Gram Safranin - Thermo Scientific

Gram Safranin - Thermo Scientific
INTERPRETATION
Gram-positive organisms stain purple.
Gram-negative organisms stain red.
GRAM SAFRANIN
(English)
INTENDED USE
Remel Gram Safranin is a reagent recommended for use in qualitative
procedures to differentiate gram-negative from gram-positive organisms.
SUMMARY AND EXPLANATION
The Gram stain method was developed in 1884 by the Danish bacteriologist,
Christian Gram, to differentiate bacterial cells from infected tissue.1 Later it was
discovered that the bacterial cell wall composition was the key to the Gram
stain and would differentiate bacteria into two groups based on cell color after
staining. Since that time there have been many modifications of the original
technique.2,3
PRINCIPLE
The primary stain is crystal violet, a basic dye taken up by all bacteria due to its
ability to rapidly permeate the cell wall. It stains the protoplast of bacteria
purple. The potassium-iodine mixture is the mordant which complexes with the
primary stain in the cell. In gram-positive cells, the crystal violet-iodine complex
is trapped in the cell due to a decrease in cell wall permeability caused by
alcohol dehydration. Gram-positive cells are stained purple. In gram-negative
cells, the complex is removed by the decolorizer due to an increase in
permeability caused by solubility of the lipids in alcohol. The counterstain used
must be a contrasting color to the primary stain and, in this case, it is safranin
which stains gram-negative cells red.
REAGENTS (CLASSICAL FORMULA)*
Safranin (CAS 477-73-6) ............................................................................ 2.5 g
Ethyl Alcohol 95% (CAS 67-17-5) .......................................................... 100.0 ml
Demineralized Water (CAS 7732-18-5) .................................................. 900.0 ml
QUALITY CONTROL
All lot numbers of Gram Safranin have been tested and found to yield
acceptable stain results as listed in the Interpretation section. Positive and
negative control slides should be tested prior to use of new lot numbers of
stains and decolorizing reagent and at least weekly thereafter. If aberrant
quality control results are noted, patient results should not be reported.
LIMITATIONS
1.
Test positive and negative controls with each new lot number of stains
and weekly thereafter to verify reagent efficacy and ensure that
decolorization procedure is performed correctly.5
2.
Remove clinical specimen isolates from an 18-24 hour culture growing on
nonselective medium, to obtain the most reliable results.5
3.
Do not overheat smears when fixing slides. Excessive heating will cause
atypical staining.5,6
4.
Gram-positive organisms contained in a specimen may appear gramnegative if the patient is on antimicrobial therapy.5
5.
Precipitated crystal violet can appear as coccoid shapes or fungal
elements, as well as other artifacts or background material.5
BIBLIOGRAPHY
1.
Bartholomew, J.W. and T. Mittwer. 1952. Bacteriol. Rev. 16:1-29.
2.
Mittwer, T., J.W. Bartholomew, and B.J. Kallman. 1950. Stain Technol.
25:169-179.
3.
Bartholomew J.W. and T. Mittwer. 1951. Stain Technol. 26:231-240.
4.
Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 2007. Bailey and Scott’s
Diagnostic Microbiology. 12th ed. Mosby Elsevier, St. Louis, MO.
5.
Garcia, L.S. 2010. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed.,
American Society for Microbiology, Washington, D.C.
6.
Mangels, J.I., M.E. Cox, and L.H. Lindberg. 1984. Diagn. Microbiol. Infect.
Dis. 2:129-137.
*Adjusted as required to meet performance standards.
PRECAUTIONS
Warning! Flammable liquid and vapor. May cause eye, skin, and respiratory
tract irritation. May cause central nervous system depression. May cause liver
and kidney damage. May cause reproductive and fetal effects.
This product is for In Vitro diagnostic use and should be used by properly
trained individuals. Precautions should be taken against the dangers of
microbiological hazards by properly sterilizing specimens, containers, and
media after use. Directions should be read and followed carefully. Refer to
Material Safety Data Sheet for additional information.
STORAGE
This product is ready for use and no further preparation is necessary. Store
product in its original container at 20-25°C until used.
PRODUCT DETERIORATION
This product should not be used if (1) the color has changed from red, (2) the
expiration date has passed, or (3) there are other signs of deterioration.
SPECIMEN COLLECTION, STORAGE, AND TRANSPORT
Specimens should be collected and handled following recommended
guidelines.4,5
PACKAGING
REF R40058, Gram Safranin ................................................................ 250 ml/Btl
REF R40059, Gram Safranin ........................................................ 250 ml/Btl, 5/Pk
REF R40079, Gram Safranin ....................................................................... Gallon
Symbol Legend
REF
Catalog Number
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device
LAB
For Laboratory Use
Consult Instructions for Use (IFU)
Temperature Limitation (Storage Temp.)
LOT
Use By (Expiration Date)
EC REP
MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
(1) Loop sterilization device, (2) Inoculating loop, swabs, collection containers,
(3) Incubators, alternative environmental systems, (4) Supplemental media,
(5) Quality control organisms, (6) Gram Crystal Violet (R40052), (7) Gram
Iodine (R40056), (8) Gram Decolorizer (R40054), (9) Glass slides, (10) Bunsen
burner or slide warmer, (11) Microscope, immersion oil, (12) Staining rack,
(13) Methanol (optional).
PROCEDURE
1.
Make a thin smear of the material for study on a glass slide. Allow the
slide to air-dry completely or use a slide warmer. Fix the slide by passing
3 or 4 times through the flame of a Bunsen burner or flood the smear with
methanol and allow it to evaporate.
2.
Place the slide on a staining rack and overlay with Gram Crystal Violet for
1 minute.
3.
Wash thoroughly with water and overlay with Gram Iodine mordant for 1
minute.
4.
Flood with Gram Decolorizer until the solvent flows colorless from the
slide (10-30 seconds).
5.
Rinse with water and overlay with Gram Safranin for 30 seconds.
6.
Rinse with water and allow to air-dry.
Batch Code (Lot Number)
Authorized European Representative
Manufacturer
12076 Santa Fe Drive
Lenexa, KS 66215, USA
www.remel.com
(800) 255-6730
International: (913) 888-0939
EC REP
Remel Europe Ltd.
Clipper Boulevard West, Crossways
Dartford, Kent, DA2 6PT, UK
For technical information contact your local distributor.
CAS (Chemical Abstracts Service Registry No.)
Manufactured for Remel Inc.
IFU 40058, Revised January 03, 2014
Printed in the U.S.A.
5.
6.
GRAM SAFRANIN
(Deutsch)
ANWENDUNGSBEREICH
Remel Gram Safranin ist ein Reagens für qualitative Verfahren zur
Unterscheidung gram-negativer von gram-positiven Organismen.
ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG
Die Gram-Färbung wurde 1884 von dem dänischen Bakteriologen Christian
Gram entwickelt, um verschiedene Bakterienzellen von infiziertem Gewebe
unterscheiden zu können.1 Später wurde dann festgestellt, dass die GramFärbung durch die Zusammensetzung der bakteriellen Zellwand zustande
kommt und die Bakterien entsprechend der Anfärbung in zwei Gruppen
eingeteilt werden können. Seitdem ist das ursprüngliche Verfahren mehrfach
abgewandelt worden.2,3
TESTPRINZIP
Das primäre Färbemittel ist Kristallviolett, ein basischer Farbstoff, der sehr
schnell die Zellwand durchdringt und dadurch von allen Bakterien
aufgenommen wird. Kristallviolett färbt die Protoplasten von Bakterien
purpurrot. Als Beizmittel wird eine Kalium-Jod-Mischung verwendet, die mit
dem primären Farbstoff in den Zellen einen Komplex bildet. In gram-positiven
Zellen kommt es aufgrund von Alkoholdehydrierung zu einer Verminderung der
Zellwandpermeabilität, wodurch der Kristallviolett-Jod-Komplex in der Zelle
verbleibt. Gram-positive Zellen werden purpurrot angefärbt. In gram-negativen
Zellen kommt es aufgrund der Löslichkeit von Lipiden in Alkohol zu einem
Anstieg der Zellwandpermeabilität, wodurch der Komplex von dem
Entfärbemittel entfernt wird. Die verwendete Gegenfärbung muss eine
Kontrastfarbe zur primären Färbung hervorbringen. In diesem Fall ist Safranin
der Farbstoff, der die gram-negativen Zellen rot färbt.
REAGENZIEN (KLASSISCHE REZEPTUR)*
Safranin (CAS 477-73-6) .......................................................................... 2,5
Ethanol 95 % (CAS 67-17-5) ................................................................ 100,0
Vollentsalztes Wasser (CAS 7732-18-5) .............................................. 900,0
g
ml
ml
*An die Erfüllung der jeweiligen Leistungsstandards angepasst.
VORSICHTSMASSNAHMEN
Achtung! Flüssigkeit und Dämpfe sind entflammbar. Kann Reizungen von
Augen, Haut und Atemwegen auslösen. Kann das Zentralnervensystem
beeinträchtigen. Kann Leber und Nieren schädigen. Kann die
Fortpflanzungsfähigkeit beeinträchtigen und Föten schädigen.
Dieses Produkt ist für die Verwendung in der In-vitro-Diagnostik bestimmt und
darf nur von entsprechend geschulten Personen verwendet werden.
Mikrobiologischen Gefahren sollte vorgebeugt werden, indem Proben, Behälter
und
Transportmedien
nach
Gebrauch
sterilisiert
werden.
Die
Gebrauchsanweisung muss sorgfältig gelesen und genau befolgt werden.
Zusätzliche Informationen finden Sie im Sicherheitsdatenblatt.
LAGERUNG
Dieses Produkt ist ohne weitere Vorbereitung gebrauchsfertig. Es sollte in
seinem Originalbehälter bei 20-25°C bis zum Gebrauch aufbewahrt werden.
BEEINTRÄCHTIGUNG DER PRODUKTQUALITÄT
Dieses Produkt darf (1) bei Veränderung der roten Farbe, (2) beim
Überschreiten des Verfallsdatums und (3) beim Auftreten anderer Anzeichen
eines Qualitätsverlusts nicht mehr verwendet werden.
PROBENENTNAHME, LAGERUNG UND TRANSPORT
Die Probenentnahme und -handhabung sollte unter Berücksichtigung der
folgenden empfohlenen Richtlinien durchgeführt werden.4,5
Gründlich mit Wasser spülen und 30 Sekunden in Gram Safranin
eintauchen.
Mit Wasser abspülen und trocknen lassen.
INTERPRETATION
Gram-positive Organismen werden purpurrot angefärbt.
Gram-negative Organismen werden rot angefärbt.
QUALITÄTSKONTROLLE
Alle Chargen des Gram Safranin wurden geprüft und für tauglich befunden,
akzeptable Färbeergebnisse zu erzeugen, wie sie in Abschnitt Interpretation
aufgeführt sind. Positive und negative Kontroll-Objektträger sollten vor der
Verwendung neuer Chargen von Farbstoffen und Entfärbereagenz sowie
anschließend mindestens wöchentlich getestet werden. Treten im Rahmen der
Qualitätskontrolle abweichende Ergebnisse auf, dürfen die Patientenergebnisse
nicht verwendet werden.
BESCHRÄNKUNGEN
1.
Positive und negative Kontrollen bei jeder neuen Charge des Färbemittels
und eine Woche danach testen, um die Wirksamkeit des Reagens zu
bestätigen und um zu gewährleisten, dass das Entfärbeverfahren
ordnungsgemäß durchgeführt wird.5
2.
Die zuverlässigsten Ergebnisse werden erreicht, wenn Isolate aus
klinischen Proben einer 18-24 Stunden alten Kultur auf einem nichtselektiven Medium wachsen.5
3.
Beim Fixieren die Objektträger nicht überhitzen. Übermäßige Erwärmung
führt zu atypischen Färbeergebnissen.5
4.
In einer Probe enthaltene gram-positive Organismen können als gramnegativ erscheinen, wenn der Patient Antibiotika einnimmt.5
5.
Präzipitiertes Kristallviolett kann als kokkoide Formen oder Pilzelemente,
5
aber auch als andere Artefakte oder Backgroundmaterial erscheinen.
LITERATURANGABEN
1.
Bartholomew, J.W. and T. Mittwer. 1952. Bacteriol. Rev. 16:1-29.
2.
Mittwer, T., J.W. Bartholomew, and B.J. Kallman. 1950. Stain Technol.
25:169-179.
3.
Bartholomew, J.W. and T. Mittwer. 1951. Stain Technol. 26:231-240.
4.
Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 2007. Bailey and Scott’s
Diagnostic Microbiology. 12th ed. Mosby Elsevier, St. Louis, MO.
5.
Isenberg, H.D. 2004. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed.,
Vol. 1. ASM, Washington, D.C
6.
Mangels, J.I., M.E. Cox, and L.H. Lindberg. 1984. Diagn. Microbiol. Infect.
Dis. 2:129-137.
PACKUNGSGRÖSSE
REF R40058, Gram Safranin .................................................. 250 ml/Fläschchen
REF R40059, Gram Safranin ...................................250 ml/Fläschchen; 5/Packg.
REF R40079, Gram Safranin ....................................................... 1 Gallone (3,8 l)
Symbollegende
REF
Katalognummer
IVD
In-vitro-Diagnostikum
LAB
Für Laborgebrauch
Gebrauchsanweisung beachten
Temperaturbeschränkungen (Lagerungstemp.)
LOT
Verfallsdatum
EC REP
BENÖTIGTE MATERIALIEN (NICHT IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN)
(1) Gerät zur Sterilisation der Inokulationsschlinge, (2) Inokulation-sschlinge,
Abstrichbesteck, Probenbehälter, (3) Inkubatoren, andere Klimasysteme,
(4) zusätzliche Transportmedien, (5) Qualitätskontroll-organismen, (6) Crystal
Violet (R40052), (7) Gram Iodine (R40056), (8) Gram Decolorizer (R40054),
(9) Glas-Objektträger,
(10) Bunsen-brenner oder Objektträgerheizgerät,
(11) Mikroskop, Immersionsöl, (12) Färbegestell, (13) Methanol (optional).
VERFAHREN
1.
Das zu untersuchende Material auf einem Glas-Objektträger dünn
ausstreichen. Die Objektträger an der Luft vollständig trocknen lassen
bzw. ein Objektträgerheizgerät verwenden. Objektträger fixieren. Dazu 3
oder 4 Mal durch die Flamme eines Bunsen-brenners ziehen oder den
Ausstrich mit Methanol tränken und anschließend verdunsten lassen.
2.
Objektträger in ein Färbegestell einsetzen und eine Minute lang in Gram
Crystal Violet eintauchen.
3.
Gründlich mit Wasser auswaschen und eine Minute in Beizmittel Gram
Iodine eintauchen.
4.
Gram Decolorizer hinzugeben, bis die Farbe vom Objektträger abgelöst
ist (10-30 Sekunden).
Chargencode (Losnummer)
Autorisierte Vertretung für U-Länder
Hersteller
12076 Santa Fe Drive
Lenexa, KS 66215, USA
www.remel.com
(800) 255-6730
International: (913) 888-0939
EC REP
Remel Europe Ltd.
Clipper Boulevard West, Crossways
Dartford, Kent, DA2 6PT, UK
Bei technischen Fragen wenden Sie sich bitte an Ihren zuständigen Vertriebspartner.
CAS (Chemical Abstracts Service)
Hergestellt für Remel Inc.
IFU 40058, Überarbeitete Fassung vom 2014-01-03
Printed in the USA.
4.
5.
GRAM SAFRANIN
(Français)
APPLICATION
La safranine pour coloration de Gram de Remel est un réactif recommandé
dans le cadre des procédures qualitatives pour différencier les organismes à
Gram négatif des organismes à Gram positif.
RÉSUMÉ ET EXPLICATION
La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois, Christian Gram,
qui mit au point le protocole en 1884 pour différencier les cellules bactériennes
des tissus infectés.1 Par la suite, on a découvert que la composition de la paroi
des cellules bactériennes expliquait la coloration de Gram et permettait de
différencier les bactéries en deux groupes selon la couleur de la cellule après
coloration. Depuis, cette technique a connu de nombreuses modifications.2,3
PRINCIPE
Le violet de gentiane (ou cristal violet) sert de colorant principal ; il s’agit d’un
colorant basique absorbé par toutes les bactéries en raison de son aptitude à
pénétrer rapidement à travers la paroi cellulaire. Il colore le cytoplasme des
bactéries en violet. Le mordançage s’effectue grâce à un mélange d’iode et de
potassium qui forme un complexe avec le colorant principal présent dans la
cellule. Dans les cellules à Gram positif, le complexe violet de gentiane-iode est
piégé à l’intérieur de la cellule en raison d’une diminution de la perméabilité de
la paroi cellulaire provoquée par une déshydratation produite par de l’alcool.
Les cellules à Gram positif sont colorées en violet. Dans les cellules à Gram
négatif, le complexe est éliminé grâce à un décolorant en raison de
l’augmentation de la perméabilité provoquée par la solubilité des lipides dans
l’alcool. Le contre-colorant utilisé doit être d’une couleur contrastante par
rapport au colorant principal, dans ce cas précis, il s’agit de la safranine qui
colore les cellules à Gram négatif en rouge.
RÉACTIFS (FORMULE CLASSIQUE)*
Safranine (CAS 477-73-6) ........................................................................ 2,5
Alcool éthylique à 95 % (CAS 67-17-5) ................................................ 100,0
Eau déminéralisée (CAS 7732-18-5).................................................... 900,0
g
ml
ml
6.
INTERPRÉTATION
Les organismes à Gram positif sont colorés en violet.
Les organismes à Gram négatif sont colorés en rouge.
CONTRÔLE DE QUALITÉ
Tous les numéros de lot de safranine de Gram ont été testés et reconnus
comme offrant des résultats de coloration acceptables, comme l’indique la
section Interprétation. Les lames de contrôle, positive et négative, doivent être
testées avant l’utilisation de nouveaux numéros de lots de colorants et de
réactif décolorant puis au moins chaque semaine. En cas de résultats de
contrôle de qualité aberrants, ne pas fournir les résultats des patients.
LIMITES
1.
Tester les contrôles positifs et négatifs avec chaque nouveau numéro de
lot de colorants et, une fois par semaine par la suite, pour vérifier
l’efficacité des réactifs et s’assurer que la procédure de décoloration est
réalisée adéquatement.5
2.
Pour obtenir les résultats les plus fiables, retirer les isolats des
prélèvements d’une culture de 18-24 h poussant sur un milieu non
sélectif.5
3.
Ne pas surchauffer les frottis au moment de les fixer sur les lames. Une
chaleur excessive provoque une coloration atypique.5,6
4.
Les organismes à Gram positif contenus dans un prélèvement risquent
de se révéler négatifs si le patient suit un traitement antimicrobien.5
5.
Le cristal violet précipité peut prendre une forme coccoïde ou l’apparence
d’élements fongiques, mais aussi d’autres artéfacts ou matériaux
d’arrière-plan.5
BIBLIOGRAPHIE
1.
2.
3.
4.
*Avec compensations éventuelles pour satisfaire les normes de performance.
5.
PRÉCAUTIONS
Avertissement ! Liquide et vapeurs inflammables. Risque d’irritation de la peau,
des yeux et des voies respiratoires. Possibilité de dépression du système
nerveux central. Atteintes possibles du foie et des reins. Effets éventuels sur la
reproduction et le fœtus.
Ce produit, exclusivement destiné à un usage diagnostique in vitro, ne doit être
utilisé que par des personnes dûment formées. Il faut prendre toutes les
précautions contre les risques microbiologiques et il est indispensable de bien
stériliser les prélèvements, les récipients et les milieux après usage. Il faut lire
attentivement les instructions et les respecter scrupuleusement. Pour de plus
amples renseignements, consulter la fiche de données de sécurité.
6.
CONSERVATION
Ce produit est prêt à l’emploi ; aucune préparation supplémentaire n’est
nécessaire. Conserver ce produit dans son flacon d’origine entre 20 et 25°C
jusqu’à son utilisation.
Recouvrir jusqu’à débordement avec le décolorant pour coloration de
Gram jusqu’à ce que le solvant s’écoule en un filet clair de la lame (10 à
30 secondes).
Rincer à l’eau et recouvrir de safranine pour coloration de Gram pendant
30 secondes.
Rincer à l’eau et laisser sécher.
Bartholomew, J.W. and T. Mittwer. 1952. Bacteriol. Rev. 16:1-29.
Mittwer, T., J.W. Bartholomew, and B.J. Kallman. 1950. Stain Technol. 25:169-179.
Bartholomew J.W. and T. Mittwer. 1951. Stain Technol. 26:231-240.
Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 2007. Bailey and Scott’s
Diagnostic Microbiology. 12th ed. Mosby Elsevier, St. Louis, MO.
Isenberg, H.D. 2004. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed., Vol.
1. ASM, Washington, D.C
Mangels, J.I., M.E. Cox, and L.H. Lindberg. 1984. Diagn. Microbiol. Infect. Dis.
2:129-137.
CONDITIONNEMENT
REF R40058, Gram Safranin ...........................................................250 ml/flacon
REF R40059, Gram Safranin .......................................... 250 ml/flacon, 5/paquet
REF R40079, Gram Safranin ........................................................... Gallon (3,8 l)
Légende des Symboles
REF
Numéro de référence
IVD
Dispositif médical de diagnostic in vitro
LAB
Pour l ‘usage de laboratoire
Lire les instructions avant utilisation (IFU = mode d’emploi)
DÉTÉRIORATION DU PRODUIT
Ce produit ne doit pas être utilisé si (1) la couleur rouge a changé, (2) la date
de péremption est dépassée ou (3) d’autres signes de détérioration sont
présents.
Limites de température (stockage)
LOT
RECUEIL, CONSERVATION ET TRANSPORT DES PRÉLÈVEMENTS
Les prélèvements doivent être recueillis et manipulés conformément aux
recommandations en vigueur.4,5
À utiliser avant le (date de péremption)
EC REP
MATÉRIEL REQUIS, MAIS NON FOURNI
(1) Dispositif de stérilisation pour anses, (2) Anse à inoculation (anse de
platine), écouvillons, récipients de prélèvement, (3) Incubateurs, autres
systèmes environnementaux, (4) Milieux supplémentés, (5) organismes de
contrôle de qualité, (6) Violet de gentiane pour coloration de Gram (R40052),
(7) Iode pour coloration de Gram (R40056), (8) Décolorant pour coloration de
Gram (R40054), (9) Lames de verre, (10) Bec Bunsen ou platine chauffante,
(11) Microscope, huile à immersion, (12) Portoir à coloration, (13) Méthanol
(optionnel).
PROCÉDURE
1.
Réaliser un étalement fin (frottis) du matériau à étudier sur une lame de
verre. Laisser la lame sécher complètement à l'air libre ou utiliser une
platine chauffante. Fixer la lame en la passant 3 ou 4 fois au-dessus de la
flamme d’un bec Bunsen ou recouvrir jusqu’à débordement le frottis de
méthanol et laisser évaporer.
2.
Placer la lame sur un portoir à coloration et recouvrir de violet de
gentiane pour coloration de Gram pendant 1 minute.
3.
Rincer soigneusement à l’eau et recouvrir de mordant, iode pour
coloration de Gram, pendant 1 minute.
Code de lot (numéro)
Représentant autorisé pour l'UE
Fabricant
12076 Santa Fe Drive
Lenexa, KS 66215, USA
www.remel.com
(800) 255-6730
International: (913) 888-0939
EC REP
Remel Europe Ltd.
Clipper Boulevard West, Crossways
Dartford, Kent, DA2 6PT, UK
Pour tout support technique, contacter le distributeur local.
CAS (numéro de registre CAS)
Fabriqué pour Remel Inc.
IFU 40058, révisée le 2014-01-03
Imprimé aux États-Unis.
4.
5.
6.
GRAM SAFRANIN
(Italiano)
USO PREVISTO
La safranina Gram Remel è un reagente consigliato per l'uso nelle procedure
qualitative allo scopo di differenziare gli organismi gram-negativi da quelli grampositivi.
DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
Il metodo di colorazione di Gram fu sviluppato nel 1884 dal batteriologo danese
Christian Gram, allo scopo di differenziare le cellule batteriche dal tessuto
infetto.1 Successivamente, fu scoperto che la composizione della parete
cellulare batterica era la chiave per la colorazione di Gram e che avrebbe
differenziato i batteri in due gruppi in base al colore delle cellule dopo la
colorazione. Da allora, sono state eseguite molte modifiche alla tecnica originale.2,3
PRINCIPIO
La colorazione primaria è il cristal violetto, un colorante basico assorbito da tutti
i batteri a causa della sua capacità di penetrare rapidamente nella parete
cellulare. Esso colora di porpora il protoplasto dei batteri. La miscela di
potassio-iodio è il mordente che forma un complesso con la colorazione
primaria nelle cellule. Nelle cellule gram-positive, il complesso viola cristalloiodio viene catturato nelle cellula a causa di una diminuzione di permeabilità
della parete cellulare, provocata dalla disidratazione dell'alcol. Pertanto le
cellule gram-positive si colorano di porpora. Nelle cellule gram-negative, il
complesso viene rimosso dal decolorante a causa di un aumento di
permeabilità provocato dalla solubilità dei lipidi nell'alcol. Il colorante di
contrasto utilizzato deve essere di un colore contrastante la colorazione
primaria e, in questo caso, si tratta di safranina che colora di rosso le cellule
gram-negative.
REAGENTI (FORMULA CLASSICA)*
Safranina (CAS 477-73-6) ........................................................................ 2,5
Alcol etilico al 95% (CAS 67-17-5) ....................................................... 100,0
Acqua demineralizzata (CAS 7732-18-5) ............................................. 900,0
g
ml
ml
PRECAUZIONI
Avvertenza! Liquido e vapore infiammabili. Può causare irritazione a occhi, cute
e vie respiratorie. Può causare depressione del sistema nervoso centrale. Può
causare danni al fegato e ai reni. Può causare effetti riproduttivi e avere
ripercussioni sul feto.
Il prodotto è indicato esclusivamente per uso diagnostico in vitro e deve essere
utilizzato solo da personale competente ed esperto. Si raccomanda di adottare
le dovute precauzioni contro eventuali rischi microbiologici, sterilizzando
opportunamente dopo l'uso campioni, contenitori e terreni di coltura. Leggere
con attenzione le istruzioni contenute in questo documento e attenervisi
scrupolosamente. Per ulteriori informazioni consultare la Scheda di Sicurezza
del prodotto.
Irrigare con il decolorante Gram, finché il solvente non scorre privo di
colorazione dal vetrino (10-30 secondi).
Sciacquare con acqua e coprire con safranina Gram per 30 secondi.
Sciacquare con acqua e lasciare asciugare.
INTERPRETAZIONE
Gli organismi gram-positivi si colorano di porpora.
Gli organismi gram-negativi si colorano di rosso.
CONTROLLO QUALITÀ
Tutti i numeri di lotto di safranina Gram sono stati esaminati ed è stato
riscontrato che forniscono risultati di colorazione accettabili, come quelli
elencati nella sezione Interpretazione. I vetrini di controllo positivo e negativo
devono essere esaminati prima di utilizzare nuovi numeri di lotto di colorante e
di reagente decolorante e almeno una volta a settimana dopo l'utilizzo. Se i test
di controllo qualità forniscono risultati aberranti, i risultati ottenuti con i campioni
in esame non devono essere refertati.
LIMITAZIONI
1.
Esaminare i controlli positivi e negativi con ogni nuovo numero di lotto di
colorazioni e, settimanalmente, verificare l'efficacia e controllare che la
procedura di decolorazione venga eseguita correttamente.5
2.
Per ottenere risultati più affidabili, rimuovere gli isolati di campione clinico
da una coltura di 18-24 ore in crescita su un terreno non selettivo.5
3.
Durante il fissaggio dei vetrini non surriscaldare gli strisci. Un
riscaldamento eccessivo darà luogo ad una colorazione atipica.5,6
4.
Gli organismi gram-positivi contenuti in un campione possono apparire
gram-negativi, se il paziente sta seguendo una terapia antimicrobica.5
5.
Il cristalvioletto precipitato può apparire come forme coccoidi o elementi
fungini, nonché come artefatti o materiale di sfondo di altra natura.5
BIBLIOGRAFIA
1.
Bartholomew, J.W. and T. Mittwer. 1952. Bacteriol. Rev. 16:1-29.
2.
Mittwer, T., J.W. Bartholomew, and B.J. Kallman. 1950. Stain Technol.
25:169-179.
3.
Bartholomew J.W. and T. Mittwer. 1951. Stain Technol. 26:231-240.
4.
Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 2007. Bailey and Scott’s
Diagnostic Microbiology. 12th ed. Mosby Elsevier, St. Louis, MO.
5.
Isenberg, H.D. 2004. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed.,
Vol. 1. ASM, Washington, D.C
6.
Mangels, J.I., M.E. Cox, and L.H. Lindberg. 1984. Diagn. Microbiol. Infect.
Dis. 2:129-137.
CONFEZIONE
REF R40058, Gram Safranin .................................................. flacone da 250 mL
REF R40059, Gram Safranin ...................... flacone da 250 mL, 5 per confezione
REF R40079, Gram Safranin ................................................................... 3,8 L ca.
Legenda dei Simboli
REF
Codice numero
IVD
Dispositivo per uso diagnostico in vitro
LAB
Per uso in laboratorio
CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE
Questo prodotto è pronto per l’uso e non necessita di ulteriore preparazione.
Conservare il prodotto nel contenitore originale ad una temperatura pari a 2025°C fino al momento dell'utilizzo.
DETERIORAMENTO DEL PRODOTTO
Questo prodotto non deve essere usato se (1) il colore non è più rosso, (2) è
trascorsa la data di scadenza o (3) sono presenti altri segni di deterioramento.
PRELIEVO, CONSERVAZIONE E TRASPORTO DEI CAMPIONI
Prelevare e trattare i campioni seguendo le linee guida raccomandate.4,5
Consultare le istruzioni per l'uso (IFU)
Limitazioni per temperatura (Temp. di conservazione)
LOT
Codice lotto (Numero Lotto)
Da utilizzare entro (data di scadenza)
EC REP
Rappresentante autorizzato per l'Europa
Fabbricante
MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
(1) Dispositivo di sterilizzazione per anse, (2) ansa per inoculo, tamponi,
contenitori di prelievo, (3) termostato o sistemi per la formazione di atmosfere
modificate, (4) terreni di coltura supplementari, (5) organismi per il controllo
qualità, (6) Cristal violetto di Gram (R40052), (7) iodio Gram (R40056),
(8) decolorante Gram (R40054), (9) vetrini, (10) becco di Bunsen o riscaldatore
per vetrini, (11) microscopio, olio di immersione, (12) rack per colorazione,
(13) metanolo (opzionale).
PROCEDIMENTO
1.
Eseguire uno striscio sottile del materiale per lo studio sul vetrino.
Lasciare asciugare completamente all'aria il vetrino oppure utilizzare un
riscaldatore per vetrini. Fissare il vetrino, passando 3 o 4 volte attraverso
la fiamma di un becco di Bunsen oppure irrigare lo striscio con metanolo
e lasciarlo evaporare.
2.
Posizionare il vetrino su un rack per colorazione e coprirlo con Cristal
violetto di Gram per 1 minuto.
3.
Lavarlo completamente con acqua e coprirlo con il mordente di iodio
Gram per 1 minuto.
12076 Santa Fe Drive
Lenexa, KS 66215, USA
www.remel.com
(800) 255-6730
International: (913) 888-0939
EC REP
Remel Europe Ltd.
Clipper Boulevard West, Crossways
Dartford, Kent, DA2 6PT, UK
Per l’assistenza tecnica, rivolgersi al distributore di zona.
CAS (Numero del registro del Chemical Abstract Service)
Prodotto per Remel Inc.
IFU 40058, data ultima revisione: 2014-01-03
Stampato in U.S.A.
4.
5.
6.
GRAM SAFRANIN
(Español)
USO PREVISTO
La safranina de Gram de Remel es un reactivo de uso indicado en
procedimientos cualitativos para diferenciar entre microorganismos gramnegativos y grampositivos.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
El método de tinción de Gram fue desarrollado en 1884 por el bacteriólogo
danés Christian Gram para diferenciar células bacterianas de tejido infectado.1
Posteriormente, se descubrió que la clave de la tinción de Gram estaba en la
composición de la pared de las células bacterianas y que era posible
diferenciar las bacterias en dos grupos según el color de las células después
de la tinción. Desde entonces se han realizado numerosas modificaciones en
la técnica original.2,3
PRINCIPIO DEL ENSAYO
La tinción principal es violeta cristal, un colorante básico absorbido por todas
las bacterias debido a su capacidad de permear rápidamente en la pared
celular. Tiñe el protoplasto de la bacteria de color morado. La mezcla de
potasio y yodo es el mordiente que se combina con la tinción principal en la
célula. En las células grampositivas, el complejo violeta cristal-yodo queda
atrapado en ellas debido a una reducción en la permeabilidad de la pared
celular causada por la deshidratación con alcohol. Las células grampositivas se
tiñen de color morado. En las células gramnegativas, el complejo es eliminado
por el decolorante debido a un aumento en la permeabilidad causado por la
solubilidad de los lípidos en alcohol. La contratinción utilizada debe ser un color
que contraste con la tinción principal. En este caso se utiliza safranina, que tiñe
las células gramnegativas de color rojo.
REACTIVOS (FÓRMULA CLÁSICA)*
Safranina (CAS 477-73-6) ........................................................................ 2,5
Alcohol etílico al 95% (CAS 67-17-5) ...................................................... 100
Agua desmineralizada (CAS 7732-18-5)................................................. 900
g
ml
ml
*Ajustado según necesidades para cumplir los estándares de comportamiento.
PRECAUCIONES
¡Advertencia! Líquido y vapor inflamables. Puede irritar los ojos, la piel y las
vías respiratorias. Puede producir depresión del sistema nervioso central.
Puede producir daño hepático y renal. Puede tener efectos nocivos en la
reproducción y el feto.
Este producto es para uso diagnóstico in vitro y debe ser utilizado por personal
con la formación adecuada. Deben tomarse precauciones frente a los riesgos
microbiológicos, esterilizando correctamente las muestras, envases y medios
después de su uso. Se deben leer y seguir atentamente las instrucciones.
Consultar más información en la Hoja de Datos de Seguridad del Material.
ALMACENAMIENTO
Este producto se presenta listo para su uso y no requiere más preparación.
Almacene el producto en su envase original a una temperatura de 20 a 25°C
hasta el momento de su uso.
Cubra con decolorante de Gram hasta que el disolvente fluya incoloro del
portaobjetos (de 10 a 30 segundos).
Aclare con agua y cubra con safranina de Gram durante 30 segundos.
Aclare con agua y deje secar.
INTERPRETACIÓN
Los microorganismos grampositivos se tiñen de color morado.
Los microorganismos gramnegativos se tiñen de color rojo.
CONTROL DE CALIDAD
Todos los números de lote de safranina Gram se han analizado y se ha
determinado que ofrecían resultados de tinción aceptables, según se indica en
la sección Interpretación. Los portaobjetos de control positivo y negativo
deben analizarse antes de usar los nuevos números de lote de tinciones y de
reactivo decolorante, y al menos una vez a la semana en lo sucesivo. Si se
observan resultados anómalos en el control de calidad, no deben comunicarse
los resultados del paciente.
LIMITACIONES
1.
Pruebe el control positivo y el control negativo cada vez que reciba un
lote nuevo de tinción y, posteriormente, de forma semanal para
comprobar la eficacia del reactivo y asegurarse de realizar correctamente
el procedimiento de decoloración.5
2.
Para obtener los resultados más fiables, retire los inóculos de muestras
clínicas de un cultivo de 18 a 24 horas en un medio no selectivo.5
3.
No caliente los frotis de forma excesiva cuando fije los portaobjetos. El
calor excesivo producirá una tinción atípica.5,6
4.
Los microorganismos grampositivos contenidos en una muestra pueden
parecer gramnegativos si el paciente está recibiendo terapia
antimicrobiana.5
5.
Puede aparecer violeta de metilo precipitado con forma de coco o
elementos fúngicos, así como otros artefactos o material de fondo.5
BIBLIOGRAFÍA
1.
Bartholomew, J.W. and T. Mittwer. 1952. Bacteriol. Rev. 16:1-29.
2.
Mittwer, T., J.W. Bartholomew, and B.J. Kallman. 1950. Stain Technol.
25:169-179.
3.
Bartholomew J.W. and T. Mittwer. 1951. Stain Technol. 26:231-240.
4.
Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 2007. Bailey and Scott’s
Diagnostic Microbiology. 12th ed. Mosby Elsevier, St. Louis, MO.
5.
Isenberg, H.D. 2004. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd
ed., Vol. 1. ASM, Washington, D.C
6.
Mangels, J.I., M.E. Cox, and L.H. Lindberg. 1984. Diagn. Microbiol. Infect.
Dis. 2:129-137.
PRESENTACIÓN
REF R40058, Gram Safranin .......................................................... 250 ml/frasco
REF R40059, Gram Safranin ........................... 250 ml/frasco, 5 unidades/envase
REF R40079, Gram Safranin ........................................................................Galón
Símbolos
REF
Número de catálogo
IVD
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
LAB
Para uso en laboratorio
Consultar las instrucciones de uso (IFU)
DETERIORO DEL PRODUCTO
Este producto no se debe usar si (1) el color ha cambiado y ya no es rojo, (2)
se ha sobrepasado la fecha de caducidad o (3) hay otros signos de deterioro.
Límite de temperatura (de almacenamiento)
LOT
OBTENCIÓN, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS
Las muestras se deben usar y manipular de acuerdo con las siguientes
recomendaciones.4,5
Fecha de caducidad
EC REP
MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
(1) Asa para esterilización, (2) asa de inoculación, torundas y envases para
recogidas, (3) incubadoras, sistemas ambientales alternativos, (4) medios
complementarios, (5) microorganismos de control de calidad, (6) violeta cristal
de Gram (R40052), (7) yodo de Gram (R40056), (8) decolorante de Gram
(R40054), (9) portaobjetos de vidrio, (10) mechero de Bunsen o calentador de
portaobjetos, (11) microscopio, aceite de inmersión, (12) gradilla de tinción,
(13) metanol (opcional).
PROCEDIMIENTO
1.
Prepare un frotis delgado del material de estudio sobre un portaobjetos
de vidrio. Deje que el portaobjetos se seque al aire completamente o
utilice un calentador de portaobjetos. Fije el portaobjetos pasándolo 3 ó 4
veces por la llama de un mechero de Bunsen o empape el frotis con
metanol y deje que se evapore.
2.
Coloque el portaobjetos sobre una gradilla de tinción y cubra con violeta
cristal de Gram durante 1 minuto.
3.
Lave bien con agua y cubra con mordiente de yodo de Gram durante 1
minuto.
Código de lote (número de lote)
Representante autorizado en Europa
Fabricante
12076 Santa Fe Drive
Lenexa, KS 66215, USA
www.remel.com
(800) 255-6730
International: (913) 888-0939
EC REP
Remel Europe Ltd.
Clipper Boulevard West, Crossways
Dartford, Kent, DA2 6PT, UK
Para obtener asistencia técnica póngase en contacto con su distribuidor local.
CAS (Nº del Chemical Abstracts Service Registry)
Fabricado para Remel Inc.
IFU 40058, Revisado el 2014-01-03
Impreso en los EE.UU.
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