VGKC-Autoantikörper Assay RIA

VGKC-Autoantikörper Assay RIA
Arbeitsanleitung
VGKC-Autoantikörper Assay RIA
125I-Radiorezeptorassay
für die quantitative Bestimmung von Antikörpern
gegen den spannungsabhängigen Kalium Kanal
(VGKC) in Serum
IVD
REF
RA115/25
25
2 – 8 °C
DLD Gesellschaft für Diagnostika und medizinische Geräte mbH
Adlerhorst 15  22459 Hamburg  Telefon: 040/ 555 87 10  Fax: 040/ 555 87 111
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April 2013
Inhaltsverzeichnis
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Klinische Bedeutung und Testprinzip
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
Lagerung und Stabilität der Reagenzien
Inhalt des Testbestecks
Probengewinnung und Aufbewahrung
Vorbereitung der Proben und Reagenzien
Testdurchführung
Testauswertung
Referenzbereich
Testcharakteristik
Literatur
Pipettierschema
Seite 3
Seite 4
Seite 5
Seite 5
Seite 6
Seite 6
Seite 7
Seite 8
Seite 10
Seite 10
Seite 11
Seite 12
Seite 2
1.
Klinische Bedeutung und Testprinzip
Die Neuromyotonie ist ein neurologisches Syndrom, das durch eine
erhöhte Erregbarkeit der Skelettmuskulatur gekennzeichnet ist und als
Autoimmunerkrankung
oder
paraneoplastisches
Syndrom
bei
kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Lymphomen und Thymomen
beschrieben wurde. Ursache ist eine gestörte Funktion der
neuromuskulären Synapse (motorische Endplatte), die in der
überwiegenden Mehrzahl der Fälle durch die Bildung von
Autoantikörpern gegen spannungsaktivierte Kaliumkanäle verursacht
wird (Isaac-Mertens-Syndrom). Wenn die Neuromyotonie in Verbindung
mit Symptomen einer limbischen Enzephalitis auftritt, wird die
Bezeichnung Morvan-Syndrom verwendet.
Die Neuromyotonie tritt sporadisch und in jedem Alter auf, sie gilt als
sehr selten. Es dominieren klinisch unwillkürliche tonische
Muskelverkrampfungen,
Faszikulationen
und
als
besonders
charakteristisches
Merkmal
dauerhafte,
wellenartige
Muskelanspannungen, die bei schlanken Personen sichtbar sind
(Myokymien). Oft kann die Muskulatur nicht richtig entspannt werden
und erscheint steif (Pseudomyotonie). Bisweilen ist außerdem
übermäßiges
Schwitzen
(Hyperhidrosis)
zu
beobachten.
Elektromyographisch können Muskelaktionspotentiale bei Entspannung
nachgewiesen werden. Bei etwa 40 % der Patienten lassen sich
Antikörper gegen spannungsaktivierte Kaliumkanäle im Serum
nachweisen, viele Betroffene haben auch andere Autoantikörper, zum
Beispiel gegen Acetylcholinrezeptoren wie bei der Myasthenia gravis.
Der vorliegenden Radioimmunoassay ist für den quantitativen Nachweis
von Autoantikörpern gegen den spannungsabhängigen Kalium-Kanal (in
der Literatur abgekürzt als VGKC; Voltage Gated K+- Channel)
bestimmt.
Das Messprinzip des VGKC-Autoantiköper Assays ist ähnlich dem des
ACHRAB®-Assays zur Bestimmung von Antikörpern gegen den
Acetylcholin-Rezeptor.
Für den Test werden aus Kaninchen-Hirngewebe isolierte und mit
125I-alpha-Dendrotoxin, das mit den VGKC Subtypen Kv 1.1, Kv 1.2 und
Kv 1.6 reagiert, radioaktiv markierte VGKCs verwendet. Das so
markierte Protein wird mit Patientenserum inkubiert. Dabei binden die
vorhandenen Antikörper an das Protein. Im zweiten Schritt werden die
Immunkomplexe mit Hilfe eines anti-human IgG ausgefällt. Die Radioaktivität im Niederschlag ist direkt proportional zur Menge an Antikörpern
im Patientenserum.
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Die Konzentrationen der Proben werden mit Hilfe der bekannten spezifischen Aktivität des alpha-Dendrotoxins unter Berücksichtigung der
unspezifischen Bindung der individuellen Patientenprobe berechnet und
in pmol/l angegeben.
2.
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen

Dieser
Kit
ist
lediglich
zum
in
vitro-Gebrauch
für
Forschungszwecke bestimmt.
Die angegebenen Verfallsdaten sind unbedingt zu beachten.
Einige der Reagenzien enthalten als Konservierungsmittel
Natriumazid. Verschlucken und Berühren mit der Haut vermeiden.
Für den Umgang mit radioaktiven Stoffen gelten die Vorschriften
der Strahlenschutzverordnung.
Folgende Vorsichtsmaßnahmen sind unbedingt einzuhalten:
Beim Umgang mit radioaktiven Stoffen nicht essen, trinken und
rauchen. Radioaktives Material niemals mit dem Mund pipettieren.
Einmalhandschuhe
verwenden.
Verschüttetes
radioaktives
Material sofort aufwischen, kontaminierte Flächen oder
Gegenstände mit geeigneten Detergenzien reinigen.
Fester und flüssiger Abfall sind gemäß StrSchV zu behandeln.
Radioaktive Reagenzien dürfen nur an Personen abgegeben
werden, die im Besitz einer gültigen Umgangsgenehmigung sind.







Alle Reagenzien dieses Testbestecks, die humanen Ursprungs
sind, ergaben bei der Prüfung auf HBsAg, HCV bzw. HIV I/II-Antikörper ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein
solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell
infektiöses Material behandelt werden. Alle Reagenzien dieses
Testbestecks, die tierischen Ursprungs sind, stammen von
gesunden Tieren, die von einer zertifizierten Stelle untersucht
wurden. Die Reagenzien sollten trotzdem wie potentiell infektiöses
Material behandelt werden.
Seite 4
3.
Lagerung und Stabilität der Reagenzien
Der Kit ist bei Lagerung zwischen 2-8 °C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. Nach Anbruch ist der Kit bis zum Verfallsdatum haltbar.
Zur Haltbarkeit der gebrauchsfertigen Reagenzien siehe Vorbereitung
der Reagenzien. Direkte Sonneneinstrahlung ist zu vermeiden.
Das Verfallsdatum sowie die Chargenbezeichnung sind auf jedem
Fläschchen bzw. Kit angegeben. Bei größeren Ansätzen möglichst nur
Reagenzien einer Charge verwenden.
4.
Inhalt des Testbestecks
4.1
125I-Tracer
TRACER
2 Fläschchen
2 x 0,75 ml, Lyophilisat,
Aktivität < 15 kBq pro Fläschchen
Lyophilisat in je 0,75 ml Aqua dest. auflösen und sofort einsetzen!
4.2
Negative Kontrolle
CONTROL ▬
250 µl, gebrauchsfertig,
enthält normales Humanserum
1 Fläschchen
4.3
Positive Kontrolle
CONTROL  I & II
2 x 250 µl, gebrauchsfertig
enthält Humanserum mit Antikörpern gegen VGKC,
Konzentrationsbereich siehe QC-Zertifikat
2 Fläschchen
4.4
Anti-human-IgG
2 ml, gebrauchsfertig
ANTI-HUMAN-IGG
1 Fläschchen
4.5
Assaypuffer
60 ml, gebrauchsfertig
ASSAY BUFFER
Seite 5
1 Flasche
Weiter werden benötigt (nicht im Kit enthalten):

Pipetten 50 µl, 75 µl und 1 ml Pipetten
Multipette mit Aufsätzen für verschiedene Volumina
4,5 ml Polystyrol-Spitzboden-Röhrchen
Zentrifuge mit Kühlung mit 3.000 x g
Dest. Wasser
Absaugvorrichtung oder Dekantiervorrichtung
Vortex-Mischer
Gamma-Counter
5.
Probengewinnung und Aufbewahrung







Für den Test kann Serum eingesetzt werden. Plasmaproben können
nicht eingesetzt werden. Hämolytische bzw. lipämische Proben sollten
nicht verwendet werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der
Proben vermeiden. Proben, die eine Trübung zeigen, sollten vor dem
Test zentrifugiert werden.
Die Proben können bis zu zwei Wochen bei 2 - 8 °C im Kühlschrank
oder eingefroren bei -20 °C für einen längeren Zeitraum gelagert
werden.
6.
Vorbereitung der Proben und Reagenzien
6.1
Patientenproben
Vor dem Test Serumproben auf Raumtemperatur bringen und gut
durchmischen. Proben 1:10 mit Assaypuffer verdünnen, z. B. 15 µl
Serum mit 135 µl Assaypuffer. Es empfiehlt sich, die verdünnten Proben
kurz zu zentrifugieren, um eventuelle Schwebteilchen zu entfernen.
6.2
Auflösen des Tracers
Kurz vor Gebrauch den lyophilisierte Tracer mit je 0,75 ml destilliertem
Wasser auflösen. Den Tracer nach Auflösen sofort einsetzen.
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7.
Testdurchführung
7.1
Je 50 l der positiven Kontrollen, der Negativ-Kontrolle und der
1:10 in Assaypuffer verdünnten Proben pro Röhrchen pipettieren.
7.2
In alle Röhrchen je 50 l frisch aufgelösten Tracer pipettieren.
7.3
Röhrchen auf einem Vortex sorgfältig mischen, abdecken und 16
bis 20 Stunden bei 2-8 °C inkubieren.
Während dieser Inkubation 2 Röhrchen 1 min im Gamma-Counter
messen, um die Totalaktivität des Tracers zu bestimmen.
7.4
Je 50 l anti-human IgG in alle Röhrchen pipettieren.
Sorgfältig mischen, abdecken und 1 ½ Stunde bei Raumtemperatur (18 bis 25 °C) inkubieren.
7.5
Je 1 ml kalten Assaypuffer (2-8 °C) in alle Röhrchen pipettieren
und sorgfältig mischen.
7.6
20 Minuten bei 3.000 x g unter Kühlung zentrifugieren.
7.7
Überstand aus
dekantieren.
7.8
Zu jedem Röhrchen 1 ml kalten Assaypuffer (2-8 °C) geben.
Anschließend den Niederschlag mit Hilfe eines Vortex-Mischers
sorgfältig aufschütteln.
7.9
Die Röhrchen anschließend wiederum 20 Minuten bei 3.000 x g
unter Kühlung zentrifugieren.
7.10 Überstand aus
dekantieren.
den
den
Röhrchen
Röhrchen
vorsichtig
vorsichtig
7.11 Röhrchen 1 Minute im Gamma-Counter messen.
Seite 7
absaugen
absaugen
oder
oder
8.
Testauswertung
Die
Berechnung
der
Antikörperkonzentration
Berücksichtigung folgender Variablen:






erfolgt
unter
Differenz aus den cpm der Probe und der Negativkontrolle
Faktor D für den Zerfall von 125I nach Markierungsdatum
Pipettiervolumen der unverdünnten Probe, normalerweise = 5 µl
Spezifische Aktivität des Toxins in Ci/mmol
Zählausbeute des Counters Z in %
Umrechnungsfaktor zwischen counts pro Minute und Curie
Die Berechnung der Antikörper-Konzentration erfolgt dann nach
folgender Formel:
(cpm Probe - cpm Negativkontrolle ) x D

Pipettiervolumen (l) x spez. Aktivität x Z x U
Die normalerweise verwendeten Werte für Pipettiervolumen (5 µl), die
chargenspezifische Aktivität des Toxins (in Ci/mmol, Angabe auf dem
Zertifikat) und Zählausbeute des Counters (70%, d.h. 0,7) können für
jede Charge als Konstante K zusammengefasst werden.
Damit vereinfacht sich die obige Formel auf:
VGKC-Antikörper-Konz. = (cpm Probe - cpm Negativkontrolle) x D x K
K wird dabei so berechnet, daß die Ergebnisse in pmol/Liter erhalten
werden.
K ist chargenspezifisch und auf dem im Kit beigelegten Zertifikat
angegeben.
Seite 8
D ist die Radioaktivität zum Zeitpunkt der Markierung geteilt durch die
Radioaktivität zum Zeitpunkt der Testdurchführung und wird für jede
Woche von der nachfolgenden Tabelle abgelesen. Der Tag der
Markierung ist auf dem Zertifikat angegeben.
Woche der
Testdurchführung
nach Markierung
1. - 2.
2. - 3.
3. - 4.
4. - 5.
5. - 6.
6. - 7.
7. - 8.
8.-9.
9.-10.
10.-11.
Faktor D
1.12
1.22
1.32
1.43
1.55
1.68
1.82
1.98
2.14
2.32
War der Tag der Markierung z. B. der 01. November, so bedeutet "1. - 2.
Woche nach Markierung" der Zeitraum vom 08. bis 15. November mit
einem Faktor D von 1,12.
K gilt für eine Zählerausbeute des Gamma-Counters von 70 %; bei
anderen Zählausbeuten (in der Bedienungsanleitung des Gerätes
angegeben) muß K entsprechend angepaßt werden.
Liegt die Zählausbeute z.B. bei 74%, d.h. 0,74, so muß K um den Faktor
0,7:0,74 = 0,95 korrigiert werden.
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Berechnungsbeispiel:
Die Konstante K sei 0,044 und D sei 1,22 (2. - 3. Woche nach
Markierung), so daß sich die Rechenkonstante 0,0537 ergibt.
Probe
9.
Mittelwert
cpmProbe –
cpm
cpmNegativkontr.
VGKC-Ak in
pmol/Liter
Negative Kontrolle
1.673
0
0
Positivkontrolle 1
8.875
7.202
387
Positivkontrolle 2
3.995
2.322
125
Referenzbereich
Messungen mit Proben gesunder Blutspender ergaben einen vorläufigen
Referenzbereich bis 85 pmol/l. Werte über 85 pmol/l können demnach
als positiv eingestuft werden.
10.
Testcharakteristika
Klinische Spezifität
Proben von 100 gesunden Blutspendern wurden im VGKC Ak RIA
gemessen. 98 Proben waren negativ (98%).
Klinische Sensitivität
Proben von 30 Patienten mit Verdacht auf Erkrankungen unter
Beteiligung der spannungsaktivierten Kaliumkanäle und verwandten
neurogischen Erkrankungen wurden im VGKC Ak RIA untersucht. 27
Proben wurden positiv gefunden (90%).
Spezifität
Es konnten keine Interferenzen durch Autoantikörper gegen den
Acetylcholinrezeptor, die 21-Hydroxylase, Aquaporin-4, GAD, TSHRezeptor, TPO, Tg, gemessen werden. 1 von 17 Patienten mit Typ 1
Diabetes (IA2 Ak positiv) und 2 von 29 Patienten mit rheumatoider
Arthritis wurden im VGKC Ak RIA positiv gefunden.
Seite 10
Interferenzen
Es konnten keine Interferenzen durch Zugabe von Hämoglobin bis 500
mg/dl, Bilirubin bis 20 mg/dl oder Intralipid bis 3000 mg/dl gemessen
werden
Sensitivität
Die untere Nachweisgrenze wurde durch eine 20fache Messung der
negativen Kontrolle, Bestimmung des Mittelwertes und der
Standardabweichung bestimmt. Die untere Nachweisgrenze als 2fache
Standardabweichung lag bei 4,5 pmol/l
Reproduzierbarkeit
Intra-Assay
Probe
Anzahl n
1
2
3
20
20
20
Probe
Anzahl n
1
2
3
12
12
12
Mittelwert
pmol/l
102
150
332
VK (%)
5,7
5,8
3,7
Inter-Assay
11.
Mittelwert
pmol/l
89
138
320
VK (%)
6,6
6,4
5,4
Literatur
Hart et al.
“Autoantibodies detected to expressed
Neuromyotonia.”
Ann Neurol 41 (1997), 238 - 246
K+
channels
are
Vincent et al.
“Potassium
channel
antibody-associated
encephalopathy:
immunotherapy-responsive form of limbic encephalitis.”
Brain 127 (2004), 701 - 712
Tan et al.
“Clinical spectrum of voltage-gated potassium channel autoimmunity.”
Neurology 70 (2008), 1883 - 1890
Seite 11
implicated
a
in
potentially
Pipettierschema
T
Negativ
Positiv Patienten
Kontrolle Kontrollen
Negativ Kontrolle
µl
Pos. Kontrolle I & II µl
Verd. Patientenproben µl
125I - VGKC
µl
50
50
50
50
50
50
50
Röhrchen sorgfältig mischen (Vortex) und16 - 20 Stunden bei 2 - 8 C
inkubieren
Anti-human-IgG
µl
50
50
50
Röhrchen sorgfältig mischen (Vortex) und 90 Minuten bei Raumtemperatur
inkubieren
Assaypuffer (2-8 °C) ml
1
1
1
20 Minuten bei 3.000 x g unter Kühlung zentrifugieren
Überstand vorsichtig absaugen oder dekantieren (außer T)
Assaypuffer (2-8 °C) ml
1
1
1
Niederschlag aufschütteln (Vortex)
20 Minuten bei 3.000 x g unter Kühlung zentrifugieren
Überstand vorsichtig absaugen oder dekantieren (außer T)
Röhrchen 1 Minute im Gamma-Counter messen
Seite 12
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