand des Wasserbads
dem Füllstand der Waschlösung II entspricht.
25
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Tabelle 4: Herstellung der Waschlösung
Die in dieser Tabelle angegebenen Volumen sind ausreichend für alle drei Waschschritte (Waschlösung I, II und III) und für
die angegebene Anzahl an PapilloCheck® Chips.
Anzahl an PapilloCheck® Chips
Komponenten
1
2
3
4
Destilliertes oder entionisiertes Wasser
140 ml
280 ml
420 ml
560 ml
PapilloCheck® Puffer A - Konzentrat
14 ml
28 ml
42 ml
56 ml
PapilloCheck® Puffer B- Konzentrat
1,75 ml
3,5 ml
5,25 ml
7 ml
155,75 ml
311,50 ml
467,25 ml
623 ml
Gesamtvolumen
!
Die Waschlösungen dürfen auf keinen Fall wiederverwendet werden, da dies zu einer Ansammlung
abgewaschener PCR-Produkte und dadurch zu einer Verfälschung der PapilloCheck® Ergebnisse führen
könnte. Verwenden Sie für jeden Test frische Waschlösungen.
Die vorbereitete Waschlösung kann bis zu eine Woche lang bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
Überprüfen Sie, ob SDS ausgefallen ist. Ist dies der Fall, erwärmen Sie die Waschlösung, bis sich der
Niederschlag gelöst hat, und lassen Sie das Gemisch anschließend wieder Raumtemperatur annehmen.
Führen Sie dann die Vorbereitungen für das nächste Hybridisierungsexperiment durch.
26
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
8.3.2
Hybridisierung
Die Hybridisierung muss bei Raumtemperatur (20-25 °C) durchgeführt werden. Die wichtigsten
Arbeitsschritte zum Hybridisieren der PCR-Produkte der PapilloCheck® PCR-Reaktion auf dem
PapilloCheck® Chip sind in Abbildung 5 gezeigt.
¯¯ Mischen und zentrifugieren Sie die PCR-Produkte kurz vor der Verwendung.
Wurden die PCR-Produkte bis zur Hybridisierung bei -20 °C aufbewahrt, müssen Sie sie vor dem
Mischen zunächst auftauen, bevor Sie wie beschrieben fortfahren können.
¯¯ Vortexen Sie den Hybridisierungspuffer vor der Verwendung und zentrifugieren Sie ihn kurz.
¯¯ Mischen Sie 30 µl des PapilloCheck® Hybridisierungspuffers in einem frischen Reaktionsgefäß
eines PCR 8er-Streifens mit 5 µl PCR-Produkt, indem Sie entweder kurz vortexen oder den
Ansatz mehrmals auf und ab pipettieren.
¯¯ Zentrifugieren Sie den Ansatz kurz.
¯¯ Überführen Sie in jedes Chip-Well 25 µl des Hybridisierungsgemisches und verwenden Sie dazu
6 Kanäle einer Multikanalpipette. Achten Sie darauf, dass keine Luftbläschen entstehen!
Es empfiehlt sich, jeweils 6 Proben parallel mit einer 8-Kanal-Multipipette zu pipettieren (siehe
Abbildung 5). Dadurch erhöhen sich Effizienz und Geschwindigkeit des Arbeitsschrittes und das
Verdunstungsrisiko wird reduziert. Werden mehrere Objektträger gleichzeitig pipettiert, ist der
Gebrauch einer Multikanalpipette obligatorisch, um die korrekte Hybridisierungsdauer einzuhalten.
Es sollten möglichst alle 12 Wells eines Chips hybridisiert werden. Falls weniger als 12 Proben
analysiert werden sollen, lassen Sie die unbenutzten Wells leer. Unbenutzte Wells auf einem
gebrauchten Chip können nicht für künftige Proben verwendet werden.
!
Behandeln Sie den Chip umsichtig, um ein Verschütten des Hybridisierungsgemisches zu vermeiden.
Verschütten kann zu Kreuzkontamination der Proben und zu falschpositiven Ergebnissen führen.
Inkubieren Sie den Chip in der mit Feuchtigkeit gesättigten Atmosphäre der vorbereiteten
Hybridisierungskammer exakt 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 °C) im Dunkeln. Achten Sie
darauf, die Hybridisierungskammer während der Hybridisierung nicht zu bewegen.
!
Ändern Sie keinesfalls Inkubationsdauer oder Temperatur der Hybridisierungsreaktion, da dies entweder zu
einem Verlust der Intensität des Fluoreszenzsignals oder zu einem Anstieg unspezifischer Fluoreszenzsignale
führen könnte.
Setzen Sie die hybridisierten Chips nicht direkt dem Sonnenlicht aus.
27
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
¯¯ Bereiten Sie in der Hybridisierungskammer
eine mit Feuchtigkeit gesättigte Atmosphäre
vor.
¯¯ Inkubieren Sie die erforderliche Anzahl an
PapilloCheck® Chips bei Raumtemperatur
(20-25 °C) in der Hybridisierungskammer
(siehe Kapitel 8.3.1).
¯¯ Mischen Sie 30 µl PapilloCheck®
Hybridisierungspuffer in einem 0,2 ml
Reaktionsgefäß eines PCR-Streifens mit 5 µl
PCR-Produkt. Gründlich mischen.
¯¯ Überführen Sie mit einer Multikanalpipette
in jedes Well des PapilloCheck® Chips 25 µl
des Hybridisierungsgemisches.
¯¯ Schließen Sie die Hybridisierungskammer
und inkubieren Sie den PapilloCheck® Chip
exakt 15 Minuten bei Raumtemperatur
(20-25 °C).
Abbildung 5: Arbeitsschritte bei der Hybridisierung
28
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
8.3.3
Waschen und Trocknen
Mit dem von Greiner Bio-One erhältlichen Spezial-Equipment können bis zu vier PapilloCheck®
Chips gleichzeitig gewaschen werden (siehe Kapitel 2). Das für die Verarbeitung der PapilloCheck®
Chips benötigte zusätzliche Equipment besteht aus drei oCheck® Waschbehältern und einem Griff
für den magnetischen Objektträgerhalter der Hybridisierungskammer.
Die verschiedenen Arbeitsschritte sind in Abbildung 6 dargestellt.
¯¯ Heben Sie den magnetischen Objektträgerhalter mit den hybridisierten PapilloCheck® Chips
vorsichtig aus der Hybridisierungskammer.
¯¯ Tauchen Sie den Objektträgerhalter mit den PapilloCheck® Chips direkt in den oCheck®
Waschbehälter mit Waschlösung I. Achten Sie darauf, dass die Magnetseite nach oben zeigt.
¯¯ Bringen Sie den oCheck® Griff an dem Objektträgerhalter an und beginnen Sie mit dem ersten
von insgesamt drei Waschschritten.
¯¯ Waschen Sie den Chip bei Raumtemperatur (20-25 °C) in Waschlösung I, indem Sie ihn
10 Sekunden lang rasch auf und ab bewegen. Die Arrays müssen dabei stets mit Waschlösung
bedeckt bleiben.
¯¯ Waschen Sie den Chip für 60 Sekunden in der auf 50 °C vorgewärmten Waschlösung II, indem
Sie ihn kräftig auf und ab bewegen.
¯¯ Waschen Sie den Chip bei Raumtemperatur (20-25 °C) in Waschlösung III, indem Sie ihn
10 Sekunden lang rasch auf und ab bewegen.
¯¯ Entfernen Sie durch Zentrifugation sofort sämtliche Flüssigkeit von der Chip-Oberfläche. Wenn
Sie für die Mikroarrays eine spezielle Tischzentrifuge verwenden, beträgt die Zentrifugationsdauer
1 Minute. Wenn Sie eine für 50 ml Gefäße geeignete Zentrifuge verwenden, geben Sie je einen
gewaschenen PapilloCheck® Chip in ein 50 ml Gefäß und zentrifugieren Sie 3 Minuten bei
500 g bei Raumtemperatur.
Der PapilloCheck® Chip ist nun bereit zum Scannen und sollte unverzüglich gescannt werden. Spülen
Sie die oCheck® Waschbehälter nach jedem abgeschlossenen Wasch- und Trocknungsprozess zum
Reinigen mehrmals mit Wasser aus.
29
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Erster Waschschritt
¯¯ Heben Sie den magnetischen Objektträgerhalter
vorsichtig aus der Hybridisierungskammer.
¯¯ Tauchen Sie den Objektträgerhalter rasch in den
oCheck® Waschbehälter mit Waschlösung I
¯¯ Bringen Sie den oCheck® Griff an
¯¯ Waschen Sie den/die PapilloCheck® Chip(s)
bei Raumtemperatur 10 Sekunden lang in
Waschlösung I, indem Sie den Objektträgerhalter
auf und ab bewegen
Zweiter Waschschritt
¯¯ Waschen Sie den/die PapilloCheck® Chip(s)
in der in einem Wasserbad vorgewärmten
Waschlösung bei 50 °C für 60 Sekunden,
indem Sie den Objektträgerhalter auf und ab
bewegen
Dritter Waschschritt
¯¯ Waschen Sie den/die PapilloCheck®
Chip(s) bei Raumtemperatur 10 Sekunden
lang in Waschlösung III, indem Sie den
Objektträgerhalter auf und ab bewegen
oder
Trocknen
¯¯ Entfernen Sie durch Zentrifugieren sofort
sämtliche Flüssigkeit von der Oberfläche der
PapilloCheck® Chips
3 Minuten
500 g
1 Minute
max. Geschw.
Abbildung 6: Arbeitsschritte beim Waschen
Die verschiedenen Wasch- und Trocknungsschritte vor der Analyse des PapilloCheck® Chips mit dem CheckScannerTM
und der CheckReportTM Software.
30
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
8.4
Scannen und Auswertung des PapilloCheck® Chips
Legen Sie den/die PapilloCheck® Chip(s) in den CheckScannerTM und fahren Sie mit dem Scannen
fort, wie es ausführlich im Benutzerhandbuch der CheckReportTM Software beschrieben ist.
Ausführlichere Informationen zur Installation des CheckScannerTM und der CheckReportTM Software
sowie zu den Anforderungen an das Computersystem finden Sie in der entsprechenden
Gebrauchsanweisung des CheckScannerTM und der CheckReportTM Software.
Bei jeder Datenanalyse mit der CheckReportTM Software muss sichergestellt werden, dass die
auf Ihrem Computer installierte Version der CheckReportTM Software mit der auf dem aktuell
verwendeten PapilloCheck® Kit angegebenen Version übereinstimmt. Ist dies nicht der Fall, muss
die CheckReportTM Software aktualisiert werden. Die neueste Software-Version kann von der Greiner
Bio-One Website heruntergeladen werden:
www.gbo.com/bioscience/biochips_download
31
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
9. FEHLERBEHEBUNG
Gehen Sie vor, wie im Folgenden beschrieben, wenn während des Scannens des Chips eine oder
mehrere der folgenden Fehlermeldungen angezeigt wird/werden oder wenn die PapilloCheck®
Analyse aufgrund bestimmter Kontrollen auf dem Chip fehlschlägt. Wenn Sie Fragen zu oder
Probleme mit PapilloCheck® Produkten haben, wenden Sie sich bitte an Ihren Greiner Bio-One
HPV DNA-Chip
Vertriebshändler vor Ort.
PROBLEM und Ursache
Anmerkungen und Vorschläge
FEHLERMELDUNG „COULD NOT
READ BARCODE“ (BARCODE
KONNTE NICHT GELESEN
WERDEN)
Beschädigter Barcode
Überprüfen Sie den Barcode auf Beschädigungen. Geben Sie den Barcode
manuell ein, wenn das entsprechende Fenster geöffnet wird.
Falsch geladener Chip
Überprüfen Sie die Ausrichtung des Chips und scannen Sie den Chip in der
korrekten Ausrichtung.
8 °C
Made in Austria
IVD
FEHLERMELDUNG „MISSING
SPOTS“ (FEHLENDE
SPOTS), DRUCKONTROLLE
FEHLGESCHLAGEN ODER
ORIENTIERUNGSKONTROLLE
FEHLGESCHLAGEN
Staub auf dem Chip
Wiederholen Sie die Hybridisierung des/der PCR-Produkt(e) auf einem anderen
Chip.
Bildung von Luftbläschen
während des Überführens des
Hybridisierungsgemisches auf
den Chip
Wiederholen Sie die Hybridisierung des/der PCR-Produkt(e) auf einem anderen
Chip. Gehen Sie beim Pipettieren vorsichtig vor, damit keine Luftbläschen
®
entstehen.
PapilloCheck
4 °C
HYBRIDISIERUNGSKONTROLLE
FEHLGESCHLAGEN
Gebrauchsanweisung
Falsche Temperierung der
Waschlösung II
Der zweite Waschschritt muss bei 50 °C durchgeführt werden. Vergewissern
Sie sich, dass die Waschlösung II 50 °C warm ist.
Falsche Temperierung des
Wasserbads
Der zweite Waschschritt muss bei 50 °C durchgeführt werden. Überprüfen Sie
die Temperatur des Wasserbads. Vergewissern Sie sich, dass das Wasserbad
auf eine Temperatur von 50 °C eingestellt ist. Überprüfen Sie notfalls die
Temperatur mit einem Thermometer.
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, Ansetzen
16, 18, 31,
40, 42,
45, 51, 52, 53,noch
56,einmal
58, 59,
70, 73,
82
Falsches
des33, 35, 39,Setzen
Sie43,
das44/55,
Hybridisierungsgemisch
mit66,
den 68,
korrekten
Volumina
Hybridisierungsgemisches
an
und
hybridisieren
Sie
die
PCR-Produkte
auf
einem
anderen
Chip.
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Deutschland
Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
32
PROBLEM und Ursache
Anmerkungen und Vorschläge
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
PCR-KONTROLLE FEHLGESCHLAGEN
Keine Zugabe von HotStarTaq®
DNA-Polymerase zum
MasterMix
Wiederholen Sie die PapilloCheck®-Analyse ab dem Schritt der Vorbereitung
der PCR-Reaktion.
HPV DNA-Chip
Zugabe defekter HotStarTaq®
DNA-Polymerase zum
MasterMix
Wiederholen Sie die PapilloCheck®-Analyse ab dem Schritt der Vorbereitung
der PCR-Reaktion.
Zugabe unverdünnter Uracil-NGlycosylase zum MasterMix
Wiederholen Sie die PapilloCheck®-Analyse ab dem Schritt der Vorbereitung
der PCR-Reaktion.
Unzureichendes Mischen des
Reaktionsgemisches
Wiederholen Sie die PapilloCheck®-Analyse ab dem Schritt der Vorbereitung
der PCR-Reaktion. Achten Sie darauf, das Reaktionsgemisch gründlich zu
mischen.
Vorhandensein von PCRInhibitoren in der Probe
Wiederholen Sie die DNA-Extraktion und die PapilloCheck®-Analyse.
Durchführung der
Hybridisierung ohne Zugabe
von PCR-Produkt
Wiederholen Sie die Hybridisierung.
Unzureichendes Mischen des
Hybridisierungsgemisches
Wiederholen Sie die Hybridisierung.
Probleme mit dem
Thermocycler
Überprüfen Sie die Funktion und die korrekte Programmierung des
Thermocyclers (PCR-Schritte, Geschwindigkeit der Temperaturerhöhung,
Volumen).
Achtung: Verwenden Sie entweder das GeneAmp® PCR-System 9700
(Applied Biosystems) als Thermocycler oder den Veriti™ 96-WellThermocycler (Applied Biosystems) in Kombination mit PapilloCheck®.
PapilloCheck®
PROBENKONTROLLE
FEHLGESCHLAGEN
Gebrauchsanweisung
Keine Zugabe von Proben-DNA
zu der PCR-Reaktion
Wiederholen Sie die PapilloCheck®-Analyse ab dem Schritt der Vorbereitung
der PCR-Reaktion.
DNA-Aufreinigung
fehlgeschlagen
Wiederholen Sie die DNA-Extraktion.
Nicht genügend Probenmaterial
vorhanden
Die Probenentnahme ist fehlgeschlagen. Die Probe ist äußerst transparent.
Konzentrieren Sie die Probe entsprechend der Beschreibung in Kapitel
9.1 und wiederholen Sie die DNA-Extraktion oder wiederholen Sie die
Probenentnahme.
PCR- UND/ODER
Dieses Ergebnis wird als gültig eingestuft, wenn die CheckReportTM Software
Diagnostisches
Kit
für diemindestens
Genotypbestimmung
von humanen Papillomaviren vom Typ
PROBENKONTROLLE
IST
NICHT
einen HPV-Typ in der Probe mit einem Signal über einem
6,
11,
16,
18,
31,
33,
35,
39,
40,
42,
43,
44/55,
45,
51,
52,
56, 58,
59, 66,
68, 70, 73, 82
FEHLGESCHLAGEN, ES WIRD
definierten Schwellenwert erfasst.
Die53,
Probenund/oder
PCR-Kontrolle
ABERinEIN
SNR-WERT
VON
0
kann in diesem Fall aufgrund einer Kompetition während der PCR ein nur
Zervikalproben
ANGEZEIGT
schwaches oder gar kein Fluoreszenzsignal liefern.
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
10. TECHNISCHER SUPPORT
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
Im Kundendienst von Greiner Bio-One stehen Ihnen erfahrene Wissenschaftler mit umfassendem
theoretischem und praktischem Fachwissen auf dem Gebiet der Molekularbiologie und der oCheck®
Produkte zur Verfügung. Wenn Sie Fragen zu oder Probleme mit oCheck® Produkten haben, wenden
Greiner
Bio-One
GmbHVertriebshändler vor Ort.
Sie sich bitte an Ihren
Greiner
Bio-One
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Deutschland
Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
33
11. LEISTUNGSMERKMALE VON PAPILLOCHECK®
11.1
Analytische Leistungsbewertung von PapilloCheck®
11.1.1 Analytische Sensitivität
HPV DNA-Chip
Die Nachweisgrenze wurde mithilfe von Referenzplasmiden, welche die von PapilloCheck®
verwendetet E1-Zielregion enthielten, für jeden nachweisbaren HPV-Typ ermittelt. Die
Nachweisgrenzen sind in Tabelle 5 aufgeführt.
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
Tabelle 5: Nachweisgrenzen der nachweisbaren HPV-Typen
HPV-Genotyp
Kopien/
Reaktion
pg/ml**
HPV 6
30*
0,052
HPV 11
150*
0,26
HPV 16
50*
0,086
HPV 18
300*
0,516
HPV 31
300*
0,522
HPV 33
300*
0,519
HPV 35
750*
1,29
HPV 39
30*
0,052
HPV 40
30*
0,052
HPV 42
30*
0,052
HPV 43
100*
0,175
HPV 44
30*
0,052
PapilloCheck®
Gebrauchsanweisung
HPV 45
50*
0,087
HPV 51
30*
0,051
HPV 52
100*
0,174
HPV 53
30*
0,052
HPV 56
30*
0,052
HPV 58
150*
0,255
HPV 59
50*
0,087
Diagnostisches Kit
für die Genotypbestimmung
von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11,
33, 35, 39, 40, 42,
43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
HPV
66 16, 18, 31, 100*
0,171
in Zervikalproben
HPV 68
30*
0,052
HPV 70
30*
0,052
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
200*
0,338
durch geschultes Laborpersonal
HPV 73
HPV 82
30*
0,052
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
* Jede Konzentration eines HPV-Referenzplasmids wurde in 2 unabhängigen Verdünnungsreihen angesetzt und in 3
Replikaten gemessen (d. h. insgesamt 6 Replikate pro Konzentration). Darüber hinaus enthielt jeder Test 10 ng
menschliche DNA. Im Falle einer Variation der validierten Daten wurden die Konzentrationen des betreffenden Plasmids
erhöht oder verringert und erneut getestet (6 Replikate aus 2 unabhängigen Verdünnungsreihen). Die Nachweisgrenze
Greiner Bio-One
GmbH
war die niedrigste Konzentration,
bei der
alle 6 Replikate positiv waren.
Maybachstr.
2 • 72636
Frickenhausen • Deutschland
** Direkt analysiert, ohne
Berücksichtigung
der DNA-Aufreinigung.
Die Mengenangabe bezieht sich auf die in dem Plasmid
Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
vorhandene HPV-DNA.
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
34
11.1.2 Analytische Spezifität – HPV-Typen
Die Referenzplasmide für die aufgeführten HPV-Typen wurden mit 2,12 x 106 Kopien/PCR-Reaktion
getestet.
HPV 6b, HPV 11, HPV 13, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 33, HPV 34, HPV 35,
P V 54,
DNA
- C h 55,
ip
HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HHPV
HPV
HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 71, HPV 73,
HPV 74, HPV 81, HPV 82, HPV 84, HPV 85, HPV 91.
Es wurden folgende Kreuzhybridisierungen festgestellt:
HPV 55 liefert ein Signal mit der HPV 44-Sonde. Die CheckReportTM Software zeigt deshalb ein
HPV 44/HPV 55-Kombinationsergebnis an.
HPV 13 kann mit der HPV 11-Sonde kreuzreagieren, liefert aber kein falschpositives Signal, da
HPV 13 in zervikalen Proben nicht vorkommt.
11.1.3 Analytische Spezifität – Nicht-HPV-Organismen
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
Es wurden folgende Nicht-HPV-Organismen mit PapilloCheck® getestet (5-10 ng genomische DNA).
Es wurden keine positiven Signale erhalten.
Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffii, Actinobacillus actinomycetemcomitans
Serovar c, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces viscosus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis,
Bifidobacterium breve, Campylobacter concisus, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Candida albicans,
Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter
freundii, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter koseri, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Eikenella
corrodens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterococcus durans, Enterococcus
faecali, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium nodatum , Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis,
Hafnia alvei, Kingella denitrificans, Klebsiella®
oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus,
Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners, Lactobacillus rhamnosus,Lactobacillus vaginalis, Mogibacterium timidum,
Morganella morganii, Mycoplama hominis, Mycoplasma buccale, Mycoplasma faucium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma
genitalium, Mycoplasma orale, Mycoplasma pirum, Mycoplasma salivrium, Mycoplosma pneumoniae, Neisseria elongata,
Neisseria gonorrhoeae, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus micros,
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Proteus hauseri, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris,
Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida,
Serratia marcescens, Staphylococcus aureus ssp. aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus,
Staphylococcus saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus agalactiae, Streptococcus constellatus,
Streptococcus criceti, Streptococcus cristatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis,
Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Tannerella forsythensis (vormals:
Bacteroides forsythus), Treponema denticola, Ureaplasma uralyticum, Veillonella parvula.
PapilloCheck
Gebrauchsanweisung
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
35
11.2
Wiederholpräzision
Zur Überprüfung der Wiederholpräzision des Tests wurden fünf Proben, die jeweils drei verschiedene
HPV-Referenz-Templates sowie DNA aus dem menschlichen Genom enthielten, mit PapilloCheck®
analysiert. Die Kopienzahl der verschiedenen, in den Proben vorhandenen HPV-Zielregionen sowie
die Menge der menschlichen DNA im Hintergrund wurden variiert (siehe Tabelle 6). Jede Probe
HPV DNA-Chip
wurden an drei
wurde in fünf unabhängigen Replikaten mit PapilloCheck® analysiert. Die Replikate
Tagen jeweils vom selben Laboranten getestet.
8 °C
Made in Austria
IVD
Tabelle 6: Zusammensetzung der Proben zur Überprüfung der Wiederholpräzision
Proben-ID
HPV-Typ
Menge an DNATemplate
Probe 1
HPV 16
HPV 18
HPV 31
menschliche genomische DNA
180 Kopien
1.500 Kopien
1.400 Kopien
1 ng
3
10
30
Probe 2
HPV 16
HPV 18
HPV 31
menschliche genomische DNA
180 Kopien
1.500 Kopien
1.400 Kopien
5 ng
3
10
30
Probe 3
HPV 16
HPV 18
HPV 45
menschliche genomische DNA
1.800 Kopien
450 Kopien
300 Kopien
5 ng
30
3
10
Probe 4
HPV 16
HPV ®
18
HPV 45
menschliche genomische DNA
10.000 Kopien
5.000 Kopien
20.000 Kopien
2,5 ng
-
PapilloCheck
Gebrauchsanweisung
4 °C
Probe 5
HPV 18
HPV 31
HPV 45
menschliche genomische DNA
4.500 Kopien
500 Kopien
90 Kopien
2,5 ng
x-Faches der Nachweisgrenze
30
10
3
In allen fünf Proben und bei jeder Analysewiederholung wurden die drei richtigen HPV-Typen
erkannt, und die Analyse war für den nicht enthaltenen Typ negativ. Demnach waren 75 von 75
Einzeltestergebnissen
5 Replikate x 4 verschiedene
HPV-Templates)
korrekt.vom Typ
Diagnostisches (5
KitProben
für diexGenotypbestimmung
von humanen
Papillomaviren
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
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durch geschultes Laborpersonal
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
36
11.3
Vergleichspräzision
Die Vergleichspräzision des PapilloCheck® Testkits wurde mithilfe von 22 klinischen Proben (siehe
Tabelle 7) ermittelt, die HPV in Konzentrationen an der Nachweisgrenze enthielten. Die Bestimmung
wurde mit derselben Methode, mit identischem Probenmaterial von unterschiedlichen Personen
und in unterschiedlichen Laboren mit unterschiedlichem Equipment durchgeführt. Die Ergebnisse
HPV DNA-Chip
wurden als konkordant für positive Proben klassifiziert, wenn bei Einzel- oder Zweifachinfektionen
identische HPV-Typen erkannt wurden oder wenn bei Mehrfachinfektionen mit drei oder vier Typen
zwei bzw. drei identische HPV-Typen erkannt wurden.
4 °C
8 °C
Made in Austria
IVD
Tabelle 7: Ergebnisse der Überprüfung der Vergleichspräzision
Proben-Nr.
Ergebnis Labor 1
Ergebnis Labor 2
Konkordanz
1
HPV 33
HPV 33
+
2
HPV 35
HPV 35
+
3
negativ
negativ
+
4
HPV 45
HPV 45
+
5
HPV 51, HPV 52
HPV 51, HPV 52
+
6
HPV 51, HPV 56
HPV 51, HPV 56
+
7
HPV 16, HPV 39, HPV 68
HPV 16, HPV 39, HPV 68, HPV 82
+
8
HPV 39, HPV 68
HPV 39, HPV 68
+
9
HPV 16
HPV 16
+
PapilloCheck
10
negativ
negativ
+
11
HPV 56, HPV 44/55
HPV 56, HPV 44/55
+
12
negativ
negativ
+
13
HPV 11, HPV 18, HPV 56
HPV 11, HPV 18, HPV 56
+
14
HPV 51, HPV 44/55
HPV 51, HPV 44/55
+
15
HPV 53, HPV 58, HPV 43
HPV 53, HPV 58, HPV 68, HPV 43
+
16
negativ
negativ
+
17
HPV 16
HPV 16
+
18
HPV 16
HPV 16
+
®
Gebrauchsanweisung
Diagnostisches
Kit für die
von humanen
Papillomaviren vom
Typ
19
HPVGenotypbestimmung
45
HPV 45
+
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
HPV 16
HPV 16
+
in20
Zervikalproben
DANGER
21 465 060
REF
HPV 53, HPV 58
HPV 53, HPV 58
+
22 zur Verwendung fürHPV31
HPV 31
+
Nur
die In-Vitro-Diagnostik
Revision: BQ-013-08
durch geschultes Laborpersonal
Mai 2015
Es wurden mit allen klinischen Proben konkordante Ergebnisse erhalten. Die in Labor 2 erfassten
Signale zusätzlicher Typen in den mehrfach infizierten Proben 7 (HPV 82) und 15 (HPV 68) lagen nur
knapp über dem definierten Schwellenwert, und diskordante Ergebnisse wurden als unproblematisch
klassifiziert.
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
37
11.4
Robustheit
Zur Untersuchung der Robustheit des PapilloCheck® Testsystems wurden Variationen der folgenden
Parameter geprüft:
• Hybridisierungstemperatur
HPV DNA-Chip
• Hybridisierungsdauer
• Waschtemperatur
• Waschdauer
Alle Tests wurden in 3 Replikaten mit hohen Template-Konzentrationen (1 ng HPV-Referenzplasmid
oder ca. 200 x 106 Kopien je Probe) durchgeführt. Die untersuchten Wertebereiche der Parameter, in
denen ein robuster Nachweis von HPV mit PapilloCheck® möglich ist, sind in Tabelle 8 aufgeführt.
Tabelle 8:Robustheit von PapilloCheck®
Parameter
Bereich
Hybridisierungstemperatur
20-25 °C
Hybridisierungsdauer
8 °C
Made in Austria
IVD
Waschtemperatur
13-17 Minuten
48-52 °C
1. Waschschritt
10-15 Sekunden
PapilloCheck®
2. Waschschritt
60-75 Sekunden
Waschdauer
Gebrauchsanweisung
4 °C
3. Waschschritt
10-15 Sekunden
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
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PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
38
11.5
Klinische Leistungsbewertung von PapilloCheck®
Zur klinischen Leistungsbewertung des PapilloCheck® Tests mittels der Bestimmung der klinischen
Sensitivität und Spezifität wurde eine Vergleichsstudie mit PapilloCheck® und dem GP5+/6+-PCR EIATest durchgeführt.7 In dieser Studie wurden Proben von 1.437 repräsentativen Frauen mit normaler
Zytologie (Kontrollgruppe) im Alter über 40 Jahren (Durchschnittsalter 49 Jahre; Altersbereich 40
PV DNA-Chip
bis 60 Jahre) und von 192 repräsentativen Frauen (Durchschnittsalter 34 Jahre;HAltersbereich
30
bis 60 Jahre) mit histologisch bestätigten CIN3+-Läsionen (Fallgruppe) analysiert. Alle in dieser
Studie verwendeten Proben stammten ursprünglich von Frauen in der Interventionsgruppe der
populationsbasierten, randomisierten, kontrollierten Implementierungsstudie POBASCAM und
wurden zu Beginn der Studie entnommen (baseline round).8
Nach Beschränkung der PapilloCheck® Analyse auf die 14 hrHPV-Typen, die mit dem GP5+/6+PCR-EIA erfasst werden, zeigte PapilloCheck® eine klinische Sensitivität für ≥ CIN3 von 95,8 %
(184/192; 95 % KI 92,8-98,8) und eine klinische Spezifität für ≥ CIN2 von 96,7 % (95 % KI 95,7-97,7).
Für den GP5+6+-PCR-EIA lagen die Werte vergleichsweise bei 96,4 % (185/192; 95 % KI: 93,998,9) bzw. 97,7 % (95 % KI: 96,9-98,5) (siehe Tabelle 9 und 10).
Tabelle 9: Vergleich der nach Kontrollen und Fällen stratifizierten Ergebnisse des PapilloCheck® (14 hr HPV-Typen)
und des GP5+/6+ PCR-EIA.
PapilloCheck®
(14 hr HPV-Typen)
Made in Austria
IVD
Kontrollen
Fälle
Gesamt
-
+
-
+
Gesamt
1.386 (96,5 %)
18 (1,3 %)
1.404 (97,7 %)
4 (0,3 %)
29 (2,0 %)
36 (2,3 %)
1.390 (96,7 %)
47 (3,3 %)
1,437
-
4 (2,1 %)
3 (1,6 %)
7 (3,6 %)
4 (2,1 %)
181 (94,3 %)
185 (96,4 %)
8 (4,2 %)
184 (95,8 %)
192
PapilloCheck
®+
Gesamt
8 °C
4 °C
GP5+/6+-PCR/EIA
Gebrauchsanweisung
Tabelle 10: Klinische Sensitivität und Spezifität des PapilloCheck® und des GP5+/6+-PCR-EIA (Ergebnisse für
mindestens einen der 14 hr HPV-Typen HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 oder 68).
14 hrHPV
PapilloCheck®
GP5+/6+
Klinische Sensitivität
für ≥ CIN3
95,8 %
96,4 %
Klinische Spezifität
für ≥ CIN2
96,7 %
97,7 %
Diagnostisches Kit für die Genotypbestimmung von humanen Papillomaviren vom Typ
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
in Zervikalproben
DANGER
REF 465 060
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
7
8
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
Comparison of the clinical performance of PapilloCheck® human papillomavirus detection with that of the GP5+/6+PCR-enzyme immunoassay in population-based cervical screening. Hesselink AT, Heideman DA, Berkhof J, Topal F, Pol
RP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol. 2010 Mar;48(3):797-801. Epub 2009 Dec 30.
Bulkmans, N. W., L. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, A. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R.
Greiner Bio-One GmbH
H. Verheijen, K. Groningen, M. E. Boon, H. J. Keuning, M. van Ballegooijen, A. J. van den Brule, and C. J. Meijer. 2004.
Maybachstr. 2randomized
• 72636 Frickenhausen
Deutschland
POBASCAM, a population-based
controlled trial• for
implementation of high-risk HPV testing in cervical
Telefon: and
+49baseline
(0) 7022
948-0
• Fax women.
+49 (0)Int.
7022
948-514
screening: design, methods
data
of 44,102
J. Cancer
110:94–101.
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
39
Zur Untersuchung der Prävalenz der vom PapilloCheck® erfassten HPV-Typen wurden
zervikale Abstriche von 881 Frauen gescreent.9 Alle zervikalen Proben wurden in STMTM
Probenentnahmemedium (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgenommen. Am häufigsten war HPV 16
mit einer Nachweisrate von 19,4 %, gefolgt von HPV 31, HPV 39, HPV 51 und HPV 52. In Tabelle
11 sind die Prävalenzen für alle nachweisbaren Typen aufgeführt.
HPV DNA-Chip
Made in Austria
IVD
Tabelle 11: Prävalenz der mit PapilloCheck® nachweisbaren HPV-Typen
HPV-Genotyp
Prävalenz mit dem
PapilloCheck®
HPV 16
19,40 %
HPV 31
14,40 %
HPV 39
9,30 %
HPV 51
9,10 %
HPV 52
7,50 %
HPV 56
7,40 %
HPV 58
6,10 %
HPV 53
6,10 %
HPV 42
5,80 %
HPV 66
5,90 %
HPV 68
5,60 %
HPV 45
4,50 %
8 °C
PapilloCheck®
HPV 33
4,40 %
HPV 18
4,00 %
HPV 70
4,10 %
HPV 44/55
3,10 %
HPV 59
2,50 %
HPV 82
1,90 %
HPV 35
1,60 %
HPV 73
1,50 %
HPV 43
0,80 %
4 °C
Gebrauchsanweisung
Diagnostisches
Kit für die Genotypbestimmung
von humanen Papillomaviren vom Typ
HPV 6
0,60 %
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82
HPV 11
0,60 %
in Zervikalproben
DANGER
40060
REFHPV
465
0,40 %
Nur zur Verwendung für die In-Vitro-Diagnostik
durch geschultes Laborpersonal
9
Revision: BQ-013-08
Mai 2015
Greiner Bio-One GmbH
Evaluation of the performance of the novel PapilloCheck® HPV genotyping test by comparison with two other genotyping
Maybachstr.
2 •B,72636
Frickenhausen
• Deutschland
systems and the HC2
test. Schopp
Holz B,
Zago M, Stubenrauch
F, Petry KU, Kjaer SK, Iftner T. J Med Virol. 2010
Apr;82(4):605-15. Telefon: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514
[email protected] • www.gbo.com/bioscience
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
40
PCR
12. PAPILLOCHECK® KURZPROTOKOLL
12.1 Raum 2: PCR - Ansatz des Reaktionsgemisches
Raum 2
K
U
R
Z
P
R
O
T
O
K
O
L
L
¯¯ Uracil-N-Glycosylase 1:200 in PCR-Wasser verdünnen
¯¯ UNG-Verdünnung sorgfältig mischen
¯¯ Das Reaktionsgemisch für die erforderliche Anzahl an PCR-Reaktionen
ansetzen
1
13
26
39
52
Reaktion
Reaktionen
Reaktionen
Reaktionen
Reaktionen
(1 Chip)
(2 Chips)
(3 Chips)
(4 Chips)
PapilloCheck®
PCR MasterMix
19,8 µl
257,4 µl
514,8 µl
772,2 µl
1029,6 µl
HotStarTaq®
Polymerase
(5 U/µl)
0,2 µl
2,6 µl
5,2 µl
7,8 µl
10,4 µl
Uracil-NGlycosylase
(1:200 verdünnt,
0,005 U/µl)
1 µl
13µl
26 µl
39 µl
52 µl
Gesamtvolumen
vor Zugabe von
Proben-DNA
21 µl
273 µl
546 µl
819 µl
1092 µl
¯¯ Das Reaktionsgemisch sorgfältig mischen
¯¯ Das Reaktionsgemisch aliquotieren: Für jede PCR-Reaktion 21 µl des
Reaktionsgemisches in ein 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäß eines PCR-Streifens
geben
41
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
12.2 Raum 2: PCR - Zugabe von DNA-Template/
PCR-Reaktion
PCR
Raum 2
K
U
R
Z
P
R
O
T
O
K
O
L
L
¯¯ In jede PCR-Reaktion 5 µl DNA-Template zugeben
¯¯ Gründlich mischen
¯¯ Die PCR-Reaktion mit dem vorbereiteten Thermocycler-Programm starten
Zeit
Temp. °C
Anzahl der Zyklen
20 min
37 °C
1
15 min
95 °C
1
30 s
25 s
45 s
95 °C
55 °C
72 °C
40
30 s
45 s
95 °C
72 °C
15
Halten (Hold)
10 °C
42
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
Hybrid. & Waschen
12.3 Raum 3: Hybridisierung - Vorbereitung/
Hybridisierungsreaktion
!
Raum 3
Beginnen Sie mit den Vorbereitungen spätestens 30 Minuten vor Beginn
der Hybridisierung.
¯¯ Etwaige Niederschläge in Hybridisierungs- und Waschpuffern auflösen und gut
K
U
R
Z
P
R
O
T
O
K
O
L
L
mischen
¯¯ Genügend Waschlösung für die Anzahl der zu analysierenden PapilloCheck®
Chips ansetzen.
Anzahl an PapilloCheck® Chips
Komponenten
1
2
3
4
Destilliertes oder
entionisiertes Wasser
140 ml
280 ml
420 ml
560 ml
PapilloCheck® Puffer A Konz.
14 ml
28 ml
42 ml
56 ml
PapilloCheck® Puffer B Konz.
1,75 ml
3.5 ml
5.25 ml
7 ml
155,75 ml
311,50 ml
467,25 ml
623 ml
Gesamtvolumen
¯¯ Die Waschlösung in drei oCheck® Waschbehälter aliquotieren
¯¯ Waschlösung II in einem Wasserbad auf 50 °C aufwärmen
¯¯ Die zu analysierende Anzahl an PapilloCheck® Chips bei Raumtemperatur in
der vorbereiteten Hybridisierungskammer inkubieren
¯¯ Die PCR-Produkte mischen und kurz zentrifugieren
¯¯ Hybridisierungspuffer mischen und kurz zentrifugieren
¯¯ 30 µl PapilloCheck® Hybridisierungspuffer mit 5 µl PCR-Produkt mischen
¯¯ Gründlich mischen und kurz zentrifugieren
¯¯ Mit einer Multikanalpipette in jedes Well des PapilloCheck® Chips 25 µl des
Hybridisierungsgemisches überführen
¯¯ Bildung von Luftbläschen vermeiden
¯¯ Den PapilloCheck® Chip exakt 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 °C)
inkubieren
43
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
12.4 Raum 3: Waschen & Trocknen/
Scannen & Auswertung
Hybrid. & Waschen
Raum 3
K
U
R
Z
P
R
O
T
O
K
O
L
L
¯¯ Den magnetischen Objektträgerhalter aus der Hybridisierungskammer heben
¯¯ Den Objektträgerhalter in den oCheck® Waschbehälter mit Waschlösung I
tauchen
¯¯ Den oCheck® Griff anbringen
¯¯ Den/die PapilloCheck® Chip(s) bei Raumtemperatur 10 Sekunden in
Waschlösung I waschen
¯¯ Den/die PapilloCheck® Chip(s) 60 Sekunden in der auf 50 °C vorgewärmten
Waschlösung II waschen
¯¯ Den/die PapilloCheck® Chip(s) bei Raumtemperatur 10 Sekunden in
Waschlösung III waschen
¯¯ Durch Zentrifugieren sämtliche Flüssigkeit von der Oberfläche des
PapilloCheck® Chips entfernen
oder
3 Minuten
1 Minute
500 g
max.
Geschw.
¯¯ Den/die PapilloCheck® Chip(s) mit dem CheckScannerTM scannen
¯¯ Scannen und Auswertung nach Beschreibung im Benutzerhandbuch der
CheckReportTM Software
¯¯ Berichte erstellen
44
PapilloCheck® - Gebrauchsanweisung
Revision: BQ-013-08 / Mai 2015
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