Dokument 1 - Gießener Elektronische Bibliothek - Justus

Dokument 1 - Gießener Elektronische Bibliothek - Justus
CHEMOTAXIS BEI DIABETIKERN MIT PARODONTITIS
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
STAUFENBERGRING 15
D-35396 GIESSEN
Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890
[email protected]
www.doktorverlag.de
ISBN: 978-3-8359-6089-3
9
7 8 3 8 3 5
SARAH K. SONNENSCHEIN
édition scientifique
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
In vivo Chemotaxis im Sulcus gingivae bei
Patienten mit Diabetes mellitus und Parodontitis
Sarah Kristin Sonnenschein
INAUGURALDISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Zahnmedizin
des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen
9 6 0 8 9 3
édition scientifique
VVB
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
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1. Auflage 2013
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1st Edition 2013
© 2013 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen
Printed in Germany
édition scientifique
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In vivo Chemotaxis im Sulcus gingivae bei Patienten mit Diabetes mellitus und Parodontitis INAUGURALDISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Zahnmedizin des Fachbereichs Medizin der Justus‐Liebig‐Universität Gießen vorgelegt von Sarah Kristin Sonnenschein aus Haan/Rheinland Gießen 2013 ii
Aus dem
Medizinischen Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde,
Poliklinik für Parodontologie
Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH
Standort Gießen
Direktor: Prof. Dr. J. Meyle
Gutachter: Prof. Dr. J. Meyle
Gutachter: PD Dr. N. Ewald
Tag der Disputation: 07.11.2013
iii
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ......................................................................................................... iii
1.
Einleitung ....................................................................................................... 1
2.
Wissenschaftliche Grundlagen ....................................................................... 2
2.1
Definition, Diagnose und Klassifikation von Diabetes mellitus ..................... 2
2.2
Parodontopathien und ihre Verlaufsformen ................................................. 6
2.3
Sulcusflüssigkeits-Fließrate (SFFR) ............................................................ 8
2.4
Diabetes mellitus als Risikofaktor für Parodontitis ..................................... 11
2.5
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten ............................................ 16
2.5.1
CD11b/CD18-Komplex (MAC-1, CR3) ............................................... 20
2.5.2
CD15 (Sialyl LewisX) ......................................................................... 20
2.6
Chemotaxisuntersuchungen ..................................................................... 21
3.
Ziele der Studie ............................................................................................ 26
4.
Materialien und Methoden ............................................................................ 27
4.1
Studiendesign ........................................................................................... 27
4.2
Votum der Ethikkommission ..................................................................... 27
4.3
Selektion der Studienpopulation ............................................................... 27
4.4
Aufklärung der Studienteilnehmer ............................................................. 28
4.5
Methodik und Vorversuche ....................................................................... 29
4.5.1
Methode nach MEYLE ........................................................................ 29
4.5.2
PMN-Einwanderungskinetik ............................................................... 31
4.6
Klinische Eingangsuntersuchung .............................................................. 33
4.7
Mundhygienephase .................................................................................. 34
4.8
Blutentnahme ........................................................................................... 37
4.9
Quantifizierung der PMN-Oberflächenantigene......................................... 37
4.10 Durchflusszytometrie ................................................................................ 39
4.11 Sulcusflüssigkeits-Volumenbestimmung mit dem Periotron 8000® ............ 40
4.12 PMN-Isolation aus dem peripheren Blut.................................................... 41
4.13 Herstellung des Chemotaktikums ............................................................. 42
iv
4.14 Registrierung und Dokumentation ............................................................. 43
4.15 Statistische Datenauswertung................................................................... 43
5.
Ergebnisse ................................................................................................... 45
5.1
Ergebnisse der Vorversuche ..................................................................... 45
5.1.1
Etablierung der Methodik ................................................................... 45
5.1.2
PMNSF-Einwanderungskinetik ............................................................ 48
5.2
Demographische Daten ............................................................................ 50
5.3
Klinische Beschreibung der Gruppen ........................................................ 51
5.3.1
Zahnanzahl ........................................................................................ 51
5.3.2
Sondierungstiefe des Gesamtgebisses (STges) .................................. 51
5.3.3
Attachmentniveau des Gesamtgebisses (CAL) .................................. 52
5.3.4
Blutung auf Sondierung (BOP) .......................................................... 52
5.4
Sondierungstiefen an Test- und Kontrollzähnen ....................................... 52
5.5
Mundhygienephase .................................................................................. 54
5.5.1
Papillenblutungsindex (PBI) ............................................................... 54
5.5.2
Plaqueindex (PLI) .............................................................................. 57
5.5.3
Sulcusflüssigkeits (SF)-Volumen ....................................................... 59
5.5.4
Klinisches Erscheinungsbild und Orthopantomogramme ................... 61
5.6
Hämatologie und Diagnostik ..................................................................... 64
5.6.1
Plasma-Glukose-Werte...................................................................... 64
5.6.2
HbA1c-Werte ..................................................................................... 65
5.6.3
Body-Mass-Index (BMI) ..................................................................... 66
5.6.4
C-reaktives Protein (CRP) ................................................................. 67
5.6.5
Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG) ................................................. 68
5.6.6
Anzahl neutrophiler Granulozyten im peripheren Blut ........................ 69
5.7
PMN-Einwanderung und Rezeptorexpression .......................................... 70
5.7.1
Anzahl eingewanderter CD45+ Zellen ............................................... 70
5.7.2
Oberflächenexpression CD11b .......................................................... 75
5.7.3
Oberflächenexpression CD15 ............................................................ 80
v
6.
Diskussion.................................................................................................... 85
6.1
Methodendiskussion ................................................................................. 85
6.1.1
Mundhygienephase ........................................................................... 85
6.1.2
Chemotaxistests ................................................................................ 85
6.1.3
Sulcusflüssigkeits-Fließrate ............................................................... 86
6.1.4
Durchflusszytometrie ......................................................................... 87
6.2
Ergebnisdiskussion ................................................................................... 87
6.2.1
Blutglukose und HbA1c ..................................................................... 87
6.2.2
Hämatologie ...................................................................................... 88
6.2.3
Body-Mass-Index ............................................................................... 89
6.2.4
Schweregrad der parodontalen Erkrankung ....................................... 89
6.2.5
Mundhygieneindizes .......................................................................... 90
6.2.6
Sulcusflüssigkeits-Fließrate (SFFR) ................................................... 91
6.2.7
PMN-Einwanderung........................................................................... 93
6.2.8
PMN-Oberflächenexpression CD11b und CD15 ................................ 99
7.
Zusammenfassung ..................................................................................... 102
8.
Summary.................................................................................................... 103
9.
Abkürzungsverzeichnis .............................................................................. 104
10.
Abbildungsverzeichnis ................................................................................ 107
11.
Tabellenverzeichnis.................................................................................... 110
12.
Literaturverzeichnis .................................................................................... 112
13.
Anhang....................................................................................................... 128
14.
Ehrenwörtliche Erklärung ........................................................................... 140
15.
Danksagung ............................................................................................... 141
.
1
1. Einleitung
Bei Diabetes mellitus (DM) handelt es sich um eine durch chronische Hyperglykämie charakterisierte heterogene Gruppe metabolischer Störungen an der in Deutschland bis zu 12 % der Bevölkerung erkrankt sind (IDF, 2009). Mit 90-95 % stellt DM Typ
2 die häufigste Form dieser Erkrankung dar, der meist eine erworbene Insulinresistenz
in Kombination mit einer Störung der Insulinsekretion zugrunde liegt (ADA, 2010).
Parodontitis ist eine primär durch einen bakteriellen Biofilm verursachte Entzündung
des gesamten Zahnhalteapparates, die durch verschiedene Faktoren, wie beispielsweise systemischen Erkrankungen und Veränderungen des Immunsystems, beeinflusst werden kann. In Deutschland sind 53 % der 35-44 Jährigen von einer mittelschweren Form der Parodontitis betroffen (Holtfreter, Kocher, Hoffmann, Desvarieux, &
Micheelis, 2010).
Der Zusammenhang zwischen diesen beiden multifaktoriellen Erkrankungen wurde
in zahlreichen Querschnitts- und Longitudinalstudien nachgewiesen und eine bidirektionale Beeinflussung wird angenommen (Lalla & Papapanou, 2011). Zahlreiche Studien
weisen bei Diabetikern auf einen proinflammatorischen Zustand des Immunsystems
hin, der durch erhöhte Zytokinspiegel charakterisiert ist (Donath & Shoelson, 2011;
Salvi, Yalda, et al., 1997). Die primären Zellen des angeborenen Immunsystems sind
polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN). PMN verlassen via Diapedese den
peripheren Blutstrom, um durch Chemotaxis an den Ort der Entzündung zu gelangen
und sind die im gingivalen Sulcus vorherrschenden Immunzellen (Cimasoni, 1983). In
vitro konnte bei PMN, die aus peripherem Blut von Diabetikern isoliert wurden, eine
verminderte Chemotaxis festgestellt werden (Delamaire et al., 1997; Shetty, Thomas, &
Ramesh, 2008). Diese Feststellung scheint im Gegensatz zu den bei Diabetikern in
klinischen Studien beobachteten verstärkten gingivalen Entzündungsreaktionen zu
stehen (Hugoson, Thorstensson, Falk, & Kuylenstierna, 1989; Salvi, Kandylaki,
Troendle, Persson, & Lang, 2005).
In dieser Arbeit wurde die lokale Chemotaxis der PMN im Sulcus gingivae bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis, bei systemisch gesunden Parodontitispatienten und bei Gesunden in vivo getestet. Die Testung der Chemotaxis erfolgte
über die Applikation eines standardisierten inflammatorischen Reizes in den Sulcus
und die anschließende Auszählung eingewanderter PMN sowie über die Bestimmung
der Oberflächenexpression der an der Diapedese beteiligten Oberflächenrezeptoren
CD11b und CD15.
2
2. Wissenschaftliche Grundlagen
2.1
Definition, Diagnose und Klassifikation von Diabetes mellitus
Diabetes mellitus (DM) stellt eine durch chronische Hyperglykämie charakterisierte
Regulationsstörung des Stoffwechsels dar, der ein Defekt der Insulinsekretion, der Insulinwirkung oder beides zugrunde liegt (ADA, 2008, 2010). Insulin ist das einzige blutzuckersenkende Hormon und wird in den β-Zellen der Langerhans-Inseln des Pankreas produziert. Mit seinen Antagonisten Glukagon, Kortisol, Katecholaminen und
Wachstumshormonen ist es für die Einstellung einer konstanten Blutglukosekonzentration zuständig. Die wesentliche Aufgabe des Insulins liegt in der Vermittlung der Glukoseaufnahme aus dem Blut und der Gewebsflüssigkeit in das Zellinnere. In den Zielgeweben bewirkt Insulin die Translokation von insulinabhängigen Glukosetransportern in
die Zellmembran, wodurch die Zellen Glukose aufnehmen können und der Blutzuckerspiegel gesenkt wird. Glukose ist als Energielieferant für die Zellen des menschlichen
Körpers, besonders des zentralen Nervensystems und der inneren Organe, von zentraler Bedeutung. Die Ausschüttung von Insulin wird durch den Blutglukosespiegel reguliert. Steigt der Blutglukosespiegel nach der Nahrungsaufnahme an, nehmen die βZellen über insulinunabhängige Glukosetransporter die Glukose aus dem Blut auf. Dies
induziert eine Änderung des Membranpotentials der β-Zellen und es kommt via Exozytose zur Ausschüttung des intrazellulär in Vesikeln gespeicherten Insulins (Dai et al.,
2012). Die Halbwertszeit des Insulins im Plasma beträgt 4 bis 6 Minuten. Dadurch ist
eine schnelle Anpassung der Insulinsekretion an Veränderungen der Blutglukosekonzentration möglich (Duckworth, Bennett, & Hamel, 1998). In der Leber drosselt Insulin
die Glukagonsynthese und die Glykolyse. Die antagonistisch wirksamen Hormone hingegen setzen über Glukoneogenese und Glycogenabbau Glukose frei. Des Weiteren
sind an der Regulation des Blutglukosespiegels das neuroendokrine System, Amylin
(Insel-Amyloid-Polipeptid, IAPP) und Inkretin (gastrointerstinalen Ursprungs) beteiligt
(Jellinger, 2011). Unter physiologischen Bedingungen ist der Körper in der Lage sowohl einen Mangel als auch einen Überschuss an Glukose zu vermeiden. Bei einem
unbehandelten oder ungenügend kontrollierten DM kommt es zu einer chronischen
Hyperglykämie, da die Zellen des Zielgewebes entweder aufgrund eines Insulinmangels die Glukose nicht aufnehmen können oder wegen einer peripheren Insulinresistenz nur eine unzureichende Verwertung der Glukose stattfindet (Abbildung 1). Die
Hypoglykämie kann besonders schnell zu einer Störung des zentralen Nervensystems
und des Gehirns führen und unter anderem durch eine zu hohe Insulindosis verursacht
werden.
3
Konzentration (mg/100ml)
250
200
150
100
50
Diabetiker
Gesunder
0
0
15
30
45
60
75
90
105
120
Zeit (Minuten)
Abbildung 1: Blutglukosegehalt nach der oralen Gabe von 75 g Glukose (Grafik basierend auf
Kerner & Brückel, 2011).
Infolge der chronischen Hyperglykämie ist DM mit einer Vielzahl von Folgeerkrankungen assoziiert, wobei die Augen, die Nieren, das Nervensystem, das Herz und die
Blutgefäße besonders häufig betroffen sind (ADA, 2010). So gehen eine erhöhte Infektionsanfälligkeit (Mancini & Ruotolo, 1997) und eine verzögerte Wundheilung
(Rosenberg, 1990) oft mit dieser Erkrankung einher. Symptome, welche eine permanente Hyperglykämie begleiten, sind Polyurie, Polydipsie, Gewichtverlust und Verlust
der Sehkraft (ADA, 2010; Kerner & Brückel, 2011). Akute lebensbedrohliche Komplikationen stellen vor allem die Hyperglykämie mit schwerer Ketoazidose und das hyperosmolare Syndrom dar (ADA, 2010). Bei den Langzeitkomplikationen handelt es sich
besonders häufig um Retinopathien, Nephropathien und periphere Neuropathien. Diabetiker zeigen eine erhöhte Inzidenz von artherosklerotischen, cardiovasculären, peripher arteriellenen und cerebrovaskulären Erkrankungen (ADA, 2010).
1997 veröffentlichte The American Diabetes Association (ADA) eine neue Klassifikation (Tabelle 1) für DM (ADA, 1997). Die WHO bestätigte diese Neuerungen und übernahm sie 2000 in ihre Leitlinien. Aktuelle Schätzungen der Deutschen Diabetes Gesellschaft (DDG) gehen von einer Prävalenz des bekannten DM von 7-8 % der erwachsenen Gesellschaft in Deutschland aus (Rathmann, 2011), während die International Diabetes Federation (IDF) die Prävalenz erkrankter Personen im Alter von 20 bis 79 Jahren in Deutschland auf bis zu 12 % schätzt (IDF, 2009).
4
Tabelle 1: Ätiologische Klassifikation von Diabetes mellitus (in verkürzter Form nach ADA
2010).
I. Typ 1 Diabetes mellitus
A. Immunvermittelt
B. Idiopathisch
II. Typ 2 Diabetes mellitus
III. Andere spezifische Formen
A. Genetische Defekte der B-Zellfunktion
B. Genetische Defekte der Insulinwirkung
C. Erkrankungen des exokrinen Pankreas
D. Endokrinopathien
E. Drogen oder medikamenteninduzierter Diabetes
IV. Gestationsdiabetes (GDM)
Die Mehrheit der diagnostizierten Diabetesfälle lässt sich in zwei Kategorien, den
Typ 1 und den Typ 2 DM, unterteilen. Beim Typ 1 DM (früher auch insulinabhängiger
Diabetes oder juveniler Diabetes) ist eine absolute Störung der Insulinproduktion die
Ursache der Erkrankung. Man unterscheidet bei dieser Form zwei Subtypen, den immunologisch vermittelten und den idiopathischen Typ. Beim immunologisch vermittelten DM Typ 1 resultiert der absolute Insulinmangel aus einer immunologisch verursachten Destruktion der insulinproduzierenden β-Zellen in den Langerhans-Inseln. Die
Geschwindigkeit der β-Zell-Zerstörung kann variabel sein und es lassen sich Marker
dieser Autoimmunreaktionen im Blut nachweisen. Dazu gehören Inselzellantikörper,
Insulinautoantikörper, Autoantikörper gegen Tyrosinphosphatase und Autoantikörper
gegen die Glutamat-Decarboxylase der β-Zellen. Bei diesem Subtyp spielen genetische Faktoren eine prädisponierende Rolle (ADA, 2010). Im Gegensatz dazu lässt sich
beim selteneren idiopathischen Typ 1 die Beteiligung eines autoimmunologischen Prozesses nicht nachweisen (ADA, 2010). Lediglich 5-10 % aller Diabetiker sind dem Typ
1 zuzuordnen (ADA, 2010). Bei der anderen, prävalenteren Kategorie (90-95 % der
Diabetiker), dem Typ 2 (früher auch als Altersdiabetes bezeichnet), ist die Ursache der
Erkrankung eine Kombination aus der Resistenz gegenüber der Insulinwirkung und
einer gestörten Insulinsekretion, wodurch ein relativer Insulinmangel entsteht (ADA,
2010; Kerner & Brückel, 2011). Das Risiko an dieser Form des Diabetes zu erkranken
steigt mit dem Alter, dem Gewicht und dem Mangel an körperlicher Betätigung (ADA,
2010). Die genetische Prädisposition ist ausgeprägter als beim Typ 1 DM (ADA, 1997).
Es werden noch weitere spezifische Typen des Diabetes und Gestationsdiabetes
5
(GDM) unterschieden. Bei den spezifischen Typen des DM handelt es sich zum größten Teil um Formen bei denen die Hyperglykämie aus einem genetischen Defekt resultiert. GDM ist als gestörte Glukosetoleranz definiert, die entweder erstmals oder nur
während der Schwangerschaft auftritt (ADA, 2010). Nach Angaben der ADA kompliziert
der GDM 7 % aller Schwangerschaften (ADA, 2004). Eine weitere Kategorie bilden
Patienten mit einem Grad an Hyperglykämie, der zwar zu pathologischen und funktionellen Veränderungen in verschiedenen Geweben führt, es jedoch nicht zur Manifestation chronischer Symptomen kommt. Diese Patienten haben eine abnorme NüchternPlasmaglukose (impaired fasting glucose, IFG) mit Werten von 100 mg/dl (5,6 mmol/l)
bis 125 mg/dl (6,9 mmol/l) oder eine gestörte Glukosetoleranz (impaired glucose tolerance, IGT). Bei einer IGT liegen die 2-Stunden-Werte des oralen Glukosetoleranztests
(OGTT) zwischen 140 mg/dl (7,8 mmol/l) und 199 mg/dl (11,0 mmol/l). Patienten mit
IGT oder IFG unterliegen einem erhöhten Risiko der Manifestation eines DM (ADA,
2010).
Zur Diagnose eines DM können verschiedene Kriterien herangezogen werden
(Tabelle 2). So stellen ein HbA1c-Wert ≥ 6,5 oder Nüchtern-Plasmaglukosewerte über
≥ 126 mg/dl (≥ 7 mmol/l) primäre Diagnosekriterien dar. Zudem spricht eine Hyperglykämie mit einer Gelegenheits-Plasmaglukose über 200 mg/dl (11,1 mmol/l) ohne kausalen Zusammenhang mit einer Kohlenhydrataufnahme für das Vorliegen eines DM.
Eine weitere Diagnosemöglichkeit ist der orale Glukosetoleranztest (OGTT) nach den
Kriterien der WHO. Der nüchterne Teilnehmer trinkt bei diesem Test innerhalb von 5
Minuten 75 g Glukose in 250-300 ml Wasser. Der Blutzuckerwert wird vor und zwei
Stunden nach Glukoseaufnahme bestimmt, wobei ein 2-Stunden-Wert ≥ 200 mg/dl
(11,1 mmol/l) ein Diagnosekriterium für DM darstellt (ADA, 2010; Kerner & Brückel,
2011).
Tabelle 2: Diagnosekriterien für Diabetes mellitus nach der Deutschen Diabetes Gesellschaft.
1. HbA1c ≥ 6,5 % (≥ 48 mmol/mol)
2. Gelegenheits-Plasmaglukosewerte von ≥ 200 mg/dl (≥ 11,1 mmol/l)
3. Nüchtern-Plasmaglukosewert von ≥ 126 mg/dl (≥ 7,0 mmol/l)
4. OGTT-2-h-Wert im venösen Plasma ≥ 200 mg/dl
OGTT: oraler Glukosetoleranztest.
Bei einigen Patienten kann eine adäquate Glukosekontrolle durch die Reduzierung
des Körpergewichts und die Einnahme oraler Antidiabetika erreicht werden. Diese Patienten sind nicht von externer Insulinzufuhr abhängig. Individuen mit ausgeprägter
Zerstörung der pankreatischen β-Zellen und ohne beziehungsweise mit einer deutlich
6
eingeschränkten Insulinrestproduktion benötigen die externe Insulinzufuhr aus vitalen
Gründen.
Der Grad der Langzeiteinstellung eines Patienten mit DM wird über den prozentualen Anteil des glykierten Hämoglobins im Blut (HbA1c-Wert) ermittelt. Glykohämoglobin
(HbA1c) stellt das kontinuierliche Produkt einer nichtenzymatischen Reaktion zwischen
der primären Aminogruppe eines Hämproteins der Erythrozyten und Glukose dar. Die
Glukolysierung des Hämoglobins ist permanent und bleibt daher über die gesamte Lebensdauer des Erythrozyten erhalten. Mit erhöhten Blutglukosekonzentrationen steigt
auch die Konzentration des HbA1c. Die Konzentration des HbA1c dient somit der klinischen Überwachung der Langzeiteinstellung und des Blutzuckerverhaltens der letzten
2-8 Wochen. Die DDG formuliert als ideales Therapieziel einen HbA1c-Wert < 6,5 %
und Blutglukosewerte von 90–120 mg/dl (nüchtern und präprandial) (Matthaei, 2011).
2.2
Parodontopathien und ihre Verlaufsformen
Im Parodont lassen sich verschiedene Entzündungszustände des Gewebes differenzieren, die als Gingivitis beziehungsweise Parodontitis kategorisiert werden. Im Jahr
1999 wurde auf dem International Workshop for a Classification of Periodontal Diseases and Conditions eine neue Klassifizierung der Parodontalerkrankungen eingeführt,
welche acht verschiedene Erscheinungsformen differenziert (Armitage, 1999) (Tabelle
3).
Tabelle 3: Klassifikation der Parodontalerkrankungen (Armitage, 2000).
I.
Gingivale Erkrankungen (G)
II.
Chronische Parodontitis (CP)
III.
Aggressive Parodontitis (AP)
IV.
Parodontitis als Manifestation einer Systemerkrankung (PS)
V.
Nekrotisierende Parodontalerkrankungen (NP)
VI.
Parodontalabszesse
VII.
Parodontitis im Zusammenhang mit endodontalen Läsionen
VIII.
Entwicklungsbedingte oder erworbene Deformationen und Zustände
Im Weiteren soll auf die Gingivitis und die chronische Parodontitis näher eingegangen werden, da die Teilnehmer der vorliegenden Studie an diesen beiden Erkrankungen litten.
7
Bei der Gingivitis ist das marginale Gewebe, insbesondere das Saumepithel, von
einer Entzündung erfasst. Histologisch lassen sich bei der Gingivitis eine initiale, eine
frühe und eine etablierte Läsionsform unterscheiden, die den jeweiligen Schweregrad
des Entzündungszustandes des Gewebes widerspiegeln (Page & Schroeder, 1976).
Eine chronische Gingivitis ist nach Entfernung des Biofilms vollständig reversibel
(Lindhe, Hamp, & Löe, 1975), wohingegen die Parodontitis (fortgeschrittene Läsionsform) durch einen irreversiblen Attachmentverlust charakterisiert ist und unbehandelt
zum Zahnverlust führen kann (Page & Schroeder, 1976). Der als orale Plaque oder
Biofilm bezeichnete supra- beziehungsweise subgingivale mikrobielle Belag auf der
Zahnoberfläche und den Geweben des Parodonts stellt die primäre Ursache beider
Erkrankungen dar. Dieser Biofilm besteht zum größten Teil aus Mikroorganismen und
deren Stoffwechselprodukten (Listgarten, 1994), welche einen großen Einfluss auf den
Zustand des Gewebes ausüben und zu einer deutlichen Immunreaktion führen
(Kornman, Page, & Tonetti, 1997). Durch den Biofilm wird das Saumepithel zunächst
aufgelockert, wodurch es dem Bakterienwachstum möglich wird sich insbesondere
subgingival weiter auszudehnen. Im Rahmen der lokalen Immunreaktion des Wirts
werden verschiedene Entzündungsmediatoren freigesetzt, die zu einer Steigerung der
Gefäßpermeabilität und damit zur Exsudation aus dem Sulcus führen. Dies äußert sich
in einer erhöhten Sulcusflüssigkeits-Fließrate (SFFR) (Darany, Beck, & Walters, 1992).
Im Verlauf ändert sich neben der Quantität der durch reichliche Substratzufuhr aus der
Sulcusflüssigkeit schneller wachsenden Plaque auch die qualitative Zusammensetzung
des Biofilms hin zu einem eher anaeroben Charakter (Listgarten, 1994). Innerhalb von
zwei bis vier Tagen nach der ersten Plaqueakkumulation entsteht die initiale Läsion
(Page & Schroeder, 1976). Durch chemotaktisch wirksame Substanzen exogenen oder
endogenen Ursprungs angelockt, gelangen polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) als phagozytische Zellen an den Ort dieser Entzündung (Lamster, 1997)
und errichten einen Leukozytenwall zwischen Epithel und Biofilm (Theilade & Attström,
1985). Wird dieser Wall von den Pathogenen überwunden, können sie in das umliegende Gewebe eindringen und die Entzündung schreitet weiter voran. Es entstehen
Ulzerationen im Saumepithel und weitere Immunzellen wandern ein. Die frühe Läsionsform ist durch eine zunehmende Infiltration von Lymphozyten und Makrophagen sowie
der beginnenden Zerstörung der gingivalen Kollagenfasern gekennzeichnet und entsteht vier bis sieben Tage nach der ersten Plaqueakkumulation. Nach zwei bis drei
Wochen geht die frühe in die etablierte Läsion über, die dem Zustand einer chronischen Gingivitis entspricht. Dieser Zustand kann über einen langen Zeitraum stabil
bleiben. Histologisch dominieren antikörperproduzierende Plasmazellen und die Zerstörung der gingivalen Kollagenfasern schreitet weiter voran, bleibt aber auf die
8
Gingiva beschränkt (Page & Schroeder, 1976). Aus dem Saumepithel entsteht ein Taschenepithel und die Gingivitis geht in eine Parodontitis (fortgeschrittenen Läsion) über
(Abbildung 2). Bei der Parodontitis dominieren histologisch ebenfalls Plasmazellen
(Berglundh & Donati, 2005). Im Gegensatz zur Gingivitis betrifft die Zerstörung des
Gewebes alle Anteile des Zahnhalteapparates. Es kommt zur Ausbildung einer parodontalen Tasche mit voranschreitendem Attachment- und Knochenverlust (Page &
Schroeder, 1976). Aktuell geht man davon aus, dass dieser Vorgang von der individuellen Immunreaktion des Wirts und von dessen Risikofaktoren beeinflusst wird. Systemische Erkrankungen wie DM, verschiedene Medikamente und Mangelernährung können den Verlauf und die Ausprägung gingivaler und parodontaler Erkrankungen beeinflussen. Auch persönliches Verhalten und Lebenswandel, Umwelteinflüsse oder angeborene und vererbte Eigenschaften stellen Risikofaktoren dar (Salvi, Lawrence,
Offenbacher, & Beck, 1997).
Abbildung 2: Entzündungszustände des Parodonts.
2.3
Sulcusflüssigkeits-Fließrate (SFFR)
1958 beschrieben BRILL UND KRASSE die Sulcusflüssigkeit (SF) erstmals als ein Filtrat der gingivalen Kapillaren, welches sich aus klinisch entzündungsfreien Parodontien
gewinnen lässt (N. Brill, Krasse, O.B., 1958). Nach weiterer Charakterisierung wurde
die SF von Parodontitis- und Gingivitispatienten als ein inflammatorisches Exsudat
beschrieben (Cimasoni, 1983; Del Fabbro et al., 2001; Lamster, 1997; Löe & Holm-
9
Pedersen, 1965). Aufgrund der Zusammensetzung, dem diagnostischen Potenzial und
der noninvasiven Entnahmemöglichkeit steht die SF seit Jahren im Mittelpunkt vieler
parodontologischer Studien. Die SF enthält neben zellulären und organischen Bestandteilen verschiedene Elektrolyte (Bang, Cimasoni, Rosenbusch, & Duckert, 1973;
Cimasoni, 1983). Die zellulären Komponenten sind neben abgeschilferten Epithelzellen
(Attström, 1975)(Attström, 1975) und Bakterien (Griffiths, Wilton, & Curtis, 1992) vor
allem Leukozyten (Nakashima, Demeurisse, & Cimasoni, 1994). Bei den organischen
Bestandteilen handelt es sich um Metaboliten des Kollagenstoffwechsels, Polypeptide
(Cho, Garant, & Lee, 1984), Hydroxyprolin (Hara & Takahashi, 1975), Proteoglykane
und Glykosaminglykane (Embery, Oliver, Stanbury, & Purvis, 1982; Last, Stanbury, &
Embery, 1985) sowie um viele weitere Proteine (Carneiro, Venuleo, Oppenheim, &
Salih, 2012). Diese Substanzen werden maßgeblich nach dem Kontakt von Bakterien
mit Immunzellen und ortsständigen Zellen freigesetzt. Durch Granulozyten freigesetzt,
gelangen unter anderem Elastase, Kollagenase, ß-Glucoronidase und Myeloperoxidase in die SF (Carneiro et al., 2012; Gustafsson, Asman, Bergstrom, & Soder, 1992).
Erhöhte Konzentrationen dieser Enzyme in der SF weisen auf eine Entzündung der
Gingiva beziehungsweise des Parodonts hin (Bickel & Cimasoni, 1985; Gustafsson et
al., 1992; Teles et al., 2010). Die SF enthält neben Leukozyten weitere immunologisch
aktive Komponenten wie IgG, IgA, IgM (Holmberg & Killander, 1971; Shillitoe & Lehner,
1972) und Komplementfaktoren (Shillitoe & Lehner, 1972). Das Komplementsystem ist
ein komplexes Kaskadensystem zu dessen Bestandteilen die proteolytischen Plasmaproteine C1 bis C9 gehören. Die drei Wirkmechanismen des Komplementsystems sind
Opsonisierung, Chemotaxis und Zelllyse. Es kann über verschiedene Mechanismen
aktiviert werden. Der klassische Aktivierungsweg wird durch die Bindung von C1 an
einen Antigen-Antikörperkomplex ausgelöst. C1 bindet dabei an die Fc-Region von IgM
oder IgG und es kommt zur Auslösung der Kaskade. Durch proteolytische Spaltung
entsteht der chemotaktisch wirksamen Faktor C5a, der weitere Phagozyten anlockt
(Van Dyke & Hoop, 1990). Das Opsonin C3b markiert das Molekül und erleichtert die
Phagozytose (Van Dyke & Hoop, 1990). Die Faktoren C5b und C6 bis C9 bilden den
Membranangriffskomplex, der in der Membran des Antigens eine Pore formt und dieses durch Osmose zerstört. Beim alternativen Aktivierungsweg kommt es zu einer direkten Anlagerung des Faktors C3b an mikrobielle Oberflächen.
Die Zusammensetzung und die kontinuierliche Abgabe von SF, durch die Bakterien
und andere Schadstoffe aus dem Sulcus gingivae herausgespült werden, verdeutlicht
ihre wichtige Rolle bei der lokalen Abwehr im Parodont (Page, 1986). Die SFFR hängt
dabei von der vaskulären Permeabilität der gingivalen Kapillaren (N. Brill, 1959b) und
10
dem Schweregrad der Entzündung ab. Mit steigendem Entzündungsgrad nimmt auch
die SFFR zu (Darany et al., 1992; Teles et al., 2010), die dadurch als ein Indikator für
entzündliche Veränderungen im parodontalen Gewebe gilt (Del Fabbro et al., 2001;
Griffiths, Sterne, Wilton, Eaton, & Johnson, 1992; Löe & Holm-Pedersen, 1965). Zudem wird die SFFR von verschieden anderen Faktoren wie zirkadianen Schwankungen
(Bissada, Schaffer, & Haus, 1967), weiblichen Sexualhormonen (Fesseler, 1977;
Lindhe, Attström, & Bjorn, 1969; Markou, Eleana, Lazaros, & Antonios, 2009), Tabakkonsum (Morozumi, Kubota, Sato, Okuda, & Yoshie, 2004) und mechanischer Irritation
der Gingiva beeinflusst (N. Brill, 1959a). Liegt eine entzündliche Veränderung vor, werden durch Produkte der Mikroorganismen, wie beispielsweise Endotoxine, Kollagenasen, Proteasen und Chondroitinsulfatasen, die gingivalen Bindegewebszellen und
Epithelzellen sowie interzelluläre Substanzen geschädigt (Caffesse & Nasjleti, 1976;
Schwartz, Stinson, & Parker, 1972). Es resultieren vergrößerte Interzellularräume,
durch die das Eindringen weiterer pathogener Mikroorganismen erleichtert wird und
das entzündlich veränderte Saumepithel zur Eintrittspforte für weitere Toxine und invasive Mikroorganismen wird (Attström, 1975; Caffesse & Nasjleti, 1976; Saglie,
Newman, Carranza, & Pattison, 1982; Schwartz et al., 1972). Die Abwehrfähigkeit gegen die eindringenden mikrobiellen Noxen hängt nun von der Funktionsfähigkeit des
zellulären und humoralen Immunsystems des Wirtes ab. Durch bakterielle Endotoxine
oder Komplementfaktoren angelockt, verlassen die neutrophilen Granulozyten und
Monozyten die dento-alveolären Kapillaren und gelangen durch Chemotaxis zum Ort
der Entzündung (Attström, 1975). Es entsteht eine kontinuierliche Migration der Zellen
in das Saumepithel und den Sulcus gingivae (Attström & Egelberg, 1970). Unabhängig
vom Entzündungsgrad stellen neutrophilen Granulozyten bei diesem Vorgang die dominierende Zellpopulation dar und weniger als 5 % der einwandernden Zellen sind den
mononukleäre Zellen zuzurechnen (Attström, 1970).
Um die Zusammensetzung der SF analysieren und die SFFR bestimmen zu können, sind verschiedene Entnahmemethoden entwickelt worden. Neben der intra- und
extrasulculären Entnahme mittels Filterpapierstreifen kann eine Probenentnahme auch
durch Waschung des Sulcus gingivae erfolgen (Guentsch et al., 2011). So wird bei der
1976 von SKAPSKI UND LEHNER entwickelten Methode der Sulcus beziehungsweise die
parodontale Tasche durch mehrfaches aspirieren von 10 µl phoshatgepufferter Kochsalzlösung mittels Mikrospritze gespült. Dieses Verfahren wurde insbesondere zur Gewinnung von Leukozyten genutzt (Golub, Iacono, Nicoll, Ramamurthy, & Kaslick, 1981;
Golub, Nicoll, Iacono, & Ramamurthy, 1982; Iacono, Singh, Golub, Ramamurthy, &
Kaslick, 1985). MEYLE entwickelte 1986 eine weitere Spülmethode zur Gewinnung von
11
Granulozyten aus dem Sulcus gingivae und verglich diese mit dem Verfahren nach
SKRAPSKI UND LEHNER. Das neue Verfahren erwies sich als zellschonender und daher
geeigneter zur Granulozytengewinnung. Eine vertiefende Darstellung dieser Methode
erfolgt im Kapitel Materialien und Methoden.
2.4
Diabetes mellitus als Risikofaktor für Parodontitis
Parodontitis gilt als eine Komplikation bei DM (Löe, 1993) und zahlreiche Studien
identifizieren DM als einen Risikofaktor für Parodontalerkrankungen. Der Zusammenhang zwischen den beiden Erkrankungen ist dabei bidirektional. Demnach kann die
Diabeteserkrankung Einfluss auf die parodontale Gesundheit haben sowie die Einstellung eines Diabetikers durch eine Parodontitis beeinflusst werden (Deschner et al.,
2011; Lalla & Papapanou, 2011; Mealey & Rethman, 2003). Bei der Untersuchung des
Zusammenhanges zwischen Markern der metabolischen Kontrolle und parodontalen
Erkrankungen bei Diabetikern, kamen LIM ET AL. (2007) zu dem Ergebnis, dass der
Grad der glykämischen Langzeiteinstellung, ausgedrückt durch den HbA1c-Wert, den
größten Risikofaktor für die Progression und den Schweregrad einer parodontalen Erkrankung darstellt. So zeigen Patienten mit einem schlecht eingestellten HbA1c-Wert
eine deutlich höhere Prävalenz für Gingivitis und Parodontitis als Patienten mit einem
gut eingestellten Diabetes und gesunde Probanden (Campus, Salem, Uzzau, Baldoni,
& Tonolo, 2005; Karjalainen & Knuuttila, 1996).
In diesem Zusammenhang sind besonders Studien mit großen Stichprobenumfängen hervorzuheben. So wurden in der in den USA durchgeführten National Health and
Nutrition Examination Study III (NHANES III) die Daten von 4343 Erwachsenen analysiert. Es wurde festgestellt, dass Typ 2 Diabetiker mit einem HbA1c-Wert > 9,0 % eine
höhere Prävalenz für schwere chronische Parodontitis zeigen als gesunde Kontrollpersonen, wohingegen sich bei Patienten mit einem HbA1c-Wert ≤ 9,0 % statistisch kein
erhöhtes Risiko für Parodontitis zeigte (Tsai, Hayes, & Taylor, 2002). Bei einer weiteren in den USA durchgeführten epidemiologischen Studie wurde der Zusammenhang
zwischen DM Typ 2 und oraler Gesundheit an einem Stamm von amerikanischen Ureinwohnern aus Arizona (Pima-Indianer) untersucht. Der untersuchte Stamm zeigt eine
besonders hohe Inzidenz und Prävalenz für DM Typ 2. Neben Alter und Geschlecht
wurden die parodontologische Parameter Attachmentlevel, Knochenverlust, Zahnsteinindex, Plaqueindex und Gingivaindex bei 1342 Angehörigen dieses Stammes erfasst.
Die Studie kam zu dem Ergebnis, dass DM Typ 2 unabhängig von Alter, Geschlecht
und Mundhygiene, das Risiko für Attachmentverlust und alveolären Knochenverlust
12
eindeutig steigert (Emrich, Shlossman, & Genco, 1991). Diese Ergebnisse wurden
durch eine longitudinale Studie an 362 Angehörigen desselben Stammes bestätigt.
Über den Zeitraum von zwei Jahren wurde der alveoläre Knochenverlust mit Hilfe von
Panoramaschichtaufnahmen dokumentiert. Auch hier wurde ein erhöhter alveolärer
Knochenverlust bei den Diabetikern festgestellt (G. W. Taylor et al., 1998). Eine aktuelle Metaanalyse zu dem Zusammenhang zwischen DM und Parodontitis kam zu dem
Ergebnis, dass die Differenz des klinischen Attachmentverlustes zwischen Patienten
mit DM Typ 2 und systemisch Gesunden 1 mm beträgt, wohingegen bei Typ 1 DM keine eindeutigen Unterschiede gefunden wurden (Chavarry, Vettore, Sansone, &
Sheiham, 2009).
In der aktuellen Literatur finden sich sowohl für Typ 2 als auch für Typ 1 DM Studien, welche auf eine veränderte Reaktivität der Granulozyten und anderer primärer
Immunzellen bei an Parodontitis und Diabetes erkrankten Patienten hinweisen. Veränderungen auf zellulärer Ebene sollen unter anderem zu einer erhöhten Freisetzung von
Entzündungsmediatoren und Zytokinen in den gingivalen Sulcus führen. So wurde in
einer Studie die Konzentration von Interleukin (IL)-1β in der SF in Abhängigkeit vom
HbA1c-Wert der Patienten mit Typ 2 DM und chronischer Parodontitis untersucht. Bei
Patienten mit einem HbA1c > 8 % konnten wesentlich höhere Konzentrationen an IL1β nachgewiesen werden als bei Patienten mit einem HbA1c ≤ 8 %. Die klinischen
Messdaten für die Sondierungstiefe, die Sondierungsblutung und das Attachmentlevel
korrelierten mit dem IL-1β-Werten in der SF (Engebretson et al., 2004).
Im Gegensatz dazu konnten ARAYA ET AL. (2003) keine Unterschiede hinsichtlich der
Zytokinfreisetzung feststellen. Sie untersuchten Vollblutproben von 14 Typ 1 Diabetikern mit aggressiver Parodontitis (AP+/DM+) und von 15 Typ 1 Diabetikern ohne aggressive Parodontitis (AP-/DM+) hinsichtlich der Fragestellung, ob die durch Lipopolysaccharide (LPS) induzierte Zytokinproduktion und Prostaglandin E2 (PGE2)Freisetzung Unterschiede aufzeigt. PGE2 wurde mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und die Zytokine mittels Chemilumineszenz gekoppelten Enzymimmunoassays nachgewiesen. Es konnten keine erhöhten Konzentrationen für TNFα,
IL-1β und IL-6 in den beiden Diabetesgruppen nachgewiesen werden. Ebenso wurden
im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe keine Unterschiede festgestellt. Die
Konzentration an PGE2 war jedoch bei AP+/DM+ und AP-/DM+ im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht.
SALVI ET AL. (1997) kamen einige Jahre zuvor zu einem ähnlichen Ergebnis. Sie untersuchten die SF von 39 insulinabhängigen Diabetikern (Typ 1 DM) um die darin enthaltenen Konzentrationen der proinflammatorischen Marker PGE2 und IL-1β zu be-
13
stimmen und diese dann mit den Proben von 64 diabetesfreien Parodontitispatienten
zu vergleichen. Dabei wurden die insulinabhängigen Diabetiker in eine Gruppe mit
Gingivitis bis leichte Parodontitis (Gruppe A) und in eine Gruppe mit mittlerer bis
schwerer parodontaler Erkrankung (Gruppe B) eingeteilt. Bei beiden Gruppen war eine
erhöhte Konzentration der Entzündungsmediatoren nachzuweisen. Die Werte der
Gruppe B waren im Vergleich zu den Werten der Gruppe A höher. Bei der Zugabe von
verschiedenen Konzentrationen an LPS der Keime Escherichia coli und Porphyromonas gingivalis war die monozytäre Ausschüttung an PGE2 bei den Diabetikern dreimal
höher als bei den Nichtdiabetikern. Die IL-1β Konzentrationen zeigten hingegen keine
Unterschiede. Das Volumen und die Konzentration der Mediatoren zeigte bei diesem
Experiment keine Korrelation mit den HbA1c-Werten.
Die durch DM bedingte Hyperglykämie beeinflusst verschiedene Zellmechanismen.
Unter anderem wird durch die erhöhte Glukosekonzentration in Blut und Gewebe die
de novo Synthese von Diacylglyceriden (DAGs) gefördert. DAGs aktivieren die Proteinkinase C (PKC) und könnten somit zu einer erhöhten Superoxidausschüttung führen. In einer hyperglykämischen Umgebung werden zudem viele Proteine nichtenzymatisch glykiert und damit zu sogenannten advanced glycated endproducts
(AGEs). Die AGEs reichern sich im Plasma und Gewebe der Diabetiker an (Makita,
Vlassara, Cerami, & Bucala, 1992), wo sie zu pathologischen Veränderungen führen.
Makrophagen und Monozyten besitzen Rezeptoren für AGEs, die als RAGEs (Receptor-AGEs) bezeichnet werden (Collison et al., 2002). Die Interaktion von AGEs und
RAGEs führt zur Aktivierung von Monozyten und Makrophagen, die daraufhin proinflammatorische Zytokine freisetzen (Lalla, Lamster, & Schmidt, 1998; Lalla &
Papapanou, 2011). Des Weiteren kommt es zu oxidativem Stress in den Zellen, der zu
vaskulären Entzündungen führt. Aufgrund dieser Auswirkungen und der Aktivierung
von Thrombozyten können AGEs die Entstehung und Progression vaskulärer Komplikationen bei Diabetikern begünstigen (Lalla & Papapanou, 2011; Yamagishi, 2011).
Auch Fibroblasten und Osteoblasten scheinen in ihrer Aktivität von AGEs beeinflusst
zu werden (Lalla & Papapanou, 2011). Eine Studie deutet darauf hin, dass PMN ebenfalls RAGEs auf ihrer Plasmamembran exprimieren. Diese Rezeptoren sollen bei Aktivierung einen intrazellulären Ca2+-Anstieg und Aktinpolymerisation auslösen. Nach den
Autoren dieser Studie kommt es durch die Interaktion von RAGEs und AGEs zu einer
Beeinflussung der Zellfunktionen der PMN, was sich in einer verminderten chemotaktischen Migration und einer gesteigerten Phagozytose widerspiegelte (Collison et al.,
2002). PMN von Patienten mit schlechter (HbA1c > 8 %) und moderater (HbA1c 7,0 %8,0 %) glykämischer Kontrolle zeigen nach Stimulierung mit N-formyl-Methionyl-Leucyl-
14
Phenylanalin (fMLF) oder Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) eine höhere Aktivität von freier und membrangebundener PKC als PMN von gesunden Individuen. Die PMN von
Diabetikern mit guter glykämischer Kontrolle (HbA1c < 7 %) hingegen zeigen keine
Steigerung der PKC-Aktivität (Karima et al., 2005). Die PKC katalysiert die Phosphorylierung der p47phox Untereinheit des NADPH-Oxidase-Komplexes, welcher die Generation von reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS) katalysiert. So zeigen die Leukozyten von diabetischen Patienten im Vergleich zu Zellen gesunder Kontrollen eine gesteigerte O2-/Peroxid-Freisetzung (Devaraj & Jialal, 2000; Karima et al., 2005), wobei
dieses Phänomen in Zusammenhang mit dem HbA1c-Wert zu stehen scheint (Karima
et al., 2005).
An diabetischen Mäusen konnten SIMA ET AL. (2010) mit Hilfe von gingivaler intravitaler
Mikroskopie nachweisen, dass chronische Hyperglykämie die Vasopermeabilität steigert und die Anzahl der am Endothel entlangrollenden Leukozyten im Vergleich zum
gesunden Zustand eindeutig höher ist (p < 0,03). Zudem stellten sie eine Trendenz für
eine gesteigerte Expression des für die Diapedese wichtigen Leukozytenoberflächenantigens CD11a fest. CD11a bildet zusammen mit CD18 das Leukozytenintegrin
LFA-1, welches bei Bindung an seine Liganden das Rollen der Leukozyten am Endothel vermittelt. Die Arbeitsgruppe schlussfolgerte daraus, dass chronische Hyperglykämie einen proinflammatorischen Zustand in der Mikrozirkulation des gingivalen Gewebes induziert, der durch eine gesteigerte Vasopermeabilität und Voraktivierung des
Endothels sowie der Leukozyten gekennzeichnet ist. Dieser proinflammatorische Zustand könnte zu einer gesteigerten Zerstörung parodontalen Gewebes führen.
NASSAR, KANTARCI UND VAN DYKE kamen 2007 zu dem Schluss, dass parodontale
Erkrankungen einen direkten Effekt auf den diabetischen Status haben. Die Aktivierung
der angeborenen Immunabwehr spielt bei beiden Erkrankungen eine entscheidende
Rolle. Bei Diabetes wird die Immunantwort vor allem durch die AGEs beeinflusst, die
zu einer Aktivierung der PKC-α und -β der Neutrophilen und Monozyten führen. Durch
die Aktivierung der PKCs kommt es zur Ausschüttung von Entzündungsmediatoren,
wie IL-1β, Tumornekrosefator-α (TNF-α), Matrix-Metallo-Proteinasen (MMPs), PGE2
und Leukotriene B4 (LTB4), sowie zur Freisetzung von reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS) und damit zu entzündlichen Prozessen im Gewebe. Die entzündlichen Prozesse können die glykämische Kontrolle durch eine entstehende Insulinresistenz komplizieren (Abbildung 3). Potentiell könnten diese Prozesse durch die Anwendung antiinflammatorischer Mediatoren blockiert werden.
15
Diabetes mellitus
Parodontitis
Hyperglykämie
PMNs
AGE
Monozyten
PKC-β
Insulinresistenz
Entzündung
Proinflammatorische
Mediatoren:
IL-1β; TNF-α; MMPs;
PGE2 etc.
PKC-α
ROS
Antiinflammatorische
Mediatoren
Abbildung 3: Stoffwechselweg diabetischer Parodontitispatienten nach Nassar et al. (2007).
AGE: nicht-enzymatisch glykierte Proteine (advanced glycated endproducts); IL-1β: Interleukin1β; MMPs: Matrix-Metallo-Proteinasen; PGE2: Prostaglandin E2; PKC: Proteinkinase; PMNs:
polymorphkernige neutrophile Granulozyten; ROS: Reaktive Sauerstoffverbindungen; TNF-α:
Tumornekrosefaktor-α.
Als ein weiterer Pathomechanismus für die Assoziation zwischen Parodontitis und
DM Typ 2 wird der veränderte Adipokinspiegel bei Diabetikern diskutiert. Adipokine
(auch als Adipozytokine bezeichnet) sind von Adipozyten sezernierte Zytokine wie IL1β, IL-6, TNF-α und Adiponektin. Die meisten dieser Zytokine haben eine proinflammatorische Wirkung (IL IL-1β, IL-6 und TNF-α) und induzieren in der Leber die Produktion
Akuter Phase Proteine wie C-reaktives Protein (CRP). Bei den meisten Patienten mit
DM Typ 2 liegt aufgrund von Übergewicht und Bewegungsmangel eine abnorme Erhöhung des Körperfettanteils vor. Dies führt zu einer vermehrten Produktion von proinflammatorischen Zytokinen durch Adipozyten. Über das Blut verteilen sich die Zytokine
im gesamten Körper und wirken somit systemisch. Durch die lokal erhöhten Zytokinspiegel im Fettgewebe werden zudem Makrophagen angelockt. Aktuell geht man davon aus, dass es dann im Fettgewebe zu einer Differenzierung der eingewanderten
Makrophagen zu einem hyperinflammatorischen Phänoyp kommt, der als M1Makrophagen bezeichnet wird und ebenfalls vermehrt proinflammatorische Zytokine
sezerniert (Abbildung 4) (Donath & Shoelson, 2011). Die genannten proinflammatorischen Zytokine spielen auch bei Parodontitis eine wichtige Rolle (Lalla & Papapanou,
2011).
16
Abbildung 4: Produktion proinflammatorischer Zytokine durch Adipozyten (nach Donath und
Shoelson 2011).
Im Gegensatz zu den proinflammatorischen Zytokinen beeinflusst das ebenfalls von
Adipozyten produzierte Adiponektin als negativer Regulator die Insulinwirkung sowie
den Energieumsatz. Studien konnten zeigen, dass niedrige Adipokin-Serumspiegel mit
Insulinresistenz und Typ 2 DM assoziiert sind (Inoue, Maehata, Yano, Taniyama, &
Suzuki, 2005). Ein mittelbarer Einfluss von Adiponekin auf Entzündungsprozesse wird
diskutiert und eine reduzierte Ausschüttung dieses Entzündungsprotektors bei Diabetikern oder übergewichtigen Patienten könnte die Parodontitis beeinflussen. So führt die
parodontale Therapie von schlecht eingestellten Diabetikern Typ 2 zu einem Anstieg
von Adiponektin im Serum und reduziert gleichzeitig den Spiegel inflammatorischer
Adipozytokine wie hsCRP, TNF-α und Interleukin-6 (Sun et al., 2011).
2.5
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) sind die primären phagozytären
Zellen der akuten Immunantwort (Van Dyke & Hoop, 1990). Sie stellen bei Gesunden
mit einem relativen Anteil von 55-70 % den größten Anteil der im Blut zirkulierenden
Leukozytenpopulation dar und Leukozytenzahlen im Bereich von 4000-10000 pro µl
Blut werden als physiologisch eingestuft (Thomas, 2008). Unter dem Einfluss von Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) werden aus den pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks bei einem gesunden Menschen täglich 1011
bis 2 x 1011 Neutrophile gebildet (Borregaard, 2010; Dale, Boxer, & Liles, 2008). Nach
Abschluss der Granulozytopoese, welche etwa 10-14 Tage in Anspruch nimmt
17
(Borregaard, 2010; Thomas, 2008), verlassen sie das Knochenmark und zirkulieren für
einige Stunden im Blut, bis sie rekrutiert werden und ins Gewebe einwandern
(Borregaard, 2010).
Das Zytoplasma der Neutrophilen enthält primäre, sekundäre und tertiäre Granula
(Borregaard, 2010; Dale et al., 2008; Segal, 2005). Die primären Granula, auch als
azurophile Granula bezeichnet, enthalten zum größten Teil Proteine und Peptide zur
Abtötung und Verdauung von Mikroorganismen. Neben Myeloperoxidase (MPO) und
Elastase enthalten sie Proteinase 3, Defensine und Lysozym. Die sekundären beziehungsweise spezifischen Granula enthalten Lysozym, Laktoferrin, Transcobalamin II,
Proteinasen (unter anderem Gelatinasen, Kollagenasen, Elastasen, Histaminase) sowie verschiedene Oberflächenrezeptorproteine. Sekundäre Granula werden primär in
Phagolysosomen und mitunter auch in die extrazelluläre Umgebung entlassen. Die
tertiären Granula werden bei direkter Stimulation der Neutrophilen freigesetzt. Sie enthalten unter anderem Gelatinase sowie verschiedene Oberflächenrezeptorproteine
(Segal, 2005). Das endoplasmatische Retikulum der Neutrophilen ist schwach ausgebildet und es finden sich wenige Mitochondrien im Zytoplasma. Um ihre Aufgabe im
Gewebe erfüllen zu können, müssen die PMN den zirkulierenden Blutstrom verlassen
und zum Ort der Entzündung vordringen. Bei diesem Vorgang spielen interzelluläre
Adhäsionsmoleküle wie Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) eine entscheidende Rolle. Die Expression von ICAM-1 auf der Oberflächenmembran von Endothelzellen
wird durch die proinflammatorischen Zytokine IL-1ß und TNFα induziert, die unter anderem von aktivierten Gewebsmakrophagen, Epithelzellen und Fibroblasten produziert
werden (Springer, 1990). ICAM-1 bindet an Lymphocyte Function associated Antigen-1
(LFA-1; CD11a/CD18) und vermittelt damit die Adhäsion zwischen Endothelzelle und
Leukozyt, die Voraussetzung für die Transmigration der Leukozyten ins Gewebe ist
(Meyle, 1994; Springer, 1990). LFA-1 gehört zur β2 Subfamilie der Leukozytenintegrine
und steht in engem Zusammenhang mit zwei anderen Integrinen, MAC-1
(CD11b/CD18) und p150,95 (CD11c/CD18), welche die gleiche β2 Untereinheit teilen
(Springer, 1990). MAC-1 und p150,95 sind besonders wichtig für die Adhäsion myeloider Zellen an andere Zellen und zu Liganden, die bei der Aktivierung des Komplementsystems und der Gerinnungskaskade gebunden werden (Springer, 1990). Die Bedeutung dieser Leukozytenintegrine lässt sich besonders an einer Erkrankung veranschaulichen, bei der durch eine Mutation in der gemeinsamen β2 Untereinheit die Adhäsion
der Leukozyten gestört ist und als Leukozyten-Adhäsionsdefekt-Syndrom (LAD) bezeichnet wird. An LAD erkrankte Patienten leiden mitunter an lebensbedrohlichen, bak-
18
teriell oder pilzlich bedingten rezidivierenden Entzündungen und Blutgerinnungsstörungen (van de Vijver et al., 2012).
Bevor am Endothel adhärierende Granulozyten den Blutstrom verlassen und via
Diapedese ins Gewebe einwandern, rollen sie zunächst an der Endothelwand entlang
und stellen eine lockere Bindung mit dieser her. Damit unterteilt sich die Extravasation
in die Schritte Aktivierung, Rollen, Adhäsion und Diapedese (Borregaard, 2010; Meyle,
1994). Die initiale Bindung zwischen den Granulozyten und den Endothelzellen kommt
durch die Bindung von Selektinen auf den Endothelzellen und Sialyl-Lewis X auf der
Oberfläche der Granulozyten zustande. L-Selektine, Oberfächenrezeptoren der
Neutrophilen, sowie P- und E-Selektine, Oberflächenmoleküle der Endothelzellen, induzieren das Rollen der Zellen auf der Endotheloberfläche durch Bindung an SialylLewis-X der Neutrophilen beziehungsweise an Addressine der Endothelzellen. Es
kommt zu einer lockeren Bindung zwischen Granulozyt und Endothelzelle. Die Bindung
von CD31 (PECAM-1 = Platelet/Endothelial Cell Adhesion Molecule) an den entsprechenden Rezeptor der Endothelzelle führt zur gesteigerten Expression sowie zur Aktivierung von Integrinrezeptoren und es kommt zur Adhäsion der Granulozyten an der
Endotheloberfläche (Borregaard, 2010; Meyle, 1994). Auf Membranen von Granulozyten werden drei verschiedene Klassen von Integrinrezeptoren exprimiert, welche die
Bindung zu den Endothelzellen vermitteln: CD11a/CD18 (LFA-1), CD11b/CD18 (MAC1) und CD11c/CD18 (p150,95) (Borregaard, 2010; Dennison & Van Dyke, 1997;
Elghetany & Lacombe, 2004; Meyle, 1994; Springer, 1990). Durch diese Bindungen
aktiviert und durch Chemotaktika angelockt, setzen die Granulozyten ihren Weg zwischen den Endothelzellen und durch das Gewebe hin zum Ursprung des entzündlichen
Reizes fort (Abbildung 5). Das Hindurchgleiten der Zellen durch das Endothel wird als
Diapedese bezeichnet. Im Gewebe angekommen bewegen sich Abwehrzellen dem
chemischen Gradienten folgend auf den Infektionsherd zu, was zu einer charakteristisch asymmetrischen Formveränderung der Zellen führt. Der vordere Teil des Granulozyts bildet das Pseudopodium aus, das durch seine Aktinfilamente und regulatorischen Proteine essenziell für die Lokomotion der Zelle ist. Das Ende der Zelle hingegen nimmt die Form eines schwanzähnlichen Ausläufers an (Dale et al., 2008;
Zigmond, 1989).
19
L-Selektin
P-Selektin und
E-Selektin
Integrin
YICAM-1
Endothelzellen
PMN
Erythrozyt
Entzündung
Abbildung 5: Schematische Darstellung der transepithelialen Migration neutrophiler Granulozyten. Selektine induzieren das Rollen der Zellen entlang des Endothels. Durch Aktivierung der
Integrine kommt es zur festen Bindung an die endotheliale Oberfläche. Die Zelle kann via
Diapedese ins Gewebe einwandern und dort durch Chemotaxis geleitet an den Ort der Entzündung gelangen (angelehnt an Borregaard, 2010).
Bei den chemotaktisch wirksamen Substanzen handelt es sich zumeist um Substanzen wie IL-8, LTB4 und andere Zytokine sowie um C3b, C5a und bakterielle Metaboliten (N-formyl-Peptide). Granulozyten können über die Länge ihres Zellkörpers Konzentrationsveränderungen des Chemotaktikums von 2 % wahrnehmen und ihre Bewegung dementsprechend ausrichten (Zigmond, 1989). Am Ort der Entzündung erkennen
sie über ihre Oberflächenrezeptoren mit C3b, C3bi oder IgG opsonierte Mikroorganismen, binden diese Moleküle und phagozytieren die Mikroorganismen indem sie diese
umfließen und in sich aufnehmen (Dale et al., 2008; Dennison & Van Dyke, 1997;
Segal, 2005). Es entsteht ein Phagosom in dem die Mikroorganismen nach Fusion mit
Lysosomen durch proteolytische Enzyme und reaktive Sauerstoffverbindungen abgetötet werden (Segal, 2005). Gelingt die Phagozytose nicht oder ist sie nur unvollständig
möglich (zum Beispiel wenn das Antigen größer als der Granulozyt ist), kann es am
Entzündungsort mitunter zur extrazellulären Freisetzung der Granula kommen
(Weissmann, Zurier, & Hoffstein, 1972). Nach Aufnahme und Verdauung des phagozytierten Materials wird dieses nach extrazellulär sezerniert oder es kommt nach Apoptose beziehungsweise Nekrose des Granulozyten zu einer extrazellulären Freisetzung
(Borregaard, 2010).
20
2.5.1
CD11b/CD18-Komplex (MAC-1, CR3)
Das CD11b/CD18-Glykoprotein (Komplement-Rezeptor 3 = CR3; Makrophagen Antigen 1 = MAC-1) wird auf PMN, Monozyten, Makrophagen, Natürlichen Killerzellen
(NK) und einer Subpolulation CD5+ B-Zellen und CD8+ T-Zellen exprimiert (Dennison &
Van Dyke, 1997; Ross & Vetvicka, 1993). Der CD11b/CD18-Komplex gehört in die
Gruppe der Leukozytenintegrine und ist Mitglied der gleichen Integrinmolekülunterfamilie wie CD11a/CD18 (LFA-1) und CD11c/CD18 (p150,95). Die Mitglieder dieser Unterfamilie sind nicht kovalent aneinander gebundene α/β Heterodimere mit der gleichen βEinheit (Van Dyke, T. E. & Hoop, G. A.1990). Bei der CD11b-Untereinheit handelt es
sich um ein Typ1-Transmembranprotein von 165 kDa und bei der CD18 Untereinheit
um eine β-Kette von 95 kDa (Ross & Vetvicka, 1993; Van Dyke & Hoop, 1990). Der
Rezeptor spielt als Ligand bei der Adhäsion PMN an ICAM-1, welches von aktivierten
Endothel- und Epithelzellen exprimiert wird, eine wichtige Rolle (Diamond et al., 1990;
Smith, Marlin, Rothlein, Toman, & Anderson, 1989). Des Weiteren ist CD11b/CD18
Rezeptor für C3bi opsonierte Partikel und kann nach Aktivierung der PKC die Phagozytose dieser Antigene induzieren (Ross & Lambris, 1982; Ross & Vetvicka, 1993). Nach
Ligandenbindung von L-Selektin kommt es zur Koaggregation von PMN (Simon,
Chambers, Butcher, & Sklar, 1992). Weitere Liganden des Rezeptors sind Fibrinogen
(Wright et al., 1988) und Faktor X der Gerinnungskaskade (Altieri & Edgington, 1988).
Die chemotaktische Stimulierung von PMN mit fMLF und anderen Zytokinen führt zu
einer Translation von CD11b/CD18-Rezeptorkomplexen aus intrazellulären Speicherpoolen an die Zelloberfläche (Hughes, Hollers, Crockett-Torabi, & Smith, 1992). Die
Translation der intrazellulären Speicherpoole ist dabei abhängig von intra- und extrazellulärem Ca2+ (Berger et al., 1985).
2.5.2
CD15 (Sialyl LewisX)
Beim CD15 Antigen handelt es sich strukturell um eine Trisaccharidsequenz. Im
Blut wird es auf Glykolipid- und Glykoproteinstrukturen von PMN, eosinophilen Granulozyten und Monozyten exprimiert. Die Sialylierung von Lewis-x (Lex) zu Sialyl-Lex
wird durch 2,3-Sialytransferasen katalysiert. Sialyl-Lex dient als Ligand für alle drei Selektine (L-, E- und P-Selektine). Durch die Bindung des Rezeptors an E- und PSelektine des Endothels werden die Neutrophilen abgebremst und es kommt zum Rollen entlang des Endothels (Bhatia, King, & Hammer, 2003; Sperandio, 2006).
21
2.6
Chemotaxisuntersuchungen
Chemotaxis ist die gerichtete Zellbewegung entlang eines chemischen Gradienten
(Zigmond, 1989). Die Bewegung entlang des Gradienten zum Ort der höheren Konzentration wird als positive Chemotaxis bezeichnet, die Bewegung in die andere Richtung als negative Chemotaxis. Der chemotaktisch wirksame Stoff wird entsprechend
als chemoattractant (positive Chemotaxis) oder chemorepellent (negative Chemotaxis)
bezeichnet. Im Folgenden werden Methoden zur Untersuchung positiver Chemotaxis
humaner Zellen beschrieben, wie sie sich bei Entzündungen abspielt.
1955 untersuchten REBUCK ET AL. mit der von ihm entwickelten Hautfenster-Technik
Chemotaxis in vivo. Er untersuchte die lokale leukozytäre Migration, indem er künstliche Läsionen auf der Haut seiner Probanden herstellte, auf diese eine entzündungsauslösende Substanz gab und sie dann mit einem Glasplättchen abdeckte. Nach einer
bestimmten Zeit entnahm er dieses Glasplättchen wieder um das daran haftende
Exsudat zu untersuchen und die Zellen zu zählen (Rebuck & Crowley, 1955). 1962
wurde durch BOYDEN eine Chemotaxiskammer (Boyden-Kammer) konzipiert, die als
Grundlage für viele weitere Untersuchungen diente und bis heute bei in vitro Untersuchungen eingesetzt wird. Durch einen Filter wird die Boyden-Kammer in einen oberen
und unteren Bereich geteilt. In die untere Kammer wird ein chemotaktisch wirksamer
Lockstoff gegeben und in die obere Kammer die Suspension mit der zu untersuchenden Zellpopulation (Abbildung 6). Die durch das Chemotaktikum angelockten Zellen
wandern in den Filter ein. Eine definierte Porengröße ermöglicht Wanderung der Zellen
nach Reizung, jedoch kein passives Hindurchgleiten. Die Entnahme des Filters erfolgt
nach einer festgelegten Inkubationszeit. Danach werden die an der Unterseite des Filters befindlichen Zellen fixiert und gefärbt. Die Auswertung erfolgt lichtmikroskopisch
durch Auszählen dieser Zellen (Boyden, 1962). Ein Nachteil dieser Methode ist, dass
Zellen, die innerhalb der Inkubationszeit den gesamten Filter durchwandert haben,
nicht mehr gezählt werden und Veränderungen der Zellmorphologie sowie die Richtung
der Zellbewegung und deren Geschwindigkeit nicht direkt beobachtet werden können.
22
Kammer für
Zellsuspension
Filter
Kammer für
chemotaktischen
Lockstoff
Abbildung 6: Boyden-Kammer.
Das Prinzip der Boyden-Kammer wurde unter anderem von ZIGMOND modifiziert
(Zigmond & Hirsch, 1973) und führte zur Entwicklung der Zigmond-Kammer. Bei diesem Chemotaxis-Assay sind die Kammer mit dem Zellmedium und die Kammer mit
dem chemotaktischen Lockstoff horizontal nebeneinander angeordnet und über einen
schmalen Spalt (~10 µm) verbunden, der sich zwischen der Brücke der Kammern und
einem darüber liegenden Deckglas bildet. Dieses Verfahren ermöglicht es die Zellen
direkt unter dem Mikroskop zu beobachten, morphologische Formveränderungen zu
erkennen und die Richtung der Zellbewegung zu bestimmen (Zigmond, 1977). Bei der
klinischen Anwendung dieser Kammersysteme besteht das Problem, dass zwischen
einem Testversagen (falsch-negatives Ergebnis) und einem echten funktionalen
Chemotaxisdefekte (richtig-negativ) nicht unterschieden werden kann. Um dies zu beheben entwickelte MEYLE eine neue Methode bei der mittels Mehrfachansätzen in modifizierten Boyden-Kammern und Vergleich der einzelnen Regressionskoeffizienten
fasch-negative Ergebnisse innerhalb der Zellpopulation eines Individuums identifiziert
werden können (Meyle & Axmann-Krcmar, 1999). 1975 etablierten NELSON ET AL. die
Chemotaxis durch Agarose-Gel Methode im Humanbereich. Bei dieser Methode zur
Untersuchung der chemotaktischen Aktivität wird in einer Petrischale befindliches Agarose-Gel benutzt, in das drei Vertiefungen gestanzt werden. In die äußeren Vertiefungen wird das Chemotaktikum beziehungsweise die Kontrollsubstanz gegeben und in
die zentrale Vertiefung die Suspension mit den zu untersuchenden Zellen. Nach einer
vorgegebenen Inkubationszeit erfolgt die Entfernung des Agarose-Gels durch Austrocknung. Die Zellen befinden sich danach am Boden der Petrischale, wo sie gefärbt
und ausgezählt werden können. Mit dieser Methode kann zusätzlich die Messung der
spontanen Migration (random migration), die Chemokinese (ungerichtete Zellbewegung) sowie die Hemmung der Migration geprüft werden (Nelson, Quie, & Simmons,
1975).
23
Ein anderes Konzept zur Untersuchung der in vivo Chemotaxis am Menschen wurde von GOLUB ET AL. für die Mundhöhle entwickelt. Durch Einbringen eines inflammatorischen Reizes (chemotaktisch wirksame Caseinlösung) in den Sulcus gingivae lösten
sie die leukozytäre Wanderung in diesen aus. Jeweils vor und 15, 20, 25, 30, 35, 40
und 45 Minuten nach Reizapplikation wurden Proben entnommen. Die Probengewinnung erfolgte nach der 1976 von SKAPSKI UND LEHNER entwickelte Methode, bei der
durch mehrfaches aspirieren von 10 µl phoshatgepufferter Kochsalzlösung mittels Mikrospritze im Sulcus beziehungsweise in der parodontalen Tasche, SF entnommen wird.
Im direkten Anschluss wurden die Leukozyten ausgezählt. Die Höchstwerte der leukozytären Einwanderung lagen bei 25 Minuten. In Analogie zeigte die stimulierte Messung der SFFR Maxima bei 35 Minuten. Mit diesen Tests sollten diagnostische Verfahren zur Identifikation von Patienten mit Leukozytendefekten entwickelt werden (Golub
et al., 1981).
Basierend auf dieser Methode untersuchte die gleiche Arbeitsgruppe 1982 die Leukozyten-Antwort in der Sulcusflüssigkeit von diabetischen Ratten (Alloxan-induzierter
DM) und gesunden Tieren (n = 14). Nachdem die Tiere für 4 (n = 4), 14 (n = 8) und 20
(n = 5) Tage diabetisch waren, wurde ihnen unter Narkose die Gingiva um die oberen
Inzisiven chirurgisch exzidiert und nach der beschriebenen Methode Proben entnommen. Es zeigte sich bei allen Ratten, die unter einem unkontrollierten Diabetes litten,
eine deutlich niedrigere Anzahl der zum Zeitpunkt der maximalen leukozytären Antwort
eingewanderten Zellen, als bei den Kontrolltieren. Bei den unkontrolliert diabetischen
Tieren äußerte sich dies in einem bis zu 83 % niedrigeren Maximum der chemotaktischen Antwort, wohingegen bei Tieren, die mit Insulin behandelt wurden, das Maximum nur um 34 % niedriger war. Diese Ergebnisse wurden mit Hilfe der Agarose-Gel
Methode und peritonealen Neutrophilen derselben Ratten bestätigt und als durch Diabetes bedingter Chemotaxisdefekt interpretiert (Golub et al., 1982). Es folgte die weitere Anwendung dieser Technik zur Testung der lokalen Chemotaxis im Sulcus gingivae
bei Patienten mit chronischer Parodontitis, aggressiver Parodontitis (damals lokalisierte
juvenile Parodontitis; LJP) sowie bei einem Patienten mit insulinabhängigem DM und
chronischer Parodontitis. Im Vergleich zu gesunden Probanden wanderten bei allen
Patienten mit einer oralen Erkrankung mehr Zellen in die parodontale Tasche beziehungsweise den Sulcus ein. Bei den Patienten mit juveniler Parodontitis und dem Patienten mit Diabetes konnte zudem ein atypischer Verlauf der leukozytären Einwanderungskinetik mit zwei Maxima beobachtet werden (Iacono et al., 1985).
Eine weitere Tierstudie zu diesem Thema führten OZSOY ET AL. (2004) durch. Sie
untersuchten Gingiva-Biopsien von diabetischen Ratten (Alloxan-induzierter DM) mit
24
dem Elektronenmikroskop auf ultrastrukturelle Veränderungen der sulculären PMN
nach chemotaktischer Aktivierung durch Casein oder fMLF. Eine erste Probenentnahme erfolgte 15 Minuten nach Reizapplikation, weitere in 5-minütigen Abständen mit
einer letzten Messung nach 45 Minuten. 30 Minuten nach Applikation des Caseins und
35 Minuten nach Applikation des fMLF war die chemotaktische Antwort am stärksten.
In den Proben, die nach 40 Minuten entnommen wurden, befanden sich PMN mit pyknotischen Zellkernen. Nach 45 Minuten waren PMN mit einer verminderten Anzahl von
Granula präsent. Die strukturelle Deformation der Zellen stieg in dieser Studie mit dem
Schweregrad des Diabetes.
Weitere zu diesem Themenkomplex durchgeführte Studien mit PMN aus peripherem Blut zeigten teilweise diametrale Ergebnisse. So untersuchten DELAMAIRE ET AL.
1997 Adhärenz, Chemotaxis, Phagozytose und bakterizide Funktion an PMN von 61
Diabetikern, wobei 40 Personen dieser Gruppe an DM Typ 2 und 21 an DM Typ 1 erkrankt waren, und verglichen diese Daten mit denen von Gesunden. Die Chemotaxis
wurde mit Hilfe der Chemotaxis durch Agarose-Gel Methode und den chemotaktisch
wirksamen Substanzen fMLF und Komplementproteinen untersucht, die Adhärenz mit
Hilfe der Expression von CD11a, CD11b und CD11c, die Phagozytose mit Hilfe von
opsonierten Latexpartikeln und die bakterizide Funktion über die Chemilumineszenz
reaktiver Sauerstoffverbindungen. Es zeigte sich, dass die PMN-Chemotaxis bei den
Patienten niedriger war als bei den Kontrollen (p < 0,001) und mit spontaner Adhärenz
sowie einer erhöhten Expression der Adhäsionsmoleküle CD11b und CD11c assoziiert
war. Eine Korrelation mit dem Alter, der Dauer der Erkrankung und des HbA1c-Wertes
konnte nicht festgestellt werden (Delamaire et al., 1997). Das Ergebnis bezüglich der
chemotaktischen PMN-Aktivität wurde ein Jahr später durch eine weitere Studie bestätigt. In dieser Studie wurden die aus Blut isolierten PMN von 41 Typ 1 Diabetiker sowie
die PMN einer gesunden Kontrollgruppe unter Verwendung einer modifizierten Boyden-Kammer und fMLF als Chemotaktikum untersucht. Eine Korrelation des GlukoseMetabolismus, ausgedrückt durch den HbA1c-Wert, mit der Chemotaxis konnte ebenfalls nicht festgestellt werden (Gustke et al., 1998).
Zu einem völlig anderen Ergebnis kamen VALERIUS ET AL., die mit einer modifizierten
Boyden-Kammer insgesamt 36 gut und schlecht eingestellte insulinabhängige sowie
insulinunabhängige Typ 1 und 2 Diabetiker untersuchten. Als Chemotaktikum wurde
Casein und in einigen Experimenten auch Escherichia coli LPS benutzt. Es konnten
keine Unterschiede in der chemotaktischen Aktivität der PMN zwischen den untersuchten Gruppen gefunden werden (Valerius et al., 1982). Zu einem vergleichbaren Ergebnis kamen auch NAGHIBI ET AL. nachdem sie die PMN-Chemotaxis von 26 Patienten,
25
10 mit DM Typ 1 und 16 mit DM Typ 2, mit der Agarose-Gel Methode und fMLF untersucht hatten (Naghibi et al., 1987). Auch WIERUSZ-W YSOCKA ET AL. konnten unter Anwendung der gleichen Methode keinen Unterschied in der Chemotaxis isolierter Granulozyten von Diabetikern Typ 1 (n = 50) zu Gesunden (n = 50) auf fMLF und Escherichia coli LPS feststellen, wohingegen die Chemotaxis auf Zymosan-aktiviertes
oder mit Cellophan inkubiertes Plasma bei den Diabetikern beeinträchtigt war
(Wierusz-Wysocka et al., 1987).
Tabelle 4: Zusammenfassung der Daten zur Chemotaxis bei Diabetikern.
Autor
Jahr
Methode
PMN
Golub,
Nicoll et
al.
1982
Skapski und
Lehner
Agarose-Gel
PMNSF
Valerius,
Eff et al.
1982
Modifizierte
BoydenKammer
Iacono,
Singh et
al.
1985
Skapski und
Lehner
Naghibi,
Smith et
al.
1987
Agarose-Gel
PMNPB
WieruszWysocka
et al.
1987
Agarose-Gel
PMNPB
Delamaire et
al.
1997
Agarose-Gel
Durchflusszytometrie
Gustke,
Stein et
al.
1998
Modifizierte
BoydenKammer
Chemotaktikum
Art
DM
Ergebnis
Casein und
fMLF
A
Alloxaninduziert
--
PMNPB
Casein und
E. coli LPS
H
1 und 2
+/-
PMNSF
Casein
A
--
H
Alloxaninduziert
1
fMLF
H
1 und 2
+/-
Casein und
E. coli LPS
Zymosanaktiviertes
Plasma
H
1
+/-
PMNPB
fMLF
H
1
-Expression
CD11a, b ↑
PMNPB
fMLF
H
1
--
PMNPER
atypische
PMNEinwanderungskinetik
--
DM: Typ des Diabetes mellitus; -- : Verminderte Chemotaxis bei Diabetikern; +/-: Kein Unterschied; PMNPB: Neutrophile Granulozyten aus peripherem Blut; PMNSF: Neutrophile Granulozyten aus Sulcusflüssigkeit; PMNPER: Neutrophile Granulozyten aus dem Peritonealraum; fMLF:
N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylanalin; A: Tierexperiment; H: Humanstudie.
26
3. Ziele der Studie
Ziel der Studie war es, die experimentelle chemotaktische Reaktion von PMN im
Sulcus gingivae von Diabetikern mit chronischer Parodontitis zu analysieren. Die Arbeitshypothesen wurden basierend auf der zu diesem Themenkomplex vorhandenen
Evidenz formuliert. Die Arbeit soll Aufschluss über die Frage geben:
Beeinflusst Diabetes mellitus die lokale Chemotaxis von PMN im Parodont?
Arbeitshypothesen
H1 = Ein standardisierter inflammatorischer Reiz (Casein) löst gegenüber einer Negativkontrolle eine gesteigerte PMN-Einwanderung in den Sulcus gingivae aus.
H2 = Die Anzahl der nach Setzen eines inflammatorischen Reizes in den Sulcus
gingivae eingewanderten PMN ist bei Diabetikern mit Parodontitis im Vergleich zu Patienten mit Parodontitis und Gesunden vermindert.
H3 = Die Expression des leukozytären Oberflächenrezeptors CD11b ist auf sulculären
PMN von Diabetikern mit Parodontitis im Vergleich zu Patienten mit Parodontitis und
Gesunden nach Stimulation mit einem inflammatorischen Reiz erhöht.
H4 = Die Expression des leukozytären Oberflächenrezeptors CD15 ist auf sulculären
PMN von Diabetikern mit Parodontitis im Vergleich zu Patienten mit Parodontitis und
Gesunden nach Stimulation mit einem inflammatorischen Reiz erhöht.
27
4. Materialien und Methoden
4.1
Studiendesign
Es handelte sich um eine prospektive, dreiarmige kontrollierte Studie mit deskriptiver Auswertungscharakteristik.
4.2
Votum der Ethikkommission
Die Studienpopulation rekrutierte sich aus Patienten und Probanden der Studie „Zytosolische Signalübertragung humaner polymorphkerniger Granulozyten und zelluläre
Effektorfunktionen bei Patienten mit Diabetes mellitus und chronischer Parodontitis“
(Ethikkommission Antragsnummer: 175/07). Für die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen der oben genannten Studie bei der Ethikkommission der Justus-Liebig-Universität
ein Amendment beantragt, das ein positives Votum erhielt (Ethikkommission Antragsnummer: 175/07 Amendment I).
4.3
Selektion der Studienpopulation
Basierend auf der bisherigen Literatur zum bearbeiteten Themenkomplex und Beratung in der Abteilung für medizinische Statistik (Dr. Bödeker) wurde festgelegt, dass
pro Diagnosegruppe 10 Personen an der Studie teilnehmen sollten. Die erste Patientengruppe bestand aus 10 Typ 2 Diabetikern mit chronischer Parodontitis (DM2+P) und
die zweite aus 10 Personen mit chronischer Parodontitis (P). Als Kontrollgruppe (C)
dienten 10 systemisch und parodontal Gesunde. Im Folgenden werden die allgemeinen und lokalen Ein- und Ausschlusskriterien der Studie beschrieben.
Allgemeine Einschlusskriterien:

Alter zwischen 18 und 80 Jahre

Schriftliches Einverständnis nach Aufklärung

Restzahnbestand ≥ 12 Zähne

Gute Compliance

Nichtraucher

DM2+P: Diagnose Diabetes mellitus Typ 2 und chronische Parodontitis

P: Diagnose chronische Parodontitis
28
Allgemeine Ausschlusskriterien:

Schwangerschaft

Zigaretten- oder sonstiger Nikotinkonsum

Allergien, insbesondere gegen Milchprodukte und Casein

Chronische Allgemeinerkrankungen, die in der Mundhöhle zu Veränderungen führen

Restzahnbestand < 12 Zähne

Akute Erkrankungen, wie grippale oder fiebrige Infekte

Einnahme von Antibiotika, Psychopharmaka, Antihistaminika oder Immunsuppressiva innerhalb der letzten 6 Monate

DM2+P: Diabetische Folgeerkrankungen, wie Retinopathien, Nephropathien
oder periphere Neuropathien
Aus Gründen der Praktikabilität (Speichelzutritt oder Ähnliches) und des Patientenkomforts bei der Probenentnahme erfolgte die Probengewinnung ausschließlich an
Oberkieferzähnen.
Lokale Einschlussbedingungen:

Parodontien des Test- und Kontrollzahnes: Sondierungstiefe ≤ 3 mm

Zähne, an denen SF zur Volumenbestimmung entnommen wurde: Sondierungstiefe ≤ 4 mm

Am Tag der Probenentnahme (Tag 0): Papillenblutungsindex = 0 an allen in
die Studie einbezogenen Zähnen, das heißt völlige klinische Entzündungsfreiheit
Lokale Ausschlusskriterien:

Zähne mit gingivalen und subgingivalen Füllungs- oder Kronenrändern

Parodontien des Test- und Kontrollzahnes: Sondierungstiefe > 3 mm

Zähne, an denen SF zur Volumenbestimmung entnommen wurde: Sondierungstiefe > 4 mm

Am Tag der Probenentnahme (Tag 0): Papillenblutungsindex ≠ 0 an einem
oder mehreren in die Studie einbezogenen Zähnen
4.4
Aufklärung der Studienteilnehmer
Alle Probanden und Patienten wurden über die Inhalte der Untersuchung, geplante
Behandlungen, mögliche Risiken und Nebenwirkungen aufgeklärt. Konform mit den
29
Vorgaben der Ethikkommission erfolgte die Aufklärung im persönlichen Gespräch und
unter Verwendung eines Informationsblatts, welches den Teilnehmern in Kopie ausgehändigt wurde. Jeder Studienteilnehmer legte seine Einwilligung schriftlich nieder und
es wurde ihm mitgeteilt, dass dieses Einverständnis jederzeit widerrufbar sei und er
aus der Studie ausscheiden könne.
Es wurde darauf hingewiesen, dass nach Abschluss der Mundhygienephase am
Tag der Probenentnahme keine Zahnseide angewendet werden dürfe, um eine mechanische Irritation der Gingiva zu vermeiden.
4.5
Methodik und Vorversuche
Um die Methodik der SF-Entnahme zu etablieren, wurde bei 8 Personen jeder
Gruppe die PMN-Einwanderungskinetik in den Sulcus gingivae nach chemotaktischer
Reizapplikation untersucht.
4.5.1
Methode nach MEYLE
Die Entnahme der SF wurde modifiziert nach der von MEYLE (1986) etablierten Methode durchgeführt. Die Probenentnahme erfolgte bei den Vorversuchen an den Zähnen 12 und 22. Waren diese Zähne nicht vorhanden, wurde der jeweils nächste mesial
der Lücke gelegene Zahn zur Probenentnahme herangezogen. Die Zuordnung von
Test- und Kontrollzahn wurde für jeden Studienteilnehmer per Losung im Vorhinein
festgelegt (Urnenmodell). Nach Trockenlegung des Oberkiefers mittels Watterollen und
Entfernung möglicher supragingivaler weicher Beläge mit dem Scaler, wurden die
Zahnzwischenräume mit sanften Luftpüsterstößen jeweils 2 Sekunden von mesio- und
distobuccal getrocknet. Der Zutritt von Speichel wurde während des gesamten sich
anschließenden Probengewinnungszeitraums unterbunden. Die zwei zur Probenentnahme herangezogenen Zähne wurden mesial mit einer Markierung versehen um die
Proben immer an derselben Stelle des Sulcus entnehmen zu können. Zunächst erfolgte an allen Zähnen eine Baselinewaschung des Sulcus (BL) um an allen Entnahmestellen die gleichen Ausgangsbedingungen herzustellen. Dazu wurde die abgerundete
Kanüle einer 5 ml Luer-Lock-Einmalspritze entlang der am Zahn befindlichen Markierung 1 mm in den betreffenden Sulcus eingebracht und dieser mit 1 ml phosphatgepufferter isotonischer Kochsalzlösung ohne Ca2+ und Mg2+ (PBS-/-) innerhalb von 15 Sekunden ausgespült (Abbildung 7).
30
Watterolle
Abgerundete Kanüle
Kunststoffhülse
einer Braunüle
Abbildung 7: Entnahme von Sulcusflüssigkeit.
Die aus dem Sulcus hervortretende Flüssigkeit wurde mit der Kunststoffhülse einer
Braunüle über einen 20 cm langen Infusionsschlauch in ein auf Eis gelagertes 15 ml
Falcon abgesaugt. Das Falcon war über einen Schlauch und ein Dreiwegeventil an die
Vakuumversorgung der Einheit angeschlossen, welche einen Unterdruck von etwa 0,1
bar an der Spitze der Ansaugkanüle erzeugte (Abbildung 8).
Kunststoffhülse
einer Braunüle
Zentrifugenröhrchen
Eiskühlung
3-Wege-Ventil
Wasserstrahlpumpe der
Behandlungseinheit
Abbildung 8: Schematischer Aufbau des SF-Absaugsystems (Meyle, 1986).
Um verbliebene Zellen aus dem Absaugsystem in das Röhrchen zu schwemmen,
wurde das Probensammelsystem nach den Waschungen jeweils mit 2 ml PBS(-/-) nachgespült. Vor und nach jeder Probenentnahme wurde das Schlauchsystem mit 20 ml 70
%igem Ethanol und anschließend zweimal mit 20 ml steriler Kochsalzlösung durchgespült um etwaige Plastikmonomere oder sonstige Produktionsrückstände zu entfernen,
die die zelluläre Aggregation begünstigen könnten.
31
Nach der Baselinewaschung wurden alle betroffenen Zähne wiederholt mit 2 Sekunden andauernden sanften Luftpüsterstößen getrocknet, um eine mögliche Verdünnung der Testsubstanzen zu verhindern. In den Sulcus des Testzahnes wurde mittels
Pipette 2 µl einer Caseinlösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml als inflammatorischer Standardreiz appliziert (Abbildung 9). In den Sulcus des Kontrollzahnes wurde
als Placebo die gleiche Menge der Trägersubstanz (PBS mit Ca2+ ohne Mg2+) ohne
Casein appliziert.
B
A
C
Casein
Sulcus
PMN
Abbildung 9: Lokale experimentelle Entzündungsreaktion durch Casein. A: Das Casein wird in
den Sulcus gingivae pipettiert. B: Das Casein verteilt sich im umliegenden Gewebe und induziert eine lokale Entzündungsreaktion. Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) werden chemotaktisch aktiviert und rollen am Endothel entlang. C: Die PMN verlassen die Kapillaren via Diapedese und wandern durch das Gewebe in den Sulcus gingivae ein.
Weitere Probenentnahmen erfolgten 15, 25, 35 und 45 Minuten nach Reiz- beziehungsweise Placeboapplikation. Die Falcons mit den gewonnen Proben wurden direkt
nach jeder SF-Entnahme verschraubt und weiterhin auf Eis gelagert. Alle Flüssigkeiten, die in Kontakt mit der Gingiva kamen, wurden zuvor in einem Wärmebecken auf
37°C temperiert, um einen möglichen Einfluss der Temperatur auf das Gewebe auszuschließen.
4.5.2
PMN-Einwanderungskinetik
Die Anzahl der zu den verschiedenen Entnahmezeitpunkten BL, 15, 25, 35 und 45
Minuten eingewanderten PMN wurde im direkten Anschluss an die Probenentnahme
durchflusszytometrisch bestimmt. Für jeden Studienteilnehmer ergab sich eine Gesamtmenge von 10 SF-Proben, wobei 5 Einzelproben aus dem mit Casein stimulierten
Ansatz des Testzahnes und 5 aus dem nicht stimulierten Ansatz des Kontrollzahnes
stammten. Die auf Eis gelagerten Falcons mit den Proben wurden unmittelbar nach
Abschluss der Gewinnung bei 200 g (g = 9,81 m/s2) und 4°C für 10 Minuten zentrifu-
32
giert. Da das Zellpellet sehr klein und mit bloßem Auge kaum sichtbar war, wurde der
Überstand in 2 Schritten reduziert. Im ersten Schritt wurde der Inhalt bis zur 500 µl
Markierung des Röhrchens entnommen und verworfen. Danach wurden weitere 350 µl
abgenommen, das Restvolumen wurde auf 150 µl ergänzt und das Pellet resuspendiert. 100 µl jeder Probe wurden in die vorbereiteten Röhrchen zur durchflusszytometrischen Analyse pipettiert und jeweils das gleiche Volumen an CytoCountTM hinzugegeben. CytoCountTM ist eine für die durchflusszytometrische Anwendung bestimmte
Suspension aus charakteristisch fluoreszierenden 5,2 µm großen Polystyrolkügelchen
(counting beads; CB) in einer wässrigen Lösung. Sie dienen als Referenzpopulation für
die Auszählung einer zu untersuchenden Leukozytenpopulation. Die genaue Anzahl
Kügelchen pro µl ist vom Hersteller angegeben. Um ein möglichst gleiches Verhältnis
von PMN zu CB zu erreichen, wurde die CytoCountTM-Suspension vor Anwendung in
einem Verhältnis von 1:10 mit PBS(-/-) verdünnt. Das Absetzen der Zellen und CB auf
dem Boden des Röhrchens wurde durch 3 Sekunden andauerndes Mischen mit einem
Vortex-Mixer unmittelbar vor der durchflusszytometrischen Messung verhindert. Bei
jeder Messung wurden 5000 Ereignisse gezählt. Der Schwellenwert für ein Ereignis
war auf ≥ 0,5 µm festgelegt. Zur Analyse der Proben wurden die Ereignisse in einem
Punkt-Diagramm mit Vorwärtsstreuung auf der x-Achse, als ein Maß für die Größe der
Zellen beziehungsweise CB, gegen die Seitwärtsstreuung auf der y-Achse, als Maß für
die Granularität, dargestellt. Die beiden interessierenden Populationen wurden dann
eingegrenzt (gating) und die Anzahl der Ereignisse in den definierten Regionen bestimmt (Abbildung 10). Die Gates für die sulculären PMN (PMNSF) entsprachen dabei
denen der aus peripherem Blut isolierten PMN (PMNpB) des gleichen Studienteilnehmers.
33
10 3
10 4
10 4
SS Log
R6
R3
R6
R3
10 2
10 3
10 3
SS Log
SS Log
10 1
10 2
10 0
100
10 2
101
102
FS Log
103
104
10 1
10 1
Abbildung 10: Durchflusszytometrische Darstellung einer SF-Probe. Vorwärtsstreuung (FS) vs.
TM
seitliche Streuung (SS); Gate R6: CytoCounts (grün); Gate R3: PMNs (pink).
Die absolute Anzahl der bei einer Sulcuswaschung gewonnen PMNSF wurde mit Hilfe0 der folgenden Formel
berechnet:
0
10
100
10
101 100
102 101
FS Log
(
)
103 102
FS Log
104 103
104
µl
PMNges. = Gesamtanzahl, der durch die Sulcuswaschung gewonnenen PMNSF
CB = Cytocount Beats
Anzahl gezählter Zellen = Anzahl durchflusszytometrisch gezählter PMNSF
Anzahl gezählter CB-Kügelchen = Anzahl der durchflusszytometrisch gezählten CB
CB_Konzentration = Konzentration der CB in der hinzugegebenen Lösung (Anzahl/µl)
4.6
Klinische Eingangsuntersuchung
Mittels Florida Probe® erfolgte eine vollständige parodontologische Untersuchung.
Bei diesem System handelt es sich um eine PC-gestützte, druckkalibrierte Parodontalsonde mit einer Software zur Visualisierung, Ansage und Speicherung von erhobenen
parodontalen Befunddaten. Die zu Messzwecken eingesetzte Version der FloridaSonde arbeitet mit einem konstanten Sondendruck von 15 g und misst auf 0,2 mm genau. Im Befundschema (Anhang E) werden ganze Millimeterangaben angezeigt. So
werden Werte > 0,5 mm oberhalb der ganzen Millimeterangabe aufgerundet, niedrigere Werte entsprechend abgerundet, wobei die jeweiligen Dezimalzahlen jedoch nach
Export in MS-Excel für die spätere Auswertung zur Verfügung stehen. Für die Erhebung des Befundes wurde das europäische Befundschema gewählt. Es wurde an
sechs Stellen pro Zahn (mesial, zentral und distal jeweils buccal und oral) untersucht.
34
Neben Sondierungstiefe (ST) wurde Sondierungsblutung (BOP) und differenziert dazu
Pusaustritt, Gingivalrand (GR), klinisches Attachmentniveau (CAL) und Furkationsgrade (FK) dokumentiert (Abbildung 54, Anhang E). Die kariologische Untersuchung wurde auf einem getrenntem Formblatt dokumentiert (Abbildung 55, Anhang E).
4.7
Mundhygienephase
Nach der vollständigen Eingangsuntersuchung schlossen sich 3 weitere Mundhygieneuntersuchungen (Tag -14, Tag -7 und Tag 0) im Abstand von jeweils einer Woche
an. Ziel dieses Vorgehens war die Optimierung der Mundhygiene der Studienteilnehmer und damit das Erreichen einer klinisch entzündungsfreien Gingiva. Es sollten
gingival vergleichbare Ausgangsbedingungen bei Patienten und Probanden geschaffen
werden, um den Einfluss von Gingivitis ausschließen zu können. Dazu wurden an den
Tagen -14 und 0 die Mundhygieneindizes (Papillenblutungsindex und Plaqueindex)
erfasst und die Ergebnisse dieser Untersuchungen in Dokumentationsbögen
(Abbildung 59-60; Anhang E) festgehalten. An den Tagen -14 und -7 folgte eine professionelle Zahnreinigung (PZR) mit Entfernung aller supragingivalen und gingivalen
Beläge, wie Plaque, Zahnstein und Verfärbungen. Anschließend wurde an allen Zähnen eine Schmelzpolitur durchgeführt. Die Studienteilnehmer erhielten eine Intensivmotivation und ihnen wurden individuelle Schwachstellen bei der täglichen Zahnreinigung aufgezeigt. Weiterhin erfolgte eine Auswahl von geeigneten Maßnahmen (Zahnputztechnik) und Hilfsmitteln (Zahnseide, Interdentalbürstchen u. Ä.) zur Verbesserung
der individuellen Mundhygiene einschließlich der Demonstration dieser am Modell und
individuell im Mund des Patienten beziehungsweise Probanden. Tabelle 5 gibt eine
zusammenfassende Übersicht der Maßnahmen der Mundhygienephase. Die Probenentnahme erfolgte am Tag 0 vor der klinischen Untersuchung um eine mögliche Irritation des gingivalen Gewebes zu vermeiden.
Tabelle 5: Maßnahmen der Mundhygienephase.
Maßnahmen
Tag -14
Tag -7
Tag 0
Instruktion & Motivation
X
X
X
Mundhygieneindizes
X
PZR + Schmelzpolitur
X
SFFR
X
X
X
X
SF-Entnahme
X
Blutentnahme
X
PZR: Professionelle Zahnreinigung; SFFR: Sulcusflüssigkeits-Fließrate; SF: Sulcusflüssigkeit.
35
Modifizierter Papillenblutungsindex (PBI)
Jede interproximale Papille, mit Ausnahme der zwischen den mittleren Inzisiven,
wurde nach dem Ausstreichen mit einer parodontalen Sonde bezüglich einer auftretenden Blutung beurteilt. Die Beurteilung erfolgte im 1. und 3. Quadranten oral und im 2.
und 4. Quadranten vestibulär. Die Intensität der Blutung wurde basierend auf den Studien von SAXER UND MÜHLEMANN (1975) mit einem Indexwert von 0 bis 4 beurteilt (Tabelle 6).
Die Berechnung des Papillenblutungsindex eines Studienteilnehmers erfolgte nach
der Formel:
∑
∑
Tabelle 6: Papillenblutungsindex nach Saxer und Mühlemann (1975).
Grad
Kriterien
0
Keine Blutung.
1
Leichte, punktuelle Blutung.
2
Moderate Blutung, Auftreten mehrerer Blutungspunkte oder
einer Blutungslinie.
3
Die Blutung füllt das interdentale Dreieck aus.
4
Blut fließt über den Zahn oder die Gingiva, spontane Blutung.
36
Modifizierter Plaqueindex (PLI)
Die Zähne wurden mit Plaquerelevator (Mira-2-Tone®) angefärbt und jeder Zahn an
4 Flächen (mesial, buccal, distal, lingual beziehungsweise palatinal) nach den Kriterien
des modifizierten QUIGLEY UND HEIN PLI (1962) auf Vorhandensein von Plaque geprüft
(Tabelle 7). Die Modifikationen lagen in der Verwendung von Plaquerelevator (O'Leary,
Drake, & Naylor, 1972) und der Aufzeichnung von vier Stellen pro Zahn, während QUIGLEY UND HEIN
lediglich die buccalen Flächen der Zähne beurteilten.
Die Berechnung des Plaqueindex erfolgte nach der Formel:
∑
Tabelle 7: Plaqueindex nach Quigley und Hein (1962).
Grad
Kriterien
0
Keine Plaque sichtbar.
1
Einzelne Plaqueinseln im zervikalen Bereich des Zahnes.
2
Eine durchgehende Plaquelinie (bis zu 1 mm breit) am Sulcusrand.
3
Die Zahnkrone ist bis zum zervikalen Drittel mit Plaque bedeckt.
4
Die Zahnkrone ist bis zu zwei Drittel mit Plaque bedeckt.
5
Die Zahnkrone ist mehr als zwei Drittel mit Plaque bedeckt.
37
4.8
Blutentnahme
Am Tag 0 wurde vor der Probenentnahme und der klinischen Untersuchung jedem
Patienten und Probanden Blut aus einer Armvene entnommen. Die Bestimmung der
Blutsenkungsgeschwindigkeit und die Isolation der PMN (Boyum, 1968; Herrmann et
al., 2007) erfolgten im Labor der Poliklinik für Parodontologie. Alle weiteren labormedizinischen Blutwerte, wie die Bestimmung des HbA1c, Serum-Glukose, C-Reaktives
Protein (CRP) sowie ein großes Blutbild wurden im Zentrallabor des Universitätsklinikums Gießen und Marburg (Leiter: Prof. Dr. Renz) bestimmt.
4.9
Quantifizierung der PMN-Oberflächenantigene
Die Quantifizierung repräsentativer Zelloberflächenantigene erfolgte durch die Verwendung fluorochromkonjugierter Antikörper im Durchflusszytometer (CyAn™ ADP).
Zur Probenentnahme wurden die Sulci der Zähne 13 und 23 herangezogen, wobei die
Zuordnung von Test- und Kontrollzahn für jeden Studienteilnehmer per Losverfahren
im Vorhinein festgelegt worden war (Urnenmodell). Um eine für die Oberflächenrezeptormarkierung ausreichende Anzahl an PMN aus dem Sulcus zu gewinnen, wurde die
SF-Probe 35 Minuten nach BL-Waschung und Reiz- beziehungsweise Placeboapplikation entnommen. Diese Zeitspanne ergab sich aus den Ergebnissen der Vorversuche.
Der Probenumfang für jeden Patienten beziehungsweise Probanden betrug 4 Röhrchen. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 200 g und 4°C wurde der Überstand bis zur
500 µl Markierung abgenommen und das Zellpellet vorsichtig resuspensiert. Aus jeder
Probe wurden viermal 100 µl entnommen, in 4 neue Röhrchen aliquotiert und entsprechend der Herstellerangaben die Antikörper hinzugegeben. Um die Anzahl der unspezifischen Bindungen darstellen zu können, diente das erste Röhrchen jeder Probe als
Isotypenkontrolle (RIso). Im zweiten Röhrchen erfolgte die Markierung der CD45+ Zellen als Pan-Leukozytenmarker (RPan), im dritten die der CD11b+ (R1) und im vierten die
der CD15+ Zellen (R2) (Abbildung 11).
38
500 µl Zellsuspension
500 µl Zellsuspension
SF-Probe
SF-Probe
100 µl Zellsuspension
100 µl Zell+
suspension
100 µl
+ CC
100 +µl CC
Isotypen+
ktr.
Isotypenktr.
100 µl Zellsuspension
100 µl Zell+
suspension
100 µl
+ CC
100 +
µl CC
CD45-AK
+
CD45-AK
100 µl Zellsuspension
100 µl Zell+
suspension
100 µl
+ CC
100 +
µl CC
CD11b-AK
+
+
CD11b-AK
CD16-AK
+
CD16-AK
100 µl Zellsuspension
100 µl Zell+
suspension
100 µl
+ CC
100 +
µl CC
CD15-AK
+
CD15-AK
RIso
RIso
RPan
RPan
R1
R1
R2
R2
TM
Abbildung 11: Schematische Darstellung der Aufteilung der SF-Probe. CC: CytoCount , AK:
Antikörper.
Die Berechnung der Anzahl der CD45+ Zellen erfolgte mit der im Unterkapitel 4.5.2
dargestellten Formel, mit dem Unterschied der Multiplikation mit 500 µl, anstatt mit 150
µl. Bei den verwendeten Antikörpern handelte es sich ausschließlich um monoklonale
anti-humane und farbmolekülkonjungierte Antikörper murinen Ursprungs (Maus anti
Human). Eine detaillierte Übersicht über die verwendeten Antikörper wird in Tabelle 8
gegeben. Die Proben wurden dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln
inkubiert. Um die Anzahl der PMN bestimmen zu können, wurde jedem Röhrchen nach
der Inkubationszeit 100 µl 1:10 verdünnte CytoCountTM-Suspension hinzugegeben. Vor
der Messung am Durchflusszytometer wurden alle Röhrchen 3 Sekunden mit dem Vortexmixer gemischt. Im Messprotokoll des Summit® Programms war zuvor ein Schwellenwert von 0,5 µm und eine Anzahl von 5000 zu messenden Ereignissen festgelegt
worden.
39
Tabelle 8: Übersicht verwendeter Antikörper (weitere Details in Anhang F).
Antikörper
µl/Test
Isotypenkontrolle
5
Anti-human CD15
20
Isotypenkontrolle
5
Anti-human CD45
5
Anti-human CD11b
5
Konjugierter
Farbstoff
PMT
Emissionsfilter
LASER
FITC (Fluoresceinisothiocynat)
FL1
430/10 nm
Laser 1
(488 nm)
APC (Allo-PhycoCyanin)
FL8
665/20 nm
Laser 3
(635 nm)
PTMs: Photodetektoren. PTMs, Emissionsfilter und LASER nach Angaben des Herstellers
TM
(CyAn ADP-Bedienungsanleitung, 2004).
4.10 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie ist ein optisches Messverfahren für einzelne in einem
Flüssigkeitsstrom fokussierte Partikel oder Zellen. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie
können diese entsprechend ihrer Größe und Granularität charakterisiert werden. Durch
die Verwendung fluoreszierend markierter monoklonaler Antikörper ist es zudem möglich Antigene, wie beispielsweise bestimmte Rezeptoren, auf der Oberfläche von Zellen
quantitativ nachzuweisen (Shapiro, 2003).
Durch eine hydrodynamische Fokussierung in einem laminaren Flüssigkeitsstrom
werden die zu untersuchenden Zellen perlschnurartig hintereinander aufgereiht und
passieren Exzitationsquellen, bei denen es sich um LASER handelt (Shapiro, 2003).
Das auf die Zelle auftreffende Licht wird gestreut. Im Kleinwinkelbereich (0-10°) gestreutes Licht wird als Vorwärtsstreulicht (forward scatter; FS) bezeichnet. Das FS ist
sensitiv für die Querschnittfläche der Zelle und liefert damit Informationen über die
Größe der Zelle. Das im Winkel von 90° gestreute Licht (side scatter; SS) gibt Aufschluss über die Granularität und die Membranfaltung der Zelle (Shapiro, 2003). Das
von den Fluorochromen der gebundenen Antikörper emittierte Licht wird über dichroitische Spiegel und Bandpassfilter in verschiedene Spektralbereiche aufgetrennt und trifft
dann auf die Photodetektoren (photo-multiplier-tubes; PMTs) (Shapiro, 2003). Diese
Funktionen laufen annähernd zeitgleich ab. In den PMTs wird das optische Signal in
elektrische Impulse konvertiert, welche dann über den Analog-Digital-Übersetzer (analog-digital-converter; ADC) in ein digitales Signal umgewandelt wird. Das digitale Signal
kann in einem sogenannten Punkt-Diagramm (dot-plot) zweidimensional oder eindimensional als Histogramm dargestellt werden. Beim Punkt-Diagramm entspricht jeder
Punkt einem Ereignis (Shapiro, 2003). Werden in einem Punkt-Diagramm FS und SS
40
gegeneinander aufgetragen, gibt dies Aufschluss über die Größe und Granularität der
Zelle. In einem Histogramm hingegen wird die Häufigkeitsverteilung der Fluoreszenzen
dargestellt. Dabei wird auf der x-Achse die Lichtintensität und auf der y-Achse die Anzahl der gezählten Ereignisse aufgetragen. Da die Emissionswellenlänge (Abstrahlungswellenlänge) länger ist als die Exzitationswellenlänge (Anregungswellenläge),
stellt sich die positive Farbmarkierung eines Antigens gegenüber einer Negativkontrolle
als Rechtsverschiebung im Histogramm dar. Diese Wellenlängendifferenz wird als
Stokes-Shift bezeichnet. Die relative Fluoreszenzintensität verhält sich dabei proportional zu der Anzahl markierter Antigene (Shapiro, 2003).
Das Gerät (CyAnTM ADP) und die dazugehörige Software (Summit®) verwalten alle
Messereignisse über Auswertefenster (gates). Die Analyse kann so gezielt auf ausgewählte Ereignispopulationen ausgerichtet werden. Bei der Verwendung mehrere Farbstoffe kann es zur Überlagerung der Emissionsspektren einzelner Fluorochrome kommen, was als potentielle Fehlerquelle zu betrachten ist. Aus diesem Grund wurden in
der vorliegenden Studie die Farbmarker so ausgewählt, dass sich ihre Emissionsspektren nicht überlappten und die Oberflächenrezeptormarkierung in 4 parallelen Ansätzen
vorgenommen. Auf eine optionale Fluoreszenzkompensation wurde bewusst verzichtet.
4.11 Sulcusflüssigkeits-Volumenbestimmung mit dem Periotron 8000®
Um den Erfolg der Mundhygienephase zu überprüfen, wurde als weiterer Parameter
die SFFR herangezogen. Die SFFR gilt als ein Indikator für entzündliche Veränderungen im parodontalen Gewebe und steigt mit dem Entzündungsgrad des gingivalen beziehungsweise parodontalen Gewebes an (Del Fabbro et al., 2001; Griffiths, Sterne, et
al., 1992; Löe & Holm-Pedersen, 1965). An den Tagen -14 und 0 wurde dazu an vier
zuvor festgelegten Zähnen (ein Zahn/Quadrant; ST ≤ 4 mm) das SF-Volumen bestimmt. Nach Trockenlegung mittels Watterollen und Beseitigung möglicher supragingivaler Beläge, wurden die Zähne zur Vermeidung von Speichelkontamination mit 23 kurzen Luftpüsterstößen von vestibulär und oral getrocknet. Dann wurde ein genormter Filterpapierstreifen (Periopaper®) 1 mm in den Sulcus eingeführt und dort für 30
Sekunden belassen (Abbildung 12).
41
Abbildung 12: In den Sulcus gingivae eingeführtes Periopaper®.
Mit Blut kontaminierte Proben wurden verworfen. Die Volumenbestimmung der vom
Periopaper® aufgenommenen Flüssigkeit erfolgte mit dem Periotron 8000®. Das Periopaper® wurde dazu zwischen den Messplatten des Gerätes platziert und der über Änderung des elektrischen Widerstandes ermittelte digitale Skalenwert aufgezeichnet.
Durch die zuvor durchgeführte Kalibrierung des Gerätes (Poolserum Gesunder; n = 5)
konnten die Periotronwerte (PTW) in entsprechende Sulcusflüssigkeits-Volumina umgerechnet werden. Nach dreimaliger Null-Wert-Bestimmung wurde das Poolserum mit
einer 1 µl Präzisions-Spritze, in 0,10 µl-Schritten von 0,10 bis 1,00 µl auf ein Periopaper® gegeben und gemessen. Die Messreihe wurde fünfmal wiederholt (Ciantar &
Caruana, 1998). Aus den arithmetischen Mittel der 5 Messreihen ergab sich eine polynomische Regressionskurve mit einem Bestimmtheitsmaß von r2 = 0,9995 (Abbildung
52 und Abbildung 53, Anhang A). Die Formel der Regressionskurve diente zur Umrechnung der PTWs in die entsprechenden Sulcusflüssigkeits-Volumina:
y = Sulcusflüssigkeits-Volumen in µl
x = PTW
4.12 PMN-Isolation aus dem peripheren Blut
Die Isolation der PMN erfolgte modifiziert nach der von BOYUM veröffentlichten Methode (Boyum, 1968; Herrmann et al., 2007). Für jeden Patienten beziehungsweise
42
Probanden wurden zwei Polypropylen-Falcons (PP) mit 4,3 %-Natriumcitratlösung im
Labor vorbereitet. Nach Hautdesinfektion wurde mit Hilfe einer 15 G Butterfly-Nadel
und einer Perfusor-Spritze Blut aus einer Armvene entnommen. Das Blut wurde zu
gleichen Teilen in die vorbereiteten Falcons verteilt und diese im Anschluss mehrmals
vorsichtig über Kopf gedreht um Blut und Antikoagulant zu vermischen. Es folgte die
Zugabe des gleichen Volumens einer 2 % Dextran in 0,9 % NaCl-Lösung, sowie eine
erneute Durchmischung. Dann wurden die Proben für 35 Minuten bei 4°C inkubiert.
Das so entstandene leukozytenreiche Plasma wurde abgenommen, in ein neues Falcon überführt und zentrifugiert. In der Zwischenzeit wurden je 3 ml Ficoll in zwei Falcons gegeben. Nach der Zentrifugation wurde der Plasma-Überstand aspiriert und
verworfen, das Zellpellet mit 0,9 %iger NaCl-Lösung resuspendiert und vorsichtig über
das Ficoll geschichtet. Es folgte eine erneute Zentrifugation. Der so entstandene Überstand wurde bis auf das Zellpellet abgenommen und verworfen. Um verbliebene rote
Blutzellen zu zerstören, wurde das Zellpellet hypoton lysiert und erneut zentrifugiert.
Nach Abnahme und Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in PBS(-/-) resuspendiert. Die Anzahl der PMNpB/µl wurde mit Hilfe eines Hämatozytometers bestimmt.
Die PMN-Anzahl wurde dann mit PBS(-/-) für die anschließende durchflusszytometrische Analyse und Antikörper-Färbung auf die Konzentration von 1x106 PMN/100 µl
eingestellt. Das Gate der isolierten PMNpB diente als Referenz-Gate für PMNSF.
4.13 Herstellung des Chemotaktikums
Als Chemotaktikum diente das Milchprotein β-Casein. β-Casein ist ein amphiphiles
Phosphoprotein von 24 kDa, welches sich unter physiologischen Bedingungen in Mizellen anordnet (Van Epps, Bankhurst, & Williams, 1977). Die Arbeitsgruppe um VAN
EPPS postulierte die Hypothese eines spezifischen Rezeptors für Casein auf der Plasmamembran für PMN, welcher zu einer chemotaktischen Aktivierung der PMN führen
soll (Lewis & Van Epps, 1983; Van Epps et al., 1977). Casein wurde sowohl in verschiedenen in vivo (Egenolf, 2010; Golub et al., 1981; Golub et al., 1982; Iacono et al.,
1985; Lütkemeier, 1995) als auch in zahlreichen in vitro Untersuchungen (Golub et al.,
1982; Srinivas et al., 2012; Wierusz-Wysocka et al., 1987) als Standardchemotaktikum
verwendet.
Die Herstellung des Chemotaktikums erfolgte nach der Methode von LÜTKEMEIER
(1995). Die Endkonzentration der Caseinlösung betrug 2 mg/ml. Bei dieser Konzentration ist die maximale chemotaktische Antwort der PMN zu erwarten (Golub et al.,
1981).
43
4.14 Registrierung und Dokumentation
Die Dokumentation der Eintragungen und aller Folgeuntersuchungen erfolgten PC
gestützt mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Excel. Patientendaten wurden in spezielle Befundschemata und in der Florida-Probe©-Software erfasst (Anhang E). Alle
erhobenen Daten wurden über eine Identifikationsnummer anonym verwaltet.
4.15 Statistische Datenauswertung
Im Rahmen einer explorativen Datenanalyse wurden pro Studiengruppe 10 Individuen untersucht. Die statistische Auswertung erfolgte im Institut für medizinische Statistik der Justus-Liebig-Universität Giessen (Dr. Bödeker) unter der Verwendung von
SAS (Version 9.3).
Alle erfassten Daten (klinische Parameter, Anzahl PMN, Fluoreszenzintensitäten)
wurden auf ihre Normalverteilung geprüft (Shapiro-Wilk-Test). Bei der statistischen
Betrachtung auf Normalverteilung kam es zu einzelnen Zeitpunkten bei wenigen Parametern vor, dass diese normal verteilt waren. Für die meisten Parameter wurde die
Normalverteilung jedoch abgelehnt. Im Sinne der Gesamtauswertungsstrategie wurde
daher festgelegt, diese Parameter nicht-parametrisch zu betrachten. Für die Blutwerte
(Blut-Glukose, HbA1c, CRP, Blutsenkungsgeschwindigkeit und Anzahl PMNpB) und
den Body-Mass-Index wurde von einer Normalverteilung ausgegangen.
Die Überprüfung der Strukturgleichheit für das Geschlecht, welches die einzige diskrete Variable darstellte, wurde mittels zweiseitigem exakten Fisher-Test vorgenommen. Die Überprüfung der Strukturgleichheit der drei Diagnosegruppen bezüglich der
Daten der Mundhygieneindizes, SF-Volumina, Alter und ST wurde mit dem Mediantest
durchgeführt. Zur Überprüfung der Wechselwirkung zwischen Diagnose und Test/Kontrollzahn wurde der Kruskal-Wallis-H und der Mediantest für den Vergleich der drei
Diagnosegruppen bezüglich der Differenz stimulierter (am Testzahn) minus nicht stimulierter Ansatz (am Kontrollzahn) zum Zeitpunkt 35 Minuten angewandt. Die Überprüfung eines globalen Unterschieds zwischen stimulierten und nicht stimulierten Ansatz
(hinsichtlich Rezeptorexpression und PMN-Anzahl) zum Zeitpunkt 35 Minuten wurde
mittels Vorzeichen- und Vorzeichen-Rang-Test für alle Diagnosegruppen gemeinsam
bezüglich der Differenz stimulierter (am Testzahn) minus nicht stimulierter Ansatz (am
Kontrollzahn) zum Zeitpunkt 35 Minuten durchgeführt. Die Überprüfung eines globalen
Unterschieds zwischen den drei Diagnosegruppen zum Zeitpunkt 35 Minuten erfolgte
mit dem Kruskal-Wallis-H-Test und dem Mediantest für den Vergleich der drei Diagnosegruppen bezüglich der Summe Testzahn plus Kontrollzahn, gefolgt von den entspre-
44
chenden Anschlusstests. Die Auswertung der Blutwerte, des Body-Mass-Index, der
Zahnanzahl, der mittleren Gesamtsondierungstiefe, des klinischen Attachmentniveaus
und der Stellen mit Blutung auf Sondierung erfolgte mittels t-Test für unabhängige
Stichproben. Das Signifikantsniveau wurde mit p < 0,05 festgelegt.
45
5. Ergebnisse
5.1
5.1.1
Ergebnisse der Vorversuche
Etablierung der Methodik
Erste Vorversuche dienten der Erlernung der angewandten Methodik zur SFEntnahme. Die aus den ersten Vorversuchen stammenden SF-Proben wurden mittels
Zytozentrifuge auf einen Objektträger aufgebracht. Nach Pappenheim-Färbung konnten in den Zytozentrifugenpräparaten lichtmikroskopisch PMN und abgeschilferte
50 µm
A
D
20 µm
50 µm
Epithelzellen sowie Epithelzelltrümmer erkannt werden (Abbildung 13 A-C).
E
PMN
50 µm
Epithelzelle
B
PMN
C
100 µm
20 µm
PMN
F
PMN
Epithelzelle
Abbildung 13: Zytozentrifugenpräparate; Pappenheim-Färbung. A-C: SulcusflüssigkeitsProben;. D-F: Isolierte PMN.
Weitere Vorversuche zeigten, dass die aus dem Sulcus gingivae gewonnenen
PMNSF bei durchflusszytometrischer Analyse eine gut abzugrenzende und eindeutig zu
46
10 4 10
identifizierende
Population bildeten. Die PMNSF konnten gut von den anderen gemes10 4
4
R3
senen Ereignissen, bei welchen es sich vermutlich
zum größten Teil um Zelltrümmer
R3
R3
oder sonstige
Partikel aus dem Sulcus handelte, abgegrenzt werden (Abbildung 14).
10 3 10
3 4
1010
10 4
10
10
4
10 4
10
3
4
R3
R3
R3R3
R3
R3
10 2
10 3
10103
3
10 1
10 2
10 2
10102
SS Log
10 3
SSSS
LogLog
SS Log
10 1
1 2
1010
2
10
SS Log
SS Log
SS Log
10 2
2 3
1010
3
10
10 0 10
1 010
0 10
1010
1 0 10
1010
2
0
1010110 1
10110101
0
10FS102Log
FS Log2
10
FS Log
1
2
1
1
10 3
10
10 4
10
3
4
103
104
Abbildung 14: Durchflusszytometrische Darstellung aus dem Sulcus gingivae gewonnener
PMNSF. Vorwärtsstreuung (FS) vs. seitliche Streuung (SS); Gate R3: PMNSF.
10 0
10 0
0
1 10
10
10
102 101 103 102 104 103
104
10
10
0
00
1010 4 10
10
10
10
10
10 10 10
10
10
10
FS
Log
FS
Log
FS Log
FS
Log
Die durch
aus
PMN
stellten
ebenfalls
1 peripherem
4
1
2 pB10
3
100 Isolierung10
102Blut10gewonnenen
103 10
100
10sich
104
FS Log
FS Log
sowohl lichtmikroskopisch (Abbildung 13 D-F), als auch im Durchflusszytometer als
R3
eindeutige Population dar (Abbildung 15).
10 3
10 4
10 4
0
0
1
10 1
10 2
0
2
1
3
2
4
3
4
R3
R3
10 2
10 3
10 3
SS Log
SS Log
0
SS Log
SS Log
SS Log
4
10 0
1 0
1010
10 2
10110 1
102
FS Log
103
104
Abbildung 15: Durchflusszytometrische Darstellung aus peripherem Blut isolierter PMN pB.
10 0
10 0
Vorwärtsstreuung
(FS) vs. seitliche
Streuung (SS); Gate R3: PMN-Population (4041 Ereignis0
1
3
4 103
2
10 gezählte10
102 Anteil
100 Der
101 der10
104 bei 81
se). Total: 5000
Ereignisse.
PMN10
in 10
der gemessenen
Probe
FS Log
FSlag
Log
% aller erfassten Ereignisse.
Das zuvor festgelegte Protokoll zur Antikörperfärbung und die anschließende durchflusszytometrische Analyse der PMNSF wurde durch mehrfache positive Testung etabliert (Abbildung 16).
47
10 4
35
A
10 4
35
R3
A
10 3
102
PC Log 103
R3
35
26
26
26
R4
2
1017
R4
R4
R4
Counts
Counts
Counts
Counts
SS Log
Counts
Counts
Counts
Counts
26
17
17
10 18
8
0
10 0 0
10
0
10
1
10
APC Log
103
103
103
103
103
0
1004
010
100
0
100
Counts
35
101
101
35
F
10
FITC
F
R4
26
26
R4
R4
R4
17
17
17
17
8
8
8
00
00
10
010
100
101101
101
102 102
FITCAPC
Log
102 Log
FITC Log
102
FITC Log
2
101
101
103
103
103
104
R4
8
104
104
0
104 10035
103
101
101
0
104F 100
103
10
FITC Log
R4
0
100
10
FITC
101
26
R4
17
17
17
17
R4
R4
R4
88
8
101 101
101
0
100
C
R4
FEE
F
Counts
Counts
Counts
8
104
0
10035
26
26
26
17
8
8
104
26R4
104
104
0
104 10035
350
104 35 100
104
26
R4 R4
R4
17
17
104
10
102APC
Log
2
FS
10Log
APC Log
102
APC Log
2
101
D E 101
E
26
26
103
35
2
10110
101
0
0 10035
100 35
103
88
8
8
0
100
102
102 APC Log 103
APC Log
26
17
17
17
8
104
CB
35 C
E E
101
101
Counts
FS Log
100
0
10035
35
35
104
104
Counts
103
103
Counts
B
AB
102
FS Log
102
101
1717
104
8
8
Counts
DD
101
26
103
17
0
4
1035
100
2626
Counts
Counts
02
S Log 3
10
R4
17
8
3
1026
8
R4
8
10 0
100 0
10
35
R4
17
10 1
35
R4
17
10 1
R3
C
26
Counts
Counts
Counts
SS Log
SS Log
10 2
C
26
26
10 2
3
35
B
26
R3
10 3
35
35
B
102102
APC
2 LogLog
10FITC
FITC Log
33
1010
103
00
00
1044 010
10
4
10
100
8
101101
101
102 102
Log
FITCFITC
Log
102
FITC Log
103
103
103
104
104
104
Abbildung 16: Repräsentative durchflusszytometrische Darstellung der Oberflächenrezeptormarkierung von PMNSF. A-C: Isotypenkontrolle; A: Darstellung der Isotypenkontrolle als PunktDiagramm; B: Histogramm der Isotypenkontrolle für APC; C: Histogramm der Isotypenkontrolle
für FITC; D: Antikörperfärbung CD11b-APC, im Vergleich zur Isotypenkontrolle (B) eine positive
Fluoreszenz für APC (eindeutige Verschiebung nach rechts im Diagramm); E: Antikörperfärbung CD15-FITC, im Vergleich zur Isotypenkontrolle (C) eine positive Fluoreszenz für FITC
(eindeutige Verschiebung nach rechts im Diagramm).
0
100
101
48
5.1.2
PMNSF-Einwanderungskinetik
Die PMNSF-Einwanderungskinetik über 45 Minuten zeigte, dass sich nach inflammatorischer Reizapplikation mittels Casein mehr PMNSF aus dem Sulcus des Testzahnes
(im Folgenden als stimulierter Ansatz bezeichnet) gewinnen ließen als aus dem des
Kontrollzahnes, in den das Placebo appliziert wurde (im Folgenden als nicht stimulierter Ansatz bezeichnet). Das Maximum der medianen PMN-Anzahl lag in allen Gruppen
bei 15 Minuten. Bei den Patienten mit Diabetes und Parodontitis wurde zum Entnahmezeitpunkt 45 Minuten ein erneuter Anstieg der Zellzahl beobachtet. Die Diabetiker
zeigten zu jedem Zeitpunkt sowohl im stimulierten als auch im nicht stimulierten Ansatz
die höchsten medianen Zellzahlen. Die Zellzahlen der Gesunden und der Parodontitispatienten waren während des gesamten Verlaufs ähnlich (Abbildungen 17-20).
12.000
Casein
stimulierter
Ansatz
nicht
stimulierter
Placebo
Ansatz
10.000
PMN-Anzahl
8.000
6.000
4.000
2.000
0
1 BL 2
3
15 min
4
5
6
25
7 min8
Abbildung 17: PMNSF-Einwanderungskinetik bei Gesunden.
9
35 min
10
11
12
45 min
13
14
49
80.000
stimulierter
Casein
Ansatz
nicht
stimulierter
Placebo
Ansatz
PMN-Anzahl
60.000
40.000
20.000
0
1 BL 2
3
15 min
4
5
6
25
7 min8
9
35 min
10
11
12
45 min
13
14
Abbildung 18: PMNSF-Einwanderungskinetik bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und
Parodontitis.
12.000
Casein
stimulierter
Ansatz
nicht
stimulierter
Placebo
Ansatz
10.000
PMN-Anzahl
8.000
6.000
4.000
2.000
0
1 BL 2
3
15 min
4
5
6
25
7 min8
9
35 min
10
11
Abbildung 19: PMNSF-Einwanderungskinetik bei Parodontitispatienten.
12
45 min
13
14
50
80.000
DM2+P
P
C
PMN-Anzahl
60.000
40.000
20.000
0
1 BL
2 3
4
5 15 6min 7
8
min11 12 133514
min15 16 174518
min19
9 2510
Abbildung 20: PMNSF-Einwanderungskinetik der stimulierten Ansätze aller Diagnosegruppen.
Aufgrund der Ergebnisse der Vorversuche und unter Berücksichtigung des Patientenkomforts wurde das Zeitintervall zur Probenentnahme nach Reizapplikation für den
Hauptversuch auf 35 Minuten festgesetzt. Die Anzahl der bis zu diesem Zeitpunkt akkumulierten Zellen ist in allen Diagnosegruppen für eine Zellfärbung ausreichend.
5.2
Demographische Daten
Die demografischen Daten der einzelnen Studiengruppen sind in Tabelle 9 zusammengefasst.
Tabelle 9: Demografische Daten der Studiengruppen.
Diagnose
mittleres Alter ± SD
männlich
weiblich
C
44 ± 16 Jahre
7
3
DM2+P
57 ± 10 Jahre
7
3
P
43 ± 12 Jahre
2
8
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; SD: Standardabweichung.
Bei der Überprüfung der Strukturgleichheit zwischen den Diagnosegruppen ergaben
sich für die diskrete Variable Geschlecht (p = 0,05; Exakter Fisher-Test) und das Alter
(p = 0,031; Mediantest) Unterschiede.
51
5.3
5.3.1
Klinische Beschreibung der Gruppen
Zahnanzahl
Die Anzahl der Zähne war bei den Diabetikern und den Parodontitispatienten mit
25,0 ± 4,1 und 25,4 ± 2,8 Zähnen gleich. Die Gesunden hatten zwar die meisten Zähne
(27,8 ± 2,7 Zähne) (Tabelle 10), statistische Unterschiede bestanden jedoch nicht (p =
0,1465; einfaktorielle ANOVA).
Tabelle 10: Deskriptive Auswertung der Zahnanzahl.
Diagnose
Minimum
Maximum
Median
MW ± SD
C
22
32
28
27,8 ± 2,7
DM2+P
17
30
25,5
25,0 ± 4,1
P
21
28
26
25,4 ± 2,8
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
5.3.2
Sondierungstiefe des Gesamtgebisses (STges)
Die mittlere Sondierungstiefe der Patienten mit DM und Parodontitis lag mit 2,69 ± 1,13
mm in einem ähnlichen Bereich wie die der Parodontitispatienten mit 2,50 ± 1,09 mm.
In beiden Gruppen wurden Maximalwerte von 9 mm gemessen. Die maximale Sondierungstiefe lag bei den Gesunden bei 4 mm und die mittlere Sondierungstiefe war im
Vergleich zu den beiden anderen Gruppen mit 1,86 ± 0,68 mm deutlich geringer
(Tabelle 11). Die Unterschiede zwischen den Gesunden und den Diabetikern sowie
zwischen den Gesunden und den Parodontitispatienten waren eindeutig (jeweils p <
0,001, t-Test), wohingegen zwischen den beiden Gruppen mit Parodontitis keine Unterschiede bestanden (p > 0,05; t-Test).
Tabelle 11: Deskriptive Statistik der Sondierungstiefe (mm) des Gesamtgebisses.
Diagnose
Minimum
Maximum
Median
MW ± SD
C
0,2
4,0
1,8
1,86 ± 0,68
DM2+P
0,6
9,0
2,4
2,69 ± 1,13
P
0,4
9,0
2,0
2,50 ± 1,09
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
52
5.3.3
Attachmentniveau des Gesamtgebisses (CAL)
Das mittlere Attachmentniveau (CAL) war bei den Gesunden mit 2,06 ± 0,80 mm
ebenfalls am geringsten. Das Attachmentniveau der Diabetiker betrug 3,03 ± 1,43 mm
und das der Parodontitispatienten 2,84 ± 1,29. Bei den Diabetikern wurden Maximalwerte bis 13 mm gemessen, bei den Parodontitispatienten bis 11 mm und bei den Gesunden bis 10 mm (Tabelle 12). Insgesamt ergaben sich für die Gruppen keine Unterschiede (p = 0,1595; einfaktorielle ANOVA).
Tabelle 12: Deskriptive Statistik des Attachmentniveaus (mm) des Gesamtgebisses.
Diagnose
Minimum
Maximum
Median
MW ± SD
C
0,2
10,0
2,0
2,06 ± 0,80
DM2+P
0,6
13,0
3,0
3,02 ± 1,43
P
0,4
11,0
3,0
2,84 ± 1,29
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
5.3.4
Blutung auf Sondierung (BOP)
Bei den Diabetikern wurde im Mittel bei 34,5 ± 24,2 % aller Sondierungsstellen eine
Blutung auf Sondierung diagnostiziert. Die Parodontitispatienten zeigten bei 19,0 ±
11,1 % aller Messstellen eine Blutung. Die geringsten Werte für BOP wurden bei den
Gesunden festgestellt (Tabelle 13). Eindeutige Unterschiede bestanden zwischen den
Gesunden und den Diabetikern mit Parodontitis (p < 0,001; t-Test).
Tabelle 13: Deskriptive Statistik der Sondierungsblutung (%).
Diagnose
Minimum
Maximum
Median
MW ± SD
C
0,0
30,0
9,0
6,3 ± 9,3
DM2+P
4,9
79,2
39,2
34,5 ± 24,2
P
5,1
41
15,9
19,0 ± 11,1
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
5.4
Sondierungstiefen an Test- und Kontrollzähnen
Die Mediane der mittleren Sondierungstiefen (ST) der Diabetiker mit Parodontitis
und der Parodontitispatienten waren ähnlich. Die Gesunden zeigten den niedrigsten
53
Median der mittleren ST (Abbildung 21 und Tabelle 14). Die Unterschiede zwischen
den ST der Test- und Kontrollzähne innerhalb einer Studiengruppe lagen im Rahmen
der Messgenauigkeit.
Tabelle 14: Deskriptive Statistik der Sondierungstiefen an Test- und Kontrollzahn (mm).
Testzahn
Diagnose
Kontrollzahn
Median
MW ± SD
Median
MW ± SD
P
2,2
2,1 ± 0,2
2,3
2,2 ± 0,4
DM2+P
2,3
2,3 ± 0,2
2,2
2,3 ± 0,4
C
1,8
1,3 ± 0,4
1,8
1,7 ± 0,3
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
Zur Überprüfung der Strukturgleichheit der Diagnosegruppen wurden die Differenzen der mittleren ST an Test- und Kontrollzahn verglichen. Unterschiede zwischen den
Gruppen wurden nicht festgestellt (p = 0,314; Mediantest).
ST Testzahn
ST Ktr.-zahn
3,5
3,0
mm
2,5
2,0
1,5
1,0
C
DM2+P
P
Abbildung 21: Sondierungstiefen an Test- und Kontrollzähnen. Ktr.-zahn: Kontrollzahn. C:
Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
54
5.5
5.5.1
Mundhygienephase
Papillenblutungsindex (PBI)
Am Tag -14 lag der PBI bei 5 Studienteilnehmern bereits bei 0 (2 C; 1 DM2+P; 2 P).
Bei 4 dieser Personen konnte auch am Tag 0 ein PBI von 0 befundet werden, wohingegen bei einem Patient (C) mit einem Indexwert von 0,06 eine leichte Veränderung
beobachtet wurde (Abbildung 22).
4,00
C
3,00
2,00
1,00
0,00
Tag -14
4,00
Tag 0
DM2+P
3,00
2,00
1,00
0,00
Tag -14
4,00
Tag 0
P
3,00
2,00
1,00
0,00
Tag -14
Tag 0
Abbildung 22: Veränderungen des Papillenblutungsindex (PBI) der Studienteilnehmer für jede
Diagnosegruppe. Unveränderte oder verbesserte Indexwerte sind in grün dargestellt, verschlechterte in rot. C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
55
Die übrigen 25 Studienteilnehmer zeigten nach Abschluss der Mundhygienephase
eine Verbesserung des PBI (Abbildung 22). Bei keinem Patienten wurde am Tag der
Probenentnahme eine Blutung an Test- oder Kontrollzahn festgestellt.
Mit einem Median des PBI von 0,22 und 0,09 wiesen die Patienten mit Diabetes sowohl am Tag -14 als auch am Tag 0 die höchsten Blutungswerte auf. Bei den Parodontitispatienten betrug der PBI an Tag -14 im Median 0,16 und konnte bis zum Tag 0 auf
einen Indexwert von 0 gesenkt werden. Die Gesunden zeigten zu Beginn der Mundhygienephase mit einem medianen PBI von 0,09 den niedrigsten Ausgangswert, der nach
14 Tagen ebenfalls auf 0 gesenkt werden konnte. Abbildung 23 zeigt die PBI aller
Gruppen an den Tagen -14 und 0. In Tabelle 15 sind die Mediane und Mittelwerte des
PBI an beiden Tagen zusammengefasst.
PBI_d-14
PBI_d0
4
Indexwert
3
2
1
0
C
DM2+P
P
Abbildung 23: PBI am Tag -14 und Tag 0. PBI: Papillenblutungsindex; d-14: Tag -14; d0: Tag
0; C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
56
Tabelle 15: Mediane und Mittelwerte des Papillenblutungsindex (Saxer & Mühlemann, 1975).
Diagnose
Tag
Median
MW ± SD
C
-14
0,09
0,12 ± 0,11
0
0,00
0,02 ± 0,06
-14
0,22
0,74 ± 0,97
0
0,09
0,25 ± 0,39
-14
0,16
0,14 ± 0,09
0
0,00
0,03 ± 0,05
DM2+P
P
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
Die Überprüfung der Strukturgleichheit der Studiengruppen bezüglich des PBI ergab
keine Unterschiede zwischen den Gruppen (p = 0,1997; Mediantest).
57
5.5.2
Plaqueindex (PLI)
Durch die Maßnahmen der präexperimentellen Mundhygienephase konnte der PLI
von 27 Personen verbessert werden. Bei 3 Studienteilnehmer (2 C, 1 P) wurde eine
leichte Verschlechterung des Wertes beobachtet (C: von 0,79 auf 0,81 und von 1,18
auf 1,37; P: von 0,64 auf 0,94) (Abbildung 24).
5,00
C
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Tag -14
5,00
Tag 0
DM2+P
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Tag -14
5,00
Tag 0
P
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Tag -14
Tag 0
Abbildung 24: Veränderungen des Plaqueindex der Studienteilnehmer für jede Diagnosegruppe. Unveränderte oder verbesserte Indexwerte sind in grün dargestellt, verschlechterte in rot. C:
Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Auch beim PLI wurde an den Tagen -14 und 0 mit den Medianen der Indexwerte
von 2,07 und 1,34 bei den Diabetikern am meisten Plaque festgestellt. Die Parodonti-
58
tispatienten zeigten mit einem Wert von 1,44 an Tag -14 und 0,85 an Tag 0 etwas bessere Ergebnisse. Am wenigsten Plaque wurde zu beiden Zeitpunkten mit Medianwerten des PLI von 1,15 und 0,79 bei den Gesunden festgestellt. Abbildung 25 zeigt die
Boxplot-Darstellung der PLI an den Tagen -14 und 0. In Tabelle 16 sind die Mediane
und Mittelwerte des PLI für die beiden Tage zusammengefasst.
PLI_d-14
PLI_d0
5
4
Indexwert
3
2
1
0
C
DM2+P
P
Abbildung 25: Plaqueindex an Tag -14 und Tag 0 PLI: Plaquueindex; d-14: Tag -14; d0: Tag 0;
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Tabelle 16: Mediane und Mittelwerte des Plaqueindex (Quigley & Hein, 1962).
Diagnose
Tag
Median
MW ± SD
C
-14
1,15
1,43 ± 0,94
0
0,79
1,00 ± 0,46
-14
2,07
2,28 ± 1,09
0
1,34
1,42 ± 0,55
-14
1,44
1,51 ± 0,57
0
0,85
0,95 ± 0,45
DM2+P
P
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
Eine Strukturgleichheit der Diagnosegruppen bezüglich des PLI ist aufgrund der hohen Werte der Diabetiker mit hoher Wahrscheinlichkeit abzulehnen (p = 0,0097; Mediantest).
59
5.5.3
Sulcusflüssigkeits (SF)-Volumen
Nach Umrechnung der digitalen Skalenwerte in µl-Angaben wurden die Mittelwerte
der einzelnen Patienten für den jeweiligen Tag gebildet. Eine Abnahme des SFVolumens vom Tag -14 auf den Tag 0 wurde bei 27 Studienteilnehmern beobachtet.
Bei einem Studienteilnehmer (C) blieb der Wert mit 0,10 µl gleich. Bei 2 weiteren Studienteilnehmern (1 DM2+P, 1 C) wurde eine leichte Zunahme des SF-Volumens festgestellt (DM2+P: von 0,20 µl auf 0,26 µl; C: von 0,2 µl auf 0,21 µl) (Abbildung 26).
0,50
C
0,00
Tag -14
0,50
Tag 0
DM2+P
0,00
Tag -14
0,50
Tag 0
P
0,00
Tag -14
Tag 0
Abbildung 26: Veränderungen der Sulcusflüssigkeits-Volumina der Studienteilnehmer für jede
Diagnosegruppe (Angaben in µl). Eine Abnahme sowie gleichbleibende Volumina sind in grün
dargestellt, zunehmende Volumina in rot; C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus
Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
60
Am Tag -14 wiesen die Patienten mit Parodontitis den höchsten Median der SFVolumina auf (0,27 µl). Am Tag 0 zeigten sich die höchsten medianen Werte bei den
Patienten mit DM und Parodontitis (Median: 0,19 µl). Die niedrigsten medianen Werte
wiesen sowohl am Tag -14 als auch am Tag 0 die Gesunden auf (Tabelle 17 und Abbildung 27). Die Überprüfung der Strukturgleichheit der Diagnosegruppen bezüglich
der SF-Volumina am Tag 0 ergab, dass die Nullhypothese (keine Unterschiede zwischen den Gruppen) nicht abgelehnt werden kann (p = 0,2130; Mediantest).
SF-Volumen Tag -14
SF-Volumen Tag 0
0,4
µl/30 Sekunden
0,3
0,2
0,1
0,0
C
DM2+P
P
Diagnose
Abbildung 27: Sulcusflüssigkeits-Volumen pro 30 Sekunden an Tag -14 und Tag 0. SF:
Sulcusflüssigkeit. C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis;
P: Parodontitispatienten.
Tabelle 17: Mediane und mittlere Sulcusflüssigkeit-Volumina/30 Sekunden (µl).
Diagnose
Tag
Median
MW ± SD
C
-14
0,15
0,17 ± 0,06
0
0,11
0,12 ± 0,04
-14
0,23
0,24 ± 0,07
0
0,19
0,19 ± 0,05
-14
0,27
0,28 ± 0,05
0
0,14
0,14 ± 0,03
DM2+P
P
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
61
5.5.4
Klinisches Erscheinungsbild und Orthopantomogramme
Die Abbildungen 28 bis 30 zeigen das klinische Erscheinungsbild der verschiedenen
Gruppen am Tag der Probenentnahme sowie die dazugehörigen Orthopantomogramme (OPGs).
A
B
Abbildung 28: Gesunder Proband. A: Klinisches Erscheinungsbild nach Abschluss der Mundhygienephase. B: OPG.
62
A
B
Abbildung 29: Patient mit Diabetes Typ 2 und chronischer Parodontitis. A: Klinisches Erscheinungsbild nach Abschluss der Mundhygienephase. B: OPG.
63
A
B
Abbildung 30: Patient mit chronischer Parodontitis. A: Klinisches Erscheinungsbild nach Abschluss der Mundhygienephase. B: OPG.
64
5.6
5.6.1
Hämatologie und Diagnostik
Plasma-Glukose-Werte
Erwartungsgemäß zeigten die Diabetiker die höchsten Plasma-Glukose-Werte (156
± 37 mg/dl). Der Maximalwert lag in dieser Gruppe bei 218 mg/dl. Die Mittelwerte der
Parodontitispatienten (91 ± 13 mg/dl) und der gesunden Kontrollen (91 ± 17 mg/dl)
waren nahezu identisch (Tabelle 18). Die Unterschiede zwischen den Diabetikern und
den beiden anderen Gruppen waren in beiden Fällen statistisch eindeutig (p < 0,001; tTest), wohingegen zwischen den Gesunden und den Parodontitispatienten keine Unterschiede bestanden (p = 0,528; t-Test) (Abbildung 31).
250
**
**
mg/dl
200
150
100
50
C
DM2+P
P
Abbildung 31: Plasma-Glucose-Werte. ** = p < 0,01; C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten
Tabelle 18: Deskriptive Statistik der Plasma-Glukose-Werte (mg/dl).
Diagnose
Minimum
Maximum
Median
MW ± SD
C
60
123
89
91 ± 17
DM2+P
82
218
153
156 ± 37
P
82
127
88
91 ± 13
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: ;Mittelwert; SD: Standardabweichung.
65
5.6.2
HbA1c-Werte
Die festgestellten HbA1c-Werte bei den Diabetikern lagen zwischen 6,2 und 10,9 %,
bei den Parodontitispatienten zwischen 5,2 % und 5,9 % und bei den Gesunden zwischen 4,7 % und 5,9 %. Der Mittelwert der HbA1c–Werte der Diabetespatienten lag mit
7,5 ± 1,4 % deutlich höher als der der Parodontitispatienten (5,5 ± 0,3 %) und der Gesunden (5,3 ± 0,3 %) (Tabelle 19). Die Unterschiede zwischen den Diabetikern und
den beiden anderen Gruppen waren eindeutig (p = 0,001 und p = 0,002; t-Test). Zwischen den Parodontitispatienten und den Gesunden bestanden keine Unterschiede (p
= 0,218; t-Test) (Abbildung 32).
**
**
HbA1c [%]
10,0
8,0
6,0
4,0
DM2+P
C
P
Abbildung 32: HbA1c-Werte. ** = p < 0,01; C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Tabelle 19: Deskriptive Statistik der HbA1c-Werte (%).
Diagnose
Minimum
C
4,7
DM2+P
P
Maximum
Median
MW ± SD
5,9
5,4
5,3 ± 0,3
6,2
10,9
7,0
7,5 ± 1,4
5,2
5,9
5,6
5,5 ± 0,3
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
66
5.6.3
Body-Mass-Index (BMI)
Der BMI lag bei den Diabetikern mit einem Mittelwert von 31,8 ± 6,7 deutlich höher
als bei den Vergleichsgruppen, welche ähnliche Werte zeigten (C: 25,8 ± 3,5; P: 24,6 ±
5,9). Der Maximalwert von 36,3 wurde bei den Diabetikern diagnostiziert, wohingegen
die Maximalwerte bei den Parodontitispatienten und Gesunden mit 24,4 und 28,4 deutlich geringer waren (Tabelle 20). Zwischen den Gesunden und den Parodontitispatienten bestanden statistisch keine Unterschiede (p = 0,597; t-Test). Die Unterschiede zwischen den Diabetikern und den beiden Vergleichsgruppen waren statistisch eindeutig
(p = 0,028 und p = 0,025) (Abbildung 33).
45,0
*
*
40,0
m^2/kg
35,0
30,0
25,0
20,0
15,0
C
DM2+P
P
Abbildung 33: Body-Mass-Index (BMI). * = p < 0,05; C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Tabelle 20: Deskriptive Statistik des Body-Mass-Index.
Diagnose
Minimum
Maximum
Median
MW ± SD
C
21,5
28,4
25,5
25,8 ± 3,5
DM2+P
22,0
36,3
32,4
31,8 ± 6,7
P
19,8
24,4
22,6
24,6 ± 5,9
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
67
5.6.4
C-reaktives Protein (CRP)
Die höchsten Werte wurden bei den Diabetikern gemessen. Der Graubereich (oberer Bereich der Normwerte) von 0,5 – 3,0 mg/l (Katz, 2008) wurde von vier Patienten
mit Diabetes (8,80 mg/l, 12,9 mg/l; 4,09 mg/l, 6,82 mg/l), von zwei gesunden Kontrollen
(3,82 mg/l und 8,11 mg/l) und einem Parodontitispatienten (3,86 mg/l) überschritten.
Bei 17 Studienteilnehmer lag das CRP < 0,05 mg/l und damit unterhalb der Nachweisgrenze. 8 dieser Personen gehörten zur Kontrollgruppe und 6 zu den Parodontitispatienten (Tabelle 21). Die Unterschiede zwischen den Diabetikern und den Parodontitispatienten waren statistisch eindeutig (p = 0,029; U-Test). Zwischen den Diabetikern
und den Gesunden (p = 0,218; U-Test) sowie zwischen den Gesunden und den Parodontitispatienten (p = 0,436; U-Test) zeigten sich keine Unterschiede (Abbildung 34).
*
12,5
mg/l
10,0
7,5
5,0
2,5
0,0
C
DM2+P
P
Abbildung 34: C-reaktives Protein. * = p < 0,05; C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes
mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Tabelle 21: Verteilung der Werte des C-reaktives-Proteins.
Diagnose
< Nachweisgrenze
> Nachweisgrenze
> 3,0 mg/ml
C
8
2
2
DM2+P
3
7
4
P
6
4
1
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
68
5.6.5
Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG)
Bei drei Studienteilnehmern war eine die BSG erhöht (Referenzwerte nach einer
Stunde: unter 50 Jahre > 20 mm für Frauen und > 15 mm für Männer; über 50 Jahre >
30 mm für Frauen und > 20 mm für Männer (Thomas, 2008)). Zwei dieser Personen
gehörten der Gruppe der Diabetiker an und eine der Gruppe der Parodontitispatienten
(Tabelle 22). Zu beiden Zeitpunkten zeigten die Diabetiker die höchste mediane Blutsenkungsgeschwindigkeit (Median der BSG nach einer Stunde: 8 mm; Median der
BSG nach zwei Stunden: 16 mm). Für die statistische Auswertung wurde von einer
nicht-parametrischen Verteilung ausgegangen. Die Überprüfung der Strukturgleichheit
der drei Diagnosegruppen ergab, dass ein Unterschied zwischen den Gruppen abgelehnt werden kann (p = 0,213 für BSG nach 1 Stunde, p = 0,394 für BSG nach 2 Stunden, Mediantest). Die grafische Darstellung der BSG ist in Abbildung 35 zusammengefasst.
40
45
30
30
mm
20
mm
25
20
15
10
10
5
0
0
C
C
C
DM2+P
DM2+P
DM2+P
P
P
P
Diagnose
Abbildung 35: Blutsenkung nach 1 und 2 Stunden (mm). C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit
Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Tabelle 22: Verteilung der Blutsenkungsgeschwindigkeit oberhalb des Referenzbereiches.
Diagnose
> Referenzbereich BSG
P
0
DM2+P
2
P
0
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; BSG: Blutsenkungsgeschwindigkeit.
69
5.6.6
Anzahl neutrophiler Granulozyten im peripheren Blut
Der Maximalwert betrug 6,27 giga/l und wurde bei den Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis gemessen. Der minimalste Wert wurde mit 2,13 giga/l bei
den Patienten mit Parodontitis festgestellt. Zwischen den Gesunden und den Diabetikern bestand bei der Anzahl der PMNpB mit 3,96 ± 0,69 giga/l und 4,01 ± 1,05 giga/l
kein Unterschied (p = 0,916; t-Test). Auch im Mittel wurden bei den Parodontitispatienten die niedrigsten Werte festgestellt (3,08 ± 0,82 giga/l). Der Unterschied zwischen
den Gesunden und den Parodontitispatienten war eindeutig (p = 0,025; t-Test). Die
statistische Auswertung deutet ebenfalls auf einen Unterschied zwischen den Parodontitispatienten und den Patienten mit Diabetes hin (p = 0,051) (Abbildung 36 und Tabelle
23).
7,0
*
p = 0,051
Anzahl
Anzahl[10^3]
[giga/l]
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
C
DM2+P
P
Abbildung 36: Anzahl neutrophiler Granulozyten im peripheren Blut. * = p < 0,05; C: Gesunde;
DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Tabelle 23: Deskriptive Statistik der Anzahl neutrophiler Granulozyten im peripheren Blut (giga/l).
Diagnose
Minimum
Maximum
Median
MW ± SD
C
3,10
5,60
3,83
3,96 ± 0,69
DM2+P
2,50
6,27
3,91
4,01 ± 1,05
P
2,13
4,46
2,48
3,08 ± 0,82
C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
70
5.7
PMN-Einwanderung und Rezeptorexpression
In der Gruppe der Parodontitispatienten war eine Probe des nicht stimulierten Ansatzes mit Blut kontaminiert und wurde daher nicht in die Auswertung einbezogen.
5.7.1
Anzahl eingewanderter CD45+ Zellen
Zunächst wird die globale (unabhängig von der Diagnosegruppe) Anzahl der bis zum
Zeitpunkt 35 Minuten nach inflammatorischer Reizapplikation (stimulierter Ansatz am
Testzahn) beziehungsweise Placeboapplikation (nicht stimulierter Ansatz am Kontrollzahn) eingewanderten CD45+ Zellen betrachtet. Die chemotaktische Stimulation führte
zu einer eindeutig erhöhten Einwanderung CD45+ Zellen (p < 0,001; Vorzeichen-RangTest). Im stimulierten Ansatz betrug die Anzahl eingewanderter CD45+ Zellen im Medial 10.925 und im nicht stimulierten Ansatz 2.522 (Abbildung 37 und Tabelle 24).
Anzahl CD45+ Zellen
80.000
60.000
40.000
20.000
0
Studienteilnehmer
T
K
Median T
Median K
Abbildung 37: Anzahl CD45+ Zellen mit globalem Median für stimulierten und nicht stimulierten
Ansatz. T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz.
Tabelle 24: Deskriptive Statistik der globalen Anzahl CD45+ Zellen im stimulierten und nicht
stimulierten Ansatz.
N
Min
Max
Median
MW ± SD
T
29
436
78.216
10.925
17.135 ± 20.949
K
29
285
33.265
2.522
5.010 ± 6.926
Unterschied
p < 0,001
T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz; N: Anzahl; Min: Minimalwert; Max: Maximalwert; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
71
Auch die Betrachtung der einzelnen Diagnosegruppen ergab, dass der Median des
stimulierten Ansatzes in jeder Gruppe größer als der Median des nicht stimulierten Ansatzes war. Bei den Diabetikern lag der Median im stimulierten Ansatz mit 21.228 Zellen am höchsten. Auch im nicht stimulierten Ansatz war die Zellzahl mit einem Median
von 6.349 Zellen in der Gruppe der Patienten mit DM am höchsten. Bei den Parodontitispatienten konnten im Median 4.744 Zellen aus dem Sulcus des Testzahns und 2.520
Zellen aus dem Sulcus des Kontrollzahns gewonnen werden. Im stimulierten Ansatz
der Gesunden wurde ein Median von 11.590 CD45+ Zellen und im nicht stimulierten
Ansatz von 1.694 CD45+ Zellen ermittelt (Abbildungen 38-39 und Tabelle 25).
Die größten Differenzen eingewanderter CD45+ Zellen und damit die stärkste Reaktion auf den inflammatorischen Reiz, wurden in der Gruppe der Diabetiker beobachtet
(Median: 15.363 Zellen). Bei den Parodontitispatienten bildeten die Differenzen einen
Median von 1.831 Zellen und bei den Gesunden einen Median von 6.851 Zellen
(Abbildung 41 und Tabelle 26). Wechselwirkungen zwischen Diagnose und der Differenz der an Test- und Kontrollzahn eingewanderten Zellen konnten statistisch jedoch
nicht eindeutig belegt werden (p = 0,1334; Kruskal-Wallis-H-Test und p = 0,5169; Mediantest).
Anzahl CD45+ Zellen
80.000
60.000
40.000
20.000
0
C
DM2+P
Median T
P
Median K
Abbildung 38: Grafische Darstellung der diagnosebezogenen Mediane CD45+ Zellen im stimulierten und nicht stimulierten Ansatz. C: Gesunde (grün); DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis (rot); P: Parodontitispatienten (blau); dunkle Färbung: stimulierter
Ansatz; helle Färbung: nicht stimulierter Ansatz; Median T: Median des stimulierten Ansatzes;
Median K: Median des nicht stimulierten Ansatzes.
72
Testzahn
T
Ktr.-zahn
K
80.000
**
Anzahl CD 45+ Zellen
60.000
40.000
P
20.000
0
DM2+P
C
P
Abbildung 39: Gruppenvergleich der Anzahl CD45+ Zellen der stimulierten und nicht stimulierten Ansätze (Boxplot- Darstellung). T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz; **= statistisch eindeutiger Unterschied (Kruskal-Wallis-H-Test); C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Tabelle 25: Diagnosebezogene deskriptive Statistik eingewanderter CD45+ Zellen.
N
Min
Max
Median
MW ± SD
T
10
488
21.659
11.590
9.933 ± 7.807
K
10
285
6.618
1.694
2.191 ± 1.817
T
10
3.754
78.216
21.228
32.294 ± 29.203
K
10
692
33.265
6.349
9.701± 10.033
T
9
436
23.675
4.744
8.294 ± 8.241
K
9
406
10.214
2.520
2.930 ± 2.933
C
DM2+P
P
T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz; N: Anzahl; Min: Minimalwert; Max: Maximalwert; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung; C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes
mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Der größte mediane Wert für die Summe von stimulierten und nicht stimulierten Ansatz wurde bei den Diabetikern mit Parodontitis festgestellt (32.751 CD45+ Zellen),
73
gefolgt von den Gesunden mit median 14.020 CD45+ Zellen und den Parodontitispatienten mit median 8.323 CD45+ Zellen (Abbildung 40 und Tabelle 26). Die Überprüfung
eines Unterschieds zwischen den drei Diagnosegruppen bezüglich der Summen von
stimulierten und nicht stimulierten Ansatz ergab einen p-Wert von 0,0192 (KruskalWallis-H-Test). Der entsprechende Anschlusstest zeigte einen statistisch eindeutigen
Unterschied zwischen der Gruppe der Diabetiker mit Parodontitis und den Parodontitispatienten auf (Abbildungen 39-40 und Tabelle 33, Anhang B).
120.000
Anzahl CD45+ Zellen
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0
C
DM2+P
P
Median
Abbildung 40: Summen der CD45+ Zellen von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen. C:
Gesunde (grün); DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis (rot); P: Parodontitispatienten (blau).
80.000
70.000
Anzahl CD45+ Zellen
60.000
50.000
40.000
30.000
20.000
10.000
0
C
DM2+P
P
-10.000
Abbildung 41: Differenzen der CD45+ Zellen von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen.
C: Gesunde (grün); DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis (rot); P:
Parodontitispatienten (blau).
74
Tabelle 26: Deskriptive Statistik der Summen und Differenzen CD45+ Zellen von stimulierten
und nicht stimulierten Ansätzen.
N
Min
Max
Median
MW ± SD
T-K
29
-1.167
75.268
8.445
12.125 ± 17.133
T+K
29
773
111.481
15.167
22.145 ± 26.078
T-K
10
160
19.062
6.851
7.741 ± 6.978
T+K
10
773
24.256
14.020
12.124 ± 8.934
T-K
10
-339
75.268
15.363
22.592 ± 25.130
T+K
10
5.773
111.481
32.751
41.995 ± 35.714
T-K
9
-1.167
20.379
1.831
5.364 ± 7.052
T+K
9
842
28.873
8.323
11.224 ± 10.164
Gesamt
C
DM2+P
P
T – K: Differenz stimulierter minus nicht stimulierter Ansatz; T + K: Summe stimulierter plus
nicht stimulierter Ansatz; N: Anzahl; Min: Minimalwert; Max: Maximalwert; MW: Mittelwert; SD:
Standardabweichung. . C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
75
5.7.2
Oberflächenexpression CD11b
Global betrachtet (unabhängig von der Diagnosegruppe) führte die chemotaktische
Stimulation zu einer eindeutig erhöhten CD11b Expression (p = 0,0161; VorzeichenRang-Test). Im stimulierten Ansatz betrug die mediane Fluoreszenz des CD11b Antikörpers (APC) 122 und im nicht stimulierten Ansatz 97 (Abbildung 42 und Tabelle 27).
Fluoreszenzintensität
300
200
100
0
Studienteilnehmer
T
K
Median T
Median K
Abbildung 42: Fluoreszenzen (anti CD11b-APC) mit globalem Median für stimulierten und
nicht stimulierten Ansatz. T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz.
Tabelle 27: Deskriptive Statistik der globalen Fluoreszenz (anti CD11b-APC) im stimulierten
und nicht stimulierten Ansatz.
N
Min
Max
Median
MW ± SD
T
29
34
273
122
122 ± 67
K
29
17
228
97
97 ± 54
Unterschied
p = 0,0161
T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz; N: Anzahl; Min: Minimalwert; Max: Maximalwert; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
Auch für die einzelnen Diagnosegruppen ließ sich für die PMNSF feststellen, dass
der Median der Fluoreszenzen im stimulierten Ansatz höher lag als im nicht stimulierten Ansatz. Die mediane Fluoreszenz der PMNSF lag bei den Diabetikern im stimulierten Ansatz mit 125 am höchsten. Im nicht stimulierten Ansatz war der Median mit 120
bei den Diabetikern ebenfalls am höchsten. Der Median betrug bei den Parodontitispatienten 68 im stimulierten Ansatz und 60 im nicht stimulierten Ansatz. In stimulierten
Ansatz der Gesunden wurde eine mediane Fluoreszenz von 116 gemessen und im
nicht stimulierten Ansatz von 94 (Abbildung 43-44).
76
Die größten Differenzen zwischen stimulierten und nicht stimulierten Ansatz wurden
bei den Gesunden beobachtet (Median 21). Bei den Parodontitispatienten bildeten die
Differenzen einen Median von 13 und bei den Diabetikern einen Median von 19
(Abbildung 46 und Tabelle 29). Wechselwirkungen zwischen Diagnose und der Differenz der an Test- und Kontrollzahn gemessenen Fluoreszenzen lagen nicht vor (p =
0,6286; Kruskal-Wallis-H-Test und p = 0,9636; Mediantest).
Fluoreszenzintensität
300
200
100
0
C
DM2+P
Median T
P
Median K
Abbildung 43: Grafische Darstellung der diagnosebezogenen medianen Fluoreszenzen (antiCD11b APC). C: Gesunde (grün); DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis (rot); P: Parodontitispatienten (blau); dunkle Färbung: stimulierter Ansatz; helle Färbung:
nicht stimulierter Ansatz; Median T: Median des stimulierten Ansatzes; Median K: Median des
nicht stimulierten Ansatzes.
77
Testzahn
T
Ktr.-zahn
K
300
**
Fluoreszenz
250
200
150
100
50
0
DM2+P
C
P
Abbildung 44: Gruppenvergleich der Fluoreszenzen (anti CD11b-APC) von stimulierten und
nicht stimulierten Ansätzen (Boxplot-Darstellung). T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter
Ansatz; **= statistisch eindeutiger Unterschied (Kruskal-Wallis-H-Test); C: Gesunde; DM2+P:
Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Tabelle 28: Diagnosebezogene deskriptive Statistik der Floreszenzen (anti CD11b-APC).
N
Min
Max
Median
MW ± SD
T
10
50
247
116
134 ± 76
K
10
17
174
94
86 ± 50
T
10
80
273
125
147 ± 55
K
10
72
228
120
134 ± 52
T
9
34
218
68
82 ± 56
K
9
26
165
60
68 ± 41
C
DM2+P
P
T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz; N: Anzahl; Min: Minimalwert; Max: Maximalwert; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung; C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes
mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Der größte Median der Summen der Fluoreszenzen von stimulierten und nicht stimulierten Ansatz wurde mit 282 bei den Diabetikern gemessen. Bei den Gesunden lag
der Median bei 212 und bei den Parodontitispatienten bei 124 (Abbildung 45 und Ta-
78
belle 29). Die Überprüfung dieses Unterschieds zwischen den drei Diagnosegruppen
ergab einen p-Wert von 0,0132 (Kruskal-Wallis-H-Test). Der entsprechende Anschlusstest zeigte einen statistisch eindeutigen Unterschied zwischen den Diabetikern und den
Parodontitispatienten (Abbildungen 44-45 und Tabelle 34, Anhang C).
Fluoreszenzintensität
400
300
200
100
0
C
DM2+P
P
Median
Abbildung 45: Summen der Fluoreszenzen (anti CD11b-APC) von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen. C: Gesunde (grün); DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis (rot); P: Parodontitispatienten (blau).
Fluoreszenzintensität
200
100
0
C
DM2+P
P
-100
Abbildung 46: Differenzen der Fluoreszenzen (anti CD11b-APC) von stimulierten und nicht
stimulierten Ansätzen. C: Gesunde (grün); DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und
Parodontitis (rot); P: Parodontitispatienten (blau).
79
Tabelle 29: Deskriptive Statistik der Summen und Differenzen der Fluoreszenzen (anti CD11bAPC) von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen.
N
Min
Gesamt
Max
Median
MW ± SD
C
T-K
29
-87
195
19
25 ± 62
T+K
29
66
399
209
219 ± 105
T-K
10
-59
195
21
48 ± 77
T+K
10
66
388
212
220 ± 102
T-K
10
-87
146
19
13 ± 66
T+K
10
152
399
282
281 ± 84
T-K
9
-46
57
13
14 ± 31
T+K
9
79
383
124
150 ± 93
C
DM2+P
P
T – K: Differenz stimulierter minus nicht stimulierter Ansatz; T + K: Summe stimulierter plus
nicht stimulierter Ansatz; N: Anzahl; Min: Minimalwert; Max: Maximalwert; MW: Mittelwert; SD:
Standardabweichung; C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
80
5.7.3
Oberflächenexpression CD15
Global betrachtet (unabhängig von der Diagnosegruppe) führte die chemotaktische
Stimulation zu einer eindeutig erhöhten CD15 Expression (p = 0,0379; VorzeichenRang-Test). Im stimulierten Ansatz betrug die mediane Fluoreszenz des CD15 Antikörpers (FITC) 215 und im nicht stimulierten Ansatz 165 (Abbildung 47 und Tabelle 30).
600
Fluoreszenz
400
200
0
Studienteilnehmer
T
K
Median T
Median K
Abbildung 47: Fluoreszenzen (anti CD15-FITC) mit globalem Median für stimulierten und nicht
stimulierten Ansatz. T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz.
Tabelle 30: Deskriptive Statistik der globalen Fluoreszenz (anti CD15-FITC) im stimulierten und
nicht stimulierten Ansatz.
N
Min
Max
Median
MW ± SD
T
28
57
532
215
209 ± 134
K
28
31
455
165
196 ± 143
Unterschied
p = 0,0379
T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz; N: Anzahl; Min: Minimalwert; Max: Maximalwert; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung.
In Bezug auf die einzelnen Diagnosegruppen zeigte sich für die Mediane der Fluoreszenzen (FITC) der PMNSF aus den stimulierten und nicht stimulierten Ansätze kein
einheitliches Bild. Die Fluoreszenz lag bei Diabetikern im stimulierten Ansatz mit einem
Median von 287 geringfügig niedriger als die im nicht stimulierten Ansatz (Median:
301). Im Vergleich zu den anderen Diagnosegruppen waren dies in beiden Fällen die
81
höchsten Mediane. Die Mediane der Fluoreszenzen der PMNSF bei den Parodontitispatienten wiesen mit einem Wert von 74 an beiden Zähnen keinen Unterschied auf. Im
stimulierten Ansatz der Gesunden betrug der Median der Fluoreszenzen der PMNSF
211 und die Fluoreszenzen der PMNSF aus dem nicht stimulierten Ansatz hatten einen
Median von 131 (Abbildung 48 und Tabelle 31).
Der Median der Differenzen der Fluoreszenzen von stimulierten und nicht stimulierten Ansäten lag bei allen Gruppen in einem ähnlichen Bereich. Er betrug bei den Diabetikern 14, bei den Parodontitispatienten 15 und bei den Gesunden 12 (Abbildung 51
und Tabelle 32). Wechselwirkungen zwischen Diagnose und stimulierten beziehungsweise nicht stimulierten Ansatz lagen nicht vor (p = 0,8352; Kruskal-Wallis-H-Test und
p = 0,8984; Mediantest).
Fluoreszenz
600
400
200
0
C
DM2+P
Median T
P
Median K
Abbildung 48: Grafische Darstellung der diagnosebezogenen Mediane der an den PMN SF von
Test-und Kontrollzahn gemessenen Fluoreszenzen (anti-CD15 FITC). C: Gesunde (grün);
DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis (rot); P: Parodontitispatienten
(blau); dunkle Färbung: stimulierter Ansatz; helle Färbung: nicht stimulierter Ansatz; Median T:
Median des stimulierten Ansatzes; Median K: Median des nicht stimulierten Ansatzes.
82
Testzahn
T
Ktr.-zahn
K
600
**
500
Fluoreszenz
400
300
200
100
0
C
P
DM2+P
Abbildung 49: Gruppenvergleich der Fluoreszenzen (anti CD15-FITC) von stimulierten und
nicht stimulierten Ansätzen (Boxplot-Darstellung). T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter
Ansatz; **= statistisch eindeutiger Unterschied (Kruskal-Wallis-H-Test); C: Gesunde; DM2+P:
Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
Tabelle 31: Diagnosebezogene deskriptive Statistik der Floreszenzen (anti CD15-APC).
N
Min
Max
Median
MW ± SD
T
10
83
319
211
197 ± 90
K
10
58
314
131
169 ± 94
T
10
57
532
287
302 ± 141
K
10
145
455
301
308 ± 111
T
9
62
361
74
118 ± 99
K
9
31
310
74
99 ± 86
C
DM2+P
P
T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz; N: Anzahl; Min: Minimalwert; Max: Maximalwert; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung; T: stimulierter Ansatz; K: nicht stimulierter Ansatz; C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
83
Die größten Summenwerte der Fluoreszenzen der PMNSF aus den stimulierten und
nicht stimulierten Ansätzen wurde mit einem Median von 640 bei den Patienten mit DM
und Parodontitis gemessen. Bei den Gesunden lag der Median der Summen bei einer
Fluoreszenz von 342 und bei den Parodontitispatienten von 141 (Abbildung 50 und
Tabelle 32). Die Überprüfung dieses Unterschieds zwischen den drei Diagnosegruppen
ergab einen p-Wert von 0,0024 (Kruskal-Wallis-H-Test). Der entsprechende Anschlusstest zeigte einen statistisch eindeutigen Unterschied zwischen der Gruppe der Diabetiker mit Parodontitis und den Parodontitispatienten auf (Abbildungen 49-50 und Tabelle
35, Anhang D).
1000
Fluoreszenz
800
600
400
200
0
C
DM2+P
P
Median
Abbildung 50: Summen der Fluoreszenzen (anti CD15-FITC) von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen. C: Gesunde (grün); DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis (rot); P: Parodontitispatienten (blau).
84
200
Fluoreszenzen
100
0
C
DM2+P
P
-100
-200
-300
Abbildung 51: Differenzen der Fluoreszenzen (anti CD15-FITC) von stimulierten und nicht
stimulierten Ansätzen. C: Gesunde (grün); DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und
Parodontitis (rot); P: Parodontitispatienten (blau).
Tabelle 32: Deskriptive Statistik der Summen und Differenzen der Fluoreszenzen (anti CD15FITC) von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen.
N
Min
Gesamt
Max
Median
MW ± SD
C
T-K
28
-217
152
14
13 ± 65
T+K
28
99
950
371
405 ± 256
T-K
9
-36
84
12
29 ± 42
T+K
9
154
633
342
366 ± 180
T-K
10
-217
152
14
-6 ± 99
T+K
10
202
950
640
610 ± 233
T-K
9
-16
52
15
19 ± 20
T+K
9
99
671
141
217 ± 185
C
DM2+P
P
T – K: Differenz stimulierter minus nicht stimulierter Ansatz; T + K: Summe stimulierter plus
nicht stimulierter Ansatz; N: Anzahl; Min: Minimalwert; Max: Maximalwert; MW: Mittelwert; SD:
Standardabweichung. C: Gesunde; DM2+P: Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis; P: Parodontitispatienten.
85
6. Diskussion
6.1
Methodendiskussion
6.1.1
Mundhygienephase
Durch die 14-tägige Mundhygienephase sollte ein Einfluss gingivaler Entzündung
auf die Ergebnisse des Hauptversuches ausgeschlossen werden. Das Erfassen der
Mundhygieneindizes PBI und PLI diente dabei nicht nur zur Überprüfung der Mitarbeit
des Patienten, sondern auch zu dessen Motivation. Besonders durch das Anfärben der
Plaque können dem Patienten beziehungsweise Probanden individuelle Schwachstellen visuell aufgezeigt werden. Eine ausführliche Diskussion der Ergebnisse der Mundhygienephase erfolgt in Kapitel 6.2.5.
6.1.2
Chemotaxistests
Bei den meisten etablierten Methoden zur Testung der Chemotaxis von humanen
Immunzellen handelt es sich um Verfahren, die in vitro an isolierten Zellen des peripheren Blutes durchgeführt werden. Zu diesen Verfahren gehören die Boyden-Kammer
(Boyden, 1962) und ihre Modifikationen (Meyle & Axmann-Krcmar, 1999; Zigmond,
1977; Zigmond & Hirsch, 1973) sowie die Testung der Chemotaxis in Agarose-Gel
(Nelson et al., 1975). Bei diesen Methoden ist eine Blutentnahme und die zeitaufwendige Isolation der interessierenden Zellen notwendig. Zudem repräsentiert das Ergebnis der Chemotaxistestung nicht eine lokale Situation, sondern die der Zellen im
peripheren Blut. Die von REBUCK (1955) entwickelte Hautfenstertechnik, bei der künstliche Läsionen auf der Haut geschaffen werden werden, gibt zwar Aufschluss über die
lokale chemotaktische Aktivität der Zellen, ist aber sehr invasiv. Ein nicht invasives in
vivo Verfahren zur Testung der lokalen Chemotaxis im Sulcus gingivae etablierte GOLUB
(GOLUB ET AL., 1981). Bei diesem Chemotaxistest wird der Sulcus nach Reizappli-
kation in 5-minütigen Abständen nach der Methode von SKAPSKI UND LEHNER (Skapski
& Lehner, 1976) zur Zellgewinnung ausgespült. MEYLE entwickelte 1986 ein neues
Verfahren zur Granulozytengewinnung, welches in dieser Studie zur Anwendung kam.
Bei dieser Methode sind die Zellen einem geringerem mechanischen Stress ausgesetzt, da sie nicht mehrfach in eine Spritze reaspiriert werden, sondern nur einmal abgesaugt werden und dann direkt auf Eis gelagert werden. Entsprechend zeigen nach
der Methode von MEYLE gewonnen PMNSF eindeutig längere Überlebensdauern als
PMNSF, die nach der Methode von SKAPSKI UND LEHNER gewonnen wurden (Meyle,
1986). Weiterhin ist die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit der Methode nach
86
SKAPSKI UND LEHNER nur schwer zu erreichen (Lütkemeier, 1995) und der mechanische Stress, welchem die Zellen bei dieser Methode ausgesetzt werden, kann zu Veränderungen der Zelloberfläche führen. Aufgrund der Nachteile dieser Methode wurde
für die eigenen Untersuchungen das Verfahren nach MEYLE gewählt.
6.1.3
Sulcusflüssigkeits-Fließrate
In dieser Studie betrug die Verweildauer des Filterpapierstreifens (Periopaper®) 30
Sekunden. Eine mögliche Fehlerquelle bei diesem Verfahren stellt die Kontaminierung
mit Speichel dar (Griffiths, Wilton, et al., 1992). Um dies zu vermeiden, wurden die
Zähne an denen die SFFR bestimmt wurde mit Watterollen trockengelegt und mit leichten Luftpüsterstößen 2 Sekunden von mesial und distal getrocknet. Der Zutritt von frischem Speichel wurde durch die Watterollen und Absaugen verhindert. Mit Blut kontaminierte Streifen wurden verworfen. Aufgrund der sehr geringen Volumina können
die Ergebnisse der Volumenbestimmung durch Evaporation beeinflusst werden. Hierbei handelt es sich jedoch um einen systematischen Fehler, der alle Proben gleichermaßen betrifft und somit zu vernachlässigen ist. Die Volumenbestimmung erfolgte mit
einem kalibrierten Periotron 8000. Dieses Gerät ist speziell auf die Messung der kleinen Volumina von SF ausgelegt und besitzt eine hohe Reliabilität mit der reproduzierbare Ergebnisse erreicht werden können (Ciantar & Caruana, 1998). Die SFFR kann
durch mechanische Irritation wie Kauen (N. Brill, 1959a) Plaqueentfernung, Einführen
eines Filterpapierstreifens oder Luftpüsterstöße beeinflusst werden (Cimasoni, 1983).
Die Plaqueentfernung vor dem Einführen des Filterpapierstreifens ist notwendig, um
diese nicht mit dem Streifen aufzunehmen. Eine Kontamination mit Plaque würde,
ebenso wie Speichel oder Blut, die Periotron-Werte verfälschen. Um die mechanische
Irritation der Gingiva so gering wie möglich zu halten, erfolgte die Plaqueentfernung mit
dem Scaler so vorsichtig wie möglich. Des Weiteren wurde der Filterpapierstreifen
standardisiert 1 mm in die Sulci eingeführt. Bei dieser Methode ist zum einen die mechanische Irritation gering und zum anderen wird durch diese Standardisierung eine
bessere Vergleichbarkeit zwischen den einzelnen Patienten beziehungsweise Probanden erreicht.
87
6.1.4
Durchflusszytometrie
Das Verfahren der Durchflusszytometrie ist das heute gebräuchliche Instrument zur
Zellzählung und –differenzierung. In der HIV-Diagnostik und Therapieüberwachung
wird es ebenso wie in der Tumordiagnostik routinemäßig eingesetzt.
In den Vorversuchen konnte mit dem Durchflusszytometer für die Bestimmung der
Anzahl von PMNpB und PMNSF mit Hilfe von CytoCountTM-Suspension eine gute Reproduzierbarkeit der Messungen festgestellt werden. Im Gegensatz zur Zellzählung beziehungsweise Zelldifferenzierung mit einem Lichtmikroskop, wie es GOLUB (1981; 1982)
und IACONO (1985) in ihren Studien für die Zählung von PMNSF anwendeten, werden
Zähl- oder Übertragungsfehler bei einer maschinellen Zählung vermieden. Aufgrund
der wesentlich größeren Anzahl ausgezählter Ereignisse (in dieser Studie 5000) ist das
Ergebnis zudem genauer. Eine weitere potentielle Fehlerquelle bei der Bestimmung
der Oberflächenexpression mit Antikörperfärbung besteht in der Überlagerung von
Emissionsspektren einzelner Fluorochrome. In dieser Studie wurden die Farbmarker so
ausgewählt, dass sich ihre Emissionsspektren nicht überlappten und die Oberflächenrezeptormarkierung in 4 parallelen Ansätzen vorgenommen. Auf eine optionale Fluoreszenzkompensation konnte somit verzichtet werden.
6.2
6.2.1
Ergebnisdiskussion
Blutglukose und HbA1c
Erwartungsgemäß zeigten die Diabetiker mit einem medianen Plasma-GlukoseWert von 153 mg/dl und einem medianen HbA1c von 7,0 % deutlich erhöhte Werte und
sind damit nach den Kriterien der ADA (2010) eindeutig als Diabetiker zu identifizieren.
In den beiden anderen Studiengruppen konnte kein Teilnehmer identifiziert werden,
dessen Werte nach den Kriterien der ADA (2010) für das Vorliegen eines DM gesprochen hätten (HbA1c ≥ 6,5 %, Nüchtern-Plasmaglukosewert von ≥ 126 mg/dl).
Die in der vorliegenden Studie festgestellten Schwankungen des HbA1c-Wertes innerhalb der Gruppe der Diabetiker (6,2 %-10,9 %) fallen im Literaturvergleich ähnlich
aus (Delamaire et al., 1997; Karima et al., 2005; Lecube, Pachon, Petriz, Hernandez, &
Simo, 2011; Marhoffer, Stein, Maeser, & Federlin, 1992). Für zukünftige Studien wäre
eine Stratifizierung der HbA1c-Werte denkbar.
Eine Schwierigkeit der hier vorgestellten Studie bestand in der Rekrutierung von Patienten mit DM Typ 2, welche die parodontalen Einschlusskriterien erfüllten (ST ≤ 3 mm
an den zur Probenentnahme herangezogenen Zähnen). Aufgrund des bidirektionalen
88
Zusammenhangs von DM und Parodontitis (Deschner et al., 2011; Lalla & Papapanou,
2011; Mealey & Rethman, 2003) waren die parodontalen Befunde bei den Diabetikern
oft zu schwer und führten zum Studienausschluss. Besonders häufig war dies bei Diabetikern mit einem ungenügend kontrollierten oder bis dato unbehandelten Diabetes
der Fall. Dieser, bei der Rekrutierung der Studienteilnehmer beobachtete Zusammenhang zwischen einem hohen HbA1c-Wert und dem Schweregrad der Parodontitis, ist
durch zahlreiche Studien belegt (Bandyopadhyay, Marlow, Fernandes, & Leite, 2010;
Lalla et al., 2007).
6.2.2
Hämatologie
DM Typ 2 ist mit erhöhten Konzentrationen zirkulierender Akute-Phase-Proteine,
wie beispielsweise CRP (Katagiri et al., 2009; McMillan, 1989), Haptoglobin (McMillan,
1989), Fibrinogen (Barillari, Fabbro, Pasca, & Bigotto, 2009) und Serum Amyloid A
(Pickup, Mattock, Chusney, & Burt, 1997) assoziiert. Ebenso sind die Konzentrationen
von TNF-α (Spranger et al., 2003), IL-1β und IL-6 (Pickup et al., 1997; Spranger et al.,
2003), welche die CRP-Produktion in der Leber induzieren, bei Diabetikern deutlich
erhöht. Auch in der hier vorgestellten Studie fallen die höheren CRP-Werte der Patienten mit DM Typ 2 im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen auf, obwohl bei den
Diabetikern mit Parodontitis und den Parodontitispatienten eine klinisch vergleichbare
parodontale Erkrankungsschwere bestand. Aktuelle Studien weisen darauf hin, dass
die CRP-Werte bei Parodontitispatienten im Vergleich zu Gesunden erhöht sind und
mit dem Schweregrad der parodontalen Erkrankung, ausgedrückt durch den Verlust an
klinischem Attachment und alveolärem Knochen, korrelieren (Kanaparthy, Kanaparthy,
& Niranjan, 2012; Noack et al., 2001; Saito et al., 2003). Die konservative Parodontitistherapie mit mechanischer Entfernung aller supra- und subgingivalen Beläge führt
ebenso wie die Extraktion parodontal erkrankter Zähne zu einer eindeutigen Senkung
der CRP-Werte (D'Aiuto et al., 2004; Marcaccini et al., 2009; B. A. Taylor et al., 2006).
Im Gegensatz zu den Ergebnissen der diskutierten Studien bestanden in der vorliegenden Studie keine Unterschiede zwischen den Parodontitispatienten und den Gesunden. Bei den Parodontitispatienten lagen jedoch 2 Personen weniger unterhalb der
Nachweisgrenze des CRP (CRP < 0,5 mg/l) als bei den Gesunden.
Die Anzahl der PMNpB lag bei allen Studienteilnehmern innerhalb des Referenzbereiches von 1,8 – 7,7 giga/l (Katz, 2008). In verschieden Studien konnte bei Diabetikern
eine erhöhte Anzahl neutrophiler Granulozyten im peripheren Blut nachgewiesen wer-
89
den, was einen Einfluss auf die Ergebnisse der PMNSF-Einwanderung haben könnte.
Dieser mögliche Zusammenhang wird in Kapitel 6.2.7 diskutiert.
6.2.3
Body-Mass-Index
Der BMI lag bei den Diabetikern mit einem Median von 31,8 im adipösen Bereich.
Die gesunden Kontrollen und die Parodontitispatienten zeigten ähnliche Werte innerhalb des physiologischen Normbereichs (WHO, 2000). Der Zusammenhang zwischen
Übergewicht beziehungsweise Adipositas und erhöhtem Diabetesrisiko ist wissenschaftlich fundiert (ADA, 2010). Eine aktuelle Metaanalyse über den Zusammenhang
zwischen Übergewicht beziehungsweise Adipositas und Parodontitis ergab für beide
Parameter mit einer Odds-Ratio von 1,27 für Übergewicht und 1,81 für Adipositas, sowie 2,13 für Adipositas und Übergewicht eine eindeutige Assoziation (Suvan, D'Aiuto,
Moles, Petrie, & Donos, 2011). Als ein möglicher Pathomechanismus in diesem Zusammenhang gilt die Produktion proinflammatorischer Botenstoffe wie IL-1β, IL-6 und
TNF-α durch Adipozyten. Bei übergewichtigen Patienten mit einem übermäßigen Konsum von Nährstoffen nimmt, zusammen mit dem BMI, auch der Anteil des Fettgewebes und damit die Menge der in den Blutkreislauf gelangenden Entzündungsmediatoren zu. Durch die besonders lokal im Fettgewebe erhöhten proinflammatorischen Zytokine werden Monozyten rekrutiert, welche in das Fettgewebe einwandern und zu Makrophagen werden (Donath & Shoelson, 2011). Unter dem Einfluss von IL-1β und anderen Entzündungsmediatoren, die von Adipozyten ausgeschüttet werden, differenzieren
sich die Makrophagen in den sogenannten M1-Phänotyp (klassische Aktivierung). Neben Antigenpräsentation und Phagozytose haben die M1-Makrophagen die Funktion
weitere proinflammatorische Zytokine und Mediatoren wie TNF-α, IL-6 und Stickstoffmonoxid (NO) zu produzieren und auszuschütten (Van Ginderachter et al., 2006).
Dadurch kommt es zu Rekrutierung weiterer Entzündungszellen und einen weiteren
Anstieg proinflammatorischer Zytokine sowie Akute-Phase-Proteine im Blut. Entsprechend wurde in aktuellen Studien eine positive Korrelation des Körpergewichts mit dem
CRP und anderer im Blut nacheisbaren Entzündungsparameter festgestellt (Visser,
Bouter, McQuillan, Wener, & Harris, 1999).
6.2.4
Schweregrad der parodontalen Erkrankung
Die mittlere Anzahl der Zähne war bei den beiden Gruppen mit Parodontitis mit 25
Zähnen gleich (DM2+P: 25,4 ± 2,8 Zähne; P: 25 ± 4,1 Zähne). Im Vergleich dazu lag
die mittlere Zahnzahl bei den Gesunden mit 27,8 ± 2,7 im Bereich eines komplett bezahnten natürlichen Gebisses. Sowohl die Werte für die mittlere STges als auch für das
90
mittlere CAL zeigen deutlich, dass der Schweregrad der Erkrankung in den beiden
Gruppen mit Parodontitis ähnlich war (ST: DM2+P: 2,69 ± 1,13 mm und P: 2,50 ± 1,09
mm; CAL: DM2+P: 3,02 ± 1,43 mm; P: 2,84 ± 1,29 mm). Die Werte der Gesunden lagen erwartungsgemäß niedriger (STges: 1,86 ± 0,68 mm; CAL: 2,06 ± 0,80 mm). Diese
Ergebnisse belegen, dass zwischen den Parodontitispatienten mit und ohne Diabeteskeine Unterschiede im Schweregrad der parodontalen Erkrankung bestanden.
Bei den Gesunden wurde bei 6,3 ± 9,3 % aller sondierten Stellen eine Blutung diagnostiziert. Die Parodontitispatienten bluteten an 19,0 ± 11,1 % aller Stellen und bei den
Diabetikern mit Parodontitis lag der Anteil der blutenden Stellen mit 39,5 ± 24,2 % mit
Abstand am höchsten. ST, CAL und BOP wurden vor Beginn der Mundhygienephase
erhoben um eine Irritation des Gewebes zu vermeiden und die Probenentnahme nicht
zu beeinflussen. Eine ausführliche Diskussion der bei den Diabetikern festgestellten
erhöhten Blutungsneigung erfolgt im nächsten Kapitel (6.2.5 Mundhygieneindizes).
6.2.5
Mundhygieneindizes
Das Ziel der Mundhygienephase, PBI = 0 an den Test- und Kontrollzähnen, wurde
bei allen Studienteilnehmern erreicht. Durch die Maßnahmen der Mundhygienephase
konnte der PBI des Gesamtgebisses bei 25 und der PLI bei 27 Studienteilnehmern
verbessert werden. Der mediane PLI konnte bei den Gesunden um 0,40Indexeinheiten gesenkt werden (von 1,15 auf 0,79). Bei den Diabetikern wurde der
mediane PLI durch die Mundhygienephase um 0,63 Indexeinheiten (von 2,07 auf 1,34)
gesenkt und bei den Parodontitispatienten um 0,59 Indexeinheiten (von 1,44 auf 0,85).
Auch die Indexwerte des PBI waren in allen Gruppen nach 14 Tagen deutlich verbessert. Die Gesunden und die Parodontitispatienten verbesserten ihren medianen PBI
von 0,09 und 0,16 auf 0. Bei den Parodontitispatienten wurde der mediane PBI von
0,22 um 0,13 Indexeinheiten auf 0,09 gesenkt. Diese Ergebnisse bestätigen die Wirksamkeit der angewandten PZR in Kombination mit Instruktion und Motivation. Die minimalen Verschlechterungen der Indizes, die beim PBI bei einem Gesunden und beim
PLI bei zwei Gesunden und einem Parodontitispatienten festgestellt wurden, lassen
sich darauf zurückführen, dass diese Personen bereits am Tag -14 eine sehr gute
Mundhygiene aufwiesen. Es ist davon auszugehen, dass bei diesen Patienten beziehungsweise Kontrollen keine weitere Verbesserung der Werte zu erzielen war. Die
höchsten Indexwerte für PBI und PLI wiesen an beiden Befundungstagen die Patienten
mit DM Typ 2 und chronischer Parodontitis auf. Die niedrigsten Werte wurden, wie zu
erwarten, bei den parodontal und systemisch Gesunden befundet. Bezüglich des PBI
91
bestanden am Tag 0 keine Unterschiede. Der Einfluss einer klinisch manifesten gingivalen Entzündung auf die Ergebnisse kann somit ausgeschlossen werden.
Bei Diabetikern gibt es Hinweise auf eine Korrelation zwischen schlechter glykämischer Einstellung (HbA1c-Wert) und erhöhten Plaqueindizes (Commisso, Monami, &
Mannucci, 2011). Zudem wurde in einigen Studien zum Mundhygieneverhalten von
Diabetikern ein geringeres Interesse dieser Patienten für ihre orale Gesundheit und
eine weniger ausgeprägte Compliance dokumentiert, was konsequent zu höheren
Plaquewerten führt (Commisso et al., 2011; Thorstensson, Falk, Hugoson, &
Kuylenstierna, 1989). Auf die Patienten mit DM, welche an der vorliegenden Studie
teilgenommen haben, kann diese Aussage aufgrund des großen Interesses nicht übertragen werden. Kein einziger Patient hat die Studie vorzeitig abgebrochen oder musste
aufgrund unzureichender Compliance ausgeschlossen werden.
Höheren PBI und PLI-Werte bei Patienten mit DM wurden auch von anderen Autoren beschrieben. Entsprechend zeigen Diabetiker mit Parodontitis im Vergleich zu systemisch gesunden Parodontitispatienten sowohl vor als auch nach Parodontitistherapie
höhere Plaque- (Westfelt, Rylander, Blohme, Jonasson, & Lindhe, 1996) und Papillenblutungs- beziehungsweise Gingivitiswerte (Commisso et al., 2011; Cutler, Machen,
Jotwani, & Iacopino, 1999; Westfelt et al., 1996). Ein weiterer Grund für die hohen
Plaquewerte der Diabetiker könnte darin bestehen, dass die erhöhte Glucosekonzentration in der SF (Ficara, Levin, Grower, & Kramer, 1975) und eine von verschieden
Autoren beschriebe erhöhte SFFR (Ringelberg, Dixon, Francis, & Plummer, 1977;
Sakallioglu, Lutfioglu, Sakallioglu, Diraman, & Keskiner, 2008) das Plaquewachstum
begünstigen. Im Gegensatz zu den oben diskutierten Studien und der vorliegenden
Studie, stellten HUGOSON ET AL. (1989) bei Diabetikern im Vergleich zu gesunden Kontrollen zwar eine höhere Gingivitisprävalenz, jedoch keine Unterschiede bezüglich der
Plaquewerte fest. Auch in einer experimentellen Gingivitisstudie mit Aussetzen aller
Mundhygienemaßnahmen für 3 Wochen konnten zwischen den untersuchten Diabetikern (DM Typ 1) und den gesunden Kontrollen keine Unterschiede in der akkumulierten Plaquemenge festgestellt werden. Bei den Diabetikern zeigte sich nach 7 und 21
Tagen jedoch ein eindeutig höherer Gingival-Index (Salvi et al., 2005).
6.2.6
Sulcusflüssigkeits-Fließrate (SFFR)
Die als Indikator für entzündliche Veränderungen im parodontalen Gewebe geltende
SFFR (Del Fabbro et al., 2001; Griffiths, Sterne, et al., 1992; Löe & Holm-Pedersen,
1965) konnte ebenfalls durch die Maßnahmen der Mundhygienephase deutlich reduziert werden. Entsprechend zeigte sich in allen Gruppen eine Abnahme der SFFR/30
92
Sekunden von Tag -14 zu Tag 0. Dies ist ein deutlicher Hinweis auf einen Rückgang
entzündlicher Vorgänge im gingivalen beziehungsweise parodontalen Gewebe.
Erwartungsgemäß war das SF-Volumen/30 Sekunden am Tag 0 bei den Patienten
mit DM am höchsten und bei den gesunden Kontrollen am niedrigsten. Ein Vergleich
der Strukturgleichheit ergab jedoch, dass zwischen den einzelnen Gruppen keine Unterschiede bestanden. SAKALLIOGLU ET AL. (2008) beschrieben bei gut eingestellten
Diabetikern mit Parodontitis im Vergleich zu systemisch gesunden Parodontitispatienten und gesunden Kontrollen ebenfalls höhere SF-Volumina. Im Gegensatz zur vorliegenden Studie, wurden in dieser Studie statistisch eindeutige Unterschiede zwischen
den drei Studiengruppen (DM2+P, P, C) festgestellt. Dies könnte an der größeren Studienpopulation (DM2+P: n = 15; P: n = 14; C: n=14) sowie an der homogeneren glykämischen Einstellung der Diabetiker (HbA1c ≤ 7,0 %) liegen. Zudem waren die Einschlusskriterien für die zur SF-Entnahme herangezogenen Zähne in der Studie von
SAKALLIOGLU ET AL. ein Attachmentlevel ≥ 5 mm und röntgenologisch erkennbarer Knochenabbau, wohingegen in unserer Untersuchung eine ST > 4 mm ein Ausschlusskriterium darstellte. Durch dieses Ausschlusskriterium sollte erreicht werden, dass die
Oberfläche an der SF austreten kann, zwischen den einzelnen Studienteilnehmern
vergleichbar ist. Auch RINGELBERG ET AL. (1977) stellten bei Kindern mit DM Typ 1 im
Vergleich zu systemisch Gesunden eine erhöhte SFFR fest. Im Gegensatz zu diesem
Ergebnis konnten in einer longitudinalen Studie mit Erwachsenen (Navarro-Sanchez,
Faria-Almeida, & Bascones-Martinez, 2007) keine Unterschiede festgestellt werden.
Verglichen wurde die SFFR von Patienten mit DM Typ 2 und systemisch gesunden
Patienten vor und nach Parodontitistherapie. Der Stichprobenumfang war mit n = 10
pro Gruppe der gleiche wie in der vorliegenden Studie. Die kontroversen Ergebnisse
der diskutierten Studien deuten darauf hin, dass sich mögliche Unterschiede zwischen
den SFFR von Diabetikern und Nichtdiabetikern nur mit größeren Stichprobenumfängen und homogeneren Studiengruppen belegen lassen.
Da die SFFR zirkadianen Schwankungen unterliegt (Bissada et al., 1967), wurden
die Untersuchungen und SF-Entnahmen in der vorliegenden Studie immer zur gleichen
Tageszeit (vormittags) durchgeführt. Die Behandlung beziehungsweise Probenentnahme erfolgte nach dem Frühstück und der morgendlichen Medikamenteneinnahme
der Diabetiker, um eine erhöhte Insulinpräsenz und damit eine mögliche Hypoglykämie
während der durchgeführten Maßnahmen zu vermeiden (Mealey, 1998). Eine Beeinflussung der Ergebnisse durch zirkadiane Schwankungen kann demnach ausgeschlossen werden.
93
Der Einfluss weiblicher Sexualhormone auf die SFFR wird ebenfalls kontrovers diskutiert. Einige Autoren bestätigen den Einfluss von Hormonen auf die SFFR (Fesseler,
1977; Lindhe et al., 1969; Markou et al., 2009), wohingegen eine große Studie mit 120
Studienteilnehmern zu dem Ergebnis kam, dass das Geschlecht die SFFR nicht beeinflusst (Borden, Golub, & Kleinberg, 1977). An der vorliegenden Studie nahmen vier
Frauen teil, die noch einem weiblichen Monatszyklus unterlagen (1 DM2+PA, 3 P).
Beeinflussungen durch Kontrazeptiva konnten aufgrund der Anamnese ausgeschlossen werden.
Weitere Einflussfaktoren wie Tabakkonsum (Morozumi et al., 2004) und mechanischer Irritation der Gingiva (N. Brill, 1959a) konnten ebenfalls weitgehend ausgeschlossen werden, da alle Patienten Nichtraucher waren und angewiesen wurden am
Tag der Probenentnahme keine Zahnseide zu benutzen. Nach CIMASONI (1974) stellt
jedoch bereits die alleinige Entnahme von SF mit einem Filterpapierstreifen oder die
Trockenlegung eines Zahnes mit leichten Luftpüsterstößen eine Irritation der Gingiva
dar, die zu einer höheren SFFR führen könnte. Da bei allen Studienteilnehmern das
beschriebene Protokoll eingehalten wurde, würde es sich bei diesem möglichen Einflussfaktor um einen systematischen Fehler handeln.
6.2.7
PMN-Einwanderung
Die chemotaktische Stimulation führte bei allen bestimmten Parametern zu einem
eindeutigen Anstieg (Anzahl PMN: p < 0,0001; Oberflächenexpression CD11b: p =
0,0161; Oberflächenexpression CD15: p = 0,0379). Die inflammatorische Reizapplikation mit Casein führte demnach zu einer chemotaktischen Aktivierung und der damit
verbundenen Einwanderung von Granulozyten in den Sulcus gingivae und hatte einen
Einfluss auf die Expression der untersuchten Oberflächenantigene CD11b und CD15.
Die Hypothese, dass ein standardisierter inflammatorischer Reiz gegenüber einer Negativkontrolle eine gesteigerte PMN-Einwanderung in den Sulcus gingivae auslöst
(H1), wird damit bestätigt.
Es ist bekannt, dass bei DM durch eine hyperinflammatorische Wirtsantwort bei bakterieller Invasion das Erscheinungsbild parodontaler Erkrankungen wesentlich beeinflusst wird (Hugoson et al., 1989; Ringelberg et al., 1977; Salvi et al., 2005). Bereits in
den Vorversuchen deutete sich an, dass der inflammatorische Reiz bei den Diabetikern
eine stärkere Einwanderung von PMN in den Sulcus hervorrief. Auch die Anzahl der
PMN, die in den Sulcus des Kontrollzahnes, in welchen ein nicht chemotaktisch wirksames Placebo (PBS) appliziert wurde (nicht stimulierter Ansatz), einwanderten, war
94
bei den Diabetikern höher als bei den Parodontitispatienten und den Gesunden. Das
gleiche Verhalten konnte in den Hauptversuchen festgestellt werden. Entsprechend
war die Anzahl der 35 Minuten nach Reiz- beziehungsweise Placeboapplikation eingewanderten PMNSF bei den Diabetikern am höchsten. Die größten Differenzen der
CD45+ Zellen von stimulierten abzüglich nicht stimulierten Ansätzen und damit die
stärkste Reaktion auf den inflammatorischen Reiz, wurden in der Gruppe der Diabetiker beobachtet (Median: 15.363 Zellen). Die Hypothese, dass die Anzahl der nach Setzen eines inflammatorischen Reizes in den Sulcus gingivae eingewanderten PMN bei
Diabetikern mit Parodontitis im Vergleich zu Patienten mit Parodontitis und Gesunden
vermindert ist (H2), wird demnach widerlegt.
Im Gegensatz zu den vorliegenden Ergebnissen stellten GOLUB ET AL. (Golub et al.,
1982) im Tierexperiment mit diabetischen Ratten im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren und unter Verwendung einer ähnlichen Methode eine verminderte Anzahl einwandernder Granulozyten fest. In dieser Studie wurde die sulculäre Einwanderungskinetik
nach Caseinapplikation (2 mg/ml) über einen Zeitraum von 45 Minuten untersucht. Die
Auszählung der Granulozyten erfolgte lichtmikroskopisch unter Verwendung eines
Hämatozytometers. Bei den diabetischen Tieren wanderten weniger Granulozyten ein,
als bei den gesunden Kontrolltieren. Auch ex vivo kamen sie mit Hilfe der Agarose-Gel
Methode und peritonealen PMN von Ratten zu dem gleichen Ergebnis. Das Ergebnis
ihrer Untersuchungen wurde als Chemotaxisdefekt aufgrund von Diabetes mellitus
interpretiert. Auch in Studien an menschlichen PMN (Delamaire et al., 1997; Shetty et
al., 2008) wurde bei Diabetikern über eine verminderte Chemotaxis berichtet. Die in
diesen Studien angewandten Chemotaxis-Assays wurden im Gegensatz zu der vorliegenden Studie an isolierten PMNpB und in vitro durchgeführt.
Im Anschluss an die Tierexperimente wendete die Arbeitsgruppe um GOLUB das
Verfahren zur Testung der lokalen Chemotaxis im Sulcus gingivae bei Menschen an.
Zunächst untersuchten sie 5 gesunde Probanden. Das Maximum der leukozytären
Antwort lag dabei bei 25 Minuten und betrug bis zu 4000 Granulozyten. Die Mediane
der PMN der Gesunden und der Parodontitispatienten lagen in der eigenen Untersuchung in einem ähnlichen Bereich. Das Maximum der leukozytären Antwort wurde jedoch bereits nach 15 Minuten gemessen. Auch die Sondierungstiefen der Sulci, die zur
Probenentnahme herangezogen wurden, sind mit denen in der vorliegenden Studie
vergleichbar und in beiden Studien war die Gingiva an den Testzähnen klinisch entzündungsfrei. Im Gegensatz zur vorliegenden Studie lag das mittlere Alter mit 22,2 ± 2
Jahre wesentlich niedriger und es fand zuvor keine Mundhygienephase statt. Zudem
erfolgte die Sulcuswaschung nach 15 Minuten alle 5 Minuten und wurde mit der Me-
95
thode nach SCRAPSKI UND LEHNER (1976) durchgeführt. Möglicherweise führten die
längeren Intervalle von 10 Minuten zwischen den Entnahmezeitpunkten im Vergleich
zu den Experimenten von GOLUB (1981) und IACONO (1985) (5 minütige Abnahmeintervalle) zu den höheren Zellzahlen.
Die von GOLUB entwickelte Methode zur Testung der lokalen Chemotaxis im Sulcus
gingivae wurde im Weiteren bei Patienten mit Gingivitis (n = 7), chronischer Parodontitis (n = 7), juveniler Parodontitis (n = 11) sowie bei einem Patienten mit insulinabhängigem DM und chronischer Parodontitis angewandt. Im Vergleich zu gesunden Probanden (n = 5) wanderten bei allen Patienten mit einer oralen Erkrankung mehr Zellen ein.
Die Zellzahlen des Patienten mit Diabetes lagen mit einem Maximalwert von ca. 14.000
Granulozyten/Waschung in einem ähnlichen Bereich wie die maximalen Zellzahlen der
Patienten mit chronischer Parodontitis. Bei den Patienten mit juveniler Parodontitis und
dem Patienten mit Diabetes konnte zudem ein atypischer Verlauf der leukozytären
Einwanderungskinetik mit zwei Maxima beobachtet werden. Bei dem Diabetiker kam
es zum Zeitpunkt 20 Minuten zum Maximum der leukozytären Einwanderung, woraufhin die Zellzahl wieder sank und bei 30 Minuten wieder anstieg (Iacono et al., 1985).
Auch in der vorliegenden Studie konnte bei den Diabetikern ein erneuter Anstieg der
PMN-Anzahl, jedoch zum Zeitpunkt 45 Minuten, festgestellt werden, wohingegen die
Zellzahlen bei den anderen Gruppen auf das Ausgangsniveau zurückkehrten.
Die vorliegende Studie hat in Bezug auf Gesunde (n = 10), Parodontitispatienten (n
= 10) und Diabetiker (n = 10) einen wesentlich größeren Stichprobenumfang. Die Basis
für den gewählten Stichprobenumfang stellte die bisherige Literatur zum bearbeiteten
Themenkomplex und die Vorversuche dar und wurde zusammen mit der Abteilung für
medizinische Statistik festgelegt. Des Weiteren erfolgte die Probengewinnung aus gesunden Sulci mit einer vergleichbaren Sondierungstiefe (mediane ST Testzahn:
DM2+P = 2,3 mm; C = 1,8 mm; P = 2,2 mm), wodurch den Zellen eine ähnliche Oberfläche zur Auswanderung zur Verfügung stand. Bei IACONO ET AL. (1985) wurden die
Proben der Parodontitispatienten hingegen aus Taschen unterschiedlicher ST entnommen und sowohl bei den Gingivitispatienten als auch bei den Parodontitispatienten
herrschte eine klinisch sichtbare gingivale Entzündung vor (Gingival-Index 1 bis 2). Da
eine gingivale Entzündung und unterschiedliche Sondierungstiefen die Anzahl und
Oberflächenstruktur einwandernder PMN beeinflussen könnte, wurden in der vorliegenden Studien nur gesunde Parodontien ohne gingivale Entzündung zur Probenentnahme herangezogen.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Studie von IACONO ET AL. (1985) lag der Median der in den Sulcus eingewanderten PMN in den Vor- und Hauptversuchen der ei-
96
genen Studie bei den Parodontitispatienten etwas unterhalb der PMN-Anzahl der Gesunden. Ein statistischer Unterschied wurde nicht nachgewiesen. Während es zahlreiche Studien gibt, die eine verminderte PMN-Chemotaxis bei aggressiver Parodontitis
belegen (Meyle, 1993; Palmer, Watts, & Addison, 1993; Sigusch, Eick, Pfister, Klinger,
& Glockmann, 2001), ist dies für die chronische Parodontitis nicht der Fall. In Studien
über die PMN-Chemotaxis bei Patienten mit chronischer Parodontitis wurden keine
Veränderungen (Altman, Page, Vandesteen, Dixon, & Bradford, 1985; Hidalgo, AvilaCampos, Trevisan, Mocelin, & Itano, 1997; Tufano, Ianniello, Sanges, & Rossano,
1992) oder eine verstärkte Chemotaxis gegenüber Gesunden (Meyle, 1993) festgestellt. In diesen Untersuchungen wurde die Chemotaxis ex vivo an PMN getestet, die
aus peripherem Blut isoliert wurden, wohingegen in der vorliegenden Studie die in vivo
Chemotaxis von sulculäre PMN betrachtet wurde. Da sich die Bedingungen ex vivo
und in vivo sowie der Aktivierungszustand von PMNpB und PMNSF wesentlich voneinander unterscheiden (Asman, Gustafsson, & Bergstrom, 1997; Watanabe, Hagen, &
Andersen, 1991), lassen sich die eigenen Ergebnisse nur bedingt mit der bisherigen
Literatur vergleichen. Weiterhin könnte der Unterschied in der geringen Anzahl von
PMNSF bei den Parodontitispatienten im Vergleich zu den Gesunden auch darin begründet liegen, dass die Anzahl der PMNPB bei den Gesunden eindeutig höher war als
bei den Parodontitispatienten (p = 0,916; t-Test). Zwar wurden Personen mit akuten
oder chronischen Infektionen innerhalb der letzten 6 Monate vor Studienbeginn nicht in
die Studie aufgenommen, leichte subklinische Infektionen oder falsche Angaben durch
die Patienten beziehungsweise Probanden lassen sich jedoch nicht ausschließen. Zudem lag der Wert für das CRP bei 2 Gesunden aber bei keinem Parodontitispatienten
geringfügig oberhalb des Referenzbereichs. Bei einem Stichprobenumfang von n = 10
könnte dies bereits einen Einfluss auf die Ergebnisse haben.
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie deuten auf eine eindeutig gesteigerte Entzündungsreaktion bei DM Typ 2 hin, die sich lokal durch das hier vorgestellte Testverfahren nachweisen lässt. Dieses Ergebnis liefert einen Erklärungsansatz für die bereits
diskutierten erhöhten gingivalen Entzündungsparameter (Hugoson et al., 1989; Salvi et
al., 2005) sowie die erhöhte Prävalenz und Schwere der Parodontitis bei Diabetikern
(Chavarry et al., 2009).
SIMA ET AL. (2010) konnten bei ihren in vivo Untersuchungen an diabetischen Mäusen und Kontrolltieren feststellen, dass die vaskuläre Permeabilität der Testtiere eindeutig höher war als die der gesunden Tiere. Auch die Anzahl der in den gingivalen
Kapillaren am Endothel entlangrollenden Leukozyten war nach Injektion von TNF-α
zwischen die Inzisiven der Tiere, bei den diabetischen Mäusen eindeutig höher als bei
97
den Kontrolltieren. Sie stellten ebenfalls eine gesteigerte Oberflächenexpression des
Leukozytenintegrins CD11a fest, welches bei der Diapedese von Granulozyten eine
entscheidende Rolle spielt. In den gingivalen Biopsien wurde bei den diabetischen
Mäusen eine statistisch höhere Expression von P-Selektin festgestellt, welches ebenfalls an der Diapedese von Granulozyten beteiligt ist. Aufgrund dieser Ergebnisse stellte die Arbeitsgruppe die Hypothese auf, dass eine chronische Hyperglykämie einen
proinflammatorischen Zustand der gingivalen Mikrozirkulation induziert, der durch eine
erhöhte vaskuläre Permeabilität gekennzeichnet ist. Diese Hypothese liefert einen Erklärungsansatz für die in der vorgestellten Studie beschriebenen höheren Anzahlen der
auf inflammatorische Reizung eingewanderter PMNSF bei Diabetikern.
Eine weitere Hypothese zur Ursache gesteigerter PMN-Anzahlen bei Diabetikern
stützt sich auf Studien, welche bei Diabetikern eine Beeinträchtigung der Phagozytose
und der intrazellulären Abtötung von phagozytierten Mikroorganismen feststellten
(Lecube et al., 2011; Marhoffer et al., 1992). Eine mögliche Erklärung für die erhöhte
Anzahl der auf einen entzündlichen Reiz einwandernden PMNSF bei Patienten mit DM
Typ 2 könnte demnach darin liegen, dass das Immunsystem die verminderte Phagozytosefähigkeit der PMN durch eine höhere Anzahl dieser Zellen auszugleichen versucht.
Des Weiteren ist die Produktion und Freisetzung von ROS bei Patienten mit Diabetes und Parodontitis gesteigert (Karima et al., 2005). Der durch die veränderte Zellfunktion gesteigerte Sauerstoffverbrauch könnte zu einer Hypoxie im gingivalen Gewebe
der Diabetiker führen. Hypoxie stellt für den Körper einen Reiz zu Neoangiogenese
dar, um den Sauerstoffmangel zu kompensieren. Auf diese Weise könnte es bei Diabetikern zu einer stärkeren Ausbildung des gingivalen Gefäßplexus kommen. Mehr Kapillaren transportieren mehr Zellen vor Ort. Im Weiteren würde den PMN durch die zahlreicheren Gefäßwände eine größere Oberfläche zur Verfügung stehen um das Gefäßsystem zu verlassen und durch das Gewebe in den Sulcus gingivae zu migrieren.
Tatsächlich konnten SAKALLIOGLU ET AL. (2007) im parodontalen Gewebe diabetischer
Ratten (n = 10) im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren (n = 10) einen höheren osmotischen Druck und eine gesteigerte Anzahl von Gefäßen feststellen und stützen somit
die aufgestellte Hypothese. Die erhöhte Anzahl von Kapillaren könnte auch die in den
eigenen Untersuchungen bei den Diabetikern beobachtete hohe Anzahl von PMNSF an
den Kontrollzähnen erklären. Demnach würde es sich bei dieser Beobachtung nicht um
eine gesteigerte random-migration der PMN handeln, sondern um einen Effekt, der auf
der größeren für Diapedese zur Verfügung stehenden Oberfläche basiert.
Im Gegensatz dazu steht die Tatsache, dass langfristige Hyperglykämie als Folgeschäden Mikrozirkulationsstörungen in den terminalen Strombahnen hervorruft. Der
98
Schweregrad dieser Angiopathien kann sich bis zu Makroangiopathien und Nekrosen
des zu versorgenden Gewebes steigern (ADA, 2010). Bei den Diabetikern in dieser
Studie handelte es sich um frisch diagnostizierte Fälle und nicht um langjährige Fälle.
Patienten mit Symptome von Mikro- oder Makroangiopathien wurden aus der Studie
ausgeschlossen.
FARAH ET AL. (2008) stellten bei Patienten mit DM Typ 2 (n = 30) im Vergleich zu
Gesunden eindeutig höhere PMN-Anzahlen im peripheren Blut fest. Dies könnte ebenfalls eine Rolle bei der PMN-Einwanderung spielen. Sie beobachteten des Weiteren,
dass es nach zweimonatiger Therapie mit Metformin zu einem Anstieg der PMNAnzahl kam. Der HbA1c korrelierte in dieser Untersuchung mit der PMN-Anzahl des
peripheren Blutes (r = 0,5; p = 0,0008). Auch Insulin kann die Anzahl peripher zirkulierender PMN beeinflussen. So wurde in einer klinischen Studie an 8 gesunden Probanden, welche unter euglykämischen Bedingungen über einen Zeitraum von 4 Stunden
durch Infusion einem hyperinsulinem Zustand ausgesetzt wurden, ein statistisch eindeutiger Anstieg der peripheren PMN nachgewiesen (Walrand, Guillet, Boirie, &
Vasson, 2004). In der eigenen Studie wurde kein Unterschied in der Anzahl der PMNpB
zwischen den Gesunden und den Diabetikern festgestellt (p = 0,916). Auch der Unterschied zwischen den Diabetikern und den Parodontitispatienten war nicht eindeutig (p
= 0,051; t-Test), wohingegen sich zwischen den Gesunden und den Parodontitispatienten eindeutige Unterschiede ergaben (p = 0,024; t-Test). Da bei der PMNSFEinwanderung kein Unterschied zwischen den Gesunden und den Parodontitispatienten bestand und die Werte bei den Gesunden deutlich unter denen der Diabetiker lagen, ist ein Einfluss der Anzahl der PMNpB auf die PMNSF-Einwanderung in den Sulcus
gingivae nicht nachzuweisen.
Das Fettgewebe (Adipozyten) und damit verbunden der BMI, scheinen die Entzündungsreaktion von Diabetikern ebenfalls zu beeinflussen. Eine aktuelle Hypothese geht
davon aus, dass in das Fettgewebe von Diabetikern vermehrt Makrophagen einwandern und dort zu einer gesteigerten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine und
Chemokine, wie beispielsweise IL-1b, TNF, Chemokin-Ligand 2 (CCL2), ChemokinLigand 3 (CCL3) und Chemokin-Ligand 8 (CXCL 8), führen. Die Anzahl der Makrophagen scheint dabei im Zusammenhang mit dem Grad der Fettleibigkeit zu stehen. Als
Folge kommt es zu einer Rekrutierung weiterer Immunzellen, die sich an dem Entzündungsgeschehen im Fettgewebe beteiligen. Die Freisetzung der entstehenden Zytokine und Chemokine aus dem Fettgewebe in den zirkulierenden Blutstrom begünstigt die
Entstehung und Unterhaltung von Entzündungen in anderen Geweben zu denen auch
das Parodont gehört (Donath & Shoelson, 2011). Da das Parodont aller Zähne eine
99
erhebliche Fläche darstellt und sich das Immunsystem dort mit verschiedensten Mikroorganismen auseinandersetzt, scheint es nur logisch zu sein, dass es auch hier zu
einer gesteigerten Immunantwort des Körpers kommt.
Insgesamt deuten die Ergebnisse der diskutierten Studien ebenfalls auf einen Zusammenhang zwischen der Anzahl von PMN und Diabetes hin, zeigen jedoch auch
auf, dass ein Einfluss therapeutischer Wirkstoffe auf die Anzahl der in den Sulcus einwandernden Zellen nicht ausgeschlossen werden kann.
6.2.8
PMN-Oberflächenexpression CD11b und CD15
Die Applikation eines inflammatorischen Reizes (Casein) in den Sulcus gingivae führte
zu einer eindeutig höheren PMN-Oberflächenexpression von CD11b und CD15 (p =
0,0161 und p = 0,0379; Vorzeichen-Rang Test). Die höchsten Werte wurden bei den
Diabetikern gemessen, die niedrigsten bei den Parodontitispatienten. Diese Unterschiede waren statistisch eindeutig. Der Median der Differenzen der Fluoreszenzen aus
stimuliertem und nicht stimuliertem Ansatz und damit die Reaktion der Rezeptorexpression auf den inflammatorischen Reiz war jedoch für alle Gruppen bezüglich der
beiden untersuchten Rezeptoren ähnlich. Die Hypothese, dass die Expression des
leukozytären Oberflächenrezeptors CD11b auf sulculären PMN von Diabetikern mit
Parodontitis im Vergleich zu Patienten mit Parodontitis und Gesunden nach Stimulation
mit einem inflammatorischen Reiz erhöht ist (H3) wurde demnach nicht bestätigt, da
nur die Unterschiede zwischen Diabetikern und Parodontitispatienten eindeutig waren.
Dasselbe gilt für die Hypothese, dass die Expression des leukozytären Oberflächenrezeptors CD15 auf sulculären PMN von Diabetikern mit Parodontitis im Vergleich zu
Patienten mit Parodontitis und Gesunden nach Stimulation mit einem inflammatorischen Reiz erhöht ist (H4).
ASMAN ET AL. (1997) bestimmten die Oberflächenexpression der Rezeptoren CD11b
und CD15 an unterschiedlich schwer erkrankten Stellen bei Parodontitispatienten. Dazu entnahmen sie Proben von Stellen mit und ohne parodontale Destruktion. Bei den
Kontrollen entnahmen sie Proben von Stellen mit Gingivitis. Sie konnten keine Unterschiede in der Oberflächenexpression der untersuchten Membranmoleküle und der
Anzahl der positiv gefärbten Zellen nachweisen. Verglichen mit den PMNpB zeigten die
PMNSF jedoch einen statistisch eindeutigen Anstieg der Fluoreszenzintensität aller
Oberflächenantigene. Die Arbeitsgruppe schlussfolgerte daraus, dass die Migration
von PMN aus den Kapillaren in den gingivalen Sulcus die Expression der untersuchten
Membranmoleküle zwar beeinflusst, verschiedene lokale Entzündungszustände sich
100
jedoch nicht auswirken. Ähnlich wie in der eigenen Untersuchung, war die Streuung
der Fluoreszenzintensitäten in dieser Studie bei den PMNSF recht breit. Dies könnte in
verschiedenen Aktivierungszuständen der Zellen begründet liegen. Zudem kommt es
während der Migration der PMNSF durch das Gewebe zu einem intensiven Kontakt mit
der extrazellulären Matrix und zu einer erheblichen Verformung der Zellen. Dies führt
neben einer höheren Expression des CD11b Antigens auf PMNSF im Vergleich zu
PMNpB ebenfalls zu einer größeren Streuung (Watanabe et al., 1991).
Im Gegensatz zu der oben diskutierten und der eigenen Studie gibt es auch Untersuchungen, die bei Parodontitispatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen auf eine
gesteigerte PMNSF-Oberflächenexpression des CD11b-Antigens hinweisen (Biselli,
Ferlini, Di Murro, Paolantonio, & Fattorossi, 1995; Watanabe et al., 1997). Im peripheren Blut von Parodontitispatienten wurde dieser Unterschied nicht nachgewiesen
(Pietruska, Zak, Pietruski, & Wysocka, 2005; Watanabe et al., 1997).
Verschiedene Studien kamen zu dem Ergebnis, dass bei Patienten mit DM Typ 2
die Oberflächenexpression des CD11b Antigens auf PMNpB im Vergleich zu gesunden
Kontrollpersonen erhöht ist und interpretierten dies als einen proinflammatorischen
Zustand der Zellen (Advani, Marshall, & Thomas, 2002; Delamaire et al., 1997; Mastej
& Adamiec, 2008; van Oostrom, van Wijk, Sijmonsma, Rabelink, & Castro Cabezas,
2004).
Eine mögliche Ursache
scheint
die
verminderte
intrazelluläre
Aktin-
Polymerisation zu sein, die eine Ablösung des betreffenden Rezeptors verhindert
(Advani et al., 2002). Auch bei Monozyten führen in vitro erhöhte Konzentrationen von
nichtveresterten Fettsäuren, wie sie bei Patienten mit DM Typ 2 in der Regel vermehrt
vorkommen, zu einem statistisch eindeutigen Anstieg der Oberflächenexpression von
CD11b und einer höheren Adhäsion an Endothelzellen (Zhang et al., 2006). Im Gegensatz dazu war in einer weiteren Studie, in der nur PMNpB von Diabetikern Typ 2 ohne
Angiopathien untersucht wurden, die Oberflächenexpression von CD11b nicht verschieden (Mastej & Adamiec, 2009). Auch in der hier vorgestellten Studie wurden Patienten mit bekannten vaskulären Komplikationen ausgeschlossen. Ein möglicher Einfluss dieser Komplikation auf das Ergebnis kann daher ausgeschlossen werden.
Ein weiterer Einflussfaktor auf die Oberflächenexpression des CD11b-Antigens wird
in der Behandlung mit oralen Antidiabetika vermutet. So konnte in einer Studie an isolierten PMNpB von Patienten mit DM Typ 2 (n = 30) im Vergleich zu gesunden Kontrollen (n = 20) nicht nur eine höhere Expression des CD11b Oberflächenantigens nachgewiesen, sondern auch unterschiedliche Effekte bei der Behandlung mit Metformin
oder Rosiglitazon festgestellt werden. Bei den mit Metformin behandelten Patienten
wurde nach 2 Monaten ein eindeutiger Anstieg der CD11b Oberflächenexpression
101
festgestellt, wohingegen Patienten, die mit Rosiglitazon behandelt wurden, einen
Rückgang der Oberflächenexpression zeigten (Farah et al., 2008). Seit November
2010 dürfen in Deutschland Arzneimittel mit dem Wirkstoff Rosiglitazon nicht mehr vertrieben werden (Pressemitteilung 11/10; Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte). Ein Einfluss dieses Wirkstoffes auf die Ergebnisse kann daher ausgeschlossen werden. Insulin scheint unter euglykämischen Bedingungen bei gesunden Probanden die Anzahl der Rezeptoren CD11b und CD15 auf PMNpB ebenfalls zu reduzieren
(Walrand et al., 2004). In der eigenen Untersuchung war die Expression dieser beiden
Rezeptoren jedoch bei den Diabetikern, die alle mit Insulin und/oder oralen Antidiabetikern behandelt wurden, am höchsten und steht somit im Gegensatz zu den Ergebnissen von W ALRAND (2004).
102
7. Zusammenfassung
Diabetes mellitus Typ 2 und Parodontitis sind multifaktorielle Erkrankungen mit einer
hohen Prävalenz und scheinen in einem bidirektionalen Zusammenhang miteinander
zu stehen (Lalla & Papapanou, 2011). Neben einem proinflammatorischen Zustand des
Immunsystems (Donath & Shoelson, 2011) und einer durch klinische Studien belegten
ausgeprägten gingivalen Entzündungsreaktion auf den bakteriellen Biofilm (Hugoson et
al., 1989; Salvi et al., 2005), wurde bei Diabetikern in vitro eine verminderte Chemotaxis von peripheren polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) festgestellt
(Delamaire et al., 1997; Shetty et al., 2008). PMN sind die primären phagozytären Zellen der akuten Immunantwort und die in der Sulcusflüssigkeit vorherrschende Zellart
(Cimasoni, 1983).
In der vorgestellten Arbeit wurde die in vivo Chemotaxis von PMN im Sulcus
gingivae von Diabetikern mit Parodontitis (n = 10) untersucht. Als Kontrollgruppen dienten Parodontitispatienten und Gesunde (jeweils n = 10).
Alle Teilnehmer erhielten eine vollständige zahnärztliche und parodontologische Untersuchung und nahmen an einer 14-tägigen Mundhygienephase teil. Die Testung der
lokalen Chemotaxis erfolgte nach Abschluss der Mundhygienephase an parodontal
gesunden Zähnen im Oberkiefer. Die PMN wurden dabei mit der Methode nach MEYLE
(1986) aus dem Sulcus entnommen. Dazu wurde nach Baseline-Waschung in den
Sulcus eines Testzahnes (stimulierter Ansatz; Sondierungstiefe ≤ 3 mm, klinisch gesunde Gingiva) ein inflammatorischer Reiz (Casein) und in den des kontralateralen
Zahnes (nicht stimulierter Ansatz am Kontrollzahn) ein Placebo (PBS) appliziert. 35
Minuten später wurden die in die Sulci eingewanderten Zellen ausgewaschen. Die in
den Proben enthaltenen PMN wurden durchflusszytometrisch gezählt und die Oberflächenexpression der für die Diapedese wichtigen Rezeptoren CD11b und CD15 bestimmt.
Für alle Parameter ergab sich ein eindeutiger Unterschied zwischen stimuliertem
und nicht stimuliertem Ansatz (jeweils p < 0,05; Vorzeichen-Rang-Test). Die Summe
der in beide Ansätze eingewanderten PMN war bei den Diabetikern am höchsten (Median: 32.751). Auch die chemotaktische Reaktion auf den inflammatorischen Reiz war
bei den Diabetikern am größten (Median: 15.363). Statistisch eindeutige Unterschiede
ergaben sich für alle Parameter zwischen Diabetikern mit Parodontitis und den systemisch gesunden Parodontitispatienten (jeweils p < 0,05; Mediantest).
Die Ergebnisse dieser Studie belegen erstmals in einer klinisch-experimentellen
Studie eine gesteigerte lokale parodontale Entzündungsreaktion bei Diabetikern Typ 2.
103
8. Summary
Diabetes mellitus type 2 and periodontitis are both multifactorial diseases with a high
prevalence and recent studies indicate a bidirectional linkage between them (Lalla &
Papapanou, 2011). In addition to a pro-inflammatory state of the immune system
(Donath & Shoelson, 2011) and an enhanced inflammatory reaction of gingival tissue
to bacterial biofilms (Hugoson et al., 1989; Salvi et al., 2005), various studies suggest
an impaired chemotaxis in peripheral polymorphonuclear neutrophils (PMN) in diabetics (Delamaire et al., 1997; Shetty et al., 2008). PMN are the primary cells of the innate
immune system and the predominant type of leukocytes in gingival crevicluar fluid
(Cimasoni, 1983).
The aim of this study was to investigate the in vivo chemotaxis of sulcular PMN from
patients with diabetes mellitus type 2 and periodontitis (n = 10). Systemically healthy
individuals with (n = 10) and without periodontitis (n = 10) served as controls.
All participants received a full dental and periodontal examination and an oral hygiene phase (14 days). After completion of the oral hygiene phase, local chemotaxis
was tested. Sulcular PMN were sampled with the method of MEYLE (1986). After a
baseline-wash, either a chemoattractant (casein, testtooth) or a placebo (PBS, controltooth) was pipetted into the gingival crevice (probing depth ≤ 3 mm, clinically healthy
gingiva). After 35 minutes, crevices were rinsed again and samples were collected.
PMN counts and membrane molecules involved in diapedesis (CD11b and CD15) were
analysed employing flow cytometry.
For all parameters, there was a statistically significant difference between test- and
controlteeth (p < 0.05; Signed-Rank-Test). The highest total number of PMN from testand controlteeth was detected in diabetics (median: 32,751) as well as the widest difference between test- and controlteeth (median: 15,363). Statistical significant differences were detected in all parameters between diabetics with periodontitis and systemically healthy patients with periodontitis (p < 0.05; Median-Test).
For the first time in a clinical experimental study, these results clearly demonstrate
an enhanced inflammatory reaction even in healthy sites of patients with diabetes type
2 and periodontitis.
104
9. Abkürzungsverzeichnis
ADA
The American Diabetes Organization
ADC
Analog-Digital-Übersetzer
AGEs
Advanced Glycation End Products
AP
Aggressive Parodontitis
APC
Allo-Phyco-Cyanin
aq. bidest.
aqua bidestillata
BL
Baseline
BMI
Body-Mass-Index
BOP
Sondierungsblutung
C
Kontrollgruppe
2+
Ca
Kalzium-Ionen
CAL
klinisches Attachmentniveau
CB
counting beads
CD
Cluster of Differentiation
CR3
Komplement-Rezeptor 3
CRP
C-reaktives Protein
DAG
Diacylglyceride
DDG
Deutsche Diabetes Gesellschaft
DM
Diabetes mellitus
DM2+P
Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und chronischer
Parodontitis
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
FcγR
Fcγ-Rezeptor
FITC
Fluorescein isothiocynat
FK
Furkationsgrad
FL
Filter
fMLF
N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylanalin
FS
Vorwärtsstreuung
G-CSF
Granulocyte Colony Stimulating Factor
GDM
Gestationsdiabetes
GR
Gingivalrand
HbA1c
Hämoglobin A1c
hs
high sensitive
ICAM-1
Intercellular Adhesion Molecule 1
105
IDF
International Diabetes Federation
IFG
abnorme Nüchter-Plasmaglukose
Ig
Immunglobulin
IGT
gestörte Glukosetoleranz
IL
Interleukin
Isotypenktr.
Isotypenkontrolle
LAD
Leukozyten-Adhäsionsdefekt-Syndrom
LASER
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
LFA-1
Leukocyte Function associated Antigen-1
Log
Logarithmus
LPS
Lipopolysaccharid
LTB4
Leukotriene B4
MAC-1
Makrophagen Antigen 1
Mg
2+
Magnesium-Ionen
MHI
Mundhygieneindizes
MMPs
Matrix-Metallo-Proteinasen
MPO
Myeloperoxidase
MS
Microsoft®
NK
Natürliche Killerzellen
o. Ä.
oder Ähnliches
OGTT
oraler Glukosetoleranztest
P
Patienten mit Parodontitis
PBI
Papillenblutungsindex
PBS
phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PBS(-/-)
phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+ und Mg2+
PGE2
Prostaglandin E2
PLI
Plaqueindex
PMA
Phorbol-Myristat-Acetat
PMN
polymorphkernige neutrophile Granulozyten
PMNpB
Neutrophile Granulozyten aus peripherem Blut
PMNPER
Neutrophile Granulozyten aus dem Peritonealraum
PMNSF
Neutrophile Granulozyten aus Sulcusflüssigkeit
PP
Polyprypelen-Falcon
PTM
Photodetektor
PTW
digitaler Periotronwert
PZR
professionelle Zahnreinigung
106
RAGEs
Receptor-AGEs
ROS
Reaktive Sauerstoffverbindungen
SF
Sulcusflüssigkeit
SFFR
Sulcusflüssigkeits-Fließrate
SS
Seitwärtsstreuung
ST
Sondierungstiefe
STges
Sondierungstiefe des Gesamtgebisses
TNF
Tumornekrosefaktor
WHO
World Health Organisation
107
10. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Blutglukosegehalt nach der oralen Gabe von 75 g Glukose ................... 3
Abbildung 2: Entzündungszustände des Parodonts .................................................... 8
Abbildung 3: Stoffwechselweg diabetischer Parodontitispatienten nach Nassar et al.
............................................................................................................ 15
Abbildung 4: Produktion proinflammatorischer Zytokine durch Adipozyten ............... 16
Abbildung 5: Schematische Darstellung der transepithelialen Migration neutrophiler
Granulozyten ....................................................................................... 19
Abbildung 6: Boyden-Kammer .................................................................................. 22
Abbildung 7: Entnahme von Sulcusflüssigkeit........................................................... 30
Abbildung 8: Schematischer Aufbau des SF-Absaugsystems................................... 30
Abbildung 9: Lokale experimentelle Entzündungsreaktion durch Casein .................. 31
Abbildung 10: Durchflusszytometrische Darstellung einer SF-Probe ........................ 33
Abbildung 11: Schematische Darstellung der Aufteilung der SF-Probe .................... 38
Abbildung 12: In den Sulcus gingivae eingeführtes Periopaper®.............................. 41
Abbildung 13: Zytozentrifugenpräparate; Pappenheim-Färbung ............................... 45
Abbildung 14: Durchflusszytometrische Darstellung aus dem Sulcus gingivae
gewonnener PMNSF ........................................................................... 46
Abbildung 15: Durchflusszytometrische Darstellung aus peripherem Blut isolierter
PMNpB ............................................................................................... 46
Abbildung 16: Repräsentative durchflusszytometrische Darstellung der
Oberflächenrezeptormarkierung von PMNSF ...................................... 47
Abbildung 17: PMNSF-Einwanderungskinetik bei Gesunden ..................................... 48
Abbildung 18: PMNSF-Einwanderungskinetik bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2
und Parodontitis ................................................................................ 49
Abbildung 19: PMNSF-Einwanderungskinetik bei Parodontitispatienten .................... 49
Abbildung 20: PMNSF-Einwanderungskinetik der stimulierten Ansätze aller
Diagnosegruppen .............................................................................. 50
Abbildung 21: Sondierungstiefen an Test- und Kontrollzähnen................................. 53
Abbildung 22: Veränderungen des Papillenblutungsindex (PBI) ............................... 54
Abbildung 23: PBI am Tag -14 und Tag 0 ................................................................. 55
Abbildung 24: Veränderungen des Plaqueindex ....................................................... 57
Abbildung 25: Plaqueindex an Tag -14 und Tag 0 .................................................... 58
Abbildung 26: Veränderungen der Sulcusflüssigkeits-Volumina ............................... 59
Abbildung 27: Sulcusflüssigkeits-Volumen pro 30 Sekunden an Tag -14 und Tag 0. 60
Abbildung 28: Gesunder Proband ............................................................................ 61
108
Abbildung 29: Patient mit Diabetes Typ 2 und chronischer Parodontitis ................... 62
Abbildung 30: Patient mit chronischer Parodontitis ................................................... 63
Abbildung 31: Plasma-Glucose-Werte ...................................................................... 64
Abbildung 32: HbA1c-Werte ..................................................................................... 65
Abbildung 33: Body-Mass-Index (BMI) ..................................................................... 66
Abbildung 34: C-reaktives Protein ............................................................................ 67
Abbildung 35: Blutsenkung nach 1 und 2 Stunden ................................................... 68
Abbildung 36: Anzahl neutrophiler Granulozyten im peripheren Blut ........................ 69
Abbildung 37: Anzahl CD45+ Zellen mit globalem Median für stimulierten und nicht
stimulierten Ansatz ............................................................................ 70
Abbildung 38: Grafische Darstellung der diagnosebezogenen Mediane CD45+ Zellen
im stimulierten und nicht stimulierten Ansatz ..................................... 71
Abbildung 39: Gruppenvergleich der Anzahl CD45+ Zellen der stimulierten und nicht
stimulierten Ansätze (Boxplot- Darstellung) ....................................... 72
Abbildung 40: Summen der CD45+ Zellen von stimulierten und nicht stimulierten
Ansätzen ........................................................................................... 73
Abbildung 41: Differenzen der CD45+ Zellen von stimulierten und nicht stimulierten
Ansätzen ........................................................................................... 73
Abbildung 42: Fluoreszenzen (anti CD11b-APC) mit globalem Median für stimulierten
und nicht stimulierten Ansatz ............................................................. 75
Abbildung 43: Grafische Darstellung der diagnosebezogenen medianen
Fluoreszenzen (anti-CD11b APC) ..................................................... 76
Abbildung 44: Gruppenvergleich der Fluoreszenzen (anti CD11b-APC) von
stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen (Boxplot-Darstellung) .... 77
Abbildung 45: Summen der Fluoreszenzen (anti CD11b-APC) von stimulierten und
nicht stimulierten Ansätzen ................................................................ 78
Abbildung 46: Differenzen der Fluoreszenzen (anti CD11b-APC) von stimulierten und
nicht stimulierten Ansätzen ................................................................ 78
Abbildung 47: Fluoreszenzen (anti CD15-FITC) mit globalem Median für stimulierten
und nicht stimulierten Ansatz ............................................................. 80
Abbildung 48: Grafische Darstellung der diagnosebezogenen Mediane der an den
PMNSF von Test-und Kontrollzahn gemessenen Fluoreszenzen (antiCD15 FITC) ....................................................................................... 81
Abbildung 49: Gruppenvergleich der Fluoreszenzen (anti CD15-FITC) von stimulierten
und nicht stimulierten Ansätzen (Boxplot-Darstellung) ....................... 82
Abbildung 50: Summen der Fluoreszenzen (anti CD15-FITC) von stimulierten und
nicht stimulierten Ansätzen ................................................................ 83
109
Abbildung 51: Differenzen der Fluoreszenzen (anti CD15-FITC) von stimulierten und
nicht stimulierten Ansätzen ................................................................ 84
Abbildung 52: Messergebnisse der Periotronkalibrierung ....................................... 129
Abbildung 53: Regressionskurve durch Mittelwerte der Periotronkalibrierung ......... 129
Abbildung 54: Beispielhafter Florida-Probe Befund für Patienten mit Parodontitis und
Diabetes mellitus Typ 2 ................................................................... 131
Abbildung 55: Befundbogen für eingehende zahnärztliche Untersuchung .............. 132
Abbildung 56: Anamnesebogen Seite 1 .................................................................. 133
Abbildung 57: Anamnesebogen Seite 2 .................................................................. 134
Abbildung 58: Anamnesebogen Seite 3 .................................................................. 135
Abbildung 59: Befundbogen Mundhygiene Tag -14 ................................................ 136
Abbildung 60: Befundbogen Mundhygiene und Anweisungen Blutentnahme Tag 0 137
110
11. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Ätiologische Klassifikation von Diabetes mellitus ........................................ 4
Tabelle 2: Diagnosekriterien für Diabetes mellitus ...................................................... 5
Tabelle 3: Klassifikation der Parodontalerkrankungen ................................................. 6
Tabelle 4: Zusammenfassung der Daten zur Chemotaxis bei Diabetikern ................. 25
Tabelle 5: Maßnahmen der Mundhygienephase ........................................................ 34
Tabelle 6: Papillenblutungsindex nach Saxer und Mühlemann .................................. 35
Tabelle 7: Plaqueindex nach Quigley und Hein ......................................................... 36
Tabelle 8: Übersicht verwendeter Antikörper ............................................................. 39
Tabelle 9: Demografische Daten der Studiengruppen ............................................... 50
Tabelle 10: Deskriptive Auswertung der Zahnanzahl ................................................. 51
Tabelle 11: Deskriptive Statistik der Sondierungstiefe (mm) des Gesamtgebisses .... 51
Tabelle 12: Deskriptive Statistik des Attachmentniveaus (mm) des Gesamtgebisses 52
Tabelle 13: Deskriptive Statistik der Sondierungsblutung (%) .................................... 52
Tabelle 14: Deskriptive Statistik der Sondierungstiefen an Test- und Kontrollzahn .... 53
Tabelle 15: Mediane und Mittelwerte des Papillenblutungsindex ............................... 56
Tabelle 16: Mediane und Mittelwerte des Plaqueindex .............................................. 58
Tabelle 17: Mediane und mittlere Sulcusflüssigkeit-Volumina/30 Sekunden .............. 60
Tabelle 18: Deskriptive Statistik der Plasma-Glukose-Werte ..................................... 64
Tabelle 19: Deskriptive Statistik der HbA1c-Werte..................................................... 65
Tabelle 20: Deskriptive Statistik des Body-Mass-Index .............................................. 66
Tabelle 21: Verteilung der Werte des C-reaktives-Proteins........................................ 67
Tabelle 22: Verteilung der Blutsenkungsgeschwindigkeit oberhalb des
Referenzbereiches ................................................................................. 68
Tabelle 23: Deskriptive Statistik der Anzahl neutrophiler Granulozyten im peripheren
Blut ........................................................................................................ 69
Tabelle 24: Deskriptive Statistik der globalen Anzahl CD45+ Zellen im stimulierten
und nicht stimulierten Ansatz ................................................................. 70
Tabelle 25: Diagnosebezogene deskriptive Statistik eingewanderter CD45+ Zellen . 72
Tabelle 26: Deskriptive Statistik der Summen und Differenzen CD45+ Zellen von
stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen .......................................... 74
Tabelle 27: Deskriptive Statistik der globalen Fluoreszenz (anti CD11b-APC) im
stimulierten und nicht stimulierten Ansatz .............................................. 75
Tabelle 28: Diagnosebezogene deskriptive Statistik der Floreszenzen (anti CD11bAPC) ...................................................................................................... 77
111
Tabelle 29: Deskriptive Statistik der Summen und Differenzen der Fluoreszenzen (anti
CD11b-APC) von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen .............. 79
Tabelle 30: Deskriptive Statistik der globalen Fluoreszenz (anti CD15-FITC) im
stimulierten und nicht stimulierten Ansatz .............................................. 80
Tabelle 31: Diagnosebezogene deskriptive Statistik der Floreszenzen (anti CD15APC) ...................................................................................................... 82
Tabelle 32: Deskriptive Statistik der Summen und Differenzen der Fluoreszenzen (anti
CD15-FITC) von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen ............... 84
Tabelle 33: Anschlusstest für Kruskal-Wallis-H-Test bezüglich der Summe CD45+
Zellen von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen ....................... 130
Tabelle 34: Anschlusstest für Kruskal-Wallis-H-Test bezüglich der Fluoreszenz anti
CD11b-APC von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen ............. 130
Tabelle 35: Anschlusstest für Kruskal-Wallis-H-Test bezüglich der Fluoreszenz anti
CD15-APC von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen ............... 130
112
12. Literaturverzeichnis
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128
13.
Anhang
A.
Periotronkalibrierung ....................................................................................... 129
B.
Parameter CD45 ............................................................................................. 130
C.
Parameter CD11b ........................................................................................... 130
D.
Parameter CD15 ............................................................................................. 130
E.
Anamnese, eingehende zahnärztliche Untersuchung und parodontale
Befunderhebung .............................................................................................. 131
F.
Verwendete Geräte und Materialen ................................................................. 138
129
A.
Periotronkalibrierung
180
160
140
PTW
120
100
80
60
40
20
0
0
0,2
0,4
0,6
Serumvolumen in µl
0,8
1
1,2
Abbildung 52: Messergebnisse der Periotronkalibrierung. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte mit Standardabweichung.
1,2
y = 1E-05x2 + 0,0043x - 0,0077
R² = 0,9995
Serumvolumen in µl
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
-0,2
20
40
60
80
100
120
140
PTW
Abbildung 53: Regressionskurve durch Mittelwerte der Periotronkalibrierung.
160
180
130
B.
Parameter CD45
Tabelle 33: Anschlusstest für Kruskal-Wallis-H-Test bezüglich der Summe CD45+ Zellen von
stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen.
C.
Parameter CD11b
Tabelle 34: Anschlusstest für Kruskal-Wallis-H-Test bezüglich der Fluoreszenz anti CD11bAPC von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen.
D.
Parameter CD15
Tabelle 35: Anschlusstest für Kruskal-Wallis-H-Test bezüglich der Fluoreszenz anti CD15-APC
von stimulierten und nicht stimulierten Ansätzen.
131
E.
Anamnese, eingehende zahnärztliche Untersuchung und parodontale Befunderhebung
Abbildung 54: Beispielhafter Florida-Probe Befund für Patienten mit Parodontitis und Diabetes
mellitus Typ 2.
132
Abbildung 55: Befundbogen für eingehende zahnärztliche Untersuchung.
133
Abbildung 56: Anamnesebogen Seite 1.
134
Abbildung 57: Anamnesebogen Seite 2.
135
Abbildung 58: Anamnesebogen Seite 3.
136
Abbildung 59: Befundbogen Mundhygiene Tag -14.
137
Abbildung 60: Befundbogen Mundhygiene und Anweisungen Blutentnahme Tag 0.
138
F.
Verwendete Geräte und Materialen
ADG-Lyse (Andergrub, Lot: 49)
Anti-human CD11b (eBioscience, Lot: E11648-1630)
Anti-human CD15 (BioLegend,Lot:B127387)
Anti-human CD45 (eBioscience, Lot: E13612-101)
Aqua dest.
Braunüle
Butterfly-Nadel 15G
Caseinlösung (steril filtriert)
CyAn™ ADP (Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland)
CytoCountTM (DakoCytomation, Glostrud/ Dänemark, Lot: 00046697)
Dextran 2 %
Dreiwegeventil
Einmal-Spritze 50 ml
Ethanol 70 %
Ficoll-Plaque Premium, (GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Schweden, Lot.:
10030512)
Florida Probe® (Florida Probe Corporation, Gainesville, FL/USA)
Hämatozytometer
Hamilton-Spritze 1µl (Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz/Schweiz)
Handspiegel
Infusionsschlauch
Isotypenkontrolle APC (eBiosciense, Lot: E10294-1630)
Isotypenkontrolle FITC (eBioscience, Lot: E1215153-1456)
Luor-Lock-Spritzen 5 ml
Mira-2-Tone® (Hager Werke GmbH & Co. KG, Duisburg, Deutschland)
Mundhygiene-Demo-Modell mit Zahnbürste, Zahnseide und Interdentalbürstchen
NaCl-Lösung 0,9 %
NaCl-Lösung 1,8 %
Natriumzitratlösung 4,3 %
Pale-Tim Schaumstoffpellets (Voco, Cuxhafen, Deutschland)
Periopaper (Ora Flow Inc., NY, USA, Lot. 6183)
Periopaper® (Vetter Laborbedarf, Ammerbuch, Deutschland, Lot. 6183)
Periotron 8000® (Vetter Laborbedarf, Ammerbuch, Deutschland)
Pipettenspitzen 10 µl, 100 µl, und 1000 µl (Eppendorf, Köln/Deutschland)
Polypropylen-Röhrchen 15 ml und 50 ml
S-Sedivette® (Sarstedt AG&Co, Deutschland)
139
Stoppuhr
Vortex (Vetter Laborbedarf, Ammerbruch/Deutschland)
zahnärztliche Watterollen
zahnärztliches Grundbesteck
140
14. Ehrenwörtliche Erklärung
„Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Alle
Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nichtveröffentlichten
Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen,
sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir durchgeführten und in der Dissertation erwähnten Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis, wie sie in der „Satzung der Justus-Liebig-Universität Gießen zur Sicherung guter
wissenschaftlicher Praxis“ niedergelegt sind, eingehalten sowie ethische, datenschutzrechtliche und tierschutzrechtliche Grundsätze befolgt. Ich versichere, dass Dritte von
mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten haben,
die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, oder habe
diese nachstehend spezifiziert. Die vorgelegte Arbeit wurde weder im Inland noch im
Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck
einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt. Alles aus anderen
Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt und indirekt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren. Mit der Überprüfung meiner Arbeit
durch eine Plagiatserkennungssoftware beziehungsweise ein internetbasiertes Softwareprogramm erkläre ich mich einverstanden.“
141
15. Danksagung
Ich danke Herrn Professor Dr. Jörg Meyle für die Überlassung des Dissertationsthemas und die gute Betreuung.
Ich danke der Landeszahnärztekammer Hessen für die Förderung dieser Arbeit.
Vielen Dank an Dr. Jens Martin Herrmann, Dr. Sabine Gröger und an meine lieben
Kollegen für die motivierende und gute Zusammenarbeit sowohl im Labor, als auch im
klinischen Bereich.
Bei meiner Familie möchte ich mich für ihre Unterstützung während des gesamten
Studiums und besonders während dieser Arbeit bedanken.
CHEMOTAXIS BEI DIABETIKERN MIT PARODONTITIS
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
STAUFENBERGRING 15
D-35396 GIESSEN
Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890
[email protected]
www.doktorverlag.de
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7 8 3 8 3 5
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Patienten mit Diabetes mellitus und Parodontitis
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INAUGURALDISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Zahnmedizin
des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen
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Thank you for your participation!

* Your assessment is very important for improving the work of artificial intelligence, which forms the content of this project

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