Dokument_1. - OPUS Würzburg
Aus der Klinik für Anaesthesiologie der Universität Würzburg Direktor: Professor Dr. med. N. Roewer Untersuchungen zur Modulation der interstitiellen Laktatkonzentration im isoliert perfundierten Skelettmuskel der Ratte durch Kalzium, Koffein, Ryanodin und Dantrolen im Rahmen der Entwicklung eines minimal-invasiven Verfahrens zur Diagnostik der maligne Hyperthermie Veranlagung Inaugural – Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg Vorgelegt von Frank Schuster aus Herlheim Würzburg, September 2002 Referent : Prof. Dr. N. Roewer Korreferent : Prof. Dr. C.-A. Greim Dekan : Prof. Dr. V. ter Meulen Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2002 Der Promovend ist Arzt im Praktikum Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG........................................................................................................... 1 1.1 Maligne Hyperthermie ....................................................................................... 1 1.1.1 Definition....................................................................................................... 1 1.1.2 Historie und Epidemiologie ........................................................................... 1 1.1.3 Physiologischer Erregungs-Kontraktions-Ablauf .......................................... 1 1.1.4 Zelluläre Energiegewinnung ......................................................................... 2 1.1.5 Pathophysiologie .......................................................................................... 2 1.1.6 Klinik und Therapie ....................................................................................... 2 1.1.7 Diagnostik der malignen Hyperthermie Veranlagung ................................... 3 1.1.8 Pharmakologie von Koffein, Ryanodin und Dantrolen .................................. 4 1.2 Mikrodialyse ....................................................................................................... 5 1.2.1 Geschichte der Mikrodialyse......................................................................... 5 1.2.2 Prinzip der Mikrodialyse................................................................................ 5 1.2.3 Definition der Recovery ................................................................................ 6 1.2.4 Möglichkeiten der Recovery-Bestimmung .................................................... 7 1.2.5 Beeinflussende Faktoren .............................................................................. 8 1.2.6 Perspektiven ................................................................................................. 9 1.3 2 Fragestellung ..................................................................................................... 9 METHODIK ........................................................................................................... 10 2.1 Materialien ........................................................................................................ 10 2.1.1 Mikrodialysesonden .................................................................................... 10 2.1.1.1 Eigenschaften und Pflege ....................................................................... 10 2.1.1.2 Kalibrierung der Sonden in-vitro.............................................................. 10 2.1.2 Substanzen und Material ............................................................................ 10 2.1.2.1 Pipetten ................................................................................................... 10 2.1.2.2 Systemische und lokale Perfusionslösungen.......................................... 11 2.1.3 Geräte......................................................................................................... 11 2.1.4 Versuchstiere.............................................................................................. 12 2.2 Ermittlung der Standardkurven ...................................................................... 12 2.2.1 Standardkurve für Laktat ............................................................................ 12 2.2.2 Standardkurve für Koffein ........................................................................... 13 Inhaltsverzeichnis 2.3 Versuchsaufbau ............................................................................................... 14 2.3.1 Versuchsbedingungen ................................................................................ 14 2.3.2 Versuchsaufbau für die Bestimmung der in-vitro recovery ......................... 14 2.3.2.1 Ermittlung der relative recovery von Laktat............................................. 14 2.3.2.2 Ermittlung der relative loss recovery von Koffein .................................... 15 2.3.2.3 Ermittlung der relative loss recovery von Kalzium .................................. 15 2.3.3 Isolierte Organperfusion des Skelettmuskels der Ratte.............................. 15 2.3.3.1 Präparation der Versuchstiere ................................................................ 15 2.3.3.2 Basale Laktatkonzentrationen in beiden Hinterläufen............................. 17 2.3.3.3 Einfluss der Osmolarität des Mikrodialyse-Perfusats auf die Laktatkonzentration ............................................................................................... 17 2.3.3.4 Einfluss von Kalzium im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration ............................................................................................... 17 2.3.3.5 Einfluss von Koffein im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration ............................................................................................... 17 2.3.3.6 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 0,25 µM sowie 1 µM Ryanodinlösung ................................................................................. 18 2.3.3.7 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung .................................................................................................... 18 2.3.3.8 Perfusionskontrolle.................................................................................. 18 2.4 Probenanalyse ................................................................................................. 19 2.5 Histologische Untersuchung der Muskelpräparate...................................... 19 2.6 Statistik ............................................................................................................. 19 3 ERGEBNISSE ....................................................................................................... 20 3.1 Bestimmung der relative recovery und der relative loss recovery ............. 20 3.1.1 Bestimmung der relative recovery von Laktat in-vitro................................. 20 3.1.2 Bestimmung der relative loss recovery von Koffein in-vitro ........................ 20 3.1.3 Bestimmung der relative loss recovery von Kalzium in-vitro ...................... 21 3.2 Ergebnisse der isolierten Organperfusion .................................................... 22 3.2.1 Basale Laktatkonzentrationen in beiden Hinterläufen ................................ 22 3.2.2 Einfluss der Osmolarität des Mikrodialyse-Perfusats auf die Laktatkonzentration................................................................................................... 23 Inhaltsverzeichnis 3.2.3 Einfluss von Kalzium im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration................................................................................................... 24 3.2.4 Einfluss von Koffein im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration................................................................................................... 25 3.2.5 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 0,25 µM sowie 1 µM Ryanodinlösung ..................................................................................... 26 3.2.6 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung ........................................................................................................ 27 3.3 Histologische Untersuchung der Muskelpräparate...................................... 28 4 DISKUSSION ........................................................................................................ 29 5 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................ 34 6 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................. 35 7 ANHANG .............................................................................................................40 Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ADP Adenosindiphosphat ATP Adenosintriphosphat Ca 2+ Kalzium cAMP Zyklisches Adenosintriphosphat Cl- Chlorid CO2 Kohlendioxid Da Dalton G Gauge G-Protein Guanylnucleotid Protein H2O2 Wasserstoffperoxyd IVCT in-vitro-Kontraktur-Test K+ Kalium MH Maligne Hyperthermie n Versuchszahl Na 2+ Natrium NAD+ Nicotinamidadenindinucleotid [oxidierte Form] NADH Nicotinamidadenindinuleotid [reduzierte Form] O2 Sauerstoff pH Potentia hydrogenii Pi Anorganisches Phosphat RyR Ryanodin-Rezeptor 1 Einleitung 1 1 EINLEITUNG 1.1 1.1.1 Maligne Hyperthermie Definition Die autosomal-dominante Veranlagung zur malignen Hyperthermie (MH) basiert auf einer Störung des skelettmuskulären Kalzium-Stoffwechsels. Unter Exposition mit volatilen Inhalationsnarkotika oder depolarisierenden Muskelrelaxantien kann eine unkontrollierte intrazelluläre Kalzium-Freisetzung zu einer lebensbedrohlichen metabolischen Entgleisung führen. Für eine Disposition gibt es im täglichen Leben in der Regel keine Anhaltspunkte. Rechtzeitige Diagnose und adäquate Therapie einer MH-Krise sind entscheidend für den Patienten. 1.1.2 Historie und Epidemiologie Über perioperative Komplikationen während Inhalationsnarkosen mit erheblichen Körpertemperaturanstiegen und tödlichen Verläufen wurde bereits Anfang des 20. Jahrhundert berichtet (1). 1960 beschrieben DENBOROUGH und LOVELL die maligne Hyperthermie als eigenständiges Krankheitsbild (2). Die Prävalenz der MH-Disposition wird auf 1:10.000 geschätzt. Angaben über die klinische Inzidenz einer MH-Krise schwanken zwischen 1:25 für Halothan- Succinylcholin-Narkosen bei Kindern mit Strabismus und 1:250.000 für alle Altersgruppen und Anästhesieverfahren (3). Nach einer 1997 durchgeführten Untersuchung von HARTUNG ET AL. wird die Inzidenz für Deutschland mit 1:60.000 Allgemeinanästhesien angegeben (4). 1.1.3 Der Physiologischer Erregungs-Kontraktions-Ablauf Neurotransmitter Acetylcholin löst an der motorischen Endplatte ein Aktionspotential der Skelettmuskulatur aus. Entlang der Zellmembran leitet sich das Aktionspotential bis in das transversale System fort. In den sogenannten Triaden stehen Sarkolemm und Membran des sarkoplasmatischen Retikulums in enger Beziehung. Aufgrund einer Ladungsverschiebung am sarkolemmalen DihydropyridinRezeptor öffnet sich der benachbarte sarkoplasmatische Kalzium-Kanal, auch Ryanodin-Rezeptor (RyR) genannt (5). Drei Isoformen des Ryanodin-Rezeptors wurden in Säugetieren identifiziert, wobei RyR1 im Skelettmuskel beschrieben wurde (6). Die Rezeptoröffnung führt zu einer Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum in das Zytoplasma. Nach Diffusion der Kalziumionen zu den Myofilamenten binden diese an Troponin und lösen damit die Interaktion der Filamente aus; der Skelettmuskel kontrahiert. Durch die aktive Wiederaufnahme von 1 Einleitung 2 Kalzium in das sarkoplasmatische Retikulum mit Hilfe der Kalzium-ATPase erschlafft der Muskel (7). 1.1.4 Um Zelluläre Energiegewinnung die energieabhängigen Stoffwechselabläufe in der Skelettmuskulatur zu ermöglichen benötigt die Zelle ATP. Durch die im Zytosol ablaufende Glykolyse wird Glukose in Pyruvat umgewandelt und ATP bereitgestellt: Glukose + 2 Pi + 2 ADP +2 NAD+ → 2 Pyruvat + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O Das verbrauchte NAD+ wird unter anaeroben Bedingungen durch die Reduktion von Pyruvat zu Laktat mittels Laktat-Dehydrogenase regeneriert. Unter aeroben Bedingungen folgt der Glykolyse der Citratzyklus und die Atmungskette, in welcher der wesentliche Anteil von ATP gebildet wird (8). 1.1.5 Pathophysiologie Triggersubstanzen, wie volatile Inhalationsanästhetika oder depolarisierende Muskelrelaxanzien, induzieren bei disponierten Patienten in Folge einer verlängerten Öffnungszeit des Ryanodin-Rezeptors eine unkontrollierte Freisetzung von Kalziumionen aus dem sarkoplasmatischen Retikulum in das Zytosol. Die anhaltende Aktivierung kontraktiler Filamente führt zum klinischen Bild des Rigors. Gleichzeitig aktiviert Kalzium den aeroben und anaeroben Zellstoffwechsel. Der damit einhergehende erhöhte Sauerstoffverbrauch sowie die gesteigerte CO2-, Laktat-, und Wärmeproduktion führen letztlich zu den Symptomen der MH-Krise. Neben Veränderungen des Ryanodin-Rezeptors konnte ein gesteigerter Inositolphosphatstoffwechsel mit signifikanter Erhöhung des kalziumfreisetzenden Botenstoffes 1,4,5-Inositoltriphosphat in Skelettmuskelpräparaten von MH-Veranlagten nachgewiesen werden (9). 1.1.6 Klinik und Therapie Das klinische Bild einer fulminaten MH-Krise ist eindeutig. Neben dem generalisierten Muskelrigor führt die Stoffwechselentgleisung zu Tachykardie, Hyperkapnie, Hypoxämie, metabolischer und respiratorischer Azidose und als Spätsymptom zur Hyperthermie. In Folge der zellulären Energiedepletion kommt es zur Freisetzung von Kalium, Kreatinkinase und Myoglobin im Serum als Zeichen der Rhabdomyolyse. Der gesteigerte Sauerstoffbedarf im Muskel kann weder durch sympatho-adrenerge Stimulation noch durch Vasodilatation gedeckt werden. Einer initialen Sinustachykardie und arteriellen Hypertonie folgen kardiale Arrhythmien und Hypotonie als Zeichen des 1 Einleitung 3 Kreislaufversagens. In der Spätphase können sekundäre Komplikationen, wie Verbrauchskoagulopathie, Lungen- und Hirnödem sowie Herz-, Leber- und Nierenversagen hinzutreten. Abortive Verlaufsformen dagegen gehen in der Regel nur mit unspezifischen Symptomen einher. Die Therapie der MH-Krise Triggersubstanzzufuhr, der Frischgasfluss > 10 l min besteht in Normoventilation -1 der sofortigen Beendigung der mit 100% Sauerstoff bei einem mit Normalisierung der endexspiratorischen CO2- Konzentration und Beseitigung der hypermetabolen Stoffwechsellage mit der Bolusgabe von 2,5 mg kg-1 KG Dantrolen, welche nach Bedarf wiederholt wird. Die metabolische Azidose wird entsprechend der Blutgasanalyse mittels Trispuffer oder Natriumbicarbonat therapiert. Bei einem Temperaturanstieg > 38oC ist eine aktive Kühlung des Patienten nötig. Eine mindestens 24-stündige intensivmedizinische Nachbetreuung dient zur Prophylaxe und Therapie von Sekundärkomplikationen (10). 1.1.7 Diagnostik der malignen Hyperthermie Veranlagung Der in-vitro-Kontraktur-Test (IVCT) mit Koffein und Halothan an Muskelbiopsiematerial geht auf einen Vorschlag der Arbeitsgruppen um KALOW und ELLIS zurück und ist das einzige zuverlässige Verfahren zur Erkennung einer MH-Disposition (11,12). Um die Testdurchführung zu standardisieren, wurde 1983 das Europäische Protokoll und vier Jahre später das Nordamerikanische Protokoll eingeführt (13,14). Erstgenanntes erreicht eine Sensitivität von 99% und eine Spezifität von 94% bezüglich einer MHVeranlagung. Bei 7-15% der getesteten Patienten löst nur eine der Substanzen eine pathologische Kontraktur aus. Diese Patientengruppe wird als MHE (MH eqivocal) klassifiziert und klinisch aus Gründen der Patientensicherheit als MH gefährdet eingestuft. Auch die Entwicklung von zusätzlichen in-vitro-Tests mit Ryanodin und Chlorokresol konnten dieses Problem nicht endgültig lösen (15). Eine wenig belastende Serumuntersuchung, wie die bei MH-Anlageträgern häufig leicht erhöhte Kreatinkinase, wies nur eine Sensitivität von 70% und eine Spezifität von 50% auf. 31 P-Magnetresonanzspektrometrische Analysen bezüglich Veränderungen von Adenosintriphosphat, organischem Phosphor, Phosphokreatin und intrazellulärem pH während und nach definierter Ischämie beziehungsweise nach ergometrischer Belastung erbrachten keine eindeutigen Ergebnisse. Biochemische Untersuchungen des ATP-Verbrauchs, der glykolytischen Aktivität, der cAMP-, Myophosphorylase- und Adenylatcyclaseaktivität, sowie der Nachweis pathologischer Proteine waren für die Diagnostik nicht verwertbar. Bei 30-50% der MH-Patienten wurden unspezifische histopathologische Veränderungen im Muskelbiopsat nachgewiesen. Zum Ausschluss anderer neuromuskulärer Erkrankungen wird diese Untersuchung neben dem IVCT durchgeführt. Die Entwicklung eines breit einsetzbaren molekulargenetischen 1 Einleitung 4 „Screenings“ scheint, aufgrund der Vielzahl unterschiedlicher Mutationen bei Patienten mit MH-Veranlagung, in absehbarer Zeit nicht realisierbar (16). 1.1.8 Pharmakologie von Koffein, Ryanodin und Dantrolen Das Methylxanthin Koffein beeinflusst den zellulären Metabolismus auf drei verschiedene Wege: (a) Es führt über eine Inhibition der Phosphodiesterase zu einer Erhöhung der intrazellulären Adenosintriphosphat-Konzentration (cAMP). cAMP reguliert den Glykogenmetabolismus. Es hemmt in der Zelle die Glykogen-Synthase und aktiviert die Phosphorylase, die Glykogen in Glukose umwandelt. (b) In relativ niedriger Dosis werden Adenosin-Rezeptoren durch Koffein blockiert. A1-Rezeptoren erhöhen die Öffnungswahrscheinlichkeit von neuralen Kalium-Kanälen im Gehirn durch Bindung an das inhibitorische G-Protein während der Signaltransduktion. A2Rezeptoren steigern die Konzentration von cAMP. (c) Aufgrund hoher Affinität zum Ryanodin-Rezeptor erniedrigt Koffein die Schwelle für die sarkoplasmatische KalziumFreisetzung und führt in höheren Konzentrationen zu einer Kontraktur der Skelettmuskulatur (17). Dies wird im diagnostischen Koffein-Kontrakturtest ausgenutzt. Ryanodin, ein Pflanzenalkaloid, moduliert den Ryanodin-Rezeptor und führt dadurch zu einer gesteigerten Kalzium-Freisetzung aus dem saroplasmstischen Retikulum (18). Das Hydantoinderivat sarkoplasmatischen Dantrolen Retikulum hemmt durch die Kalzium-Freisetzung Inhibierung der aus Signaltransduktion dem des Dihydropyridin-Rezeptors sowie durch Bindung an den Ryanodin-Rezeptor ohne die Kalzium-Wiederaufnahme zu beeinflussen (19). 1 Einleitung 1.2 1.2.1 5 Mikrodialyse Geschichte der Mikrodialyse GADDUM stellte 1961 die sogenannte „push-pull“ Methode vor, bei der die Perfusionslösung durch eine Kanüle in das Gehirngewebe gepumpt (push) und gleichzeitig bei konstanter Geschwindigkeit von einer parallel angrenzenden zweiten Kanüle wieder abgezogen (pull) wurde. Nachteilig war der hohe technische Aufwand und die Ödembildungen durch Flüssigkeitsaufnahme in die Zellen. Bei von BITO ET AL. 1966 durchgeführten Versuchen wurden sogenannte „dialysis sacs“, die Salzlösung mit 6% Dextrane enthielten, in das subkutane Nackengewebe und Parenchym einer zerebralen Hemisphäre von Hunden implantiert. Nach einigen Wochen wurden diese Säckchen chirurgisch entfernt und die Aminosäurekonzentration der Lösungen bestimmt. Durch diese Experimente wurde erstmals das Prinzip eines von einer Dialysemembran umgebenen separaten Volumens, welches sich mit der extrazellulären Umgebung äquilibriert, eingeführt. Allerdings war es nicht möglich akut auftretende Konzentrationsveränderungen zu verschiedenen Zeitpunkten zu messen. 1972 vereinigte DELGADO ET AL. mit der Entwicklung einer sogenannten „dialytrode“, bestehend aus zwei Stahlröhrchen, die eine push-pull-Kanüle bilden und in einer permeablen Dialysemembran enden, die vorher beschriebenen Methoden. Aufgrund der ausgeprägten Traumatisierung konnte sich dieses Verfahren nicht etablieren. Die heute eingesetzten Mikrodialysesonden wurden 1974 von UNGERSTEDT und PYCOCK entwickelt und werden mittlerweile in fast allen Organsystemen im Rahmen wissenschaftlicher Untersuchungen eingesetzt (20). 1.2.2 Prinzip der Mikrodialyse Das Prinzip der Mikrodialyse basiert auf Diffusion von Molekülen entlang eines bestehenden Konzentrationsgefälles zwischen zwei Kompartimenten, die durch eine semi-permeable Membran getrennt sind. In-vivo sind dies der Extrazellulärraum des Gewebes und das sogenannte Perfusat innerhalb der Mikrodialysesonde. Extrazelluläre Substanzen, zum Beispiel Neurotransmitter und Metabolite diffundieren in die Perfusionslösung, während dem Perfusat zugesetzte Substanzen in den Extrazellulärraum diffundieren (Abbildung 1). Das abfließende Dialysat wird gesammelt und analysiert. Die Diffusion einer Substanz ist von der Molekülgröße, der Lipophilie bzw. Hydrophilie des Perfusates, der Perfusionsgeschwindigkeit, dem Konzentrationsgradienten und den Diffusionseingenschaften der Mikrodialysemembran abhängig. Meist werden Membranen mit einer Moleküldurchlässigkeit von 3.000 bis 20.000 Da zum Nachweis 1 Einleitung 6 von Aminosäuren, Glukose, Laktat, Glycerol und Adenosin oder pharmakologischen Substanzen wie Methylxanthinen verwendet. Spezielle Membranen bis 100.000 Da erlauben auch die Diffusion kleiner Proteine (21). Abb. 1: Mikrodialysesonde: Das Perfusat fliest über den zuführenden Schenkel entlang einer semi-permeablen Membran und wird über den abführenden Schenkel als Dialysat abgeleitet (21). 1.2.3 Definition der Recovery Das Fick’sche Gesetz stellt die einfachste mathematische Beschreibung der Diffusion dar: DQ / dt = D * F * ∆C / I Q = Stoffmenge; t = Zeiteinheit; D = Diffusionskoeffizient; F = Austauschfläche; l = Diffusionsstrecke; ∆C = Konzentrationsdifferenz Zwischen den Substanzkonzentrationen im Extrazellulärraum und im Perfusat stellt sich ein dynamisches Gleichgewicht ein. Das Konzentrationsverhältnis zwischen diesen beiden Kompartimenten wird als „recovery“ bezeichnet. Die relative recovery entspricht dem prozentualen Substanzanteil, der aus dem Interstitium in die Perfusatlösung diffundiert. Durch die Perfusion der Mikrodialysesonde mit einer vorgegebenen Stoffmenge kann über die Differenz von Ausgangskonzentration und Dialysatkonzentration auf die relative loss recovery geschlossen werden. Diese wird bei Applikation exogener Substanzen über das Perfusat bestimmt. Sowohl die relative recovery, als auch die relative loss recovery korrelieren negativ mit der Perfusionsgeschwindigkeit. 1 Einleitung 7 Die absolute recovery in pmol min-1 ist definiert als die Stoffmenge einer Substanz, die das Dialysat nach einer vorgegebenen Zeitspanne enthält. Sie nimmt bei steigendem Perfusionsfluss bis zum Konzentrationsänderungen Erreichen im eines Plateaus Extrazellulärraum und zu. Aufgrund der damit möglicher verbundenen Beeinflussung des extrazellulären Milieus wird diese Methode selten eingesetzt (22) (Abbildung 2). 100 90 Relative recovery [% ] Absolute recovery [pmol/min] Absolute recovery 80 70 60 50 40 30 20 Relative recovery 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Perfusionsgeschwindigkeit [µl/min] Abb. 2: Einfluss der Perfusionsgeschwindigkeit (µl min-1) auf relative und absolute recovery einer Mikrodialysemembran (CMA/10, Membranlänge 4 mm) (21) 1.2.4 Um Möglichkeiten der Recovery-Bestimmung Substanzkonzentrationen im dialysierten Medium zu ermitteln, kommen verschiedene Methoden zur Messung der in-vitro und in-vivo recovery zur Anwendung. Bei der in-vitro recovery-Bestimmung wird die Mikrodialysesonde in einer Lösung mit bekannter Konzentration platziert und bei konstanter Flussrate das Dialysat analysiert. Die in-vitro recovery errechnet sich mit der Formel: Recovery = Konzentration im Dialysat / Ausgangskonzentration der Lösung x 100 Mit dieser Vorgehensweise können die Diffusionseigenschaften der Metabolite über die Mikrodialysemembran verglichen werden. Mittels der in-vivo recovery können die extrazellulären Konzentrationen quantifiziert werden. Bei der various-flow-rates-recovery wird die Sonde in situ mit verschiedenen Geschwindigkeiten perfundiert. Die relative recovery nimmt dabei mit abnehmender 1 Einleitung 8 Perfusionsrate zu. Unter der Annahme, dass bei keinem Fluss die Konzentration auf beiden Seiten der Membran gleich ist (relative recovery entspricht 100%) kann durch Extrapolation die Substanzkonzentration im Interstitium bestimmt werden. LÖNNROTH ET AL. entwickelte 1987 die no-net-flux Methode. Hierbei werden vier bis fünf unterschiedliche Dosierungen des zu bestimmenden Metaboliten appliziert, bis die Konzentration im Dialysat gleich der des Perfusats ist, was der gesuchten recovery invivo entspricht. Nachteilig erwies sich bei beiden Vorgehensweisen, dass sie zeitaufwendig sind und ein physiologisches Gleichgewicht voraussetzen. Ein weiteres Verfahren ist die Kalibrierung mittels der internal reference Technik. Sie basiert auf der Annahme, dass die Diffusion von Substanzen mit ähnlichen chemischen Eigenschaften über die Membran in beiden Richtungen gleich ist. Der Perfusionsflüssigkeit wird zum Beispiel ein Isotop beigesetzt. Im Dialysat sind prozentualer Verlust des Referenzwertes und prozentuale recovery der zu bestimmenden Substanz aus dem Interstitium kongruent. Die Indikatorsubstanz kann während des gesamten Versuches dem Perfusat beigesetzt werden und ermöglicht eine Kontrolle der Diffusionseigenschaften sowie der physiologischen Veränderungen (23). 1.2.5 Beeinflussende Faktoren Material und Porengröße der Mikrodialysemembran bestimmen wesentlich deren Diffusionseigenschaften. So vermindern lipophile Membranen die Diffusion hydrophiler Substanzen und umgekehrt. Das Perfusat sollte an die physiologischen Gegebenheiten des Extrazellulärraumes angepasst werden, um geringe Veränderungen im Interstitium zu erfassen und um Auswirkungen der Perfusionslösung auf den Gewebestoffwechsel zu vermeiden. Geringere Bedeutung wird der Perfusattemperatur beigemessen. DE LANGE ET AL. äußerten die Vermutung, dass eine Anpassung an die Körpertemperatur nur bei hypotonen Lösungen nötig sei (24). Unterschiedliche Perfusionsgeschwindigkeiten wirken sich sowohl auf die recovery, als auch auf das zu untersuchende Gewebe aus. Sie beeinflussen die Filtration durch die Mikrodialysesonde, den Konzentrationsgradienten zwischen Perfusat und Interstitium sowie das Volumen, das pro Zeiteinheit durch das Mikrodialysesystem fließt (25). Das Gewebetrauma nach Platzierung der Mikrodialysesonden scheint keinen ungünstigen Einfluss auf das interstitielle Milieu zu haben. Bereits nach einer etwa 15minütige Äquilibrierungszeit können im menschlichen M. quadriceps stabile Werte für Glukose und Laktat gemessen werden (26). 1 Einleitung 1.2.6 9 Perspektiven Die Mikrodialysetechnik als minimal-invasive Methode eröffnet eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise können Messungen über mehrere Tage durchgeführt werden. Das Dialysat ist je nach gewählter Membran protein- und keimfrei. Der Nachweis lokaler Konzentrationen von systemisch applizierten Substanzen ist möglich, was bei der Neuentwicklung von Medikamenten von Bedeutung ist, um Rückschlüsse auf deren Einfluss in den einzelnen Geweben zu erhalten (27). 1.3 Fragestellung Seit mehr als drei Jahrzehnten stellt der in-vitro-Kontraktur-Test das einzige zuverlässige Verfahren in der Diagnostik der malignen Hyperthermie Veranlagung dar. Das Vorgehen ist aufwendig und birgt als invasive Methode für den Patienten Risiken, wie Wundheilungsstörungen, Blutungen und lange Rekonvaleszenz. In der vorliegenden Arbeit sollte ein Tiermodell zur isolierten Organperfusion der Skelettmuskulatur entwickelt werden, um das Prinzip der Mikrodialyse für Untersuchungen zur malignen Hyperthermie nutzbar zu machen. Verschiedene theoretische Überlegungen zum intramuskulären Stoffwechsel sollten überprüft werden: Kann der lokale, intramuskuläre Metabolismus, gemessen an der intramuskulären Laktatkonzentration, durch lokal applizierte Substanzen wie Koffein und Kalzium gesteigert werden? Kann die lokale, intramuskuläre Laktatkonzentration durch die systemische Perfusion mit Substanzen, welche Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum des Skelettmuskels freisetzen (Ryanodin) beziehungsweise deren Freisetzung hemmen (Dantrolen), moduliert werden? 2 Methodik 10 2 METHODIK 2.1 2.1.1 Materialien Mikrodialysesonden 2.1.1.1 Eigenschaften und Pflege Für alle Messungen wurden CMA/20 Mikrodialysesonden (CMA/MIKRODIALYSE, Stockholm, Schweden) verwendet. Die tubuläre Membran besteht aus Polycarbonat mit einer Moleküldurchlässigkeit bis 20.000 Dalton. Der Membranaußendurchmesser beträgt 0,5 mm bei einer Membranlänge von 10 mm. Die Länge des zuführenden Schenkels, über welchen das Perfusat appliziert wird, sowie des abführenden Schenkels für das Dialysat, beträgt 200 mm. Das Totraumvolumen der Membran und des abführenden Schenkels beläuft sich auf 7,6 µl (28). Vor erstmaligen Gebrauch wurden die Sonden für 12 Stunden bei einer Geschwindigkeit von 1 µl min-1 mit 70% Ethanol (MALINCKRODT BAXTER B.V., Deventer, Holland) perfundiert, um Glycerol, welches die Austrocknung der Membran während der Lagerung verhindert, auszuwaschen. Anschließend wurden diese, ebenfalls bei 1 µl min-1 Fluss, für 3 Stunden mit aqua ad injectabile (BRAUN, Melsungen, Deutschland) gespült. Nach jedem Versuch wurden die Mikrodialysesonden für 30 min bei einer Perfusionsgeschwindigkeit von 0,5 µl min-1 mit 70% Ethanol und im Anschluss, bis zur nächsten Verwendung, mit aqua ad injectabile gespült. 2.1.1.2 Kalibrierung der Sonden in-vitro Um stabile Diffusionseigenschaften zu gewährleisten, wurde vor der erstmaligen Verwendung und nach jeweils sechs Versuchen die relative recovery in-vitro für eine bekannte Laktatkonzentration bestimmt. Betrug der ermittelte Wert bei einer Perfusionsgeschwindigkeit von 1 µl min-1 weniger als 70%, wurde die Sonde ersetzt. 2.1.2 Substanzen und Material 2.1.2.1 Pipetten Für die Gesamtdauer der Arbeit wurden stets dieselben Pipetten (EPPENDORF, Hamburg, Deutschland) mit einem Volumen von 1 ml beziehungsweise 0-200 µl und dazu passende Pipettenspitzen (HARTMANN, Hamburg, Deutschland) verwendet. Vor Beginn der Studie und in regelmäßigen Abständen wurde die exakte Eichung beider Pipetten durch Pipettieren einer vorgegebenen Volumenmenge auf einer Präzisionswaage Typ R 180 D (SARTORIUS GMBH, Göttingen, Deutschland) bestimmt. 2 Methodik 11 2.1.2.2 Systemische und lokale Perfusionslösungen Für die isolierte Organperfusion wurden Ringerlösung (Na+ 147,1 mM, K+ 4,0 mM, Ca2+ 2,25 mM, Cl- 155,6 mM) (FRESENIUS, Bad Homburg, Deutschland), Ringerlösung mit Dantrolen 1 µM (SIGMA CHEMICALS, Deisenhofen, Deutschland) sowie Ringerlösung mit Ryanodin 0,25 µM bzw. 1 µM (PROCTER & GAmble, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Zur Herstellung der 80 mM Sorbitollösung wurden zu 100 ml Ringerlösung 1457,6 mg Sorbitol (M = 182,2 g mol-1) (SIGMA CHEMICALS, Deisenhofen, Deutschland) zugesetzt und mittels Rührmagnetstab bei Raumtemperatur gelöst. Um 20 mM, 40 mM beziehungsweise 80 mM Kalziumlösungen herzustellen, wurden 294,04 mg, 588,08 mg beziehungsweise 1176,16 mg Kalziumchlorid-Dihydrat (M = 147,02 g mol-1) (MERCK, Darmstadt, Deutschland) mit 100 ml Ringerlösung zersetzt. Für 40 mM und 80 mM Koffeinlösungen wurden 776,7 mg beziehungsweise 1553,4 mg Koffein (M = 194,19 g mol-1) (MERCK, Darmstadt, Deutschland) in 100 ml Ringerlösung aufgelöst. Für die spektrophotometrische Messung von Laktat wurde Laktatreagenz (SIGMA CHEMICALS, Deisenhofen, Deutschland) in 10 ml aqua ad injectabile gelöst. Das Reagenz enthielt 400 U l-1 Laktatoxidase, 2 400 U l-1 Peroxidase, chromogene Vorstufen, verschiedene Stabilisatoren, sowie Füllstoffe bei einem pH-Wert von 7,2. Das gelöstes Reagenz war bei Raumtemperatur (18-26oC) 8 Stunden und gekühlt (28oC) 7 Tage stabil (29). 2.1.3 Geräte Es wurde die Präzisionsspritzenpumpe CMA/100 (CMA/MIKRODIALYSE, Stockholm, Schweden) mit drei dazu kompatiblen 1 ml Spritzen Exmire Microsyringe (CMA/MIKRODIALYSE, Stockholm, Schweden) verwendet. Mittels CMA/11 Umschalters (CMA/MIKRODIALYSE, Stockholm, Schweden) war es während der Versuche möglich, zwischen den Spritzen mit ihren verschiedenen Lösungen ohne Veränderungen des Flusses zu wechseln. Zur isolierten (FRESENIUS, Organperfusion Bad Homburg, wurde die Deutschland) Infusionspumpe mit VP/1000-Infusomat kompatiblem Schlauchsystem (FRESENIUS, Bad Homburg, Deutschland) verwendet. Die Bestimmung der Dialysatkonzentrationen von Laktat und Koffein erfolgten mit Hilfe des HP 8453-UV-Visible Spektrophotometers (HEWLETT PACKARD, Waldbronn, Deutschland), kombiniert mit einem Vectra XA-Computer (HEWLETT PACKARD) und dem Programm Visible-Chem-Station Software (HEWLETT PACKARD). 2 Methodik 2.1.4 12 Versuchstiere Es wurden 61 männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht zwischen 250 und 300 Gramm verwendet. Futter und Trinkwasser wurde ihnen ad libitum bis unmittelbar vor Versuchsbeginn angeboten. 2.2 2.2.1 Ermittlung der Standardkurven Standardkurve für Laktat Zur Erstellung der spektrometrischen Laktat-Standardkurve wurden jeweils zwei Messungen verschiedener Konzentrationen eines Laktatstandards (Laktat 20 mg dl-1, 40 mg dl-1, 80 mg dl-1, 120 mg dl-1) (SIGMA CHEMICALS, Deisenhofen, Deutschland) durchgeführt. Je 10 µl des Laktatstandards wurden zu 1000 µl Laktatreagenz gegeben und für 10 min in einer Präzisionsküvette (HELLMA, Hamburg, Deutschland) im Dunkeln inkubiert. Bei diesem enzymatischen Bestimmungsverfahren wird Milchsäure durch Laktatoxidase zu Pyruvat und Wasserstoffperoxid (H2O2) umgewandelt. In Gegenwart von H2O2 katalysiert Peroxidase die oxidative Kondensierung chromogener Vorstufen, die einen Farbstoff mit einem Absorptionsmaximum bei 540 nm bilden. Die gemessene Absorption ist der Laktatkonzentration in der Probe direkt proportional (30). Aus den gemessenen Werten wurde eine lineare Standardkurve durch den Nullpunkt nach dem Lambert-Beer-Gesetz erstellt (31) (Abbildung 3). 1,6 Absorbtion 540nm 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6 8 Laktat [mM ] Abb. 3: Laktat-Standardkurve 10 12 14 2 Methodik 2.2.2 13 Standardkurve für Koffein Für die Bestimmung der Koffein-Standardkurve wurden jeweils zwei Messungen einer bekannten Koffeinkonzentration (Koffein 0,004 mM, 0,01 mM, 0,02 mM, 0,04 mM, 0,1 mM) bei einem Absorptionsmaximum von 273 nm durchgeführt. Aus den gemessenen Werten wurde eine lineare Standardkurve durch den Nullpunkt nach dem LambertBeer-Gesetz erstellt (31) (Abbildung 4). 1,2 Absorbtion 273nm 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,02 0,04 0,06 Koffein [mM] Abb. 4: Koffein-Standardkurve 0,08 0,1 0,12 2 Methodik 2.3 2.3.1 14 Versuchsaufbau Versuchsbedingungen Sämtliche Versuche wurden bei Raumtemperatur (19-21oC) durchgeführt. 2.3.2 Versuchsaufbau für die Bestimmung der in-vitro recovery Sowohl für die Bestimmung der relative recovery, als auch der relative loss recovery wurde der in Abbildung 5 gezeigte Versuchsaufbau verwendet. B A D C Abb. 5: A: Präzisionsspritzenpumpe mit Perfusionslösungen; B: Umschalter; C: Mikrodialysesonden im Medium; D: Sammelgefäße für das Dialysat 2.3.2.1 Ermittlung der relative recovery von Laktat Zur Bestimmung der Diffusionseigenschaften der Membran in-vitro wurden die Mikrodialysesonden in Eppendorf Reaktionsgefäßen (EPPENDORF, Hamburg, Deutschland) mit 1 ml einer 10 mM Laktatkonzentration platziert und mittels Ringerlösung bei Geschwindigkeiten von 0,5; 1; 3; 5; und 10 µl min-1 perfundiert. Es wurden je zwei Proben mit einer Volumenmenge von 15 µl gesammelt und sofort analysiert. Die erste Probe zu Beginn und nach jeder Flussgeschwindigkeitsänderung wurde verworfen. 2 Methodik 15 2.3.2.2 Ermittlung der relative loss recovery von Koffein Zur Bestimmung der relative loss recovery wurden die Sonden in Ringerlösung platziert und mit einer 40 mM Koffeinkonzentration bei Flussgeschwindigkeiten von 0,5; 1; 3; 5 und 10 µl min-1 perfundiert. Das gesammelte Dialysatvolumen betrug 15 µl. Die erste Probe nach Versuchsbeginn, sowie nach jeder Perfusionsänderung wurde verworfen. Das mit Ringerlösung 1:1000 verdünnte Dialysat wurde spektrophotometrisch bei 273 nm gemessen. 2.3.2.3 Ermittlung der relative loss recovery von Kalzium Die in Ringerlösung platzierten Dialysesonden wurden bei Flussgeschwindigkeiten von 0,5; 1; 3; 5 und 10 µl min-1 mit einer 20 mM Kalziumlösung perfundiert. Die gesammelte Menge des Dialysats betrug 60 µl. Die erste Messung zu Beginn und nach jeder Perfusionsänderung wurde verworfen. Bis zur flammenspektrometrischen Analyse durch das Zentrallabor der Universität Würzburg, wurden die Proben in einem Verhältnis von 1:10 mit aqua ad injectabile verdünnt und bei 4oC gelagert. 2.3.3 Isolierte Organperfusion des Skelettmuskels der Ratte 2.3.3.1 Präparation der Versuchstiere Die Versuchstiere wurden unter Inhalationsanästhesie mit Isoflurane (Forene, ABBOTT GMBH, Wiesbaden, Deutschland) bei erhaltener Spontanatmung und Herz- Kreislauffunktion laparotomiert und nach Darstellung der abdominellen Gefäße unter stumpfer Präparation mit 500 U I-1 Heparin (Liquemin N 25.000, ROCHE, GrenzachWyhlen, Deutschland) über die Vena renalis antikoaguliert. Im Anschluss wurden die Versuchstiere durch Entbluten aus der Vena renalis in tiefer Narkose getötet. Nun folgte die antegrade Kanülierung der Aorta abdominalis mittels eines 26 G Venenkatheters (BOC OHMEDA AB, Hesingborg, Schweden). Nach Fixierung des Katheters durch einen chirurgischen Faden 5/0 (PETERS, Bobigny, Frankreich) und Anschluss einer mit Carbogengas-oxygenierten (95% O2 und 5% CO2) Infusionslösung, wurden beide Hinterläufe mit 30 ml h-1 perfundiert. Nach beidseitiger Freilegung der Mm. adductores wurden die Beckenorgane, der Enddarm mit versorgenden Arterien, sowie der Dünndarm on bloc ligiert. Mit Hilfe einer 18 G Führungskanüle wurden die Mikrodialysesonden in der Adduktorengruppe beider Extremitäten, jeweils 1 cm medial der Femoralgefäße platziert. Die Zeitspanne von Anästhesie bis zur Sondenplatzierung betrug 9 - 10 min (Abbildung 6 und 7). 2 Methodik 16 F B G E A C D Abb. 6: A: Präzisionsspritzenpumpe; B: Umschalter; C: Versuchstier mit Mikrodialysesonden in den Mm. adductores und Venenkatheter in der Aorta abdominalis; D: Sammelgefäße für das Dialysat; E: Infusionspumpe; 2 4 6 8 10 Versuchsbeginn Beginn der Äquilibrierungsphase Sondenplatzierung Präparation der Mm. adductores Tötung des Tieres Punktion der A. abdominalis Heparinisierung Anästhesie 0 Beginn der Präparation Infusionslösung; G: Carbogenflasche (95% O2 und 5% CO2) 12 14 Zeit [min] Abb. 7: Zeitlicher Ablauf der Tierpräparation 16 18 20 22 24 26 F: 2 Methodik 17 2.3.3.2 Basale Laktatkonzentrationen in beiden Hinterläufen Zum Vergleich der Laktatkonzentration beider Extremitäten ohne Einfluss von Medikamenten wurde das Organpräparat mit carboxygenierter Ringerlösung perfundiert (n = 6). Je eine Mikrodialysesonde wurde in den Adduktorengruppen beidseits platziert und mit Ringerlösung perfundiert. Nach 15-minütiger Äquilibrierungsphase wurden jeweils neun Proben im Abstand von 15 min, bei einer Versuchsdauer von 135 min, gesammelt. 2.3.3.3 Einfluss der Osmolarität des Mikrodialyse-Perfusats auf die Laktatkonzentration Der Einfluss der Osmolarität des Perfusats auf die Laktatkonzentration im Dialysat wurde ebenfalls an 6 Organpräparaten untersucht. Nach Platzierung der Dialysesonden und 15-minütiger Äquilibrierung wurde ein beidseitiger Kontrollwert ohne Sorbitol erhoben. Im Anschluss wurden je acht Proben im Abstand von 15 min gesammelt, wobei die rechte hintere Extremität über die Mikrodialysesonde mit 80 mM Sorbitollösung und die Kontrollseite weiterhin mit Ringerlösung perfundiert wurde. 2.3.3.4 Einfluss von Kalzium im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration Der Einfluss von 20 mM, 40 mM beziehungsweise 80 mM Kalzium/Ringerlösung auf die Laktatkonzentration im Dialysat wurde an 6 Präparaten untersucht. Nach Platzierung der Dialysesonde wurde die rechte hintere Extremität mit 20 mM, 40 mM beziehungsweise 80 mM Kalziumlösung und die linke hintere Extremität mit Ringerlösung perfundiert. Im Anschluss an die Äquilibrierungsphase wurden je neun Dialysatproben gesammelt. 2.3.3.5 Einfluss von Koffein im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration Um die Wirkung von Koffein (40 mM bzw. 80 mM) im Mikrodialyse-Perfusat zu untersuchen, wurden je sechs Versuchstiere präpariert und die Hinterläufe isoliert perfundiert. Nach Einbringen in die Adduktorengruppe wurden beide Mikrodialysesonden mit Ringerlösung perfundiert, 15 min lang äquilibriert und ein Kontrollwert ohne Koffein bestimmt. Im Anschluss wurde die rechte hintere Extremität mit 40 mM beziehungsweise 80 mM Koffeinlösung und die linke hintere Extremität weiterhin mit Ringerlösung perfundiert. 2 Methodik 18 2.3.3.6 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 0,25 µM sowie 1 µM Ryanodinlösung Der Ablauf entsprach der Versuchsreihe mit 40 mM Koffein mit dem Unterschied, dass für die systemische Organperfusion carboxygenierte 0,25 µM beziehungsweise 1 µM Ryanodinlösung verwendet wurde. 2.3.3.7 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung Der Ablauf entsprach der Versuchsreihe mit 40 mM Koffein mit dem Unterschied, dass für die systemische Organperfusion 1 µM Dantrolenlösung verwendet wurde. 2.3.3.8 Perfusionskontrolle Am Versuchsende wurde die seitengleiche und homogene Perfusion des Organpräparates durch Applikation von 1 ml Methylenblau (NEOPHARMA, Aschau im Chiemgau, Deutschland) in die Aorta abdominalis kontrolliert (Abbildung 8). Bei fehlender seitengleicher Verfärbung des Muskelgewebes wurden die Versuchsergebnisse wegen des Verdachts einer Organperfusionsstörung verworfen. Abb. 8: Der schraffierte Bereich zeigt schematisch die gleichmäßige Perfusion der Extremitäten nach Gabe von 1 ml Methylenblau. 2 Methodik 2.4 19 Probenanalyse 10 µl des frischen Dialysats wurden zu 1000 µl Laktatreagenz pipettiert, vermischt und in Dunkelheit für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Laktat wurde spektrophotometrisch bei 540 nm gemessen. 2.5 Histologische Untersuchung der Muskelpräparate Um Auswirkungen der Sondenimplantation und der applizierten Substanzen auf das Muskelgewebe zu untersuchen, wurden von untersuchtem Gewebe histologische Präparate mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung angefertigt (Institut für Pathologie). 2.6 Statistik Die statistischen Berechnungen wurden mittels EXCEL 2000, SPSS 9.0.1 sowie alternativ mittels SAS VERSION 8 durchgeführt. Die Daten sind angegeben als Mittelwert (M) und Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Aufgrund der geringen Streuung werden die Messungen der recovery als Mittelwert (M) und Standardabweichung (SD) dargestellt. Verwendet wurde der Shapiro-Wilk-Test zum Nachweis der Normalverteilung, der Mann-Whitney-U-Test mit Bonferroni-Korrektur zur Bestätigung von Verschiedenheiten der Gruppen zum jeweiligen Messzeitpunkt, sowie die Multivarianzanalyse nach Puri & Sen. Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 festgelegt. 3 Ergebnisse 20 3 ERGEBNISSE 3.1 3.1.1 Für Bestimmung der relative recovery und der relative loss recovery Bestimmung der relative recovery von Laktat in-vitro eine vorgegebene Laktatkonzentration wurde die relative recovery der Mikrodialysesonden in-vitro bestimmt. Die verwendeten Perfusionsgeschwindigkeiten von 0,5; 1 ;3; 5 und 10 µl min-1 korrelierten negativ mit der relative recovery. Die relative recovery erreichte bei 0,5 µl min-1 92 ± 6% und fiel bei 10 µl min-1 auf 16 ± 2% ab. Bei einer Perfusion mit 1 µl min-1 wurde eine relative recovery von 77 ± 7% ermittelt (Abbildung 9). Relative Recovery [%] 120 100 80 60 40 20 0 0 5 10 Perfusionsgeschwindigkeit [µl/min] Abb. 9: Recovery von Laktat über die Membran einer CMA/20 Mikrodialysesonde bei verschiedenen Perfusionsgeschwindigkeiten; M ± SD; n = 12. 3.1.2 Bestimmung der relative loss recovery von Koffein in-vitro Für die Bestimmung der in-vitro relative loss recovery von Koffein, wurden die Sonden mit einer bekannten Koffeinkonzentration perfundiert. Bei einer Perfusionsgeschwindigkeit von 0,5 µl min-1 wurde eine relative loss recovery von 90 ± 2% ermittelt, die bei 10 µl min-1 auf 17 ± 4% abfiel. Für 1 µl min-1 Fluss betrug die relative loss recovery 76 ± 8% (Abbildung 10). 3 Ergebnisse 21 Relative Recovery [%] 120 100 80 60 40 20 0 0 5 10 Perfusionsgeschwindigkeit [µl/min] Abb. 10: Relative loss recovery von Koffein über die Membran einer CMA/20 Mikrodialysesonde bei verschiedenen Perfusionsgeschwindigkeiten; M ± SD; n = 10. 3.1.3 Bestimmung der relative loss recovery von Kalzium in-vitro Die Mikrodialysesonden wurden mit einer bekannten Kalziumkonzentration perfundiert. Die ermittelten Werte lagen zwischen 77 ± 2% bei 0,5 µl min-1 und 13 ± 2% bei 10 µl min-1. Für eine Perfusion von 1 µl min-1 betrug die relative loss recovery von Kalzium 60 ± 2% (Abbildung 11). Relative Recovery [%] 120 100 80 60 40 20 0 0 5 10 Perfusionsgeschwindigkeit [µl/min] Abb. 11: Relative loss recovery von Kalzium über die Membran einer CMA/20 Mikrodialysesonde bei verschiedenen Perfusionsgeschwindigkeiten M ± SD; n = 4. 3 Ergebnisse 3.2 3.2.1 22 Ergebnisse der isolierten Organperfusion Basale Laktatkonzentrationen in beiden Hinterläufen Nach Platzierung und Äquilibierung der Sonde in beiden Adduktorengruppen wurde eine Laktatkonzentration von 1,25 ± 0,22 und 1,56 ± 0,15 mM gemessen. Unter Ringerperfusion stieg die lokale Laktatkonzentration bis auf 210 ± 16% in der rechten hinteren Extremität beziehungsweise auf 171 ± 13% in der linken hinteren Extremität (Abbildung 12). 400 Laktatanstieg [%] 350 Rechte Extremität Linke Extremität 300 250 200 150 100 50 0 0 30 60 90 120 150 Zeit [min] Abb. 12: Intramuskulärer Laktatanstieg unter isolierter Organperfusion Ringerlösung; M ± SEM; n = 6; p < 0,05 für (*) rechte vs. linke Extremität. mit 3 Ergebnisse 3.2.2 23 Einfluss der Osmolarität des Mikrodialyse-Perfusats auf die Laktatkonzentration Die Laktatausgangswerte betrugen 1,13 ± 0,21 und 1,27 ± 0,02 mM. Unter Perfusion der Mikrodialysesonde mit 80 mM Sorbitol stieg die Laktatkonzentration auf 170 ± 14% verglichen mit 167 ± 7% für die Kontrollgruppe der kontralateralen Extremität (Abbildung 13). 400 Sorbitol 80 mM Kontrolle Laktatanstieg [%] 350 300 250 200 150 100 50 0 0 30 60 90 120 150 Zeit [min] Abb. 13: Intramuskulärer Laktatanstieg mit und ohne Sorbitolzusatz im Perfusat; M ± SEM; n = 6; p < 0,05 für (*) Sorbitolgruppe vs. Kontrolle. 3 Ergebnisse 3.2.3 24 Einfluss von Kalzium im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration Die Laktatwerte zu Beginn betrugen 1,62 ± 0,15 und 1,84 ± 0,15 mM. Unter Perfusion der Sonde mit 20 mM Kalzium stieg die lokale Laktatkonzentration signifikant auf 466 ± 31% im Vergleich zu 165 ± 6% für die Kontrollgruppe. Bei den Experimenten mit 40 mM Kalzium wurden Laktatausgangswerte von 1,84 ± 0,18 und 2,04 ± 0,15 mM gemessen. Die Laktatkonzentration stieg signifikant auf 632 ± 48% für die Kalziumgruppe gegenüber 201 ± 38% für die Kontrolle. Für die Versuche mit 80 mM Kalzium lagen die Ausgangswerte von Laktat bei 1,34 ± 0,14 und 1,63 ± 0,14 mM und die Laktatkonzentration stieg unter Stimulation mit Kalzium signifikant auf 635 ± 81% im Gegensatz zu 191 ± 5% für die Kontrollmessungen (Abbildung 14). Kalzium 20 mM 800 Kontrolle 700 Laktatanstieg [%] 600 500 Kalzium 40 mM * Kontrolle + Kalzium 80 mM * Kontrolle + * + + * * + + # # # + 300 + * # * 400 * # # 200 100 0 0 30 60 90 120 150 Zeit [min] Abb. 14: Intramuskulärer Laktatanstieg unter Stimulation mit 20 mM, 40 mM und 80 mM Kalzium sowie ohne Kalziumstimulation; M ± SEM; n = 6 pro Gruppe; p < 0,05 für (#) Kalzium 20 mM vs. Kontrolle; (+) Kalzium 40 mM vs. Kontrolle; (*) Kalzium 80 mM vs. Kontrolle. 3 Ergebnisse 3.2.4 25 Einfluss von Koffein im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration Für die Versuchsreihe mit 40 mM Koffein lagen die Laktatausgangswerte bei 1,28 ± 0,16 und 1,73 ± 0,19 mM. Unter Stimulation mit 40 mM Koffein stieg die Laktatkonzentration signifikant auf 270 ± 21% im Vergleich zu 182 ± 9% für die Kontrollgruppe. Bei einer weiteren Testreihe mit 80 mM Koffein wurden Ausgangswerte von 1,39 ± 0,15 und 2,07 ± 0,11 mM ermittelt. In der Stimulansgruppe stieg die lokale Laktatkonzentration signifikant auf 337 ± 19% gegenüber 152 ± 13% für die Kontrolle (Abbildung 15). * 400 * Laktatanstieg [%] 350 Koffein 40 mM Kontrolle Koffein 80 mM Kontrolle 300 250 * 200 * 150 * * * + + + + + + 100 50 0 0 30 60 90 120 150 Zeit [min] Abb. 15: Intramuskulärer Laktatanstieg unter Stimulation mit 40 mM und 80 mM Koffein sowie ohne Koffeinstimulation; M ± SEM; n = 6 pro Gruppe; p < 0,05 für (+) Koffein 40 mM vs. Kontrolle; (*) Koffein 80 mM vs. Kontrolle. 3 Ergebnisse 3.2.5 26 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 0,25 µM sowie 1 µM Ryanodinlösung Unter isolierter Organperfusion mit 0,25 µM Ryanodinlösung äquilibrierten sich die Laktatausgangwerte bei 1,32 ± 0,16 und 2,25 ± 0,14 mM. Nach Perfusion der Mikrodialysesonde mit 40 mM Koffein stieg die lokale Laktatkonzentration signifikant auf 279 ± 23% gegenüber 151 ± 11% in der Kontrollgruppe. Bei Perfusion des Skelettmuskelpräparates mit 1 µM Ryanodinlösung wurden Laktatwerte von 1,46 ± 0,13 und 1,84 ± 0,30 mM gemessen. Durch Stimulation mit 40 mM Koffein konnte die Laktatkonzentration signifikant auf 331 ± 19% im Vergleich zu 214 ± 26% für die Kontrollreihe gesteigert werden (Abbildung 16). 400 350 Laktatanstieg [%] * Koffein 40 mM & Ryanodininfusion 0,25 µM Kontrolle 300 Koffein 40 mM & Ryanodininfusion 1 µM Kontrolle 250 200 + 150 * * * + + + + + * 100 50 0 0 30 60 90 120 150 Zeit [min] Abb. 16: Intramuskulärer Laktatanstieg unter Stimulation mit 40 mM Koffein und Organperfusion mit 0,25 µM beziehungsweise 1 µM Ryanodinlösung sowie ohne Koffeinstimulation; M ± SEM; n = 6 pro Gruppe; p < 0,05 für (+) Koffein & Ryanodin 0,25 µM vs. Kontrolle; (*) Koffein & Ryanodin 1 µM vs. Kontrolle. 3 Ergebnisse 3.2.6 27 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung Für die Versuchsreihe unter isolierter Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung wurde ein Laktatausgangswert von 1,05 ± 0,19 mM gemessen. Nach Stimulation mit 40 mM Koffein stieg die lokale Laktatkonzentration auf 193 ± 13% an. Zum Vergleich lagen die Laktatwerte der Kontrollgruppen mit beziehungsweise ohne Koffeinstimulation unter Organperfusion mit Ringerlösung bei 1,28 ± 0,16 mM sowie 1,73 ± 0,19 mM und stiegen bis zum Versuchende auf 270 ± 21% beziehungsweise 162 ± 9% (Abbildung 17). 300 250 Laktatanstieg [%] * Koffein 40 mM & Dantroleninfusion 1 µM * Koffein 40 mM 200 Kontrolle * * * + + * 150 100 50 0 0 30 60 90 120 150 Zeit [min] Abb. 17: Intramuskulärer Laktatanstieg unter Stimulation mit 40 mM Koffein und Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung sowie unter Stimulation mit 40 mM Koffein und Organperfusion mit Ringerlösung; M ± SEM; n = 6 pro Gruppe; p < 0,05 für (+) 40 mM Koffein und Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung vs. Kontrollgruppe unter Organperfusion mit Ringerlösung; (*) 40 mM Koffein und Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung vs. 40 mM Koffein und Organperfusion mit Ringerlösung. 3 Ergebnisse 3.3 28 Histologische Untersuchung der Muskelpräparate In den histologischen Untersuchungen von drei Muskelpräparaten nach isolierter Perfusion und Koffein-Applikation per Mikrodialyse ergaben sich bis auf dezente interstitielle Ödeme keine Hinweise auf eine Schädigung des Muskelgewebes durch die Platzierung der Mikrodialysesonden beziehungsweise durch die Applikation der verwendeten Substanzen (Abbildung 18). Abb. 18: Muskelgewebe mit angeschnittener Führungskanüle (links). Färbung: Hämatoxylin-Eosin 4 Diskussion 29 4 DISKUSSION In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass (a) mittels der minimalinvasiven Mikrodialysetechnik lokale Laktatmessungen im Skelettmuskel der Ratte möglich sind, (b) eine wesentliche Beeinflussung der Ergebnisse durch die Osmolarität der Perfusionslösungen beziehungsweise durch die Implantation der Sonden ausgeschlossen werden kann, (c) die intramuskuläre Laktatkonzentration durch lokale Applikation von Koffein und Kalzium mit Hilfe einer Mikrodialysesonde sowie (d) durch systemische Organperfusion mit Ryanodinlösung gesteigert wird, während die systemische Dantroleninfusion den koffeininduzierten Laktatanstieg hemmt. Die Substanzkonzentration im Dialysat ist abhängig von der Stoffmenge im Gewebe sowie von der Fläche und dem Material der gewählten Mikrodialysemembran (21). Der Konzentrationsunterschied zwischen Gewebe und Perfusat ist die treibende Kraft für die Diffusion über die Mikrodialysemembran. Je größer die Austauschfläche der Sonde ist, umso höher liegt die recovery. Allerdings führen sehr lange Membranen zu einem Verlust von Perfusatflüssigkeit bedingt durch nichtpermeable Proteine, die einen osmotischen Gradienten aufbauen. Ebenso begrenzt die Porengröße der Membran die Substanzdiffusion in das Perfusat. Vergleiche von unterschiedlichen Membranmaterialien ergaben bei identischen Substanzkonzentrationen Differenzen in der recovery (32). Die verwendeten CMA/20 Sonden wurden bei früheren Untersuchungen des Laktatstoffwechsels im Skelettmuskel von Ratten und Menschen verwendet, wobei eine Beeinflussung der Ergebnisse durch das Membranmaterial nicht beobachtet wurde (33). Um einer Veränderung des perimembranären Interstitiums, verursacht durch die Zusammensetzung des Perfusats, entgegen zu wirken, sollte dieses in Bezug auf Ionen-Zusammensetzung und Osmolarität möglichst der Extrazellulärflüssigkeit entsprechen. In der vorliegenden Arbeit wurden die verwendeten Substanzen in Ringer gelöst. Obwohl dies in früheren Untersuchungen keinen Einfluss auf das interstitielle Milieu gezeigt hat, kann eine Veränderung der interstitiellen Ionen-Zusammensetzung und des pH-Wertes unmittelbar an der Mikrodialysemembran und damit einhergehend ein Einfluss auf die Laktatkonzentration nicht völlig ausgeschlossen werden (34). Die Wahl einer optimalen Perfusionsgeschwindigkeit ist ausschlaggebend, um zuverlässige Messergebnisse zu erhalten. Niedrige Flussgeschwindigkeiten erhöhen die relative recovery, weil mehr Zeit für die Diffusion zur Verfügung steht. Nachteilig erweist sich aber die geringe absolute Menge des gewonnen Dialysats, die eine Bestimmung mit hochempfindlichen Methoden, z. B. UV-Spektrometrie, HPLChromatographie oder Massenspektrometrie, notwendig macht. Ein hoher 4 Diskussion 30 Perfusionsfluss vergrößert die Menge des gewonnen Volumens, verringert aber die Substanzkonzentration im Dialysat. Ebenso üben hohe Flussraten einen hydrostatischen Druck an der Mikrodialysemembran aus, der zur Ultrafiltration von Flüssigkeit mit Perfusatverlust in das Interstitium führt (20). Bei Flussgeschwindigkeiten bis 10 µl min-1 wurden weniger als 0,1% des Perfusatvolumens in das Interstitium filtriert (25). Somit kann in der vorliegenden Arbeit bei einem Fluss von 1 µl min-1 ein wesentlicher Filtrationseffekt ausgeschlossen werden. Bereits in früheren Untersuchungen wurden exogene Substanzen über die Mikrodialysemembran appliziert und die ausgelösten Stoffwechseländerungen im Dialysat untersucht (20). Dies wird möglich, weil Substanzen sowohl aus dem Perfusat heraus, wie auch aus dem Extrazellulärraum in das Perfusat diffundieren können (35). Um die Diffusionseigenschaften und damit die Membranqualität der Mikrodialysesonden zu überprüfen, wurde zu Beginn und nach jeder Versuchsreihe die relative recovery von Laktat in-vitro bestimmt (23). Die in-vitro recovery Werte in der vorliegenden Untersuchung entsprechen weitgehend den Messergebnissen früherer Publikationen (33). Allerdings lässt die in-vitro recovery nur bedingt Rückschlüsse auf die in-vivo Substanzkonzentration im Interstitium zu, weil Zellmembranen die Diffusion vor allem hydrophiler Stoffe beeinträchtigen und der für den Massentransport relevante Extrazellulärraum nur einen Teil des Gewebevolumens darstellt (36). In dieser Arbeit wurde keine Sondenkalibrierung in-vivo durchgeführt, da aufgrund des Versuchaufbaus kein physiologisch stabiles Gleichgewicht in der Muskulatur erreicht wurde und daher die Laktatkonzentration im Verlauf zwar gering aber stetig anstieg. Bei vergleichbaren absoluten Ausgangswerten der beiden Extremitäten unter Ringerperfusion, wurden in Anlehnung an ARNER ET AL. nur die relativen Veränderungen bewertet (37). Um absolute Laktatkonzentrationen zu bestimmen, hätte die Anwendung eines internen Standards im Perfusat eine Alternative dargestellt, da diese Methode keine „steadystate“-Bedingungen im Gewebe voraussetzt und Veränderungen im Extrazellulärraum unmittelbar nachweist (21). Untersuchungen von Anästhetikawirkungen auf den Stoffwechsel der Skelettmuskulatur von Ratten zeigen für das in unserer Arbeit verwendete Anästhetikum Isofluran nur geringe Veränderungen des Laktatstoffwechsels. Noch geringere Effekte sind nur unter Enfluran oder intraperitonealer Ketamininjektion beschrieben (38). Die Beeinflussung durch das verwendete Anästhetikum scheint vernachlässigbar klein zu sein. Ein Einfluß auf die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist daher unwahrscheinlich. Bereits nach 5-minütiger Ischämiezeit kommt es zu einem deutlichen Anstieg der Laktatkonzentration im Muskelgewebe (39). Um das Risiko einer emboliebedingten 4 Diskussion 31 Perfusionsstörung und eines damit verbundenen Laktatanstieges im Skelettmuskel zu vermeiden, wurden die Versuchstiere vor dem Exitus über die Vena renalis heparinisiert. Obwohl minimal-invasiv, so kommt es auch bei der Mikrodialyse durch die Sondenplatzierung zu einem umschriebenen Gewebetrauma. Inwieweit sich die Gewebeverletzung auf die Messungen auswirkt, wird für die einzelnen Organe unterschiedlich diskutiert. Untersuchungen am Skelettmuskel belegen, dass 15 min nach Sondenplatzierung stabile Ergebnisse erzielt werden (26) während zuverlässige Messungen im Gehirngewebe erst am zweiten Tag nach Implantation der Mikrodialysesonden erreicht wurden (20). In der vorliegenden Arbeit wurde eine 15minütige Äquilibrierungszeit gewählt, da das von uns gewählte Tiermodell nur eine Annäherung an die physiologischen Bedingungen darstellt. Eine wesentliche Schädigung des Muskelgewebes durch die Implantation der Sonden konnten wir in histologischen Schnitte ausschließen. Nur vereinzelt wurden interstitielle Ödeme im untersuchten Gewebe nachgewiesen. Um anfallende Metabolite in der Skelettmuskulatur zu entfernen, wurden die hinteren Extremitäten über einen Katheter in der Aorta abdominalis mit Ringer, Dantrolen/Ringer beziehungsweise Ryanodin/Ringer perfundiert. Wir nahmen an, dass ein Teil der entstehenden Stoffwechselprodukte durch die Perfusion abtransportiert wird. In früheren Publikationen konnte mittels der Ethanol-Technik nachgewiesen werden, dass sich sowohl bei vermindertem, wie auch bei vermehrtem Blutfluss die Laktatwerte in der Muskulatur nur minimal ändern (40). Trotz isolierter Organperfusion kam es in unserer Untersuchung auch in der Kontrollgruppe zu einem kontinuierlichen Laktatanstieg über die Versuchszeit. Wir folgerten daraus, dass sich durch die unphysiologische Perfusion mit Ringerlösung in Abwesenheit von Sauerstoffträgern eine Laktatazidose entwickelte. Für unsere Arbeit hatte dies zwei Konsequenzen: Die Versuchszeit war durch den allmählichen Laktatanstieg zeitlich begrenzt und machte eine Kontrollmessung in der kontralateralen Extremität notwendig, um intrinsische und extrinsische Effekte durch das applizierte Pharmakon trennen zu können beziehungsweise um Perfusionsstörungen im Muskelpräparat zu erkennen. Durch die Perfusion mit einer raumtemperierten Infusionslösung (19-20oC) glich sich die Temperatur im untersuchten Organpräparat rasch an die Umgebungstemperatur an. Der Vergleich der Laktatplasmaspiegel von anästhesierten Ratten während akuter Hypothermie (30oC und 20oC) zeigt für beide Gruppen nur einen geringen Anstieg (41). Folglich dürfte die Auswirkung der Hypothermie auf die Messergebnisse vernachlässigbar gering sein. Um eine Beeinflussung des Lakatatanstieges durch die Osmolarität der applizierten Lösungen auszuschließen wurde eine Mikrodialysesonde mit 80 mM Sorbitollösung 4 Diskussion 32 und die Kontrollseite mit Ringerlösung perfundiert. Dieses Vorgehen geht auf BONEN ET AL. zurück, die belegen konnten, dass Sorbitol die Laktatkonzentration im Skelettmuskel nicht erhöht (42). Die gemessenen relativen Laktatveränderungen zeigen im Vergleich keine signifikanten Unterschiede. Wir schlussfolgerten, dass die Laktatkonzentration nicht wesentlich durch die Osmolarität der verwendeten Lösungen beeinflusst wird. Unter physiologischen Bedingungen führt ein Nervenimpuls zur AcetylcholinFreisetzung an der motorischen Endplatte und zur Entstehung von Endplattenpotentialen. Viele Miniatur-Endplattenpotentiale lösen schließlich das Muskelmembranpotential aus, welches fortgeleitet in den transversen Tubuli zu einer Konformationsänderung am sarkolemmalen Dihydropyridin-Rezeptor und dadurch zu einer Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum über den Ryanodin-Rezeptor in das Zytosol führt. Steigt die intrazelluläre Kalziumkonzentration auf 10 µM an, so kontrahiert sich der Muskel (43). Darüber hinaus steigern Kalziumionen die Glykolyse durch direkte Aktivierung der Phosphorylasekinase, die Glukose und ATP in Glukose-6-phosphat, ADP sowie H+ umwandelt. Im Verlauf kommt es unter anaeroben Verhältnissen zu einem vermehrten Anfall von Laktat. Bei maligne Hyperthermie veranlagten Patienten können Triggersubstanzen zu einem massiven Anstieg der zytosolären Kalziumkonzentration über den Ryanodin-Rezeptor führen. Der intrazelluläre Botenstoff Kalzium aktiviert sodann die Myosin-Aktin-Filamente, erhöht über eine Stoffwechselsteigerung den O2-Verbrauch und die CO2-Produktion mit der Folge einer Laktatazidose, und führt schließlich zu Rhabdomyolyse und Zelluntergang (16). In der vorliegenden Untersuchung wurden diese pathophysiologischen Abläufe durch die exogene Applikation hochkonzentrierter Kalziumlösungen induziert und zum Nachweis der Auswirkung auf den zellulären Stoffwechsel die Laktatkonzentrationen gemessen. Die verwendeten Kalziumlösungen führten zu deutlichen Laktatanstiegen im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Wir schlossen daraus, dass durch die lokale Applikation von Kalzium über eine Mikrodialysesonde der intrazelluläre Metabolismus moduliert werden kann. Unklar bleibt, wie hoch die Konzentration der perfundierten Triggersubstanz im Interstitium des Muskels ist. Trotz der signifikanten Laktatanstiege ist eine Verdünnung durch die extrazelluläre Flüssigkeit im sondenumgebenden Muskelgewebe wahrscheinlich. Koffein führt durch Interaktion am Ryanodin-Rezeptor zur Kalzium-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (44). Dieser Wirkungsmechanismus wird für die Diagnostik der malignen Hyperthermie Veranlagung im in-vitro-Kontraktur-Test ausgenützt. Durch die lokale Applikation von 40 mM beziehungsweise 80 mM Koffeinlösung kam es zu signifikanten Laktatanstiegen gegenüber den 4 Diskussion 33 Kontrollgruppen, die aber im Vergleich zu den Kalziumgruppen schwächer ausfielen. Dies kann dadurch erklärt werden, dass Koffein erst nach der Diffusion in die Zelle und Bindung am Ryanodin-Rezeptor Kalzium als „second-messenger“ freisetzt, während nach Gabe der Kalziumlösungen der Muskelmetabolismus wahrscheinlich unmittelbar moduliert wird. In Anwesenheit von Ryanodin wurde für den Ryanodin-Rezeptor eine verlängerte Öffnungszeit mit verstärkter Kalzium-Freisetzung beschrieben (45). Wir konnten zeigen, dass bei konstanter lokaler Koffeinperfusion die Laktatkonzentration abhängig von der Konzentration der Ryanodinlösung zusätzlich gesteigert werden kann. Dies legt nahe, dass beide Wirkstoffe agonistisch die Kalzium-Freisetzung beeinflussen. Das Hydantoinderivat Dantrolen verringert die zytosoläre Kalziumkonzentration durch Hemmung der Kalzium-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, ohne die Wiederaufnahme von Kalzium in die intrazellulären Speicher zu beeinflussen. Dieser Wirkmechanismus wird Dihydropyridin-Rezeptors durch eine Inhibierung beziehungsweise der durch Signaltransduktion eine des spezifische Dantrolenbindungsstelle am Ryanodin-Rezeptor vermittelt (19). In der vorliegenden Arbeit konnte der koffeininduzierte Laktatanstieg durch die systemische Applikation von 1 µM Dantrolen inhibiert werden. Wir folgern daraus, dass Dantrolen die pharmakologische Wirkung von Koffein antagonisiert. Zusammenfassend weisen die vorliegenden Untersuchungen nach, dass mit Hilfe der Mikrodialysetechnik lokale Laktatmessungen in der Skelettmuskulatur möglich sind. Durch die Sondenplatzierung beziehungsweise durch die Applikation der Substanzen kommt es zu keinen wesentlichen Schädigungen des Muskelgewebes. Die Versuchdauer ist aufgrund der sich entwickelnden Laktatazidose zeitlich begrenzt. Eine erhöhte Osmolarität der Perfusionslösung beeinflusst die Laktatkonzentration nicht. Die lokale intramuskuläre Laktatkonzentration kann durch Applikation von Kalziumbeziehungsweise Koffeinlösungen über eine Mikrodialysesonde gesteigert werden. Durch die systemische Perfusion von Ryanodin kann die lokale intramuskuläre Laktatkonzentration gesteigert werden, während die systemische Applikation von Dantrolen einem koffeininduzierten Laktatanstieg entgegenwirkt. Aufgrund der Modulierbarkeit des lokalen intramuskulären Stoffwechsels scheint die Technik der Mikrodialyse für minimal-invasive Untersuchungen zur Diagnostik der maligne Hyperthermie Veranlagung gut geeignet zu sein. 5 Zusammenfassung 34 5 ZUSAMMENFASSUNG Die maligne Hyperthermie ist eine metabolische Muskelerkrankung, die durch eine unkontrollierte Kalzium-Freisetzung in das Zytosol der Muskelzelle zu einer Aktivierung des kontraktilen Apparates und zu einer Beschleunigung des Zellstoffwechsels führen kann. Der in-vitro-Kontraktur-Test am Skelettmuskel ist zur Zeit das einzige zuverlässige Verfahren zur Erkennung einer MH-Veranlagung. In dieser Arbeit sollte untersucht werden inwieweit die lokale Laktatkonzentration durch die Applikation von Kalzium und Koffein mit Hilfe einer Mikrodialysesonde beziehungsweise durch die systemische Infusion von Ryanodin und Dantrolen beeinflusst wird. Mit Tierschutz-Genehmigung wurden 61 Sprague-Dawley Ratten anästhesiert und post exitum über die Aorta die Hinterbeine mit Ringer-, Ryanodin- (0,25 µM, 1 µM) oder Dantrolenlösung (1 µM) perfundiert (30 ml h-1, 19-20oC). Über Mikrodialysesonden (1 µl min-1) in den Mm. adductores wurde Ringer, Sorbitol (80 mM), Kalzium (20 mM, 40 mM, 80 mM) oder Koffein (40 mM, 80 mM) appliziert und im Dialysat Laktat spektrometrisch gemessen. Bei einer relativen recovery von 77 ± 2% für Laktat in-vitro stieg die Laktatkonzentration unter Perfusion mit 20 mM, 40 mM beziehungsweise 80 mM Kalziumlösung auf 466 ± 31%, 632 ± 48% beziehungsweise 635 ± 81%, während unter Perfusion mit 40 mM und 80 mM Koffein eine relative Zunahme auf 270 ± 21% und 377 ± 21% beobachtet wurde. Unter systemischer Organperfusion mit 0,25 µM und 1 µM Ryanodinlösung und lokaler Applikation von 40 mM Koffein wurden relative Laktatanstiege von 279 ± 23% und 331 ± 19% gemessen. Dagegen stieg die relative Laktatkonzentration bei systemischer Infusion von 1 µM Dantrolenlösung und lokaler Perfusion mit 40 mM Koffein nur bis auf 193 ± 13% an. Diese methodische Untersuchung beweist, dass durch die lokale Perfusion von Kalzium und Koffein sowie die systemische Infusion von Ryanodin ein Anstieg der lokalen Laktatkonzentration induziert, beziehungsweise durch systemische Applikation von Dantrolen dieser Anstieg inhibiert werden kann. Systemische Effekte müssen allerdings im in-vivo Tierversuch ausgeschlossen werden, um die Mikrodialysetechnik für die Entwicklung eines minimal-invasiven Verfahrens zur Diagnostik der malignen Hyperthermie nutzbar machen zu können. 6 Literaturverzeichnis 35 6 LITERATURVERZEICHNIS 1 GIBSON C.: Heat stroke as a post-operative complication. Med News (N.Y.) 1900; 77: 883-888 2 DENBOROUGH M.A., LOVELL R.R.H.: Anaesthetic deaths in a family. 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Je 4 Messungen pro Sonde. µl min-1 0 0,5 1 3 5 10 2,22 1,57 1,42 0,98 0,57 0,29 Absolute Laktatwerte 2,22 2,13 1,83 2,04 1,37 1,82 0,99 1,22 0,58 0,66 0,30 0,34 2,13 2,04 1,79 1,23 0,66 0,34 µl min-1 0 0,5 1 3 5 10 2,28 2,08 1,62 0,82 0,59 0,36 Absolute Laktatwerte 2,28 2,11 2,06 1,94 1,56 1,66 0,87 0,84 0,58 0,58 0,41 0,41 2,11 1,96 1,57 0,84 0,58 0,37 µl min-1 0 0,5 1 3 5 10 8,80 8,26 7,36 3,78 2,26 1,42 Absolute Laktatwerte 8,80 8,63 8,20 8,14 7,30 7,09 3,72 3,73 2,53 2,66 1,40 1,43 8,63 8,43 6,98 3,73 2,60 1,53 Tabelle 2: Absolute Werte der relative loss recovery von Koffein in mM bei unterschiedlichen Perfusionsgeschwindigkeiten (µl min-1). Je 2 Messungen pro Sonde. µl min-1 0 0,5 1 3 5 10 0,17 0,02 0,04 0,10 0,13 0,15 Absolute Koffeinwerte 0,17 0,18 0,02 0,01 0,03 0,03 0,10 0,10 0,13 0,12 0,15 0,15 0,18 0,01 0,03 0,10 0,13 0,15 µl min-1 0 0,5 1 3 5 10 0,18 0,01 0,03 0,10 0,13 0,15 Absolute Koffeinwerte 0,18 0,35 0,02 0,04 0,03 0,11 0,11 0,23 0,14 0,26 0,16 0,28 0,35 0,04 0,10 0,21 0,26 0,28 7 Anhang 41 µl min-1 0 0,5 1 3 5 10 Absolute Koffeinwerte 0,35 0,04 0,12 0,23 0,27 0,28 0,35 0,04 0,13 0,24 0,27 0,28 Tabelle 3: Absolute Werte der relative loss recovery von Kalzium in mM bei unterschiedlichen Perfusionsgeschwindigkeiten (µl min-1). Je 2 Messungen pro Sonde. µl min-1 0 0,5 1 3 5 10 4,3 3,2 2,5 1,3 0,8 0,5 Absolute Kalziumwerte 4,3 4,3 3,3 3,4 2,5 2,6 1,3 1,4 0,8 1,0 0,5 0,6 4,3 3,4 2,7 1,4 1,0 0,7 Tabelle 4: Vergleich der Laktatkonzentrationen beider Extremitäten in mM unter isolierter Organperfusion mit Ringerlösung. Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 1 Rechts Links 1,09 1,67 1,25 1,75 1,31 1,77 1,50 1,84 1,40 1,98 1,69 2,22 1,65 2,24 2,06 2,40 2,08 2,40 Versuch 2 Rechts Links 1,80 1,23 2,17 1,13 2,05 1,47 2,30 1,35 2,34 1,64 2,96 1,86 3,12 2,05 3,25 2,33 3,25 2,35 Versuch 3 Rechts Links 0,89 1,37 1,10 1,47 1,34 1,62 1,42 1,68 1,49 2,02 1,69 2,30 1,75 2,47 2,08 2,52 2,10 2,53 Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 4 Rechts Links 0,88 1,33 1,20 1,47 1,35 1,55 1,49 1,64 1,53 1,74 1,67 1,90 1,80 2,16 2,02 2,30 2,09 2,47 Versuch 5 Rechts Links 0,80 1,55 0,80 1,59 0,76 1,82 0,88 1,89 0,84 1,76 0,99 2,32 1,26 2,37 1,51 2,80 1,51 2,82 Versuch 6 Rechts Links 2,05 2,22 2,41 2,19 2,52 2,02 3,05 2,43 3,71 2,57 3,81 3,07 4,03 3,13 4,62 3,10 4,63 3,11 7 Anhang 42 Tabelle 5: Laktatkonzentrationen in mM mit und ohne 80 mM Sorbitolzusatz im Perfusat und systemischer Organperfusion mit Ringerlösung. Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 1 Sorbitol Ringer 0,75 1,32 0,82 1,31 0,92 1,50 0,91 1,37 0,91 1,83 0,99 1,54 0,91 2,12 1,12 2,01 1,29 2,13 Versuch 2 Sorbitol Ringer 0,91 1,29 0,84 1,16 0,86 1,18 0,76 1,24 0,91 1,32 1,02 1,29 1,00 1,49 1,18 1,40 1,28 1,77 Versuch 3 Sorbitol Ringer 2,12 1,20 2,07 1,66 2,03 1,89 2,07 2,05 2,47 2,15 2,57 2,03 2,86 1,99 2,63 2,09 2,85 2,12 Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 4 Sorbitol Ringer 1,11 1,28 1,15 1,42 1,17 1,49 1,20 1,63 1,36 1,67 1,52 1,72 1,56 1,82 1,68 1,98 1,80 2,07 Versuch 5 Sorbitol Ringer 0,76 1,28 0,57 1,43 0,86 1,21 0,88 1,60 1,44 1,82 1,57 2,21 1,75 2,35 1,77 2,18 1,76 2,35 Versuch 6 Sorbitol Ringer 1,12 1,25 1,14 1,37 1,15 1,46 1,24 1,63 1,32 1,82 1,43 1,95 1,58 2,03 1,79 2,14 1,97 2,29 Tabelle 6: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 20 mM Kalzium und systemischer Organperfusion mit Ringerlösung. Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 1 Kalzium Ringer 1,35 1,98 1,27 2,01 1,59 2,07 2,35 2,30 3,29 2,72 4,05 2,63 4,90 2,50 5,45 3,13 5,70 3,18 Versuch 2 Kalzium Ringer 0,99 1,37 1,32 1,54 1,48 1,79 1,62 1,88 1,90 1,98 2,61 2,07 3,50 2,53 4,54 2,48 4,64 2,59 Versuch 3 Kalzium Ringer 1,91 1,56 1,91 1,41 2,22 1,70 3,19 1,75 3,96 1,92 5,52 2,01 6,27 2,20 7,27 2,21 7,24 2,45 7 Anhang Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 43 Versuch 4 Kalzium Ringer 1,96 2,34 2,08 2,39 2,37 2,49 3,71 2,55 6,01 2,56 7,01 2,75 8,77 3,17 10,64 3,91 11,87 3,94 Versuch 5 Kalzium Ringer 1,68 1,63 1,40 1, 05 1,62 1,72 2,09 1,89 2,36 2,01 3,21 2,35 5,16 2,49 6,41 2,73 7,87 2,78 Versuch 6 Kalzium Ringer 1,83 2,16 2,07 2,02 2,22 2,30 3,04 2,52 4,39 2,45 6,76 2,37 7,71 2,69 8,18 2,99 8,35 3,13 Tabelle 7: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 40 mM Kalzium und systemischer Organperfusion mit Ringerlösung. Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 1 Kalzium Ringer 1,36 1,49 1,74 1,74 3,71 2,10 6,60 2,28 6,90 2,70 7,80 3,03 8,15 3,30 9,37 3,86 9,41 3,99 Versuch 2 Kalzium Ringer 2,53 2,22 2,96 2,44 3,66 2,53 5,57 3,44 7,28 2,88 9,14 3,46 9,78 3,56 10,88 4,08 10,76 4,73 Versuch 3 Kalzium Ringer 2,01 2,08 2,37 2,18 4,71 2,18 7,33 2,29 8,62 2,39 9,89 2,86 10,34 2,95 10,33 3,59 11,63 3,90 Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 4 Kalzium Ringer 1,69 2,60 3,64 2,71 7,18 2,67 9,13 2,97 10,38 3,89 11,85 4,07 12,40 4,62 12,60 4,66 12,70 4,53 Versuch 5 Kalzium Ringer 1,45 1,90 1,73 2,03 5,38 2,29 8,36 1,82 8,40 2,13 8,80 2,36 9,19 2,27 9,90 2,55 10,10 2,99 Versuch 6 Kalzium Ringer 1,99 1,93 2,45 1,84 3,82 2,09 5,81 2,03 8,49 2,56 10,57 2,73 11,19 2,92 11,62 3,27 12,88 3,93 7 Anhang 44 Tabelle 8: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 80 mM Kalzium und systemischer Organperfusion mit Ringerlösung. Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 1 Kalzium Ringer 1,91 1,56 2,77 1,60 4,84 1,81 6,42 1,91 7,42 2,04 8,59 2,27 8,24 2,50 9,00 2,64 8,58 3,16 Versuch 2 Kalzium Ringer 1,41 1,63 2,71 1,57 6,15 1,80 7,38 2,41 7,84 2,21 7,35 2,57 7,60 2,44 7,68 2,67 7,82 2,85 Versuch 3 Kalzium Ringer 1,450 1,98 2,22 2,14 5,82 2,19 10,48 2,41 10,81 2,46 11,92 2,47 11,82 2,71 11,63 2,98 11,12 3,46 Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 4 Kalzium Ringer 1,18 1,76 2,04 1,88 5,63 2,14 7,37 2,43 8,16 2,63 9,10 2,86 8,93 3,08 9,53 3,34 9,84 3,51 Versuch 5 Kalzium Ringer 0,92 1,03 1,57 1,13 5,01 1,20 5,70 1,51 5,99 1,42 6,18 1,54 6,27 1,59 8,10 2,01 8,36 2,02 Versuch 6 Kalzium Ringer 1,15 1,84 1,27 2,19 2,37 2,37 4,01 2,58 4,76 2,89 5,35 3,25 5,77 3,30 5,75 3,31 5,24 3,70 Tabelle 9: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 40 mM Koffein und systemischer Organperfusion mit Ringerlösung. Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 1 Koffein Ringer 1,52 1,87 1,69 2,09 1,73 2,11 2,01 2,23 2,32 2,46 2,86 2,60 3,40 2,56 4,21 2,76 4,73 3,13 Versuch 2 Koffein Ringer 1,56 2,42 1,56 2,50 1,74 2,59 2,07 2,66 2,37 2,89 2,52 2,92 3,10 3,07 3,55 3,15 3,95 3,85 Versuch 3 Koffein Ringer 1,62 1,60 1,65 1,49 1,69 1,44 1,76 1,52 1,94 1,57 2,38 1,88 2,65 2,02 2,83 2,16 2,86 2,30 7 Anhang Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 45 Versuch 4 Koffein Ringer 1,31 1,12 1,34 1,15 1,51 1,30 1,71 1,11 2,05 1,20 2,53 1,48 2,99 1,57 3,13 1,86 3,64 2,28 Versuch 5 Koffein Ringer 1,08 1,97 0,95 1,97 1,05 1,94 1,40 1,80 1,81 2,01 2,05 2,18 2,52 2,29 2,85 2,62 3,23 2,95 Versuch 6 Koffein Ringer 0,60 1,38 0,67 1,24 0,73 1,49 0,88 1,50 1,09 1,61 1,28 1,66 1,44 1,92 1,62 2,01 1,83 2,08 Tabelle 10: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 80 mM Koffein und systemischer Organperfusion mit Ringerlösung. Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 1 Koffein Ringer 1,52 2,40 1,50 2,35 1,54 2,37 1,71 2,67 2,34 2,72 2,63 2,56 3,09 2,70 3,50 2,73 3,76 2,99 Versuch 2 Koffein Ringer 1,80 2,13 1,89 2,21 2,08 2,06 2,15 2,00 2,90 1,95 3,76 2,30 4,27 2,20 5,21 2,29 6,41 2,70 Versuch 3 Koffein Ringer 1,60 2,39 1,80 2,45 1,84 2,53 2,40 2,34 2,88 3,16 3,64 3,38 4,06 3,61 4,66 3,78 5,24 4,41 Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 4 Koffein Ringer 1,24 1,87 1,76 1,89 1,94 1,94 2,01 1,94 2,48 1,95 2,91 2,15 3,31 2,46 4,09 2,84 5,10 2,92 Versuch 5 Koffein Ringer 1,46 1,76 1,56 2,04 1,56 1,99 1,81 2,11 2,30 2,09 3,19 2,18 4,02 3,01 4,86 3,17 5,48 3,41 Versuch 6 Koffein Ringer 0,74 1,86 0,90 1,85 1,08 1,51 0,90 1,45 1,90 1,52 1,47 1,74 1,89 1,94 2,27 2,21 2,96 2,31 7 Anhang 46 Tabelle 11: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 40 mM Koffein und systemischer Organperfusion mit 0,25 µM Ryanodinlösung. Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 1 Koffein Ringer 1,21 2,92 1,37 2,86 1,37 3,10 1,56 3,08 1,78 3,25 2,19 2,74 2,52 3,64 2,98 3,71 3,68 4,20 Versuch 2 Koffein Ringer 1,11 2,33 1,41 2,39 1,44 2,47 1,78 2,30 2,13 2,54 2,63 2,96 2,97 3,27 3,64 4,91 3,58 4,16 Versuch 3 Koffein Ringer 1,46 2,19 1,38 2,19 1,77 2,24 1,60 2,27 2,06 2,43 2,54 2,70 3,07 2,78 3,18 2,92 3,74 3,19 Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 4 Koffein Ringer 1,88 2,10 1,85 2,14 1,79 2,40 1,89 2,48 2,18 2,61 2,56 2,66 3,05 2,78 3,34 3,31 3,81 3,44 Versuch 5 Koffein Ringer 1,47 2,02 1,40 2,16 1,44 2,11 1,81 2,00 2,04 1,98 2,38 1,97 2,65 2,19 3,03 2,15 3,46 2,15 Versuch 6 Koffein Ringer 0,76 1,95 0,83 1,73 0,91 1,97 0,95 2,04 1,12 2,12 1,45 2,66 1,84 2,55 2,41 2,81 2,68 3,32 Tabelle 12: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 40 mM Koffein und systemischer Organperfusion mit 1 µM Ryanodinlösung. Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 1 Koffein Ringer 1,18 0,70 1,33 0,82 1,48 0,96 1,87 1,04 2,41 1,22 2,80 1,33 3,37 1,75 4,11 1,90 4,83 2,28 Versuch 2 Koffein Ringer 1,93 2,22 2,17 2,26 2,46 2,36 2,81 2,91 3,09 3,35 3,87 3,66 4,56 4,22 5,42 4,68 6,21 5,35 Versuch 3 Koffein Ringer 1,52 2,68 1,83 2,40 1,85 2,41 2,23 2,62 2,70 2,53 3,33 2,88 3,78 3,18 4,67 3,49 5,52 3,94 7 Anhang Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 47 Versuch 4 Koffein Ringer 1,75 1,92 1,85 1,75 1,99 1,67 2,03 1,96 2,38 2,02 2,96 2,32 3,612 2,60 4,21 3,04 4,97 3,47 Versuch 5 Koffein Ringer 1,20 2,26 1,41 2,24 1,48 2,60 1,42 2,88 1,91 3,23 2,00 3,43 2,55 3,86 2,87 4,25 3,47 4,35 Versuch 6 Koffein Ringer 1,20 1,23 1,34 1,21 1,34 1,24 1,56 1,91 1,90 1,75 2,45 1,76 2,85 2,04 3,25 2,24 3,80 2,43 Tabelle 13: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 40 mM Koffein und systemischer Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung. Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 1 Koffein Ringer 1,95 1,87 1,36 2,09 1,82 2,11 2,07 2,23 2,04 2,46 2,26 2,60 3,08 2,56 3,47 2,76 3,60 3,13 Versuch 2 Koffein Ringer 0,97 2,42 0,88 2,50 0,98 2,59 1,02 2,66 1,04 2,89 1,39 2,92 1,52 3,07 1,76 3,15 2,02 3,85 Versuch 3 Koffein Ringer 1,12 1,60 1,72 1,49 0,97 1,44 1,02 1,52 0,99 1,57 1,09 1,88 1,24 2,02 1,35 2,16 1,68 2,30 Zeit [min] 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Versuch 4 Koffein Ringer 0,73 1,12 0,62 1,15 0,73 1,30 0,86 1,11 0,91 1,20 0,92 1,48 1,10 1,57 1,21 1,86 1,30 2,28 Versuch 5 Koffein Ringer 0,76 1,97 0,74 1,97 0,78 1,94 0,83 1,80 0,87 2,01 1,00 2,18 1,20 2,29 1,26 2,62 1,46 2,95 Versuch 6 Koffein Ringer 0,75 1,38 0,72 1,24 0,70 1,49 0,69 1,50 0,86 1,61 1,13 1,66 1,32 1,92 1,40 2,01 1,83 2,08 Danksagung DANKSAGUNG Herrn Prof. Dr. med. N. Roewer, Direktor der Klinik für Anaesthesiologie der Universität Würzburg, danke ich für die freundliche Überlassung des Themas. Besonders danken möchte ich Herrn Dr. med. M. Anetseder für seine stete Diskussionsbereitschaft und für seine mir jederzeit gewährte Unterstützung, die wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat. Herrn Prof. Dr. med. C.-A. Greim danke ich für die Übernahme des Korreferats. Den gesamten Mitarbeitern des Anaesthesie-Labors sage ich herzlichen Dank für die freundliche Hilfe während meiner Untersuchung. Der größte Dank gebührt meinen Eltern, denen ich diese Arbeit widmen möchte. Ihre ausnahmslose Unterstützung in jeder Hinsicht, die mir immer ein großer Rückhalt war und ist, ermöglichte mir erst diese Ausbildung. Lebenslauf Persönliche Daten Name Frank Schuster Adresse Blumengasse 3 97509 Kolitzheim - Herlheim Geburtsdatum, -ort 27. April 1972 in Gerolzhofen Familienstand ledig SCHULISCHE AUSBILDUNG 1978 – 1982 Grundschule Gerolzhofen 1982 – 1991 Gymnasium Franken – Landschulheim Gaibach 1991 Abschluss: Allgemeine Hochschulreife ZIVILDIENST Sep. 1991 – Nov. 1992 Rettungsdienst Bayerisches Rotes Kreuz Schweinfurt HOCHSCHULAUSBILDUNG März 1994 – Sep. 1996 Vorklinisches Studium, Universität Würzburg Okt. 1996 – März 2000 Klinisches Studium, Universität Würzburg April 2000 – März 2001 Praktisches Jahr, Leopoldina Krankenhaus, Schweinfurt Mai 2001 Abschluss des Studiums FAMULATUREN März 1997 Ambulante Chirurgie, Praxis, Gerolzhofen Okt. 1997 Anaesthesie, Leopoldina Krankenhaus, Schweinfurt April 1998 Innere Medizin, Geomed Klinik, Gerolzhofen Aug. 1998 Anaesthesie, Universitätsklinik, Würzburg März 1999 Notfallmedizin, Methodist Healthcare Hospital, Memphis, TN, U.S.A. Aug. 1999 Innere Medizin, Geomed Klinik, Gerolzhofen Berufliche Tätigkeit Seit Sep. 2001 Arzt im Praktikum an der Klinik für Anaesthesiologie der Universität Würzburg Herlheim, im September 2002
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