PDFファイル - 医薬品医療機器総合機構

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ま た 、 必 要 時 に 読 め る よ う に 保 管 し て お い て く だ さ い 。

体外診断用医薬品

製造販売承認番号:22100AMX00779000

チトクローム P450(CYP)ジェノタイプ解析キット

** 2012 年 12 月改訂(第 3 版)

* 2010 年 3 月改訂(第 2 版)

アンプリチップ

®

CYP450

*

【重要な基本的注意】

本キットは、薬物代謝酵素 Cytochrome P450(CYP)の2D6及び2C19 のジェノタイピングを行うものですが、そ

のすべてのアリルのタイピングを行えるものではありません。特に、14A、18、21 などに代表される、日本人の poor metabolizer の要因となり得るため臨床的に注意が必要な、いくつかのアリルは測定できません。上記の

アリル以外にも、添付文書で本品により解析不可能とされているアリル、新たに報告されたアリル、現在までに

報告されていない遺伝子多型が存在する検体の場合、正しく測定できない可能性があるので注意してください。

2. アンプリチップ CYP450 プライマーミックス A〔CYP450 PM-A〕

プライマー‐MN431

プライマー‐D12R

プライマー‐NP162

プライマー‐WK621

プライマー‐WK418CC

プライマー‐NP158

3. アンプリチップ CYP450 プライマーミックス B〔CYP450 PM-B〕

プライマー‐WK404

プライマー‐WK405

プライマー‐NP164

プライマー‐NP165

4. アンプリチップ マグネシウム試液〔Mg

2+

5. アンプリチップ TdT 標識試液〔TdT〕

6. アンプリチップ B1 オリゴヌクレオチド試液〔B1 Oligo〕

7. アンプリチップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕

CYP450 用 DNA プローブ固相マイクロアレイ

8. アンプリチップ CYP450 陽性コントロール〔CYP450 (+)C〕

1×0.7 mL

1×0.7 mL

1×1.3 mL

1×25μL

1×1.3 mL

24 個

アンプリチップ CYP450 で解析可能なアリル

1×20μL

以下に示した CYP2D6及び CYP2C19 アリルについて、本品で解析可能です。

CYP2D6:1、2ABD、3、4ABDJK、5、6ABC、7、8、9、10AB、11、15、17、19、20、29、35、36、40、41、1XN、

2XN、4XN、10XN、17XN、35XN、41XN

CYP2C19:1、2、3

【全般的な注意】

1.

本品は体外診断用であり、それ以外の目的には使用しないでください。

2.

測定結果に基づく臨床診断は、臨床症状やほかの検査結果などと伴せて、担当医師が総合的に判断してください。

3.

添付文書に記載された使用目的及び用法・用量に従って使用してください。記載された使用目的及び用

法・用量以外での使用については、測定結果の信頼性を保証しかねます。

4.

使用する機器の添付文書及び取扱説明書をよく読み、記載に従って使用してください。また、試薬ごとに設

定された反応時間及び温度などは厳守してください。

5.

試薬及び消耗品は専用のものを使用し、その容器・付属品などはほかの目的に転用しないでください。

6.

キットの試薬を取り扱う際には保護用眼鏡、実験着及び使い捨てゴム手袋を着用し、試薬が皮膚、目、粘膜

などに触れないように注意してください。万が一、このようなことが起きた場合は、大量の水でじゅうぶんに洗

い流し、必要があれば医師の手当てなどを受けてください。

形状・構造等(キットの構成)】

アンプリチップ CYP450

1. アンプリチップ CYP450 マスターミックス〔CYP450 MMX〕

2’‐デオキシアデノシン‐5’‐三リン酸(dATP)

2’‐デオキシシチジン‐5’‐三リン酸(dCTP)

2’‐デオキシグアノシン‐5’‐三リン酸(dGTP)

2’‐デオキシチミジン‐5’‐三リン酸(dTTP)

2’‐デオキシウリジン‐5’‐三リン酸(dUTP)

AmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼ

CS5 Gold DNA ポリメラーゼ

1×1.3 mL

1/15

9. アンプリチップ 陰性コントロール〔A-CHIP (-)C〕 1×1.2 mL

*

【使用目的】

全血中の薬物代謝酵素CYP2D6(1、2ABD、3、4ABDJK、5、6ABC、7、8、9、10AB、11、15、17、19、20、29、

35、36、40、41、1XN、2XN、4XN、10XN、17XN、35XN、41XN)及びCYP2C19(1、2、3)のジェノタイプの解析

(薬物代謝酵素活性の予測の補助)

【測定原理】

1. 測定法

本キットは全血検体から抽出したゲノム DNA を用いて、薬物代謝酵素 CYP2D6及び CYP2C19 のジェノタイプの

解析を、以下のステップにより行います。

(1) PCR による増幅

PCR(Polymerase Chain Reaction)法により、ゲノム DNA 中の CYP2D6及び CYP2C19 遺伝子をアンプリチップ

CYP450 マスターミックスと、アンプリチップ CYP450 プライマーミックス A 及びアンプリチップ CYP450 プライ

マーミックス B をそれぞれ用いて増幅します。アンプリチップ CYP450 プライマーミックス A を用いた PCR 反応

により、検体又はコントロール中の CYP2D6遺伝子のプロモーター領域及びコーディング領域を含む増幅産物

と、CYP2D6遺伝子重複が起こっている場合に特異的な増幅産物が生成します。アンプリチップ CYP450 プラ

イマーミックス B を用いた PCR 反応により、検体又はコントロール中の CYP2C19 遺伝子のエクソン4及び5を含

む増幅産物と、CYP2D6遺伝子欠損が起こっている場合に特異的な増幅産物が生成します。まず、高温で検体

中のゲノム DNA を1本鎖に変性させるとともに、DNA ポリメラーゼ(AmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼ及び CS5

Gold DNA ポリメラーゼ)を活性化させます。次に温度を下げると、プライマー(アンプリチップ CYP450 プライ

マーミックスA中のプライマー‐MN431、プライマー‐D12R、プライマー‐NP162、プライマー‐WK621、プライマー

‐WK418CC 及びプライマー‐NP158、アンプリチップ CYP450 プライマーミックス B 中のプライマー‐WK404、プ

ライマー‐WK405、プライマー‐NP164 及びプライマー‐NP165)をそれぞれ標的配列にアニールし、Mg 2+ 及び

過剰なデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)である 2’‐デオキシアデノシン‐三リン酸(dATP)、2’‐デオキシシ

チジン‐三リン酸(dCTP)、2’‐デオキシグアノシン‐三リン酸(dGTP)、2’‐デオキシチミジン‐三リン酸(dTTP)及

び 2’‐デオキシウリジン‐三リン酸(dUTP)の存在下、DNA ポリメラーゼの働きにより標的配列に相補的な DNA

鎖が伸長されます。この「熱変性」、「プライマーのアニーリング」、「DNA ポリメラーゼによる相補鎖の伸長」を

35 サイクル繰り返すことで、増幅産物が生成されます。

(2) 増幅産物の断片化及び標識

アンプリチップ CYP450 プライマーミックス A 及びアンプリチップ CYP450 プライマーミックス B を用いてそれ

ぞれ得た増幅産物をプールし、調製済み断片化ミックスを用いて増幅産物の断片化を行います。まず、DNase

Ⅰの働きにより平均サイズ 50~200 ヌクレオチドの DNA フラグメントを得ます。なお、断片化した増幅産物のサ

イズ(50~200 ヌクレオチド)はゲル電気泳動により確認されています。続いて、調製済み断片化ミックス中のア

ルカリフォスファターゼの働きにより、増幅反応における残留デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)を取り除き

ます。更に、断片化した DNA 増幅産物の 3’末端に、ターミナルトランスフェラーゼの働きにより、アンプリチップ

TdT 標識試液中のビオチンを標識します。

(3) アンプリチップ CYP450 マイクロアレイへのハイブリダイゼーション及び蛍光染色

ビオチン標識した CYP450 標的 DNA フラグメントを、ハイブリダイゼーションコントロールであるアンプリチップ

B1 オリゴヌクレオチド試液を含むハイブリダイゼーション緩衝液に加えます。この混合液を、GeneChip Fluidics

Station 450Dx(Affymetrix 社)を用いてアンプリチップ CYP450 マイクロアレイ中の CYP450 用DNA プローブ固

相マイクロアレイ上の DNA プローブにハイブリダイズさせます。ハイブリダイズしたアンプリチップ CYP450 マ

イクロアレイを洗浄し、蛍光(R‐フィコエリスリン)標識ストレプトアビジンコンジュゲートを結合させます。アンプリ

チップ CYP450 マイクロアレイは、フォトリソグラフィー法とコンビナトリアルケミストリーを合わせた技術により製

造し

1), 2)

、増幅した標的 DNA のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を解析するため 15,000 以上の異なるオリ

ゴヌクレオチドプローブがガラス表面上に合成されています。20μm 四方のプローブマイクロアレイのプローブ

セルと呼ばれる特異エリアにプローブの種類ごとに約 10

6

~10

7

コピーのプローブが固相されています。アンプ

リチップ CYP450 マイクロアレイには各多型を正確に解析するために約 240 のプローブが用いられています。

プローブマイクロアレイは Light-Directed コンビナトリアルケミストリーを複数回繰り返して製造します。ガラス基

盤に感光性保護基を含むリンカーを付加した後、マスクをセットしてプローブマイクロアレイの選択した位置を

暴露させます。光を照射すると、マスキングしていない位置の感光性保護基が脱保護され、選択したヌクレオシ

ドへのホスホラミダイト付加が行われます。次に、別のマスクがセットされ、照射と化学カップリングが再び行わ

れます。これを繰り返すことにより、特定の位置に必要な種類のオリゴヌクレオチドプローブのセットが合成され

ます。完成したプローブマイクロアレイはGeneChip Fluidics Station 450 Dx用のカートリッジにパッケージされま

す。

(4) アンプリチップ CYP450 マイクロアレイのスキャニング

蛍光染色後、アンプリチップ CYP450 マイクロアレイのプローブにハイブリダイズした CYP450 標的 DNA 断片

と結合した蛍光物質を GeneChip Scanner 3000Dx(Affymetrix 社)を用い、レーザー光で励起してスキャンします。

**

て、測定した DNA のアリルと一致するものを決定します。結果にはジェノタイプの要約と解析されたアリル

と多型のリストが報告されます。ジェノタイプの解析結果を用い、発表された研究に基づいて予測される

CYP2D6及び CYP2C19 酵素活性が示されます

3)

2. キャリーオーバーコンタミネーションの防止

本キットでは、以下の方法により増幅された DNA 産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止し

ています。DNA 合成に必要な基質の一つである dTTP の代わりに dUTP を用いて増幅反応を行うため、増幅された

DNA の塩基配列はチミン(T)がウラシル(U)に全て置き換わっています。また、この系で増幅された DNA が新たに

試験する試料中へ混入した場合、マスターミックスに含まれているウラシル N-グリコシラーゼ(UNG)が作用し DNA

中の U 塩基は除去されます。塩基を失った DNA は構造上極めて不安定な分子であり、増幅反応の最初の加熱に

よりリン酸結合が切断され、新たな増幅の鋳型とはなり得ません。UNG は高温で失活するため、それ以後に増幅さ

れてくる U 塩基を含む増幅 DNA は影響を受けません。また、UNG は 6 塩基以上の DNA 上のウラシルのみに反応

し、モノマーの dUTP や RNA 上のウラシルには作用しません

4) 。

【操作上の注意】

1. コンタミネーションの防止法

本キットのアンプリチップ CYP450 マスターミックスにはウラシル N-グリコシラーゼ(UNG)が添加されており、また

DNA 合成に必要な基質の一つである dTTP の代わりに dUTP を用いて PCR を行うため、本キットにて増幅された

DNA のキャリーオーバーコンタミネーションによる誤差を防止することはできますが、検体間で発生するクロスコン

タミネーションを防止することはできません。クロスコンタミネーションは、主に検体を扱ったピペットなどで発生する

エアロゾルやピペット本体の汚染が原因となるので、検査区域の分割やピペットの専用化及び次亜塩素酸剤(有効

塩素濃度 5,000 ppm、0.5%)による器具、実験台の清掃などを徹底することで、クロスコンタミネーションの発生を最

小限に防止することができます。

2. 測定試料の性質、採取法

測定試料には全血を用います。全血は EDTA 入り採血管に採取します。全血の保管は室内温度で7日以内です。

また、2~8℃で1ヵ月間、-20℃保存で7週間保存できます。凍結融解は5回まで可能です。2~8℃又は-20℃

保存した検体を使用する際は、室内温度にじゅうぶん戻してから使用してください。

3. 妨害物質・妨害薬剤

脂質、ビリルビン及びヒト血清アルブミンによる影響を検討するため、各妨害物質について、正常値の約 10 倍の濃

度の妨害物質をそれぞれ添加した検体と添加していない検体を 10 検体調製して本品で測定したところ、以下の濃

度まで測定への影響は認められませんでした。

アルブミン 6,000 mg/dL

発光量はプローブマイクロアレイの各位置に結合した標的 DNA 量に比例します。約 15,000 のプローブセルの

イメージがそれぞれデータファイルに記録され、データ解析に使用されます。

(5) ジェノタイプと予測されるフェノタイプの決定

GeneChip Operating Software(GCOS v1.1.3 以上)と AmpliChip CYP450_US Data Analysis Software v 2.1、又は、

Affymetrix Molecular Diagnostic Software(AMDS v1.0 以上)と AmpliChip CYP450 Data Analaysis Software v3.1

を用いてデータ解析を次のステップにより行います。

① GeneChip Operating Software が自動的に、スキャンしたマイクロアレイのイメージにグリッドをつけて個々

のプローブセルを区別し、各プローブセルの平均蛍光強度を算出します。

② AmpliChip CYP450_US Data Analysis Software は CYP450 用のアルゴリズムを用いて蛍光強度のパターンを

分析し、プローブマイクロアレイ上の変異型及び野生型を標的とした相補的な配列のプローブにハイブリダ

イズした相対的な程度を分析し、それぞれに特異的である多型の位置からジェノタイプを解析します。

③ AmpliChip CYP450_US Data Analysis Softwareのアルゴリズムは29 の特異的な多型のジェノタイプ(野生型、

変異型、ヘテロ接合型)を解析し、判明しているアリルのジェノタイプパターンの組み合わせ情報と比較し

2/15

ビリルビン 60 mg/dL

トリグリセライド 3,000 mg/dL

4. 反応特異性

本品2ロットを用い、CYP2D6及び CYP2C19 のジェノタイプが判っている 390 例の全血検体から抽出したゲノム

DNA と、32 例のプラスミド DNA クローンの混合試料について、RFLP 法(Restriction Fragment Lenghth

Polymorphism、制限酵素断片長多型測定)、AS-PCR 法(Allele Specific PCR)及び DNA 塩基配列決定法を含む他

の測定方法による結果と本品での測定結果を用いて、アリル毎の解析率を求めたところ、CYP2D6遺伝子は 99.2%、

CYP2C19 遺伝子は 100%でした(表1、2)。

アリル

*30

*31

*35

*36

*40

*41

*1XN

*2XN

*4XN

*10XN

*17XN

*35XN

*41XN

*9

*10

*11

*14

*15

*17

*19

*20

*25

*26

*29

*1

*2

*3

*4

*5

*6

*7

*8

合計

試験数

34

76

16

12

63

35

12

231

109

13

129

39

11

844

Correct

Call 数

34

76

15

12

61

35

12

230

108

13

129

39

11

表1 CYP2D6アリルの解析

Miscall

No Call 数

837 1 6

解析率

75.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

93.8%

85.7%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

99.6%

99.1%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

96.8%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

99.2%

クローン

試料の

使用

3試験分

使用

4試験分

使用

3試験分

使用

3試験分

使用

アリル

*1

*2

*3

試験数

628

202

14

Correct

Call 数

628

202

14

表2 CYP2C19 アリルの解析

Miscall

No Call 数

解析率

100.0%

100.0%

100.0%

クローン

試料の

使用

32 試験

分使用

合計 844 844 0 0 100.0%

3/15

また、ジェノタイプごとの解析を行ったところ、CYP2D 遺伝子の Genotype Accuracy(分析感度)は 99.1%、Genotype

Call Rate(Correct Call 数と Miscall 数の割合)は 99.3%であり、CYP2C19 遺伝子は Genotype Accuracy、Genotype Call

Rate とも 100%でした。(表3、4)を行いました。

表3 ゲノム DNA 試料を用いた CYP2D6ジェノタイプの解析

CYP2D6

ジェノタイプ

試料数

Correct

Call 数

Miscall

No Call

Genotype

Accuracy

*1/*1

*1/*1XN

*1/*2A

*1/*2AXN

*1/*2D

*1/*2DXN

*1/*3

*1/*4A

*1/*4AXN

*1/*4D

*1/*4DXN

*1/*5

*1/*6B

*1/*9

*1/*10B

*1/*10BXN

*1/*17

*1/*17XN

*1/*29

*1/*35

*1/*35XN

*1/*40

*1/*41

*1XN/*2A

*1XN/*4A

*1XN/*10A

31

30

30

15

16

13

13

14

31

30

30

15

16

13

13

14

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

66.7%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

50.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

Genotype

Call Rate

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

66.7%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

50.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

試料数

17

11

23

20

16

CYP2D6

ジェノタイプ

*4A/*35

*4A/*41

*4D/*5

*4D/*41

*4DXN/*5

*4DXN/*17

*5/*5

*5/*9

*5/*10B

*5/*10BXN

*5/*17

*5/*29

*5/*35

*5/*41

*6B/*41

*9/*17

*9/*41

*10B/*10B

*10B/*10BXN

*10B/*17

*1XN/*35

*1XN/*41

*2A/*2A

*2A/*3

*2A/*4A

*2A/*5

*2A/*6B

*2A/*9

*2A/*10B

*2A/*35

*2A/*41

*2AXN/*17

*2AXN/*41

*3/*3

*3/*4A

*3/*5

*3/*35

*3/*41

*4A/*4A

*4A/*4D

*4A/*5

*4A/*6B

*4A/*9

*4A/*15

Correct

Call 数

16

11

23

20

16

Miscall

No Call

Genotype

Call Rate

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

94.1%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

Genotype

Accuracy

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

94.1%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

4/15

CYP2D6

ジェノタイプ

*10B/*35

*10B/*36

*10B/*40

*10B/*41

*10BXN/*41

*17/*17

*17/*29

*17/*41

*29/*29

*29/*36

*29/*41

*35/*35

*35/*41

*41/*41

*41/*41XN

合計

試料数

403

Correct

Call 数

400

Miscall

No Call

Genotype

Accuracy

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

99.3%

Genotype

Call Rate

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

100.0%

99.3%

CYP2C19

ジェノタイプ

*1/*1

*1/*2

*1/*3

*2/*2

*2/*3

*3/*3

試料数

270

101

15

表4 CYP2C19 ジェノタイプの解析

Correct

Call 数

270

101

14

Miscall

No Call

Genotype

Accuracy

100.0%

100.0%

100.0%

93.3%

100.0%

100.0%

Genotype

Call Rate

100.0%

100.0%

100.0%

93.3%

100.0%

100.0%

合計 399 398 1 0 99.7% 99.7%

5. その他

本キットの測定には専用機器『Gold 96-well GeneAmp PCR System 9700』 、『GeneChip Fluidics Station 450Dx』、

『GeneChip Scanner 3000Dx』を用いてください。

【用法・用量(操作方法)】

1. 試薬の調製方法

(1) 調製済みマスターミックス A 及び B

アンプリチップ CYP450 マスターミックス〔CYP450 MMX〕、アンプリチップ CYP450 プライマーミックス A

〔CYP450 PM-A〕、アンプリチップ CYP450 プライマーミックス B〔CYP450 PM-B〕及びアンプリチップ マグネシ

ウム試液〔Mg

2+

〕は常温で15 分間放置し、10~15 回転倒混和します。2.0 mLチューブを2本用意し、それぞれA、

B とします。増幅する検体及びコントロール数に応じて、以下の各試薬を各容量ずつ加え、調製済みマスターミ

ックス A 及び B を調製します。キャップを閉め、10~15 回転倒混和する。24 試料より少ない試料を増幅する場

合、以下の1テスト用の容量とテスト数を掛けあわせ、更にこれに 1.05 をかけた容量の調製済みマスターミックス

A 及び B を調製します。調製済みマスターミックス A 及び B は調製後 1 時間以内に使用してください。

構成試薬

CYP450 MMX

CYP450 PM-A 又は CYP450 PM-B

Mg

2+

24 テスト用

630μL

630μL

630μL

1テスト用

25μL

25μL

25μL

(2) 調製済み断片化ミックス

調製済み断片化ミックスは使用直前に調製してください。調製済み断片化ミックスを含むチューブは調製及び

使用する間、常に氷冷しておいてください。未使用の調製済み断片化ミックスは廃棄してください。

① 20 mmol/L EDTA 溶液を調製する。0.5 mol/L EDTA 1 mL を脱イオン水 24 mL に加えてよく混和します。

20 mmol/L EDTA 溶液は、清浄な密閉プラスチック容器に2~8℃保存で調製後6ヵ月まで安定です。

② 各試薬を以下の表の順にしたがって各容量ずつ加え、調製済み断片化ミックスを 2.0 mL チューブを用い

て氷冷しながら調製します。

③ 調製済み断片化ミックスを軽く混和します。

24 テストより少ない数を断片化する場合、残った調製済み断片化ミックスは廃棄してください。DNase Ⅰ、アル

カリフォスファターゼ及びターミナルトランスフェラーゼ(リコンビナント)は Roche Applied Science 社製のものを

用いてください。DNase Ⅰの酵素活性単位は各社で異なっています。Roche Applied Science社は

Kunits

5)

の方

法にしたがって酵素活性の単位を定義しています。

試薬

精製水(ヌクレアーゼフリー)

20 mmol/L EDTA 溶液

アルカリフォスファターゼ(1 U/μL)

Dnase Ⅰ(10 U/μL)

24 テスト用

191.4μL

3.3μL

22μL

3.3μL

220μL

最終濃度

0.3 mmol/L

0.1 U/μL

0.15 U/μL

(3) 調製済み標識用ミックス

調製済み標識用ミックスは使用直前に調製すること。調製済み標識用ミックスを含むチューブは調製及び使用

する間、常に氷冷してください。未使用の調製済み標識用ミックスは廃棄してください。

① 標識するテスト数に応じて、以下の各試薬を各容量ずつ加え、調製済み標識用ミックスを 2.0 mL チューブ

を用いて氷冷しながら調製します。24 試料より少ない試料を標識する場合、以下の1テスト用の容量とテス

ト数を掛けあわせ、更にこれに 1.1 をかけた容量の調製済み標識用ミックスを調製します。

5/15

② 調製済み標識用ミックスを軽く混和します。

試薬

5× Terminal Transferase Reaction Buffer

25 mmol/L CoCl

2

アンプリチップ TdT 標識試液〔TdT〕

ターミナルトランスフェラーゼ(リコンビナント)

(400 U/μL)

24 テスト用

187μL

22μL

22μL

44μL

275μL

1テスト分

6.8μL

0.8μL

0.8μL

1.6μL

10μL

(4) ハイブリダイゼーション緩衝液

① 10% Triton X-100 溶液を調製します。清潔なボトルに Triton X-100 10 mL を分注し、精製水 90 mL を加

え、よく混和します。10% Triton X-100 溶液は調製後 15~30℃保存(遮光)で6ヵ月間安定です。

② ハイブリダイゼーション緩衝液を以下の表にしたがって 15 mL チューブに調製し、10~15 回転倒混和しま

す。ハイブリダイゼーション緩衝液は2~8℃保存で6ヵ月間安定です。

試薬

20× SSPE Buffer

10% Triton X-100 溶液

アンプリチップ B1 オリゴヌクレオチド試液

〔B1 Oligo〕

50× Denhardt’s solution

5% アジ化ナトリウム

精製水

24 テスト用

3.125 mL

62.5μL

1.25 mL

250μL

225μL

7.588 mL

12.5 mL

最終濃度

5×

0.05%

1:10 B1 Oligo

1×

0.09%

(5) 染色試液

染色試液を以下の表にしたがって調製し、10~15 回転倒混和します。ストレプトアビジン‐R-フィコエリスリンコン

ジュゲート(1 mg/mL)は遮光して取り扱ってください。染色試液は2~8℃保存(遮光)で6ヵ月間安定です 。

試薬 24 テスト用 最終濃度

20X SSPE Buffer

Acetylated bovine serum albumin(20 mg/mL)

ストレプトアビジン‐R-フィコエリスリンコンジュゲート(1 mg/mL)

5% アジ化ナトリウム

精製水

3.5 mL

625μL

125μL

225μL

8.025 mL

5.6×

1 mg/mL

0.01 mg/mL

0.09%

計 12.5 mL

(6) 洗浄液

洗浄液を以下の表にしたがって 15 mL チューブに調製し、ゆっくりと混和します。洗浄液は 15~30℃保存で6ヵ

月間安定です。

試薬 24 テスト用 最終濃度

20X SSPE Buffer

10% Triton X-100 溶液

5% アジ化ナトリウム

精製水

300 mL

1.0 mL

36 mL

1,663 mL

2,000 mL

3×

0.005%

0.09%

2. 別途必要な器具・器材・試薬

[ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社より供給]

・ AmpliChip CYP450_US Data Analysis Softwawre(CD-ROM)v2.1 以上(GCOS v1.1.3 以上用)

・ AmpliChip CYP450 Test Data Analysis Softwawre(CD-ROM)v3.1(AMDS v1.0 以上用)

・ DNase Ⅰ(RNase-free)

・ アルカリフォスファターゼ(ウシ腸由来)

・ ターミナルトランスフェラーゼ(リコンビナント)(5× Terminal Transferase Reaction Buffer、と CoCl

2

solution を含む)

・ ストレプトアビジン‐R-フィコエリスリンコンジュゲート(1 mg/mL)

[その他]

機器

・ Gold 96-well GeneAmp PCR Systems 9700 及び付属品(Applied Biosystems 社)

・ GeneChip Fluidics Station 450Dx v.1(GCOS 用)又は v.2 以上(AMDS 用)(Affymetrix 社)

・ GeneChip Scanner 3000Dx v.1(GCOS 用)又は v.2(AMDS 用)(Affymetrix 社)

・ Data Station for the GCOS with GCOS software v1.1.3 以上又は Data Station with AMDS v1.0 以上(Affymetrix 社)

試薬(推奨品)

・ ゲノム DNA 調製キット:QIAamp DNA Blood Mini Kit 又は QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit(QIAGEN 社)

・ 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)(Invitrogen Corp.社)又は同等品

・ 精製水

・ 精製水(分子生物学用グレード、ヌクレアーゼフリー)

・ AccuGENE 20X SSPE Buffer(3 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaH

2

PO

4

、0.02 mol/L EDTA)(Cambrex 社)又は同等品

・ Triton X-100 surfactant(Sigma-Aldrich 社)

・ Denhardt’s solution, 50× concentrate(Sigma-Aldrich 社)

・ Sodium azide solution, 5%(w/v)(VWR International Mississauga 社)

・ Acetylated bovine serum albumin, 20 mg/mL(Sigma-Aldrich 社)

消耗品(推奨品)

・ For Applied Biosystems 96-Well GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler、及び MicroAmp(0.2 mL) Reaction

Tubes (0.2 mL), Reaction Tubes, Caps, Tay/Retainers 又は MicroAmp Reation Tubes/Tray/Retainer Assembly and Base 又は Optical 96 well Reaction Tube

・ Tough-Spots label, small(USA Scientific, Inc.社)又は同等品

・ 2.0 mL screw cap tubes(Sarstedt 社)又は同等品

・ 1.5 mL microfuge tubes(VWR 社)又は同等品

・ Sterile polypropylene conical tubes, 15 mL(Corning 社)又は同等品

・ 500 mL square media bottles: Nalgene

その他(推奨品)

・ マイクロピペット及びチップ(チップは疎水性フィルター付き、ヌクレアーゼフリー)

・ ヒートブロック式インキュベーター(95℃を維持できるもの)

・ プラスチック製 Resealable bag

・ 使い捨て滅菌済みピペット(5 mL 用、10 mL 用)

・ 目盛付き容器

・ 試験管ミキサー

・ チューブ用ラック

・ 使い捨て手袋(パウダーなし)

3. 操作法

本キットは 24 テスト分の構成試薬を含みます。 本キットの測定は1日又は2日間で行うことができます。1日で測定

を行う場合は以下の(1)~(8)の順に操作を行います。2日間に渡って測定を行う場合、1日目は以下の(3)増幅又

は(4)増幅産物の断片化及び標識までの操作を行います。

・ 1日目に(3)までを行う場合:1日目に以下の(1)の①~(3)の④までの操作を行った後、増幅産物を-

20℃保存します。2日目は(4)の①以降の操作を行います。

・ 1日目に(4)までを行う場合:1日目に以下の(1)の①~(4)の⑪までの操作を行った後、標識及び断片化し

た増幅産物を-20℃保存します。2日目は(5)の①以降の操作を行います 。

・ アンプリチップ 陰性コントロール及び CYP450〔A-CHIP (-)C〕及びアンプリチップ CYP450 陽性コ

ントロール〔CYP450 (+)C〕は、測定ごと又は 24 テストごとに1テストずつ測定してください。

(1) 検体及びコントロールの調製

① 各 DNA 調製キットの製造元プロトコールにしたがって、ゲノム DNA を抽出・精製します。DNA 濃度は 50

~500 ng/PCR、A

260

/A

280

比は 1.50~1.85 としてください。DNA を希釈する必要がある場合は、10 mmol/L

Tris-HCl、0.1 mmol/L EDTA、0.09% アジ化ナトリウム、pH 8.0 の溶液で希釈します。未希釈又は希釈し

た検体 DNA は2~8℃で1週間又は-20℃で1ヵ月間保存可能です。凍結融解は3回まで可能です。

② 10 倍希釈アンプリチップ CYP450 陽性コントロールを、アンプリチップ 陰性コントロールを希釈液と

して用いて調製します。2.0 mL スクリューキャップ付きチューブにアンプリチップ陰性コントロール

〔A-CHIP (-)C〕 54μL とアンプリチップ CYP450 陽性コントロール〔CYP450 (+)C〕 6μL を分注し

ます。キャップを閉め、5秒間混和します(以降、「調製済み CYP450 陽性コントロール」)。

(2) 試薬の準備

Gold 96-well GeneAmp PCR System 9700 は使用する少なくとも 15 分前にスイッチを入れておきます。アンプリ

チップ CYP450 では、CYP2D6 及び CYP2C19 遺伝子の増幅は2つの別々の反応を行い、これをプールしたも

のを断片化、標識及びハイブリダイゼーションに用います。アンプリチップ CYP450 では、各検体及びコントロ

ールについて、それぞれ2つの増幅反応が必要です。

① MicroAmp tray に 96 本チューブ(又は Reaction Tube)をセットし、Retainer と共に決まった位置に固定しま

す。テスト数に係らず必ず 96 本チューブをセットします。

② 1.試薬の調製方法 (1)にしたがって調製済みマスターミックス A 及び B を調製します。

③ 検体又はコントロール用に使用する以外のチューブ全てに精製水を 100μL 分注します。

④ 調製済みマスターミックス A 75μL を検体及びコントロール用のチューブに分注します。

⑤ 調製済みマスターミックス B 75μL を検体及びコントロール用のチューブに分注します。

⑥ 調製済みマスターミックス A 及び B の入ったトレイを Resealable plastic bag に入れ、使用するまでチャック

をします。調製済みマスターミックス A 及び B は常温で1時間まで安定です。

⑦ 調製済み検体、調製済み CYP450 陽性コントロール及びアンプリチップ 陰性コントロール各 25μL を調

製済みマスターミックス A の入ったチューブに分注し、キャップを閉める。フィルター付きチップは検体及

びコントロールごとに新しいものを用いてください。

⑧ 調製済み検体、調製済み CYP450 陽性コントロール及びアンプリチップ 陰性コントロール各 25μL を調

製済みマスターミックス B の入ったチューブに分注し、キャップを閉めます。フィルター付きチップは検体

及びコントロールごとに新しいものを用いてください。調製済み検体及びコントロールを調製済みマスター

ミックス A 及び B に分注したら、15 分以内に増幅を開始してください。

⑨ 残った調製済み検体は2~8℃で1週間又は-20℃で1ヵ月間まで保存可能です。凍結融解は3回まで可

能です。

6/15

(3) 増幅

① Gold 96-well GeneAmp PCR System 9700 をアンプリチップ CYP450 用として以下のとおりプログラムします。

プリサイクル

プリサイクル

50℃で2分間

95℃で 10 分間

サイクル 1~35 95℃で 20 秒間、67℃で4分間

ポストサイクル 72℃で7分間

ポストサイクル 4℃でホールド

ユーザー名と Method 名を入力する。Gold 96-well GeneAmp PCR System 9700 の取扱説明書をご

参照ください。

② トレイと Retainer をサーマルサイクラーにセットし、全てのチューブがしっかりとキャップされていることを確

認します。

③ METHOD プログラムを開始します。“Method Options”画面で“Ramp Speed”を“Max”、“Reaction Volume”

を“100μL”にセットします。START を再度押します。プログラム終了まで約3時間 30 分を要します。

④ 72℃のポストサイクルを含む増幅が終了したら、トレイをサーマルサイクラーから取り出し、MicroAmp Base

に置きます。必要な場合は、チューブは増幅終了後、サーマルサイクラー内に4℃で 18 時間まで置いて

おくことができます。サーマルサイクラーからチューブを取り出してから 30 分以内に増幅産物の断片化を

行わない場合は、増幅トレイを-20℃保存してください。

(4) 増幅産物の断片化及び標識

① 1.試薬の調製方法 (2)にしたがって調製済み断片化ミックスを使用直前に調製し、氷冷してください。

② 新しいトレイと Retainer を用意し、必要な反応チューブをトレイにセットし(1 検体又はコントロールにつき1

チューブが必要)、断片化用トレイを Retainer で固定します。増幅産物を-20℃保存した場合、常温で完

全に融解してから使用してください。

③ 調製済みマスターミックス A のチューブのキャップを開けます。増幅産物のエアロゾルが発生しないよう、

慎重に開けてください。ピペッティングを3回繰り返して増幅産物をゆっくり混和し、トレイのチューブに増

幅産物8μL を分注します。

④ 調製済みマスターミックス B のキャップを開けます。増幅産物のエアロゾルが発生しないよう、慎重に開け

ます。ピペッティングを3回繰り返して増幅産物をゆっくり混和し、断片化用トレイの調製済みマスターミック

ス A の増幅産物が分注されたチューブに調製済みマスターミックス B の増幅産物8μL を分注します。

⑤ 調製済み断片化ミックス8μL を各チューブに加えます。ピペッティングを3回繰り返して増幅産物をゆっく

り混和し、キャップを閉めます。

⑥ 直ちに断片化用トレイ/Retainer を以下のとおりプログラムされた Gold 96-well GeneAmp PCR System

9700 にセットします。

プリサイクル 25℃で 20 分間

プリサイクル 95℃で 10 分間

プリサイクル 4℃でホールド

ユーザー名と Method 名を入力します。Gold 96-well GeneAmp PCR System 9700 の取扱説明書をご参照

ください。METHOD プログラムを開始します。“Method Options”画面で“Ramp Speed”を“Max”、

“Reaction Volume”を“24μL”にセットします。START を再度押します。プログラム終了まで約 40 分を要し

ます。

この反応における反応時間と熱負荷による不活化は重要な過程であるため、ヒートブロックを用いて行わ

ないでください。

⑦ 断片化が終了したら、1. 試薬の調製 (3)にしたがい、調製済み標識用ミックスを調製します。

7/15

⑧ 断片化用トレイをサーマルサイクラーから取り出し、増幅用ベースに置きます。

⑨ チューブのキャップを増幅産物のエアロゾルが発生しないよう慎重に外し、調製済み標識用ミックス 10μL

を分注します。ピペッティングを3回繰り返してゆっくりと混和した後、新しいキャップを付けます。

⑩ 直ちに断片化用トレイ/Retainer を以下のとおりプログラムされた Gold 96-well GeneAmp PCR System

9700 にセットします。

プリサイクル 37℃で 35 分間

プリサイクル 95℃で5分間

プリサイクル 4℃でホールド

ユーザー名と Method 名を入力する。Gold 96-well GeneAmp PCR System 9700 の取扱説明書をご参照く

ださい。METHOD プログラムを開始します。“Method Options”画面で“Ramp Speed”を“Max”、“Reaction

Volume”を“34μL”にセットします。START を再度押します。プログラム終了まで約 45 分を要します。

⑪ 標識が終了したら、断片化用トレイをサーマルサイクラーから取り出し、増幅用ベースに置きます。ハイブリ

ダイゼーションを行うまで、トレイを2~8℃で保存します(18 時間まで可能)。18 時間以内にハイブリダイゼ

ーションを行わない場合、トレイは-20℃で保存してください。標識した断片化増幅産物は-20℃で1週

間まで保存可能です。

(5) ハイブリダイゼーション

ヒートブロックを 95℃にセットし、氷冷浴を用意しておきます。

① 1.試薬の調製方法 (4)~(6)にしたがってハイブリダイゼーション緩衝液、染色試液及び洗浄液を調製しま

す。

② 検体及びコントロールの数に応じた 1.5 mL チューブを用意し、試料番号を記載し、ハイブリダイゼーション

緩衝液 500μL を各チューブに分注します。

③ 標識した断片化増幅産物をピペットにてよく混和後、対応する②のチューブに標識した断片化増幅産物

20μL を分注し、キャップをして試験管ミキサーを用いて 10 秒間混和します。標識した断片化増幅産物を

-20℃保存した場合、室温で完全に融解してから使用してください。

④ ヒートブロックを用いて 95℃で 10 分間インキュベーションする。インキュベーション終了後、直ちにチュー

ブを氷冷浴に入れます。

⑤ 検体及びコントロールの数に応じて別の 1.5 mL チューブを用意し、染色試液 500μL を分注します。

⑥ アンプリチップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕を検体及びコントロールの数だけ用意します。

(6) GeneChip Fluidics Station の準備及び操作

機器の詳細な操作法、エラーメッセージ、ユーザー情報等については、GCOS 又は AMDS 用の各ユーザーズ

ガイドを参照してください。

① ワークステーションのコンピュータにログインし、GCOS v1.1.3 以上又は AMDS v1.0 以上を立ち上げる。

GeneChip Fluidics Station 450Dx のスイッチを入れます。

(7)ハイブリダイゼーション及び染色

① ハイブリダイゼーション緩衝液と変性した標識した断片化増幅産物を含むチューブを GeneChip Fluidics

Station 450Dx の Position 1に、染色試液を含むチューブを GeneChip Fluidics Station 450Dx の Position

2に置きます。

② ハイブリダイゼーション及び染色が終了したら、Washblock door を閉じる前に GeneChip Fluidics

Station からアンプリチップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕を取り出します。アレイウインド

ーに気泡がないか目視確認します。気泡がある場合は、アンプリチップ CYP450 マイクロアレイ

〔CYP450 Array〕を再度挿入し、washblock door を閉めます。GeneChip Fluidics Station 450Dx が自

動的に洗浄液をアンプリチップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕に満たします。詳細は機器

の取扱説明書に従ってください。

(8) アンプリチップ CYP450 マイクロアレイのスキャニング

① アンプリチップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕から液漏れしないよう、Tough-Spots ラベルをアン

プリチップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕の背面の 2 つの Septa に貼り、穴が平らにふさがるよう

に押します。

② アンプリチップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕をGeneChip Scanner Autoloaderに置きます。ハイ

ブリダイゼーション及び染色したアンプリチップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕を 30 分以内に

GeneChip Scanner Autoloader にセットしない場合は、2~8℃で遮光保存してください。染色したアンプリ

チップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕は2~8℃、暗所で1週間保存可能です。アンプリチップ

CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕のデータ解析は、ハイブリダイゼーションを操作するコンピュータ

及びアンプリチップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕をスキャニングするコンピュータと同じコンピ

ュータで行ってください。

③ 以下の操作により、アンプリチップ CYP450 マイクロアレイ〔CYP450 Array〕をスキャニングします 。

GCOS v1.1.3 以上と AmpliChip CYP450_US Data Analaysis Software v2.1 を用いる場合

(a) GCOS v 1.1.3 以上のユーザーインターフェース上でスキャニング機能を開始します。

(b) アンプリチップ CYP 450 マイクロアレイ〔 C YP450 Array 〕のスキャンが成功しない場合は、ア

ンプリチップ CYP 450 マイクロアレイ〔 CYP450 Array 〕を拭いてから再度挿入し、

のボックスを選択してから“ OK ”ボタンを押してスキャンを試みます。スキャンごとに別々の

CEL ファイルが作成されます。

(c) 結果報告を見るために、以下のステップを順次踏みます。

ステップ1: AmpliChip CYP450_US Data Analaysis Software v2.1 を開きます。

ステップ2: CEL ファイルを選んでデータ解析を開始します。

ステップ3: 結果が表示されます。

各検体及びコントロールごとに結果とレポートファイルが作成されます。カスタマイズや結果の印刷な

どについては AmpliChip CYP450 Test Data Analysis Software の取扱説明書をご参照ください。

AMDS v1.0 以上と AmpliChip CYP450_US Data Analaysis Software v3.1 を用いる場合

(a) スキャニングを開始する前に、AmpliChip CYP450 Test Data Analaysis Software v3.1 以上内の

Additional Information Window 又は Batch Information Window から結果が必要な項目(CYP2D6のみ、

CYP2C19 のみ、CYP2D6と CYP2C19 の両方)を選択します。

(b) AMDS v1.0 以上のユーザーインターフェース上でスキャニング機能を開始します。

(c) スキャニング後、結果は自動的に Report 画面に表示されます。

各検体及びコントロールごとに結果とレポートファイルが作成されます。カスタマイズ や結果の印刷など

については AMDS の取扱説明書をご参照ください。

**

【測定結果の判定法】

1. 結果の計算

アンプリチップ CYP450 のデータ解析ソフトでは、プローブセルの蛍光強度パターンを分析することで、特異

的な多型サイトにおけるジェノタイプを決定します。その多型サイトにおけるジェノタイプを組み合わせにより、

対応する CYP2D6及び CYP2C19 のアリルが同定されます。結果には、CYP2D6及び CYP2C19 遺伝子のジ

ェノタイプと予測されるフェノタイプ(表現型)が報告されます。

8/15

2. 結果の表示

各コントロールについて以下の結果が得られた場合、測定は有効です。

コントロール

アンプリチップ 陰性コントロール

〔A-CHIP (-)C〕

アンプリチップ CYP450 陽性コントロール

〔CYP450 (+)C〕

CYP2D6の結果

No Call

*

4/

*

41

CYP2C19 の結果

No Call

*

1/

*

測定が無効である場合は全ての過程(増幅、断片化、標識、ハイブリダイゼーション及びスキャン)をやり直し

てください。

検体の結果は、Data Analysis Software により以下に示したアンプリチップ CYP450 で解析可能なアリルの変異型を

もとに示されます。

アンプリチップ CYP450 で解析可能な CYP2D6アリル

多型の組み合わせから CYP2D6アリル遺伝子産物の酵素活性を予測することができます

6)

。以下の表においては、

アリルとして定義される塩基変化を太字で示しました。

アリル 塩基変化

予測される

酵素活性

参 照

*

*

*

*

*

*

*

2ABD

4ABDJK

6ABC

なし

-1584G , 1039C>T, 1661G>C,

2549Adel

100C>T,

1707Tdel

2935A>C

1039C>T,

2850C>T, 4180G>C

CYP2D6遺伝子の欠損

2850C>T

1661G>C,

, 1976G>A, 4180G>C

, 4180G>C

1846G>A ,

正常

正常

活性なし

活性なし

活性なし

活性なし

活性なし

Marez et al, 1997 7)

Sachse et al, 1997

8)

Kimura et al, 1989 9)

Johansson et al, 1993

10)

Panserat et al, 1994 11)

Raimundo et al, 2000

12)

Marez et al, 1997

7)

Sakuyama et al, 2008 59)

Kagimoto et al, 1990

13)

Marez et al, 1997

7)

Sachse et al, 1997 8)

Marez et al, 1997

7)

Kagimoto et al, 1990

13)

Gough et al, 1990 14)

Hanioka et al, 1990

15)

Gaedigk et al, 1991 16)

Steen et al, 1995

17)

Marez et al, 1997 7)

Evert et al, 1994

18)

Daly et al, 1995 19)

Saxena et al, 1994

20)

Evert et al, 1994 18)

* 8

*

* 10AB

1661G>C, 1758G>T , 2850C>T, 4180G>C

2613-2615delAGA

100C>T , 1039C>T, 1661G>C, 4180G>C

活性なし

低下

低下

Broly et al, 1995 21)

Tyndale et al, 1991

22)

Broly & Meyer, 1993 23)

Yokota et al, 1993

24)

Johansson et al, 1994 25)

Sakuyama et al, 2008

59)

アリル 塩基変化

予測される

酵素活性

活性なし

参 照

*

11 883G>C , 1661G>C, 2850C>T, 4180G>C Marez et al, 1995

26)

*

*

15

17

138ins T

1023C>T , 1661G>C, 2850C>T , 4180G>C

活性なし

低下

Sachse et al, 1996

27)

Masimirembwa et al,

1996

28)

Oscarson et al, 1997 29)

*

*

*

*

*

19

20

29

35

36

1661G>C, 2539-2542delAACT ,

2850C>T, 4180G>C

1661G>C,

2850C>T, 4180G>C

1659G>A

3183G>A

-1584G,

1973insG

, 1661G>C, 2850C>T,

, 4180G>C

31G>A

, 1978C>T, 1979T>C,

, 1661G>C, 2850C>T, 4180G>C

100C>T, 1039C>T, 1661G>C, 4180G>C,

エクソン9における CYP2D7への遺伝子変換

活性なし

活性なし

低下

正常

低下

Marez et al, 1997

7)

Marez-Allorge et al,

1999 30)

Marez et al, 1997

7)

Wennerholm, et al. 2001 57)

Wennerholm, et al. 2002

58)

Marez et al, 1997 7)

Gaedigk et al, 2003

55)

Wang, 1992 31)

Johansson et al, 1994

25)

Leathart et al, 1998 32)

*

40

1023C>T, 1661G>C,

1863ins(TTT CGC CCC)2; 2850C>T, 4180G>C

活性なし Gaedigk et al, 2002

33)

*

*

*

*

*

*

41

1XN

2XN

4XN

10XN

17XN

-1584C, 1661G>C, 2850C>T, 4180G>C duplicate active

*

1 genes

(n is not determined-range 2-13) duplicate active

*

2 genes

(n is not determined-range2-13) duplicate inactive * 4 genes (n is not determined) duplicate partially active

(n is not determined)

*

10 genes duplicate partially active

*

17 genes

(n is not determined) duplicate active * 35 genes (n is not determined)

低下

増加

増加

活性なし

低下

低下

Raimundo et al, 2000

12)

Raimundo et al, 2004 34)

Toscano et al, 2006

60)

Rau et al, 2006 61)

Dahl et al, 1995

35)

Sachse et al, 1997 8)

Johansson et al, 1993

10)

Dahl et al, 1995 35)

Aklillu et al, 1996

62)

Lovlie et al, 1997 36)

Sachse et al, 1998

37)

Garcia-Barcelo et al,

2000

38)

Ji et al, 2002

39)

Mitsunaga et al, 2002

40)

Ishiguro et al, 2004

41)

Cai et al, 2006

42)

Gaedigk et al, 2007

43)

Gaedigk et al, 2007 43) * 35XN 増加

* 41XN duplicate partially active

(n is not determined)

*

41 genes

低下 Candiotti et al, 2005 44)

*検体が、表に示したアリルを保有していない場合、”No Call”もしくは、表に記載されているアリルに最も類似

するアリルを表示します。

9/15

アリルの表、Site 及び Call のリストは Data Analysis Software により示されます。Site 及び Call のリストはヌクレオチド

位置と塩基変化だけでなく多型 Call により定義された多型を示します。アリルの表、Site 及び Call のリストについて

は AmpliChip CYP450_US Data Analysis Software の取扱説明書をご参照ください。

WT

HET

ホモ接合の野生型

ヘテロ接合

MUT

No Call

Positive

Negative

ホモ接合の変異型

No call の場合

示された突然変異が存在する場合

示された突然変異が存在しない場合

予測される CYP450 2D6の代謝活性

2つの CYP2D6アリルによりコードされる酵素の活性の組み合わせは、個人の代謝活性全体を決定します。これらの

組み合わせを以下の表に示します。代謝活性には4種のフェノタイプ(poor metaborizer、intermediate metabolizer、 extensive metabolizer、ultrarapid metabolizers)があります。CYP2D6及び CYP2C19 遺伝子により示されるジェノタイ

プに基づいて予測されるフェノタイプは Data Analysis Software により示されます。

ア リ ル 1

10

11

15

35

36

40

41

17

19

20

29

2 3

E E E

E E

P

E:Extensive metabolizer

I:Intermediate metabolizer

P:Poor metabolizer

U:Ultrarapid metabolizer

E

E

P

P

5 6 7 8

E

E

P

P

P

E

E

P

P

P

E

E

P

P

P

P P P

P P

P

E

E

P

P

P

15

I

I

P

P

P

P

P

E

E

P

P

P

11

P

I

I

P

P

P

E

E

P

P

P

10

I

I

I

I

I

E

E

I

I

I

I

I

I

I

E

E

I

I

I

19

I

I

P

P

P

P

P

E

E

P

P

P

I

P

17

I

I

I

I

I

I

I

E

E

I

I

I

I

29

I

I

I

I

I

I

I

E

E

I

I

I

I

I

I

I

20

I

I

P

P

P

P

P

E

E

P

P

P

I

P

P

35

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

41

I

I

I

I

I

I

I

E

E

I

I

I

I

I

E

I

I

I

I

I

36 40

I

I

I

I

I

I

I

E

E

I

I

I

I

I

I

I

E

I

P

E

I

I

P

P

I

P

P

I

I

P

P

P

E

E

P

P

P

2XN

E

E

E

E

E

E

E

U

U

E

E

E

U

E

E

E

E

E

E

E

1XN

E

E

E

E

E

E

E

U

U

E

E

E

U

E

E

E

E

E

E

E

4XN

P

P

I

I

P

P

P

E

E

P

P

P

E

I

P

I

I

P

P

I

10XN

I

I

I

I

I

I

I

E

E

I

I

I

I

I

E

I

I

I

I

I

17XN

I

I

I

I

I

I

I

I

I

E

E

I

I

I

E

I

I

I

I

I

41XN

I

I

I

I

I

I

I

I

I

E

E

I

I

I

E

I

I

I

I

I

35XN

E

E

E

E

E

E

E

U

U

E

E

E

U

E

E

E

E

E

E

E

10/15

アンプリチップ CYP450 で解析可能な CYP2C19 アリル

以下の表に示した典型的な多型の有無により CYP2C19 アリルが決定し、遺伝子産物の可能性のある酵素活性が

予測されます

45)

。アリルとして定義される塩基変化を太字で示しました。

アリル

*

*

*

塩基変化

なし

681G>A

636G>A

予測される CYP450 2C19 の代謝活性

予測される酵素活性

正常

活性なし

活性なし

参照

Romkes et al, 1991

46)

Richardson et al, 1995 47)

Blaisdell et al, 2002 48) de Morais et al, 1994 49)

Ibeanu et al, 1998

50)

Fukushima-Uesaka et al, 2005

63)

Lee et al, 2009 64) de Morais et al, 1994

51)

Fukushima-Uesaka et al, 2005 63)

2つの CYP2C19 アリルによりコードされる酵素の活性の組み合わせは、個人の代謝活性全体を決定します。これら

の組み合わせを以下の表に示します。代謝活性には2種のフェノタイプ(poor metaborizer、extensive metabolizer)

があります。

アリル

E:Extensive metabolizer

E

P:Poor metabolizer

E

P

E

P

P

アリル頻度の地理的分布

CYP2D6及び CYP2C19 遺伝子の多型性は地理的に異なった起源の人々の間では同等に分布されておらず、い

くつかの多型とアリルは人種の分布と事実上同一です。白人の約7%は CYP2D6 poor metaborizer であるが、アジ

ア人の約1~2%とアフリカ系アメリカ人の約2~4%のみが CYP2D6 poor metaborizer です

8), 52)

。しかし、アジアに

おける CYP2D6

*

10 アリル(アリルの頻度 50%)、アフリカ住民における CYP2D6

*

17 及び CYP2D6

*

29(各約 30%)

といったような活性を低下させる数種のアリルが存在し、低い酵素活性により intermediate metabolizer を高い割合で

もたらします。極度に低い活性や ultrarapid metabolizer のフェノタイプが個々の薬物の反応に最も大きく影響します

が、ある種の薬物ではintermediate metabolizerで異なる反応を示します

53)

。対照的に、エチオピア人の約29%、南ヨ

ーロッパ人の約 10%及び北ヨーロッパ人の約1~2%は遺伝的に CYP2D6遺伝子重複による ultrarapid metabolizer

です

52)

。CYP2C19 の poor metabolizer の大多数は CYP2C19

*

2及び CYP2C19

*

3の 2 アリルにより説明できます。こ

れらのアリルはいずれも単一ヌクレオチドの多型により起こり、スプライス部位の欠損又は停止コドンを引き起こしま

す。これらのアリルはアジアでは人口の約 13~23%と一般的であり、フェノタイプとして poor metabolizer を示します。

CYP2C19 の poor metabolizer は日本人では約 17%

56)

、白人及びアフリカ系アメリカ人の約3~5%を占めます

54)

CYP2D6及び CYP2C19 アリルの頻度の推定を表5及び6に示します。また、日本人における CYP2C19 アリルの頻

度の推定を表7に示します。

表5:地理的違いによる CYP2D6アリルの頻度

52)

アリル

増加

増加

なし

低下

低下

なし

低下

低下

低下

低下

低下

予測される

酵素活性

正常

正常

なし

なし

なし

日本人 中国人 白人 黒人 アメリカインディアン

* 17

*

29

*

41

* 1XN

* 2XN

*

4XN

*

10XN

* 41XN

* 5

*

*

* 10

* 1

*

*

* 4

37%

16%

0%

<1%

3~6%

0%

0%

38~40%

0%

0%

0%

<1%

<1%

0%

3%

0%

28%

16%

0%

2~3% 17~19%

5~6%

0%

0%

57%

0%

0%

2~4%

<1%

<1%

0%

1%

<1%

35%

29%

1%

3%

<1%

2~3%

3~5%

<1%

<1%

7~14%

<1%

1~3%

<1%

<1%

<1%

注:アリルの頻度の割合の幅は公表された研究結果を元に記載。

表6:地理的違いによる CYP2C19 アリルの頻度

54)

25~42% 60%

23~33% 20~33%

<1%

3~7%

6~7%

<1%

3~11%

1~2%

<1%

<1%

4~6%

12~21%

7%

3%

0~3%

0%

3~6%

0~1%

0%

0%

3%

2%

1~4%

0%

0%

2~3%

2~3%

<1%

<1%

0%

北アフリカ

12%

28%

0%

12%

3%

0%

0%

0%

8%

0%

8%

0%

28%

0%

0%

0%

西アフリカ

アリル 予測される酵素活性 中国

* 1

*

正常

なし

58%

35%

*

なし 7%

また、日本人における CYP2C19 アリルの頻度の推定を表7に示します。

黒人

83%

16%

<1%

表7:日本人における CYP2C19 アリルの頻度

56)

アリル 予測される酵素活性 日本人

*

* 2

正常

なし

* 3

アンプリチップ CYP450 で解析不可能なアリル

なし

以下に示したいくつかの CYP2D6及び CYP2C19 アリルについては、本品では解析できません。

CYP2C19: 4~28

58%

28%

14%

CYP2D6: 12~14、16、18、21~28、30~34、37~39、42~80

また、新しいアリルは現在の AmpliChip CYP450_US Data Analysis Software では正しく解析できません。

白人

86%

13%

<1%

42%

12%

0%

6~7%

4~6%

0%

0%

4~5%

6~18%

9~12%

2~6%

0%

2~4%

7~14%

0%

0%

11/15

3. 結果の判定に関する注意

(1) 本キットは EDTA 入り採血管で採取した全血検体のみ測定可能です。これ以外の検体を用いた場合、誤った測

定結果を得るか、結果が得られないことがあります。

(2) 信頼のできる結果を得るには、適切な検体の採取、搬送、保存及び操作方法を行ってください。

測定結果に基づく臨床診断は、臨床症状やほかの検査結果等と伴わせて担当医師が総合的に判断してください。

【臨床的意義】

解析した CYP2D6及び CYP2C19 のジェノタイプに基づいて、CYP2D6及び CYP2C19 の薬物代謝酵素活性を予測し、

その予測結果に基づき薬物治療を行う際の補助として用いることができます。

【性能】

1. 性能

(1) 性能試験

試験対象となるキットを用いて、「アンプリチップ 陰性コントロール」及び「アンプリチップ CYP450 陽性コントロ

ール」、ゲノムDNA試料「GM07439」及び「GM09912」についてそれぞれ2重測定し、それぞれの試料の結果が

いずれも以下のとおりであることを確認します。

① アンプリチップ 陰性コントロール:CYP2D6及びCYP2C19のいずれもNo Callの結果を得ます。

② アンプリチップ CYP450 陽性コントロール:CYP2D6は

* 4/ * 41、CYP2C19は * 1/ * 2の結果を得ます。

③ ゲノムDNA試料「GM07439」:CYP2D6は * 4XN/ * 41、CYP2C19は * 2/ * 2の結果を得ます。

④ ゲノムDNA試料「GM09912」:CYP2D6は * 4/ * 5、CYP2C19は * 1/ * 1の結果を得ます。

(2) 最小検出感度

CYP2D6:25 ng DNA

CYP2C19:2.5 ng DNA

2. 相関性試験成績

【操作上の注意】の項、「4. 反応特異性」に示した試料を用いて、本品の結果と、PCR-RFLP 法(RFLP:

Restriction Fragment Lenghth Polymorphism、制限酵素断片長多型測定)、AS-PCR 法(Allele Specific

PCR)と PCR-RFLP 法を組み合わせた方法、DNA 塩基配列決定法、DNA 塩基配列決定法と AS-PCR 法を

組み合わせた方法のいずれかの結果を比較しました。その結果、他法との一致率は CYP2D6 遺伝子 99.1%

(418/422)、CYP2C19 遺伝子は 100%(398/398)、でした(表8、9)。

表8 CYP2D6アリルの解析の比較

試料数 Correct Call 数 Miscall 数

301 299 0

No Call 数

一致率

99.3% AS-PCR

AS-PCR と

PCR-RFLP

PCR-RFLP

DNA 塩基配列決定

DNA 塩基配列決定と

AS-PCR

DNA 塩基配列決定と

PCR-RFLP

PCR サイズのみ

合計

14

40

41

21

422

14

40

40

21

418

100.0%

100.0%

97.6%

100.0%

50.0%

100.0%

99.1%

12/15

表9 CYP2C19 アリルの解析の比較

PCR-RFLP

DNA 塩基配列決

定と PCR-RFLP

試料数 Correct Call 数

276 276

122 122

Miscall 数

No Call 数

一致率

100.0%

100.0%

合計 398

【使用上又は取り扱い上の注意】

1.

取り扱い上(危険防止)の注意

398 0 0 100.0%

(1) 増幅反応の準備は、紫外線照射装置の装備されたクリーンベンチ内で行ってください。ピペットなどは常にこ

のクリーンベンチ内に置いてください。

(2) 増幅反応を準備するエリアには増幅後の DNA を持ち込まないでください。また、検体の分注には疎水性フィ

ルター付きピペットと使い捨てチップを使用してください。

(3) 本キットを取り扱う時には使い捨てチップ及びピペットなどを使用し、微生物や核酸分解酵素のコンタミネーシ

ョンを避けてください。

(4) 検体及び本キットを取り扱う時には使い捨てゴム手袋、実験着、保護眼鏡を着用して操作してください。また、

取り扱い後は手をよく洗ってください。

(5) 検体は HIV、HBV、HCV などのウイルスによる感染の危険性があるものとして取り扱い、検体又は検査に使用

した器具類は高圧蒸気滅菌器を用いて 121℃で 20 分間以上加熱滅菌処理をするか、次亜塩素酸剤(有効塩

素濃度 5,000 ppm、 0.5%)に1時間以上浸すなどにより消毒してください。これらの作業中は、じゅうぶんに換

気を行ってください。

(6) ピペットは口で吸わないでください。

(7) 検体及び本キットを取り扱う場所では飲食又は喫煙をしないでください。

(8) キットの試薬を取り扱う際には保護眼鏡、実験着及び使い捨てゴム手袋を着用し、試薬が皮膚、目、粘膜など

に触れないように注意してください。もし、このようなことが起きた場合は、大量の水でじゅうぶんに洗い流し、

必要があれば医師の手当てなどを受けてください。

(9) 試薬をこぼした場合には、水でよく希釈してから拭き取ってください。

2. 使用上の注意

(1) ロットの異なる試薬又は残った試薬を混ぜ合わせて使用しないでください。

(2) ロット又は同一ロットでバイアルの異なるコントロールを混ぜ合わせて使用しないでください。

(3) 期限切れの試薬は使用しないでください。判定結果の信頼性を保証しかねます。

(4) すべての構成試薬は2~8 ℃で保存してください。これらの構成試薬は開封後2~8℃で6ヵ月間(有効期間

内)まで保存可能です。

(5) アンプリチップ CYP450 マイクロアレイはプラスチック製カートリッジ上の正方形のガラス製マイクロアレイです。

ガラス表面の傷や汚れは誤測定の原因となります。指で直接ガラスを触らないでください。また、ローション、イ

ンクや綿くずは蛍光を発します。ガラス表面が明らかに汚れている場合は、精製水を用いて慎重に洗浄してく

ださい。

(6) 洗浄液は調製後 15~30℃で保存してください。また、20 mmol/L EDTA 溶液及びハイブリダイゼーション緩衝

液は調製後2~8℃で保存してください。染色試液は2~8℃で遮光保存してください。10% Triton X-100 溶

液は 15~30℃で遮光保存してください。これらの試薬は調製後6ヵ月まで保存可能です。

3. 廃棄上の注意

(1) 使用後の容器を廃棄する場合には廃棄物に関する規定に従って医療廃棄物又は産業廃棄物など区別

して処理してください。また、これらを廃棄する場合には、各都道府県によって定められた規定に従ってく

ださい。

(2) ピペットの専用化及び次亜塩素酸剤(有効塩素濃度 5,000 ppm、0.5%)による器具、実験台の清掃など

を徹底してください。

(3) 検体を取り扱う際に使用した器具類は高圧蒸気滅菌器を用いて 121°C で 20 分間加熱して滅菌するか、

次亜塩素酸剤(有効塩素濃度 5,000 ppm、0.5%)に1時間以上浸すなどにより消毒した後廃棄してくださ

い。これらの作業中には、じゅうぶんに換気を行ってください。

(4) アンプリチップ CYP450 マスターミックス、アンプリチップ CYP450 プライマーミックス A、アンプリチップ

CYP450 プライマーミックス B、アンプリチップ マグネシウム試液、アンプリチップ B1 オリゴヌクレオチド

試液、アンプリチップ CYP450 陽性コントロール、アンプリチップ 陰性コントロール、5% アジ化ナトリウ

ム、ハイブリダイゼーション緩衝液、染色液及び洗浄液はアジ化ナトリウムを含んでいます。アジ化ナトリ

ウムは鉛管、銅管と反応して爆発性の金属アジドを生成するので、これらの試薬を廃棄する際には大量

の水で洗い流してください。

(5) 遺伝子検査後の核酸試料及び増幅された DNA の廃棄は、次亜塩素酸剤(有効塩素濃度 5,000 ppm、

0.5%)に混和後一晩放置するなど、DNA を破壊してから廃棄してください。

(6) DNA を扱ったピペットチップ及びプラスチック容器などは、次亜塩素酸剤(有効塩素濃度 5,000 ppm、

0.5%)に一晩浸すなどにより DNA を破壊してから、焼却処理又は密閉できるビニ-ル袋を2重に施し、

医療廃棄物として処理してください。

(7) DNA 試料を含む溶液は、次亜塩素酸剤(有効塩素濃度 5,000 ppm、0.5%)に混和後一晩放置するなど、

DNA を破壊してから、各都道府県によって定められた規定に従って廃液処理してください。

【貯蔵方法・有効期間】

1. 貯蔵方法

2~8℃で保存

2. 有効期間

構成試薬の有効期間

アンプリチップ CYP450 マスターミックス

アンプリチップ CYP450 プライマーミックス A

アンプリチップ CYP450 プライマーミックス B

アンプリチップ マグネシウム試液

アンプリチップ TdT 標識試液

15 ヵ月

15 ヵ月

15 ヵ月

12 ヵ月

16 ヵ月

アンプリチップ B1 オリゴヌクレオチド試液

アンプリチップ CYP450 マイクロアレイ

アンプリチップ CYP450 陽性コントロール

アンプリチップ 陰性コントロール

12 ヵ月

12 ヵ月

12 ヵ月

12 ヵ月

キットの有効期限

各ロットに含まれる各構成試薬の有効期限のうち、最短のものをキットの有効期限とします。

【包装単位】

アンプリチップ CYP450 24 テスト

(各構成試薬の詳細につきましては、【形状・構造等(キットの構成)】を参照してください)

**

【主要文献】

1) Fodor, S.P.A. et al. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Scinece. 1991, 251, p.767~773.

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