grundpraktikum physiologie teil

grundpraktikum physiologie teil
GRUNDPRAKTIKUM PHYSIOLOGIE
TEIL: „PFLANZENPHYSIOLOGIE“
BIOLOGIE
Universität des Saarlandes
Sommersemester 2008
TITELBILD
Arabidopsis thaliana ist eine kleine Blütenpflanze und ein viel genutzter Modellorganismus in der
Pflanzenbiologie. Arabidopsis zählt zur Familie der Brassicaceen (Kreuzblütler, Senfgewächse), welcher
auch Kulturpflanzen wie Kohl und Raps angehören. Arabidopsis hat zwar keine agronomische
Bedeutung, aber bietet wichtige Vorteile für die Genetik und Molekularbiologie in der
Grundlagenforschung. Weitere Informationen unter http://www.arabidopsis.org/info/aboutarabidopsis.jsp.
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INHALTSVERZEICHNIS
A. Allgemeines……………………………………………………..
Termine, Sicherheitsregeln
Vorbereitung und Protokollierung
Weiterführende Literatur zur Kursthematik
Auswertung und Versuchsbericht
B. Versuche………………………………………………………….
I Photosynthesepigmente………………………………………………..
I/1 Dünnschichtchromatographische Trennung der
Chloroplastenfarbstoffe
I/2 Absorptionsspektren der Chlorophylle und Carotinoide
I/3 Quantitative Bestimmung der Chlorophylle und Carotinoide
II Phytohormone ……………………………….
II/1 Zylindertest auf Auxin
II/2 Induktion der α-Amylase in Gerstenkaryopsen durch
Gibberellinsäure
II/3 Induktion der Dormanz durch Abscisinsäure
III Entwicklungsbiologie am Modellsystem
Arabidopsis thaliana……………………………………………….
III/1 Steuerung des Hypokotyl-Längenwachstums durch Licht mittels
Phytochrom
III/2 Arabidopsis Genetik zur Untersuchung ausgewählter
Entwicklungsprozesse
III/3 Nachweis der β-Glucuronidase (GUS) Aktivität in transgenen
Arabidopsis Pflanzen
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IV Ionenaufnahme und Pufferkapazität des Bodens………………..
IV/1 Selektive Ionenaufnahme
IV/2 Pufferkapazität des Bodens
V Transpiration und Osmotische Vorgänge…………………………...
V/1 Messung der Saugkraft von Kartoffelparenchym
V/2 Messung des osmotischen Wertes durch Grenzplasmolyse
V/3 Nachweis der Wasserdampfabgabe durch Spaltöffnungen
V/4 Messung der Transpiration im Potometer
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A. WICHTIGE INFORMATIONEN ZUM PRAKTIKUM
Termine:
Das Praktikum findet in Nachmittagskursen ab 13.00 s.t. statt. Der praktische Teil wird
im Kursraum 1.01 Botanik, Gebäude 6, 1. OG durchgeführt. Treffpunkt: jeweils im
Seminarraum neben dem Kursraum.
Alle Termine werden im Zeitplan bekannt gegeben.
Benötigte Schreib- und Arbeitsutensilien, die von jedem/jeder Teilnehmer/in
mitgebracht werden müssen:
Präparierbesteck, Schere, wasserfester schwarzer Marker zum Beschriften,
Taschenrechner, Bleistift, kariertes Laborheft zur Protokollierung (keine losen
Blätter), Laborkittel.
Sicherheitsregeln:
• Beim Arbeiten im Laborbereich sind grundsätzlich Laborkittel zu tragen.
• Beim Arbeiten mit Säuren und Laugen sowie organischen Lösungsmitteln ist eine
Schutzbrille zu tragen.
• Beim Pipettieren von allen Flüssigkeiten unbedingt Peleus-Ball oder andere
Pipettierhilfe benutzen, niemals mit dem Mund pipettieren!
• Im Kursraum sind Rauchen, Essen und Trinken grundsätzlich verboten.
• Die Sicherheitsregeln werden besprochen und sind von allen TeilnehmerInnen zur
Kenntnisnahme zu unterschreiben.
Vorbereitung der Versuche im Laborheft (VOR DEM PRAKTIKUM):
Die jeweils durchzuführenden Versuche müssen gründlich vorbereitet sein. Es ist
wichtig, dass Sie die theoretischen Grundlagen und Anleitung nicht nur vor dem
Praktikumstag lesen sondern auch verstehen. Sie sollten bei der Vorbereitung die
Versuchsdurchführung mitplanen. Dies bedeutet:
1. Erstellen Sie vor dem Praktikumstag gruppenweise eine Arbeitsskizze (Ziel
und grobe Durchführung).
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2. Erarbeiten Sie gruppenweise bereits vor dem Praktikum einen Zeitplan für
die Versuche, d.h. wie die Teilversuche sinnvoll verschachtelt werden können,
um die Praktikumszeit effizient auszunutzen. Die Reihenfolge der Teilversuche
stellt nicht unbedingt eine chronologische Anleitung dar.
3. Bei einigen Teilversuchen müssen praktische Berechnungen vorab erledigt
werden, d.h. erstellen Sie Verdünnungsschemen und andere Berechnungen
gruppenweise bereits vor dem Praktikumstag, wie angegeben.
4. Machen Sie sich Gedanken, wie die Ergebnisse am sinnvollsten dargestellt
werden können, z.B. in Tabellenform, als Graph, etc.
Diese vier Punkte sollten Sie in Ihrem Laborheft vor dem Praktikum schriftlich
festhalten, um bei der Besprechung mit den BetreuerInnen optimal vorbereitet zu sein.
Protokollierung
der
Versuchsabläufe
im
Laborheft
(WÄHREND
DES
PRAKTIKUMS):
Zu jedem Versuch ist während des Praktikums ein Protokoll im Laborheft zu führen.
Dieses Protokoll soll Ihnen später helfen, die Versuchsabläufe nochmals zu
rekonstruieren und die Ergebnisse auszuwerten. Wichtig ist, dass Sie alle wesentlichen
Arbeitsschritte, Ergebnisse, Beobachtungen und mögliche Abweichungen von der
Anleitung schriftlich festhalten. Daher sollte das Protokoll in chronologischer
Reihenfolge die Arbeitsschritte und Ergebnisse enthalten. Ein ordentlich geführtes
Protokoll in gebundenem Laborbuch dient in der Forschung nicht nur als Hilfe für die
spätere Dokumentation, sondern kann auch ein wichtiger Beweis sein, um die eigene
Arbeitsleistung und die eigenen Ergebnisse an bestimmten Arbeitstagen nachweisen zu
können.
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Das Laborheft sollte mindestens folgende Informationen enthalten:
(Vorbereitung vor dem Praktikum, Stichworte und Skizzen):
Datum:
Versuchstitel:
Titel der Teilversuche mit grober Skizze zu Ziel und Durchführung:
Zeitplan:
Vorabberechnungen (Verdünnungsschemen, etc.):
Notizen zur Darstellung der späteren Ergebnisse:
(Protokoll während des Praktikums):
Beschreibung der Arbeitsschritte und wesentlichen Details mit Angabe der Nummer
der Teilversuche in chronologischer Reihenfolge, ggf. mit Uhrzeit, Abweichungen von
der Praktikumsanleitung unbedingt notieren. Informationen der Betreuer/-innen zur
Vorbereitung des Versuchs ebenfalls festhalten, z.B. Pflanzenanzuchtbedingungen. Sie
können darüber hinaus alles aufschreiben und zeichnen, was Ihnen wichtig erscheint.
Ergebnisse der Teilversuche (Zahlen, Tabellen, Zeichnungen, etc.)
Ihre Beobachtungen und kurze Schlußfolgerung
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Weiterführende Literatur zur Kursthematik:
Campbell, E.A. 2003. Biologie. 6. Auflage, Spektrum.
Hess, D. 1999. Pflanzenphysiologie. 10. Auflage, Ulmer.
Kutschera, U. 1998. Grundpraktikum zur Pflanzenphysiologie. Quelle & Meyer.
Lüttge, U., Kluge, M., Bauer, G. 1999. Botanik. 3. Auflage, Wiley-VCH.
Mengel, K. 1991. Ernährung und Stoffwechsel der Pflanze. 7. Auflage, Fischer.
Nultsch, W. 1996. Allgemeine Botanik. 10. Auflage, Thieme.
Richter, G. 1998. Stoffwechselphysiologie der Pflanzen. 6. Auflage, Thieme.
Schopfer & Brennecke 1999. Pflanzenphysiologie. 5. Auflage, Springer.
Taiz & Zaiger 2002. Plant Physiology. 3. Auflage, Sinauer.
Auswertung und Versuchsbericht (NACH DEM PRAKTIKUM):
Die Ausarbeitung des Versuchsberichts erledigen Sie bitte am Ende oder nach dem
Praktikum. Forschungsergebnisse werden in der Regel schriftlich veröffentlicht. Ganz
ähnlich sollten Sie Ihren Versuchsbericht aufbauen. Einen Vorschlag finden sie unten.
Den Versuchsbericht verfassen Sie bitte auf Blättern mit Seitenangaben und liefern ihn
den jeweiligen BetreuerInnen zum Beispiel im Hefter ab. Der Termin für die
letztmögliche Abgabe von Versuchsberichten wird bei der Vorbesprechung gewählt. Die
Ausarbeitung des Versuchsberichts ist eine sinnvolle Klausurvorbereitung!
Bei der Angabe von Zahlenwerten ist darauf zu achten, nicht mehr signifikante Stellen
anzugeben als reproduzierbar sind.
Bei
Kurvendarstellungen
sollte
in
der
Auswertung
das
Zeichenpapier
(Millimeterpapier) möglichst vollständig ausgenutzt werden. Gleichzeitig sollten die
Darstellungen aber in vernünftigen Maßstabsverhältnissen gezeichnet und das Format so
gewählt werden, dass genügend Platz zum Anbringen der Koordinaten bleibt. Diese sind
stets eindeutig mit Messgröße und deren Benennung zu versehen.
Ebenso unmissverständlich muss auch eine darüber hinausgehende Beschriftung von
Abbildungen sein. Tabellen und Abbildungen sind grundsätzlich mit Titel und
Legenden zu versehen, so dass die zugehörigen Tabellen bzw. Abbildungen für fremde
Leser ohne Zuhilfenahme des Textes verständlich sind.
Abbildungen. und Tabellen nummerieren Sie bitte durch und verweisen im Text darauf.
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Versuchsbericht
Datum:
Versuchstitel:
Name:
Hintergrund und Ziel (ca. ½ Seite): nur theoretische Hintergrundinformationen, um
das Ziel des Versuchs zu verstehen
Ergebnisse: Versuchsablauf und Ergebnisse (keine Details zu Methoden und Material,
wie sie in Anleitung und Protokoll stehen). Alle Ergebnisse in leicht verständlicher
Form in Tabellen oder Abbildungen präsentieren, ggf. mit statistischer Auswertung.
Diskussion: Die Versuchsergebnisse entsprechend der Aufgabenstellung kritisch
interpretieren. Mögliche Fehlerquellen sind aufzuzeigen und die Ergebnisse in den
Rahmen des etablierten Wissens einzuordnen, d.h. mit Erwartungs- und Literaturwerten
zu vergleichen.
Formal:
- zweizeilig
- 5 cm breiter rechter Rand einseitig bedruckt
- Computer erstellt; Graphiken können auch per Hand auf Millimeterpapier gezeichnet
werden
Der in Veröffentlichungen übliche Material- und Methodenteil kann wegfallen.
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B. VERSUCHE
Versuch I
PHOTOSYNTHESEPIGMENTE
Zur Thematik des Versuchs siehe:
Campbell, S. 209-231; Lüttge et al. S. 119-143; Mengel, S. 64-85; Nultsch, S. 281-311;
Richter, S. 67-199.
Versuch I/1:
DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE TRENNUNG DER
CHLOROPLASTENFARBSTOFFE AUS FRISCHEN EFEUBLÄTTERN
a) Theoretische Grundlagen:
Eine Auftrennung der photosynthetisch aktiven Blattfarbstoffe in die Einzelpigmente ist
mit chromatographischen Methoden zu erreichen. Hierzu müssen sie zunächst mit
organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Alkohol u.ä. aus dem Blattmaterial extrahiert
werden. Nach Abtrennung von unlöslichen Bestandteilen (Filtration oder Zentrifugation)
liegt eine grüne Lösung vor, die die verschiedensten Blattinhaltsstoffe enthält. Dieser
Rohextrakt kann direkt der Chromatographie unterworfen werden.
Unter Chromatographie versteht man physikalische Verfahren zur Stofftrennung, bei
denen das zu untersuchende Stoffgemisch mit Hilfe einer Flüssigkeit oder eines Gases der beweglichen oder mobilen Phase - an einem festen oder flüssigen Stoff mit großer
Oberfläche - der ruhenden oder stationären Phase - vorbeigeführt wird. Eine Trennung
der einzelnen Substanzen des Gemischs tritt dadurch ein, dass diese in verschiedenem
Ausmaß zurückgehalten werden und so verschieden schnell durch das zweiphasige
System wandern.
Entsprechend ihrer Eigenschaften können verschiedenartige Substanzen in kleinsten
Mengen aus Geweben isoliert, mit fluoreszierenden Stoffen ggf. gekoppelt und durch
Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC)
verbunden
mit
entsprechenden
(Fluoreszenz-) Detektoren aufgetrennt werden (anwendbar für Metabolite, Peptide,
DNA). Im Anschluss kann eine Identifizierung durch massenspektrometische Methoden
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erfolgen. Bei automatisierten Verfahren, wie sie heute häufig angewendet werden, ist
der Durchsatz enorm.
Nach Art der Kräfte, die während des chromatographischen Prozesses zur Trennung der
Substanzen führen, unterscheidet man zwischen:
a) Adsorptionschromatographie
b) Verteilungschromatographie
c) Ionenaustauschchromatographie
d) Ausschlusschromatographie
Die meisten chromatographischen Verfahren beruhen auf den beiden Prinzipien
Adsorption und Verteilung. Diese werden im Folgenden näher beschrieben.
Adsorption nennt man allgemein die Anreicherung eines Stoffes an die Oberfläche
eines anderen, meist festen Stoffes, der auch als Adsorptionsmittel oder Sorbens
bezeichnet wird. Die Stofftrennung durch Adsorptionschromatographie beruht auf
vielfach wiederholter Adsorption und Desorption der zu trennenden Stoffe an der
Oberfläche eines Adsorptionsmittels. Hierzu kommt es, wenn ein Substanzgemisch mit
Hilfe einer flüssigen oder gasförmigen mobilen Phase durch die Schicht des
Adsorptionsmittels als stationärer Phase geführt wird. Es bildet sich für jede einzelne
Komponente des Gemischs ein Adsorptionsgleichgewicht aus. Resultiert daraus eine
unterschiedliche Adsorption für zwei Substanzen an der festen stationären Phase, so
wandern diese verschieden schnell und werden getrennt.
Die stationäre Phase bilden Sorbentien wie z.B. Calciumcarbonat, Kieselgel oder
Aluminiumoxid. Ist die mobile Phase flüssig, so handelt es sich meist um ein
organisches Lösungsmittel, das auch als Fließmittel oder Elutionsmittel bezeichnet wird.
Für ein solches System gilt allgemein: leicht adsorbierbare und schwer eluierbare Stoffe
wandern langsamer, schwer adsorbierbare und leicht eluierbare Stoffe dagegen
schneller.
Die Adsorptionschromatographie wurde erstmals von dem russischen Botaniker
TSWETT im Jahre 1906 angewandt. Er ließ einen Petroleumbenzinextrakt aus grünen
Blättern durch ein mit Calciumcarbonat gefülltes Glasrohr (Säule) laufen und
beobachtete, dass sich der anfangs einheitliche Extrakt in mehrere grün und gelb
gefärbte Zonen aufgliederte (Chromatographie: chroma, chromatos (gr.): Farbe;
graphein (gr.): schreiben; historisch gesehen also „Farbschreiben“). TSWETT fand auf
diese Weise die beiden Chlorophylle a und b. Zu Anfang der dreißiger Jahre gelang es
mit dieser Methode, eine Reihe von Carotinoidfarbstoffen in präparativem Maßstab zu
isolieren, so u.a. α- und β-Carotin. Zu Beginn der sechziger Jahre wurde die
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Adsorptionschromatographie in Form der Dünnschichtchromatographie zu einem neuen,
vorwiegend in der Analytik verwendeten Verfahren weiterentwickelt (Übergang von der
„geschlossenen“ zur „offenen“ Säule).
Die Verteilungschromatographie beruht auf der unterschiedlichen Verteilung der zu
trennenden Substanzen zwischen zwei nicht oder nur begrenzt mischbaren flüssigen
Phasen. Grundlage dieses Trennverfahrens ist das Nernstsche Verteilungsgesetz. Es
besagt, dass in einem System aus zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten das Verhältnis der
Konzentration
eines
gelösten
Stoffes
in
den
beiden
Flüssigkeitsphasen
im
Gleichgewichtszustand eine Konstante ist, sofern die Temperatur unverändert bleibt.
Mathematisch wird das Gesetz wie folgt formuliert:
K=
C1
______
= konstant
C2
C1 und C2 sind die Gleichgewichtskonzentrationen des Stoffes in der ersten und zweiten
Phase. Die Konstante K wird Verteilungskoeffizient genannt.
Substanzen
mit
verschiedenen
Verteilungskoeffizienten
für
ein
zweiphasiges
Lösungsmittelsystem reichern sich also unterschiedlich in einer Phase an. Diese
Tatsache wird in der Praxis beim Ausschütteln von gelösten Substanzen ausgenutzt. Da
organische Substanzen besser in organischen Lösungsmitteln als in Wasser löslich sind,
können sie in einem Scheidetrichter aus wässrigen Lösungen durch Ausschütteln mit
organischen, in Wasser schwer löslichen Lösungsmitteln extrahiert und so von gut
wasserlöslichen Stoffen getrennt werden.
Bei der Verteilungschromatographie handelt es sich um eine kontinuierliche Folge
derartiger
Ausschüttelungsprozesse.
Transportiert
die
mobile
Phase
ein
Substanzgemisch entlang der stationären Phase, so stellen sich ständig neue
Verteilungsgleichgewichte zwischen den beiden nicht miteinander mischbaren Phasen
ein (multiplikative Verteilung). Es genügen dabei bereits kleine Unterschiede zwischen
den Verteilungskoeffizienten, um zwei Substanzen voneinander zu trennen.
Die stationäre Phase besteht bei der Verteilungschromatographie meist aus Wasser oder
anderen polaren Flüssigkeiten, welche als polarer Flüssigkeitsfilm an einer inerten
Trägerschicht (= Sorbens) haften. Die Trägerschicht ist nicht am Trennprozess beteiligt,
sie dient lediglich dazu, die stationäre Phase aufzunehmen. Die mobile Phase (=
Solvens) stellt ein mehr oder weniger apolares Lösungsmittel dar. Sie ist so zu wählen,
dass sie sich mit der stationären Phase nicht mischt, aber die zu trennenden Substanzen
noch lösen kann. In einem solchen System wandern polare Verbindungen langsamer als
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apolare; umgekehrt wandern die Komponenten umso schneller, je besser sie in der
mobilen Phase löslich sind.
Als Beispiel einer Verteilungschromatographie dient die im vorliegenden Versuch
vorzunehmende dünnschichtchromatographische Trennung der Blattfarbstoffe nach
einem Verfahren von HAGER und BERTENRATH (1962). Die Sorptionsschicht der
Platte ist ein Gemisch aus Kieselgel, Kieselgur und CaCO3. Das Fließmittel besteht
überwiegend aus Petroleumbenzin mit einem Zusatz von Isopropanol und einer Spur
Wasser. Bei dieser Kombination bildet wässriges Isopropanol durch Adsorption an das
Schichtmaterial (Träger!) die stationäre, das Petroleumbenzin die mobile Phase. Einer
polaren stationären wässrigen Alkoholphase steht somit eine apolare mobile
Petroleumbenzinphase gegenüber. Die Laufhöhe der Blattpigmente hängt nun von ihrem
Löslichkeitsverhalten in diesen beiden Phasen ab. Das apolare sauerstofffreie β-Carotin
ist am besten in Petroleumbenzin löslich und wandert deshalb mit der Fließmittelfront
durch die Schicht. Die schwach polaren sauerstoffhaltigen Xanthophylle (Lutein,
Violaxanthin, Neoxanthin) wandern langsamer und lassen eine Trennfolge erkennen, die
der Zahl und der Polarität ihrer sauerstoffhaltigen Gruppen entspricht. Die beiden
Chlorophylle lösen sich aufgrund ihres apolaren Phytolrestes relativ gut in der mobilen
Phase, Chlorophyll a wandert jedoch wegen der apolaren CH3-Gruppe im Pyrrolring B
etwas weiter als Chlorophyll b, das an der genannten Position eine polare
Aldehydgruppe (-CHO) trägt.
Chromatographische Methoden sind in erster Linie Trennmethoden, dienen darüber
hinaus aber auch der Isolierung und Identifizierung von Substanzen. Eine
dünnschichtchromatographisch getrennte Substanz lässt sich vor allem anhand folgender
Kriterien identifizieren: Rf-Wert (Rf = Retentionsfaktor) bzw. Rf-Wert-Reihenfolge,
Tageslicht- und Fluoreszenzfarbe, Reaktionen nach Behandlung mit spezifischen
Sprühreagenzien. Größere Sicherheit bei der Identitätsbestimmung ist zu erreichen,
wenn die abgetrennte Substanz aus der Schicht eluiert und spektroskopisch weiter
untersucht wird (vgl. hierzu Versuch I/2): Präparative Dünnschichtchromatographie.
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b) Praktische Durchführung:
1. Extraktion:
Efeublätter (Hedera helix) ohne Stiele in kleine Stücke reißen und 4 g auf Feinwaage
abwiegen (genaues Gewicht mit 2-3 Stellen hinter dem Komma protokollieren!) und in
ein Kunststoff-Becherglas geben. Nach Zusatz zweier gehäufter Spatelspitzen CaCO3
(soll Pheophytinbildung durch sauren Zellsaft verhindern!) und 12 ml Aceton werden
die Blattstücke im Becherglas mit einem Schnitzelwerk gründlich zerkleinert. Der
Überstand des Extraktionsgemischs wird anschließend so vollständig wie möglich durch
einen Rundfilter in ein Pillengläschen abfiltriert, das Pillengläschen verschlossen und
dunkel, z.B. in der Labortischschublade, aufbewahrt.
2. Dünnschichtchromatographie:
Schicht: Als Masse zum Streichen von 5 Dünnschichtplatten wird eine Suspension aus
12 g Kieselgur G (Merck Nr.8129), 3 g Kieselgel 60 (7729), 3 g CaCO3 (2066)
und 0,022 g Ca(OH)2 (zur Neutralisation der Ascorbinsäure!) in 55 ml 8x10-3
mol/l Ascorbinsäure (Oxidationsschutz für zu trennende Pigmente) benutzt.
Nach dem Ausstreichen (Streichdicke: 0,25 mm) werden die Platten bei 60 °C
90 min lang getrocknet und im Exsikkator im Dunkeln aufbewahrt (dadurch
soll eine Photooxidation der Ascorbinsäure verhindert werden). Die
Dünnschichtplatten werden vom Betreuer des Versuchs vorbereitet und stehen
bei Kursbeginn zur Verfügung.
Fließmittel (ml): Petroleumbenzin (Kp 100 - 140 °C)- Isopropanol – H2O deion. (50 + 6
+ 0,125). Zuerst 6 ml Isopropanol und 0,125 ml H2O deion. (0,2 ml-Pipette) in
Erlenmeyerkolben mischen; 50 ml Petroleumbenzin zugeben und mischen.
Fließmittel in DC- Kammer geben und diese verschließen (Deckelrand vorher
nicht zu dick fetten!).
Auftragen des Extraktes:
DC-Platte nur am oberen Rand anfassen, unterer Rand der Sorptionsschicht darf nicht
beschädigt werden. Auftrageschablone mit Graduierung 1,5 cm vom unteren Plattenrand
entfernt auflegen und mit 5 µl Mikrokapillare 200-250 µl Extrakt in einer 16 cm langen
Startbande durch dicht nebeneinander gesetzte Punkte gleichmäßig auftragen (dabei
Sorptionsschicht möglichst nicht beschädigen!). Die äußersten Punkte der Startlinie
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sollen etwa 2 cm vom linken und rechten seitlichen Plattenrand entfernt sein. Zum
Auftragen von 200-250 µl Extrakt wird die Startbande etwa 2x durchlaufen.
Entwicklung des Chromatogramms:
Platte in DC-Kammer stellen, diese verschließen und mit Dunkelschutz versehen;
Uhrzeit notieren. Wenn Fließmittelfront ca. 10 cm Steighöhe erreicht hat (i.d.Regel nach
20-30 min), Platte aus der Kammer nehmen, mit eigener Digitalkamera photographieren
und dann noch auf der feuchten Platte die Front (direkt oberhalb der β-Carotin-Zone)
sofort mit Präpariernadel nachziehen; Laufzeit notieren. Danach zunächst die DC-Platte
unter einer UV-Lampe bei 366 nm in einer Dunkelkammer betrachten (siehe nächsten
Abschnitt!). Anschließend bis auf Chlorophyll a, b und Lutein alle übrigen
Pigmentbanden mit Präpariernadel markieren. Danach Chlorophyll a-, Chlorophyll bund Lutein-Zonen (siehe Musterchromatogramm) sofort, wie in Versuch I/2 angegeben,
ausschaben. (Chlorophyll a = blaugrün, Chlorophyll b = gelbgrün, Lutein = gelb)
Detektion der Pigmente und Dokumentation:
Bei der Betrachtung der DC-Platte im kurzwelligen Blaulicht (UV-Lampe, 366 nm;
Schutzbrille!) fluoreszieren die Chlorophylle a und b rot, die Carotinoide zeigen keine
Fluoreszenz (Photo Digitalkamera; auch der Gesamtextrakt im Pillengläschen soll auf
Fluoreszenz untersucht werden!). Anhand der Rotfluoreszenz auf dem Chromatogramm
können mögliche Chlorophyll-Abbauprodukte erkannt werden, z.B. Pheophytin, auf
dem Chromatogramm etwas oberhalb von Chlorophyll a.
Zur
Dokumentation
Chromatogramm
mit
dünner
Glasplatte
abdecken,
auf
Transparentpapier durchzeichnen, Start- und Frontlinie nicht vergessen! Substanzen
durch Tageslicht- und Fluoreszenzfarben sowie Rf-Werte kennzeichnen, außerdem
Datum, Schicht, Fließmittel, aufgetragenes Extraktionsgemisch und Laufzeit auf dem
Dokument vermerken.
Der Rf-Wert ist durch folgenden Quotienten definiert:
Abstand Mitte der Startlinie – Schwerpunkt der Substanzbande
Rf =
Abstand Mitte der Startlinie – Fließmittelfront
Rf-Werte liegen zwischen 0 und 1 und werden mit 2 Stellen hinter dem Komma
angegeben, hRf-Werte sind Rf-Werte x 100 und liegen demnach zwischen 0 und 100.
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c) Auswertung:
Die Identifizierung der getrennten Substanzen erfolgt durch vergleichende Methode, d.h.
alle zur Charakterisierung der Einzelpigmente erhobenen Daten werden, möglichst in
tabellarischer Übersicht, auf Übereinstimmung mit Literaturangaben überprüft. Folgende
Identifizierungshilfen sind hierbei zu berücksichtigen: Tageslicht- und Fluoreszenzfarben,
Rf-Werte bzw. Rf-Wert-Reihenfolge, Anzahl der getrennten Pigmente sowie deren
chemische Natur (Chlorophylle, Carotine, Xanthophylle). Hinsichtlich der Rf-WertReihenfolge wird das eigene Chromatogramm mit einem in einem ähnlichen
chromatographischen System (Schicht/Fließmittel) erstellten und dieser Anleitung in
Kopie beigefügten Musterchromatogramm (HAGER und BERTENRATH, 1962)
verglichen. Sowohl die eigene Schicht als auch die Schicht bei HAGER und
BERTENRATH (1962) werden hauptsächlich mit Kieselgur und Kieselgel hergestellt.
Seit 1962 haben sich die Herstellungsweise und folglich auch die Herstellungsnummern
bei der Firma Merck für Kieselgur und Kieselgel geändert. Dies kann eine veränderte
Teilchengröße der beiden Sorbentien und damit eine unterschiedliche Schichtdichte auf
der DC-Platte verursachen. Daraus resultieren insbesondere bei den 3 Xanthophyllen
deutliche Rf-Wert-Unterschiede zwischen den eigenen Platten und dem bei HAGER und
BERTENRATH (1962) abgebildeten Chromatogramm. Vergleichswerte für die
Tageslichtfarben der Pigmente sowie das Fluoreszenzverhalten der Chlorophylle sind der
Fachliteratur zu entnehmen.
Literatur:
Hager, A. & Bertenrath, T.: Verteilungschromatographische Trennung von Chlorophyllen
und Carotinoiden grüner Pflanzen an Dünnschichten.- Planta 58, 564-568 (1962)
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Vergleichschromatogramm zu Versuch I/1
Abb. 2: Dünnschichtchromatogramme (20x20 cm und 20x5 cm; Schichtdicke: 0.25 mm) eines
Blattextraktes von Hedera helix 30 min nach Beendigung der Trennung; links Dünnschicht (a) mit
Ascorbinsäurebeimischung, welche weitgehenden Schutz gegen ein oxidatives Verblassen der Farbstoffe
bewirkt. 1 ß-Carotin (an der Front), 2 Chlorophyll a, 3 Chlorophyll b, 4 Lutein, 5 Lutein-5,6-epoxid, 6
Violaxanthin, 7 Neoxanthin, 8 Startlinie (Aus Hager & Bertenrath, 1962)
Hinweis: Lutein-5,6-epoxid (Zone 5) kann bei der Extraktion als Artefakt in Spuren
entstehen und ist deshalb im Chromatogramm, wenn überhaupt, nur als schwachgelbe
Bande erkennbar.
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Versuch I/2:
ABSORPTIONSSPEKTREN DER CHLOROPHYLLE A UND B UND DES
LUTEINS, ISOLIERT AUS FRISCHEN EFEUBLÄTTERN
a)
Theoretische Grundlagen:
Die spezifische Absorption einer Substanz lässt sich mit Hilfe eines Spektralphotometers
bestimmen. Dazu wird die Substanz in Lösung gebracht und ihre Fähigkeit zur
Lichtabsorption in Abhängigkeit von der Wellenlänge ermittelt. Die am häufigsten
verwendete Messgröße für die Lichtabsorption ist die Extinktion E (vgl. Versuch I/3).
Stellt man die gemessenen Absorptions- bzw. Extinktionswerte (Ordinate!) über der
zugehörigen Wellenlänge (Abszisse!) in einem Kurvendiagramm dar, so erhält man das
Absorptionsspektrum
der
Substanz.
Die
Kurvenmaxima
(λmax)
geben
den
Wellenlängenbereich an, in dem die Substanz das Licht am stärksten absorbiert. Lage
und Intensität der Maxima charakterisieren eine Substanz und erlauben Rückschlüsse
auf ihre chemische Struktur.
Die Absorptionsspektren der Chlorophylle sind typische Porphyrinspektren, wie sie auch
von den Cytochromen und vom Häm erhalten werden. Die Haupt-Absorptionsmaxima
liegen im blauen (430 - 470 nm) und hellroten (640 - 675 nm) Spektralbereich. Grünes
Licht (470 - 560 nm) wird nur in geringem Maße, dunkelrotes (700 - 760 nm) gar nicht
absorbiert. Wegen der geringen Absorption des grünen Lichtes erscheinen verdünnte
Chlorophyll-Lösungen in der Durchsicht grün. Bei starker Konzentration oder bei
genügender Schichtdicke der Lösung genügt die geringe Absorption im Grün, um im
durchfallenden Licht auch diesen Teil des Spektrums zu eliminieren. Die Lösungen
erscheinen uns dann dunkelrot (wird im Praktikum demonstriert).
Die Spektren der beiden Chlorophylle a und b zeigen trotz prinzipieller
Übereinstimmung charakteristische Verschiedenheiten, die auf einen geringfügigen
Unterschied in der chemischen Struktur zurückgehen: Chlorophyll b besitzt im
Pyrrolring B am C-Atom 7 anstelle der Methylgruppe bei Chlorophyll a eine Formyloder Aldehyd-Gruppe (-CHO). Beim Chlorophyll b sind dadurch die beiden
Absorptionsmaxima im blauen und roten Spektralbereich einander deutlich genähert,
d.h. der blaue Gipfel ist zu längeren (bathochrom), der hellrote zu kürzeren
Wellenlängen (hypsochrom) verschoben. Hinzu kommt, dass beim Chlorophyll b der
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blaue Gipfel höher (hyperchrom), der hellrote niedriger (hypochrom) als bei Chlorophyll
a ist. Chlorophyll b, das im gesamten Blaubereich absorbiert, ist gelbgrün, Chlorophyll
a, das längerwelliges Blau transmittiert, ist deshalb blaugrün gefärbt.
Die gelb bis orange gefärbten Carotinoide zeigen ein dreigipfliges Absorptionsspektrum
im blauen Spektralbereich. Die Maxima der beiden Hauptgipfel liegen für die einzelnen
Komponenten zwischen 430 und 490 nm.
Die Absorptionsspektren von Chlorophyllen und Carotinoiden können, wie dies in der
Regel auch für andere Stoffe gilt, zur Identifizierung der Substanzen herangezogen
werden. Eine exakte Identifizierung ist beispielsweise unerlässlich, wenn es um die
mögliche photosynthetische Wirksamkeit eines der Pigmente geht. Voraussetzung für
die Aufnahme eines hierfür brauchbaren Spektrums ist, dass die Substanz rein und in
klarer Lösung vorliegt. Mit Einschränkungen bietet sich diese Möglichkeit, wenn die
Pigmente
durch
die
im
vorangehenden
Versuch
beschriebene
Dünnschichtchromatographie getrennt werden. Die nach der Trennung vorliegenden
Farbzonen werden hierzu einzeln aus der Sorptionsschicht ausgeschabt, das jeweilige
Pigment mit einem geeigneten Lösungsmittel aus dem Schichtmaterial eluiert und vom
Eluat ein Absorptionsspektrum aufgenommen. Zur Identifizierung der Pigmente werden
die gewonnenen Absorptionsmaxima mit denjenigen der authentischen Verbindungen
verglichen (vgl. S.24). Als zusätzliche Identifizierungshilfe wird noch das Verhältnis der
Extinktionen der beiden Hauptmaxima ermittelt und dem entsprechenden Literaturwert
gegenübergestellt. Eine so vorgenommene Identifizierung dient gleichzeitig der
Untermauerung
der
im
dünnschichtchromatographischen
Versuch
gemachten
Identitätsaussage für ein Pigment.
b) Praktische Durchführung:
1. Ausschaben der Chlorophyll a-, Chlorophyll b- und Luteinzonen (Fortsetzung
von Versuch I/1):
Pigmentzonen unmittelbar nach Betrachten der DC-Platte im UV-Licht ausschaben
(Gefahr photooxidativer Zerstörung, wenn man zu lange wartet!). Hierzu Platte vertikal
auf glattes Papier stellen, jeweilige Pigmentzone mit Schabespachtel sorgfältig
ausschaben
und
ausgeschabte
Schicht
vom
Papier
durch
Pulvertrichter
in
Zentrifugenglas (ungraduiert) schütten; Pulver der Chlorophyll a- und Chlorophyll bZonen mit jeweils ca. 1 ml Aceton (Pasteurpipette!), Pulver der Luteinzone mit ca. 1 ml
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Ethanol (EtOH; Pasteurpipette!) übergießen und bis zur Weiterverarbeitung mit Stopfen
verschlossen in Kühlschrank stellen.
2. Elution der Pigmente aus der DC-Schicht:
Zentrifugenglas mit Stopfen auf Whirl-Mix kurz durchschütteln. Suspension auf
Glasfilternutsche (G4) geben und Pigmentlösung in graduiertes Zentrifugenglas saugen
(Zentrifugenglas steht in einem Saugfinger, der an eine Wasserstrahlpumpe
angeschlossen ist); auf Filternutsche und evtl. im Zentrifugenglas zurückbleibendes
Sorptionsmaterial mehrfach mit wenig Aceton (Chlorophyll a und b) bzw. EtOH
(Lutein) bis zur Farblosigkeit nachwaschen; Endvolumen des Eluats etwa 3 ml (genaues
Volumen im Protokoll notieren !); Lösungen bis zur Aufnahme der Spektren mit Stopfen
verschlossen in Kühlschrank stellen.
3. Aufnahme der Absorptionsspektren:
Das Messgerät ist ein automatisch registrierendes Zweistrahl-Spektralphotometer der
Firma Shimadzu, Modell UV 260, mit Bildschirm und Schreiber.
Messung der Chlorophyll a-Lösung:
a) Allgemeiner Messvorgang: das Absorptionsspektrum wird gegen Aceton als
Blindlösung im Wellenlängenbereich zwischen 700 und 390 nm aufgenommen; durch
Eingabe der Peak-Pick-Funktion (s.u.) werden neben der automatischen Aufzeichnung
des Spektrums auch die Wellenlängen aller Haupt- und Nebenmaxima sowie deren
Extinktionswerte automatisch ausgedruckt.
b) Parameter (P) am Gerät wie folgt einstellen: Messmodus (P Null): ABS (=
Extinktion); Scangeschwindigkeit (P 1): FAST; Wellenlängenvorschub (P 2): 20 nm/cm;
Extinktionsbereich
Extinktionsbereich
(P
5):
dem
0
–
1,0
höchsten
(später
bei
Aufnahme
des
Absorptionsmaximum
Spektrums
anpassen);
Wellenlängenbereich (P 6): 700-390 nm; Spaltbreite (P 10): 1 nm (evtl. Datum (P 11)
einstellen).
c) Funktionen (F) am Gerät wie folgt einstellen: Kommentar (F 1): „Chlorophyll a in
Aceton“ als Überschrift für aufzunehmendes Spektrum; Peak-Pick-Funktion (F 4):
PEAK (Lage der Maxima und jeweiliger Extinktionswert werden erfasst).
20
d) Nullabgleich: Zwei Küvetten mit je etwa 3 ml Aceton füllen: Küvetten mit Deckel
verschließen. Die Küvetten müssen peinlich sauber sein, sie dürfen insbesondere keine
Kratzer, außen anhaftende Flüssigkeitsreste oder Fingerspuren aufweisen. Eine Küvette
in Referenzstrahl (Referenzküvette), die andere in Probenstrahl (Probenküvette) stellen.
Bei geschlossenem Küvettenraum Extinktion auf Null einstellen (Taste: ABS 0) (der
Monochromator muss dabei innerhalb des oben angegebenen Wellenlängenbereichs
stehen).
e) Extinktionskontrolle: Probenküvette entleeren, mit Chlorophyll- Lösung füllen und in
Probenstrahl
zurückbringen;
Extinktionsmaximum
von
Monochromator
Chlorophyll
a)
auf
einstellen
430
und
nm
bei
(höchstes
geschlossenem
Küvettenraum Extinktion prüfen. Diese sollte nicht über 1.0 liegen, da sonst das
Lambert-Beer’sche Gesetz, d.h. die Linearität der Beziehung Extinktion/Konzentration
nicht erfüllt sein kann. Falls bei vorliegender Probenlösung die Extinktion größer als 1,0
ist, ihren Wert genau ermitteln und Chlorophyll-Lösung nach Zurückgießen in
graduiertes Zentrifugenglas mit Aceton entsprechend verdünnen; Lösung danach wieder
in Probenküvette überführen, Extinktion erneut messen und Extinktionsbereich (P 5)
dem neuen Messwert anpassen.
f) Automatische Aufzeichnung der spektralanalytischen Daten: zur Aufnahme aller
Daten am Schreiber bzw. Bildschirm werden nacheinander folgende Tasten gedrückt:
FORMAT-Taste: Ausdrucken der Messbedingungen; ENTER-Taste; FRAME-Taste:
Aufzeichnen des Rahmens mit Skaleneinteilung für Wellenlänge und Extinktion;
START-Taste: Aufzeichnen der „Absorptionskurve“ und Ausdrucken der Wellenlängen
und Extinktionswerte der „Absorptionspeaks“.
Messung der Chlorophyll b-Lösung:
Wie mit Chlorophyll a; Nullabgleich entfällt, da gleiches Lösungsmittel wie bei der
Chlorophyll a-Messung; Wellenlängenbereich (P 6): 700-400 nm; Extinktionskontrolle
bei 456 nm; Kommentar (F 1): „Chlorophyll b in Aceton“.
Messung der Lutein-Lösung:
Wie bei der Chlorophyll-Messung; Blindlösung: EtOH; Nullabgleich mit EtOH;
Wellenlängenbereich (P 6): 550 - 390 nm; Extinktionskontrolle bei 446 nm; Kommentar
(F 1): „Lutein in Ethanol“.
21
4. Auswertung:
Zur Identifizierung der Pigmente sind die Haupt- und Nebenmaxima, die sog. λmaxWerte, den Aufzeichnungen zu entnehmen. Der sog. E430/E663-Wert, also das Verhältnis
der Extinktionen der beiden Hauptmaxima von Chlorophyll a, wird errechnet und alle
Daten tabellarisch mit Literaturangaben verglichen. Nach MACKINNEY (1940) besitzt
Chlorophyll a in Aceton gelöst folgende λ-max-Werte: 410, 430, 535, 580, 615, 663 nm;
der E430/E663-Wert beträgt 1,26 (Quotient der beiden Extinktionskoeffizienten bei 430
und 663 nm). Die λ-max-Werte für Chlorophyll b gelöst in Aceton liegen nach
MACKINNEY (1940) bei: 455, 595, 645 nm; der E455/E645-Wert beträgt 2.8. Für Lutein
in EtOH gelöst werden von HAGER und MEYER-BERTENRATH (1967) folgende λmax-Werte angegeben: 422 (Schulter), 446, 475 nm; der E445/473-Wert beträgt nach
Schopfer, Brennicke (1999) 1.07. Zu beachten: das zur Absorptionsmessung verwendete
Lösungsmittel ist stets mitanzugeben, da von seiner Natur (Brechungsindex, Polarität)
sowohl die Lage als auch die Höhe eines Absorptionsmaximums abhängig ist.
Literatur:
Mackinney (1940), aus: Paech, K. & Tracey, M.V.: Moderne Methoden der
Pflanzenanalyse, Bd.4, Springer, Berlin, 1955.
Hager, A. & Meyer-Bertenrath, T.: Die Identifizierung der an Dünnschichten getrennten
Carotinoide grüner Blätter und Algen. Planta (Berl.) 76, 149-168 (1967).
Schopfer, P. & Brennicke, A.: Pflanzenphysiologie.- 5. Aufl., Springer, 1999.
22
Versuch I/3:
QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER CHLOROPHYLLE A UND B UND DER
GESAMTCAROTINOIDE IN GRÜNEN BLÄTTERN
a) Theoretische Grundlagen:
Der Gehalt der Chloroplastenpigmente in den Blättern einzelner Pflanzen variiert in
Abhängigkeit von äußeren und inneren Faktoren. Im Verlauf der Blattentwicklung einer
Pflanze steigt er zunächst an, erreicht allmählich ein Maximum und nimmt bei Eintritt
von Seneszenzerscheinungen wieder ab.
Von den Umweltfaktoren üben vor allem das Licht und die Nährstoffversorgung einen
maßgeblichen Einfluss auf den Chlorophyllgehalt aus. Bezogen auf das Trockengewicht
sind Schattenblätter chlorophyllreicher (und carotinoidärmer) als Lichtblätter der
gleichen Pflanze. Allgemein gilt, dass der Chlorophyllgehalt mit steigender
Beleuchtungsstärke abnimmt. Gut mit Stickstoff ernährte Pflanzen enthalten in der
Regel mehr Chlorophyll als mangelhaft versorgte Pflanzen. Bekannt ist auch, dass saure
und photooxidativ wirkende Immissionen der Luft den Pigmentgehalt der Pflanzen
verändern.
Änderungen im Pigmentgehalt betreffen meist auch das Verhältnis der Pigmente
zueinander. Auf Unterschiede in der Beleuchtungsstärke reagieren viele Pflanzen mit
deutlichen Verschiebungen im Mengenverhältnis der beiden Chlorophylle. Beim
photooxidativen Ausbleichen von Nadeln und Blättern erfolgt der Abbau von
Chlorophyll a und ß-Carotin rascher als derjenige des Chlorophyll b und der
Xanthophylle.
Jede Änderung im Gehalt an photosynthetisch aktiven Pigmenten wird stets auch eine
Änderung in der Photosyntheserate und damit in der Energiebilanz der Pflanze nach sich
ziehen. Der quantitativen Pigmentbestimmung, insbesondere der Chlorophyll-Analyse,
kommt somit besondere Bedeutung zu. Eine quantitative Bestimmung von Chlorophyll
ist auch dann notwendig, wenn der Chlorophyllgehalt als Bezugsgröße für
Versuchsdaten verwendet werden soll. Dies ist bei Photosynthesemessungen häufig der
Fall. In neuerer Zeit sind Chlorophyll- und Carotinoidmessungen auch als biochemische
Indikationsmöglichkeit für die Einwirkung von Luftverunreinigungen benutzt worden.
Die quantitative Bestimmung der Pigmente erfolgt spektralphotometrisch. Zuvor müssen
sie
allerdings
aus
dem
Untersuchungsmaterial
extrahiert,
eventuell
sogar
23
chromatographiert werden. Als Messgröße im Spektralphotometer dient die Extinktion
E. Sie gibt die Schwächung der Lichtintensität durch Absorption im Spektralphotometer
an und ist der dekadische Logarithmus des Verhältnisses der Intensität des
eingestrahlten Lichtes (I0) zur Intensität des die Messprobe wieder verlassenden
Lichtstrahls (I):
I0
E = log ___
I
Das Photometer zeigt den Wert E = log (Io/I) dimensionslos an, die Extinktion ist also
eine dimensionale Größe. Sie ergibt sich aus dem Lambert-Beer’schen Gesetz:
E=εxcxd
Dieses besagt, dass die Extinktion linear von der Konzentration c [mol x l -1] und der
Schichtdicke
d
[cm]
der
zu
messenden
Substanzlösung
abhängt.
Den
Proportionalitätsfaktor ε bezeichnet man als molaren Extinktionskoeffizienten. Er stellt
eine charakteristische Stoffkonstante (Einheit: 1000 cm2 x mol-1 = cm2 x mmol-1; wird
häufig ohne Dimension angegeben) dar, die wellenlängenabhängig ist (ελ) und meist für
die Absorptionsmaxima (λ
max)
einer Substanz angegeben wird. Anstelle des molaren
Extinktionskoeffizienten ε verwendet man manchmal auch den spezifischen
Extinktionskoeffizienten α mit der Einheit l x g-1 x cm-1. Da Lage und Höhe der
Absorptionsmaxima vom jeweiligen Lösungsmittel abhängen, muss bei der Angabe
eines Extinktionskoeffizienten auch das Lösungsmittel genannt werden.
Zur quantitativen Bestimmung einer Substanz mit Hilfe des Lambert-Beer’schen
Gesetzes wird zunächst die Extinktion Ex der jeweiligen Probelösung bei einer
charakteristischen Wellenlänge (normalerweise ein Absorptionsmaximum) gemessen
und anschließend aus Ex die Konzentration cx der zu bestimmenden Substanz nach einer
der folgenden Methoden ermittelt:
A.
Berechnung nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz (vgl. vorliegenden Versuch)
B.
Bestimmung mit Hilfe einer Vergleichslösung (vgl. Versuch III/2)
C.
Bestimmung über eine Eichkurve
24
Zu Methode A:
Bei Kenntnis des Extinktionskoeffizienten ε (α) (er kann in vielen Fällen der Literatur
entnommen werden) errechnet sich die Konzentration der zu bestimmenden Substanz
aus der gemessenen Extinktion Ex wie folgt:
cX =
Ex
_______
ε (α) x d
Zu Methode B:
Bei unbekanntem Extinktionskoeffizienten kann die Gehaltsbestimmung mit Hilfe einer
Vergleichslösung von bekannter Konzentration cv der zu bestimmenden Substanz
durchgeführt werden. Bei gleicher Schichtdicke d gemessen, gilt für die Extinktion der
Vergleichslösung:
Ev = ε (α) x cv x d
und für die Extinktion der Probelösung:
Ex = ε (α) x cx x d
Die Extinktionswerte beider Lösungen verhalten sich wie ihre Konzentrationen:
Ex
cx
= ___
Ev cv
__
Durch Umformen ergibt sich die unbekannte Konzentration cx:
Ex
cx = cv x ______
Ev
Zu Methode C:
Zum Erstellen einer Eichkurve dienen mehrere Lösungen mit bekannter, aber
unterschiedlicher Konzentration der zu bestimmenden Substanz (Eichlösungen). Die
gemessenen Extinktionen dieser Lösungen werden in einem Diagramm als Funktion der
jeweiligen Konzentration aufgetragen. Aus der so erhaltenen Eichkurve kann mit der
gemessenen Extinktion der unbekannten Probe deren Konzentration graphisch ermittelt
werden.
25
Mehrkomponentenanalyse:
Nach Methode A können Substanzen, die gemeinsam in einer Lösung vorliegen und
deren Absorptionskurven sich teilweise überdecken, dennoch einzeln bestimmt werden.
Beispielsweise werden die beiden Chlorophylle im Gemisch eines Blattextraktes häufig
quantitativ
nebeneinander
erfasst.
Dies
geschieht
durch
die
photometrische
Mehrkomponentenanalyse, bei der die Konzentrationen der Einzelkomponenten
rechnerisch ermittelt werden. Hierbei wird vorausgesetzt, dass sich die Extinktionen der
Einzelkomponenten bei jeder Wellenlänge addieren. Es gilt also:
Etotal =
E1 +
E2
+ ....... +
En
oder (d = konst.)
Etotal = ε1 (α1) x c1 + ε2 (α2) x c2 + ....... + εn (αn) x cn
Liegt ein Gemisch aus zwei Komponenten vor, muss die Extinktion bei zwei
verschiedenen Wellenlängen gemessen werden. Für beide Wellenlängen müssen die
Extinktionskoeffizienten für beide Komponenten bekannt sein.
Im Falle der Chlorophylle wird in Aceton bei 662 nm (λmax für Chlorophyll a im
langwelligen Bereich) und 645 nm (λmax für Chlorophyll b im langwelligen Bereich)
gemessen. Die zugehörigen spezifischen Extinktionskoeffizienten (α ) sind der
folgenden Tabelle (nach Lichtenthaler & Wellburn, 1983) zu entnehmen:
λmax
α
Chl a
[nm]
α
α
Chl b
Gesamtcarotinoide
[l x g-1 x cm-1]
662
88,88
11,22
-
645
18,91
56,11
-
470
2,27
81,36
227
Für die Gesamtextinktion bei 662 und 645 nm (d=1) gilt dann:
(1)
E662 = 88,88 x cChl a + 11,22 x cChl b
(2)
E645 = 18,91 x cChl a + 56,11 x cChl b
Damit liegen zwei Gleichungen vor mit den unbekannten Konzentrationen cChl a und cChl b.
Diese lassen sich durch Einsetzen errechnen:
26
(a)
cChl a = 11,75 x E662 - 2,35 x E645 [µg x ml-1]
(b)
cChl b = 18,61 x E645 - 3,96 x E662 [µg x ml-1]
Zur Bestimmung von drei Komponenten müssen Extinktionswerte bei drei
verschiedenen Wellenlängen gemessen werden. Dies ist der Fall, wenn im Rohextrakt
eines Blattes neben den beiden Chlorophyllen auch die Gesamtcarotinoide (Carotine und
Xanthophylle) erfasst werden sollen. Es wird dann zusätzlich im Blaubereich bei 470
nm, dem Maximum im längerwelligen Bereich der Absorptionskurve aller Carotinoide,
gemessen. Die dritte Bestimmungsgleichung lautet:
(3)
E470 = 227 x cCar. + 2,27 x cChl a + 81,36 x cChl b
wobei die Konzentration der Gesamtcarotinoide mit cCar. angegeben ist. Für die
Konzentration der Gesamtcarotinoide (Ccar.) ergibt sich folgende Gleichung (c):
1000 x E470 - 2,27 x cChl a - 81,4 x cChl b
(c)
cCar. =
_______________________________________________________
[µg x ml-1]
227
Die Berechnung der drei unbekannten Konzentrationen mit Hilfe der genannten
Gleichungen ist insofern vereinfacht, als die Carotinoide im Rotbereich, also bei den
Wellenlängen 662 und 645 nm, keine Absorption besitzen.
Anzumerken ist noch, dass die Einzelsubstanzen der Carotinoide (vgl. Versuch I/1) nur
nach vorheriger chromatographischer Trennung quantitativ bestimmt werden können.
Im vorliegenden Versuch wird der Gehalt der beiden Chlorophylle und der
Gesamtcarotinoide in Brennnesselblättern (warum?) bestimmt. Da es sich um eine
quantitative Analyse handelt, haben selbstverständlich alle Einzelschritte des Versuchs
in quantitativem Maßstab zu erfolgen, d.h., das zu analysierende Blattmaterial ist exakt
einzuwiegen, die im Blattmaterial enthaltenen Pigmente sind daraus erschöpfend zu
extrahieren, es dürfen bei der Extraktion und bei der Bearbeitung des Extraktes keine
Pigmentverluste eintreten, und schließlich müssen die aus der eingewogenen Blattmenge
extrahierten Pigmente zur photometrischen Messung in einem genau definierten
Lösungsvolumen vorliegen.
27
b) Praktische Durchführung:
1. Extraktion:
Etwa 250 mg frische Brennnesselblätter (Urtica dioica) ohne Stiele werden mit einer
Schere zerkleinert und auf der Analysenwaage abgewogen. Mit wenig Aceton werden
sie im Mörser unter Zusatz einer Spatelspitze CaCO3 und einiger Spatelspitzen Seesand
gründlich zerrieben (es dürfen danach keine Blattstrukturen mehr erkennbar sein!), der
Überstand nach Zugabe weiterer ml Aceton vorsichtig (dünnen Glasstab an
Mörserausguss anlegen!) in eine Glasfilternutsche (G4) abdekantiert und mittels
Wasserstrahlpumpe in einen 50 ml Rundkolben abgesaugt. Der Rückstand im Mörser
wird mehrmals mit Aceton ausgespült und die Spülflüssigkeit ebenfalls abgesaugt. Der
Spülvorgang wird solange wiederholt, bis die Spülflüssigkeit ± farblos ist. Danach wird
der Extrakt aus dem Rundkolben durch einen Trichter in einen 50 ml-Messkolben
gegossen. Auch der Rundkolben wird anschließend mehrfach nachgespült, bis die 50
ml-Marke im Messkolben erreicht wird. Der Messkolben wird mit Parafilm
verschlossen.
2. Extinktionsmessung:
Die Extinktion des Extrakts wird bei 662 (Chl a), 645 (Chl b), und 470
(Gesamtcarotinoide) nm gemessen. Das Extraktionsmittel (Aceton) dient als
Vergleichslösung, mit der vor Beginn der Messungen ein Nullabgleich vorzunehmen ist;
vgl. hierzu in Versuch I/2 die notwendigen Einstellungen am Spektralphotometer.
c) Auswertung:
Die Konzentrationen der Pigmente werden nach den in den „Theoretischen Grundlagen“
angegebenen Gleichungen (a), (b) und (c) berechnet.
Für den jeweiligen Pigmentgehalt pro g Frischgewicht des Blattmaterials gilt:
28
Pigmentgehalt [mg x g-1] =
Extraktionsmittel [ml] x Pigmentkonzentration Extrakt [µg x ml-1]
__________________________________________________________________________________
Blatteinwaage [mg]
Aus den Ergebnissen sollen darüber hinaus der Gesamtchlorophyllgehalt und die
Verhältnisse zwischen den beiden Chlorophyllen sowie zwischen Chlorophyllen
(Gesamtchlorophyll) und Carotinoiden bestimmt werden. Die erhaltenen Werte sind
übersichtlich in einer Tabelle darzustellen und zusammen mit den in den beiden
ausgeteilten Literaturstellen angegebenen Werten zu diskutieren.
Literatur:
Lichtenthaler, H.K. & Wellburn, A.R.: Determination of the total carotinoids and
chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents.- Biochem. Soc. Transactions
603, 591-592 (1983).
29
Versuch II
PHYTOHORMONE
Zur Thematik des Versuchs siehe:
Campbell, S. 949-951; 961-994; Lüttge et al. S. 522-530; Mengel, S. 250-257; Nultsch,
S. 460-470; Taiz & Zaiger S. 423-492, 539-558.
Versuch II/1:
ZYLINDERTEST AUF AUXIN
a) Theoretische Grundlagen:
Hormone kommen in der Pflanze definitionsgemäß nur in sehr kleinen Mengen vor; so
enthält z. B. eine Haferkoleoptile nur etwa 10-10 Mol des Hormons Auxin (= Indol-3essigsäure, abgekürzt IES oder engl. IAA; Strukturformel: Campbell, S. 968). Für den
Nachweis dieses Phytohormons und vor allem für seine quantitative Bestimmung sind
deshalb chemische Methoden meist zu wenig empfindlich oder nicht spezifisch genug.
Zur quantitativen Bestimmung verwendet man daher biologische Tests, deren Prinzip
darin besteht, dass man an lebenden, auf das Hormon ansprechenden Objekten eine
spezifische Reaktion misst. Die Stärke der Reaktion wird dann mit einer sog. Eichkurve
(Reaktion auf das entsprechende Hormon in bekannter Konzentration) verglichen. Ein
solcher Biotest bietet auch noch eine weitere Untersuchungsmöglichkeit: man kann
damit prüfen, ob synthetisch hergestellte Stoffe die gleiche Reaktion hervorrufen wie
das pflanzeneigene Hormon und weiterhin, von welchen Faktoren die untersuchte
Reaktion abhängt.
Als Testobjekt verwendet man verständlicherweise solche Pflanzenteile, die auf das zu
untersuchende Hormon mit einer signifikanten Reaktion ansprechen. Beim Auxin ist das
klassische Objekt die etiolierte, d. h. im Dunkeln angezogene Koleoptile (Keimscheide;
koleo-, koleós, gr. Scheide; koleo-ptile: ptílon, gr. Flügel, Feder; Scheide am
Sprossvegetationspunkt bei Poaceen) von Gräsern, vor allem Avena (Hafer), im Versuch
aber Triticum (Weizen; siehe dazu auch Campbell, S. 965-967). Bei Koleoptilen wird
das Auxin in der nicht wachstumsfähigen Spitze produziert, wandert polar basipetal und
löst in den tiefer gelegenen Regionen ein starkes Streckungswachstum aus. Entfernt man
30
die Spitze, reagiert das übrige Koleoptilgewebe aus Mangel an eigenem Auxin auf von
außen zugeführtes Auxin sehr empfindlich.
Die Größe des Streckungswachstums kann man mit zwei Methoden messen:
1.) Man führt dem Koleoptilstumpf Auxin einseitig zu und löst damit an dieser Flanke
Zellstreckung aus, was zu einer Krümmung in Richtung der entgegengesetzten Flanke
führt.
Die Größe des Krümmungswinkels dient als Maß für die Auxinmenge, „WENT’scher
Krümmungstest“ (siehe Campbell S. 967). Dieser Test ist zwar die genaueste Methode,
aber relativ schwierig auszuführen.
2.) Einfacher, aber etwas weniger empfindlich, ist der „Zylindertest“, bei dem die
Längenzunahme eines Koleoptilzylinders in der entsprechenden Hormonlösung
gemessen wird. Die höchste Zuwachsrate im Koleoptilzylinder-Test liegt im Bereich
einer IES-Konzentration von 10-5 mol/l. Höhere oder niedrigere Konzentrationen sind
weniger oder gar nicht wirksam.
b) Praktische Durchführung:
Lösungen:
Als Testlösungen werden benutzt:
Lösung 1: 1 x 10-5 mol/l IES (Vorratslösung 10-4 mol/l) in wässrigem 0,01 mol/l
Phosphatpuffer (KH2PO4; pH 5,0; der Phosphatpuffer wurde vorher mit Na2HPO4 x 2
H2O am pH-Meter auf pH 5 eingestellt; warum?).
Lösung 2: reine Phosphatpufferlösung (pH 5,0) als Kontrolle (IES-Konz. = 0).
Beide Lösungen wegen Lichtempfindlichkeit der IES möglichst wenig dem Licht
aussetzen, also sofort unter den Dunkelsturz stellen.
Versuch:
Gerade gewachsene, etiolierte (4 Tage im Dunkeln mit 4x5 Rotlichtphasen angezogene)
30-40 mm lange Weizen-Koleoptilen (Triticum aestivum) werden mit einer
Korkpinzette direkt über der Basis vorsichtig abgezupft. Anschließend werden pro
Versuchslösung 14 Koleoptilen mit einer Dekapitierungspinzette etwa 15-20 mm
unterhalb der Spitze von der Schmalseite (Weizenkoleoptilen haben einen ovalen
Querschnitt) her eingeritzt, durch vorsichtiges Biegen gebrochen, der apikale Teil ohne
31
Quetschen von dem eingeschlossenen Primärblatt abgezogen und mit einer
Uhrfederpinzette vorübergehend in einer Schale mit Pufferlösung unter Dunkelsturz
aufbewahrt (um Trockenstress zu vermeiden). Danach werden sie der Pufferlösung
entnommen, kurz auf einem Zellstofftuch abgetrocknet und dann mit der Spitze gegen
den Anschlag des Schneideapparates (Dekapitierungslänge 3 mm) gelegt, um die
Spitzen zu dekapitieren. 2 x 14 Koleoptilen werden auf 5 mm Länge geschnitten und die
erhaltenen Zylinder in die beiden jeweils mit 10 ml IES- bzw. Pufferlösung versehenen
Glasschalen gegeben (Uhrzeit notieren, Protokoll!). Wichtig ist, dass die Koleoptilen
nicht zu lange dem Licht ausgesetzt sind (warum?). Deshalb werden die beiden
Glasschalen mit den Koleoptilen bei Raumtemperatur unter einen Dunkelsturz gestellt.
Die Versuchsdauer beträgt ca. 4h.
Danach werden die Zuwachslängen der Zylinder mikroskopisch vermessen. Hierzu
werden sie mit der Uhrfederpinzette aus der Lösung entnommen, wieder kurz auf einem
Zellstofftuch getrocknet und dann auf einen speziell dazu hergerichteten Objektträger
jeweils mit einer Schnittfläche gegen einen Anschlag gelegt. Die über die 5 mmMarkierung des Objektträgers hinausreichenden Endstücke der Zylinder werden mit
Hilfe eines geeichten Messokulars bei 32x Vergrößerung [z.B. 10 (Okular) x 3,2
(Objektiv)] gemessen. Die gezählten Skalenteile werden notiert und mit dem Faktor 0.03
multipliziert. Daraus ergibt sich ein auf maximal 0.03 mm (ein Teilstrich im Messokular
entspricht 30µ) genauer Zylinderzuwachs.
Die Messtabelle hierzu entwerfen Sie bitte vor dem Versuchstag.
c) Auswertung:
Um eine statistisch gesicherte Aussage über die wachstumsstimulierende Wirkung von
IES machen zu können, sind die Ergebnisse der Zuwachsmessung mit IES dem
sogenannten t-Test zu unterziehen. Verglichen werden soll hierbei das Ergebnis der
Kontrolllösung mit dem Ergebnis der IES-Lösung.
Die Streuungsbreite der Messwerte um x wird durch die „Standardabweichung“ s
gekennzeichnet. Sie wird nach folgender Formel berechnet:
s=
32
∑a
2
n −1
wobei a die Abweichung des jeweiligen Messwertes vom Mittelwert und n die Zahl der
Einzelwerte ist.
Will man unterscheiden, ob der Mittelwert des Zuwachses bei der Kontrolle von dem bei
10-5-molarer Auxinlösung wirklich verschieden ist, dann muss die Wahrscheinlichkeit
für den Unterschied mit Hilfe einer statistischen Methode berechnet werden. Eine
Prüfung dieser Wahrscheinlichkeit oder des Grades der Signifikanz ist mit Hilfe der
Prüffunktion t möglich, die nach folgender Formel berechnet wird (t-Test oder StudentTest):
t=
x1 − x 2
sD
wobei sD der mittlere Fehler der Differenz der beiden Mittelwerte ist und sich nach der
Formel:
sD =
∑a + ∑a
2
1
n1 + n 2 − 2
2
2
(
1
1
+ )
n1 n2
berechnet. Die verwendeten Symbole wurden bereits definiert, die Indizes
1
bzw.
2
beziehen sich auf die beiden betrachteten Messreihen.
Die statistische Sicherheit für den Unterschied der beiden Mittelwerte ist umso größer,
je größer der Wert t ist. Aus der beigefügten Tafel zur t-Verteilung kann entnommen
werden, welchen Wert t bei einer entsprechenden Zahl von Freiheitsgraden f (= n1 + n2 2) und bei bestimmten Sicherungsgrenzen mindestens haben muss. Liegt der errechnete
t-Wert numerisch über dem theoretischen, dann ist der Unterschied mit der
entsprechenden Sicherheit wahrscheinlich. Der Grad der Wahrscheinlichkeit wird durch
den p-Wert ausgedrückt; er ist gleich α, wird aber meist nicht in % angegeben (z. B. α =
0.25 %, p = 0.0025).
33
Tafel:
t-Verteilung
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
40
60
120
∞
f
1.00
.816
.765
.741
.727
.718
.711
.706
.703
.700
.697
.695
.694
.692
.691
.690
.689
.688
.688
.687
.686
.686
.685
.685
.684
.684
.684
.683
.683
.683
.681
.679
.677
.674
2.41
1.60
1.42
1.34
1.30
1.27
1.25
1.24
1.23
1.22
1.21
1.21
1.20
1.20
1.20
1.19
1.19
1.19
1.19
1.18
1.18
1.18
1.18
1.18
1.18
1.18
1.18
1.17
1.17
1.17
1.17
1.16
1.16
1.15
6.31
2.92
2.35
2.13
2.01
1.94
1.89
1.86
1.83
1.81
1.80
1.78
1.77
1.76
1.75
1.75
1.74
1.73
1.73
1.73
1.72
1.72
1.71
1.71
1.71
1.71
1.71
1.70
1.70
1.70
1.68
1.67
1.66
1.64
12.7
4.30
3.18
2.78
2.57
2.45
2.36
2.31
2.26
2.23
2.20
2.18
2.16
2.14
2.13
2.12
2.11
2.10
2.09
2.09
2.08
2.07
2.07
2.06
2.06
2.06
2.05
2.05
2.05
2.04
2.2
2.00
1.98
1.96
31.82
6.97
4.54
3.75
3.37
3.14
3.00
2.90
2.82
2.76
2.72
2.68
2.65
2.62
2.60
2.58
2.57
2.55
2.54
2.53
2.52
2.51
2.50
2.49
2.49
2.48
2.47
2.47
2.46
2.46
2.42
2.39
2.36
2.33
63.7
9.92
5.84
4.60
4.03
3.71
3.50
3.36
3.25
3.17
3.11
3.05
3.01
2.98
2.95
2.92
2.90
2.88
2.86
2.85
2.83
2.82
2.81
2.80
2.79
2.78
2.77
2.76
2.76
2.75
2.70
2.66
2.62
2.58
318.3
22.33
10.22
7.17
5.89
5.21
4.79
4.50
4.30
4.14
4.03
3.93
3.85
3.79
3.73
3.69
3.65
3.61
3.58
3.55
3.53
3.51
3.49
3.47
3.45
3.44
3.42
3.41
3.40
3.39
3.31
3.23
3.17
3.09
637.0
31.6
12.9
8.61
6.86
5.96
5.40
5.04
4.78
4.59
4.44
4.32
4.22
4.14
4.07
4.01
3.96
3.92
3.88
3.85
3.82
3.79
3.77
3.74
3.72
3.71
3.69
3.67
3.66
3.65
3.55
3.46
3.37
3.29
25
12.5
5
2.5
1
0.5
0.1
0.05
α
Irrtumswahrscheinlichkeit für einseitige Fragestellung ( in % )
34
Versuch II/2:
NACHWEIS DER AMYLASE-AKTIVITÄT UND INDUKTION DER α-AMYLASE
IN GERSTENKARYOPSEN DURCH GIBBERELLINSÄURE
a) Theoretische Grundlagen:
Gibberelline zählen zu den wachstumsfördernden Pflanzenhormonen. Sie wurden
benannt nach dem Pilz Gibberella fujikuroi (eine imperfekte Form von Fusarium
moniliforme) , der z.B. frühzeitige starke Internodienverlängerung in Reispflanzen
verursacht, was zu einer Schwächung der Pflanzen führt. Heute weiß man, dass
Gibberelline zunächst bei der Keimung wichtig sind und dort in den Samen gespeicherte
Nährstoffe mobilisieren. Gibberelline verursachen auch das Streckungswachstum beim
Übergang der vegetativen zur reproduktiven Phase, z.B. in Gräsern, Salat oder
Kohlpflanzen („Schießen“). Zudem sind Gibberelline auch beim Fruchtwachstum und
anderen morphologischen Prozessen beteiligt.
Bei der Keimung stellen die Reservestoffe für die Keimpflanze zunächst die einzige
Quelle organischer Nährstoffe dar. Ihre Verwertung durch die Jungpflanze kann
allerdings nicht direkt erfolgen, denn es handelt sich um unlösliche oder kolloidlösliche
makromolekulare Substanzen, die zunächst „mobilisiert“, also für die Jungpflanze
verwertbar gemacht werden müssen. Sie werden in lösliche, niedermolekulare Einheiten
zerlegt, die dann zu den stoffwechselaktiven Geweben und Organen der Keimpflanze
geleitet werden können. Der „Mobilisierung“ liegen enzymatische Prozesse zugrunde.
Einige bei diesen Vorgängen aktive Enzyme liegen bereits im ruhenden Samen vor und
werden bei der Quellung lediglich aktiviert, andere müssen während des Keimvorgangs
neu gebildet werden (mRNA und Proteinsynthese); dies ist nur bei entsprechendem
Quellungsgrad des Samens möglich.
Die
Mobilisierung
eines
pflanzlichen
Reservestoffes
unter
Beteiligung
von
Gibberellinen wird im Folgenden am Beispiel der „Stärkeverzuckerung“ in
Gerstenkaryopsen (Karyopse: Grasfrucht aus oberständigem Fruchtknoten, bei der
Frucht- und Samenschale verwachsen sind = „Gerstenkorn“) verfolgt.
Stärke ist das wichtigste Speicherkohlenhydrat in Pflanzen. Sie entsteht in den
Chloroplasten bei der Photosynthese aus der zunächst gebildeten Glukose. Die
Organellen, in denen Stärke gespeichert wird, sind Amyloplasten. Sie finden sich
vorwiegend in Speichergeweben und Speicherorganen wie Samen, Wurzeln oder
Spross- bzw. Wurzelknollen.
35
Pflanzliche Stärke besteht in der Regel aus zwei chemisch verschiedenen
Polysacchariden: Amylose und Amylopektin. In Stärkekörnern liegt Amylopektin meist
zu 80-90% vor, häufig als Hüllsubstanz des Stärkekorns, Amylose im Zentrum zu 1020%.
Amylose besteht aus 200–1000 Glukose-Molekülen, die in ausschließlich 1→4-α-DGlykosidbindungen in demnach unverzweigter Kette verknüpft sind. Das dieser Kette
zugrunde liegende Disaccharid ist die Maltose, eine 1→4-α-D-Diglukose.
Abb. 5 a, b: Raven et al., Biologie der Pflanzen, 2000; c: Raumstruktur der Amylose, Karlson et al. Biochemie,
1994
Im Amylose-Polysaccharid stellt das Glukose-Molekül, dessen HO-Gruppe am
anomeren C-1-Atom mit dem nächsten Glukose-Molekül glykosidisch verknüpft ist, das
sog. „nicht-reduzierende“ Ende dar. Das Glukose-Molekül am anderen Ende des
Polymers, dessen C-4-OH-Gruppe mit der C-1-HO-Gruppe des vorhergehenden
Glukose-Moleküls verknüpft ist, bildet das sog. „reduzierende“ Ende, da es noch seine
reaktionsfähige C-1-HO-Gruppe besitzt.
Wegen der sterischen Anordnung der 1→4-Glykosidbindungen kommt es im AmylosePolymer zu einer spiraligen Aufwindung (Schraube oder Helix). Bei der zum Nachweis
von Stärke verwendeten „Iodstärkereaktion“ werden Iodmoleküle aus der KII2 -Lösung
(Lugol’sche Lösung) in den Hohlraum der Amyloseschraube eingelagert, wodurch eine
Einschlussverbindung entsteht.
36
Abb. 6: Aufbau des Amylose-Iod-Komplexes: in die Zwischenräume der schraubig gewundenen Kette aus Glukose
(Sechsecke!) sind Iodmoleküle (gestrichelt!) eingelagert; aus Kretowitsch, Grundzüge der Biochemie der Pflanzen,
1965
Daraus resultiert eine veränderte Lichtabsorption der Iodmoleküle, die je nach
Kettenlänge eine tiefe Blaufärbung oder, bei kürzeren Ketten, nur eine Violett-, Rotoder Rotbraunfärbung bewirkt.
Amylopektin besteht aus 2000 – 22000 Glukosemolekülen, bei denen es neben den
1→4-α-D-Glykosidbindungen immer wieder zu 1→6-α-D-Glykosidbindungen kommt;
Etwa jedes 25igste Glukosemolekül zeigt eine 1→6-Bindung. Auf diese Weise kann
Amylopektin als „verzweigte“ Stärke angesehen werden.
Abb. 7: Struktur des Amylopektins; am Diagramm „schwarz“, ein reduzierendes Kettenende; Heß,
Pflanzenphysiologie, 1991
Die Schraubenstruktur im Amylopektin besteht insgesamt aus kürzeren Teileinheiten
wie die der Amylose, woraus eine violette bis rote Färbung mit KII2 entsteht.
Werden Stärkekörner mit heißem Wasser behandelt, so geht Amylose kolloidal in
Lösung. Amylopektin ist in heißem Wasser unlöslich, oberhalb 60 °C quillt es auf:
Stärkekleister!
Der enzymatische Abbau der Stärke erfolgt entweder durch Phosphorylasen oder durch
Hydrolasen. Beim Abbau durch Phosphorylasen werden die Glykosidbindungen durch
Phosphorsäure gespalten, also „phosphoryliert“; als Spaltprodukt entsteht Glukose-1phosphat. Beim Abbau durch Hydrolasen werden die Glykosidbindungen durch Wasser
37
„hydrolytisch“ gespalten. Diese Enzyme heißen Amylasen. Sie hydrolysieren Stärke
zum Disaccharid Maltose.
In Gerstenkörnern (Hordeum vulgare) wird die α-Amylase bei der Keimung in den
Aleuronzellen synthetisiert und ins Endosperm sezerniert. Dies wird durch
Gibberellinsäure (GA) gesteuert. Das vom Embryo produzierte Hormon gelangt nach
der Quellung in die Aleuronzellen und bewirkt dort die Aktivierung des α-Amylase
Gens. Es kommt so zu einer de novo-Synthese der α–Amylase. Die Resorption der
Zucker erfolgt durch den Embryo.
Dieser Prozess wird auch in der Brauerei ausgenutzt. Um die Maltoseproduktion bei der
Malzbildung zu beschleunigen, wird gelegentlich GA zugesetzt.
In diesem Versuch wird die α-Amylase-Aktivität in gequollenen und nicht gequollenen
Gerstenkörnern überprüft, die auf einem Stärke-Agar Medium inkubiert werden. Durch
KII2-Lösung kann die intakte Stärke nachgewiesen werden. Um die Getreidekörner mit
α -Amylase-Aktivität zeigen sich farblose Höfe aufgrund des Stärkeabbaus. Durch
Zusatz von Gibberellinsäure im Stärkeagar wird die α-Amylase-Synthese verstärkt.
Keine Aktivität ist nachweisbar, wenn die Getreidekörner durch Hitze abgetötet werden.
Abb.:
Mobilisierung
von
Zucker
während
der
Keimung
von
Gerstenpflanzen
durch
Gibberellinsäure (GA) (Campbell, Biologie, S. 950). GA wird vom Embryo produziert und induziert
in der Aleuronschicht α-Amylase. Dieses Enzym baut im Endosperm Stärke ab.
38
b) Praktische Durchführung.
Zunächst wird der Stärkeagar hergestellt. Dazu werden pro Gruppe in einem 500 ml
Becherglas 375 mg Kartoffelstärke, 6 g Agar und 300 mg CaCl2x2H2O in 255 ml H2O
deion. auf dem Magnetrührer unter Rühren kurz aufgekocht (Achtung, brennt an!).
Nachdem eine ± klare Lösung entstanden ist, wird sie bei 60oC im Trockenschrank am
Arbeitsplatz aufbewahrt (warum?). Danach werden pro Gruppe aus einer 0.3
millimolaren (mM) Stammlösung Gibberellinsäure (GA3; Strukturformel: Campbell S.
968) 20 ml einer 0.03 mM-Lösung hergestellt (in 20 ml Messkolben).
Zur Versuchsdurchführung werden insgesamt 7 Petrischalen gebraucht. Zur Herstellung
von 3 Petrischalen mit je 30 ml Inhalt werden in jede einzelne 5 ml der 0.03 mM GA3Lösung mit 25 ml Stärkeagar gemischt (die GA3 wird dadurch 0.005 mM; verstanden?).
Zuerst gibt man mit einer 5 ml Vollpipette die GA3-Lösung in die beschriftete
Petrischale, gießt 25 ml warmen Stärkeagar aus einem 50 ml Messzylinder dazu und
verrührt das Ganze mit einem Plastikspatel. Man stellt dann 3 weitere Petrischalen mit
30 ml reinem Stärkeagar her. Zur Kontrolle wird eine 7. Petrischale mit Stärkeagar
hergestellt, die nicht mit Karyopsen bestückt wird.
Ein Teil der Karyopsen wurde zur Quellung ca. 24 h vorher in eine Petrischale mit
Leitungswasser gelegt: a) lebende und b) 72 h in 70% EtOH und anschließend 8 h bei
120° C erhitzte und dadurch abgetötete Karyopsen (Zahl siehe unten!).
Nach Abkühlen des Stärkeagars (ca. 10 min) werden die Petrischalen mit Hilfe einer
beigelegten Schablone folgendermaßen beschickt:
I Petrischalen mit GA3
Petrischale 1: lebende, gequollene Karyopsen, quer halb durchgeschnitten (warum?),
mit Embryo (warum?)
Petrischale 2: lebende, trockene Karyopsen, quer halb durchgeschnitten, mit Embryo
Petrischale 3: abgetötete, gequollene Karyopsen, quer halb durchgeschnitten, mit
Embryo
II Petrischalen ohne GA3 wie oben
(Vorsicht: vor dem Schnitt eines jeden Korntyps, Rasierklingen, Brettchen und
Pinzetten gründlich reinigen!)
Je 8 Gerstenkaryopsen werden mit der Schnittfläche nach unten (nach vorherigem
Abtupfen auf Zellstofftuch) vorsichtig mit einer Pinzette auf den Agar gelegt und leicht
angedrückt.
39
Man lässt die abgedeckten Petrischalen 24 h bei Zimmertemperatur auf dem Labortisch
stehen. Die α-Amylase diffundiert aus dem Gerstenkorn gleichmäßig in alle Richtungen
in den Agar und baut die Stärke rund um die Auflagefläche der jeweiligen Kornhälfte
ab. Man muss ferner davon ausgehen, dass die der einen Petrischale zugesetzte GA3
ebenfalls und zusätzlich über die Schnittfläche in die Kornhälfte diffundieren kann
(Folgerung?).
Nach 24 h wird zunächst von jeder Petrischale mit den Karyopsenhälften ein Digitalfoto
gemacht. Dann werden sie mit einer Pinzette entfernt und der Agar vorsichtig mit KII2Lösung (Lugolsche Lösung; 300 ml Wasser, 2 g KI, 0,2 g I2) übergossen (inklusive
Kontrollpetrischale). Man lässt die Lösung etwa 20 Sekunden einwirken und gießt dann
das KII2 ab. Mit einem Digitalfoto (eigene Kamera mitbringen) werden die entstandenen
weißen Flecken dokumentiert. Anschließend werden die Petrischalen mit ihrem Deckel
umgekehrt auf einen Lichtkasten gelegt, die Ø der Flecken mit Hilfe eines Lineals
abgelesen und notiert. Der gesamte übrige Stärkeagar ist nun blau gefärbt.
Die Messtabelle hierzu entwerfen Sie bitte vorher!
c) Auswertung:
Der Durchmesser der erkennbaren weißen Flecken als Ausmaß der α-Amylaseaktivität
ist graphisch darzustellen. Wie interpretieren Sie die Ergebnisse mit den unterschiedlich
behandelten Gerstenkörnern? Kurze schriftliche Zusammenfassung!
40
Versuch II/3:
INDUKTION DER DORMANZ DURCH ABSCISINSÄURE
a) Theoretische Grundlagen:
Neben anderen Wirkungen kann Abscisinsäure (ABA; Strukturformel: Campbell S. 968)
in der pflanzlichen Entwicklung Ruhezustände einleiten und aufrechterhalten. Sie
verhindert während der frühen Reifungsphase des Embryos dessen spontane
Auskeimung in der befruchteten Samenanlage (Viviparie) und erzwingt die
Weiterentwicklung
zum
austrocknungstoleranten
Samen
unter
Speicherstoffeinlagerungen. Mutanten von Mais und Tomate, welche die Fähigkeit zur
ABA-Synthese verloren haben, zeigen Viviparie. Diese lässt sich durch Besprühen mit
ABA-Lösung verhindern.
Der ausgereifte dormante Samen enthält im Allgemeinen keine nennenswerten Mengen
an ABA, so dass die natürliche Keimhemmung nicht direkt mit diesem Hormon in
Zusammenhang gebracht werden kann. Reife Samen aber reagieren ähnlich wie junge
Embryonen auf äußere Zufuhr von ABA mit Entwicklungsruhe. Bei der Aussaat
keimfähiger Samen auf einem ABA-haltigen Keimsubstrat findet zunächst eine normale
Quellung statt, die Wachstumsphase jedoch, während der der Embryo unter weiterer
Wasseraufnahme zum aktiven Streckungswachstum übergeht, wird je nach ABAKonzentration völlig unterdrückt. Das keimungshemmende Hormon ABA hemmt
spezifisch den Übergang von der Quellungsphase zur Wachstumsphase. Der während
der Quellungsphase eintretende Aufbruch der Samenschale bleibt durch ABA
unbeeinträchtigt, der zu Beginn der Wachstumsphase zu beobachtende Wurzelaustritt (z.
B. bei Rapssamen etwa 12 h nach Quellungsbeginn) dagegen wird durch ABA
vollständig gehemmt. ABA-behandelte Samen können so in gequollener Form, selbst
unter optimalen Keimungsbedingungen (Wasser, Temperatur), für viele Tage in
erzwungener Dormanz gehalten werden. Dieser Zustand kann durch Auswaschen des
Hormons sehr rasch aufgehoben werden. Die Keimungshemmung durch ABA ist also
reversibel.
Auch unter natürlichen Bedingungen kann ABA in der eben geschilderten Weise als
Keimungshemmstoff fungieren. Es ist bekannt, dass Tomaten- oder andere Samen
innerhalb der Frucht, selbst wenn sie ausgereift sind, nie keimen, nach Entfernen aus der
Frucht aber hohe Keimraten aufweisen. Die keimungshemmende Wirkung des
41
Fruchtfleisches bei Beeren lässt sich neben möglichen weiteren Stoffen auch auf das
Vorkommen von ABA zurückführen.
42
b) Praktische Durchführung und Auswertung:
Lösungen:
ABA 4 µmol/l; aus dieser Stammlösung wird durch Verdünnen mit H2O deion.
folgende Konzentrationsreihe hergestellt: 2 µmol/l, 1 µmol/l, 0,5 µmol/l, 0,25
µmol/l (wie? Ansatz jeweils in einem 20 ml-Messkolben; 10 ml Pipetten).
¾ H2O deion. als Kontrolle
¾ Tomatensaft: für 2 Gruppen wird 1 Tomate (Solanum lycopersicum) zerkleinert
und der Saft durch Gaze in eine Glasschale gepresst (Tomatensaft unverdünnt).
Zusätzlich wird pro Gruppe 1 ml davon in einem 10 ml Messzylinder mit H2O
deion. 1:10 verdünnt.
¾ Maracujasaft: für 2 Gruppen werden 2 Maracujas (Passiflora edulis)
aufgeschnitten, die Samen mit dem verschleimenden Arillus und der Pulpa aus
den Früchten ausgekratzt und der Saft durch Gaze gepresst (Maracujasaft
unverdünnt). Zusätzlich wird pro Gruppe 1 ml davon in einem 10 ml
Messzylinder mit H2O deion. 1:10 verdünnt (siehe Tomatensaft).
Versuch:
Je 30 Senfsamen (Sinapis alba) werden in 10 Petrischalen äquidistant auf 3 Lagen
Filterpapier (Ø 70 mm) ausgelegt, welches zuvor mit jeweils 5 ml ABA-Lösung (0,25;
0,5; 1; 2; 4 µmol/l, siehe oben!), H2O deion. (Kontrolle) sowie Tomaten- und
Maracujasaft (jeweils unverdünnt und 1:10 verdünnt) gleichmäßig getränkt worden
war. Die Petrischalen werden abgedeckt und bei Raumtemperatur im Kursraum bei
Tageslicht zum Keimen aufgestellt. Nach etwa 48 Stunden wird die Keimrate bestimmt
und
der
Entwicklungszustand
der
Keimlinge
protokolliert:
Mit
Hilfe
von
Millimeterpapier wird die Länge jeder Keimpflanze von der Wurzelspitze bis zur
Insertion der Kotyledonen vermessen und die Länge in einer Tabelle notiert (Tabelle
bitte vor dem Praktikum entwerfen!)
43
c) Auswertung:
Die Mittelwerte der Keimpflanzenlängen in den unterschiedlichen Versuchsgefäßen
(Ordinate) werden gegen die ABA-Konzentrationen (0 – 4 µmol; Abszisse) aufgetragen.
Die Ergebnisse der Versuche mit Tomaten- und Maracujasaft sind in die gleiche
Graphik als Balken einzutragen. Kurze schriftliche Zusammenfassung der Ergebnisse!
44
ENTWICKLUNGSPHYSIOLOGIE
AM
MODELLSYSTEM
ARABIDOPSIS THALIANA
Zur Thematik des Versuchs siehe:
Campbell, S.493-495, 890-891, 977-980, Taiz & Zaiger S. 375-402, 559-566, Schopfer
& Brennecke S. 423-448, 465-482
Versuch III/1:
STEUERUNG DES HYPOKOTYL-LÄNGENWACHSTUM DURCH LICHT
MITTELS PHYTOCHROM
a) Theoretische Grundlagen und Ziel:
Pflanzen benötigen Licht für die Photosynthese und müssen daher ihr Wachstum zur
optimalen Ausnutzung der Lichtquelle hin steuern. Licht ist bei Pflanzen als
Umweltfaktor
auch
ein
Signal
zur
Steuerung
von
Entwicklungs-
und
Differenzierungsprozessen. Man kann dies sehr gut beobachten, indem man
Pflanzenkeimlinge im Dunkeln und im Licht anzieht. Im Dunkeln etiolieren Pflanzen,
d.h. das Hypokotyl streckt sich (Hypokotylelongation), die weitere Blattbildung und
Blattausfaltung werden unterdrückt, die Plastiden bilden kein Chlorophyll aus
(Etioplasten). Diese Entwicklung im Dunkeln wird als Skotomorphogenese bezeichnet,
deren Ziel die Verwendung aller Samenressourcen zur schnellstmöglichen Erreichung
der Erdoberfläche ist. Sobald die Jungpflanzen Licht wahrnehmen, wird die
Hypokotylelongation inhibiert, Blätter werden entfaltet und weitere gebildet und
Chlorophyll wird produziert, d.h. die Jungpflanzen de-etiolieren. Diese Licht-abhängige
Entwicklung heißt Photomorphogenese und erlaubt der Pflanze das schnellstmögliche
Ausnutzen der Lichtenergie für die Photosynthese.
In der Pflanzenphysiologie umfasst Licht den elektromagnetischen Wellenlängenbereich
von 320 nm (UV-A) bis 760 nm (Dunkelrot). Weißlicht enthält dabei immer Licht
unterschiedlicher Wellenlängen. Zur Wahrnehmung von Licht verfügen Pflanzen über
sensorische Photorezeptorsysteme für verschiedene Spektralbereiche, wie Phytochrom
(Rot- und Dunkelrotlichtrezeptoren, 660, 730 nm), Cryptochrom (UV-A- und
Blaulichtrezeptoren, 340 – 520 nm) und UV-B Photorezeptoren (280 – 350 nm). Am
besten untersucht ist das Phytochromrezeptorsystem und die Rotlichtsignaltransduktion.
Phytochrome sind Proteinkomplexe, die aus einem Apoprotein bestehen und einem
45
gebundenen
Chromophor,
dem
Phytochromobilin.
Das
Chromophor
liegt
in
Abhängigkeit vom einfallenden Licht in den Konfigurationen cis oder trans vor. Hierbei
handelt es sich jedoch um ein Gleichgewicht, das zur cis- oder trans Form verschoben
werden kann. Rotlicht aktiviert den Übergang zur trans Form, Pfr, mit einer maximalen
Absorption bei 730 nm. Eine Konformationsänderung im Protein aktiviert Phytochrom
und Photomorphogeneseantworten werden eingeleitet. Bei Dunkelrot hingegen liegt die
biologisch inaktive cis Form vorwiegend vor, Pr, mit einer maximalen Absorption bei
660 nm. Da die Konversion von der aktiven in die inaktive Form und umgekehrt
reversibel ist, spricht man auch von Photoreversibilität:
Rotlicht 660 nm
Pr
Pfr
Dunkelrotlicht 730 nm
Struktur der Pr und Pfr Formen des Chromophor, welches kovalent mit Phytochrom verbunden ist (aus
Taiz & Zaiger).
Pflanzen besitzen unterschiedliche Formen von Phytochromen. Die Zusammenhänge
zwischen Struktur und Funktion von Phytochromen wurden durch genetische Methoden
46
aufgeklärt.
Phytochrommutanten
wurden
in
„Mutanten-Screening“
Verfahren
gefunden, d.h. Tausende Nachkommen von mutagenisierten Pflanzen wurden nach
Individuen mit veränderten Lichtantworten durchsucht. Solche mutagenisierten
Populationen werden künstlich durch Mutageneseverfahren erhalten, z.B. durch
chemische Mutagenese mit DNA-verändernden Chemikalien. Statistisch ist es dabei
möglich, aus Tausenden Pflanzen mit DNA Mutationen solche zu identifizieren, bei
denen ein wichtiges Gen für den gewünschten physiologischen Prozess durch eine
Mutation betroffen oder zerstört ist. Für solche genetischen Methoden und insbesondere
die anschließende Identifizierung des betroffenen Gens eignen sich Modellpflanzen wie
Arabidopsis thaliana am besten (s. Vorlesung, 1. Stunde).
Mutanten der Rotlichtwahrnehmung zeigen im kontinuierlichen Rotlicht einen
Phänotyp. Statt der üblichen De-Etiolierung bei Wildtyppflanzen im Rotlicht fand man
etiolierte Mutanten, welche nicht auf das Rotlicht reagieren konnten. Hierzu zählt die
Arabidopsis Hypokotylelongationsmutante hy1, welche einen Defekt in einem Gen der
Phytochromobilin Synthese aufweist. hy1 Mutanten können kein intaktes Phytochrom
aufgrund des fehlenden Chromophors produzieren.
Im Folgenden sollen die Lichtantworten von Arabidopsis Keimlingen getestet werden.
Hierzu wird das Pflanzenwachstum im Dunkeln verglichen mit dem im kontinuierlichen
Weißlicht und kontinuierlichen Rotlicht. Die Beteiligung von Phytochromen wird dabei
anhand der Mutante hy1 (Chromophormutante) im Vergleich zum Wildtyp untersucht.
b) Praktische Durchführung:
Pflanzenmaterial:
Wildtyp (Ler, Landsberg erecta)
90 Samen
hy1
90 Samen
47
Weißlicht
Rotlicht
Dunkel
Ler
Ler
Ler
hy1
hy1
hy1
75 ml Wasser mit 0,6 g Pflanzenagar werden autoklaviert. Festgewordene Agarlösung
kann in der Mikrowelle aufgekocht werden. 3 Petrischalen werden mit Agarlösung
befüllt. Sterilisierte Samen* werden auf das Agarmedium pipettiert und mit einem
Spatel (vorher mit EtOH gereinigt, abgeflämmt und luftgetrocknet) vorsichtig verteilt,
jeweils auf der einen Hälfte 30 Ler Samen und auf der anderen Hälfte 30 hy1 Samen.
Anschließend werden die Platten für 1-4 Tage bei 4°C gut verschlossen und dunkel
aufbewahrt (Stratifizierung zur gleichmäßigeren Auskeimung, Terminabsprache
beachten).
Dann werden die Platten 1 Stunde lang mit Weißlicht bestrahlt, um die Keimung zu
induzieren (Arabidopsis benötigt Licht zum Keimen). Anschließend werden die Platten
entweder in eine Verdunklungsbox gegeben (Dunkel), in eine dunkle Box mit
Rotlichtfilterdeckel (Rotlicht) oder in eine Box ohne Deckel (Weißlicht). Die drei
Boxen werden bei 21°C für drei Tage in einen Pflanzenschrank mit kontinuierlichem
Weißlicht gestellt.
Am Montag der darauf folgenden Woche werden die Platten aus dem Lichtschrank
genommen.
* Sterilisierte Samen werden von Betreuern zur Verfügung gestellt. Die winzigen Samen werden im
Eppendorfgefäß mit 6 %iger Na-Hypochloritlösung, 0,1 % Triton-X 8 min lang sterilisiert, durch
Zentrifugation wird der Überstand entfernt und durch steriles Wasser ersetzt. Insgesamt wird 5mal mit
sterilem Wasser gewaschen und die Samen in 0,1%iger Agarlösung aufbewahrt.
48
Folgende Phänotypen werden unter dem Binokular festgehalten:
- Farbe der Kotyledonen (grün, gelb, weißlich) und Hypokotylfarbe (weiß, rotAnthocyane)
- Stellung der Kotyledonen (auseinander, gefaltet, Hypokotylkrümmung?)
- Hypokotyllänge (s. Tafelbild): Die Hypokotyle werden mit Millimeterpapier unter dem
Binokular genau vermessen, und die Längen in eine Tabelle eingetragen. Bitte Tabelle
vorbereiten !
c) Auswertung:
Die Durchschnittswerte und Standardabweichungen der Hypokotyllängen werden
ermittelt (siehe t-test Versuch II/1) und in einem Säulendiagramm graphisch dargestellt.
Die Ergebnisse der Phänotypen werden in einer Tabelle für die Lichtqualitäten und
Linien dargestellt. Welches Licht inhibiert das Streckungswachstum des Hypokotyls?
Welche Photorezeptoren agieren primär? Welche Phänotypen werden durch die
Lichtqualität
beeinflusst,
welche
von
Phytochromen?
Was
bedeutet
die
Anthocyanbildung, die Sie ggf. beobachten?
LITERATUR
Koorneef, M., Rolff, E., Spruit, C.: Genetic control of light-inhibited hypocotyl
elongation in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. – Z. Pflanzenphysiol. 100, 147-160
(1980).
49
Versuch III/2:
ARABIDOPSIS MUTANTEN ZUR UNTERSUCHUNG VON AUSGEWÄHLTEN
ENTWICKLUNGSPROZESSEN
a) Theoretische Grundlagen und Ziel:
Die für jede Pflanzenspezies typische Morphologie, anhand der wir die Spezies
bestimmen können, entwickelt sich gemäß eines genetischen Programms. So entwickeln
die verschiedenen Pflanzenspezies und –familien die für sie charakteristischen
Blattformen, Blattstellungen, Blütenstände und Blütenformen sowie Farben. In der
Entwicklungsphysiologie wird das Entwicklungsprogramm der verschiedenen Organe
und
Zellen
von
der
Initiation,
der
Determinierung
bis
zur
vollständigen
Ausdifferenzierung untersucht. Heute interessiert man sich insbesondere für die Gene
und Proteine und deren Wirkungsweise bei Entwicklungsprozessen. In Pflanzen kann
dies durchaus kommerzielle Interessen haben. Gerade in der Pflanzenzüchtung (Gemüse,
Zierpflanzen) kommen ständig Varietäten mit veränderten morphologischen Merkmalen
auf den Markt, die vermutlich zum Teil nur durch Veränderungen in einzelnen Genen
hervorgerufen wurden.
Interessanterweise hat sich gezeigt, dass gerade bei der Initiation und der
Determinierung von Zellen und Organen sequenzähnliche, also verwandte Gene
(Homologe) in evolutionär verschiedenen Pflanzenpezies und –familien agieren. Bei der
Herausbildung spezifischer Blüten- und Blattformen kann es sich um die Anreicherung
von Veränderungen in der DNA Sequenz von wenigen Schlüsselgenen handeln, denen
eine
grundlegende
Funktion
bei
dem
betreffenden
Prozess
zukommt.
Um
Verwandtschaftsverhältnisse zwischen verschiedenen Pflanzenarten zu bestimmen und
Stammbäume zu erstellen, verlässt man sich daher nicht mehr auf rein morphologische
Kriterien, sondern zieht molekulare Daten hinzu. Hier eignen sich konservierte Gene der
Photosynthese oder ribosomale DNA besonders gut. Trotz großer morphologischer
Unterschiede lassen sich einzelne Arten durch molekulare Bestimmung ihrer
Verwandschaftsverhältnisse zum Teil in einem Stammbaum neu einordnen.
Schlüsselgene der Pflanzenentwicklung hat man insbesondere anhand des Modells
Arabidopsis thaliana untersucht. Molekulargenetische Methoden waren sehr wichtig
zum Auffinden von Schlüsselgenen in Entwicklungsprozessen. Wie bereits im
vorangegangenen Versuch erläutert wurde, werden dazu Mutantenpopulationen erstellt.
In der Entwicklungsphysiologie werden die mutagenisierten Populationen nach
Individuen mit veränderter Morphologie durchsucht. Diese Mutanten müssen zunächst
50
genetisch näher bestimmt werden. Eine zu klärende Frage betrifft die Ausprägung des
Phänotyps: Die Mutation kann rezessiv wirken, d.h. nur im homozygoten Zustand des
mutanten Allels ist der Phänotyp zu erkennen (Allel = Zustand des Gens). Ist hingegen
ein Wildtyp-Allel vorhanden (heterozygoter Zustand) zeigt sich die phänotypische
Veränderung durch das mutante Allel nicht mehr. Auf der anderen Seite kann sich die
Mutation dominant auswirken, d.h. eine Kopie des mutanten Allels reicht für die
Ausprägung des Phänotyps aus in Anwesenheit des Wildtyp-Allels. In der Regel
beruhen rezessive Allele auf einer Mutation, welche die Funktion des Gens zerstört
(Funktionsverlust), zum Beispiel kein Protein, defektes Protein. Hingegen beruhen
dominante Allele häufig auf Mutationen, welche neue Funktionen für das Gen gewinnen
(Funktionsgewinn),
zum
Beispiel
durch
Aminosäureaustausche,
die
eine
Funktionsänderung bewirken, oder durch veränderte Mengen an produziertem Protein.
Um rezessive oder dominante Ausprägung von mutanten Allelen zu überprüfen, kann
eine Rückkreuzung hilfreich sein. Dabei wird die Mutante mit dem elterlichen Wildtyp
gekreuzt. Jetzt gelten die Mendelschen Regeln. Ist der Phänotyp bei den Nachkommen
(F1) sichtbar, ist die Mutation dominant, ansonsten voraussichtlich rezessiv. In der
zweiten Generation (F2) spaltet der Phänotyp auf (Segregation). Bei einer rezessiven
Mutation liegt das Verhältnis von Mutante:Wildtyp bei 1:3 (= 1:2:1, homo
mut:het:homo wt). Bei einer dominanten Mutation liegt das Verhältnis von
Mutante:Wildtypphänotyp bei 3:1 (= 1:2:1, homo mut:het:homo wt). Manche Mutanten
können im homozygoten Zustand vermehrt werden, d.h. die Mutation verhindert die
Samenbildung nicht. Mutanten mit schweren Entwicklungsstörungen oder sterile
Mutanten können über heterozygote Pflanzen vermehrt werden, vorausgesetzt die
Mutation ist rezessiv.
Im Praktikum werden Ihnen vier Mutanten vorgestellt. Eine Mutation betrifft die
Spezifikation
von
Blatthaaren
(Trichome)
in
der
Epidermis.
Einzelne
Battepidermiszellen entwickeln sich zu Trichomen, andere hingegen nicht. Dies
geschieht in einem Muster auf der Blattoberfläche. Für die Ausbildung von Trichomen
sind mehrere Schlüsselgene identifiziert, eines davon ist GLABRA1. Der Name glabra
bedeutet „glatt ohne Haare“. glabra1 Mutanten bilden keine Trichome aus. Das Protein
GLABRA1 ist also für die Ausbildung von Trichomen essentiell. Es handelt sich dabei
um einen Transkriptionsfaktor, der für die Determinierung von Epidermiszellen zu
Trichomen wichtig ist.
51
Drei weitere Mutanten haben eine veränderte Spezifikation von Blütenorganen und
können nicht alle Blütenorgane ausbilden. Man spricht im allgemeinen von vier
verschiedenen Blütenorganen, die in vier Wirteln (Stellungen) ausgebildet werden. Das
erste Wirtel enthält die grünen Kelchblätter, das zweite Wirtel die meist bunten
Kronblätter, das dritte Wirtel die Staubblätter und das vierte Wirtel die Fruchtblätter.
Anzahl und Verwachsung der Blütenorgane in den Wirteln sind art- bzw.
familienabhängig. Im Wildtyp Arabidopsis erfolgt die Ausbildung der Blütenorgane
entsprechend des folgenden Blütendiagramms:
Die Arabidopsis Blüte: Links, Photo. Mitte, Schematischer Längsschnitt durch das Blütenmeristem mit
den Organanlagen. Rechts, Blütendiagramm, Anordnung der Blütenorgane im Querschnitt (aus Schopfer
& Brennicke).
Bei den Blütenorganen handelt es sich um:
Se (Sepalen) – Kelchblätter
Pe (Petalen) – Kronblätter
St (Stamina) – Staubblätter
Ka (Karpelle) - Fruchtblätter
In den Mutanten agamous (ag), apetala2 (ap2) und apetala3 (ap3) sind zwar alle Wirtel
vorhanden, aber die Identität der Blütenorgane in den Wirteln ist betroffen
(homöotische Mutation). ag Mutanten haben nur Kelchblätter und Kronblätter. Es
fehlen Staub- und Fruchtblätter. Die Blütenorgane der dritten und vierten Wirtel haben
erneut die Identität der Blütenorgane der ersten beiden Wirtel. In ag Mutanten scheint
außerdem das vierte Wirtel indeterminiert zu sein, da sich die Abfolge der Wirtel
wiederholt. ap2 Mutanten
fehlen Kelch- und Kronblätter. ap3 Mutanten haben
Kelchblätter nicht nur im ersten sondern auch im zweiten Wirtel und dadurch keine
Kronblätter. Anstelle der Staubblätter finden sich weitere Fruchtblätter, wenn auch
52
morphologisch veränderte und verwachsene. Zum Teil sind die hier beschriebenen
Phänotypen nur inkomplett ausgebildet.
Von den Untersuchungen an diesen Mutanten wurde ein vereinfachtes Modell zur
Determinierung von Blütenorganen erstellt, das sog. ABC Modell:
ABC-Modell der Blütenorganidentitätsgene: A-Funktion = APETALA2; B-Funktion = APETALA3; CFunktion = AGAMOUS. ABC Gene werden entsprechend der unteren beiden Schemen in den vier
Wirteln exprimiert. Entsprechend des Modells ergibt sich, dass die vier Blütenorgane vier verschiedene
ABC Genkonstellationen benötigen. Fällt ein Gen aus, ergeben sich die jeweils anderen Konstellationen,
die dann zu den homöotischen Veränderungen führen. (aus Schopfer & Brennicke).
Se (Sepalen) – Kelchblätter
A
Pe (Petalen) – Kronblätter
AB
St (Stamina) – Staubblätter
BC
Ka (Karpelle) – Fruchtblätter
C
Ziel ist hier, die entwicklungsspezifischen Phänotypen von vier Mutanten zu erkennen
und zu beschreiben (glabra1, agamous, apetala2, apetala3), sich die zugehörige Genetik
zu überlegen und Erklärungen für die Phänotypen herzuleiten.
53
b) Praktische Durchführung:
Sie erhalten Töpfe mit blühenden Arabidopsispflanzen. Es handelt sich dabei jeweils um
unterschiedliche Linien (Nachkommen derselben Mutterpflanze). Diese sollen Sie
anhand der Fragen der Auswertung näher charakterisieren und die entsprechenden
Zeichnungen anfertigen.
c) Auswertung:
1) Bei welchen Töpfen handelt es sich um Wildtyp, glabra1, agamous, apetala2
und apetala3? Zeichnen sie die charakteristischen Phänotypen verglichen mit
dem Wildtyp auf. Woran haben Sie die Mutanten erkannt?
2) Erarbeiten
Sie
Blütendiagramme
für
die
analysierten
Blütenmutanten,
vergleichen Sie mit dem Wildtyp und diskutieren Sie das ABC Modell.
3) Sind die Linien homozygot (keine Segregation) oder heterozygot (Segregation)?
Wenn Sie eine Segregation feststellen, wie ist das Segregationsverhältnis? Was
leiten Sie daraus ab? Wie müssen die Linien vermehrt werden fürs Praktikum im
nächsten Jahr und wie kann man die korrekten Linien auswählen und
überprüfen?
4) glabra1 und ap2 Mutanten können homozygot vermehrt werden, ag und ap3
nicht. Weshalb?
5) Angenommen Sie wollten Samen von einer segregierenden und einer nicht
segregierenden Linie von glabra1 erhalten. Wie würden Sie vorgehen ausgehend
von einer homozygot vorliegenden glabra1 Pflanze?
6) Arabidopsis kann durch Selbstung vermehrt werden (keine manuelle Operation
notwendig). Wird genetisch gearbeitet, müssen die Organismen jedoch häufig
gekreuzt werden. Bei Arabidopsis werden dafür zunächst geschlossene Blüten
mit hervorstehendem Karpell gewählt. Die Blüten werden mit einer Pinzette
vorsichtig geöffnet und Staubblätter entfernt. Kelch- und Kronblätter können
stehen bleiben. Wichtig ist das zentrale Karpell. Mit der Pinzette werden von
einer reifen Blüte Staubblätter abgezupft und der Pollenstaub auf das behaarte
Stigma getupft. Den Vorgang unbedingt unter dem Binokular verfolgen! Falls
verschiedene Linien miteinander gekreuzt werden, muß die Pinzette ständig in
Alkohol sterilisiert werden, um Fremdpollenbestäubung zu verhindern.
54
Konventionen für die Bezeichnung von Arabidopsis Allelen/Genen/Proteinen:
a. das Gen, Wildtypallel GLABRA1
b. das Protein GLABRA1
c. die rezessive Mutante glabra1.
LITERATUR:
Oppenheimer D.G., Herman P.L., Sivakumaran S., Esch J., Marks M.D.: A myb gene
required for leaf trichome differentiation in Arabidopsis is expressed in stipules. – Cell
67, 483-493 (1991).
Bowman, J.L., Smyth, D.R., Meyerowitz, E.M.: Genes directing flower development in
Arabidopsis. – Plant Cell 1, 37-52 (1989).
Abb.: Reife Arabidopsis Blüte im Schema. Sepalen und Petalen werden mit einer Pinzette abgetrennt. Die
Staubblätter zur Bestäubung können dann mit einer Pinzette an der unteren Basis abgezupft werden.
Reife Staubblätter sind tiefgelb und tragen Pollenkörner, die unter dem Binokular erkennbar sein sollten.
Abb.: Unreife Arabidopsisblüte zur Befruchtung. Sepalen und Petalen umschließen Staub- und
Fruchtblätter. Das behaarte Stigma steht hervor. Sepalen und Petalen werden mit einer Pinzette entfernt
oder nach unten geknickt. Die unreifen Staubblätter, die grünlich und etwa nur halb so lang wie Petalen
sein sollen, werden mit einer Pinzette abgetrennt. Dadurch wird das Stigma freigelegt und kann bestäubt
werden.
55
Versuch III/3:
NACHWEIS
DER
AKTIVITÄT
EINES
TRANSGENS
IN
GENETISCH
VERÄNDERTEN ARABIDOPSIS PFLANZEN
a) Theoretische Grundlagen und Ziel:
1. Bestimmung des Genexpressionsmusters mittels Reportergentests
Die Funktionsweise von Genen wird heute in der Regel durch Standardexperimente
zunächst bestimmt. Hierzu bestimmt man häufig zuerst, wann (in welchem Stadium der
Entwicklung oder einer physiologischen Behandlung), wo (in welchen Zellen, Geweben,
Organen) und wie stark ein Gen aktiv ist, d.h. mRNA gebildet wird. Diese Aktivitäten
sind charakteristisch für alle Gene. Die Gesamtheit der Aktivitäten eines Gens
bezeichnet man auch als Genexpressionsmuster. Das Genexpressionsmuster wird vom
regulatorischen Bereich des Gens bestimmt, insbesondere des Promoters. Bei der
Untersuchung der Funktionsweise von Genen in einem biologischen Prozess ist es
sinnvoll, das Genexpressionsmuster während des biologischen Prozesses zu bestimmen.
Im Allgemeinen geht man von der Annahme aus, dass Gene dann exprimiert werden,
wenn sie auch eine Funktion erfüllen sollen. Neben der direkten Untersuchung von
isolierter RNA beruht eine alternative Methode auf der Verwendung eines PromoterReportergentests. Als Reportergen bezeichnet man ein Gen, dessen Proteinprodukt
direkt oder indirekt durch einen enzymatischen Test in den Zellen leicht nachzuweisen
ist. Die Aktivität des Reportergens hängt dabei von der Regulation des Promoters ab,
d.h. die Reporteraktivität soll die Expressionsaktivität des eigentlich zu untersuchenden
Genpromoters wiederspiegeln. Dabei wird die Promoterregion des zu untersuchenden
Gens mit einem Reportergen fusioniert (durch entsprechende Klonierung in binären
Vektoren, die sowohl in Escherichia coli als auch Agrobacterium tumefaciens repliziert
werden können). Durch Agrobakterien-vermittelte Transformation wird die PromoterReportergenfusion als Transgen in Pflanzen eingebracht (Pflanzentransformation).
Die Aktivität des Promoters bestimmt, wann, wo und wie stark das Reportergen in
diesen genetisch veränderten Pflanzen exprimiert wird. Einfach und preisgünstig ist der
Reportertest mittels des Reportergens für die β-Glucuronidase (abgekürzt GUS),
welches vorwiegend in Pflanzen zur Anwendung kommt. In Bakterien, Hefe und
Säugerzellen ist der Reporter mittels β-Galactosidase geläufiger. Das GUS Gen stammt
ursprünglich aus E. coli. Pflanzen haben in der Regel keine vergleichbare interne GUS
Aktivität. GUS spaltet β-Glucuronide durch Hydrolyse. Im GUS Test werden spezielle
56
käufliche Substrate (β-Glucuronide) gespalten, deren Produkte kolorimetrisch
nachweisbar sind, wie das x-Glucuronid (x-Gluc). Dabei entsteht ein Indoxylderivat, das
nach unspezifischer Oxidation als blauer Farbstoff präzipitiert.
Abb.: GUS Reaktion mit x-Gluc. Der erste Schritt erfolgt spezifisch und wird vom GUS Enzym
katalysiert. Die Zwischenstufe kann in den Zellen diffundieren. Der zweite Schritt erfolgt spontan durch
Oxidation und wird durch Hexacyanoferrat (III) beschleunigt. Es entsteht ein blaues Präzipitat.
2. Verstärkte und konstitutive Expression von Genen in transgenen Pflanzen
(„Überexpression“)
Das Genexpressionsmuster kann künstlich beeinflusst werden, zum Beispiel indem man
ein Gen in allen Zellen oder ständig stark überaktiviert (= konstitutive Genexpression
oder Überexpression). Durch konstitutive oder Überexpression kann ein beliebiges Gen
(pflanzeneigenes oder auch ein fremdes Gen aus einem anderen Organismus) also in
allen Zellen unabhängig von seinem normalen Expressionsmuster aktiviert werden. Mit
Überexpressionsstudien untersucht man zum Beispiel, was passiert, wenn ein Gen nicht
mehr nur in bestimmten Zellen exprimiert wird, sondern auf einmal in allen Zellen. Dies
kann helfen, die Genfunktionen näher zu charakterisieren. Man kann durch konstitutive
Expression auch erreichen, dass Pflanzen fremde Gene aus eigentlich anderen
Organismen ständig aktivieren, zum Beispiel Resistenzfaktoren gegen Pathogene. Um
57
einen Überexpressionseffekt zu erreichen, muß das gewünschte Gen zunächst mit einem
konstitutiven Promoter fusioniert (Klonierung ähnlich wie oben) und in Pflanzen als
Transgen eingeführt werden. In Pflanzen verwendet man im Labor im allgemeinen den
35S Promoter des Blumenkohl Mosaikvirus (Cauliflower Mosaic Virus, CaMV). Der
35S Promoter wurde vor zwanzig Jahren als quasi konstitutiv in fast allen getesteten
dikotyledonen Pflanzen beschrieben. Seither ist der CaMV 35S Promoter in vielen
transgenen Laboransätzen zur Routineüberexpression verwendet worden. In transgenen
Pflanzen, die für kommerzielle Anwendungen in der Landwirtschaft bestimmt sind, wird
der 35S Promoter jedoch nicht verwendet.
Hier werden Ihnen eine nicht-transgene Linie und zwei verschiedene transgene
Arabidopsis Linien vorgestellt. Einmal ist das GUS Gen hinter dem 35S Promoter
exprimiert, das andere Mal hinter einem wurzelspezifischen Promoter. Sie sollen durch
GUS Tests die GUS Färbungen beobachten, bestimmen, wie stark und in welchen
Pflanzenteilen die Promoteren aktiv sind, und die Linien entsprechend des Muster
zuordnen.
CaMV35S
Promoter
Wurzelspezifischer Promoter
GUS
Reportergen
GUS
Reportergen
b) Praktische Durchführung:
Vorbereitung der Lösungen (Berechnung vor dem Praktikum):
Der GUS Aktivitätstest wird in einer GUS Pufferlösung durchgeführt, von der Sie
insgesamt 1 ml benötigen. Die GUS Pufferlösung wird durch Mischung mehrerer
konzentrierter Ausgangslösungen und Verdünnung in wässriger Lösung hergestellt.
Überlegen Sie sich, wozu das gut sein könnte. Berechnen Sie im folgenden, welche
Mengen an Stammlösung und an dest. Wasser Sie zusetzen müssen, damit Sie am Ende
1 ml GUS Pufferlösung haben.
58
Stammlösungen und deren Gewünschte
zu
Konzentrationen
Endkonzentrationen
Volumen für 1 ml GUS
in GUS Pufferlösung
Pufferlösung
1 M Na2HPO4
100 mM Puffer
57 µl
1 M NaH2PO4
pH 7,0
43 µl
100 mM
2 mM
?
2 mM
?
20 % Triton-X (Detergenz)
0,2 %
?
GUS Substrat x-Gluc 100 mM
2 mM
?
K4[Fe(CN)6]
(Fe II)
100 mM
K3[Fe(CN)6]
pipettierendes
(Fe III)
Pflanzenmaterial: mehrere Tage alte Pflanzenkeimlinge auf steriler Platte mit
Pflanzenmedium (sind bereits angezogen):
* p35S-GUS Pflanzen, transgen
* Wurzelpromoter-GUS Pflanzen, transgen
* Wildtyp, nicht transgen
Die drei Linien werden im Kurs als A, B und C bezeichnet und sollen von Ihnen
zugeordnet werden.
ACHTUNG: TRANSGENE PFLANZEN IN AUTOKLAVIERMÜLL ENTSORGEN
!!!!
59
Histochemischer GUS Test
Je 300 µl GUS Lösung werden in drei Eppendorfgefäße gegeben für die drei
Pflanzenlinien A, B, C. Gekeimte Pflanzen werden mit einer Pinzette in die GUS
Lösung gegeben. Die Inkubation erfolgt bei 37 °C im Dunkeln bis Blaufärbung klar zu
erkennen ist.
Anschließend wird die GUS Inkubationslösung mit einer Pasteurpipette entfernt und
durch Wasser ersetzt. Die Keimlinge werden zurück auf die Platte mit Medium gegeben,
ausgebreitet oder in einem Wassertropfen aufbewahrt, um Austrocknen zu verhindern.
Unter dem Binokular werden die Pflanzen untersucht. Die Organe und Gewebe mit
Blaufärbung werden bei größtmöglicher Vergrößerung betrachtet. Die Blaufärbungen
werden in Zeichnungen detailliert festgehalten. Es kann auch photografiert werden.
Auswertung
Die histochemischen GUS Befunde werden aufgezeichnet und verglichen. Welche
Transgene enthalten die Linien A, B und C?
Diskutieren Sie, ob der 35S Promoter konstitutiv in Arabidopsis Keimlingen exprimiert
wird. In welchen Geweben sind die Promotoren aktiv? Weshalb könnte der CaMV einen
konstitutiv in Pflanzen exprimierten Promoter benötigen? Was könnte die Funktion
eines wurzelspezifisch exprimierten Gens sein?
LITERATUR:
Jefferson R.A., Kavanagh T.A., and Bevan M.W.: GUS fusions: beta-glucuronidase as a
sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.- EMBO J. 6, 3901–3907
(1987).
60
Versuch IV
IONENAUFNAHME VON PFLANZEN UND
PUFFERKAPAZITÄT DES BODENS
Zur Thematik des Versuchs siehe:
Campbell, S. 895-904; 919-925; Lüttge et al. S. 372, 373; 467-482; Mengel, S. 183-250;
Nultsch, S. 273-280; Richter, S. 31-62.
Versuch IV/1:
SELEKTIVE IONENAUFNAHME
a) Theoretische Grundlagen:
Zellen können sowohl Ionen als auch ungeladene Moleküle selektiv aus dem
umgebenden Medium aufnehmen. Bei Pflanzen kann die selektive Ionenaufnahme durch
pH-Verschiebungen
im
Nährmedium
verfolgt
werden.
Überwiegt
die
Kationenaufnahme, so werden zum Ladungsausgleich Protonen abgegeben. Das
Medium wird dadurch sauer. Umgekehrt wird bei bevorzugter Anionenaufnahme das
Nährmedium durch die Abgabe von Hydrogencarbonat-Ionen (HCO3-) basisch. Derart
induzierte pH-Veränderungen lassen sich besonders drastisch am Beispiel des
stickstoffhaltigen Ionenpaars NH4+ und NO3- zeigen. Beide Ionen werden von Pflanzen
besonders leicht aufgenommen. Ammoniumernährung wirkt auf das Außenmedium pHerniedrigend, Nitraternährung dagegen pH-erhöhend. Ammoniumsalze [NH4Cl,
(NH4)2SO4] werden deshalb auch als physiologisch saure, Nitrate (z.B. KNO3) als
physiologisch basische Salze bezeichnet. Im vorliegenden Versuch wird eine
Zellsuspension der Grünalge Scenedesmus vacuolatus mit (NH4)2SO4 bzw. mit KNO3
versetzt und etwa 2-3 h inkubiert. Die zu erwartenden Änderungen des pH-Wertes der
ungepufferten Lösungen werden mit einem pH-Meter gemessen.
Grundsätzlich kann selektive Stoffaufnahme die Folge von zwei verschiedenen
Ursachen sein:
a) Das Plasmalemma ist für verschiedene Ionen gleichermaßen durchlässig (Diffusion
oder Permeation). Bis zum Konzentrationsausgleich (außen = innen) werden sie gleich
gut aufgenommen. Für alle Ionen, die im Zellinnern sehr rasch weiterverarbeitet werden
61
(z.B. Stickstoff enthaltende Ionen), bleibt jedoch ein Konzentrationsgradient erhalten.
Nur für diese Ionen beobachtet man eine große Nettoaufnahme, was zum selektiven
Verschwinden eines Ions aus dem Außenmedium führt.
b) Das Plasmalemma ist nur für bestimmte Ionen durchlässig; diese werden mit Hilfe
von Transportproteinen (Translokatoren, Carriern) durch die Biomembran transportiert.
Es werden zwei Formen von spezifischem Transport unterschieden:
1) die katalysierte Diffusion (oder der passive Trägertransport), die wiederum nur zu
einem Konzentrationsausgleich führt: Hier folgt der Ionentransport dem chemischen
bzw. elektrochemischen Potentialgradienten des Substrats.
2) der aktive Transport, der unter Energieverbrauch (ATP) auch gegen einen
Konzentrationsgradienten zu einer Ionenanreicherung im Zellinnern führt (siehe dazu
auch Campbell S. 896-898).
Die selektive Ionenaufnahme bei Scenedesmus erfolgt über den aktiven Transport. Das
hierzu benötigte ATP wird durch Veratmung von Glukose (aus Stärke) gewonnen; sind
die Zellen durch eine vorangegangene Dunkelperiode stärkeverarmt oder -frei, so kann
im Außenmedium angebotene Glukose aufgenommen und veratmet werden. Diese
Zellen können dann im Vergleich zu Zellen ohne Glukoseangebot mehr Ionen
aufnehmen. Wenn die Aufnahmegeschwindigkeit von Ionen durch Zugabe von Glukose
ins Nährmedium erhöht wird, so ist dies ein Hinweis für die Beteiligung von aktivem
Transport bei der selektiven Ionenaufnahme.
pH-Messung:
Die Messung des pH-Wertes erfolgt in der Regel mit Farbindikatoren oder mit einer
Glaselektrode. Mit der Glaselektrode (Einstabmesskette) wird eine Potentialdifferenz
gemessen, die sich zwischen einer Lösung bekannter Wasserstoffionenkonzentration (=
Füllung der Glaselektrode) und der zu messenden Außenlösung einstellt. Die
Ausbildung des Potentials beruht auf einem H+/Na+-Ionenaustauschvorgang zwischen
der gequollenen Schicht eines Spezialglases (Zapfen am unteren Ende der Elektrode;
Glaselektrode stets wässern!) und den beiden angrenzenden Lösungen. Diese
Glaselektrode steht mit einer Vergleichselektrode (gesättigte Kalomelelektrode) in
Verbindung, deren Potential konstant und pH-unabhängig ist. Die zwischen den beiden
Elektroden vorhandene Spannung ist ein Maß für den pH-Wert der Außenlösung und
wird mit einem Voltmeter gemessen. Mit der Glaselektrode kann kein absoluter pH62
Wert bestimmt werden; Das Gerät wird daher vor der Messung mit Eichpuffern
eingestellt.
b) Praktische Durchführung:
1. Eichung des pH-Meters:
Die Eichung des pH-Meters (Eichpuffer pH ~ 7.0 und pH ~ 4.0) und die anschließende
pH-Messung erfolgen nach der am Arbeitsplatz aushängenden Bedienungsanleitung.
Zusätzlich sind folgende Punkte zu beachten:
Die Eichpufferlösungen werden zur besseren Handhabung vor der Eichung in 25 ml
Bechergläser eingefüllt, danach wieder in die Vorratsgefäße zurück gegossen.
Die Glaselektrode (leicht zerbrechlich und teuer!) wird vor jeder Benutzung mit H2O
deion. abgespült und anschließend vorsichtig mit weichem Papiertuch getrocknet. Beim
Eich – und Messvorgang ist darauf zu achten, dass die Elektrode genügend tief in die
Eich- bzw. Messlösung eintaucht. Der pH-Wert wird abgelesen, nachdem sich die
Anzeige stabilisiert hat (kann mehrere Minuten dauern!). Der Vorgang lässt sich durch
leichtes Bewegen des Probegefäßes beschleunigen und stabilisieren. Zwischen den
Messungen ist die Elektrode stets in H2O deion. eingetaucht aufzubewahren.
Die Eichung wird vor dem Praktikum vom Kursleiter/in durchgeführt.
2. Ansetzen der Algensuspension und pH-Messungen:
Die in einem Klimaschrank bei Licht und 27o C angezogenen Algen werden vom
Betreuer/in am Vorabend des Versuchstages dem Klimaschrank entnommen (100 ml
Suspension pro Gruppe) und über Nacht im Kursraum in einem mit Alufolie
verdunkelten Erlenmeyerkolben belüftet auf einen Schüttler gestellt (warum ?). Am
Morgen wird die Algensuspension vom Kursleiter/in 2 min lang bei 600 x g (∼2200
U/min) zentrifugiert. Die zentrifugierten Algen werden in 55 ml H2O
deion.
resuspendiert, in einen 100 ml Erlenmeyerkolben gegeben und mit Alufolie verdunkelt
bis zum Versuchsbeginn belüftet auf den Schüttler gestellt. Anschließend werden 4
Erlenmeyer-Kolben (100 ml) mit folgenden Lösungen beschickt:
1:
4 ml (NH4)2SO4-Lösung
+ 4 ml H2O deion.
2:
4 ml (NH4)2SO4-Lösung
+ 4 ml Glukose-Lösung
3:
4 ml KNO3-Lösung
+ 4 ml H2O deion.
4:
4 ml KNO3-Lösung
+ 4 ml Glukose-Lösung
Die Konzentrationen der Lösungen sind jeweils 2%ig.
63
Anschließend werden nach Schütteln 12 ml der Algen-Vorratssuspension mit einer 10
ml Messpipette in den Erlenmeyer 1 gegeben und davon sofort der Anfangs-pH-Wert
bestimmt (auf 2 Dezimalstellen genau!). Zur pH-Einstellung und -Messung werden die
Proben zwecks besserer Handhabung der pH-Messelektrode in 25 ml-Bechergläser
(beschriftet mit der Nummer der jeweiligen Algensuspension) gegossen. Die pH-WertMessungen werden durch vorsichtiges Schütteln des Becherglases durchgeführt, der
End-pH-Wert muss dabei mindestens 30 sek stabil sein. Unmittelbar nach der ersten pHMessung wird der Erlenmeyerkolben nummeriert und mit Alufolie verdunkelt. Auch die
Alufolie wird außen mit der gleichen Nummer beschriftet. Dann wird er auf einen
Schüttler gestellt und bei Stufe 100/min geschüttelt (Zeitwert Null, Anfangs-pH-Wert).
Falls dieser Wert > 6.3 oder < 5.8 ist, wird er mit 0,01 oder 0.0025 mol/l HCl oder
NaOH auf ~ pH 6.0 eingestellt. Ebenso wird mit Suspension 2 verfahren.
Auch von den Proben 3 und 4 werden gleich nach Zugabe der 12 ml Algensuspension
die pH-Werte bestimmt und durch Zugabe von 3-4 Tropfen 0,01 mol/l HCl auf ~ pH 4,5
eingestellt.
Für jede pH-Messung werden die Suspensionen in die jeweiligen Bechergläser überführt
und danach in den Erlenmeyer-Kolben zurück gegossen. Dieser wird wieder mit der
Alufolie verdunkelt und auf den Schüttler zurückgestellt. In Abständen von 30 min wird
der pH-Wert der Proben dann noch vier-fünfmal gemessen. Der Messvorgang dauert
also mindestens 2 – 2 ½ h!
Vor dem Praktikum:
Erstellen Sie bitte eine Tabelle für die pH-Messergebnisse entsprechend den
Inkubationsbedingungen und in Abhängigkeit von der Zeit.
c) Auswertung:
Die gemessenen Veränderungen der pH-Werte (Ordinate!) sind in Abhängigkeit von der
Zeit (Abszisse!) graphisch darzustellen. In einer kurzen Zusammenfassung sind die
Versuchsergebnisse zu interpretieren.
64
Versuch IV/2:
PUFFERKAPAZITÄT DES BODENS
a) Theoretische Grundlagen:
Der pH-Wert des Bodens beeinflusst die chemischen, physikalischen und biologischen
Bodeneigenschaften und damit das Pflanzenwachstum. Erheblichen Einfluss hat diese
durch Azidität bzw. Basizität bewirkte Bodenreaktion auf die Verfügbarkeit einiger
Nährstoffe. So geht die Verfügbarkeit der meisten Spurenelemente (B, Mn, Co, Zn) mit
zunehmendem pH-Wert zurück. Bei K, Ca und Mg führt dagegen abnehmender pH-Wert
zu einem Mangel an diesen Elementen. Unter den Nährstoffanionen geht das
-
-
pflanzenverfügbare H2PO4 mit steigendem pH-Wert zunehmend in HPO42 und PO43
-
über, die wegen ihrer geringen Löslichkeit weniger (HPO4)2- bzw. nicht (PO4)3verfügbar sind.
Die Ansprüche der Pflanzen an den pH-Wert des Bodens variieren. Hafer und Kartoffel
sind Beispiele für Pflanzen, die schwach saure Böden bevorzugen, während Gerste und
Luzerne auf basischen Böden besser gedeihen. Die meisten unserer Kulturpflanzen
erreichen ihre beste Entwicklung auf ± neutralen Böden (pH 6,5 – 7,5).
Wegen der Wirkungen auf die Nährstoffverfügbarkeit reagieren Pflanzen und
Bodenorganismen sehr empfindlich gegenüber plötzlichen und starken pH-Änderungen.
Die Fähigkeit des Bodens, solche pH-Änderungen abzupuffern, ist daher für die
Pflanzenernährung von großer Wichtigkeit. Unter Pufferung versteht man die Fähigkeit
des Bodens, einer Änderung der Wasserstoffionen- oder Hydroxidionenkonzentration
Widerstand zu leisten. Wässrige Bodenauszüge sind in dieser Hinsicht vergleichbar mit
den aus der Chemie bekannten Pufferlösungen: Versetzt man sie mit Säure oder Lauge,
so ändert sich ihr pH-Wert sehr viel langsamer als der einer ungepufferten Lösung.
Besondere Bedeutung für die Bodenreaktion hat die Pufferung gegen H+-Ionen. Im
Boden werden durch zahlreiche biologische Prozesse Protonen freigesetzt (z.B. auch bei
der Stoffaufnahme durch die Pflanzenwurzel, vgl. Versuch IV/1). Hinzu kommt der
anthropogen bedingte Eintrag saurer Immissionen, zu denen der „saure Regen“ gehört.
Zunehmende Bodenversauerung führt zu verstärkter Nährstoffauswaschung und
Freisetzung toxischer Ionen.
65
Wichtige Puffersysteme im Boden sind die mineralischen und organischen
Bodenkolloide, wozu in erster Linie Tonminerale und Huminsäuren bzw. Humate
zählen. Sie binden ankommende H+- bzw. OH--Ionen im Austausch gegen vorher
sorbierte Kationen bzw. Anionen. Je höher die Austauschkapazität für Ionen ist, desto
höher ist auch die Pufferung der Böden. Weitere Puffersysteme im Boden sind
Gemische schwacher Säuren mit ihren Salzen. Hierzu gehören der Carbonatpuffer sowie
in phosphatreichen Böden zusätzlich der Phosphatpuffer. Fehlen freie Carbonate im
Boden, dann übernehmen die genannten Kolloide die Pufferung.
Im vorliegenden Versuch wird die Pufferkapazität von drei verschiedenen Böden
untersucht. Hierzu werden wässrige Auszüge hergestellt, steigende Mengen an Säure
bzw. Lauge zugegeben und die jeweilige pH-Änderung gemessen. Aus dem Verlauf der
so ermittelten Titrationskurven kann auf die Pufferkapazität, d.h. die Fähigkeit der
Bodensuspension, H+- bzw. OH--Ionen abzufangen, geschlossen werden. Gut gepufferte
Böden zeigen flachen, schlecht gepufferte steilen Kurvenverlauf. Darüber hinaus sind
lineare Kurvenabschnitte ein Zeichen dafür, dass die Pufferkapazität im entsprechenden
pH-Bereich nahezu konstant ist, während Krümmungen oder gar Wendepunkte auf
Änderungen der Pufferkapazität hinweisen. Steilheit und Form der Pufferungskurven
sind abhängig vom Vorhandensein und der Wirkung der verschiedenen Puffersysteme.
Dies im Einzelnen zu analysieren, gelingt allerdings nur in besonderen Fällen und mit
großem Aufwand.
b) Praktische Durchführung:
Je zwei 10 g-Proben von Sandboden, Kalkboden und Komposterde werden in
Bechergläsern mit je 100 ml 0.1 mol/l KCl versetzt und auf einem Magnetrührer zu einer
homogenen Suspension vermischt. Sodann wird eine Glaselektrode eingesetzt (Vorsicht
beim Rühren!) und der Anfangs-pH-Wert bestimmt (hierzu eventuell mehrere Minuten
warten, bis sich der endgültige pH-Wert eingestellt hat!). Der abzulesende pH-Wert
muss mindestens 30 sek stabil sein (Stoppuhr!). Bei laufendem Rührwerk werden den
Bodenauszügen nun aus einer Bürette 10 ml 0,05 mol/l HCl in 2 ml-Portionen
zugegeben. Der neue pH-Wert wird ebenfalls erst dann abgelesen und protokolliert,
wenn er mindestens 30 sek stabil ist. Nach Ablesen dieses Wertes werden die nächsten 2
ml zugegeben u.s.w. Ebenso verfährt man mit der Zugabe der 0.05 mol/l NaOH zur
66
Parallelprobe. Als Kontrolle zu den Bodensuspensionen dienen zwei Ansätze ohne
Boden, nur mit 100 ml 0.1 mol/l KCl, die in der beschriebenen Weise bearbeitet werden.
Vor dem Praktikum: Erstellen Sie zu diesem Versuch eine Ergebnistabelle.
c) Auswertung:
Die gemessenen pH-Änderungen sind gemäß dem Anfangs-pH-Wert und in
Abhängigkeit von zugegebener Menge an HCl bzw. NaOH für die drei Böden graphisch
darzustellen. Eine gute Übersicht ergibt sich, wenn die verschiedenen Titrationskurven,
einschließlich derjenigen für die reinen KCl-Lösungen, zusammen in einem Diagramm
aufgetragen werden (Ordinate: pH-Änderung; Abszisse: Menge HCl bzw. NaOH; 1
Graphik!).
67
Versuch V
TRANSPIRATION UND OSMOTISCHE VORGÄNGE
Zur Thematik des Versuchs siehe:
Campbell, S. 163-181; 895-917; Kutschera, S.33-59; Lüttge et al. S. 67-76; 372-373;
410-418; 448-465; Mengel, S. 218-250; Nultsch, S. 54-60; 259-280; Richter, S. 31-66.
Versuch V/1:
MESSUNG DER SAUGKRAFT VON KARTOFFELPARENCHYM
a) Theoretische Grundlagen:
Die Kraft, mit der eine Pflanzenzelle Wasser aus ihrer Umgebung ansaugt, nennt man
Saugkraft. Eine Pflanzenzelle weist nur so lange eine positive Saugkraft auf, wie der
osmotische Wert des Zellsaftes nicht vollständig durch den Wanddruck kompensiert ist.
Ist letzteres der Fall (z.B. durch längeres Einlegen in Wasser), so wird die Saugkraft =
Null und die Zelle kann kein weiteres Wasser mehr aufnehmen; sie ist dann voll
turgeszent. Andererseits wird die maximale Saugkraft dann erreicht, wenn die Zellwand
vollständig entspannt ist. Die Saugkraft ist also eine aktuelle Größe, die vom jeweiligen
Sättigungszustand der Zelle bzw. des Gewebes und Organs mit Wasser abhängt.
Zur
Messung
der
Saugkraft
lebender
Gewebe
wendet
man
eine
„Kompensationsmethode“ an, d.h. man bestimmt, ob ein Gewebe aus verschiedenen
Lösungen bekannter Saugkraft (bei Lösungen ist die Saugkraft gleich dem osmotischen
Wert) Wasser aufnehmen kann oder Wasser abgibt. Diejenige Lösung, in der Wasser
weder aufgenommen noch abgegeben wird, hat die Saugkraft, die der des Gewebes
entspricht.
Das Saugvermögen pflanzlicher Gewebe wird heute meist als Wasserpotential Ψ (Psi)
oder Ψz bestimmt. Diese thermodynamische Kenngröße ist ein Maß für den
Energieinhalt des Wassers in einem System (Zelle, Gewebe, Boden, Atmosphäre) und
hat die Dimension eines Drucks (bar oder Pascal bzw. Megapascal, 1 MPa = 10 bar).
Das Wasserpotential ΨZ der Zelle ist der negative Wert der Saugkraft: Wasser wird
angesaugt (positiver Wert: Wasser wird ausgepresst). Je niedriger (je stärker negativ)
also das Wasserpotential der Zelle, umso höher (positiver) ihre Saugkraft!
68
Das Wasserpotential stellt analog dem elektrischen Potential die potentielle Energie des
Wassers dar. Die Wasserpotentialdifferenz gibt die Unterschiede in der potentiellen
Energie des Wassers an. Wenn Wasser sich bewegt, kann es Arbeit leisten. Der
Wortbestandteil „Potential“ (lat. potens – kräftig) im Begriff „Wasserpotential“ bezieht
sich auf diese potentielle Energie, also auf die Fähigkeit, Arbeit zu leisten, wenn sich
Wasser von einer Region mit hohem Ψ in eine Region mit niedrigem Ψ bewegt. Bei
reinem Wasser ist die Wasser-„Konzentration“, also die Konzentration der H2OMoleküle hoch, dies entspricht hohem Wasserpotential, bei Wasser in Lösungen ist die
Wasser-„Konzentration“ niedrig, dies entspricht niedrigem Wasserpotential.
Das Potential reinen Wassers in einem der Atmosphäre ausgesetzten offenen Behälter
wird = 0 gesetzt: 0 MPa.
Das Wasserpotential einer Pflanzenzelle setzt sich aus 3 Komponenten zusammen:
Ψπ (in Campbell Ψs) = Potential gelöster Substanzen (= an osmotisch wirksame
Teilchen in der Zellvakuole gebundenes Wasser). Steigt die Konzentration gelöster
Substanzen im Zellsaft, so nimmt die Saugkraft der Zelle zu, gleichzeitig wird ihr
Wasserpotential erniedrigt.
Ψp = Druckpotential oder Turgorpotential (ein hydrostatisches Potential). Es ist ein
Wasserpotential, das durch Druck erzeugt wurde, wie Wasser in einer Pipette, das durch
Druck auf das Gummihütchen herausgespritzt werden kann: erhöht man den Druck, wird
auch Ψp erhöht.
Ψτ = Matrixpotential (= oberflächengebundenes Wasser). Hier handelt es sich um
Wasser, das an Zellwandbestandteile, an Zelloberflächen, an Proteine u.a. gebunden ist.
Die Wasserpotentialgleichung ist nun folgendermaßen zu formulieren:
Das Wasserpotential der Zelle (Ψz) ist gleich dem Potential gelöster Substanzen (Ψπ,
negativer Wert, weil Wasser in Lösungen „weniger verfügbar“ ist, Lösungen „halten ihr
Wasser fest“) plus dem Druck- oder Turgorpotential (Ψp, positiver Wert, hydrostatischer
Druck, er hat die Tendenz, Wasser fortzubewegen), erweitert um ein matrikales
Potential oder Quellungspotential (Ψτ, negativer Wert, da an Oberflächen bzw. an
Quellkörper gebundenes Wasser ebenfalls „weniger verfügbar“ ist).
Wasserpotentialgleichung: Ψz = Ψπ (-) + Ψp (+) + Ψτ (-)
Je stärker erniedrigt, also je stärker negativ das Wasserpotential der Zelle ist, umso
höher (positiver!) ist ihre Saugkraft. Das Wasserpotential einer voll turgeszenten,
wassergesättigten Zelle ist gleich 0.
69
Ob und in welche Richtung Wasser zwischen 2 Lösungen bewegt wird, hängt nicht
davon ab, welche Substanzen in Wasser gelöst sind, sondern nur davon, wie viel gelöste
Substanzen das Wasser enthält, also wie viele Teilchen (Moleküle oder Ionen) in Wasser
gelöst sind.
Eine 1-molare Lösung einer beliebigen Substanz, die nicht dissoziiert ist, hat bei 0 °C
ein Wasserpotential von -22,7 bar oder 2,27 MPa.
Äquimolare Lösungen verschiedener nicht-dissoziierender Substanzen haben demnach
gleiche Ψπ-Werte: Sie sind isotonisch (iso, gr. - gleich; tonos, gr. - Druck).
b) Praktische Durchführung:
Lösungen:
Vor dem Praktikum berechnen:
In einem 100 ml-Messkolben wird eine 0.5 molare Saccharose-Stammlösung angesetzt
(M = 342,30 g/mol). Welche Menge an Saccharose muss eingewogen werden? (Als
Hilfe kann man das u.a. Mischungskreuz oder die Formel V1 = c2 x V2 / c1 benutzen.)
Aus dieser Stammlösung werden die folgenden Konzentrationen durch Verdünnen in 25
ml-Messkolben hergestellt (ml berechnen!):
70
Endkonzentration
ml Stammlösung
ml H2O deion.
(mol/l),
(0,5 M)
-kann auf 25 ml
Endvolumen 25 ml
aufgefüllt werden
0,10 M
-
0,20 M
-
0,25 M
-
0,30 M
-
0,35 M
-
0,40 M
-
Als Hilfe:
V1 =
c2 x V2
c1
oder:
Die jeweils benötigte Menge der Stammlösung wird mit 5- bzw. 10 ml-Messpipetten in
die Messkolben übertragen und diese bis zur Markierung mit H2O deion. aufgefüllt.
Messkolben verschließen und Lösungen gut durchmischen!
Lösungen zur Verwendung in Versuch V/2 aufbewahren.
Versuch:
Vor dem Praktikum: Tabelle für die Gewichtsermittlung der
Kartoffelstücke erstellen.
In 6 Reagenzgläser werden (mit Hilfe einer Vollpipette) je 10 ml folgender
Saccharoselösungen (0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,5 mol/l) pipettiert, in ein siebtes 10 ml
H2O deion. zur Kontrolle.
Aus einer Kartoffel werden ca.130 (s.u.) Zylinder mit 5 mm Durchmesser gestanzt
(Korkbohrer) und in 5 mm lange Abschnitte geschnitten. Diese werden in eine kleine
Petrischale gelegt, die ihrerseits in eine große, mit angefeuchtetem Filterpapier
ausgelegte Schale gestellt wird (feuchte Kammer - Verdunstungsschutz). Zu
Versuchsbeginn werden Kartoffelstückchen entnommen, vorsichtig mit weichen
71
Zellstofftüchern abgetupft und zu 7 Proben à 2 g (~15-20 Stück) abgewogen (das
exakte Gewicht notieren!).
6 Proben werden in die Saccharose-Lösungen, 1 Probe in die Wasserkontrolle gebracht
und während des Versuchs mehrmals durchmischt. Nach 2 h werden die
Kartoffelstückchen herausgenommen, nochmals zwischen Zellstofftüchern vorsichtig
(ohne Druck) abgetupft und erneut gewogen.
c) Auswertung:
In einem Diagramm ist die Differenz der Gewichtszu- bzw. -abnahme der
Kartoffelstückchen (Ordinate) in Abhängigkeit von der Molarität der Zuckerlösungen
(Abszisse) darzustellen. Die Kurve, die durch die Messpunkte gezeichnet wird,
schneidet die Abszisse bei jener Konzentration, bei der keine Gewichtsveränderung
eingetreten wäre, ihre Saugkraft also der des Kartoffelparenchyms entspricht. Die
Saugkraft ist der Sog, mit dem Wasser osmotisch in die Vakuole einströmt! Aus der
beigefügten Tabelle kann anhand der im Versuch ermittelten molaren Konzentration der
entsprechende Druck (in bar) abgelesen werden. Um die Saugkraft als Wasserpotential
zu kennzeichnen, ist der errechnete Druck nur mit negativem Vorzeichen zu versehen.
72
Tabelle zu den Versuchen V/1 und V/2:
Beispiel für die Benutzung der Tabelle:
Der osmotische Druck einer 0,22 molaren Saccharoselsg. entspricht einem osmotischen
Wert von 5,94 bar, bzw. einem Wasserpotential Ψz von -5,94 bar.
73
Versuch V/2:
MESSUNG DES OSMOTISCHEN WERTES DURCH GRENZPLASMOLYSE
a) Theoretische Grundlagen:
Der osmotische Wert einer Lösung hängt von der Zahl der darin gelösten Teilchen ab.
Die Messung des osmotischen Werts ist durch die physikalische Methode der
Kryoskopie (= Messung der Gefrierpunktserniedrigung) möglich; dazu braucht man
jedoch einige ml Zellsaft, die man durch Auspressen von sehr vielen Zellen, also eines
größeren Gewebestücks, gewinnen kann. Will man den osmotischen Wert von wenigen
bestimmten Zellen messen, so bedient man sich der Methode der Grenzplasmolyse, die
auf folgenden Überlegungen beruht:
Die Netto-Saugkraft der Zelle ist gleich 0, wenn keine Wandspannung, kein
Turgordruck mehr vorhanden ist. Dies ist dann sicher der Fall, wenn sich der Protoplast
gerade von der Wand abhebt, also bei Grenzplasmolyse. Legt man Gewebestückchen in
verschieden konzentrierte Lösungen und prüft nach einer genügend langen Zeit, in
welcher der Lösungen gerade Grenzplasmolyse eingetreten ist, dann gilt bei dieser
Konzentration:
Saugkraft der Außenlösung = Saugkraft der Zelle = Osmotischer Wert
Der osmotische Wert des Zellinhalts ist also gleich dem der Außenlösung, Zellinhalt und
Außenlösung sind isotonisch.
Grenzplasmolyse kann man bei Geweben, deren Zellen eine gefärbte Vakuole (z. B.
durch Anthocyane) besitzen, leicht erkennen.
Bei Anwendung des Wasserpotentialkonzepts auf die osmotischen Verhältnisse der
Zelle tritt an die Stelle des osmotischen Werts bzw. des dazu proportionalen potentiellen
osmotischen Drucks das Potential gelöster Teilchen Ψπ. Dessen Wert ist numerisch
gleich demjenigen des osmotischen Drucks, hat aber im Unterschied zu diesem ein
negatives Vorzeichen.
Im Zustand der Grenzplasmolyse wird das Wasserpotential der Zelle ausschließlich
durch das Potential gelöster Teilchen Ψπ und das Matrixpotential Ψτ bestimmt:
Ψz = Ψπ + Ψτ.
74
Die mit dem Wasseraustritt verbundene Volumenabnahme führt zunächst zu einer
Entspannung der gedehnten Zellwand (ΨP = 0). Ist diese ganz entspannt, dann löst sich
der Protoplast bei weiterer Vakuolenverkleinerung von der Zellwand ab. Dieser
Vorgang wird als „Plasmolyse“ bezeichnet. Den Zustand, in dem der Protoplast gerade
beginnt, sich von der Zellwand abzuheben, bezeichnet man als „Grenzplasmolyse“.
Hypertonische Außenlösung:
Ψπ (Außenlösung) < Ψπ (Zellsaft) → Plasmolyse
Hypotonische Außenlösung:
Ψπ (Außenlösung) > Ψπ (Zellsaft) → Deplasmolyse
Wird das hypertonische Außenmedium durch ein hypotonisches ersetzt, dann nehmen
Protoplast und Vakuole wieder osmotisch Wasser auf, die Plasmolyse wird rückgängig
gemacht: Deplasmolyse.
Plasmolysierbar sind nur lebende Zellen, da nur sie selektiv permeable Membranen
besitzen. Die Plasmolysierbarkeit ist deshalb ein Test für die Lebensfähigkeit einer
Zelle.
Mit Hilfe der Plasmolyse kann das Potential Ψπ des Zellsaftes bestimmt werden. Dazu
ermittelt man die Außenlösungskonzentration, die gerade noch bei 50% der Zellen des
untersuchten Gewebes Grenzplasmolyse herbeiführt.
b) Praktische Durchführung:
Vor
dem
Praktikum:
Tabelle
für
die
Anzahl
der
plasmolysierten Zellen vorbereiten.
Versuchspflanze: Rhoeo discolor, Commelinaceae
In 8 kleine Petrischalen werden je 5 ml Saccharoselösungen der Konzentrationen 0,1;
0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,5 mol/l (Herstellung der Lösungen siehe Versuch V/1) bzw.
5 ml H2O deion. (Kontrolle) gefüllt. Von der Blattunterseite (nicht Blattrippe!) von
Rhoeo discolor werden mit einer scharfen Rasierklinge Flächenschnitte mit mindestens
50 intakten Epidermiszellen angefertigt (bei Kontrolle unter dem Mikroskop daran
erkennbar, dass die Vakuolen noch durch Anthocyane gefärbt, also unverletzt sind). Zu
Versuchsbeginn werden jeweils 5 geeignete Schnitte mittels einer Pinzette mit der
Schnittfläche nach unten in die verschiedenen Lösungen gelegt; (beginnend mit der
75
niedrigsten Konzentration; jeweils in 10 minütigen Abständen). Die Petrischalen werden
verschlossen und der Zeitpunkt protokolliert!
Nach 30 min werden die Schnitte, wiederum mit der Schnittfläche nach unten, in einem
Tropfen der jeweiligen Saccharoselösung bzw. die 8. Probe in H2O deion. zwischen
Objektträger und Deckglas gebracht. Unter dem Mikroskop wird durch Auszählen von
jeweils 50 Zellen ermittelt, wie hoch der Prozentsatz der plasmolysierten Zellen ist. Am
Schnittrand liegende Zellen dürfen nicht mitgezählt werden, da sie durch den Wundreiz
pathologisch beeinflusst sind.
c) Auswertung:
Der Prozentsatz plasmolysierter Zellen (Ordinate) wird in ein Diagramm gegen die
Konzentration der Rohrzuckerlösungen (Abszisse) aufgetragen. Der Schnittpunkt der
Kurve mit der 50%-Linie stellt den gesuchten Grenzplasmolysewert dar. Er entspricht
dem durchschnittlichen osmotischen Wert der Zellen. Anhand der beigefügten Tabelle
(siehe Versuch V/1) kann die ermittelte molare Konzentration in den zugehörigen
osmotischen Druck und in das entsprechende Potential gelöster Teilchen Ψπ
(Vorzeichen beachten), beide mit der Einheit bar, umgerechnet werden.
76
Versuch V/3:
NACHWEIS DER WASSERDAMPFABGABE DURCH SPALTÖFFNUNGEN
Theoretische Grundlagen der stomatären Transpiration:
Wasserdampfabgabe und Gasaustausch sind durch die Spaltöffnungen aktiv regulierbar.
a
b
Abb.9:
Geöffnete
bzw.
geschlossene
Spaltöffnung; schematisch; Querschnitt (a)
bzw. Aufsicht (b)
(nach HESS: „Pflanzenphysiologie“, 10.
Auflage)
Die Funktion der Spaltöffnungen ergibt sich durch den Aufbau der Schließzellen. Mit
steigendem Turgor werden die Rückenwand und ein kleiner Teil der Vorderwand als
einzige nicht verdickte Wandbereiche der Schließzelle gedehnt. Da die dem Spalt
zugekehrten Wände wegen ihrer Verdickungsleisten der Dehnung nicht folgen können,
krümmen sich die Schließzellen nach ihrer Rückenseite und es öffnet sich ein Spalt.
Umgekehrt führt eine Turgorabnahme zu einer Entspannung der Rückenwände und
somit zur Entkrümmung der Schließzellen, folglich zum Spaltenschluss.
Die Verteilung der Stomata hängt von den jeweiligen Blatttypen ab. Vorwiegend
befinden sie sich in der Epidermis der Blattunterseite (hypostomatisch), weniger häufig
in der Epidermis beider Blattseiten (amphistomatisch), bei Schwimmblättern nur auf
der Blattoberseite (epistomatisch).
Die Anzahl der Spaltöffnungen kann zwischen 100 und 1000/mm2 Blattfläche betragen.
Dadurch erreicht die stomatäre Transpiration Werte von 80-90% der Evaporation.
Mit folgendem Versuch kann die stomatäre Transpiration auf einfache Weise
veranschaulicht werden. Er basiert auf einer einfachen Farbreaktion eines Indikators, in
diesem Fall Kobaltchlorid (CoCl2), der sich bei zunehmender Feuchtigkeit von blau
nach rosa verfärbt.
77
Reaktionsgleichung:
Co2++ 6 H2O
trocken
blau
Co[(H2O)6]2+
feucht
rosa
Pflanzenmaterial:
a) hypostomatische Blätter von
Prunus laurocerasus, Rosaceae, Kirschlorbeer; oder
Parthenocissus tricuspidata, Vitaceae, Wilder Wein
b) amphistomatische Blätter von
Bergenia crassifolia bzw. B. stracheyi, Saxifragaceae, Bergenie
Sonstige Materialien und Geräte:
2 Glasplättchen ~50x50 mm mit aufgeklebten Dichtungsringen (∅ 40 mm), (siehe
Abb.), 2 Klammern, Schere, Präparierbesteck, Trockenschrank, Mikroskop
Chemikalien:
Kobaltpapier (Herstellung: runde Scheibchen ∅ 40 mm aus Filterpapier ausschneiden, in
Kobaltchloridlösung (CoCl2, 5%ig), legen und anschließend bei 90 °C im
Trockenschrank trocknen, bis sie tiefblau geworden sind; trocken aufbewahren).
Durchführung:
Die Kobaltpapierscheibchen werden in Dichtungsringen, bedeckt mit Glasplättchen, auf
der Blattober- und -unterseite befestigt; (siehe Abb.). Mit Hilfe von Klammern werden
sie soweit zusammengedrückt, dass die Kobaltpapierscheibchen ohne Quetschen der
Blätter luftdicht eingeschlossen sind.
Nach 20 min -1 h (je nach Temperatur und Sonnenlicht) kann man eine Rosafärbung des
Kobaltpapiers bei Prunus laurocerasus bzw. bei Parthenocissus tricuspidata auf der
Blattunterseite beobachten, während das Papier auf der Blattoberseite zum gleichen
Zeitpunkt noch deutlich blau ist. Dagegen färbt sich das Kobaltpapier bei Bergenia
sowohl auf der Blattunterseite als auch auf der Blattoberseite rosa.
Zur Veranschaulichung werden von beiden Blatttypen jeweils Flächenschnitte von der
Blattober- und der Blattunterseite angefertigt und im Mikroskop betrachtet. Die
78
Beobachtungen werden im Protokoll notiert, von diesen 4 Schnitten eine schematische
Skizze angefertigt und dem Protokoll (sowie später dem Bericht) beigelegt.
Versuchsaufbau:
Stativklemme mit Muffe
Blatt
Stativ
Gefäß mit Wasser
Seitenansicht
Aufsicht:
Kobaltpapier
Dichtungsring
Glasplättchen
Klammer
Blatt
Abb. 10: Aufbau zu Versuch V/3
79
Versuch V/4:
MESSUNG DER TRANSPIRATION IM POTOMETER
a) Theoretische Grundlagen:
Ein feuchter Körper gibt infolge der Saugkraft der Luft ΨLuft < Ψfeuchter
Körper
Wasserdampf an die Umgebung ab. Das Gleiche gilt für Pflanzen, aus deren
wasserdampfgesättigten Interzellularen Wasserdampf in die umgebende, nicht
dampfgesättigte
Luft
diffundiert.
Diese
als
Transpiration
bezeichnete
Wasserdampfabgabe der Pflanzen wird der Evaporation, d.h. der Wasserdampfabgabe
einer freien Wasserfläche, gegenübergestellt. Bei gleicher Verdunstungsfläche kann die
Transpiration bis zu 80-90% der Evaporation erreichen. Die Höhe der pflanzlichen
Transpiration wird bestimmt durch eine physikalische Komponente, bei der die
Wasserabgabe
nach
den
gleichen
Gesetzmäßigkeiten
erfolgt
wie
die
eines
physikalischen Systems, und durch eine physiologische Komponente, die dem
physikalischen Teil der Transpiration überlagert ist.
Die physikalische Komponente kann mit einfachen Mitteln an Modellversuchen
untersucht werden (Gipspilz). Für sie sind alle Faktoren von Bedeutung, die das
Sättigungsdefizit Pflanze-Luft bestimmen: der Wasserdampfgehalt der Atmosphäre, die
Temperatur der umgebenden Luft, die Temperatur des Wasser abgebenden Körpers,
Sonneneinstrahlung, welche die Temperatur beider ändert, und nicht zuletzt die
herrschenden Windgeschwindigkeiten, die die Transpiration durch das Wegblasen der
Dampfhauben von den untersuchten Organen beschleunigen. Zur Bestimmung der
physiologischen Komponente bedarf es der Untersuchung der Pflanzen unter
verschiedenen äußeren Bedingungen und physiologischen Zuständen. Hier ist besonders
das Verhalten der Stomata auf Licht, Wassergehalt und Temperatur der Umgebung, die
Saugkraft sowie Bau und Alter der Pflanzen von Bedeutung. Die Wasseraufnahme der
Pflanzen, die u. a. von der Temperatur des Bodens abhängig ist, reguliert indirekt
ebenfalls die Wasserabgabe.
Die insgesamt messbare Transpiration setzt sich aus zwei Anteilen zusammen, der
cuticulären Transpiration durch Epidermis, Haare und deren Cuticula und der
stomatären Transpiration mit Hilfe der Spaltöffnungen. Erstere hängt in ihrer Höhe
weitgehend von der Ausbildung der Epidermis und der Cuticula ab (Wanddicke,
Cutineinlagerung, cutinisierte Schicht, Behaarung, Wachsschicht) und ist somit nur von
den unterschiedlichen äußeren physikalischen Bedingungen abhängig. Die stomatäre
80
Transpiration ist dagegen von der Pflanze durch Öffnen und Schließen der
Spaltöffnungen regulierbar; sie macht bei den meisten einheimischen Pflanzen bis ca.
80-90% der Gesamttranspiration aus (siehe auch Versuch V/3).
Die Transpiration ist für die Pflanze lebensnotwenig, da sie die treibende Kraft des
Wasserstroms ist, der von der Wurzel bis in die höchsten Teile der Pflanze im Xylem
der Leitbündel über weite Strecken der Schwerkraft entgegenläuft und für die Verteilung
der in der Wurzel aufgenommenen Mineralsalze in den oberirdischen Pflanzenteilen
sorgt. Ausschlaggebend für den Antrieb dieses auch als „Transpirationsstrom“
bezeichneten Wassertransports ist die saugende Wirkung der Transpiration der
oberirdischen Pflanzenteile, insbesondere der Blätter. Von hier aus pflanzt sich der
Transpirationssog über die Leitbahnen des Xylems bis in die Wurzel, wahrscheinlich
sogar bis zur Wurzeloberfläche fort, wobei das Abreißen der in den kapillaren Gefäßen
nach oben wandernden Wasserfäden infolge der starken Kohäsionskräfte zwischen den
Wassermolekülen sowie durch die Adhäsion des Wassers an die Gefäßwände verhindert
wird
(Kohäsionstheorie
der
Wasserleitung).
Zur
Bewerkstelligung
des
Transpirationsstroms muss die Pflanze keine eigene Energie aufwenden. Sie nutzt hierzu
die Wasserpotentialdifferenz zwischen Boden und Atmosphäre aus. Funktionell steht die
Pflanze zwischen dem fast wassergesättigten Bodenraum (hohes Wasserpotential) und
dem nicht wasserdampfgesättigten Luftraum (niedriges Wasserpotential).
Das Wasserpotential der Pflanze liegt in Bereichen von -10 bis -30 bar, das der
Atmosphäre um -940 bar bei 50% rel. Luftfeuchte, das hohe Wasserpotential des Bodens
zwischen 0 und -1 bar. Bemerkenswert ist weiterhin, dass das Wasserpotential innerhalb
der Pflanze von den Wurzeln bis zu den Blättern von -2 bis -4 bar auf -5 bis -25 bar
absinkt, wobei die Werte in der Tracheenflüssigkeit der Sprossachse von Angiospermen
zwischen -5 und -15 bar liegen.
Die Messung der Transpiration erfolgt entweder durch Bestimmung der Wasserabgabe
mit Hilfe einer Wägung oder, wie im vorliegenden Versuch, durch Messung der
Wasseraufnahme mit Hilfe eines Potometers. Im letzteren Fall wird die am Potometer
volumetrisch gemessene Wasseraufnahme gleich der Wasserdampfabgabe durch
Transpiration gesetzt. Erlaubt ist dieses Vorgehen, weil sich bei Wasserbilanzmessungen
gezeigt hat, dass die Werte für Wasseraufnahme und -abgabe im Allgemeinen gleich
sind.
81
b) Praktische Durchführung:
Vor dem Praktikum: Tabelle vorbereiten zur Messung des
Meniskusstandes in Abhängigkeit von der Zeit
Das Potometer (lat. potare – trinken, gr. métron – das Maß, Gerät zur Messung der
Wasseraufnahme von Pflanzen) wird mit abgestandenem Leitungswasser bis zum
Gefäßrand so gefüllt, dass auch die seitliche Kapillare luftblasenfrei ist. Der zu
verwendende Kirschlorbeerzweig (Prunus laurocerasus) wird einige Stunden vor
Versuchsbeginn abgeschnitten und am Arbeitsplatz in Leitungswasser gestellt. Etwa 1
Stunde vor Versuchsbeginn wird der Zweig unter Wasser noch einmal gekürzt und dann
mit Hilfe eines durchbohrten Gummistopfens im Potometer luftdicht und luftblasenfrei
befestigt (gegebenenfalls mit Vakuumfett abdichten). Der Stand des Wassermeniskus in
der Kapillare wird markiert und sein Rückgang unter verschiedenen Bedingungen
jeweils 40 min lang im 10-Minuten-Abstand an der Millimeter-Skala abgelesen.
Bedingungen: ruhende Luft und Wind, der mit einem Ventilator erzeugt wird. Aus der
gemessenen Wegstrecke des Wassermeniskus lässt sich mit Hilfe des Eichwertes der
Kapillare die von der Pflanze jeweils aufgenommene Wassermenge (in µl angeben)
errechnen.
Gleichzeitig werden relative Luftfeuchtigkeit und Temperatur (Thermohygrometer)
sowie die Windgeschwindigkeit (Schalenkreuz-Windmesser) gemessen und notiert.
c) Auswertung:
In einem Diagramm soll die Wasseraufnahme (in µl, als Maß für die transpirierte
Wassermenge; Ordinate) für ruhende Luft und Wind gegen die Zeit (in min; Abszisse)
auftragen werden.
82
Teilversuch:
Wie schnell der Wassertransport (Transpirationsstrom) in den Blattadern erfolgen kann,
lässt sich durch folgenden einfachen Versuch ermitteln:
Versuchspflanzen:
Weiß blühende Pflanzen, z.B. im Frühjahr Stiefmütterchen (Viola tricolor),
Hornveilchen (Viola spec.) oder Buschwindröschen (Anemone nemorosa); im Herbst
Japan-Anemone (Anemone japonica) oder eine andere Art, die im Zeitraum der
Versuchsdurchführung gerade blüht.
Durchführung:
Eine Blüte mit Blütenstiel wird frisch gekürzt, die Länge des Blütenstiels vermessen und
notiert und dann in ein Gefäß mit 10%iger saurer Fuchsin-Lösung gestellt.
Nach einiger Zeit färben sich vom Blütenstiel her die Adern der Blütenkron- bzw.
Perigonblätter rot. Die Geschwindigkeit des Farbstofftransports soll im Blütenstiel und
im Kron- bzw. Perigonblatt ermittelt und in Meter pro Stunde angegeben werden.
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