Änderungen in Lebensstil und Nährstoffangebot als treibende Kräfte

Änderungen in Lebensstil und Nährstoffangebot als treibende Kräfte
Änderungen in Lebensstil und Nährstoffangebot
als treibende Kräfte der Genomevolution in
Escherichia coli und Salmonella
Inaugural - Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
vorgelegt von
Thomas Laubach
aus Düsseldorf
Düsseldorf, Juli 2014
aus dem Institut für Informatik
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Referent:
Univ. Prof. Dr. Martin J. Lercher
Korreferent:
Univ. Prof. Dr. William Martin
Tag der mündlichen Prüfung: 11. Dezember 2014
Inhaltsverzeichnis
Publikationen............................................................................................................................ v
1
Zusammenfassung................................................................................................................. 1
2
Abstract................................................................................................................................... 2
3
Einführung.............................................................................................................................. 3
3.1
Escherichia coli und Salmonellen sind nach wie vor eine globale Bedrohung
für den Menschen......................................................................................................... 3
3.2
Die Vererbung bei Prokaryoten geschieht nicht nur vertikal..........................................4
3.3
Zielsetzung................................................................................................................... 5
4
Externe Software und Web-Frontends.................................................................................7
5
Halbautomatische Erkennung von Phylogenien in Rastergrafiken.................................13
5.1 Einleitung.................................................................................................................... 13
5.2 Material und Methoden...............................................................................................14
5.3 Ergebnisse.................................................................................................................. 16
5.3.1
Einfluß verschiedener Faktoren auf den Digitalisierungsvorgang................16
5.3.2
Benchmarks................................................................................................17
5.4 Diskussion.................................................................................................................. 18
6
Ein erweiterter Robinson-Foulds-Abstand für ausschließlich signifikante
Splits.................................................................................................................................... 20
6.1 Einleitung.................................................................................................................... 20
6.2 Material und Methoden...............................................................................................22
6.2.1
Herleitung des erweiterten Distanzmaßes...................................................22
6.2.2
Vergleich zweier E. coli-Phylogenien auf konservierten Genen...................24
6.2.3
Algorithmus zur Berechnung des ssRF-Abstands........................................24
6.3 Ergebnisse.................................................................................................................. 26
6.4 Diskussion.................................................................................................................. 27
7
Automatisierte Ableitung einer Phylogenie aus einem Alignment
konkatenierter Genfamilien von E. coli und Salmonellen................................................30
7.1 Funktionalität des Programms MMN...........................................................................30
7.2 Ablaufsteuerung der Module von MMN.......................................................................35
8
Inferenz robuster Phylogenien für Escherichia coli und Salmonellen mit
verschiedenen Methoden und Vergleich mit Literaturbäumen........................................38
8.1 Einleitung.................................................................................................................... 38
8.2 Material und Methoden...............................................................................................40
8.2.1
Herkunft der verwendeten Genomdaten........................................................40
8.2.2
Escherichia coli- und Salmonellen-Phylogenie auf Grundlage
universeller Genfamilien................................................................................41
8.2.2.1 Inferenz in einem Maximum-Likelihood-Framework..........................41
8.2.2.2 Inferenz in einem Bayesianischen Framework..................................49
8.2.2.3 Phylogenien mit Neighbor-Joining.....................................................58
8.2.2.4 Phylogenien auf Grundlage hochkonservierter Genfamilien..............59
8.2.2.5 Phylogenien nach einer Methode von Sergei Maslov........................62
8.3
8.4
Ergebnisse................................................................................................................... 67
8.3.1
Statistischer Support der Splits von Escherichia coli- und
Salmonellen-Phylogenie................................................................................67
8.3.2
Distanzen zwischen den mit verschiedenen Methoden
berechneten Phylogenien..............................................................................68
8.3.3
Vergleich der ML-Bäume mit Literaturbäumen...............................................70
Diskussion................................................................................................................... 76
9
Identifikation biologisch assoziierter Gen/Nährstoff-Paare in der Evolution
von Escherichia coli und Salmonellen................................................................................82
9.1 Einleitung..................................................................................................................... 82
9.2 Material und Methoden................................................................................................83
9.2.1
Berechnung von Proteinfamilien....................................................................83
9.2.2
Anzestraler Gengehalt...................................................................................83
9.2.3
Anzestrale Umgebungen mit essentiellen Nährstoffen...................................89
9.2.4
Test auf assoziierte Gen/Nährstoff-Paarungen..............................................85
9.3 Ergebnisse................................................................................................................... 89
9.3.1
Salmonellen-Datensatz..................................................................................89
9.3.2
Escherichia coli-Datensatz............................................................................89
9.3.3
Escherichia coli/Salmonellen-Datensatz........................................................91
9.3.4
Was passiert für andere q-Werte?.................................................................95
9.4 Zusammenfassung......................................................................................................98
9.5 Diskussion................................................................................................................... 99
10
Gingen verstärkte Gengewinne oder -verluste mit einer Änderung in der
Lebensweise bei E. coli einher?.......................................................................................101
10.1 Einleitung................................................................................................................... 101
10.1.1 Pathogenität der Stämme von Escherichia coli............................................102
10.1.2 Pathovare von Escherichia coli....................................................................102
10.1.3 Mechanismen der Evolution pathogener Escherichia coli............................104
10.2 Material und Methoden...............................................................................................105
10.2.1 Lebensstil-Merkmale...................................................................................105
10.2.2 Rekonstruktion der anzestralen Lebensstile................................................105
10.2.3 Berechnung von Proteinfamilien..................................................................106
10.2.4 Anzestraler Gengehalt.................................................................................107
10.2.5 Korrelation von Lebensstil-Änderungen und Gen-Änderungen....................107
10.3 Ergebnisse.................................................................................................................. 109
10.3.1 Experiment 1................................................................................................111
10.3.2 Experiment 2................................................................................................111
10.3.3 Experiment 3................................................................................................112
10.3.4 Experiment 4................................................................................................112
10.3.5 Zusammenhang zwischen der Zahl der Gen-Änderungen und
Astlängen.....................................................................................................113
10.3.6 Zahl der Gen-Änderungen auf Ästen mit und ohne LebensstilÄnderungen.................................................................................................113
10.4 Diskussion................................................................................................................... 114
11
Ausblick.............................................................................................................................. 117
Literaturverzeichnis.................................................................................................................... 119
Publikationen
Kohl, J., I. Paulsen, T. Laubach, A. Radke, A. von Haeseler. HvrBase++: a phylogenetic database
for primate species. Nucleic Acids Res. 34 (2006):D700-4.
Laubach, T. und A. von Haeseler. TreeSnatcher: Coding Trees from Images. Bioinformatics 23.24
(2007):3384-385.
Laubach, T., A. von Haeseler und M. J. Lercher. TreeSnatcher Plus: Capturing Phylogenetic
Trees from Images. BMC Bioinformatics 13.1 (2012):110.
1
Zusammenfassung
Die Erhellung der Ursachen der Pathogenität vieler Stämme von Escherichia coli und aller
Salmonellen, die nahe Verwandte von E. coli sind, ist von großer Bedeutung für die medizinische
Forschung. Bakterien evolvieren fortwährend, was die Behandlung der von ihnen hervorgerufenen
Krankheitsbilder erschwert. Sie tauschen Resistenzen gegen Antibiotika über lateralen Gentransfer
(LGT) aus, der in der Bakterienevolution eine große Rolle spielt, die Ableitung von Phylogenien
aber erschwert. Können wir verstehen, was die Evolution von E. coli durch LGT antreibt? Wie wird
LGT von der Lebensumgebung der Bakterien beeinflußt?
Für Anschlußuntersuchungen sind zunächst statistisch robuste Phylogenien notwendig, da auf ihnen
später die anzestralen Verteilungen von Gen-Anwesenheit und -abwesenheit mittels Maximum
Parsimony geschätzt werden. Mittels MMN, einem für diese Arbeit entwickelten Perl-Programm,
wurden zunächst Maximum-Likelihood-Phylogenien auf Grundlage konkatenierter universeller
Genfamilien berechnet. Die E. coli-Phylogenie enthält 61 der 63 vollständig sequenzierten Genome,
die Salmonellen-Phylogenie alle 25 (Stand 9/2013). Sie wurden mit Phylogenien verglichen, die mit
zwei anderen Methoden inferiert worden sind, welche darauf abzielen, den Effekt von LGT auf die
Ableitung der Phylogenie zu vermindern. Eine Methode („iTol“) basiert auf ausgewählten COGs,
die andere („Maslov“) benutzt als Distanzmaß die Zahl rekombinanter Regionen zwischen zwei
Genomen. Beide lieferten – entgegen der Erwartung - statistisch schlecht unterstützte Phylogenien,
die sich deutlich von den ML-Phylogenien unterscheiden.
Zwei Phylogenien, die subjektiv als ähnlich empfunden werden, werden von den populären
Distanzverfahren, insbesondere der Split-Distanz, nicht als ähnlich ausgewiesen. Das Distanzmaß
ssRF wurde konzipiert, das diesen Nachteil beseitigt und nur als signifikant empfundene Splits bei
der Distanzberechnung berücksichtigt. Es wurde für die Phylogenievergleiche in dieser Arbeit
verwendet.
Für eine der untersuchten Phylogenien war keine maschinenlesbare Datenquelle mehr vorhanden.
Für einen solchen Fall wurde vom Verfasser das Java-Programm TreeSnatcher Plus entwickelt.
Damit wurde die Abbildung der Phylogenie digitalisiert und in einen Newick-Ausdruck
umgewandelt.
Um sich den eingangs gestellten Fragen zu nähern, wurde die Verteilung der anzestralen Gengehalte
der Verteilung der rekonstruierten essentiellen Nährstoffe auf den Phylogenien von E. coli und
Salmonellen gegenübergestellt. Die These war, daß LGT auf dem Stammbaum nicht mit
gleichmäßiger Rate geschehen ist, sondern daß die betrachteten Bakterien immer dann die Fähigkeit
erworben (verloren) haben, bestimmte essentielle Nährstoffe aus der Umwelt metabolisch zu
nutzen, wenn sie gleichzeitig Gene hinzugewonnen (abgegeben) haben. Das für diese Untersuchung
konzipierte Verfahren lieferte mathematisch assoziierte Gen/Nährstoff-Paarungen, die auch
biologisch sinnvoll sind. Neben untersuchenswerten Paaren mit hypothetischen Proteinen befanden
sich in der Ergebnisliste insbesondere auch Paare aus Nährstoff und dem Gen für den
entsprechenden Transporter - eine Information, die so nicht explizit in den Eingangsdaten vorhanden gewesen ist. Das Verfahren lieferte also eine Mehrzahl von Ergebnissen, die die o. g. These
unterstützen.
Die Evolution von Bakterien wird möglicherweise auch von Änderungen in ihrem Lebensstil
mitgestaltet. So ist vorstellbar, daß sich apathogene E. coli an einen Lebensstil als Pathogene
anpaßten, indem sie verstärkt Gene aufnahmen oder abgaben. In einer zweiten Analyse wurde diese
Hypothese untersucht. Die Ergebnisse deuten an, daß Lebensstil-Änderungen bei E. coli tatsächlich
von einer erhöhten Rate von Gen-Änderungen begleitet waren.
1
2
Abstract
The elucidation of the causes of the pathogenicity of many strains of Escherichia coli and of all
Salmonella who are close relatives of E. coli, is of great importance for medical research. Bacteria
evolve continually, which complicates the treatment of the diseases caused by them. They exchange
resistances against antibiotics by means of lateral gene transfer (LGT), which plays a major role in
bacterial evolution. However, it makes the derivation of phylogenies difficult. Can we understand
what drives the evolution of E. coli by LGT? How is LGT influenced by the living environment of
the bacteria?
First of all, statistically robust phylogenies are required as on them ancestral gene presence/absence
patterns will be estimated using Maximum Parsimony. By means of MMN, a Perl program
developed for this thesis, Maximum Likelihood phylogenies based on concatenated universal gene
families were inferred. The E. coli phylogeny contains 61 of the 63 fully sequenced genomes, the
Salmonella phylogeny all 25 (as of 9/2013). They were compared with phylogenies that have been
inferred with two other methods, which aim to reduce the effect of LGT on phylogeny inferences.
The first method ("iTol") is based on selected COGs, the other ("Maslov") uses as distance measure
the number of recombinant regions between two genomes. Both delivered - contrary to expectation
- statistically insufficiently supported phylogenies that differ significantly from the phylogenies
obtained with Maximum Likelihood.
Two lineage trees that are subjectively perceived as similar, are not recognized by the popular
distance methods, in particular the split distance, as similar. The distance measure ssRF has been
designed which eliminates this drawback. It only considers as significant perceived splits in its
distance calculation. In this work, it was used for the comparisons of the phylogenies.
For one of the studied phylogenies no machine-readable data source was present. For such a case,
the author had developed the Java program TreeSnatcher Plus. It was used to digitize the phylogeny
that was contained in a picture and to convert it into a Newick expression.
To approach the questions asked at the outset, the distribution of ancestral gene content was
compared to the distribution of the reconstructed essential nutrients on the phylogenies of E. coli
and Salmonella. The hypothesis was that LGT has not occurred on the family tree at an even rate,
but that the bacteria always acquired (lost) the ability to use certain essential nutrients from the
environment metabolically whenever they simultaneously gained (lost) genes. The procedure that
were designed for this study yielded mathematically associated gene/nutrient pairings that are
biologically meaningful. In addition to pairs with hypothetical proteins worth investigating there
were also pairs of nutrient and the gene for the corresponding transporter - information that has not
explicitly been present in the input data. Thus, the method provided a plurality of results that
support the above hypothesis.
The evolution of bacteria might be shaped also by changes in their lifestyle. Thus, it is conceivable
that non-pathogenic E. coli adapted to a lifestyle as pathogens by accepting or donating genes with
an increased rate. In a second analysis of this hypothesis has been investigated. The results indicate
that lifestyle changes in E. coli were indeed accompanied by an increased rate of gene changes.
2
3
Einführung
3.1
Escherichia coli und Salmonellen sind nach wie
vor eine globale Bedrohung für den Menschen
Wie ist das Bakterium Escherichia coli zu dem geworden, was es ist - ein unverzichtbarer
Bestandteil der menschlichen Darmflora, ein wichtiges Objekt der Biotechnologie und ein
Modellorganismus der Mikrobiologie einerseits, und ein gefürchtetes Pathogen von Warmblütern,
verantwortlich für mehr als 160 Millionen Durchfallerkrankungen und einer Million Todesfälle pro
Jahr (Hahn et al., 2008) andererseits?
Mit dieser ambivalenten Fragestellung haben sich schon einige Generationen von Wissenschaftlern
beschäftigt, seit der Kinderarzt Theodor Escherich das „Kolibakterium“ im Jahre 1885 erstmalig
beschrieben hat (Escherich, 1885). Die Ursachen der Pathogenität von Escherichia coli (kurz „E.
coli“) liegen aber nach wie vor im Dunkeln. Die Erhellung der Ursachen besitzt nicht nur eine
abstrakte, lediglich akademische Komponente, sondern ist für die medizinische Forschung von
entscheidendem Interesse. Die Erwartung ist nämlich, daß sich die über E. coli gewonnenen
Erkenntnisse auch auf andere Bakterien übertragen lassen, und daß man später in der Lage sein
wird, durch Bakterien hervorgerufene Epidemien vorherzusagen und zu verhindern. Traditionell
werden die als Shigellen bezeichneten Bakterien als Stämme von E. coli gewertet (Pupo et al.,
2000): sagt man E. coli, meint man in der Regel auch Shigellen. Neuerdings gibt es aber wieder
Kritik an dieser Einordnung (Zuo et al., 2013).
Die mit E. coli nahe verwandten Bakterien der Gattung Salmonella wurden im Jahre 1900 von
Joseph Lignieres nach dem US-amerikanischen Tierarzt Daniel Elmer Salmon benannt. Die
Salmonellen gehören ebenso wie E. coli/Shigellen zu der Familie der Enterobacteriaceae und sind,
ebenso wie viele Stämme von E. coli, Pathogene von Säugetieren. Beide Organismen kommen
weltweit innerhalb und außerhalb von Mensch und Tier vor. Salmonellen lösen beim Menschen die
meldepflichtige Salmonellose aus, die sich durch meist spontan ausheilende Durchfallerkrankungen
äußert. Für sehr junge und alte Menschen sowie immungeschwächte Patienten können
Salmonellosen allerdings sehr gefährlich werden. Im Jahr 2011 trat ein bis dahin unbekannter
enterohämorrhagischer E. coli-Stamm erstmals in Erscheinung, als er vor allem in Norddeutschland
eine Epidemie auslöste, in deren Verlauf 53 Menschen starben. Fast 3000 Personen erkrankten an
Gastroenteritis und 855 am hämolytisch-urämischen Syndrom (HUS). Nachdenklich macht dabei
die Tatsache, daß serologische Untersuchungen den verantwortlichen Stamm zwar als O104:H4
identifizierten, man jedoch nach seiner Sequenzierung zu dem Ergebnis kam, daß er eine
Mischform aus EHEC (enterohämorrhagische E. coli) und EAEC (enteroaggregative E. coli)
darstellt, der bis auf weiteres als HUSEC („HUS-assoziierte E. coli“) bzw. STEC („Shiga-Toxin
produzierende E. coli“) bezeichnet wird.
Wie bereits angedeutet, entwickeln Bakterien sich stetig weiter und erwerben dabei Resistenzen, die
sie mitunter gegen Antibiotika immun machen. Das ist ein ernstes Problem im Zusammenhang mit
der Behandlung bakterieller Infektionen, mit dem die Medizin sich zunehmend konfrontiert sieht.
Schon heute (2014) sterben Menschen an den Folgen eigentlich heilbarer Bakterieninfektionen, weil
sie auf kein Antibiotikum mehr ansprechen.
3
3.2
Die Vererbung bei Prokaryoten geschieht nicht nur
vertikal
Da Bakterien sich durch Teilung vermehren, kann ihre Genealogie prinzipiell als Baum dargestellt
werden. Nach dieser Metapher werden Gene von einem Bakterium entlang der Ahnenreihe an seine
zwei Nachkommen weiter vererbt. Der Weg jedes Gens läßt sich dann leicht verfolgen. Bakterien
tauschen genetisches Material sehr wahrscheinlich aber auch untereinander während ihres Lebens
aus, und das sogar über Artgrenzen hinweg. Man glaubt, daß dieser als „lateraler“ oder
„horizontaler Gentransfer“ („LGT/HGT“) bezeichnete Prozeß für die Vermittlung von
Antibiotikaresistenzen zwischen verschiedenen Bakterien verantwortlich ist und ein nahezu
gewöhnlicher Bestandteil der Prokaryotenevolution ist.
Es gibt diverse Ansätze, den Einfluß von HGT auf Genome zu modellieren und seinen Effekt auf
Stammbaumrekonstruktionen vorherzusagen (Pal et al., 2005; Abby et al., 2011; Schönknecht et al.,
2013). Die molekularen Ursachen sind aber noch nicht vollständig verstanden, einige Überlegungen
dazu werden in Kapitel 9 vorgestellt. Es sind mehrere mutmaßliche Mechanismen bekannt, durch
die genetisches Material zwischen – nicht notwendigerweise nah verwandten - Prokaryoten
ausgetauscht wird. Hauptsächlich sind dies Konjugation (Thomas und Nielsen, 2005; Norman et al.,
2009), Transduktion (Frost et al., 2005) und Transformation. Nicht nur chromosomale Gene sind
von LGT betroffen, auch Gene auf Plasmiden. Plasmide gelten als Träger von AntibiotikaResistenzen und werden vererbt.
Akzeptiert man horizontalen Gentransfer als einen dem vertikalen Gentransfer gleichgestellten
adaptiven Prozeß, läßt sich prokaryotische Evolution nicht mehr als Baum darstellen, eher als Netz
mit unterschiedlich gewichteten Kanten (Kunin et al., 2005; Huson et al., 2006). Autoren
zukünftiger Inferenz-Programme sollten versuchen, den Einfluß lateralen Gentransfers auf Genome
zu modellieren und ihn damit explizit in ihre Modelle zu integrieren. Der Verfasser ist allerdings der
Ansicht, daß die Vererbung bei Prokaryoten maßgeblich von ihren vertikalen und weniger von ihren
horizontalen Anteilen geprägt ist. Es ist unstrittig, daß Prokaryoten ihr genetisches Material
verdoppeln und es weitgehend unverändert an zwei Nachkommen vererben. Dieser „vertikale“
Prozeß läßt sich durch einen bifurzierenden Baum darstellen. Aus den Ergebnissen ihrer Studien
folgern Touchon und Kollegen (Touchon et al., 2009), daß während der Evolution von E. coli
innerhalb ihrer Klade, also in flacher phylogenetischer Tiefe, LGT keine allzu große Rolle gespielt
hat. Ihre Erkenntnisse ermuntern ebenfalls dazu, die Verwandtschaftsverhältnisse zumindest bei E.
coli trotz der Anwesenheit von LGT in deren Stammesgeschichte als Baum darzustellen. Der
Verfasser benutzte für diese Arbeit daher Programme zur Untersuchung der
Verwandtschaftsverhältnisse von E. coli und Salmonellen, die entweder ausschließlich Bäume
erzeugen oder auf solchen operieren.
Diese Ausführungen sollten klar gemacht haben, daß ein Verständnis der evolutionären Dynamik
von E. coli, Salmonellen und anderer Pathogene von entscheidender Wichtigkeit ist, ist man doch
bestrebt, die Ausbreitung der von ihnen hervorgerufenen Krankheitsbilder in Zukunft zu verhindern.
Das allein wird aber nicht genügen. Es muß ebenso Klarheit darüber erlangt werden, welches die
Faktoren sind, die diese Bakterien zu Pathogenen machen und in ferner Vergangenheit gemacht
haben und wie die Pathogenitätsfaktoren an andere Bakterien weitergegeben werden.
Diesbezügliche Forschungsvorhaben für E. coli und Salmonellen sind seit geraumer Zeit in vollem
Gange (Johnson und Russo, 2002; Kaper et al., 2004; Kaur und Jain, 2012). Dieses Wissen muß in
ein mathematisches Gewand gekleidet werden und in Form von Modellen 1 in Computerexperimente
eingehen (McNeil und Aziz, 2009, Yang et al., 2010, Maslov et al., 2010). Der bakterielle
1 Modelle sind für die Wissenschaft äußerst nützlich, obwohl sie generell falsch sind. Die folgende populärwissenschaftliche Darstellung
diskutiert dieses und verwandte Probleme von Modellen: http://www.utexas.edu/courses/bio301d/Topics/False.models/Text.html.
4
Metabolismus muß ebenso verstanden und hinreichend akkurat modelliert werden (Pal et al., 2006;
Vieira et al., 2011; Closkey et al., 2013; Reed und Palsson, 2014), um zu verstehen, wie er durch die
Umwelt beeinflußt wird. In-silico-Analysen sind aber kaum geeignet, derartige Fragen zu
beantworten, wenn sie auf falschen Hypothesen beruhen. Die Verwandtschaftsverhältnisse der
Bakterien sind eine solche Hypothese und müssen daher möglichst umfassend aufgeklärt werden.
3.3
Zielsetzung
Vor diesem Hintergrund war es zunächst Aufgabe dieser Arbeit, statistisch robuste Phylogenien für
alle vollständig sequenzierten Genome von E. coli und Salmonella zu schätzen. Zwar wurden in der
Vergangenheit diverse Phylogenien insbesondere für E. coli publiziert, jedoch umfaßten die Studien
oft nur wenige Stämme (Sims und Kim, 2011; Chaudhuri et al., 2011), oder nicht alle Äste der
Phylogenie waren durchgängig gut statistisch abgesichert (z. B. Reeves et al., 2011). Auch wurden
viele Genome erst in den letzten Jahren vollständig sequenziert.
Das zentrale Anliegen dieser Arbeit war es jedoch, in zwei in-silico-Analysen die anzestralen
Gengehalte, das Angebot essentieller Nährstoffe in der Umwelt (E. coli und Salmonellen) sowie
Änderungen im Lebensstil (E. coli) auf den Phylogenien zu schätzen und zu ergründen, ob
zwischen ihnen mathematische Abhängigkeiten existieren, die man biologisch erklären kann.
Für die Bauminferenz und andere Aufgaben wurden externe Programme und Web-Frontends
benutzt. Sie werden in Kapitel 4 beschrieben.
Um viele immer wiederkehrende handwerkliche Arbeitsschritte bei der Bauminferenz zu
automatisieren, entwickelte der Verfasser das Programm MMN, das in Kapitel 5 vorgestellt wird.
Es schätzt einen ML-Speziesbaum für eine vorher festgelegte Menge von E. coli- und SalmonellenStämmen und ist vielfältig parametrisierbar. MMN arbeitet grundsätzlich nach der
Konkatenationsmethode. Dabei wird ein multiples Sequenzalignment aus Genfamilien
zusammengesetzt. MMN setzt diverse externe Programme ein.
Für den Vergleich phylogenetischer Bäume wurde das Programm computeSSRF realisiert, das ein
neuartiges Distanzmaß für Phylogenien benutzt, welches dem menschlichen Denken eher entspricht
als herkömmliche Distanzmaße. Das Maß, seine Motivation sowie die Realisation des
entsprechenden Programms sind Thema von Kapitel 6.
Darstellungen von Phylogenien, für die keine maschinenlesbare Datenquelle (mehr) vorhanden ist,
müssen manuell in das Newick-Format konvertiert werden, hat man den Wunsch, sie in einem
Forschungsvorhaben weiter zu verwerten. Der Verfasser hat im Rahmen seiner Masterarbeit das
Programm TreeSnatcher Plus verfaßt, das erstmals eine halbautomatische Erkennung beliebiger
phylogenetischer Bäume in Pixelbildern und deren Umwandlung in das gängige Newick-Format
ermöglichte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Fehler bereinigt, neue Funktionen hinzugefügt und
eine Anleitung verfaßt, um das Programm online anzubieten. Für einen Beitrag in einer
Fachzeitschrift (Laubach et al., 2012) wurde die Leistung des Programms auf einem BenchmarkDatensatz des Programms TreeRipper (Hughes, 2011) gemessen. Ferner hat der Verfasser das
Programm um eine Texterkennung (OCR) erweitert. Die Benchmarks und Verbesserungsmöglichkeiten für TreeSnatcher Plus werden in Kapitel 7 thematisiert.
Die verschiedenen Verfahren, mit denen für diese Arbeit Phylogenien unterschiedlicher
Zusammensetzung für 61 Escherichia coli und 25 Salmonellen-Stämme (siehe Tab. 8.1) geschätzt
wurden, sind Gegenstand von Kapitel 8. Drei der fünf verwendeten Techniken (Maximum
Likelihood-Paradigma/universelle Genfamilien, Bayesianisches Paradigma/universelle Genfami5
lien, Maximum-Likelihood-Paradigma/COGs) schätzen einen Baum auf einem multiplen
Sequenzalignment aus konkatenierten Genfamilien, das mit MMN hergestellt worden ist. Die vierte
Technik (Neighbor-Joining, Distanzmatrix) gilt als weniger leistungsfähig als diese und wurde zu
Vergleichszwecken mit der fünften Methode in die Arbeit aufgenommen. Letztere verwendet
ebenfalls Neighbor-Joining, benutzt aber ein neuartiges Distanzmaß, das bisher noch nicht
Gegenstand einer Veröffentlichung gewesen ist. Nach erfolgter Beschreibung der Techniken zur
Bauminferenz werden die Bäume untereinander und mit von anderen Arbeitsgruppen
veröffentlichten Bäumen verglichen. Grundlage dafür sind die Distanzen, die vorher mit
computeSSRF errechnet worden sind. Der Versuch einer qualitativen Bewertung der Unterschiede
wird unternommen. Abschließend erfolgt eine Diskussion der verwendeten Methoden und der
Ergebnisse.
Geschieht lateraler Gentransfer auf dem Stammbaum mit gleichmäßiger Rate, oder haben die
Vorfahren von E. coli und Salmonellen während der Evolution immer dann die Fähigkeit erworben
oder verloren, bestimmte essentielle Nährstoffe aus der Umwelt metabolisch zu nutzen, wenn sie
gleichzeitig Gene hinzugewonnen oder abgegeben haben? Um diese Frage geht es in Kapitel 9. Die
Verteilungen anzestraler Gengehalte auf den E. coli- und Salmonellen-Phylogenien werden mit
einem Maximum-Parsimony-Ansatz geschätzt. Die Rekonstruktion der Verteilung der essentiellen
Nährstoffe auf der Phylogenie, die E. coli metabolisieren muß, um zu überleben, wird mit einem
Verfahren von Elhanan Borenstein und Kollegen (Borenstein et al., 2008) bewerkstelligt.
Abschließend wird betrachtet, inwieweit die mathematisch gewonnenen signifikanten
Gen/Nährstoff-Paare auch biologisch sinnvoll sind. Eine Beurteilung der Methodik schließt das
Kapitel ab.
In Kapitel 10 wird die These aufgestellt, daß Änderungen im Lebensstil bei E. coli mit verstärktem
lateralen Gentransfer einhergingen. Dazu werden zwölf Lebensstil-Merkmale untersucht, die über
die von E. coli bekannten Pathotypen definiert worden sind. Die Verteilung der anzestralen
Gengehalte auf der E. coli-Phylogenie wird aus Kapitel 9 übernommen und mit den anzestralen
Verteilungen der individuellen und der kumulierten Lebensstil-Änderungen verglichen. Letztere
Verteilungen wurden ebenfalls mit einem Parsimonie-Ansatz geschätzt. Es erfolgt eine
Schlußbetrachtung, in der die eingesetzte Strategie mit Blick auf die Ergebnisse hinterfragt wird.
Kapitel 11 beschließt die Arbeit mit einem Ausblick. Es wird darum gehen, ob die für diese Arbeit
gesteckten Ziele erreicht worden sind und inwieweit die hier charakterisierten Methoden und
Ergebnisse für künftige Studien nützlich sein können.
6
4
Externe Software und Web-Frontends
Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Projekte wurde neben den Programmen des
Verfassers eine Vielzahl fremder Programme und Web-Frontends verwendet, die in diesem Kapitel
beschrieben werden. Für nahezu alle Programme und Frontends wurden Aufsätze in
wissenschaftlichen Fachzeitschriften veröffentlicht. Die vom Verfasser selbst erstellten Programme
werden jeweils in den betreffenden Kapiteln dargestellt.
BEAST und Tracer
Mit BEAST haben Alexei Drummond und Andrew Rambaut (Drummond und Rambaut, 2007) eine
Applikation für die MCMC-basierte Analyse („Markov-Chain-Monte-Carlo“) molekularer
Sequenzen vorgelegt. Nach Aussage der Autoren eignet sich BEAST besonders zur Analyse von
Datensätzen, die die Anwesenheit einer molekularen Uhr fordern. Tracer von Andrew Rambaut,
Marc Suchard und Alexei Drummond dient der Analyse der Ausgabedateien von MCMCProgrammen wie BEAST, MrBayes und LAMARC (Kuhner, 2009). In dieser Arbeit wurde die bis
September 2013 entwickelte Version von Tracer genutzt. Mittlerweile existiert die Software
BEAST2 (Drummond et al. 2014). Für weitere Informationen zu Tracer siehe auch Abschnitt
8.2.2.2.
Bioperl
Bioperl von Stajich und Kollegen (Stajich et al., 2002) ist ein Gemeinschaftsprojekt, das sich zum
Ziel gesetzt hat, Perl-Programme zu schreiben, die für biologische Fragestellungen nützlich sind.
Bioperl bietet objektorientierte Methoden für eine Vielzahl von biologischen Problemen. Der
Verfasser dieser Arbeit hat die Funktionalität von Bioperl zum Lesen und Schreiben verschiedener
Sequenzformate während der Entwicklung des MMN-Programms (siehe Kapitel 4) eingesetzt.
BLAST
Das „Basic Local Alignment And Search Tool“, BLAST (Altschul, 1997), oft der Einfachheit halber
„Blast“ geschrieben, implementiert eine schnelle heuristische Suche ähnlicher Nukleotid- oder
Proteinsequenzen in Datenbanken. Die Version blastp für Proteinsequenzen ist in dem vom NCBI
angebotenen Paket Legacy BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), enthalten und stellt eines der
Grundmodule des Perl-Programms MMN des Verfassers dar (vgl. Kapitel 4). Mittlerweile rät das
NCBI dazu, anstelle von Legacy BLAST ihr moderneres Paket BLAST+ zu benutzen.
DendroPy/SumTree
SumTrees (Sukumaran und Holder, 2010) gehört zur DendroPy-Programmsammlung und ist ein
Programm von Jeet Sukumaran und Mark T. Holder, mit dem man Support-Zahlen aus einem
nichtparametrischen Bootstrap oder Bayesian Posterior Probabilities für Splits oder Claden eines
phylogenetischen Baumes zusammenfassen kann.
In dieser Arbeit wurde SumTree dazu benutzt, die Split-Supports der Genbäume den Splits eines
Speziesbaumes aufzuprägen.
Figtree
Die in Java geschriebene Software FigTree von Andrew Rambaut (Rambaut, 2012) dient der
grafischen Darstellung phylogenetischer Bäume und der Produktion entsprechender
7
publikationsreifer Abbildungen. Der Verfasser hat die meisten der in dieser Arbeit dargestellten
Phylogenien mit FigTree produziert.
Gblocks
Das Programm Gblocks (Castresana, 2000) löscht schlecht alignierte Positionen und divergente
Regionen in einem Alignment aus Nukleotid- oder Proteinsequenzen. Solche Positionen sind
entweder nicht homolog oder mit mehreren Substitutionen angereichert. Laut Castresana wählt
Gblocks die Blöcke auf eine ähnliche Weise aus wie der Mensch. Jeder Block muß bestimmten
Kriterien genügen: er enthält keine langen Segmente zusammenhängender, nichtkonservierter
Positionen, er hat keine Gaps, und die flankierenden Positionen sind hochkonserviert. Gblocks ist
sehr schnell und ermöglicht die Automatisierung einer phylogenetischen Analyse großer
Datenmengen, da es die Notwendigkeit, multiple Alignments von Hand zu editieren, weitgehend
beseitigt. Im Jahr 2007 konnten Gerard Talavera und Jose Castresana zeigen (Talavera und
Castresana, 2007), daß die Entfernung von Blöcken mittels Gblocks für die meisten Alignments, die
allerdings nicht zu kurz sein dürfen, zu besseren Bäumen führt, obwohl das Verfahren mit einem
Informationsverlust einhergeht. Sie stellten darüberhinaus fest, daß bereinigte Alignments zwar
bessere Topologien produzieren, diese sich aber paradoxerweise durch eine schlechtere BootstrapUnterstützung auszeichnen.
GLOOME
GLOOME (Cohen und Pupko, 2010), die „Gain Loss Mapping Engine“, ist ein System aus WebFrontend und dahinterliegendem Server. Für ein vom Benutzer hochzuladendes FASTA-Alignment
von 0/1-Sequenzen, sog. „phyletischer Muster“, und bei Bedarf eine Phylogenie im Newick-Format
schätzt GLOOME ast- und positionsspezifische Gewinn- und Verlust-Ereignisse (engl. „gain and
loss events“). Ist kein Baum vorhanden, schätzt GLOOME ihn aus den phyletischen Mustern. Dazu
setzt es eine modellbasierte Distanzberechnung und Neighbor Joining ein.
GLOOME stellt für die Detektion der Ereignisse die Techniken Stochastic Mapping und Parsimony
zur Verfügung. Entscheidet sich der Benutzer für das Parsimonie-Kriterium, kann er die relativen
Kosten von Gewinn- und Verlust-Ereignissen angeben. Stochastic Mapping (Nielsen, 2002; Minin
und Suchard, 2008) vollzieht sich in einem probabilistischen Bezugsrahmen. Für ein gegebenes
evolutionäres Modell werden Erwartungswert und Wahrscheinlichkeit für die Ereignisse pro Ast
und jeden der vier möglichen Konfigurationen der Zeichen 0 und 1 am Anfang und Ende eines Asts
berechnet (siehe dazu http://gloome.tau.ac.il/overview.php). Der totale Erwartungswert für einen
Ast ergibt sich dann über die gewichtete Summe aus den vier Konfigurationen.
Die Webanwendung stellt eine Auswahl unterschiedlich komplexer evolutionärer Modelle bereit,
mit der die Dynamik von Gewinn- und Verlust-Ereignissen modelliert wird.
Obwohl der Fokus von GLOOME auf Stochastic Mapping liegt, nutzte der Verfasser dieser Arbeit
ausschließlich das Parsimonie-Kriterium, um anzestrale Gewinn- und Verlust-Ereignisse für
verschiedene Escherichia coli- und Salmonellen-Phylogenien zu schätzen (siehe Abschnitt 10.4).
iTol: Interactive Tree Of Life
Das Web-Frontend iTol (http://itol.embl.de) der Autoren Letunic und Bork (Letunic und Bork, 2006;
Letunic und Bork, 2011) ist ein frei verfügbares Werkzeug zur Anzeige, interaktiven Manipulation
und Annotation phylogenetischer Bäume. Es zeichnet sich besonders durch seine Fähigkeit aus,
diverse Pixel- und Vektorgrafik-Formate exportieren zu können. Der vom Frontend in der
Grundeinstellung angezeigte Baum wurde mit Methoden generiert, die die Gruppe um Francesca D.
Ciccarelli im Fachblatt Science publiziert hat (Ciccarelli et al., 2006). Ihr Verfahren nutzt
8
hochkonservierte Gene. Für diese Arbeit wurden Verwandtschaftsbäume für Escherichia coli und
Salmonellen mit einer Methode bestimmt, die der von Ciccarelli et al. ähnelt.
JModeltest/JModeltest2
Die in Java geschriebene GUI-Applikation JModeltest/JModeltest2 (Posada et al., 2012) wählt mit
statistischen Methoden für eine gegebene Nukleotidsequenz das Modell aus, das die Substitution
der Nukleotide am besten beschreibt. Dazu setzt die Applikation fünf Auswahlverfahren ein:
hierarchischer und dynamischer Likelihood-Ratio-Test (hLRT, dLRT), Akaike- (AIC) und
Bayesianisches Informationskriterium (BIC) sowie ein auf der Entscheidungstheorie fußendes
Kriterium (DT). Bei Bedarf schätzt das Programm die Unsicherheit bei der Modellauswahl, die
Wichtigkeit von Parametern oder über alle Modelle gemittelte Parameter und Phylogenien. Das
Programm JModeltest/JModeltest2 bedient sich intern PhyML (Guindon und Gascuel, 2003).
KEGG
KEGG, die „Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes“, ist eine Datenbank-Resource der
Kanehisa Laboratories, die der Organisation NPO Bioinformatics Japan angehören. Sie hat sich
dem Ziel verpflichtet, zum Verständnis der Funktionen der biologischen Systeme Zelle, Organismus
und Ökosystem beizutragen. Dazu integriert sie molekulare Daten aus Genomsequenzierungsprojekten und Hochdurchsatzexperimenten. KEGG stellt eine Programmierschnittstelle
zum Download verschiedener Daten bereit, darunter biochemische Stoffwechselwege,
Informationen zu Genen, Enzymen, Reaktionen und Liganden.
Für diese Arbeit wurde die Programmierschnittstelle im Zusammenhang mit der Rekonstruktion
essentieller Nährstoffe in der anzestralen Umwelt von Escherichia coli benutzt.
MCL
Der MCL-Algorithmus („Markov Cluster Algorithm“) ist ein schneller und skalierbarer,
unüberwachter Clustering-Algorithmus für Graphen, welcher stochastische Flüsse in Graphen
simuliert. Sein Entdecker, Stijn van Dongen, hat ihn in seiner Dissertation (van Dongen, 2000)
beschrieben und seine mathematischen Grundlagen untersucht. Die Anwendung des MCLAlgorithmus im Bereich der Detektion von Proteinfamilien wurde etwas später publiziert (Enright
et al., 2002) und mit der griffigen Bezeichnung „TRIBE-MCL“ versehen.
Die vorliegende Arbeit benutzt zur Bestimmung orthologer Gruppen sowohl MCL als auch die von
Christian Eßer für seine Dissertation (Eßer, 2010) entwickelte Methode, die auf Sequenzidentität
und Syntenie beruht (vgl. Abschnitt MpBatch/Alignomat).
MAFFT
MAFFT ist ein von Kazutaka Katoh und Kollegen (Katoh et al., 2002; Katoh et al., 2005)
konzipiertes Programm zur Erstellung eines multiplen Sequenzalignments (MSA). Es bedient sich
zweier Techniken, die in vergleichbaren Programmen bisher nicht zum Einsatz gekommen sind.
Zum einen identifiziert es homologe Regionen mittels schneller Fouriertransformation (FFT), wobei
eine Aminosäuresequenz in eine Folge von Mengen- und Polaritätswerten pro Aminosäurerest
überführt wird. Zum anderen benutzt MAFFT ein vereinfachtes Scoring-System, das die benötigte
CPU-Zeit verkürzt und die Genauigkeit der Alignments verbessert, und das sowohl bei Sequenzen
mit großen Insertionen und Anhängen als auch bei wenig verwandten Sequenzen ähnlicher Länge.
MAFFT implementiert als Heuristiken eine progressive und eine iterative Methode.
In dieser Arbeit kamen die Versionen v6.902b vom 15.05.2012 und v6.864b vom 10.11.2011 zum
9
Einsatz, die nach Setzen des auto-Parameters selbständig die geeignete von MAFFT angebotene
Bearbeitungsstrategie auswählen.
Mesquite
Das Open-Source-Projekt Mesquite ist eine Software für Evolutionsbiologie, die Wissenschaftlern
behilflich ist, vergleichende Daten über Organismen zu analysieren. Der Schwerpunkt liegt auf der
phylogenetischen Analyse, aber es sind auch Module für Populationsgenetik und andere Bereiche
vorhanden, die bei Bedarf hinzugefügt werden können. In dieser Arbeit wurde Mesquite verwendet,
um Äste aus phylogenetischen Bäumen zu entfernen und Multifurkationen einzuführen.
Desweiteren wurden die Abbildungen einiger Bäume mit Mesquite angefertigt.
Wayne und David Maddison sind die Initiatoren des mit der Programmiersprache Java erstellten
Projektes (Maddison und Maddison, 2011).
MpBatch/Alignomat
Die von Christian Eßer für seine Dissertation (Eßer, 2010) entwickelten Perl-Skripten synti und
alignomat (in seiner Dissertation, Kapitel 6, als synti bezeichnet) identifizieren Genfamilien
aufgrund ihrer Position im Genom. Dazu werden zunächst die paarweisen Sequenzähnlichkeiten
zwischen allen Proteinen aus den verglichenen Organismen mittels blastp (siehe BLAST) berechnet.
MpBatch realisiert einen Algorithmus, der versucht, orthologe Gruppen derart anzulegen, daß
möglichst viele Proteine in identischer Reihenfolge im als Referenz dienenden Genom und dem
Zielgenom vorliegen. Zweck ist es, solche Proteine in einer Familie zu vereinen, die bei einer
ausreichenden Sequenzidentität eine sehr ähnliche Position haben. Alignomat obliegt die Aufgabe,
die von MpBatch erzeugten Orthogruppen in einzelne FASTA-Dateien (Lipman und Pearson, 1985)
zu schreiben.
Die Methode liest zunächst aus den PTT-Dateien die Positionsinformationen für alle Gene ein, dann
ordnet sie jedem eine eindeutige ID zu. Im Anschluß werden die BLAST-Ergebnisse verarbeitet,
wobei nichtreziproke und solche Treffer ausgeschlossen werden, deren normalisierte Identität (Zahl
identischer Positionen/Länge des kürzeren der beiden verglichenen Proteine) kleiner ist als ein über
den Parameter -n spezifizierter Schwellenwert. Für E. coli wird 70 % als Standard-Schwellenwert
verwendet. Der chromosomalen Reihenfolge des Referenzgenoms folgend, versucht der
Algorithmus, für jedes Gen in jedem anderen Genom parallele Abschnitte zu finden. Dabei werden
alle Treffer aus der BLAST-Suche verwendet. Gelingt es, mehrere aufeinander folgende Sequenzen
mit ihren Homologen aneinander auszurichten, wird diese Reihe solange weiter verfolgt, bis sich
kein weiterer Treffer mehr finden läßt. Für das betrachtete Paar von Genen werden alle
untersuchten Gene markiert, um ihre Mehrfachverwendung auszuschließen. Lassen sich weniger als
fünf Gene konsekutiv aneinander ausrichten, werden alle Treffer verworfen, und die Suche wird mit
dem nächsten Gen fortgesetzt. Das Skript gibt eine Tabelle aus, die für jedes Genom eine Spalte
enthält und zusätzliche eine mit der Größe der Proteinfamilien. Jede Zeile repräsentiert eine
Proteinfamilie. Wurde nur ein Genom als Referenz ausgewählt, werden die Proteinfamilien an
dieser ausgerichtet. Die Einträge der Tabelle sind die GI-Nummern der entsprechenden Proteine.
MrBayes
Die Autoren John Huelsenbeck, Bret Larget, Paul van der Mark, Fredrik Ronquist, Donald Simon
und Maxim Teslenko haben mit MrBayes ein Programm für die Bayesianische Inferenz
phylogenetischer Bäume und die Wahl evolutionärer Modelle geschaffen. MrBayes nutzt eine auf
Markov-Chain-Monte-Carlo (MCMC) basierende Methodik, um die posteriore Verteilung von
10
Modellparametern zu schätzen. Im Gegensatz zu Programmen wie PhyML und RAxML liefert
MrBayes konzeptbedingt nicht einen optimalen Baum, sondern eine Schar sehr guter Bäume.
Weitere Informationen zu MrBayes folgen in Abschnitt 8.2.2.2.
NCBI FTP Server
Alle in dieser Arbeit verwendeten 86 Bakteriengenome wurden zu verschiedenen Zeitpunkten in
den Jahren 2010 bis 2013, spätestens Ende September 2013, vom FTP Server
(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria) des National Center for Biotechnology Information,
NCBI, heruntergeladen.
PHYLIP
PHYLIP ist der Name eines von Joseph Felsenstein (Felsenstein, 1981) entwickelten SoftwarePakets zur Erstellung phylogenetischer Bäume („phylogeny inference package“) unter einem
Maximum-Likelihood-Framework und gleichzeitig des Sequenzformats, das durch dieses Paket
populär gemacht worden ist. Die Webseite zu PHYLIP wird von der Universität Washington
betrieben (http://evolution.genetics.washington.edu/PHYLIP/general.html). Sequenzen im PHYLIPFormat sind entweder sequentiell oder verschachtelt angeordnet. Viele Phylogenieprogramme, unter
ihnen PhyML und RAxML (Stamatakis, 2006), akzeptieren ausschließlich Alignments im PHYLIPFormat.
Für diese Arbeit wurde eine Auswahl der Programme in PHYLIP verwendet: CONSENSE
berechnet Consensus-Bäume primär anhand des Majority-Rule-Kriteriums. Der Benutzer kann bei
Bedarf aber auch Strict-Consensus oder Varianten des Majority Rule-Consensus benutzen.
NEIGHBOR erzeugt Bäume nach der Neighbor-Joining-Methode von Saitou und Nei (Saitou und
Nei, 1987) oder nach der UPGMA-Methode (Sokal und Michener, 1958). SEQBOOT erzeugt aus
einem gegebenen Datensatz eine Vielzahl neuer Datensätze unter Verwendung von BootstrapResampling. TREEDIST berechnet die Branch-Score-Distanz zwischen zwei Bäumen und
berücksichtigt dabei sowohl Topologie als auch Astlängen. Zusätzlich berechnet das Programm den
Robinson-Foulds-Abstand („RF-Distanz“), der lediglich Unterschiede zwischen den Topologien,
nicht aber Astängen, berücksichtigt. Die verwendete Programmversion stammt vom April 2001.
PhyML
Bei PhyML der Autoren Stephane Guindon und Olivier Gascuel (Guindon und Gascuel, 2003)
handelt es sich um ein Programm zur Ableitung von Phylogenien, das auf dem MaximumLikelihood-Prinzip beruht. Im Kern benutzt PhyML einen Hill-Climbing-Ansatz, der gleichzeitig
sowohl Baumtopologie als auch Astlängen modifiziert. Ihr Algorithmus beginnt bei einem
Anfangsbaum, der vorher von einer schnellen distanzbasierten Methode erzeugt worden ist, und
modifiziert ihn iterativ, um seine Likelihood zu verbessern. Da in jeder Iteration Topologie und
Astlängen gleichzeitig geändert werden, nähert sich das Verfahren schnell einem Optimum an.
Die in dieser Arbeit eingesetzte Version 3 dieser Software (Guindon und Gascuel, 2010) mit der
Kennung 20121204 bietet neben anderen Verbesserungen erweiterte Möglichkeiten zur Erzeugung
eines Startbaumes unter einem Maximum-Parsimony-Kriterium an. Auf einem Rechencluster wurde
ferner PhyML-MPI, die für den parallelen Betrieb auf Rechenclustern compilierte Version des
Programms, eingesetzt.
Proteinortho
Die Software Proteinortho dient der Detektion von Orthologen/Koorthologen im Rahmen
11
großangelegter phylogenetischer Analysen. Marcus Lechner und Mitautoren (Lechner et al., 2011)
haben das Programm für den Betrieb auf Rechenclustern optimiert. Für einen Satz paarweiser
Sequenzähnlichkeiten, die vorher beispielsweise mit Blast (Altschul, 1997) generiert wurden,
bestimmt es Orthologe mit einer auf reziproken Best-Hits basierenden Heuristik. Die Software
zeichnet sich dadurch aus, daß sie in den meisten Fällen schneller als vergleichbare Programme
arbeitet.
RAxML
Neben PhyML wurde das verwandte Programm RAxML (Stamatakis, 2014) zur Inferenz großer
Phylogenien eingesetzt. RAxML bietet eine parallele Abarbeitung von Bootstrap-Suchen auf LinuxClustern sowie über POSIX-Threads an. Leider offeriert es im Gegensatz zu PhyML nur wenige
Nukleotidsubstitutionsmodelle, unter ihnen GTR. RAxML bietet in neueren Versionen neben dem
ursprünglichen einen sehr viel schnelleren Algorithmus zur Baumsuche. Der als „Rapid Hillclimbing“ bezeichnete Ansatz verzichtet darauf, Topologien weiter zu verfeinern, die
wahrscheinlich keine bessere Likelihood erzielen, und liefert dabei Bäume, die nur unwesentlich
schlechter als die sind, die der ursprüngliche Suchalgorithmus liefert.
In dieser Arbeit wurde überwiegend Version 7.4.2 vom 23. November 2012 mit „Rapid Hill
Climbing“ eingesetzt.
TOPD/FMTS
Mit dem Perl-Programm TOPD/FMTS von Autor Pere Puigbo (Puigbo, 2007) lassen sich
Unterschiede zwischen Bäumen evaluieren. Neben bereits veröffentlichten Methoden zum
Vergleich von Phylogenien bietet es eigene an. Es kombiniert das Programm TOPD („Topological
Distance“), das zwei Bäume mit gleichen Taxa oder beschnittene Bäume vergleicht, mit dem
Programm FMTS („From Multiple To Single“), das Bäume auf Grundlage multipler Genfamilien in
Bäume auf Grundlage von Einzelgenen konvertiert.
12
5
Halbautomatische Erkennung von
Phylogenien in Rastergrafiken
Auszüge dieses Kapitels wurden bereits veröffentlicht in:
Laubach, T., A. von Haeseler und M. J. Lercher. TreeSnatcher Plus: Capturing Phylogenetic
Trees from Images. BMC Bioinformatics 13.1 (2012): 110.
5.1
Einleitung
Jedes wissenschaftliche Feld, das Informationen mithilfe von Computern verarbeitet, muß
technische Darstellungen zur späteren Wiederverwendung in einem maschinenlesbaren Format
vorhalten und archivieren. Dazu muß die Struktur einer Darstellung in seine geometrischen
Primitive zerlegt werden. Je mehr Vorwissen zum Bildinhalt für den Computer verfügbar ist, desto
weniger Fehler macht dieser während der Analyse. Heutzutage digitalisieren und archivieren
Computerprogramme jahrzehntealte architektonische Zeichungen, für die die verwendeten
Symbole, Piktogramme und Schrifttypen in der Regel genormt sind. Dahingegen gibt es kein
Computerprogramm, das automatisch beliebig geformte phylogenetische Bäume aus einer
Abbildung in einen maschinenlesbaren Ausdruck, z. B. das bis heute nicht veröffentlichte NewickFormat, konvertieren kann. Die Stile, in denen phylogenetische Bäume bisher veröffentlicht worden
sind, sind genauso vielfältig wie die Softwarepakete, die zur Herstellung der Bäume und Bilder
verwendet werden können. Eine umfassende Link-Sammlung zu solchen Programmen hat Joseph
Felsenstein (Felsenstein, 2008) online gestellt (siehe http://evolution.genetics.washington.edu/
phylip/doc/sequence.html). Da es keine festen Regeln für das Design solcher Bäume gibt, darf ein
Programm, das auf die Erkennung prinzipiell beliebiger phylogenetischer Bäume abzielt, keinerlei
Vorwissen voraussetzen, von der bloßen Existenz des dargestellten Baumes einmal abgesehen.
In diesem Kapitel wird die vom Verfasser realisierte Java-Applikation TreeSnatcher Plus („TSP“)
beschrieben, die mit Unterstützung des Benutzers eine Digitalisierung phylogenetischer Bäume in
Bildern erlaubt. TSP wurde in dieser Arbeit praktisch eingesetzt, um eine von Reeves und Kollegen
(Reeves et al., 2011) veröffentlichte E. coli-Phylogenie maschinenlesbar zu machen (siehe
Abschnitt 8.3.3). Vor TSP gab es andere Programme, deren Ziel es war, phylogenetische
Darstellungen digital zu erfassen. TreeThief von Autor Andrew Rambaut (Rambaut, 2000) für Mac
OS 9 war die erste Applikation, die das Bild eines Baumes in seine computerlesbare Repräsentation
übersetzt. Das Programm erlaubte es dem Benutzer, einen Baum zu erfassen, indem er schrittweise
jeden Knoten mit der Maus anklickt. TreeRipper von Joseph Hughes (Hughes, 2011) konvertiert
Darstellungen rechteckiger Phylogenien automatisch in das Newick-Format, sofern sie mehreren
eng definierten Kriterien genügen. Er bietet ein Web-Frontend an, das es Benutzern gestattet,
Abbildungen zur automatischen Bearbeitung hochzuladen. Hughes hat zusammen mit TreeRipper
außerdem einen Satz von Darstellungen phylogenetischer Bäume veröffentlicht, der für andere
Programme als Benchmark dienen kann.
Obwohl Wissenschaftler die Ergebnisse ihrer Studien zur Stammbaumforschung gewöhnlich durch
Abbildungen phylogenetischer Bäume illustrieren, haben sich die Herausgeber der einschlägigen
13
wissenschaftlichen Fachzeitschriften bisher noch nicht auf Standards geeinigt. Ein solcher Standard
könnte beispielsweise fordern, daß als Voraussetzung für eine Veröffentlichung phylogenetische
Bäume in einem maschinenlesbaren Format in einer der einschlägigen Online-Datenbanken,
beispielsweise TreeBASE (www.treebase.org/treebase-web/home.html), MorphoBank (www.morphobank.org) oder Dryad (www.datadryad.org), hinterlegt werden müssen. Das Fehlen solcher
Standards hat dazu geführt, daß bis heute Phylogenien oft nur in bildlicher Form veröffentlicht
werden, was sowohl ihre Weiterverwendung in anderen Studien als auch die Archivierung der
Forschungsergebnisse erschwert. Leebens-Mack und Kollegen schlagen einen Fahrplan für die
Entwicklung minimaler Standards für das Berichtswesen im Zusammenhang mit Daten aus
phylogenetischen Analysen, MIAPA (engl. „Minimal Information about a Phylogenetic Analysis“),
vor (Leebens-Mack et al., 2006). Sie betreiben eine Webseite, auf welcher sie mögliche Barrieren
für die Verwertung von Daten aus wissenschaftlichen Analysen diskutieren (siehe
http://www.evoio.org/wiki/BarriersToReUse). Prinzipiell sollte es möglich sein, Daten in
elektronischer Form von den Autoren wissenschaftlicher Publikationen zu erhalten. Dieser
offensichtliche Ansatz erscheint jedoch nicht praktikabel. In einem Beispiel aus einer anderen
wissenschaftlichen Disziplin verweigerten 73 % der befragten Autoren die Herausgabe ihrer Daten
(Wicherts et al., 2006). Möchte man trotzdem die meisten veröffentlichen Bäume wiederverwenden,
scheint deren Digitalisierung die zurzeit einzig realistische Option zu sein.
5.2
Material und Methoden
Die Dateien zu diesem Kapitel befinden sich innerhalb der Ordnerstruktur im Projektordner
Kapitel_TSP. Kopien des Quellcodes zu TreeSnatcher Plus, die PDF-Tutorien zum Programm sowie
die in TSP verarbeiteten Benchmark-Bilder von Joseph Hughes sind ebenfalls dort zu finden.
Neue Funktionalitäten in TreeSnatcher Plus
Der Verfasser hat im Rahmen seiner Masterarbeit die Java-Applikation TreeSnatcher Plus (Laubach
et al., 2012) entwickelt, die es erstmals ermöglichte, mit Benutzerassistenz phylogenetische Bäume
in Pixelbildern mit Methoden aus dem Bereich Bildverarbeitung zu analysieren, zu vermessen und
schließlich in das Newick-Format zu überführen. Letzteres ist ein gängiges, aber nicht offiziell
standardisiertes Datenaustauschformat für Bäume. Während die unter Umständen notwendige
Vorverarbeitung eines Eingabebildes bei dem Vorgänger von TSP, TreeSnatcher (Laubach und von
Haeseler, 2007) noch außerhalb des Programms erfolgen mußte, kann ein zu verarbeitendes
Pixelbild nunmehr innerhalb von TSP mit diversen Techniken vorbearbeitet werden (vgl. Abb. 5.1).
Die grafische Benutzeroberfläche (engl. „Graphical User Interface“, abgekürzt „GUI“) von TSP
basiert auf dem Java Swing API. Das Programm bietet neben einer Undo-Funktionalität die
Möglichkeit, den aktuellen Bearbeitungszustand zu speichern und wieder herzustellen („Snapshot“).
Dieser kann auch in Form eines Bildes gespeichert werden, das auf Wunsch verschiedene Schichten
mit visuellen Informationen enthält. TSP erkennt zuverlässig Knoten und Kanten der dargestellten
Phylogenie und baut daraus eine programminterne Repräsentation in Form eines mathematischen
Graphen. Es berechnet die Astlängen für beliebig geformte Äste und erkennt dabei die horizontal
verlaufenden Astanteile in rechteckigen Phylogenien, selbst wenn die Darstellung geringfügig
„gekippt“ ist. Vom Programm berechnete und vom Benutzer eingegebene Astlängen dürfen
gleichzeitig verwendet werden. Desweiteren kann der Benutzer einen existierenden Baum
modifizieren oder einen völlig neuen konstruieren. Der Verfasser hat die Linux- und Windows14
Versionen von TSP mit einer einfachen OCR-Funktionalität ausgestattet. Dabei kommt die von Jörg
Schulenburg programmierte OCR-Engine GOCR in der Version 0.49 (Schulenburg, 2013) zum
Einsatz. Der Benutzer von TSP hat die Möglichkeit, horizontal angeordneten Text mit einer
Auswahlbox zu markieren. Das Programm versucht dann eine Texterkennung und weist den
erkannten Text dem am nächsten stehenden Taxon zu. Die Erkennungsrate schwankt von akzeptabel
bis sehr schlecht, abhängig von Schriftart und Auflösung.
Bearbeitungswerkzeuge
TreeSnatcher Plus akzeptiert Bilddateien in den Formaten PNG, JPG/JPEG und GIF. Das Format
PDF wird derzeit nicht unterstützt, jedoch sind Werkzeuge für die Extraktion von Bildern aus PDFs
anderweitig verfügbar, für Linux beispielsweise die Xpdf-Suite (www.foolabs.com/xpdf).
TreeSnatcher Plus bietet die folgenden, aus Standard-Algorithmen (Burger und Burge, 2005)
modifizierten Vorverarbeitungs-Werkzeuge: Stift, Radiergummi, Linie, Flächenfüller, Stempel,
Histogrammspreizung, Farbreduktion, Graustufenkonvertierung, Binarisierung über lokales und
globales Thresholding, Farbbereichsmanipulation, Inversion, Median- und Minimumfilter,
Verwaschen, Schärfen, Aufhellen und Abdunkeln, Ausdünnen/Skelettieren. Vor der automatischen
Plazierung der Knoten muß der Benutzer das Bild geeignet vorbereiten. Insbesondere muß das Bild
in eine Liniengrafik umgewandelt werden, in der sich Text und Grafikelemente nicht mit dem Baum
überschneiden dürfen. Sollte das Bild diesen Anforderungen nicht genügen, wird das Programm die
Baumtopologie nicht fehlerfrei identifizieren können.
Arbeitsablauf
Die Arbeit mit TreeSnatcher Plus vollzieht sich entlang einer generellen Abfolge globaler Schritte,
von denen jeder mindestens einmal ausgeführt wird, und das entweder für einen Teil des Bildes
oder für das Gesamtbild. Dem Benutzer obliegt die Gesamtaufsicht über den Prozeß. Er nimmt
geeignete Korrekturen vor und wiederholt Teilschritte, falls nötig. Der Arbeitsablauf sieht wie folgt
aus:
1. Eingabebild lesen: Das Programm liest das Eingabebild und wandelt es in ein
Graustufenbild um. Der Benutzer beschneidet das Bild nach Belieben. Auf diese Weise löst
er Teilbäume aus dem Gesamtbaum oder wählt eine Untermenge der Taxa.
2. Vorverarbeitung: Der Benutzer bereitet das Bild mit den Vorverarbeitungswerkzeugen
geeignet vor.
3. Binarisierung: Der Benutzer gibt einen Schwellenwert an. Die Graustufen unterhalb des
Schwellenwerts oder gleich dem Schwellenwert werden schwarz, alle anderen werden weiß.
Ziel dieses Schrittes ist es, Vordergrund und Hintergrund voneinander zu trennen.
4. Skelettieren: Der Benutzer dünnt halbautomatisch den Vordergrund in dem Teil des Bildes
aus, der den Baum enthält. Dieser Schritt ist notwendig, damit das Programm die Pfade
zwischen den Linienkreuzungen finden kann (siehe Schritt 8).
5. Fluten des Vordergrundes: Der Benutzer markiert eine Position auf einem Ast des
Baumes. Das Programm färbt den gesamten von dort erreichbaren, zusammenhängenden
Vordergrund ein. Darauf folgende Schritte behandeln den so eingefärbten Bereich als „den
Baum“. Alle anderen Vordergrundbestandteile werden ignoriert.
6. Plazierung der inneren und äußeren Knoten: Das Programm schlägt Positionen für
Linienkreuzungen und Linienenden vor. Diese repräsentieren Verzweigungen und Blätter
des Baumes. Jeder Position wird ein logischer Baumknoten zugeordnet. Der Benutzer kann
15
Knoten hinzufügen, löschen und verschieben. Im skelettierten Bild werden schwarze Pixel,
die Nachbar genau eines anderen schwarzen Pixels sind, zu einer Blattposition. Schwarze
Pixel, die Nachbar von mindestens drei schwarzen Pixeln sind, werden Kandidaten für eine
Verzweigungsposition. Falls es mehrere Kandidatenpositionen für eine Verzweigung gibt,
wird diese aus dem Durchschnitt dieser Positionen gebildet.
7. Wahl des Baum-Typs: Das Programm kann zwischen beliebig geformten (aber nicht
zirkulären und polaren) Bäumen sowie rechteckigen Bäumen unterscheiden. Die Wahl des
Typs beeinflußt, wie das Programm Astlängen behandelt. Der Baum-Typ muß gewählt
werden, bevor Schritt 8 aufgerufen wird.
8. Erkennung der Äste: Das Programm verfolgt lückenlose Vordergrundpfade zwischen
jedem Paar von Knoten, um die Äste des Baumes zu identifizieren. Gibt es mehrere
mögliche Pfade, entscheidet es sich für den kürzesten. Sollte das Programm einen Ast nicht
erkannt oder falsch gesetzt haben, kann der Benutzer entweder das Bild mithilfe der
Malwerkzeuge modifizieren und Schritt 8 wiederholen oder einen neuen Ast zwischen zwei
Knoten manuell hinzufügen und dessen Länge manuell setzen.
9. Bestimmung der Astlängen: Die Genauigkeit hängt davon ab, wie gut die ausgedünnte
Baumstruktur, die Plazierung der Knoten und der Originalbaum übereinstimmen. Für
beliebig geformte Bäume basiert die Astlänge in Pixeln auf der gesamten Länge des
Vordergrundpfades zwischen den beiden definierenden Knoten. Für rechteckige Bäume ist
die Astlänge jeweils die Summe der Längen der horizontalen Pfadsegmente. Der Benutzer
darf eigenständig definierte Astlängen eintippen und sie mit den vom Programm
berechneten Astlängen mischen. Indem der Benutzer mit der Maus eine Maßstabsleiste im
Bild markiert, kann er den Baum an dieser definierten Länge skalieren.
10. Zuweisen der Taxon-Namen: Der Benutzer klickt hintereinander mit der rechten Maustaste
auf jeden Blattknoten und gibt dann in einem Textfeld den entsprechenden Taxon-Namen
ein. Alternativ kann der Benutzer horizontal geschriebene Taxon-Namen markieren,
woraufhin das Programm eine Texterkennung versucht und den erkannten Text dem am
nächsten gelegenen Blattknoten zuweist (nur für rechteckige Topologien).
11. Wahl der Baumwurzel: Das Programm wählt, ggf. benutzerassistiert, den inneren Knoten,
relativ zu welchem der gewurzelte Newick-Ausdruck für den Baum berechnet wird.
12. Konstruktion des Newick-Ausdrucks: Das Programm berechnet den Newick-Ausdruck
für den dargestellten Baum und zeigt ihn an. Der Benutzer kann ihn entweder in der
Zwischenablage speichern oder ihn in eine Textdatei exportieren.
5.3
5.3.1
Ergebnisse
Einfluß verschiedener Faktoren auf den Digitalisierungsvorgang
Ein Bild, das einen einheitlich schwarzen, rechteckigen phylogenetischen Baum auf einem
gleichmäßig hellen Hintergrund in genügend hoher Auflösung anzeigt, und in welchem keine
Vordergrundelemente, z. B. Text, mit der Baumstruktur überlappen, bedarf nur wenig bis keiner
Vorverarbeitung. Genügen dem Benutzer Zahlen als Taxon-Namen, kann so der gesamte
Erkennungsprozeß der Baumtopologie innerhalb von Minuten vonstatten gehen. Im Allgemeinen
16
gibt es jedoch Bereiche in einem Eingabebild, die einer manuellen Vorverarbeitung bedürfen. Dies
können Äste sein, die nicht vollständig von anderen Vordergrundelementen getrennt sind,
beispielsweise Zahlen und Buchstaben. Für solche Fälle stellt TSP ein besonderes Werkzeug zur
Verfügung, das vom Benutzer gemalten Vordergrund mit einem weißen "Rahmen" ausstattet.
Um Astlängen bestimmen zu können, muß TSP die Pfadlänge in Pixeln zwischen Verzweigungen
auf dem skelettierten Vordergrund feststellen. Zusätzlich muß das Programm für
Rechtecktopologien zuverlässig Knicke in den Ästen und die horizontalen Astanteile erkennen. Das
funktioniert besser bei höher aufgelösten Bildstrukturen. Je besser sich die Äste im Originalbild und
die im skelettierten Bild überdecken, umso genauer können die Astlängen berechnet werden.
Die für die gesamte Digitalisierung des dargestellten Baumes benötigte Zeit hängt von mehreren
Faktoren ab, so beispielsweise Bildgröße, Bildqualität, Größe des Baumes und Komplexität der
Topologie, aber auch davon, ob Astlängen berechnet werden sollen und Taxon-Namen eingetippt
werden müssen, ob eine Vorverarbeitung notwendig und wie erfahren der Benutzer im Gebrauch
von TSP ist.
5.3.2
Benchmarks
Um die Leistungsfähigkeit von TreeSnatcher Plus zu testen, wurden die 100 Bäume aus dem
Benchmark-Set für TreeRipper (siehe Dateien im Ordner Benchmarks) von Joseph Hughes
digitalisiert, zusätzlich neun andere Bilder mit nichtrechteckiger Topologie sowie ein weiteres Bild
aus dem Satz von Benchmark-Bildern. Die Ergebnisse sind in der Microsoft Excel-Tabelle
17
12859_2011_5272_MOESM1_ESM.xls aus dem Ordner Papers/BMCBioinformatics hinterlegt. Die
Taxon-Namen wurden in allen Fällen manuell eingegeben. Da TSP nicht vollautomatisch arbeitet,
obliegt es dem Benutzer, die jeweiligen Vorverarbeitungs- und Analyseschritte zu initiieren.
Abhängig von seinen Fähigkeiten schwankt daher die Zeit, die er zur Bearbeitung verschiedener
Aufgaben benötigt. Für die Benchmark-Bäume lag die Bearbeitungszeit zwischen 30 und 1.800
Sekunden mit einem Durchschnitt von 165 Sekunden auf einem PC, der mit einem Core i7-960
Prozessor ausgestattet ist. Das Eintippen der Speziesnamen über die Tastatur dauerte
durchschnittlich 4,4 Minuten und maximal 35 Minuten. Die kürzeste Baumdigitalisierung erfolgte
innerhalb einer Minute, die längste dauerte 45 Minuten. Die Erkennung der Topologie eines
Baumes mit mehr als 100 Taxa inkl. Eingabe der Speziesnamen (Ordner 1471-2148-6-93 im
Benchmark-Set) nahm 17 Minuten in Anspruch. Die gleiche Topologie und die Speziesnamen
lieferte das TreeRipper-Frontend innerhalb von fünf Minuten, allerdings mußten alle Namen
manuell nachbearbeitet werden.
Zusätzlich wurden neun Abbildungen von Bäumen mit nichtrechteckiger Topologie (Verzeichnis
OtherTrees im Ordner Benchmarks) analysiert. Wie zuvor wurden Topologie und Astlängen
erkannt. Da TSP Astlängen in beliebig geformten Bäumen, jedoch nicht speziell in zirkulären oder
polaren Bäumen messen kann, wurden die horizontalen Anteile der Äste in den Bäumen „bustard“,
„TreeofLife“ und „Phylogenetic_Tree_of_Life“ mit dem Werkzeug „Line Selection Tool“ mit
geringerer Genauigkeit vermessen. Im Fall der Abbildung „vert_tree“ mußte der Baum manuell
nachgezeichnet werden. Mit TSP können auch gekippte Darstellungen rechteckiger Bäume
zuverlässig analysiert werden. Um zu testen, wie gut das gelingt, wurde Bild 1471-2148-6-99-1 aus
dem Benchmark-Set um 6° nach rechts rotiert („RotatedTree“ im Ordner Benchmarks/OtherTrees).
Die Vorverarbeitungsschritte waren für das Originalbild und das rotierte Bild sehr ähnlich. Im
rotierten Bild erkannte TSP 10 von 81 horizontalen Astanteilen nicht gegenüber 3 im Originalbild.
Die Korrektur überlappender Vordergrundstrukturen, die Eingabe von Astlängen und die Eingabe
von Taxon-Namen stellen generell die zeitaufwendigsten Schritte dar. Für bestimmte Bäume
werden ggf. mehrere Anläufe benötigt, bis eine Abfolge von Verarbeitungsschritten gefunden wird,
die zu einer zuverlässigen Erkennung der Baumtopologie führt.
5.4
Diskussion
Mit Blick auf die Leistungsfähigkeit der heute verwendeten Bildanalyse- und OCR-Methoden sind
für das gesetzte Ziel, in Bildern dargestellte phylogenetische Bäume zu digitalisieren und zu
archivieren, zwei verschiedene Strategien denkbar: entweder ein vollautomatischer Ansatz, der auf
einem fest definierten Baumtyp arbeitet und einen festgelegten Illustrationsstil fordert, oder ein
halbautomatischer Ansatz, der für eine Vielzahl von Bäumen geeignet ist.
TreeRipper strebt eine vollautomatische Verarbeitung von Baumtopologien an. Um das zu
erreichen, beschränkt sich das Programm auf Darstellungen rechteckiger Topologien, welche
bestimmte eng umgrenzte Kriterien erfüllen müssen. Unter den diese Kriterien erfüllenden
Abbildungen in seinem Benchmark-Set erkennt TreeRipper die Verzweigungsmuster von lediglich
32 % der Bäume. Die Abbildungen mußten zuvor allerdings keiner Vorverarbeitung unterzogen
werden. Die Leistungsfähigkeit der vom Programm angebotenen Texterkennung ist vom Schrifttyp
und der Auflösung der zu verarbeitenden Bilder abhängig. Der Verfasser hält eine vollautomatische
Stapelverarbeitung (engl. „batch processing“) rechteckiger Baumtopologien angesichts dieser
Ergebnisse bis auf weiteres für unrealistisch, obwohl Joseph Hughes angibt, sein Programm
ausdrücklich für diesen Zweck geschaffen zu haben. Die Benutzung von TreeRipper empfiehlt sich
18
daher für die Digitalisierung von Darstellungen phylogenetischer Bäume, die den strikten
Anforderungen des Programms genügen.
TreeSnatcher Plus kann jede Baumtopologie erkennen und damit archivieren, nimmt aber die
Notwendigkeit einer manuellen Vorverarbeitung der Bilder in Kauf. Abhängig von der Komplexität
der Abbildung erfordert es eine unter Umständen beträchtliche Benutzerinteraktion, kann dafür aber
prinzipiell beliebige Bäume erfassen. Durchschnittlich benötigt TSP für die Digitalisierung eines
Baumes unter drei Minuten. Die Leistung der verwendeten Schrifterkennung ist noch nicht gut,
insbesondere ist sie auf horizontal angeordneten Text beschränkt. Die Taxon-Namen müssen daher
in vielen Fällen nach wie vor manuell eingegeben bzw. nachkorrigiert werden. Obwohl
TreeSnatcher Plus nicht vollkommen automatisch arbeitet, ist es geeignet, prinzipiell jede beliebige
Darstellung einer Phylogenie zu digitalisieren und für eine zukünftige wissenschaftliche
Anwendung zu erhalten.
Verbesserungspotential für TreeSnatcher Plus gibt es an mehreren Stellen. Hier wird nur auf die
prominenteste hingewiesen. In der Literatur werden am häufigsten rechteckige Baumtopologien
angetroffen. Es lohnt sich daher, das Programm speziell für diesen Baumtyp zu optimieren. Zwar
kann der Benutzer dem Programm signalisieren, daß der zu erkennende Baum eine
Rechtecktopologie besitzt, jedoch wird dieses Wissen bisher nur zur Bestimmung der Astlängen
eingesetzt und trägt nicht zur Erkennung der Baumtopologie bei. Die nötige Erweiterung des
Programms ist mit verhältnismäßig geringem Aufwand möglich. Danach könnte TSP überlappende
Vordergrundregionen bei rechteckigen Baumtopologien weitgehend autonom korrigieren, da es die
Ausrichtungen der Äste kennen würde. Ultrametrische Bäume würde es ebenso zuverlässig
bearbeiten. Die Leistung der Schrifterkennung für rechteckige Bäume könnte stark verbessert
werden, würde Vorwissen zu der zu verarbeitenden Phylogenie genutzt. Dem Programm wären
nämlich in diesem Fall die wahrscheinlichen Positionen und die Ausrichtung der Taxon-Namen im
Bild bekannt. Dieses Wissen würde TSP in die Lage versetzen, die Taxon-Namen weitgehend
automatisch zu finden und diese den passenden Blattknoten zuzuweisen.
TreeSnatcher Plus wurde eigens zu dem Zweck entwickelt, Abbildungen phylogenetischer Bäume
zu digitalisieren, deren Datengrundlage nicht mehr zu beschaffen ist. Eine höhere Akzeptanz
verbesserter Minimalstandards für das Berichtswesen in der phylogenetischen Forschung würde
jedoch garantieren, daß phylogenetische Daten in zukünftigen Veröffentlichungen maschinenlesbar
sind und damit auch anderen Forschern zur Verfügung stehen. Es ist seit Jahren verbindlich, daß
DNA-Sequenzen auch elektronisch in maschinenlesbarer Form in einem der akzeptierten Formate
veröffentlicht werden. Daher erscheint es wünschenswert, daß sich die Herausgeber
wissenschaftlicher Fachzeitschriften auf einen vergleichbaren Standard für Phylogenien einigen.
19
6
Ein erweiterter Robinson-Foulds-Abstand für
ausschließlich signifikante Splits
6.1
Einleitung
Einer der entscheidenden Schritte in der Stammbaumforschung ist der Vergleich von
phylogenetischen Bäumen. Bei entsprechenden Forschungsvorhaben können Bäume, die nicht
deckungsgleich sind und mit verschiedenen Methoden hergestellt wurden, im Vordergrund stehen,
aber auch die Frage, wie leistungsfähig verschiedene Methoden der Stammbaumrekonstruktion
sind. Generell ist zum Vergleich zweier Bäume die Definition eines Abstands zwischen ihnen
erforderlich. Die Distanz zwischen zwei Phylogenien manifestiert sich in der Zahl der Unterschiede
zwischen ihnen. Zwei intrinsische Eigenschaften von Bäumen können verglichen werden:
Topologie und Astlängen. Einige der am häufigsten verwendeten Distanzmaße verwenden
ausschließlich topologische Informationen, so z. B. die Robinson-Foulds-Metrik (Robinson und
Foulds, 1978; Robinson und Foulds, 1981), Nearest-Neighbor-Interchange (Waterman und Smith,
1978), Quartet Distance (Estabrook et al., 1985) und Subtree Pruning and Regrafting (Hein, 1990).
Im Jahr 2007 haben Pattengale und Kollegen eine randomisierte Approximation der ursprünglichen
Robinson-Foulds-Metrik („RF-Distanz“) veröffentlicht (Pattengale et al., 2007), die schneller ist als
der ältere Ansatz. Eine auf der Topologie basierende Distanzmethode vermag es, in zwei gegebenen
Bäumen die Bereiche zu quantifizieren, die einander widersprechen. Der gewichtete RobinsonFoulds-Abstand („weighted Robinson-Foulds“, RFW), die geodäsische Distanz (Billera et al., 2001;
Kupczok et al., 2008) und die Branch-Score-Distanz (Kuhner und Felsenstein, 1994) benutzen
neben der Topologie zusätzlich noch die Astlängen. Ein Distanzmaß, das Astlängen berücksichtigt,
ist besonders nützlich, wenn man Bäume mit vielen unterschiedlichen Astlängen vergleicht, sofern
sich die evolutionären Raten in den Ästen nicht zu sehr unterscheiden.
Phylogenien können nicht nur anhand der intrinsischen Eigenschaften Topologie und Astlängen
miteinander verglichen werden, sondern auch anhand der extrinsischen Eigenschaft BootstrapSupport-Wert (ab jetzt mit BSW abgekürzt) an ihren Ästen. Ein BSW an einem Ast in einer
rekonstruierten Phylogenie drückt, umgangssprachlich formuliert, aus, wie sehr man darauf
vertrauen kann, daß dieser sich hinsichtlich seiner Position in der wahren Phylogenie an der
richtigen Stelle befindet. Man könnte einen Ast mit einem niedrigen BSW, der als einziger zwischen
zwei zu vergleichenden Phylogenien unterscheidet, als nicht-signifikant werten und ihn daher
ignorieren. Konsequenz daraus wäre dann, dass man die Phylogenien als praktisch gleich ansieht.
Der Begriff des BSW hat allerdings durchaus ein mathematisches Fundament. 1985 schlug Joseph
Felsenstein (Felsenstein, 1985) vor, die von Efron eingeführte Technik namens „Bootstrap“ (Efron,
1979) auf das Baumproblem zu übertragen. Seitdem wurden viele Anstrengungen unternommen,
die daraus resultierenden Anwendungen sowie verschiedenste statistische Eigenschaften zu
untersuchen. Susko und Mitautoren (Susko et al., 2006) verwendeten BSW, um die Frage zu
beantworten, inwieweit ein Split in einem Baum die Taxa korrekt an beiden Seiten des Splits
plaziert hat. Berry und Gascuel beschäftigten sich mit der allgemeinen Frage, wie man einen
Bootstrap-Baum (Berry und Gascuel, 1996) richtig interpretiert. Sie untersuchten in diesem
Zusammenhang Fehlermaße, die auf eine Generalisierung der RF-Distanz zurückgehen. Ihr Ziel
war es, die Divergenz zwischen wahrer und geschätzter Phylogenie zu quantifizieren. Efron et al.
konnten zeigen, daß das Bootstrap-Verfahren auf Bäumen zwar nicht statistisch verzerrt (engl.
„biased“) ist (Efron et al., 1996), es aber unter den Aspekten Hypothesentesten und
20
Konfidenzniveaus die damals geltenden Standards noch nicht erreichte. Cardona und Kollegen
haben eine RF-Distanz zwischen phylogenetischen Netzwerken erarbeitet (Cardona et al. 2009;
Asano et al., 2012). Die ursprüngliche RF-Distanz kann keine ungewurzelten Phylogenien mit
gewurzelten vergleichen. Um diese Einschränkung aufzuheben, haben Gorecki und Eulenstein eine
weitere Variante der RF-Distanz, urRF, entwickelt (Gorecki et al., 2012).
Verschiedene Programmpakete wurden veröffentlicht, die mehrere gängige Methoden für den
Phylogenievergleich bündeln (Bogdanovicz et al., 2012; Puigbo et al., 2007). In ihrer Dissertation
(Kupczok, 2010) erörtert Anne Kupczok die Eigenschaften verschiedener Distanzmaße und stellt
Methoden zur Vereinigung von Phylogenien vor. Joseph Felsenstein bietet in seinem Buch
„Inferring Phylogenies“ (Felsenstein, 2004) einen historischen Überblick über die
Vergleichsmetriken für Phylogenien.
21
Im Rahmen dieses Kapitels wird eine vom Verfasser realisierte Erweiterung der RF-Distanz
vorgestellt, ssRF, die zwischen signifikanten und nichtsignifikanten Ästen unterscheidet. Der
Algorithmus benutzt entweder den BSW oder alternativ eine Bayesian Posterior Probability (BPP)
als Maß für die Signifikanz eines Asts. Er reduziert zunächst zwei ungewurzelte, bifurzierende
Bäume mit BSW („Konfidenzwerten“) an den Ästen auf ihre gemeinsamen Taxa. Dann werden alle
Splits unterhalb der initial vom Benutzer (ggf. auch subjektiv) festgelegten Signifikanzschwelle aus
der Menge aller Splits entfernt. Für die Newick-Repräsentation eines Baumes bedeutet das, daß
Teilbäume in Multifurkationen zusammengezogen werden. Die ssRF-Distanz zwischen den
Bäumen ist die Zahl der Splits im ersten Baum, die mit dem zweiten Baum inkompatibel sind,
zuzüglich der Zahl der Splits im zweiten Baum, die mit dem ersten Baum inkompatibel sind. Ein
Split S teilt die Taxa im Baum in zwei disjunkte Mengen S1 und S2 auf. Zwei Splits A, B sind
kompatibel, wenn für sie gilt: (A1 ∩ B1 = ø) v (A1 ∩ B2 = ø) v (A2 ∩ B1 = ø) v (A2 ∩ B2 = ø).
6.2
Material und Methoden
Die für das in diesem Kapitel vorgestellte Projekt benötigten Dateien befinden sich innerhalb der
Ordnerstruktur im Projektordner Distanzmaß.
6.2.1
Herleitung des erweiterten Distanzmaßes
Die vom Verfasser als ssRF bezeichnete Distanz stellt eine Erweiterung des Robinson-FouldsAbstands (Robinson und Foulds, 1979; Robinson und Foulds, 1981) dar. 1981 konnten Robinson
und Foulds beweisen, daß ihr Distanzmaß eine Metrik2 ist.
Robinson-Foulds-Abstand
Die RF-Distanz ist die symmetrische Differenz zwischen zwei Phylogenien, betrachtet aus einer
mengentheoretischen Perspektive. Dabei handelt es sich um die Summation der Zahl der Splits in
jeweils einem der Bäume, die aber nicht im jeweils anderen Baum vorkommen. Die Distanz
zwischen zwei Bäumen T1 und T2 ist dann wie folgt definiert:
RF( T1, T2 ) := | ( T1 ⋃ T2 ) | - | ( T1 ∩ T2 ) |
Gewichteter Robinson-Foulds-Abstand
1979 veröffentlichten Robinson und Foulds eine verbesserte Variante ihres Distanzmaßes, RFW, die
als gewichteter RF-Abstand („weighted Robinson-Foulds“) bezeichnet wird (Robinson und Foulds,
1979). Werden Astlängen als Gewichte benutzt, kann RFW als die Summe der absoluten Differenzen
der Astlängen über alle Äste der Topologie ausgedrückt werden.
2 Ob ssRF ebenfalls eine Metrik ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht.
22
Für die Bäume T1, T2, die Menge wi aller positiven Gewichte an den Ästen von Ti, die Menge ∑(Ti)
aller Splits in Ti und das Gewicht wi(A|B) des Asts, der mit dem Split A|B, i = 1, 2 korrespondiert, ist
die Metrik definiert über
RFW(T1,T2) :=
∑
|w1(A|B) – w2(A|B)|
A|B ∈ ∑(T1) ⋃ ∑(T2)
23
Die gewöhnliche RF-Distanz tritt bei dieser Definition als Spezialfall auf, wenn alle Äste das
gleiche Gewicht besitzen. Es ist möglich, eine RF-Distanz zu definieren, die Bootstrap-Werte
anstelle von Astlängen als Gewichte benutzt.
Robinson-Foulds-Abstand für ausschließlich signifikante Splits
Die ssRF-Distanz zwischen zwei Bäumen ist die Anzahl Splits des ersten Baumes, die mit allen
Splits im zweiten Baum inkompatibel sind, zuzüglich der Anzahl Splits des zweiten Baumes, die
mit allen Splits im ersten Baum inkompatibel sind. Für die Bäume T 1 und T2, die Splits S1 von T1
und S2 von T2 sowie X1 := S1 ⋃ { Split s | s ist kompatibel mit S 1 } und S1 := { Splits in T1 } und X2
analog definiert, kann die Distanz über die Gleichung
ssRF(T1, T2) := |S1 – X2| ⋃ |S2 – X1|
ausgedrückt werden. Die ssRF-Distanz berücksichtigt sowohl die Topologie als auch die
Signifikanz der Äste eines Baumes. Dabei benutzt sie den Bootstrap-Support als Maß für das
Vertrauen in die Äste: solche oberhalb des gesetzten Schwellenwerts werden als signifikant
bewertet, wohingegen solche unter dem Schwellenwert in einem Vergleich zweier Bäume ignoriert
werden. Für die Newick-Repräsentation eines Baumes bedeutet dies, daß von einem Ast ausgehende
Teilbäume, welcher einen zu niedrigen Bootstrap-Support besitzt, in Multifurkationen
zusammengezogen werden.
6.2.2
Vergleich zweier E. coli-Phylogenien auf konservierten Genen
Um die Praxistauglichkeit der entwickelten Distanzmethode zu testen, wurden zwei Phylogenien
mit jeweils 61 Escherichia coli-Stämmen miteinander verglichen, die zuvor mit einem MaximumLikelihood-Ansatz auf einem Alignment aus 29 konkatenierten konservierten Genfamilien (COGs)
inferiert worden waren. Der in Abbildung 6.1 links dargestellte Baum zeigt den E. coli-Teil einer
Phylogenie mit ursprünglich 61 E. coli- und 25 Salmonellen-Stämmen (Datei outtree_cor im
Verzeichnis
Kapitel_Phylogenien/iTol/iTol_29COGs/EC_iTol_29COGs/MMN/data/alignments/
gblocks_reverse_concatenated), der nach der in Kapitel 8, Abschnitt 2.2.4 dargestellten Methode
konstruiert wurde. Der rechte Baum basiert auf COGs mit E. coli- und Salmonellen-Genen (Datei
outtree_cor im Ordner Kapitel_Phylogenien/iTol/iTol_29COGs/ECSA_iTol_29COGs/MMN/data/
alignments/gblocks_reverse/concatenated). Seine Konstruktion wird an der gleichen Stelle
beschrieben. Die Beschreibungen beziehen sich allerdings auf die dort abgedruckten Bäume, die auf
26 COGs basieren.
6.2.3
Algorithmus zur Berechnung des ssRF-Abstands
Das Perl-Programm computeSSRF.pl (Verzeichnis Distanzmaß) wurde entwickelt, um den
ssRF-Abstand zwischen zwei ungewurzelten, bifurzierenden phylogenetischen Bäumen mit BSW
an allen Ästen zu berechnen. Es setzt als Signifikanzschwellen alle unterschiedlichen BSW ein, die
in den beiden zu vergleichenden Bäumen existieren, und liefert eine Tabelle der ssRF-Distanzen
zwischen ihnen pro Signifikanzschwelle zurück.
Beim Aufruf von einer Linux-Shell nimmt das Programm zwei separate Dateien als Eingabe
entgegen (Schalter -i und -j), von der jede genau einen Newick-Ausdruck enthalten muß. Dieser
wird abgewiesen, und das Programm wird vorzeitig beendet, falls er nicht geeignet ist, d. h. er
entweder keine BSW enthält oder nicht wohldefiniert ist. Im nächsten Schritt werden die Taxa aus
24
dem ersten Baum, T1, entfernt, die nicht auch im zweiten Baum, T2, zu finden sind. Das kann
bedenkenlos gemacht werden, da Taxa, welche nur in einem Baum vorhanden sind, nicht zur ssRFDistanz beitragen. Zur Ermittlung der Menge aller Signifikanzschwellen wird eine Liste aller BSW
in beiden Bäumen erstellt. Danach werden für jede Schwelle b die Split-Zerlegungen für T1 und T2
bestimmt3. Aus dieser Menge werden die Splits kleiner b entfernt. Die verbleibenden Splits in T1
werden als S1 bezeichnet, die verbleibenden Splits in T2 als S2. Dann wird die Menge C1 der Splits in
T1, die kompatibel mit T2 sind, berechnet und ebenso die Menge C2 der Splits in T2, die kompatibel
mit T1 sind. Als letzter Schritt wird der Abstand ssRF(T1,T2) über |S1| – |C1| + |S2| – |C2| berechnet.
Abschließend wird die Ergebnistabelle ausgegeben.
Das Programm gibt neben der ssRF-Distanz auch die RF-Distanz (RF), die gewichtete RF-Distanz
(RFW), welche BSW als Gewichte benutzt, die Zahl der Splits sowie die Zahl kompatibler und
gemeinsamer Splits aus (vgl. Tabelle 6.1).
Bei der Berechnung der RFW-Distanz folgt computeSSRF standardmäßig der Definition von Shi und
Kollegen, wie diese sie in ihrer Arbeit (Shi et al., 2010) verwendet haben. Sie entspricht in zwei
Punkten nicht der ursprünglichen Definition von Robinson und Foulds (Robinson und Foulds,
1979). Robinson und Foulds addieren zusätzlich noch einen weiteren Term, nämlich die Summe der
BSW für die Splits, die nur in einem der Bäume vorhanden sind, aber nicht im anderen, und
andersherum. Für das vorliegende Programm ist diese ursprüngliche Definition jedoch nicht
sinnvoll, denn es soll RFW = 0 liefern, wenn zwei identische, bifurzierende Phylogenien sich nur in
den (signifikanten) Gewichten an den Ästen unterscheiden.
Algorithmus 6.1: Berechnung des ssRF-Abstands mit dem Programm computeSSRF
Eingabe:
Ausgabe:
Zwei Dateien mit jeweils einem Newick-Ausdruck inkl. Bootstrap-Werten
Tabelle mit ssRF-Abständen für alle Signifikanzschwellen
Lies die Bäume T1 und T2 aus den Newick-Ausdrücken
Entferne aus T1 die Taxa, die nicht in T2 sind
Entferne aus T2 die Taxa, die nicht in T1 sind
Bestimme die Menge B aller individuellen Bootstrap-Werte in T1 und T2
Foreach b in B
/* alle Bootstrap-Werte bzw. Signifikanzschwellen */
Berechne die Splits-Zerlegung S1 für T1
Berechne die Splits-Zerlegung S2 für T2
Entferne aus S1 die Splits mit einem Bootstrap-Wert kleiner b
Entferne aus S2 die Splits mit einem Bootstrap-Wert kleiner b
S1 := Menge der verbliebenen Splits in T1
S2 := Menge der verbliebenen Splits in T2
Berechne die Menge C1 der Splits in T1, die mit (allen Splits in) T2 kompatibel sind
Berechne die Menge C2 der Splits in T2, die mit (allen Splits in) T1 kompatibel sind
Distanz := ssRF(T1, T2) = |S1| – |C1| + |S2| - |C2|
End
Gib die Tabelle der Distanzen pro Signifikanzschwelle aus
Algorithmus 6.1: Berechnung des ssRF-Abstands mit computeSSRF
Sollte die Addition des Terms ausdrücklich erwünscht sein, kann das durch Hinzufügen des
Schalters -a erzwungen werden. Ferner nehmen Shi und Kollegen im Gegensatz zu Robinson und
3 Das Programm für die Zerlegung der Splits wurde von Christian Eßer für seine Dissertation (Eßer, 2010) entwickelt und vom Verfasser
für die Benutzung im Programm computeSSRF modifiziert (siehe Kapitel 4).
25
Foulds eine Normierung vor, indem sie RFW noch durch die Summe der Zahl der Splits
ausschließlich im ersten Baum zuzüglich der Zahl der Splits im zweiten Baum teilen (falls -a
gesetzt ist, wird zu dieser Summe noch die Zahl der Splits, die die Bäume gemeinsam haben,
addiert). Mit dem Schalter -n kann diese Normierung unterbunden werden.
Wurde der Schalter -w gesetzt und dabei ein Verzeichnis angegeben, speichert das Programm dort
zusätzliche Daten für jede Bootstrap-Schwelle, die während des Programmlaufs generiert werden:
die Splits pro Baum, die Splits in Baum 1, die zu Baum 2 kompatibel sind und andersherum,
inkompatible Splits sowie die Splits, die beide Bäume gemeinsam haben. Der Name der Dateien
beginnt immer mit einem der Präfixes „tree1_“ oder „tree2_“, dann folgt eine Zeichenkette, die die
Art der enthaltenen Daten angibt, gefolgt von dem Suffix „_bs_140.txt“, falls 140 die BootstrapSchwelle ist, für die diese Daten erzeugt wurden. Algorithmus 6.1 faßt den Ablauf zusammen.
6.3
Ergebnisse
Für die beiden in Abbildung 6.1 gezeigten Escherichia coli-Phylogenien wurden die ssRFDistanzen mit dem Programm computeSSRF mit den Standardeinstellungen berechnet. Der Aufruf
erfolgte über perl computeSSRF.pl -i ec_iTol_alt.tre -j ec_iTol_neu.tre
-w Lauf innerhalb des Ordners Distanzmaß.
Abbildung 6.2 visualisiert die Verzweigungsmuster der beiden Phylogenien bei Bootstrap-Schwelle
151. Die Phylogenien weisen an mehreren Stellen unmittelbar sichtbare strukturelle
Gemeinsamkeiten auf, die in der Abbildung jeweils in der gleichen Farbe hervorgehoben sind. Die
in Abbildung 6.1 rot eingefärbten Äste und weitere Äste mit einem niedrigeren BSW als 151 sind
in den Bäumen nicht mehr enthalten. Die betroffenen Teilbäume wurden an Multifurkationen
zusammengezogen. Für den initialen Zustand, d. h., alle Splits sind vorhanden, ist der RF-Abstand
zwischen den Bäumen 62, der ssRF-Abstand ebenfalls. Mit steigender Signifikanzschwelle nimmt
die Zahl der Splits in beiden Bäumen ab, ebenso die Zahl gemeinsamer Splits. Aus diesen Größen
ergibt sich direkt die RF-Distanz, die entsprechend sinkt. Die Zahl kompatibler Splits ist von der
Zahl der Multifurkationen in den Bäumen abhängig. Da letztere Zahl sowohl zwischen den Bäumen
als auch bei unterschiedlichen Schwellen schwankt, verhält sie sich monoton, jedoch nicht streng
monoton4. Insgesamt sinkt die Zahl kompatibler Splits jedoch, bis sie am Ende der noch in den
Bäumen vorhandenen Zahl der Splits gleicht. Die gewichtete RF-Distanz steigt im Beispiel, von
Ausnahmen abgesehen, insgesamt an, da mit höherer Bootstrap-Schwelle auch immer höhere BSW
summiert werden, die aber an einer abnehmenden Zahl von Splits normiert werden. Ein Vergleich
mit den anderen Distanzmaßen bietet sich nicht an. Wie RFW in einem konkreten Anwendungsfall
berechnet wird, muß anhand der Anforderungen entschieden werden.
Im Projektordner befindet sich noch der Unterordner OhneNormierung, der die Ergebnisse für einen
Programmlauf auf den gleichen Bäumen ohne Normierung von RFW enthält. Es fällt auf, daß der
gewichtete RF-Abstand in diesem Fall - wie zu erwarten – fällt.
Die ssRF-Distanz zwischen den Bäumen sinkt mit steigender Schwelle monoton und schneller als
die RF-Distanz, da sie zusätzlich von der Entfernung nichtsignifikanter Splits beeinflußt ist (siehe
Abb. 6.3). Bei Bootstrap-Schwelle 139 (ca. 70 %) ist die ssRF-Distanz zwischen den Bäumen 4.
Mit anderen Worten, die Bäume unterscheiden sich durch vier signifikante Splits, wenn man alle
Äste wegläßt, „denen man nicht vertraut“5. Es bietet sich dabei die Interpretation an, daß die Bäume
4 Diese Vermutung wurde nicht mathematisch bewiesen.
5 Ein Ast mit einem BSW von mindestens 70 % wird in phylogenetischen Studien gewöhnlich als signifikant angesehen.
26
zwar grundsätzlich verschieden sind, jedoch in geringerem Maße, als es die symmetrische
Differenz/RF-Distanz suggeriert. Bei Schwelle 151 (vgl. Tab. 6.1) unterscheiden zwei Äste
zwischen den Bäumen, und ab der Schwelle 153 gibt es keinen Split mehr, der zwischen beiden
Bäumen unterscheidet.
ssRF-Distanz zwischen den beiden E. coli-Phylogenien mit
steigender Signifikanzschwelle
62
70
60
50
ssRF
40
30
20
10
4
0
0
20
40
60
80
100 120 140 160 180 200
BOOTSTRAP-SCHWELLE
Abbildung 6.3: ssRF-Abstände pro Signifikanzschwelle zwischen den
verglichenen Phylogenien. Ab Schwelle 151 sind alle Splits (im Diagramm
schwarz) signifikant. Der ssRF-Abstand fällt mit steigender Schwelle monoton.
6.4
Diskussion
In seinem Buch „Inferring Phylogenies“ (Felsenstein, 2004, S. 534) führt Joseph Felsenstein aus,
daß es nur beschränkt sinnvoll ist, nach signifikanter Ähnlichkeit zweier Bäume oder nach
signifikanten Unterschieden zu fragen, wenn dabei die zugrunde liegenden Daten ignoriert werden.
Noch weniger sinnvoll sei die bloße Frage nach Unterschieden, denn sobald es einen Unterschied
gibt, sind die Bäume nicht gleich. Auch ist es zwar möglich, für zwei Bäume festzustellen, daß sie
einander stärker ähneln, als bloßer Zufall es erklären könnte, aber dieses Wissen ist selten hilfreich.
Es können nämlich gemeinsame Merkmale in den Bäumen dafür verantwortlich sein, die in
biologischer Hinsicht irrelevant sind. Felsenstein schränkt allerdings ein, daß es trotzdem sinnvoll
sein kann, explizit nach den signifikanten Unterschieden zwischen zwei Bäumen zu fragen, wenn
das Hauptaugenmerk bei einer phylogenetischen Analyse auf den zugrunde liegenden Daten liegt.
Bisher wurde aber kein Distanzmaß vorgestellt, das einen statistischen Zusammenhang zwischen
Merkmalen in einem Baum und den Daten, die ihn erzeugt haben, herzustellen vermag.
Ebensowenig werden persönliche Präferenzen unterstützt, wie etwa, ob der Mensch eine bestimmte
Eigenheit eines Baumes als wichtig ansieht.
Das in diesem Kapitel vorgestellte Distanzmaß ssRF füllt dieses Lücke ansatzweise, steuert es doch
bei der Distanzberechnung über eine Signifikanzschwelle für BSW oder BPP, welche Äste
berücksichtigt werden und welche nicht. Zwar beruhen Bootstrap-Werte auf einem soliden
statistischen Unterbau, die Wahl der Schwelle vollzieht sich dennoch subjektiv und unterliegt damit
der Präferenz des Benutzers.
27
Im Fall der hier untersuchten E. coli-Phylogenien wäre es verlockend, die Bäume bei
Signifikanzschwelle 153 als „praktisch gleich“ oder „signifikant ähnlich“ zu beschreiben, da es
keinen Split mehr gibt, der zwischen ihnen unterscheidet. Allerdings ließe man dabei die zu diesem
Zeitpunkt eingeführten Multifurkationen außer acht, die darauf hinweisen, daß sich die
Verzweigungsmuster der wahren Bäume möglicherweise beträchtlich voneinander unterscheiden.
Dieser vermeintliche Nachteil des Verfahrens ist allerdings tatsächlich ein Vorteil: bei der
Konstruktion der Phylogenie werden keine signifikanten Daten unterdrückt, und die statistischen
Unsicherheiten in ihnen werden über das veränderte Verzweigungsmuster unmittelbar auf die
Phylogenie abgebildet.
Für welchen Anwendungsfall ergibt sich durch die Benutzung des Distanzmaßes ssRF ein Vorteil?
In diesem Projekt wurde ssRF eingesetzt, um Escherichia coli- oder Salmonellen-Phylogenien
miteinander zu vergleichen, die mit einem Maximum-Likelihood-, einem Bayesianischen Ansatz
oder Neighbor-Joining konstruiert wurden und entweder auf ausgewählten konservierten Genen
oder auf universellen orthologen Genfamilien basieren (vgl. diesbezüglich Kapitel 7 sowie Kapitel
8). Mehrere Phylogenien wiesen hohe strukturelle Gemeinsamkeiten auf. Die Vermutung lag nahe,
daß sich die Bäume ab der als signifikant empfundenen Schwelle von 70 % nicht mehr voneinander
unterscheiden, was durch ihren ssRF-Abstand untermauert werden sollte. Zwar deckte sich dessen
Höhe mit dem subjektiven Empfinden der Ähnlichkeit der Bäume, Unterschiede waren dennoch in
jedem Fall vorhanden. Obwohl im Rahmen dieser Arbeit nicht gänzlich zufriedenstellend, ist die
Verwendung der ssRF-Distanz in vergleichbaren phylogenetischen Studien trotzdem empfehlenswert, bietet sie doch den Vorteil, als unbedeutend empfundene Äste ausblenden 6 und verfolgen zu
können, wie robust eine Phylogenie bei steigender Bootstrap-Schwelle ist.
Gegenüber der symmetrischen Differenz, welche für zwei Phylogenien, die viele Strukturen, aber
keine Partitionen gemeinsam haben, maximal groß werden kann (Felsenstein, 2004, S. 529),
entspricht die ssRF-Distanz eher dem subjektiven Ähnlichkeitsempfinden des Menschen. Sofern die
zu vergleichenden Phylogenien sehr unterschiedlich lange Äste besitzen, sollte zusätzlich der
gewichtete RF-Abstand, der Astlängen als Gewichte benutzt, berechnet werden. Für andere
Anwendungsszenarien sollte eines der in der Einleitung angesprochenen Distanzmaße ausgewählt
werden.
6
Man könnte ssRF dergestalt benutzen, daß man nicht ausschließlich (automatisch generierte) Bootstrap-Gewichte verwendet,
sondern die Gewichte für Äste, von denen man überzeugt ist, manuell sehr hoch setzt. So könnte man einen Teilbaum, dessen
Verzweigungsmuster als gesichert gilt, konservieren. Diese Praxis müßte selbstverständlich begründbar sein.
28
Bootstrap- Zahl der Splits Zahl der Splits Zahl gemeinsamer
Schwelle
in Baum 1
in Baum 2
Splits
9
14
17
23
25
32
36
41
42
45
46
48
49
50
51
52
53
55
57
63
66
68
69
71
76
79
81
83
85
101
102
103
105
106
107
109
111
112
113
115
120
121
123
124
129
137
138
139
142
143
145
148
149
151
153
154
156
159
160
162
165
167
168
172
173
177
180
182
183
191
192
193
194
196
198
199
58
57
55
54
53
52
51
50
49
49
49
48
48
46
46
46
45
45
45
44
44
42
41
41
40
40
40
40
40
38
36
35
34
33
32
32
31
30
30
30
29
28
26
26
26
25
25
25
24
24
24
24
24
24
24
23
22
21
20
20
20
19
19
18
17
16
15
14
13
12
12
12
12
10
8
7
58
58
58
58
58
58
58
57
56
55
54
54
53
53
52
51
51
50
49
49
48
48
48
47
47
46
45
44
43
43
43
43
43
43
43
42
42
42
41
40
39
37
37
37
36
36
35
34
34
33
32
31
30
29
26
26
26
26
26
25
24
24
23
23
23
23
23
22
22
22
21
20
19
19
16
15
27
27
27
27
27
26
26
26
26
26
26
26
26
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
24
24
23
23
23
23
23
22
22
22
22
22
22
21
20
20
20
20
19
19
18
17
17
17
17
17
17
17
17
17
17
17
17
17
17
17
16
15
14
13
12
11
11
11
11
10
8
7
Zahl kompatibler
Splits in Baum 1
Zahl kompatibler
Splits in Baum 2
27
27
27
27
27
26
26
26
26
27
27
26
26
25
25
25
25
26
26
26
26
25
25
25
25
25
29
29
29
28
27
27
26
26
25
25
25
24
25
25
24
23
22
22
22
22
22
23
22
22
22
23
23
23
24
23
22
21
20
20
20
19
19
18
17
16
15
14
13
12
12
12
12
10
8
7
27
27
29
31
32
32
32
32
31
31
31
31
30
32
31
31
31
31
30
32
31
32
32
32
33
33
33
33
32
33
34
34
34
34
34
33
34
34
34
33
32
31
32
32
31
33
32
32
32
31
30
30
29
28
26
26
26
26
26
25
24
24
23
23
23
23
23
22
22
22
21
20
19
19
16
15
RFDistanz
62
61
59
58
57
58
57
55
53
52
51
50
49
49
48
47
46
45
44
43
42
40
39
38
37
36
35
34
35
33
33
32
31
30
29
30
29
28
27
26
24
23
23
23
22
21
22
21
22
23
22
21
20
19
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
8
9
10
10
11
12
11
10
9
9
8
8
Gewichtete
RF-Distanz
45
46
47
48
49
48
49
50
51
52
53
53
54
56
56
57
58
59
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
67
69
69
70
71
72
72
72
73
74
75
75
77
78
79
80
81
81
81
82
82
83
83
84
84
85
87
88
88
89
90
91
92
93
95
96
97
97
97
98
98
98
98
99
99
99
99
100
ssRFDistanz
62
61
57
54
52
52
51
49
48
46
45
45
45
42
42
41
40
38
38
35
35
33
32
31
29
28
23
22
22
20
18
17
17
16
16
16
14
14
12
12
12
11
9
9
9
6
6
4
4
4
4
2
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Tabelle 6.1: Ergebnistabelle des computeSSRF-Laufs. Die Tabelle entspricht dem
Inhalt der Datei ssrfDistances.txt im Ordner Distanzmaß/Lauf. Alle Splits ab BootstrapSchwelle 139 (entspricht ca. 70 % des höchsten Bootstrap-Wertes 199) sind
signifikant. Ab Schwelle 153 gibt es keinen signifikanten Split mehr, der zwischen den
Phylogenien unterscheidet.
29
7
Automatisierte Ableitung einer Phylogenie aus
einem Alignment konkatenierter Genfamilien
von E. coli und Salmonellen
Ein Anliegen der vorliegenden Arbeit bestand darin, mit verschiedenen Methoden Phylogenien aller
sequenzierten Escherichia coli- und Salmonellen-Stämme abzuschätzen. Die dazu notwendigen
Arbeitsschritte lassen sich sehr gut automatisieren und somit auch protokollieren. Zu diesem Zweck
wurde das Programm MMN in der Programmiersprache Perl entwickelt, das in diesem Kapitel
vorgestellt wird.
7.1
Funktionalität des Programms MMN
MMN berechnet für einen gegebenen Datensatz molekularer Sequenzen von Escherichia
coli-/Shigellen- und/oder Salmonellen-Stämmen halbautomatisch eine Phylogenie. Die Inferenz
wird mit einem Maximum-Likelihood-Framework auf Grundlage des multiplen Sequenzalignments
der konkatenierten (ggf. universellen) Gene jedes Bakteriums durchgeführt. Das Verfahren benutzt
eine definierte Abfolge von Schritten, von denen jeder über vom Benutzer im Vorfeld einzustellende
Parameter gesteuert werden kann. Ein Schritt kann entweder individuell ausgeführt werden, sofern
alle Daten aus den vorigen Schritten an vorgesehener Stelle in der Ordnerstruktur von MMN
hinterlegt sind, oder es werden alle Schritte hintereinander ausgeführt. Das Programm wird in der
Linux-Shell mittels perl MMNmain.pl aus dem Verzeichnis MMN aufgerufen.
Die Gesamtfunktionalität des Programms wurde auf mehrere Perl-Dateien („packages“) aufgeteilt.
Zum Lesen von Sequenzen aus Dateien in den Formaten FASTA und PHYLIP ist die Installation
des BioPerl-Core-Pakets (Stajich und Birney, 2000) erforderlich. MMN verwendet die aus Tabelle
7.2 ersichtliche Dateistruktur. Das Programm behandelt sämtliche Verzeichnisse als relativ zum
übergeordneten Verzeichnis MMN. Das ermöglicht es, für ein neues Projekt den ganzen Ordner
MMN einfach an eine andere Stelle zu kopieren und alle nicht mehr benötigten Textdateien im
Ordner tables und ggf. nicht mehr notwendige Dateien im Ordner data zu löschen. Weitere
Informationen können dem ausführlich kommentierten Quellcode, insb. der Datei Config.pm im
Ordner Core, entnommen werden.
Es folgt eine Erklärung der Programmschritte (siehe Abb. 7.1):
Download der Sequenzen
Das Programm lädt für jedes in der Datei bacteriaTable.txt markierte Genom die chromosomalen
und plasmidischen Sequenzdaten (Suffixes *.faa, *.fna, *.ppt und *.fna, siehe auch Kapitel 8,
Material und Methoden) in das Verzeichnis downloads_NCBI herunter. Zum jetzigen Zeitpunkt
können nur Escherichia coli/Shigellen- und Salmonellen-Genome benutzt werden.
Zusammenfassen chromosomaler und plasmidischer Proteinsequenzen
Chromosomale und plasmidische Proteinsequenzen werden in neu generierten FASTA-Dateien
zusammengefaßt und im Ordner extendedSeqs gesammelt, ebenso die entsprechenden
30
Informationen zur Genabfolge in den PTT-Dateien. Sowohl chromosomale als auch plasmidische
Sequenzdaten enthalten phylogenetische Signale, die den Gesamtaufbau der Phylogenie bestimmen.
Die Module von MMN
Download der Sequenzdaten vom NCBI-Server
Inferenz des Speziesbaums
Zusammenfassen chromosomaler
und plasmidischer Sequenzdaten
Schätzen des passenden
Modells für Nukleotidevolution
pro Genfamilie (optional)
Blast-Suche
Übersetzen der Protein-MSAs
in Nukleotid-MSAs
Vergleich aller Gene anhand
Syntenie und Sequenzidentität
Inferenz eines Genbaums
pro Genfamilie (optional)
Bestimmung universeller
Genfamilien/Orthogruppen
Einfügen einer künstlichen
Outgroup (optional)
Protein-MSA der konkatenierten
universellen Gene
Abbildung 7.1: Die Module von MMN
MMN erzeugt für jeden Bakterienstamm ein neue FASTA-Datei, indem es die plasmidischen
Proteinsequenzen hinter die chromosomalen schreibt. Das Gleiche geschieht für die PTT-Dateien.
Da alle Gen-Positionsinformationen in aufsteigender Reihenfolge angeordnet sein müssen, werden
die Positionsinformationen für die gerade hinzugefügten plasmidischen Gene neu durchnummeriert.
Die Gen-Start- und Stop-Daten in den FASTA-Dateien werden ebenfalls entsprechend modifiziert.
Das Programm mpBatch, welches die orthologen Gruppen generiert, wäre jetzt in der Lage, hintereinanderstehende chromosomale und plasmidische Proteinsequenzen in den neu erzeugten FASTADateien (Ordner extendedSeqs) als einen zusammenhängenden Block zu interpretieren. Das muß
unterbunden werden, da das biologisch sinnlos ist. Dazu wird in die PTT-Dateien vor die
Positionsinformationen für ein plasmidisches Gen immer ein künstliches Gen einer bestimmten
Länge eingefügt. Die Länge des künstlichen Gens ist stets höher als der Parameter g von mpBatch,
der den maximalen Abstand zwischen zwei zu vergleichenden Sequenzfragmenten angibt.
Blast-Suche
Das Programm blastAll aus dem Basic Local Alignment and Search Tool, Blast (Altschul et al.,
1990), wird eingesetzt, um paarweise Sequenzähnlichkeit, Sequenzidentität und den
Erwartungswert7 (e-value) für alle Genpaare und Bakterien zu berechnen. Dazu wird eine BlastDatenbank im Ordner data/blast/db angelegt. Die Ergebnisse der Blast-Suche werden im Ordner
data/blast/result deponiert. Die Blast-Suche kann auch parallel auf einem Rechencluster erfolgen.
In diesem Fall befinden sich alle Dateien im Ordner data/blast/parallel.
7 BLAST normalisiert den e-value an der Sequenzlänge. Dieser drückt aus, wie hoch die Wahrscheinlichkeit dafür ist, daß die in der
vorliegenden BLAST-Datenbank gefundene Sequenzidentität nur durch Zufall so niedrig ist. Bei Experimenten dient der e-value
gewöhnlich als Schwelle: Genpaare mit einer paarweisen Identität oberhalb dieser Schwelle werden verworfen.
31
Konstruktion orthologer Gruppen bzw. Genfamilien
MMN berechnet orthologe Gruppen (ab jetzt mit „OG“ abgekürzt) für eine vom Benutzer
bestimmbare Untermenge der Bakteriengenome (Datei organisms_synteny.txt im Ordner tables), die
sich im Verzeichnis extendedSeqs befinden. Mit der Wahl einer Untermenge legt der Benutzer
gleichzeitig fest, daß alle anderen Genome in den Folgeschritten ignoriert werden. MMN benutzt die
von Christian Eßer im Rahmen seiner Doktorarbeit entwickelten Perl-Programme mpbatch und
alignomat (Eßer, 2010), deren Funktionsweise in Kapitel 4 dargestellt worden ist. Bei der
Erstellung der Genfamilien bzw. OG berücksichtigt sein Algorithmus Sequenzähnlichkeit und
Syntenie der Gene. Dabei werden aber nur Genkopien berücksichtigt, die in mindestens 50 % aller
Organismen vorhanden sind. Das Hilfsprogramm alignomat schreibt die resultierenden Genfamilien
(Ordner data/synteny/mpBatch_result) in Sequenzdateien im FASTA-Format und legt diese im
Ordner data/synteny/alignomat_result ab.
Bei der Rekonstruktion der Phylogenie sollen nur universelle Gene berücksichtigt werden. Das
Programm speichert daher Genfamilien, für die in jedem Organismus genau eine Kopie vorhanden
ist, im Ordner fullGroups ab und alle anderen in otherGroups. Die Familien in otherGroups werden
- außer bei der Berechnung von Genbäumen - nicht mehr gebraucht.
Anfügen einer künstlichen Outgroup (optional)
Sollte es für ein Projekt, in dem ein Speziesbaum für E. coli-Genome geschätzt wird, sinnvoll
erscheinen, kann MMN einen künstlichen Bakterienstamm aus Genen von Salmonellen-Stämmen
konstruieren. Zweck ist es, mit diesem Stamm eine Outgroup für das E. coli-Phylum im
Speziesbaum zu erhalten. Dazu wird jeder universellen Genfamilie von E. coli ein SalmonellenGen hinzugefügt. MMN inspiziert alle paarweisen Blast-Vergleiche für die Gene innerhalb der
Genfamilie. Dann fügt es das Salmonellen-Gen, das zu allen Genen in der Familie eine maximale
Ähnlichkeit aufweist, der Familie hinzu, sofern der e-value des Salmonellen-Gens nicht höher als
ein vom Benutzer festzulegender Schwellenwert ist. Tritt Letzteres ein, wird die gesamte Familie
von der weiteren Benutzung ausgeschlossen.
Oben dargestelltes Prozedere kann durch Setzen entsprechender Parameter dergestalt abgewandelt
werden, daß einem Speziesbaum für Salmonellen-Stämme eine Outgroup aus E. coli-Genen
hinzugefügt wird. Diese Funktionalität ist im Programm vorhanden, wurde aber in jüngerer Zeit
nicht mehr benutzt. Sie diente ursprünglich dem Zweck, eine Wurzelposition für die ungewurzelte
E. coli- bzw. Salmonellen-Phylogenie vorzuschlagen und so die Phylogenien zu wurzeln, ohne daß
sich dadurch der statistische Support der Äste deutlich verschlechtert 8. Für die konkrete Anwendung
war das aber nicht der Fall.
Multiples Sequenzalignment der Proteine in den universellen Gruppen
Ab diesem Schritt benutzt MMN ausschließlich die universellen Genfamilien, entweder mit oder
ohne künstliche Outgroup. Für jede universelle Familie aus Proteinsequenzen wird ein multiples
Sequenzalignment (MSA) mit MAFFT (Katoh et al., 2002) im Ordner data/alignments/mafft
erzeugt. MAFFT benutzt dazu eine FFT-Methode („Schnelle Fouriertransformation“), die
automatisch die beste ihm zur Verfügung stehende Strategie für die zu alignierenden Sequenzen
wählt. Aus den MSAs werden dann mittels Gblocks (Castresana, 2000) schlecht alignierte und
divergente Regionen entfernt. Die modifizierten Alignments werden im Ordner
data/alignments/gblocks abgelegt.
8 Das Wurzeln der Phylogenien gelang mit diesem Vorgehen, aber die Bootstrap-Unterstützung verschlechterte sich deutlich. Es deutet
einiges darauf hin, daß bei der Wahl der an die Orthogruppen anzufügenden Gene ausgerechnet solche ausgewählt wurden, die
wahrscheinlich lateral transferiert worden sind. Dadurch kam es zu widersprüchlichen phylogenetischen Signalen.
32
Inferenz von Genbäumen (optional)
MMN kann Genbäume für die universellen Familien mit der Applikation phyML (Guindon und
Gascuel, 2003) für die Phylogenieinferenz mittels eines Maximum-Likelihood-Ansatzes schätzen.
Vorher müssen die FASTA-Alignments allerdings in das PHYLIP-Format konvertiert werden. Die
Genbäume werden im Ordner data/phyml_GeneTrees gespeichert.
Rückübersetzung der Proteinsequenzen in Nukleotidsequenzen
Da bei der Proteinbiosynthese die Basentripletts in nur eine Aminosäure übersetzt werden,
unterstellt man Nukleotidsequenzen, daß sie ein reicheres phylogenetisches Signal als
Proteinsequenzen tragen. MMN übersetzt daher die vorliegenden multiplen Proteinalignments
zurück in Nukleotidsequenzen, wobei es die von MAFFT eingeführten Gaps konserviert. Da dies
ohne das Wissen, welche Basentripletts ursprünglich in die hier und jetzt sichtbaren Aminosäuren
übersetzt worden sind, nicht ohne Informationsverlust machbar ist, werden die passenden
Nukleotidsequenzen aus den FNA-Dateien als Schablone benutzt.
Der Algorithmus iteriert jeweils über alle Proteinsequenzen in einer ALN-Datei (enthält ein MSA)
im Ordner data/alignments/mafft und übersetzt sie hintereinander zurück in Nukleotidsequenzen.
Die erfolgreich übersetzten MSAs werden im Ordner data/alignments/mafft_reverse gespeichert.
Auffinden der als Schablone dienenden Nukleotidsequenz:
Für eine gegebene Proteinsequenz wird zunächst das Präfix der FASTA-Datei, aus der die Sequenz
ursprünglich stammt, ermittelt. Über das Präfix, eine NC-Nummer, wird die GI-Nummer für das
betreffende Gen der Tabelle synti.consense entnommen, die mit einem Eintrag in der PTT-Datei mit
dem gleichen Präfix korrespondiert. Die gesuchte Nukleotidsequenz wird dann der FFN-Datei mit
der passenden NC-Nummer entnommen.
Rückübersetzung:
Der Algorithmus bewegt sich an der Proteinsequenz (PS) entlang und inspiziert schrittweise jede
Aminosäure. Gleichzeitig bewegt er sich an der Schablone (codierende Region, NS) entlang und
inspiziert schrittweise jedes Basentriplett. Dabei wird das rückübersetzte Nukleotidalignment (NA)
inkrementell erzeugt. Wird ein Basentriplett in der NS aufgefunden, das für die Aminosäure in der
PS codiert, wird das Triplett in das NA aufgenommen. Aus einem Gap in der PS werden drei Gaps
im NA. Ein „X“ in der PS bedeutet, daß die Aminosäure nicht identifiziert werden konnte. Daher
wird das Triplett an der entsprechenden Position in der NS in das NA übernommen. Steht in der PS
ein „J“, gemäß IUPAC-Code für Nukleotide entweder Leucin oder Isoleucin, wird das
entsprechende Triplett ebenfalls in das NA übernommen. Für die restlichen Fälle wird zur
Übersetzung der Basentripletts in Aminosäuren die Übersetzungstabelle für Prokaryoten genutzt,
wie das NCBI sie vorschlägt (Elzanowski und Ostell, 2013).
Sofern es gelungen ist, alle Proteinsequenzen im MSA aus der Quelldatei in Nukleotidsequenzen
zurück zu übersetzen, wird eine Zieldatei mit einem MSA aus den übersetzten Sequenzen angelegt.
Schlug die Rückübersetzung mindestens einer Sequenz fehl, wird das MSA als unbrauchbar
markiert. Das bedeutet, daß keine Sequenz in dieser Datei bei der Berechnung des Speziesbaumes
berücksichtigt wird.
Während der Rückübersetzung können zwei Fehler geschehen:
•
Der Algorithmus trifft in der Mitte der PS auf eine Aminosäure, die nicht zum vorgefundenen Basentriplett paßt. Dieser Fehler ist fatal und führt dazu, daß das gesamte
Ursprungsalignment - die Genfamilie - zukünftig ignoriert wird.
33
•
Eine NS beginnt mit einem anderen Startcodon als „ATG“ 9. Der Algorithmus toleriert dies
zunächst und schreibt das Codon in das NA. Trifft er danach allerdings nochmals auf ein
Basentriplett, das er nicht in die angetroffene Aminosäure übersetzen kann, bricht er die
Rückübersetzung ab. Auch dieser Fehler ist fatal.
Gblocks (Castresana, 2000) wird nochmals eingesetzt, um aus den resultierenden NAs im Ordner
data/alignments/mafft_reverse schlecht alignierte oder divergente Regionen zu entfernen. Die
modifizierten Alignments befinden sich im Ordner data/alignments/gblocks_reverse. Diese werden
dann mittels BioPerl (Stajich und Birney, 2000) in das PHYLIP-Format10 übersetzt und in
data/alignments/phylip gespeichert.
Auswahl eines Modells für Nukleotidevolution je universeller Genfamilie (optional)
Für jedes Nukleotidalignment kann das Java-basierte Werkzeug JModeltest2 das auf die Sequenzen
am besten passende Modell für Nukleotidevolution schätzen. Das Modell für ein bestimmtes
Alignment kommt dann bei der Ableitung des entsprechenden Genaumes zum Einsatz, indem es als
Parameter für phyML spezifiziert wird. Bei der Ableitung des Speziesbaumes wird standardmäßig
das Modell für Nukleotidevolution verwendet, das am häufigsten von JModeltest2 vorgeschlagen
worden ist.
Für die Auswahl eines Modells bedient sich JModeltest2 des Akaike Information Criterions, AIC.
David Posada und Thomas R. Buckley (Posada und Buckley, 2004) und auch Diego Pol (Pol, 2004)
heben hervor, daß eine bayesianische, insbesondere eine auf dem AIC beruhende Strategie für die
Modellauswahl mehrere Vorteile gegenüber einer solchen besitzt, die den oft benutzten Likelihood
Ratio Test, LRT (Felsenstein, 1973; Felsenstein, 1981), benutzt. Einer der Vorteile besteht darin, daß
eine AIC-basierte Strategie zur gleichen Zeit verschachtelte und nicht-verschachtelte Modelle
vergleichen kann. MMN führt für jedes Nukleotid-MSA im Ordner data/alignments/phylip einen
Test durch und schreibt die Ergebnisse in den Ordner data/modeltests.
Inferenz des Speziesbaumes
Im letzten Schritt schätzt MMN einen Speziesbaum für alle Bakterien. Es gibt zwei grundsätzlich
verschiedene Strategien zur Abschätzung einer Phylogenie auf Grundlage von Genen bzw.
Genfamilien. Die eine besteht darin, einen Consensus-Baum aus den individuell geschätzten
Genbäumen zu berechnen, die andere, Gensequenzen in einem universellen Alignment
zusammenzufassen und für dieses einen Speziesbaum zu schätzen. Gadagkar und Mitautoren
(Gadagkar et al., 2005) berichten, daß letzterer Ansatz präzisere Bäume hervorbringt11.
MMN erzeugt ein globales Nukleotid-MSA aus den Nukleotid-MSAs der universellen Genfamilien.
Jede Zeile in diesem MSA enthält die betreffenden Gensequenzen eines Bakteriums
hintereinandergeschrieben. Die Reihenfolge der Gene ist in jeder Zeile identisch. Das globale MSA
wird dann ins PHYLIP-Format übersetzt.
Die Bauminferenz geschieht mittels PhyML der Autoren Stephane Gascuel und Olivier Guindon
(Guindon und Gascuel, 2003). PhyML erwartet als Argumente ein MSA und ein Modell für
Nukleotidevolution. Als Modell sollte das gewählt werden, das JModeltest2 am häufigsten als das
9 Die Translation der DNS bei Bakterien und Archaeen kann auch über die Codons „GTG“ oder „TTG“ bzw. über „AUG“, „GUG“ und
„UUG“ bei mRNA initiiert werden (Elzanowski und Ostell, 2013), aber der Algorithmus sucht nicht gezielt nach diesen Codons.
10 Gelegentlich erfolgte die Konvertierung extern mit dem Programm sortal.pl. Dieses von einem unbekannten Autor verfaßte
Programm wurde von Gabriel Gelius-Dietrich, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, für seine Doktorarbeit (Gelius-Dietrich, 2008)
modifiziert.
11 Eine schon vor der Jahrtausendwende entbrannte Kontroverse („total evidence debate“, nachzulesen z. B. bei Felsenstein, 2004, S.
536) zwischen Befürwortern und Gegnern von Konkatenationsmethoden ist zum jetzigen Zeitpunkt (Frühjahr 2014) noch nicht beigelegt.
34
zu den universellen Genfamilien passende bestimmt hat 12. Zurzeit muß das Modell noch manuell in
der Datei BuildSpeciesTree.pm in Zeile 571 festgelegt werden.
MMN fordert, daß in einem vorhergehenden Programmschritt das MSA mit dem festen Namen
fgRevNucGenome_ALL.faa.phy im Ordner data/alignments/gblocks_reverse/concatenated angelegt
worden ist.
7.2
Ablaufsteuerung der Module von MMN
Es folgt an dieser Stelle eine Kurzerklärung der Parameter in der Datei Config.pm. Genauere
Informationen zum Gebrauch der Parameter sind in der Datei selbst und in Tabelle 7.3 zu finden,
insbesondere die Speicherorte der jeweiligen Datentypen relativ zum Ordner MMN. Tabelle 7.1 gibt
über den Aufbau von Config.pm Auskunft.
Der Benutzer legt mit den in Tabelle 7.3 beschriebenen Schaltern fest, welche Module von MMN
ausgeführt werden. Gültige Belegungen für jeden Schalter sind 0 oder 1. Für die Mehrzahl der
Schalter ist nur eine Stellung dargestellt. Es handelt sich dabei um Programmfunktionalitäten, die
aus bereits vorhandenen Daten neue Daten erzeugen. Wird der Schalter so eingestellt, daß keine
neuen Daten erzeugt werden, erwartet das Programm, daß die Daten bereits an der richtigen Stelle
innerhalb des Ordners data vorhanden sind. Sofern neue Daten erzeugt werden, werden die Daten,
die sich bereits im Zielverzeichnis befinden, in eines der Backup-Verzeichnisse verschoben (vgl.
Datei Config.pm, Zeilen 268 - 356) und dabei mit einem Zeitstempel versehen.
Programminterne Parameter (brauchen normalerweise nicht verändert werden)
Zeilen 106 - 214
Zeilen 268 - 356
Zeilen 357 - 433
Zeilen 757 - 768
Von MMN benutzte Verzeichnisnamen relativ zum Ordner MMN
Backup-Verzeichnisse
Programminterne Listen, Hashes und Skalare
Beschaffung des Zeitstempels
Vom Benutzer ggf. zu ändernde Parameter
Zeilen 215 – 267 Verzeichnisse mit den Executables der externen Programme Blast, MAFFT, Gblocks, PhyML, PHYLIP,
Java, JModelTest2, PAUP innerhalb des Ordners exec
Hinweis: Es kann vorkommen, daß auf einem individuellen System ein externes Programm aufgrund
fehlender Benutzerrechte nicht innerhalb des Ordners exec installiert werden darf.
Zeilen 434 - 481 Parameter für die Programme Blast, mpBatch, MAFFT, jModeltTest2, phyML
Zeilen 487 - 750 Schalter für die Ablaufsteuerung von MMN
Tabelle 7.1: Aufbau der Konfigurationsdatei Config.pm
Die meisten zeitkritischen Module wurden sowohl für eine sequentielle als auch für eine parallele
Abarbeitung auf Rechenclustern vorbereitet. Hier werden nur die Parameter für die stabile
sequentielle Abarbeitung gezeigt. Erklärungen zu den Parametern für die parallelen Methoden
können der Datei Config.pm sowie den verschiedenen Programmteilen entnommen werden.
12 Es ist biologisch unwahrscheinlich, daß durch die Benutzung lediglich eines einzelnen Modells die wahre Dynamik in der Evolution
aller Nukleotide im gesamten MSA nachgebildet wird. Bis dato kennt die Forschung im Zusammenhang mit Konkatenationsmethoden
allerdings keine bessere Möglichkeit.
35
Ordner in MMN
Datei
Erklärung
/tables
bacteriaTable.txt
Textdatei mit den Verzeichnisnamen der Bakteriengenome auf NCBI.
Gewünschte Genome werden mit „i“ oder „o“ markiert. Die Datei wird
auf Wunsch des Benutzers neu konstruiert.
NCBI-Nummern aller Dateien mit chromosomalen Sequenzen
Verzeichnisnamen der Genome und zugehörige Dateien
Aufbau wie filesPerStrain.txt; Genome, die für die Konstruktion
orthologer Gruppen benutzt werden sollen, werden mittels „x“
markiert.
Ordnet jeder NCBI-Nummer eines der Schlagworte „chromosomal“
oder „plasmidisch“ zu.
chromosomeFiles.txt
filesPerStrain.txt
organismsSynteny.txt
sequenceType.txt
/exec
/Core
Verzeichnisse der Linux-Executables Blast, MAFFT, Gblocks etc.
Config.pm
AddSingleBestHitToOGs.pm
alignomat.pl
BuildBlastDB.pm
BuildGeneTrees.pm
CalculateSynteny.pm
InitProject.pm
MakeAlignments.pm
MakeOrthologs.pm
mp_batch_013.pl
PerformBlast.pm
ReconstructAncestralStates.pm
/IO
AppendChromosomesPlasmids.pm
AssignNames.pm
GetSequences.pm
RevTransSeq.pm
/data
alignments/
blast/
downloads_NCBI/
extendedSeqs/
modeltests/
phyml_GeneTrees/
phyml_SpeciesTrees/
synteny/
MMNMain.pl
Hauptprogramm
Sämtliche Einstellungen werden in diesem Modul vorgenommen.
Fügt jeder orthologen Gruppe von E. coli-Genen das am besten
passende Salmonellen-Gen hinzu. In der letzten MMN-Version
wurde diese Funktionalität nicht mehr gebraucht.
Setzt das Ergebnis von mp_batch_013.pl zu orthologen Gruppen
zusammen (Autor: Christian Eßer)
Erstellt eine Blast-Datenbank
Erlaubt die Konstruktion von Genbäumen mit verschiedenen
Methoden
Integriert die von Christian Eßer realisierten Funktionalitäten in MMN
Erzeugt alle notwendigen Verzeichnisse, nimmt Prüfarbeiten vor.
Erzeugt multiple Alignments mit MAFFT und entfernt uninformative
Regionen
Separiert universelle Genfamilien von den berechneten
Orthogruppen.
Berechnet den Abstand zwischen Genen basierend auf Ähnlichkeit
und Syntenie
Führt eine Blast-Suche auf den Sequenzen im Datensatz durch.
Inferiert den anzestralen Gengehalt für die Spezies im Datensatz
unter Verwendung von PAUP, wird in der neuesten MMN-Version
nicht mehr verwendet.
Faßt chromosomale und plasmidische Sequenzen in neuen Dateien
zusammen, modifiziert ebenfalls die PTT-Dateien.
Ordnet den heruntergeladenen Dateien die im Projekt verwendeten
Kürzel zu.
Lädt die ausgewählten Dateien vom NCBI-Server herunter.
Übersetzt ein Alignment von Proteinsequenzen in Nukleotidsequenzen und verwendet die Original-Nukleotidsequenzen
als Schablone.
Multiple Protein- und Nukleotidalignments im FASTA- und PHYLIPFormat
Blast-Datenbank und Ergebnisse der sequentiellen oder parallelen
Blast-Suche
Speicherort der vom NCBI-Server heruntergeladenen Dateien
Speicherort der aus chromosomalen und plasmidischen Sequenzen
zusammengesetzten FASTA- und PTT-Dateien
Ergebnisse von JModeltest pro Genfamilie/Orthogruppe
Genbäume für jede Genfamilie/Orthogruppe
Speziesbaum auf Basis des Alignments der konkatenierten Gene in
den Orthogruppen
Ausgabedateien von mpBatch und Alignomat: alle auf Grundlage von
Sequenzähnlichkeit und Syntenie ermittelten Genfamilien, universelle
Genfamilien („full groups/“), alle anderen Genfamilien
(„otherGroups/“)
Arbeitet sequentiell alle Programmschritte ab. Durch Setzen der
Parameter in der Datei Config.pm werden Schritte ein- oder
ausgeschaltet.
Tabelle 7.2: Verzeichnisstruktur von MMN
36
Schalter für die Ablaufsteuerung (Datei Config.pm, Zeilen 487 - 750)
Herstellung des Datensatzes
rebuildBacteriaList
downloadDataset
checkFiles
Blast-Suche
buildBLASTDB
runBLASTALL
backupIntermediateBLASTResults
1 - Erzeugt eine aktuelle Liste der E. coli/Salmonellen-Genome auf dem FTP-Server
0 - Lädt die in bacteriaTable.txt ausgewählten Sequenzen herunter,
0 - Gleicht herunterzuladende und vorhandene Dateien ab
0 - Erzeugt eine neue Blast-Datenbank
0 - Startet eine neue Blast-Suche
0 - Sichert ein vorhandenes Blast-Ergebnis vor einer neuen Blast-Suche,
1 - sichert keine vorhandenen Blast-Ergebnisse
Erzeugung universeller Proteinfamilien
useExistingBLASTResultFile
0 - Kopiert alle Blast-Ergebnisse in eine neue Datei, sehr aufwendig
calculateSynteny
0 - Berechnet Orthogruppen für die in organisms_synteny.txt markierten Organismen
generateOrthologousGroups
1 - Schreibt die Orthogruppen in FASTA-Dateien und teilt sie in universelle und übrige
Genfamilien auf
appendOrthologousGroups
0 - Fügt den universellen E. coli-Familien ein Salmonellen-Gen an, oder vice versa
tryToAddProteinToAllGroups
Falls appendOrthologousGroups = 0:
0 - Versucht, allen universellen Genfamilien ein Gen anzufügen (siehe Datei Config.pm),
1 - Ignoriert solche Familien, bei denen das vorher nicht gelungen ist (Suffix *.bad)
readBLASTResultInMemory
Falls appendOrthologousGroups = 0:
0 - Liest das vollständige Blast-Ergebnis in den Speicher (schneller),
1 - Liest das Blast-Ergebnis zeilenweise (langsamer, spart Speicherplatz)
addSingleBestEC
Falls appendOrthologousGroups = 0:
0 - MMN soll einen E. coli-Baum mit einem künstlichen Salmonellen-Stamm als Outgroup,
1 - einen Salmonellen-Baum mit einem künstlichen E. coli-Stamm als Outgroup berechnen
Globales Alignment von Proteinsequenzen
buildMultipleAlignment
0 - Berechnet neue MAFFT-Alignments
removeDivergentRegions_AA
0 - Enfernt nichtinformative Positionen aus den Alignments
unifyPHYLIP
0 - kopiert die PHYLIP-Alignments in eine Datei
Rückübersetzung der Protein-MSAs in Nukleotid-MSAs
reverseTranslateFASTA
0 - übersetzt Proteinalignments zurück in Nukleotidalignments
removeDivergentRegions_NT
0 - Enfernt nichtinformative Positionen aus den Alignments
convertFASTAtoPHYLIP
concatenateRevFASTA
convertRevFASTAtoPHYLIP
0 - konvertiert die zurückübersetzten Alignments vom FASTA- ins PHYLIP-Format
0 - konkateniert die zurückübersetzten Alignments und schreibt sie in eine einzige Datei
0 - übersetzt die Datei mit allen FASTA-Alignments in das PHYLIP-Format
Auswahl der Modelle für die Nukleotidevolution
runModeltests
0 - Sucht für jede universelle Genfamilie das passende Modell für Nukleotidevolution
Ableitung der Genbäume
computeGeneTrees
Ableitung des Speziesbaums
computeConcatSpeciesTree
computeSchemeSpeciesTree
useGuideTree**
computeConsenseSpeciesTree
computeModelSpeciesTree
0 - Berechnet Genbäume für alle universellen Genfamilien
0 - Berechnet einen Speziesbaum auf Basis der konkatenierten Gene der universellen
Genfamilien (Voreinstellung)
0 - Berechnet einen Speziesbaum auf Grundlage der konkatenierten Gene ausgewählter
universellen Genfamilien. Es handelt sich dabei um die Familien, für die JModelTest2 in
das gleiche Schema (nicht Modell!) für Nukleotidevolution ausgewählt hat
1 - PhyML verfeinert einen Guide Tree, der vom Benutzer im Ordner data/alignments/
gblocks_reverse/concatenated abgelegt wurde
0 - PhyML schätzt einen Speziesbaum auf Grundlage des MSAs der konkatenierten Gene
aus den universellen Genfamilien
0 - Berechnet einen Consensus-Baum für die Äste in den Genbäumen, die in mindestens
50% der Bäume vorkommen („Majority Rule Consensus“)
0 - Berechnet verschiedene Spezies-Bäume. Falls JModelTest2 für mindestens 20 Proteine
das gleiche Modell für Nukleotidevolution vorgeschlagen hat, wird für diese jeweils ein
Baum konstruiert
Tabelle 7.3: Schalter für die Ablaufsteuerung von MMN
37
8
Inferenz robuster Phylogenien für Escherichia
coli und Salmonellen mit verschiedenen
Methoden und Vergleich mit Literaturbäumen
8.1
Einleitung
Für die Rekonstruktion des anzestralen Lebensstils von Bakterien oder des Nährstoffangebots in
den anzestralen Umgebungen ihrer Vorfahren ist eine statistisch belastbare Rekonstruktion ihrer
phylogenetischen Beziehungen von außerordentlicher Bedeutung. In den letzten beiden Kapiteln
dieser Arbeit werden zwei Projekte vorgestellt, die diese Thematik im Zusammenhang mit lateralem
Gentransfer untersuchen. Dieses Kapitel beschreibt, wie robuste Phylogenien für die 61
Escherichia coli-Stämme und 25 Salmonellen-Serotypen aus Tabelle 8.1 geschätzt wurden.
In Abschnitt 8.2 werden die verschiedenen Methoden beschrieben, die zur Rekonstruktion von
Phylogenien für E. coli und Salmonellen eingesetzt wurden, und die rekonstruierten Phylogenien
werden gezeigt. Zunächst wurden Bäume auf Grundlage eines Alignments der konkatenierten
universellen Genfamilien erstellt. Bäume wurden zunächst unter einem Maximum-LikelihoodAnsatz (Abschnitt 8.2.2.1), danach mit einem Bayesianischen Ansatz (Abschnitt 8.2.2.2) und
schließlich mit Neighbor-Joining (Abschnitt 8.2.2.3) inferiert. Mit einer Methode, die auf einem
Alignment hochkonservierter Genfamilien (sog. COGs, „Clusters of Orthologous Groups“) arbeitet,
wurden ebenfalls Phylogenien geschätzt (Abschnitt 8.2.2.4). Eine deutlich andere Strategie zur
Bauminferenz wird in Abschnitt 8.2.2.5 vorgestellt. Die entsprechende Methode definiert die
Distanz zwischen zwei E. coli-Genomen über die Zahl rekombinanter Regionen zwischen ihnen
und berechnet auf der Matrix aller paarweisen Distanzen einen Neighbor-Joining-Baum.
Abschnitt 8.3 vergleicht die rekonstruierten Phylogenien für E. coli untereinander, ebenso die für
Salmonella. Grundlage dafür ist die statistische Unterstützung ihrer Splits durch die angewandten
Baumrekonstruktionsmethoden. Die Distanzen zwischen den Bäumen werden mit dem vom
Verfasser implementierten Programm computeSSRF (siehe Kapitel 6) berechnet, welches nur Äste,
deren Bootstrap-Support mindestens so hoch wie eine gegebene Schwelle ist, berücksichtigt.
Abschließend werden die E. coli- und Salmonellen-Phylogenien mit Bäumen verglichen, die von
anderen Gruppen publiziert worden sind.
Eine Diskussion der Stärken und Schwächen (Abschnitt 8.4) der verwendeten Methoden sowie der
Versuch einer Bewertung der geschätzten Phylogenien schließen das Kapitel ab.
In der Vergangenheit wurden andere Methoden angewandt, um Phylogenien für die Spezies E. coli
und das Genus Salmonella zu schätzen, da Nukleotidsequenzdaten noch nicht zur Verfügung
standen. Zunächst wurden die Antigene O, H und K zur Unterscheidung der Stämme benutzt (für
ein Review siehe Orskov et al., 1977). Mit der Verfügbarkeit größerer Sammlungen von E. coliStämmen und mit Aufkommen des Verfahrens „Multi-locus enzyme elektrophoresis“ (MLEE)
stellte sich allerdings heraus, daß die Klassifikation nach Serotypen kein geeignetes Werkzeug zur
Unterscheidung der verschiedenen E. coli- und Shigellen-Stämme ist (Ochman und Selander,
1984a; Caugant et al., 1985). Ochman und Selander etablierten im Jahre 1984 ECOR, eine
Referenzsammlung mit 72 E. coli-Stämmen (Ochman und Selander, 1984b). Die Stämme waren so
handverlesen worden, daß sie eine maximale elektrophoretische Diversität und eine möglichst breite
38
E. coli-Genom
NCBI-Nummer
Salmonella enterica serovar-Genom
NCBI-Nummer
IAI1 uid59377
NC 011741
Arizonae 62 z4 z23 RSK2980 uid58191
NC 010067
55989 uid59383
NC 011748
Agona SL483 uid59431
NC 011149
ATCC 8739 uid58783
NC 010468
Choleraesuis SC B67 uid58017
NC 006905
HS
NC 009800
Dublin CT 02021853 uid58917
NC 011204
K-12 substr MG1655 uid57779
NC 000913
Enteritidis P125109 uid59247
NC 011294
K-12 substr W3110 uid161931
NC 007779
Gallinarum 287 91 uid59249
NC 011274
UMN026 uid62981
NC 011751
Gallinarum pullorum RKS5078 uid87035
NC 016831
APEC 01 uid58623
NC 008563
Heidelberg B182 uid162195
NC 017623
S88 uid62979
NC 011742
Heidelberg SL476 uid58973
NC 011083
UTI89 uid58541
NC 007946
Newport SL254 uid58831
NC 011080
ED1a uid59379
NC 011745
Paratyphi A AKU 12601 uid59269
NC 011147
536 uid58531
NC 008253
Paratyphi A ATCC 9150 uid58201
NC 006511
CFT073 uid57915
NC 004431
Paratyphi B SPB7 uid59097
NC 010102
O127:H6 E2348 69 uid59343
NC 011601
Paratyphi C RKS4594 uid59063
NC 012125
IAI39 uid59381
NC 011750
Schwarzengrund CVM19633 uid58915
NC 011094
SMS 3 5 uid58919
NC 010498
Typhi CT18 uid57793
NC 003198
042 uid161985
NC 017626
Typhi P stx 12 uid87001
NC 016832
ABU 83972 uid161975
NC 017631
Typhi Ty2 uid57973
NC 004631
BL21 DE3 uid161947
NC 012971
Typhimurium 14028S uid86059
NC 016856
BL21 DE3 uid161949
NC 012892
Typhimurium 798 uid158047
NC 017046
BW2952 uid59391
NC 012759
Typhimurium LT2 uid57799
NC 003197
B REL606 uid58803
NC 012967
Typhimurium SL1344 uid86645
NC 016810
DH1 uid161951
NC 017625
Typhimurium ST4 74 uid84393
NC 016857
DH1 uid162051
NC 017638
Typhimurium T000240 uid84397
NC 016860
H10407 uid161993
NC 017633
Typhimurium UK 1 uid87049
NC 016863
IHE3034 uid162007
NC 017628
KO11FL uid162099
NC 017660
KO11FL uid52593
NC 016902
Sh. boydii Sb227 uid58215
NC 007613
K-12 substr DH10B uid58979
NC 010473
Sh. boydii CDC3083 94 uid58415
NC 010658
LF82 uid161965
NC 011993
Sh. flexneri 2a 301 uid62907
NC 004741
NA114 uid162139
NC 017644
Sh. flexneri 2a 2457T uid57991
NC 004337
O103:H2 uid41013
NC 013353
Sh. flexneri 5 8401 uid58583
NC 008258
O111:H 11128 uid41023
NC 013364
Sh. dysenteriae Sd197 uid58213
NC 007606
O157:H7 EC4115 uid59091
NC 011353
Sh. flexneri 2002017 uid159233
NC 017328
O157:H7 TW14359 uid59235
NC 013008
Sh. Sonnei 53G uid84383
NC 016822
O26:H11 uid41021
NC 013361
Sh. sonnei Ss046 uid58217
NC 007384
O55:H7 CB9615 uid146655
NC 013941
O55:H7 RM12579 uid162153
NC 017656
O7:K1 CE10 uid162115
NC 017646
O83:H1 NRG 857C uid161987
NC 017634
P12b (O15:H17) uid162061
NC 017663
SE11 uid59425
NC 011415
SE15 uid161939
NC 013654
UM146 uid162043
NC 017632
UMNK88 uid161991
NC 017641
W uid162011
NC 017635
O157:H7 Xuzhou21 uid163995
NC 017906
BL21 Gold DE3 pLysS AG uid59245
NC 012947
D i14 uid162049
NC 017652
D i2 uid162047
NC 017651
O157:H7 EDL933 uid57831
NC 002655
W uid162101
NC 017664
Shigella-Genom
NCBI-Nummer
Tabelle 8.1: In dieser Arbeit verwendete Prokaryotengenome
39
geografische Herkunft aufwiesen und von so vielen verschiedenen Wirten wie möglich stammten.
Sie umfaßte pathogene und nichtpathogene Stämme, von ersteren allerdings lediglich UPEC.
Eine initiale, mit der UPGMA-Methode (Sneath und Sokal, 1974) erfolgte phylogenetische Analyse
der Stämme mittels MLEE führte zur Definition von sechs großen phylogenetischen Gruppen, die
als A, B1, B2, C, D und E bezeichnet wurden (Selander et al., 1987). Anschlußstudien, zunächst die
von Herzer et al. (1990), die Neighbor-Joining benutzte, haben die Definition der großen
phylogenetischen Gruppen für Escherichia coli bestätigt (Desjardins et al., 1995; Clermont et al.,
2000). Die ECOR-Sammlung hat daher eine große Bedeutung für das Studium der Diversität von E.
coli erlangt. Sie wurde später durch die als DEC-Sammlung bezeichnete Kollektion mit 78
Diarrhoe-auslösenden E. coli ergänzt (Whittam et al., 1993).
Als Alternative zu MLEE kam Ende der 90er Jahre „multilocus sequence typing“, MLST, auf. Eine
der ersten Studien, die MLST benutzte, untersuchte die phylogenetischen Beziehungen zwischen
pathogenen Stämmen aus der DEC-Sammlung und anderen pathogenen Stämmen sowie dem
Laborstamm K-12 (Reid et al., 2000). Dazu wurden die Sequenzen mehrerer Housekeeping-Gene
konkateniert und mit der Methode „Split Decomposition“ von Daniel Huson (Huson, 1998)
untersucht. Diese Methode fordert nicht, daß die evolutionären Beziehungen als baumartige
Struktur abgebildet werden müssen. Stattdessen erlaubt sie es, einander widersprechende
phylogenetische Informationen in Form eines Netzes darzustellen. Für die MLST-Daten von E. coli
ergab sich eine überwiegend baumartige Struktur mit Ausnahme eines parallelen Pfades innerhalb
der Gruppe B2. Das legte nahe, daß sich die Daten für eine phylogenetische Analyse eigneten. Die
im Anschluß inferierte Phylogenie stimmt in wesentlichen Zügen mit früheren MLEE-Bäumen
überein (Whittam et al., 1993).
Bis heute (2014) wird die Debatte geführt, ob insbesondere die Evolution der Prokaryoten besser als
Baum (vgl. „Tree of Life“-Hypothese) oder als Netz dargestellt werden sollte. Befürworter von
Netzdarstellungen argumentieren, daß Ereignisse lateralen Gentransfers unbedingt in die
Visualisierung von Stammesgeschichten miteinfließen müssen, da sowohl laterale als auch vertikale
Vererbung allgegenwärtige adaptive Prozesse in der Bakterienevolution sind (Dagan und Martin,
2006; Bapteste und Doolittle, 2007). Verfechter von Baumdarstellungen führen an, daß die
vertikalen phylogenetischen Signale durch lateralen Gentransfer zwar verwässert werden, aber in
der Regel dominant bleiben (Touchon et al., 2009). Der Verfasser hält die Darstellung der
Prokaryotenevolution als Baum für angemessen, da Bakterien ihr genetisches Material verdoppeln
und an jeweils zwei Nachkommen vererben. Dieser Prozeß hat binären Charakter und kann durch
einen bifurzierenden Baum dargestellt werden.
8.2
Material und Methoden
Die für die in diesem Kapitel vorgestellten Analysen benötigten Dateien befinden sich innerhalb der
Ordnerstruktur im Projektordner Kapitel_Phylogenien. Alle nicht vom Autor verfaßten Programme,
die im Text erwähnt werden, wurden in Kapitel 4 beschrieben.
8.2.1
Herkunft der verwendeten Genomdaten
Für die verschiedenen Experimente, die in diesem Kapitel vorgestellt werden, wurden
chromosomale und plasmidische Sequenzdaten für 63 Escherichia coli-, Shigellen- und 25
Salmonellen-Stämme von der Genomdatenbank (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomefs/) des U. S.
40
National Center for Biotechnology Information (NCBI) heruntergeladen. Da die Experimente sich
über einen Zeitraum von ca. drei Jahren erstreckten, wurde der Datensatz sukzessive auf immer
mehr Organismen ausgedehnt. Die hier vorgestellten Experimente beziehen sich ausschließlich auf
den letzten Stand von September 2013.
Das NCBI hat ein allgemein akzeptiertes und benutztes Modell für biologische Sequenzdaten
eingeführt (Ostell, 1995; Ostell, 1996), das es erlaubt, unkompliziert Sequenzen logisch miteinander
zu verknüpfen und sie zu annotieren. Die sog. NC-Nummer identifiziert eindeutig genau ein
Chromosom. Für jede NC-Nummer bietet der vom NCBI betriebene FTP-Server Dateien dreier
Typen im FASTA-Format (Lipman und Pearson, 1985) sowie eines vierten, PTT, zum
Herunterladen an:
PTT
Informationen zur Position von Genen innerhalb des Genoms
FAA
Aminosäuresequenzen, nur codierende Regionen
FNA
Nukleotidsequenzen, ganze Chromosomen oder Plasmide als ein Block
FFN
Nukleotidsequenzen, nur codierende Regionen
Für jeden Bakterienstamm wurden jeweils die Dateien dieser vier Formate heruntergeladen. In
vielen Fällen wird neben einer Datei mit chromosomalen Sequenzdaten auch mindestens eine Datei
mit Sequenzen plasmidischen Ursprungs angeboten. Ein Dateiname besteht aus einer NC-Nummer
als Präfix und einem der vier Dateityp-Abkürzungen als Suffix.
Anmerkung: Das für diese Arbeit verfaßte Programm MMN, vorgestellt in Kapitel 7, lädt die
Dateien für den Benutzer vom NCBI FTP-Server selbständig herunter. Es ist lediglich erforderlich,
die gewünschten Genome in einer aktualisierbaren Liste zu markieren.
Tabelle 8.1 zeigt die in dieser Arbeit verwendeten Genome und ihre NC-Nummern.
8.2.2
Escherichia coli- und Salmonellen-Phylogenie auf Grundlage
universeller Genfamilien
8.2.2.1 Inferenz in einem Maximum-Likelihood-Framework
In diesem Unterabschnitt wird dargestellt, wie mit einer Maximum-Likelihood-Methode
Phylogenien für E. coli und Salmonellen und eine gemeinsame Phylogenie auf der Basis
konkatenierter universeller Genfamilien erzeugt wurden, die dann als Referenzbäume EC-Referenz,
SA-Referenz und ECSA-Referenz bei den sich anschließenden Vergleichen mit den mit anderen
Methoden generierten Phylogenien dienen würden. Es wird auch gezeigt, wie äquivalente EC- und
SA-Phylogenien mit einer Bayesianischen Methode geschätzt wurden.
Vorgehen bei der Berechnung der E. coli-Phylogenie
In MMN, dessen Arbeitsweise in Kapitel 7 vorgestellt worden ist, wurde für die Berechnung der E.
coli- und der Salmonellen-Phylogenien die in Tabelle 8.2 gezeigte Parameterbelegung verwendet,
alle anderen Parameter wurden in ihrer Standardeinstellung belassen. Die dargestellte
Parameterbelegung wurde empirisch festgelegt. Der Erwartungswert 0,01 für Blast dient als obere
Schranke für die paarweise Sequenzähnlichkeit der Proteine und filtert damit die Ergebnismenge
von Blast aus dem Ordner Referenzbaeume/MMN_ALL_EC_OKT12/MMN/data/ blast/result).
41
Blast
e
0,01
mpBatch
g
4
m
7
e
0,001
n
75
MAFFT
auto
Gblocks
t
b5
Maximaler Abstand zwischen zwei Hits
Minimale Anzahl Hits
Erwartungswert, sollte höchstens so groß wie der für die BLAST-Suche verwendete
Erwartungswert sein
Schwellenwert für die normalisierte Sequenzidentität
MAFFT bestimmt jeweils die für die Eingabe-Sequenzen am besten geeignete AlignmentMethode selbst
p
a
JModeltest2
s
11
f
i
AICc
g
4
p
v
w
a
PhyML
f
e
v
s
e
BEST
o
n
bootstrap
model
In der Datenbank-Suche verwendeter Erwartungswert („expectation value“)
tl
1
100
TN93
Sequenztyp ist „Protein“
Erlaubte Gap-Positionen: alle; Alignment-Positionen mit Gaps werden genauso wie andere
behandelt. Die resultierenden Alignments enthalten u. U. Gaps.
Zahl der Substitutions-Schemata
Benutzt Modelle mit ungleichen Basen-Frequenzen
Benutzt Modelle mit einem Anteil invariabler Positionen
Berechnet das korrigierte Akaike-Informations-Kriterium
Benutzt Modelle mit variabler Substitutionsrate zwischen den Positionen, 4 Kategorien
Schätzt die Wichtigkeit der Parameter („Parameter Importance“)
Benutzt Model Averaging und Parameter Importance
Schreibt einen PAUP-Block (nicht benutzt)
Schätzt eine über alle Modelle gemittelte Phylogenie für jedes aktive Kriterium
Bestimmt die Equilibrium-Frequenzen der Nukleotide empirisch durch Zählen der verschiedenen
Basen im Alignment
Schätzt den Anteil invarianter Positionen über Maximum-Likelihood
Sucht die beste Baumtopologie auf Grundlage von NNI („Nearest Neighbor Interchange“) und SPR
(„Subtree Pruning and Regrafting“)
Optimiert Baumtopologie und Astlängen
Analysiert einen einzigen Datensatz
Berechnet 100 Bootstrap-Replikate
Benutzt als Modell für die Nukleotidsubstitution „Tamura-Nei 1993“ (TN93 wurde von JModeltest2
vorher am häufigsten als das am besten geeignete Modell identifiziert. Diese Aussage bezieht sich auf
die Alignments im Ordner Referenzbaeume/MMN_ALL_EC_ohne_009801_002695/MMN/data/alignments/gblocks_reverse.
Tabelle 8.2: Für die Berechnung der Referenz-Phylogenien verwendete MMN-Parameter
Das Programm mpBatch (Eßer, 2010) arbeitet auf dieser Ergebnismenge und filtert sie nochmals
über einen eigenen Erwartungswert, hier 0,001. Es ermittelt orthologe Gruppen bzw. Genfamilien
aufgrund von Sequenzähnlichkeit und Syntenie. Mit Blick auf die konkret verwendete
Parameterbelegung sind beide Kriterien erfüllt, wenn das Programm beim Vergleich zweier
Regionen 7 Gene in Folge findet, die maximal jeweils einen Abstand 4 voneinander haben und
deren paarweise Sequenzidentität mindestens 75 % ist. Die Arbeitsweise des Programms wurde in
Kapitel 4 dargestellt. Sie folgt inhaltlich den Ausführungen in Eßer, 2010.
Die orthologen Gruppen befinden sich in den Ordnern Referenzbaeume/MMN_ALL_EC_OKT12/
MMN/data/synteny/fullGroups bzw. /otherGroups. Multiple Alignments für die universellen
Genfamilien wurden mittels MAFFT (Katoh et al., 2002) generiert, das die zu verwendenden
Parameter selbst bestimmt. MAFFT wurde aufgrund seiner Schnelligkeit benutzt, insbesondere
rechnet es parallel auf mehreren Threads. Die Alignments sind im Ordner
Referenzbaeume/MMN_ALL_EC_OKT12/MMN/data/ alignments/mafft abgelegt.
Gblocks (Castresana, 2000) entfernt schlecht alignierte und divergente Regionen aus den
Alignments. Der verwendete Parameter legt fest, daß es dabei nicht alle Gaps bzw. einen Anteil von
Gaps entfernt, sondern sie nicht anders behandelt als jede andere Position. Die dadurch
42
resultierenden Blocks dürfen also Gaps enthalten. Aus Zeitgründen wurde hier nicht mit
unterschiedlichen Parametersetzungen experimentiert. Auch ist unklar, welche Parametersetzung
der biologischen Wirklichkeit am besten entspricht. Die Alignments befinden sich im Ordner
Referenzbaeume/MMN_ALL_EC_OKT12/MMN/data/alignments/gblocks.
Die Proteinalignments wurden in MMN mit den ursprünglichen Nukleotidsequenzen als Schablone
zurück in Nukleotidalignments übersetzt, wobei Gap-Positionen beibehalten wurden. Für jedes
Nukleotidalignment schätzt JModeltest2 (Darriba et al., 2012) das am besten zu den vorgefundenen
Nukleotiden passende Modell für die Nukleotidsubstitution. Die verwendete Parameterbelegung
stellt einen Kompromiß zwischen Genauigkeit und Rechenaufwand dar. Für die vorgelegten
universellen Genfamilien von E. coli wählte JModeltest2 am häufigsten das Modell TN93 von
Tamura und Nei als passend aus. Die rückübersetzten Nukleotid-Alignments befinden sich im
Ordner Referenzbaeume/MMN_ALL_EC_OKT12/MMN/data/alignments/mafft_reverse.
Vor der Berechnung des Speziesbaumes konkateniert MMN die Genfamilien im Ordner
Referenzbaeume/MMN_ALL_EC_OKT12/MMN/data/alignments/gblocks_reverse und konvertiert
das resultierende multiple Sequenzalignment (MSA) in das PHYLIP-Format. Der E. coliSpeziesbaum für alle 63 vollständig sequenzierten Genome, hier nicht gezeigt, wurde mit PhyML
(Guindon und Gascuel, 2003) aus diesem MSA der konkatenierten Genfamilien (Datei
fgRevNucGenome_ALL.faa.phy im Ordner MMN_ALL_EC_OKT12/MMN/data/alignments/
gblocks_reverse/concatenated) berechnet. Als Nukleotidsubstitutionsmodell wurde TN93 gewählt,
das die Dynamik in der Evolution aller Nukleotide im MSA näherungsweise beschreibt13.
Aus den 100 Bootstrap-Replikaten in der Datei fgRevNucGenome_ALL.faa.phy_phyml_boot_
trees.txt wurde mit dem Programm consense aus der PHYLIP-Suite (Felsenstein et al., 1980) unter
der erweiterten Majoritätsregel MRe ein Consensus-Baum (Datei ec_outtree_phyml) mit BootstrapZahlen an den Ästen berechnet.
Anmerkung: PHYLIP consense liefert Newick-Ausdrücke, in denen allen Bootstrap-Zahlen immer
ein Doppelpunkt vorausgeht. Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Programme erwarten
jedoch Bootstrap-Zahlen direkt nach einer schließenden Klammer. Daher wurden alle von consense
produzierten Newick-Ausdrücke zunächst in dieses Format gebracht. Auf diese Tatsache wird ab
jetzt nicht mehr gesondert hingewiesen.
E. coli-Baum mit 61 Stämmen
Der Baum für alle 63 vollständig sequenzierten E. coli- und Shigellen-Stämme enthält 54
Escherichia coli-Stämme und 9 Shigellen. Die Äste der Teilbäume, in denen sich diese Stämme
befinden, weisen teilweise einen unzureichenden Bootstrap-Support von deutlich unter 70 % auf.
Für die sich anschließenden Projekte, die in den folgenden Kapiteln dargestellt werden, werden
allerdings statistisch robuste Phylogenien für E. coli und Salmonellen benötigt. Es wurden daher
Experimente angestellt, in deren Verlauf die Taxa NC_011748, NC_009801, NC_002655,
NC_002695, NC_013353 und NC_017906 (siehe Tabelle 8.1 für die entsprechenden Klarnamen)
einzeln oder in unterschiedlicher Kombination entfernt wurden, wobei sich teilweise der BootstrapSupport der Äste im resultierenden Baum verbesserte. Das Optimum wurde mit der Entfernung der
Taxa NC_009801 und NC_002695 erreicht14.
13 Dieses Verfahren stellt mit Sicherheit lediglich eine grobe Näherung an die biologische Realität dar. Es ist unwahrscheinlich, daß die
Dynamik der Nukleotidevolution für viele verschiedene Gene mit nur einem Modell hinreichend genau simuliert werden kann. Bis dato
(2014) kennt man allerdings keine bessere Methode.
14 Die entfernten Stämme lieferten offenbar ein widersprüchliches phylogenetisches Signal. Im Interesse einer robusten Phylogenie
erschien es dem Autor vertretbar, sie zu entfernen.
43
Abbildung 8.1: Phylogenie aller 25 vollständig sequenzierten
Salmonellen (Stand Oktober 2012) auf den konkatenierten
universellen Genfamilien unter einem Maximum-LikelihoodFramework. Es wurden 200 Bootstrap-Replikate berechnet. Die
Astlängen sind proportional dargestellt. Alle Äste haben einen
Bootstrap-Support von über 70 Prozent.
Taxa, deren Entfernung die Inferenz von Verwandtschaftsverhältnissen zwischen betrachteten
Organismen stark beeinflußt, werden in der Literatur als „instabile Taxa“ (engl. „unstable taxa“)
bezeichnet. Diego Pol und Ignacio H. Escapa haben ein Protokoll vorgestellt (Pol und Escapa,
2009), mit dem sich instabile Äste, entweder terminale Taxa oder Kladen, detektieren lassen. Ferner
erlaubt es die Identifikation solcher Zeichen, die möglicherweise für Instabilität im Rahmen einer
kladistischen Analyse verantwortlich sind.
44
Das MMN-Projekt zu diesem Abschnitt befindet sich in der Ordnerstruktur bei
Referenzbaeume/MMN_ALL_EC_ohne_009801_002695. Die folgenden Ausführungen beziehen
sich auf den Unterordner MMN/data/alignments/gblocks_reverse/ concatenated.
Mit Phyml wurde ein phylogenetischer Baum mit 200 Bootstrap-Wiederholungen auf der Grundlage
des MSAs in fgRevNucGenome_ALL.phy geschätzt15 und in der Datei fgRevNucGenome_ALL.faa.
phy_phyml_tree.txt abgelegt. Bis auf einen Split mit 63,5 % weisen alle Splits eine statistische
Unterstützung von mindestens 70 % auf.
MPI-basierte Berechnung einer Bootstrap-Phylogenie mittels PhyML-MPI
mpirun -n 20 ./phyml-mpi -i fgRevNucGenome_ALL.faa.phy --datatype nt -f e -v
e -s BEST -o tlr --r_seed 11111 --use_median --bootstrap 200 --model TN93
Auf den Bootstrap-Bäumen wurde mit PHYLIP consense unter der MRe der in Abbildung 8.2
dargestellte Consensus-Baum berechnet (Datei outtree_phyml).
Auf dem gleichen Alignment wurden mit RAxML (Stamatakis, 2014) unter Verwendung der RapidBootstrapping-Methode ein Bootstrap-Baum (Datei RaxML_bipartitions.raxml_out im Ordner
raxml_200BootstrapReps) mit 200 Wiederholungen sowie der Maximum-Likelihood-Baum mit
dem höchsten Score bestimmt16. Als Nukleotidsubstitutionsmodell kam GTR („General Time
Reversible“) zum Einsatz, das das speziellere Modell TN93 einschließt, welches RAxML nicht
anbietet.
Parallele, auf POSIX-Threads basierende Berechnung eines Bootstrap-Baumes sowie des
Maximum-Likelihood-Baumes mit dem höchsten Score mittels RAxML
raxmlHPC-PTHREADS -p 123614 -T 20 -s fgRevNucGenome_ALL.phy -m GTRGAMMA -n
raxml_output -x 12354 -f a -#200
Der entsprechende Consensus-Baum, erstellt wieder mit PHYLIP consense unter der MRe, liegt in
Datei raxml_consense.txt.
Unter Verwendung der mit JModeltest2 berechneten Nukleotidsubstitutionsmodelle für die
Genfamilien wurden mit PhyML Genbäume generiert (Verzeichnis Kapitel_Phylogenien/Referenzbaeume/MMN_ALL_SA_OKT12/MMN/data/phyml_GeneTrees) und aus ihnen mit
PHYLIP consense ein Consensus-Baum berechnet (Datei geneTrees_consensus.phy).
Die Unterstützung der Splits des Speziesbaumes durch die Genbäume, ausgedrückt in Prozent17,
wurde dem E. coli-Speziesbaum mit dem Python-Programm SumTrees aus dem DendroPy-Paket
(Sukumaran und Holder, 2010) aufgeprägt. Die Bäume mit Split-Support-Werten sind in den
Dateien ec_phylipConsensus_mitSplitsSupport.tre und sa_phylipConsensus_mitSplitsSupport.tre im
Ordner Referenzbaeume/Speziesbaum_und_Genbäume-Support zu finden.
15 Für PhyML wurde der Parameter use_median gesetzt. Er legt fest, daß für die Bestimmung der Mitte jeder diskretisierten Klasse von
Substitutionsraten nicht der Mittelwert, sondern der Median benutzt wird. Die Autoren weisen im Handbuch von PhyML 3.0 darauf hin,
daß durch diese Setzung gewöhnlich höhere Likelihood-Werte erzielt werden. Bei der Berechnung der Genbäume wurde allerdings der
Mittelwert (Standardeinstellung) genommen. Das Gesagte gilt sowohl für die E. coli- als auch für die Salmonellen-Phylogenie. Es wurde
nicht untersucht, inwieweit diese (irrtümlich vorgenommene) willkürliche Setzung den resultierenden Baum verändert.
16 Laut RAxML sind die Sequenzen von NC_017651 und NC_017652 (siehe Tabelle 1) identisch. Da unter PhyML mit beiden
Sequenzen gearbeitet worden war, wurden beide Sequenzen im Datensatz belassen.
17 Die Prozentwerte wurden für die später vorzunehmenden Vergleiche in Zahlen zwischen 0 und 200 umgerechnet, da dies die
Skalierung der Bootstrap-Zahlen in den übrigen Bäumen ist.
45
Berechnung der Split-Support-Werte (in %) der Genbäume auf dem E. coli-Speziesbaum mittels
sumtrees.py
python sumtrees.py ec_ref_allGeneTrees.tre --unrooted -t
ec_phylipConsensus_mitGTS.tre --min-clade-freq=0.00 --decimals=0 >
ec_phylipConsensus_mitSplitsSupport.tre
Abbildung 8.2: E. coli-Phylogenie für 61 E. coli- und Shigella-Genome (Stand Oktober 2012)
auf den konkatenierten Genfamilien der universellen Genfamilien unter einem MaximumLikelihood-Framework. Es wurden 200 Bootstrap-Replikate berechnet. Die Astlängen sind
proportional dargestellt. Alle Äste bis auf einen mit einem Bootstrap Support von 127 haben
einen Bootstrap-Support von mindestens 70 Prozent.
Salmonellen-Baum mit 25 Taxa
Die Salmonellen-Phylogenie, gezeigt in Abb. 8.1, (Datei fgRevNucGenome_ALL.faa.phy_phyml_
46
tree.txt) mit Bootstrap-Zahlen an den Ästen wurde mit PhyML aus dem MSA der konkatenierten
Genfamilien
(Datei
fgRevNucGenome_ALL.faa.phy
im
Ordner
MMN_ALL_SA_
OKT12/MMN/data/alignments/gblocks_reverse/concatenated) für das Nukleotidsubstitutionsmodell
TN93 berechnet. Zusätzlich wurde aus den Bootstrap-Replikaten in der Datei fgRevNucGenome_
ALL.faa.phy_phyml_boot_trees.txt mit dem Programm consense aus der PHYLIP-Suite unter der
erweiterten Majoritätsregel MRe ein Consensus-Baum (Datei sa_outtree_phyml) erstellt.
Auf den gleichen Eingabedaten wurde mit RAxML unter Verwendung der Rapid-BootstrappingMethode ein Bootstrap-Datensatz berechnet, aus dem anschließend mit Consense wieder ein
Consensus-Baum (Datei outtree im Ordner raxml_Consensus) berechnet wurde. Alle Bäume
basieren auf 200 Bootstrap-Replikaten. Alle Splits haben eine Unterstützung von über 70 %.
Für die universellen Genfamilien von Salmonella wurden unter dem Nukleotidsubstitutionsmodellen TN93 und GTR Genbäume mit PhyML erzeugt18 (Verzeichnis
Kapitel_Phylogenien/Referenzbaeume/MMN_ALL_EC_ohne_009801_002695/MMN/data/phyml_GeneTrees) und aus ihnen mit PHYLIP consense jeweils ein Consensus-Baum berechnet (Dateien
sa_geneTreesConsensus_GTR bzw. sa_geneTreesConsensus_TN93.txt). Wie zuvor für den E. coliSpeziesbaum wurde auch dem Salmonellen-Speziesbaum die Unterstützung der Splits durch die
Genbäume aufgeprägt. Die resultierenden Prozentwerte wurden wieder auf Zahlen zwischen 0 und
200 umgerechnet.
E. coli+Salmonellen-Baum mit 86 Taxa
Ebenfalls wurde eine Bootstrap-Phylogenie für die 61 Escherichia coli- und 25 SalmonellenGenome (Datei fgRevNucGenome_ALL.faa.phy_phyml_tree.txt an der entsprechenden Position im
Ordner MMN_ECSA_OKT12) auf den konkatenierten Genfamilien von E. coli und Salmonellen
berechnet. Dabei wurden für MMN die gleichen Parameter wie zuvor benutzt.
Wurzeln der E. coli- und Salmonellen-Teilbäume
Für das Projekt, welches den Zusammenhang zwischen Nährstoff-Angebot in den anzestralen
Umgebungen von E. coli und Salmonellen und lateralem Gentransfer auf den Phylogenien
untersucht (vgl. Kapitel 9), war es notwendig, die E. coli- und Salmonellen-Bäume zu einem Baum
zu verbinden. Da beide Teilbäume ungewurzelt sind, mußte dazu jeweils die Position in einem der
beiden Bäume gefunden werden, an welcher der jeweils andere Baum angehängt würde. Implizit
wird dabei festgelegt, an welchen Stellen die Teilbäume gewurzelt werden müssen. Das Programm
RAxML bietet die Möglichkeit (Option -r), einen bifurzierenden Teilbaum einer zu schätzenden
Phylogenie als unveränderlich festzulegen (engl. „Constraint Tree/Backbone Tree“). Die fehlenden
Taxa werden sukzessive unter Benutzung eines Maximum-Parsimonie-Kriteriums hinzugefügt.
Nachdem auf diese Weise ein Baum mit allen Taxa aufgebaut worden ist, optimiert RAxML ihn
unter Maximum-Likelihood unter Einhaltung der durch den Constraint Tree auferlegten
topologischen Einschränkungen.
Für den E. coli-Baum wurde über die beschriebene Methode die Wurzelposition dergestalt
bestimmt, daß eine Phylogenie aller E. coli-Stämme und Salmonellen berechnet wurde, in der der
Teilbaum EC-Referenz als Constraint Tree festgehalten wurde, dem schrittweise die Salmonellen
angefügt wurden. Das als Datengrundlage benötigte MSA (Datei fgRevNucGenome_ALL.faa.phy im
Ordner
ConstraintTrees/EC_mit_SA_ConstraintTree_ohne_009801_002695/MMN/data/alignments/gblocks_reverse/concatenated) wurde mittels MMN mit der eingangs dargestellten
Parameterbelegung für alle 86 E. coli- und Salmonellen-Genome berechnet. Es wurden jeweils 200
18 In den Experimenten des Autors waren der Consensus-Baum für die Salmonellen-Genbäume unter dem Modell TN93 und der
Consensus-Baum unter dem Modell GTR hinsichtlich ihrer Topologie identisch (vgl. auch Fußnote 19).
47
Bootstrap-Wiederholungen berechnet. Aus Gründen der Schnelligkeit wurde das von RAxML
angebotene Rapid-Bootstrapping-Verfahren benutzt (Option -x). Als Nukleotidsubstitutionsmodell
kam GTR („General Time Reversible“) zum Einsatz, das das speziellere Modell TN93 einschließt19,
welches RAxML nicht anbietet. Aus den Bootstrap-Replikaten in der Datei
RaxML_bootstrap.raxml_rapid wurde mit dem Programm Consense unter der erweiterten
Majoritätsregel ein Consensus-Baum (Datei outtree im Ordner raxml_Consensus) berechnet. Für
den Salmonellen-Baum wurden die äquivalenten Schritte mit demselben Alignment durchgeführt.
Wurzelpositionen der E. coli- und Salmonellen-Teilbäume
Inferenz einer E. coli+Salmonellen-Phylogenie mit unveränderlichem Salmonellen-Teilbaum
raxmlHPC-PTHREADS -p 12345 -s fgRevNucGenome_ALL.faa.phy -m GTRGAMMA
sa_referenz.tre -n raxml_rapid -x 12354 -#200 -T 20
-r
Inferenz eines E. coli+Salmonellen-Phylogenie mit unveränderlichem E. coli-Teilbaum
raxmlHPC-PTHREADS -p 12345 -s fgRevNucGenome_ALL.faa.phy -m GTRGAMMA
ec_referenz.tre -n raxml_rapid -x 12354 -#200 -T 20
-r
Der Consensus-Baum (Datei outtree) befindet sich im Ordner ConstraintTrees/SA_mit_EC_
ConstraintTree_ohne_009801_002695/MMN/data/alignments/gblocks_reverse/concatenated/raxml
_Consensus.
Konstruktion eines Gesamtbaumes aus den Teilbäumen
Die folgenden Erläuterungen beziehen sich auf die Dateien im Ordner Gesamtbaum/ohne
_009801_002695/ohneAstlängen. Wie im vorigen Schritt erklärt, wurden geeignete
Wurzelpositionen für den E. coli-Teilbaum und den Salmonellen-Teilbaum ermittelt. Der gewurzelte
Salmonellen-Teilbaum wurde wie folgt gewonnen:
Der Newick-Ausdruck, der den Gesamtbaum mit fest belassenem Salmonellen-Teilbaum beschreibt
(Datei ec_mit_sa_constraintTree), wurde unter Zuhilfenahme von FigTree und Mesquite so
umgebaut, daß er an der Stelle, wo zuvor das E. coli-Phylum mit dem Salmonellen-Teilbaum
verbunden war, gewurzelt ist (Datei sa_mitWurzel.tre). Der gewurzelte E. coli-Teilbaum wurde
äquivalent hergestellt (Datei ec_mitWurzel.tre).
Beide Newick-Ausdrücke wurden manuell zu einem Ausdruck für den Gesamtbaum
zusammengesetzt (siehe dazu Unterordner ConstraintTrees/Wurzelpositionen_Teilbaeume).
Zwischenschritte sind in der Datei combinedTree_Zwischenschritte.txt gespeichert, der
Gesamtbaum ist in der Datei combinedTree.txt zu finden.
Schätzen der Astlängen des Gesamtbaumes
Die folgenden Erläuterungen beziehen sich auf die Dateien im Ordner Gesamtbaum/März2013_
FinalerBaum/ohne_009801_002695/mitAstlängen. Der Gesamtbaum hat seine Wurzel an der
Position, an welcher der E. coli- und Salmonellen-Teilbaum miteinander verbunden wurden. Da die
dort zusammenlaufenden Äste manuell eingefügt worden sind, ist deren Länge unbekannt. Die
Astlängen des Gesamtbaumes wurden mit PhyML wieder auf Grundlage des Alignments geschätzt,
das bereits im Rahmen der Berechnungen für die Bestimmung der Wurzelpositionen der Teilbäume
19 Es wird in Wissenschaftskreisen angenommen, daß dies bei verschachtelten (engl. „nested“) Modellen zulässig ist. Das
allgemeinere Modell GTR umschließt in diesem Fall das speziellere Modell TN93. Eine Quelle kann hier nicht benannt werden.
48
benutzt wurde. PhyML optimiert die Astlängen für eine Topologie, die beim Aufruf als Startbaum
(Option inputtree) und gleichzeitig als Constraint-Baum (Option constraint_file) spezifiziert wird.
Es sollen lediglich die Astlängen, nicht aber die Topologie, optimiert werden:
Optimieren der Astlängen der Phylogenie aus E. coli und Salmonellen mit PhyML
phyml -i fgRevNucGenome_ALL.faa.phy --datatype nt -f e -v e -s BEST -o l
--inputtree combinedTree.tre --constraint_file combinedTree.tre --r_seed
11223 --use_median --model TN93
Der Gesamtbaum, zu sehen als Kladogramm in Abbildung 8.3, wurde in der Datei namens
finalerBaum_mitAstlaengen.tre („ECSA-Referenz“) abgelegt. Er wird mit unter Zuhilfenahme von
PhyML geschätzten Astlängen in Abschnitt 8.3.3, Abbildung 8.13 gezeigt.
EC-Referenz, SA-Referenz und ECSA-Referenz
Das E. coli-Monophylum im Gesamtbaum wird für den Rest dieses Kapitels als „EC-Referenz“, das
Salmonellen-Monophylum als „SA-Referenz“ und der Gesamtbaum als „EC+SA-Referenz“
bezeichnet. Die aus dem Gesamtbaum herausgelösten Teilbäume sind in den Dateien
ec_referenz.tre und sa_referenz.tre im Ordner Gesamtbaum/März2013_FinalerBaum/ohne_
009801_002695/mit Astlängen abgelegt.
8.2.2.2 Inferenz in einem Bayesianischen Framework (MrBayes, BEAST)
Die Daten und Ergebnisse für diesen Abschnitt sind
Kapitel_Phylogenien im Ordner MrBayes_Laeufe gespeichert.
innerhalb
des
Projektordners
MrBayes benutzt den Bayesianischen Wahrscheinlichkeitsbegriff
Der Bayesianische Wahrscheinlichkeitsbegriff unterscheidet sich von dem herkömmlichen,
„frequentistischen“ Wahrscheinlichkeitsbegriff in mehrfacher Hinsicht. Zum einen beruht er auf
dem Theorem von Bayes, mit dem unbekannte Parameter geschätzt, ihre Konfidenz angegeben und
Hypothesen für sie abgeleitet werden können. Zum anderen sind die unbekannten Parameter in der
bayesianischen Statistik Zufallsvariablen. Schließlich erweitert sie den Wahrscheinlichkeitsbegriff
dergestalt, als daß die Wahrscheinlichkeit einer Aussage ein Maß für ihre Plausibilität wird. Um
statistische Probleme mithilfe dieses Wahrscheinlichkeitsbegriffes analysieren zu können, wurde
das Konzept der „A-priori-Wahrscheinlichkeit“ eingeführt, welches vorsieht, daß etwaiges
Vorwissen und subjektive Grundannahmen (engl. „priors“) zu dem zu untersuchenden Sachverhalt
in einer Wahrscheinlichkeitsverteilung ausgedrückt werden.
Das Programm MrBayes (Ronquist und Hülsenbeck, 2003), das ein Bayesianisches Framework zur
Inferenz einer Phylogenie für ein gegebenes Alignment nutzt, wurde verwendet, um eine E. coliund eine Salmonellen-Phylogenie auf Grundlage der Alignments zu schätzen, die schon für die
Berechnungen in Abschnitt 8.2.2.1 benutzt wurden. MrBayes verwendet Priors, die auf den Bereich
Bauminferenz zugeschnitten sind. Die A-posteriori-Wahrscheinlichkeit der phylogenetischen
49
Bäume und anderer Parameter des Substitutionsmodells können nicht analytisch bestimmt werden.
Stattdessen wird die posteriore Wahrscheinlichkeitsverteilung der Bäume approximiert, indem
abhängige Stichproben aus ihr gezogen werden und das verwendete Modell schrittweise angepaßt
wird.
Im Gegensatz zu Programmen für die Bauminferenz unter Maximum-Likelihood (ML) wie PhyML
und RAxML liefert MrBayes nicht einen Baum mit hoher Likelihood, sondern eine Menge von
Bäumen mit möglichst hohen Likelihoods, die während des eingesetzten Markov Chain Monte
Carlo-Prozesses („MCMC“) gefunden wurden. Weder die ML-basierten Verfahren noch die
bayesianischen Verfahren, die im Kern ebenfalls mit ML arbeiten, finden garantiert den auf das
gegebene Alignment am besten passenden Baum bzw. die am besten passenden Bäume, und erst
recht nicht garantiert den „wahren“ Baum. Die in einem MCMC-Lauf gefundenen Bäume können
von den Bäumen eines anderen Laufs, der auf der gleichen Datengrundlage beruht, abweichen, da
das Verfahren randomisiert arbeitet. Startet man beide Läufe mit dem gleichen Startwert für den
Zufallszahlenalgorithmus, werden sie allerdings das exakt gleiche Ergebnis liefern.
Im Rahmen dieser Arbeit hat der Verfasser das Programm GPU MrBayes benutzt20, das MarkovKetten parallel auf einer CUDA-fähigen NVidia-Grafikkarte simuliert. Aus Gründen der Effizienz
bietet GPU MrBayes lediglich das Nukleotidsubstitutionsmodell GTR+I+R (gamma-verteilte Raten
und invariante Positionen) an. MrBayes kann entweder interaktiv oder über eine Textdatei21 im
Nexus-Format gesteuert werden. Für diese Arbeit wurde das Programm im interaktiven Modus
benutzt.
Arbeitsweise von MrBayes
Das Programm benutzt (MC)3, „Metropolis-coupled Markov Chain Monte Carlo“/ „MCMCMC“,
eine Variante von MCMC. (MC)3 setzt eine wählbare Anzahl von aufsteigend nummerierten
Markov-Ketten ein, von denen alle bis auf eine, die „kalte“ Kette, „erhitzt“ werden. Je höher die
Temperatur einer Kette, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit dafür, daß sie sich von einem
isolierten Gipfel (Extremum) zu einem anderen innerhalb der posterioren Verteilung bewegen wird.
Die Hitze von Kette i ist B = 1 / (1 + i ∙ λ), wobei λ der von B gesteuerte Anheizkoeffizient ist. Ihre
posteriore Wahrscheinlichkeit wird in die B-te Potenz erhoben. Für B = 0 werden alle Bäume mit
gleicher Wahrscheinlichkeit besucht, die Kette besucht Bäume dabei weitgehend beliebig. B = 1 ist
die „kalte“ Kette bzw. die Verteilung an sich. Nachdem jede Kette einen Schritt in der
Suchlandschaft vollzogen hat, werden zwei Ketten zufällig gezogen, und der Versuch wird
unternommen, ihren Zustand zu tauschen. Die Akzeptanzwahrscheinlichkeit dafür bestimmt die
Gleichung von Nicholas Metropolis (Metropolis et al., 1953). Exzessives Erhitzen kann aber dazu
führen, daß die Akzeptanzrate zwischen verschiedenen Ketten allzu gering wird. Während der
Burn-in-Phase (s. u.) schwanken die Akzeptanzraten mitunter beträchtlich. Die Autoren von
MrBayes heben im Handbuch auf S. 21 hervor, daß ihrer Erfahrung nach für die Analyse
bestimmter Datensätze Erhitzen (engl. „Heating“) wichtig sei, für andere nicht, ohne jedoch
diesbezügliche Regeln angeben zu können.
20 Tatsächlich hat der Verfasser daneben auch das Programm MrBayes v3.2.1. X64 benutzt, allerdings nur für Analysen, die nicht in
dieser Arbeit gezeigt werden. Für diese Programmversion ist die hier dargestellte Arbeitsweise im übrigen ebenso zutreffend.
21 Die Datei muß einen sog. „MrBayes-Block“ mit dem Alignment, Steuerbefehlen und Parameterbelegungen enthalten. Auskunft zum
Aufbau dieses Blocks gibt das Benutzerhandbuch zu MrBayes (http://mrbayes.sourceforge.net/manual.php).
50
Abbildung 8.3: Gewurzeltes Kladogramm für 86 E. coli und Salmonella (ECSA-Referenz). Die Phylogenie
beruht auf den ungewurzelten E. coli- und Salmonellen-Teilbäumen. Die Wurzelposition für den E. coliTeilbaum wurde über RAxML aus einem Baum für alle Taxa bestimmt, in dem der E. coli-Teil fest belassen
(„Constraint Tree“) und dem die Salmonellen inkrementell angefügt wurden. Die Wurzelposition des E. coliTeilbaumes ist die Position, an der der Salmonellen-Teilbaum mit ihm verbunden ist. Die Wurzelposition für
den Salmonellen-Teilbaum wurde analog bestimmt. Die Äste tragen die für die Teilbäume separat ermittelten
Bootstrap-Zahlen, die auf jeweils 200 Wiederholungen basieren.
51
Für beide Analysen zusammen kann MrBayes jeweils nach Verstreichen einer wählbaren Zahl von
Generationen eine Diagnostik berechnen, anhand der das Programm entscheiden kann, ob die
unterschiedlichen MCMC-Läufe konvergieren, sie also die posteriore Verteilung hinreichend gut
abgebildet haben. Am Ende sollten die abgetasteten Bäume weitgehend gleich sein. Das wichtigste
Diagnostik-Maß, die Ähnlichkeit der abgetasteten Bäume aus den verschiedenen Läufen, wird am
Bildschirm angezeigt.
Immer, wenn die Diagnostik berechnet wird, wird – falls der Benutzer es wünscht - entweder eine
feste Zahl oder ein Prozentsatz von Samples vom Beginn einer Kette gelöscht. Die Phase eines
MCMC-Laufes, in der Samples gelöscht werden, wird als „Burn-in-Phase“ bezeichnet. Der Burn-in
wird allgemein als notwendig erachtet, da eine Markov-Kette gewöhnlich erst nach Verstreichen
einer bestimmten Zahl von Generationen einen stationären Zustand mit Likelihood-Werten, die
innerhalb eines mehr oder weniger stabilen Bereiches fluktuieren, erreicht22. Das bedeutet aber
keineswegs, daß die Markov-Kette dieses „Plateau“ nicht doch nach Verstreichen einer hohen Zahl
von Generationen verläßt und dann Bäume findet, die eine noch höhere Likelihood haben.
Gegenüber MCMC, das nur eine Kette benutzt, bietet (MC) 3 den Vorteil, daß mehrere Ketten lokale
Extrema in der Suchlandschaft unabhängig voneinander besuchen können. Ist eine Kette in einem
lokalen Optimum „gefangen“, läuft die Analyse trotzdem weiter, da die anderen Ketten noch aktiv
sind.
Auswertung der MCMC-Läufe mit MrBayes
Die Stationärität bzw. die sog. Mixing Time23 der in dieser Arbeit durchgeführten Läufe wurde mit
den Kommandos sump und sumt von MrBayes und mit dem Programm Tracer aus der BEASTSuite (Drummond und Rambaut, 2007) beurteilt. MrBayes bietet die Kommandos sump und
sumt, mit denen sich die abgetasteten Parameter, Topologien und Astlängen übersichtlich
zusammenfassen lassen. Während eines MCMC-Laufes speichert das Programm die Parameter
Generation, Log Likelihood der kalten Kette (LnL), Summe aller Astlängen (TL, engl. „Total tree
length“), die sechs GTR-Parameter für die Raten r(A<->C), r(A<->G) etc., die vier stationären
Nukleotidfrequenzen pi(A), pi(C) etc., den Shape-Parameter alpha für die Variation der Raten sowie
den Anteil invariabler Position pinvar in Dateien mit der Endung .p. In dieser Arbeit wurde
ausschließlich das Modell GTR+I+R verwendet; für ein anderes Modell weicht der Inhalt der Datei
selbstverständlich ab.
Das Kommando sump verwendet standardmäßig die bei der Berechnung der Markov-Kette
benutzten Burn-in-Einstellungen. Es generiert einen Graphen, in dem die Logarithmen der
Wahrscheinlichkeit, die Daten zu beobachten (lnL-Werte), je Generation aufgetragen sind. Hat ein
Lauf hinsichtlich der lnL-Werte innerhalb der dargestellten Generationen einen stationären Zustand
erreicht, zeigen die Werte keinerlei Tendenz zu steigen oder zu fallen24. Sind solche Trends trotzdem
zu sehen, sollte die Analyse nochmals mit höherer Kettenlänge ausgeführt werden. Zusätzlich liefert
sump eine Tabelle der Mittelwerte und Varianzen der oben genannten Parameter, die oberen und
unteren Grenzen des 95 % Konfidenzintervalls und den Median der abgetasteten Werte. Die letzte
Spalte der Tabelle enthält den PSRF (engl. „Potential Scale Reduction Factor“), der als
Diagnosemaß für die Konvergenz benutzt werden kann. Wurde die posteriore Wahrscheinlichkeitsverteilung hinreichend gut abgetastet, bewegt sich der PSRF zwischen 1.00 und 1.0225.
22 Neben Befürwortern des Burn-Ins gibt es auch Wissenschaftler, die seinen Nutzen anzweifeln. Für eine Diskussion zu „Fallstricken“
bei der Arbeit mit MrBayes sowie zur Bedeutung der Burn-In-Phase siehe http://treethinkers.blogspot.de/2009/05/for-this-unauthorizedinstallment-of.html.
23 Im Zusammenhang mit MCMC bezeichnet die Mixing Time die verstrichene Zahl von Generationen, die eine Markov-Kette benötigt
hat, um, ausgehend von einer beliebigen Startposition, einen annähernd stationären Zustand zu erreichen. Eine „gute“ Kette weist
„schnelles Mixing“ auf.
24 Die Autoren von MrBayes vergleichen das Aussehen des Plots im Fall der Stationarität anschaulich mit „weißem Rauschen“.
25 Es ist nicht unumstritten, den PSRF hier als Diagnosemaß einzusetzen. Leider kann hierzu keine Quelle benannt werden.
52
Das Kommando sumt liefert neben einer mit Indices versehenen Liste aller Bipartitionen
insbesondere eine Tabelle der informativen Bipartitionen (solche Partitionen, die mehr als ein Taxon
beinhalten). Für jede Partition sind folgende Informationen enthalten: ihr Index (ID), wie oft sie
abgetastet wurde (#obs), ihre Wahrscheinlichkeit (Probab.), Standardabweichung (Sd(s)+),
Minimum (Min(s)) und Maximum (Max(s)) ihrer Häufigkeit über die Läufe sowie die Zahl der
unabhängigen Analysen (Nruns), in welchen die Partition angetroffen worden ist. Man erhält eine
weitere Tabelle mit den Parameter der Äste, z. B. Astlängen und Knoten, und neben anderen Größen
wieder den PSRF, für den das bereits Gesagte gilt. Ferner gibt sumt ein Phylogramm aus, das auf
den durchschnittlichen Astlängen beruht, sowie ein einen Baum mit Bayesian Posterior
Probabilities (BPP) an den Ästen. Dieser Baum kann nach den gleichen Gesichtspunkten
ausgewertet werden, wie ein Baum mit Bootstrap-Zahlen. Im Hintergrund produziert sumt mehrere
Dateien: Taxon-Bipartitionen und ihre Indices/IDs (*.parts), zusammenfassende Statistik der
Partitionen (*.tstat) bzw. der Astlängen (*.vstat), Consensus-Baum mit allen Konfidenzwerten und
Astlängen (*.con).
Auswertung der MCMC-Läufe mit Tracer
Das Java-Programm Tracer aus dem BEAST-Paket bietet unter einer grafischen Benutzeroberfläche
eine ähnliche Auswertungsfunktionalität wie MrBayes mit sumt/sump. Es erlaubt dem Benutzer,
die Ausgaben von einem der Bayesianischen MCMC-Programme BEAST, MrBayes und LAMARC
grafisch darzustellen und statistisch zu analysieren. Entsprechende Details können der Datei
README.txt im Installationsordner von BEAST entnommen werden. Für diese Arbeit wurden die
sog. „Likelihood-Traces“ (siehe Abb. 8.4) ausgewertet, die inhaltlich dem Graph entsprechen, den
sump produziert. Tracer informiert den Benutzer mittels einer Farbcodierung darüber, ob die für
den MCMC-Lauf statistisch relevanten Größen genügend abgetastet worden sind. Die in der Spalte
„ESS“ („Estimated Sample Size“) rot hervorgehobenen Größen wurden in dem dargestellten
MCMC-Lauf unterabgetastet, die blaßroten noch genügend, die schwarzen ausreichend. Der Lauf
mit 30 Mio. Generationen und einer Burn-in-Phase von 50 % sollte also mit einer höheren
Generationenzahl wiederholt werden. Die Log-Likelihood (LnL) der gezogenen Bäume, für die
genug Stichproben vorhanden sind, bewegt sich nach der Burn-in-Phase um den Mittelwert
-4554740 herum. Ein Abwärts- oder Aufwärtstrend der Log-Likelihoods ist nicht zu erkennen
(obwohl der Lauf insgesamt zu kurz ist).
Bewegt sich die LnL bei einem anderen MCMC-Lauf auf den gleichen Daten und gleichen
Parametern um den gleichen Mittelwert, können die Läufe zusammengefaßt werden, wodurch im
Endeffekt eine höhere, für die hier betrachteten Daten ausreichende Abtastung der Suchlandschaft
erzielt wird. Der Verfasser hat sich dieser Möglichkeit bedient und verschiedene MrBayes-Läufe für
E. coli und Salmonellen kumuliert betrachtet und ausgewertet.
MrBayes-Läufe für den E. coli-Datensatz
Für den E. coli-Datensatz wurden drei Programmläufe mit jeweils 15 Mio. Samples, einer Burn-InPhase von 3,75 Mio. Samples und jeweils unterschiedlichem Startwert für den
Zufallszahlengenerator durchgeführt. Es wurde die Parameterbelegung verwendet, die aus der
untenstehenden Auflistung ersichtlich ist. Das zugrunde liegende Verzeichnis ist
EC/ohne_009801_002695. Da MrBayes lediglich Alignments im „neuen“ Nexus-Format (*.nnex)
akzeptiert, wurde das Original-Alignment zunächst mittels der Exportfunktionalität von Mesquite in
dieses Format konvertiert (Datei ec_modified.nnex). Die Dateien für die drei Läufe befinden sich in
den Ordnern lauf1, lauf2 und lauf3. Screenshots der mit Tracer erzeugten Likelihood-Traces sind im
Ordner LikelihoodTraces zu finden.
53
Während der drei Läufe wurden jeweils neun unterschiedliche Bäume gefunden (vgl. Datei
ec_modified.nnex.trprobs und Tab. 8.4). In Lauf 1 und Lauf 3 besitzt der Baum mit der höchsten
Wahrscheinlichkeit bzw. Posterior Probability (PP), in Lauf 2 der Baum mit der zweithöchsten
Wahrscheinlichkeit die gleiche Topologie wie der Baum EC-Referenz26. Der maximale RFAbstand27 zwischen einem Baum und dem Baum EC-Referenz ist, unabhängig von der Posterior
Probability des Baumes, entweder 2 oder 4.
Die Unterschiede in den Bäumen ergeben sich größtenteils aus dem Platztausch verschiedener
Stämme im Teilbaum der E. coli K12- und B-Stämme. Die evolutionären Abstände der Bakterien
voneinander sind gering, das phylogenetische Signal daher kaum ausgeprägt. Die RF-Distanzen
zwischen den Bäumen wurden mit dem Programm TOPD/FMTS (Puigbo et al., 2007) berechnet.
Neben der RF-Distanz kann TOPD/FMTS die Taxa ausgeben, deren Positionen in den Bäumen
voneinander abweichen („Disagree“-Maß).
Abbildung 8.4: Likelihood-Trace für einen MrBayes-Lauf
Berechnung der symmetrischen Differenz (Split-Abstand) und den Unterschieden nach der
Disagree-Methode von topd
perl topd_v3.3.pl -f tree8_vs_referenz.txt -r no -m disagree -l 4
Sind die IDs für zwei Bäume in der Tabelle identisch, handelt es sich um den gleichen Baum, der in
mindestens zwei verschiedenen Läufen aufgefunden worden ist. Das Programm PHYLIP treedist
wurde zur Erstellung einer Distanzmatrix aller Bäume benutzt, aus der die Gleichheit von Bäumen
26 Bei EC-Referenz handelt es sich um den gewurzelten E. coli-Baum, hier wurde aber der ungewurzelte E. coli-Baum verwendet. Der
Einfachheit halber werden die Begriffe EC-Referenz und SA-Referenz in diesem Kapitel weiterhin in dieser Form verwendet.
27 Der Split-Abstand ist identisch mit dem Robinson-Foulds-Abstand (Robinson und Foulds, 1981).
54
direkt abgelesen werden konnte.
Die Ergebnisse der drei Läufe für den E. coli-Datensatz wurden kumuliert betrachtet (Ordner
EC/kumulierteLaeufe). Zu diesem Zweck wurde die Datei cumulated_renum.nnex.t manuell aus den
.t-Dateien der einzelnen Läufe zusammengesetzt, wobei wie folgt vorgegangen wurde:
•
Header sowie „End;“ aus den .t-Dateien der Läufe 1 und 2 entfernen
•
Die 3749999 Bäume aus der Burn-in-Phase entfernen
•
Modifizierte .t-Dateien konkatenieren
•
Numerierung
der
Bäume
und
Parametersätze
mit
den
Skripten
replaceFirstColumn_t.pl und replaceFirstColumn_p.pl erneuern.
•
Resultierende Datei mit MrBayes analysieren: execute cumulated_renum.nnex,
dann sump Relburnin=No Nruns=1.
Der von sump ausgegebene Graph der LnL pro Generation zeigt „weißes Rauschen“ mit einem
minimalen Aufwärtstrend. Es empfiehlt sich daher, die Burn-in-Phase etwas zu verlängern. Die ESS
(„Estimated sample size“) für alle abgetasteten Parameter sind alle deutlich größer als 100 und
weisen damit auf eine ausreichende Abtastung hin. Der Baum mit der höchsten PP ist identisch mit
dem Baum aus Lauf 1 mit der höchsten PP und gleicht damit dem Baum EC-Referenz. Der
MrBayes-Consensus-Baum für die neun Bäume hat RF-Abstand 1 von EC-Referenz: die sehr nah
verwandten E. coli-B-Stämme BL21 DE3 uid161947, BL21 DE3 uid161949 und B REL606 bilden
einen multifurzierenden Teilbaum (siehe Datei cumulated_renum.nnex.con.tre).
MrBayes-Läufe für den Salmonellen-Datensatz
Mit dem Salmonellen-Alignment mit 25 Taxa und 2.230,097 Zeichen wurden sechs Läufe mit
jeweils zwei unabhängigen Analysen („Runs“), fünf Markov-Ketten, Temperaturkoeffizient=3,
Swap-Frequenz=2 (mcmcp Nchains=4 Temp=0.3 Swapfreq=2) mit unterschiedlicher
Generationenzahl und variierender Abtastrate durchgeführt. Alle notwendigen Quell- und
Ergebnisdateien befinden sich im Unterordner SA.
In Lauf 1 wurde ein Baum mit PP = 1 gefunden, der identisch mit dem Baum SA-Referenz ist. In
den Läufen 2 – 6 wurden jeweils drei Bäume gefunden, jeweils einer mit PP = 0,5. Einer unter den
drei Bäumen war jeweils identisch mit dem Baum SA-Referenz, allerdings nicht immer der mit der
höchsten PP, die anderen Bäume wiesen jeweils einen RF-Abstand von 6 zu SA-Referenz auf. In
diesen Bäumen tritt das Serovar Paratyphi B als Outgroup zu Paratyphi C und Choleraesuis SC
B67 auf, während es im Referenzbaum einen Teilbaum mit Newport SL254 bildet (siehe Tab. 8.6).
In den beiden unabhängigen, parallel ausgeführten Analysen der Läufe 2, 5 und 6 haben die
Markov-Ketten nicht konvergiert, daher sind die Ergebnisse als Einzelresultate nur eingeschränkt
brauchbar. MrBayes empfiehlt entweder eine höhere Zahl von Generationen oder eine Modifikation
der Heating-Parameter (siehe Textdateien MrBayes_Warnung.txt im Unterordner Laeufe).
Wie zuvor die Ergebnisse der drei MCMC-Läufe für den E. coli-Datensatz wurden die Läufe für
Salmonella kumuliert betrachtet. Alle Dateien befinden sich im Ordner MrBayes_Laeufe/SA/
kumulierteExperimente/Laeufe2bis5. Es wurden allerdings nicht jeweils beide Runs aller sechs
Läufe benutzt: Lauf 1 wurde komplett ausgespart, da eine Begutachtung des „Likelihood Trace“Diagramms mit Tracer auf eine Unterabtastung diverser Parameter hinwies. Von den Läufen 2 und
5 wurden die Bäume aus Run2, von den Läufen 3 und 4 die Bäume aus Run1 gewählt, da die
jeweils letzten 50 gesampleten Bäume hinsichtlich ihrer negativen Log-Likelihood eine Gruppe der
55
am besten bewerteten Bäume bilden (vgl. Tab. 8.5). Die restlichen Runs, ausgenommen Run2 von
Lauf 6, bilden eine Gruppe mit weniger hoch bewerteten Bäumen. Run2 von Lauf 6 liegt bezüglich
seiner Bewertung zwischen den Gruppen. In den Läufen 2, 3, 5 und 6 besitzt der am höchsten
bewertete Baum jeweils eine PP und eine kumulierte PP von 0,500. Dieses auffällige Ergebnis ist
dadurch zustande gekommen, daß in einem Run immer ein einziger Baum aufgefunden worden ist,
der keinem der zwei im anderen Run aufgefundenen Bäume gleicht. Das weist darauf hin, daß in
den Runs der Suchraum wahrscheinlich nicht ausreichend abgetastet worden ist. Es sind weitere
Experimente notwendig, die Hinweise zu möglichen Ursachen der Unterabtastung geben können.
MrBayes GPU: Parameter für den E. coli-Datensatz
Nicht genannte Parameter verbleiben in ihrer Standardeinstellung.
Filename
exe ec_modified.nnex
Evolutionäres Modell
lset nst=6 rates=invgamma
nucmodel=4by4
Anmerkung: Alignment mit 61 Taxa, 1.296.988 Zeichen
6 Substitutionstypen (GTR), Raten sind gammaverteilt, invariante
Positionen
Modell für Nukleotidsubstitution wird über eine 4x4-Matrix
ausgedrückt
Priors
Standardeinstellung
Parameter für den MCMC-Lauf
Filename
NGen=15000000
NRuns=1
NChains=2
Relburnin=Yes Burninfrac=0.25
Stoprule=No
DiagnFreq=1000
Metropolis-Coupling
Temp=0.1
SwapFreq=1 NSwaps=1
SampleFreq=500
ec_modified.nnex
Anzahl Generationen für den MCMC-Algorithmus
Zahl der unabhängigen, gleichzeitig zu startenden Analysen
Zahl der Ketten pro Analyse (1 kalte Kette, Rest warme Ketten)
Die ersten 100∙Burninfrac % der Samples werden als Burn-in
gelöscht
Es wird kein Konvergenzkriterium benutzt. Stattdessen läuft eine
Kette NGen Generationen und wird danach gestoppt.
Zahl von Generationen zwischen der Berechnung von MCMCDiagnostiken. Ausgabedatei ist Filename.mcmc.
Temperatur-Parameter für das Erhitzen der Ketten
Nach jeweils SwapFreq Generationen wird versucht,
NSwaps Zustände zwischen Paaren von Ketten auszutauschen
Bäume werden alle SampleFreq Generationen gesammelt.
Ausgabedateien sind Filename.p für die Parameter des
Substitutionsmodells und Filename.t für die Topologien und
Astlängen.
Tabelle 8.3: MrBayes-Parameter für den E. coli-Datensatz
Die ausgewählten Läufe wurden auf die gleiche Weise zusammengefaßt wie zuvor die E. coliLäufe, indem die Einzeldateien wie dort beschrieben modifiziert worden sind. Die entsprechende
Datei cumulatedRun_renum.nnex.t enthält 771.061 Samples (d. h. untersuchte Baumtopologien).
56
E. coli-Datensatz: 15 Mio. Generationen, 300.000 Bäume
Lauf 1
Baum
Lauf 2
PP
Kumulierte Split-Distanz
PP
zu EC-Referenz
ID
Baum
PP
Kumulierte Split-Distanz
PP
zu EC-Referenz
ID
1
0,344
0,344
0
A
1
0,338
0,338
2
C
2
0,307
0,651
2
B
2
0,319
0,656
0
A
3
0,299
0,651
2
C
3
0,287
0,943
2
B
4
0,010
0,960
2
D
4
0,011
0,954
4
I
5
0,010
0,969
2
E
5
0,011
0,965
4
G
6
0,008
0,977
4
F
6
0,009
0,974
2
E
7
0,008
0,985
4
G
7
0,009
0,983
4
H
8
0,008
0,993
4
H
8
0,009
0,992
2
D
9
0,007
1,000
4
I
9
0,008
1,000
4
F
Lauf 3
Baum
Läufe 1 – 3 kumuliert
PP
Kumulierte Split-Distanz
PP
zu EC-Referenz
ID
Baum
PP
Kumulierte Split-Distanz
PP
zu EC-Referenz
ID
1
0,329
0,329
0
A
1
0,331
0,331
0
A
2
0,310
0,640
2
C
2
0,315
0,646
2
C
3
0,308
0,947
2
B
3
0,300
0,947
2
B
4
0,009
0,956
4
I
4
0,009
0,956
2
D
5
0,009
0,965
2
D
5
0,009
0,965
4
H
6
0,009
0,974
4
H
6
0,009
0,974
2
E
7
0,009
0,983
4
G
7
0,009
0,983
4
G
8
0,008
0,992
2
E
8
0,008
0,992
4
H
9
0,008
1,000
4
F
9
0,008
1,000
4
Tabelle 8.4: E. coli-Datensatz: In den Läufen 1 – 3 aufgefundene Bäume
MrBayes-Lauf
Generationenzahl
Anzahl
Bäume pro
Run
Durchschnittl. Log-Likelihood der letzten
50 gefundenen Bäume
Run1
Run2
1
1,0 Mio.
20000,0
-4658978,99280
-4658963,93176
2
30,0 Mio.
300000,0
-4554918,65364
-4554736,94974
3
12,8 Mio.
85378,0
-4554731,38738
-4554923,89032
4
40,0 Mio.
400000,0
-4554735,09700
-4554924,62742
5
20,0 Mio.
400000,0
-4554924,17728
-4554732,21962
6
15,0 Mio.
300000,0
-4554925,87672
-4554741,23126
Tabelle 8.5: MrBayes-Läufe und Log-Likelihoods der letzten 50 Bäume
Der Likelihood-Trace-Graph, angezeigt mittels sump, wies drei „Plateaus“ verschiedener LogLikelihoods auf und unterstützte damit die Vermutung, daß das Mixing wahrscheinlich nicht
ausreichend gewesen ist (siehe Dateien cumulatedRun_renum.nnex.stat und *.parts, *.con,
*.trprobs). Die einzelnen Läufe sollten mit einer höheren Generationenzahl wiederholt werden.
MrBayes liefert für die kumulierten Daten drei Bäume mit PPs = 0,828, 0,163 und 0,010. Der erste
Baum (mit der höchsten PP) ist hinsichtlich des Verzweigungsmusters identisch mit dem Baum SAReferenz, der zweite und dritte Baum haben zu diesem Split-Distanz 6 (siehe Ordner
Laeufe2bis5/Vergleiche).
57
Salmonellen-Datensatz
Lauf 1
Baum
1
Lauf 4
PP
1,000
Kumulierte Split-Distanz zu
PP
SA-Referenz
1,000
0
ID
A
Lauf 2
Baum
Baum
PP
Kumulierte Split-Distanz zu
PP
SA-Referenz
ID
1
0,868
0,868
6
B
2
0,089
0,957
6
C
3
0,043
1,000
0
A
Lauf 5
PP
Kumulierte Split-Distanz zu
PP
SA-Referenz
ID
Baum
PP
Kumulierte Split-Distanz zu
PP
SA-Referenz
ID
1
0,500
0,500
0
A
1
0,500
0,500
0
A
2
0,371
0,871
6
B
2
0,439
0,939
6
B
3
0,129
1,000
6
C
3
0,061
1,000
6
C
Lauf 3
Baum
Lauf 6
PP
Kumulierte Split-Distanz zu
PP
SA-Referenz
ID
Baum
PP
Kumulierte Split-Distanz zu
PP
SA-Referenz
ID
1
0,500
0,500
0
A
1
0,500
0,500
0
A
2
0,441
0,941
6
B
2
0,472
0,472
6
B
3
0,059
1,000
6
C
3
0,028
1,000
6
C
Läufe 2-5 kumuliert
Baum
PP
Kumulierte Split-Distanz zu
PP
SA-Referenz
ID
1
0,828
0,828
0
A
2
0,163
0,990
6
B
3
0,010
1,000
6
C
Tabelle 8.6: Salmonellen-Datensatz: In den Läufen 1 – 6 aufgefundene Bäume
8.2.2.3 Phylogenien mit Neighbor-Joining
Bäume nach der Neighbor-Joining-Methode (Saitou und Nei, 1987) wurden auf der Grundlage der
Alignments, auf denen die Referenzphylogenien beruhen, mit der PHYLIP-Suite erstellt. Aus dem
Alignment wurde dazu jeweils mit seqboot ein Bootstrap-Datensatz aus 200 Wiederholungen
generiert, für die dann dnadist jeweils die Distanzen zwischen den Spezies schätzte (siehe Tab. 8.7).
Aus der resultierenden Datei mit den Distanzmatrizen erstellte neighbor Neighbor-Joining-Bäume,
für die consensus zuletzt einen Consensus-Baum konstruierte (Datei outtree im Ordner
Kapitel_Phylogenien/Referenzbaeume/MMN_ALL_EC_ohne_009801_002695/MMN/data/alignments/gblocks_reverse/concatenated/nj_Baum/seqboot/dnadist/neighbor/consense). Der NeighborJoining-Baum für den Salmonellen-Datensatz liegt im Ordner
Kapitel_Phylogenien/
Referenzbaeume/MMN_ALL_SA_OKT12/MMN/data/alignments/gblocks_reverse/concatenated/nj_
Baum/seqboot/dnadist/neighbor/consense in der Datei outtree.
58
Erstellung eines Neighbor-Joining-Baumes mit den Programmen der PHYLIP-Suite
Alignment → seqboot → dnadist → neighbor → consense → Neighbor-Joining-Consensus
Verwendete Parameter
seqboot
Random number seed: 3, sequence: Molecular sequences, Bootstrap, regular or altered sampling
fraction: regular, block size for block-bootstrapping: 1, how many replicates: 200 , read weights of
characters: no, read categories of sites: no
dnadist
Distance: F84, gamma distributed rates across sites: no, transition/transversion ratio: 2.0
one category of substitution rates: yes, use weights for sites: no, use empirical base frequencies: yes,
form of distance matrix: square, analyze multiple data sets: yes (200)neighbor
Neighbor-joining or UPGMA tree: neighbor-joining, outgroup root: no, use as outgroup species 1,
lower-triangular data matrix: no, upper-triangular data matrix: no, subreplicates: no, randomize input
order of species: yes (random number seed = 3), analyze multiple data sets: yes, 200 sets
consense
Consensus type: majority rule (extended) , outgroup root: no, use as outgroup species 1, trees to be
treated as rooted: no
Tabelle 8.7: Zur Berechnung der Neighbor-Joining-Bäume verwendete Parameter
8.2.2.4 Phylogenien auf Grundlage hochkonservierter Genfamilien
Der primäre phylogenetische Baum für 191 Spezies, „Tree of Life v1.0“, auf dem das Projekt
„Interactive Tree of Life“ (kurz „iTol“) beruht (www.iTol.embl.de), wurde mit der in Ciccarelli et
al. im Jahre 2006 beschriebenen Methodik generiert.
Der Baum basiert auf einer Konkatenation von 31 stark konservierten Orthologen, „COGs“ (siehe
Tab. 8.8): Von den ursprünglich entdeckten 36 Familien entfernten die Autoren im Vorfeld fünf
Familien mit multiplen horizontalen Gentransfers oder solche, die schwierig zu alignieren waren.
Ciccarelli et al. schätzten eine ML-Phylogenie mit PhyML. Für den „iTol-Baum“ benutzten
Ciccarelli und Kollegen die in Tabelle 8.7 aufgeführten 31 COGs.
Identifikation der zu den COGs äquivalenten OGs in den eigenen Datensätzen
Die Schnittmenge der für den „iTol-Baum“ verwendeten vollständig sequenzierten 191 Genome
und der in dieser Arbeit eingesetzten 86 Genome ist klein: lediglich die Taxa E. coli K-12 MG1655,
E. coli O157:H7 EDL933 und Salmonella Typhimurium LT2 wurden in beiden Arbeiten verwendet.
Um die den COGs entsprechenden universellen Genfamilien im EC-, SA- bzw. ECSA-Datensatz
des Verfassers zu identifizieren, wurde auf Kopien der MMN-Projekte MMN_EC_ohne009801
_002695, MMN_SA_OKT12 und MMN_ECSA_ohne009801_002695 gearbeitet, nämlich EC_iTol,
ECSA_iTol und SA_iTol im Ordner iTol im Projektordner Kapitel_Phylogenien.
Jeweils im Unterordner data/alignments/gblocks_reverse sind alle Nukleotidalignments der
universellen orthologen Gruppen im FASTA-Format gespeichert. Diese werden innerhalb der
MMN-Pipeline vor der Berechnung eines Baumes mittels PhyML konkateniert. Für die
Konstruktion eines konkatenierten MSAs der zu den iTol-COGs äquivalenten universellen
59
Genfamilien wurden alle Orthogruppen gelöscht, die keines der Gene in den iTol-COGs enthalten28.
E. coli-, Salmonellen- und E. coli/Salmonellen-Phylogenien
Mit MMN wurde ein konkateniertes MSA der verbliebenen 26 orthologen Gruppen hergestellt und
danach auf ihnen ein Bootstrap-Baum geschätzt (Verzeichnis concatenated, Datei fgRevNuc
Genome_ALL.faa.phy_phyml_tree.txt im jeweiligen Ordner), der hier nicht dargestellt ist. Fünf der
von Ciccharelli et al. benutzten COGs waren im Datensatz des Verfassers nicht universell.
Bei beiden Teilbäumen (siehe Abb. 8.5 und 8.6) fällt auf, daß die statistische Unterstützung vieler
Splits durch den Bootstrap sehr unausgewogen ist.
28 Die Gene der drei Spezies in der Schnittmenge, die jeweils in einem iTol-COG sind, sind in den E. coli- bzw. SalmonellenDatensätzen ebenfalls in einer OG, was angesichts der hohen Konserviertheit der COGs auch der Erwartung entspricht.
60
Aus den Teilbäumen zusammengesetzte E. coli/Salmonellen-Phylogenie
Mit der in Abschnitt 8.2.2.1 beschriebenen Technik wurde aus den ungewurzelten, auf den wie oben
beschrieben geschätzten E. coli- und Salmonellen-Teilbäumen ein zusammengesetzter, gewurzelter
Baum mit Astlängen (Datei ecsa_iTol_zusammengesetzt.tre) konstruiert. Die Bootstrap-Werte an
seinen Ästen sind hier aus Platzgründen nicht dargestellt, sie stammen von den Teilbäumen. Die
entsprechenden Dateien befinden sich innerhalb des Projektordners im Unterordner
iTol/ECSA_kombiniert_iTol/Konstruktion_kombinierterECSA_iTol_Baum. Das Alignment, aus dem
die Distanzen für den Baum geschätzt wurden, stammt aus dem MMN-Projekt im Ordner
Referenzbaeume/MMN_ALL_ECSA_ohne009801_002695. Die MMN-Projekte für die Berechnung
der Constraint-Bäume sind in den Unterordnern EC_itol_mitSAConstraintTree und
SA_itol_mitECConstraintTree innerhalb des Ordners ECSA_kombiniert_iTol zu finden. Der aus den
Teilbäumen zusammengesetzte iTol-E. coli/Salmonellen-Baum (Abb. 8.7) hat zu dem direkt
berechneten iTol-E. coli/Salmonellen-Baum, der hier nicht abgebildet ist, einen Robinson-FouldsAbstand 66 und einen ssRF-Abstand 0 bei Bootstrap-Schwelle 129 (entspricht 65 %, vgl.
Verzeichnis
iTol/ECSA_kombiniert_iTol/Konstruktion_kombinierterECSA_iTol_Baum/Vergleich_
ecsa_vs_ecsaZusammengesetzt).
Verwendete Clusters of Orthologous Groups (COGs)
COG
Bezeichnung
Ciccarelli et al. EC
(„iTol-Baum“)
SA
ECSA
0012
0016
0018
0048
0049
0052
0060
0080
0081
0085
0087
0091
0092
0093
0094
0096
0097
0098
0099
0100
0102
0103
0124
0143
0172
0184
0186
0197
0200
0201
0202
0256
0495
0522
0525
0533
Predicted GTPase, probable translation factor
Phenylalanyl-tRNA synthetase alpha subunit
Arginyl-tRNA-synthetase
Ribosomal protein S12
Ribosomal protein S7
Ribosomal protein S2
Isoleucyl-tRNA-Synthetase
Ribosomal protein L11
Ribosomal protein L1
DNA-directed RNA polymerase, beta subunit/140 kd subunit
Ribosomal protein L3
Ribosomal protein L22
Ribosomal protein S3
Ribosomal protein L14
Ribosomal protein L5
Ribosomal protein S8
Ribosomal protein L6P/L9E
Ribosomal protein S5
Ribosomal protein S13
Ribosomal protein S11
Ribosomal protein L13
Ribosomal protein S9
Histidyl-tRNA-synthetase
Methionyl-tRNA-synthetase
Seryl-tRNA-synthetase
Ribosomal protein S15P/S13E
Ribosomal protein S17
Ribosomal protein L16/L10E
Ribosomal protein L15
Preprotein translocase subunit SecY
DNA-directed RNA polymerase, alpha subunit/40 kd subunit
Ribosomal protein L18
Leucyl-tRNA-synthetase
Ribosomal protein S4 and related proteins
Valyl-tRNA-synthetase
Metal-dependent proteases with possible chaperone activity
x
x
x
x (n. u.)
x (n. v.)
x
x
x
x
x
x
x
x
x
nicht verwendet
n. u.: Genfamilie ist im Datensatz des Verfassers nicht universell
n. v.: Mindestens ein Gen der Genfamilie ist im Datensatz des Verfassers nicht vorhanden
x (n. u.)
x (n. u.)
x (n. v.)
x (n. v.)
x
x
x
x (n. v.)
x (n. u.)
x
x
x (n. u.)
x (n. v.)
x (n. v.)
x (n. u.)
x (n. u.)
x (n. v.)
x (n. v.)
Tabelle 8.8: Einsatz der COGs bei Ciccarelli et al. und in dem hier dargestellten Projekt
61
8.2.2.5 Phylogenien nach einer Methode von Sergei Maslov
Dieser Abschnitt stellt eine neuartige Methode (Dixit et al., 2013) vor, die auf Ideen von Sergei
Maslov, Wissenschaftler am Brookhaven National Laboratory, Long Island, New York, USA,
zurückgeht. Sie benutzt Neighbor-Joining (Saitou und Nei, 1987).
Idee des Verfahrens
Sergei Maslovs Methode fußt auf der Bobachtung, daß viele Regionen auf dem Genom in E. coli
von Rekombination geprägt sind, sodaß sie sich nicht für Vorhersagen zur vertikalen Evolution der
Spezies eignen. Chromosomenfragmente, die auf verschiedene Art in eine Bakterienzelle gelangen,
können über homologe Rekombination mit anderen Chromosomen Anteile austauschen. Maslov
definiert Gene als klonal, wenn sie weniger als drei Substitutionen per 1000 bp aufweisen. Alle
anderen Gene wertet er als rekombinant und spricht ihnen dabei jedes vertikale Signal ab.
Darüberhinaus finde Rekombination nur zwischen E. coli-Stämmen statt, deren genetisches
Material sich um höchstens zwei Prozent unterscheidet. Darüber sei lediglich lateraler Gentransfer,
aber keine Rekombination mehr möglich. Dieser Schwellenwert könne auch einer Abgrenzung
zwischen den Arten dienen. Eben Gesagtes läßt den Schluß zu, daß die Distanz zwischen zwei
molekularen Sequenzen möglicherweise proportional zu der Zahl der Regionen auf einem
Chromosom ist, die durch Rekombination ausgetauscht worden sind. Dementsprechend könnte die
Distanz auch proportional zur evolutionären Distanz sein.
Realisation
Die vom Verfasser dieser Arbeit ausprogrammierte Methode wurde in Form des Perl-Programmes
computePairwiseDistances.pl realisiert (vgl. Algorithmus 8.1). Das Programm benutzt
die mit Gblocks vorbehandelten MSAs der einzelnen universellen Genfamilien. Mit dem
unveröffentlichten C-Programm PowerNeedle, einer schnellereren Version des Programms
EMBOSS für globale Alignments (Rice et al., 2000), wird die paarweise globale Sequenzähnlichkeit
zwischen allen Genen innerhalb einer Genfamilie berechnet. Der dazu benutzte Algorithmus für die
Berechnung eines globalen Alignments zweier Sequenzen wurde seinerzeit von Saul B. Needleman
und Christian D. Wunsch eingeführt (Needleman und Wunsch, 1970). Als Nächstes wird eine
Distanzmatrix für den zu berechnenden Neighbor-Joining-Baum konstruiert.
Die Distanz zwischen zwei E. coli-Stämmen ist gleich dem Prozentsatz rekombinanter Regionen.
Genpaare mit einer paarweisen Sequenzidentität über 99,6% werden als klonal, Genpaare unter
dieser Schranke als rekombinant gewertet. Für jedes Paar von Stämmen werden die rekombinanten
Regionen, also die rekombinanten Genpaare zwischen den Stämmen, gezählt. Paare von Genen aus
unterschiedlichen Genfamilien werden nicht als rekombinant behandelt. Der Prozentsatz
rekombinanter Regionen für ein konkretes Paar von Stämmen wird an der entsprechenden Stelle in
die Distanzmatrix eingetragen. Für die Berechnung von 200 Bootstrap-Wiederholungen wird für
jeden Stamm jeweils ein neuer Genpool geschaffen, indem aus dem tatsächlichen Genpool mit
Zurücklegen gezogen wird. Für jeden Bootstrap-Lauf wird eine neue Distanzmatrix berechnet. Die
resultierenden 200 Distanzmatrizen werden hintereinander in einer Datei gespeichert. Aus ihnen
generiert PHYLIP neighbor einen Neighbor-Joining-Baum mit Bootstrap-Werten ohne Outgroup.
Abschließend wird mittels PHYLIP consense ein Consensus-Baum berechnet.
62
Inferenz von Phylogenien nach der Methode von Sergei Maslov
Der folgende Absatz bezieht sich auf das Verzeichnis Maslovs_Methode innerhalb des
Projektordners Kapitel_Phylogenien. Mithilfe des oben beschriebenen Verfahrens wurden jeweils
Phylogenien für die E. coli- bzw. Salmonellen-Taxa aus Tabelle 8.1 auf Basis der universellen
Genfamilien berechnet (Ordner CoreGenes).
Die Daten für die Berechnung des E. coli-Teilbaumes befinden sich im Unterordner EC, zusammen
mit dem Programm ec_computePairwise Distances.pl. In EC befindet sich ein weiterer
Unterordner, pw, mit den mit einer Variante des Programmes EMBOSS Needle berechneten
paarweisen Sequenzidentitäten zwischen den E. coli-Genen. Für den Ordner SA gilt Äquivalentes.
Die mit dem Verfahren von Sergei Maslov berechneten Bäume für den E. coli- und den
Salmonellen-Datensatz sind in den Dateien ec_Maslov_PHYLIPConsensus.tre im Ordner
ec/pw/neighbor/consense und in sa_Maslov_PHYLIPConsensus.tre im Ordner sa/pw/neighbor/con
sense zu finden.
Algorithmus 8.1: Paarweise Distanzen nach einer Idee von Sergei Maslov
Eingabe
Ausgabe
Paarweise Sequenzidentitäten je Genfamilie, #Bootstrap-Wiederholungen, Ausgabedatei
Neighbor-Joining-Baum
For ( 1 .. #Bootstrap-Wiederholungen )
Foreach Bakterium
Erstelle einen neuen Genpool: ziehe so oft Gene mit Zurücklegen aus dem UrsprungsGenpool, wie das Bakterium Gene besitzt
EndFor
Foreach Paar { Bakterium1, Bakterium2 }
ZahlRekombinanterPaare = ZahlKlonalerPaare = ZahlPaareGesamt := 0
If Bakterium1 = Bakterium2
Then Distanz(Bakterium1, Bakterium2) = Distanz(Bakterium2, Bakterium1) := 0
Else Foreach Paar { GI-Nummer1 aus Bakterium1, GI-Nummer2 aus Bakterium2 }
If paarweise Sequenzidentität(GI-Nummer1, GI-Nummer2) > 99,6 %
Then ZahlKlonalerPaare++
Else ZahlRekombinanterPaare++
EndFor
ZahlPaareGesamt := ZahlKlonalerPaare + ZahlRekombinanterPaare
ProzentsatzRekombinanterPaare := 100 ∙ ( ZahlRekombinanterPaare /
ZahlPaareGesamt )
Distanz(Bakterium1, Bakterium2) := Distanz(Bakterium2, Bakterium1) =
ProzentsatzRekombinanterPaare
EndFor
EndFor
Konstruiere eine Distanzmatrix für das Paar (Bakterium1, Bakterium2)
Füge die Distanzmatrix der Ausgabedatei für Distanzmatrizen hinzu
EndFor
Erstelle für die Distanzmatrizen in der Ausgabedatei einen Consensus-Baum
Die Splits im E. coli-Baum (Abb. 8.8) werden insgesamt nur schlecht unterstützt. Die
Differenzierung der einzelnen phylogenetischen Gruppen von E. coli ist nur an zwei Stellen
statistisch ausreichend, nämlich bei dem Teilbaum aus Shigella sonnei und Shigella boydii sowie
dem Teilbaum aus den E. coli-Stämmen IAI39, O7:K1, SMS 3-5, 042 und UMN26, die gewöhnlich
den phylogenetischen Gruppen D1 und D2 zugeschlagen werden (siehe z. B. Chaudhuri und
63
Henderson, 2012). Die statistische Unterstützung der Splits im Salmonellen-Baum (Abb. 8.9) ist
insgesamt gut, sieht man von einem Teilbaum mit Typhimurium-Serovaren ab, bei denen es der
Methode nicht gelungen ist, diese genügend zu differenzieren.
Abbildung 8.6: Kladogramm für die E. coli-Stämme aus Tab. 8.1 auf Grundlage von 26
iTol-COGs. Die Zahlen an den Ästen sind Bootstrap-Werte aus 200 Wiederholungen.
64
Abbildung 8.7: Aus den Teilbäumen in den Abb. 8.5 und 8.6 zusammengesetzter iTol-E. coli/SalmonellenBaum. Die beiden Äste an der Wurzel sind verkürzt dargestellt. Die Astlängen wurden aus einem Alignment
der konkatenierten universellen Genfamilien der E. coli- und Salmonellen-Stämme geschätzt.
65
Abbildung 8.8: Kladogramm der mit der Methodik nach Maslov konstruierten Phylogenie für die
E. coli-Stämme aus Tab. 8.1. Die Zahlen an den Ästen sind Bootstrap-Werte aus 200
Wiederholungen.
66
8.3
Ergebnisse
In den vorhergehenden Abschnitten dieses Kapitels wurde dargestellt, wie unter einem MLFramework (Abschnitt 8.2.2.1) und einem bayesianischen Framework (Abschnitt 8.2.2.2) auf
einem MSA universeller Genfamilien Speziesbäume für die in dieser Arbeit verwendeten (siehe
Tabelle 8.1) E. coli-Stämme, für die Salmonellen und für E. coli und Salmonellen gemeinsam
geschätzt wurden. Desweiteren wurden Speziesbäume aus den E. coli- und Salmonellen-Teilbäumen
zusammengesetzt. Daneben wurden E. coli- und Salmonellen-Speziesbäume noch auf der
Grundlage ausgewählter hochkonservierter Genfamilien ebenfalls unter ML (Abschnitt 8.2.2.4)
und über Neighbor-Joining (Abschnitt 8.2.2.3) geschätzt. Abschließend wurde gezeigt, wie
Speziesbäume für E. coli und Salmonellen über eine bisher unveröffentlichte, auch auf NeighborJoining basierende Methode inferiert wurden, die als Distanzmaß den Prozentsatz rekombinierter
Regionen zwischen einem Paar von Spezies benutzt (Abschnitt 8.2.2.5). Dieser Abschnitt stellt die
mit den verschiedenen Methoden berechneten Phylogenien in einen quantitativen Zusammenhang.
Zunächst wird gezeigt, wie gut die statistische Absicherung der Splits der E. coli- und SalmonellenReferenzbäume ist. Dazu wurden Bootstrap-Werte, BPPs und die Split-Frequenzen in den
Genbäumen verglichen. Ein Vergleich der Distanzen zwischen den mit verschiedenen Methoden
berechneten Phylogenien schließt sich an, und zuletzt werden die E. coli- und SalmonellenReferenzbäume mit von anderen Gruppen veröffentlichten Phylogenien verglichen.
8.3.1
Statistischer Support der Splits von Escherichia coli- und
Salmonellen-Phylogenie
Aus den Alignments der konkatenierten universellen Genfamilien für die 25 Salmonellen bzw. 61
Escherichia coli (vgl. Tabelle 8.1) wurden mit verschiedenen Methoden drei Phylogenien
geschätzt:
a)
ein Speziesbaum mit PhyML/RAxML (Abb. 8.1 und 8.2),
b)
ein Consensusbaum der Genbäume (siehe Abschnitt 8.2.2.1) und
c)
ein Consensusbaum mehrerer mit MrBayes aufgefundener Bäume (vgl. Abschnitt
8.2.2.2).
Die Abb. 8.10 und 8.11 zeigen die Bäume SA-Referenz und EC-Referenz. Jeder Ast trägt drei
Zahlen, die darüber Auskunft geben, wie hoch seine statistische Unterstützung in Prozent unter den
drei Methoden ausgefallen ist. V. l. n. r. sind dies Bootstrap-Support, Bayesian Posterior Probability,
Häufigkeit des Splits in den Genbäumen.
E. coli-Datensatz: Abb. 8.10 zeigt die E. coli-Phylogenie aus Abb. 8.2. Die Bäume a) und c) haben,
bis auf eine Abweichung innerhalb der phylogenetischen Gruppe B, das gleiche
Verzweigungsmuster, Baum b) weicht signifikant ab. Praktisch alle Äste besitzen einen BootstrapSupport oberhalb 70 %, lediglich ein Ast weist einen Bootstrap-Wert von 64 % auf. Alle Splits bis
auf einer werden durch Posterior Probabilities von 100 % unterstützt. Der Split, der zwischen den
zwei Laborstämmen K-12 W3110 und K-12 MG1655 und den beiden von K-12 MG1655
abstammenden DH1-Stämmen unterscheidet, wird durch eine immer noch sehr gute Posterior
Probability von 95 % unterstützt. Unzureichend durch die Genbäume unterstützte Splits finden sich
sowohl tief im Baum als auch in der Nähe der Blätter. Die sehr hohe Verwandtschaft der E. colierschwert wahrscheinlich deren phylogenetische Unterscheidung.
67
Abbildung 8.9: Kladogramm der mit der Methodik von Maslov konstruierten Phylogenie für die SalmonellenStämme aus Tab. 8.1. Die Zahlen an den Ästen sind Bootstrap-Werte aus 200 Wiederholungen.
Salmonellen-Datensatz: Abb. 8.11 zeigt die Salmonellen-Phylogenie aus Abb. 8.1. Die Bäume a)
und c) besitzen die gleiche Topologie. Ihre Äste sind statistisch durchgängig gut durch BootstrapWerte über 70 % und BPPs von 100 % abgesichert. Baum b) weicht allerdings signifikant von ihnen
ab, was sich unmittelbar in einem größtenteils niedrigen Split-Support manifestiert. Für die Splits,
die zwischen sehr nah verwandten Salmonellen unterscheiden, ist der Split-Support besonders
schlecht, so gesehen beispielsweise bei den Typhimurium-Serotypen. Da sie erst in jüngerer Zeit
divergiert sind und damit die diesbezüglichen Astlängen sehr kurz sind, reichen die Unterschiede
zwischen ihnen nicht zu einer phylogenetischen Differenzierung aus. Viele Splits tiefer im Baum
werden durch die Genbäume allerdings vergleichbar schlecht unterstützt. Eine nahe liegende
Erklärung könnte über Plasmide vermittelter häufiger lateraler Gentransfer auf Spezies-Niveau sein
(Kloesges et al., 2010).
8.3.2
Distanzen zwischen den mit verschiedenen Methoden
berechneten Phylogenien
Die Abstände zwischen den Phylogenien hat der Verfasser mit dem Perl-Programm computeSSRF
berechnet. RF-Distanzen zwischen dem mit MrBayes berechneten Consensus-Baum („BayesBaum“) und den anderen Bäumen wurden mit dem Programm treedist aus der PHYLIP-Suite
68
berechnet (siehe Anmerkung unterhalb von Tab. 8.9). Die Ergebnisse für die EC, SA-, ECSA- und
die aus EC und SA zusammengesetzten Phylogenien sind in entsprechend benannten Unterordnern
im Ordner Baumvergleich gespeichert. Innerhalb der Unterordner
sind die eigentlichen
Distanzberechnungen in Ordnern abgelegt, deren Name die verglichenen Methoden 29 widerspiegelt.
Das Ergebnis einer Distanzberechnung mit computeSSRF findet sich immer in einer Datei namens
ssrfDistances.txt.
Tab. 8.9 zeigt die Robinson-Foulds-Abstände (schwarz auf weiß) und die ssRF-Abstände (weiß auf
schwarz) bei Signifikanzschwelle 70 % (entspricht Bootstrap-Wert 140 auf einer Skala bis 200) für
die in diesem Kapitel gezeigten Phylogenien. Für den Fall, daß bei einem Vergleich kein BootstrapWert 140 präsent gewesen ist, wurde die ssRF-Distanz für die nächsthöhere Bootstrap-Schwelle
genommen und im Text jeweils hinter den ssRF-Abstand in Klammern gesetzt.
E. coli: Die mit der Bayesianischen Methode und der Maximum-Likelihood-Methode inferierten E.
coli-Phylogenien weisen nur einen Unterschied in einem Teilbaum mit drei sehr nah verwandten E.
coli B-Taxa auf (vgl. dazu den Kommentar unter Tab. 8.9). Die ML-Phylogenie hat ssRF-Abstand
10 von der iTol- und ssRF-Abstand 6 von der mit der Maslov-Methode erzeugten Phylogenie,
während diese untereinander einen ssRF-Abstand 3 haben. Die iTol- und Maslov-Methoden
erzeugen demzufolge einen ähnlicheren Baum.
Salmonellen: Die mit der Bayesianischen Methode und der Maximum-Likelihood-Methode
inferierten Salmonellen-Phylogenien sind in ihrem Verzweigungsmuster identisch. Die mit der iTolMethode generierte Phylogenie hat von der ML-Phylogenie ssRF-Abstand 0 (Signifikanzschwelle
150), von der mit Maslovs Methode erzeugten Phylogenie ssRF-Abstand 11 (Schwelle 144). Die
ML-Phylogenie hat ebenfalls ssRF-Abstand 11 von der Maslov-Phylogenie (Schwelle 144). Die in
den folgenden beiden Absätzen vorgestellten Phylogenien wurden mit den anderen Phylogenien
dieses Kapitels verglichen, erscheinen aber aus Platzgründen nicht in Tabelle 8.9.
iTol-Datensatz für 29 COGs
Im Vorfeld dieser Arbeit wurden drei Phylogenien mit den oben verwendeten COGs sowie den
COGs 060, 085 und 124, sofern sie jeweils universell waren, mit der gleichen Technik berechnet.
Dies geschah in der Erwartung, die statistische Unterstützung der Splits insgesamt verbessern zu
können, was allerdings nicht der Fall war. Francesca Ciccarelli und Kollegen, Urheber des „iTolBaumes“ (Ciccarelli et al., 2006), haben bei ihren Recherchen die o. g. COGs ausgeschlossen, da
sie die COGs 060 und 124 in Verdacht haben, zweimal bzw. dreimal horizontal in mehrere Spezies
transferiert worden zu sein. Für COG 085 konnten sie kein eindeutiges MSA herstellen.
Die Salmonellen-Teilbäume, die auf der Grundlage von 26 bzw. 29 COGs erzeugt worden sind,
haben RF-Distanz 24 und ssRF-Distanz 2 (Signifikanzschwelle 142) und die entsprechenden E.
coli-Teilbäume RF-Distanz 44 und ssRF-Distanz 6 (Schwelle 142). Die erzeugten Phylogenien sind
nicht identisch, worauf man hätte hoffen können, da mit hochkonservierten COGs gearbeitet
worden ist. Womöglich stören die hinzugenommenen COGs 060 und 124 das phylogenetische
Signal tatsächlich. Da sich der Bootstrap-Support vieler Äste auch in den auf mehr COGs
beruhenden Phylogenien nicht verbessert hat, ist es zusätzlich denkbar, daß das in den COGs
vorhandene phylogenetische Signal nicht zur Differenzierung der nah verwandten Taxa ausreicht.
Die für die Berechnung der Phylogenien relevanten Dateien sind im Ordner iTol_29COGs zu
finden, die vorgenommenen Distanzberechnungen befinden sich im Ordner Ordnervergleich.
29 Da mit der Methode von Maslov (vgl. Abschnitt 8.2.2.5) mangels Verfügbarkeit der paarweisen Sequenzidentitäten kein Baum für
E. coli und Salmonellen berechnet werden konnte, fehlen die entsprechenden Vergleiche.
69
Neighbor-Joining-Bäume
Die mit der mit dem Neighbor-Joining-Verfahren erzeugte E. coli-Phylogenie aus Abschnitt 8.2.2.3
hat von der mit der Methode von Maslov generierten Phylogenie einen RF-Abstand 30
(Signifikanzschwelle 140) und einen ssRF-Abstand 4 (Schwelle 143). Sie hat RF-Abstand 4 und
ssRF-Abstand 5 von EC-Referenz (Schwelle 144). Der Neighbor-Joining-Baum für die
Salmonellen, dessen Konstruktion ebenfalls in Abschnitt 8.2.2.3 erläutert wurde, hat von der mit
Maslovs Methode erzeugten Phylogenie RF-Abstand 14 und einen ssRF-Abstand 5 (Schwelle 144).
Von SA-Referenz hat er RF-Abstand 6 und einen ssRF-Abstand 6 (Schwelle 150).
8.3.3
Vergleich der ML-Bäume mit Literaturbäumen
In diesen Abschnitt wird die E. coli-Phylogenie EC-Referenz mit zwei Bäumen aus im Jahr 2011
veröffentlichten Arbeiten von Chaudhuri et al. und Reeves et al. verglichen. Es bot sich
darüberhinaus an, die Bäume im Hinblick auf deren Übereinstimmung mit den von Selander
(Selander et al., 1987) definierten großen phylogenetischen Gruppen der Spezies Escherichia coli
zu untersuchen. Die Salmonellen-Phylogenie SA-Referenz wird mit einer von Timme (Timme et
al., 2013) veröffentlichten Phylogenie verglichen.
Phylogenie für 24 E. coli von Chaudhuri und Henderson
Chaudhuri und Henderson (Chaudhuri und Henderson, 2011) haben eine Phylogenie für 24 E. coli
mit RAxML auf Grundlage der konkatenierten universellen Genfamilien berechnet. Ihre Phylogenie
ist entsprechend der in der Literatur verwendeten Klassifikation der E. coli-Stämme entlang der
großen phylogenetischen Gruppen (Selander et al., 1987) eingefärbt. Alle Splits im Baum werden
von allen 100 Bootstrap-Replikaten unterstützt. Die für diese Arbeit berechnete ECReferenzphylogenie (siehe Abschnitt 8.2.2.1) basiert - ebenfalls wie die von Chaudhuri und
Henderson geschätzte Phylogenie für 24 Stämme (siehe Abb. 8.12) - auf einem multiplen
Sequenzalignment der universellen konkatenierten Genfamilien.
Beide Bauminferenzen erfolgten unter einem ML-Framework; erstere wurde mittels PhyML mit
dem Nukleotidsubstitutionsmodell TN93 berechnet, letztere mittels RAxML mit dem Modell GTR.
Abbildung 8.13 zeigt die gewurzelte E. coli-Referenzphylogenie EC-Referenz für 61 Stämme mit
geschätzten Astlängen und analog zum Baum von Chaudhuri kolorierten phylogenetischen
Gruppen. Die Stämme TW 10509, B171, TY 2482, O104:H4, E1167 und B7A im Chaudhuri-Baum
sind im Baum EC-Referenz nicht vorhanden. Der Bootstrap-Support der Splits in EC-Referenz ist
mit einer Ausnahme in der Gruppe B2 mindestens 70 %. Der Baum spiegelt ebenfalls die für E.
coli definierten großen phylogenetischen Gruppen wider. Die Taxa, die gemäß ihrer
elektrophoretischen Eigenschaften den verschiedenen phylogenetischen Gruppen zugerechnet
werden, clustern in EC-Referenz auch in eben diesen Gruppen. Der zur Gruppe B1 gehörende
Stamm O103:H2 befindet sich in EC-Referenz im Vergleich zum Chaudhuri-Baum allerdings an
einer anderen Stelle innerhalb von B1.
Chaudhuri und Mitarbeiter haben bei der Auswahl der E. coli-Stämme für ihre Phylogenie solche
ausgewählt, die sich gut differenzieren lassen bzw. die nicht zu nah verwandt sind. Im Ergebnis
konstruierten sie damit eine robuste, wenn auch nicht hoch aufgelöste Phylogenie für E. coli.
70
Abbildung 8.10: E. coli-Phylogenie mit Support durch Bootstrap, Häufigkeit der Splits in den Genbäumen
und Posterior Probabilities. Die Zahlen sind Prozentwerte.
71
E. coli/Shigellen-Phylogenie von Reeves et al.
Von der Arbeitsgruppe um Peter Reeves stammt eine Phylogenie für 56 vollständig sequenzierte
Escherichia coli- und Shigellen-Genome (Reeves et al., 2011). Aufgrund der nahen Verwandtschaft
der K-12-, O157:H7- und B-Stämme untereinander haben sich die Autoren entschlossen, diese
jeweils als einzelnes Taxon im Baum darzustellen. Das Genom von E. fergusonii wurde als
Outgroup benutzt. Die Phylogenie wurde ebenfalls auf Grundlage der Alignments der Gene des
Kerngenoms von E. coli und Shigellen konstruiert. Viele Bootstrap-Zahlen an den Ästen ihres
Baumes (vgl. dazu Abb. 1 aus Reeves et al., 2011) sind aber sehr niedrig, dessen Verzweigungsmuster ist daher nicht sehr sicher. Reeves Phylogenie und EC-Referenz haben 41 Taxa gemeinsam.
Da der Reeves-Baum nicht in einem maschinenlesbaren Format vorlag, wurde die Abbildung aus
Reeves et al. mit dem Java-Programm TreeSnatcher Plus in einen Newick-String übersetzt (für eine
Erklärung des Programms siehe Kapitel 5). Nachdem aus den Bäumen mit Mesquite jeweils die
Taxa entfernt worden waren, die nicht in beiden Bäumen vorkommen, wurden für Reeves Baum die
Bootstrap-Zahlen manuell an die Skalierung der Bootstrap-Zahlen von EC-Referenz angepaßt. Dann
wurden RF- und ssRF-Distanzen mittels computeSSRF ermittelt. Das Entfernen von Taxa aus den
72
Bäumen führte naturgemäß zu einer veränderten Konfidenz der Splits, daher sind die ssRFDistanzen nur eingeschränkt gültig30. Die RF-Distanz von EC-Referenz zum Baum von Reeves ist 8,
die ssRF-Distanz bei Signifikanzschwelle 140 ist 4 und 0 bei Schwelle 172. Unter besagtem
Vorbehalt wird insgesamt aber deutlich, daß die Verzweigungsstruktur der Bäume, die beide fast
alle heute sequenzierten E. coli-Genome berücksichtigen und beide aus Alignments konkatenierter
Genfamilien konstruiert worden sind, sehr ähnlich ist. Die Bäume sind in Abb. 8.14 dargestellt.
Die editierten Newick-Ausdrücke für die Phylogenien sind in den Dateien ec_PHYLIPConsensus_
final.tre und ec_reeves_final.tre im Ordner Reeves zu finden.
RF- und ssRF-Distanzen zwischen den mit verschiedenen Methoden rekonstruierten Phylogenien
Methode
ML
Spezies
EC
SA
Bayes
ECSA
ECSA
komb.
EC
ML
iTol: 26 COGs
0
9
13
10
3
18
78
74
72
72
11
0
66
31*
20
SA
6*
51*
18
SA
15
0
52
32
EC
11
14
10*
ECSA
EC
ECSA
komb.
6
10
SA
ECSA
0
?
1
ECSA komb.
Maslovs
Methode
SA
Maslovs Methode
10
4
SA
EC
EC
0
ECSA komb.
EC
SA
0*
SA
ECSA
Bayes
EC
iTol: 26 COGs
60
20
20
SSRF-Distanz
SSRF-Distanz
RF-Distanz
bei Signifikanzschwelle 70 %
* Der bayesianische E. coli-Baum unterscheidet sich nur durch einen Teilbaum mit drei B-Stämmen vom ML-Baum. In letzterem fungiert einer der
Stämme als Outgroup zu den beiden anderen, im Bayes-Baum sind alle drei Stämme gleichberechtigt (der Teilbaum ist multifurzierend). Da sich
weder mit computeSSRF noch mit TOPD der Abstand zwischen multifurzierenden Bäumen berechnen läßt, wurde das Programm treedist aus dem
PHYLIP-Paket benutzt, um den RF-Abstand zu berechnen. Da ssRF-Abstand zwischen dem Bayes- und dem ML-Baum lediglich 1 ist, wurde der
Abstand zum ML-Baum anstelle des Abstandes zum Bayes-Baum eingesetzt. Der wahre Abstand dürfte nur geringfügig abweichen.
Tabelle 8.9: Distanzen zwischen den rekonstruierten Phylogenien bei Bootstrap-Schwelle 140 (von
200) bzw. dem nächsthöheren Wert
Phylogenie für 13 Salmonellen von Timme et al.
Ruth Timme und ihre Mitautoren haben die erste Phylogenie (Abb. 1 in Timme et al., 2013) für
Salmonella enterica subsp. enterica vorgelegt (Timme et al., 2013), die auf einem neuartigen,
referenzlosen k-mer-Ansatz beruht, der genomweit gesammelte SNPs konkateniert. Ihre Phylogenie
umfaßt 156 annotierte Salmonellen-Genome mit 78 Serovaren, von denen 102 erst kurze Zeit vor
Veröffentlichung ihrer Arbeit sequenziert worden sind. 59 vollständig oder teilweise sequenzierte
Genome stammen vom NCBI. Die Inferenz eines Maximum-Likelihood-Baumes wurde von ihnen
auf den konkatenierten SNPs mittels RAxML 7.3.2 ausgeführt, wobei Rapid Bootstrapping zum
Einsatz kam. Zum Wurzeln des Baumes wurde eine Outgroup, bestehend aus vier Vertretern der
Subspezies von Salmonella, S. e. diarizonae, S. e. houtenae, S. e. indica und S. e. salamae, benutzt.
In der ursprünglichen Phylogenie wurden die Bootstrap-Werte an den Ästen indirekt über deren
30 Zum Zwecke einer genaueren Aussage könnte man die Konfidenz der Splits ausrechnen, indem man die jeweiligen Taxa aus den
Bäumen entfernt.
73
Dicke und Färbung visualisiert. Aus der Abbildung ist ersichtlich, daß zahlreiche endständige Äste
einen sehr guten, viele Äste tiefer im Baum aber auch einen unzureichenden Bootstrap-Support
besitzen. Beide Bäume wurden auf ihr gemeinsames Taxon-Set mit 13 Spezies reduziert (siehe
Dateien timme_13Taxa.phy und sa_PHYLIPConsensus_13Taxa.phy im Verzeichnis Timme).
Da aus beiden Phylogenien, insbesondere aus der von Timme, viele Taxa entfernt wurden, wurde
auf die Berechnung des ssRF-Abstands verzichtet. Der RF-Abstand zwischen beiden Bäumen ist 6
(vgl. Abb. 16), er wurde mit treedist aus der PHYLIP-Suite berechnet (vgl. Abb. 8.15). Im Hinblick
auf die Größe der Phylogenie sind die Unterschiede beträchtlich, trotz gemeinsamer Struktur
sowohl im Bereich der Blätter als auch tief im Baum. Die Dissonanz zwischen den Bäumen könnte
zwei Hauptursachen haben: zum einen ist der Baum von Timme deutlich feiner aufgelöst als SAReferenz, was es schwieriger macht, für ihn die Signale vertikaler Vererbung herauszuarbeiten.
Abbildung 8.12: E. coli-Phylogenie aus Chaudhuri et al., Abb. 4, auf
Grundlage konkatenierter universeller Genfamilien. Die Phylogenie
wurde mit RAxML v7.04 unter Benutzung des GTR-Modells für
Nukleotidsubstitution und der CAT-Approximation für Ratenheterogenität geschätzt. Die Zahlen an den Ästen repräsentieren den
Bootstrap-Support in Prozent.
Zum anderen weisen Timme et al. selbst auf mögliche Probleme im Zusammenhang mit ihrer
Methode hin (Timme et al., 2013, S. 2): ihre neuartige Methode baut eine Matrix mit
Polymorphismen der einzelnen Nukleotide (SNPs), wendet darauf aber traditionelle Modelle unter
einem Maximum-Likelihood-Framework an. Außerdem läßt ihre Methode eine separate
74
Betrachtung von Genbäumen nicht zu. Das macht es unmöglich, inkongruente, durch HGT
hervorgerufene phylogenetische Signale zu identifizieren und zu analysieren. Da der Verfasser zur
Konstruktion von SA-Referenz keine Outgroup benutzt hat, stand wahrscheinlich mehr
innerartliches phylogenetisches Signal zur Differenzierung der Serovare zur Verfügung.
75
8.4
Diskussion
In diesem Kapitel wurden Methoden beschrieben, die es zum Ziel hatten, in statistischer Hinsicht
robuste Phylogenien für die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten 86 E. coli/Shigellen- und
Salmonellen-Stämme (siehe Tab. 8.1) zu schätzen. Rekonstruktionen, die möglichst den „wahren“
Phylogenien entsprechen, sind unabdingbar für Studien, die den anzestralen Lebensstil, den
Metabolismus oder die Simulation evolutionärer Prozesse bei den betrachteten Bakterien zum Inhalt
haben. Wurde in den Arbeiten, die dieses Kapitel beschreibt, die "wahre" Phylogenie von E. coli
bzw. Salmonellen gefunden?
76
Zunächst empfiehlt es sich, die rekonstruierten Phylogenien nochmals einer Betrachtung zu
unterziehen. Die ML-Methode und die Bayesianische Methode haben einen beinahe identischen E.
coli-Baum geliefert, die Salmonellen-Bäume sind sogar völlig identisch. Die entsprechenden
Neighbor-Joining-Bäume weisen lediglich geringe Unterschiede zu ihnen auf. Den Bäumen ist
gemeinsam, daß ihre Splits bis auf wenige Ausnahmen durchgängig gut statistisch abgesichert sind.
Die E. coli-Bäume zeigen die für diese Spezies definierten großen phylogenetischen Gruppen
(Selander et al., 1987) und entsprechen damit im Wesentlichen bereits publizierten Bäumen
(Chaudhuri et al., 2011; Reeves et al., 2011), sie sind allerdings höher aufgelöst. Der SalmonellenBaum teilt seine Grundstruktur mit einem von Timme et al. im Jahr 2013 veröffentlichten Baum,
weist aber einige Unterschiede zu ihm auf.
77
Neben dieser ersten Gruppe von Bäumen existiert eine zweite Gruppe von Bäumen, die zum einen
auf Grundlage hochkonservierter Gene („iTol-Methode“) erzeugt wurden, zum anderen mit einer
bis dato unveröffentlichten, auf Neighbor-Joining basierenden Methode („Maslov-Methode“), die
den Prozentsatz rekombinanter Regionen zwischen zwei Genomen als Distanz benutzt. Die von den
beiden Methoden rekonstruierten E. coli-Bäume sind sich einander ähnlicher, als sie den E. coliBäumen der ersten Gruppe sind. Die Salmonellen-Bäume der zweiten Gruppe andererseits sind sich
einander ebenso unähnlich wie den Bäumen der ersten Gruppe. Die statistische Unterstützung der
Splits in den Bäumen der zweiten Gruppe ist grundsätzlich schlechter als in der ersten Gruppe, am
schlechtesten ist sie bei der „iTol-Methode“.
Aufgrund dieser Überlegungen spräche einiges dafür, eher den Bäumen der ersten Gruppe
zuzubilligen, womöglich eine Annäherung an die „wahren“ Phylogenien darzustellen. Allerdings
können die verwendeten Methoden eine hohe statistische Unterstützung der Splits in den Bäumen
selbst in Anwesenheit von systematischen und anders gearteten Fehlern im Vorfeld produzieren. Es
kommen gleich mehrere Fehlerquellen in Frage:
Die Bestimmung von Orthologen ist eine Hypothese gemeinsamer Verwandtschaft (Timme et al.,
2013). Falls sie inkorrekt ist, führt sie unweigerlich einen systematischen Fehler in die
Bauminferenz ein. Die in dieser Arbeit eingesetzte Methode zur Orthologenbestimmung über
Sequenzähnlichkeit und Syntenie (Eßer, 2010) wurde bisher noch nicht peer-reviewed. Es ist u. a.
diskutabel, ob sie zur Detektion lateralen Gentransfers zwischen weniger nah verwandten Spezies
eingesetzt werden kann. So erwartet sie neben einem hohen Grad an Sequenzidentität noch eine
ausgeprägte Syntenie, die bei weniger nah verwandten Spezies aber gar nicht vorhanden ist. Für die
Arbeiten zu den Kapiteln 6 und 7 wurden Orthogruppen mit Proteinortho bestimmt, da der
Verfasser vermutet, daß die Methode von Christian Eßer in Anwesenheit lateralen Gentransfers
ausgerechnet die syntenischen Gene nicht liefert.
Die in vielen Studien und auch vom Verfasser eingesetzte Konkatenationsmethode konstruiert ein
multiples Sequenzalignment aus den universellen Genfamilien, auf dem die Phylogenie inferiert
wird. Es werden also die Sequenzen aller Loci in einem gemeinsamen Datenquelle gebündelt, d. h.,
die gesamte zur Verfügung stehende Information wird zur Inferenz eines Baumes verwendet. Aus
praktischen Gründen wird aber lediglich ein Modell für die Substitution der Nukleotide in den
Sequenzen eingesetzt, obwohl davon auszugehen ist, daß die einzelnen Gene unterschiedlich
evolvieren. Nur falls die evolutionären Raten aller Loci niedrig sind, kombinieren Maximum
Parsimony- und Maximum Likelihood-Verfahren zuverlässig alle vorhandenen phylogenetischen
Signale (Felsenstein, 2004, Kapitel 9).
Trotz dieser Einwände halten Touchon und Kollegen (Touchon et al., 2009) Whole-GenomeAnalysen, d. h. Analysen, in deren Verlauf die gesamte in einem Genom enthaltene Information
benutzt wird, nach wie vor für den „Gold-Standard“, wobei sie sich aber nur auf Escherichia coli
beziehen. Salichos und Rokas (2013) bezeichnen Konkatenation und das Entfernen von Taxa aus
einer Phylogenie demgegenüber als „Brute-Force“-Methode. Ihre Untersuchung von 1.070
Orthologen aus 23 Hefe-Genomen identifizierte 1.070 unterschiedliche Genbäume, von denen kein
einziger mit dem Speziesbaum kongruent war, den sie über eine Konkatenationsmethode bestimmt
hatten. Die Inkongruenz war für kürzere Äste tiefer in der Phylogenie größer. Die Wahl von Genen
oder Knoten mit durchschnittlich hoher statistischer Unterstützung bei der Verwendung derartiger
Methoden verbesserte insgesamt die Robustheit ihrer Bauminferenz. Sie erhielten ähnliche
Ergebnisse bei Analysen von Vertebraten- und Metazoen-Phylogenien. Im Lichte ihrer Ergebnisse
raten sie von der Verwendung von Konkatenation ab und befürworten stattdessen die Auswahl von
Genen mit starkem phylogenetischem Signal.
Consensus-Bäume umgehen diese Probleme, berücksichtigen aber nicht alle in den konsolidierten
Bäumen vorhandenen Signale und insbesondere nicht die Stärke der Signale. Eine
78
Charakterisierung der unter dem Begriff „Total Evidence Debate“ geführten Debatte für und wider
Consensus bzw. Konkatenation ist nachzulesen bei Felsenstein, 2004. Steel und Böcker (2000)
lieferten mathematisch begründete Einwände gegen die Consensus-Methode.
Die E. coli- und Salmonellen-Teilbäume wurden für die Verwendung mit dem Programm
GLOOME, das anzestrale Muster auf der Phylogenie schätzt, gewurzelt. Die Bestimmung
geeigneter Wurzelpositionen ging wie in Abschnitt 8.2.2.1 erläutert vonstatten. Dabei wurde die
Option „Constraint Tree/Guide Tree“ des Programms RAxML verwendet. Mit Angabe eines
„Constraint-Trees“ wird allerdings eine – wenn auch biologisch motivierte - Grundannahme über
die Gestalt der Phylogenie in die Bauminferenz eingebracht, die unter Umständen keine
Entsprechung in den Daten besitzt31.
Die Bäume ECSA-Referenz aus Abschnitt 8.2.2.1 und der kombinierte „iTol-Baum“ aus Abschnitt
8.2.2.4 wurden aus den gewurzelten Teilbäumen zusammengesetzt, und die Bootstrap-Zahlen aus
den Teilbäumen wurden übernommen. Die Bäume wurden allerdings in unterschiedlichen
Sitzungen auf verschiedenen Alignments berechnet, wenn auch mit den gleichen Parametern und
der identischen Zahl von Bootstrap-Wiederholungen. Auf diesen Sachverhalt wird durch die
unterschiedliche Einfärbung der Speziesnamen in Abb. 8.3 hingewiesen. Insgesamt erscheint dem
Verfasser dieses Vorgehen vertretbar, da es sich bei E. coli und Salmonellen nach heutigem
Kenntnisstand um Kladen (Porwollik et al., 2002; Elena et al., 2005) handelt, die einen
gemeinsamen Vorfahren haben32. Einen etwas anderen Ansatz, Teilbäume zu wurzeln und zu einem
Baum zusammenzufassen, haben Tal Dagan, Yael Artzy-Randrup und William Martin (Dagan et al.,
2008) benutzt: Von den Alignments der Teilbäume werden jeweils Consensus-Sequenzen derartig
konstruiert, daß die am häufigsten in einer Spalte vorkommenden Nukleotide in eine Sequenz
übernommen werden. Diese Sequenzen werden dazu benutzt, den Baum der Teilbäume zu schätzen
und die Teilbäume zu wurzeln.
Der Ansatz der Gruppe hinter dem „Interactive Tree of Life“-Baum (Ciccarelli et al., 2006)
erscheint geeignet, einen „Stammbaum des Lebens“ (engl. „Tree of Life“) hervorzubringen, da er
auf Genfamilien beruht, die über das ganze zelluläre Leben verbreitet und hochkonserviert sind.
Nach Auswahl universeller Proteine und Ausschluß evtl. lateral transferierter Proteine lieferte der
Ansatz 31 orthologe Gruppen, die in 191 Genomen vorhanden sind. Auf ihnen errechnete er einen
Baum mit durchweg guten Bootstrap-Werten. Dagan und Martin (Dagan und Martin, 2006)
kritisierten, daß Ciccarelli et al. mit ihrer Technik nur lediglich ein Prozent der Positionen in einem
durchschnittlichen prokaryotischen Genom konkatenierten. Demnach erhielten Ciccarelli und ihre
Mitautoren zwar einen Baum, jedoch einen, den Dagan und Martin als „Tree of one percent of life“
bezeichneten. Dessen ungeachtet – da für diese Arbeit nicht relevant - hat der Verfasser die zu den
von Ciccarelli et al. benutzten COGs äquivalenten Orthogruppen in seinen E. coli- und
Salmonellen-Datensätzen bestimmt und auf ihnen Phylogenien geschätzt. Warum weisen die Äste
dieser Phylogenien beinahe durchgehend einen schlechten Bootstrap-Support auf? Der
Verwandtschaftsgrad der Organismen im „Tree of Life“-Baum ist vermutlich gering genug, daß
diese sich über die COGs genügend differenzieren lassen. Der E. coli-Teilbaum im „Tree of Life“
umfaßt sechs Stämme, die sich auch in den höher aufgelösten Bäumen des Verfassers gut
differenzieren ließen. Für diese Arbeit wurde der von Ciccarelli et al. erdachte Algorithmus nicht
nachgebaut, sondern es wurden bestimmte Orthogruppen unter den bereits existierenden, mit dem
Verfahren von Christian Eßer (Eßer, 2010) erzeugten Gruppen ausgewählt. Der Verfasser geht
31 Der Autor des Programms RAxML weist in einem Tutorium (http://sco.h-its.org/exelixis/web/software/raxml/hands_on.html) auf ein
Szenario hin, in dem der Einsatz eines Guide Trees seiner Ansicht nach vertretbar ist: „The only purpose for which they may be useful is
to assess various hypotheses of monophyly by imposing constraint trees and then conducting likelihood-based significance tests to
compare the trees that were generated by the various constraints“.
32 Die phylogenetische Einordnung der Shigellen hingegen wird mittlerweile wieder diskutiert. Zu Beginn des 21. Jahrhunderts schien
sicher, daß sie ein Stamm von E. coli ist und kein eigenes Genus (siehe z. B. Lan und Reeves, 2002). Eine jüngere Studie von Zuo und
Kollegen (Zuo et al., 2013) kommt zu dem Schluß, daß die Shigellen eine Schwesterspezies von E. coli innerhalb des Genus
Escherichia sind.
79
jedoch davon aus, daß dieser Unterschied sich nicht oder nur kaum auswirkt. Er hat allerdings die
Vermutung, daß sich die Methode so, wie sie hier beschrieben ist, nicht uneingeschränkt für nah
verwandte Organismen verwenden läßt. Es empfiehlt sich, eine größere Zahl von COGs zu
verwenden, um den zufälligen Fehler bei der Schätzung der Phylogenie zu verkleinern.
Die von Sergei Maslov vorgeschlagene Methode produziert Phylogenien, die statistisch besser
unterstützt, aber nicht völlig robust sind. Das verwendete Distanzmaß ist biologisch sinnvoll.
Maslov hat seine Beobachtungen allerdings vorerst nur für E. coli aufgestellt. Zur Berechnung der
Distanz zwischen zwei Spezies werden die rekombinanten Regionen jeweils innerhalb der
Genfamilien bestimmt und aufaddiert. Der Verfasser hat in seinem Algorithmus für die
Distanzberechnung zwischen einem Paar von Spezies rekombinante Regionen auch zwischen
Genen aus verschiedenen Genfamilien zur Distanz addiert. Dieses Vorgehen führt möglicherweise
zu den beobachteten, sehr niedrigen Bootstrap-Zahlen an den Ästen. In Wirklichkeit sind die
Distanzen vielleicht kürzer. Ciccarelli und Kollegen und Sergei Maslov haben ihre Ansätze zur
Ableitung einer Phylogenie so ausgelegt, daß diese eine robuste Phylogenie liefern, ohne dabei von
Ereignissen lateralen Gentransfers beeinflußt zu werden. Aus diesem Grund erwartete der Verfasser,
daß die von den Methoden erzeugten Bäume ähnlicher sind, als es tatsächlich der Fall ist. Da die
Methode von Maslov für eine unabhängige Bewertung bisher noch nicht zur Verfügung stand,
wurden etwaige Stärken und Schwächen noch nicht untersucht.
Der Verfasser schlägt insgesamt vor, für phylogenetische Studien zur Diversität von E. coli bzw.
Salmonellen die in Abschnitt 8.2.2.1 beschriebene Methodik zu benutzen: Konkatenation der
universellen Genfamilien, Schätzen eines Baumes, besser mehrerer Bäume unter einem MaximumLikelihood-Framework, Schätzen eines Consensus-Baumes für die „besten“ Bäume aus mehreren
unabhängigen Experimenten unter einem Bayesianischen Framework. Die solchermaßen
gewonnene E. coli-Phylogenie gibt, wie die bisher veröffentlichten Phylogenien, die für
Escherichia coli definierten großen phylogenetischen Gruppen wieder, was ihr (subjektiv) eine
gewisse Glaubwürdigkeit verleiht. Selbstverständlich brauchen aber auch diese Phylogenien nicht
der „wahren“ Phylogenie von E. coli zu entsprechen. Es wird kritisiert, daß die im Jahre 1987
vorgenommene Einteilung in phylogenetische Gruppen maßgeblich auf E. coli-Isolaten von
Menschen, Zootieren und domestizierten Tieren stammt, aber nicht von Tieren aus natürlichen
Habitaten (Pupo et al., 2000).
Wahrscheinlich funktioniert die in Abschnitt 8.2.2.1 skizzierte Vorgehensweise auch bei weniger
nah verwandten Bakterienspezies. Es besteht dann aber die Gefahr, daß mit abnehmender
Verwandtschaft der Organismen die vertikalen phylogenetischen Signale durch die Zunahme
lateralen Gentransfers immer stärker verwaschen werden und dadurch schwerer zu entdecken sind
(Kloesges et al., 2011).
Wie visualisiert man die Diversität von Bakterien angesichts lateralen Gentransfers am besten –
durch einen Baum oder durch ein Netz? Bakterien vermehren sich durch Verdopplung, wobei ihr
Erbmaterial mit den bekannten Einschränkungen nahezu unverändert dupliziert wird. Dieser Prozeß
hat binären Charakter und wird daher folgerichtig als bifuzierender Baum dargestellt. LGTEreignisse während der Bakterienevolution verwässern dieses Signal allerdings, ihr Effekt darf
daher nicht unberücksichtigt bleiben (Dagan und Martin, 2006; Dagan und Martin, 2008). Es ist für
die Fragestellung nicht entscheidend, in welchem Maße LGT die möglicherweise dominanten
vertikalen Signale stört. Vielmehr müssen, wenn möglich, beide Arten von Signalen integriert
werden. Eine geeignete Darstellung für die Prokaryotenevolution wäre ein Netz, in welchem die
vertikalen Kanten sehr viel höhere Gewichte besitzen als die horizontalen bzw. gerade die
Gewichte, die den individuellen Stärken der Vererbungspfade entsprechen. Phylogenetische Bäume
würden ihren Sinn nicht einbüßen, wenn man sie für die Darstellung evolutionärer Prozesse
verwendete, in denen lateraler Gentransfer nur eine sehr eingeschränkte Rolle spielte.
80
Gewöhnlich betrachten Phylogenetiker LGT immer als „Störenfried“, der die Rekonstruktion von
Stammesgeschichten unnötig erschwert, und versuchen daher, den Effekt von LGT auf Phylogenien
zu minimieren. Damit ignorieren sie allerdings einen Großteil der in den einzelnen Genen
steckenden Information. Sollte LGT im Verlauf der Evolution tatsächlich jedes Gen tangieren, sind
dann molekulare Marker überhaupt ein probates Werkzeug zur Rekonstruktion der Beziehungen
zwischen Spezies (Abby et al., 2011)? Sophie S. Abby und Kollegen schlagen ein phylogenetisches
Modell für Gentransfers vor, das die in den Gene enthaltene Information mit dem Baum für die
untersuchten Arten abgleicht. Für ihren Datensatz aus 16 Bakterien- und Archaeen-Phyla mit 12,000
Genfamilien in 336 Genomen stellten sie fest, daß LGT vermochte, bei den meisten Phyla die
Diversifizierungsmuster der Spezies hervorzuheben, und daß die Ergebnisse robust gegenüber der
Wahl der verwendeten Genfamilien war. Ebenso lieferte ihnen LGT ein ergiebiges Signal für die
Wurzelung der Speziesbäume. Die Idee von Abby und Kollegen verdient breite Beachtung und
sollte in der Forschungsgemeinde weiter verfolgt werden.
Die eingangs gestellte Frage, ob in dieser Arbeit die wahre Phylogenie für E. coli oder Salmonellen
berechnet worden sind, ist rein abstrakter Natur und muß selbstverständlich unbeantwortet bleiben.
Anhand von Experimenten, die auf Grundlage einer geschätzten Phylogenie weitere Daten
produzieren, aus denen überprüfbare Ergebnisse gewonnen werden, läßt sich ggf. ermessen, wie
präzise eine Phylogenie, die als Hypothese in die Arbeit eingeht, die Wirklichkeit annähert.
81
9
Identifikation biologisch assoziierter
Gen/Nährstoff-Paare in der Evolution von
Escherichia coli und Salmonellen
9.1
Einleitung
In der zweiten Hälfte des 20. Jahrhundert hat sich die Wissenschaftsgemeinde intensiv darum
bemüht, das Erbmaterial vieler Lebewesen möglichst vollständig zu sequenzieren, zu kartografieren
und jedes einzelne Gen zu annotieren, um dessen Funktion zu bestimmen.
Die Genomannotation allein vermag allerdings nicht die Frage zu klären, welche Rolle die
Genprodukte innerhalb des Gesamtsystems Zelle und darüber hinaus haben. Dazu ist ein
ganzheitlicher Ansatz erforderlich, in dessen Rahmen die Interaktion der verschiedenen Teilsysteme
des Organismus untersucht wird.
Die Systembiologie ist ein solcher ganzheitlicher Ansatz. Sie entstand in den 1990er Jahren, als die
Rechenleistung der Computer bereits genügend hoch war, um in-silico-Simulationen metabolischer
Netzwerke von Prokaryoten in vertretbarer Zeit zuzulassen (Varma et Palsson, 1995; Edwards et al.,
2001). Vor allem die Spezies Escherichia coli war oft Ziel metabolischer Rekonstruktionen, da sie
zu den am besten untersuchten Prokaryoten zählt. Das metabolische Netzwerk von Bakterien ist
nicht statisch, sondern evolvierte im Laufe der Jahrmillionen, indem an seiner Peripherie neue Gene
integriert wurden, während die zentralen Bereiche konserviert blieben (Pal et al., 2005). Für den
Großteil der Änderungen am metabolischen Netzwerk von E. coli wird lateraler Gentransfer
verantwortlich gemacht.
Da der gesamte Genpool von E. coli sehr viel größer als sein Kerngenom ist, fällt es zunehmend
schwer, die einzelnen E. coli-Stämme voneinander abzugrenzen und zu definieren, welches
überhaupt die definierenden Eigenschaften der Spezies E. coli sind. Monk und Kollegen (Monk et
al., 2013) haben den Metabolismus für 55 lebende E. coli- und Shigella-Stämme in-silico
rekonstruiert und die Ergebnisse durch Laborexperimente unterstützt. Sie haben herausgefunden,
daß sich die einzelnen Stämme offenbar durch individuelle, für die besetzte ökologische Nische
charakteristische Wachstumsmöglichkeiten unterscheiden. Die Spezies E. coli charakterisieren sie
über gemeinsame metabolische Fähigkeiten.
Möchte man die Dynamik der metabolischen Fähigkeiten von E. coli und anderer Organismen in
die Zukunft extrapolieren oder vorhersagen können, welches Nährstoffangebot in der Umwelt zum
Überleben einer Spezies vorhanden sein muß, ist es notwendig, den Einfluß sich verändernder
Nährstoffangebote auf den Umbau des metabolischen Netzwerkes im Laufe der Evolution zu
betrachten. Ein solcher Umbau kann aber nur geschehen, wenn zum passenden Zeitpunkt die
notwendigen Genprodukte bereitstehen: der Transport eines Nährstoffs durch die Zellmembran
erfordert beispielsweise mindestens einen entsprechenden Transporter. Evtl. ist auch die Expression
mehrerer gekoppelter Gene notwendig, um einen bestimmten metabolischen Prozeß zu
ermöglichen.
Für dieses Projekt wurden derartig assoziierte Paare von Genen und Nährstoffen gesucht, die auf
der Phylogenie entweder gleichzeitig gewonnen oder verloren wurden. Dazu wurden der anzestrale
Gengehalt auf Basis orthologer Gruppen sowie die essentiellen Nährstoffe in den anzestralen
Umgebungen, die E. coli zum Überleben metabolisieren können mußte, mithilfe des Verfahrens von
Borenstein (Borenstein et al. 2008) bestimmt. Eine etwaige mathematische Assoziation zwischen
82
den Verteilungen der Gewinn- und Verlustereignisse wurde über Fishers Exakten Test (Fisher, 1923)
berechnet und, wo möglich, auch biologisch untermauert. Eine interessante Fragestellung im
Zusammenhang mit diesem Projekt ist es, nach Genen zu fahnden, die meistens zusammen
gewonnen oder verloren worden sind und herauszufinden, welcher Nährstoff zeitgleich
aufgenommen oder verloren worden ist.
Für dieses Kapitel werden folgende Konventionen getroffen: Jede Aussage zu Salmonella bezieht
sich auf den von der NCBI-Seite heruntergeladenen Datensatz von 25 Salmonellen-Genomen (SA)
(Stand Oktober 2013), der der vorliegenden Arbeit zugrunde liegt. Jede Aussage zu Escherichia
coli (EC) bezieht sich auf den von dort zum gleichen Zeitpunkt heruntergeladenen Datensatz von 61
E. coli- und Shigellen-Genomen (siehe Tab. 8.1). Der Datensatz aus den 61 E. coli/Shigellen- und
25 Salmonellen-Genomen wird im Folgenden als ECSA bezeichnet. Obwohl inhaltlich nicht völlig
korrekt, werden die Begriffe Nährstoff und Compound der Einfachheit halber äquivalent benutzt.
Äquivalent verwendet werden ebenfalls die Begriffspaare gain und Gewinn, loss und Verlust sowie
retained und keine Zustandsänderung. Das Gleiche gilt für den Gebrauch von Genfamilie und
Proteinfamilie.
9.2
Material und Methoden
Die für das in diesem Kapitel vorgestellte Projekt benötigten Dateien befinden sich innerhalb der
Ordnerstruktur im Projektordner Nährstoffe. Die Daten im Ordner Proteinfamilien_Ecoli_
ProteinOrtho sind dort der Übersicht halber redundant abgelegt. Sie befinden sich auch im Ordner
Proteinfamilien_ProteinOrtho.
9.2.1
Berechnung von Proteinfamilien
Für dieses Projekt wurden die E. coli-Proteinfamilien verwendet, die auch im Rahmen des
Lebensstil-Projekts (Kap. 10) verwendet wurden. Nach dem gleichen Verfahren und mit identischer
Parameterbelegung wie dort beschrieben wurden mittels proteinOrtho Proteinfamilien für die 25
Salmonella-Stämme konstruiert.
Die von proteinOrtho produzierte Ausgabedatei proteinOrtho_output_SA_75.txt enthält 11.177
Proteinfamilien und befindet sich im Ordner Proteinfamilien_Salmonella_proteinOrtho, zusammen
mit der Datei gi_matrix_sa_75.txt. Ebenfalls auf die gleiche Weise wurden die kombinierten
Familien für die ECSA-Proteine berechnet. Die Ausgabedateien proteinOrtho_output_ECSA_75.txt
mit 25.955 Proteinfamilien und gi_matrix_ecsa_75.txt sind im Ordner Proteinfamilien_
EcoliSalmonella_proteinOrtho abgelegt.
9.2.2
Anzestraler Gengehalt
Für dieses Projekt wurde der anzestrale Gengehalt von E. coli benutzt, dessen Konstruktion an
anderer Stelle beschrieben worden ist (siehe Kap. 10.2.4). Die dazugehörigen Dateien sind
redundant im Ordner AnzestralerGengehalt/EC abgelegt. Mit der gleichen Prozedur wurden der
anzestrale Gengehalt von SA (Ordner SA) auf der Salmonellen-Phylogenie (sa_tree.tre) und der
von ECSA (Ordner ECSA) auf der ECSA-Phylogenie (Datei ecsa_tree.tre) geschätzt.
83
9.2.3
Anzestrale Umgebungen mit essentiellen Nährstoffen
Aufbauend auf dem Gengehalt der anzestralen E. coli (s. o.) wurden mit KEGG (Kanehisha, 2004),
der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, deren metabolische Netzwerke vorhergesagt. Für
diese Netzwerke wurden die essentiellen Nährstoffe, die in der Vergangenheit in der Umwelt von E.
coli wahrscheinlich vorhanden waren und die E. coli nicht selbst synthetisieren konnte, von
Jonathan Fritzemeier, einem Kollegen am Lehrstuhl für Bioinformatik, mit dem von Borenstein und
Kollegen (Borenstein et al., 2008) vorgestellten Verfahren bestimmt. Dazu hat er Programme
modifiziert, die Benjamin Braasch im Rahmen seiner Masterarbeit am gleichen Lehrstuhl
angefertigt hat (Braasch, 2012). Folgende Schritte sind notwendig:
Die Dateien EC_orthogroupsPresentPerNode.txt und gi_matrix_ec_75.txt im Ordner Anzestraler
Nährstoffgehalt/Fritzemeier/ verknüpfen die Informationen, welche Genfamilien jeweils an einem
Knoten in der Phylogenie präsent sind und welche Gene, identifiziert über ihre GI-Nummer, in
jeder Genfamilie vertreten sind. Für jeden anzestralen E. coli-Repräsentanten werden die GINummern über die von KEGG angebotene Enzym-Datenbank mit einer Reaktion verknüpft. In der
Regel werden dabei immer mehrere Gene mit einer Reaktion verknüpft. Aus der Menge der
gefundenen Reaktionen wird ein metabolisches Netzwerk erstellt. Für jedes Netzwerk wird mit dem
Borenstein-Algorithmus auf Basis der Netzwerktopologie die Menge der exogenen Nährstoffe
errechnet. Diese Menge wird von Borenstein als „Seed Set“ bezeichnet.
Die Implementierung des Verfahrens von Borenstein in der Programmiersprache R war u. a. Thema
der unveröffentlichten Masterarbeiten von Jonathan Fritzemeier (Fritzemeier, 2012) und Rafael
Dellen (Dellen, 2012) am Lehrstuhl für Bioinformatik, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. Es
wird daher an dieser Stelle nicht erläutert. Die grundlegenden Schritte des Algorithmus sehen
allerdings wie folgt aus:
1. Dem rekonstruierten metabolischen Netzwerk liegt eine sog. stöchiometrische Matrix zugrunde,
die die Stöchiometrie aller chemischen Vorgänge im Netzwerk, also Reaktanten, Produkte,
Reaktionsrichtungen und Stoffmengen, bündelt. Aus der Matrix und den Reaktionsrichtungen wird
ein bipartiter Graph aufgebaut, dessen eine Sorte Knoten Metabolite und dessen andere Sorte
Knoten Reaktionen sind, die jeweils zwei Metabolite verbinden.
2. Der Graph wird in starke Zusammenhangkomponenten zerlegt. In einer starken
Zusammenhangskomponente ist jeder Knoten über einen Pfad von jedem anderen Knoten
erreichbar.
3. Starke Zusammenhangkomponenten enthalten dann Metabolite, die alle aus den anderen
synthetisiert werden können. Wenn eine starke Zusammenhangskomponente keine eingehende
Kante hat, dann muss mindestens ein Metabolit, der in dieser enthalten ist, vom Organismus
aufgenommen werden, also exogen sein.
Die hier verwendete Implementierung stellt eine Modifikation der o. g. Algorithmen dar. Sie
betrachtet „Inseln“ in den rekonstruierten Netzwerken mit maximal 10 Metaboliten nicht weiter,
falls sie nicht mit der größten starken Zusammenhangskomponente verbunden sind33.
Für die SA- und ECSA-Datensätze wurde analog vorgegangen.
Alle im Zusammenhang mit der Rekonstruktion des anzestralen Nährstoffgehaltes verwendeten
Dateien befinden sich im Verzeichnis AnzestralerNährstoffgehalt/Fritzemeier.
33 J. Fritzemeier schreibt dazu sinngemäß in seiner Masterarbeit: Während der Borenstein-Rekonstruktion kann es, je nach
Vollständigkeit der Netzwerke, vorkommen, daß Graphen nicht zusammenhängend sind. Ein partitionierter Graph ist biologisch sinnlos,
da es dann eine Gruppe von Metaboliten gäbe, die niemals aus anderen Metaboliten, z. B. Grundbausteinen, hergestellt werden
könnten. Borenstein et al. schlagen vor, Knoten und Kanten aus dem Graphen zu entfernen, die nicht mit der größten starken
Zusammenhangskomponente verbunden waren und nicht mehr als 10 Knoten enthalten. Falls der Schwellenwert von 10 Knoten
überschritten wird, sollte das Netzwerk manuell kontrolliert werden.
84
9.2.4
Test auf assoziierte Gen/Nährstoff-Paarungen
Im folgenden wird ein Verfahren erläutert, das sich auf die E. coli/Shigella-Phylogenie und die
mittels GLOOME rekonstruierten anzestralen Gengehalte und Nährstoffumgebungen von E. coli
bezieht. Die dazu nötigen Quelldateien befinden sich in den Ordnern AnzestralerGengehalt/EC,
Proteinfamilien_Ecoli_proteinOrtho und dem Projektordner Kapitel_Nährstoffe. Das Verfahren
speichert seine Ausgaben im Verzeichnis FisherTests/EC. Zur Durchführung des Verfahrens wurde
das Perl-Programm getSignificantGeneNutrientPairs_EC.pl, das sich im Ordner
FisherTests/EC befindet, erstellt. Außer der Version für EC existieren noch Varianten des Verfahrens
für SA und ECSA. Die nötigen Daten sind in ähnlich lautenden Dateien und Verzeichnissen
gespeichert.
Da
die
entsprechenden
Perl-Programme
inhaltlich
identisch
zu
getSignificantGeneNutrientPairs_EC.pl sind, werden sie nicht zusätzlich zu diesem
besprochen.
Neben den vom Programm verwendeten Pfaden setzt der Benutzer zwei Konstanten:
SIGN_THRESHOLD ist die Signifikanzschwelle, die für die Bewertung der Ergebnisse der
Fisher-Tests (Exakter Test nach Fisher) herangezogen wird. SUM_GAIN_LOSS_DEMANDED
wird verwendet, um die Zahl der Gen/Nährstoff-Paare (ab jetzt als „GN-Paare“ bezeichnet) zu
beschränken, für die ein Fisher-Test durchgeführt wird. Wird die Konstante beispielsweise auf 3
gesetzt, werden nur Paare aus Gen und Nährstoff weiter betrachtet, für die gilt: Gewinn+Verlust des
Gens >= 3 und Gewinn+Verlust des Nährstoffs >=3.
Vorbereitende Arbeitsschritte
Die im Perl-Programm realisierten vorbereitenden Arbeitsschritte 1 - 8 sind:
1. Die Datenstruktur, in der die E. coli-Phylogenie vorgehalten wird, wird aufgebaut. Ihre
Konstruktion wird in Abschnitt 10.2.5 beschrieben.
2. Die Zuordnung zwischen GI-Nummern und Proteinfamilien wird aus
AnzestralerGengehalt/EC/gi_matrix_ec_75.txt gelesen.
der Datei
3. Die Zuordnung zwischen GI-Nummern und den Klarnamen der entsprechenden Gene sowie der
Spezies-Bezeichner wird aus der Datei FisherTests/EC/geneTable.txt gelesen.
4. Der mittels GLOOME rekonstruierte anzestrale Gengehalt wird aus der Datei AnzestralerGengehalt/EC/Parsimony_count_of_events_per_site_per_branch.txt eingelesen. GLOOME unterscheidet
zwischen den Zuständen gain - ein Gen wurde auf einem Ast hinzugewonnen - und loss - ein Gen
wurde auf einem Ast verloren. Das Programm fügt einen dritten Zustand, retained (etwa
„beibehalten“), auf den Ästen hinzu, auf denen das betreffende Merkmal weder gewonnen noch
verloren wurde. Zweck ist es, diese in den Daten bereits vorhandene Mehrinformation zu nutzen.
5. Aus der Datei AnzestralerNährstoffgehalt/EC/KEGG_CompoundClearnames.txt wird die Zuordnung der von KEGG verwendeten Compound-Abkürzungen zu ihren Klarnamen eingelesen34.
6. Den Compound-Abkürzungen wird eine laufende Nummer zugeordnet. Eine Liste der
Compound-Abkürzungen, der entsprechenden laufenden Nummer und der Klarnamen wird in der
Datei FisherTests/EC/ec_FisherTests_X_compoundMappings.txt abgelegt, wobei X ein Parameter
ist, der als Kommandozeilen-Parameter spezifiziert ist.
7. Mit dem Borenstein-Algorithmus wurde bereits der Gehalt an essentiellen Nährstoffen an den
Knoten der E. coli-Phylogenie berechnet (siehe Absatz 9.2.3). Die Zustände wurden als 1 Nährstoff anwesend und 0 - Nährstoff abwesend codiert. Diese Informationen werden eingelesen.
34 Für die Rekonstruktion des anzestralen Nährstoffgehalts für E. coli hat der dafür verwendete Borenstein-Algorithmus nicht alle
KEGG für E. coli bekannten Compounds verwendet, sondern eine Teilmenge, ebenso wie für die beiden anderen Rekonstruktionen.
85
Für jeden Ast zwischen zwei Knoten werden die Zustände gain, loss und retained folgendermaßen
abgeleitet: Ist der Zustand am Vorgänger-Knoten abwesend und der Zustand am Nachfolger-Knoten
anwesend, wähle den Zustand gain für den Ast. Ist der Zustand am Vorgänger-Knoten anwesend
und am Nachfolger-Knoten abwesend, wähle den Zustand loss für den Ast. Anderenfalls wähle den
Zustand retained.
An die vorbereitenden Schritte schließt sich der Algorithmus an, der mathematisch assoziierte
Paare, bestehend aus einem Gen35 und einem Nährstoff, identifiziert.
Algorithmus zur Identifikation assoziierter Gen-/Nährstoff-Paare
Die anzestralen Gengehalte und die Umgebungen essentieller Nährstoffe auf der E. coli-Phylogenie
wurden wie oben beschrieben rekonstruiert, und ihr Zustandekommen kann über gain- und lossEreignisse sowie den später ergänzten Zustand retained auf den Ästen nachgezeichnet werden.
Für ein bestimmtes E. coli-Gen und einen von E. coli verwerteten Nährstoff soll festgestellt werden,
ob ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen den auf der Phylogenie rekonstruierten
gain- und loss-Mustern existiert. Idealerweise liegt diesem Zusammenhang aber auch eine plausible
biologische Erklärung zugrunde. So könnte beispielsweise ein statistischer Zusammenhang
zwischen den Mustern für ein Gen und einem Nährstoff darauf hindeuten, daß dieses Gen für einen
Transporter codiert, der den betreffenden Stoff durch die Zellmembran schleust. Der Exakte Test
nach Fisher (Fisher, 1923) wird eingesetzt, um für ein Gen/Nährstoff-Paar einen etwaigen
nichtzufälligen, statistisch signifikanten Zusammenhang festzustellen.
Anmerkung: Generell wird ein bestimmtes Gen auf einem Ast nur einmal entweder gewonnen oder
verloren, das Gleiche gilt für einen bestimmten Nährstoff.
Es werden drei Fälle unterschieden, in denen die Verteilungen von Gen- und Nährstoff-Ereignissen
für ein gegebenes Gen/Nährstoff-Paar miteinander verglichen werden. Die Fälle sind:
Direkt: Die drei Ereignisse gain, loss und retained für Gen und Nährstoff werden verglichen. Es
sollen Paare von Genen und Nährstoffen identifiziert werden, die sowohl gleichzeitig gewonnen als
auch verloren worden sind.
Co-Gain: Die zwei Ereignisklassen gain und non-gain (eines der Ereignisse loss oder retained)
werden gegenübergestellt. Hier steht die Frage im Vordergrund, ob Gen und Nährstoff zusammen
auf der Phylogenie gewonnen wurden. Ob der Verlust auch synchron erfolgte, ist zweitrangig.
Co-Loss: Die zwei Ereignisklassen loss und non-loss (eines der Ereignisse gain oder retained)
werden gegenübergestellt. Hier steht die Frage im Vordergrund, ob Gen und Nährstoff zusammen
auf der Phylogenie verloren wurden. Ob der Gewinn auch synchron erfolgte, ist zweitrangig.
Für den Fall Direkt wird eine 3x3-Kontingenztafel als Eingabe für den Fisher-Test mit den
numerischen Variablen a - i konstruiert (siehe Abb. 9.1). Beispiel zur Interpretation: die Variable a
zählt, wie oft auf allen Ästen die Paarung „Gengewinn bei gleichzeitigem Nährstoffgewinn“
rekonstruiert wurde. Die Variable i zählt die Paarungen „keine Veränderung - retained - beim Gen
und keine Veränderung beim Nährstoff“.
Für die Fälle Co-Gain (siehe Abb. 9.2) und Co-Loss (siehe Abb. 9.3) werden jeweils 2x2Kontingenztafeln mit den numerischen Variablen j - m respektive n - q konstruiert. Beispiel zur
Interpretation: die Variable k zählt, wie oft auf allen Ästen die Paarung „Gengewinn bei
gleichzeitigem Nährstoffverlust oder keiner gleichzeitigen Veränderung beim Nährstoff“
rekonstruiert wurde.
35 Anstelle des Begriffs „Gen“ müßte richtigerweise eher „Genfamilie“ verwendet werden, da das Gen in diesem Zusammenhang als
Repräsentant „seiner“ Genfamilie anzusehen ist, welche sich aus den orthologen Genen der verschiedenen E. coli zusammensetzt.
86
Neben den Summen, die in den Variablen a - q gespeichert werden, werden für jedes Gen/NutrientPaar weitere Größen erfaßt, die sich ebenfalls jeweils auf die Gesamtheit aller Äste beziehen: Zahl
der Gengewinne oder -verluste, Zahl der Nährstoffgewinne oder -verluste.
Fall Direkt
Kontingenztafel
Konstellation
Gen
Nährstoff
Variable
Nährstoff
a
gain
gain
b
gain
loss
c
gain
retained
d
loss
gain
e
loss
loss
f
loss
retained
g
retained
gain
h
retained
loss
i
retained
retained
Gen
gain
loss
retained
gain
a
b
c
loss
d
e
f
retained
g
h
i
Abbildung 9.1: Variablenbelegung der Kontingenztafel für den Fall Direkt
Um die FDR-Korrektur (engl. „False Discovery Rate“) in Grenzen zu halten und eine genügende
Genauigkeit des Fisher-Tests zu gewährleisten, werden nur für solche Paarungen aus Gen und
Nährstoff Fisher-Tests durchgeführt, für die gilt (Zahl der Gengewinne oder -verluste >=
SUM_GAIN_LOSS_DEMANDED) und (Zahl der Nährstoffgewinne oder -verluste >=
SUM_GAIN_LOSS_DEMANDED). Die theoretisch durchzuführende Zahl von Tests für EC ist
(Anzahl Gene/Genfamilien) · (Anzahl Nährstoffe) = 19.400 · 127 = 2.463.800.
Fall Co-Gain
Kontingenztafel
Variable
Gen
Nährstoff
Konstellation
Nährstoff
j
gain
gain
k
gain
loss oder retained
l
loss oder retained
gain
m
loss oder retained
loss oder retained
Gen
gain
non-gain
gain
j
k
non-gain
l
m
Abbildung 9.2: Variablenbelegung der Kontingenztafel für den Fall Co-Gain
Im Anschluß werden für das Gen/Nährstoff-Paar drei Fisher-Tests in der Statistiksprache R für
jeden der drei Fälle durchgeführt. Das Programm benutzt die Methode fisher.test, die bereits im RGrundpaket enthalten ist. Die Kontingenztafel wird der Methode jeweils als R-Matrix übergeben.
Für jeden fisher.test werden der p-Wert und das odds-ratio erfaßt und gespeichert. Der Test wird in
seiner einseitigen Variante und einem Konfidenzniveau von 0,95 ausgeführt. Für 2x2-Matrizen, das
betrifft die Fälle Co-Gain und Co-Loss, verwendet fisher.test den Parameter „alternative“, der die
Richtung der alternativen Hypothese für den Fisher-Test angibt.
87
Empirische Experimente mit verschiedenen Kontingenztafeln haben im konkreten Fall die Richtung
„greater“ als geeignet ausgewiesen. Fisher.test kann lediglich für 2x2-Matrizen die Grenzen des
Kontingenzintervalls ausgeben. Für größere Matrizen verwendet fisher.test ein anderes Verfahren.
Für den Fall Direkt, das eine 3x3-Matrix erfordert, ist es erforderlich, den Parameter
simulate.p.value auf TRUE zu setzen. Hier werden die p-Werte über eine Monte Carlo-Simulation
ermittelt. In allen anderen Fällen ist er auf FALSE voreingestellt; dort werden die p-Werte aus einer
hypergeometrischen Verteilung gewonnen.
Fall Co-Loss
Variable
Kontingenztafel
Nährstoff
Konstellation
Gen
Nährstoff
n
loss
loss
o
loss
gain oder retained
p
gain oder retained
loss
q
gain oder retained
gain oder retained
Gen
loss
non-loss
loss
n
o
non-loss
p
q
Abbildung 9.3: Variablenbelegung der Kontingenztafel für den Fall Co-Loss
Die Ergebnisse der Fisher-Tests werden in die drei Dateien
ec_FisherTest_SUM_GAINLOSS_DEMANDED_3V_notCorrected.txt
(Direkt)
ec_FisherTest_SUM_GAINLOSS_DEMANDED_GN_notCorrected.txt
(Co-Gain)
ec_FisherTest_SUM_GAINLOSS_DEMANDED_LN_notCorrected.txt
(Co-Loss)
im Ordner FisherTests/EC geschrieben. Dabei wird die Konstante SUM_GAINLOSS
_DEMANDED durch ihre im Programmlauf verwendete Belegung ersetzt. Die anderen
Ergebnisdateien tragen ebenfalls diese Namen, jedoch mit anderem Suffix.
Die Belegungen der Variablen a - q, der unkorrigierte p-Wert sowie die Grenzen des
Konfidenzintervalls für die Fisher-Tests pro Gen/Nährstoff-Paar werden in der Datei
ec_FisherTest_SUM_GAINLOSS_DEMANDED_3V_rawData.txt im gleichen Ordner gespeichert.
Da im Fall Direkt die Grenzen des Konfidenzintervalls nicht berechnet bzw. ausgegeben werden,
werden diese auf 0 gesetzt. Für Debugging-Zwecke werden die Belegungen der Variablen a - q
redundant ohne andere Daten in der Datei ec_FisherTest_SUM_GAINLOSS_DEMANDED_3V_
params.txt ebenfalls im gleichen Verzeichnis abgelegt.
Im Rahmen dieses Projektes werden z. B. für EC maximal 2,47 Millionen Tests für die
verschiedenen Gen/Nährstoff-Paarungen durchgeführt. Da es sehr wahrscheinlich ist, daß sich unter
diesen Tests diverse Falsch-Positiv-Resultate befinden, werden die p-Werte der Tests noch mit der
Methode von Benjamini-Hochberg (auch als „FDR-Korrektur“ bezeichnet) für multiples Testen
korrigiert (Benjamini und Hochberg, 1995). Die Tests mit den korrigierten p-Werten („q“ im FDRJargon) werden in Dateien mit dem Suffix „_corrected.txt“ im Ordner FisherTests/EC abgelegt.
Alle Tests, die im Sinne der geforderten Schwelle für den p-Wert, SIGN_THRESHOLD, signifikant
sind, werden ebenfalls dort in Dateien mit dem Suffix „_significant.txt“ abgelegt, alle anderen in
gleichlautenden Dateien mit dem Suffix „_nonSignificant.txt“.
Abschließend werden die IDs für die KEGG-Compounds in die entsprechenden Klarnamen der
Nährstoffe übersetzt. Ebenso wird jede Gen-ID in eine Liste der Gene in der entsprechenden
88
Genfamilie übersetzt, wobei die Liste zusätzlich die Annotation der Gene beherbergt. Die
solchermaßen übersetzten Dateien tragen das Suffix „_clearnames.txt“.
9.3
Ergebnisse
Für dieses Projekt wurden mit dem im vorhergehenden Abschnitt dargestellten Verfahren assoziierte
GN-Paare für den EC-, den SA- bzw. den ECSA-Datensatz gesucht. Die Informationen zur
physiologischen Rolle der untersuchten Gene und Nährstoffe stammen aus der EcoCyc-Datenbank
(Keseler et al., 2012) und aus der KEGG-Datenbank (Kanehisa, 2004), sofern nicht Gegenteiliges
gesagt wird.
Es wurden zunächst Fisher-Tests nur für solche GN-Paare durchgeführt, die das Kriterium
SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3 erfüllen (siehe vorheriger Abschnitt). Generell wurden Tests
mit p ≤ SIGN_THRESHOLD = 0.05 als signifikant eingestuft. Im Anschluß wurden die Tests für
unterschiedliche Obergrenzen für q (Tests mit p-Wert < q werden als signifikant gewertet) im
Rahmen der FDR-Korrektur nochmals durchgeführt, um ggf. weitere untersuchenswerte Paare zu
erhalten. Da diese Testergebnisse aus statistischen Gründen nicht mit den übrigen zusammengefaßt
werden dürfen, werden sie gesondert aufgelistet. Die gezeigten p-Werte wurden für multiples Testen
korrigiert.
9.3.1
Salmonellen-Datensatz
Der SA-Datensatz enthält 11.178 Proteinfamilien. Die mit dem Borenstein-Algorithmus (Borenstein
et al., 2010) konstruierten anzestralen Nährstoffumgebungen basieren auf einem Reservoir von 139
KEGG-Compounds. Es wurden insgesamt 335.823 Fisher-Tests durchgeführt. Nach der im
Anschluß erfolgten Benjamini-Hochberg-Korrektur für multiples Testen der p-Werte war kein
Testergebnis in einem der drei Fälle Direkt, Co-Gain oder Co-Loss signifikant.
9.3.2
Escherichia coli-Datensatz
Der EC-Datensatz enthält 19.400 Proteinfamilien. Die anzestralen Nährstoffumgebungen basieren
auf 127 KEGG-Compounds.
Fall Co-Gain
Unter 876.204 Fisher-Tests waren folgende drei Tests nach erfolgter Benjamini-HochbergKorrektur signifikant (vgl. Datei ec_FisherTest_3_GN_significant_clearnames.txt):
1
EC: Co-Gain, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
Nährstoff
Genfamilie
phytic acid (myo-inositol hexakisphosphate)
hypothetical protein b4592
hypothetical protein SSON_0986
yccB gene product (appX)
membrane protein
…
unnamed protein product
(KEGG-Compound C01204)
(GI 145698240)
(GI 74311536)
(GI 82776269 )
(GI 82544697)
(GI 386708791)
89
p-Wert
0.0147
Phytinsäure (auch: Myoinositolhexakisphospat) speichert Phosphat und kommt in der Natur als Anion,
dann als Phytat bezeichnet, vor. Lebewesen nehmen Phytinsäure nicht über die Nahrung auf, sondern
müssen es selbst aus Phosphat und Inositol bzw. dessen Vorläufer Glukose synthetisieren (Hanakahi et
al., 2000; Ungewickell et al., 1995).
AppX (auch: yccB) ist ein überwiegend in der stationären Phase (Hemm et al., 2008) exprimiertes Gen,
das für ein vorhergesagtes Segment der äußeren Membran bei E. coli codiert.
Putative biologische Assoziation:
Die Gene appX und appA sind beide auf der Transkriptionseinheit appCBA-yccB lokalisiert. Die
Expression des Phytase-Gens appA (Greiner et al., 1993) ist u. a. von der Phosphatkonzentration
abhängig. Es wird unter anaeroben Bedingungen und spät in der stationären Phase exprimiert.
Aufbereitete E. coli-Phytase dephosphoryliert Myoinositolhexakisphosphat (Greiner et al., 1993; Wyss et
al. 1999; Greiner et al., 2000).
Abb. 9.4 zeigt die Gengewinne, Genverluste, Nährstoffgewinne und Nährstoffverluste auf der E. coliPhylogenie.
2
EC: Co-Gain, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
Nährstoff
Genfamilie
p-Wert
2-Trimethylaminoethylphosphonate
(auch N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonate)
flgC gene product
flagellar basal body rod protein FlgC
flagellar basal body rod protein FlgC
putative lateral flagellar component of cell-proximal portion of basal-body rod
unnamed protein product
…
flgC2 gene product
(KEGG-Compound C06459)
(GI 170021362)
(GI 170683008)
(GI 218703523)
(GI 260866411)
(GI 378714340)
(GI 386708052)
0.0147
N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonat ist am Phosphonat- und Phosphinatmetabolismus beteiligt.
FlgC (auch: flaFIII und flaW) ist ein Bestandteil des Flagellenmotor-Komplexes bei E. coli.
Putative biologische Assoziation: keine gefunden
3
EC: Co-Gain, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
Nährstoff
Genfamilie
p-Wert
N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonate (2-Trimethylaminoethylphosphonate)
unnamed protein product
glycosyl transferase, group 2 family protein
putative glycosyltransferase
…
unnamed protein product
(KEGG-Compound C06459)
(GI 170021368)
(GI 170680272)
(GI 218703517)
(GI 386708046)
0.0147
N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonat ist am Phosphonat- und Phosphinatmetabolismus beteiligt. Das
Enzym Glycosyltransferase katalysiert die Übertragung von Glycosylresten auf auf ein Akzeptor-Molekül
(Breton et al., 2005).
Putative biologische Assoziation: keine gefunden
90
9.3.3
Escherichia coli/Salmonellen-Datensatz
Der ECSA-Datensatz enthält 25.955 Proteinfamilien. Die mit dem Borenstein-Algorithmus
(Borenstein et al., 2008) konstruierten anzestralen Nährstoffumgebungen basieren auf 139 KEGGCompounds.
Fall Direkt
In diesem Fall gab es kein signifikantes Gen/Nährstoff-Paar.
91
Fall Co-Loss
In diesem Fall gab es sechs signifikant assoziierte GN-Paare. Bei drei von ihnen ist der Metabolit
eine tRNA. Diese Paare werden hier nicht gezeigt, da tRNA kein in einem metabolischen Netzwerk
hergestellter Compound ist36.
Fall Co-Gain
In diesem Fall gab es 42 signifikant assoziierte GN-Paare. Bei 40 Paaren handelte es sich beim
Nährstoff um N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonate.
1
ECSA: Co-Loss, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
Nährstoff
Genfamilie
p-Wert
6-Deoxy-L-galactose (L-Fucose)
L-fucose transporter
fucP gene product
...
L-fucose transporter
(KEGG-Compound C01019)
(GI 16130708)
(GI 15803323)
(GI 387883981)
0.0023
6-Deoxy-L-galactose (auch: Fucose) ist eine der essentiellen Zuckerarten, die für die Zell-ZellKommunikation benötigt wird. Fucose ist Bestandteil der bakteriellen Zellwand. FucP ist ein L-Fukose/Proton-Symporter
Putative biologische Assoziation: Stoff und Stoff-Transporter
2
ECSA: Co-Loss, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
Nährstoff
Genfamilie
p-Wert
Bilirubin beta-diglucuronide (Bilirubin-bisglucuronoside)
glucuronide transporter
uidB gene product
...
glucuronide transporter
(KEGG-Compound C05787)
(GI 16129574)
(GI 15802031)
(GI 387882721)
0.0063
Bilirubinbetadiglucuronid ist an der Herstellung von Porphyrin beteiligt. Das von Bakterien hergestellte
Vitamin B12 enthält Corrin, das ähnlich wie Porphyrin aufgebaut ist. Das Protein UidB (auch: GusB) ist
ein Transporter für Alpha- und Beta-Glucoronide (Poolman et al., 1996).
Putative biologische Assoziation: Stoff und Stoff-Transporter
3
ECSA: Co-Loss, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
Nährstoff
Genfamilie
2-(alpha-D-Mannosyl)-3-phosphoglycerate
predicted protein
hypothetical protein
…
(KEGG-Compound C11516)
(GI 90111359)
(GI 15802388)
36 Das Borenstein-Verfahren behandelt tRNAs fälschlich als essentielle Nährstoffe, da unbeladene tRNAs von keiner
metabolischen Reaktion erzeugt werden, sie jedoch an vielen Reaktionen partizipieren. In diesen Reaktionen wird die
unbeladene tRNA in die geladene umgewandelt bzw. andersherum.
92
hypothetical protein STM1984
...
yodD gene product
…
hypothetical protein CDCO157_2486
p-Wert
(GI 16765321)
(GI 62180559)
(GI 387883054)
0.0063
Das Enzym 2-(alpha-D-Mannosyl)-3-Phosphoglycerat ist eine Glykotransferase, die am Fruktose- und
Mannosemetabolismus beteiligt ist. Das Gen yodD wird als Streßantwort auf Azidität und
Wasserstoffperoxid exprimiert (Lee et al., 2010). Das Genprodukt YodD ist an der Bildung von Biofilmen
beteiligt.
Putative biologische Assoziation: keine gefunden
1
ECSA: Co-Gain, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
Nährstoff
Genfamilie
p-Wert
N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonate
unnamed protein product
cytidyltransferase-like protein
glycerol-3-phosphate cytidylyltransferase
...
unnamed protein product
(KEGG-Compound C06459)
(GI 170021369)
(GI 170681619)
(GI 218703516)
(GI 386707990)
5.4212 ∙10-5
N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonat ist am Phosphonat- und Phosphinatmetabolis-mus beteiligt. Das
Enzym Cytidyltransferase überträgt innerhalb des Glycerophospho-lipid-Metabolismus phosphorhaltige
Gruppen auf Akzeptor-Moleküle.
Putative biologische Assoziation: keine gefunden
2
ECSA: Co-Gain, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
Nährstoff
Genfamilie
p-Wert
N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonate
glycosyl transferase, group 2 family protein
putative glysosyltransferase
putative glycosyltransferase
unnamed protein product
…
unnamed protein product
(KEGG-Compound C06459)
(GI 170680272)
(GI 218703517)
(GI 260866405)
(GI 386607617)
(GI 386708046)
5.4212 ∙10-5
N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonat ist am Phosphonat- und Phosphinatmetabolismus beteiligt. Das Enzym Glycosyltransferase katalysiert die Übertragung von Glycosylresten auf auf
ein Akzeptor-Molekül (Breton et al., 2005).
Putative biologische Assoziation: keine gefunden
3
ECSA: Co-Gain, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
93
Nährstoff
Genfamilie
p-Wert
D-Galactonate (Galactonate)
SopD-like protein
sopD gene product
…
unnamed protein product
(KEGG-Compound C00880)
(GI 16764332)
(GI 62179496)
(GI 386590837)
5.4212 ∙10-5
D-Galaktonat (auch: Galaktonat) kann E. coli als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle dienen
(Deacon et al., 1977). SopD ermöglicht es dem Bakterium, in Epithelzellen einzudringen.
Putative biologische Assoziation: keine gefunden
4
ECSA: Co-Gain, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
Nährstoff
Genfamilie
p-Wert
Phytic acid (myo-inositol hexakisphosphate)
hypothetical protein b4592
membrane protein
…
yccB gene product
…
unnamed protein product
(KEGG-Compound C01204)
(GI 145698240)
(GI 16765135:)
(GI 387506090)
(GI 386708791)
5.8641 ∙10-7
Phytinsäure (siehe Co-Gain, EC, Fall1)
appX/yccB (siehe Co-Gain, EC, Fall 1)
Biologische Assoziation (siehe Co-Gain, EC, Fall 1)
Die übrigen Ergebnisse 5 – 42 assoziieren N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonat mit folgenden
Proteinen, die am Betrieb oder am Aufbau des Flagellen-Komplexes beteiligt sind:
5 - 42 ECSA: Co-Gain, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3
Nährstoff
Genfamilien
N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonate
flagellar biosynthesis sigma factor
lateral flagellar flagellin LafA
lateral flagellar hook length control proteins LafC, LafD, LafE
lateral flagellar basal body-associated protein LafF
lateral flagellar RpoN-interacting regulatory protein LafK
lateral flagellar associated protein LafV
lateral flagellar hook associated protein LafW
lateral flagellar hook associated proteins 1, 2, 3
lateral flagellar peptidoglycan hydrolase LfgJ
flagellar basal body P-ring/L-ring proteins
flagellar basal body rod proteins FlgB, FlgC, FlgD, FlgF, FlgG
lateral flagellar hook protein LfgE
lateral flagellar P-ring addition protein LfgA
lateral flagellar anti-sigma factor 28 protein LfgM
lateral flagellar chaperone protein LfgN
lateral flagellar basal body component protein LfiE
lateral flagellar export/assembly proteins LfiI, LfiJ, LfiM, LfiN, LfiQ, LfiR
flagellar biosynthesis protein FliP
flagellar assembly protein H
flagellar motor switch protein G
94
flagellar MS-ring protein
flagellar biosynthesis protein FlhB
flagellar motor protein MotA
Putative biologische Assoziation: keine gefunden
Die Ergebnisse und ihre p-Werte sind in der Datei ecsa_FisherTest_3_GN_significant_clear
names.txt im Ordner FisherTests/ECSA/ nachzulesen.
9.3.4
Was passiert für andere q-Werte?
Durch eine weniger restriktive Wahl des q-Wertes bei der FDR-Korrektur läßt sich eine u. U.
größere Untermenge von Gen/Nährstoff-Paaren aus der Menge aller Paare auswählen. Tatsächlich
erhöht man damit die akzeptierte Obergrenze für die p-Werte der Tests, die man als signifikant
betrachtet. Man findet auf diese Weise möglicherweise Paare, deren nähere Inspektion sich unter
Umständen lohnt.
Für SA wiesen bereits im Ausgangsdatensatz alle Paare p-Wert 1 vor FDR-Korrektur aus. Eine
Variation von q bringt für SA daher keine Änderung. Ebensowenig gab es Paare für einen der drei
Datensätze für den Fall Direkt bei unterschiedlicher Setzung von q. Die Datei FisherTests/
assoziiertePaare.txt bietet einen Überblick über alle mathematisch assoziierten GN-Paare mit pWerten aus den Fisher-Tests und GI-Nummern. Im Anschluß werden die Veränderungen bei den
Paaren für verschiedene Setzungen von q dargestellt.
EC
Co-Gain, q = 0,0523
Ein neues Paar gegenüber dem Fall q = 0,0500
Nährstoff
Gen
Assoziation
Stachyose
cscK (Genprodukt ist eine Fructokinase)
Zucker-Metabolismus
Co-Gain, q = 0,0670
Verlust zweier Paare gegenüber dem Fall q = 0,0524
Co-Loss, q = 0,1532
Zwei neue Paare gegenüber dem Fall q = 0,0500
Nährstoff
Gen
Assoziation
Bilirubin beta-diglucuronide
uidB (Genprodukt ist ein Glucoronid-Carrier)
Stoff und Stoff-Transporter
Nährstoff
Gen
Assoziation
2-(alpha-D-Mannosyl)-3-phosphoglycerate
yodD, hypothetisches Protein
keine gefunden
Co-Loss, q = 0,2379
Verlust aller Paare gegenüber dem Fall q = 0,1532
95
ECSA
Co-Gain, q = 0,0524
74 neue Paare gegenüber Fall q = 0,0500, darunter 16 ignorierte Paare mit einer tRNA als Nährstoff
Nährstoff
Gen
Assoziation
Phytic acid
yshB (Genprodukt: Transmembranprotein)
keine gefunden
Nährstoff
Gen
Assoziation
N-Acetylneuraminate
hypothetisches Protein
keine gefunden
Gen
Nährstoffe
hypothetisches Protein, sopD-like (Genprodukt ermöglicht es dem Bakterium, in Epithelzellen einzudringen)
Maltose, dCMP, L-Sorbose, ADP-ribose, Mannitol, L-Cystine, Raffinose, XTP, Pantheteine, Cob(I)alamin,
L-Rhamnulose, Aquacob(III)alamin, 6-Deoxy-L-galactose (Fucose), N-Acetyl-D-galactosamine, Inositol 1phosphate, P1,P4-Bis(5'-adenosyl) tetraphosphate, RX, Butanal, Salicin, Linamarin, L-Fuculose, D-Glucoside,
Pseudouridine, D-Galactosamine, D-Phenylalanine, (R)-2-Methylmalate, N-Acetylmuramate, 1-(5-Phospho-Dribosyl)-ATP, N-((R)-Pantothenoyl)-L-cysteine, N-Succinyl-2-L-amino-6-oxoheptanedioate, 5-Methyltetrahydropteroyltri-L-glutamate, D-erythro-1-(Imidazol-4-yl)glycerol 3-phosphate, Dhurrin, 5(S)-HPETE, Selenite,
Selenate, 15(S)-HPETE, O-Phosphorylhomoserine, Uroporphyrinogen, Cobinamide, L-4-Hydroxyglutamate
semialdehyde, Digalactosyl-diacylglycerol, Digalactosylceramide, Arbutin, Amygdalin, Lotaustralin, trans-2Methyl-5- isopropylhexa-2,5-dienoyl-CoA, cis-2-Methyl-5-isopropylhexa-2,5-dienoyl-CoA, N-Acetyl-L-citrulline,
Methylselenic acid, D-glycero-alpha-D-manno-Heptose 1,7-bisphosphate, D-Cysteine, 2-(alpha-D-Mannosyl)-3phosphoglycerate
keine gefunden
Assoziation
Co-Gain, q = 0,0554
Verlust aller Paare gegenüber Fall q = 0,0524
Co-Loss, q = 0,0565
171 neue Paare gegenüber Fall q = 0,05, darunter 9 ignorierte Paare mit einer tRNA als Nährstoff
Gene
Nährstoffe
Assoziation
hcaR, hcaA1 (hcaE), hcaA2 (hcaF), hcaC (bphF), hcaB
Trans-Cinnamate, Benzene, Toluene, Phenylpropanoate, 4-Chlorobiphenyl, Biphenyl
keine gefunden (ausgenommen die nächsten fünf Paare)
Gen
Nährstoff
Assoziation
hcaA1/hcaE (Genprodukt: 3-phenylpropionate/cinnamic acid dioxygenase subunit alpha)
Trans-Cinnamate
Phenylalanin-Metabolismus
Gen
Nährstoff
Assoziation
hcaA2/hcaF (Genprodukt: 3-phenylpropionate/cinnamic acid dioxygenase subunit beta)
Trans-Cinnamate, Phenylpropanoate
Phenylalanin-Metabolismus
Gen
Nährstoff
Assoziation
hcaC/bphF (Genprodukt: Dioxygenase ferredoxin subunit)
Phenylpropanoate
Phenylalanin-Metabolismus
Gen
Nährstoffe
Assoziation
hcaB (Genprodukt: 2,3-dihydroxy-2,3-dihydrophenylpropionate dehydrogenase)
Trans-Cinnamate, Phenylpropanoate
Phenylalanin-Metabolismus
Gen
Nährstoff
Assoziation
hcaR (Genprodukt: LysR family transcriptional regulator, hca operon transcriptional activator)
Phenylpropanoate
HcaR + 3-phenylpropanoate = HcaR transcriptional dual regulator (Quelle: http://ecocyc.org)
Nährstoff
Gene
D-Allose
ygeX (Genprodukt: diaminopropionate ammonia-lyase)
ygeY (Genprodukt: Peptidase)
yqeB/xdhC (Genprodukt: hypothetisches Protein, xanthine dehydrogenase accessory factor)
yqeC (Genprodukt: 6-phosphogluconate dehydrogenase-like protein, hypothetical protein)
ygfJ (Genprodukt: involved in (molybdenum cofactor) cytidylyltransferase activity, hypothetical protein (Quelle:
ECMDB, http://www.ecmdb.ca)
yecD (Genprodukt: isochorismatase family protein)
frV (Genprodukt: putative frV operon regulator (Quelle: www.ecogene.org)
yjcS (hypothetical protein, conserved protein, metallo-beta-lactamase superfamily)
csgA (Genprodukt: major curlin subunit)
yfiN (Genprodukt: transport permease YfiN, ABC-2 type transport system permease protein)
yhiM (Genprodukt: acid resistance protein, inner membrane protein)
96
Assoziation
unnamed (Genprodukt: membrane protein, hypothetical protein, ATP binding protein of ABC transporter)
keine gefunden
Nährstoff
Gene
Assoziation
D-Allose
yqeA (Genprodukt: carbamoyl phosphokinase)
Microbial metabolism in diverse environments
Nährstoff
Gene
2-(alpha-D-Mannosyl)-3-phosphoglycerat
ymiA (Genprodukt: Membranprotein, hypothetisches Protein)
yheV, yciX, ydcA (Genprodukte: hypothetisches Protein)
keine gefunden
Assoziation
Nährstoffe
Gene
Assoziation
Nährstoffe
Gene
2',3'-Cyclic AMP, 2',3'-Cyclic GMP, 2',3'-Cyclic CMP, 2',3'-Cyclic UMP
sipC (Genprodukt: invasin C)
sipD (Genprodukt: cell invasion protein), yacA (Genprodukt: SecA regulator SecM)
yaiV (Genprodukt: predicted DNA-binding transcriptional regulator (KEGG), putative transcriptional regulator
(Quelle: www.ecogene.org)
misL (Genprodukt: autotransporter family porin)
ecnR (Genprodukt: LuxR family transcriptional regulator, putative regulatory protein)
caiF (Genprodukt: DNA-binding transcriptional activator, transcriptional activator CaiF)
yajG (Genprodukt: lipoprotein, uncharacterized lipoprotein)
ahpF (Genprodukt: alkyl hydroperoxide reductase)
yccU (Genprodukt: hypothetical protein, function unknown (Quelle: www.ecogene.org)
mltE (Genprodukt: membrane-bound lytic murein transglycosylase E)
yfcB (Genprodukt: site-specific DNA-methyltransferase (adenine-specific)
glmY (Genprodukt: tRNA1Val (adenine37-N6)-methyltransferase)
amiC (Genprodukt: N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)
rpiA (Genprodukt: ribose 5-phosphate isomerase, constitutive)
yhaD (Genprodukt: glycerate 3-kinase)
yrdA (Genprodukt: conserved protein, ferripyochelin-binding protein, transferase)
yigL (Genprodukt: pyridoxal phosphate phosphatase YigL)
yijC (Genprodukt: FabR: Putative ABC transport system)
ytfH (Genprodukt: predicted transcriptional regulator, HxlR-type, DUF24 family)
unnamed (Genprodukt: transcriptional regulator, hypothetical protein)
unnamed (Genprodukt: hypothetical protein)
unnamed (Genprodukt: membrane transporter)
keine gefunden
Assoziation
2',3'-Cyclic AMP, 2',3'-Cyclic GMP, 2',3'-Cyclic CMP, 2',3'-Cyclic UMP
yfcB (Genprodukt: site-specific DNA-methyltransferase (adenine-specific)
yfiC (Genprodukt: tRNA1Val (adenine37-N6)-methyltransferase
pnp/PNPT1 (Genprodukt: polyribonucleotide nucleotidyltransferase)
Synthese von Purinen und Pyrimidinen
Nährstoff
Gen
Assoziation
Bilirubin beta-diglucuronide
flhD (Genprodukt: transcriptional activator FlhD)
keine gefunden
Gen
Nährstoffe
Assoziation
D-ala-D-ala transporter subunit
trans-Cinnamate, Benzene, Toluene, D-Allose, Biphenyl
keine gefunden
Gen
Nährstoffe
Assoziation
orfB (Genprodukt: transposase/IS protein)
(Indol-3-yl)acetamide, 4-Guanidinobutanamide
keine gefunden
Gen
Nährstoffe
Assoziation
fimA (Genprodukt: major type 1 subunit fimbrin (pilin))
3-Cyano-L-alanine, 3-Aminopropiononitrile
keine gefunden
Gen
Funktion
Nährstoffe
Assoziation
fimC (Genprodukt: fimbrial chaperone protein)
biogenesis of type 1 fimbriae. Binds and interact with FimH (Quelle: http://www.uniprot.org)
3-Cyano-L-alanine, 3-Aminopropiononitrile
keine gefunden
Co-Loss, q = 0,2379
2 neue Paare gegenüber Fall q = 0,0565, beide ignoriert, da Nährstoff tRNA
Verlust aller anderen Paare
97
9.3.5
Zusammenfassung
Für viele Gen/Nährstoff-Paare (GN-Paare) konnte eine mögliche biologische Assoziation gefunden
werden. Die Ergebnisse im einzelnen sind in der Datei Fisher-Tests/signifikantePaare.txt
nachzulesen; es folgt eine Übersicht:
•
Als der Nährstoff Bilirubin beta-diglucuronide in der Umwelt vorhanden war bzw. benötigt
wurde, wurde das Gen uidB exprimiert, das für seinen Transporter codiert. Das Gleiche gilt
für den Nährstoff 6-Deoxy-L-galactose/L-Fucose und das Gen fucP.
•
Das Gen appX wurde exprimiert, als Phytinsäure neu verfügbar war. Die Gene appA und
appX liegen auf der gleichen Transkriptionseinheit. Phytase ist das Genprodukt von appA
und dephosphoryliert Phytinsäure.
•
Zeitlich zusammen lagen die Verfügbarkeit von N-Trimethyl-2-aminoethylphosphonat und
die Expression diverser Gene, die in Beziehung zum Flagellen-Komplex von E. coli und
Salmonellen stehen. Möglicherweise ist dieser Nährstoff am Aufbau bzw. Betrieb des
Flagellenapparates beteiligt.
•
Wenn auf der Phylogenie das Gen sopD, dessen Produkt das Bakterium befähigt, in
Epithelzellen einzudringen, exprimiert wurde, war eine Vielzahl von Nährstoffen neu in der
Umgebung vorhanden. Zwar konnte keine Begründung gefunden werden, man kann jedoch
spekulieren, daß E. coli bzw. Salmonellen zu diesen Zeitpunkt in eine neue Umgebung
eingewandert sind (ggf. in die Epithelzellen), in der sie sich dieser neuen Nährstoffe
bedienen konnten.
•
Mehrere Gene und Nährstoffe gingen zeitgleich verloren, die im Rahmen der Synthese von
Phenylalanin interagieren.
•
Als der Zucker D-Allose nicht mehr vorhanden war, gingen diverse Gene verloren, unter
denen einige für Transporter codieren. Der genaue Zusammenhang konnte nicht ergründet
werden.
•
Die Nukleotide 2',3'-Cyclic AMP, 2',3'-Cyclic GMP, 2',3'-Cyclic CMP, 2',3'-Cyclic UMP
müssen entweder produziert werden, oder sie sind in der Umwelt vorhanden. Es gibt
Hinweise darauf, daß diverse assozierte Genprodukte direkt oder indirekt an der Synthese
von Purinen und Pyrimidinen beteiligt sind. Sie wurden möglicherweise dafür benötigt bzw.
nicht mehr gebraucht, als die Nukleotide von außerhalb der Zelle bezogen werden konnten.
Mit dem Begriff der Gleichzeitigkeit wurde oben etwas nachlässig umgegangen. Für ein konkretes
GN-Paar sollte individuell entschieden werden, welche Definition von „Gleichzeitigkeit“ für die
Gewinn- und Verlust-Ereignisse für die jeweilige Fragestellung passend ist. Abb. 9.4 illustriert, daß
der Fisher-Test die Verteilungen der Ereignisse für ein konkretes GN-Paar durchaus für signifikant
erklärt, selbst wenn die Ereignispaare nicht immer exakt gleichzeitig liegen.
Für den Fall Direkt, SUM_GAINLOSS_DEMANDED ≥ 3, gab es keine mathematisch assoziiierte
GN-Paare. Während für Co-Gain der kleinste nichtsignifikante p-Wert vor Benjamini-HochbergKorrektur 2,404∙10-7 und nach Korrektur 0,053 war, waren die p-Werte in diesem Fall deutlich
größer: 0,0005 vor und 0,232 nach der Korrektur. Die p-Werte für Co-Loss bewegen sich in einer
vergleichbaren Größenordnung. Intuitiv sind die niedrigeren p-Werte für Co-Gain und Co-Loss
dadurch erklärbar, daß anstatt für drei Zustände die Verteilungen für nur zwei Zustände verglichen
werden. Dadurch steigt die Wahrscheinlichkeit, daß die Verteilungen signifikant ähnlich sind. Der
Vorteil, niedrigere p-Werte und damit mehr signifikante Tests zu erhalten, wird allerdings durch den
98
Nachteil aufgewogen, daß das Zusammenziehen zweier Variablen einen Genauigkeitsverlust mit
sich bringt.
9.4
Diskussion
Eine verfeinerte Suche nach etwaigen physiologischen Beziehungen zwischen solchen assoziierten
Genen und Nährstoffen, für die hier keine unmittelbare Erklärung gefunden werden konnte, ist
außerhalb der Möglichkeiten dieser Arbeit, zumal eine solche interdisziplinär erfolgen sollte. Das
Gleiche gilt für erweiterte Fragestellungen, von denen oben einige skizziert wurden. Eine solche
Analyse sollte vielmehr in einem Anschlußprojekt mit einer angemessenen biochemischen
Expertise angestellt werden.
In dem hier dargestellten Projekt wurde, teilweise erfolgreich, versucht, biologische Assoziationen
zwischen mathematisch assoziierten Paaren von Genen und Nährstoffen manuell über den Vergleich
von Annotationen und Beschreibungen in Datenbanken zu bestimmen. Ein erste Verbesserung, die
es erlaubt, derartige biologische Assoziationen immerhin halbautomatisch z. B. auf Basis der
Informationen in KEGG zu bestimmen, könnte wie folgt aussehen:
1.
Modelliere die Vereinigung der metabolischen Netzwerke der betrachteten Spezies.
2.
Erstelle einen bipartiten Graphen mit Metaboliten und Reaktionen als Knoten und
Stoffwechselflüsse als Kanten.
3.
Messe für jedes GN-Paar die Länge des Pfades im Netzwerk, der beide verbindet.
Diese Zahl repräsentiert den Grad der Assoziation zwischen Gen und Nährstoff.
Mit diesem Ansatz ließen sich indirekte Beziehungen zwischen Genen und Nährstoffen aufdecken.
Direkte Beziehungen zwischen Liganden und Genen lassen sich mit der KEGG API sehr leicht
abfragen.
Keiner der Tests, in denen die Verteilungen der Zustände gain, loss und retained verglichen wurden,
war signifikant. Ob mathematische oder methodische Gründe dafür verantwortlich sind, konnte
bisher nicht geklärt werden. Darüberhinaus war kein Test im Zusammenhang mit dem SADatensatz signifikant. Es ist denkbar, daß dort die Zahl der Ereignisse zu gering gewesen ist. Die
SA-Phylogenie besitzt sehr viel weniger Äste als die EC-Phylogenie, und für die ECSA-Phylogenie
gab es sehr viel mehr signifikante Ergebnisse als für die EC-Phylogenie allein.
Führt man Ergebnisse mit individuellen Belegungen des Parameters SUM_GAINLOSS_
DEMANDED durch, müssen die p-Werte aller durchgeführten Tests nachträglich FDR-korrigiert
werden, bevor die Testergebnisse bewertet werden. Mit einer steigenden Zahl von Tests werden die
p-Werte durch die FDR-Korrektur allerdings immer größer, wodurch umgekehrt die Zahl
signifikanter Tests sinkt. Möchte man lediglich Paare aus Genen und Nährstoffen identifizieren,
deren Untersuchung sich unter Unständen lohnt, ist es vertretbar, verschiedene Programmläufe mit
unterschiedlicher Schranke für q durchzuführen.
Die putativen biologischen Assoziationen, die für einen beträchtlichen Teil der GN-Paare gefunden
wurden, erscheinen plausibel. Das spricht dafür, daß die in diesem Kapitel vorgestellte Methode mit
Kenntnis der geschätzten Verteilungen der Ereignisse auf der Phylogenie tatsächlich biologisch
assoziierte Paare zu liefern vermag. Wenn auch nur implizit, nutzt sie dabei die Ergebnisse von
Laborexperimenten, auf denen die von KEGG bezogenen Daten beruhen.
99
Über den Borenstein-Algorithmus fließt Vorwissen über durch Stoffwechselwege assoziierte Gene
und Nährstoffe in das hier dargestellte Verfahren ein. Findet es diese Assoziationen auch wieder?
Gibt es die entsprechenden Gen/Nährstoff-Paare als signifikant assoziiert aus? Dieser Frage, die auf
die Zirkularität des Ansatzes abzielt, sollte nachgegangen werden. Der Ansatz lieferte signifikant
assoziierte Paarungen aus Nährstoff und dem Gen, das für den entsprechenden Transporter codiert,
zurück. Der Borenstein-Algorithmus liefert nur Metabolite, jedoch keine Gene und insbesondere
keine Transporter. Das läßt vermuten, daß der Ansatz sinnvolle Ergebnisse hervorzubringen vermag,
die nicht explizit in den Eingangsdaten vorhanden waren. Unter den signifikant assoziierten
Paarungen sind einige hypothetische Proteine. Das vorgestellte Verfahren kann bei der Suche nach
den mutmaßlichen Genprodukten hilfreich sein.
Eigene Ergebnisse aus in-silico-Simulationen mit Laborexperimenten abzugleichen, empfiehlt sich,
wenn die Möglichkeit besteht, da Simulationen praktisch immer unvollkommen sind. Monk und
Kollegen (Monk et al., 2013) haben die unvollständige in-silico-Rekonstruktion metabolischer
Netzwerke für 55 lebende E. coli- und Shigella-Stämme durch Daten aus Laborexperimenten
komplettiert. Ihr Interesse galt allerdings nicht der Evolution der metabolischen Fähigkeiten der
Spezies E. coli, sondern einer Momentaufnahme. Sie war dazu geeignet, die Spezies E. coli von
anderen prokaryotischen Spezies abzugrenzen und die nischen-spezifischen metabolischen
Anpassungen der einzelnen E. coli-Stämme herauszuarbeiten.
Für die Borenstein-Rekonstruktionen der anzestralen metabolischen Netzwerke, die für dieses
Projekt angefertigt wurden, wurde nicht geprüft, ob sie Biomasse produzieren können, auch wurde
nicht versucht, etwaige Lücken in den Stoffwechselwegen zu füllen. Um die Tauglichkeit der
Methode weiter zu verbessern, sollte beides in einem Anschlußprojekt nachgeholt werden.
100
10 Gingen verstärkte Gengewinne
oder -verluste mit einer Änderung
in der Lebensweise bei E. coli
einher?
10.1 Einleitung
Die Vertreter der Klade Escherichia coli-Shigella besetzen verschiedene ökologische Nischen und
weisen einen sehr unterschiedlichen Lebensstil auf. So können sie unter extremen Bedingungen
überleben und auch ein Leben in Frischwasser und in Böden führen (Winfield und Groisman,
2003). Mehrere Stämme leben als Kommensalen im Darm von Warmblütern, andere sind
Pathogene, die für zum Teil lebensbedrohliche Krankheiten beim Menschen verantwortlich sind.
Aus diesem Grund beschäftigt sich die Forschung seit langem mit den möglichen Ursprüngen ihrer
Pathogenität. Pathogene E. coli haben sich mehrfach auf unterschiedlichen Teilen der Phylogenie
aus apathogenen Stämmen entwickelt (Ogura et al., 2009). Der Wechsel von einer apathogenen zu
einer pathogenen Lebensweise, oder andersherum, erfordert es, sich schnell an wechselnde
Lebensbedingungen anpassen zu können. Es wurde vielfach die These aufgestellt, daß Bakterien die
dazu notwendigen neuen Fähigkeiten nicht durch vertikale Vererbung, sondern durch horizontalen
Gentransfer (HGT) erworben haben (Ochman et al., 2000).
Verschiedene Arbeiten haben sich zum einen mit der Frage beschäftigt, zwischen welchen
Prokaryoten wie intensiv lateraler Gentransfer betrieben wurde (Skippington und Ragan, 2012), und
zum anderen, ob ursächlich eine phylogenetische Beziehung, die gemeinsame ökologische Nische
oder gleicher Lebensstil dafür verantwortlich sind (Skippington und Ragan, 2012; Popa et al.,
2011). Skippington und Ragan haben 27 Escherichia coli-Stämme untersucht und herausgefunden,
daß E. coli lateralen Gentransfer überwiegend innerhalb der eigenen Klade betrieben hat, während
Transfers über Speziesgrenzen hinweg zwar unbehindert möglich waren, aber sehr viel seltener
stattgefunden haben. Dabei waren weder Frequenz noch Stärke lateralen Gentransfers uniform.
Bemerkenswert ist hierbei, daß sie keinen Hinweis darauf gefunden haben, daß E. coli, die den
gleichen Lebensstil pflegen oder in vergleichbarer Umgebung leben, intensiver oder häufiger HGT
betrieben haben als ihre Verwandten, die beides nicht tun.
Popa et al. (Popa et al., 2011) haben beobachtet, daß bei nah verwandten Bakterien pathogene
Spezies häufiger Gene austauschen als nicht pathogene. Der phylogenetischen Beziehung wird
generell eine entscheidende Rolle zugedacht, da nah verwandte Spezies ausgetauschtes genetisches
Material leicht durch homologe Rekombination in das Genom integrieren können (Lawrence und
Retchless, 2009). Im Gegensatz dazu berichten Smillie und Kollegen (Smillie et al., 2011), dass
zwischen fern verwandten Genomen der genetische Austausch mehr über die Ökologie als über eine
phylogenetische Beziehung strukturiert wird, und dies vorzugsweise zwischen Isolaten, die in einer
ökologisch vergleichbaren Umgebung leben.
In der vorliegenden Arbeit wurde die verwandte Frage untersucht, ob während der Evolution von
Escherichia coli Änderungen in deren Lebensstil mit verstärktem lateralen Gentransfer einher
gingen. Es wurden 12 Lebensstil-Merkmale für 61 E. coli-/Shigella-Stämme betrachtet. Der nächste
Abschnitt liefert eine Übersicht über die verschiedenen Lebensstile von E. coli.
101
10.1.1 Pathogenität der Stämme von Escherichia coli
Neben Archäen, Eukaryoten, anderen Enterobakterien und Streptokokken gehören auch
verschiedene Stämme des Bakteriums Escherichia coli zur Normalflora im unteren Darmtrakt des
Menschen und anderer Warmblüter. Die meisten Stämme von Escherichia coli sind apathogen, d.
h., sie lösen keine Krankheiten aus, sondern pflegen eine kommensalische bzw. mutualistische
Lebensweise (van Beneden, 1876). So versorgen die im Darm des Menschen lebenden E. coli ihren
Wirt z.B. mit den Vitaminen K und B, die für die Entwicklung und ein intaktes Immunsystem
notwendig sind (Munk und Dersch, 2008). Im Gegenzug sorgt der Wirt für eine stabile
Lebensumgebung, in der es E. coli möglich ist, pathogene Bakterien zu verdrängen, was
Infektionen vorbeugt. Apathogene E. coli sind auch an feuchten und warmen Hautregionen
anzutreffen (Petkovsek et al., 2000). Viele E. coli können auch in anderen Habitaten als dem
Darmtrakt überleben (siehe Abb. 10.1).
Abbildung 10.1: Humanpathogene E. coli und ihre
Gewebe (Fig. 1 aus Croxen and Finlay, 2010)
10.1.2 Pathovare von Escherichia coli
Bestimmte Serotypen von E. coli sind pathogen und damit für Erkrankungen innerhalb und
außerhalb des Darms verantwortlich (Kaper et al., 2004). Sie gehören nicht zur physiologischen
Darmflora. Erstere werden als IPEC – intraintestinal pathogene E. coli -, letztere als ExPEC extraintestinal pathogene E. coli - bezeichnet (Johnson und Russo, 2002).
Insbesondere darmpathogene E. coli (IPEC) sind für die hohe Zahl von Krankheits- und
Todesfällen, nämlich ca. 160 Mio. Durchfallerkrankungen und rund 1 Mio. Todesfälle pro Jahr,
verantwortlich (Hahn et al., 2008). So verursachten im Zeitraum Mai bis Juli 2011
102
enterohämorrhagische E. coli (EHEC) des Serotyps O104:H4 4000 Erkrankungsfälle mit dem
hämolytisch-urämischen Syndrom (HUS) überwiegend in Norddeutschland, 53 Personen verstarben
in Folge der Infektion (Appel et al., 2011). Laut Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)
„handelte es sich um den bisher größten Krankheitsausbruch durch EHEC-Infektionen in
Deutschland und bezogen auf die Anzahl der HUS-Fälle um den größten weltweit beschriebenen
derartigen Ausbruch“.
Man unterscheidet sechs Pathovare bei den darmpathogenen E. coli: diffus adhärierende (DAEC),
enteroaggregative (EAEC oder EaggEC), enteroinvasive (EIEC), enteropathogene (EPEC),
enterotoxische (ETEC) und Verocytotoxin/Shigatoxin bildende E. coli (VTEC/STEC).
Enterohämorrhagische E.coli (EHEC) sind eine Untergruppe der letzten Kategorie.
Obwohl in der Bevölkerung weniger wahrgenommen, stellen neben den darmpathogenen aber auch
extraintestinal pathogene E. coli (ExPEC) eine ernsthafte Bedrohung für die Gesundheit dar
(Johnson und Russo, 2002). Es sind dies überwiegend die Pathovare NMEC
(Neugeborenenmeningitis-auslösende E. coli) und UPEC (uropathogene E. coli). Tabelle 10.1 stellt
den Pathovaren bei E. coli die von ihnen hervorgerufenen Krankheitsbilder gegenüber. Wie aus den
Abkürzungen für die Pathovare ersichtlich ist, kolonisieren pathogene E. coli verschiedene Orte im
menschlichen Körper (vgl. Abb. 10.1). Enteropathogene (EPEC), enterotoxische (ETEC) und
diffus-adhärente (DAEC) E. coli kolonisieren den Dünndarm und verursachen Diarrhoe, während
enterohämorrhagische (EHEC) und enteroinvasive (EIEC) E. coli für Krankheiten des Dickdarms
verantwortlich sind. Enteroaggregative (EAEC) E. coli sind sowohl im Dünndarm als auch im
Dickdarm anzutreffen und verursachen dort verschiedene Krankheiten. Uropathogene E. coli
bevölkern die Harnwege und können in die Blase einwandern, wo sie eine Blasenentzündung
verursachen. Wird die Infektion nicht behandelt, können uropathogene E. coli weiter in die Nieren
wandern und dort eine Pyolenephritis (Nierenbeckenentzündung) verursachen. Sowohl die UPECStämme als auch die Neugeborenenmeningitis auslösenden NMEC-Stämme können eine
Blutvergiftung verursachen. NMEC kann die Blut-Hirn-Schranke überwinden und im zentralen
Nervensystem eine Meningitis (Hirnhautentzündung) auslösen.
Pathotyp
Bedeutung
Klinik
AIEC
Adhärent-invasive E. coli
Vermutlich mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa assoziiert
APEC
Geflügelpathogene E. coli
Extraintestinale Krankheiten bei Geflügel
DAEC
Diffus-adhärente E. coli
Diarrhoe, extraintestinale Erkrankungen
EAEC/EAggEC
Enteroaggregative E. coli
Diarrhoe, extraintestinale Erkrankungen oder symptomlos
EHEC
Enterohämorrhagische E. coli
Diarrhoe, HUS (Hämolytisch-urämisches Syndrom)
EIEC
Enteroinvasive E. coli
Diarrhoe
EPEC
Enteropathogene E. coli
Diarrhoe, häufig bei Säuglingen
ETEC
Enterotoxische E. coli
Diarrhoe, Durchfall ähnlich wie bei Cholera
NMEC
Neonatale-Meningitis auslösende E. coli
Hirnhautentzündung bei Neugeborenen, Sepsis (falls im Blutstrom)
NTEC
Nekrotoxische E. coli
Diarrhoe,
UPEC
Uropathogene E. coli
Harnwegsinfektionen, Sepsis (falls im Blutstrom)
VTEC/STEC
Vero-/shigatoxin-bildende E. coli
Shigellose (Shigellenruhr), Diarrhoe
Tabelle 10.1: Klinische Manifestation der E. coli-Pathovare
Die Virulenzfaktoren und insbesondere die molekularen Pathogenitätsmechanismen der
verschiedenen Pathovare werden nicht in dieser Arbeit beleuchtet. Für einen Einstieg in dieses
Thema siehe z.B. die Reviews von Croxen und Finlay (Croxen und Finlay, 2010) sowie Kaper et al.
(Kaper et al., 2004). Es folgt kurzer Abriß (ungekürzt nachzulesen bei Croxen und Finlay, 2010):
Escherichia coli bedient sich verschiedener Virulenzstrategien, um Krankheiten beim Menschen zu
verursachen. Weitgehend gemeinsam haben alle Pathovare außer EIEC, daß sie sich mittels
103
Fimbrien oder Pili an eine Wirtszelle heften. Danach unterlaufen sie die Prozesse der Wirtszelle,
was sie häufig durch Sekretion von Proteinen bewerkstelligen. Durch die Manipulation von
Signalwegen können E. coli gezielt Wirtszellen befallen und sie kolonisieren sowie
Immunantworten des Wirtes umgehen. Am Ende steht der Ausbruch einer Krankheit (Bhavsar et al.,
2007). Viele Virulenzfaktoren, die bei durch E. coli hervorgerufenen Krankheiten eine Rolle
spielen, sind bekannt. Nicht für alle Pathovare bekannt und daher noch Gegenstand der Forschung
sind die Interaktionen auf molekularer Ebene zwischen Wirtsproteinen und Virulenzfaktoren, die
schließlich zur Ausprägung eines spezifischen Krankheitsbildes führen.
10.1.3 Mechanismen der Evolution pathogener Escherichia coli
Der Gewinn und der Verlust mobiler genetischer Elemente spielt eine entscheidende Rolle in der
Modellierung der Genome pathogener Bakterien. Horizontaler Gentransfer (HGT) sorgt für eine
schnelle Verteilung neuer Merkmale zwischen verschiedenen Organismen. Die Aneignung solcher
Merkmale ist unter Umständen entscheidend für die Aufrechterhaltung der Fitness und sogar das
Überleben eines Bakteriums, während es mit seinem Wirt ko-evolviert (Shames et al., 2009).
Ausschließlich in den Chromosomen pathogener Bakterien oder in deren Plasmiden finden sich
Verbände von Virulenzgenen, sog. Pathogenitätsinseln (PAIs – pathogenicity islands). Gewöhnlich
werden PAIs von mobilen genetischen Elementen flankiert - Bakteriophagen, Insertionssequenzen
oder Transposons – und in der Nachbarschaft von tRNA-Genen eingefügt. Viele der von E. coli
bekannten Virulenzfaktoren befinden sich auf solchen PAIs, auf Plasmiden oder auch Prophagen,
der latenten Form eines Bakteriophagen. Obwohl gewöhnlich defekt, können einige wenige
Prophagen trotzdem infektiöse Partikel ausprägen (Asaldulghani et al., 2009). Durch lateralen
Gentransfer erworbene Merkmale erlauben es dem empfangenden Bakterium, eine neue
ökologische Nische zu bevölkern, und Selektionsdruck sorgt dann für Varianten, die diesem
Selektionsdruck folgen. Die Evolution von Pathovaren erfolgt oft nicht ausschließlich entlang von
Vererbungslinien. Die Virulenzfaktoren von EHEC beispielsweise wurden mehrfach unabhängig auf
der E. coli-Phylogenie erworben (Ogura et al., 2009 ). Die Genome pathogener E. coli
unterscheiden sich untereinander deutlich und sind bis zu 1 Mb größer als die Genome
kommensaler E. coli, was auf den Erwerb oder den Verlust von Pathogenitätsinseln zurückzuführen
ist. Escherichia coli verfügt in seinem Kerngenom37 über ca. 2.200 Gene und in seinem Pangenom
über 13.000 Gene. Obwohl die pathogenen E. coli für mehr als 5.000 Gene kodieren können, macht
nur rund die Hälfte dieser Gene tatsächlich das Kerngenom aus, was maßgeblich für die Plastizität
der Genome und deren genetische Vielfalt verantwortlich ist.
Der enteroaggregative E. coli-Ausbruchstamm O104:H4 ist ein Hybrid aus dem enteroaggregativen
Stamm O104:H4 und einem EHEC-Stamm (Karch, 2006). Die genaue Entstehung dieses Stamms
ist noch nicht vollständig geklärt. Eine Theorie geht davon aus, daß ein afrikanischer EAEC-Stamm
O104:H4 durch lateralen Gentransfer die Eigenschaft erworben hat, Shigatoxine zu produzieren
(Tribe, 2011). Eine alternative Theorie besagt, daß es einen bisher unbekannten zur ShigatoxinProduktion fähigen O104:H4-Stamm gibt, von dem sowohl der pathogene EHEC O104:H4 als auch
der apathogene EAEC O104:H4 abstammen (Karch, 2001; Mellmann et al., 2011). Nicht nur der
Gewinn von Genen, sondern auch ihr Verlust hat maßgeblich zur Ausprägung der verschiedenen
Stämme pathogener E. coli beigetragen. So haben EIEC durch lateralen Gentransfer des
Virulenzplasmids pINV die Fähigkeit erworben, invasiv zu sein (Maurelli et al., 2007). Eine
Deletion in der Region ihres Genoms, das die Lysincarboxylase-Gene enthält, war verantwortlich
dafür, daß EIEC ihre Fitness behielten und sich an einen intrazellulären Lebensstil anpaßten.
37 Gemeint ist die Menge der universellen Genfamilien aller E. coli-Stämme.
104
10.2 Material und Methoden
Die für die in diesem Kapitel vorgestellten Analysen benötigten Dateien befinden sich innerhalb der
Ordnerstruktur im Projektordner Lebensstil. Die Daten im Ordner Proteinfamilien_Ecoli_
ProteinOrtho sind dort der Übersicht halber redundant abgelegt. Sie befinden sich auch im Ordner
Proteinfamilien_ProteinOrtho. Jede Aussage zu Salmonella bezieht sich auf den von der NCBISeite heruntergeladenen Datensatz von 25 Salmonellen-Genomen (Stand September 2013), der der
vorliegenden Arbeit zugrunde liegt. Jede Aussage zu Escherichia coli bezieht sich auf den von dort
zum gleichen Zeitpunkt heruntergeladenen Datensatz von 61 E. coli-Genomen aus Tabelle 8.1.
10.2.1 Lebensstil-Merkmale
Es wurden Daten zu verschiedenen Facetten (vgl. Tab 10.3) des Lebensstils der 61 verwendeten E.
coli-Stämme aus verschiedenen Quellen (siehe Dokument Quellen.odt im Ordner Lebensstil)
gesammelt. Dabei wurde die von Skippington und Ragan (Skippington und Ragan, 2012)
verwendete Lebensstil-Klassifikation nach dem Pathotyp übernommen und um die Gruppe
„Humanpathogen“ erweitert. Die Merkmale wurden den Gruppen "IPEC", "ExPEC", "EHEC",
"Human pathogen", "UPEC", "ETEC", "Commensal", "NMEC", "EAEC", "EPEC", "STEC" und
"AIEC" zugeordnet.
Für einige Stämme ist nicht gesichert, ob sie als Human-Pathogen einzustufen sind. Das gilt für das
Geflügel-Pathogen E. coli APEC 01 (Dho-Moulin et al. 1999) sowie für die beiden E. coli KO11FLStämme. Für letztere ist unbekannt, ob sie nicht doch für andere Warmblüter pathogen sind. In
dieser Arbeit werden alle drei Stämme als Nicht-Humanpathogene klassifiziert. Der gegen viele
Antibiotika resistente Stamm E. coli SMS-3-5 (Typ SECEC – Environmental E. coli) nimmt eine
Sonderrolle ein, da er nach heutigem Kenntnisstand weder Pathogen noch Kommensale ist (Fricke
et al., 2008). Alle anderen apathogenen E. coli-Stämme sind gleichzeitig auch Kommensalen. Die
enterohämorrhagischen E. coli bilden eine Gruppe innerhalb der Shigatoxin/Verotoxin
produzierenden Obergruppe STEC. Läßt man die Shigellen außer acht, sind die Klassen „EHEC“
und „VTEC/STEC“ deckungsgleich.
10.2.2 Rekonstruktion der anzestralen Lebensstile
Die anzestralen Lebensstil-Merkmalsmuster sind im Projektordner in der Datei
AnzestraleLebensstilMerkmale/Parsimony_count_of_events_per_site_per_branch.txt abgelegt.
Anhand der bei den einzelnen E. coli-Stämmen im Datensatz an- oder abwesenden Merkmale und
der im Newick-Format vorliegenden gewurzelten E. coli-Phylogenie (Datei gemeinsameDateien/
ec_tree.tre) wurde mit der GLOOME Gain Loss Mapping Engine in Version VR01.266 (Cohen und
Pupko, 2010) das phyletische Muster der Merkmale für alle Äste der Phylogenie berechnet.
105
Kategorie
Variable
Belegung
Evolutionary model
Allow root freq to differ from stationary ones
no
Loss only model (gain rate ~ 0)
no
Correction for un-observable data
Results
Minimum number of ones (1)
1
Minimum number of zeros (0)
1
Stochastic Mapping
no (nicht verwendet)
Parsimony
yes
Parsimony cost of gain
1
Parsimony count of events per site
no (nicht verwendet)
Parsimony count of events per branch
no (nicht verwendet)
Parsimony count of events per site per branch
yes
Additional features
no (nicht verwendet)
Tabelle 10.2: Verwendete GLOOME-Parameter
GLOOME benötigt als Eingabe die binären Merkmalsmuster in Form eines multiplen Alignments
im FASTA-Format: Zeilen korrespondieren mit Spezies und Spalten mit binären Mustern. Dazu
wurden die Merkmale als 1 (Merkmal vorhanden) oder 0 (Merkmal nicht vorhanden) kodiert.
Verwendet wurde der von GLOOME angebotene Maximum Parsimony-Ansatz unter Verwendung
der in Tabelle 10.2 dargestellten Parameterbelegung. Die Kostenmatrix belegt Gewinn und Verlust
eines Merkmals mit gleichen Kosten. Die GLOOME-Ausgabedatei mit der Rekonstruktion des
anzestralen Gengehalts auf der E. coli-Phylogenie findet sich im Ordner AnzestralerGengehalt/
Parsimony_count_of_events_per_site_per_branch.txt. Desweiteren produzierte GLOOME die
Datei Tree_with_inner_nodes_notation.ph, die im übergeordneten Ordner abgelegt ist. Sie enthält
die vom Benutzer als Eingabe spezifizierte Phylogenie im Newick-Format, jedoch um innere
Knoten erweitert. Jeder Knotenname in dieser Datei enspricht dabei dem Namen eines Astes in
obiger Datei. Der Knoten ist dabei stets der jüngere der beiden Knoten, die über diesen Ast
verbunden werden.
10.2.3 Berechnung von Proteinfamilien
Das Perl-Programm proteinOrtho in Version 4.26 (Lechner et al., 2011) wurde verwendet, um
orthologe Gruppen für die chromosomalen und plasmidischen Proteinsequenzen der E. coli-Stämme
zu konstruieren. Dazu berechnete proteinOrtho mittels einer BLAST-Suche (Altschul et al., 1990)
reziproke best Hits zwischen 287.840 Proteinen mit einer Sequenzidentität von mindestens 75%
und einem e-value von 0.01. Um die Zusammensetzung der orthologen Gruppen bei Bedarf
vergleichen zu können, wurde die gleiche Parameterbelegung verwendet wie zuvor bei der
Herstellung von Proteinfamilien auf Grundlage von Syntenie und Sequenzähnlichkeit (vgl.
Abschnitt 8.2.2).
Die von proteinOrtho produzierte Ausgabedatei proteinOrtho_output_EC_75.txt enthält 19.400
Proteinfamilien und befindet sich im Ordner gemeinsameDateien/Proteinfamilien_
Ecoli_proteinOrtho. Aus der Ausgabedatei wurde eine Matrix von GI-Nummern abgeleitet, deren
Spalten Genome und deren Zeilen Proteinfamilien bzw. orthologe Gruppen von Proteinen
repräsentieren. Ein „*“ anstelle einer GI-Nummer bedeutet, daß in der Familie kein Protein aus dem
betroffenen Genom bzw. der betroffenen Spezies vorhanden ist. Die Matrix wurde in die Datei
gemeinsameDateien/gi_matrix_ec_75.txt geschrieben. Die von proteinOrtho errechnete
Konnektivität für die Proteinfamilien wurde dabei außer acht gelassen, alle Gruppen wurden in die
106
weitere Analyse übernommen. Dort, wo proteinOrtho eine Menge duplizierter Gene in
verschiedenen Chromosomen ermittelte, wurde immer das Gen aus dem jeweils passenden
Chromosom in die orthologe Gruppe übernommen.
10.2.4 Anzestraler Gengehalt
Analog zur Vorgehensweise für die Lebensstil-Merkmale wurden die Proteinfamilien mit dem PerlProgramm getBinaryCodedOGs_FASTA.pl für E. coli aus der Datei proteinOrtho_output_
EC_75.txt (s.o.) in ein multiples FASTA-Alignment binärer Muster von Genanwesenheit (1) und
-abwesenheit (0) umgeschrieben. Das Ergebnis ist in Datei gemeinsameDateien/Proteinfamilien_
Ecoli_proteinOrtho/ec_binaryCodedOG.fasta abgelegt. Mit der gleichen GLOOME-Version wie
zuvor wurden die anzestralen Gengehalte auf der E. coli-Phylogenie (gemeinsameDateien/
ec_tree.tre) geschätzt. Die Parameterbelegung (siehe Tab. 10.2) wurde beibehalten.
Zwei Besonderheiten traten während der Berechnung auf: erstens stellte GLOOME bei der Analyse
des Alignments fest, daß in der zweiten Spalte nur Einsen standen und demnach jedes E. coli das
betreffende Protein besitzt. Daher änderte GLOOME den Parameter „Minimum number of zeros
(0)“ auf 0. Zweitens änderte GLOOME die kürzesten Astlängen in der Phylogenie von 10 -8 in 10-7
und begründete sein Vorgehen damit, daß die Äste zu kurz seien.
Die Gain-Loss-Ereignisse pro Ast und Gen, die das von GLOOME geschätzte anzestrale
phyletische Muster ausbilden, sind in der Datei gemeinsameDateien/AnzestralerGengehalt/Parsi
mony_count_of_events_per_site_per_branch.txt zu finden. Es wurde ebenfalls wieder die Datei
Tree_with_inner_nodes_notation.ph erzeugt. Die Datei ist identisch mit der Datei gleichen Namens
im Ordner AnzestraleLebensstilMerkmale. Das ist auch erforderlich, da die Namen der inneren und
äußeren Knoten auf der Phylogenie jeweils gleich sein müssen.
10.2.5 Korrelation von Lebensstil-Änderungen und Gen-Änderungen
Als Gradmesser dafür, wieviel höher die Intensität lateralen Gentransfers auf Ästen mit Änderungen
im Lebensstil im Vergleich zu der auf Ästen ohne Änderungen im Lebensstil ist, wird jeweils der
Quotient Qorig berechnet, der die Anzahl von Gen-Änderungen auf Ästen mit LebensstilÄnderungen in Beziehung setzt zu der auf Ästen ohne Lebensstil-Änderungen. Ist er in einem
konkreten Fall deutlich größer als 1, z.B. 2, kann das bedeuten, daß E. coli immer dann ungefähr
doppelt so viele Gene ausgetauscht haben, wenn sie ihren Lebensstil geändert haben, wie zu Zeiten
ohne solche Änderungen. Ob dieser Schluß zulässig ist, wird durch einen nachgeschalteten
randomisierten Test geprüft. Dazu werden Qi für eine hohe Zahl von Permutationen der LebensstilÄnderungen auf den Ästen berechnet und jeweils mit QOrig verglichen. Es wird gezählt, für wieviele
Permutationen Qi mindestens so groß wie QOrig ist. Letzterer Wert geht in den p-Wert für den
randomisierten Test ein.
Für diesen Schritt des Projekts wurde das Perl-Programm compare_LS_vs_HGT.pl entwickelt.
Der einzige Kommandozeilen-Parameter gibt an, welches Lebensstil-Merkmal während des
Programmlaufs untersucht werden soll. Für mehrere Merkmale sind demnach mehrere
Programmläufe notwendig. Das Programm vergleicht die Verteilung der Gengewinne und -verluste
mit der der Änderungen im Lebensstil auf der E. coli-Phylogenie. Die Phylogenie ist gewurzelt und
besitzt damit eine Zeitachse; der Wurzelknoten ist dabei der jüngste gemeinsame Vorfahr aller
endständigen Taxa. Ist im Folgenden die Rede von einem Vorgängerast, ist damit der ältere Ast
107
gemeint, der mit einem anderen Ast über einen Knoten verbunden ist. Der jüngere Ast wird
dementsprechend als Nachfolgeast bezeichnet. Es folgt eine Beschreibung der Arbeitsschritte:
1. Die Phylogenie wird implizit in einer Datenstruktur vorgehalten, in der ein innerer oder äußerer
Knoten im Baum jeweils auf seinen Vorgänger verweist. Diese Nachfolger-Vorgänger-Relationen
wurden manuell anhand der GLOOME-Ausgabedateien erstellt. Die von GLOOME verwendete
Bezeichnung
der
inneren
und
äußeren
Knoten
(siehe
beide
Dateien
Tree_with_inner_nodes_notation.ph) wurde dabei beibehalten. Die Bezeichner der Äste werden im
Programm gleichzeitig noch für den jüngeren der beiden Knoten an diesen Ästen verwendet.
2. Der Inhalt der Datei gemeinsameDateien/gi_matrix_ec_75.txt wird gelesen. Aus ihr geht die
Einordnung der verschiedenen Proteine in orthologe Gruppen/Proteinfamilien hervor. Jede Zeile
repräsentiert dabei eine Proteinfamilie. Zeile 1 entspricht Position 1 und damit Proteinfamilie 1 in
der Datei AnzestralerGengehalt/Parsimony_count_of_events_per_site_per_branch.txt. Das Gleiche
gilt auch für die identisch bezeichnete Datei im Ordner AnzestraleLebensstilMerkmale.
3. Für jede GI-Nummer wird die Annotation des jeweiligen Proteins gespeichert. Die Zuordnung
wird aus der im Vorfeld konstruierten Datei gemeinsameDateien/geneTable.txt gelesen.
4. Das Perl-Programm liest die Daten zu Gengewinnen und -verlusten pro Ast aus der Datei
AnzestralerGengehalt/Parsimony_count_of_events_per_site_per_branch.txt sowie die Daten zu
Lebensstil-Änderungen
aus der entsprechenden Datei gleichen Namens im Ordner
AnzestraleLebensstilMerkmale ein.
In beiden Dateien wird der numerische Bezeichner „pos“ verwendet, der auf eine Spalte des
jeweiligen für GLOOME verwendeten Eingabe-Alignments Bezug nimmt. Er entspricht im ersten
Fall der Nummer der Proteinfamilie, im zweiten Fall einem der zwölf Lebensstil-Merkmale. Ein
Gen oder Merkmal wird auf einem Ast entweder hinzugewonnen („gain“) oder verloren („loss“).
5. Die von GLOOME geschätzten Lebensstil-Änderungen und lateralen Gentransfers je Ast werden
um den Zustand „retained“ („beibehalten“) ergänzt. Bezogen auf einen bestimmten Ast ist damit
gemeint, daß ein bestimmtes Lebensstil-Merkmal bzw. Gen auf ihm weder gewonnen noch verloren
wurde. Entweder ist es also auf ihm vorhanden und war schon auf dem Vorgängerast vorhanden,
oder es ist nicht vorhanden und war auch auf dem Vorgängerast schon nicht vorhanden. Dieser dritte
Zustand neben „gain“ und „loss“ hat den Zweck, diese in den Daten bereits vorhandene
Mehrinformation zu nutzen.
6. Eine Zeichenkette Sorig aus den Zeichen „1“ für „gain“, „2“ für „loss“ oder „4“ für „retained“
wird gebildet. Ein Zeichen repräsentiert den Zustand des Lebensstil-Merkmals auf einem Ast. Die
Reihenfolge der Zeichen wird von den alphabetisch aufsteigend sortierten Astnamen vorgegeben.
7. Auf den Ausgangsdaten wird der Quotient QOrig aus
Summe aller Gen-Änderungen auf Ästen mit Lebensstil-Änderungen
Anzahl Äste mit Lebensstil-Änderungen
und
Summe aller Gen-Änderungen auf Ästen ohne Lebensstil-Änderungen
Anzahl Äste ohne Lebensstil-Änderungen
berechnet. Ein Gen-Ereignis bzw. eine Gen-Änderung ist entweder ein Gengewinn oder ein
Genverlust. Ist QOrig >= 2, gab es auf den Ästen der E. coli-Phylogenie, auf denen sich der
Lebensstil geändert hat, mindestens doppelt so viele laterale Gentransfers wie auf Ästen, auf denen
108
sich der Lebensstil nicht geändert hat.
8. Es muß noch untersucht werden, ob die Verteilung von Gen-Ereignissen und LebensstilÄnderungen lediglich durch Zufall zustande gekommen ist. Dazu wurde der wie folgt ablaufende
randomisierte Test konzipiert:
Das Programm berechnet n zufällige Permutationen Si von Sorig. Für jede Permutation Si wird der
Quotient Qi berechnet. Die Variable z zählt die Anzahl Qi, für die gilt Qi >= Qorig.
9. Berechne die Wahrscheinlichkeit p = (z+1) / ( n + 1). Beispiel: Gab es bei 1.000 Durchäufen 11
Mal ein Qi >= Qorig, ist die Wahrscheinlichkeit nur ca. 1,1 %, daß die Ausgangsverteilungen der
Lebensstil-Änderungen und Gen-Änderungen durch Zufall entstanden sind. Legt man ein
Signifikanzniveau von 5 % zugrunde, ist das Ergebnis signifikant.
Das Programm legt die errechneten Qi, den Zähler von Qi und den Nenner von Qi zeilenweise in
einer Datei oddsRatios_ID*.txt ab. Anstelle des Wildcards wird der Name des Lebensstil-Merkmals
eingesetzt. Eine zweite Datei, testResults_ID*.txt wird angelegt, in der QOrig sowie Zähler und
Nenner von QOrig gespeichert werden, daneben die Anzahl Äste, auf denen sich das LebensstilMerkmal geändert hat, die Zahl der Qi >= QOrig und p für diesen Test.
Das hier dargestellte Verfahren (Ordner Experiment1) existiert in einer zweiten Version in Form des
Programms compare_LS_vs_HGT_normiert.pl. Hier wird die Zahl der Gen-Ereignisse pro
Ast auf die Astlänge normiert (Ordner Experiment2). Zwei weitere Programmversionen wurden
erstellt, die nicht ein einzelnes Lebensstil-Merkmal je Ast untersuchen, sondern die Summe aller
Merkmalsänderungen je Ast.
Die Version, die die Zahl der Lebensstil-Veränderungen nicht auf die Astlänge normiert, heißt
compare_LS_vs_HGT_alleMerkmale.pl (Ordner Experiment3), die andere Version heißt
compare_LS_vs_HGT_normiert_alleMerkmale.pl (Ordner Experiment4).
Die Varianten des Programms compare_LS_vs_HGT.pl für die einzelnen Lebensstil-Merkmale
verteilen im Randomisierungsschritt die Merkmale neu auf dem Baum, indem sie eine Permutation
aller Lebensstil-Merkmale berechnen und sie über die Phylogenie legen. Dahingegen berechnen die
Varianten, die die Lebensstil-Merkmale in Summe betrachten, eine Permutation der Äste und
weisen diesen jeweils die Merkmale, die sich zusammen auf einem Ast befinden, zu.
10.3 Ergebnisse
Mit dem in Korrelation von Lebensstil-Änderungen und Gen-Änderungen dargestellten Protokoll
wurden vier Experimente durchgeführt. Die Dateien für Experiment i befinden sich jeweils in einem
Ordner Experiment mit angehängter Zahl i. Die Dateien oddsRatio_ID*.txt, testsResults_ID*.txt
und testsResults.txt wurden jeweils mit der in diesem Ordner befindlichen Variante des Programms
compare_LS_vs_HGT.pl erzeugt. Für den randomisierten Test wurde ein Signifikanzniveau
von 5 % zugrundegelegt. Es wurden jeweils 100.000 Permutationen der Lebensstil-Änderungen
erzeugt.
109
E. coli/Shigella-Genom
NCBINummer
IPEC
ExPEC EHEC
Hum.UPEC
Path.
ETEC
x
Komm./
NMEC
Apath.
EAEC
EPEC
VTEC/
STEC
IAI1 uid59377
NC_011741
55989 uid59383
NC_011748
ATCC 8739 uid58783
NC_010468
x
HS
NC_009800
x
K-12 substr MG1655 uid57779
NC_000913
x
K-12 substr W3110 uid161931
NC_007779
UMN026 uid62981
NC_011751
x
APEC 01 uid58623
NC_008563
x
S88 uid62979
NC_011742
x
x
UTI89 uid58541
NC_007946
x
x
x
ED1a uid59379
NC_011745
536 uid58531
NC_008253
x
x
x
CFT073 uid57915
NC_004431
x
x
x
O127:H6 E2348 69 uid59343
NC_011601
IAI39 uid59381
NC_011750
SMS 3 5 uid58919
NC_010498
042 uid161985
NC_017626
x
ABU 83972_uid161975
NC_017631
x
BL21 DE3 uid161947
NC_012971
x
BL21 DE3 uid161949
NC_012892
x
BW2952 uid59391
NC_012759
x
B REL606 uid58803
NC_012967
x
DH1 uid161951
NC_017625
x
DH1 uid162051
NC_017638
H10407 uid161993
NC_017633
IHE3034 uid162007
NC_017628
KO11FL uid162099
NC_017660
x
KO11FL uid52593
NC_016902
x
K-12 substr DH10B uid58979
NC_010473
LF82 uid161965
NC_011993
NA114 uid162139
NC_017644
O103:H2 uid41013
NC_013353
x
x
x
x
O111:H 11128 uid41023
NC_013364
x
x
x
x
O157:H7 EC4115 uid59091
NC_011353
x
x
x
x
O157:H7 TW14359 uid59235
NC_013008
x
x
x
x
O26:H11 uid41021
NC_013361
x
x
x
O55:H7 CB9615 uid146655
NC_013941
x
O55:H7 RM12579 uid162153
NC_017656
x
O7:K1 CE10 uid162115
NC_017646
O83:H1 NRG 857C uid161987
NC_017634
x
x
P12b (O15:H17) uid162061
NC_017663
x
x
SE11 uid59425
NC_011415
SE15 uid161939
NC_013654
UM146 uid162043
NC_017632
x
x
UMNK88 uid161991
NC_017641
x
x
W uid162011
NC_017635
O157:H7 Xuzhou21 uid163995
NC_017906
BL21 Gold DE3 pLysS AG uid59245
NC_012947
D i14 uid162049
NC_017652
x
x
x
D i2 uid162047
NC_017651
x
x
x
O157:H7 EDL933 uid57831
NC_002655
W uid162101
NC_017664
Sh. boydii Sb227 uid58215
NC_007613
x
x
x
Sh. boydii CDC3083 94 uid58415
NC_010658
x
x
x
Sh. flexneri 2a 301 uid62907
NC_004741
x
x
x
Sh. flexneri 2a 2457T uid57991
NC_004337
x
x
x
Sh. flexneri 5 8401 uid58583
NC_008258
x
x
x
Sh. dysenteriae Sd197 uid58213
NC_007606
x
x
x
Sh. flexneri 2002017 uid159233
NC_017328
x
x
x
Sh. Sonnei 53G uid84383
NC_016822
x
x
x
Sh. sonnei Ss046 uid58217
NC_007384
x
x
x
AIEC
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Tabelle 10.3: E. coli-Stämme und ihre Pathotypen
110
10.3.1 Experiment 1 (siehe Tabelle 10.4)
•
Lebensstil-Merkmale wurden getrennt betrachtet
•
Die Summe der Gengewinne und -verluste je Ast wurde nicht auf die Astlänge normiert
Der für das Lebensstil-Merkmal ETEC errechnete Wert 1,783 für QOrig ist der höchste Q-Wert in
diesem Experiment. Diesem Wert liegen allerdings lediglich Änderungen im Lebensstil auf nur
zwei von 120 Ästen zugrunde. Der p-Wert 0,12, obwohl der niedrigste in diesem Experiment, ist
daher nur beschränkt aussagekräftig und wie alle anderen p-Werte nichtsignifikant. Für die
Merkmale IPEC, ExPEC, Human-Pathogen und Kommensale wurden Lebensstil-Änderungen auf
genügend Ästen beobachtet. Für jeden der drei Merkmale wurde ein QOrig um 1,00 errechnet: 0,87,
0,94, 1,02 und 1,38. Die Anzahl von Gen-Ereignissen in den Ausgangsdaten entspricht der
durchschnittlichen Zahl von Gen-Ereignissen in den randomisierten Daten, sowohl für die Äste mit
Lebensstil-Änderungen als auch für Äste ohne Lebensstil-Änderung. Die Zahl der Gen-Ereignisse
war pro Ast in allen Fällen ähnlich hoch (zwischen 322 und 373) außer für das Merkmal
Kommensale (492). Die p-Werte 0,66, 0,54, 0,44 und 0,13 weisen die Ergebnisse als
nichtsignifikant aus. Streng genommen müssen die p-Werte noch FDR-korrigiert werden. Dies
wurde unterlassen, da alle Tests nichtsignifikant sind.
LebensstilMerkmal
QOrig
Anzahl Äste mit
LebensstilÄnderungen
(Orig.)
Anzahl HGT auf Ästen mit
Lebensstil-Änderungen
(Orig.)
Mittlere Anzahl HGT
auf Ästen mit
Lebensstil-Änderungen
(Random.)
Anzahl Äste
ohne LebensstilÄnderungen
(Orig.)
Anzahl HGT auf
Ästen ohne
LebensstilÄnderungen (Orig.)
IPEC
0,869
12
3865
4352
108
40034
ExPEC
0,945
10
3472
3630
110
40427
EHEC
0,753
2
553
724
118
Human-Pathogen
1,024
11
4111
3987
UPEC
1,017
5
1860
ETEC
1,783
2
Kommensale
1,385
NMEC
Mittlere Anzahl HGT
auf Ästen ohne
Lebensstil-Änderungen
(Random.)
Anzahl
Qi >= Qorig
p-Wert
39547
66024
0,66
40269
54407
0,54
43346
43175
57495
0,57
109
39788
39912
43943
0,44
1815
115
42039
42084
43843
0,44
1288
726
118
42611
43173
11761
0,12
9
4431
3263
111
39468
40636
12769
0,13
1,443
3
1566
1088
117
42333
42811
19180
0,19
EAEC
1,259
2
917
726
118
42982
43173
30569
0,31
EPEC
0,918
5
1685
1817
115
42214
42082
53420
0,53
VTEC/STEC
0,811
6
1797
2180
114
42102
41719
66152
0,66
AIEC
1,215
2
886
723
118
43013
43176
31859
0,32
Tabelle 10.4: Einzelne Lebensstil-Merkmale, nicht normiert, 100.000 Permutationen
10.3.2 Experiment 2 (siehe Tabelle 10.5)
•
Lebensstil-Merkmale wurden getrennt betrachtet
•
Die Summe der Gengewinne und -verluste je Ast wurde auf die Astlänge normiert
Da die Astlängen in der verwendeten E. coli-Phylogenie sehr stark schwanken, ist die
vorgenommene Normierung der Gen-Ereignisse auf die Astlängen sinnvoll. Durch die Normierung
haben sich die QOrig deutlich verändert. Wie zuvor wurde das höchste QOrig, hier 6,900, für das
Merkmal ETEC berechnet. Der randomisierte Test für dieses Merkmal war mit p = 0,04 signifikant,
basiert jedoch nur auf Lebensstil-Änderungen auf 2 von 120 Ästen. Alle anderen Ergebnisse sind
nichtsignifikant. Insbesondere das Ergebnis für das Merkmal Kommensale, QOrig = 0,081, p = 0,9,
fällt völlig anders aus als in Experiment 1. Die p-Werte für dieses Experiment müßten ebenfalls
FDR-korrigiert werden. Das würde den Test für ETEC voraussichtlich ebenfalls nichtsignifikant
machen.
111
LebensstilMerkmal
QOrig
Anzahl Äste mit
LebensstilÄnderungen
(Orig.)
Anzahl HGT auf Ästen
mit LebensstilÄnderungen (Orig.)
Mittlere Anzahl HGT
auf Ästen mit
Lebensstil-Änderungen
(Random.)
Anzahl Äste
ohne LebensstilÄnderungen
(Orig.)
Anzahl HGT auf
Ästen ohne
LebensstilÄnderungen
(Random.)
IPEC
1,690
12
3865
4356
108
40034
ExPEC
1,550
10
3624
3624
110
40427
EHEC
0,002
2
553
727
118
Human-Pathogen
0,026
11
4111
3990
UPEC
0,005
5
1860
ETEC
6,900
2
Kommensale
0,081
NMEC
Mittlere Anzahl HGT
auf Ästen ohne
Lebensstil-Änderungen
(Random.)
Anzahl
Qi >= Qorig
p-Wert
39543
19903
0,20
40275
25202
0,25
43346
43172
73882
0,74
109
39788
39909
96020
0,96
1813
115
42039
42086
85138
0,85
1288
725
118
42611
43174
4216
0,04
9
4431
3264
111
39468
40635
90001
0,90
0,027
3
1566
1086
117
42333
42813
59990
0,60
EAEC
4,034
2
917
725
118
42982
43174
10857
0,11
EPEC
2,440
5
1685
1814
115
42214
42085
16808
0,17
VTEC/STEC
0,080
6
1797
2176
114
42102
41723
80492
0,80
AIEC
5,958
2
886
727
118
43013
43172
6901
0,07
Tabelle 10.5: Einzelne Lebensstil-Merkmale, normiert, 100.000 Permutationen
10.3.3 Experiment 3 (siehe Tabelle 10.6)
•
Lebensstil-Merkmale wurden kumuliert betrachtet
•
Die Summe der Gengewinne und -verluste je Ast wurde nicht auf die Astlänge normiert
Gegenüber den Experimenten 1 und 2 wurden zwei Änderungen vorgenommen: zum einen werden
in den Experimenten 3 und 4 alle 12 Lebensstil-Merkmale zusammen betrachtet, indem alle
Veränderungen der Lebensstil-Merkmale auf jedem Ast aufsummiert werden. Dabei spielt die
„Richtung“, d. h. Gewinn oder Verlust, keine Rolle. Zum anderen wurden die Lebensstil-Merkmale
für den randomisierten Test nach einer anderen Strategie neu verteilt. Es wurde zunächst eine
Permutation der Äste erzeugt, danach wurden die Lebensstil-Merkmale auf dem ehemaligen Ast
dem neuen zugewiesen. Das bedeutet, daß die Merkmale nicht mehr individuell von einem
beliebigen Ast auf einen anderen verteilt werden, sondern nur zusammen auf einen anderen Ast. Das
Randomisierungsverfahren lieferte kein Qi, das mindestens so groß ist wie Qorig. Der p -Wert für den
Test ist damit kleiner oder gleich (0+1)/(100.000+1) ≈ 0,00001. Der Test ist demnach signifikant.
10.3.4 Experiment 4 (siehe Tabelle 10.6)
•
Lebensstil-Merkmale wurden kumuliert betrachtet
•
Die Summe der Gengewinne und -verluste je Ast wurde auf die Astlänge normiert
Für dieses Experiment wurden die Veränderungen aller 12 Lebensstil-Merkmale pro Ast
aufsummiert, und deren Summe wurde auf die Astlänge normiert. Während des
Randomisierungsschritts wurden die Lebensstil-Merkmale auf die gleiche Weise wie in Experiment
3 auf die Äste verteilt. Für 1.845 von 100.000 Permutationen wurde ein Qi errechnet, das
mindestens genauso groß wie Qorig = 0,180 ist. Der p-Wert 0,0180 weist den Test als signifikant aus.
Die Ergebnisse der Experimente 3 und 4 (vgl. Tab. 10.6) erlauben den Schluß, daß Escherichia coli
während ihrer Evolution immer dann mehr lateralen Gentransfer betrieben haben, wenn sich ihr
Lebensstil geändert hat.
112
Q Orig
2,549
2,765
Anzahl Äste
mit LebensstilÄnderungen
(Orig.)
41
Anzahl Äste
ohne
LebensstilÄnderungen
(Orig.)
Anzahl HGT
auf Ästen mit
LebensstilÄnderungen
(Orig.)
79
25002
Anzahl HGT auf
Ästen ohne
LebensstilÄnderungen
(Orig.)
18897
Durchschn.
Anzahl HGT
auf Ästen mit
LebensstilÄnderungen
(Random.)
Durchschn.
Anzahl HGT auf
Ästen ohne
LebensstilÄnderungen
(Random.)
15013
28886
15002
28897
Anzahl
Q i >= Q orig
p-Wert
Auf Astlänge
normiert
0
0,00001
Nein (Exp. 3)
1845
0,01800
Ja (Exp. 4)
Tabelle 10.6: Lebensstil-Merkmale kumuliert, 100.000 Permutationen
10.3.5 Zusammenhang zwischen der Zahl der Gen-Änderungen und
Astlängen
Das Diagramm aus Abbildung 10.2 stellt den Astlängen die Zahl der Gen-Ereignisse auf den
jeweiligen Ästen gegenüber. Grundlage für das Diagramm sind die Daten in der Datei
numHGT_vs_branchLengths.txt im Unterordner Rohdaten/lifestyleProjekt. Der SpearmanKorrelationskoeffizient für die Größen „Astlängen“ und „Zahl der Gen-Ereignisse“ ist 0,254, was
auf eine schwache Korrelation hinweist.
Abbildung 10.2: Anzahl HGT-Ereignisse und Astlängen
10.3.6 Zahl der HGT-Ereignisse auf Ästen mit und ohne LebensstilÄnderungen
Für die in Abschnitt 10.3.5 verwendeten Daten wurde die Zahl der Gen-Änderungen auf Ästen mit
Lebensstil-Änderungen denen auf Ästen ohne Lebensstil-Änderungen gegenübergestellt. Das
entsprechende, in R erstellte Diagramm ist in Abbildung 10.3 dargestellt. Mit hoher
Wahrscheinlichkeit sind die Gen-Ereignisse weder auf Ästen mit Lebensstil-Änderungen (p-Wert
0,012) noch auf Ästen ohne Lebensstil-Änderungen (p-Wert 5,565·10-7) normalverteilt, wie die
entsprechenden, in R durchgeführten Shapiro-Tests ergeben haben. Die Verteilungen wurden daher
mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf Übereinstimmung getestet. Aus dem p-Wert 9,04·10-7 für
den Test geht hervor, daß die verglichenen Stichproben mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit nicht aus
der gleichen Grundgesamtheit stammen. Die Verteilung der Gen-Änderungen auf Ästen mit
113
Lebensstil-Änderungen stimmt demnach nicht mit der der Gen-Änderungen auf Ästen ohne
Lebensstil-Änderungen überein. Dieses Ergebnis unterstützt die eingangs aufgestellte Hypothese in
der Hinsicht, als daß diese besagt, daß lateraler Gentransfer in der Evolution von E. coli nicht mit
gleichmäßiger Rate geschehen ist.
Abbildung 10.3: Zahl von Gen-Änderungen auf Ästen mit und ohne
Lebensstil-Änderung
Abbildung 10.4: Länge der Äste mit und ohne Lebensstil-Änderung
Die Verteilungen für die Längen der Äste mit und ohne Lebensstil-Änderungen (siehe Abb. 10.4)
haben einen ähnlichen Mittelwert nahe Null. Die Ergebnisse aus diesem Abschnitt lassen vermuten,
daß die Zahl von Gen-Änderungen auf der E. coli-Phylogenie unabhängig von den Astlängen ist.
10.4 Diskussion
In diesem Projekt wurde die Hypothese untersucht, daß Escherichia coli/Shigella im Laufe der
Evolution immer dann verstärkt horizontalen Gentransfer betrieben haben, wenn sie ihren
Lebensstil geändert haben. Diese Idee erscheint plausibel: zum einen geht die Forschung davon aus,
daß lateraler Gentransfer in der Prokaryotenevolution ein sehr häufiges, praktisch gewöhnliches
Phänomen ist, zum anderen gibt es Hinweise darauf, daß Bakterien sich schnell an neue
Umgebungen anpassen, indem sie Fähigkeiten durch den Gewinn oder Verlust von Genen
114
hinzugewinnen bzw. modifizieren. Es wurde ein Verfahren vorgestellt, mit dem untersucht wurde,
ob Änderungen in zwölf unterschiedlichen Lebensstilen bei E. coli tatsächlich mit verstärktem
lateralen Gentransfer einhergingen und ob dieses Ergebnis vertrauenswürdig ist.
Letztendlich konnte die eingangs aufgestellte Hypothese gestützt werden. Das gelang, als in den
Experimenten 3 und 4 alle Änderungen in den Lebensstil-Merkmalen kumuliert betrachtet wurden.
Diese Praxis ist statistisch zulässig, da lediglich zwischen den zwei Klassen „keine Änderung im
Lebensstil“ und „mindestens eine Änderung im Lebensstil“ unterschieden werden muß.
Insbesondere spielt es dabei keine Rolle, ob die Lebensstil-Merkmale teilweise voneinander
abhängig sind. Die statistischen Untersuchungen aus den Abschnitten 10.3.5 und 10.3.6
unterstützen ebenfalls die Hypothese. So scheint die Zahl der Gen-Änderungen auf Ästen der
Phylogenie nicht von den Astlängen abzuhängen. Die Verteilung der Gen-Änderungen auf Ästen
mit Lebenssstil-Änderung weicht deutlich von der auf Ästen ohne Lebensstil-Änderung ab, und die
Verteilungen der Längen von Ästen mit und ohne Lebensstil-Änderungen haben einen ähnlichen
Mittelwert.
Wieso waren keine Korrelationen zwischen den einzelnen Lebensstil-Merkmalen und der Zahl von
Gen-Veränderungen auf der Phylogenie festzustellen? Für viele Lebensstil-Merkmale war die
Grundvoraussetzung einer erhöhten Zahl von Gen-Änderungen bei gleichzeitiger Änderung im
Lebensstil auf der E. coli-Phylogenie gar nicht erst erfüllt. Weiterhin war eine verläßliche Aussage
für bestimmte Lebensstil-Merkmale oft von vornherein unmöglich, da Änderungen auf nur wenigen
Ästen stattgefunden hatten.
Mit welchen Maßnahmen könnte das Verfahren verbessert werden?
•
Gain- und Loss-Ereignisse wurden nicht differenziert betrachtet. Sie sollten auch getrennt
ausgewertet werden. Die These, daß ein bestimmtes Gen auf der Phylogenie gewonnen
wurde, immer wenn ein Vorfahr von E. coli pathogen geworden ist, kann mit dem jetzigen
Ansatz beispielsweise nicht erfaßt werden.
•
Die Ergebnisse hängen sehr stark von dem Verfahren ab, mit dem die anzestralen
Gengehalte und Lebensstil-Merkmale rekonstruiert wurden. In diesem Projekt wurde das
von GLOOME angebotene Verfahren benutzt, das auf Maximum Parsimony (MP) basiert.
MP verteilt Änderungen auf der Phylogenie nach dem Gedanken maximaler Sparsamkeit.
Das führt dazu, daß man auf einem Ast niemals mehr als eine Änderung pro Merkmal
antrifft. Diesen Sachverhalt kann man so interpretieren, daß die Astlänge für die Verteilung
der Merkmale wenigstens in der Praxis keine Rolle spielt. Obwohl hier MP in einem seiner
typischen Anwendungsbereiche benutzt worden ist, weist es bestimmte Schwächen auf
(Swofford et al., 2001). Es erscheint lohnenswert, ebenfalls das von GLOOME offerierte
„Stochastic Mapping“-Verfahren auszuprobieren, das auf Maximum-Likelihood basiert. In
vom Verfasser durchgeführten Versuchen kam es allerdings vor, daß das Verfahren Gainund Loss-Ereignisse für das gleiche Merkmal mehrfach auf einem Ast rekonstruierte. Gegen
die Benutzung eines ML-Ansatzes im Rahmen der hier dargestellten Analysen spricht auch,
daß ML ein explizites Modell für die Verteilung der Ereignisse auf der Phylogenie benutzt,
das von der Astlänge abhängig ist. Die eingangs aufgestellte These erfordert es jedoch, daß
verstärkter lateraler Gentransfer bei E. coli ausschließlich von Änderungen im Lebensstil
abhängig ist und ausdrücklich nicht von der Astlänge.
•
In den Experimenten 10.2 und 10.4 wurde die Summe der HGT-Ereignisse jeweils auf die
Astlänge normiert. Da es Hinweise darauf gibt, daß die Zahl der HGT-Ereignisse nur sehr
schwach von der Astlänge abhängig ist (siehe Abschnitt 10.3.5), bringt dieses Vorgehen
wahrscheinlich keinen Erkenntnisgewinn.
•
Man könnte im Randomisierungsschritt die Lebensstil-Änderungen mit einer zur Astlänge
115
proportionalen Wahrscheinlichkeit neu auf die Äste verteilen. Auf kurzen Ästen fänden dann
weniger Lebensstil-Änderungen statt als auf langen, was das Ergebnis des Tests im
Vergleich zur Ausgangssituation wahrscheinlich deutlich verändern würde. Diese
Handlungsweise fußt aber auf der Annahme, daß in längeren evolutionären Zeiträumen bei
E. coli auch mehr Änderungen im Lebensstil erfolgt sind. Diese neuerliche Normierung auf
die Astlängen bringt möglicherweise keinen zusätzlichen Nutzen, da die Zahl der
Genveränderungen bereits auf die Astlänge normiert worden ist. Die Normierung wurde
vorgenommen, da es möglich ist, daß für Änderungen im Lebensstil und Veränderungen im
Gengehalt eine scheinbare Korrelation beobachtet wird, diese Größen jedoch tatsächlich nur
jede für sich mit der Astlänge korrelieren.
116
11 Ausblick
Es war ein Teilziel dieser Arbeit, robuste Referenzphylogenien für möglichst viele vollständig
sequenzierte Escherichia coli/Shigellen- und Salmonellen-Stämme zu inferieren. Das ist gelungen.
Für 25 Salmonellen wurde eine Phylogenie berechnet, deren Äste durchweg sehr gut statistisch
unterstützt werden. Für 61 von 63 vollständig sequenzierten E. coli wurde erstmalig eine
Phylogenie erzeugt, deren Äste bis auf eine Ausnahme ebenfalls durchweg hohe Konfidenzwerte
aufweisen. Zusätzlich spiegelt sie die für E. coli definierten phylogenetischen Gruppen wider.
Die über Maximum-Likelihood und ein Bayesianisches Modell inferierten SalmonellenPhylogenien sind deckungsgleich, die entsprechenden E. coli-Phylogenien unterscheiden sich nur
durch eine Multifurkation in einem Teilbaum. Phylogenien, die mit anderen Methoden erzeugt
wurden, weisen einen großen symmetrischen Abstand zu den Referenzphylogenien auf. Der Autor
hat das Abstandsmaß ssRF für Bäume implementiert, das eine Fortentwicklung des symmetrischen
Abstands ist. Es attestiert subjektiv als ähnlich wahrgenommenen Bäumen tatsächlich einen kurzen
Abstand, indem es nur signifikante Äste berücksichtigt. Selbst bei Vergleichen mit diesem
Abstandsmaß bleiben die Unterschiede zwischen den Phylogenien teilweise beträchtlich. Bei den
angesprochenen Methoden handelt es sich einerseits um einen Ansatz, der hochkonservierte
Genfamilien benutzt („iTol“), und andererseits um einen Ansatz („Idee von Sergei Maslov“), der
den Prozentsatz rekombinanter Regionen zwischen zwei Genomen als Abstandsmaß benutzt. Mit
ihnen war die Hoffnung verbunden, daß sie noch besser aufgelöste bzw. robustere Bäume liefern
würden, waren sie doch so ausgelegt worden, daß sie unempfindlich gegenüber lateralem
Gentransfer sind. Diese Hoffnung hat sich nicht erfüllt. Die „iTol“-Methode hat für die sehr nah
verwandten E. coli- und Salmonellen-Stämme statistisch schlecht unterstützte Bäume geliefert.
Zwar wurde dazu das von den Urhebern des „iTol“-Baumes veröffentlichte Verfahren nicht völlig
nachgebaut. Der Verfasser ist allerdings der Ansicht, daß dies das Ergebnis nicht beeinflußt hat. Die
von Sergei Maslov vorgeschlagene Methode hat in diesem Sinne nur etwas bessere Bäume
produziert. Es bleibt abzuwarten, ob sich der Bootstrap-Support der „Maslov-Bäume“ insgesamt
verbessert, wenn – wie in der Diskussion zu Kap. 8 vorgeschlagen – die rekombinanten Regionen
zwischen unterschiedlichen Genfamilien nicht mehr in die Abstandsberechnung einfließen.
Hauptgegenstand dieser Arbeit waren zwei In-silico-Analysen, die die inferierten Phylogenien
benutzt haben, um Zusammenhänge zwischen anzestralem Gengehalt und Lebensstil-Änderungen
bzw. der Fähigkeit, essentielle, in der Umwelt vorhandene Nährstoffe zu metabolisieren, zu
untersuchen. Im Rahmen der ersten Analyse gelang es, die Ausgangshypothese zu unterstützen,
nach der Änderungen im Lebensstil von E. coli mit verstärktem lateralen Gentransfer einhergingen.
Dieses Ergebnis deutet die Möglichkeit an, daß Prokaryoten Fähigkeiten, die für das Überleben in
einer neuen Lebensumgebung notwendig sind, durch die Aufnahme geeigneter Gene erwerben.
Im zweiten Experiment wurden mathematisch signifikante Paarungen von Genen und Nährstoffen
identifiziert, von denen eine größere Zahl dem Autor tatsächlich biologisch sinnvoll erscheint,
wenngleich sie nur einen geringen Prozentsatz aller betrachteten Paarungen ausmachen. Als sehr
positiv zu bewerten ist, daß dabei signifikante Paarungen aus Transporter und Nährstoff ermittelt
wurden, die nicht explizit in den Eingangsdaten vorhanden waren. Die entwickelte Methode vermag
es also allem Anschein nach, neue Ergebnisse zu liefern. Der Verfasser hält die Resultate dieses
Experiments insgesamt für vielversprechend, stellen sie doch in Aussicht, daß E. coli und
Salmonellen im Laufe ihrer Evolution Gene nicht mit gleichbleibender Rate horizontal
aufgenommen bzw. abgegeben haben, sondern dann, wenn die jeweiligen Genprodukte tatsächlich
benötigt bzw. nicht mehr benötigt worden sind.
Der Verfasser geht ferner davon aus, daß die von ihm rekonstruierten Referenzphylogenien die
117
wahren Phylogenien von E. coli und Salmonellen hinreichend gut annähern. Beide Analysen sollten
unter Verwendung der mit den anderen Methoden rekonstruierten Phylogenien wiederholt werden.
So kann ausgeschlossen werden, daß etwaige Trends in den Ergebnissen, die robust gegenüber
Perturbationen in der Phylogenie sind, unentdeckt bleiben.
Leider haftet allen Rekonstruktionen von Stammesgeschichten, gleichgültig, ob als Baum oder als
Netz dargestellt, gleichermaßen der Makel fehlender Überprüfbarkeit an. Mit der stetig
anwachsenden Zahl von Computersimulationen, die auf solchen Rekonstruktionen aufbauen, steigt
jedoch auch das Vertrauen in die Rekonstruktionen, wann immer es gelingt, die Ergebnisse in-vivo
zu verifizieren. Würden zukünftige Studien ergeben, daß die Gestalt metabolischer Netzwerke von
Prokaryoten maßgeblich durch lateralen Gentransfer geformt wird, und wird man schließlich die
molekularen Mechanismen kennen, welche die Vorfahren von E. coli und Salmonellen zu
Pathogenen gemacht haben, wäre dies ein entscheidender Schritt für die medizinische und
molekularbiologische Forschung.
118
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Danksagung
Ich danke Prof. Dr. Martin J. Lercher für die Möglichkeit, eine Dissertation an seinem Lehrstuhl zu
verfassen. Wir haben beide nicht damit gerechnet, daß die vorliegende, sehr „biologielastige“ Arbeit
dabei herauskommen würde, enthielt der anfangs erstellte Plan doch sehr viel mehr „angewandte
Informatik“. Im Ergebnis freue ich mich aber darüber, daß ich dadurch die Chance erhalten habe,
hochgradig interdisziplinär zu arbeiten und mir unbekanntes Territorium erforschen zu können.
Die stets kameradschaftliche und immer motivierende Atmosphäre am Lehrstuhl für Bioinformatik
tat ihr übriges, um mich immer wieder zur Fortführung meiner Arbeit anzuspornen. Die erhellenden
Diskussionen mit meinen Kollegen, insbesondere Christian Eßer, Jonathan Fritzemeier und Ulrich
Wittelsbürger, haben mich sehr oft weiter gebracht, wenn ich mich gedanklich oder emotional in
einer Sackgasse befand. Aber auch unsere anderen (ehemaligen und aktuellen) Kollegen haben dazu
beigetragen, daß wir alle immer gern am Lehrstuhl waren – auch außerhalb der Kernarbeitszeit.
Ohne besondere Reihenfolge sind dies Janina Maß, David Heckmann, Deya Alzoubi, Na Gao, Jodie
Napp, Sabine Thuß, Daniel Hartleb, Abdelmonem Desouki, Nina Knipprath, Gabriel GeliusDietrich, Ingo Paulsen, Dominic Mainz, Indra Mainz, Jochen Kohl, Esther Sundermann, Jan
Wolfertz, Bastian Pfeifer, Simone Linz, Michael Roßkopf, Benjamin Braasch, Rafael Dellen, Karim
Benyaa, Trupti Gohel, Anas Amro, Abla Jaber, Kollegen und Freunde von anderen Lehrstühlen,
unter ihnen Ingo Weigelt, Michael Jastram, Jens Bendisposto und Ivaylo Dobrikov, sowie diverse
Bachelor- und Masterarbeits-Studenten, deren Namen mir leider entfallen sind.
Ich danke unserem „guten Geist“ Anja Walge für ihre humorvolle und unkomplizierte Hilfe, mit der
sie uns allen stets beigestanden und uns gegen den bürokratischen Wahnsinn abgeschottet hat. Mein
Dank geht auch an die anderen Sekretärinnen des Instituts für Informatik, die uns immer
unkompliziert geholfen haben: Angela Rennwanz, Sabine Freese, Claudia Kiometzis u. a. Ohne sie
würde der Laden nicht laufen.
Danke sagen möchte ich auch den anderen Professoren am Institut für Informatik. Sie haben es
geschafft, mich durch die Qualität ihrer Lehre immer wieder neu für die verschiedensten Themen
der Informatik zu begeistern.
Ich danke den einschlägigen Produzenten von Kaffeebohnen und Kaffeepulver für den endlosen
Nachschub an koffeinhaltigen Heißgetränken. Ein Leben ohne Kaffee ist möglich, aber sinnlos.
Vor allem danke ich meiner Lebensgefährtin Annika Hoinkes und unserem Sohn Noah für ihre
schier endlose Geduld und ihren Beistand. Wie oft mußten sie auf mich verzichten, als ich wieder
einmal die „jetzt aber wirklich letzte“ Berechnung abschloß. Wie oft habe ich zu Hause für
schlechte Laune gesorgt. Einmal mußten sie sogar ohne mich in den Urlaub fahren!
Besonderer Dank gebührt meinen Eltern. Sie haben mir stets mit Rat und Tat zur Seite gestanden
und mich finanziell unterstützt. Ohne sie wäre ich heute nicht da, wo ich bin.
129
Erklärung
Ich versichere an Eides Statt, daß die Dissertation von mir selbständig und ohne unzulässige fremde
Hilfe unter Beachtung der „Grundsätze zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis an der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf“ erstellt worden ist. Die Dissertation wurde weder in der
vorgelegten noch in ähnlicher Form bei einer anderen Institution eingereicht. Ich habe bisher keine
erfolglosen Promotionsversuche unternommen.
Düsseldorf, den
_______________
(Thomas Laubach)
130
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Thank you for your participation!

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