pdf-File - Elektronische Dissertationen - Otto-von

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Elektrische Anregung von Zellsystemen mittels einer
zweidimensionalen Elektrodenstruktur
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
genehmigt durch die Fakultät für Naturwissenschaften
der Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg
von Dipl.-Phys. Antje Reiher
geb. am 24.07.1978 in Stendal
1. Gutachter
Prof. Dr. rer. nat. habil. Alois Krost
2. Gutachter
Prof. Dr. rer. nat. habil. Martin Stutzmann
3. Gutachter
Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas Voigt
eingereicht am
24.04.2007
verteidigt am
24.09.2007
Meinen Eltern
Kurzbeschreibung
Das Ziel der Arbeit war die Entwicklung einer einfachen, planaren Stimulationselektrode,
die in verschiedenen biologischen System einsetzbar ist. Die Konzeptionierung der ineinandergreifenden Elektroden erfolgt dabei unter Berücksichtung der Notwendigkeit von
optischer Transparenz, elektrischer Leitfähigkeit, Bioverträglichkeit und Spannungsfestigkeit aufgrund experimenteller Randbedingungen. Als optimierter Schichtaufbau wird eine
mittels Elektronenstahlverdampfen hergestellte 50 nm dünne Goldschicht auf einer 5 nm
dünnen Titan-Haftschicht experimentell bestimmt.
Das elektrische Verhalten des Systems, bestehend aus Elektroden, Elektrolyt und Zellen,
wird für Gleich- und Wechselspannungen frequenzabhängig analysiert. Mit Hilfe eines
sukzessiv optimierten Ersatzschaltbildes werden die Impedanzmessungen modelliert und
Wechselwirkungsvorgänge charakterisiert.
Die vielseitige Anwendbarkeit der Stimulationselektrode wird anhand von zwei unabhängigen biologischen Systemen, dissoziierten Neuronennetzwerken und suspensierten
Hefezellen, durch Bestimmung der Stimulationsparameter (Pulsbreite, Pulsamplitude und
Flankensteilheit) demonstriert.
Eine synchrone Netzwerkanregung von dissoziierten Neuronenkulturen wird durch
Anlegen eines biphasigen, rechteckigen 10fach-Pulses der Amplitude ±2.2 V und der Pulsbreite 1 ms erreicht. Eine gezielte Untersuchung des Anregungsmechanismus von
Einzelneuronen ist durch das Blockieren der Glutamat- und GABAA-Neurotransmitterrezeptoren in speziell strukturierten Netzwerken möglich. So wird in Netzwerkbereichen,
1.5 mm entfernt von den Elektroden, eine axonale Anregung (antidrome Stimulation) in
dissoziierten Kulturen nachgewiesen. Es stellt sich heraus, dass die Anregungseffizienz
direkt mit der Axondichte über den Elektrodenkanten, dem Ort des höchsten Potentialgradienten, korreliert.
Durch eine Stimulation mit einzelnen, biphasigen, rechteckigen Pulsen der Amplitude
±11 V und der Pulsbreite 4 ms kann der Stoffwechsel von Hefezellen beeinflusst werden.
Zusätzlich kann die Elektrode zur elektrischen Detektion der glykolytischen Oszillationen
von Hefezellen, hervorgerufen durch periodische Änderungen der Systemimpedanz oder
der Membranleitfähigkeit, und von Hefeextrakt, verursacht durch Konzentrationsänderungen von Zuckerphosphaten, verwendet werden.
I
II
Abstract
A simple, planar interdigitated stimulation electrode for applications in different biological
environments was developed considering essential experimental boundary conditions, i.e.
optical transmission, electrical conductivity, withstand voltage and biocompatibility.
Experimental results suggest an electrode structure of an 5 nm thin Titan-undercoating
followed by a 50 nm thin gold layer deposited by electron beam evaporation.
The experimental setup consisting of a metal electrode, an electrolyte and living cells are
electrically characterized for frequency dependent direct and alternating voltage. The
successively defined equivalent circuit allows a simulation of the measured impedance to
analyze the discrete influence of the electrode, the electrolyte or the biological component
and their interdependencies.
Two different biological systems are used to demonstrate the variable adaptability for stimulation experiments. Infect, dissociated neural networks and suspended yeast cells are
investigated to determine the excitation parameters, i.e. pulse amplitude, pulse width, and
edge steepness.
Synchronous neural network activity is evoked by stimulation with biphasic, 10fold square
pulses of an amplitude of ±2.2 V and a pulse width of 1 ms. To analyze the excitation
mechanism of single neurons, the present superposed neural activity of directly stimulated
neurons and of mediately activated neurons due to synaptical signal transmission has to be
distinguished. After blocking the synaptic activity by an addition of antagonists to the
glutamate and GABAA receptors, only direct electrical excitation occurs. Since in
synaptically blocked networks that are located 1.5 mm far from the electrode neural
activity is observed after an electrical excitation, antidromic stimulation has to be
occurred. The stimulation efficiency correlates with the axonal density across the electrode
edges, which is the region of highest potential gradient.
The energy metabolism of yeast cells is affected by electrical excitation of single, biphasic
square pulses with an amplitude of ±11 V and a pulse width of 4 ms. Additionally, the electrode offers the possibility of an electrical investigation of glycolytic oscillations of yeast
cells and yeast extract. Thus, these electrically measured oscillation effects could be correlated to changes in the system impedance or in the membrane conductivity of yeast cells as
well as to periodic concentration changes of ionic and dipole compounds from glycolytic
intermediates of yeast extract.
III
IV
Danksagung
Diese Arbeit ist durch die interdisziplinäre Zusammenarbeit von vier Arbeitsgruppen entstanden. Daher möchte ich mich persönlich bei allen bedanken, die zum Gelingen
beigetragen haben:
Prof. Alois Krost für die Möglichkeit, ein völlig neues Forschungsthema in Angriff zu
nehmen, für seine konstruktiven Hinweise und sein Vertrauen in meine Arbeit,
Prof. Thomas Voigt, der einer Physikerin den Zugang zu Neuronen ermöglichte, für die
Bereitstellung des Versuchsplatzes und die Diskussion der Ergebnisse,
Prof. Martin Stutzmann, für die Begutachtung dieser Arbeit,
Prof. Frank Ohl, der mir Gelegenheit für erste Untersuchungen in vivo gab und mich für
den Anregungsmechanismus sensibilisierte,
Prof. Rainer Clos für sein Interesse an meinem wissenschaftlichen und persönlichen
Vorankommen,
Dr. Hartmut Witte für die kritische Diskussion der elektrischen Aspekte,
Dr. André Krtschil, der großen Anteil nicht nur an der wissenschaftlichen Entwicklung
dieser Arbeit hatte,
Dr. Thomas Mair für die Bereitstellung der Hefekulturen und seine Geduld beim Erklären
der Glykolyse,
Dr. Ana D. de Lima, die mir unterschiedliche Aspekte neuronaler Aktivität erläuterte und
besonders für die konstruktiven Hinweise zum wissenschaftlichen Arbeiten,
Dr. Thoralf Opitz für die ersten gemeinsamen Stimulationsexperimente und die Einführung in das Ca2+-Imaging,
Dr. Julia Kluewa, die völlig unkompliziert die Patch-Clamp-Versuche durchführte,
V
Dr. Matthias Deliano für die Implantationsversuche an Gerbils und die Diskussionen über
elektrische Stimulation und Neurotransmitterantagonisten wie TTX, PTX, APV,
CNQX und BMI,
Dr. Ulrich Schreppel und Ulrike Kühne, die mir die Messungen mit der Nicolet
ermöglichten,
Dipl.-Phys. Stephan Radoch für die Impedanzmessungen, persönliche Unterstützung und
das Drängen zum Klettersport (Dank auch an seine Frau Melanie),
Dipl.-Phys. Christian Warnke, der mich immer mit frischen Hefezellen versorgte, den Versuchsplatz der Hefezellen aufbaute und mir erläutere; unvergessen bleiben wird das
"Halt durch" in jeder möglichen Situation,
Dipl.-Phys. Annette Diez für ihre Hilfe bei so vielen Dingen, wie z.B. einem kaputten Mask
Aligner, einem unter Wasser stehenden Labor, einem mit Wasser gefluteten Rezipienten, dem Finden und Wechseln von defekten Sicherungen der Ebeam usw.,
Marietta Hinz, die kleinste Halbleiterproben für Implantationsversuche präparierte,
Birgit Adam und Sabine Mücke für ihre unendliche Geduld bei der Neuronenpräparation
auf den Goldelektroden,
Olaf Born, den ich meist in seiner Frühstückspause störte und der trotzdem alle möglichen
unmöglichen Lötarbeiten zur Fertigstellung meiner Probenhalterungen durchführte,
dem Werkstattteam unter Leitung von Jürgen Weißenborn, welches alle Mikroskophalter
anfertigte – bis hin zum "Schweinerl"!
Dr. Jürgen Bläsing, der während der gesamten Zeit immer ein offenes Ohr für meine
Probleme hatte,
Dr. Frank Bertram und Dr. Till Riemann, die mir in schweren Zeiten Beistand leisteten,
Dipl.-Phys. Fabian Schulze für ungezählte Gespräche und Abende, die weit über das Maß
an wissenschaftlichem Austausch hinausgingen
10
∑ k 2= 385
,
k =1
Martin Zornemann, der mehr Anteil an dieser Arbeit hat, als er es für möglich hält,
Anke, Alex und Zozi nicht nur als Kletterpartner, sondern als Freunde,
meinen Eltern, die immer an mich geglaubt haben,
Heiko, ohne den diese Arbeit nicht geschrieben worden wäre.
VI
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung und Motivation.................................................................. 5
2. Grundlagen....................................................................................... 11
2.1. Elektrische Grundlagen........................................................................ 11
2.1.1. Einfluss verschiedener Parameter auf die Stimulationsbedingungen der
Neuronen bei Verwendung einer Nadelelektrode ........................................................ 12
2.1.2. Ineinander greifende Elektroden / Fingerelektroden......................................... 13
2.1.3. Phasengrenze Metall-Elektrolyt.......................................................................... 13
2.1.4. Gouy-Chapman-Theorie...................................................................................... 17
2.1.5. Ableitung der Gouy-Chapman-Kapazität............................................................ 19
2.2. Pulseinkopplung in neuronale Netzwerke........................................... 22
2.2.1. Spezielle Modelle................................................................................................. 22
2.2.2. Dynamische Einflüsse der angelegten elektrischen Felder auf Zellen und
Elektrolyt ...................................................................................................................... 32
2.3. Biologische Grundlagen...................................................................... 34
2.3.1. Aufbau von Neuronen......................................................................................... 34
2.3.2. Entstehung eines Aktionspotentials .................................................................. 35
2.3.3. System der Hefezellen........................................................................................ 40
2.3.4. Energiestoffwechsel der Hefezellen.................................................................... 41
2.3.5. Glykolytische Oszillationen von Saccharomyces carlsbergensis........................ 43
2.3.6. Impedanzmessungen an Hefezellen .................................................................. 44
3. Versuchsaufbau................................................................................45
3.1. Herstellung der Metallelektroden........................................................ 45
3.1.1. Bemerkungen zur Lithografie.............................................................................. 47
3.1.2. Bestimmen des Parametersatzes für die Lithografie.......................................... 49
3.2. Elektrische Methoden ........................................................................ 52
1
3.3. Kultivierung von Neuronen................................................................. 54
3.3.1. Präparation der Neuronen.................................................................................. 54
3.3.2. Calcium-Fluoreszenz-Technik (Ca2+-Imaging)................................................. 57
3.3.3. Stimulation der Neuronen.................................................................................. 59
3.3.4. Auswertung der Ergebnisse................................................................................. 61
3.4. Präparation der Hefezellen Saccharomyces carlsbergensis................ 62
3.4.1. Hefezell- und Hefeextraktgewinnung ................................................................ 62
3.4.2. Beschreibung des Versuchsplatzes..................................................................... 65
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen................ 67
4.1. Überprüfung des Ausgangssignals...................................................... 68
4.2. Die Stimulationselektroden................................................................ 69
4.2.1. Materialwahl und Geometrie.............................................................................. 69
4.2.2. Beschreibung der Elektrodenstruktur durch ein Ersatzschaltbild .................... 72
4.3. Die Wechselwirkung von Elektroden und Elektrolyt........................... 75
4.3.1. Charakterisierung des Elektrolyten .................................................................... 75
4.3.2. Die elektrochemische Doppelschicht.................................................................. 77
4.3.3. Charakterisierung von Elektrodenarray und Elektrolyt ................................... 80
4.4. Impedanzmessungen an Elektroden, Elektrolyt und Zellen................ 83
4.5. Feldverteilung im Elektrolyten............................................................ 85
5. Anregung von biologischen Systemen.............................................. 89
5.1. Anregungsmechanismus von Neuronen.............................................. 89
5.1.1. Bestimmung der Stimulationsparameter von Netzwerken................................. 89
5.1.2. Bestimmung der Stimulationsparameter für Einzelzellanregung...................... 95
5.1.3. Analyse des Anregungsmechanismus von Neuronen......................................... 99
5.1.4. Langzeitstimulation im Inkubator.................................................................... 106
5.1.5. Anregung mit Mikroelektroden......................................................................... 109
5.2. Stimulation von Hefezellen................................................................ 111
5.2.1. Bestimmung der Stimulationsparameter von Hefezellen ................................. 113
5.2.2. Detektion der glykolytischen Oszillationen....................................................... 117
5.3. Untersuchungen zur Bioverträglichkeit............................................. 122
6. Zusammenfassung.......................................................................... 127
7. Literatur.......................................................................................... 131
2
8. Anhang............................................................................................145
8.1. Ätzen der Oberfläche der Deckgläschen............................................. 145
8.2. Zusammensetzung der Kulturmedien der Neuronen......................... 145
8.3. Zusammensetzung der Nährmedien für die Hefekulturen ................ 148
8.4. Ergänzungen zur elektrischen Charakterisierung ............................ 150
8.5. Einfluss der Flankensteilheit auf die Anzahl angeregter Neuronen.... 151
8.6. Dauerstimulationsexperimente ........................................................ 152
Lebenslauf..........................................................................................155
Publikationsliste................................................................................ 157
Eidesstattliche Erklärung...................................................................159
3
4
1. Einleitung und Motivation
1.
Einleitung und Motivation
Die Anwendung von Stimulationselektroden als therapeutisches Mittel in der Humanmedizin hat sich seit der Entdeckung der spannungsabhängigen Kontraktion von Muskeln
durch Galvani [Galvani, 1791] etabliert. Das klassische Beispiel für die Verwendung von
Stimulationselektroden ist wohl der Herzschrittmacher. Die fortwährende Anpassung seit
den ersten erfolgreichen Anwendungen 1872 [Green, 1872] führte schließlich zu der Kombination von transvenösen Elektroden und implantiertem Herzschrittmacheraggregat
[Ekeström, et al., 1962]. Diese Art des Herzschrittmachers ermöglicht es heute unzähligen
Patienten, in jedem Lebensalter mit ihren bradykarden Herzrhythmusstörungen, weitgehend ohne Beeinträchtigung zu leben [Böttcher et al., 2003]. Eine Entwicklung von
ähnlicher Bedeutung wie die des Herzschrittmacher wäre die eines Retina-Implantats. Im
März 2007 wurde die erste klinische Studie vorgelegt, in der Blinde nach Implantation
einer Prothese erfolgreich Gegenstände und Muster erkennen konnten [Gekeler und
Zrenner, 2005; Pressemitteilung Retina Implant GmbH, 2007]. Elektrische Felder, die
über Elektroden appliziert werden, finden beispielsweise auch Anwendung in der Therapie
von Knochenfrakturen [Rubin et al., 1993; Habel, 2004]. Neben Blasenimplantaten [Barrington et al., 2005] spielen chronisch implantierte Elektroden für die Verringerung von
Symptomen der Parkinsonschen Krankheit [Obeso, 1997; Yelnik et al., 2000; McCreery,
2006] oder dem essentiellen Tremor eine große Rolle [Javidan et al., 1992].
Die bisher beschriebenen Stimulationselektroden finden ausschließlich in der therapeutischen Humanmedizin Anwendung, um Krankheitssymptome zu verringern. Aber auch
bei der Überprüfung von Organfunktionen oder der Früherkennung von Krankheitsbildern
werden Elektroden eingesetzt. So gehören neurophysiologische Analysen der elektrischen
Muskelaktivität (Elektro-Myographie, EMG), der Gehirnströme (Elektro-Enzephalographie, EEG) oder der rhythmischen Aktivität der Herzmuskelfasern (Elektrokardiogramm,
EKG) mittlerweile zu den Standarduntersuchungen [Birbaumer et al., 2004]. Im Gegensatz zu den chronischen Implantaten, die durch Stimulation eine therapeutische Wirkung
aufweisen, werden die EMG-, EEG- oder EKG-Elektroden ausschließlich zur Detektion von
5
1. Einleitung und Motivation
elektrischen Signalen eingesetzt. Bevor jedoch Elektroden präzise in der Humanmedizin
eingesetzt werden können, ist eine genaue Kenntnis der grundlegenden biologischen und
physikalischen Wechselwirkung Voraussetzung.
Da bei vielen Krankheiten die Ursache in einer veränderten Signalverarbeitung im Gehirn
zu suchen ist, wird versucht, die elektrische Aktivität zu analysieren. Ursachen für epileptische Anfälle oder Epilepsie sind zum einen die Hyperexzitabilität von Nervenzellen, zum
anderen eine abnorme gleichzeitige elektrische Aktivität von größeren Netzwerken. Es
wird angenommen, dass aufgrund fortgesetzter Erregung Elektrolytungleichgewichte
hemmende GABA-verwendende Synapsen in erregende Synapsen umgewandelt werden,
und so ein Ungleichgewicht von Erregung und Hemmung entsteht [Kandel et al., 2000].
Um die Überaktivität von Hirnregionen, die zu einem Zusammenkrampfen einzelner Muskeln oder des gesamtes Körpers führen, zu verringern, gibt es verschiedene Ansätze.
Resektionen und Durchschneidungsverfahren sind dabei genauso etabliert wie eine medikamentöse Behandlung oder die Implantation eines "Hirnschrittmachers" [Lüders, 2004;
Yamamoto et al., 2006]. Anders als bei der Epilepsie liegt bei Taubheit eine gestörte
Signalweiterleitung der Haarzellen vor. Die ankommenden Schallwellen werden nicht in
Aktionspotentiale umgewandelt und erreichen den Hörnerv, die Cochlea, nicht. Da jedoch
99% aller Gehörlosen mit zerstörten Hörsinneszellen eine funktionierende Cochlea
besitzen [Hannoversche Cochlear-Implant-Gesellschaft, 2000], kann mittels elektrischer
Stimulation der Hörsinn wiedererlangt werden. Bei den Implantaten ist eine hohe Elektrodenanzahl und eine genaue Positionierung anzustreben, so dass spezifische Nervenzellen
stimuliert und damit ein breiteres Frequenzband erfasst werden kann [Lenarz et al., 2001;
Briggs et al., 2005].
Die genannten Beispiele zeigen, dass nur das Erkennen und Verstehen der Fehlfunktionen
des Gehirns eine gezielte Therapie ermöglichen. Aufgrund der Komplexität der Signalverarbeitung des Gehirns ist bisher nur ein Bruchteil der Signalverarbeitung analysiert und
erfasst. Um mehr über die verschiedenen Mechanismen und Funktionen des Gehirn zu
erfahren, wird an Modellsystemen geforscht. Diese Modellsysteme werden hinsichtlich
des Aufbaus und der Komplexität so gewählt, dass Fragestellungen und Probleme aus dem
Gehirns übertragbar sind. So bilden zweidimensionale, dissoziierte Neuronennetzwerke
meist den Ausgangspunkt der Forschungen, da diese in vitro-Kulturen relativ einfach und
in hoher Anzahl herzustellen und zu untersuchen sind. Da die Komplexität dieser
Neuronennetzwerke begrenzt ist, werden Experimente an akuten Hirnschnitten (Slices)
oder in Versuchstieren (in vivo) durchgeführt, um dem tatsächlichen Aufbau des Gehirns
näher zu kommen. Aufgrund der Unterschiede der vorgestellten Versuchsobjekte werden
jeweils spezifische Elektroden zur Stimulation und Ableitung verwendet.
6
1. Einleitung und Motivation
Obwohl in dissoziierten Netzwerken und Hirnschnitten nach wie vor Glaspipetten (PatchElektroden) für Experimente verwendet werden, gewinnen andere neuartige Elektrodenarten an Bedeutung. Grund hierfür könnte sein, dass die Glaspipetten intrazellulär
platziert werden müssen. Die sehr gute Signalqualität der gepatchten Zellen und die hohen
Signalamplituden von 70 mV stehen der Tatsache gegenüber, dass eine Ableitung oder Stimulation des entsprechenden Neurons nur über einige Stunden möglich ist. Weiterhin ist
die Anzahl der gleichzeitig verwendbaren Glaselektroden in der Regel auf zwei begrenzt, so
dass keine Neuronennetzwerke untersucht werden können [Borkholder, 1998; Regehr et
al., 1988].
Abb. 1.1: Verschiedene Elektrodentypen;
A) EKG-Elektroden [meetB],
B) UTAH-Elektrode [Aoyagi et al., 2003],
C) Feld mit 60 Mikro-Elektroden (MEA) [Multi Channel Systems],
D) spezielles Elektrodendesign [NeuroNexus Technologies]
Mit Hilfe von extrazellulären Elektroden (vgl. Abb. 1.1) sind Stimulation und Detektion
ebenfalls möglich. Aufgrund einer chronischen Verbindung zwischen Elektrode und
Neuron(en) in vivo, in Slices und auch in vitro besteht die Möglichkeit, Experimente an
einer Neuronenstruktur über einige Monate hinweg durchzuführen. Die einsatzspezifische
Anpassung der extrazellulären Elektroden eröffnet so ein breites Anwendungsfeld für Forschungen, die für Glaspipetten nicht zugänglich sind.
7
1. Einleitung und Motivation
Die häufigsten extrazellulären Elektroden besitzen eine planare [Maeda et al., 1995] oder
eine dreidimensionale Struktur [Rousche und Normann, 1998]. Für komplexe Hirnstrukturen mit einem Schichtaufbau eignen sich 3d-Elektroden besser für Stimulations- und
Ableitsprozesse, weil so tieferliegende Zellen kontaktiert werden und sich strukturell
bedingte Aktivitäten der Signalverarbeitung analysieren lassen. Da sich bei akuten Hirnschnitten in den Randschichten abgestorbene Zellen befinden, die die Amplitude der
Zellsignale reduzieren, ist eine direkte Kontaktierung der aktiven Neuronen wünschenswert [Heuschkel et al., 2002]. Daher werden hauptsächlich Nadelelektroden [Thiele et al.,
2006], Nadelarrays (UTAH-Elektrode) [Rousche und Normann, 1998] und 3d-MultiElektroden-Arrays [Heuschkel et al., 2002] in Slices oder in vivo eingesetzt. In den relativ
einfachen Neuronenstrukturen eines in vitro–Netzwerkes treten bereits sehr komplexe
Prozesse der Signalverarbeitung auf, weshalb dieses Elektrodensystem in der Forschung
sehr verbreitet ist. Da es sich hierbei um ein zweidimensionales Netzwerk handelt, sind
keine 3d-Elektroden für die Stimulation und Ableitung notwendig. Aufgrund unterschiedlichster Ansprüche an planare Elektroden sind diverse Elektroden etabliert bzw. werden
neue Materialsysteme erprobt. So werden beispielsweise Transistoren auf Silizium[Schoen und Fromherz, 2005] oder AlGaN-Basis [Steinhoff et al., 2005] für einzelne
Schnecken-Neuronen bzw. Herzzellen für Anwendungen getestet. Andererseits werden
Elektroden aus Edelmetallen wie Gold oder Platin [Robblee et al., 1983; Geddes und Roemer, 2001; 2003] verwendet. Am häufigsten werden jedoch Multi-Elektroden-Arrays
(MEAs), z.B. der Firma Multi Channel Systems, verwendet [Rutten et al., 2001, Eytan et
al., 2003, Wagenaar et al., 2004].
Ein Vorteil der MEA-Strukturen ist, dass durch den geringen Elektrodendurchmesser von
minimal 10 µm [Multi Channel Systems] ein Neuron im Idealfall eine Elektrode abdeckt.
So kann mit ähnlicher Präzision einer Patch-Elektrode gezielt ein Neuron stimuliert und
seine Aktivität analysiert werden. Eine geringe Elektrodenfläche ist jedoch mit einer Erhöhung der Impedanz und einem erschwerten Ladungsausgleich verbunden, was die
Signaldetektion aufgrund des geringen Signal-zu-Rausch-Verhältnisses erschwert. Um die
Zellaktivität mit einem geringen Rauschanteil aufzunehmen, muss bei einer sehr kleinen
Elektrodenfläche die effektive Oberfläche vergrößert werden [Kovacs, 1994]. Dies kann
beispielsweise durch das Aufwachsen einer dünnen TiN-Schicht auf die Elektroden [Multi
Channel Systems] oder das Abscheiden von Goldelektroden auf polykristallinem Silizium
[Paik et al., 2003] geschehen. Die Analyse der elektrischen Aktivität von Neuronen
gestaltet sich zum Teil schwierig, da die Signale eine große Variabilität aufweisen. Trotz
der weit verbreiteten Verwendung der MEAs, fehlen geeignete Modelle, welche die unterschiedlichen Aktivitätsmuster von Einzelneuronen oder Neuronennetzwerken hinreichend
erklären und präzise Interpretationen zulassen [Martinoia et al., 2004]. Es gibt Ansätze, in
denen die Zellsignale nach bestimmten Kriterien, d.h. Spike-Länge, Spike-Abstand, Burst-
8
1. Einleitung und Motivation
Länge, Burst-Abstand, Anzahl von Spikes und Burst usw., untersucht werden, um Rückschlüsse auf den Ursprung der Zellaktivität zu erhalten [Egert et al., 2002]. Dabei kann die
Zugabe bestimmter Neurotransmitterantagonisten oder -agonisten eine Inhibition oder
verstärkte Aktivität hervorrufen. Damit können selektiv Fragestellungen bearbeitet werden
[Wagenaar et al., 2004; Steidl et al., 2006]. Eine weitere Möglichkeit, die vielfachen Antwortmuster zu analysieren, bietet die Verwendung eines physikalisch motivierten
Ersatzschaltbildes. Dabei setzt sich das Ersatzschaltbild aus Einzelkomponenten
zusammen, die spezielle Teile des Interfaces, wie das Neuron selbst, die Synapsen, die
Metallelektrode und die Verbindung von Elektrode und Neuron, darstellen. Durch eine
Variation der Modellparameter bis zu einer Übereinstimmung von Simulation und
Messung können Rückschlüsse auf den Einfluss bestimmter biologischer Komponenten
auf das detektierte Signal gezogen werden [Paik et al., 2003]. Bei der Aufnahme und der
Auswertung der elektrischen Zellsignale ist darauf zu achten, dass die gemessene Signalform nicht durch den gewählten Messaufbau aufgeprägt wird [Wrobel et al., 2007].
Ein Nachteil der Multi-Elektroden-Arrays ist, dass diese sich nur in Kombination mit spezifischer Elektronik (Stimulationsgeneratoren, Verstärkern) und Software verwenden
lassen. Darüberhinaus erfordert die Fabrikation der MEAs umfangreiche Herstellungsverfahren, die hauptsächlich in der Siliziumtechnik genutzt werden [Nisch et. al.,1994; Novak
und Wheeler, 1988], so dass eine eigene Fabrikation sehr aufwendig ist. Da die maximale
2
räumliche Ausdehnung eines MEAs auf 4.5×4.5 mm beschränkt ist [Multi Channel Systems], können im Vergleich zum Gehirn nur sehr begrenzte Netzwerke untersucht werden.
Trotz dieser Einschränkungen werden die Multi-Elektroden-Arrays vielfach angewendet.
Es muss jedoch die Frage gestellt werden, ob nicht auch einfache Mittel genügen, um eine
Schnittstelle von biologischen Strukturen und Elektronik zu etablieren, welche die Untersuchung von komplexen Problemen zulässt.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine einfache Stimulationselektrode zu entwickeln, mit der
interessante Fragestellungen aus dem Bereich der Zellphysiologie bearbeitet werden
können, die zum weiteren Verständnis der Signalverarbeitung in Netzwerken beiträgt.
Dabei soll die zu entwickelnde Elektrode im Gegensatz zu MEAs die Möglichkeit bieten,
sowohl einzelne Neuronen als auch ganze Neuronennetzwerke im Zentimeterbereich zu
stimulieren und unkompliziert mit etablierter Elektronik anzuwenden sein. Ein Grundstein für die Anwendung der entwickelten Elektrode in der Forschung ist die genaue
Kenntnis der Signaleinkopplung in das Gesamtsystem. Dazu muss die neue Elektrode hinsichtlich ihrer physikalischen Eigenschaften charakterisiert und optimiert werden. Die
generelle Einsatzfähigkeit der Elektroden soll am Beispiel der Stimulation von zwei verschiedenen Zelltypen überprüft werden. Grundlage dafür bildet die Bestimmung der
Stimulationsparameter. Der vorliegende Anregungsmechanismus der beiden verwendeten
9
1. Einleitung und Motivation
Zelltypen soll charakterisiert und mit bekannten Mechanismen verglichen werden. Mit den
durchgeführten Analysen soll ein Verständnis der Stimulationsvorgänge erreicht werden,
damit die entwickelte Elektrode für spezifische wissenschaftliche Fragestellungen von Forschungsgruppen angewendet werden kann.
Die Einkopplung von elektrischen Signalen in einen Elektrolyten wird maßgeblich durch
die elektrochemische Doppelschicht bestimmt, die sich ausbildet, wenn Metallelektrode
und Elektrolyt in Kontakt zueinander kommen. Daher liegt neben der Charakterisierung
der Metallelektrode und der Elektrolyten der Schwerpunkt in der Analyse der Doppelschicht. So wird das Gesamtsystem mit Hilfe von impedanzspektroskopischen Messungen
analysiert und durch ein Ersatzschaltbild beschrieben. Der Einfluss von spezifischen
Systemparametern auf das Frequenzverhalten des Gesamtsystems wird durch die Variation der Elektrolytstärke, des Systemvolumens und nach Zugabe von Zellen untersucht.
Von großem Interesse ist ebenfalls, welche Potentialverteilung im Elektrolyten bei dem
Anlegen eines elektrischen Pulses an die Elektroden vorliegt. Mit Hilfe von ortsaufgelösten
Messungen und Simulationen wird der Potentialverlauf entlang der Elektroden detailliert
analysiert, um Bereiche mit hohen und geringen Potentialen angeben zu können. Die
Kenntnis der genauen Potentialverteilung erlaubt eine Aussage über die herrschenden
Anregungsbedingungen.
Als Versuchs- bzw. Modellsysteme für die Elektroden werden einfache biologische Strukturen, z.B. suspensierte Hefezellen und dissoziierte Neuronennetzwerke, gewählt, um die
Einkopplung von elektrischen Pulsen mit Hilfe der neu entwickelten Elektrode zu demonstrieren. Nach der Bestimmung des Parameterfensters für eine erfolgreiche Stimulation
werden die Anregungsmechanismen sowohl von Hefenzellen als auch von Neuronen
analysiert. Speziell für diese Fragestellung angefertigte Neuronennetzwerke, deren synaptische Signaltransmission durch Zugabe von Neurotransmitter-Antagonisten blockiert ist,
werden zur Analyse des vorliegenden Anregungsmechanismus verwendet. Ein Modell,
dass die Einflüsse der spezifischen biologischen Zellparameter und der Elektrodencharakteristika berücksichtigt und in Korrelationen zur lokalen Potentialverteilung steht,
vervollständt das Verständnis des Stimulationsprozesses.
10
2. Grundlagen
2.
Grundlagen
Ziel dieser Arbeit ist es, eine neuartige planare Elektrodenstruktur zur Stimulation von
Zellsystemen zu entwickeln. Um eine Elektrode für Stimulationsexperimente zu konzipieren, müssen sowohl physikalische als auch biologische Aspekte beachtet werden. Um
dem Leser einen Eindruck der Komplexität bei der Entwicklung einer Elektrode zu vermitteln, werden in Abschnitt 2.1. Effekte beschrieben, die eine große Bedeutung bei der
Signaleinkopplung haben. Die elektrochemische Doppelschicht, die sich an der Phasengrenze Metall-Elektrolyt ausbildet, beeinflusst maßgeblich die elektrischen
Eigenschaften der Gesamtsystems. Die Vorstellung einiger Modelle der Doppelschicht und
der Signaleinkopplung in Neuronen sollen den Leser für diese Problematik sensibilisieren.
Im Abschnitt 2.2. werden die beiden verwendeten Zellkulturen, Neuronen und Hefezellen
(Saccharomyces carlsbergensis), vorgestellt. Der Zellaufbau, spezifische Stoffwechselprozesse und Aktivitätsmuster, die für das Grundverständnis der Stimulation und der
detektierten Zellantwort notwendig sind, werden ebenfalls dargelegt.
2.1. Elektrische Grundlagen
Die hier vorgestellten elektrischen Grundlagen geben einen allgemeinen Überblick über
die Parameter, die bei der Stimulation von Neuronen wichtig sind. Einleitend werden die
Nadelelektrode und eine Fingerelektrode, ähnlich der entwickelten, vorgestellt und kurz
charakterisiert. Den Hauptteil dieses Kapitels bilden die Beschreibung der elektrochemischen Doppelschicht und Modelle der Signalübertragung in Neuronen. Einige
Bemerkenungen zu auftretenden Effekten bei der Pulseinkopplung über Elektroden in
Elektrolyten beschließen diesen Abschnitt.
11
2. Grundlagen
2.1.1. Einfluss verschiedener Parameter auf die Stimulationsbedingungen der Neuronen bei Verwendung einer
Nadelelektrode
Für die medizinische und physiologische Grundlagenforschung ist die Verwendung von
Nadelelektroden im Gehirn von Versuchstieren sehr verbreitet. Dabei wird eine spitze
Nadelelektrode in ein komplexes Volumen, bestehend aus einem Elektrolyten, Zellkörpern,
Dendriten und Axonen, platziert. Beim Anlegen eines Stimulationspulses an die die
Elektroden wird folglich eine unbestimmte Anzahl von Zellen angeregt [Ranck, 1975]. Um
die neurale Aktivität zu beeinflussen und damit Krankheiten zu heilen, muss bekannt sein,
welche Teile des Neurons bei einer Mikrostimulation im Gehirn angeregt werden. Experiment [Nowak und Bullier, 1998a,b] und Simulation [McIntyre und Grill, 1999]
beschreiben einheitlich, dass ein Aktionspotential immer im Axon oder Axonhügel ausgelöst wird, wenn die Elektrode über dem Zellkörper liegt. Ein weiteres Ergebnis der
Untersuchungen [McIntyre und Grill, 1999] ist, dass der Ort der höchsten Depolarisation
nicht immer der Ort ist, von dem das Aktionspotential ausgeht. Weiterhin wird detailliert
analysiert, wie sich die Schwellwerte für eine Stimulation mit dem Abstand von Elektrode
zu Zelle und dem Ort der Stimulation ändern. Bei nicht punktförmigen, ausgedehnten
Elektroden können diese Unterschiede vernachlässigt werden, da die Elektrode groß
gegenüber den Neuronen ist und damit das elektrische Feld immer alle Bereiche der Zellen
erreicht.
Lange Zeit war nur wenig über die räumliche Stromdichteverteilung auf der Elektrodenoberfläche, die Feldverteilung und über den Einfluss von Elektrodengeometrien und
-eigenschaften auf die Anregung der Neuronen bekannt. Aus experimentellen Befunden
geht hervor, dass die Elektrodengeometrie, d.h. die Größe und der Radius der Elektrodenspitze, das elektrische Feld so beeinflussen kann, dass ein lokaler Zellschaden verursacht
wird [McCreery et al., 1990]. Mit den Simulationen von McIntyre und Grill [McIntyre und
Grill, 2001] sind erstmals Aussagen über Stromdichteverteilung einer Nadelelektrode
möglich. Wie zu erwarten, ist die Stromdichte an der Spitze der Nadel und dem Übergang
zwischen Elektrode und Isolationsschicht am höchsten. Dabei hängt die Stromdichteverteilung von der speziellen Elektrodengeometrie ab [Habel, 2004]. Die Verwendung einer
Isolationsschicht kann die räumliche Veränderung der Stromdichte verringern und damit
die Homogenität erhöhen. In Entfernungen von über 50 µm zur Elektrode können die Veränderungen des elektrischen Feldes durch veränderte Geometrien vernachlässigt werden.
Der Einfluss auf die elektrische Anregbarkeit der Neuronen ist minimal. Für Neuronen, die
sich ungefähr 50 µm von der Elektrode entfernt befinden, verhält sich das elektrische Feld
von Nadelelektroden nahezu identisch zu dem einer Punktelektrode [McIntyre und Grill,
2001] .
12
2.1.2. Ineinander greifende Elektroden / Fingerelektroden
2.1.2. Ineinander greifende Elektroden / Fingerelektroden
Ineinander greifende oder auch Fingerelektroden sind in ihrer Anwendung sehr vielseitig
und daher weit verbreitet. Dabei spielt das elektrostatische Feld zwischen den Elektroden
für verschiedenen Anwendungen eine große Rolle. Die ineinander greifenden Elektroden
werden als photosensitive Detektoren [Averin et al., 1996], als Filter für Oberflächenwellen
(SAW) [Morgan, 1985] und als Feuchtigkeitssensoren [Bearzotti et al., 1996] verwendet.
Bei biologischen Fragestellungen gewinnt dieser Elektrodentyp ebenfalls an Bedeutung.
Mit Hilfe der Fingerstrukturen kann durch Impedanzmessungen das Anhaften von Zellen
auf den Elektroden charakterisiert oder eine Zelldichte ermittelt werden [Chang et al.,
2005]. Eine räumliche Trennung von lebenden und toten Bakterien der Art Listeria ist
durch das Anlegen einer 1 V-Wechselspannung mit einer Frequenz von 50 kHz möglich
[Li, 2002]. Diese Effekte, verursacht durch das Anlegen einer Wechselspannung an ineinander greifende Elektroden, werden in der Biotechnologie, speziell für die
Charakterisierung und Trennung von Zellen mittels dielektrischer Spektroskopie, ausgenutzt [Asami, 2002]. Zum besseren Verständnis der Kräfte, die auf die Zellen wirken,
tragen Berechnungen der Dielektrophorese [Pohl et al., 1978; Pething et al., 1992], der
Elektrorotation [Holzapfel et al., 1982; Gimsa und Wachner, 1998] und der sich ausbreitenden Wellen der Dielektrophorese [Li, 2004] bei.
Der Vorteil dieser Sensoren bzw. Elektroden ist dabei die einfache und preiswerte Herstellung. Die Berechnungen des elektrischen Potentials und der Kapazität zwischen den
einzelnen Elektroden waren bisher nur mit erheblichem Aufwand möglich [Engan, 1969].
Erst den Otter publizierte eine vereinfachte Möglichkeit, die charakteristischen Größen zu
ermitteln [den Otter, 2002]. Die gemachten Annahmen führen zu vernachlässigbaren
Abweichungen von der exakten Lösungen von Engan [Engan, 1969].
2.1.3. Phasengrenze Metall-Elektrolyt
Eine, die Stimulation von biologischen Zellen wesentlich bestimmende, Komponente ist
die Phasengrenze zwischen den Metallelektroden und Elektrolyt. Der Elektrolyt, der das
Überleben der Zellen gewährleistet, besteht aus in Wasser gelösten Ionen. Aufgrund von
elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den Dipolmomenten der Wassermoleküle
und der Ionenladung bildet sich um die Ionen eine Solvathülle. Die damit verbundene eingeschränkte Beweglichkeit der Ionen führt also zu einer Erhöhung des Widerstandes des
Elektrolyten.
Unter Gleichgewichtsbedingungen sind die Kräfte, die auf ein Ion wirken, isotrop. Daher
13
2. Grundlagen
wird auch kein elektrisches Potential aufgebaut. An einer Phasengrenze, in diesem Fall am
Metall-Elektrolyt, wird diese Symmetrie gebrochen. An der Grenzfläche zwischen Metall
und Elektrolyt wirken auf die Ionen anisotrope Kräfte, die mit Abhängigkeit des Abstands
zur Grenzfläche variieren. Dieses führt zu einer Ausrichtung der gelösten Ionen und der
Dipole des Lösungsmittels und damit zu einem Überschuss von ionischer Ladung in der
Nähe der Phasengrenze.
Die Ladungsakkumulation im Elektrolyten führt dazu, dass sich auf der Oberfläche der
Metallelektrode ein gleichgroßes Potential mit entgegengesetztem Vorzeichen ausbildet. So
entsteht eine Ladungstrennung an der Grenzfläche von Metall und Elektrolyt, die mit
einem Potentialgradienten verbunden ist. Diese Grenzfläche kann daher als Kapazität
betrachtet werden. Ein Ladungsausgleich ist nicht möglich, da es keine direkte Leitung
zwischen der ionischen im Elektrolyten und der Elektronen-Leitung im Metall gibt. Im
Ruhezustand ist das Potential betragsmäßig so klein, dass an den Metallelektroden keine
elektrolytischen Prozesse einsetzen.
Die hier vorgestellten Modelle zur Beschreibung der Phasengrenze basieren auf einem
ideal polarisierbaren Übergang von Metall und Elektrolyt. Das heißt, dass das Potential
verändert werden kann, ohne dass ein Strom fließt [Rubinstein, 1995] und sich die
Elektrode rein kapazitiv verhält.
Das Helmholtz-Modell (Abb. 2.1 a)) für die Doppelschicht besteht aus einem einfachen
Plattenkondensator. Dabei wird davon ausgegangen, dass sich die Überschussladung der
Elektrode an der Oberfläche befindet. Im Elektrolyten bildet sich dann eine starre Schicht
aus solvatisierten Ionen parallel zur Metallelektrode aus. Diese Ebene, auch äußere Helmholtz-Ebene genannt, ist definiert durch den Ladungsschwerpunkt der Ionen. Die
Flächenkapazität ist dann gegeben durch
C H=
⋅ 0
,
d
(2.1)
wobei  die Dielektrizitätskonstante des Elektrolyten,  0 die Dielektrizitätskonstante von
Vakuum (8.85·10-12 F·m-1) und d der kleinste Abstand der Ionen zur Metalloberfläche sind.
Dabei wird der Abstand der solvatisierten Ionen gewöhnlicherweise mit 3 Å angenommen
[Rubinstein, 1995]. Die Kapazität, die durch das Ausbilden der starren Doppelschicht entsteht, liegt in einem Bereich von 5 µF·cm-1 bis 50 µF·cm-1 [Hamann und Vielstich, 1998].
Der große Vorteil dieses Modells ist seine Einfachheit. Eine oft beobachtete Abhängigkeit
der Doppelschichtkapazität von der Elektrolytkonzentration bzw. -komposition und dem
Potential kann mit diesem Modell nicht erklärt werden.
In dem Modell von Gouy und Chapman [Gouy, 1910; Chapman, 1913] wird angenommen,
dass die elektrostatische Wechselwirkung von Metallelektrode und Ionen durch die ther14
2.1.3. Phasengrenze Metall-Elektrolyt
mische Bewegung der Ionen und Moleküle beeinflusst wird. Es kommt deshalb zur Ausbildung einer diffusen Doppelschicht, in der sich die Ionen bewegen können (Abb. 2.1 b)).
Dabei wird die Elektrode als ein "makroskopisches Ion" betrachtet, welches durch die diffuse Anordnung der solvatisierten Ionen abgeschirmt wird. Der Vorteil dieses Modells ist,
dass es eine Abhängigkeit der Doppelschichtkapazität von dem Potential und der
Elektrolytkonzentration gibt. Der Nachteil dieses Modells ist, dass es nur für sehr schwache Elektrolyten eine gute Übereinstimmung mit den gemessenen Werten liefert. In höher
konzentrierten Elektrolyten ist die gemessene Kapazität größer als die nach Gleichung
(2.17) berechnete. Die Dicke und die Kapazität der diffusen Doppelschicht hängen
unmittelbar von der Konzentration des Elektrolyten ab und wachsen mit sinkender Konzentration. So beträgt beispielsweise die Ausdehnung der Doppelschicht für eine 0.1
molare Lösung ca. 10 Å [Fromherz, 2003].
a)
b)
c)
starre Doppelschicht
-
+
+
+
+
+
a/2
starre Doppelschicht
-
+
+
+
+
+
+
+
+
diffuse Doppelschicht
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
a/2
+
+
+
+
diffuse Doppelschicht
Abb. 2.1: Modelle verschiedener Doppelschichten
a) starre, elektrolytische Doppelschicht (nach Helmholtz)
b) diffuse Doppelschicht aus Überschussladungen (nach Gouy-Chapmann)
c) Kombination aus starrer und diffuser Doppelschicht (nach Stern)
Das Stern-Modell verbindet die beiden vorherigen Modelle miteinander (Abb. 2.1 c)). Es
beinhaltet sowohl die Bildung einer starren und einer diffusen Doppelschicht. Die gemessene Doppelschicht-Kapazität verhält sich dann wie die Summe von zwei in Reihe
geschalteten Kondensatoren (Gl. 2.18).
Obwohl das Stern-Modell in sehr vielen Fällen ausreichend ist, gibt es unter bestimmten
Bedingungen Abweichungen von der gemessenen Doppelschicht-Kapazität. So verfeinerte
Grahame [Grahame, 1947] das Modell von Stern wie folgt: Ionen, Lösungsmitteldipole
oder neutrale Moleküle mit und ohne Dipolcharakter können an einer Metalloberfläche
durch van-der-Waals-Kräfte oder Coulombsche Wechselwirkungen adsorbiert werden.
15
2. Grundlagen
Dabei wird die Adsorption in Abhängigkeit vom Potential der Elektrode entweder unterstützt oder geschwächt. So kann auch der Fall auftreten, dass Anionen auch bei einer
negativen Aufladung der Elektrode adsorbiert werden. Durch die berücksichtigte
Adsorption muss die starre Doppelschicht in Unterschichten unterteilt werden. Nach
Grahame wird in diesem Fall eine innere und eine äußere Helmholtz-Schicht unterschieden. Die Ebene durch die Schwerpunkte der adsorbierten Ladungen wird als innere
Helmholtz-Ebene bezeichnet [Jogl, 2005]. Bemerkenswert ist, dass innerhalb der Doppelschicht Feldstärken von bis zu 109 V·m-1 auftreten können [Schmickler und Henderson,
1996].
orientierte Wasserdipole
Elektrode
-
solvatisierte Kationen
unorientierte Wasserdipole
durch von-der-Waals-Kräfte spezifisch adsorbierte Ionen
starre Doppelschicht
Metalloberfläche
diffuse Doppelschicht
äußere Helmholtz-Ebene
innere Helmholtz-Ebene
Abb. 2.2: Doppelschichtstruktur nach Graham [Bard und Faulkner, 2001]
Weiterführende theoretische Abhandlungen über die Grenzfläche zwischen Elektrolyt und
Elektrode finden sich in [Lipkowski und Ross, 1993].
16
2.1.4. Gouy-Chapman-Theorie
2.1.4. Gouy-Chapman-Theorie
Ein sehr einfaches Modell für die Phasengrenze Metall-Elektrolyt wurde von Gouy [Gouy,
1910] und Chapman [Chapman, 1913] bereits Anfang des letzten Jahrhunderts entwickelt.
Dabei werden in ihrem Modell folgende Annahmen getroffen:
•
Ionen sind Punktladungen und -massen
•
keine Fluktuationen in der Ionenverteilung
•
Ionen wechselwirken nur mit dem Elektrodenpotential, jedoch nicht untereinander
•
keine Adsorptions- oder Hydratationsvorgänge
•
Lösungsmittel besitzt eine konstante Dielektrizität
•
vollkommen ebene, unendlich ausgedehnte Oberfläche mit gleichmäßiger Ladungsverteilung
Die Verteilung der Ionen an der Phasengrenze kann nun mit Hilfe der Elektrostatik und
der Statistischen Mechanik berechnet werden. Dafür wird folgendes angenommen: Die
ebene Elektrode sei in Kontakt mit einer Lösung eines z-z Elektrolyten (d.h. Kationen der
Ladungszahl z und Anionen der Ladungszahl -z).
Dabei wird das Koordiantensystem so gewählt, dass die Elektrode bei x = 0 liegt und senkrecht zur x-Achse steht. Weiterhin erfüllt das innere Potential   x  die PoissonGleichung.
2
d 
dx
2
=−
 x 
⋅ 0
(2.2)
wobei ρ(x) die Ladungsdichte des Elektrolyten,  die Dielektrizitätskonstante des
Lösungsmittels und  0 die des Vakuums sind. Die Dichten n+(x) und n-(x) sind die Dichten
der Kationen und Anionen, die im Inneren der Lösung gleich n0 sind.
  x = z⋅e 0 [ n  x −n−  x ]
(2.3)
Die Ionendichte muss vom Potential   x  abhängen. Wird ein Punkt im Lösungsinneren
als Bezugspunkt gewählt, so ist  ∞=0 , und es kann die Boltzmann-Statistik wie folgt
angewendet werden:


n +  x =n 0⋅exp −
z⋅e 0⋅ x 
k B⋅T
z⋅e0⋅ x 
n -  x =n 0⋅exp
k B⋅T


(2.4)
17
2. Grundlagen
Dabei entsprechen e0 der Elementarladung mit e0= 1.602·10-19 C, kB der Boltzmannkonstanten kB= 8.62·10-5 eV·K-1,   x  dem inneren Potential und z der Anzahl der
Ladungen. Werden nun die Gl. (2.4) und Gl. (2.3) in Gl. (2.2) eingesetzt, so ergibt sich eine
Differentialgleichung für   x  , die als Poisson-Boltzmann-Gleichung bekannt ist.
d2 
dx
2
=−
[ 
 
z⋅e 0⋅n 0
z⋅e 0⋅  x 
z⋅e 0⋅  x 
⋅ exp −
−exp
⋅0
k B⋅T
k B⋅T
]
(2.5)
Zunächst wird der einfache Fall betrachtet, in dem überall z⋅e 0⋅  x / k B⋅T ≪ 1 gilt. Dann
kann der Exponent linearisiert werden, und es ergibt sich die linearisierte Poisson-Boltzmann-Gleichung
d2  2
= ⋅ x 
d x2
[
2⋅ z⋅e0 2⋅n 0
=
⋅0⋅k B⋅T
]
1/2
,
(2.6)
wobei κ die inverse Debye-Länge ist. Die Lösung, die der Randbedingung  ∞=0 genügt,
hat die Form  x = A⋅exp −⋅x  , wobei die Konstante A durch das Ladungsgleichgewicht festgelegt wird.
∞
∫  x  d x =−
(2.7)
0
Dabei ist σ die Oberflächenladungsdichte des Metalls, welche durch die Raumladung in der
Lösung kompensiert wird. Durch einige Zwischenberechnungen lässt sich die Konstante A
bestimmen.
d
  x =−⋅0
A⋅exp ⋅x  ]=−⋅0⋅A⋅2⋅exp ⋅x 
2[
dx
∞
∫
 x  d x =−⋅0⋅A⋅
0
A=
2
∞
∫
0

⋅0⋅
[
]
1
2
exp⋅x  d x =−⋅ 0⋅A⋅ − ⋅exp x 

=−⋅ 0⋅A⋅=−
∞
0
ρ(x) berechnet sich aus  x  und der Poisson-Gleichung. Es ergeben sich für das Potential
somit
 x =

⋅exp−⋅x 
⋅0⋅
und für die Ladungsdichte entsprechend
18
(2.8)
2.1.4. Gouy-Chapman-Theorie
d2 
  x =−⋅0
=⋅⋅exp−⋅x  .
d x2
(2.9)
Die Raumladung fällt also in der Lösung exponentiell ab, wobei die Debye-Länge die Ausdehnung festlegt. Dieser Ladungsverteilung entspricht eine Kapazität.
Das Elektrodenpotential ist gegeben durch Gl. (2.10)
 x =0=

⋅0⋅
,
(2.10)
wobei Dipolpotentiale in diesem Modell nicht betrachtet werden. Die Kapazität der Phasengrenze pro Fläche ist bekannt als Doppelschichtkapazität und berechnet sich nach Gl.
(2.11).
C=

=⋅ 0⋅
 0
(2.11)
Die Doppelschichtkapazität ähnelt der Kapazität eines Plattenkondensators, bei dem der
Plattenabstand durch die Debye-Länge charakterisiert wird. Dieser Abstand beträgt in sehr
konzentrierten Elektrolyten nur wenige Ångström und entsprechend hoch sind dann die
Kapazitäten.
Obwohl Gl. (2.9) und Gl. (2.10) die Berechnung des Potentials bzw. der Ladungsdichte
ermöglichen, gelten sie nur sehr eingeschränkt für kleine Ladungsdichten an den Elektroden.
2.1.5. Ableitung der Gouy-Chapman-Kapazität
Für einen z-z Elektrolyten kann man über die lineare Näherung hinausgehen und die
nichtlineare Poisson-Boltzmann-Gleichung (2.5) explizit lösen. Dazu wird die Gl. (2.5) in
folgende Form umgewandelt.

2 z e0 n0
z e0  x 
d2 
=−
sinh
2
0
kB T
dx

(2.12)
Nach Multiplikation mit 2 d  x /d x und der Verwendung einer einfachen Relation
können beide Seiten integriert werden.
19
2. Grundlagen

2 z e0 n0
z e0  x 
d2 
=−
sinh
2
 0
kB T
dx

 ∣
⋅2
4 z e0 n0 d 
z e0  x
d  d2 
2
=−
sinh
dx dx2
 0 d x
kB T
 ∣
d
dx
2 ∞
ze n
=−4 0 0
0
0
∞
∫ sinh
0

∣∫
∞
0
d
dx
 
2
d2  d 
d d
d x mit :
=2
d x dx
d x2 d x

z e0  x d 
dx
kB T
dx
(2.13)
Damit ergibt sich die Gl. (2.13).
Da sowohl das elektrische Feld E und das Potential  im Unendlichen verschwinden,
kann man beide berechnen. Für die Lösung des Integrals muss jedoch die Funktion
innerhalb des sinh substituiert und die Ableitung von da/dx gebildet werden.
∞
∫ sinh
0


z e0  x  d 
z e0  x 
d x  a x  =
kB T
dx
kB T
k T d
d a z e0 d  x 
=
 d x= B
da
d x kB T d x
z e0 d x
∞
∫
sinh
0


∞
z e0  x d 
d  kB T d x
d x =∫ sinh a 
da
kB T
dx
d x z e0 d 
0
kB T
=
z e0
∞
kT
∫ sinh a d a = z e
0
∞
[cosh a]0
0
Für das elektrische Feld ergibt sich also
 ∣
d
dx

2 ∞
4 z e0 n0 kB T
z e 0  x 
= E0 =−
cosh
0
z e0
kBT
0
2
=−
E 02 =
[

4 e0 n0 k B T
z e0 0
1−cosh
 0
kB T
4 e 0 n0 k B T
 0
[ 
cosh
z e 0 0
kB T
]
−1
.
]
∣
∞
0
(2.14)
Die Oberflächenladungsdichte σ und die Feldstärke E sind gemäß E(0) = σ/εε0 voneinander abhängig. Durch das Verwenden der Winkelidentität cosh(x)-1=2·sinh2(x/2) ergibt
sich für die Oberflächenladungsdichte
20
2.1.5. Ableitung der Gouy-Chapman-Kapazität
1/ 2
 =  8k T n 0  0 
sinh 2

z e 0  0
2 kB T

.
(2.15)
Wird nun noch nach dem Potential differentiert, da C =   /   , so ergibt sich schließlich
die differentielle Kapazität
C GC = 0  cosh

z e0 0
2 kB T

.
(2.16)
Da das Potential 0 nicht gemessen werden kann, muss Gl. (2.16) umgeformt werden.
Das Elektrodenpotential  unterscheidet sich von  0 nur durch eine Konstante. Wenn
0=0 ist, so trägt die Elektrode keine Ladung. Das entsprechende Elektrodenpotential
 pzc ist das Potential am Ladungsnullpunkt (pzc = potential of zero charge). Mit dieser
Annahme kann Gl. (2.16) in die Gouy-Chapman-Kapazität umgeformt werden.
C GC =  0  cosh

z e0 − pzc
2 kB T

(2.17)
Bei geringen Elektrolytkonzentrationen bis zu 10-3 M stimmt die Gouy-Chapman-Theorie
gut mit den experimentellen Werten für die Doppelschichtkapazität überein, wenn die spezifische Adsorption vernachlässigt wird. Bei höheren Elektrolytkonzentrationen gibt es
jedoch systematische Abweichungen. Die experimentellen Werte folgen dann der Gleichung (2.18),
1
1
1
=

C C GC C H
(2.18)
wobei C GC der Gouy-Chapmann-Kapazität aus Gl. (2.16) und C H der Helmholtz-Kapazität
entsprechen und C H unabhängig von der Konzentration n0 des Elektrolyten ist (SternModell).
Experimentell kann die Helmholtz-Kapazität bestimmt werden, indem man die flächenbezogene Kapazität C der Phasengrenze bei verschiedenen Konzentrationen misst und
anschließend 1/C gegen die berechnete inverse Gouy-Chapmann-Kapazität 1/ C GC bei
konstanter Oberflächenladungsdichte aufträgt. Es ensteht eine Gerade, deren Schnittpunkt
mit der Ordinate die gesuchte Größe 1/C H repräsentiert [Schmickler und Henderson,
1996]. Wenn die Oberfläche der Elektrode unbekannt ist, so wird die nicht flächenbezogene Kapazität aufgetragen und man erhält die Fläche aus dem Anstieg der Geraden. Sollte
bei dem Auftragen der experimentellen Werte keine Gerade entstehen, so liegt eine spezifische Adsorption vor.
21
2. Grundlagen
2.2. Pulseinkopplung in neuronale Netzwerke
Bei Stimulationsexperimenten werden elektrische Strom- oder Spannungspulse in neuronale Netzwerke eingekoppelt. Die Art der gewählten Stimulation hängt dabei von der
Elektrodengeometrie, den zu untersuchenden Zellen und dem speziellen Experiment ab.
Bei der Stimulation mit Multi-Elektroden-Arrays (MEAs) werden meist stromkonstante
Pulse verwendet [Buitenweg et al., 2002; Jimbo und Kawana, 1992], um die zeitliche Veränderung der Elektrodenimpedanz zu kompensieren. Im Gegensatz dazu stehen
Experimente von Wagenaar et al., die mit Spannungspulsen eine größere Stimulationseffizienz als mit Strompulsen gleicher Maximalspannung erreichten [Wagenaar et al., 2004].
Da durch die Impedanz des Gesamtsystems, bestehend aus Elektrode, Elektrolyt und
Neuron, der angelegte Puls verändert wird, ist die Kenntnis der Übertragungsfunktion und
der herrschenden Potentialverhältnisse für Stimulationsvorgänge notwendig.
Die Übertragungsfunktion modelliert die Spannung, die tatsächlich über der Zellmembran
in Abhängigkeit von den an den Elektroden angelegten Pulsen, abfällt. Für eine solche
Simulation ist eine genaue Kenntnis der elektrischen Eigenschaften des Systems Elektrode-Elektrolyt-Neuron zwingend erforderlich. Daher liegen zahlreiche Modelle vor, die
die Einkopplung elektrischer Signale über Elektroden in Nervenzellen beschreiben. Die
wichtigsten Ansätze zur Pulseinkopplung an MEAs werden in dem folgenden Kapitel 2.2.1.
vorgestellt.
2.2.1. Spezielle Modelle
Bei den etablierten Stimulationselektroden wird mittels eines Ersatzschaltbildes der Einkopplungsprozess in die Nervenzellen beschrieben. Die Wahl und Anordnung der
Einzelkomponenten (Elektrode, Elektrolyt, Neuron) ergeben ein Modell, welches idealerweise die gleichen elektrischen Eigenschaften wie das Gesamtsystem aufweisen soll. Ein
Vergleich von gemessener und berechneter Impedanz fordert eine Neuanpassung des
Ersatzschaltbildes oder lässt Rückschlüsse auf Eigenschaften des Gesamtsystems zu. Ein
sehr einfaches Beispiel eines Ersatzschaltbildes ist in Abb. 2.3 dargestellt [Rutten et al.,
2001]). Die entscheidenden Größen in Abb. 2.3 sind die Impedanz Z el der Elektrode, der
Widerstand R seal , der ein Maß für die Güte der Verbindung von Neuron und Elektrode ist,
und die Kapazität C sh zwischen den Zuleitungen und dem Elektrolyten. Die Impedanz der
Elektrode wird mit Z el =K /i   beschrieben, wobei K einen freien Parameter darstellt. Es
wird also von einer rein kapazitiven Einkopplung über die Elektroden ausgegangen.
22
2.2.1. Spezielle Modelle
Abb. 2.3: Ersatzschaltbild der Schnittstelle von Elektrode und Neuron
(nach [Rutten et al., 2001])
Ein wesentlicher Parameter für die Qualität der Verbindung von Neuron und Elektrode ist
der Dichtungswiderstand R seal . Dabei indiziert ein hoher Widerstand eine sehr gute Kontaktqualitiät von Neuron und Elektrode, die selektive Stimulation und Ableitung von
Zellen zulässt. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass eine hohe Qualität der Verbindung
von Neuron und Elektrode mit einem hohen Bedeckungsgrad der Elektrode korreliert
[Regehr et al., 1989, Breckenridge et al., 1995; Bove et al., 1995]. Im Falle eines kleinen
Widerstandes ist das detektierbare Zellsignal wesentlich kleiner, da ein Teil des Stromes
über den Elektrolyten abfließt [Rutten et al., 2001].
Abb. 2.4: Ersatzschaltbild zur Beschreibung des ElektrodenNeuronen-Interfaces (nach [Bove et al., 1995])
Ein deutlich komplexeres Schaltbild beschreiben Bove et al. [Bove et al., 1995], der die
Zellmembran und ihre Ionenkanälen unter Verwendung des Hodgkin und Huxley Modells
23
2. Grundlagen
[Gerstner und Kistler, 2002] berücksichtigt. In dem Modell (vgl. Abb. 2.4) werden die
Elektrodenimpedanz mit den Parametern R e und C e , die Ionenströme von Natrium und
Calcium durch I act , das Gleichgewichtspotential mit U Cl und der Membranwiderstand der
Chlor-Ionen durch U Cl beschrieben. Die Parameter R seal und R spread bilden den Dichtungsbzw. Elektrolytwiderstand und R i stellt den Widerstand zu den angrenzenden Zellbereichen dar. Die Kapazität zwischen Elektrolyt und Zellinnerem wird durch C me beschrieben,
der sich aus der Membrankapazität, der Kapazität der inneren und äußeren Helmholtzebenen sowie der Kapazität der diffusen Doppelschicht zusammensetzt. Es muss an dieser
Stelle erwähnt werden, dass in diesem Modell die elektrochemische Doppelschicht, die
sich über den Elektroden ausbildet, nicht berücksichtigt wird.
Das in Abb. 2.4 genannte Hogkin-Huxley-Modell ist in Abb. 2.5 ausführlich erklärt. Die
semipermeable Zellmembran trennt das Zellinnere vom Extrazellulärraum (Elektrolyten)
und stellt eine Kapazität dar. Der an die Elektrode angelegte Strom lädt zum einen die Zellmembran-Kapazität auf und fließt zum anderen durch die Ionenkanäle der Membran in
das Zellinnere. Nach der Ladungserhaltung gilt in einem kleinen Gebiet der Membran,
dass der angelegte Strom I(t) sich in einen kapazitiven Anteil I cap , der die Kapazität in
Abb. 2.5 auflädt, und weitere Komponenten I k , die durch die Ionenkanäle fließen, aufteilt.
I t = I cap t ∑ I k t 
k
(2.19)
Im Standard-Hodgkin-Huxley-Modell werden drei Ionenkanal-Typen berücksichtigt; der
Natrium-Kanal (Index Na), der Kalium-Kanal (Index K) und ein Verlustkanal mit dem
Widerstand R (siehe Abb. 2.5).
Abb. 2.5: Schematische Darstellung des Hodgkin-Huxley-Modells. Beschreibung der passiven
elektrischen Eigenschaften der Zellmembran durch die Kapazität C und den Widerstand R. Darstellung der nichtlinearen Eigenschaften durch die spannungsunabhängigen Ionenkanäle von Natrium (Na) und Kalium (K) [Gerstner und Kistler, 2002].
Nach der Definition der Kapazität C=Q/U, mit der Ladung Q und der Spannung U, kann
der Strom, der die Kapazität der Zellmembran auflädt, als I cap = C⋅d U /d t ausgedrückt
werden. Somit ergibt sich für den Strom Gl. (2.20).
24
2.2.1. Spezielle Modelle
C
dU
=−∑ I k t I t 
dt
k
(2.20)
Die drei im Hodgkin-Huxley-Modell beschriebenen Ionenkanäle werden durch ihren
Widerstand oder ihre Leitfähigkeit charakterisiert. Der Verlustkanal wird durch eine
spannungsunabhängige Leitfähigkeit gL = 1/ R beschrieben. Die Leitfähigkeiten der beiden
anderen Kanäle sind sowohl zeit- als auch spannungsabhängig. Falls alle Kanäle geöffnet
sind, können die Ströme bei der höchsten Leitfähigkeit gNa bzw. gK fließen. Gewöhnlich
sind immer einige von den Ionenkanälen blockiert. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Kanal
geöffnet ist, wird durch die zusätzlichen Variablen m, n und h beschrieben. Die Kombination von m und h kontrolliert das Öffnen und Schließen der Na+-Kanäle und die Variable n
analog für die K+-Kanäle. Nun lassen sich die drei Anteile des Stromes wie folgt formulieren:
∑ I k = g Na⋅m3⋅h⋅U −E Na gK⋅n4⋅U −E K g L⋅U −E L 
k
(2.21)
wobei die Parameter E Na , E K und E L den reversiblen Potentialen der zugehörigen Ionenkanäle entsprechen [Gerstner und Kistler, 2002].
Die Gleichungen von Hodgkin und Huxley beschreiben sehr allgemein die elektrophysiologischen Eigenschaften von Axonen, die zu einem Aktionspotential führen: einem kurzen
Einfluss von Na+-Ionen und dem folgenden Ausfluss von Ka+-Ionen. In höher entwickelten
neuronalen Netzwerken finden aufgrund der höheren Anzahl von Ionenkanälen komplexere Vorgänge statt. Um diese Mechanismen korrekt zu beschreiben, muss das HodgkinHuxley-Modell durch Ionenkanäle von z.B. Chlor und Calcium und um die Spannungsabhängigkeit einzelner Kanäle erweitert werden.
Fromherz beschreibt den Elektroden-Neuronen-Kontakt mit Hilfe des Ersatzschaltbildes
eines planaren Kern-Mantel-Leiters [Fromherz, 2003]. Der Elektrolyt im Spalt zwischen
Neuron und Elektrode bildet dabei den leitfähigen Kern und die Isolationsschicht der
Elektrode und die Zellmembran werden als Mantel angenommen. Dieses Modell erlaubt
die Annahme des Kontaktes zwischen Neuron und Elektrode als flächig oder als punktförmig. Ein flächiger Kontakt ist dadurch gekennzeichnet, dass der Strom eines jeden
Flächenelementes des Interfaces durch ein Ersatzschaltbild wie in Abb. 2.6 a) charakterisiert wird. Der Strom im Spalt zwischen Zelle und Elektrode ergibt sich aus dem
Verschiebungs- und Ionenstrom durch die Zellmembran und dem Verschiebungsstrom
durch die Isolationsschicht auf der Elektrode, die durch eine flächenspezifische Kapazität
ausgezeichnet ist. Die Zellmembran wird dabei sowohl durch eine flächenspezifische Kapazität als auch durch einen flächenspezifischen Widerstand gebildet. Der laterale
Spaltwiderstand kann aus der Spalthöhe und der spezifischen Leitfähigkeit des Elektroly25
2. Grundlagen
ten berechnet werden. Mit dem Ersatzschaltbild in Abb. 2.6 lassen sich sowohl ein
Spannungsprofil für den Spalt zwischen Elektrolyt und Neuron als auch die Spannung, die
über der Zellmembran abfällt, bestimmen. Ein Nachteil dieses Modells ist, dass keine
aktiven Komponenten zur Beschreibung der Zellmembran, wie im erweiterten HodgkinHuxley-Modell, eingehen. Daher können Stimulations- und Ableitprozesse mit dem
Modell eines flächigen Kontaktes nicht hinreichend beschrieben werden.
a)
Elektrolyt
UM
Zelle
UE
US
b)
Elektrolyt
UM
Zelle
UE
UJ(x,y)
Silizium
Silizium
US
Abb. 2.6: Ersatzschaltbild für das Kern-Mantel-Modell
a) flächiger Kontakt, b) punktförmiger Kontakt [Fromherz, 2003]
Der Kontakt zwischen einem Neuron und der Elektrode soll nun als punktförmig
angenommen werden. In diesem Fall wird die Isolationsschicht durch eine globale
Kapazität beschrieben. Die Zellmembran weist nun ein elektrophysiologisches Verhalten
nach Hodgkin und Huxley auf. Der im Spalt vorhandene Elektrolyt wird durch einen
globalen Widerstand charakterisiert, der identisch dem Dichtungswiderstand ist [Rutten et
al., 2001; Bove et al., 1995]. Durch die Berücksichtigung des Hodgkin-Huxley-Modells bei
einem punktförmigen Kontakt von Neuron und Elektrode ist es möglich, die
Anregungsprozesse und das Antwortverhalten der Neuronen zu beschreiben. Zusätzlich
kann das Potential bestimmt werden, das über der Zellmembran anliegt.
Das Problem bei der Detektion von neuraler, elektrischer Aktivität ist das hohe Maß der
Variabilität der Signale. Daher ist es für das Verständnis der Informationsverarbeitung in
neuronalen Netzwerken unerlässlich, dass die bestehenden Modelle immer weiter angepasst bzw. neue Techniken zur Bestimmung der Zellsignale entwickelt werden. Daher wird
abschließend noch ein Modell beschrieben, welches von Martinoia [Martinoia et. al., 2004]
entwickelt wurde, um der biologischen Varianz der elektrischen Signale gerecht zu werden.
Im Fokus dieser Arbeit steht die Verbindung von Zellmembran und Mikroelektrode, die
durch ein Ersatzschaltbild modelliert wird (FEM-Berechnung mit Hilfe der Software
HSPICE [Massobrio und Antognetti, 1993]). Im Detail besteht das hier entwickelte Modell
aus vier Bestandteilen: dem Makromodell des Neurons, der synaptischen Interaktion, dem
26
2.2.1. Spezielle Modelle
Makromodell der Metallmikroelektrode sowie der Verbindung von Elektrode und Neuron.
Das Makromodell des Neurons basiert auf den Annahmen von Hodgkin und Huxley und
erfasst die dynamischen Eigenschaften der Na+-, K+- und anderer Ionenkanäle. In
Anlehnung an Gl. (2.19) ergibt sich für den Strom I durch die Membran Gl. (2.22), wobei
V mem dem Membranpotential, C mem der Membrankapazität und I L dem Leckstrom entsprechen.
I = C mem
d V mem
 I Na I K  I L
dt
(2.22)
Die Betrachtung der Einzelströme wie in Gl. 2.21 führt zu „anomalen Impedanzen“, wie
von Mauro [Mauro, 1961] beobachtet wurde. Um diesen Effekt zu beseitigen, formulierte
Chua [Chua, 1980] die Annahme, dass die Aktivierungsparameter für die Kalium-Kanäle
und die Aktivierungs- und Inaktivierungsparameter der Natrium-Kanäle proportional zu
der Spannungsvariablen einer linearen Kapazität sind. Nun können die Gleichungen für
den Natrium- bzw. Kalium-Strom in algebraische Gleichungen [Storace et al., 1997] umgeformt werden. Die zeitlich veränderliche Leitfähigkeit der Ionenströme wird ersetzt und
durch Ersatzschaltbilder (vgl. [Martinoia et. al., 2004] Fig. 1) mit einer ähnlicher Struktur
wie die Hodgkin-Huxley-Gleichungen modelliert.
Die synaptischen Interaktionen zwischen den Neuronen des Netzwerkes werden durch die
Kinetik des Bindens der Neurotransmitter an postsynaptische Rezeptoren simuliert. Dabei
werden die synaptischen Aktionen ebenfalls mit Gleichungen der Struktur von Hodgkin
und Huxley modelliert [Destexhe et al., 1994]. Die präsynaptischen Ersatzschaltbilder
erzeugen dabei einen Rechteckpuls von charakteristischer Dauer und Amplitude, welcher
im realen Netzwerk die ausgestoßene Transmittermenge nach einem präsynaptischen
Aktionspotential repräsentiert.
Das Makromodell der Metallelektrode besteht ausschließlich aus passiven Bauelementen
in der Konfiguration von Abb. 2.7. Dabei entspricht der metallische Widerstand R met dem
Widerstand der Leiterbahn der Mikroelektrode. Die Kapazität des Interfaces von Elektrode
und Elektrolyt wird durch den Parameter C e dargestellt. Der Widerstand R e repräsentiert
Abb. 2.7: Modell der Metall-Mikroelektrode [Martinoia et. al., 2004]
27
2. Grundlagen
die Menge der Ladungsträger, die die Doppelschicht passieren und fasst alle
Streukapazitäten zusammen. Die Verbindung von Elektrode und Neuron stellt in dem
Modell von Martinoia den entscheidenden Teil dar und kann experimentell durch
Isolationsschichten oder den Bedeckungsgrad der Elektrode beeinflusst werden. Der
Dichtungswiderstand R seal zwischen Zelle und Elektrode gibt an, wie gut das Neuron mit
der Mikroelektrode verbunden ist.
R seal =
s
⋅
d
(2.23)
Dabei ist ρs der spezifische Widerstand des Elektrolyten (ρs = 0.7 Ω·m-1 für normale Kochsalzlösung), d der mittlere Abstand von Neuron und Elektrode und δ der
Oberflächenüberlappungskoeffizient (δ = Oberfläche Neuron/ Oberfläche Mikroelektrode).
Der Verlustwiderstand R spread charakterisiert den Signalverlust der Zelle aufgrund des
signifikanten Abstandes von Elektrode und Neuron und berechnet sich nach Gl. (2.24)
[Newman, 1966].
R spread =
s  
(2.24)
4  S microel
Die Variable S microel entspricht dabei der Oberfläche der Mikroelektrode. Schließlich wird
für die Elektroden-Neuronen-Verbindung noch die Kapazität C hd zwischen der Zellmembran und der Elektrolytlösung benötigt. Sie modelliert die Polarisationsschichten des
Elektrolyten, die sich direkt vor dem Neuron und der Mikroelektrode ausbilden. Unter
Berücksichtigung der Doppelschicht-Theorie [Yates et al., 1974] und dem Stern-Modell
ergibt sich die Kapazität C hd aus der Reihenschaltung von C h und C d . Dabei repräsentieren C h die Kapazität der Helmholtz-Schicht und C d die Gouy-Chapman-Kapazität
(Kapazität der diffusen Doppelschicht). Die Berechnung der beiden Kapazitäten erfolgt
nach den Gln. (2.25) und (2.26),
Ch =
Cd =
 IHP⋅ 0 ⋅ OHP⋅0 
⋅S
 OHP⋅0 ⋅d IHP IHP⋅ 0⋅d OHP cont
 2⋅d⋅0⋅kB⋅T⋅C b⋅S
kBT
e0
cont
(2.25)
(2.26)
wobei  IHP und  OHP die Dielektrizitätskonstanten der inneren und äußeren HelmholtzEbenen sind.  0 entspricht der Dielektrizitätskonstanten im Vakuum, d IHP repräsentiert
28
2.2.1. Spezielle Modelle
den unhydratisierten Abstand von Ionen und Neuron bzw. d OHP den hydratisierten
Abstand von Ionen und Neuronen. Der Parameter  d entspricht der Dielektrizitätskonstanten der diffusen Doppelschicht. Die Größe S cont berechnet sich nach S cont = S microel⋅
und ist gleich der Kontaktfläche von Neuron und Elektrode. Letztlich stehen k B für die
Boltzmann-Konstante, T für die absolute Temperatur, e0 für die Elementarladung und C b
für die Grundkonzentration des Elektrolyten.
Abb. 2.8: Ersatzschaltbild der Schnittstelle Elektrode/ Neuron und der
Elektrode [Martinoia et. al., 2004]
In den Simulationen sind R seal , R spread und C hd die Parameter, die berechnet werden. In
den Berechnungen zeigt sich, dass der Dichtungswiderstand R seal und die Kapazität C hd
den größten Einfluss auf die berechnete Signalschärfe bzw. Form des extrazellulären
Signals haben.
Für die Simulation eines Aktionspotentials von Nervenzellen auf Mikroelektroden sind
bestimmte Annahmen notwendig. Unter der Bedingung  R e C e =1 ergeben sich für eine
Frequenz von f = 1 kHz(nach Vereinbarung in der Literatur [Robinson, 1968]) die Parameter Ce = 1.14 nF und Re = 0.14 MΩ unter Beachtung der experimentell bestimmten
Impedanz mit Z = 100 kΩ. Ein weiterer experimentell bestimmter Wert ist der Elektrodendurchmesser von 30 µm mit einer Fläche von 707 µm2. Der Bahnwiderstand und die
Streukapazität werden mit Rmet = 1.5 Ω bzw. Csh = 5 pF bestimmt. Der Teil des Neurons, der
mit der Elektrode in Kontakt ist, wird mit einem Bedeckungsgrad von δ=0.5 angenommen.
Mit diesen Parametern wird die elektrische Aktivität simuliert und mit den experimentell
bestimmten Werten von 21 Tage alten Neuronenkulturen verglichen. Eine sehr gute Übereinstimmung mit der detektierten Aktivität lässt sich nur unter der Verwendung von
Rspread = 11.7 kΩ, Chd = 17.45 pF und Rseal = 5 MΩ erzielen. Dabei entspricht der Dichtungswiderstand von Rseal = 5 MΩ einem mittleren Zell-Elektroden-Abstand von 70 nm, welcher
auch von anderen Forschungsgruppen bestimmt wurde [Vassanelli und Fromherz, 1999].
Das in Abb. 2.9 gemessene biphasige Signal eines Neurons konnte erst mit der gewünschten Übereinstimmung berechnet werden, als die Ionenkanaldichte im Bereich der
Kontaktfläche von Neuron und Elektrode um 40% reduziert wurde. Dabei bezieht sich die
29
2. Grundlagen
Verringerung der Ionenkanäle auf den Mittelwert über der gesamten Zellmembran, die
keinen Kontakt mit der Metallelektrode hat. Zellphysiologisch bedeutet es, dass die Ionenkanäle in Gebiete ohne Elektrodenkontakt migrieren. Wird die Ionenkanaldichte im
Bereich der Überlappung nicht verändert, so ist das Ergebnis ein stärker monophasiges
Signal, welches nicht dem tatsächlich aufgenommenen entspricht. Die Verringerung der
Kanalanzahl führt somit zu einer stärkeren kapazitiven Einkopplung des elektrischen
Signals in das Neuron.
Abb. 2.9: Vergleich der gemessenen und simulierten Aktivität eines Neurons
[Martinoia et. al., 2004]
Die Parameter R seal und C hd haben nur einen geringen Einfluss auf die Signalform,
hängen dabei aber stark von dem Spalt zwischen Neuron und Elektrode ab. Einen großen
Einfluss haben diese beiden Parameter auf die detektierbare Signalhöhe. Wird z.B. der
Dichtungswiderstand von 5 MΩ auf 20 MΩ erhöht, dann vergrößert sich das zu messende
Zellsignal von 75 µV auf 200 µV.
Alle in diesem Kapitel aufgeführten Ersatzschaltbilder wurden unter der Randbedingung
aufgestellt, dass die Elektroden einen Durchmesser aufweisen, der höchstens so groß wie
die Neuronen sind (dNeuron ≈ 10-30 µm). Außerdem besitzen alle hier betrachteten Elektroden eine Isolationsschicht.
Da die neuentwickelten Fingerstrukturen (vgl. Kap. 3) sehr viel größer als der Neuronendurchmesser sind, wird ein eigenes Ersatzschaltbild entwickelt, um die Einkopplung der
elektrischen Pulse zu beschreiben. Die nicht-isolierten Metallelektroden finden daher in
den Untersuchungen besondere Beachtung.
30
2.2.1. Spezielle Modelle
Abschließend werden einige Parameter, die in den Simulationen betrachtet wurden, auf
ihren Einfluss im Experiment untersucht. Dabei bilden die Arbeiten von Paik et al. die
Grundlage für diese Untersuchungen [Paik et al., 2003]. Es hat sich gezeigt, dass eine hohe
Selektivität der Zellsignale erreicht wird, wenn die Elektrodenfläche möglichst klein ist.
Mit einer kleinen Elektrodenfläche ist eine Verbesserung des Signal-zu-RauschVerhältnisses verbunden. Gleichzeitig wird aber die Impedanz erhöht, was zu einer
Verringerung des Ladungstransfers führt. Daher schlagen Paik et al. vor, dass die Elektroden minimiert werden bei gleichzeitiger Vergrößerung der "effektiven" Oberfläche. Dies
wird durch das Abscheiden einer sehr rauhen polykristallinen Silizium-Schicht auf einem
Siliziumwafer realisiert. Auf dieser Oberfläche wird nun die eigentliche Goldelektrode auf
einer Haftschicht abgeschieden. Als Isolationsschicht dient eine 300 nm dünne SiNSchicht. Durch die Abscheidung der Elektroden auf dem polykristallinen Silizium wird die
Oberfläche im Gegensatz zu herkömmlichen Elektroden stark vergrößert (vgl. Abb.
2.10).Die veränderten Oberflächen spiegeln sich dann in den Werten der experimentell
bestimmten Impedanzen wider. So wurde für die glatte Elektrodenoberfläche ein Wert von
Z = 1.03 MΩ bzw. für die Impedanz der rauhen Elektrode mit Z = 2.451 kΩ bestimmt. Die
für die Detektion von Aktionspotentialen unbedingt notwendig kleine Elektrodenimpedanz
ist also relativ einfach durch die Verwendung einer polykristallinen Siliziumschicht zu
erreichen.
a)
b)
Abb. 2.10: AFM-Aufnahmen der Elektrodenoberfläche (5x5 µm2)
a) Glatte Oberfläche der Goldelektrode auf einer SiN-Schicht mit einer
rms-Rauhigkeit von 4.57 nm
b) Rauhe Oberfläche der Goldelektrode auf Polysilizium mit einer
rms-Rauhigkeit von 37.3 nm (entnommen aus [Paik et al., 2003])
31
2. Grundlagen
2.2.2. Dynamische Einflüsse der angelegten elektrischen
Felder auf Zellen und Elektrolyt
Bei Anlegen eines elektrischen Pulses an ein biologisches System treten verschiedene
dynamische Effekte auf, die an dieser Stelle vorgestellt werden. Es wird dabei geprüft,
inwiefern die auftretenden Einflüsse für das untersuchte Stimulationsinterface, speziell die
vorgenommenen Impedanzmessungen, relevant sind.
Temperaturanstieg im Stimulationsgebiet bzw. der Elektrolytlösung
Durch das Anlegen einer Spannung an Elektrolyte kann durch die Umwandlung von
elektrischer in thermische Energie eine Erwärmung der Lösung auftreten. Mit einem Temperaturanstieg der Elektrolytlösung ist gleichzeitig ein höherer Leitwert verbunden. Da
eine Erwärmung von 1 K den Leitwert um 3% erhöht [Hamann und Vielstich, 1998], kann
sich dieser Effekt als störend in Impedanzmessungen erweisen. Kontrollmessungen mit
einer Infrarot-Kamera an einer 0.1 M KH2PO4-Lösung (Kulturmedium für Hefezellen)
ergaben jedoch, dass bei einer 30-minütigen Stimulation mit biphasigen 10 V-Pulsen sich
die Temperatur nur um 0.3 K erwärmte. Daher kann dieser Effekt bei allen weiteren
Betrachtungen vernachlässigt werden.
Dielektrophorese
Die dielektrophoretische Kraft wurde erstmal von Pohl [Pohl und Crane, 1971] beobachtet.
Er zeigte, dass durch das Anlegen von ungleichen AC-Feldern an einen Elektrolyten eine
Bewegung der polarisierbaren Partikel induziert wird und nannte die auftretende Kraft
dielektrophoretische Kraft.
Die Grundlage dieser Kraft ist also ein inhomogenes elektrisches Feld, welches sich auch
an asymmetrischen oder auch an planaren Elektrodenarrays ausbildet. Das elektrische
Feld erzeugt in der Zelle ein Dipolmoment, welches dann mit dem inhomogenen Feld
wechselwirkt. Die auftretenden Kräfte können von der Zelle aufgrund der Inhomogenität
nicht kompensiert werden. Für kugelförmige Zellen kann die resultierende Kraft berechnet
werden [Prasad et al., 2004]
F =2 r 3 m Re  f CM  ∇ E2
(2.27)
In Gl. (2.27) sind r der Zellradius,  m die Dielektrizitätskonstante des Mediums, E der
Effektivwert des elektrischen Feldes und Re(fCM) der Realteil des Clausius-Mosotti-Faktors
(effektive Polarisierbarkeit der Zelle). Dieser ist in Gl. (2.28) definiert,
32
2.2.2. Dynamische Einflüsse der angelegten elektrischen Felder auf Zellen und Elektrolyt
f CM =
 ✶z −m✶ 
 ✶z 2 ✶m
(2.28)
✶
✶
in der z und  m die komplexe Permittivität von Zelle und Medium darstellen und
 ✶z =−i  / gilt. Durch den Clausius-Mosotti-Faktor hängt die dielektrophoretische Kraft
F von der angelegten Frequenz und der Leitfähigkeit des Mediums ab. Weiterhin ist die
Kraft die auf eine Zelle wirkt umso größer, je geringer die Elektrodenfläche wird. Ursache
hierfür sind die inhomogenen Felder, die durch die Kanteneffekte verstärkt werden.
Die dielektrophoretische Kraft wird ganz gezielt genutzt, um Neuronen gezielt bestimmte
Orte auf der Elektrode zuzuweisen. Zusätzlich können verschiedene Zell- oder Bakterientypen aufgrund verschiedener intrazellulärer Potentiale voneinander getrennt werden [Pohl,
1978]. Dabei wird jeweils nur der Ort der entsprechenden Zelle verändert, aber nicht in die
Zellaktivität beeinflusst [Prasad et al., 2004; Rutten et al., 2001].
Das Auftreten dielektrophoretischer Kräfte bei Impedanzmessungen an den Fingerstrukturen kann vernachlässigt werden, da sich über den ausgedehnten Elektroden ein über
große Bereiche homogenes elektrisches Feld [Günther, 2004] ausbildet. Desweiteren sind
für eine Bewegung von Partikeln oder Zellen mit einem Durchmesser von 1-10 µm Feldstärken von 104-105 V·m-1 erforderlich [Ramos et al., 1998], die aber mit einer
Messspannung von 100 mV für die Impedanzmessungen nicht erreicht werden. Bei der
Stimulation der Neuronen mit 2.2 V werden nach FEM-Berechnung Feldstärken von ca.
4 kV·m-1 erzielt. Es konnte aber bei keinem Experiment ein Anzeichen für das Wirken von
dielektrophoretischen Kräften, z.B. durch Ortsveränderung, festgestellt werden. Dies liegt
zum einen an den recht homogenen Feldern und zum anderen daran, dass die Neuronen
fest auf dem Glassubstrat bzw. der Elektrode haften und nicht frei beweglich sind. Einzig
bei der Stimulation von suspensierten Hefezellen mit 10 V-Pulsen kann eine Beeinflussung
durch dielektrophoretische Kräfte nicht ausgeschlossen werden.
Abb. 2.11: Schema zur Entstehung der AC-Elektroosmose und der resultierenden
Kraft FC auf die Doppelschicht [Green et al., 2002]
33
2. Grundlagen
AC-Elektroosmose
Durch das Anlegen einer Wechselspannung an koplanare Elektroden werden inhomogene
Felder erzeugt, die einen Ionenfluss in der Elektrolytlösung hervorrufen. Die Ursache
dafür ist, dass eine Komponente Ex des angelegten Feldes tangential zur diffusen
Doppelschicht der Elektroden ausgerichtet ist [Green et al., 2002]. In einem anderen
Experiment wird das elektrische Feld senkrecht zur Elektrodenoberfläche angelegt [Yeh et
al., 1997]. Daher ist auch hier mit der räumlichen Modulation der elektrochemischen
Doppelschicht ein lateraler Fluss verbunden. Da die Ladungsträger der Doppelschicht mit
dem elektrischen Feld wechselwirken, ergibt sich eine resultierende Kraft Fc, die von dem
Spalt zwischen den Elektroden in Richtung der Elektrodenoberfläche zeigt (siehe Abb.
2.11). Durch viskose Reibung in der Flüssigkeit überträgt sich diese Bewegung auf den restlichen Elektrolyten und resultiert in einer Rollbewegung [Ramos et al., 1999a; Ramos et
al., 1999b; Green et al., 2000].
Die Elektrorotation sei nur kurz als möglicher Effekt erwähnt, der ausschließlich bei einer
Quadrupol-Anordnung von Elektroden auftritt und zu einer Rotationsbewegung von biologischen Zellen führt [Asami 2002].
2.3. Biologische Grundlagen
In diesem Teil der Arbeit werden biologische Begriffe und Mechanismen erläutert, die zum
Verständnis der in den Experimenten untersuchten Mechanismen notwendig sind. Dabei
werden insbesondere die elektrische Aktivität der Neuronen und die Stoffwechselvorgänge
der Hefezellen betrachtet.
2.3.1. Aufbau von Neuronen
Ein typisches Neuron besteht aus vier morphologisch definierten Bereichen: dem Zellkörper (Soma), den Dendriten, dem Axon und den präsynaptischen Verbindungen. Das Soma
ist umgeben von der Zellmembran, ca. 2 nm bis 8 nm dünn [Kartalopous,1995] und enthält neben dem Zellkern u.a. Mitochondrien, die für die Funktionalität des Neurons
notwendig sind. In dem Zellkörper (Soma) findet die Verarbeitung der Eingangssignale
statt, die unter gewissen Randbedingungen weitergeleitet werden. Die Dendriten sind
dünne, röhrenförmige und meist stark verästelte Fortsätze der Zellen, die für das Detek34
2.3.1. Aufbau von Neuronen
tieren von ankommenden Signalen anderer Nervenzellen verantwortlich sind. Im Gegensatz dazu steht das Axon, welches sich in weit vom Soma entfernten Gebiete ausbreitet.
Das Axon hat die Hauptaufgabe, Ausgangssignale zu anderen Neuronen weiterzuleiten.
Dabei kann ein Axon über eine Länge von 0.1 mm bis zu 3 m ein elektrisches Signal, das
Aktionspotential, übertragen. Das Aktionspotential ist ein schneller, transienter Nervenimpuls mit einer Amplitude von 100 mV und einer Dauer von ca. 1 ms [Kandel et al.,
2000]. Diese elektrischen Signale finden ihren Ursprung in dem Axonhügel und werden
dann das Axon entlang weitergeleitet. Das Ende des Axons teilt sich in feine Verästelungen
und bildet Synapsen zu anderen Neuronen. Dabei wird die Zelle, welche das Signal weiterleitet, als präsynaptisch und die Empfängerzelle als postsynaptisch bezeichnet.
Abb. 2.12: Schematischer Aufbau eines Neurons
2.3.2. Entstehung eines Aktionspotentials
Jedes Neuron weist eine Ansammlung von positiven Ionen außerhalb und eine negative
Ladungsakkumulation innerhalb der Membran auf. Unter physiologischen Bedingungen
sind die Neuronen meist von einem kochsalz-ähnlichen Elektrolyten, bestehend aus Na+und Cl--Ionen, umgeben. Der Innenraum der Zelle ist hauptsächlich mit K+-Ionen und
organischen Anionen gefüllt (vgl. Tab. 2.1). Im elektrochemischen Gleichgewicht sind
einige Ionenkanäle durchlässig für K+-, aber undurchlässig für Na+-Ionen. Durch den
35
2. Grundlagen
osmotischen Druck getrieben diffundieren K+-Ionen aus dem Zellkörper in den Elektrolyten. Die Na+-Ionen können dagegen nicht durch die semipermeable Zellmembran
diffundieren. Durch den Transport von positiven Ladungsträgern aus der Zelle wird ein
elektrisches Feld aufgebaut, und es stellt sich ein Gleichgewicht ein [Birbaumer und
Schmidt, 1996; Hille, 2001]. Somit ist dann der Innenraum der Zelle negativer geladen als
der die Zelle umgebende Elektrolyt. Die Potentialdifferenz zwischen Intra- und Extrazellulärraum ist als Membranpotential definiert und weist im Ruhezustand typischerweise
Werte zwischen -90 mV ≤ VMR ≤ -60 mV auf. Diese Werte entsprechen etwa dem NernstPotential von K+-Ionen. Dabei beschreibt das Nernst-Potential die Gleichgewichtsspannung VMR(j) an einer für Ionen j permeablem Membran.
V MR =
 
c  j
RT
⋅ln Za
zj F
c Zi  j
(2.29)
Dabei sind cZa und cZi die Konzentration innerhalb (i) bzw. außerhalb (a) der Membran, zk
die Wertigkeit der Ionen, R die Gaskonstante, F die Faraday-Konstante und T die Temperatur. Das Ruhepotential ist also im wesentlichen ein Kalium-Gleichgewichtspotential. Bei
einer ausschließlichen Permeabilität der Natrium-Ionen wäre das Ruhepotential positiv.
Tab. 2.1: Nernst-Potentiale für verschiedene Ionentypen j, mit den Ionenkonzentrationen cZa und cZi
von Säugetier-Skelettmuskelzellen [Hille, 2001]
j
cZa(j) [mM]
cZi(j) [mM]
VMR(j) [mV]
Na+
145
12
+67
K+
4
155
-98
2+
1.5
0.0001
+129
-
123
4.2
-90
Ca
Cl
Von biologischem Interesse sind neben den K+- und Na+- auch noch die Ca2+- und Cl-Kanäle, welche jeweils nur für eine spezifische Ionenart i gut durchlässig sind. Die Leitfähigkeit gi ist dabei von dem Membranpotential VM, der Konzentration verschiedener
Moleküle cL und der Zeit t abhängig.
gMi = g Mi i , V M , C L , t 
(2.30)
Die Leitfähigkeit spannungsgesteuerter Ionenkanäle ist abhängig vom Membranpotential
der Zelle. Überschreitet das Membranpotential einen bestimmten Schwellwert, so wird die
Leitfähigkeit durch die Ionenkanäle weiter erhöht, und es wird ein Aktionspotential ausgelöst.
36
2.3.2. Entstehung eines Aktionspotentials
Im Gleichgewichtszustand (VM = -70 mV) ist die Leitfähigkeit der spannungsgesteuerten
Na+- und K+-Kanäle klein. Wird nun das Ruhepotential, z.B. durch einen externen Stimulus, verringert, so erhöht sich die Leitfähigkeit der Na+-Kanäle. Durch den folgenden
Einstrom von positiven Na+-Ionen in die Zelle wird der Potentialunterschied innerhalb
und außerhalb der Membran geringer (VMR ≤ VM ≤ 0 mV, Depolarisation). Wird bei der
Depolarisation ein Schwellwert erreicht, wird die Na+-Leitfähigkeit so weit erhöht, dass ein
positiver Rückkopplungseffekt eintritt. Durch den erhöhten Na+-Einstrom wird das
Zellinnere weiter positiv geladen, welches die Na+-Leitfähigkeit noch weiter erhöht. Das
hat zur Folge, dass noch mehr Na+-Ionen einströmen. Dabei kann das Membranpotential
sogar positiv werden. Durch die Änderung des Membranpotentials zu positiveren Werten
wird mit einiger zeitlicher Verzögerung die Leitfähigkeit der K+-Kanäle ebenfalls erhöht,
und positive geladene K+-Ionen strömen aus der Zelle. Durch das Ausfließen der positiven
Ladung aus der Zelle wird das Membranpotential wieder negativ (VM < 0 mV, Repolarisation) und die Na+-Kanäle schließen. Durch die zeitliche Verzögerung der K+-Kanäle strömt
meist soviel positive Ladung aus, dass ein negativeres Membranpotential als das Ruhepotential erreicht wird (VM < VRM, Hyperpolarisation) bevor die spannungsgesteuerten K+Kanäle wieder schließen. Nun wird das Membranpotential durch spannungsunabhängige
K+-Kanäle wieder auf das Ruhepotential eingestellt [Birbaumer und Schmidt, 1996]. Über
eine energie-verbrauchende Pumpe wird langfristig gewährleistet, dass im Gleichgewichts-
Abb. 2.13: Zeitlicher Verlauf eines Aktionspotentials, gemessen an einem Tintenfisch-RiesenAxon bei 18.5°C. Aufgetragen sind der Verlauf des Membranpotentials UM (UM = VM)
und die Leitfähigkeit der potential-gesteuerten Na+- und K+-Kanäle. Aufgrund etwas
unterschiedlicher Ionen-Konzentrationen im Vergleich zu Säugetier-SkelettmuskelZellen, weichen die hier eingetragenen Nernst-Potentiale von den in Tab. 2.1
dargestellten ab (entnommen aus [Birmbaumer und Schmidt, 1996])
37
2. Grundlagen
zustand die Na+- und K+-Gleichgewichtskonzentrationen in der Zelle aufrechterhalten
werden [Birbaumer und Schmidt, 1996]. Diese Na+-K+-Pumpe ist aber nicht direkt mit
dem Prozess der Aktionspotentialentstehung verbunden.
Der Stromfluss durch die einzelnen Ionenkanäle wird für das Beispiel eines TintenfischNeurons beschrieben, da hier nur drei Typen von Kanälen berücksichtigt werden müssen.
Dazu gehören potential-abhängige Natrium-Kanäle i, potential-abhängige Kalium-Kanäle j
und potential-unabhängige Leck-Kanäle l. Die Leck-Kanäle bestehen dabei im wesentlich
aus den potential-unabhängigen K+-Kanälen, die das Ruhepotential der Zelle einstellen.
Die Ionenkanäle werden durch ihre Leitfähigkeiten (gNa, gK, gL) und ihr Gleichgewichtspotential (VMR(Na)>0 mV, VMR(K)<0 mV, VMR<0 mV) beschrieben. Der Membranwiderstand
der Zelle im Gleichgewichtszustand entspricht dann dem Kehrwert der Summe der Leitfä−1
higkeiten der potential-unabhängigen Leck-Kanäle  RM = ∑ g   . Für den Gesamtstrom IM
muss zusätzlich noch die Aufladung der Membran bei zeitlich veränderlichen Potentialen
beachtet werden.
L
I M =∑ I MiC M
i
L
d UM
dt
=∑ g Na⋅ U M−U MR  Na  ∑ g K⋅ U M−U MR K  ∑ gL⋅ U M U MR  C M
i
j
l
d UM
dt
(2.31)
Grundsätzlich sind auch in den Nervenzellen von Säugetieren diese drei Kanal-Typen vorhanden. Jedoch sind beispielsweise in der Membran mehrere Natrium-Kanäle vorhanden,
die sich durch ihre Aktionspotentialschwelle und Dynamik unterschieden. Mit dem schon
vorgestellten Modell von Hodgkin-Huxley lassen sich diese Kanäle beschreiben.
Durch spezielle Wirkstoffe können einige Ionenkanäle gezielt blockiert werden, so dass
keine Ionen mehr durch sie transportiert werden. Als Beispiel sei hier Tetrodotoxin (TTX)
für das gezielte Blockieren der potential-abhängigen Na+-Kanäle genannt.
Die Aktionspotentiale können sich innerhalb der Neuronen ausbreiten. An dem Ort x1 wird
durch einen Stimulus die Zellmembran über den Schwellwert für ein Aktionspotential
depolarisiert. An der Stelle x1 strömen lokal Na+-Ionen durch die Membran ins Innere der
Zelle. Durch die lokale elektrostatische Abstoßung und durch Diffusion verteilen sich die
Na+-Ionen innerhalb der Zelle. Dadurch kann an einem angrenzenden Ort x2 die
Zellmembran depolarisiert und ein Aktionspotential generiert werden. Durch das
Einströmen und Verteilen der Na+-Ionen wird die Membran an der Stelle x3 depolarisiert.
Durch diesen sich wiederholenden Na+-Ionen-Einstrom senkrecht zur Membran kann sich
ein Aktionspotential parallel zur Membran ausbreiten (vgl. Abb. 2.14).
38
2.3.2. Entstehung eines Aktionspotentials
Abb. 2.14: Aktionspotential-Ausbreitung innerhalb einer Nervenzelle und Informationsfluss
an einer erregenden Synapse zwischen zwei Nervenzellen [Parak, 1999]
Aufgrund der zeitabhängigen Leitfähigkeit der Ionenkanäle (vgl. Gl. (2.30)) muss beachtet
werden, dass die Na+-Kanäle nach jedem Aktionspotential für eine bestimmte Zeit inaktiv
sind. Innerhalb dieser Zeit – auch Refraktärzeit genannt – kann an dieser Stelle der Zellmembran kein Aktionspotential ausgelöst werden. Auf diesem Mechanismus basiert auch
die Annahme, dass Aktionspotentiale nicht rückwärts laufen können [Birbaumer und
Schmidt, 1996; Hille, 2001].
Die Verbindung der Neuronen und der Austausch von Information ist für alle Lebewesen
von grundlegender Bedeutung. Der Austausch von Informationen zwischen zwei Nervenzellen findet über die Synapsen statt. So werden über diese Postsynapsen, die sich
hauptsächlich an den Dendriten und dem Soma befinden, Signale von anderen Zellen
wahrgenommen und verarbeitet. Die Weiterleitung erfolgt dann aus dem Axonhügel, dem
Axon entlang bis zu den präsynaptischen Verbindungen zu den benachbarten Neuronen.
Bemerkenswert ist, dass nicht die Höhe der Aktionspotentiale die Information überträgt,
die im Mittel etwa konstant sind, sondern die Ereignishäufigkeit. Entlang der Zellfortsätze
wird das Aktionspotential zu den Schnittstellen mit anderen Zellen geleitet. An den Synapsen werden die Aktionspotentiale elektrisch oder chemisch übertragen. Bei der chemischen
Synapse wird bei Ankommen eines Aktionspotentials von der Präsynapse ein Botenstoff,
der Neurotransmitter, in den synaptischen Spalt abgegeben. Der synaptische Spalt ist der
Zwischenraum zwischen den beiden Synapsen und beträgt bei chemischen Synapsen zwischen 20 nm und 40 nm [Kandel et al., 2000]. Dieser ausgeschüttete Neurotransmitter
bindet an Rezeptoren ligand-gesteuerter Kanäle in der postsynaptischen Membran und
bewirkt dort einen Ionenstrom. Aufgrund der differenzierten Aufgaben der Nervenzellen
im Organismus werden verschiedene Neurotransmitter freigesetzt. An erregenden Synapsen werden Botenstoffe ausgeschüttet, die bei Bindung an Rezeptoren der
postsynaptischen Zelle die Kanäle depolarisieren (Na+-Kanäle). Durch die Depolarisation
39
2. Grundlagen
kann dann ein Aktionspotential in dem postsynaptischen Neuron ausgelöst werden und
sich dort ausbreiten. An hemmenden Synapsen werden Neurotransmitter in den synaptischen Spalt abgegeben, die bei Bindung an die Rezeptoren Ionenkanäle öffnen (z.B. Cl-Kanäle). Dies führt zu einer Hyperpolarisation der postsynaptischen Zelle und verhindert
somit die Bildung eines Aktionspotentials.
Diese beiden Typen von erregenden bzw. hemmenden Synapsen sind verantwortlich für
die Informationsverarbeitung in neuronalen Netzwerken. Die Ausbildung eines Aktionspotentials hängt davon ab, ob die Eingangssignale der erregenden oder hemmenden
Synapsen dominieren. Sind die erregenden Synapsen vorherrschend, wird die Zelle
depolarisiert und ein Aktionspotential wird über das Axon weitergeleitet, welches wieder
als Eingangssignal für andere Zellen wirkt. Im Organismus von Säugetieren werden die
von Rezeptorzellen, wie z.B. Hör- oder Sehzellen, empfangenen Signale über erregende
Synapsen an das Gehirn weitergeleitet. Dort findet eine Verarbeitung der Signale statt und
eine Weiterleitung, beispielsweise an Muskelzellen, die eine Aktion durchführen, erfolgt.
Dadurch, dass die Verknüpfung einzelner Neuronen nicht statisch ist, kann durch Lerneffekte die Stärke von Synapsen beeinflusst werden.
2.3.3. System der Hefezellen
Die elektrische Charakterisierung des Interfaces und seine Einkoppeleigenschaften soll
möglichst detailliert erfolgen. Aus diesem Grund wird das Elektrodenarray in einer
weiteren biologischen und damit auch elektrisch veränderten Umgebung untersucht. Dazu
wird hier das System der Hefezellen gewählt, da es zum einen leicht zugänglich ist (Ottovon-Guericke Universität Magdeburg, Institut für Experimentelle Physik, Abteilung Biophysik) und zum anderen einige elektrische Eigenschaften der Hefen bekannt sind. Die
Hefezellen wurden mittels dielektrischer Spektroskopie in einem Frequenzbereich von
10 kHz bis 10 GHz untersucht [Asami und Yonezawa, 1996] und hinsichtlich ihrer
Zellteilung analysiert [Asami et al., 1999]. Weiterhin wurde beobachtet, dass bei dem
Fließen eines bestimmten Stromes in das System Elektrolyt/ Hefezellen die Hefezellen
gezielt abgetötet werden können [Guillou und El Murr, 2002], was von großer Bedeutung
für die Medizin und die Nahrungsmittelindustrie ist.
Im Folgenden werden der Stoffwechselprozess der Hefezellen und die elektrischen Eigenschaften der elektrolytischen Pufferlösung beschrieben. Diese beiden Komponenten und
deren Zusammenwirken sind wichtig, damit die experimentellen Daten richtig interpretiert werden können.
40
2.3.4. Energiestoffwechsel der Hefezellen
2.3.4. Energiestoffwechsel der Hefezellen
Für eine weiterführende Charakterisierung des Interfaces wird eine andere Umgebung als
die bisher verwendete benötigt. Die Hefezellen erfüllen diese Voraussetzung zum einen
dadurch, dass ein anderer Elektrolyt als Pufferlösung (KH2PO4) dient. Die verwendete Pufferlösung und die Hefezellen bilden einen starken Elektrolyten, der sich in seinen
Eigenschaften von denen eines schwachen, wie im vorhergehenden Fall, unterscheidet.
Zum anderen kann der Stoffwechsel der Hefezellen durch die Zugabe von Glukose angeregt werden. In dem sehr komplexen Stoffwechselprozess – der Glykolyse – wird dabei die
Glukose unter Gewinnung von ATP (Adenosintriphosphat) in Pyruvat umgewandelt. Die
sich während der Glykolyse ändernden Ionenkonzentrationen und damit verbundenen
Leitfähigkeite eignen sich daher sehr gut zur weiterführenden Analyse des Elektrodenarrays.
Die Glykolyse ist ein kataboler Stoffwechselweg des Zytoplasmas, der in fast allen Organismen und Zellen vorkommt und ein bedeutender Teil des Energiestoffwechsels ist. Dieser
Stoffwechselvorgang ist unabhängig davon, ob die Zellen unter aeroben oder anaeroben
Verhältnissen leben. Unter aeroben Bedingungen können Organismen verschiedene Nahrungsstoffe durch oxidative Prozesse vollständig abbauen. Fehlt der Sauerstoff (anaerober
Zustand), kann nur noch Glukose zur ATP-Bildung und damit zur Energiegewinnung herangezogen werden. Obwohl der Glukose-Abbau unter diesen Bedingungen bereits beim
Lactat endet und nur geringe Mengen an ATP liefert, ist er für das Überleben der Zellen
unter Sauerstoffmangel von entscheidender Bedeutung (Koolman und Röhm, 1998).
Bei der Glykolyse wird Glukose in Pyruvat, umgewandelt, wobei je Mol Glukose zwei Mol
Pyruvat erzeugt werden. Unter Enegiegewinnung wird das ATP durch Enzyme hydrolytisch in ADP (Adenosindiphosphat) bzw. AMP (Adenosinmonophosphat) gespalten, wobei
jeweils etwa 32.6 kJ/mol oder 64.3 kJ/mol Energie frei werden [Lehninger et al., 1995].
Vereinfachend kann die Glykolyse in zwei Stufen - den oberen und unteren Teil - gegliedert
werden, die jeweils fünf enzymatische Reaktionen umfassen (vgl. Abb. 2.15). Die einzelnen
Die chemische Formel der Gesamtreaktion lautet:
+
4Glukose2NAD+ 2ADP 3-2P2i  2NADH2H 2Pyruvat2ATP
(2.32)
Bei der Glykolyse in Gl. 2.32 ist NAD+ das Oxidationsmittel. Das durch die Reduktion entstandene NADH muss oxidiert werden, wenn die Glykolyse zur Generierung von ATP
genutzt werden soll. Bei den Hefezellen kann die Reduktion auf zwei verschiedenen
Reaktionswegen erfolgen. Unter aeroben Bedingungen wird NAD+ über die Atmungskette
regeneriert, während es in einer anaeroben Umgebung bei einer Folgereaktion von Pyruvat
zu Ethanol oxidiert wird.
41
2. Grundlagen
Abb. 2.15: Der glykolytische Abbau von Glukose zu Pyruvat (nach [Lehninger et al., 1995])
+ +
+
+
- +
+ - + -
H+- ATPase
Hefezelle
ADP
Mitochondrium
NADH
X
ATP
NAD +
NADH
NAD +
Glykolyse
Glukose
Pyruvat
ATP
Ionenkanäle
Abb. 2.16: Schema zur Energiegewinnung einer Hefezelle durch Glykolyse und Zellatmung
bei gleichzeitiger Produktion von NADH, Aufbau einer Potentialdifferenz an der
Zellwand durch ATP-verbrauchende H+-Pumpen (X ≡ Tricarbonsäurezyklus)
42
2.3.5. Glykolytische Oszillationen von Saccharomyces carlsbergensis
2.3.5. Glykolytische Oszillationen von Saccharomyces
carlsbergensis
Die Bierhefe Saccharomyces carlsbergensis gewinnt durch die Glykolyse Energie in Form
von ATP, welches für Stoffwechselprozesse benötigt wird. Dieser Prozess liefert in einer
Nebenreaktion (vgl. Abb. 2.16) NADH-Moleküle, die unter Einstrahlung von ultraviolettem
Licht λ = 340 nm bei einer Wellenlänge von λ = 460 nm fluoreszieren [Guilbault, 1990].
Durch die Detektion des emittierten Lichtes kann der NADH-Gehalt der Hefezellen und
damit der qualitative Energiegehalt der Zellen bestimmt werden. Typische Glykoseoszillationen von Hefezellen und zellfreiem Hefeextrakt sind in Abb. 2.17 bzw. Abb. 2.18
dargestellt.
Abb. 2.17: Glykolytische Oszillationen nach Zugabe von 20 mM Glukose und
4 mM KCN zur Synchronisation der Hefezellen [Reijenga et al., 2001]
Abb. 2.18: Glykolytische Oszillationen in Hefeextrakt nach der Zugabe von 0.14 mM
Trehalose [Pye and Chance, 1966]
Die Beschriftung DPNH-Fluoreszenz ist eine veraltete Bezeichnung und entspricht der
heutigen Bezeichnung NADH [Karlson et al., 1994].
43
2. Grundlagen
2.3.6. Impedanzmessungen an Hefezellen
Wegen der sich ändernden Ionenkonzentrationen währen der Glykolyse und damit verbunden der Membranleitfähigkeit sind die Hefezellen für Impedanz-Messungen sehr
interessant. So sind verschiedene Dispersionen bekannt, die charakteristisch für HefezellLösungen sind. Die α-Dispersion tritt bei geringen Frequenzen von ca. 1 kHz auf, verursacht durch die Verschiebung von Ionen, die die Zellmembran umgeben [Asami, 2002].
Bei höheren Frequenzen ensteht eine β-Dispersion, die noch einmal in die Dispersionen β1
und β2 aufgeteilt wird. Die β1-Dispersion entsteht, weil die polarisierte Zellmembran der
angelegten Frequenz von einigen MHz nicht mehr folgen kann. Die β2-Dispersion, bei etwa
50 MHz, wird dem Einfluss der Vakuolen in der Zelle zugeschrieben [Asami und Yonezawa, 1996]. Oberhalb von 1 GHz tritt schließlich die γ-Dispersion auf, die durch den
Dipolcharakter der Wassermoleküle hervorgerufen wird, die sich bei dieser Frequenz nicht
mehr im elektrischen Feld ausrichten können [Asami, 2002].
Diese Dispersionen können mit einem Ersatzschaltbild durch entsprechende R-C-Glieder
dargestellt werden [Gimsa und Wachner, 1998]. Durch den eingeschränkten Messbereich
von 20 Hz bis 1 MHz sind für diese Arbeit sind nur die α- und die β1-Dispersion von
Bedeutung. In der zitierten Literatur wird ein Frequenzbereich betrachtet, in dem die Auswirkung der Doppelschicht über den Elektroden komplett vernachlässigt werden kann. Die
Messungen werden an Zellsuspensionen durchgeführt, in denen eine Gleichverteilung der
Zellen vorausgesetzt wird. Um eine homogenes elektrisches Feld zu gewährleisten, wurden
planparallele Elektroden verwendet [Gimsa und Wachner, 1998; Asami, 2002].
Im Gegensatz zu diesen Annahmen steht die Fingerstruktur unserer Elektroden, die ein
inhomogenes elektrisches Feld erzeugen. Lediglich zu Beginn der Messungen kann von
einer Gleichverteilung der Hefezellen ausgegangen werden, da diese im Laufe der Zeit zu
Boden sinken und sedimentieren. Zusätzlich wurden Impedanzmessungen in einem
Frequenzbereich aufgenommen, in dem die elektrochemische Doppelschicht nicht
vernachlässigt werden kann. Aufgrund dieser abweichenden experimentellen Randbedingungen kann das Modell von Gimsa und Wachner [Gimsa und Wachner, 1998] nicht
auf unsere Elektroden übertragen werden.
44
3. Versuchsaufbau
3.
Versuchsaufbau
In diesem Kapitel werden die Herstellung der Elektroden und verschiedene Messapparaturen zur elektrischen Charakterisierung des Systems, bestehend aus
Stimulationselektroden, Elektrolyt und lebenden Zellen beschrieben. Weiterhin werden
die Versuchsplätze, die zum Teil neu aufgebaut oder erweitert werden mussten, vorgestellt.
3.1. Herstellung der Metallelektroden
Als Substrat für die verschiedenen Schichtstrukturen wurden Deckgläschen mit einer
Größe von 24 x 24 mm² (Assistent, Sondheim) verwendet. Zur Verbesserung der Haftung
der Neuronen auf den Deckgläschen wird die Oberfläche mit Säuren und Basen vorbehandelt (Anhang 8.1). Der Vergleich der beiden AFM-Aufnahmen1 in Abb. 3.1 verdeutlicht
die Ausbildung von Haftzentren für die nachfolgende Beschichtung mit Poly-D-Lysin
(PDL) und die Neuronen.
Abb. 3.1: AFM-Aufnahmen eines Deckgläschens a) vor und b) nach dem Ätzen
1 gemessen von Dr. A. Krtschil
45
3. Versuchsaufbau
Nach der Behandlung der Deckgläschen werden diese direkt vor dem Abscheiden der
Metallelektroden kurz gereinigt. Der Reinigungsprozess findet in einem Ultraschallbad
statt. Für jeweils 5 Minuten werden die Deckgläschen in Aceton, 1,2-Isopropanol und
Methanol gereinigt. Zwischen jeden Lösungsmittelwechsel und abschließend werden die
Deckgläser für 5 Minuten in destilliertem Wasser gesäubert. Im Stickstoffstrom werden die
Glassubstrate getrocknet und dann in die Elektrodenstrahlverdampfungsanlage eingelegt.
Dort werden bei einem Druck von ca. 10-3 Pa die Metallschichten aufgedampft. Mit Hilfe
einer Schattenmaske wird die gewünschte Elektrodenform realisiert. Alle Elektrodenstrukturen bestehen aus einer 5 nm dünnen Titan-Haftschicht und der 50 nm dünnen GoldElektrode.
Abb. 3.2: Elektrodenaufbau, bestehend aus einer 5 nm TitanHaftschicht und der 50 nm dünnen Gold-Elektrode
Die Struktur, die am häufigsten in den gemachten Experimenten verwendet wurde, ist die
Fingerstruktur in Abb. 3.3 b). Durch die Herstellung der Wolfram-Schattenmasken mittels
elektroerosivem Ätzen liegt die maximale Auflösung bei ca. 300 µm. Für kleinere Strukturen, wie z.B. für die Herstellung von Ableitstrukturen in Abb. 3.3 c) muss ein anderes
Verfahren angewendet werden. Die Ableitstrukturen wurden daher mittels Photolithographie hergestellt.
Abb. 3.3: Verwendete Elektrodengeometrien,
a) großflächige Elektrode, b) Fingerelektrode und c) Mikroelektrode
46
3.1.1. Bemerkungen zur Lithografie
3.1.1. Bemerkungen zur Lithografie
Die Photolithografie ist ein maskengestütztes Verfahren. Die Maske, die aus einem
Glasträger mit darauf aufgebrachten Absorberstrukturen besteht, wird mit Licht im
Wellenlängenbereich zwischen 200 nm und 450 nm auf das mit einem lichtempfindlichen
Lack (Photoresist) beschichteten Substrat abgebildet. Je nach dem, ob es sich dabei um
einen Positivlack oder einen Negativlack handelt, werden die bestrahlten Bereiche im
anschließenden Entwicklungsprozess leicht gelöst bzw. nicht entfernt [Sachse, 1995].
Die Photolithografie-Strecke ist zur Herstellung der Ableitelektroden eingerichtet worden.
Dazu wurden ein entsprechender Spincoater (Lackschleuder) der Firma Süss Mikrotec AG,
eine Heizplatte der Firma Harry Gestigkeit GmbH und ein Mask' Aligner verwendet. Ebenfalls wurden verschiedene Photolacke der Firmen Micro resist technology und Allresist auf
ihre Verwendbarkeit für die Strukturgröße und die vorhandenen Geräte getestet.
Abb. 3.4: Einzelne Schritte der Photolithografie
Bevor die Photolacke zur Herstellung der Ableitstrukturen verwendet werden können,
müssen sie auf ihre Bioverträglichkeit untersucht werden. Nur so kann eine toxische
Wirkung mittels Photolithografie hergestellter Strukturen von Anfang an ausgeschlossen
werden. Dazu wurden die sechs vorhandenen Lacke ma-P 205, ma-P 215S, ma-P 1205,
mr-P1105 der Firma Micro resist technology und AR-P 3020 bzw. AR-P 3220 der
Firma Allresist mit einem Pinsel auf die Deckgläschen aufgebracht, getrocknet und
anschließend in den Zyklus der Gliapräparation gegeben.
47
3. Versuchsaufbau
100 µm
ma-P 205
100 µm
ma-P 215S
100 µm
ma-P 1205
100 µm
mr-P 1105
100 µm
AR-P 3020
100 µm
AR-P 3120
Abb. 3.5: Mikroskopische Aufnahmen der mit Glia-Zellen bewachsenen Photolacke (14 DIV),
(DAPI-Färbung)
Auf allen getesteten Photolacken haben sich Glianetzwerke ohne toxische Reaktionen ausgebildet (Abb. 3.5). Die unterschiedlichen Zelldichten resultieren aus den manuell und
damit inhomogen aufgetragenen Lacken. Aufgrund dieser Ergebnisse können die getesteten Photolacke für die Strukturierung mittels Photolithografie verwendet werden.
48
3.1.2. Bestimmen des Parametersatzes für die Lithografie
3.1.2. Bestimmen des Parametersatzes für die Lithografie
Ausgehend von den angegebenen Parametern des Herstellers wird versucht, Strukturen
mittels der Photolithografie herzustellen. Dazu werden systematisch alle Parameter der
Lithografiestrecke verändert, um das beste Ergebnis zu erzielen. Dazu gehören Variationen
des aufgebrachten Photolackvolumens, der Schleuderzeit, der Drehzahl des Spin-Coaters,
der Ausheiztemperatur und -zeit, der Belichtungsdauer, der Entwicklungszeit bzw. -konzentration und ein Einstellen des Ätzprozesses.
Da die meisten Versuche mit dem Photolack AP 3120 der Firma Allresist durchgeführt
werden, wird der Name des verwendeten Lackes nur dann angegeben, wenn ein anderer
als der AP 3120 verwendet wird. In über 150 Einzelversuchen werden alle auftretenden
Parameter systematisch variiert und die Ergebnisse mittels Nomarski- und AFM-Aufnahmen überprüft. Anfangs werden nur sehr einfache Strukturen, die Fingerelektroden,
photolithografisch reproduziert. Dabei erweisen sich die Parameter in Tab. 3.1 als geeignet,
um Strukturen von ca. 300 µm Größe herzustellen.
Tab. 3.1: Parametersatz zur Herstellung Strukturen einer Größe bis 300 µm
Volume Schleudern
n
0.25 ml
120 s
6000 U/min
Trocknen
Belichten
Entwickeln
AR 300-35
Ätzen
20 min
75°C
45 s
45 s
Konz. 1:1
HCl + HNO3
HF (5%)
In dieser Anfangsphase werden zwei verschiedene Lithografie-Techniken ausprobiert: die
Positiv-Entwicklung und das Lift-Off-Verfahren. Dabei stellt sich die Positiv-Entwicklung
als vorteilhaft heraus, da bei dem Lift-Off-Prozess das Gold nicht konturenscharf entfernt
werden kann und bereits die 300 µm großen Strukturen nicht in gleichbleibender Güte
reproduzierbar sind.
Nach Ermittlung der Startwerte in Tab. 3.1 wird damit begonnen, kleinere Strukturen, die
Ableitelektroden, in der Größenordnung von 20 µm herzustellen. Zu dünne oder fehlende
Ableitelektroden legen den Schluss nahe, dass eine zu große Belichtungszeit vorliegt.
Daher wird die Belichtungsdauer von 45 s schrittweise reduziert, um bei 20 s
Belichtungszeit ein Optimum zu erreichen. Trotz einer Anpassung der weiteren Parameter
(vgl. Tab. 3.2) sind die erzielten Ergebnisse nicht zufriedenstellend, da kleine Löcher
(Abb. 3.6 a)) und Ablagerungen (Abb. 3.6 b)) zu erkennen sind, die im Ätzprozess zu
Fehlstellen in den Zuleitungen führen.
49
3. Versuchsaufbau
Tab. 3.2: Parametersatz zur Herstellung der Ableitstrukturen einer Größe bis 20 µm
Volumen Schleudern
0.25 ml
120 s
6000 U/min
Trocknen
Belichten
Entwickeln
AR 300-35
Ätzen
30 min
75°C
20 s
30 s
Konz. 1:1
HCl + HNO3
HF (5%)
Abb. 3.6: Inhomogenitäten der Photolackoberfläche
a) Löcher im Photolack, b) Löcher und Ablagerungen
Durch die Verwendung eines Adhäsionspromoters soll die Haftung des Photolackes auf der
Goldschicht verbessert und damit die Anzahl der Fehlstellen verringert werden. Es zeigt
sich jedoch, dass die durch Verwendung des Adhäsionspromoters nur eine geringfügige
Verbesserung der Oberflächenstruktur erreicht werden kann (Abb. 3.7 a)) und
Photolackreste auf den Elektroden verbleiben (Abb. 3.7 b)).
Abb. 3.7: Die Verwendung des Adhäsionspromotors verringert die Anzahl der Fehlstellen
im Photolack nur unzureichend
a) Aufnahme vor dem Ätzen mit Fehlstellen,
b) Aufnahme nach dem Ätzen in Königswasser und HF und dem Entfernen des
Photolackes, unterbrochene Zuleitung
50
3.1.2. Bestimmen des Parametersatzes für die Lithografie
Durch eine verlängerte Ultraschallbad-Reinigung der Strukturen im Remover, zum Entfernen des entwickelten Photolackes, kann keine Verbesserung erreicht werden. Dieser Effekt
trat unsystematisch auf und ist wahrscheinlich auf ein inhomogenes Temperaturprofil der
Heizplatte zurückzuführen, da es sich bei dem Modell nicht um eine spezielle Heizplatte
zum Trocknen von Photolacken handelt. Eine höhere Temperatur und eine verlängerte
Trockenzeit auf der Heizplatte reproduzierten das Auftreten von nicht-löslichen Photolackresten (Abb. 3.8). Dabei ist der thermische Energieeintrag in den Lack so hoch, dass er
chemisch verändert wird. Die Lösungsmittel-Chemikalien finden keinen Reaktionspartner
und der Photolack kann nicht abgelöst werden. Der auf den Elektroden verbliebene Photolack kann nur mechanisch oder mit Säuren entfernt werden, wobei beide Methoden die
Elektroden zerstören. Ein Verbleiben der Photolackreste auf den Elektroden ist nicht wünschenswert, weil dann keine homogenen Wachstumsbedingungen für die Neuronen
gegeben sind.
Abb. 3.8: Thermisch zerstörter Photolack durch zu langes Trocken (3 Stunden bei 75°C)
nach den Ätz- und Reingungsprozessen
Auch in Folgeexperimenten kann das zufällige Auftreten des Effektes von thermisch
inaktiviertem Photolack nicht unterdrückt werden. Eine geringere Temperatur oder eine
verkürzte Trockenzeit führen zu einer ungenügenden Aushärtung des Lackes, so dass
dieser bei der weiteren Prozessierung beschädigt wird (Abb. 3.9 a)).
Das Problem der auftretenden Löcher im Photolack kann schließlich durch eine 5:1-Verdünnung des Entwicklers erreicht werden. Der Entwickler, der sowohl unbelichteten als
auch belichteten Photolack (mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten) auflöst, wirkt dann
selektiver. Das Ablösen des belichteten Lackes ist nach wie vor gegeben. Allerdings werden
dünne, unbelichtete Photolack-Flächen während des Entwicklungsprozesses nicht mehr so
großporig freigelegt (Abb. 3.9 b)).
51
3. Versuchsaufbau
Abb. 3.9: a) Pinzettenabdruck auf einem nicht vollständig ausgehärteten Photolack,
b) Entwickeln der Lackstruktur in 5:1 verdünntem Lösungsmittel, nur noch sehr
kleine Löcher, die die Zuleitungen nicht unterbrechen
Tab. 3.3: Parametersatz zur Herstellung der Ableitstrukturen einer Größe bis 20 µm
Volumen Schleudern
0.25 ml
120 s
6000 U/min
Trocknen
Belichten
Entwickeln
AR 300-35
Ätzen
30 min
75°C
20 s
30 s
Konz. 5:1
HCl + HNO3
HF (5%)
Abschließend werden die Elektroden mit einem Golddraht (∅ 50 µm) kontaktiert. Der leitfähige Klebstoff „Leit-C“ der Firma Neubauer auf Kohlenstoffbasis gewährleistet dabei
reproduzierbare Kontakte mit konstantem Übergangswiderstand. Dabei kann der Übergangswiderstand im Vergleich zu dem Leitungswiderstand der Goldbahnen vernachlässigt
werden [Günther, 2003].
3.2. Elektrische Methoden
Wie schon aus den elektrischen Grundlagen ersichtlich, spielt der komplexe Widerstand
der Elektroden eine große Rolle für die Pulseinkopplung in den Elektrolyten und die
Zellen. Die für die Charakterisierung des System notwendigen Impedanzmessungen
werden mit einem Präzisions-LCR Meter HP4284A der Firma Hewlett Packard durchgeführt. Dieses Messgerät eignet sich zur Impedanzananalyse in einem Frequenzbereich von
20 Hz bis 1 MHz, bei messbaren Kapazitäten und Widerständen von 1 fF bis zu 10 F bzw.
0.01 mΩ bis 100 MΩ [HP4284A]. Um störende Einflüsse, wie das 50 Hz-Rauschen,
während der Messungen zu minieren, werden die Messungen innerhalb eines
52
3.2. Elektrische Methoden
abgeschirmten Metallgehäuses durchgeführt. Innerhalb des Metallgehäuses befinden sich
ausschließlich abgeschirmte Kabel, die die Streukapazitäten verringern. Um den Einfluss
des Kabelwiderstandes zu eliminieren, werden Strom- und Spannungsmesskreis voneinander getrennt, wie die Schaltskizze in Abb. 3.10 illustriert.
HP 4284A
~
V
Messkäfig
R2
C2
ZX
A
Abb. 3.10: Prinzipskizze zum Bestimmen der Impedanz ZX unter Berücksichtigung einer
Streukapazität C2 und einem Leckwiderstand R2 [Günther, 2004]
Die Größe der Streukapazität C2 und des Leckwiderstandes werden mit C2 = 0.7 pF bzw.
R2 = 1015 Ω abgeschätzt [Günther, 2003]. Ein Vergleich der Simulation einer Impedanzmessung mit und ohne Streuparameter ergibt keinen Unterschied. Daher kann
geschlussfolgert werden, dass die Streuparameter keinen Einfluss auf die Größenordnung
der Admittanz des gemessenen System haben [Günther, 2004]. Der zufällige Fehler der
Messbrücke wird mit 6% angegeben, der sich aber nicht signifikant in den Messungen auswirkt [HP4284A].
Abb. 3.11: Schematischer Aufbau des Versuchsplatzes zur Stimulation
Für die Stimulationsversuche wird ein Pulsgenerator (HP 8110A, Hewlett Packard)
verwendet, wobei ein Computer mit integrierter AD/DA-Karte (Data Translation GmbH)
den Pulsgenerator steuert und Stimuli detektiert. Ein Schema des Versuchsaufbau ist in
Abb. 3.11 dargestellt.
53
3. Versuchsaufbau
Abb. 3.12: Schematischer Aufbau des Versuchsplatzes zur Stimulation
Der Potentialverlauf zwischen den Elektroden wird mittels eines Nadelprobers in
Elektrodenhöhe (50 nm) mit einer Schrittweite von 10 µm ausgemessen. Für DCMessungen wird ein Elektrometer und für AC-Messungen ein Lock-in-Verstärker
verwendet (Abb. 3.12).
3.3. Kultivierung von Neuronen
Im folgenden Kapitel werden die biologischen Methoden beschrieben die notwendig sind,
um an Neuronennetzwerken Stimulationsexperimente durchzuführen. Dabei wird im
Detail auf die Präparation, die verwendete Ca2+-Imaging-Technik und die Stimulation eingegangen. Dabei wurde die Neuronenpräparation an der Otto-von-Guericke Universität
Magdeburg im Institut für Physiologie durchgeführt.
3.3.1. Präparation der Neuronen
Vorbereitung der Zellkulturschalen
In die Petrischalen (∅ 60 mm) wird mit einer Kniehebelpresse eine zentrierte kreisförmige
Öffnung von ca. 20 mm Durchmesser gestanzt. Um Sterilität zu gewährleisten, wird die
Kulturschale beidseitig 15 min lang mit UV-Licht bestrahlt. Die Deckgläser mit den
Elektrodenstrukturen werden mit einem Wachs, einem speziellen Paraffin (Firma VWR)
-Vaseline (Firma Fluka)-Gemisch im Verhältnis 3:1, von unten an der Petrischale befestigt.
Nach dem Auftragen des Wachses zwischen Deckglas und Petrischale wird das mit einem
Gewicht beschwerte Deckgläschen auf die Petrischalenöffnung gelegt und für 20 min bei
54
3.3.1. Präparation der Neuronen
70°C gelagert. Dies gewährleistet, dass das flüssige Wachs Petrischale und Deckglas so
abdichtet, dass die Kulturmedien nicht auslaufen. Abschließend werden die Kulturschalen
in einen speziell entwickelten Halter eingebaut (Abb. 3.13), der das Anschließen der Stimulationselektroden an den Stimulationsgenerator vereinfacht.
Abb. 3.13: Kulturschalenhalter mir vier Kontaktpunkten für Golddrähte
und DMEM als Kulturmedium [Nörenberg, 2006]
Abschließend werden die Innenseite und der Deckel der Kulturschale 20 Minuten mit UVLicht bestrahlt. Nach dem Zusammenbau der Schalen werden die Petrischalen mit Poly-DLysin (PDL), einem Eiweißmolekül (Sigma) beschichtet, welches haftunterstützend für
Neuronen wirkt.
Astroglia-Kultur
Durch eine gemeinsame Plattierung von Neuronen und Glia-Zellen wird die Neuronenproliferation gehemmt [de Lima und Voigt, 1999]. Da die von den Glia-Zellen abgegebene
Stoffe aber notwendig für das Auswachsen der Neuronen sind [Kandel et al., 2000],
müssen beide Zellarten in einer Kulturschale vorhanden sein. Daher werden beide Zelltypen räumlich voneinander getrennt. Dies wird durch einen Silikon-bestrichenen Edelstahlbzw. Plexiglasring realisiert, der den Elektrodenbereich von dem Rest der Kulturschale
separiert. Bis zur Plattierung der Glia-Zellen verbleiben die Kulturschalen Inkubator bei
36°C und 5% CO2, wobei sich 5 ml DMEM sowie 10% FKS außerhalb des Ringes und 1 ml
DMEM sowie 10% fötales Kälberserum (FKS) innerhalb des Ringes befinden.
Nach der Dekaptiation von neugeborenen Sprague Dawley Ratten (P0) oder einen Tag
alten Ratten (P1) wird der Schädel entlang der Mittellinie geöffnet. Das entnommene
Gehirn wird in Hank’s Kulturmedium (Invitrogen) überführt. Anschließend werden beide
55
3. Versuchsaufbau
Kortizes unter einem Binokular mechanisch zerkleinert. Die so gewonnenen Gewebeteile
werden mittels einer Pasteurpipette in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und mit Kanülen
unterschiedlicher Größe (G21, G25 mit ∅ 0.8 mm und 0.5 mm)) mechanisch dissoziiert.
Diese Zellsuspension wird in 20 ml DMEM und 10% FKS enthaltende Gliakulturflaschen
überführt und im Inkubator kultiviert. Innerhalb von zwei Wochen bildet sich ein konfluenter Glia-Zell-Rasen, der notwendig für die Plattierung in den Kulturschalen ist. Nach
Ablauf der zweiwöchigen Kultivierung werden die Gliakulturen über Nacht bei Raumtemperatur mit 180 U/min geschüttelt. Die Erschütterungen trennen die Astrogliazellen, die
ausschließlich am Boden haften, von den anderen Zellen. Die abgelösten Zellen werden
durch dreimaliges Waschen mit 36°C warmen DMEM und Hank’s Kulturmedium aus der
Kulturflasche entfernt. Die am Boden haftenden Astrogliazellen werden enzymatisch durch
ein Hank’s-Trypsin-EDTA-Gemisch (Invitrogen) abgelöst und dissoziiert. Nach 7 min wird
Trypsin durch die Zugabe von 10% FKS in DMEM inaktiviert. Die so vorbereitete Zellsuspension wird in Zentrifugenröhrchen gegeben und 10 Minuten mit 1200 U/min
zentrifugiert. Der so gewonnene Zellabsatz wird nach Entfernen des Überstandes in 5 ml
10% FKS in DMEM resuspensiert. Die Anzahl der lebenden und toten Zellen wird in einer
Neubauer-Zählkammer durch Färbung von 100 µl Zellsuspension mit 1 µl mit PropidiumIodid bestimmt. Fünf Tage vor der Neuronenkultivation werden die Glia-Zellen in den
äußeren Bereich der Petrischalen mit einer einer Dichte von ca. 250 Glia-Zellen je mm²
plattiert [Nörenberg, 2006].
Neuronen-Kultur
Einen Tag, bevor die Neuronen in den Petrischalen kultiviert werden, muss das serumhaltige Medium der Glia-Zellen durch serumfreies ersetzt werden. Die Edelstahl- oder
Plexiglasringe werden entfernt und die Petrischale mit DMEM gewaschen. Abschließend
werden 6 ml auf 36°C erwärmtes N2 Kulturmedium mit Hormonen (vgl. Anhang 8.2) in
die Kulturschalen gegeben. Die verbleibende Zeit bis zur Neuronenplattierung ist ausreichend, damit die Glia-Zellen das Kulturmedium mit Nährstoffen für die Neuronen
konditionieren.
Für die Neuronengewinnung wird eine trächtige Sprague Dawley Ratte am embryonalen
Tag 16 (E16) durch eine intraperitoneale Injektion mit Chloralhydrat (Roth, 4% Chloralhydrat, 1 ml/ 100 g Körpergewicht) anästhesiert und nach Entnahme der Embryonen durch
einen Kaiserschnitt mit einer kardial injizierten Überdosis an Chloralhydrat (Roth, 10%
Chloralhydrat, 1 ml/ 100 g Körpergewicht) getötet. Nach der Überführung der Embryonen
aus dem Amnion in Hank's Medium werden die Gehirne aus dem Schädel getrennt und
nach dem Entfernen der Hirnhäute die Kortizes beider Hemisphären oberhalb der telencephalen Anlagen abgetrennt. Analog der Verwendung einer Pasteurpipette bei der Astro56
3.3.1. Präparation der Neuronen
Glia-Präparation, wird das Gewebe zerkleinert und in Zentrifugenröhrchen gegeben. Die
Dissoziation des Neuronengewebes erfolgt enzymatisch 25 min lang bei 36°C durch ein
Trypsin-EDTA-Gemisch (Invitrogen, Karlsruhe). Die nachfolgende Protease-Aktivität wird
durch Verwenden einer Trypsin-Inhibitor/DNAse Lösung (Sigma) unterbunden. Nach einmaligem Waschen mit Hank’s Medium werden 900 μl Hank’s Medium der Zellsuspension
hinzu gegeben. Nach mechanischer Dissoziation mittels zweier Kanülen unterschiedlicher
Größe (G21, G25 mit ∅ 0.8 mm und 0.5 mm) wird die Zellsuspension 10 min zentrifugiert.
Der erhaltene Zellabsatz wird nach Entfernen des Überstandes in 7 ml Hank's Medium
resuspendiert. Das Verhältnis von lebenden zu toten Nervenzellen wird erneut durch eine
Propidium-Iodid-Färbung in Verbindung mit der Neubauer-Zählkammer bestimmt.
Abschließend werden in die mit Glia-Zellen vorbereiteten Kulturschalen Neuronen mit
einer Dichte von 300 Zellen/mm² plattiert und im Inkubator kultiviert.
Der Mitoseblocker AraC wird nach sechs Kultivationstagen (days in vitro, DIV) dem
Medium zugegeben, um eine weitere Zellteilung zu verhindern. Am siebten Tag in Kultur
wird in allen Petrischalen ein Drittel des Mediums durch frisches N2 ersetzt.
3.3.2. Calcium-Fluoreszenz-Technik (Ca2+-Imaging)
Die Calcium-Fluoreszenz-Technik wird angewendet, um intrazelluläre Calcium-Konzentrationsänderungen zu detektieren. Bei der Entstehung eines Aktionspotentials wird die
Zellmembran depolarisiert und verschiedene Ionenkanäle werden geöffnet. Bei dem Calcium-Imaging steht dabei der Einstrom der [Ca2+]i-Ionen aufgrund von Aktionspotentialen
im Vordergrund.
Das Prinzip dieser Methode beruht darauf, den Farbstoff Fluo-3 AM (Molecular Probes,
MoBiTec) in Zellen einzuschleusen, der in Abhängigkeit vom Bindungszustand der [Ca2+]iIonen seine Fluoreszenzeigenschaften ändert. Nach einer erfolgreichen Stimulation oder
spontanen Depolarisation der Nervenzellen erhöht sich die intrazelluläre Calcium-Konzentration. Dadurch wird die Fluoreszenz des calcium-bindenden Farbstoffs Fluo-3 AM
(kurz: Fluo-3) bis zu 200-fach verstärkt [Harkins et al., 1993]. Unter Einstrahlung von
monochromatischem Licht spezifischer Wellenlänge (λ = 506 nm) kann die Änderung der
Fluoreszenzintensität bestimmt werden. Typischerweise emittiert Fluo-3 nach CalciumBindung Licht mit einer Wellenlänge von 526 nm [Molecular Probes, 2002].
Der Farbstoff Fluo-3 (Strukturformel siehe Abb. 3.14), ein Penta-Aceto-Oxy-Methylester
und ein fettlösliches Molekül, kann durch die Zellmembran in die Zelle diffundieren. Dort
werden die Estergruppen des Farbstoffes enzymatisch von Esterasen hydrolisiert und das
so entstandene Molekül ist nicht mehr membranpermeabel.
57
3. Versuchsaufbau
Abb. 3.14: Erweiterte Strukturformel des Ca2+-Indikators Fluo3-AM
[Invitrogen]
Um die Calcium-Imaging Methode anwenden zu können, muss der Farbstoff in die Zellen
diffundieren. Daher werden vor Beginn der Messungen 50 µg Fluo-3 in 45 µl DMSO gelöst.
Von diesem Ansatz werden 15 µl mit 3 ml aus der Kulturschale entnommenem Medium
vermischt. Das restliche Kulturmedium wird aus der Kulturschale entfernt und das farbstoff-enthaltende Kulturmedium in die Petrischale zurückgegeben. Für einen Zeitraum von
60 Minuten verbleibt die Kulturschale im Inkubator bei 36°C, 100% Luftfeuchtigkeit und
5% CO2. Der Zeitraum von einer Stunde gewährleistet, dass hinreichend viele Farbstoffmoleküle in die Zelle diffundieren. Anschließend werden die Zellen zweimal mit HEPESgepuffertem aCSF (engl. artificial cerebrospinal fluid) gewaschen, um den restlichen
extrazellulären Farbstoff zu entfernen. Die Kulturschale wird mit 6 ml aCSF aufgefüllt, und
die Neuronen verbleiben darin für die Messungen, da dieses Medium bei Raumtemperatur
pH-Wert-stabil ist. Innerhalb der nachfolgenden 30 Minuten werden keine Experimente
durchgeführt, da die Neuronen diese Zeit benötigen, um das veränderte Medium und die
geringere Raumtemperatur von ungefähr 24°C zu adaptieren. Diese Ruhezeit gewährleistet
ebenfalls, dass der restliche Farbstoff hydrolisiert wird.
Die Fluoreszenzaufnahmen werden mit einen Imaging-Mikroskop Axiovert 100TV (Zeiss)
durchgeführt. Die Calcium-Signale werden dabei über einen Zeitraum von 120 Sekunden
zur Detektion der spontanen Aktivität und 40 Sekunden zur Analyse der Stimulationsexperimente aufgenommen. Dabei wird pro Sekunde ein Bild mit einer CCD-Kamera
aufgenommen, welches über 550 ms die Calcium-Fluoreszenz integriert. Die restliche Zeit
(450 ms) wird für das Öffnen und Schließen des Shutters benötigt. Die Einzelaufnahmen,
die die calcium-abhängigen Lichtintensitätsänderungen wiedergeben, werden mit Hilfe
der Software Metamorph (Visitron Systems) als 12-bit-Graubilder gespeichert.
58
3.3.3. Stimulation der Neuronen
3.3.3. Stimulation der Neuronen
Für die Stimulationsversuche werden Kulturschalen mit Neuronen verschiedenen Alters
verwendet. Die Kulturschalen werden dazu auf einem speziell entwickelten Mikroskophalter befestigt (Abb. 3.15).
Abb. 3.15: Mikroskophalter mit Kulturschale und elektrischen Anschlüssen [Nörenberg, 2006]
An diesem Halter befinden sich elektrische Anschlüsse, so dass das elektrische Signal eingekoppelt werden kann. Durch Anlegen eines Testpulses mit einer geringen Amplitude von
500 mV wird überprüft, ob beide Stimulationselektrodenpaare richtig kontaktiert sind.
In jeder Kulturschale werden die Felder zufällig, aber unter dem Aspekt ausgewählt, dass
die Neuronen gleichmäßig ohne Clusterbildung verteilt sind. Die untersuchten Felder
befinden sich sowohl zwischen als auch außerhalb der Stimulationselektroden.
Vor Beginn der Stimulationsexperimente wird ein differentielles Interferenzkontrastbild
(DIC) der zu untersuchenden Stelle aufgenommen. So ist die gesamte Zellanzahl und später die Anzahl spontan aktiver und stimulierter Neuronen bestimmbar. Anschließend wird
zwei Minuten lang die spontane Aktivität im beobachteten Bereich mittels Ca2+-Imaging
detektiert. Dies dient zum einem als Kontrolle für die Aktivität der Kultur und zum
anderen als Vergleichswert zur Anzahl stimulierter Neuronen. Nach der Aufnahme der
spontanen Aktivität beginnen die Stimulationsexperimente. Dabei wird in einem Zeitintervall von 40 s in der 3. und in der 33. Sekunde ein Stimulationspuls angelegt. Ein
Vergleich der Neuronenaktivität zu beiden Stimulationszeitpunkten ermöglicht das
Trennen von spontaner und induzierter Aktivität. Eine erfolgreiche Stimulation regt
sowohl in der 3. als auch in der 33. Sekunde Neuronen zum Feuern von Aktionspotentialen
an. Spontane Aktivität hingegen ist nur zu einem Zeitpunkt beobachtbar. Nach Abschluss
59
3. Versuchsaufbau
der Stimulationsexperimente wird das untersuchte Gebiet mit einem Diamantschreiber
von unten markiert, um es später, z.B. nach Zugabe von Inhibitoren, erneut zu untersuchen. In einer Kulturschale werden je nach Experiment und Güte des Netzwerkes bis zu
acht Gebiete untersucht.
Anzahl stimulierter Zellen
16
b)
a)
1. Zeitpunkt (3.s)
2. Zeitpunkt
14
12
10
8
3.s
3.s
3.s
3.s
6
4
13.s
23.s
33.s
43.s
2
50 µm
0
10
20
30
40
Abstand der Stimulationszeitpunkte (s)
DIC-Aufnahme
Abb. 3.16: a) Vergleich der angeregten Zellen in Abhängigkeit des Intervalls zwischen zwei Stimuli
b) DIC-Aufnahme des untersuchten Zellgebietes
Der zeitliche Abstand von 30 Sekunden zwischen zwei Stimulationen eines Experimentes
basiert auf der Refraktärzeit des Neuronennetzwerkes. In Vorversuchen wurde der zeitliche Abstand zweier Stimuli variiert. Die erste Stimulation wird zum Zeitpunkt t = 3 s
vorgenommen. Erfolgt die zweite Stimulation 10 oder 20 Sekunden nach der ersten, so
können nur sehr wenige Neuronen erneut stimuliert werden (Abb. 3.16). Ein zeitlicher
Abstand von 30 Sekunden oder mehr zwischen den elektrischen Reizen erhöht die Effizienz des zweiten Stimulationspulses. Es fällt auf, dass nach einer Erholungszeit von 40
Sekunden weniger Neuronen angeregt werden können als nach 30 Sekunden. Ursache
hierfür ist die Zunahme der spontanen Aktivität des Netzwerkes und damit die nachfolgende Refraktärzeit einzelner Neuronen, die durch den elektrischen Puls nicht depolarisiert
werden.
Nach Abschluss der Stimulationsexperimente werden die Neuronennetzwerke für spätere
Untersuchungen fixiert. Dazu wird Paraformaldehyd (PFA) in die Kulturschale gegeben
(Endkonzentration: 4%). Die Kulturschale verbleibt 30 Minuten bei 36°C im Inkubator
und wird zum Entfernen der Fixierstoffe zweimal mit PBS gewaschen. Das Dehydrieren
der Zellen erfolgt in Alkoholbädern mit steigenden Konzentrationen (50%, 70%, 80%, 95%
und zweimal 100%) von jeweils fünf Minuten. In zwei Xylolbädern, mit einer Dauer von
60
3.3.3. Stimulation der Neuronen
jeweils fünf Minuten, werden die auf dem Deckgläschen befindlichen dehydrierten Zellen
gereinigt, mit Fluormount eingebettet (BDH Laboratory Supplies) und auf Mikroskopträgern befestigt.
3.3.4. Auswertung der Ergebnisse
Für die Analysen werden die Anzahl der elektrisch stimulierten Neuronen, der spontan
aktiven Zellen und die Gesamtzahl der Neuronen bestimmt. Die Gesamtanzahl der Neuronen wird durch das Markieren aller vorhandenen Zellen einer DIC-Aufnahme ermittelt.
Zur Analyse der neuronalen Aktivität, spontan und induziert, werden die 12-bit-Graubilder
verwendet. Dabei durchlaufen die Einzelaufnahmen ein Subtraktionsverfahren (Nachfolger minus Vorgänger), um die Grundfluoreszenz der Neuronen herauszufiltern und die
Fluoreszenzänderungen aufgrund von Zellaktivität hervorzuheben. Zur Bestimmung der
spontanen Aktivität werden der Zeitraum von 120 Sekunden auf Zellaktivität überprüft
und die aktiven Zellen markiert (Abb. 3.17).
100 µm
100 µm
Abb. 3.17: DIC-Aufnahme eines Zellbereiches (links) und Aufnahme eines Graubildes (rechts),
nach Subtraktion mit markierten aktiven Neuronen
61
3. Versuchsaufbau
3.4. Präparation der Hefezellen Saccharomyces
carlsbergensis
Im folgenden Abschnitt werden die Gewinnung der Hefekulturen und der spezielle Messaufbau in Detail beschrieben und erklärt.
3.4.1. Hefezell- und Hefeextraktgewinnung
In Zusammenarbeit mit der Abteilung Biophysik, Otto-von-Guericke Universität Magdeburg, Institut für Experimentell Physik, wurden die Hefekulturen präpariert, wobei für die
Gwinnung von Hefezellen ist ein Zeitraum von drei Tagen notwendig ist. Um Experimente
an Hefeextrakt durchzuführen, ist ein Zeitspanne von vier Tagen anzusetzen [Warnke,
2003].
Am ersten Tag werden die Stammlösungen für das Nährmedium angesetzt. Im Anhang in
Tabelle 8.4 finden sich die detaillierten Stoffe und Konzentrationen, aus denen sich die
Stammlösungen zusammensetzen. Da auch Hefeextrakt im Medium enthalten ist, wird die
Lösung als auch als halb-synthetisches Medium bezeichnet.
Ausgehend von den Stammlösungen wird das Nährmedium angesetzt (vgl. Tab. 8.5,
Anhang). Alle Werte der Stoffmengen beziehen sich auf die geometrisch bedingte Reaktorfüllmenge von 9.1 Liter. Es wird zunächst der Hefeextrakt in destilliertem Wasser gelöst,
und dann werden die anderen Substanzen dazu gegeben. Es muss dabei beachtet werden,
dass das Salz B als letztes zugeführt wird, da sonst Fällungsreaktionen von Calciumphosphat auftreten. Das so gewonnene Gemisch wird mit destilliertem Wasser auf 4500 ml
aufgefüllt und auf den pH-Wert 5.5 eingestellt. Im Fermenter wird das Medium erneut mit
destilliertem Wasser bis auf ein Volumen von 8727 ml verdünnt und vermischt. Von
diesem Medium werden 95.4 ml in einen 500 ml fassenden Schüttelkolben überführt.
Diese Menge stellt die Vorkultur dar. Das im Fermenter verbliebene Medium bildet die
Hauptkultur.
In den Fermenter wird vor Beginn der Rührprozedur 1 ml Antifoam Typ 289 (Sigma) gegeben. Dieser Zusatzstoff ist wichtig, da der sich sonst durch das Rühren und chemische
Prozesse bildende Schaum den Wachstumsprozess der Hefezellen stört. Das Antischaummittel wird nur in sehr kleiner Konzentration verwendet, da diese oberflächenaktive
Substanz nur geringfügig löslich ist und der Sauerstoff-Übergangskoeffizient verringert
wird.
62
3.4.1. Hefezell- und Hefeextraktgewinnung
Als nächstes werden die Vorkultur für 15 Minuten und der Fermenter mit der Hauptkultur
für 60 Minuten bei 120°C und 1.2 bar sterilisiert. Dann werden steril zu der Vorkultur Glukose (4 ml) und Vitamine (0.1 ml) sowie eine Impfkultur der Hefe Saccharomyces
carlsbergensis gegeben. Die vorbereitete Vorkultur wird auf einen Schüttler gestellt und
wächst bei 28°C und 170 U/min ca. 20 Stunden lang. Nach Ablauf der Zeit wird eine Zellzählung mittels Thoma-Kammer vorgenommen, da die Impfbedingungen der Hauptkultur
mit einer konstanten Zellanzahl von 2.5·105 je ml erfolgen soll. Nach Bestimmung der Zellanzahl je Milliliter in der Vorkultur kann die notwendige Menge zum Impfen der
Hauptkultur mit einer einfachen Verhältnisgleichung berechnet werden,
V VK =
V HK⋅Z Soll
Z VK
(3.1)
wobei VVK dem Volumen der Vorkultur, die zugegeben werden muss, VHK dem Volumen der
Hauptkultur, ZSoll der gewünschten Zelldichte und ZVK der gemessenen Zelldichte der
Vorkultur entsprechen. Die so berechnete Menge der Vorkultur, Glukose (360 ml) und Vitamine (9 ml) werden steril in den Fermenter gegeben und mit der Hauptkultur vermischt.
Für 16 Stunden verbleibt die Hauptkultur im Fermenter bei 28°C, 550 U/min und einem
Fluss von 600 l/h (Luft). Während dieser Zeit vermehren sich die Hefezellen nach den
Wachstumskurven in Abb. 3.18.
Der Zeitpunkt der Ernte wird durch einen enzymatischen Glukosetest bestimmt. Es ist darauf zu achten, dass die bei der Ernte die Glukosekonzentration <0.1 mM beträgt. Dieser
Zeitpunkt ist zu wählen, da so gute oszillatorische Eigenschaften der Hefe gewährleistet
sind [Richard et al., 1993; Pye, 1968].
Abb. 3.18: Entwicklung der Hefezellen Saccharomyces carlsbergensis in einer Kultur
bei 30°C, 2% Glukose [Mochan und Pye, 1973].
63
3. Versuchsaufbau
Bei der Weiterverarbeitung der Hefe ist genau auf eine Temperatur von 4°C zu achten, da
eine zu warme Umgebungstemperatur zur Denaturierung der Enzyme führt. Dies bedeutet
eine irreversible Veränderung der Enzymstruktur, die mit einem Verlust der biologischen
Aktivität einhergeht. Ein weiterer Vorteil der geringen Temperatur ist die verminderte
Aktivität der Proteasen, die Proteine – auch Enzyme der Glykolyse – abbauen [Dellweg et
al., 1992; Schlegl, 1992]. Der Fermenter wird zur Zellgewinnung dreimal für sechs Minuten
bei 5000 g zentrifugiert (Rotor JLA 8100). Nach dem ersten Zentrifugieren wird der
sedimentierte Hefesatz in gekühltem (5°C), destilliertem Wasser resuspensiert. Im zweiten
Zentrifugeschritt werden statt 6 nur noch 4 Zentrifugenbecher Wasser verwendet, da die
Hefen dann weniger stark verdünnt werden. So diffundieren weniger Zellbestandteile aufgrund des unterschiedlichen osmotischen Druckes ins Zelläußere. Nach dem letzten
Zentrifugieren ergibt sich ein Hefemasse mit einem Feuchtgewicht von 150-200 g je Präparation. Entsprechend der Menge der gewonnenen Hefezellen berechnet sich daraus das
Volumen an MOPS-Puffer, in dem die Hefen gelöst werden. Von dem MOPS-Puffer,
bestehend aus 25 mM KCl und 50 mM MOPSO (3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropansulfonsäure), werden 10 ml Puffer auf 100 g Hefe gegeben, wobei diese Hefe-Lösung auf Eis
zu lagern ist. In dem folgenden Ultraschallaufschluss werden in vier Zyklen die Zellwand
und die Zellmembran der Hefezellen zerstört, um an die Metaboliten und das Zytoplasma
zu gelangen. Dabei ist bei der Beschallung (Ultraschall Steuereinheit HD 2200, Bandelin
Sonoplus, Spitze KE76) darauf zu achten, dass die Temperatur so gering wie möglich ist.
Dies geschieht durch die Verwendung von Edelstahlbehältern für die Beschallung (Wärmeleitung), eine Kühlung der Hefen durch eine wässrige Kältemischung aus NaCl und Eis mit
einer Temperatur von T = -12°C und einer Beschalldauer von 20 Minuten. Zudem wird der
nächste Ultraschallzyklus erst begonnen, wenn die Hefetemperatur unter T = 7°C liegt.
Nach Beendigung des Aufschlussprozesses wird die Hefesuspension in einen auf Eis
gelagerten Erlenmeyerkolben überführt. Die nun folgenden Zentrifuge-Schritte trennen
die störenden Zellbestandteile und die benötigten Enzyme voneinander (Tab. 3.4). Die
Enzymfraktion wird abschließend noch einmal für eine Stunde bei 40000 U/min zentrifugiert (Rotor Ti 70), in geeignete Portionsgrößen aufgeteilt und zur späteren Verwendung
eingefroren.
Von dem so gewonnenen Hefeextrakt kann auch die Metabolitenmenge und die Proteinkonzentration bestimmt werden [Warnke, 2003]. Da die Experimente mit einer
konstanten Metaboliten- und Proteinkonzentration durchgeführt werden, wird nicht näher
auf die Bestimmungsmethoden eingegangen.
64
3.4.1. Hefezell- und Hefeextraktgewinnung
Tab. 3.4: Zentrifugationsschritte zur Herstellung von Hefeextrakten. [Zentrifugeschritte 1-3 erfolgen
mit der Zentrifuge Avanti J20 (Beckman) und Zentrifugeschritt 4 mit der Ultrazentrifuge
Optima LE80K (Beckman) [Warnke, 2003]
Schritt Zyklen Dauer Zentrifugieren
mit
Rotor
Ziel
1
3
6 min
5000 g
JLA
8100
Gewinnung der Hefezellen
2
1
5 min
6000 g
JLA
16250
Trennung der nicht
aufgeschlossenen Zellen
3
1
30 min
20000 g
JA 20
Sedimentation der Zellorganellen
4
2
60 min
40000 U/min
Ti 70
Fraktionierung von weißen
Fetten, gelben Proteinen (Enzymen), bräunlichen Organellen,
dunkelbraunen Mitochondrien.
Erneute Zentrifugation der
Enzyme, Entnahme des gelben
Extraktes
3.4.2. Beschreibung des Versuchsplatzes
Mittels einer 300 W Xenon Lampe wird ultraviolettes Licht der Wellenlänge von 340 nm
bereitgestellt und anschließend durch den optischen Versuchsaufbau geführt. Bei dem
ultravioletten Filter λ = 340 nm handelt es sich um einen Breitbandfilter, da dieser eine
hohe Transmission im Vergleich zu einem Bandpassfilter aufweist. Für den zweiten Filter
λ = 460 nm wird ein Langpassfilter verwendet, da so auch relativ schwache Fluoreszenzsignale detektiert werden können. Dies ist erstrebenswert, da einzelne Metabolite, z.B.
NADH, sehr empfindlich gegenüber UV-Licht sind und eine hohe Lichtintensität die
Lebensdauer dieser Moleküle herabsetzt. Nach Durchlaufen der Linsen und Blenden trifft
das Licht auf einen dichromatischen Spiegel und wird senkrecht nach unten auf die Probe
gelenkt. Dieser Spiegel (Linos) zeichnet sich durch die einseitige dielektrische Beschichtung und einen Einfallswinkel von 45° aus. Darüber hinaus liegt sein Minimum der
Transmission bei λ = 358 nm. Licht mit einer Wellenlänge von λ > 400 nm kann den
Spiegel passieren. In der Probe werden durch das auftreffenden UV-Licht NADH-Moleküle
angeregt, die dann bei einer Wellenlänge von λ = 460 nm fluoreszieren [Lehninger et al.,
1995]. Dieses Fluoreszenzlicht trifft nach dem dichromatischen Spiegel und Passieren des
Langpassfilters auf eine CCD-Kamera und spiegelt die räumliche Verteilung des NADH in
der Probe wider.
65
3. Versuchsaufbau
Abb. 3.19: Schematischer Versuchsaufbau zur Beobachtung des NADH-Signals [Warnke, 2003]
Für die Versuche mit Hefezellen und Hefeextrakt wird die Versuchskammer in Abb. 3.20
verwendet. Für jeden Versuch wird die Kammer neu vorbereitet. Dazu wird ein Teflonring
(∅innen= 15 mm, ∅außen= 22 mm, h = 4 mm) mit Silikonpaste auf dem Boden des mit Elektroden bedampften Deckgläschens befestigt. Nach Abschluss dieser Vorbereitungen wird
die Probenmischung mit einem Volumen von V = 400 µl in den Teflonring gegeben. Die
befüllte Versuchskammer wird abschließend mit einem Menzelglas abgedeckt, um eine
Verschmutzung durch Staubpartikel und ein Verdunsten des Nährmediums zu verringern.
Abb. 3.20: Querschnitt durch die Versuchskammer (Skala in mm)
Mit Hilfe einer CCD-Kamera werden die Bilder aufgenommen. Bei allen Messungen wird
die Verstärkerröhre auf einen festen Potentialwert eingestellt, um die Messungen
vergleichbar auszuwerten. Durch einen Monitor und eine Videokarte (Frame-GrabberKarte DT 302, Data Translation) werden die Experimente aufgezeichnet und digitalisiert.
Die Graubilder der Kamera werden in dem zu untersuchenden Bereich 2x2 mm2 gemittelt,
und es ergibt sich ein zeitlicher Intensitätsverlauf.
66
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
4.
Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt
und Zellen
In diesem Kapitel werden systematisch die physikalischen Eigenschaften der entwickelten
Elektroden untersucht. Dabei stehen zunächst die elektrische Charakterisierung und die
Anpassung der Metallelektroden an erforderliche Eigenschaften im Vordergrund. Nach der
Materialauswahl und dem Festlegen des Elektrodenaufbaus ermöglichen Impedanzmessungen und -simulationen die Bestimmung des Frequenzverhaltens der Metallelektroden,
der Elektroden im Elektrolyten und schließlich des gesamtes Systems mit biologischen
Strukturen (vgl. Abb. 4.1). Ein Ersatzschaltbild, dass sukzessive aufgebaut wird, soll unter
Berücksichtigung der elektrochemischen Doppelschicht Einflüsse einzelner Systemparameter herausstellen. Die experimentell bestimmte lokale Potentialverteilung im
Elektrolyten nach Anlegen eines Pulses wird mit Simulationsrechunngen verglichen.
Abb. 4.1: Schematische Darstellung der Untersuchungsschwerpunkte
67
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
Die generelle Anwendung der Elektroden für Stimulationszwecke wird an zwei einfachen
biologischen Systemen, Hefezellen und Neuronen, getestet. Die Bestimmung des Parameterfensters für eine erfolgreiche Anregung von Hefezellen und Neuronenkulturen erlaubt
die Analyse von sofortiger Zellantwort und Langzeiteffekten. Abschließend soll die Untersuchung der spezifischen Anregungsmechanismen demonstrieren, dass die Elektroden für
die Bearbeitung aktueller wissenschaftlicher Fragestellungen geeignet sind.
4.1. Überprüfung des Ausgangssignals
Der für alle Experimente verwendete Pulsgenerator 8010A der Firma Hewlett Packard
besitzt eine Ausgangsimpedanz von 48 Ω auf [Hewlett Packard, 1993]. Das für die Stimulation definierte Rechtecksignal wird durch die Elektroden nur geringfügig verändert.
Befindet sich die Elektrode im Medium, so fällt zeitabhängig ein Teil der Eingangsspannung über der Lösung bzw. der Grenzfläche ab. Dieser Verlust wird einerseits durch
den ohmschen Widerstand des Elektrolyten bestimmt und andererseits durch Polarisationseffekte an der Grenzfläche Metallelektrode und Elektrolyt. Das gemessene Potential
ähnelt daher dem Aufladungs- oder Entladungsvorgang eines R-C-Gliedes (Abb. 4.2).
Spannung U (V)
2
Ausgangssignal Pulsgenerator
Pulsform (Elektrode )
Pulsform (Elektrode+Elektrolyt)
1
0
-1
-2
0
1
2
3
4
Zeit t (ms)
Abb. 4.2: Ausgangssignal des Pulsgenerators, Einfluss der
Elektroden sowie Elektroden und Elektrolyt auf das
Ausgangssignal
68
4.2. Die Stimulationselektroden
4.2. Die Stimulationselektroden
Die neuartige Stimulationselektrode soll einfach herzustellen sein. Daher werden die
Elektroden mittels Elektronenstrahlverdampfen von bioverträglichen Metallen angefertigt.
Optische und elektrische Messungen ermöglichen Aussagen über die spezifische Eigenschaften der entwickelten Elektrode. Die Messdaten aus I-U-Kennlinien und
Impedanzspektren in Korrelation mit der Simulation der Impedanzspektren erlauben eine
genaue elektrische Charakterisierung der Einzelparameter sowie das Frequenzverhaltens
der Elektroden.
4.2.1. Materialwahl und Geometrie
Das Ziel meiner Arbeit ist es, einfach herzustellende Elektroden für die Stimulation von
lebenden Organismen zu entwickeln, die eine preisgünstige und vielseitig anwendbare
Alternative zu den bereits erhältlichen Elektroden bietet. Die Metalle, die später als
Elektrodenmaterial verwendet werden, müssen generell eine hohe Korrosionsbeständigkeit gegenüber den gelösten Salzen des Zellmediums (Elektrolyten) aufweisen, besonders
jedoch während eines Stromflusses [Navarro et al., 2005], und eine geringe Impedanz
besitzen [Stieglitz und Meyer, 1998].
Abb. 4.3: Faltenbildung in einer 200 nm dicken, gesputterten
Platin-Schicht nach der Neuronenplattierung
69
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
a)
b)
100 µm
100 µm
Abb. 4.4: Vergleich der Netzwerke a) ohne Nickel-Haftschicht, b) mit Nickel-Haftschicht (50 nm)
auf einer Platin-Teststuktur (200 nm), wobei die Metallschichten heller erscheinen (Mitte)
als die umgebenden Glasbereiche.
Gold und Platin werden beispielsweise als bioverträgliche Materialien vorgeschlagen, die
einen ohmschen Kontakt zum Zellgewebe ausbilden [Geddes und Roeder, 2001; Geddes
und Roeder, 2003]. Eine einfache und schnelle Depositionsart Metallschichten abzuscheiden ist das Sputtern, weshalb diese Methode anfänglich verwendet wird. Als
Targetmaterial steht nur Platin zur Verfügung. Daher wird eine 200 nm dünne PlatinSchicht mittels dieser Methode auf die Deckgläschen aufgebracht. Nach dem Plattieren der
Neuronen kommt es jedoch zu einer Faltenbildung der Platinschicht (Abb. 4.3).
Eine wellenfreie Oberfläche ist jedoch notwendig, um das Auswachsen eines unfaszikulierten, homogenen Netzwerkes (Abb. 4.4 b)) zu gewährleisten. Durch die Verwendung
einer zusätzlichen 50 nm dünnen Nickel-Haftschicht lässt sich die Faltenbildung vermeiden. Dadurch bildet sich sowohl auf den glatten Metallelektroden als auch auf den
unbedeckten Glasflächen das Netzwerk nahezu homogen aus (Abb. 4.4 b)). Das homogene
Auswachsen wird durch die Verwendung einer 50 nm dünnen Nickel-Haftschicht gewährleistet.
Um jedoch die für die mikroskopischen Analysen mindestens notwendige Transmissionseigenschaften der Metallelektroden von T = 0.05 sicherzustellen, darf die Schichtdicke der
Elektroden höchstens 55 nm betragen [Günther, 2003]. Bei ausführlichen Versuchsreihen
stellte sich heraus, dass die Reproduzierbarkeit der Sputterdeposition gezielte Schichten
dieser Dicke nicht gewährleisten kann. Daher werden die Elektroden mittels Elektronenstrahlverdampfen hergestellt. Aufgrund der thermischen Eigenschaften von Platin wird
Gold als alternatives, bioverträgliches Elektrodenmaterial gewählt. Eine größtmögliche
70
4.2.1. Materialwahl und Geometrie
Transmission von T = 0.07 bei geschlossener, leitender Metallschicht wird reproduzierbar
mit einer 5 nm dünnen Nickel-Haftschicht gefolgt von einer 50 nm dünnen Goldschicht
mittels Elektronenstrahlverdampfen erreicht.
Mit dem optimierten Aufbau der Elektrodenstruktur soll nun eine Stimulation erfolgen.
Dabei tritt während der ersten Stimulationsversuche mit biphasigen Pulsen einer Amplitude von 3 V eine elektrolytische Zersetzung der Nickel-Schicht auf [Günther, 2003; Opitz,
2003]. Ursache hierfür ist das dicht bei Null liegende Standardpotential E0 = -0.23 V von
Nickel [Formeln und Tabellen, 1994], welches die Redoxreaktion von Nickel
(Ni ↔ Ni2++2e-) begünstigt, was zum Ablösen der Goldelektroden führt. Die dann in der
Lösung vorliegenden Nickel-Ionen wirken toxisch auf biologisches Gewebe [Diwan et al.,
1992]. Aus diesen Gründen muss ein anderes Haftschichtmaterial verwendet werden. Da
Titan eine sehr korrosionsbeständige Oxidschicht ausbildet [Cotton und Hanson, 1994],
die in chlorid-haltigen Umgebungen (Zellmedien) bis über 10 V stabil bleibt [Dugdale und
Cotton, 1964], wird dieses Material für die Haftschicht getestet.
Die Verwendung einer Ti- anstatt einer Ni-Haftschicht zeigt dabei keine für die Versuchsanforderungen relevante Änderung der elektrischen Eigenschaften der Elektroden,
was durch I-U-Kennlinien und eingehende Impedanzmessungen nachgewiesen ist [Günther, 2003]. Die Transmission wird durch den Austausch der Haftschichten sogar noch
erhöht (TTi = 0.12), wodurch das mikroskopische Arbeiten erleichtert wird. Die auftretenden Abweichungen für den Bahnwiderstand RB aufgrund der Änderung des
Haftschichtmaterials liegen innerhalb der Variation für Elektrodenstrukturen mit gleicher
Haftschicht.
100
50
10
10
großflächige Struktur
5 nm Ni + 50 nm Au
mit RB = 24..55 Ω
8
10
5 nm Ti + 50 nm Au
mit RB = 33..37 Ω
6
10
10
5
4
0.5
2
10
10
Fingerstruktur
5 nm Ti + 50 nm Au
mit RB = 52 Ω
1
3
10
4
10
2
10
3
10
4
10
Kreisfrequenz ω (s )
-1
5
10
Widerstand RS (Ω)
Kapazität CS (pF)
500
2
10
6
10
Abb. 4.5: Vergleich der Impedanzmessungen von großflächigen Elektroden mit unterschiedichen Haftschichten (Nickel bzw. Titan) und der Fingerstruktur (Titan-Haftschicht)
71
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
E=
U
d
(4.1)
In den Impedanzmessungen ist eine Unterscheidung der Elektrodenstrukturen aufgrund
der veränderten Haftschicht nicht möglich, da die Kapazität und der Widerstand von
nominell gleichen Strukturen um den Faktor zwei bis drei variieren kann [Günther, 2003].
Es muss an dieser Stelle erwähnt werden, dass die Elektrodenstruktur aus Abb. 3.3 a) nicht
zur Stimulation von Neuronen geeignet ist. Der Grund hierfür ist der Elektrodenabstand
von 1 mm, wodurch die benötige Feldstärke zur Anregung nicht ohne elektrolytische
Effekte erzeugt werden kann. Nach Gl. (4.1) wird bei gleicher angelegter Spannung mit
einem verringerten Elektrodenabstand von 300 µm ungefähr die dreifache Feldstärke
erreicht. Die Verwendung von zwei ineinandergreifenden Elektroden mit einem Abstand
von 300 µm (vgl. Abb. 3.3 b)) sichert zum einen eine höhere Feldstärke. Darüber hinaus
weist diese Struktur eine größere Varianz der Feldverteilung auf, was eine vielseitige
Analyse der Anregungsbedingungen ermöglicht.
Die veränderte Geometrie der Elektrode spiegelt sich jedoch nicht signifikant in den I-UKennlinien oder den Impedanzmessungen (Abb. 4.5) wider.
4.2.2. Beschreibung der Elektrodenstruktur durch ein
Ersatzschaltbild
Für die Modellierung des Gesamtsystems durch ein Ersatzschaltbild müssen sukzessive die
Einzelkomponenten bestimmt werden. Die Impedanzmessungen der Fingerstrukturen
bilden daher die Grundlage für das Verständnis der späteren Wechselwirkungen. Eine
Variation der Einzelparameter erfolgt solange, bis eine Übereinstimmung von Messwerten
und Simulation erreicht ist.
Z =RS
1
i CS
(4.2)
Die Motivation der Wahl der Ersatzschaltbilder erfolgt nach Abb. 4.6, wobei nicht zwischen großflächiger Elektrodengeometrie und Fingerstruktur unterschieden wird, da die
Unterschiede in den Impedanzmessungen zu gering sind (vgl. Abb. 4.5).
Das Ersatzschaltbild 1 enthält den Widerstand der Leiterbahnen RB, den Widerstand R1
und die Kapazität C1 zwischen den Elektroden und darüber hinaus eine Streukapazität C2
(vgl. Abb. 4.6).
72
4.2.2. Beschreibung der Elektrodenstruktur durch ein Ersatzschaltbild
R1, C1
RB
C2
24 mm
Abb. 4.6: Photo der Elektrodenstruktur mit gekennzeichneten Parameter des Ersatzschaltbildes
Die Aufstellung der Einzelkomponenten innerhalb des Ersatzschaltbildes erfolgt durch die
Analyse der möglichen Strompfade. Aufgrund des Messaufbaus und des Aufbaus der
Elektroden ergibt sich ein Verschiebungsstrom über die Streukapazität und über die Impedanz der Elektrode, was zu einer Parallelschaltung führt. In dem Ersatzschaltbild werden
die Kapazität C 1 und der Widerstand R1 als Parallelschaltung festgelegt und der Bahnwiderstand RB in Reihe dazu angenommen (vgl. Abb. 4.7).
R1
RB
C1
C2
Abb. 4.7: Ersatzschaltbild 1 der Elektrodenstruktur, RB -Widerstand der Leiterbahnen,
R1 -Widerstand zwischen den Elektroden, C 1 -Kapazität zwischen den Elektroden,
C 2 Streukapazität
Mit diesem Schaltbild ist es möglich, die Impedanz der Elektrodenstruktur über mehrere
Zehnerpotenzen hinweg zu beschreiben (Abb. 4.8). Dabei werden für die einzelnen
Parameter folgende Werte definiert:
RB = 80 Ω
R1 = 3 GΩ
C1 = 0.249 pF
C2 = 0.7 pF
73
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
CS (gemessen)
Kapazität CS (pF)
20
CS (simuliert)
10
8
6
4
2
1
0.8
2
10
3
10
4
10
5
10
-1
Kreisfrequenz ω (s )
6
10
Abb. 4.8: Simulation der Impedanzmessung mit dem Ersatzschaltbild 1, [Günther, 2003]
Eine Vergrößerung der Komplexität des Ersatzschaltbildes in Abb. 4.7 führt durch die Einführung eines zusätzlichen Streuwiderstandes oder einer Induktivität der Leiterbahnen zu
keiner signifikant verbesserten Simulation der Messwerte [Günther, 2003].
Aus den Simulationen ergibt sich ein Wert von 80 Ω für den Bahnwiderstand, der etwa
zweimal dem durch I-U-Kennlinien an Einzelfingern bestimmten Wert des Widerstandes
von 33 Ω bzw. 45 Ω entspricht (vgl. Abb. 4.5). Der Glaswiderstand zwischen den Elektroden wird mit Hilfe einer Direktmessung, mit dem Messgerät Advantest R8340A, bestimmt
und liefert für R1 einen Wert von 10 GΩ [Günther. 2003]. Dieser Wert liegt in der gleichen Größenordnung wie der für die Simulationen verwendete Widerstand R1 mit 3 GΩ.
Die Streugrößen in den erweiterten Ersatzschaltbildern werden durch Impedanzmessungen ohne Probe durchgeführt und entsprechen den simulierten Werten.
74
4.3. Die Wechselwirkung von Elektroden und Elektrolyt
4.3. Die Wechselwirkung von Elektroden und Elektrolyt
An die Analyse der Metallelektroden schließt sich die Charakterisierung des Elektrolyten
an. Untersuchungen der Zellmedien hinsichtlich ihres Verhaltens während des Anlegens
von Gleich- und Wechselspannung grenzen den Stimulationsbereich und die Pulsform ein,
die für Stimulationszwecke ohne das Auftreten von elektrolytischen Effekten verwendet
werden können. Anschließend erfolgt die Charakterisierung der Elektroden, die sich im
Zellmedium befinden. Nach einer Bestimmung der Charakteristika der Einzelkomponenten können die auftretenden Wechselwirkungen interpretiert werden. Eine Modellierung
des Frequenzverhaltens des Gesamtsystems ist nur möglich, wenn die elektrochemische
Doppelschicht im Ersatzschaltbild berücksichtigt wird.
4.3.1. Charakterisierung des Elektrolyten
In diesem Kapitel werden die elektrischen Eigenschaften der Elektrolyten untersucht, die
bei der Stimulation das Überleben der Hefezellen und Neuronen sicherstellen. Dabei ist
der Elektrolyt KH2PO4 das Medium der Hefezellen und aCSF bzw. DMEM (CO2-gepuffert)
sind die Nährmedien der Neuronen für Versuche unter atmosphärischen Bedingungen
bzw. im Inkubator (5% CO2). Bei den Stimulationsexperimenten werden Rechteckpulse
angelegt, deren Einfluss auf den Elektrolyten analysiert wird (Abb. 4.9). Um Ladungsakkumulationen und damit verbundene elektrolytische Effekte und Zellschäden zu vermeiden,
werden ausschließlich biphasige Rechteckpulse für die Stimulation verwendet (Abb. 4.9).
4
3.5
3
3.0
2
2.5
1
2.0
0
-1
1.5
-2
1.0
-3
0.5
Pulsamplitude U (V)
Pulsamplitude U (V)
4.0
-4
0
10
20
30
40
0
10
20
30
40
50
Zeit t (ms)
Abb. 4.9: Vergleich von monophasigen Pulsen mit Ladungsakkumulation
(links) und biphasigen Pulsen (rechts)
75
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
11.5
120
f = 1 kHz
100
aCSF
DMEM
11.0
80
60
10.5
40
ρ = 1.55 Ωm
ρ = 1.62 Ωm
10.0
2
10
3
10
4
10
Frequenz f (Hz)
0
4
20
Effektiv-Strom I eff (mA)
Effektiv-Strom I eff (mA)
Ueff = 1 V
0
12
8
Effektiv-Spannung Ueff (V)
Abb. 4.10: Stromabhängigkeit von zwei Elektrolytlösungen von der angelegten
Frequenz und Spannung [Günther, 2003]
Die frequenzabhängigen Untersuchungen bei einer konstanten Spannungsamplitude
ergeben für beide Elektrolyten, aCSF und DMEM, einen konstanten und damit frequenzunabhängigen Wert des Effektivstroms (Abb. 4.10). Die Abhängigkeit des Effektivstroms
von der angelegten Effektivspannung lässt sich für beide Elektolyten bei 1 kHz sehr gut
durch ein ohmsches Verhalten annähern. Als vernachlässigbarer Unterschied der
Lösungen kann nur der leicht höhere Widerstand der DMEM-Lösung genannt werden
(Abb. 4.10).
1.8
1.6
2. Peak
Strom I (mA)
1.4
1.2
1.0
0V
0.8
2.8 V
0.6
1. Peak
0.4
0.2
0.0
0
1
2
3
Spannung U (V)
4
5
Abb. 4.11: I-U-Kennlinie der Elektrodenstruktur mit Elektrolyt aCSF und Auftreten von
Elektrolyse, Photo der Elektrolyse von DMEM bei 2.8 V in einer Küvette mit
Wolfram-Elektroden [Günther, 2003]
76
4.3.1. Charakterisierung des Elektrolyten
Die I-U-Kennlinie einer mit aCSF bedeckten Elektrodenstruktur zeigt deutlich, dass sich
an die Zersetzung von aCSF die Elektrolyse der Metallelektroden anschließt (Abb. 4.11).
Bei einer Gleichspannung von ca. 2.6 V kommt es zu einer Bildung von Gasbläschen, welches elektrisch mit dem Auftreten des ersten Peaks in Abb. 4.11 identisch ist. Bei einer
weiteren Erhöhung der Spannung lösen sich die Metallelektroden auf. Ein äquivalentes
Verhalten wird auch bei dem Elektrolyten DMEM in einer Küvette mit Wolfram-Elektroden aufgrund gleicher elektrischer Eigenschaften festgestellt. Die erste Stromspitze ist
dabei mit der Elektrolyse des DMEMs korreliert, was die Photos in Abb. 4.11 bestätigen.
Da für Stimulationszwecke nur biphasige Pulse verwendet werden, treten bis ±2.5 V keine
messbaren Elektrolyse-Effekte auf. Erst nach der Erhöhung der Pulsamplitude eines
biphasigen Doppelpulses auf ±6 V kann eine elektrolytische Zersetzung des Mediums aCSF
(Abb. 4.12) nachgewiesen werden (vgl. im Anhang Abb. 8.1).
Elektrode
100 µm
Elektrolyt
Abb. 4.12: DIC-Aufnahme von Elektrolyse-Effekten bei Anlegen eines biphasigen
Doppelpulses an einer Fingerelektrode mit einer Amplitude von ±6 V
Da das Frequenzverhalten von Elektroden mit Elektrolyt starke Unterschieden zu den
Impedanzmessungen nur an den Elektroden aufweist [Günther, 2003], muss das Ersatzschaltbild um eine frequenzabhängige Komponente erweitert werden.
4.3.2. Die elektrochemische Doppelschicht
Da bei jedem Kontakt von Metalloberfläche und Elektrolyt eine elektrochemische Doppelschicht entsteht, muss diese bei der elektrischen Beschreibung und Charakterisierung des
Elektrodenarrays mit Elektrolyt berücksichtigt werden. Unter der Voraussetzung, dass
keine Elektrolyse stattfindet, fließt bei Anlegen einer Gleichspannung an die Elektroden
kein Strom über die Doppelschicht. Da aber die Doppelschicht mit der Frequenz einer angelegten Wechselspannung umgeladen wird, fließt ein Strom, ohne dass Ladungsträger die
Phasengrenze Metall-Elektrolyt durchdringen. Daher kann die Doppelschicht durch eine
Parallelschaltung von einem frequenzabhängigem Widerstand und einer frequenzab77
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
hängigen Kapazität beschrieben werden [Hamann und Vielstich, 1998; Green et al., 2002].
Dabei ist in [Green et al., 2002] die Formel für die frequenzabhängige Doppelschicht mit
Gl. (4.3) angegeben.
Z DS=
[    ]


A
A
=  cos
 −i cos


2
2
 i 
(4.3)
Die Parameter A und β charakterisieren die Doppelschicht, wobei A die Stärke der Einkopplung beeinflusst und β die Frequenzabhängigkeit moduliert. Beide Parameter
beeinflussen das elektrische Verhalten der Doppelschicht, welches stärker ohmsch oder
kapazitiv sein kann. Ein kleiner Wert des Parameters A symbolisiert eine schwach ausgeprägte Doppelschicht mit eher kapazitivem Verhalten, ein großer Wert des Parameters A
repräsentiert hingegen einen starken Einfluss der Doppelschicht mit dem damit verbundenen eher ohmschen Verhalten. Der Parameter β variiert zwischen den Werten 0 und 1.
Dabei bedeutet ein kleiner Wert eine mehr ohmsche Doppelschicht ohne starke Frequenzabhängigkeit und ein Wert nahe 1 eine starke Frequenzabhängigkeit der eher kapazitiven
Doppelschicht.
Eine Integration der elektrochemischen Doppelschicht in das Ersatzschaltbild erfolgt über
die Betrachtung der Strompfade, bei spannungsführenden Elektroden. Der Strom fließt
durch die Zuleitungen bzw. die Elektroden selbst, über die Impedanz der elektrochemischen Doppelschicht und als Verschiebungs- oder Ionenstrom durch den Elektrolyten.
Aus diesem Stromweg ergibt sich eine Parallelschaltung von Kapazität und Widerstand des
Elektrolyten. In Reihe dazu sind die Impedanzen der Leiterbahnen und der Doppelschicht
zu setzen. Aus diesen Überlegungen resultiert das Ersatzschaltbild 2 in Abb. 4.13.
Abb. 4.13: Ersatzschaltbild 2 mit Bahnwiderstand RB, elektrochemischer Doppelschicht ZDS
und Elektrolytwiderstand RE und Elektrolytkapazität CE [Günther, 2004]
Die im Vorfeld durch Messungen bestimmbaren Größen, Elektrolytwiderstand und Bahnwiderstand, werden bei der Simulation als Startwerte vorgegeben (Details in [Günther,
2004]). Das Frequenzverhalten des Systems kann unter Berücksichtigung des Ersatzschaltbildes 2 in hoher Übereinstimmung simuliert werden (Abb. 4.14). Das bedeutet, dass
die sich ausbildende elektrochemische Doppelschicht das elektrische Verhalten maß-
78
4.3.2. Die elektrochemische Doppelschicht
geblich beeinflusst, so dass aus dem Ersatzschaltbild 1 nur noch der Bahnwiderstand eine
Relevanz besitzt.
Für die Simulation mit dem Ersatzschaltbild 2 werden folgende Werte für die Einzelparameter gewählt:
A = 6369
β = 0.48
RE =167 kΩ
CE = 1.11 µF
750
Kapazität CS (µF)
1
0.8
500
0.6
0.4
250
0.2
100
Messung
Simulation
2
10
3
10
4
10
Widerstand RS (Ω)
RB = 70 Ω
75
5
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
10
Kreisfrequenz ω (s )
-1
Abb. 4.14: Vergleich von Impedanzmessung an Fingerstrukturen mit aCSF
und der Simulation nach Ersatzschaltbild 2 [Günther, 2004]
Da die elektrochemische Doppelschicht für eine angepasste Simulation der Messwerte
zwingend erforderlich ist, wird kurz der Einfluss der Parameter A und β auf das Gesamtverhalten analysiert. Der Parameter A allein beeinflusst die Impedanz nur sehr schwach,
kann jedoch in Kombination mit β die Krümmung variieren. Änderungen der anderen
Parameter ziehen keinerlei signifikante Auswirkung nach sich, ausgenommen der Einfluss
des Elektrolytwiderstandes RE und der -kapazität CE bei geringen Frequenzen und des
Bahnwiderstandes RB bei hohen Frequenzen [Günther, 2004].
Trotz der guten Simulationsergebnisse der Impedanzverläufe für die Elektrolytlösungen
der Nervenzellen ist das aufgestellte Ersatzschaltbild 2 nicht für die elektrische
Beschreibung der Phosphat-Lösung geeignet (vgl. Abb. 4.15). Grund dafür sind wahrscheinlich die verschiedenen Ionenradien, die zur Ausbildung von sehr unterschiedlichen
elektrochemischen Doppelschichten auf den entgegengesetzt geladenen Elektroden führen.
Eine deutlich verbesserte Simulation kann durch die Berücksichtung einer weiteren
Doppelschichtimpedanz im Ersatzschaltbild erreicht werden. Eine zusätzliche Doppelschicht erlaubt eine genauere Charakterisierung der Systemimpedanz. Da sich die
physikalischen Vorgänge an einer bzw. mehreren Grenzschichten jedoch ähneln, wird auf
eine zeitaufwendige Erweiterung der Simulation verzichtet.
79
6
Serienkapazität CS (nF)
400
Fitparameter
4 4
A = 8.06x10
200
β
= 0.575
RB = 70 Ω
2
RE = 79.7 kΩ
1
0.8
0.6
0.4
CE = 510 nF
100
80
60
40
2
10
0.2
Messung
Simulation
3
10
4
10
0.1
0.08
5
10
2
10
3
10
4
10
Kreisfrequenz ω (s )
-1
5
10
Serienwiderstand RS (kΩ)
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
6
10
Abb. 4.15: Vergleich von Impedanzmessung an Fingerstrukturen mit KH2PO4
und der Simulation nach Ersatzschaltbild 2 [Günther, 2004]
4.3.3. Charakterisierung von Elektrodenarray und Elektrolyt
Um auftretende Dispersionen besser analysieren zu können, werden nachfolgend die
Impedanzen des Systems im Nyquistplot dargestellt. Der Einfluss der frequenzabhängigen
Doppelschicht auf die Gesamtimpedanz ist in Abb. 4.16 dargestellt, wobei die Parameter
RB = 70 Ω
RE = 250 kΩ
CE = 600 nF
A = 4·104
für die Simulation verwendet werden.
Abb. 4.16: Vergleich der simulierten Impedanzkurven im Nyquistplot für ein
Ersatzschaltbild mit und ohne Doppelschicht [Günther, 2004]
80
β = 0.65
4.3.3. Charakterisierung von Elektrodenarray und Elektrolyt
Aufgrund des eingeschränkten Messbereichs von 20 Hz bis 1 MHz kann die Grenzfrequenz
des Systems nicht bestimmt werden.
Im Folgenden werden Impedanzmessungen an Fingerelektroden mit verschiedenen
Elektrolyten durchgeführt, um den Einfluss der elektrolyt-abhängigen Doppelschicht auf
die Gesamtimpedanz zu analysieren. Da die beiden Elektrolyten aCSF und DMEM
elektrisch nicht zu unterscheiden sind (vgl. Abb. 4.10), wird im Anschluss aCSF mit dem
Phosphatpuffer der Hefezellen verglichen. Dabei weist DMEM eine höhere Kapazität als
KH2PO4 auf (Abb. 4.17).
4
-Im(Z) (kΩ)
10
3
10
2
10
1
10
DMEM (0.1 M NaCl)
KH2PO4 (0.1 M, 6.5 pH)
0.1
1
Re(Z) (kΩ)
Abb. 4.17: Nyquistplot der Impedanz von Elektroden und Elektrolyt in
Abhängigkeit von DMEM und KH2PO4 [Günther, 2004]
Eine Veränderung der Molarität des Elektrolyten beeinflusst die Dielektrizitätskonstante
und die Doppelschicht des Gesamtsystems. Aufgrund der sensiblen ionenkonzentrationsbedingten Diffusions- und Stoffwechselprozesse von Neuronen kann der Einfluss der
Molarität auf die Impedanz nur mit Hilfe des Phosphatpuffers analysiert werden. Dies ist
unproblematisch, da Hefezellen in Elektrolyten mit verschiedenen Molaritäten bzw. pHWerten überlebensfähig sind [Asami und Yonezawa, 1996]. Mit steigender Molarität sollten die Dielektrizitätskonstante und die Systemkapazität abnehmen [Chowdhuri und
Chandra, 2001], was Impedanzmessungen jedoch nicht bestätigen (Abb. 4.18 a)). Bei der
Analyse des Nyquistplots ist der zu kleinen Imaginärteilen hin verschobene Kurvenverlauf
der 1 molaren KH2PO4-Lösung auffällig, der auf einen stark kapazitiven Anteil der Doppelschicht schließen lässt. Das dominierende kapazitive Verhalten resultiert aus dem
veränderten Aufbau der Doppelschicht von 1 molaren Lösungen. Die Doppelschicht
besteht hier nämlich nur noch aus der starren Komponente; die diffuse Doppelschicht fehlt
81
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
[Schmickler und Henderson, 1996; Hamann und Vielstich, 1998]. Die mögliche Erklärung,
dass die Ladungsträger näher an die Elektroden gelangen und die Kapazität erhöhen, steht
dabei im Widerspruch zu dem Ergebnis der Impedanzmessung. Eine Erklärung für
Plausibel erscheint jedoch, dass der Widerstand aufgrund des Fehlens der beweglichen
Ladungsträger größer wird.
Da Hefezellmedien hinsichtlich ihres pH-Wertes variieren können [Asami und Yonezawa,
1996], wird der Einfluss der Hydronium-Ionen auf die elektrischen Eigenschaften des
Systems analysiert (Abb. 4.18 a)). Die Konzentrationsänderung der Hydronium-Ionen aufgrund der verschiedenen pH-Werte (pH-Wert 6.5 und pH-Wert 4.5) kann gegenüber der
Anzahl von Anionen und Kationen des Phosphatpuffers KH2PO4 vernachlässigt werden. Da
die Doppelschicht oder die Dielektrizitätskonstante von der pH-Wertänderung nahezu
unbeeinflusst bleiben, ändern sich die elektrischen Eigenschaften des Systems ElektrodeElektrolyt nicht.
b)
a)
-Im(Z) (kΩ)
-Im(Z)
(kΩ)
10
1
0.1
0.1M KH2PO4 (pH-Wert 6.5)
4
10
3
10
2
10
0.1 molar
KH2PO4 ohne Glukose
1M KH2PO4 (pH-Wert 6.5)
0.01
0.1M KH2PO4 (pH-Wert 4.5)
0.1
1
Re(Z) (kΩ)
KH2PO4 mit Glukose
1
10
0.1
1
Re(Z)
(kΩ)
Abb. 4.18: Vergleich der Nyquistplot des Systems Elektrode-Elektrolyt
a) für verschiedene Molaritäten und pH-Werte des Phosphatpuffers KH2PO4
b) für 0.1 molares KH2PO4 (pH 6.5) mit und ohne Glukose [Günther, 2004]
In späteren Experimenten wird durch Glukosezugabe ein oszillierender Stoffwechsel der
Hefezellen erreicht. Daher muss der Einfluss der Glukose auf die Gesamtimpedanz
analysiert werden (Abb. 4.18 b)). Ein erhöhter Elektrolytwiderstand und eine verringerte
Elektrolytkapazität zeichnen das System mit Glukose aus (Impedanzmessungen, vgl. im
Anhang Abb. 8.2). Da die Imaginärteile beider Systeme übereinstimmen, können ein
Einfluss der zusätzlichen Ionen auf die Doppelschicht, genau wie eine durch die Glukose
induzierte Dispersion, ausgeschlossen werden.
82
4.4. Impedanzmessungen an Elektroden, Elektrolyt und Zellen
4.4. Impedanzmessungen an Elektroden, Elektrolyt
und Zellen
Abschließend wird das System von Elektroden und Elektrolyt um die biologische
Komponenten erweitert, um den Einfluss der Zellen auf die Impedanzeigenschaften zu
untersuchen. Die Nyquistplots von zwei verschiedenen Neuronenkulturen (15 DIV)
besitzen den gleichen Verlauf und unterscheiden sich lediglich im Bahnwiderstand
(Abb. 4.19).
35
-Im(Z) (kΩ)
30
Schale A
Seite 1
Seite 2
25
20
15
Schale B
Seite 1
Seite 2
10
5
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Re(Z) (kΩ)
Abb. 4.19: Vergleich der Nyquistplots von zwei Kulturschalen mit Neuronen und aCSF
Da das zweidimensionale Neuronennetzwerk die Elektroden nicht vollständig abdeckt, und
die Zellen im Vergleich zur Elektrolytmenge von 6 ml ein geringes Volumen aufweisen, ist
der zu erwartende Einfluss auf die Gesamtimpedanz klein. Um dennoch einen möglichen
Einfluss der Neuronen auf die Impedanz zu analysieren, werden an den gleichen Kulturschalen nach jedem Präparationsschritt (Elektrolyt; Elektrolyt und PDL-Beschichtung;
Elektrolyt, PDL-Beschichtung und Neuronen) Impedanzuntersuchungen durchgeführt. So
können zufällige Abweichungen, beispielsweise hervorgerufen durch verschiedene Zelldichten oder unterschiedliche Elektroden- bzw. Kontaktwiderstände, ausgeschlossen
werden.
83
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
a)
35
30
20
15
mit Neuronen
Seite 1
Seite 2
mit PDL und aCSF
Seite 1
Seite 2
10
5
0
0
1
2
3
Re(Z) (kΩ)
4
5
-Im(Z) (kΩ)
-Im(Z) (kΩ)
25
b)
25
20
15
mit Neuronen
Seite 1
Seite 2
nur mit aCSF
Seite 1
Seite 2
10
5
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Re(Z) (kΩ)
3.0
3.5
Abb. 4.20: Vergleich der Nyquistplots innerhalb einer Kulturschale
a) mit Neuronen und Eiweißbeschichtung+Elektrolyt (PDL+ aCSF)
b) mit Neuronen und Elektrolyt (PDL+ aCSF)
Die Impedanzmessungen von Elektrolyt und Neuronenkultur können nicht unterschieden
werden (vgl. Abb. 4.20 b)). Das Frequenzverhalten der PDL-beschichteten Elektrode
weicht im Bereich von 20 Hz bis 50 Hz geringfügig von dem Verhalten der Neuronenkulturen (vgl. Abb. 4.20 a)) ab. Da dieser Frequenzbereich durch die Doppelschicht
bestimmt wird, ist wahrscheinlich das positiv geladene Eiweißmolekül PDL die Ursache für
diesen Unterschied [Zhu et. al, 2004; Hong et al., 2006].
Die elektrostatische Wechselwirkung von positiver PDL-Schicht und negativ geladener
Zellmembran, verantwortlich für das Anhaften der Zellen [Nevo et al., 1955; Katchalsky et
al., 1959] und führt zu einem Ladungsgleichgewicht, so dass nicht zwischen Neuronennetzwerk (Zellen, PDL und Elektrolyt aCSF) und Elektrolyt (aCSF) unterschieden werden kann
(vgl. Abb. 4.20 b)).
Neben den Neuronen dienen die Hefekulturen als Beispielsystem für die Anwendung der
entwickelten Stimulationselektrode. Daher wird der Einfluss der suspensierten Hefezellen
auf die Systemimpedanz analysiert. Ein Vergleich der Nyquistplots des Elektrolyten KH2O4
und des Elektrolyten KH2PO4 mit Hefezellen zeigt eine Dispersion. Die bei sehr geringen
Frequenzen von einigen 10 Hz bis einigen 1000 Hz auftretende α-Dispersion kann aus
Polarisationseffekten der Doppelschicht und der Zellen (Membranleitfähigkeitsphänomenen, dem Aufladen von intrazellulären membrangebundenen Organellen oder
Diffusionsprozessen von Ionen durch die Zellmembran) resultieren [Schwartz, 1962;
Pething, 1987]; Martinsen, 2002].
Da Glukose die Impedanz des Gesamtsystem beeinflusst (vgl. Abb. 4.18 b)), wird das
Frequenzverhalten von Hefezellsuspensionen unterschiedlicher Zelldichte analysiert.
Neben der bereits detektierten α-Dispersion tritt die β1-Dispersion auf, die im Bereich von
84
4.4. Impedanzmessungen an Elektroden, Elektrolyt und Zellen
ca. 1 MHz beobachtet wird [Asami et al., 1977, Asami et al., 1996]. Die β1-Dispersion wird
dominiert durch die unterschiedlichen Leitfähigkeiten, die an Grenzflächen, hier speziell
der Doppelschicht und der wenig leitfähigen Zellmembran bzw. Zellwand, auftreten [Pauly
und Schwan, 1959]. Die β1-Dispersion tritt nur hervor, wenn die Sedimentation der Hefezellen bereits eingesetzt hat. Die damit verbundene Verringerung der Elektrodenfläche und
der Anstieg des Elektrolytwiderstandes [Bieberich und Guiseppi-Elie, 2004] hat bei den
Versuchen unter Glukosezugabe noch nicht eingesetzt, was durch das Fehlen der β1Dispersion bestätigt wird.
2
10
a)
2
10
mit 0.1 M Glukose
-Im(Z) (kΩ)
-Im(Z) (kΩ)
1
10
α-Dispersion
0
10
-1
1
10
b)
mit 0.1 M Glukose
β 1-Dispersion
0
10
α-Dispersion
-1
10
9
10
-1
KH2PO4 + Hefezellen (1.3x10 ml )
-2
0.2
0.4
0.6 0.8 1
4
-1
9
-1
KH2PO4 + Hefezellen 0.87x10 ml
-2
2
9
KH2PO4 + Hefezellen 1.30x10 ml
KH2PO4
10
KH2PO4
6
10
0.2
Re(Z) (kΩ)
0.4 0.6 0.8
Re(Z) (kΩ)
2
4
Abb. 4.21: Vergleich der Nyquistplots von
a) 0.1 molarem KH2PO4 (pH 6.5) + 0.1 molarer Glukose mit und ohne Hefezellen
b) 0.1 molarem KH2PO4 (pH 6.5) + 0.1 molarer Glukose mit Hefezellen verschiedener
Dichte [Günther, 2004]
Eine Simulation der Impedanz von Hefezellen, ähnlich wie bei den Neuronenkulturen, ist
mit dem aufgestellten Ersatzschaltbild nicht möglich. Grund hierfür ist das zu einfach
gewählte Ersatzschaltbild, welches das deutlich andere Frequenzverhalten von Hefezellen
nicht hinreichend genau beschreiben kann [Günther, 2004].
4.5. Feldverteilung im Elektrolyten
Neuronen können nur dann durch externe elektrische Felder angeregt werden, wenn die
Potentialdifferenz entlang der Zellmembran und -fortsätze einen kritischen Schwellwert
überschreitet. In Bereichen mit hoher elektrischer Feldstärke bzw. großen Potentialgradienten ist daher von einer direkten Anregung der Neuronen auszugehen. Da die gewählte
Elektrodenstruktur stark der eines Plattenkondensators ähnelt, ist eine analoge Feld- bzw.
85
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
Potentialverteilung zu erwarten.
Zur Bestimmung Potentialverlaufs wird mit einer Nadelelektrode die Fingerstruktur in
10 µm-Schritten in Elektrodenhöhe abgerastert und mit einem Elektrometer lokal das
Potential gemessen (Abb. 3.12). Dabei wird zwischen den Elektroden (s=0 µm und
s=250 µm) ein konstantes Potential gemessen, welches aufgrund der verschiedenen
verwendeten Nadelmaterialien schwankt (Abb. 4.22). Die gemessenen Potentiale korrelieren nicht ausschließlich mit den Standardpotentialen für Silber (Ag/Ag+: +0.8 V),
Wolfram (W/W6+: -0.09 V; W/W4+: -0.12 V), Platin (Pt/Pt2+:+1.2 V) und Eisen (Fe/Fe3+:
-0.04 V; Fe/Fe2+:-0.44 V) [Bard et al., 1985]. Das höchste Elektrolyt-Potential kann der
PtIr-Elektrode mit dem größten Standardpotential zugeordnet werden. Der geringste
Spannungswert wird mit der Wolfram-Nadel gemessen. Das mit einer Stahl-Elektrode aufgenommene Potential müsste aufgrund des Standardpotentials kleiner als das mit einer
Silber-Elektroden detektierte sein (Ag/Ag+: +0.8 V und Fe/Fe3+: -0.04 V bzw. Fe/Fe2+:0.44 V)
0µm
Potential ϕ (mV)
1000
800
1V
250µm
Silber-Elektrode
Wolfram-Nadel
PtIr-Elektrode
Stahl-Elektrode
0V
600
400
200
0
0
50
100
150
200
250
Weg s (µm)
Abb. 4.22: Gemessener Potentialverlauf zwischen den Fingerelektroden mit aCSF
in Höhe der Elektroden und mit verschiedenen Nadelmaterialien
Da bei der Messung des Potentialwertes zwangsläufig über die gesamt Elektrode integriert
wird, können mögliche Potentialverläufe direkt über der Elektroden nicht aufgelöst
werden. Eine Potentialmessung mit einer teflon-isolierten Stahlelektrode, die eine freiliegende Spitze von ca. 1 mm aufweist, kann diese Überlagerung eliminieren. Doch die
Messungen ergeben einen ebenfalls konstanten Potentialverlauf zwischen den Elektroden
(Abb. 4.22). Ein Einfluss des Nadeldurchmessers auf den Potentialverlauf kann bei den
Messungen vernachlässigt werden. Der konstante Potentialverlauf wird so interpretiert,
dass die im Elektrolyten vorliegenden Ladungsträger das Elektrodenpotential vollständig
86
Potentialdifferenz (mV)
4.5. Feldverteilung im Elektrolyten
30
100 Hz
1 kHz
25
30 mV
20
15
10
5
0
0
50
100
150
200
250
Abstand s (µm)
Abb. 4.23: Potentialdifferenz zwischen Referenz- und Messsignal zwischen den
Stimulationselektroden mit aCSF bei 100 Hz und 1 kHz mit 30 mV
(gemessen mit Wolfram-Nadelelektrode)
abschirmen; zwischen den Elektroden liegt ein nahezu feldfreier Bereich vor.
Zusätzlich zu dem Gleichspannungsverhalten soll untersucht werden, ob das Potential zwischen den Elektroden durch Anlegen einer Wechselspannung signifikant verändert wird.
Mit Hilfe eines Lock-in-Verstärkers wird die Differenz zwischen Referenzsignal und mit
der Nadel detektiertem Signal gemessen.
Das Referenzsignal wird an die Stimulationselektroden angelegt und lokal mit der Nadelelektrode das Potential gemessen. Die gemessene Potentialdifferenz in Abb. 4.23 zeigt,
dass das Elektrodenpotential auch bei Anlegen einer Wechselspannung vollständig abgeschirmt wird. Die Ladungsträger des Elektrolyten folgen der angelegten Frequenz, was auf
eine hohe Beweglichkeit schließen lässt. Diese Abschirmung wird durch vorhergehende
Messungen des Effektivstrom des Elektrolyten aCSF (vgl. Abb. 4.10) und dem späten Auftreten der Polarisationseffekte von Wasser bei einigen GHz [Kaatze, 1989] bestätigt.
Die Berechnung des Potentialverlaufs mit der Finite Elemente Methode stimmt nicht mit
dem gemessenen überein [Günther, 2004]. Ursache hierfür ist wahrscheinlich, dass bei
den Berechnungen das Modell eines polarisierbaren Dielektrikum als Elektrolyt, ähnlich
der Beschreibung im Gehirn [McIntyre und Grill, (1999), Kuncel und Grill, 2004]
verwendet wurde. Die frei beweglichen Ladungsträger des Elektrolyten, die das Elektrodenpotential abschirmen, werden nicht berücksichtigt.
Aufgrund des gemessenen Potentialgradienten an den Elektrodnenkanten ist dort die
höchste Stimulationseffizienz zu erwarten [ Kuncel und Grill, 2004]
87
4. Charakterisierung von Elektroden, Elektrolyt und Zellen
88
5. Anregung von biologischen Systemen
5.
Anregung von biologischen Systemen
In diesem Kapitel wird die Verwendung der Elektrode für Stimulationszwecke an zwei verschiedenartigen biologischen System, den Neuronen und Hefezellen, getestet. Nach der
Bestimmung der Stimulationsparameter werden die zellspezifischen Anregungsmechanismen untersucht.
5.1. Anregungsmechanismus von Neuronen
Im Folgenden wird die elektrische Anregung von Netzwerken und von Neuronen in Netzwerken mit blockierter synaptischer Transmission untersucht. Dabei wird die
Abhängigkeit der Stimulationseffizienz von der Pulsamplitude, der Pulsbreite und der Pulsanzahl bestimmt. Mit Hilfe von speziell angeordneten Netzwerken und dem Blockieren
der synaptischen Signaltransmission durch Zugabe von Neurotransmitterantagonisten der
GABAA- und Glutamat-Rezeptoren können bekannte Anregungsmechanismen von Netzwerken und Einzelneuronen verifiziert werden.
5.1.1. Bestimmung der Stimulationsparameter von Netzwerken
Um mit der neu entwickelten Elektrode interessante Fragestellungen zu bearbeiten, muss
zunächst der Bereich für eine erfolgreiche Stimulation bestimmt werden. In Vorversuchen
wird der Bereich für eine Stimulation von ±1 V auf maximal ±2.5 V begrenzt, um Zellschäden möglichst auszuschließen. Konkret wird ein Ausschnitt einer Kultur (16 DIV) mit
20 Zellen hinsichtlich des Spannungsbereiches untersucht (vgl. Abb. 5.1, DIC-Aufnahme).
89
5. Anregung von biologischen Systemen
Anzahl angeregter Zellen
Puls nach 3 Sekunden
20
15
1. Messung 100%
2. Messung
(nach 45 min)
10
5
0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
Pulsamplitude Umax (V)
DIC-Aufnahme
Abb. 5.1: Abhängigkeit der Anzahl der angeregten Neuronen (16 DIV) von der Pulsamplitude der
biphasigen Doppelpulse, Wiederholungsmessung nach 45 min zur Überprüfung der
Ergebnisse (tPB=1 ms, Stimulation nach 3 Sekunden)
In einem Zeitintervall von 40 Sekunden findet eine Stimulation zu zwei fest definierten
Zeitpunkten, in der 3. und 33. Sekunde, statt. Die Anregungsamplitude der biphasigen
Doppelpulse mit einer Pulsbreite von 1 ms wird von ±1.2 V bis ±2.5 V in 0.1 V-Schritten
zufällig variiert, um Sättigungseffekte zu vermeiden. Die Anzahl der angeregten Neuronen
in der 3. und 33. Sekunde werden ausgezählt und in Anhängigkeit von der Amplitude
dargestellt. Zur Überprüfung der erhaltenen Ergebnisse wird das Experiment nach einer
45 minütigen Pause wiederholt. Für eine effektive Stimulation sollte laut Abb. 5.1 und
Abb. 5.2 eine Pulsamplitude ≥±2.2 V gewählt werden.
Anzahl angeregter Zellen
Puls nach 33 s
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
100%
1. Messung
2. Messung
(nach 45 min)
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
Pulsamplitude Umax (V)
Abb. 5.2: Abhängigkeit der Anzahl der angeregten Neuronen (16 DIV) von
der Pulsamplitude (tPB=1 ms, Stimulation nach 33 Sekunden)
90
5.1.1. Bestimmung der Stimulationsparameter von Netzwerken
Ausschlaggebend für die Wahl dieses Wertes sind die Ergebnisse der Wiederholungsmessung in der 33. Sekunde (Abb. 5.2), wo erst bei Erreichen einer Amplitude von ±2.2 V
nahezu alle Zellen angeregt werden. Um Zellschäden so gering wie möglich zu halten bzw.
ganz auszuschließen, muss die Pulsamplitude so klein wie möglich bei einer hohen Anregungseffizienz gewählt werden.
Anzahl angeregter Zellen
Puls nach 3 s
14
12
10
100%
1. Messung
2. Messung
(nach 1h)
8
6
4
2
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Pulsbreite tPB (ms)
DIC-Aufnahme
Abb. 5.3: Abhängigkeit der Anzahl der angeregten Neuronen (18 DIV) von der Pulsbreite
(U=±2.2 V, Stimulation nach 3 Sekunden)
Neben der Amplitude wird die Pulsbreite der Halbwellen variiert, um das Parameterfenster für die Stimulation weiter einzuschränken. Die Pulsbreite wird dabei in 200 µsSchritten von 0.2 bis 1.4 ms je Halbwelle unsystematisch verändert (Abb. 5.3, Abb. 5.4).
Anzahl angeregter Zellen
Puls nach 33 s
100%
14
12
10
1. Messung
2. Messung
(nach 1h)
8
6
4
2
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Pulsbreite tPB (ms)
Abb. 5.4: Abhängigkeit der Anzahl der angeregten Neuronen (18 DIV)
von der Pulsbreite (U=±2.2 V, Stimulation nach 33 Sekunden)
91
5. Anregung von biologischen Systemen
Die experimentelle Vorgehensweise ist analog der Amplitudenvariation, wobei der zeitliche
Abstand zwischen erster und zweiter (Wiederholungs-) Messung 60 Minuten und das Alter
der Kultur 18 Tage betragen. Bei der Analyse der Anregungseffizienz ergibt sich eine Pulsbreite von ≥0.8 ms für die Anregung vieler Neuronen. Die Anzahl der stimulierten Zellen
in Sekunde 33 der Wiederholungsmessung erreicht nicht mehr die maximal mögliche bzw.
vorher stimulierbare Anzahl. Da systematisch der Wert von 14, Anzahl der Zellen im untersuchten Gebiet (vgl. Abb. 5.3, DIC-Aufnahme), unterschritten wird, können eine spontane
Netzwerkaktivität, ein Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffes Fluo3 aufgrund der wenigen
Stimulationen und eine Zellschädigung ausgeschlossen werden. Eine mögliche Ursache für
die verminderte Anregbarkeit der Neuronen ist ein Trennen von synaptischen Verbindungen, was jedoch nicht näher untersucht wird.
Abb. 5.5: Aufnahmen zur Bestimmung der lebenden und toten Neuronen in einem
Netzwerkbereich einer Kultur nach 1 h Dauerstimulation (11 DIV)
Eine Zellschädigung, verursacht durch die Stimulation in Abb. 5.4 , kann ausgeschlossen
werden. In einem einstündigen Dauerstimulationsexperiment an einer 11 DIV Neuronenkultur wird an ein Elektrodenpaar alle 30 Sekunden ein biphasiger Doppelpuls (U=±2.2 V,
tPB= 1 ms) angelegt. Nach der Stimulationssequenz wird der nicht membranpermeable
DNA-Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid (C27H34I2N4) dazugegeben. So ist gewährleistet,
dass nur Zellen mit beschädigter Zellmembran angefärbt werden. Durch die Überlagerung
92
5.1.1. Bestimmung der Stimulationsparameter von Netzwerken
von DIC- und Fluoreszenz-Aufnahmen können die toten und lebenden Zellen je Netzwerkbereich bestimmt werden (Abb. 5.5). Die 10 zufällig gewählten Bereiche auf der
stimulierten Seite werden mit 10 Bereichen der unstimulierten Seite innerhalb der gleichen Kulturschale verglichen (Tab. 5.1), um eine mögliche Zellschädigung durch die
Stimulation zu erkennen.
Tab. 5.1: Gesamtzellzahl und Anzahl der toten bzw. geschädigten Zellen in 10 Netzwerkbereichen der Stimulations- und Referenzelektrode
Stimulationsseite
Referenzseite
Zellanzahl tote Zellen
Zellanzahl tote Zellen
64
14
60
15
63
30
42
10
36
16
36
21
43
6
70
18
34
11
24
9
43
8
32
14
55
21
49
16
45
20
45
21
46
19
48
20
66
14
52
31
495
195
458
175
32%
38%
In den Netzwerkbereichen der Stimulationselektrode haben 32% der Gesamtzellen eine
beschädigte Membran, auf der unstimulierten Referenzseite sind es mit 38% nur
unwesentlich mehr Zellen. Dieses Ergebnis zeigt, dass durch die Stimulation mit biphasigen Doppelpulsen einer Amplitude von ±2.2 V und einer Pulsbreite von 1 ms keine
Zellschäden verursacht werden. Ein Wiederholungsexperiment mit ebenfalls 120 Stimuli,
jedoch innerhalb von vier Stunden, bestätigt, dass keine anregungsbedingten Zellschäden
auftreten.
Die Flankensteilheit der Pulse wird kleinstmöglich gewählt, obwohl keine Abhängigkeit der
Anzahl angeregter Neuronen von der Steilheit im untersuchten Bereich von 2 ns bis 500 µs
gefunden wurde (Abb. 8.3).
93
5. Anregung von biologischen Systemen
Aus den durchgeführten Experimenten ergeben sich für die Pulsamplitude U=±2.2 V bzw.
für die Pulsbreite tPB=1 ms als Parameter für einen hohe Anregungseffizienz. Mit diesen
Parametern wird eine Netzwerkanregung über den gesamten Netzwerkbereich von ca. 1 cm
ohne Zellschädigung erreicht, was in weit über 100 Einzelexperimenten nachgewiesen
werden konnte.
a)
b)
150
Netzwerkaktivität
10
Stimulus-Artefakt
Doppelpuls
U = ±0.6 V
0
100
50
-10
0
-20
-50
-30
keine Zellaktivität
Einzelzellaktivität
-150
-40
-200
-50
-60
-100
-250
2 3 4 5 6 7 8 9
Membranpotential U (mV)
Membranpotential U (mV)
20
1.50 1.75 2.00 2.25
Zeit t (s)
Abb. 5.6: Membranpotential eines gepatchten Neurons (20 DIV), a) spontane Aktivität,
b) keine induzierte Aktivität nach einen Stimulationspuls
Mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik1 werden die mittels Calcium-Imaging bestimmten Stimulationsparameter überprüft, da sie den Vorteil der direkten Korrelation von Messsignal
und zu untersuchender Zelle erlaubt [Opitz et al., 2002]. Beispielhaft sind in Abb. 5.6 a)
typische spontane Zellaktivitätsmuster, ein einzelnes Aktionspotential und ein Netzwerkereignis, dargestellt. Bei der Variation der Pulsamplitude eines Doppelpulses der Pulsbeite
tPB=1 ms kann schon bei einer Amplitude von U=±0.7 V ein induziertes Aktionspotential
nachgewiesen werden (Abb. 5.7 a)). Bei Unterschreiten dieser Spannung findet keine Anregung mehr statt (vgl. Abb. 5.6 b)). Eine synchrone Netzwerkanregung ist bei Pulsen mit
U=±1.1 V zu beobachten (Abb. 5.7 b)), was deutlich unterhalb des mit Calcium-Imaging
bestimmten Wertes liegt. Grund hierfür ist, dass die Farbstofffluoreszenz des Fluo3 erst
nach mehreren Aktionspotentialen und dem damit verbundenen Ca2+-Einstrom hoch
genug für eine Detektion ist. Das Calcium-Imaging ist also wesentlich unempfindlicher bei
der Detektion der Zellaktivität als die Patch-Clamp-Technik. Da eine gleichzeitige Analyse
der Aktivität vieler Zellen notwendig für die Untersuchung des Netzwerkverhalten ist,
genügt das Anpatchen von Einzelneuronen nicht. Das Calcium-Imaging wird jedoch weiterhin für die Aufnahme der Zellaktivität nach elektrischer Anregung verwendet, da bei
einer Stimulation mit Amplituden von U=±2.2 V keine Zellschäden aufgetreten sind.
1 gemessen von Dr. J. Kluewa
94
5.1.1. Bestimmung der Stimulationsparameter von Netzwerken
150
100
50
a)
b)
Stimulus-Artefakt,
Doppelpuls
U = ±0.7 V
0
-50
-100
-150
-200
induzierte
Einzelzellaktivität
-250
-300
1.8 2.0 2.2 2.4 2.6
300
250
Stimulus-Artefakt
200
Doppelpuls
U = ±1.1 V
150
100
50
0
-50
-100
-150
induzierte
Netzwerkaktivität -200
-250
-300
1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4
Membranpotential U (mV)
Membranpotential U (mV)
200
Zeit t (s)
Abb. 5.7: Membranpotential eines gepatchten Neurons (20 DIV) während und nach
Stimulation mit einem Doppelpuls
a) von U=±0.7 V, Auslösen eines einzelnen Aktionspotentials
b) von U=±1.1 V, Auslösen von Netzwerkaktivität
Es muss an dieser Stelle erwähnt werden, dass bei einer Stimulation mit den Fingerstrukturen und den gewählten Parameter immer eine Netzwerkanregung erreicht wird. Dabei
kann nicht zwischen direkter elektrischer Anregung und synaptischer Signalweiterleitung
unterschieden werden. Die beobachtete Zellaktivität ist daher immer eine Überlagerung
aus direkter Stimulation und synaptischer Signalweiterleitung, sofern diese nicht durch
chemische Substanzen verhindert wird. Für die Untersuchung der Anregungsmechanismen mit den Fingerelektroden ist eine Zell-Zell-Anregung jedoch hinderlich. Daher wird
im nächsten Kapitel nur die direkte Anregung von Einzelneuronen betrachtet.
5.1.2. Bestimmung der Stimulationsparameter für
Einzelzellanregung
Um die GABAA- und glutamat-gebundene synaptische Signaltransmission vollständig zu
blockieren, wird ein Gemisch aus D-2-Amino-5-. phosphopentanoischer Säure (APV,
50 µM), 6-Cyano-7-Nitroquinoxaline-2,3-Dione (CNQX, 10 µM), Bicucullin Methiodid
(BMI, 20 µM) und Picrotoxin (PTX, 10 µM) in die Kulturschale appliziert. Die Blockade
der glutamatergen NMDA- und AMPA-Rezeptoren erfolgt mit APV und CNQX, wobei die
GABAA-Rezeptoren mit BMI und PTX gehemmt werden [Voigt et al., 2005].
95
5. Anregung von biologischen Systemen
Abb. 5.8: Schematische Darstellung der glutamatergen NMDAund AMPA-Rezeptoren [Liang, 2004]
Anteil angeregter Neuronen (%)
Der vorher als effizient für eine Stimulation bestimmte Doppelpuls mit einer Amplitude
von U=±2.2 V wird an eine 15 DIV Neuronenkultur vor und nach Zugabe des Gemisches
zum Blockieren der synaptischen Signaltransmission angelegt. Dabei wird in sechs Gebieten der Elektrode in Übereinstimmung mit den vorherigen Experimenten eine hohe
Anregungseffizienz (Normierung der stimulierten Neuronen auf die Gesamtzellzahl im
entsprechenden Bereich) von ca. 80% vor Zugabe der Neurotransmitterantagonisten beobachtet (Abb. 5.9 a), Kontrolle). Nach der Blockade der Signaltransmission werden nur
noch vereinzelt Neuronen angeregt (Abb. 5.9 b), Blockiert). Dieses Ergebnis einer
schwachen Anregung konnte in diversen Netzwerken unterschiedlichen Alters (9, 12, 14, 15
DIV) in 43 untersuchten Zellbereichen verifiziert werden (Abb. 5.10 a)).
100
Kontrolle
a)
Blockiert
b)
80
60
R1
R2
R3
R4
R5
R6
40
1
2
4
5
3
6
20
15 DIV
0
Doppelpulse mit U=±2.2V
Abb. 5.9: Anteil angeregter Neuronen vor Blockade der synaptischen Transmission
(Kontrolle) und nach Zugabe der Neurotransmitterantagonisten (Blockiert)
96
5.1.2. Bestimmung der Stimulationsparameter für Einzelzellanregung
Anteil angeregter Neuronen (%)
Da die geringe Reaktion auf Stimuli für Analysen des Anregungsmechanismus nicht ausreicht, muss eine Anpassung der Pulsparameter erfolgen. Daher werden im Folgenden die
Pulsanzahl und anschließend die Pulsamplitude variiert. Mit der Erhöhung der Pulsanzahl
ist ein Anstieg der Anregungseffizienz von Netzwerken mit und ohne synaptischer Signaltransmission verbunden (Abb. 5.10).
100
a)
Kontrolle
Blockiert
b)
c)
80
n = 43
60
n = 32
n = 32
40
20
0
2
6
10
Pulsanzahl mit U=±2.2V
Abb. 5.10: Vergleich der Anregungseffizienz von Netzwerken mit und ohne
synaptischer Transmission in Abhängigkeit von der Pulsanzahl
Die Tatsache, dass in nicht blockierten Netzwerken mit einem Doppelpuls nicht die maximale Anzahl erregbarer Zellen stimuliert wird (Abb. 5.10 a)), steht scheinbar im Gegensatz
zu den experimentellen Ergebnissen des Kapitels 4.6.1., wo mit einem Doppelpuls nahezu
alle Zellen angeregt werden konnten. Die Abweichung in der Effizienz wird durch die
Größe des analysierten Bereiches verursacht. In den Experimenten mit Netzwerkanregung
werden lediglich Netzwerkgebiete einer Größe von 190x190 µm² zwischen zwei Elektrodenfingern untersucht (vgl. Bereich 3 und 4 in Abb. 5.9), in denen sich 14 bzw. 20
Neuronen befinden. Für eine genauere Bestimmung der Anregungsparameter von Einzelneuronen wird ein größerer Bereich (380x380µm²) mit teilweise über 100 Zellen sowohl
zwischen den Elektrodenfingern als auch in unmittelbarer Nähe analysiert (vgl. Abb. 5.9).
Da die Anregung des Netzwerkes u.a. von der Konnektivität der Zellen abhängig ist [Maeda
et al., 1995], ist davon auszugehen, dass bei den vorangegangenen Versuchen lokale, stark
vernetzte Zellenbereiche analysiert wurden. Bei einer Vergrößerung der beobachteten Zellregion wird auch die Aktivität von Neuronen erfasst, die nicht so stark mit den elektrisch
angeregten Zellen verbunden sind. Da heißt, dass die Anzahl ankommender präsynaptischer Signale zu gering ist, um ein Aktionspotential auszulösen. Eine Erhöhung der
Pulsanzahl (tetanische Stimulation) steigert aufgrund der wiederholten Potential-
97
5. Anregung von biologischen Systemen
differenzen die Anzahl der ausgelösten Aktionspotentiale [Perez et al., 1999; Jimbo et al.,
1993] der direkt erregbaren Neuronen. Dieser Effekt ist mit dem Ca2+-Imaging (Integrationszeit von 550 ms) nicht auflösbar, erhöht jedoch die absolute Anzahl ankommender
Eingangssignale der Postsynapse und löst im Neuron ein Aktionspotential aus. Unter
Beachtung des vergrößerten Netzwerkbereichs und der Konnektivität der Neuronen kann
also der Effekt der Erhöhung der Stimulationseffizienz für nicht blockierte Netzwerke
erklärt werden. Nach Zugabe der Neurotransmitterantagonisten ist der Anteil angeregter
Zellen sehr klein und steigt dann mit Erhöhung der Pulsanzahl an. Ursache hierfür ist
ebenfalls die Superposition der wiederholten Potentialdifferenzen, die schließlich zum
Auslösen eines Aktionspotentials führen.
Die weitere Erhöhung der Pulsanzahl über 10 hinaus erscheint nicht nötig, da einerseits
nahezu alle Zellen, das heißt 90% der Gesamtneuronenanzahl, (vgl. Abb. 5.10 c)) stimuliert
werden und andererseits nicht mehr Pulse als nötig für die Anregung verwendet werden
müssen, um Zellschäden zu vermeiden.
Anteil angeregter Neuronen (%)
Nach der Variation der Pulsanzahl wird der Einfluss der Pulsamplitude auf die Stimulationseffizienz untersucht. Da in Vorversuchen Zellschäden bei einer Amplitude von
U=±2.5 V beobachtet werden konnten, ist für die generelle Analyse der Spannungsabhängigkeit die Pulsamplitude zunächst auf U=±2.0 V beschränkt. In fünf verschiedenen
Netzwerkbereichen (Kulturen 16 bzw. 19 DIV) wird die Pulsamplitude von ±1.0 V, in 0.1 VSchritten, auf ±2.0 V jeweils vor und nach Zugabe von APV, BMI, CNQX und PTX erhöht.
Ohne Zugabe der Neurotransmitterantagonisten werden mit einer Amplitude von ±1.4 V
nahezu alle erregbaren Neuronen stimuliert. Die leicht verringerte Effizienz für ±1.3 V wird
durch spontane Aktivität in einem untersuchten Bereich hervorgerufen.
100
Kontrolle
Blockiert
80
60
40
n=5
20
0
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Pulsamplitude der 10fach Pulse (V)
Abb. 5.11: Vergleich der Anregungseffizienz von Netzwerken mit und ohne
synaptischer Transmission in Abhängigkeit von der Pulsamplitude
98
5.1.2. Bestimmung der Stimulationsparameter für Einzelzellanregung
Nach dem Blockieren der Glutamat- und GABAA-Rezeptoren ist die Stimulationseffizienz
für alle gewählten Pulsamplituden stark herabgesetzt. Eine elektrisch induzierte Aktivität
nach Blockieren der Signalweiterleitung kann erst für Amplituden ≥±1.4 V beobachtet werden. Mit steigender Pulsamplitude nimmt die Stimulationseffizienz zu, wobei bei ±2.2 V
keine Sättigung erreicht wird. Die Entwicklung der Anzahl erregter Zellen lässt vermuten,
dass eine weitere Erhöhung der Pulsamplitude die Stimulationseffizienz steigert. Da aber
bei ±2.5 V Zellschäden beobachtet werden und in Langzeitstudien mit ±2.2 V keine toxischen Reaktionen auftreten, wird für eine effektive Stimulation ein 10fach-Puls der
Amplitude von ±2.2 V vorgeschlagen und nachfolgend immer verwendet.
Nach der Bestimmung der Parameter zur Anregung von Einzelneuronen nach Unterdrücken der synaptischen Transmission, soll mit den neu entwickelten Elektroden der
Anregungsmechanismus selbst untersucht werden.
5.1.3. Analyse des Anregungsmechanismus von Neuronen
Eine elektrische Anregung von Neuronen ist nur möglich, wenn die Zellmembran durch
Potentialunterschiede über einen Schwellwert depolarisiert und ein Aktionspotential generiert wird. Um den Anregungsmechanismus zu untersuchen, wird von einem Modell
ausgegangen, das die Neuronen als polarisierbare Kugeln in einem Plattenkondensator
betrachtet. Unter der Berücksichtigung, dass sich die Feldstärke an den Elektrodenkanten
am stärksten ändert, wird eine erhöhte Anregungseffizienz im Bereich der Elektrodenkanten erwartet. Zur Überprüfung dieses Modells wird der zu analysierende Bereich in
acht gleich große Gebiete unterteilt (vgl. Abb. 5.12).
Abb. 5.12: Aufteilung des Abstandes zwischen zwei Elektrodenfingern in 8 Bereiche
In den DIC- und Fluoreszenzaufnahmen wird die Anzahl der angeregten Neuronen in den
entsprechenden Bereichen bestimmt, um eine Normierung vorzunehmen. Für die Auswertung hat es sich als günstig herausgestellt, die Anzahl der angeregten Zellen der
synaptisch blockierten Netzwerke auf die stimulierbare Anzahl in unblockierten Netzwerken für jedes Feld zu normieren.
99
5. Anregung von biologischen Systemen
Abb. 5.13: Aufteilung der DIC- und Fluoreszenz-Aufnahme zur Bestimmung der
Gesamtzellzahl und der Anzahl angeregter Neuronen
Der Vorteil hierbei ist, dass die inhomogene Verteilung der Neuronen berücksichtigt wird
und nicht stimulierbare Zellen bei der Betrachtung unberücksichtigt bleiben. Bei der
Analyse der Anregungsverteilung eines 9 DIV Netzwerkes zwischen den Elektrodenfingern
(vgl. Abb. 5.13) in Abhängigkeit der Feldstärke scheint es eine Korrelation zu geben, da in
den Bereichen der Elektrodenkanten die Stimulation sehr effektiv ist (Abb. 5.14). Auffällig
ist allerdings, dass für kleine Pulsamplituden die Anregung an einer Elektrode bevorzugt
ist. Der Einfluss der Polung auf die Anregungseffizienz von Neuronen wird anhand von
vier Netzwerksbereichen zwischen den Elektrodenfingern analysiert.
normierte Aktivität (%)
100
80
60
F1 Elektrode
F2
F3
F5
F4
F6
F7
F8 Elektrode
40
20
0
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Spannung U (V)
Abb. 5.14: Abhängigkeit der Stimulationseffizienz der Neuronen (9 DIV) in blockierten
Netzwerken von der lokalen Feldstärke und der Pulsamplitude
100
Anzahl angeregter Neuronen
5.1.3. Analyse des Anregungsmechanismus von Neuronen
50
F1
F2
F3
F4
40
F5
F6
F7
F8
30
20
10
0
Polung 1
Polung 2
Abb. 5.15: Abhängigkeit der Anzahl stimulierter, blockierter Zellen einer 13
Tage alten Kultur von der Polung der Elektroden
normierte Aktivität (%)
Nach dem Umpolen der Elektroden wird das Experiment wiederholt. Da jedoch in
Abb. 5.15 keine Abhängigkeit der Polung auftritt, kann ein signifikanter Einfluss ausgeschlossen werden. Beide Elektroden stimulieren mit gleich hoher Effizienz.
Die in Abb. 5.14 gefundene Korrelation von Anregungsverteilung und lokaler Feldstärke
war zufällig und nur eine von vielen gemessenen Varianten. Die in Abb. 5.16 und Abb. 5.17
dargestellten Verteilungen stehen stellvertretend für alle anderen und sollen die Variabilität der aufgetretenen Verteilungen verdeutlichen. In Abb. 5.16 ist die Anregungsverteilung
eines Netzwerkbereiches bestimmt, der sich in unmittelbarer Nähe zu einem Elektrodenfinger befindet, d.h. es gibt nur auf einer Seite eine Änderung der Feldstärke.
100
80
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8 Elektrode
60
40
20
0
1.8
2.0
Spannung U (V)
Abb. 5.16: Abhängigkeit des Anregungsortes von der lokalen Feldverteilung und der Pulsamplitude einer Neuronenkultur (15 DIV) mit blockierter synaptischer Transmission (Elektrode in R8, Stimulation mit einem 10fach-Puls)
101
5. Anregung von biologischen Systemen
Abb. 5.17: Abhängigkeit des Anregungsortes von der lokalen Feldverteilung und der Pulsamplitude einer Neuronenkultur (14 DIV) mit blockierter synaptischer Transmission
(Elektroden in F1 und F8, Stimulation mit einem 10fach-Puls)
Entgegen den Erwartungen des Modells ist die Stimulation nicht in unmittelbarer Nähe
der Elektrode am effektivsten, sondern ca. in der Mitte des Netzwerkbereiches. In einem
anderen Beispiel (vgl. Abb. 5.17) ändert sich die lokale Anregungsverteilung, wenn die Pulsamplitude des 10fach-Pulses von ±1.8 V auf ±2.0 V erhöht wird. Bei der Stimulation mit
±1.8 V scheinen eine Elektrode und ein mittlerer Bereich bevorzugt. Wird die Amplitude
jedoch geringfügig erhöht, so findet sich die effektivste Anregung erneut in dem mittleren
Netzwerkbereich.
Da die ermittelten Anregungsverteilungen der Neuronen nicht mit dem Modell der polarisierbaren Kugeln in einem Plattenkondensator erklärbar sind, muss ein anderer
Anregungsmechanismus vorliegen.
Bei der Betrachtung eines Neurons zwischen den Elektrodenfingern fällt auf, dass die Ausdehnung der Zellfortsätze, Dendriten und Axone, wesentlich größer als die des Somas ist
(vgl. Abb. 5.18, Färbung mit Lucifer Yellow CH [Huettner und Baughman, 1988]1). Die
Größe des Somas liegt im 20 µm-Bereich. Die Zellfortsätze hingegen können Distanzen
von bis zu einigen Millimetern überspannen. Unter diesem Gesichtspunkt muss eine Anregung der Neuronen über die Zellfortsätze in Betracht gezogen werden, obwohl eine
erfolgreiche Stimulation oft als Depolarisation der unteren Zellmembran entlang des
Somas interpretiert wird [Rutten et al., 2001; Bove et al., 1995].
Diese Interpretation ist naheliegend, da nur Neuronen betrachtet werden, die die Elektroden des verwendeten Multi-Elektroden-Arrays vollständig abdecken. Andererseits weisen
1 gemessen von Dr. T. Opitz
102
5.1.3. Analyse des Anregungsmechanismus von Neuronen
300 µm
Stimulationsexperimente im visuellen Kortex von Ratten darauf hin, dass nur die Axone,
jedoch nicht die Somata angeregt werden [Nowak und Bullier, 1998b].
Elektroden
Abb. 5.18: Mikroskopische Aufnahme eines mit Lucifer Yellow CH gefärbten Neurons
zur Veranschaulichung der Ausdehnung zwischen zwei Elektrodenfingern
(schwarze Linien oben und unten)
Die antidrome Stimulation konnte in hochorganisierten Gehirnstrukturen [Harvey, 1980;
Taylor und Dudek, 1984] nachgewiesen werden und findet Berücksichtigung in theoretische Arbeiten [McIntyre und Grill, 1999; Rattay, 1999]. In Stimulationsexperimenten an
dissoziierten Netzwerken auf Silizium-Substraten und MEA-Strukturen zeigte sich, dass
Zellfortsätze sensitiver auf Stimuli reagieren als der Zellkörper selbst [Wagenaar et al.,
2004; Starovoytov et. al., 2005]. In den Studien von Wagenaar et al. und Starovoytov et al.
werden Einzelneuronen betrachtet. Da mit den entwickelten Elektroden jedoch immer
ausgedehnte Netzwerkbereiche stimuliert werden und eine gezielte Einzelzellanregung nur
eingeschränkt durch Blockieren der synaptischen Transmission möglich ist, muss ein spezieller Versuchsaufbau entwickelt werden, um die These der antidromen Stimulation zu
überprüfen.
Um den Anregungsmechanismus von Einzelneuronen zu untersuchen, muss die synaptische Signaltransmission in speziell strukturierten Netzwerken (vgl. Abb. 5.20) blockiert
werden, was durch Zugabe der Substanzen APV, BMI, CNQX und PTX erreicht wird. Mit
Hilfe von Silikon-Matrizen werden die Neuronen nur in die gewünschten Bereiche (grau
dargestellt) plattiert. Nach ca. 6 Stunden werden die Matrizen entfernt und die Zellfortsätze können sich ungehindert ausbilden. Die zwei speziell angeordneten Bereiche c und d
(vgl. Abb. 5.20) werden zur Analyse des Anregungsmechanismus verwendet. In Fall c wird
ein Netzwerk untersucht, welches sich 1.5 mm entfernt von einem Elektrodenfinger
befindet.
103
5. Anregung von biologischen Systemen
Abb. 5.20: Verschiedene Netzwerkbereiche in unterschiedlichen Positionen zu den Elektrodenfingern, a und b repräsentieren Kontrollnetzwerken, c eine Netzwerkregion
1.5 mm von den Elektroden entfernt und d ein Mini-Netzwerk in unmittelbarer
Nähe zu Elektroden. Die grauen Bereichen markieren die mit Zellkörpern
plattierten Gebiete, wobei sich die Axone und Dendriten frei über das Deckglas
ausbreiten können. Die gestrichelte Linie markiert die Stelle, an der das Netzwerk
durchtrennt wird, um axonale Stimulation auszuschließen.
Die Neuronen in Netzwerk c verbinden sich mit Neuronen in unmittelbarer Nähe und mit
Neuronen, die sich auf und zwischen den Elektrodenfingern befinden. Da die Neuronen
innerhalb von 12 Tagen Axonlängen von mehr als 2 mm erreichen [Voigt el al., 2005], ist
eine Vernetzung der Neuronen aus Bereich c mit den Zellen zwischen den Elektrodenfingern gewährleistet. Ein Überwachsen der Elektrodenkante im Bereich d für Kulturen
≥12DIV ist dann ebenfalls gesichert. Da eine direkte Anregung des Zellkörpers ausgeschlossen werden kann, erfolgt die Stimulation über eine Potentialänderung entlang des
Axon. Zur Überprüfung dieser These wird nach dem Blockieren der Glutamat- und GABAARezeptoren der Bereich c mit einem 10fach-Puls der Amplitude ±2.2 V stimuliert. In dem
1.5 mm von den Elektroden entfernten Bereich sind das elektrische Feld bzw. eine
Potentialänderung vernachlässigbar und lösen kein Aktionspotential aus.
100 µm
Kontrolle (10P, ± 2.2V)
Blockiert (10P, ± 2.2V)
Abb. 5.19: DIC- und Fluoreszenzaufnahmen eines Netzwerkbereiches c während der Stimulation
mit einem 10fach-Puls der Amplitude ±2.2 V vor und nach Zugabe von APV, BMI,
CNQX und PTX zum Nachweis der axonalen Stimulation (14 DIV)
104
5.1.3. Analyse des Anregungsmechanismus von Neuronen
Eine Anregung kann also nur über axonal induzierte Potentialänderung, die an der
Elektrodenkante am größten ist (vgl. Abb. 4.22), erreicht werden.
Anteil angeregter Neuronen (%)
In vier von acht untersuchten Bereichen c kann eine direkte Anregung der Neuronen
durch axonale Stimulation nachgewiesen werden (vgl. Abb. 5.21 c). Als Beispiel wird ein
Netzwerkbereich mit acht Neuronen gewählt, der vor und nach Blockieren der Glutamatund GABAA-Rezeptoren stimuliert wird (Abb. 5.19). Vor dem Blockieren der synaptischen
Transmission werden alle Neuronen stimuliert (vgl. Abb. 5.19, Kontrolle), wobei danach
nur bei zwei Neuronen ein Aktionspotential ausgelöst wird (vgl. Abb. 5.19, Blockiert). Es ist
also davon auszugehen, dass beide Neuronen direkt durch den elektrischen Puls axonal
erregt werden und ihre weitergeleiteten Aktionspotentiale im unblockierten Fall zu einer
Netzwerkaktivität führen. Diese Annahme wird durch Experimente an Netzwerke mit
durchtrennten Axonen gestützt. Nach erfolgreicher Stimulation der synaptisch blockierten
Netzwerkbereiche b (vgl. Abb. 5.20) werden die Axone entlang der gestrichelten Linie mit
einem Skalpell durchtrennt und erneut stimuliert. In keinem der sechs untersuchten
Bereiche konnte nach dem Durchtrennen der Axone ein Aktionspotential detektiert
werden. Erst nach dreimaligem Auswaschen der Glutamat- und GABAA-Rezeptor-Antagonisten wird eine schwache Aktivität nach einem elektrischen Puls aufgrund der
synaptischen Signalweiterleitung detektiert.
100
80
a
b
zwischen
Elektroden
c
d
nahe Elektroden Abstand 1.5 mm Mini-Netzwerk
Kontrolle
Blockiert
60
40
20
0
n=15
1.4
n=15
2.2
1.4
n=8
2.2
1.4
n=7
2.2
1.4
2.2
Pulsamplitude (V)
Abb. 5.21: Abhängigkeit der Anzahl stimulierter Neuronen des untersuchten Netzwerkes
vor und nach Zugabe von APV, BMI, CNQX und PTX für herkömmliche
Netzwerke (a, b), Netzwerke 1.5 mm entfernt von der Elektrode (c) und für
Mini-Netzwerke (d), die Buchstaben a-d korrelieren zu denen in Abb. 5.19
(Normierung auf Gesamtzellzahl)
105
5. Anregung von biologischen Systemen
Mit diesen Experimenten können also die bereits vorhandenen experimentellen Hinweise
[Wagenarr et al., 2004, Starovoytov et al., 2005] zur axonalen Stimulation für unsere
Elektrodenstruktur verifiziert werden. Dies zeigt, dass mit den relativ einfachen Fingerelektroden komplexe Fragestellungen, wie z.B. den Anregungsmechanismus betreffend,
untersucht werden können.
Abschließend werden die verschiedenen Netzwerkbereiche a, b und d stimuliert und
verglichen, um Fragen der Netzwerkanregung zu beantworten. Die Anregung erfolgt
erneut vor und nach Blockieren der synaptischen Transmission mit 10fach-Pulsen der
Amplitude von ±1.4 V und ±2.2 V (Abb. 5.21). In allen Gebieten werden erwartungsgemäß
Aktionspotentiale mit den verwendeten Pulsparametern ausgelöst, wobei die Effektivität
der Pulse mit ±1.4 V deutlich geringer ist als die mit höherer Amplitude analog zu bekannten Ergebnissen. Interessanterweise ist die Stimulation des Mini-Netzwerkes (vgl.
Abb. 5.21 d) vor Zugabe von APV, BMI, CNQX und PTX genauso effektiv wie in den Kontrollregionen a und b. Nach der Zugabe der Antagonisten der Neurotransmitterrezeptoren
ist nur noch eine axonale Stimulation möglich. Die Anzahl der direkt angeregten Neuronen
im Fall d ist signifikant geringer als für die herkömmlichen Netzwerke a und b. Grund
hierfür ist die geringere Anzahl der Axone, welche die Elektrodenkante und damit den
Bereich der höchsten Potentialänderung überqueren. Die reduzierte Anzahl der Axone, die
den Bereich höchster Potentialänderung durchlaufen, ist auf das nähere neuronale Umfeld
zurückzuführen. Im Fall a und b verbinden sich die Neuronen isotrop mit ihren
unmittelbaren Nachbarn, da in jeder Richtung annähernd gleich viele Zellen kontaktiert
werden können. Die Neuronen des Mini-Netzwerkes jedoch finden nur in Richtung einer
Halbebene, in einem großen Abstand zur Elektrode, Verbindungspartner. Die Anzahl der
die Elektroden querenden Axone ist reduziert, da in diesem Bereich weniger Verbindungspartner zur Verfügung stehen. Aus der Anzahl axonal angeregter Neuronen des MiniNetzwerkes ergibt sich weiterhin, dass bei einer Anregung von weniger als 20% der
Gesamtneuronen eine synchrone Netzwerkaktivität erreicht wird.
5.1.4. Langzeitstimulation im Inkubator
In diesem letzten Abschnitt zu Stimulationsuntersuchungen an Neuronennetzwerken soll
untersucht werden, ob durch die Einkopplung elektrischer Pulse die Zellmorphologie verändert werden kann. In dieser Versuchsreihe befinden sich die Neuronenkulturen im
Inkubator bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und in dem Zellmedium DMEM. Gepulst
werden die 12 Tage alte Kulturen zunächst alle 60 Sekunden mit einem biphasigen
Einfachpuls der Pulsbreite tPB=1.5 ms und der Amplitude U=±2.2 V über einen Zeitraum
106
5.1.4. Langzeitstimulation im Inkubator
von 72 Stunden. Jeweils nach 24 Stunden Dauerstimulation wird eine Kulturschale entnommen und mit einer unstimulierten Schwesterkultur verglichen.
Abb. 5.22: Netzwerkmorphologie nach 72 h Stimulation (links). Es kommt zur Ausbildung von Filopodien (rote Pfeile), die in der unstimulierten Schwesterkultur (rechts) nicht auftreten
(15 DIV), Stimulation mit Einfachpulsen alle 60 Sekunden (U=±2.2 V, tPB=1.5 ms)
Die Netzwerke, die 24 bzw. 48 Stunden stimuliert werden, zeigen keine Unterschiede zu
den elektrisch nicht angeregten Kontrollkulturen (vgl. in Anhang Abb. 8.4, Abb. 8.5). Nach
dreitägiger Stimulation konnten erste geringfügige Unterschiede beobachtet werden. So
werden verstärkt Filopodien und Verästelungen beobachtet, die in Gebieten weit entfernt
der Stimulationselektroden und in unstimulierten Netzwerken gleichen Alters nicht auftreten. Da die beobachteten Zellveränderungen lediglich ein Hinweis für einen
stimulationsbedingten Einfluss sind, wird in einem zweiten Experiment gezielt versucht,
die morphologischen Veränderungen zu verstärken. Falls die Stimulation die Zellfortsätze
beeinflusst, wird bei einer erhöhten Anregungsfrequenz eine signifikante Veränderung
stimuliert
unstimuliert
250 µm
100 µm
100 µm
Abb. 5.23: 24h Dauerstimulation (links) mit einem Bereich von 300 µm abgestorbener Zellen,
wobei die Ellipse lebende Zellen markiert, intaktes Netzwerk auf der unstimulierten
Elektrodenseite (13 DIV), Stimulation mit Doppelpulsen alle 30 s (U=±2.2 V, tPB=1 ms)
107
5. Anregung von biologischen Systemen
erwartet. Die Netzwerke werden daher alle 30 s mit biphasigen Doppelpulsen der Amplitude U=±2.2 V mit tPB=1 ms stimuliert.
Bereits nach 24 Stunden sind die Zellen über den Stimulationselektroden und in
unmittelbarer Umgebung von 100-300 µm abgestorben. Da auf der unstimulierten Referenzseite hingegen das Netzwerk intakt ist, muss die Ursache des Zellsterbens die
Stimulation sein. Wird die Stimulation auf 48 bzw 72 Stunden ausgedehnt, so vergrößert
sich der Bereich der abgestorbener Zellen rund um die Stimulationselektrode. Nach 48
Stunden konnten erst in 1.6-1.8 mm Abstand zur Stimulationselektrode lebende Zellen
detektiert werden. Auf Referenzseite scheint das Netzwerk intakt bei sehr geringer Zelldichte. Nach drei Tagen Dauerstimulation weitet sich der Bereich ohne Neuronen bis auf
2.6 mm aus, und die Zellanzahl auf der unstimulierten Referenzseite ist stark vermindert.
Die Wiederholung der Dauerstimulation mit einem Doppelpuls im 30 Sekunden-Intervall
führt zu dem gleichen Ergebnis, so dass die Zellschäden tatsächlich stimulationsbedingt
sind. Die Ursache des toxischen Einflusses der Stimulation im Inkubator im Gegensatz zu
den Experimenten bei Raumtemperatur kann der Temperaturunterschied sein. Bei einer
höheren Temperatur reagiert die Zellmembran wesentlich empfindlicher auf mögliche
induzierte Strömungen im Elektrolyten und ist anfälliger für Zellperforationen. Die verringerte Anzahl Neuronen zwischen den Elektrodenfingern der unstimulierten Seite wird
nicht durch eine Ladungsakkumulation hervorgerufen. In einem Langzeitexperiment ohne
Zellen wird auf einer Elektrodenseite mit einem 10fach-Puls (U=±2.2 V, tPB=1 ms) alle 30
Sekunden stimuliert und dabei das Elektrodenpotential auf der Referenzseite mit einem
Elektrometer gemessen. Nach Einsetzen der Stimulationpulse wird eine geringe Potentialänderung in Korrelation zu den Pulsen gemessen, eine Ladungsakkumulation findet
jedoch nicht statt (Abb. 5.24).
0.04
Spannung U (V)
0.00
-0.04
-0.08
-0.12
Start der Stimulation
mit einem 10fach-Puls
U= ±2.2V, tPB = 1ms
-0.16
-0.20
1
10
100
1000
Zeit (min)
Abb. 5.24: Potentialmessung an der nicht stimulierten Elektrode zur Überprüfung einer durch
elektrische Pulse ausgelösten Ladungsakkumulation
108
5.1.4. Langzeitstimulation im Inkubator
Stromspitzen, die ebenfalls zu Zellschäden führen, können mit einem digitalen Speicheroszilloskop und verschiedenen Schaltungen (vgl. Abb. 8.6-8.8) nicht nachgewiesen
werden. Da die Zellschäden nur im Inkubator auftreten, kann eine temperaturabhängige
Perforation der Zellmembran oder eine lokale Elektrolyse nicht ausgeschlossen werden.
5.1.5. Anregung mit Mikroelektroden
In diesem Kapitel werden die ersten Ergebnisse der Experimente der kombinierten Stimulations- und Ableitstruktur (vgl. Abb. 3.3 c) vorgestellt. Im Gegensatz zu der bisher
verwendeten Struktur dienen hier zwei Einzelfinger als Stimulationselektroden. Zwischen
diesen befinden sich 3x2 Ableitelektroden mit einem Durchmesser von 50 µm. Das Ziel ist
es, die extrazelluläre neurale Aktivität zu detektieren, wobei die Zellsignale typischerweise
eine Amplitude von ca. 50-100 µV aufweisen und Spitzenwerte bis 600 µV betragen
können [Egert et al., 1998]. Trotz dieser im Vergleich zur Messtechnik relativ hohen
Signale, ist eine Detektion aufgrund des biologischen Rauschens von 50 µV schwierig [Jah
et al, 1999]. Da nach den theoretischen Betrachtungen eine mit Neuronen bedeckte
Elektrode Grundlage für eine erfolgreiche Ableitung von Zellaktivität ist, werden selektiv
nur mit Elektroden bedeckte Neuronen verwendet (vgl. Abb. 5.25).
Um Zellaktivität im Detektionszeitraum zu gewährleisten, soll die Neuronenkultur über die
Stimulationselektroden angeregt werden, und anschließend die evozierte Aktivität sowohl
mittels Ca2+-Imaging als auch elektrisch aufgenommen werden.
Abb. 5.25: Mikroskopische Aufnahme von zwei Ableitelektroden, die mit Neuronen
bedeckt sind (13 DIV). Die gelben Kreise markieren die Zellen.
109
5. Anregung von biologischen Systemen
Abb. 5.26: Stimulation zwischen Ableit- (1) und Stimulationselektrode (2) mit einem Doppelpuls
von U=±2.9 V und mit Zellantwort in der 3. und 33. Sekunde
Bei der Anregung einer nicht blockierten Neuronenkultur, mit einem Doppelpuls von
U=±2.2 V mit tPB=1 ms, über die Stimulationselektroden fällt auf, dass innerhalb der Stimulationselektroden keine Neuronen erregt werden. Ursache hierfür sind wahrscheinlich
die Zuleitungen der Ableitelektroden, die abschirmend wirken. Der Potentialsprung an der
Kante der Stimulationselektroden induziert eine lokale Depolarisation des Axons, die sich
in Richtung des Somas ausbreitet. Überquert dabei das Axon eine erdfreie Zuleitung, die
keinen Potentialunterschied zur Lösung aufweist, schreitet die Depolarisation nicht weiter
voran, und es wird kein Aktionspotential ausgelöst. Außerhalb der Stimulationselektroden
kann jedoch eine erfolgreiche Anregung beobachtet werden. Um die Abschirmung zu
verhindern, wird der Stimulationpuls an eine Stimulationselektrode und eine
Ableitelektrode angelegt. Nach einer Pulshöhenvariation stellt sich heraus, dass erst mit
einer Amplitude von U=±2.9 V eine Zellaktivität induziert werden kann (Abb. 5.26).
Zeitgleich zum Anregungspuls wird das Signal von Stimulations- und Ableitelektrode verstärkt und aufgenommen. Aufgrund des hohen Rauschens von ca. 20 mV kann jedoch kein
Zellsignal detektiert werden (Abb. 5.27). Um mit der Elektrodenstruktur aus Abb. 3.3 c)
Zellsignale detektieren zu können, müssen die Zuleitungen der Ableitelektroden isoliert,
der Versuchsaufbau modifiziert und ein Probenhalter mit 8 Kontakten konzipiert werden.
Durch eine Isolation der Zuleitungen wird zum einen das Rauschen verringert und zum
anderen die Anregung der Neuronen zwischen den Stimulationselektroden möglich.
Generell ist eine Detektion der extrazellulären Signale möglich, jedoch müsste der Versuchsplatz in einem faradayschen Käfig aufgebaut und die provisorische Kontaktierung
von Ableitelektroden und Verstärker verbessert werden. In weiterführenden Arbeiten
sollen diese Modifikationen vorgenommen werden, um die Anwendungsmöglichkeiten der
einfachen Elektrodenstrukturen zu erweitern.
110
5.1.5. Anregung mit Mikroelektroden
U = ±2.9 V
Spannung U (V)
2
1
0
-1
-2
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
Zeit t (s)
Abb. 5.27: Stimulationpuls (links) und detektiertes Signal, welches von Rauschen dominiert ist
5.2. Stimulation von Hefezellen
Um die Vielseitigkeit der Elektrode zu demonstrieren, wird zusätzlich zu den Neuronen ein
weiteres, andersartiges biologischen System untersucht. Es wird das System der Hefezellen
Saccharomyces carlsbergensis gewählt (vgl. Abb. 5.28), da die Hefezellen im Gegensatz zu
den vernetzten Neuronenkulturen suspensiert vorliegen. Die Hefezellen besitzen intraund extrazelluläre Membranen mit elektrochemischen Potentialgradienten, die empfindlich auf elektrischen Pulse reagieren [Tomov und Tsoneva, 1988]. Eine Beeinflussung
durch elektrische Felder ist daher aufgrund der ionenkonzentrationsgebundenen Transportsysteme der Zellmembran immer mit einer Änderung der Membranleitfähigkeit
verbunden.
5 µm
Abb. 5.28: REM-Aufnahme einer Hefezelle, Saccharomyces carlsbergensis, [Danø, 1999]
111
5. Anregung von biologischen Systemen
Relative NADH-Fluoreszenz
(bel. Einheiten)
Mit der entwickelten Elektrodenstruktur werden also die Hefezellen stimuliert, um die
oben genannten Effekte experimentell zu bestätigen. Die stimulationsbedingte Änderung
der elektrochemischen Potentiale wird von den Hefezellen durch Aktivierung von energieverbrauchenden Ionenpumpen kompensiert. Durch Stoffwechselprozesse, beispielsweise
Glykolyse, muss dann Energie in Form ATP nachgebildet werden. Da in einer gekoppelten
Reaktion NADH, ein fluoreszierendes Molekül, gebildet wird (vgl. Abb. 2.15, Abb. 2.16),
kann über die Analyse der NADH-Fluoreszenz die Beeinflussung der Hefezellen durch
elektrische Pulse untersucht werden.
250
Imax
200
Imin
150
Stimulation
100
Glykolytische
Oszillationen
0
5
10
15
Zeit (min)
20
25
Abb. 5.29: Entwicklung der NADH Fluoreszenz während glykolytischer Oszillationen und nach
elektrischer Stimulation. Die Ausschnittvergrößerung zeigt das Absinken der Fluoreszenz nach einem elektrischen Puls und indiziert die Punkte I min und Imax , die für die
Normierung der Intensität verwendet werden.
In Abb. 5.29 ist ein typischer Fluoreszenz-Verlauf von Hefezellen dargestellt, die sich in
einem Energiezustand befinden, in der glykolytische Oszillationen nach Zugabe von Glukose beobachtet werden können. An die glykolytischen Oszillationen schließt sich ein
Bereich leicht sinkender Fluoreszenz an, in der Stimulationspulse angelegt werden. Dabei
bewirkt eine elektrische Stimulation bewirkt einen sofortigen Abfall der Fluoreszenz und
einen langsamen Anstieg des NADH-Signals. Die Hefezellen benötigen ca. eine halbe
Minute, um die NADH-Fluoreszenzänderung, ausgelöst durch den elektrischen Puls, zu
kompensieren und den Fluoreszenzwert vor der Stimulation zu erreichen (Abb. 5.29, Ausschnittsvergrößerung). Mit Hilfe der Punkte Imax und Imin kann die Intensitätsänderung
normiert (∆I/Imax mit ∆I = Imax-Imin) und in Abhängigkeit verschiedener Pulsparameter aufgetragen werden. Da bei abgetöteten Hefezellen nach einer elektrischen Stimulation keine
Fluoreszenzänderungen nachgewiesen werden können, ist die gemessene Fluoreszenzabnahme biologisch bedingt.
112
5.2.1. Bestimmung der Stimulationsparameter von Hefezellen
5.2.1. Bestimmung der Stimulationsparameter von Hefezellen
Um das Stimulationsfenster für eine signifikante Beeinflussung des Stoffwechsels, welches
durch eine große NADH-Signaländerung ausgezeichnet ist, zu bestimmen, werden systematisch die Pulsbreite, die Flankensteilheit und die Pulsamplitude variiert. Da jedoch
mehrere Zeitpunkte einer Stimulation möglich sind, z.B. während oder nach den glykolytischen Oszillationen, wird zunächst untersucht, in welchem Zeitfenster eine Stimulation
die größte Intensitätsänderung im NADH-Signal auslöst. Dafür werden die Hefezellen in
einem Zeitintervall von 90 Minuten jede zweite Minute mit einem biphasigen Puls mit
einer Pulsbreite tPB=4 ms und einer Amplitude U=±10 V stimuliert (vgl. Abb. 5.30). Nur
während dieses Experimentes wird die Sedimentationszeit der Hefezellen nicht eingehalten und direkt nach dem Befüllen der Versuchskammer mit der Stimulation begonnen. Im
Zeitintervall I (0-25 Minuten) sedimentieren die Zellen, die Fluoreszenzintensität verringert sich, die glykolytischen Oszillationen setzen ein (Glukose-Zugabe bei t=0) und die
elektrischen Eigenschaften des System verändern sich aufgrund der Bedeckung der
Elektroden mit Hefezellen. Trotz dieser Effekte kann die Fluoreszenzänderung nach den
Stimulationspulsen deutlich detektiert werden. Um Superpositionseffekte zu vermeiden
und ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten, werden alle Stimulationsexperimente im II. Intervall (25-80 Minuten) durchgeführt. Das sich verringernde NADHSignal bedeutet dabei, dass die in den Zellen vorhandene Energie abnimmt, was durch eine
reduzierte Intensitätsänderung nach einer Stimulation charakterisiert wird. Die Änderung
des NADH-Signals nach Anlegen eines Pulses ist schließlich so klein, dass nicht mehr zwi-
I
II
III
140
12
10
120
8
100
6
80
∆I/Imax (%)
Relative NADH-Fluoreszenz
(bel. Einheiten)
160
Stimulation
4
60
0
10
20
30
40
50
Zeit (min)
60
70
80
90
Abb. 5.30: Entwicklung der NADH-Fluoreszenz und der Intensitätsänderung
über 90 Minuten mit einem Stimulationsabstand von 120 s
113
5. Anregung von biologischen Systemen
schen Rauschen und Stimulation unterschieden werden kann (Intervall III, ≥80 min).
Nachdem der Stimulationszeitraum feststeht, wird die Pulsbreite von 0.25 ms auf 10 ms
erhöht, um das Stimulationsfenster einzugrenzen. Dabei kann für Pulsbreiten über 1 ms
eine stimulationsinduzierte Verringerung des Fluoreszenzsignals detektiert werden (vgl.
Abb. 5.31). Mit steigender Pulsbreite wird die Intensitätsänderung ausgeprägter, wobei für
tPB≥10 ms die Sättigung einsetzt. Da aber elektrolytische Effekte bei Pulsbreiten über
20 ms auftreten und die Intensitätsänderung bereits ab einer Pulsbreite von 4 ms sehr
deutlich ist, wird dieser Wert für die weiteren Experimente gewählt.
20
Hefezellen ohne Glukose
∆ I/Imax (%)
16
12
8
4
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Pulsbreite tPB (ms)
Abb. 5.31: Abhängigkeit des Intensitätsverhältnisses ΔI/Imax von der Pulsbreite (n=3, U=±11 V)
Bei Abhängigkeitsuntersuchungen des Intensitätsverhältnisses von der Flankensteilheit
der Stimulationpulse zeigt sich, dass die Rechteckpulse mit einer Flankensteilheit von 2 ns
eine wesentlich deutlichere Intensitätsänderung und damit eine Manipulation des Metabolismus hervorrufen als vergleichbare Dreieckspulse (vgl. Abb. 5.32).
Durch elektrische Pulse kann der Energiestoffwechsel von Hefekulturen verändert werden.
Eine detaillierte Analyse des Einflusses von elektrischen Feldern kann durch die Stimulation von Hefezellen in zwei unterschiedlichen Energiezuständen untersucht werden.
Nach der Ernte besitzen die Zellen relativ wenig ATP und befinden sich in einem energiearmen Zustand. Durch die Zugabe von Glukose wird durch Glykolyse Energie (ATP)
gewonnen und die Zellen in einen energiereichen Zustand überführt. Beide Zellsysteme
werden mit Pulsen unterschiedlicher Amplitude (±3 V≤ U ≤±11 V) stimuliert (vgl.
Abb. 5.33). Ein Einfluss auf den Energiestoffwechsel in beiden Systemen kann erst für
Amplituden ≥±5 V detektiert werden. Interessanterweise zeigt sich, dass die Intensitätsänderung in dem System der energiearmen Hefezellen nach einem Stimulus immer
ausgeprägter ist als in dem energiereichen System.
114
5.2.1. Bestimmung der Stimulationsparameter von Hefezellen
6
5
∆ I/Imax (%)
4
3
2
1
0
1E-3
0.01
0.1
1
10
100
1000
Flankensteilheit (µs)
Abb. 5.32: Abhängigkeit des Intensitätsverhältnisses von der
Flankensteilheit (n=3, U=±10 V, tPB=4 ms)
Ursache für das empfindliche Verhalten der Zellen ohne Glukose könnte das geringe ATPDepot sein, was auf aktive Prozesse hindeutet, welche die elektrische Sensibilität der Zellen
beeinflussen. Die vorgenommenen Stimulationsexperimente an Hefezellzellen indizieren,
dass der Energiestoffwechsels, im speziellen die ATP-Produktion von Hefezellen, durch
elektrische Felder beeinflusst werden kann. Übereinstimmend mit dieser Beobachtung
wurde bereits 1981 von einer Beeinflussung der ATP-Herstellung in Mitochondrien
berichtet [Teissie et al., 1981]. Eine Sättigung der Intensitätsänderung für Hefezellen ohne
Glukose, ähnlich wie für die energiereichen Zellen (mit Glukose), durch eine Erhöhung der
20
mit Glukose
ohne Glukose
∆ I/Imax (%)
15
10
5
0
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Pulsamplitude (V)
Abb. 5.33: Abhängigkeit des Intensitätsverhältnisses von der Pulsamplitude
(tPB=4 ms) für Hefezellen mit und ohne Glukose (jeweils n=5)
115
5. Anregung von biologischen Systemen
Pulsamplitude über ±11 V ist nicht möglich, ohne elektrolytische Effekte zu verursachen,
da ab ±12 V eine Bläschenbildung einsetzt.
Eine Zellschädigung durch Elektroporation kann für Stimulationspulse mit U=±11 V und
einer Pulsbreite tPB=4 ms ausgeschlossen werden. In Anregungsversuchen mit Propidiumiodid [Deng et al., 2003] werden mit den gewählten Parametern nach 15-minütiger
Stimulation bei einem Pulsintervall von 30 s keine signifikanten Zellveränderungen beobachtet. Die berechnete Feldstärke der entwickelten Fingerelektrode von 7500 V·m-1 ist im
Vergleich zu den Feldstärken für eine Zellschädigung von 7.7·105 V·m-1 bis 30·105 V·m-1 zu
gering [Jakob et al., 1981; Schrive et al., 2006]. Um Hysterese- oder Ermüdungseffekten
während der Stimulation vorzubeugen, wird die Pulsamplitude, ausgehend von den hohen
Werten, in 1 V-Schritten reduziert und wieder auf den Startwert erhöht.
Abschließend werden die Stimulationsergebnisse bzw. die Intensitätsänderungen in Abhängigkeit der durch die Pulse induzierten Ladung betrachtet. Dabei berechnet sich die
Ladung, die durch den Puls induziert wird, nach Gl. (5.1) und ist das Produkt aus Pulsamplitude und -breite unter Beachtung der Flankensteilheit.
d Q=I d t=
U
dt
Z
I ,U , Z ∈ ℂ
1
Q= ⋅∫ U d t
Z
(5.1)
∆ I/Imax (bel. Einheiten)
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Variation der
Pulsbreite (ohne Glukose)
Amplitude (ohne Glukose)
Amplitude (mit Glukose)
Flankensteilheit
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Ladung Q (in mC)
Abb. 5.34: Abhängigkeit der Intensitätsänderung von der induzierten Ladung
Die Berechnung der Ladung in den vorherigen Stimulationsexperimenten ermöglicht eine
Analyse der Änderung der Fluoreszenz in Abhängigkeit der parameterbedingten induzierten Ladungsmenge (vgl. Abb. 5.34). Es zeigt sich, dass die Erhöhung der Pulsbreite,
116
5.2.1. Bestimmung der Stimulationsparameter von Hefezellen
-höhe und der Flankensteilheit die induzierte Ladungsmenge vergrößern. Die bei der
maximalen Pulsbreite von 10 ms induzierte Ladung ist etwa doppelt so hoch wie die bei
maximaler Pulsamplitude. Interessanterweise ist die hervorgerufene Intensitätsänderung
dabei gleich groß. Ursache für dieses Ergebnis kann eine zellbedingte Begrenzung des
NADH-Gehaltes und damit eine maximale Intensitätsänderung sein, die bei Erreichen
einer bestimmten Ladungsmenge möglich ist. Gegen diese Erklärung spricht, dass bei der
induzierten Ladung von ca. 45 mC verschiedene Intensitätsänderungen detektiert werden.
Trotz der Möglichkeit der direkten Beeinflussung des Stoffwechsels durch elektrische Pulse
kann beispielsweise durch Sauerstoffzugabe ein ähnlicher Effekt erreicht werden [Winfree,
1972]. In Stimulationsexperimenten unter Verwendung eines sauerstoffempfindlichen
Sensors wird dieses Gas nachgewiesen (Elektrolyse von Wasser), so dass eine sauerstoffbedingte Stoffwechselmanipulation nicht auszuschließen ist.
Die Experimente haben gezeigt, dass eine stoffwechselbeeinflussende Stimulation mit
Pulsen einer Amplitude ±5 V ≤ U ≤±11 V, einer Pulsbreite von ±1 ms ≤ tPB ≤±10 ms und
einer Flankensteilheit von 2 ns durchgeführt werden sollten. Ob die Beeinflussung dabei
nur durch Ladungsinduktion oder indirekt auch durch elektrolytische Generation von Sauerstoff erfolgt, ist Schwerpunkt weiterführender Untersuchungen.
5.2.2. Detektion der glykolytischen Oszillationen
Neben der Stimulation sollen die entwickelten Elektroden für die elektrische Detektion von
Oszillationen in Hefekulturen verwendet werden. Dabei soll die Aufnahme der glykolytischen Oszillationen von Hefezellen als ein Beispiel dienen, da deren oszillatorisches
Verhalten während der Glykolyse im Detail, z.B. die Frequenz und die Phase betreffend,
bekannt sind. Da die dielektrische Spektroskopie vielfältig, z.B. für die elektrische Analyse
von Zellkonzentrationen [Carvell and Turner, 2003 ], verschiedenen Zelltypen [Suehiro et
al., 2005] und hefezellbedingte Dispersionen [Asami and Yonezawa, 1996], eingesetzt
wird, erscheinen Impedanzmessungen vielversprechend zur Analyse der Glykolyse-Oszillationen.
Aufgrund des oszillatorischen Verhaltens des ATP-Gehaltes während der Glykolyse, welches den Ionentransport durch die Zellmembran beeinflusst, ist von einer sich periodisch
ändernden Leitfähigkeit innerhalb des Systems Zellen und Elektrolyt auszugehen. Um die
erwarteten Leitfähigkeitsänderungen zu analysieren, werden parallel zu den Fluoreszenzmessungen Impedanzmessungen mit 10 kHz, korrespondierend zu dem unteren
Frequenzbereich der β1-Dispersion der Zellmembran bzw. -wand [Asami and Yonezawa,
1996], durchgeführt. Die absoluten Widerstands- und Kapazitätssignale werden durch die
117
5. Anregung von biologischen Systemen
Sedimentation der Hefezellen dominiert, die drei bis fünf Größenordnungen über den
oszillationsbedingten Leitfähigkeitsänderungen liegen. Um dennoch das oszillatorische
Verhalten zu untersuchen, wird das sedimentationsbedingte Hintergrundsignal simuliert
und von den Messgrößen subtrahiert, um die Oszillationen zu visualisieren. Die Oszillationen können bei der Untersuchung von Hefezellen nur im Widerstandssignal mit
einem Signal-zu-Rausch-Verhältnis von 7 dB identifiziert werden (vgl. Abb. 5.35 a). Im
Kapazitätssignal wird aufgrund des geringen Signal-zu-Rausch-Verhältnisses kein periodisches Verhalten detektiert.
Hefezellen
0.2
0.0
0.10
-0.2
-0.4
0.05
-0.6
0.00
-0.8
-1.0
-0.05
-1.2
-0.10
0
200
400
Zeit t (s)
-1.4
600
0.2
b)
Hefeextrakt
0.3
Hintergrundkorrigierter Widerstand (Ω)
a)
Hintergrundkorrigierte Kapazität (nF)
Hintergrundkorrigierte Kapazität (nF)
0.15
Hintergrundkorrigierter Widerstand (Ω)
Um diese Hypothese zu überprüfen, werden in einem Kontrollexperiment das Widerstands- und Kapazitätssignal von zell- und membranfreiem Hefeextrakt nach TrehaloseZugabe aufgenommen. Durch die Verwendung von Hefeextrakt können membrangebundene Leitfähigkeitsänderungen ausgeschlossen werden. Trotz des Fehlens von
Zellwänden können sowohl im korrigierten Widerstand- als auch im korrigierten Kapazitätssignal glykolyse-induzierte Oszillationen, mit einem Signal-zu-Rausch-Verhältnis von
6 dB bzw. 7 dB, detektiert werden. Also können mit Impedanzmessungen bei 10 kHz die
Änderungen der Leitfähigkeit bzw. der Dielektrizitätskonstanten des Mediums, wie von
Asami und Yonezawa (1996) beschrieben, detektiert werden.
0.1
0.2
0.0
-0.1
0.1
-0.2
-0.3
0.0
-0.4
-0.5
0
40
80
120
Zeit t (min)
Abb. 5.35: Impedanzmessungen der glykolytischen Oszillationen von
a) Hefezellen und b) Hefeextrakt nach einer Hintergrundkorrektur
Der Vergleich der optischen und Widerstandsmessungen ergibt eine Phasendifferenz von
180° für Hefezellen (Abb. 5.36) und 50° für Hefeextrakt (Abb. 5.37). Dieses unterschied-
118
5.2.2. Detektion der glykolytischen Oszillationen
liche Verhalten korreliert mit den aus der Literatur bekannten Phasenbeziehungen der
Zwischenprodukten der Glykolyse nach Zuckerzugabe sowohl in Hefeextrakt als auch in
Hefezellen [Betz und Chance, 1965; Hess et al., 1969]. So existieren mindestens zwei
Gruppen von Zwischenprodukte sowohl im oberen als auch im unteren Teil der Glykolyse,
die eine Winkeldifferenz von 180° aufweisen. So oszillieren im unteren Teil der Glykolyse
ATP und NADH um 180° phasenverschoben. Zusätzlich gibt es zwischen der oberen und
unteren Glykolyse eine variable Phasenverschiebung.
0.0
Hefezellen
180
φ = 180°
160
-0.1
-0.2
140
-0.3
-0.4
120
-0.5
100
0
50
100
150
200
Zeit t (s)
250
300
350
-0.6
Hintergrundkorrigierter Widerstand (Ω)
Relative Fluoreszenz (bel. Einheiten)
Die Ergebnisse der Impedanzmessungen indizieren sowohl die feste als auch die zusätzliche Winkeldifferenz. Die Verschiebung von 180° ist zwischen dem Widerstands- und
NADH-Fluoreszenzsignal von Hefezellen zu bestimmen. Im Fall von Hefeextrakt tritt die
variable, hier 50° groß, Winkeldifferenz zwischen dem Widerstand und der NADH-Fluoreszenz auf. Dabei wird das unterschiedliche Verhalten von Hefezellen und Extrakt wie
folgt interpretiert: Die Konzentrationsänderungen des ATP regulieren ATP-abhängigen K+Kanäle in der Zellmembran von Hefezellen [Bertl et al., 1998], was zu ATP-abhängigen
Änderungen der Membrankapazität und des -widerstandes führt. Diese periodischen
Änderungen beeinflussen direkt die Impedanz des Systems Elektrolyt-Hefezellen. Da die
periodischen Änderungen nur im Widerstandssignal auftreten, ist von einer dominierenden Oszillation der Membranleitfähigkeit auszugehen.
Abb. 5.36: Vergleich der optisch und elektrisch aufgenommenen glykolytischen Oszillationen
von Hefezellen mit einer Periode von 45 s und einer Winkeldifferenz von φ = 180°
Da der Hefeextrakt frei von Zellmembranbestandteilen ist, können die detektierten Oszillationen nicht durch sich ändernde Eigenschaften der Membran ausgelöst werden.
Ursache für die Oszillationen ist wahrscheinlich die periodische Konzentrationsänderung
119
5. Anregung von biologischen Systemen
0.20
Hefeextrakt
200
φ = 50°
0.15
0.10
150
0.05
100
0.00
50
Hintergrundkorrigierter Widerstand (Ω)
Relative Fluoreszenz (bel. Einheiten)
von Ionen und Dipolen der glykolytischen Edukte und Produkte, die sowohl die Kapazität
als auch den Widerstand des Gesamtsystems beeinflussen. Bekannterweise oszillieren
Konzentrationen der Zuckerphosphate in beiden Abschnitten der Glykolyse, im oberen Teil
jedoch mit höherer Amplitude. Die Winkeldifferenz von 50° kann mit der variablen Phasenverschiebung zwischen dem oberen und dem unteren Glykolyseabschnitt [Hess et al.,
1969] erklärt werden und bestätigt die Annahme, dass die Konzentrationsänderungen,
speziell der Zuckerphosphate, mittels Impedanzmessungen detektiert werden.
-0.05
0
20
40
60
80
100 120 140 160
Zeit t (min)
Abb. 5.37: Vergleich der optisch und elektrisch aufgenommenen glykolytischen Oszillationen
von Hefeextrakt mit einer Periode von 11 min und einer Winkeldifferenz von φ = 50°
Mit einer abschließenden Fourier-Transformation der optischen und elektrischen Signale
der Hefezellen und des Hefeextrakt werden die Oszillationsfrequenzen bestimmt
(Abb. 5.38). Für die Hefezellen ergeben sich sowohl für das NADH- als auch das Widerstandssignal eine Frequenz von f = 0.022 Hz, was einer Periode von 45 s entspricht und
sehr gut mit den Werten der Literatur (>30 s [Betz und Chance, 1965] bzw. 40 s [Richard
et al., 1996]) übereinstimmt. Nach der Transformation der Messwerte des Hefeextrakts
kann eine Periode der glykolytischen Oszillationen von 11 Minuten (f = 0.0016 Hz), in
Übereinstimmung mit bekannten Werten (13 min [Mair et al., 2006] und 8.6 min [Hess et
al., 1969], bestimmt werden.
120
5.2.2. Detektion der glykolytischen Oszillationen
a)
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
-1
10
t = 45s
-2
10
1
10
Widerstand
NADH-Signal
-3
10
0
10
b)
-3
120
8.0x10
Hefeextrakt
-3
Widerstand
Amplitude
100
2.0x10
60
20
0
0.000
-3
4.0x10
-3
80
40
6.0x10
Kapazität
t = 11min
-11
2.0x10
0.0
Amplitude
Amplitude
Hefezellen
Amplitude
0.00
2
10
Frequenz (Hz)
NADH-Signal
-11
0.001
0.002
0.003
-2.0x10
0.004
Frequenz (Hz)
Abb. 5.38: Fourier-Transformation der optischen und elektrischen
Oszillationen von Hefezellen a) und Hefeextrakt b)
121
5. Anregung von biologischen Systemen
5.3. Untersuchungen zur Bioverträglichkeit
Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Entwicklung von einfachen planaren Elektrodenstrukturen zur Stimulation von lebenden Zellen in vitro. Die Verwendbarkeit der 2dElektroden ist jedoch begrenzt und gerade für Implantationszwecke in Tieren nicht
geeignet. Aus diesem Grund wird versucht ein alternatives Materialsystem zu finden, mit
dem Ableit- und Stimulationsversuche in vivo möglich sind. Da gerade GaN-basierte Halbleiterbauelemente vielversprechend für die Anregung von Herzzellen und Detektion der
Zellsignale sind [Steinhoff et al., 2005], werden GaN- und AlGaN-Schichten auf ihre
Bioverträglichkeit untersucht. In einem ersten Schritt werden dabei Neuronen auf die
Halbleiterschichten plattiert und 14 Tage im Inkubator kultiviert.
Abb. 5.39: Ungestörte Ausbildung von Neuronennetzwerken auf Halbleiteroberflächen
a) AlGaN-Oberfläche, b) GaN-Oberfläche nach 14 DIV (DAPI-Färbung)
Das Netzwerk bildet sich ungestört aus, und es treten weder im Fall von AlGaN noch bei
GaN toxische Reaktionen oder andere Zellveränderungen auf (vgl. Abb. 5.39). Da bei
dissoziierten Netzwerken kein Einfluss der Halbleitermaterialien festgestellt wird, kann
mit Implantationsversuchen in mongolischen Wüstenrennmäusen (Gerbils) begonnen
werden. Drei adulten Tieren werden jeweils eine GaN-Schicht auf Silizium(111) und ein
Stück PtIr-Draht für 4 Wochen implantiert. Der PtIr-Draht dient dabei als Referenzprobe,
bei der keine toxischen Reaktionen auftreten, sondern nur eine Glia-Narbe beobachtet
wird. Nach Ende des Versuchzeitraums werden die Proben explantiert, 50 µm dünne Hirnschnitte angefertigt und mit Kresylviolettacetat (0.5%, Firma Aldrich) gefärbt (NisslFärbung). Da der Farbstoff sich an basophile Verbindungen wie RNA und DNA anlagert,
werden die Somata blau bzw. violett gefärbt. Mit dieser Methode können nur toxische und
starke Gewebereaktionen detektiert werden, was jedoch für erste Biokompatibilitätsversuche hinreichend ist.
122
5.3. Untersuchungen zur Bioverträglichkeit
Abb. 5.40: Nissl-Färbung eines Hirnschnittes nach vierwöchiger Implantation von GaN und PtIr
bei Ausbildung einer Glia-Narbe um die Implantate ohne Entzündungsreaktionen
Bei der Analyse der Nissl-Färbung des Kortex im Bereich der Implantate kann keine Entzündungsreaktion beobachtet werden (vgl. Abb. 5.40). Die nach einer Implantation
auftretende charakteristische Bildung von einer Glia-Narbe ist in beiden Gebieten zu
erkennen. Dabei kann anhand der Glia-Vernarbung nicht zwischen der Zellschädigung von
PtIr und GaN unterschieden werden. Der geschädigte Bereich um das GaN-Implantat ist
aufgrund des größeren Probenstückes ausgedehnter. Während der Implantationszeit von 4
Wochen zeigte keines der Gerbils Verhaltensauffälligkeiten, so dass von einer Bioverträglichkeit von GaN ausgegangen werden kann.
Nach der Explantation wird die GaN-Schicht unter dem Mikroskop auf Oberflächenschäden untersucht. Nach einer Reinigung in Azeton befinden sich noch stark anhaftende
Zellrückstände auf dem GaN, die erst mit Piranha H2SO4 : H2O2 : H2O (4:1:1) entfernt
Abb. 5.41: Mikroskopische Aufnahme einer 4 Wochen implantierten GaN-Schicht,
a) mit Zellrückständen, b) nach dem Ätzen mit Piranha (H2SO4 : H2O2 : H2O; 4:1:1)
123
5. Anregung von biologischen Systemen
werden können. Auf der freigeätzten GaN-Oberfläche sind keine mikroskopisch sichtbaren
Schädigungen erkennbar. Weiterführende Untersuchungen zur elektrischen Charakterisierung der Oberflächen sollen bei einer ausführlichen Versuchsreihe mit AlGaN, AlN,
SiN, InGaN und InN durchgeführt werden. Die Silizium-Rückseite der GaN-Probe weist
jedoch starke Degradationsspuren (Abb. 5.42) auf.
Abb. 5.42: Mikroskopische Aufnahme einer 4 Wochen implantierten
Silizium-Schicht
Vor der Implantation von Bauelementen, z.B. GaN-basierten Transistoren, sollte daher das
Silizium-Substrat entfernt werden. Da das Hirngewebe sehr empfindlich auf eine Temperaturerhöhung reagiert, muss die Verlustleistung der implantierten Transistoren möglichst
Null sein. Durch eine gute Isolation der Transistoren können temperaturbedingte Zellschäden vermieden werden. Die für die Isolation von Bauelementen gebräuchlichen
Polymide müssen daher auf ihre Bioverträglichkeit getestet werden.
Abb. 5.43: Mikroskopische Aufnahmen einer Polymidoberfläche,
a) vor der Implantation: glatte Schicht mit einzelnen Gräben,
b) nach vierwöchiger Implantation: tiefe Gräben und rauhe Oberfläche
124
5.3. Untersuchungen zur Bioverträglichkeit
Daher werden zwei verschiedene Polymide in der o.g. Präparation ebenfalls in drei adulte
Gerbils implantiert. Da sich auch hier nur die für Operationsverletzungen typische GliaNarbe ausbildet, scheinen die Polymide biokompatibel zu sein. Bei dem Vergleich der
explantierten Polymid-Proben mit dem Ausgangsmaterial fällt auf, dass die Oberfläche des
Polymids beschädigt und teilweise aufgelöst ist (Abb. 5.43). Bevor fertig prozessierte Bauelemente zur Detektion von Zellsignalen oder zur Stimulation in vivo eingesetzt werden,
muss gewährleistet sein, dass die Isolationsmaterialien inert gegenüber den chemischen
Einflüssen des Gehirns sind. Eine mögliche Alternative könnten Photolacke sein, da diese
bei Glia-Zellen keine toxischen Reaktionen hervorrufen (vgl. Abb. 3.5).
125
5. Anregung von biologischen Systemen
126
6. Zusammenfassung
6.
Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war die Realisierung einer einfachen, kostengünstigen und biologisch
vielfältig einsetzbaren Stimulationselektrode, mit der an verschiedenen Zellkulturen
wissenschaftlich interessante Fragestellungen untersucht werden können.
Unter Berücksichtigung der zwingend erforderlichen Eigenschaften der optischen Transparenz, der elektrischen Leitfähigkeit, der Bioverträglichkeit und der Spannungsfestigkeit
mussten dazu Elektroden konzipiert werden, die in Zellkulturen verwendet werden
können. Für die Stimulation von neuronalen in vitro-Netzwerken musste die Elektrode so
integriert werden, dass die Netzwerkmorphologie nicht beeinflusst wird. Aus diesem
Grund wurden planare, zweidimensionale Elektroden entwickelt, die direkt auf den standardmäßig verwendeten Deckgläschen der Neuronenpräparation abgeschieden werden. In
Vorversuchen wurden die Metallelektroden mittels Sputterdepostion auf den Deckgläsern
aufgebracht, wobei nur bei Verwendung einer zusätzlichen Haftschicht die Netzwerke
unfaszikuliert auswachsen. Aufgrund der an der Zellkultur durchzuführenden Standarduntersuchungsmethoden mittels Durchlichtmikroskopie musste der Elektrodenaufbau so
dimensioniert werden, dass eine optische Transmission gewährleistet war. Da die dünnsten, durch Sputterdepostion herzustellenden Schichten jedoch keine signifikante optische
Transparenz aufwiesen, wurden alle folgenden Elektrodenstrukturen ausschließlich mittels
Elektronenstrahlverdampfen abgeschieden. Hinsichtlich der Homogenität der elektrischen
Eigenschaften der Elektrode war eine geschlossene Oberfläche anzustreben. Toxische
Wechselwirkungen wurden durch die Verwendung der bioverträglichen Metalle Titan, als
Haftschichtmaterial, und Gold, als Elektrodenmaterial, ausgeschlossen. Unter Berücksichtigung dieser Aspekte wurde eine 5 nm dünne Titan-Haftschicht und eine 50 nm
dünne Gold-Deckschicht als der optimale Schichtaufbau bestimmt. Die für eine Depolarisation der Zellmembran notwendige Feldstärke konnte unter Ausschluss von irreversiblen,
elektrolytischen Effekten durch eine ineinandergreifende Elektrodenstruktur mit einem
nominellen Abstand der Einzelelektroden von 300 µm erreicht werden. Der Bahnwiderstand einer Elektrode wurde dabei reproduzierbar kleiner als 50 Ω bestimmt.
127
6. Zusammenfassung
Das elektrische Verhalten des Systems, bestehend aus Elektroden, Elektrolyt und Zellen,
wurde für Gleich- und Wechselspannungen frequenzabhängig analysiert. Mit Hilfe eines
sukzessiv optimierten Ersatzschaltbildes konnten die Impedanzmessungen modelliert und
Wechselwirkungsvorgänge charakterisiert werden. Durch die Kombination von R-C-Gliedern konnte zudem das Frequenzverhalten der Elektroden unter Berücksichtigung der
Strompfade in sehr guter Näherung beschrieben werden. Durch Hinzufügen der Elektrolyten aCSF und KH2PO4 wurden die elektrischen Eigenschaften des Systems signifikant
verändert. Insbesondere erhöhten die freibeweglichen Ladungsträger deutlich die Leitfähigkeit des Gesamtsystems. Erst unter Berücksichtung der frequenzabhängigen, sich
zwischen Metalloberfläche und Elektrolyt ausbildenden Doppelschicht in Kombination mit
R-C-Gliedern war eine Simulation der Impedanzmessungen möglich. Lediglich bei der
Modellierung der Impedanz von Phosphatpuffer und Elektroden zeigten sich für Frequenzen >10 kHz Abweichungen von den Messwerten. Bei der Betrachtung des Systems mit
Neuronen wurde keine Veränderung der elektrischen Eigenschaften beobachtet. Ursache
dafür ist der geringe additive Anteil der Membrankapazitäten bzw. -widerstände des
zweidimensionalen Netzwerkes im Vergleich zum Elektrolytvolumen. Die Zugabe von
suspensierten Hefezellen (ca. ein Drittel des Volumens) führte zu zusätzlich auftretenden
α- und β1-Dispersionen, die charakteristisch für Hefezellen sind.
Nach der Entwicklung sowie der elektrischen Charakterisierung der Elektroden wurde
deren Anwendbarkeit an zwei verschiedenen biologischen Systemen, dissoziierten
Neuronennetzwerken und Hefezellen, getestet. Die Stimulationsparameter für eine hohe
Anregungseffizienz wurden für beide Zellsysteme durch Variation der Pulsbreite, der Pulsamplitude und der Flankensteilheit bestimmt.
Eine synchrone Netzwerkanregung der dissoziierten Neuronenkulturen konnte durch
Anlegen eines biphasigen, rechteckigen Doppelpulses der Amplitude ±2.2 V und der Pulsbreite tPB=1 ms erreicht werden. Die beobachtete Aktivität setzte sich dabei kumulativ aus
direkt stimulierten und durch synaptische Transmission angeregten Zellen zusammen. Da
für Untersuchungen des Anregungsmechanismus nur die direkt stimulierten Neuronen
eine Relevanz besitzen, wurden die Glutamat- und GABAA-Neurotransmitterrezeptoren
chemisch blockiert. Um ein vergleichbare Resonanz wie in nichtblockierten Kontrollkulturen nach einem Stimulus zu erhalten, musste mit einem 10fach Puls der Amplitude
±2.2 V angeregt werden. Durch spezielle Präparationstechniken wurden Netzwerkbereiche
mit unterschiedlicher Axondichte entlang der Elektrodenkanten generiert. Da lokale
Potentialmessungen übereinstimmend für Gleich- und Wechselspannung den höchsten
Gradienten an den Elektrodenkanten bestimmten, ist hier die größte Anregungseffizienz
zu erwarten. Mit Hilfe von Netzwerkbereichen, die 1.5 mm entfernt von den Elektroden
platziert werden, konnte eine axonale Anregung (antidrome Stimulation) in dissoziierten
Kulturen nachgewiesen werden. Die Anregungseffizienz nach einem Stimulus korrelierte
128
6. Zusammenfassung
dabei direkt mit der Axondichte über den Elektrodenkanten. Durch einen Vergleich mit
unstrukturierten Kontrollkulturen zeigte sich, dass eine elektrische Direktanregung von
weniger als 20% der Gesamtneuronen hinreichend für das Auslösen von synchroner Netzwerkaktivität war.
Kritisch muss angemerkt werden, dass die Empfindlichkeit des Ca2+-Imaging zur Detektion
von neuraler Aktivität nicht ausreicht, um einzelne Aktionspotentiale zu messen. Bei der
direkten Ableitung von Zellsignalen zeigte sich, dass bereits mit Pulsen <±1 V Aktionspotentiale ausgelöst werden konnten. Da der Untersuchungsschwerpunkt jedoch nicht die
Bestimmung des Schwellwertes zum Auslösens von Zellaktivität war und bei höheren
Amplituden keine Schädigung der Neuronen auftrat, ist dieser Aspekt bei der Bestimmung
des Anregungsmechanismus irrelevant.
Zusätzlich zu den Stimulationsversuchen in Neuronen wurde die Elektrode verwendet, um
den Energiestoffwechsel von Hefezellen zu manipulieren. Übereinstimmend mit Beobachtungen an Mitochondrien [Teissie et al., 1981] konnte gezeigt werden, dass elektrische
Felder den ATP-Gehalt beeinflussen. Dabei wurde eine signifikante Veränderung der
NADH-Fluoreszenz und damit des Stoffwechsels für einzelne biphasige Rechteckpulse der
Amplitude ±11 V und Pulsbreite tPB=4 ms erreicht. Während der Stimulation wurde mit
einem Gassensor elektrolytisch entstandener Sauerstoff detktiert, der ebenfalls die
Stoffwechselprozesse von Hefen beeinflusst [Winfree, 1972]. Daher konnte nicht zwischen
einer direkten Beeinflussung des Stoffwechsels durch elektrische Felder und einer
indirekten durch Sauerstoffgeneration unterschieden werden.
Neben der Einkopplung von elektrischen Feldern in lebende Zellen konnten mit der
entwickelten Elektrode die glykolytischen Oszillationen von Hefezellen und von Hefeextrakt detektiert werden. Dabei ergaben die Analyse der Impedanzmessungen und der
optischen NADH-Messungn übereinstimmend eine Oszillationsperiode für Hefezellen
(45 s) bzw. Hefeextrakt (11 min). Bei Hefezellen resultierten die glykolysebedingten
Konzentrationsänderungen von ATP in einer periodischen Veränderung der Systemimpedanz, die auf Variationen der Membranleitfähigkeit zurückzuführen waren. Bei
Hefeextrakt, das frei von Zellmembranbestandteilen ist, wurden die mit Impedanzmessungen detektierten Oszillationen den Konzentrationsänderungen von Zuckerphosphaten
zugeordnet.
Aufgrund der zweidimensionalen Struktur war die entwickelte Elektroden nicht für in
vivo-Untersuchungen geeignet. Halbleitermaterialien mit einer chemisch inerten Oberfläche erscheinen vielsprechend für Anwendungen in Gehirn. Da nach einer vierwöchigen
Implantationszeit weder GaN noch AlGaN toxische Reaktion hervorriefen, können mit
diesen Halbleitern Transistoren zur Untersuchung von Hirnaktivität hergestellt werden.
129
6. Zusammenfassung
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144
8. Anhang
8.
Anhang
8.1. Ätzen der Oberfläche der Deckgläschen
Tab. 8.1: Oberflächenbehandlung der Deckgläschen
Vorgang
Chemische Substanz
Zeitdauer
Lagern
2N-NaOh
1h
3 x Spülen
Dest. Wasser
Lagern
70% HNO3
3 x Spülen
Dest. Wasser
Lagern
9N-HCl
10 x Spülen
Dest. Wasser
Lagern
100% Ethanol
1 x Spülen
Dest. Wasser
Lagern
80% Ethanol
Trocken
3d
1h
½h
Bis zur Verwendung
2h
8.2. Zusammensetzung der Kulturmedien der
Neuronen
Hank’s, steril filtriert und ohne Calcium und Magnesium
Die Stammlösung (Invitrogen, Karlsruhe) war 10fach konzentriert. Nach einer 1:10 Verdünnung wurde noch eine HEPES-Lösung (1 M) zugesetzt, die durch Lösen von 4.76 g
HEPES in 20 ml destilliertem Wasser entstand. Die HEPES-Lösung wurde vor ihrer
Zugabe zur Stammlösung mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 7.4 eingestellt.
145
8. Anhang
Dulbecco’s Modification Eagle Medium (DMEM; Invitrogen, Karlsruhe), steril filtriert
Um den pH auf 7.4 einzustellen, wurde Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3) dazugegeben
und gegebenenfalls mit 1 N HCl oder 1 N NaOH korrigiert. Für die Herstellung
serumhaltigen DMEMs wurden 10% fetales Kälberserum (Pan Systems, Aidenbach)
dazugegeben.
Ham’s F12 (Invitrogen, Karlsruhe), steril filtriert
Der pH wurde mit NaHCO3 eingestellt und gegebenenfalls mit 1 N HCl korrigiert.
N2- (Bottenstein and Sato, 1979), steril filtriert
Dieses Medium bestand aus folgenden Substanzen:
75% DMEM, 25% Ham’s F12 und Supplement N2 (Invitrogen, Karlsruhe), das aus
10 µg/ml Insulin, 10.7 ng/ml Natriumselenit, 32 µg/ml Putrescin und 14 ng/ml
Progesteron bestand. Dieser erworbenen Substanz wurden noch 20 ng/ml Triiodo-LThyronin und 0.2 µg/ml Corticosteron (beide Sigma, Taufkirchen) hinzugefügt.
Hank’s-Trypsin-EDTA-Gemisch (Invitrogen, Karlsruhe)
Die 10fachx konzentrierte Lösung wurde 1:10 in Hank’s verdünnt und verwendet.
Trypsin Inhibitor/DNAse Lösung, steril filtriert
Hierfür wurden 0,52 mg/ml Trypsin Inhibitor (aus der Sojabohne; Sigma, Taufkirchen),
0.04 mg/ml DNAse I (Sigma) und 3 mg/ml bovines Serumalbumin (Invitrogen, Karlsruhe)
in DMEM gelöst.
Tab. 8.2: Stoffkonzentrationen von aCSF
NaCl
Konzentration
(g/l)
8.182 (≡0.14 M)
KCl
0.373
CaCl2 x H2O
0.221
NaH2PO4 x H2O
0.172
Glukose x H2O
3.963 (≡20 mM)
Inhaltsstoff
146
8.2. Zusammensetzung der Kulturmedien der Neuronen
Tab. 8.3: Stoffkonzentrationen von DMEM [Life Technolgies, 2001]
Inhaltsstoff
NaCl
Konzentration
(mg/l)
6400 (≡0.1 M)
KCl
400
CaCl2
200
Fe(NO3)
0.1
NaH2PO4 x H2O
125
MgSO4
97.67
D-Glukose
4500 (≡ 25mM)
Phenolrot
15
L-Arginin x HCl
84
L-Cystin x 2HCl
62.75
L-Glutamin
584
Glycin
30
L-Histidin HCl x H2O
42
L-Isoleucin
105
L-Leucin
105
L-Lysin x HCl
146
L-Methionin
30
L-Phenylalanin
66
L-Serin
42
L-Threonin
95
L-Tryptophan
16
L-Tyrosin (Di-Natrium-Salz)
104.20
L-Valin
94
D-Ca-Pantothenat
4
Cholinchlorid
4
Folsäure
4
I-Inositol
7.2
Nikotinamid
4
Pyridoxine HCl
4
Riboflavin
4
Thiamin x HCl
4
147
8. Anhang
8.3. Zusammensetzung der Nährmedien für die
Hefekulturen
Tab. 8.4: Stammlösungen des Nährmediums
Salze A
(50fach konzentriert)
(NH4)2SO4
H2PO4
KCl
MgSO4 x 7 H2O
Salz B
(200fach konzentriert)
CaCl2 x 2 H2O
Spurenelemente
(1000fach konzentriert)
FeCl3 x 6 H2O
MnSO4
Vitamine
(1000fach konzentriert)
Pyridoxine/HCl
Thiamine
Biotin
Ca-Pantothenate
myo-Inositol
9.375%
2.75 %
2.125 %
0.625 %
Menge je
200 ml
18.75 g
5.5 g
4.25 g
1.25 g
Menge je 50 ml
2.5%
0.85 g
Menge je 50 ml
0.25%
0.25%
125 mg
125 mg
Menge je 100
ml
25 mg
25 mg
2.5 mg
350 mg
1000 mg
Steril filtern
Zitronensäure
(20fach konzentriert)
Monohydrat
0.3M
Menge je 500
ml
31.52 g
(pH 5 mit festen KOH-Pellets)
Casein-Hydrolysat
(25fach konzentriert)
10%
Glukose
(25fach konzentriert)
50%
20 min autoklavieren
Tryptophan
(5.5fach konzentriert)
148
Menge je 375
ml
37.5 g
Menge je
400 ml
200 g
1.638 g in 2N
KOH lösen
8.3. Zusammensetzung der Nährmedien für die Hefekulturen
Tab. 8.5: Herstellung des Nährmediums und Hefeaufzucht
Substanzen und Arbeitsschritte
Hefeextrakt
Salze A
Spurenelemente
Citronensäure
Casein-Hydrolyst
Salz B
Tryptophan in KOH
Menge für 9.1 l
9.1 g
182 ml
9.1 ml
455 ml
364 ml
45.5 ml
1.638 g
mit destilliertem Wasser auffüllen auf
ph 5.5 mit festem KOH Pellets
Überführung in Fermenter und auffüllen auf
Durchmischen
4500 ml
Entnahme der Vorkultur in Schüttelkolben
Sterilisation der Vorkultur
Zugabe von Antischaummittel zur Hauptkultur
Sterilisation der Hauptkultur
STERIL zur Vorkultur geben:
Glukose
Vitamine
Animpfen der Vorkultur mit einer Impfhefe
Wachsen der Vorkultur
nach ca. 18 Stunden Zellzahlzählung
8727 ml
95.4 ml
15 min, 120 °C; 1.2 bar
1 ml
60 min, 120 °C; 1.2 bar
4 ml
0.1 ml
28 °C, 170 U/min
STERIL zur Hauptkultur geben:
Glukose
360 ml
Vitamine
9 ml
5
Animpfen der Hauptkultur mit 2.5x10 Zellen/ml
Wachsen der Hauptkultur
28 °C, 550 U/min, 600 l/h
nach ca. 16 Stunden Glukosetest
Glukose < 0,1 mM  Ernte
149
8. Anhang
8.4. Ergänzungen zur elektrischen Charakterisierung
± 5.5 V
vor Stimulation
Elektrode
100 µm
Elektrolyt
± 6.0 V
± 6.5 V
Elektrode
100 µm
± 7.0 V
Elektrolyt
Elektrode
± 7.5 V
Elektrode
100 µm
Lösung
Elektrolyt
Abb. 8.1: Auftreten von Elektrolyseeffekten in aCSF mit steigender Pulsamplitude des biphasigen
Doppelpulses
150
8.4. Ergänzungen zur elektrischen Charakterisierung
Serienkapazität CS (nF)
4
2
200
1
0.8
0.6
100
80
0.4
60
ohne Glukose
mit Glukose
40
2
3
10
10
4
10
0.2
5
2
10
10
3
10
4
10
-1
Kreisfrequenz ω (s )
5
10
Serienwiderstand RS (kΩ )
6
400
6
10
Abb. 8.2: Einfluss der Glukose auf die Impedanzmessungen von 0.1 M KH2PO4 (pH-Wert 6.5)
Anzahl angeregter Zellen
8.5. Einfluss der Flankensteilheit auf die Anzahl
angeregter Neuronen
25
100%
20
15
10
5
0
1
10
100
Flankensteilheit (µs)
Abb. 8.3: Abhängigkeit der angeregten Zellen von der
Flankensteilheit (U=±2.2 V, tPB=1 ms) einer
Neuronenkultur (13 DIV)
151
8. Anhang
8.6. Dauerstimulationsexperimente
100 µm
100 µm
Abb. 8.4: Vergleich der 24h-stimulierten Kultur direkt neben den Elektroden (links) mit einer
unstimulierten Schwesterkultur (rechts), beide 13 DIV. Die Stimulation erfolgte alle
60 Sekunden mit einem biphasigen Einfachpuls der Amplitude U=±2.2 V mit tPB=1.5 ms.
100 µm
100 µm
Abb. 8.5: Vergleich der 48h-stimulierten Kultur direkt neben den Elektroden (links) mit einer
unstimulierten Schwesterkultur (rechts), beide 14 DIV. Die Stimulation erfolgte alle
60 Sekunden mit einem biphasigen Einfachpuls der Amplitude U=±2.2 V mit tPB=1.5 ms
152
8.6. Dauerstimulationsexperimente
50Ω Eingangswiderstand
50Ω Eingangswiderstand
1kΩ
Messzelle
Messzelle
47Ω
Abb. 8.6: Messaufbau zur Detektion von Stromspitzen (Tiefpass und Hochpass)
Die Pfeile repräsentieren die Messpunkte des Oszilloskops.
Puls mit ±2.2V
(1:10 Tastteiler)
Spannung U (V)
0.2
0.1
0.0
-0.1
Ausgangssignal
Messsignal
-0.2
0
1
2
3
Zeit t (ms)
Abb. 8.7: Mit dem Tiefpass detektiertes Signal, keine Spannungsspitzen
2.5
Spannung U (V)
2.0
Ausgangssignal
Messsignal
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-1
0
1
2
3
4
Zeit t (ms)
Abb. 8.8: Mit dem Hochpass detektiertes Signal, keine Spannungsspitzen
153
8. Anhang
154
Lebenslauf
Lebenslauf
Persönliche Angaben
Name:
Antje Reiher
Geburtstag:
24.07.1978
Geburtsort:
Stendal
Anschrift:
Schillerstr. 5
39517 Tangerhütte
Staatsangehörigkeit:
Deutsch
Schulische Ausbildung
1985-1990
POS „Heinrich Rieke“ in Tangerhütte
1990-1997
„Altmärkisches Gymnasium“ Tangerhütte
1997
Abitur
Hochschulstudium
1997-2002
Studium der Physik (Diplom) an der Otto-vonGuericke-Universtiät Magdeburg
seit 19.11.02
akademischer Titel „Diplom-Physikerin“
155
Lebenslauf
Beruflicher Werdegang
156
11/02-04/05
wissenschaftliche Mitarbeiterin an der
Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg,
Fakultät für Naturwissenschaften,
Institut für Experimentelle Physik,
Abteilung Halbleiterepitaxie
05/05-07/05
Graduierten-Stipendium des Landes Sachsen-Anhalt
08/05-08/07
wissenschaftliche Mitarbeiterin an der
Otto-von-Guericke Universität Magdeburg,
Fakultät für Naturwissenschaften,
Institut für Experimentelle Physik,
Abteilung Halbleiterepitaxie
Publikationsliste
Publikationsliste
Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht
A. Reiher, S. Günther, A. Krtschil, H. Witte, T. Opitz, A. de Lima, T. Voigt und A. Krost
(2005), In vitro stimulation of neurons by a planar Ti-Au-electrode interface, Appl.
Phys. Lett. 86, 103901
A. Reiher, C. Warnke, S. Radoch, H. Witte, A. Krtschil, T. Mair, S.C. Müller und A. Krost,
(2006), Electrical Stimulation of the Energy Metabolism in Yeast Cells Using a Planar
Ti-Au-Electrode Interface, J. Bioenerg. Biomembranes 38, 143
weitere Veröffentlichungen
J. Bläsing, A. Reiher, A. Dadgar, A. Diez und A. Krost (2002), The origin of stress
reduction by low-temperature AlN interlayers, Appl. Phys. Lett. 81, 2722
A. Dadgar, M. Poschenrieder, J. Bläsing, O. Contreras, F. Bertram, T. Riemann, A. Reiher,
M. Kunze, I. Daumiller, A. Krtschil, A. Diez, A. Kaluza, A. Modlich, M. Kamp, J.
Christen, F.A. Ponce, E. Kohn und A. Krost (2002), Bright future for GaN-on-Si,
Proceedings of the 202nd ECS meeting 2002, Vol. 2002-14, 301
A. Reiher, J. Bläsing, A. Dadgar, A. Diez und A. Krost (2003), Efficient stress relieve in
GaN heteroepitaxy on Si(111) by low-temperature AlN interlayers, J. Cryst. Growth
248, 536
A. Dadgar, M. Poschenrieder, J. Bläsing, O. Contreras, F. Bertram, T. Riemann, A. Reiher,
M. Kunze, I. Daumiller, A. Krtschil, A. Diez, A. Kaluza, A. Modlich, M.Kamp, J.
Christen, F.A. Ponce, E. Kohn und A. Krost (2003), MOVPE growth of GaN on
Si(111) substrates, J. Cryst. Growth 248, 556
157
Publikationsliste
A. Dadgar, M. Poschenrieder, A. Reiher, J. Bläsing, J. Christen, A. Krtschil, T. Finger, T.
Hempel, A. Diez und A. Krost (2003), Reduction of stress at the initial stages of GaN
growth on Si(111), Appl. Phys. Lett. 82, 28
A. Dadgar, M. Poschenrieder, I. Daumiller, M. Kunze, A. Strittmatter, T. Riemann, F.
Bertram, J. Bläsing, F. Schulze, A. Reiher, A. Krtschil, O. Contreras, A. Kaluza, A.
Modlich, M. Kamp, L. Reißmann, A. Diez, J. Christen, F.A. Ponce, D. Bimberg, E.
Kohn und A. Krost (2003), Gallium-nitride-based devices on silicon, phys. stat. sol.
(c) 0, 1940
A. Dadgar, A. Strittmatter, J. Bläsing, M. Poschenrieder, O. Contreras, P. Veit, T. Riemann,
F. Bertram, A. Reiher, A. Krtschil, A. Diez, T. Hempel, T. Finger, A. Kasic, M.
Schubert, D. Bimberg, F. A. Ponce, J. Christen und A. Krost (2003), Metalorganic
chemical vapor phase epitaxy of gallium-nitride on silicon, phys. stat. sol. (c) 0,
1583
A. Reiher, J. Bläsing, A. Dadgar und A. Krost (2004), Depth-resolving structural analysis
of GaN layers by skew angle x-ray diffraction, Appl. Phys. Lett. 84, 15
158
Eidesstattliche Erklärung
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, die vorliegende Dissertation selbständig und nur unter Nutzung
der angegebenen Literatur und Hilfsmittel erarbeitet und verfasst zu haben.
Magdeburg, den 24.05.2007
159
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