guide d`utilisation

guide d`utilisation
IGH/BCL2 DNA-FISH Probe
Sonde de Translocation Bicolore, Deux Fusions
h18-001
VC
s wF
-20oC
Usage prévu
La sonde DNA-FISH IGH/BCL2 de Cancer Genetics Italia est conçue pour
détecter la translocation entre le gène IGH situé sur 14q32 et le gène BCL2
situé sur 18q21, par hybridation in situ en fluorescence (FISH).[1] La translocation entre les gènes IGH et BCL2 est désignée t(14;18)(q32;q21) et est
caractéristique du lymphome folliculaire (FL). La translocation t(14;18) est
plus fréquente dans les FL avec un grade inférieure FL, tels que les grades
1 et 2 (88%) que dans les cas avec un grade supérieure, tels que FL3b (413%).[2] La translocation est également détectée dans 30% des Lymphome
diffus à grandes cellules B, mais est moins fréquemment détectée dans
d’autres lymphomes non hodgkiniens.[2,3] Par cytogénétique conventionnelle, la translocation t(14;18)(q32;q21) qui implique les gènes IGH et
BCL2 est indiscernable de la translocation t(14;18)(q32;q21) qui implique
les gènes IGH et MALT1.[2] Ces translocations peuvent être distinguées par
FISH, en utilisant les sondes DNA-FISH respectives.
C segments
14q32
centromèret
J segments
D segments
Mode d’emploi
IGH V segments
3’
5’
~561kb
BCL2
IGH
18q21
élomère
~420kb
3’
centromère
~441kb
BCL2
5’
télomère
~575kb
18
14
Représentation schématique de la sonde DNA-FISH IGH/BCL2:
Les barres horizontales rouges et vertes indiquent les régions couvertes par les
sondes (approximativement à l’échelle, GRCh37/Hg19/2009). Les sondes directement marquées IGH (verte) et BCL2 (rouge) flanquent les points de cassure des gènes
IGH et BCL2 respectivement.
Conservation
À l’arrivée, conserver le produit à - 20°C, à l’abri de la lumière, jusqu’à la date de
péremption.
Conservation des lames : Conserver les lames hybridées a -20oC, à l’abri de la
lumière.
Remarque: Ces conditions de conservation s’appliquent à la fois aux produits
non ouverts et ouverts. Le nombre de cycles de gel-dégel ne doit pas
dépasser le nombre de tests recommandés par flacon. Conserver dans
le flacon d’origine. Les flacons conservés dans d’autres conditions peuvent ne pas offrir de performance optimale et par conséquent affecter
les résultats du test.
Manipulation
»» Tous les réactifs doivent être manipulés comme s’ils étaient capables de transmettre des agents infectieux. Après usage, tout le matériel doit être éliminé
conformément à la loi nationale en vigueur.
»» Manipuler tous les réactifs et lames contenant des fluorophores en éclairage
réduit, afin d’éviter toute détérioration du signal fluorescent.
Avertissements et mises en garde
Lire le mode d’emploi avant toute utilisation.
»» Tout transport ou conservation impropre peut détruire ou détériorer la performance du produit.
»» En cas de réception d’emballage ou de flacon endommagé, de défaillance
du dispositif (après utilisation conforme au mode d’emploi) ou de blessure de
l’utilisateur, contacter le fabricant.
»» Tout flacon endommagé doit être éliminé conformément à la loi nationale en
vigueur et aucun essai ne doit être réalisé à partir d’un tel réactif.
»» Manipuler tous les réactifs avec soin et porter un équipement de protection individuelle approprié.
»» Le formamide, la solution saline de citrate de sodium (SSC/Saline-Sodium Citrate)
et le dodécyl sulfate de sodium (SDS) peuvent avoir des effets tératogènes et mutagènes : éviter toute inhalation, ingestion ou contact avec la peau.
»» Le DAPI est un irritant. Consulter le Material Safety Data Sheet (MSDS) du produit
pour les informations concernant la sécurité.
Réactif fourni
Sonde DNA-FISH prête à l’emploi : 100 μL par flacon (10 tests). Un test est
défini comme suffisant pour une aire de 22mm x 22mm.
Sonde étiquetée au fluorophore pour le locus BCL2 (rouge) et au fluorophore pour le locus IGH (vert), prémélangée avec de l’ADN bloquant et un
tampon d’hybridation (formamide, sulfate de dextran, SSC et SDS).
Réactifs et matériel nécessaire mais non fournis
Préparation des réactifs
Remarque: Utiliser de l’eau distillée pour la préparation de toutes les solutions-mères et
Equipements
Bocal coplin
Microcentrifugeuse
Lamelles couvre-objets
Microtube à centrifuger (0,5
(22x22 e 25x25)
mL)
Microscope à épifluoresMicropipettes (1 à 200 mL)
cence
pH-mètre
Pinces
Colle de caoutchouc
Hotte aspirante
Plateau pour lames
Gants
Thermomètre, calibré
Chambre humidifiée
(37oC to 80oC)
Huile d’immersion
Plaque chauffante
Incubateur
Bain-marie
Lampe à mercure (100 watts)
Reactifs
Étanol à 100%
PBS 10X
HCl 1N
MgCl2 1M
NaOH 1M
SSC 20X
Formaline à 10%
DAPI et Antifade
Eau distillée
Pepsine
Tween 20
de toutes les solutions de travail.
Série d’éthanol (70%, 85% et 100%): Préparer des dilutions vol/vol d’éthanol
à 100% et d’eau distillée. Conserver à TA.
HCl 0,01N (acide chlorhydrique): Ajouter 0,5 mL de HCl 1N à 49,5 mL d’eau
distillée. Conserver à TA. Préchauffer la solution à 37oC dans un bain-marie
avant usage.
Solution-mère de pepsine à 0.4% (4 mg/mL): Dissoudre 100 mg de pepsine
dans 25 mL de HCL 0.2N. Conserver des aliquots de 500 μL à - 20oC.
Formaldéhyde à 1%: Ajouter 12,5 mL de formaline à 10% (4% formaldehye)
à 37 mL de PBS 1X. Ajouter 500 mL de MgCl2 100X. Conserver à 4oC jusqu’à
une semaine.
SSC 0,5X(Citrate de sodium salin)/Tween 20 à 0,1%: Ajouter 25 mL de SSC
20X et 1 mL de Tween 20 à 974 mL d’eau distillée. Bien mélanger en tournoyant. Conserver à TA.
PBS 1X (solution saline dans un tampon phosphate): Mélanger 100 mL de
PBS 10X et 900 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 7,0. Conserver à TA.
SSC 2X: Mélanger 100 mL de SSC 20X et 900 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à
7,0. Conserver à température ambiante (TA).
SSC 2X/Tween 20 à 0,1%: Ajouter 100 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 à
899 mL d’eau distillée. Bien mélanger en tournoyant. Conserver à TA.
MgCl2 100X (Chlorure de magnesium) dans PBS 1X: Ajouter 50 mL de MgCl2
1M a 450 mL de PBS 1X.
Procédure Standard for FISH
Prétraitement facultatif des lames à la pepsine
1. Préchauffer 50 mL de HCl 0,01N à 37°C.
2. Ajouter 10 à 15 μL de solution-mère de pepsine à 0.4% aux 50 mL de HCl
0,01N préchauffés et incuber la lame pendant 5 à 10 min à 37°C dans la
»» Seul(e) un(e) technologiste médical(e) familiarisé(e) avec les méthodes de
pepsine.
cytogénétique et formé(e) à la technique FISH peut réaliser le test. Tout
Remarque sur la procédure: Certains spécimens peuvent nécessiter des temps de
l’équipement doit être étalonné avant la réalisation du test.
Remarque: Produit prêt à l’emploi. Ne pas reconstituer ni diluer. Pour usage professionnel
uniquement.
»» Le tissu visé est du sang périphérique et la moelle osseuse. Les lames doivent être préparées conformément aux directives des méthodes cytogénétiques standards du laboratoire réalisant le test.
Préparation des lames
Toutes les lames fraîchement préparées doivent être vieillies pendant 1
heure et demie à 45 -50°C avant l’hybridation. Si l’hybridation n’a pas lieu
le même jour que la préparation, conserver les lames à 4°C ou à - 20°C. Les
lames avec des cellules à cytoplasme visible peuvent nécessiter un prétraitement à l’aide d’un enzyme protéolytique du type pepsine (voir prétraitement facultatif à la pepsine).
digestion plus longs dans la pepsine.
3. Laver deux fois la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X à température ambiante (TA).
4. Incuber la lame pendant 5 min dans du formaldéhyde à 1% à TA.
5. Laver la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X à TA.
6. Déshydrater la lame dans de l’éthanol à 70%, 85% et 100% à TA pendant
1 min chacun.
7. Laisser sécher la lame à l’air libre.
Remarque sur la procédure: Vérifier la morphologie de l’échantillon à l’aide d’un
microscope à contraste de phase avant l’hybridation. Ne pas hybrider en cas de
compromission de la morphologie nucléaire.
(Suite à la page suirante)
Procédure Standard for FISH
Lavage post-hybridation
Dénaturation/hybridation de la sonde DNA-FISH
Remarque sur la procédure: Eviter de faire sécher la lame avant que le lavage soit fini.
1. Vortexer brièvement la sonde DNA-FISH et centrifuger le tube dans une 1. Préchauffer les solutions de SSC 2X/Tween 20 à 0,1% et de SSC 0,5X/
microcentrifugeuse pendant 30 secondes.
Tween 20 à 0,1% à 45°C.
2. Appliquer 10 μL de sonde DNA-FISH sur la zone cible sur la lame et la 2. Retirer la colle de caoutchouc de la lame à l’aide de pinces.
recouvrir d’une lamelle couvre-objet (22 x 22 mm).
3. Tremper brièvement la lame dans la solution de SSC 2X à TA. Retirer la
lamelle couvre-objet.
Remarque sur la procédure: Prendre soin d’éviter toute formation de bulles d’air. Des
lamelles couvre-objets plus petites ou plus grandes peuvent être utilisées en 4.Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X/Tween 20
à 0,1% à 45°C.
fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA-FISH.
3. Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre-objet à l’aide de 5.Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 0,5X/Tween 20
à 0,1% à 45°C.
colle de caoutchouc.
4. Co-dénaturer la lame et la sonde DNA-FISH pendant 3 min à 80°C sur une 6.Rincer brièvement la lame dans de l’eau distillée.
7.Laisser sécher la lame à l’air libre à l’abri de la lumière directe.
plaque chauffante à température controlée.
5. Incuber pendant 12 à 18 heures dans une chambre humidifiée à 37°C, à 8.Appliquer 20 μL de DAPI/Antifade à la zone hybridée et recouvrir d’une
lamelle couvre-objet (25 x 25 mm).
l’abri de toute lumière directe.
Accessoires pour microscope
»» Objectifs
»» Filtres recommandés
Un objectif 10X est adapté au balayage de la zone cible. Un grossissement
Fluorophore
supérieur s’avère nécessaire pour l’analyse des signaux et doit avoir lieu
avec un objectif à immersion à huile 63X ou 100X.
Verte
»» Huile d’immersion
Rouge
L’huile d’immersion doit être adaptée à la microscopie en fluorescence.
»» Lampe
DAPI
Une lampe à mercure de 100 watts avec une durée de vie maximale de 200
heures est recommandée. Remplacer la lampe avant qu’elle ne dépasse les
200 heures.
Visualisation et interprétation des signaux
Le signal doit être visualisé à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé des filtres appropriés.
Remarque sur la procédure: Les signaux peuvent être à différents plans focaux,
c’est pourquoi il est important de focaliser vers le haut et vers le bas des spécimens, afin de s’assurer du comptage de tous les signaux.
»» Dans la métaphase diploïde normale et dans les noyaux en interphase, la
sonde DNA-FISH IGH/BCL2 génère deux signaux verts et deux rouges correspondant respectivement aux deux chromosomes normaux 14 et 16.
»» Dans les cellules avec translocation entre les gènes IGH et BCL2 le modèle
le plus couramment observé est un signal vert et un signal rouge,
représentant les chromosomes normaux 14 et 18 et deux signaux de fusion (rouge/vert ou jaune), représentant les deux chromosomes transloqués.
Glossaire des symboles
g
Numéro de lot
FRisques biologiques
h
Numéro de catalogue
YAttention, consulter la
documentation d’accompagnement
CMarquage CE de conformité
XContient suffisamment pour 10 tests
V
Dispositif
vitro
médical de diagnostic in
wConserver à l’abri de la lumière du
soleil
MFabricant
s Limite supérieure de température
H Utiliser avant le
Excitation max
Émission max
496 nm
520 nm
580 nm
603 nm
360 nm
460 nm
Recommandations et limitations
»» Ce produit a été optimisé pour être utilisé sur des lames préparées à partir
de spécimens de sang périphérique, et de moelle osseuse conformément
aux méthodes cytogénétiques courantes. Le fabricant garantit que ce
produit répond aux caractéristiques de performance analytique (sensibilité, spécificité, reproductibilité et intervalle de validité) établies sur du
sang périphérique normal ou des tissus prévus.
»» Chaque nouveau lot de sonde DNA-FISH doit être testé pour la spécificité
du locus sur un spécimen de sang périphérique normal et sur le tissu
prévu, pour vérifier la bonne performance du réactif. Il incombe au laboratoire d’établir les intervalles de validité à l’aide de spécimens de controle
positifs et négatifs du tissu prévu.
»» L’utilisation de filtres aux caractéristiques spectrales autres que celles
spécifiées peut affecter négativement la force du signal. Par exemple, le
fluorophore rouge est visible à travers un filtre orange, mais les signaux
apparaissent faibles.
»» La technique FISH sur métaphase est recommandée pour caractériser les
variantes et les patrons de signaux anormaux atypiques.
»» Le test FISH est considéré comme une adjonction à la cytogénétique
classique (caryotype). Les résultats de ces tests doivent être interprétés
dans la totalité du contexte des antécédents cliniques du patient. Aucune
décision médicale ne peut être prise en se fondant uniquement sur les
résultats du test FISH.
M
Cancer Genetics Italia S.r.l.
Viale Luigi Majno, 17
20122 Milano - Italia
www.cancergeneticsitalia.com
support@cancergeneticsitalia.com
DNA-FISH Probe fabriquée dans la communanté européenne par
Cancer Genetics Italia S.r.l.
Bibliographie
1. Huret, J. L., et al. www.AtlasGeneticsOncology.org.
2. Heim, S., et al. Cancer Cytogenetics, 2009 (3rd Edition).
3. Jaffe, E. S., et al. Hematopathology, 2011 (1st Edition).
© 2012 Cancer Genetics Italia S.r.l.
Version: 05.17.12
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