LEMS-1311

LEMS-1311
Arbeitsanleitung
LEMS® - Assay RIA
125I-Radioimmunoassay
für die quantitative Bestimmung von Antikörpern
gegen den spannungsabhängigen P/Q-CalciumKanal (VGCC) in Serum oder Plasma
IVD
REF RA006/12
12
2 – 8 °C
DLD Gesellschaft für Diagnostika und medizinische Geräte mbH
Adlerhorst 15 • D-22459 Hamburg • Germany
Tel +49-40-555 87 10 • Fax +49-40-555 87 111
Internet: http://www.dld-diagnostika.de • E-Mail: [email protected]
2013-11
Inhaltsverzeichnis
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Klinische Bedeutung und Testprinzip
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
Lagerung und Stabilität der Reagenzien
Inhalt des Testbestecks
Probengewinnung und Aufbewahrung
Vorbereitung der Proben und Reagenzien
Testdurchführung
Testauswertung
Referenzbereich
Testcharakteristika
Literatur
Seite 2
Seite 3
Seite 4
Seite 5
Seite 5
Seite 6
Seite 6
Seite 7
Seite 9
Seite 11
Seite 11
Seite 12
1.
Klinische Bedeutung und Testprinzip
Die primäre physiologische Störung beim Lambert-Eaton Syndrom (in
der Literatur abgekürzt als LEMS = Lambert-Eaton Myasthenic
Syndrom) liegt in einer verminderten Freisetzung des Neurotransmitters
Acetylcholin aus den Nervenendigungen in den synaptischen Spalt.
Ursache für diesen präsynaptischen Defekt sind Autoantikörper gegen
ein Membranprotein der Nervenzelle, den spannungsabhängigen
Calcium-Kanal (in der Literatur abgekürzt als VGCC = Voltage Gated
Calcium Channel).
Die typischen Symptome des LEMS ähneln sehr stark den
generalisierten Symptomen der Myasthenia gravis, so daß häufig das
LEMS zunächst als Myasthenia gravis fehldiagnostiziert wird. Hier kann
die Bestimmung der VGCC-Antikörper differentialdiagnostisch eingesetzt
werden.
Bei der überwiegenden Zahl der Patienten mit Lambert-Eaton Syndrom
(ca. zwei Drittel) ist ein kleinzelliges Bronchialkarzinom assoziiert. Da die
Diagnose des LEMS in der Regel der klinischen Manifestation des
Tumors vorausgeht, kann das LEMS schon sehr früh einen entscheidenden Hinweis auf diese maligne Erkrankung geben.
Zur Diagnose des Lambert-Eaton Syndroms kann die radioimmunologische Messung der Autoantikörper gegen die spannungsabhängigen
Calcium-Kanäle eingesetzt werden.
Das Messprinzip des LEMS®-Assays ist ähnlich dem des ACHRAB®Assays zur Bestimmung von Antikörpern gegen den AcetylcholinRezeptor.
Für den Test werden mit 125Iod radioaktiv markierte Calcium-KanalProteine eingesetzt. Für die radioaktive Markierung nutzt man die Tatsache, daß dieses Membranprotein eine hohe Affinität zu Conotoxin hat.
Conotoxin ist das Gift von Meeresschnecken und bindet fast irreversibel
an die VGCCs.
Die Calcium-Kanal Proteine lassen sich anhand ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften in mehrere Untergruppen einteilen, die jeweils
unterschiedliche Conotoxine binden. Die VGCCs vom P-Subtyp
kontrollieren offenbar die Neurotransmitter-Freisetzung an der neuromuskulären Verbindung und sind wahrscheinlich das Zielantigen der
Autoantikörper. Dieser Subtyp bindet das ω-Conotoxin MVIIC aus der
Meeresschnecke Conus magus.
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Für den Test wird das ω-Conotoxin MVIIC mit 125I markiert und anschließend mit den vorgereinigten VGCCs gemischt. Auf diese Weise
werden die Calcium-Kanäle vom P-Subtyp selektiv indirekt markiert. Das
so markierte Protein wird mit Patientenserum inkubiert. Dabei binden die
vorhandenen Antikörper an das Protein. Im zweiten Schritt werden die
Immunkomplexe mit Hilfe eines anti-human IgG ausgefällt. Die Radioaktivität im Niederschlag ist direkt proportional zur Menge an Antikörpern
im Patientenserum.
Die Konzentrationen der Proben werden mit Hilfe der bekannten spezifischen Aktivität des Conotoxins unter Berücksichtigung der
unspezifischen Bindung der individuellen Patientenprobe berechnet und
in pmol/l angegeben.
2.
Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
•
Dieser
Kit
ist
lediglich
zum
in
vitro-Gebrauch
für
Forschungszwecke bestimmt.
Die angegebenen Verfallsdaten sind unbedingt zu beachten.
Einige der Reagenzien enthalten als Konservierungsmittel
Natriumazid. Verschlucken und Berühren mit der Haut vermeiden.
Für den Umgang mit radioaktiven Stoffen gelten die Vorschriften
der Strahlenschutzverordnung.
Folgende Vorsichtsmaßnahmen sind unbedingt einzuhalten:
Beim Umgang mit radioaktiven Stoffen nicht essen, trinken und
rauchen. Radioaktives Material niemals mit dem Mund pipettieren.
Einmalhandschuhe
verwenden.
Verschüttetes
radioaktives
Material sofort aufwischen, kontaminierte Flächen oder
Gegenstände mit geeigneten Detergenzien reinigen.
Fester und flüssiger Abfall sind gemäß StrSchV zu behandeln.
Radioaktive Reagenzien dürfen nur an Personen abgegeben
werden, die im Besitz einer gültigen Umgangsgenehmigung sind.
•
•
•
•
•
•
•
Alle Reagenzien dieses Testbestecks, die humanen Ursprungs
sind, ergaben bei der Prüfung auf HBsAg, HCV bzw. HIV I/II-Antikörper ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein
solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell
infektiöses Material behandelt werden. Alle Reagenzien dieses
Testbestecks, die tierischen Ursprungs sind, stammen von
gesunden Tieren, die von einer zertifizierten Stelle untersucht
wurden. Die Reagenzien sollten trotzdem wie potentiell infektiöses
Material behandelt werden.
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3.
Lagerung und Stabilität der Reagenzien
Der Kit ist bei Lagerung zwischen 2 - 8 °C bis zum angegebenen
Verfallsdatum haltbar. Nach Anbruch ist der Kit bis zum Verfallsdatum
haltbar. Zur Haltbarkeit der gebrauchsfertigen Reagenzien siehe
Vorbereitung der Reagenzien. Direkte Sonneneinstrahlung ist zu
vermeiden.
Das Verfallsdatum sowie die Chargenbezeichnung sind auf jedem
Fläschchen bzw. Kit angegeben. Bei größeren Ansätzen möglichst nur
Reagenzien einer Charge verwenden.
4.
Inhalt des Testbestecks
4.1
125I-Tracer (T)
TRACER (T)
für die Messung der Gesamt-Bindung
Lyophilisat, Aktivität < 6 kBq,
125I-ω-Conotoxin MVIIC markierte VCGGs
1 Fläschchen
4.2
125I-Tracer (NSB)
TRACER (NSB)
für die Messung der unspezifischen Bindung
Lyophilisat, Aktivität < 6 kBq,
125I-markiertes ω-Conotoxin MVIIC und VGCCs,
gesättigt mit unmarkiertem ω-Conotoxin MVIIC
1 Fläschchen
4.3
Negative Kontrolle
CON 0,2 ml, enthält normales Humanserum
1 Fläschchen
4.4
Positive Kontrolle
CON +
0,15 ml, 1:10 vorverdünnt, gebrauchsfertig
enthält Humanserum mit Antikörpern gegen VGCC,
Konzentrationsbereich siehe QC-Zertifikat
1 Fläschchen
4.5
Anti-human-IgG
4 ml, gebrauchsfertig
1 Fläschchen
4.6
Waschlösung
WASH
120 ml, gebrauchsfertig,
enthält PBS mit 0,01 % Triton X-100
4.7
Verdünnungspuffer
DIL
zum Verdünnen der Proben
10 ml, gebrauchsfertig,
enthält Natriumazid (< 0,1 %)
ANTI-HUMAN-IGG
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1 Flasche
1 Fläschchen
Weiter werden benötigt (nicht im Kit enthalten):
•
Pipetten 25, 50, 125 µl und 1 ml Pipetten
Multipette mit Aufsätzen für verschiedene Volumina
Polystyrol-Spitzboden-Röhrchen (keine Glasröhrchen)
Zentrifuge (möglichst mit Kühlung) mit mind. 1500 x g
Dest. Wasser
Absaugvorrichtung oder Dekantiervorrichtung
Vortex-Mischer
Gamma-Counter
5.
Probengewinnung und Aufbewahrung
•
•
•
•
•
•
•
Für den Test kann Serum oder Plasma eingesetzt werden. Hämolytische
bzw. lipämische Proben sollten nicht verwendet werden. Wiederholtes
Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. Proben, die eine
Trübung zeigen, sollten vor dem Test zentrifugiert werden.
Die Proben können bis zu zwei Wochen bei 2 - 8 °C im Kühlschrank
oder eingefroren bei -20 °C für einen längeren Zeitraum gelagert
werden.
6.
Vorbereitung der Proben und Reagenzien
6.1
Patientenproben
Vor dem Test sollen die Proben auf Raumtemperatur gebracht und
durchmischt werden. Es empfiehlt sich, eingefrorene Proben nach dem
Auftauen kurz zu zentrifugieren, um eventuelle Schwebteilchen zu
entfernen.
6.2
Verdünnung der Patientenproben und der Negativ-Kontrolle
Patientenseren und Negativ-Kontrolle werden mit dem Verdünnungspuffer 1:10, d.h. 1+9, verdünnt (z.B. 20 µl Serum + 180 µl Puffer).
Anschließend müssen die Röhrchen mit den Verdünnungen 5 Minuten
bei 3000 x g zentrifugiert werden, um eventuelle Partikel abzutrennen.
Der Testansatz wird dann aus dem Überstand pipettiert. Für diesen
Vorgang empfiehlt es sich, wegen der geringen Volumina
Spitzbodenröhrchen zu verwenden.
ACHTUNG: Die Positiv-Kontrolle ist bereits 1 : 10 vorverdünnt!
Seite 6
6.3
Auflösen der Tracer (T) und Tracer (NSB)
Ca. 10 Minuten vor Gebrauch werden die lyophilisierten Tracer mit
je 0,7 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Fläschchen kurz (ungefähr
5 Sekunden) auf einem Vortex-Mischer mischen, leicht schwenken, bis
sich eine homogene, leicht trübe Lösung gebildet hat und dann wieder
gerade hinstellen. Ein längerer Kontakt der Tracerlösung mit den
Gummistopfen sollte vermieden werden, da der Tracer an den
Stopfen binden und so die Totalaktivität des Tracers deutlich vermindert
sein kann.
Die Tracer enthalten eine Aktivität von ca. 15.000 cpm pro 50 µl.
Die Tracer sind nach Auflösen nur einige Stunden stabil und sollten
sofort verbraucht werden.
7.
Testdurchführung
7.1
Es wird von jeder Probe bzw. Kontrolle sowohl die GesamtBindung als auch die unspezifische Bindung gemessen.
Daher je ein Set Röhrchen für die Messung der Gesamt-Bindung
(Inkubation der Proben mit dem Tracer (T)) und ein Set Röhrchen
für die Messung der unspezifischen Bindung (Inkubation der
Proben mit dem Tracer (NSB)) beschriften.
Es empfiehlt sich, die Proben in jedem Set in Spitzbodenröhrchen
und in Doppelbestimmungen anzusetzen.
7.2
In beiden Sets je 25 µl der positiven Kontrolle, der 1:10 verdünnten
Negativ-Kontrolle und der 1:10 verdünnten Proben pro Röhrchen
pipettieren.
7.3
In die Röhrchen für die Gesamt-Bindung je 50 µl Tracer (T)
pipettieren.
In die Röhrchen für die unspezifische Bindung je 50 µl Tracer
(NSB) pipettieren.
7.4
Röhrchen auf einem Vortex sorgfältig mischen und 1 Stunde bei
Raumtemperatur inkubieren.
Während dieser Inkubation aus jedem Set je 2 Röhrchen 1 min im
Gamma-Counter messen, um die Totalaktivität der beiden Tracer
(T) und (NSB) zu bestimmen.
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7.5
Je 125 µl anti-human IgG in alle Röhrchen pipettieren.
Sorgfältig mischen und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
7.6
Je 1 ml Waschlösung in alle Röhrchen pipettieren und sorgfältig
mischen.
Anschließend 10 Minuten bei 4.000 x g oder 20 Minuten bei
1.500 x g (möglichst unter Kühlung) zentrifugieren.
7.7
Überstand aus
dekantieren.
7.8
Zu jedem Röhrchen wiederum 1 ml Waschlösung geben.
Anschließend den Niederschlag mit Hilfe eines Vortex-Mischers
sorgfältig aufschütteln.
7.9
Die Röhrchen anschließend wiederum 10 Minuten bei 4.000 x g
oder 20 Minuten bei 1.500 x g (möglichst unter Kühlung)
zentrifugieren.
7.10 Überstand aus
dekantieren.
den
den
Röhrchen
Röhrchen
vorsichtig
vorsichtig
7.11 Röhrchen 2 Minuten im Gamma-Counter messen.
Seite 8
absaugen
absaugen
oder
oder
8.
Testauswertung
Die
Berechnung
der
Antikörperkonzentration
Berücksichtigung folgender Variablen:
erfolgt
unter
• Differenz aus den cpm der Gesamt-Bindung (Inkubation der Probe
mit dem Tracer (T)) und den cpm der unspezifischen Bindung
(Inkubation der Probe mit dem Tracer (NSB))
• Faktor D für den Zerfall von 125I nach Markierungsdatum
• Verdünnungsfaktor der Probe, normalerweise = 10
(siehe Probenvorbereitung Punkt 6.2).
• Pipettiervolumen der verdünnten Probe, normalerweise = 25 µl
• Spezifische Aktivität des Toxins in dpm/fmol
• Zählausbeute des Counters Z in %
Die Berechnung der Antikörper-Konzentration erfolgt dann nach
folgender Formel:
(cpm T-Probe - cpm NSB-Probe) x D x Verd.faktor

Pipettiervolumen (µl) x spez. Aktivität x Z
Die normalerweise verwendeten Werte für Verdünnungsfaktor (10),
Pipettiervolumen (25 µl), die chargenspezifische Aktivität des Toxins (in
dpm/fmol, Angabe auf dem Zertifikat) und Zählausbeute des Counters
(70%, d.h. 0,7) können für jede Charge als Konstante K zusammengefasst werden.
Damit vereinfacht sich die obige Formel auf:
Antikörper-Konzentration = (cpm T-Probe - cpm NSB-Probe) x D x K
K wird dabei so berechnet, daß die Ergebnisse in pmol/Liter erhalten
werden.
K ist chargenspezifisch und auf dem im Kit beigelegten Zertifikat
angegeben.
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D ist die Radioaktivität zum Zeitpunkt der Markierung geteilt durch die
Radioaktivität zum Zeitpunkt der Testdurchführung und wird für jede
Woche von der nachfolgenden Tabelle abgelesen. Der Tag der
Markierung ist auf dem Zertifikat angegeben.
Woche der
Testdurchführung
nach Markierung
1. - 2.
2. - 3.
3. - 4.
4. - 5.
5. - 6.
6. - 7.
7. - 8.
Faktor D
1.12
1.22
1.32
1.43
1.55
1.68
1.82
War der Tag der Markierung z. B. der 01. November, so bedeutet "1. - 2.
Woche nach Markierung" der Zeitraum vom 08. bis 15. November mit
einem Faktor D von 1,12.
K gilt für eine Zählerausbeute des Gamma-Counters von 70 %; bei
anderen Zählausbeuten (in der Bedienungsanleitung des Gerätes
angegeben) muß K entsprechend angepaßt werden.
Liegt die Zählausbeute z.B. bei 74%, d.h. 0,74, so muß K um den Faktor
0,7:0,74 = 0,95 korrigiert werden.
Am Ende der Auswertung wird die berechnete Konzentration der
Negativkontrolle in pmol/l von allen berechneten Konzentrationen der
Patientenproben und der Positivkontrolle in pmol/l abgezogen.
Die Differenz ist das Meßergebnis in pmol/l.
Seite 10
Berechnungsbeispiel:
Die Konstante K sei 0,114 und D sei 1,32 (3. - 4. Woche nach
Markierung), so daß sich die Rechenkonstante 0,150 ergibt.
Probe
Negative Kontrolle
Probe –
Mittelwert Mittelwert cpmT - x K x D =
Neg. Kontrolle
cpmT
cpmNSB cpmNSB
pmol/l
pmol/l
544
429
115
17
Positive Kontrolle
3.167
326
2.841
426
409
Patientenserum
1.582
355
1.227
184
167
9.
—
Referenzbereich
Als Referenzbereich wird der auch von der Universität Oxford, Großbritannien (s. Literatur M. Motomura et al., 1995) publizierte Bereich bis
40 pmol/l empfohlen. Proben mit einer Konzentration über 40 pmol/l
können als positiv bewertet werden.
10.
Testcharakteristika
Klinische Spezifität
Proben von 160 gesunden Blutspendern wurden im LEMS-Assay
gemessen. Alle Proben waren negativ (100%).
Klinische Sensitivität
Proben von 50 Patienten mit diagnostizierten Lambert-Eaton Syndrom
wurden im LEMS-Assay gemessen. Alle 50 Proben wurden positiv
gefunden (100%).
Seite 11
Spezifität
Es konnten keine Interferenzen durch Autoantikörper gegen den
Acetylcholinrezeptor, die 21-Hydroxylase, GAD, TSH-Rezeptor, TPO,
Tg, dsDNA oder Rheumafaktoren gemessen werden.
Es konnten keine Interferenzen durch Zugabe von Hämoglobin bis 500
mg/dl, Bilirubin bis 20 mg/dl oder Intralipid bis 3000 mg/dl gemessen
werden
Sensitivität
Die untere Nachweisgrenze wurde durch eine 20fache Messung der
negativen Kontrolle, Bestimmung des Mittelwertes und der
Standardabweichung bestimmt. Die untere Nachweisgrenze als 2fache
Standardabweichung lag bei 2,9 pmol/l.
Reproduzierbarkeit
Intra-Assay
Probe
1
2
Anzahl n
25
25
Mittelwert
145 pmol/l
62 pmol/l
VK (%)
6,9
15,5
Probe
1
2
Anzahl n
20
20
Mittelwert
142 pmol/l
61 pmol/l
VK (%)
14,6
14,3
Inter-Assay
11.
Literatur
• V.A. Lennon, Th.J. Kryzer, G.E. Griesmann, P.E. O'Suilleabhain, A.J.
Windebank, A. Woppmann, G.P. Miljanich, E.H. Lambert
Calcium-channel antibodies in the Lambert-Eaton syndrome and other
paraneoplastic syndromes.
N. Engl. J. Med. 1995;332:1467-1474
• M. Motomura, I. Johnston, B. Lang, A. Vincent, J. Newsom-Davis
An improved diagnostic assay for Lambert-Eaton myasthenic syndrome.
J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 1995;58:85-87
Seite 12
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