IDK® Tryptophan ELISA high sensitive

IDK® Tryptophan ELISA high sensitive
Arbeitsanleitung / Manual
IDK® Tryptophan ELISA
high sensitive
Zur in-vitro-Bestimmung von L-Tryptophan in Nagern (Plasma,
Serum, Hirngewebe), sowie in Zellkulturüberständen und CSF
For the in vitro determination of L-tryptophan in rodents (plasma,
serum and brain tissue), in cell culture supernatant and CSF
Nur zu Forschungszwecken / For research use only
Gültig ab / Valid from 2017-07-14
K 3730
Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Germany
Tel.: +49 6251 70190-0
Fax: + 49 6251 849430
e.mail: [email protected]
www.Immundiagnostik.com
Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Inhalt
1.
VERWENDUNGSZWECK
2
2.
INHALT DER TESTPACKUNG
2
3.
ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL
3
4.
VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN
3
5.
PROBENVORBEREITUNG UND -LAGERUNG
5
6.
TESTDURCHFÜHRUNG
5
Testprinzip
5
Pipettierschema Probenvorbereitung
6
Pipettierschema Testdurchführung
7
7.
ERGEBNISSE
9
8.
EINSCHRÄNKUNGEN
10
9.
QUALITÄTSKONTROLLE
10
Referenzwerte
11
10. TESTCHARAKTERISTIKA
11
Präzision und Reproduzierbarkeit
11
Spike-Wiederfindung
11
Wiederfindung in der Verdünnung
12
Analytische Sensitivität
12
Spezifität
13
11. VORSICHTSMASSNAHMEN
13
12. TECHNISCHE MERKMALE
13
13. ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST
14
14. LITERATUR
14
1
Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
1. VERWENDUNGSZWECK
Der hier beschriebene Assay ist geeignet für die quantitative Bestimmung von
L-Tryptophan in EDTA-Plasma, Serum und Hirngewebe von Nagern (Maus,
Ratte), sowie in Zellkulturüberständen und CSF (Cerebrospinal-Flüssigkeit). Nur
für wissenschaftliche Forschung. Nicht für diagnostische Zwecke.
Für humane Plasma-, Serum-, und Urinproben empfehlen wir Ihnen unseren
IDK® Tryptophan ELISA K 7730.
2. INHALT DER TESTPACKUNG
Artikel Nr. Bezeichnung
Kit Komponenten
Menge
K 3730
PLATE
Mikrotitermodul, vorbeschichtet
12 x 8 Vertiefungen
K 3730
STD
Standards, gebrauchsfertig
(0, 2, 8, 30, 80, 250 µM)
6 x 200 µl
K 3730
K 3730
CTRL 1
CTRL 2
Kontrollen, gebrauchsfertig
(Bereich der Spezifikation entnehmen)
2 x 200 µl
K 3730
STD
„Cell culture medium“ Standards,
gebrauchsfertig
(0, 2, 8, 30, 80, 250 µM)
6 x 200 µl
K 3730
K 3730
CTRL 1
CTRL 2
„Cell culture medium” Kontrollen,
gebrauchsfertig
(Bereich der Spezifikation entnehmen)
2 x 200 µl
K 3730
WASHBUF
Waschpufferkonzentrat, 10x
2 x 100 ml
K 3730
AB
L-Tryptophan-Antikörper, lyophilisiert
4 x 1 Fläschchen
K 3730
CONJ
Konjugat, Peroxidase-markiert,
Konzentrat
1 x 65 µl
K 3730
CONJBUF
Konjugatstabilisierungspuffer,
gebrauchsfertig
1 x 13 ml
K 3730
REABUF
Reaktionspuffer, gebrauchsfertig
1 x 45 ml
K 3730
DER
Derivatisierungsreagenz
2 x 25 mg
K 3730
DMSO
Dimethylsulfoxid (DMSO)
1 x 4 ml
K 3730
ASYBUF
Assaypuffer, gebrauchsfertig
1 x 28 ml
2
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IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
K 3730
SUB
TMB-Substrat (Tetramethylbenzidin),
gebrauchsfertig
1 x 15 ml
K 3730
STOP
Stopplösung, gebrauchsfertig
1 x 15 ml
Für Nachbestellungen von Einzelkomponenten verwenden Sie als Bestellnummer die Artikelnummer gefolgt von der Bezeichnung.
3. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL
• Reinstwasser*
• Präzisionspipetten und Pipettenspitzen für den Einmalgebrauch mit
variablen Volumina von 10 - 1000 µl
• Folie zum Abkleben der Mikrotiterplatte
• Mikrotiterplattenschüttler
• Multikanal- bzw. Multipipette
• Vortex-Mixer
• Zentrifuge, 14000 g
• Laborwaage
• Ultraschallhomogenisator
• Laborübliche Glas- oder Plastikröhrchen (Einmalartikel)
• Mikrotiterplattenphotometer (benötigte Filter siehe Kapitel 6)
* Immundiagnostik AG empfiehlt die Verwendung von Reinstwasser nach ISO 3696. Es handelt sich
dabei um Wasser des Typs 1, welches frei von ungelösten und kolloidalen Ionen und organischen
Molekülen ist (frei von Partikeln > 0,2 μm) mit einer elektrischen Leitfähigkeit von 0,055 μS/cm bei
25°C (≥18,2 MΩ cm).
4. VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN
• Bitte achten Sie bei mehrfachem Einsatz des Kits darauf, dass die Reagenzien
wie in der Vorschrift beschrieben gelagert und nur die für den jeweiligen
Ansatz benötigten Reagenzienmengen frisch angesetzt werden. Der Kit
kann so je nach Probenaufkommen bis zu 2 x bis zum angegebenen
Haltbarkeitsdatum verwendet werden.
• Reagenzien mit einem Volumen kleiner 100 µl sollten vor Gebrauch kurz
anzentrifugiert werden, um Volumenverluste zu vermeiden.
3
Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
• Vorbereitung des Waschpuffers:
Das
Waschpufferkonzentrat
(WASHBUF) muss vor Gebrauch 1:10 in Reinstwasser verdünnt werden
(100 ml WASHBUF + 900 ml Reinstwasser), gut mischen. Aufgrund der hohen
Salzkonzentration in den Stammlösungen kann es zu Kristallbildungen
kommen. Die Kristalle lösen sich bei Raumtemperatur bzw. im Wasserbad bei
37°C auf. Das WASHBUF kann bei 2-8 °C bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum aufbewahrt werden. Der Waschpuffer (1:10 verdünntes WASHBUF)
ist 1 Monat bei 2-8 °C in einem geschlossenen Gefäß haltbar.
• Die Standards (STD) und die Kontrollen (CTRL1, CTRL2) werden
eingefroren bei -20°C gelagert. Für den Test die Standards und Kontrollen
auftauen und kurz vortexen. Standards und Kontrollen sind bei -20 °C bis
zum angegebenen Haltbarkeitsdatum verwendbar, das Wiedereinfrieren
sollte sofort nach Entnahme erfolgen.
• DMSO kristallisiert bei 4 °C aus. Zum Lösen das DMSO bei Raumtemperatur
stehen lassen oder im Wasserbad erwärmen.
• Der Inhalt eines Fläschchens Derivatisierungsreagenz (DER) (25 mg) wird
in 1,5 ml DMSO gelöst und das Fläschchen für 5 min auf einen Horizontalschüttler gelegt. Das DER sollte unmittelbar vor Gebrauch frisch angesetzt
werden. Falls mehrere Fläschchen benötigt werden, deren Inhalt vereinen
und vor Gebrauch mischen. Nach Gebrauch ist das Restreagenz zu
verwerfen. Bitte beachten: DMSO greift Plastik an, DMSO reagiert nicht mit
Polypropylen-Produkten und Glasgefäßen.
• Der Inhalt eines Fläschchens L-Tryptophan-Antikörper (AB) wird in 3 ml
verdünntem Waschpuffer gelöst. Werden mehrere Fläschchen benötigt,
deren Inhalt vereinen und vor Gebrauch mischen. Gelöster L-TryptophanAntikörper kann 1 Monat bei -20 °C aufbewahrt werden.
• Das Peroxidase-Konjugat (CONJ) wird 1:201 in Konjugatstabilisierungspuffer (CONJBUF) verdünnt (z.B. 60 µl CONJ + 12 ml CONJBUF; nur die
benötigte Menge ansetzen). Unverdünntes Konjugat ist bei 2-8 °C bis zum
angegebenen Haltbarkeitsdatum stabil. Verdünntes Konjugat kann 1 Woche
bei 2-8 °C aufbewahrt werden.
• Alle anderen Testreagenzien sind bei 2-8 °C zu lagern und bei
entsprechender Lagerung bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum (siehe
Etikett) verwendbar.
4
Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
5. PROBENVORBEREITUNG UND -LAGERUNG
EDTA-Plasma, Serum, Zellkulturüberstände, CSF
• Als Probe eignet sich EDTA-Plasma und Serum von Nagern (Maus, Ratte),
Zellkulturüberstände und CSF (Cerebrospinal-Flüssigkeit). Die Haltbarkeit der
Proben beträgt bei 2-8 °C drei Tage. Zur längeren Lagerung müssen die
Proben bei -20 °C oder -80 °C aufbewahrt werden.
• Proben mit sichtbaren Mengen an Feststoff sollten zentrifugiert werden.
• Die Proben werden unverdünnt verwendet.
Wenn bei Nager-Seren und -Plasmen weniger als 20 µl vorhanden sind,
können diese Proben 1:2 mit Reaktionspuffer verdünnt werden (10 µl Probe
+ 10 µl REABUF). Dieser Verdünnungsfaktor muss bei der Auswertung
berücksichtigt werden.
Hirngewebe
• Auch Hirngewebe von Nagern (Maus, Ratte) ist als Probe geeignet. Dazu die
Gewebeprobe in ein Mikroreaktionsgefäß geben und die exakte Masse
bestimmen. Pro Milligramm Gewebe werden 40 µl Reaktionspuffer (REABUF)
in das Gefäß pipettiert, z. B. 25 mg Gewebe + 1000 µl REABUF. Mittels
Ultraschall die Probe homogenisieren und anschließend 10 min bei 14.000g
gekühlt zentrifugieren. Den Überstand in ein frisches Gefäß überführen.
200 µl davon werden im Test eingesetzt (siehe Pipettierschema Probenvorbereitung). Proben und Überstände bei -20 °C oder -80 °C aufbewahren.
Zur weiteren Vorbereitung müssen alle Proben mit einem Derivatisierungsreagenz (DER) zur Derivatisierung des enthaltenen L-Tryptophan
versetzt werden (Details siehe Pipettierschema Probenvorbereitung).
6. TESTDURCHFÜHRUNG
Testprinzip
Der Test basiert auf der Methode des kompetitiven Enzymimmunoassays. Zur
Vorbereitung wird die zu untersuchende Probe mit einem Derivatisierungsreagenz zur Derivatisierung des enthaltenen L-Tryptophan versetzt.
Anschließend wird die derivatisierte Probe zusammen mit einem polyklonalen
L-Tryptophan-Antiserum in einer mit L-Tryptophan-Derivat (Tracer)
beschichteten ELISA-Platte inkubiert. Während der Inkubation kompetitiert das
5
Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Zielantigen in der Probe mit dem an die Platte gebundenen Tracer um die
Bindung der polyklonalen Antikörper. Hierbei verdrängt das Zielantigen in der
Probe den Antikörper aus der Bindung an den Tracer. Daher ist die
Konzentration des an den Tracer gebundenen Antikörpers umgekehrt
proportional zu der Konzentration des Zielantigens in der Probe.
Beim zweiten Inkubationsschritt wird ein Peroxidase-markierter Sekundärantikörper zugegeben, der an die polyklonalen L-Tryptophan-Antikörper
bindet. Nach einem Waschschritt zur Entfernung ungebundener Komponenten
wird das Peroxidasesubstrat Tetramethylbenzidin (TMB) zugegeben. Die
Enzymreaktion wird durch Zugabe von Säure abgestoppt. Dadurch erfolgt ein
Farbumschlag von blau nach gelb. Die entstandene chromogene Verbindung
wird photometrisch bei 450 nm gemessen. Die Intensität der Farbe ist
umgekehrt proportional zur Konzentration des gemessenen Analyten, d.h. mit
steigender L-Tryptophan-Konzentration in der Probe reduziert sich die
Konzentration der an den Tracer gebundenen Antikörper und das Signal
nimmt ab. Anhand einer mitgeführten Standardkurve - optische Dichte
(Absorption bei 450 nm) versus Standardkonzentration - lässt sich die
Konzentration der Probe ermitteln.
Pipettierschema Probenvorbereitung
Die Derivatisierung der Standards (STD), der Kontrollen (CTRL) und der Proben
(SAMPLE) wird als Einzelbestimmung in Mikroreaktionsgefäßen (z.B. 1,5-mlReaktionsgefäße) durchgeführt.
Die Reagenzien dieses Kits reichen aus für 48 Derivatisierungen, welche jeweils
als Doppelbestimmung in die Wells der Platte aufgetragen werden.
Dieser Kit enthält zwei Standardkurven mit Kontrollen:
Eine Standardkurve mit Kontrollen ist für Nagerserum, -plasma
und -Gehirngewebe sowie CSF geeignet.
Die zweite Standardkurve mit Kontrollen („Cell culture medium“) ist speziell für
die Messung von Zellkulturüberständen ausgelegt.
Bitte wählen Sie die für Ihre Proben geeignete(n) Standardkurve(n) mit
Kontrollen aus.
1.
Vor Gebrauch alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur
(15-30 °C) bringen, gut mischen.
6
Arbeitsanleitung
2.
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Standards/Kontrollen, Plasma, Serum, Zellkulturüberstände, CSF:
Jeweils 20 µl Standard (STD), Kontrolle (CTRL), Probe (SAMPLE) in Mikroreaktionsgefäße pipettieren.
Dazu jeweils 200 µl Reaktionspuffer (REABUF) pipettieren.
Hirngewebe:
200 µl des Überstandes aus der Zentrifugation in Mikroreaktionsgefäße
pipettieren (SAMPLE).
3.
50 µl frisch angesetztes Derivatisierungsreagenz (DER) in alle
Reaktionsgefäße (STD, CTRL, SAMPLE) pipettieren und gründlich
mischen (z.B. durch mehrmaliges Umdrehen, oder mehrere Sekunden
vortexen). Auf einem Horizontalschüttler (180-240 rpm) 45 min bei
Raumtemperatur (15-30 °C) inkubieren.
4.
Anschließend in alle verwendeten Mikroreaktionsgefäße 500 µl
Assaypuffer (ASYBUF) zugeben, gründlich mischen (z.B. durch
mehrmaliges Umdrehen oder vortexen) und auf einem Horizontalschüttler (180-240 rpm) 5 min bei Raumtemperatur (15-30°C)
inkubieren.
2 x 25 µl der so vorbereiteten Proben (STD, CTRL, SAMPLE) werden im ELISA als
Doppelbestimmung eingesetzt.
Pipettierschema Testdurchführung
5.
Positionen für Standards/Kontrollen/Proben (STD/CTRL/SAMPLE) in
Doppelbestimmung in einem Protokollblatt markieren.
6.
Die benötigten Streifen der Mikrotiterplatte (PLATE) aus dem Kit nehmen.
Nicht verwendete Mikrotiterplattenstreifen können abgeklebt bis zum
angegebenen Haltbarkeitsdatum bei 2-8 °C gelagert werden.
Bitte beachten: Platte nicht waschen!
7.
2 x 25 µl der vorbereiteten, derivatisierten Proben (STD, CTRL,
SAMPLE) aus den Mikroreaktionsgefäßen als Doppelbestimmung in die
jeweiligen Vertiefungen pipettieren.
8.
100 µl gelösten L-Tryptophan-Antikörper (AB) in jede Vertiefung
pipettieren. Streifen luftdicht abdecken.
7
Arbeitsanleitung
9.
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Über Nacht (15-20 Stunden) bei 2-8 °C inkubieren
Inhalt der Platte verwerfen und 5 x mit je 250 µl Waschpuffer waschen.
10. Mikrotiterplatte nach dem letzten Waschgang auf saugfähigem Papier
ausschlagen.
11.
100 µl verdünntes Peroxidase-Konjugat (CONJ) in alle Vertiefungen
pipettieren.
12.
Platte abdecken und 1 Stunde bei Raumtemperatur (15-30 °C) unter
Schütteln (180-240 rpm) inkubieren.
Inhalt der Platte verwerfen und 5 x mit je 250 µl Waschpuffer waschen.
13. Mikrotiterplatte nach dem letzten Waschgang auf saugfähigem Papier
ausschlagen.
14. 100 µl TMB-Substrat (SUB) in alle Vertiefungen pipettieren.
15. 8-12 min bei Raumtemperatur (15-30 °C) im Dunkeln inkubieren*.
16.
100 µl Stopplösung (STOP) in alle Vertiefungen pipettieren, gut
mischen.
Extinktion sofort im Mikrotiterplattenphotometer bei 450 nm gegen
die Referenzwellenlänge 620 nm (oder 690 nm) messen. Ist keine
Referenzwellenlänge vorhanden, wird nur bei 450 nm gemessen. Falls
17.
die Extinktion des höchsten Standards den Messbereich des Photometers übersteigt, sollte sofort bei 405 nm gegen 620 nm (690 nm)
gemessen werden.
* Die Intensität der Farbentwicklung ist temperaturabhängig. Es wird empfohlen, den Farbumschlag
während der Inkubationszeit zu beobachten und entsprechend der Farbentwicklung die Reaktion zu
stoppen.
Im Fall einer automatisierten Abarbeitung des Tests können automatenspezifische Anpassungen der Prozedur notwendig sein, um den jeweiligen
technischen Gegebenheiten gerecht zu werden. Für Unterstützung und
Rückfragen wenden Sie sich bitte an Ihren Anbieter oder Immundiagnostik AG.
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Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
7. ERGEBNISSE
Die unten beschriebenen mathematischen Modelle können alternativ zur
Auswertung benutzt werden. Wir empfehlen die 4-Parameter-Funktion.
1. 4-Parameter-Funktion
Für die optische Dichte empfehlen wir eine lineare Ordinate und für die
Konzentration eine logarithmische Abszisse (bei einer logarithmischen
Abszisse muss für den Standard mit der Konzentration 0 ein Wert kleiner 1
eingegeben werden, z.B. 0,001).
2. Punkt-zu-Punkt-Auswertung
Für die optische Dichte und für die Konzentration empfehlen wir eine
lineare Ordinate bzw. Abszisse.
3. Gewichtete Spline-Funktion
Für die optische Dichte und für die Konzentration empfehlen wir eine
lineare Ordinate bzw. Abszisse.
Vor jeder automatischen Auswertung sollte stets eine Kontrolle der
Doppelwerte auf Plausibilität („Ausreißerkontrolle“) durchgeführt werden; falls
dies nicht durch das verwendete Programm erfolgt, sollte die Kontrolle
manuell durchgeführt werden.
CSF
Die Konzentrationen der Proben können direkt aus der Standardkurve in
µmol/l abgelesen werden. Es wird kein Faktor benötigt.
EDTA-Plasma, Serum
Für unverdünnte Proben wird kein Faktor benötigt. Im Fall einer 1:2Verdünnung werden die Ergebnisse mit dem Faktor 2 multipliziert.
Zellkulturüberstände
Die Konzentrationen der Proben können direkt aus der „Cell culture medium“Standardkurve abgelesen werden. Es wird kein Faktor benötigt.
Hirngewebe
Die ermittelte Konzentration muss mit dem Faktor 4 multipliziert werden
9
Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Die folgende Abbildung zeigt ein typisches Beispiel einer Standardkurve. Sie
darf nicht zur Auswertung der Messwerte benutzt werden.
8. EINSCHRÄNKUNGEN
Proben, deren OD niedriger ist als die des höchsten Standards, sollten mit
Reaktionspuffer (REABUF) verdünnt und erneut gemessen werden. Bitte
beachten Sie diesen Verdünnungsfaktor bei der Ergebnisberechnung.
9. QUALITÄTSKONTROLLE
Immundiagnostik empfiehlt den Einsatz von externen Kontrollen für die
interne Qualitätskontrolle, wenn möglich.
Wir empfehlen, bei jedem Testansatz Kontrollen mitzumessen. Die Ergebnisse
der Kontrollen müssen auf Richtigkeit überprüft werden. Liegen eine oder
mehrere Kontrollen außerhalb des angegebenen Bereiches, kann
Immundiagnostik die Richtigkeit der Messergebnisse nicht gewährleisten.
10
Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Referenzwerte
CSF: Yan, E.B. et al., 2015. Activation of the kynurenine pathway and increased
production of the excitotoxin quinolinic acid following traumatic brain injury in
humans. Journal of Neuroinflammation, 12(1):110.
Plasma (Maus): Murray, C. et al., 2015. Interdependent and independent roles
of type I interferons and IL-6 in innate immune, neuroinflammatory and
sickness behaviour responses to systemic poly I:C. Brain, Behavior, and
Immunity, 48:274-286.
Wir empfehlen jedem Labor, einen eigenen Referenzbereich zu etablieren.
10. TESTCHARAKTERISTIKA
Präzision und Reproduzierbarkeit
Intra-Assay (n = 23)
Probe
L-Tryptophan [µmol/l]
VK [%]
1
26,45
5,8
2
55,70
4,5
Inter-Assay (n = 9)
Probe
L-Tryptophan [µmol/l]
VK [%]
1
29,74
7,4
2
62,13
9,2
Spike-Wiederfindung
Zwei Proben wurden mit unterschiedlichen Mengen an L-Tryptophan versetzt
und gemessen. Die mittlere Wiederfindung betrug 104,6 % (n = 2).
11
Arbeitsanleitung
Spike
[µmol/l]
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
L-Tryptophan
erwartet
[µmol/l]
L-Tryptophan
gemessen
[µmol/l]
Probe 1
Wiederfindung
[%]
73,63
25
98,63
107,28
108,7
50
123,63
136,82
110,7
Probe 2
90,85
25
115,85
106,01
91,5
50
140,85
151,29
107,4
Wiederfindung in der Verdünnung
Zwei Proben wurden jeweils mit Reaktionspuffer verdünnt. Die mittlere
Wiederfindung betrug 111,4 % (n = 2).
Verdünnung
erwartet
[µmol/l]
gemessen
[µmol/l]
Probe 1
Wiederfindung
[%]
73,63
1:2
36,82
40,42
109,8
1:4
18,41
21,26
115,5
Probe 2
90,85
1:2
45,42
48,25
106,2
1:4
22,71
25,86
114,0
Analytische Sensitivität
Die Nachweisgrenze wurde festgelegt als B0 – 2 SD. Gemessen wurde 58 x der
Standard Null. Die Messungen ergaben eine Nachweisgrenze von 1,46 µmol/l.
Bei Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors liegt die Nachweisgrenze für
Hirngewebe bei 5,84 µmol/l.
Standard Null
Mittelwert
[OD]
2 Standardabweichungen
(2 x SD)
Nachweisgrenze
[µmol/l]
Nachweisgrenze
Hirngewebe
[µmol/l]
2,372
0,208
1,46
5,84
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Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Spezifität
Die Spezifität wurde nachgewiesen durch Bestimmung der Kreuzreaktivität
verwandter Substanzen. Die Kreuzreaktivität wird angegeben in Prozent,
bezogen auf die Tryptophan-Reaktivität:
5-HTP (5-Hydroxy-Tryptophan)
L-Phenylalanin
L-Tyrosin
< 0,5 %
< 0,1 %
< 0,1 %
11. VORSICHTSMASSNAHMEN
• Alle im Kit enthaltenen Reagenzien dürfen ausschließlich zu Forschungszwecken verwendet werden.
• Das für Kitkomponenten verwendete humane Material wurde auf HIV,
Hepatitis B und Hepatitis C getestet und für negativ befunden. Dennoch wird
empfohlen, die Kitkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie
potentiell infektiöses Material zu behandeln.
• Die Kitkomponenten enthalten Natriumazid oder ProClin zum Schutz vor
bakteriellen Kontaminationen. Natriumazid bzw. ProClin sind giftig. Auch
Substrate für enzymatische Farbreaktionen sind als giftig und karzinogen
beschrieben. Jeder Kontakt mit Haut oder Schleimhaut ist zu vermeiden.
• Die Stopplösung besteht aus verdünnter Schwefelsäure (H2SO4). H2SO4 ist
eine starke Säure und muss auch im verdünnten Zustand mit Vorsicht
benutzt werden. H2SO4 verursacht bei Kontakt mit der Haut Verätzungen. Es
sollte daher mit Schutzhandschuhen, Schutzkleidung und Schutzbrille
gearbeitet werden. Bei Kontakt mit der Säure muss die verätzte Stelle sofort
mit viel Wasser gespült werden.
12. TECHNISCHE MERKMALE
• Reagenzien der Testpackung dürfen nicht mit anderen Chargen gemischt
werden. Ferner dürfen Kavitäten unterschiedlicher Mikrotiterplatten, selbst
der gleichen Charge, nicht zusammengefügt und zur Analyse verwendet
werden.
• Qualitätskontrollen sollten immer mitgemessen werden.
• Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatums nicht
mehr verwendet werden.
13
Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
• Substratlösung muss vor Gebrauch farblos sein.
• Mikrotiterstreifen müssen während den Inkubationen mit Folie abgedeckt
sein.
• Vermeiden Sie Schaumbildung beim Mischen der Reagenzien.
• Stopfen und Verschlüsse verschiedener Reagenzien dürfen nicht vertauscht
werden.
• Der Assay ist immer nach der im Kit beigefügten Arbeitsanleitung
durchzuführen.
13. ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST
• Für die Qualitätskontrolle sind die für medizinische Laboratorien erstellten
Richtlinien zu beachten.
• IDK® ist eine Marke der Immundiagnostik AG.
• Die Testcharakteristika wie Inkubationszeiten, Inkubationstemperaturen und
Pipettiervolumina der verschiedenen Komponenten wurden vom Hersteller
festgelegt. Nicht mit dem Hersteller abgesprochene Veränderungen in der
Testdurchführung können die Resultate beeinflussen. Die Firma Immundiagnostik AG übernimmt für die hierdurch entstandenen Schäden und
Folgeschäden keine Haftung.
• Bei Gewährleistungsansprüchen ist das beanstandete Material mit
schriftlicher Erklärung innerhalb von 14 Tagen zum Hersteller, der
Immundiagnostik AG, zurückzusenden.
14. LITERATUR
Brandacher G, Hoeller E, Fuchs D, Weiss HG. Chronic immune activation
underlies morbid obesity: is IDO a key player. Curr Drug Metab. 2007; 8 (3): 28995.
Chuang SC, Fanidi A, Ueland PM et al: Circulating biomarkers of tryptophan and
the kynurenine pathway and lung cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.
2014 Mar;23(3):461-8
Ciorba MA: Indoleamine 2,3 dioxygenase in intestinal disease. Curr Opin
Gastroenterol. 2013 Mar;29(2):146-52
14
Arbeitsanleitung
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Creelan BC, Antonia S, Bepler G, Garrett TJ, Simon GR, Soliman HH: Indoleamine
2,3-dioxygenase activity and clinical outcome following induction
chemotherapy and concurrent chemoradiation in Stage III non-small cell lung
cancer. Oncoimmunology. 2013 Mar 1;2(3):e23428
Gupta NK, Thaker AI, Kanuri N, Riehl TE, Rowley CW, Stenson WF, Ciorba MA:
Serum analysis of tryptophan catabolism pathway: correlation with Crohn's
disease activity. Inflamm Bowel Dis. 2012 Jul;18(7):1214-20.
Murray C, Griffin ÉW, O’Loughlin E, Lyons A, Sherwin E, Ahmed S, Stevenson N J,
et al. Interdependent and independent roles of type I interferons and IL-6 in
innate immune, neuroinflammatory and sickness behaviour responses to
systemic poly I:C. Brain, Behavior, and Immunity. 2015, 48: 274-286.
Suzuki Y, Suda T, Asada K, Miwa S, Suzuki M, Fujie M, Furuhashi K, Nakamura Y,
Inui N, Shirai T, Hayakawa H, Nakamura H, Chida K: Serum Indoleamine 2,3Dioxygenase Activity Predicts Prognosis of Pulmonary Tuberculosis. Clin
Vaccine Immunol. 2012 March; 19(3): 436–442
Yan EB, Frugier T, Lim C K, Heng B, Sundaram G, Tan M, Rosenfeld J V, et al.
Activation of the kynurenine pathway and increased production of the
excitotoxin quinolinic acid following traumatic brain injury in humans. Journal
of Neuroinflammation. 2015,12(1), 110.
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Table of Contents
1.
INTENDED USE
18
2.
MATERIAL SUPPLIED
18
3.
MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
19
4.
PREPARATION AND STORAGE OF REAGENTS
19
5.
PREPARATION AND STORAGE OF SAMPLES
21
6.
ASSAY PROCEDURE
21
Principle of the test
21
Sample preparation procedure
22
Test procedure
23
7.
RESULTS
25
8.
LIMITATIONS
26
9.
QUALITY CONTROL
26
Reference Range
27
10. PERFORMANCE CHARACTERISTICS
27
Precision and reproducibility
27
Spiking recovery
27
Dilution recovery
28
Analytical sensitivity
28
Specificity
29
11. PRECAUTIONS
29
12. TECHNICAL HINTS
29
13. GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE
30
14. REFERENCES
30
17
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
1. INTENDED USE
This Immundiagnostik assay is intended for the quantitative determination of
L-tryptophan in EDTA plasma, serum and brain tissue of rodents (mouse, rat),
and in cell culture supernatant and CSF. For research use only. Not for use in
diagnostic procedures.
For human plasma, serum, and urine samples we recommend our IDK®
Tryptophan ELISA K 7730.
2. MATERIAL SUPPLIED
Catalog No
Label
Kit Components
Quantity
K 3730
PLATE
Microtiter plate, pre-coated
12 x 8 wells
K 3730
STD
Standards, ready to use
(0, 2, 8, 30, 80, 250 µM)
6 x 200 µl
K 3730
K 3730
CTRL 1
CTRL 2
Controls, ready to use
(see specification for range)
2 x 200 µl
K 3730
STD
Cell culture medium standards,
ready to use
(0, 2, 8, 30, 80, 250 µM)
6 x 200 µl
K 3730
K 3730
CTRL 1
CTRL 2
Cell culture medium controls,
ready to use
(see specification for range)
2 x 200 µl
K 3730
WASHBUF
Wash buffer concentrate, 10x
2 x 100 ml
K 3730
AB
L-tryptophan antibody, lyophilized
2 x 1 vial
K 3730
CONJ
Conjugate (peroxidase-labeled),
concentrate
1 x 65 µl
K 3730
CONJBUF
Conjugate stabilizing buffer, ready to use
1 x 13 ml
K 3730
REABUF
Reaction buffer, ready to use
1 x 45 ml
K 3730
DER
Derivatization reagent
2 x 25 mg
K 3730
DMSO
Dimethylsulfoxide (DMSO)
1 x 4 ml
K 3730
ASYBUF
Assay buffer, ready to use
1 x 28 ml
18
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
K 3730
SUB
TMB substrate (tetramethylbenzidine),
ready to use
1 x 15 ml
K 3730
STOP
Stop solution, ready to use
1 x 15 ml
For reorders of single components, use the catalogue number followed by the label as product
number.
3. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Ultra pure water*
Calibrated precision pipets and 10-1000 µl tips
Foil to cover the microtiter plate
Horizontal microtiter plate shaker
Multi-channel pipets or repeater pipets
Vortex
Centrifuge, 14000 x g
Laboratory balance
Ultrasonic homogenizer
Standard laboratory glass or plastic vials, cups, etc.
Microtiter plate reader (required filters see chapter 6)
* Immundiagnostik AG recommends the use of Ultra Pure Water (Water Type 1; ISO 3696), which is
free of undissolved and colloidal ions and organic molecules (free of particles > 0.2 μm) with an
electrical conductivity of 0.055 μS/cm at 25 °C (≥18.2 MΩ cm).
4. PREPARATION AND STORAGE OF REAGENTS
• To run the assay more than once, ensure that reagents are stored at the
conditions stated on the label. Prepare only the appropriate amount
necessary for each assay. The kit can be used up to 2 times within the
expiry date stated on the label.
• Reagents with a volume less than 100 µl should be centrifuged before use to
avoid loss of volume.
• Preparation of the wash buffer: The wash buffer concentrate
(WASHBUF) has to be diluted with ultra pure water 1:10 before use (100 ml
WASHBUF + 900 ml ultra pure water), mix well. Crystals could occur due to
19
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
high salt concentration in the stock solution. The crystals must be
redissolved at room temperature or in a water bath at 37 °C before dilution
of the buffer solutions. The WASHBUF is stable at 2-8 °C until the expiry date
stated on the label. Wash buffer (1:10 diluted WASHBUF) can be stored in a
closed flask at 2-8 °C for 1 month.
• Store Standards (STD) and controls (CTRL1, CTRL2) frozen at -20 °C, thaw
before use in the test and mix well. Re-freeze immediately after use. The
standards and controls are stable at -20 °C until the expiry date stated on the
label.
• DMSO crystallizes at 4 °C. Dissolve the crystals at room temperature or in a
water bath.
• Dissolve the content of one vial of derivatization reagent (DER) (25 mg) in
1.5 ml DMSO. Put the vial on a horizontal shaker for 5 min. DER must be
prepared immediately before use. When more than one vial is to be used,
combine the contents and mix prior to use. Discard any rest of the reagent
after use. Please note: DMSO attacks all plastics but not polypropylene
products and laboratory glass.
• Dissolve the content of one vial of L-tryptophan antibody (AB) in 3 ml of
diluted wash buffer. When more than one vial is to be used, combine the
contents and mix prior to use. Diluted L-tryptophan antibody can be stored
at -20 °C for one month.
• Dilute the peroxidase conjugate (CONJ) 1:201 with conjugate stabilizing
buffer (CONJBUF) (e.g. 60 µl CONJ + 12 ml CONJBUF, prepare only the
required amount). The undiluted POD conjugate is stable at 2-8 °C until the
expiry date stated on the label. Diluted POD conjugate can be stored at
2-8 °C for 1 week.
• All other test reagents are ready to use. Test reagents are stable until the
expiry date (see label of test package) when stored at 2-8 °C.
20
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
5. PREPARATION AND STORAGE OF SAMPLES
EDTA plasma, serum, cell culture supernatant, CSF
• EDTA-Plasma and serum of rodents (mouse, rat), cell culture supernatant and
CSF (cerebrospinal fluid) is suited for this test system. The samples are stable
for 3 days at 2-8 °C. For longer storage samples must be frozen at -20 °C
or -80 C.
• Samples with visible amounts of precipitates should be centrifuged.
• Samples are used undiluted.
If the sample volume of serum or plasma of rodents is less than 20 µl, dilute
these samples 1:2 with reaction buffer (10 µl sample + 10 µl REABUF). This
dilution factor must be considered in data evaluation.
Brain tissue
• Brain tissue of rodents (mouse, rat) can be tested in this assay. Place the
tissue sample in a microcentrifuge tube and determine the exact wet mass.
Add 40 µl of reaction buffer (REABUF) per milligram of tissue to the tube, e.g.
25 mg tissue + 1000 µl REABUF. Homogenize the sample by sonication
and centrifuge at 14,000 x g for 10 min at 4 °C. Transfer the supernatant to a
clean tube. 200 µl of the supernatant are used in the test (see sample
preparation procedure). Store samples and supernatants at -20 °C or -80 °C.
For sample preparation, a derivatization reagent (DER) for derivatization of
L-tryptophan is added to all samples (details are given in the sample
preparation procedure).
6. ASSAY PROCEDURE
Principle of the test
This assay is based on the method of competitive enzyme linked
immunoassays. The sample preparation includes the addition of a
derivatization reagent for L-tryptophan derivatization. Afterwards, the treated
samples and a polyclonal L-tryptophan antiserum are incubated in the wells of
a microtiter plate coated with L-tryptophan derivative (tracer).
During the incubation period, the target L-tryptophan in the sample competes
with the tracer immobilized on the wall of the microtiter wells for the binding
of the polyclonal antibodies. The L-tryptophan in the sample displaces the
21
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
antibodies out of the binding to the tracer. Therefore the concentration of the
tracer-bound antibody is inverse proportional to the L-tryptophan
concentration in the sample.
During the second incubation step a peroxidase-conjugated antibody is added
to each microtiter well to detect the L-tryptophan antibodies. After washing
away the unbound components tetramethylbenzidine (TMB) is added as a
peroxidase substrate. Finally, the enzymatic reaction is terminated by an acidic
stop solution. The color changes from blue to yellow and the absorbance is
measured in a photometer at 450 nm. The intensity of the yellow color is
inverse proportional to the tryptophan concentration in the sample; this
means, high L-tryptophan concentration in the sample reduces the
concentration of tracer-bound antibodies and lowers the photometric signal. A
dose response curve of absorbance unit (optical density, OD at 450 nm) vs.
concentration is generated using the values obtained from the standard.
L-tryptophan present in the patient samples is determined directly from this
curve.
Sample preparation procedure
Derivatization of standards (STD), controls (CTRL) and samples (SAMPLE) is
carried out in single analysis in vials (e.g. 1.5 ml vials).
The reagents provided with this kit are sufficient for up to 48 derivatizations,
which are transferred in duplicate determinations to the wells of the microtiter
plate.
The kit provides two standard curves with controls:
One is for plasma, serum and brain tissue of rodents and for CSF.
The second standard curve with controls (“Cell culture medium”) is intended to
measure cell culture supernatants.
Please choose the appropriate standard curve(s) and controls for your
purposes.
1.
Bring all reagents and samples to room temperature (15-30 °C) and mix
well.
22
Manual
2.
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Standards/controls, plasma, serum, cell culture supernatant, CSF:
Add 20 µl of standards (STD), controls (CTRL), samples (SAMPLE) in the
corresponding vials.
Add 200 µl of reaction buffer (REABUF) into each vial (STD, CTRL,
SAMPLE).
Brain tissue:
Add 200 µl of supernatant after centrifugation into the corresponding
vial (SAMPLE).
3.
Add 50 µl of freshly prepared derivatization reagent (DER) into each
vial (STD, CTRL, SAMPLE) and mix thoroughly by repeated inversion or
several seconds on a vortex mixer. Incubate for 45 min at room
temperature (15-30 °C) on a horizontal shaker.
4.
Afterwards add 500 µl of assay buffer (ASYBUF) into each vial, mix
thoroughly by repeated inversion or on a vortex mixer and incubate for
5 min at room temperature (15-30 °C) on a horizontal shaker.
2 x 25 µl of each treated sample (STD, CTRL, SAMPLE) are used in the ELISA as
duplicates.
Test procedure
5.
Mark the positions of standards/ controls/ samples (STD/ CTRL/
SAMPLE) in duplicate on a protocol sheet.
6.
Take as many microtiter plate strips (PLATE) as needed from kit. Store
unused strips covered at 2-8°C. Strips are stable until the expiry date
stated on the label.
Please note: Do not wash the plate!
7.
For the analysis in duplicate, take 2 x 25 µl of the derivatized
standards/ controls/ samples (STD/ CTRL/ SAMPLE) out of the vials
and add into the respective wells of the microtiter plate.
8.
Add 100 µl of L-tryptophan antibody (AB) into each well. Cover the
plate tightly.
9.
Incubate overnight (15-20 hours) at 2-8 °C.
23
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
10.
Discard the content of each well and wash 5 times with 250 µl of wash
buffer. After the final washing step, the inverted microtiter plate should
be firmly tapped on absorbent paper.
11.
Add 100 µl of diluted peroxidase conjugate (CONJ) into each well.
12.
Cover the plate tightly and incubate for 1 hour at room temperature
(15-30°C) on a horizontal shaker.
13.
Discard the content of each well and wash 5 times with 250 µl of wash
buffer. After the final washing step, the inverted microtiter plate should
be firmly tapped on absorbent paper.
14.
Add 100 µl of TMB substrate (SUB) into each well.
15.
Incubate for 8-12 min at room temperature (15-30 °C) in the dark*.
16.
Add 100 µl of stop solution (STOP) into each well, mix thoroughly.
17.
Determine absorption immediately with an ELISA reader at 450 nm
against 620 nm (or 690 nm) as a reference. If no reference wavelength is
available, read only at 450 nm. If the extinction of the highest standard
exceeds the range of the photometer, absorption must be measured
immediately at 405 nm against 620 nm (690 nm) as a reference.
* The intensity of the color change is temperature sensitive. We recommend to observe the color change
and to stop the reaction upon good differentiation.
For automated ELISA processors, the given protocol may need to be adjusted
according to the specific features of the respective automated platform. For
further details please contact your supplier or Immundiagnostik AG.
24
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
7. RESULTS
The following algorithms can be used alternatively to calculate the results. We
recommend using the "4 parameter algorithm".
1. 4-parameter algorithm
It is recommended to use a linear ordinate for optical density and a
logarithmic abscissa for concentration. When using a logarithmic abscissa,
the zero calibrator must be specified with a value less than 1 (e.g. 0.001).
2. Point-to-point calculation
We recommend a linear ordinate for optical density and a linear abscissa for
concentration.
3. Spline algorithm
We recommend a linear ordinate for optical density and a linear abscissa for
concentration.
The plausibility of the duplicate values should be examined before
automatically evaluating the results. If this option is not available within the
used program, the duplicate values should be evaluated manually.
CSF
The concentrations can be determined directly from the standard curve in
µmol/l. No factor is needed.
EDTA plasma, serum
The concentrations of undiluted samples can be determined directly from the
standard curve, no factor is needed. Results from 1:2 diluted samples must be
multiplied by 2.
Cell culture supernatant
The concentrations can be determined directly from the Cell Culture Medium
standard curve. No factor is needed.
Brain tissue
The obtained L-tryptophan levels of brain tissue samples have to be multiplied
by the factor of 4.
25
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
In the following, an example of a standard curve is given; do not use it for the
calculation of your results.
8. LIMITATIONS
Samples with an OD lower than the OD of the highest standard should be
diluted with reaction buffer (REABUF) and re-assayed. Please consider this
dilution factor when calculating the results.
9. QUALITY CONTROL
Immundiagnostik recommends the use of external controls for internal quality
control, if possible.
Control samples should be analyzed with each run. Results generated from the
analysis of control samples should be evaluated for acceptability using
appropriate statistical methods. The results for the patient samples may not be
valid if within the same assay one or more values of the quality control samples
are outside of the acceptable limits.
26
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Reference Range
CSF: Yan, E.B. et al., 2015. Activation of the kynurenine pathway and increased
production of the excitotoxin quinolinic acid following traumatic brain injury in
humans. Journal of Neuroinflammation, 12(1):110.
Plasma (mice): Murray, C. et al., 2015. Interdependent and independent roles
of type I interferons and IL-6 in innate immune, neuroinflammatory and
sickness behaviour responses to systemic poly I:C. Brain, Behavior, and
Immunity, 48:274-286.
We recommend each laboratory to establish its own reference range.
10. PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Precision and reproducibility
Intra-Assay (n = 23)
Sample
L-tryptophan [µmol/l]
CV [%]
1
26.45
5.8
2
55.70
4.5
Inter-Assay (n = 9)
Sample
L-tryptophan [µmol/l]
CV [%]
1
29.74
7.4
2
62.13
9.2
Spiking recovery
Two samples were spiked with different L-tryptophan concentrations and
measured in this assay. The mean recovery rate was 104.6 % (n = 2).
27
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Spike
[µmol/l]
L-tryptophan
expected
[µmol/l]
L-tryptophan
measured
[µmol/l]
sample 1
Recovery
[%]
73.63
25
98.63
107.28
108.7
50
123.63
136.82
110.7
sample 2
90.85
25
115.85
106.01
91.5
50
140.85
151.29
107.4
Dilution recovery
Two samples were diluted with reaction buffer and measured in this assay. The
mean recovery rate was 111.4 % (n = 2).
Dilution
L-tryptophan
expected
[µmol/l]
L-tryptophan
measured
[µmol/l]
sample 1
Recovery
[%]
73.63
1:2
36.82
40.42
109.8
1:4
18.41
21.26
115.5
sample 2
90.85
1:2
45.42
48.25
106.2
1:4
22.71
25.86
114.0
Analytical sensitivity
The zero-standard was measured 58 times. The detection limit was set as
B0 - 2 SD and estimated to be 1.46 µmol/l. Considering the dilution factor, the
detection limit for brain tissue samples is calculated to be 5.48 µmol/l.
Zero standard
mean value
[OD]
2 x standard
deviation
(SD)
detection limit
[µmol/l]
detection limit
brain tissue
[µmol/l]
2.372
0.208
1.46
5.84
28
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Specificity
Specificity was tested by measuring the cross-reactivity against compounds
with structural similarity to tryptophan. The specificity is calculated in percent
in relation to the tryptophan binding activity.
5-HTP (5-Hydroxy-Tryptophan)
L-Phenylalanine
L-Tyrosine
< 0.5 %
< 0.1 %
< 0.1 %
11. PRECAUTIONS
• All reagents in the kit package are for research use only.
• Human materials used in kit components were tested and found to be
negative for HIV, Hepatitis B and Hepatitis C. However, for safety reasons all
kit components should be treated as potentially infectious.
• Kit reagents contain sodium azide or ProClin as bactericides. Sodium azide
and ProClin are toxic. Substrates for the enzymatic color reactions are toxic
and carcinogenic. Avoid contact with skin or mucous membranes
• The stop solution consists of sulfuric acid, which is a strong acid. Although
diluted, it still must be handled with care. It can cause acid burns and should
be handled with gloves, eye protection, and appropriate protective clothing.
Any spills should be wiped up immediately with copious quantities of water.
Do not breathe vapour and avoid inhalation.
12. TECHNICAL HINTS
• Do not interchange different lot numbers of any kit component within the
same assay. Furthermore, we recommend not assembling wells of different
microtiter plates for analysis, even if they are of the same batch.
• Control Samples should be analyzed with each run.
• Reagents should not be used beyond the expiration date stated on kit label.
• Substrate solution should remain colourless until use.
• To ensure accurate results proper adhesion of plate sealers during
incubation steps is necessary.
• Avoid foaming when mixing reagents.
29
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
• Do not mix plugs and caps from different reagents.
• The assay should always be performed according to the enclosed manual.
13. GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE
• The guidelines for medical laboratories should be followed.
• IDK® is a trademark of Immundiagnostik AG.
• Incubation time, incubation temperature, and pipetting volumes of the
different components are defined by the producer. Any variation of the test
procedure, which is not coordinated with the producer, may influence the
results of the test. Immundiagnostik AG can therefore not be held
responsible for any damage resulting from incorrect use.
• Warranty claims and complaints regarding deficiencies must be logged
within 14 days after receipt of the product. The product should be sent to
Immundiagnostik AG along with a written complaint.
14. REFERENCES
Brandacher G, Hoeller E, Fuchs D, Weiss HG. Chronic immune activation underlies
morbid obesity: is IDO a key player. Curr Drug Metab. 2007; 8 (3): 289-95.
Chuang SC, Fanidi A, Ueland PM et al: Circulating biomarkers of tryptophan and
the kynurenine pathway and lung cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.
2014 Mar;23(3):461-8
Ciorba MA: Indoleamine 2,3 dioxygenase in intestinal disease. Curr Opin
Gastroenterol. 2013 Mar;29(2):146-52
Creelan BC, Antonia S, Bepler G, Garrett TJ, Simon GR, Soliman HH: Indoleamine
2,3-dioxygenase activity and clinical outcome following induction
chemotherapy and concurrent chemoradiation in Stage III non-small cell lung
cancer. Oncoimmunology. 2013 Mar 1;2(3):e23428
Gupta NK, Thaker AI, Kanuri N, Riehl TE, Rowley CW, Stenson WF, Ciorba MA:
Serum analysis of tryptophan catabolism pathway: correlation with Crohn's
disease activity. Inflamm Bowel Dis. 2012 Jul;18(7):1214-20.
30
Manual
IDK® Tryptophan high sensitive ELISA
Murray C, Griffin ÉW, O’Loughlin E, Lyons A, Sherwin E, Ahmed S, Stevenson N J,
et al. Interdependent and independent roles of type I interferons and IL-6 in
innate immune, neuroinflammatory and sickness behaviour responses to
systemic poly I:C. Brain, Behavior, and Immunity. 2015, 48: 274-286.
Suzuki Y, Suda T, Asada K, Miwa S, Suzuki M, Fujie M, Furuhashi K, Nakamura Y,
Inui N, Shirai T, Hayakawa H, Nakamura H, Chida K: Serum Indoleamine 2,3Dioxygenase Activity Predicts Prognosis of Pulmonary Tuberculosis. Clin Vaccine
Immunol. 2012 March; 19(3): 436–442
Yan EB, Frugier T, Lim CK, Heng B, Sundaram G, Tan M, Rosenfeld JV, et al.
Activation of the kynurenine pathway and increased production of the
excitotoxin quinolinic acid following traumatic brain injury in humans. Journal of
Neuroinflammation. 2015,12(1), 110.
31
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