Arbeitsanleitung

VGKC-Autoantikörper Assay RIA

125 I-Radiorezeptorassay für die quantitative Bestimmung von Antikörpern gegen den spannungsabhängigen Kalium Kanal

(VGKC) in Serum

I V D

REF RA115/25

25

2

– 8 °C

DLD Gesellschaft für Diagnostika und medizinische Geräte mbH

Adlerhorst 15



22459 Hamburg

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Telefon: 040/ 555 87 10

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Fax: 040/ 555 87 111

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April 2013

Inhaltsverzeichnis

1. Klinische Bedeutung und Testprinzip

2. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen

3. Lagerung und Stabilität der Reagenzien

4. Inhalt des Testbestecks

5. Probengewinnung und Aufbewahrung

6. Vorbereitung der Proben und Reagenzien

7. Testdurchführung

8. Testauswertung

9. Referenzbereich

10. Testcharakteristik

11. Literatur

Pipettierschema

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1. Klinische Bedeutung und Testprinzip

Die Neuromyotonie ist ein neurologisches Syndrom, das durch eine erhöhte Erregbarkeit der Skelettmuskulatur gekennzeichnet ist und als

Autoimmunerkrankung oder paraneoplastisches Syndrom bei kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Lymphomen und Thymomen beschrieben wurde. Ursache ist eine gestörte Funktion der neuromuskulären Synapse (motorische Endplatte), die in der

überwiegenden Mehrzahl der Fälle durch die Bildung von

Autoantikörpern gegen spannungsaktivierte Kaliumkanäle verursacht wird (Isaac-Mertens-Syndrom). Wenn die Neuromyotonie in Verbindung mit Symptomen einer limbischen Enzephalitis auftritt, wird die

Bezeichnung Morvan-Syndrom verwendet.

Die Neuromyotonie tritt sporadisch und in jedem Alter auf, sie gilt als sehr selten. Es dominieren klinisch unwillkürliche tonische

Muskelverkrampfungen, Faszikulationen und als besonders charakteristisches Merkmal dauerhafte, wellenartige

Muskelanspannungen, die bei schlanken Personen sichtbar sind

(Myokymien). Oft kann die Muskulatur nicht richtig entspannt werden und erscheint steif (Pseudomyotonie). Bisweilen ist außerdem

übermäßiges Schwitzen (Hyperhidrosis) zu beobachten.

Elektromyographisch können Muskelaktionspotentiale bei Entspannung nachgewiesen werden. Bei etwa 40 % der Patienten lassen sich

Antikörper gegen spannungsaktivierte Kaliumkanäle im Serum nachweisen, viele Betroffene haben auch andere Autoantikörper, zum

Beispiel gegen Acetylcholinrezeptoren wie bei der Myasthenia gravis.

Der vorliegenden Radioimmunoassay ist für den quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen den spannungsabhängigen Kalium-Kanal (in der Literatur abgekürzt als VGKC; Voltage Gated K+- Channel) bestimmt.

Das Messprinzip des VGKC-Autoantiköper Assays ist ähnlich dem des

ACHRAB®-Assays zur Bestimmung von Antikörpern gegen den

Acetylcholin-Rezeptor.

Für den Test werden aus Kaninchen-Hirngewebe isolierte und mit

125 I-alpha-Dendrotoxin, das mit den VGKC Subtypen Kv 1.1, Kv 1.2 und

Kv 1.6 reagiert, radioaktiv markierte VGKCs verwendet. Das so markierte Protein wird mit Patientenserum inkubiert. Dabei binden die vorhandenen Antikörper an das Protein. Im zweiten Schritt werden die

Immunkomplexe mit Hilfe eines anti-human IgG ausgefällt. Die Radioaktivität im Niederschlag ist direkt proportional zur Menge an Antikörpern im Patientenserum.

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Die Konzentrationen der Proben werden mit Hilfe der bekannten spezifischen Aktivität des alpha-Dendrotoxins unter Berücksichtigung der unspezifischen Bindung der individuellen Patientenprobe berechnet und in pmol/l angegeben.

2. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen

 Dieser Kit ist lediglich zum in vitro-Gebrauch für

Forschungszwecke bestimmt.

 Die angegebenen Verfallsdaten sind unbedingt zu beachten.

 Einige der Reagenzien enthalten als Konservierungsmittel

Natriumazid. Verschlucken und Berühren mit der Haut vermeiden.

 Für den Umgang mit radioaktiven Stoffen gelten die Vorschriften der Strahlenschutzverordnung.

 Folgende Vorsichtsmaßnahmen sind unbedingt einzuhalten:

Beim Umgang mit radioaktiven Stoffen nicht essen, trinken und rauchen. Radioaktives Material niemals mit dem Mund pipettieren.

Einmalhandschuhe verwenden. Verschüttetes radioaktives

Material sofort aufwischen, kontaminierte Flächen oder

Gegenstände mit geeigneten Detergenzien reinigen.

 Fester und flüssiger Abfall sind gemäß StrSchV zu behandeln.

 Radioaktive Reagenzien dürfen nur an Personen abgegeben werden, die im Besitz einer gültigen Umgangsgenehmigung sind.

 Alle Reagenzien dieses Testbestecks, die humanen Ursprungs sind, ergaben bei der Prüfung auf HBsAg, HCV bzw. HIV I/II-Antikörper ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. Alle Reagenzien dieses

Testbestecks, die tierischen Ursprungs sind, stammen von gesunden Tieren, die von einer zertifizierten Stelle untersucht wurden. Die Reagenzien sollten trotzdem wie potentiell infektiöses

Material behandelt werden.

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3. Lagerung und Stabilität der Reagenzien

Der Kit ist bei Lagerung zwischen 2-8 °C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. Nach Anbruch ist der Kit bis zum Verfallsdatum haltbar.

Zur Haltbarkeit der gebrauchsfertigen Reagenzien siehe Vorbereitung der Reagenzien. Direkte Sonneneinstrahlung ist zu vermeiden.

Das Verfallsdatum sowie die Chargenbezeichnung sind auf jedem

Fläschchen bzw. Kit angegeben. Bei größeren Ansätzen möglichst nur

Reagenzien einer Charge verwenden.

4. Inhalt des Testbestecks

4.1 125 I-Tracer TRACER 2 Fläschchen

2 x 0,75 ml, Lyophilisat,

Aktivität < 15 kBq pro Fläschchen

Lyophilisat in je 0,75 ml Aqua dest. auflösen und sofort einsetzen!

4.2 Negative Kontrolle

250 µl, gebrauchsfertig,

CONTROL enthält normales Humanserum

▬ 1 Fläschchen

4.3 Positive Kontrolle CONTROL  I & II

2 x 250 µl, gebrauchsfertig enthält Humanserum mit Antikörpern gegen VGKC,

Konzentrationsbereich siehe QC-Zertifikat

2 Fläschchen

ANTI-HUMAN-IGG 1 Fläschchen 4.4 Anti-human-IgG

2 ml, gebrauchsfertig

4.5 Assaypuffer

60 ml, gebrauchsfertig

ASSAY BUFFER 1 Flasche

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Weiter werden benötigt (nicht im Kit enthalten):

 Pipetten 50 µl, 75 µl und 1 ml Pipetten

 Multipette mit Aufsätzen für verschiedene Volumina

 4,5 ml Polystyrol-Spitzboden-Röhrchen

 Zentrifuge mit Kühlung mit 3.000 x g

 Dest. Wasser

 Absaugvorrichtung oder Dekantiervorrichtung

 Vortex-Mischer

 Gamma-Counter

5. Probengewinnung und Aufbewahrung

Für den Test kann Serum eingesetzt werden. Plasmaproben können

nicht eingesetzt werden. Hämolytische bzw. lipämische Proben sollten nicht verwendet werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der

Proben vermeiden. Proben, die eine Trübung zeigen, sollten vor dem

Test zentrifugiert werden.

Die Proben können bis zu zwei Wochen bei 2 - 8 °C im Kühlschrank oder eingefroren bei -20 °C für einen längeren Zeitraum gelagert werden.

6. Vorbereitung der Proben und Reagenzien

6.1 Patientenproben

Vor dem Test Serumproben auf Raumtemperatur bringen und gut durchmischen. Proben 1:10 mit Assaypuffer verdünnen, z. B. 15 µl

Serum mit 135 µl Assaypuffer. Es empfiehlt sich, die verdünnten Proben kurz zu zentrifugieren, um eventuelle Schwebteilchen zu entfernen.

6.2 Auflösen des Tracers

Kurz vor Gebrauch den lyophilisierte Tracer mit je 0,75 ml destilliertem

Wasser auflösen. Den Tracer nach Auflösen sofort einsetzen.

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7. Testdurchführung

7.1 Je 50

 l der positiven Kontrollen, der Negativ-Kontrolle und der

1:10 in Assaypuffer verdünnten Proben pro Röhrchen pipettieren.

7.2 In alle Röhrchen je 50

 l frisch aufgelösten Tracer pipettieren.

7.3 Röhrchen auf einem Vortex sorgfältig mischen, abdecken und 16 bis 20 Stunden bei 2-8 °C inkubieren.

Während dieser Inkubation 2 Röhrchen 1 min im Gamma-Counter messen, um die Totalaktivität des Tracers zu bestimmen.

7.4 Je 50

 l anti-human IgG in alle Röhrchen pipettieren.

Sorgfältig mischen, abdecken und 1 ½ Stunde bei Raumtemperatur (18 bis 25 °C) inkubieren.

7.5 Je 1 ml kalten Assaypuffer (2-8 °C) in alle Röhrchen pipettieren und sorgfältig mischen.

7.6 20 Minuten bei 3.000 x g unter Kühlung zentrifugieren.

7.7 Überstand aus den Röhrchen vorsichtig absaugen oder dekantieren.

7.8 Zu jedem Röhrchen 1 ml kalten Assaypuffer (2-8 °C) geben.

Anschließend den Niederschlag mit Hilfe eines Vortex-Mischers sorgfältig aufschütteln.

7.9 Die Röhrchen anschließend wiederum 20 Minuten bei 3.000 x g unter Kühlung zentrifugieren.

7.10 Überstand aus den Röhrchen vorsichtig absaugen oder dekantieren.

7.11 Röhrchen 1 Minute im Gamma-Counter messen.

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8. Testauswertung

Die Berechnung der Antikörperkonzentration erfolgt unter

Berücksichtigung folgender Variablen:



Differenz aus den cpm der Probe und der Negativkontrolle



Faktor D für den Zerfall von 125 I nach Markierungsdatum



Pipettiervolumen der unverdünnten Probe, normalerweise = 5 µl



Spezifische Aktivität des Toxins in Ci/mmol



Zählausbeute des Counters Z in %



Umrechnungsfaktor zwischen counts pro Minute und Curie

Die Berechnung der Antikörper-Konzentration erfolgt dann nach folgender Formel:

(cpm

Probe

- cpm

Negativkontrolle

) x D



Pipettiervolumen (

 l) x spez. Aktivität x Z x U

Die normalerweise verwendeten Werte für Pipettiervolumen (5 µl), die chargenspezifische Aktivität des Toxins (in Ci/mmol, Angabe auf dem

Zertifikat) und Zählausbeute des Counters (70%, d.h. 0,7) können für jede Charge als Konstante K zusammengefasst werden.

Damit vereinfacht sich die obige Formel auf:

VGKC-Antikörper-Konz. = (cpm

Probe

- cpm

Negativkontrolle

) x D x K

K wird dabei so berechnet, daß die Ergebnisse in pmol/Liter erhalten werden.

K ist chargenspezifisch und auf dem im Kit beigelegten Zertifikat angegeben.

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D ist die Radioaktivität zum Zeitpunkt der Markierung geteilt durch die

Radioaktivität zum Zeitpunkt der Testdurchführung und wird für jede

Woche von der nachfolgenden Tabelle abgelesen. Der Tag der

Markierung ist auf dem Zertifikat angegeben.

Woche der

Testdurchführung nach Markierung

Faktor D

1. - 2.

2. - 3.

3. - 4.

4. - 5.

5. - 6.

6. - 7.

7. - 8.

8.-9.

9.-10.

1.12

1.22

1.32

1.43

1.55

1.68

1.82

1.98

2.14

10.-11. 2.32

War der Tag der Markierung z. B. der 01. November, so bedeutet "1. - 2.

Woche nach Markierung" der Zeitraum vom 08. bis 15. November mit einem Faktor D von 1,12.

K gilt für eine Zählerausbeute des Gamma-Counters von 70 %; bei anderen Zählausbeuten (in der Bedienungsanleitung des Gerätes angegeben) muß K entsprechend angepaßt werden.

Liegt die Zählausbeute z.B. bei 74%, d.h. 0,74, so muß K um den Faktor

0,7:0,74 = 0,95 korrigiert werden.

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Berechnungsbeispiel:

Die Konstante K sei 0,044 und D sei 1,22 (2. - 3. Woche nach

Markierung), so daß sich die Rechenkonstante 0,0537 ergibt.

Probe Mittelwert cpm cpm

Probe

– cpm

Negativkontr.

VGKC-Ak in pmol/Liter

Negative Kontrolle 1.673 0 0

Positivkontrolle 1 8.875 7.202 387

Positivkontrolle 2 3.995 2.322 125

9. Referenzbereich

Messungen mit Proben gesunder Blutspender ergaben einen vorläufigen

Referenzbereich bis 85 pmol/l. Werte über 85 pmol/l können demnach als positiv eingestuft werden.

10. Testcharakteristika

Klinische Spezifität

Proben von 100 gesunden Blutspendern wurden im VGKC Ak RIA gemessen. 98 Proben waren negativ (98%).

Klinische Sensitivität

Proben von 30 Patienten mit Verdacht auf Erkrankungen unter

Beteiligung der spannungsaktivierten Kaliumkanäle und verwandten neurogischen Erkrankungen wurden im VGKC Ak RIA untersucht. 27

Proben wurden positiv gefunden (90%).

Spezifität

Es konnten keine Interferenzen durch Autoantikörper gegen den

Acetylcholinrezeptor, die 21-Hydroxylase, Aquaporin-4, GAD, TSH-

Rezeptor, TPO, Tg, gemessen werden. 1 von 17 Patienten mit Typ 1

Diabetes (IA2 Ak positiv) und 2 von 29 Patienten mit rheumatoider

Arthritis wurden im VGKC Ak RIA positiv gefunden.

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Interferenzen

Es konnten keine Interferenzen durch Zugabe von Hämoglobin bis 500 mg/dl, Bilirubin bis 20 mg/dl oder Intralipid bis 3000 mg/dl gemessen werden

Sensitivität

Die untere Nachweisgrenze wurde durch eine 20fache Messung der negativen Kontrolle, Bestimmung des Mittelwertes und der

Standardabweichung bestimmt. Die untere Nachweisgrenze als 2fache

Standardabweichung lag bei 4,5 pmol/l

Reproduzierbarkeit

Intra-Assay

Probe

1

2

3

Anzahl n

20

20

20

Mittelwert pmol/l

102

150

332

VK (%)

5,7

5,8

3,7

Inter-Assay

Probe

1

2

3

Anzahl n

12

12

12

Mittelwert pmol/l

89

138

320

VK (%)

6,6

6,4

5,4

11. Literatur

Hart et al.

“Autoantibodies detected to expressed K+ channels are implicated in

Neuromyotonia.”

Ann Neurol 41 (1997), 238 - 246

Vincent et al.

“Potassium channel antibody-associated encephalopathy: a potentially immunotherapyresponsive form of limbic encephalitis.”

Brain 127 (2004), 701 - 712

Tan et al.

“Clinical spectrum of voltage-gated potassium channel autoimmunity.”

Neurology 70 (2008), 1883 - 1890

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Pipettierschema

T

Negativ

Kontrolle

Positiv

Kontrollen

Patienten

Negativ Kontrolle

Pos. Kontrolle I & II

µl

µl

50

50

Verd. Patientenproben µl 50

125 I - VGKC µl 50 50 50 50

Röhrchen sorgfältig mischen (Vortex) und16 - 20 Stunden bei 2 - 8



C inkubieren

Anti-human-IgG µl 50 50 50

Röhrchen sorgfältig mischen (Vortex) und 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren

Assaypuffer (2-8 °C) ml 1 1 1

20 Minuten bei 3.000 x g unter Kühlung zentrifugieren

Überstand vorsichtig absaugen oder dekantieren (außer T)

Assaypuffer (2-8 °C) ml 1 1 1

Niederschlag aufschütteln (Vortex)

20 Minuten bei 3.000 x g unter Kühlung zentrifugieren

Überstand vorsichtig absaugen oder dekantieren (außer T)

Röhrchen 1 Minute im Gamma-Counter messen

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