Aptima HIV-1 Quant Dx assay package insert

Aptima HIV-1 Quant Dx assay package insert
Aptima®
Aptima® HIV-1 Quant Dx Assay
In-vitro-Diagnostikum.
Nur zum US-Export.
Allgemeine Informationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Verwendungszweck . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Zusammenfassung und Testerklärung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Testprinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Lagerungs- und Handhabungsbedingungen für Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Probenentnahme und -lagerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Proben auf dem Panther System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Transport von Patientenproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Panther System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Im Lieferumfang enthaltene Reagenzien und Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Erforderliche, jedoch nicht im Lieferumfang enthaltene Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Optionale Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Testverfahren mit dem Panther System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Verfahrenshinweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Assay-Kalibrierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Negativ- und Positivkontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Interner Kalibrator/Interne Kontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Testauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Einschränkungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Leistung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Nachweisgrenze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Nachweisgrenze bei HIV-1-Subtypen und -Gruppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Linearer Bereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Linearität bei HIV-1-Subtypen und -Gruppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bestimmung der unteren Quantifizierungsgrenze mithilfe des 3. internationalen WHO-Standards . .
Verifizierung der LLOQ bei HIV-1-Subtypen und -Gruppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Präzision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Stoffe mit möglicher beeinträchtigender Wirkung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Spezifität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Analytische Spezifität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Wiederholbarkeit bei klinischen Patientenproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Probenverdünnung mit Probenverdünner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Methodenkorrelation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Diagnostische Übereinstimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Verschleppung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Serokonversionspanel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Serum, Plasmaäquivalenz-Studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Bibliographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Aptima®
Allgemeine Informationen
Allgemeine Informationen
Verwendungszweck
Der Aptima® HIV-1 Quant Dx Assay ist ein In-vitro-Nukleinsäure-Amplifikationstest zum
Nachweis und zur Quantifizierung von RNA des humanen Immunschwächevirus Typ 1
(HIV-1) auf dem voll automatisierten Panther® System. Er ist zur Verwendung als Hilfsmittel
bei der Diagnose einer HIV-1-Infektion, zur Bestätigung einer HIV-1-Infektion und als
Hilfsmittel beim klinischen Management von Patienten mit HIV-1-Infektion bestimmt.
Der Aptima HIV-1 Quant Dx Assay kann als Hilfsmittel bei der Diagnose eine HIV-1-Infektion,
einschließlich einer Akut- oder Primärinfektion, verwendet werden. Das Vorhandensein von
HIV-1-RNA im Plasma oder Serum von Patienten ohne Antikörper gegen HIV-1 weist auf
eine akute oder primäre HIV-1-Infektion hin. Der Aptima HIV-1 Quant Dx Assay kann
ergänzend zur Testung von Patientenproben eingesetzt werden, die in zugelassenen HIVImmunassays mehrmals reaktiv waren. Erweist sich eine solche Patientenprobe im Aptima
HIV-1 Quant Dx Assay als reaktiv, ist dies eine Bestätigung der HIV-1-Infektion.
Der Aptima HIV-1 Quant Dx Assay kann auch in Verbindung mit dem klinischen Bild und
anderen Labormarkern zur Krankheitsprognose bei HIV-1-Infizierten angewendet werden.
Der Aptima HIV-1 Quant Dx Assay kann als Hilfsmittel zur Überwachung der Wirksamkeit
einer antiretroviralen Behandlung durch Messen von Veränderungen der HIV-1-RNAKonzentration im Plasma herangezogen werden.
Wenn der Aptima HIV-1 Quant Dx Assay als Hilfsmittel zur Diagnose einer HIV-1-Infektion
verwendet wird, muss die Leistung hinsichtlich qualitativer Ergebnisse sowohl mit Plasmaals auch mit Serumproben festgestellt werden. Bei Verwendung als Hilfsmittel bei der
Überwachung der Wirksamkeit einer antiretroviralen Therapie muss die Leistung hinsichtlich
quantitativer Ergebnisse lediglich mit Plasmaproben festgestellt werden. Serumproben
können für quantitative Ergebnisse nicht verwendet werden.
Dieser Assay ist nicht für die Verwendung beim Screening von Blut- oder Plasmaspendern
bestimmt.
Zusammenfassung und Testerklärung
Epidemiologische Studien identifizierten das humane Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1) als
Etiological Agent des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) (1-7). HIV kann durch
sexuellen Kontakt, Exposition gegenüber infiziertem Blut oder infizierten Blutprodukten oder von
einer HIV-positiven Mutter auf das ungeborene Kind übertragen werden (8). Nach einer HIVExposition entwickeln die Infizierten innerhalb von 3 bis 6 Wochen im Allgemeinen ein kurzes,
akutes Syndrom mit grippeartiger Symptomatik und ausgeprägter Virämie im peripheren Blut
(9-12). Bei den meisten Infizierten folgt auf diese Frühphase eine HIV-spezifische Immunreaktion
und ein Rückgang der Plasmavirämie, in der Regel innerhalb von 4 bis 6 Wochen nach
Symptombeginn (13-14). Nach der Serokonversion tritt bei den Infizierten normalerweise eine
klinische stabile, asymptomatische Phase ein, die jahrelang andauern kann (15-17). Die
asymptomatische Phase ist durch persistierende, geringe Plasmavirämie (18) und eine
allmähliche Depletion von CD4-positiven T-Lymphozyten gekennzeichnet. Diese Depletion führt
zu gravierender Immunschwäche, multiplen opportunistischen Infektionen, Tumorerkrankungen
und zum Tod (19). Wenngleich die Viruszahl im peripheren Blut in der asymptomatischen Phase
der Infektion relativ niedrig ist, scheint es sich bei der Replikation und Beseitigung des Virus um
dynamische Prozesse zu handeln, bei denen sich eine rasche Virusbildung und die Infektion von
CD4-positiven Zellen mit einer gleich raschen Viruseliminierung, dem Tod infizierter Zellen und
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Allgemeine Informationen
der Erneuerung von CD4-positiven Zellen die Waage halten, sodass die Plasmavirämie und die
Zahl der CD4-positiven Zellen relativ stabil bleiben (20-22).
Quantitative Messungen von HIV im peripheren Blut haben gezeigt, dass höhere Viruszahlen
möglicherweise mit einem erhöhten Risiko einer klinischen Progression von HIV-assoziierten
Krankheiten einhergehen, Verringerungen der Viruszahl im Plasma dagegen mit einem
verringerten Risiko für eine klinische Progression (23-25). Die Viruszahl im peripheren Blut
lässt sich durch Messung des HIV p24-Antigens im Serum, durch quantitative Kultur von HIV
aus Plasma oder durch direkte Messung viraler RNA im Plasma mittels NukleinsäureAmplifikations- oder Signalamplifikationstechnologien quantifizieren (26-30).
Die Detektion einer HIV-1-Infektion beruht derzeit in erster Linie auf serologischen Tests auf
Antikörper und/oder p24-Antigen mit einem Immunassay. Die US-amerikanischen Centers for
Disease Control empfehlen die Verwendung eines Antikörper- und RNA-Tests zur Diagnose
einer akuten HIV-Infektion (31). Wenngleich sich die Empfindlichkeit der Detektion von
Antikörpern gegen HIV-1 und p24-Antigen verbessert hat, besteht nach wie vor ein Zeitfenster
zwischen dem Zeitpunkt der Infektion und dem Zeitpunkt der Detektion anhand von
serologischen Markern. Dieses Zeitfenster hängt von der Empfindlichkeit des verwendeten
serologischen Tests ab. Einer Schätzung (32) zufolge können die p24-Antigen/AntikörperAssays der 4. Generation eine Infektion nachweisen, wenn die HIV-1-RNA-Konzentration
14.000 Kopien/ml erreicht hat. Die Nachweisgrenze des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays liegt
erheblich unter 14.000 Kopien/ml und könnte das Vorhandensein von HIV-1 früher als HIVImmunassays nachweisen.
Testprinzip
Der Aptima HIV-1 Quant Dx Assay umfasst drei Hauptschritte, die alle in einem einzigen
Röhrchen auf dem Panther® System stattfinden: Target Capture, Target-Amplifikation durch
transkriptionsvermittelte Amplifikation (Transcription-Mediated Amplification, TMA) und Detektion
der Amplifikationsprodukte (Amplikons) mithilfe der fluoreszenzmarkierten Sonden (Fackeln).
Während des Target Capture wird virale RNA aus Patientenproben isoliert. Die Patientenprobe
wird mit einem Detergens behandelt, um die Virushülle zu solubilisieren, Proteine zu
denaturieren und die genomische Virus-RNA freizusetzen. Capture-Oligonukleotide hybridisieren
an hoch konservierte Regionen der ggf. in der Testprobe vorhandenen HIV-1-RNA. Das
hybridisierte Target wird anschließend auf magnetischen Mikropartikeln gebunden, die dann in
einem Magnetfeld von der Patientenprobe getrennt werden. Irrelevante Bestandteile werden
durch Waschschritte aus dem Reaktionsröhrchen entfernt.
Die Target-Amplifikation findet durch TMA statt, eine transkriptionsbasierte
Nukleinsäureamplifikationsmethode, bei der zwei Enzyme, die reverse Transkriptase des MMLV
(Moloney murines Leukämievirus) und die T7-RNA-Polymerase zum Einsatz kommen. Die
reverse Transkriptase erzeugt eine DNA-Kopie (mit einer Promotorsequenz für die T7-RNAPolymerase) der Targetsequenz. Die T7-RNA-Polymerase produziert mehrere Kopien des
RNA-Amplikons vom Template der DNA-Kopie. Der Aptima HIV-1 Quant Dx Assay verwendet
die TMA-Methode zur Amplifizierung von zwei Regionen in der HIV-1-RNA (Pol und LTR). Zur
Amplifikation dieser bestimmten Regionen werden spezielle Primer zur Amplifizierung der
HIV-1-Gruppen M, N und O verwendet. Das Design der Primer und der Ansatz mit zwei
Targets gewährleisten eine akkurate Detektion und Quantifizierung von HIV-1.
Die Detektion wird erreicht, indem einzelsträngige Nukleinsäure-Fackeln verwendet werden, die
während der Amplifikation des Targets vorhanden sind und spezifisch und in Echtzeit an das
Amplikon hybridisieren. Jede Fackel hat ein Fluorophor und einen Quencher. Wenn die Fackel
nicht mit dem Amplikon hybridisiert, befindet sich der Quencher nahe bei dem Fluorophor und
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unterdrückt die Fluoreszenz. Bindet die Fackel jedoch an das Amplikon, ist der Abstand zwischen
Quencher und Fluorophor größer, sodass dieses bei Anregung mit einer Lichtquelle ein Signal mit
einer bestimmten Wellenlänge abgibt. Je mehr Fackeln an Amplikons hybridisieren, desto stärker
ist das erzeugte Fluoreszenzsignal. Der Zeitraum, der verstreicht, bis das Fluoreszenzsignal einen
bestimmten Schwellenwert erreicht hat, ist zur HIV-1-Ausgangskonzentration proportional. Jede
Reaktion hat einen internen Kalibrator/eine interne Kontrolle (Internal Control, IC) zur Überprüfung
auf Schwankungen bei der Probenbearbeitung, Amplifikation und Detektion. Die Konzentration
einer Probe wird von der Panther System Software bestimmt, indem die HIV-1- und IC-Signale in
jeder Reaktion mit Kalibrierungsdaten verglichen werden.
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
A. In-vitro-Diagnostikum.
B. Zur Verringerung des Risikos ungültiger Ergebnisse müssen die Packungsbeilage und
das Panther System Operator’s Manual (Bedienungsanleitung für das Panther System)
vollständig durchgelesen werden, bevor dieser Assay durchgeführt wird.
Laborbezogen
C.
VORSICHT: Die Kontrollen für diesen Assay enthalten Humanplasma. In von der
US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassenen Verfahren ist das
Plasma negativ auf Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg), Antikörper gegen HCV,
Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2 und HIV-Antigen. Das Plasma ist außerdem bei
Testung mit zugelassenen Nukleinsäuretests von Probenpools nicht-reaktiv auf HCV-RNA
und HIV-1-RNA. Alle aus Humanblut stammenden Materialien sind als potenziell infektiös
zu betrachten und mit den allgemeinen Vorsichtsmaßnahmen zu behandeln (33-35).
D. Dieses Verfahren sollte nur von Personen durchgeführt werden, die in der Anwendung
des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays und in der Handhabung potenziell infektiösen
Materials entsprechend geschult sind. Verschüttungen sind unter Einhaltung
entsprechender vor Ort gültiger Verfahren sofort zu desinfizieren.
E. Nur die im Lieferumfang enthaltenen oder angegebenen Einweg-Laborprodukte verwenden.
F. Die normalen Vorsichtsmaßnahmen im Labor ergreifen. Nicht mit dem Mund pipettieren.
In den ausgewiesenen Arbeitsbereichen nicht essen, trinken oder rauchen. Ungepuderte
Einweghandschuhe, Augenschutz und Laborkittel beim Umgang mit Proben und
Kitreagenzien tragen. Nach der Handhabung von Proben und Kitreagenzien die Hände
gründlich waschen.
G. Arbeitsflächen, Pipetten und andere Geräte müssen regelmäßig mit einer 2,5-%igen bis
3,5-%igen (0,35 M bis 0,5 M) Natriumhypochloritlösung dekontaminiert werden.
H. Material, das in Kontakt mit Patientenproben und Reagenzien gelangt ist, nach allen
geltenden Vorschriften entsorgen (33-36). Alle Arbeitsflächen gründlich reinigen und
desinfizieren.
I.
Die Kontrollen enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Für den Reagenzientransfer
keinen Metallröhrchen verwenden. Wenn Lösungen mit Natriumazidverbindungen in ein
Rohrsystem entsorgt werden, sind sie zu verdünnen und mit reichlichen Mengen an
fließendem Leitungswasser hinuntergespült werden. Diese Vorsichtsmaßnahmen werden
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Allgemeine Informationen
empfohlen, um die Ansammlung von Ablagerungen in Metallrohren und ein dadurch
bedingtes Explosionsrisiko zu vermeiden.
J. Zu der guten Standardpraxis für Molekularbiologie-Laboratorien gehört auch die
Überwachung der Laborumgebung. Zur Überwachung der Laborumgebung wird folgende
Vorgehensweise empfohlen.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Einen Tupfer mit Wattespitze und ein SAT bereitlegen.
Jedes SAT entsprechend beschriften.
Jedes SAT mit 1 ml Aptima Probenverdünner füllen
Zur Erfassung der Oberflächenproben einen Tupfer leicht mit nukleasefreiem
entionisiertem Wasser befeuchten.
Den Tupfer auf der betreffenden Oberfläche in einer vertikalen Bewegung von oben
nach unten führen. Während der Probengewinnung den Tupfer etwa eine halbe
Drehung drehen.
Die Tupferprobe sofort in das Röhrchen geben und in dem Verdünner vorsichtig
schwenken, um möglicherweise auf dem Tupfer vorhandenes Material zu extrahieren.
Den Tupfer an der Seite des Transportröhrchens ausdrücken, um so viel Flüssigkeit
wie möglich zu extrahieren. Den Tupfer entsorgen und das Röhrchen mit der Kappe
verschließen.
Die Schritte mit den verbleibenden Tupferproben wiederholen.
Die Tupferprobe mit dem molekularen Assay testen.
Probenbezogen
K. Proben können infektiös sein. Bei der Durchführung dieses Assays sind die allgemeinen
Vorsichtsmaßnahmen (33-35) zu befolgen. Entsprechend den vor Ort geltenden
Bestimmungen sind angemessene Handhabungs- und Entsorgungsmethoden festzulegen
(36). Dieses Verfahren sollte nur von Personen durchgeführt werden, die in der
Anwendung des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays und in der Handhabung infektiösen
Materials entsprechend geschult sind.
L. Um die Probenintegrität zu wahren, müssen während des Probenversands die
ordnungsgemäßen Lagerbedingungen aufrecht erhalten werden. Die Probenstabilität
unter anderen Versandbedingungen als den hier empfohlenen wurde nicht beurteilt.
M. Kreuzkontamination in den Probenbehandlungsschritten vermeiden. Insbesondere ist
darauf zu achten, beim Lösen oder Entfernen von Kappen von Patientenproben eine
Kontamination durch Verbreitung von Aerosolen zu vermeiden. Die Proben können sehr
hohe Konzentrationen von Organismen aufweisen. Es ist sicherzustellen, dass die
Probenbehälter nicht miteinander in Berührung kommen. Benutzte Materialien dürfen
nicht über offene Behälter hinweg entsorgt werden. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn
sie mit Proben in Kontakt kommen.
Assaybezogen
N. Quantitative Ergebnisse des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays wurden mit Plasma
evaluiert. Serum kann für quantitative Ergebnisse nicht verwendet werden. Qualitative
Ergebnisse wurden sowohl mit Plasma als auch mit Serum evaluiert.
O. Das Reagenzien-Kit, den Kalibrator oder die Kontrollen nicht nach Ablauf des
Verfallsdatums verwenden.
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Allgemeine Informationen
P. Assay-Reagenzien aus Kits mit verschiedenen Hauptchargennummern nicht
austauschen, vermischen oder kombinieren. Assay-Flüssigkeiten können verschiedene
Chargennummern aufweisen. Kontrollen und Kalibratoren können verschiedene
Chargennummern aufweisen.
Q. Eine mikrobielle und Nuklease-Kontamination der Reagenzien ist zu vermeiden.
R. Alle Assay-Reagenzien verschließen und bei den angegebenen Temperaturen lagern. Die
Assayleistung kann durch Verwendung von falsch gelagerten Assay-Reagenzien
beeinträchtigt sein. Für weitere Informationen siehe Lagerungs- und
Handhabungsbedingungen für Reagenzien und Testverfahren mit dem Panther System.
S. Assay-Reagenzien oder Flüssigkeiten nicht kombinieren, außer auf ausdrückliche
Anweisung. Füllen Sie Reagenzien oder Flüssigkeiten nicht nach. Das Panther System
überprüft die Reagenzien-Füllstände.
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Allgemeine Informationen
Lagerungs- und Handhabungsbedingungen für Reagenzien
A. Die folgende Tabelle zeigt die Lagerungsbedingungen und die Stabilität der Reagenzien,
der Kontrollen und des Kalibrators.
Reagenz
Lagerung im
ungeöffneten
Zustand
Offenes Kit (rekonstituiert)
Lagerung
Stabilität
2 °C bis 8 °C
30 Tagea
2 °C bis 8 °C
30 Tagea
qHIV-1-Amplifikationsreagenz
2 °C bis 8 °C
qHIV-1-Amplifikationsrekonstitutionslösung
2 °C bis 8 °C
qHIV-1-Enzymreagenz
2 °C bis 8 °C
qHIV-1-Lösung zur Enzymrekonstitution
2 °C bis 8 °C
qHIV-1-Promotorreagenz
2 °C bis 8 °C
qHIV-1-Lösung zur Promotorrekonstitution
2 °C bis 8 °C
2 °C bis 8 °C
30 Tagea
qHIV-1-Target Capture-Reagenz
2 °C bis 8 °C
2 °C bis 8 °C
30 Tagea
-15 °C bis -35 °C
15 °C bis 30 °C
Fläschchen für den
Einmalgebrauch
Innerhalb von 20 Stunden
verwenden
15 °C bis 30 °C
Fläschchen für den
Einmalgebrauch
Innerhalb von 20 Stunden
verwenden
15 °C bis 30 °C
Fläschchen für den
Einmalgebrauch
Innerhalb von 20 Stunden
verwenden
15 °C bis 30 °C
Fläschchen für den
Einmalgebrauch
Innerhalb von 20 Stunden
verwenden
qHIV-1 CONTROL – (Negativkontrolle)
qHIV-1 CONTROL + L (schwach positive
Kontrolle)
qHIV-1 CONTROL + H (stark positive
Kontrolle)
qHIV-1 PCAL (Positivkalibrator)
-15 °C bis -35 °C
-15 °C bis -35 °C
-15 °C bis -35 °C
a
Wenn Reagenzien aus dem Panther System genommen werden, sind sie sofort wieder bei ihren jeweiligen
Lagerungstemperaturen aufzubewahren.
B. Alle unbenutzten rekonstituierten Reagenzien und das Target Capture-Reagenz (Target
Capture Reagent, TCR) nach 30 Tagen oder nach Ablauf des Verfallsdatums der
Hauptcharge (das frühere Datum ist ausschlaggebend) entsorgen.
C. Im Panther System gelagerte Reagenzien sind im Gerät 72 Stunden stabil. Reagenzien
können bis zu 5 Mal auf das Panther System geladen werden. Das Laden von
Reagenzien wird jedes Mal im Panther System-Protokoll vermerkt.
D. Nach dem Auftauen des Kalibrators muss die Lösung klar sein, d. h., keine Trübungen
oder Präzipitate aufweisen.
E.
Das Promotorreagenz und das rekonstituierte Promotorreagenz sind lichtempfindlich.
Diese Reagenzien sind lichtgeschützt zu lagern und für die Anwendung vorzubereiten.
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Allgemeine Informationen
Probenentnahme und -lagerung
Hinweis: Alle Patientenproben sind als potenziell infektiös zu handhaben. Es sind allgemeine
Vorsichtsmaßnahmen zu treffen.
Hinweis: Bei den Schritten, die eine Handhabung von Proben erfordern, darauf achten, eine
Kreuzkontamination zu vermeiden. Benutztes Material ist beispielsweise so zu beseitigen,
dass es nicht über geöffnete Röhrchen geführt wird.
Es können in die folgenden Glas- oder Kunststoffröhrchen entnommene Vollblutproben
verwendet werde:
Für quantitative Messungen:
• Röhrchen, die EDTA oder Acid-Citrate-Dextrose (ACD)-Antikoagulanzien enthalten, oder
• Plasmapräparationsröhrchen (Plasma Preparation Tubes, PPTs).
Für die qualitative Bestimmung:
• Röhrchen, die EDTA- oder ACD-Antikoagulanzien enthalten, oder
• PPTs, oder
• Serumröhrchen, oder
• Serumtrennröhren (Serum Separator Tubes, SSTs).
Bei Serum ist vor der Weiterverarbeitung die Koagelbildung abzuwarten.
A. Probenentnahme
Vollblut kann bei 2 °C bis 30 °C gelagert werden und ist innerhalb von 24 Stunden nach
der Probenentnahme zu zentrifugieren. Plasma oder Serum unter Einhaltung der
Herstelleranweisungen für das jeweils verwendete Röhrchen vom Erythrozytenpellet
trennen. Plasma oder Serum kann im primären Röhrchen auf dem Panther System
getestet oder zuerst in ein sekundäres Probenaliquotröhrchen (Specimen Aliquot Tube,
SAT) überführt und dann auf dem Panther System getestet werden. Das Mindestvolumen
für primäre Entnahmeröhrchen beträgt 1200 µl bzw. 700 µl bei SATs.
Wird der Test nicht sofort durchgeführt, können Plasma und Serum nach den nachstehenden
Spezifikationen gelagert werden. In ein SAT überführtes Plasma kann bei -20 °C oder -70 °C
eingefroren werden. Serum kann bei -20 °C eingefroren werden. Die Proben sollten
höchstens dreimal eingefroren und wieder aufgetaut werden, um Auswirkungen auf das
Ergebnis zu vermeiden. Patientenproben nicht in EDTA-, ACE- oder primären
Serumentnahmeröhrchen einfrieren.
B. Bedingungen für die Lagerung von Patientenproben
1. EDTA- und ACD-Plasmaproben
Primärröhrchen mit zentrifugiertem Plasma können nach der Probenentnahme bis
zu 24 Stunden lang bei 2 °C bis 30 °C gelagert werden (Abbildung 1, oberes
Rahmenfeld). Nach 24 Stunden kann das Plasma unter einer der folgenden
Bedingungen längere Zeit gelagert werden (Abbildung 1, untere Rahmenfelder):
• Im primären Entnahmeröhrchen bis zu 3 Tage lang bei 2 °C bis 8 °C oder
• im SAT bis zu 5 Tage lang bei 2 °C bis 8 °C oder
• im SAT bis zu 90 Tage lang bei -20 °C oder -70 °C.
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Allgemeine Informationen
Abbildung 1. Bedingungen für die Lagerung von EDTA/ACD-Primärröhrchen
2. PPT-Patientenproben
PPTs mit zentrifugiertem Plasma können nach der Probenentnahme bis zu
24 Stunden lang bei 2 °C bis 30 °C gelagert werden (Abbildung 2, oberes
Rahmenfeld). Nach 24 Stunden kann das Plasma unter einer der folgenden
Bedingungen längere Zeit gelagert werden (Abbildung 2, untere Rahmenfelder):
• Im PPT bis zu 3 Tage lang bei 2 °C bis 8 °C,
• im SAT bis zu 5 Tage lang bei 2 °C bis 8 °C oder
• im PPT oder SAT bis zu 90 Tage lang bei -20 °C oder -70 °C.
Abbildung 2. Bedingungen für die Lagerung von PPTs
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Allgemeine Informationen
3. Patientenproben in Serumröhrchen
Serumröhrchen mit zentrifugiertem Serum können nach der Probenentnahme bis
zu 24 Stunden lang bei 2 °C bis 30 °C gelagert werden (Abbildung 3, oberes
Rahmenfeld). Nach 24 Stunden kann das Serum unter einer der folgenden
Bedingungen längere Zeit gelagert werden (Abbildung 3, untere Rahmenfelder):
• Im Serumröhrchen bis zu 5 Tage lang bei 2 °C bis 8 °C,
• im SAT bis zu 5 Tage lang bei 2 °C bis 8 °C oder
• im SAT bis zu 7 Tage lang bei -20 °C.
Abbildung 3. Bedingungen für die Lagerung von Serumröhrchen
4. SST-Patientenproben
SSTs mit zentrifugiertem Serum können nach der Probenentnahme bis zu 24 Stunden
lang bei 2 °C bis 30 °C gelagert werden (Abbildung 4, oberes Rahmenfeld). Nach
24 Stunden kann das Serum unter einer der folgenden Bedingungen längere Zeit
gelagert werden (Abbildung 4, untere Rahmenfelder):
• Im den SSTs bis zu 5 Tage lang bei 2 °C bis 8 °C,
• im SAT bis zu 5 Tage lang bei 2 °C bis 8 °C oder
• im SAT bis zu 7 Tage lang bei -20 °C.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Allgemeine Informationen
Abbildung 4. Bedingungen für die Lagerung von SSTs
C. Verdünnung von Plasmaproben
Eine Plasmaprobe kann für die Analyse auf dem Panther System in einem SAT verdünnt
werden. Für weitere Informationen siehe Testverfahren mit dem Panther System, Schritt E.6.
Wenn eine Patientenprobe verdünnt wird, sollte sie sofort nach dem Verdünnung
analysiert werden. Eine verdünnte Patientenprobe nicht einfrieren.
Proben auf dem Panther System
Proben können insgesamt bis zu 8 Stunden lang unverschlossen auf dem Panther System
stehen gelassen werden. Solange die Gesamtverweildauer auf dem System vor dem
Pipettieren der Probe vom Panther System 8 Stunden nicht übersteigt, können die Proben
wieder aus dem Panther System genommen und getestet werden.
Transport von Patientenproben
Es ist auf Einhaltung der Probenlagerungsbedingungen entsprechend der Beschreibung
unter Probenentnahme und -lagerung zu achten.
Hinweis: Ein Versand der Patientenproben muss in Übereinstimmung mit geltenden
nationalen, internationalen und regionalen Frachtbestimmungen erfolgen.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Panther System
Panther System
Nachstehend sind die Reagenzien für den Aptima HIV-1 Quant Dx Assay für das Panther
System gelistet. Die Symbole zur Identifikation der Reagenzien sind neben dem
Reagenznamen angegeben.
Im Lieferumfang enthaltene Reagenzien und Materialien
Hinweis: Informationen zu eventuell mit den Reagenzien verbundenen Gefahren- und
Vorsichtshinweisen finden Sie in der Sicherheitsdatenblatt-Sammlung (Safety Data Sheet
Library) unter www.hologic.com/sds.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay-Kit, 100 Tests, Kat.-Nr. PRD-03000 (1 Assay-Box,
1 Kalibrator-Kit, und 1 Kit mit Kontrollen)
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay-Box
(Lagerung bei 2 °C bis 8 °C nach Empfang)
Symbol
Komponente
Menge
A
qHIV-1-Amplifikationsreagenz
Nicht-infektiöse Nukleinsäuren, getrocknet, in Pufferlösung.
1 Fläschchen
E
qHIV-1-Enzymreagenz
Reverse Transkriptase und RNA-Polymerase, getrocknet, in HEPESgepufferter Lösung.
1 Fläschchen
PRO
qHIV-1-Promotorreagenz
Nicht-infektiöse Nukleinsäuren, getrocknet, in Pufferlösung.
1 Fläschchen
AR
qHIV-1-Amplifikationsrekonstitutionslösung
Wässrige Lösung mit Glyzerol und Konservierungsmitteln.
1 x 7,2 ml
ER
qHIV-1-Lösung zur Enzymrekonstitution
HEPES-gepufferte Lösung mit oberflächenaktiver Substanz und Glyzerol.
1 x 5,8 ml
qHIV-1-Lösung zur Promotorrekonstitution
Wässrige Lösung mit Glyzerol und Konservierungsmitteln.
1 x 4,5 ml
qHIV-1-Target Capture-Reagenz
Nukleinsäuren in einer gepufferten Salzlösung mit nicht-infektiösen
Nukleinsäuren in der Festphase und einem internen Kalibrator.
1 x 72,0 ml
PROR
TCR
Rekonstitutionsverbindungsstücke
Barcode-Blatt für Hauptcharge
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
3
1 Blatt
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Kit mit Aptima HIV-1 Quant Dx Kontrollen (Kat.-Nr. PRD-03002)
(Lagerung bei -15 °C bis -35 °C nach Empfang)
Symbol
NC
LPC
HPC
Komponente
Menge
qHIV-1 Negativkontrolle
HIV-1-negatives defibriniertes Humanplasma mit Gentamicin und 0,2%
Natriumazid als Konservierungsmittel.
5 x 1,5 ml
qHIV-1 schwach positive Kontrolle
Nicht-infektöse HIV-1-Armored RNA in defibriniertem Humanplasma mit
Gentamicin und 0,2% Natriumazid als Konservierungsmittel.
5 x 1,5 ml
qHIV-1 stark positive Kontrolle
Nicht-infektöse HIV-1-Armored RNA in defibriniertem Humanplasma mit
Gentamicin und 0,2% Natriumazid als Konservierungsmittel.
5 x 1,5 ml
Barcode-Etikett der Kontrolle
—
Aptima HIV-1 Quant Dx-Kalibrator-Kit (Kat.-Nr. PRD-03001)
(Lagerung bei -15 °C bis -35 °C nach Empfang)
Symbol
Komponente
PCAL
qHIV-1 Positivkalibrator
Transkript in gepufferter Lösung.
Menge
5 x 2,5 ml
Barcode-Etikett des Kalibrators
—
Erforderliche, jedoch nicht im Lieferumfang enthaltene Materialien
Hinweis: Materialien, die von Hologic erhältlich sind, sind mit der Katalognummer
aufgeführt, sofern nicht anders angegeben.
Material
Kat.-Nr.
Panther System
303095
Aptima Assayflüssigkeitskit
303014 (1000 Tests)
enthält Aptima Waschlösung, Aptima Puffer für Deaktivierungsflüssigkeit und
Aptima Ölreagenz
Multi-Röhrchen-Einheiten (multi-tube units, MTUs)
104772-02
Panther Entsorgungsbeutel-Kit
902731
Panther Abfallabdeckung
902714
Oder Panther Durchlaufkit für Echtzeit-Assay
PRD-03455 (5000 Tests)
enthält MTUs, Entsorgungsbeutel, Abfallabdeckungen und Assayflüssigkeiten
Spitzen, 1000 µl, leitfähig, zur Flüssigkeitsstandmessung
10612513 (Tecan)
Bleichmittel, 5% bis 7% (0,7 M bis 1,0 M) Natriumhypochloritlösung
—
Ungepuderte Einweghandschuhe
—
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Ersatzkappen, undurchlässig
103036A
Ersatzkappen für Reagenzien
Lösungen zur Rekonstitution von Amplifikations-,
Enzym- und Promotorreagenz
TCR
CL0041 (100 Kappen)
CL0040 (100 Kappen)
Labortischunterlagen mit Kunststoffunterschicht auf der Rückseite
—
Fusselfreie Tücher
—
Pipettierer
—
Spitzen
—
Es können primäre Entnahmeröhrchen mit folgenden Abmessungen
verwendet werden:
—
13 mm x 100 mm
13 mm x 75 mm
16 mm x 100 mm
Zentrifuge
—
Vortexer
—
Optionale Materialien
Material
Kat.-Nr.
Probenaliquotröhrchen (Specimen Aliquot Tubes, SAT) (100 St.)
503762
Kappe für Transportröhrchen (100 St.)
504415
Kappe für SAT
Aptima Probenverdünner
PRD-03003
Kit mit zusätzlichen Aptima HIV-1 Quant Dx Assay-Kontrollen
PRD-03002
Kit mit zusätzlichem Aptima HIV-1 Quant Dx Assay-Kalibrator
PRD-03001
Transferpipetten
—
Handelsübliche Panels, z. B.:
—
HIV-1 von Quality Control for Molecular Diagnostics oder
Panel des College of American Pathologists zur Erhebung der HIV-Viruslast oder
SeraCare ACCURUN HIV-Panels
Wattestäbchen
—
Schwenkvorrichtung für Röhrchen
—
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Panther System
Testverfahren mit dem Panther System
Hinweis: Nähere Verfahrensinformationen finden Sie im Panther System Operator’s
Manual (Bedienungsanleitung für das Panther System).
A. Vorbereitung des Arbeitsbereichs
1. Reinigen Sie die Arbeitsflächen, wo die Reagenzien vorbereitet werden. Wischen
Sie die Arbeitsflächen mit einer 2,5%igen bis 3,5%igen (0,35 M bis 0,5 M)
Natriumhypochloritlösung ab. Lassen Sie die Natriumhypochloritlösung mindestens
1 Minute auf den Flächen einwirken. Spülen Sie sie anschließend mit entionisiertem
Wasser ab. Die Natriumhypochloritlösung darf nicht antrocknen. Decken Sie die
Arbeitsfläche, auf der die Reagenzien und Proben vorbereitet werden, mit sauberen,
absorbierenden Labortischunterlagen mit Kunststoffunterschicht ab.
2. Reinigen Sie eine separate Arbeitsfläche, wo die Proben vorbereitet werden. Gehen
Sie dabei vor, wie vorstehend beschrieben (Schritt A.1).
3. Reinigen Sie alle Pipettierer. Gehen Sie dabei vor, wie vorstehend beschrieben
(Schritt A.1).
B. Vorbereitung von Kalibrator und Kontrollen
Lassen Sie den Kalibrator und die Kontrollen vor der Verarbeitung eine Temperatur von
15 °C bis 30 °C annehmen, indem Sie folgenderweise vorgehen:
1. Nehmen Sie den Kalibrator und die Kontrollen aus der Lagerung (-15 °C bis -35 °C)
und bringen Sie sie auf eine Temperatur von 15 °C bis 30 °C. Drehen Sie jedes
Röhrchen während des gesamten Auftauprozesses um, um den Inhalt gründlich zu
mischen. Es ist darauf zu achten, dass der Röhrcheninhalt vor dem Gebrauch
komplett aufgetaut ist.
Option. Die Röhrchen mit dem Kalibrator und den Kontrollen können auf einer
geeigneten Schwenkvorrichtung platziert werden, um ihren Inhalt gründlich zu
mischen. Es ist darauf zu achten, dass der Röhrcheninhalt vor dem Gebrauch
komplett aufgetaut ist.
Hinweis: Beim Umdrehen des Kalibrators und der Kontrollen ist starke Schaumbildung
zu vermeiden. Schaum beeinträchtigt die Füllstandsmessung im Panther System.
2. Wenn der Röhrcheninhalt aufgetaut ist, trocknen Sie das Röhrchen außen mit einem
sauberen, trockenen Einwegtuch ab.
3. Zur Verhinderung einer Kontamination sollten Sie die Röhrchen nicht öffnen.
C. Reagenzrekonstitution/Vorbereitung eines neuen Kits
Hinweis: Die Reagenzrekonstitution sollte vor Beginn von Arbeiten mit dem Panther
System durchgeführt werden.
1. Gehen Sie folgenderweise vor, um das Target Capture-Reagenz (TCR) vorzubereiten:
a. Nehmen Sie das TCR aus der Lagerung (2 °C bis 8 °C). Überprüfen Sie die
Chargennummer auf der TCR-Flasche, um sicherzustellen, dass sie mit der
Chargennummer auf dem Hauptchargen-Barcodeblatt übereinstimmt.
b. Schütteln Sie die TCR-Flasche sofort kräftig 10 Mal. Lassen Sie die TCR-Flasche
mindestens 45 Minuten bei 15 °C bis 30 °C erwärmen. Während dieser Zeit sollten
Sie das TCR-Fläschchen mindestens alle 10 Minuten schwenken und umdrehen.
Option. Das TCR-Fläschchen kann auf einer geeigneten Schwenkvorrichtung
folgenderweise vorbereitet werden: Nehmen Sie das TCR aus der Lagerung (2 °C
bis 8 °C) und schütteln Sie es sofort kräftig 10 Mal. Platzieren Sie die TCR-
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Panther System
Flasche auf einer geeigneten Schwenkvorrichtung und lassen Sie sie mindestens
45 Minuten bei 15 °C bis 30 °C erwärmen.
c. Vergewissern Sie sich vor dem Gebrauch, dass alle Präzipitate in Lösung und die
Magnetpartikel suspendiert sind.
2. Zum Rekonstituieren von Amplifikations-, Enzym- und Promotorreagenz gehen Sie
folgenderweise auf:
a. Nehmen Sie die gefriergetrockneten Reagenzien und die entsprechenden
Rekonstitutionslösungen aus der Lagerung (2 °C bis 8 °C). Paaren Sie jede
Rekonstitutionslösung mit ihrem gefriergetrockneten Reagenz.
b. Vergewissern Sie sich, dass das Etikett der Rekonstitutionslösung und das des
gefriergetrockneten Reagenzes dieselbe Farbe aufweisen. Prüfen Sie die
Chargennummern auf dem Hauptchargen-Barcodeblatt, um sicherzustellen, dass
die richtigen Reagenzien miteinander gepaart wurden.
i.
Öffnen Sie das Fläschchen mit dem gefriergetrockneten Reagenz, indem Sie
die Metallversiegelung und den Gummistopfen entfernen.
ii. Führen Sie das gekerbte Ende des Rekonstitutionsverbindungsstücks
(schwarz) fest in das Fläschchen ein (Abbildung 5, Schritt 1).
iii. Öffnen Sie die Flasche mit der entsprechenden Rekonstitutionslösung und
legen Sie die Kappe auf eine saubere, abgedeckte Arbeitsfläche.
iv. Stellen Sie die Flasche mit der Rekonstitutionslösung auf eine stabile
Fläche (d. h. den Labortisch). Drehen sich dann das Fläschchen mit dem
gefriergetrockneten Reagenz über der Flasche mit der Rekonstitutionslösung
um und befestigen Sie das Verbindungsstück an der Flasche mit
Rekonstitutionslösung (Abbildung 5, Schritt 2).
v. Drehen Sie die zusammengefügte Flaschen (an Flasche mit Lösung
aufgesetztes Fläschchen) langsam um, damit die Lösung in das
Glasfläschchen laufen kann (Abbildung 5, Schritt 3).
vi. Schwenken Sie die zusammengefügten Flaschen mindestens 10 Sekunden
lang (Abbildung 5, Schritt 4).
vii. Warten Sie mindestens 30 Sekunden, damit das gefriergetrocknete Reagenz
in Lösung gehen kann.
viii. Nachdem das gefriergetrocknete Reagenz in Lösung gegangen ist,
schwenken Sie die zusammengefügten Flaschen mindestens 10 Sekunden
lang und mischen Sie anschließend die Lösung gründlich, indem Sie das
Glasfläschchen leicht nach vorne und hinten kippen.
c. Drehen Sie die zusammengefügten Flaschen dann wieder langsam um, damit die
Lösung wieder komplett zurück in die Flasche mit der Rekonstitutionslösung
fließen kann (Abbildung 5, Schritt 5).
d. Nehmen Sie das Rekonstitutionsverbindungsstüc und das Glasfläschchen vorsichtig
ab (Abbildung 5, Schritt 6) und entsorgen Sie sie (Abbildung 5, Schritt 8).
e. Tragen Sie die Initialen des Bedieners und das Rekonstitutionsdatum auf dem
Etikett ein. Laden Sie die Flaschen für den sofortigen Gebrauch auf den
Reagenzienständer; andernfalls verschließen Sie die Flaschen und überführen Sie
sie in die Lagerung (2 °C bis 8 °C) (Abbildung 5, Schritt 7).
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Panther System
Warnung: Bei der Rekonstitution von Reagenzien übermäßige Schaumbildung
vermeiden. Schaum beeinträchtigt die Füllstandsmessung im Panther System.
Abbildung 5. Rekonstitution von Reagenzien
D. Reagenzienvorbereitung für bereits vorbereitete Reagenzien
1. Nehmen Sie die bereits vorbereiteten Reagenzien aus der Lagerung (2 °C bis 8 °C).
2. Bereits vorbereitete Amplifikations-, Enzym-, Promotor- und TC-Reagenzien müssen
vor Beginn des Assays auf eine Temperatur von 15 °C bis 30 °C gebracht werden.
3. Bei bereits vorbereiteten TCR führen Sie vor dem Laden auf das System den
Schritt C.1 oben durch.
4. Vor dem Laden auf das System müssen Amplifikations-, Enzym- und
Promotorreagenzien zum gründlichen Mischen geschwenkt und umgedreht werden.
Beim Umdrehen von Reagenzien übermäßige Schaumbildung vermeiden.
5. Füllen Sie Reagenzienflaschen nicht nach. Das Panther System erkennt Flaschen,
die nachgefüllt wurden, und nimmt sie nicht an.
E. Probenhandhabung
1. Vergewissern Sie sich, dass gefrorene Patientenproben ganz aufgetaut sind. Mischen
Sie die aufgetauten Patientenproben gründlich 3 bis 5 Sekunden auf dem Vortexer.
2. Bringen Sie die Patientenproben vor der Verarbeitung auf eine Temperatur von 15 °C
bis 30 °C. Weitere Informationen über Proben auf dem Gerät siehe Proben auf dem
Panther System.
3. Vergewissern Sie sich, dass jedes primäre Entnahmeröhrchen mindestens 1200 µl
Patientenprobe enthält. Vergewissern Sie sich, dass jedes Probenaliquotröhrchen
(Specimen Aliquot Tube, SAT) mindestens 700 µl Patientenprobe enthält. Falls eine
Verdünnung der Patientenprobe erforderlich ist, siehe Schritt E.6 für weitere
Informationen.
4. Mischen Sie die Patientenproben in SATs gründlich 3 bis 5 Sekunden auf dem
Vortexer.
5. Zentrifugieren Sie jede Patientenprobe unmittelbar vor dem Laden in einen
Probenständer 10 Minuten bei 1000 bis 3000g. Nehmen Sie nicht die Kappen ab.
Luftbläschen im Röhrchen stören die Füllstandsmessung des Panther Systems.
Für Informationen zum Laden des Ständers und zum Abnehmen der Kappen siehe
Vorbereitung des Systems, Schritt F.2 nachstehend.
6. Verdünnen einer Plasmaprobe in einem SAT
Eine Plasmaprobe kann für die Analyse auf dem Panther System in einem SAT
verdünnt werden.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Panther System
Wenn überhaupt, so ist eine Verdünnung von Plasmaproben nur für quantitative
Ergebnisse erforderlich. Für diagnostische Ergebnisse dürfen Plasmaproben nicht
verdünnt werden.
Hinweis: Wenn eine Patientenprobe verdünnt wird, ist sie unmittelbar nach der
Verdünnung zu testen.
a. Verdünnung von Patientenproben, die in kleinen Volumen vorliegen
Das Volumen von Plasmaproben kann mit dem Aptima Probenverdünner auf das
erforderliche Mindestvolumen (700 µl) erhöht werden. Patientenproben mit
mindestens 240 µl Plasma können mit zwei Teilen Probenverdünner (1:3)
folgenderweise verdünnt werden:
i.
Geben Sie 240 µl Patientenprobe in ein SAT.
ii. Geben Sie 480 µl Probenverdünner hinzu.
iii. Verschließen Sie das Röhrchen.
iv. Drehen Sie es vorsichtig 5 Mal um, um den Inhalt zu mischen.
Patientenproben, die 1:3 verdünnt worden sind, können mit der 1:3-Option auf
dem Panther System getestet werden (weitere Informationen finden Sie im
Panther System Operator’s Manual [Bedienungsanleitung für das Panther
System]). Die Software gibt automatisch das Ergebnis für die unverdünnte Probe
ab, indem sie den Verdünnungsfaktor anwendet. Solche Patientenproben werden
als verdünnte Patientenproben gekennzeichnet.
b. Verdünnung hochtitriger Patientenproben
Liegt das Ergebnis einer Patientenprobe über dem oberen Quantifizierungsgrenzwert,
kann sie mit 99 Teilen des Aptima Probenverdünners (1:100) folgenderweise verdünnt
werden:
i.
Geben Sie 30 µl Patientenprobe in ein SAT.
ii. Geben Sie 2970 µl Probenverdünner hinzu.
iii. Verschließen Sie das Röhrchen.
iv. Drehen Sie es vorsichtig 5 Mal um, um den Inhalt zu mischen.
v. Multiplizieren Sie das Ergebnis mit 100.
F. Vorbereitung des Systems
1. Richten Sie das System entsprechend den Anweisungen im Panther System
Operator’s Manual (Bedienungsanleitung für das Panther System) und den
Verfahrenshinweise ein. Achten Sie darauf, Reagenzienständer und TCR-Adapter der
geeigneten Größe zu verwenden.
2. Laden Sie Proben in den Probenständer. Führen Sie für jedes Probenröhrchen
(Patientenproben und ggf. Kalibrator und Kontrollen) die folgenden Schritte durch:
a. Lösen Sie die Kappe eines Probenröhrchens, aber nehmen Sie sie noch nicht ab.
Hinweis: Achten Sie besonders darauf, eine Kontamination durch
Aerosolausbreitung zu vermeiden. Lösen Sie vorsichtig die Kappen der Proben.
b. Laden Sie das Probenröhrchen in den Probenständer.
c. Wiederholen Sie Schritt 2.a und 2.b für jede verbleibende Probe.
d. Wenn die Proben in den Probenständer geladen sind, nehmen Sie die Kappe von
jedem Probenröhrchen ab und entsorgen Sie sie in einen Probenständer. Führen
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Panther System
Sie die Kappen zur Vermeidung von Kontamination nicht über einen
Probenständer oder ein Probenröhrchen.
e. Verwenden Sie ggf. eine neue Einwegtransferpipette, um etwaige Luft- oder
Schaumbläschen zum Platzen zu bringen.
f.
Wenn die letzte Kappe abgenommen worden ist, fixieren Sie den Probenhalter,
wenn gleichzeitig andere Assays und Probentypen analysiert werden, und laden
Sie den Probenständer in ein Probenfach.
g. Wiederholen Sie Schritt 2.a bis 2.f für den nächsten Probenständer.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Panther System
Verfahrenshinweise
A. Kalibrator
1. Der qHIV-1 Positivkalibrator kann in jede Position im Probenständer und in jede
Probenfach-Bahn auf dem Panther System geladen werden. Die Pipettierung der
Proben beginnt, wenn eine der folgenden beiden Bedingungen erfüllt ist:
a. Der Kalibrator wird derzeit vom System verarbeitet.
b. Ein gültiges Ergebnis für den Kalibrator ist im System gespeichert.
2. Sobald das Kalibratorröhrchen pipettiert worden ist und mit dem Aptima HIV-1 Quant Dx
Assayreagenzien-Kit verarbeitet wird, können bis zu 24 Stunden lang Patientenproben
mit dem zugehörigen rekonstituierten Kit getestet werden, es sei denn:
a. Das Kalibratorergebnis ist ungültig.
b. Das zugehörige Assayreagenzien-Kit wird aus dem System genommen.
c. Das zugehörige Assayreagenzien-Kit hat die Stabilitätsgrenze überschritten.
3. Das Kalibratorröhrchen kann einmal getestet werden. Wenn versucht wird, mehr als
drei Replikate aus dem Röhrchen zu pipettieren, kann es zu Verarbeitungsfehlern
kommen.
B. Kontrollen
1. Die Röhrchen mit der schwach positiven, der stark positiven und der negativen
qHIV-1-Kontrolle können in jede Position im Probenständer und in jede ProbenfachBahn auf dem Panther System geladen werden. Die Pipettierung der Proben beginnt,
wenn eine der folgenden beiden Bedingungen erfüllt ist:
a. Die Kontrollen werden derzeit vom System verarbeitet.
b. Gültige Ergebnisse für die Kontrollen sind im System gespeichert.
2. Sobald die Röhrchen mit den Kontrollen pipettiert worden sind und mit dem Aptima
HIV-1 Quant Dx Reagenzien-Kit verarbeitet werden, können bis zu 24 Stunden lang
Patientenproben mit dem zugehörigen rekonstituierten Kit getestet werden, es sei
denn:
a. Die Kontrollenergebnisse sind ungültig.
b. Das zugehörige Assayreagenzien-Kit wird aus dem System genommen.
c. Das zugehörige Assayreagenzien-Kit hat die Stabilitätsgrenze überschritten.
3. Jedes Kontrollröhrchen kann einmal getestet werden. Wenn versucht wird, mehr als
einmal aus dem Röhrchen zu pipettieren, kann es zu Bearbeitungsfehlern kommen.
C. Handschuhpuder
Wie in jedem Reagenzsystem kann übermäßiger Puder auf manchen Handschuhen eine
Kontamination geöffneter Röhrchen verursachen. Es werden ungepuderte Handschuhe
empfohlen.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Qualitätskontrolle
Qualitätskontrolle
Ein Lauf- oder Patientenprobenergebnis kann von einem Anwender für ungültig erklärt
werden, wenn während der Durchführung des Assays technische, anwenderbezogene oder
gerätebezogene Probleme auftreten und dokumentiert werden.
Assay-Kalibrierung
Zur Erzeugung gültiger Ergebnisse muss eine Assay-Kalibrierung durchgeführt werden.
Ein einzelner Positivkalibrator wird (i) jedes Mal, wenn ein Reagenzien-Kit auf das Panther
System geladen wird, (ii) bei jedem neu rekonstituierten Reagenzien-Kit und (iii) alle
24 Stunden in Dreifachausführung analysiert. Der Anwender wird von Software auf dem
Panther System darauf aufmerksam gemacht, wenn eine Kalibration erforderlich ist. Der
Anwender scannt einen Kalibrierungskoeffizienten, der auf dem jedem Reagenzien-Kit
beiliegenden Masterchargen-Barcodeblatt angegeben ist.
Während der Verarbeitung werden Kriterien für die Annahme des Kalibrators von der
Software auf dem Panther System automatisch verifiziert. Wenn weniger als zwei
Kalibratorreplikate gültig sind, erklärt die Software den Lauf automatisch für ungültig. Proben
eines für ungültig erklärten Laufs sind mit einem frisch vorbereiteten Kalibrator und frisch
vorbereiteten Kontrollen erneut zu testen.
Negativ- und Positivkontrollen
Zur Erzeugung gültiger Ergebnisse muss ein Satz von Assay-Kontrollen getestet werden.
Ein Replikat der Negativkontrolle, der schwach positiven Kontrolle und der stark positiven
Kontrollen muss jeweils (i) jedes Mal, wenn ein Reagenzien-Kit auf das Panther System
geladen wird, (ii) bei jedem neu rekonstituierten Reagenzien-Kit und (iii) alle 24 Stunden
getestet werden. Der Anwender wird von Software auf dem Panther System darauf
aufmerksam gemacht, wenn Kontrollen erforderlich sind.
Während der Verarbeitung werden Kriterien für die Annahme der Kontrollen von der Software
auf dem Panther System automatisch verifiziert. Zur Erzeugung gültiger Ergebnisse muss die
Negativkontrolle ein Ergebnis „Keine HIV-1-RNA nachgewiesen“ liefern und die Ergebnisse
der Positivkontrollen müssen innerhalb vordefinierter Parameter liegen. Wenn das Ergebnis
für eine der Kontrollen ungültig ist, erklärt die Software den Lauf automatisch für ungültig.
Proben eines für ungültig erklärten Laufs sind mit einem frisch vorbereiteten Kalibrator und
frisch vorbereiteten Kontrollen erneut zu testen.
Interner Kalibrator/Interne Kontrolle
Jede Probe enthält einen internen Kalibrator/eine interne Kontrolle (IC). Während der
Verarbeitung werden IC-Annahmekriterien von der Software auf dem Panther System
automatisch verifiziert. Wenn das IC-Ergebnis ungültig ist, wird das Probenergebnis für
ungültig erklärt. Jede Probe mit ungültigem IC-Ergebnis muss erneut getestet werden, um
ein gültiges Ergebnis zu erhalten.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Testauswertung
Testauswertung
Hinweis: Unter Verwendung von Plasma wurden die quantitativen Ergebnisse des Aptima
HIV-1 Quant Dx Assays evaluiert. Serum kann für quantitative Ergebnisse nicht verwendet
werden. Qualitative Ergebnisse wurden sowohl mit Plasma als auch mit Serum evaluiert.
Ergebnisse
Das Panther System bestimmt die Konzentration der HIV-1-RNA in Patientenproben und Kontrolle
automatisch, indem es die Ergebnisse mit einer Kalibrationskurve vergleicht. HIV-1-RNAKonzentrationen werden in Kopien/ml und log10 Kopien/ml angegeben. In Tabelle 1 ist die
Ergebnisauswertung gezeigt. Wenn für 1:3 verdünnte Patientenproben die 1:3-Option verwendet
wird, berechnet das Panther System automatisch die HIV-1-Konzentration der unverdünnten
Patientenprobe, indem es die Konzentrationsergebnisse mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert.
Hinweis: Bei verdünnten Patientenproben können Ergebnisse wie „Nicht nachgewiesen“ oder
„<30 nachgewiesen“ erhalten werden, indem eine Patientenprobe mit einer Konzentration knapp
über der LOD bzw. LLOQ verdünnt wird. Es wird empfohlen, eine andere unverdünnte
Patientenprobe zu entnehmen und zu testen, wenn kein quantitatives Ergebnis erhalten wird.
Das Panther System liefert kein qualitatives Ergebnis (d. h. „Reaktiv“ oder „Nicht-reaktiv“ für
die diagnostische Anwendung. Der Anwender muss die angegebene HIV-1-RNA-Konzentration
selbst zu einem qualitativen Ergebnis interpretieren (Tabelle 1). Patientenproben mit einem
Ergebnis „Nicht nachgewiesen“ sind nicht-reaktiv auf HIV-1-RNA. Patientenproben mit einem
Ergebnis „<30 nachgewiesen“ oder Patientenproben mit Ergebnissen innerhalb des linearen
Bereichs bedeuten, dass HIV-1-RNA nachgewiesen wurde und dass diese Patientenproben auf
HIV-1-RNA reaktiv sind.
Tabelle 1: Ergebnisauswertung
Angegebenes Aptima HIV-1
Quant Dx-Ergebnisa
Kopien/mlb
Auswertung der HIV-1-RNA-Konzentrationa
Diagnostische qualitative
Auswertung des
Anwendersc
Keine HIV-1-RNA festgestellt.
Nicht reaktiv auf HIV-1-RNA.
Es wird HIV-1-RNA nachgewiesen, aber in einer
Menge unter der unteren Quantifizierungsgrenze
(Lower Limit of Quantitation, LLOQ).
Reaktiv auf HIV-1-RNA.
1,47 bis 7,00 Die HIV-1-RNA-Konzentration liegt im linearen
Bereich von 30 bis 10.000.000 Kopien/ml.
Reaktiv auf HIV-1-RNA.
Log10 Wert
Nicht
Nicht
nachgewiesen nachgewiesen
<30
nachgewiesen
30 bis
10.000.000
<1,47
>10.000.000
>7,00
Die HIV-1-RNA-Konzentration liegt über der
oberen Quantifizierungsgrenze (Upper Limit of
Quantitation, ULOQ).
Reaktiv auf HIV-1-RNA.
Ungültig
Ungültig
Es gab einen Fehler bei der Erzeugung des
Ergebnisses. Die Patientenprobe sollte noch
einmal getestet werden.
Ungültig.d
Die Leistung des Assays hinsichtlich der Quantifizierung von HIV-1-RNA in Serumproben wurde nicht ermittelt. Für Serumproben
keine quantitativen HIV-1-RNA-Ergebnisse angeben.
b
Der Faktor zum Umrechnen von Kopien in internationale Einheiten (IE) für den 3. Internationalen Standard für HIV-1-RNA (10/152)
lautet 0,35 Kopien/IE.
c
Eine diagnostische Auswertung kann ausgehend von unverdünnten Serum- oder Plasmaproben erfolgen.
a
Hinweis: Bei verdünnten Patientenproben können Ergebnisse wie „Nicht nachgewiesen“ oder „<30 nachgewiesen“ erhalten
werden, indem eine Patientenprobe mit einer Konzentration knapp über der LOD/LLOQ verdünnt wird. Es wird empfohlen, eine
andere unverdünnte Patientenprobe zu entnehmen und zu testen, wenn kein quantitatives Ergebnis erhalten wird.
d
Ungültige Ergebnisse sind in blauer Schrift angezeigt.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
22
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Einschränkungen
Einschränkungen
A. Dieser Test darf nur von Mitarbeitern durchgeführt werden, die im Verfahren unterwiesen
wurden. Eine Nichtbefolgung der Anweisungen in dieser Packungsbeilage kann
fehlerhafte Ergebnisse zur Folge haben.
B. Zuverlässige Ergebnisse hängen von der Adäquanz der Entnahme, des Transports, der
Lagerung und der Verarbeitung der Patientenproben ab.
C. Dieser Assay wurde nur mit Humanplasma zur Verwendung als quantitativer Assay
validiert.
D. Dieser Assay wurde mit Humanplasma und Humanserum zur Verwendung als qualitativer
Assay validiert.
E. Eine Kontamination kann nur durch Einhaltung der guten Laborpraxis und der in der
vorliegenden Packungsbeilage angegebenen Vorgehensweise vermieden werden.
F. Es besteht die seltene Möglichkeit, dass Mutationen in den hoch konservierten Regionen
des Virusgenoms, in denen die Primer und/oder Sonden im Aptima HIV-1 Quant Dx
Assay binden, zu einer zu niedrigen Quantifizierung oder zu einem nicht erfolgten
Nachweis des Virus führen.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
23
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Aptima®
Leistung
Leistung
Nachweisgrenze
Die Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD) ist definiert als die HIV-1-RNA-Konzentration, die
gemäß CLSI EP17-A2 (37) mit einer Wahrscheinlichkeit vom mindestens 95% festgestellt wird.
Die LOD wurde durch Testung von Panels bestimmt, die aus Verdünnungen des 3. Internationalen
HIV-1-Standards der WHO (Subtyp B, NIBSC-Code: 10/152) in HIV-1-negativem Plasma
bestanden. Es wurden 30 Replikate jeder Verdünnung auf drei Panther Systemen mit drei
Reagenzchargen analysiert, d. h. insgesamt 90 Replikate pro Verdünnung. Gemäß CLSI EP17-A2
sind die Ergebnisse der Reagenzcharge mit der höchsten Konzentration für die vorhergesagte
Nachweisgrenze als LOD definiert und in Tabelle 2 gezeigt. Die LOD für den Aptima HIV-1
Quant Dx Assay beträgt per Probit-Analyse 13 Kopien/ml (37 IE/ml; 0,35 Kopien = 1 IE).
Tabelle 2: Nachweisgrenze des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays bei Verwendung des 3. internationalen
HIV-1-Standards der WHO
Vorhergesagte
Nachweisgrenze
Konzentration
(Kopien/ml)
10%
1,3
20%
1,8
30%
2,3
40%
2,7
50%
3,2
60%
3,9
70%
4,9
80%
6,5
90%
9,5
95%
13,1
Nachweisgrenze bei HIV-1-Subtypen und -Gruppen
Für die HIV-1-Gruppe M (Subtyp A, C, D, F, G, CRF01_AE, CRF02_AG) und die Gruppen N
und O wurden sieben Panels hergestellt, indem HIV-1-negatives Humanplasma entweder mit
einer HIV-1-Viruskultur oder positiven klinischen Patientenproben versetzt wurde (0 bis
40 Kopien/ml). Jede Panelprobe wurde in 30 Replikaten mit zwei Reagenzchargen getestet,
d. h. insgesamt 60 Replikate pro Panelprobe. Die Zuweisung der Konzentration zu klinischen
Patientenproben oder Viruskultur-Stammlösungen wurde mit einem Vergleichsassay
bestimmt. Zur Aufstellung der vorhergesagten 50-%- und 95-%-Nachweisgrenzen wurde eine
Probit-Analyse durchgeführt. Gemäß CLSI EP17-A2 (37) sind die Ergebnisse der
Reagenzcharge mit der höchsten Konzentration für die vorhergesagte Nachweisgrenze als
LOD definiert und in Tabelle 3 gezeigt.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Aptima®
Leistung
Tabelle 3: Nachweisgrenze bei HIV-1-Subtypen und -Gruppen
Subtyp/Gruppe
Vorhergesagte
Nachweisgrenze
Konzentration
(Kopien/ml)
50%
3,0
95%
12,3
50%
1,8
95%
7,6
50%
3,4
95%
15,4
50%
2,2
95%
11,8
50%
4,2
95%
14,8
50%
2,0
95%
8,3
50%
3,5
95%
18,2
50%
1,3
95%
7,9
50%
2,0
95%
8,0
A
CRF01_AE
CRF02_AG
C
D
F
G
N
O
Linearer Bereich
Der lineare Bereich des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays wurde durch Testung von Panels
bestimmt, die aus einer nach CLSI EP06-A (38) in HIV-1-negativem Humanplasma
verdünnten HIV-1-Subtyp-B-Viruskultur bestanden. Die Konzentration der Panels lag im
Bereich von 1,30 bis 7,30 log Kopien/ml. Die Tests erfolgten auf sieben Panther Systemen
mit zwei Reagenzchargen des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays. Wie in Abbildung 6 gezeigt,
erwies sich der Aptima Quant Dx Assay im gesamten Testbereich als linear.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Leistung
Aptima HIV-1 Quant Dx (log Kopien/ml)
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
R² = 0,9995
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
Target-Konzentration (log Kopien/ml)
Abbildung 6. Linearität des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays
Linearität bei HIV-1-Subtypen und -Gruppen
Die lineare Reaktion des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays in Gruppe M (Subtyp A, B, C, D, F,
G, H, CRF01_AE) und in den Gruppen N und O wurde durch Testung von pufferverdünnten
HIV-1-Transkript-Panels im Konzentrationsbereich von 2,00 bis 6,50 log Kopien/ml bestätigt.
Die Tests erfolgten auf vier Panther Systemen in sechs Läufen. Im gesamten Testbereich
wurde Linearität aufgezeigt (Abbildung 7).
Aptima HIV-1 Quant Dx (log Kopien/ml)
8,00
7,00
6,00
Subtyp A
Subtyp B
5,00
Subtyp C
Subtyp D
4,00
Subtyp AE
Subtyp F
3,00
Subtyp G
Subtyp H
2,00
Gruppe N
Gruppe O
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
Target-Konzentration (log Kopien/ml)
Abbildung 7. Linearität in Gruppe M (Subtyp A, B, C, D, F, G, H, CRF01_AE) und in den Gruppen N und O
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Leistung
Bestimmung der unteren Quantifizierungsgrenze mithilfe des 3. internationalen
WHO-Standards
Die untere Quantifizierungsgrenze (Lower Limit of Quantitation, LLOQ) ist definiert als die
niedrigste Konzentration, bei der HIV-1-RNA innerhalb eines Gesamtfehlers (Total Error, TE)
zuverlässig gemäß CLSI EP17-A2 (37) quantifiziert werden kann. Der TE wurde mit dem
Westgard-Modell berechnet (TE = Bias + 2 SA). Zur Sicherstellung der Genauigkeit und
Präzision der Messungen wurde der TE des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays auf 1 log
Kopien/ml festgesetzt (d. h., an der LLOQ ist der Unterschied zwischen zwei Messungen von
mehr als 1 log Kopien/ml statistisch signifikant).
Die LLOQ wurde durch Testung von Panels bestimmt, die aus Verdünnungen des 3.
internationalen HIV-1-WHO-Standards (Subtyp B, NIBSC-Code: 10/152) in HIV-1-negativem
Plasma bestanden. Gemäß CLSI EP17-A2 wurden die Panels mit drei Reagenzchargen in
Replikaten von je 30 pro Charge in 26 Läufen getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4
gezeigt. Die höchste LLOQ für die drei auf dem Aptima HIV-1 Quant Dx Assay mit dem 3.
internationalen WHO-Standard gemessenen Chargen beträgt 19 Kopies/ml (1,27 log Kopien/ml)
(Tabelle 5).
Tabelle 4: Bestimmung der LLOQ des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays mit dem 3. internationalen
HIV-1-Standard der WHO
Reagenzcharge
1
2
3
TargetKonzentration
(log Kopien/ml)
Aptima HIV-1
Quant Dx
(log Kopien/ml)
SA
(log Kopien/ml)
Bias
(log Kopien/ml)
Berechneter TE
(log Kopien/ml)
1,15
0,97
0,36
0,18
0,90
1,24
0,86
0,34
0,39
1,06
1,42
1,27
0,35
0,15
0,85
1,54
1,36
0,23
0,19
0,64
1,94
1,90
0,15
0,05
0,34
2,42
2,40
0,08
0,01
0,18
1,15
0,49
0,30
0,65
1,26
1,24
0,73
0,41
0,51
1,33
1,42
0,88
0,38
0,54
1,30
1,54
1,20
0,25
0,34
0,84
1,94
1,74
0,22
0,21
0,64
2,42
2,30
0,19
0,12
0,50
1,15
0,86
0,40
0,29
1,09
1,24
0,95
0,37
0,29
1,03
1,42
1,10
0,33
0,32
0,98
1,54
1,27
0,36
0,27
0,99
1,94
1,79
0,18
0,15
0,51
2,42
2,35
0,12
0,07
0,31
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
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Leistung
Tabelle 5: Aufstellung von LLOQ mit dem 3. internationalen HIV-1-Standard der WHO (3 Reagenzchargen)
Reagenzcharge
LLOQ
(log Kopien/ml)
LLOQ
(log Kopien/ml)
1
1,27
19
2
1,20
16
3
1,10
13
Verifizierung der LLOQ bei HIV-1-Subtypen und -Gruppen
Die LLOQ bei HIV-1-Subtypen und -Gruppen wurde gemäß CLSI EP17-A2 (37) verifiziert.
Für jede HIV-1-Gruppe M (Subtyp A, B, C, D, F, G, CRF01_AE, CRF02_AG) und die
Gruppen N und O wurden Panels hergestellt, indem gepooltes HIV-1-negatives
Humanplasma entweder mit natürlich infizierten klinischen Proben oder klinischen Isolaten
versetzt wurde. Die Tests bestanden aus insgesamt 30 Replikaten pro Panelprobe. Die
Daten in Tabelle 6 zeigen die niedrigste Konzentration für jeden Subtyp bzw. jede Gruppe,
bei dem bzw. der der TE unter 1 log Kopien/ml bestand. Die höchste LLOQ für alle
getesteten Subtypen und Gruppen betrug 30 Kopien/ml; daher wurde dieser höhere Wert als
LLOQ für den Aptima HIV-1 Quant Dx Assay gewählt.
Tabelle 6: Verifizierung des LLOQ nach HIV-1-Subtyp oder -Gruppe
Panel
LLOQ
(log Kopien/ml)
Subtyp A
30
Subtyp CRF01_AE
10
Subtyp CRF02_AG
30
Subtyp B
15
Subtyp C
30
Subtyp D
20
Subtyp F
15
Subtyp G
30
Gruppe N
10
Gruppe O
15
Präzision
Zur Beurteilung der Präzision des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays wurde ein Panel aus mit
HIV-1-Subtyp-B-Viruskultur versetztem HIV-1-negativem Plasma von drei Anwendern mit drei
Reagenzchargen auf drei Panther Systemen in einem Zeitraum von 20 Tagen getestet
(Tabelle 7). Das Panel bestand aus einer HIV-1-negativen Panelprobe und acht HIV-1-
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
28
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Aptima®
Leistung
positiven Panelproben. Die Zuweisung der Konzentration zu klinischen Patientenproben oder
Viruskultur-Stammlösungen wurde mit einem Vergleichsassay bestimmt.
Tabelle 7: Präzision des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays
Anzahl der
gültigen
Replikate
Mittlere
Konzentration
(log Kopien/ml)
132
Zwischen
Geräten
Zwischen
Bedienern
Zwischen
Chargen
Zwischen
Durchläufen
Innerhalb von
Durchläufen
Gesamt
SD
VK
(%)
SD
VK
(%)
SD
VK
(%)
SD
VK
(%)
SD
VK
(%)
SD
VK
(%)
1,74
0,00
0,00
0,03
1,76
0,00
0,00
0,00
0,00
0,16
9,08
0,16
9,25
157
2,32
0,00
0,00
0,05
2,17
0,02
0,91
0,09
3,75
0,15
6,57
0,18
7,92
158
2,42*
0,00
0,00
0,02
0,61
0,05
1,93
0,07
2,81
0,13
5,31
0,15
6,34
162
2,92
0,02
0,53
0,08
2,58
0,04
1,28
0,09
3,23
0,09
3,02
0,16
5,30
162
3,80
0,02
0,57
0,04
0,93
0,05
1,29
0,05
1,38
0,08
2,10
0,12
3,03
159
4,99
0,01
0,19
0,03
0,51
0,05
0,94
0,05
1,09
0,04
0,79
0,09
1,73
162
5,73
0,00
0,00
0,02
0,38
0,04
0,78
0,04
0,65
0,07
1,28
0,10
1,67
161
6,75
0,00
0,00
0,02
0,26
0,04
0,62
0,04
0,54
0,05
0,80
0,08
1,17
Die Variabilität aufgrund von manchen Faktoren kann numerisch negativ sein, und zwar dann, wenn die Variabilität aufgrund
dieser Faktoren sehr klein ist. In diesem Fall gilt SA = 0 und VK = 0%. Pro Panel wurden insgesamt 162 Replikate getestet; es
wurden nur Replikate mit numerischem Wert analysiert.
*Diese Panelprobe wurde 1:3 mit Probenverdünner verdünnt und zur Evaluierung der Präzision mit der verdünnten Probe getestet.
Stoffe mit möglicher beeinträchtigender Wirkung
Es wurde die Anfälligkeit des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays gegenüber Interferenzen durch
erhöhte Konzentrationen endogener Stoffe und von Wirkstoffen, die HIV-1-Infizierten häufig
verordnet werden, evaluiert. Es wurden HIV-1-negative Plasmaproben und Proben
verwendet, die bis zu einer Konzentration von 3 log Kopien/ml mit HIV-1-RNA versetzt
worden waren.
Bei Vorhandensein von Albumin (90 mg/ml), Hämoglobin (5 mg/ml), Triglyzeriden (30 mg/ml)
oder unkonjugiertem Bilirubin (0,2 mg/ml) wurde keine Interferenz der Leistung des Aptima
HIV-1 Quant Dx Assays festgestellt.
Bei Vorhandensein der in Tabelle 8 gelisteten exogenen Stoffe in Konzentrationen vom
mindestens Dreifachen der Cmax (Humanplasma) wurde keine Interferenz der Leistung des
Aptima HIV-1 Quant Dx Assays festgestellt.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
29
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Aptima®
Leistung
Tabelle 8: Exogene Stoffe
Pool von
exogenen
Stoffen
Getestete exogene Stoffe
1
Lopinavir, Indinavir, Saquinavir, Ritonavir, Nelfinavirmesylat, Darunavir,
Amprenavir, Atazanavir
2
Nevirapin, Efavirenz, Rilpivirin, Clarithromycin, Amphotericin B
3
Tenofovir-Disoproxilfumarat, Adefovirdipivoxil, Ribavirin, Enfuvirtid, Maraviroc,
Raltegravir, Dolutegravir
4
Abacavirsulfat, Didanosin, Zidovudin, Lamivudin, Stavudin, Entecavir,
Telbivudine, Emtricitabin
5
Paroxetin-HCl, Fluoxetin, Sertralin
6
Ganciclovir, Valacyclovir, Acyclovir, Rifampin/Rifampicin, Ethambutol
7
Ciprofloxacin, Azithromycin, Amoxicillin, Cephalexin, Ampicillin, Trimethoprim
8
Valganciclovirhydrochlorid, Boceprevir, Telaprevir, Simeprevir, Sofosbuvir
9
PegInterferon alpha -2b, Interferon alpha -2a, Interferon alpha -2b
10
Heparin, EDTA, Natriumcitrat
11
Tipranavir
12
Isoniazid
Die in Tabelle 9 gelisteten klinischen Plasmaproben von Patienten mit erhöhten
Konzentrationen definierter Stoffe oder von Patienten mit den gelisteten Krankheiten wurden
mit dem Aptima HIV-1 Quant Dx Assay mit oder ohne 3 log Kopien von HIV-1-RNA getestet.
Es wurde keine Interferenz der Leistung beobachtet.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
30
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Leistung
Tabelle 9: Getestete Typen klinischer Patientenproben
Typen klinischer Patientenproben
1
Rheumafaktor (RF)
2
Anti-Kern-Antikörper (ANA)
3
Anti-Jo-1-Antikörper (JO-1)
4
Systemischer Lupus eryth. (SLE)
5
Rheumatoide Arthritis (RA)
6
Multiple Sklerose (MS)
7
Hyperglobulinämie (IgG oder IgM ist akzeptabel)
8
Erhöhte Alaninaminotransferase (ALT)
9
Alkoholbedingte Zirrhose (AC)
10
Multiples Myelom (MM)
11
Lipämisch (erhöhte Lipide)
12
Ikterisch (erhöhtes Bilirubin)
13
Hämolysiert (erhöhtes Hämoglobin)
14
Erhöhtes Proteinalbumin
15
HCV-Antikörper
16
HBV-Antikörper
17
HIV-2-Antikörper
Spezifität
Die Spezifität des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays wurde mithilfe von 120 frischen und 510
gefrorenen HIV-1-negativen Plasmaproben und mithilfe von 120 frischen und 510 gefrorenen
HIV-1-negativen Serumproben. Alle Ergebnisse waren nicht-reaktiv (Spezifität 100%; 95%-KI:
99,4-100%).
Tabelle 10: Serum- und Plasmaspezifität
Frisches
Plasma
Gefrorenes
Plasma
Gesamtplasma
Frisches
Serum
Gefrorenes
Serum
Gesamtserum
Gültige Replikate (n)
120
510
630
120
510
630
Nicht-reaktiv
120
510
630
120
510
630
100%
(99,3-100)
100%
(99,4-100)
100%
(97,0-100)
100%
(99,3-100)
100%
(99,4-100)
100%
Spezifität % (95%-KI) (97,0-100)
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
31
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Leistung
Analytische Spezifität
Die mögliche Kreuzreaktivität auf Erreger (Tabelle 11) im Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
wurde mit oder ohne 3 log Kopien von HIV-1-RNA in HIV-1-negativem Plasma evaluiert. Bei
Gegenwart der Erreger wurde keine Interferenz der Leistung des Assays festgestellt.
Tabelle 11: Zur Ermittlung der Analysespezifität getestete Erreger
Erreger
Konzentration
Hepatitis A
100.000 PBE/ml1
Hepatitis B
100.000 IE/ml2
Hepatitis C
100.000 IE/ml
Hepatitis G
100.000 Kopien/ml
Herpes-Simplex-Virus 1
100.000 PBE/ml
Herpes-Simplex-Virus 2
75.000 PBE/ml
Humanes Herpesvirus 6
100.000 Kopien/ml
Humanes Herpesvirus 8
42.000 PBE/ml
HIV-2
5.500 PBE/ml
HTLV
West Nil-Virus
Parvo B19
100.000 vp/ml3
100.000 Kopien/ml
100.000 IE/ml
Zytomegalievirus
100.000 Kopien/ml
Epstein-Barr-Virus
100.000 Kopien/ml
Adenovirus Typ 5
100.000 PBE/ml
Dengue
100.000 Kopien/ml
Influenza A
100.000 PBE/ml
Staphylococcus aureus
1.000.000 KBE/ml4
Propionibacterium acnes
1.000.000 KBE/ml
Staphylococcus epidermis
1.000.000 KBE/ml
Neisseria gonorrhoeae
1.000.000 KBE/ml
Chlamydia trachomatis
300.000 IFU/ml5
Candida albicans
1.000.000 KBE/ml
PBE/ml = Plaque-bildende Einheiten pro ml.
IE/ml = Internationale Einheiten pro ml.
3
vp/ml = Viruspartikel pro ml.
4
KBE/ml = Kolonie-bildende Einheiten pro ml.
5
IFU/ml = Einschlusskörper-bildende Einheiten pro ml.
1
2
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
32
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Leistung
Wiederholbarkeit bei klinischen Patientenproben
Es wurden zehn klinische Plasmaproben in drei Replikaten mit dem Aptima HIV-1 Quant Dx
Assay getestet. Die Durchschnittskonzentration und die Standardabweichungen sind in
Tabelle 12 gezeigt.
Tabelle 12: Wiederholbarkeit bei klinischen Patientenproben
Patientenprobe
Durchschnittskonzentration
(log Kopien/ml)
SD
1
2,51
0,08
2
3,14
0,02
3
3,17
0,02
4
3,95
0,03
5
4,20
0,06
6
4,94
0,02
7
5,19
0,08
8
5,55
0,03
9
5,86
0,02
10
6,67
0,01
Probenverdünnung mit Probenverdünner
Zur Beurteilung der Probenverdünnung wurde ein Panel aus 11 Proben mit Konzentrationen
im linearen Bereich des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays, inkl. zwei Proben über der oberen
Quantifizierungsgrenze des Assays, unverdünnt und verdünnt (1:3 oder 1:100 in
Probenverdünner) in dreifacher Ausführung (Tabelle 13), getestet.
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
33
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Leistung
Tabelle 13: Probenverdünnung
Durchschnittskonzentration,
unverdünnt
(log Kopien/ml)
Durchschnittskonzentration,
angegebena
(log Kopien/ml)
Unterschied
2,51
2,65
0,14
3,14
3,31
0,17
3,17
3,51
0,34
3,95
4,02
0,07
4,20
4,21
0,01
4,94
4,81
0,13
5,19
5,11
0,08
5,55
5,38
0,17
5,86
5,99
0,13
6,67
6,66
0,01
2,39b
2,17c
0,22
1:100
>7,00 (7,13)
7,51
0,38
1:100
>7,00 (7,46)b
7,45
0,01
Verdünnungsfaktor
1:3
Die angegebene Konzentration ist der nach Anwendung des Verdünnungsfaktors
berechnete Wert.
b
Versetzte Patientenprobe.
c
Ergebnis von zwei von drei getesteten Replikaten. Ein angegebenes Replikatergebnis
war nicht-numerisch („<30 nachgewiesen“).
Hinweis: Alle Ergebnisse > 7,00 log Kopien/ml wurden in einer weiteren Analyse geschätzt.
a
Methodenkorrelation
Die Leistung des Aptima HIV-1 Quant Dx Assays wurde mit dem eines anderen Assays mit
CE-Kennzeichnung verglichen, indem unverdünnte klinische Plasmaproben von HIV-1Infizierten auf vier Panther Systemen mit zwei Reagenzchargen getestet wurden. Für die
lineare Regression wurden insgesamt 340 gefrorene und 103 frische Plasmaproben mit
quantifizierbaren Ergebnissen sowohl im Aptima HIV-1 Quant Dx Assay als auch im
Vergleichsassay verwendet (Abbildung 8). Die Proben beinhalteten die HIV-1-Gruppe M
(Subtyp A, B, C, D, F, G, H, CRF01_AE, CRF02_AG).
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
34
AW-11853-801 Rev. 001 (DE)
Aptima®
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay (log Kopien/ml)
Leistung
8,00
7,00
y = 1,05x - 0,05
R2 = 0,94
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
Vergleichsassay (log Kopien/ml)
Abbildung 8. Korrelation zwischen dem Aptima HIV-1 Quant Dx Assay und einem Vergleichsassay
Diagnostische Übereinstimmung
Zur Beurteilung der diagnostischen Übereinstimmung wurden Patientenproben von HIV-1-positiven
Personen mit dem Aptima HIV-1 Quant Dx Assay und einem qualitativen HIV-1-Vergleichsassay
mit CE-Kennzeichnung getestet: 413 Patientenproben lieferten gültige Ergebnisse (Tabelle 14). Die
Ergebnisse beider Assays wurden folgenderweise kategorisiert. Jedes quantifizierbare oder
nachweisbare Ergebnis wurde als „Nachgewiesen“ kategorisiert. Jedes Ergebnis mit nicht
nachgewiesenem Target wurde als „Target nicht nachgewiesen“ kategorisiert.
Tabelle 14: Diagnostische Übereinstimmung zwischen dem Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
und einem Vergleichsassay
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
Vergleichsassay
Nachgewiesen
Target nicht
nachgewiesen
Nachgewiesen
213
0
Target nicht
nachgewiesen
0
200
Verschleppung
Um festzustellen, ob das Panther System das Risiko falschpositiver Ergebnisse infolge einer
verschleppungsbedingten Kontamination minimiert, wurde eine Analysestudie mit mehreren
Läufen durchgeführt, bei der versetzte Panels auf zwei Panther Systemen getestet wurden. Die
Beurteilung der Verschleppung erfolgte anhand von hochtitrigen, mit HIV-1 versetzten Proben
(7 log Kopien/ml), die im Schachbrettmuster zwischen HIV-1-negativen Proben verteilt waren. Zur
Testung wurden fünf Läufe durchgeführt. Die Gesamtverschleppungsrate betrug 0% (n=470).
Serokonversionspanel
Es wurden 19 HIV-1-Serokonversionspanelsets aus 204 Proben mit dem Aptima HIV-1
Quant Dx Assay getestet. Der Nachweis von HIV-1-RNA wurde mit dem Nachweis in p24Antigentests und in HIV-1/2-Antikörpertests verglichen. Die Anzahl der Tage bis zum ersten
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
35
AW-11853-801 Rev. 001 (DE)
Aptima®
Leistung
reaktiven Ergebnis bei p24-Antigentests, Anti-HIV-1/2-Antikörpertests und im Aptima HIV-1
Quant Dx Assay ist in Tabelle 15 gelistet. Der Aptima HIV-1 Quant Dx Assay wies HIV-1RNA durchschnittlich 5,58 und 10,89 Tage vor dem p24-Antigentest bzw. dem Anti-HIV-1/2Antikörpertest nach.
Tabelle 15: Zusammenfassung der Daten mit dem Serokonversionspanel
Anzahl der reaktiven Panelproben
Panel-ID
Anzahl der
getesteten
Panelproben
Aptima
HIV-1
Quant Dx
HIV-p24- Anti-HIV 1/2Antigen- AntikörperTest
Test
Tage bis zum ersten reaktiven
Ergebnis
Aptima
HIV-1
Quant Dx
Unterschied bzgl. der Tage bis
zum ersten reaktiven Ergebnis
(ausgehend vom Datum der
Blutentnahme)
Nachweis um
Nachweis um
HIV-p24- Anti-HIV 1/2- x Tage früher als x Tage früher als
mit dem HIV- mit dem Anti-HIV
Antigen- Antikörper1/2-Antikörperp24-AntigenTest
Test
Test
Test
6248
7
3
2
1
14
18
25
4
11
6243
10
6
3
2
18
25
32
7
14
6247
9
4
4
1
21
21
30
0
9
9016
10
3
2
0
27
30
34**
3
7
9018
11
5
3
2
21
28
32
7
11
9020
22
5
4
1
83
87
97
4
14
9021
17
5
4
1
43
47
57
4
14
9022
9
3
2
1
23
25
32
2
9
9023
22
5
3
0
71
78
85**
7
9
9030
16
5
3
1
40
47
54
7
14
9034
13
4
3
1
41
46
53
5
12
9089
6
5
3
2
7
16
20
9
13
12008
13
7
4
4
21
28
33
7
12
PRB962
6
4
2
0
7
14
17**
7
10
PRB963
7
4
2
0
9
17
21**
8
12
PRB966
10
5
3
2
35
44
48
9
13
PRB974*
4
3
2
1
7
9
16
2
9
PRB975*
5
3
1
0
7
14
14**
7
7
PRB978*
7
3
1
0
26
33
33**
7
7
Gesamt
204
82
51
20
Mittel
5,58
10,89
Median
7
11
Die Tests auf Anti-HIV 1/2-Antikörper wurden mit dem Anti-HIV-1/2-Test von Abbott durchgeführt, mit folgenden Ausnahmen:
*Die Panels PRB974, PRB975 und PRB978 wurden mit dem Anti-HIV 1/2-Test von Siemens getestet.
Die Tests auf HIV-1-p24-Antigen wurden mit dem HIV-1 p24 Ag-Test von Coulter durchgeführt, mit folgenden Ausnahmen:
*Die Panels PRB974, PRB975 und PRB978 wurden mit dem p24 Ag-Test von BioMerieux getestet.
**Alle Blutproben in diesem Panel waren im Anti-HIV-1/2-Antikörper-Test nicht-reaktiv. Als Basis für die „Tage bis zum ersten
reaktiven Ergebnis“ wurde der letzte Blutentnahmetag verwendet.
Serum, Plasmaäquivalenz-Studie
Zur Beurteilung der Äquivalenz wurden Serum- und Plasmapaare (25 HIV-1-positiv und 25
HIV-1-negativ) und 40 Proben, die mit HIV-1-Kultur (50-1.000.000 Kopien/ml in HIV-1negativem Plasma und Serum) versetzt worden waren, mit dem Aptima HIV-1 Quant Dx
Assay getestet. Die negative Übereinstimmung betrug 100,0% (95%-KI: 96,6%-100,0%). Die
positive Übereinstimmung betrug 98,4% (95%-KI: 95,4%-99,5%).
Aptima HIV-1 Quant Dx Assay
36
AW-11853-801 Rev. 001 (DE)
Aptima®
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