pdf-Dokument - ULB Bonn :: Amtliche Bekanntmachungen und

pdf-Dokument - ULB Bonn :: Amtliche Bekanntmachungen und
Detektion diabetischer Stoffwechselentgleisungen
bei forensischen Fragestellungen
Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
vorgelegt von
Cornelius Heß
aus Karlsruhe
Bonn, Oktober 2013
Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
1. Gutachter: Prof. Dr. Frank Musshoff
2. Gutachter: Prof. Dr. Alf Lamprecht
Tag der Promotion: 18.10.2013
Erscheinungsjahr: 2013
Teilergebnisse dieser Arbeit wurden in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht:
Veröffentlichungen:
Hess C, Thomas A, Thevis M, Stratmann B, Quester W, Tschoepe D, Madea B,
Musshoff F. Simultaneous determination and validated quantification of human
insulin and its synthetic analogues in human blood serum by immunoaffinity
purification and liquid chromatography-mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 2012;
404(6-7):1813-22.
Hess C, Stratmann B, Quester W, Tschoepe D, Madea B, Musshoff F. Clinical and
forensic examinations of glycaemic marker methylglyoxal by means of high
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Int J Legal Med.
2013;127(2):385-93.
Hess C, Stratmann B, Quester W, Madea B, Musshoff F, Tschoepe D. Clinical and
forensic examinations of glycemic marker 1,5-anhydroglucitol by means of high
performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Forensic Sci Int
2012 10;222(1-3):132-6.
Hess C, Musshoff F, Madea B. Simultaneous identification and validated
quantification of 11 oral hypoglycaemic drugs in plasma by electrospray ionisation
liquid chromatography-mass spectrometry. Anal Bioanal Chem. 2011; 400(1):33-41.
Musshoff F, Hess C, Madea B. Disorders of glucose metabolism: post mortem
analyses in forensic cases--part II. Int J Legal Med. 2011;125(2):171-80. Review
Hess C, Musshoff F, Madea B. Disorders of glucose metabolism-post mortem
analyses in forensic cases: part I. Int J Legal Med. 2011;125(2):163-70. Review.
Engelbrecht B, Stratmann B, Hess C, Tschoepe D, Gawlowski T. Impact of
Methylglyoxal on GLUT4 Translocation in L6 Myoblasts. Plos One 2013; 8(5):e65195
Hess C, Wöllner K, Musshoff F, Madea B. Detection of diabetic metabolism disorders
post mortem - forensic case reports of cause on death hyperglycaemia. Drug Test
Anal. 2013;5(9-10):795-801.
Hess C, Musshoff F, Madea B,Daldrup T. Determination of a hypoglycaemia induced
by insulin or is synthetic analogues post mortem. Drug Test Anal. 2013;5(9-10):802-7
Andere Veröffentlichungen:
Hess C, Ritke N, Bröcker S, Madea B, Musshoff F. Metabolism of levamisole and
kinetics of levamisole and aminorex in urine by means of liquid chromatography
hybrid quadrupole time-of-flight high-resolution mass spectrometry (LC-QTOF-
HRMS) and triple-quadrupole mass spectrometry (LC-QqQ-MS). Anal Bioanal Chem
2013;405(12):4077-88
Kirschbaum KM, Grigoleit L, Hess C, Madea B, Musshoff F. Illegal drugs and
delinquency. Forensic Sci Int. 2013: 10;226(1-3):230-4
F. Musshoff, L. Hottmann, C. Hess, B. Madea. „Legal Highs“ aus dem deutschen
Internet – Der Vormarsch von „Badesalz-Drogen“. Accepted in Arch Krim.
Fachvorträge und Poster:
Simultaneous quantification of human insulin and its synthetic analogues in human
plasma by immunopurification and liquid chromatography mass spectrometry; TIAFT
Meeting 2010 in Bonn (Poster).
Simultaneous quantification of 15 oral antidiabetics in human plasma by means of
liquid chromatography tandem mass spectrometry; TIAFT Meeting 2010 in Bonn
(Vortrag).
Das molare Verhältnis humanes Insulin zu C-Peptid: Bestimmung mittels
immunchemischer Aufreinigung und anschließender Flüssigkeitschromatographisch /
massenspektrometrischer Bestimmung; Jahrestagung Rechtsmedizin 2010 in Berlin
(Vortrag).
Anhydroglucitol - a new marker for antemortem hyperglycemia; Jahrestagung der
GTFCh 2011 in Mosbach/Baden (Poster).
Methylglyoxal - ein neuer Marker zum Nachweis einer antemortem Hyperglykämie?
Frühjahrstagung Rechtsmedizin der Regionalgruppe Nord 2011 in Münster (Vortrag).
Anhydroglucitol and methylglyoxal - new marker for an antemortem hyperglycemia;
TIAFT Meeting 2011 in San Francisco/USA (Vortrag).
Quantifizierung von humanem Insulin und seinen synthetischen Analoga in
forensischen
Fällen:
Vergleich
eines
Immunoassays
mit
einer
flüssigkeitschromatographisch/massenspektrometrischen Methode; Frühjahrstagung
Rechtsmedizin der Regionalgruppe Nord 2012 in Bonn (Vortrag).
Determination of human and synthetic insulins and problems in forensics:
comparison of immunoassay and liquid chromatographic mass spectrometric results;
TIAFT Meeting 2012 in Hamamatsu/Japan (Poster).
Das molare Verhältnis humanes Insulin zu C-Peptid in klinischen und forensischen
Fällen; Jahrestagung Rechtsmedizin 2012 in Freiburg (Vortrag).
Danksagung
Allem voran möchte ich mich an dieser Stelle bei Herrn Prof. Dr. Frank Musshoff für
die Überlassung des überaus interessanten Themas, die fachliche Unterstützung und
den großzügigen Gestaltungsfreiraum während der gesamten Promotionsarbeit
bedanken.
Herrn Prof. Dr. med. Burkhard Madea danke ich für die Bereitstellung der
instrumentellen Mittel, der Ermöglichung dieser wissenschaftlichen Arbeit und der
guten Zusammenarbeit während meiner Zeit am Institut für Rechtsmedizin der
Universität Bonn.
Weiterhin danke ich meinen lieben Kolleginnen und Kollegen der Abteilung für
forensische Toxikologie des Instituts für Rechtsmedizin für die bereichernde Zeit am
Institut, allen voran Jörg Bayer für die technische Unterstützung am LC/MS-Gerät,
Pia Aymans für die große Hilfe bei der Probenvorbereitung.
Danken möchte ich auch den fleißigen Probensammlern aus Bonn (Julia Brünig und
Charlotte Meister) und Bad Oeynhausen (Yvonne Mattern) und Herrn Dr. rer. nat.
Bernd Stratmann für die fachliche Unterstützung bei klinischen Fällen. Vielen Dank
auch an Herrn Prof. Dr. rer. nat. Thomas Daldrup für die Bereitstellung von
Probenmaterial und die gute Zusammenarbeit.
Zum Schluss danke ich den wichtigsten Menschen: Ich danke meinen Eltern, meiner
Schwester und meiner Oma Helga, dass sie nicht nur in den vergangenen drei
Jahren ständig für mich erreichbar waren und mich in allem, was ich getan habe,
unterstützt haben. Ich habe mich nie gescheut, einen Gefallen von Ihnen zu erwarten
und sie haben nie gezögert, mir diesen Gefallen zu tun. Und sie haben mir Werte wie
Durchhaltevermögen, Bescheidenheit, Zurückhaltung, aber auch Selbstbewusstsein
vermittelt, die mir auch bei dieser Arbeit zugute kamen. Und ich danke Gesa Kleine
Borgmann, die mich in den letzten Monaten der Arbeit mit Kuchen, Käse, Oliven und
Schinken kulinarisch und - noch viel wichtiger - mit viel Liebe versorgt hat.
Abkürzungsverzeichnis
AG
1,5-Anhydroglucitol
AGE
Advanced Glycation End Products
APCI
Atmospheric Pressure Chemical Ionisation
CE
Kollisionsenergie
CEL
Nδ-1-Carboxyethyllysin
CSF
Cerebrospinalflüssigkeit
(Liquor cerebrospinalis)
COPD
chronisch obstruktive Lungenerkrankung
CXP
cell exit potential
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay
ESI
Elektrospray Ionisation
DAD
Dioden-Array-Detektion
DCCT
Diabetes Control and Complications Trial
DKA
Diabetische Ketoazidose
FID
Flammenionisationsdetektion
GC
Gaschromatographie
GKF
Glaskörperflüssigkeit
GTfCh
Gesellschaft für Toxikologie und forensische
Chemie
HPLC
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
HU
hypoglycaemia unawareness
HWZ
Halbwertszeit
IA
Immuoassay
IFCC
International Federation of Clinical Chemistry
IRMA
Immunradiometric assay
IDE
insulin degrading enzyme
IS
Interner Standard
LoD
Limit of Detection (Nachweisgrenze)
LoQ
Limit of Quantification (Bestimmungsgrenze)
MALDI-TOF
Matrix assisted laser desorption ionisationtime of flight
MG
Methylglyoxal
MOLD
MG-Lysin-Dimer (1,3-di(Nε-lysino)-4-methylimidazolium
MRM
Multiple Reaction Monitoring
MS
Massenspektrometrie
MS/MS
Tandem-Massenspektrometrie
m/z
Masse zu Ladungs-Verhältnis
NAD
Nicotinamidadenindinukleotid
PMI
Post mortem Intervall (Zeit zwischen Tod und
Obduktion)
PMSC
Phenylmethylsulfonylchlorid
Q (1 - 3)
Quadrupol
QC-Proben
Qualitätskontrollproben
RIA
Radioimmunoassay
(R) SD
(relative)
standard
deviation
Standardabweichung)
SGLT 4
sodium-glucose linked transporter
SPE
solid phase extraction
TBME
tert. Butyl-methyl-ether
TFA
Trifluoressigsäure
U
International Unit
V
Volt
(relative
1
EINFÜHRUNG
1.1
Diabetes und Diabetes-Typen
5
5
1.1.1
Therapie des Diabetes
5
1.1.2
Akute Komplikationen bei Diabetikern
6
1.2
Diabetes, Hypoglykämie und forensische Fragestellungen
10
1.3
Pathomorphologie
12
1.3.1
Hyperglykämie: Pathomorphologische Auffälligkeiten beim Toten
12
1.3.2
Hypoglykämie: Anamnese und pathomorphologische Auffälligkeiten beim Toten
12
Potentielle biochemische Parameter zum Nachweis einer Hyper- / Hypoglykämie
13
1.4
1.4.1
Glucose und Laktat
13
1.4.2
Glykierte Proteine
14
1.4.3
Insulin, C-Peptid und Proinsulin
15
1.4.4
Orale Antidiabetika
22
1.4.5
Methylglyoxal
26
1.4.6
Anhydroglucitol
29
1.4.7
Ketonkörper
30
1.5
Analytik
31
1.5.1
Glucose und Laktat
31
1.5.2
Glykierte Proteine
31
1.5.3
Humanes Insulin
32
1.5.4
C-Peptid
33
1.5.5
Proinsulin
34
1.5.6
Orale Antidiabetika
34
1.5.7
Methylglyoxal
34
1.5.8
Anhydroglucitol
35
1.5.9
Ketonkörper
35
1.6
Nachweis von Glucosestoffwechselentgleisungen im Lebenden bei forensischen
Fragestellungen
36
1.7
Nachweis von Glucosestoffwechselentgleisungen post mortem
37
1.8
Massenspektrometrie
40
1.8.1
Elektrospray-Ionisation
41
1.8.2
Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)
42
1.8.3
Triple-Quadrupol
42
1.8.4
Lineare Ionenfalle
44
1.8.5
Validierung massenspektrometrischer Methoden
45
1.9
Headspace-Gaschromatographie
47
1.10
Immunchemie
48
2
FRAGESTELLUNG
49
3
MATERIAL UND METHODEN
51
3.1
Allgemein
51
3.1.1
Chemikalien und Reagenzien
51
3.1.2
Puffer und Lösungen
51
3.1.3
HPLC-MS
51
3.1.4
Head-Space GC/FID
52
3.2
Validierung
52
3.2.1
Leermatrix
52
3.2.2
Selektivität und Spezifität
52
3.2.3
Linearität
53
3.2.4
Lösemittelkalibration
53
3.2.5
Genauigkeit
53
3.2.6
Matrixeffekte und Wiederfindung
54
3.2.7
Analytische Grenzen
55
3.2.8
Ionenverhältnisse
56
3.3
Analytik
56
3.3.1
Glucose und Laktat
56
3.3.2
Glykierte Proteine
58
3.3.3
Humanes und synthetische Insuline
59
3.3.4
C-Peptid
63
3.3.5
Proinsulin
64
3.3.6
Orale Antidiabetika
65
3.3.7
Methylglyoxal
70
3.3.8
Anhydroglucitol
73
3.3.9
Ketonkörper
75
Probenmaterial
76
3.4
3.4.1
Klinische Proben
3.4.2
Vergleich der immunchemischen mit der chromatographischen Methode für humanes
Insulin
76
77
3.4.3
Forensische Proben
77
3.4.4
Statistische Auswertung
78
2
4
ERGEBNISSE
4.1
Analytische Methodenentwicklung
79
79
4.1.1
Humanes und synthetische Insuline
79
4.1.2
C-Peptid
82
4.1.3
Orale Antidiabetika
83
4.1.4
Methylglyoxal
88
4.1.5
Anhydroglucitol
89
Klinische Proben
91
4.2
4.2.1
Glucose
91
4.2.2
HbA1c
92
4.2.3
Fructosamin
92
4.2.4
Humanes und synthetische Insuline
93
4.2.5
C-Peptid
97
4.2.6
Das molare Verhältnis humanes Insulin:C-Peptid
99
4.2.7
Proinsulin
100
4.2.8
Methylglyoxal
103
4.2.9
Anhydroglucitol
103
4.2.10 Zusammenhang der Parameter
4.3
104
Forensische Proben
108
4.3.1
Glucose und Laktat
108
4.3.2
Summenformel nach Traub
110
4.3.3
HbA1c
111
4.3.4
Fructosamin
112
4.3.5
Methylglyoxal
113
4.3.6
Anhydroglucitol
115
4.3.7
Humanes Insulin
115
4.3.8
Zusammenhang der Parameter
115
5
DISKUSSION
5.1
Analytische Methodenentwicklung
119
119
5.1.1
Humanes und synthetische Insuline
119
5.1.2
C-Peptid
122
5.1.3
Orale Antidiabetika
123
5.1.4
Methylglyoxal
124
5.1.5
Anhydroglucitol
126
Klinische Proben
126
5.2
5.2.1
Humanes und synthetische Insuline
126
3
5.2.2
C-Peptid
129
5.2.3
Das molare Verhältnis humanes Insulin : C-Peptid
130
5.2.4
Proinsulin
130
5.2.5
Orale Antidiabetika
131
5.2.6
Methylglyoxal
133
5.2.7
Anhydroglucitol
134
5.2.8
Hypoglykämien im Straßenverkehr
135
5.3
Forensische Proben
140
5.3.1
Glucose und Laktat
140
5.3.2
HbA1c
142
5.3.3
Fructosamin
144
5.3.4
Der Nachweis von humanem und synthetischen Insulinen
145
5.3.5
Methylglyoxal
149
5.3.6
Anhydroglucitol
149
5.3.7
Hypogklykämien post mortem
150
5.3.8
Hyperglykämien post mortem
152
5.3.9
Anwendungsbeispiele Hyperglykämie
155
5.3.10 Anwendungsbeispiele Hypoglykämie
160
6
ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK
162
7
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
165
8
TABELLENVERZEICHNIS
167
9
LITERATURVERZEICHNIS
168
4
1. Einführung
1
Einführung
1.1
Diabetes und Diabetes-Typen
Diabetes mellitus ist eine weltweit auftretende chronische Krankheit. Ungefähr 285
Millionen Menschen sind zur Zeit von dieser Krankheit betroffen [1]. Diabetes wird
gleichermaßen selten in Todesbescheinigungen [2, 3] als Krankheit (es kann mit
weiteren 8% Menschen mit unentdecktem Diabetes mellitus gerechnet werden) bzw.
Todesursache [4, 5] festgehalten. Dabei sind Folgen einer Diabeteserkrankung die
siebthäufigste Todesursache in den Entwicklungsländern (2007 waren Diabetes und
dessen Folgen bei 2,7 % der Verstorbenen die Todesursache) [6].
Eine konstante Hyperglykämie bei Diabetikern ist auf einen Mangel an Insulin
zurückzuführen (siehe Kapitel 1.4.3.1). Dieses Protein wird durch die β-Zellen des
Pankreas
in
den
Blutstrom
abgegeben,
sobald
diese
durch
eine
hohe
Blutglucosekonzentration stimuliert werden. Insulin und sein Vorläuferprotein
Proinsulin haben beide die Fähigkeit, Blutglucosekonzentrationen zu senken
Grundsätzlich wird Diabetes mellitus in zwei Klassen aufgeteilt: Typ 1 Diabetes ist
durch eine autoimmunbedingte Zerstörung der β-Zellen im Pankreas und als Folge
durch ein Fehlen der Insulinsekretion gekennzeichnet. Typ 2 Diabetes kann durch
eine
verminderte
Insulinsekretion
und
eine
Insulinresistenz
des
Gewebes
charakterisiert werden. In Deutschland gehören ca. 90 % der Diabetiker zum Typ 2
und 5-10 % zum Typ 1 [7]. Dabei sind sowohl genetische als auch Umweltfaktoren
(Übergewicht) an der Entstehung beteiligt. Der Primärbefund bei beiden Typen ist
der Verlust der glykämischen Kontrolle. Die Diagnose eines Diabetes mellitus wird
exklusiv durch diese dauerhafte Hyperglykämie, der erhöhten Glucosekonzentration
im Plasma, gestellt (Tabelle 1).
1.1.1 Therapie des Diabetes
Typ 1- Diabetiker sind auf die Injektion von Insulin angewiesen. Das Ziel dieser
Insulintherapie besteht darin, das Hormon in einer der physiologischen Sekretion
ähnelnden
Weise
zu
substituieren
und
normale
Glucosekonzentrationen
wiederherzustellen. Das humane Insulinmolekül wurde hierzu in den letzten Jahren
derart modifiziert, dass durch sogenannte Insulinanaloga pharmakokinetische
5
1. Einführung
Vorteile im Vergleich zum humanen Insulin entwickelt werden konnten (siehe
1.4.3.2). Therapiemöglichkeiten für Typ 2- Diabetiker beinhalten zunächst orale
Antidiabetika (siehe 1.4.4), viele sind aber ebenfalls auf exogenes Insulin
angewiesen.
Venöse
Venöse
Blutglucosekon- Plasmaglucosezentration
konzentration
Normale
Konzentration
DiabetesSymptome
Tabelle
1:
und
> 180 mg/dl
> 180 mg/dl
Nach 12 h nüchtern > 110 mg/dl
> 126 mg/dl
2 h nach einem
> 180 mg/dl
Glucosetoleranztest
> 200 mg/dl
Optionale
Kriterien
für
eine
Diagnose
von
Diabetes
[8];
1 mmol/l = 18,02 mg/dl
1.1.2 Akute Komplikationen bei Diabetikern
Trotz sehr variablen Intervallen zwischen Mahlzeiten oder gelegentlich beachtlicher
Kohlenhydratlast nach Nahrungsaufnahme bleibt die Blutglucosekonzentration des
gesunden Menschen innerhalb eines engen Bereichs (60-140 mg/dl [9]), da einige
pathophysiologische Mechanismen vonstattengehen, falls die Glucosekonzentration
aus diesem Bereich fällt. Diese Mechanismen sind bei Patienten mit der Diagnose
Diabetes mellitus gestört, was zu den im Folgenden beschriebenen Konsequenzen
führt.
1.1.2.1 Hyperglykämie
Coma diabeticum ist die schwerwiegendste Form einer hyperglykämischen
Stoffwechselfunktionsstörung. Es kann zwischen diabetischer Ketoazidose (DKA)
und einer hyperosmolaren Krise unterschieden werden. Die Pathogenese ist in
Abbildung 1 dargestellt. Hohe Blutglucosekonzentrationen (Tabelle 4, Kapitel 1.4.1)
und Ketonkörper im Blut führen zu den sofortigen medizinischen Konsequenzen wie
fehlender Orientierung, Dehydrierung, Koma und Tod. Die jährliche Inzidenzrate für
DKA wird zwischen 4,6 und 8 Episoden pro 1000 Patienten mit Diabetes angegeben
6
1. Einführung
[10, 11]. Die Mortalitätsrate bei Patienten mit DKA liegt bei < 5 % [12]. Die Mortalität
während einer DKA hängt von der Länge der Zeit zwischen Einsetzen der
Ketoazidose und des Beginns der Behandlung, der Anwesenheit einer Sepsis und
dem Alter ab. Die jährliche Inzidenz hyperosmolarer Komata ist geringer und liegt bei
einem von 1000 Diabetikern [11], die Mortalität wird von den meisten Publikationen
mit 15% beschrieben [13].
1.1.2.2 Hypoglykämie
Die
gebräuchliche
Definition
für
eine
Hypoglykämie
ist
eine
niedrige
Blutglucosekonzentration (Tabelle 2). Allgemeine Symptome einer Hypoglykämie
werden in Tabelle 3 zusammengefasst. Das Gehirn ist abhängig von Glucose und ist
selbst nicht in der Lage, Glucose zu synthetisieren oder einzulagern. Die Unfähigkeit
des Gehirns, dadurch in hypoglykämischen Situationen trotz normalem arteriellen
Sauerstoffflusses Sauerstoff zu verwerten, resultiert in einer beeinträchtigten
Gehirnfunktion [14]. Glukagon ist das wichtigste Hormon für die schnelle Genesung
von einer akuten Hypoglykämie. Doch innerhalb der ersten 5 Jahre nach Diagnose
eines Diabetes mellitus zeigen Patienten eine progressiv sinkende Glukagonantwort
auf hypoglykämische Situationen [15]. Innerhalb von 10 Jahren nach Diagnose sinkt
auch die Adrenalin-Gegenregulation, was in einem Verlust der adrenergen
Symptome (Tabelle 3) mündet. So kann eine Hypoglykämie - falls sie nicht mit
schnell resorbierbaren Kohlenhydraten behandelt wird - mit dauerhaften Hirnschäden
und signifikanter Mortalität einhergehen [16]. Die Prävalenz schwerwiegender
Hypoglykämien wird mit 0,64 bzw. 1,6 Episoden pro Patient und Jahr, für
Hypoglykämien mit Verlust des Bewusstseins mit 0,07 [17] oder 0,19 [18] pro Patient
und Jahr angegeben.
Etwa 10-20 % der Patienten leiden an mindestens einer schwerwiegenden
Hypoglykämie im Jahr [19, 20]. Die Einführung von Insulinanaloga in die
Diabetestherapie konnte die Hypoglykämieraten um fast 25 % senken (Insulin lispro
vs. humanes Insulin) [21], andere Studien konnten dies nicht bestätigen [22].
7
1. Einführung
Absolutes Insulindefizit
(Typ 1 Diabetes, aber auch bei Typ 2
Diabetes unter bestimmten
Voraussetzungen)
Gegenregulierende Hormone
(Glukagon, Catecholamine)
Relatives Insulindefizit,
Insulinresistenz
(Typ 2 Diabetes)
+ akute Auslöser: Infektionen, neu diagnostizierter Diabetes, Trauma, Schwangerschaft, Stress, Alkoholeinnahme, Myokardinfarkt,
Cerebrovaskuläre Ereignisse, akute Pankreatitis, Verbrennungen, Medikamente (Corticosteroide), Auslassen der Insulininjektion
Gluconeogenese
Lipolyse
Glycogenolyse
Gluconeogenese
Glucoseaufnahme in Zellen
hepatische Glucosefreisetzung
Milde Hyperglykämie
(250 - 600 mg/dl)
freie Fettsäuren im Blut
Hyperglycaemia (> 600mg/dl)
Fehlende Ketose
Osmotische Diurese
Acetyl CoA
Dehydrierung, Polyurie,
Verlust von Wasser und Elektrolyten
Ketonkörper im Blut
pH
diabetische Ketoazidose
Abbildung
1:
Pathogenese
einer
Hyperosmolares Koma
diabetischen
Ketoazidose
und
eines
hyperosmolaren Komas [11]
Plasma
Glucosekonzentration
Reaktionen des menschlichen Körpers
40 - 83 mg/dl
Abfall der endogenen Insulinsekretion
58 - 63 mg/dl
Anstieg der Sekretion von Glukagon, Adrenalin und
später Wachstumshormon als hormonelle Vertreter
des autonomen Nervensystems mit antiinsulinärer
Wirkung
< 56 mg/dl
Anstieg der Cortisol-Sekretion
< 54 mg/dl
Autonome Symptome der Hypoglykämie
< 45 mg/dl
(< 40 mg/dl im Blut)
Definition Hypoglykämie und neuroglykopenische
Symptome einer Hypoglykämie
Tabelle 2: Definition einer Hypoglykämie und die Reaktionen des menschlichen
Körpers bei sinkender Glucosekonzentration [23]
8
1. Einführung
Adrenerge Symptome
Neuroglukopenische Symptome
Tachykardie
Fehlende Koordination / Konfusion
Unruhe
fehlende Koordination
Müdigkeit
Kalter Schweiß
Verschwommenes oder doppeltes Sehen
undeutliche / ausbleibende Sprache
Tremor
Konzentrationsmängel
Hunger
Schwächegefühl / Schwindel
Übelkeit
Paresthaesien an Lippen und Zunge
Flush
Übelkeit / Erbrechen
Herzrasen
Kopfschmerzen
Angst (das Bewusstsein zu
verlieren)
Durst
Kältegefühl
Benommenheit
Reizbarkeit
Koma
Tabelle 3 : Mögliche Syptome einer Hypoglykämie
Eine Überdosis Insulin ist die häufigste Ursache einer Hypoglykämie [24]. Die
Ausbildung einer Hypoglykämie dauert mindestens 20 Minuten nach der Injektion
von Insulin. Dosis und Typ Insulin stehen in engem Zusammenhang mit der Dauer,
nicht aber mit dem Schweregrad einer Hypoglykämie [25]. Weitere Ursachen von
Hypoglykämien
sind
Mangelernährung,
abnorme
physische
Anstrengung,
chronischer Alkoholismus, Therapiefehler, Insulinome (Zelltumore in den Inselzellen
des
Pankreas),
“reaktive
Hypoglykämien”
nach
der
Zufuhr
von
Zucker,
Autoimmunhypoglykämien oder Drogen- bzw. Toxin- induzierte Hypoglykämien.
Potentielle Medikamente, die eine Hypoglykämie auslösen oder noch verstärken,
wurden beschrieben: Acetylsalicylsäure stimuliert die Glucoseaufnahme durch den
Muskel. Einige β-Blocker verhindern die Glykogenolyse im Muskel und die periphere
Glucosemobilisierung [26], stumpfen die Glukagon-Antwort auf die Hypoglykämie ab
[27] und maskieren außerdem die durch Adrenalin hervorgerufenen Symptome einer
Hypoglykämie.
Die Behandlung mit insulinotropen oralen Antidiabetika kann ebenfalls zu
Hypoglykämien führen, besonders wenn die Therapie mit Sulfonylharnstoffen der
ersten Generation erfolgt. Sulfonylharnstoffe führen aber seltener zu Hypoglykämien
9
1. Einführung
als Insulin [28]. Jennings et al. zeigten eine Inzidenz von Hypoglykämien von 20 %
bei Diabetikern, die mit Sulfonylharnstoffen behandelt wurden [29]. Neuere
Substanzen wie Glimepirid oder die Glinide zeigen kaum Tendenzen zur Ausbildung
von Hypoglykämien [30, 31].
1.2
Diabetes, Hypoglykämie und forensische Fragestellungen
Diabetische
Stoffwechselentgleisungen
können
bei
der
Teilnahme
am
Straßenverkehr in hypoglykämischem Zustand nach der Einnahme von Insulin oder
insulinotropen Substanzen forensisch relevant werden [32]. Die Nebenwirkungen der
Diabetestherapie
(hauptsächlich
Hypoglykämie)
und
das
durch
diabetische
Folgekomplikationen (hauptsächlich das Sehvermögen betreffend, aber auch Mikround Makroangiopathie, Neuropathie, Nierenversagen, Herzinfarkt) hervorgerufene
potentielle Risiko können eine Bedrohung bzw. Behinderung im Straßenverkehr
darstellen. Besonders die diabetische Retinopathie spielt im Straßenverkehr eine
Rolle, Reduktion der Sehschärfe, Einschränkung des Gesichtsfeldes oder auch
Probleme im Farbsehen können die Folge sein [33]. In der forensischen Praxis ist
aber hauptsächlich die akute Komplikation Hypoglykämie von Interesse. Sie kann zu
jedem Zeitpunkt auftreten und kann einen Bewusstseinsverlust zur Folge haben.
Hyperglykämie spielt in diesem Kontext eine untergeordnete Rolle, da sich diese
langsamer entwickelt und mit klaren klinischen Symptomen einhergeht. Ob
Straßenverkehrsunfälle bei mit Insulin behandelten Diabetikern häufiger vorkommen,
bleibt umstritten: manche Studien zeigen eine Signifikanz auf [34, 35], andere nicht
[36]. Laborstudien mit Fahrsimulatoren haben demonstriert, dass schon durch milde
Hypoglykämien kognitive Funktionen, die wichtig für das Führen eines Fahrzeuges
sind (visuelle Informationsverarbeitung, Reaktionszeit, Aufmerksamkeit, Hand-AugeKoordination), eingeschränkt werden [37]. Die minimale Blutglucosekonzentration,
die für die Teilnahme am Straßenverkehr als erforderlich angesehen wird, beträgt 72
mg/dl [38].
In Deutschland gelten folgende Regelungen, um als Diabetiker ein Fahrzeug im
Straßenverkehr führen zu dürfen [39]: Wer zu Zuckerstoffwechselerkrankungen wie
Hypo- und/oder Hyperglykämie tendiert, ist grundsätzlich nicht in der Lage, ein
Kraftfahrzeug zu führen. Dies gilt für Diabetiker in der Phase der Einstellung ihrer
10
1. Einführung
Medikation. Gut eingestellte Diabetiker dürfen Fahrzeuge aller Kategorien fahren.
Nach einer Entscheidung des bayrischen Verwaltungsgerichts im Jahre 1989 dürfen
Diabetiker unter der Voraussetzung, dass sie unter Therapie mit oralen Antidiabetika
oder Insulin stehen und keine hypoglykämische Attacke in den vorausgehenden 3
Monaten
hatten,
neben
der
Führerscheinklasse
A
und
B
auch
die
Führerscheinklasse C und E besitzen. Dies setzt regelmäßige Kontrollen voraus und
zu Beginn einer Insulintherapie ist die Teilnahme am Straßenverkehr aufgrund
möglicher Sehstörungen strengstens verboten. In der deutschen “FahrerlaubnisVerordnung (FeV)”, §§ 11, 13 und 14, Nummer 5.1 - 5.4 sind diese Voraussetzungen
definiert. Wenn Diabetiker allerdings zu schweren Stoffwechselentgleisungen neigen,
dürfen sie den Führerschein nicht erhalten [40]. Bisher war für beantragende
Betroffene die Angabe über den Diabetes freiwillig. Ab dem Jahr 2013 werden jedoch
die EU-Führerscheinrichtlinien in nationales Recht umgesetzt: Menschen mit
Diabetes mellitus müssen dann bei einem Antrag auf Erteilung der Fahrerlaubnis
künftig ein medizinisches Gutachten eines Facharztes mit verkehrsmedizinischer
Qualifikation vorlegen [41].
Weiterhin erlangen diabetische Stoffwechselentgleisungen forensisches Interesse
bei der Diagnose „Glucosestoffwechselerkrankung“ post mortem. Diese ist in der
forensischen Praxis im Rahmen einer Sektion häufig schwierig, da klare
morphologische
Auffälligkeiten
fehlen.
Dabei
muss
ein
todesursächliches
diabetisches Koma erkannt werden. Außerdem wurden auch Fälle beschrieben, in
denen Insulin oder insulinotrope Substanzen als Selbstmord- (Suizid oder
faktitiöse/künstliche Hypoglykämie, Munchausen by proxy Syndrom) oder Mordmittel
eingesetzt werden. Im 2005 Annual Report of the American Association of Poison
Control Centers standen 0,16% (3934 Fälle) der berichteten Aufnahmen in
Zusammenhang mit Insulin [42], im Report aus dem Jahr 2007 waren es schon
0,70% (17270 Fälle) [43]. Von Mach et al. legten allerdings in einem Review dar,
dass 90 % der Insulin-Überdosen suizidalen Hintergrund hatten [44]. Arem [45] fand
bis 1985 81 Fälle von faktitiöser Hyperinsulinämie, weitere Suizide mit Insulin wurden
beschrieben (z.B. [46]). Seit synthetische Insuline auf dem Arzneimittelmarkt
erhältlich sind, wurden sowohl kurz- als auch langwirksame Insuline zum Selbsttod
benutzt (57.8 % vs. 42.8 %) [44]. Marks gibt einen Überblick über die beschriebenen
53 Insulinmorde bis 1999 [47] und weitere 13 Fälle in den Jahren 1999 bis 2009 [48].
11
1. Einführung
1.3
Pathomorphologie
1.3.1 Hyperglykämie: Pathomorphologische Auffälligkeiten beim Toten
Im Falle des Verdachts auf ein diabetisches Koma ist die Kenntnis über einen
vorliegenden Diabetes mellitus, dessen Dauer, Verlauf, Therapie und die
therapeutische Disziplin von Wichtigkeit. Vor dem Tod sind bei Patienten mit
anschließendem hyperglykämischem Koma meist Symptome wie Poly- / Dysurie,
Polydipsie, Polyphagie, Erbrechen, Bauchschmerzen, Schwächegefühl, Fieber,
Brustschmerzen, Kurzatmigkeit, Hypotonie, Tachykardie und neurologische Defizite
zu
beobachten.
Physische
Zeichen
können
Dehydrierung,
trockene
Mucosamembranen, Hautschwellungen, und die sogenannte Kussmaul-Atmung
(schnelles und tiefes Ausatmen mit Aceton-Geruch) sein [49].
Während einer Obduktion kann häufig eine fettige Veränderung der Niere mit gelbroter Eintrübung des Nierenparenchyms beobachtet werden. Weitere Diabetesspezifische
Organveränderungen
sind
die
diabetische
Glomerulosklerose
Kimmelstiel-Wilson (siehe auch Abbildung 46) [50] oder eine Fettleber. Beckmann
[51] zeigte, dass eine Fettleber häufiger bei Diabetikern auftaucht, brachte diesen
Fakt aber in Zuammenhang mit der höheren Inzidenz von Adipositas unter
Diabetikern. Meistens sind arteriosklerotische Veränderungen der peripheren,
Koronar-, Becken- oder Hirnarterien zu beobachten [52]. Eine Xanthochromie
(Gelbverfärbung) des Craniums ist ein relativ häufiger Sektionsbefund bei
Diabetikern [53].
Eine histologische Untersuchung erbringt häufig hilfreiche Befunde wie z.B. eine
Glykogen-Nephrose mit sogenannten Armanni-Ebstein Zellen (siehe auch Abbildung
46), die sehr spezifisch für eine langanhaltende Hyperglykämie > 500 mg/dl sind [51].
1.3.2 Hypoglykämie: Anamnese und pathomorphologische Auffälligkeiten
beim Toten
Während einer Sektion können kaum pathomorphologische Befunde erhoben
werden, die direkt auf eine Überdosis mit Insulin oder oralen Antidiabetika hindeuten.
Weniger bekannte Nebenwirkungen einer zu hohen Dosis Insulin sollten ggf. als
Hinweis
in
Erwägung
gezogen
werden:
Hypokalämie,
Hypophosphatämie,
Hypomagnesiämie [54], akute Fettleber [55] oder akutes Lungenödem [56]. Die erste
Reaktion des Gehirns auf mangelnde Glucosekonzentrationen zeigt sich meist in
12
1. Einführung
einer Schwellung, in einem Gehirnödem. Intrinsische Ursachen einer Hypoglykämie,
insbesondere ein Insulinom, sollten bei der Obduktion ausgeschlossen werden.
Falls eine Injektionsstelle gefunden werden kann, kann das Ausschneiden der
Injektionsstelle und der immunhistochemische [57] oder toxikologische Nachweis des
Insulins in Betracht gezogen werden.
1.4
Potentielle biochemische Parameter zum Nachweis einer Hyper- /
Hypoglykämie
Glucose
[mg/dl]
Arterielles Blut
74 - 106 nüchtern
Laktat
[mg/dl]
4,5 - 20
< 140 postprandial
Venöses Blut
74 - 106 nüchtern
< 16,3
~ 40 niedriger als in
arteriellem
Blut
postprandial
Diabetische
Ketoazidose
> 600
> 21,6
Hyperosmolares
Koma
250 - 600
> 35
Tabelle 4: Referenzkonzetrationen von Glucose und Laktat im Blut und
Konzentrationen in hyperglykämischen Situationen [58]
1.4.1 Glucose und Laktat
Die Diagnose einer glykämischen Stoffwechselentgleisung ante und post mortem
basiert auf der Feststellung einer hohen bzw. niedrigen Glucosekonzentration. Post
mortem kann auch noch die Laktatkonzentration in Betracht gezogen werden, da
Glucose nach dem Tod in Laktat umgewandelt wird. Referenzkonzentrationen für
beide Parameter sind in Tabelle 4 dargestellt.
13
1. Einführung
1.4.2 Glykierte Proteine
Serumproteine werden posttranslational durch eine langsame nichtenzymatische
Reaktion zwischen Glucose und Aminogruppen von Proteinen glykiert [59]. In der
Diabetesdiagnostik hat sich vor allem die Quantifizierung des HbA1c zur
Bestimmung der glykämischen Kontrolle durchgesetzt. HbA1c ist als an ein oder
beide
N-terminale Valine der β-Kette des Hämoglobins gebundene D-Glucose definiert.
Das
Ausmaß
der
HbA1c-Synthese
steht
in
Zusammenhang
mit
der
Glucosekonzentration, der die Erythrozyten ausgesetzt sind [60]. Glykiertes
Hämoglobin ist - einmal gebildet - stabil und akkumuliert während der gesamten
Lebensspanne eines roten Blutkörperchens. Daher ist es ein nützlicher Index
während der vorausgehenden 120 Tage und um eine längerfristige Glykämie zu
beurteilen [61]. Gleichwohl ist es nicht geeignet, um kurzfristige Änderungen in der
Glucosekonzentration zu überprüfen. Die HbA1c-Konzentration wird erst nach einer
12 Stunden anhaltenden Hyperglykämie beeinflusst [62], kurze Hyperglykämien sind
ohne Auswirkung auf den HbA1c. Im Jahr 2008 änderte die diabetische Gesellschaft
die Einheit des HbA1c von % (des totalen Hämoglobins) in mmol HbA1c/mol
Hämoglobin [63].
Als Alternative zum HbA1c (z.B. bei hämolytischer Anämie) im Routinemanagement
gilt das Fructosamin [64]. Die Albumin-Konzentration spiegelt zu einem Großteil
(80% [65]) die Fructosamin-Konzentration (“glykierte Proteine im Blut”) wider. Die
durchschnittliche Halbwertszeit von Plasmaproteinen beträgt 5-15 Tage. Daher stellt
die Bestimmung des Fructosamin einen sich schneller auf glykämische Missstände
einstellenden Parameter als HbA1c dar und dient als ein Index für die intermediäre
Glucosekontrolle (1-3 Wochen) [64, 66]. Referenzkonzentrationen der glykierten
Proteine sind in Tabelle 5 dargestellt.
Ritz et al. [67] untersuchten die erhöhte α1-Antitrypsin- und HaptoglobinGlykosylierung als Index einer Hyperglykämie vor dem Tod.
Beide Peptide
glykosylieren deutlich schneller als Albumin oder Hämoglobin. Diese schnelle
Glykosylierung
glykämischen
erleichtern
Status
eines
die
Detektion
Patienten.
von
Die
schnellen
α1-Antitrypsin
Veränderungen
und
im
Haptoglobin-
Glykosylierung scheint eine ante- und post-mortem Unterscheidung zwischen
Normoglykämie
und
Hyperglykämie
zu
erlauben,
es
sind
jedoch
noch
umfangreichere Studien notwendig.
14
1. Einführung
HbA1c
im
IFCC
Blut
Einheit
HbA1c im
DCCT
Blut
Einheit
Fructosamin
Serum [µmol/l]
[mmol/mol]
[%]
15 - 44
3,5% - 6,2%
[58, 68]
[58, 69]
< 48
< 6,5%
< 320 [58]
Neubewertung der Therapie
> 64
>8%
320 - 370
erfolgen sollte
[71]
[71]
> 86
> 10 %
Während eines
> 109
> 12,1 %
Coma diabeticum
[73]
[73]
Nicht-Diabetiker
im
205 - 285
[58, 70]
Ziel der Einstellung in
der Therapie des Diabetes
Wert, ab dem eine
Patienten mit schlecht
eingestelltem Diabetes mellitus
> 370 [72]
Tabelle 5: Referenzkonzentrationen HbA1c und Fructosamin. IFCC = International
Federation of Clinical Chemistry; DCCT = The Diabetes Control and Complications
Trial.
1.4.3 Insulin, C-Peptid und Proinsulin
1.4.3.1 Strukturen und Biosynthese
Humanes Insulin ist ein Peptidhormon mit einer Molekülmasse von 5808 Da, das
vom Pankreas sezerniert wird. Es besteht aus 51 Aminosäuren, die sich auf zwei
Peptidketten verteilen, einer A-Kette mit 21 Aminosäuren und einer B-Kette mit 30
Aminosäuren. Die beiden Ketten sind über zwei Disulfidbrücken verbunden. Ein
Vorläuferprotein, Präproinsulin, wird im endoplasmatischen Retikulum der β-Zellen
des Pankreas gebildet und wird direkt nach der Synthese durch mikrosomale
Enzyme in Proinsulin gespalten.
15
1. Einführung
Abbildung 2: Abbau von Proinsulin zu Insulin und C-Peptid [74]
Proinsulin, das aus einer Einzelkette aus 86 Aminosäuren besteht (Abbildung 2), wird
in den Golgi-Apparat transportiert. Das Reifen sekretorischer Partikel im GolgiApparat ist verbunden mit der Spaltung von Proinsulin in Zwischenprodukte, in
Insulin und das C-Peptid. Das C-Peptid ist ein Polypeptid (31 Aminosäuren) mit einer
Molekülmasse von 3017 Da [75]. Unter physiologischen Bedingungen enthalten
gesunde reife sekretorische Granulae im Pankreas äquimolare Mengen an Insulin
16
1. Einführung
und C-Peptid plus 2-6 % intaktes und gespaltenes Proinsulin [76]. Wenn die β-Zellen
durch eine hohe Blutglucosekonzentration stimuliert werden, werden die beiden
Peptide in äquimolaren Mengen in den Blutstrom abgegeben. Insulin und Proinsulin
(Proinsulin weist nur 5-10 % der Bioaktivität von Insulin auf [77]) haben beide die
Fähigkeit, Blutglucoselevel zu senken. Die physiologische Funktion des C-Peptids ist
noch unklar.
1.4.3.2 Die Insulintherapie
In den letzten Jahren wurde das humane Insulinmolekül (Struktur in Abbildung 3)
modifiziert, sodass man heute humanes Insulin und synthetische Insulinanaloga in
der Therapie des Diabetes mellitus anwendet. Tabelle 6 zeigt den Wirkbeginn, das
Wirkmaximum und die Wirkdauer der verschiedenen Insuline auf dem deutschen
Arzneimittelmarkt. Nur zwei Darreichungsformen von humanem Insulin sind noch auf
dem Markt: lösliches reguläres Insulin und NPH (neutrales Protamin Hagedorn) und
Kombinationen der beiden. NPH-Insulin ist humanes Insulin, das an Protamin
gebunden ist.
Schnell wirkende Insulinanaloga sollen die postprandiale Insulinsekretion imitieren.
Insulin lispro, Insulin aspart und Insulin glulisin weisen eine beträchtlich geringere
Neigung zur Assoziation auf und sind daher nach subkutaner Injektion schneller
bioverfügbar und kürzer wirksam. Die Strukturen sind in Abbildung 3 dargestellt. Bei
Insulin lispro (Humalog®) sind in der B-Kette Pro28 and Lys29 gegeneinander
ausgetauscht. Die maximale Konzentration ist etwa 3mal höher als bei regulärem
Insulin in derselben Dosierung. Bei Insulin aspart (Novomix®) ist Pro28 gegen Asp
ausgetauscht. Es wird schneller als Humaninsulin resorbiert und erreicht eine
maximale Konzentration im Plasma, die doppelt so hoch ist wie die des
Humaninsulin. Bei Insulin glulisin (Apidra®) ist Lys29 gegen Glutamat ausgetauscht
während Asp3 gegen Lysin ausgetauscht ist. [78, 79]
17
1. Einführung
Abbildung 3: Strukturen von Humaninsulin (a) und dessen synthetischen Analoga
Insulin lispro (Humalog®, b), Insulin aspart (Novomix®, c), Insulin glargin (Lantus®,
d), Insulin glulisin (Apidra®, e) und Insulin detemir (Levemir®, f)
18
1. Einführung
Der Vorteil der langwirksamen Analoga (Insulin glargin, Insulin detemir) ist ihre
peakfreie
und
konstante
Wirkung,
welche
die
basale
oder
Hintergrundinsulinsekretion imitieren soll. Insulin glargin (Lantus®) kann durch eine
langsame Diffusion aus dem subkutanen Depot charakterisiert werden. Die
Änderung der Aminosäurekette(die B-Kette ist am C-Ende durch zwei Arginine
verlängert, in der A-Kette ist Asp21 durch Glycin ersetzt) verändert die pH-abhängige
Ladung des Moleküls, sodass Injektionslösungen einen pH von 4 aufweisen und die
Substanz in Wasser löslich ist. Nach der Injektion ins Gewebe kristallisiert Glargin
aus und entwickelt hexamere Assoziate, aus denen es nur langsam befreit wird.
Insulin detemir (Levemir®) stellt ein Konjugat aus genverändertem Insulin (das B Ketten Thr30 wird entfernt) und Myristinsäure an der nun letzten Aminosäure der BKette, Lys29, dar. In pH-neutraler Injektionslösung liegt detemir als Hexamer vor. Der
hydrophobe
Fettsäurerest
führt
das
Insulin
in
eine
erhöhte
Bindung
mit
Plasmaproteinen und zu einer verzögerten Freisetzung aus dem subkutanen Depot.
[78, 79]
Insulintyp
Wirkbeginn
Wirkhöhepunkt
Wirkdauer
Insulin lispro
0,2 - 0,5 h
0,5 - 2 h
3-4h
Insulin aspart
0,2 - 0,5 h
0,5 - 2 h
3-5h
Insulin glulisin
0,2 - 0,5 h
0,5 - 2 h
4h
Humanes Insulin
0,5 - 1 h
2-3h
6-8h
NPH
1-2h
5-7h
13 -18 h
Insulin glargin
1-2h
flach
20 h
Insulin detemir
1-2h
6-8h
17 - 20 h
Tabelle 6: Wirkbeginn, Wirkhöhepunkt und Wirkdauer von Normalinsulin und
synthetischen Insulinen auf dem Arzneimittelmarkt [79, 80]
19
1. Einführung
1.4.3.3 Referenzkonzentrationen
Die endogene Insulinkonzentration wird durch mehrere Faktoren beeinflusst:
Ernährungszustand, Adipositas, Alter, Geschlecht, Herkunft und auch durch die
Messmethode [81]. Leider basieren die Referenzkonzentrationen (Tabelle 7) meist
auf einer limitierten Anzahl (gesunder) Probanden, sie sollten allerdings auf den
dazugehörigen Glucosekonzentrationen basieren [80]. Am Tag werden ca.
454±108 nmol (7,217 nmol = 1U) Insulin und 367±89 nmol C-Peptid vom gesunden
menschlichen Pankreas abgegeben [82]. Ein Großteil dieses Insulins ist frei, nur ein
geringer Teil an Globuline gebunden [78]. Die Leber kann die Produktion von
Glucose komplett einstellen, wenn die Insulinkonzentration unter 50 µU/ml fällt [83].
Wenn im Gegensatz dazu in hypoglykämischen Situationen Glucosekonzentrationen
unter 81 mg/dl fallen, sinken die Insulinkonzentrationen und bei < 54 mg/dl wird kein
Insulin mehr sezerniert [84].
Die Bestimmung des C-Peptids ist zum Nachweis einer Injektion mit humanem
Insulin vonnöten [85], um die Sekretion des Pankreas zu evaluieren. Im Falle einer
Insulininjektion kann man nicht zwischen dem endogenen Insulin der β-Zellen und
injiziertem humanem Insulin unterscheiden. Die Insulininjektion verändert das molare
Verhältnis
humanes
Insulin
zu
C-Peptid
(I:C)
zugunsten
von
Insulin.
Insulinkonzentrationen im Serum sind hoch, C-Peptid-Konzentrationen sind durch
einen
negativen
Feedback-Mechanismus
[86],
der
die
Teilung
des
Proinsulinmoleküls stoppt, niedrig bzw. nicht detektierbar [48]. Sowohl Insulin als
auch das C-Peptid werden durch Enzyme mit unterschiedlichen Halbwertszeiten
(HWZ) abgebaut. Zirkulierendes intaktes Humaninsulin hat eine HWZ von 5 min [87]
und ist in 10-20 min aus dem Kreislauf verschwunden [88]. Der Insulinabbau ist die
Folge der Arbeit des Enzyms Glutathion-Insulintranshydrogenase in Leber, Niere,
Plazenta, Muskel und zu einem geringeren Ausmaß im Plasma an A- und B-Kette,
die vorher durch reduktive Spaltung der Disulfidbrücken getrennt wurden [89]. Etwa
50 % wird bei einem Durchgang durch die Leber entzogen. Das C-Peptid wird
hauptsächlich durch die Niere abgebaut, passiert die Leber ohne Extraktion durch
Hepatozyten und hat eine HWZ von 30 min. Daher hat das C-Peptid (4,4 ml/min)
eine erheblich niedrigere Clearancerate als Insulin (11-34 ml/min) [90]. Als
Konsequenz
erreichen
Zusammensetzung
ihre
Insulin
und
maximalen
C-Peptid
abhängig
Konzentrationen
zu
von
Größe
und
unterschiedlichen
Zeitpunkten nach Glucosezufuhr. Sie sind nicht in äquimolaren Mengen im Serum
20
1. Einführung
aufzufinden, die C-Peptid-Konzentrationen sind meist 5-10fach höher als die
Insulinkonzentrationen in venösem Blut (Referenzkonzentrationen in Tabelle 7).
Proinsulin wird nur in sehr geringen Mengen in den Blutstrom abgegeben. Von
Lebermetabolismus verschont, ist die HWZ höher als die des Insulins (90 min). So
akkumuliert Proinsulin im Blut und macht 15-20% der gesamten Menge Insulin plus
Proinsulin aus [91]. Das Verhältnis Insulin / Proinsulin wird mit 3,4:1 bei Typ 2
Diabetikern im Vergleich zu 6:1 beim Gesunden, 1:1 bei Insulinompatienten und 10:1
bei Sulfonylharnstoff-Überdosierungen beschrieben [92]. Neben intaktem Proinsulin
kommt im Plasma vor allem des31,32-Proinsulin vor, beide liegen in etwa
äquimolaren Mengen vor und werden als “Proinsulin-like material” bezeichnet [93].
Dieses ist bei Insulinom-Patienten [92, 94] und auch bei Typ 2 Diabetikern erhöht
[95, 96]. Die Proinsulinsekretion wird wie die endogene Insulin- und C-PeptidSekretion durch eine Hypoglykämie unterdrückt. In pharmazeutischen Präparaten ist
kein Proinsulin enthalten, weshalb das Auffinden im Plasma eines hypoglykämischen
Patienten ein Beweis dafür ist, dass aufgefundenes Insulin endogenen Ursprungs ist
[97].
Humaninsulin
C-Peptid
I:C-Verhältnis
Proinsulin
Nüchtern-
5 - 30 µU/ml
140 - 1120 pmol/l
0,13
< 11 pmol/l [102]
Refernzkonzentrationen
[85, 98, 99]
[100]
[101]
bei Nicht-Diabetikern
0,1
[92]
Bis zu 120 µU/ml
Bis zu 2800 pmol/l
0,19
8,5 - 11,3 pmol/l
[103]
[100, 104]
[101]
[9]
Bis zu 200 µU/ml
Bis zu 1596 pmol/l
0,12±0,47
[9]
[9]
[85]
Für die Diagnose einer
< 4,14 µU/ml
< 300 pmol/l
< 20pmol/l
Hypoglykämie
[105]
[105]
[105]
< 4,97µU/ml
< 200 pmol/l
< 5pmol/l
[106]
[106-108]
[107]
Nach Glucoseeinnahme
im
Lebenden
Tabelle 7: Referenzkonzentrationen von humanem Insulin, C-Peptid, dem molaren
Verhältnis Insulin : C-Peptid und von Proinsulin
21
1. Einführung
1.4.3.4 Insulin als Mordgift
Grundsätzlich ist eine Insulinvergiftung eine ineffektive (Selbst)Mordvariante
aufgrund der vergleichsweise langen Zeit (ca. 15-30 min) bis zum Eintritt einer
lebensgefährlichen Hypoglykämie. Weiterhin ist die Diagnose der entstehenden
Hypoglykämie im Lebenden relativ einfach und die Behandlung schnell und einfach
durchführbar [48]. Einige frühere Berichte dokumentieren, dass die Dosis des
injizierten Insulins unabhängig ist von der letztendlichen Prognose. Lindqvist et al.
[109] erachteten 100 U Humaninsulin als die minimal letale Dosis, während Marks
[48] 300 - 550 U als minimale letale Dosis ansah. Todesfolge hatte bereits eine Dosis
von 400 U Normalinsulin [110, 111], während Menschen Dosen bis zu 3000 U
überlebten und ihre volle Gesundheit wiedererlangten [112, 113]. Ein großer Bereich
an Dosen wurde für Suizide mit Insulin benutzt (von 100 bis 2000 U, im Durchschnitt
1220 U) [114]. Es konnte keine Korrelation zwischen den durch Täter angegebenen
Dosen und den post-mortem Konzentrationen gefunden werden [25].
1.4.4 Orale Antidiabetika
Für die Therapie von Typ 2- Diabetikern stehen auch Antidiabetika in peroraler Form
zur Verfügung. Wirkstoffgruppen, Wirkmechanismen und Wirkstoffe sind in Tabelle 9
dargestellt. Die Diagnose einer hypoglykämischen Entgleisung unbekannter Ursache
beinhaltet die Möglichkeit, dass der Patient diese oralen Antidiabetika eingenommen
hat. Bei der Entstehung von Hypoglykämien spielen hauptsächlich Sulfonylharnstoffe
eine Rolle, die aufgrund ihrer insulinotropen Wirkung häufig diese Nebenwirkung
aufweisen. Neben diesen können auch Glinide, die sich zwar strukturell, nicht aber in
ihrem Wirkmechanismus von den Sulfonyharnstoffen unterscheiden, Hypoglykämien
auslösen. Sie binden an Rezeptoren auf pankreatischen β-Zellen und stimulieren die
Insulinsekretion,
indem
Kaliumkanäle
inhibiert
werden.
PPARγ-Agonisten
(peroxisome proliferator-activated receptor) haben keinen Einfluss auf die Sekretion
von Insulin, erhöhen allerdings die Sekretion von Proteinen, die für den
Glucosetransport verantwortlich sind. So erhöhen sie die Glucoseaufnahme in die
Gewebe und führen nur selten zu Hypoglykämien.
Strukturen aller relevanten oralen Antidiabetika sind in Abbildung 4 dargestellt.
Peakplasmakonzentrationen werden 1-8 h nach Einnahme erreicht, das Einsetzen
von Hypoglykämien in Situationen akuter Überdosierung kann in weniger als 8
Stunden eintreten [115] aber auch für einige Tage verzögert sein [116].
22
1. Einführung
Wirkstoff
Maximale
Plasma- HWZ
Plasmakonz.[ng/ml] protein- [h]
bindung
[%]
Glibenclamid 100 1-2 h nach 1,75 99
mg
1,3
2,6
Hepatische
Metabolisierungsrate
[%]
- 100
renale
Wirkein- Maximale
Eliminierung tritt [h]
Wirkung
[%], davon
[h]
unverändert
[%]
Wirkdauer
[h]
50, 0
0,5
1,5 - 2
6 bis 8
2 bis 4
24
Glibornurid
1300; 2-4 h nach 25 95
mg
8
100
60 - 72, 0
0,5
Glisoxepid
110 ; 1h nach 4 mg
2
50
76, 60
0,5
0,75
Gliquidon
500 - 700; 2-3 h 99
nach 3 mg
4 bis 100
6
5, 0
1 - 1,5
Glipizid
450; 1-2 h nach 5 98
mg
2,7
bis 4
> 90
Gliclazid
2000 - 4000 4 h 85 - 97
nach 80 mg
12
99
Glimepirid
309; 2,5 h nach 4 > 99
mg
5 bis 100
8
93
- 1
bis 10
2 bis 3
4
65 - 68, 3 - 0,5
10
1 bis 2
8 bis 10
60 - 70, 0
2 bis 5
4
6
58, 0
0,5
2,5
12 bis 24
Tabelle 8: Pharmakokinetik und biologisches Verhalten der Sulfonylharnstoffe
[117-128]
Im Allgemeinen korreliert die biologische Wirkdauer von Sulfonylharnstoffen nicht mit
ihrer Plasmahalbwertszeit. Pharmakokinetische Daten und biologisches Verhalten
der Sulfonylharnstoffe sind in Tabelle 8 aufgeführt. Das Hypoglykämie-Risiko ist im
Allgemeinen bei den lang wirkenden Sulfonylharnstoffen größer als bei kurz
wirksamen. Aufgrund seiner hohen Lipophilie kumuliert vor allem Glibenclamid in den
β-Zellen und führt vermehrt zu Hypoglykämien [129]. In einer 5-Jahresstudie betrug
die Inzidenz der Hypoglykämien für Glibenclamid 8,3 %, für Glipizid 4,6 % und für
Gliclazid 2,3 % [129]. Aufgrund der geringen Kontaktzeit mit dem Rezeptor treten bei
Glimepirid Hypoglykämien seltener auf. Vergleichend ergaben sich Inzidenzen von
1,7 % bei Glimepirid, 2,4 % bei Glibenclamid oder 0,9 % vs. 1,2 % (gegenüber
Glipizid) [119, 130]. Da die Sulfonylharnstoffe der dritten Generation fast komplett in
ihrer metabolisierten Form in den Urin ausgeschieden werden (Metaboliten sind in
Tabelle 9 aufgeführt), müssen analytische Methoden, die Urin als Matrix benutzen,
diese Metaboliten erfassen können.
23
1. Einführung
Gruppe
Wirkmechanismus
Sulfonylharnstoffe
Insulinotrope Substanzen: Blockade Glibenclamid
von Kaliumkanälen in der β-Zelle führt
zu Depolarisation der Zellmembran
und
Aktivierung Glibornurid
spannungsabhängiger
Calciumkanäle. Aus der erhöhten
Gliclazid
cytosolischen Calciumkonzentration
resultiert
Insulinausschüttung
Wirkstoff
vermehrte
Hauptmetaboliten
im Urin
Hypoglykämie
als
Nebenwirkung
Hydroxymetabolit a
ja
Hydroxymetaboliten
b und c
Hydroxymetabolit d
Glimepirid
Hydroxymetabolit e
Glipizid
Muttersubstanz und
Hydroxymetabolit f
Glinide
Gliquidon
Hydroxymetabolit g
Repaglinid
Muttersubstanz
Nateglinid
Muttersubstanz und
ja
Hydroxymetabolit h
Glitazone
Agonisten an nukleären peroxisome Pioglitazon
proliferator-activated receptor PPARγ ,
erhöhen
Insulinsensitivität
der
Rosiglitazon
Gewebe
Hydroxymetabolit i
selten*
Hydroxymetabolit j
und
N-desmethyl
hydroxymetabolit k
Dipeptidyl
Peptidase-4
Inhibitoren
Verhindern den Abbau von Inkretinen
Sitagliptin
Muttersubstanz
- (glucagon like peptide 1 und glucose
Vildagliptin
dependent insulinotropic peptide),
Muttersubstanz
welche Synthese und Ausschüttung
Saxagliptin
von Insulin erhöhen
Muttersubstanz
selten*
a=N-(4-(b-5-Chloro-2-methoxybenzamidoethyl)benzenesulfonyl)-N´-(4-hydroxycyclohexyl)urea
b=1-[(1R)-2-endo-Hydroxy-3-endobornyl]-3-(p-(hydroxymethylphenyl)sulfonyl)urea
c=1-[(1R)-2-endo-Hydroxy-3-endo-hydroxybornyl]-3-(p-tolylsulfonyl)urea
d=1-(4-Hydroxymethylbenzenesulfonyl)-3-(3-azabicyclo[3.3.0]octyl)urea
e=1-[[p-[2-(3-Ethyl-4-methyl2-oxo-3-pyrroline-1-carboxamido)ethyl]phenyl]sulfonyl]-3-(trans-4-hydroxymethylcyclohexyl)urea
f=1-(4-Hydroxycyclohexyl)-3-[[p-[2-(5-methylpyrazinecarboxamido)ethyl]-phenyl]sulfonyl]urea
g=1-(4-Hydroxycyclohexyl)-3-[[4-[2-(3,4-dihydro-7-methoxy-4,4-dimethyl-1,3-dioxo-2(1H)-isochinoyl)ethyl]phenyl]sulfonyl]urea
h=N-[(trans-4-isopropanoylcyclohexyl)carbonyl]-D-phenylalanine
i= 5-(4-(2-(5-Hydroxyethyl-2-pyridyl)ethoxy)benzyl)-2,4-thiazolidinedione
j=5-[[4-[2-Methyl-2-(hydroxypyridinylamino)ethoxy]phenyl]methyl]-2,4-thiazolidinedione
k=5-[[4-[2-(Hydroxypyridinylamino)ethoxy]phenyl]methyl]-2,4-thiazolidinedione
Tabelle 9: Wirkstoffgruppen, Wirkmechanismen, Wirkstoffe und Hauptmetabolite der
oralen Antidiabetika (* Herstellerangaben)
24
1. Einführung
O
O
O
Cl
CH3
N
H
S N
H
O
N
H
O
N
OMe
a
NH
S
O
O
N
k
O
C2H5
O
O
N
N
S N
O H
N
H
NH
S
O
O
b
O
S
N
N
O H
N
H
O
CF3
CH3
O
N
F
N
H
N
N
c
NH2
F
N
O
F
N
O
N
O
N
H
N
N
H
S N
H
O
HN
m
HO
O
O
d
N
n
O
O
N
MeO
S
O
O N
O
O
O
N
H
e
N
CH2OH
S
O
N
H
O
N
H
N
O
H
N S
H3C
CH3
H D
N
O O D
N
H
g
D
CD3
DD
D
p
OH
O
O
O
H
N
O
CH3
CH3
o
S
O O
f
N
H3C
H
OH
NH2
OH
N
H
H
N
O
H3C
l
D
O
D
CD3
N
q
25
1. Einführung
O
O
C2H5
OH
HN
N D
D
CH3
O
D
O
CH3
CH3
S
NH
O
D
r
h
O
H3C
N
H
HO
OH
O
H
N
O
O
D
D
N
N
NC
i
D
s
Abbildung 4 : Chemische Strukturen oraler Antidiabetika: Glibenclamid (a), Gliclazid
(b), Glimepirid (c), Glipizid (d), Gliquidon (e), Glisoxepid (f), Glibornurid (g), Nateglinid
(h), Repaglinid (i), Rosiglitazon (k), Pioglitazon (l), Sitagliptin (m), Vildagliptin (n),
Saxagliptin (o) und die verwendeten Internen Standards Hydroxy-Tolbutamid-d9 (p),
Repaglinid-ethyl-d5 (q), Pioglitazon-d4 (r) und Vildagliptin-d3 (s)
1.4.5 Methylglyoxal
O
CH3
H
O
Abbildung 5: Strukturformel von Methylglyoxal
Methylglyoxal (MG, Pyruvaldehyd, 2-Oxopropanal, Acetylformaldehyd; Struktur in
Abbildung 5) ist ein hochreaktives Aldehyd. Es kann aus exogenen Quellen stammen
oder innerhalb des Körpers synthetisiert werden (Abbildung 6). Exogene Quellen von
MG sind Regenwasser [131], Nahrungsmittel [132] und Zigarettenrauch [133]. In vivo
entsteht es über einige Stoffwechselwege, unter anderem über AminosäureKatabolismus mittels Aminooxidasen, Aceton-Metabolismus und Glykolyse mittels
der MG Synthase [134]. Beim Aminosäureabbau von Threonin und Glycin kann aus
dem Zwischenprodukt Aminoaceton [135] durch oxidative Desaminierung MG
gebildet werden [136]. Weiterhin kann Aceton [137] in zwei Schritten durch die
Cytochrom P450 IIE1 Isoenzyme Aceton-Monooxygenase in das Zwischenprodukt
Acetol und weiter mittels der Acetol-Monooxygenase [138] in MG umgewandelt
26
1. Einführung
werden. Die Bildung des Ketonkörpers Aceton wird durch Diabetes induziert [139]
und die Enzymkapazität der Cytochrom P450 Isoenzyme kann durch verschiedene
physiologische und pathologische Umstände (z.B. Fasten oder Diabetes mellitus)
induziert werden [140]. Außerdem kann MG durch spontane nichtenzymatische
Eliminierung von Phosphat aus den Triosephosphaten Dihydroxyacetonphosphat
(DHAP) und Glycerinaldehyd-3-phosphat (G3P) entstehen [141, 142]. Bei diesen
Produkten handelt es sich um Zwischenprodukte der Glykolyse. MG kann auch
enzymatisch aus DHAP durch das Enzym Methylglyoxalsynthase gebildet werden
[143]. (Abbildung 6)
Unter normalen physiologischen Umständen wird die MG-Konzentration durch den
Metabolismus über die Enzyme Glyoxylase I und II, die reduziertes Glutathion als
Cofaktor benötigen, gering gehalten [144]. Unter hyperglykämischen Bedingungen
sind die MG-Konzentrationen im Plasma erhöht. In der Literatur zeigen sich sehr
unterschiedliche Angaben zu MG-Konzentrationen, die auf die unterschiedlichen
Aufarbeitungsprotokolle zurückzuführen sind (Tabelle 10). MG bindet aufgrund seiner
hoch elektrophilen Struktur an Sulfhydryl- und Aminogruppen von Membranproteinen
und formt so Konjugate, die sogenannten „Advanced Glycation End Products“ (AGE).
Dabei ist die Aldehydgruppe anfälliger für den Angriff einer anderen Gruppe als die
Ketogruppe
[145].
AGE
sind
komplexe
und
verschiedenartige
chemische
Verbindungen. Sie sind das Endprodukt der nichtenzymatischen Glykierungsreaktion
(nukleophile Addition) von Carbonylgruppen reduzierender Zucker (MG) mit freien
Aminogruppen von Proteinen (Maillard-Reaktion), Lipiden und Nukleinsäuren. Es
entsteht eine labile Schiffsche Base, die spontan zu einem stabileren Ketoamin
(Amadori-Produkt) umgelagert werden kann [146]. Die Bildung der Schiffschen Base
ist konzentrationsabhängig. Da die Konzentration an Proteinen in vivo als nahezu
konstant angesehen werden kann, ist die Konzentration an reduzierenden Zuckern
der
reaktionsbestimmende
Faktor.
Diabetische
Hyperglykämie
ist
damit
reaktionsfördernd. Für MG treten die in Abbildung 7 dargestellten Modifikationen von
Proteinen vor allem an Arginin- und Lysinresten auf [139]. AGE modifizieren
Membranfunktionen, was zu vaskulären diabetischen Komplikationen, erhöhtem
Bluthochdruck im Tiermodell, zu oxidativem Stress, Arteriosklerose oder Alzheimer
führt [147, 148].
27
1. Einführung
Glykolyse
Aceton - Metabolismus
Aminosäurenkatabolismus
Glukose
Fettsäuren
Proteine
Glukose - 6 phosphat
Acetoacetat
Glycin, Threonin
Fructose - 6 phosphat
Aceton
Aminoaceton
Aminoxidase
Fructose -1,6 bisphosphat
Acetol
Propandiol
Acetol - monooxygenase
Glyceraldehyd - 3 phosphat
Methylglyoxal-reduktase
Methylglyoxalsynthase
Dihydroxyaceton
phosphat
Laktaldehyd
METHYLGLYOXAL
Glyoxylase I and II
Oxoaldehyd-dehydrogenase
D - Laktat
Pyruvat
L - Laktat
phosphorylierende Glykolyse
Abbildung 6: Synthese und Metabolismus von MG
Protein
H
O
O
CH3
C4H8
COOH
N
+ Lysin
+
HC CH3
N
NH
C4H8
Methylglyoxal
CH3
C4H8
Protein
Protein
CEL
MOLD
H
O
O
CH3
OH
+ Arginin
Methylglyoxal
OH
CH3
H3C
N
N
HOOC
+
H3C
CH3 H3C
N
OH
NH
+
O
N
N
NH
NH
NH
C3H6
C3H6
C3H6
Protein
Protein
Protein
Argpyrimidin
Tetrahydropyrimidin 5-Hydro-5-methylimidazol
Abbildung 7: Bildung von verschiedenen AGEs durch Reaktion von MG mit Lysinund Argininresten von Proteinen [149]; MOLD: MG-Lysin-Dimer (1,3-di(Nε-lysino)-4methyl-imidazolium und CEL: Nδ-1-Carboxyethyllysin
28
1. Einführung
[150]
[156]
Typ
Diabetiker
(n=43)
Typ
Diabetiker
[151]
[152]
[153]
[154]
1 33,87 (6,19 - 13,6 ± 2,78
60,65 ± 17 34,52 ± 3,5
75,25) ng/ml ng/ml
158 ± 46 ng/ml ng/ml
ng/ml
(n=20)
(n=56)
(n=55)
(n=20)
(n=56)
259,4
ng/ml
(n=55)
5,75 (1,82 - 8,86 ± 2,66 Normal: 47 ± 31,648
± 18,45 ± 6,6 Im
Bereich 100,8
64,34) ng/ml ng/ml
12 ng/ml
6.49 ng/ml
ng/ml
von 720 ng/ml ng/ml
Diabetiker
(n=21)
(n=18)
165,7
±
165,7
±
14,4
(n=85)
Nicht -
(n=15)
±
(n=85)
2 20,66 (3,9 - 13,6 ± 27,8
60,65 ± 17 34,52 ± 3,5
170,78) ng/ml ng/ml
ng/ml
158 ± 46 ng/ml ng/ml
(n= 107)
[155]
259,4
ng/ml
(n=12)
(n=45)
Tabelle 10: Referenzkonzentrationen für MG in der Literatur
1.4.6 Anhydroglucitol
a
CH2OH
O
HO
b
CH2OH
OH
OH
O
HO
OH
OH
OH
Abbildung 8: Strukturformel von AG (a). Im Vergleich zu Glucose (b) fehlt die
Hydroxygruppe in Position 1.
1,5-Anhydroglucitol (AG, Abbildung 8), die 1-Deoxy-Form von Glucose, wird über die
Nahrung aufgenommen und konkurriert mit Glucose um die Reabsorption über den
spezifischen Transporter SGLT4 (sodium dependent glucose transporter) in der
Niere[157].
Normale
Plasma-AG-Konzentrationen
können
während
hyperglykämischen Phasen aufgrund der Hemmung der normalerweise hohen
(> 99 %) tubulären Reabsorption dramatisch erniedrigt sein. Bei Normoglykämie
bleibt AG aufgrund der im Vergleich zu der Nahrungseinnahme großen
Körperreserve und aufgrund des fehlenden Metabolismus bei konstanten Steady
State Konzentrationen [157]. Wenn die Blutglucosekonzentration die renale Schwelle
für Glucose von 180 mg/dl übersteigt, fällt die Konzentration von AG in enger
Beziehung zum Ausmaß der Glucosurie [158]. Daher zeigen Patienten mit Diabetes
signifikant niedrigere AG-Serumkonzentrationen als Nicht-Diabetiker [158, 159]. Es
wurde gezeigt, dass die Messung von AG eine Alternative zur Bestimmung des HbA1c
darstellt, da es schnelle Veränderungen im glykämischen Status, vor allem
postprandiale Hyperglykämien, genauer prognostizieren kann als HbA1c oder
29
1. Einführung
Fructosamin [159]. Referenzkonzentrationen für AG werden im Mikrogramm pro MilliliterBereich für Nicht-Diabetiker beschrieben (26,6±7,2 µg/ml bei Männern, 21,5±6,0 µg/ml bei
Frauen [160]). Diabetiker gelten mit AG-Konzentrationen zwischen 10 und 13,9 µg/ml
als
exzellent,
zwischen
6,0
und
9,9
µg/ml
als
gut
und
bei
< 6 µg/ml als schlecht eingestellt [160].
1.4.7 Ketonkörper
Die diabetische Ketoazidose stellt einen medizinischen Notfall dar und wird zunächst
durch
eine
erhöhte
Ketonkörperproduktion
(Aceton,
Acetoacetat
und
β-Hydroxybutyrat) gekennzeichnet [161]. Die Produktion dieser Ketonkörper wird von
einer äquimolaren Menge von Wasserstoffionen begleitet und verursacht daher eine
Azidose [162]. Die Hauptketonkörper β-Hydroxybutyrat (27-86 µmol/l nüchtern und
11-31 µmol/l postprandial [163]) und Acetoacetat (28-203 µmol/l [73]) sind im Blut
normalerweise in äquimolaren Mengen aufzufinden. Aceton, normal nur in geringen
Konzentrationen
aufzufinden
(0,8-2,4
mg/l
[164]),
wird
durch
spontane
Decarboxylierung aus Acetoacetat gebildet. Die Konzentrationen unterscheiden sich
kaum zwischen diabetischen und nicht-diabetischen Patienten. Das Verhältnis
Acetoacetat zu β-Hydroxybutyrat ist eng mit dem NAD+/NADH-Verhältnis der
Lebermitochondrien verknüpft und Änderungen in diesem Verhältnis spiegeln den
pathophysiologischen Status der Leber wider. Jeder Zustand, der den Redoxstatus
der hepatischen Mitochondrien verändert, indem er die NADH-Konzentrationen
erhöht (Hypoxie, nüchterner Status, diabetische Stoffwechselentgleisungen wie
Hypoglykämie und Ketoazidose, alkoholische Ketoazidose, Lebererkrankungen,
hepatische Ischämie, generell oxidativer Stress), verschiebt das Gleichgewicht
zwischen Acetoacetat und β-Hydroxybutyrat zugunsten des β-Hydroxybutyrats.
β-Hydroxybutyrat macht dann ungefähr 75 % der Gesamtketonkörper aus [165].
Daher muss β-Hydroxybutyrat in die analytischen Methoden mit aufgenommen
werden [73]. Eine Acetonkonzentration > 21 mg/l spricht für eine diabetische
Ketoazidose [166], in diesen Fällen wurden Acetonkonzentrationen im FVB von
0-2900 mg/l [167], 50-800 mg/l [168] und 146-748 mg/l [168] beobachtet.
30
1. Einführung
1.5
Analytik
1.5.1 Glucose und Laktat
Die Präanalytik ist aufgrund fehlender Stabilität des Analyts Glucose von enormer
Wichtigkeit: Empfohlen wird der Zusatz von Glykolyse-Inhibitoren wie Natriumfluorid
(2,5 g/l oder 4,3 g/l Natriumfluorid und Calciumoxalat als Antikoagulans [169]),
Maleinimid, Lithiumiodacetat oder Mannose (2 g/l) [58, 170] zur Stabilitätserhöhung.
Die Glucosekonzentration ist in diesen Behältnissen dann für 12 Stunden bei
Raumtemperatur, für 2 [171] bis 6 Tage [172] bei 4°C und einige Monate [172] bei
-20°C konstant. Im Lebenden sollte Blut aus Arterien zur Glucosemessung
herangezogen
zurückgegriffen.
werden.
Im
Leider
nüchternen
wird
häufig
Zustand
ist
auf
venöses
dies
kein
oder
Kapillarblut
Problem,
da
die
Glucosekonzentration dann in arteriellem wie in venösem Blut ähnliche Werte
aufweist. Im postprandialen Zustand ist die arterielle Konzentration aber um
ca. 36-54 mg/dl höher als die venöse. Laktatkonzentrationen sind dagegen im
venösen Blut um 20% höher [58].
Die empfohlene Referenzmethode zur Bestimmung von Glucose ist die Hexokinaseglucose-6-phosphatase Technik. Weitere Methoden sind die Glucoseoxidase- oder
die Glucosedehydrogenase-Methode [58]. Für die Laktatbestimmung wird meistens
die Reaktion mit dem Enzym Laktatdehydrogenase erfasst, wobei die Produktion von
NADH2 photometrisch gemessen wird [58]. Ebenso besteht die Möglichkeit der
enzymatischen Umsetzung mit der Laktatperoxidase [173].
1.5.2 Glykierte Proteine
Bei den meisten Methoden wird HbA1c quantifiziert, bei anderen das “gesamte
glykierte Hämoglobin”, welches sowohl HbA1c als auch weitere HämoglobinGlucose-Addukte beinhaltet. Eine Referenzmethode zur Bestimmung des HbA1c
wurde entwickelt [174], um eine einheitliche Normierung der HbA1c-Messung zu
erreichen. In dieser Methode wird Hämoglobin in einem ersten Schritt mittels des
Enzyms Endoproteinase Glu-C in Peptide gespalten, in einem zweiten Schritt werden
die erhaltenen glykierten und nicht-glykierten N-terminalen Hexapeptide der β-Kette
per
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC)
getrennt
und
mittels
Elektrospray-Massenspektrometrie (ESI-MS) quantifiziert. Der HbA1c ist bei 4°C für
31
1. Einführung
mindestens 40 Tage [175], in Behältnissen mit Natriumfluorid für 3 Monate und in
Behältnissen mit Heparin für 6 Monate konstant [176].
Die verbreitetste Methode zur Bestimmung des Fructosamins beruht auf der
Fähigkeit von Ketoaminen, NBT (nitroblue tetrazolium) bei pH 10,35 zu Formazan zu
reduzieren [65]. Seit der ersten Beschreibung dieses Tests gab es einige Berichte
über
Störungen
und
Verbesserungen
(zusammengefasst
in
[165]).
Eine
Hyperproteinämie kann zu falsch erhöhten, eine Hypoproteinämie zu falsch
erniedrigten Resultaten führen [165]. Serum für die Fructosamin-Bestimmung kann
für 24 h bei Raumtemperatur [177], für zwei Wochen bei 4°C [177] und für einige
Monate bei - 20°C [65] gelagert werden.
1.5.3 Humanes Insulin
Bei der Präanalytik sind vor allem die Störungen der Insulinanalytik wie Hämolyse
und die Stabilität des Insulins zu beachten. O´Rahilly zeigte, dass nur schwach
ausgeprägte Hämolyse einen merklichen Effekt auf die Insulinkonzentration im
Plasma hat [178]. Das insulin-degrading enzyme (IDE), eine peroxisomale Protease
[179], ist in diversen Geweben anzutreffen, unter anderem in den roten
Blutkörperchen und besonders im Hämolysat [180]. Eine schnelle Trennung des
Serums, Lagerung bei niedriger Temperatur und der Zusatz von IDE-Inhibitoren
können dem entgegenwirken. Die effektivsten Inhibitoren sind Sulfhydrylgruppenmodifizierende Agenzien wie Diamid, p-Hydroxymercuribenzoat (1 mmol/l) [181] und
p-Chloro-mercuriphenylsulphonsäure (100 mg/l) [80, 178, 182]. N-Ethyl-maleimid
(1 mmol/l) erwies sich als effektiver Inhibitor [183], es mangelte allerdings an
Löslichkeit in Wasser [182]. Insulinkonzentrationen sind bei 4°C bis zu 5 Tage [184],
bei -20°C für einige Monate stabil. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen hatte keinen
Einfluss auf die gemessene Konzentration [185-187].
Normalerweise werden zur Routinemessung von Insulin verschiedene Arten
Immunoassays genutzt (zusammengefasst in [74, 81]). Doch Proinsulin und weitere
Proinsulin-ähnliche Moleküle (und Anti-Insulin Antikörper) in humanem Plasma
machen 10-20 % und bei Diabetikern sogar mehr als 20% der Immunogenität der
Insulin-ähnlichen Moleküle aus [95, 188, 189]. Daher muss die Spezifität dieser
Immunoassays stark in Frage gestellt werden. Die Kreuzreaktivität variiert von
40-100%,
je
nach
benutztem
polyklonalen
Antikörper,
Probenverdünnung,
Inkubationszeit und Inkubationstemperatur [80]. Weitere potentielle Assayprobleme
32
1. Einführung
sind Sensitivität, Standardisierung und Referenzkonzentrationen [190-192]. Weiterhin
können kommerziell erhältliche Immunoassays, die für die Bestimmung von
humanem Insulin entworfen wurden, synthetische Insuline nur teilweise oder gar
nicht erfassen und führen so zu falschen Ergebnissen, auch wenn inzwischen schon
verbesserte Immunoassays erarbeitet wurden [193, 194]. Für forensische Zwecke
wären massenspektrometrische Methoden vonnöten. In der Dopinganalytik wurde
eine Methodik veröffentlicht, mit der ein eindeutiger Nachweis von humanem Insulin
und synthetischen Insulinanaloga und Metaboliten in Urin- und Plasmaproben gelingt
[195].
1.5.4 C-Peptid
Blut für die C-Peptid-Analytik sollte in Röhrchen mit Heparin gesammelt werden,
während EDTA nicht zu gebrauchen ist [196]. Serum sollte von Blutbestandteilen so
schnell wie möglich getrennt und sofort bei -20°C gelagert werden. Dann ist die
C-Peptidkonzentration für 40 Tage stabil [197]. Ansonsten wird das C-Peptid schnell
abgebaut [198]. Die gesamte Plastik- und Glasware, die in Kontakt mit C-Peptidhaltigen
Lösungen
(auch
Serumalbuminlösung
Matrixlösungen)
versetzt
sein
[194],
steht,
da
sollte
das
mit
Peptid
einer
sehr
1%igen
leicht
an
Glasoberflächen adsorbiert und sich so einer Messung entzieht. Eine weitere
Möglichkeit, dem entgegenzuwirken, ist die Nutzung sogenannter „low protein-bind
polypropylen“-Röhrchen [199]. Die Herausforderung bei der C-Peptid-Messung liegt
nicht unbedingt in der Sensitivität der analytischen Methode, sondern vor allem in der
Präanalytik und Probenvorbereitung [200]. Wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen
scheinen variable oder keine Effekte auf die gemessene C-Peptidkonzentration zu
haben [81].
Immunoassays
für
die
Analyse
des
C-Peptids
in
Plasma
sind
etabliert
(Zusammenfassung in [98, 201, 202]). Da das C-Peptid jedoch ein relativ kleines
Peptid ist, ist seine Antigenität und dadurch die Spezifität von Immunoassays gering.
Es besteht ein Mangel an Übereinstimmung zwischen RIA und ELISA und auch
verschiedenen RIAs [98, 203], der auf die unterschiedlichen Antikörperspezifitäten
oder Matrixeffekte zurückzuführen sein könnte. In vergleichenden Studien ergaben
Immunoassays
häufig
übereinstimmend
höhere
Ergebnisse
als
massenspektrometrische Methoden [204]. Zur C-Peptid-Immunoreaktivität könnten
katabolische Produkte des C-Peptids mit einer erhöhten Halbwertszeit beitragen.
33
1. Einführung
Alternativen
zu
Immunoassays
in
forensischen
Laboren
stellen
LC-MS/(MS)-Methoden nach Ultrafiltration des Urins [98, 203, 205] oder nach SPE
[203] und anschließender positiver [204, 205] oder negativer Ionisation [179, 206]
dar.
1.5.5 Proinsulin
Da die IDE nur eine geringe Aktivität gegenüber Proinsulin aufweist [200], ist das
Proinsulin in Serum relativ stabil. Keine Effekte zeigten wiederholte Einfrier- und
Auftauzyklen [81]. Proinsulin wird meistens mittels immunologischer Verfahren
bestimmt (Zusammenfassung in [207]). Indirekte RIA, die auf einer Trennung des
Proinsulins von Insulin und C-Peptid vor der Analyse basieren [92, 208, 209] oder
direkte RIA, die polyklonale Antikörper gegen Proinsulin benutzen [210, 211], wurden
beschrieben. Auch diese mussten sich Kritik stellen, da sie nicht zwischen intaktem
Proinsulin und Zwischenstufen unterscheiden können [212-215]. Vor allem die
Kreuzreaktivität zu Des64,65-Proinsulin und gespaltenem 65/66-Proinsulin ist
problematisch. In der Literatur wird keine massenspektrometrische Methode
beschrieben, auch weil eine Referenzsubstanz nicht erhältlich ist.
1.5.6 Orale Antidiabetika
Analytische Methoden zur Bestimmung einzelner Sulfonylharnstoffe basieren auf
GC-
oder
HPLC-Trennung
[216,
217]
oder
mizellarer
elektrokinetischer
Kapillarchromatographie mit Diodenarray- oder UV-Detektion [218]. Die ESI-LC-MSAnalytik von 4 Sulfonylharnstoffen im Serum [219] oder APCI (Atmospheric pressure
chemical ionization)-LC-MS [220] zur Bestimmung aller Sulfonylharnstoffe wurde
beschrieben. Zwei Publikationen zeigten erfolgreiche simultane Nachweise von
Sulfonylharnstoffen, Gliniden und Glitazonen in Pferdeplasma [221] und humanem
Urin [222].
1.5.7 Methylglyoxal
Eine verlässliche Quantifizierung von MG von Probe zu Probe fällt schwer. Die
direkte quantitative Messung von MG wird durch die hohe Reaktivität erschwert. Zur
Quantifizierung von freiem bzw. reversibel gebundenem MG werden daher
Derivatisierungsmittel verwendet, die eine weitere Reaktion verhindern. Als
Derivatisierungsreagenz
dienen
o-Phenylendiamin
Dichloro-1,2-phenylendiamin,
4,5-Methylendioxy-1,2-phenylendiamin
[156],
[223],
34
1. Einführung
o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamin
HCl
(PFBOA)
[224],
Dinitrophenylhydrazin [225] oder 9-(3,4-diaminophenyl)acridin [223, 226]. Die
entstehenden Chinoxaline können über HPLC oder GC [156] nachgewiesen werden.
Chinoxaline besitzen konjugierte Doppelbindungen und sind Fluorophore [227]. Es
wurde auch eine GC-Methode ohne Derivatisierung beschrieben [159].
1.5.8 Anhydroglucitol
Es sind zwei enzymatische Assays zur Bestimmung von AG in klinischen Serumproben
kommerziell erhältlich, der GlykoMark® Test [160] und der Determiner-L-1,5-AG® (Kyowa
Medex, Japan) [228], die bei vergleichenden Untersuchungen ähnliche Ergebnisse
lieferten [160]. Bei diesen Tests wird nach Oxidation des AG zu 1,5-Anhydrofructose
durch die Pyranoseoxidase ein Wasserstoffperoxid-Reaktionsprodukt mit einem
Standard-Peroxidase-Assay kolorimetrisch vermessen. Da Glucose ebenfalls durch die
Pyranoseoxidase oxidiert wird, kann sie die Messung stören. Daher wird die Probe
zunächst mit Glucosekinase versetzt, die Glucose zu Glucose-6-phosphat umwandelt.
Obwohl diese Tests sehr sensitiv und robust sind, wurden Interferenzen mit Glucose,
Bilirubin, Hämoglobin [229], Maltose [230] oder Myo-Inositol [231] beschrieben. Um dies
zu umgehen, nutzten Tanabe et al. [232] ein “Flow-Injektions”-System, in dem diese
interferierenden Substanzen durch eine online Anionenaustauschersäule vor der
Enzymreaktion adsorbiert wurden.
Weiterhin wurde eine HPLC-Methode mit gepulster amperometrischer Detektion nach
Passieren der Probe durch eine 2- oder 3- schichtige Anionenaustauschersäule
beschrieben [233]. Eine fluorometrische Methode nach Derivatisierung mit Benzoesäure
wurde ebenfalls beschrieben [157, 234]. Auch massenspektrometrische Methoden
wurden genutzt: GC-MS [235, 236] ebenso wie LC-MS-Methoden, die AG im negativen
Ionisierungsmodus [235] mit ESI [230, 236] oder APCI [235] nach Trennung aufgrund
der polaren Eigenschaften des AG über eine polare Säule erfassten (Amidphase [236],
hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) mit einer Amino-Säule [230] oder
ein sulfoniertes Styren-Divinylbenzen Copolymer mit Zinkionen [237, 238]).
1.5.9 Ketonkörper
Für klinische Fragestellungen wird meistens die eine lila Farbe produzierende
Reaktion zwischen Ketonen und Nitroprussid photometrisch beobachtet [239]. Diese
Methode ist in Form von Vorteststicks und Tabletten kommerziell erhältlich
35
1. Einführung
(Ketostix®, Acetest®) und eignet sich zur Analyse von Ketonkörpern in Blut und Urin
[240]. Diese Nitroprussid-Methode misst allerdings nur Acetoacetat [241], es sei
denn, die Reagenzien enthalten Glycin. In diesem Fall wird Aceton ebenfalls erfasst
[71]. Die American Diabetes Association empfahl für die Routinebestimmung von
Hydroxybutyrat [162] eine enzymatische Methode, während der das aus NAD
produzierte NADH photometrisch erfasst werden kann. In der forensischen Praxis
sollte die Head-Space gaschromatographische Methodik nach Felby et al. [242]
benutzt werden.
Die Methode beruht auf der Umwandlung von Acetoacetat und
β-Hydroxybutyrat in Aceton und anschließender Bestimmung des Acetons mittels
Headspace-Gaschromatographie. Weitere beschriebene Methoden, die forensischen
Ansprüchen genügen, sind GC/MS-Techniken nach Derivatisierung mit TBDMS
[243-245] oder noch besser ESI-MS [246].
Für die Ketonkörperbestimmung kann sowohl zentrales venöses Blut als auch
arterielles Blut genommen werden [247]. Bei 4°C sind die Ketonkörper für
mindestens 24 h stabil [247]. β-Hydroxybutyrat ist für mindestens zwei Tage im Blut
stabil [248]. Acetoacetat dagegen ist weniger stabil und unterliegt einer nichtenzymatischen Decarboxylierung zu Aceton [249]. Proben sollten bei -20°C gelagert
werden.
1.6
Nachweis von Glucosestoffwechselentgleisungen im Lebenden bei
forensischen Fragestellungen
Blut- oder Serumglucose wird bei forensischen Fragestellungen normalerweise nur
bei absolutem Verdacht auf eine Hypoglykämie am Tat- bzw. Unfallort direkt mittels
eines tragbaren Glucosemeters gemessen. Ein solcher Fingerkuppentest dient nur
als klinischer Anhaltspunkt und ist in forensisch relevanten Fällen unzuverlässig. Die
Aufnahme von Nahrung oder schnell resorbierbaren Kohlenhydraten oder die
intravenöse Zufuhr von Glucose durch einen Arzt am Ort des Vorfalls, die Einnahme
anderer Medikamente oder der totale Verlust der Inselzellfunktion, wie er in manchen
Fällen mit akuter Pankreatitis oder Trauma zu beobachten ist [250], können eine
Verfälschung der aktuellen glykämischen Situation darstellen und müssen beachtet
werden. Weiterhin kann eine Erhöhung der Glucosekonzentration durchaus durch
eine „Alarmreaktion“ des Körpers im Todeskampf in Assoziation mit einer erhöhten
36
1. Einführung
Ausschüttung von Catecholaminen zustande kommen [251]. Die Gabe von Adrenalin
zur
Unterstützung
von
Glykogenmobilisierung
Wiederbelebungsmaßnahmen
fördern,
während
kann
außerdem
Wiederbelebungsmaßnahmen
die
das
mobilisierte Glykogen und Glucose durch die Zirkulation pumpen können [252].
Weiterhin können Hypoglykämien sich auch von selbst ohne die Zufuhr von Zucker
korrigieren [114]. Daher sollte beim Lebenden alles dafür getan werden, genug Blut
während der mutmaßlich hypo- (oder hyper)glykämischen Episode zu sammeln. Bei
Verkehrsunfällen wird leider häufig Glucose gar nicht bzw. viel zu spät gemessen.
Einerseits werden Blutproben 1-2 h nach einem Verkehrsunfall von den örtlichen
Behörden genommen, andererseits sinkt die Glucosekonzentration mit dem Moment
der Abnahme stetig ab. Die Glykolyse baut Glucose bei fehlendem Zusatz von
Glykolyseinhibitoren anaerob mit einer Geschwindigkeit von bis zu 13 mg/dl/h zu
Laktat ab, sodass die gesamte Blutglucose abhängig von der Temperatur in 6-8 h
abgebaut ist [253].
Neben dem Nachweis der Hypoglykämie kann anschließend auch die Ursache
mittels analytischer Methoden aufgeklärt werden. Dafür sollten orale Antidiabetika,
synthetische Insuline, humanes Insulin und das C-Peptid bestimmt werden. Bei
Verdacht auf Injektion von humanem Insulin ist die C-Peptid-Analytik unablässig. In
klinischen Proben kann laut immunchemischen Messungen I:C zwischen einer
exogenen Humaninsulingabe (I:C>1, hohe Insulinkonzentration und niedrige
C-Peptid-Konzentration) und einer durch ein Insulinom (I:C<1, wie gesunde
Menschen) oder einer Überdosierung mit oralen Antidiabetika (hohe Insulin- und
hohe C-Peptidkonzentrationen) ausgelösten Hypoglykämie unterscheiden [166].
1.7
Nachweis von Glucosestoffwechselentgleisungen post mortem
Nach dem Tod hat die Blutglucosekonzentration kaum noch Aussagekraft. Diese
verhält sich im toten Körper genau wie nach Abnahme aus einem lebenden
Menschen: Der maximale Wert im Moment des Todes sinkt rapide ab
(ca. 13 mg/dl pro Stunde [166]), sodass sich aus der absoluten Glucosekonzentration
kein Hinweis auf die Konzentration zum Zeitpunkt des Todes ergibt. Daraus
resultierend steigen die Laktatkonzentrationen bis zu zehn Stunden nach dem Tod
mit einer Geschwindigkeit von 10-15 mg/dl/h an [254]. Neben Blut werden in der
37
1. Einführung
Forensik daher häufig die Matrizes Glaskörperflüssigkeit (GKF) und Liquor
cerebrospinalis (CSF) zur Analyse herangezogen. Die Glucosekonzentrationen in der
GKF korrelieren gut mit der Blutglucose vor dem Tod [255] und betragen ca. 50 %
[256] bis 85 % [257] der ante mortem Blutkonzentrationen. Die GKF ist weniger
bakterieller Kontamination, Autolyse, biochemischen Fäulnisprozessen wie z.B. einer
Glykolyse ausgesetzt. Ein Nachteil ist das geringe Volumen der GKF. Trotzdem hat
die Glykolyse Einfluss (stündliche Abnahme von 35-70 % in den ersten 6 Stunden
nach dem Tod bei Raumtemperatur) auf die Glucosekonzentration in der GKF [73]
und in der CSF (5 mg/dl/h normal und 45 mg/dl/h bei Todesursache diabetisches
Koma [258]). Nach dem anfänglichen Abfall der Glucosekonzentration bleibt sie dann
für einige Tage stabil [259]. Im Gegensatz dazu steigt die Laktatkonzentration weiter
leicht an.
Neben der Glucosekonzentration allein kann auch die Addition der Glucose- und
Laktatkonzentration in der GKF bzw. im Liquor [260] in mg/dl weiterhelfen [258].
Diese sogenannte „Summenformel nach Traub“ kann zur Diagnose einer
Hyperglykämie herangezogen werden (siehe Tabelle 11), gibt aber laut Zilg et al.
keine weiteren Hinweise als die Glucosekonzentration alleine [114]. Aufgrund der
steigenden
Laktatkonzentration
zeigten
einige
Studien
einen
Anstieg
der
Summenformel bis 30 Stunden [261, 262] oder 2 Tage nach dem Tod [114]. Nach
diesem Intervall bleibt sie für ca. 1 Woche stabil [263]. Bei der Benutzung der
Summenformel sollte daran gedacht werden, dass Laktat in vivo auch bei malignen
Tumoren,
chronischen
Entzündungserkrankungen,
Urämie,
Ateminsuffizienz,
entzündlichen Erkrankungen des ZNS, Fasten oder Alkoholismus vermehrt gebildet
wird [258, 262, 264]. Einige Autoren [254, 256] zeigten, dass die Benutzung der
Summenformel zu einer Überschätzung der Hyperglykämie-Fälle führen kann und
die Glucosekonzentration alleine in der GKF zur Diagnose besser geeignet ist.
Die Glucosekonzentration im Urin ist weniger verlässlich. Glucose wird in den
Nierentubuli rückresorbiert. Obwohl Glucose im Urin von Patienten mit erhöhter
Blutglucosekonzentration detektierbar ist (> 30 mg/dl bei Diabetikern, < 15 mg/dl bei
Nicht-Diabetikern), gibt es keinen Hinweis über die aktuelle Blutglucosekonzentration
unter der sehr variablen renalen Glucoseschwelle (ungefähr 180 mg/dl) [9, 73]. Das
bedeutet, dass man im Falle einer negativen Uringlucose nicht zwischen einer
Hypoglykämie, Euglykämie oder einer milden oder mäßigen Hyperglykämie
unterscheiden kann. Während diabetischer Komata wurden Werte > 500 mg/dl
38
1. Einführung
beobachtet (Mittel 1549 mg/dl) [265]. Urinkonzentrationen > 100 mg/dl geben einen
Hinweis auf abnormale Blutglucosekonzentrationen [266]. Die Bestimmung der
Glucosekonzentration im Urin kann nur als Plausibilitätskontrolle dienen, um sich
einer Hyperglykämie zu versichern.
Glucose
Glucose
in GKF
CSF
[mg/dl]
[mg/dl]
in
30-80 [80]
Nicht-
3-60
[70, 267]
Diabetiker
0-75
[167]
Laktat in GKF
Laktat in CSF
Summenformel in GKF
[mg/dl]
[mg/dl]
[mg/dl]
20,5 -211,3
40-70
[70]
0-108 [268]
10,8-210,6
10-19
[70]
[58]
MW 90 [70]
Diabetiker
2-674
[267]
51,5-207,7 [167]
3-872
[256]
63-331
[268]
> 200
[167]
54-207
[70]
formel in CSF
[mg/dl]
31-508
[268]
Summen-
[167]
30,5-211,3
[268]
46-236
[254, 256]
79-830
[268]
108-973
[167]
323-1400
[269, 270]
191-1100
[268]
0,9- 668 [70]
Grenzwerte für
eine
tödliche
> 300
Hyperglykämie
[261]
> 200
[90]
> 410
[271]
> 427
[272]
> 450
[273]
> 650
[260]
>362
[272]
>400
[73]
>415
[271]
>422
[273]
>500
[9]
Tabelle 11: Glucose- und Laktatkonzentrationen post mortem
Auch die Bestimmung des HbA1c ist von einiger Bedeutung in der post mortem
Diagnose eines tödlichen diabetischen Komas, da es für einige Wochen nach dem
Tod
stabil
[73,
274]
und
von
einer
Hämolyse
verschont
bleibt
[175].
HbA1c-Konzentrationen von Diabetikern post mortem liegen bei 8,7-15,4%
[266, 275] bzw. 7,5-19,6% [274] und entsprechen so den Konzentrationen lebender
Diabetiker.
Erhöhte
HbA1c-Konzentrationen
(>
10%)
korrelieren
mit
der
Summenformel nach Traub im Liquor [72]. Umgekehrt ist das allerdings nicht der
Fall. Für die post mortem Analytik erweist sich HbA1c als leicht handzuhaben: Es
wurden keine oder nur geringe Unterschiede zwischen den Probeentnahmeorten am
Körper gezeigt (rechtes oder linkes Herzblut, Femoralvenenblut) [275]. Winecker et
al.
[72]
zeigten
keinen
Einfluss
der
Lagerung
(EDTA/NaF)
auf
die
HbA1c-Konzentrationen. Die HbA1c-Konzentration stellt aber nur einen Hinweis auf
die längerfristige Einstellung des glykämischen Status dar.
Ein weiterer Parameter, um auf die glykämische Einstellung des Verstorbenen in den
Wochen
vor
dem
Tod
zu
schließen,
ist
das
Fructosamin.
Fructosamin39
1. Einführung
Konzentrationen zeigen bis 72 Stunden nach dem Tod keine signifikanten
Änderungen [276-278]. Einige Studien zeigten, dass die Fructosaminkonzentrationen
im Blut bei Diabetikern im Vergleich zu Nicht-Diabetikern um das Doppelte erhöht
sind
[72].
Post
mortem
wurden
keine
Unterschiede
zwischen
den
Probeentnahmeorten am Körper (rechtes oder linkes Herzblut, Femoralvenenblut) für
Fructosamin gezeigt [268]. Auch der Nutzen einer Fructosaminbestimmung in der
GKF konnte nachgewiesen werden. Nicht-Diabetiker zeigten Konzentrationen
zwischen 0 und 1300 µmol/l (MW 200 µmol/l; [70, 267]) oder im Mittel 500 µmol/l
[268],
während
Diabetiker
Fructosaminkonzentrationen
von
0-590
µmol/l
(MW 800 µmol/l; [70, 267]) oder im Mittel 1500 µmol/l [70, 267] in der GKF
aufwiesen. Osuna et al. [109] beobachteten eine statistisch signifikante Korrelation
zwischen GKF-Fructosamin und der β-Hydroxybutyrat-Konzentrationen in Fällen von
diabetischer Ketoazidose.
Für den Nachweis einer Hypoglykämie stehen neben der Summenformel nach Traub
vor allem der Nachweis der Ursache der Hypoglykämie durch Analytik von
synthetischen Insulinen, humanem Insulin, oralen Antidiabetika und C-Peptid zur
Verfügung. Forensische Wissenschaftler berichteten jedoch von einer hohen Varianz
von Insulinkonzentrationen post mortem [85]. Nach Iwase et al. [109, 279] sinken die
Insulinkonzentrationen nach dem Tod stark ab. In Leichenfällen wurden mittels RIA
erhebliche Unterschiede in den Insulinkonzentrationen zwischen verschiedenen
Herzseiten festgestellt [269, 280]. In Blut aus dem rechten Herzkreislauf wurden
10fach erhöhte Insulinkonzentration im Vergleich zum linken Herzkreislauf
gemessen, was wahrscheinlich einer postmortalen Diffusion von Insulin via der
Pfortader geschuldet ist [109]. Die Messung sollte daher in peripherem venösen
(Femoralblut oder iliakal) Blut durchgeführt werden [281]. Merklich erhöhte
Humaninsulinkonzentrationen > 1000 µU/ml sollten den Verdacht auf eine
Insulinüberdosis lenken, da diese nur sehr selten in Patienten mit Insulinsezernierenden Tumoren zu finden sind.
1.8
Massenspektrometrie
Die
Massenspektrometrie
stellt
eine
Analysentechnik
zur
Bestimmung
der
Molekülmasse im Hochvakuum dar.
40
1. Einführung
1.8.1 Elektrospray-Ionisation
Ein Massenspektrometer besteht aus einer Ionenquelle, in der aus der gelösten
Substanzprobe ein Strahl gasförmiger Ionen erzeugt wird. Eine Möglichkeit der
Generierung dieser Ionen ist die Elektrospray-Ionisation (ESI). Der Begriff
Elektrospray beschreibt die Dispersion einer Flüssigkeit in viele kleine geladene
Tröpfchen in einem elektrostatischen Feld. Mit zunehmender Verdampfung des
Lösungsmittels erhöht sich die Ladungsdichte auf der Tropfenoberfläche, die Ladung
verbleibt auf den ionisierten Makromolekülen. Beim Transfer der Analytmoleküle ins
Massenspektrometer werden diese desolvatisiert. Dabei beginnt der ESI-Prozess mit
der kontinuierlichen Zuführung des gelösten Analyten an die Spitze einer leitfähigen
Kapillare.
Das
angelegte
elektrische
Feld
zwischen
Kapillarspitze
und
Massenspektrometer durchdringt auch die Analytlösung und trennt die Ionen. Dabei
werden im positiven Modus die positiven Ionen an die Oberfläche gezogen, bis das
elektrische Feld in der Lösung durch die Umverteilung negativer und positiver Ionen
aufgehoben ist. Die an der Flüssigkeitsoberfläche akkumulierten positiven Ionen
werden weiter in Richtung Kathode gezogen. Dadurch entsteht ein charakteristischer
Flüssigkeitskonus (Taylor-Konus), weil die Oberflächenspannung der Flüssigkeit dem
elektrischen Feld entgegenwirkt. Bei ausreichend hohem elektrischen Feld bleibt der
Konus stabil und emittiert von seiner Spitze einen kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom
von wenigen µm Durchmesser. Dieser wird in einiger Entfernung von der Anode
instabil und zerfällt in winzige, aneinandergereihte Tröpfchen. Die Oberfläche der
Tröpfchen
ist
mit
positiven
Ladungen
angereichert.
Die
ESI
findet
bei
Atmosphärendruck statt, die anschließende Analyse der freien Ionen jedoch im
Hochvakuum (≤10-5 Torr). Dies erfordert ein spezielles Interface, um den Übergang
der Ionen in den Massenanalysator zu gewährleisten. Der Ionisierungsraum steht
über eine Mikroöffnung (100 µm) mit dem Massenspektrometer in Verbindung.
Trockener, geheizter Stickstoff strömt zwischen der Mündung und der viel größeren
Öffnung der Interface-Platte in den Ionisierungsraum (curtain gas, Abbildung 9). Der
Stickstoff kollidiert mit den Molekülkomplexen des Elektrosprays. Dadurch wird
verhindert, dass ein Großteil der Neutralteilchen in das Hochvakuum gesaugt wird.
Außerdem unterstützen die Kollisionen auch die Desolvatisierung der Moleküle. In
Abhängigkeit von Lösungsmittel und Analyt ist es möglich, dass bei der ESI relativ
stabile Quasimolekülionen folgender Zusammensetzung gebildet werden: [M+H]+
41
1. Einführung
z.B. bei Aminen, [M-H]- z.B. bei sauren Substanzen wie Carbonsäuren oder
Phenolen und Addukte des Moleküls mit Na+, NH4+, K+, HCOO-, CH3COO-). [281]
1.8.2 Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)
Falls der Analyt mit ESI schlecht ionisierbar ist, kann auf die APCI ausgewichen
werden. Bei der APCI werden die Ionen nicht durch das Anlegen eines elektrischen
Feldes sondern durch einen Stickstoffstrom zerstäubt. [281]
1.8.3 Triple-Quadrupol
Triple-Quadrupol-Instrumente bestehen aus 4 Quadrupolen Q0 bis Q3. Ein
Quadrupol ist im Prinzip ein Massenfilter, das heißt es werden nur Ionen mit einem
bestimmten m/z-Verhältnis durchgelassen. Dies wird durch eine Anordnung von vier
paralellen stabförmigen Metallelektroden (Quadrupol) erreicht. Unter dem Einfluss
eines kombinierten Wechsel- und Gleichspannungsfeldes können Ionen eines
definierten m/z-Verhältnisses auf einer stabilen oszillierenden Bahn den Quadrupol
durchlaufen. Alle anderen Ionen fliegen auf instabilen Bahnen und werden durch
Kollisionen mit den Metallstäben gestoppt. Beim Scannen des Massenbereichs
werden Gleichspannung und Amplitude des Wechselfeldes gleichzeitig erhöht,
wodurch Ionen verschiedener Massen nacheinander in den stabilen Bereich des
Quadrupolfeldes gebracht werden. So kann ein Massenbereich von m/z 50 bis
m/z 4000 gescannt werden.
Im Falle eines Triple-Quadrupol-Instruments (Abbildung 10, auch als TandemMassenspektrometer bezeichnet) ist Q0 ein mit Wechselstrom betriebener
Hilfsquadrupol, mit dem die generierten Ionen zunächst fokussiert und anschließend
in den zentralen Ionenweg überführt werden. Q1 ist der erste Messquadrupol zum
Scannen der Ionen. Q2 führt die Ionen durch eine Kollisionskammer, die mit
Stickstoffgas gefüllt ist. Durch Kollision mit den inerten Gasatomen fragmentieren die
Ionen im Q2 (collision-induced dissociation, CID). Die Molekulargewichte der
entstandenen Fragmentionen werden im Messquadrupol Q3 bestimmt. Für eine
effektivere Fragmentierung werden die Ionen daher vor der Stoßaktivierung
zusätzlich mit etwa 20-150 V beschleunigt.
42
1. Einführung
Abbildung
9:
Aufbau
einer
ESI-Quelle
mit
Interface
zu
einem
Quadrupolmassenspektrometer [281]
Abbildung 10: Schematischer Aufbau eines Triple-Quadrupol-Massenspektrometers
[281]
Mit diesen 4 Quadrupolen lassen sich nun verschiedene Experimente ausführen, von
denen in dieser Arbeit folgende angewendet wurden:
1. Produktionen-Analyse (Enhanced Product Ion Scan, EPI): Das Quadrupolfeld
von Q1 wird so eingestellt, dass nur Ionen eines bestimmten m/zVerhältnisses transferiert werden. Diese Vorläuferionen (precursor ions)
werden im Q2 fragmentiert und die generierten Fragmentionen über den
gesamten Massenbereich im Q3 analysiert (Abbildung 11).
2. Multiple Reaction Monitoring (MRM): Das Quadrupolfeld von Q1 wird so
eingestellt, dass nur Ionen eines bestimmten m/z-Verhältnisses transferiert
43
1. Einführung
werden. Durch Beobachtung von nur zwei oder drei Fragmentionen im Q3 pro
Analyt kann sehr empfindlich und selektiv quantifiziert werden. Diese
sogenannten Ionenübergänge Mutterion Æ Fragmentionen können durch
Optimierung von Kollisionsenergie (CE) und cell exit potential (CXP)
hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit optimiert werden (Abbildung 11) [282]
1.8.4 Lineare Ionenfalle
Die
Möglichkeit
der
Tandem-Massenspektrometrie
wird
heute
in
vielen
Massenspektrometern mit Hilfe einer der Quadrupole anschließenden Ionenfalle
verwirklicht [283]. Das Prinzip der Ionenfalle beruht auf dem Einfangen von Ionen in
einem geeigneten elektrischen Feld. Die Ionen können für variable Zeiten (µs bis s)
auf stabilen Bahnen gehalten und dann nach ihrer Masse analysiert werden. Limitiert
wird diese Funktion jedoch bei dreidimensionalen Ionenfallen (3D-IT) durch das
relativ kleine Volumen der Falle, was ab einer bestimmten Füllmenge zu
unerwünschten Raum-zu-Ladungs-Interferenzen führt und die Effektivität der
Stabilisierung auf ca. 1-10 % der erzeugten Ionen in der Falle begrenzt [284]. Lineare
Ionenfallen stellen eine Verbesserung dar, indem das Quadrupol-Spannungsfeld nur
zweidimensional ausgebreitet wird, so dass die axiale Energie der Ionen in der Falle
reduziert wird und sie sich zweidimensional wie eine Perlenschnur in der Mitte des
Quadrupols aufreihen. Zusätzlich können durch das größere Volumen einer LIT
gleichzeitig mehr Ionen stabilisiert werden.
In Tandem-Massenspektrometern kann nun Q3 auch als Ionenfalle genutzt werden.
Während der Massenanalyse (Scan) in der LIT können die Ionen aus der Ionenquelle
im Q0 zusätzlich akkumuliert werden (Q0 Trapping), sodass Ionenverluste minimiert
und die Empfindlichkeit gesteigert wird. Die weiteren Vorteile dieser Kombination
sind ein größerer dynamischer Bereich durch die selektive Füllung der Falle und die
Aufnahme von kompletten Massenspektren ohne Diskriminierung von kleinen
Massen („low mass cut off“), weil Selektion, Fragmentierung und Massenanalyse
räumlich voneinander getrennt sind [281].
44
1. Einführung
Abbildung 11: Prinzip des Multiple Reaction Monitoring (MRM, oben) und der
Produktionen-Analyse (Enhanhed Product Ion, EPI) auf einem Triple-QuadrupolMassenspektrometer [285, 286]
1.8.5 Validierung massenspektrometrischer Methoden
Die Validierung analytischer Methoden ist eine Grundvoraussetzung für die Qualität
und die Vergleichbarkeit von Analyseergebnissen. Sie dient der Dokumentation der
Eignung von Analysenverfahren für ihren Bestimmungszweck. Analysenbefunde, die
mit validierten Methoden erhoben werden, sind daher nicht nur die Basis für eine
verlässliche Interpretation, sondern auch im Streitfall bei forensisch-toxikologischen
Fragestellungen nur schwer anfechtbar. [287]
1.8.5.1 Selektivität und Spezifität
Selektivität ist die Fähigkeit einer Methode, verschiedene nebeneinander zu
bestimmende Analyten ohne gegenseitige Störungen oder Störungen durch andere
endogene
oder
exogene
Substanzen
(Metaboliten,
Verunreinigungen,
Abbauprodukte, Matrix) zu erfassen und sie somit eindeutig zu identifizieren.
Spezifität ist die Fähigkeit einer Methode, einen Analyten oder eine Substanzklasse
ohne Verfälschung durch andere in der Probe vorhandene Komponenten (s.o.) zu
erfassen und sie somit eindeutig zu identifizieren. [287]
45
1. Einführung
1.8.5.2 Linearität
Die Linearität einer analytischen Methode ist ihre Fähigkeit, innerhalb eines
gegebenen Bereiches Testergebnisse zu liefern, die direkt proportional zur
Konzentration des Analyten in der Probe sind. Dabei ist der Kalibrationsbereich einer
analytischen Methode das Intervall zwischen oberer und unterer Konzentration des
Analyten in der Probe, für das ein geeignetes Maß an Präzision, Richtigkeit und
Linearität gezeigt werden konnte. Dieser sollte so gewählt werden, dass er einen
möglichst
großen
Konzentrationen
Anteil
abdeckt.
der
in
authentischen
Sofern
bekannt,
Proben
sollte
zu
der
erwartenden
therapeutische
Konzentrationsbereich möglichst innerhalb des Kalibrationsbereichs liegen. [288]
1.8.5.3 Genauigkeit
Unter Bias versteht man die Differenz zwischen Messergebnis und Sollwert. Er ist ein
Maß
für
die
systematische
Fehlerkomponente
eines
quantitativen
Analysenverfahrens. Unter Richtigkeit (Trueness) versteht man den Abstand des
Mittelwertes einer ausreichend großen Anzahl von Messwerten vom Sollwert. Das
Ausmaß an Richtigkeit wird gewöhnlich in Form eines systematischen Fehlers (Bias)
ausgedrückt. Unter Präzision versteht man den Grad der Streuung der einzelnen
Werte um den Mittelwert. Sie ist ein Maß für die zufällige Fehlerkomponente eines
quantitativen Analysenverfahrens. Die Präzision wird gewöhnlich in Form der
„Impräzision“ ausgedrückt und als eine Standardabweichung der Messergebnisse
berechnet. Unter Wiederholpräzision (Repeatability) versteht man die Präzision unter
Bedingungen, bei denen unabhängige Messergebnisse mittels derselben Methode
mit identischem Probenmaterial im selben Labor von derselben Person mit derselben
Gerätschaft innerhalb kurzer Zeitintervalle erhalten werden. Unter Laborpräzision
versteht man die Präzision bei der Bestimmung derselben Probe innerhalb eines
Labors bei bewusster Änderung eines Parameters (z.B. Person, Gerätschaft oder
Zeit). [289]
1.8.5.4 Matrixeffekte und Wiederfindung
Die absolute Wiederfindung ist definiert als kompletter Transfer des Analyten von der
Matrix in die zu vermessende Lösung. Unter Matrixeffekten versteht man die direkte
oder
indirekte
Veränderung
des
Messsignals
durch
die
Anwesenheit
unbeabsichtigter Analyten (zur Analyse) oder anderer interferierender Substanzen in
46
1. Einführung
der Probe. Dabei sind sowohl eine Unterdrückung (Ion suppression) als auch eine
Verstärkung (Ion enhancement) des Messsignals möglich. [290]
1.8.5.5 Stabilität
Stabilität einer analytischen Methode beschreibt die chemische Stabilität eines
Analyten in einer gegebenen Matrix unter bestimmten Bedingungen für gegebene
Zeitintervalle. Die Stabilität eines Analyten sollte vom Zeitpunkt der Probennahme bis
zum Abschluss der Analyse gewährleistet sein. Die Stabilität während der Lagerung
und
während
eventuell
wiederholtem
Einfrieren
und
Auftauen
ist
methodenunabhängig, so dass entsprechende Stabilitätsdaten aus der Literatur
übernommen werden können. [288]
1.8.5.6 Analytische Grenzen
Die Nachweisgrenze (Limit of Detection, LoD)
ist definiert als die niedrigste
Konzentration des Analyten in der Probe, bei der die Identifizierungskriterien erfüllt
sind. Die Bestimmungsgrenze (Limit of Quantification, LoQ) ist die niedrigste
Konzentration eines Analyten in der Probenmatrix, die mit akzeptablen Bias- (± 20 %)
und Präzisiondaten (RSD ≤ 20 %) bzw. mit einer vorgegebenen relativen
Ergebnisunsicherheit (33 %, Signifikanz: 99 %) bestimmt werden kann. [291]
1.9
Headspace-Gaschromatographie
Eine Möglichkeit, um flüchtige Bestandteile von der nicht oder nur schwer flüchtigen
Matrix abzutrennen, ist die sog. Headspace (Kopf- bzw. Dampfraum)-Technik. Dabei
befindet sich die Probensubstanz in einer Probenflasche, die durch ein Septum
(Gummidichtung) verschlossen ist. In dem Dampfraum über der Probe stellt sich bei
meist erhöhten Temperaturen ein Gleichgewicht der flüchtigen Bestandteile zwischen
Gasraum und Probe ein. Mit Hilfe einer gasdichten Spritze wird dann ein aliquoter
Teil des Dampfraums über der Probe entnommen und direkt in den Injektor eines
Gaschromatographen eingespritzt. Diese Methodik wird in der forensischen
Toxikologie für die Bestimmung flüchtiger Blutkomponenten wie Ethanol, weiteren
kurzkettigen Alkoholen und Aceton genutzt. Die Erfassung der Analyten nach der
chromatographischen Trennung kann dann mittels Flammenionisationsdetektion
(FID) erfolgen.
47
1. Einführung
1.10 Immunchemie
Bei Immunoassays ist das Grundprinzip die Erkennung und damit der Nachweis von
Analyten durch die Bindung eines Antigens an einen Antikörper, deren hohe
Spezifität und Bindungsstärke genutzt wird. Weit verbreitet ist die Markierung mittels
Enzymen, die eine chemische Reaktion katalysieren, bei der entweder durch ein
Substrat eine bestimmte Farbe entsteht oder über Chemilumineszenz Licht
abgegeben wird. Ein weiteres optisches Verfahren ist die Markierung mit
Fluoreszenz-Farbstoffen.
Auf
Enzymmarkierungen
basierende
Assays
werden
als
Enzyme-linked
Immunosorbent Assays (ELISA) bezeichnet. Dabei wird ein Antikörper zuvor mit
einem Enzym markiert. Die durch das Reporterenzym katalysierte Reaktion dient als
Nachweis für das Vorhandensein des Antigens. Das Substrat wird vom Enzym
umgesetzt, das Reaktionsprodukt kann üblicherweise durch Farbumschlag, eventuell
auch durch Chemolumineszenz nachgewiesen werden. Die Signalstärke ist eine mit
einem Photometer sehr genau bestimmbare Funktion der Antigenkonzentration, so
dass ELISA auch für quantitative Nachweise verwendet werden kann.
Bei
Radioimmunoassays
(RIA)
werden
schwachradioaktive
Substanzen
zur
Markierung verwendet, der Nachweis und die Quantifizierung erfolgen hierbei durch
die Messung der Radioaktivität. Die Antikörper binden kompetitiv an die zu
messenden Antigene und an die radioaktiven künstlichen Antigene: Radioaktiv
markierte Antigene und „natürliche” Antigene (also der in der Probe interessierende
Gehalt) sind im Bindungsverhalten an die Antikörper gleich; die Bindungsplätze sind
mit der Anzahl der Antikörper begrenzt. Je mehr natürliche Antigene vorhanden sind,
desto
weniger
radioaktive
Antikörper
werden
gebunden.
Am
Ende
der
Inkubationszeit werden ungebundene Antigene weggespült und die (gebundene)
Radioaktivität bestimmt. So kann auf die gesuchte Antigenkonzentration in der Probe
zurückgerechnet werden. [289]
48
2. Fragestellung
2
Fragestellung
Folgen einer Diabetes-Erkrankung sind die siebthäufigste Todesursache der Welt.
Auch bei Lebenden sind Stoffwechselentgleisungen außergewöhnlich häufig zu
verzeichnen und stellen z.B. bei der aktiven Teilnahme am Straßenverkehr eine
Gefahr dar. Akute Komplikationen und Entgleisungen des Kohlenhydratstoffwechsels
äußern
sich
in
hyperosmolares
einem
Koma)
diabetischen
Koma
bzw.
Hypoglykämie.
einer
(diabetische
Die
Ketoazidose
Diagnose
oder
dieser
Komplikationen gerade bei forensischen Fragestellungen ist oft problematisch, bei
Todesfällen auch aufgrund fehlender charakteristischer Obduktionsbefunde. In vielen
Fällen ist man nicht in der Lage, einen unzweifelhaften Beweis für eine hypo- bzw.
hyperglykämische Stoffwechselentgleisung zu erbringen. Die Diagnose post mortem
kann daher nur durch eine Zusammenstellung der pathomorphologischen Befunde,
der Anamnese und anhand von biochemischen Parametern gestellt werden. Das
grundlegende Ziel dieser Arbeit ist es, diabetische Stoffwechselentgleisungen ante
und post mortem analytisch so nachzuweisen, dass Befunde den hohen
Anforderungen bei forensischen Fragestellungen standhalten.
Hypoglykämie ist nicht selten eine Folge von exogener Zufuhr von Insulin oder oralen
Antidiabetika und besonders Insulin wird nicht nur überdosiert, sondern hat sich als
effektives Mord- bzw. Suizidgift erwiesen. Bisher wurde Insulin in forensischen Fällen
meistens über unspezfische Immunoassays nachgewiesen. Die Kreuzreaktivität von
Immunoassays zu Vorläuferproteinen wird immer wieder kritisiert. Außerdem können
diese Immunoassays neue synthetische Insuline nicht oder nur teilweise detektieren.
Ziel dieser Arbeit ist es, flüssigkeitschromatographische-massenspektrometrische
Methoden zum Nachweis sowohl von menschlichem Insulin als auch von kurz- und
langwirksamen Insulinanaloga und oralen Antidiabetika zu entwickeln, zu validieren
und in die Routineanalytik zu integrieren.
Das Verhältnis Insulin / C-Peptid stellt einen wichtigen Parameter dar, um eine
exogene Zufuhr von humanem Insulin von anderen Formen der Hyperinsulinämie
(z.B. Insulinom, Zufuhr oraler Antidiabetika) abzugrenzen. Ein erhöhter Insulinwert im
Serum bei gleichzeitigen supprimierten C-Peptidkonzentrationen stellt einen Hinweis
auf eine exogene Zufuhr von humanem Insulin dar. Eine weitere Aufklärung des
Verhältnisses
humanes
Insulin
zu
C-Peptid
mit
Hilfe
chromatographisch-
massenspektrometrischer Methoden und Ermittlung von Cut-Offs zur Abgrenzung
einer Injektion mit humanem Insulin zu physiologischen Verhältnissen oder zu
49
2. Fragestellung
anderen Ursachen hoher Inulinkonzentrationen (nach Einnahme oraler Antidiabetika)
soll angestrebt werden. Weiterhin soll die Nachweismöglichkeit und Stabilität von
Insulin vor und nach dem Tod in diversen Matrizes untersucht werden.
Zur Bestimmung einer todesursächlichen Hyperglykämie steht dem forensischen
Toxikologen die Summenformel nach Traub in der Glaskörperflüssigkeit und im
Liquor cerebrospinalis zur Verfügung. Die Blutglucose wird nach dem Tod im
Rahmen der Glykolyse rasch zu Laktat abgebaut, sodass sich aus der absoluten
Glucosekonzentration kein Hinweis auf die Konzentration zum Zeitpunkt des Todes
ergibt. Daher müssen metabolisch resistentere Matrizes wie die Glaskörperflüssigkeit
zu Rate gezogen werden, wobei man sich einer Addition der Glucose- und
Laktatkonzentrationen nach dem Tod behilft. Die Grenzwerte der „Traubschen
Summenformel“ werden immer wieder diskutiert und auch die Bestimmung von
HbA1c und Fructosamin nach dem Tod kann zwar eine Einordnung des diabetischen
Status über die letzten Wochen ermöglichen, aber keine Rückschlüsse auf den
glykämischen Status kurz vor dem Tod zulassen. Zusätzlich zu den oben
dargestellten Punkten wurden die Ketonkörper Aceton, β-Hydroxybutyrat und
Acetoacetat nach dem Tod bestimmt. Ziel dieser Arbeit ist es zudem, nach weiteren
potentiellen biochemischen Parametern zur Bestimmung einer ante mortem
Hyperglykämie nach dem Tod zu suchen.
50
3. Material und Methoden
3
3.1
Material und Methoden
Allgemein
3.1.1 Chemikalien und Reagenzien
Chemikalie
Qualität
Firma
Sitz
Ammoniumformiat
Ameisensäure
Tert.Butyl-Methyl-Ether
(TBME)
Acetonitril
Methanol
Water HPLC grade
Essigsäure
Trifluoressigsäure
Magnetische beads mit
Immunglobulin G auf der
Oberfläche
Dinatriumhydrogenphosphat-dihydrat
(Na2HPO4 x 2 H20)
Natriumhydrogencarbon
at
Natriumdihydrogenphosphat-hydrat
(NaH2PO4 x H20)
Natriumchlorid
Ethylacetat
Perchlorsäure
Analytische Qualität
Analytische Qualität
Analytische Qualität
Sigma
Sigma
Sigma
Steinheim, Deutschland
Steinheim, Deutschland
Steinheim, Deutschland
HPLC grade
HPLC grade
HPLC grade
100%
25% in Wasser
10 ml
Sigma
Sigma
Riedel de Haen
Merck
Merck
Invitrogen Dynal AS
Steinheim, Deutschland
Steinheim, Deutschland
Seelze, Deutschland
Darmstadt, Deutschland
Darmstadt, Deutschland
Oslo, Norwegen
Merck
Darmstadt, Deutschland
Merck
Darmstadt, Deutschland
Merck
Darmstadt, Deutschland
Merck
Merck
Riedel de Haen
Darmstadt, Deutschland
Darmstadt, Deutschland
Seelze, Deutschland
Per analysi
70%
Tabelle 12: Chemikalien und Reagenzien allgemein
3.1.2 Puffer und Lösungen
Der Salzpuffer pH 7,4 wurde einmal im Monat folgendermaßen frisch vorbereitet:
0,14 g NaH2PO4 x H20, 0,98 g Na2HPO4 x 2 H20 und 8,1 g Natriumchlorid wurden zu
1 l Wasser HPLC grade gegeben und die Salze für 10 min im Ultraschallbad
aufgelöst.
3.1.3 HPLC-MS
Alle Proben wurden auf einem Shimadzu (Duisburg, Germany) LC 20 series (binäre
Pumpe, Entgaser, Controller und Autosampler) Flüssigkeitschromatograph, der an ein
Applied Biosystems API4000 QTrap Massenspektrometer (Darmstadt, Deutschland)
gekoppelt ist, gemessen. Q3 konnte wahlweise als Quadrupol oder als Lineare
51
3. Material und Methoden
Ionenfalle benutzt werden. Die Daten wurden mit der Software Analyst 1.5.1 (Applied
Biosystems, Darmstadt, Deutschland) aufgenommen.
3.1.4 Head-Space GC/FID
Die Ketonkörperbestimmung erfolgte mit Hilfe des TurboMatrix HS-110 Trap
automatic headspace sampler (Perkin Elmer, Shelton, USA). Stickstoff wurde als
Trägergas benutzt, die Ionen wurden mittels Flammenionisation detektiert.
3.2
Validierung
3.2.1 Leermatrix
Plasma von verschiedenen Spendern wurde vom Institut für Hämatologie des
Universitätsklinikums Bonn zur Verfügung gestellt. Bei der Validierung ergab sich für
einige Substanzen ein Problem: Humanes Insulin, C-Peptid, MG und AG liegen auch
physiologisch immer im Plasma vor. Daher ist es für diese Analyten nicht oder nur
sehr schwer möglich, Leerplasma zu erhalten. Im Falle von humanem Insulin und
C-Peptid kann man sich insofern behelfen, dass man Plasma einige Tage bei
Raumtemperatur stehen lässt. Insulin und das C-Peptid werden bei diesen
Temperaturen abgebaut und so erhält man Plasma frei von diesen Analyten. Diese
wurden vor dem Beginn der Validierung mittels der beschriebenen Methoden
gemessen und erst bei vollständiger Abwesenheit der Analyten für die Validierung
freigegeben. Für AG und MG ist es nicht möglich, Leerserum zu generieren, weshalb
bei den Validierungen einige Besonderheiten beachtet werden mussten, auf die in
den Kapiteln zu den jeweiligen Analyten eingegangen wird.
3.2.2 Selektivität und Spezifität
In der Praxis wurden sechs verschiedene Blank-Plasmaproben nach den
beschriebenen Aufarbeitungsmethoden auf Peaks analysiert, die die Detektion der
Analyten
oder
der
IS
störten.
Zusätzlich
wurden
drei
verschiedene
Blank-Plasmaproben mit dem IS gespikt, um die Störung der Detektion der Analyten
durch die IS zu untersuchen. Da für AG und MG keine Leerseren existieren, konnten
bei diesen Analyten die Seren nur nach Peaks untersucht werden, die die Detektion des
IS störten. Zudem wurde Wasser mit dem IS gespikt, um das Chromatogramm auf
52
3. Material und Methoden
Störpeaks zu untersuchen, die vom IS herrühren und die mit der Detektion des Analyten
interferieren.
3.2.3 Linearität
Zur Bestimmung der Linearität wurden mindestens fünf von Null verschiedene,
gleichmäßig über den Kalibrationsbereich verteilte Kalibratoren durch Aufstocken von
Leerseren hergestellt. Der niedrigste Kalibrator musste größer oder gleich der
Bestimmungsgrenze sein. Um Wiederholbedingungen zu garantieren, sollten sechs
Bestimmungen bei jeder Konzentration stattfinden. Die Peakflächenverhältnisse
(Analyt/IS) wurden dann gegen die Sollkonzentrationen der Kalibratoren aufgetragen.
Die Messwerte wurden folgenden statistischen Tests unterzogen:
- Test auf Ausreißer mittels Grubbs-Test (Signifikanzniveau: 95%) und ggf. deren
Elimination. Insgesamt dürfen nicht mehr als zwei Ausreißer und diese nicht auf dem
gleichen Konzentrationsniveau auftreten.
- Test auf Varianzhomogenität mittels F-Test zwischen höchster und niedrigster
Konzentration oder mittels Cochran-Test über alle Konzentrationen (Signifikanz:
99%)
Bei gegebener Varianzhomogenität (Homoskedastizität) erfolgte eine einfache
lineare Regression und die Anpassung mittels Linearitätstest nach Mandel
(Signifikanz: 99%). Im Falle einer Heteroskedastizität wurde ein gewichtetes
Kalibrationsmodell gewählt. Im Falle von AG und MG konnten die zugespikten
Konzentrationen nur ein Zusatz zur physiologisch im Serum enthaltenen Konzentration
sein. Kalibrationskurven wurden mittels der Standardadditionsmethode ausgewertet.
3.2.4 Lösemittelkalibration
Um wässrige/methanolische Kalibrierungen mit Matrixkalibrierungen zu vergleichen,
wurden wässrige/methanolische Standards in denselben Konzentrationen hergestellt,
die zu den Matrixproben zudotiert wurden. Anschließend wurde anhand der
Steigungen
der
Geraden
für
jeden
Analyten
diskutiert,
ob
eine
Lösungsmittelkalibration möglich ist.
3.2.5 Genauigkeit
Die Konzentrationen der sechs Kalibrationskurven wurden gewichtet und die
gewichtete Kalibriergerade wurde zur Abschätzung der Genauigkeit mit dem
Programm Valistat® (Arvecon GmbH, Walldorf, Deutschland) herangezogen. Die
53
3. Material und Methoden
errechneten Werte jeder Konzentration wurden gemittelt und der prozentuale Bias
wurde zur Bestimmung der Genauigkeit herangezogen. Für die Bestimmung der
Laborpräzision wurde für alle Methoden die tagesverschiedene Laborpräzision (timedifferent intermediate precision) benutzt. Dabei variiert der Zeitfaktor „Tag“ zwischen
den Bestimmungen. Praktisch wurden homogene Pools von Qualitätskontrollproben
(QC-Proben) bei mindestens zwei (niedrig und hoch relativ zum Kalibrationsbereich),
möglichst aber drei verschiedenen Konzentrationen (niedrig, mittel, hoch relativ zum
Kalibrationsbereich) durch Aufstockung von Leermatrixpools generiert. Diese wurden
zu einzelnen QC-Proben aliquotiert. Zwei QC-Proben (Wiederholpräzision) jeder
Konzentration an mindestens acht verschiedenen Tagen (tagesverschiedene
Laborpräzision)
wurden
analysiert.
Die
Wiederholpräzision
und
die
tagesverschiedene Laborpräzision werden als relative Standardabweichungen
angegeben und mit folgenden Formeln berechnet:
Formel 1: Bestimmung der Wiederholpräzision RSDR mit s2: Wiederholvarianz und X:
Mittelwert aller Bestimmungen
Formel 2: Bestimmung der tagesverschiedenen Laborpräzision RSDT mit st2 :
Wiederholvarianz, sr2 : Varianz zwischen den Tagen und X Mittelwert aller
Bestimmungen
3.2.6 Matrixeffekte und Wiederfindung
Nach Matuszewski et al. [174] werden fünf verschieden Leerplasmen auf folgende
Art und Weise aufgearbeitet:
1. normale Aufarbeitung nach Spiken mit niedriger und hoher Konzentration
bezogen auf den Kalibrierbereich
2. Aufarbeitung und Spiken der Extrakte nach Extraktion mit niedriger und hoher
Konzentration
3. fünf methanolische Standards in der selben Konzentration wie die finalen
Extrakte aus 1
54
3. Material und Methoden
Matrixeffekte sind definiert als der Anteil der absoluten Peakflächen der fünf
gespikten Extrakte zu den Peakflächen der methanolischen Standards in derselben
Konzentration. Wiederfindungsraten sind definiert als der Anteil der absoluten
Peakflächen der fünf gespikten Plasmen zu den Peakflächen der gespikten Extrakte.
Für den Mittelwert des Matrixeffektes gilt ein Akzeptanzintervall von 75-125%.
3.2.7 Analytische Grenzen
Zur Bestimmung von LoD und LoQ wurden mindestens fünf von Null verschiedene
Kalibratoren beginnend im Bereich der erwarteten Nachweisgrenze durch Aufstocken
von Leermatrix hergestellt. Diese Kalibratorkonzentrationen sollten möglichst
gleichmäßig über den Kalibrationsbereich verteilt sein und die Konzentration des
höchsten Kalibrators darf maximal das Zehnfache der errechneten Nachweisgrenze
sein. Damit ist der Bereich dieser Kalibrationskurve zur Bestimmung der analytischen
Grenzen nicht identisch mit dem vollen Kalibrations- bzw. Linearitätsbereich der
Methode.
Diese Kalibratoren wurden einmal analysiert. Die Peakflächenverhältnisse (Analyt/IS)
des Targetions wurden gegen die Sollkonzentrationen der Kalibratoren aufgetragen
und eine lineare Regression und Ermittlung der LoD und LoQ nach folgenden
Formeln durchgeführt (k = 3 und mit α = 0,01; Formel 3):
Formel
3:
Bestimmung
der
Nachweisgrenze
(LoD;
oben)
und
der
Bestimmungsgrenze (LoQ; unten) mit k : relative Ergebnisunsicherheit; sx0:
Verfahrensstandardabweichung; t
f,α
: Quantil der t - Verteilung; m : Anzahl der
Messungen; n : Anzahl der Kalibrationsniveaus; X: Gehaltsgröße; Qx: Summe der
Abweichungsquadrate; α Signifikanzniveau (Fehler 1. Art); β : Wahrscheinlichkeit
(Fehler 2. Art).
Zusätzlich
galt,
dass
die
Bestimmungsgrenze
die
Nachweisgrenze
nicht
unterschreiten durfte. War die berechnete Bestimmungrenze kleiner als die
55
3. Material und Methoden
Nachweisgrenze,
so
wurde
die
Nachweisgrenze
automatisch
auch
die
Bestimmungsgrenze.
3.2.8 Ionenverhältnisse
Das
Ionenverhältnis
der
Ionenübergänge
im
MRM
Modus
zwischen
1.
Ionenübergang (Target, Quantifier) und 2. und 3. Ionenübergang (Qualifier) wurde
überprüft. Bei einem relativen Ionenverhältnis > 50 % war ein 20 % Toleranzintervall
akzeptabel, bei < 50% wurde ein 30% Toleranzintervall akzeptiert.
3.3
Analytik
3.3.1 Glucose und Laktat
Glucose wurde in klinischen Fällen mittels des immunchemischen Architect GlucoseHexokinase-Testkits der Firma Abbott (Wiesbaden, Deutschland) im Diabetszentrum
Bad Oeynhausen bestimmt. Dabei wird die Glucose in der Probe bei Anwesenheit
von ATP mittels des Enzyms Hexokinase zu Glucose-6-phosphat phosphoryliert.
Anschließend wird dies mittels der Glucose-6-phosphat-dehydrogenase spezifisch zu
6-Phosphogluconat oxidiert (Formel 4). Ein mol NADH wird aus jedem mol Glucose
gebildet. Das produzierte NADH absorbiert Licht einer Wellenlänge von 340 nm, die
Absorption wird spektrophotometrisch gemessen.
Hexokinase
β-D-Glucose + ATP
Glucose-6-phosphat + ADP
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
Glucose-6-phosphat + NAD
6-Phosphogluconat + NADH
Formel 4: enzymatische Reaktionen des Glucose-Hexokinase-Tests
Folgende Validierungsparameter wurden von Abbott bestimmt: LoQ 3 mg/dl,
Linearitätsbereich 10,5 mg/dl bis 697,7 mg/dl, intra day precision 0,99 % (bei
29,9 mg/dl, n = 50) und 0,69 % (bei 305,9 mg/dl, n = 50); inter day precision 0,00 %
(bei 29,9 mg/dl, n = 50) und 0,00 % (bei 305,9 mg/dl, n = 50).
In forensischen Fällen wurde das Glucose Testkit der Firma Labor und Technik
(Berlin, Deutschland) auf dem Olympus AU 400 Immunoanalyzer in der
Rechtsmedizin Bonn benutzt. Dabei handelt es sich um einen enzymatischen Test,
56
3. Material und Methoden
bei dem die Glucose mittels Glucosedehydrogenase nach der Reaktion gemäß
Formel 5 oxidiert. Die Menge des gebildeten NADH ist der Glucosekonzentration
proportional und kann photometrisch erfasst werden.
Glucosedehydrogenase
D-Gluconolacton + NADH + H+
β-D-Glucose + NAD
Formel 5: enzymatische Reaktion des Glucosedehydrogenase-Tests von Labor und
Technik
Folgende Validierungsparameter wurden von Labor und Technik bestimmt: LoQ
3 mg/dl, Linearitätsbereich bis 700 mg/dl, intra day precision 1,56 % (bei 96,7 mg/dl,
n = 20), 1,4 % (bei 165 mg/dl, n = 20) und 0,83 % (bei 236 mg/dl, n = 20); inter day
precision 1,63 % (bei 96,7 mg/dl, n = 20), 1,90 % (bei 165 mg/dl, n = 20) und 1,28 %
(bei 236 mg/dl, n = 20). Es findet eine Einpunktkalibration statt.
Laktat wurde nur in forensischen Fällen als Teil der Summenformel nach Traub
mittels des Laktatoxidase Testkits LOX-PAP der Firma Labor und Technik (Berlin,
Deutschland) auf dem Olympus AU 400 Immunoanalyzer in der Rechtsmedizin Bonn
gemessen. Der Test beruht auf der Umsetzung (Enzym: Laktatoxidase, Formel 6)
von Laktat zu Pyruvat. Das in dieser Reaktion gebildete Wasserstoffperoxid wird
dann in einer zweiten Reaktion zur Farbentwicklung eingesetzt.
Laktatoxidase
(1)
L-Laktat + O2
(2)
2 H2O2 + TBHB + 4-Aminopyrin
Formel
6:
enzymatische
Reaktion
Pyruvat + H2O2
Chinoimin Farbstoff + 4 H20
des
Laktattests
mit
TBHB:
Tribrom-3-
hydroxybenzoesäure
Folgende Validierungsparameter wurden von Labor und Technik bestimmt: LoQ:
1 mg/dl; Linearitätsbereich 1 bis 200 mg/dl; Kreuzreaktivität nur bei Ascorbinsäure ab
> 20 mg/dl; intra day precision 1,44 % (bei 15,3 mg/dl, n=20), 1,44 % (bei 22,8 mg/dl,
n = 20) und 0,67 % (bei 27,8 mg/dl, n = 20); inter day precision 0,54% (bei
15,0 mg/dl, n = 20), 2,01 % (bei 21,9 mg/dl, n = 20) und 1,31 % (bei 24,4 mg/dl,
n = 20). Es findet eine Einpunktkalibration statt.
57
3. Material und Methoden
3.3.2 Glykierte Proteine
HbA1c wurde in klinischen Fällen mit dem Adams A1c HA-8180 Testkit von Arkray
Europe (Amstelveen, Niederlande) im Diabeteszentrum Bad Oeynhausen gemessen.
Dieses
misst
HbA1c
im
Vollblut
mittels
Umkehrphasen-Kationenaustausch-
Chromatographie. Die mit einer Hämolysierlösung verdünnte Blutprobe wird in eine
Säule geleitet und mittels HPLC in mehrere Hämoglobinfraktionen aufgetrennt.
Folgende
Validierungsparameter
wurden
von
Arkray
Europe
bestimmt:
Linearitätsbereich: 3-20 % (9-195 mmol/mol). Genauigkeitsdaten wurden nicht
geliefert.
In forensischen Fällen wurde das HbA1c Testkit der Firma Labor und Technik (Berlin,
Deutschland) auf dem Olympus 400 AU Immunoanalyzer in der Rechtsmedizin Bonn
benutzt. Dabei handelt es sich um einen partikelverstärkten immunturbidimetrischen
Test.
Die
Messung
erfolgt
ohne
Messung
des
Gesamthämoglobins.
Das
Gesamthämoglobin und HbA1c binden beide mit derselben Affinität an Latexpartikel
im Reagenz. Das Ausmaß der Bindung ist proportional zur relativen Konzentration
beider Substanzen im Blut. Ein muriner monoklonaler anti-human HbA1c-Antikörper
bindet
dann
an
partikelgebundenes
HbA1c.
Ein
polyklonaler
anti-Maus
IgG-Antikörper (Ziege) reagiert mit dem anti-human HbA1c-Antikörper und es kommt
zu einer Agglutination. Die gemessene Extinktion ist proportional zum gebundenen
HbA1c, das wiederum proportional zum prozentuellen Anteil von HbA1c in der Probe
ist. Die Ergebnisse werden in der Einheit mmol HbA1c / mol Gesamthämoglobin
angegeben. Die Kalibration wurde mit 4 Kalibrationspunkten und NatriumchloridLösung (9 g/l) als Nullpunkt durchgeführt. Mit jeder Probenserie wurden
2 Qualitätskontrolllevel gemessen. Folgende Validierungsparameter wurden von
Labor
und
Technik
bestimmt:
Linearitätsbereich
15-150
mmol/mol;
keine
Interferenzen; LoQ 10 mmol/mol; intra day precision 1,37 % (bei 35 mmol/mol,
n = 20), 1,36 % (bei 80,7 mmol/mol, n = 20) und 1,8 % (bei 114 mmol/mol, n = 20);
inter day precision 1,82 % (bei 36,5 mmol/mol, n = 20), 1,67 % (bei 83,3 mmol/mol,
n = 20) und 1,58 % (bei 116 mmol/mol, n = 20).
Beide Tests sind standardisiert nach der IFCC Referenzmethode [235].
Fructosamin wurde in klinischen Fällen mit dem Architect Fructosamin Testkit von
Abbott (Wiesbaden, Deutschland) im Diabeteszentrum Bad Oeynhausen gemessen.
Das im Serum vorliegende Fructosamin liegt im alkalischen Milieu in der
58
3. Material und Methoden
Enaminolform vor. Dieses reduziert Nitroblautetrazolium zu Formazan. Die Kinetik
der Farbentwicklung (bei Wellenlänge 546 nm) ist der Fructosamin-Konzentration
proportional. Folgende Validierungsparameter wurden von Abbott bestimmt:
Linearitätsbereich 11-1000 µmol/l; bei proteinpathologischen Zuständen Werte
verfälscht; Glucose bis 900 mg/dl interferiert nicht; LoQ 11 µmol/l; intra day precision
0,93 % (bei 190,5 µmol/l, n = 40), 0,78 % (bei 314 µmol/l, n = 40) und 0,49 % (bei
547,9 µmol/l, n = 40); inter day precision 4,51 % (bei 190,5 µmol/l, n = 40), 2,96 %
(bei 314 µmol/l, n = 40) und 2,20 % (bei 547,9 µmol/l, n = 40).
In forensischen Fällen wurde das Fructosamin Testkit der Firma Labor und Technik
(Berlin, Deutschland) auf dem Olympus AU 400 Immunoanalyzer in der
Rechtsmedizin Bonn benutzt. Die Analytik ist dabei dieselbe wie beim Abbott Testkit.
Die Kalibration wurde als Einpunktkalibration durchgeführt. Mit jeder Probenserie
wurden 2 Qualitätskontrolllevel gemessen. Folgende Validierungsparameter wurden
von
Labor
und
Technik
bestimmt:
Linearitätsbereich
10-1000
µmol/l;
bei
proteinpathologischen Zuständen Werte verfälscht; Glucose bis 800 mg/dl interferiert
nicht; LoQ 10 µmol/l; intra day precision 0,90 % (bei 286 µmol/l, n = 21), 0,70 % (bei
270 µmol/l, n = 21) und 0,8 % (bei 521 µmol/l, n = 21); inter day precision 3,0 % (bei
296 µmol/l, n = 21), 1,4 % (bei 273 µmol/l, n = 21) und 1,7 % (bei 512 µmol/l, n = 21).
3.3.3 Humanes und synthetische Insuline
3.3.3.1 Immunchemie
Für die Messung des Insulins per Immunoassay wurde das ARCHITECT Insulin
Reagent Kit der Firma Abbott (Wiesbaden, Deutschland) im Diabeteszentrum Bad
Oeynhausen verwendet. Dabei handelt es sich um einen CMIA (ChemilumineszenzMikroimmunoassay). 20µl Serum werden benötigt. Folgende Validierungsdaten
wurden von der Firma Abbott getestet: Linearitätsbereich 1,0-300 µU/ml; intra day
presicion 3,8 %, inter day precision 4,8 % (bei 7,6 µU/ml, n = 3); intra day precision
2,0 %, inter day precision 2,5 % (bei 38 µU/ml, n = 3); intra day precision 1,9 %, inter
day precision 2,2 % (bei 119 µU/ml, n = 3); Wiederfindung in 5 verschiedenen Seren
bei 3 Wiederholungen 93,8 %; LoD 1,0 µU/ml; Kreuzreaktivität: Proinsulin bei 106
pg/ml ≤ 0,1 %, C-Peptid bei 107 pg/ml ≤ 0,001 %, Glukagon bei 107 pg/ml ≤ 0,001 %.
59
3. Material und Methoden
3.3.3.2 Chemikalien und Reagenzien LC-MS
Die Insuline wurden von Lilly (humanes Insulin als Huminsulin® und Insulin lispro als
Humalog®, beide 100 U/ml; Bad Homburg, Deutschland), NovoNordisk (Insulin aspart
als Novomix® und Insulin detemir als Levemir®, beide 100 U/ml; Mainz, Deutschland)
und Sanofi Aventis (Insulin glargin als Lantus® und Insulin glulisin als Apidra®,
100 U/ml; Frankfurt, Deutschland) bezogen. Der Interne Standard (IS) Rinderinsulin
wurde von Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. 94 % der Aminosäuresequenz
des Rinderinsulins entspricht der des humanen Insulins. Anti-Insulin Antikörper-Lösung
(1,0 mg/ml) wurde von der CER groupe (Marloie, Belgien) gekauft. Diese Antikörperlösung
wurde 1:10 mit Salzpuffer pH 7,4 verdünnt, in Aliquote von 1 ml geteilt und bis zur
Anwendung bei -20°C gelagert.
3.3.3.3 Stamm- und Arbeitslösungen der Insuline
Rinderinsulin wurde in allen Proben als IS benutzt. Die Stammlösung hatte eine
Konzentration von 1,25 U/ml in 2% Essigsäure. Eine Arbeitslösung (12,5 mU/ml)
wurde an jedem Arbeitstag frisch hergestellt. Die Stammlösungen der Analyten
wurden in 2% Essigsäure angesetzt (1 U/mL) und vor der Probenvorbereitung in die
Arbeitslösung (1 mU/ml) verdünnt. Stammlösungen wurden bei 4° C gelagert. Um die
Adsorption der Insulinmoleküle an Glasoberflächen zu minimieren, wurden alle
Lösungen in LoBind Protein Reaktionsgefäßen (Firma Eppendorf, Hamburg,
Deutschland) aufbewahrt.
3.3.3.4 Optimierte Probenvorbereitung LC-MS
15 µl der IS Arbeitslösung (12,5 mU/ml = 1 pmol/µl) wird zu 2 ml Serum gegeben.
Zunächst schließt sich eine Proteinfällung mit 2 ml Acetonitril an. Die Probe wird dann
10 s gevortext und 10 min bei 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird in ein LoBind
Protein Reaktionsgefäß überführt. 300 µl Salzpuffer pH 7,4, 75 µl Anti-Insulin- Antikörper
(0,1 mg/ml) und 150 µl der magnetischen beads werden zugegeben. Die Mischung wird
1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird der Überstand von den nun an den
Antikörper-Insulin-Komplex gebundenen magnetischen beads mittels eines Magneten
getrennt. Die beads werden dreimal mit 300 µl Salzpuffer pH 7,4 durch 5 s vortexen, 30s
zentrifugieren bei 10.000 g und Trennung von der Lösung durch magnetische Kraft
gewaschen. Zur Dissoziation der Analyten von den beads wurden diese für 15 min in
80 µl 2 % Essigsäure inkubiert. Der Überstand wurde in ein 1,5 ml LoBind Protein
60
3. Material und Methoden
Reaktionsgefäß überführt. 30 µl der Probe wurden direkt aus diesem Gefäß ins
chromatographische System injiziert.
3.3.3.5 Chromatographische und massenspektrometrische Bedingungen
Die chromatographische Trennung wurde mittels einer Zorbax StableBond Vorsäule
(1 mm*17 mm, 5 µm Partikelgröße) und einer Zorbax 300SB C18 analytischen Säule
(1*50 mm, 3,5 µm Partikelgröße) bei einer Säulentemperatur von 40 °C durchgeführt.
Die mobilen Phasen bestanden aus 0,2 % Essigsäure mit 0,01 % TFA (Phase A) und
0,04 % Essigsäure und 0,002 % TFA in Acetonitril (Phase B). Der Gradient startet
bei 0 % B, endet bei 100 % B nach 10 min bei einer Flussrate von 0,15 ml/min.
Innerhalb der nächsten 8 min wird der Gradient wieder auf 0 % B zurückgesetzt und
ein 7 min Equilibrierungsschritt bei 0% B angeschlossen. Die Moleküle wurden per
ESI im positiven Ionenmodus bei einer Nadelspannung von 5500 V ionisiert.
Massenspektrometrische Parameter wurden optimiert, indem eine Lösung (1 mU/ml) der
Analyten oder des IS direkt in die Ionenquelle infundiert wurden und die in Tabelle 13
aufgeführten Parameter manuell optimiert wurden. EPI Spektren wurden in einem
Massenbereich von m/z 100 bis 400 aufgenommen. Die Analyten können aufgrund
ihrer charakteristischen Produktionen unterschieden werden.
Analyt
Molekular Precursor Charakteristische Kollisionsenergie Declustering
gewicht
Ion; m/z
Produktionen
[eV]
potential
[Da]
[eV]
Humanes
Insulin
5807
(M+5H)5+
= 1162,5
120,129,136, 143, 80
219, 226
70
Insulin lispro 5807
(M+5H)5+
= 1162,5
120,129,136,143,
217, 219
80
70
Insulin
aspart
5826
(M+5H)5+
= 1166,2
120, 129, 136, 80
143, 219, 226
70
Insulin
glulisin
5823
(M+5H)5+
= 1165,5
120, 129, 136, 80
143, 199, 213
70
Insulin
detemir
5916
(M+5H)5+ 120, 136,
= 1184,6 219, 357
Insulin
glargin
6064
Rinderinsulin 5733
143, 90
70
(M+6H)6+
= 1011,4
120, 129, 136, 80
143, 175, 219
70
(M+6H)6+
= 956,4
120, 129, 136, 80
143, 219, 226
70
Tabelle 13: Massenspektrometrische Daten und Parameter Insuline
61
3. Material und Methoden
Da Novolog (m/z 1166,2) und Apidra (m/z 1165,5) ähnliche Precursor-Ionen
aufweisen, wurde die Detektion durch die Aufnahme eines Produktionen-Scans bei
m/z 1165,5 für beide Analyten erreicht. Spannungen und Gaseinstellungen wurden
wie folgt optimiert: Curtain Gas = 25 psi, Temperatur = 400 °C, Ion Source Gas 1 =
40 psi (für Levemir 50 psi), Ion Source Gas 2 = 40 psi. Die Ionen wurden im
Quadrupol 0 gefangen, die Eintrittsbarriere in Quadrupol 3 wurde auf 8 V festgelegt
und eine Ionenfallenfüllzeit von 20 ms wurde bestimmt.
3.3.3.6 Besonderheiten bei der Validierung LC-MS
Das Validierungsprozedere musste in zwei Teile aufgeteilt werden, da die Detektion
mittels EPI Insulin lispro und humanes Insulin und ebenso Apidra und Novolog
aufgrund ihrer identischen Molekülgewichte nicht nebeneinander quantifizieren kann.
Eine komplette Validierung wurde mit den Analyten humanes Insulin, Novolog und
Lantus, eine andere Validierung mit Humalog, Apidra und Levemir durchgeführt. Die
Methode wurde in humanem Plasma validiert.
Linearität: Matrixkalibrationsstandards wurden in den Konzentrationen 5 µU/ml,
10 µU/ml, 20 µU/ml, 50 µU/ml, 75 µU/ml, 100 µU/ml und 200 µU/ml hergestellt.
Analytische Grenzen: 2 Kalibrationskurven im niedrigen Bereich der Kalibrationskurve
mit folgenden Konzentrationen in Plasma wurden angefertigt: 1 µU/ml, 2,5 µU/ml,
5 µU/ml, 7,5 µU/ml, 10 µU/ml und 20 µU/ml. Wiederfindung und Matrixeffekte:
Wiederfindung und Matrixeffekte wurden in den Konzentrationen 10 µU/ml und
100 µU/ml bestimmt. Stabilitätsstudien für humanes Insulin: Blut von 3 NichtDiabetikern wurde in Serummonovetten gesammelt, zentrifugiert, in Aliquote geteilt
und bei -20°C gelagert. Einige Aliquote wurden mit den Insulinase-Inhibitoren Diamid
(1 mmol/l) oder Phenylmethansulfonylchlorid (PMSC; 1 mmol/l) versetzt. Humanes
Insulin wurde mit der oben beschriebenen Methodik sofort, 24 h, 96 h, eine Woche
und zwei Wochen nach dem Sammeln vermessen. Die Stabilität wurde als
ausreichend angesehen, wenn die Abnahme der Peakfläche von humanem Insulin
innerhalb von 2 Wochen weniger als 20 % betrug.
62
3. Material und Methoden
3.3.4 C-Peptid
3.3.4.1 Immunchemie
Für die Messung des C-Peptids per Immunoassay wurde das ARCHITECT
C-Peptide Reagent Kit der Firma Abbott (Wiesbaden, Deutschland) verwendet.
Dabei handelt es sich um einen CMIA (Chemilumineszenz-Mikroimmunoassay). 75
µl Serum werden benötigt. Folgende Validierungsdaten wurden von der Firma
getestet: Linearitätsbereich 0-30 ng/ml; Referenzwerte Median 1,78 ng/ml; intra day
presicion 2,4 %, inter day precision 3,2 % (bei 0,96 ng/ml, n = 160); intra day
precision 1,9 %, inter day precision 2,3 % (bei 3,9 ng/ml, n = 160); intra day precision
1,9 %, inter day precision 2,1 % (bei 17,9 ng/ml, n = 160); Wiederfindung 96,2 % (n =
10); LoD 0,01 ng/ml; LoQ 0,08 ng/ml; Kreuzreaktivität: Proinsulin bei 100 ng/ml: 12,8
%, Humaninsulin bei 8660 ng/ml : 0 %, Glukagon bei 10000 ng/ml: 0 %.
3.3.4.2 Chemikalien LC-MS
C-Peptid und der IS Val-d5- C-Peptid wurden von Sigma Aldrich (Steinheim,
Deutschland) erhalten. Anti-C-Peptid Antikörper-Lösung (1,0 mg/ml) wurde von der
Firma Abdserotec (Düsseldorf, Deutschland) gekauft. Diese Antikörperlösung wurde
1:10 mit Salzpuffer pH 7,4 verdünnt, in Aliquote von 1 ml geteilt und bis zur
Anwendung bei -20°C gelagert.
3.3.4.3 Stammlösungen C-Peptid
Val-d5- C-Peptid wurde in allen Proben als IS benutzt. Die Stammlösung hatte eine
Konzentration von 300 µg/ml in 2 % Essigsäure. Eine Arbeitslösung (3 µg/ml) wurde
an jedem Arbeitstag frisch hergestellt. Die C-Peptid-Stammlösung wurde in 2 %
Essigsäure angesetzt (1 mg/mL) und vor der Probenvorbereitung in die
Arbeitslösung (1 µg/ml) verdünnt. Stammlösungen wurden bei 4° C gelagert. Um die
Adsorption der C-Peptid-Moleküle an Glasoberflächen zu minimieren, wurden alle
Lösungen in LoBind Protein Reaktionsgefäßen aufbewahrt.
3.3.4.4 Optimierte Probenvorbereitung LC-MS/MS
10 µl der IS Arbeitslösung (3 µg/ml) wird in einem LoBind Protein Reaktionsgefäß zu
2 ml Serum gegeben. 300 µl Salzpuffer pH 7,4, 30 µl Anti-Insulin-Antikörper
(0,1 mg/ml) und 75 µl der magnetischen beads werden zugegeben. Die Mischung
wird 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird das Serum von den nun an den
Antikörper-C-Peptid-Komplex
gebundenen
magnetischen beads mittels eines
63
3. Material und Methoden
Magneten getrennt. Die beads werden dreimal mit 300 µl Salzpuffer pH 7,4 durch 5 s
vortexen, 30 s zentrifugieren bei 10.000 g und Trennung von der Lösung durch
magnetische Kraft, gewaschen. Zur Dissoziation der Analyten von den beads wurden
diese für 15 min in 80 µl 2 % Essigsäure inkubiert. Der Überstand wird in ein 1,5 ml
LoBind Protein Reaktionsgefäß überführt. 30 µl der Probe wurden direkt aus diesem
Gefäß ins chromatographische System injiziert.
3.3.4.5 Chromatographische und massenspektrometrische Bedingungen
Die chromatographische Trennung wurde mittels einer Zorbax StableBond Vorsäule
(1 mm*17 mm, 5 µm Partikelgröße) und einer Zorbax 300SB C18 analytischen Säule
(1*50 mm, 3,5 µm Partikelgröße) bei einer Säulentemperatur von 40 °C durchgeführt.
Die mobilen Phasen bestanden aus 0,2% Essigsäure mit 0,01 % TFA (Phase A) und
0,04 % Essigsäure und 0,002 % TFA in Acetonitril (Phase B). Der Gradient startet
bei 20 % B, endet bei 90 % B nach 15 min bei einer Flussrate von 0,2 ml/min.
Innerhalb der nächsten 3 min wurde der Gradient wieder auf 20% B zurückgesetzt
und
ein
4 minütiger Equilibrierungsschritt bei 20 % B angeschlossen. Die Moleküle wurden
per ESI im positiven Modus bei einer Nadelspannung von 5500 V ionisiert.
Massenspektrometrische Parameter wurden optimiert, indem eine Lösung (1 mU/ml) des
Analyten oder des IS direkt in die Ionenquelle infundiert wurde und die in Tabelle 14
aufgeführten Parameter für eine Detektion im MRM manuell optimiert wurden.
Analyt
Target
Declustering Ionenüberpotential [V] gang
CE [V]
C - Peptid
1007,5
86,0
-
56
Val-d5- C
-Peptid
56
1013,0
85,9
-
Qualifier
Ionenüber- CE
CXP [V] gang
[V]
46
1007,5
146,9
-
129
18
1013,0
130,2
-
113
CXP [V]
51
6
101
12
Tabelle 14: Optimierte massenspektrometrische Parameter Methode C-Peptid
3.3.5 Proinsulin
Für die Messung des Proinsulins wurde der Human Intakt Proinsulin ELISA der
Firma Reco medical AG (Sissach, Schweiz) verwendet. Es handelt sich um einen
„two-site“ sandwich enzyme-linked immunosorbent Test. Die Mikrotiterplatten sind
mit einem monoklonalen Antikörper, spezifisch für die C-Peptid/Insulin A64
3. Material und Methoden
Kettenbindung beschichtet. Dieser Antikörper kann intakte Proinsulin-Isotope binden:
des-(31,32)-Proinsulin und split-(32,33)-Proinsulin. Insulin, C-Peptid und andere
„des“-oder „split“-Formen sollen nicht gebunden werden (Bedienungsanleitung Teco
ELISA). Anschließend wird die Extinktion bei 450 nm gemessen, die der ProinsulinKonzentration direkt proportional ist. Folgende Validierungsdaten wurden von der
Firma getestet: Intraday precision 2,0 % (n = 12), interday precision 2,65 % (n = 20),
LoD 0,3 pmol/l, Wiederfindung (0 pmol/l zugefügt) 100,0 % (n = 5), Wiederfindung
(10
pmol/l
zugefügt)
103,5
%
(n
=
5),
Referenzwerte
Nicht-Diabetiker
3,99 ± 1,58 pmol/l (SD), Median 3,61 pmol/l, Kreuzreaktionen: Humanes Insulin
< 10000 pmol/l, Humanes C-Peptid 50000 pmol/l, Proinsulin des (31,32)
< 200 pmol/l, Proinsulin split (32,33) 5000 pmol/l, des(64,65) Proinsulin 200 pmol/l,
split (65,66) Proinsulin 1000 pmol/l.
3.3.6 Orale Antidiabetika
3.3.6.1 Chemikalien
Chemikalien
Firma
Sitz
Glibenclamid,
Glimepirid,
Glisoxepid, Gliclazid, Repaglinid
Sigma
Steinheim, Deutschland
Gliquidon
Astellas
München, Deutschland
Glipizid
Pfizer
Karlsruhe, Deutschland
Nateglinid
Novartis
Nürnberg, Deutschland
Pioglitazon
Takeda
London, UK
Rosiglitazon
GlaxoSmithKline
Brentford, UK
Sitagliptin
Merck Sharpe and Dohme
Hertfordshire, UK
Vildagliptin
MSD
Haar, Deutschland
Saxagliptin
Bristol Myers Squibb
Middlesex, UK
Hydroxytolbutamid - d9, Repaglinid ethyl - d5, Pioglitazon - d4,
Vildagliptin - d3
Toronto
Chemicals
Toronto, Kanada
Research
Tabelle 15: Chemikalien für die Analytik oraler Antidiabetika
65
3. Material und Methoden
3.3.6.2 Probenvorbereitung
Serumproben (0,5 ml) werden mit 50 µl des IS-Mix versetzt (1 µg/ml
Hydroxytolbutamid-d9, Repaglinid-ethyl-d5, Pioglitazon-d4 und Vildagliptin-d3). Die
wässrige Phase wird mit 4 ml TBME extrahiert. Nach einminütigem Vortexen und
10 min Zentrifugieren bei 4.000 rpm wird die organische Phase in ein anderes
Reagenzglas überführt. Der pH-Wert der wässrigen Phase wird anschließend durch
die Zugabe von 0,5 ml Phosphatpuffer (pH 3) reduziert und erneut mit 4 ml TBME
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden unter Stickstoff bei 60°C bis
zur Trockne eingeengt und der Rückstand in 200 µl Acetonitril wiederaufgenommen.
Ein Aliquot von 5 µl wurde in das LC-MS/MS System injiziert.
3.3.6.3 Chromatographische und massenspektrometrische Bedingungen
Die HPLC war mit einer Luna® Reversed phase C8 analytischen Säule (Partikelgröße
3 µm, 150*2 mm; Phenomenex, Aschaffenburg, Deutschland) und einer Kromasil®
C18 Vorsäule (Partikelgröße 4*2 mm; Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)
ausgestattet. Die Laufmittel bestanden aus A: Ammoniumformiat (0,005 M, mit
Ameisensäure auf pH 3 eingestellt)/Acetonitril 90:10 und B: Acetonitril. Der Gradient
und die Flussrate wurden folgendermaßen eingestellt: 0-4 min 40 % B (Fluss:
0,3 ml/min), 4-6 min 90 % B (Fluss: 0,5 ml/min), 6-7min 90 % B (Fluss: 0,7 ml/min),
7-10 min 40 % B (Fluss: 0,3 ml/min). Die Ionisation fand per ESI im positiven Modus
bei 400°C statt. Alle Analyten wurden mit 2 Ionenübergängen von protonierten
Molekülionen zu Fragmentionen im MRM erfasst. Für jeden Analyten wurde der
intensivste
Ionenübergang
für
die
Quantifizierung,
der
zweitintensivste
Ionenübergang für die Qualifizierung des Analyten genutzt. Die optimierten
Ionenübergänge, Kollisionsenergien und Ionenverhältnisse zur Quantifizierung jedes
Analyten sind in Tabelle 16 dargestellt.
3.3.6.4 Besonderheiten bei der Validierung
Die LC-MS/MS Methode wurde in humanem Plasma für die Quantifizierung der in
Abbildung 4 dargestellten Analyten validiert. Für Kalibrierungen und Quantifizierung
wurden die Peakflächenverhältnisse Analyt / IS benutzt. Sulfonylharnstoffe wurden
auf Hydroxytolbutamid-d9, die Glinide auf Repaglinid-ethyl-d5, die Glitazone auf
Pioglitazon-d4 und die Gliptine auf Vildagliptin-d9 bezogen.
66
3. Material und Methoden
Tabelle
Analyt
Declustering
Potential
Target
Ionenübergang
Glimepirid
106
491,17
352,1
-
Gliclazid
66
324,17
127,12
-
Glipizid
56
446,30
103,08
-
Glibenclamid
81
494,16
368,95
-
Glibornurid
86
367,16
170,1
-
Gliquidon
91
528,28
403,0
-
Glisoxepid
11
450,25
115,16
-
Repaglinid
26
453,33
230,14
-
Nateglinid
66
318,37
166,0
-
Rosiglitazon
91
358,23
135,2
-
Pioglitazon
76
357,25
134,1
-
Vildagliptin
61
304,19
153,9
-
Sitagliptin
71
408,22
235,0
-
Saxagliptin
66
316,22
180,0
-
Hydroxy
Tolbutamid
d9
- 71
296,40
83,0
-
Repaglinidethyl - d5
81
458,14
230,1
-
91
361,15
138,2
-
62
307,20
162,9
-
Pioglitazon
d4
-
Vildagliptin
d3
-
16:
Optimierte
CE
Qualifier
Ionenüber- CE
gang
Relative
IonenintensitätArea
qualifier/
Area
target)*100)
19
491,24
126,09
-
37
33,40%
23
324,17
110,08
-
53
56,80%
61
446,30
77,06
-
101
52,10%
19
494,16
168,95
-
49
31,40%
25
367,16
152,0
-
29
91,50%
19
528,28
386,0
-
31
33,60%
33
450,25
141,07
-
33
46,30%
47
453,33
162,04
-
25
36,00%
21
318,37
125,1
-
21
79,20%
37
358,23
119,2
-
75
17,20%
43
357,25
119,08
-
63
12,60%
25
304,19
97,0
-
43
43,20%
27
408,22
173,9
-
39
85,30%
29
316,22
163,0
-
51
4,70%
21
296,40
90,1
-
59
8,90%
39
458,14
162,3
-
29
38,60%
41
361,15
123,1
-
69
57,10%
20
307,20
106,0
-
40
40,70%
Ionenübergänge,
Kollisionsenergien
und
relative
Ionenintensitäten orale Antidiabetika
Linearität: Kalibrationsstandards (9 Kalibrationslevel) wurden durch Spiken von
Leerplasma mit methanolischen Standards erstellt (Tabelle 17). Die Konzentrationen
der Analyte wurden mit einem linearen Regressionsmodell aufgetragen. Präzision
des Messgeräts („Instrument precision“): Qualitätskontrollproben in niedrigen und
67
3. Material und Methoden
hohen Konzentration wurde extrahiert und fünf mal innerhalb einer Batch und in fünf
unterschiedlichen Batches injiziert, um die Präzision des Messgeräts zu testen.
Genauigkeit: Tabelle 17 zeigt die Konzentration der Qualitätskontrollproben. Stabilität
aufgearbeiteter Proben: Die Stabilität der Analyten in extrahierten Proben wurde
ermittelt, indem zwei Konzentrationen der Analyten sechs Mal analysiert wurden,
nachdem die sechs Extrakte der sechs Proben zunächst vereint wurden, um sie
anschließend wieder in sechs Teile aufzuteilen. Diese sechs Proben wurden dann
innerhalb eines Tages in Intervallen von zwei Stunden gemessen. Die maximale
Abweichung von der ersten Messung und die Genauigkeit wurde bestimmt. Die
absoluten Peakflächen jeder Konzentration wurde auf die Injektionszeit bezogen.
Stabilität in der extrahierten Probe wurde angenommen, wenn innerhalb von 10
Stunden die absoluten Peakflächen nur um 20 % von der ersten Probe abwichen.
Matrixeffekte und Wiederfindung: Die niedrige und hohe Konzentration waren: 5 und
150 ng/ml für Glibenclamid, 50 und 750 ng/ml für Gliquidon, 50 und 750 ng/ml für
Glibornurid, 50 und 2500 ng/ml für Gliclazid, 25 und 1000 ng/ml für Glimepirid,
10 und 750 ng/ml für Glipizid, 50 und 750 ng/ml für Glisoxepid, 2 und 250 ng/ml für
Repaglinid, Nateglinid, Pioglitazon, Rosiglitazon und 5 und 200 ng/ml für Vildagliptin,
Sitagliptin und Saxagliptin. Analytische Grenzen: Die LoD wurde definiert als die
geringste Konzentration, die mit statistischer Sicherheit bei einem Signal-RauschVerhältnis > 3 noch detektiert werden kann. Für die Bestimmung wurden
Qualitätskontrollproben mit 1 ng/ml jedes Analyten vermessen. Das mittlere
Hintergrundrauschen plus dreifacher Standardabweichung wurde aus sechs
Leerplasmaproben (Selektivität) bei den entsprechenden Retentionszeiten im MRM
errechnet.
68
3. Material und Methoden
Analyt
Konzentrationslevel Linearität [ng/ml]
Glimepirid
10, 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 3000
Coefficient
of
QC-Level
determination
Low, Middle,
2
(R )
High [ng/ml]
25 (Low)
250 (Middle)
0,9994
1000 (high)
50 (Low)
Gliclazid
10, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000
500 (Middle)
0,9984
2500 (High)
10 (Low)
Glipizid
5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000
100 (middle)
0,9966
750 (High)
5 (Low)
Glibenclamid
1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200
50 (middle)
0,9966
150 (High)
50 (Low)
Glibornurid
10, 50, 75, 100, 150, 250, 500, 750, 1000
150 middle)
0,999
750 (High)
50 (Low)
Gliquidon
10, 50, 75, 100, 150, 250, 500, 750, 1000
150 (middle)
0,9993
750 (High)
40 (Low)
Glisoxepid
10, 50, 75, 100, 150, 250, 500, 750, 1000
200 (middle)
0,9952
750 (High)
2 (Low)
Repaglinid
1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500
25 (middle)
0,9973
250 (High)
2 (Low)
Nateglinid
1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500
25 middle)
0,9972
250 (High)
2 (Low)
Rosiglitazon
1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500
25 Middle)
0,9992
250 (High)
2 (Low)
Pioglitazon
1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500
25 (middle)
0,9952
250 (High)
5 (Low)
Sitagliptin
1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500
50 (middle)
0,998
200 (High)
5 (Low)
Vildagliptin
1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500
50 (middle)
0,9915
200 (High)
5 (Low)
Saxagliptin
1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500
50 (middle)
0,9944
200 (High)
Tabelle 17: Konzentrationen der gespikten Plasmaproben für Linearitätsstudien orale
Antidiabetika
69
3. Material und Methoden
3.3.7 Methylglyoxal
3.3.7.1 Chemikalien und Reagenzien
MG (40% Arbeitslösung in Wasser), 3,4-Hexandion und 2,3-Diaminonaphthalen wurden
von Sigma (Steinheim, Deutschland) erhalten.
3.3.7.2 Stamm- und Arbeitslösungen, QC-Lösungen
Die kommerziell erhältliche Stammlösung von MG (40%) und des IS (1 mg/ml
3,4-Hexandion in Methanol) wurden auf 100 µg/ml mit Methanol verdünnt, unter
Heliumatmosphäre und in Braunglasflaschen gelagert. Für jede Probenbatch wurde
die IS Arbeitslösung (1 µg/ml Methanol) frisch hergestellt. Für jede neue
Kalibrationskurve wurde die MG Stammlösung frisch verdünnt, um Serum oder post
mortem Femoralblut mit den zusätzlichen Konzentrationen zu spiken: 5 ng/ml,
10 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 75 ng/ml, 100 ng/ml, 150 ng/ml, 250 ng/ml und
500 ng/ml. QC-Proben wurden ebenfalls frisch am Tag der Probenvorbereitung in
folgenden zusätzlichen Konzentrationen hergestellt: 15 ng/ml (low), 60 ng/ml (middle)
und 125 ng/ml (high).
3.3.7.3 Probenvorbereitung Serum und post mortem Blut
Post mortem Proben, die immer eine höhere Konzentration MG als der höchste
Kalibrationspunkt aufwiesen, wurden vor der Probenvorbereitung mit HPLC grade
Wasser 1:10 verdünnt. 500 µl Blutserum oder verdünntes post mortem FVB wurden mit
10 µl der IS Arbeitslösung (1 µg/ml) versetzt. Anschließend wurden die Proteine durch
Zugabe von 250 µl Perchlorsäure (7 %) gefällt und MG aus seiner hohen Proteinbindung
befreit. Die Probe wurde dann für 10 s gemischt, für 15 Minuten stehen gelassen und für
10 min bei 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Zugabe von 250 µl
gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung neutralisiert. Anschließend wurde nach
Zugabe von 100 µl 2,3-Diaminonaphthalen (1 mg/ml in Methanol) über Nacht bei 4°C
derivatisiert (Derivatisierungsschema in Abbildung 12). Die Probe wurde mit 4 ml
Ethylacetat extrahiert. Nach Überführen der organischen Phase in ein anderes
Reagenzglas wurde diese unter Stickstoff bei 40°C eingedampft und in 200 µl Methanol
wiederaufgenommen.
3.3.7.4 Überwachung des Derivatisierungsschritts
Die Beendigung des Derivatisierungsschritts wurde getestet, indem MG und der IS in
drei Konzentrationen (10 ng/ml, 40 ng/ml, 200 ng/ml) nach Zugabe des
70
3. Material und Methoden
Derivatisierungsmittels nach 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 18 h, 24 h und 48 h extrahiert und
vermessen wurden.
O
H
CH3
+
O
O
C2H5
N
NH2
N
CH3
2,3-Diaminonaphthalen
Methylglyoxal
C2H5
NH2
NH2
N
C2H5
NH2
N
C2H5
+
O
2,3-Diaminonaphthalen
3,4-Hexandion
Abbildung 12: Derivatisierung von MG und des IS mit 2,3-Diaminonaphthalen
3.3.7.5 Probenvorbereitung Zellmaterial
Das Zellmaterial wurde mit 1 ml Lysepuffer versetzt und solange gevortext, bis das
gesamte Zellmaterial homogen im Puffer verteilt war. Anschließend wurde die
Lösung dreimal nacheinander zunächst in flüssigem Stickstoff schockgefroren und
anschließend im Ultraschallbad wieder aufgetaut. Durch dieses Prozedere wurden
die Zellwände lysiert und das MG freigesetzt. 100 µl der Lösung wurden dann mit
400 µl HPLC grade Wasser versetzt und mit der Proteinfällung wie unter 3.3.7.3
beschrieben fortgesetzt.
3.3.7.6 Chromatographische und massenspektrometrische Bedingungen
Die chromatographische Trennung wurde mittels einer Phenomenex (Aschaffenburg,
Deutschland) Synergi® MAX-RP C12 analytischen Säule (150*2 mm, 4 µm
Partikelgröße)
und
einer
Phenomenex
C18
(4*2mm)
Vorsäule
bei
einer
Säulentemperatur von 40 °C durchgeführt. Ein Gradient wurde mit den folgenden
Eluenten angelegt: Eluent A war 5 mM Ammoniumformiat in Wasser HPLC grade, der
pH-Wert mit Ameisensäure auf 3,5 eingestellt. Eluent B war 5 mM Ammoniumformiat in
Methanol. Der Gradient war: 70 % Eluent B auf 90 % Eluent B in 7 Minuten, 90 %
Eluent B auf 70 % B in 0,5 Minuten, abschließend 2,5 Minuten Equilibrierung bei 70 %
Eluent
B.
Es
wurde
per
ESI
im
positiven
Modus
gemessen.
Die
massenspektrometrischen Parameter wurden optimiert, indem eine Lösung des
derivatisierten MG oder des derivatisierten IS direkt in die Ionenquelle infundiert wurde.
Dazu wurde 1 ml einer Lösung von MG oder des IS (20 µg/ml) über Nacht mit
2,3-Diaminonaphthalen bei 4°C derivatisiert und mit der oben aufgeführten Methodik
71
3. Material und Methoden
aufgearbeitet. Die optimierten Ionenübergänge, Declustering potentials, CE und CXP im
MRM werden in Tabelle 18 gezeigt. Spannungen und Gaseinstellungen wurden
wiefolgt optimiert: Curtain Gas = 30 psi, Ion Spray Voltage 5500 V;
Temperatur = 420 °C, Ion Source Gas 1 = 40 psi, Ion Source Gas 2 = 60 psi;
Entrance Potential 10 V.
Target
Declustering Ionenüber- CE
Analyt
potential [V] gang
[V]
195.1
49
MG Derivat 81
126.7
237.1
86
222.0
35
IS Derivat
CXP
[V]
24
36
Qualifier
IonenüberCE [V]
gang
195.1
63
77.0
237.1
126.9
85
CXP
[V]
14
6
Tabelle 18: Optimierte Ionenübergänge, declustering potentials, Kollisionsenergien
und cell exit potentials der MG-Methodik
3.3.7.7 Besonderheiten bei der Validierung
Die Methode wurde in humanem Serum und post mortem Femoralblut validiert.
Genauigkeit: Genauigkeitsdaten wurden nur in Blutserum als Matrix erhoben. Die
Qualitätskontrollproben wurden gegen ein lineares Regressionsmodell ausgewertet,
indem die Standardadditionsmethode benutzt wurde. Die Konzentrationen der 6
Matrixkalibrationen wurden gewichtet und die gewichtete Kalibrationskurve wurde
nach Subtraktion der initialen Konzentration und Extrapolierung zur y-Achse zur
Abschätzung der Genauigkeitsdaten herangezogen. Analytische Grenzen: Für die
Bestimmung der analytischen Grenzen wurde Wasser mit den folgenden
Konzentrationen im erwarteten Bereich der LoD gespikt: 1 ng/ml, 2 ng/ml, 2.5 ng/ml,
5 ng/ml, 7.5 ng/ml, 10 ng/ml. Zur Erstellung der Kalibrationskurve wurde die
Peakfläche des schwächeren Qualifierpeaks von MG auf die Peakfläche des IS
Targetpeaks bezogen und mittels linearer Kalibration ausgewertet. Stabilität in
klinischen Proben: Blut von 10 Freiwilligen wurde sofort zentrifugiert. Das Blutserum
wurde in Aliquote aufgeteilt, sofort aufgearbeitet und gemessen oder bei -20 °C
gelagert und 24 h, 48 h, 5 d und 8 d nach Probennahme aufgearbeitet. Stabilität
wurde angenommen, wenn die Abnahme der absoluten Peakflächenvon MG
innerhalb der 14 Tage weniger als 20% betrug. Veränderungen der MG
Konzentrationen in forensischen Proben nach dem Tod: FVB, GKF und CSF von 5
Verstorbenen ohne eine Diabeteserkrankung (Mittelwert der Zeit zwischen Tod und
Obduktion 3,0 Tage; Fallinformationen in Tabelle 29, 4.3.5) wurden bei der
72
3. Material und Methoden
Obduktion gesammelt und die MG-Konzentration sofort, 24 h, 48 h, 5 d, 8 d oder 10
d nach Probennahme gemessen. Glucose- und Laktat-Konzentrationen in der GKF
und der CSF wurden gemessen. Zu diesem Anlass wurden die post mortem-Proben
mit Aceton gefällt und mit einer Natriumchlorid-Lösung (7% in Wasser) 1:2 verdünnt.
3.3.8 Anhydroglucitol
3.3.8.1 Chemikalien
1,5-Anhydro-D-glucitol
wurde
von
Sigma
1,5- Anhydro-D-[13C6] glucitol (98 atom%
(Steinheim,
Deutschland),
der
IS
13
C) von Omicron Chemicals (South Bend,
USA) erhalten.
3.3.8.2 Herstellung von Stamm- und Arbeitslösungen
Stammlösungen von AG und dem IS wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml in
HPLC grade Wasser angesetzt. Die Arbeitslösung des IS hatte die Konzentration
200 µg/ml HPLC grade Wasser.
3.3.8.3 Optimierte Probenvorbereitung
Die Proben wurden nach Li et al. [287, 292] vorbereitet: 50 µl Serum wurde mit 10 µl
der IS-Arbeitslösung (200 µg/ml 1,5-Anhydro-D-[13C6] glucitol) versetzt und die Proteine
durch Zugabe von 200 µl Methanol gefällt. Die Probe wurde 10 s gevortext und 10 min
bei 10.000g zentrifugiert. Der Überstand wurde fünffach mit Acetonitril verdünnt. 10 µl
dieses verdünnten Extrakts wurden dann ins chromatographische System injiziert.
3.3.8.4 Chromatographische und massenspektrometrische Bedingungen
Die chromatographische Trennung wurde mit einer Luna® NH2 (150*2 mm, 3 µm
Partikelgröße) analytischen Säule von Phenomenex (Aschaffenburg, Deutschland)
und einer Phenomenex NH2 (4*2mm) Vorsäule durchgeführt. Ein isokratischer Fluss
(0,5 ml/min) mit einer Mischung aus Acetonitril und Wasser (80:20, v/v) für 6 min wurde
genutzt. Die Moleküle wurden mittels APCI im negativen Modus ionisiert. Die
massenspektrometrischen Parameter wurden optimiert, indem eine Lösung (10 µg/ml)
von AG oder des IS direkt in die Ionenquelle des Massenspektrometers infundiert wurde.
Die optimierten Ionenübergänge im MRM waren 162,8-112,7 (target) und 162,8-101,0
(qualifier) für AG und 168,9-105,0 für den IS. Declustering Potentiale waren -20 V für AG
und -25 V für den IS, CE -10 V (target) und -7 V (qualifier) für die Übergänge von AG und
-12 V für den IS. CXP waren -7 V für AG und -5 V für the IS. Die Spannungen und
73
3. Material und Methoden
Gaseinstellungen wurden wie folgt optimiert: Curtain Gas 10 psi, Ion Spray Voltage
-4500 V, Temperatur 450 °C, Ionenquelle (Gas 1) 50 psi, Ionenquelle (Gas 2) 40 psi,
Entrance Potential -10 V.
3.3.8.5 Besonderheiten bei der Validierung
Die Methode wurden in humanem Serum validiert [293]. Für postmortem Vollblut
wurde
die
Methode
teilweise
validiert
(keine
Genauigkeit).
Linearität:
Kalibrationsstandards für AG wurden in den zusätzlichen Konzentrationen 1 µg/ml,
2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 25 µg/ml und 50 µg/ml hergestellt. Genauigkeit: Zur
Herstellung von QC-Proben wurden wässrige Lösungen hergestellt und derart zu
Serum dotiert, dass die zusätzlichen Konzentrationen low (3 µg/ml), medium
(15 µg/ml) und high (40 µg/ml) entstanden. Analytische Grenzen: Die Kalibrierung zur
Bestimmung der analytischen Grenzen wurde in Wasser erstellt. Wasser wurde so
gespikt,
um
dieselbe
Konzentration
wie
die
finalen
Extrakte
der
sieben
Kalibrationslevel 0,1 µg/ml, 0,2 µg/ml, 0,25 µg/ml, 0,5 µg/ml, 0,75 µg/ml, 1,0 µg/ml
und 1,5 µg/ml im Bereich der erwarteten LoD zu erreichen. Matrixeffekte und
Wiederfindung: Die Methode von Matuszewski et al. [294] wurde aufgrund des
endogenen Vorkommens von AG folgendermaßen verändert: zu jeder Probe, die
normalerweise zur Bestimmung der Matrixeffekte und der Wiederfindung aufgearbeitet
wurde, wurde zusätzlich eine „Leer“probe aufgearbeitet und die absoluten Peakflächen
dieser „Leer“probe von der absoluten Peakfläche der gespikten Proben abgezogen. Die
beiden Konzentrationen betrugen 2,5 µg/ml und 25 µg/ml. Stabilität in klinischen
Proben: Blut von 10 Freiwilligen wurde direkt nach der Entnahme zentrifugiert und in
sechs Teile aliquotiert. Ein Teil wurde direkt aufgearbeitet und gemessen, die
anderen Aliquote wurden bei -20°C gelagert und 24 h, 48 h, 72 h, 7 d und 14 d nach
der Entnahme aufgearbeitet. Stabilität wurde angenommen, wenn die Abnahme der
absoluten Peakfläche des Targetionenübergangs von AG innerhalb von 14 Tagen
weniger als 20 % betrug. Stabilität in forensischen Proben: FVB von 5 Verstorbenen
ohne eine Diabeteserkrankung (PMI 3,2 Tage) wurde bei der Obduktion gesammelt
und jeweils sofort, 24 h, 48 h, 72 h, 7 d und 14 d doppelt auf AG analysiert.
3.3.8.6 Das Verhältnis Vollblut-Serum
Das Verhältnis Vollblut/Serum von AG wurde bestimmt, indem Serum und Vollblut
von 20 gesunden lebenden Nicht-Diabetikern bestimmt wurden.
74
3. Material und Methoden
3.3.9 Ketonkörper
3.3.9.1 Chemikalien
Die Enzyme β-Hydroxybutyratdehydrogenase und Laktat-Dehydrogenase wurden
von Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) erhalten. Aceton, LithiumAcetoacetat,
Natrium-β-Hydroxybutyrat,
Pyruvat,
Nicotinamidadenindinukleotid
(NAD) und tertiär-Butanol wurden von Sigma (Steinheim, Deutschland) erhalten.
3.3.9.2 Probenvorbereitung
Zur
gaschromatographischen
Bestimmung
von
Aceton
ist
keine
vorherige
Probenaufarbeitung notwendig. 1 ml Blut wird in ein 20 ml Head-Space-Vial pipettiert
und 100 µl einer Lösung des IS (tertiär-Butanol, 100µg/ml) zugegeben. Anschließend
wird die Probe vermessen.
Für die Bestimmung des Acetoacetat-Gehalts wird ähnlich vorgegangen: 1ml der
Matrix mit internem Standard wird in ein Head-Space-Vial gegeben und das
Acetoacetat wird im Head-Space Ofen 60 min bei einer Temperatur von 100°C zu
Aceton decarboxyliert. Anschließend wird die Probe vermessen.
β-Hydroxybutyrat muss dagegen vorher in einer enzymatischen Reaktion in
Acetoacetat umgewandelt werden. Dazu werden zu 1 ml Matrix IS, 10 µmol Pyruvat,
0,5
µmol
NAD,
10µl
β-Hydroxybutyratdehydrogenase
und
10µl
Laktat-Dehydrogenase zugefügt. Das Enzym β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase
wandelt β-Hydroxybutyrat in 30 min bei 45°C in Acetoacetat um. Daran schließt sich
wiederum eine einstündige Decarboxylierung an.
Abbildung
13:
Reaktion
von
Hydroxybutyrat
zu
Aceton
während
der
Probenvorbereitung
3.3.9.3 Head Space gaschromatographische Parameter
Die Head-Space-Bedingungen für die Bestimmung des Acetons sind wiefolgt:
Nadeltemperatur:
90°C,
Ofentemperatur:
60°C,
Transfertemperatur:
90°C,
Thermostatierzeit: 20 Minuten. Die Head-Space Bedingungen für die Bestimmung
von Acetoacetat und β-Hydroxybutyrat sind wie folgt: Nadeltemperatur: 110°C,
75
3. Material und Methoden
Ofentemperatur: 100°C, Transfertemperatur: 115°C, Thermostatierzeit: 60 Minuten.
Die Injektortemperatur betrug 150 °C, die Detektortemperatur 250 °C. Folgendes
Temperaturprogramm wurde gefahren: Start: 40 °C, 15 Minuten halten; mit 4°C/min
auf 200°C, 10 Minuten halten; mit 15°C/min auf 230°C, 10 Minuten halten.
3.3.9.4 Validierung
Folgende Validierungsparameter wurden bestimmt: Linearitätsbereich: 0-3000 mg/l
(Aceton); 0-1000 µmol/l (Acetoacetat); 0-30000 µmol/l (β-Hydroxybutyrat); LoQ
0,6 mg/l (Aceton); 9,5 µmol/l (Acetoacetat); 85 µmol/l (β-Hydroxybutyrat); intra day
precision 5,0 % (bei 10 mg/l, n = 16), 2,6 % (bei 100 mg/l, n = 16) für Aceton; 13 %
(bei 100 µmol/l, n = 16) und 1,7 % (bei 1000 µmol/l, n = 16) für Acetoacetat und
2,8 % (bei 100 µmol/l, n = 16) und 0,2 % (bei 1000 µmol/l, n = 16) für
β-Hydroxybutyrat; inter day precision 10,0 % (bei 10 mg/l, n = 16) und 5,1 % (bei 100
mg/l, n = 16) für Aceton; 1,7 % (bei 100 µmol/l, n = 16) und 14,0 % (bei 1000 µmol/l,
n = 16) für Acetoacetat und 4,5 % (bei 100 µmol/l, n = 16) und 0,2 % (bei
1000 µmol/l, n = 16) für β-Hydroxybutyrat.
3.4
Probenmaterial
3.4.1 Klinische Proben
Serum von 480 Diabetikern wurde aus dem Herz- und Diabeteszentrum NordrheinWestfalen
in
Bad
Oeynhausen
erhalten.
Die
Studie
wurde
von
den
Ethikkommissionen der Ruhr-Universität Bochum und der Universität Bonn
genehmigt. Die Diagnose des Diabetestyps wurde auf der Basis von spezifischen
Messungen (Antikörperscreening, oraler Glucosetoleranztest) oder der Anamnese
bei Aufnahme ins Krankenhaus getätigt. Das Blut wurde morgens nach dem
Aufstehen und nach Medikamenteneinnahme entnommen und innerhalb der
folgenden Stunden zentrifugiert. Das Serum wurde bis zum Transport bei -20 °C
gelagert und der Transport auf Trockeneis innerhalb von 3 Werktagen durchgeführt.
Glucose, Fructosamin, humanes Insulin, C-Peptid, Proinsulin und AG wurde im
Serum gemessen. HbA1c wurde noch vor der Zentrifugation im EDTA-Blut
gemessen. Für die MG-Untersuchungen wurden zusätzlich zu Blutproben von 100
Diabetikern (24 Typ 1 Diabetiker und 74 Typ 2 Diabetiker, 2 mit einem unbekannten
76
3. Material und Methoden
Diabetestyp) Blut von 18 Nicht-Diabetikenr gesammelt und in gleicher Weise
behandelt.
Die klinische Population wurde für die statistische Auswertung neben der Einteilung
nach Geschlecht, Diabetestyp oder Länge der Diabeteserkrankung nach ihrer
Medikation aufgeteilt. Die humanen Insulin-Konzentrationen waren nur bei
Diabetikern quantifizierbar, in deren Serum kein Humalog® (Insulin lispro) mittels
LC-MS nachgewiesen werden konnte. Diese wurden aus dem Kollektiv entfernt und
das Restkollektiv in die im Folgenden aufgeführten Gruppen eingeteilt:
1. Diabetiker ohne nachgewiesene antidiabetische Medikation
2. Diabetiker nach Einnahme oraler Antidiabetika, die mittels der beschriebenen
LC-MS/MS-Methodik
Patienten,
bei
quantifiziert
denen
wurden
synthetische
(siehe Kapitel
Insulinanaloga
3.3.6.3). Alle
mittels
LC-MS
nachgewiesen werden konnten oder in deren Anamnese die Einnahme von
humanem Insulin verordnet war, wurden aus dem Kollektiv entfernt.
3. Diabetiker nach Injektion von synthetischen Insulinanaloga, die mittels der
beschriebenen LC-MS-Methodik (siehe Kapitel 3.3.3.5) quantifiziert wurden.
Alle Patienten, bei denen orale Antidiabetika mittels LC-MS/MS nachgewiesen
werden konnten oder in deren Anamnese die Einnahme von humanem Insulin
verordnet war, wurden aus dem Kollektiv entfernt.
4. Diabetiker nur unter Therapie mit humanem Insulin. Die Therapie mit
humanem Insulin wurde dem ärztlichen Bericht entnommen. Alle Patienten,
bei
denen
orale
Antidiabetika
mittels
LC-MS/MS
oder
synthetische
Insulinanaloga mittels LC-MS nachgewiesen werden konnten, wurden aus
dem Kollektiv entfernt.
3.4.2 Vergleich der immunchemischen mit der chromatographischen Methode
für humanes Insulin
Humanes Insulin im Serum wurde bei 203 Diabetikern mit beiden beschriebenen
(3.3.3.1 und 3.3.3.4) Methoden gemessen. Bei allen Patienten wurde die Einnahme
von synthetischen Insulinen, die die immunchemische Insulinanalytik stört, mittels
der LC-MS-Methodik ausgeschlossen.
3.4.3 Forensische Proben
Forensische Proben wurden dem Obduktionsgut des Instituts für Rechtsmedizin der
Universität Bonn entnommen. Fallbeispiel 5.3.10.1 wurde vom Institut für
77
3. Material und Methoden
rechtsmedizin
der
Universität
Düsseldorf
bereitgestellt.
Die
Einteilung
der
Verstorbenen in Nicht-Diabetiker und Diabetiker wurde auf Basis der Patienten- und
Gerichtsakten getätigt. Blut wurde aus der Vena femoralis entnommen, Urin während
der Obduktion durch eine Punktion der Blase gewonnen. Die Glaskörperflüssigkeit
(GKF) wurde aus dem rechten Auge nach Punktion der vorderen Augenkammer mit
einer feinen Spritze vorsichtig angesaugt. Der Liquor cerebrospinalis (CSF) wurde
durch eine suboccipitale Punktion gewonnen. Für die Analytik wurde der nach
Zentrifugation erhaltene Überstand genommen. GKF, CSF und Urin wurden nach
Zentrifugation unbehandelt vermessen. Die Konzentrationen lagen vor allem bei
Laktat oberhalb der Kalibrationsbereiche und die Proben wurden mit einer
Natriumchlorid-Lösung
(9 g/l) vor der Messung verdünnt. Glucose, Laktat und Fructosamin wurden im mit
Aceton (1:1) gefällten FVB, GKF und CSF gemessen. HbA1c wurde im FVB
gemessen. 20 µl des Bluts wurden dazu mit 1000 µl Hämolysereagenz versetzt und
bis zur vollständigen Hämolyse 5 min stehen gelassen.
3.4.4 Statistische Auswertung
Die statistische Analyse wurde mit der Software SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL,
USA) durchgeführt. Aufgeführt werden bei Variablen mit Normalverteilung der
Mittelwert, der Bereich zwischen minimaler und maximaler Konzentration und die
Standardabweichung. Einzelne Kollektive wurden mittels des Mann-Whitney-U-Tests
(bei 2 Kollektiven) und mittels des Kruskal-Wallis-Tests (bei mehr als 2 Kollektiven)
miteinander verglichen. Um einzelne Parameter miteinander zu korrelieren, wurde
eine
Korrelationskoeffizienten-Analyse
nach
Pearson
und
multiple
Regressionsanalysen durchgeführt. Statistische Signifikanz wurde bei einem p-Wert
von < 0,05 angenommen.
78
4. Ergebnisse
4
4.1
Ergebnisse
Analytische Methodenentwicklung
4.1.1 Humanes und synthetische Insuline
Die chromatographische Trennung und Enhanced Produktionenspektren der
unterschiedlichen Insuline werden in Abbildung 14 dargestellt. Die Methode wurde
erfolgreich in humanem Serum validiert. Die wichtigsten Validierungsdaten sind in
Tabelle 19 dargestellt. Selektivität ist gegeben. Es gab keine interferierenden Peaks
mit den Signalen aller Insuline. Weiterhin störte der IS nicht bei der Detektion der
Analyten. Die Methode ist für alle Insuline innerhalb des Kalibrationsbereichs
5-200 µU/ml (0,2-8 ng/ml) linear. Regressionskoeffizienten waren immer R2 > 0,99.
Eine wässrige und eine Matrixkalibration waren aufgrund der unterschiedlichen
Wiederfindungsraten von Analyten und IS nicht vergleichbar. Daher musste bei der
Routineanalytik auf zwei Matrixkalibrationen (für jeweils 3 Analyten) zurückgegriffen
werden. Die LoD aller Insuline liegt bei < 2 µU/ml (< 0,08 ng/ml), die LoQ bei
< 5 µU/ml (< 0,2 ng/ml). Nüchtern-Konzentrationen von humanem Insulin, die
normalerweise bei 5-30 µU/ml (0,2-1,2 ng/ml) liegen, können mit dieser Methode
detektiert werden. Matrixeffekte waren innerhalb der akzeptablen Bereiche 75 % bis
125 %. Wiederfindungsraten mit dieser Immunoaffinitätsaufreinigung betragen
33,2-51,7
%.
Für
die
Stabilitätsstudien
wurde
Serum
sofort
nach
der
Probensammlung von den roten Blutkörperchen getrennt. Abbildung 15 zeigt die
Veränderungen der humanen Insulinkonzentrationen von drei Patienten im Serum in
den ersten zwei Wochen nach Probensammlung. Die Abnahme der Peakfläche des
humanen Insulins betrug weniger als 20 % und die Insulinkonzentration war über den
Zeitraum von 2 Wochen stabil, sodass bei diesen Bedingungen eine Stabilität
angenommen werden kann. Der Zusatz von Insulinase-Inhibitoren brachte keinen
Stabilitätsvorteil.
79
4. Ergebnisse
Abbildung 14: Chromatographische Trennung und Produktionenspektren von (a)
humanem Insulin und seinen synthetischen Analoga (b) Lantus®, (c) Apidra®,
(d) Humalog®, (e) Novolog® und (f) Levemir®
80
4. Ergebnisse
Humanes Insulin
LoD
LoQ
Level
Intra
day
precision (n
= 16)
Inter
day
precision (n=16)
Wiederfindung (n
= 5)
SD
Matrixeffekte (n
= 5)
SD
1,0 µU/ml
3,0 µU/ml
100 µU/ml
9,86%
13,20%
51.7 %
15,80%
101%
12,80%
10 µU/ml
4,82%
12,10%
38.1 %
4,40%
79,30%
6,50%
10,90%
12,80%
37.2 %
5,30%
94,70%
2,10%
Humalog
1,2 µU/ml
3,3 µU/ml
100 µU/ml
10 µU/ml
6,88%
14,80%
38.6 %
3,20%
97,40%
6,80%
Apidra
1,5 µU/ml
4,3 µU/ml
100 µU/ml
11,70%
12,80%
39.9 %
4,50%
82,70%
7,00%
10 µU/ml
6,44%
16,70%
34.0 %
3,90%
96,40%
13,90%
Novolog
1,8 µU/ml
5,2 µU/ml
100 µU/ml
12,40%
14,10%
42.2 %
5,30%
89,60%
8,30%
10 µU/ml
10,40%
14,10%
33.2 %
5,00%
99,60%
8,80%
100 µU/ml
15,70%
14,10%
37.3 %
4,10%
93,70%
15,30%
10 µU/ml
19,80%
19,80%
40.6 %
3,50%
90,00%
13,30%
100 µU/ml
12,80%
7,75%
45.7 %
7,90%
88,20%
7,40%
10 µU/ml
9,18%
9,82%
46.1 %
9,20%
92,50%
6,80%
Lantus
Levemir
1,0 µU/ml
1,5 µU/ml
2,6 µU/ml
3,8 µU/ml
Tabelle 19: Validierungsdaten der Insuline in humanem Serum: Bestimmungs- und
Nachweisgrenzen, Genauigkeit, Wiederfindung und Matrixeffekte
Abbildung 15: Stabilität der Konzentration von humanem Insulin in Serumproben von
3 Patienten, die bei -20°C gelagert wurden und unbehandelt oder mit IDE-Inhibitoren
versetzt wurden
81
4. Ergebnisse
4.1.2 C-Peptid
Abbildung 16 zeigt ein Chromatogramm bei der Analyse auf C-Peptids inklusive IS
im MRM Modus nach Immunoaffinitätsaufreinigung.
Abbildung 16: Chromatogramm der beiden Ionenübergänge im MRM-Modus für das
C-Peptid und den IS Val-d5-C-Peptid einer Plasmaprobe mit 15 ng/ml C-Peptid
Selektivität und Spezifität sind gegeben. Es gab keine interferierende Peaks in den
Leermatrixproben, weiterhin störte der IS nicht bei der Detektion der Analyten.
Linearität ist im Bereich von 1-50 ng/ml im Serum gegeben. Die Methodik zeigte sich
aber nicht in der Lage, physiologische Konzentrationen des C-Peptids im Serum
nachzuweisen. Diese liegen bei 0,2-5 ng/ml. Die errechnete LoD der Methode liegt
bei 4,7 ng/ml, die LoQ bei 6,5 ng/ml. Daher wurde zur Messung der klinischen
Proben auf die in 3.3.4.1 beschriebene Immunchemie zurückgegriffen.
82
4. Ergebnisse
4.1.3 Orale Antidiabetika
Eine Methode zur simultanen Quantifizierung von 14 antidiabetischen Arzneistoffen
vom
Sulfonylharnstoff-,
Glinid-,
Glitazon-
und
Gliptintyp
wurde
entwickelt.
Abbildung 17 zeigt Chromatogramme. Wiederfindungsraten der meisten Arzneistoffe
lagen zwischen 79,3% und 106 %, die Wiederfindungsraten von Vildagliptin und
Saxagliptin lagen bei ungefähr 40 %. Geringe Wiederfindungsraten sind allerdings
kein großes Problem, da alle Gliptine auf den Peak des ebenfalls schlecht
extrahierbaren deuterierten Vildagliptins bezogen werden und vergleichbare
physikochemische Eigenschaften aufweisen. Wiederfindungsraten und Matrixeffekte,
die alle im akzeptablen Bereich von 75 bis 125 % lagen, sind in Tabelle 21
dargestellt. Alle sechs Leerplasmaproben waren selektiv für die Ionenübergänge aller
Analyten. Die drei Leerplasmen, die mit IS versetzt wurden, waren ebenfalls selektiv.
In Abbildung 17 sind Chromatogramme der Ionenübergänge im MRM dargestellt. Die
Methode ist linear von den LoD bis zu hohen therapeutischen Konzentrationen und
Überdosen. Die LLoD wurde definiert als die niedrigste Konzentration, die mit einer
statistischen Sicherheit bei einem Signal-to-noise-Verhältnis > 3 gemessen werden
kann. Dieses entscheidende Kriterium wurde für alle Analyten bei 1 ng/ml erreicht.
Linearitätsbereiche und das Bestimmheitsmaß der Arzneistoffe, die quantifiziert
werden können, sind in Tabelle 17 (siehe 3.3.6.4) dargestellt. Intraday precision
wurde bei drei Konzentrationen ermittelt und variierte zwischen 1,06 und 11,74 %,
interday precision zwischen 2,14 und 19,05 % (Tabelle 22). Stabilität in extrahierten
Proben wurde bei zwei Konzentrationen bestimmt. Alle Analyten waren im Extrakt
nach 10 Stunden stabil (Tabelle 20). Die Präzision des Instruments wurde ebenfalls
bei zwei Konzentrationen ermittelt, indem eine extrahierte Probe abwechselnd
fünfmal innerhalb einer Sequenz und im Verlauf von 5 aufeinanderfolgenden
Sequenzen injiziert wurde. Die Präzision des Instruments war für alle Analyten
< 15%. Die Methode wurde an 480 Realproben von Diabetikern getestet.
Gemessene Konzentrationsbereiche der einzelnen Wirkstoffe werden in Tabelle 23
gezeigt.
83
4. Ergebnisse
Abbildung 17: Chromatogramme der quantitativen Ionenübergänge für alle oralen
Antidiabetika im MRM einer mit 50 ng/ml jedes Analyten gespikten Plasmaprobe
84
4. Ergebnisse
Analyt
Gespikte
Konzentration Richtigkeit
(low und high) [ng/ml]
[%] (n = 10)
Stabilität
extrahierter
Proben
(n=6, t=10h);
Maximaler
Abfall
der
Regressionsgeraden
30
7,4
-18,1
1000
7,7
-10,7
75
6,4
-9,67
2500
4,3
0,63
10
4,4
-0,51
750
4,4
-6,04
5
9,6
-8,32
150
8,4
-11,6
50
6,5
13,4
750
4,7
0,35
50
8,7
-17,7
750
10,4
-4,08
50
5,2
-3,62
750
9,3
5,2
2
4,1
5,85
250
4
-0,6
2
6,9
11
250
8,1
-2,62
2
3,9
-3,4
250
2
-8,08
2
2,2
-3,89
250
1,5
-4,34
5
6,5
-6,06
200
4,1
-8,91
5
14,7
-17,7
200
2,8
-7,04
5
5,8
-12,1
200
2,6
-5,24
Glimepirid
Gliclazid
Glipizid
Glibenclamid
Glibornurid
Gliquidon
Glisoxepid
Repaglinid
Nateglinid
Rosiglitazon
Pioglitazon
Vildagliptin
Sitagliptin
Saxagliptin
Tabelle 20: Genauigkeit des Messinstruments und Stabilitätsdaten
85
4. Ergebnisse
Analyt
gespikte
Konzentration gespikte
Matrixeffekte
(low
und Konzentration
[%]
high)
[ng/ml]
SD [%]
Wiederfindungsrtae
SD [%]
[%]
Low
25
108,6
10,8
85,05
5,46
High
1000
97,21
14
99,57
13,4
Low
50
111,2
5,38
79,68
9,41
High
2500
89,31
13,2
88,44
11,1
Low
10
94,01
5,65
79,32
14
High
750
83,78
17,7
102,4
17,6
Low
5
93,63
3,87
84,02
10,1
High
150
84,84
12,6
101,4
11,8
Low
50
91,4
2,71
98,58
17,7
High
750
87,02
18,2
95,6
14,5
Low
50
101,5
5,8
90,59
11,3
High
750
92,75
12,2
89,63
13,1
Low
50
129,2
6
90,1
12,4
High
750
85,08
12,8
101,4
14,4
Low
2
91,66
4,28
99,98
19,1
High
250
78,63
7,65
102,8
11,4
Low
2
106
7,86
89,89
12,4
High
250
104,7
18,8
97,92
14,4
Low
2
92,07
6,06
91,26
9,14
High
250
80,3
13,2
105,7
16,4
Low
2
91,37
3,68
90,55
8,26
High
250
83,64
10,2
103,8
13,8
Low
5
81,88
4,59
41,87
1,05
High
200
84,83
6,41
40,62
13,2
Low
5
102,5
4,88
85,25
3,5
High
200
80,09
10,2
79,9
5,57
Low
5
70,04
5,22
37,2
5,41
High
200
73,48
7,23
39,2
7,88
Glimepirid
Gliclazid
Glipizid
Glibenclamid
Glibornurid
Gliquidon
Glisoxepid
Repaglinid
Nateglinid
Rosiglitazon
Pioglitazon
Vildagliptin
Sitagliptin
Saxagliptin
Tabelle 21: Matrixeffekte und Wiederfindungsraten orale Antidiabetika
86
4. Ergebnisse
Analyt
Glimepirid
Gliclazid
Glipizid
Glibenclamid
Glibornurid
Gliquidon
Glisoxepid
Gespikte
Konzentration
[ng/ml]
Mittlere
berechnete
Konzentration
[ng/ml] (n = 16)
Relative Standard
abweichung [%]
aller 16 Proben
Accuracy bias [%]
Intra
precision
[%]; n = 16)
25 (Low)
24,42
13,8
2,33
11,7
13,9
250 (Middle)
255,3
13,9
2,1
8,94
14,2
1000 (high)
1041
12,8
4,11
6,09
13,1
50 (Low)
50,98
11,3
1,96
7,84
11,6
500 (Middle)
538,8
8,37
7,77
7
8,46
2500 (High)
2382
10,8
4,73
7,07
11
10 (Low)
10,43
9,44
4,33
8,04
9,54
100 (middle)
92,62
6,17
7,38
7,87
7,87
750 (High)
778,2
7,46
3,76
5,36
7,59
5 (Low)
5,018
9,56
0,36
8,05
9,66
50 (middle)
52,77
8,39
5,53
8,01
8,41
150 (High)
162,5
10,9
8,35
7,48
11,1
50 (Low)
39,72
7,76
0,55
5,98
7,88
150 middle)
148,4
7,51
1,1
7,91
7,91
750 (High)
786,9
8,59
4,91
5,35
8,78
50 (Low)
51,68
9,39
3,36
8,75
9,44
150 (middle)
144,5
9,85
3,82
8,1
9,97
750 (High)
764,8
9,88
1,97
8,34
9,98
40 (Low)
39,72
6,9
0,7
7,99
7,99
200 (middle)
195,3
8,99
2,36
9,58
9,58
750 (High)
745,4
8,9
0,62
8,03
8,96
2,236
8,52
11,8
5,99
8,67
27,58
5,42
10,3
5,52
5,52
239,8
8,29
4,07
8,03
8,3
1,896
15,6
2,37
7,35
14
21,66
18,6
10,1
10,1
19,1
218,4
10,5
1,47
10,6
10,6
2,047
8,64
5,18
8,26
8,66
27,51
8,8
13,4
7,74
8,87
253,7
7,43
12,7
4,66
7,59
1,878
12,8
6,11
10,1
13
29,37
9,47
17,5
5,18
9,7
276,3
8,81
10,5
5,46
8,97
5,22
28,9
4,4
21,7
29,3
51,18
16,7
2,36
15,2
16,8
167,9
25,3
16
11,7
26
4,957
2,09
0,86
1,06
2,14
39,37
12,2
21,3
9,1
12,4
153,7
11,8
23,1
9,54
12
5,181
16,8
3,67
16,7
16,8
53,95
16,4
7,91
15
16,5
201,2
18,5
0,59
15,5
18,7
2 (Low)
Repaglinid
25 (middle)
250 (High)
2 (Low)
Nateglinid
25 middle)
250 (High)
2 (Low)
Rosiglitazon
25 Middle)
250 (High)
2 (Low)
Pioglitazon
25 (middle)
250 (High)
5 (Low)
Vildagliptin
50 (middle)
200 (High)
5 (Low)
Sitagliptin
50 (middle)
200 (High)
5 (Low)
Saxagliptin
50 (middle)
200 (High)
day
(RSD
Inter
precision
[%]; n = 16)
day
(RSD
Tabelle 22: Genauigkeitsdaten orale Antidiabetika
87
4. Ergebnisse
Wirkstoff
n
Mittelwert Minimum Maximum
45
15
< LoQ
174
Glimepirid
8,02
< LoQ
40,2
Glibenclamid 8
1
65,2
Gliquidon
58
98,3
< LoQ
670
Sitagliptin
3
16,9
9,96
27,3
Vildagliptin
4
228
31,3
488
Pioglitazon
1
< LoQ
Rosiglitazon
Tabelle 23: Gemessene Konzentrationsbereiche der oralen antihyperglykämischen
Wirkstoffe bei diabetischen Patienten
4.1.4 Methylglyoxal
Da MG ein sehr reaktives Dicarbonyl ist, war die Flüssigkeitschromatographie ohne
vorherige schützende Derivatisierung nicht möglich. 2,3-Diaminonaphthalen wurde als
Derivatisierungsmittel gewählt. Die Proben werden nach Fällung über Nacht bei 4 °C zu
stabilen und nicht reaktiven Derivaten derivatisiert (Abbildung 12, 3.3.7.3). Nach 8 h
waren die Peakflächen des derivatisierten MG und des derivatisierten IS konstant und
die Derivatisierung konnte als abgeschlossen betrachtet werden. Die NaphtopyrazinDerivate sind unpolar und können über eine Reversed phase C12 Säule getrennt
werden. Abbildung 18 zeigt ein Chromatogramm einer Analyse. Die Methode erlaubt
einen guten Durchsatz aufgrund eines schnellen chromatographischen Gradienten mit
einer Gesamtanalysenzeit von 10 Minuten. Für die massenspektrometrische Detektion
wurden ESI und APCI sowohl im positiven als auch im negativen Modus verglichen, ESI
im positiven Modus ergab die besten Ergebnisse bezüglich Sensitivität und Selektivität.
Das endogene Vorkommen von MG erschwerte die Strategie für die Detektion
störender Signale im Zuge der Selektivitätsbestimmung. Alle Serum- und post
mortem Blutproben enthielten MG. Für die Detektion des IS ist Selektivität gegeben.
Die Methode zeigte eine gute Sensitivität mit einer LoD von 1,3 ng/ml und einer LoQ
von 3,2 ng/ml. Die meisten Konzentrationen in Realproben lagen zwischen 5 und
100 ng/ml. Die Methode ist über den gesamten Kalibrationsbereich (5 bis 500 ng/ml)
linear. Korrelationskoeffizienten waren immer R > 0.99. Wässrige Kalibrationen konnten
nicht mit Matrixkalibrationen (Serum oder post mortem Femoralblut) nach Subtraktion der
endogenen MG Konzentrationen verglichen werden, daher wurde in der Routineanalytik
auf eine Matrixkalibration und das Standardadditionsverfahren zurückgegriffen. Die
Genauigkeit der Methode im niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationsbereich war
in Übereinstimmung mit den GTFCh-Richtlinien: intra day precision war 10,3 %, 9,2 %
88
4. Ergebnisse
und 8,3 %, inter day precision 15,3 %, 14,2 % und 9,4 %, der Richtigkeitsfehler -5,7 %,
-3,0 % und 7,4 %. Stabilität (Abnahme der Konzentration < 20%) von MG im Serum ist
bis
mindestens
4
Wochen
nach
Probennahme
unter
angemessenen
Lagerungsbedingungen (-20°C) gegeben.
Abbildung 18: Chromatogramm einer realen Serumprobe mit 123 ng/ml MG
(detektiert über das Derivat mit Masse 195 in blauem und rotem Chromatogramm);
Derivat des IS 3,4-Hexandion (Masse 237 in grünem und grauem Chromatogramm)
4.1.5 Anhydroglucitol
Da AG ein sehr polarer Zucker ist, können reversed-phase HPLC-Säulen AG nicht
retenieren. Eine Aminosäule wurde gewählt und kann AG und den IS während eines 6
minütigen Runs für 2 min retenieren (Abbildung 19). Die Methode erlaubt einen hohen
Durchsatz
aufgrund
des
schnellen
Fällungsschritts
und
der
kurzen
chromatographischen Trennung. Für die massenspektrometrische Detektion wurden
89
4. Ergebnisse
APCI und ESI im positiven und negativen Modus verglichen. APCI im negativen
Modus ergab die besten Ergebnisse im Hinblick auf Sensitivität und Selektivität. Die
LC-MS/MS-Methodik wurde erfolgreich in humanem Serum und post mortem FVB
validiert. Alle sechs Serum- und post mortem Blutproben enthielten AG. Für die
Detektion des IS ist Selektivität gegeben, wässrige Lösungen des IS enthielten keine
Spuren des Analyten. Die Grenzen der Methode liegen bei LoD = 0,20 µg/ml und
LoQ = 0,55 µg/ml.
Abbildung 19: LC-MS/MS Ergebnisse Anhydroglucitol: Chromatogramm des Serum
eines diabetischen Patienten mit 23.7 µg/ml AG. Die oberen zwei Ionenübergänge stellen
AG bei 1,91 min dar, der untere Ionenübergang zeigt den IS bei 1,88 min.
Der Assay ist linear innerhalb des Kalibrierbereiches (1,0 µg/ml bis 50 µg/ml).
Korrelationskoeffizienten waren immer R > 0,99. Die wässrige Kalibration und die
Matrixkalibration
nach
Subtraktion
der
endogenen
Konzentrationen
zeigten
Steigungsgleichheit. Serum [y = (0,00789 ± 0,00248) x] und postmortem Femoralblut
[y = (0,00802 ± 0,00182)x] zeigten ebenfalls Steigungsgleichheit (jeweils n = 6). Daher
kann
für
die
Routineanalytik
eine
wässrige
Kalibrierung
empfohlen
werden.
Genauigkeitsdaten bei drei Konzentrationen lagen innerhalb der geforderten Grenzen:
90
4. Ergebnisse
intra day precision 13,6 %, 2,7 % und 1,9 %, inter day precision 13,6 %, 3,6 % und
3,7 %, Richtigkeit 9,9 %, 0,5 % und -1,9 %. Die Wiederfindungsraten im Serum
waren 89,8 % im unteren (2,5 µg/ml) und 76,3 % im höheren Konzentrationsbereich
(25 µg/ml). Im postmortem FVB lagen die Wiederfindungsraten niedriger (75,7 % bei
2,5 µg/ml und 70,8 % bei 25 µg/ml). Matrixeffekte lagen innerhalb der geforderten
Grenzen, obwohl ion enhancement gezeigt werden konnte: 107 % im unteren
(2,5 µg/ml) und 122 % im höheren Konzentrationsbereich (25 µg/ml). Postmortem FVB
zeigte jedoch Ionensupression (93,7% bei 2,5 µg/ml und 85,1% bei 25 µg/ml). Stabilität
(Abfall der Peakflächen um < 20%) von AG ist für mindestens zwei Wochen nach
Probenentnahme gegeben. Die Kriterien für Stabilität nach dem Tod wurden für
mindestens einen Monat erfüllt. Das Verhältnis Vollblut/Serum lag bei 0,804 (n = 20,
Bereich 0,667-0,967, SD 0,079).
4.2
Klinische Proben
4.2.1 Glucose
Abbildung 20: Glucosekonzentrationen in klinischen Proben Typ 1- und Typ 2Diabetikern und männlichen und weiblichen Diabetikern im Vergleich
450 Diabetiker wurden auf ihren glykämischen Status untersucht, im Mittel ergab sich
eine Nüchtern-Glucose-Serumkonzentration von 159 mg/dl (53-329 mg/dl; SD
50,6 mg/dl; n = 450). Nur 101 Patienten (22,3 %) wurden in einem
normoglykämischen Zustand (Nüchtern-Glucose-Serumkonzentration 65-120 mg/dl)
91
4. Ergebnisse
erfasst. Die Mehrzahl der Patienten (n = 346; 76,8 %) wiesen eine Hyperglykämie auf
(> 120 mg/dl im nüchternen Zustand), nur drei Patienten (0,7 %) waren
hypoglykämisch (< 65 mg/dl). Typ 1- (n = 109) und Typ 2- (n = 323) Diabetiker
zeigten keine signifikanten Unterschiede (p = 0,388), ebensowenig männliche
(n = 305) und weibliche (n = 145) Diabetiker (p = 0,638). Abbildung 20 macht dies
anhand von Boxplots deutlich.
4.2.2 HbA1c
Die diabetischen Patienten zeigten HbA1c-Konzentrationen von 8,81 % (MW;
4,30-17,3 %; SD 1,8 %; n = 470). Typ 1- (n = 113) und Typ 2- (n = 337) Diabetiker
zeigten keine signifikanten (p = 0,639) Unterschiede, ebensowenig männliche (n =
317) und weibliche (n = 152) Diabetiker (p = 0,555). Abbildung 21 macht dies anhand
von Boxplots deutlich.
Abbildung 21: HbA1c-Konzentrationen in klinischen Proben von Typ 1- und Typ 2Diabetikern und männlichen und weiblichen Diabetikern im Vergleich
4.2.3 Fructosamin
Die diabetischen Patienten zeigten Fructosamin-Konzentrationen von 346 µmol/l
(MW; 181-696 µmol/l; SD 89,3 µmol/l; n = 475). Typ 1-
(MW 376 µmol/l;
244-627 µmol/l; SD 88,0 µmol/l; n = 113) und Typ 2- (MW 336 µmol/l;
181-696 µmol/l; SD 86,3 µmol/l; n = 341) Diabetiker zeigten signifikant
unterschiedliche Fructosamin-Konzentrationen (p < 0,0001). Zwischen männlichen
(n = 319) und weiblichen (n = 154) Diabetikern gab es keinen signifikanten
Unterschied (p = 0,730). Abbildung 22 macht dies anhand von Boxplots deutlich.
92
4. Ergebnisse
Abbildung 22: Fructosamin-Konzentrationen in klinischen Proben von Typ 1- und
Typ 2-Diabetikern und männlichen und weiblichen Diabetikern im Vergleich
4.2.4 Humanes und synthetische Insuline
4.2.4.1 Humanes Insulin
Abbildung 23: Konzentrationen von humanem Insulin in klinischen Proben von Typ 1und Typ 2- Diabetikern und männlichen und weiblichen Diabetikern im Vergleich
(ohne Ausreißer bei 32391 pmol/l)
Konzentrationen von humanem Insulin bei Diabetikern lagen im Mittel bei 293 pmol/l
(MW; 0-32391 pmol/ml; SD 1765 pmol/l; n = 343). Referenzbereiche für NichtDiabetiker liegen bei 29-188 pmol/l. Es zeigte sich kein signifikanter (p = 0,409)
Unterschied in den Humaninsulinkonzentrationen bei Aufteilung der Probanden nach
Geschlecht. Männer zeigten einen Mittelwert von 333 pmol/l (0-32391 pmol/l; SD
2137 pmol/l; n = 231), Frauen zeigten einen Mittelwert von 212 pmol/l (0-2135 pmol/l;
SD 342 pmol/l; n = 112). Typ 2-Diabetiker (MW 361 pmol/l; 0-32391 pmol/l;
93
4. Ergebnisse
SD 2056 pmol/l; n = 250) zeigten aber signifikant (p < 0,0001) erhöhte HumaninsulinKonzentrationen im Vergleich mit Typ 1-Diabetikern (MW 119 pmol/l; 0-2135 pmol/l;
SD 321 pmol/l; n = 81). Abbildung 23 zeigt Boxplots. Tabelle 24 zeigt die Mittelwerte
der einzelnen nach Medikation eingeteilten Kollektive. Die Verteilung der
Humaninsulin-Konzentrationen über die Kollektive war nicht gleich (p < 0,0001). Die
Injektion von humanem Insulin oder die Einnahme von oralen Antidiabetika erhöhen
die Humaninsulin-Konzentrationen signifikant. Eine Therapie mit synthetischem
Insulin vermindert die körpereigene Insulinproduktion signifikant. Abbildung 24 zeigt
einen Boxplot.
Mittelwert
[pmol/l]
Gruppe
n
Minimum
[pmol/l]
Maximum
[pmol/l]
SD [pmol/l]
Diabetiker ohne
135
Medikation
58
7,21
470
104
Diabetiker;
Therapie
humanem
Insulin
30
26,4
32391
5865
Diabetiker; nur
orale
202
Antidiabetika
nachgewiesen
45
< LoQ
1003
196
Diabetiker;
Nachweis
synthetischer
Insuline
73
< LoQ
757
139
mit
1475
77,2
Tabelle 24: Konzentrationen von humanem Insulin der nach Medikation eingeteilten
Kollektive
94
4. Ergebnisse
_________________________________ p < 0,0001__________________________
_________________p = 0,047_____________________
________ p < 0,0001________
________ p < 0,0001___________________________
________ p = 0,021________
________ p < 0,0001_________
Abbildung 24: Konzentrationen von humanem Insulin der nach ihrer Medikation
eingeteilten Kollektive
4.2.4.2 Vergleich der immunchemischen mit der chromatographischen Methode
Bei Vergleich der Ergebnisse von immunchemischer und chromatographischer
Methoden (Abbildung 25, n = 202) zeigten sich erhebliche Abweichungen und nur
eine schwache Korrelation. Ein Bland-Altman-Plot wurde angefertigt, der die beiden
Messmethoden graphisch besser darstellen sollte. Dabei wird das Mittel der beiden
gemessenen Konzentrationen (x-Achse), das als beste Annäherung für die reale
Konzentration angenommen wird, gegen die Differenz der beiden Konzentrationen
(y-Achse) aufgetragen.
95
4. Ergebnisse
R = 0,639; R2 = 0,409; p < 0,0001; n = 202
Bland‐Altman‐Plot
mittlere Humaninsulin‐Konzentration IA und LC/MS [µU/ml]
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
80
60
c (IA) ‐ c (LC/MS) [µU/ml]
40
20
0
‐20
‐40
‐60
‐80
Abbildung 25: Vergleich der beiden Methoden: oben links Korrelation, oben rechts
Korrelation in kleinerem Maßstab; unten Bland-Altman-Plot (rotes Akzeptanzintervall
20 %)
4.2.4.3 Synthetische Insuline
Mit der entwickelten Methode konnten neben humanem Insulin auch die
beschriebenen synthetischen Insuline im Serum nachgewiesen werden. Tabelle 25
zeigt die gemessenen Konzentrationen der synthetischen Insuline bei den
Diabetikern.
96
4. Ergebnisse
MW
[µU/ml]
51,1
54,9
95,2
118
77
n
Novolog
Apidra
Lantus
Levemir
Humalog
26
15
9
46
42
Minimum
[µU/ml]
< LoQ
< LoQ
20,7
10,7
12
Maximum
[µU/ml]
181
130
191
393
175
Tabelle 25: Konzentrationen in klinischen Serumproben von Diabetikern mit
synthetischen Insulinen
4.2.5 C-Peptid
Die Diabetiker zeigten im Mittel C-Peptidkonzentrationen von 1077 pmol/l
(MW; < LoQ-6620 pmol/l; SD 1161 pmol/l; n = 402). Dabei wurde deutlich, dass bei
Aufteilung der diabetischen Probanden nach Geschlecht männliche Diabetiker
(MW 1131,36 pmol/l; < LoQ-6620 pmol/l; SD 1166 pmol/l; n = 269) leicht signifikant
(p = 0,018) erhöhte C-Peptid-Konzentrationen im Vergleich zu weiblichen
Teilnehmern zeigten (MW 835,5 pmol/l; < LoQ-4340 pmol/l; SD 888,8 pmol/l;
n = 133) (Abbildung 26). Typ 2-Diabetiker (MW 1404 pmol/l; < LoQ-6620 pmol/l;
SD 1078 pmol/l; n = 284), bei denen die Proinsulin-Sekretion und dementsprechend
auch die C-Peptid-Sekretion noch intakt ist, zeigten signifikant (p < 0,0001) höhere
C-Peptid-Konzentrationen
als
Typ
1-Diabetiker
(MW
109,6
pmol/l;
< LoQ-3153 pmol/l; SD 348,7 pmol/l ; n = 97), bei denen die endogene Sekretion
weitestgehend eingestellt ist (Abbildung 26). Tabelle 26 und Abbildung 27 zeigen die
Mittelwerte der nach Medikation eingeteilten Kollektive. Die Verteilung der C-PeptidKonzentrationen
Sulfonylharnstoffe
über
und
die
Stichproben
andere
orale
war
nicht
Antidiabetika
gleich
erhöhen
(p
<
0,0001).
aufgrund
ihres
Wirkmechanismus die C-Peptid-Konzentrationen signifikant. Eine Therapie mit
synthetischem oder humanem Insulin hat keinen Einfluss auf die mittleren C-PeptidKonzentrationen.
97
4. Ergebnisse
Abbildung 26: C-Peptid-Konzentrationen in klinischen Proben von Typ 1- und Typ 2Diabetikern und männlichen und weiblichen Diabetikern im Vergleich
_____ p < 0,0001_____
_____ p < 0,0001_____
___________ p < 0,0001______________
____ p = 0,576_____
____________ p < 0,0001_____________
___________________ p < 0,0001_______________________
__________________________ p = 0,568 _______________________________
__________ p < 0,0001__________
_______________ p < 0,0001_____________________
Abbildung 27: C-Peptid-Konzentrationen der nach ihrer Medikation eingeteilten
Kollektive
98
4. Ergebnisse
Mittelwert
[pmol/l]
Median
[pmol/l]
Minimum
[pmol/l]
Maximum
[pmol/l]
SD
[pmol/l]
Diabetiker ohne Medikation 1027
808
< LoQ
6290
1093
Diabetiker
2465
Sulphonylharnstofftherapie
2028
970
6620
1293
Diabetiker Therapie andere
1653
orale Antidiabetika
1728
106
3480
823
Diabetiker
Therapie
495
synthetische Insuline
430
< LoQ
6060
943
Diabetiker Therapie
humanem Insulin
745
< LoQ
4600
928
Gruppe
mit
891
Tabelle 26: C-Peptid-Konzentrationen von Diabetikern eingeteilt nach ihrer Therapie
4.2.6 Das molare Verhältnis humanes Insulin:C-Peptid
Mittelwert
[pmol/l]
n
Minimum
[pmol/l]
Maximum
[pmol/l]
SD [pmol/l]
0,13
58
<
(Ins.)
0,59
0,13
Diabetiker
Therapie
mit 18,4
humanem Insulin
30
0,22
438
79,6
Diabetiker
nur
orale Antidiabetika 0,13
nachgewiesen
86
<
(Ins.)
LoQ
1,1
0,15
Diabetiker
Nachweis
synthetischer
Insuline
74
<
(Ins.)
LoQ
1,2
0,2
Gruppe
Diabetiker ohne
Medikation
0,1
LoQ
Tabelle 27: Konzentrationen des I:C-Verhältnisses der nach ihrer Medikation
eingeteilten Kollektive
Das molare Verhältnis humanes Insulin zu C-Peptid (I:C) wurde berechnet, indem die
Konzentrationen von humanem Insulin und C-Peptid in pmol/l ins Verhältnis gesetzt
wurden. I:C lag im Mittel bei den Diabetikern bei 4,58 (MW; 0-712; SD = 42,1;
n = 409). Die I:C-Verhältnisse unterschieden sich nicht signifikant (p = 0,824)
zwischen Typ 1- (MW 19,1; Median 0,094; 0-712; SD = 91,2; n = 85) und Typ 299
4. Ergebnisse
Diabetikern (MW 0,53; Median 0,12; 0-26,1; SD = 2,29; n = 304). Abbildung 27 zeigt
Boxplots. Tabelle 27 zeigt die Mittelwerte der einzelnen Kollektive „Medikation“. Die
Verteilung der I:C-Verhältnisse über die Stichproben war nicht gleich (p < 0,0001).
Die Injektion von humanem Insulin erhöht die I:C-Verhältnisse signifikant. Die
Einnahme von oralen Antidiabetika dagegen verändert die I:C-Verhältnisse im
Vergleich zu Diabetikern ohne Medikation nicht, da orale Antidiabetika aufgrund ihres
Wirkmechanismus sowohl die Humaninsulin als auch die C-Peptidkonzentrationen
ansteigen lassen. Eine Therapie mit synthetischem Insulin verringert die I:CVerhältnisse minimal. Die Boxplots sind in Abbildung 28 dargestellt.
_________ p < 0,0001______________
p < 0,0001
____ p < 0,0001_____
_______ p = 0,993______
_p< ,0001 _
_ p < 0,0001_
Abbildung 28: I:C-Verhältnisse von Typ 1- und Typ 2-Diabetikern im Vergleich und
eingeteilt nach ihrer Medikation (unten, rechts vergrößert)
4.2.7 Proinsulin
Proinsulin-Konzentrationen von Diabetikern lagen im Mittel bei 9,82 pmol/l
(0-83,6 pmol/l; Standardabweichung 9,54 pmol/l; n = 402). Im Bereich des in der
Literatur beschriebenen Referenzbereichs für Nüchtern-Proinsulin-Konzentrationen
100
4. Ergebnisse
von < 11 pmol/l liegen 66,2 % der Fälle (n = 266), während 33,8 % (n = 136) der
Fälle über 11 pmol/l lagen. Es zeigte sich, dass bei Aufteilung der diabetischen
Probanden nach Geschlecht männliche Diabetiker (MW 10,71 pmol/l; SD
10,08 pmol/l; n = 269) signifikant (p < 0,0001) höhere Proinsulin-Konzentrationen im
Vergleich zu weiblichen Teilnehmern (MW 8,00 pmol/l; SD 8,10 pmol/l; n = 133)
aufwiesen. Typ 2- Diabetiker (MW 12,22 pmol/l; SD 9,09 pmol/l; n = 284), bei denen
die Proinsulin-Sekretion noch intakt ist, zeigten signifikant (p < 0,0001) höhere
Proinsulin-Konzentrationen als Typ 1-Diabetiker (MW 3,87 pmol/l; SD 8,75 pmol/l;
n = 97), bei denen die endogene Sekretion weitestgehend eingestellt ist. Weiterhin
besteht ein klarer Zusammenhang zwischen der schon bekannten Länge der
Diabeteserkrankung und der Proinsulinsekretion. Bei Diabetikern, die von Ihrer
Krankheit erst vor Kurzem erfuhren, ist die Proinsulinsekretion noch ausgeprägt,
während bei Langzeit-Diabetikern Proinsulinkonzentrationen > 10 pmol/l nicht mehr
auftreten (siehe Abbildung 29).
n = 380; R = 0,295; R2 = 0,097
Abbildung 29: Proinsulin-Konzentrationen von Typ 1- und Typ 2-Diabetikern und
männlichen und weiblichen Diabetikern im Vergleich und Korrelation zwischen Länge
der bekannten Diabeteserkrankung und der Proinsulin-Konzentration [pmol/l]
101
4. Ergebnisse
Gruppe
Mittelwert
[pmol/l]
Median
[pmol/l]
Minimum
[pmol/l]
Maximum
[pmol/l]
n
SD [pmol/l]
8,38
6,75
0
51
140
7,63
Diabetiker Therapie mit
21,14
Sulphonylharnstoffen
16,9
3,9
83,6
27
15,47
Diabetiker
Therapie
andere
orale 12,87
Antidiabetika
12,4
3,4
34,6
21
7,73
Diabetiker
Therapie
7,4
synthetische Insuline
3,65
< LoD
83,4
82
10,79
Diabetiker Therapie mit
8,66
humanem Insulin
7,05
< LoD
32
74
9,76
Diabetiker
Medikation
ohne
Tabelle 28: Proinsulin-Konzentrationen der nach ihrer Medikation eingeteilten
Kollektive
_________________ p < 0,0001 ____________________
___ p < 0,0001__
___ p < 0,0001__
__________ p < 0,0001___________
__________ p < 0,0001___________
_______________ p = 0,018 ___________________
___ p = 0,007__
_____________________ p = 0,568 ___________________________
Abbildung 30: Proinsulin-Konzentrationen [pmol/l] von Diabetikern geordnet nach
ihrer Therapie
Abbildung 30 zeigt die Proinsulin-Konzentrationen der nach Medikation eingeteilten
Kollektive. Die Verteilung der Proinsulinkonzentrationen über die Stichproben war
102
4. Ergebnisse
nicht gleich (p < 0,0001). Sulfonylharnstoffe und andere orale Antidiabetika erhöhen
aufgrund ihres Wirkmechanismus die Proinsulinkonzentrationen signifikant. Eine
Therapie mit synthetischem oder humanem Insulin hat keinen Einfluss auf die
mittleren Proinsulinkonzentrationen.
4.2.8 Methylglyoxal
Diabetiker (MW 81,1 ng/ml; Median 79,2 ng/ml; 19,9-192 ng/ml; n = 98) mit
chronischer
Hyperglykämie
zeigten
signifikant
(p
<
0,001)
höhere
Serumkonzentrationen in klinischen Proben als Nicht-Diabetiker (MW 10,5 ng/ml;
Median 10,1 ng/ml; 6,0-14,5 ng/ml; n = 98). Abbildung 31 zeigt die Mittelwerte und
Konzentrationsbereiche von MG in Serumproben. Innerhalb der Diabetikergruppe
gab es keinen signifikanten Unterschied (p = 0,924) zwischen Typ 1-Diabetikern
(MW 77,2 ng/ml, 30,1-129 ng/ml; n = 24) und Typ 2-Diabetikern (MW 82,1 ng/ml,
19.9-192 ng/ml; n = 74).
Abbildung 31: klinische MG-Serumkonzentrationen
4.2.9 Anhydroglucitol
Abbildung 32 zeigt in einem Boxplot die Konzentrationsbereiche von AG in
Serumproben diabetischer Patienten (MW 5,74 µg/ml; < LoQ-31,4 µg/ml, SD
6,08 µg/ml, n = 434) im Vergleich zum nicht-diabetischen Kollektiv (MW 23,3 µg/ml;
4,52-67,4 µg/ml, SD 7,39 µg/ml, n = 263), zu dem es einen signifikanten Unterschied
gab (p < 0,001). Innerhalb des diabetischen Kollektivs gibt es keinen signifikanten
Unterschied (p = 0,633) zwischen männlichen (MW 5,72 µg/ml, < LoQ-31,4 µg/ml,
SD 6,14 µg/ml, n = 291) und weiblichen Diabetikern (MW 5,73 µg/ml,
< LoQ-29,0 µg/ml, SD 5,98 µg/ml, n = 146). Dagegen gibt es einen signifikanten
103
4. Ergebnisse
(p < 0,0001) Unterschied zwischen Typ 1 Diabetikern (MW 3,02 µg/ml;
0,07 µg/ml-14,5 µg/ml; SD 2,70 µg/ml; n = 103) und Typ 2-Diabetikern
(MW 6,26 µg/ml, 0,12 µg/ml-31,4 µg/ml; n = 308). Ein Zusammenhang zwischen der
Länge der Diabeteserkrankung und der AG - Konzentration besteht allerdings nicht
(Abbildung 32).
R = 0,021; R2 = 0,000; p = 0,677; n = 406
Abbildung 32: AG-Serumkonzentrationen von Nicht-Diabetikern und Diabetikern,
männlichen und weiblichen Diabetikern und Typ 1- und Typ 2-Diabetikern im
Vergleich und Zusammenhang zwischen bekannter Diabeteslänge und AGKonzentration
4.2.10 Zusammenhang der Parameter
Inwiefern
klinische
Parameter
miteinander
korrelieren
wurde
mit
der
Gegenüberstellung dieser getestet, um auch für forensische Fälle geeignete Marker
zu finden, die Rückschlüsse auf den glykämischen Status der Patienten zulassen.
Die Glucosekonzentrationen wurden mit einigen Parametern korreliert (Abbildung
33): Zwischen HbA1c- und aktueller Glucosekonzentration besteht ein geringer
104
4. Ergebnisse
Zusammenhang, der sich noch am ehesten durch eine kubische Kurve beschreiben
lässt. Noch schwächer korreliert die Fructosamin-Konzentration mit der aktuellen
Glucosekonzentration.
AG
korrelierte
schwach
negativ
mit
Glucose,
eine
quadratische Kurve korrelierte besser. Alle drei Parameter sind eher Langzeitmarker,
als dass sie die aktuelle Glucosekonzentration widerspiegeln. Untereinander
korrelieren HbA1c und Fructosamin, HbA1c und AG negativ und Fructosamin und
AG negativ. Diese Zusammenhänge sind in Abbildung 33 dargestellt.
Mit der aktuellen Humaninsulin-Konzentration, der C-Peptid-Konzentration, dem
I:C-Verhältnis und der Proinsulin-Konzentration korreliert die Glucose-Konzentration
nicht. Zwischen der aktuellen Humaninsulin-Konzentration und der C-PeptidKonzentration besteht über das gesamte Kollektiv ebensowenig ein Zusammenhang
wie zwischen Humaninsulin- und Proinsulin-Konzentration. Das Verhältnis I:C
korreliert ebenso nicht mit der Proinsulin-Konzentration. In Abbildung 34 wird aber
deutlich, dass bei I:C-Verhältnissen > 5, wie sie nach der Injektion von humanem
Insulin vorkommen, Proinsulin-Konzentrationen stets unter 5 pmol/l liegen und somit
auch die Proinsulin- Konzentration ein Indiz für eine Injektion mit humanem Insulin
sein kann. Die Proinsulinkonzentration korreliert signifikant mit der C-PeptidKonzentration (Abbildung 34).
105
4. Ergebnisse
Linear:
R = 0,341; R2 = 0,116; p < 0,0001
2
R = 0,205; R2 = 0,040; p < 0,0001; n = 448
Kubisch: R = 0,127; p < 0,0001; n = 445
Linear: R = - 0,250; R2 = 0,060; p < 0,0001
R = 0,566; R2 = 0,319; p < 0,0001; n = 467
Quadratisch: R2 = 0,070; p < 0,0001; n = 410
Linear: R = - 0,541; R2 = 0,293; p < 0,0001
Linear: R = - 0,351; R2 = 0,121; p < 0,0001
Kubisch: R2 = 0,358; p < 0,0001; n = 427
Kubisch: R2 = 0,159; p < 0,0001; n = 429
Abbildung 33: Korrelation der Glucosekonzentration mit den Langzeitmarkern HbA1c,
Fructosamin und AG und Korrelationen dieser untereinander
106
4. Ergebnisse
R = 0,077; R2 = 0,006 ; p = 0,119; n = 408
R = 0,040; R2 = 0,002; p = 0,405; n = 442
R = 0,032; R2 = 0,001; p = 0,549; n = 343
R = 0,118; R2 = 0,014; p = 0,018; n = 393
R = 0,019; R2 = 0,001; p = 0,743; n = 292
107
4. Ergebnisse
R = 0,085; R2 = 0,007 ; p = 0,109; n = 356
Linear: R = 0,614; R2 = 0,375; p < 0,0001;
Kubisch: R2 = 0,450; p < 0,0001; n = 394
Abbildung 34: Korrelation von Humaninsulin-, C-Pepid-, Proinsulinkonzentration und
I : C-Verhältnis mit der Glucosekonzentration und untereinander
4.3
Forensische Proben
4.3.1 Glucose und Laktat
Glucose wurde post mortem in der GKF (MW 35,1 mg/dl; < LoQ-1053 mg/dl;
SD 143 mg/dl; n = 134), in der CSF (MW 54,3 mg/dl; < LoQ-676 mg/dl;
SD 131 mg/dl; n = 76) und im Urin (MW 361 mg/dl; < LoQ-4202 mg/dl;
SD 1019 mg/dl; n = 22) bestimmt. Die Konzentrationen in den drei Matrices
unterschieden sich signifikant (p < 0,0001). Abbildung 35 zeigt Boxplots. NichtDiabetiker (MW 11,4 mg/dl; < LoQ-201 mg/dl; SD 30,5 mg/dl; n = 99) und Diabetiker
(MW 118 mg/dl; < LoQ-1053 mg/dl; SD 296 mg/dl; n = 28) zeigten keine signifikanten
108
4. Ergebnisse
Unterschiede (p = 0,399) in der Glucosekonzentration im Glaskörper. Im CSF zeigte
sich dasselbe Bild bei Vergleich von Nicht-Diabetikern (MW 14,9 mg/dl; 0-82,6 mg/dl;
SD 20,8 mg/dl; n = 42) und Diabetikern (MW 116 mg/dl; 0-176 mg/dl; SD 202 mg/dl;
n = 27) (p = 0,066; Abbildung 35).
Abbildung 35: Glucosekonzentrationen post mortem in GKF, CSF und Urin (rechts
kleinerer Maßstab) und Vergleich der Glucosekonzentrationen post mortem in GKF
und CSF zwischen Diabetikern und Nicht-Diabetikern
Laktat wurde post mortem in der GKF, in der CSF und im Urin (MW 109 mg/dl;
5,4-298 mg/dl; SD 85,1 mg/dl; n = 21) bestimmt. Die Laktatkonzentrationen in GKF
(MW 284 mg/dl; 0,2-582 mg/dl; SD 98,2 mg/dl; n = 134) und CSF (MW 288 mg/dl;
5-504 mg/dl; SD 107 mg/dl; n = 76) unterschieden sich nicht signifikant (p = 0,899).
Abbildung 36 zeigt Boxplots. Laktatkonzentrationen in der GKF unterschieden sich
signifikant (p = 0,002) zwischen Nicht-Diabetikern (MW 270 mg/dl ; 0,2-462 mg/dl;
SD 95,5 mg/dl; n = 99) und Diabetikern (MW 331 mg/dl ; 8-592 mg/dl; SD 105 mg/dl;
n = 28). In der CSF zeigte sich dieser Unterschied (p = 0,195) zwischen NichtDiabetikern (MW 277 mg/dl ; 59-504 mg/dl; SD 104 mg/dl; n = 42) und Diabetikern
109
4. Ergebnisse
(MW 312 mg/dl ; 5-495 mg/dl; SD 120 mg/dl; n = 27) nicht. Abbildung 36 macht dies
deutlich.
Abbildung 36: Laktatkonzentrationen post mortem in GKF, CSF und Urin
4.3.2 Summenformel nach Traub
Die Summenformel nach Traub in der GKF und der CSF wurde berechnet, indem die
Glucosekonzentration in mg/dl und die Häfte der Laktatkonzentration in mg/dl addiert
wurden. Die Summenformeln in GKF (MW 177 mg/dl, 0,1-1210 mg/dl, SD 160 mg/dl;
n = 134) und CSF (MW 198 mg/dl, 5,7-801 mg/dl, SD 154 mg/dl; n = 76)
unterschieden sich nicht signifikant (p = 0,250). Summenformeln in der GKF
unterschieden
sich
signifikant
(p
=
0,003)
zwischen
Nicht-Diabetikern
(MW 147 mg/dl; 0,1-344 mg/dl; SD 57,7 mg/dl; n = 99) und Diabetikern
(MW 284 mg/dl; 4,0-1210 mg/dl; SD 312 mg/dl; n = 28). Ebenso unterschieden sich
die Summenformeln in der CSF signifikant (p = 0,046) zwischen Nicht-Diabetikern
(MW 153 mg/dl; 30,1-355 mg/dl; SD 61,6 mg/dl; n = 42) und Diabetikern
(MW 272 mg/dl; 5,7-801 mg/dl; SD 228 mg/dl; n = 27). Abbildung 37 zeigt in Boxplots
110
4. Ergebnisse
Vergleiche der Summenformeln nach Traub zwischen Nicht-Diabetikern und
Diabetikern in GKF und CSF.
Abbildung 37: Summenformeln nach Traub in GKF und CSF; Vergleich von NichtDiabetikern und Diabetikern
4.3.3 HbA1c
Von 115 Verstorbenen wurde der HbA1c im FVB bestimmt, die Konzentrationen
lagen im Mittel bei 49,8 mmol/l (MW; entspricht 6,69 %; 24,6-132,2 mmol/l entspricht
4,40-14,3 %; SD 18,9 mmol/l). Diabetiker (MW 59,9 mmol/mol entspricht 7,63 %;
27,2-108,9 mmol/mol entspricht 4,64-12,11 %; SD 23,0 mmol/mol; n = 24) zeigten
signifikant (p = 0,006) höhere HbA1c-Konzentrationen post mortem als NichtDiabetiker (MW 47,8 mmol/mol entspricht 6,52 %; 24,6-132,2 mmol/mol entspricht
4,40-14,3 %; SD 17,1 mmol/mol; n = 85). Abbildung 38 zeigt einen Boxplot. Einige
extrem hohe HbA1c-Konzentrationen von Verstorbenen, in deren Unterlagen keine
Diabeteserkrankung festgehalten war, lassen darauf schließen, dass hier ein
unbekannter oder nicht dokumentierter Diabetes mellitus vorlag.
Abbildung 38: HbA1c-Konzentrationen post mortem
111
4. Ergebnisse
4.3.4 Fructosamin
Fructosamin wurde post mortem im gefällten Blut (MW 92,3 µmol/l; 11,6-513 µmol/l;
SD 70,5 µmol/l; n = 104), in der GKF (MW 48,1 µmol/l; < LoQ-448 µmol/l;
SD 102 µmol/l; n = 40) und in der CSF (MW 109 µmol/l; 11,3-383 µmol/l;
SD 99,8 µmol/l; n = 21) gemessen. Fructosamin-Konzentrationen in den 3 Matrizes
sind Abbildung 39 aufgeführt. Die Konzentrationen unterscheiden sich signifikant
(p < 0,0001). Nur in der Matrix Serum konnte ein signifikanter Unterschied
(p = 0,005) zwischen Diabetikern (MW 138 µmol/l; 12,3-513 µmol/l; SD 113 µmol/l;
n = 19) und Nicht-Diabetikern (MW 78,4 µmol/l; 11,6-286 µmol/l; SD 49,7 µmol/l;
n = 81) beobachtet werden. In der GKF (p = 0,599) und in der CSF (p = 0,252)
zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen Nicht-Diabetikern und
Diabetikern. Werte > 100 µmol/l in der GKF und > 150 µmol/l in der CSF wurden
allerdings nur bei bekannten Diabetikern ermittelt (Abbildung 39).
Abbildung 39: Fructosamin-Konzentrationen post mortem in Serum, GKF und CSF
und Vergleich Nicht-Diabetiker / Diabetiker in den drei Matrizes
112
4. Ergebnisse
4.3.5 Methylglyoxal
No.
1
2
3
4
Alter
48
49
56
33
Geschlecht
f
m
m
m
Todesursache
Lungenembolie
Fulminante
Lungenembolie
Tage zwischen
Tod
und Matrix
Obduktion
2
6
Herztod
mit
2
Kardiomyopathie
Multidrogen
2
40
m
Kohlenmonoxid
3
MG
[ng/ml]
0
321
1
1210
2
1100
5
1250
8
1300
12
1305
Summenformel
[mg/dl] (Mittelwert
aus 5 Messungen)
FVB
GKF
268
CSF
479
FVB
0
148
1
555
2
820
5
1360
10
1170
GKF
166
CSF
227
FVB
0
218
1
348
2
605
5
1095
10
1045
GKF
127
CSF
120
FVB
intoxikation
5
Tage nach
Obduktion
0
412
1
590
4
1090
8
1085
GKF
119
CSF
124
FVB
intoxikation
0
384
4
915
8
1050
14
1080
GKF
124
CSF
241
Tabelle 29: Veränderungen der MG-Konzentrationen [ng/ml] in den Tagen nach der
Obduktion (m:männlich, f:weiblich)
113
4. Ergebnisse
Das post mortem Intervall (PMI) der Nichtdiabetiker betrug 3,59 Tage (MW,
0-8 Tage, Median 3 Tage, PMI von 20 Nicht-Diabetikern unbekannt). Von 54 der 98
Nicht-Diabetiker konnte GKF oder CSF gesammelt werden, die Summenformel nach
Traub war < 450 mg/dl in der GKF. Weiterhin wurden 7 Fälle von Diabetikern im
Status eines hyperglykämischen Komas mit einer Summenformel nach Traub
> 450 mg/dl in der GKF betrachtet. Die PMI dieser Verstorbenen war 3,40 Tage
(MW, 1-8 Tage, Median 3 Tage, PMI von 5 dieser Verstorbenen unbekannt). Die PMI
der beiden Gruppen unterschieden sich nicht signifikant (p > 0,2).
Nach der Probennahme bei der Obduktion erhöhten sich die MG Konzentrationen
enorm. FVB, GKF und CSF von 5 Obduktionsfällen ohne eine DiabetesVorerkrankung
wurden
entnommen
(Tabelle
29).
Die
gemessenen
MG- Konzentrationen stiegen mit dem post mortem Intervall, bis sie nach ca. 5
Tagen post mortem ein Plateau erreichten. Die gemessenen Konzentrationen sind
dann signifikant (p < 0,0001) erhöht im Vergleich zu lebenden Personen und
betragen > 1000 ng/ml. Es gab einen signifikanten Unterschied zwischen der
Todesursache „Hyperglykämisches Koma“ und anderen Todesursachen (p = 0.001).
Verstorbene mit der Todesursache “diabetisches Koma” zeigten MG Konzentrationen
von 4785 ng/ml (MW; Median 2595 ng/ml; 754-12500 ng/ml; n = 7), andere
Todesursachen zeigten MG Konzentrationen von 2383 ng/ml (MW, Median
1380 ng/ml; 104-35200 ng/ml, n = 84). Abbildung 39 zeigt die mittleren
Konzentrationen in einem Boxplot.
Abbildung 40: Vergleich der MG-Konzentrationen post mortem
114
4. Ergebnisse
4.3.6 Anhydroglucitol
In Toten waren die mittleren AG-Konzentrationen im FVB signifikant (p < 0,001)
höher bei Nicht-Diabetikern (MW 15,5 µg/ml; 3,21-40,8 µg/ml; SD 8,7 µg/ml; n = 88)
als bei Diabetikern (MW 4,74 µg/ml; < LoQ-25,2 µg/ml; SD 5,4 µg/ml; n = 71).
Abbildung 41 zeigt einen Boxplot. Bei 5 Fällen mit Todesursache „diabetisches Koma“
mit einer Summenformel nach Traub > 450 mg/dl in der GKF oder in der CSF wurde
ebenfalls AG gemessen. Die mittleren Konzentrationen dieser durch diabetisches
Koma Verstorbenen (MW 1,13 µg/ml; < LoQ-3,15 µg/ml; SD 1,2 µg/ml; n = 5) waren
signifikant niedriger (p < 0,001) als bei Nicht-Diabetikern. Die Konzentrationen
unterscheiden sich aber nicht signifikant von diabetischen Verstorbenen mit einer
Summenformel im Normbereich (p = 0,09).
Abbildung 41: Vergleich der AG-Konzentrationen post mortem im FVB von
Diabetikern,
Nicht-Diabetikern
und
von
Verstorbenen
mit
einer
erhöhten
Summenformel nach Traub
4.3.7 Humanes Insulin
In forensischen Fällen konnte humanes Insulin bei Kontrollfällen weder in FVB
(n = 60), noch in GKF (n = 46) und CSF (n = 27) nachgewiesen werden.
4.3.8 Zusammenhang der Parameter
In
Abbildung
42
sind
jeweils
Glucose-
und
Laktatkonzentrationen
und
Summenformeln nach Traub in GKF und CSF gegeneinander aufgetragen. Die
Parameter korrelieren in den beiden Matrizes signifikant miteinander. Ob die
Glucosekonzentration im Urin ebenfalls eine Aussagekraft bezüglich einer ante
mortem
Hyperglykämie
besitzt,
wurde
durch
die
Korrelation
der
115
4. Ergebnisse
Glucosekonzentrationen im Urin mit den Summenformeln in GKF oder CSF erfasst
(Abbildung 42).
2
R = 0,961; R = 0,922; p < 0,0001; n = 46
2
R = 0,507; R = 0,240; p < 0,0001; n = 46
2
R = 0,905; R = 0,815; p < 0,0001; n = 46
2
R = 0,836; R = 0,682; p < 0,0001; n = 20
2
R = 0,510; R = 0,260; p = 0,036; n = 17
Abbildung 42: Korrelation der Glucose- bzw. Laktatkonzentrationen und der
Summenformeln in der GKF und der CSF und Korrelation der Glucosekonzentration
im Urin mit der Summenformel nach Traub in der GKF und in der CSF
116
4. Ergebnisse
Die Glucosekonzentration im Urin korreliert mit der Summenformel in der GKF und in
der CSF. Abbildung 43 zeigt die signifikanten Korrelationen der HbA1c-Konzentration
post mortem mit den Summenformeln in GKF und CSF.
2
2
R = 0,712; R = 0,499; p < 0,0001; n = 63
Abbildung
43:
Korrelation
R = 0,660; R = 0,419; p < 0,0001; n = 36
der
HbA1c-Konzentration
post
mortem
mit
der
Summenformel nach Traub in der GKF und in der CSF
Abbildung 45 zeigt die Korrelation der Fructosamin-Konzentration in Serum, GKF
und CSF post mortem mit der Summenformel in der GKF und der HbA1cKonzentration. Zwischen der Summenformel nach Traub in der GKF und den
MG-Femoralblutkonzentrationen ergab sich kein Zusammenhang, für die AGKonzentrationen post mortem ein schwacher (Abbildung 44).
2
R = 0,092; R = 0,008; p = 0,439; n = 87
2
R = -0,414; R = 0,146; p = 0,014; n = 35
Abbildung 44: Korrelation der Summenformel nach Traub in der GKF mit der
MG-Konzentration und der AG-Konzentration post mortem im FVB
117
4. Ergebnisse
2
R = 0,710; R = 0,494; p < 0,0001; n = 52
2
R = 0,337; R = 0,114; p = 0,006; n = 66
2
2
R = 0,171; R = 0,013, p = 0,414; n = 25
2
R = 0,742; R = 0,550; p < 0,0001; n = 18
R = 0,337; R = 0,075; p = 0,099; n = 25
R = 0,841; R = 0,688; p < 0,0001; n = 17
2
Abbildung 45: Korrelationen der Fructosamin-Konzentration in Serum, GKF und CSF
post mortem mit der Summenformel in der GKF und dem HbA1c
118
5. Diskussion
5
5.1
Diskussion
Analytische Methodenentwicklung
5.1.1 Humanes und synthetische Insuline
Bisher basierten die meisten biologischen Methoden auf Liganden-Bindungsassays
wie RIA oder ELISA [295]. Ein großes Problem bei diesen Methoden ist die
Kreuzreaktivität zwischen den einzelnen Insulinanaloga und zu anderen Peptiden.
Diese ist von der Wahl der spezifischen monoklonalen Antikörper abhängig und kann
konzentrationsabhängig bis zu 50-100 % betragen [190]. Für die Bestimmung
einzelner Insulinanaloga wurden Immunoassays beschrieben [296], die durch
Benutzung von Subtraktions- oder Multiplikationsfaktoren basierend auf der
bekannten
Kreuzreaktivität
beschriebene
die
Vergleich
Konzentrationen
von
Immunoassay
ermitteln.
und
Auch
der
in
4
chromatographisch-
massenspektrometrischer Methodik zeigte massive Abweichungen für humanes
Insulin. Für die Bewältigung der Probleme der Immunoassays wurde auf die LC/MSAnalytik zurückgegriffen. Die erhöhte Spezifität der Methodik und die breiteren
dynamischen Bereiche erhöhen die Verlässlichkeit deutlich. Die Analytik von intakten
Insulinen mittels LC-MS gestaltet sich aber aufgrund unspezifischer Bindung und
schwacher Sensitivität, Löslichkeit und Fragmentierung schwer. Die beschriebene
Methodik zur Bestimmung von humanem und synthetischen Insulinen konnte diese
Probleme lösen.
Die Erhöhung von Selektivität und Wiederfindungsraten für Insulinanaloga in Serum
stellt keine einfache Aufgabe dar. Die Peptide sind zwitterionisch und ihr Verhalten
schwer vorherzusehen. Sie müssen allerdings von einer Vielzahl anderer, potentiell
isobarer Peptide getrennt werden. Die sensitivste der bisher beschriebenen
Methoden beschreibt eine Urinaufarbeitung mittels einer mehrstündigen vierstufigen
SPE gefolgt von einem immunoaffinitätschromatographischen Aufreinigungsschritt
und einem weiteren SPE-Schritt [297]. Es konnte gezeigt werden, dass eine alleinige
Proteinfällung eine nicht ausreichende Selektivität zur Folge hat [298]. Mittels der in
3.3.4.4
beschriebenen
Probenaufarbeitung
Immunoaffinitätsaufreinigung
Aufarbeitungstechnik
mit
darstellt.
magnetischen
Die
Vorteile
wurde
deutlich,
beads
gegenüber
eine
sehr
einem
dass
die
selektive
Anti-Insulin
119
5. Diskussion
Immunoaffinitätsgel [298] sind die leichtere und schnellere Handhabung der beadLösung. Die Immunoglobuline an der Oberfläche der magnetischen beads tendieren
jedoch dazu, nicht nur die Insulin-Antikörper, sondern auch unspezifisch weitere
Proteine zu binden. Zwei Möglichkeiten, dieses Problem zu umgehen, konnten in
Betracht gezogen werden: Ho et al. [299] banden die beads an die Antikörper, bevor
die Probe zugegeben wurde. Dies dauert zwei Tage, überschüssige Tosylgruppen
werden dadurch blockiert und die Bindung an andere Proteine wird reduziert. Die
andere
Möglichkeit
war
die
Einführung
eines
Fällungsschrittes
vor
der
Immunoaffinitätsaufreinigung. Diese gängige Praxis in der forensischen Toxikologie
zur Probenvorbereitung ist für viele Peptide mit erheblichen Verlusten verbunden
(siehe C-Peptid), für die Insuline ist ein Fällungsschritt allerdings möglich. Humanes
Insulin und seine Analoga werden weder mit Acetonitril noch mit Methanol gefällt.
Aufgrund seiner milderen Fällungseigenschaften wurde Acetonitril als Fällungsagens
gewählt. Die Probenvorbereitung für Urinproben erfordert keinen Fällungsschritt, da
weniger Proteine in Urinproben die Selektivität der Probenvorbereitung und die
chromatographische massenspektrometrische Detektion nicht beeinflussen [297].
Eine weitere selektive Möglichkeit, diesen Fällungsschritt zu umgehen, ist die
Benutzung von 96-well Mikroelutionsplatten [297], um die Insuline vor der
massenspektrometrischen Bestimmung zu konzentrieren. Diese Platten (in diesem
Fall polymere Reversed phase-SPE) sind charakterisiert durch eine hohe
Ladungsfähigkeit
und
geringe
Elutionsvolumina,
die
eine
bis
zu
15fache
Konzentrierung erlauben.
Die
Wiederfindungsraten
mit
der
Immunoaffinitätsaufreinigung
mittels
der
magnetischen beads waren mit 33,2-51,7 % ausreichend. Die Inkubationszeit hatte
nach 1 h keinen Einfluss auf die Peakflächen der Insuline und die Wiederfindung der
Insuline konnte nicht mehr erhöht werden. Eine weitere Möglichkeit, die Selektivität
zu erhöhen, ist die Trennung der Disulfidbrücken der Insuline vor der Analyse. Die
meisten Methoden bestimmen die intakten Insuline, andere benötigen hingegen die
Reduktion der Disulfidbrücken, um A- und B- Kette separat zu vermessen. Dazu
werden die Proben in 10 mM TRIS Base bei ungefähr pH 9-9,5 verdünnt. So konnte
das Untergrundrauschen verringert und die Wiederfindungsrate auf bis zu 95 % (für
Insulin glargin) erhöht werden [296]. Diese Trennung der Peptidketten war nach der
selektiven Aufarbeitung mittels magnetischer beads mit der beschriebenen Methode
nicht mehr nötig. Um die erforderliche Sensitivität im Bereich von < 5 µU/ml zu
120
5. Diskussion
erreichen, musste auf mindestens 2 Milliliter Serum zurückgegriffen werden. Auch
Thevis et al. [296] benötigten mindestens 4 ml Serum für die sensitive Detektion der
Analyten in Serum. Die Probensammlung spielt eine wichtige Rolle bei dieser
Aufreinigung. Falls die Proben nicht in Serumröhrchen gesammelt werden, müssen
härtere
Fällungsbedingungen
angewendet
werden
und
Aceton
dient
als
Fällungsagens. Um die Adsorption der Insuline an aktive Glasoberflächen zu
minimieren, ging die Aufarbeitung in LoBind Protein Gefäßen vonstatten.
Ein weiteres Problem stellt die Löslichkeit der Insuline dar. Diese ist grundsätzlich im
Sauren besser, sodass Essigsäure zum Wiederaufnehmen genommen und
Essigsäure und Trifluoressigsäure in das Laufmittel mitaufgenommen wurden, was
auch die Wiederfindungsrate erhöhte. Die Zeit für die chromatographische Trennung
einer Probe konnte von 40 Minuten [297] auf 25 Minuten reduziert werden, kommt
aber bei weitem nicht an die schnelle sechsminütige Trennung einer Ultra HPLC
Methode heran [193, 296].
Auch die massenspektrometrische Detektion erweist sich als nicht einfach. Die
Aminosäuresequenzen der sechs Zielanalyten ähneln der des humanen Insulins
sehr. Eine Unterscheidung ist über ihre unterschiedlichen Molekulargewichte und
Produktionen möglich. Die meisten der Analyten zeigten die höchste Peakintensität
beim fünffach protonierten Molekül als Precursor-Ion. Das Chromatogramm des
fünffach geladenen IS Rinderinsulin zeigte interferierende Matrixpeaks, weshalb die
Dissoziation des sechsfach geladenen Moleküls betrachtet wurde. Eine effiziente
Fragmentierung erforderte Kollisionsenergien von 80 oder 90 eV, welche in kleinen
m/z-Verhältnissen der Produktionen resultieren. Diese Produktionen wurden dafür
herangezogen, Insuline mit derselben Molekülmasse zu unterscheiden. Die Sequenz
des schnellwirksamen Insulinanalogon Humalog® unterscheidet sich nur in zwei
Aminosäuren, die untereinander vertauscht wurden, von humanem Insulin. Eine
chromatographische Trennung ist daher nicht möglich. Ihre Produktionenspektren
unterscheiden sich nur in den beiden speziellen Produktionen m/z 226 für humanes
Insulin und m/z 217 für Humalog (Abbildung 14), die aus dem C-Terminus der
B-Ketten entstehen [179]. Humanes Insulin zeigt keine Fragmentierung zu m/z 217,
sodass ein Fragment m/z 217 im Precursor-Chromatogramm von m/z 1162,5
(Retentionszeit: 7,07 min) einen klaren Hinweis auf eine Humalog®-Gabe gibt. Die
Quantifizierung von Humalog ist trotz Anwesenheit von humanem Insulin über die
Integration des Fragmentpeaks m/z 217 im Massenspektrum möglich. Im Falle einer
121
5. Diskussion
Humalog-Gabe ist dann allerdings keine Quantifizierung von humanem Insulin
möglich, da Humalog in geringem Ausmaß ebenfalls zu m/z 226 fragmentiert wird.
Durch die benötigten hohen Kollisionsenergien entstehen viele leichte Fragmente der
Insuline, was bedeutet, dass eine Messung im MRM deutlich geringere Sensitivität
als die Messung im EPI gezeigt hätte.
Für die Stabilitätsstudien wurde Serum sofort nach der Probensammlung von den
roten
Blutkörperchen
getrennt.
Das
insulin-degrading
enzyme
(IDE),
eine
peroxisomale Protease [180], ist in vielen Geweben, auch in roten Blutkörperchen,
aber besonders im Hämolysat, weit verbreitet [184]. Die Aktivität der IDE wird durch
die von uns durchgeführten Lagerungsbedingungen bei -20°C erniedrigt, Insulin ist
so stabil über einige Monate [181, 182]. Der enzymatische Abbau von Insulin kann
ebenfalls verhindert werden, indem sogenannte IDE-Inhibitoren dem Blutröhrchen
zugesetzt werden. Sulfhydryl-modifizierende Reagenzien werden in der Literatur als
die effektivsten Inhibitoren beschrieben z.B. Diamid in einer Konzentration von ca.
1 mmol/l [200]. Die Stabilität von Insulin für mindestens zwei Wochen wurde von
unserer Stabilitätsstudie bestätigt. Die Stabilität wurde auch durch den Zusatz von
Diamid
oder
Phenylmethansulfonylsäurechlorid
nicht
positiv
beeinflusst.
Abwechselnde Einfrier- und Auftauzyklen hatten in früheren Studien keinen Effekt auf
die gemessene Insulinkonzentration [98].
5.1.2 C-Peptid
Es konnte nachgewiesen werden, dass die Immunoaffinitätsaufreinigung mit
magnetischen beads auch für das C-Peptid eine selektive Aufarbeitungstechnik
darstellt. Ein Fällungsschritt wie bei der Insulinanalytik (siehe 5.1.1) ist bei der
Analytik des C-Peptids nicht möglich, das C-Peptid wird gefällt. Dies ist allerdings
auch nicht vonnöten, eine selektive Aufarbeitung ist mit einem geeigneten Antikörper
möglich. Um die Adsorption der Moleküle an aktive Glasoberflächen zu minimieren,
ging die Aufarbeitung in LoBind Protein Gefäßen vonstatten. Leider konnten die
gewünschten analytischen Grenzen nicht erreicht werden. Dies kann an der
mangelnden Immunoreaktivität des monoklonalen Antikörpers gegen das C-Peptid,
der mangelnden Immunogenität des kleinen Moleküls C-Peptid oder mangelhaft
optimierten Parametern für die Immunoaffinitätsreinigung zusammenhängen. Es wird
empfohlen, einige weitere kommerziell erhältliche Antikörper gegen das C-Peptid zu
beziehen. Der Fokus muss auf der Spezifität der Probenvorbereitung liegen, um das
122
5. Diskussion
Signal-Rausch-Verhältnis und so die LoD und LoQ nach Aufarbeitung einer
vernünftigen Menge Serums zu erniedrigen. Andere Probenvorbereitungen wie SPE
mittels C18 Sep Pak Säulen, beschrieben von Kippen et al. [99] und Darby et al. [205]
können in Kombination mit den in dieser Arbeit beschriebenen chromatographischen
und massenspektrometrischen Bedingungen als Ausgangsmethodik zugrunde gelegt
werden. Diese Arbeitsgruppen quantifizierten das C-Peptid in Urin, die Serumanalytik
erfordert allerdings eine zehnfach höhere Sensitivität. Cabaleiro et al. [300] zeigten
kürzlich
C-Peptid
diese
Sensitivität,
massenspektrometrisch
nach
indem
sie
das
SPE-Aufarbeitung
im
negativen
Ionisierungsmodus als Precursor-Ions [M - 2H]2- detektierten.
5.1.3 Orale Antidiabetika
Mit der beschriebenen validierten Methodik ist der quantitative Nachweis der oralen
Antidiabetika aus der Gruppe der Sulfonylharnstoffe, der Glinide und der Glitazone
und der qualitative Nachweis der Dipeptidyl-Peptidase-Hemmstoffe möglich. Die
Methodik erlaubt den Nachweis von sehr geringen Konzentrationen, aber auch von
Überdosiskonzentrationen. Eine LLE wurde als angemessen angesehen, um die
verschiedenen Pharmazeutika aus dem Serum zu isolieren. Verschiedene
organische Lösungsmittel (Ethylacetat / Diethylether, n-Chlorobutan, Dichlormethan,
Diethylether, TBME) wurden verglichen, um die besten Wiederfindungsraten zu
ermitteln. Die Extraktion mit TBME ergab die besten Wiederfindungen. Aufgrund der
unterschiedlichen chemischen Strukturen und pKa der Arzneistoffe wurde TBME bei
2 pHs als Extraktionsmittel benutzt. Der Preis für die Aufnahme aller oralen
Antidiabetika in die Methode war die Abnahme der Wiederfindungsraten besonders
für Saxagliptin und Vildagliptin. Beide Substanzen besitzen einen relativ hohen pKa
(Saxagliptin 7,3) und einen polaren Charakter aufgrund der Einführung von Aminound
besonders
Cyanogruppen
ins
Molekül
und
werden
mit
organischen
Lösungsmitteln nicht gut extrahiert. Für alle anderen oralen Antidiabetika war die
Wiederfindungsrate hervorragend. Für Vildagliptin und Saxagliptin zeigten sich auch
jeweils Präzisionsdaten > 15%. Daher ist die Methode allenfalls bedingt geeignet, um
die Gliptine quantitativ nachzuweisen. Ein sicherer qualitativer Nachweis dieser
Substanzen mit dieser Methode ist jedoch möglich.
123
5. Diskussion
5.1.4 Methylglyoxal
Die beschriebene Methodik erlaubt die Quantifizierung des MG in Serum und post
mortem Blut. Validierungsparameter waren alle in Übereinstimmung mit den
Vorgaben der GTfCh. Die gemessenen Konzentrationen unterschieden sich aber
teilweise stark von anderen Studien (siehe Tabelle 10 in Kapitel 1.4.5). Zwei Punkte,
die bei anderen Studien Kritik auf sich ziehen könnten, sind Probenvorbereitung und
die Herstellung der Kalibrierstandards. Dhar et al. [300] zeigten, dass MG durch
Fällung mit sauren Substanzen (wie hier Perchlorsäure) aus seiner hohen
Proteinbindung befreit werden muss. Anschließend werden die gefällten Proteine
entfernt, während MG frei im sauren Überstand vorliegt. Nach diesem Fällungsschritt
muss eine viertelstündige Standzeit der Probe abgewartet werden, in dem MG in
saurer Umgebung aus seiner Proteinbindung befreit wird. Die Molarität der sauren
Komponente und die Standzeit hatten einen signifikanten Einfluss auf die
gemessenen MG-Konzentrationen. 10 Minuten Standzeit nach Fällung mit 7 %
Perchlorsäure
führte
zur
besten
Freisetzung
von
MG
[301].
Mit
diesem
Fällungsschritt mit anschließendem Stehenlassen konnten die MG-Konzentrationen
bis aufs Zehnfache gesteigert werden.
Durch Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung wird der pH-Wert
dann wieder erhöht, um optimale Voraussetzungen für die Derivatisierung und die
anschließende Extraktion zu schaffen. Dabei muss darauf geachtet werden, dass der
pH nicht zu hoch wird. Gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung selbst besitzt
einen pH von 8,4. Bei diesen Bedingungen sind zelluläre Metaboliten wie
Triosephosphate instabil und werden zu MG abgebaut. MG selbst ist bei höheren
pHs in Lösung instabil. Es unterliegt einer intramolekularen Cannizarro-Reaktion
unter Bildung von Laktat [302]. Daher würden höhere pH-Werte als die bei dieser
Methode benutzten (pH 5) zu Verfälschungen der Ergebnisse führen. Bei leicht
saurem pH werden die genannten Metabolite, die zu MG abgebaut werden können,
und MG selbst nach dessen Befreiung aus der Proteinbindung stabilisiert. Der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt der anschließenden Derivatisierung mit
2,3-Diaminonaphthalen ist dann die säurekatalysierte Dehydrierung, daher wird die
Derivatisierung bei leicht saurem pH-Wert schneller ausgeführt als bei basischem.
Die pKa von 1,2-Diaminobenzen liegen bei 0,8 und 4,6 und sind ähnlich für
2,3-Diaminonaphthalen [303]. Daher ist pH 5 der beste Kompromiss für eine
124
5. Diskussion
gelungene Derivatisierung, da bei diesem pH noch freie unprotonierte Aminogruppen
für eine Reaktion mit den Dicarbonylkomponenten vorliegen.
Zur Verbesserung der Stabilität und der Chromatographie von MG ist ein
Derivatisierungsschritt
dringend
notwendig.
Alternativen
zum
beschriebenen
Derivatisierungsschritt umfasst die Reaktion mit dem allerdings explosiven
2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) [222] zu Hydrazon-Derivativen. Das Produkt
MG-bis-2,4-dinitrophenylhydrazon fällt aber teilweise aus der Lösung aus und
beschränkt so die Verlässlichkeit der Methode. Ein weiterer Kritikpunkt dieser
Derivatisierungsmöglichkeit ist, dass viele Hersteller zur Verbesserung der
Explosionssicherheit des gefährlichen DNPH dieses als wässrige Lösung ohne
exakte Gehaltsangabe anbieten. Weitere Derivatisierungsmöglichkeiten bieten oPhenylendiamin
[156],
Dichloro-1,2-phenylendiamin,
4,5-Methylendioxy-1,2-
phenylendiamin [223], o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl) hydroxylamin (PFBOA) [225]
oder 9-(3,4-diaminophenyl)acridin [304]. Die „Goldstandard“-Methodik für die
Bestimmung von MG beinhaltet allerdings die Reaktion von MG mit reduziertem
Glutathion über Hemithioacetal Zwischenstufen zu S-D-Lactoylglutathion, katalysiert
durch das Enzym Glyoxylase I. Diese Methodik, zuerst beschrieben durch Racker
[305], benötigt aber das Enzym und reduziertes Glutathion, welche beide ziemlich
teuer sind. Eine weitere Möglichkeit wurde von Wild et al. [306] aufgezeigt, die die
Reaktion von MG mit N-Acetyl-L-cystein zu N-α-Acetyl-S-(1-hydroxy-2-oxo-prop-1-yl)
cystein bei Raumtemperatur mit guter Präzision erfassten.
Weiterhin ist wichtig, ob Plasma oder Serum als Matrix gewählt wird und welche
Fraktionen von MG mit der Methodik erfasst werden können. Weniger als 1 % des
MG liegt frei vor, während mehr als 99 % des Gesamt-MG proteingebunden ist [307,
308]. MG reagiert mit Cystein-, Arginin- und Lysinresten verschiedener Proteine
[306]. Die proteingebundene Fraktion kann noch in die irreversibel und reversibel
gebundene Fraktion unterteilt werden. Das reversibel gebundene MG scheint in
einem dynamischen Equilibrium mit freiem MG zu stehen und kann gemessen
werden [309, 310]. Das reversibel gebundene MG ist allerdings sehr variabel und ist
sicherlich eine mögliche Fehlerquelle der MG-Analytik. Die irreversible Form bleibt
selbst unter relativ extremen Bedingungen (Fällungsschritt) stabil und kann daher
nicht mit dieser Methode, aber mit speziellen Assays für AGE [311, 312] detektiert
werden.
125
5. Diskussion
Weiterhin
ist
die
Herstellung
der
Kalibrierstandards
ein
wichtiger
Punkt.
Methanolische MG- und IS-Lösungen verlieren aufgrund der hohen Reaktivität der
Dicarbonylgruppen ihren ursprünglichen Gehalt relativ schnell. Die Standards
müssen daher immer frisch hergestellt und in einer inerten Umgebung (Helium)
gelagert werden. Die kommerziell erhältliche Lösung muss vor Benutzung auf
Unreinheiten getestet werden. Wenn die MG-Standards nicht frisch hergestellt
werden, werden höhere MG-Konzentrationen gemessen. Es wird angeregt, eine
definierte Referenzmethode für MG in biologischem Probenmaterial zu entwickeln
und festzulegen.
Auch aus Zellmaterial kann mit dieser Methode MG extrahiert werden. Die Zellwände
werden durch Einfrieren mit flüssigem Stickstoff in Lysepuffer lysiert und das
Prozedere anschließend wie mit den anderen Matrices fortgesetzt. Die Ergebnisse
sind in der Fachliteratur beschrieben [230, 236].
5.1.5 Anhydroglucitol
Die Methode wurde erfolgreich im humanen Serum und post mortem Blut validiert.
Das intensivste Ion war im Gegensatz zu anderen Studien [236] das deprotonierte [M
- H+] – mit einem m/z-Verhältnis von 162,9 für AG und 168,9 für den IS. Die Methode
ist begrenzt auf Serum und post mortem FVB als Probenmatrix, für beide wurden
gute Ergebnisse in puncto Selektivität und Sensitivität erreicht. Versuche mit Urin als
Probenmatrix
zeigten
bei
diesem
chromatographischen
Setting
einen
interferierenden Peak im Target- und Qualifierchromatogramm des Analyten. Dies
entspricht Onorato et al. [9], die die Selektivität in Urinproben durch die Einführung
von MS3-Experimenten erhöhen mussten, um interferierende Peaks auszuschließen.
Die Sensitivität der Methode ist mit LoD = 0,55 µg/ml ausreichend, da die meisten
gemessenen Konzentrationen im Bereich 1-25 µg/ml lagen.
5.2
Klinische Proben
5.2.1 Humanes und synthetische Insuline
Humanes Insulin zeigt über einen Zeitraum von mindestens 2 Wochen nach
Probennahme Stabilität im Serum. Daher war es möglich, Proben nach Verschickung
aus Bad Oeynhausen innerhalb der ersten Woche nach Probennahme zu
126
5. Diskussion
vermessen, ohne einen signifikanten Verlust an Analyt verzeichnen zu müssen.
werden. Das Gesamtkollektiv der Diabetiker zeigte humane Insulinkonzentrationen,
die größer als die Referenzkonzentrationen waren. Dies lag daran, dass sich einige
Diabetiker humanes Insulin injiziert hatten oder orale Antidiabetika eingenommen
hatten und so den Mittelwert erhöhten. Diabetiker ohne Medikation zeigten mit im
Mittel 135 pmol/l Konzentrationen etwa im Referenzbereich (29-188 pmol/l). Typ 2Diabetiker zeigten signifikant erhöhte Humaninsulin-Konzentrationen im Vergleich mit
Typ 1- Diabetikern, bei denen die Sekretion des Humaninsulins nahezu versiegt ist.
Bei Einteilung der Diabetes-Patienten nach ihrer Medikation ergaben sich einige
interessante Aspekte: Sowohl die Injektion von humanem Insulin als auch die
Einnahme von oralen Antidiabetika erhöhen die Humaninsulin-Konzentrationen
signifikant. Angesichts der Tasache, dass eine Einnahme von oralen Antidiabetika
nachweisbar ist, muss eine Injektion mit humanem Insulin nur von der endogenen
Insulinkonzentration eines Diabetikers ohne Medikation oder eines Nicht-Diabetikers
unterschieden werden. Diese liegen bei 135 Diabetikern ohne Medikation bei bis zu
470 pmol/l, Referenzbereiche für Nicht-Diabetiker liegen bei bis zu 1400 pmol/l
postprandial [48]. Alle Werte, die über diesen 1400 pmol/l (200 µU/ml) bestimmt
werden, sollten den Verdacht auf eine Injektion mit humanem Insulin lenken. So
konnten
die
Insulinkonzentrationen
im
beschriebenen
Fallbeispiel
5.3.10.2
(5180 µU/ml = 37369 pmol/l) leicht auf die Injektion von humanem Insulin
zurückgeführt werden. Allerdings überlappen sich die Konzentrationen, sodass eine
Konzentration < 1400 pmol/l auf keinen Fall eine Injektion mit humanem Insulin
ausschließen sollte. Im Kollektiv der Diabetiker in Therapie mit humanem Insulin
kamen Konzentrationen ab 26,4 pmol/l vor, die nicht direkt auf eine Injektion
schließen lassen könnten. Will man falsch positive Ergebnisse vermeiden und setzt
die Grenze für die Injektion mit humanem Insulin auf > 500 pmol/l NüchternInsulinkonzentration (Selektivität 100 %), ergibt sich eine Spezifität von nur 30 %.
Marks [105] beschreibt die in 29 Fällen von Insulinmord per Immunoassay
gemessenen Insulinkonzentrationen als 234-323600 pmol/l (Mittel 63000 pmol/l). Nur
in 4 Fällen war die Insulinkonzentration < 1000 pmol/l. Daraus folgernd sollte man die
absolute Konzentration von humanem Insulin zur Beurteilung der Ursache einer
Hypoglykämie durchaus zu Rate ziehen, die zusätzliche C-Peptid-Analytik ist aber
unerlässlich.
127
5. Diskussion
Einige Arbeitsgruppen hatten postuliert, dass in Fällen einer nicht durch Insulin
ausgelösten Hypoglykämie Insulinkonzentrationen < 29,8 pmol/l (< 4,14 µU/ml) [106]
bzw. < 35,8 pmol/l (< 4,97 µU/ml) [313] auftreten. Bei allen drei Diabetikern in diesem
Kollektiv, die unter einer Hypoglykämie litten, wurden Insulinkonzentrationen < LoQ
ermittelt.
Der Nachweis von synthetischen Insulinen gelang mit Hilfe der beschriebenen
Methodik
in
vielen
Fällen
und
zeigte
die
in
Tabelle
25
aufgeführten
Konzentrationsbereiche. Im beschriebenen Patientenkollektiv wies keiner der
Diabetiker nach Therapie mit synthetischen Insulinen eine Hypoglykämie auf.
Gleichwohl können Überdosen zu diesen Stoffwechselentgleisungen führen. Seit der
Einführung der Insulinanaloga sind in der Literatur einige Fälle beschrieben, die
meisten für Insulin glargin (Lantus®): Ein Mann injizierte sich in einem Suizidversuch
an mehreren Körperstellen 150 U Lantus® [314]. Lantus® wird üblicherweise einmal
am Tag gegeben, da es eine mutmaßliche HWZ von ca. 24 h und dabei keinen
Wirkhöhepunkt aufweist. Die normale Tagesdosis beträgt bis zu 20 U. Im Falle dieser
Überdosierung mit 150 U erfolgte eine starke Fluktuation der Glucosekonzentration
auch nach Behandlung, so dass angenommen wurde, dass die Bolusinjektion mit
großer Dosis langsam aus einem subkutanen Depot freigesetzt wurde. Bis zu 72
Stunden nach der Injektion litt der Patient noch unter Hypoglykämien. Die Absorption
von Lantus® kann ebenfalls durch das Ausweichen auf mehrere Injektionsstellen
erhöht werden. Ein anderer Suizidversuch mit 24 U Lantus® [315] misslang.
Zweieinhalb
Stunden
nach
der
Injektion
wurde
eine
Frau
komatös
(Blutglucosekonzentration von 31 mg/dl) aufgefunden. In diesem Fall reichte also
schon die doppelte tägiche Dosis aus, eine lebensgefährliche Hypoglykämie zu
erwirken. Das Ausmaß einer Hypoglykämie für Lantus® ist also nicht dosisabhängig.
Die Dauer einer Hypoglykämie nach der Injektion von NPH (neutral protamin human)
Insulin ist im Gegensatz dazu dosisabhängig; eine Hypoglykämie, die länger als 54
Stunden dauerte, wurde nur nach einer massiven Überdosis beobachtet [316]. Auch
im beschriebenen Fall führten ca. 600 U Normalinsulin zu einer 72 Stunden
andauernden Hypoglykämie (5.3.10.2). Der Mechanismus der länger andauernden
hypoglykämischen Episoden nach Lantus®-Injektion ist unklar, es konnte jedoch
gezeigt werden, dass nach einer Standarddosis mit radioisotop-gekennzeichnetem
Lantus® die Radioaktivität in der Injektionsstelle noch 48 Stunden nach Injektion
detektiert werden konnte [317]. Ein weiterer Suizidversuch mit 2700 U Lantus® wurde
128
5. Diskussion
berichtet [318]. Erst 16 h nach der Injektion wurde die Patientin mit einer
Blutglucosekonzentration von 29 mg/dl eingeliefert. In einem weiteren Fall [319]
musste das Injektionsareal nach Injektion von 4800 U Lantus® ausgeschnitten
werden, um den Patienten zu retten.
Ein weiteres Insulinanalogon, für das Hypoglykämien beschrieben wurden, ist Insulin
lispro (Humalog®). Das schnell wirksame Analogon beginnt schon nach 10-30 min zu
wirken, nach 30-120 min hat es seinen Wirkhöhepunkt. So wurde eine Frau [101]
schon 30 min nach der Injektion von 300 U Humalog® komatös (Glucose 7 mg/dl) ins
Krankenhaus gebracht. Die hypoglykämischen Episoden dauerten 11 h an.
5.2.2 C-Peptid
Typ 2-Diabetiker, bei denen die Proinsulin-Sekretion und dementsprechend auch die
C-Peptid-Sekretion
noch
intakt
ist,
zeigten
signifikant
höhere
C-Peptid-
Konzentrationen als Typ 1-Diabetiker, bei denen die endogene Sekretion
weitestgehend eingestellt ist. Erhöhte C-Peptid-Konzentrationen (> 1000 pmol/l) bei
Typ 2-Diabetikern im Vergleich zu Normalpersonen sind auf die Insulinresistenz der
Gewebe und dem darauf folgenden Versuch des Körpers zurückzuführen, die
fehlende Reaktion auf Insulin- und C-Peptid-Sekretion durch vermehrte endogene
Produktion aufzuheben. Im Spätstadium eines Diabetes Typ 2 kann es aber auch
durchaus vorkommen, dass bei Versagen der Insulin- und der C-Peptid-Produktion
C-Peptid-Konzentrationen erniedrigt sind. Bei Einteilung der Diabetes-Patienten nach
ihrer Medikation ergaben sich einige interessante Aspekte: Sulfonylharnstoffe und
andere orale Antidiabetika erhöhen aufgrund ihres Wirkmechanismus die endogenen
C-Peptid-Konzentrationen. Die niedrigsten gemessenen C-Peptid-Konzentrationen
nach Einnahme von Sulfonylharnstoffen betrugen 970 pmol/l. Nach Injektion von
humanem Insulin oder synthetischen Insulinen erniedrigt sich die C-PeptidKonzentration, aber nicht signifikant. Auch im beschriebenen Fall (5.3.10.2) wurde
eine eher niedrige C-Peptid-Konzentration detektiert (336 pmol/l). Nach Injektion mit
humanem Insulin wurden Konzentrationen bis zu 4600 pmol/l C-Peptid gefunden. Im
Gegensatz dazu wurden auch bei Diabetikern ohne Medikation extrem niedrige CPeptid-Konzentrationen < LoQ gefunden. Dies lässt den Schluss zu, dass eine
niedrige C-Peptid-Konzentration per se zwar einen Hinweis auf eine exogene Gabe
von Insulin geben kann, aber nur in Relation zur Insulinkonzentration Aussagekraft
besitzt.
129
5. Diskussion
5.2.3 Das molare Verhältnis humanes Insulin : C-Peptid
Für Diabetiker ohne Medikation wurden im Mittel Nüchtern-I:C-Verhältnisse von 0,13
ermittelt. Diese liegen in etwa im Bereich der mittels Immunoassay ermittelten
Verhältnisse aus der Literatur, die für Nicht-Diabetiker mit 0,13 [92] bzw. 0,1 [101]
beschrieben werden. Diese können postprandial auf 0,19 [85] bzw. 0,12 [253] leicht
ansteigen. Die C-Peptid-Konzentrationen sind also meist 5-10fach höher als die
entsprechenden Insulinkonzentrationen im Serum, das Verhältnis steigt aber nach
dem Essen leicht an. Unsere Beobachtungen können sich also nur auf nüchterne
Patienten beziehen. Diabetiker haben I:C-Verhältnisse in derselben Größenordnung
wie
gesunde
Personen.
Die
Injektion
von
humanem
Insulin
erhöht
die
I:C-Verhältnisse signifikant. Die gängige Meinung, dass I:C-Verhältnisse > 1 klar für
eine Injektion mit Insulin sprechen [92], wird hier allerdings nicht bestätigt. Zwei
Patienten, die sich nicht humanes Insulin injiziert hatten, sondern nur synthetische
Insuline bzw. orale Antidiabetika eingenommen hatten, erreichten ein I:C von > 1.
Auch 19 von 30 Patienten, die sich nur humanes Insulin injiziert hatten, zeigten I:C
< 1. Die Einnahme von oralen Antidiabetika dagegen verändert die I:C-Verhältnisse
im Vergleich zu Diabetikern ohne Medikation nicht, da orale Antidiabetika aufgrund
ihres
Wirkmechanismus
sowohl
die
Humaninsulin-
als
auch
die
C-
Peptidkonzentrationen ansteigen lassen.
Da eine Injektion synthetischer Insuline bzw. die Einnahme oraler Antidiabetika mit
unseren Methoden leicht als Ursache einer Hypoglykämie detektiert werden können,
muss nur eine Abgrenzung von Diabetikern ohne Medikation zu Diabetikern nach
Injektion von humanem Insulin geschaffen werden. Bei einem Cut Off des NüchternI:C-Verhältnisses von 0,22 erreicht man eine Sensitivität von 100 % und eine
Selektivität von 87,2% für die Abgrenzung zur Gruppe „orale Antidiabetika“ und
81,3% für die Abgrenzung zur Gruppe
„keine Medikamenteneinnahme“. Im
beschriebenen Fallbeispiel (5.3.10.2) lag das I:C-Verhältnis mit 111 deutlich über
diesen Cut-Offs.
5.2.4 Proinsulin
Proinsulin-Konzentrationen von Diabetikern lagen im Mittel bei 9,82 pmol/l. Im
Bereich des in der Literatur beschriebenen Referenzbereichs für ProinsulinKonzentrationen von < 11 pmol/l liegen 66,2 % der Fälle (n = 266), während 33,8 %
(n = 136) der Fälle über 11 pmol/l lagen. Nüchtern-Proinsulin-Konzentrationen, wie
130
5. Diskussion
sie hier gemessen wurden, wurden bei Gesunden mit 6,7±1,7 pmol/l [320],
2,2-6,2pmol/l [9], postprandial mit 8,5-11,3 pmol/l [105] beschrieben. Damit liegen die
meisten der Diabetiker über den Referenzkonzentrationen. Der bei uns ermittelte
signifikante Unterschied der Proinsulinsekretion zwischen Männern und Frauen
wurde bisher noch nicht beschrieben. Typ 2-Diabetiker, bei denen die ProinsulinSekretion noch intakt ist, zeigten signifikant höhere Proinsulin-Konzentrationen als
Typ 1-Diabetiker, bei denen die endogene Sekretion weitestgehend eingestellt ist.
Weiterhin besteht ein klarer Zusammenhang zwischen der schon bekannten Länge
der Diabeteserkrankung und der Proinsulinsekretion. Bei Diabetikern, die von Ihrer
Krankheit erst vor Kurzem erfuhren, ist die Proinsulin-Sekretion noch ausgeprägt,
während bei Langzeit-Diabetikern Proinsulinkonzentrationen > 10 pmol/l nicht mehr
auftreten.
Bei Einteilung der Diabetiker nach ihrer Medikation ergaben sich folgende Aspekte:
Sulfonylharnstoffe
und
andere
orale
Antidiabetika
erhöhen
aufgrund
ihres
Wirkmechanismus die Proinsulinkonzentrationen signifikant. Eine Therapie mit
synthetischem oder humanem Insulin hat keinen Einfluss auf die mittleren
Proinsulinkonzentrationen. Auch gibt die Proinsulin-Konzentration keinen Hinweis
darauf, ob ein Diabetiker sich gerade Insulin injiziert hat oder nicht. Auch im
beschriebenen Fall 5.3.10.2 wurde eine Proinsulin-Konzentration im Normbereich
(5,3 pmol/l) detektiert. Einige Arbeitsgruppen hatten sich mit den ProinsulinKonzentrationen im Falle einer Hypoglykämie auseinandergesetzt und diese als
< 20 pmol/l [107] bzw. < 5 pmol/l [321, 322] beschrieben. Die Proinsulinsekretion wird
also wie die endogene Insulin- und C-Peptid-Sekretion durch eine Hypoglykämie
unterdrückt. Aus der Gegenüberstellung von Glucose und Proinsulin (Abbildung 34)
lässt sich erkennen, dass in den 28 Fällen einer Glucosekonzentration < 100 mg/dl
stets eine Proinsulin-Konzentration < 15 pmol/l vorherrschte (Sensitivität 100 %).
Damit ist eine niedrige Proinsulin-Konzentration ein Indiz für eine hypoglykämische
Episode, nicht jedoch ein absoluter Beweis, da die Spezifität in diesem Fall sehr
niedrig ist und selbst bei stark hyperglykämischen Patienten niedrige ProinsulinKonzentrationen vorkommen.
5.2.5 Orale Antidiabetika
Orale antidiabetische Medikation kann ebenfalls zur Ausbildung einer Hypoglykämie
führen. Vor allem Sulfonylharnstoffe wurden schon häufig als Suizidmittel
131
5. Diskussion
beschrieben [129]. Als unerwünschte Nebenwirkung treten Hypoglykämien meist in
den ersten 6 Wochen der Therapie auf [323]. Die gastrointestianale Absorption von
Sulfonylharnstoffen (in Deutschland sind aktuell mit Glimepirid, Glibenclamid,
Gliclazid und Gliquidon 4 auf dem Arzneimittelmarkt erhältlich) erfolgt innerhalb von
15 Minuten nach Einnahme [324]. Die Peakplasmakonzentrationen werden nach
Einnahme therapeutischer Dosen innerhalb von 2-12 h erreicht [129]. Im
Allgemeinen
korreliert
die
biologische
Wirkdauer
aber
nicht
mit
der
Plasmahalbwertszeit (pharmakokinetische Daten in Kapitel 1.4.4). Wegen der
Anreicherung der Sulfonylharnstoffe im Gewebe halten Hypoglykämien oft länger an,
als
aufgrund
der
HWZ
zu
erwarten
wäre
[325,
326].
Alle
ermittelten
Serumkonzentrationen der Sulfonylharnstoffe bei Diabetikern lagen hier unterhalb
dieser beschriebenen Peakplasmakonzentrationen. Die Peakplasmakonzentrationen
gehen mit dem Einsetzen der Hypoglykämien einher. Diese setzen bei diesen
Wirkstoffen normalerweise in den ersten 8 h nach Einnahme ein, kann aber bis zu 12
Stunden verzögert sein [327]. In Überdosissituationen können die Hypoglykämien bis
zu 72 Stunden andauern [328]. Hypoglykämien können auf die falsche Dosierung,
Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten, verzögerten Metabolismus oder
erniedrigte Ausscheidung zurückzuführen sein. Die Wirkstoffe haben einen engen
therapeutischen Index und so gab es Fälle von Hypoglykämien bei Kindern nach
Einnahme von nur einer Tablette Glipizid [329]. Das Einsetzen der Hypoglykämien ist
nicht von der Dosis abhängig, das Potential steigt aber mit höheren Dosen
besonders bei älteren Patienten [330].
Glinide weisen denselben Wirkmechanismus wie Sulfonylharnstoffe auf. Ein
Selbstmordversuch mit Nateglinid wurde beschrieben [331]. Die Patientin hatte
3420 mg Nateglinid eingenommen, was zu einer Blutglucosekonzentration 1 h nach
Einweisung ins Krankenhaus von 36 mg/dl führte. Eine Stunde später war die
Glucosekonzentration nach Behandlung auf 56 mg/dl gestiegen, sank aber 2
Stunden später wieder auf 22 mg/dl ab. Die hypoglykämischen Effekte von Nateglinid
dauerten 6 h nach Einlieferung der Patientin an. In einem Rattenversuch mit
Nateglinid führte das Antidiabetikum schon nach einer Stunde zu einem
dosisabhängigen
Abfall
der
Glucosekonzentration.
Die
maximalen
Plasmakonzentrationen (1000-3000 ng/ml) wurden 0.5-1,5h nach einer Einzeldosis
von 60 mg ermittelt, die Wirkung hielt aber nicht länger als 3 h an [332].
132
5. Diskussion
Auch Repaglinid führte zu einer unbeabsichtigten Hypoglykämie in klinischer
Dosierung 4-6 h nach Einnahme [333]. Ein junger Mann wurde mit den folgenden
Laborwerten
eingeliefert:
Glucose
19
mg/dL,
Insulin
395
pmol/L
(normal
145-323 pmol/l), C-Peptid 2966 pmol/L, Proinsulin 44 pmol/l (normal: < 11 pmol/l).
Die erhöhten Konzentrationen der Peptide ließen auf eine Einnahme oraler
Antidiabetika
schließen.
Repaglinid
wurde
in
Konzentrationen
zwischen
4,8 und 20,7 ng/ml gefunden. Peakplasmakonzentrationen von Repaglinid wurden
mit 105 ng/ml 0,5-1,5h nach einer Einzeldosis von 2 mg beschrieben. Repaglinid hat
eine kurze HWZ von 1,0-1,4 h und dadurch eine kurze Wirkdauer [334].
Während einer Pubmed-Recherche konnten keine Fälle einer ThiazolidindionÜberdosis gefunden werden.
Bei Dipeptidyl-Peptidase-Inhibitoren kommen schwere Hypoglykämien ebenfalls nur
recht selten vor. Die Inzidenz von Hypoglykämien in einer randomisierten
kontrollierten Studie in Japan über eine Reihe von Sitagliptin-Dosen (50, 100 und
200 mg) betrug 1,3-4,4 % [335]. So beschreiben Furukawa et al. den Fall einer Frau,
die einen Suizid mit Sitagliptin versuchte. Sie hatte 1700 mg Sitagliptin
eingenommen, das mehr als 30fache der gängigen Tagesdosis. Bei Einlieferung
wies sie trotzdem eine relativ normale Glucosekonzentration von 124 mg/dl auf und
auch in den folgenden Tagen schwankte der Glucosewert nach Glucoseinfusion im
normoglykämischen Bereich. Sitagliptin-Konzentrationen erreichten 1544 ng/ml 16 h
und 279 ng/ml 7 Tage nach Einlieferung. Bei einer pharmakokinetischen Studie mit
gesunden Freiwilligen wurden die cmax und tmax nach Einnahme von 400 mg bzw.
800 mg folgendermaßen bestimmt: 1481 ng/ml nach 1,5 h für 400 mg und 4518
ng/ml nach 1 h für 800 mg. Die von uns ermittelten Konzentrationsbereiche bei 58
Diabetikern lagen zwischen < LoQ und 670 ng/ml [150-152, 156].
5.2.6 Methylglyoxal
In Übereinstimmung mit anderen Studien [153] zeigten Diabetiker mit chronischer
Hyperglykämie in Kliniken signifikant (p < 0,001) höhere Serumkonzentrationen als
Nicht-Diabetiker. Typ 1- und Typ 2-Diabetiker zeigten keine Unterschiede. Der Grund
dafür ist, dass MG hauptsächlich aus Glucose gebildet wird und die MGKonzentrationen unabhängig von der Ursache einer Hyperglykämie steigen. Die
Konzentrationen waren im Einklang mit einer früheren Studie [336, 337] und lagen
133
5. Diskussion
innerhalb eines engen Konzentrationsbereiches (67% aller diabetischen Patienten
zeigten MG Konzentrationen innerhalb 60-100 ng/ml).
5.2.7 Anhydroglucitol
Wie schon von Won et al. beschrieben [232], zeigen Diabetiker mit chronischer
Hyperglykämie in den hier vorgenommenen Untersuchungen signifikant (p < 0,001)
niedrigere mittlere AG-Serumkonzentrationen als Nicht-Diabetiker. Die Diabetiker
wiesen im Mittelwert Konzentrationen von 5,74 µg/ml (< LoQ-31,4 µg/ml), NichtDiabetiker Konzentrationen von 23,3 µg/ml auf. Ähnliche Konzentrationen sind in der
Literatur beschrieben. Tanaka et al. [338] ermittelten AG-Konzentrationen von
24,6±7,2 µg/ml bei Gesunden, Won et al. [232] von 24,6±6,2 µg/ml (17,9-36,6 µg/ml).
In dieser Studie zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen Typ 1-Diabetikern
und Typ 2-Diabetikern. Auch Tanaka et al. [338] (7,7±7,2 µg/ml bei Typ 2- und
2,7±2,7 µg/ml bei Typ 1-Diabetikern) ermittelten Konzentrationsunterschiede. Won et
al. [339] ermittelten höhere Konzentrationen bei Typ 2-Diabetikern (18,0 ± 7,0 µg/ml).
Dies konnte schon in einer früheren Studie gezeigt werden [339], in der ein
signifikanter Unterschied zwischen fulminanten Typ 1-Diabetikern (3,3±1,4µg/ml) und
Typ 2-Diabetikern (13,5 ±5,4 µg/ml) beschrieben wurde. Typ 1-Diabetiker zeigten in
unserer Studie ähnliche Konzentrationen (MW 3,02 µg/ml), die Konzentrationen von
Typ 2-Diabetikern lagen allerdings deutlich darunter (MW 6,26 µg/ml). Koga et al.
[235] zeigten weiterhin, dass Patienten mit fulminantem Typ 1 Diabetes in 6 von
7
Fällen
Konzentrationen
<
5
µg/ml
zeigten,
während
Typ
2-Diabetiker
AG-Konzentrationen < 5 µg/ml nur in 1 von 32 Fällen aufwiesen. Dies konnte in
unserer
Studie
nicht
bestätigt
werden,
auch
Typ
1-Diabetiker
zeigten
Konzentrationen > 10 µg/ml. Beschriebene geschlechtsspezifische Unterschiede
wurden in diesem Kollektiv allerdings nicht beobachtet. Li et al. [159] hatten gezeigt,
dass AG-Konzentrationen bei Gesunden bei 18,96±5,71 µg/ml (n = 185) für Frauen
und 28,97±7,57 µg/ml (n = 82) für Männer lagen (p < 0,001). Bei Typ 2-Diabetikern
zeigte sich dieses Phänomen nicht (7,62 ± 5,52 µg/ml bei 55 männlichen und
6,59 ± 5,20 µg/ml bei 104 weiblichen Typ 2-Diabetikern). Li et al. hatten daraufhin
geschlechtsspezifische Referenzintervalle vorgeschlagen.
Wenn eine AG- Konzentration von > 10 µg/ml im Serum als ein Kriterium für gutkontrollierten Diabetes mellitus herangezogen wird [338], waren die meisten der
Patienten in dieser Studie unter dieser Grenze und schlecht eingestellt. Tatsächlich
134
5. Diskussion
zeigten nur 69 von 434 Diabetikern (15,9 %) eine AG Konzentration > 10 µg/ml. Die
Patienten der Studie befanden sich allerdings fast alle in Situationen, in denen der
Glucosemetabolismus kurze Zeit vorher entgleist war. Daraufhin waren die Patienten
ins
Krankenhaus
eingeliefert
worden.
Dies
könnte
die
niedrigeren
AG-
Konzentrationen im Vergleich zu anderen Studien erklären. Nicht-Diabetiker zeigten
nur in 4 von 116 Fällen Konzentrationen < 10 µg/ml.
Der weitere Langzeitmarker HbA1c korreliert mit AG. Dies zeigt sich auch in der
Tatsache, dass nur 22 der 69 Diabetiker mit < 10 µg/ml einen erhöhten (> 7,5 %)
HbA1c-Wert aufwiesen. Auch Won et al. [338] hatten einen linearen Zusammenhang
zwischen AG und HbA1c (R2 = 0,208; p < 0,001) ermitteln können. Mit der NüchternInsulin-Konzentration korrelierte AG allerdings nicht (R2 = -0,02; p = 0,77). In unserer
Studie korrelierte die AG-Konzentration nur schwach mit der aktuellen NüchternGlucose-Konzentration. Eine Assoziation zwischen AG und der postprandialen
Plasmaglucose bei Patienten mit normaler glykämischer Stoffwechsellage oder gut
eingestelltem Diabetes, nicht aber bei extremen Hyperglykämien, ist allerdings
gegeben [158].
AG-Konzentrationen normalisieren sich signifikant über einen Zeitraum von
mehreren Tagen im Anschluss an eine ausgeprägte Hyperglykämie [340, 341].
Außerdem haben Unterschiede in der individuellen renalen Schwelle für Glucosurie
oder Schwankungen in der Hämoglobin- oder Lipidfraktion keine Änderungen der
AG-Konzentrationen zur Folge [342].
Einschränkungen für diesen Marker wurden beschrieben: der urämische Zustand
[343] oder der Leberzustand [344], Ernährung [345], populationsgenetische
Abstammung [346] und die Nierenfunktion [158, 234] haben einen Einfluss auf die
AG-Konzentrationen
im
Serum.
Weiterhin
ist
bei
Patienten
mit
extremen
Hyperglykämien die Bestimmung des AG weniger anfällig gegenüber mäßigen
Veränderungen des glykämischen Status [347].
5.2.8 Hypoglykämien im Straßenverkehr
Da vorwiegend Hypoglykämien, nicht aber Hyperglykämien akut Probleme im
Straßenverkehr hervorrufen können, wird der Nachweis einer Hypoglykämie hier
diskutiert. Eine beträchtliche Zahl von Unfällen wird durch eine Unterzuckerung am
Steuer hervorgerufen. In einem solchen Fall ist es vonnöten, die glykämische
Situation des Patienten sofort abzuklären. Gleichzeitig sollte zum schnellstmöglichen
135
5. Diskussion
Zeitpunkt ein Blutröhrchen gesammelt werden, das zur Verhinderung der Glykolyse
mit Natriumfluorid versetzt wird. Neben der schnellen Blutentnahme sollten während
der Anamnese und später im forensisch-toxikologischen Labor folgende Fragen
beantwortet werden.
1. Die Anamnese: Die Aufklärung eines hypoglykämischen Status im Lebenden
basiert zunächst auf dem Erkennen der bekannten Syptome (1.1.2.2). Weitere
Hinweise in einem Straßenverkehrsfall, die darauf hindeuten, dass die
Fahrunsicherheit eine Hypoglykämie zur Ursache hatte, sind:
- offensichtlich grundlos untypisches Verhalten;
- Umstände, die das Entstehen einer Hypoglykämie prädisponieren wie z.B. ein
ausgelassenes
Essen,
viel
Sport,
psychischer
Stress,
Sekundärleiden,
Schlaflosigkeit, Alkohol, Leberbeschwerden, Sucht oder häufige dokumentierte
hypoglykämische Episoden. Personen, die unter einem Insulinom leiden, weisen die
Symptome der Hypoglykämie häufiger postprandial (manchmal nur dann) auf [83],
während Personen mit einer Überdosis Insulin oder oralen Antidiabetika unabhängig
von der Nahrungsaufnahme unregelmäßig hypoglykämische Episoden durchlaufen.
- die Umkehr von den typischen hypoglykämischen Symptomen zur “Normalität”
sollte durch einen Arzt am Tatort dokumentiert werden. Die Syptome der
Hypoglykämie sind unspezifisch (I) und so ist es notwendig, die niedrige
Blutglucosekonzentration zur Zeit der Symptome nachzuweisen (II) und aufzuzeigen,
dass die Symptome und das unnatürliche Verhalten des Betroffenen durch
Glucosegabe nachlassen (III) (Whipple´s Triade). Die primäre Unterschied zwischen
Insulin-induzierter Hypoglykämie und anderen Ursachen besteht im signifikant
erhöhten Bedarf an Glucose. Daher sollte initial geringes Ansprechen auf eine
intravenöse oder orale Glucosegabe den Verdacht einer Überdosis mit Insulin oder
oralen Antidiabetika erregen [348].
- Patienten mit einer Hypoglykämie zeigen nach dem Abklingen der Symptome
häufig eine Amnesie der Ereignisse, die gerade passiert waren.
2. Wurde die Hypoglykämie durch Insulin oder orale Antidiabetika hervorgerufen
oder etwa durch eine Krankheit selbst (z.B. Diabetes, Insulinom)?
136
5. Diskussion
Der Nachweis von synthetischen Insulinen bzw. oralen Antidiabetika kann im Labor
durch die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden bewerkstelligt werden. Dazu
muss das Blutserum im Labor schnellstmöglich von den roten Blutkörperchen
getrennt werden, um eine Hämolyse und daraus resultierenden Kontakt des
Hämoglobin-Moleküls mit Insulin zu verhindern. Bis zur Analyse auf humanes oder
synthetische Insuline sollte das Gefäß bei -20 °C gelagert werden. Zum Nachweis
einer Injektion von humanem Insulin muss sich eine Analyse auf das C-Peptid
anschließen. Die Interpretation der Ergebnisse fällt dann allerdings schwer. Ein
alleiniger Nachweis eines synthetischen Insulins oder eines hohen I:C-Verhältnisses
ist nicht ausreichend. Die zur Tatzeit vorrherrschende Hypoglykämie als Folge dieser
Insulininjektion
muss
festgehalten
worden
sein,
um
die
Ursache
von
Fahrauffälligkeiten erklären zu können. Natürlich ist es wahrscheinlich, dass ein
gleichzeitiger
Nachweis
einer
Hypoglykämie
und
eines
Insulins
/
oralen
Antidiabetikums die Ursache der Hypoglykämie erklärt. Andererseits ist die
Entstehung
einer
Hypoglykämie
bei
Einnahme
von
oralen
Antidiabetika
konzentrationsunabhängig (siehe Kapitel 5.2.5). Normale Plasmakonzentrationen für
synthetische Insuline sind in Kapitel 4.2.4.3 aufgeführt.
3. Handelte der Beschuldigte sorglos, indem er zu viel Insulin spritzte oder zu
wenig aß?
Typ, Menge und Zeit der letzten Insulininjektion und der letzten Nahrungsaufnahme
sollten in einem Diabetestagebuch aufgezeichnet werden. Es wäre schwer, zu
argumentieren, wenn sich die Hypoglykämie eine Stunde nach einem Festessen
ereignete.
4. Handelte der Beschuldigte sorglos, indem er zusätzlich Alkohol oder Drogen
einnahm?
Wusste der Beschuldigte über die Effekte von Alkohol Bescheid, der schon in kleinen
Dosen Hypoglykämien hervorrufen kann [349]? An einen Ethanolnachweis im Blut
sollte bei Ausbleiben eines Nachweises von Insulin oder oralen Antidiabetika gedacht
werden.
5. Handelte der Beschuldigte anderweitig sorglos?
Sorglosigkeit im Falle eines Verkehrsunfalls kann nach § 21 FeV angenommen
werden, wenn Diabetiker nicht alles Notwendige tun, um sich und andere
Verkehrsteilnehmer nicht in Gefahr zu bringen. Dies impliziert, dass bevorstehende
137
5. Diskussion
Hypoglykämien erkannt und verlässlich behandelt werden: die Fahrer sollten immer
einen Vorrat an schnell resorbierbaren Kohlenhydraten in ihrem Fahrzeug mitführen.
Weiterhin sollten Autofahrer mit Diabetes nachweisen können, dass sie ihre
Blutglucosekonzentration vor dem Fahrtantritt (§2 StVZO - Pflicht zur Einschätzung
der eigenen Verkehrsfähigkeit vor Fahrtantritt) gemessen haben, alle 2 Stunden eine
Fahrtpause eingelegt haben, um erneut ihre Blutglucosekonzentration zu messen
und sich dementspechend Nahrung zuzuführen [350]. Im Falle erster Anzeichen
einer Hypoglykämie (siehe 1.1.2.2) muss die Fahrt sofort abgebrochen werden; die
Fahrt darf erst fortgesetzt werden, wenn nach der Einnahme von Kohlenhydraten die
hypoglykämischen Symptome abgeklungen sind. Das Wiedererlangen der normalen
kognitiven Fähigkeiten nach einer hypoglykämischen Attacke dauert normalerweise
40-90 min [351]. Weiterhin sollte die Blutzuckereinstellung alle 6 Wochen beim Arzt
überprüft werden.
6. War dem Beschuldigten überhaupt bewusst, dass Insulin möglicherweise
hypoglykämische Episoden bewirken könnte? Hatte die Person zuvor
hypoglykämische Attacken erlitten? Wann zuletzt? Zeigten sich ähnliche
Symptome während einer früheren Hypoglykämie beim Beschuldigten?
Im deutschen Strafrecht beschreiben §§20, 21 und 42b StGB, §3 JGG die
Zurechenbarkeit und die deutliche Abnahme der Fähigkeit, seinen eigenen Willen im
Falle einer Hypoglykämie auszuführen. Laut diesen Paragraphen kann ein
Freispruch nur erfolgen, wenn hypoglykämische Episoden vorher nicht auftraten.
7. Nahm der Beschuldigte die Symptome der Hypoglykämie überhaupt wahr?
Dies ist ein schwieriger Punkt, da Diabetiker die ersten Anzeichen einer
Hypoglykämie unterschiedlich wahrnehmen [349]. Das rechtzeitige Bemerken der
Unterzuckerung hängt von der Abnahmerate der Blutglucosekonzentration und vom
Ausmaß der Gegenregulation durch andere Hormone ab [349, 352]. Eine
sogenannte „hypoglycaemia unawareness” (HU) kann in 25% aller Typ 1-Diabetiker
beobachtet werden [353, 354]. Diese unterliegen einem höheren Risiko eine
Hypoglykämie zu erleiden. Die „hypoglycaemia unawareness” ist definiert als das
fehlende
Wahrnehmungsvermögen
für
vegetative
und
neuroglykopenische
Symptome und das Ausbleiben gegenregulierender Aktivität, hauptsächlich aufgrund
der unterdrückten Ausschüttung von Adrenalin [355]. Einige Patienten mit HU
bemerken
schließlich
die
Symptome,
aber
bei
viel
niedrigeren
138
5. Diskussion
Blutglucosekonzentrationen. Bei Patienten, deren Krankengeschichte chronische
oder periodische Hypoglykämien anzeigt, tritt HU häufiger auf, da die Gehirnfunktion
„geschützt“ ist und die kognitive Dysfunktion bei niedrigeren Glucosekonzentrationen
beginnt [356]. Falls Hypoglykämien häufiger auftreten, wird der Glucosetransport ins
Gehirn beschleunigt. Dies bewirkt die in diesen Fällen paradoxe Situation einer
niedrigen
Glucosekonzentration
Glucosekonzentrationen
im
im
Blut
(Hypoglykämie),
Gehirn
und
dadurch
das
aber
normalen
Ausbleiben
einer
Neuroglykopenie. Das erklärt das Fehlen von insbesondere vegetetativen Antworten
des Gehirns. Der Verlust des Bewusstseins kann hier sehr schnell vonstatten gehen.
Weitere Risikofaktoren für HU sind Alkoholeinnahme [349], höheres Alter,
Langzeitdiabetes, Neuropathie, normale HbA1c-Werte, der falsche Insulintyp oder zu
ambitionierte Therapieziele [357, 358]. Das Phänomen der HU in Verkehrsunfällen
wurde in der Literatur nicht häufig diskutiert, aber einige Arbeitsgruppen waren der
Meinung, dass eine HU eine absolute Kontraindikation für das Führen eines
Fahrzeugs im Straßenverkehr darstellen sollte [359].
Zur Schuldfähigkeit der Fahrer im Falle einer Hypoglykämie hat sich vor allem die
britische Rechtssprechung in einigen Fällen geäußert. Ein neu diagnostizierter
Diabetiker gab an, während der Fahrt hypoglykämisch gewesen zu sein und in der
Vergangenheit noch nie in einem solchen Zustand gewesen zu sein. Er wurde als
nicht schuldig befunden, da er nach Aussage des Richters theoretisch „das Fahrzeug
nicht selbst gefahren hat“ [360, 361]. Dieselben Umstände und dieselbe Verteidigung
wurden in zwei weiteren Fall vorgetragen [362]. Doch in diesen Fällen war der
Diabetes schon länger bekannt und den
Fahrern war aufgrund früherer
dokumentierter Hypoglykämien bewusst, dass sie während der Fahrt ohne
Vorwarnung fahrunfähig werden könnten. So hätten sie anhalten müssen und andere
nicht in Gefahr bringen dürfen. Da sie dies nicht gemacht hatten, hatten sie laut
Richter sorglos gehandelt und wurden dafür haftbar gemacht. Einen besonderen Fall
beschreibt Bovill 1973 [363]. Eine Anklage wegen fahrlässiger Tötung durch
Verkehrsunfall wurde aufgrund der Tatsache fallengelassen, dass der Fahrer vor
dem Vorfall eine spontane „reaktive Hypoglykämie nach der Einnahme von Zucker“
erlitten habe. Die Stoffwechselsituation wurde einige Zeit nach dem Vorfall mittels
zweier oraler Glucosetoleranztests nachempfunden. In einem weiteren Fall [364] hielt
das
Berufungsgericht
eine
Verurteilung
aufgrund
der
Verursachung
eines
Verkehrsunfalls aufrecht. Die Amtsrichter hatten einen Fahrer mit dem Hinweis
139
5. Diskussion
„Automatismus aufgrund einer Hypoglykämie“ freigesprochen. Beteiligt an diesem
Unfall war ein Diabetiker, der das Einsetzen einer Hypoglykämie nicht bemerkte.
Diese
wurde
auf
Hepatitiserkrankung
seine
und
die
erniedrigten
dadurch
Insulinbedürfnisse
erniedrigte
nach
Gegenregulation
einer
bei
Glucosestoffwechselentgleisungen zurückgeführt. Im Gegensatz zu diesem Fall hatte
die Verteidigung „Automatismus“ in einem britischen [365] und im folgenden
deutschen Fall aus dem Jahre 1957 [260] Erfolg: Ein 49-jähriger Gynäkologe wurde
aufgrund eines tödlichen Verkehrsunfalls angeklagt.
Er war seit 13 Jahren
Diabetiker. Der Verteidiger vertrat die Ansicht, dass der Angeklagte einen
schleichenden hypoglykämischen „Schock“ erlitten hätte. Der Angeklagte wäre 30
Jahre ohne einen Unfall Auto gefahren, daher könne ihm keine sorglose Teilnahme
am Straßenverkehr vorgeworfen werden. Dieser Schock wäre durch etwas
„Außergewöhnliches“ ausgelöst worden. Das Gericht folgte dieser Meinung und zog
nur den Führerschein des Mannes ein.
In der deutschen Rechtssprechung kann unabhängig von den strafrechtlichen Folgen
die zivilrechtliche Verantwortlichkeit evaluiert werden (§7 StVB, §823 und 829 BGB).
5.3
Forensische Proben
5.3.1 Glucose und Laktat
Laut der Hypothese nach Traub [167, 258] sind die addierten post mortem
Konzentrationen von Glucose und Laktat in der GKF oder in der CSF als erste
Indikatoren für ante mortem Glucosekonzentrationen anzusehen. Einige Autoren
[264] fragten sich jedoch angesichts der Tatsache, dass Laktatkonzentrationen nach
dem Tod in GKF und CSF ansteigen, ob die Summenformel nach Traub dann nicht
zu einer Überschätzung der Glucosestoffwechselentgleisungen mit tödlichem
Ausgang führen würde. Daher wurden die Summenformeln in der GKF und in der
CSF mit den Glucosekonzentrationen verglichen. Abbildung 42 illustriert die
Korrelation zwischen der Glucosekonzentration in der GKF und in der CSF
(R2 = 0,922). Das Miteinbeziehen der Laktatkonzentration erniedrigte die Korrelation
beider Matrices (R2 = 0,815), was zu der Annahme führt, dass die Glucose-, nicht
aber die Laktatkonzentration nahe dem Tod unterschiedlich beeinflusst wird. Auch
Palmiere et al. [264] zeigten dies an 470 post mortem Fällen. Fünf der 124 Fälle in
140
5. Diskussion
unserer Studie zeigen Glucosekonzentrationen post mortem in der GKF > 180 mg/dl.
Vier dieser Fälle zeigen auch eine Summenformel nach Traub in der GKF von > 450
mg/dl. Ein Fall wurde nur durch Betrachtung der Glucosekonzentration in der GKF
zusätzlich als diabetisches Koma erkannt. Dieser Fall zeigte auch in der CSF eine
Glucosekonzentration von 217 mg/dl, eine Summenformel in der CSF aber < 450
mg/dl. Aceton und β-Hydroxybutyrat dieses Falles wiesen allerdings auf eine
diabetische Ketoazidose hin, sodass die Glucosekonzentration > 180 mg/dl, nicht
aber die niedrige Summenformel der Todesursache entsprachen. Sieben von 76
Verstorbenen wiesen eine Glucosekonzentration > 144 mg/dl in der CSF auf. In
diesen 7 Fällen war auch die Summenformel nach Traub in der CSF > 450 mg/dl.
Entsprechend dieser Ergebnisse ergibt die Summenformel nach Traub keine
zusätzliche
Information
für
die
Abschätzung
der
ante
mortem
Blutglucosekonzentration. Ein Cut-Off für Glucose in der GKF von 180 mg/dl
erscheint verlässlich (Sensitivität 100 %, Spezifität 100 %). Palmiere et al. [271]
kamen zum selben Schluss, Karlovsek et al. [251, 259, 269, 270, 366] waren der
Meinung, dass Glucosekonzentrationen > 234 mg/dl für ein diabetisches Koma
sprächen. Glucosekonzentrationen von nicht- diabetischen Verstorbenen liegen bei
20 mg/dl [80], 30-80 mg/dl [70, 267], 4-60 mg/dl [167], 0-75 mg/dl [268] oder 0-108
mg/dl [258], sodass auch im Vergleich mit anderen Studien ein Cut-Off von 180
mg/dl Glucose eine gute Sensitivität verspricht. Zilg et al. [262] postulierten, dass
nach einem anfänglichen Abfall der GKF-Glucosekonzentration in der frühen
postmortalen Phase diese konstant bleiben, während Laktatkonzentrationen
anstiegen. Der Abfall liegt wahrscheinlich an der zurückgebliebenen metabolischen
Aktivität der überlebenden Hyalozyten und der inneren Retinazellen. Anschließend
bleiben die Glucosekonzentrationen konstant. Weiterhin kann das Ansteigen der
Laktatkonzentrationen auch auf andere Ursachen als den Glucosestoffwechsel
zurückzuführen sein. Auch bei unseren Fällen zeigt sich daher, dass die
Summenformel nach Traub sich bei ante mortem Hyperglykämien hauptsächlich aus
der Glucosekonzentration zusammensetzt. Bei anderen Todesursachen setzt sie
sich dann hauptsächlich aus der Laktatkonzentration zusammen, die mit dem
postmortem Intervall steigt. Tabelle 30 zeigt die Glucose-, Laktatkonzentration und
die Summenformel nach Traub in der GKF und der CSF für alle Fälle mit der
Todesursache diabetische Ketoazidose. In keinem der Kontrollfälle wurden hohe
Summenformeln nach Traub gefunden, die sich nur aus der Laktatkonzentration
141
5. Diskussion
zusammensetzten. Daher wird daraus geschlossen, dass die Summenformel aus
Glucose und Laktat in der GKF oder CSF keine zusätzliche Information liefert, wenn
auf die Glucosekonzentration vor dem Tod geschlossen werden soll. Die Benutzung
der Summenformel kann sogar zur Überschätzung der Fälle mit tödlichem
diabetischen Koma führen. Die Glucosekonzentration in der GKF und der CSF
erscheint als der verlässlichste Marker, um antemortem Blutglucosekonzentrationen
abzuschätzen. DeLetter et al. [72] hatten gezeigt, dass das PMI kaum Einfluss auf
die Summenformel in der GKF hat.
Beim Blick auf Tabelle 30 fällt auf, dass Glucosekonzentrationen im Urin wenig
Aussagekraft zum glykämischen Status eines Verstorbenen haben. Diese korrelieren
in diesen Fällen nicht mit den Glucosekonzentrationen in der GKF oder der CSF.
Eine hohe Urin-Glucosekonzentration wurde trotzdem nur in Fällen mit diabetischem
Koma beobachtet, sodass diese durchaus einen Hinweis auf diese Todesursache
geben kann. Umgekehrt ist eine niedrige Glucosekonzentration im Urin aber kein
Argument, um ein diabetisches Koma auszuschließen.
Glucose
[mg/dl]
Laktat Traub
[mg/dl] [mg/dl]
Glucose Laktat
[mg/dl]
[mg/dl]
Traub
[mg/dl]
OHGlucose HbA1c
Aceton
butyrat
[mg/dl]
[mmol/mol] [mg/l]
[µmol/l]
S309/11
GKF
1053
GKF
315
GKF
1210
CSF
501
CSF
293
CSF
648
Urin
4202
FVB
97,9
FVB
25709
FVB
41400
V0580/11
203
323
365
217
336
385
0
47
900
4590
S213/12
489
398
688
85,5
3280
24190
S212/12
817
582
1108
321
472
557
2559
87,1
855
6761
S77/12
860
291
1006
524
435
741
261
108,9
S143/10
524
465
757
88,6
5023
9896
S11/10
216
495
464
74
6132
18540
4930/12
676
249
801
47,8
53
300
Fall
28
Tabelle 30: Glucose-, Laktatkonzentration und die Summenformel nach Traub in der
GKF und der CSF, HbA1c und Ketonkörper für alle Fälle mit der Todesursache
diabetische Ketoazidose.
5.3.2 HbA1c
Die HbA1c-Konzentrationen von 115 Verstorbenen lagen im Mittel bei 49,8 mmol/mol
(6,71 %). Nicht-diabetische Verstorbene lagen im Mittel bei 47,8 mmol/mol (6,5 %)
und damit höher als der für lebende Nicht-Diabetiker angegebene Referenzbereich
(4,4-6,1 %). Diabetische Verstorbene hingegen lagen im Mittel bei 59,9 mmol/mol
(7,6 %) und damit niedriger als das Kollektiv der klinischen Diabetespatienten
(8,81 %). HbA1c-Konzentrationen bleiben demzufolge also nach dem Tode relativ
142
5. Diskussion
konstant. Auch Uemura [266] sah den HbA1c als einen der nützlichsten und
verlässlichsten Marker post mortem an, weil glykiertes Hämoglobin für mindestens
36 Stunden nach dem Tod stabil und von einer Hämolyse verschont bleibt [72, 176].
HbA1c zeigte wie auch in anderen Studien nur geringe Abweichungen von lebenden
Menschen [62]. Die HbA1c-Konzentration wird aber erst nach einer 12 Stunden
anhaltenden Hyperglykämie beeinflusst [274], kurze Hyperglykämien sind ohne
Auswirkung auf die HbA1c-Konzntration. So lässt der HbA1c zwar keine
Rückschlüsse auf die aktuelle Glucosekonzentration vor dem Tod zu, kann aber
grundsätzliche
Informationen
zum
glykämischen
Status
des
Diabetes
des
Verstorbenen in den Wochen vor dessen Tod geben. Bei 7 von 8 Verstorbenen, bei
denen die Todesursache „diabetisches Koma“ ermittelt wurde, zeigte sich ein HbA1c
im FVB weit über dem Referenzbereich (74-108,9 mmol/mol entspricht 8,9-12,1 %).
Nur in einem Fall wurde neben der erhöhten GK-Glucosekonzentration ein HbA1c im
nur leicht erhöhten Bereich gefunden (47,8 mmol/mol entspricht 6,5 %). Andere
Studien
hatten
HbA1c-Konzentrationen
nach
diabetischen
Komata
mit
> 109 mmol/mol (> 12,1 %) beschrieben. Erhöhte HbA1c-Konzentrationen
korrelierten bei Kernbach et al. mit der Summenformel nach Traub im Liquor
[276, 278]. Abbildung 43 zeigt die Korrelation der HbA1c-Konzentration post mortem
mit den Summenformeln in GKF und CSF. Die HbA1c-Konzentration korreliert
sowohl mit der Summenformel in der GKF (R2 = 0,499) als auch mit der in der CSF
(R2 = 0,419), höhere HbA1c-Konzentrationen korrelieren noch besser. Umgekehrt ist
das aber nicht der Fall. Das zeigt, dass derartige Fälle in der Regel nur bei
Diabetikern mit schlecht eingestelltem Diabetes auftreten. Es wäre schwer, für ein
hyperglykämisches Koma zu plädieren, wenn eine HbA1c-Konzentration im
Normalbereich oder gar darunter, wie sie bei periodisch auftretenden Hypoglykämien
vorkommen, gemessen werden würde. Weiterhin ist die Bestimmung des HbA1c
post mortem in Fällen nützlich, wenn die Todesursache ein nicht diagnostizierter
Diabetes mellitus war, um zwischen einem diabetischen und einem nichtdiabetischen Verstorbenen zu unterscheiden. So traten auch einige extrem hohe
HbA1c-Konzentrationen
bei
Verstorbenen
auf,
in
deren
Unterlagen
keine
Diabeteserkrankung festgehalten war. In diesen Fällen konnte dadurch ein
unbekannter oder nicht dokumentierter Diabetes mellitus erkannt werden. Falls die
Ketonkörper erhöht sind, kann ein erhöhter HbA1c helfen, zwischen einer
143
5. Diskussion
diabetischen Ketoazidose und anderen Ursachen (Verhungern, Alkohol) zu
unterscheiden.
5.3.3 Fructosamin
Ähnlich
wie
die
HbA1c-Konzentration
stellt
Fructosamin
ein
Langzeitglucosegedächtnis der letzten Wochen dar. Mit Fructosamin sind alle
glykierten Proteine gemeint, die einen Hinweis auf die Glucosekonzentrationen der
letzten
1-3
Wochen
geben
und
daher
direkt
mit
den
ante
mortem
Glucosekonzentrationen im Serum korrelieren [70, 72, 267, 268]. Dies zeigt sich
auch an unserem klinischen Kollektiv an einer nur schwachen Korrelation mit der
aktuellen Glucosekonzentration und einer starken signifikanten Korrelation mit
HbA1c. Im post mortem gefällten Blut zeigten sich durchaus Unterschiede zwischen
Diabetikern (MW 138 µmol/l; 12,3-513 µmol/l; n = 19) und Nicht-Diabetikern
(MW 78,4 µmol/l; 11,6-286 µmol/l; n = 81). Im Vergleich zu einer früheren Studie, in
denen Konzentrationen für Nicht-Diabetiker post mortem von 325,3±147,1 μmol/l
und für Diabetiker von 1500 µmol/l (MW) gemessen wurden [267], waren die
gemessenen Serumkonzentrationen aber erheblich niedriger. Damit zeigten
Diabetiker
auch
im
Vergleich
zum
klinischen
Kollektiv
stark
erniedrigte
Fructosaminkonzentrationen (klinisches diabetisches Kollektiv 181-696 µmol/l; MW
346 µmol/l). Auch die Nicht-Diabetiker zeigten deutlich erniedrigte FructosaminSerumkonzentrationen als die beschriebenen Referenzkonzentrationen (205-285
µmol/l). Somit lässt sich zwar bei hoher Fructosamin-Serumkonzentration post
mortem ein ante mortem undiagnostizierter Diabetes bestätigen, aber keine
Rückschlüsse auf die Glucosekonzentration vor dem Tod tätigen. FructosaminKonzentrationen von > 300 µmol/l im Serum, > 100 µmol/l in der GKF und > 150
µmol/l in der CSF wurden nur bei bekannten Diabetikern ermittelt (Abbildung 39) und
geben daher post mortem einen Hinweis auf einen nicht dokumentierten Diabetes.
Fructosamin-Serumkonzentrationen von 4 der 8 in Tabelle 30 dargestellten Fälle
eines Todes durch diabetisches Koma lagen bei 51 µmol/l, 110 µmol/l, 129 µmol/l
und 512 µmol/l und lassen daher alleine keine Aussage über den akuten
glykämischen Status vor dem Tod zu.
In der GKF und der CSF zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in den
Fructosamin-Konzentrationen zwischen Nicht-Diabetikern und Diabetikern. Werte
> 100 µmol/l in der GKF und > 150 µmol/l in der CSF wurden allerdings nur bei
144
5. Diskussion
bekannten Diabetikern ermittelt. Dies widerspricht einigen Studien, bei denen GKFFructosaminkonzentrationen im Mittel bei 500 µmol/l lagen. Osuna et al. [267]
beschrieben bei 92 Verstorbenen ebenfalls viel höhere Konzentrationen in der GKF
als in unserer Studie (MW 48,1 µmol/l; 0-448 µmol/l). Diabetiker (MW 1500 µmol/l;
0-5900 µmol/l; n = 49) zeigten bei Osuna et al. [367] signifikant (p < 0,0001) höhere
Konzentrationen als Nicht-Diabetiker (MW 500 µmol/l; 0 - 3500 µmol/l; n = 43). In
einer
weiteren
Studie
von
Osuna
et
al.
[367]
beschrieben
diese
dann
Konzentrationen von 880 µmol/l bei Diabetikern (n = 111) und 160 µmol/l (n = 342) in
der GKF post mortem. Das Verhältnis der Fructosamin-Konzentration in der GKF und
das Verhältnis der Mikroproteine war ebenfalls signifikant (p = 0,021) unterschiedlich
[367]. Die höchsten Konzentrationen wurden auch in unserer Studie in der GKF bei
bereits diagnostizierten Diabetikern ermittelt. Doch auch in der GKF lässt sich bei
hoher Fructosamin-Konzentration kein Rückschluss auf die Glucosekonzentration vor
dem Tod tätigen. Fructosamin-GKF-Konzentrationen von 4 der 8 in Tabelle 30
dargestellten Fälle eines Todes durch diabetisches Koma lagen bei 0 µmol/l,
77,2 µmol/l, 222 und 333 µmol/l. Das PMI hatte keinen Einfluss [368] auf die
Fructosaminkonzentrationen.
5.3.4 Der Nachweis von humanem und synthetischen Insulinen
Bei forensischen Fällen zeigte sich zunächst ein Matrixproblem. Weiterhin zeigt sich,
dass die Schwierigkeit der Insulinanalytik post mortem nicht nur in der Qualifizierung
und Quantifizierung selbst, sondern auch in der Interpretation der Analyseergebnisse
besteht. In der Literatur sind nur wenige Fälle beschrieben.
Postmortale Blutproben weisen meistens eine Hämolyse auf. Das zähe FVB lässt
sich zwar noch zentrifugieren, um Hämolysat zu entfernen. Durch Zentrifugation lässt
sich jedoch kein Serum post mortem gewinnen. Blut hat jedoch den Nachteil der
bekannten Instabilität von Insulin post mortem. Diese wurde in einer Doktorarbeit am
Institut für Rechtsmedizin in Frankfurt untersucht [368]. Es zeigte sich, dass bei einer
Inkubation von Insulin mit Serum oder mit intakten Blutzellen keine Abnahme der
Insulinkonzentration
eintritt.
Stabilitätsuntersuchungen
Daher
bestätigt,
für
kann,
die
wie
auch
bei
Insulinbestimmung
unseren
Serum
als
Untersuchungsmaterial empfohlen werden. Bei Inkubation des Insulins mit
hämolysiertem Blut zeigte sich dagegen, dass die Insulinkonzentration schon
145
5. Diskussion
innerhalb von 5 h bei 37°C signifikant auf 20% der Ausgangskonzentration sank. Ein
proteolytischer Insulinabbau konnte ausgeschlossen werden, da der Zusatz von
Enzyminhibitoren keine Hemmung des Insulinabbaus bewirkte. Nach weiteren
Versuchen wurde der Abbau des Insulins post mortem auf den Austritt von
Hämoglobin aus den Erythrozyten zurückgeführt. Dabei führte nur die Inkubation von
Insulin mit den isolierten Globinketten zu einem Insulinabbau. Von der Globinkette ist
mindestens eine Thiolgruppe der Hämoglobin-Betakette für den Abbau verantwortlich
[178, 368, 369]. Unsere Untersuchungen an post mortem Femoralvenen- und
Herzblut bestätigten diese Untersuchungen. In keinem Fall konnte humanes Insulin
in diesen Matrices nachgewiesen werden. Leider lässt sich auch über die Stabilität
von synthetischen Insulinen post mortem keine Aussage treffen, da für diese
Aussagen Realfälle vorliegen müssen.
Die Überlebenszeit nach einer Insulininjektion hängt von vielen Faktoren ab:
Insulintyp
(und
dadurch
Wirkbeginn
und
Halbwertszeit), Administrationsweg
(Injektion, Infusionspumpe) oder Ort der Injektion. Die Überlebenszeit und das post
mortem Intervall beeinflussen sicherlich die gemessene Insulinkonzentration, da
Insulin im Blut bei Kontakt mit Hämoglobin und bei Körpertemperatur enorm schnell
abgebaut wird [368]. Leider ist in der forensischen Praxis diese Zeit meist unbekannt,
da Leichen erst eine längere Zeit nach dem Todseintritt gefunden werden. Die
Abläufe des Insulinabbaus ante- und post mortem, der Verteilung und des
Insulintransports über die Blut-Glaskörperbarriere oder in andere Organe sollte
Anlass weiterer Forschung sein. Die Insulinbestimmung in post mortem Blut hat
aufgrund der ablaufenden thanatochemischen Prozesse, vorwiegend Hämolyse,
wenig diagnostischen Wert.
Daher muss auf andere post mortem Matrices ausgewichen werden. Wie unser
Fallbeispiel belegt, ist es durchaus möglich, eine Insulinzufuhr in post mortem
Matrices nachzuweisen. Die beste Möglichkeit bei Verdacht auf eine Insulinzufuhr
liefert dabei die Injektionsstelle. Diese muss bei einer Obduktion vorsichtig und
großflächig ausgeschnitten werden und kann anschließend nach Extraktion mit
Methanol oder einer wässrigen Natriumchlorid-Lösung (7 %) mit der beschriebenen
Immunoaffinitätsaufreinigung mittels magnetischer beads für die LC-MS-Analyse
vorbereitet werden. Ähnlich ist es mit dem umgebenden Muskelgewebe. Auch in
146
5. Diskussion
Nierengewebe konnte Humalog nachgewiesen werden. Wunder et al. [370] hatten
allerdings postuliert, dass Leber- und Nierengewebe nicht geeignet erscheinen, da
bei Inkubationen eine erhebliche Insulinabnahme festgestellt werden konnte. Die
Extraktion verlief mit Methanol (808 µU/g in der Injektionsstelle) mit einer höheren
Extraktionsausbeute als mit Natriumchlorid-Lösung (581 µU/g in der Injektionsstelle),
daher kann die (Prä)Extraktion mit Methanol empfohlen werden.
Eine weitere wichtige post mortem Matrix ist die GKF. Die GKF ist ein wertvolles
Material für chemisch-toxikologische Analysen und während der Obduktion leicht zu
gewinnen. Der Vorteil dieser Matrix liegt in seiner anatomischen Isolation, so ist sie
besonders nützlich in Fällen von fortgeschrittener Autolyse und Fäulnis. Für GKF
zeigten Coe et al., dass humanes Insulin kaum die Blut-GKF-Barriere durchdringt.
Ein in der Literatur beschriebener Fall [371] ist insofern interessant, da in diesem Fall
ante mortem Blutproben vorliegen. Eine solche Situation ist in forensischen
Routinefällen nicht üblich. Der Fall beschreibt die Analyse von Glaskörpermaterial im
Falle einer Insulinüberdosis, die in ante mortem Blutproben (humanes Insulin
> 5000 µU/ml) bestätigt werden konnte. In diesem Fall lieferte post mortem Blut kein
Ergebnis, sodass auf den Glaskörper ausgewichen wurde, in dem humanes Insulin in
einer Konzentration von 28,8 µU/ml aufgefunden wurde. Laut Literatur [372] wird
immunoreaktives Insulin in der GKF von nicht-diabetischen Ratten im Mittel in
Konzentrationen von 0,15 µU/ml aufgefunden, in etwa 100fach geringer als in den
entsprechenden Serumkonzentrationen. Angesichts der Beobachtung, dass die
Diffusion von Analyten zwischen der Blut-Okular-Barriere konzentrationsabhängig ist
und die Blutkonzentrationen bei Nicht-Diabetikern zwischen 5 und 30 µU/ml
schwankt, wurden noch viel geringere Konzentrationen in der GKF erwartet.
In 10 nicht-diabetischen Kontroll-GKF fand sich daher bei Thevis et al. [373] kein
humanes Insulin. Auch bei unseren 46 Kontrollfällen post mortem fand sich im
Glaskörper
kein
humanes
Insulin.
Nowicka
et
al.
[372]
analysierten
93
Glaskörperflüssigkeiten mittels Radioimmunoassay, wovon in 86 Fällen kein Insulin
nachweisbar war. Nur in 7 Fällen konnte Insulin bestimmt werden (1,42-24,4 µU/ml).
Besonders im Falle der höchsten Insulinkonzentration (24,4 µU/ml) konnte die
Insulinkonzentration und die Anwesenheit einer Insulinspritze neben dem Leichnam
auf eine Insulinintoxikation hinweisen.
147
5. Diskussion
Daher ist die Entnahme der Glaskörperflüssigkeit bei einer Obduktion unablässlich,
wenn Verdacht auf eine Insulinintoxikation besteht. Das synthetische Insulinanalogon
Humalog konnte auch von uns in einem authentischen Fall in dieser Matrix in relativ
hoher Konzentration (103 µU/ml) nachgewiesen werden. In einem weiteren Fall
wurde eine Insulinintoxikation durch die Messung in der GKF mittels Immunoassay
nachgewiesen, in dem eine Humaninsulinkonzentration von 31μU/ml gemessen
wurde. Insulin im Blut war auch hier nicht detektierbar. Dies lässt darauf schließen,
dass humanes Insulin nur bei exogener Gabe im Glaskörper nachzuweisen ist [374].
In einem weiteren in der Literatur beschriebenen Fall konnte auch in Galle eine
Insulinintoxikation bestätigt werden [375]. Für die Praxis wird, wenn möglich, eine
Insulinbestimmung aus Serum empfohlen, am besten in ante mortem Material von
Verstorbenen. Weiterhin können die Injektionsstelle und weitere Organe und die GKF
extrahiert werden. Weiterer Forschungsbedarf besteht für die Untersuchung der
Insulinstabilität in realen postmortalen Blutproben.
Auch der qualitative Nachweis von humanem oder synthetischen Insulinen im Urin ist
möglich. Insulin wird ganz normal im Glomerulus der Niere filtriert, wird aber nahezu
komplett rückresorbiert [376]. Daher kommt nur eine geringe und sehr variable
Fraktion des Insulins im Blutstrom in den Urin. Schon geringe Nierenfehlfunktion
kann die Reabsorption beeinträchtigen und eine größere Fraktion des Insulins
erreicht den Urin. Die Niere ist das Organ, in dem Insulin am meisten
verstoffwechselt wird, daher erreicht nur weniger als 1 % des Insulins den Urin intakt.
Humaninsulin wird [377] – wie auch die synthetischen Insulinanaloga Lantus® und
Levemir®, die ebenfalls nicht intakt in Urinproben aufgefunden werden können [378]
– erheblich metabolisiert. Die Enzyme “insulin-degrading enzyme” (IDE) und
“endosomal-acidic insulinase” (EAI) wurden als die Hauptenzyme identifiziert [378].
Einige Stellen des Moleküls in unterschiedlichen A- und B-Kettenpositionen, an
denen Teilungen mittels IDE vonstatten gehen, wurden beschrieben: A13/14,
A14/15, B9/10, B10/11, B13/14, B16/17, B24/25, B25/26 [194]. Thomas et al. [194]
entdeckten nur einen dieser Metabolite in humanem Urin (desB25-30), fügten
allerdings neue Metaboliten hinzu (DesB24-30, DesB25-30, DesB32-30, DesB30).
Für Lantus® wurden desB30-32, desB31-32 und desB24-32 als Metaboliten
identifiziert. Der Hauptmetabolismus von Levemir® beinhaltet eine Deacylierung des
Myristinsäurerests, was zu dem Metaboliten desB30 Humaninsulin führt [48]. Nur in
148
5. Diskussion
einem
Insulin-Mordfall
wurde
das
Urteil
durch
die
Messung
der
Humaninsulinkonzentration im Urin gestützt [48]. Ansonsten ist aber eine quantitative
quantitative Aussage in Urin nicht aussagekräftig genug.
5.3.5 Methylglyoxal
Die steigenden MG Konzentrationen nach dem Tod (von Konzentrationen wie im
Lebenden bis zu 1300 ng/ml 8 Tage nach der Obduktion) sind nicht auf den
Glucosemetabolismus zurückzuführen, sondern entstehen wahrscheinlich aus
anderen Stoffwechselwegen und mikrobieller Aktivität. Besonders könnte der
Aminosäuremetabolismus mit der Zwischenstufe MG eine Rolle spielen. Weiterhin
besteht die Möglichkeit, dass MG in vitro aus seiner irreversiblen proteingebundenen
Form in die reversible oder freie Form freigesetzt wird, was zur hohen Gesamt-MGKonzentration beitragen könnte. Aufgrund der Tatsache, dass sich die MGKonzentrationen nach dem Tod in einer unvorhersehbaren Weise verändern und
dass keine Korrelation zur Summenformel nach Traub besteht, lässt sich sagen,
dass MG kein nützlicher glykämischer Marker post mortem darstellt.
5.3.6 Anhydroglucitol
AG besitzt auch post mortem den großen Vorteil der metabolischen Stabilität. Nach
dem Tod kann es in etwa denselben Konzentrationen wie im Lebenden detektiert
werden. Die AG-Konzentrationen waren jedoch niedriger als vor dem Tod. Die
mittleren AG Konzentrationen bei lebenden Nicht-Diabetikern lagen bei 23,3 µg/ml,
bei verstorbenen Nicht-Diabetikern bei 15,5 µg/ml (p < 0,0001). Die mittleren AGKonzentrationen bei lebenden Diabetikern lagen bei 5,74 µg/ml, bei verstorbenen
Diabetikern bei 4,74 µg/ml (p < 0,0001). Der Grund für diese Beobachtung liegt auch
in der unterschiedlichen gemessenen Probenmatrix: in postmortem Fällen wurde
Vollblut verwendet, in ante mortem Fällen Serum. Das Vollblut/Serum-Verhältnis
wurde in unserer Studie mit 0,8 gemessen, das bedeutet, dass die Konzentrationen
im Serum grundsätzlich höher sind als im Vollblut.
In Toten waren die mittleren AG Konzentrationen im FVB bei Nicht-Diabetikern
ebenfalls signifikant höher als bei Diabetikern. Somit ist zumindest eine Aussage
über die Diabeteserkrankung möglich. Ein Cut-Off von > 10 µg/ml für einen gut
eingestellten Glucosehaushalt, wie er im Lebenden vorgeschlagen wurde, kann auch
post mortem gelten. Nur 14 der 71 Diabetiker wiesen post mortem eine
Konzentration > 10 µg/ml auf, im Gegensatz dazu zeigten 24 von 88 Nicht149
5. Diskussion
Diabetikern Konzentrationen < 10 µg/ml. Die Konzentrationen überlappen sich also
zwischen Diabetikern und Nicht-Diabetikern. Nur im Falle einer sehr niedrigen AG
Konzentration kann ein Diabetes, der vor dem Tod nicht bekannt war, aufgrund der AGAnalytik aufgedeckt werden. Ein Diabetes kann aber aufgrund eines AG-Konzentration
> 10 µg/ml nicht ausgeschlossen werden.
Bei 5 Fällen mit Todesursache „diabetisches Koma“ waren die AG-Konzentrationen
immer < 10 µg/ml und extrem niedrig. Die Konzentrationen unterscheiden sich zwar
nicht signifikant von diabetischen Verstorbenen mit einer Summenformel im
Normbereich, eine deutliche Korrelation zwischen der AG-Konzentration und der
Summenformel nach Traub war nicht gegeben, die maximale Konzentration der
Verstorbenen mit diabetischem Koma lag aber bei 3,15 µg/ml. AG kann als Alternative
zur Messung des HbA1c oder Fructosamin angesehen werden, um abzusichern, ob der
Verstorbene Diabetiker war und der Diabetes schlecht kontrolliert war. Im Falle eines
diabetischen Komas werden sehr niedrige AG-Konzentrationen beobachtet.
5.3.7 Hypogklykämien post mortem
Der Nachweis einer todesursächlichen Hypoglykämie fällt sehr schwer. Erste
Hinweise für eine Überdosis mit Insulin oder oralen Antidiabetika kann aus der
Beziehung der toten Person / des Täters zu bestimmten Berufsgruppen, z.B. Ärzten,
Apothekern, Krankenschwestern etc. geschlossen werden, da diese Gruppen häufig
in Zusammenhang mit Insulinmorden standen. Insulinvials, Spritzen, Nadeln oder
Arzneimittelblister in der Nähe der aufgefundenen Person können weitere Hinweise
geben [54, 379]. Während der Obduktion gibt es kaum pathomorphologische
Befunde, die direkt auf eine Überdosis mit Insulin oder oralen Antidiabetika hindeuten
können. Weniger bekannte Nebenwirkungen einer zu hohen Dosis Insulin sollten in
Erwägung gezogen werden: Hypokalämie, Hypophosphatämie, Hypomagnesiämie
[55], akute Fettleber [56] oder Lungenödem [271].
Zunächst gestaltet sich der Nachweis der Hypoglykämie selbst über die
Summenformel nach Traub als schwierig. Es wurden Grenzwerte von < 160 mg/dl
[256] bzw. < 100 mg/dl [262] in der Literatur beschrieben. Bei Anlegung dieser
Cut-Offs würden aber auch 14 der hier beschriebenen Kontrollfälle post mortem
unter Hypoglykämien gelitten haben. De Letter et al. [105] beschrieben den Cut-Off
für die Summenformel nach Traub für den Nachweis einer Hypoglykämie mit 25
150
5. Diskussion
mg/dl. Ein extrem geringer HbA1c bei behandelten Diabetikern spricht weiterhin für
periodisch aufgetrende hypoglykämische Episoden.
Neben dem Nachweis einer Hypoglykämie sollte auch die Ursache dieser gelingen.
Intrinsische Ursachen einer Hypoglykämie, insbesondere ein Insulinom, sollten
während der Obduktion ausgeschlossen werden. Bei der Obduktion sollten neben
den gängigen Materialien FVB und Urin auch die GKF entnommen werden. Für die
Praxis wird, wenn möglich, eine Insulinbestimmung aus Serum empfohlen, am
besten in ante mortem Material von Verstorbenen. Weiterhin können die
Injektionsstelle und weitere Organe extrahiert werden. Weiterer Forschungsbedarf
besteht für die Untersuchung der Insulinstabilität in realen postmortalen Blutproben.
Weiterhin sollte chromatographisch die Einnahme von oralen Antidiabetika
ausgeschlossen
werden.
Die
Detektion
der
Injektion
von
synthetischen
Insulinanaloga stellt mit der beschriebenen Methodik zumindest im Serum kein
Problem dar. Im Falle des Verdachts auf eine Injektion mit humanem Insulin muss
auch die Analytik auf das C-Peptid erfolgen. Nüchtern-Insulinkonzentrationen
> 500 pmol/l sollten den Verdacht auf eine Insulininjektion lenken, die zusätzliche
C-Peptid-Analytik ist aber unerlässlich. Wurde kein humanes Insulin injiziert, treten
bei hypoglykämischen Patienten in unserem Patientenkollektiv extrem niedrige
Insulinkonzentrationen auf, < 29,8 pmol/l (< 4,14 µU/ml) [106] bzw. < 35,8 pmol/l
(< 4,97 µU/ml) [45] bzw. < LoQ. Eine niedrige C-Peptid-Konzentration alleine ist dann
zwar ein Hinweis auf eine exogene Gabe von Insulin, besitzt aber nur in Relation zur
Insulinkonzentration Aussagkraft und darf nie alleiniges Kriterium sein. Ein Verhältnis
Insulin zu C-Peptid > 0,22 im nüchternen Zustand in den der Injektion folgenden
180 min spricht sehr für die Injektion von Insulin. I:C kann aber nur richtig interpretiert
werden, wenn sowohl die Blutglucosekonzentration als auch die absoluten
Konzentrationen der beiden Peptide mit zu Rate gezogen werden.
Die Pharmakokinetik in Situationen einer Insulinüberdosierung ist von Bedeutung.
Die Kinetik von exogenem Insulin wird durch eine große intra- und interindividuelle
Variabilität charakterisiert [44]. Es gibt folgenden Unterschied zwischen endogenem
und exogenem Insulin: Das endogene Hormon kommt zunächst über den
Leberpfortaderkreislauf in die Leber, welche einen überproportionalen Anteil der
Insulinfraktion im Vergleich zu anderen Geweben aufnimmt. Nach parenteraler
Aufnahme von Insulin erhält die Leber nur eine kleine Fraktion. Die Resorptionsrate
151
5. Diskussion
von Insulin hängt von mehreren Faktoren ab: der Injektionsort spielt eine Rolle, die
Resorptionsrate steigt in der Reihenfolge Bein, Gesäß, Arm, Bauch. Von Mach et al.
[80] zeigten, dass in der Mehrzahl der Überdosen das Insulin subkutan injiziert
wurde. Injektionstechnik, Insulinkonzentration und -typ, die Konzentration an Glucose
und gegenregulierenden Hormonen, nüchtern- oder postprandialer Status des
Patienten
haben
ebenfalls
einen
enormen
Einfluss
[25].
Während
einer
Insulinüberdosis verläuft die Kinetik des exogenen Insulins nach erster Ordnung und
tritt als lineare Abnahme in einer halblogarithmischen Skala auf [380]. In einem
Nichtkompartimentenmodell zeigten Shibutani und Ogawa [381] bei einem Typ 1Diabetiker eine Eliminationshalbwertszeit von 6,2 h. Bei einem weiteren Typ 1Diabetiker, der mit Insulin vergiftet wurde, zeigte Fasching [2, 3] einen zweiphasigen
langsamen Abfall mit Halbwertszeiten von 4 h und 10 h für die aufeinanderfolgenden
Schritte.
5.3.8 Hyperglykämien post mortem
Diabetes wird gleichermaßen selten in Todesscheinen [50] als Krankheit (es kann mit
weiteren 8% Menschen mit unentdecktem Diabetes mellitus gerechnet werden) und
Todesursache festgehalten. Daher stehen in dieser Diskussion zwei mögliche
Fragestellungen im Vordergrund: 1. Litt der Verstorbene unter einem nicht bekannten
Diabetes mellitus? und 2. War dieser im Sinne eines diabetischen Komas
todesursächlich?
Die Frage nach einem Diabetes kann zunächst durch eine gezielte Anamnese der
Patientenunterlagen geklärt werden. Ist ein Diabetes nicht bekannt, kann die
Obduktion Hinweise geben. Diese zeigt bei diabetischen Verstorbenen häufig fettige
Veränderungen der Niere mit gelb-roter Eintrübung des Nierenparenchyms, eine
diabetische Glomerulosklerose Kimmelstiel-Wilson (Abbildung 46) oder eine
Leberverfettung [53]. Ein gelbfarbenes Cranium gibt einen Hinweis auf einen
Diabetes. Weiterhin können biochemische Messungen Hinweise geben: ein HbA1c >
6,5 %, Fructosamin im Serum > 300 µmol/l im Serum, > 100 µmol/l in der GKF und >
150 µmol/l in der CSF, AG < 10 µg/ml im FVB geben klare Hinweise auf eine
anhaltende Hyperglykämie in den Wochen vor dem Tod. Umgekehrt schließen aber
andere Ergebnisse bzgl. dieser Parameter einen Diabetes nicht aus.
Auch bei der Frage nach einem diabetischen Koma kann zunächst eine gezielte
Anamnese helfen, wenn die Situation vor dem Tode vom Arzt oder Beteiligten
152
5. Diskussion
beschrieben werden kann. Vor dem Tod sind bei Patienten mit anschließendem
hyperglykämischem Koma meist Symptome wie Polyurie, Polydipsie, Polyphagie,
Erbrechen, Bauchschmerzen, Schwächegefühl und Benommenheit zu beobachten.
Vor allem die Kussmaul-Atmung (schnelles und tiefes Ausatmen mit Aceton-Geruch)
ist leicht zu erkennen und gibt später einen Hinweis auf die Todesursache. Eine
histologische Untersuchung sollte unbedingt angeschlossen werden, eine GlykogenNephrose mit sogenannten Armanni-Ebstein Zellen in der Niere ist sehr spezifisch für
eine langanhaltende Hyperglykämie > 500 mg/dl [262]. Abbildung 46 zeigt
allgemeine histologische Befunde der in Kapitel 6.3.9 beschriebenen Fälle,bei denen
als Todesursache eine hyperglykämische Stoffwechselentgleisung ermittelt wurde.
Abbildung 46: Typische pathomorphologiche Auffälligkeiten post mortem bei den
aufgeführten Fällen mit diabetischem Koma: links oben eine geschrumpfte Niere
eines Diabetikers; rechts oben Armanni-Ebstein-Zellen in der Niere (x 400); links
unten diabetische Glomerulosklerose Kimmelstiel-Wilson (x 100); rechts unten
Glykogenablagerung in einer diabetischen Leber
Zur chemisch-toxikologischen Untersuchung müssen auf jeden Fall bei der
Obduktion GKF, CSF, FVB und bedarfsweise auch Urin entnommen werden. Eine
153
5. Diskussion
Glucosekonzentration in der GKF > 180 mg/dl ist der verlässlichste Hinweis auf eine
diabetische Stoffwechselentgleisung. Zusätzlich kann die Messung von Laktat in der
GKF und der CSF und damit die Summenformel > 450 mg/dl in diesen Matrizes
ergänzend auf ein diabetisches Koma hindeuten. Es muss allerdings auch auf die
Geschichte des Falles geachtet warden, denn Fälle mit intensiver Reanimation vor
dem Tod oder längerem Todeskampf wiesen ebenfalls Summenformeln in der GKF
> 430 mg/dl auf [382].
Eine hohe Urin-Glucosekonzentration wird nur in Fällen mit diabetischem Koma
beobachtet, sodass diese durchaus einen Hinweis auf diese Todesursache geben
kann. Umgekehrt ist eine niedrige Glucosekonzentration im Urin aber kein Argument,
um ein diabetisches Koma auszuschließen. Erhöhte HbA1c-Konzentrationen
korrelieren mit der Summenformel nach Traub. In der Regel stirbt ein Diabetiker bei
schlecht eingestelltem Diabetes daran. Es wäre schwer für ein hyperglykämisches
Koma zu plädieren, wenn eine HbA1c-Konzentration im Normalbereich oder gar
darunter, wie sie bei periodisch auftretenden Hypoglykämien vorkommen, gemessen
werden würde. Falls die Ketonkörper erhöht sind, kann ein erhöhter HbA1c zwischen
einer diabetischen Ketoazidose und anderen Ursachen (Verhungern, Alkohol)
unterscheiden. Stark erniedrigte (< 5 µg/ml) AG-Konzentrationen weisen ebenfalls
auf hyperglykämische Episoden in den Tagen vor dem Tod hin.
Neben den in dieser Arbeit vorgestellten Parametern ist die Messung von
Ketonkörpern
bei
Verdacht
auf
eine
diabetische
Stoffwechselentgleisung
unumgänglich. Die in dieser Arbeit beschriebenen Fälle lagen zwischen 53 und
25709 mg/l. Acetoacetat-Konzentrationen bei diabetischer Ketoazidose lagen bei
1500-5400
µmol/l
[383],
in
unseren
Fällen
bei
215-18780
µmol/l.
Eine
β-Hydroxybutyrat-Konzentration > 3800 µmol/l spricht für eine Ketoazidose [80], in
diesen Fällen wurden β-Hydroxybutyrat-Konzentrationen im FVB von > 600 µmol/l
[168], 5600-11300 µmol/l [384-387] oder 4000-12000 µmol/l [168] beschrieben. Bei
den hier beschriebenen Fällen lagen die Werte bei 300- 41400 µmol/l. Auch während
Hypoglykämien wurden β-Hydroxybutyrat- Konzentrationen von > 600 µmol/l
beobachtet [388]. Bei tödlichen alkoholischen Ketoazidosen wurden ebenfalls
Konzentrationen zwischen 3000 und 47000 µmol/l beschrieben.
154
5. Diskussion
5.3.9 Anwendungsbeispiele Hyperglykämie
5.3.9.1 S 309/11
Vorgeschichte: Am 01.11.2011 gegen 2 Uhr nachts sei der Verstorbene Herr S.
(66 Jahre) durch einen Nachbarn auf der Straße gesehen worden. Herr S. sei nur mit
einem Hemd und Unterhose bekleidet gewesen. Gegen 2:30 Uhr habe die Ehefrau
Herrn S. wieder in die eigene Wohnung gelassen, in der Zwischenzeit habe er ein
Glas Cola getrunken. Am Morgen nach diesem Vorfall habe Frau S. die Küche gegen
8 Uhr betreten, ihr Mann habe auf einem Stuhl gesessen und etwas
Unverständliches gemurmelt. Die Wohnungstür habe offen gestanden, er sei
weiterhin nur mit einem Hemd und einer Unterhose bekleidet gewesen. Herr S. habe
aufstehen wollen, sei aber zu Boden gefallen. Auf dem Boden liegend sei Herr S.
nicht mehr ansprechbar gewesen und habe schwer geatmet. Die Ehefrau habe den
Rettungsdienst nicht gerufen. Erst als der Sohn angerufen wurde und die Stiefmutter
ihm vom Zustand des Vaters berichtete, habe der Sohn den Rettungsdienst
verständigt. Die Ehefrau des Verstorbenen habe bei Eintreffen der Polizei einen
alkoholisierten, wirren Eindruck gemacht. Sie habe keinen schlüssigen Grund für das
Nicht-Informieren des Rettungsdienstes gegeben. Laut Ehefrau habe Herr S. unter
schweren Lungenbeschwerden und Diabetes gelitten, die Medikamente habe er nur
unregelmäßig genommen, teils verweigert. In den 7 Tagen vor dem Tod habe er
Essen und Medikamente verweigert. Der Sohn habe in seiner Vernehmung die
Vermutung geäußert, dass die Stiefmutter den Vater vergiftet habe, belegen konnte
er dies aber nicht.
Obduktion: Obduktionsdatum war der 03.11.2011, das post mortem Intervall betrug 2
Tage. Folgende Obduktionsbefunde wurden festgehalten: blasse Schleimhäute und
Organe; teils trockenes Gewebe; gelbes Schädeldach; mäßige und nicht
stenosierende
Koronarsklerose;
konzentrische
Zunahme
der
Herzkammerwandstärke links und rechts; chronische Lungenüberblähung bei
chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) mit Zwerchfellschnürfurchen;
ausgeprägte Aorten- und Arteriosklerose; Hirnödem und Frontalhirnatrophie.
Toxikologische und biochemische Befunde:
-
Blut:
Carbamazepin
10,11-Carbamazepin-epoxid
309
52
ng/ml
ng/ml
und
dessen
(therapeutische
Metabolit
Konzentration
von Carbamazepin: 2 - 8 µg/ml)
155
5. Diskussion
-
Glucose im FVB: 926 mg/dl
-
Glucose in der GKF: 1052,6 mg/dl, Laktat in der GKF: 314,8 mg/dl,
Summenformel nach Traub in der GKF: 1210 mg/dl
-
Glucose in der CSF: 501,2 mg/dl,
Laktat
in
der
GKF:
293
mg/dl,
18980
µmol/l,
Summenformel nach Traub in der CSF: 647,7 mg/dl
-
Glucose im Urin: 4202 mg/dl
-
HbA1c im FVB: 97,9 mmol/mol
-
Fructosamin im FVB: 512,7 µmol/l
-
Anhydroglucitol im FVB: 1,02 µg/ml
-
Aceton
im
FVB
25709
mg/l,
Acetoacetat
im
FVB
β-Hydroxybutyrat im FVB 41400 µmol/l
5.3.9.2 S 77/12
Vorgeschichte: Herr A. (41 Jahre) sei am 08.03.2012 leblos auf der Beifahrerseite im
Führerhaus des Lkw einer Speditionsfirma auf einem Parkplatz an einer
Bundesstraße, den Kopf an die Beifahrertür angelehnt aufgefunden worden. Er sei
Typ 1- Diabetiker gewesen und habe unregelmäßig Insulin gespritzt. Die Jeanshose
sei bis auf die Oberschenkel herabgelassen gewesen.
Obduktion: Obduktionsdatum war der 12.03.2012, das PMI betrug 4 Tage. Folgende
Obduktionsbefunde wurden festgehalten: Teerstuhl im Dünndarm; längs gestellte
Schleimhautrisse des Ösophagus am Mageneingang bei venöser Gefäßzeichnung
des Ösophagus; kaffeesatzartiger Inhalt im Magen; Aspiration von Magensaft bis in
die mittleren Bronchien mit akuter Überblähung der Lungen; Blutfülle der inneren
Organe; blasse Nieren; mäßiges Lungenödem, deutliches Hirnödem; beginnende
Verfettung der Leber; reduzierte Pankreas; beginnende Balkenblase.
Biochemische Befunde:
-
Glucose im FVB: 95,4 mg/dl
-
Glucose in der GKF: 860,4 mg/dl, Laktat in der GKF: 290,6 mg/dl,
Summenformel nach Traub in der GKF: 1005,7 mg/dl
-
Glucose in der CSF: 524
mg/dl,
Laktat
in
der
GKF:
434,6
mg/dl,
Summenformel nach Traub in der CSF: 741,3 mg/dl
-
Glucose im Urin: 261 mg/dl
-
HbA1c im FVB: 108,9 mmol/mol
156
5. Diskussion
-
Fructosamin in der GKF: 0 µmol/l, Fructosamin in der CSF: 383,4 µmol/l,
Fructosamin im FVB: 115,8 µmol/l
-
Anhydroglucitol im FVB: 0,5 µg/ml
5.3.9.3 S 212/12
Vorgeschichte: Herr J. (73 Jahre) habe mit seiner Frau zusammengelebt, diese sei
allerdings für einige Zeit zu Verwandten verreist. Der Sohn habe am Mittag des
03.07.2012 versucht, ihn telefonisch zu erreichen. Dies sei nicht gelungen. Gegen
17 Uhr sei er an der Wohnung vorbeigefahren, die Situation sei ihm komisch
vorgekommen, da das Schlafzimmerfenster offen gestanden habe. Er habe Herrn J.
leblos neben dem Bett auf dem Boden vor dem offenen Fenster liegend
aufgefunden. Der Notarzt habe den Tod festgestellt. Herr J. sei übergewichtig
gewesen und habe Bluthochdruck gehabt, zudem habe er unter Luftnot gelitten und
sei Träger eines Herzschrittmachers gewesen. Vor der Wohnungstür seien
Zeitungen aufgefunden worden, die älteste mit Datum 30.06./01.07.2012.
Obduktion: Obduktionsdatum war der 06.07.2012, das post mortem Intervall betrug 3
Tage.
Folgende
Obduktionsbefunde
wurden
festgehalten:
muskulöse
Herzvergrößerung (700 g); mäßige Koronarsklerose; kleinfleckige weiße Narben in
der Herzhinterwand; erhebliche muskuläre Wandverdickung der Speiseröhre in den
unteren 2/3 bis auf 1 cm Dicke; flüssiger Mageninhalt mit feinsten schwärzlichen
Flocken; wenig Teerstuhl in Anfangsabschnitten des Dünndarms; einzelne
Schleimhauterosionen im Magen; minimal umbluteter Abbruch des rechten
Kehlkopfoberhorns. a.e. hypostatisch bedingte EInblutungen in die Halsmuskulatur
rechtsseitig; Hirnödem und Lungenödem; Zeichen der COPD: hart schneidbarer weit
aufschneidbarer Bronchialbaum, Knistern des Lungengewebes bei Betasten,
minimale Pulmonalsklerose.
Toxikologische und biochemische Befunde:
- Glucose in der GKF: 816,6 mg/dl, Laktat in der GKF: 582,3 mg/dl,
Summenformel nach Traub in der GKF: 1007,8 mg/dl
- Glucose in der CSF: 321
mg/dl,
Laktat
in
der
GKF:
471,6
mg/dl,
Summenformel nach Traub in der CSF: 556,8 mg/dl
- Glucose im Urin: 2559,4 mg/dl
- HbA1c im FVB: 87,1 mmol/mol
- Anhydroglucitol im FVB: 3,15 µg/ml
157
5. Diskussion
- Fructosamin in der GKF: 333 µmol/l, Fructosamin in der CSF: 286,4 µmol/l;
Fructosamin im FVB: 169,2 µmol/l
- Aceton
im
FVB
855mg/l,
Acetoacetat
im
FVB
2379
µmol/l,
β-Hydroxybutyrat 6761µmol/l
5.3.9.4 S 213/12
Vorgeschichte: Herr W. (57 Jahre) sei insulinpflichtiger Diabetiker gewesen und habe
an Prostatakrebs gelitten. Nach Angaben des Hausarztes habe er außerdem an
einer Depression gelitten. Seine Ehefrau habe ihn am 03.07.2012 leblos im Bett
liegend aufgefunden.
Obduktion: Obduktionsdatum war der 09.07.2012, das post mortem Intervall betrug 6
Tage. Folgende Obduktionsbefunde wurden festgehalten: Hirngewebsschwund,
Hirnödem; geringes Lungenödem; Blutfülle der inneren Organe; Verschmälerung und
Fettdurchwachsung
der
Bauchspeicheldrüse;
Prostata
mit
kleinen
Knoten,
Verkalkungen am Übergang zu den Samenbläschen; Zeichen der COPD: hart
schneidbarer Bronchialbaum, Bronchiektasen, Lungengewebe knistert bei Betasten;
Leberverfettung.
Toxikologische und biochemische Befunde:
- Glucose in der GKF: 488,6 mg/dl, Laktat in der GKF: 398,2 mg/dl,
Summenformel nach Traub in der GKF: 687,7 mg/dl
- HbA1c im Femoralvenenblut: 85,5 mmol/mol
- Fructosamin in der GKF: 222 µmol/l; Fructosamin im FVB: 99,6 µmol/l
- Aceton 3280 mg/l, Acetoacetat 388 µmol/l, β-Hydroxybutyrat 24190 µmol/l
5.3.9.5 S11/10
Vorgeschichte: Der Sohn habe Frau H. (80 Jahre) am 31.12.2009 tot im Flur vor dem
Badezimmer, bäuchlings, mit dem Kopf unter einem Schreibtisch aufgefunden. Der
Sohn habe zuletzt am 29.12.2009 mit seiner Mutter telefoniert. Frau H. sei seit
Jahren Diabetikerin gewesen. Sie habe häufiger über Schwindel geklagt. Sie sei am
27.10.2009 von einer Leiter gestürzt und habe seitdem Rückenschmerzen gehabt.
Dabei habe sie sich keine Brüche zugezogen. Frau H. sei am 04., 08., 09., 11. und
17.12.09 bei ihrem Hausarzt wegen einer „Spritzentherapie“ gewesen. Am 29.12.09
habe sie dem Hausarzt gegenüber über Schwindel und Hörprobleme geklagt. Sie
158
5. Diskussion
leide weiter unter einem Hypertonus, einer Blasenschwäche und Auffälligkeiten an
der Schilddrüse.
Obduktion: Obduktionsdatum war der 08.01.2012, das post mortem Intervall betrug 8
Tage. Folgende Obduktionsbefunde wurden festgehalten: wandhaftender Thrombus
in der rechten Halsschlagader; thrombotischer Verschluss der inneren und äußeren
Kopfschalgader der rechten Seite; Einblutungen in den linken Kopfwendermuskel
und die rechte, dem Kehlkopf aufgelagerte Muskulatur sowie die linksseitige
Mundbodenmuskulatur;
deutliche
Arteriosklerose
des
Schlagaderkranzes
am
Hirngrund; kein Hirnödem, keine Zeichen eines frischen oder älteren Hirninfarktes;
deutliche Koronarsklerose ohne frische oder ältere Infarkte.
Toxikologische und biochemische Befunde:
-
im
FVB:
Aceton
6132
mg/l,
Acetoacetat
5384
µmol/l,
β-Hydroxybutyrat 18540 µmol/l
-
Glucose in der CSF: 216 mg/dl; Laktat in der CSF: 495 mg/dl; Summenformel
nach Traub in der CSF: 464 mg/dl
-
HbA1c: 74 mmol/mol
-
Fructosamin im FVB: 110 µmol/l
5.3.9.6 S143/10
Vorgeschichte: Frau S. (58 Jahre) sei von ihrem Nachbarn, der sie zuletzt vor
ca. 8 Tagen gesehen habe, tot im Bad aufgefunden worden. Frau S. habe sehr
zurückgezogen gelebt, wirres Zeug geredet, sei wegen Schizophrenie im
Krankenhaus behandelt worden und sei bekannte Alkoholikerin gewesen. Eine
Sektion wurde zum Ausschluss von Fremdverschulden durchgeführt.
Obduktion: Obduktionsdatum war der 02.04.2010, das post mortem Intervall betrug 5
Tage. Folgende Obduktionsbefunde wurden festgehalten: Fettleber mit Fibrose und
zwei bis kirschengroßen Hämangiomen; chronische calcifizierte Pankreatitis;
Hirnatrophie.
Toxikologische und biochemische Befunde:
-
Glucose in der CSF: 524 mg/dl; Laktat in der CSF: 465 mg/dl;
Summenformel nach Traub in der CSF: 757 mg/dl
-
HbA1c im FVB: 88,6 mmol/mol
-
Fructosamin im FVB: 128,6 µmol/l
-
FVB:
Aceton
β-Hydroxybutyrat
5023
mg/l,
Acetoacetat
12511
µmol/l,
9896µmol/l
159
5. Diskussion
5.3.10 Anwendungsbeispiele Hypoglykämie
5.3.10.1
Suizid mit Humalog
Vorgeschichte: Eine Frau bat ihren Ehemann, sie im gemeinsamen Schlafzimmer
alleine zu lassen. Sie wolle sich mit seinem Insulinvorrat – er ist Diabetiker – das
Leben nehmen. Aus Rücksicht auf den Wunsch der Frau sollte der Ehemann erst
nach einigen Stunden wieder ins Schlafzimmer gehen. Der Mann tat wie ihm
aufgetragen und rief erst einige Stunden nach dem geäußerten Wunsch die Polizei,
die die Ehefrau tot auf ihrem Bett vorfand.
Toxikologische und biochemische Befunde::
Insulin lispro in folgenden Matrices: FVB: 0 µU/ml, Herzblut: 0 µU/ml, GKF
103 µU/ml, mit Methanol extrahierte Injekionsstelle: 808 µU/g (Abbildung 47), mit
wässriger
Natriumchlorid-Lösung
extrahierte
Injektionsstelle:
581
µU/g,
Muskelgewebe: 373 µU/g, Nierengewebe: 384 µU/g, Gehirngewebe: 0 µU/g,
Myokardgewebe: 0 µU/g, Lungengewebe: 0 µU/g, Lebergewebe: 0 µU/g,
Mageninhalt: 0 µU/g. Abbildung 47 zeigt das Chromatogramm und das zugehörige
Produktionenspektrum von Insulin lispro in der Injektionsstelle.
Abbildung 47: Chromatogramm von m/z ([M+5H]5+) = 1162,5 und das dazugehörige
Produktionenspektrum mit dem spezifischen Fragment m/z = 217 für Humalog in der
extrahierten Injektionsstelle
160
5. Diskussion
5.3.10.2
Tötungsdelikt mit humanem Insulin
Vorgeschichte: Frau D. war eine aufgrund ihrer ständigen Extrawünsche bei den
Stationsschwestern ungeliebte Bewohnerin einer Seniorenwohnanlage in S. Eines
Abends nach dem Abendessen verlor sie nach Symptomen wie Zittern und Blässe
das Bewusstsein. Der herbeieilende Arzt konnte an Ort und Stelle eine
Blutglucosekonzentration von 26 mg/dl feststellen und ordnete das Verbringen in ein
Krankenaus an. Vom Notarzt wurde eine Blutgluosekonzentration von 17 mg/dl
festgestellt.
Nach
Eintreffen
des
Notarztes
und
Behandlung
mit
40%iger
Glucoselösung stieg der Blutzucker auf 203 mg/dl an, um nur eine viertel Stunde
später wieder auf 86 mg/dl zu sinken. Frau D. überlebte den Vorfall nach intensiven
Glukagon- und Glucoseinfusionen über 4 Tage. Glücklicherweise wurde noch vom
Notarzt ein Röhrchen Blut abgenommen, sofort zentrifugiert und das Serum bei
-20°C gelagert. Der Verdacht keimte auf, dass eine der Nachtschwestern Frau D. ein
hypoglykämisches Agens verabreicht haben könnte. Eine der Nachtschwestern hatte
schon bei früheren Anlässen selbstständig Medikamente verabreicht. Im Computer
der Verdächtigen wurde dann ein Bekennerbrief gefunden. In diesem wurde die Tat
gestanden und der Hinweis gegeben, dass „sowohl 2 Fertigpens Insulin Rapid als
auch 2 Fertigpens Actraphane 30/70 (30 % Normalinsulin und 70 % NPH Insulin)
über eine Zeitspanne von 3-5 Stunden gegeben wurde. Die letzte Spritze habe Frau
D. laut diesem Brief 7-8 Stunden, bevor die hypoglykämische Episode erkannt
wurde, erhalten.
Analytik: Im Serum der Frau B. vom Tag des Vorfalls wurde eine HumaninsulinKonzentration von 5,18 mU/ml (= 37369 pmol/l) quantifiziert. In einer Probe, die
später am Tag genommen wurde, wurde eine Konzentration von 2,86 mU/ml
gefunden. Serumproben 2 und 3 Tage nach dem Vorfall enthielten kein humanes
Insulin mehr. In keiner der Proben wurden synthetische Insuline nachgewiesen. Die
C-Peptid-Konzentration in der Probe vom Vorfall war 336 pmol/l, sodass sich ein
I:C-Verhältnis von 111 ergibt. Die Proinsulin-Konzentration lag bei 5,3 pmol/l.
161
6. Zusammenfassung und Ausblick
6
Zusammenfassung und Ausblick
Folgen einer Diabeteserkrankung sind die siebthäufigste Todesursache der Welt.
Stoffwechselentgleisungen
bei
Lebenden
sind
außergewöhnlich
häufig
zu
verzeichnen und stellen z.B. bei der aktiven Teilnahme am Straßenverkehr eine
Gefahr dar. Akute Komplikationen und Entgleisungen des Kohlenhydratstoffwechsels
sind das diabetische Koma (diabetische Ketoazidose oder hyperosmolares Koma)
und die Hypoglykämie. Die Diagnose dieser Komplikationen gerade bei forensischen
Fragestellungen ist oft problematisch, bei Todesfällen auch aufgrund fehlender
charakteristischer Obduktionsbefunde.
Werden bei der Insulin-Diagnostik bisher vornehmlich immunchemische Verfahren im
klinischen
Alltag
eingesetzt,
wurden
nun
chromatographisch-
massenspektrometrische Methoden zur Bestimmung von relevanten Parametern
zum Nachweis der Ursache einer Hypoglykämie (humanes Insulin, C-Peptid,
synthetische
Insulinanaloga,
orale
Antidiabetika)
und
zum
Nachweis
einer
Hyperglykämie (Anhydroglucitol, Methylglyoxal) entwickelt und validiert. Damit ist das
Labor der forensischen Toxikologie zukünftig in der Lage, bei diesen Fragestellungen
beweissichere analytische Belege zu erbringen.
Die Methoden wurden an 480 klinischen Realproben von Diabetikern und
forensischen Proben wurden diese Methoden getestet. Die einzelnen Parameter
(Glucose, HbA1c, Fructosamin, Anhydroglucitol, humanes Insulin, C-Peptid und
Proinsulin)
wurden
miteinander
korreliert,
um
die
Zusammenhänge
der
Diabetesmarker nachvollziehen zu können. Das Diabetikerkollektiv wurde nach
seiner Medikation (ohne Medikation, Einnahme von Sulfonylharnstoffen, Injektion mit
humanem
Insulin,
Injektion
synthetischer
Insuline)
eingeteilt,
um
Konzentrationsbereiche von humanem Insulin, des C-Peptids, Proinsulin und des
I:C-Verhältnisses zu gewinnen, die einen Rückschluss auf die Medikation/Einstellung
zulassen können.
Bei 134 Obduktionen der vergangenen Jahre aus dem Obduktionsgut der Institute für
Rechtsmedizin Bonn und Düsseldorf wurden die forensisch relevanten Matrizes
Femoralvenenblut,
Urin,
Glaskörperflüssigkeit
und
Liquor
cerebrospinalis
entnommen. Die einzelnen Parameter (Glucose, Laktat, Summenformel nach Traub,
HbA1c, Fructosamin, Anhydroglucitol) wurden miteinander korreliert, um die
Zusammenhänge der Diabetesmarker auch nach dem Tod nachvollziehen zu
können. Die Nachweisbarkeit von humanem Insulin und seinen synthetischen
162
6. Zusammenfassung und Ausblick
Analoga in post mortem Flüssigkeiten konnte an 2 Fallbeispielen dargelegt werden.
Die Möglichkeit der Detektion eines diabetishen Komas post mortem wird anhand
von 6 Fallbeispielen diskutiert.
Bei Verdacht auf eine Hypoglykämie post mortem gestaltet sich der Nachweis der
Hypoglykämie selbst über die Summenformel nach Traub als schwierig. Cut-Offs für
die Summenformel nach Traub sollten bei 25 mg/dl liegen. Ein extrem geringer
HbA1c bei behandelten Diabetikern spricht weiterhin für periodisch aufgetretende
hypoglykämische Episoden. Neben dem Nachweis einer Hypoglykämie sollte auch
die Klärung der Ursache gelingen. Orale Antidiabetika des Sulfonylharnstoff- , des
Glinid- , des Glitazon- und des Gliptin-Typs können Hypoglykämien auslösen und
nach
LLE
präzise
von
subtherapeutischen
bis
Überdosiskonzentrationen
nachgewiesen werden. Für den Nachweis der Injektion von humanem Insulin sollten
Nüchtern-Insulinkonzentrationen > 500 pmol/l den Verdacht auf eine Insulininjektion
lenken, die zusätzliche C-Peptid-Analytik ist aber unerlässlich. Ein Verhältnis
humanes Insulin zu C-Peptid > 0,22 im nüchternen Zustand in den der Injektion
folgenden 180 min spricht sehr für die Injektion von Insulin. Post mortem sollte bei
der Obduktion neben den gängigen Materialien FVB und Urin auch die GKF
entnommen werden. In FVB und GKF ist humanes Insulin normalerweise nicht
nachweisbar. Erst in Überdosissituationen kann humanes oder synthetische Insuline
in der GKF nachgewiesen werden. Für die Praxis wird, wenn möglich, eine
Insulinbestimmung aus Serum empfohlen, am besten in ante mortem Material von
Verstorbenen. Weiterhin konnte in einem Fall gezeigt werden, dass die
Injektionsstelle und weitere Organe für einen chromatographischen Nachweis von
humanem/synthetischen
Insulinen
nach
Immunoaffinitätsaufreinigung
mit
magnetischen beads als geeignete Untersuchungsmaterialien gelten können.
Für die Diagnose „Diabetes“ post mortem stehen neben pathomorphologischen und
histologischen Befunden biochemische Messungen zur Verfügung. Hinweise geben
ein HbA1c > 6,5 %, Fructosamin im Serum > 300 µmol/l im Serum, > 100 µmol/l in
der GKF und > 150 µmol/l in der CSF, Anhydroglucitol < 10 µg/ml im FVB.
Umgekehrt schließen aber andere Ergebnisse bzgl. dieser Parameter einen Diabetes
nicht aus. Methylglyoxal eignet sich nicht als post mortem Marker, da nach dem Tod
ein enormer Anstieg der Konzentrationen sowohl bei Kontrollfällen als auch bei
Fällen mit einer diabetischen Stoffwechselentgleisung auftritt.
163
6. Zusammenfassung und Ausblick
Bei der Frage nach einem diabetischen Koma wird zusätzlich eine Analyse auf
Ketonkörper empfohlen, eine Glucosekonzentration in der GKF > 180 mg/dl als
verlässlichsten Hinweis auf eine diabetische Stoffwechselentgleisung zu betrachten.
Zusätzlich kann die Messung von Laktat in der GKF und der CSF und damit die
Summenformel > 450 mg/dl in diesen Matrizes ergänzend auf ein diabetisches Koma
hindeuten. Die Miteinbeziehung der Laktatkonzentration ergibt aber keinen Vorteil.
Eine hohe Glucosekonzentration im Urin wird nur in Fällen mit diabetischem Koma
beobachtet, sodass diese durchaus einen Hinweis auf diese Todesursache geben
kann. Umgekehrt ist eine niedrige Glucosekonzentration im Urin aber kein Argument,
ein diabetisches Koma auszuschließen. Erhöhte HbA1c-Konzentrationen und stark
erniedrigte Anhydroglucitol-Konzentrationen korrelieren mit der Summenformel nach
Traub und geben weitere Hinweise. In der Regel muss die Diagnose „diabetische
Stoffwechselentgleisung“ aber immer eine Zusammenstellung von Befunden aus
Anamnese, Obduktion, Histologie und forensischer Chemie erfolgen.
Weiterer Forschungsbedarf besteht für die Untersuchung der Insulin- und C-PeptidStabilität in realen postmortalen Blutproben und in anderen Matrizes. Das Verhalten
von Anhydroglucitol im Urin ante und post mortem ist noch wenig untersucht und
sollte Gegenstand weiterer Forschung sein. AG-Konzentrationen im Urin und
Blutglucosekonzentrationen korrelieren aufgrund der Konkurrenz der beiden Zucker
zur Rückresorption in der Niere positiv miteinander, was sich auch die Forensik bei
der Diagnose von hyperglykämischen Stoffwechselentgleisungen zunutze machen
könnte.
164
7. Abbildungsverzeichnis
7
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Pathogenese einer diabetischen Ketoazidose und eines hyperosmolaren Komas
8
Abbildung 2: Abbau von Proinsulin zu Insulin und C-Peptid
16
Abbildung 3: Strukturen von Humaninsulin und dessen synthetischen Analoga
18
Abbildung 4 : Chemische Strukturen oraler Antidiabetika
26
Abbildung 5: Strukturformel von Methylglyoxal
26
Abbildung 6: Synthese und Metabolismus von MG
28
Abbildung 7: Bildung von verschiedenen AGEs durch Reaktion von MG
27
Abbildung 8: Strukturformel von AG
29
Abbildung 9: Aufbau einer ESI-Quelle
43
Abbildung 10: Aufbau eines Triple-Quadrupol-Massenspektrometers
43
Abbildung 11: Prinzip des Multiple Reaction Monitoring und der Produktionen-Analyse
45
Abbildung 12: Derivatisierung von MG und des IS mit 2,3-Diaminonaphthalen
71
Abbildung 13: Reaktion von Hydroxybutyrat zu Aceton
74
Abbildung 14: Chromatographische Trennung und Produktionenspektren von humanem Insulin und
seinen synthetischen Analoga
80
Abbildung 15: Stabilität der Konzentration von humanem Insulin in Serumproben
80
Abbildung 16: Chromatogramm C-Peptid
82
Abbildung 17: Chromatogramme orale Antidiabetika
84
Abbildung 18: Chromatogramm MG
89
Abbildung 19: Chromatogramm AG
90
Abbildung 20: Glucosekonzentrationen in klinischen Proben
91
Abbildung 21: HbA1c-Konzentrationen in klinischen Proben
92
Abbildung 22: Fructosamin-Konzentrationen in klinischen Proben
93
Abbildung 23: Konzentrationen von humanem Insulin in klinischen Proben
92
Abbildung 24: Konzentrationen von humanem Insulin der nach ihrer Medikation eingeteilten Kollektive
95
Abbildung 25: Vergleich der beiden Methoden für humanes Insulin
95
Abbildung 26: C-Peptid-Konzentrationen in klinischen Proben
98
Abbildung 27: C-Peptid-Konzentrationen der nach ihrer Medikation eingeteilten Kollektive
98
Abbildung 28: I:C-Verhältnisse
100
Abbildung 29: Proinsulin-Konzentrationen
101
Abbildung 30: Proinsulin-Konzentrationen on Diabetikern geordnet nach ihrer Therapie
102
Abbildung 31: klinische MG-Serumkonzentrationen
103
Abbildung 32: klinische AG-Konzentrationen
103
Abbildung 33: Korrelation der Glucosekonzentration mit den Langzeitmarkern HbA1c, Fructosamin
und AG und Korrelationen dieser untereinander
106
Abbildung 34: Korrelation von Humaninsulin-, C-Pepid-, Proinsulinkonzentration und I : C-Verhältnis
mit der Glucosekonzentration und untereinander
108
Abbildung 35: Glucosekonzentrationen post mortem in GKF, CSF und Urin
108
165
7. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 36: Laktatkonzentrationen post mortem in GKF, CSF und Urin
110
Abbildung 37: Summenformeln nach Traub in GKF und CSF
111
Abbildung 38: HbA1c-Konzentrationen post mortem
111
Abbildung 39: Fructosamin-Konzentrationen post mortem
112
Abbildung 40: MG-Konzentrationen post mortem
114
Abbildung 41: AG-Konzentrationen post mortem
115
Abbildung 42: Korrelation der Glucose- bzw. Laktatkonzentrationen und der Summenformeln in der
GKF und der CSF und Korrelation der Glucosekonzentration im Urin mit der Summenformel nach
Traub in der GKF und in der CSF
116
Abbildung 43: Korrelation der HbA1c-Konzentration post mortem mit der Summenformel nach Traub
in der GKF und in der CSF
117
Abbildung 44: Korrelation der Summenformel nach Traub in der GKF mit der MG-Konzentration und
der AG-Konzentration post mortem im FVB
117
Abbildung 45: Korrelationen der Fructosamin-Konzentration in Serum, GKF und CSF post mortem mit
der Summenformel in der GKF und dem HbA1c
118
Abbildung 46: Typische pathomorphologiche Auffälligkeiten post mortem bei diabetischem Koma 153
Abbildung
47:
Chromatogramm
von
m/z
([M+5H]5+)
=
1162,5
und
das
dazugehörige
Produktionenspektrum mit dem spezifischen Fragment m/z = 217 für Humalog in der extrahierten
Injektionsstelle
160
166
8. Tabellenverzeichnis
8
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Optionale Kriterien für eine Diagnose von Diabetes
3
Tabelle 2: Definition einer Hypoglykämie und die Reaktionen des menschlichen Körpers bei sinkender
Glucosekonzentration
8
Tabelle 3 : Mögliche Syptome einer Hypoglykämie
9
Tabelle 4: Referenzkonzetrationen von Glucose und Laktat
10
Tabelle 5: Referenzkonzentrationen HbA1c und Fructosamin
13
Tabelle 6: Wirkbeginn, Wirkhöhepunkt und Wirkdauer von Normalinsulin und synthetischen Insulinen
auf dem Arzneimittelmarkt
19
Tabelle 7: Referenzkonzentrationen von humanem Insulin, C-Peptid, dem molaren Verhältnis Insulin :
C-Peptid und von Proinsulin
21
Tabelle 8: Pharmakokinetik und biologisches Verhalten der Sulfonylharnstoffe
21
Tabelle 9: Wirkstoffgruppen, Wirkmechanismen, Wirkstoffe und Hauptmetabolite der oralen
Antidiabetika
24
Tabelle 10: Referenzkonzentrationen für MG
29
Tabelle 11: Glucose- und Laktatkonzentrationen post mortem
39
Tabelle 12: Chemikalien und Reagenzien allgemein
51
Tabelle 13: Massenspektrometrische Daten und Parameter Insuline
61
Tabelle 14: Optimierte massenspektrometrische Parameter Methode C-Peptid
64
Tabelle 15: Chemikalien für die Analytik oraler Antidiabetika
65
Tabelle 16: Optimierte Ionenübergänge, Kollisionsenergien und relative Ionenintensitäten orale
Antidiabetika
67
Tabelle 17: Konzentrationen der gespikten Plasmaproben für Linearitätsstudien orale Antidiabetika 69
Tabelle 18: Massenspektrometrische Daten MG-Methodsik
71
Tabelle 19: Validierungsdaten der Insuline in humanem Serum
81
Tabelle 20: Genauigkeit des Messinstruments und Stabilitätsdaten orale Antidiabetika
84
Tabelle 21: Matrixeffekte und Wiederfindungsraten orale Antidiabetika
86
Tabelle 22: Genauigkeitsdaten orale Antidiabetika
87
Tabelle 23: Gemessene Konzentrationsbereiche der oralen antihyperglykämischen Wirkstoffe bei
diabetischen Patienten
88
Tabelle 24: Konzentrationen von humanem Insulin der nach Medikation eingeteilten Kollektive
94
Tabelle 25: Konzentrationen in klinischen Serumproben von Diabetikern mit synthetischen Insulinen 97
Tabelle 26: C-Peptid-Konzentrationen von Diabetikern
99
Tabelle 27: Konzentrationen des I:C-Verhältnisses
98
Tabelle 28: Proinsulin-Konzentrationen
102
Tabelle 29: Veränderungen der MG-Konzentrationen [ng/ml] in den Tagen nach der Obduktion
113
Tabelle 30: Glucose-, Laktatkonzentration und die Summenformel nach Traub in der GKF und der
CSF, HbA1c und Ketonkörper für alle Fälle mit der Todesursache diabetische Ketoazidose.
142
167
9. Literaturverzeichnis
9
Literaturverzeichnis
1. International Diabetes Federation. http://derstandard.at/1254311950510/285-Millionen-Diabetiker-weltweit. 2009.Zugriff
Mai 2012.
2.
Andresen EM, Lee JA, Pecoraro RE, Koepsell TD, Hallstrom AP, Siscovick DS. Underreporting of diabetes on death
certificates, King County, Washington. Am J Public Health 1993;83:1021-4.
3.
Fuller JH. Mortality trends and causes of death in diabetic patients. Diabete Metab 1993;19:96-9.
4.
Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care
1997;20:1183-97.
5.
Rathmann W, Haastert B, Icks A, et al. High prevalence of undiagnosed diabetes mellitus in Southern Germany:
target populations for efficient screening. The KORA survey 2000. Diabetologia 2003;46:182-9.
6.
Federal Statistic Office Germany.
http://www.destatis.de/jetspeed/portal/cms/Sites/destatis/Internet/DE/Presse/pm/2007/11/PD07__454__232,templateI
d=renderPrint.psml. 2007.Zugriff Mai 2012.
7.
Hauner H. Diabetesepidemie und Dunkelziffer.In: Deutscher Gesundheitsbericht Diabetes 2008, Deutsche Diabetes
Union e.V.,Kirchheim + Co GmbH Mainz, p.7-11. 2007.
8.
Sacks DB, Bruns DE, Goldstein DE, Maclaren NK, McDonald JM, Parrott M. Guidelines and recommendations for
laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus. Clin Chem 2002;48:436-72.
9.
Thomas L. Labor und Diagnose. Indikationen und Bewertung von Laborbefunden für die medizinische Diagnostik.
5.erweiterte Auflage, TH Books. 2000.
10.
Faich GA, Fishbein HA, Ellis SE. The epidemiology of diabetic acidosis: a population-based study. Am J Epidemiol
1983;117:551-8.
11.
Standards of medical care in diabetes 2006. Diabetes Care 2006;29 Suppl 1:S4-42.:S4-42.
12.
Gouni-Berthold I, Krone W. Diabetic ketoacidosis and hyperosmolar hyperglycemic state. Med Klin (Munich) 2006;101
Suppl 1:100-5.:100-5.
13.
Kitabchi AE, Umpierrez GE, Murphy MB, et al. Hyperglycemic crises in diabetes. Diabetes Care 2004;27 Suppl
1:S94-102.:S94-102.
14.
Hirabayashi S, Kitahara T, Hishida T. Computed tomography in perinatal hypoxic and hypoglycemic encephalopathy
with emphasis on follow-up studies. J Comput Assist Tomogr 1980;4:451-6.
15.
Cryer PE. Glucose counterregulation in man. Diabetes 1981;30:261-4.
16.
MacLeod KM, Hepburn DA, Frier BM. Frequency and morbidity of severe hypoglycaemia in insulin-treated diabetic
patients. Diabet Med 1993;10:238-45.
17.
Nilsson A, Tideholm B, Kalen J, Katzman P. Incidence of severe hypoglycemia and its causes in insulin-treated
diabetics. Acta Med Scand 1988;224:257-62.
18.
Epidemiology of severe hypoglycemia in the diabetes control and complications trial. The DCCT Research Group. Am
J Med 1991;90:450-9.
19.
Mokan M. The phenomenon of unawareness of hypoglycemia. Vnitr Lek 2001;47:298-303.
20.
Muhlhauser I, Berger M, Sonnenberg G, et al. Incidence and management of severe hypoglycemia in 434 adults with
insulin-dependent diabetes mellitus. Diabetes Care 1985;8:268-73.
21.
Hirsch IB. Insulin analogues. N Engl J Med 2005;352:174-83.
22.
Rodriguez PC, Lizondo EA, Lopez Garcia MJ, Escriva CL, Alpera LR, Collado PC. A study of variability in glycaemia
in children and adolescents with diabetes mellitus type 1 on treatment with insulin glargine. An Pediatr (Barc )
2008;69:426-31.
23.
Mitrakou A, Ryan C, Veneman T, et al. Hierarchy of glycemic thresholds for counterregulatory hormone secretion,
symptoms, and cerebral dysfunction. Am J Physiol 1991;260:E67-E74.
168
9. Literaturverzeichnis
24.
Butler PC, Rizza RA. Regulation of carbohydrate metabolism and response to hypoglycemia. Endocrinol Metab Clin
North Am 1989;18:1-25.
25.
Megarbane B, Deye N, Bloch V, et al. Intentional
toxicokinetic/toxicodynamic profiles. Crit Care 2007;11:R115.
26.
Barnett AH, Leslie D, Watkins PJ. Can insulin-treated diabetics be given beta-adrenergic blocking drugs? Br Med J
1980;280:976-8.
27.
Lawrence AM, Hagen TC. Propranolol-associated hypoglycemia. N Engl J Med 1983;309:1327-8.
28.
Amiel SA, Dixon T, Mann R, Jameson K. Hypoglycaemia in Type 2 diabetes. Diabet Med 2008;25:245-54.
29.
Jennings AM, Wilson RM, Ward JD. Symptomatic hypoglycemia in NIDDM patients treated with oral hypoglycemic
agents. Diabetes Care 1989;12:203-8.
30.
Holstein A, Plaschke A, Egberts EH. Lower incidence of severe hypoglycaemia in patients with type 2 diabetes
treated with glimepiride versus glibenclamide. Diabetes Metab Res Rev 2001;17:467-73.
31.
Holstein A, Plaschke A, Hammer C, Egberts EH. Characteristics and time course of severe glimepiride- versus
glibenclamide-induced hypoglycaemia. Eur J Clin Pharmacol 2003;59:91-7.
32.
Stevens AB, Roberts M, McKane R, Atkinson AB, Bell PM, Hayes JR. Motor vehicle driving among diabetics taking
insulin and non-diabetics. BMJ 1989;299:591-5.
33.
Madea B. Verkehrsmedizin. Fahreignung, Fahrsicherheit, Unfallkonstruktion. Deutscher Ärzte Verlag. In: Mußhoff F
BG, ed. 2007.
34.
Cox DJ, Penberthy JK, Zrebiec J, et al. Diabetes and driving mishaps: frequency and correlations from a multinational
survey. Diabetes Care 2003;26:2329-34.
35.
Harsch IA, Stocker S, Radespiel-Troger M, et al. Traffic hypoglycaemias and accidents in patients with diabetes
mellitus treated with different antidiabetic regimens. J Intern Med 2002;252:352-60.
36.
MacLeod KM. Diabetes and driving: towards equitable, evidence-based decision-making. Diabet Med 1999;16:28290.
37.
Cox DJ, Gonder-Frederick LA, Kovatchev BP, Julian DM, Clarke WL. Progressive hypoglycemia's impact on driving
simulation performance. Occurrence, awareness and correction. Diabetes Care 2000;23:163-70.
38.
Graveling AJ, Warren RE, Frier BM. Hypoglycaemia and driving in people with insulin-treated diabetes: adherence to
recommendations for avoidance. Diabet Med 2004;21:1014-9.
39.
R Penning. Alkohol, Drogen uns Verkehrssicherheit. UNI-MED Verlag AG. 4.Auflage.
40.
Huismans H. Lexikon der klinischen Diabetologie. Deutscher Ärzte Verlag. 2008.
41.
http://www.deutsche-diabetes-gesellschaft.de/presse/pressemeldungen/meldungendetailansicht/article/verkehrsmedizinische-gutachten-fuer-menschen-mit-diabetes-ddg-passt-arztsuche-an-eufuehrerscheinri.html?cHash=8debfbda076af303323a8847a9d7be07. 2013.Zugriff Januar 2013.
42.
Lai MW, Klein-Schwartz W, Rodgers GC, et al. 2005 Annual Report of the American Association of Poison Control
Centers' national poisoning and exposure database. Clin Toxicol (Phila) 2006;44:803-932.
43.
Bronstein AC, Spyker DA, Cantilena LR, Jr., Green JL, Rumack BH, Heard SE. 2007 Annual Report of the American
Association of Poison Control Centers' National Poison Data System (NPDS): 25th Annual Report. Clin Toxicol (Phila)
2008;46:927-1057.
44.
von Mach MA, Meyer S, Omogbehin B, Kann PH, Weilemann LS. Epidemiological assessment of 160 cases of insulin
overdose recorded in a regional poisons unit. Int J Clin Pharmacol Ther 2004;42:277-80.
45.
Arem R, Zoghbi W. Insulin overdose in eight patients: insulin pharmacokinetics and review of the literature. Medicine
(Baltimore) 1985;64:323-32.
46.
Kaminer Y, Robbins DR. Attempted suicide by insulin overdose in insulin-dependent diabetic adolescents. Pediatrics
1988;81:526-8.
47.
Marks V. Murder by insulin. Med Leg J 1999;67:147-63.
48.
Marks V. Insulin murders. Med Leg J 2009;77:39-47.
overdose
with
insulin:
prognostic
factors
and
169
9. Literaturverzeichnis
49.
Eledrisi MS, Alshanti MS, Shah MF, Brolosy B, Jaha N. Overview of the diagnosis and management of diabetic
ketoacidosis. Am J Med Sci 2006;331:243-51.
50.
Falk H. Praktische Sektionsdiagnostik mit Schnellmethoden. Veb Georg Thieme Leipzig. In: Pfeifer K, ed. 196
51.
Beckmann ER, Puschel K, Picht S. [Pathomorphology of diabetes mellitus and diabetic coma]. Beitr Gerichtl Med
1984;42:307-13.:307-13.
52.
Reimann W. Vademecum Gerichtsmedizin. 4.Auflage Berlin Volk und Gesundheit. In: Prokop O GG, ed. 1985.
53.
Schibel N. Zur postmortalen Diagnose von Störungen des Kohlenhydratstoffwechsels. Doctora thesis at the institute
of legal medicine Berlin. 2007.
54.
Matsumura M, Nakashima A, Tofuku Y. Electrolyte disorders following massive insulin overdose in a patient with type
2 diabetes. Intern Med 2000;39:55-7.
55.
Jolliet P, Leverve X, Pichard C. Acute hepatic steatosis complicating massive insulin overdose and excessive glucose
administration. Intensive Care Med 2001;27:313-6.
56.
Ortega E, Wagner A, Caixas A, Barcons M, Corcoy R. Hypoglycemia and pulmonary edema: a forgotten association.
Diabetes Care 2000;23:1023-4.
57.
Hood I, Mirchandani H, Monforte J, Stacer W. Immunohistochemical demonstration of homicidal insulin injection site.
Arch Pathol Lab Med 1986;110:973-4.
58.
Gressner. Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik. Band 1: Klinische Chemie. In: Arndt, ed. 2006.
59.
Bunn HF. Nonenzymatic glycosylation of protein: relevance to diabetes. Am J Med 1981;70:325-30.
60.
Nathan DM, Kuenen J, Borg R, Zheng H, Schoenfeld D, Heine RJ. Translating the A1C assay into estimated average
glucose values. Diabetes Care 2008;31:1473-8.
61.
Cefalu WT, Wang ZQ, Bell-Farrow A, Kiger FD, Izlar C. Glycohemoglobin measured by automated affinity HPLC
correlates with both short-term and long-term antecedent glycemia. Clin Chem 1994;40:1317-21.
62.
Goldstein DE, Walker B, Rawlings SS, et al. Hemoglobin A1c levels in children and adolescents with diabetes
mellitus. Diabetes Care 1980;3:503-7.
63.
Nordin G, Dybkaer R. Recommendation for term and measurement unit for "HbA1c". Clin Chem Lab Med
2007;45:1081-2.
64.
Tahara Y, Shima K. Kinetics of HbA1c, glycated albumin, and fructosamine and analysis of their weight functions
against preceding plasma glucose level. Diabetes Care 1995;18:440-7.
65.
Johnson RN, Metcalf PA, Baker JR. Fructosamine: a new approach to the estimation of serum glycosylprotein. An
index of diabetic control. Clin Chim Acta 1983;127:87-95.
66.
Mayer TK, Freedman ZR. Protein glycosylation in diabetes mellitus: a review of laboratory measurements and of their
clinical utility. Clin Chim Acta 1983;127:147-84.
67.
Ritz S, Mehlan G, Martz W. Postmortem diagnosis of diabetic metabolic derangement: elevated alpha 1-antitrypsin
and haptoglobin glycosylation levels as an index of antemortem hyperglycemia. J Forensic Sci 1996;41:94-100.
68.
Sacks DB, Bruns DE, Goldstein DE, Maclaren NK, McDonald JM, Parrott M. Guidelines and recommendations for
laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus. Clin Chem 2002;48:436-72.
69.
Sacks DB, Bruns DE, Goldstein DE, Maclaren NK, McDonald JM, Parrott M. Guidelines and recommendations for
laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus. Clin Chem 2002;48:436-72.
70.
Osuna E, Garcia-Villora A, Perez-Carceles M, et al. Glucose and lactate in vitreous humor compared with the
determination of fructosamine for the postmortem diagnosis of diabetes mellitus. Am J Forensic Med Pathol
2001;22:244-9.
71.
Type 2 diabetes in children and adolescents. American Diabetes Association. Diabetes Care 2000;23:381-9.
72.
Uemura K, Shintani-Ishida K, Saka K, et al. Biochemical blood markers and sampling sites in forensic autopsy. J
Forensic Leg Med 2008;15:312-7.
73.
Kernbach G, Puschel K, Brinkmann B. [Biochemical measurements of glucose metabolism in relation to cause of
death and postmortem effects]. Z Rechtsmed 1986;96:199-213.
170
9. Literaturverzeichnis
74.
Chevenne D, Trivin F, Porquet D. Insulin assays and reference values. Diabetes Metab 1999;25:459-76.
75.
Robbins DC, Andersen L, Bowsher R, et al. Report of the American Diabetes Association's Task Force on
standardization of the insulin assay. Diabetes 1996;45:242-56.
76.
Karam JH. Pancreatic hormones and diabetes mellitus.
77.
Galloway JA, Hooper SA, Spradlin CT, et al. Biosynthetic human proinsulin. Review of chemistry, in vitro and in vivo
receptor binding, animal and human pharmacology studies, and clinical trial experience. Diabetes Care 1992;15:66692.
78.
Lüllmann, Mohr: Lehrbuch der Pharmakologie. Thieme Verlag, Stuttgart. 2006.
79.
Sheldon B, Russell-Jones D, Wright J. Insulin analogues: an example of applied medical science. Diabetes Obes
Metab 2009;11:5-19.
80.
Wark G. How to look for insulin etc. In: SAS Peptide Hormone Section RGPHS, ed. 2009.
81.
Clark PM. Assays for insulin, proinsulin(s) and C-peptide. Ann Clin Biochem 1999;36:541-64.
82.
Kruszynska YT, Home PD, Hanning I, Alberti KG. Basal and 24-h C-peptide and insulin secretion rate in normal man.
Diabetologia 1987;30:16-21.
83.
Roberge RJ, Martin TG, Delbridge TR. Intentional massive insulin overdose: recognition and management. Ann
Emerg Med 1993;22:228-34.
84.
Service FJ. Hypoglycemia. Endocrinol Metab Clin North Am 1997;26:937-55.
85.
Iwase H, Kobayashi M, Nakajima M, Takatori T. The ratio of insulin to C-peptide can be used to make a forensic
diagnosis of exogenous insulin overdosage. Forensic Sci Int 2001;115:123-7.
86.
Batalis NI, Prahlow JA. Accidental insulin overdose. J Forensic Sci 2004;49:1117-20.
87.
Mayors FH. Review of Medical Pharrnacology ed 7. Los Altos, California, Lange Medical Publications. In: Jawetz
E.Goldfein A, ed. 1980.
88.
Guyton. Insulin, Glucagon and Diabetes. In: Textbook of medical physiology, 8 edn. Philadelphia. WB Saunders 20,
Chp 78. 1991.
89.
Katzen HM, Tietze F, Stetten D, Jr. Further studies on the properties of hepatic glutathione-insulin transhydro-genase.
J Biol Chem 1963;238:1006-11.:1006-11.
90.
Lebowitz MR, Blumenthal SA. The molar ratio of insulin to C-peptide. An aid to the diagnosis of hypoglycemia due to
surreptitious (or inadvertent) insulin administration. Arch Intern Med 1993;153:650-5.
91.
Horwitz DL, Starr JI, Mako ME, Blackard WG, Rubenstein AH. Proinsulin, insulin, and C-peptide concentrations in
human portal and peripheral blood. J Clin Invest 1975;55:1278-83.
92.
Hampton SM, Beyzavi K, Teale D, Marks V. A direct assay for proinsulin in plasma and its applications in
hypoglycaemia. Clin Endocrinol (Oxf) 1988;29:9-16.
93.
Ostrega D, Polonsky K, Nagi D, et al. Measurement of proinsulin and intermediates. Validation of immunoassay
methods by high-performance liquid chromatography. Diabetes 1995;44:437-40.
94.
Alsever RN, Roberts JP, Gerber JG, Mako ME, Rubenstein AH. Insulinoma with low circulating insulin levels: the
diagnostic value of proinsulin measurements. Ann Intern Med 1975;82:347-50.
95.
Ward WK, LaCava EC, Paquette TL, Beard JC, Wallum BJ, Porte D, Jr. Disproportionate elevation of immunoreactive
proinsulin in type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus and in experimental insulin resistance. Diabetologia
1987;30:698-702.
96.
Kahn SE, Leonetti DL, Prigeon RL, Boyko EJ, Bergstrom RW, Fujimoto WY. Proinsulin as a marker for the
development of NIDDM in Japanese-American men. Diabetes 1995;44:173-9.
97.
Vezzosi D, Bennet A, Fauvel J, Caron P. Insulin, C-peptide and proinsulin for the biochemical diagnosis of
hypoglycaemia related to endogenous hyperinsulinism. Eur J Endocrinol 2007;157:75-83.
98.
Kippen AD, Cerini F, Vadas L, et al. Development of an isotope dilution assay for precise determination of insulin, Cpeptide, and proinsulin levels in non-diabetic and type II diabetic individuals with comparison to immunoassay. J Biol
Chem 1997;272:12513-22.
th
171
9. Literaturverzeichnis
99.
Darby SM, Miller ML, Allen RO, LeBeau M. A mass spectrometric method for quantitation of intact insulin in blood
samples. J Anal Toxicol 2001;25:8-14.
100.
Cabaleiro DR, Stockl D, Kaufman JM, Fiers T, Thienpont LM. Feasibility of standardization of serum C-peptide
immunoassays with isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem 2006;52:1193-6.
101.
Boyko EJ, Keane EM, Marshall JA, Hamman RF. Higher insulin and C-peptide concentrations in Hispanic population
at high risk for NIDDM. San Luis Valley Diabetes Study. Diabetes 1991;40:509-15.
102.
Human Intakt Proinsulin ELISA. Testanleitung deutsch. TECO Medical Group. 2012.
103.
Tillil H, Shapiro ET, Miller MA, et al. Dose-dependent effects of oral and intravenous glucose on insulin secretion and
clearance in normal humans. Am J Physiol 1988;254:E349-E357.
104.
Sacks DB, Bruns DE, Goldstein DE, Maclaren NK, McDonald JM, Parrott M. Guidelines and recommendations for
laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus. Clin Chem 2002;48:436-72.
105.
Marks V, Teale JD. Hypoglycaemia in the adult. Baillieres Clin Endocrinol Metab 1993;7:705-29.
106.
Service FJ. Hypoglycemic disorders. N Engl J Med 1995;332:1144-52.
107.
Service FJ. Hypoglycemia. Med Clin North Am 1995;79:1-8.
108.
Service FJ, O'Brien PC, McMahon MM, Kao PC. C-peptide during the prolonged fast in insulinoma. J Clin Endocrinol
Metab 1993;76:655-9.
109.
Lindquist O, Rammer L. Insulin in post-mortem blood. Z Rechtsmed 1975;75:275-7.
110.
Bour H. Coma hypoglycémique mortel par suicide à l`insuline. In: Roman M, Hecht H, eds., 36 Edn 1960.
111. Gulzow M. Suicide with insuline, Ztschr Klin Med 1951 (148); pp 479.
112.
Martin FI, Hansen N, Warne GL. Attempted suicide by insulin overdose in insulin-requiring diabetics. Med J Aust
1977;1:58-60.
113.
Lindgren L. Enormous dose of insulin with suicidal intent. Acta Med Scand 1960;167:297-300.:297-300.
114.
Kernbach-Wighton G, Puschel K. On the phenomenology of lethal applications of insulin. Forensic Sci Int 1998;93:6173.
115.
Boyle PJ, Kempers SF, O'Connor AM, Nagy RJ. Brain glucose uptake and unawareness of hypoglycemia in patients
with insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1995;333:1726-31.
116.
Gordon MR, Flockhart D, Zawadzki JK, Taylor T, Ramey JN, Eastman RC. Hypoglycemia due to inadvertent
dispensing of chlorpropamide. Am J Med 1988;85:271-2.
117.
Amaryl (Fachinformation), Bundesverband der Pharmazeutischen Industrie e.V. Fachinfo-Service Postfach 1255, D88322 Aulendorf; Stand: Oktober 1996.
118.
Artosin (Fachinformation), Bundesverband der Pharmazeutischen Industrie e.V. Fachinfo-Service Postfach 1255, D88322 Aulendorf; Stand: Mai 1992. 2012.
119.
Campbell RK. Glimepiride: role of a new sulfonylurea in the treatment of type 2 diabetes mellitus. Ann Pharmacother
1998;32:1044-52.
120.
Diamicron (Fachinformation) Bundesverband der Pharmazeutischen Industrie e.V. Fachinfo-Service, Postfach 1255,
D-88322 Aulendorf; Stand: August 1996.
121.
Euglucon (Fachinformation) Bundesverband der Pharmazeutischen Industrie e.V. Fachinfo-Service, Postfach 1255,
D-88322 Aulendorf; Stand: April 1994. 2012.
122.
Glurenorm (Fachinformation) Bundesverband der Pharmazeutischen Industrie e.V. Fachinfo-Service, Postfach 1255,
D-88322 Aulendorf; Stand: Januar 1999.
123.
Gluborid (Fachinformation) Bundesverband der Pharmazeutischen Industrie e.V. Fachinfo-Service, Postfach 1255,
D-88322 Aulendorf; Stand: August 1991.
124.
Kopitar Z, Koss FW. [Pharmacokinetic behaviour of gliquidone (AR-DF 26), a new sulfonyl urea. Summary of the
studies so far (author's transl)]. Arzneimittelforschung 1975;25:1933-8.
172
9. Literaturverzeichnis
125.
Langtry HD, Balfour JA. Glimepiride. A review of its use in the management of type 2 diabetes mellitus. Drugs
1998;55:563-84.
126.
Luzi L, Pozza G. Glibenclamide: an old drug with a novel mechanism of action? Acta Diabetol 1997;34:239-44.
127.
Pro-Diaban (Fachinformation) Bundesverband der Pharmazeutischen Industrie e.V., Fachinfo-Service, Postfach
1255, D-88322 Aulendorf; Stand 1995.
128.
Zilker T. Serumspiegel von Glurenorm in Abhängigkeit von Dosishöhe und Dosisintervall., 35 Edn 1975.
129.
Pharmazeutische Zeitung online. Sulfonylharnstoffe. Stellenwert in der medikamentösen Therapie des Typ-2Diabetikers. http://www.pharmazeutische-zeitung.de/index.php?id=titel_09_2000. 2010. Zugriff August 2012.
130.
Harrower AD. Comparison of diabetic control in type 2 (non-insulin dependent) diabetic patients treated with different
sulphonylureas. Curr Med Res Opin 1985;9:676-80.
131.
Igawa M. Analysis of aldehydes in cloud- and fogwater samples by HPLC post-column reaction detector. In: Munger
JW HM, ed., 23 Edn 1989.
132.
IARC Working Group on the evaluation of carcinogenic risks to humans. Methylglyoxal. In: Monographs on the
Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Vol. 51, IARC, Lyon. 1991.
133.
Moree-Testa P. Determination of alpha-dicarbonyl compounds in cigarette smoke. In: Saint-Jalm Y, ed., 217 Edn
1981.
134.
Desai KM, Chang T, Wang H, et al. Oxidative stress and aging: is methylglyoxal the hidden enemy? Can J Physiol
Pharmacol 2010;88:273-84.
135.
Urata G, Granick S. Biosynthesis of alpha-aminoketones and the metabolism of aminoacetone. J Biol Chem
1963;238:811-20.:811-20.
136.
Yu PH, Wright S, Fan EH, Lun ZR, Gubisne-Harberle D. Physiological and pathological implications of semicarbazidesensitive amine oxidase. Biochim Biophys Acta 2003;1647:193-9.
137.
Coleman DL. Acetone metabolism in mice: increased activity in mice heterozygous for obesity genes. Proc Natl Acad
Sci U S A 1980;77:290-3.
138.
Casazza JP, Felver ME, Veech RL. The metabolism of acetone in rat. J Biol Chem 1984;259:231-6.
139.
Kapalos MP. Methylglyoxal in living organisms: Chemistry, biochemistry, toxicology and biological implications., 110
Edn 1999.
140.
Gonzalez FJ. The molecular biology of cytochrome P450s. Pharmacol Rev 1988;40:243-88.
141.
Phillips SA, Thornalley PJ. The formation of methylglyoxal from triose phosphates. Investigation using a specific
assay for methylglyoxal. Eur J Biochem 1993;212:101-5.
142.
Richard JP. Mechanism for the formation of methylglyoxal from triosephosphates. Biochem Soc Trans 1993;21:54953.
143.
Ray S, Ray M. Isolation of methylglyoxal synthase from goat liver. J Biol Chem 1981;256:6230-3.
144.
Thornalley PJ. Pharmacology of methylglyoxal: formation, modification of proteins and nucleic acids, and enzymatic
detoxification--a role in pathogenesis and antiproliferative chemotherapy. Gen Pharmacol 1996;27:565-73.
145.
Leoncini G. The role of alpha-ketoaldehydes in biological systems. Ital J Biochem 1979;28:285-94.
146.
Mulac K. Pathomechanismen der Artherosklerose bei Diabetes mellitus., 12 Edn 2005.
147.
Desai K, Wu L. Methylglyoxal and advanced glycation endproducts: new therapeutic horizons? Recent Pat
Cardiovasc Drug Discov 2007;2:89-99.
148.
Vlassara H, Bucala R, Striker L. Pathogenic effects of advanced glycosylation: biochemical, biologic, and clinical
implications for diabetes and aging. Lab Invest 1994;70:138-51.
149.
Bourajjaj M, Stehouwer CD, van H, V, Schalkwijk CG. Role of methylglyoxal adducts in the development of vascular
complications in diabetes mellitus. Biochem Soc Trans 2003;31:1400-2.
150.
Beisswenger PJ, Howell SK, Touchette AD, Lal S, Szwergold BS. Metformin reduces systemic methylglyoxal levels in
type 2 diabetes. Diabetes 1999;48:198-202.
173
9. Literaturverzeichnis
151.
Odani H, Shinzato T, Matsumoto Y, Usami J, Maeda K. Increase in three alpha,beta-dicarbonyl compound levels in
human uremic plasma: specific in vivo determination of intermediates in advanced Maillard reaction. Biochem Biophys
Res Commun 1999;256:89-93.
152.
Han Y, Randell E, Vasdev S, et al. Plasma methylglyoxal and glyoxal are elevated and related to early membrane
alteration in young, complication-free patients with Type 1 diabetes. Mol Cell Biochem 2007;305:123-31.
153.
McLellan AC, Phillips SA, Thornalley PJ. The assay of methylglyoxal in biological systems by derivatization with 1,2diamino-4,5-dimethoxybenzene. Anal Biochem 1992;206:17-23.
154.
Kalapos MP. Methylglyoxal toxicity in mammals. Toxicol Lett 1994;73:3-24.
155.
Thornalley PJ, Hooper NI, Jennings PE, et al. The human red blood cell glyoxalase system in diabetes mellitus.
Diabetes Res Clin Pract 1989;7:115-20.
156.
McLellan AC, Thornalley PJ, Benn J, Sonksen PH. Glyoxalase system in clinical diabetes mellitus and correlation with
diabetic complications. Clin Sci (Lond) 1994;87:21-9.
157.
Yamanouchi T, Tachibana Y, Akanuma H, et al. Origin and disposal of 1,5-anhydroglucitol, a major polyol in the
human body. Am J Physiol 1992;263:E268-E273.
158.
Yamanouchi T, Ogata N, Tagaya T, et al. Clinical usefulness of serum 1,5-anhydroglucitol in monitoring glycaemic
control. Lancet 1996;347:1514-8.
159.
McGill JB, Cole TG, Nowatzke W, et al. Circulating 1,5-anhydroglucitol levels in adult patients with diabetes reflect
longitudinal changes of glycemia: a U.S. trial of the GlycoMark assay. Diabetes Care 2004;27:1859-65.
160.
Fukumura Y, Tajima S, Oshitani S, et al. Fully enzymatic method for determining 1,5-anhydro-D-glucitol in serum. Clin
Chem 1994;40:2013-6.
161.
Halperin ML, Bear RA, Hannaford MC, Goldstein MB. Selected aspects of the pathophysiology of metabolic acidosis
in diabetes mellitus. Diabetes 1981;30:781-7.
162.
Porter WH, Yao HH, Karounos DG. Laboratory and clinical evaluation of assays for beta-hydroxybutyrate. Am J Clin
Pathol 1997;107:353-8.
163.
Uno S, Ito S, Kurono M, Yamaoka Y, Kamiyama Y, Ozawa K. A simple and sensitive assay for blood ketone bodies
using highly purified 3-hydroxybutyrate dehydrogenase. Clin Chim Acta 1987;168:253-5.
164.
Kreisberg RA. Diabetic ketoacidosis: new concepts and trends in pathogenesis and treatment. Ann Intern Med
1978;88:681-95.
165.
Goldstein DE, Little RR, Lorenz RA, Malone JI, Nathan D, Peterson CM. Tests of glycemia in diabetes. Diabetes Care
1995;18:896-909.
166.
Gormsen H, Lund A. The diagnostic value of postmortem blood glucose determinations in cases of diabetes mellitus.
Forensic Sci Int 1985;28:103-7.
167.
Peclet C, Picotte P, Jobin F. The use of vitreous humor levels of glucose, lactic acid and blood levels of acetone to
establish antemortem hyperglycemia in diabetics. Forensic Sci Int 1994;65:1-6.
168.
Sulway MJ, Malins JM. Acetone in diabetic ketoacidosis. Lancet 1970;2:736-40.
169.
Astles R, Williams CP, Sedor F. Stability of plasma lactate in vitro in the presence of antiglycolytic agents. Clin Chem
1994;40:1327-30.
170.
Liss E, Bechtel S. Improvement of glucose preservation in blood samples. J Clin Chem Clin Biochem 1990;28:689-90.
171.
Rick W. Klinische Chemie und Mikroskopie, 5.Auflage, Springer Verlag. 1977.
172.
Müller. in Madea, Musshoff: Rechtsmedizin. Springer Verlag, Berlin. 2005.
173.
Thomas L. Blutglucose. In: Labor und Diagnose, Herausgeber: Thomas, L, 5.Auflage, TH Books Verlagsgesellschaft
mbH. 1998.
174.
Jeppsson JO, Kobold U, Barr J, et al. Approved IFCC reference method for the measurement of HbA1c in human
blood. Clin Chem Lab Med 2002;40:78-89.
175.
Hindle EJ, Rostron GM, Gatt JA. The diagnostic value of glycated haemoglobin levels in post-mortem blood. Ann Clin
Biochem 1985;22:144-7.
174
9. Literaturverzeichnis
176.
Goulle JP, Lacroix C, Bouige D. Glycated hemoglobin: a useful post-mortem reference marker in determining
diabetes. Forensic Sci Int 2002;128:44-9.
177.
Lemon M, Forrest AR. Fructosamine activity of proteins in serum. Clin Chem 1986;32:2101.
178.
O'Rahilly S, Burnett MA, Smith RF, Darley JH, Turner RC. Haemolysis affects insulin but not C-peptide immunoassay.
Diabetologia 1987;30:394-6.
179.
Authier F, Posner BI, Bergeron JJ. Insulin-degrading enzyme. Clin Invest Med 1996;19:149-60.
180.
Duckworth WC, Hamel FG, Bennett R, Ryan MP, Roth RA. Human red blood cell insulin-degrading enzyme and rat
skeletal muscle insulin protease share antigenic sites and generate identical products from insulin. J Biol Chem
1990;265:2984-7.
181.
Shi K. Purification and characterization of Insulin-Degrading Enzyme from human erythrocytes. In: Yokono K BSRR,
ed., 35 Edn 1996.
182.
Sapin R, Ongagna JC, Gasser F, Grucker D. Insulin measurements in haemolysed serum: influence of insulinase
inhibitors. Clin Chim Acta 1998;274:111-7.
183.
Wroblewski VJ, Masnyk M, Khambatta SS, Becker GW. Mechanisms involved in degradation of human insulin by
cytosolic fractions of human, monkey, and rat liver. Diabetes 1992;41:539-47.
184.
Haibach H, Dix JD, Shah JH. Homicide by insulin administration. J Forensic Sci 1987;32:208-16.
185.
Bray M. The effect of chilling, freezing, and rewarming on the postmortem chemistry of vitreous humor. J Forensic Sci
1984;29:404-11.
186.
Livesey JH, Hodgkinson SC, Roud HR, Donald RA. Effect of time, temperature and freezing on the stability of
immunoreactive LH, FSH, TSH, growth hormone, prolactin and insulin in plasma. Clin Biochem 1980;13:151-5.
187.
Kubasik NP, Ricotta M, Hunter T, Sine HE. Effect of duration and temperature of storage on serum analyte stability:
examination of 14 selected radioimmunoassay procedures. Clin Chem 1982;28:164-5.
188.
Mako ME, Starr JI, Rubenstein AH. Circulating proinsulin in patients with maturity onset diabetes. Am J Med
1977;63:865-9.
189.
Heding LG. Determination of total serum insulin (IRI) in insulin-treated diabetic patients. Diabetologia 1972;8:260-6.
190.
Lindstrom T, Hedman CA, Arnqvist HJ. Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of
rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 2002;25:1049-54.
191.
Bowsher RR, Lynch RA, Brown-Augsburger P, et al. Sensitive RIA for the specific determination of insulin lispro. Clin
Chem 1999;45:104-10.
192.
Andersen L, Jorgensen PN, Jensen LB, Walsh D. A new insulin immunoassay specific for the rapid-acting insulin
analog, insulin aspart, suitable for bioavailability, bioequivalence, and pharmacokinetic studies. Clin Biochem
2000;33:627-33.
193.
Thevis M, Thomas A, Delahaut P, Bosseloir A, Schanzer W. Doping control analysis of intact rapid-acting insulin
analogues in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chem 2006;78:1897-903.
194.
Thomas A, Thevis M, Delahaut P, Bosseloir A, Schanzer W. Mass spectrometric identification of degradation products
of insulin and its long-acting analogues in human urine for doping control purposes. Anal Chem 2007;79:2518-24.
195.
Associated Regional and University Pathologists. Inc. web [email protected]://www.arup-lab.com. 2009.Zugriff Mai 2012.
196.
Myrick JE, Gunter EW, Maggio VL, Miller DT, Hannon WH. An improved radioimmunoassay of C-peptide and its
application in a multiyear study. Clin Chem 1989;35:37-42.
197.
Given BD, Ostrega DM, Polonsky KS, Baldwin D, Jr., Kelley RI, Rubenstein AH. Hypoglycemia due to surreptitious
injection of insulin. Identification of insulin species by high-performance liquid chromatography. Diabetes Care
1991;14:544-7.
198.
Fierens C, Thienpont LM, Stockl D, De Leenheer AP. Matrix effect in the quantitative analysis of urinary C-peptide by
liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2000;14:936-7.
199.
Rogatsky E, Balent B, Goswami G, et al. Sensitive quantitative analysis of C-peptide in human plasma by 2dimensional liquid chromatography-mass spectrometry isotope-dilution assay. Clin Chem 2006;52:872-9.
175
9. Literaturverzeichnis
200.
Smith S. Stability of samples for insulin, proinsulin and C-peptide. In: Tolliday U SRHACPM, ed., 151 (Suppl.) Edn
1996.
201.
Bristow AF, Das RE. WHO international reference reagents for human proinsulin and human insulin C-peptide. J Biol
Stand 1988;16:179-86.
202.
Linco Research. Inc. Human C-peptide ELISA kit. St. Charles, MO: Linco
http://lincoresearch.com/protocols/ezhcp-20k.html (accessed 2009). 2009. Zugriff Mai 2012.
203.
Rogatsky E, Tomuta V, Cruikshank G, Vele L, Jayatillake H, Stein D. Direct sensitive quantitative lC/MS analysis of Cpeptide from human urine by two dimensional reverse phase/reverse phase high-performance liquid chromatography.
J Sep Sci 2006;29:529-37.
204.
Fierens C, Thienpont LM, Stockl D, Willekens E, De Leenheer AP. Quantitative analysis of urinary C-peptide by liquid
chromatography-tandem mass spectrometry with a stable isotopically labelled internal standard. J Chromatogr A
2000;896:275-8.
205.
Rodriguez-Cabaleiro D, Stockl D, Thienpont LM. Improvement of sample pretreatment prior to analysis of C-peptide in
serum by isotope-dilution liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom
2005;19:3600-2.
206.
Duckworth WC. Insulin degradation: mechanisms, products, and significance. Endocr Rev 1988;9:319-45.
207.
Ward WK, Paquette TL, Frank BH, Porte D, Jr. A sensitive radioimmunoassay for human proinsulin, with sequential
use of antisera to C-peptide and insulin. Clin Chem 1986;32:728-33.
208.
Cohen RM, Nakabayashi T, Blix PM, et al. A radioimmunoassay for circulating human proinsulin. Diabetes
1985;34:84-91.
209.
Bowsher RR, Wolny JD, Frank BH. A rapid and sensitive radioimmunoassay for the measurement of proinsulin in
human serum. Diabetes 1992;41:1084-90.
210.
Dhahir FJ, Cook DB, Self CH. Amplified enzyme-linked immunoassay of human proinsulin in serum (detection limit:
0.1 pmol/L). Clin Chem 1992;38:227-32.
211.
Kjems LL, Roder ME, Dinesen B, Hartling SG, Jorgensen PN, Binder C. Highly sensitive enzyme immunoassay of
proinsulin immunoreactivity with use of two monoclonal antibodies. Clin Chem 1993;39:2146-50.
212.
Chalk JB, Patterson M, Smith MT, Eadie MJ. Correlations between in vitro dissolution, in vivo bioavailability and
hypoglycaemic effect of oral glibenclamide. Eur J Clin Pharmacol 1986;31:177-82.
213.
Abdel-Hamid ME, Suleiman MS, el-Sayed YM, Najib NM, Hasan MM. A rapid high-performance liquid
chromatography assay of glibenclamide in serum. J Clin Pharm Ther 1989;14:181-8.
214.
Drummer OH, Kotsos A, McIntyre IM. A class-independent drug screen in forensic toxicology using a photodiode
array detector. J Anal Toxicol 1993;17:225-9.
215.
Lo DS, Chao TC, Ng-Ong SE, Yao YJ, Koh TH. Acidic and neutral drugs screen in blood with quantitation using
microbore high-performance liquid chromatography-diode array detection and capillary gas chromatography-flame
ionization detection. Forensic Sci Int 1997;90:205-14.
216.
Sener A, Gillet C, Verhelst J, DeBoeck K, Mahler C, Malaisse WJ. Factitious hypoglycaemia documented by a
modified assay for the measurement of plasma sulphonylurea. Diabet Med 1995;12:433-5.
217.
Magni F, Marazzini L, Pereira S, Monti L, Galli KM. Identification of sulfonylureas in serum by electrospray mass
spectrometry. Anal Biochem 2000;282:136-41.
218.
Nunez M, Ferguson JE, Machacek D, et al. Detection of hypoglycemic drugs in human urine using micellar
electrokinetic chromatography. Anal Chem 1995;67:3668-75.
219.
Maurer HH, Kratzsch C, Kraemer T, Peters FT, Weber AA. Screening, library-assisted identification and validated
quantification of oral antidiabetics of the sulfonylurea-type in plasma by atmospheric pressure chemical ionization
liquid chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2002;773:63-73.
220.
Ho EN, Yiu KC, Wan TS, Stewart BD, Watkins KL. Detection of anti-diabetics in equine plasma and urine by liquid
chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2004;811:65-73.
221.
Thevis M, Geyer H, Schanzer W. Identification of oral antidiabetics and their metabolites in human urine by liquid
chromatography/tandem mass spectrometry-a matter for doping control analysis. Rapid Commun Mass Spectrom
2005;19:928-36.
Research,
Inc.
176
9. Literaturverzeichnis
222.
Mittelmaier S, Funfrocken M, Fenn D, Berlich R, Pischetsrieder M. Quantification of the six major alpha-dicarbonyl
contaminants in peritoneal dialysis fluids by UHPLC/DAD/MSMS. Anal Bioanal Chem 2011;401:1183-93.
223.
Hoffmann GF, Sweetman L. O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)oxime-trimethylsilyl ester derivatives for sensitive
identification and quantitation of aldehydes, ketones, and oxoacids in biological fluids. Clin Chim Acta 1991;199:23742.
224.
Ohmori S, Mori M SKKM. Enzymology and Molecular Biology of Carbonyl Metabolism,2,Liss,New York. In: in: Weiner
H FTe, ed. 1989.
225.
Mugo SM, Bottaro CS. Rapid analysis of alpha-dicarbonyl compounds by laser desorption/ionization mass
spectrometry using 9-(3,4-diaminophenyl)acridine (DAA) as a reactive matrix. Rapid Commun Mass Spectrom
2008;22:1087-93.
226.
Chaplen FW, Fahl WE, Cameron DC. Method for determination of free intracellular and extracellular methylglyoxal in
animal cells grown in culture. Anal Biochem 1996;238:171-8.
227.
Peinado J, Lopez-Soriano FJ, Argiles JM. The metabolism of acetone in the pregnant rat. Biosci Rep 1986;6:983-9.
228.
Selvin E, Rynders GP, Steffes MW. Comparison of two assays for serum 1,5-anhydroglucitol. Clin Chim Acta
2011;412:793-5.
229.
Fukumura Y, Oshitani S, Ushijima Y, et al. Interference of maltose in Lana AG kit determination of 1,5-anhydroglucitol
and how to avoid it. Clin Chem 1992;38:2553-4.
230.
Niwa T, Dewald L, Sone J, Miyazaki T, Kajita M. Quantification of serum 1,5-anhydroglucitol in uremic and diabetic
patients by liquid chromatography/mass spectrometry. Clin Chem 1994;40:260-4.
231.
Tanabe T, Umegae Y, Koyashiki Y, et al. Fully automated flow-injection system for quantifying 1,5-anhydro-D-glucitol
in serum. Clin Chem 1994;40:2006-12.
232.
Tanaka S, Nakamori K, Akanuma H, Yabuuchi M. High performance liquid chromatographic determination of 1,5anhydroglucitol in human plasma for diagnosis of diabetes mellitus. Biomed Chromatogr 1992;6:63-6.
233.
Katayama M, Matsuda Y, Kobayashi K, Kaneko S, Ishikawa H. Simultaneous determination of glucose, 1,5-anhydrod-glucitol and related sugar alcohols in serum by high-performance liquid chromatography with benzoic acid
derivatization. Biomed Chromatogr 2006;20:440-5.
234.
Yamanouchi T, Akanuma Y. Serum 1,5-anhydroglucitol (1,5 AG): new clinical marker for glycemic control. Diabetes
Res Clin Pract 1994;24 Suppl:S261-8.:S261-S268.
235.
Li S, Heng X, Sheng H, Wang Y, Yu C. Determination of glycemic monitoring marker 1,5-anhydroglucitol in plasma by
liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
2008;875:459-64.
236.
Onorato JM, Langish RA, Shipkova PA, et al. A novel method for the determination of 1,5-anhydroglucitol, a glycemic
marker, in human urine utilizing hydrophilic interaction liquid chromatography/MS(3). J Chromatogr B Analyt Technol
Biomed Life Sci 2008;873:144-50.
237.
Winter WE. Evaluation of hypoglycemia and hyperglycemia. In Jialal I, Winter WE, Chan DW, eds. Handbook of
Diagnostic Endocrinology. Washington: AACC Press. 1999.
238.
Young DS. Effects of Drugs on Clinical Laboratoty tests. Vol.1.Washington:AACC Press., 3 Edn 2000.
239.
Sacks DB. Carbohydrates. In: Burtis C, Ashwood E, eds. Tietz textbook of clinical chemistry, 3rd ed. Philadelphia: WB
Saunders. 1999.
240.
Byrne HA, Tieszen KL, Hollis S, Dornan TL, New JP. Evaluation of an electrochemical sensor for measuring blood
ketones. Diabetes Care 2000;23:500-3.
241.
Marliss EB, Ohman JL, Jr., Aoki TT, Kozak GP. Altered redox state obscuring ketoacidosis in diabetic patients with
lactic acidosis. N Engl J Med 1970;283:978-80.
242.
Felby S, Nielsen E. Determination of ketone bodies in postmortem blood by head-space gas chromatography.
Forensic Sci Int 1994;64:83-8.
243.
Schwenk WF, Berg PJ, Beaufrere B, Miles JM, Haymond MW. Use of t-butyldimethylsilylation in the gas
chromatographic/mass spectrometric analysis of physiologic compounds found in plasma using electron-impact
ionization. Anal Biochem 1984;141:101-9.
177
9. Literaturverzeichnis
244.
Miles JM, Schwenk WF, McClean KL, Haymond MW. Determination of ketone body turnover in vivo with stable
isotopes, utilizing gas chromatography/mass spectrometry. Anal Biochem 1984;141:110-5.
245.
Des RC, Montgomery JA, Desrochers S, et al. Interference of 3-hydroxyisobutyrate with measurements of ketone
body concentration and isotopic enrichment by gas chromatography-mass spectrometry. Anal Biochem 1988;173:96105.
246.
Moreau NM, Goupry SM, Antignac JP, et al. Simultaneous measurement of plasma concentrations and 13Cenrichment of short-chain fatty acids, lactic acid and ketone bodies by gas chromatography coupled to mass
spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2003;784:395-403.
247.
Laun RA, Rapsch B, Abel W, et al. The determination of ketone bodies: preanalytical, analytical and physiological
considerations. Clin Exp Med 2001;1:201-9.
248.
Custer EM, Myers JL, Poffenbarger PL, Schoen I. The storage stability of 3-hydroxybutyrate in serum, plasma, and
whole blood. Am J Clin Pathol 1983;80:375-80.
249.
Yamazaki M, Ogura Y, Wakasugi C, Mitsukuni Y, Yoshimura M. Sudden death due to diabetic coma in insulindepartment diabetes mellitus: an autopsy report. Nihon Hoigaku Zasshi 1997;51:102-10.
250.
Lund A. Adrenaline and noradrenaline in post mortem blood. Med Sci Law 1964;4:194-7.:194-7.
251.
Coe JI. Postmortem chemistry: practical considerations and a review of the literature. J Forensic Sci 1974;19:13-32.
252.
Warrell D. Oxford textbook of medicine. 4 ed. Oxford: Oxford University Press. In: Cox T, Firth J, eds. 2003.
253.
R.L.Mitchell. The molar ratio of insulin to C peptide. In: A.M.Stanley, ed., 153 Edn 1993.
254.
Sturner WQ, Gantner GE. Postmortem vitreous glucose determinations. J Forensic Sci 1964;9:485-91.
255.
Lundquist O, Osterlin S. Glucose concentration in the vitreous of nondiabetic and diabetic human eyes. Graefes Arch
Clin Exp Ophthalmol 1994;232:71-4.
256.
Coe JI. Postmortem chemistries on human vitreous humor. Am J Clin Pathol 1969;51:741-50.
257.
Bray M, Luke JL, Blackbourne BD. Vitreous humor chemistry in deaths associated with rapid chilling and prolonged
freshwater immersion. J Forensic Sci 1983;28:588-93.
258.
Zilg B, Alkass K, Berg S, Druid H. Postmortem identification of hyperglycemia. Forensic Sci Int 2009;185:89-95.
259.
Coe JI. Postmortem chemistry of blood, cerebrospinal fluid, and vitreous humor. Leg Med Annu 1977;1976:55-92.:5592.
260.
F.Traub. Methode zur Erkennung von tödlichen Zuckerstoffwechselstörungen an der Leiche (Diabetes mellitus und
Hypoglykämie)., 112 Edn 1969.
261.
Sippel H, Mottonen M. Combined glucose and lactate values in vitreous humour for postmortem diagnosis of diabetes
mellitus. Forensic Sci Int 1982;19:217-22.
262.
De Letter EA, Piette MH. Can routinely combined analysis of glucose and lactate in vitreous humour be useful in
current forensic practice? Am J Forensic Med Pathol 1998;19:335-42.
263.
Kleine TO, Baerlocher K, Niederer V, et al. [Diagnostic significance of lactate concentration in CSF in patients with
meningitis. Dtsch Med Wochenschr 1979;104:553-7.
264.
Palmiere C, Sporkert F, Vaucher P, et al. Is the formula of Traub still up to date in antemortem blood glucose level
estimation? Int J Legal Med 2012;126:407-13.
265.
Canfield DV, Chaturvedi AK, Boren HK, Veronneau SJ, White VL. Abnormal glucose levels found in transportation
accidents. Aviat Space Environ Med 2001;72:813-5.
266.
Chen C, Glagov S, Mako M, Rochman H, Rubenstein AH. Post-mortem glycosylated hemoglobin (HbA1c): evidence
for a history of diabetes mellitus. Ann Clin Lab Sci 1983;13:407-10.
267.
Osuna E, Garcia-Villora A, Perez-Carceles MD, et al. Vitreous humor fructosamine concentrations in the autopsy
diagnosis of diabetes mellitus. Int J Legal Med 1999;112:275-9.
268.
Vivero G, Vivero-Salmeron G, Perez C, Bedate A, Luna A, Osuna E. Combined determination of glucose and
fructosamine in vitreous humor as a post-mortem tool to identify antemortem hyperglycemia. Rev Diabet Stud
2008;5:220-4.
th
178
9. Literaturverzeichnis
269.
Coe JI. Postmortem chemistry update. Emphasis on forensic application. Am J Forensic Med Pathol 1993;14:91-117.
270.
Forrest AR. ACP Broadsheet no 137: April 1993. Obtaining samples at post mortem examination for toxicological and
biochemical analyses. J Clin Pathol 1993;46:292-6.
271.
Karlovsek MZ. Diagnostic values of combined glucose and lactate values in cerebrospinal fluid and vitreous humour-our experiences. Forensic Sci Int 2004;146 Suppl:S19-23.:S19-S23.
272.
Ritz S, Kaatsch HJ. [Postmortem diagnosis of fatal diabetic metabolic dyscontrol: what is the significance of
cerebrospinal fluid and vitreous body total values and HbA1c. Pathologe 1990;11:158-65.
273.
Kugler J, Oehmichen M. [Studies of glucose metabolism in the cadaver]. Beitr Gerichtl Med 1986;44:185-8.:185-8.
274.
Kernbach G, Picht S, Brinkmann B, Puschel K. [Initial results of postmortem diagnosis of diabetes mellitus by Hb A1
determination]. Z Rechtsmed 1983;90:303-8.
275.
Winecker RE, Hammett-Stabler CA, Chapman JF, Ropero-Miller JD. HbA1c as a postmortem tool to identify glycemic
control. J Forensic Sci 2002;47:1373-9.
276.
Valenzuela A. Postmortem diagnosis of diabetes mellitus. Quantitation of fructosamine and glycated hemoglobin.
Forensic Sci Int 1988;38:203-8.
277.
Prior TW, Chapman JF, Bankson DD. Sensitivity of serum fructosamine in short term glycemic control. Ann Clin Lab
Sci 1989;19:107-13.
278.
John WG, Scott KW, Hawcroft DM. Glycated haemoglobin and glycated protein and glucose concentrations in
necropsy blood samples. J Clin Pathol 1988;41:415-8.
279.
O.Lindquist. Determination of insulin and glucose post mortem. Z Rechtsmed 1975: 75 (4); 275-277.
280.
Patel F. Fatal self-induced hyperinsulinaemia: a delayed post-mortem analytical detection. Med Sci Law 1992;32:1519.
281.
Lottspeich F EJ. Bioanalytik (2.Auflage). Spektrum, Akademischer Verlag. 2006.
282.
Hopfgartner G, Varesio E, Tschappat V, Grivet C, Bourgogne E, Leuthold LA. Triple quadrupole linear ion trap mass
spectrometer for the analysis of small molecules and macromolecules. J Mass Spectrom 2004;39:845-55.
283.
Hager JW, Le Blanc JC. High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with a new
quadrupole/linear ion trap instrument. J Chromatogr A 2003;1020:3-9.
284.
Hager JW. Recent trends in mass spectrometer development. Anal Bioanal Chem 2004;378:845-50.
285.
Polettini A (Hrsg.). Applications of LC-MS in Toxicology. Pharmaceutical Press (Grayslake, USA), 2006. ISBN-13:
978-0853696292. 2013.
286.
Albermann ME, Musshoff F, Madea B. A fully validated high-performance liquid chromatography-tandem mass
spectrometry method for the determination of ethyl glucuronide in hair for the proof of strict alcohol abstinence. Anal
Bioanal Chem 2010.
287.
Peters FT, Drummer O, Musshoff F. Anhang B zur Richtlinie der GTFCh zur Qualitätssicherung bei forensichtoxikologischen
Untersuchungen:
Anforderung
an
die
Validierung
von
Analysensystemen.
https://www.gtfch.org/cms/files/GTFCh_Richtlinie_Anhang%20B_Validierung_Version%201.pdf, Zugriff im November
2011.
288.
International Conference on Harmonization (ICH). Validation of Analytical Methods: Methodology; ICH Q2 B. 1996.
289.
Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Matrix effect in quantitative LC/MS/MS analyses of biological
fluids: a method for determination of finasteride in human plasma at picogram per milliliter concentrations. Anal Chem
1998;70:882-9.
290.
Shah VP, Midha KK, Dighe S, et al. Analytical methods validation: bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetic
studies. Conference report. Eur J Drug Metab Pharmacokinet 1991;16:249-55.
291.
Lequin RM. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clin Chem 2005;51:2415-8.
292.
Peters FT, Drummer OH, Musshoff F. Validation of new methods. Forensic Sci Int 2007;165:216-24.
179
9. Literaturverzeichnis
293.
Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Matrix effect in quantitative LC/MS/MS analyses of biological
fluids: a method for determination of finasteride in human plasma at picogram per milliliter concentrations. Anal Chem
1998;70:882-9.
294.
Marcovina S, Bowsher RR, Miller WG, et al. Standardization of insulin immunoassays: report of the American
Diabetes Association Workgroup. Clin Chem 2007;53:711-6.
295.
Manley SE, Stratton IM, Clark PM, Luzio SD. Comparison of 11 human insulin assays: implications for clinical
investigation and research. Clin Chem 2007;53:922-32.
296.
Thevis M, Thomas A, Delahaut P, Bosseloir A, Schanzer W. Qualitative determination of synthetic analogues of
insulin in human plasma by immunoaffinity purification and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for
doping control purposes. Anal Chem 2005;77:3579-85.
297.
Erin E Chambers, Cristina Legido-Quigley, Norman Smith, Kenneth J Fountain. Development of a fast method for
direct analysis of intact synthetic insulins in human plasma: the large peptide challenge. 2013. Bioanalysis, 5(1) 6581.
298.
Ho EN, Wan TS, Wong AS, Lam KK, Stewart BD. Doping control analysis of insulin and its analogues in equine urine
by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A 2011;1218:1139-46.
299.
Thomas A, Schanzer W, Delahaut P, Thevis M. Sensitive and fast identification of urinary human, synthetic and
animal insulin by means of nano-UPLC coupled with high-resolution/high-accuracy mass spectrometry. Drug Test
Anal 2009;1:219-27.
300.
Dhar A, Desai K, Liu J, Wu L. Methylglyoxal, protein binding and biological samples: are we getting the true measure?
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2009;877:1093-100.
301.
Fedoronko M KJ. Kinetik und Mechanismus der Disproportionierung von Methylglyoxal zu Milchsäure., 34 Edn 1971.
302.
Handbook of Chemistry and Physics, CRC press, New York. 92nd Edition. 2011.
303.
Kampf CJ, Bonn B, Hoffmann T. Development and validation of a selective HPLC-ESI-MS/MS method for the
quantification of glyoxal and methylglyoxal in atmospheric aerosols (PM2.5). Anal Bioanal Chem 2011;401:3115-24.
304.
Racker E. The mechanism of action of glyoxalase. J Biol Chem 1951;190:685-96.
305.
Wild R, Ooi L, Srikanth V, Munch G. A quick, convenient and economical method for the reliable determination of
methylglyoxal in millimolar concentrations: the N-acetyl-L-cysteine assay. Anal Bioanal Chem 2012;403:2577-81.
306.
Chaplen FW, Fahl WE, Cameron DC. Evidence of high levels of methylglyoxal in cultured Chinese hamster ovary
cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:5533-8.
307.
Lo TW, Westwood ME, McLellan AC, Selwood T, Thornalley PJ. Binding and modification of proteins by
methylglyoxal under physiological conditions. A kinetic and mechanistic study with N alpha-acetylarginine, N alphaacetylcysteine, and N alpha-acetyllysine, and bovine serum albumin. J Biol Chem 1994;269:32299-305.
308.
Ahmed MU, Brinkmann FE, Degenhardt TP, Thorpe SR, Baynes JW. N-epsilon-(carboxyethyl)lysine, a product of the
chemical modification of proteins by methylglyoxal, increases with age in human lens proteins. Biochem J
1997;324:565-70.
309.
Ahmed N, Thornalley PJ. Chromatographic assay of glycation adducts in human serum albumin glycated in vitro by
derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and intrinsic fluorescence. Biochem J
2002;364:15-24.
310.
Nagaraj RH, Shipanova IN, Faust FM. Protein cross-linking by the Maillard reaction. Isolation, characterization, and in
vivo detection of a lysine-lysine cross-link derived from methylglyoxal. J Biol Chem 1996;271:19338-45.
311.
Engelbrecht B, Gawlowski T, Poschmann G, Eisenacher M, Meyer HE, Hess C, Tschoepe D, Stühler K, Stratmann B.
Proteom-based analysis of intracellular Methylglyoxal accumulation by Glyoxalase 1 knock down in human aortic
endothelial cells. Submitted to Diabetologia.
312.
Engelbrecht B, Stratmann B, Hess C, Tschoepe D, Gawlowski T. Impact of Methylglyoxal on GLUT4 Translocation in
L6 Myoblasts. (revised manuscript submitted to PloS One).
313.
Fuller ET, Miller MA, Kaylor DW, Janke C. Lantus overdose: case presentation and management options. J Emerg
Med 2009;36:26-9.
314.
Brvar M, Mozina M, Bunc M. Poisoning with insulin glargine. Clin Toxicol (Phila) 2005;43:219-20.
180
9. Literaturverzeichnis
315.
Samuels MH, Eckel RH. Massive insulin overdose: detailed studies of free insulin levels and glucose requirements. J
Toxicol Clin Toxicol 1989;27:157-68.
316.
Owens DR, Coates PA, Luzio SD, Tinbergen JP, Kurzhals R. Pharmacokinetics of 125I-labeled insulin glargine (HOE
901) in healthy men: comparison with NPH insulin and the influence of different subcutaneous injection sites.
Diabetes Care 2000;23:813-9.
317.
Lu M, Inboriboon PC. Lantus insulin overdose: a case report. J Emerg Med 2011;41:374-7.
318.
Warriner D, Debono M, Gandhi RA, Chong E, Creagh F. Acute hepatic injury following treatment of a long-acting
insulin analogue overdose necessitating urgent insulin depot excision. Diabet Med 2012;29:232-5.
319.
Brvar M, Mozina M, Bunc M. Prolonged hypoglycaemia after insulin lispro overdose. Eur J Emerg Med 2005;12:2345.
320.
Snorgaard O, Kjems LL, Roder ME, Hartling SG, Dinesen B, Binder C. Proinsulin immunoreactivity in recent-onset
IDDM: the significance of insulin antibodies and insulin autoantibodies. Diabetes Care 1996;19:146-50.
321.
Glatstein M, Garcia-Bournissen F, Scolnik D, Koren G. Sulfonylurea intoxication at a tertiary care paediatric hospital.
Can J Clin Pharmacol 2010;17:e51-e56.
322.
Klonoff DC, Barrett BJ, Nolte MS, Cohen RM, Wyderski R. Hypoglycemia following inadvertent and factitious
sulfonylurea overdosages. Diabetes Care 1995;18:563-7.
323.
Litovitz TL, Klein-Schwartz W, Dyer KS, Shannon M, Lee S, Powers M. 1997 annual report of the American
Association of Poison Control Centers Toxic Exposure Surveillance System. Am J Emerg Med 1998;16:443-97.
324.
AHFS Drug Information. American Hospital Formulary Serice Board oft the American Society of Health System
Pharmacists 68: 2595-2597. 1998.
325.
Spiller HA, Villalobos D, Krenzelok EP, et al. Prospective multicenter study of sulfonylurea ingestion in children. J
Pediatr 1997;131:141-6.
326.
Little GL, Boniface KS. Are one or two dangerous? Sulfonylurea exposure in toddlers. J Emerg Med 2005;28:305-10.
327.
Hussain K, Mundy H, ynsley-Green A, Champion M. A child presenting with disordered consciousness, hallucinations,
screaming episodes and abdominal pain. Eur J Pediatr 2002;161:127-9.
328.
Szlatenyi CS, Capes KF, Wang RY. Delayed hypoglycemia in a child after ingestion of a single glipizide tablet. Ann
Emerg Med 1998;31:773-6.
329.
McKendry JB. Fatal hypoglycaemic coma from the use of tolbutamide (orinase). Can Med Assoc J 1957;76:572-3.
330.
Nakayama S, Hirose T, Watada H, Tanaka Y, Kawamori R. Hypoglycemia following a nateglinide overdose in a
suicide attempt. Diabetes Care 2005;28:227-8.
331.
Ikenoue T, Okazaki K, Fujitani S, et al. Effect of a new hypoglycemic agent, A-4166 [(-)-N-(trans-4isopropylcyclohexanecarbonyl)-D-phenylalanine], on postprandial blood glucose excursion: comparison with
voglibose and glibenclamide. Biol Pharm Bull 1997;20:354-9.
332.
Hirshberg B, Skarulis MC, Pucino F, Csako G, Brennan R, Gorden P. Repaglinide-induced factitious hypoglycemia. J
Clin Endocrinol Metab 2001;86:475-7.
333.
Owens DR. Repaglinide: a new short-acting insulinotropic agent for the treatment of type 2 diabetes. Eur J Clin Invest
1999;29 Suppl 2:30-7.:30-7.
334.
Iwamoto Y, Taniguchi T, Nonaka K, et al. Dose-ranging efficacy of sitagliptin, a dipeptidyl peptidase-4 inhibitor, in
Japanese patients with type 2 diabetes mellitus. Endocr J 2010;57:383-94.
335.
Furukawa S, Kumagi T, Miyake T, et al. Suicide attempt by an overdose of sitagliptin, an oral hypoglycemic agent: a
case report and a review of the literature. Endocr J 2012;59:329-33.
336.
Januszewski AS, Karschimkus C, Davis KE, O'Neal D, Ward G, Jenkins AJ. Plasma 1,5 anhydroglucitol levels, a
measure of short-term glycaemia: assay assessment and lower levels in diabetic vs. non-diabetic subjects. Diabetes
Res Clin Pract 2012;95:e17-e19.
337.
Yamanouchi T, Akanuma Y, Toyota T, et al. Comparison of 1,5-anhydroglucitol, HbA1c, and fructosamine for
detection of diabetes mellitus. Diabetes 1991;40:52-7.
181
9. Literaturverzeichnis
338.
Won JC, Park CY, Park HS, et al. 1,5-Anhydroglucitol reflects postprandial hyperglycemia and a decreased
insulinogenic index, even in subjects with prediabetes and well-controlled type 2 diabetes. Diabetes Res Clin Pract
2009;84:51-7.
339.
Koga M, Murai J, Saito H, et al. Serum 1,5-anhydroglucitol levels in patients with fulminant type 1 diabetes are lower
than those in patients with type 2 diabetes. Clin Biochem 2010;43:1265-7.
340.
Akanuma Y, Morita M, Fukuzawa N, Yamanouchi T, Akanuma H. Urinary excretion of 1,5-anhydro-D-glucitol
accompanying glucose excretion in diabetic patients. Diabetologia 1988;31:831-5.
341.
Nowatzke W, Sarno MJ, Birch NC, Stickle DF, Eden T, Cole TG. Evaluation of an assay for serum 1,5-anhydroglucitol
(GlycoMark) and determination of reference intervals on the Hitachi 917 analyzer. Clin Chim Acta 2004;350:201-9.
342.
Gotoh M, Li C, Yatoh M, Iguchi A, Hirooka Y. Serum uric acid concentrations in type 2 diabetes: its significant
relationship to serum 1,5-anhydroglucitol concentrations. Endocr Regul 2005;39:119-25.
343.
Koga M, Murai J, Saito H, et al. 1,5-Anhydroglucitol levels are low irrespective of plasma glucose levels in patients
with chronic liver disease. Ann Clin Biochem 2011;48:121-5.
344.
Koga M, Murai J, Saito H, Mukai M, Kasayama S. Habitual intake of dairy products influences serum 1,5anhydroglucitol levels independently of plasma glucose. Diabetes Res Clin Pract 2010;90:122-5.
345.
Selvin E, Steffes MW, Ballantyne CM, Hoogeveen RC, Coresh J, Brancati FL. Racial differences in glycemic markers:
a cross-sectional analysis of community-based data. Ann Intern Med 2011;154:303-9.
346.
Fujisawa T, Ikegami H, Tsutsui T, et al. Renal tubular function affects glycosuria-related urinary excretion of 1,5anhydroglucitol. Diabetes Care 1999;22:863-4.
347.
Connor H, Scarpello JH. An insulinoma presenting with reactive hypoglycaemia. Postgrad Med J 1979;55:735-8.
348.
Kerr D, Macdonald IA, Heller SR, Tattersall RB. Alcohol causes hypoglycaemic unawareness in healthy volunteers
and patients with type 1 (insulin-dependent) diabetes. Diabetologia 1990;33:216-21.
349.
Quester. In: Madea: Rechtsmedizin. Springer Verlag, Berlin. 2007.
350.
Frier BM. Hypoglycemia and driving performance. Diabetes Care 2000;23:148-50.
351.
Schneider S, Beyer J, Sarnighausen HE, et al. [Comparison of hypoglycemia perception and hormonal
counterregulation in controlled hypoglycemia. A contribution to diagnosis of hypoglycemia unawareness syndrome in
type 1 diabetic patients]. Dtsch Med Wochenschr 2000;125:177-81.
352.
Gerich JE, Mokan M, Veneman T, Korytkowski M, Mitrakou A. Hypoglycemia unawareness. Endocr Rev 1991;12:35671.
353.
Bolli GB. Prevention and treatment of hypoglycaemia unawareness in type 1 diabetes mellitus. Acta Diabetol
1998;35:183-93.
354.
Boyle PJ, Kempers SF, O'Connor AM, Nagy RJ. Brain glucose uptake and unawareness of hypoglycemia in patients
with insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1995;333:1726-31.
355.
Fanelli C, Pampanelli S, Epifano L, et al. Relative roles of insulin and hypoglycaemia on induction of neuroendocrine
responses to, symptoms of, and deterioration of cognitive function in hypoglycaemia in male and female humans.
Diabetologia 1994;37:797-807.
356.
D.Kerr. Drugs and alcohol. in: B. Fier, M. Fisher (Eds.),Hypoglycemia and Diabetes, Arnold, London
336. 1993.
357.
Marks V, Teale JD. Hypoglycemia: factitious and felonious. Endocrinol Metab Clin North Am 1999;28:579-601.
358.
Kernbach-Wighton G, Sprung R, Puschel K. On the diagnosis of hypoglycemia in car drivers--including a review of the
literature. Forensic Sci Int 2001;115:89-94.
359.
Farrell v. Stirling. 1976. In: 40 J. Crim. L. 171 (1976) In the Scottish Courts - Comments on Cases.
360.
Mcleod v. Mathieson. 1993 S.C.C.R. 488 (Sh.Ct.). In:
http://www.lemac.co.uk/resources/guides/Road_Traffic_Prosecution.htm. Zugriff 05.02.2013.
361.
Rogers DJ, Stark MM. Driving whilst unfit through drugs. J Clin Forensic Med 1999;6:166-7.
362.
Bovill D. A case of functional hypoglycaemia--a medico-legal problem. Br J Psychiatry 1973;123:353-8.
182
9. Literaturverzeichnis
363.
Watmore
05.02.2013
vs.
Jenkins.
http://sixthformlaw.info/02_cases/mod3a/cases_60_gen_def_automatism.htm.Zugriff
364.
Diabetes
in
Control.com
98
(14).
Hypoglycemia
a
Defense
http://www.diabetesincontrol.com/articles/53-diabetes-news/178-. Zugriff am 05.02.2013.
365.
DIE ZEIT. 20 (16.05.1957).
366.
Hill E. Significance of dextrose and nondextrose reducing substances in post-mortem blood. Arch Pathol 1941: 32;
452-473
367.
Osuna E, Vivero G, Conejero J, et al. Postmortem vitreous humor beta-hydroxybutyrate: its utility for the postmortem
interpretation of diabetes mellitus. Forensic Sci Int 2005;153:189-95.
368.
Wunder C. Systematische Untersuchungen zur Problematik postmortaler Insulin-Instabilität. Doktorarbeit am Institut
für Rechtsmedizin der Universität Frankfurt. 2011.
369.
M.Muhm. Zur Möglichkeit der postmortalen Dianose einer exogenen Insulinintoxikation. In: A.Berlanovich, ed., 36 Edn
1991.
370.
Winston DC. Suicide via insulin overdose in nondiabetics: the New Mexico experience. Am J Forensic Med Pathol
2000;21:237-40.
371.
Shires TK, Braddock KJ, Pulido JS. Insulin in the vitreous of the normal and streptozotocin-induced diabetic rat.
Peptides 1992;13:671-5.
372.
Thevis M, Thomas A, Schanzer W, Ostman P, Ojanpera I. Measuring insulin in human vitreous humour using LCMS/MS. Drug Test Anal 2012;4:53-6.
373.
Nowicka J, Skowronek R, Czech E, Kulikowska J, Olszowy Z. Comments on 'Measuring insulin in human vitreous
humour using LC-MS/MS' by Thevis et al. Drug Test Anal 2012;10.
374.
Sturner WQ, Putnam RS. Suicidal insulin poisoning with nine day survival: recovery in bile at autopsy by
radioimmunoassay. J Forensic Sci 1972;17:514-21.
375.
Mirsky IA, Podore CJ, . The urinary excretion of insulin by normal and diabetic subjects. J Clin Invest 1948;27:515-9.
376.
Thevis M, Thomas A, Schanzer W. Mass spectrometric determination of insulins and their degradation products in
sports drug testing. Mass Spectrom Rev 2008;27:35-50.
377.
Kuerzel GU, Shukla U, Scholtz HE, et al. Biotransformation of insulin glargine after subcutaneous injection in healthy
subjects. Curr Med Res Opin 2003;19:34-40.
378.
Authier F, Danielsen GM, Kouach M, Briand G, Chauvet G. Identification of insulin domains important for binding to
and degradation by endosomal acidic insulinase. Endocrinology 2001;142:276-89.
379.
Vogl A, Youngwirth SH. The effects of a single dose of 2000 units of protamine zinc insulin taken by a diabetic patient
with suicidal intent. N Engl J Med 1949;241:606-9.
380.
Shibutani Y, Ogawa C. Suicidal insulin overdose in a type 1 diabetic patient: relation of serum insulin concentrations
to the duration of hypoglycemia. J Diabetes Complications 2000;14:60-2.
381.
Fasching P, Roden M, Stuhlinger HG, et al. Estimated glucose requirement following massive insulin overdose in a
patient with type 1 diabetes. Diabet Med 1994;11:323-5.
382.
Laffel L. Ketone bodies: a review of physiology, pathophysiology and application of monitoring to diabetes. Diabetes
Metab Res Rev 1999;15:412-26.
383.
Sheikh-Ali M, Karon BS, Basu A, et al. Can serum beta-hydroxybutyrate be used to diagnose diabetic ketoacidosis?
Diabetes Care 2008;31:643-7.
384.
Umpierrez GE, Watts NB, Phillips LS. Clinical utility of beta-hydroxybutyrate determined by reflectance meter in the
management of diabetic ketoacidosis. Diabetes Care 1995;18:137-8.
385.
Luzi L, Barrett EJ, Groop LC, Ferrannini E, DeFronzo RA. Metabolic effects of low-dose insulin therapy on glucose
metabolism in diabetic ketoacidosis. Diabetes 1988;37:1470-7.
386.
Wallace TM, Meston NM, Gardner SG, Matthews DR. The hospital and home use of a 30-second hand-held blood
ketone meter: guidelines for clinical practice. Diabet Med 2001;18:640-5.
for
Manslaughter.
183
9. Literaturverzeichnis
387.
Stephens JM, Sulway MJ, Watkins PJ. Relationship of blood acetoacetate and 3-hydroxybutyrate in diabetes.
Diabetes 1971;20:485-9.
388.
Iten PX. ß-Hydroxybuttersäure, ein Indikator für eine alkoholische Ketoacidose als Todesursache bei unerwartet
verstorbenen Alkoholikern. 75. DGRM-Jahrestagung, 24.-28.09.1996, Universität Zürich. In: Meier M BW, ed. 1996.
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