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PP071JAA

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COMPANY CONFIDENTAL. THIS DOCUMENT IS

THE PROPERTY OF BECTON, DICKINSON AND

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COMPANY WITHOUT WRITTEN PERMISSION

Category and Description

Package Insert,

BACTEC PZA Test Medium Culture Vials

Becton, Dickinson and Company

7 Loveton Circle

Sparks, MD 21152 USA

Sheet: 1 of 25

Scale: 1:1

A

%

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Français : pages

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BACTEC

™

PZA Test Medium

Culture Vials

Middlebrook 7H12 Medium pH 6.0

1 – 4

5 – 8

8 – 12

Italiano: pagine 12 – 15

Português: páginas 15 – 19

Español: páginas 19 – 22

8 PP071JAA

2010/07

INTENDED USE

BACTEC ™ PZA Test Medium (Middlebrook 7H12 Broth, pH 6.0) is specially developed to perform susceptibility testing with

Mycobacterium tuberculosis against pyrazinamide (PZA). Principal use is with the BACTEC ™ 460TB instrument.

SUMMARY AND EXPLANATION

The BACTEC Radiometric Technique is used for antimicrobial susceptibility testing of primary anti-mycobacterial drugs

(streptomycin, isoniazid, rifampin, and ethambutol).

1-4 In this technique, 14 CO

2 produced by mycobacteria from the metabolism of the 14 C-labeled substrate present in BACTEC 12B Medium is quantitatively measured. If an antimicrobial is added to the medium, mycobacterial isolates which are susceptible to the antimicrobial are inhibited and the amount of

14 CO

2 generated is reduced.

Butler and co-workers 5 proposed an improved conventional method for susceptibility testing of PZA that required a special

7H10 Agar Medium at pH 5.5. A limitation of this method is that at a pH of 5.5, many isolates of M. tuberculosis either fail to grow or grow poorly.

BACTEC 12B Medium cannot be used for susceptibility testing of PZA since this drug is active only at lower pH values.

5

Heifets et al. suggested a radiometric method for testing PZA susceptibility by using BACTEC 12B Medium at pH 5.5. This method required lowering the pH of each individual bottle from 6.8 to 5.5 once the growth was initiated in the vial.

6 At pH 5.5 several isolates failed to grow in 12B Medium although overall results obtained in 12B pH 5.5 were better than those obtained by using 7H10 pH 5.5. Later, addition of egg yolk was suggested to improve growth of mycobacteria.

7 This resulted in more reportable results but the addition of fresh egg-yolk was found to be cumbersome and not practical for a routine clinical laboratory. Salfinger and Heifets, after further studies, reported that the MIC of PZA increased with an increase in pH of medium from 5.5 to 6.8.

8 Using a modification of the above published radiometric susceptibility procedures, Salfinger et al. recommended the use of BACTEC 12B Medium at pH 5.9 to 6.0 (BACTEC PZA Test Medium) with a concentration of PZA higher than that used in the conventional solid medium (pH 5.5).

9

PRINCIPLES OF THE PROCEDURE

BACTEC PZA Test Medium is a modified 7H12 Medium with a reduced pH of 6.0. At this pH, PZA activity against mycobacteria can be determined without inhibiting the growth of most M. tuberculosis isolates. To compensate for the increase in the pH, a higher concentration of PZA (100 µg/mL) is used in the BACTEC test as compared to the conventional test (25 – 50 µg/mL).

The PZA Test Medium contains a 14 C-labeled substrate. When mycobacteria grow in this medium they metabolize the labeled substrate and 14 CO

2 is released into the atmosphere above the medium inside the sealed vial. The BACTEC 460TB instrument tests for the presence of 14 CO

2 by removing the gas from the vial and transferring it to an electrometer where the amount of ionization is converted to a number called a Growth Index (GI).

The rate and amount of 14 CO

2 produced in the medium is directly proportional to the rate and amount of growth in the medium. When the anti-mycobacterial drug PZA is added to the medium, growth of susceptible mycobacteria is inhibited.

This is indicated by the reduction of 14 CO

2 production as compared to an increasing trend in the control. If the organisms are resistant, little or no suppression of growth occurs in the test vial.

REAGENTS

Contents* per vial (4 mL) PZA Test Medium (Final pH 6.0 ± 0.2):

7H9 Broth ............................................................. 0.47% w/v

Casein Hydrolysate .............................................. 0.10% w/v

Bovine Serum Albumin ........................................ 0.50% w/v

Catalase ............................................................. 192 units

14 C substrate ......................................................... 4 µCi

Deionized water (mL)........................................... 4 q.s.

*Supplemented as required to achieve performance criteria.

Warnings and Precautions:

For in vitro Diagnostic Use.

This product contains dry natural rubber.

Pathogenic microorganisms, including hepatitis viruses and Human Immunodeficiency Virus, may be present in clinical specimens. “Standard Precautions” 10-13 and institutional guidelines should be followed in handling all items contaminated with blood and other body fluids.

Procedures should be performed in a suitable safety cabinet and properly ventilated area. Inoculated vials must be tested on a BACTEC 460TB instrument equipped with a BACTEC 460TB hood which provides HEPA filtered air and negative pressure in the instrument test area.

Prior to use, each vial should be examined for evidence of damage, deterioration, or contamination such as cloudiness, bulging or depressed septum. DO NOT USE any vial showing evidence of contamination. A contaminated vial could contain positive pressure. Vial contamination may not be readily apparent. Vials that exhibit evidence of damage should be discarded prior to inoculation. On rare occasions, the glass bottle may be cracked and the neck may break during removal of the flip-off cap or in handling. Also, on rare occasions a vial may not be sealed sufficiently. In both cases, the contents of the vials may leak or spill especially if the vial is inverted. If the vial has been inoculated, treat the leak or spill with caution, as pathogenic organisms/agents may be present. Before discarding, sterilize all inoculated vials by autoclaving.

To minimize the potential of leakage during inoculation of specimen into culture vials, use syringes with permanently attached needles or Luer-Lok ™ Brand Tips.

Contamination

Care must be taken to prevent contamination of the sample during collection and inoculation into the BACTEC vial.

A contaminated sample will give a positive reading but will not indicate a relevant clinical result. Such contamination may result from improper maintenance of BACTEC needles and tubing, poor septum cleansing or malfunction of the BACTEC needle heating unit (see Instrument Operation and Maintenance Manual). Such a determination must be made by the user based on such factors as type of organism recovered, occurrence of the same organism in multiple cultures, patient history, appropriate equipment checks, etc.

Storage Instructions

BACTEC PZA Test Medium vials should be stored in a cool (2 – 25°C), dry place. Write the “Use By” date on the outside of each package and use the oldest stock first.

It is good practice to segregate radioactive material by storage in a cabinet accessible only to authorized personnel. The cabinet should be labeled with the words “Caution: Radioactive Materials.”

Do not expose the medium to direct bright light. Always initially test each vial on the BACTEC 460TB instrument to establish 5 – 10% CO

2 atmosphere in the vial and to screen out vials with high background readings. If a vial reads GI 20 or more on initial screening, discard it.

SPECIMEN PREPARATION

Isolated pure cultures of M. tuberculosis should be freshly grown in BACTEC 12B Medium and should be used for this test when they are in an active growth phase. Do not use old, refrigerated cultures or cultures which have shown peak GI readings for more than one day.

PROCEDURE

Materials Provided

BACTEC PZA Test Medium

Materials Required But Not Provided

BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 tests)

BACTEC 12B Medium

BACTEC 460TB instrument

Tuberculin syringe with permanently attached needle

}

See “Availability”

5 mL syringe

Disinfectant solution

70% Isopropyl alcohol

Preparation of the Drug Medium a. Lyophilized PZA drug is provided separately along with a special PZA Reconstituting Fluid (RF).

b. Clean the top of the vial with an alcohol swab. Aseptically add 5 mL of RF with a syringe into the lyophilized PZA vial. Mix well. When completely dissolved, this will yield a stock solution of 4000 µg PZA/mL.

c.

Prior to inoculation, after cleaning the top of the vial with an alcohol swab, add 0.1 mL of the stock PZA solution into each PZA medium vial using a 1 mL syringe. The resultant PZA concentration is 100 µg PZA/mL of medium.

Precautions: Do not prepare PZA with water or any diluent other than RF. The volume of RF in the vial may vary.

Measure exactly 5 mL from the supplied vial when reconstituting the PZA powder. Addition of the correct amount of the test drug into the medium is critical to the performance of the susceptibility test. Add exactly 0.1 mL of stock solution using a 1 mL tuberculin syringe.

Preparation of the Control

A PZA Test Medium without any drug is used as a control. Add 0.1 mL of RF into the control vial before inoculation of the culture. RF contains a growth promoting substance, polyoxyethylene stearate (POES). It is necessary to have RF in all inoculated vials.

2

Preparation of Inoculum

Only actively growing cultures should be used for setting up this test. Do not use overgrown, stored cultures or cultures grown in other media.

a. The test culture should be subcultured into a BACTEC 12B Medium vial (Catalog No. 442004) supplemented with

0.1 mL RF per vial.

b. Incubate at 37°C ± 1°C and test the vial daily on the BACTEC 460TB instrument.

c.

Once the daily GI reaches 300 – 499, use this vial for inoculation of the susceptibility test.

d. If the GI is higher than 300 – 499, add fresh 12B Medium to the initial growth vial according to the table shown below. If diluted, record the dilution used for future reference.

GI

GI

GI

GI

300 – 499: No dilution

500 – 599: Add 1.0 mL of 12B Medium



GI

GI



Mix thoroughly before use. Avoid vials reading 999 which have passed the peak GI.

Inoculation of the Test a. Clean the tops of all culture vials with a 70% alcohol swab prior to inserting a syringe.

b. Mix the test culture in 12B Medium thoroughly using a 1.0 mL tuberculin syringe with a permanently attached needle.

c.

Add 0.1 mL of this inoculum into the control vial and the PZA vial. DO NOT DILUTE THE CULTURE FOR THE

CONTROL as recommended for other drugs (e.g. isoniazid, streptomycin, ethambutol, rifampin, etc.).

d. Disinfect the top of the rubber septum with a proper disinfectant and then clean with a 70% alcohol swab.

NOTE: Caution should be exercised in handling vials while performing test. The vial septums may be contaminated with culture organisms.

Incubation and Testing a.

All the inoculated vials (including control vials) should be tested on the BACTEC 460TB instrument before incubation to ensure a 5% CO

2 atmosphere. If this was not done earlier, the vials may be tested immediately following the inoculation.

b. Incubate the vials at 37°C ± 1°C.

c.

Test the PZA and control vials daily on the BACTEC 460TB instrument until the GI of the control vial reaches 200 or more.

Quality Control

DO NOT use vials past their expiration date.

Do not use vials that exhibit any cracks or defects. Discard vials in the appropriate manner.

For information on quality control for the BACTEC 460TB instrument, refer to the Operation and Maintenance Manual for the BACTEC 460TB and 460.

Like any other drug susceptibility test, the quality of the inoculum is very critical. Use only actively growing cultures in 12B

Medium with appropriate dilution.

Under ideal circumstances, the control should read GI ≥ 200 within 4 to 7 days. If a GI of 200 is achieved in the control in less than 4 days, it indicates that the inoculum was too heavy. Unless the results are clear cut, the test should be repeated.

If a GI of 200 is achieved in the control in more than 7 – 10 days, it indicates poor quality of inoculum (i.e., low viability, low initial GI reading of the inoculum or poor dilution) and the results may be erroneous. The GI in the control and the drug vials should be followed carefully until clear cut results are achieved. When in doubt, repeat the test. If the GI in the drug vial is very close to 10% of that in the control, test the vials for an additional 1 – 3 days. This will help in making a judgment on the susceptibility pattern of the test culture. If the results are not interpretable, repeat the test with an isolate grown in fresh BACTEC 12B Medium (Catalog No. 442004). Always use H37Rv (ATCC ™ 27294) as a susceptible control and H37Rv PZA-R (ATCC 35828) as a resistant control.

Quality control requirements must be performed in accordance with applicable local, state and/or federal regulation or accreditation requirements and your laboratory’s standard Quality Control procedures. It is recommended that the user refer to pertinent NCCLS guidance and CLIA regulations for appropriate Quality Control practices.

INTERPRETATION OF RESULTS

The instrument reads out directly on a Growth Index scale of 0 – 999. The Growth Index is actually a measure of metabolic activity of organisms in the medium. When the GI of the control vial reaches 200 or more interpret the results as follows:

GI in the drug vial is < 9% of GI in the control vial

GI in the drug vial is > 11% of GI in the control vial

GI in the drug vial is between 9% and 11% (inclusive) of GI in the control vial

= Susceptible

= Resistant

= Borderline

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

The Growth Index number reflects the rate and amount of growth occurring in the medium but cannot be used to quantify colony forming units per mL. Colonial morphology and pigmentation characteristics can only be determined on solid media. The approximate 10% cut off could be used as an approximate estimate of resistance or susceptibility based on the GI output. The BACTEC PZA susceptibility test is recommended only for M. tuberculosis complex isolates. The usefulness of PZA or the susceptibility testing method for mycobacteria other than tuberculosis (MOTT) is not known.

EXPECTED VALUES

There should be a gradual increase in the GI of the control vial. In the test vial, the GI may remain the same, or may increase or decrease depending upon the susceptibility of the test organisms (see example 1 and 2).

3

Usually, BACTEC results will be obtained in 4 to 7 days. Occasionally, slow growing cultures may take longer. Do not interpret results in less than 4 days or more than 21 days.

Example #1: PZA Susceptibility

Daily GI Readings

Control

Drug

1 2 3 4 5

9 31 74 195 475

6 9 9 9 4

GI Drug

GI Control %

< 9%

4 x 100 = 0.8% Susceptible

475

Results:

Example #2: PZA Resistance Daily GI Readings

Daily GI Readings

Control

Drug

1 2 3

7 28 41

17 29 40

4 5 6 7

70 120 177 282

68 92 157 244

GI Drug

GI Control %

> 11%

244 x 100 = 86.5% Resistant

282

Results:

PERFORMANCE CHARACTERISTICS

Based on a modified 7H12 medium at pH 6.0, the radiometric BACTEC 460TB technique is, to date, the only culture-based method for PZA susceptibility testing which is recommended by the National Committee for Clinical Laboratory

Standards.

14,15

In a study by Pfyffer et al., testing of susceptibility of M. tuberculosis to PZA resulted in an agreement of greater than

96%, when comparing the BACTEC 460TB PZA Medium and Drug and the BACTEC MGIT 960 PZA Medium and Drug. The mean turnaround time for the BACTEC 460TB PZA test was 5.4 days, not including the time required to obtain a radiometric subculture with a growth index (GI) of 200.

14

Availability

Cat. No.

442139

442143

442004

445203

Description

BACTEC PZA Test Medium Culture Vials, 4 mL, ctn. of 10



BACTEC 460TB Instrument

REFERENCES

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tuberculosis, Mycobacteria bovis, and other mycobacteria.“ J. Clin. Microbiol., 21:565-568.

2.

Middlebrook, G. et al. 1977 “Automatable radiometric detection of growth of Mycobacterium tuberculosis in selective media.“ Amer. Rev. Resp. Dis. 115:1066-1069.

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tuberculosis.” J. Clin. Microbiol. 13:908-912.

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Woodley, C.L. and R. W. Smithwick, 1988. “Radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of

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Salfinger, M. et al. 1989. “Rapid radiometric method for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium

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13.

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14.

Pfyffer, G.E., F. Palicova and S. Rüsch-Gerdes. 2002. Testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide with the nonradiometric BACTEC MGIT 960 System. J. Clin. Microbiol. 40:1670-1674.

15.

National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Tentative standard M24-T2. Susceptibility testing of mycobacteria, nocardia and other aerobic actinomycetes, 2nd ed. NCCLS, Wayne, PA.

4

0

BACTEC PZA Test Medium

Culture Vials


Français

APPLICATION

Le BACTEC PZA Test Medium [milieu de test BACTEC PZA] (milieu Middlebrook 7H12 pH 6,0) est spécialement conçu pour réaliser le test de sensibilité du Mycobacterium tuberculosis à la pyrazinamide (PZA). Ce milieu s’utilise principalement avec le BACTEC 460TB Instrument (instrument BACTEC 460TB).

RESUME ET EXPLICATION

La technique radiométrique BACTEC s’utilise pour réaliser les tests de sensibilité aux agents antimycobactériens primaires

(streptomycine, isoniazide, rifampine, et éthambutol).

1-4 Dans cette technique, le 14 CO

2 produit par les mycobactéries après métabolisme d’un substrat marqué au 14 C, présent dans le BACTEC 12B Medium est mesuré de manière quantitative.

Si un agent antimicrobien est ajouté au milieu, le développement des isolats de mycobactéries qui sont sensibles à cet agent antimicrobien est inhibé et la quantité de 14 CO

2 dégagé est réduite.

Butler et al.

5 ont proposé une amélioration de la méthode conventionnelle pour le test de sensibilité à la PZA qui demandait un milieu gélosé 7H10 spécial à pH 5,5. Une limitation de cette méthode est que de nombreux isolats de M.

tuberculosis ne se développent que peu ou pas à pH 5,5.

Le BACTEC 12B Medium ne peut pas être utilisé pour le test de sensibilité à la PZA car cet agent n’est actif qu’à des valeurs de pH inférieures.

5 Heifets et al. ont proposé une méthode radiométrique pour le test de sensibilité à la PZA à l’aide du

BACTEC 12B Medium à pH 5,5. Cette méthode nécessitait l’abaissement du pH de chaque flacon de 6,8 à 5,5 une fois la croissance commencée dans le flacon.

6 A pH 5,5, plusieurs isolats ne se développaient pas dans le 12B Medium, mais les résultats obtenus avec le 12B Medium à pH 5,5 étaient dans leur ensemble supérieurs à ceux obtenus avec le milieu 7H10 à pH 5,5. Par la suite, l’ajout de jaune d’œuf a été proposé pour améliorer la croissance des mycobactéries.

7 Les résultats obtenus étaient plus conformes, mais l’ajout de jaune d’œuf frais s’avérait une méthode lourde et peu pratique en routine de laboratoire d’analyses. Après des études complémentaires, Salfinger et Heifets ont rapporté que la CMI de la PZA augmentait avec l’augmentation du pH du milieu de 5,5 à 6,8.

8 Modifiant les méthodes radiométriques de test de sensibilité mentionnées ci-dessus, Salfinger et al. ont préconisé l’utilisation du BACTEC 12B Medium à pH 5,9 et 6,0

(BACTEC PZA Test Medium) avec une concentration de PZA plus élevée que celle utilisée dans le milieu solide conventionnel (pH 5,5).

9

PRINCIPES DE LA METHODE

BACTEC PZA Test Medium est un milieu 7H12 modifié avec un pH réduit à 6,0. A ce pH, l’activité de la PZA contre les mycobactéries peut être déterminée sans inhiber la croissance de la plupart des isolats de M. tuberculosis. Pour compenser l’augmentation du pH, la concentration de PZA utilisée dans le test BACTEC (100 µg/mL) est plus élevée que dans le test conventionnel (25 à 50 µg/mL).

Le PZA Test Medium contient un substrat marqué au 14 métabolisent le substrat marqué et du 14 CO

2

Instrument recherche la présence de 14 CO

2

C. Lors de leur croissance sur ce milieu, les mycobactéries se dégage du milieu dans l’atmosphère du flacon scellé. Le BACTEC 460TB en prélevant le gaz du flacon, puis en le transférant dans un électromètre où la quantité d’ionisation est convertie en une valeur appelée indice de croissance (« Growth Index » ou GI).

Le taux de production et la quantité de 14 CO

2 dégagé dans le milieu sont directement proportionnels au taux de croissance et à la charge mycobactérienne dans le milieu. Lorsque l’agent antimycobatérien PZA est ajouté au milieu, la croissance des mycobactéries sensibles est inhibée. Ceci se traduit par une réduction de l’émission de de test, ou pas du tout.

14 CO

2

, contrairement à une émission croissante dans le milieu de contrôle. Si les microorganismes sont résistants, la croissance est peu supprimée dans le flacon

REACTIFS

Contenu* par flacon (4 mL) de PZA Test Medium (pH final de 6,0 ± 0,2) :

Bouillon 7H9 ......................................................... 0,47 % m/v

Hydrolysat de caséine .......................................... 0,10 % m/v

Sérum albumine bovine ...................................... 0,50 % m/v

Catalase ............................................................. 192 unités

Substrat au 14 C ...................................................... 4 µCi

Eau désionisée (mL)........................................ q.s. 4 mL

*Complémenté selon les besoins pour satisfaire aux critères de performance.

Avertissements et précautions :

Réservé au diagnostic in vitro.

Ce produit contient du caoutchouc naturel sec.

Des microorganismes pathogènes, notamment les virus de l’hépatite et de l’immunodéficience humaine, sont susceptibles d’être présents dans les échantillons cliniques. Respecter les « Précautions standard » 10-13 et les consignes en vigueur dans l’établissement pour manipuler tout objet contaminé avec du sang ou d’autres liquides organiques.

Les procédures doivent être réalisées sous une hotte de sécurité biologique raccordée à une ventilation adéquate. Les flacons ensemencés doivent être testés avec un BACTEC 460TB Instrument équipé d’une hotte BACTEC 460TB Hood fournissant un air purifié par un filtre HEPA et créant une pression négative dans la zone de test de l’instrument.

5

Avant utilisation, il convient d’examiner les flacons pour vérifier l’absence d’endommagement ou de contamination

(turbidité, bouchon protubérant ou enfoncé). NE PAS UTILISER les flacons présentant des signes de contamination. Les flacons contaminés peuvent être sous pression. La contamination du flacon peut ne pas être visible. Jeter les flacons visiblement endommagés avant l’étape d’ensemencement. Il peut arriver que le goulot d’un flacon en verre soit fêlé et se rompe lors du retrait de la capsule de protection ou pendant les manipulations. Il peut aussi arriver qu’un flacon ne soit pas hermétiquement bouché. Dans les deux cas, le contenu du flacon risque de fuire ou de se répandre, surtout si le flacon est renversé. Si le flacon a été ensemencé, traiter la fuite ou le liquide répandu avec précaution en raison de la présence éventuelle de microorganismes ou d’agents pathogènes. Avant de les jeter, stériliser à l’autoclave tous les flacons ensemencés.

Afin de minimiser les risques de fuite pendant l’ensemencement des échantillons dans les flacons de culture, utiliser des seringues munies d’aiguilles ou d’embouts Luer-Lok inamovibles.

Contamination

Veiller à ne pas contaminer l’échantillon au cours du prélèvement et de l’ensemencement dans le flacon BACTEC.

Un échantillon contaminé donne une lecture positive, mais n’indique pas un résultat cliniquement positif de façon valide.

Cette contamination peut provenir d’un entretien insuffisant des aiguilles et des tubulures BACTEC, d’un bouchon mal nettoyé ou d’un mauvais fonctionnement du système de chauffage des aiguilles BACTEC (consulter le Manuel de fonctionnement et d’entretien de l’instrument). Cette détermination doit être effectuée par l’utilisateur sur la base de facteurs comme le type de microorganisme récupéré, l’apparition du même microorganisme dans plusieurs cultures, les antécédents du malade, les contrôles appropriés des équipements, etc.

Instructions pour la conservation

Les flacons de BACTEC PZA Test Medium doivent être stockés dans un endroit frais et sec (entre 2 et 25 °C). Noter la date de péremption inscrite à l’extérieur de chaque boîte et utiliser le stock le plus ancien en premier.

Il convient d’isoler la matière radioactive en la stockant dans une armoire uniquement accessible au personnel autorisé.

L’armoire doit porter l’avertissement : « Danger : matières radioactives ».

Ne pas exposer le milieu directement à une lumière vive. Toujours tester initialement chaque flacon sur le BACTEC 460TB

Instrument pour s’assurer que l’atmosphère du flacon contient 5 à 10 % de CO

2 et éliminer les flacons produisant des bruits de fond élevés. Si un flacon donne une valeur initiale de GI supérieure ou égale à 20, éliminer ce flacon.

PREPARATION DES ECHANTILLONS

Les cultures pures isolées de M. tuberculosis doivent être fraîchement ensemencées dans le BACTEC 12B Medium et utilisées pour ce test lorsqu’elles se trouvent en phase exponentielle de croissance. Ne pas utiliser de culture âgée ou conservée au réfrigérateur, ni de culture ayant présenté des valeurs maximales de GI pendant plus d’une journée.

METHODE

Matériaux fournis


Matériaux requis mais non fournis

Trousse BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 tests)



Seringue tuberculinique avec aiguille inamovible

} voir « Conditionnement »

Seringue de 5 mL

Solution de désinfectant

Alcool isopropylique à 70 %

Préparation du milieu contenant l’agent antimicrobien a. La PZA lyophilisée est fournie séparément avec un fluide spécial de reconstitution de la PZA (RF).

b. Nettoyer la partie supérieure du flacon avec un tampon imbibé d’alcool. Ajouter en conditions aseptiques 5 mL de

RF avec une seringue dans le flacon de PZA lyophilisée. Bien mélanger. Lorsque la PZA est complètement dissoute, une solution mère de PZA à 4000 µg/mL est obtenue.

c.

Avant l’ensemencement, après nettoyage de la partie supérieure du flacon au moyen d’un tampon imbibé d’alcool, ajouter 0,1 mL de la solution mère de PZA dans chaque flacon de milieu PZA à l’aide d’une seringue de

1 mL. La concentration résultante de PZA est de 100 µg/mL de milieu.

Précautions : Ne pas reconstituer la PZA avec de l’eau ou tout autre diluant que le RF. Le volume de RF dans le flacon peut varier. Lors de la reconstitution de la poudre de PZA, mesurer exactement 5 mL à partir du flacon fourni. L’ajout de la quantité exacte d’agent antimicrobien au milieu est primordiale pour le fonctionnement du test de sensibilité.

Ajouter exactement 0,1 mL de la solution mère à l’aide d’une seringue tuberculinique de 1 mL.

Préparation du contrôle

Un PZA Test Medium sans agent antimicrobien sert de contrôle. Ajouter 0,1 mL de RF dans le flacon de contrôle avant d’ensemencer la culture. Le RF contient une substance favorisant la croissance, le stéarate de polyoxyéthylène (POES). Il est nécessaire que le RF soit présent dans tous les flacons ensemencés.

Préparation de l’inoculum

N’utiliser que des cultures en phase exponentielle de croissance pour réaliser ce test. Ne pas utiliser de cultures ayant dépassé cette phase, ni de cultures stockées ou obtenues sur d’autres milieux.

a. Repiquer la culture à tester dans un flacon de BACTEC 12B Medium (référence 442004) complémentée avec 0,1 mL de RF par flacon.

b. Incuber à 37 °C ± 1 °C et tester le flacon chaque jour sur le BACTEC 460TB Instrument.

c.

Lorsque la valeur journalière de GI se situe entre 300 et 499, utiliser ce flacon pour l’ensemencement du test de sensibilité.

6

d. Si la valeur de GI est supérieure à 300 – 499, ajouter du 12B Medium frais au flacon de culture initial selon le tableau présenté ci-dessous. Si une dilution est effectuée, noter la dilution utilisée pour pourvoir s’y reporter ultérieurement.

GI

GI

300 – 499 : Pas de dilution

500 – 599 : Ajouter 1,0 mL de 12B Medium

GI

GI

GI

GI





Bien mélanger avant utilisation. Ecarter les flacons ayant une valeur de GI égale à 999 (dépassement de la valeur maximale de GI).

Ensemencement du test a. Nettoyer la partie supérieure de tous les flacons de culture avec un tampon imbibé d’alcool à 70 % avant d’insérer une seringue.

b. Bien mélanger la culture à tester au 12B Medium en utilisant une seringue tuberculinique de 1,0 mL munie d’une aiguille inamovible.

c.

Ajouter 0,1 mL de cet inoculum dans le flacon de contrôle et dans le flacon contenant la PZA. NE PAS DILUER LA

CULTURE POUR LE CONTROLE comme il est recommandé pour d’autres agents antimicrobiens (p. ex., isoniazide, streptomycine, éthambutol, rifampine, etc.).

d. Désinfecter le dessus du bouchon en caoutchouc avec un désinfectant approprié et nettoyer ensuite avec un tampon imbibé d’alcool à 70 %.

REMARQUE : Un grand soin doit être apporté à la manipulation des flacons pendant le test. Le dessus des bouchons des flacons peut être contaminé avec des microorganismes provenant de la culture.

Incubation et déroulement du test a. Tester tous les flacons ensemencés (y compris les flacons de contrôle) sur le BACTEC 460TB Instrument avant l’incubation pour s’assurer que l’atmosphère des flacons contient 5 % de CO

2 les flacons peuvent être testés aussitôt après l’ensemencement.

. Si cela n’a pas été fait auparavant, b. Incuber les flacons à 37 °C ± 1 °C.

c.

Tester quotidiennement les flacons de contrôle et les flacons PZA sur le BACTEC 460TB Instrument jusqu’à ce que la valeur de GI du flacon de contrôle atteigne ou dépasse 200.

Contrôle de qualité

NE PAS utiliser les flacons au-delà de leur date de péremption.

Ne pas utiliser de flacon fissuré ou visiblement défectueux. Jeter les flacons en respectant les procédures en vigueur dans l’établissement.

Pour plus d’informations sur le contrôle de qualité pour le BACTEC 460TB Instrument, consulter les manuels de fonctionnement et d’entretien des instruments BACTEC 460TB et 460.

Comme pour d’autres tests de sensibilité aux antibiotiques, la qualité de l’inoculum est primordiale. N’utiliser que de cultures en phase exponentielle de croissance dans le 12B Medium avec une dilution appropriée.

Idéalement, la valeur de GI du flacon de contrôle doit atteindre ou dépasser 200 en 4 à 7 jours. Si une valeur de GI de 200 est atteinte dans le flacon de contrôle en moins de 4 jours, cela signifie que l’inoculum était trop concentré. A moins que les résultats soient clairement interprétables, le test doit être répété. S’il faut plus de 7 à 10 jours pour atteindre une valeur de GI de 200 dans le flacon de contrôle, cela signifie que l’inoculum était de mauvaise qualité (viabilité limitée, faible valeur initiale de GI de l’inoculum ou dilution inadaptée) et que les résultats peuvent être erronés. Les valeurs de GI des flacons de contrôle et des flacons contenant l’agent antimicrobien doivent être suivies avec attention jusqu’à obtention de résultats incontestables. En cas de doute, répéter le test. Si la valeur de GI du flacon contenant l’agent antimicrobien est très proche de 10 % de celle du flacon de contrôle, tester les flacons pendant 1 à 3 jours supplémentaires. Ceci facilitera la détermination du profil de sensibilité de la culture à tester. Si les résultats ne sont pas interprétables, répéter le test avec un isolat cultivé dans du BACTEC 12B Medium frais (réf. 442004). Toujours utiliser les souches H37Rv (ATCC 27294) comme contrôle sensible et H37Rv PZA-R (ATCC 35828) comme contrôle résistant.

Effectuer les contrôles de qualité conformément aux réglementations nationales et/ou internationales, aux exigences des organismes d’homologation concernés et aux procédures de contrôle de qualité en vigueur dans l’établissement. Il est recommandé à l’utilisateur de consulter les directives NCCLS et la réglementation CLIA concernées pour plus d’informations sur les modalités de contrôle de qualité.

INTERPRETATION DES RESULTATS

L’instrument donne directement la valeur de l’indice de croissance sur une échelle allant de 0 à 999. L’indice de croissance traduit en fait l’activité métabolique des microorganismes présents dans le milieu. Lorsque la valeur de GI du flacon de contrôle est égale ou supérieure à 200, interpréter les résultats comme suit :

Le GI du flacon contenant l’agent antimicrobien est inférieur à 9 % du GI du flacon de contrôle = Sensible

Le GI du flacon contenant l’agent antimicrobien est supérieur à 11 % du GI du flacon de contrôle = Résistant

Le GI du flacon contenant l’agent antimicrobien est compris entre 9 % et 11 % (inclus) du GI du flacon de contrôle = Faible

LIMITES DE LA PROCEDURE

La valeur de l’indice de croissance traduit le taux de croissance et la croissance mycobactérienne dans le milieu, mais ne permet pas de quantifier les unités formant colonies (UFC/mL). La morphologie et les caractéristiques de pigmentation des colonies ne peuvent être déterminées qu’en milieu solide. La valeur limite approximative de 10 % peut être utilisée comme estimation de la résistance ou de la sensibilité sur la base des valeurs de GI. Le test de sensibilité BACTEC PZA n’est

7

recommandé que pour les isolats de complexes de M. tuberculosis. La pertinence de la PZA ou de la méthode de test de sensibilité pour les mycobactéries autres que M. tuberculosis (MOTT) n’est pas connue.

VALEURS ATTENDUES

Il doit y avoir une augmentation progressive de la valeur de GI du flacon de contrôle. Dans le flacon testé, la valeur de GI peut demeurer constante, ou peut augmenter ou diminuer selon la sensibilité des microorganismes testés (voir exemples 1 et 2).

En général, les résultats BACTEC sont obtenus en 4 à 7 jours. Il faut parfois plus de temps pour obtenir un résultat avec des cultures à croissance lente. Ne pas interpréter les résultats de test avant 4 jours ou après 21 jours.

Exemple nº 1 : Sensibilité à la PZA

Valeurs quotidiennes de GI

1 2 3 4 5

Contrôle

Agent antimicrobien

9 31 74 195 475

6 9 9 9 4

GI avec agent antimicrobien

GI de contrôle%

< 9 %

Résultats :

4 x 100 = 0,8 % Susceptible

475

Exemple nº 2 : Valeurs quotidiennes de GI en cas de résistance à la PZA

Valeurs quotidiennes de GI GI avec agent antimicrobien

GI de contrôle% 1 2 3

Contrôle 7 28 41

Agent antimicrobien

17 29 40

4 5 6 7

70 120 177 282

68 92 157 244 > 11 %

Résultats :

244 x 100 = 86,5 % Résistant

282

CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES

Basée sur un milieu 7H12 modifié à pH 6,0, la technique radiométrique BACTEC 460TB est, à ce jour, la seule méthode en culture de test de sensibilité à la PZA recommandée par le NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards).

14,15

Dans une étude par Pfyffer et al. comparant le BACTEC 460TB PZA Medium au BACTEC MGIT 960 PZA Medium, le test de sensibilité de M. tuberculosis à la PZA a montré une concordance supérieure à 96 % entre les deux systèmes pour cet agent antimicrobien. Le temps moyen d’obtention d’un résultat était de 5,4 jours pour le BACTEC 460TB PZA, sans compter le temps nécessaire à l’obtention d’un repiquage radiométrique avec un index de croissance (GI) de 200.

14

Conditionnement

N o réf.

Description

442139

442143

BACTEC PZA Test Medium Culture Vials, 4 mL, carton de 10


442004

445203



REFERENCES : Voir la rubrique « References » du texte anglais.

0


Culture Vials


Deutsch

VERWENDUNGSZWECK

Das BACTEC PZA Test Medium (Middlebrook 7H12 Broth, pH 6.0) wurde speziell für Empfindlichkeitsprüfungen von

Mycobacterium tuberculosis gegen Pyrazinamid (PZA) entwickelt. Die Fläschchen werden vornehmlich zusammen mit dem

BACTEC 460TB Instrument verwendet.

ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG

Das radiometrische BACTEC-Verfahren wird bei antimikrobiellen Empfindlichkeitstests mit Tuberkulostatika der ersten Wahl

(Streptomycin, Isoniazid, Rifampicin und Ethambutol) verwendet.

1-4 Bei diesem Verfahren wird das von Mykobakterien aus dem Stoffwechsel eines 14 C-markierten Nährbodens erzeugte und im BACTEC 12B Medium vorhandene empfindlichen Mykobakterien-Isolate und verringert die Menge des erzeugten 14 CO

2

.

14 CO

2 quantitativ gemessen. Die Zugabe von antimikrobiellen Substanzen zum Medium hemmt das Wachstum der gegen diese Substanzen

Butler und Kollegen 5 schlugen ein verbessertes konventionelles Verfahren für PZA-Empfindlichkeitstests vor, das ein spezielles 7H10-Agarmedium mit einem pH-Wert von 5,5 erfordert. Dieses Verfahren ist dadurch begrenzt, dass bei einem pH-Wert von 5,5, viele M. tuberculosis-Isolate entweder schlecht oder gar nicht wachsen.

Das BACTEC 12B Medium kann nicht für PZA-Empfindlichkeitstests verwendet werden, da dieses Arzneimittel nur bei niedrigen pH-Werten aktiv ist.

5 Heifets et al. schlugen für den PZA-Empfindlichkeitstest ein radiometrisches Verfahren unter

Verwendung des BACTEC 12B Mediums mit einem pH-Wert von 5,5 vor. Dieses Verfahren erfordert die Senkung des pH-Werts jedes Fläschchens von 6,8 auf 5,5, sobald das Wachstum im Fläschchen eingeleitet ist.

6 Bei einem pH-Wert von 5,5 wuchsen einige Isolate im BACTEC 12B Medium nicht; trotzdem wurden im BACTEC 12B-Medium (pH-Wert 5,5) insgesamt bessere

Ergebnisse erzielt als im 7H10-Medium (pH-Wert 5,5). Später wurde zur Verbesserung des Wachstums von Mykobakterien die

8

Zugabe von Eidotter vorgeschlagen.

7 Die dabei erzielten Ergebnisse eigneten sich besser zur Berichterstattung, doch die

Zugabe von frischem Eidotter erwies sich als umständlich und ungeeignet für die Laborroutine. Nach weiteren Studien berichteten Salfinger und Heifets, dass bei einer Erhöhung des pH-Werts von 5,5 auf 6,8 ein Anstieg der MHK (Minimale

Hemmkonzentration) von PZA zu verzeichnen war.

8 Salfinger et al. empfahlen die Verwendung des BACTEC 12B Mediums mit einem pH-Wert von 5,9 – 6,0 (BACTEC PZA Test Medium) und einer höheren PZA-Konzentration als bei konventionellen

Festmedien (pH-Wert 5,5) 9 zur Modifizierung des o.g. radiometrischen Empfindlichkeitsverfahrens.

VERFAHRENSGRUNDLAGEN

Das BACTEC PZA Test Medium ist ein modifiziertes 7H12-Medium mit einem auf 6,0 reduzierten pH-Wert. Dieser pH-Wert ermöglicht den Nachweis der PZA-Aktivität gegen Mykobakterien, ohne dabei das Wachstum der meisten M. tuberculosis-

Isolate zu hemmen. Um den erhöhten pH-Wert auszugleichen, wird beim BACTEC-Test eine höhere PZA-Konzentration

(100 µg/mL) verwendet als bei konventionellen Tests (25 – 50 µg/mL).

Das PZA-Testmedium enthält einen 14 C-markierten Nährboden. Wenn Mykobakterien in diesem Medium wachsen, metabolisieren sie den markierten Nährboden und setzen in der Überstandsatmosphäre des verschlossenen Fläschchens

14 CO

2 frei. Das BACTEC 460TB Instrument analysiert die Überstandsatmosphäre auf das Vorhandensein von

Wachstumsindex (Growth Index oder GI) umgewandelt wird.

14 CO

2

, indem es

Gas aus dem Fläschchen abführt und dieses auf ein Elektrometer weiterleitet, wo die Ionisierungsmenge in den sog.

Die Rate und Menge des im Medium entstandenen 14 CO

2 steht in direktem Verhältnis zur Rate und Menge des bakteriellen

Wachstums im Medium. Die Zugabe des Tuberkulostatikums PZA zu dem Medium hemmt das Wachstum empfindlicher

Mykobakterien, was im Vergleich zu einem Anstieg in der Kontrolle durch verringerte 14 CO

2

-Produktion angezeigt wird.

Handelt es sich um resistente Organismen, so wird das Wachstum im Fläschchen nur minimal oder gar nicht gehemmt.

REAGENZIEN

Inhalt* pro 4-mL-Fläschchen des PZA-Testmediums (End-pH-Wert 6,0 ± 0,2):

7H9 Bouillon-Base ................................................ 0,47 % Gewicht/Volumen

Kaseinhydrolysat .................................................. 0,10 % Gewicht/Volumen

Rinderserumalbumin ........................................... 0,50 % Gewicht/Volumen

Katalase............................................................ 192 Einheiten

14 C-Substrat.......................................................... 4 µCi

Demineralisiertes Wasser (mL)............................ 4 q.s.

*Auf die geforderten Testkriterien angereichert.

Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen:

In-vitro-Diagnostikum.

Dieses Produkt enthält Naturlatex (getrocknet).

Klinische Proben können pathogene Mikroorganismen, wie z.B. Hepatitis-Viren und HIV enthalten. Beim Umgang mit allen mit Blut oder anderen Körperflüssigkeiten kontaminierten Artikeln sind die „Allgemeinen Vorsichtsmaßnahmen” 10-13 sowie die einschlägigen Institutionsrichtlinien zu beachten.

Testverfahren sollten in einem geeigneten Sicherheitsschrank und bei guter Belüftung durchgeführt werden. Inokulierte

Fläschchen müssen auf einem BACTEC 460TB Instrument ausgewertet werden, das mit einer Schutzhaube ausgestattet ist, die im Testbereich des Geräts für HEPA-Atmosphäre und Unterdruck sorgt.

Vor Gebrauch muss jedes Fläschchen auf Anzeichen von Kontamination, wie z.B. Trübung, Wölbung oder Einbeulung des

Septums, oder undichte Stellen untersucht werden. Fläschchen, die Anzeichen von Kontamination aufweisen, NICHT

VERWENDEN. Kontaminierte Fläschchen können Überdruck erzeugen. Die Kontamination eines Fläschchens ist nicht in allen Fällen sichtbar. Fläschchen, die Anzeichen von Beschädigung aufweisen, müssen vor dem Inokulieren verworfen werden. In seltenen Fällen kann der gläserne Fläschchenhals einen Sprung haben und beim Entfernen des Abrißdeckels oder während der Handhabung des Fläschchens brechen. Auch kann es in seltenen Fällen vorkommen, dass ein Fläschchen nicht richtig verschlossen ist. In beiden Fällen ist es möglich, dass der Fläschcheninhalt ausläuft oder verschüttet wird, besonders wenn das Fläschchen auf den Kopf gestellt wird. Falls das betreffende Fläschchen bereits inokuliert war, muß das ausgelaufene oder verschüttete Medium mit äußerster Vorsicht behandelt werden, weil es pathogene Organismen oder Erreger enthalten kann. Vor ihrer Beseitigung müssen alle inokulierten Fläschchen im Autoklaven sterilisiert werden.

Um potentiellen Sickerverlust bei der Inokulation von Proben in die Kulturfläschchen so weit wie möglich auszuschließen, sollten Spritzen mit fest eingesetzten Kanülen oder mit LUER-LOK-Kegel verwendet werden.

Kontamination

Die Kontamination der Proben während der Entnahme und der Inokulation in die BACTEC-Fläschchen muss sorgfältig vermieden werden.

Eine kontaminierte Probe ergibt einen positiven Wert ohne klinische Relevanz. Kontamination kann durch unsachgemäße

Wartung der BACTEC-Kanülen und Schläuche, durch unzureichende Reinigung des Septums oder durch Störung in der

BACTEC-Kanülen-Glüheinheit verursacht werden (vgl. Betriebs- und Wartungsanleitung). Eine entsprechende Beurteilung muss vom Anwender auf der Basis von Faktoren wie z.B. der Art des isolierten Organismus, dem Vorkommen desselben Organismus in mehreren Kulturen, der Anamnese des Patienten sowie geeigneter Überprüfung der Geräte usw. vorgenommen werden.

Aufbewahrung

Fläschchen mit BACTEC PZA Test Medium kühl (2 – 25 °C) und trocken aufbewahren. Jede Packung sollte auf der

Außenseite mit einem Verfallsdatum versehen und der älteste Vorrat zuerst verbraucht werden.

Es ist ratsam, radioaktive Substanzen separat in einem Schrank aufzubewahren, der nur den dazu befugten Mitarbeitern zugänglich ist. Der Schrank sollte folgendermaßen beschildert werden: „Vorsicht: Radioaktives Material“.

Das Medium muss vor direktem, hellem Licht geschützt werden. Jedes Fläschchen sollte auf dem BACTEC 460TB Instrument einem vorläufigen Test unterzogen werden, um eine 5 – 10%ige CO

2

-Atmosphäre herzustellen und um Fläschchen mit hohen Hintergrundwerten auszusondern. Fläschchen, die dabei einen GI von 20 oder höher aufzeigen, sind zu entsorgen.

9

PROBENVORBEREITUNG

Für diesen Test sollten im BACTEC 12B Medium frisch angelegte Reinkulturen von M. tuberculosis verwendet werden, die sich in der aktiven Wachstumsphase befinden. Überaltete, im Kühlschrank gelagerte Kulturen, oder Kulturen, die seit mehr als einem Tage GI-Höchstwerte aufweisen, sind nicht zu verwenden.

VERFAHREN

Mitgeliefertes Arbeitsmaterial


Benötigtes, jedoch nicht mitgeliefertes Arbeitsmaterial

BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 Tests)



Tuberkulinspritze mit fest eingesetzter Kanüle

5-mL-Spritze

Desinfektionslösung

70 % Isopropyl-Alkohol

} siehe „Liefebare Produkte“

Vorbereitung des PZA-Mediums a. Lyophilisiertes PZA wird separat mit einer speziellen PZA-Rekonstituierungsflüssigkeit (RF) geliefert.

b. Den oberen Teil des Fläschchens mit einem Alkoholtupfer säubern. Mit einer Spritze 5 mL RF aseptisch in das

Fläschchen mit dem lyophilisierten PZA injizieren. Gut durchmischen. Nach der völligen Auflösung des Pulvers ergibt sich eine Stammlösung von 4000 µg PZA/mL.

c.

Vor der Inokulation, und nachdem der obere Teil des Fläschchens mit einem Alkoholtupfer gereinigt wurde, mit einer 1-mL-Spritze je 0,1 mL der PZA-Stammlösung zu jedem PZA-Fläschchen geben. Die PZA-Konzentration im

Testfläschchen beträgt 100 µg PZA/mL Medium.

Sicherheitshinweise: PZA ausschließlich mit der Rekonstituierungsflüssigkeit, nicht mit Wasser oder einem anderen

Verdünnungsmittel zubereiten. Das Volumen der Rekonstituierungsflüssigkeit im Fläschchen kann variieren. Für die

Rekonstituierung des PZA-Pulvers genau 5 mL aus dem mitgelieferten Fläschchen abmessen. Die Zugabe der korrekten

Menge PZA zum Medium ist ausschlaggebend für die Leistungsfähigkeit des Empfindlichkeitstests. Mit einer 1-mL-

Tuberkulinspritze genau 0,1 mL der Stammlösung zugeben.

Vorbereitung der Kontrolle

Als Kontrolle wird ein PZA-freies Medium verwendet. Vor Inokulation der Kultur 0,1 mL der Rekonstituierungsflüssigkeit zu dem Kontrollfläschchen geben. RF enthält eine wachstumsfördernde Substanz, Polyoxyethylenstearat (POES) RF muss in komplett in inokulierten Fläschchen aufbewahrt werden.

Vorbereitung der Inokulation

Für diesen Test sollten nur Kulturen in der aktiven Wachstumsphase verwendet werden. Übermäßig bewachsene, zuvor gelagerte oder in anderen Medien angelegte Kulturen sollten nicht verwendet werden.

a. Die Testkultur sollte in einem BACTEC 12B Medium (Best.-Nr. 442004) mit 0,1 mL RF-Zusatz pro Fläschchen subkultiviert werden.

b. Bei 37 °C ± 1 °C inkubieren und täglich auf dem BACTEC 460TB Instrument testen.

c.

Sobald der tägliche GI-Wert 300 – 499 erreicht hat, das betreffende Fläschchen für die Inokulation des

Empfindlichkeitstests verwenden.

d. Falls der GI-Wert höher als 300 – 499 ist, gemäß der untenstehenden Tabelle frisches BACTEC 12B Medium zu dem

Fläschchen mit dem ursprünglichen Wachstum geben. Falls verdünnt, das Verdünnungsverhältnis für spätere

Bezugnahme notieren.

GI

GI

GI

GI

GI

GI

300 – 499: Keine Verdünnung

500 – 599: 1,0 mL BACTEC 12B Medium zugeben





Vor Gebrauch gründlich mischen. Fläschchen, die einen GI-Wert von 999 aufweisen und den GI-Höchstwert

überschritten haben, nicht verwenden.

Inokulation des Tests a. Vor dem Einführen einer Spritze den oberen Teil aller Kulturfläschchen mit einem Alkoholtupfer mit

70 % Alkohol reinigen.

b. Mit einer 1,0-mL-Tuberkulinspritze mit fest eingesetzter Kanüle die Testkultur in dem BACTEC 12B Medium gründlich mischen.

c.

0,1 mL dieses Inokulats zu dem Kontrollfläschchen und dem PZA-Fläschchen geben. DIE KULTUR FÜR DIE

KONTROLLE NICHT VERDÜNNEN, wie es für andere Arzneimittel empfohlen wird (z.B. Isoniazid, Streptomycin,

Ethambutol, Rifampicin, etc.).

d. Die Oberfläche des Gummiseptums mit einem Desinfektionsmittel desinfizieren und danach mit einem

Alkoholtupfer mit 70 % Alkohol reinigen.

HINWEIS: Während der Durchführung des Tests sollten die Fläschchen mit Vorsicht gehandhabt werden. Die Septa können mit Kulturorganismen kontaminiert sein.

10

Inkubation und Testen a. Alle inokulierten Fläschchen (einschließlich der Kontrollfläschchen) sollten vor der Inkubation auf dem BACTEC

460TB Instrument getestet werden, um eine 5%ige CO

2

-Atmosphäre sicherzustellen. Falls dieser Schritt nicht zuvor durchgeführt wurde, können die Fläschchen unmittelbar nach der Inokulation getestet werden.

b. Die Fläschchen bei 37 °C ± 1 °C inkubieren.

c.

Die PZA-Fläschchen und die Kontrollfläschchen täglich auf dem BACTEC 460TB Instrument testen, bis der GI-Wert des Kontrollfläschchens mindestens 200 erreicht hat.

Qualitätskontrolle

Die Fläschchen dürfen AUF KEINEN FALL nach dem Verfallsdatum verwendet werden.

Fläschchen, die Sprünge oder andere Beschädigungen aufweisen, nicht verwenden. Fläschchen entsprechend Vorschriften entsorgen.

Informationen bezüglich der Qualitätskontrolle für das BACTEC 460TB Instrument und das BACTEC 460 Instrument sind in der betreffenden Bedienungsanleitung enthalten.

Wie bei jedem anderen Empfindlichkeitstest ist die Qualität des Inokulats ausschlaggebend. Im entsprechend verdünnten

BACTEC 12B Medium sind ausschließlich Kulturen in der aktiven Wachstumsphase zu verwenden.

Unter idealen Bedingungen sollte der GI-Wert im Kontrollfläschchen innerhalb von 4 – 7 Tagen ≥ 200 betragen. Das Erreichen eines GI-Werts von 200 in weniger als 4 Tagen lässt ein zu schweres Inokulat vermuten. Falls die Ergebnisse nicht eindeutig sind, sollte der Test wiederholt werden. Wird ein GI-Wert von 200 in der Kontrolle erst nach 7 – 10 Tagen erreicht, so weist das auf schlechte Qualität des Inokulats hin (d.h., geringe Lebensfähigkeit, niedriger Anfangs-GI des Inokulats oder unzulängliche

Verdünnung), was zu falschen Ergebnissen führen kann. Der GI-Wert in der Kontrolle und in den Arzneimittelfläschchen sollten sorgfältig beobachtet werden, bis eindeutige Ergebnisse erzielt werden. Im Zweifelsfall den Test wiederholen. Wenn der GI-

Wert im Arzneimittelfläschchen bis auf ungefähr 10 % an den Wert in der Kontrolle heranreicht, die Fläschchen weitere 1 – 3

Tage testen. Dies erleichtert die Beurteilung der Empfindlichkeit der Testkultur. Falls die Ergebnisse nicht interpretierbar sind, den Test mit einem in frischem BACTEC 12B Medium (Best.-Nr. 442004) kultivierten Isolat wiederholen. Der H37Rv-Stamm (ATCC

27294) sollte als Empfindlichkeitskontrolle und der H37Rv PZA-R (ATCC 35828) als Resistenzkontrolle immer mitgeführt werden.

Es sind die geltenden gesetzlichen und behördlichen und in den Akkreditierungsbedingungen festgelegten Vorschriften zur Qualitätskontrolle sowie die laborinternen Standardvorgaben zur Qualitätskontrolle zu beachten. Benutzer sollten die relevanten NCCLS-Dokumente und CLIA-Vorschriften über geeignete Testverfahren zur Qualitätskontrolle einsehen.

INTERPRETATION DER ERGEBNISSE

Das Gerät zeigt den GI-Wert direkt auf einer Skala über einen Bereich von 0 – 999 an. Der Wachstumsindex (GI) ist ein Maß der metabolischen Aktivität von Organismen im Medium. Wenn der GI-Wert des Kontrollfläschchens 200 ist, die Ergebnisse wie folgt ablesen:

GI im Arzneimittelfläschchen ist < 9 % des GI-Werts im Kontrollfläschchen

GI im Arzneimittelfläschchen ist > 11 % des GI-Werts im Kontrollfläschchen

= Empfindlich

= Resistent

GI im Arzneimittelfläschchen ist zwischen 9 % und 11 % (einschl.) des GI-Werts im Kontrollfläschchen = Grenzwertig

VERFAHRENSBESCHRÄNKUNGEN

Der Wachstumsindex (GI) zeigt Rate und Menge des Wachstums im Medium an, kann jedoch nicht zur Quantifizierung der koloniebildenden Einheiten pro mL verwendet werden. Koloniemorphologie und Pigmentierungscharakteristiken können nur auf festem Medium bestimmt werden. Der etwa 10%ige Cut-Off kann als grobe Schätzung der Resistenz oder

Empfindlichkeit auf der Basis des GI-Werts betrachtet werden. Der BACTEC PZA-Empfindlichkeitstest wird nur für komplexe M. tuberculosis-Isolate empfohlen. Die Verwendungsfähigkeit von PZA oder des Empfindlichkeitstestverfahrens für nichttuberkulose Mykobakterien (MOTT) ist nicht bekannt.

ERWARTETE WERTE

Der GI-Wert des Kontrollfläschchens sollte allmählich ansteigen. Im Testfläschchen kann der GI-Wert je nach

Empfindlichkeit des Testorganismus konstant bleiben, ansteigen oder abfallen (vgl. Beispiel 1 und 2).

Normalerweise liefert der BACTEC-Test Ergebnisse in 4 bis 7 Tagen. Gelegentlich kann es bei langsam wachsenden

Kulturen länger dauern. Ergebnisse nicht vor 4 oder nach 21 Tagen ablesen.

Beispiel 1: PZA-Empfindlichkeit

Tägliche GI-Werte

1 2 3 4 5

Kontrolle 9 31 74 195 475

Arzneimittel 6 9 9 9 4

GI des Arzneimittelfläschchens

GI des Kontrollfläschchens %

< 9 %

Ergebnisse:

4 x 100 = 0,8 % Empfindlich

475

Beispiel 2: PZA-Resistenz Tägliche GI-Werte

Kontrolle

1 2

Tägliche GI-Werte

3

7 28 41

4 5 6

70 120 177 282

GI des Arzneimittelfläschchens

7 GI des Kontrollfläschchens %

Arzneimittel 17 29 40 68 92 157 244 > 11 %

Ergebnisse:

244 x 100 = 86,5 % Resistent

282

LEISTUNGSMERKMALE

Basierend auf einem modifizierten 7H12-Medium mit einem auf 6,0 reduzierten pH-Wert, ist das radiometrische BACTEC

460TB-Verfahren derzeit das einzige kulturbasierte Verfahren für PZA-Empfindlichkeitstests, welches vom NCCLS (National

Committee for Clinical Laboratory Standards) empfohlen wird.

14,15

11

In einer Studie von Pfyffer et al. ergab die Empfindlichkeitsbestimmung von M. tuberculosis auf PZA eine Übereinstimmung von mehr als 96 %, bei einem Vergleich von BACTEC 460TB PZA Medium and Drug und BACTEC MGIT 960 PZA Medium and

Drug. Die durchschnittliche Umschlagzeit für den BACTEC 460TB PZA-Test betrug 5,4 Tage, nicht inbegriffen die Zeit, die zum Erhalt einer radiometrischen Subkultur mit einem Wachstumsindex (GI) von 200 aufgewendet wurde.

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Liefebare Produkte

Best.-Nr.

Beschreibung

442139

442143

BACTEC PZA Test Medium Culture Vials, 4 mL, Karton mit 10 Fläschchen

BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 Tests)

442004

445203



LITERATUR: S. “References” im englischen Text.

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Culture Vials


USO PREVISTO

Italiano

BACTEC PZA Test Medium (Terreno di test BACTEC PZA) (brodo Middlebrook 7H12, pH 6,0) è un terreno di test concepito specificamente per eseguire test di sensibilità di Mycobacterium tuberculosis a pirazinamide (PZA) ed è destinato principalmente all’uso con lo strumento BACTEC 460TB.

SOMMARIO E SPIEGAZIONE

La tecnica radiometrica BACTEC è usata per i test di sensibilità antibiotica dei principali farmaci antimicobatterici

(streptomicina, isoniazide, rifampina ed etambutolo).

1-4 Questa tecnica misura quantitativamente la 14 al terreno determina l’inibizione degli isolati micobatterici sensibili all’antibiotico e la riduzione della

CO

14

2

CO

2 prodotta dai micobatteri dal metabolismo del substrato marcato con 14 C presente nel terreno BACTEC 12B. L’aggiunta di un antibiotico prodotta.

Butler et al.

5 hanno perfezionato la metodica tradizionale dei test di sensibilità al PZA, che richiedeva uno speciale terreno agar 7H10 con pH pari a 5,5 ed era limitata dal fatto che a tale pH numerosi isolati di M. tuberculosis non crescono o evidenziano una crescita inadeguata.

Il terreno BACTEC 12B non può essere usato per i test di sensibilità a PZA poiché questo farmaco è attivo solamente a valori di pH più bassi.

5 Heifets et al. hanno suggerito una metodica radiometrica per testare la sensibilità a PZA usando il terreno

BACTEC 12B con pH di 5,5. Questa metodica richiedeva l’abbassamento del pH in ogni flacone da 6,8 a 5,5 una volta iniziata la crescita.

6 A tale pH, non si è verificata la crescita di numerosi isolati nel terreno BACTEC 12B, anche se i risultati complessivi ottenuti con il terreno 12B pH 5,5 sono stati considerati migliori di quelli ottenuti usando il 7H10 pH 5,5. Successivamente, è stata suggerita l’aggiunta di tuorlo d’uovo per migliorare la crescita dei micobatteri.

7 Pur producendo risultati più affidabili, l’aggiunta di tuorlo d’uovo fresco si è dimostrata poco pratica soprattutto per la routine dei laboratori clinici. Salfinger e

Heifets, dopo ulteriori studi, hanno riscontrato che la concentrazione minima inibente (CMI) del PZA aumentava con l’aumento del pH del terreno da 5,5 a 6,8.

8 Con una modifica delle procedure radiometriche sopra riportate, Salfinger et al.

hanno raccomandato l’uso del terreno BACTEC 12B a pH tra 5,9 e 6,0 (BACTEC PZA Test Medium) con una concentrazione di

PZA più alta rispetto a quella usata nel terreno solido tradizionale (pH 5,5).

9

PRINCIPI DELLA PROCEDURA

BACTEC PZA Test Medium è un terreno 7H12 modificato con un pH ridotto pari a 6,0. A questo pH si può determinare l’attività antimicobatterica di PZA senza inibire la crescita della maggior parte degli isolati di M. tuberculosis. Per compensare l’aumento del pH, nel test BACTEC si usa una concentrazione di PZA più elevata (100 µg/mL) rispetto a quella del test tradizionale (25 – 50 µg/mL).

Il terreno di test PZA contiene un substrato marcato con 14 C. I micobatteri che crescono in questo terreno metabolizzano il substrato marcato e rilasciano 14 CO

2 nell’atmosfera al di sopra del terreno, all’interno del flacone sigillato. Lo strumento

BACTEC 460TB verifica la presenza di 14 CO

2 rimuovendo il gas dal flacone e trasferendolo in un elettrometro, dove la quantità ionizzata viene convertita in numero detto Indice di Crescita (GI).

La velocità e la quantità di 14 CO

2 prodotta sono direttamente proporzionali alla velocità e alla quantità di crescita batterica nel terreno. L’aggiunta dell’antibiotico PZA al terreno determina l’inibizione della crescita dei micobatteri sensibili, indicata dalla riduzione della produzione di 14 CO

2 rispetto alla tendenza all’aumento nel controllo. Se i microrganismi sono resistenti, la soppressione della crescita nel flacone di test è minima o inesistente.

REAGENTI

Ogni flacone (4 mL) di PZA Test Medium (pH finale 6,0 ± 0,2) contiene*:

Brodo 7H9 ............................................................ 0,47% p/v

Idrolisato di caseina ............................................. 0,10% p/v

Sieroalbumina bovina ......................................... 0,50% p/v

Catalasi ............................................................. 192 unità

Substrato 14 C........................................................ 4 µCi

Acqua deionizzata (mL) ...................................... 4 q.s.

*Supplementato nella misura necessaria a rispettare i criteri di performance.

12

Avvertenze e precauzioni

Per uso diagnostico in vitro.

Questo prodotto contiene gomma naturale secca.

I campioni clinici possono contenere microrganismi patogeni, inclusi i virus dell’epatite e i virus dell’immunodeficienza umana. Manipolare tutti i materiali e gli articoli contaminati con sangue e altri fluidi biologici in conformità alle linee guida dell’istituto e alle “Precauzioni standard”.

10-13

Eseguire le procedure in una cappa di sicurezza appropriata e in un’area ben ventilata. Testare i flaconi inoculati con uno strumento BACTEC 460TB munito di cappa BACTEC 460TB che fornisce aria filtrata HEPA e pressione negativa nell’area dello strumento di test.

Prima dell’uso, esaminare ogni flacone per assicurasi che non presenti tracce di danni, deterioramento o contaminazione come torbidità, rigonfiamento o schiacciamento del setto. NON USARE un flacone se presenta tracce di contaminazione.

Un flacone contaminato può contenere pressione positiva. La contaminazione del flacone può non essere immediatamente visibile. Eliminare prima dell’inoculo i flaconi che presentano segni di danni. Raramente può succedere che il collo di un flacone di vetro sia incrinato e si rompa durante la rimozione del tappo o la manipolazione o che un flacone sia stato sigillato in modo insufficiente. In entrambi i casi e in particolar modo al capovolgimento del flacone, possono esservi perdite o fuoriuscite del suo contenuto. Se il flacone è stato inoculato, trattare la perdita o la fuoriuscita con cautela data la potenziale presenza di agenti/microrganismi patogeni. Sterilizzare in autoclave tutti i flaconi inoculati prima di gettarli.

Per ridurre al minimo potenziali fuoriuscite durante l’inoculo dei campioni nei flaconi di coltura, usare siringhe con aghi fissi o punte con raccordo Luer-Lok.

Contaminazione

Prestare attenzione a non contaminare il campione durante la raccolta e l’inoculo nel flacone BACTEC.

Un campione contaminato produce una lettura positiva, senza però fornire un risultato clinico significativo. La contaminazione può essere dovuta a errata manutenzione di aghi e tubi BACTEC, a insufficiente pulizia del setto o al malfunzionamento dell’unità di riscaldamento degli aghi BACTEC (vedere il Manuale d’uso e manutenzione dello strumento). La determinazione di contaminazione deve essere effettuata dall’utente sulla base di fattori quali il tipo di microrganismo recuperato, la presenza dello stesso microrganismo in più colture, l’anamnesi del paziente, appropriati controlli delle apparecchiature, ecc.

Istruzioni per la conservazione

Conservare i flaconi di prova BACTEC PZA Test Medium in un luogo fresco (2 – 25 °C) e asciutto. Scrivere la data di scadenza all’esterno di ogni confezione e usare prima il materiale più vecchio.

È prassi comune conservare il materiale radioattivo in un armadio apposito accessibile esclusivamente al personale autorizzato. L’armadio deve recare la dicitura: “Attenzione: Materiali Radioattivi”.

Non esporre il terreno a luce intensa diretta. All’inizio delle operazioni, testare sempre ogni flacone con lo strumento

BACTEC 460TB per stabilire un’atmosfera di CO

2 al 5 – 10% e gettare i flaconi con letture di fondo elevata. Gettare anche i flaconi che allo screening iniziale danno una lettura GI 20 o più.

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

Le colture pure di isolati di M. tuberculosis devono essere create ex novo nel terreno BACTEC 12B e usate per questo test quando sono in fase di crescita attiva. Non usare colture vecchie, refrigerate o che hanno dato letture massime di GI per più di un giorno.

PROCEDURA

Materiali forniti


Materiali necessari ma non forniti

BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 test)


Strumento BACTEC 460TB

Siringa per tubercolina con ago fisso

Siringa da 5 mL

Soluzione disinfettante

Alcol isopropilico al 70%

} vedere “Disponibilità”

Preparazione del terreno con antibiotico a.

L’antibiotico PZA liofilizzato viene fornito separatamente, insieme a uno speciale liquido di ricostituzione (RF).

b. Pulire il tappo del flacone con un tampone imbevuto di alcol e iniettare in asepsi 5 mL di RF nel flacone di PZA liofilizzato. Mescolare accuratamente. Una volta completamente dissolta, la soluzione stock ottenuta sarà pari a

4000 µg PZA/mL.

c.

Prima dell’inoculo e dopo aver pulito il tappo con un tampone imbevuto di alcol, dispensare 0,1 mL della soluzione stock in ciascun flacone di terreno PZA usando una siringa da 1 mL. La concentrazione di PZA così ottenuta è pari a 100 µg PZA/mL.

Precauzioni - Non preparare il PZA con acqua o diluenti diversi dall’RF fornito. Il volume di RF può variare da un flacone all’altro. Per ricostituire il PZA in polvere, prelevare quindi esattamente 5 mL dal flacone fornito. L’aggiunta della corretta quantità di antibiotico da testare è decisiva per l’esito del test di sensibilità. Dispensare esattamente 0,1 mL di soluzione stock usando una siringa per tubercolina da 1 mL.

Preparazione del controllo

Come controllo si usa un terreno di test PZA senza alcun antibiotico. Dispensare 0,1 mL di RF nel flacone di controllo prima dell’inoculo della coltura. L’RF contiene poliossietilene stearato (POES), una sostanza che favorisce la crescita. L’RF deve essere presente in tutti i flaconi inoculati.

13

Preparazione dell’inoculo

Questo test deve essere condotto usando esclusivamente colture in crescita attiva. Non usare colture eccessivamente cresciute, conservate oppure cresciute in altri terreni.

a. La subcoltura per il test deve essere ottenuta in un flacone BACTEC 12B Medium (n. di catalogo 442004) supplementato con 0,1 mL di RF per flacone.

b. Incubare il flacone a 37 °C ± 1 °C e testarlo ogni giorno nello strumento BACTEC 460TB.

c.

Quando il GI giornaliero raggiunge 300 – 499, usare questo flacone per l’inoculo del test di sensibilità.

d. Se il GI supera 300 – 499, dispensare terreno 12B fresco nel flacone di crescita iniziale secondo la tabella seguente.

Per riferimento futuro, annotare la diluizione usata.

GI

GI

GI

GI

300 – 499: Nessuna diluizione

500 – 599: Dispensare 1,0 mL di terreno 12B



GI

GI



Prima dell’uso, mescolare accuratamente. Evitare flaconi con letture 999, ossia superiori al GI massimo.

Inoculo del test a. Pulire i tappi di tutti i flaconi di coltura con un tampone imbevuto di alcol al 70% prima di inserire la siringa.

b. Con una siringa per tubercolina da 1,0 mL e ad ago fisso, mescolare la coltura del test nel terreno 12B.

c.

Dispensare 0,1 mL di questo inoculo nel flacone di controllo e nel flacone PZA. NON DILUIRE LA COLTURA PER IL

CONTROLLO come raccomandato per altri antibiotici (es. isoniazide, streptomicina, etambutolo, rifampina, ecc.).

d. Disinfettare la superficie superiore del setto di gomma con un disinfettante adatto e pulire quindi con un tampone imbevuto di alcol al 70%.

NOTA - Durante il test, maneggiare i flaconi con cautela perché i tappi potrebbero essere contaminati dai microrganismi della coltura.

Incubazione e test a. Testare tutti i flaconi inoculati (compresi quelli di controllo) con lo strumento BACTEC 460TB prima dell’incubazione per garantire un’atmosfera di CO

2 subito dopo l’inoculo.

al 5%. Se non lo si è ancora fatto, si possono testare i flaconi b. Incubare i flaconi a 37 °C ± 1 °C.

c.

Testare ogni giorno i flaconi PZA e quelli di controllo con lo strumento BACTEC 460TB, finché il GI del controllo non raggiunge almeno 200.

Controllo di qualità

NON USARE i flaconi oltre la data di scadenza.

Non usare flaconi che presentano incrinature o difetti. Eliminare i flaconi nel modo appropriato.

Per informazioni sul controllo qualità dello strumento BACTEC 460TB, consultare il Manuale d’uso e manutenzione di

BACTEC 460TB e 460.

Come per tutti gli altri test di sensibilità agli antibiotici, la qualità dell’inoculo è essenziale. Usare solo colture in crescita attiva nel terreno 12B diluito in modo appropriato.

In condizioni ideali, il controllo deve dare una lettura di GI ≥ 200 entro 4 – 7 giorni. Una lettura di 200 ottenuta prima di 4 giorni indica un inoculo troppo intenso. Salvo in caso di risultati inequivocabili, ripetere il test. Una lettura di 200 dopo più di 7 – 10 giorni indica una qualità scadente di inoculo (cioè bassa vitalità, bassa lettura iniziale del GI dell’inoculo oppure insufficiente diluizione) e quindi i risultati possono essere inattendibili. Il GI del flacone di controllo e quello dell’antibiotico devono essere osservati attentamente finché non si ottengono risultati inequivocabili. In caso di dubbio, ripetere il test. Se il GI nel flacone dell’antibiotico è prossimo al 10% di quello del controllo, testare i flaconi per altri 1 – 3 giorni. Ciò facilita l’interpretazione del pattern di sensibilità della coltura da testare. In caso di risultati non interpretabili, ripetere il test con isolati cresciuti in un terreno BACTEC 12B fresco (n. di catalogo 442004). Usare sempre H37Rv (ATCC

27294) come controllo sensibile e H37Rv PZA-R (ATCC 35828) come controllo resistente.

Le procedure prescritte per il controllo di qualità devono essere effettuate in conformità alle norme vigenti o ai requisiti di accreditazione e alla prassi di controllo di qualità del laboratorio specifico. Per una guida alla prassi di controllo di qualità appropriata, si consiglia di consultare le norme CLIA e la documentazione NCCLS in merito.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Lo strumento effettua direttamente la lettura del GI (Indice di Crescita), su una scala da 0 a 999. Il GI è in effetti una misura dell’attività metabolica dei microrganismi nel terreno. Quando il GI del controllo raggiunge almeno 200, i risultati vanno interpretati come segue.

GI nel flacone con l’antibiotico < 9% rispetto al GI nella fiala di controllo

GI nel flacone con l’antibiotico > 11% rispetto al GI nella fiala di controllo

GI nel flacone con l’antibiotico compreso fra 9% e 11% (incluso) rispetto al

GI nella fiala di controllo

= Sensibile

= Resistente

= Borderline

LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA

Il valore del GI riflette la velocità e la quantità di crescita nel terreno, ma non può essere usato per quantificare le unità formanti colonie per mL. La morfologia e le caratteristiche di pigmentazione delle colonie possono essere determinate solamente su terreni solidi. Come stima approssimata di resistenza o sensibilità in base al valore GI, si può usare un cutoff con

14

approssimazione del 10%. Il test di sensibilità PZA BACTEC è raccomandato soltanto per isolati del complesso M. tuberculosis.

La validità della metodica di test di sensibilità o PZA per micobatteri non tubercolari (MOTT) non è stata accertata.

VALORI ATTESI

Il GI del controllo dovrebbe evidenziare un aumento graduale. Nel flacone di test, il GI può rimanere lo stesso oppure aumentare o diminuire a seconda della sensibilità dei microrganismi testati (vedere gli esempi 1 e 2).

Esempio n. 1: Sensibilità a PZA

Letture GI giornaliere

1 2 3 4 5

Controllo 9 31 74 195 475

Antibiotico 6 9 9 9 4

Esempio n. 2: Letture GI giornaliere resistenza a PZA

Controllo

1 2

7 28

Letture GI giornaliere

3

41

Antibiotico 17 29 40

4

70 120 177 282

68

5 6 7

92 157 244

GI antibiotico

GI controllo %

< 9%

GI antibiotico

GI controllo %

> 11%

Risultati:

4 x 100 = 0,8% Sensibile

475

244 x 100 = 86,5% Resistente

282

Risultati:

I risultati BACTEC si ottengono di norma in 4 – 7 giorni. Le colture a crescita lenta possono talvolta richiedere periodi più lunghi. Non interpretare risultati prima di 4 giorni o dopo 21 giorni.

PERFORMANCE

La tecnica radiometrica BACTEC 460TB, basata su un terreno 7H12 modificato con pH 6,0, è a tutt’oggi l’unica metodica colturale per test di sensibilità a PZA raccomandata da National Committee for Clinical Laboratory Standards.

14,15

In uno studio di Pfyffer et al., i test di sensibilità di M. tuberculosis a PZA hanno dato una concordanza superiore al 96%, comparando terreno e antibiotico BACTEC 460TB PZA a terreno e antibiotico BACTEC MGIT 960 PZA. La durata media del test BACTEC

460TB PZA è stata di 5,4 giorni, escluso il tempo richiesto per ottenere una subcultura con un indice di crescita (GI) di 200.

14

Disponibilità

N. di cat.

Descrizione

442139

442143

Flaconi di coltura BACTEC PZA Test Medium, 4 mL, confezione da 10

BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 test)

442004

445203


Strumento BACTEC 460TB

BIBLIOGRAFIA - Vedere “References” nel testo inglese.

0


Culture Vials


Português

UTILIZAÇÃO PRETENDIDA

O meio de ensaio BACTEC PZA (Middlebrook 7H12 Broth, pH 6,0) é especialmente concebido para realização de testes de sensíbilidade com Mycobacterium tuberculosis contra a pirazinamida (PZA). A principal utilização é com o instrumento

BACTEC 460TB.

RESUMO E EXPLICAÇÃO

A técnica radiométrica BACTEC é usada para testes de sensibilidade antimicrobiana a fármacos anti-micobacterianos primários (estreptomicina, isoniazido, rifampina e etambutol).

1-4 Nesta técnica, é medido de forma quantitativa o 14 CO

2 produzido por micobactérias originárias do metabolismo do substrato marcado com 14 C, presente no meio BACTEC 12B. Se um antimicróbio for adicionado ao meio, os isolados micobacterianos que são susceptíveis aos antimicróbios são inibidos e a quantidade de 14 CO

2 gerado diminui.

Butler e colegas 5 propuseram um método convencional melhorado, para a realização de testes de sensibilidade à PZA, que necessitava de um meio Agar 7H10 especial, com pH de 5,5. Uma das limitações deste método é que a um pH de 5,5, muitos isolados de M. tuberculosis ou não conseguem crescer ou crescem de forma deficiente.

O meio BACTEC 12B não pode ser utilizado em testes de sensibilidade à PZA, uma vez que este fármaco só está activo com um pH baixo.

5 Heifets et al. sugeriram um método radiométrico para testar a sensibilidade à PZA, usando o Meio BACTEC

12B a um pH de 5,5. Este método obrigava a baixar o pH de todos os frascos de 6,8 para 5,5 logo que houvesse sinais de crescimento no frasco.

6 Vários isolados não conseguiram crescer no Meio 12B com um pH de 5,5, embora os resultados gerais obtidos com o Meio 12B a um pH de 5,5 tivessem sido melhores que os obtidos com o Meio 7H10 a um pH de 5,5.

Posteriormente, foi sugerida a adição de gema de ovo para aumentar o crescimento das micobactérias.

7 Embora este procedimento tenha produzido mais resultados, a adição de gema de ovo fresca revelou ser incómoda e pouco prática para

15

a rotina de um laboratório clínico. Após a realização de outros estudos, Salfinger e Heifets, referiram que as micobactérias da PZA aumentaram, com um crescimento do pH do Meio de 5,5 para 6,8.

8 Utilizando uma modificação dos procedimentos de sensibilidade radiométrica acima mencionados, Salfinger et al. recomendaram o uso do Meio BACTEC 12B com um pH entre 5,9 e 6,0 (Meio de Teste BACTEC PZA), com uma concentração de PZA mais elevada que a usada no meio sólido convencional (pH 5,5).

9

PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO

O Meio de Teste BACTEC PZA é um Meio 7H12 modificado, com um pH reduzido de 6,0. Com um pH, a actividade da PZA contra as micobactérias pode ser determinada sem inibir o crescimento da maioria dos isolados M. tuberculosis. Para compensar o pH, é usada uma concentração mais elevada de PZA (100 µg/mL) no teste BACTEC, comparativamente à usada no teste convencional (25 – 50 µg/mL).

O Meio de Teste PZA contém um substrato marcado com 14 metabolizam o substrato marcado e é libertado o 14 CO

2 instrumento BACTEC 460TB testa a presença de 14 CO

2

C. Quando as micobactérias crescem neste meio, estas para a atmosfera acima do Meio dentro do frasco selado. O removendo o gás de dentro do frasco e transferindo-o para um electrómetro, onde o total de ionização é convertido num número chamado Índice de Crescimento (GI).

O índice e total de 14 CO

2 produzido no meio, é directamente proporcional ao índice e total de crescimento no meio.

Quando o fármaco anti-micobacteriano PZA é adicionado ao meio, o crescimento de micobactérias susceptíveis é inibido.

Isto é indicado pela redução da produção de 14 CO

2, comparativamente a uma tendência de crescimento do controlo. Se os organismos forem resistentes, ocorre pouca ou nenhuma supressão de crescimento nos frascos de teste.

REAGENTES

Conteúdo* por frasco (4 mL) de PZA Test Medium (pH final de 6,0 ± 0,2):

Meio líquido 7H9 .............................................. 0,47% p/v

Hidrolisado de Caseína ..................................... 0,10% p/v

Albumina sérica de bovino .............................. 0,50% p/v

Catalase.............................................................. 192 unidades

Substrato 14 C...................................................... 4 µCi

Água desionizada (mL) ..................................... 4 q.s.

*Complementados de modo a atingirem os critérios de desempenho.

Advertências e precauções:

Para diagnóstico in vitro.

Este produto contém borracha natural desidratada.

Nas amostras clínicas podem existir microrganismos patogénicos, incluindo vírus de hepatites e o vírus da imunodeficiência humana. No manuseamento de todos os itens contaminados com sangue e outros fluidos corporais, devem ser seguidas as “Precauções Padrão” 10-13 e as linhas de orientação da instituição.

Os procedimentos devem ser realizados em câmaras de segurança adequadas e a área deve ser devidamente ventilada. Os frascos inoculados devem ser testados num instrumento BACTEC 460TB, equipado com uma câmara BACTEC 460TB que fornece ar filtrado HEPA e uma pressão negativa na área de teste do instrumento.

Antes de ser utilizado, cada frasco deve ser examinado relativamente a sinais de danos, ou contaminação, tais como turvação, abaulamento ou depressão do septo. NÃO UTILIZE nenhum frasco que apresente sinais de contaminação. Um frasco contaminado pode conter uma pressão positiva. A contaminação do frasco pode não ser imediatamente aparente. Os frascos que apresentem sinais de danos devem ser eliminados antes da inoculação. Em raras ocasiões, o gargalo do frasco de vidro poderá estar rachado e partir-se durante a remoção da tampa de encaixe, ou durante a manipulação. Igualmente, em ocasiões raras, um frasco poderá não se encontrar suficientemente selado. Em ambos os casos, poderá ocorrer uma fuga ou o derrame do conteúdo do frasco, especialmente se o frasco for invertido. Se o frasco tiver sido inoculado, trate a fuga ou o derrame com cuidado pois podem existir organismos/agentes patogénicos. Antes de eliminar, esterilize todos os frascos inoculados em autoclave.

Para minimizar a possibilidade de fugas durante a inoculação da amostra dentro dos frascos de cultura, utilize seringas com agulhas fixas ou pontas da marca Luer-Lok.

Contaminação

Deverá tomar precauções para evitar a contaminação da amostra durante a colheita e a inoculação dentro do frasco

BACTEC.

Uma amostra contaminada apresentará uma leitura positiva, mas não indicará um resultado clinicamente relevante. Esta contaminação poderá resultar de uma manutenção inadequada das agulhas e tubos BACTEC, limpeza deficiente do septo ou avaria da unidade de aquecimento das agulhas BACTEC (consulte o Manual de Manutenção e Funcionamento do

Instrumento). Tal determinação deverá ser efectuada pelo utilizador com base em factores tais como o tipo de organismos recuperados, a ocorrência do mesmo organismo em culturas múltiplas, a história do doente e as verificações do equipamento etc.

Instruções de armazenamento

Os frascos de Meio de Teste BACTEC PZA devem ser conservados em local fresco (2 – 25°C) e seco. Escreva a data de validade no exterior de cada embalagem e utilize primeiro a mais antiga em stock.

É uma boa prática separar os materiais radioactivos dos outros materiais, conservando-os numa câmara apenas acessível a pessoal autorizado. A câmara deve estar marcada com as palavras “Cuidado: Materiais Radioactivos”.

Não exponha o meio à luz directa. Analise sempre cada um dos frascos no instrumento BACTEC 460TB para determinar uma atmosfera de 5 – 10% CO

2 e para separar os frascos com leituras de fundo muito altas. Se num exame inicial um frasco tiver uma leitura de GI 20 ou mais, deite-o fora.

16

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Devem ser criadas culturas puras de isolados de M. tuberculosis no Meio BACTEC 12B para serem usadas para este teste quando estiverem numa fase de crescimento activa. Não utilize culturas velhas, refrigeradas, ou culturas que registaram leituras GI altas durante mais de um dia.

PROCEDIMENTO

Material fornecido


Material necessário mas não fornecido



BACTEC 460TB instrument

Seringa de tuberculina com agulha permanentemente fixa

}

Ver “Apresentação”

Seringa de 5 mL

Solução desinfectante

Álcool Isopropílico a 70%

Preparação do meio do fármaco a. A PZA liofílizada é fornecida em separado com um Fluído Reconstituinte PZA especial (FR).

b. Limpe o topo do frasco com uma gaze embebida em álcool. Adicione assepticamente, com a ajuda de uma seringa, 5 mL de FR ao frasco com PZA liofílizada. Misture bem. Quando completamente dissolvido, produzirá uma solução stock de 4000 µg PZA/mL.

c.

Antes da inoculação, após limpar o topo do frasco com uma gaze com álcool, adicione 0,1 mL da solução PZA em stock a cada um dos frascos que contêm meio PZA, usando para o efeito uma seringa de 1 mL. A concentração de

PZA resultante é de 100 µg PZA/mL de meio.

Precauções: Não prepare a PZA com água ou qualquer outro diluente para além do Fluído Reconstituinte. O volume de FR no frasco pode variar. Meça e retire exactamente 5 mL do conteúdo do frasco quando estiver a reconstituir o pó

PZA. A adição da quantidade correcta de fármaco no meio, é essencial para o desempenho do teste de sensibilidade.

Adicione exactamente 0,1 mL de solução de stock, usando uma seringa com 1 mL de tuberculina.

Preparação do controlo

É utilizado como controlo um Meio de Teste PZA sem fármaco. Adicione 0,1 mL de FR ao frasco do controlo antes da inoculação da cultura. O Fluído Reconstituinte contém uma substância promotora do crescimento denominada Estearato de Polioxietileno (POES). É necessário ter o Fluído Reconstituinte em todos os frascos inoculados.

Preparação do inóculo

Apenas deverão ser usadas culturas de crescimento activo na preparação deste teste. Não utilize culturas armazenadas, que sejam demasiado grandes, ou culturas desenvolvidas noutros meios.

a. Deverá ser efectuada uma repicagem da cultura de teste para um frasco contendo Meio BACTEC 12B (Catálogo nº

442004) complementado com 0,1 mL de FR por frasco.

b. Incube a 37°C ± 1°C e analise diariamente o frasco no instrumento BACTEC 460TB.

c.

Quando o GI diário chegar a 300 – 499, use este frasco para inoculação do teste de sensibilidade.

d. Se o GI for superior a 300 – 499, adicione Meio 12B fresco ao frasco de crescimento inicial, de acordo com a tabela abaixo. Se diluído, registe a diluição usada para futura referência.

GI

GI

GI

GI

300 – 499: Sem diluição

500 – 599: Adicione 1,0 mL de Meio 12B



GI

GI



Misture bem antes de usar. Evite a utilização de frascos com leituras de 999, ou seja, que ultrapassaram o pico do

GI.

Inoculação do teste a. Limpe o topo de todos os frascos que contêm cultura, utilizando uma gaze embebida em álcool a 70%, antes de inserir uma seringa.

b. Misture bem a cultura de teste num Meio 12B, usando uma seringa de agulha fixa contendo 1,0 mL de tuberculina.

c.

Adicione 0,1 mL deste inóculo ao frasco do controlo e ao frasco da PZA. NÃO DILUA A CULTURA PARA O

CONTROLO como é recomendado para outros fármacos (ex: isoniazida, estreptomicina, etambutol, rifampina, etc).

d. Desinfecte o topo do septo de borracha com um desinfectante próprio e, em seguida, limpe com uma gaze embebida em álcool a 70%.

NOTA: Enquanto estiver a realizar o teste, os frascos devem ser manuseados com muito cuidado. Os septos dos frascos podem estar contaminados com organismos de cultura.

Incubação e teste a. Todos os frascos inoculados (incluindo os dos controlos) devem ser analisados no instrumento BACTEC 460TB antes da incubação para assegurar uma atmosfera de 5% CO

2 ser analisados imediatamente após a inoculação.

. Se não tiver sido feito anteriormente, os frascos podem

17

b. Incube os frascos a 37°C ± 1°C.

c.

Analise diariamente os frascos com PZA e os frascos de controlo no instrumento BACTEC 460TB, até o GI do frasco de controlo atingir 200 ou mais.

Controlo de qualidade

NÃO utilize os frascos de cultura que tenham ultrapassado o prazo de validade.

Não utilize frascos que exibam rachas ou defeitos. Elimine os frascos conforme recomendado.

Para qualquer informação sobre o controlo de qualidade do instrumento BACTEC 460TB, consulte o Manual de

Manutenção e Funcionamento para o instrumento BACTEC 460TB e 460.

Tal como acontece com qualquer outro teste de sensibilidade a fármacos, a qualidade do inóculo é muito importante.

Utilize apenas culturas de crescimento activo no Meio 12B com a diluição adequada.

Sob circunstâncias ideais, a leitura do controlo deverá ser ≥ 200 GI ao fim de 4 a 7 dias. Se o controlo alcançar um GI de 200 em menos de 4 dias, isto indica que o inóculo era demasiado pesado. A menos que o resultado não apresente quaisquer dúvidas, o teste deve ser repetido. Se o controlo alcançar um GI de 200 após 7 – 10 dias, isto indica que o inóculo é de fraca qualidade (i.e., fraca viabilidade, leitura GI inicial fraca do inóculo ou diluição fraca) e os resultados podem estar errados.

O GI dos frascos que contêm o controlo e o fármaco deve ser seguido com atenção, até serem alcançados resultados perfeitamente claros. Quando houver dúvidas, repita o teste. Se o GI do frasco do fármaco apresentar uma diferença aproximada de 10% em relação ao do controlo, analise os frascos durante mais 1 a 3 dias. Isto ajudará a formar uma opinião sobre o padrão de sensibilidade da cultura de teste. Se os resultados não forem interpretáveis, repita o teste com um isolado desenvolvido no BACTEC 12B Medium fresco (Catálogo nº. 442004). Use sempre o controlo H37Rv (ATCC 27294) como controlo susceptível e o H37Rv PZA-R (ATCC 35828) como controlo resistente.

Os requisitos do controlo de qualidade devem ser efectuados de acordo com os regulamentos ou requisitos de acreditação locais, nacionais e/ou federais aplicáveis e com os procedimentos padrão de controlo de qualidade do laboratório. É recomendado que o utilizador consulte as orientações NCCLS e os regulamentos CLIA relativamente às práticas de controlo de qualidade apropriadas.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

O instrumento lê directamente numa escala de Índice de Crescimento de 0 – 999. O Índice de Crescimento é, na realidade, uma medida de actividade metabólica dos organismos no meio. Quando o GI dos frascos de controlo atingem os 200 ou mais, interprete os resultados da seguinte forma:

O GI no frasco do fármaco é < 9% do que o GI no frasco do controlo

O GI no frasco do fármaco é > 11% do que o GI no frasco do controlo

O GI no frasco do fármaco está entre 9% e 11% (inclusive) em relação ao

GI no frasco do controlo

= Sensível

= Resistente

= Fronteira

LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO

O valor do Índice de Crescimento reflecte a taxa e o total de crescimento ocorrido no meio, mas não pode ser usado para quantificar unidades formadoras de colónias por mL. A morfologia e pigmentação características das colónias podem ser determinadas apenas em meios sólidos. O “cut-off” aproximado de 10% pode ser usado como uma estimativa aproximada de resistência ou sensibilidade baseada nos valores GI. O teste de sensibilidade BACTEC PZA é recomendado apenas para isolados complexos de M. tuberculosis. Não é conhecida a utilidade da PZA ou dos métodos de teste de sensibilidade para outras micobactérias além da tuberculosis (MOTT).

VALORES ESPERADOS

Deverá verificar-se um crescimento gradual do GI do frasco do controlo. No frasco do teste, o GI pode permanecer igual, ou pode aumentar ou diminuir conforme a sensibilidade dos organismos testados (ver exemplo 1 e 2).

Normalmente os resultados BACTEC são obtidos ao fim de 4 a 7 dias. Ocasionalmente, as culturas de crescimento lento podem levar mais tempo. Não interprete os resultados antes de passarem 4 dias ou tendo passado mais de 21 dias.

Exemplo 1: Sensibilidade PZA

Leituras GI diárias

Controlo

Fármaco

1 2 3 4 5

9 31 74 195 475

6 9 9 9 4

GI do fármaco

% GI do controlo

< 9%

4 x 100 = 0,8% Sensível

475

Resultados:

Exemplo 2: Leituras GI diárias da Resistência à PZA

Leituras GI diárias

Control

Fármaco

1 2 3

7 28 41

17 29 40

4 5 6 7

70 120 177 282

68 92 157 244

GI do fármaco

% GI do controlo

> 11%

Resultados:

244 x 100 = 86,5% Resistente

282

CARACTERISTICAS DO DESEMPENHO

Utilizando um meio 7H12 modificado com um pH de 6,0, a técnica radiométrica BACTEC 460TB é, até à data, o único método baseado em culturas para testes de sensibilidade à PZA, que é recomendado pelo National Committee for Clinical

Laboratory Standards.

14,15

Num estudo realizado por Pfyffer et al., os testes de sensibilidade da M. tuberculosis à PZA resultaram num acordo de mais de 96%, quando se comparou o Fármaco e Meio PZA BACTEC 460TB e o Fármaco e Meio PZA BACTEC MGIT 960. O tempo médio de resposta para o teste PZA BACTEC 460TB foi de 5,4 dias, não incluindo o tempo necessário para se obter uma repicagem radiométrica com um Índice de Crescimento (GI) de 200.

14

18

Apresentação

Nº de Cat.

Descrição

442139

442143

BACTEC PZA Test Medium Culture Vials, 4 mL, conteúdo para 10 testes

BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (50 testes)

442004

445203



BIBLIOGRAFIA: Consulte "References" no texto em Inglês.

Somente para uso diagnóstico in vitro

Importado e Distribuído no Brasil por:

Becton Dickinson Indústrias Cirúrgicas Ltda

Rua Cyro Correia Pereira 550, Curitiba – Paraná-Brasil

CNPJ 21.551.379/0013-31

Serviço de Suporte Tecnico (11) 5185-9961

Registro ANVISA nº 10033430300

Centro de Relacionamento com o Cliente: 0800 0555 654

0


Culture Vials


Español

USO PREVISTO

BACTEC PZA Test Medium (medio BACTEC para la prueba PZA) (caldo Middlebrook 7H12, pH 6,0) fue desarrollado especialmente para analizar la sensibilidad de Mycobacterium tuberculosis a la pirazinamida (PZA). Se utiliza principalmente con el instrumento BACTEC 460TB.

RESUMEN Y EXPLICACION

La técnica radiométrica de BACTEC se utiliza para analizar la sensibilidad antimicrobiana de medicamentos antimicobacterianos primarios (estreptomicina, isoniacida, rifampina y etambutol) 1-4 . Con esta técnica, se mide cuantitativamente el

14 CO

2 producido por las micobacterias durante el metabolismo del substrato marcado con 14 C presente en el BACTEC 12B

Medium. Si se añade un agente antimicrobiano al medio, se inhiben los aislados micobacterianos sensibles al mismo y se reduce la producción de 14 CO

2

.

Butler et al.

5 propusieron un método convencional mejorado para analizar la sensibilidad a la pirazinamida. Este método requería un medio especial de agar 7H10 con un pH 5,5. Una desventaja de este método es que muchos aislados de M.

tuberculosis no crecen o crecen débilmente con un pH 5,5.

No se puede usar el BACTEC 12B Medium para analizar la sensibilidad a la PZA porque este medicamento es activo solamente a valores con pH más bajos 5 . Heifets et al. sugirieron un método radiométrico para analizar la sensibilidad a la

PZA mediante el uso del BACTEC 12B Medium con un pH 5,5. Para este método, era necesario reducir el pH en cada frasco de 6,8 a 5,5 una vez comenzado el crecimiento dentro del frasco 6 . Con un pH 5,5, varios aislados no crecieron en el BACTEC

12B Medium aunque los resultados fueron generalmente mejores que los que se obtuvieron con el medio 7H10 con un pH

5,5. Posteriormente, se sugirió que se añadiera yema de huevo para facilitar el crecimiento de las micobacterias 7 . Aunque así se obtuvieron más resultados publicables, se determinó que la adición de yema fresca era incómoda e impráctica en el laboratorio clínico de rutina. Estudios adicionales realizados por Salfinger y Heifets demostraron que la concentración inhibitoria mínima (MIC) de la PZA se incrementó con el aumento del pH del medio de 5,5 a 6,8 6 . Salfinger et al.

modificaron los procedimientos radiométricos de sensibilidad anteriormente indicados y recomendaron el uso del BACTEC

12B Medium con un pH entre 5,9 y 6,0 (BACTEC PZA Test Medium) con una concentración de PZA más elevada que la que se usa en el medio sólido convencional (pH 5,5) 9 .

PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO

BACTEC PZA Test Medium es un medio 7H12 modificado con un pH reducido de 6,0. A este pH, la actividad de la PZA frente a las micobacterias puede detectarse sin inhibir el crecimiento de la mayoría de los aislados de M. tuberculosis. Para compensar el aumento del pH, se usa una concentración de PZA más elevada (100 µg/mL) en la prueba BACTEC que en la prueba convencional (25 – 50 µg/mL).

PZA Test Medium contiene un substrato marcado con 14 C. Cuando las micobacterias crecen en este medio, metabolizan el substrato marcado y desprenden 14 CO

2 a la atmósfera sobre el medio en el interior del frasco sellado. El instrumento

BACTEC 460TB detecta la presencia de 14 CO

2 extrayendo el gas del frasco y transfiriéndolo a un electrómetro, donde el grado de ionización se expresa en términos de un valor llamado Índice de crecimiento (“Growth Index”, o GI).

La velocidad y cantidad de producción de 14 CO

2 en el medio son directamente proporcionales a la velocidad y al índice de crecimiento bacteriano en el medio. Cuando se añade el medicamento antimicobacteriano PZA al medio, se inhibe el crecimiento de micobacterias sensibles. Esto se demuestra por la reducción en la producción de dentro del frasco.

14 CO

2 en comparación con una tendencia creciente en el control. Si los organismos son resistentes, se ve poca o ninguna supresión del crecimiento

19

REACTIVOS

Contenido* por frasco (4 mL) del PZA Test Medium (pH final 6,0 ± 0,2):

Caldo 7H9 ........................................................... 0,47% p/v

Hidrolizado de caseína ...................................... 0,10% p/v

Albúmina sérica bovina ..................................... 0,50% p/v

Catalasa ........................................................... 192 unidades

Substrato de 14 C.................................................. 4 µCi

Agua desionizada (mL)....................................... 4 q.s.

*Con suplemento necesario para alcanzar los criterios de rendimiento.

Advertencias y precauciones:

Para uso diagnóstico in vitro.

Este producto contiene caucho natural seco.

En las muestras clínicas puede haber microorganismos patógenos, como los virus de la hepatitis y el virus de la inmunodeficiencia humana. Para la manipulación de todos los elementos contaminados con sangre u otros líquidos corporales deben seguirse las “Precauciones estándar” 10-13 y las directrices del centro.

Los procedimientos se deben llevar a cabo en una cabina de seguridad adecuada y en una zona bien ventilada. Los frascos inoculados deben analizarse en un instrumento BACTEC 460TB provisto de una campana BACTEC 460TB que proporcione aire HEPA filtrado y presión negativa en la zona de uso del instrumento.

Se debe examinar cada frasco antes de usarlo para detectar indicios de daños, deterioro o contaminación, por ejemplo, turbiedad o membrana hinchada o hundida. NO SE DEBE USAR ningún frasco que presente indicios de contaminación. Un frasco contaminado podría contener presión positiva. Es posible que la contaminación de un frasco no se vea fácilmente.

Los frascos que muestren indicios de daños deben ser desechados antes de la inoculación. En raras ocasiones, el cuello del frasco puede estar rajado y puede romperse al quitar el tapón a presión o al manipular el frasco. También, en raras ocasiones, es posible que un frasco no esté bien precintado. En ambos casos, el contenido de los frascos puede gotear o derramarse, especialmente si se invierte el frasco. Si se ha inoculado el frasco, se extremarán las precauciones, ya que pueden existir organismos y agentes patógenos en el líquido derramado. Todos los frascos inoculados deben esterilizarse en autoclave antes de desecharse.

Para reducir a un mínimo la posibilidad de pérdidas durante la inoculación de muestras en los frascos de cultivo, usar jeringas de aguja fija o puntas Luer-Lok.

Contaminación

Se deben extremar las precauciones para evitar contaminar la muestra durante la extracción e inoculación en el frasco BACTEC.

Una muestra contaminada dará una lectura positiva pero no indicará un resultado clínicamente relevante. La contaminación puede ser resultado del mantenimiento inadecuado de las agujas y los tubos BACTEC, de una desinfección inadecuada de la membrana o del funcionamiento defectuoso del sistema BACTEC de calentamiento de las agujas (vea el

Manual de uso y mantenimiento del instrumento). El usuario debe tomar tal determinación teniendo en cuenta factores tales como tipo de organismo aislado, presencia del mismo organismo en varios cultivos, historia clínica del paciente, comprobación adecuada del estado del equipo, etc.

Instrucciones para el almacenamiento

Los frascos de BACTEC PZA Test Medium deben almacenarse en un lugar fresco (entre 2 y 25 °C) y seco. Escribir la fecha de caducidad en el exterior de cada paquete y usar primero los paquetes más antiguos.

Es recomendable separar los materiales radioactivos, almacenándolos en un armario accesible solamente al personal autorizado. El armario debe tener un letrero que indique “Precaución: Materiales radioactivos”.

No exponer el medio a la luz brillante directa. Siempre se debe analizar cada frasco en el instrumento BACTEC 460TB para establecer un nivel de un 5 a 10% de CO

2 en la atmósfera dentro del frasco y para eliminar los frascos que demuestren valores de fondo altos. Desechar cualquier frasco con un valor de GI de 20 ó más en el análisis inicial.

PREPARACION DE LAS MUESTRAS

Los cultivos puros aislados de M. tuberculosis deben prepararse nuevamente en el BACTEC 12B Medium y deben utilizarse para esta prueba cuando estén en una fase activa de crecimiento. No utilizar cultivos refrigerados antiguos ni tampoco los que demuestren valores máximos de GI durante más de un día.

PROCEDIMIENTO

Materiales suministrados


Materiales necesarios pero no suministrados

BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (equipo de 50 pruebas)


Instrumento BACTEC 460TB

Jeringa de tuberculina de aguja fija

Jeringa de 5 mL

Solución desinfectante

Alcohol isopropílico al 70%

} véase “Disponibilidad”

Preparación del medio con medicamento a. La PZA liofilizada se suministra por separado junto con un fluido especial de reconstitución de PZA (RF).

20

b. Limpiar la parte superior del frasco con un trozo de algodón empapado en alcohol. Inyectar asépticamente con una jeringa 5 mL del RF al frasco de PZA liofilizada. Mezclar bien. Una vez disuelta por completo, se obtendrá una solución concentrada de 4000 µg de PZA por mL.

c.

Antes de la inoculación y después de limpiar la parte superior del frasco con un trozo de algodón empapado en alcohol, usar una jeringa de 1 mL para añadir 0,1 mL de la solución concentrada de PZA a cada frasco del medio con

PZA. La concentración de PZA resultante es de 100 µg de PZA por mL del medio.

Precauciones: No preparar la PZA con agua ni con cualquier otro diluyente que no sea el RF. El volumen del RF en el frasco puede variar. Al reconstituir el polvo de PZA, medir exactamente 5 mL del frasco suministrado. El rendimiento de la prueba de sensibilidad depende de la medida precisa de la cantidad del medicamento que se añada al medio.

Utilizando una jeringa de tuberculina de 1 mL, añadir exactamente 0,1 mL de la solución concentrada.

Preparación del control

Como control, se usa un PZA Test Medium sin añadir ningún medicamento. Añadir 0,1 mL del RF al frasco de control antes de inocular el cultivo. El RF contiene estearato de polioxietileno (POES), sustancia que fomenta el crecimiento. Es necesario tener el RF en todos los frascos inoculados.

Preparación del inóculo

En la preparación de esta prueba, se deben usar solamente los cultivos que están en una fase activa de crecimiento. No deben usarse cultivos demasiado crecidos, cultivos almacenados ni los que han crecido en otros medios.

a. El cultivo de prueba debe subcultivarse en un frasco de BACTEC 12B Medium (Nº de catálogo 442004) suplementado con 0,1 mL de RF por frasco.

b. Incubar a 37 °C ± 1 °C y analizar el frasco diariamente en el instrumento BACTEC 460TB.

c.

Una vez que el GI diario alcance un valor de 300 a 499, utilizar este frasco para la inoculación de la prueba de sensibilidad.

d. Si el GI supera los 300 a 499, añadir el BACTEC 12B Medium de nuevo al frasco de crecimiento inicial de acuerdo con la tabla que aparece a continuación. Si se diluye, anotar la dilución utilizada para referencia posterior.

GI

GI

GI

GI

GI

GI

300 – 499: Sin diluir

500 – 599: Añadir 1,0 mL del BACTEC 12B Medium





Mezclar bien antes de usar. Evitar los frascos con un valor de 999 que han superado el GI máximo.

Inoculación de la prueba a. Limpiar la parte superior de cada frasco con un trozo de algodón empapado en alcohol al 70% antes de introducir la jeringa.

b. Mezclar bien el cultivo de prueba en el BACTEC 12B Medium, usando una jeringa de tuberculina de aguja fija de 1,0 mL.

c.

Añadir 0,1 mL de este inóculo al frasco de control y al frasco de PZA. NO DILUIR EL CULTIVO PARA EL CONTROL, tal como se recomienda en el caso de otros medicamentos (por ejemplo, isoniacida, estreptomicina, etambutol, rifampina, etc.).

d. Desinfectar la parte superior de la membrana de goma con un desinfectante adecuado y luego limpiar con un trozo de algodón empapado en alcohol al 70%.

NOTA: Debe tenerse cuidado al manipular los frascos durante la prueba. Los organismos de cultivo pueden haber contaminado la membrana de los frascos.

Incubación y análisis a. Todos los frascos inoculados (incluso los frascos de control) deben analizarse en el instrumento BACTEC 460TB antes de la incubación a fin de asegurar una atmósfera con 5% de CO

2 pueden analizarse inmediatamente después de la inoculación.

. Si no se ha hecho esto antes, los frascos b. Incubar los frascos a 37 °C ± 1 °C.

c.

Analizar los frascos de PZA y de control diariamente en el instrumento BACTEC 460TB hasta que el GI del frasco de control alcance un valor de 200 ó más.

Control de calidad

NO UTILIZAR los frascos después de la fecha de caducidad.

No utilizar los frascos que muestran indicios de rajaduras o defectos. Desechar los frascos en la forma apropiada.

Para obtener información sobre el control de calidad para el instrumento BACTEC 460TB, consulte el Manual del usuario del instrumento BACTEC 460TB y 460.

Como en cualquier prueba de sensibilidad con medicamentos, la calidad del inóculo es muy importante. Utilizar solamente los cultivos que estén creciendo activamente en el BACTEC 12B Medium con una dilución adecuada.

En circunstancias ideales, el control debe tener un GI ≥ de 200 en 4 a 7 días. Si se obtiene un GI de 200 en el control antes del cuarto día, esto indica que el inóculo fue demasiado grande. A menos que los resultados sean bien claros, la prueba debe repetirse. Si se obtiene un GI de 200 en el control después de 7 a 10 días, indica un inóculo de baja calidad (es decir, viabilidad baja, valor inicial de GI bajo del inóculo o una dilución pobre) y los resultados pueden ser erróneos. Los valores de GI en los frascos de control y con medicamento deben vigilarse con cuidado hasta que se obtengan resultados bien definidos. Si los resultados son inciertos, repetir la prueba. Si el GI en el frasco con medicamento se acerca al 10% del que se obtiene en el frasco de control, continuar la prueba durante 1 a 3 días más. Así será más fácil juzgar el patrón de sensibilidad del cultivo de prueba. Si no se pueden interpretar los resultados, repetir la prueba con un aislado que haya crecido en un BACTEC 12B Medium reciente (Nº de catálogo 442004). Siempre se debe usar H37Rv (ATCC 27294) como control sensible y H37Rv PZA-R (ATCC 35828) como control resistente.

21

El control de calidad debe llevarse a cabo conforme a la normativa local y/o nacional, a los requisitos de los organismos de acreditación y a los procedimientos estándar de control de calidad del laboratorio. Se recomienda consultar las instrucciones de NCCLS y normativas de CLIA correspondientes para obtener información acerca de las prácticas adecuadas de control de calidad.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

El índice de crecimiento (GI) se lee directamente en el instrumento, en una escala de 0 a 999. El índice de crecimiento es en realidad una medida de la actividad metabólica de los organismos en el medio. Si el GI del frasco de control alcanza un valor de 200 o más, los resultados deben interpretarse del siguiente modo:

GI en el frasco con medicamento es < 9% del GI en el frasco de control

GI en el frasco con medicamento es > 11% del GI en el frasco de control

GI en el frasco con medicamento está entre 9% y 11% del GI en el frasco de control

= Sensible

= Resistente

= Indeterminado

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

El índice de crecimiento refleja la velocidad y el grado de crecimiento que se produce en el medio, pero no se puede usar para cuantificar las unidades formadoras de colonias por mL. Las características morfológicas y de pigmentación de las colonias sólo se pueden determinar en medios sólidos. El límite aproximado del 10% puede usarse como un índice aproximado de resistencia o sensibilidad basado en el GI obtenido. Se recomienda usar BACTEC PZA Susceptibility Test solamente para analizar los aislados del complejo M. tuberculosis. No se conoce la utilidad de la PZA ni del método de la prueba de sensibilidad para las micobacterias diferentes a M. tuberculosis (MOTT).

VALORES ESPERADOS

Debe haber un aumento gradual del GI en el frasco de control. En el frasco de prueba, el GI puede no cambiar, o puede aumentar o disminuir de acuerdo con la sensibilidad de los organismos que se analicen (vea los ejemplos 1 y 2).

Por lo general, se obtienen resultados en el instrumento BACTEC en 4 a 7 días. A veces, hay cultivos de crecimiento lento que tardan más en dar resultados. Los resultados no deben leerse antes de los 4 días ni después de los 21 días.

Ejemplo Nº 1: Sensibilidad a la PZA

Valores diarios del GI

Control

1 2

9 31

Antibiótico 6 9

3

74 195 475

9

4

9

5

4

GI del medicamento

GI del control %

< 9%

4 x 100 = 0,8% Sensible

475

Resultados:

Ejemplo Nº 2: Resistencia a la PZA Valores diarios del GI

Valores diarios del GI GI del medicamento

GI del control %

Control

1 2

7 28

3

41

Antibiótico 17 29 40

4 5 6 7

70 120 177 282

68 92 157 244 >11%

244 x 100 = 86,5% Resistente

282

Resultados:

CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO

Sobre la base del medio 7H12 modificado con un pH 6,0, la técnica radiométrica de BACTEC 460TB es, hasta la fecha, el

único método basado en cultivo para analizar la sensibilidad a la PZA, recomendado por la National Committee for Clinical

Laboratory Standards 14,15 .

En un estudio realizado por Pfyffer et al., la prueba de sensibilidad de M. tuberculosis a la PZA generó una concordancia de más del 96%, al comparar el BACTEC 460TB PZA Medium y el medicamento con el BACTEC MGIT 960 PZA Medium y el medicamento. El tiempo de respuesta promedio del BACTEC 460TB PZA Test fue de 5,4 días, sin incluir el tiempo necesario para obtener un subcultivo radiométrico con un índice de crecimiento (GI) de 200 14 .

Disponibilidad

N.º ref.

Descripción

442139

442143

BACTEC PZA Test Medium, frascos de cultivo de 4 mL, caja de 10

BACTEC PZA Drug/Reconstituting Fluid Kit (equipo de 50 pruebas)

442004

445203


Instrumento BACTEC 460TB

REFERENCIAS: Ver “References” en el texto en inglés.

22

23

%

O

Becton, Dickinson and Company

7 Loveton Circle

Sparks, MD 21152 USA

800-638-8663 ww.bd.com/ds

$ Benex Limited

Rineanna House

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BACTEC PZA Test Medium Culture Vials

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