Dokument_1. - OPUS Würzburg

Dokument_1. - OPUS Würzburg
Aus der Klinik für Anaesthesiologie
der Universität Würzburg
Direktor: Professor Dr. med. N. Roewer
Untersuchungen zur Modulation der interstitiellen Laktatkonzentration
im isoliert perfundierten Skelettmuskel der Ratte
durch Kalzium, Koffein, Ryanodin und Dantrolen
im Rahmen der Entwicklung eines minimal-invasiven Verfahrens zur Diagnostik
der maligne Hyperthermie Veranlagung
Inaugural – Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg
Vorgelegt von
Frank Schuster
aus Herlheim
Würzburg, September 2002
Referent :
Prof. Dr. N. Roewer
Korreferent : Prof. Dr. C.-A. Greim
Dekan :
Prof. Dr. V. ter Meulen
Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2002
Der Promovend ist Arzt im Praktikum
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG........................................................................................................... 1
1.1
Maligne Hyperthermie ....................................................................................... 1
1.1.1
Definition....................................................................................................... 1
1.1.2
Historie und Epidemiologie ........................................................................... 1
1.1.3
Physiologischer Erregungs-Kontraktions-Ablauf .......................................... 1
1.1.4
Zelluläre Energiegewinnung ......................................................................... 2
1.1.5
Pathophysiologie .......................................................................................... 2
1.1.6
Klinik und Therapie ....................................................................................... 2
1.1.7
Diagnostik der malignen Hyperthermie Veranlagung ................................... 3
1.1.8
Pharmakologie von Koffein, Ryanodin und Dantrolen .................................. 4
1.2
Mikrodialyse ....................................................................................................... 5
1.2.1
Geschichte der Mikrodialyse......................................................................... 5
1.2.2
Prinzip der Mikrodialyse................................................................................ 5
1.2.3
Definition der Recovery ................................................................................ 6
1.2.4
Möglichkeiten der Recovery-Bestimmung .................................................... 7
1.2.5
Beeinflussende Faktoren .............................................................................. 8
1.2.6
Perspektiven ................................................................................................. 9
1.3
2
Fragestellung ..................................................................................................... 9
METHODIK ........................................................................................................... 10
2.1
Materialien ........................................................................................................ 10
2.1.1
Mikrodialysesonden .................................................................................... 10
2.1.1.1 Eigenschaften und Pflege ....................................................................... 10
2.1.1.2 Kalibrierung der Sonden in-vitro.............................................................. 10
2.1.2
Substanzen und Material ............................................................................ 10
2.1.2.1 Pipetten ................................................................................................... 10
2.1.2.2 Systemische und lokale Perfusionslösungen.......................................... 11
2.1.3
Geräte......................................................................................................... 11
2.1.4
Versuchstiere.............................................................................................. 12
2.2
Ermittlung der Standardkurven ...................................................................... 12
2.2.1
Standardkurve für Laktat ............................................................................ 12
2.2.2
Standardkurve für Koffein ........................................................................... 13
Inhaltsverzeichnis
2.3
Versuchsaufbau ............................................................................................... 14
2.3.1
Versuchsbedingungen ................................................................................ 14
2.3.2
Versuchsaufbau für die Bestimmung der in-vitro recovery ......................... 14
2.3.2.1 Ermittlung der relative recovery von Laktat............................................. 14
2.3.2.2 Ermittlung der relative loss recovery von Koffein .................................... 15
2.3.2.3 Ermittlung der relative loss recovery von Kalzium .................................. 15
2.3.3
Isolierte Organperfusion des Skelettmuskels der Ratte.............................. 15
2.3.3.1 Präparation der Versuchstiere ................................................................ 15
2.3.3.2 Basale Laktatkonzentrationen in beiden Hinterläufen............................. 17
2.3.3.3 Einfluss der Osmolarität des Mikrodialyse-Perfusats auf die
Laktatkonzentration ............................................................................................... 17
2.3.3.4 Einfluss von Kalzium im Mikrodialyse-Perfusat auf die
Laktatkonzentration ............................................................................................... 17
2.3.3.5 Einfluss von Koffein im Mikrodialyse-Perfusat auf die
Laktatkonzentration ............................................................................................... 17
2.3.3.6 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 0,25 µM
sowie 1 µM Ryanodinlösung ................................................................................. 18
2.3.3.7 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 1 µM
Dantrolenlösung .................................................................................................... 18
2.3.3.8 Perfusionskontrolle.................................................................................. 18
2.4
Probenanalyse ................................................................................................. 19
2.5
Histologische Untersuchung der Muskelpräparate...................................... 19
2.6
Statistik ............................................................................................................. 19
3
ERGEBNISSE ....................................................................................................... 20
3.1
Bestimmung der relative recovery und der relative loss recovery ............. 20
3.1.1
Bestimmung der relative recovery von Laktat in-vitro................................. 20
3.1.2
Bestimmung der relative loss recovery von Koffein in-vitro ........................ 20
3.1.3
Bestimmung der relative loss recovery von Kalzium in-vitro ...................... 21
3.2
Ergebnisse der isolierten Organperfusion .................................................... 22
3.2.1
Basale Laktatkonzentrationen in beiden Hinterläufen ................................ 22
3.2.2
Einfluss der Osmolarität des Mikrodialyse-Perfusats auf die
Laktatkonzentration................................................................................................... 23
Inhaltsverzeichnis
3.2.3
Einfluss von Kalzium im Mikrodialyse-Perfusat auf die
Laktatkonzentration................................................................................................... 24
3.2.4
Einfluss von Koffein im Mikrodialyse-Perfusat auf die
Laktatkonzentration................................................................................................... 25
3.2.5
Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 0,25 µM
sowie 1 µM Ryanodinlösung ..................................................................................... 26
3.2.6
Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 1 µM
Dantrolenlösung ........................................................................................................ 27
3.3
Histologische Untersuchung der Muskelpräparate...................................... 28
4
DISKUSSION ........................................................................................................ 29
5
ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................ 34
6
LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................. 35
7
ANHANG .............................................................................................................40
Abkürzungsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ADP
Adenosindiphosphat
ATP
Adenosintriphosphat
Ca
2+
Kalzium
cAMP
Zyklisches Adenosintriphosphat
Cl-
Chlorid
CO2
Kohlendioxid
Da
Dalton
G
Gauge
G-Protein
Guanylnucleotid Protein
H2O2
Wasserstoffperoxyd
IVCT
in-vitro-Kontraktur-Test
K+
Kalium
MH
Maligne Hyperthermie
n
Versuchszahl
Na
2+
Natrium
NAD+
Nicotinamidadenindinucleotid [oxidierte Form]
NADH
Nicotinamidadenindinuleotid [reduzierte Form]
O2
Sauerstoff
pH
Potentia hydrogenii
Pi
Anorganisches Phosphat
RyR
Ryanodin-Rezeptor
1 Einleitung
1
1 EINLEITUNG
1.1
1.1.1
Maligne Hyperthermie
Definition
Die autosomal-dominante Veranlagung zur malignen Hyperthermie (MH) basiert auf
einer Störung des skelettmuskulären Kalzium-Stoffwechsels. Unter Exposition mit
volatilen Inhalationsnarkotika oder depolarisierenden Muskelrelaxantien kann eine
unkontrollierte
intrazelluläre
Kalzium-Freisetzung
zu
einer
lebensbedrohlichen
metabolischen Entgleisung führen. Für eine Disposition gibt es im täglichen Leben in
der Regel keine Anhaltspunkte. Rechtzeitige Diagnose und adäquate Therapie einer
MH-Krise sind entscheidend für den Patienten.
1.1.2
Historie und Epidemiologie
Über perioperative Komplikationen während Inhalationsnarkosen mit erheblichen
Körpertemperaturanstiegen und tödlichen Verläufen wurde bereits Anfang des 20.
Jahrhundert berichtet (1). 1960 beschrieben DENBOROUGH und LOVELL die maligne
Hyperthermie als eigenständiges Krankheitsbild (2).
Die Prävalenz der MH-Disposition wird auf 1:10.000 geschätzt. Angaben über die
klinische
Inzidenz
einer
MH-Krise
schwanken
zwischen
1:25
für
Halothan-
Succinylcholin-Narkosen bei Kindern mit Strabismus und 1:250.000 für alle
Altersgruppen und Anästhesieverfahren (3). Nach einer 1997 durchgeführten
Untersuchung von HARTUNG ET AL. wird die Inzidenz für Deutschland mit 1:60.000
Allgemeinanästhesien angegeben (4).
1.1.3
Der
Physiologischer Erregungs-Kontraktions-Ablauf
Neurotransmitter
Acetylcholin
löst
an
der
motorischen
Endplatte
ein
Aktionspotential der Skelettmuskulatur aus. Entlang der Zellmembran leitet sich das
Aktionspotential bis in das transversale System fort. In den sogenannten Triaden
stehen Sarkolemm und Membran des sarkoplasmatischen Retikulums in enger
Beziehung. Aufgrund einer Ladungsverschiebung am sarkolemmalen DihydropyridinRezeptor öffnet sich der benachbarte sarkoplasmatische Kalzium-Kanal, auch
Ryanodin-Rezeptor (RyR) genannt (5). Drei Isoformen des Ryanodin-Rezeptors
wurden in Säugetieren identifiziert, wobei RyR1 im Skelettmuskel beschrieben wurde
(6). Die Rezeptoröffnung führt zu einer Freisetzung von Kalzium aus dem
sarkoplasmatischen Retikulum in das Zytoplasma. Nach Diffusion der Kalziumionen zu
den Myofilamenten binden diese an Troponin und lösen damit die Interaktion der
Filamente aus; der Skelettmuskel kontrahiert. Durch die aktive Wiederaufnahme von
1 Einleitung
2
Kalzium in das sarkoplasmatische Retikulum mit Hilfe der Kalzium-ATPase erschlafft
der Muskel (7).
1.1.4
Um
Zelluläre Energiegewinnung
die
energieabhängigen
Stoffwechselabläufe
in
der
Skelettmuskulatur
zu
ermöglichen benötigt die Zelle ATP. Durch die im Zytosol ablaufende Glykolyse wird
Glukose in Pyruvat umgewandelt und ATP bereitgestellt:
Glukose + 2 Pi + 2 ADP +2 NAD+ → 2 Pyruvat + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O
Das verbrauchte NAD+ wird unter anaeroben Bedingungen durch die Reduktion von
Pyruvat
zu
Laktat
mittels
Laktat-Dehydrogenase
regeneriert.
Unter
aeroben
Bedingungen folgt der Glykolyse der Citratzyklus und die Atmungskette, in welcher der
wesentliche Anteil von ATP gebildet wird (8).
1.1.5
Pathophysiologie
Triggersubstanzen,
wie
volatile
Inhalationsanästhetika
oder
depolarisierende
Muskelrelaxanzien, induzieren bei disponierten Patienten in Folge einer verlängerten
Öffnungszeit
des
Ryanodin-Rezeptors
eine
unkontrollierte
Freisetzung
von
Kalziumionen aus dem sarkoplasmatischen Retikulum in das Zytosol. Die anhaltende
Aktivierung kontraktiler Filamente führt zum klinischen Bild des Rigors. Gleichzeitig
aktiviert
Kalzium
den
aeroben
und
anaeroben
Zellstoffwechsel.
Der
damit
einhergehende erhöhte Sauerstoffverbrauch sowie die gesteigerte CO2-, Laktat-, und
Wärmeproduktion führen letztlich zu den Symptomen der MH-Krise.
Neben
Veränderungen
des
Ryanodin-Rezeptors
konnte
ein
gesteigerter
Inositolphosphatstoffwechsel mit signifikanter Erhöhung des kalziumfreisetzenden
Botenstoffes 1,4,5-Inositoltriphosphat in Skelettmuskelpräparaten von MH-Veranlagten
nachgewiesen werden (9).
1.1.6
Klinik und Therapie
Das klinische Bild einer fulminaten MH-Krise ist eindeutig. Neben dem generalisierten
Muskelrigor
führt
die
Stoffwechselentgleisung
zu
Tachykardie,
Hyperkapnie,
Hypoxämie, metabolischer und respiratorischer Azidose und als Spätsymptom zur
Hyperthermie. In Folge der zellulären Energiedepletion kommt es zur Freisetzung von
Kalium, Kreatinkinase und Myoglobin im Serum als Zeichen der Rhabdomyolyse. Der
gesteigerte Sauerstoffbedarf im Muskel kann weder durch sympatho-adrenerge
Stimulation noch durch Vasodilatation gedeckt werden. Einer initialen Sinustachykardie
und arteriellen Hypertonie folgen kardiale Arrhythmien und Hypotonie als Zeichen des
1 Einleitung
3
Kreislaufversagens. In der Spätphase können sekundäre Komplikationen, wie
Verbrauchskoagulopathie,
Lungen-
und
Hirnödem
sowie
Herz-,
Leber-
und
Nierenversagen hinzutreten. Abortive Verlaufsformen dagegen gehen in der Regel nur
mit unspezifischen Symptomen einher.
Die
Therapie
der
MH-Krise
Triggersubstanzzufuhr,
der
Frischgasfluss > 10 l min
besteht
in
Normoventilation
-1
der
sofortigen
Beendigung
der
mit 100% Sauerstoff bei einem
mit Normalisierung der endexspiratorischen CO2-
Konzentration und Beseitigung der hypermetabolen Stoffwechsellage mit der
Bolusgabe von 2,5 mg kg-1 KG Dantrolen, welche nach Bedarf wiederholt wird. Die
metabolische Azidose wird entsprechend der Blutgasanalyse mittels Trispuffer oder
Natriumbicarbonat therapiert. Bei einem Temperaturanstieg > 38oC ist eine aktive
Kühlung des Patienten nötig. Eine mindestens 24-stündige intensivmedizinische
Nachbetreuung dient zur Prophylaxe und Therapie von Sekundärkomplikationen (10).
1.1.7
Diagnostik der malignen Hyperthermie Veranlagung
Der in-vitro-Kontraktur-Test (IVCT) mit Koffein und Halothan an Muskelbiopsiematerial
geht auf einen Vorschlag der Arbeitsgruppen um KALOW und ELLIS zurück und ist das
einzige zuverlässige Verfahren zur Erkennung einer MH-Disposition (11,12). Um die
Testdurchführung zu standardisieren, wurde 1983 das Europäische Protokoll und vier
Jahre später das Nordamerikanische Protokoll eingeführt (13,14). Erstgenanntes
erreicht eine Sensitivität von 99% und eine Spezifität von 94% bezüglich einer MHVeranlagung. Bei 7-15% der getesteten Patienten löst nur eine der Substanzen eine
pathologische Kontraktur aus. Diese Patientengruppe wird als MHE (MH eqivocal)
klassifiziert und klinisch aus Gründen der Patientensicherheit als MH gefährdet
eingestuft. Auch die Entwicklung von zusätzlichen in-vitro-Tests mit Ryanodin und
Chlorokresol konnten dieses Problem nicht endgültig lösen (15).
Eine wenig belastende Serumuntersuchung, wie die bei MH-Anlageträgern häufig
leicht erhöhte Kreatinkinase, wies nur eine Sensitivität von 70% und eine Spezifität von
50% auf.
31
P-Magnetresonanzspektrometrische Analysen bezüglich Veränderungen
von Adenosintriphosphat, organischem Phosphor, Phosphokreatin und intrazellulärem
pH während und nach definierter Ischämie beziehungsweise nach ergometrischer
Belastung erbrachten keine eindeutigen Ergebnisse. Biochemische Untersuchungen
des ATP-Verbrauchs, der glykolytischen Aktivität, der cAMP-, Myophosphorylase- und
Adenylatcyclaseaktivität, sowie der Nachweis pathologischer Proteine waren für die
Diagnostik nicht verwertbar. Bei 30-50% der MH-Patienten wurden unspezifische
histopathologische Veränderungen im Muskelbiopsat nachgewiesen. Zum Ausschluss
anderer neuromuskulärer Erkrankungen wird diese Untersuchung neben dem IVCT
durchgeführt.
Die
Entwicklung
eines
breit
einsetzbaren
molekulargenetischen
1 Einleitung
4
„Screenings“ scheint, aufgrund der Vielzahl unterschiedlicher Mutationen bei Patienten
mit MH-Veranlagung, in absehbarer Zeit nicht realisierbar (16).
1.1.8
Pharmakologie von Koffein, Ryanodin und Dantrolen
Das Methylxanthin Koffein beeinflusst den zellulären Metabolismus auf drei
verschiedene Wege: (a) Es führt über eine Inhibition der Phosphodiesterase zu einer
Erhöhung der intrazellulären Adenosintriphosphat-Konzentration (cAMP). cAMP
reguliert den Glykogenmetabolismus. Es hemmt in der Zelle die Glykogen-Synthase
und aktiviert die Phosphorylase, die Glykogen in Glukose umwandelt. (b) In relativ
niedriger Dosis werden Adenosin-Rezeptoren durch Koffein blockiert. A1-Rezeptoren
erhöhen die Öffnungswahrscheinlichkeit von neuralen Kalium-Kanälen im Gehirn durch
Bindung an das inhibitorische G-Protein während der Signaltransduktion. A2Rezeptoren steigern die Konzentration von cAMP. (c) Aufgrund hoher Affinität zum
Ryanodin-Rezeptor erniedrigt Koffein die Schwelle für die sarkoplasmatische KalziumFreisetzung und führt in höheren Konzentrationen zu einer Kontraktur der
Skelettmuskulatur (17). Dies wird im diagnostischen Koffein-Kontrakturtest ausgenutzt.
Ryanodin, ein Pflanzenalkaloid, moduliert den Ryanodin-Rezeptor und führt dadurch zu
einer gesteigerten Kalzium-Freisetzung aus dem saroplasmstischen Retikulum (18).
Das
Hydantoinderivat
sarkoplasmatischen
Dantrolen
Retikulum
hemmt
durch
die
Kalzium-Freisetzung
Inhibierung
der
aus
Signaltransduktion
dem
des
Dihydropyridin-Rezeptors sowie durch Bindung an den Ryanodin-Rezeptor ohne die
Kalzium-Wiederaufnahme zu beeinflussen (19).
1 Einleitung
1.2
1.2.1
5
Mikrodialyse
Geschichte der Mikrodialyse
GADDUM stellte 1961 die sogenannte „push-pull“ Methode vor, bei der die
Perfusionslösung durch eine Kanüle in das Gehirngewebe gepumpt (push) und
gleichzeitig bei konstanter Geschwindigkeit von einer parallel angrenzenden zweiten
Kanüle wieder abgezogen (pull) wurde. Nachteilig war der hohe technische Aufwand
und die Ödembildungen durch Flüssigkeitsaufnahme in die Zellen. Bei von BITO ET AL.
1966 durchgeführten Versuchen wurden sogenannte „dialysis sacs“, die Salzlösung mit
6% Dextrane enthielten, in das subkutane Nackengewebe und Parenchym einer
zerebralen Hemisphäre von Hunden implantiert. Nach einigen Wochen wurden diese
Säckchen chirurgisch entfernt und die Aminosäurekonzentration der Lösungen
bestimmt. Durch diese Experimente wurde erstmals das Prinzip eines von einer
Dialysemembran
umgebenen
separaten
Volumens,
welches
sich
mit
der
extrazellulären Umgebung äquilibriert, eingeführt. Allerdings war es nicht möglich akut
auftretende Konzentrationsveränderungen zu verschiedenen Zeitpunkten zu messen.
1972 vereinigte DELGADO ET AL. mit der Entwicklung einer sogenannten „dialytrode“,
bestehend aus zwei Stahlröhrchen, die eine push-pull-Kanüle bilden und in einer
permeablen Dialysemembran enden, die vorher beschriebenen Methoden. Aufgrund
der ausgeprägten Traumatisierung konnte sich dieses Verfahren nicht etablieren. Die
heute eingesetzten Mikrodialysesonden wurden 1974 von UNGERSTEDT und PYCOCK
entwickelt und werden mittlerweile in fast allen Organsystemen im Rahmen
wissenschaftlicher Untersuchungen eingesetzt (20).
1.2.2
Prinzip der Mikrodialyse
Das Prinzip der Mikrodialyse basiert auf Diffusion von Molekülen entlang eines
bestehenden Konzentrationsgefälles zwischen zwei Kompartimenten, die durch eine
semi-permeable Membran getrennt sind. In-vivo sind dies der Extrazellulärraum des
Gewebes
und
das
sogenannte
Perfusat
innerhalb
der
Mikrodialysesonde.
Extrazelluläre Substanzen, zum Beispiel Neurotransmitter und Metabolite diffundieren
in die Perfusionslösung, während dem Perfusat zugesetzte Substanzen in den
Extrazellulärraum diffundieren (Abbildung 1). Das abfließende Dialysat wird gesammelt
und analysiert.
Die Diffusion einer Substanz ist von der Molekülgröße, der Lipophilie bzw. Hydrophilie
des Perfusates, der Perfusionsgeschwindigkeit, dem Konzentrationsgradienten und
den Diffusionseingenschaften der Mikrodialysemembran abhängig. Meist werden
Membranen mit einer Moleküldurchlässigkeit von 3.000 bis 20.000 Da zum Nachweis
1 Einleitung
6
von Aminosäuren, Glukose, Laktat, Glycerol und Adenosin oder pharmakologischen
Substanzen wie Methylxanthinen verwendet. Spezielle Membranen bis 100.000 Da
erlauben auch die Diffusion kleiner Proteine (21).
Abb. 1: Mikrodialysesonde: Das Perfusat fliest über den zuführenden Schenkel entlang
einer semi-permeablen Membran und wird über den abführenden Schenkel als
Dialysat abgeleitet (21).
1.2.3
Definition der Recovery
Das Fick’sche Gesetz stellt die einfachste mathematische Beschreibung der Diffusion
dar:
DQ / dt = D * F * ∆C / I
Q = Stoffmenge; t = Zeiteinheit; D = Diffusionskoeffizient; F = Austauschfläche;
l = Diffusionsstrecke; ∆C = Konzentrationsdifferenz
Zwischen den Substanzkonzentrationen im Extrazellulärraum und im Perfusat stellt
sich ein dynamisches Gleichgewicht ein. Das Konzentrationsverhältnis zwischen
diesen beiden Kompartimenten wird als „recovery“ bezeichnet.
Die relative recovery entspricht dem prozentualen Substanzanteil, der aus dem
Interstitium
in
die
Perfusatlösung
diffundiert.
Durch
die
Perfusion
der
Mikrodialysesonde mit einer vorgegebenen Stoffmenge kann über die Differenz von
Ausgangskonzentration und Dialysatkonzentration auf die relative loss recovery
geschlossen werden. Diese wird bei Applikation exogener Substanzen über das
Perfusat bestimmt. Sowohl die relative recovery, als auch die relative loss recovery
korrelieren negativ mit der Perfusionsgeschwindigkeit.
1 Einleitung
7
Die absolute recovery in pmol min-1 ist definiert als die Stoffmenge einer Substanz, die
das Dialysat nach einer vorgegebenen Zeitspanne enthält. Sie nimmt bei steigendem
Perfusionsfluss
bis
zum
Konzentrationsänderungen
Erreichen
im
eines
Plateaus
Extrazellulärraum
und
zu.
Aufgrund
der
damit
möglicher
verbundenen
Beeinflussung des extrazellulären Milieus wird diese Methode selten eingesetzt (22)
(Abbildung 2).
100
90
Relative recovery [% ]
Absolute recovery [pmol/min]
Absolute recovery
80
70
60
50
40
30
20
Relative recovery
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Perfusionsgeschwindigkeit [µl/min]
Abb. 2: Einfluss der Perfusionsgeschwindigkeit (µl min-1) auf relative und absolute
recovery einer Mikrodialysemembran (CMA/10, Membranlänge 4 mm) (21)
1.2.4
Um
Möglichkeiten der Recovery-Bestimmung
Substanzkonzentrationen
im
dialysierten
Medium
zu
ermitteln,
kommen
verschiedene Methoden zur Messung der in-vitro und in-vivo recovery zur Anwendung.
Bei der in-vitro recovery-Bestimmung wird die Mikrodialysesonde in einer Lösung mit
bekannter Konzentration platziert und bei konstanter Flussrate das Dialysat analysiert.
Die in-vitro recovery errechnet sich mit der Formel:
Recovery = Konzentration im Dialysat / Ausgangskonzentration der Lösung x 100
Mit dieser Vorgehensweise können die Diffusionseigenschaften der Metabolite über die
Mikrodialysemembran verglichen werden.
Mittels der in-vivo recovery können die extrazellulären Konzentrationen quantifiziert
werden.
Bei der various-flow-rates-recovery wird die Sonde in situ mit verschiedenen
Geschwindigkeiten perfundiert. Die relative recovery nimmt dabei mit abnehmender
1 Einleitung
8
Perfusionsrate zu. Unter der Annahme, dass bei keinem Fluss die Konzentration auf
beiden Seiten der Membran gleich ist (relative recovery entspricht 100%) kann durch
Extrapolation die Substanzkonzentration im Interstitium bestimmt werden. LÖNNROTH
ET AL.
entwickelte 1987 die no-net-flux Methode. Hierbei werden vier bis fünf
unterschiedliche Dosierungen des zu bestimmenden Metaboliten appliziert, bis die
Konzentration im Dialysat gleich der des Perfusats ist, was der gesuchten recovery invivo entspricht. Nachteilig erwies sich bei beiden Vorgehensweisen, dass sie
zeitaufwendig sind und ein physiologisches Gleichgewicht voraussetzen. Ein weiteres
Verfahren ist die Kalibrierung mittels der internal reference Technik. Sie basiert auf der
Annahme, dass die Diffusion von Substanzen mit ähnlichen chemischen Eigenschaften
über die Membran in beiden Richtungen gleich ist. Der Perfusionsflüssigkeit wird zum
Beispiel
ein
Isotop
beigesetzt.
Im
Dialysat
sind
prozentualer
Verlust
des
Referenzwertes und prozentuale recovery der zu bestimmenden Substanz aus dem
Interstitium kongruent. Die Indikatorsubstanz kann während des gesamten Versuches
dem
Perfusat
beigesetzt
werden
und
ermöglicht
eine
Kontrolle
der
Diffusionseigenschaften sowie der physiologischen Veränderungen (23).
1.2.5
Beeinflussende Faktoren
Material und Porengröße der Mikrodialysemembran bestimmen wesentlich deren
Diffusionseigenschaften. So vermindern lipophile Membranen die Diffusion hydrophiler
Substanzen und umgekehrt.
Das Perfusat sollte an die physiologischen Gegebenheiten des Extrazellulärraumes
angepasst werden, um geringe Veränderungen im Interstitium zu erfassen und um
Auswirkungen der Perfusionslösung auf den Gewebestoffwechsel zu vermeiden.
Geringere Bedeutung wird der Perfusattemperatur beigemessen. DE LANGE ET AL.
äußerten die Vermutung, dass eine Anpassung an die Körpertemperatur nur bei
hypotonen Lösungen nötig sei (24).
Unterschiedliche Perfusionsgeschwindigkeiten wirken sich sowohl auf die recovery, als
auch auf das zu untersuchende Gewebe aus. Sie beeinflussen die Filtration durch die
Mikrodialysesonde, den Konzentrationsgradienten zwischen Perfusat und Interstitium
sowie das Volumen, das pro Zeiteinheit durch das Mikrodialysesystem fließt (25).
Das Gewebetrauma nach Platzierung der Mikrodialysesonden scheint keinen
ungünstigen Einfluss auf das interstitielle Milieu zu haben. Bereits nach einer etwa 15minütige Äquilibrierungszeit können im menschlichen M. quadriceps stabile Werte für
Glukose und Laktat gemessen werden (26).
1 Einleitung
1.2.6
9
Perspektiven
Die Mikrodialysetechnik als minimal-invasive Methode eröffnet eine Vielzahl von
Anwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise können Messungen über mehrere Tage
durchgeführt werden. Das Dialysat ist je nach gewählter Membran protein- und
keimfrei.
Der
Nachweis
lokaler
Konzentrationen
von
systemisch
applizierten
Substanzen ist möglich, was bei der Neuentwicklung von Medikamenten von
Bedeutung ist, um Rückschlüsse auf deren Einfluss in den einzelnen Geweben zu
erhalten (27).
1.3
Fragestellung
Seit mehr als drei Jahrzehnten stellt der in-vitro-Kontraktur-Test das einzige
zuverlässige Verfahren in der Diagnostik der malignen Hyperthermie Veranlagung dar.
Das Vorgehen ist aufwendig und birgt als invasive Methode für den Patienten Risiken,
wie Wundheilungsstörungen, Blutungen und lange Rekonvaleszenz.
In der vorliegenden Arbeit sollte ein Tiermodell zur isolierten Organperfusion der
Skelettmuskulatur
entwickelt
werden,
um
das
Prinzip
der
Mikrodialyse
für
Untersuchungen zur malignen Hyperthermie nutzbar zu machen. Verschiedene
theoretische Überlegungen zum intramuskulären Stoffwechsel sollten überprüft
werden:
Kann
der
lokale,
intramuskuläre
Metabolismus,
gemessen
an
der
intramuskulären Laktatkonzentration, durch lokal applizierte Substanzen wie
Koffein und Kalzium gesteigert werden?
Kann die lokale, intramuskuläre Laktatkonzentration durch die systemische
Perfusion mit Substanzen, welche Kalzium aus dem sarkoplasmatischen
Retikulum des Skelettmuskels freisetzen (Ryanodin) beziehungsweise deren
Freisetzung hemmen (Dantrolen), moduliert werden?
2 Methodik
10
2 METHODIK
2.1
2.1.1
Materialien
Mikrodialysesonden
2.1.1.1 Eigenschaften und Pflege
Für alle Messungen wurden CMA/20 Mikrodialysesonden (CMA/MIKRODIALYSE,
Stockholm, Schweden) verwendet. Die tubuläre Membran besteht aus Polycarbonat
mit einer Moleküldurchlässigkeit bis 20.000 Dalton. Der Membranaußendurchmesser
beträgt 0,5 mm bei einer Membranlänge von 10 mm. Die Länge des zuführenden
Schenkels, über welchen das Perfusat appliziert wird, sowie des abführenden
Schenkels für das Dialysat, beträgt 200 mm. Das Totraumvolumen der Membran und
des abführenden Schenkels beläuft sich auf 7,6 µl (28).
Vor erstmaligen Gebrauch wurden die Sonden für 12 Stunden bei einer
Geschwindigkeit von 1 µl min-1 mit 70% Ethanol (MALINCKRODT BAXTER B.V., Deventer,
Holland) perfundiert, um Glycerol, welches die Austrocknung der Membran während
der Lagerung verhindert, auszuwaschen. Anschließend wurden diese, ebenfalls bei 1
µl min-1 Fluss, für 3 Stunden mit aqua ad injectabile (BRAUN, Melsungen, Deutschland)
gespült. Nach jedem Versuch wurden die Mikrodialysesonden für 30 min bei einer
Perfusionsgeschwindigkeit von 0,5 µl min-1 mit 70% Ethanol und im Anschluss, bis zur
nächsten Verwendung, mit aqua ad injectabile gespült.
2.1.1.2 Kalibrierung der Sonden in-vitro
Um stabile Diffusionseigenschaften zu gewährleisten, wurde vor der erstmaligen
Verwendung und nach jeweils sechs Versuchen die relative recovery in-vitro für eine
bekannte Laktatkonzentration bestimmt. Betrug der ermittelte Wert bei einer
Perfusionsgeschwindigkeit von 1 µl min-1 weniger als 70%, wurde die Sonde ersetzt.
2.1.2
Substanzen und Material
2.1.2.1 Pipetten
Für die Gesamtdauer der Arbeit wurden stets dieselben Pipetten (EPPENDORF,
Hamburg, Deutschland) mit einem Volumen von 1 ml beziehungsweise 0-200 µl und
dazu passende Pipettenspitzen (HARTMANN, Hamburg, Deutschland) verwendet. Vor
Beginn der Studie und in regelmäßigen Abständen wurde die exakte Eichung beider
Pipetten
durch
Pipettieren
einer
vorgegebenen
Volumenmenge
auf
einer
Präzisionswaage Typ R 180 D (SARTORIUS GMBH, Göttingen, Deutschland) bestimmt.
2 Methodik
11
2.1.2.2 Systemische und lokale Perfusionslösungen
Für die isolierte Organperfusion wurden Ringerlösung (Na+ 147,1 mM, K+ 4,0 mM, Ca2+
2,25 mM, Cl- 155,6 mM) (FRESENIUS, Bad Homburg, Deutschland), Ringerlösung mit
Dantrolen 1 µM (SIGMA CHEMICALS, Deisenhofen, Deutschland) sowie Ringerlösung mit
Ryanodin 0,25 µM bzw. 1 µM (PROCTER & GAmble, Weiterstadt, Deutschland)
verwendet.
Zur Herstellung der 80 mM Sorbitollösung wurden zu 100 ml Ringerlösung 1457,6 mg
Sorbitol (M = 182,2 g mol-1) (SIGMA CHEMICALS, Deisenhofen, Deutschland) zugesetzt
und mittels Rührmagnetstab bei Raumtemperatur gelöst.
Um 20 mM, 40 mM beziehungsweise 80 mM Kalziumlösungen herzustellen, wurden
294,04 mg, 588,08 mg beziehungsweise 1176,16 mg Kalziumchlorid-Dihydrat (M =
147,02 g mol-1) (MERCK, Darmstadt, Deutschland) mit 100 ml Ringerlösung zersetzt.
Für 40 mM und 80 mM Koffeinlösungen wurden 776,7 mg beziehungsweise 1553,4 mg
Koffein (M = 194,19 g mol-1) (MERCK, Darmstadt, Deutschland) in 100 ml Ringerlösung
aufgelöst.
Für die spektrophotometrische Messung von Laktat wurde Laktatreagenz (SIGMA
CHEMICALS, Deisenhofen, Deutschland) in 10 ml aqua ad injectabile gelöst. Das
Reagenz enthielt 400 U l-1 Laktatoxidase, 2 400 U l-1 Peroxidase, chromogene
Vorstufen, verschiedene Stabilisatoren, sowie Füllstoffe bei einem pH-Wert von 7,2.
Das gelöstes Reagenz war bei Raumtemperatur (18-26oC) 8 Stunden und gekühlt (28oC) 7 Tage stabil (29).
2.1.3
Geräte
Es wurde die Präzisionsspritzenpumpe CMA/100 (CMA/MIKRODIALYSE, Stockholm,
Schweden)
mit
drei
dazu
kompatiblen
1
ml
Spritzen
Exmire
Microsyringe
(CMA/MIKRODIALYSE, Stockholm, Schweden) verwendet. Mittels CMA/11 Umschalters
(CMA/MIKRODIALYSE, Stockholm, Schweden) war es während der Versuche möglich,
zwischen den Spritzen mit ihren verschiedenen Lösungen ohne Veränderungen des
Flusses zu wechseln.
Zur
isolierten
(FRESENIUS,
Organperfusion
Bad
Homburg,
wurde
die
Deutschland)
Infusionspumpe
mit
VP/1000-Infusomat
kompatiblem
Schlauchsystem
(FRESENIUS, Bad Homburg, Deutschland) verwendet.
Die Bestimmung der Dialysatkonzentrationen von Laktat und Koffein erfolgten mit Hilfe
des HP 8453-UV-Visible Spektrophotometers (HEWLETT PACKARD, Waldbronn,
Deutschland), kombiniert mit einem Vectra XA-Computer (HEWLETT PACKARD) und dem
Programm Visible-Chem-Station Software (HEWLETT PACKARD).
2 Methodik
2.1.4
12
Versuchstiere
Es wurden 61 männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht zwischen 250 und
300 Gramm verwendet. Futter und Trinkwasser wurde ihnen ad libitum bis unmittelbar
vor Versuchsbeginn angeboten.
2.2
2.2.1
Ermittlung der Standardkurven
Standardkurve für Laktat
Zur Erstellung der spektrometrischen Laktat-Standardkurve wurden jeweils zwei
Messungen verschiedener Konzentrationen eines Laktatstandards (Laktat 20 mg dl-1,
40 mg dl-1, 80 mg dl-1, 120 mg dl-1) (SIGMA CHEMICALS, Deisenhofen, Deutschland)
durchgeführt. Je 10 µl des Laktatstandards wurden zu 1000 µl Laktatreagenz gegeben
und für 10 min in einer Präzisionsküvette (HELLMA, Hamburg, Deutschland) im Dunkeln
inkubiert. Bei diesem enzymatischen Bestimmungsverfahren wird Milchsäure durch
Laktatoxidase zu Pyruvat und Wasserstoffperoxid (H2O2) umgewandelt. In Gegenwart
von H2O2 katalysiert Peroxidase die oxidative Kondensierung chromogener Vorstufen,
die einen Farbstoff mit einem Absorptionsmaximum bei 540 nm bilden. Die gemessene
Absorption ist der Laktatkonzentration in der Probe direkt proportional (30). Aus den
gemessenen Werten wurde eine lineare Standardkurve durch den Nullpunkt nach dem
Lambert-Beer-Gesetz erstellt (31) (Abbildung 3).
1,6
Absorbtion 540nm
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
2
4
6
8
Laktat [mM ]
Abb. 3: Laktat-Standardkurve
10
12
14
2 Methodik
2.2.2
13
Standardkurve für Koffein
Für die Bestimmung der Koffein-Standardkurve wurden jeweils zwei Messungen einer
bekannten Koffeinkonzentration (Koffein 0,004 mM, 0,01 mM, 0,02 mM, 0,04 mM, 0,1
mM) bei einem Absorptionsmaximum von 273 nm durchgeführt. Aus den gemessenen
Werten wurde eine lineare Standardkurve durch den Nullpunkt nach dem LambertBeer-Gesetz erstellt (31) (Abbildung 4).
1,2
Absorbtion 273nm
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,02
0,04
0,06
Koffein [mM]
Abb. 4: Koffein-Standardkurve
0,08
0,1
0,12
2 Methodik
2.3
2.3.1
14
Versuchsaufbau
Versuchsbedingungen
Sämtliche Versuche wurden bei Raumtemperatur (19-21oC) durchgeführt.
2.3.2
Versuchsaufbau für die Bestimmung der in-vitro recovery
Sowohl für die Bestimmung der relative recovery, als auch der relative loss recovery
wurde der in Abbildung 5 gezeigte Versuchsaufbau verwendet.
B
A
D
C
Abb. 5: A: Präzisionsspritzenpumpe mit Perfusionslösungen; B: Umschalter; C:
Mikrodialysesonden im Medium; D: Sammelgefäße für das Dialysat
2.3.2.1 Ermittlung der relative recovery von Laktat
Zur Bestimmung der Diffusionseigenschaften der Membran in-vitro wurden die
Mikrodialysesonden
in
Eppendorf
Reaktionsgefäßen
(EPPENDORF,
Hamburg,
Deutschland) mit 1 ml einer 10 mM Laktatkonzentration platziert und mittels
Ringerlösung bei Geschwindigkeiten von 0,5; 1; 3; 5; und 10 µl min-1 perfundiert. Es
wurden je zwei Proben mit einer Volumenmenge von 15 µl gesammelt und sofort
analysiert. Die erste Probe zu Beginn und nach jeder Flussgeschwindigkeitsänderung
wurde verworfen.
2 Methodik
15
2.3.2.2 Ermittlung der relative loss recovery von Koffein
Zur Bestimmung der relative loss recovery wurden die Sonden in Ringerlösung platziert
und mit einer 40 mM Koffeinkonzentration bei Flussgeschwindigkeiten von 0,5; 1; 3; 5
und 10 µl min-1 perfundiert. Das gesammelte Dialysatvolumen betrug 15 µl. Die erste
Probe nach Versuchsbeginn, sowie nach jeder Perfusionsänderung wurde verworfen.
Das mit Ringerlösung 1:1000 verdünnte Dialysat wurde spektrophotometrisch bei 273
nm gemessen.
2.3.2.3 Ermittlung der relative loss recovery von Kalzium
Die in Ringerlösung platzierten Dialysesonden wurden bei Flussgeschwindigkeiten von
0,5; 1; 3; 5 und 10 µl min-1 mit einer 20 mM Kalziumlösung perfundiert. Die
gesammelte Menge des Dialysats betrug 60 µl. Die erste Messung zu Beginn und nach
jeder Perfusionsänderung wurde verworfen. Bis zur flammenspektrometrischen
Analyse durch das Zentrallabor der Universität Würzburg, wurden die Proben in einem
Verhältnis von 1:10 mit aqua ad injectabile verdünnt und bei 4oC gelagert.
2.3.3
Isolierte Organperfusion des Skelettmuskels der Ratte
2.3.3.1 Präparation der Versuchstiere
Die Versuchstiere wurden unter Inhalationsanästhesie mit Isoflurane (Forene, ABBOTT
GMBH,
Wiesbaden,
Deutschland)
bei
erhaltener
Spontanatmung
und
Herz-
Kreislauffunktion laparotomiert und nach Darstellung der abdominellen Gefäße unter
stumpfer Präparation mit 500 U I-1 Heparin (Liquemin N 25.000, ROCHE, GrenzachWyhlen, Deutschland) über die Vena renalis antikoaguliert. Im Anschluss wurden die
Versuchstiere durch Entbluten aus der Vena renalis in tiefer Narkose getötet. Nun
folgte die antegrade Kanülierung der Aorta abdominalis mittels eines 26 G
Venenkatheters (BOC OHMEDA AB, Hesingborg, Schweden). Nach Fixierung des
Katheters durch einen chirurgischen Faden 5/0 (PETERS, Bobigny, Frankreich) und
Anschluss
einer
mit
Carbogengas-oxygenierten
(95%
O2
und
5%
CO2)
Infusionslösung, wurden beide Hinterläufe mit 30 ml h-1 perfundiert. Nach beidseitiger
Freilegung der Mm. adductores wurden die Beckenorgane, der Enddarm mit
versorgenden Arterien, sowie der Dünndarm on bloc ligiert. Mit Hilfe einer 18 G
Führungskanüle wurden die Mikrodialysesonden in der Adduktorengruppe beider
Extremitäten, jeweils 1 cm medial der Femoralgefäße platziert. Die Zeitspanne von
Anästhesie bis zur Sondenplatzierung betrug 9 - 10 min (Abbildung 6 und 7).
2 Methodik
16
F
B
G
E
A
C
D
Abb.
6:
A:
Präzisionsspritzenpumpe;
B:
Umschalter;
C:
Versuchstier
mit
Mikrodialysesonden in den Mm. adductores und Venenkatheter in der Aorta
abdominalis;
D:
Sammelgefäße
für
das
Dialysat;
E:
Infusionspumpe;
2
4
6
8
10
Versuchsbeginn
Beginn der Äquilibrierungsphase
Sondenplatzierung
Präparation der Mm. adductores
Tötung des Tieres
Punktion der A. abdominalis
Heparinisierung
Anästhesie
0
Beginn der Präparation
Infusionslösung; G: Carbogenflasche (95% O2 und 5% CO2)
12
14
Zeit [min]
Abb. 7: Zeitlicher Ablauf der Tierpräparation
16
18
20
22
24
26
F:
2 Methodik
17
2.3.3.2 Basale Laktatkonzentrationen in beiden Hinterläufen
Zum Vergleich der Laktatkonzentration beider Extremitäten ohne Einfluss von
Medikamenten
wurde
das
Organpräparat
mit
carboxygenierter
Ringerlösung
perfundiert (n = 6). Je eine Mikrodialysesonde wurde in den Adduktorengruppen
beidseits
platziert
und
mit
Ringerlösung
perfundiert.
Nach
15-minütiger
Äquilibrierungsphase wurden jeweils neun Proben im Abstand von 15 min, bei einer
Versuchsdauer von 135 min, gesammelt.
2.3.3.3 Einfluss
der
Osmolarität
des
Mikrodialyse-Perfusats
auf
die
Laktatkonzentration
Der Einfluss der Osmolarität des Perfusats auf die Laktatkonzentration im Dialysat
wurde
ebenfalls
an
6
Organpräparaten
untersucht.
Nach
Platzierung
der
Dialysesonden und 15-minütiger Äquilibrierung wurde ein beidseitiger Kontrollwert
ohne Sorbitol erhoben. Im Anschluss wurden je acht Proben im Abstand von 15 min
gesammelt, wobei die rechte hintere Extremität über die Mikrodialysesonde mit 80 mM
Sorbitollösung und die Kontrollseite weiterhin mit Ringerlösung perfundiert wurde.
2.3.3.4 Einfluss von Kalzium im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration
Der Einfluss von 20 mM, 40 mM beziehungsweise 80 mM Kalzium/Ringerlösung auf
die Laktatkonzentration im Dialysat wurde an 6 Präparaten untersucht. Nach
Platzierung der Dialysesonde wurde die rechte hintere Extremität mit 20 mM, 40 mM
beziehungsweise 80 mM Kalziumlösung und die linke hintere Extremität mit
Ringerlösung perfundiert. Im Anschluss an die Äquilibrierungsphase wurden je neun
Dialysatproben gesammelt.
2.3.3.5 Einfluss von Koffein im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration
Um die Wirkung von Koffein (40 mM bzw. 80 mM) im Mikrodialyse-Perfusat zu
untersuchen, wurden je sechs Versuchstiere präpariert und die Hinterläufe isoliert
perfundiert.
Nach
Einbringen
in
die
Adduktorengruppe
wurden
beide
Mikrodialysesonden mit Ringerlösung perfundiert, 15 min lang äquilibriert und ein
Kontrollwert ohne Koffein bestimmt. Im Anschluss wurde die rechte hintere Extremität
mit 40 mM beziehungsweise 80 mM Koffeinlösung und die linke hintere Extremität
weiterhin mit Ringerlösung perfundiert.
2 Methodik
18
2.3.3.6 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 0,25 µM sowie
1 µM Ryanodinlösung
Der Ablauf entsprach der Versuchsreihe mit 40 mM Koffein mit dem Unterschied, dass
für die systemische Organperfusion carboxygenierte 0,25 µM beziehungsweise 1 µM
Ryanodinlösung verwendet wurde.
2.3.3.7 Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 1 µM
Dantrolenlösung
Der Ablauf entsprach der Versuchsreihe mit 40 mM Koffein mit dem Unterschied, dass
für die systemische Organperfusion 1 µM Dantrolenlösung verwendet wurde.
2.3.3.8 Perfusionskontrolle
Am
Versuchsende
wurde
die
seitengleiche
und
homogene
Perfusion
des
Organpräparates durch Applikation von 1 ml Methylenblau (NEOPHARMA, Aschau im
Chiemgau, Deutschland) in die Aorta abdominalis kontrolliert (Abbildung 8). Bei
fehlender
seitengleicher
Verfärbung
des
Muskelgewebes
wurden
die
Versuchsergebnisse wegen des Verdachts einer Organperfusionsstörung verworfen.
Abb. 8: Der schraffierte Bereich zeigt schematisch die gleichmäßige Perfusion der
Extremitäten nach Gabe von 1 ml Methylenblau.
2 Methodik
2.4
19
Probenanalyse
10 µl des frischen Dialysats wurden zu 1000 µl Laktatreagenz pipettiert, vermischt und
in
Dunkelheit
für
10
min
bei
Raumtemperatur
inkubiert.
Laktat
wurde
spektrophotometrisch bei 540 nm gemessen.
2.5
Histologische Untersuchung der Muskelpräparate
Um Auswirkungen der Sondenimplantation und der applizierten Substanzen auf das
Muskelgewebe zu untersuchen, wurden von untersuchtem Gewebe histologische
Präparate mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung angefertigt (Institut für Pathologie).
2.6
Statistik
Die statistischen Berechnungen wurden mittels EXCEL 2000, SPSS 9.0.1 sowie
alternativ mittels SAS VERSION 8 durchgeführt.
Die Daten sind angegeben als Mittelwert (M) und Standardfehler des Mittelwertes
(SEM). Aufgrund der geringen Streuung werden die Messungen der recovery als
Mittelwert (M) und Standardabweichung (SD) dargestellt. Verwendet wurde der
Shapiro-Wilk-Test zum Nachweis der Normalverteilung, der Mann-Whitney-U-Test mit
Bonferroni-Korrektur zur Bestätigung von Verschiedenheiten der Gruppen zum
jeweiligen Messzeitpunkt, sowie die Multivarianzanalyse nach Puri & Sen.
Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 festgelegt.
3 Ergebnisse
20
3 ERGEBNISSE
3.1
3.1.1
Für
Bestimmung der relative recovery und der relative loss recovery
Bestimmung der relative recovery von Laktat in-vitro
eine
vorgegebene
Laktatkonzentration
wurde
die
relative
recovery
der
Mikrodialysesonden in-vitro bestimmt. Die verwendeten Perfusionsgeschwindigkeiten
von 0,5; 1 ;3; 5 und 10 µl min-1 korrelierten negativ mit der relative recovery. Die
relative recovery erreichte bei 0,5 µl min-1 92 ± 6% und fiel bei 10 µl min-1 auf 16 ± 2%
ab. Bei einer Perfusion mit 1 µl min-1 wurde eine relative recovery von 77 ± 7% ermittelt
(Abbildung 9).
Relative Recovery [%]
120
100
80
60
40
20
0
0
5
10
Perfusionsgeschwindigkeit [µl/min]
Abb. 9: Recovery von Laktat über die Membran einer CMA/20 Mikrodialysesonde bei
verschiedenen Perfusionsgeschwindigkeiten; M ± SD; n = 12.
3.1.2
Bestimmung der relative loss recovery von Koffein in-vitro
Für die Bestimmung der in-vitro relative loss recovery von Koffein, wurden die Sonden
mit
einer
bekannten
Koffeinkonzentration
perfundiert.
Bei
einer
Perfusionsgeschwindigkeit von 0,5 µl min-1 wurde eine relative loss recovery von 90 ±
2% ermittelt, die bei 10 µl min-1 auf 17 ± 4% abfiel. Für 1 µl min-1 Fluss betrug die
relative loss recovery 76 ± 8% (Abbildung 10).
3 Ergebnisse
21
Relative Recovery [%]
120
100
80
60
40
20
0
0
5
10
Perfusionsgeschwindigkeit [µl/min]
Abb. 10: Relative loss recovery von Koffein über die Membran einer CMA/20
Mikrodialysesonde bei verschiedenen Perfusionsgeschwindigkeiten; M ± SD; n = 10.
3.1.3
Bestimmung der relative loss recovery von Kalzium in-vitro
Die Mikrodialysesonden wurden mit einer bekannten Kalziumkonzentration perfundiert.
Die ermittelten Werte lagen zwischen 77 ± 2% bei 0,5 µl min-1 und 13 ± 2% bei 10 µl
min-1. Für eine Perfusion von 1 µl min-1 betrug die relative loss recovery von Kalzium
60 ± 2% (Abbildung 11).
Relative Recovery [%]
120
100
80
60
40
20
0
0
5
10
Perfusionsgeschwindigkeit [µl/min]
Abb. 11: Relative loss recovery von Kalzium über die Membran einer CMA/20
Mikrodialysesonde bei verschiedenen Perfusionsgeschwindigkeiten M ± SD; n = 4.
3 Ergebnisse
3.2
3.2.1
22
Ergebnisse der isolierten Organperfusion
Basale Laktatkonzentrationen in beiden Hinterläufen
Nach Platzierung und Äquilibierung der Sonde in beiden Adduktorengruppen wurde
eine Laktatkonzentration von 1,25 ± 0,22 und 1,56 ± 0,15 mM gemessen. Unter
Ringerperfusion stieg die lokale Laktatkonzentration bis auf 210 ± 16% in der rechten
hinteren Extremität beziehungsweise auf 171 ± 13% in der linken hinteren Extremität
(Abbildung 12).
400
Laktatanstieg [%]
350
Rechte Extremität
Linke Extremität
300
250
200
150
100
50
0
0
30
60
90
120
150
Zeit [min]
Abb.
12:
Intramuskulärer
Laktatanstieg
unter
isolierter
Organperfusion
Ringerlösung; M ± SEM; n = 6; p < 0,05 für (*) rechte vs. linke Extremität.
mit
3 Ergebnisse
3.2.2
23
Einfluss der Osmolarität des Mikrodialyse-Perfusats auf die Laktatkonzentration
Die Laktatausgangswerte betrugen 1,13 ± 0,21 und 1,27 ± 0,02 mM. Unter Perfusion
der Mikrodialysesonde mit 80 mM Sorbitol stieg die Laktatkonzentration auf 170 ± 14%
verglichen mit 167 ± 7% für die Kontrollgruppe der kontralateralen Extremität
(Abbildung 13).
400
Sorbitol 80 mM
Kontrolle
Laktatanstieg [%]
350
300
250
200
150
100
50
0
0
30
60
90
120
150
Zeit [min]
Abb. 13: Intramuskulärer Laktatanstieg mit und ohne Sorbitolzusatz im Perfusat; M ±
SEM; n = 6; p < 0,05 für (*) Sorbitolgruppe vs. Kontrolle.
3 Ergebnisse
3.2.3
24
Einfluss von Kalzium im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration
Die Laktatwerte zu Beginn betrugen 1,62 ± 0,15 und 1,84 ± 0,15 mM. Unter Perfusion
der Sonde mit 20 mM Kalzium stieg die lokale Laktatkonzentration signifikant auf 466 ±
31% im Vergleich zu 165 ± 6% für die Kontrollgruppe.
Bei den Experimenten mit 40 mM Kalzium wurden Laktatausgangswerte von 1,84 ±
0,18 und 2,04 ± 0,15 mM gemessen. Die Laktatkonzentration stieg signifikant auf 632 ±
48% für die Kalziumgruppe gegenüber 201 ± 38% für die Kontrolle.
Für die Versuche mit 80 mM Kalzium lagen die Ausgangswerte von Laktat bei 1,34 ±
0,14 und 1,63 ± 0,14 mM und die Laktatkonzentration stieg unter Stimulation mit
Kalzium signifikant auf 635 ± 81% im Gegensatz zu 191 ± 5% für die
Kontrollmessungen (Abbildung 14).
Kalzium 20 mM
800
Kontrolle
700
Laktatanstieg [%]
600
500
Kalzium 40 mM
*
Kontrolle
+
Kalzium 80 mM
*
Kontrolle
+
*
+
+
*
*
+
+
#
#
#
+
300
+
*
#
*
400
*
#
#
200
100
0
0
30
60
90
120
150
Zeit [min]
Abb. 14: Intramuskulärer Laktatanstieg unter Stimulation mit 20 mM, 40 mM und 80
mM Kalzium sowie ohne Kalziumstimulation; M ± SEM; n = 6 pro Gruppe; p < 0,05 für
(#) Kalzium 20 mM vs. Kontrolle; (+) Kalzium 40 mM vs. Kontrolle; (*) Kalzium 80 mM
vs. Kontrolle.
3 Ergebnisse
3.2.4
25
Einfluss von Koffein im Mikrodialyse-Perfusat auf die Laktatkonzentration
Für die Versuchsreihe mit 40 mM Koffein lagen die Laktatausgangswerte bei 1,28 ±
0,16 und 1,73 ± 0,19 mM. Unter Stimulation mit 40 mM Koffein stieg die
Laktatkonzentration signifikant auf 270 ± 21% im Vergleich zu 182 ± 9% für die
Kontrollgruppe.
Bei einer weiteren Testreihe mit 80 mM Koffein wurden Ausgangswerte von 1,39 ±
0,15 und 2,07 ± 0,11 mM ermittelt. In der Stimulansgruppe stieg die lokale
Laktatkonzentration signifikant auf 337 ± 19% gegenüber 152 ± 13% für die Kontrolle
(Abbildung 15).
*
400
*
Laktatanstieg [%]
350
Koffein 40 mM
Kontrolle
Koffein 80 mM
Kontrolle
300
250
*
200
*
150
*
*
*
+
+
+
+
+
+
100
50
0
0
30
60
90
120
150
Zeit [min]
Abb. 15: Intramuskulärer Laktatanstieg unter Stimulation mit 40 mM und 80 mM
Koffein sowie ohne Koffeinstimulation; M ± SEM; n = 6 pro Gruppe; p < 0,05 für (+)
Koffein 40 mM vs. Kontrolle; (*) Koffein 80 mM vs. Kontrolle.
3 Ergebnisse
3.2.5
26
Lokale Koffeinstimulation und gleichzeitige Organperfusion mit 0,25 µM sowie 1
µM Ryanodinlösung
Unter isolierter Organperfusion mit 0,25 µM Ryanodinlösung äquilibrierten sich die
Laktatausgangwerte bei 1,32 ± 0,16 und 2,25 ± 0,14 mM. Nach Perfusion der
Mikrodialysesonde mit 40 mM Koffein stieg die lokale Laktatkonzentration signifikant
auf 279 ± 23% gegenüber 151 ± 11% in der Kontrollgruppe.
Bei Perfusion des Skelettmuskelpräparates mit 1 µM Ryanodinlösung wurden
Laktatwerte von 1,46 ± 0,13 und 1,84 ± 0,30 mM gemessen. Durch Stimulation mit 40
mM Koffein konnte die Laktatkonzentration signifikant auf 331 ± 19% im Vergleich zu
214 ± 26% für die Kontrollreihe gesteigert werden (Abbildung 16).
400
350
Laktatanstieg [%]
*
Koffein 40 mM &
Ryanodininfusion 0,25 µM
Kontrolle
300
Koffein 40 mM &
Ryanodininfusion 1 µM
Kontrolle
250
200
+
150
*
*
*
+
+
+
+
+
*
100
50
0
0
30
60
90
120
150
Zeit [min]
Abb. 16: Intramuskulärer Laktatanstieg unter Stimulation mit 40 mM Koffein und
Organperfusion mit 0,25 µM beziehungsweise 1 µM Ryanodinlösung sowie ohne
Koffeinstimulation; M ± SEM; n = 6 pro Gruppe; p < 0,05 für (+) Koffein & Ryanodin
0,25 µM vs. Kontrolle; (*) Koffein & Ryanodin 1 µM vs. Kontrolle.
3 Ergebnisse
3.2.6
27
Lokale
Koffeinstimulation
und
gleichzeitige
Organperfusion
mit
1
µM
Dantrolenlösung
Für die Versuchsreihe unter isolierter Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung wurde
ein Laktatausgangswert von 1,05 ± 0,19 mM gemessen. Nach Stimulation mit 40 mM
Koffein stieg die lokale Laktatkonzentration auf 193 ± 13% an. Zum Vergleich lagen die
Laktatwerte der Kontrollgruppen mit beziehungsweise ohne Koffeinstimulation unter
Organperfusion mit Ringerlösung bei 1,28 ± 0,16 mM sowie 1,73 ± 0,19 mM und
stiegen bis zum Versuchende auf 270 ± 21% beziehungsweise 162 ± 9% (Abbildung
17).
300
250
Laktatanstieg [%]
*
Koffein 40 mM &
Dantroleninfusion 1 µM
*
Koffein 40 mM
200
Kontrolle
*
*
*
+
+
*
150
100
50
0
0
30
60
90
120
150
Zeit [min]
Abb. 17: Intramuskulärer Laktatanstieg unter Stimulation mit 40 mM Koffein und
Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung sowie unter Stimulation mit 40 mM Koffein
und Organperfusion mit Ringerlösung; M ± SEM; n = 6 pro Gruppe; p < 0,05 für (+) 40
mM Koffein und Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung vs. Kontrollgruppe unter
Organperfusion mit Ringerlösung; (*) 40 mM Koffein und Organperfusion mit 1 µM
Dantrolenlösung vs. 40 mM Koffein und Organperfusion mit Ringerlösung.
3 Ergebnisse
3.3
28
Histologische Untersuchung der Muskelpräparate
In den histologischen Untersuchungen von drei Muskelpräparaten nach isolierter
Perfusion und Koffein-Applikation per Mikrodialyse ergaben sich bis auf dezente
interstitielle Ödeme keine Hinweise auf eine Schädigung des Muskelgewebes durch
die Platzierung der Mikrodialysesonden beziehungsweise durch die Applikation der
verwendeten Substanzen (Abbildung 18).
Abb. 18: Muskelgewebe mit angeschnittener Führungskanüle (links). Färbung:
Hämatoxylin-Eosin
4 Diskussion
29
4 DISKUSSION
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass (a) mittels der minimalinvasiven Mikrodialysetechnik lokale Laktatmessungen im Skelettmuskel der Ratte
möglich sind, (b) eine wesentliche Beeinflussung der Ergebnisse durch die Osmolarität
der Perfusionslösungen beziehungsweise durch die Implantation der Sonden
ausgeschlossen werden kann, (c) die intramuskuläre Laktatkonzentration durch lokale
Applikation von Koffein und Kalzium mit Hilfe einer Mikrodialysesonde sowie (d) durch
systemische Organperfusion mit Ryanodinlösung gesteigert wird, während die
systemische Dantroleninfusion den koffeininduzierten Laktatanstieg hemmt.
Die Substanzkonzentration im Dialysat ist abhängig von der Stoffmenge im Gewebe
sowie von der Fläche und dem Material der gewählten Mikrodialysemembran (21). Der
Konzentrationsunterschied zwischen Gewebe und Perfusat ist die treibende Kraft für
die Diffusion über die Mikrodialysemembran. Je größer die Austauschfläche der Sonde
ist, umso höher liegt die recovery. Allerdings führen sehr lange Membranen zu einem
Verlust von Perfusatflüssigkeit bedingt durch nichtpermeable Proteine, die einen
osmotischen Gradienten aufbauen. Ebenso begrenzt die Porengröße der Membran die
Substanzdiffusion
in
das
Perfusat.
Vergleiche
von
unterschiedlichen
Membranmaterialien ergaben bei identischen Substanzkonzentrationen Differenzen in
der recovery (32). Die verwendeten CMA/20 Sonden wurden bei früheren
Untersuchungen des Laktatstoffwechsels im Skelettmuskel von Ratten und Menschen
verwendet, wobei eine Beeinflussung der Ergebnisse durch das Membranmaterial nicht
beobachtet wurde (33).
Um einer Veränderung des perimembranären Interstitiums, verursacht durch die
Zusammensetzung des Perfusats, entgegen zu wirken, sollte dieses in Bezug auf
Ionen-Zusammensetzung und Osmolarität möglichst der Extrazellulärflüssigkeit
entsprechen. In der vorliegenden Arbeit wurden die verwendeten Substanzen in Ringer
gelöst. Obwohl dies in früheren Untersuchungen keinen Einfluss auf das interstitielle
Milieu gezeigt hat, kann eine Veränderung der interstitiellen Ionen-Zusammensetzung
und des pH-Wertes unmittelbar an der Mikrodialysemembran und damit einhergehend
ein Einfluss auf die Laktatkonzentration nicht völlig ausgeschlossen werden (34).
Die Wahl einer optimalen Perfusionsgeschwindigkeit ist ausschlaggebend, um
zuverlässige Messergebnisse zu erhalten. Niedrige Flussgeschwindigkeiten erhöhen
die relative recovery, weil mehr Zeit für die Diffusion zur Verfügung steht. Nachteilig
erweist sich aber die geringe absolute Menge des gewonnen Dialysats, die eine
Bestimmung mit hochempfindlichen Methoden, z. B. UV-Spektrometrie, HPLChromatographie
oder
Massenspektrometrie,
notwendig
macht.
Ein
hoher
4 Diskussion
30
Perfusionsfluss vergrößert die Menge des gewonnen Volumens, verringert aber die
Substanzkonzentration
im
Dialysat.
Ebenso
üben
hohe
Flussraten
einen
hydrostatischen Druck an der Mikrodialysemembran aus, der zur Ultrafiltration von
Flüssigkeit mit Perfusatverlust in das Interstitium führt (20). Bei Flussgeschwindigkeiten
bis 10 µl min-1 wurden weniger als 0,1% des Perfusatvolumens in das Interstitium
filtriert (25). Somit kann in der vorliegenden Arbeit bei einem Fluss von 1 µl min-1 ein
wesentlicher Filtrationseffekt ausgeschlossen werden.
Bereits
in
früheren
Untersuchungen
wurden exogene Substanzen über die
Mikrodialysemembran appliziert und die ausgelösten Stoffwechseländerungen im
Dialysat untersucht (20). Dies wird möglich, weil Substanzen sowohl aus dem Perfusat
heraus, wie auch aus dem Extrazellulärraum in das Perfusat diffundieren können (35).
Um
die
Diffusionseigenschaften
und
damit
die
Membranqualität
der
Mikrodialysesonden zu überprüfen, wurde zu Beginn und nach jeder Versuchsreihe die
relative recovery von Laktat in-vitro bestimmt (23). Die in-vitro recovery Werte in der
vorliegenden Untersuchung entsprechen weitgehend den Messergebnissen früherer
Publikationen (33). Allerdings lässt die in-vitro recovery nur bedingt Rückschlüsse auf
die in-vivo Substanzkonzentration im Interstitium zu, weil Zellmembranen die Diffusion
vor allem hydrophiler Stoffe beeinträchtigen und der für den Massentransport relevante
Extrazellulärraum nur einen Teil des Gewebevolumens darstellt (36). In dieser Arbeit
wurde keine Sondenkalibrierung in-vivo durchgeführt, da aufgrund des Versuchaufbaus
kein physiologisch stabiles Gleichgewicht in der Muskulatur erreicht wurde und daher
die Laktatkonzentration im Verlauf zwar gering aber stetig anstieg. Bei vergleichbaren
absoluten Ausgangswerten der beiden Extremitäten unter Ringerperfusion, wurden in
Anlehnung an ARNER ET AL. nur die relativen Veränderungen bewertet (37). Um
absolute Laktatkonzentrationen zu bestimmen, hätte die Anwendung eines internen
Standards im Perfusat eine Alternative dargestellt, da diese Methode keine „steadystate“-Bedingungen im Gewebe voraussetzt und Veränderungen im Extrazellulärraum
unmittelbar nachweist (21).
Untersuchungen
von
Anästhetikawirkungen
auf
den
Stoffwechsel
der
Skelettmuskulatur von Ratten zeigen für das in unserer Arbeit verwendete
Anästhetikum Isofluran nur geringe Veränderungen des Laktatstoffwechsels. Noch
geringere Effekte sind nur unter Enfluran oder intraperitonealer Ketamininjektion
beschrieben (38). Die Beeinflussung durch das verwendete Anästhetikum scheint
vernachlässigbar klein zu sein. Ein Einfluß auf die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
ist daher unwahrscheinlich.
Bereits nach 5-minütiger Ischämiezeit kommt es zu einem deutlichen Anstieg der
Laktatkonzentration im Muskelgewebe (39). Um das Risiko einer emboliebedingten
4 Diskussion
31
Perfusionsstörung und eines damit verbundenen Laktatanstieges im Skelettmuskel zu
vermeiden, wurden die Versuchstiere vor dem Exitus über die Vena renalis
heparinisiert. Obwohl minimal-invasiv, so kommt es auch bei der Mikrodialyse durch
die Sondenplatzierung zu einem umschriebenen Gewebetrauma. Inwieweit sich die
Gewebeverletzung auf die Messungen auswirkt, wird für die einzelnen Organe
unterschiedlich diskutiert. Untersuchungen am Skelettmuskel belegen, dass 15 min
nach Sondenplatzierung stabile Ergebnisse erzielt werden (26) während zuverlässige
Messungen im Gehirngewebe erst am zweiten Tag nach Implantation der
Mikrodialysesonden erreicht wurden (20). In der vorliegenden Arbeit wurde eine 15minütige Äquilibrierungszeit gewählt, da das von uns gewählte Tiermodell nur eine
Annäherung an die physiologischen Bedingungen darstellt. Eine wesentliche
Schädigung des Muskelgewebes durch die Implantation der Sonden konnten wir in
histologischen Schnitte ausschließen. Nur vereinzelt wurden interstitielle Ödeme im
untersuchten Gewebe nachgewiesen.
Um anfallende Metabolite in der Skelettmuskulatur zu entfernen, wurden die hinteren
Extremitäten
über
einen
Katheter
in
der
Aorta
abdominalis
mit
Ringer,
Dantrolen/Ringer beziehungsweise Ryanodin/Ringer perfundiert. Wir nahmen an, dass
ein Teil der entstehenden Stoffwechselprodukte durch die Perfusion abtransportiert
wird. In früheren Publikationen konnte mittels der Ethanol-Technik nachgewiesen
werden, dass sich sowohl bei vermindertem, wie auch bei vermehrtem Blutfluss die
Laktatwerte in der Muskulatur nur minimal ändern (40). Trotz isolierter Organperfusion
kam es in unserer Untersuchung auch in der Kontrollgruppe zu einem kontinuierlichen
Laktatanstieg über die Versuchszeit. Wir folgerten daraus, dass sich durch die
unphysiologische Perfusion mit Ringerlösung in Abwesenheit von Sauerstoffträgern
eine Laktatazidose entwickelte. Für unsere Arbeit hatte dies zwei Konsequenzen: Die
Versuchszeit war durch den allmählichen Laktatanstieg zeitlich begrenzt und machte
eine Kontrollmessung in der kontralateralen Extremität notwendig, um intrinsische und
extrinsische
Effekte
durch
das
applizierte
Pharmakon
trennen
zu
können
beziehungsweise um Perfusionsstörungen im Muskelpräparat zu erkennen. Durch die
Perfusion mit einer raumtemperierten Infusionslösung (19-20oC) glich sich die
Temperatur im untersuchten Organpräparat rasch an die Umgebungstemperatur an.
Der Vergleich der Laktatplasmaspiegel von anästhesierten Ratten während akuter
Hypothermie (30oC und 20oC) zeigt für beide Gruppen nur einen geringen Anstieg (41).
Folglich
dürfte
die
Auswirkung
der
Hypothermie
auf
die
Messergebnisse
vernachlässigbar gering sein.
Um eine Beeinflussung des Lakatatanstieges durch die Osmolarität der applizierten
Lösungen auszuschließen wurde eine Mikrodialysesonde mit 80 mM Sorbitollösung
4 Diskussion
32
und die Kontrollseite mit Ringerlösung perfundiert. Dieses Vorgehen geht auf BONEN ET
AL.
zurück, die belegen konnten, dass Sorbitol die Laktatkonzentration im
Skelettmuskel nicht erhöht (42). Die gemessenen relativen Laktatveränderungen
zeigen im Vergleich keine signifikanten Unterschiede. Wir schlussfolgerten, dass die
Laktatkonzentration nicht wesentlich durch die Osmolarität der verwendeten Lösungen
beeinflusst wird.
Unter physiologischen Bedingungen führt ein Nervenimpuls zur AcetylcholinFreisetzung
an
der
motorischen
Endplatte
und
zur
Entstehung
von
Endplattenpotentialen. Viele Miniatur-Endplattenpotentiale lösen schließlich das
Muskelmembranpotential aus, welches fortgeleitet in den transversen Tubuli zu einer
Konformationsänderung am sarkolemmalen Dihydropyridin-Rezeptor und dadurch zu
einer Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum über den
Ryanodin-Rezeptor in das Zytosol führt. Steigt die intrazelluläre Kalziumkonzentration
auf 10 µM an, so kontrahiert sich der Muskel (43). Darüber hinaus steigern
Kalziumionen die Glykolyse durch direkte Aktivierung der Phosphorylasekinase, die
Glukose und ATP in Glukose-6-phosphat, ADP sowie H+ umwandelt. Im Verlauf kommt
es unter anaeroben Verhältnissen zu einem vermehrten Anfall von Laktat. Bei maligne
Hyperthermie veranlagten Patienten können Triggersubstanzen zu einem massiven
Anstieg der zytosolären Kalziumkonzentration über den Ryanodin-Rezeptor führen.
Der intrazelluläre Botenstoff Kalzium aktiviert sodann die Myosin-Aktin-Filamente,
erhöht über eine Stoffwechselsteigerung den O2-Verbrauch und die CO2-Produktion mit
der Folge einer Laktatazidose, und führt schließlich zu Rhabdomyolyse und
Zelluntergang
(16).
In
der
vorliegenden
Untersuchung
wurden
diese
pathophysiologischen Abläufe durch die exogene Applikation hochkonzentrierter
Kalziumlösungen induziert und zum Nachweis der Auswirkung auf den zellulären
Stoffwechsel die Laktatkonzentrationen gemessen. Die verwendeten Kalziumlösungen
führten zu deutlichen Laktatanstiegen im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Wir
schlossen daraus, dass durch die lokale Applikation von Kalzium über eine
Mikrodialysesonde der intrazelluläre Metabolismus moduliert werden kann. Unklar
bleibt, wie hoch die Konzentration der perfundierten Triggersubstanz im Interstitium
des Muskels ist. Trotz der signifikanten Laktatanstiege ist eine Verdünnung durch die
extrazelluläre Flüssigkeit im sondenumgebenden Muskelgewebe wahrscheinlich.
Koffein führt durch Interaktion am Ryanodin-Rezeptor zur Kalzium-Freisetzung aus
dem sarkoplasmatischen Retikulum (44). Dieser Wirkungsmechanismus wird für die
Diagnostik der malignen Hyperthermie Veranlagung im in-vitro-Kontraktur-Test
ausgenützt. Durch die lokale Applikation von 40 mM beziehungsweise 80 mM
Koffeinlösung
kam
es
zu
signifikanten
Laktatanstiegen
gegenüber
den
4 Diskussion
33
Kontrollgruppen, die aber im Vergleich zu den Kalziumgruppen schwächer ausfielen.
Dies kann dadurch erklärt werden, dass Koffein erst nach der Diffusion in die Zelle und
Bindung am Ryanodin-Rezeptor Kalzium als „second-messenger“ freisetzt, während
nach Gabe der Kalziumlösungen der Muskelmetabolismus wahrscheinlich unmittelbar
moduliert wird.
In Anwesenheit von Ryanodin wurde für den Ryanodin-Rezeptor eine verlängerte
Öffnungszeit mit verstärkter Kalzium-Freisetzung beschrieben (45). Wir konnten
zeigen, dass bei konstanter lokaler Koffeinperfusion die Laktatkonzentration abhängig
von der Konzentration der Ryanodinlösung zusätzlich gesteigert werden kann. Dies
legt nahe, dass beide Wirkstoffe agonistisch die Kalzium-Freisetzung beeinflussen.
Das Hydantoinderivat Dantrolen verringert die zytosoläre Kalziumkonzentration durch
Hemmung der Kalzium-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, ohne die
Wiederaufnahme von Kalzium in die intrazellulären Speicher zu beeinflussen. Dieser
Wirkmechanismus
wird
Dihydropyridin-Rezeptors
durch
eine
Inhibierung
beziehungsweise
der
durch
Signaltransduktion
eine
des
spezifische
Dantrolenbindungsstelle am Ryanodin-Rezeptor vermittelt (19). In der vorliegenden
Arbeit konnte der koffeininduzierte Laktatanstieg durch die systemische Applikation von
1 µM Dantrolen inhibiert werden. Wir folgern daraus, dass Dantrolen die
pharmakologische Wirkung von Koffein antagonisiert.
Zusammenfassend weisen die vorliegenden Untersuchungen nach, dass mit Hilfe der
Mikrodialysetechnik lokale Laktatmessungen in der Skelettmuskulatur möglich sind.
Durch die Sondenplatzierung beziehungsweise durch die Applikation der Substanzen
kommt es zu keinen wesentlichen Schädigungen des Muskelgewebes. Die
Versuchdauer ist aufgrund der sich entwickelnden Laktatazidose zeitlich begrenzt. Eine
erhöhte Osmolarität der Perfusionslösung beeinflusst die Laktatkonzentration nicht. Die
lokale intramuskuläre Laktatkonzentration kann durch Applikation von Kalziumbeziehungsweise Koffeinlösungen über eine Mikrodialysesonde gesteigert werden.
Durch die systemische Perfusion von Ryanodin kann die lokale intramuskuläre
Laktatkonzentration gesteigert werden, während die systemische Applikation von
Dantrolen einem koffeininduzierten Laktatanstieg entgegenwirkt. Aufgrund der
Modulierbarkeit des lokalen intramuskulären Stoffwechsels scheint die Technik der
Mikrodialyse für minimal-invasive Untersuchungen zur Diagnostik der maligne
Hyperthermie Veranlagung gut geeignet zu sein.
5 Zusammenfassung
34
5 ZUSAMMENFASSUNG
Die maligne Hyperthermie ist eine metabolische Muskelerkrankung, die durch eine
unkontrollierte Kalzium-Freisetzung in das Zytosol der Muskelzelle zu einer Aktivierung
des kontraktilen Apparates und zu einer Beschleunigung des Zellstoffwechsels führen
kann. Der in-vitro-Kontraktur-Test am Skelettmuskel ist zur Zeit das einzige
zuverlässige Verfahren zur Erkennung einer MH-Veranlagung.
In dieser Arbeit sollte untersucht werden inwieweit die lokale Laktatkonzentration durch
die Applikation von Kalzium und Koffein mit Hilfe einer Mikrodialysesonde
beziehungsweise durch die systemische Infusion von Ryanodin und Dantrolen
beeinflusst wird.
Mit Tierschutz-Genehmigung wurden 61 Sprague-Dawley Ratten anästhesiert und post
exitum über die Aorta die Hinterbeine mit Ringer-, Ryanodin- (0,25 µM, 1 µM) oder
Dantrolenlösung (1 µM) perfundiert (30 ml h-1, 19-20oC). Über Mikrodialysesonden (1 µl
min-1) in den Mm. adductores wurde Ringer, Sorbitol (80 mM), Kalzium (20 mM, 40
mM, 80 mM) oder Koffein (40 mM, 80 mM) appliziert und im Dialysat Laktat
spektrometrisch gemessen.
Bei
einer
relativen
recovery
von
77
±
2%
für
Laktat
in-vitro
stieg
die
Laktatkonzentration unter Perfusion mit 20 mM, 40 mM beziehungsweise 80 mM
Kalziumlösung auf 466 ± 31%, 632 ± 48% beziehungsweise 635 ± 81%, während unter
Perfusion mit 40 mM und 80 mM Koffein eine relative Zunahme auf 270 ± 21% und 377
± 21% beobachtet wurde. Unter systemischer Organperfusion mit 0,25 µM und 1 µM
Ryanodinlösung und lokaler Applikation von 40 mM Koffein wurden relative
Laktatanstiege von 279 ± 23% und 331 ± 19% gemessen. Dagegen stieg die relative
Laktatkonzentration bei systemischer Infusion von 1 µM Dantrolenlösung und lokaler
Perfusion mit 40 mM Koffein nur bis auf 193 ± 13% an.
Diese methodische Untersuchung beweist, dass durch die lokale Perfusion von
Kalzium und Koffein sowie die systemische Infusion von Ryanodin ein Anstieg der
lokalen Laktatkonzentration induziert, beziehungsweise durch systemische Applikation
von Dantrolen dieser Anstieg inhibiert werden kann.
Systemische Effekte müssen allerdings im in-vivo Tierversuch ausgeschlossen
werden, um die Mikrodialysetechnik für die Entwicklung eines minimal-invasiven
Verfahrens zur Diagnostik der malignen Hyperthermie nutzbar machen zu können.
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7 Anhang
40
7 ANHANG
Tabelle 1: Absolute Werte der relative recovery von Laktat in mM bei unterschiedlichen
Perfusionsgeschwindigkeiten (µl min-1). Je 4 Messungen pro Sonde.
µl min-1
0
0,5
1
3
5
10
2,22
1,57
1,42
0,98
0,57
0,29
Absolute Laktatwerte
2,22
2,13
1,83
2,04
1,37
1,82
0,99
1,22
0,58
0,66
0,30
0,34
2,13
2,04
1,79
1,23
0,66
0,34
µl min-1
0
0,5
1
3
5
10
2,28
2,08
1,62
0,82
0,59
0,36
Absolute Laktatwerte
2,28
2,11
2,06
1,94
1,56
1,66
0,87
0,84
0,58
0,58
0,41
0,41
2,11
1,96
1,57
0,84
0,58
0,37
µl min-1
0
0,5
1
3
5
10
8,80
8,26
7,36
3,78
2,26
1,42
Absolute Laktatwerte
8,80
8,63
8,20
8,14
7,30
7,09
3,72
3,73
2,53
2,66
1,40
1,43
8,63
8,43
6,98
3,73
2,60
1,53
Tabelle 2: Absolute Werte der relative loss recovery von Koffein in mM bei
unterschiedlichen Perfusionsgeschwindigkeiten (µl min-1). Je 2 Messungen pro Sonde.
µl min-1
0
0,5
1
3
5
10
0,17
0,02
0,04
0,10
0,13
0,15
Absolute Koffeinwerte
0,17
0,18
0,02
0,01
0,03
0,03
0,10
0,10
0,13
0,12
0,15
0,15
0,18
0,01
0,03
0,10
0,13
0,15
µl min-1
0
0,5
1
3
5
10
0,18
0,01
0,03
0,10
0,13
0,15
Absolute Koffeinwerte
0,18
0,35
0,02
0,04
0,03
0,11
0,11
0,23
0,14
0,26
0,16
0,28
0,35
0,04
0,10
0,21
0,26
0,28
7 Anhang
41
µl min-1
0
0,5
1
3
5
10
Absolute Koffeinwerte
0,35
0,04
0,12
0,23
0,27
0,28
0,35
0,04
0,13
0,24
0,27
0,28
Tabelle 3: Absolute Werte der relative loss recovery von Kalzium in mM bei
unterschiedlichen Perfusionsgeschwindigkeiten (µl min-1). Je 2 Messungen pro Sonde.
µl min-1
0
0,5
1
3
5
10
4,3
3,2
2,5
1,3
0,8
0,5
Absolute Kalziumwerte
4,3
4,3
3,3
3,4
2,5
2,6
1,3
1,4
0,8
1,0
0,5
0,6
4,3
3,4
2,7
1,4
1,0
0,7
Tabelle 4: Vergleich der Laktatkonzentrationen beider Extremitäten in mM unter
isolierter Organperfusion mit Ringerlösung.
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 1
Rechts
Links
1,09
1,67
1,25
1,75
1,31
1,77
1,50
1,84
1,40
1,98
1,69
2,22
1,65
2,24
2,06
2,40
2,08
2,40
Versuch 2
Rechts
Links
1,80
1,23
2,17
1,13
2,05
1,47
2,30
1,35
2,34
1,64
2,96
1,86
3,12
2,05
3,25
2,33
3,25
2,35
Versuch 3
Rechts
Links
0,89
1,37
1,10
1,47
1,34
1,62
1,42
1,68
1,49
2,02
1,69
2,30
1,75
2,47
2,08
2,52
2,10
2,53
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 4
Rechts
Links
0,88
1,33
1,20
1,47
1,35
1,55
1,49
1,64
1,53
1,74
1,67
1,90
1,80
2,16
2,02
2,30
2,09
2,47
Versuch 5
Rechts
Links
0,80
1,55
0,80
1,59
0,76
1,82
0,88
1,89
0,84
1,76
0,99
2,32
1,26
2,37
1,51
2,80
1,51
2,82
Versuch 6
Rechts
Links
2,05
2,22
2,41
2,19
2,52
2,02
3,05
2,43
3,71
2,57
3,81
3,07
4,03
3,13
4,62
3,10
4,63
3,11
7 Anhang
42
Tabelle 5: Laktatkonzentrationen in mM mit und ohne 80 mM Sorbitolzusatz im
Perfusat und systemischer Organperfusion mit Ringerlösung.
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 1
Sorbitol
Ringer
0,75
1,32
0,82
1,31
0,92
1,50
0,91
1,37
0,91
1,83
0,99
1,54
0,91
2,12
1,12
2,01
1,29
2,13
Versuch 2
Sorbitol
Ringer
0,91
1,29
0,84
1,16
0,86
1,18
0,76
1,24
0,91
1,32
1,02
1,29
1,00
1,49
1,18
1,40
1,28
1,77
Versuch 3
Sorbitol
Ringer
2,12
1,20
2,07
1,66
2,03
1,89
2,07
2,05
2,47
2,15
2,57
2,03
2,86
1,99
2,63
2,09
2,85
2,12
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 4
Sorbitol
Ringer
1,11
1,28
1,15
1,42
1,17
1,49
1,20
1,63
1,36
1,67
1,52
1,72
1,56
1,82
1,68
1,98
1,80
2,07
Versuch 5
Sorbitol
Ringer
0,76
1,28
0,57
1,43
0,86
1,21
0,88
1,60
1,44
1,82
1,57
2,21
1,75
2,35
1,77
2,18
1,76
2,35
Versuch 6
Sorbitol
Ringer
1,12
1,25
1,14
1,37
1,15
1,46
1,24
1,63
1,32
1,82
1,43
1,95
1,58
2,03
1,79
2,14
1,97
2,29
Tabelle 6: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 20 mM Kalzium und
systemischer Organperfusion mit Ringerlösung.
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 1
Kalzium
Ringer
1,35
1,98
1,27
2,01
1,59
2,07
2,35
2,30
3,29
2,72
4,05
2,63
4,90
2,50
5,45
3,13
5,70
3,18
Versuch 2
Kalzium
Ringer
0,99
1,37
1,32
1,54
1,48
1,79
1,62
1,88
1,90
1,98
2,61
2,07
3,50
2,53
4,54
2,48
4,64
2,59
Versuch 3
Kalzium
Ringer
1,91
1,56
1,91
1,41
2,22
1,70
3,19
1,75
3,96
1,92
5,52
2,01
6,27
2,20
7,27
2,21
7,24
2,45
7 Anhang
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
43
Versuch 4
Kalzium
Ringer
1,96
2,34
2,08
2,39
2,37
2,49
3,71
2,55
6,01
2,56
7,01
2,75
8,77
3,17
10,64
3,91
11,87
3,94
Versuch 5
Kalzium
Ringer
1,68
1,63
1,40
1, 05
1,62
1,72
2,09
1,89
2,36
2,01
3,21
2,35
5,16
2,49
6,41
2,73
7,87
2,78
Versuch 6
Kalzium
Ringer
1,83
2,16
2,07
2,02
2,22
2,30
3,04
2,52
4,39
2,45
6,76
2,37
7,71
2,69
8,18
2,99
8,35
3,13
Tabelle 7: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 40 mM Kalzium und
systemischer Organperfusion mit Ringerlösung.
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 1
Kalzium
Ringer
1,36
1,49
1,74
1,74
3,71
2,10
6,60
2,28
6,90
2,70
7,80
3,03
8,15
3,30
9,37
3,86
9,41
3,99
Versuch 2
Kalzium
Ringer
2,53
2,22
2,96
2,44
3,66
2,53
5,57
3,44
7,28
2,88
9,14
3,46
9,78
3,56
10,88
4,08
10,76
4,73
Versuch 3
Kalzium
Ringer
2,01
2,08
2,37
2,18
4,71
2,18
7,33
2,29
8,62
2,39
9,89
2,86
10,34
2,95
10,33
3,59
11,63
3,90
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 4
Kalzium
Ringer
1,69
2,60
3,64
2,71
7,18
2,67
9,13
2,97
10,38
3,89
11,85
4,07
12,40
4,62
12,60
4,66
12,70
4,53
Versuch 5
Kalzium
Ringer
1,45
1,90
1,73
2,03
5,38
2,29
8,36
1,82
8,40
2,13
8,80
2,36
9,19
2,27
9,90
2,55
10,10
2,99
Versuch 6
Kalzium
Ringer
1,99
1,93
2,45
1,84
3,82
2,09
5,81
2,03
8,49
2,56
10,57
2,73
11,19
2,92
11,62
3,27
12,88
3,93
7 Anhang
44
Tabelle 8: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 80 mM Kalzium und
systemischer Organperfusion mit Ringerlösung.
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 1
Kalzium
Ringer
1,91
1,56
2,77
1,60
4,84
1,81
6,42
1,91
7,42
2,04
8,59
2,27
8,24
2,50
9,00
2,64
8,58
3,16
Versuch 2
Kalzium
Ringer
1,41
1,63
2,71
1,57
6,15
1,80
7,38
2,41
7,84
2,21
7,35
2,57
7,60
2,44
7,68
2,67
7,82
2,85
Versuch 3
Kalzium
Ringer
1,450
1,98
2,22
2,14
5,82
2,19
10,48
2,41
10,81
2,46
11,92
2,47
11,82
2,71
11,63
2,98
11,12
3,46
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 4
Kalzium
Ringer
1,18
1,76
2,04
1,88
5,63
2,14
7,37
2,43
8,16
2,63
9,10
2,86
8,93
3,08
9,53
3,34
9,84
3,51
Versuch 5
Kalzium
Ringer
0,92
1,03
1,57
1,13
5,01
1,20
5,70
1,51
5,99
1,42
6,18
1,54
6,27
1,59
8,10
2,01
8,36
2,02
Versuch 6
Kalzium
Ringer
1,15
1,84
1,27
2,19
2,37
2,37
4,01
2,58
4,76
2,89
5,35
3,25
5,77
3,30
5,75
3,31
5,24
3,70
Tabelle 9: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 40 mM Koffein und
systemischer Organperfusion mit Ringerlösung.
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 1
Koffein
Ringer
1,52
1,87
1,69
2,09
1,73
2,11
2,01
2,23
2,32
2,46
2,86
2,60
3,40
2,56
4,21
2,76
4,73
3,13
Versuch 2
Koffein
Ringer
1,56
2,42
1,56
2,50
1,74
2,59
2,07
2,66
2,37
2,89
2,52
2,92
3,10
3,07
3,55
3,15
3,95
3,85
Versuch 3
Koffein
Ringer
1,62
1,60
1,65
1,49
1,69
1,44
1,76
1,52
1,94
1,57
2,38
1,88
2,65
2,02
2,83
2,16
2,86
2,30
7 Anhang
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
45
Versuch 4
Koffein
Ringer
1,31
1,12
1,34
1,15
1,51
1,30
1,71
1,11
2,05
1,20
2,53
1,48
2,99
1,57
3,13
1,86
3,64
2,28
Versuch 5
Koffein
Ringer
1,08
1,97
0,95
1,97
1,05
1,94
1,40
1,80
1,81
2,01
2,05
2,18
2,52
2,29
2,85
2,62
3,23
2,95
Versuch 6
Koffein
Ringer
0,60
1,38
0,67
1,24
0,73
1,49
0,88
1,50
1,09
1,61
1,28
1,66
1,44
1,92
1,62
2,01
1,83
2,08
Tabelle 10: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 80 mM Koffein und
systemischer Organperfusion mit Ringerlösung.
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 1
Koffein
Ringer
1,52
2,40
1,50
2,35
1,54
2,37
1,71
2,67
2,34
2,72
2,63
2,56
3,09
2,70
3,50
2,73
3,76
2,99
Versuch 2
Koffein
Ringer
1,80
2,13
1,89
2,21
2,08
2,06
2,15
2,00
2,90
1,95
3,76
2,30
4,27
2,20
5,21
2,29
6,41
2,70
Versuch 3
Koffein
Ringer
1,60
2,39
1,80
2,45
1,84
2,53
2,40
2,34
2,88
3,16
3,64
3,38
4,06
3,61
4,66
3,78
5,24
4,41
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 4
Koffein
Ringer
1,24
1,87
1,76
1,89
1,94
1,94
2,01
1,94
2,48
1,95
2,91
2,15
3,31
2,46
4,09
2,84
5,10
2,92
Versuch 5
Koffein
Ringer
1,46
1,76
1,56
2,04
1,56
1,99
1,81
2,11
2,30
2,09
3,19
2,18
4,02
3,01
4,86
3,17
5,48
3,41
Versuch 6
Koffein
Ringer
0,74
1,86
0,90
1,85
1,08
1,51
0,90
1,45
1,90
1,52
1,47
1,74
1,89
1,94
2,27
2,21
2,96
2,31
7 Anhang
46
Tabelle 11: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 40 mM Koffein und
systemischer Organperfusion mit 0,25 µM Ryanodinlösung.
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 1
Koffein
Ringer
1,21
2,92
1,37
2,86
1,37
3,10
1,56
3,08
1,78
3,25
2,19
2,74
2,52
3,64
2,98
3,71
3,68
4,20
Versuch 2
Koffein
Ringer
1,11
2,33
1,41
2,39
1,44
2,47
1,78
2,30
2,13
2,54
2,63
2,96
2,97
3,27
3,64
4,91
3,58
4,16
Versuch 3
Koffein
Ringer
1,46
2,19
1,38
2,19
1,77
2,24
1,60
2,27
2,06
2,43
2,54
2,70
3,07
2,78
3,18
2,92
3,74
3,19
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 4
Koffein
Ringer
1,88
2,10
1,85
2,14
1,79
2,40
1,89
2,48
2,18
2,61
2,56
2,66
3,05
2,78
3,34
3,31
3,81
3,44
Versuch 5
Koffein
Ringer
1,47
2,02
1,40
2,16
1,44
2,11
1,81
2,00
2,04
1,98
2,38
1,97
2,65
2,19
3,03
2,15
3,46
2,15
Versuch 6
Koffein
Ringer
0,76
1,95
0,83
1,73
0,91
1,97
0,95
2,04
1,12
2,12
1,45
2,66
1,84
2,55
2,41
2,81
2,68
3,32
Tabelle 12: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 40 mM Koffein und
systemischer Organperfusion mit 1 µM Ryanodinlösung.
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 1
Koffein
Ringer
1,18
0,70
1,33
0,82
1,48
0,96
1,87
1,04
2,41
1,22
2,80
1,33
3,37
1,75
4,11
1,90
4,83
2,28
Versuch 2
Koffein
Ringer
1,93
2,22
2,17
2,26
2,46
2,36
2,81
2,91
3,09
3,35
3,87
3,66
4,56
4,22
5,42
4,68
6,21
5,35
Versuch 3
Koffein
Ringer
1,52
2,68
1,83
2,40
1,85
2,41
2,23
2,62
2,70
2,53
3,33
2,88
3,78
3,18
4,67
3,49
5,52
3,94
7 Anhang
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
47
Versuch 4
Koffein
Ringer
1,75
1,92
1,85
1,75
1,99
1,67
2,03
1,96
2,38
2,02
2,96
2,32
3,612
2,60
4,21
3,04
4,97
3,47
Versuch 5
Koffein
Ringer
1,20
2,26
1,41
2,24
1,48
2,60
1,42
2,88
1,91
3,23
2,00
3,43
2,55
3,86
2,87
4,25
3,47
4,35
Versuch 6
Koffein
Ringer
1,20
1,23
1,34
1,21
1,34
1,24
1,56
1,91
1,90
1,75
2,45
1,76
2,85
2,04
3,25
2,24
3,80
2,43
Tabelle 13: Laktatkonzentrationen in mM unter Stimulation mit 40 mM Koffein und
systemischer Organperfusion mit 1 µM Dantrolenlösung.
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 1
Koffein
Ringer
1,95
1,87
1,36
2,09
1,82
2,11
2,07
2,23
2,04
2,46
2,26
2,60
3,08
2,56
3,47
2,76
3,60
3,13
Versuch 2
Koffein
Ringer
0,97
2,42
0,88
2,50
0,98
2,59
1,02
2,66
1,04
2,89
1,39
2,92
1,52
3,07
1,76
3,15
2,02
3,85
Versuch 3
Koffein
Ringer
1,12
1,60
1,72
1,49
0,97
1,44
1,02
1,52
0,99
1,57
1,09
1,88
1,24
2,02
1,35
2,16
1,68
2,30
Zeit [min]
15
30
45
60
75
90
105
120
135
Versuch 4
Koffein
Ringer
0,73
1,12
0,62
1,15
0,73
1,30
0,86
1,11
0,91
1,20
0,92
1,48
1,10
1,57
1,21
1,86
1,30
2,28
Versuch 5
Koffein
Ringer
0,76
1,97
0,74
1,97
0,78
1,94
0,83
1,80
0,87
2,01
1,00
2,18
1,20
2,29
1,26
2,62
1,46
2,95
Versuch 6
Koffein
Ringer
0,75
1,38
0,72
1,24
0,70
1,49
0,69
1,50
0,86
1,61
1,13
1,66
1,32
1,92
1,40
2,01
1,83
2,08
Danksagung
DANKSAGUNG
Herrn Prof. Dr. med. N. Roewer, Direktor der Klinik für Anaesthesiologie der Universität
Würzburg, danke ich für die freundliche Überlassung des Themas.
Besonders danken möchte ich Herrn Dr. med. M. Anetseder für seine stete
Diskussionsbereitschaft und für seine mir jederzeit gewährte Unterstützung, die
wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
Herrn Prof. Dr. med. C.-A. Greim danke ich für die Übernahme des Korreferats.
Den gesamten Mitarbeitern des Anaesthesie-Labors sage ich herzlichen Dank für die
freundliche Hilfe während meiner Untersuchung.
Der größte Dank gebührt meinen Eltern, denen ich diese Arbeit widmen möchte. Ihre
ausnahmslose Unterstützung in jeder Hinsicht, die mir immer ein großer Rückhalt war
und ist, ermöglichte mir erst diese Ausbildung.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Frank Schuster
Adresse
Blumengasse 3
97509 Kolitzheim - Herlheim
Geburtsdatum, -ort
27. April 1972 in Gerolzhofen
Familienstand
ledig
SCHULISCHE AUSBILDUNG
1978 – 1982
Grundschule Gerolzhofen
1982 – 1991
Gymnasium Franken – Landschulheim Gaibach
1991
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
ZIVILDIENST
Sep. 1991 – Nov. 1992
Rettungsdienst Bayerisches Rotes Kreuz Schweinfurt
HOCHSCHULAUSBILDUNG
März 1994 – Sep. 1996
Vorklinisches Studium, Universität Würzburg
Okt. 1996 – März 2000
Klinisches Studium, Universität Würzburg
April 2000 – März 2001
Praktisches Jahr, Leopoldina Krankenhaus, Schweinfurt
Mai 2001
Abschluss des Studiums
FAMULATUREN
März 1997
Ambulante Chirurgie, Praxis, Gerolzhofen
Okt. 1997
Anaesthesie, Leopoldina Krankenhaus, Schweinfurt
April 1998
Innere Medizin, Geomed Klinik, Gerolzhofen
Aug. 1998
Anaesthesie, Universitätsklinik, Würzburg
März 1999
Notfallmedizin, Methodist Healthcare Hospital, Memphis,
TN, U.S.A.
Aug. 1999
Innere Medizin, Geomed Klinik, Gerolzhofen
Berufliche Tätigkeit
Seit Sep. 2001
Arzt im Praktikum an der Klinik für Anaesthesiologie der
Universität Würzburg
Herlheim, im September 2002
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