Application Note 194

Application Note 194
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Note 194 | August 2008
Automatisierte Zellaussaat von HeLa-Zellen in verschiedenen Zelldichten in 24‑Well‑Zellkultur-Platten
mit der epMotion® 5070 CB
Dagmar Bracht, Eppendorf Instrumente GmbH, Deutschland
Zusammenfassung
In der Zellkultur gibt es bisher kaum automatisierte Prozesse, die die aufwendigen manuellen Arbeiten erleichtern würden. Das Aussäen von HeLa-Zellen in verschiedenen Zelldichten in eine 24-Well-Zellkultur-Platte über
Verdünnungsreihen ist mit der epMotion® 5070 CB durchführbar. Dadurch steht nun eine Möglichkeit zur
Verfügung, Teilbereiche der Zellkultur zu automatisieren.
Einleitung
Trotz zunehmender Wichtigkeit der Zellkultur in Pharma,
Biotechnologie und Grundlagenforschung gibt es wenig
Möglichkeiten, einfache und auch komplexere Arbeiten der
Zellkultur automatisch durchzuführen. Die Durchführung
von Zellkulturarbeiten unter sterilen Bedingungen ist dabei
entscheidend. Die epMotion 5070 CB wurde daher speziell
auf die Anwendung unter der Cleanbench entwickelt und
ermöglicht es damit, diverse Arbeitsabläufe auch unter sterilen Bedingungen zu automatisieren.
Material und Methoden
Eppendorf epMotion 5070 CB
Reservoir Rack
Reservoirs, 100 ml
Höhenadapter 85 mm (optional)
24-Well-Zellkultur-Platten
epT.I.P.S Motion, 1000 µl
HeLa-Zellen
Medium (RPMI 1640) + 10% FCS (fetal calf serum)
Trypsin
PBS (Phosphatsalzpuffer)
Neubauer Hämocytometer
Zellkulturflachen 75 cm2
Kultivierte HeLa-Zellen einer Zellkulturflasche (75 cm²) wurden mit Trypsin gelöst, mit PBS gewaschen und in frischem
Medium aufgenommen.
Abb. 1: Screenshot vom Control Panel der epMotion 5070 CB
mit der Platzierung der Labware für die Methode “Zellaussaat“
in 24-Well-Zellkultur-Platten.
Die Zellzahl der HeLa-Zellen wurde in einer NeubauerZählkammer bestimmt und auf eine Konzentration von
1 Mio Zellen/ml eingestellt. Frisches Medium und die
Zellsuspension wurden in je einem 100 ml Reservoir vorgelegt und zusammen mit einem weiteren leeren 100 ml
Reservoir im Reservoir Rack platziert. Alternativ können
selbstverständlich auch 50 ml oder 15 ml Falcon Gefäße
verwendet werden. In diesem Fall steht dann allerdings
die automatische Flüssigkeitslevelerkennung [1] nicht zur
Verfügung.
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In die erste Reihe der 24-Well-Zellkultur-Platte sollte eine
Zellzahl von 50.000 Zellen pro Well ausgesät werden.
Danach sollte für jedes Well eine Verdünnungsreihe mit je
halbierter Zellzahl erstellt werden. Dazu wurden in allen
24 Wells je 1 ml frisches Medium mittels eines „Reagent
Transfer“ [1] vorgelegt. Benutzt wurde die Liquid Class
„Protein“. Anschließend erfolgte die Aussaat der Zellen. Je
100 µl der Zellsuspension wurden in die ersten 6 Wells der
Platte ebenfalls mittels eines „Reagent Transfer“ [1] überführt. Das Volumen in den Wells wurde wiederum mit einem
„Reagent Transfer“ [1] auf 2 ml mit frischem Medium aufgefüllt. Die Verdünnung erfolgte anschließend über den Befehl
„Dilute“ [1].
Je 1 ml wurde für die Verdünnungsreihe eingesetzt, dabei
wurde sowohl vor der Aufnahme als auch nach der Abgabe
der Zellsuspension gemischt. Als Mischparameter wurden 2 Zyklen und die Geschwindigkeit 5 mm/sec eingesetzt. In der letzten Reihe der Platte lagen danach 2 ml
Zellsuspension vor. Die Anzahl der Zellen pro Milliliter war
zwar halbiert zur vorherigen Reihe, da bei der Zellaussaat
aber die Anzahl der Zellen pro Well entscheidend ist, musste die Hälfte der Zellsuspension wieder entnommen werden. Dies erfolgte mit dem Befehl „PoolOneDest“ [1]. Als
Abfallgefäß wurde das leere 100 ml Reservoir verwendet.
Abbildung 3: : Screenshot vom Control Panel der epMotion
5070 CB mit der Auflistung der notwendigen Befehle für die
Methode “Zellaussaat“ in einer 24-Well-Zellkultur-Platte.
Anschließend wurden die Zellen bei 37 °C in einer
Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid und 100 %
Luftfeuchtigkeit 24 Stunden inkubiert.
Ergebnis
Abbildung 2: Screenshots vom Control Panel der epMotion
5070 CB mit dem Pattern des „Dilute“-Befehls [1]. Die Wells
der ersten Reihe sind die Quelle (A). Daraus wird je 1 ml
Zellsuspension entnommen und in das darunter liegende Well
überführt, aus diesem wird dann wiederum 1 ml entnommen
und weiterverteilt, etc. So entsteht in jeder Spalte der Platte eine
Verdünnungsreihe. Daraus ergibt sich obiges Zielposition-Pattern für den „Dilute“-Befehl [1] (B).
Die Ergebnisse (s. Abb. 4) haben gezeigt, das Zellen mit der
epMotion 5070 CB automatisiert ausgesät werden können.
Die HeLa-Zellen wurden in 24-Well-Zellkultur-Platten automatisiert in verschiedenen Zelldichten ausgesät.
Die Zelldichte wurde mittels der Neubauer Zählkammer
erfasst.
Bestimmt wurde die Zelldichte jeweils vor Beginn der
Methode.
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A
B
C
D
Abb. 4: HeLa-Zellen in einer 24-Well-Zellkultur-Platte einen Tag nach der automatisierten Aussaat mit der epMotion 5070 CB mit
einer Zelldichte bei der Aussaat von (A) 50.000 Zellen/ml, (B) 25.000 Zellen/ml, (C) 12.500 Zellen/ml, (D) 6.250 Zellen/ml dargestellt mit einer 5fachen Vergrößerung.
Fazit
Die epMotion 5070 CB eignet sich für die automatische
Zellaussaat bei adhärenten Zellen. In Kombination mit dem
automatisierten Medienwechsel [2] bietet dies eine komfortables Setup bei der Kultivierung von adhärenten Zellen in
24-Well-Zellkultur-Platten.
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Referenzen
[1] Eppendorf Bedienungsanleitung für epMotion 5070 CB
[2] Eppendorf Application Note 185
Produkt
Bestell Nr. International
epMotion® 5070 CB
5070 000.700
5280 000.053
5075 754.002
0030 126.513
5075 751.003
Einkanal-Pipettierwerkzeug TS_1000
Reservoir Rack
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Höhenadapter 85mm (optional)
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