Agilent ChemStation Informationen zu Ihrer ChemStation

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Agilent ChemStation
Informationen zu Ihrer
ChemStation
s1
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Publikationsnummer
G2070-92113
Ausgabe 04/00
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Dieses Handbuch
bezieht sich auf die
Version A.08.xx der
ChemStation-Software,
wobei xx eine Zahl von
00 bis 99 ist und kleinere
Änderungen der
Software bezeichnet, die
keinen Einfluß auf die
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haben.
Agilent Technologies Deutschland GmbH
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Agilent ChemStation
Informationen zu Ihrer
ChemStation
In diesem Handbuch
In diesem Handbuch werden die verschiedenen Konzepte der ChemStation
beschrieben. Sie können damit einen Einblick in die Funktionsweise Ihrer
ChemStation gewinnen.
Informationen zur Verwendung der ChemStation finden Sie im OnlineHilfesystem sowie im integrierten Tutorial.
4
Inhalt
1 ChemStation Konzepte
Allgemeine Beschreibung 13
ChemStation Hardware 16
Zur ChemStation Software 17
Gerätesteuerung 33
Dokumentation 34
Die Verzeichnisstruktur der ChemStation
36
2 Methoden
Was ist eine Methode? 43
Die Bestandteile einer Methode 44
Der Status von Methoden 46
Erstellen von Methoden 47
Editieren von Methoden 48
Verzeichnisstruktur von Methoden 50
Was geschieht während der Ausführung einer Methode? 51
Zusammenfassung des Methodenablaufs 56
3 Datenerfassung
Was ist Datenerfassung? 59
Datensätze 60
Online-Monitore 62
Logbuch 63
Statusinformationen 64
5
Inhalt
4 Integration
Was ist eine Integration? 69
Was wird bei der Integration durchgeführt? 70
Die Integrationsalgorithmen der ChemStation 71
5 Der Standardintegrationsalgorithmus
Der Standardintegrationsalgorithmus 77
Funktionsweise der Integration 78
Peakerkennung 79
Konstruktion der Basislinie 83
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
Berechnung der Peakfläche 88
Integrationsparameter 91
Tabellen mit Integrationsparametern 98
Integrationsmethoden 99
Autointegration 100
Integration 102
Manuelle Integration 103
84
6 Der neue Integrationsalgorithmus
Der neue Integratoralgorithmus 109
Wie wird der neue Integrator an eine Konfiguration
angepaßt? 110
Funktion des verbesserten Integrators 111
Integrieren von Peaks in der Praxis 115
Mehr über den neuen Integrator 116
Peakerkennung 117
Basislinienbestimmung 123
6
Inhalt
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
Berechnung der Peakfläche 131
Integrationsparameter 134
Tabellen mit Integrationsparametern 139
Anwendung des neuen Integrators 140
Integration 141
Autointegration 142
Manuelle Integration 144
125
7 Peak Identification (Peakerkennung)
Was ist eine Peakidentifizierung? 149
Regeln zur Peakübereinstimmung 150
Möglichkeiten der Peakidentifizierung 151
Absolute Retentions- bzw. Migrationzeit 152
Korrigierte Retentions- bzw. Migrationszeiten 154
Peakqualifier 156
Die Durchführung der Identifizierung 159
8 Quantifizierung
Was ist Quantifizierung? 163
Rechenmethoden in der Quantifizierung 164
Korrekturfaktoren 165
Unkalibrierte Rechenmethoden 167
Kalibrierte Rechenverfahren 168
Berechnungen mit externem Standard (ESTD) 169
Berechnung von Norm% 171
Berechnungen mit internem Standard (ISTD) 172
7
Inhalt
9 Kalibrierung
Definition der Begriffe 179
Kalibriertabelle 180
Kalibrierkurve 181
Unbekannte Proben 183
Kalibrierverfahren 184
Gruppenkalibrierung 191
Peakaddition 192
Rekalibrierung 193
10 Automatisierung
Was ist Automatisierung? 199
Was ist eine Sequenz? 200
Sequenzparameter 201
Sequenztabelle 202
Erstellen einer Sequenz 203
Arbeiten mit Sequenzen 204
Logbuchdatei einer Sequenz 207
Was geschieht während der Ausführung einer Sequenz? 208
Vergabe von Dateinamen in einer Sequenz 209
Aktionen nach der Sequenz 211
Automatische Rekalibrierung 212
Spezifizieren von Rekalibrierungen 213
Sequenztypen 216
Explizite Kalibriersequenzen 217
Zyklische Kalibriersequenzen eines Kalibrierpunkts 218
Zyklische Kalibriersequenzen mit mehrerer Kalibrierpunkte
219
Kombination aus expliziter und zyklischer Kalibrierung 223
8
Inhalt
Umschließende zyklische Kalibriersequenzen (Bracketing)
226
Zyklische Rekalibriersequenzen mit mehreren Probenfläschchen, die dieselbe Standardverdünnung enthalten 230
11 Batch-Review
Was versteht man unter Batch-Review?
Batch-Konfiguration 238
Funktionen für den Review 240
Batch-Reports 241
237
12 Verwendung der ChemStation Reports
Was ist ein Report? 245
Reportergebnisse 246
Quantitative Ergebnisse 248
Reportvorlagen 250
Weitere Parameter für die Reportvorlagen 253
Reportausgabe 254
Sequence Summary Reporting 256
13 Ermittlung der Systemleistung
Bestimmung des Rauschens 265
Berechnung der Peaksymmetrie 268
Formeln und Rechenmethoden zur Beurteilung der
Systemleistung 270
Allgemeine Definitionen 271
9
Inhalt
Definitionen des Leistungstests 272
Definitionen der Reproduzierbarkeit 278
Interner gespeicherter Doppelpräzisions Zahlenzugriff 283
14 Überprüfung des Systems
Überprüfung des Systems 288
Das Register “GLPsave” 291
Die Funktion “DAD Test” 293
10
1
1
ChemStation Konzepte
ChemStation Konzepte
In diesem Kapitel werden die Hauptkomponenten und die wichtigsten
Merkmale der ChemStation beschrieben. Aufgabenspezifische Hilfe zu Ihrer
ChemStation finden Sie in der Online-Hilfe oder dem ChemStation-Tutorial,
das zusammen mit Ihrer Software geliefert wird.
12
ChemStation Konzepte
Allgemeine Beschreibung
Allgemeine Beschreibung
Die ChemStations für GC, LC, LC/MSD, CE und A/D Systeme dienen der
Gerätesteuerung, der Datenaufnahme und der Datenauswertung für
• HP 5890 Gaschromatographen der Serie II und der Agilent 6890 Serie,
• Module und LC-Systeme der Agilent 1100 Serie,
• LC/MSD der Agilent 1100 Serie,
• Flüssigkeitschromatographen der HP 1090 Serie,
• Module für Flüssigkeitschromatographen der HP 1050 Serie,
• Agilent Kapillarelektrophorese-System und
• Agilent 35900C/D/E Zweikanalschnittstellen für A/D-Wandler.
Die Software ist zum Einsatz auf IBM-kompatiblen Personalcomputern unter
der Arbeitsumgebung von Microsoft®Windows NT 4.0 ausgelegt.
Die Software wird als Einzelgeräte ChemStation in fünf Versionen verkauft.
Alle Versionen umfassen die Datenerfassung, Gerätesteuerung,
Datenauswertung (Integration, Quantifizierung und Reporterstellung) sowie
die Automatisierung und Anpassung eines Analysengerätes. Jedes
Gerätemodul hat seinen eigenen Zeitablauf und kann dabei Daten simultan
aus verschiedenen Detektoren aufzeichnen. Die fünf Versionen sind:
• eine Einzelgeräte ChemStation für Gaschromatographiesysteme (GC),
Bestellnummer: G2070AA,
• eine Einzelgeräte ChemStation für Flüssigkeitschromatographie-Systeme
(LC), Bestellnummer G2170AA,
• eine Einzelgeräte ChemStation für Flüssigkeitschromatographie-Systeme
mit massenselektivem Detektor (LC/MSD), Bestellnummer G2710AA,
• eine Einzelgeräte ChemStation für Kapillarelektrophorese-Systeme (CE),
Bestellnummerr G1601A und
• eine Einzelgeräte (A/D) ChemStation für für die Erfassung von
Analogdaten mit externer Gerätesteuerung, Bestellnummer G2072AA.
Die Möglichkeiten zur Gerätesteuerung mit der ChemStation Software
können durch den Erwerb zusätzlicher Gerätemodule erweitert werden. Dies
ermöglicht gemischte Konfigurationen mit mehreren Analysengeräten.
13
ChemStation Konzepte
Allgemeine Beschreibung
Zusätzliche Gerätemodule
Folgende zusätzlichen Gerätemodule stehen zur Verfügung:
• Zusätzliches Modul zur GC-Steuerung und Datenaufnahme,
Bestellnummer G2071AA.
• Zusätzliches Modul zur LC-Steuerung und Datenaufnahme,
Bestellnummer G2171AA,
• Zusätzliches Modul zur LC/MSD-Steuerung und Datenaufnahme,
erweiterbar auf die Datenauswertung, Bestellnummer G2715AA,
• Zusätzliches Modul zur CE-Steuerung, Datenaufnahme und -verarbeitung,
Bestellnummer G2172AA,
• Zusatzmodul zur analogen Datenerfassung, Bestellnummer G2073AA.
Zusätzliche Datenbearbeitungsmodule
Die Möglichkeiten zur Datenbearbeitung mit der ChemStation können durch
den Erwerb zusätzlicher Datenbearbeitungsmodule erweitert werden,
hauptsächlich für Spezialanwendungen:
• Zusätzliches Modul zur Spektrenauswertung des Dioden-Array-Detektors
(DAD), Bestellnummer G2180AA,
• Zusätzliches Datenbankmodul ChemStore zur Organisation von Daten und
Ergebnissen, Bestellnummer G2181AA,
• Zusätzliches Datenbearbeitungsmodul für die Auswertung und Bioanalyse
von LC/MSD-Daten, Bestellnummer G2720AA, nur für die LC/MSD
ChemStation.
An jede ChemStation können bis zu vier chromatographische Geräte
angeschlossen werden. Wenn Geräte mit spektroskopischen Detektoren
(Dioden-Array-Detektoren für LC oder CE) angeschlossen sind, können von
einer ChemStation lediglich zwei Dioden-Array-Detektoren gesteuert
werden; die Anzahl der zu steuernden Geräte verringert sich auf drei. Wenn
die ChemStation für den LC/MSD zur Steuerung eines LC/MSD-Moduls der
Serie 1100 (optional mit einer LC der Serie Agilent 1100 oder HP 1090 Series
II) verwendet wird, kann vom PC kein weiteres Gerät unterstützt werden.
14
ChemStation Konzepte
Allgemeine Beschreibung
Produkte zur Datenauswertung
Es sind auch drei Produkte zur Datenauswertung verfügbar, die ohne
angeschlossene Analysensysteme funktionieren. Sie sind zur
Datenauswertung in Büroumgebungen ausgelegt:
• Die ChemStation für die Datenauswertung, Bestellnummer G2090AA,
verfügt über dieselben Möglichkeiten der Datenauswertung wie die
ChemStations.
• Die ChemStation für LC 3D-Datenauswertung, Bestellnummer G2190AA,
verfügt über eine Diodenarray-Spektrenauswertung und die Möglichkeiten
der ChemStation für die Datenauswertung.
• Die ChemStation für LC/MSD Datenauswertung, Bestellnummer
G2730AA, verfügt über Diodenarray-Spektrenauswertung,
Massenspektrenauswertung sowie die Möglichkeiten der ChemStation für
Datenauswertung.
15
ChemStation Konzepte
ChemStation Hardware
ChemStation Hardware
Nähere Informationen zur ChemStation Hardware finden Sie bei Installieren
Ihrer ChemStation.
16
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Zur ChemStation Software
Betriebssystem
Die ChemStation erfordert entweder Microsoft Windows NT 4.0, erweitert
mit dem Micrsoft Service Pack 3 (SP3) oder das Betriebssystem Windows 95.
Für die Control Charts Funktion der ChemStation benötigt man Microsoft
Excel 97.
Methoden und Sequenzen
Eine analytische Methode ist die vollständige Beschreibung einer speziellen
Trennung. Sie enthält alle Parameter zur Gerätesteuerung, der
Datenerfassung und Auswertung, einschließlich Integration, Quantifizierung
und Reporterstellung. Das System kann so konfiguriert werden, daß es Daten
von verschiedenen Proben mit verschiedenen Methoden aufnimmt. Die
Steuerdatei für eine solche Folge heißt Sequenz und enthält Informationen zu
den einzelnen Proben. Sie greift auf die geeigneten Methoden und die
Angaben zur Rekalibrierung zu. Weitere Informationen zu Methoden und
Sequenzen entnehmen Sie bitte Kapitel10 “Automatisierung” und dem
Online-Hilfesystem.
Systemkonfiguration
Die Konfiguration eines Analysengerätes erfolgt mit Hilfe des
Konfigurationsprogrammes. Es ermöglicht Ihnen die Definition Ihres
Analysengerätes, dessen GPIB- oder LAN-Adressen, die Verzeichnisse zur
Speicherung von Daten, Sequenzen, Methoden und Farbdefinitionen der
ChemStation Software. Weitere Informationen entnehmen Sie bitte dem
Handbuch, das mit Ihren zusätzlichen ChemStation-Modulen mitgeliefert
wurde.
Datenmodell
Das Datensystem der ChemStation basiert auf bestimmten
Speicherstrukturen, die als Register bezeichnet werden. Register sind
zweckmäßige Strukturen, die analystische Daten und Informationen
zweidimensional (z.B. mit Zeit- und Intensitätsachse) und dreidimensional
(z.B. mit Zeit-, Intensitäts, und Wellenlängenachse) ablegen können. Mittels
17
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
verschiedener Befehle und Fuktionen läßt sich die Funktionalität der
ChemStation erweitern.Weitere Informationen entnehmen Sie bitte dem
Macro Programming Guide, der über die Online-Hilfe verfügbar ist.
Gliederung der Software
ChemStation-Software ist in mehrere Hauptmenüs gegliedert. In die
Softwarekonfiguration sind standardmäßig folgende drei Hauptmenüs
eingebunden:
• “Method und Run Control” zur Kontrolle des Geräts und zur
Datenaufnahme,
• “Data Analysis” zum Wiederaufrufen und Auswerten bereits
aufgenommener Daten und
• “Report Layout” zum Erstellen bestimmter Reportvorlagen.
Für weitere Datenauswertungsmodule oder bestimmte
Gerätekonfigurationen, die Fehlerdiagnosen und Geräteüberprüfungen
ermöglichen, gibt es weitere Hauptmenüs. Zudem kann zu der ChemStation
das Hauptmenü "Companion" installiert werden, wenn Gerätebediener
Proben bequem über eine vorgefertigte Tabelle abarbeiten können sollen.
Jedes Hauptmenü besteht aus einer Reihe der standardmäßigen
Anwenderelemente wie Menüs und Symbolleisten. Die voreingestellte
Symbolleiste bietet schnellen Zugriff auf allgemeine Informationen zur
Gerätespezifikation wie Methoden und Sequenzen. Das Hauptmenü “Method
und Run Control” enthält zusätzlich eine Informationszeile über den
Gerätestatus, ein Informationsfeld zur Probe, das sowohl für einzelne als
auch automatisierte Läufe festgelegt werden kann und für GC, LC und
CE-Konfigurierungen eine schematisch dargestellete Geräteschnittstelle.
Über dieses schematisch Benutzerinterface kann man sehr schnell auf die
Geräteparameter zugreifen, wobei ein graphischer Überblick über den Status
jeder folgenden Analyse gegeben wird. Man kann die schematisch
dargestelllte Geräteschnittstelle auch ausschalten, um Arbeitsspeicherplatz
und andere Speicherquellen von Windows zu sparen.
Das Hauptmenü ”Data Analysis” (Datenauswertung) erweitert die
Standardsymbolleiste um bestimmte Datenauswertungsmodi einschließlich
Integration, Kalibrierung, Reporterstellung, Beschriftungsmöglichkeiten,
Signalvergleich und eventuell speziellen weiteren Modi. Jeder dieser
einzelnen Datenauswertungsmodi wird durch ein artspezifisches Symbolset
unterstützt.
18
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Das Hauptmenü “Report Layout” ermöglicht es Ihnen die äußere Form einer
bestimmten Reportart bezogen auf die Objekte graphisch festzulegen. Auch
dieses Hauptmenü enthält eine Symbolleiste, die speziell für diese Aufgaben
ausgelegt ist.
Datenerfassung
Der Status der Analysengeräte wird kontinuierlich verfolgt und auf dem
Bildschirm zusammen mit der abgelaufenen Analysenzeit angegeben, wenn
die ChemStation als sichtbares Fenster oder als Symbol ausgeführt wird. Alle
Ereignisse aus einem Analysenlauf, einschließlich aller Fehlermeldungen und
der Bedingungen der Analysengeräte bei Start und Ende des Laufes, werden
in einem Logbuch des Systems abgelegt, ein Auszug wird in jedem Datensatz
gespeichert.
Gerätebedingungen wie Flußrate, Temperatur, Druck und die
Lösungsmittelzusammensetzung von LC-Systemen können aufgezeichnet
und in jedem Datensatz gespeichert werden. Diese Bedingungen können
angezeigt und als Beleg der Analysenqualität ausgedruckt werden. Genaue
Einzelheiten der gespeicherten Parameter hängen von der Methode und den
Möglichkeiten des gewählten Analysengerätes ab.
Ein weiteres Darstellungsfenster kann dazu verwendet werden, die vom
Gerät aufgenommen Daten in einer Echzeit-Anzeige anzugeben. Die Daten
werden in ihrer tatsächlichen Meßeinheit wie mAU, Volt oder bar angegeben.
Jedes der Fenster kann meherere übereinander gelegte
Chromatographiesignale oder Geräteparameter, wie z.B. den Druck
enthalten. Die Voreinstellung der Anzeige kann angepaßt werden und wird
vom System gespeichert, so daß der Anwender eine eigene bevorzugte
Einstellung als Standardeinstellung für das Gerät festsetzen kann. Das
Fenster ist zoomfähig und mit Hilfe des Cursors kann der Wert für ein
bestimmtes Signal zu jeder Zeit der Messung abgerufen werden.
Die gesamte Funktionalität der ChemStation kann auch während laufender
Analysen durch eine Offline-Session genutzt werden.
Für Anwender, die mit der Datenauswertung beginnen wollen, bevor die
Datenerfassung abgeschlossen ist, steht der Snapshot-Befehl zur Verfügung.
Die Layouts der Signal- und Statusinformations-Fenster, einschließlich der
Bestandteile der schematisch dargestelllten Geräteschnittstelle, werden
automatisch gespeichert.
Weitere Informationen zur Datenaufnahme entnehmen Sie bitte Kapitel3
“Datenerfassung” und dem Online-Hilfesystem.
19
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Datenauswertung — Darstellung
Die Ansicht von “Data Analysis” (Datenauswertung) enthält die
Standardsymbolleiste, um aufgabenorientierte Funktionen zur
Datenauswertung, einschließlich der Symbole für Integration, Kalibrierung,
Reporterstellung, Beschriftungsmöglichkeiten und Signalvergleich
auszuführen. Im folgenden sind die wichtigsten Graphikfunktionen
aufgeführt:
• Darstellungen im Einzel- oder Mehrfachsignalmodus, wählbar beim Laden
des Chromatogramms;
• Überlagern von Chromatogrammen verschiedener Proben;
• Abziehen eines Chromatogramms von einem anderen;
• graphische Anpassung der Signale in vertikaler und horizontaler Richtung,
um den visuellen Vergleich zu vereinfachen;
• Signalumkehr oder -spiegelung, um den visuellen Vergleich zu
vereinfachen;
• graphische Funktionen zum Zoomen oder Verschieben;
• Festlegung der Darstellungsmerkmale, wie z.B. der Auswahl von
Markierungen, Basislinien, Achsen, Retentionszeiten und Substanznamen
(der Anwender kann auch die Schriftart der Retentionszeit und der
Substanznamen festlegen, die Größe und Ausrichtung der Darstellung
bestimmen, auswählen, ob die Darstellung überlagert oder getrennt
erfolgen soll und die Skalierungsfaktoren festsetzen);
• die Darstellung des Chromatogramms kann, je nach den Möglichkeiten des
angeschlossenen Gerätes, auch mit Verläufen der Geräteparameter
überlagert sein;
• Anmerkungen können vom Anwender definiert und in die Darstellung
eingefügt werden, wobei die Schriftart und -größe sowie die Ausrichtung
und Farbe wählbar sind (eine einmal definierte Anmerkung kann
graphisch verschoben, editiert oder gelöscht werden);
• Kopieren der Darstellung in die Windows Zwischenablage als Metafile
oder im Bitmap-Format,
• eine pick mode -Funktion ermöglicht die Ausgabe von Werten für einzelne
Datenpunkte in Detektoreinheiten;
• Export von digitalisierten Werten in die Windows Zwischenablage.
20
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Datenauswertung — Integration
Die ChemStation enthält zwei Integrationsalgorithmen. Der traditionelle
Integrationsalgorithmus war Bestandteil der früheren Versionen der
ChemStation und befindet sich in den meisten anderen
Auswertesoftware-Paketen für analytische Daten von Agilent Technologies.
Der neue Integrationsalgorithmus zielt auf bessere Robustheit,
Zuverlässigkeit und Anwenderfreundlichkeit ab. Für diese Softwareversion
empfehlen wir den Einsatz des traditionellen Algorithmus für bereits
vorhandene validierte Methoden und des neuen Algorithmus für neue
Methoden.
Allgemeine Integrationsmöglichkeiten
Die wichtigsten Möglichkeiten beider Integrationsalgorithmen sind folgende:
• eine Autointegrationsfunktion zur Einstellung anfänglicher
Integrationsparameter;
• die Fähigkeit, für jedes Chromatographiesignal eine eigene Tabelle mit
Integrationsparametern festzulegen, wenn mehrere Signale oder mehr als
ein Detektor verwendet werden;
• die interaktive Festlegung von Integrationsparametern, die es dem
Anwender ermöglichen, die Zeiten für die Ereignisse graphisch zu
bestimmen;
• manuelle oder “Rubber Band” Integration für Chromatogramme oder
Elektropherogramme, die eine spezielle Interpretation erfordern (diese
Parameter können auch in die Methode integriert und somit automatisch
aufgerufen werden);
• Darstellung und Ausdruck von Integrationsergebnissen und
• die Fähigkeit mindestens 1000 Peaks pro Chromatogramm zu integrieren.
Beide Integrationsalgorithmen enthalten folgende Befehlsgruppen:
• Definitionen für Integrationsparameter, um die Grundeinstellungen für
den Integrator, Area Rejection, Peak Width und Threshold (als Parameter
für die Rauschunterdrückung), festzusetzen oder zu verändern;
• Parameter zur Kontrolle der Basislinie wie “force baseline” (Basislinie
erzwingen), “hold baseline” (Basislinie halten), “baseline at all valleys”
(Basislinie zu jedem Tal), “baseline at the next valley” (Basislinie beim
nächsten Tal), “fit baseline backwards from the end of the current peak”
(rückwärtige Anpassung der Basislinie vom Ende des aktuellen Peaks);
21
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
• Kontrolle der Flächenaddition;
• negative Peakerkennung,
• Abtastprozesse einschließlich Befehlen zur Festlegung des
Lösungsmittelpeaks und
• Befehle zur Integratorsteuerung, die Retentionszeitbereiche festlegen, in
denen der Integrator wirksam ist.
Der neue Integrationsalgorithmus
Der neue Integrationsalgorithmus bietet Verbesserungen bezüglich:
• Basislinienzuweisungen für Peaks bei Chromatogrammen und
Elektropherogrammen mit driftender Basislinie;
• Erkennung “negativer Flächen” bei tangential angepassten Peaks; das
Problem wird über eine Änderung des Basislinienverlaufes beseitigt,
• optionale Messung und Berechnung von Flächen, die zwischen der
Basislinie und dem Signal auftreten und keinem bekannten Peak
zugewiesen werden können,
• zusätzliche Anfangsparameter zum Ausschluß von Peaks, die durch
Rauschen entstanden sind (anfängliche Peakhöhe),
• bessere Peakerkennung bei verrauschten Signalen,
• Schultererkennung bei Peaks durch Verwendung der zweiten Ableitung
oder des zweiten Grades bei Kurvenberechnungen und
• Anwenderfreundlichkeit — der neue Integrationsalgorithmus ist auf der
Benutzeroberfläche über Symbolleisten und auch über
Tastenkombinationen zugänglich.
Datenauswertung — Quantifizierung
Der Kalibriermodus innerhalb der Datenauswertung der ChemStation
ermöglicht die gleichzeitige Darstellung von:
• einem oder mehreren Signalen, bei deren Auswertung auf das
Retentionszeitfenster der aktuellen Substanz hingewiesen wurde;
• der Kalibriertabelle, deren Darstellung aus einer umfassenden Auswahl
von Kalibrierparametern festgelegt werden kann und
• der Kalibrierkurve für die zu bestimmende Substanz.
22
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Alle Fenster des Kalibriermodus’ sind miteinander verbunden, so daß
Veränderungen, die in einem Fenster vorgenommen werden, auf alle anderen
übertragen werden. Der Modus ermöglicht die graphische Auswahl und
Veränderung der Kalibrierdaten.
Die Quantifizierung erfolgt als Berechnung von %-Werten, normierten
%-Werten, bezüglich externem Standard, externen Standard %, internem
Standard und internen Standard % für Peakfläche oder Peakhöhe. Sie kann
Mehrpunktkalibrierungen und mehrfache Definitionen eines internen
Standards umfassen. Veränderungen der Kalibrierung (Histories) werden
automatisch gespeichert und zur Gewichtung von Berechnungen mit
Rekalibrierungen verwendet.
Weitere Informationen zur Kalibrierung und Quantifizierung finden Sie in
Kapitel1 “ChemStation Konzepte” und Kapitel9 “Kalibrierung”.
Datenauswertung — Standardreports
Anwender-definierbare Reportvorlagen für die Analysenberichte sind auf
dem Bildschirm Report Specification wählbar. Jede Standard Reportvorlage
umfaßt standardisierte Informationsgruppen und eine Reihe optionaler
Informationsgruppen.
Weitere Informationen über verfügbare Reportvorlagen finden Sie in
Kapitel12 “Verwendung der ChemStation Reports”.
Datenauswertung — Spezielle Reports
Umfassendere Reportmöglichkeiten stehen in der ChemStation für
Anwendungen zur Verfügung, die spezielle Reports erfordern. Sie umfassen
die statistische Auswertung der Trennleistung, Trendanalysen sowie
Anwender-definierbare Reportvorlagen.
Reports zur Systemeignung
Reports zur Systemeignung ermöglichen dem Anwender, die Systemleistung
für einzelne Analysen zu überprüfen. Hierfür stehen drei Reportvorlagen zur
Verfügung.
Der StandardPerformance Reportdruckt folgende Parameter für
unkalibrierte Methoden aus:
• Retentionszeit,
• k’,
23
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
• Peakfläche,
• Peakhöhe
• Symmetrie,
• Halbwertbreite der Peaks,
• Effizienz als Anzahl der theoretischen Trennstufen,
• Auflösung und
• Selektivität.
Bei Methoden mit Kalibrierungen werden die Spalten für Peakfläche,
Peakhöhe und Selektivität durch den Substanznamen und Gehalt ersetzt.
Die Kopfzeile für den Report enthält die Standardkopf- und -fußzeile, die
Probeninformation, die Parameter zur Trennsäule und optional eine
Abbildung des Chromatogramms.
Die Reportvorlage Performance and Noise style fügt zum Performance
Report eine Bewertung des Signalrauschens in bis zu sieben
anwenderdefinierten Bereichen hinzu. Die Angabe des Rauschens erfolgt mit
Signal-zu-Rausch-Verhältnissen für jeden Peak oder jede kalibrierte
Komponente und einer Rauschtabelle für jedes Signal. Jede Rauschtabelle
enthält Werte aus der sechsfachen Standardabweichung des Rauschens, dem
Peak-zu-Peak Abstand nach ASTM-Berechnungen sowie Angaben zu
Abweichungen und Drift.
Die Reportvorlage Extended Performance zeigt von jedem einzelnen Peak
eine Darstellung, in der graphisch der Peakstart, das Peakende, die
Halbwertbreiten und die Basislinie eingetragen sind. Zusätzlich werden
folgende Parameter angegeben:
• Fläche, Höhe und berechnete Substanzmenge,
• Verzerrung (Skew),
• Überschuß (Excess),
• Tailingfaktor nach der USP-Methode,
• Zeitintervall zwischen den Datenpunkten und Anzahl der Datenpunkte im
Peak,
• Die Statistischen Momente M0 bis M4,
• Peakbreite in halber Höhe: wahrer Wert, Berechnung mit fünf Sigma-,
Tangenten- und Tailingmethode
24
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
• Anzahl theoretischer Trennböden pro Säule und pro Meter, berechnet mit
der Halbwertbreite des Peaks, fünf Sigma-, Tangenten- und statistischen
Methode.
Anwender können eigene Bereiche zur Berechnung der Rauschhöhe und
eigene Akzeptanzkriterien angeben. Werte außerhalb des
Anwender-definierten Akzeptanzbereiches werden im Report markiert.
Weitere Informationen zur Berechnung der Systemeignung entnehmen Sie
bitte Kapitel13 “Ermittlung der Systemleistung”.
Zusammenfassende Reports einer Sequenz (Sequence Summary
Reports)
Zusammenfassende Reports werden am Ende einer automatischen
Analysensequenz erstellt. Es stehen verschiedene Möglichkeiten, von einer
kurzen Zusammenfassung der gemessenen Proben bis zur genauen
graphischen Auswertung von Reproduzierbarkeit oder Trendanalysen nach
Benutzervorgaben zur Verfügung. Diese Reports werden aus folgenden neun
Informationsquellen zusammengestellt:
• Titelseite mit Informationen nach Anwendervorgaben,
• Gerätekonfiguration mit Revisionsnummern und Angaben zur
analytischen Säule für LC- und CE Systeme,
• eine Liste der Proben (Sequenz),
• ein Ausdruck des Logbuches mit Angaben zu den Proben und
Dokumentationen zur Datenerfassung und -auswertung sowie
unerwarteten Ereignissen,
• ein Ausdruck der analytischen Methoden,
• Reports zu den einzelnen Proben,
• Statistische Angaben zu kalibrierten Proben,
• Statistische Angaben zu den Proben unbekannten Gehaltes und
• Eine Zusammenfassung, die entweder aus einer Zusammenfassung der
Proben (eine Zeile Information je Probe) oder als kurze Substanztabelle in
Ergänzung der Probenzusammenfassung ausgegeben wird.
Weitere Informationen zu “Sequence Summary Reporting” entnehmen Sie
bitte der Online-Hilfe und dem Abschnitt “Sequence Summary Reporting” auf
Seite 256.
25
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Report Layout
Im Menü zur Erstellung angepaßter Reports der ChemStation können
Anwender den genauen Inhalt Ihrer eigenen Reports festlegen. Sie können
Reportvorlagen graphisch gestalten, darin allgemeine Informationen zu den
Proben, den Signalen, die Integration und die quantitativen analytischen
Ergebnisse aufnehmen. Sie können eigene Gestaltungselemente wie Texte,
Tabellen und Graphiken aufnehmen und die Informationen graphisch in
Abschnitte gliedern sowie die Relativpositionen und Ausrichtung aller
Elemente graphisch festlegen. Eigene Abschnitte können hinzugefügt,
gelöscht, sortiert oder verschachtelt werden.
Anwender können eigene Kopf- und Fußzeilen für alle Seiten definieren und
Datumseinträge sowie Seitenzahlen für beliebige Seiten im gewünschten
Format festlegen. Informationen zur Aufnahme in den Report können alle
Parameter der ChemStation oder alle Benutzer-definierten Parameter sein.
Ein Reportdesign kann mit jeder Methode verbunden werden und zum
Standardformat für einen bestimmten Analysentyp werden.
Angepaßte Reports können über den Bildschirm, den Drucker oder auf eine
Datei ausgegeben werden. Reports auf dem Bildschirm enthalten auch
Graphiken.
Weitere Informationen zu Reportformatierungen finden Sie in der
Online-Hilfe.
Control Chart Reports
In der ChemStation Software ist die Funktion "Control Chart" enthalten.
Sobald diese Funktion installiert und angewählt ist, kann der Anwender beim
Ausführen der Methode automatisch einen bestimmten Substanzparameter
verfolgen. Als Parameter kommen dabei in Frage: Menge, Responsefaktor,
Retentionszeit und Fläche.
Weitere Informationen zu den Control Chart Reports finden Sie in der
Online-Hilfe.
Möglichkeiten und Kompatibilitäten
Allgemein
Die ChemStation kann Datendateien in das ANDI (Analytical Data
Interchange) Chromatographieformat der Analytical Instrument Association
(AIA), Version 1.0, Copyright 1992 importieren und daraus exportieren. Der
Datenimport wird durch den Compliance-Level eins (Probeninformation und
26
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Signaldaten) unterstützt und der Datenexport duch den Compliance-Level
zwei (Probeninformation, Signaldaten und Intgrationsergebnisse).
Die ChemStation enthält Befehle und Funktionen, mit denen der dynamische
Datenaustausch (DDE) auf der Ebene von Microsoft Windows sowohl als
DDE-Empfänger als auch als DDE-Verteiler durchgeführt werden kann. Die
Befehlsreihe enthält Befehle zum Verbinden und Trennen, zum beidseitigen
Austausch von Informationen sowie zum ferngesteuerten Ausführen von
Funktionen.
Die ChemStation enthält Befehle und Funktionen, mit denen der Open
Database Connectivity (ODBC) Standard von Microsoft genützt werden
kann. Der ODBC Standard wird über den Erweiterungslevel eins unterstützt.
Weitere Informationen befinden sich in den Spezifikationen für das Produkt
Agilent ChemStore.
ChemStations für LC und CE
Methoden, Datendateien, Spektrenbibliotheken und Sequenzen aus früheren
Versionen der ChemStations für LC, einschließlich der Versionen A.01.00 bis
A.04.02, sind mit der ChemStation Software kompatibel.
Die ChemStation-Software enthält Möglichkeiten zur Umwandlung von
Dateien mit Flüssigkeitschromatographiedaten und Spektrenbibliotheken für
die LC ChemStation (Pascal Series). Diese können auch automatisch durch
das Anwenden von Makros (siehe den Abschnitt “Weitgehende Anpassung”)
ablaufen, um Chromatographiedaten in das neue ChemStation Format für LC
umzuwandeln. Beachten Sie jedoch, daß die Umwandlungsroutine nur von
Windows 95 untersützt wird.
Der Datentransfer zwischen der Pascal- und der DOS-Umgebung kann über
3.5-Zoll Disketten, serielle Verbindungen oder lokale Netzwerke durchgeführt
werden.
HP 3365 ChemStations
Methoden, Datendateien und Sequenzen aus der Reihe der HP 3365
ChemStation (DOS Series) müssen über geeignete, in der ChemStation
installierte Importfunktionen umgewandelt werden. Nach der Umwandlung
sind sowohl die Methoden als auch die Datendateien mit der ChemStation
kompatibel. Importierte Sequenzen können lediglich zum wiederholten
Berechnen der Datendateien verwendet werden.
27
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Weitgehende Anpassung
Die ChemStation kann mit Hilfe des umfangreichen Befehlssatzes angepasst
werden. Die enthaltenen Befehle können zu automatischen Funktionen
kombiniert werden. Eine solche Kombination von Befehlen heißt Makro.
Anwender können zur Erstellung von Makros eigene Variablen definieren,
Verzweigungen und Schleifen sowie Ein-/Ausgabeoperationen festlegen.
Diese umfassen Dateioperationen, Interaktionen mit dem Anwender, eigene
verschachtelte Makros und Datenabgleich und Austausch mit anderen
MS-DOS oder Windows-Anwendungen.
Für weitere Informationen zur weitgehenden Anpassung schlagen Sie bitte
im Macro Programming Guide nach, der über die Online-Hilfe verfügbar ist.
Die ChemStation unterstützt das Microsoft ODBC-Protokoll mit Befehlen, um
Verbindungen zu Datenbanken herzustellen und wieder zu trennen, den
Status einer bestimmten Verbindung abzulesen und die Structured Query
Language (SQL) auszuführen.
Automatisierung
Die ChemStation kann Sequenzen ausführen, die mehrere Methoden
beinhalten.
Im Parametersatz einer Sequenz kann die Verwendung automatisch erzeugter
Dateien oder von sequentiell numerierten Dateien mit einem Prefix nach
Benutzervorgaben von 7 Zeichen Länge eingestellt werden. Der Anwender
kann vollständige Sequenzen wählen oder solche, die nur die
Datenauswertung durchführen. Weiter kann unter mehreren
Abschlußbefehlen oder einem Anwender-definierten Abschlußmakro
gewählt werden, das dann ausgeführt wird, wenn eine Sequenz durch eine
Fehlerbedingung beendet wird oder alle Analysen durchgeführt wurden.
Die Sequenztabelle mit den auszuführenden Analysen wird ähnlich einer
Tabellenkalkulation bedient. Hier können die Nummern von
Probenfläschchen, Probennamen, Analysenmethoden, Parameter zur
quantitativen Auswertung mit Angaben zur gefundenen Menge, ein
Multiplikations- oder Verdünnungsfaktor, Angaben zur Kalibrierung sowie die
Zahl der Injektionswiederholungen festgelegt werden. Es ist möglich,
zwischen den Zellen der Tabelle zu springen und dabei deren Inhalte oder
ganze Reihen oder mehrere ganze Reihen zu kopieren, auszuschneiden oder
einzusetzen. Damit können Sequenzen leicht und schnell erstellt werden.
28
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Proben können in der Sequenztabelle als Unbekannte, Standard oder
Kontrolle festgelegt werden. Der Probentyp bestimmt, ob die Probe einer
speziellen Datenauswertung unterzogen wird:
• unbekannte Proben werden entsprechend der Methodenspezifikationen
ausgewertet und als Report abgelegt;
• Standards werden dazu verwendet, die Substanzen zur Quantifizierung der
Methode wie unten beschrieben neu zu kalibrieren;
• Kontrollen werden bezogen auf den in der Methode festgelegten
Grenzwert für eine Substanz ausgewertet. Wenn das Ergebnis außerhalb
eines bestimmten Bereiches liegt, wird die Sequenz angehalten.
Kalibrierungsstandards können als einfach, zyklisch oder umschließend
definiert werden. Einfache Rekalibrierung bedeutet, daß eine Rekalibrierung
immer dann durchgeführt wird, wenn ein Kalibrierungsstandard in der
Sequenz vorkommt. Zyklische Rekalibrierungen werden während einer
Analysenserie in festgelegten Intervallen durchgeführt. Bei der
umschließenden Rekalibrierung wird je ein Standard vor und einer nach
einer Reihe unbekannter Proben gemessen. Zur quantitativen Auswertung
der unbekannten Proben wird eine Kalibriertabelle aus den Mittelwerten der
beiden Kalibrierungen verwendet.
Die Funktion für Teilsequenzen erlaubt einen Einblick in die Reihenfolge der
Sequenzbearbeitung und stellt eine Wiederholungsmöglichkeit zur
Vermessung oder Nachbearbeitung einzelner Proben zur Verfügung. Bei der
wiederholten Auswertung kann für die Quantifizierung zwischen den
Originaldaten oder neuen Einträgen der Probentabelle gewählt werden.
Sequenzen können zur schnellen Vermessung von Vorzugsproben
unterbrochen werden. Danach kann die Sequenz ohne eine Beeinflussung
des automatischen Ablaufs fortgesetzt werden. Proben können zu einer
Sequenztabelle hinzugefügt werden, während die Sequenz bearbeitet wird.
Sowohl die Sequenz als auch die Teilsequenz können ausgedruckt werden.
Weitere Informationen zu Sequenzen entnehmen Sie bitte Kapitel10
“Automatisierung” und dem Online-Hilfesystem.
Gute Laborpraxis (Good Laboratory Practice, GLP)
Die ChemStation wurde gemäß internationaler Konzeptions- und
Design-Richtlinien entwickelt und verfügt über eine Reihe von Merkmalen,
die den Betrieb unter behördlicher Kontrolle erleichtern. Diese Merkmale
beziehen sich auf die umfassende Spezifikation und Überprüfung von
29
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Methoden hinsichtlich ihrer Eignung für ein Meßvorhaben, auf die
Funktionskontrolle im System und stellen die Nachvollziehbarkeit, Herkunft
und Qualität der Daten sicher.
Entwicklungsprozeß
• Ein Zertifikat zur Validierung wird mit jedem Softwarepaket geliefert und
dokumentiert die Schritte der Softwareentwicklung und Erprobung als
Teil des Entwicklungsprozesses. Der Entwicklungsprozeß entspricht der
Qualitätsnorm ISO 9001. Er ist zusammen mit den Protokollen zur
Revalidierung im Validation Binder der ChemStation für LC
dokumentiert.
Spezifikation und Anwendung von Methoden
• Globale Methoden — alle Spezifikationen für Analysengeräte und zur
Datenauswertung werden an einem Ort gespeichert. Methoden beinhalten
Spezifikationen des Mengenbereiches von Komponenten. Hierdurch wird
sichergestellt, daß Mengenangaben nicht außerhalb des
Kalibrierungsbereiches erfolgen.
• Das Logbuch über Änderungen der Methode (History) ermöglicht es den
Anwendern einer validierten Methode, automatisch zu dokumentieren wie
und wann die Methode verändert wurde. Anwender können optional eine
Begründung für die Veränderung der Methode mit ins History-Logbuch
eintragen. Das History-Logbuch wird automatisch als Teil der Methode im
Binärformat abgelegt. Um einen unerlaubten Eingriff in die
Dokumentationen zu verhindern, wird es entsprechend des Schemas zur
Anmeldung eines Anwenders, wie unten beschrieben, geschützt. Jede
Veränderung im History-Logbuch kann auf dem Bildschirm angesehen und
ausgedruckt werden.
• In jeder Methode können für eine Reihe von Chromatographie- und
Geräteleistungsparametern Grenzwerte auf der Basis von einzelnen
Substanzen festgelegt werden. Eine genauere Beschreibung hierzu
befindet sich im Abschnitt “Datenauswertung - Quantifizierung”.
Ergebnisse, die diese Parameterbereiche überschreiten, werden dazu
verwendet, die Durchführung automatischer Sequenzen,wie unter
“Automatisierung” beschrieben, zu kontrollieren. Sie werden auf dem
entsprechenden Analysenreport vermerkt.
• Reports zur Systemeignung und Systemleistung (siehe den Abschnitt zur
Reporterstellung oben) liefern genaue Daten zur Trennleistung.
30
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Die ChemStation kann mit Zugangsbeschränkungen auf zwei Ebenen, einer
Bediener- und einer Managerebene konfiguriert werden. Die Manager-Ebene
kann durch ein Passwort geschützt werden und ermöglicht den Zugriff auf
alle Funktionen der ChemStation. Die Bedienerebene ist auf die Nutzung
einer Grundfunktionalität und die Ausführung definierter analytischer
Methoden beschränkt. Die Bedienerebene ist zum Einsatz in Routinelabors
gedacht und hindert Bediener insbesondere daran, Methoden zu verändern
oder neu zu erstellen.
Stabilität von Methoden
• Zusammenfassende Reports von Sequenzen (vgl.
“Datenauswertung — Spezielle Reports” auf Seite 23) bieten die
Möglichkeit, Methoden auf Stabilität zu testen. Erweiterte Reportformate
mit Anwender-definierbaren Kriterien werden als Trendgraphiken
ausgegeben und können zur Beurteilung der realistischen Betriebsgrenzen
dienen. Die Betriebsgrenzen können in eine Methode aufgenommen
werden, wodurch zusammen mit Kontrollproben sichergestellt wird, daß
die Methode innerhalb dieser Grenzen arbeitet.
Systembetrieb
• Das Verification Kit der ChemStation ist ein Teil der Standardsoftware und
überprüft automatisch auf korrekte Installation und Funktion der
Datenauswertung der Software, indem bekannte Ergebnisse mit einer
Testauswertung verglichen werden. Das Verification Kit ermöglicht die
Definition eigener Datensätze und Methoden zur Durchführung des Tests.
Nachvollziehbarkeit, Herkunft und Qualität der Daten
Das Logbuch liefert ein Protokoll über das komplette System. Es speichert
alle unerwarteten Ereignisse (Fehler, Parameterveränderungen während der
Analyse) sowie die Gerätebedingungen vor und nach jeder Analyse. Eine
Kopie des relevanten Logbuchauszuges wird mit jedem Datensatz
gespeichert.
Die aktuellen Gerätebedingungen, wie zum Beispiel Druck, Flußrate und
Temperatur während einer Analyse werden ebenfalls gespeichert, falls das
entsprechende Gerät diese Möglichkeit bietet. Diese Daten können später mit
dem Chromatogramm graphisch dargestellt werden, um den Gerätezustand
während dieser Analyse zu zeigen und in den Report aufzunehmen.
Mit den Datensätzen werden Kopien der verwendeten Methode gespeichert,
womit eine vollständige Reproduzierbarkeit der Daten zu einem späteren
31
ChemStation Konzepte
Zur ChemStation Software
Zeitpunkt möglich ist. Die Methode wird nach Abschluß aller analytischer
Schritte gespeichert.
Alle Reports tragen Datumseinträge und eine nachvollziehbare
Seitennummerierung (Seite x von y). Der Anwender kann einen
Reportumfang von einer einfachen Zusammenfassung bis zur Darstellung
aller Gerätedetails wählen (vgl. Abschnitt zu Reports oben).
GLP Registerdateien, die als Teil einer Methode definiert werden, sichern alle
Originaldaten mit Probeninformation, die Datenauswertemethode, die
chromatographischen Meßwerte, die Geräteeinstellungen, die Ergebnisse
aus Integration und Quantifizierung, die Daten des Reports und das Logbuch
des Analysenlaufes in einer binären Registerdatei mit einem
Prüfsummenschutz. Dieses Binärformat kann nicht editiert werden und
sichert daher die Originalität der Ergebnisse.Die Datei enthält ein
Revisionsschema, welches anzeigt, wenn die Daten erneut bearbeitet
werden.
In der Sequenztabelle können Kontrollen definiert und dazu verwendet
werden, die Leistungsfähigkeit des Gerätes über einen Vergleich zu den
Ergebnissen der Kontrollproben automatisch zu überprüfen, wenn das Gerät
unbeobachtet läuft. Ergebnisse, die außerhalb eines vom Anwender
festgelegten Akzeptanzbereiches liegen, führen zum Abruch der
automatischen Abarbeitung von Sequenzen durch das Gerät.
32
ChemStation Konzepte
Gerätesteuerung
Gerätesteuerung
Die Möglichkeiten der Gerätesteuerung mit der ChemStation können durch
den Erwerb zusätzlicher Gerätemodule zu einer Mehrgeräte- Konfiguration
erweitert werden. Weitere Informationen finden Sie in den
Gerätehandbüchern der zusätzlichen ChemStation Module.
Einsatz von Netzwerken
Die ChemStation wurde erfolgreich auf die Kompatibilität mit der
LanManager Software, der Novell NetWare sowie Microsoft Windows 95 und
Microsoft Windows NT-Produkten, die auf IEEE 802.3 CSMA/CD
Spezifikationen basieren, getestet. Sie sollte mit jeder Netzwerk-Software
kompatibel sein, die dem Programmierstandard von Microsoft Windows
entspricht.
Diese Produkte ermöglichen es der ChemStation physikalisch vorhandene
Geräte, wie Plotter und Drucker und Informationen, wie Daten- oder
Methodendateien mit anderen Laboratorien und deren Computern zu teilen.
Client/Server
Die ChemStation Software kann auf einem geeigneten Netzwerkserver
installiert und nach Bedarf auf einen damit verbundenen PC geladen werden.
Die spezielle Konfigurierung jedes angebundenen PCs gewährleistet eine
angemessene Umgebung für verschiedenen Techniken und einzelne
Anwender. Die zentralisierte Installation der Software löst das Problem, viele
Kopien derselben ChemStation innerhalb einer Abteilung zu verwalten.
Gerätesteuerung über LAN
Die ChemStation Software ermöglicht die Gerätesteuerung über LAN und die
Datenaufnahme für Agilent 6890 Gaschromatographen, Agilent 35900E A/D
Steuermodule und Flüssigkeitschromatographen der Agilent 1100 Serie.
Geräte können leicht eingebunden werden, indem man sie an ein LAN
anschließt, an dem auch der ChemStation PC angeschlossen ist. Diese
Anordnung ermöglicht es, den ChemStation PC von den Geräten, die er
ansteuert örtlich zu trennnen.
33
ChemStation Konzepte
Dokumentation
Dokumentation
Die Dokumentation enthält bestimmte Abschnitte über:
• die Installation und das Erlernen der ChemStation Software,
• das Anwenden der ChemStation Software,
• das Verstehen der Arbeitsprinzipien der Software und
• die Anpassung der ChemStation.
Installation und Erlernen
Jede ChemStation Software wird mit einem Installationshandbuch geliefert,
das Details über die wichtigsten Punkte der PC Hardware- und
Softwareanforderungen, den Einbau der Schnittstelle, die Installation der
ChemStation und die Voraussetzungen für die Installation enthält. Das
Installationshandbuch ist spezifisch für die gekaufte Konfiguration und kann
Anweisungen zu Troubleshooting, Systemdokumentationen und
Instandhaltung des Systems beinhalten.
Jede ChemStation enthält ein aufgabenorientiertes Tutorial, das in die
Software integriert werden kann. Das Tutorial ist in erster Linie eine
Lernhilfe und so ausgelegt, daß der Anwender selbständig die notwendigen
Anwendungen erlernen kann. Jede analytische Aufgabe ist in eine Anzahl
leicht verständlicher Schritte unterteilt, die der Anwender automatsch von
der Software ausführen lassen und anschließend selbst üben kann.
Anwenden der Software
Zwei zusätzliche Kategorien von Online-Informationen wurden für den
Routineanwender entworfen.
Die ChemStation enthält eine verständliche, an den Kontext anlehnende,
katalogisierte Online-Hilfe im Windowsformat. Sie liefert zu jeder
Bildschirmdarstellung und zur Bedeutung der wichtigsten darauf enthaltenen
Parameter detaillierte Erklärungen. Die Erklärungen werden, wenn nötig,
durch Graphiken ergänzt und können in die Windows-Zwischenablage
kopiert werden. Von dort können sie in Anwenderdokumentationen
eingebunden oder ausgedruckt werden.
Der Abschnitt “How to” (Wie man ...) der Online-Hilfe enthält Checklisten
über die technikorientierten und die chromatographischen Aufgaben. Sie
34
ChemStation Konzepte
Dokumentation
helfen dem weniger routinierten Anwender, das System richtig einzurichten.
Diese Checklisten sind direkt mit den detaillierten Informationen der
Online-Hilfe verbunden.
Verstehehen der Prinzipien
Das Handbuch ChemStation-Konzepte dokumentiert die Prinzipien der
Software-Bedienung und die Algorithmen bei der Datenbearbeitung.
Anpassung
Erfahrene Anwender, die die Bedienungsweise der ChemStation an ihre
Bedürfnisse anpassen oder zusätliche Möglichkeiten einbauen wollen,
können dies durch Schreiben von Makros erreichen.
Das erste Referenzhandbuch, Macro Programming Guide , das über die
Online-Hilfe verfügbar ist, enthält leicht verständliche Beispiele, die durch
die vollständige Beschreibung der internen Datenarten und Strukturen
ergänzt sind.
Die Hilfedatei zu den Befehlen dient dem Programmierer als Arbeitsreferenz
und ist direkt über das Hilfemenü der ChemStation oder über das Dialogfeld
“Show Command” zugänglich. Sie enthält Erklärungen zu Syntax und den
Parametern mit Beispielmakros, die den Einsatz vieler der Befehle erläutern.
Dadurch, daß sie sich online befinden, kann der Anwender ganze Beispiele
oder nur eine Befehlssyntax direkt in das eigene Makro kopieren.
35
ChemStation Konzepte
Die Verzeichnisstruktur der ChemStation
Die Verzeichnisstruktur der ChemStation
Die Verzeichnisstruktur der ChemStation wird im Folgenden als Beispiel
gezeigt. Sie besteht aus allgemeinen Verzeichnissen, die von allen
angeschlossenen Analysengeräten benutzt werden sowie aus
gerätespezifischen Verzeichnissen. Das Installationsprogramm legt ein
Unterverzeichnis des Verzeichnisses der ChemStation (Standardname:
HPCHEM) für jedes angeschlossene Analysengerät mit dessen
Gerätenummer an. In diesem Verzeichnis werden standardmäßig alle Daten,
Methoden und Sequenzen für dieses Analysengerät gespeichert.
36
ChemStation Konzepte
Die Verzeichnisstruktur der ChemStation
HPCHEM
REPSTYLE
PICTURES
CORE
LANGUAGE
HELPENU
1024
800
LANGUAGE
SYS
HELPENU
LANGUAGE
BACKUP
LC
GC
CE
HELPENU
DRIVERS
LANGUAGE
800
TEMP
1
DATA
DEMO
METHODS
SEQUENCE
VERIFY
SPECLIBS
37
ChemStation Konzepte
Die Verzeichnisstruktur der ChemStation
Folgende sind die Unterverzeichnisse der ChemStation:
Verzeichnis
Inhalte
HPCHEM
In diesem Verzeichnis stehen alle Programme zum
Konfigurieren und Starten der ChemStation. Es muß in der
Umgebungsvariable PATH enthalten sein. Dieses
Verzeichnis wird vom Installationsprogramm automatisch
angelegt, außer wenn eine Alternative eingegeben wird.
REPSTYLE
Hier befinden sich alle Reportvorlagen, die mit dem
Reportdesigner definiert wurden.
CORE
Hier befinden sich die Basiskomponenten der Software,
die von allen chromatographischen Geräten benutzt
werden. Es ist auch das Arbeitsverzeichnis der
ChemStation.
PICTURES
Die für die ChemStation erforderlichen Graphiken
befinden sich in diesem Verzeichnis.
LANGUAGE
Hier befinden sich spezifische Sprachmodule dieses Teils
der Software.
1024 and 800
Hier befinden sich Intitialisierungsdateien für die
Softwareschnittstelle für Anwender. Diese nicht ändern!
SYS
Hier befinden sich die allgemeinen Komponenten, die von
allen chromatographischen Gerätemodulen genutzt
werden. \hpchem\sys muß in der Umgebungsvariablen
PATH enthalten sein. Das Installationsprogramm fügt es
standardmäßig hinzu.
HELPENU
Hier befindet sich die US-Englische Version der
Hilfedateien für die passenden Teile der Software.
LANGUAGE
Hier werden andere Sprachen-spezifische Teile der
Software gespeichert.
BACKUP
Hier werden während der Installation Sicherungskopien
alter Dateien abgelegt.
DRIVERS
Hier befinden sich die Gerätetreiber der konfigurierten
Analysengeräte.
1
Verwendung für das jeweilige Gerät (1 bis 4). Dieses
Verzeichnis enthält fünf weitere Unterverzeichnisse:
DATA, METHODS, SEQUENCE, VERIFY und TEMP.
38
ChemStation Konzepte
Die Verzeichnisstruktur der ChemStation
DATA
Hier stehen alle Verzeichnisse mit den
Analysenergebnissen. Es können noch weitere
Unterverzeichnisse enthalten sein, deren Definition im
Dialogfeld Sample Information oder Sequence Parameters
möglich ist. Unterverzeichnisse mit Ergebnissen tragen die
Dateinamenerweiterung .D. Zu weiteren Informationen
zur Struktur von Datensätzen siehe “Datensätze” auf
Seite 60.
METHODS
Hier stehen alle Methodenverzeichnisse mit der
Dateinamenerweiterung .M. Zu weiteren Informationen
siehe “Verzeichnisstruktur von Methoden” auf Seite 50.
SEQUENCE
Hier stehen die Sequenztabellen. Die Sequenzdateien
tragen die Dateinamenerweiterung .S.
VERIFY
Hier stehen Datensätze, Methoden und Ergebnisse der
Datenbearbeitung in Registerdateien (.REG). Diese
Dateien führen die Prüfroutinen aus, die in der
Online-Hilfe beschrieben werden. Ein Satz, bestehend aus
Daten, Methode und Registerdatei wird für jeden
Überprüfungstest benötigt
TEMP
Das Unterverzeichnis TEMP enthält temporäre
Arbeitsdateien und Logbuchdateien. Zum Beispiel wird bei
Gerät 1 das Online-Logbuch INSTR1.LOG und das
Offline-Logbuch INSTR1-2.LOG genannt.
LC, GC, CE
Hier befinden sich Dateien, die für die Gerätetreiber
erforderlich sind, zum Beispiel die Initialisierungsdatei
INI. Diese Verzeichnisse sind nur vorhanden, wenn die
entsprechenden Geräte vorhanden sind.
SPECLIBS
Hier stehen alle Spektrenbibliotheken. (nur für
ChemStations mit 3D LC Systemen, LC/MS Systemen und
CE Systemen).
39
ChemStation Konzepte
Die Verzeichnisstruktur der ChemStation
40
2
2
Methoden
Methoden
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Was ist eine Methode?
• Die Bestandteile einer Methode
• Der Status von Methoden
• Erstellen von Methoden
• Editieren von Methoden
• Die Verzeichnisstruktur von Methoden
• Was geschieht während der Ausführung einer Methode?
42
Methoden
Was ist eine Methode?
Was ist eine Methode?
Eine Methode besteht aus allen erforderlichen Parametern zur
Datenerfassung und Datenauswertung, und gegebenenfalls aus den Aktionen
vor und nach der Messung (Pre- und Post-Run Tasks) für bestimmte Proben.
43
Methoden
Die Bestandteile einer Methode
Die Bestandteile einer Methode
Eine Methode trägt einen Namen, der aus bis zu acht alphanumerischen
Zeichen bestehen kann. An der Dateinamenerweiterung .M kann man stets
erkennen, daß es sich um eine Methode handelt. Methoden werden als
MS-DOS Verzeichnisse gespeichert und enthalten bestimmte Dateien für die
einzelnen Teile einer Methode.
Jede Methode besteht aus fünf Komponenten:
• Methodeninformation,
• Steuerung der Analysengeräte ,
• Datenauswertung und
• Checkliste zur Ausführung
Methodeninformation
In diesem Abschnitt werden Informationen zur Methode gespeichert.
Die Steuerung der Analysengeräte
Hier werden Parameter zur Steuerung von Analysengeräten oder deren
Komponenten definiert. Bei LC-Geräten dienen Angaben, wie
Zusammensetzung der mobilen Phase, Flußrate, Injektionsvolumen,
Wellenlänge des Detektors etc. zur Steuerung von Pumpe, Probengeber und
Detektor. Bei GC-Geräten steuern die Angaben zur Einlaßtemperatur,
Einlaßdruck, Flußrate auf gepackter Säule etc. das Analysengerät.
Datenauswertung
Hier werden Parameter zur Durchführung der Datenauswertung definiert.
Signaldetails
Hier werden Signale und ihre Eigenschaften für die Datenauswertung
definiert.
44
Methoden
Die Bestandteile einer Methode
Integration Events (Integrationsparameter)
Hier werden zeitabhängige Parameter definiert, die innerhalb eines
Chromatogrammes oder Elektropherogrammes zu einer bestimmten
Retentions- bzw. Migrationszeit auftreten. Über die zeitabhängigen Parameter
kann die Art der Integration geändert werden.
Peak Identification (Peakerkennung)
Hier werden Parameter definiert, die zur Peakerkennung in
Chromatogrammen oder Elektropherogrammen dienen.
Peak Quantification (Mengenbestimmung)
Hier werden Parameter zur Konzentrations- oder Mengenberechnung eines
Peaks definiert.
Calibration and Recalibration (Kalibrierung und Rekalibrierung)
Hier werden Parameter für die Kalibrierung definiert, die festlegen, wie oft
eine Kalibrierung ausgeführt wird.
Report
Hier wird das Format des Reports festgelegt, der nach einem Analysenlauf
gedruckt wird.
Run-Time Checklist (Checkliste zum Analysenlauf)
Hier wird definiert, welcher Teil einer laufenden Methode ausgeführt wird.
Sie können die Checkliste zum Analysenlauf für folgende Funktionen
verwenden:
• zum Erfassen, Speichern und Bearbeiten von Daten bis zur
Reporterstellung,
• zum Ausführen von nur einem Methodenteil,
• zum Erfassen und Speichern von Daten ohne Bearbeitung,
• zum erneuten Nachbearbeiten von Datensätzen,
• zum Einsatz eigener Makros zur Datenanalyse und Aktionen vor und nach
dem Analysenlauf (Pre- und Postrun Processing) und
• zum Ablegen der Analysenergebnisse in Registern für GLP-Zwecke .
45
Methoden
Der Status von Methoden
Der Status von Methoden
Eine Methode kann auf zwei Arten vorliegen.
Gespeicherte Methode (Stored Method)
Dies ist eine Methode, die auf der Festplatte des Computers gespeichert ist.
Gespeicherte Methoden haben einen Namen aus bis zu acht
alphanumerischen Zeichen gefolgt von der Dateinamenerweiterung .M.
Aktuelle Methode (Current Method)
Wenn eine gespeicherte Methode von der Festplatte aufgerufen wird, ist sie
die aktuelle Methode. Im Speicher existiert immer eine aktuelle Methode.
Beim ersten Start der ChemStation wird die von Agilent Technologies
gelieferte Standardmethode als Teil des Startprozesses geladen. Es könnte
eine der folgenden Methoden sein:
• DEF_LC.M bei einem LC-Gerät,
• DEF_GC.M bei einem GC-Gerät oder
• DEF_CE.M bei einem CE-Gerät.
Eine Kopie der Standardmethode wird im Hauptspeicher abgelegt und wird
zur aktuellen Methode. Sie können an dieser Stelle eine andere Methode
laden, die dann zur aktuellen Methode wird. Die oben aufgeführten Methoden
verwenden den neuen Integrationsalgorithmus. Wenn Sie den
Standardintegrationsalgorithmus verwenden wollen, müssen Sie Ihre
Methode aus eine der folgenden Methoden aufbauen:
• DEFOLDLC.M für einen Flüssigkeitschromatographen,
• DEFOLDGC.M für einen GC oder
• DEFOLDCE.M für eine CE.
46
Methoden
Erstellen von Methoden
Erstellen von Methoden
Das Erstellen einer neuen Methode läuft immer über Abändern der aktuellen
Methode und anschließende Speicherung der Modifikation unter einem
neuen Methodennamen. Beachten sie, daß nach der Änderung einer Methode
die Version auf der Festplatte unverändert bleibt, bis die Änderungen
gespeichert werden.
Die Art der Methodenerstellung ist frei wählbar. Sie können eine Methode
erstellen, die entweder einen oder alle Teile einer Analyse steuert. Sie können
also eine Methode zum Beispiel nur für die Datenerfassung erstellen. Für die
Datenauswertung mit Report zur Bibliothekssuche von Spektren können Sie
die Methode dann um diese Aufgaben erweitern.
VO RS IC HT
Löschen Sie nicht die Standardmethoden DEF_LC.M, DEF_CE.M oder
DEF_GC.M. Diese Methoden dienen bei der Erstellung neuer Methoden als
Vorlagen.
47
Methoden
Editieren von Methoden
Editieren von Methoden
Sie können eine existierende Methode editieren, indem Sie den Menüpunkt
Edit Entire Method im Menü Method aufrufen. Sie werden durch alle
Dialogfelder geführt und schließlich kann die Methode gespeichert werden.
Dieser Ablauf wird unten verdeutlicht:
Methode auf Festplatte
Laden der Methode
Methode wird in den Speicher geladen und wird zur aktuellen Methode
Wahl von “ Edit Entire Method” im Menü “Method”
Editieren der Methode
Speichern der Methode
Speichern unter neuem Namen
Speichern unter selbem Namen
Erstellt eine neue Methode
auf Festplatte
Überscheibt aktuelle
Methode
Editierbare Methodenteile
Jede Methode besteht aus fünf Komponenten, die separat editierbar sind:
Es folgen nun Abschnitte, die sich auf bestimmte Dialogfelder beziehen
sowie allgemeine Beschreibungen.
• die Methodeninformation besteht aus:
48
Methoden
Editieren von Methoden
Text zur Beschreibung einer Methode
• die Gerätesteuerung ist von der Konfiguration abhängig und kann
beispielsweise Folgendes enthalten:
Ofenparameter
Parameter des automatischen Probengebers
Detektorparameter
• die Datenauswertung besteht aus:
Signaldetails,
Integrationsparametern
Parametern zur Quantifizierung
Parametern zur Kalibrierung
Parametern zur Reporterstellung
• die Checkliste zur Ausführung eines Analysenlaufes besteht aus:
den Teilen der Methode, die ausgeführt werden.
49
Methoden
Verzeichnisstruktur von Methoden
Verzeichnisstruktur von Methoden
Eine Methode besteht aus einer Gruppe von Dateien, die im
Methodenverzeichnis gespeichert werden.
Im Verzeichnis METHODS stehen alle Methoden. Sie besitzen die
Dateinamenerweiterung .M.
Methodendateien mit der Erweiterung .MTH enthalten die Parametersätze
und liegen im ASCII -Format vor. Die Datei INFO.MTH faßt die
Kontrollparameter der Methode zusammen.
Methodendateien mit Parametern zur Gerätesteuerung tragen den Namen
des zugehörigen Analysengerätes. Einige Beispiele:
LC1090.MTH
Datenerfassungsmethode des HP 1090
GC5890.MTH
Datenerfassungsmethode des HP 5890
HPCE1.MTH
Datenerfassungsmethode der Agilent
Kapillarelektrophorese
DAD1.MTH
Datenerfassungsmethode des HP 1090, HP 1050 oder
HP 1040 Dioden-Array-Detektors.
FLD1.MTH
Datenerfassungsmethode des HP 1046
Fluoreszenzdetektors.
ECD1.MTH
Datenerfassungsmethode des Agilent 1049
Elektrochemischen Detektors.
ADC1.MTH
Datenerfassungsmethode des Agilent 35900. Wenn
zwei identische Module angeschlossen sind, heißen
die Methoden ADC1.MTH, ADC2.MTH.
1050VWD
Datenerfassungsmethode von Modulen der Serie
HP 1050. Das Modul wird in den letzten drei
Buchstaben beschrieben, wie hier z.B. der Variable
Wellenlängendetektor.
DAMETHOD.REG
für die Datenauswertung.
LALS1.REG
Parameter für die automatischen Probengeber der
Agilent 1100 Serie. Die Methodendatei für andere
Module der Agilent 1100 Series folgt derselben Regel
lxxx1.reg, wobei xxx dem Initialwort für das Modul
entspricht.
50
Methoden
Was geschieht während der Ausführung einer Methode?
Was geschieht während der Ausführung
einer Methode?
Die Checkliste zur Ausführung legt in einem Dialogfeld fest, welcher Teil
einer Methode in einem Analysenlauf ausgeführt wird.
Die Checkliste zur Ausführung besteht aus acht Teilen:
• Befehl oder Makro vor dem Analysenlauf (Pre-Run)
• Datenerfassung
• Standard Datenauswertung
• Auswertemethode des zweiten Datensignals (nur bei GC-Geräten)
• Angepaßte Datenauswertung
• Speicherung von GLP-Daten
• Befehl oder Makro nach dem Analysenlauf (Post-Run)
• Speicherung einer Kopie der Methode mit Daten
Bei der Ausführung einer Methode werden die im Dialogfeld „RunTime
Checklist" spezifizierten Teile ausgeführt.
Ablauf einer Methode
Abbildung 1 vermittelt einen Überblick über den Status der ChemStation
während des Ablaufes einer Methode, wenn alle Bestandteile der Checkliste
zur Ausführung gewählt wurden.
51
Methoden
Was geschieht während der Ausführung einer Methode?
Methodenablauf
Status der ChemStation
Post-Run Makro
Injektion
Datenauswertung
Injektion und
Analysenlauf
Schließen des
Rohdatensatzes
Pre-Run Makro
Statusebenen
Abbildung 1
Pre-Run
Methodenlauf mit der
ChemStation gestartet
Zeit
Befehl oder Makro vor dem Analysenlauf (Pre-Run)
Wenn ein Makro oder ein Befehl zur Ausführung vor dem Analysenlauf
angegeben wird, erfolgt die Ausführung vor dem Start der Analyse. Dieser
Teil dient normalerweise der Systemanpassung in Verbindung mit anderen
Softwarepaketen.
Datenerfassung
• Alle Parameter werden auf die Anfangsbedingungen gesetzt, die in der
aktuellen Methode angegeben sind.
• Wenn angegeben, wird ein Injektionsprogramm ausgeführt und eine
Injektion erfolgt aus dem aktuell definierten Probenfläschchen.
• Auf dem Bildschirm wird der Verlauf der Analyse, zusammen mit
chromatographischen oder elektrophoretischen Informationen sowie
gegebenenfalls den Spektren dargestellt.
• Daten werden erfaßt und in einer Datei gespeichert.
52
Methoden
Was geschieht während der Ausführung einer Methode?
Datenauswertung
Bei Erreichen der Stopzeit wird der Analysenlauf beendet und die Rohdaten
werden auf der Festplatte des Computers gespeichert. Der Softwareteil zur
Datenauswertung startet nach dem Speichern der Rohdaten.
Integration
• Chromatographische/elektrophoretische Objekte im Signal werden so
integriert wie im Dialogfeld „Integration Events" festgelegt.
• Peakstart, Peakmaximum, Retentions- bzw. Migrationszeit sowie das
Peakende werden ermittelt.
• Unter jedem Peak wird der Verlauf der Basislinie zur Bestimmung von
Peakfläche und Peakhöhe definiert.
• Die Integrationsergebnisse (Integration Results) werden als Liste
dargestellt.
Peakidentifizierung und Quantifizierung
• Mit den Retentions- bzw. Migrationszeiten und optionalen Peakqualifiern
identifiziert die Software die Peaks durch Vergleich mit bekannten Stoffen,
deren Daten in der Kalibriertabelle (Calibration Table) enthalten sind.
• Mit den Peakhöhen oder Peakflächen berechnet die Software die
gefundene Menge jeder integrierten Substanz durch die Verwendung der
Kalibrierparameter aus der Kalibriertabelle.
Bibliothekssuche mit Spektren (nur bei ChemStations für LC 3D
Systeme, LC/MS Systeme und CE Systeme)
Für alle Peaks mit gemessenen UV/VIS-Spektren kann eine automatische
Suche in vorgegebenen Spektrenbibliotheken zur Identifizierung erfolgen.
Weitere Informationen hierzu finden Sie im Buch Installation und Funktion
des Spektrenmoduls .
Überprüfen der Peakreinheit (nur bei ChemStations für LC 3D
Systeme, LC/MS Systeme und CE Systeme)
Für Peaks mit vorhandenen UV/VIS-Spektren kann ein Reinheitsfaktor
errechnet und in einem Register gespeichert werden. Die Peakreinheit kann
auch automatisch am Ende eines Analysenlaufes als Teil einer Methode
ermittelt werden. Hierzu muß das Ankreuzkästchen Check Purity aktiviert
werden, wenn die automatische Bibliothekssuche oder eine geeignete
53
Methoden
Was geschieht während der Ausführung einer Methode?
Reportvorlage gewählt wird. Weitere Informationen hierzu finden Sie im
Buch Installation und Funktion des Spektrenmoduls .
Ausdruck eines Reports
Ein Report mit qualitativen und quantitativen Ergebnissen des Analysenlaufs
wird erzeugt.
Angepaßte Datenauswertung
Die angepaßte Datenauswertung ermöglicht Ihnen die Ausführung spezieller
Makros zur Auswertung Ihrer analytischen Daten.
Speichern von GLP-Daten
Das Binärregister GLPSave.Reg wird zusammen mit der Methode der
Datenauswertung im Standardverzeichnis der Datensätze gespeichert. Dies
dient zur Sicherung von Datenqualität und Datenherkunft.
Die binäre Registerdatei GLPSave.Reg enthält folgende Informationen in
einem Format, das nicht editiert werden kann und durch eine Prüfsumme
geschützt ist:
• die wichtigsten Eingabeparameter des Analysengerätes (können
graphisch betrachtet werden)
• chromatographische oder elektrophoretische Signale
• Integrationsergebnisse
• Ergebnisse der quantitativen Auswertung
• Methode der Datenauswertung
• Logbuch
Diese Daten werden nur gesichert, wenn die Option „Save GLP Data" durch
Aktivieren des Kontrollkästchens in der RunTime Checklist gewählt wurde.
Sie können diese Daten über das Menü Data Analysis der ChemStation
einsehen aber nicht verändern.
Befehl oder Makro nach dem Analyselauf (Post-Run)
Falls ein Befehl oder ein Makro zur Ausführung nach dem Analysenlauf
gewählt wurde, erfolgt die Ausführung, zum Beispiel das Anfertigen einer
Sicherungskopie der Daten auf Diskette, nach der Datenauswertung.
54
Methoden
Was geschieht während der Ausführung einer Methode?
Speichern einer Kopie der Methode mit den Daten
Dies erfolgt nach der Datenerfassung nur, wenn in der RunTime Checklist
„Save Method with Data" aktiviert wurde. Hiermit wird die aktuelle Methode
in das Datenverzeichnis kopiert.
55
Methoden
Zusammenfassung des Methodenablaufs
Zusammenfassung des Methodenablaufs
Die folgende Liste faßt den Ablauf der Methode zusammen, für den Fall, daß
alle Teile der RunTime Checklist gewählt wurden.
1 Befehl oder Makro vor dem Analysenlauf
Führt eine Aufgabe aus, bevor der Analysenlauf gestartet wird.
2 Datenerfassung
Führt ein Programm im automatischen Probegeber aus.
Injiziert die Probe.
Erfaßt die Rohdaten.
Speichert diese Daten.
3 Speichern der Methode mit den Daten
4 Datenauswertung (Datenbearbeitung)
Lädt den Datensatz.
Integriert den Datensatz.
Identifiziert und quantifiziert Peaks.
Durchsucht, wenn möglich, Spektrenbibliotheken.
Überprüft, wenn möglich, die Peakreinheit.
Druckt einen Report.
5 Angepaßte Datenauswertung
Führt Ihre Makros aus.
6 Speichern von GLP-Daten
Speichert die binäre Registerdatei GLPSave.Reg
7 Befehl oder Makro nach dem Analysenlauf
Führt eine Aufgabe nach vollständigem Abschluß der Analyse durch. Zum
Beispiel wird ein Report nach Benutzervorgaben ausgedruckt.
56
3
3
Datenerfassung
Datenerfassung
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Was ist Datenerfassung?
• Datensätze
• Verzeichnisstruktur
• Online-Monitore
• Logbuch
• Systemstatus
• Die Systemübersicht
58
Datenerfassung
Was ist Datenerfassung?
Was ist Datenerfassung?
Während der Datenerfassung werden alle analogen Signale im Analysengerät
in digitale Signale konvertiert. Das digitale Signal wird elektronisch zur
ChemStation übertragen und in einem Rohdatensatz abgelegt.
59
Datenerfassung
Datensätze
Datensätze
Ein Datensatz besteht aus einer Gruppe von Dateien, die im Verzeichnis
DATA als Unterverzeichnisse angelegt werden. Sie tragen einen Namen und
die Dateinamenerweiterung .D. Jede Datei im Verzeichnis wird nach
folgender Konvention benannt.
Name
Description
*.CH
Rohdatensatz mit Daten aus Chromatographie oder
Elektrophorese. Der Dateiname besteht aus dem Moduloder Detektortyp, der Modulnummer und einer
Identifikationsnummer für das Signal oder den Kanal. Zum
Beispiel heißt der Rohdatensatz ADC1A.CH, wenn der
ADC das Modul ist, 1 die Modulnummer und A die
Signalidentifikation. Die Erweiterung für
Chromatographie ist .CH.
*.UV
Datensätze mit UV-Spektren. Der Dateiname besteht aus
Detektortyp und Gerätenummer (nur bei
Dioden-Array-Detektor und Fluorszenzdetektor).
REPORT.TXT
Reportdatensätze für die zugehörigen Rohdatensätze. Der
Dateiname besteht aus Detektortyp, Gerätenummer und
Signal- oder Kanalidentifikation, z. B. ADC1A.TXT.
SAMPLE.MAC
Makro zur Probeninformation.
RUN.LOG
Logbucheinträge, die während eines Analysenlaufes
aufgenommen wurden. Das Logbuch zeichnet alle
Vorgänge während der Analyse auf. Es werden alle
etwaigen Fehlermeldungen und wichtige
Statusänderungen der ChemStation aufgezeichnet.
LCDIAG.REG
Nur bei LC. Enthält Kurven zum Geräteverhalten
(Gradienten, Temperaturen, Drücke etc.),
Injektionsvolumina und Lösungsmittelbeschreibungen.
ACQRES.REG
Enthält die Säuleninformation. Bei GC-Systemen enthält
die Datei auch das Aufgabevolumen.
GLPSAVE.REG Teil des Datensatzes, wenn “Save GLP Data” angegeben
ist.
60
Datenerfassung
Datensätze
Die Methode kann zusammen mit den Ergebnisdateien gespeichert werden.
In diesem Fall wird das Methodenverzeichnis als Unterverzeichnis des
Verzeichnisses des Datensatzes angelegt.
61
Datenerfassung
Online-Monitore
Online-Monitore
Es gibt zwei verschiedene Online-Monitore: Einen Online-Monitor für das
Signal und einen weiteren für Spektren.
Online-Monitor für Signale
Der Online-Monitor für Signale ermöglicht es Ihnen, mehrere Signale und
Aufzeichnungen der Geräteleistung, wenn dies vom angeschlossenen Gerät
her unterstützt wird, im selben Fenster darzustellen. Sie können bequem die
gewünschten Signale auswählen, um die Zeit- und Intesitätsachse zu
formatieren. Für Detektoren, die diese Funktion unterstützen gibt es eine
Ausgleichtaste.
Wenn Sie mit dem Cursor in die Darstellung gehen, können Sie den absoluten
Signalresponse aus der Meldungszeile ablesen.
Online-Monitor für Spektren
Den Online-Monitor für Spektren gibt es nur in Verbindung mit
ChemStations, die Spektrenauswertungen unterstützen. Er zeigt eine
Auftragung der Absorption als Funktion der Wellenlänge. Sie können sowohl
den angezeigten Wellenlängenbereich als auch die Absorptionsskala
einstellen.
62
Datenerfassung
Logbuch
Logbuch
Das Logbuch zeigt Meldungen an, die vom analytischen System erzeugt
wurden. Diese Meldungen können Fehlermeldungen, Systemmeldungen oder
Ereignismeldungen aus einem Modul sein. Das Logbuch zeichnet diese
Ereignisse auf, wobei es keine Rolle spielt, ob die Meldungen auch auf dem
Bildschirm angezeigt werden. Für weitere Informationen zu einem Ereignis
klicken Sie die entsprechende Zeile doppelt an, um eine Beschreibung als
Hilfstext aufzurufen.
63
Datenerfassung
Statusinformationen
Statusinformationen
Die Statusanzeige der ChemStation
Das Statusfenster der ChemStation zeigt eine Zusammenfassung des Status’
der ChemStation-Software.
Wenn eine einzige Analyse läuft, zeigt sie folgendes an:
• In der ersten Zeile des Statusfensters der ChemStation wird “Run in
Progress” angezeigt.
• In der zweiten Zeile des Statusfensters der ChemStation wird der aktuelle
Status der Methode angezeigt.
• In der dritten Zeile wird der Name des Rohdatensatzes zusammen mit der
aktuellen Laufzeit angezeigt (bei einem GC-System werden auch Dateien
für Front- und Back-Injektor angezeigt).
Das Statusfenster des Analysengerätes bietet Informationen über die
Gerätemodule und die Detektoren. Sie zeigen den Status der einzelnen
Komponenten und, je nach System, die aktuellen Bedingungen von zum
Beispiel Druck, Gradient oder Fluß an.
Statuszeile
Der graphische Anwenderzugriff des ChemStation-Systems enthält
Symbolzeilen und eine Statuszeile in der Darstellung “Method and Run
Control” der ChemStation. Die Statuszeile enthält den Systemstatus und
Informationen über die aktuelle Methode und Sequenz. Wenn diese nach dem
Laden geändert wurden, sind sie mit einem roten Dreieck markiert. Bei
einem LC-Modul der Agilent 1100 Serie macht ein gelbes EMF-Symbol den
Anwender darauf aufmerksam, wenn Haltbarkeitsgrenzen von
Vebrauchsmaterialien (wie z.B. der Lampe) überschritten wurden.
Systemübersicht
Sie können zu Ihrem ChemStation-System eine graphische
Benutzeroberfläche aufrufen, wenn diese Funktion von dem
angeschlossenen Analysengerät (wie z.B. von den LC-Modulen der
Agilent 1100 Serie oder den Agilent 6890 Series GCs) unterstützt wird. Dies
ermöglicht es Ihnen, den Systemstatus mit einem Blick zu überprüfen.
64
Datenerfassung
Statusinformationen
Wählen Sie den Befehl “System Diagram” aus dem Darstellungsmenü für
“Method and Run Control” auf, um die Übersicht aufzurufen. Sie ist eine
graphische Darstellung Ihres ChemStation-Systems. Jeder Bestandteil wird
durch ein Symbol representiert. Unter Verwendung des folgenden Farbcodes
wird der aktuelle Status angezeigt.
Farbe
Status
grau
inaktiv oder abgeschaltet
gelb
nicht bereit
grün
bereit
blau
in Funktion
rot
Fehler
Zusätzlich können Sie Auflistungen über die aktuellen Einstellungen der
Parameter aufrufen. Abgesehen von der Statusübersicht ermöglicht die
Darstellung einen schnellen Zugriff auf die Dialogfelder der
Parametereinstellungen für jede Komponente des Systems.
Weitere Informationen über die Systemübersicht finden Sie im
Geräteabschnitt der Online-Hilfe.
65
Datenerfassung
Statusinformationen
66
4
4
Integration
Integration
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Was ist eine Integration?
• Was wird bei einer Integration durchgeführt?
• Die Integrationsalgorithmen der ChemStation
68
Integration
Was ist eine Integration?
Was ist eine Integration?
Über die Integration werden in einem chromatographischen Signal die Peaks
bestimmt und ihre Größe berechnet.
Die Integration ist erforderlich für die:
• Quantifizierung
• Berechnung der Peakreinheit (nur bei ChemStations für LC 3D, LC/MS
Systeme und CE Systeme)
• Bibliothekssuchen mit Spektren (nur bei ChemStations für LC 3D, LC/MS
Systeme und CE Systeme).
69
Integration
Was wird bei der Integration durchgeführt?
Was wird bei der Integration
durchgeführt?
Zur Integration eines Peaks führt die Software folgende Aktionen aus:
• Für jeden Peak werden die Start- und Endpunkte bestimmt und mit
vertikalen Strichmarkierungen markiert.
• Das Maximum jedes Peaks wird bestimmt. Es entspricht der Retentionsbzw. Migrationszeit.
• er konstruiert eine Basislinie,
• Fläche, Höhe und Peakbreite werden für jeden Peak berechnet.
Dieser Prozess wird mit Integrationsparametern (Integration Events)
kontrolliert.
70
Integration
Die Integrationsalgorithmen der ChemStation
Die Integrationsalgorithmen der
ChemStation
Die ChemStation enthält zwei Integrationsalgorithmen. Der
Standardintegrationsalgorithmus war Bestandteil der früheren Versionen der
ChemStation und befindet sich in den meisten anderen
Auswertungssoftware-Paketen für analytische Daten von Agilent
Technologies. Der neue Integrationsalgorithmus zielt auf bessere Robustheit,
Zuverlässigkeit und Anwenderfreundlichkeit ab. Agilent Technologies
empfiehlt den Einsatz des traditionellen Algorithmus’ für bereits vorhandene
validierte Methoden und des neuen Algorithmus’ für neue Methoden.
Eine kurze Abhandlung zum
Standardintegrationsalgorithmus
Um 1980 wurde der Standardintegrationsalgorithmus mit dem HP 3350
Labordatensystem eingeführt. Später wurde er in das HP 3365 ChemStation
System eingegliedert und schließlich auch in die neue ChemStation.
Der Standardintegrationsalgorithmus war dazu ausgelegt, bei möglichst
geringem Optimierungsaufwand durch den Anwender, den vollen Bereich der
analytischen Anwendungen abzudecken.
Mit steigender Zahl an analytischen Anwendungen wurde erkannt, daß ein
einziger Standardintegrator nicht für alle möglichen Anwendungen ohne
Kompromisse bezüglich der Leistungsfähigkeit optimiert werden kann.
Kompatibilität
Den Standardintegrator gibt es auch weiterhin für Anwender, die bereits
Methoden für den Standardintegrator entwickelt haben oder im Augenblick
nicht zu dem neuen Integrator wechseln wollen. Für Datensätze, die mit dem
Standardintegrator aufgenommen oder neuberechnet wurden, können beide
Integratoren verwendet werden.
Eine Vorstellung des neuen Integrationsalgorithmus
Hewlett Packard hat den neuen Integrator auf Empfehlungen von Kunden
entwickelt. Wir sind uns bewußt, daß ein Integratoralgorithmus variabel sein
71
Integration
Die Integrationsalgorithmen der ChemStation
sollte, um der verschiedenen analytischen Techniken heutzutage und in der
Zukunft Rechnung zu tragen.
Allgemeine Integrationsmöglichkeiten
Die wichtigsten Möglichkeiten beider Integrationsalgorithmen sind folgende:
• eine Autointegrationsfunktion zur Einstellung anfänglicher
Integrationsparameter;
• die Fähigkeit, für jedes Chromatographiesignal eine eigene Tabelle mit
Integrationsparametern festzulegen, wenn mehrere Signale oder mehr als
ein Detektor verwendet werden;
• die interaktive Festlegung von Integrationsparametern, die es dem
Anwender ermöglichen, die Zeiten für die Ereignisse graphisch zu
bestimmen;
• manuelle oder “Rubber Band” Integration für Chromatogramme oder
Elektropherogramme, die eine spezielle Interpretation erfordern (diese
Parameter können auch in die Methode integriert und somit automatisch
aufgerufen werden);
• Darstellung und Ausdruck von Integrationsergebnissen und
• die Fähigkeit mindestens 1000 Peaks pro Chromatogramm zu integrieren.
Beide Integrationsalgorithmen enthalten folgende Befehlsgruppen:
• Definitionen für Integrationsparameter, um die Grundeinstellungen für
den Integrator, Area Rejection, Peak Width und Threshold (als Parameter
für die Rauschunterdrückung) festzusetzen oder zu verändern;
• Parameter zur Kontrolle der Basislinie wie “force baseline” (Basislinie
erzwingen), “hold baseline” (Basislinie halten), “baseline at all valleys”
(Basislinie zu jedem Tal), “baseline at the next valley” (Basislinie beim
nächsten Tal), “fit baseline backwards from the end of the current peak”
(rückwärtige Anpassung der Basislinie vom Ende des aktuellen Peaks);
• Kontrolle der Flächenaddition;
• negative Peakerkennung;
• Abtastprozesse einschließlich Befehlen zur Festlegung des
Lösungsmittelpeaks und
• Befehle zur Integratorsteuerung, die Retentionszeitbereiche festlegen, in
denen der Integrator wirksam ist.
72
Integration
Die Integrationsalgorithmen der ChemStation
Fähigkeiten des neuen Integrators
Der neue Integrator bietet folgende Fähigkeiten, die im Vergleich zum
Standardintegrator verbessert wurden:
• optimierte Basislinienzuweisung unter Verwendung von Parametern aus
individuellen Methoden und Datensätzen,
• zusätzliche Anfangsparameter zum Ausschluß von Peaks, die durch
Rauschen entstanden sind (anfängliche Peakhöhe),
• bessere Peakerkennung bei verrauschten Signalen,
• Schultererkennung bei Peaks durch Verwendung der zweiten Ableitung
oder des zweiten Grades bei Kurvenberechnungen und
• Erweiterung der Rechenmodi für die tangentiale Anpassung durch die
Funktion geradlinig/exponentiell, bei der die tangentiale Anpassung von
einem exponentiellen Verlauf in eine gerade Linie übergeht.
• verbesserte Aufnahme von Datenpunkten mit unterschiedlichen
Abständen zur Verbesserung der DAD LC Datensätze, die aus DAD
Spektren rekonstruiert wurden
• Anwenderfreundlichkeit — der neue Integrationsalgorithmus ist auf der
Benutzeroberfläche über Symbolleisten und auch über
Tastenkombinationen zugänglich.
Die beiden Integrationsalgorithmen sind genauer in Kapitel5 “Der
Standardintegrationsalgorithmus” und Kapitel6 “Der neue
Integrationsalgorithmus”.
73
Integration
Die Integrationsalgorithmen der ChemStation
74
5
5
Der Standardintegrationsalgorithmus
Der
Standardintegrationsalgorit
hmus
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Der Standardintegrationsalgorithmus,
• Integrationsparameter
• Integrationsarten
• Autointegration,
• Integration
• manuelle Integration
76
Der Standardintegrationsalgorithmus
Der Standardintegrationsalgorithmus
Der Standardintegrationsalgorithmus
Der Standardintegrationsalgorithmus war Bestandteil früherer Versionen der
ChemStation und ist Bestandteil der meisten anderen
Auswertungssoftware-Pakete für analytische Daten von Agilent
Technologies. In diesem Kapitel wird die Funktionsweise des
Standardintegrationsalgorithmus’ behandelt.
Zur Integration eines Signals führt der Standardintegrationsalgorithmus
folgende Aktionen aus:
• Für jeden Peak werden die Start- und Endzeiten bestimmt und mit
vertikalen Strichmarkierungen markiert.
• Das Maximum jedes Peaks wird bestimmt. Es entspricht der Retentionsbzw. Migrationszeit.
• er konstruiert eine Basislinie,
• Fläche, Höhe und Peakbreite werden für jeden Peak berechnet.
Dieser Vorgang wird mit den sogenannten Integrationsparametern
kontrolliert. Die beiden wichtigsten Parameter sind der Schwellenwert und
die Peakbreite (Threshold, Peak Width). Die ChemStation ermöglicht die
Eingabe von Anfangswerten für diese und andere Parameter. Die Werte
gelten für den Beginn eines Signaldatensatzes. In den meisten Fällen genügen
diese Werte für eine gute Integration des gesamten Signals. Es könnten
jedoch Fälle auftreten, wo Sie die Integration mit einem Zeitprogramm
durchführen möchten. Dies kann mit zeitprogrammierbaren Parametern der
ChemStation erreicht werden. Sie finden weitere Informationen über
zeitabhängige Parameter unter “Integrationsparameter” auf Seite 91.
77
Der Standardintegrationsalgorithmus
Funktionsweise der Integration
Funktionsweise der Integration
Der Integrationsprozess besteht aus folgenden Schritten:
• Peakerkennung (Definition der Kardinalpunkte)
• Konstruktion der Basislinie
• Berechnung der Peakfläche
78
Der Standardintegrationsalgorithmus
Peakerkennung
Peakerkennung
Der erste Schritt der Integration ist die Peakerkennung, die aus folgenden
Teilen besteht:
• Erkennen des Peakanfangs
• Definition des Peakmaximums
• Erkennen des Peakendes
Integration isolierter Peaks
Der Integrator prüft die digitalen Signaldaten mit der Annahme, daß der erste
Punkt des Signals auf der Basislinie liegt. Gleichzeitig wird ein der
anfänglichen Peakhalbwertsbreite entspechender gleitender Durchschnitt
berechnet und als Basislinie definiert. Dieser Prozess wird solange
fortgesetzt, wie der Wert unter dem vorgegebenen Schwellenwert
(Threshold) liegt. Bei Überschreiten dieses Wertes kann ein Peakanfang
vorliegen. Wird der Wert weiter überschritten, handelt es sich um die
Anstiegsflanke eines Peaks. Der Peak wird bearbeitet und der Integrator
kehrt in den Modus zur Basislinienauswertung zurück.
Der Prozess zur Erkennung eines positiven Peaks besteht aus folgenden
Schritten (siehe Abbildung 2):
1 Steigung und Krümmung unter Schwellenwert: Basislinie prüfen
2 Steigung und Krümmung über Schwellenwert: Möglichkeit eines Peaks.
3 Steigung bleibt über Schwellenwert: Peak erkannt
4 Krümmung wird negativ: Wendepunkt der Anstiegsflanke.
5 Steigung wird negativ: Peakmaximum
6 Krümmung wird positiv: Wendepunkt der Abstiegsflanke.
7 Steigung und Krümmung unter Schwellenwert: Peakende erreicht
8 Steigung und Krümmung unter Schwellenwert: Peakende erreicht,
Basis-linie prüfen.
79
Der Standardintegrationsalgorithmus
Peakerkennung
Abbildung 2
Kardinalpunkte
5
4
6
2
7
1
8
3
Die Schritte 3, 5 und 8 definieren die Kardinalpunkte, die den Peakstart, das
Peakmaximum und das Peakende markieren.
Der Peak wird bestätigt, wenn die resultierende Peakbreite in halber
Peakhöhe die Schwellenwerte erfüllt, die mit der Option Peakwidth
(Peakbreite) im Dialogfeld “Integration Events” vorgegeben wurden. Sie
finden weitere Einzelheiten im Abschnitt “Peakbreite (Peak Width)” auf
Seite 91.
Bestimmung des Peakmaximums
An der höchsten Stelle des Peaks wird die positive Steigung negativ. Zur
Berechnung der Retentions- bzw. Migrationszeiten und der Peakhöhe nimmt
der Integrator den höchstgelegenen Datenpunkt auf beiden Seiten des Peaks.
An diese beiden Punkte wird eine quadratische Gleichung angepaßt, deren
Lösung den höchsten Punkt des Peaks ergibt.
Abbildung 3
Bestimmung des Peakmaximums
Peakmaximum
80
Der Standardintegrationsalgorithmus
Peakerkennung
Integration überlappender Peaks
Manchmal überlappen zwei Peaks so, daß zwischen ihnen kein
Basislinienpunkt vorhanden ist. Im Falle eines Basislinie Valley (BV) und
eines Valley Basislinie (VB) Peaks trennt der Integrator die überlappenden
Peaks durch Lotfällung vom Talpunkt zwischen den beiden Peaks. Der
Integrator erkennt den Start des ersten Peaks und integriert die Fläche bis er
einen Talpunkt findet. Am Talpunkt endet die Integration des ersten Peaks.
Nun beginnt die Flächenaddition für den zweiten Peak. Wenn der Integrator
das Ende des zweiten Peaks erkennt, wird die Flächenaddition beendet.
Sie finden Einzelheiten zur Trennung überlappender Peaks im Abschnitt
“Kodierung zur Peaktrennung” auf Seite 104.
Abbildung 4
Überlappende Peaks
Talpunkt
Integration von Peakschultern
Eine Schulter ist ein nicht aufgetrennter Peak auf der vorderen oder hinteren
Flanke eines größeren Peaks. Es ist kein Talpunkt vorhanden, an dem sich
eine negative Steigung in eine positive Steigung ändert.
81
Der Standardintegrationsalgorithmus
Peakerkennung
Abbildung 5
Peakschultern
Schulterpunkt
Die gefundenen Schultern werden einer Retentionszeit zugeordnet, wo die
negative Steigung maximal ist. Die Fläche, die für den Hauptpeak angegeben
wird, umfaßt die Fläche der Schultern.
82
Der Standardintegrationsalgorithmus
Konstruktion der Basislinie
Konstruktion der Basislinie
Nach Erkennung eines Peaks wird die Basislinie konstruiert, damit die
Fläche des Peaks berechnet werden kann. Die Konstruktion der Basislinie
folgt der Änderung des Signals.
Der Integrator konstruiert die Basislinie als Folge gerader Linienstücke
zwischen folgenden Punkten:
• Wert des Signals zu Beginn des Analysenlaufes
• den Strichmarkierungen (die Anfang und Ende eines Peaks markieren)
• Wert des Signals am Ende des Analysenlaufes; ein Punkt, der sich zur
Stopzeit auf einer horizontalen Verlängerung des letzten erkannten
Punktes der Basislinie befindet
Abbildung 6
Standardmäßige Konstruktion der Basislinie
Strichmarken
Basislinie
83
Der Standardintegrationsalgorithmus
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
In den Reports wird jedem Peak ein Code aus zwei Buchstaben zugeordnet,
der angibt, wie die Basislinie konstruiert wurde. Falls ein dritter Buchstabe
angegeben ist, gibt dieser Auskunft über die Peakart. Diese Codes werden bei
den tabellarischen Ergebnisse in einer Spalte namens "Type" aufgeführt. Der
erste Buchstabe beschreibt die Basislinie am Peakanfang, der zweite die
Basislinie am Peakende (Codes für die Peaktrennung). Alle in den
ChemStation Reports verwendeten Codes sind in alphabetischer Reihenfolge
aufgelistet:
A
Die Peakintegration wurde abgebrochen (Peakart).
b
Peakanfang oder Peakende auf der Basislinie.
H
Peakanfang oder Peakende auf horizontaler Basislinie.
N
Dies ist ein negativer Peak (Peakart).
P
Peakanfang oder Peakende durch Schneiden der
Basislinie.
S
Der Integrator erkannte den Peak als Lösungsmittelpeak
(Peakart).
T
Der Peak begann oder endete, während die Funktion
tangentiale Anpassung (Tangent Skim) (gerade Linie)
eingeschaltet war (Peakart).
V
Peakanfang oder Peakende durch Lotfällung von einem
Talpunkt.
+
Der Peak ist ein flächenaufsummierter Peak (Area
Summed Peak) (Peakart).
-
Der Peak ist negativ, liegt also unterhalb der Basislinie
(Peakart).
Bei manueller Integration können einige andere Codes als Basislinien- oder
Peaktrennungscodes erscheinen:
M
Der Peak wurde manuell integriert
f
Der Peak wurde durch manuelle Integration erzwungen.
Falls ein Peak vor einem manuell integrierten Peak
erscheint und sein Ende von einer manuellen Integration
84
Der Standardintegrationsalgorithmus
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
beeinflußt wird, erhält der Peak die Klassifizierung
„erzwungen" (forced).
R
Ein Lösungsmittelpeak wurde von manueller Integration
betroffen. Eine solche tangentiale Peakanpassung
(Tangent Skim) wird als neuberechneter
Lösungsmittelpeak klassifiziert (Peakart).
Bei eingeschalteter Option Schultererkennung (shoulder detection) wird in
die Spalte “Type” ein vier-Buchstabencode eingefügt:
FSHO
Auf der Anstiegsflanke des Peaks wurde eine Schulter
entdeckt (Front Shoulder).
RSHO
Auf der Abstiegsflanke des Peaks wurde eine Schulter
entdeckt (Rear Shoulder).
Konstruktion einer modifizierten Basislinie
Unter bestimmten Bedingungen modifiziert der Integrator die Basislinie und
schließt Punkte durch Anwendung bestimmter Regeln (siehe Abbildung 7)
ein.
Abbildung 7
Konstrunktion einer modifizierten Basislinie
• Wenn ein Peak die Basislinie schneidet (BP und PB) geht die Basislinie
durch den niedrigsten Punkt des Peaks gemäß Punkt 1 in Abbildung 7.
• Wenn ein Lösungsmittelpeak nach Verwendung einer tagentialen
Anpassung nicht auf der Basislinie beginnt, wird die Basislinie durch einen
Punkt gelegt, der auf einer horizontalen Verlängerung des letzten
gefundenen Basislinienpunktes und dem Anfang des Lösungsmittelpeaks
85
Der Standardintegrationsalgorithmus
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
liegt, vgl. Punkt 2 in Abbildung 7. Die Buchstaben OSHB bedeuten
„Overflow solvent horizontal Basislinie" und besagen, daß das Signal den
linearen Bereich des Detektors überschritten hat.
• Wenn ein Peak in einem nachfolgenden Tal endet, der folgende Peak aber
die Vorgabe des Wertes für “Area Reject” (Mindestfläche) nicht erreicht,
wird die Basislinie vom Anfang des Peaks zum nächsten gefundenen
Basislinienpunkt gemäß Punkt 3 in Abbildung 7 gezogen. Bei einem
Peakstart unter denselben Umständen wird dieselbe Regel angewandt.
• Zur verbesserten Behandlung von Peaks mit Tailing werden die Zeiten
registriert, in welchen der Peak die Kriterien für Anstieg und Abfall
überschreitet und es wird ein Viertel dieser Zeit am Peakende zu diesem
Peak addiert, vgl. Punkt 4 in Abbildung 7.
Schneiden der Basislinie
Ein Schnittpunkt tritt auf, wenn das Signal unter die konstruierte Basislinie
fällt. Wenn ein Schnittpunkt mit der Basislinie vorliegt, wird dieser Teil der
Basislinie neu festgelegt.
Abbildung 8
Unterschreiten der Basislinie
ursprüng.
Basislinie
Korrektur für das Schneiden
Tangentiale Anpassung
Tangentiale Anpassung ist eine Möglichkeit der Basislinienkonstruktion für
Peaks, die auf der abfallenden Flanke eines Lösungsmittelpeaks erscheinen.
Der Integrator legt die Tangente durch den Talpunkt vor dem aufgesetzten
Peak zum Tangentenpunkt nach dem aufgesetzten Peak, wo die Steigung des
Signals gleich der Steigung der Tangenten ist.
86
Der Standardintegrationsalgorithmus
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
Abbildung 9
Tangentiale Anpassung
aufgesetzter
Peak
Tangentenpunkt
Talpunkt
Tang.
Anpassung
87
Der Standardintegrationsalgorithmus
Berechnung der Peakfläche
Berechnung der Peakfläche
Der letzte Schritt einer Integration besteht aus der Bestimmung der
Peakfläche.
Die Fläche, die der Integrator bei der Integration berechnet, wird
folgendermaßen bestimmt:
• bei Basislinien-getrennten (BB) Peaks liegt die Fläche oberhalb der
Basislinie zwischen den Strichmarkierungen,
Abbildung 10
Flächenbestimmung für Basislinien-getrennte Peaks,
• für nicht getrennte Peaks (Valley to Valley, VV) wird die Fläche oberhalb
der Basislinie durch Lotfällung zwischen den Strichmarkierungen
unterteilt,
Abbildung 11
Flächenbestimmung für Tal-zuTal-getrennte Peaks
• bei tangentialen Peaks (T) liegt die Fläche oberhalb der neu bestimmten
Basislinie,
88
Der Standardintegrationsalgorithmus
Berechnung der Peakfläche
• bei Lösungsmittelpeaks (S) liegt die Fläche oberhalb der horizontalen
Verlängerung vom letzten gefundenen Basislinienpunkt und unterhalb der
korrigierten Basislinie des tangentialen Peaks (T). Ein Lösungsmittelpeak
kann eventuell zu langsam ansteigen, um erkannt zu werden oder eine
Peakgruppe kann der Erfahrung zufolge ein Lösungsmittelpeak mit
einigen Aufsetzern sein. Dabei handelt es sich normalerweise um eine
Gruppe gemischter Peaks, wobei der erste Peak weit größer ist als der
Rest. Eine einfache Lotfällung ergäbe dann eine zu große Fläche für
spätere Peaks, weil sie nur auf dem ersten Peak aufsitzen. Durch
Erzwingen der Erkennung des ersten Peaks als Lösungsmittelpeak werden
die restlichen Peaks durch tangentiale Anpassung integriert.
Obwohl in CE-Analysen kein Lösungsmittelpeak auftritt, kann diese
Bezeichnung dennoch von der ChemStation für CE-Systeme für große Peaks
eingefügt werden.
Abbildung 12
Flächenbestimmung für Lösungsmittelpeaks und tangential abgetrennte Peaks
Lösungsmittelpeak
Tangentenpeak
• Negative Peaks liegen unterhalb der Basislinie und haben, wie in
Abbildung 13 gezeigt, eine positive Fläche.
89
Der Standardintegrationsalgorithmus
Berechnung der Peakfläche
Abbildung 13
Flächenbestimmung bei negativen Peaks
Totale Fläche
90
–
Fläche unter der Basislinie
=
Basislinien-korrigierte Fläche
Der Standardintegrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Integrationsparameter
Für den Integrator stehen vier Anfangsparameter und neunzehn
zeitprogrammierbare Parameter (Events) zur Verfügung. Viele Parameter
sind Paare und bestehen aus An und Aus bzw. Start und Stop.
Anfangsparameter (Initial events)
Anfängliche
Peakbreite
(Initial
Peakwidth)
Anfängliche Peakbreite in halber Höhe
Initial
Threshold
Minimale Signalhöhe zur Peakerkennung
Initial Area
Reject
Minimale Peakfläche zur Peakerkennung
Shoulder
Detection
Aktiviert (on) oder deaktiviert (off) die Erkennung von
Peakschultern
Peakbreite (Peak Width)
Der Standardintegrator berechnet die Peakbreite W mit Hilfe der folgenden
Formel (siehe Abbildung 14 für weitere Informationen):
A
W = 0.3 × ( t 2 + t 3 ) + 0.7 × ---H
mit:
t i = Zeitabschnitt
A = Peakfläche
H = Peakhöhe
Dies entspricht der Breite bei halber Höhe eines Gauss-Peaks, wobei t2 + t 3
und A ⁄ H identisch sind. Peaks mit Tailing weisen relativ zu ihrer
Halbwertbreite eine größere Breite auf, so daß die Berechnung der Anzahl
theoretischer Trennböden mit dieser Breite eine zu kleine Zahl ergibt.
Dennoch gibt der Integrator gute Werte für die Peakbreite überlappender
Peaks an.
91
Der Standardintegrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Abbildung 14
Peakbreitenberechnung
H
Wendepunkte
Hr
HF
Peakanfang
start of peak
tT1 1
endof peak
Peakende
a1
a2
2 2
tT
a3
t3T 3
a4
Tt44
baseline
Zeit
tim
e
Die Voreinstellung der Peakbreite steuert die Selektivität des Integrators in
der Unterscheidung zwischen Peaks und Basislinienrauschen. Eine geeignete
Voreinstellung ist die Halbwertbreite eines einzelnen Peaks in Minuten.
Eine gute Einstellung der Peakbreite soll Rauschen mindestens so gut
ausfiltern, daß im Rauschen keine Peaks gefunden werden, und andererseits
die chromatographische bzw. elektrophoretische Information nicht verzerrt
wird. Bei einer zu geringen Einstellung der Peakbreite, wird Rauschen als
Peak interpretiert.
Die anfängliche Peakbreite soll der Breite des schmalsten Peaks
entsprechen. Normalerweise nehmen die Peakbreiten in isokratischen bzw.
isothermen Analysenläufen mit der Retentionszeit zu. In solchen Fällen
könnte es erforderlich sein, die Peakbreite im Dialogfeld Integration Events
für einen Analysenlauf dieser Verbreiterung anzupassen. Es können auch
breitere und schmalere Peaks gemischt auftreten. Die Peakbreite kann im
Dialogfeld “Integration Events” mit “Peak Width Event” zeitprogrammiert
werden, um erforderliche Anpassungen vorzunehmen.
Die Peakbreite wird während der Integration automatisch aktualisiert, wenn
Peaks identifiziert werden. Die Aktualisierung geschieht mit folgender
Gewichtung:
0.75 × existing peak width + 0.25 × width of current peak
Die Aktualisierung ist auf eine Änderung von 25 % beschränkt. Bei
Verwendung eines zeitprogrammierten Integrationsparameters im
Integrationsprozess wird die automatische Anpassung der Peakbreite
deaktiviert.
92
Der Standardintegrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Peak Width Range (Peakbreitenbereich)
Der Peakbreitenbereich ist ein Bereich, innerhalb dessen ein Peak erkannt
wird. Ein Peak mit einer Breite oberhalb oder unterhalb dieser Grenze wird
nicht als Peak erkannt, vgl. Abbildung 15. Die Größe dieses Bereiches hängt
vom Signal-Rausch Verhältnis ab. Bei einem guten Signal-Rausch Verhältnis,
zum Beispiel 100:1 oder darüber, beträgt die Untergrenze des
Breitenbereiches etwa ein Drittel und die Obergrenze etwa den dreifachen
Wert der Breite des angegebenen Peaks. Bei einem schlechten
Signal-Rausch-Verhältnis, zum Beispiel 5:1, wird der Bereich der Peakbreite
auf 90 % bzw. 110 % der Breite des fraglichen Peaks reduziert.
Threshold (Schwellenwert)
Der Schwellenwert steuert die Rauscherkennung für die Integration.
Der Schwellenwert legt eine minimale Signalhöhe fest. Peaks, die eine
geringere Höhe als den Schwellenwert aufweisen, werden vom Integrator
ignoriert. Umso höher der Schwellenwert gewählt wird, desto höher muß ein
Datenpunkt über der erkannten Basislinie liegen, damit ein Peakstart erkannt
wird.
Der Schwellenwert wird mit folgender Formel errechnet:
Threshold = c2
n–6
mit:
c eine Konstante ist, deren Wert vom Detektor abhängt, und
n dem Schwellenwert entspricht.
Der Schwellenwert basiert auf einer Skala, die von -20 bis 25 reicht. Die
folgende Tabelle zeigt den Zusammenhang zwischen der Einstellung des
Schwellenwertes und der Signalintensität (mAU) der Detektoren, die mit der
ChemStation eingesetzt werden können. Es handelt sich dabei um folgende
Detektoren: den HP 1090 Dioden-Array-Detektor, den Agilent CE
Dioden-Array-Detektor, den HP 1046 Fluoreszenzdetektor, den HP 1050
Dioden-Array-Detektor, den variablen Wellenlängendetektor der HP 1050
Serie und den HP 1050 Multiwellenlängendetektor. Beim Zweikanal
A/D-Wandler Agilent 35900C/D/E werden dieselben Werte in der Einheit mV
angewandt.
Der Schwellenwert sollte nicht dazu verwendet werden, Peaks
auszuschließen, deren Höhe mit den kleinsten interessierenden Peaks
vergleichbar ist, weil dieser Parameter dafür nicht ausgelegt ist. Zum
93
Der Standardintegrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Tabelle 1
Schwellenwerte für LC Detektoren
Einstellung
LC Detektor (mAU) A/D-Wandler (mV)
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0.03125
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
31
62
125
250
500
1000
Ausschluß kleiner Peaks wird der Einsatz der Funktion “Area Reject”
(Mindestfläche) empfohlen.
Area Reject (Mindestfläche)
Die Einstellung der Mindestfläche schließt Peaks aufgrund ihrer Fläche aus.
Peaks, deren Flächen kleiner sind als die Mindestfläche, werden nicht in den
Report aufgenommen.
Shoulder Detection (Schultererkennung)
Bei aktivierter Schultererkennung benutzt der Integrator einen erweiterten
Algorithmus, der auch Schultern eines Peaks erkennen kann.
Anpassung von Schwellenwert und Peakbreite
Sowohl Peakbreite als auch Schwellenwert sind wichtige Vorgaben für die
Integration. Veränderungen führen zu anderen Ergebnissen.
• Eine Erhöhung von sowohl Schwellenwert als auch Peakbreite sind
nützlich, wo dominante Komponenten bei starkem Rauschen entdeckt und
quantifiziert werden müssen. Eine Erhöhung der Peakbreite führt zu einer
94
Der Standardintegrationsalgorithmus
Integrationsparameter
stärkeren Filterung des Signals und eine Erhöhung des Schwellenwertes
stellt sicher, daß das Rauschen ignoriert wird.
• Eine Reduzierung von Schwellenwert und Peakbreite sind zur Entdeckung
und Quantifizierung von Spurenkomponenten nützlich, deren Höhen mit
der Rauschhöhe vergleichbar sind. Eine Reduzierung der Peakbreite führt
zu schwächerer Signalfilterung, die Reduzierung des Schwellenwertes
stellt sicher, daß kleine Peaks nicht aufgrund einer zu geringen Höhe
ignoriert werden.
• Wo sowohl breite, als auch schmale Peaks detektiert und quantifiziert
werden müssen, ohne daß die Peakbreite individuell angepaßt wird, sollte
eine schmale Peakbreite eingestellt werden und der Schwellenwert sollte
ebenfalls reduziert werden.
95
Der Standardintegrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Anpassung der Integration
Oft ist es nützlich, die Werte für Peakbreite, Schwellenwerte und
Mindestfläche so zu ändern, daß Sie eine optimierte Integration Ihres Signals
erhalten.
Abbildung 15 zeigt den Einfluß von Schwellenwert, Peakbreite und
Mindestfläche auf die fünf Peaks des Chromatogramms.
Abbildung 15
Verwendung von Anfangsparametern
Obere Grenze des Bereiches der Peakbreite
Untere Grenze des Bereiches der Peakbreite
Mindestfläche
=80
Peakbreite
Schwelle
Tabelle 2
Flächenwerte
Peak 1
Peak 2
Peak 3
Peak 4
Peak 5
Peak 6
110
50
200
32
30
241
Ein Peak wird nur integriert, wenn die Vorgaben aller drei
Integrationsparameter erfüllt werden. Mit der Peakbreite des Peaks 3, der
96
Der Standardintegrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Mindestfläche und des Schwellenwertes aus Abbildung 15 werden nur die
Peaks 1 und 3 integriert.
Tabelle 3
Schwellenwerte
Integrationsparam
eter
Peak 1
Peak 2
Peak 3
Peak 4
Peak 5
Peak 6
Schwelle
darüber
darüber
darüber
darunter
darüber
darüber
Peakbreitenbereich
innerhalb innerhalb innerhalb innerhalb darunter
darüber
Mindestfläche
darüber
darunter
darüber
darunter
darunter
darüber
Peak integriert
ja
nein
ja
nein
nein
nein
Peak 1
wird integriert, da alle drei Vorgaben erfüllt werden.
Peak 2
wird nicht integriert, da die Fläche nicht die Mindestfläche
erreicht.
Peak 3
wird integriert, da alle drei Vorgaben erfüllt werden.
Peak 4
wird nicht integriert, weil die Peakhöhe den
Schwellenwert nicht übertrifft.
Peak 5
wird nicht integriert, weil die Peakbreite die Untergrenze
des Bereiches der Peakbreite nicht erreicht.
Peak 6
wird nicht integriert, weil die Peakbreite den Wert der
Obergrenze überschreitet.
Zeitprogrammierbare Parameter (Timed Events)
Sie können die Konstruktion der Basislinie mit zeitabhängigen
Integrationsparametern optimieren, wenn die standardmäßige Konstruktion
nicht ausreicht. Diese Parameter können zur Bestimmung der endgültigen
Peakflächen und zur Korrektur schneller oder langsamer Abweichungen der
Basislinie dienen. Weitere Informationen zu Integrationsparametern finden
Sie in Ihrer Online-Hilfe.
97
Der Standardintegrationsalgorithmus
Tabellen mit Integrationsparametern
Tabellen mit Integrationsparametern
Jedes Signal (Chromatogramm oder Elektropherogramm), das mit einer
bestimmten Methode erfaßt wurde, kann über seine eigenen
Integrationsparameter verfügen, die in einer Tabelle zur Signalintegration
eingestellt werden. Diese Tabellen werden nicht benutzt, bis sie speziell
eingerichtet werden:
• Anwender können diese auswählen und Parameter im Dialogfeld
“Integration Events” definieren.
• Anwender können “Autointegrate” wählen, wodurch die Parameter für
jedes Signal optimiert werden.
Falls die individuelle Parametertabelle des Signals nicht benutzt wird,
werden alle Signale mit der Standardtabelle der Integrationsparameter
integriert.
98
Der Standardintegrationsalgorithmus
Integrationsmethoden
Integrationsmethoden
Die ChemStation bietet folgende Integrationsmethoden:
• Autointegration,
• Integration
• manuelle Integration
99
Der Standardintegrationsalgorithmus
Autointegration
Autointegration
Die Autointegration untersucht den vorderen und den hinteren Bereich eines
Chromatogramms, um ein Maß für das Rauschen abzuschätzen und
entsprechende Anfangseinstellungen für den Schwellenwert (Threshold) und
die Mindestfläche (Area Reject) festzulegen. Außerdem bestimmt die
Autointegration auch einen temporären Wert für die Peakbreite (Peak
Width), der von der Laufzeit und den unteren Detektionskriterien abhängt.
Mit einem Wert für "Area Reject" von null wird probeweise eine Integration
durchgeführt.
Wenn bei der probeweisen Integration keine Peaks erkannt werden, erfolgt
eine Anpassung der Parameter und es wird erneut integriert. Diese
Integration auf Probe kann, so notwendig, mehrere Male wiederholt werden.
Aus den Breiten der ersten gefundenen Peaks wird die Anfangseinstellung
für die Peakbreite ermittelt, die die Autointegration für das bearbeitete
Chromatogramm verwendet.
Begrenzung
Die Autointegration ist eine nützliche Startplattform für die Integration der
meisten Chromatogramme und die ersten Schritte der Methodenentwicklung.
Allerdings sollte die Autointegration nicht als Ersatz für eine gute
Probenvorbereitung oder Chromatographie verstanden werden.
Die Autointegration bestimmt Werte für den Anfang des Chromatogramms,
was die Fähigkeit der Autointegration beschränkt, mit ungewöhnlichen
Peaks umzugehen, die später im Chromatogramm auftreten können.
100
Der Standardintegrationsalgorithmus
Autointegration
Mit der Autointegration kann es bei Chromatogrammen, die Störungen oder
Peaks zu Beginn oder am Ende aufweisen, zu Problemen kommen.
Dabei sind folgende Störungen denkbar:
• umgekehrte Peaks
• Störungen oder Einschwingen der Basislinie (Ventil- oder
Signalschaltungen)
• ansteigende Basislinie am Ende eines Laufs (Säulenbluten)
Wenn die Autointegration allein keine zufriedenstellenden Ergebnisse liefert,
können zusätzliche Integrationsparameter programmiert werden. Im obigen
Chromatogramm wurden folgende zeitprogrammierten
Integrationsparameter verwendet.
Integrator Off
Integrator On, Baseline All Valleys
Set Baseline
Mit Hilfe der zeitabhängigen Integrationsparameter kann
Autointegrate-Funktion gute Ergebnisse liefern.
101
Der Standardintegrationsalgorithmus
Integration
Integration
Das Signal wird entsprechend der Integrationsparametertabelle integriert.
Sie können diese Tabelle zur Optimierung der Integrationsergebnisse für eine
nachfolgende Reintegration verwenden.
Sowohl Autointegrate als auch Integrate liefern Integrationsergebnisse.
Autointegrate berechnet jedoch automatisch Anfangswerte von
Schwellenwert und Peakbreite. Über “Edit Integration” können Sie Werte für
diese Parameter vorgeben oder die Standardwerte zu verwenden.
102
Der Standardintegrationsalgorithmus
Manuelle Integration
Manuelle Integration
Dieser Integrationstyp ermöglicht Ihnen die Integration ausgewählter Peaks
oder Peakgruppen. Mit Ausnahme des anfänglichen Wertes für die
Mindestfläche werden im Bereich der manuellen Integration die
Parametertabellen der ChemStation ignoriert.
Die manuelle Integration erlaubt Ihnen die Definitionen von Peakstart und
Peakende und die Einbeziehung der damit ermittelten Peakflächen in die
Quantifizierung und Reporterstellung. Manuell integrierte Peaks werden in
einem Report mit dem Code M markiert.
Die manuelle Integration bietet folgende Möglichkeiten:
Draw Baseline
(Basislinie
ziehen)
Es wird festgelegt, wo die Basislinie für einen Peak oder
eine Peakgruppe verläuft. Sie können außerdem angeben,
ob die Peaks dieses Bereiches an allen Talpunkten
automatisch getrennt werden sollen.
Negative Peaks Es wird festgelegt, wann Flächen unterhalb der Basislinie
als negative Peaks behandelt werden. Sie können
außerdem angeben, ob die Peaks dieses Bereiches an allen
Talpunkten automatisch getrennt werden sollen.
Tang.
Anpassung
Es werden die Flächen von Peaks bestimmt, indem sie
durch tangentiale Anpassung von der Flanke eines
Hauptpeaks abgetrennt werden. Sie können außerdem
angeben, ob die Peaks dieses Bereiches an allen
Talpunkten automatisch getrennt werden sollen. Die
Fläche des tangential abgetrennten Peaks wird von der
Fläche des Hauptpeaks abgezogen.
Split Peak
(Peaktrennung) Angabe des Punktes, an dem ein Peak durch Lotfällung
abgetrennt wird.
All Valleys (Alle
Talpunkte)
All Valleys ist ein aktiver oder inaktiver Menüpunkt. Wenn
er aktiv ist, werden Peaks an allen Talpunkten im Bereich
der manuellen Integration abgetrennt, wenn einer der
103
Der Standardintegrationsalgorithmus
Manuelle Integration
Menüpunkte Draw Baseline, Negative Peaks oder Tangent
Skim verwendet wird.
Trace Mode
(Verfolgen des
Signals)
Löschen von
Peaks
Aktiviert einen vertikalen Pfeilcursor, der nicht vom Signal
getrennt werden kann. Damit wird sichergestellt, daß
Start- und Endpunkte des Peaks auf dem Chromatogramm
oder Elektropherogramm liegen.
Löscht einen oder mehrere Peaks aus den
Integrationsergebnissen.
Kodierung zur Peaktrennung
• Manuell integrierte Peaks werden im Integrationsreport mit der Kodierung
MM markiert.
• Falls vor dem manuell integrierten Peak ein Peak erscheint, dessen Ende
wegen diesem Peak verändert wird, trägt er die Kodierung F (für forced,
erzwungen).
• Ein Lösungsmittelpeak, der durch manuelle Integration beeinflußt wurde,
zum Beispiel durch tangentiale Anpassung, trägt die Kodierung R (für
re-calculated solvent, neuberechneter Lösungsmittelpeak) anstatt S.
Vorgehensweise in der manuellen Integration
• Der erste Schritt einer manuellen Integration besteht in der Wahl eines
Signalbereiches zur manuellen Integration. Dies geschieht durch
Herausvergrößern (zoomen) des interessierenden Bereiches.
• Im nächsten Schritt wird Draw Baseline, Negative Peaks, Tangent Skim
oder Delete Peak(s) gewählt.
• Die Basislinie kann nun gezeichnet werden, indem die Maus mit
gedrückter linker Maustaste bewegt wird. Während der Mausbewegung
wird eine Linie vom Startpunkt bis zur aktuellen Position der Maus
gezeichnet. Im Falle von Delete Peak(s) wird ein Auswahlrechteck um die
zu löschenden Peaks geöffnet.
• Die graphische Eingabe kann in den zwei Modi Absolute (das ist der
Standardwert) und Trace (Verfolgen des Signals) erfolgen. In beiden Fällen
wird in der Mitteilungszeile die Zeit und die Höhe des Cursors angezeigt.
104
Der Standardintegrationsalgorithmus
Manuelle Integration
• Im Modus “Trace” ist der Cursor ein abwärts weisender Pfeil und folgt dem
Profil des Signals indem er sich von Datenpunkt zu Datenpunkt bewegt.
Sie können den Trace-Modus aktivieren, wenn sich der Cursor am
gewünschten Peakstart befindet, indem Sie den rechten Mausknopf
drücken.
• Im Modus “Absolute” ist der Cursor ein Fadenkreuz und folgt dem Signal,
erlaubt jedoch eine Positionierung an jeder Stelle des Bildschirmes. Sie
können von einem Modus in den anderen umschalten, indem Sie den
rechten Mausknopf drücken.
• Für jeden manuell integrierten Peak werden die Flächenwerte (Area
Counts) zusammen mit der Retentions- bzw. Migrationszeit auf dem
Bildschirm angezeigt.
Einfügen manueller Parameter in die Methode
Der Befehl “Copy Manual Events to Method” im Menü Integration ermöglicht
Ihnen das Einfügen Ihrer manuell definierten Integration in die aktuelle
Methode. Diese manuellen Parameter werden in der Methode separat
gespeichert. Sie können im Dialogfeld “Integration Events” nicht eingesehen
werden. Nach Laden eines Signales werden sie nur durch Aktivieren von
“Apply Manual Integration Events” im Dialogfeld “Integration Events” oder
durch Wahl von “Apply Manual Events from Method” im Menü “Integration”
angewendet.
Die manuellen Integrationsparameter verwenden absolute Zeitfenster. Sie
führen keine Anpassung bei einer Signalverschiebung durch.
105
Der Standardintegrationsalgorithmus
Manuelle Integration
106
6
6
Der neue
Integrationsalgorithmus
Der neue
Integrationsalgorithmus
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Der neue Integrator
• Wie wird der neue Integrator an eine Konfiguration angepaßt?
• Ein Überblick über die Funktionen des neuen Integrators
• Integrieren von Peaks in der Praxis
• Mehr über den neuen Integrator
• Basislinienzuweisung
• Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
• Tangentiale Anpassung von Peaks
• Berechnung der Peakfläche
• Integrationsparameter
• Anwendung des neuen Integrators
108
Der neue Integrationsalgorithmus
Der neue Integratoralgorithmus
Der neue Integratoralgorithmus
Der neue Integratoralgorithmus zielt auf bessere bessere Robustheit,
Zuverlässigkeit und Anwenderfreundlichkeit ab und wurde in der Version
A.04.01 der ChemStation vorgestellt. In dieser Version der Software
empfiehlen wir den Einsatz des Standard-Algorithmus' für bereits
vorhandene validierte Methoden und des neuen Algorithmus' für neue
Methoden.
109
Der neue Integrationsalgorithmus
Wie wird der neue Integrator an eine Konfiguration angepaßt?
Wie wird der neue Integrator an eine
Konfiguration angepaßt?
Der neue Integrator wurde für optimale Integration unterschiedlicher
Analysensysteme (LC, GC, CE) entwickelt. Zu diesem Zweck beinhaltet er
• festgelegte Integrationsparameter und
• veränderbare Integrationsparameter.
Festgelegte Integrationsparameter
Festgelegte Integrationsparameter können nicht über den normalen
Benutzerzugriff verändert werden. Die meisten dieser Parameter wurden von
Agilent Technologies für eine bestimmte Hardware/Software-Konfiguration
festgelegt. Allerdings werden einige davon über Informationen aus den
Methoden und Datensätzen bestimmt.
Für verschiedene chromatographische Systeme muß das Peakmaximum
unterschiedlich berechnet werden. Der neue Integrator berechnet z.B. das
Peakmaximum über eine der folgenden Methoden: Er kann den höchsten
Datenpunkt, eine quadratische Anpassung, den ersten Moment oder eine
Gaußanpassung verwenden. Die geeignete Berechnungsart wird festgelegt,
um den Integrator für die jeweilige Hardware (Detektor, Säulenart usw.) und
die Anwendung zu optimieren.
Wir haben die Berechnung des Peakmaximums gewählt, um das Konzept der
festgelegten Integrationsparameter zu veranschaulichen. Gegenwärtig gibt es
mehr als ein Dutzend weiterer festgelegter Parameter, die allerdings für die
meisten Anwender als unveränderlich betrachtet werden sollten. Erfahrene
Anwender können über den Einsatz geeigneter Makros auf sie zugreifen, was
im Macro Programming Guide beschrieben ist.
Veränderliche Integrationsparameter
Die veränderlichen Integrationsparameter lassen sich dadurch als solche
erkennen, daß sie für den Anwender zugänglich sind.
Zu den veränderbaren Integrationsparametern gehören:
• Integrationsparameter, die vom Anwender vor einer Analyse festgelegt
werden (wie Initial Area Reject, Initial PW, usw) und
• Parameter, die zeitabhängig verändert werden können.
110
Der neue Integrationsalgorithmus
Funktion des verbesserten Integrators
Funktion des verbesserten Integrators
Wenn Sie die Integrationsvorgänge in ihre grundsätzlichen Schritte trennen,
muß der verbesserte Integrator genauso funktionieren wie jeder Integrator.
Die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Integrationsergebnisse hängt
davon ab, wie der Integrator die einzelnen Integrationsschritte ausführt.
Der Integrator führt beim Integrieren der Peaks folgende Schritte durch:
• er bestimmt die anfängliche Basislinie,
• er verfolgt den Verlauf der Basislinie und legt sie neu fest,
• er erkennt den Peakanfang und markiert ihn mit einer vertikalen
Strichmarkierung,
• er findet das Peakmaximum und legt die Retentions- bzw. Migrationszeit
ab,
• er erkennt das Peakende und markiert es mit einer vertikalen
Strichmarkierung,
• er konstruiert eine Basislinie,
• er berechnet für jeden Peak die Fläche, Höhe und Peakbreite.
Dieser Vorgang wird mit den sogenannten Integrationsparametern
kontrolliert. Die wichtigsten Parameter sind die anfängliche
Steigungsempfindlichkeit (Slope Sensitivity), Peakbreite (Peak Width) und
Mindesthöhe (Height Reject). Die ChemStation ermöglicht die Eingabe von
Anfangswerten für diese und andere Parameter. Die Werte gelten für den
Beginn eines Signaldatensatzes.
In den meisten Fällen genügen diese Werte für eine gute Integration des
gesamten Signals. Es können jedoch Fälle auftreten, wo Sie eine Integration
auf bestimmte Weise durchführen wollen.
Zur weiteren Optimierung einer Integration gibt es folgende Möglichkeiten:
• die Verwendung der zeitprogrammierten Parameter der ChemStation
• die Verwendung eines Makros, um die Funktionsweise des Integrators
anzupassen.
111
Der neue Integrationsalgorithmus
Funktion des verbesserten Integrators
Weitere Informationen finden Sie unter dem Abschnitt "Einstellungen der
festen Parameter für den neuen Integrator und im Macro Programming
Guide, der über die Online-Hilfe verfügbar ist.
Definition der Anfangsbasislinie
Der Integrator verwendet Parameter aus der Methode und den Datensätzen,
um die Basislinie für die jeweilige Anwendung zu optimieren.
Bevor der Integrator damit beginnen kann, die Peaks zu integrieren, versucht
er einen Punkt auf der Basislinie zu bestimmen. Zu Beginn der Analyse
richtet der Integrator einen Anfangslevel für die Basislinie ein, wobei der
erste Punkt des Signals als vorläufiger Basislinienpunkt verwendet wird.
Danach versucht er den Anfangswert der Basislinie bezogen auf den
Mittelwert des ankommenden Signals neu zu definieren. Wenn der Integrator
keinen neu definierten Anfangswert für die Basislinie erzielt, behält er den
Wert des ersten Datenpunktes als möglichen Anfangswert für die Basislinie
bei.
Basislinienauswertung
Der Integrator betrachtet die digitalen Daten in Intervallen entsprechend der
anfänglichen Peakbreite oder im Lauf der Analyse anhand der berechneten
Peakbreite. Er behandelt jeden Datenpunkt als möglichen Basislinienpunkt.
Um als Basislinienpunkt zu gelten, muß ein Datenpunkt folgende
Bedingungen erfüllen:
• der Datenpunkt muß innerhalb des festgelegten Basislinienbereiches
liegen
• die Krümmung der Basislinie am Datenpunkt (bestimmt über die zweite
Ableitung) muß unterhalb des kritischen Wertes liegen, der von der
aktuellen "Slope Sensitivity" (Steigungsempfindlichkeit) festgelegt wird.
Der Integrator legt einen Basislinienbereich mittels der Steigung der
Basislinie unter Verwendung des Algorithmus’ der Basislinienauswertung
fest. Die Steigung wird dabei über die erste Ableitung und die Krümmung
über die zweite Ableitung bestimmt.
Der Anfangswert der Basislinie, der zu Beginn der Analyse festgelegt wurde,
wird dann immer wieder neu bestimmt, wobei das Bestimmungsintervall von
der Peakbreite abhängt. Der Wert für die Basislinie ergibt sich dann aus dem
sich ändernden Mittelwert der Datenpunkte, die über einen von der
Peakbreite abhängigen Zeitraum innerhalb des Basislinienbereiches liegen.
112
Der neue Integrationsalgorithmus
Funktion des verbesserten Integrators
Der Integrator verfolgt den Lauf der Basislinie und legt ihren Wert periodisch
neu fest, um ein mögliches Abdriften der Basislinie zu kompensieren, bis ein
Peakanstieg, wie in Abbildung 16 dargestellt, erkannt wird.
Basislinienbestimmung
Der Integrator bestimmt während der Analyse die chromatographische
Basislinie in regelmäßigen Abständen neu. Der Wert für die Peakbreite legt
die Häufigkeit der Basislinienbestimmung fest. Wenn der Integrator eine
bestimmte Anzahl an Datenpunkten gemittelt hat, legt er den Wert für die
Basislinie vom anfänglichen Wert auf den Wert des aktuellen Datenpunktes.
Der Integrator verfolgt den Basislinienverlauf über den nächsten Datensatz
und stellt den Wert für die Basislinie erneut ein. Dieser Vorgang wird solange
fortgeführt, bis der Integrator den Startpunkt eines Peaks erkennt.
Abbildung 16
Basisinie
Legende
Erwartete Peakbreite
Anfangswert der Basislinie
Datanpunkt
Aktueller Wert
T
Startpunkt
T
T
T
T
T
T
2T
2T
Einstellung der
Basislinie
2T
2T
Erkennen von Peakanfang, -ende und -maximum
Der Integrator erkennt einen eventuellen Peakanfang daran, daß mögliche
Basislinienpunkte außerhalb des Basislinienbereiches liegen und die
Krümmung der Basislinie einen durch den Integrationsparameter "slope
sensitivity" (Steigungsempfindlichkeit) bestimmten Wert überschreitet. Wird
diese Bedingung weiterhin erfüllt, erkennt der Integrator definitiv, daß er
sich auf einem Peakanstieg befindet und der Peak wird nach folgendem
Schema behandelt. Siehe Abbildung 17.
Peakanfang —
113
Der neue Integrationsalgorithmus
Funktion des verbesserten Integrators
1 Steigung und Krümmung unter Schwellenwert: Basislinie prüfen.
2 Steigung und Krümmung über Schwellenwert: Möglichkeit eines Peaks.
3 Steigung bleibt über Schwellenwert: Peak erkannt, Kardinalpunkt
festgelegt.
4 Krümmung wird negativ: Wendepunkt der Anstiegsflanke.
Peakmaximum —
5 Steigung wird negativ: Peakmaximum, Kardinalpunkt festgelegt.
6 Krümmung wird positiv: Wendepunkt der Abstiegsflanke.
Peakende —
7 Steigung und Krümmung unter Schwellenwert: Peakende erreicht.
8 Steigung und Krümmung unter Schwellenwert: Peakende erreicht,
Kardinalpunkt festgelgegt.
9 Integrator kehrt in den Modus zur Basislinienauswertung zurück.
Abbildung 17
Integrierter Peak
5
4
2
6
7
1
8
3
Kardinalpunkte sind Punkte, die der Integrator auswählt, um einen Peak zu
definieren und zu quantifizieren. Basislinienpunkte, Talpunkte,
Peakmaximum und Wendepunkte werden als Kardinalpunkte festgelegt und
gespeichert. Jeder Kardinalpunkt erhält eine horizontale Koordinate in Form
der abgelaufenen Zeit und eine vertikale Koordinate in Form der Höhe von
der Basislinie aus betrachtet sowie andere Parameter, die der Integrator zur
Berechnung der Peakflächen verwendet.
114
Der neue Integrationsalgorithmus
Integrieren von Peaks in der Praxis
Integrieren von Peaks in der Praxis
In der Praxis muß der Integrator normalerweise mit mehr als einem
komplizierten chromatographischen Problem umgehen können. Die Größe
der Peaks kann innerhalb einer Analyse stark variieren, wobei die
interessierenden Peaks oft nur geringe Konzentrationen aufweisen.
Störungen wie Systemrauschen, Driften und Wandern können die Basislinie
beeinflussen, von der aus der Integrator die Peakflächen und -höhen
bestimmt. Außerdem kann es manchmal unmöglich sein, die Peaks durch
einen chromatographischen Vorgang vollständig zu trennen. Wann immer
möglich sollte die Chromatographie so weit optimiert sein, daß es zu einer
vollständigen Trennung kommt. Wenn dies aus irgendwelchen Gründen nicht
möglich ist, muß der Integrator mit überlappenden Peaks umgehen können.
Die Integration komplexer Chromatogramme ist nicht immer einfach. Der
neue Integrator kann eine schlechte Chromatographie zwar nicht
ausgleichen, aber er kann Rauschen, Driften oder eine unvollständige
Peaktrennung besser ausgleichen und somit für schwierige
Chromatogramme reproduzierbare Ergebnisse erzielen.
115
Der neue Integrationsalgorithmus
Mehr über den neuen Integrator
Mehr über den neuen Integrator
Nun soll genauer betrachtet werden, wie der Integrator den Peakanfang, das
Peakmaximum und das Peakende erkennt, wie er die Kardinalpunkte für die
Basislinienbestimmung festlegt und wie die Flächen berechnet werden.
Der Integrationsprozess besteht aus folgenden Schritten:
• Peakerkennung (Definition der Kardinalpunkte)
• Basislinienbestimmung
• Berechnung der Peakfläche
116
Der neue Integrationsalgorithmus
Peakerkennung
Peakerkennung
Der neue Integrator verwendet verschiedene Mittel, um einen Peak zu
erkennen:
• Peakbreite
• Peakerkennungsfilter
• Bündeln (Bunching)
• Peakerkennungsalgorithmus
• Algorithmus für das Peakmaximum
• Berechnungen zu Abweichungen von der Gauß-Kurve (Tailing,
überlappende Peaks, usw.)
Peakbreite
Die Voreinstellung der Peakbreite steuert die Selektivität des Integrators in
der Unterscheidung zwischen Peaks und Basislinienrauschen. Um gute
Leistungen zu erzielen, muß die Peakbreite auf einen Wert eingestellt
werden, der der tatsächlichen Breite der Chromatographiepeaks nahe
kommt.
Die Peakbreite kann auf drei Arten verändert werden:
• vor der Analyse, kann der Anwender die anfängliche Peakbreite
bestimmen,
• während der Analyse vergibt der Integrator automatisch neue Werte für
die Peakbreite, sobald dies zum Einhalten der Peakerkennungsfilter
notwendig ist,
• während der Analyse kann die Peakbreite mit Hilfe einer zeitabhängigen
Programmierung eingestellt oder verändert werden.
Peakerkennungsfilter
Der Integrator verwendet drei Peakerkennungsfilter als Mittel zur
Peakerkennung, wobei er Veränderungen der Steigung und Krümmung
innerhalb einer Reihe aufeinanderfolgender Datenpunkte erkennt. Diese
Filter enthalten die erste Ableitung (zur Bestimmung der Steigung) und die
117
Der neue Integrationsalgorithmus
Peakerkennung
zweite Ableitung (zur Bestimmung der Krümmung) der vom Integrator
untersuchten Datenpunkte. Die Erkennungsfilter sind wie folgt definiert:
Filter 1
Steigung und Krümmung zweier aufeinanderfolgender
Datenpunkte
Filter 2
Steigung und Krümmumg von vier aufeinanderfolgenden
Datenpunkten
Filter 3
Steigung und Krümmumg von acht aufeinanderfolgenden
Datenpunkten
Der gerade verwendete Filter hängt von der Einstellung für die Peakbreite
ab. Beispielsweise kann zu Beginn einer Analyse Filter 1 verwendet werden.
Würde die Peakbreite im Lauf der Analyse ansteigen, kämen Filter 2 und
möglicherweise Filter 3 zum Einsatz. Um gute Leistungen zu erzielen, muß
die Peakbreite auf einen Wert eingestellt werden, der der tatsächlichen Breite
der Chromatographiepeaks nahe kommt. Wenn notwendig vergibt der
Integrator während der Analyse neue Werte für die Peakbreite, um die
Integration zu optimieren.
Der neue Integrator kann je nach Gerät die neuen Werte für die Peakbreite
auf verschiedene Arten berechnen:
Für LC/CE-Konfigurationen, berechnet der neue Integrator die Peakbreite
standardmäßig über folgende zusammengesetzte Formel:
(0,3 × (rechter Wendepunkt – linker Wendepunkt) + 0,7 × Fläche/Höhe).
Für GC-Konfigurationen berechnet der neuer Integrator die Peakbreite
standardmäßig als Verhältnis von Fläche/Höhe. Diese Berechnung führt zu
keiner Überschätzung der Breite, wenn die Peaks oberhalb der halben Höhe
überlappen.
Bei manchen Analysen können die Peaks im Analysenverlauf deutlich breiter
werden. Diese Charakteristik ist typisch für isothermische GC- und
isokratische LC-Analysen. Um dies auszugleichen, vergibt der Integrator
automatisch neue Werte für die Peakbreite, sowie die Peaks im Laufe einer
Analyse breiter werden. Er führt dies automatisch durch, bis die Funktion
ausgeschaltet oder durch eine zeitabhängige Programmierung ein
bestimmter Wert eingestellt wird.
Die neue Einstellung für die Peakbreite wird folgendermaßen gewichtet:
[ 0.75 × ( existing peak width ) + 0.25 × ( width of current peak ) ]
Wenn die Peakbreite durch eine zeitabhängige Programmierung eingestellt
wird, wird die automatische Peakbreitenanpassung deaktiviert.
118
Der neue Integrationsalgorithmus
Peakerkennung
Bündeln (Bunching)
Der Integrator kann die Peakbreite bei Verbreiterung der Peaks nicht
unendlich heraufsetzen. Die Peaks könnten dabei so breit werden, daß sie
von den Peakerkennungsfiltern nicht mehr erkannt werden. Um das Problem
dieser Begrenzung zu umgehen, verwendet der Integrator das Bündeln
(Bunching). Durch das Bündeln der Datenpunkte verringert der Integrator
die Breite der Peaks beträchtlich und erhält dennoch dieselbe Peakfläche.
Bündeln ist demnach das Mittel mit dem der Integrator breiter werdende
Peaks innerhalb des Bereiches des Peakerkennungsfilters hält und so eine
gute Selektivität sicher stellt.
Wenn es aktiviert ist, wird das Bündeln in Abhängigkeit von der erwarteten
oder erfahrungsgemäßen Peakbreite durchgeführt. Der Algorithmus für das
Bündeln ist in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Tabelle 4
Kriterien für das Bündeln
erwartete Peakbreite (T)
verwendeter Filter
Bündeln durchgeführt
0 – 10 Datenpunkte
erster
nicht
8 – 16 Datenpunkte
zweiter
nicht
12 – 24 Datenpunkte
dritter
nicht
16 – 32 Datenpunkte
zweiter
einmal
24 – 48 Datenpunkte
dritter
einmal
32 – 96 Datenpunkte
dritter, zweiter
zweimal
64 – 192 Datenpunkte
dritter, zweiter
dreimal
Der Peakerkennungsalgorithmus
Der Integrator erkennt den Peakanfang anhand eines Basislinienpunktes, der
durch den Peakerkennungsalgorithmus bestimmt wurde. Der
Peakerkennungsalgorithmus vergleicht zunächst die Ausgangswerte aus den
Peakerkennungsfiltern mit der anfänglichen "Slope Sensitivity"
(Steigungsempfindlichkeit), um den Anstiegsakkumulator zu erhöhen oder
zu senken. Wenn sein Wert ≥ 15 beträgt, legt der Integrator diesen Punkt als
Indikator für einen Peakanfang fest.
Der Peakerkennungsalgorithmus ist in Tabelle 5 und Tabelle 6
zusammengefaßt.
119
Der neue Integrationsalgorithmus
Peakerkennung
Tabelle 5
Steigende Werte für den Anstiegsakkumulator
Ableitungsfilter 1-3 Ausgangswerte
gegenüber Steigungsempfindlichkeit
Filter 1
Filter 2
Filter 3
Steigung > |Steigungsempfindlichkeit
+8
+5
+3
Krümmung > Steigungsempfindlichkeit
+0
+2
+1
Steigung < ( − ) Steigungsempfindlichkeit
−8
−5
−3
Steigung < |Steigungsempfindlichkeit|
−4
−2
−1
Krümmung < ( - ) Steigungsempfindlichkeit − 0
−2
−1
In Tabelle 5 bestimmt die erwartete Peakbreite den Filter, dessen Wert für
Steigung und Krümmung mit der Steigungsempfindlichkeit verglichen
werden. So werden beispielsweise die Zahlen für Filter 1 zu dem
Anstiegsakkumulator hinzugefügt, wenn die erwartete Peakbreite klein ist.
Wenn die Werte für die erwartete Peakbreite größer werden, kommen die
Zahlen für Filter 2 und möglicherweise Filter 3 zum Einsatz.
Wenn der Wert für den Anstiegsakkumulator größer oder gleich 15 beträgt,
erkennt der Algorithmus an dieser Stelle einen möglichen Peakanfang.
Tabelle 6
Steigende Werte für den Abfallakkumulator
Ableitungsfilter 1-3 Ausgangswerte
gegenüber Steigungsempfindlichkeit
Filter 1
Filter 2
Filter 3
Steigung > |Steigungsempfindlichkeit
+8
+5
+3
Krümmung > Steigungsempfindlichkeit
+0
+2
+1
Steigung < ( − ) Steigungsempfindlichkeit
− 11
−7
−4
Steigung < |Steigungsempfindlichkeit|
− 28
− 18
− 11
−2
−1
Krümmung < ( − ) Steigungsempfindlichkeit − 0
In Tabelle 6 bestimmt die erwartete Peakbreite den Filter, dessen Werte für
die Steigung und Krümmung mit der Steigungsempfindlichkeit verglichen
werden. So werden beispielsweise die Zahlen für Filter 1 zu dem
Anstiegsakkumulator hinzugefügt, wenn die erwartete Peakbreite klein ist.
120
Der neue Integrationsalgorithmus
Peakerkennung
Wenn die Werte für die erwartete Peakbreite größer werden, kommen die
Zahlen für Filter 2 und möglicherweise Filter 3 zum Einsatz.
Wenn der Wert für den Anstiegsakkumulator größer oder gleich 15 beträgt,
erkennt der Algorithmus an dieser Stelle ein mögliches Peakende.
Der Algorithmus für das Peakmaximum
Das Peakmaximum wird als höchster Punkt im Chromatogramm erkannt,
indem eine parabolisch verlaufende Kurve durch die höchsten Datenpunkte
gelegt wird.
Berechnungen zur Abweichung von der Gauß-Kurve
Überlappende
Peaks
Abbildung 18
Treten auf, wenn ein neuer Peak anfängt, ehe das Ende des
ersten Peaks festgelegt wurde. Die folgende Abbildung
verdeutlicht, wie der Integrator mit überlappenden Peaks
umgeht.
Überlappende Peaks
Talpunkt
Der Integrator behandelt überlappende Peaks nach folgender
Vorgehensweise:
1 Der Integrator summiert die Fläche des ersten Peaks bis zum Talpunkt auf.
2 Am Talpunkt endet die Flächensummierung für den ersten Peak und die
Aufsummierung für den zweiten Peak beginnt.
3 Wenn der Integrator das Ende des zweiten Peaks erkennt, endet die
Flächensummierung. Der Vorgang kann veranschaulicht werden, indem
121
Der neue Integrationsalgorithmus
Peakerkennung
man die überlappenden Peaks mittels einer Lotfällung vom Talpunkt
zwischen den beiden Peaks auf die Basislinie trennt.
Schultern
Abbildung 19
Sind nicht aufgetrennte Peaks auf der vorderen oder
hinteren Flanke eines größeren Peaks. Bei einer Schulter
ist kein Talpunkt vorhanden, an dem sich eine negative
Steigung in eine positive Steigung ändert. Ein Peak kann
eine beliebige Anzahl an Schultern auf der vorderen
und/oder hinteren Flanke aufweisen..
Peakschultern
(a)
Schultern werden über die Krümmung des Peaks, die über die zweite
Ableitung berechnet wird, erkannt. Wenn die Krümmung gegen null geht,
erkennt der Integrator einen Wendepunkt, wie Punkt “a” in Abbildung 19.
• Eine mögliche Schulter auf der vorderen Flanke erkennt man am
Vorhandensein eines zweiten Wendepunktes vor dem Peakmaximum.
Wenn sie sich bestätigt, wird der Anfang der Schulter auf den Punkt mit der
maximalen positiven Krümmung vor dem Wendepunkt festgelegt.
• Eine mögliche Schulter auf der hinteren Flanke erkennt man am
Vorhandensein eines zweiten Wendepunktes vor dem Peakende oder
einem Tal. Wenn sie sich bestätigt, wird der Anfang der Schulter auf den
Anfangspunkt der Krümmung gelegt.
Die Retentionszeit wird über den Punkt der Schulter bestimmt, wo die
negative Krümmung maximal ist. Mit Hilfe eines programmierten
Integrationsparameters kann der neue Integrator auch die Schulterflächen
über Lotfällung vom Wendepunkt der Peakschulter aus als normale Peaks
berechnen.
Die Fläche der Schulter wird vom Hauptpeak abgezogen.
Peakschultern können mit Hilfe eines zeitabhängigen Integrationsparameters
wie normale Peaks behandelt werden.
122
Der neue Integrationsalgorithmus
Basislinienbestimmung
Basislinienbestimmung
Nachdem alle Peakgruppen bestimmt und die Basislinie gefunden wurde,
benötigt der Integrator den Algorithmus zur Basisliniebestimmung, der die
Basislinie mit Hilfe einer pegs-and-thread-Technik bestimmt. Er verwendet
Annäherungen an trapezförmige Flächen und die entsprechenden Höhen, um
den Lauf zu normalisieren und die niedrigste Basislinie zu erhalten. Zu den
Eingangsdaten für den Algorithmus zur Basislinienbestimmung gehören auch
Parameter aus der Methode und den Datensätzen, die den Detektor und die
Anwendung, die der Integrator zur Optimierung seiner Berechnungen
verwendet, kennzeichnen.
Standardmäßige Konstruktion der Basislinie
Im einfachsten Fall konstruiert der Integrator die Basislinie als Folge gerader
Linienstücke zwischen folgenden Punkten:
• dem Anfang der Basislinie,
• den Strichmarkierungen,
• dem Peakende.
Abbildung 20
Standardmäßige Konstruktion der Basislinie
Basislinie
Strichmarkierungen
123
Der neue Integrationsalgorithmus
Basislinienbestimmung
Anfang der Basislinie
Wenn zu Beginn eines Laufes keine Basislinie gefunden wird, wird der
Anfang der Basislinie auf eine der folgenden Wege festgelegt:
• Vom Startpunkt der Analyse zum ersten Basislinienpunkt, wenn der
Startpunkt der Analyse niedriger ist als der erste Basislinienpunkt.
• Vom Startpunkt der Analyse zum ersten Talpunkt, wenn der Startpunkt der
Analyse niedriger ist als der erste Talpunkt.
• Vom Startpunkt der Analyse zum ersten Talpunkt, wenn das erste Tal eine
imaginäre Linie zwischen dem Startpunkt der Analyse und dem ersten
Basislinienpunkt schneidet.
• Vom Startpunkt der Analyse zu einer horizontalen Basislinie, die zum
ersten Basislinienpunkt verlängert wird.
Strichmarkierungen
Strichmarkierungen kennzeichnen den Peakanfang und das Peakende. Ihre
Position wird von den Zeiten für Peakanfang und Peakende bestimmt, die in
der Peaktabelle abgelegt werden.
Ende der Basislinie
Der letzte gültige Basislinienpunkt wird dazu verwendet, das Ende der
Basislinie zu kennzeichnen. In den Fällen, in denen der Lauf nicht auf der
Basislinie endet, wird das Ende der Basislinie über den letzten gültigen
Basislinienpunkt unter Berücksichtigung des ermittelten Driftens berechnet.
124
Der neue Integrationsalgorithmus
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
In den Reports wird jedem Peak ein Code aus zwei Buchstaben zugeordnet,
der angibt, wie die Basislinie konstruiert wurde. Falls ein dritter Buchstabe
angegeben ist, gibt dieser Auskunft über die Peakart. Diese Codes werden bei
den tabellarischen Ergebnisse in einer Spalte namens "Type" aufgeführt. Der
erste Buchstabe beschreibt die Basislinie am Peakanfang, der zweite die
Basislinie am Peakende (Codes für die Peaktrennung). Alle in den
ChemStation Reports verwendeten Codes sind in alphabetischer Reihenfolge
aufgelistet:
A
Die Peakintegration wurde abgebrochen (Peakart).
b
Peakanfang oder Peakende auf der Basislinie.
H
Peakanfang oder Peakende auf horizontaler Basislinie.
N
Dies ist ein negativer Peak (Peakart).
P
Peakanfang oder Peakende durch Schneiden der
Basislinie.
S
Der Integrator erkannte den Peak als Lösungsmittelpeak
(Peakart).
T
Der Peak begann oder endete, während die Funktion
tangentiale Anpassung (Tangent Skim) (gerade Linie)
eingeschaltet war (Peakart).
U
Markiert den Anfang oder das Ende eines nicht
zugeordneten Peaks.
V
Peakanfang oder Peakende durch Lotfällung von einem
Talpunkt.
X
Exponentiale tangentiale Peakanpassung (Tangent Skim)
(Peakart).
+
Der Peak ist ein flächenaufsummierter Peak (Area
Summed Peak) (Peakart).
Bei manueller Integration können einige andere Codes als Basislinien- oder
Peaktrennungscodes erscheinen:
M
Der Peak wurde manuell integriert
125
Der neue Integrationsalgorithmus
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
f
Der Peak wurde durch manuelle Integration erzwungen.
Falls ein Peak vor einem manuell integrierten Peak
erscheint und sein Ende von einer manuellen Integration
beeinflußt wird, erhält der Peak die Klassifizierung
„erzwungen" (forced).
R
Ein Lösungsmittelpeak wurde von manueller Integration
betroffen. Eine solche tangentiale Peakanpassung
(Tangent Skim) wird als neuberechneter
Lösungsmittelpeak klassifiziert (Peakart).
Bei eingeschalteter Option Schultererkennung (Shoulder Detection) und
detektierten Schultern enthalten Spalten drei und vier des
Peaktrennungscodes einen der folgenden Buchstaben:
f
Auf der Anstiegsflanke des Peaks wurde eine Schulter
entdeckt (Front Shoulder)—Flächenbestimmung über
Lotfällung.
b
Auf der Abstiegsflanke des Peaks wurde eine Schulter
entdeckt (Rear Shoulder)—Flächenbestimmung über
Lotfällung.
f
Auf der Anstiegsflanke des Peaks wurde eine Schulter
entdeckt (Front Shoulder)—Flächenbestimmung über
tangentiale Anpassung.
b
Auf der Abstiegsflanke des Peaks wurde eine Schulter
entdeckt (Rear Shoulder)—Flächenbestimmung über
tangentiale Anpassung.
FALLS ein vierter Buchstabe vorhanden ist, gibt dieser zusätzliche
Peakinformation (Peak flag). Ein O im Peakcode weist darauf hin, dass der
Messbereich überschritten wurde, U bedeutet, dass der Messbereich
unterschritten wurde und D bedeutet einen verzogenen Peak.
Konstruktion einer modifizierten Basislinie
Die meisten Analysen ergeben ein komplizierteres Chromatogramm als das,
welches in Abbildung 21 dargestellt ist. Der Integrator verändert die
Basislinie nach folgenden Regeln:
126
Der neue Integrationsalgorithmus
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
Abbildung 21
Konstrunktion einer modifizierten Basislinie
HBOS
BP
PB
BV VV
BB
BV
1
2
3
BB
4
• Wenn ein Peak die Basislinie schneidet (BP und PB) geht die Basislinie
durch den niedrigsten Punkt des Peaks gemäß Punkt 1 in Abbildung 21.
• Wenn ein Lösungsmittelpeak nach Verwendung einer tangentialen
Anpassung nicht auf der Basislinie beginnt, wird die Basislinie durch einen
Punkt gelegt, der auf einer horizontalen Verlängerung des letzten
gefundenen Basislinienpunktes und dem Anfang des Lösungsmittelpeaks
liegt, vgl. Punkt 2 in Abbildung 21. Die Buchstaben HBOS bedeuten
“Overflow solvent horizontal Baseline” und besagen, daß das Signal den
linearen Bereich des Detektors überschritten hat.
• Wenn ein Peak in einem nachfolgenden Tal endet, der folgende Peak aber
die Vorgabe des Wertes für “Area Reject” (Mindestfläche) nicht erreicht,
wird die Basislinie vom Anfang des Peaks zum nächsten gefundenen
Basislinienpunkt gemäß Punkt 3 in Abbildung 21 gezogen. Bei einem
Peakstart unter denselben Umständen wird dieselbe Regel angewandt.
Schneiden der Basislinie
Ein Schnittpunkt tritt auf, wenn das Signal unter die konstruierte Basislinie
fällt (Punkt “a”). Wenn ein Schnittpunkt mit der Basislinie vorliegt, wird
dieser Teil der Basislinie neu festgelegt (wie bei Punkt "b" dargestellt).
127
Der neue Integrationsalgorithmus
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
Abbildung 22
Schneiden der Basisline
Tangentiale Anpassung
Tangentiale Anpassung ist eine Möglichkeit der Basislinienkonstruktion für
Peaks, die auf der abfallenden Flanke eines Lösungsmittelpeaks erscheinen.
Wenn die Funktion vom Anwender als zeitabhängiger Parameter eingegeben
wurde, kann der Lösungsmittelpeak folgendermaßen tangential angepaßt
werden:
• als Geradenberechnung,
• als exponentielle Berechnung,
• als Kombination aus exponentieller und Geradenberechnung für beste
Übereinstimmung (Standardeinstellung).
Die geeignete Berechnung für die tangentiale Anpassung wird bei der
Konfigurierung der ChemStation-Software für eine bestimmte Anwendung
festgelegt. Die Standardeinstellung ist die Kombination aus exponentieller
und Geradenberechnung. Der Standardalgorithmus verwendet dieselbe
Berechnung.
Der Wechsel von der exponentiellen zur Geradenberechnung wird so
vollzogen, daß eine plötzliche Diskontinuität der Höhen oder Flächen
ausgeschlossen ist.
• Wenn ein Signal weit über der Basislinie liegt, wird zur Berechnung des
Tailens die Exponentialfunktion herangezogen.
• Wenn sich das Signal innerhalb des Basisliniebereiches befindet, wird zur
Berechnung des Tailens die Geradenfunktion herangezogen.
Die kombinierten Berechnungen gehen in den Report als exponentielle oder
tangentiale Anpassung ein.
128
Der neue Integrationsalgorithmus
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
Wenn die tangentiale Anpassung laufzeitabhängig angegeben ist, vergleicht
der Integrator das Signal mit dem Tangentenpunkt. Der Tangentenpunkt wird
durch die Annäherung an den Startpunkt des anzupassenden Peaks
bestimmt, wie in Abbildung 23 dargestellt.
Abbildung 23
Tangentiale Anpassung
Lösungsmittelpeak
Tangentenpeak
Manchmal führt die normale Basislinienführeung zu einer großen negativen
Fläche. Das ist besonders dann der Fall, wenn kleine Peaks auf der
abfallenden Flanke des Lösungsmittelpeaks tangential angepaßt werden.
Wenn diese Fläche zur Fläche über der Basislinie addiert wird, resultiert
daraus eine deutlich kleinere Peakfläche als tatsächlich vorliegt. Um
derartige Fehler zu vermeiden, sucht der Integrator negative Flächen und
zieht die Basislinie entsprechend der Darstellung in Abbildung 24 neu.
Abbildung 24
Tangentiale Anpassung kleiner Peaks auf der abfallenden Flanke des
129
Der neue Integrationsalgorithmus
Codes zur Beschreibung der Peaktrennung
Lösungsmittelpeaks
%DVLVOLQLH
SXQNW
XUVSUQJOLFKH%DVLVOLQLHGLH]XHLQHU
QHJDWLYHQ)OlFKHIKUW
QHXH%DVLVOLQLH
]XU7DQJHQWHJHIKUW
Nicht zugeordnete Peaks
Manche Basislinienführungen ergeben kleine Fläche zwischen der Basislinie
und dem Signal, die jedoch keinem bekannten Peak zugeordnet werden
können. Normalerweise werden solche Flächen weder gemessen noch im
Report aufgeführt. Wenn die Funktion "unassigned peaks" eingeschaltet ist,
werden diese Flächen mitgemessen und im Report als "Unassigned Peaks"
(nicht zugeordnete Peaks) aufgeführt. Die Retentionszeit für solche Flächen
ergibt sich aus dem Mittelpunkt zwischen Anfang und Ende der Fläche, siehe
Abbildung 25.
Abbildung 25
Nicht zugeordnete Peaks
130
Der neue Integrationsalgorithmus
Berechnung der Peakfläche
Berechnung der Peakfläche
Der letzte Schritt einer Integration besteht aus der Bestimmung der
Peakfläche.
Während einer Analyse werden die Flächen unter der Basislinie aufsummiert
und gespeichert. Die Peakflächen werden über die Daten aus den
Kardinalpunktdateien berechnet. Die Kardinalpunkte sind die Punkte, die der
Integrator auswählt, um einen Peak zu definieren und zu quantifizieren. Sie
bestehen aus den Basislinienpunkten, den Talpunkten, dem Peakmaximum
und den Punkten auf halber Peakhöhe. Kardinalpunkte besitzen eine
horizontale Koordinate in Form der verstrichenen Zeit, eine vertikale
Koordinate in Form der Höhe von der Basislinie aus sowie andere Parameter,
die der Integrator zur Berechnung der Peakflächen verwendet.
Abbildung 26
Flächenbestimmung für Basislinien-getrennte Peaks
BB
Im Fall eines einfachen getrennten Peaks wird die Peakfläche als Fläche
oberhalb der Basislinie zwischen Peakanfang und Peakende bestimmt (über
Strichmarkierungen gekennzeichnet).
Die Fläche, die der Integrator bei der Integration berechnet, wird
folgendermaßen bestimmt:
• bei Basislinien-getrennten (BB) Peaks liegt die Fläche oberhalb der
Basislinie zwischen den Strichmarkierungen,
• Bei Tal-zu-Tal-getrennten (VV) Peaks wird die Fläche oberhalb der
Basislinie mittels Lotfällung von den Strichmarkierungen aus geteilt.
131
Der neue Integrationsalgorithmus
Berechnung der Peakfläche
Abbildung 27
Flächenbestimmung für Tal-zuTal-getrennte Peaks
VV
• bei tangentialen Peaks (T) liegt die Fläche oberhalb der neu bestimmten
Basislinie,
• bei Lösungsmittelpeaks (S) liegt die Fläche oberhalb der horizontalen
Verlängerung vom letzten gefundenen Basislinienpunkt und unterhalb der
korrigierten Basislinie des tangentialen Peaks (T). Ein Lösungsmittelpeak
kann eventuell zu langsam ansteigen, um erkannt zu werden oder eine
Peakgruppe kann der Erfahrung zufolge ein Lösungsmittelpeak mit
einigen Aufsetzern sein. Dabei handelt es sich normalerweise um eine
Gruppe gemischter Peaks, wobei der erste Peak weit größer ist als der
Rest. Eine einfache Lotfällung ergäbe dann eine zu große Fläche für
spätere Peaks, weil sie nur auf dem ersten Peak aufsitzen. Durch
Erzwingen der Erkennung des ersten Peaks als Lösungsmittelpeak werden
die restlichen Peaks durch tangentiale Anpassung integriert.
• Negative Peaks liegen unterhalb der Basislinie und haben, wie in
Abbildung 28 gezeigt, eine positive Fläche.
132
Der neue Integrationsalgorithmus
Berechnung der Peakfläche
Abbildung 28
Flächenbestimmung bei negativen Peaks
Totale Fläche
_
Fläche unter der Basislinie
=
Basislinien-korrigierte F
Symmetrie
Der neue Integrator behandelt die Peaksymmetrie auf folgende Weise:
• wenn die Berechnung der Peakbreite über das Verhältnis von Fläche/Höhe
erfolgt, wird die Symmetrie über das Verhältnis von vorderer
Fläche/hinterer Fläche bestimmt (die Berechnung erfolgt auch dann auf
diese Weise, wenn der vordere bzw. der hintere Wendepunkt nicht
bestimmt wurde)
• ansonsten wird die Symmetrie entsprechend den Berechnungen des
Standardintegrators bestimmt
133
Der neue Integrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Integrationsparameter
Der neue Integrator stellt dem Anwender Anfangsparameter und
zeitprogrammierbare Parameter (Events) zur Verfügung. Viele Parameter
sind Paare und bestehen aus An und Aus bzw. Start und Stop.
Anfangsparameter (Initial Events)
Anfängliche
Peakbreite
(Initial
Peakwidth)
Interne Peakbreite des Integrators zu Beginn der Analyse.
Die anfängliche Peakbreite wird dazu verwendet, um die
Größe des Akkumulators festzulegen, der Peakanstieg,
Peakabfall und Tailing erkennt. Der Integrator kann diesen
Wert im Laufe der Analyse abändern, um die Integration zu
optimieren. Er wird vom Anwender als die Anzahl an
Zeiteinheiten angegeben, die der Peakbreite auf halber
Höhe des ersten Peaks entspricht (den Lösungsmittelpeak
ausgenommen).
Steigungsempfin
dlichkeit (Slope
Sensitivity)
Einstellung der Empfindlichkeit. Beim neuen Integrator ist
die Steigungsempfindlichkeit ein Wert für die Steigung, die
sich linear verändert. Darin unterscheidet er sich vom
Standardintegrator, der die Höhe der
Steigungsempfindlichkeit in Form von Zweierpotenzen
ausdrückt.
Mindesthöhe
(Height
reject)
Die Mindesthöhe ist ein Parameter, der vom Anwender bei
der Integration zur Rauschverringerung festgesetzt wird.
Peaks, die diesen Wert unterschreiten, werden vom
Integrator ignoriert. Je höher die Einstellung für die
Mindesthöhe ist, desto weiter muß ein Datenpunkt über
der fest-gelegten Basislinie liegen, ehe er als Peakanfang
qualifiziert werden kann.
Die Mindesthöhe sollte nicht dazu verwendet werden,
134
Der neue Integrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Peaks zu unterdrücken, deren Höhe der Höhe des
kleinsten interessierenden Peaks nahe kommt. Verwenden
Sie statt dessen den Parameter der Mindestfläche (Area
Reject), um kleine Peaks auszuschließen.
Mindestfläche
Die Einstellung der Mindestfläche schließt Peaks aufgrund
ihrer Fläche aus. Peaks, deren Flächen kleiner sind als die
Mindestfläche, werden nicht in den Report aufgenommen.
Schulter-erkenn
ung
(Shoulder
detection)
Wenn die Schultererkennung aktiviert ist, erkennt der
Integrator Schultern anhand der Krümmung des Peaks, die
durch die zweite Ableitung gegeben ist. Wenn die
Krümmung gegen null geht, wertet der Integrator diesen
Wendepunkt als möglichen Anfang einer Schulter. Wenn
der Integrator vor dem Peakmaximum einen weiteren
Wendepunkt findet, ist die Schulter identifiziert.
Peakbreite
Der Berechnungsalgorithmus für die Peakbreite hat sich hinsichtlich des
Standardintegrators nicht geändert. Informationen finden Sie im
entsprechenden Abschnitt über den Standardintegrator (siehe Peakbreite
(Peak Width)auf Seite 91).
Die Voreinstellung der Peakbreite steuert die Selektivität des Integrators in
der Unterscheidung zwischen Peaks und Basislinienrauschen. Um gute
Leistungsfähigkeit zu sichern, muß der Wert der Peakbreite nahe an den
Breiten auf halber Höhe der tatsächlichen Chromatographiepeaks liegen. Der
Integrator kann den Wert für die Peakbreite im Lauf der Analyse neu
festlegen, um die Integration zu optimieren.
Auswählen der Peakbreite
Eine gute Einstellung der Peakbreite sollte Rauschen mindestens so gut
ausfiltern, daß im Rauschen keine Peaks gefunden werden und andererseits
die Informationen des Signals nicht verzerrt werden.
• Eine geeignete Voreinstellung für die Peakbreite bei einem einzigen
interessierenden Peak ist seine Breite in Zeiteinheiten als Basiswert.
• Eine geeigneten Voreinstellung für die Peakbreite, wenn der Lauf mehrere
interessierende Peaks aufweist, ist der Wert der der Breite des schmalsten
135
Der neue Integrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Peaks entspricht. Damit wird optimale Selektivität erreicht.
Wenn die Voreinstellung für die Peakbreite zu klein gewählt wurde, kann
Rauschen als Peaks interpretiert werden. Wenn breite und schmale Peaks
vermischt auftreten, können Sie durch die Programmierung von
zeitabhängigen Parametern die Peakbreite für bestimmte Peaks festlegen.
Manchmal können die Peaks im Analysenverlauf deutlich breiter werden.
Diese Charakteristik ist typisch für isothermische GC- und isokratische
LC-Analysen. Um dies auszugleichen, vergibt der Integrator automatisch
neue Werte für die Peakbreite, sowie die Peaks im Laufe einer Analyse
breiter werden. Er führt diese Funktion solange durch bis sie deaktiviert oder
die Peakbreite durch einen zeitabhängigen Parameter festgelegt wird.
Die neue Einstellung für die Peakbreite wird folgendermaßen gewichtet:
[ 0.75 × ( existing peak width ) + 0.25 × ( width of current peak ) ]
Wenn die Peakbreite durch eine zeitabhängige Programmierung eingestellt
wird, wird die automatische Peakbreitenanpassung deaktiviert.
Verändern der Mindesthöhe und der Peakbreite
Sowohl die Peakbreite als auch die Mindeshöhe sind sehr wichtig für den
Integrationsvorgang. Sie können durch Verändern dieser Werte
unterschiedliche Ergebnisse erzielen.
• Erhöhen Sie sowohl die Mindesthöhe als auch die Peakbreite, wenn relativ
dominierende Bestandteile detektiert und in einer Umgebung mit starkem
Rauschen quantifiziert werden sollen. Eine Erhöhung der Peakbreite
verbessert die Rauschfilterung, während eine Erhöhung der Mindesthöhe
hin und wieder auftretendes Rauschen unterdrückt.
• Verringern Sie sowohl die Mindesthöhe als auch die Peakbreite, um
Spurenkomponenten, deren Höhe dem Rauschen nahe kommt, zu
detektiern und zu quantifizieren. Eine Verringerung der Peakbreite
vermindert die Signalfilterung, während eine Verringerung der
Mindesthöhe sicher stellt, daß auch kleine Peaks nicht aufgrund ihrer
geringen Höhe vernachlässigt werden.
Wenn eine Analyse Peaks unterschiedlicher Peakbreiten ergibt, sollte die
Peakbreite an die schmalen Peaks angepaßt sein. Die Mindesthöhe sollte
reduziert werden, um sicher zu stellen, daß breite Peaks nicht aufgrund ihrer
geringen Höhe vernachlässigt werden.
136
Der neue Integrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Anpassung der Integration
Oft ist es nützlich, die Werte für die Steigungsempfindlichkeit, die Peakbreite
und die Mindesthöhe und Mindestfläche so zu ändern, daß Sie eine
optimierte Integration Ihres Signals erhalten.
Abbildung 29 zeigt den Einfluß dieser Parameter auf die Integration der
sieben Peaks des Chromatogramms.
Abbildung 29
Verwendung von Anfangsparametern
Mindesthöhe
Basislinie
3
1
6
Peakbreite
7
5
2
Mindesthöhe
4
Ein Peak wird nur integriert, wenn die Vorgaben aller dreier
Integrationsparameter erfüllt werden. Mit einer Peakbreite von Peak 3 und
der Mindestfläche und Steigungsempfindlichkeit aus Abbildung 29 werden
nur die Peaks 1 und 3 und sieben integriert.
Peak 1
wird integriert, da alle drei Vorgaben erfüllt werden.
Peak 2
wird nicht integriert, da die Fläche nicht die Mindestfläche
erreicht.
Peak 3
wird integriert, da alle drei Vorgaben erfüllt werden.
Peak 4
wird nicht integriert, weil die Peakhöhe unterhalb der
Mindesthöhe liegt.
Peak 5
wird integriert.
Peak 6
wird nicht integriert, weil der Peak als Spike interpretiert
wird.
Peak 7
wird integriert.
137
Der neue Integrationsalgorithmus
Integrationsparameter
Tabelle 7
Werte für "Slope Sensitivity" (Steigungsempfindlichkeit)
Integrationsparame
ter
Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Peak 5 Peak 6 Peak 7
Mindesthöhe
darüber darüber darüber darunter darüber darüber darüber
Mindestfläche
darüber darunter darüber darunter darüber darüber darüber
kleinste Mindesthöhe darüber darüber darüber darüber darüber darunter darüber
Peak integriert
ja
nein
ja
nein
ja
nein
ja
Zeitprogrammierbare Parameter (Timed Events)
Sie können die Konstruktion der Basislinie mit zeitabhängigen
Integrationsparametern optimieren, wenn die standardmäßige Konstruktion
nicht ausreicht. Diese Parameter können zur Bestimmung der endgültigen
Peakflächen und zur Korrektur schneller oder langsamer Abweichungen der
Basislinie dienen. Weitere Informationen zu Integrationsparametern finden
Sie in Ihrer Online-Hilfe.
138
Der neue Integrationsalgorithmus
Tabellen mit Integrationsparametern
Tabellen mit Integrationsparametern
Jedes Signal (Chromatogramm oder Elektropherogramm) kann über seine
eigenen Integrationsparameter verfügen, die in einer Tabelle zur
Signalintegration eingestellt werden.
Zum Erstellen einer Tabelle mit Integrationsparametern hat ein Anwender
folgende Möglichkeiten :
• er kann die Integrationsparameter manuell eingeben oder
• Autointegrate auswählen, um für jedes Signal die Anfangswerte
festzusetzen.
Falls die individuelle Parametertabelle des Signals nicht benutzt wird,
werden alle Signale mit der Standardtabelle mit Integrationsparameter für
den entsprechenden Detektor integriert. Für jede Detektorart gibt es eine
Standardtabelle mit Integrationsparametern, zum Beispiel für FID, ECD oder
DAD. Die Standardtabellen mit Integrationsparametern können nicht
gelöscht werden und sind immer fester Bestandteil der Methode zur
Datenauswertung.
139
Der neue Integrationsalgorithmus
Anwendung des neuen Integrators
Anwendung des neuen Integrators
Der neue Integrator der ChemStation bietet folgende Methoden zur
Integration eines Datensatzes:
• Integration
• Autointegration
• manuelle Integration
140
Der neue Integrationsalgorithmus
Integration
Integration
Das Signal wird entsprechend der Integrationsparametertabelle integriert.
Sie können diese Tabelle zur Optimierung der Integrationsergebnisse für eine
nachfolgende Reintegration verwenden.
Sowohl Autointegrate als auch Integrate liefern Integrationsergebnisse.
Autointegrate berechnet jedoch automatisch Anfangswerte für die
Steigungsempfindlichkeit und Peakbreite, während es die Funktion "Edit
Integration Event" ermöglicht, zwischen selbst bestimmten und den
Standardwerten zu wählen.
141
Der neue Integrationsalgorithmus
Autointegration
Autointegration
Für den neuen Integrator wurde die Autointegration so verändert, daß die
gewählten Parameter stabiler sind und der Anwender mehr Informationen
über die Probleme erhält, die bei der Autointegration auftreten.
Die Autointegration untersucht den vorderen und den hinteren Bereich eines
Chromatogramms, um ein Maß für das Rauschen abzuschätzen und
entsprechende Anfangseinstellungen für die Steigungsempfindlichkeit (Slope
Sensitivity) und die Mindesthöhe (Height Reject) festzulegen. Außerdem
bestimmt die Autointegration auch einen temporären Wert für die
Peakbreite (Peak Width), der von der Laufzeit und den unteren
Detektionskriterien abhängt. Mit einem Wert für "Area Reject" von null wird
probeweise eine Integration durchgeführt. Wenn bei dieser Integration
weniger Peaks erkannt werden, erfolgt eine Anpassung der Parameter und es
wird erneut integriert. Diese Integration kann bei Bedarf mehrere Male
wiederholt werden.
Nach einer geeigneten probeweisen Integration wird bei der Autointegration
die Breite des ersten gefundenen Peaks als Anfangswert für die Peakbreite
eingesetzt. Die Peaksymmetrie wird dazu verwendet, Peaks mit
inakzeptablen Peakformen aus der Berechnung auszuschließen.
AutoIntegrate sucht zwischen den detektierten Peaks nach einem sicheren
Basisliniensegment. Es wird bei der Autointegration zusammen mit der
Peakbreite dazu verwendet, die Werte für die Steigungsempfindlichkeit und
die Mindesthöhe neu zu definieren. Der Wert für die Mindestfläche wird über
die anfängliche Peakbreite und das Maß für das Rauschen bestimmt.
AutoIntegrate gibt einen Warnhinweis in der Meldungszeile aus, wenn:
• die Anforderungen für die Peaksymmetrie zur Berechnung der Peakbreite
gelockert wurden
• zu wenig Peaks für einen genaue Berechnung der Peakbreite vorhanden
sind
• keine Peaks gefunden werden (AutoIntegrate versucht ein
Signal-Rausch-Verhältnis von 10:1 einzuhalten, auch wenn dann keine
Peaks mehr detektiert werden)
142
Der neue Integrationsalgorithmus
Autointegration
Begrenzung
Die Autointegration ist eine nützliche Startplattform für die Integration der
meisten Chromatogramme und die ersten Schritte der Methodenentwicklung.
Allerdings sollte die Autointegration nicht als Ersatz für eine gute
Probenvorbereitung oder Chromatographie verstanden werden.
Die Autointegration bestimmt Werte für den Anfang des Chromatogramms,
was die Fähigkeit der Autointegration beschränkt, mit ungewöhnlichen
Peaks umzugehen, die später im Chromatogramm auftreten können. Mit der
Autointegration kann es bei Chromatogrammen, die Störungen oder Peaks zu
Beginn oder am Ende aufweisen, zu Problemen kommen.
Bei der Autointegration gibt es Schwierigkeiten, wenn ein Chromatogramm
zeitprogrammierte Integrationsparamter erfordert, um z.B. die folgenden
Störungen zu umgehen:
• umgekehrte Peaks
• Störungen oder Einschwingen der Basislinie (Ventil- oder
Signalschaltungen)
• ansteigende Basislinie am Ende eines Laufs (Säulenbluten)
Im obigen Chromatogramm wurden folgende zeitprogrammierten
Integrationsparameter verwendet.
Integrator Off
Integrator On, Baseline All Valleys
Set Baseline
Wenn der erforderliche zeitabhängige Parameter gesetzt ist, kann die
Autointegration sehr leistungsfähig arbeiten.
143
Der neue Integrationsalgorithmus
Manuelle Integration
Manuelle Integration
Dieser Integrationstyp ermöglicht Ihnen die Integration ausgewählter Peaks
oder Peakgruppen. Mit Ausnahme des anfänglichen Wertes für die
Mindestfläche werden im Bereich der manuellen Integration die
Parametertabellen der ChemStation ignoriert.
Die manuelle Integration erlaubt Ihnen die Definitionen von Peakstart und
Peakende und die Einbeziehung der damit ermittelten Peakflächen in die
Quantifizierung und Reporterstellung. Manuell integrierte Peaks werden in
einem Report mit dem Code M markiert.
Die manuelle Integration bietet folgende Möglichkeiten:
Basislinie
ziehen
Es wird festgelegt, wo die Basislinie für einen Peak oder
eine Peakgruppe verläuft. Sie können außerdem angeben,
ob die Peaks dieses Bereiches an allen Talpunkten
automatisch getrennt werden sollen.
Negative Peaks Es wird festgelegt, wann Flächen unterhalb der Basislinie
als negative Peaks behandelt werden. Sie können
außerdem angeben, ob die Peaks dieses Bereiches an allen
Talpunkten automatisch getrennt werden sollen.
Tangentiale
Anpassung
Peaktrennung
Alle
Talpunkte
144
Es werden die Flächen von Peaks bestimmt, indem sie
durch tangentiale Anpassung von der Flanke eines
Hauptpeaks abgetrennt werden. Sie können außerdem
angeben, ob die Peaks dieses Bereiches an allen
Talpunkten automatisch getrennt werden sollen. Die
Fläche des tangential abgetrennten Peaks wird von der
Fläche des Hauptpeaks abgezogen.
Angabe des Punktes, an dem ein Peak durch Lotfällung
abgetrennt wird.
Die Einstellung “Alle Talpunkte” (All Valleys) legt fest, daß
die Peaks innerhalb eines ausgewählten
Integrationsbereiches über eine Basislinienkonstruktion
von allen Talpunkten aus getrennt werden.
Der neue Integrationsalgorithmus
Manuelle Integration
Löschen von
Peaks
Löscht einen oder mehrere Peaks aus den
Integrationsergebnissen.
Kodierung zur Peaktrennung
• Manuell integrierte Peaks werden im Integrationsreport mit der Kodierung
MM markiert.
• Falls vor dem manuell integrierten Peak ein Peak erscheint, dessen Ende
wegen diesem Peak verändert wird, trägt er die Kodierung F (für forced,
erzwungen).
• Ein Lösungsmittelpeak, der durch manuelle Integration beeinflußt wurde,
zum Beispiel durch tangentiale Anpassung, trägt die Kodierung R (für
re-calculated solvent, neuberechneter Lösungsmittelpeak) anstatt S.
Vorgehensweise in der manuellen Integration
• Der erste Schritt einer manuellen Integration besteht in der Wahl eines
Signalbereiches zur manuellen Integration. Dies geschieht durch
Herausvergrößern (zoomen) des interessierenden Bereiches.
• Im nächsten Schritt wird Draw Baseline, Negative Peaks, Tangent Skim
oder Delete Peak(s) gewählt.
• Die Basislinie kann nun gezeichnet werden, indem die Maus mit
gedrückter linker Maustaste bewegt wird. Während der Mausbewegung
wird eine Linie vom Startpunkt bis zur aktuellen Position der Maus
gezeichnet. Im Falle von Delete Peak(s) wird ein Auswahlrechteck um die
zu löschenden Peaks geöffnet.
• Die graphische Eingabe kann in den zwei Modi Absolute (das ist der
Standardwert) und Trace (Verfolgen des Signals) erfolgen. In beiden Fällen
wird in der Mitteilungszeile die Zeit und die Höhe des Cursors angezeigt.
• Im Modus “Trace” ist der Cursor ein abwärts weisender Pfeil und folgt dem
Profil des Signals indem er sich von Datenpunkt zu Datenpunkt bewegt.
Sie können den Trace-Modus aktivieren, wenn sich der Cursor am
gewünschten Peakstart befindet, indem Sie den rechten Mausknopf
drücken.
• Im Modus “Absolute” ist der Cursor ein Fadenkreuz und folgt dem Signal,
erlaubt jedoch eine Positionierung an jeder Stelle des Bildschirmes. Sie
können von einem Modus in den anderen umschalten, indem Sie den
rechten Mausknopf drücken.
145
Der neue Integrationsalgorithmus
Manuelle Integration
• Für jeden manuell integrierten Peak werden die Flächenwerte (Area
Counts) zusammen mit der Retentions- bzw. Migrationszeit auf dem
Bildschirm angezeigt.
Einfügen manueller Parameter in die Methode
Die Software ermöglicht Ihnen über den Befehl “Copy Manual Events to
Method” im Menü Integration das Einfügen Ihrer manuell definierten
Integration in die aktuelle Methode. Diese manuellen Parameter werden in
der Methode separat gespeichert. Sie können im Dialogfeld “Integration
Events” nicht eingesehen werden. Nach Laden eines Signales werden sie nur
durch Aktivieren von “Apply Manual Integration Events” im Dialogfeld
“Integration Events” oder durch Wahl von “Apply Manual Events from
Method” im Menü “Integration” angewendet.
Die manuellen Integrationsparameter verwenden absolute Zeitfenster. Sie
führen keine Anpassung bei einer Signalverschiebung durch.
146
7
7
Peak Identification
(Peakerkennung)
Peak Identification
(Peakerkennung)
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Was ist eine Peakidentifizierung?
• Regeln zur Peakübereinstimmung
• Möglichkeiten der Peakidentifizierung
• Absolute Retentionszeiten
• Relative Retentionszeiten
• Peakqualifier
• Der Ablauf der Identifizierung
148
Peak Identification (Peakerkennung)
Was ist eine Peakidentifizierung?
Was ist eine Peakidentifizierung?
Die Peakidentifizierung ist die Identifizierung der Komponenten einer
unbekannten Probe auf der Basis ihrer chromatographischen oder
elektrophoretischen Eigenschaften mit einer definierten Standard- oder
Kalibrierprobe.
Die Identifizierung von Komponenten ist die Voraussetzung zur
Quantifizierung. Eigenschaften jeder interessierenden Komponente werden
in der Kalibriertabelle einer Methode gespeichert.
Die Peakidentifizierung erfolgt durch Vergleich jedes Peaks im Signal mit den
Peaks in der Kalibriertabelle.
Die Kalibriertabelle enthält die erwarteten Retentions- bzw. Migrationszeiten
der interessierenden Komponenten. Ein Peak, der mit der Retentions- bzw.
Migrationszeit eines Peaks aus der Kalibriertabelle übereinstimmt, erhält die
Attribute dieser Komponente, zum Beispiel Name und Responsefaktor. Peaks
ohne Übereinstimmung mit einem Peak der Kalibriertabelle werden als
unbekannt eingestuft. Dieser Prozeß wird durch folgende Faktoren
kontrolliert:
• Retentions- bzw. Migrationszeiten für Peaks in der Kalibriertabelle, die als
Zeitreferenz vorgesehen wurden;
• Festgelegte Retentions- bzw. Migrationszeitfenster der Referenzpeaks;
• Retentions- bzw. Migrationszeiten kalibrierter Peaks der Kalibriertabelle,
die keine Zeitreferenzpeaks sind;
• Festgelegte Retentions- bzw. Migrationszeitfenster dieser
nicht-Referenzpeaks;
• die Gegenwart weiterer qualifizierender Peaks in richtigen Verhältnissen.
149
Peak Identification (Peakerkennung)
Regeln zur Peakübereinstimmung
Regeln zur Peakübereinstimmung
Folgende Regeln werden zur Feststellung einer Übereinstimmung zwischen
Peaks angewandt:
• Wenn ein Probenpeak innerhalb des vorgegebenen Zeitfensters (Peak
Matching Window) eines Peaks der Kalibriertabelle liegt, werden diesem
die Attribute der Komponente der Kalibriertabelle zugeordnet.
• Wenn mehr als ein Probenpeak innerhalb des vorgegebenen Zeitfensters
liegt, wird der Peak mit der geringsten Abweichung von der vorgegebenen
Retentions- bzw. Migrationszeit als diese Komponente identifiziert.
• Wenn ein Peak als Zeitreferenz oder interner Standard dient, wird der
größte Peak im Zeitfenster als diese Komponente identifiziert.
• Wenn Peakqualifier verwendet werden, wird das Signalverhältnis in
Kombination mit dem Zeitfenster zur Identifizierug der Komponente
benutzt.
• Wenn der Peak ein Peakqualifier ist, wird der gemessene Peak identifiziert,
der dem Hauptpeak der Komponente am nächsten benachbart ist.
• Wenn ein Probenpeak nicht in eines der vorgegebenen Zeitfenster fällt,
wird er als unbekannte Komponente aufgelistet.
150
Peak Identification (Peakerkennung)
Möglichkeiten der Peakidentifizierung
Möglichkeiten der Peakidentifizierung
Eine Übereinstimmung von Probenpeaks mit den Peaks in der
Kalibriertabelle der ChemStation Software kann mit verschiedenen
Methoden festgestellt werden.
Absolute Retentions- bzw. Migrationszeit
Die Retentions- bzw. Migrationszeit des Probenpeaks wird mit der erwarteten
Retentions- bzw. Migrationszeit der Komponente in der Kalibriertabelle
verglichen.
Korrigierte Retentions- bzw. Migrationszeit
Die erwartete Retentions- bzw. Migrationszeit von Peaks wird über die
aktuellen Retentions- bzw. Migrationszeiten von einem oder mehreren
Referenzpeaks korrigiert. Die Peakübereinstimmung erfolgt dann auf der
Basis dieser korrigierten relativen Retentions- bzw. Migrationszeiten. Die
Referenzpeaks müssen in der Kalibriertabelle spezifiziert werden.
Peakqualifier
Zusätzlich zur Identifizierung von Peaks mit ihrer Retentions- bzw.
Migrationszeit können Sie Peakqualifier zur Erreichung eines noch
genaueren Ergebnisses einsetzen. Wenn mehr als ein Peak im Retentionsbzw. Migrationszeitfenster erscheint, sollten Peakqualifier zur Identifizierung
der korrekten Komponente eingesetzt werden.
Mengenangaben (Amount Limits)
Die Grenzwerte für die Mengenangaben werden im Dialogfeld “Compound
Details” definiert und zur qualifizierten Peakidentifizierung benutzt. Wenn die
Mengenangabe einer identifizierten Komponente im vorgegebenen Bereich
liegt, wird die Peakidentifizierung im Report aufgeführt.
151
Peak Identification (Peakerkennung)
Absolute Retentions- bzw. Migrationzeit
Absolute Retentions- bzw. Migrationzeit
Zur Feststellung einer Peakübereinstimmung wird ein Zeitfenster für die
Retentions- bzw. Migrationszeit verwendet. Dieses Zeitfenster wird um die
erwartete Retentions- bzw. Migrationszeit für einen erwarteten Peak
zentriert. Jeder Probenpeak, der innerhalb dieses Fensters liegt, wird zur
Identifizierung dieser Komponente herangezogen.
In Abbildung 30 ist ein Retentions- bzw. Migrationszeitfenster für Peak 2
zwischen 1,809 und 2,631 Minuten eingetragen, die erwartete Retentionsbzw. Migrationszeit beträgt 2,22 Minuten. Für Peak 2 bestehen also zwei
Möglichkeiten: Eine bei 1,85 und eine andere bei 2,33 Minuten. Wenn der
erwartete Peak kein Referenzpeak ist, wird bei 2,22 Minuten der
nächstgelegene Peak gewählt.
Wenn der erwartete Peak eine Zeitreferenz oder ein interner Standard ist,
wird der größte Peak innerhalb des Fensters gewählt.
In beiden Fällen wählt die ChemStation den Peak bei 2,33 Minuten. Wenn die
Peaks gleichgroß wären, würde der Peak, der dem Mittelpunkt des
Zeitfensters am nächsten liegt, gewählt.
Abbildung 30
Zeitfenster für die Retentions- bzw. Migrationszeiten
Peak 1
Peak 2
Peak 3
Peak 4
Fenster für Peak 2
Beim Versuch Peaks zu lokalisieren werden drei Fenstertypen benutzt.
• Fenster für Referenzpeaks, die nur auf Referenzpeaks angewendet
werden,
152
Peak Identification (Peakerkennung)
Absolute Retentions- bzw. Migrationzeit
• Fenster für nicht-Referenzpeaks werden auf alle anderen kalibrierten
Peaks angewendet
• Spezielle Fenster mit Werten für einzelne Komponenten, die im Dialogfeld
“Compound Details” eingestellt werden.
Die Standardwerte für diese Fenster werden im Dialogfeld “Calibration
Settings” eingegeben. Die Lage jeder Seite des Fensters der Retentions- bzw.
Migrationszeit für die Peakübereinstimmung ist die Summe aus absolutem
und prozentual angepaßtem Fenster.
Ein Fenster von 5 % definiert eine Retentions- bzw. Migrationszeit, die
innerhalb eines Rahmens von plus/minus 2.5 % der kalibrierten Retentionsbzw. Migrationszeit des Peaks liegt. Beispielsweise muß ein Peak mit einer
Retentions- bzw. Migrationszeit von 2,00 Minuten in den nachfolgenden
Analysen nach Ablauf von 1,95 bis 2,05 Minuten erscheinen.
Ein Fenster mit der Absolutbreite von 0,20 Minuten und einer relativen
Anpassung von 10 % ergibt also ein Retentions- bzw. Migrationszeitfenster
zwischen 1,80 und 2,20 Minuten.
1,80 min = 2,00 min − 0,10 min (0,20 min / 2) − 0,10 min (10 % of 2,00 min).
2,20 min = 2,00 min + 0,10 min (0,20 min / 2) + 0,10 min (10 % von 2,00 min).
153
Peak Identification (Peakerkennung)
Korrigierte Retentions- bzw. Migrationszeiten
Korrigierte Retentions- bzw.
Migrationszeiten
Die Übereinstimmung von Peaks auf der Basis absoluter Retentions- bzw.
Migrationszeiten ist leicht anwendbar aber nicht immer zuverlässig. Einzelne
Retentions- bzw. Migrationszeiten können leichte Abweichungen aufgrund
schwankender chromatographischer Bedingungen aufweisen. Daher können
Peaks auch außerhalb des Fensters für die Peakübereinstimmung auftreten
und werden nicht identifiziert.
Eine Möglichkeit zur Begegnung unvermeidlicher Schwankungen der
absoluten Retentions- bzw. Migrationszeiten ist die Festlegung einer
Retentions- bzw. Migrationszeit relativ zu einem oder mehreren
Referenzpeaks.
Referenzpeaks werden in der Referenzspalte der Kalibriertabelle definiert.
Die Methode einer relativen Peakübereinstimmung verwendet einen oder
mehrere Referenzpeaks zur Positionsanpassung des Fensters zur
Peakübereinstimmung. Hierdurch werden Verschiebungen der Retentionsbzw. Migrationszeiten der Probenpeaks kompensiert.
Falls in der Methode kein Referenzpeak definiert ist oder die ChemStation
nicht mindestens einen Referenzpeak während des Analysenlaufes erkennen
kann, werden von der Software die absoluten Retentions- bzw.
Migrationszeiten verwendet.
Einzelne Referenzpeaks
Es wird für den Referenzpeak ein Fenster mit der Retentions- bzw.
Migrationszeit bei seiner erwarteten Retentions- bzw. Migrationszeit erzeugt.
Der größte Peak in diesem Fenster wird als Referenzpeak identifiziert. Die
erwarteten Retentions- bzw. Migrationszeiten aller anderen Peaks in der
Kalibriertabelle werden korrigiert. Dazu wird das Verhältnis der erwarteten
zur aktuell gefundenen Retentions- bzw. Migrationszeit des Referenzpeaks
herangezogen.
Mehrere Referenzpeaks
Die Korrektur der Retentions- bzw. Migrationszeit mit einem einzelnen Peak
basiert auf der Annahme, daß die Abweichung der aktuellen von der
154
Peak Identification (Peakerkennung)
Korrigierte Retentions- bzw. Migrationszeiten
erwarteten Retentions- bzw. Migrationszeit gleichmäßig bzw. linear mit
zunehmender Retentions- bzw. Migrationszeit im Analysenlauf erfolgt.
Während längerer Analysenläufe ändern sich die Retentions- bzw.
Migrationszeiten jedoch uneinheitlich. In solchen Fällen können bessere
Ergebnisse erhalten werden, wenn mehrere Referenzpeaks eingesetzt
werden, die in geeigneten Abständen über den Analysenlauf verteilt sind. Das
Signal wird dann in Zonen aufgeteilt. Innerhalb jeder Zone wird dann eine
lineare Abweichung der aktuellen von der erwarteten Retentions- bzw.
Migrationszeit ermittelt.
HINWEIS
Der Algorithmus für die Zeitkorrektur kann scheitern, wenn die
Retentionszeiten der Referenzpeaks zu eng zusammen liegen und nicht über
den gesamten Analysenlauf verteilt sind.
155
Peak Identification (Peakerkennung)
Peakqualifier
Peakqualifier
Viele Komponenten können mit mehreren Signalen detektiert werden.
Grundsätzlich ist diese Methode auf alle Arten der Chromatographie
anwendbar, die mit mehreren Detektoren arbeiten oder mit Detektoren, die
über mehrere Signalausgänge verfügen. Sie wird aber hauptsächlich in der
LC mit Multiwellenlängendetektoren oder Dioden-Array-Detektoren
eingesetzt. Diese Detektoren werden normalerweise so eingestellt, daß eine
Wellenlänge nahe der maximalen Absorption des Hauptpeaks in der
Kalibriertabelle eingesetzt wird. In Abbildung 31 ist das λ1.
Die beiden anderen detektierten Wellenlängen können zur Bestätigung des
Peaks dienen. In Abbildung 31 sind dies λ2 und λ3.
Abbildung 31
Peakqualifier
Wellenlänge des Hauptpeaks
Response
Wellenlänge eines
Peakqualifiers
Wellenlänge
Peaks ohne Verunreinigungen weisen ein konstantes Verhältnis des Response
über verschiedene Wellenlängen auf.
Der Peakqualifier weist einen anteiligen Response des Hauptpeaks auf. Die
akzeptierten Grenzen des Response-Bereiches können in der Kalibriertabelle
eingestellt werden, wenn die Option "Identification Details" angewählt ist.
Wenn das Verhältnis zwischen dem Hauptpeak λ1 und einem Peakqualifier,
zum Beispiel, λ3 innerhalb vorgegebener Grenzen liegt, wird die
Peakidentität bestätigt.
156
Peak Identification (Peakerkennung)
Peakqualifier
Signalkorrelation
Unter Signalkorrelation versteht man, daß zwei Peaks, die von
unterschiedlichen Detektoren innerhalb eines bestimmten Zeitfensters
gemessen wurden, derselben Substanz zugeordnet werden. Das Fenster für
die Signalkorrelation kann über den Parameter "SignalCorrWin" der Tabelle
"QuantParm" innerhalb des _DaMethod-Registers festgelegt werden. Wenn
das Fenster für die Signalkorrelation auf 0.0 gestellt ist, ist die
Signalkorrelation ausgeschaltet (weitere Informationen finden Sie im Macro
Programming Guide). Wenn die Signalkorrelation ausgeschaltet ist, werden
Peaks, die zur selben Retentionszeit in zwei unterschiedlichen Detektoren
erfaßt werden, als unterschiedliche Substanzen behandelt.
Standardmäßig ist das Fenster für die Signalkorrelation für LC-, LC/MS- und
CE-Daten auf 0,03 Minuten und für GC-Daten auf 0,0 Minuten eingestellt.
Überprüfung der Qualifier
Wenn die Signalkorrelation eingeschaltet ist, werden standardmäßig die
Qualifier für alle Arten von Datendateien überprüft. Diese Option kann
abgestellt werden, indem man in der Methode innerhalb der Tabelle der
"Quantification Parameters" die UseQualifiers Flag setzt (weitere
Informationen entnehmen Sie bitte dem Macro Programming Guide). Die
Überprüfung der Qualifier wird auch dann abgeschaltet, wenn die
Signalkorrelation abgestellt ist.
Berechnung des Qualifierverhältnisses
Wenn die Überprüfung der Qualifier für eine Substanz eingeschaltet ist, wird
das Gößenverhältnis des Qualifiers zum Hauptpeak gegenüber den
kalibrierten Grenzwerten überprüft. Je nach der Einstellung unter "Specify
Report" kann die Größe über die Höhe oder die Fläche ermittelt werden.
Die Peakqualifier können genauso kalibriert werden wie die Zielsubstanzen.
Der Anwender muß die erwarteten Qualifierverhältnisse nicht angeben. Sie
werden automatisch berechnet:
QualRespRatio = Response des Qualifiers / Response des Hauptpeaks
beide werden zur Retentionszeit der Substanz bestimmt.
Der Parameter "QualTolerance" bestimmt den akzeptabeln Bereich für das
Qualifierverhältnis, zum Beispiel, ± 20%.
157
Peak Identification (Peakerkennung)
Peakqualifier
Die Toleranz kann in der Kalibriertabelle über die Benutzeroberfläche
(Identification Details) eingestellt werden und wird in absoluten Prozent
angegeben. Zum Beispiel:
Akzeptabler Bereich = 50% ± 20% = 30% … 70%
158
Peak Identification (Peakerkennung)
Die Durchführung der Identifizierung
Die Durchführung der Identifizierung
Beim Versuch der Peakidentifizierung durchläuft die Software die
integrierten Daten dreimal.
Auffinden des Referenzpeaks
Im ersten Durchlauf werden die Zeitreferenzpeaks gesucht. Die Software
sucht im Analysenlauf nach Retentions- bzw. Migrationszeiten, die mit denen
der Referenzpeaks aus der Kalibriertabelle übereinstimmen. Ein Peak eines
Analysenlaufes wird als Referenzpeak der Kalibriertabelle identifiziert, wenn
dessen Retentions- bzw. Migrationszeit innerhalb des angegebenen Fensters
des Peaks aus der Kalibriertabelle liegt.
Werden in diesem Fenster mehrere Peaks gefunden, wird der Peak mit der
größten Fläche oder Höhe, gegebenenfalls mit einer positiven
Übereinstimmung der Peakqualifier, als Referenzpeak gewählt.
Für jeden gefundenen Zeitreferenzpeak wird die Abweichung zwischen der
gefundenen Retentions- bzw. Migrationszeit und der in der Kalibriertabelle
festgelegten ermittelt. Dann werden alle anderen erwarteten Retentions- bzw.
Migrationszeiten in der Kalibriertabelle angepaßt.
Auffinden der Internen Standardpeaks (ISTD Peak)
Im zweiten Durchlauf werden alle definierten internen Standardpeaks
gesucht. Falls sie nicht bereits als ISTD identifiziert wurden, können Peaks
auch als Zeitreferenz identifiziert werden. ISTD-Peaks werden durch ihre
Fenster für Retentions- bzw. Migrationszeiten und Peakqualifier identifiziert.
Werden in demselben ISTD-Fenster mehrere Peaks gefunden, dann wird der
größte Peak gewählt.
Suchen aller anderer kalibrierter Peaks
Im dritten Durchgang werden alle anderen Peaks aus der Kalibriertabelle
gesucht. Diese nicht-Referenzpeaks der Kalibriertabelle werden mit dem
Retentions- bzw. Migrationszeitfenster auf Übereinstimmung mit den Peaks
des Analysenlaufes untersucht.
Jeder kalibrierte Nicht-Referenzpeak wird in der Kalibriertabelle mit seiner
Retentions- bzw. Migrationszeit angegeben. Diese wird an den
159
Peak Identification (Peakerkennung)
Die Durchführung der Identifizierung
entsprechenden Lauf anhand der Vor-Identifizierung der Zeitreferenzpeaks
angepaßt. Das Fenster für die Retentions- bzw. Migrationszeit des
kalibrierten Peaks wird anhand der korrigierten Retentions- bzw.
Migrationszeiten des kalibrierten Peaks angepaßt.
Werden mehrere Peaks in demselben Fenster gefunden, wird der Peak mit
der Retentions- bzw. Migrationszeit gewählt, die am nächsten der erwarteten
Retentions- bzw. Migrationszeit liegt und die auch die Vorgaben zum Qualifier
erfüllt.
Klassifizierung unidentifizierter Peaks
Falls Peaks verbleiben, die nicht identifiziert sind, werden sie als unbekannt
klassifiziert. Die ChemStation versucht die unbekannten Peaks derselben
Komponente zu einer Gruppe zusammenzufassen. Wenn ein Peak in
mehreren Signalen entdeckt wurde, werden die Peaks mit derselben
Retentions- bzw. Migrationszeit in jedem Signal dieser Komponente
zugeordnet.
Unbekannte Peaks werden im Report aufgenommen, wenn die
entsprechende Vorgabe im Dialogfeld “Calibration Settings” eingestellt
wurde.
160
8
8
Quantifizierung
Quantifizierung
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Was ist Quantifizierung?
• Rechenmethoden in der Quantifizierung
• Berechnung von Area% und Height% (Flächen% und Höhen%)
• Berechnungen mit einem externen Standard (ESTD)
• Berechnung von normierten Flächenprozenten (Norm%)
• Berechnungen mit einem internen Standard (ISTD)
• Quantifizierung unidentifizierter Peaks
162
Quantifizierung
Was ist Quantifizierung?
Was ist Quantifizierung?
Nach Integration und Identifizierung der Peaks ist der nächste
Auswertungsschritt die Quantifizierung. Die Quantifizierung bestimmt
aufgrund der Peakfläche oder Peakhöhe die Konzentration einer Substanz in
einer Probe.
Eine quantitative Analyse besteht aus mehreren Schritten, die wie folgt
zusammengefaßt werden können:
• Die zu analysierende Substanz muß bekannt sein.
• Eine Analysenmethode zur Vermessung von Proben mit dieser Substanz
muß vorhanden sein.
• Es müssen eine oder mehrere Proben vermessen werden, die eine
bekannte Konzentration der Substanz erhalten, so daß deren
Responsefaktor ermittelt werden kann.
Alternativ können auch mehrere Proben mit unterschiedlichen
Konzentrationen dieser Substanzen vermessen werden, falls Ihr Detektor
einen nichtlinearen Response aufweist. Dieser Prozeß wird
Mehrpunktkalibrierung (Multi-Level Calibration) genannt .
• Die Probe mit einer unbekannten Konzentration der Substanz wird zur
Ermittlung von Peakfläche oder Peakhöhe vermessen.
• Bei bekanntem Responsefaktor kann die unbekannte Konzentration
ermittelt werden.
Für einen korrekten Vergleich einer Probe mit unbekannter und einer mit
bekannter Konzentration müssen die Daten unter identischen Bedingungen
erfaßt und bearbeitet werden.
163
Quantifizierung
Rechenmethoden in der Quantifizierung
Rechenmethoden in der Quantifizierung
Die ChemStation bietet folgende Berechnungsmöglichkeiten zur
Konzentrationsbestimmung der Substanz einer Mischung:
• Prozentualer Anteil
• Normalisierungen
• Berechnungen mit einem externen Standard (ESTD)
• Prozentualer Anteil relativ zu einem externen Standard (ESTD%)
• Berechnungen mit einem internen Standard (ISTD)
• Prozentualer Anteil relativ zu einem internen Standard (ISTD%)
Die Berechnungen zur Konzentrationsbestimmung einer Substanz in einer
unbekannten Probe hängen vom Typ der Quantifizierung ab. Jede
Berechnungsart verwendet Peakfläche oder Peakhöhe, erzeugt jedoch einen
unterschiedlichen Report.
164
Quantifizierung
Korrekturfaktoren
Korrekturfaktoren
Zur quantitativen Berechnung werden vier verschiedene Korrekturfaktoren
eingesetzt: Absolute Response Factor (absoluter Responsefaktor),
Multiplier (Multiplikationsfaktor), Dilution Factor (Verdünnungsfaktor)
und Sample Amount (Probenmenge). Diese Faktoren dienen der Korrektur
von Kalibrierungen hinsichtlich variierendem Detektorresponse,
verschiedenen Konzentrationen, Probenverdünnung, Probenmengen und zur
Umrechnung von Konzentrationseinheiten.
Absoluter Responsefaktor
Der absolute Responsefaktor einer Substanz ist definiert als Quotient der
Substanzmenge geteilt durch die gemessene Fläche oder Höhe des
zugehörigen Standardpeaks. Der absolute Responsefaktor wird stets für
Kalibrierungen verwendet und korrigiert den Detektorresponse für einzelne
Probenbestandteile.
Multiplikationsfaktor
Mit dem Multiplikationsfaktor können die Ergebnisse jeder Substanz
multipliziert werden. Multiplikatoren können dazu eingesetzt werden,
Konzentrationseinheiten umzurechnen.
Verdünnungsfaktor
Der Verdünnungsfaktor ist eine Zahl, mit der alle Ergebnisse multipliziert
werden, bevor der Report gedruckt wird. Sie können den Verdünnungsfaktor
zur Anpassung der Skala, in der die Ergebnisse angegeben werden, oder zur
Korrektur von Konzentrationsänderungen, zum Beispiel durch eine
Probenvorbereitung, verwenden. Er dient auch für alle anderen Berechnung
mit einem konstanten Faktor.
Probenmenge
Bei der Wahl der Rechenmethoden ESTD% oder ISTD% werden in den
Reporttypen ESTD und ISTD relative anstelle absoluter Werte angegeben.
Das bedeuted, daß die Menge jeder Substanz als prozentualer Anteil an der
Probengesamtmenge angegeben wird. Die Probenmenge dient in den Reports
165
Quantifizierung
Korrekturfaktoren
ESTD% und ISTD% zur Umrechnung der Absolutmenge der analysierten
Substanzen in relative Werte. Dies geschieht mit einer Division durch den
angegebenen Wert.
166
Quantifizierung
Unkalibrierte Rechenmethoden
Unkalibrierte Rechenmethoden
Unkalibrierte Rechenmethoden erfordern keine Kalibriertabelle.
Area% und Height% (Flächen% und Höhen%)
Die Berechnungsart Flächen% berechnet die Fläche jedes Peaks der Probe
als prozentualen Anteil an der Gesamtfläche aller Peaks eines
Analysenlaufes. Die Berechnung von Flächen% erfordert keine vorherige
Kalibrierung und hängt in bestimmten Grenzen des Detektors nicht von der
injizierten Probenmenge ab. Es werden keine Responsefaktoren
berücksichtigt. Falls alle Substanzen identische Responsefaktoren
aufweisen, kann die Angabe Flächen% eine Näherung für die vorhandenen
Mengen der Substanzen darstellen.
Flächen% wird routinemäßig dort eingesetzt, wo die qualitative Information
ausreicht oder zur Erstellung von Kalibriertabellen für andere
Kalibrierverfahren.
Die Angabe Höhen% berechnet die Höhe jedes Peaks der Probe als
prozentualen Anteil an der Gesamthöhe aller Peaks eines Analysenlaufes.
167
Quantifizierung
Kalibrierte Rechenverfahren
Kalibrierte Rechenverfahren
Die Methoden Externer Standard (ESTD), Normierung und Interner Standard
(ISTD) erfordern jeweils bekannte Responsefaktoren und daher eine
Kalibriertabelle. Die Kalibriertabelle steuert die Umrechnung einer Fläche
oder Höhe in eine Einheit, die Sie durch die Wahl des Verfahrens festlegen
können.
168
Quantifizierung
Berechnungen mit externem Standard (ESTD)
Berechnungen mit externem Standard
(ESTD)
Das ESTD-Verfahren dient zur Quantifizierung, wobei Standards und Proben
unter identischen Bedingungen aufgenommen wurden. Die Ergebnisse der
unbekannten Proben werden mit der Kalibriertabelle verglichen und damit
die Menge der unbekannten Probe errechnet.
Das ESTD-Verfahren verwendet absolute Responsefaktoren und
unterscheidet sich damit vom ISTD-Verfahren. Die Responsefaktoren werden
in einer Kalibrierung gewonnen und gespeichert. In den nachfolgenden
Probenläufen werden die Substanzmengen durch Anwendung dieser
Responsefaktoren auf die gemessenen Mengen errechnet. Bei Verfahren
dieses Typs muß beachtet werden, daß die injizierte Probenmenge von einem
Lauf zum nächsten reproduzierbar sein muß, da in der Probe kein Standard
enthalten ist, der Abweichungen des Injektionsvolumens oder aus der
Probenvorbereitung korrigiert.
Bei der Erstellung eines ESTD-Reports erfolgt die Berechnung der Menge
einer bestimmten Substanz in der unbekannten Probe in zwei Schritten:
1 Für diese Substanz wird eine passende Kalibrierkurve errechnet, die in
den Dialogfeldern “Calibration Settings” oder “Calibration Curve” gewählt
wurde.
2 Die Substanzmenge der Substanz in der unbekannten Probe wird mit der
unten beschriebenen Formel berechnet. Diese Menge kann im Report
erscheinen, oder zuvor durch Anwendung von Multiplikationsfaktor,
Verdünnungsfaktor oder Probenmenge weiter bearbeitet werden, bevor
sie im Report erscheint.
Die Formel des ESTD-Verfahrens zur Berechnung einer Absolutmenge der
Substanz x lautet:
Absolute Amt of x = Response x ⋅ RF x ⋅ M ⋅ D
Erläuterung:
Responsex ist der Response der Substanz im Peak x;
Amount
x
RFx ist der Responsefaktor der Substanz x, gemäß: RFx = -------------------------
Response x
169
Quantifizierung
Berechnungen mit externem Standard (ESTD)
M ist der Multiplikationsfaktor.
D ist der Verdünnungsfaktor.
Response
(RF)x
Response x
Menge x
Menge
Multiplikations- und Verdünnungsfaktor werden den Dialogfeldern
“Calibration Settings” oder “Sample Information” entnommen.
Wenn der Report ESTD% Report gewählt wird und die Probenmenge nicht
Null ist, wird der relative Anteil (in %) einer Substanz mit der unten gezeigten
Formel berechnet:
( Absolute Amt of x ) ⋅ 100
Relative Amt of x = --------------------------------------------------------------Sample Amount
Erläuterung:
Absolute Menge von x wird analog zur oben gezeigten ESTD-Methode
berechnet;
Probenmenge (Sample Amount) wird dem Feld “Sample Information”
oder dem “Dialogfeld Calibration Settings” bei Einzelanalysen
entnommen. Wenn die Probenmenge Null ist, wird der ESTD berechnet.
170
Quantifizierung
Berechnung von Norm%
Berechnung von Norm%
In der Normierungsmethode werden Responsefaktoren auf die Peakflächen
oder Peakhöhen angewendet, um Schwankungen der
Detektorempfindlichkeit für verschiedene Probenbestandteile
auszugleichen.
Der Report Norm% wird genauso berechnet wie der Report ESTD, außer, daß
über einen zusätzlichen Rechenschritt die relativen Mengen anstelle der
absoluten Mengen der Substanzen berechnet werden.
Der Report Norm% hat dieselben Nachteile wie die Reports Flächen% und
Höhen%. Jede Änderung mit einem Einfluß auf die Gesamtpeakfläche hat
auch einen Einfluß auf die berechneten Konzentrationen der
Einzelsubstanzen. Der Report Normierung sollte nur eingesetzt werden,
wenn alle interessierenden Substanzen eluiert bzw. migriert sind und
integriert wurden. Die Herausnahme von Peaks aus dem Report Normierung
verändert die Ergebnisse dieser Probe im Report.
Die Formel zur Berechnung der Norm% einer Substanz x lautet:
Response x ⋅ RF x ⋅ 100 ⋅ M ⋅ D
Norm% of x = -----------------------------------------------------------------------∑ ( Response ⋅ RF )
Erläuterung:
Responsex ist die Fläche (oder Höhe) des Peaks x;
RFx ist der Responsefaktor;
∑ ( Response ⋅ RF ) ist die Summe aller Produkte (RESPONSE)(RF) für
alle Peaks einschließlich des Peaks x;
M ist der Multiplikationsfaktor
D ist der Verdünnungsfaktor.
Multiplikations- und Verdünnungsfaktor werden den Dialogfeldern
“Calibration Settings” oder “Sample Information” entnommen.
171
Quantifizierung
Berechnungen mit internem Standard (ISTD)
Berechnungen mit internem Standard
(ISTD)
Die Berechnung ISTD eliminiert die Nachteile des ESTD-Verfahrens durch
Hinzufügen einer bekannten Menge einer Substanz in die Proben. Diese
Substanz, der interne Standard wird sowohl zu Kalibrier- als auch zu
unbekannten Proben gegeben.
Die Software verwendet die entsprechenden Responsefaktoren aus der in der
Methode gespeicherten Kalibrierung. Mit der Konzentration des internen
Standards und den Peakflächen oder Peakhöhen des Analysenlaufes
berechnet die Software die Konzentration unbekannter Substanzen.
Die Substanz, die als interner Standard eingesetzt wird, sollte ein ähnliches
Verhalten, wie die übrigen Substanzen haben, sowohl chemisch als auch in
der Retentions- bzw. Migrationszeit, muß aber chromatographisch oder
elektrophoretisch klar unterscheidbar sein.
Tabelle 8
Das ISTD-Verfahren
Vorteile
Nachteile
Variierende Probenmengen sind nicht
kritisch.
Der interen Standard muß jeder Probe
beigemengt werden
Drift des Analysengerätes wird durch
internen Standard kompensiert
Verluste in der Probenvorbereitung werden
minimiert, wenn das chemische Verhalten
von ISTD und Probe ähnlich ist
Wenn das ISTD-Verfahren für Kalibrierungen mit nicht-linearer
Charakteristik verwendet wird, muß sichergestellt werden, daß die
Rechenmethode keine systematischen Fehler erzeugt. Bei
Mehrpunktkalibrierungen muß die Menge des internen Standards konstant
gehalten werden, das heißt in jedem Kalibrierlevel ist dieselbe Menge
enthalten.
172
Quantifizierung
Berechnungen mit internem Standard (ISTD)
Bei einer Analyse mit internem Standard wird die Menge der
interessierenden Substanz über das Responseverhältnis der beiden Peaks auf
die Menge an internem Standard bezogen.
Bei einer ISTD-Kalibrierung mit zwei Läufen wird die Berechnung eines
korrigierten Mengenverhältnisses einer bestimmten Substanz in einer
unbekannten Probe mit folgenden Schritten durchgeführt:
Lauf 1: Kalibrierung
1 Die Kalibrierkurve wird erstellt, indem für jeden Punkt ein
Mengenverhältnis und ein Responseverhältnis berechnet wird.
Das Mengenverhältnis ist die Menge der Substanz dividiert durch die
Menge des internen Standards für diesen Kalibrierpunkt.
Das Responseverhältnis errechnet sich als Peakfläche der Substanz
dividiert durch Peakfläche oder Höhe des internen Standards für diesen
Kalibrierpunkt.
2 Die Kalibrierkurve wird auf der Basis der Anpassung (Fit) berechnet, die
in den Dialogfeldern “Calibration Settings” oder “Calibration Curve”
angegeben wurde.
Amount Ratio
RF x = ------------------------------------Response Ratio
Abbildung 32
Mengenverhältnis
Responseverhältnis
RFx
Mengenverhältnis
173
Quantifizierung
Berechnungen mit internem Standard (ISTD)
Lauf 2: Unbekannte Probe
1 Zur Ermittlung des Responseverhältnisses der unbekannten Probe wird
der Response der Substanz in der unbekannten Probe durch den Response
des internen Standards in der unbekannten Probe dividiert.
2 Das Mengenverhältnis für die unbekannte Probe wird mit der
Kurven-anpassung aus Schritt 2 oben und der Menge an internem Standard
ermittelt.
Berechnung mit ISTD für kalibrierte Peaks
Die Gleichungen zur Berechnung der Menge einer kalibrierten Substanz x für
eine Einpunktkalibrierung lauten:
Response x
Response Ratio = --------------------------------Response ISTD
Actual Amt of x = ( Response Ratio ⋅ RF x ) ⋅ ( Actual Amount of ISTD ) ⋅ M ⋅ D
Erläuterung:
RFx ist der Responsefaktor der Substanz x;
Die Menge des internen Standards in der Probe (Actual Amt) ist der Wert,
der in den Dialogfeldern "Calibration Settings" oder "Sample Info"
eingegeben wurde;
M ist der Multiplikationsfaktor;
D ist der Verdünnungsfaktor.
Bei gewähltem Reporttyp ISTD% wird die relative Menge (in %) der Menge x
in der Probe mit folgender Gleichung berechnet:
( Actual Amount of x ) ⋅ 100
Relative Amt of x = -----------------------------------------------------------------Sample Amount
Berechnung unkalibrierter Peaks mit ISTD
Zur Definition des Responsefaktors nicht identifizierter Peaks gibt es zwei
Möglichkeiten.
1 Verwendung eines festen Responsefaktors With Rsp Factor, der im
Dialog-feld “Calibration Settings” eingegeben wird. Sie können einen
festen Responsefaktor durch Angabe einer ISTD-Korrektur korrigieren.
174
Quantifizierung
Berechnungen mit internem Standard (ISTD)
Actual Amount of x = RFx ⋅ ( Response Ratio )x ⋅ Actual Amount of ISTD ⋅ M ⋅ D
Response x
Response Ratio = --------------------------------Response ISTD
RFx ist der Responsefaktor aus dem Dialogfeld “Calibration Settings”.
Sie können an diesen Formeln sehen, daß die Variationen des ISTD Response
zur Korrektur in der Mengenbestimmung der unbekannten Substanz benutzt
werden.
2 Verwendung eines kalibrierten Peaks. Damit wird sichergestellt, daß zur
Quantifizierung aller Peaks derselbe Responsefaktor benutzt wird. Der
Responsefaktor der ausgewählten Substanz und die unkalibrierten Peaks
werden durch Rekalibrierungen korrigiert. Änderungen des
Responsefaktors des kalibrierten Peaks führen zur gleichen Änderung des
Responsefaktors des unbekannten Peaks. Falls eine Kalibriertabelle
erstellt wurde, können Sie in “Using Compound” des Dialogfeldes
“Calibration Settings” eine Substanz auswählen .
Die Gleichungen zur Berechnung der Menge einer Substanz eines
unkalibrierten Peaks x sind oben aufgeführt.
175
Quantifizierung
Berechnungen mit internem Standard (ISTD)
176
9
9
Kalibrierung
Kalibrierung
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Definition der Bergriffe
• Kalibriertabelle
• Kalibrierkurve
• Unbekannte Proben
• Kalibrierverfahren
• Gruppenkalibrierung
• Rekalibrierung
178
Kalibrierung
Definition der Begriffe
Definition der Begriffe
Kalibrierung
Eine Kalibrierung ist ein Verfahren zur Berechnung absoluter
Substanzkonzentrationen. Hierzu werden spezielle Kalibrierproben
(Standards) gemessen und ihr Response ermittelt. Die Kalibriertabelle wird
auch zur Identifizierung verwendet. Siehe Kapitel7 “Peak Identification
(Peakerkennung)”.
Substanz
Eine chemische Substanz kann bei einer Mehrfachsignalkalibrierung
mehrere Peaks liefern, normalerweise einen Peak pro Signal. Bei einer
Einfachsignalkalibrierung wird die Substanz nur auf einen Peak bezogen.
Kalibrierstufen (Level)
Eine Kalibrierstufe enthält die Kalibrierpunkte für die Kalibrierung einer
Probenkonzentration an. Bei einer Mehrfachsignalkalibrierung können die
Kalibrierpunkte auf mehrere Signale verteilt sein.
Kalibrierpunkt
Ein Kalibrierpunkt bezieht sich auf das Mengen/Response-Verhältnis eines
Peaks auf der Kalibrierkurve.
Kalibrierprobe
Eine Kalibrierprobe, auch Kalibrierstandard oder Standardmischung
genannt, ist eine Probe mit einem bekannten Gehalt der Substanz, die
quantifiziert werden soll. In der Software wird die Kalibrierprobe als
Injektion aus dem Kalibrierfläschchen bezeichnet.
Kalibrierproben sind bei den Anbietern von Feinchemikalien erhältlich oder
können durch sorgfältiges Verdünnen einer bekannten Menge eines reinen
Stoffes hergestellt werden. Die Menge des Stoffes in der Kalibrierprobe wird
meist in Konzentrationseinheiten angegeben, oft in der Einheit ng/ml.
179
Kalibrierung
Kalibriertabelle
Kalibriertabelle
Eine Kalibriertabelle enthält Umrechnungen von Peakflächen oder
Peakhöhen in Einheiten, die Sie selbst wählen können. Sie enthält eine Liste
mit Retentions- bzw. Migrationszeiten aus einem Kalibrierlauf. Diese
Retentions- bzw. Migrationszeiten werden mit denen des Analysenlaufes
verglichen. Wenn eine Übereinstimmung vorliegt, wird für den Peak der
Probe mit den Verfahren aus Kapitel7 “Peak Identification (Peakerkennung)”
angenommen, daß es sich um dieselbe Substanz handelt wie in der
Kalibriertabelle. Bei der Analyse oder der Reporterstellung werden die
Mengen jedes eingetragenen Peaks dazu verwendet, die Mengen für das
ausgewählte Kalibrierverfahren zu bestimmen. Die Art und Menge an
Information, die zur Erstellung einer Kalibriertabelle notwendig ist, hängt
von der Art des Kalibrierverfahrens ab.
Folgende Informationen sind zur Erstellung einer Kalibriertabelle
erforderlich:
• Die Retentions- bzw. Migrationszeiten aller Komponenten der Kalibriermischung.
• Eine Mengenangabe für jede Komponente der Kalibriermischung in
konsistenten Einheiten.
180
Kalibrierung
Kalibrierkurve
Kalibrierkurve
Eine Kalibrierkurve ist eine graphische Auftragung von Menge und Response
(Peakfläche oder Peakhöhe) für eine Komponente aus einer oder mehreren
Kalibrierproben.
Normalerweise wird ein Aliquot der Kalibrierprobe injiziert, ein Signal
gemessen und der Response mit der Peakfläche oder Peakhöhe gemäß
Abbildung 33 berechnet.
Abbildung 33
Kalibrierprobe (10 ng/µl) Signal und Kalibrierkurve
Response
Response
Zeit (min)
Menge (ng/µl)
Mit der graphischen Darstellung der Kalibrierkurve wird ein
Korrelationskoeffizient angegeben. Der Der Korrelationskoeffizient ist die
Wurzel aus dem Regressionkoeffizienten und ist ein Maß für die Anpassung
der Kalibrierkurve an die Datenpunkte. Der Koeffizient wird mit drei
Dezimalstellen im Wertebereich von
0,000 bis1,000 angegeben.
mit:
0,000 = keine Übereinstimmung
1,000 = beste Übereinstimmung
181
Kalibrierung
Kalibrierkurve
Für jede Kalibrierstufe wird die relative Abweichung angezeigt. Sie wird mit
folgender Formel berechnet:
Response calibrated – Response calculated
relRES = ----------------------------------------------------------------------------------------------------- ⋅ 100
Response calculated
mit:
relRES= relative Abweichung in Prozent
Der berechnete Response entspricht einem Punkt der Kalibrierkurve.
Die Standardabweichung kann durch Wahl von “Print calibration table and
curves” auf einigen Reports angegeben werden und wird mit folgender
Formel berechnet:
n
∑ ( Resp
ResSTD =
calibratedi
– Resp calculatedi )2
i=1
----------------------------------------------------------------------n–2
mit:
ResSTD = Standardabweichung
Respcalibratedi = kalibrierter Response im Punkt i
Respcalculatedi = berechneter Response im Punkt i
n= Anzahl der Kalibrierpunkte
182
Kalibrierung
Unbekannte Proben
Unbekannte Proben
Eine unbekannte Probe ist eine Probe, die eine unbekannte Menge einer
Substanz enthält, die quantifiziert werden soll.
Zur Ermittlung der Menge dieser Substanz in der Probe müssen Sie folgende
Schritte durchführen:
• Erstellen einer Kalibrierkurve für diese Substanz;
• Ein Aliquot der unbekannten Probe injizieren und eine Analyse auf exakt
dieselbe Weise ausführen wie bei der Kalibrierprobe;
• Ermitteln des Response, der als Fläche oder Höhe des Peaks entsprechend
des unbekannten Gehaltes an der Substanz gemessen wird;
• Berechnen des Gehaltes der unbekannten Substanz mit Hilfe der
Kalibrierkurve.
Wenn zum Beispiel für eine Probe unbekannten Gehaltes eine Fläche von 500
gemessen wird, wird mit der unter gezeigten Kalibrierkurve ein Gehalt der
unbekannten Probe von 5 ng/ml ermittelt.Abbildung 34
Abbildung 34
Signal einer unbekannten Probe und Kalibrierkurve
Response
Response
Fläche = 500
Zeit (min)
Response der
unb. Probe
= 500
Menge der
unb. Probe
= 5 ng/µl
Menge (ng/µl)
183
Kalibrierung
Kalibrierverfahren
Kalibrierverfahren
Die ChemStation bietet die beiden Kalibrierverfahren Einpunktkalibrierung
(Single-Level Calibration) und Mehrpunktkalibrierung (Multilevel
Calibration) an.
Einpunktkalibrierung
Die Kalibrierkurve aus Abbildung 35 enthält einen einzigen Kalibrierpunkt.
Einer Einpunktkalibrierung liegt die Annahme zugrunde, daß der
Detektorresponse über den interessierenden Konzentrationsbereich linear
ist. Der Responsefaktor einer bestimmten Substanz wird durch die inverse
Steigung der Kalibrierkurve durch Meßpunkt und Koordinatenursprung
bestimmt. Nachteile der Einpunktkalibrierung sind die Annahmen von
Detektorlinearität und Verlauf der Kurve durch den Ursprung. Dies stimmt
nicht immer und kann daher zu unkorrekten Ergebnissen führen.
Abbildung 35
Einpunktkalibrierkurve
Response
Kalibrierkurve
Konzentration (ng/µl)
Zur Erzielung korrekter Ergebnisse sollte eine Kalibrierkurve mindestens
zwei Kalibrierpunkte aufweisen. Diese Kalibrierpunkte sollten die in der
Probe erwarteten Mengen umschließen, d. h. darüber und darunter liegen.
184
Kalibrierung
Kalibrierverfahren
Abbildung 36
Zweipunktkalibrierkurve
Response
Kalibrierkurve
Konzentration (ng/µl)
Wenn Sie zum Beispiel eine Probe vermessen wollen, deren Gehalt im
Bereich von 1 bis 10 ng/ml erwartet wird, sollte die Kalibrierkurve
mindestens die beiden Punkte gemäß Abbildung 36 aufweisen.
Bestimmungsgrenzen
Die ChemStation erlaubt Ihnen die Definition von Bestimmungsgrenzen in
absoluten Einheiten für jede Komponente.
Mehrpunktkalibrierung
Mehrpunktkalibrierungen können bei nichtlinearem Verhalten einer Substanz
im kalibrierten Bereich oder zur Bestätigung der Linearität eingesetzt
werden. Jeder Kalibrierpunkt wird mit einer Probe einer bestimmten
Konzentration gewonnen. Die Kalibrierproben sollen mit Konzentrationen
angesetzt werden, die den Bereich der erwarteten Probenkonzentrationen
umschließen. Dann ist es möglich, Änderungen des Detektorresponse in
Abhängigkeit von der Konzentration zu berücksichtigen und die
Reponsefaktoren dafür zu berechnen.
Diese Mehrpunktkalibrierkurve hat drei Kalibrierpunkte und eine lineare
Kurvenanpassung, die durch den Koordinatenursprung verläuft. Eine solche
lineare Anpassung ähnelt der Einpunktkalibrierung insofern, als ebenfalls ein
lineares Verhältnis zwischen Detektorresponse und Konzentration
angenommen wird. Der Unterschied besteht darin, daß die Geradensteigung
durch die beste Anpassung an die Kalibrierpunkte erhalten wird.
185
Kalibrierung
Kalibrierverfahren
Abbildung 37
Mehrpunktkalibrierkurve mit drei Kalibrierpunkten
Response
Kalibrierkurve
Menge (ng/µl)
Die zugehörige Kalibriertabelle, die tabellarische Zusammenstellung der
Kalibrierdaten, wird in Tabelle 9 dargestellt.
Tabelle 9
Kalibriertabelle
Kalibrier
stufe
Menge (ng/ml)
Response (Flächeneinheiten)
2
5
500
3
10
1000
In diesem Beispiel wurden die Kalibrierproben zur Erzeugung der drei
Kalibrierpunkte mit 1, 2 und 3 bezeichnet.
Kalibrierbereiche
Jede Mehrpunktkalibrierung ist über den Konzentrationsbereich gültig, der
durch die Kalibrierproben vorgegeben wurde. Eine Extrapolation der
Kalibrierkurve, besonders im nichtlinearen Fall, ist bestenfalls eine
Näherung. Der gültige Konzentrationsbereich kann für jede Substanz im
Dialogfeld “Compound Details” definiert werden. Jeder Eintrag besteht aus
einer Ober- und einer Untergrenze. Bei Überschreiten dieser Grenzen wird
ein Hinweis in den Report eingefügt.
186
Kalibrierung
Kalibrierverfahren
Anpassungsverfahren an Kalibrierkurven
Für die Mehrpunktkalibrierung sind verschiedene Anpassungsverfahren
verfügbar.
• Punkt zu Punkt
• Linear
• Logarithmisch
• Potenziert
• Exponentiell
• Quadratisch
• Kubisch
• Mittelwertbildung (Response/Menge)
Nichtlineare Anpassungsverfahren
In einigen Fällen ändert sich der Detektorresponse nicht linear mit der
Probenkonzentration. In diesen Fällen ist eine Kalibrierung auf der Basis
einer linearen Regression unzulässig und es sollte eine
Mehrpunktkalibrierung eingesetzt werden.
Behandlung des Koordinatenursprunges
Es stehen vier Möglichkeiten zur Einbeziehung des Koordinatenursprunges
zur Verfügung:
• Ursprung ignorieren
• Ursprung einbeziehen
• Verlauf durch Koordinatenursprung erzwingen
• Mit Koordinatenursprung verbinden
Um zu erzwingen, dass der Koordinatenursprung in der Kalibrierkurve
enthalten ist, werden die Kalibrierpunkte am Ursprung vom ersten
Quadranten in den dritten gespiegelt. Die Verwendung aller Punkte für die
Regressionsberechnung sichert, dass die Kalibrierkurve durch den Ursprung
läuft. Dies wird auch in Abbildung 38 auf Seite 188 erklärt.
187
Kalibrierung
Kalibrierverfahren
Abbildung 38
Verlauf durch Koordinatenursprung erzwingen
Response
Kalibrierkurve
()
Menge (ng/µl)
()
()
Weitere Informationen zu Kurvenanpassungen in Kalibrierungen und zur
Behandlung des Achsenabschnittes finden Sie in Ihrer Online-Hilfe.
Gewichtung von Kalibrierpunkten
Bei der Erstellung Ihrer Standardkalibrierkurve können Sie eine relative
Gewichtung der verschiedenen Kalibrierpunkte angeben. Folgende Optionen
können zur Gewichtung gewählt werden:
Gewichtung
Description
Gleich
Alle Kalibrierpunkte der Kurve werden gleich gewichtet.
Linear (Menge) Ein Kalibrierpunkt der Menge x erhält die Gewichtung
1/x, normiert auf die niedrigste Konzentration. So ergibt
sich für den höchsten Gewichtungsfaktor der Wert 1. Die
Normierung wird über die Multiplikation der Gewichtung
mit der niedrigsten Konzentration durchgeführt.
Beispielsweise resultiert die Gewichtung für einen
Kalibrierpunkt der Menge x aus 1 ⁄ x ⋅ a , wobei a die
kleinste Menge Kalibriersubstanz darstellt, die in den
Kalibrierstandards enthalten ist.
Wenn der Ursprung einbezogen ist, wird ihm der
188
Kalibrierung
Kalibrierverfahren
Mittelwert der Gewichtungen der anderen Kalibrierpunkte
zugewiesen.
Linear (Resp)
Quadratisch
(Menge)
Quadratisch
(Resp)
# kalibriert
Ein Kalibrierpunkt mit der Response y hat die Gewichtung
1/y auf die niedrigste Response normalisiert, so dass der
größte Gewichtungsfaktor 1 ist. Die Normalisierung
geschieht durch Multiplikation der Gewichtung mit der
kleinsten Response. Beispielsweise ist die Gewichtung
eines Kalibrierpunktes mit der Menge y ( 1 ⁄ y ) – b , wobei b
die Reponse bezogen auf die kleinste Menge
Kalibriersubstanz, die in den Kalibrierstandards enthalten
ist, darstellt.
Wenn der Ursprung einbezogen ist, wird ihm der
Mittelwert der Gewichtungen der anderen Kalibrierpunkte
zugewiesen.
Ein Kalibrierpunkt der Menge x erhält die Gewichtung 1/x2
, normiert auf die niedrigste Konzentration. So ergibt sich
für den höchsten Gewichtungsfaktor der Wert 1. Die
Normierung wird über die Multiplikation der Gewichtung
mit der niedrigsten Konzentration durchgeführt.
Beispielsweise resultiert die Gewichtung für einen
2
2
Kalibrierpunkt der Menge x aus 1 ⁄ x ⋅ a , wobei a die
kleinste Menge Kalibriersubstanz darstellt, die in den
Kalibrierstandards enthalten ist.
Ein Kalibrierpunkt mit der Response y hat die Gewichtung
1/y2 auf die niedrigste Response normalisiert, so dass der
größte Gewichtungsfaktor 1 ist. Die Normalisierung
geschieht durch Multiplikation der Gewichtung mit der
kleinsten Response. Beispielsweise ist die Gewichtung
2
2
eines Kalibrierpunktes mit der Response y 1 ⁄ y ⋅ b ,
wobei b die Reponse bezogen auf die kleinste Menge
Kalibriersubstanz, die in den Kalibrierstandards enthalten
ist, darstellt.
Jeder Kalibrierpunkt erhält eine Gewichtung
entsprechend der vorliegenden Anzahl an
Rekalibrierungen für diesen Punkt. Es wird keine
Normierung durchgeführt.
Quadratische Kalibrierpunkt-Gewichtung kann z.B. zur Anpassung bei
streuenden Kalibrierpunkten verwendet werden. Sie führt dazu, dass
189
Kalibrierung
Kalibrierverfahren
Kalibrierpunkte, die näher am Ursprung liegen und somit genauer bestimmt
werden können, höher gewichtet werden als Kalibrierpunkte, die weiter vom
Ursprung entfernt sind und eher streuen können.
Sie sollten Ihre Entscheidung bezüglich der Kalibrierpunktgewichtung von
den Anforderungen Ihrer Methode abhängig machen.
190
Kalibrierung
Gruppenkalibrierung
Gruppenkalibrierung
Gruppenkalibrierungen können für Substanzen verwendet werden, bei denen
für einzelne Komponenten keine Konzentrationen bekannt sind, sondern nur
die Konzentrationen einer Gruppe von Komponenten. Ein Beispiel dafür sind
Isomere. Es werden vollständige Substanzgruppen kalibriert; dabei kommen
folgende Formeln zum Einsatz:
Kalibrierung
Conc AB = RF A ⋅ R esponse + RFB ⋅ Response B
A
mit:
ConcAB ist die Konzentration der Substanzgruppe, die aus Substanz A und
B besteht
ResponseA ist die Fläche (bzw. Höhe) der Substanz A
RFA ist der Responsefaktor
Dabei werden für die Substanzen einer Gruppe dieselben Responsefaktoren
vorausgesetzt:
RF A = RF B
Folglich wird die Konzentration einer Substanz aus einer Substanzgruppe wie
folgt berechnet:
Conc AB ⋅ Resp A
Conc A = ----------------------------------------Resp A + RespB
191
Kalibrierung
Peakaddition
Peakaddition
Die Tabelle der Peaksummen wird für einige Anwendungen für die
petrochemische oder pharmazeutische Industrie geliefert und läßt sich
folgendermaßen sehr wirksam einsetzen:
• Addition der Peakflächen, die innerhalb eines benutzerdefinierten
Bereiches liegen
• Addition der Flächen eines Peakbereiches und Berechnung mit einem
einzigen Multiplikator
• Addieren Sie die Flächen aller Peaks, die denselben Namen haben.
Die Tabelle der Peaksummen ähnelt in mancher Hinsicht der Kalibriertabelle.
Wie die Kalibriertabelle ist sie mit der aktuellen Methode verknüpft.
HINWEIS
Sie müssen erst eine Kalibriertabelle für eine Analyse erstellen, bevor Sie eine
Tabelle der Peaksummen anlegen können.
192
Kalibrierung
Rekalibrierung
Rekalibrierung
Was ist Rekalibrierung?
Unter Rekalibrierung versteht man die Aktualisierung eines Kalibrierpunktes
auf einer Kalibriergeraden. Bei einer Rekalibrierung wird eine Probe
vermessen, die dieselben Substanzen in denselben Mengen enthält wie die
Originalprobe. Durch Vermessen dieser Kalibrierprobe erhalten Sie
aktualisierte Responsefaktoren und Retentions- bzw. Migrationszeiten. Sie
können auch eine Mittelwertbildung aus mehreren Läufen zur Gewichtung
der Responsefaktoren wählen.
Warum ist die Rekalibrierung wichtig?
Die meisten Kalibrierungen sind nur für eine beschränkte Zeit gültig, weil
sich die chromatographischen bzw. elektropherographischen
Rahmenbedingungen verändern. Die Rekalibrierung dient zur Sicherstellung
der Genauigkeit der Quantifizierung. Falls zum Beispiel eine Kalibriertabelle
zur quantitativen Bestimmung von Coffein angelegt wurde, muß nach einem
etwaigen Säulen- bzw. Kapillarenwechsel eine Rekalibrierung durchgeführt
werden. Auch wenn es sich um denselben Säulen- bzw. Kapillarentyp handelt,
besitzt die Säule bzw. Kapillare nicht genau dieselben Eigenschaften, wie die,
mit der die Kalibriertabelle für Coffein erstellt wurde. Daher sollten die
Stufen der Kalibriertabelle mit der neuen Säule bzw. Kapillare nochmals
ermittelt werden, bevor die unbekannte Probe auf ihren Coffeingehalt
untersucht wird. Durch diese Vorgehensweise werden die Proben unter
denselben Bedingungen analysiert.
Manuelle Rekalibrierung
Sie können Informationen für Peakkalibrierungen auch manuell eingeben
und die Kalibriertabelle mit Hilfe der Schaltfläche "Manual Setup" im
Dialogfeld "New Calibration Table" normieren. Normalerweise wird eine
neue Kalibriermethode erstellt, indem man eine Standardmischung
analysiert, eine Kalibriertabelle erstellt und die Menge aller kalibrierter Peaks
angibt, um die Responsefaktoren zu berechnen. Für einige Anwendungen,
z.B. in der petrochemischen Industrie, ist dieser Ansatz sehr ineffizient, da
dieselben Substanzen seit Jahren untersucht werden und die
Responsefaktoren der verschiedenen Substanzen für verschiedene
Detektoren bereits vorliegen.
193
Kalibrierung
Rekalibrierung
In diesem Fall wird die Kalibriertabelle manuell erstellt, indem die Peaks und
ihre Responsefaktoren in die Kalibriertabelle eingetragen werden. Außerdem
muß die Methode mit einem Standard, der mindestens einen Referenzpeak
enthält, rekalibriert und Abweichung (%) aktualisiert werden.
Rekalibrierung mit Peakaddition
Wenn eine Rekalibrierung durchgeführt wird, werden die Bereiche für die
Retentionszeiten in der Peaksummen-Tabelle vor der eigentlichen
Rekalibrierung aktualisiert. Rekalibrierungen der Peaksumme werden auf
diese Weise durchgeführt, um sicherzustellen, daß Abweichungen in die
Zeitberechnungen aufgenommen werden.
Optionen für die Rekalibrierung
Es gibt mehrere Möglichkeiten, die Werte für den Response in der
Kalibriertabelle durch neue Kalibrierdaten zu ersetzen.
Mittelwert
(Average)
Der Mittelwert aus allen Ergebnissen der Kalibrierläufe
wird nach folgender Formel berechnet
n ⋅ Response + MeasResponse
Response = ------------------------------------------------------------------------------n+1
mit
n = Anzahl der vorherigen Kalibrierungen
MeasResponse = gemessener Response
Fließender
Mittelwert
(Floating
Average)
Aus allen Kalibrierläufen wird ein gewichteter Mittelwert
berechnet. Die neue Gewichtung wird im Dialogfeld
“Recalibration Settings” eingetragen.
Weight
Weight
Response =  1 – ------------------- ⋅ Response +  ------------------- ⋅ MeasResponse

 100 
100 
mit
Prozentanteil= neue Gewichtung für den Response in den
Einstellungen für die Rekalibrierung
194
Kalibrierung
Rekalibrierung
MeasResponse = gemessener Response
Ersetzen
(Replace)
Die alten Werte für den Response werden durch die neuen
Werte ersetzt.
Möglichkeiten der Rekalibrierung
Mit der ChemStation Software können Rekalibrierungen auf zwei Arten
durchgeführt werden. Sie können interaktiv oder automatisch während einer
Sequenz rekalibrieren. Die interaktive Rekalibrierung ist die direkte
Durchführung aller Rekalibrierschritte mit der ChemStation nach der
Injektion einer oder mehrerer Proben. Rekalibrierungen mit einer Sequenz
erfordern die Angabe des Rekalibrierzeitpunktes, die Rekalibrierung wird
von der Software dann automatisch vorgenommen. Für weitere
Informationen schlagen Sie bitte unter “Automatische Rekalibrierung” on
page 212 nach.
Weitere Informationen über die Durchführung einer Rekalibrierung mit Hilfe
der Software finden Sie im Abschnitt “How To” des Hilfe-Systems oder im
integrierten Tutorial.
Rekalibrierung unidentifizierter Peaks
Es gibt drei Möglichkeiten zur Rekalibrierung unidentifizierter Peaks.
Keine Rekalibrierung
Wenn ein Peak der Kalibriertabelle bei der Ausgabe der
Integrationsergebnisse nicht identifiziert werden kann, wird die Kalibrierung
abgebrochen. Wenn dies innerhalb einer Sequenz auftritt, wird die Sequenz
ebenfalls abgebrochen.
Partielle Rekalibrierung
Diese Möglichkeit gestattet die Rekalibrierung der identifizierten Peaks.
Fehlende Peaks führen nicht zum Abbruch der Kalibrierung, aber zu einem
entsprechenden Hinweis im Report.
Rekalibrierung aller Retentions- bzw. Migrationszeiten
Diese Möglichkeit gestattet die Rekalibrierung von Retentions- bzw.
Migrationszeit aller identifizierten und unidentifizierten Peaks. Dies
geschieht mit Hilfe der Retentions- bzw. Migrationszeiten aller identifizierten
195
Kalibrierung
Rekalibrierung
Peaks. Die Responsefaktoren unidentifizierter Peaks werden nicht
aktualisiert.
196
10
10
Automatisierung
Automatisierung
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Was ist Automatisierung?
• Was ist eine Sequenz?
• Mit Sequenzen arbeiten
• Sequenztypen
• Sequenzen editieren
• Was geschieht während der Ausführung einer Sequenz? und
• Anpassung von Sequenzen
198
Automatisierung
Was ist Automatisierung?
Was ist Automatisierung?
Unter Automatisierung versteht man die unbeaufsichtigte Ausführung
mehrerer Analysen.
Der Sequenzteil der ChemStation Software ermöglicht Ihnen die
automatische Datenerfassung, Datenauswertung und Reporterstellung.
199
Automatisierung
Was ist eine Sequenz?
Was ist eine Sequenz?
Eine Sequenz ist eine Folge von Anweisungen zur Automatisierung der
Analyse von Proben.
Eine Sequenz kann eine Probe automatisch injizieren und die Daten gemäß
der gewählten Methode erfassen und auswerten. Jede Probe in einer Sequenz
kann mit einer anderen analytischen Methode vermessen werden. Daher
können unterschiedliche Parametersätze für die chromatographischen oder
elektrophoretischen Bedingungen und in der Datenauswertung verwendet
werden.
200
Automatisierung
Sequenzparameter
Sequenzparameter
Das Dialogfeld “Sequence Parameters” enthält Informationen, die für alle
Proben einer Sequenz gleich bleiben. Sie können in diesem Dialogfeld
folgende Parameter einstellen:
• Informationen zum Verzeichnis der Datensätze und zum Anwender (der
Anwendername aus dem Dialogfeld “Operator Name” wird angezeigt)
• Angaben zur Ausführung der Sequenz durch Wahl von Parametern im
Dialogfeld “Part of Methods to Run”.
Hier können zum Beispiel folgende Eingaben gemacht werden:
• Durchführung der Sequenz entsprechend der RunTime Checkliste
• Nur die Datenerfassung durchführen
• Nur die Datenauswertung durchführen
Wenn die Option Datenauswertung (Reprocessing) gewählt wird, können Sie
zwischen den Probendaten, die bei der ursprünglichen Auswertung der
Proben gewählt wurden oder aktualisierten Daten wählen. Dies geschieht
durch Aktivieren des Ankreuzkästchens “Use Sequence Table” oder Eingabe
der Daten in die Sequenztabelle.
• Mit dem Parameter “Shutdown” kann festgelegt werden, was nach Ende
der Sequenz geschehen soll
• Legen Sie fest, ob Strichcodes verwendet werden sollen und was bei einer
Nichtübereinstimmung der Strichcodes geschehen soll; dies setzt voraus,
daß Sie einen Strichcodeleser an Ihrem System installiert haben.
201
Automatisierung
Sequenztabelle
Sequenztabelle
In der Sequenztabelle werden die Methoden zur Analyse der Proben und die
Reihenfolge der Probenfläschchen in der Messung festgelegt. Diese Tabelle
enthält auch Informationen zu jeder Probe, einschließlich eines Namens und
Parametern zur Quantifizierung und Rekalibrierung.
Das Gruppenfeld “Injector” wird beim Einsatz mit Geräten angezeigt, die
Dual Sampling unterstützen, z. B. ein GC. Die Wahl von Front oder Back zeigt
die Zeilen in der Sequenztabelle neben dem aktiven Status dieses Injektors
an.
Eine Beschreibung der einzelnen Spalten dieser Tabelle und das
Zusammenwirken mit Informationen aus der Methode finden Sie in der
Online-Hilfe.
202
Automatisierung
Erstellen einer Sequenz
Erstellen einer Sequenz
Verwenden Sie die Sequenztabelle zur Festlegung der Proben, Methoden und
Probenfläschchen in der Sequenz. Die Sequenztabelle zeigt jede Probe der
Sequenz in der Reihenfolge, in der die Messung erfolgt und enthält die
notwendigen Informationen bezüglich Probenfläschchen, Methode und
Kalibrierung für jede Probe.
Verwenden der Schaltfläche “Insert Vial Range”
Falls Sie sehr viele Proben zur Vermessung mit einer Methode haben, können
Sie diese schnell in die Sequenztabelle einfügen, indem Sie die Funktion
“Insert Vial Range” (Probenbereich einfügen) nutzen. Diese Funktion kopiert
Methodenname, Bereich der Probenfläschchen, Anzahl der Injektionen pro
Probenfläschchen und nach Wunsch die Probenmenge, Menge des internen
Standards, Multiplikations- und Verdünnungsfaktor. Das System fügt die
erforderlichen Informationen für jede Probe innerhalb dieses Bereiches in
die Sequenztabelle ein.
Verwenden der Schaltfläche “Append Line”
Wenn Sie eine leere Zeile an die Sequenz anhängen wollen, wählen Sie die
Schaltfläche “Append Line” an.
203
Automatisierung
Arbeiten mit Sequenzen
Arbeiten mit Sequenzen
Sequenzen werden im Menü “Sequence” aufgerufen und erstellt. Sequenzen
werden in derselben Weise erstellt und gespeichert wie Methoden. Beim
Speichern einer Sequenz wird eine Datei mit der Erweiterung .S abgelegt.
Wenn Sie die Sequenz erneut editieren oder laden wollen, erfolgt der Zugriff
mit “Load Sequence” im Menü “Sequence”.
Vorzugsproben (Priority Samples)
Eine aktuell laufende Sequenz kann nach Abschluß einer aktuell laufenden
Methode unterbrochen werden. Eine dazwischengeschobene Vorzugsprobe
kann dann mit derselben oder einer anderen Methode vermessen werden.
Die Sequenz wird anschließend mit derjenigen Probe fortgesetzt, mit der die
Sequenz auch ohne Unterbrechung weitergelaufen wäre.
Durchführung von Sequenzen mit Kontrollproben
Eine Probe kann im Feld “Sample Type” der Sequenztabelle als
Kontrollprobe festgelegt werden. Die Methode, mit der diese Probe
abgearbeitet wird, muß eine Kalibriertabelle besitzen, in der Grenzwerte für
eine der enthaltenen Substanzen eingegeben sind. Wenn die festgelegten
Grenzwerte für die Kontrollprobe überschritten werden, wird die Sequenz
gestoppt und eine Meldung in das Logbuch geschrieben. Wenn Sie einen der
Reportarten der ChemStation verwenden, werden die Grenzwerte für die
Kontrollproben in den Analysenreport mit aufgenommen. Weitere
Informationen über das Festlegen einer Sequenz mit Kontrollproben finden
Sie im Abschnitt “How To” Ihres Online-Hilfe Systems.
Stoppen einer Sequenz
Der aktuelle Lauf wird vor dem Stop der Sequenz vollständig durchgeführt.
Eine gestoppte Sequenz kann nicht mehr fortgesetzt werden.
Abbrechen einer Sequenz
Die Funktion “Abort” unterbricht eine Sequenz sofort.
204
Automatisierung
Arbeiten mit Sequenzen
Pausieren einer Sequenz
Während einer Pause im Sequenzablauf können die Namen von
Sequenztabelle und Datensätzen nicht geändert werden. Sie können in der
Sequenztabelle nur die Zeilen, die noch nicht bearbeitet wurden oder in der
aktuellen Zeile die Nummer des Probenfläschchens verändern. Sie können
bei anstehenden Analysen Zeilen hinzufügen, löschen und verändern.
Es könnte zum Beispiel erforderlich sein, zu einer aktiven Sequenz weitere
Proben hinzuzufügen. Sie können die Sequenz editieren und eingeben, daß
diese Proben im Anschluß an die aktuell laufende Sequenz bearbeitet
werden.
Ausführen einer Teilsequenz
Eine bereits erstellte Sequenztabelle kann durch Wahl von “Partial Sequence”
im Menü “Sequence” auch teilweise ausgeführt werden. Das System zeigt das
Dialogfeld “Partial Sequence” an und ermöglicht Ihnen die Auswahl einzelner
Proben zur Analyse.
Jede Zeile des Dialogfeldes “Partial Sequence” entspricht einem
Analysenlauf. Für jeden Analysenlauf werden Probenfläschchen, Methode,
Datensatz- und Probenname angegeben. Zusätzlich stehen in den Spalten
„Seq Tbl" und „Calib:RF:RT" kodierte Informationen zur Sequenztabelle und
den Kalibrierproben. In der Online-Hilfe finden Sie die Erläuterungen dieser
Kodierungen.
Über die Druckschaltfläche können Sie die Teilsequenz ausdrucken.
Das folgende Dialogfeld "Partial Sequence" wird erstellt, wenn die Methode
"SimpReg Method" und die Sequenztabelle, die unter Tabelle 14 und Tabelle
15 dargestellt ist, gewählt werden. Die Proben 1, 2, 4, 5 und 8 sind für eine
Bearbeitung markiert.
205
Automatisierung
Arbeiten mit Sequenzen
Abbildung 39
Dialogfeld für eine Teilsequenz
206
Automatisierung
Logbuchdatei einer Sequenz
Logbuchdatei einer Sequenz
Es wird eine Logbuchdatei angelegt, die alle Ereignisse enthält, die während
der Ausführung der Analyse auftraten. Dies ist zur Fehlererkennung bei
unbeobachtet ausgeführten Sequenzen, zum Beispiel über Nacht, von Nutzen.
Die Logbuchdatei trägt stets die Dateinamenerweiterung .log. Die
Logbuchdatei wird in dem Verzeichnis abgelegt, in dem sich die Datensätze
der Sequenz befinden.
207
Automatisierung
Was geschieht während der Ausführung einer Sequenz?
Was geschieht während der Ausführung
einer Sequenz?
• Bei vorhandenem Autosampler sucht die ChemStation Software zuerst die
Probe im Autosampler gemäß der Zahl in der Spalte “Vial”.
• Die Methodenparameter werden an die Analysengeräte weitergegeben.
• Das Makro vor dem Analysenlauf (Prerun Macro) wird ausgeführt.
• Die Probe wird entweder manuell oder automatisch injiziert.
• Die Datenauswertung der Methode wird durchgeführt. Dies umfaßt
Integration, Quantifizierung, Reporterstellung und eventuelle Makros des
Anwenders.
• Das Makro nach dem Analysenlauf (Postrun Macro) wird ausgeführt.
• Während des gesamten Vorganges verfolgt die ChemStation den
Fortschritt der Sequenz in Echtzeit und legt eine Logbuchdatei an.
Abbildung 40
Statusfolge einer Sequenz
Status der ChemStation
Injektion
Post-Run Makro
Datenauswertung
Statusebenen
Injektion und
Analysenlauf
Pre-Run Makro
Laden d. Methode
Start der Sequenz
208
Rohdaten
geschlossene
Datei
Automatisierung
Vergabe von Dateinamen in einer Sequenz
Vergabe von Dateinamen in einer Sequenz
In einer Sequenz können Dateinamen folgendermaßen vergeben werden:
• automatisch
• manuell
• mit Prefix-Zähler
Sie sollten auf jeden Fall ein Unterverzeichnis angeben, in dem die
Datensätze gemäß Abschnitt “Sequenzparameter” auf Seite 201 gespeichert
werden sollen.
Automatische Vergabe von Dateinamen in einer Sequenz
Probenfläschchen
Beispiel: 017-0103.D
mit:
• Die ersten drei Stellen nennen die Nummer des Probenfläschchens, hier
017.
• Die vierte Stelle ist bei LC und Elektrophorese ein Trennstrich (-). In der
Gaschromatographie erscheinen entweder F (für Front) oder B (für Back).
• In der fünften und sechsten Stelle steht die Zeilennummer der Sequenz, die
die verwendete Methode vorgibt, hier 01 für die erste Zeile der Sequenz.
• In der siebten und achten Stelle stehen die Injektionsnummern dieses
Probenfläschchens mit dieser Methode, hier 03 für die dritte Injektion.
Nullproben als Analysenläufe
Beispiel: NV--0499.D
mit:
• NV steht für “no vial” (kein Probenfläschchen)
• - ist der Trennstrich
• 0499 ist die 99-te Nullprobe aus der Sequenzzeile 4.
209
Automatisierung
Vergabe von Dateinamen in einer Sequenz
Manuelle Vergabe von Dateinamen
Eine Spalte in der Sequenztabelle hat die Beschriftung “Datafile”. Wenn hier
nichts eingetragen wird, werden die Dateinamen nach einer der anderen
Möglichkeiten (automatisch oder über Prefix-Zähler) vergeben. Wird in die
Spalte mit der Beschriftung “Datafile” irgendein Text eingegeben, verwendet
die ChemStation diesen Text als Dateinamen für den Analysenlauf.
Wenn in einer Zeile mit einem manuell vergebenen Dateinamen für ein
Probenfläschchen mehrere Injektionen vorgesehen sind, schneidet die
ChemStation automatisch Buchstaben vom eingegebenen Namen ab und
hängt die Injektionsnummer an. Dies verhindert, daß derselbe Dateiname für
mehrere Injektionen vergeben wird.
Vergabe von Dateinamen über einen Prefix-Zähler
Wenn Sie für die Benennung von Datensätzen den Prefix-Zähler verwenden,
erstellt die ChemStation für jede Analyse einen Namen. Bei Geräten, die
Analysen mit Doppelsignalen ermöglichen, wie z.B. dem GC, erstellt die
ChemStation für jedes Signal einen Dateinamen.
Die ChemStation erstellt die Dateinamen aus einem vom Anwender
eingegebenen Prefix (bestehend aus 1 bis 7 alphanumerischen Zeichen) und
einem Zähler (8 weniger der Anzahl der Zeichen im Prefix).
Im unten aufgeführten Beispiel ist TEST der Prefix und 0001 der Zähler.
TEST0001
Der Zähler wird mit jedem erstellten Datensatz um eins erhöht.
210
Automatisierung
Aktionen nach der Sequenz
Aktionen nach der Sequenz
Sie können angeben, was nach dem Ende der planmäßigen
Sequenzausführung oder wenn die ChemStation während der Ausführung
einen Fehler entdeckt, geschehen soll. Für LC-Sequenzen ermöglicht das
Ankreuzkästchen “Post-Sequence Cmd/Macro” des Dialogfeldes “Sequence
Parameters” folgende Wahlmöglichkeiten:
• Aktivieren eines STANDBY-Status mit ausgeschalteten Pumpen und
Lampen
• Aktivieren eines LAMPOFF-Status mit ausgeschalteten Lampen (nur LC
und CE)
• Aktivieren eines PUMPOFF-Status mit ausgeschalteten Pumpen (nur LC
und CE)
• Aktivieren eines SHUTDOWN-Makros oder Modifikation von
SHUTDOWN.MAC zur Festlegung bestimmter Operationen.
So können Sie Ihr System nach der Ausführung der Sequenz abschalten.
Das Makro SHUTDOWN kann auch zum Reduzieren oder Abschalten der
Flußrate benutzt werden.
Im Dialogfeld “Sequence Parameters” können Sie die Ausführung eines
beliebigen Makros festlegen, indem Sie dessen Namen im Feld
“Post-Sequence Cmd/Macro” eintragen und das Kontrollkästchen aktivieren.
Not Ready Timeout (nur für LC und CE)
Der Parameter “Not Ready Timeout” im Dialogfeld “Sequence Parameters”
bestimmt die Zeitdauer, die das System maximal darauf wartet, daß ein
Analysengerät bereit ist. Nach einer Zeitüberschreitung erfolgt eine
Abschaltung (Shutdown).
Wait Time (nur für LC und CE)
Im Dialogfeld “Sequence Parameters” kann eine Wartezeit spezifiziert
werden, die nach Laden der Methode und vor der ersten Injektion mit dieser
Methode verstreicht. Dies könnte der Equilibrierung von Säule oder Kapillare
unter neuen analytischen Bedingungen dienen.
211
Automatisierung
Automatische Rekalibrierung
Automatische Rekalibrierung
Eine Kalibrierung wird meistens nach einer Änderung der
Arbeitsbedingungen, zum Beispiel nach dem Wechsel einer Säule oder
Kapillare, durchgeführt. Eine automatische Rekalibrierung wird
normalerweise beim Start einer Analysensequenz oder in regelmäßigen
Abständen während der Sequenz zur Kompensation von Faktoren
durchgeführt, die das analytische Ergebnis beeinflussen.
Zwei Möglichkeiten stehen zur Durchführung einer automatischen
Sequenzrekalibrierung zur Verfügung:
• Explizit angegebene Kalibriersequenzen
• Zyklische Kalibriersequenzen
212
Automatisierung
Spezifizieren von Rekalibrierungen
Spezifizieren von Rekalibrierungen
Die Parameter zur Rekalibrierung einer Sequenz werden direkt in die
Sequenztabelle eingetragen. Diese Parameter legen fest, wie die Methode im
Lauf einer Sequenz rekalibriert wird.
Die Rekalibrierparameter in der Sequenztabelle
Der Responsefaktor und die Retentions- bzw. Migrationszeiten können auf
mehrere Arten aktualisiert werden. Der Kalibrierpunkt, der aktualisierte
Responsefaktor und aktualisierte Retentions- bzw. Migrationszeiten werden
in der Datenauswertung benutzt, wenn die Kalibriertabelle rekalibriert
wurde.
Wenn in der Spalte mit der Beschriftung “ SampleType” der Probentabelle
“Calibration “ eingegeben ist, werden folgende Spalten aktiviert und somit
editierbar:
• CAL level
• Update RT
• Update RF
• Intervall
Die Werte, die man für jede dieser Spalten eingeben kann, sind in Tabelle 10
aufgeführt.
Tabelle 10 zeigt die Spalten der Sequenztabelle, die die Rekalibrierparameter
enthalten sowie die verwendbaren Werte.
Keine Aktualisierung (No Update)
Responsfaktoren oder Retentions- bzw. Migrationszeiten werden nicht
aktualisiert.
Ersetzen (Replace)
Ersetzt die vorigen Responsefaktoren (Flächen oder Höhen) mit den Werten
des aktuellen Laufes. Der Response wird für Peaks, die in diesem Lauf nicht
gefunden wurden, nicht geändert.
213
Automatisierung
Spezifizieren von Rekalibrierungen
Tabelle 10
Rekalibrierparameter in der Sequenztabelle
CAL level
Update RT
Kalibriertabelle Stufe No update (Kein
(Level) # (1-999)
Update)
Update RF
Intervall
No update (Kein
Update)
Zyklisches
Rekalibrierintervall #
(1-999)
Mittelwert (Average) Mittelwert
(Average)
Ersetzen (Replace)
Blank
Ersetzen (Replace)
Bracket
(Umschließen)
Delta%
Mittelwert (Average)
Aus den Responsefaktoren (Flächen oder Höhen) der Originalkalibrierung
und allen nachfolgenden Kalibrierungen werden Mittelwerte gebildet. Wenn
ein Peak in einem der Rekalibrierläufe fehlt, wird der durchschnittliche
Response nicht beeinträchtigt.
Umschließen (Bracket)
Die Analysenläufe werden von Kalibrierungen vor und nach der Messung
umschlossen. Die Auswertung wird durchgeführt, nachdem die letzte
Kalibrierprobe vermessen wurde. Die zuvor durchgeführten Kalibrierdaten
werden durch die neuen Ergebnisse ersetzt, die nachfolgenden
Kalibrierungen werden zur Mittelwertbildung mit dieser Kalibriertabelle
verwendet.
Intervall
Das Intervall legt die Häufigkeit von Rekalibrierungen während der
Durchführung einer Sequenz fest. Die Kalibrierhäufigkeit nennt die Anzahl
durchzuführender Analysenläufe, bevor Kalibrierproben injiziert werden. Zu
Beginn des Analysenlaufes wird eine Kalibriertabelle mit den Ergebnissen
(Responsefaktoren) erstellt. Diese Ergebnisse werden in den nachfolgenden
quantitativen Berechnungen verwendet. Nach der vorgegebenen Zahl von
Injektionen wird eine erneute Kalibrierung durchgeführt. Deren Ergebnisse
werden in die Kalibriertabelle eingegeben und überschreiben die früheren
Ergebnisse.
214
Automatisierung
Spezifizieren von Rekalibrierungen
Delta%
Mit Hilfe der Delta%-Berechnung lassen sich die Responsefaktoren einer
Analyse mit Responsefaktoren vergleichen, die von Hand in eine
Kalibriertabelle eingetragen wurden. Dabei wird Delta% auf alle kalibrierten
Peaks der Tabelle angewendet. Sie können verschiedene interne Standards
bestimmen, über deren gemessene Responsefaktoren dann die neuen
Responsefaktoren der anderen Peaks berechnet werden. Sie legen für jeden
Peak in der Kalibriertabelle fest, welcher interne Standard für die
Delta%-Berechnung verwendet werden soll.
215
Automatisierung
Sequenztypen
Sequenztypen
Es gibt folgende Sequenztypen:
• Explizite Kalibriersequenzen
• Explizite Kalibriersequenzen eines Kalibrierpunkts
• Zyklische Kalibriersequenzen mehrerer Kalibrierpunkte
• Explizite und zyklische Kalibrierungen in einer Sequenz
• Umschließende zyklische Kalibriersequenzen
216
Automatisierung
Explizite Kalibriersequenzen
Explizite Kalibriersequenzen
Dieser Sequenztyp führt eine Rekalibrierung in Intervallen durch, die Sie in
der Sequenztabelle eingeben können.
Zur Durchführung expliziter Kalibriersequenzen werden die Kalibrierproben
in die Sequenz eingegeben, ohne daß ein Eintrag für ein Intervall in der
Sequenztabelle erfolgt. Eine Rekalibrierung wird mit jeder in der
Sequenztabelle eingetragenen Kalibrierprobe durchgeführt.
217
Automatisierung
Zyklische Kalibriersequenzen eines Kalibrierpunkts
Zyklische Kalibriersequenzen eines
Kalibrierpunkts
Dieser Sequenztyp entnimmt in regelmäßigen Abständen Kalibrierlösung aus
demselben Probenfläschchen.
Das Intervall in der Sequenztabelle legt fest, wie oft die Rekalibrierung
durchgeführt wird. Ein Intervall von 2 führt zu einer Rekalibrierung nach
jeweils zwei vermessenen Proben der Sequenz.
218
Automatisierung
Zyklische Kalibriersequenzen mit mehrerer Kalibrierpunkte
Zyklische Kalibriersequenzen mit
mehrerer Kalibrierpunkte
Dieser Sequenztyp benutzt mehrereKalibrierproben zur Rekalibrierung einer
Mehrpunktkalibriermethode.
Das folgende Beispiel beschreibt eine Sequenz, die aus den beiden Methoden
A und B zur Kalibrierung zweier verschiedener Probengruppen besteht.
Beide Methoden sind Mehrpunktkalibrierungen die in definierten Intervallen
automatisch rekalibriert werden.
< 1>Für jede Methode existieren drei Einträge in der Sequenztabelle:
• Zwei Kalibrierpunkte:
Sequenzzeilen 1 und 2 in Methode A.
Sequenzzeilen 8 und 9 in Methode B.
• Fünf Einträge für Proben:
Sequenzzeilen 3 bis 7 für Methode A.
Sequenzzeilen 10 bis 14 für Methode B.
Die Angabe der regelmäßigen Intervalle erfolgt durch Einträge unter
“Recalibration Interval” in der Rekalibriertabelle der Sequenz.
• Methode A wird nach der Vermessung von jeweils 2 Proben rekalibriert.
• Methode B wird nach der Vermessung von jeweils 3 Proben rekalibriert.
Die unten aufgeführte Sequenztabelle ist zur Vereinfachung des Beispiels
verkürzt.
Tabelle 11
Sequenztabelle für Methode A und Methode B
Zei-l
Proben- Methodene
Vial name
name
Inj/V Pobenart
ial
CAL Update
level RF
Update
RT
Intervall …
1
1
Methode A
1
Kalibrierung
1
Mittelwert
(Average)
No update
(Kein Update)
2
…
2
2
Methode A
1
Kalibrierung
2
Mittelwert
(Average)
No update
(Kein Update)
2
…
219
Automatisierung
Zyklische Kalibriersequenzen mit mehrerer Kalibrierpunkte
Tabelle 11
Sequenztabelle für Methode A und Methode B, continued
Zei-l
Proben- Methodene
Vial name
name
Inj/V Pobenart
ial
CAL Update
level RF
Update
RT
Intervall …
3
10
Methode A
1
…
4
11
Methode A
1
…
5
12
Methode A
1
…
6
13
Methode A
1
…
7
14
Methode A
1
…
8
3
Methode B
1
Kalibrierung
1
Mittelwert
(Average)
No update
(Kein Update)
3
…
9
5
Methode B
2
Kalibrierung
2
Mittelwert
(Average)
No update
(Kein Update)
3
…
10
20
Methode B
1
…
11
21
Methode B
1
…
12
22
Methode B
1
…
13
23
Methode B
1
…
14
24
Methode B
1
…
Analysenfolge der Methode A
Dieser Abschnitt beschreibt die Analysenfolge der Methode A, die den ersten
Teil der Sequenz mit zwei Methoden darstellt.
Analysenfolge der Methode B
Dieser Abschnitt beschreibt die Analysenfolge der Methode B, die den
zweiten Teil der Sequenz mit zwei Methoden darstellt.
Methode B unterscheidet sich in folgenden Punkten von Methode A:
• Der Level 2 wird mit 2 Injektionen pro Probenfläschchen gewonnen. Das
Intervall wird auf 3 gestellt.
220
Automatisierung
Zyklische Kalibriersequenzen mit mehrerer Kalibrierpunkte
Tabelle 12
Analysenfolge der Methode A
Inj Nr.
Methode
Vial
Operation
1
Methode A
1
Level 1 und Report
2
Methode A
2
Level 2 und Report
3
Methode A
10
Analysenlauf und Report
4
Methode A
11
Analysenlauf und Report
5
Methode A
1
Level 1 und Report
6
Methode A
2
Level 2 und Report
7
Methode A
12
Analysenlauf und Report
8
Methode A
13
Analysenlauf und Report
9
Methode A
1
Level 1 und Report
10
Methode A
2
Level 2 und Report
11
Methode A
14
Analysenlauf und Report
Bitte beachten Sie, daß die Ergebnisse in Tabelle 12 und Tabelle 13 durch
Verwendung von “Partial Sequence” dargestellt werden können. Nachdem die
Sequenztabelle erstellt wurde, kann damit eine Vorschau auf die Ablauffolge
aufgerufen werden.
221
Automatisierung
Zyklische Kalibriersequenzen mit mehrerer Kalibrierpunkte
Tabelle 13
Analysenfolge der Methode B
Inj Nr.
Methode
Vial
Operation
12
Methode B
3
Level 1 und Report
13
Methode B
5
Level 2 und Report
14
Methode B
5
Level 2 und Report
15
Methode B
20
Analysenlauf und Report
16
Methode B
21
Analysenlauf und Report
17
Methode B
22
Analysenlauf und Report
18
Methode B
3
Level 1 und Report
19
Methode B
5
Level 2 und Report
20
Methode B
5
Level 2 und Report
21
Methode B
23
Analysenlauf und Report
22
Methode B
24
Analysenlauf und Report
222
Automatisierung
Kombination aus expliziter und zyklischer Kalibrierung
Kombination aus expliziter und zyklischer
Kalibrierung
Dieser Sequenztyp besteht aus expliziten und zyklischen Kalibrierungen in
derselben Sequenz.
Diese Möglichkeit erlaubt Ihnen eine komplette Rekalibrierung der Methode
zu Beginn einer Sequenz (explizite Rekalibrierung) und danach die
Aktualisierung der Kalibrierung (zyklische Rekalibrierung) während der
Sequenz.
• Es müssen für jeden Kalibrierpunkt (Level) in der Tabelle “Sequence
Recalibration” zwei Zeilen für die Kalibrierung angegeben werden. Eine
Zeile enthält die Einträge für die explizite, die andere für die zyklische
Rekalibrierung.
• Die Sequenztabelle muß Einträge für jede Kalibrierzeile aufweisen. Alle
Probenfläschchen der zyklischen Rekalibrierungen müssen vor den
Einträgen der expliziten Rekalibrierung und der Proben selbst eingetragen
werden.
Beispiel
Die unten dargestellte Sequenztabelle zeigt eine Methode mit
Einpunktkalibrierung namens SimpReg. Sie ist zur Vereinfachung des
Beispiels verkürzt.
Tabelle 14
Sequenztabelle für SIMPREG
1
1
SimpReg
1
Kalibrierung
1
Mittelwert
(Average)
Mittelwert
(Average)
3
…
2
1
SimpReg
1
Kalibrierung
1
Ersetzen
(Replace)
Ersetzen
(Replace)
3
2
SimpReg
1
…
4
3
SimpReg
1
…
5
4
SimpReg
1
…
6
5
SimpReg
1
…
…
223
Automatisierung
Kombination aus expliziter und zyklischer Kalibrierung
Tabelle 14
7
6
Sequenztabelle für SIMPREG
SimpReg
1
…
…
Die Tabelle hat zwei Einträge für einen Kalibrierpunkt.
• Die erste Zeile bezieht sich auf denselben Kalibrierpunkt und gibt die
Mittelwertbildung der Rekalibrierparameter vor. Das Rekalibrierintervall
gibt an, daß nach je drei Proben eine Rekalibrierung durchgeführt wird.
• Mit dem zweiten Eintrag werden alle Kalibrierparameter ersetzt; das
bedeuted, daß eine komplette Rekalibrierung ohne Rekalibrierintervall
durchgeführt wird.
Sequenztabelle
Die Sequenztabelle besteht aus sieben Zeilen. Die erste Zeile spezifiziert die
Probe zur zyklischen Rekalibrierung. Die zweite Zeile spezifiziert die
explizite Rekalibrierung, die zu Beginn der Sequenz durchgeführt wird. Die
dritte bis siebte Zeile spezifiziert die zu analysierenden Proben.
Die Reihenfolge der Einträge in die Sequenztabelle ist sehr wichtig. Alle
Einträge zu Probenfläschchen für zyklische Rekalibrierungen müssen vor
den Einträgen der Proben oder den Einträgen zur expliziten Rekalibrierung
der Methode stehen.
Analysenfolge der Methode SimpReg
In diesem Abschnitt wird die Analysenfolge der Methode SimpReg
beschrieben.
224
Automatisierung
Kombination aus expliziter und zyklischer Kalibrierung
Tabelle 15
Analysenfolge der Methode SimpReg
Seq. Zeile Inj Nr.
Methode
Vial
Operation
2
1
SimpReg
1
einfache Kalibrierung
1
2
SimpReg
1
regelmäßige Kalibrierung
3
3
SimpReg
2
Analysenlauf
3
4
SimpReg
3
Analysenlauf
4
5
SimpReg
4
Analysenlauf
5
6
SimpReg
1
regelmäßige Kalibrierung
6
7
SimpReg
5
Analysenlauf
7
8
SimpReg
6
Analysenlauf
225
Automatisierung
Umschließende zyklische Kalibriersequenzen (Bracketing)
Umschließende zyklische
Kalibriersequenzen (Bracketing)
Dieser Sequenztyp interpoliert Kalibrierungen über eine oder mehrere
unbekannte Proben. Dies dient einer exakteren Berücksichtigung des
Response des Analysengerätes zum Analysenzeitpunkt. Durch die
Verwendung einer umschließenden Kalibrierung können die Auswirkungen
einer instrumentellen Drift minimiert werden.
Beispiel
Folgende Situation soll betrachtet werden:
• Das Analysengerät zeigt einen Response mit Drift.
• Es werden drei Injektionen identischer Mischungen mit drei Substanzen
durchgeführt.
• Zwei dieser Injektionen werden als Kalibrierproben, eine weitere als Probe
spezifiziert.
• Die erste und dritte Probe sind die Kalibrierproben.
• Die zweite Injektion ist eine Probe gemäß Abbildung 41.
Zur Berechnung eines möglichst exakten Ergebnisses für die zweite Injektion
(der Probe) muß zwischen den beiden Kalibrierungen eine Interpolation
durchgeführt werden, wie in Abbildung 41 gezeigt. Dieser Prozeß heißt
umschließende Kalibrierung (Bracketing).
226
Automatisierung
Umschließende zyklische Kalibriersequenzen (Bracketing)
Abbildung 41
Umschließende Kalibrierung
Gerätedrift
Kalibrierung 1
Zeit
Sample
Kalibrierung 2
Die Kalibriertabelle zur quantitativen Auswertung der Probe wird bei einer
zyklisch kalibrierten Sequenz durch Mittelwertbildung aus den Ergebnissen
der aktuellen und der vorherigen Kalibrierung gewonnen. Diese neue
Kalibriertabelle stellt eine exaktere Berücksichtigung des Response des
Analysengerätes zum Zeitpunkt der Probenvermessung dar.
Arbeitsschritte einer umschließenden Kalibrierung
• Die ersten Probenfläschchen der Kalibrierung werden analysiert.
• Die Proben werden analysiert.
• Die nächsten Kalibrierproben werden analysiert.
• In der Kalibriertabelle werden die Responsefaktoren durch
Mittelwertbildung aus den Ergebnissen der umschließenden Kalibrierung
berechnet.
• Die Datensätze der Proben werden ausgewertet und die Reports werden
erstellt.
• Die Sequenz wiederholt Schritt 2, falls weitere Proben analysiert werden
müssen.
227
Automatisierung
Umschließende zyklische Kalibriersequenzen (Bracketing)
Beispiel
In diesem Abschnitt wird eine umschließende Kalibrierung beschrieben, die
aus einer Methode mit dem Namen Brack.M besteht. Die Methode Brack.M
ist eine Methode mit zwei Kalibrierpunkten und internem Standard mit
zyklischer Kalibrierung.
Sequenztabelle
Die Sequenztabelle für die Methode Brack.M (nächste Seite) ist zur
Vereinfachung des Beispiels verkürzt. Sie besteht aus sieben Zeilen, wovon
die ersten beiden Zeilen die Rekalibrierbedingungen für jede Stufe festlegen.
In den verbleibenden Zeilen werden die zu analysierenden Proben definiert.
Die Sequenztabelle für die Methode Brack.M besteht aus:
• Dem Eintrag “Bracket” in der Spalte “Update Response Factor”, wodurch
die Umschließung der Proben mit Kalibrierungen spezifiziert wird.
• Dem Eintrag “Replace” in der Spalte “Update Retention/Migration Times”,
wodurch Retentions- bzw. Migrationszeiten ersetzt werden.
• Dem Eintrag “3” in der Spalte “Recalib Interval”, wodurch eine
Rekalibrierung nach jeweils drei Proben spezifiziert wird.
Tabelle 16
Sequenztabelle der Methode BRACK-M
1
1
BRACK-M
2
Kalibrierung
1
Bracket
Ersetzen
(Umschließe (Replace)
n)
3
…
2
2
BRACK-M
2
Kalibrierung
2
Bracket
Ersetzen
(Umschließe (Replace)
n)
3
…
3
10
BRACK-M
1
…
4
11
BRACK-M
1
…
5
12
BRACK-M
1
…
6
13
BRACK-M
1
…
7
14
BRACK-M
1
…
228
Automatisierung
Umschließende zyklische Kalibriersequenzen (Bracketing)
Analysenfolge der Sequenz mit umschließender Kalibrierung
-----------------------------------------------------------------------------------Run Method
Vial Inj DataFile
Lvl Upd
Upd
Operation
No. Name
No. No. Name
No. RF
Ret
-----------------------------------------------------------------------------------1
Brack.M
1
1
c1-03001.d 1
R
R
Report for Calibration Run No.1
2
Brack.M
1
2
c1-03002.d 1
A
R
Report for Calibration Run No.2
3
Brack.M
2
1
c2-03001.d 2
R
R
Report for Calibration Run No.3
4
Brack.M
2
2
c2-03002.d 2
A
R
Report for Calibration Run No.4
Print Calibration Table
5
Brack.M 10
1
010-0301.d
Sample Analysis, no report
6
Brack.M 11
1
011-0301.d
Sample Analysis, no report
7
Brack.M 12
1
012-0301.d
Sample Analysis, no report
8
Brack.M
1
1
c1-03003.d 1
A
R
Calibration Analysis, no report
9
Brack.M
1
2
c1-03004.d 1
A
R
Calibration Analysis, no report
10
Brack.M
2
1
c2-03003.d 2
A
R
Calibration Analysis, no report
11
Brack.M
2
2
c2-03004.d 2
A
R
Calibration Analysis, no report
Print Calibration Table
010-0301.d
Report for Sample
Run No.5
011-0301.d
Report for Sample
Run No.6
012-0301.d
Report for Sample
Run No.7
c1-03003.d 1
R
Report for Calibration Run No.8
c1-03004.d 1
A
Report for Calibration Run No.9
c2-03003.d 2
R
Report for Calibration Run No.10
c2-03004.d 2
A
Report for Calibration Run No.11
12
Brack.M 13
1
013-0301.d
Sample Analysis, no report
13
Brack.M 14
1
014-0301.d
Sample Analysis, no report
14
Brack.M
1
1
c1-03005.d 1
A
R
Calibration Analysis, no report
15
Brack.M
1
2
c1-03006.d 1
A
R
Calibration Analysis, no report
16
Brack.M
2
1
c2-03005.d 2
A
R
Calibration Analysis, no report
17
Brack.M
2
2
c2-03006.d 2
A
R
Calibration Analysis, no report
Print Calibration Table
013-0301.d
Report for Sample Run No.12
014-0301.d
Report for Sample Run No.13
c1-03005.d 1
R
Report for Calibration Run No.14
c1-03006.d 1
A
Report for Calibration Run No.15
c2-03005.d 2
R
Report for Calibration Run No.16
c2-03006.d 2
A
Report for Calibration Run No.17
------------------------------------------------------------------------------------Where A = Mittelwert (Average)
R = Ersetzten (Replace)
229
Automatisierung
Zyklische Rekalibriersequenzen mit mehreren Probenfläschchen, die dieselbe
Standardverdünnung enthalten
Zyklische Rekalibriersequenzen mit
mehreren Probenfläschchen, die dieselbe
Standardverdünnung enthalten
Zyklische Rekalibriersequenz unter zyklischer
Verwendung von mehreren Kalibrierfläschchen
Wenn man eine lange Sequenz mit zyklischer Rekalibrierung laufen läßt, das
heißt eine automatische Rekalibrierung nach einer festen Anzahl von
Probeninjektionen durchführt, besteht die Gefahr, daß das
Kalibrierfläschchen im Lauf der Sequenz geleert wird. Die Sequenztabelle der
ChemStation bietet die Möglichkeit, eine Reihe von Probengefäßen mit
derselben Standardverdünnung zyklisch nacheinander zu verwenden.
Über diese Möglichkeit lassen sich lange Sequenzen mit automatischen
Rekalibrierläufen nach festen Intervallen definieren, bei denen die
Kalibriersubstanzen für jede Stufe aus mehreren Probenfläschchen pipettiert
und gleichmäßig verbraucht werden.
Wenn man die passende Anzahl von Kalibrierfläschchen einsetzt, wird jedes
Kalibrierfläschchen nur einmal verwendet. Dies ist besonders bei solchen
Fällen erforderlich, bei denen für jede Rekalibrierung ein neues
Kalibrierfläschchen verwendet werden muß, weil Lösungsmittel oder oder
reagieren können. Der folgende Abschnitt beschreibt, wie die Sequenztabelle
der ChemStation ausgefüllt werden muß, um diese Anforderungen zu
erfüllen.
Bestimmen Sie über die Anzahl der Kalibrierungen innerhalb einer Sequenz
die Menge an Kalibrierfläschchen für jede Stufe.
Legen Sie für jedes Kalibrierfläschchen eine gesonderte Zeile für die
zyklische Rekalibrierung an. Informationen für dieselbe Kalibrierstufe
müssen in angrenzenden Zeilen der Sequenztabelle stehen und auch die
festgelegten Positionen der Kalibrierfläschchen müssen nebeneinander
liegen. Wählen Sie für alle Kalibrierzeilen identische Intervalle für die
Rekalibrierung. Wenn Ihre Sequenz beispielsweise alle 6 Probeninjektionen
eine Kalibrierung durchführen soll, müssen Sie das Rekalibrierintervall auf 6
stellen.
Die Proben werden in folgender Reihenfolge abgearbeitet:
• Probenfläschchen 1 (Cal1a)
230
Automatisierung
Zyklische Rekalibriersequenzen mit mehreren Probenfläschchen, die dieselbe
Standardverdünnung enthalten
Tabelle 17
Zyklische Rekalibriersequenz mit drei Fläschchen für jede Kalibrierstufe
Vial No. Sample Name
Sample Type
Method Name
No. of Inj.
Lvl
Upd RT
Upd RF
Intervall
1
Cal1a
Calib
Methode A
1
1
Avg
Avg
6
2
Cal1b
Calib
Methode A
1
1
Avg
Avg
6
3
Cal1c
Calib
Methode A
1
1
Avg
Avg
6
5
Cal2a
Calib
Methode A
1
2
Avg
Avg
6
6
Cal2b
Calib
Methode A
1
2
Avg
Avg
6
7
Cal2c
Calib
Methode A
1
2
Avg
Avg
6
10
Sample10
Sample
Methode A
6
11
Sample11
Sample
Methode A
6
12
Sample12
Sample
Methode A
6
13
Sample13
Sample
Methode A
6
14
Sample14
Sample
Methode A
6
• Probenfläschchen 5 (Cal2a)
• 6 Injektionen aus Probenfläschchen 10 (Probe 10)
• Probenfläschchen 2 (Cal1b)
• Probenfläschchen 6 (Cal2b)
• 6 Injektionen aus Probenfläschchen 11 (Probe 11)
• Probenfläschchen 3 (Cal1c)
• Probenfläschchen 7 (Cal2c)
• 6 Injektionen aus Probenfläschchen 12 (Probe 12)
• Probenfläschchen 1 (Cal1a)
• Probenfläschchen 5 (Cal2a)
• 6 Injektionen aus Probenfläschchen 13 (Probe 13)
• Probenfläschchen 2 (Cal1b)
• Probenfläschchen 6 (Cal2b)
• usw.
231
Automatisierung
Zyklische Rekalibriersequenzen mit mehreren Probenfläschchen, die dieselbe
Standardverdünnung enthalten
Zyklische Rekalibrierung aus verschiedenen
Kalibrierfläschchen
Um sicherzustellen, daß aus jedem Kalibrierfläschchen nur einmal injiziert
wird, muß die Sequenz eine ausreichende Anzahl von verschiedenen
Kalibrierfläschchen festlegen, so daß die zyklische Abfolge, die im folgenden
Beispiel beschrieben wird, nicht vorliegt. Wenn in einer Sequenz zum Beispiel
80 Proben analysiert und nach jeweils 10 Proben Rekalibrierungen erfolgen
sollen, muß die Sequenztabelle für jede Stufe 80/10 + 1= 9 Kalibrierzeilen
enthalten.
Wie im letzten Beispiel müssen die Zeilen, die aneinandergrenzende
Positionen kennzeichnen auch in der Sequenztabelle benachbart sein.
Umschließende Sequenz mit verschiedenen
Kalibierfläschchen vor und nach den Probeninjektionen
Diese Möglichkeit läßt sich auch bei umschließenden Sequenzen anwenden.
Eine umschließende Sequenz kann so definiert werden, daß für den
Kalibrierlauf vor den Proben ein anderes Fläschchen benutzt wird, als für
den nach den Proben, indem die entsprechende Anzahl von
Kalibrierfläschchen eingesetzt wird. Auch in diesem Fall müssen die
Kalibrierzeilen innerhalb der Sequenz wie auch die Positionen der
Kalibrierfläschchen aneinandergrenzen.
Ob die Kalibrierfläschchen für die umschließende Sequenz zyklisch
nacheinander oder nur einmal injiziert werden, hängt einzig von der Anzahl
der Kalibrierfläschchen für jede Stufe ab und davon, wie häufig innerhalb der
Sequenz rekalibriert werden soll.
Im folgenden Beispiel sind 3 Injektionen mit umschließender Kalibrierung
definiert. Die Kalibriersubstanz für den anfänglichen Kalibrierlauf wird aus
einem anderen Fläschchen entnommen, als die für den abschließenden
Kalibrierlauf. Nach jeder Probeninjektion soll rekalibriert werden; folglich
232
Automatisierung
Zyklische Rekalibriersequenzen mit mehreren Probenfläschchen, die dieselbe
Standardverdünnung enthalten
muß das Rekalibrierintervall 1 betragen. Die Anzahl an Kalibierzeilen pro
Stufe entspricht der Anzahl der Proben plus eins.
Tabelle 18
Verschiedene Fläschchen für die Kalibrierläufe vor und nach den
Probeninjektionen
Vial No. Sample Name
Sample Type
Method Name
No. of Inj.
Lvl Upd RT
Upd RF
Intervall
1
Cal1a
Calib
Methode A
1
1
Brkt
Brkt
1
2
Cal1b
Calib
Methode A
1
1
Brkt
Brkt
1
3
Cal1c
Calib
Methode A
1
1
Brkt
Brkt
1
4
Cal1d
Calib
Methode A
1
1
Brkt
Brkt
1
10
Sample10
Sample
Methode A
1
11
Sample11
Sample
Methode A
1
12
Sample12
Sample
Methode A
1
Die Sequenz wird in folgender Reihenfolge durchgeführt:
• Probenfläschchen 1 (Cal1a), Kalibrierlauf vor dem 1. Probensatz
• Probenfläschchen 10 (Probe 10)
• Probenfläschchen 2 (Cal1b), Kalibrierlauf nach dem 1. und vor dem 2.
Probensatz
• Probenfläschchen 11 (Probe 11)
• Probenfläschchen 3 (Cal1c), Kalibrierlauf nach dem 2. und vor dem 3.
Probensatz
• Probenfläschchen 12 (Probe 12)
• Probenfläschchen 4 (Cal1d), Kalibrierlauf nach dem 3. Probensatz
233
Automatisierung
Zyklische Rekalibriersequenzen mit mehreren Probenfläschchen, die dieselbe
Standardverdünnung enthalten
234
11
11
Batch-Review
Batch-Review
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Was versteht man unter Batch-Review?
• Batch-Konfiguration
• Funktionen für den Review
• Batch-Reports
236
Batch-Review
Was versteht man unter Batch-Review?
Was versteht man unter Batch-Review?
Unter "Batch-Review" versteht man die Möglichkeit, schnell einen ersten
Überblick über die Ergebnisse einer Sequenz oder einer Auswahl von
Analysenläufen zu erhalten. Dies ist vor allem bei großen Probenzahlen sehr
zeitsparend. Immer wenn eine Sequenz ausgeführt wird, wird automatisch
eine Batch-Datei (mit der Dateinamenwerweiterung .b) erstellt und mit den
Datensätzen im Datenverzeichnis abgelegt. Diese Batch-Datei enthält Zeiger
auf die entsprechenden Datensätze des Batch-Reviews. Um einen Batch zu
laden, muß der Anwender nur eine Methode für den Batch anwählen und
dann die einzelnen Datensätze aussuchen, die innerhalb des Batches
bearbeitet werden sollen. Man kann die Genauigkeit der Kalibrierung, die
Leistungsfähigkeit des Systems und die einzelnen Integrationen überprüfen,
ehe man die Ergebnisse verbessert. Alle Integrationsparameter, die für ein
Chromatogramm spezifisch sind, sowie ihre Änderungen werden aus
Gründen der Nachvollziehbarkeit der Ergebnisse mit dem Datensatz
gespeichert. Diese interaktive Umgebung bietet auch den vollen Zugriff auf
alle anderen Funktionen der Datenauswertung, wie die Überprüfung der
Peakreinheit, die Bibliothekssuche usw.
Der Batch-Review verwendet dieselben Register für die Datenauswertung
(ChromReg and ChromRes) wie die Standard-Datenauswertung und sollte
daher nicht innerhalb einer Online-Sitzung zum Einsatz kommen, in der
gerade Analysen duchgeführt werden.
237
Batch-Review
Batch-Konfiguration
Batch-Konfiguration
Als Batch bezeichnet man eine individuelle Auswahl von Datensätzen, die mit
einer indviduell bestimmten Methode ausgewertet werden. Dabei wird für
alle Datensätze innerhalb eines Batches dieselbe Methode verwendet. Die
Auswertungsschritte, die für jede zu bearbeitende Probe im Review
durchgeführt werden sollen, sind frei wählbar (Integration,
Identifizierung/Quantifizierung, Reporterstellung).
Die Ergebnissse aller Kalibrierläufe eines Batches gehen über gemittelte
Response-Faktoren in eine Kalibriertabelle ein, die dann zur Quantifizierung
verwendet wird.
Batch-Tabelle
Die Läufe werden in einer frei definierbaren Batch-Tabelle angezeigt:
• die Anzahl und der Inhalt der Tabellenspalten kann festgelegt werden;
• die Läufe können folgendermaßen sortiert werden
nach dem Laufindex (in der Reihenfolge, in der sie aufgenommen wurden)
unabhängig von allen anderen Kriterien,
nach der Probenart (erst die Kontrollen, dann die Standards, dann die
Proben) und innerhalb einer Probenart nach dem Laufindex,
nach der Methode (wenn mehr als eine Methode zur Datenaufnahme
verwendet wurde) und innerhalb jeder Methode nach dem Laufindex;
• Proben, Standards und Kontrollen können in der Tabelle angezeigt oder
versteckt werden.
Jeder Lauf macht eine Zeile der Batch-Tabelle aus. Sie können einzelne Läufe
aus der Batch-Tabelle ausblenden, indem Sie sie auf die Probenart
"Removed" (entfernt) setzen.
Substanztabelle
Die Ergebnisse für die Substanzen werden in einer individuell definierbaren
Substanztabelle dargestellt, deren Inhalt von den Probenarten der
Batch-Tabelle abhängt:
• Die Substanzliste enthält alle Substanzen, die in der Methode aufgeführt
238
Batch-Review
Batch-Konfiguration
wurden, die im Batch-Review zum Einsatz kam;
• wenn nur Standards in der Batch-Tabelle aufgeführt sind (Proben und
Kontrollen also versteckt sind), enthält die Substanztabelle zusätzliche
Spalten für weitere Informationen zum Standard (erwartete Menge,
relativer und absoluter Fehler);
• wenn nur Kontrollen in der Batch-Tabelle aufgeführt sind (Proben und
Standards also versteckt sind), enthält die Substanztabelle zusätzliche
Spalten für mögliche Grenzwerte.
Für Spalten, die Substanz-spezifische Informationen enthalten, können Sie
den Namen der Substanz in den Titel der Tabelle aufnehmen, indem Sie in die
Spaltenbedingungen %s aufnehmen.
Batch-Report
Der Batch-Report enthält zwei Tabellen, die im Allgemeinen der Batch- und
der Substanztabelle entsprechen; auch diese Tabellen sind individuell
definierbar.
Für Spalten, die Substanz-spezifische Informationen enthalten, können Sie
den Namen der Substanz in den Titel der Tabelle aufnehmen, indem Sie in die
Spaltenbedingungen %s aufnehmen. Auch mehrzeilige Kopfzeilen sind
erlaubt; über Eingabe des Zeichens ‘|’ erfolgt ein Zeilenumbruch an dieser
Stelle.
Benutzeroberfläche
Der Batch-Review ermöglicht die Auswahl zwischen zwei
Benutzeroberflächen:
• die Standardoberfläche enthält eine Leiste mit Schaltflächen, die den
Zugriff auf die meisten Menüeinträge für den Batch ermöglichen,
einschließlich der Batch- und Substanztabelle;
• eine minimale Benutzeroberfläche bietet eine ganz ähnliche Symbolleiste,
wobei allerdings die Batch- und die Substanztabelle durch ein Feld ersetzt
sind, das nur die Information für die festgelegte Batch-Tabelle enthält. Die
Symbolleiste für die minimale Benutzeroberfläche enthält keine direkte
Schaltflächen für die Batch- oder die Substanztabelle.
239
Batch-Review
Funktionen für den Review
Funktionen für den Review
Datendateien können auf zwei unterschiedliche Arten dargestellt werden:
• manuell, indem aus der Tabelle ein darzustellender Lauf ausgewählt wird,
• automatisch, mit festgelegten Intervallen zwischen den einzelnen
Datensätzen. Bei der automatischen Darstellung werden nur die
Probenarten dargestellt, die auch in der Tabelle zu sehen sind; die Läufe
werden entsprechend der Reihenfolge, in der sie in der Tabelle aufgeführt
sind, dargestellt. Der automatische Überblick kann angehalten und später
weitergeführt oder ganz gestoppt werden.
Die Standardfunktionen der ChemStation sind auch im Batch-Review
verfügbar. Sie beinhalten die Kalibrierung, die manuelle Änderung von
Chromatogrammen, wie z.B. die Glättung oder die manuelle Integration. Alle
Änderungen, die an einer Datendatei vorgenommen werden, lassen sich
kennzeichnen und mit dem Datensatz abspeichern. Chromatogramme, die
nachbearbeitet wurden, werden in der Batch-Tabelle mit einem Sternchen
markiert. Sie können auch die Änderungen des aktuellen Chromatogrammes
oder die Änderungen aller Chromatogramme des Batches wieder verwerfen.
Wenn ein Lauf aufgerufen wird, werden die ausgewählten
Bearbeitungsschritte durchgeführt; wenn der Lauf bereits bearbeitet und mit
den Änderungen abgespeichert wurde, wird er in seiner nachbearbeiteten
Form aufgerufen. Dies geht natürlich schneller, da die Bearbeitungsschritte
nicht mehr durchgeführt werden müssen.
240
Batch-Review
Batch-Reports
Batch-Reports
Die individuell definierbare “Batch-Tabelle”, siehe Seite238, kann direkt auf
dem Drucker, auf dem Bildschirm oder in eine Datei ausgegeben werden. Die
Datei besteht aus einem wählbarem Prefix und kann in einem der folgenden
Formate abgelegt werden:
• als ASCII-Textdatei mit der Dateinamenerweiterung .TXT
• im Data Interchange Format mit der Dateinamenerweiterung .DIF
• im CSV-Format (Comma-Separated Values) mit der
Dateinamenerweiterung .CSV
• im Microsoft Excel-Format mit der Dateinamenerweiterung .XLS.
Die Optionen für die Reporterstellung ermöglichen es auch, die Proben
unabhängig von der Reihenfolge in der Batch-Tabelle zu sortieren (über den
Laufindex, die Probenart oder die Methode). Die Prioritäten für die
Reihenfolge entsprechen denen für die “Batch-Tabelle”, siehe Seite238.
Batch-History
Der Batch-Review zeichnet alle Aktionen innerhalb des aktuellen Batches
auf. Aktionen, die zu Änderungen des Batches führen (zum Beispiel eine
Änderung des dargestellten Chromatogrammes, eine Änderung der
Probenart, Laden und Speichern des Batches) erweitert die Batch-History um
eine Zeile mit Datum- und Zeitangabe, dem Namen des derzeitigen
Anwenders sowie einer Beschreibung des Vorganges.
Sie können der Batch-History auch eigene Kommentare hinzufügen.
Vorhandene Einträge in der Batch-History lassen sich nicht ändern. Die
Auflistung kann nur über die Menüeinträge für "Batch History" aufgerufen
werden.
241
Batch-Review
Batch-Reports
242
12
12
Verwendung der
ChemStation Reports
Verwendung der
ChemStation Reports
In diesem Kapitel werden folgende Themen behandelt:
• Was ist ein Report?
• Reportergebnisse
• Quantitative Ergebnisse
• Reportvorlagen
• Reportausgabe
• Zusammenfassende Reports einer Sequenz
244
Verwendung der ChemStation Reports
Was ist ein Report?
Was ist ein Report?
Ein Report kann aus qualitativen und quantitativen Informationen zu einer
analysierten Probe bestehen. Der Report kann als Ausdruck, als
Bildschirmdarstellung oder als elektronische Datei ausgegeben werden. Der
Report kann Details der Peakerkennung eines Analysenlaufes enthalten und
Darstellungen der Chromatogramme bzw. Elektropherogramme.
245
Verwendung der ChemStation Reports
Reportergebnisse
Reportergebnisse
Es stehen zwei Reporttypen zur Verfügung:
• Ein unkalibrierter Report ohne Korrektur des Detektor-Response
• Ein kalibrierter Report mit korrigiertem Detektor-Response für
unterschiedliche Substanzen.
Unkalibrierte Reports
Unkalibrierte Reports umfassen die Reports Flächen% und Höhen%. Diese
Reports werden hauptsächlich zur Vorbereitung kalibrierter Reports
verwendet. Sie können auch als endgültiger Report benutzt werden, wenn die
Substanzen vergleichbare Responsefaktoren aufweisen, so daß sich auch
ähnliche Flächen- oder Höhenwerte ergeben.
Kalibrierte Reports
In kalibrierten Reports werden die unterschiedlichen Responsefaktoren der
untersuchten Substanzen berücksichtigt. Eine oder mehrere Kalibrierproben
mit bekanntem Gehalt dieser Substanzen müssen dazu unter identischen
Bedingungen vermessen werden. Die integrierten Daten dieser
Kalibrierprobe(n) werden zur Erstellung einer Kalibriertabelle benötigt. Das
ist eine Liste von Retentions- oder Migrationszeiten, Mengen und
Responsefaktoren, die zur Reporterstellung benötigt werden.
Der kalibrierte Report basiert auf zwei Kalibrierverfahren, externer oder
interner Standard.
Report mit externem Standard
Der ESTD-Report erstellt eine Ergebnisliste mit Konzentrationseinheiten
Ihrer Wahl oder Angaben der prozentualen Anteile an der Gesamtmenge der
Substanzen. Das Verfahren des externen Standards erfordert die genaue
Kenntnis der injizierten Volumina von Kalibrier- und Probenlösung. Die
Verläßlichkeit dieses Reports hängt von der Reproduzierbarkeit der
Injektionsvolumina und anderer Faktoren ab, die sich von Probe zu Probe
ändern können.
246
Verwendung der ChemStation Reports
Reportergebnisse
Report mit internem Standard
Die Beschränkungen des Reports mit externem Standard entfallen bei der
Verwendung eines internen Standards. Eine exakt bekannte Menge des
internen Standards wird sowohl zur Kalibrierlösung, als auch zur
Probenlösung gemischt. Die Responsefaktoren jeder interessierenden
Substanz werden durch die Response des internen Standards dividiert, womit
das Response-Verhältnis errechnet wird. Die Kalibrierkurven werden als
Auftragung dieses Response-Verhältnisses gegen das Mengenverhältnis
gewonnen. Mit dieser Information werden die Ergebnisse im Report
berechnet. Mit diesem Verfahren werden Fehler des Injektionsvolumens oder
leichte Schwankungen des chromatographischen Systems mit Auswirkungen
auf alle Substanzen berücksichtigt. Im ISTD-Report werden die Ergebnisse
mit Einheiten Ihrer Wahl ausgegeben.
Control Charts Report
Beim Control Charts Report wird ein einzelnes Ergebnis für eine bestimmte
kalibrierte Substanz über mehrere Läufe hinweg verfolgt. Die Control Chart
Funktion wird erst installiert, wenn die ChemStation betriebsbereit ist. Am
Ende eines Laufes, dessen Methode diese Funktion beinhaltet, wird das
verfolgte Ergebnis direkt in ein Microsoft Excel-Datenblatt überführt.
Schließlich wird der Report auch über Excel ausgedruckt.
247
Verwendung der ChemStation Reports
Quantitative Ergebnisse
Quantitative Ergebnisse
Der Reporttyp trägt den Namen der Rechenmethode, die zur Auswertung
verwendet wurde, zum Beispiel ISTD-Report. Jeder Typ wird unten kurz
beschrieben. Die Rechenmethoden werden in Kapitel8 “Quantifizierung”
ausführlich besprochen.
Area% (Flächen%) erzeugt den einfachsten Report und erfordert keine
Kalibrierdaten, da keine Korrektur des Detektor-Response für
unterschiedliche Substanzen erfolgt. Dieser Reporttyp kann zur Entwicklung
einer Kalibriertabelle zur Verwendung mit anderen Reportoptionen genutzt
werden. Dieser Report ist für Substanzen anwendbar, deren
Responsefaktoren gleich sind.
Height% (Höhen%) ergibt einen Report ähnlich des Typs Area%, wobei
anstelle der Peakfläche die Peakhöhe zur Berechnung verwendet wird.
Norm% ergibt einen Report, in dem jede Komponente als prozentualer Anteil
an der Gesamtmenge ausgedrückt wird. Die Peaks werden vor der
Berechnung hinsichtlich ihres Detektor-Response korrigiert.
ESTD (Externer Standard) ergibt einen Report der aktuellen Menge jeder
Substanz in frei wählbaren Einheiten. Die Mengenberechnung erfolgt mit
einer zuvor erstellten Kalibriertabelle. Die Verwendung eines externen
Standards erfordert die Kenntnis des Injektionsvolumens der
Kalibriermischung.
ESTD% erzeugt einen Report der relativen Mengen jeder Substanz als
prozentualer Anteil der injizierten Probe. Die Mengenberechnung erfolgt mit
einer zuvor erstellten Kalibriertabelle. Die Verwendung eines externen
Standards erfordert die Kenntnis des Injektionsvolumens der
Kalibriermischung.
ISTD (Interner Standard) erzeugt einen Report mit den aktuellen Mengen
jeder Substanz. Die Mengen werden mit einer zuvor erstellen Kalibrierkurve
berechnet. Die Verwendung eines internen Standards in der Probe und der
Kalibriermischung erfordert keine so exakte Kontrolle des
Injektionsvolumens. Diese Methode korrigiert Schwankungen der
instrumentellen Leistungen zwischen einzelnen Analysenläufen.
ISTD% erzeugt einen Report mit den relativen Mengen jeder Substanz als
prozentualer Anteil an der injizierten Probe. Die Verwendung eines internen
Standards in der Probe und der Kalibriermischung erfordert keine so exakte
248
Verwendung der ChemStation Reports
Quantitative Ergebnisse
Kontrolle des Injektionsvolumens. Diese Methode korrigiert Schwankungen
der instrumentellen Leistungen zwischen einzelnen Analysenläufen.
249
Verwendung der ChemStation Reports
Reportvorlagen
Reportvorlagen
Folgende Reportvorlagen sind verfügbar:
Sie können die gewünschte Reportvorlage durch Aktivieren des
entsprechenden Ankreuzkästchens in “Specify Report” auswählen.
• None (keiner)Es wird keinerlei Text in den Report aufgenommen. Das
Chromatogramm wird nur dann als Report ausgegeben, wenn die Option
“Add Chromatogram Output” angewählt ist.
• Short (Kurz) besteht aus quantitativen Ergebnissen aller integrierten
Signale, die im Dialogfeld “Signal Details” (nur bei LC) oder “Signal” (nur
GC) aufgeführt sind.
• Detail (Genau) besteht aus Signalen, quantitativen Ergebnissen in
Textform und Kalibrierkurven. Der Kopfteil stammt aus der Datei
RPTHEAD.TXT im Methodenverzeichnis. Sie können den Kopfteil mit
einem Texteditor an Ihre Methode anpassen.
• Header + Short (Kopfteil + Kurz) Besteht aus Kopfteil und quantitativen
Ergebnissen. Der Kopfteil stammt aus der Datei RPTHEAD.TXT im
Methodenverzeichnis. Sie können den Kopfteil mit einem Texteditor an
Ihre Methode anpassen.
• GLP + Short (GLP + Kurz) besteht aus Kopfteil, Probeninformation,
apparativen Bedingungen, Logbuch, Signal und quantitativen Ergebnissen.
Der Kopfteil stammt aus der Datei RPTHEAD.TXT im
Methodenverzeichnis. Sie können den Kopfteil mit einem Texteditor an
Ihre Methode anpassen.
• GLP + Detail (GLP + Genau) besteht aus Kopfteil, Probeninformation,
apparativen Bedingungen, Logbuch, Signal, Kalibrierkurven und
quantitativen Ergebnissen. Der Kopfteil stammt aus der Datei
RPTHEAD.TXT im Methodenverzeichnis. Sie können den Kopfteil mit
einem Texteditor an Ihre Methode anpassen.
• Full (Vollständig) besteht aus Kopfteil, Probeninformation, apparativen
Bedingungen, Logbuch, Signale und quantitativen Ergebnissen. Der
Kopfteil stammt aus der Datei RPTHEAD.TXT im Methodenverzeichnis.
Sie können den Kopfteil mit einem Texteditor an Ihre Methode anpassen.
• Performance (Systemleistung) produziert einen Report gemäß der
Grenzen aus dem Dialogfeld “Edit Performance Limits” aus dem Menü
250
Verwendung der ChemStation Reports
Reportvorlagen
“System Suitability”.
Bei unkalibrierten Reports enhalten die Reportparameter die
Peaknummer, Retentions- bzw. Migrationszeit, Peakfläche, Peakhöhe,
Signalbeschreibung, wahre Halbwertsbreite (siehe auch Wahre
Peakbreite Wx [min]auf Seite 274), Symmetrie, k’, Effizienz (Anzahl
Trennböden) und Auflösung für jeden Peak.
Für kalibrierte Methoden besteht der Report aus Peaknummer,
Retentions- bzw. Migrationszeit, Substanzname, Menge,
Signalbeschreibung, wahre Halbwertsbreite, Symmetrie, k', Effizienz
(Anzahl Trennböden) und Auflösung für jeden Peak.
Die Halbwertsbreite wird an den Wendepunkten der Peakflanke
berechnet und nicht mit der komplexeren Formel des Integrators. Die
Werte für Effizienz und Auflösung basieren auf dieser berechneten
Halbwertsbreite. Der Kopfteil des Reports umfaßt alle relevanten
Informationen zur Methode, einschließlich Analysengerät,
Säule/Kapillare, Probe und Parameter der Datenerfassung. Auch das
Signal wird dargestellt.
• Performance + Noise (Systemleistung + Rauschen) kombiniert die
Reportvorlage ’Systemleistung’ mit Berechnungen zum Rauschen für
einen Bereich, der im Dialogfeld “Edit Noise Range” aus dem Menü
“System Suitability” festgelegt wird. Zusätzlich wird das Rauschen als
sechsfache Standardabweichung, Peak zu Peak und als ASTM-Rauschen
angegeben. Drift und Abweichungen werden ebenfalls bestimmt.
• Performance + Extended (Systemleistung + Erweitert) erzeugt einen
erweiterten Report mit allen Parametern aus den Leistungsberechnungen
der Peaks und einzelnen Peakdarstellungen. Die Darstellungen umfassen
die Basislinie, die Tangenten und die Peakbreiten in definierten Höhen.
Dieser Reporttyp berücksichtigt nur kalibrierte Peaks.
Zusätzlich zu den Parametern, die für den Performance Report
ausgedruckt werden, werden weitere Parameter zur Peakleistung
bestimmt: Anfangs- und Endzeiten des Peaks, Verzerrung, Überschuß,
Peakbreite, USP für das Peaktailing, Zeitintervall zwischen
Datenpunkten, Anzahl der Datenpunkte, statistische Momente, Anzahl
der Trennstufen, Trennstufen pro Meter, Selektivität und Peakauflösung
werden mit ausgedruckt. Die Peakbreite, Anzahl Trennböden,
Trennböden pro Meter, Selektivität und Auflösung werden mit der wahren
Halbwertsbreite-, 5 Sigma-, Tangenten- und Tailing-Methode berechnet
(genauere Beschreibungen finden Sie unter Definitionen des
Leistungstestsauf Seite 272).
251
Verwendung der ChemStation Reports
Reportvorlagen
Der Kopfteil des Reports umfaßt alle relevanten Informationen zur
Methode, einschließlich Analysengerät, Säule/Kapillare, Probe und
Parameter der Datenerfassung, das Signal wird ebenfalls dargestellt. Eine
vollständige Liste der Algorithmen zur Berechnung der
Leistungsparameter finden Sie unter “Definitionen des Leistungstests” auf
Seite 272.
Die Spektrenreportvorlagen (Short + Spectrum (Kurz + Spektrum),
Detail + Spectrum (Ausführlich + Spektrum), Performance + Library
Search (Leistungsfähigkeit + Bibliothekssuche)) sind bei
Informationen zu Ihrem Spektrenmodul beschrieben.
Hinzufügen eines individuellen Reports zu den
Reportvorlagen
Sie können zur Liste der verfügbaren Reportvorlagen eine individuelle
Reportvorlage hinzufügen, die Sie in der Ansicht "Report Layout" der
ChemStation erstellen können.
HINWEIS
Bei alle Reports ausser der Leistungsfähigkeitsreports sind die aufgelisteten
Peakbreiten vom Integrator mit einer komplexeren Formel berechnet worden
(genauere Informationen zur Peakbreitenberechnung finden Sie unter
Peakbreite (Peak Width)auf Seite 91).
252
Verwendung der ChemStation Reports
Weitere Parameter für die Reportvorlagen
Weitere Parameter für die Reportvorlagen
Summed Peaks Table
Die Tabelle der Peaksummen existiert für einige Anwendungen der
petrochemischen und pharmazeutischen Industrie und dient der
vereinfachten Durchführung folgender Schritte:
• Addition der Peakflächen, die innerhalb eines benutzerdefinierten
Bereiches liegen
• Addition der Flächen eines Peakbereiches und Berechnung mit einem
einzigen Multiplikator
• Addition der Flächen aller Peaks mit gleichem Namen
Wenn der Report erstellt ist, verwendet die ChemStation die Tabelle der
Peaksummen dazu, den Peaksummenreport zu generieren. Die
Berechnungen erfolgen analog dem Standardreport, außer daß Norm% durch
den Peaksummenreport ersetzt ist.
Reportvorlage für unkalibrierte Peaks
Wenn Sie die Reportvorlage für unkalibrierte Peaks verändern wollen,
müssen Sie einen der folgenden Reports im Dialogfeld "Specify Report"
auswählen.
• Über "Separately" werden die unkalibrierten Peaks in einer gesonderten
Tabelle (wenn die Peaks nach der Retentionszeit sortiert sind) oder in
getrennten Tabellen (wenn die Peaks nach dem Signal sortiert sind) im
Report aufgeführt.
• Über "With Calibrated Peaks" werden die unkalibrierten Peaks zusammen
mit den kalibrierten Peaks im Report aufgeführt.
• Über "Do Not Report" werden die unkalibrierten Peaks gar nicht in den
Report aufgenommen.
253
Verwendung der ChemStation Reports
Reportausgabe
Reportausgabe
Der Report kann an folgende Stellen ausgegeben werden:
• Bildschirm
Ein Report (bestehend aus Text und Graphiken) wird auf dem Bildschirm
im Fenster des Reportanzeigers dargestellt und kann von dort aus
gedruckt werden.
• Drucker
Ein Report, der aus Text und Grafik besteht, wird auf dem aktuellen
Drucker ausgegeben.
• Datei
Der Report wird in eine Datei gesichert. Nachdem Daten in einer Datei
gespeichert wurden, ist eine Nachbearbeitung der Daten mit einem
anderen Programm, zum Beispiel Microsoft EXCEL möglich.
Dateiformate für Reports
Jeder Report kann in vier verschiedenen Formaten gespeichert werden.
Jedes Format weist eine eigene Dateinamenerweiterung auf. Es ist möglich,
mehr als ein Format für einen Report zu wählen.
.TXT
Der Text des Reports wird als ASCII-Textdatei gedruckt.
.WMF
Jede Grafik eines Reports (Signal oder Kalibrierkurve)
wird als Microsoft Windows Metadatei (WMF) gesichert.
Es können mehrere Metadateien für einen Report
gespeichert werden. Dieses Dateiformat entspricht dem
Microsoft Standard für das Metadateiformat gemäß der
Dokumentation zur Windows Softwareentwicklung. Diese
Dateien sind mit dem Format der Aldus Placeable
Metafiles (APM) kompatibel, das von einer Reihe von
Softwarepaketen unterstützt wird.
.DIF
Tabellarische Reportdaten werden im Data Interchange
Format (DIF) gespeichert. Dieses Format wird von
Tabellenkalkulationsprogrammen wie Microsoft Excel
unterstützt. Unabhängig vom gewählten Reportformat
werden nur die Informationen der Reportvorlage „Short"
254
Verwendung der ChemStation Reports
Reportausgabe
gespeichert.
.CSV
Dieses Format heißt Comma Separated Values (CSV, Werte
mit Kommatrennung). Es ist ein sehr einfaches Format für
tabellarische Daten und wird von vielen
Tabellenkalkulationsprogrammen und Datenbanken
akzeptiert. Unabhängig vom gewählten Reportformat
werden nur die Informationen der Reportvorlage „Short"
gespeichert.
Für einen Report können mehrere Dateien der Formate .DIF und .CSV
angelegt werden. Für jeden Reportblock enthält die erste Datei, zum Beispiel
REPORT00.CSV den Kopfteil. Die nachfolgenden Dateien enthalten die
tabellarischen Ergebnisse.
Wenn die Ergebnisse nach Retentions- bzw. Migrationszeit sortiert werden,
ist nur eine Datei für die vollständige Tabelle erforderlich, zum Beispiel
REPORT01.CSV.
Wenn die Ergebnisse nach dem Signal sortiert werden, ist für jedes Signal
eine getrennte Tabelle erforderlich. In diesem Fall lautet die Namensgebung
Report01.CSV bis ReportNN.CSV, wobei NN die Nummer des Signals ist.
.XLS
Der Report wird in das XLS-Format der Tabellen von
Microsoft Excel exportiert. Die Daten müssen im
Allgemeinen nachbearbeitet werden.
255
Verwendung der ChemStation Reports
Sequence Summary Reporting
Sequence Summary Reporting
Überblick
Die ChemStation kann verschiedene Standardreports für einzelne
Analysenläufe ausgeben. Der zusammenfassende Report einer Sequenz ist
eine weitere Möglichkeit der Reporterstellung und ermöglicht Ihnen,
Berechnungen und Parameterausgaben über mehrere Analysen zu erstellen.
Das ist zum Beispiel als Beleg der Stabilität des Instrumentes oder einer
neuen Methode erforderlich.
Ein zusammenfassender Report kann folgende Bestandteile aufweisen:
• Eine Titelseite
• Konfiguration der Analysengeräte einschließlich Revisionsnummer von
Gerät und Einzelheiten zur analytischen Säule/Kapillare
• Eine Sequenztabelle mit einer Beschreibung des vorgesehenen Ablaufs der
automatischen Analysen
• Logbucheinträge mit einer Beschreibung des Ablaufes der Sequenz mit
unerwarteten Ereignissen, die während des Ablaufes auftraten
• Eine Methodenliste
• Einzelreports für jede Probe
• Eine statistische Auswertung der Analysen mit auszuwählenden
Kriterien—Statistische Daten werden nur für kalibrierte Substanzen
errechnet
• Ein Inhaltsverzeichnis mit Querverweisen auf die Seitennummern der
Abschnitte mit detaillierten Informationen
Erstellung eines zusammenfassenden Reports für
Sequenzen
Bei der Erstellung eines zusammenfassenden Reports für Sequenzen können
Sie beliebige Kombinationen der folgenden neun Kategorien wählen, indem
Sie die entsprechenden Ankreuzkästchen aktivieren und, wo möglich, eine
Reportvorlage mit der Auswahl “Template” vornehmen. Jede Vorlage
spezifiziert Inhalt und Layout des bestimmten Abschnittes des
zusammenfassenden Reports.
256
Verwendung der ChemStation Reports
Sequence Summary Reporting
Sie können unter folgenden Reportvorlagen für zusammenfassende Reports
wählen:
• One Page Header (Kopfzeilen auf einer Seite)
Die Vorlage GLP druckt GLP mit großen Buchstaben als Titelseite für den
folgenden Report. Datum und Platz für eine Unterschrift sind vorgesehen.
• Configuration (Konfiguration)
Mit der Wahl von “Configuration” können Sie die Gerätekonfiguration und
die Daten der analytischen Säule/Kapillare in den Report aufnehmen.
• Sequence Table (Seqzuenztabelle)
Mit der Wahl von “Sequence table” können Sie eine Probenliste,
Parameter zur Quantifizierung und Methodennamen im Report
aufnehmen. Diese Liste umfaßt die vorgesehenen Aufgaben des Systems.
• Logbook (Logbuch)
Mit der Wahl von “Logbook” können Sie eine Liste mit den vermessenen
Proben, den Gerätebedingungen und allen unerwarteten Ereignissen
während der Messungen erstellen.
• Methods (Methoden)
Mit der Wahl von “Methods” können Sie eine Liste aller Methoden, die in
einer Serie von Messungen benutzt wurden, erstellen.
• Analysis Reports (Analysenreports)
Mit der Wahl von “Analysis reports” erhalten Sie Reports der einzelnen
Analysen gemäß der in der Methode gewählten Vorlage.
Einzelne Analysenreports können nach jeder Analyse mit der gewählten
Reportvorlage der Methode ausgedruckt werden. Dies erfolgt zusätzlich
zu den Reportabschnitten des zusammenfassenden Reports der Sequenz.
Siehe “Sequence Output (Spezifikationen zur Ausgabe)” auf Seite 258.
• Statistics for Calibrated and Sample Runs (Statistik für Standards
und Analysen)
Mit der Wahl von “Statistics cal. runs” werden statistische Trendanalysen
der Kalibrierproben erzeugt. Mit der Wahl von “Statistics sample runs”
werden statistische Trendanalysen für die unbekannten Proben erstellt.
Beide Wahlmöglichkeiten bieten die Gestaltungsvorlagen “Standard
-Statistic” und “Extended Statistic”. Extended Statistics druckt die
statistischen Trends der Analysen graphisch, Standard Statistics druckt
257
Verwendung der ChemStation Reports
Sequence Summary Reporting
nur Text. Die Auswahl des Dialogfeldes “Items and Limits for Extended
Statistics” werden nur bei Wahl der Option “Extended Statistic” im
Dialogfeld “Sequence Summary Parameters” verwendet.
Bei Wahl der Option “Standard Statistic” im Dialogfeld “Sequence
Summary Parameters” werden folgende statistische Auswertungen
angeboten:
Retentions- bzw. Migrationszeit
Fläche
Höhe
Menge
Halbwertsbreite des Peaks
Symmetrie
Die statistische Auswertung unterscheidet nicht zwischen verschiedenen
Kalibrierpunkten in einer Sequenz mit Mehrpunktkalibrierung. Das
bedeutet, daß konzentrationsabhängige Angaben (Fläche, Höhe, Menge,
siehe Dialogfeld zu Angaben und Grenzen von Extended Statistics)
gemeinsam betrachtet werden. Die Werte von „Statistics for Calibration
Runs" sind bei Mehrpunktkalibrierungen in Sequenzen daher nicht
anwendbar.
• Summary (Zusammenfassung)
Die Wahl von “Summary” druckt eine Übersicht über die analysierte
Probenreihe und die verwendeten Methoden. Wenn “Summary”
zusammen mit anderen Wahlmöglichkeiten aus “Sequence Summary”
gewählt wird, werden Verweise mit Seitenzahlen auf andere Teile der
Zusammenfassung eingefügt.
Es sind zwei Vorlagen für “Summary” verfügbar:
“Sample Summary” präsentiert die Analysenläufe der Sequenz tabellarisch
mit Probeninformationen, wie Probenname, Name des Datensatzes,
Methode und Nummer des Probenfläschchens.
“Compound Summary” faßt die Ergebnisse tabellarisch zusammen und
nennt Ergebnisse der Quantifizierung für jede kalibrierte Komponente
oder für jeden Peak, was von dem in der Methode festgelegten Report
abhängt.
• Sequence Output (Spezifikationen zur Ausgabe)
Im Dialogfeld “Sequence output” können Sie auch festlegen, wohin der
Summmary-Report der Sequenz gedruckt werden soll.
258
Verwendung der ChemStation Reports
Sequence Summary Reporting
Die Wahl von “Report to file” und Eingabe eines Dateinamens sichert den
Report in dieser Datei. Die Standardeinstellung ist die Ausgabe in die
Datei GLPrprt.txt. Bei GC-Systemen mit Dual-Injektion werden die
Dateien GLPrptF.txt und GLPrptB.txt für den vorderen bzw. hinteren
Injektor angelegt.
Durch die Wahl von “Report to printer” wird der Report auf dem aktiven
Drucker des Systems ausgedruckt.
“Print individual reports for each run” aktiviert auch das Drucken von
Reports nach jeder Analyse. Diese Reports werden zusätzlich zu den
zusammenfassenden Reports am Ende der Sequenz ausgegeben. Sie
können für diesen Ausdruck ein neues Ausgabeziel im Dialogfeld
“Sequence Output” angeben oder das Ausgabeziel verwenden, das in der
einzelnen Methode bestimmt wurde.
259
Verwendung der ChemStation Reports
Sequence Summary Reporting
260
13
13
Ermittlung der
Systemleistung
Ermittlung der
Systemleistung
Es ist Bestandteil der guten Laborpraxis, die Leistungsfähigkeit von
Analysengerät und Methode vor der Vermessung von Proben und dem
Routineeinsatz zu überprüfen. Dazu zählt auch die Überprüfung des
Analysensystems vor, während und nach Routineanalysen. Die ChemStation
Software bietet Hilfsmittel zur automatischen Durchführung dieser drei
Tests. Der Test eines Analysengerätes kann die Überprüfung der
Detektorempfindlichkeit, die Reproduzierbarkeit von Retentionszeiten und
Peakflächen umfassen. Der Test einer Methode kann die Überprüfung der
Reproduzierbarkeit von Retentionszeiten und berechneten Mengen, die
Selektivität und die Stabilität der Methode hinsichtlich Abweichungen im
täglichen Einsatz umfassen. Ein Systemtest kann die Überprüfung der
berechneten Mengen, die Auflösung zwischen zwei bestimmten Peaks und
des Tailings umfassen.
Laboratorien, die nach den Vorschriften der
• GLP (Good Laboratory Practice),
• GMP (Good Manufacturing Practice) und cGMP (Current Good
Manufacturing Practice) oder
• GALP (Good Automated Laboratory Practice)
arbeiten, sollten diese Tests durchführen und sämtliche Ergebnisse
dokumentieren. Laboratorien, die einem Qualitätssicherungssystem, zum
Beispiel nach ISO9000 unterliegen, müssen die korrekte Funktion ihrer
Analysengeräte dokumentieren.
Die ChemStation sammelt Ergebnisse aus mehreren Analysenläufen und
wertet diese im zusammenfassenden Report einer Sequenz statistisch aus.
Die Testergebnisse werden in einer Form dokumentiert, die von
behördlichen Stellen oder von unabhängigen Auditoren akzeptiert werden.
Die statistischen Daten umfassen:
• Retentionszeiten der Peaks
• Peakflächen
• Berechnete Mengen
• Peakhöhe
262
Ermittlung der Systemleistung
• Peakbreite in halber Höhe
• Peaksymmetrie
• Peaktailing
• Kapazitätsfaktoren (k´)
• Anzahl theoretischer Trennstufen
• Auflösung zwischen Peaks
• Selektivität relativ zu einem vorausgegangenen Peak
• Verzerrung
• Überschuß
Der Mittelwert, die Standardabweichung, die relative Standardabweichung
und die Konfidenzintervalle werden berechnet. Sie können Grenzwerte
entweder für die Standardabweichung, die relative Standardabweichung oder
die Konfidenzintervalle dieser Parameter angeben. Sollten die Werte die
vorgegebenen Grenzwerte überschreiten, werden entsprechende
Anmerkungen zur besonderen Beachtung im Report aufgenommen.
Die Qualität der analytischen Daten kann mit Aufzeichnungen der
Meßbedingungen zum Analysenzeitpunkt belegt werden. Die ChemStation
trägt die apparativen Bedingungen vor und nach einem Analysenlauf in ein
Logbuch ein. Diese Informationen werden zusammen mit den Daten
gespeichert und in Reports aufgenommen. Daten zur Beschreibung der
Geräteleistung werden während des gesamten Analysenlaufes aufgezeichnet
und im Datensatz gespeichert. Diese Gerätedaten können, wenn vom
Analysengerät unterstützt, dem Chromatogramm bzw. Elektropherogramm
unterlegt werden und bei Bedarf, zum Beispiel einem Audit abgerufen
werden.
Basislinienrauschen und Drift können automatisch gemessen werden. Damit
kann über die Peakhöhe eine Nachweisgrenze für jede kalibrierte Substanz
der Methode berechnet werden.
Schließlich können die Gerätekonfiguration, die Seriennummern der Geräte,
die Säulenkennung und Ihre eigenen Kommentare in jeden Report
aufgenommen werden.
263
Ermittlung der Systemleistung
Erweiterte Leistungswerte können nur für kalibrierte Substanzen berechnet
werden, womit die Identifizierung über Retentions- bzw. Migrationszeiten
und mit Substanznamen sichergestellt wird.
Ein typischer Report über einen Systemleistungstest umfaßt Ergebnisse zu
folgenden Leistungsprüfungen:
• Details zu den Analysengeräten
• Details zur Trennsäule/Kapillare
• Die analytische Methode
• Informationen zur Probe
• Informationen zur Datenerfassung
• Signalbeschreibung und Bestimmung des Basislinienrauschens
• Beschriftung von Chromatogramm/Elektropherogramm mit
Retentions-/Migrationszeiten und Substanznamen.
Zusätzlich werden folgende Informationen für jede kalibrierte Substanz in
das Chromatogramm/Elektropherogramm aufgenommen:
• Retentions-/Migrationszeiten
• k´
• Symmetrie
• Peakbreite
• Anzahl der theoretischen Trennböden
• Auflösung
• Verhältnis von Signal zu Rauschen
• Substanznamen
264
Ermittlung der Systemleistung
Bestimmung des Rauschens
Bestimmung des Rauschens
Die Rauschhöhe wird aus den Daten eines Zeitintervalls im
Chromatogramm/Elektropherogramm bestimmt. Rauschen kann auf drei
Arten beschrieben werden:
1 Als sechsfache Standardabweichung aus der linearen Regression der Drift
2 Als Peak-zu-Peak Wert (mit Driftkorrektur)
3 Durch Bestimmung mit der ASTM-Methode (ASTM E 685-93).
Abbildung 42
Bestimmung des Rauschens als sechsfache Standardabweichung
- linear
regression
noise=
6xSd
slope = drift
time
Abbildung 43
Bestimmung des Rauschens als maximaler Peak-zu-Peak Spitzenabstand
noise=
max. peak
minus
min. peak
time
Die Drift wird als Steigung der Regressionsgeraden gemäß Abbildung 42
ermittelt. Die mittlere Abweichung wird gemäß Abbildung 44 als
Peak-zu-Peak Rauschhöhe der Mittelwerte der ASTM-Abschnitte bestimmt.
265
Ermittlung der Systemleistung
Bestimmung des Rauschens
Abbildung 44
Bestimmung des Rauschens mit der ASTM-Methode
noise=
max. peak
minus
min. peak
i
wander
time
dt
Die Bestimmung des Rauschens mit der ASTM-Methode (ASTM E 685-93)
basiert auf einem Standardverfahren zum Testen von Detektoren variabler
Wellenlänge nach einer Definition der American Society for Testing and
Materials. Es werden drei Typen von Rauschen nach dem Zeitintervall zur
Bestimmung unterschieden. Die Bestimmung von Rauschen basiert auf der
Messung der Abstände von Peak-zu-Peak innerhalb bestimmter
Zeitintervalle.
1 Langzeitrauschen—Es ist die maximale Amplitude aller zufälligen
Schwankungen des Detektorsignals mit Frequenzen von 6 bis 60 Zyklen
pro Stunde. Langzeitrauschen wird in einem Zeitintervall bestimmt, das
länger als eine Stunde ist. Die Zeitintervalle für jeden Zyklus (dt) werden
auf 10 Minuten eingestellt, so daß im gewählten Zeitbereich mindestens
sechs Zyklen erfaßt werden.
2 Kurzzeitrauschen—Es ist die maximale Amplitude aller zufälligen
Schwankungen des Detektorsignals mit einer Frequenz von mehr als
einem Zyklus pro Minute.
Kurzzeitrauschen wird in einem Zeitintervall zwischen 10 und 60 Minuten
bestimmt. Als Zeitintervall eines Zyklus (dt) wird eine Minute gewählt, so
daß im gewählten Zeitbereich mindestens 10 Zyklen erfaßt werden.
3 Schnelles Kurzzeitrauschen (kein Bestandteil von ASTM E 685-93)—Diese
Definition wird zur Beschreibung der maximalen Amplitude aller
zufälligen Schwankungen des Detektorsignals mit einer Frequenz von
mehr als einem Zyklus in 0,1 Minuten eingeführt. Schnelles
Kurzzeitrauschen wird in einem Zeitintervall zwischen 1 und 10 Min.
bestimmt. Als Zeitintervall eines Zyklus (dt) wird eine Minute gewählt, so
daß im gewählten Zeitbereich mindestens 10 Zyklen erfaßt werden.
Eine Bestimmung des Rauschens nach ASTM wird nicht durchgeführt, wenn
der gewählte Zeitbereich kürzer ist als eine Minute. Bei gewählten
Zeitintervallen von größer oder gleich einer Minute wird die Rauschhöhe mit
266
Ermittlung der Systemleistung
Bestimmung des Rauschens
einer der oben beschriebenen ASTM-Methoden beschrieben. In jedem Zyklus
werden mindestens sieben Datenpunkte zur Berechnung verwendet. Die
Zyklen in der automatischen Bestimmung der Rauschhöhe überlappen um
10 %.
267
Ermittlung der Systemleistung
Berechnung der Peaksymmetrie
Berechnung der Peaksymmetrie
Die ChemStation führt keine Bestimmung der Peakasymmetrie durch
Vergleich der halben Peakbreiten in 10 %, oder wie von der FDA empfohlen,
in 5 % der Peakhöhe durch.
Die Peaksymmetrie wird vom Integrator als Pseudomoment mit folgenden
Gleichungen berechnet:
a1
m 1 = a 1  t 2 + -------------
1.5H
f
2
a2
m 2 = -------------------------------0.5H f + 1.5H
2
a3
m 3 = -------------------------------0.5H r + 1.5H
a4
m 4 = a 4  t 3 + -------------
1.5H
r
Peak symmetry =
m1 + m2
-------------------m3 + m4
Wenn nur ein Wendepunkt oder keine Wendepunkte gefunden werden, dient
folgende Formel zur Berechnung der Peaksymmetrie:
a1 + a2
Peak symmetry = ---------------a3 + a4
268
Ermittlung der Systemleistung
Berechnung der Peaksymmetrie
Abbildung 45
Berechnung der Peaksymmetrie
H
Hr
HF
start of peak
t1
a1
a2
t2
a3
a4
t3
t4
endof peak
baseline
time
mit:
ai = Flächenwert des Abschnittes
ti = Zeit des Abschnittes
Hf = Höhe des vorderen Wendepunktes
Hr = Höhe des hinteren Wendepunktes
H = Höhe im Maximum
269
Ermittlung der Systemleistung
Formeln und Rechenmethoden zur Beurteilung der Systemleistung
Formeln und Rechenmethoden zur
Beurteilung der Systemleistung
Die ChemStation verwendet die folgenden Formeln zur Berechnung der
Systemleistung in den verschiedenen Tests. Die Ergebnisse werden in den
Reportvorlagen “Performance”, “Performance + Noise” und “Performance +
Extended” eingebunden.
Wenn in einer gegebenen Definition ASTM oder USP angegeben wird,
entsprechen die Definitionen der Referenz. Es ist jedoch zu beachten, daß die
hier verwendeten Symbole von jenen der Referenzen abweichen können.
Die beiden Referenzen in diesem Zusammenhang sind:
1
ASTM: Abschnitt E 682 – 93, Jahrbuch der ASTM Standards, Band.14.01
2
USP: Die Pharmacopeia der Vereinigten Staaten, XX. Version, pp. 943 946
270
Ermittlung der Systemleistung
Allgemeine Definitionen
Allgemeine Definitionen
Totvolumen
V = d 2 πl ( f ⁄ 4 )
mit:
d = Durchmesser der Säule [cm]
π = Konstante; Wert für das Verhältnis von Durchmesser zu Fläche eines
Kreises
l = Säulenlänge [cm]
f =Anteil am Säulenvolumen, das nicht durch die stationäre Phase
ausgefüllt wird und mobile Phase aufnehmen kann; Standardwert beträgt:
f = 0,68 (für Hypersil)
Retentionszeit einer nicht retardierten Substanz T (m)
[min]
(Andere Bezeichnung Totzeit oder Nullzeit)
Tm = V ⁄ F
mit:
F = Flußrate der mobilen Phase der LC [ml/min]
271
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen des Leistungstests
Definitionen des Leistungstests
Statistische Momente
M0 = d t ⋅ X
X
M1 = t 0 + d t ⋅ ---Y
N
2
dt
M2 = ----- ⋅
X
∑   i – 1 – ---X-
Y
2
⋅ A i

3
⋅ A i

4
⋅ A i

i=1
N
3
dt
M3 = ----- ⋅
X
∑   i – 1 – ---X-
Y
i=1
N
4
dt
M4 = ----- ⋅
X
∑   i – 1 – ---X-
Y
i=1
mit:
N = Anzahl der Flächenabschnitte
Ai = Fläche des Abschnitts i
N
= Summenbildung über die Einzelbeobachtungen mit dem Index 1
∑
bis
zum
letzten Index N
i=1
dt = Zeitintervall zwischen benachbarten Flächenabschnitten der
Peakfläche
t0 = Zeit des ersten Flächenabschnittes der Peakfläche
N
X=
∑ ( Ai )
i=1
272
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen des Leistungstests
N
Y=
∑ ( ( i – 1 )Ai )
i=1
Statistische Momente, Verzerrung (Skew) und Überschuß
(Excess)
Die statistischen Momente werden zur Beschreibung asymmetrischer
Peakformen verwendet. Es existiert eine unendliche Anzahl statistischer
Momente zu einem Peak, es werden jedoch nur die ersten fünf zur
Beschreibung chromatographischer Peaks verwendet.
Diese werden das 0. Moment, 1. Moment, … 4. Moment genannt.
Das 0. Moment repräsentiert die Peakfläche.
Das 1. Moment repräsentiert die mittlere Retentionszeit, gemessen am
Peakschwerpunkt. Dies unterscheidet sich von der chromatographischen
Retentionszeit, die am Peakmaximum gemessen wird, vorausgesetzt es
handelt sich um einen symmetrischen Peak.
Das 2. Moment ist eine Repräsentation der Peakvarianz, die ein Maß für die
Peakerweiterung ist. Es ist eine Summe der Varianzen aus verschiedenen
Beiträgen der Analysengeräte.
Das 3. Moment beschreibt die vertikale Symmetrie oder Verzerrung. Es ist
ein Maß für die Abweichung der Peakform von der idealen Gaußform. Die
Verzerrung wird im Report “Performance & Extended” zusätzlich
dimensionslos angegeben.
Ein symmetrischer Peak hat eine Verzerrung von Null. Peaks mit Tailing
haben eine positive Verzerrung mit einem 1. Moment, das größer als die
Retentionszeit ist. Peaks mit Fronting haben eine negative Verzerrung und ihr
1. Moment ist kleiner als die Retentionszeit.
Das 4. Moment oder der Überschuß ist ein Maß für die Stauchung oder
Zerrung eines Peaks längs einer vertikalen Achse als Vergleich zur idealen
Gaußform, die ein 4. Moment von Null aufweist. Eine visuelle
Vergleichsdarstellung wäre das Verschieben der Seiten eines Gaußpeaks bei
konstanter Fläche. Wenn ein Peak in diesem Vergleich „komprimiert" wird,
weist er einen negativen Überschuß auf. Wenn er höher und schmaler wird,
ist der Überschuß positiv. Der Wert des Überschusses wird im Report
“Performance & Extended” als dimensionsloser Wert präsentiert.
273
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen des Leistungstests
Wahre Peakbreite Wx [min]
W x = width of peak at height x % of total height
Spezialfälle:
WB
Basisbreite, 4 Sigma, wird erhalten, indem Tangenten
durch die Wendepunkte gelegt werden, die die Basislinie
schneiden (Tangenten-Peakbreite) siehe Abbildung 46 auf
Seite 275)
W4,4
Breite bei 4,4% der Höhe (5 Sigma Breite)
W5,0
Breite bei 5% der Höhe (Tailing Peakbreite), wird für den
USP Tailingfaktor verwendet
W50,0
Breite bei 50% der Höhe (wahre Peakbreite bei halber
Höhe oder 2,35 Sigma). Detaillierte Informationen finden
Sie in Abbildung 46.
Kapazitätsfaktor (USP), Kapazitätsverhältnis (ASTM) k′
TR – T 0
k′ = ------------------T0
mit:
TR = Retentionszeit des Peaks [min]
T0 = Nullzeit [min]
Peaktailing nach USP t
W 5.0
t = -----------tw ⋅ 2
wobei:
tw = Abstand in min zwischen der Peakfront und TR, gemessen bei 5% der
Peakhöhe (siehe Abbildung 46)
W5,0 = Peakbreite bei 5% der Peakhöhe [min]
274
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen des Leistungstests
Abbildung 46
Leistungsparameter
W50
H
Basislinie
5% H
TR
Zeit
Tw
W5,0
Wb
Anzahl der theoretischen Trennstufen der Säule (USP,
ASTM) n
Tangentenmethode (USP, ASTM):
TR 2
n = 16  ---------
W 
B
wobei:
WB = Basisbreite [min] (siehe Abbildung 46 auf Seite 275)
Methode unter Verwendung der Halbwertsbreite (ASTM):
TR 2
n = 5.54  ----------
W 
50
wobei:
W50 = Peakbreite bei halber Höhe [min] (siehe Abbildung 46 auf Seite 275)
275
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen des Leistungstests
Methode unter Verwendung von 5Sigma:
TR 2
n = 25  -----------
W 4.4
wobei:
W4,4 = Peakbreite bei 4,4% der Peakhöhe [min]
Methode unter Verwendung der Varianz:
2
M1
n = ----------M2
wobei:
Mx = x th statistischer Moment (Siehe auch Statistische Momenteauf Seite
272)
Anzahl der theoretischen Trennböden pro Meter N [1/m]
N = 100
n
--l
wobei:
n = Anzahl theoretischer Böden
l = Säulenlänge [cm]
Relative Retention (USP, ASTM), Selektivität Alpha
(Bezogen auf zwei Peaks a und b, mit TR des Peaks a < TR des Peaks b)
k′ ( b )
alpha = -----------, alpha ≥ 1
k′ ( a )
mit:
k′(x) = Kapazitätsfaktor des Peaks x
wobei Auflösung (USP, ASTM) R
(bezogen auf Peaks a und b, TR von Peak a < TR von Peak b; TR in min)
Tangentenmethode (USP, ASTM):
2 ( TR ( b) – TR ( a) )
R = ---------------------------------------WB ( b ) + W B ( a )
276
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen des Leistungstests
Methode unter Verwendung von 5 Sigma:
2.5 ( T R ( b ) – T R ( a ) )
R = --------------------------------------------W4.4 ( b ) + W4.4 ( a )
Methode unter Verwendung der Halbwertsbreite:
( 2.35 ⁄ 2 ) ( TR ( b ) – TR ( a ) )
R = -----------------------------------------------------------W 50 ( b ) + W 50 ( a )
Statistische Methode:
M1 ( b ) – M1 ( a )
R = -----------------------------------WS ( b ) + W S ( a )
mit:
M1(x)=mittlere Retentionszeit für Peak x (1. statistischer Moment) [min]
WB(x)= Basisbreite von Peak x [min]
W4,4(x)= Breite bei 4,4% Höhe für Peak x [min]
W50(x)= Breite bei 50% Höhe für Peak x [min]
WS(x)=Breite erhalten aus statistischen Momenten = ( M2 ) für Peak x
(Siehe auch Statistische Momenteauf Seite 272) [min]
277
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen der Reproduzierbarkeit
Definitionen der Reproduzierbarkeit
Für die statistische Betrachtung der Analysendaten mit Hinblick auf die
Reproduzierbarkeit, wird die Sequenz als eine kleine, zufällig aus einer
unendlichen Anzahl möglicher experimenteller Ergebnisse
herausgenommene Probe betrachtet. Um einen kompletten Ergebnissatz zu
erreichen, bräuchte man eine unbegrenzte Menge Probenmaterial und Zeit.
Strikte statistische Daten beziehen sich ausschließlich auf einen kompletten,
in sich selbst geschlossenen Satz oder Datenpopulation. Aus diesem Grund
ist die Voraussetzung für solch eine Datenbehandlung, dass die ausgewählte
Probe als repräsentativ für alle Daten betrachtet werden kann.
Probenmittelwert M
Der Mittelwert M einer zufällig ausgewählten Probe, die N mal gemessen
wurde, wird aus diesem begrenzten Satz von N einzeln ermittelten Werten Xi
(mit dem Index i als fortlaufendem Zähler) entsprechend folgender Formel
berechnet:
N
∑ Xi
i=1
M = --------------N
mit:
N = Anzahl der Einzelbeobachtungen
Xi = Wert der Einzelbeobachtung mit dem Index i
Probe Standardabweichung S
Eine zufällige Probe der Größe N wird angenommen. Die
Proben-Standardabweichung S für die ausgewählte begrenzte Probe aus der
großen Datenpopulation wird ermittelt durch
N
∑ ( Xi – M )
S =
278
i=1
2
---------------------------------N–1
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen der Reproduzierbarkeit
Die Proben-Standardabweichung S unterscheidet sich in zwei Punkten von
der Standardabweichung s für die gesamte Population:
• anstelle des wirklichen Mittelwertes wird nur der Proben-Mittelwert M
verwendet und
• die Division durch N-1 anstelle von N.
Relative Standardabweichung RSD[%] (USP)
Die relative Standardabweichung ist definiert als
S
RSD = 100 ----M
Standardabweichung des Mittelwertes SM
M stellt den Probenmittelwert dar und S die Proben-[oder
(N-1)]-Standardabweichung. Die Standardabweichung SM vom
Probenmittelwert M wird folgendermaßen ermittelt
S
S M = -------N
Beispiel
Dies kann durch ein Beispiel verdeutlicht werden:
Während die Retentionszeit einer bestimmten Substanz während einer
Sequenz leicht vom berechneten Mittelwert abweichen kann, können die
Daten einer anderen Sequenz z.B. durch Umgebungstemperaturänderungen,
Abbau des Säulenmaterials mit der Zeit u.s.w. viel mehr differieren. Um diese
Abweichung zu bestimmen, kann die Standardabweichung des
Probenmittelwertes SM mit der oben genannten Formel berechnet werden.
Konfidenzintervall CI
Das Konfidenzintervall wird berechnet, um Informationen über die Güte der
Einschätzung des Mittelwertes zu erhalten, wenn dieser auf die ganze
Population und nicht nur auf eine Probe angewandt wird.
Das 100 ⋅ ( 1 – α ) % Konfidenzintervall für den gesamten Mittelwert ist gegeben
durch
279
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen der Reproduzierbarkeit
CI = t ( α ⁄ 2 ) ;N – 1 ⋅ S M
mit:
Prozentpunkt der t-Verteilungstabelle bei einer
Risikowahrscheinlichkeit von α
t ( α ⁄ 2 ) ;N – 1
Für die erweiterte Statistik im Sequenz Summary-Report kann das 95%
Konfidenzintervall verwendet werden ( α = 0.05 ).
Die t Verteilung (oder ‘Student-Verteilung’) muss bei kleinen Probenvolumen
verwendet werden. Im Falle großer Probenvolumina differieren die
Ergebnisse für die t-Verteilung und die Normal(Gauss)-Verteilung nicht mehr.
Deshalb kann bei 30 oder mehr Proben stattdessen die Normalverteilung
verwendet werden (es wäre sehr schwierig, die t-Verteilung für eine große
Probenanzahl zu berechnen, die Normalverteilung ist die beste Annäherung
daran).
Beispiel
95% Konfidenzintervall für 6 Proben:)
1 – α = 0,95
N=6
Der korrekte Wert für t muss aus der t-Verteilungstabelle für 5 (N-1)
Freiheitsgrade genommen werden und für den Wert α ⁄ 2 , der 0,025
entspricht. Daraus ergibt sich die folgende Berechnungsformel für CI:
1
CI = 2.571 ⋅ ------- ⋅ S M
6
Regressionsanalyse
Mit:
N = Anzahl der Einzelbeobachtungen
Xi = Unabhängige Variable, i-te Beobachtung
Yi = Abhängige Variable, i-te Beobachtung
Geradengleichung: y ( X ) = a + bX
Koeffizienten:
 N
2
1
a = -------  ∑ X i ⋅
∆ X 
i=1
280
N
 N


Y
–
X
⋅
∑ i  ∑ i ∑ Xi Yi 
i = 1

i=1
i=1
N
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen der Reproduzierbarkeit
N
N

 N

1
b = -------  N ⋅ ∑ X i Y i –  ∑ X i ⋅ ∑ Y i 
∆X 
i = 1
i=1
i = 1 
281
Ermittlung der Systemleistung
Definitionen der Reproduzierbarkeit
mit:
N
∆X = N ⋅
∑
2
Xi
i=1
 N

–  ∑ X i
i = 1 
2
Regressionskoeffizient
N
N
N


N ⋅

Y
–
X
⋅
Y
X
∑ i i ∑ i ∑ i

i=1
i=1
i=1 

r = -----------------------------------------------------------------------------∆x ⋅ ∆y
mit:
N
∆Y = N ⋅
∑
i=1
2
Yi
 N

–  ∑ Y i


i = 1 
2
Standardabweichung (S)
N
∑ ( Yi – a – bXi )
S =
282
i=1
2
----------------------------------------------N–2
Ermittlung der Systemleistung
Interner gespeicherter Doppelpräzisions Zahlenzugriff
Interner gespeicherter Doppelpräzisions
Zahlenzugriff
Für Validierungszwecke kann eine manuelle Neuberechnung der
ChemStation Ergebnisse, wie Kalibrierkurven, Korrelationskoeffizienten,
theoretische Trennböden u.s.w. notwendig sein. Dabei muss das in der
ChemStation verwendete Zahlenformat berücksichtigt werden.
Für alle in der ChemStation intern gespeicherte Zahlen wird der “C” Datentyp
DOUBLE verwendet. Dies bedeutet, dass für jede Zahl 14 signifikante Stellen
gespeichert werden. Die Implementierung dieses Datentyps folgt der
Microsoft Implementierung des IEEE Standards für den “C” Datentyp und die
damit verbundenen Rundungsregeln (siehe Microsoft Dokumentationen
Q42980, Q145889 und Q125056).
Entsprechend der unbegrenzten Anzahl Parameter, die für die Berechnung
der Kalibriertabelle verwendet werden können, ist es nicht möglich, den
exakten Fehler zu berechnen, der sich durch die Fortpflanzung und
Aufaddierung von Rundungsfehlern ergibt. Gründliches Testen mit
verschiedenen Kalibrierkurven-Konstruktionen hat jedoch gezeigt, dass die
Genauigkeit von bis zu 10 Stellen garantiert werden kann. Da die
Wiederholbarkeit von chromatographischen Analysen die Fläche, Höhe und
Retentionszeit betreffend 3 signifikante Stellen besitzt, ist die Verwendung
von 10 signifikanten Stellen während der Berechnung ausreichend. Aus
diesem Grund werden bei der Kalibrierung und anderen Tabellen maximal 10
signifikante Stellen angegeben.
Wird für die Validierung eine externe (manuelle) Berechnung benötigt, wird
empfohlen, alle für die interne Berechnung angewendeten Stellen zu
benutzen. Die Verwendung der angezeigten und/oder gerundeten Daten bei
der externen Berechnung kann durch Rundungsfehler zu anderen
Ergebnissen führen, als die ChemStation ermittelt hat.
Im folgenden Abschnitt wird beschrieben, wie alle intern gespeicherten
Stellen für Zahlen, die typischerweise für manuelle Berechnungen benötigt
werden, erreicht werden können. In allen Fällen muss vor der Eingabe der
aufgelisteten Befehle eine Datendatei geladen und ein Report mit der
geeigneten Reportvorlage erstellt werden. Alle Befehle werden in der
ChemStation Befehlszeile eingegeben, die vom Menü View aus verfügbar
gemacht werden kann. Die Information in der Datei
283
Ermittlung der Systemleistung
Interner gespeicherter Doppelpräzisions Zahlenzugriff
“C:\HPCHEM\TEMP.TXT” kann mit Hilfe von NOTEPAD oder einem
geeigneten Text-Editor angesehen werden.
Rohpeakinformation:
• Retentionszeit
• Fläche
• Mindest• Breite (Integrator)
• Symmetrie
• Peak Startzeit
• Peak Endzeit
Verwenden Sie folgenden Eintrag in der Befehlszeile:
DUMPTABLE CHROMREG, INTRESULTS,”C:\HPCHEM\1\TEMP\INTRES.TXT”
Bearbeitete Peakinformation:
• Gemessene Retentionszeit
• Erwartete Retentionszeit
• Fläche
• Mindest• Breite (Integrator)
• Symmetrie
• Halbe Breite - Halbe Peakhöhe (Leistungstest & Erweiterter Leistungstest)
• Tailingfaktor (Leistungstest & Erweiterter Leistungstest)
• Selektivität (Leistungstest & Erweiterter Leistungstest)
• K‘ (Erweiterter Leistungstest)
• Tangenten-Peakbreite (Erweiterter Leistungstest)
• Verzerrung (Erweiterter Leistungstest)
• Theoretische Trennböden - Halbe Breite (Leistungstest & Erweiterter
Leistungstest)
• Theoretische Trennböden - Tangente (Erweiterter Leistungstest)
284
Ermittlung der Systemleistung
Interner gespeicherter Doppelpräzisions Zahlenzugriff
• Theoretische Trennböden – 5-Sigma (Erweiterter Leistungstest)
• Theoretische Trennböden - Statistisch (Erweiterter Leistungstest)
• Auflösung - Halbe Breite (Leistungstest & Erweiterter Leistungstest)
• Auflösung - Tangente (Erweiterter Leistungstest)
• Auflösung – 5-Sigma (Erweiterter Leistungstest)
• Auflösung - Statistisch (Erweiterter Leistungstest)
Verwenden Sie den Befehlszeileneintrag:
DUMPTABLE CHROMRES, PEAK,”C:\HPCHEM\1\TEMP\PEAK.TXT”
Bearbeitete Substanzinformation:
• Berechnete Menge
Verwenden Sie den Befehlszeileneintrag:
DUMPTABLE CHROMRES, COMPOUND,”C:\HPCHEM\1\TEMP\COMPOUND.TXT”
Kalibriertabelleninformation:
• Stufenzahl
• Menge
• Fläche
• MindestVerwenden Sie folgenden Eintrag in der Befehlszeile:
DUMPTABLE _DAMETHOD, CALPOINT,”C:\HPCHEM\1\TEMP\CALIB.TXT”
Lineare Regressionsinformation:
• Y-Achsenabschnitt (CurveParm1)
• Steigung (CurveParm2)
• Korrelationskoeffizient
Verwenden Sie folgenden Eintrag in der Befehlszeile:
DUMPTABLE _DAMETHOD, PEAK,”C:\HPCHEM\1\TEMP\REGRESS.TXT”
285
Ermittlung der Systemleistung
Interner gespeicherter Doppelpräzisions Zahlenzugriff
286
14
14
Überprüfung des
Systems
Überprüfung des Systems
Überprüfung des Systems
Die Systemüberprüfung ist ein Schlüsselbaustein in der Qualitätssicherung
des Routinebetriebs eines analytischen Labors. Die Möglichkeiten der
ChemStation zur Überprüfung nach GLP sind so ausgelegt, daß Ihnen
folgende Hilfen zur Verfügung stehen: Überprüfung korrekter
Funktionsweise der Software oder wichtiger Softwarekomponenten zum
jetzigen Zeitpunkt oder zum Zeitpunkt einer bestimmten Analyse.
Die Funktion zur Überprüfung der ChemStation ermöglicht Ihnen die
Überprüfung der korrekten Funktion Ihrer ChemStation Software. Sie
können dies durch Nachbearbeitung Ihrer Datensätze mit speziellen
Methoden erreichen und die Ergebnisse mit definierten Standards
vergleichen. Die Überprüfung ist besonders wichtig zur Sicherstellung der
Zuverlässigkeit der Daten aus Integration und Quantifizierung.
Sie können den Standard Test zur Überprüfung verwenden oder Ihre eigenen
Tests mit unterschiedlichen Methoden und Datensätzen definieren, um die
Kombinationen der bei Ihrer Methode verwendeten Rechensoftware zu
prüfen. Der Überprüfungstest ist eine geschützte Datei, die nicht geändert
oder gelöscht weden kann.
Der Befehl “Verification” unter “Data Analysis” ermöglicht es Ihnen, eine der
folgenden Optionen auszuwählen:
• Durchführung einer Überprüfung aus der Datenbank
• Definition eines neuen Verfahrens für eine Überprüfung und Hinzufügen
zur Datenbank
• Löschen einer Überprüfung aus der Datenbank
Im Abschnitt “How To” des Online-Hilfe Systems wird beschrieben, wie diese
Aufgaben durchgeführt werden können. Während einer Überprüfung der
ChemStation können Sie wählen, ob der gesamte Test oder nur Teile des Test
durchlaufen werden sollen.
Die Ergebnisse aus Überprüfungstests werden im Binärformat
standardmäßig im Verzeichnis c:\hpchem\1\Verify zusammen mit Methoden
288
Überprüfung des Systems
Überprüfung des Systems
und Datensätzen gespeichert. Das Unterverzeichnis Verify steht auf
derselben Ebene wie die Verzeichnisse der Sequenzen, Methoden und
Datensätze. Sie können die Ergebnisse an eine Datei oder auf einem Drucker
ausgeben. Die Testergebnisse einschließlich der Testergebnisse für
kombinierte Überprüfungen werden mit “Test bestanden” bzw. “Test nicht
bestanden” bewertet.
Für die Überprüfungstests stehen folgende Komponenten zur Verfügung:
Digitale Elektronik (nur für HP 1050 DAD und Agilent 1100 Series
DAD)
Im Dioden-Array-Detektor ist ein Testchromatogramm gespeichert. Dieses
Chromatogramm wird zur ChemStation geschickt, nachdem es dieselben
Bearbeitungsschritte durchlaufen hat wie normale Rohdatensätze von den
Photodioden. Die daraus resultierenden Daten werden mit den
Ursprungsdaten verglichen, die für dieses Testchromatogramm in der
ChemStation abgelegt sind. Wenn die Werte nicht übereinstimmen, gilt der
Test als nicht bestanden. Dieser Test stellt sicher, daß die Elektronik des
DAD, die die Daten bearbeitet, richtig funktioniert. Es wird ein gespeichertes
Testchromatogramm verwendet; d.h. die Lampe und der Dioden-Array sind
nicht an diesem Test beteiligt. Sie können mit Hilfe des Abschnitts “Die
Funktion “DAD Test”” auf Seite 293 überprüft werden.
Peakintegration
Der Datensatz wird noch einmal mit der Ursprungsmethode integriert und
die Ergebnisse mit den im Überprüfungsregister gespeicherten
Ursprungsdaten verglichen. Wenn die Werte nicht übereinstimmen, gilt der
Test als nicht bestanden.
Quantifizierung der Substanzen
Die Substanzen des Datensatzes werden noch einmal quantifiziert und die
Ergegnisse mit den im Überprüfungsregister gespeicherten Ursprungsdaten
verglichen. Wenn die Werte nicht übereinstimmen, gilt der Test als nicht
bestanden.
Drucken der Reports
Der Originalreport wird noch einmal gedruckt.
Folgende Seite zeigt ein Beispiel für einen erfolgreich durchgeführten
Verifikationstest.
289
Überprüfung des Systems
Überprüfung des Systems
===================================================================
ChemStation Verification Test Report
===================================================================
Tested Configuration:
Component
Revision
Serial Number
-----------------------------------------------------------LC 2D ChemStation
A.05.01
N/A
Microsoft Windows
3.95 (enhanced mode) N/A
MS-DOS
7.0
N/A
Processor
Pentium
N/A
CoProcessor
yes
N/A
ChemStation Verification Test Details:
Test Name
: C:\HPCHEM\1\VERIFY\DEFAULT.M
Original Data File
: C:\HPCHEM\1\VERIFY\DATA\NV-0019.D
Original Acquisition Method
: TC1ISO2.M
Original Data Analysis Method : TC1ISO2.M
Original Operator
: Agilent Technologies
Original Injection Date
: WEd Feb 17 08:59:51 1997
Original Sample Name
:
Signals Tested:
Signal 1: DAD1 A, Sig=254,4 Ref=450,80 of NV-0019.D
Signal 2: VWD1 A, Wavelength=254 nm of NV-0019.D
ChemStation Verification Test Results:
Test Module
Selected For Test
Test Result
----------------------------------------------------------------Digital electronics test
No
N/A
Integration test
yes
Pass
Quantification test
yes
Pass
Print Analytical Report
No
N/A
ChemStation Verification Test Overall Results:
Pass
Darstellungen für Überprüfungen und Fehlererkennungen
Die ChemStation bietet zur Durchführung von Überprüfungen und
Fehlererkennungen zwei zusätzliche Darstellungen, wenn dies vom
konfigurierten Gerät unterstützt wird, wie z.B. den LC-Modulen der Serie
Agilent 1100. Weitere Informationen dazu finden Sie in der Online-Hilfe und
im Handbuch Performance Verification.
290
Überprüfung des Systems
Das Register “GLPsave”
Das Register “GLPsave”
Das Register “GLPsave” wird am Ende jeder Analyse gespeichert, wenn diese
Option in der Runtime-Checkliste angewählt ist. Es enthält folgende
Informationen:
• die Signale
• das Logbuch
• die Tabelle mit den Integrationsergebnissen
• die Tabelle mit den Quantifizierungsergebnissen
• Daten zur Gerätefunktion
• die Methode zur Datenauswertung
Dieses Register ist eine vollständige, geschützte Aufnahme, die beim
Analysenlauf erstellt wird. Sie können es jederzeit aufrufen, wenn Sie einmal
Ihre Analysenmethode überprüfen wollen.
Die Option “GLPsave Register” unter “Data Analysis” ermöglicht es Ihnen, die
Daten im Register “GLPsave” jederzeit einzusehen. Die entsprechende Datei
ist durch eine Kontrollzahlsumme geschützt und als Binärcode verschlüsselt,
damit sie nicht verändert werden kann.
Im Dialogfeld zur Ansicht des Registers “GLPsave”, können Sie folgende
Optionen auswählen:
• Laden der Ursprungsmethode
• Laden der Ursprungssignale
• Laden der Daten zur Gerätefunktion
• Ausdruck der Ursprungsmethode
• Ausdruck der ursprünglichen Integrationsergebnisse
• Ausdruck der ursprünglichen Quantifizierungsergebnisse
• Erstellen eines Originalreports aus Ursprungsmethode und -signalen.
Mit Hilfe der Funktion zur Ansicht der GLP können Sie zeigen, daß es sich bei
Ihren Chromatogrammen um Originaldaten handelt. Weiterhin läßt sich
anhand der Daten zur Gerätefunktion die Qualität der Analyse unter Beweis
stellen und die Berechtigung der Datenbewertung demonstrieren.
291
Überprüfung des Systems
Das Register “GLPsave”
Sie können beispielsweise:
• den Datenauswertungsteil der Methode, die zum Zeitpunkt der
Datenauswertung verwendet wurde, neu laden und ausdrucken, um zu
beweisen, daß die in den Ergebnissen dargestellte Datenauswertung für
die Analyse in keiner Weise verändert wurde;
• die Integrations- und Quantifizierungsergebnisse ohne erneute
Berechnung aufrufen, um die Echtheit des Reports unter Beweis zu
stellen.
292
Überprüfung des Systems
Die Funktion “DAD Test”
Die Funktion “DAD Test”
In einem Labor mit GLP-Standard können Detektortests dazu verwendet
werden, routinemäßig Systembewertungen für ein Analysengerät
durchzuführen.
Der DAD-Test prüft die Funktionen Ihres Dioden-Array-Detektors. Wenn Sie
aus dem Menü “Instrument” (nur für LC3D an 3DCE) den DAD-Test
auswählen, wird das Gerät auf seine Intensität und Wellenlängenkalibrierung
hin geprüft. Wenn Sie “Save” betätigen werden die Testergebnisse
automatisch in der DADTest-Datenbank gespeichert. Dabei handelt es sich
um ein Datenregister, das mit DADTest.Reg benannt und im
Standardverzeichnis für das Gerät abgelegt ist.
Die Funktion “Review DAD Test”
Die Funktion “Review DAD Test” im Menü “View” der Datenanalyse
ermöglicht es Ihnen, die Datei DADTest.Reg jederzeit einzusehen. Die Datei
wird durch eine Kontrollzahlsumme geschützt und als Binärcode
verschlüsselt, damit sie nicht verändert werden kann.
Sie können folgende Teile des DAD-Tests zur Wiedereinsicht auswählen:
Anzeige der Heliumspektren (Show Holium Spectra)
Stellt alle in der Anzeigetabelle des DAD-Tests aufgeführten
Holmiumspektren dar. Das aktive Spektrum ist markiert.
Anzeige der Intensitässpektren (Show Intensity Spectra)
Stellt alle in der Anzeigetabelle des DAD-Tests aufgeführten
Intensitätsspektren dar. Das aktive Spektrum ist markiert.
Speichern unter einer neuen Datenbank (Save as New Database)
Wenn Sie die Lampe Ihres DAD auswechseln, können Sie den DAD-Test
wieder in die Ausgangssituation zurückstellen, um ungewollte Testergebnisse
aus der Tabelle zu löschen. Danach können Sie die Funktion “Save As New
Database” einsetzen.
Anzeige der gewählten Spektren (Show Selected Spectra)
Stellt nur die in der Tabelle ausgewählten Spektren dar.
293
Überprüfung des Systems
Die Funktion “DAD Test”
Anzeige eines Intensitässchaubilds (Show Intensity Graph)
Sie können ein Intensitätsschaubild auf dem Bildschirm darstellen, um die
Lebensdauer der Lampe Ihres Dioden-Array-Detektors abschätzen zu
können. Das Schaubild liefert eine Funktion der maximalen
Lampenintensität gegen die Zeit.
294
Index
A
abbrechen
einer Sequenz, 204
Abhandlung über den HP Standardintegrationsalgorithmus, 71
absolut
Responsefaktor, 165
Retentionszeit, 151, 152
Abweichung, 182
Abweichung von Gauß-Kurve, 121
Agilent 1100 Series, 230
Agilent 1100 Series LC
anschließen, 230
aktuell
Methode, 46
All Valleys, 104, 145
analoges Signal, 59
Analyse
Genauigkeit der, 195
Anfangsparameter, 91, 134
Mindestfläche, 91
Peakbreite, 91
Schwellenwert, 91
angepaßte Datenauswertung, 54
angepaßte Konfiguration, 110
angepaßte Reports, 26
Anpassung
Kurve, 188
nicht-lineare, 187
Anzahl der Trennböden, 275
Methode der Halbwertsbreite, 275
Methode unter Verwendung der Varianz, 276
Tangentenmethode, 275, 276
Anzahl der Trennböden pro Meter, 276
Area%
Berechnung, 167
Report, 248
ASCII-Datei, 241
Auflösung, 276
5 Sigma-Methode, 277
Methode der Halbwertsbreite, 277
statistische Methode, 277
Tangentenmethode, 276
Ausgabe
von Reports, 254
Autointegration, 100, 142
automatisch
Rekalibrierung, 212
Shutdown, 211
automatische Bibliothekssuche, 53
automatischer Batch-Review, 240
Automatisierung, 28
B
baseline
penetration, 128
Basisilinie
Auswertung, 112
Basislinie, 79
Anfang der, 124
angepaßte Konstruktion, 97
Auswertung, 79, 113
Bestimmung, 112, 113, 123
Definition, 112
Ende der, 124
Kodierung, 104, 145
Konstruktion einer modifizierten,
126
Konstruktionsparameter, 97
modifizierte, 86
Schneiden der, 86
standardmäßige Konstruktion, 123
Basislinie ziehen, 104, 145
Batch, 238
Batch-History, 241
Batch-Report, 239
Batch-Tabelle, 238
Benutzeroberfläche, 239
Berechnung
kalibrierte Rechenverfahren, 168
mit ESTD, 169
mit ISTD, 172
Norm%, 171
unkalibrierte Rechenmethoden, 167
zur Quantifizierung, 164
Berechnung der Peaksymmetrie, 268
Bereiche
der Kalibrierung, 186
Bestimmung des Rauschens, 265, 266
mit der ASTM-Methode, 266
Bestimmungsgrenzen, 185
C
Checkliste zur Ausführung
Datenauswertung, 53
Datenerfassung, 52
Post-Run Befehl, 54
Post-Run Makro, 54
Pre-Run Befehl, 52
Pre-Run Makro, 52
Speichern der GLP-Daten, 54
Speichern einer Kopie der Methode,
55
ChemStation
allgemeine Beschreibung, 13
Anschließen einer LC der Agilent
1100 Serie, 230
weitgehende Anpassung, 28
CI, 279
Control Chart Reports, 26
CSV-Datei, 241
D
Datei
Daten, 61
Erweiterung, 61
Methode, 50
Name, 61
Report, 61
Datenauswertung
angepaßte, 54
Integration, 21
Quantifizierung, 22
Reports, 23
Spezielle Reports, 23
Datenerfassung, 19
Was ist Datenerfassung?, 59
Datensatz
chromatographisch, 61
spektral, 61
Definition für Linearitätstests, 278
Definitionen der Reproduzierbarkeit,
278
delta%, 215
Detektorresponse, 184, 185, 246
Dialogfeld "Calibration Settings", 175
DIF-Datei, 241
digitales Signal, 59
Drift
der Response, 226
E
Einpunktkalibrierkurve, 184
295
Index
einzelne Referenzpeaks, 154
Ereignismeldungen, 63
Ersetzen (Replace), 213
Erweiterung
Datei, 61
ESTD
Berechnung, 169
Report, 246, 248
Verfahren, 169
Excel-Datei, 241
explizit
Kalibriersequenzen, 217
externer Standard, 169
Extrapolation, 186, 226
F
Fehlermeldungen, 63
einer Sequenz, 207
Fenster
Referenz, 153
Retentionszeit, 153
Fläche
Mindest-, 94
Parameter, 97
Formeln
allgemeine Definitionen, 271
Definitionen des Leistungstests, 272
Formeln für die Systemleistung
Anzahl der Trennböden, 275
Auflösung, 276
Kapazitätsfaktor, 274
Mittelwert, 278
Nullzeit, 271
Peakbreite, 274
Peaktailing nach USP, 274
Regressionsanalyse, 280
Regressionskoeffizient, 282
relative Retention, 276
relative Standardabweichung, 279
Retentionszeit einer nicht retardiertenSubstanz, 271
Standardabweichung, 278, 282
Totvolumen, 271
Totzeit, 271
Funktion des neuen Integrators, 111
G
Genauigkeit
296
der Analyse, 195
Gerät
Response, 226
Status des, 65
Gerätesteuerung, 33
Netzwerke, 33
Gewichtung
der Kalibrierpunkte, 188
gleich, 188
linear, 188
quadratisch, 188
GLPSave.Reg, 54
mit der Methode speichern, 54
Grenzwerte, 239
Gute Laborpraxis (Good Laboratory
Practice, GLP), 29
H
Height%
Berechnung, 167
Report, 248
I
Integration, 53, 102
Anpassung, 96, 137
Ergebnistabelle, 53
isolierte Peaks, 79
Kontrollparameter, 97
manuell, 103
Methoden, 99
neuen, 71
Parameter, 77, 91, 134
Parametertabelle, 102, 139
Peakschultern, 81
Strichmarkierungen, 70
überlappender Peaks, 81
Was ist eine Integration?, 77
Integrationsparameter, 53
interner Standard, 172
Intervall
der Rekalibrierung, 214
ISTD
Berechnung, 172
Peaks auffinden, 159
Report, 247
Verfahren, 172
K
Kalibrierkurve
Anpassung, 188
Arten, 184
Beschreibung der, 181
Einpunktkalibrierung, 184
Gewichtung des Kalibrierpunkts, 188
Mehrpunktkalibrierung, 185
Verlauf durch Ursprung erzwingen,
188
Was ist eine Kalibrierkurve?, 181
Kalibriertabelle, 149
Was ist eine Kalibriertabelle?, 180
Kalibrierung, 179
Bereiche der, 186
explizite, 217
Häufigkeit, 214
Kurve, 181
Kurvenanpassung, 188
Mehrpunkt-, 185
Probe, 179, 185
Punkt, 179
Stufe, 179
Substanz, 179
umschließende, 214
zyklische, 218
Kapazitätsfaktor, 274
Kapazitätsverhältnis, 274
Kardinalpunkte, 80
Konfidenzintervall, 279
Konfiguration, 17
angepaßte, 110
Konstruktion einer modifizierten Basislinie, 86
Kontrolle, 238
Koordinatenursprung
Behandlung, 188
einbeziehen, 188
erzwingen, 188
ignorieren, 188
verbinden, 188
Kopfzeile, mehrzeilig, 239
Korrekturfaktoren, 165
korrigierte Retentionszeit, 151, 154
Kurve
Anpassung, 188
Kalibrierung, 181
Index
L
Laufindex, 238
Leistungstest Definitionen
statistische Momente, 272
Logbuch, 61, 63
Logbuchdatei
einer Sequenz, 207
Löschen von Peaks, 104, 145
Lösungsmittelpeak, 84, 86, 89, 125, 132
Lotfällung, 81
M
Makro
Shutdown, 211
Manuelle Integration, 144
manuelle Integration, 103
alle Talpunkte, 104, 145
Basislinie ziehen, 104, 145
Codes zur Trennung, 104, 145
Löschen von Peaks, 104, 145
negative Peaks, 104, 145
Peaktrennung, 104, 145
tangentiale Anpassung, 104, 145
Trace Mode, 104, 145
Vorgehensweise, 104, 145
manuelle Parameter
einfügen, 146
manueller Batch-Review, 240
Maus
rechter Mausknopf, 104, 145
mehrere
Referenzpeaks, 155
Mehrpunktkalibrierung, 172, 185
Kalibrierkurve, 185
mehrzeilige Kopfzeile, 239
Mengenangaben, 151
Methode, 238
Ablauf, 51
aktuelle, 46
automatische Bibliothekssuche, 53
Bestandteile, 44
editieren, 48
erstellen, 47
gespeicherte, 46
GLPSave.Reg, 54
Information, 44
Integration, 53
Integrationsparameter, 53
Standard-, 46
Status, 46, 65
Überprüfen der Peakreinheit, 53
verändern, 47
Verzeichnis, 50
Warten, 211
Was ist eine Methode?, 43
Zusammenfassung des Ablaufs, 56
Methodendatei
Geräteparameter, 50
Parameter für die Datenauswertung,
50
Microsoft Excel-Datei, 241
Mindesthöhe, 134
Mittelwert (average), 214
Monitor
für Signale, 62
Gerätestatus, 65
Multiplikationsfaktor, 165, 170
N
Name
einer Sequenzdatei, 209
negative Peaks, 104, 145
negativer Peak, 84, 125
neuer HP Integrator
Anwendung, 140
Nicht zugeordnete Peaks, 130
nicht zugeordnete Peaks, 125
nicht-linear
Kurvenanpassung, 187
No Update, 213
Norm%
Berechnung, 171
Report, 171, 248
Normalisierungsfaktor, 172
Not Ready Timeout, 211
Nullprobe
Analysenlauf, 209
Nullzeit, 271
O
Online
Monitore, 62
Online-Hilfe, 34
P
Parameter
Anfangs-, 91
-arten, 91
Integrations-, 91
zeitprogrammierbare, 97
partielle Rekalibrierung, 195
pausieren
einer Sequenz, 205
Peak
Algorithmus für Maximum, 121
-anfang, 80, 113
Ausschlußkriterien, 94
-breite, 91, 117
Bündeln, 119
Codes zur Trennung, 84, 125
Durchführung der Identifizierung,
159
-ende, 80, 113
Erkennung, 79
-erkennung, 117
Flächenberechnung, 131
-höhe, 167
Identifizierung, 53, 149
Integration, 77
Krümmung, 80
Lösungsmittel, 86
-maximum, 113
-parameter, 91
Qualifier, 150, 151
-qualifier, 156
Quantifizierung, 53, 163
Regeln zur Übereinstimmung, 150
Response, 156
Retentionszeit, 154
Retentionszeitfenster, 153
-schulter, 81
Steigung, 80
überlappend, 81
Peakbreite, 274
2,35 Sigma, 274
4,4% der Höhe, 274
5 Sigma Breite, 274
auswählen, 135
Basisbreite WB, 274
bei 5% der Höhe, 274
Bereich, 93
Einfluß der, 94
halbe Höhe, 274
Tangente, 274
297
Index
verändern, 94
Peakidentifizierung
Möglichkeiten, 151
Was ist Peakidentifizierung?, 149
Peakreinheit, 53
Peaks
in der Praxis, 115
Peakschultern
Detektion, 91, 94
Peaktailing, 274
Peaktailing nach USP, 274
Post-Run
Befehl, 54
Makro, 54
Post-Sequenz Aktionen, 211
Präzision
Zahlenformat, 283
Pre-Run
Befehl, 52
Makro, 52
Probe
Kalibrierung, 179, 185
-menge, 165
unbekannte, 183
Vorzugsproben, 204
Probenart, 238
Probenart "removed" (entfernt), 238
prozentuale Berechnung, 167
Q
Qualifier, 156
Quantifizierung
Berechnungen, 164
ESTD-Verfahren, 169
ISTD-Verfahren, 172
Was ist Quantifizierung?, 163
quantitative Ergebnisse, 248
R
Referenzfenster, 153
Referenzpeaks
Anwendung, 154
auffinden, 159
einzelne, 154
mehrere, 155
Regression
Regressionskoeffizient, 282
Regressionsanalyse, 280
298
Rekalibrierung, 195
automatische, 212
Intervall, 214
partielle, 195
Retentionszeit, 195
unidentifizierter Peaks, 195
vollständige, 195
Warum Rekalibrierung wichtig ist,
195
Was ist Rekalibrierung?, 195
relative Retention, 276
Report
Area%, 248
Ausgabe, 254
Control Chart, 26
Dateiformate, 254
Datensatz, 61
ESTD, 246, 248
Height%, 248
kalibrierter, 246
Layout, 26
Norm%, 248
Sequence Summary, 25
unkalibrierter, 246
-vorlagen, 250
Was ist ein Report?, 245, 248
zur Systemeignung, 23
Report zur Systemeignung
Extended Performance, 24
Performance and Noise style, 24
Performance Report, 23
Reports zur Systemeignung, 23
Response, 163, 183
Detektor, 184
Drift, 226
Verhältnis, 156
Responsefaktor
absoluter, 165
Update, 213
Retentionszeit, 271
absolute, 151, 152
Fenster, 153
korrigierte, 151, 154
Rekalibrierung, 195
Update, 213
Run-Time Checkliste, 45, 49, 51
S
Schneiden
der Basislinie, 86
Schultererkennung, 135
Schultern
Integration, 81
Schwellenwert, 93
Einfluß des, 94
verändern, 94
Sequence Summary Report
Analysenreports, 257
Festlegung der Ausgabe, 258
Konfiguration, 257
Kopfzeilen, 257
Logbuch, 257
Methoden, 257
Probentabelle, 257
Sequenztabelle, 257
Statistik, 257
Zusammenfassung, 258
Sequenz
abbrechen, 204
Arbeitsschritte zur umschließenden
Kalibrierung, 227
Dateiname, 209
editieren, 204
erstellen, 203, 204
explizite Kalibrierung, 217
Fehlermeldungen, 207
Logbuchdatei, 207
Nullproben, 209
pausieren, 205
Probengefäße, 209
speichern, 204
stoppen, 204
umschließende Kalibrierung, 226
Unterverzeichnis, 39
Was ist eine Sequenz, 200
zyklische Kalibrierung, 218, 219, 226
Sequenzparameter
Tabelle, 201
Sequenztabelle, 202
Rekalibrierparameter, 213
Shutdown
automatisch, 211
des Systems, 211
Makro, 211
Signal
Index
analog, 59
Details, 44
digital, 59, 79
Kennzeichnung, 61
Monitor, 62
Software-Überblick
Bertriebssystem, 17
Datenmodell, 17
Methoden und Sequenzen, 17
Systemkonfiguration, 17
Speichern der GLP-Daten, 54
Standard, 238
externer, 169
interner, 172
Standardabweichung, 182
Proben-Standardabweichung, 278
Standardabweichung des Mittelwertes, 279
Standardabweichung RSD, 279
Standardabweichung S, 282
Standby Status, 211
Status
des Gerätes, 65
Fenster, 65
stoppen
einer Sequenz, 204
Strichmarkierungen, 70, 83, 124
Substanz, 179
Substanztabelle, 238
System
Meldungen, 63
Shutdown, 211
Status, 64
Systemleistung
Grenzen der, 263
mit Statistik, 262
T
t Verteilung, 280
Table der Peaksummen, 253
Talpunkt, 81
tangentiale Anpassung, 104, 128, 145
Totvolumen, 271
Totzeit, 271
Trace Mode, 104, 144
aktivieren, 104, 145
manuelle Integration, 104, 144
TXT-Datei, 241
U
überlappende Peaks
Integration, 81
überprüfen
Unterverzeichnis, 39
Überprüfen der Peakreinheit
als Teil der Methode, 53
Überprüfung, 288
Überprüfung des Systems, 288
Umschließen (bracket), 214
Umschließend
Kalibrierung, 214
umschließende
Kalibriersequenz, 226
unbekannte Probe, 183
unidentifizierte Peaks
Klassifizierung, 160
Rekalibrierung, 195
unkalibrierte Rechenmethoden, 167
Update
der Retentionszeit, 213
des Responsefaktors, 213
zusammenfassende Reports einer Sequenz (Sequence Summary Reports), 25
zyklisch
Kalibriersequenzen, 218, 219, 226
V
veränderbare Integration
Parameter, 110
Verdünnungsfaktor, 165, 170
Verification, 288
Verzeichnis
Methode, 50
Vorlagen
für Reports, 250
Vorzugsprobe, 204
W
Weitgehende Anpassung, 28
Wendepunkt
Abstiegsflanke, 80
Anstiegsflanke, 80
X
XLS-Datei, 241
Z
zeitprogrammierbare Parameter, 97,
138
299
Index
300
s1
In diesem Handbuch
In diesem Handbuch werden die
verschiedenen Konzepte der ChemStation
beschrieben. Sie können damit einen
Einblick in die Funktionsweise Ihrer
ChemStation gewinnen.
Informationen zur Verwendung der
ChemStation finden Sie im OnlineHilfesystem sowie im integrierten Tutorial.
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