QMS® Tacrolimus Immunoassay

QMS® Tacrolimus Immunoassay
QMS® Tacrolimus Immunoassay
In-vitro-Diagnostikum
10015556
Diese Packungsbeilage zum Quantitative Microsphere System (QMS) muss vor
Gebrauch aufmerksam gelesen werden. Die Anweisungen in der Packungsbeilage sind
entsprechend zu beachten. Wenn von den Anweisungen in dieser Packungsbeilage
abgewichen wird, kann die Zuverlässigkeit der Assay-Ergebnisse nicht garantiert werden.
HANDHABUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN
•
•
•
VERWENDUNGSZWECK
Der QMS Tacrolimus-Immunoassay ist für die quantitative Bestimmung von Tacrolimus
in menschlichem Vollblut mit klinisch-chemischen Analysenautomaten vorgesehen.
Die Ergebnisse werden zur Unterstützung der Tacrolimus-Therapie bei Patienten mit
Nieren-, Leber- oder Herztransplantaten verwendet. Dieses In-vitro-Diagnostikum ist
ausschließlich für klinische Laboruntersuchungen bestimmt.
ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTS
Tacrolimus (FK506, PROGRAF®) ist ein Makrolidantibiotikum mit fungalen Ursprungs
(isoliert aus Streptomyces tsukubaensis) mit starken immunsuppressiven Wirkungen, die
bei Patienten nach einer Nieren- bzw. Lebertransplantation erwünscht sind.1 Tacrolimus
hemmt Kalzineurin, eine Phosphatase, und aktiviert die T-Zellen-Proliferation.2-4
Tacrolimus bindet sich intrazellulär an eine Gruppe von Proteinen, die sog. FKBP (FK506Bindungsproteine), und bildet damit einen pentamerischen Komplex bestehend aus
Tacrolimus, FKBP, Kalzineurin A und B sowie Kalmodulin.2-5 Durch die Pentamerbildung
kommt es zu einer Hemmung der Phosphataseaktivität von Kalzineurin, die zur Aktivierung
von Transkriptionsfaktoren für den Transport in den Zellkern benötigt wird. Dadurch wird
die Genexpression von T-Lymphozyten, insbesondere bei Zytokinen wie IL-2 gestört, was
zu einer immunsuppressiven Wirkung bei den Patienten führt.2-5
Die Verteilung von Tacrolimus zwischen Vollblut und Plasma hängt von mehreren Faktoren
ab, wie dem Hämatokrit, der Arzneimittelkonzentration und der Konzentration des
Plasmaproteins. Das Verhältnis von Vollblut zur Plasmakonzentration lag im Durchschnitt
bei 35 (in einem Bereich von 12 bis 67).6-7 Tacrolimus wird vom Cytochromsystem P-450,
und zwar hauptsächlich von CYP3A, schnell metabolisiert.8-11 Das Arzneimittel wird
durch Demethylierung und Hydroxylierung in 8 Metaboliten (M1–M8) metabolisiert.12
Die Halbwertzeit von Tacrolimus liegt in vivo bei durchschnittlich 48 Stunden.8-11
Außerdem wurden große Unterschiede in den Tacrolimus-Konzentrationen im Vollblut
der einzelnen Patienten sowie zwischen den verschiedenen Patienten festgestellt.13
Daher muss die Tacrolimus-Konzentration sorgfältig und häufig kontrolliert werden.14
GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS
Der QMS Tacrolimus-Immunoassay ist ein homogener partikelverstärkter
turbidimetrischer Immunoassay. Der Assay basiert auf der Konkurrenz des freien
Arzneistoffs in der Probe mit dem Arzneistoff auf einem Mikropartikel um die
Antikörper-Bindungsstellen des Tacrolimus-Antikörperreagens. Das mit Tacrolimus
markierte Mikropartikelreagens agglutiniert in Gegenwart des Anti-TacrolimusAntikörperreagens schnell, sofern sich kein konkurrierender Arzneistoff in der Probe
befindet. Die Geschwindigkeit der Extinktionsänderung wird photometrisch bei
700 nm gemessen. Wenn eine Probe zugegeben wird, die Tacrolimus enthält, wird
die Agglutinationsreaktion teilweise gehemmt, sodass sich die Extinktionsänderung
verlangsamt. Eine klassische, konzentrationsabhängige Agglutinationshemmkurve zeigt
die maximale Agglutinationsrate bei der niedrigsten Tacrolimus-Konzentration und die
geringste Agglutinationsrate bei der höchsten Tacrolimus-Konzentration.
•
•
VORSICHT: Luftblasen im Reagens können die Bestimmung des
Reagenzienfüllstands in der Kartusche behindern, was zu unzureichender
Aspiration des Reagens und damit einer Beeinflussung der Ergebnisse führen kann.
Ungeöffnete Reagenzien sind bei einer Lagerungstemperatur von 2 bis 8 °C bis
zum Verfallsdatum stabil.
Reagenzien nicht einfrieren oder Temperaturen über 32 °C aussetzen.
•
•
•
Reagenzien-Kit
QMS Tacrolimus,
10015556, wird als Kit mit drei gebrauchsfertigen, flüssigen
Reagenzien geliefert. Das Kit enthält:
1 x 18 ml
1 x 12 ml
EXT 1 x 50 ml Extraktionsreagens
In-vitro-Diagnostikum: Die im Umgang mit Laborreagenzien normalerweise
erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen sind anzuwenden.
Materialien mit verschiedenen Kitchargennummern dürfen nicht gemischt werden.
Reagenskits nicht nach Ablauf des Haltbarkeitsdatums verwenden.
VORSICHT: Material menschlichen Ursprungs wurden durch eine von der FDA
zugelassene Methode auf HIV-1 und 2, Hepatitis B und Hepatitis C getestet. Die Ergebnisse
waren negativ. Da jedoch mit keiner Testmethode das potenzielle Infektionsrisiko mit
absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden kann, muss mit dem Material genauso
vorsichtig umgegangen werden wie mit einer Patientenprobe. Bei Kontakt mit dem
Material sind die Richtlinien der zuständigen Gesundheitsbehörden zu befolgen.
Xn
VORSICHT:
Die Reagenzien im QMS Tacrolimus-Immunoassay enthalten weniger
als 0,1 % Natriumazid. Kontakt mit Haut und Schleimhäuten vermeiden. Die betroffenen
Stellen mit reichlich Wasser abspülen. Falls Reagenzien verschluckt wurden oder in
die Augen geraten sind, sofort einen Arzt aufsuchen. Natriumazid kann mit Blei- oder
Kupferrohren reagieren und potenziell explosive Metallazide bilden. Bei der Entsorgung
solcher Reagenzien immer mit großen Mengen Wasser nachspülen, um die Bildung von
Aziden zu verhindern. Freiliegende Metallflächen mit 10%iger Natriumhydroxidlösung
reinigen.
•
•
Reaktive Bestandteile
Inhaltsstoff
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
PROBENENTNAHME UND -HANDHABUNG
REAGENZIEN
,
und EXT (Extraktionsreagens) sind gebrauchsfertig.
Vor Gebrauch mehrmals umdrehen und dabei Blasenbildung vermeiden.
Luftblasen in der Reagenskartusche ggf. entfernen. Alternativ kann das Reagens
bei der entsprechenden Lagerungstemperatur stehen gelassen werden, bis die
Luftblasen entwichen sind. Zur Minimierung der Volumendepletion die Luftblasen
nicht mit einer Transferpipette entfernen.
Wenn die Reagenskartusche
oder
leer ist, beide
Kartuschen ersetzen und die Kalibrierung mit mindestens einer Probe jeder
Kontrollkonzentration gemäß den Qualitätskontrollvorschriften des Labors
überprüfen. Falls die Ergebnisse mit den Kontrollen außerhalb der akzeptablen
Bereiche liegen, ist u. U. eine erneute Kalibrierung nötig.
Informationen zur Haltbarkeit von Reagenzien im Analysegerät sowie andere
systemspezifische Informationen sind im analysatorspezifischen Datenblatt der
Assay-Systemparameter zu finden.
Konzentration
Monoklonale Anti-Tacrolimus-Antikörper (Kaninchen) Natriumazid < 1,0 %
0,09 %
Mit Tacrolimus markierte Mikropartikel Natriumazid
< 0,3 %
0,09 %
EXT Natriumazid
0,09 %
•
Ausschließlich in EDTA-Röhrchen gesammelte Vollblutproben verwenden.
Bei allen Probenentnahmeröhrchen sind die Anweisungen des Herstellers zu
beachten. Die Integrität der Probe muss von der Entnahme bis zur Durchführung
des Tests unbedingt gewahrt werden. Die Proben sind mit dem Zeitpunkt der
Blutabnahme und dem Zeitpunkt der letzten Arzneimittelgabe zu kennzeichnen.
Die Blutproben sollten verschlossen und bei einer Lagerungstemperatur von
2–8 °C innerhalb von 7 Tagen bzw. bei einer Lagerungstemperatur von ≤ –20 °C
innerhalb von 2 Monaten analysiert werden.6,10-11 Wiederholtes Einfrieren und
Auftauen vermeiden. Die Blutproben nicht aufschäumen.
Lichteinwirkung kann die Stabilität der Proben beeinträchtigen. Proben
lichtgeschützt lagern.
VERFAHREN
Mitgeliefertes Material
•QMS Tacrolimus-Reagenzien-Kit
Verdünnung der Probe
Zur manuellen Verdünnung von Proben, deren Konzentration außerhalb des linearen
Bereichs des Assays liegt, QMS Tacrolimus-Kalibrator A (0,0 ng/ml) verwenden.
10015556
Manuelle Verdünnung
Blutproben mit einer Tacrolimus-Konzentration von mehr als 30 ng/ml können vor dem
Extrahieren der Probe manuell mit dem QMS Tacrolimus-Kalibrator A (0,0 ng/ml) im
Verhältnis 1:1 verdünnt werden. Die Verdünnung muss so durchgeführt werden, dass
die Ergebnisse der verdünnten Probe über der Assay-Sensitivität von 1 ng/ml liegen.
Die als Ergebnis erhaltene Konzentration muss mit dem manuellen Verdünnungsfaktor
multipliziert werden, um die endgültige Probenkonzentration zu erhalten.
Zusätzlich erforderliches Material (nicht im Lieferumfang)
• QMS Tacrolimus-Kalibratoren, 10015573, Kal. A: 1 x 4 ml, Kal. B–F: je 1 x 2 ml
• Qualitätskontrollprodukte
Empfohlene Materialien:
• MORE Diagnostics Rap/Tac/CsA-Kontrollen,
Level 1, 280-1: je 4 x 4 ml
Level 2, 280-2: je 4 x 4 ml
Level 3, 280-3: je 4 x 4 ml
• Bio-Rad Lyphocheck® Vollblut-Immunsuppressiva-Kontrollen,
Level 1, 274: je 6 x 2 ml
Level 2, 275: je 6 x 2 ml oder Level 4, 277: je 6 x 2 ml
Level 3, 276: je 6 x 2 ml
Level 5, 278: je 6 x 2 ml oder 5-Level-Minipack, 279X: je 5 x 2 ml
• Informationen zu anderen erhältlichen Qualitätskontrollprodukten erhalten
Sie vom technischen Support von Thermo Fisher Scientific.
• Methanol, HPLC-Qualität (≥ 99,8 % rein)
• Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden
• Klinisch-chemischer Analysenautomat
Endgültige Probenkonzentration = Gemessene Konzentration x Manueller Verdünnungsfaktor
Manueller Verdünnungsfaktor = (Probenvolumen + Volumen von Kal. A) / Probenvolumen
KALIBRIERUNG
Der QMS Tacrolimus-Immunoassay muss mit einem vollständigen Kalibrierverfahren
(6 Punkte) kalibriert werden. Hierzu müssen die QMS Tacrolimus-Kalibratoren A, B,
C, D, E und F getestet werden. Für den QMS Tacrolimus-Immunoassay dürfen nur die
QMS Tacrolimus-Kalibratoren verwendet werden. Wenn für die Kalibrierung des QMS
Tacrolimus-Immunoassays nicht das QMS Tacrolimus-Kalibratorset 10015573
verwendet wird, ist keine exakte quantitative Tacrolimus-Bestimmung möglich.
Probenvorbereitung
Hinweis: Bitte beachten Sie die herstellerspezifischen Anweisungen und Empfehlungen
auf der Packungsbeilage der Kontrollen (falls vorhanden).
Für jede neue Charge muss eine Kalibrierung durchgeführt werden. Die Kalibrationskurve
muss mit mindestens einer Probe jeder Kontrollkonzentration gemäß den
Qualitätskontrollvorschriften des Labors überprüft werden. Falls die Ergebnisse mit
den Kontrollen außerhalb der akzeptablen Bereiche liegen, sind entsprechende
Korrekturmaßnahmen erforderlich.
Vor der Extraktion die Proben, Kalibratoren und Kontrollen auf Raumtemperatur
äquilibrieren lassen. Die Kalibratoren sollten mindestens 15–20 gemischt werden.
Die Proben vor der Verwendung gründlich bei Raumtemperatur mischen. Kalibratoren
und Proben durch vorsichtiges Umdrehen gut mischen (vorzugsweise mithilfe eines
Wippschüttlers). Blasenbildung vermeiden.
Hinweis: Jedem Kalibratorkit liegt eine Wertzuweisungskarte bei. Vor der Verwendung
eines neuen Kalibratorkits die Chemieparameter prüfen, um sicherzustellen, dass die
Kalibratorkonzentrationen den Werten auf der Wertzuweisungskarte entsprechen.
Vorbereitung der Extraktionslösung
1. Genau 10 ml des zimmerwarmen Extraktionsreagens in eine saubere, trockene
und luftdichte Flasche füllen.
2. Genau 40 ml Methanol in HPLC-Qualität (≥ 99,8 % rein) in die Flasche geben
und vorsichtig mischen. Die Flasche mit „Tacrolimus-Arbeitsextraktionslösung“
beschriften. Das aktuelle Datum und das Verfallsdatum (2 Wochen nach
Herstellungsdatum) auf dem Etikett vermerken. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
Kalibrierungshäufigkeit
Eine erneute Kalibrierung ist in den folgenden Situationen zu empfehlen:
• Nach einem Wechsel der Kalibratoren- oder Reagenzcharge (Kit)
• Nach Durchführung der monatlichen Gerätewartung
• Im Bedarfsfall nach den Qualitätskontrollverfahren
QUALITÄTSKONTROLLE
Alle Qualitätskontrollen müssen in Übereinstimmung mit den örtlichen und staatlichen
Vorschriften bzw. Akkreditierungsbestimmungen durchgeführt werden.
Extraktionsverfahren für Proben, Kalibratoren und Kontrollen
OPTIMALE ERGEBNISSE SIND NUR GEWÄHRLEISTET, WENN DIE FOLGENDEN
SCHRITTE GENAU EINGEHALTEN WERDEN. DIE EXTRAKTE MÜSSEN SOFORT NACH
DER EXTRAKTION BENUTZT WERDEN.
1. Die Mikrozentrifugenröhrchen für die Extraktion von Proben, Kalibratoren
und Kontrollen vorbereiten und beschriften. Für jede Probe ein
Mikrozentrifugenröhrchen vorbereiten.
2. Genau 200 µl des Proben-, Kalibrator- oder Kontrollmaterials in das
beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Die Probe mit der
Pipette aufnehmen, mit der Pipettenspitze vorsichtig über den Rand des
Probenfläschchens streichen, um überschüssiges Material abzustreifen,
und die Probe an die Innenwand des Mikrozentrifugenröhrchens ausstoßen.
Hinweis: Die Pipettenspitze auf Luftblasen überprüfen. Wenn sich Luft in der
Spitze befindet, kann es zu Ungenauigkeiten kommen.
3. Genau 200 µl der der Extraktionslösung in das Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren.
Wenn mehrere Proben vorbereitet werden, wird eine Repetierpipette zum
Aufnehmen und Ausstoßen der Extraktionslösung empfohlen. Vor dem Ausstoßen
der Extraktionslösung evtl. in der Pipettenspitze vorhandene Luftblasen entfernen.
4. Das Mikrozentifugenröhrchen verschließen und sofort 15–30 Sekunden lang mit
höchster Geschwindigkeit vortexen. Bei jedem Röhrchen überprüfen, ob die
Mischung homogen ist. Falls dies nicht der Fall ist, den nicht vermischten Teil
entfernen und erneut vortexen.
5. Die Mischung im Mikrozentrifugenröhrchen für 5–7 Minuten bei Raumtemperatur
stehen lassen.
6. Das Mikrozentrifugenröhrchen in eine Zentrifuge stellen und 5 Minuten lang mit
13.000 1/min zentrifugieren.
7. Den Überstand in ein Probengefäß dekantieren (Blasenbildung vermeiden) und
sofort die Messung durchführen, damit möglichst wenig Material verdunstet.
Wenn versucht wird, den letzten Tropfen aus dem Gefäß zu entfernen, das Pellet
nicht durch Klopfen aufwirbeln.
8. Die Extrakte nach der Analyse entsorgen. Für Proben, die erneut analysiert
werden sollen, sind neue Extrakte erforderlich.
Zusätzliche Qualitätskontrollanforderungen und mögliche Korrekturmaßnahmen sind in den
Standardarbeitsanweisungen des Labors und/oder im Qualitätssicherungsplan zu finden.
Empfohlene Kontrollverfahren für den QMS Tacrolimus-Immunoassay:
• Für jede Blutprobenanalyse sollte mindestens eine Probe jeder
Kontrollkonzentration getestet werden.
• Wenn eine häufigere Überwachung mit Kontrollen erforderlich ist, sind die
festgelegten Qualitätskontrollverfahren für das Labor zu befolgen.
• Alle Qualitätskontrollen müssen in Übereinstimmung mit den vor Ort geltenden
und den Landes- und/oder Bundesvorschriften durchgeführt werden.
• Falls die Ergebnisse der Qualitätskontrolle außerhalb des im Labor definierten
akzeptablen Bereichs liegen, können die Blutprobenwerte falsch sein und sollten
nicht gemeldet werden. Es sind dann Korrekturmaßnahmen durchzuführen.
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse des QMS Tacrolimus-Immunoassays werden in der Einheit ng/ml
angegeben.
Ergebnismeldung: Labore sollten melden, dass die Ergebnisse mit dem QMS TacrolimusVerfahren erzielt wurden.
Fehlermeldungen bei den Ergebnissen:
Ergebnisse können Ergebnisfehlercodes enthalten. Die Beschreibung solcher Codes ist
in der gerätespezifischen Bedienungsanleitung zu finden.
GRENZEN DES VERFAHRENS
•
Aufgrund der Unterschiede bei den Assay-Methoden und der Reagensspezifität
kann es bei der ermittelten Tacrolimus-Konzentration zu Abweichungen kommen,
wenn dieselbe Probe mit Assays verschiedener Hersteller getestet wird. Es wird
daher die konsistente Überwachung mit einem einzigen Assay empfohlen.
• Immunoassays sind unspezifisch und kreuzreagieren mit Metaboliten. Aus diesem
Grund können Immunoassays die Konzentration von Tacrolimus überbewerten
(siehe Abschnitt Method „Methodenvergleich“). Wenn die Elimination von
Tacrolimus beeinträchtigt ist, können die Metaboliten in einem größeren
Ausmaß akkumulieren und damit zu einer höheren Überbewertung führen.
In solchen Fällen sollte ein spezifisches Assay (z. B. Chromatografieverfahren)
erwogen werden.
Hinweis: Wenn Sie weitere Tipps und Empfehlungen zur Extraktion von Proben für den
QMS Tacrolimus-Immunoassay benötigen, wenden Sie sich an den technischen Support
von Thermo Fisher Scientific.
Durchführung des Assays
Eine detaillierte Beschreibung der Durchführung und Kalibrierung des Assays ist in der
instrumentenspezifischen Bedienungsanleitung zu finden.
2
•
•
•
Die störenden heterophilen Antikörper treten in der Bevölkerung nur selten
auf. Diese Antikörper können die Ergebnisse verfälschen (einschließlich
fälschlicherweise niedriger Ergebnisse aufgrund der Autoagglutination des
Mikropartikel-Reagens).
Die Testergebnisse sollten stets in Verbindung mit der Patientenanamnese, den
klinischen Untersuchungen und anderen Befunden ausgewertet werden. Falls die
Ergebnisse nicht mit den klinischen Befunden übereinstimmen, sind weitere Tests
zur Bestätigung der Ergebnisse durchzuführen.
Informationen zu den Wechselwirkungen mit anderen gleichzeitig verabreichten
Arzneimitteln und zu Arzneimitteln, die die Tacrolimus-Konzentration erhöhen oder
verringern können, können der PROGRAF-Packungsbeilage entnommen werden.14
Fortsetzung der Tabelle
Aufgrund der der unterschiedlichen klinischen Zustände der Patienten sollten Ärzte den
gewünschten therapeutischen Bereich auf der Grundlage ihrer eigenen Erfahrungen
sowie der klinischen Anforderungen jedes Patienten wählen. Die Tacrolimus-Werte
sollten nicht als einziges Kriterium für eine Änderung des Behandlungsschemas
herangezogen werden. Unterschiede in der Sensitivität gegenüber den
immunsuppressiven und nephrotoxischen Wirkungen von Tacrolimus, die gleichzeitige
Verabreichung von anderen Immunsuppressiva, die Art des Transplantats, die
Zeitspanne seit der Transplantation und eine Reihe weiterer Faktoren bedingen
unterschiedliche Zielwerte für die optimale Konzentration von Tacrolimus im Blut.
Die optimalen Bereiche unterscheiden sich je nach verwendetem Assay und sollten
daher für jedes Assay festgelegt werden. Aufgrund der methodischen Unterschiede
und der unterschiedlichen Kreuzreaktivität dürfen Werte, die mit verschiedenen
Assays ermittelt wurden, nicht als austauschbar betrachtet werden. Zudem sollten
keine Umrechnungsfaktoren angewendet werden. Für jeden Patienten sollte daher
immer dasselbe Assay verwendet werden.
Funktionale Sensitivität (Nachweisgrenze)
Die funktionale Sensitivität entspricht der niedrigsten Tacrolimus-Konzentration, die
mit einer Inter-Assay-Präzision von 20 % CV gemessen werden kann Die Untersuchung
wurde mit Vollblutproben durchgeführt, die mit Tacrolimus im Bereich von 0,5 bis 5,0 ng/ml
dotiert wurden. Es wurde zwei Mal täglich, 30 Tage lang, eine Messung pro Durchlauf
vorgenommen, was insgesamt 60 Datenpunkte ergab. An der oberen Vertrauensgrenze
von 95 % betrug die berechnete Nachweisgrenze 0,9 ng/ml und stützt damit die untere
Assay-Nachweisgrenze von 1,0 ng/ml. Die prozentuale Wiederfindung bei 0,9 mg/ml lag
bei 102,0 %.
29,9
100,0 %
90,0 %
26,9
26,0
96,8 %
80,0 %
23,9
22,8
95,4 %
70,0 %
20,9
19,2
91,8 %
60,0 %
17,9
17,2
96,1 %
50,0 %
14,9
14,7
98,6 %
40,0 %
12,0
11,1
92,7 %
30,0 %
9,0
8,6
95,7 %
20,0 %
6,0
6,0
100,0 %
10,0 %
3,0
3,1
102,9 %
5,0 %
1,5
1,5
100,4 %
3,3 %
1,0
1,0
101,4 %
0,8
99,6 %
0,0
0,0
–
Proben-ID
n
Erwartete
Konzentration
(ng/ml)
Gemessene
Konzentration
(ng/ml)
Probe 1
21
2,7
2,7
101,8
Probe 2
21
9,8
10,8
109,4
Probe 3
21
18,0
17,7
98,2
Probe 4
21
19,8
21,3
107,5
Probe 5
21
27,0
27,1
100,4
Wiederfindung
(%)
n
Mittelwert
(ng/ml)
Innerhalb des
Laufs
Gesamter Lauf
Std.
abw.
VK (%)
Std.
abw.
VK (%)
Dotierte Probe A
80
3,0
0,2
4,9 %
0,2
7,1 %
Dotierte Probe B
80
10,0
0,2
1,9 %
0,4
3,6 %
Dotierte Probe C
80
20,9
0,4
1,9 %
1,1
5,0 %
Patientenprobe A
80
3,2
0,1
4,1 %
0,2
6,2 %
Patientenprobe B
80
10,4
0,2
2,2 %
0,4
3,6 %
Patientenprobe C
80
24,2
0,5
2,1 %
1,1
4,6 %
Methodenvergleich
Es wurden Korrelationsstudien durchgeführt, um den QMS Tacrolimus-Immunoassay
mit zwei LC-MS/MS-Methoden (System 1 und System 2) und mit dem Tacrolimus-Assay
Abbott ARCHITECT® zu vergleichen. In den Studien wurden EDTA-Vollblutproben von
Patienten mit einem Nieren-, Leber- oder Herztransplantat verwendet, die Tacrolimus
erhielten. Die getesteten Proben stammten hauptsächlich von erwachsenen Patienten,
bei denen seit der Transplantation in der Regel mehr als 9 Monate vergangen waren.
Die Patienten erhielten entweder Tacrolimus alleine oder zusammen mit einem
anderen Immunsuppressivum, hauptsächlich mit Mycophenolat-Mofetil (MMF),
Mycophenolsäure (MPA) oder Kortikosteroiden. Die Ergebnisse der DemingRegressionsanalyse16 zwischen den verschiedenen Methoden sind in der folgenden
Tabelle zu sehen.
Vedünnungslinearität
Zur Beurteilung der Linearität wurde eine Probe mit hoher Tacrolimus-Konzentration mit
dem QMS Tacrolimus-Kalibrator A auf Konzentrationen verdünnt, die über den gesamten
Assaybereich gleichmäßig verteilt waren. Die prozentuale Wiederfindung wurde durch
Dividieren der gemessenen Tacrolimus-Konzentration durch die erwartete Konzentration
ermittelt. Die erwarteten Konzentrationen wurden durch Multiplizieren des gemessenen
Wertes der hochkonzentrierten Probe mit einem Verdünnungsfaktor berechnet.
29,9
0,8
0,0 %
Proben
Messbereich
Der Messbereich des QMS Tacrolimus-Assays reicht von 1 ng/ml (gemessener
Mindestwert auf Basis der funktionalen Sensitivität) bis 30 ng/ml Tacrolimus.
100,0 %
2,8 %
Präzision
Die Präzision wurde mit gepoolten Vollblutproben von Patienten und dotierten Proben
beurteilt. Die Untersuchung wurde wie im CLSI-Protokoll EP5-A2 beschrieben durchgeführt.15
Jede Probe wurde 20 Tage lang zwei Mal täglich in zwei Replikaten pro Durchlauf getestet.
Für die Standardabweichung und den prozentualen Variationskoeffizienten wurden
der Mittelwert sowie die Werte innerhalb des Durchlaufs und insgesamt berechnet.
Repräsentative Ergebnisse sind im Folgenden zusammengestellt:
Im Folgenden sind repräsentative Leistungsdaten zusammengestellt, die mit einem
handelsüblichen klinisch-chemischen Analysenautomaten unter Anwendung von
turbidimetrischer quantitativer Analyse erzielt wurden. Sofern nicht anders angegeben,
wurden alle Assays unter Befolgung des hierin beschriebenen Testverfahrens mit dem
Analysenautomaten Beckman AU680 durchgeführt. Die in den einzelnen Laboren erzielten
Ergebnisse können sich von diesen Daten unterscheiden. Weitere Leistungsdaten
für den jeweiligen Analysenautomaten sind im zugehörigen Anwendungsprotokoll zu
finden. Wenn Sie Hilfe benötigen, wenden Sie sich an den technischen Support von
Thermo Fisher Scientific.
Wiederfindung
(%)
Wiederfindung
(%)
Wiederfindung (%) = (Gemessene Konzentration / Erwartete Konzentration) x 100
SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE
Gemessene
Konzentration (ng/ml)
Gemessene
Konzentration (ng/ml)
Wiederfindung
Negative Vollblutproben wurden mit bekannten Mangen an Tacrolimus bei
Konzentrationen über den gesamten Assaybereich dotiert. Die TacrolimusKonzentrationen in diesen Proben wurden mittels LC-MS/MS verifiziert und mit dem QMS
Tacrolimus-Immunoassay getestet. Die Ergebnisse sind im Folgenden zusammengestellt:
Der optimale Therapiebereich für Tacrolimus in Vollblut wurde mit diesem Assay noch
nicht ermittelt. Die therapeutischen Bereiche für Tacrolimus können in Abhängigkeit
von den klinischen Faktoren und angewandten Verfahren variieren.
Erwartete
Konzentration (ng/ml)
Erwartete
Konzentration (ng/ml)
Erwartete Konzentration = % der hohen Probe x Gemessene hohe Konzentration
Wiederfindung (%) = (Gemessene Konzentration / Erwartete Konzentration) x 100
ERWARTETE WERTE
% der hohen
Probe
% der hohen
Probe
Vergleichende
Methode
n
Steigung
(95 % KI*)
Schnittpunkt
(95 % KI)
Korrelationskoeffizient
(r)
LC-MS/MS-System 1
383
1,111
(1,084 bis 1,137)
0,53
(0,31 bis 0,76)
0,972
LC-MS/MS-System 2
232
1,130
(1,092 bis 1,167)
0,71
(0,42 bis 1,01)
0,967
Abbott ARCHITECTTacrolimus-Assay
208
1,126
(1,071 bis 1,181)
–0,03
(–0,63 bis
+0,56)
0,937
*Konfidenzintervall (KI)
Probenbereich QMS Tacrolimus: 1,0 bis 30,8 ng/ml
Probenbereich LC-MS/MS: 0,8 bis 29,5 ng/ml
Probenbereich ARCHITECT Tacrolimus: 2,4 bis 28,1 ng/ml
3
Streudiagramm der Ergebnisse des Vergleichs von QMS Tacrolimus und LC-MS/
MS-System 1 bei kombinierten Proben von Patienten mit Nieren-, Leber- und
Herztransplantat.
Streudiagramm der Ergebnisse des Vergleichs von QMS Tacrolimus und Abbott
ARCHITECT Tacrolimus bei kombinierten Proben von Patienten mit Nieren- und
Lebertransplantat.
QMS Tacrolimus vs. LC-MS/MS-System 1
1:1-Linie
Deming-Regr.
25
QMS Tacrolimus (ng/ml)
QMS Tacrolimus (ng/ml)
30
QMS Tacrolimus vs. ARCHITECT Tacrolimus
20
15
10
5
0
30
1:1-Linie
Deming-Regr.
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
LC-MS/MS-System 1 (ng/ml)
25
0
30
0
10
15
20
ARCHITECT Tacrolimus (ng/ml)
25
30
Bland-Altman-Diagramm17 der Ergebnisse des Vergleichs von QMS Tacrolimus und
Abbott ARCHITECT Tacrolimus bei kombinierten Proben von Patienten mit Nieren- und
Lebertransplantat. Die mittlere Verzerrung wird als durchschnittliche Differenz zwischen
den Ergebnissen des QMS Tacrolimus-Immunoassays und des ARCHITECT-TacrolimusAssays berechnet.
Bland-Altman-Diagramm17 der Ergebnisse des Vergleichs von QMS Tacrolimus und
LC-MS/MS-System 1 bei kombinierten Proben von Patienten mit Nieren-, Leber- und
Herztransplantat. Die mittlere Verzerrung wird als durchschnittliche Differenz zwischen
den Ergebnissen des QMS Tacrolimus-Immunoassays und des LC-MS/MS-Systems 1
berechnet.
Unterschied von QMS Tacrolimus zu ARCHITECT Tacrolimus
Unterschied von QMS Tacrolimus zu LC-MS/MS
8
8
Mittlere
Verzerrung
Mittlere
Verzerrung
Unterschied von QMS zu ARCHITECT
Tacrolimus (ng/ml)
Unterschied von QMS zu LC-MS/MS-System 1
(ng/ml)
5
KI (95 %)
6
4
2
0
–2
KI (95 %)
6
4
2
0
–2
–4
–4
–6
0
5
10
15
20
25
0
30
Durchschnitt von LC-MS/MS-System 1 und QMS (ng/ml)
5
10
15
20
25
Durchschnitt von ARCHITECT Tacrolimus und QMS (ng/ml)
4
30
Spezifität
Die Spezifizitätsstudien wurden gemäß dem CLSI-Protokoll EP7-A2 durchgeführt.18
Die Kreuzreaktivität wurde für die verfügbaren Hauptmetaboliten von Tacrolimus getestet.
Außerdem wurden weitere Medikamente getestet, die routinemäßig zusammen mit
Tacrolimus verabreicht werden, um festzustellen, ob diese Verbindungen die Quantifizierung
von Tacrolimus-Konzentrationen mit dem QMS Tacrolimus-Immunoassay beeinflussen.
Cefazolin
150.000
Nadolol
Die Kreuzreaktivität der Metaboliten wurde mit folgender Formel berechnet:
Fortsetzung der Tabelle
Verbindung
Konzentration
(ng/ml)
Verbindung
Konzentration
(ng/ml)
1.200
Ceftriaxon
500.000
Naproxen
Kreuzreaktivität (%) = Gemessene Konzentration – Erwartete Konzentration x 100
Kreuzreaktantenkonzentration
Cephalosporin C
100.000
Nicardipin
Chlorpromazin
50.000
Nikotin
20.000
Kreuzreaktivität mit Tacrolimus-Metaboliten
Die Kreuzreaktivität des QMS Tacrolimus-Immunoassays mit den Hauptmetaboliten
von Tacrolimus wird in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Die getesteten
Verbindungen wurden in menschliche Vollblutproben gegeben, die zwei Konzentrationen
des Tacrolimus-Medikaments enthalten, und in drei Replikaten getestet. Der Prozentsatz
der Kreuzreaktivität wurde anschließend berechnet.
Chloramphenicol
250.000
Nifedipin
100.000
Chlordiazepoxid
20.000
Penicillin G
100.000
1.500
Pentobarbital
100.000
100.000
Phenobarbital
150.000
TacrolimusMetaboliten
Chloroquin
Cimetidin
Metaboliten- Erwartete
Gemessene Wieder- Kreuzkonzentration Konzentration Konzentration findung reaktivi(ng/ml)
(ng/ml)
(ng/ml)
(%)
tät (%)
M-I (13-O-Demethyl)
M-II (31-O-Demethyl)
M-III
(15-O-Demethyl)
M-IV (12-Hydroxy)
M-VII
(13,15-O-Didemethyl)
20
5,8
7,6
131,0
9,2
20
13,3
14,8
111,3
7,7
20
5,7
5,9
103,5
0,7
20
13,2
13,1
99,2
–0,5
20
5,3
6,0
113,2
3,8
20
12,4
13,0
104,8
2,7
3,5
14,6
18,7
128,1
117,1
3,3
21,2
27,0
127,4
174,8
20
5,0
6,1
122,0
5,7
20
12,0
14,1
117,5
10,5
20
5,4
7,3
135,2
9,3
20
13,4
14,7
109,7
6,7
20
5,4
5,8
107,4
2,2
20
13,4
13,8
103,0
2,0
100.000
500
Ciprofloxacin
7.400
Phenytoin
100.000
Clarithromycin
5.000
Prazosin
100.000
Clonidin
100
Prednisolon
100.000
Colchicin
90
Prednison
100.000
Cortison
1.200
Primidon
100.000
Cyclosporin/Cyclosporin A
10.000
Probucol
600.000
Diazepam
20.000
Procainamid
100.000
Digitoxin
100.000
Propoxyphen
4.000
Digoxin
10.000
Propranolol
40.000
Diltiazem
60.000
Quinidin
100.000
Disopyramid
100.000
Ranitidin
200.000
Erythromycin
200.000
Rifampin/Rifampicin
100.000
Ethosuximid
300.000
Salicylsäure
500.000
Everolimus
100
Famotidin
10.000
Spectinomycin
100.000
Fluconazol
100.000
Streptomycin
100.000
Flucytosin/
5-Fluorocytosin
40.000
Sulfamethoxazol
150.000
Furosemid
100.000
Theophyllin
250.000
Ganciclovir
1.000.000
Ticlopidin
150.000
Die Konzentration der Tacrolimus-Metaboliten war in den Blutproben der Patienten im Vergleich zur
Muttersubstanz sehr gering. Sie betrug bei M-I 6 %, bei M-II 15 %, bei M-III 6 % und war bei M-IV
nahezu nicht nachweisbar. 9,12,19
Gemfibrozil
100.000
Tobramycin
100.000
Gentamicin
120.000
Triamteren
100.000
Störsubstanzen
Die Störsubstanzstudien wurden gemäß dem CLSI-Protokoll EP7-A2 durchgeführt.18
Häufig zusammen mit Tacrolimus angewendete Arzneimittel sowie verschiedene
gebräuchliche Arzneimittel wurden hinsichtlich Ihres Störpotenzials beim QMS
Tacrolimus-Immunoassay untersucht. Die untersuchten Verbindungen wurden
menschlichen Vollblutproben zugegeben, die ca. 5 und 12 ng/ml Tacrolimus enthielten,
und mit dem QMS Tacrolimus-Immunoassay getestet. Ein Fehler bei der Wiederfindung
der Tacrolimus-Konzentration von mehr als 10 % wurde als Störung des Arrays
betrachtet. Die in der folgenden Tabelle aufgelisteten Verbindungen führten in den
angegebenen Konzentrationen zu keiner Störung des Assays. Die durchschnittliche
prozentuale Wiederfindung von Tacrolimus lag im Bereich von 91 bis 109 %.
Hydrochlorothiazid
40.000
Trimethoprim
40.000
Hydrocortison
100.000
Valproinsäure
500.000
Ibuprofen
400.000
Vancomycin
100.000
Itraconazol
100.000
Verapamil
100.000
Kanamycin A Sulfat
100.000
M-VII
(13,15-O-Didemethyl)
+ M-VI
(13,31-O-Didemethyl)
Wiederfindung (%) = (Gemessene Konzentration / Erwartete Konzentration) x 100
Die beobachtete Kreuzreaktivität des Tacrolimus-Metaboliten M-IV betrug ≤ 174,8 %. Die TacrolimusMetaboliten M-V und M-VIII wurden nicht auf mögliche Kreuzreaktivität untersucht.
Verbindung
Acetaminophen
Acycloguanisin/Acyclovir
Konzentration
(ng/ml)
200.000
1.000.000
Verbindung
Sirolimus (Rapamycin)
Die folgenden, potenziell störenden endogenen Substanzen führten in den angegebenen
Konzentrationen beim Test mit dem QMS Tacrolimus-Immunoassay zu einer
Wiederfindung von 92 bis 108 %.
Konzentration
(ng/ml)
Potenzielle Störsubstanz
Konzentration
Kanamycin B Sulfat
100.000
Ketoconazol
100.000
Albumin
12 g/dl
60 mg/dl
500 mg/dl
Allopurinol
50.000
Labetalol
17.100
Bilirubin
Amikacinsulfat
150.000
Lidocain
100.000
Cholesterin
5 mg/dl
Amphotericin B
100.000
Lithium
35.000
Kreatinin
Ampicillin
100.000
Lovastatin
20.000
Triglycerid
15.00 mg/dl
100.000
Harnsäure
20 mg/dl
Apresolin/Hydralazin
100.000
Methylprednisolon
Atenolol
40.000
Metoclopramid
100.000
IgG Gammaglobulin
Azathioprin
100.000
Minoxidil
60.000
Rheumafaktor
500 IU/ml
HAMA*
400 ng/ml
Hämatokrit
12 – 64 %
Azithromycin
5.000
Morphinsulfat
100.000
Bromocriptin/2-Bromo-αergocryptine
8.000
Mycophenolsäure
100.000
N-Acetylprocainamid
120.000
Carbamazepin
120.000
300
*HAMA = Humane Anti-Maus-Antikörper
5
12 g/dl
Schlüssel zu den verwendeten Symbolen
LITERATUR
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