分解から眺める生命現象

ライフテクノロジーズ情報誌 NEXT 6 月号
2014 /June / No.25
NEXT Interview
分 解 から 眺 め る 生 命 現 象
一 つ ひとつ の 発 見 が 新 た な 科 学 を 作り出 す
水島 昇 氏（東京大学大学院医学系研究科教授）
P. 04
Bolt™ プレキャストゲル & 泳動槽
iBlot ® 2 ドライブロッティングシステム
iBind™ Western System
P. 06
Expi293™ Expression System
P. 07
Click-iT ® Plus OPP Alexa Fluor ® Protein Synthesis Assay Kits
P. 08
Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer
P. 10
Antibody Conjugate Purification kits
CellMask™ Green Plasma Membrane Stain
P. 11
EVOS ® FL Auto セルイメージングシステム
P. 12
Premo™ Cellular Redox Sensor
Premo™ Cellular hydrogen peroxide（ H2O2 ）Sensor
ReadyProbes ® Cell Viability Imaging Kit
P. 14
Ambion ® mMESSAGE mMACHINE ® Kit
GeneArt ® Genomic Cleavage Detection Kit
P. 16
SimpliAmp™ サーマルサイクラー ® 96-well 0.2mL
P. 18
Ion AmpliSeq™ Community パネル
Invitrogen™
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Applied Biosystems®
Gibco®
Molecular Probes®
Novex®
Ambion®
Ion Torrent™
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NEXT Interview
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02
分 解 から 眺 め る 生 命 現 象
一 つ ひとつ の 発 見 が 新 た な 科 学 を 作り出 す
水島 昇 氏 （東京大学大学院医学系研究科教授）
「生物の体の中では多くの合成系が盛んに働き、
オートファジー研究の広がり
いろいろなものがどんどん増えていくのに、なぜ体はそれほど大きくならないのか。
できたものがなくなる仕組みはどうなっているんだろう」。
オ ートファジ ー は 細 胞 内 の 分 解 機 構 の 一
そんな学部生時代からの疑問に水島氏が向き合ったのは 1997 年、
つであり、タンパク質やオルガネラをも分
内科医として大学病院で臨床と研究に取り組んでいた頃です。
生化学雑誌で読んだ論文をきっかけに、基礎生物学研究所の大隅良典氏の下で、
細胞内の大規模な分解機構「オートファジー（自食作用）」研究を開始します。
そして酵母において分解するものを包み込み
液胞に運ぶ膜（オートファゴソーム）に関する分子モデルを提唱しつつ、
哺乳類へも研究の幅を広げて多くのオートファジー遺伝子を同定しました。
解 することで 、常 に 細 胞 の 新 鮮 さを 保 つ
役 割 を 担って い ます 。例 えば 神 経 細 胞 で
は、オートファジーが細 胞 内に異 常タンパ
ク質の蓄積を防ぎ、神経変性を抑制してい
ると考 えられて います 。水 島 氏らは 、遺 伝
子 改 変 マウスなどを使 い 、オートファジー
が 新 生 児 期 に 代 表 さ れる飢 餓 適 応 、着 床
さらに全身のオートファゴソームが蛍光標識されたトランスジェニックマウスや
前 の 初 期 胚 発 生 、細 胞 内 浄 化 、神 経 変 性
オートファジー機能欠損マウスの作製を通して、
抑止、腫瘍発生抑制に重要であることを明
その生理的・病態生理的意義を世界に先駆けて報告し続けています。
らかにしました 。さらに共 同 研 究によって 、
オートファジーという現象を軸に分野横断的研究を展開し、
オ ートファジ ー が 細 胞 内 侵 入 細 菌 の 除 去
このシステムのさらに詳細な仕組みや病気との関連の解析を進める水島氏に
や 抗 原 提 示 などのさまざまな 免 疫 機 能に
お話を伺いました。
関わることを明らかにしました。2013 年に
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03
インタビュアー： ライフテクノロジーズサイエンスコミュニケーター 橋本裕子
図左
ミトコンドリアを取り囲もうとして
いるオートファゴソームの電子顕
微鏡像（撮影・岸千絵子）
図右
GFP-LC3 マウス（全身のオート
ファゴソームが緑色蛍光タンパク
質で標識されているマウス）の肝
臓。24 時間絶食後。白い輝点が
オートファゴソームを示す。
は 共 同 研 究 で 、神 経 変 性 疾 患 S E N D A の
偏 極 点にオ ートファジー 研 究 は 華 や か な
原因遺伝子として WDR45 が同定されま
研 究 の 表 舞 台に立 つ の です。今 では 毎 週
なる幅広い役割を担っている様です。
す。この 遺 伝 子 は 、オートファジー の 必 須
1 0 0 報 近くの 論 文を数える研 究にまで 成
自分にとって解くべき課題を
分 子で ある酵 母 A t g 1 8 のヒトホモログの
長しました。
「 研 究を始 めた頃 は予 想 もし
ゆっくりと見つけてほしい
ひとつ WIPI4 タンパク質をコードしていま
ませんでしたね。多くの論文を読まなけれ
す 。S E N D A は 、オートファジー 遺 伝 子 の
ばならな い 今 の 大 学 院 生 が 気 の 毒 です 」
これからの 科 学を担う研 究 者 へ の 水 島 氏
変異によって明らかなオートファジー機能
と水 島 氏は笑 い ながらコメントします。そ
からのコメントを最後に紹介します。
「やり
低下を示す初めてのヒト疾患であり、オー
ん な 彼にとって、オートファジー の 魅 力は
た い 分 野を早く決 めな い 方 が 良 いと思 い
トファジー の 異 常と神 経 変 性 疾 患 の 関 連
「 大 ら か で 、大 雑 把 な とこ ろ 。結 構 適 当
ます。なぜなら若 いうちは知らないことが
なところ」だそうです。もう一 つ の 細 胞 質
多いので、あまり早く決めてしまうと、後か
性を強く裏付けるものと考えられます。
オートファジーとの出会い
分 解システムであるユビキチン・プロテア
ら本当にやるべき分野が出てきたときに移
ソー ム 系 が 不 要になったタンパク質に目
りにくいから。私自身も、24 、5 才と30 才の
印をつけて厳 密に選 択 的に分 解するのに
頃では物の見方が違っていました。30 才ま
「 研 究を始 めた 頃 、オートファジーに関 わ
対し、オートファジーは、約 1µm の 領 域を
でに科 学 的 な 考 え 方 や 、問 題 点 や 課 題 の
る遺 伝 子 の 機 能 はまだ 分 からな いことば
基 本 的にランダムに包 み 込 ん でリソソー
見つけ方を学び、そして自分の残りの 35 年
かりでした 。しかし一 つ の 細 胞 の 中 で 完
ムに運 びます 。
「 オ ートファジーにも 選 択
に何をやるのかを決めるのがベストチョイ
結 することを やって み た いと思 い 、出 芽
性 が あることが 最 近 わかってきて います
スでは ? 」とアドバイスします。水 島 氏が若
酵 母 で 実 験 を 開 始した ん で す 」と水 島 氏 。 が、それでも『 非選択性 』にこそ、種を超え
い頃の直感でオートファジー研究と出会っ
1 9 6 3 年 にリソソー ム 研 究 の 過 程 で 発 見
て 保 存 されて いるオ ートファジ ー の 基 本
たのは、ちょうど 3 0 才 の 頃 。限られた外か
されたオートファジーは、1980 年後半、大
隅 氏が酵 母 の 液 胞 の 中で観 察したことを
的な秘密があると考えています」と水島氏。 らの情報だけで選ばず、自分の中からやり
た いことが 湧きでてくるまでじっくり待 つ
きっかけに研究が再稼働します。大隅氏の
もうしばらく、
研究室では、変異株を取得してゲノム情報
どこを目指すかを決めずにいたい
ことも大 事だと語ります。そうすれば誰も
手を付つけていない、科学の常識がまだ確
と照らし合わせながら、このシステムに不
立される前 の 未 知 の 世 界 へ 飛 び 込 むこと
可 欠 な 遺 伝 子 を 次 々と同 定し、分 子 生 物
「 私 の 研 究 はプロジェクト型 ではなくボト
が、自然にできるのかもしれません。
学 的 研 究 の 道を拓 い て いきます 。そ れで
ムアップ型であり、どこを目指すかは決め
も 当 時 、研 究 者 の 関 心 は 低く水 島 氏 は 次
ない方が良い気がしています。こんなふう
のように語ります。
「 関 連 する論 文を読 む
に言うと反対する人もいますが、目標を決
必要もなく、教科書に載っていないので勉
めると対象を狭めてしまいそうな気がしま
強することもなく、すべての真実を自分た
す」と水島氏。
「オートファジーがどんな分
ちで見つけに行く必要がありました。時に
野とつながるかは、本当に予測できません
は不安になりますが、同時にものすごく楽
でした。研 究を進める過 程で、神 経や免 疫
しむこともできました。なぜなら自分たち
や 発 生 など、思 い もかけ な い 分 野との つ
が出す一つひとつの結果が、そのまま新し
ながりが出てきたのです。もうしばらくは
い科学になっていくから」。
領 域を絞らず 、逆に分 野 横 断 的 な 横 軸 の
大学大学院博士課程修了、岡崎国立共同研究機構
その後水島氏を中心に哺乳類で研究が
広がりを大事にしていきたいと思っていま
基礎生物学研究所助手、東京都臨床医学総合研究
進 む に 従 い 、オ ートファジ ー が 多くの 生
す。ふらふらとやっていきたいですね」。特
物に共 通 のシステムで あるという認 識 が
別 な 生 体 反 応や 限 局した時 期や 場 所では
ムソン・ロイター「引用栄誉賞」
（ 2013 年）など多くの
広がっていきます。そして 2 0 0 6 年 前 後を
なく、オートファジー は生 命 現 象 の 根 幹と
受賞歴。
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水島 昇（みずしま のぼる）
1991 年東京医科歯科大学医学部卒業、1996 年同
所室長などを経て、2006 年東京医科歯科大学教授、
2012 年より現職。日本学術振興会賞（ 2008 年）やト
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Novex®
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ウェスタンブロッティングの膨大な作業量にフラスト レ
ウェスタンブロッティングにおける3 つのステップの時間や手間を減らせ、さらにデータ品質を改善する高性能なツールや技術をご紹介します。
WESTERN WORKFLOW Easy!
Western drama
STEP 1
Western done!
Separate
─ タンパク質の分離 ─
クリアで高品質な分離バンドが得られる
■ Bolt™ プレキャストゲル & 泳動槽
Slow western
STEP 2
Fast western!
Transfer
─ タンパク質の転写 ─
わずか 7 分で転写完了 !
■ iBlot ® 2 ドライブロッティングシステム
Western weary
STEP 3
Western wonderful!
Detect
─ タンパク質の検出 ─
抗体反応 & 洗浄ステップを自動化
■ iBind™ Western System
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Novex®
05
ト レーションを感じることはありませんか ?
Fast! Clear!
中性 pH 条件下で泳動するので、サンプルやゲルの劣化を防ぎ、高い分離能と安定でクリアなデー
タを提供します。さらにこのゲルは転写効率が高いので、ウェスタン解析で良好なバンドが検出で
きます。また Bolt™ 泳動槽は、使いやすさを追求し、サンプルアプライや泳動中のモニタリングが
簡便です。
●
ウェスタン解析に最適な高い分離能と転写効率
●
室温で 16 か月保存できる長期安定性
●
ゲルはくさび型ウェルを採用し、一般的なチップでもアプライしやすい
●
泳動槽はゲル 2 枚が横並びに配置され、アプライや泳動中のモニタリングが容易
Bolt™ プレキャストゲル & 泳動槽
製品名
サイズ
製品番号
価格
Bolt™ Welcome Pack A（ 4-12% 10well ）※
1 キット
B0412A
¥68,000
Bolt™ Welcome Pack B（ 4-12% 15well ）※
1 キット
B0412B
Bolt™ Welcome Pack + iBlot® 2 システム
1 キット
B0412AIB2
¥68,000
¥248,000
※ Bolt™ プレキャストゲル、Bolt™ 泳動槽、泳動バッファー、サンプル調製用試薬、タンパク質スタンダードのセットです。
転写バッファーを一切使わないユニークな“ドライ式”ブロッティング装置です。わずか 7 分でタンパ
ク質が転写できます。転写効率や均一性を損なうことなく、ウェスタンブロッティングに要する時間
と手間を大幅に削減します。
●
タンパク質転写は 7 分で完了
●
高い検出感度および再現性
●
転写バッファー不要、パワーサプライ不要
●
タッチスクリーンによる直感的で快適な操作性
iBlot ® 2 ドライブロッティングシステム
製品名
サイズ
製品番号
価格
iBlot ® 2 Gel Transfer Device
1台
IB21001
¥198,000
iBlot ® 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size
10 パック
IB23001
¥22,100
iBlot ® 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, mini size
10 パック
IB23002
¥17,400
iBlot ® 2 Transfer Stacks, PVDF, regular size
10 パック
IB24001
¥24,200
iBlot ® 2 Transfer Stacks, PVDF, mini size
10 パック
IB24002
¥19,000
ウェスタン解析のブロッキングから2 次抗体反応後の洗浄までのプロセスを自動化したシステムです。
電源を必要としないので、実験室のどこでも使え、全くの無音で反応が進みます。自動化 ・ ハンズフ
リーによる利便性に加え、さらにマニュアル法よりも良好なウェスタンデータが得られます。
●
すべての抗体反応および洗浄ステップを自動化
●
最初に溶液をセットしたら、あとは反応終了まで待つだけ（約 2.5 時間）
●
マニュアル法よりも高感度に検出し、S/N 比の高いクリアなウェスタンデータ
●
煩雑な作業から解放され、研究のための新たな時間を確保
iBind™ Western System
製品名
サイズ
製品番号
iBind™ Western Starter Kit ※
1 セット
SLF1000S
¥168,000
価格
iBind™ Western Device
1台
SLF1000
¥158,000
iBind™ Cards
10 枚 / 箱
SLF1010
¥17,000
iBind™ Solution Kit
1 キット（ 10 反応分）
SLF1020
¥8,000
※ iBind™ Device 、iBind™ Card 、iBInd™ Solution kit のセットです。
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Gibco®
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06
User's Voice
杉 山 暁 氏（ 東 京 大 学 アイソト ー プ 総 合 センタ ー R I 防 護・環 境 保 全 部 門 助 教 ）
抗体工学を駆使し、がん幹細胞を狙い撃つ
Expi293™ Expression System で抗体タンパク質を高発現へ
す。SA を scFvに付加した状態で体内に投
人体でより効果的に働く低分子抗体
scFv の分子設計を目指して
与後、抗がん剤を付加したビオチンを投与
あ たりで 1 0 m g ほどの 抗 体 が 分 泌 さ れ 、
2 0 0 ｍｌあ れば 結 晶 化 解 析に必 要 な 量 が
することでがん細胞を集中的に攻撃しよう
得られるそうです。現在テクニシャンと二
というものです」。ＳＡは放線菌由来のタン
人 で 研 究を進 めて いる杉 山 氏 。
「発現ベ
パク質であるため、体内で抗体が産生され
クターの構築には、便利な GeneArt ® 人
ますが、昨年杉山氏らは、低免疫原性化し
工遺伝子合成サービスも利用しています
たＳＡの開発に成功しました。また体内に
よ」。作業を最大限効率化させ最適な抗体
わずかに存在するビオチンとは反応しない
を絞り込んでいます。
SA の改変も進めています。
Expi293™ Expression System
結晶化解析とコンピューター
シミュレーションの併せ技で挑む
の一つ「がんの再発・転移を治療する多機
で大量かつ効率的な発現が可能に
発 現した抗 体タンパク質と抗 原との 親 和
能な分子設計抗体の実用化（中心研究者・
親 和 性 や 安 定 性 が 向 上 する抗 体 の 候 補
性を確認するとともに、抗体を精製し結晶
児玉龍彦）」として推進されてきた、がんに
は、共同研究先からのスーパーコンピュー
解析で抗原との反応を分子レベルで確認
最先端研究開発支援プログラム（ＦＩＲＳＴ）
対する抗体医薬開発。進行したがんは手術
ターのシミュレーション結果からも上がっ
することで、さらに新たな変異候補が出て
しても再発しやすく、また全身に転移する
て き ま す 。い くつ も の 候 補 を 検 証 す る
くることもあります。
「スーパーコンピュー
と手術もできなくなりますが、抗体医薬を
ため 抗 体 発 現 系 の 構 築 は 研 究 の 進 行に
ターによるシミュレーションで分子を設計
使えば副作用を抑え、進行がんを治療でき
大 きく影 響します 。そこで 採 用した の が
するアプローチと、私のように実際に抗体
ると期待されています。東京大学先端科学
哺 乳 類 細 胞 で の 一 過 性 タンパク質 の 高
タンパク質を発現させて結晶構造を解析
技術研究センターの杉山暁氏らのグルー
発現システム Expi293™ Expression
するという両 方 の アプロ ー チで 、分 子レ
プは、
ＦＩＲＳＴで得られた研究成果をもと
「 他 社 の 安 定 株 発 現 系 も 試し
System。
ベルでの抗体医薬の設計はより確実にな
に、ヒト化抗体や抗原への親和性を高めた
てみましたが、ライセンス料が高く、安 定
るはずです」と杉山氏。副作用が少なく治
低分子抗体 scFv の作製を通して抗体医薬
株を得るまでに時 間や手 間がかかりまし
療 効 果 の 高 い 抗 体 の 分 子 設 計に向 けて 、
への貢献を目指しています。
「私たちは、大
た。E x p i 2 9 3 ™ は簡 単に使え、数日で多
着々と研究が進められています。
腸がんの幹細胞に発現している抗原へ特
量のタンパク質が得られる点がいいです
異的に結合する scFv を目印として、抗が
ね。従来製品の FreeStyle™ と比べても、
Expi293™ Expression
Systemを使い、振とう培
ん剤をがん幹細胞に適切に届けるために、
細胞の生存率や抗体の発現量が大きく向
ストレプトアビジン（ＳＡ）とビオチンの強
上しています」。杉山氏がこれまで発現さ
の 細 胞 。培 養フラスコに
固な結合を利用する方法を検討していま
せた抗原や抗体は約 30 種類。培地 30ml
いる。
養でタンパク質を発現中
直 接 8%CO 2 を吸 入して
哺乳類細胞でのタンパク質高発現システム
■ Expi293™ Expression System
一過性タンパク質を高い効率で発現するための優れたシステムです。少ない培養量で、より多く
のタンパク質を回収できます。無血清培地＋浮遊培養系なので、精製やスケールアップも簡単。
FreeStyle™を改良し、従来の 2 ∼ 10 倍量のタンパク質発現を可能にしました。
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製品名
サイズ
製品番号
価格
Expi293™ Expression System Kit
1 キット
A14635
¥197,000
ExpiFectamine™ 293 Transfection Kit
1 培養分
A14524
¥92,000
Expi293™ Expression Medium
1000 ml
A1435101
¥26,000
Expi293F™ Cells
1 ml
A14527
¥55,000
Antibody-Expressing Positive Control Vector
1 バイアル（ 150µg ）
A14662
¥58,000
Opti-MEM ® I Reduced Serum Medium
100 ml
31985062
¥1,600
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Molecular Probes®
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培地交換や放射性物質なしで、新生タンパク質をイメージング !
■ Click-iT ® Plus OPP Alexa Fluor ® Protein Synthesis Assay Kits
NEW!
● 培地交換不要：メチオニンや血清を含む完全培地で使え、培地の除去は不要です。
● 非放射性：従来の 35Sメチオニン法のような放射性物質を使いません。
● in vivoで機能：in vivoのタンパク質翻訳を報告した論文があります。※1. Liu J et al.（2012）Proc Natl Acad Sci U S A. 109: 413-418
● マルチプレックス可能：温和な Click-iT ® Plus 技術を採用し、GFP など蛍光タンパク質のシグナルを同時検出。
このキットでは蛍光標識ファロイジンとも組み合わせられます。
［実験手順］
OPP ※ 2を添加
Click 反応で検出
※ 2: O-プロパルギル-ピューロマイシン。
新生タンパク質合成時、OPP が一部のタンパク質の C 末端に結合
ピューロマイシンのアルキンアナログ
▶ 既存の取り込み型手法の結果とも一致
HeLa 細胞を 30 分間 AHA（製品番号 C10102 ）、も
［A］
［B］
［C］
［D］
しくは OPP（ 製 品 番 号 C10459 ）でインキュベ ート。
その後、細胞を固定透過処理しました。
AHAとOPP の Click-iT ® 反応は、Alexa Fluor ®
488 Alkyne（製品番号 A10267 ）とAlexa Fluor ®
647picolyl azide（製品番号 C10456 ）を用いて行
いました。コネキシンは、抗コネキシン一次抗体（製
品 番 号 7 1 2 2 0 0 ）とヤ ギ抗ウサ ギ A lex a F l u o r ®
555 抗体（製品番号 A21429 ）を用いて検出しました。
［ A ］緑：Click-iT ® AHA Alexa Fluor ® 488 Azide protein synthesisを用いたタンパク質合成の検出
［ B ］赤：コネキシンの検出
［ C ］青：Click-iT ® OPP Alexa Fluor ® 647 picolyl azideを用いたタンパク質合成の検出
［ D ］重ね合わせ画像
▶
in vivo 新生タンパク質合成イメージングへの使用例
マウスにOPP を注射し、3 時間後に腸の組織を採取しました。
Tetramethylrhodamine（ TAMRA ）Azide（製品番号 T10182 ）を添加して Click-iT ® 反応を行い、タンパ
ク質合成を検出。Quant-iT™ OliGreen ® ssDNA Reagent（ 製品番号 O7582 ）を使用して、腸絨毛（緑蛍
光のシグナル）の個々の細胞を染色し強調しました。
これにより、腸絨毛の Basal Section（基部の切片）に、オレンジ蛍光シグナルが検出され、限定的にタンパク
質合成が起きていることが示されました。
製品名
サイズ
製品番号
価格
Click-iT ® Plus OPP Alexa Fluor® 488 Protein Synthesis Assay Kit
1 キット
C10456
¥90,000
Click-iT ® Plus OPP Alexa Fluor® 594 Protein Synthesis Assay Kit
1 キット
C10457
¥90,000
Click-iT ® Plus OPP Alexa Fluor® 647 Protein Synthesis Assay Kit
1 キット
C10458
¥90,000
OPP（ O-propargyl-puromycin）
5 mg
C10459
¥180,000
（注）OPPは高濃度ではタンパク質合成に影響するため、最終濃度 2∼20µMになるように培地に加えるようにマニュアルに記載しています。文献※ 1では25µMで阻害が示されています。
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Life Technologies™
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ユーザーと共に時間をかけて開発
新登場 ! 最先端フローサイトメーター
■ Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer
NEW!
［今までの機種とはここが違います ! ］
●
独自開発で使いやすいソフトウェア：ユーザーと共に開発した独自の優れたソフトウェアは直感的に操作でき、未経験者からベテランユーザーまで誰でも扱えます。
●
速やかな検出スピードを実現：データ精度を犠牲にせず、短い解析時間で測定できます。
（≧10 の 5 乗 cells/ml のサンプルで、10,000events を数秒で解析）
●
優れたモジュラーデザイン：1 ∼ 4 本のレーザーシステムをたった 1 日で現場でアップグレード。最大 14 色の蛍光検出。
●
ラボに適したコンパクト設計：実験ベンチにピッタリ収まるサイズ。限りあるラボのスペースを有効に使えます。
●
よりシンプルな流路系：フラットトップレーザーを採用し、より安定した光軸を実現します。
フローサイトメーターにおける細胞増殖測定を新しいステージで
Click-iT ® Plus EdU で簡単便利なマルチパラメーター測定
金井 拓哉（ライフテクノロジーズジャパン株式会社 テクニカルサポート）
［要旨］
［使用キット］
Jurkat 細胞を用い、新しい細胞増殖測定キットClick-iT ® Plus EdUと従来
の Click-iT ® EdU を比較しました。その結果、新しいキットは従来品と同等以上
に新生 DNA を検出し、優れた多重染色が行えました。また操作ステップに要す
る時間は、従来品と変わらず、
トータル 1 ∼ 2 時間ほどで済みましたが、Attune ®
Acoustic Focusing Cytometerでデータを比較したところ、新しいキットは
従来品よりも解像度が高いことがわかりました。Click-iT ® Plusシリーズは従
来よりも穏やかな条件下でクリック反応を行うので、これまでは難しかった GFP
や PE などの蛍光タンパク質とも併用できます。
［背景］
●
Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor ® 488 Flow Cytometry Assay Kit
（ NEW・新製品、製品番号 C10632 ）
Click-iT ® EdU Alexa Fluor ® 488 Flow Cytometry Assay Kit
（ Classic・従来品、製品番号 C10425 ）
●
［細胞および EdU の取り込み］
●
Jurkat 細胞へ EdUをfinal10µM で添加し、37 ℃5%CO 2 環境下で 90 分
インキュベーション
［実験操作］
これまで細胞増殖測定（ S 期細胞の同定）には、核酸誘導体として BrdU を使用
●
操作は全て製品プロトコルに準じて実施
するケースが一般的でしたが、DNAに取り込まれた BrdU の検出には抗体を使
●
固定処理前に PE 標識抗 CD3 抗体（製品番号 MHCD0304 ）で表面抗原を
用するため、事前に厳しい条件下で DNA を変性ステップする必要がありました。
検出
これに対して、EdUという核酸誘導体を使うと、検出はマイルドなクリック反応
●
細胞周期解析には FxCycle™ Violet Stain（製品番号 F10347 ）を使用
を介して低分子化合物で行うので、変性ステップは不要です（下図参照）。高次
●
データはすべて Attune ® Acoustic Focusing Cytometer（ Violet/
構造を保持したままで検出できるので、組織染色にも適しています。
Blue laser type ）で測定
▶ BrdU 法とクリック反応を用いた EdU 法の比較
従来の BrdU 法
Anti-Brdu antibody
EdU 法
Inaccessible
without
denaturation
Click-iT Plus EdU（ New ）& Click-iT EdU（ Classic ）
Time
細胞へ EdUを添加
1∼2hour
細胞を回収
5min
細胞表面抗原の検出（必要に応じて）
15∼30min
Click-iT ® Fixativeで細胞を固定処理
15min
Click-iTTM AlexaFluor® azide
Accessible
®
Incorporated BrdU
Incorported Edu
BrdU 法は抗体で検出するので、サンプルを塩酸や加熱処理する必要があり、操作が煩雑でデータ解
像度も低いという問題点がありました。クリックケミストリに基づくEdU 法は、DNA 鎖に取り込まれた
チミジンアナログの EdUに蛍光色素を特異標識するので、煩雑な処理も必要なく、高解像度のデータ
を取得できます。
Click-iT permeabilization bufferで細胞膜を透過処理
15min
Click-iT ® 検出反応※
30min
細胞内・表面抗原の検出（必要に応じて）
15∼30min
細胞周期解析用蛍光試薬での染色（必要に応じて）
15∼30min
Total
3∼4.5hour
各ステップ間に洗浄操作が必要です。※ Click-iT ® 検出反応用カクテルの調製ステップも同じです。
（混合する試薬の種類は異なりますが、量は変わりません）
Technical Review
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Life Technologies™
▶ 音響技術を利用して、正確・迅速に測定 !
音響技術を利用して超音波で細胞をキャピラリーの中心軸に一列に整列させる独自の技術
アコースティック
フォーカシング＝OFF
を採用しています（右図参照）。
サンプルスピードに関係なく、レーザー照射の時点で細胞をきちんと集束させることができ
アコースティック
フォーカシング＝ON
サンプルは
サンプルは
フォーカスされません。
フォーカスされます。
るので、かつてない高いフローレートで高精度の解析を可能にします。
製品名
製品番号
価格
Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer Blue Laser
A24864
お問い合わせ
Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer Blue / Red Lasers
A24863
お問い合わせ
Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer Blue / Violet Lasers
A24862
お問い合わせ
Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer Blue / Yellow Lasers
A24861
お問い合わせ
Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer Blue / Red / Violet Lasers
A24860
お問い合わせ
Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer Blue / Violet / Yellow Lasers
A24859
お問い合わせ
Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer Blue / Red / Violet / Yellow Lasers
A24858
お問い合わせ
［結果と考察］
Jurkat 細 胞 へ 実 験 方 法 の 通りに EdU を取り込ませて
回 収 後 、 PE 標 識 抗 CD3 抗 体で表 面 抗 原を標 識しまし
シグナル分離が向上
た。次に Click-iT ® Fixative で細胞を固定後、Click-
iT ® permeabilization buffer で細胞膜を透過処理
し、そ れぞ れの EdU キットでクリック反 応を行 いました。
さらに細胞周期解析試薬 FxCycle™ Violet Stain で
細胞内のすべての DNA を染色し、Attune ® Acoustic
Focusing Cytometer（ Violet / Blue laser type ）
で 測 定しました（ 図 1 ）。細 胞 周 期 解 析 用 の 蛍 光 試 薬
FxCycle™ Violet Stain のシグナルは、細胞の DNA
含量に比例するので、細胞周期のどのステージに細胞が
いるかを示します（図 2 参照）。図 1 の結果より、 Click-
iT ® Plus EdU（緑色）は Click-iT ® EdU （紫色）に比
図 1 EdUとFxCycle Violet のマルチプレックス解析
X 軸は細胞周期ステージ、Y 軸は新生 DNA 合成量を示します。デー
タの組み合わせから、G1/G0 期、S 期、G2/M 期の細胞を同定でき
ます。FxCycle™ Violet Stain のシグナルは、細胞あたりの DNA
含量を反映しています（図 2 参照）。緑はClick-iT ® Plus EdU 、紫
はClick-iT ® EdU 。
図 2 細胞周期と解析試薬の蛍光量の関係
細 胞は、分 裂 前に DNA 複 製を行 い 、DNA 量が 2 倍にな
ります（ 2N → 4N ）。DNA と選択的に結合する蛍光色素
（ FxCycle™ Violet Stain ）でラベ ルすると、細 胞 の
DNA 量から細胞周期のステージが分かります。
べてシグナル分離が優れていることがわかりました。
次 に 2 つ の E d U キット の E d U – A l e x a F l u o r ®
4 8 8 a z i d e 由 来 の シグ ナ ル に 対 する細 胞 数 をカウン
トしたところ（ 図 3 ）、C l i c k - i T ® P l u s E d U では 4 6 % 、
Click-iT ® EdU では 36%となり、新生 DNA 合成が行わ
れた細胞集団（ S 期細胞集団）の割合は 36 ∼ 46%という
結 果が得られました。最 後に、PE 標 識 抗 CD3 抗 体で細
胞表面の CD3 を検出した結果を図 4 に示します。ClickiT ® Plus EdU では Click 反応前に PE 標識抗体を添加
緑は Click-iT ® Plus EdU 、紫は Click-iT ® EdU 、黄色は
緑はClick-iT ® Plus EdU 、紫はClick-iT ® EdU 、黄色はClick
してもデータに影響せず、多重染色が行えることが示さ
Click 反応を行っていないサンプル（ No Azide ）を示します。
反応を行っていないサンプル（ No Azide ）を示します。
図 3 EdU – Alexa Fluor ® 488azide 由来シグナルの比較
図 4 PE 標識抗 CD3 抗体による検出
れました。これによりClick-iT ® Plus は PE 標識抗体と
も併用できることがわかりました。
なおフローサイトメトリー用 Click-iT ® Plus EdU キッ
トには Alexa Fluor 488 以 外にも、レッドレー ザ ー 励
起の Alexa Fluor 647 やバイオレットレーザー励起の
Pacific Blue があり、GFP や PE などの蛍光色素と柔軟
［まとめ］
●
Click-iT ® Plus EdU キットは従来の Click-iT ® EdU キットと同等以上の性能
●
両キットは操作ステップ、所要時間も同じなので、これまでの実験系を変えずに使用可能
●
Click-iT ® Plus EdU キットは、PEや PEタンデム、GFP などと併用でき、
マルチプレックス解析により便利
に組合わせて様々なアプリケーションに使えます。
製品名
サイズ
製品番号
価格
Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor® 488 Flow Cytometry Assay Kit（ 50アッセイ）
1 キット
C10632
¥85,000
Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor® 647 Flow Cytometry Assay Kit（ 50アッセイ）
1 キット
C10634
¥85,000
Click-iT ® Plus EdU Pacific Blue™ Flow Cytometry Assay Kit（ 50アッセイ）
1 キット
C10636
¥85,000
CD3 Mouse Anti-Human mAb, PE conjugate
0.5 ml
MHCD0304
¥39,000
FxCycle™ Violet Stain
1 キット
F10347
¥60.000
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Molecular Probes®
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蛍光ラベル後の抗体やタンパク質の精製を簡便化 !
■ Antibody Conjugate Purification kits
NEW!
抗体やタンパク質をラベル後、未反応の蛍光標識物を効率的に除去します。Molecular
Probes ® の様々な蛍光物質のラベリング後に使用する上で最適なツールです。量に合わ
せてお選びください。
●
簡便 & 迅速
ハンズオンタイム：5 分（ 20-50µg 用）、または 15 分（ 50-100µg 、0.5-1mg ）以下
トータルの作業時間：10 分（ 20-50µg 用）、または∼ 45 分（ 50-100µg 、0.5-1mg ）
●
Alexa Fluor ® などの低分子量色素の除去に最適です。
※酵素（ HRP ）や蛍光タンパク（ R-phycoerythrin ）など高分子量タンパク質（＞8 kDa ）の除去には使用できません。
製品名
サイズ
製品番号
価格
Antibody Conjugate Purification Kit for 0.5-1 mg（ 3 回分）
1 キット
A33086
¥27,000
Antibody Conjugate Purification Kit for 50-100 µg（ 5 回分）
1 キット
A33088
¥27,000
Antibody Conjugate Purification Kit for 20-50 µg（ 3 回分）
1 キット
A33087
¥27,000
Alexa Fluor ® 488 carboxylic acid（標識レファレンススタンダード用）
5 mg
A33077
¥41,000
Alexa Fluor ® 546 carboxylic acid（標識レファレンススタンダード用）
5 mg
A33079
¥41,000
Alexa Fluor ® 555 carboxylic acid（標識レファレンススタンダード用）
5 mg
A33080
¥41,000
Alexa Fluor ® 647 carboxylic acid（標識レファレンススタンダード用）
5 mg
A33084
¥41,000
ラベリング効率の確認用 スタンダードも新発売 !
®
※ Molecular Probes では、その他多くの色素についてサクシニジミルエステルやスタンダードを取りそろえています。さらにAlexaやPasific Blueなどの色素には最適化済みのキット品もあります。
一覧はこちらからwww.lifetechnologies.com/LCST
原形質膜を染色し、細胞形態を鮮明に !
■ CellMask™ Green Plasma Membrane Stain
NEW!
生きたままの細胞形態を観察するための染色試薬です。
顕微鏡観察やハイコンテンツスクリーニングに適しています。
［特長］
● 原形質膜での染色保持時間が長い
● 生細胞で使用可能
※
● ハイコンテンツスクリーニングや顕微鏡観察で多くの実績
※固定できますが、浸透処理はできません
Deep Red
Orange
新色 Greenが出ました!
細胞膜の染色に脂溶性色素を使うと、急速にインターナライズされ、細胞内に取
つ親水性の色素と、膜へのローディングに優れた脂溶性の両方を含む両親媒性
り込まれます。また標識レクチンは、細胞表面の糖に依存して染色するので、細
分子であるため、より長時間にわたって細胞膜を染色できます。そのため顕微鏡
胞タイプで異なる可能性があり、一貫性が欠ける場合があります。これに対して、
観察や、ハイコンテンツスクリーニングなどでの細胞形態認識が必要な実験で有
CellMask™ シリーズは、原形質膜中のプローブに親和性がある負の電荷を持
用です。
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製品名
サイズ
製品番号
価格
CellMask™ Green plasma membrane stain
100 µl
C37608
¥24,000
CellMask™ Orange plasma membrane stain
100 µl
C10045
¥24,000
CellMask™ Deep Red plasma membrane stain
100 µl
C10046
¥24,000
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Life Technologies™
User's Voice
関 根 秀 一 氏（東京女子医科大学
先端生命医科学研究所 講師）
細胞シートから血管付き三次元組織の作製を目指して
再生医療研究を支える EVOS ® FL Auto セルイメージングシステムの多彩な機能
で臓器の補助的な機能を担っていた細胞
勝 手をコメントします。さらに今 後は、灌
シートが、この 方 法を用 い れば 1 2 層まで
流培養による組織の経時変化を解析する
積 層でき、より機 能 的 な 心 筋 組 織を作 製
ため、搭載されている多点タイムラプス機
することができました。
能も使っていきたいとのこと。EVOS ® FL
EVOS ® FL Auto システムで
内の再現にむけた研究が順調に進められ
広い視野や狭い視野も自在に観察
ていくようです。
Auto システムの機能をフル活用し、生体
灌流培養バイオリアクターで
血管付き三次元心筋組織を作製
関 根 氏 の 研 究 で 欠 か せ な い の は 、細 胞
一つひとつの観察だけでなく、組織が生成
体内環境の再現に目標を定める
していく過程を広い視野で観察する機能。
今回開発したバイオリアクターによる灌流
細 胞を層 状に培 養し、患 者 の 様々な組 織
「組織全体を撮影する際、これまでは目測
培養装置は、心筋組織のモデルとしてより
へ の 移 植を目 指 す 細 胞シート。これまで
で 何 枚 も 撮 影し、手 作 業 で 画 像どうしの
再現性の高い薬剤のスクリーニングを可
シートを多 層 化していくと酸 素や 栄 養が
境 界を照らし合わせながら貼り合 せるな
能にします。すでにこの方法で iPS 細胞を
細胞に行き渡らなくなり、細胞が死滅して
ど、手 間をかけていました。また 1 倍 のレ
使った研究も進められているとのこと。腎
しまうという課題を抱えていました。東京
ンズで広 い 視 野を撮 影することもありま
臓や肝 臓 、あるいは皮 膚 組 織 へも応 用を
女 子 医 科 大 学 の 関 根 秀 一 氏らのグ ル ー
したが、解 像 度が低 下し、見にくいという
進めたい、と熱意を語る関根氏。
「灌流培
プは、昨 年 新たに組 織に毛 細 血 管を張り
問題もありました。昨年の 9 月に購入した
養の条件を最適化することでより適切な
巡らせ 、多 層 化した細 胞 全 体に栄 養や 酸
EVOS ® FL Autoシステムには、広い部分
量の酸素や栄養を届けることができ、さら
素を供 給することでより厚 い 心 筋 組 織を
を自動 的につないで撮 影できるタイリン
なる多層化も実現可能です。体内環境を
作 ることに 成 功 。この 組 織 を ラット生 体
グ機 能が内 蔵されていて、大 変 助 かって
いかにして再現するか試行錯誤の毎日で
へ 移 植 すると、そ の 機 能を保ったまま生
います」と語る関 根 氏 。もともとクリーン
すが、研 究を進めていく原 動 力は実 際 の
着することを確 認しました。
「まず大 腿 動
ベンチの中で細胞をカウントするという機
人 体 の 環 境に近 づけた、と感じた時 の 喜
静 脈を含 む 筋 組 織を成 形 することで、血
能で他の EVOS ® システムを検討しました
び」と関根氏。様々な臓器そのものの再生
管新生の場となる血管床を作製しました。
が、カタログを見ていくうちにタイリング
技術が少しずつ、着実に現実味を帯びてき
そして、新たに開発したバイオリアクター
ができる EVOS ® FL Auto システムに興
ているようです。
で血管新生因子を添加しながら血管床を
味が移っていきました。
「タイリングだけ
灌流培養し、血管の成長を促します。さら
でなく、タッチパネル操作で直感的に指で
に 血 管 床 の 上 に 血 管 内 皮 細 胞と心 筋 細
視野を移動させることができ、大変便利で
胞を共 培 養させた細 胞シートを積 層して
すね。また明 視 野 の 撮 影に便 利なカラー
いくと、3 日後に血管内皮細胞から新生し
カメラだけでなく、蛍光観察に適したモノ
た 血 管と、血 管 床 の 血 管とがつ ながるこ
クロカメラを搭載しているという点も魅力
とが確認できたんです」と関根氏。これま
®
です」とEVOS FL Autoシステムの使い
（写真左）ブタ心臓の切片をEVOS ® FL Autoシステムで撮影
し、56 枚をタイリングした画像
（写真右）バイオリアクターによる灌流培養装置
オールインワン次世代イメージングシステム
■ EVOS ® FL Auto セルイメージングシステム
主な機能
●
画像貼り合わせ ● 多点タイムラプス ● Z- Stack ● オートフォーカス機能
●
モノクロとデジタルカメラ両方搭載 ● 96 、384 ウェルプレート全ウェルスキャン
▶ [ 組み合わせ例 ] 下記は一部の例です。多数のアクセサリーからカスタマイズ可能
製品名
対物レンズ
Light Cube
EVOS ® FL Auto System
4×Ph, 10×Fl, 20×Fl, 40×Fl
GFP, RFP, DAPI
メカニカル XYステージ
電動
カメラ
デュアル カラー & モノクロ
価格
¥6,800,000
※ EVOS ® シリーズは全部で 5 種類です。デモ依頼はこちらまで → www.lifetechnologies.com/evos
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Molecular Probes®
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グルタチオン酸化還元電位、過酸化水素の変化を高感度に検出
■ Premo™ Cellular Redox Sensor
■ Premo™ Cellular hydrogen peroxide（ H 2 O 2 ）Sensor
NEW!
生細胞中の細胞内グルタチオン濃度や、過酸化水素濃度の変化を
● 刺激に迅速に応答し、応答は可逆的
測定する試薬です。細胞内での濃度上昇に応じて、蛍光の励起波
● フィルターが合えば、他の蛍光色素とも同時測定可能
長が変化します。検出は、405nmと488nm で励起し、515nm の
● 培地中の細胞に加え一晩インキュベートするだけで、
値を読み取り、その比率を測定します。
すぐに使えます。
H 2O 2
roGFP は Or1（またはFrx-1 ）とはタンデム結合でつながっており、
BacMam technology を用いて細胞内で発現します。
H 2O 2によってOrp1を介してroGFPが酸化されると
roGFP の励起波長が変化します。
図 2. Premo™ Cellular hydrogen peroxide
図 1.Premo™ Cellular hydrogen peroxide（ H 2 O 2 ）Sensor の原理
Orp1 は、H 2 O 2 感受性の酵母タンパク質です。H 2 O 2と反応して、ジスルフィドを形成し、ジスルフィド交換によって他の酸化還元タンパク質
（ H 2 O 2 ）SensorによるH 2 O 2 の検出
へシグナルを伝達する能力があります。Orp1 の H 2 O 2 選択特性とroGFP を組み合わせることによって、Premo™ Cellular hydrogen
Premo Cellular Hydrogen Peroxide（ H 2O 2）Sensorを導入
peroxide（ H 2O 2）Sensorは、細胞中の H 2O 2を選択的に定量します。Premo™ Cellular Redox Sensor, Grx-1-roGFPはグルタチオン
に特異的に反応し、上記と同様の機構でroGFP の蛍光励起波長が変化します。
したHeLa 細胞に、25µMメナジオンを添加後、共焦点顕微鏡で 15
秒ごとに画像を取得し、蛍光強度比を算出しました。
製品名
サイズ
製品番号
価格
Premo™ Cellular Redox Sensor, Grx-1-roGFP（グルタチオン酸化還元電位センサー）
5 ml
P36242
¥73,000
Premo™ Cellular hydrogen peroxide（ H 2O 2）Sensor, Orp1-roGFP（過酸化水素センサー）
5 ml
P36243
¥73,000
室温保存ですぐ使える便利な細胞生死判別キット
■ ReadyProbes ® Cell Viability Imaging Kit
ドロッパーボトルで滴下するだけで、すぐに細胞の生死を判別できます。
しかも室温保存なので実験台の上や培養室などに保管可能。
希釈、秤量、ピペット操作などの作業が不要になります。
［特長］
● ドロッパーボトルで試薬を滴下するだけの簡単操作
● 室温保存 OK
● 実験の手間を削減
簡単便利な ReadyProbes ®シリーズは他に核染色や Alexa 二次抗体など、全部で 23 種類。
効率よく実験を進めたい場合に最適です。
詳しくは、www.lifetechnologies.com/readyprobes
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製品名
サイズ
製品番号
価格
ReadyProbes ® Cell Viability Imaging Kit（ Blue/Green ）
1 キット
R37609
¥28,000
ReadyProbes ® Cell Viability Imaging Kit（ Blue/Red ）
1 キット
R37610
¥28,000
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Invitrogen™
Leading Edge Topic
エキソソームへの工学的アプローチから
斬新な DDS バイオナノトランスポーター開発へ
秋 吉 一 成 氏（京都大学大学院工学研究科高分子化学専攻 教授）、澤田晋一 氏（助教）、下田麻子 氏（研究員）
学的に改変してその機能を調べようとして
います」と共同研究者の澤田晋一氏（写真
中央）は説明します。
エキソソームにナノゲルや
リポソームをハイブリッドする
一方、がんワクチンのキャリアとしてすで
に臨床試験の段階にあるのが、前述のナノ
ゲルです。ナノゲルは 20 ∼ 30 ナノメートル
ています。秋吉氏は「がんの免疫療法にも
の微小なゲルですが、内部に入れたタンパ
学的な手法で新規バイオマテリアルを開
エキソソームを活用できるのでは」と考え、
ク質の構造を保ったままにできる分子シャ
発 する京 都 大 学 の 秋 吉 一 成 氏（ 写 真 左 ）。
三重大学教授の珠玖洋氏と共同研究を推
ペロン機能を持つほか、表面に抗体を付加
体 内 の 狙った場 所に薬を届ける DDS（ド
進中です。エキソソームに特別なタンパク
したり、これらを組み合わせて自在にシー
ラッグ・デリバリー・システム）のキャリアと
質を組み入れるなどして、がんワクチンと
トやチューブなどにしたりすることもでき
して、ナノゲル（ナノサイズのゲル微粒子）
しての活用を目指しています。しかしエキ
ます。
「エキソソームの機能を人工的に改
を開発し、2011 年から JST 戦略創造研究
ソソームの 研 究を開 始した 2 0 1 1 年 当 時 、
変して使いたい。ナノゲルとエキソソーム
「秋吉バイオナノトラ
推進事業（ ERATO ）
単 離 方 法 は 確 立 されて おらず 、
「最初の
をハイブリッドにすれば、さらに使いやすく
ンスポータープロジェクト」を開始しました。
1 年間は、いくつもの方法を試してみまし
なりそう」と秋吉氏。例えばエキソソームだ
このプロジェクトでは、壊れやすく血中で
た」と秋吉氏。エキソソームの研究を担当
けでは細胞内に入らない場合でも、その表
存在できない RNA を運ぶ生体内キャリア
している研究員の下田麻子氏（写真右）は、
面をナノゲルで覆うことで表面がカチオン
である、
「エキソソーム」を工学的に加工し
「 培 養 上 清など量が多 いときは超 遠 心 法 、
性になり入りやすくなります。同様にバイ
血液など少量の時は試薬キットを使うなど、
オナノトランスポーターとして開発を進め
生体機能の巧妙な仕組みに啓発され、工
て核酸医薬の有望なキャリアとして臨床に
今は単離方法を使い分けています。キット
るプロテオリポソームについても、
「無細
は最 初 のスクリーニングなどに便 利です
胞タンパク質合成系で膜タンパク質を発
生体内の核酸キャリアとして働く
ね」とコメントします。まだ不明な点が多い
現させ、リポソームに直接組み込む方法を
エキソソームに注目
エキソソームの機能解析も、工学的な手法
確立しています。これを利用して、さまざま
でアプローチしています。
「遺伝子組換え
な膜タンパク質を組み込んだ人工エキソ
細 胞 から 分 泌 さ れ る エ キ ソソ ー ム は 、
でエキソソームの膜タンパク質などを改変
ソーム作製へつなげたい」と語ります。バ
miRNA や mRNA 、タンパク質を内包して
して機能を調べても、細胞が作り出すもの
イオ医薬の実用化を大きく後押しするキャ
他の細胞へ運ぶ細胞間コミュニケーション
なので安 定 せずなかなかうまくいきませ
リアの確立に向けて、研究が着々と進んで
を司る小胞であり、近年大きな注目を集め
ん 。そこで私 達は例えば膜 そ のものを工
います。
つなげることが重要な柱となっています。
ご存 知 で す か ? エ キソソー ム 解 析 のため の エ キ スパ ート試 薬
■ Total Exosome Isolation シリーズ
超遠心法と同等のインタクトなエキソソームが短時間で回収できる試薬キットです。細胞培養上清、血清、
血漿、尿、その他体液（脳脊髄液、腹水、羊水、母乳、唾液）と幅広いサンプルに対応する回収試薬の他、エ
キソソームRNA やタンパク質の精製試薬、またエキソソームの蛍光標識試薬も取り揃えています。
製品ラインナップ、詳細はこちらから。→ www.lifetechnologies.com/exosome-jp
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Ambion®
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生物種を選ばず、ゲノム上の任意の遺伝子に変異を生じさせる注目
ゲノム編集をぐっと身近に
のゲノム編 集 。現 在 の 主 要ツー ルは TAL エフェクターヌクレアーゼ
（ TALENs ）とCRISPR/Cas9 システム。実験ワークフローはいずれ
も標的部位の選択からスタートします。標的部位に対してカスタマイズ
実験ワークフローのキーステップに
高性能で、簡便なツールを使おう!
ゲノム編集ワークフロー
された TALENs または CRISPR/Cas9 発現ベクターをプラスミド調
製し、細胞へ導入します。または in vitro 転写で調製した mRNA を導
標的部位の選択
クローニング
プラスミド調製
■ Ambion ® mMESSAGE mMACHINE ® Kit
ゲノム編集実験で、TALENs や CRISPR/Cas9を mRNA で導入する場合に最適です。
●
最大 80% のキャッピング効率 ● マイクロインジェクション、in vitro 翻訳、
トランスフェクションに最適
●
キャップ構造を持つ RNA を大量に合成可能 ● 最適な比率に混合済みのキャップアナログとヌクレオチド
●
RNase 阻害剤の SUPERase ・ In™ 、DNase I 、ポジティブコントロールが全て入ったキット
製品名
サイズ
製品番号
価格
mMESSAGE mMACHINE® T7 ULTRA Kit ※1
10 反応
AM1345
¥82,000
mMESSAGE mMACHINE® T7 Kit
25 反応
AM1344
¥82,000
mMESSAGE mMACHINE® T3 Kit
25 反応
AM1348
¥82,000
mMESSAGE mMACHINE® SP6 Kit
25 反応
AM1340
¥82,000
Poly（ A ）Tailing Kit
25 反応
AM1350
¥33,500
※ 1 T7 ULTRA Kit（ AM1345 ）には、Poly（ A ）Tailing Kit（ AM1350 ）が含まれています。
杉 拓 磨 氏（ 京 都 大 学 物 質 – 細 胞 統 合 システム 拠 点
さきが け 研 究 者 ）
線虫を使い、ゲノム編集で記憶のメカニズム解明に挑む
mRNA 注入でターゲット遺伝子の改変を自在に
た。しかしいずれもランダムに遺伝子変異を
杉拓磨氏。記憶の保持は遺伝子発現の変化
起こさせてから目的の変異体を探すという
けでなく、TAL エフェクターを活用してエピ
に依存しているという仮説に基づき、記憶に
アプローチのため、作業が膨大になるという
ジェネティックな修飾も試したいですね。細
関わるとされる10 対ほどの神経細胞での遺
難点があります。一方、ゲノム編集を活用す
胞 系 譜 が 解 明 された 線 虫 でゲノム 編 集 を
伝子発現を解析しています。杉氏は 2013 年
れば、例えばプラスミド状 態 の TALENs か
使えば、たった一つの神経細胞の、たった一
3 月頃からTALENs を活用し、記憶に関わる
ら mRNA を作り、成虫の生殖腺にインジェ
つの遺伝子座の発現制御ができるはず」と
遺伝子の開始コドンを飛ばしたり、プロモー
クションすることで、F1 世 代で目 的 の 変 異
今後の展開を語ります。線虫では、あらかじ
ターに変異を導入したりして目的の遺伝子
体を素早く得られます。
「生まれた個体の 5
め振動という恐怖の記憶を与えるトレーニ
発現を変化させ、その影響を観察していま
∼ 10 ％はヘテロの変異を持っています。十
ングを施し、そ の 記 憶 の 保 持 状 態を調 べて
す。
「他の生物に比べ、線虫は一世代のライ
分 な 効 率 で す ね 」と杉 氏 。m R N A 合 成 は
います 。
「 記 憶 のメカニ ズムが 分 子レベ ル
®
®
フサイクルが圧倒的に短く、究極のモデル生
Ambion の mMESSAGE mMACHINE
物と言えます。ゲノム編集を活用することで
Kit 、続くポリA の付加は Poly（ A ） Tailing
研究の幅がさらに広がりました。変異体を自
Kit 、RNA 精製には MEGAclear™ Kit を
あたかも記憶を保持しているかのような状
在に得られるようになったので、特定の遺伝
使っています。
「それぞれのキットのマニュア
態を創り出 せるかもしれな い 」と続 けます。
子の機能を迅速に調べられます」と語ります。
ルが他を意識して書かれていて一緒に使う
と便利です」とコメントします。
エピジェネティックな改変にも挑みたい
記憶のトレーニングをしていない個体でも、
「 線 虫というわ ず か 体 長 1 ミリの 生 き 物 が
示す記憶の実体をとらえ、その結果を記憶
会に還 元したい 」。杉 氏は小さな 線 虫 研 究
から大きな目的へ向かって確実に進んでい
線虫では、変異原の薬剤を使うなど、これま
でもいくつか遺伝子改変の方法がありまし
で 明らかにな れば 、ゲノム編 集を活 用して
異常が関わる疾患解明に役立てることで社
ゲノム編集で線虫の変異体作製が容易に
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（ V P 6 4 ）による内 在 性 遺 伝 子 の 活 性 化 だ
線虫を使い、記憶のメカニズムを研究中の
「遺伝子のノックアウトや TALE-Activator
ます。
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Invitrogen™
入する方法もあります ※ 1 。この方法では、ゲノム編集ツールが翻訳後に
短時間で効果を発揮することや、発現ベクターにおける最適プロモー
タ選択の手間が省けるので、一部の細胞や受精卵で利用されます。そ
酵素と電気泳動による確認法が簡便です。今回は、ゲノム編集のワー
クフローのキーステップとなる「遺伝子導入（ mRNA による導入）」と
「変異導入の評価」に簡便で高性能な 2 つの製品をご紹介します。
してゲノム編集の後半ステップでは変異導入を評価します。シーケン
※ 1 CRISPR/Cas9システムの場合にはCas9 mRNAをguide RNAと共導入します。
ス確認や定量 PCR やウェスタンによる発現解析など目的に応じた方法
▶ ゲノム編集の原理やツールの情報はこちらから。
www.lifetechnologies.com/GenomeEditors
がありますが、最初に多くのサンプルを調べるにはミスマッチ認識切断
（ Option ）mRNA 調製
遺伝子導入
変異導入の評価
■ GeneArt ® Genomic Cleavage Detection Kit
TALENs や、CRISPR/Cas9 によるDNA 二本鎖切断に続いて起こる
塩基の欠失 / 挿入の成功を評価する簡便で信頼性の高いツールです。
変異（塩基の挿入や欠失がおこった箇所）
●
ゲノム DNA,PCR 産物の精製不要
●
コントロール付きでデータの高い信頼性を確認
ミスマッチ
変性＆再アニーリング
①
ミスマッチ認識酵素が切断
製品名
サイズ
②
①変異なし
②変異あり
電気泳動
製品番号
価格
GeneArt ® Genomic Cleavage Detection Kit
20 反応
A24372
¥42,000
Cell lysis buffer,AmpliTaq Gold® 360 Master Mix,Cotrol Template & Primers,Protein Degrader,10×Detection Reaction Buffer,Detection Enzyme,Water
佐 久 間 哲 史 氏（ 広 島 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科
数理分子生命理学専攻 分子遺伝学教室特任助教）
新たな研究ツールとして期待されるゲノム編集の技術開発
効率評価は GeneArt ® Genomic Cleavage Detection Kit で定量化
ゲノム編 集 で 有 名 な 広 島 大 学 の 山 本 卓 教
子 の 変 異を簡 単に検 出できる G e n e A r t ®
なかうまくいかず大変苦労したと言います。
授の研究室で、TALENs や CRISPR を使っ
Genomic Cleavage Detection Kit 。ゲ
しかしTALENs や CRISPR が登場し、使い
たシステム の 改 良 を 手 がける佐 久 間 哲 史
ノム編集の過程で起きた、塩基の挿入や欠
やすい キットやツー ルが出てきたこともあ
氏。歯学部から理学部に転入し、分子遺伝学
失の成功を定量的に評価できます。
「最初に
り、研究がスムーズに進むようになったそう
教室を選んだのは、
「（当時ゲノム編集のた
使った他社製品では、プロトコル通りにやっ
です。そして今 後 の 展 開を次 のように予 測
めに同教室で行っていた）ジンクフィンガー
てもスメアになったりバンドがたくさん出て
します。
「たとえば TA L エフェクターとヌク
ヌクレアーゼ（ ZFN ）が広がりのある技術と
きたりして使いづらい点がありました。酵素
レアーゼを融 合させて遺 伝 子をノックアウ
思 い 、興 味を持ったから」と話します。そ の
の量や反応時間を最適化したプロトコルを
トやノックインするだけでなく、転写活性の
後いくつかの新たなゲノム編集技術が登場
自分たちで作れば一応使えるようになりま
コントロー ルやゲノムの特定領域における
する中で、佐久間氏は TALENs の作製シス
すが、初めて使うときにはそれが課題ですね。
修 飾など、ゲノム編 集には多 様な可 能 性が
®
テムの改良やその活性を高めた Platinum
一 方 、GeneArt
Genomic Cleavage
あります。将来は遺伝子の機能解析におい
TALEN の開発、さらにCRISPR の改良シス
Detection Kit は取扱説明書のプロトコル
て RNAi を超えるアプローチになり、PCR
テムの開発も手がけます。今では上司の山
通りにやれば、本当にうまくいきます。初め
の様に誰もが使える技術として研究室に普
本卓教授も「彼はうちの研究室には欠かせ
てやる人でも誰でも使 いやすいですし、汎
及するのではないでしょうか」。佐久間氏自
ない研究者です」と太鼓判を押すほどに。
用性が高くていいですね」とコメントします。
身も普及のための講習会やゲノム編集コン
ソーシアムの活動もこなします。
「なるべく
ゲノム編集の効率評価はキットで簡単に確認
さらにエキサイティングな展開へ
そ の 佐 久 間 氏 が「これは 使 いやすい 」と評
ZFN に興味を持って研究者としての道を歩
改良開発に主眼を置いて進めていきたいで
価しているのが、ゲノム編 集 後 の 標 的 遺 伝
き出した佐久間氏ですが、その作製はなか
すね」と話します。
多くの人に広く使ってもらえるように、今後
も TA L E N s や C R I S P R を使うシステムの
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Applied Biosystems®
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16
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2720 サーマルサイクラー ® を 10 年ぶりにモデルチェンジ !
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なグラフィックで必要な機能にすばやくアク
（ ℃ / 秒 ））とそ の 指 値コントロー ルで 、微 妙
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Applied Biosystems ® のサーマルサイ
モードを搭載。ラボの大切な資産を守り、研
AmpliTaq ® 、Platinum ® Taq などの各種
P C R マスターミックスに加え、逆 転 写 のた
めの SuperScript ® 、シーケンスのための
BigDye ® など、多くのアプリケーションをサ
究を滞らせません。
ポート
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クラー はもちろん、他メーカーからの更新
でも、温度制御を再現するシミュレーション
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from
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は実現できなかった便利な機能を搭載し
G e n e A m p ® 9 6 0 0 P C R シ ス テ ム 。 ▶ 最後に一言
SimpliAmp のシミュレーションモードを
困ったときは、いつでも私たちテクニカル
使えば、9600 システムを始め、他 のサ ー
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実験が行えます。買い替えや論文記載の
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世 界 標 準 とし て 世 界 中 の 研 究 室 で 愛
します。大 学 などでは実 験が初 めての 学
用 さ れた A p p l i e d B i o s y s t e m s ®の
生さんも不安なくお使いいただけます。
中山 收
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Applied Biosystems®
17
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歴史と信頼の Applied Biosystems ® ブランド
1987 年に世界ではじめてサーマルサイクラー ®とPCR 酵素を発売以来 27 年間、
常に先端をいくPCR 装置で多くの研究を支えてきました。
SimpliAmp ® サーマルサイクラー ®は、2720 サーマルサイクラー ®を10 年振りにリニューアル。
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96/2×96ウェル（ 0.2ml ）
2×384ウェル
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60ウェル（ 0.5ml ）
96ウェル（ 0.1/0.2ml ）
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Ion Torrent™
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User's Voice
坂 井 和 子 氏 （ 近 畿 大 学 医 学 部 ゲノム 生 物 学 教 室 助 教 ）
網羅的ながん体外診断のバイオマーカー探索研究
Ion PGM™ システムとAmpliSeq™ 技術で研究を効率化
者さんにとってメリットとなるでしょう」。
きれば 、一 人 ひとりの 患 者に合 わ せ た 分
子 標 的 薬 を 選 択 できます 。
「 有 望 な バイ
がん の 体 外 診 断 の 開 発を見 据え、バイオ
オマーカーの探索には網羅的解析が有効
変異検出の技術を開発
な 手 段となりますが、リア ルタイム P C R
ゲノム生 物 学 教 室では、変 異 検 出 の 技 術
では既 知 の 変 異しか確 認できませ ん 。こ
開発も並行して進めています。2014 年 4 月
れに対して Ion PGM™ システムは DNA
の A A C R（ 米 国 癌 学 会 ）で は 、参 画 する
配列を直接読み取るので、多検体の新規
OncoNetwork コンソーシアムと肺がん
の変異を同時に検出できるのが強みです
融 合 遺 伝 子 パネ ル の 共 同 開 発につ い て
ね」と坂井氏。
発表。Ion AmpliSeq™ RNA ケミスト
マーカーとなるDNA 変異を探索している
近畿大学医学部ゲノム生物学教室。その
10ng の微量 DNA でも検出可能
基礎研究を支えているのが次世代シーケ
解 析 する肺がん サンプ ル の 多くは、がん
ンサ Ion PGM™システムです。ヒトゲノム
リに基づく肺がん融合遺伝子パネル（ Ion
患 者 の バイオプシー（ 生 体 組 織 診 断 ）で
AmpliSeq™ RNA Lung Fusion
Panel ）を用いてALK , ROS1 , RETの融
合 遺 伝 子を検 出した 結 果 、従 来 の F I S H
上の複数領域をマルチプレックスでシーケ
得ら れ た パ ラフィン 包 埋 の 組 織 検 体 で
法より効 率 的に変 異が検 出できることを
ンスできるIon AmpliSeq™ 技術を導入
す。1 枚 の サンプ ルから抽 出できる DNA
示し、腫 瘍 RNA の 1% 以 下でE M L 4 - A L K
し、肺がんをはじめ肝がん、大腸がん、乳が
は 30 ∼ 100ng ほど。
「 貴 重なサンプルを
融 合 遺 伝 子が検 出することを報 告しまし
んで、がん 関 連 遺 伝 子 の 変 異 検 出をおこ
シーケンス解 析だけで使 い 切りたくない
た。Ion PGM™ システムの使い勝手につ
なっています。Ion PGM™システムを使い
ので、10ng から検出できる Ion PGM™
いては、
「慣れれば楽ですね。サンプル調
こなし、1 年に400 ∼ 500 サンプルは解析す
シ ス テ ム の 解 析 能 力 は 魅 力 でし た 」と
製を自動化するIon Chef™システムも導
るという坂井和子氏にお話を伺いました。
坂 井 氏 は 語ります 。I o n A m p l i S e q ™
入したので、今後さらに時間を短縮できる
技 術 では 、C a n ce r H o t s p o t パネ ル ,
でしょう」と微 笑む坂 井 氏 。バイオプシー
検 体 の 解 析 の み ならず、採 血で得られる
肺がん治療薬イレッサがEGFR遺伝子変異
C o m p re h e n s i v e C a n c e r パ ネ ル ,
Colon＆Lung Cancer パネルという既
をもつ症例で奏効するとの論文が 2004 年
製のキャンサーパネルに加え、カスタムパ
（ cfDNA ）の研究も手がけます。
「私たち
に報 告されてから、抗 が ん 剤に対 する感
ネルも積極的に利用しています。
「融合遺
の基礎研究を、患者さんへの負担が少な
受 性と遺 伝 子 変 異との 関 係 が 徐 々 にわ
伝子や抗がん薬耐性に関わる遺伝子をよ
い診断ツー ル開発へと橋渡ししたいので
かってきました。E G F R遺 伝 子 変 異 のよう
り効 率 的に探 索 できるようになりました 。
す」と話す坂井氏。最新の技術を駆使して
なバイオマーカーでがんの体外診断がで
検出の高速化は将来的に、治療を待つ患
医療への貢献を目指しています。
有望なバイオマーカーを探す
■ Ion AmpliSeq™ Community パネル
血漿の DNA を解析するCell free DNA
Ion AmpliSeq™ パネルラインアップ
がん
さまざまなアンプリコンシーケンスのニーズに合わせて、
最先端の研究者が検証済のパネルデザインを公開しており、
●
●
●
BRCA1/2
Colon & Lung
TP53
遺伝性疾患
●
●
CFTR
Dimentia
個人識別
●
Human Identity
すぐに利用できます。
●
最先端の研究者による検証済パネルが利用可能
●
1プールあたり10ng の DNA からスタート
FFPE サンプル対応 1 サンプルあたり平均 500カバレッジのデータ取得
変異解析、CNV 解析のためのクラウド解析環境
●
●
●
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Life Technologies™
い つ 行 く ? どうす る ? 海 外 留 学
Title
Name
Number
今こそ海外にトライ。
これだ ! というテーマを基点に、
世界を広 げる
杉本亜砂子 氏 （東北大学大学院
07
生命科学研究科生命機能科学専攻 発生ダイナミクス分野 教授）
線虫C.elegansの胚発生をモデル系に、細胞極性、紡錘体形成
た。
「大御所のラボで箔を付けるのが王道なのに大丈夫 ? と
を解析し、細胞分裂のダイナミズムを鮮やかに描き出すライブ
周囲からは心配されましたが、逆に良かった。ジョエルにとっ
イメージング技術も開発する杉本亜砂子氏（東北大学大学院生
て私は最初のポスドクなので、彼の知識を全て、直接教えて
命科学研究科教授）。大学院では酵母を研究し、その後新しいモ
くれた。ラボの立ち上げを一緒にやった経験は、自分が日本
デル生物として注目されだした線虫に興味をもち、卒業後は線
で独立する時のシミュレーションにもなりました」
（杉本氏）。
虫研究のメッカである米国ウィスコンシン大学へ留学しました。
ユニークな留学体験や線虫研究の魅力について伺います。
線虫コミュニティの一員に
留 学していた 1990 年 代は、線 虫 のゲノム配 列 の 決 定 、ライ
ブイメージング、RNAi 技術が確立された時期。
「研究はエキ
酵母から線虫へ
サイティング。線虫研究者は、未発表データを積極的に共有
栄養源が豊富な時は分裂で増え、枯渇すると減数分裂で有性
し、みんなで技術を開発しようという勢いもありました。これ
生殖する酵母。このような分裂様式の切り替えは、多細胞生
は、線虫コミュニティで私が気に入っているところです」
（杉
物では、体細胞での分裂と生殖細胞での減数分裂の違いに
本氏）。ここで培ったネットワークは、帰国後に始めた線虫全
見られます。
「酵母を研究するうちに、この分裂の切り替えが
遺伝子の網羅的機能解析（ RNAi ）にも役立ったと話します。
生じるしくみを、多細胞生物で研究したいと思い始めました」
という杉本氏。1 個の受精卵から細胞の運命が変わっていく
生活してわかる文化の違い
現象を、半透明の身体で丸ごと研究できる線虫は、酵母の変
米国の大学では、年齢、性別、国籍に関係なく、斬新なアイデ
異体作製や遺伝子解析の技術を生かせる実験系としても魅
アを出す若手が技術をもつ経験者にアドバイスするなど、フ
力的だったといいます。
ラットでお互いを尊重する環境がありました。
「東北大学の私
のラボでも、上級生だから、先生だから偉い、ということはあ
「留学＝大御所ラボ」とは限らない
りません」と杉本氏。
「日本は研究者に
“女性”
とつける時点で
電 子メー ルが一 般 的でな い 時 代 、杉 本 氏は、欧 米 の 線 虫 研
遅れているのではないでしょうか。米国では私が女性だから
究者にエアメー ルを何通も出しました。第一希望は、優秀な
と特別扱いされた意識は全くもちませんでした」とも指摘し
線虫研究者の集まる米国ウィスコンシン大学の大御所教授。 ます。
残念ながら最終選考で落ちますが、その時、隣のビルに新し
く入る若手 PI のジョエル・ロスマン（ Joel Rothman ）博士
を紹介され、線虫のアポトーシスをテーマに留学を決めまし
好きなことを中心に世界は広がる !
若者には、
「研究に対するアプローチも国や文化によって違
う。頭が柔軟な若いうちに、身をもって経験してほしい」と海
外 留 学をすすめます。大 学 院 時 代にこれだ ! と決 めたテー
マを続 けるために、必 要 な 技 術を身につけ自ら開 発してき
た杉 本 氏 。次に注 目するのはゲノム編 集 技 術だとい います。
「C. elegansの近縁種をつかった進化的な研究もやってみた
い 。自 分 が 好 きで 興 味 をもったテ ー マを 基 点に、世 界 は 広
がっていくのです」
（ 杉本氏）。
後列左から3 人目がJoel Rothman 氏、前列右から2 人目が杉本氏。2011 年 6 月、UCLAで開
催された国際線虫集会（ International C. elegans Meeting ）にて。
Next_25.indd 19
1992年東京大学大学院理学系研究科生物化学専攻博士課程修了、理学博士。1992年 -1996年
米国ウィスコンシン大学マジソン校博士研究員、1996 年東京大学大学院理学系研究科生物化
学専攻助手、2001 年理化学研究所 発生・再生科学総合研究センター チームリーダー、2010
年 4 月より現職。
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INFORMATION
2014 / June / No.25
Century of
AMAZING SCIENCE
驚くべき科学の世紀へ
子供たちに科学の魅力を伝える活動として、6 月 8 日（日）に日本
科学未来館と共催イベントを開催します。クラブ Miraikan のメ
ンバー 20 人が、東京本社の実験室で研究者と同じ実験器具や試
薬を使って DNA 実験に挑みます。この日は、世界中の社員がボラ
ンティア活動を行うグローバルボランティアデイ。この驚くべき
科学の世紀を受け継ぐ、子供たちと実りある一日を過ごしたいと
lifetechnologies.com/amazingscience
思っています。
マンガで 学 ぶ「 ゲノム 編 集 」
素敵なイラストのゲノム編集小冊子が完成しました。ゲノム編集の原理や必要な
な
ガ
ツールをまとめています。しかも 2014 年 7 月 31 日までにゲノム編集のメールマガ
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ト ! ご登録や PDF 閲覧、その他「ゲノム編集」技術に関する情報はこちらから →
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NEXT 6 月号はいかがでしたか ?
特集の水島昇氏や留学記の杉本亜砂子氏から、若い方へのメッセージをいただきました。じっくりと研究テーマを決めるにしても、若い
頃の感覚は大事なようですね。そして今号も多くのユーザーの方のお話を伺いました。再生医療や話題のゲノム編集、工学的視点から
エキソソームにアプローチ中の研究者の方々。研究の幅広さと躍動感を読者の皆様にお伝えできれば幸いです。ぜひアンケートにご協
力ください。抽選で 10 名様にQuoカード（ 2000 円分）をプレゼントします。
バックナンバーや抜粋記事もご覧いただけます。→ URL: www.lifetechnologies.com/nextforum
photographs: muraguchi keiichiro（p.02-03）
art direction & design: masami furuta（opportune design）
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● 記載価格は 2014 年 6 月現在の価格です。● 消費税は含まれていません。● 価格は予告なしに変更する場合がありますので
あらかじめご了承ください。● 最新の価格および在庫数は、弊社ホームページ右上の
“製品価格と在庫の検索”
でご確認いた
だけます。● 研究用にのみ使用できます。● 診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。● 記載の社名および製品
名は、弊社または各社の商標または登録商標です。● 販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC
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Printed in Japan. LFT063-A1405OB
ライフテクノロジーズジャパン株式会社
本社：〒108-0023
大阪：〒564-0052
東京都港区芝浦 4-2-8
大阪府吹田市広芝町 10-28
TEL.03（ 6832 ）9300 FAX.03（ 6832 ）9580
TEL.06（ 6389 ）1201 FAX.06（ 6389 ）1206
ウェブサイト: www.lifetechnologies.com
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