DIAsource KAPG4SGE3 HBsAg Elisa Instructions for Use
Below you will find brief information for HBsAg Elisa KAPG4SGE3. This product is a fast test for the qualitative detection of the presence of HBsAg in serum or plasma (heparin, citrate or EDTA) specimen. The test utilizes monoclonal and polyclonal (anti-guinea pig) antibodies to selectively detect elevated levels of HBsAg in serum or plasma. Specimens which are non-reactive by HBsAg Elisa are considered negative for HBsAg.
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HBsAg Elisa
KAPG4SGE3
DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue du Bosquet, 2 - B-1348 Louvain-la-Neuve - Belgium
: 110627/3
HBsAg Elisa
For in-vitro qualitative detection of hepatitis B surface antigen (HBsAG) in human serum or plasma.
KAPG4SGE3
IN VITRO DIAGNOSTIC USE
en
DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium
Tel: +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90
1) I NTENDED U SE
HBsAg Elisa is an enzyme immunoassay diagnostic kit for in-vitro qualitative detection of hepatitis B surface antigen
(HBsAg) in human serum or plasma (heparin, citrate or EDTA).
2) S UMMARY AND T EST E XPLANATION
The hepatitis B surface antigen (HBsAg) is the first marker that appears in the blood following infection with hepatitis B virus (HBV) some days or weeks before clinical symptoms manifest. It is a lipoprotein polypeptide which constitutes the external envelope of the HB virus. The detection of HBsAg in human serum or plasma indicates an ongoing HBV infection, either acute or chronic. Testing of additional HBV markers is needed to define the specific disease state.
HBsAg assays are used not only to diagnose HBV infections but also to monitor the course of the disease and the efficacy of antiviral therapy.
HBsAg Elisa is a fast test for the qualitative detection of the presence of HBsAg in serum or plasma (heparin, citrate or
EDTA) specimen. The test utilizes monoclonal and polyclonal (anti-guinea pig) antibodies to selectively detect elevated levels of HBsAg in serum or plasma.
Specimens which are non-reactive by HBsAg Elisa are considered negative for HBsAg. Specimens with positive reaction should be retested in duplicate.
In case of a reactive repeat reaction, the specimen should be confirmed for HBsAg reactivity with validated confirmatory reagents .
Only confirmed positive specimens are considered to contain HBsAg.
3) T EST DESCRIPTION
HBsAg Elisa is a solid-phase enzyme immunoassay (ELISA= enzyme-linked immuno-sorbent assay ) based on the
"sandwich principle".
The solid phase of the microtiter plate is made of polystyrene wells coated with mouse monoclonal antibodies specific for HBsAg; whereas guinea pig polyclonal antibody purified by affinity chromatography is used to prepare the anti-HBs• peroxidase (horseradish) conjugate in the liquid-phase.
When a serum or plasma specimen containing HBsAg is added to the anti-HBs antibody-coated wells together with the peroxidase conjugated anti-HBs antibody and incubated, an antibody-HBsAg-antibody-peroxidase complex will form on the wells.
After washing the microtiter plate to remove unbound material, a solution of TMB substrate is added to the wells and incubated. A color develops in proportion to the amount of HBsAg boud to Anti-HBs. The peroxidase-TMB reaction is stopped by addition of sulfuric acid. The optical density of developed color is read with a suitable photometer at 450nm with a selected reference wavelength within 620 to 690nm
*1
.
The test principle is shown also in the following figure.
A Specimen containing HBsAg:
1. Plate well (Anti-HBs) + specimen (HBsAg)+ Anti-HBs•peroxidase → Anti-HBs•HBsAg•(Anti-HBs•peroxidase) sandwich complex
2. Sandwich complex + TMB substrate solution → Light blue to blue color
3. Add sulfuric acid to stop the color development → Read OD at 450nm (reference wavelength 620-690 nm
*8
)
B Specimen without HBsAg:
Catalogue Nr: KAPG4SGE3 PI number : 1701153 Revision Nr : 110627/1
4) D ESCRIPTION OF M ATERIALS P ROVIDED
● Item 1 - 6 in the following reagent table should be refrigerated at 2-8°C . Washing Solution D (20X) and stop solution can be stored at 2-30°C.
ITE
MS
Components Description
Qt. per
96 tests
(1)
Anti-HBs Plate Microtiter plate coated with mouse monoclonal anti-HBs. 1 plate
(2)
(3)
(4)
(5)
Anti-HBs
Peroxidase
Solution
Ab HRP
HBsAg Positive
Control
CONTROL H
HB Negative
Control
CONTROL L
Chromogenic
TMB concentrate
CHROM TMB CONC
Polyclonal Anti-HBs HRPO conjugate, diluted in buffer with protein stabilizers.
Preservatives:
0.003% Gentamycin and
0.01% Thimerosal.
Dye: phenol red.
Inactivated human serum positive for HBsAg but non-reactive for anti-
HCV and anti-HIV1/2, diluted in buffer with protein stabilizers.
Preservatives: 0.003% Gentamycin and 0.01% Thimerosal.
Serum non-reactive for HBV markers, anti-HCV and anti-HIV1/2, diluted in buffer with protein stabilizers.
Preservatives: 0.003% Gentamycin and 0.01% Thimerosal.
0.6 mg/ml of
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
(TMB) in an organic base with
DMSO.
1 bottle,
8 ml
1 bottle,
1.5 ml
1 bottle,
2.0 ml
1 bottle,
12 ml
(6)
Substrate buffer
SUB BUF
Conc. Washing
Solution (20X)
Citrate Acid Buffer containing
0.03% H2O2.
1 bottle,
12 ml
(7)
WASH SOLN CONC
Concentrated
Phosphate buffer with Tween-20
1 bottle
58 ml
(8)
Stop Solution
STOP SOLN
1N sulfuric acid
1 bottle
12 ml
● OTHER REQUIRED MATERIALS, BUT NOT PROVIDED
ITEMS Components
(1) 50µl, 100µl micropipettes and tips are needed
(2) Water bath or incubator with temperature control at +37°C.
(3) Plate washing equipment.
(4)
(5)
ELISA Microwell Reader:
Dual wavelength 450nm with 620-690nm as reference wavelength, bandwidth 10nm
*1
.
Fully automatic EIA micro-plate analyzer is optional. User should validate the automatic
EIA micro-plate analyzer in combination with the kit.
1. Plate well (Anti-HBs) + specimen (no HBsAg) + Anti-HBs•peroxidase → Anti-HBs (on the well)
2. Anti-HBs (on the well) + TMB substrate solution → Colorless to light blue color
3. Add sulfuric acid to stop the color development →Read OD at 450nm (reference wavelength 620-690 nm
*8
)
Catalogue Nr: KAPG4SGE3
4.1)Storage condition and Stability of the kit and components
PI number : 1701153 Revision Nr : 110627/1
Kit/components
HBsAg Elisa KIT
HBsAg Positive Control
HB Negative Control
Anti-HBs Plate
Anti-HBs‧ HRPO Conjugate Solution
Concentrated Washing Solution (20X)
20X Diluted Washing Solution
Chromogenic TMB concentrate
Substrate buffer
TMB substrate mixture
1N Sulfuric Acid
Storage temp.
+2 to +8°C
+2 to +8°C
+2 to +8°C
+2 to +8°C
+2 to +8°C
Room temp.
Room temp.
+2 to +8°C
+2 to +8°C
+2 to +8°C
Room temp.
Room temp.
State
Original
Once open
Original
Once open
Original
Once open
Original
Once open
Original
Once open
Original
Once open
Diluted
Diluted
Original
Once open
Original
Once open
Mixture
Original
Once open
Stability
18 months
1 month
18 months
1 month
18 months
1 month
24 months
1 month
18 months
1 month
24 months
1 month
2 days
1 week
24 months
1 month
24 months
1 month
6 hours
24 months
1 month
5) Instructions for Use
5.1) Warnings:
5.1.1) This reagent kit is for professional use only.
5.1.2) This reagent kit is for in vitro diagnosis only.
5.1.3) Bring all kit reagents and samples to room temperature (+20 to +30°C) and mix carefully before use.
5.1.4) Do not use reagent beyond its expiration date.
5.1.5) Do not interchange reagents between different lots.
5.1.6) Do not put pipette in mouth.
5.1.7) Do not smoke or eat in areas where specimens or reagents are handled.
5.1.8) All kit components and specimens should be regarded as potential health hazards It should be used and discarded according to your laboratory’s safety procedures. Such safety procedures probably include the wearing of protective gloves and avoiding the use of aerosols.
5.1.9) Potential infectious specimens and non-acid containing spills or leakages should be wiped up thoroughly with
5% sodium hypochlorite or treated in accordance with your practice for potential bio-hazard control.
5.1.10) Prior to disposing used specimens and kit reagents as general waste; it should be treated in accordance with the local practice of potential bio-hazardous waste or treated as follows:
Both liquid and solid waste should be autoclaved at +121°C for at least 30 minutes.
Solid waste can also be incinerated.
Non-acidic liquid waste can be treated with sodium hypochlorite diluted to a final concentration of 1%.
Acidic liquid wastes must be neutralized before treatment with sodium hypochlorite as mentioned above and should stand for 30 minutes to obtain effective disinfection.
5.1.11) Stop Solution is an irritant to skin, eyes, respiratory tract and mucous membranes. Avoid contact of the stop solution with skin and mucous membranes. In case of contact, flush immediately with abundant amounts of water. In case of inhalation, find fresh air and seek medical attention in case of pain.
5.1.12) Chromogenic TMB concentrate contains organic solvent, which is flammable : danger of serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. Chromogenic TMB concentrate contains dimethyl sulfoxide, an irritant to skin and mucous membranes.
5.1.13) Although all human sourced material are tested non reactive for Anti-HCV and Anti-HIV, and inactivated at
+56°C for one hour, the reagent shall be handled as potential infectious material.
*2
5.2) Specimen Collection and Preparation for Analysis
Catalogue Nr: KAPG4SGE3 PI number : 1701153 Revision Nr : 110627/1
5.2.1) No special preparation of the patient is required prior to blood collection. Blood should be collected by approved medical techniques.
5.2.2) Either serum or plasma specimens can be used with this test kit. Whole blood specimen should be separated as soon as possible in order to avoid hemolysis. Any particulates (e.g. fibrin clots, erythrocytes) contained in the specimen should be removed prior to use.
5.2.3) Specimens must be stored at +2 to +8°C and avoid heat-inactivation to minimize deterioration. For long-term storage, they should be frozen below -20°C. Storage in self-defrosting freezer is not recommended.
5.2.4) Frozen specimens must be thoroughly thawed and mixed homogenously before test.
5.2.5) Avoid multiple freeze-thaw procedures.
WARNING
1.The specimen must not contain any compounds of AZIDE, which inhibits the peroxidase activity.
2. Incompletely coagulated sera and microbial-contaminated specimens should not be used.
5.3) Storage conditions and Stability of Reagents
5.3.1) The kit must be stored at +2 to +8°C. Do not freeze.
5.3.2) Strips of the plate should be used within one month after opening the original aluminum foil bag. The unused strips should be kept in the aluminum foil bag and taped tightly.
5.3.3) Return reagents to +2 to +8°C immediately after use.
5.3.4) Washing Solution (20X) Concentrate can be stored at room temperature to avoid crystallization, because the kits are stored and shipped at +2 to +8°C. If crystals have been precipitated before use, warm up the solution at
37°C in a water bath until the crystals dissolve .
5.4) Plate Washing Procedure
5.4.1) Preparation of washing solution:
Dilute Washing Solution (20X) Concentrate with distilled or de-ionized water to obtain a 1:20 dilution. Do not use tap water.
5.4.2) Plate washing:
(a) For plate washer with overflow aspirating function: 6 cycles with at least 0.5 ml washing buffer per well per cycle. or
(b) For plate washer without overflow aspirating function: 8 cycles with at least 0.35 ml washing buffer per well per cycle.
5.4.3) Blot dry by inverting the plate and tapping firmly onto absorbent paper. Too much residual wash buffer will cause false results.
WARNING:Improper washing will cause false results.
5.5) Test Procedure
5.5.1) Bring all reagents and specimens to room temperature (+20 to +30°C) before assay. Adjust water bath or incubator to +37±1°C.
5.5.2) Reserve one well for blank. Add 50 µl of each control or specimen to appropriate wells of the microtiter plate
(3 Negative Controls and 2 Positive Controls).
NOTE: a. Use a clean pipette tip for each sampling to avoid cross-contamination. b. Each plate needs respective negative controls, positive controls and blank well. c. Do not use any cut-off value established for other plates of HBsAg Elisa.
5.5.3) Add 50 µl of Anti-HBs Peroxidase Solution to each well except the blank.
NOTE: Do not touch the wall of the plate wells to prevent contamination.
5.5.4) Gently tap the plate.
5.5.5) Remove the protective backing from the Adhesive Slip and press it onto the reaction plate, so that it is tightly sealed.
5.5.6) Incubate the reaction plate at +37±1°C in a water bath or incubator for 80 minutes.
5.5.7) At the end of the incubation period, remove and discard the Adhesive Slip and wash the plate in accordance with 5.4) Plate Washing Procedure.
5.5.8) Select one of the following two methods for color development:
Catalogue Nr: KAPG4SGE3 PI number : 1701153 Revision Nr : 110627/1
A. Mix equal volumes of Chromogenic TMB concentrate and Substrate Buffer in a clean container immediately prior to use. Add 100
l of the mixture solution to each well including the blank well.
B. Add 50
l of Chromogenic TMB concentrate first, and then add 50
l of Substrate buffer into each well including the blank. Mix well carefully.
NOTE: Chromogenic TMB concentrate should be colorless to light blue; otherwise, it should be discarded. The mixture of Chromogenic TMB concentrate and Substrate buffer should be used within 30 minutes after mix. The mixture should be kept away from intense light.
5.5.9) Cover the plate with a black cover and incubate at room temperature for 30 minutes.
5.5.10) Stop the reaction by adding 100 µl of stop solution to each well including the blank.
5.5.11)Determine the absorbance of Controls and test specimens within 30 minutes with a precision spectrophotometer at 450/620-690nm (450nm reading wavelength with 620 – 690 nm reference wavelength)
*2
.
Use the blank well to blank spectrophotometer.
NOTE: The color of the blank should be colorless to light yellow; otherwise, the test results are invalid.
Substrate blank : absorbance value must be less than 0.100.
5.6) Calculations of Results
5.6.1) Calculation of the NC (Mean Absorbance of Negative Control).
Example: Sample No. Absorbance
1
2
0.022
0.025
3 0.023
NC = (0.022 + 0.025 + 0.023) / 3 = 0.023
NCx should be ≦0.1, otherwise, the test is invalid.
5.6.2) Calculation of the PC (Mean Absorbance of Positive Control)
Example: Sample No. Absorbance
1 1.432
2 1.508
PC = (1.432 + 1.508) / 2 = 1.470
PC should be ≧0.6, otherwise, the test is invalid.
5.6.3) Calculation of the P - N Value
P - N = PC – NC
Example: NC = 0.024
PC = 1.470
P - N = 1.470 - 0.024 = 1.446
P - N Value must be ≧0.5, otherwise, the test is invalid.
5.6.4) Calculation of the Cutoff Value
Cutoff Value = NC + 0.025
Example:
Cutoff Value = 0.023 + 0.025 = 0.048
5.7) Validity of Test Runs
5.7.1) NC should be ≦0.1; otherwise, the test is invalid.
5.7.2) PC should be ≧0.6, otherwise, the test is invalid.
5.7.3) P - N Value must be ≧0.5, otherwise, the test is invalid.
NOTE: Negative Control: absorbance value must be less than or equal to 0.100 after subtracting the blank.
5.8) Interpretation of Results
5.8.1) Specimens with absorbance values LESS than the Cutoff Value are NON-REACTIVE and are considered
NEGATIVE for HBsAg.
5.8.2) Specimens with absorbance value GREATER than or EQUAL to the Cutoff Value are considered
INITIALLY REACTIVE. The original specimens must be retested in duplicate.
5.8.3) If both absorbance values in the retest are less than the cutoff value, the specimens are considered NEGATIVE
for HBsAg.
Catalogue Nr: KAPG4SGE3
If in the retest at least one of the two absorbance values is GREATER than or EQUAL to the Cutoff Value then the specimens are considered as repeated HBsAg positive. The repeated positive specimen shall be confirmed with validated confirmatory reagents.
PI number : 1701153 Revision Nr : 110627/1
5.9) Troubleshooting
If the result cannot be reproduced, perform a preliminary troubleshooting by checking the possibilities listed below:
5.9.1) Improper washing procedure.
5.9.2) Contamination with positive specimen.
5.9.3) Wrong volume of sample, conjugate or substrates.
5.9.4) Contamination of the well rim with conjugate.
5.9.5) Improper specimen, such as hemolyzed serum or plasma, specimen containing sediments and specimen not thoroughly mixed before use.
5.9.6) Wrong incubation time or temperature.
5.9.7) Obstructed or partial obstructed washer aspirate/dispense head and needles.
5.9.8) Insufficient aspiration.
5.10) Limitations and Interferences
5.10.1) This reagent kit is to be used for un-pooled human serum or plasma only.
5.10.2) The reagent kit has not been validated for use with cadaveric samples.
5.10.3) A negative HBsAg result without other evidence should not be used to exclude an HBV infection.
5.10.4) Interfering Substances:
The following results were obtained in respective experiments:
1. No interferences with different anticoagulants such as lithium heparin, EDTA, citrate have been observed.
2. Heat-treated specimens (+60°C, 10 hours) exhibited diminished HBsAg titer.
3. No cross reactivity was detected using specimens deriving from patients with a) other infections by HAV,
EBV, CMV, HSV, VZV, Lyme Borreliosis, HCV, HIV, b) other disease states such as chronic renal failure, hemodialysis, autoimmune hepatitis, liver cirrhosis, and c) presence of certain antibodies like HAMA , GAD,
IA2, APS).
4. Samples containing potential interfering substances [e.g. triglycerides (lipemia), hemoglobin (hemolysis), bilirubin (icterus), monoclonal immunoglobulin components, elevated levels of autoimmune antibodies
(rheumatoid factor-RF, antinuclear antibodies-ANA, or antimitochondrial antibodies-ANA)] and samples from pregnant women did not interfere with the HBsAg Elisa assay.
5.11) Performance Characteristics
5.11.1) Diagnostic Specificity
Results from the European Performance Evaluation for DIAsource HBsAg Elisa - Reactivity of HBV Negative
"Donor" and "Clinical" Specimens.
Total No.of Specimens
N Neg
DIAsource HBsAg Elisa
*
IR
**
RR Confirmed False Positive
HBV negative
(clinical specimen)
213 211 2 2 0 2
HBV negative
(donor specimen)
5501 5479 22 22
Total 5714 5690 24 24
*IR: initial reactive **RR: repeat reactive
Diagnostic specificity = 5690/5714 = 99.58%
0
0
22
24
5.11.2) Diagnostic Sensitivity
1. The diagnostic sensitivity determined in the European performance evaluations yielded the following results:
Sample
HBsAg positive sera
No. of sample Reactive Sensitivity
400 400 100%
Diagnostic sensitivity = 400/400 = 100%
Catalogue Nr: KAPG4SGE3
2. The evaluation of the HBsAg Sensitivity Panel PHA807 (BBI, USA) yielded the following results:
Panel
BBI HBsAg Sensitivity Panel
PHA807
No. of panel members
PHA807-01~21
Results
Equivalent to or better than the competitors.
PI number : 1701153 Revision Nr : 110627/1
Catalogue Nr: KAPG4SGE3
3. The evaluation of the HBsAg Mixed Titer Performance Panel PHA205 (BBI, USA) yielded the following results:
Panel
BBI HBsAg Mixed Titer
Performance Panel PHA205
No. of panel members
PHA205-01~25
Results
Equivalent to or better than the competitors.
4. The HBsAg Mixed Titer Performance Panel VHA601 (BBI, USA) evaluation yielded the following results:
Panel
No. of panel members
Results
BBI HBsAg Mixed Titer Performance
Panel VHA601
VHA601-01~06
Met BBI’s expected results.
5. The evaluation of the HBsAg Mixed Titer Performance Panel QHA711 (BBI, USA) yielded the following results:
BBI HBsAg Mixed Titer Performance
Panel QHA711
Panel
No. of panel members
QHA711-01~06
Results
Met BBI’s expected results.
6. INTS HBsAg Subtype Panel Test Result:
The results of the evaluation demonstrate that all known HBsAg serotypes (HBsAg subtypes) available in the
INTS HBsAg subtype panel can be detected by both HBsAg Elisa and the reference assay up to 10
4 x ~ 10
6 x dilutions.
7. Summary table of the evaluation of all tested seroconversion panels:
PPanel ID
PHM907(ay)
PHM916(ay)
PHM920(ad)
PHM921(ad)
PHM930(ad)
PHM933(ad)
PHM934(ad)
PHM935A
(ad)
PHM935B
(ad)
NabiSB0411
PHM903(ad)
PHM904(ad)
PHM906(ad)
PHM909(ad)
PHM910(ad)
PHM912(ad)
PHM914(ad)
PHM915(ind)
PHM917(ind)
PHM918 (ad)
PHM923 (ay)
PHM924 (ad)
PHM925(ind)
PHM926(ind)
PHM927(ind)
PHM928 (ad)
PHM929 (ad)
PHM931(ind)
PHM932 (ad)
PHM935A
(ad)
HBsAg Positive Result From Date of First Blood Collection
Reference HBsAg
Assay
(A in days)
HBsAg Elisa
(B in days)
Difference in Bleed
Days
(A-B)
Difference in
Bleed #s
(panel member
No.)
50 50 0 0
62
26
65
26
-3
0
-1
0
0
3
7
0
0
3
9
0
0
0
-2
0
0
0
-1
0
9
231
6
6
7
137
9
35
42
0
12
36
7
15
29
8
13
4
9
14
19
61
21
21
217
6
10
18
0
9
18
0
146
28
>43
7
21
35
14
15
7
9
18
21
61
28
-12
14
0
-4
-11
137
0
17
42
-146
-16
->7
0
-6
6
-6
-2
-3
0
-2
-2
0
-7
-3
-1
-2
-5
->2
0
-1
1
-1
-1
-1
0
-1
-1
0
0
1
7
-1
0
-1
-1
1
----- -----
Over all
Average
Sum = -13
-13/30 = 0.4 days
- - - - -
- - - - -
PI number : 1701153 Revision Nr : 110627/1
Summary of the evaluation of all tested seroconversion panels:
The results have shown that the HBsAg Elisa is nearly equivalent to the reference assay. On average the HBsAg
Elisa test is only 0.4 days later in the 30 tested seroconversion panels in comparison to the reference assay.
5.11.3) Mutants
1. Mutant Panel
A Hepatitis B Pre Core Mutant panel of Teragenix, USA was tested. HBsAg Elisa can detect the results while panel’s dilution ratio is 1:2 or 1:5.
This panel consists of 3 samples Core Promoter (A1762/G1764) wild type; PreCore codon 28 mutant/wild type infection, of 4 samples Core Promotor (A1762/G1764) wild type; PreCore codon 28 mutant, of 2 samples Core
Promotor (T1762/A1754) MUTANT/(A1762/G1754) wild type mixed infection.
2. Mutant samples
The detection rate of HBsAg Elisa is 17/21 which is better than reference kit’s (14/21).
Mutation HbsAg Elisa
Reference kit
Mutation HbsAg Elisa
Reference kit
113A114
P120L
R122I
R122T
E122I
T123N
122RA123
Int positive positive negative positive positive positive negative negative
Int positive C137W positive C139Y negative K141E
Int positive positive positive positive P142L/G145R negative positive P142L positive positive D144G negative G145K positive positive negative C147T/C148T positive
Int negative positive positive negative positive negative negative positive C124R
T131I
T131P
Y134S
Detection
Rate positive positive positive
8/11 positive positive positive
8/11
E164D
S174N
Detection
Rate positive positive
9/10 positive positive
6/11
5.11.4) 25 same day fresh positive samples
HBsAg Elisa detected 25 same day fresh positive samples. The criteria of the chapter 3.1.9 of the 2009/886/EC was fulfilled.
5.11.5) Analytical Sensitivity
Standard Material
WHO 2 nd
international Standard
※
PEI standard Subtype ad
PEI standard Subtype ay
Calculated Sensitivity
0.03 IU/mL
0.08 PEI U/mL
0.09 PEI U/mL
※
WHO Second International Standards for HBsAg, subtype adw2, genotype A, NIBSC code: 00/588
5.11.6) Precision
1. Intra-assay reproducibility
Catalogue Nr: KAPG4SGE3 PI number : 1701153 Revision Nr : 110627/1
Intra-assay precision was determined using one positive control sample and two patient serum samples of different
HBsAg concentration (slightly above the cutoff level and at medium level) which were analyzed in replicates of 20 in a single run over 3 days.
Run
2
2
3
3
3
1
1
1
2
Sample ID
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
Mean
0.7541
2.2766
1.3159
0.9671
2.7325
1.5822
0.9669
2.6088
1.6502
Standard
Deviation
0.0857
0.1571
0.1168
0.0358
0.1025
0.0888
0.0909
0.2367
0.1499
Coefficient of
Variation
11.36
6.90
8.88
3.70
3.75
5.61
9.40
9.07
9.08
The calculated CV´s ranged between 3.7 % and 11.36 %. (= acceptable value for an immunoassay in microtiter plate format).
2. Inter-assay reproducibility
The precision evaluation experiments were performed over 10 operating days is using five serum samples (with borderline positive and clearly above cutoff value HBsAg levels).
Sample ID N Mean
Standard
Deviation
Coefficient of
Variation
F1
F2
F3
F4
F5
10
10
10
10
10
0.0609
0.0770
0.1000
0.1786
0.6107
0.0185
0.0189
0.0245
0.0462
0.1412
30.41
24.56
24.51
25.87
23.12
The calculated CV´s ranges between 30.4 for an HBsAg negative sample and 23.1 % for an HBsAg low positive sample (= acceptable values for the inter-assay imprecision of an immunoassay in microtiter plate format).
5.11.7) Antigen Excess/High-dose hook effect
This was performed testing a serum sample with a very high HBsAg concentration of 125 mg/L in serial dilution with the DIAsource HBsAg Elisa assay. No high-dose hook effect was observed.
5.11.8) Traceability
The DIAsource HBsAg Master Calibrator has been calibrated against the British Working Standard for HBsAg
(NIBSC-Code: 01/476-006) using the HBsAg Elisa assay. The relative potency (ratio) of the British Working
Standard for HBsAg versus the DIAsource HBsAg Master Calibrator is 4.081 (3.853-4.325 95% CI). The concentration of the Positive Control of HBsAg Elisa assay has been determined against the DIAsource HBsAg
Master Calibrator and was established with 42 IU/ml ± 20%.
Catalogue Nr: KAPG4SGE3 PI number : 1701153 Revision Nr : 110627/1
5.12) Flow chart of the test procedure
Add 50 µl of controls (3 X NC, 2 X PC) and add 50µl of each specimen into wells. Reserve one well for blank.
↓
Add 50 µl of Anti-HBs‧ Peroxidase Solution into each reaction well, except one blank.
↓
Incubate the plate at +37±1°C for 80 minutes.
↓
Wash the plate.
(Choose one of the following two methods for enzymatic reaction with color development)
↙ ↘
Mix equal volumes of
Chromogenic TMB concentrate and Substrate buffer. Add 100 µl of the mixed solution to wells.
Add 50 µl of Chromogenic
TMB concentrate to wells and then add 50 µl of
Substrate buffer. Mix well, gently.
↘ ↙
Incubate at R.T. for 30 minutes.
↓
Add 100µl of 1N sulfuric acid into each well.
↓
Determine absorbance using 450 nm as reading wavelength with 620-690nm reference wavelength
6) N OTES
*1 The reference wavelength of the photometer to be used can be 620 nm to 690 nm. However, the user should validate the photometer in combination with HBsAg Elisa before use.
*2 Incomplete inactivation of hepatitis B virus after heat treatment at +60°C for 10 hours, J. Infect. Dis. 138:242-244.
7) B IBLIOGRAPHY
1. Blumberg BS, Alter HJ, Visnich S. A „new“ antigen in leukemia sera. JAMA, 1965;191:101- 106.
2. Dane DS, Cameron CH, Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis. Lancet 1970; 1: 695 - 698.
3. Aach RD, Grisham JW, Paker CW. Detection of Australia antigen by radioimmunoassay. Proc Natl Acad Sci. USA
1971;68:1056-1060.
4. Kim CY, Tikes JG. Purification and biophysical characterization of hepatitis antigen. J Clin Invest. 1973; 52:1176-
1186.
5. Wolters G. Kuijpers LP, Kacaki J, Schuurs AH, Enzyme linked immunosorbent assay for hepatitis B surface antigen.
J Infect. Dis 1977;136:Suppl 311-377.
6. Shih JW, Cote PJ Jr, Dapolito GM, Gerin JL. Production of monoclonal antibodies against hepatitis B surface antigen
(HBsAg)by somatic cell hybrids. J Virol Methods. 1980;1:257-273.
7. Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM. Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis.
1991;11:73-83
Revision date : 2011-06-27
Catalogue Nr: KAPG4SGE3 PI number : 1701153 Revision Nr : 110627/1
HBsAg Elisa
Pour la détection qualitative in vitro de l’antigène de surface de l’hépatite B
(HBsAG) dans le sérum ou le plasma humain.
KAPG4SGE3
DIAGNOSTIC IN VITRO
fr
DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgique
Tél. : +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90
1) B UT DU D OSAGE
L’HBsAg Elisa est un kit de diagnostic d'essai immuno-enzymatique pour la détection qualitative in vitro de l’antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg) dans le sérum ou le plasma humain (hépariné, citraté ou sur EDTA).
2) R ESUME ET E XPLICATION DU T EST
L’antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg) est le premier marqueur qui apparaît dans le sang suite à une infection par le virus de l’hépatite B (HBV) quelques jours ou semaines avant la manifestation des symptômes cliniques. Il s’agit d’un polypeptide lipoprotéique qui constitue l’enveloppe externe du virus HB. La détection de l’HBsAg dans le sérum ou le plasma humain indique une infection par l’HBV en cours, aiguë ou chronique. La recherche de marqueurs HBV supplémentaires est nécessaire pour définir le stade précis de la pathologie. Les essais HBsAg sont utilisés non seulement pour diagnostiquer les infections par l’HBV, mais également pour surveiller la progression de la pathologie et l’efficacité du traitement antiviral.
L’HBsAg Elisa est un test rapide servant à la détection qualitative de la présence de l’HBsAg dans un échantillon de sérum ou de plasma (hépariné, citraté ou sur EDTA). Ce test utilise des anticorps monoclonaux et polyclonaux (cochons d’Inde) afin de détecter de façon sélective des niveaux élevés d’HBsAg dans le sérum ou le plasma.
Les échantillons qui ne réagissent pas à l’HBsAg Elisa sont considérés comme négatifs pour l’HBsAg. Les échantillons qui réagissent doivent être testés à nouveau en doublon.
Si la réaction positive se répète, la réactivité pour l’HBsAg de l’échantillon doit être confirmée par des réactifs de confirmation validés.
Seuls les échantillons positifs confirmés sont considéré contenir de l’HBsAg.
3) D ESCRIPTION DU TEST
L’HBsAg Elisa est un essai immuno-enzymatique en phase solide (ELISA = enzyme-linked immuno-sorbent assay) basé sur le « principe du sandwich ».
La phase solide de la plaque de microtitration est composée de puits en polystyrène tapissés d’anticorps monoclonaux de souris spécifiques de l’HBsAg ; par ailleurs, un anticorps polyclonal de cochon d’Inde purifié par chromatographie d’affinité est utilisé pour préparer le conjugué anti-HBs• peroxydase (de raifort) dans la phase liquide.
Lorsqu’un échantillon de sérum ou de plasma contenant des HBsAg est ajouté avec l’anticorps anti-HBs conjugué contenant de la peroxydase aux puits tapissés d’anticorps anti-HBs et incubé, un complexe anticorps-HBsAg-anticorpsperoxydase se forme sur les puits.
Après lavage de la plaque de microtitration pour éliminer le matériel non lié, une solution du substrat TMB est ajoutée aux puits et la plaque est incubée. Une couleur apparaît, proportionnelle à la quantité d’HBsAg liés aux anti-HBs. La réaction peroxydase-TMB est stoppée par ajout d’acide sulfurique. La densité optique de la couleur développée est lue à
450 nm à l’aide d’un photomètre adapté avec une longueur de référence comprise entre 620 et 690 nm
*1
.
Le principe du test est également décrit ci-dessous.
A Échantillon contenant de l’HBsAg :
1. Puits d’une plaque (Anti-HBs) + échantillon (HBsAg) + Anti-HBs•peroxydase → complexe sandwich anti-
HBs•HBsAg•(Anti-HBs•peroxydase)
2. Complexe sandwich + solution du substrat TMB → coloration bleu clair à bleu
3. Ajouter de l’acide sulfurique pour arrêter la coloration → Lire la DO à 450 nm (longueur d’onde de référence entre
620 et 690 nm
*8
)
Nº de catalogue : KAPG4SGE3 Nº de PI : 1701153 Nº de révision : 110627/1
B Échantillon sans HBsAg :
1. Puits d’une plaque (Anti-HBs) + échantillon (sans HBsAg) + Anti-HBs•peroxydase → Anti-HBs (sur le puits)
2. Anti-HBs (sur le puits) + solution du substrat TMB → couleur incolore à bleu clair
3. Ajouter de l’acide sulfurique pour arrêter la coloration → Lire la DO à 450 nm (longueur d’onde de référence entre
620 et 690 nm
*8
)
4) D ESCRIPTION DU M ATERIEL F OURNI
● Les articles 1 - 6 dans le tableau des réactifs suivant doivent être réfrigérés entre 2 et 8 °C. La solution de lavage D
(20X) et la solution d’arrêt de la réaction peuvent être stockées entre 2 et 30 °C.
ART
Qté par
ICL Composants Description
96 tests
ES
Plaque anti-HBs
(1)
Plaque de microtitration tapissée d’anti-HBs monoclonaux de souris.
1 plaque
(2)
Solution de peroxydase anti-
HBs
Ab HRP
Contrôle HBsAg concentré
CHROM TMB
SOLN
CONC
CONC
Conjugué polyclonal anti-HBs
HRPO, dilué dans un tampon avec stabilisateurs des protéines.
Conservateurs :
0,003 % de Gentamycine et
0,01 % de Thimérosal.
Colorant : rouge de phénol.
1 flacon,
8 ml
(3) positif
CONTROL H
Sérum humain inactivé positif pour l’HbsAg, mais non réactif pour l’anti-HCV et l’anti-HIV1/2, dilué dans un tampon avec stabilisateurs des protéines.
Conservateurs : 0,003 % de
Gentamycine et 0,01 % de Thimérosal.
1 flacon,
1,5 ml
(4)
Contrôle HB négatif
CONTROL L
Sérum non réactif aux marqueurs
HBV, anti-HCV et anti-HIV1/2, dilué dans un tampon avec stabilisateurs des protéines.
Conservateurs : 0,003 % de
Gentamycine et 0,01 % de Thimérosal.
Chromogène TMB 0,6 mg/ml de
1 flacon,
2,0 ml
(5)
3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine
(TMB) dans une base organique avec du DMSO.
1 flacon,
12 ml
(6)
(7)
(8)
Tampon du substrat
SUB BUF
Solution de lavage conc. (20X)
WASH
Solution d'arrêt
Tampon citrate contenant 0,03 % d’H2O2.
Tampon phosphate concentré avec du Tween-20
Acide sulfurique 1N
1 flacon,
12 ml
1 flacon
58 ml
1 flacon
12 ml
● AUTRE MATÉRIEL REQUIS, MAIS NON FOURNI
ARTICLES Composants
(1)
(2)
(3)
Des micropipettes de 50 µl, 100 µl et des embouts sont nécessaires.
Bain-marie ou incubateur avec contrôle de la température à +37 °C.
Matériel de lavage de la plaque.
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(4)
(5)
Lecteur de microplaques ELISA :
Longueur d’onde double à 450 nm avec longueur d’onde de référence entre 620 et
690 nm, bande passante de 10 nm
*1
.
Un analyseur de microplaque pour EIA totalement automatique est facultatif.
L’utilisateur doit valider l’analyseur automatique de microplaque pour EIA par rapport au kit.
4.1) Conditions de stockage et stabilité du kit et des composants
Kit/composants
Temp. de stockage
Kit HBsAg Elisa
Contrôle HBsAg positif
Contrôle HB négatif
Plaque anti-HBs
Solution du conjugué Anti-HBs‧HRPO
Solution de lavage concentrée (20X)
Solution de lavage diluée 20X
+2 à +8 °C
+2 à +8 °C
+2 à +8 °C
+2 à +8 °C
+2 à +8 °C
Temp. ambiante
Temp. ambiante
+2 à +8 °C
État
Original
Après ouverture
Original
Après ouverture
Original
Après ouverture
Original
Après ouverture
Original
Après ouverture
Original
Après ouverture
Diluée
Chromogène TMB concentré
Tampon du substrat
+2 à +8 °C
+2 à +8 °C
Diluée
Original
Après ouverture
Initial
Après ouverture
Mélange substrat TMB
Acide sulfurique 1N
Temp. ambiante
Temp. ambiante
Mélange
Original
Après ouverture
Stabilité
18 mois
1 mois
18 mois
1 mois
18 mois
1 mois
24 mois
1 mois
18 mois
1 mois
24 mois
1 mois
2 jours
1 semaine
24 mois
1 mois
24 mois
1 mois
6 heures
24 mois
1 mois
5) Mode d’emploi
5.1) Avertissements :
5.1.1) Ce kit de réactifs est uniquement à usage professionnel.
5.1.2) Ce kit de réactifs est uniquement destiné à un diagnostic in vitro.
5.1.3) Placer l’ensemble des réactifs du kit et des échantillons à température ambiante (+20 à +30 °C) et mélanger soigneusement avant utilisation.
5.1.4) Ne pas utiliser les réactifs après la date d’expiration.
5.1.5) Ne pas échanger les réactifs entre différents lots.
5.1.6) Ne pas porter la pipette à la bouche.
5.1.7) Ne pas fumer ou manger dans les zones où des échantillons ou des réactifs sont manipulés.
5.1.8) Tous les composants du kit et les échantillons doivent être considérés comme potentiellement dangereux pour la santé. Ils doivent être utilisés et éliminés conformément aux procédures de sécurité de votre laboratoire. Ces procédures de sécurité incluent probablement le port de gants de protection et éviter de produire des aérosols.
5.1.9) Les échantillons potentiellement infectieux et les déversements ou fuites non acides doivent être minutieusement nettoyés à l’aide d’hypochlorite de sodium à 5 % ou traités selon votre procédure de contrôle des risques biologiques potentiels.
5.1.10) Avant d’éliminer les échantillons et les kits de réactifs usagés dans les ordures ménagères, ils doivent être traités conformément à la procédure locale de traitement des déchets biologiques potentiellement dangereux ou comme suit :
Les déchets liquides et solides doivent être stérilisés par autoclave à +121 °C pendant au moins 30 minutes.
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Les déchets solides peuvent également être incinérés.
Les déchets liquides non acides peuvent être traités à l’aide d’hypochlorite de sodium dilué à une concentration finale de 1 %.
Les déchets liquides acides doivent être neutralisés avant traitement à l’aide d’hypochlorite de sodium tel que mentionné ci-dessus et doivent être stérilisés pendant 30 minutes pour obtenir une désinfection effective.
5.1.11) La solution d’arrêt est un irritant pour la peau, les yeux, les voies respiratoires et les muqueuses. Éviter le contact de la solution d’arrêt avec la peau et les muqueuses. En cas de contact, laver immédiatement et abondamment à l’eau. En cas d’inhalation, respirer immédiatement de l’air frais et consulter un médecin en cas de douleur.
5.1.12) Le chromogène TMB concentré contient un solvant organique inflammable : risques d’effets graves irréversibles en cas d’inhalation, contact avec la peau ou ingestion. Le chromogène TMB concentré contient du sulfoxyde de diméthyle, un irritant pour la peau et les muqueuses.
5.1.13) Bien que tous les échantillons d’origine humaine soient testés non réactifs pour l’anti-HCV et l’anti-HIV et ont
été inactivés à +56 °C pendant une heure, le réactif doit être manipulé comme une substance potentiellement infectieuse.
*2
5.2) Collecte et préparation des échantillons pour analyse
5.2.1) Aucune préparation spéciale du patient n’est requise avant une prise de sang. Le sang doit être prélevé par des techniques médicales approuvées.
5.2.2) Des échantillons de sérum ou de plasma peuvent être utilisés avec ce kit de test. Les échantillons de sang total doivent être séparés au plus tôt pour éviter l’hémolyse. Toute particule (par ex., caillots de fibrine,
érythrocytes) contenue dans l’échantillon doit être retirée avant utilisation.
5.2.3) Les échantillons doivent être stockés entre +2 et +8 °C et éviter l’inactivation par la chaleur pour minimiser la détérioration. Pour un stockage de longue durée, ils doivent être congelés en dessous de -20 °C. Un stockage en congélateur à dégivrage automatique n’est pas recommandé.
5.2.4) Les échantillons congelés doivent être entièrement décongelés et mélangés de façon homogène avant le test.
5.2.5) Éviter les procédures de congélation-décongélation multiples.
AVERTISSEMENT
1. L’échantillon ne doit contenir aucun composé d’AZOTURE qui inhibe l’activité de la peroxydase.
2. Les sérums partiellement coagulés et les échantillons avec une contamination bactérienne ne doivent pas être utilisés.
5.3) Conditions de stockage et stabilité des réactifs
5.3.1) Le kit doit être conservé entre +2 et +8 °C. Ne pas congeler.
5.3.2) Les barrettes de la plaque doivent être utilisées dans le mois suivant l’ouverture du sachet en aluminium d’origine. Les barrettes non utilisées doivent être conservées dans le sachet en aluminium qui doit être solidement fermé.
5.3.3) Replacer les réactifs entre +2 et +8 °C immédiatement après utilisation.
5.3.4) La solution de lavage concentrée (20X) peut être conservée à température ambiante pour éviter la cristallisation, car les kits sont conservés et expédiés entre +2 et +8 °C. Si des cristaux se sont formés avant utilisation, réchauffer la solution dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à dissolution des cristaux.
5.4) Procédure de lavage de la plaque
5.4.1) Préparation de la solution de lavage :
Diluer la solution de lavage concentrée (20X) avec de l’eau distillée ou désionisée pour obtenir une dilution
1:20. Ne pas utiliser d’eau du robinet.
5.4.2) Lavage de la plaque :
(a) Pour un laveur de plaques avec fonction d’aspiration du trop-plein : 6 cycles avec au moins 0,5 ml de tampon de lavage par puits par cycle. ou
(b) Pour un laveur de plaques sans fonction d’aspiration du trop-plein : 8 cycles avec au moins 0,35 ml de tampon de lavage par puits par cycle.
5.4.3) Sécher en retournant la plaque et en la tapotant fermement sur du papier absorbant. Une trop grande quantité de tampon de lavage résiduel entraînera des résultats erronés.
AVERTISSEMENT:un lavage insuffisant entraînera des résultats erronés.
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5.5) Procédure du test
5.5.1) Placer tous les réactifs et échantillons à température ambiante (+20 à +30 °C) avant l’essai. Régler le bain-marie ou l’incubateur à +37±1 °C.
5.5.2) Garder un puits pour le blanc. Ajouter 50 µl de chaque contrôle ou d’échantillon dans les puits appropriés de la plaque de microtitration (3 contrôles négatifs et 2 contrôles positifs).
REMARQUE : a. Utiliser un embout de pipette propre pour chaque prélèvement afin d’éviter la contamination croisée. b. Chaque plaque doit avoir respectivement des contrôles négatifs, des contrôles positifs et un puits pour le blanc. c. Ne pas utiliser la valeur du seuil de positivité établie pour d’autres plaques d’HBsAg Elisa.
5.5.3) Ajouter 50 µl de solution de peroxydase anti-HBs à chaque puits sauf au blanc.
REMARQUE : Ne pas toucher la paroi des puits de la plaque pour éviter la contamination.
5.5.4) Tapoter doucement la plaque.
5.5.5) Retirer le support de protection de la bande adhésive et la placer en appuyant sur la plaque de réaction de sorte qu’elle soit scellée hermétiquement.
5.5.6) Incuber la plaque de réaction dans un bain-marie ou un incubateur à +37±1 °C pendant 80 minutes.
5.5.7) À la fin de la période d’incubation, retirer et jeter la bande adhésive et laver la plaque selon le paragraphe 5.4)
Procédure de lavage de la plaque.
5.5.8) Sélectionner l’une des deux méthodes suivantes pour la coloration :
A. Mélanger immédiatement avant utilisation des volumes identiques de chromogène TMB concentré et de
tampon du substrat dans un récipient propre. Ajouter 100
l de la solution du mélange à chaque puits, y compris au blanc.
B. Ajouter tout d’abord 50
l de chromogène TMB concentré, puis ajouter 50
l de tampon du substrat à chaque puits, y compris au blanc. Bien mélanger avec précaution.
REMARQUE : Le chromogène TMB concentré doit être incolore à bleu clair ; sinon il faut le jeter. Le mélange de chromogène TMB concentré et de tampon du substrat doit être utilisé dans les 30 minutes après le mélange. Le mélange doit être tenu à l’écart de toute lumière intense.
5.5.9) Recouvrir la plaque d’un couvercle noir et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
5.5.10) Stopper la réaction en ajoutant 100 µl de solution d’arrêt à chaque puits, y compris au blanc.
5.5.11) Déterminer l’absorbance des contrôles et des échantillons dans les 30 minutes avec un spectrophotomètre de précision à 450/620-690 nm (longueur d’onde de lecture à 450 nm avec une longueur d’onde de référence entre
620 et 690 nm)
*2
.
Utiliser le puits du blanc pour définir le zéro du spectrophotomètre.
REMARQUE : La couleur du puits du blanc doit être incolore à jaune clair ; sinon les résultats du test sont invalides.
Blanc du substrat : la valeur de l’absorbance doit être inférieure à 0,100.
5.6) Calculs des résultats
5.6.1) Calcul du NC (absorbance moyenne du contrôle négatif).
Exemple : Nº d’échantillon Absorbance
1 0,022
2
3
0,025
0,023
NC = (0,022 + 0,025 + 0,023) / 3 = 0,023
Le NCx doit être ≦0,1, sinon le test n’est pas valide.
5.6.2) Calcul du PC (absorbance moyenne du contrôle positif).
Exemple : Nº d’échantillon Absorbance
1 1,432
2 1,508
PC = (1,432 + 1,508) / 2 = 1,470
Le PC doit être ≧0,6, sinon le test n’est pas valide.
Nº de catalogue : KAPG4SGE3
5.6.3) Calcul de la valeur P - N
P - N = PC – NC
Exemple : NC = 0,024
PC = 1,470
P - N = 1,470 – 0,024 = 1,446
Nº de PI : 1701153 Nº de révision : 110627/1
La valeur P - N doit être ≧0,5, sinon le test n’est pas valide.
5.6.4) Calcul de la valeur du seuil de positivité
Valeur du seuil de positivité = NC + 0,025
Exemple :
Valeur du seuil de positivité = 0,023 + 0,025 = 0,048
5.7) Validité des runs de tests
5.7.1) Le NC doit être ≦0,1, sinon le test n’est pas valide.
5.7.2) Le PC doit être ≧0,6, sinon le test n’est pas valide.
5.7.3) La valeur P - N doit être ≧0,5, sinon le test n’est pas valide.
REMARQUE : Contrôle négatif : la valeur de l'absorbance doit être inférieure ou égale à 0,100 après avoir soustrait le blanc.
5.8) Interprétation des résultats
5.8.1) Les échantillons présentant des valeurs d’absorbance INFÉRIEURES à la valeur du seuil de positivité sont
NON RÉACTIFS et sont considérés comme NÉGATIFS pour l’HBsAg.
5.8.2) Les échantillons présentant des valeurs de l’absorbance SUPÉRIEURES ou ÉGALES à la valeur du seuil de
positivité sont considérés comme INITIALEMENT RÉACTIFS. Les échantillons d’origine doivent être testés
à nouveau en doublon.
5.8.3) Si les deux valeurs d’absorbance du nouveau test sont inférieures à la valeur du seuil de positivité, les
échantillons sont considérés comme NÉGATIFS pour l’HBsAg.
Si, dans le nouveau test, au moins l’une des deux valeurs d’absorbance est SUPÉRIEURE ou ÉGALE à la
valeur du seuil de positivité, les échantillons sont considérés comme positifs pour l’HBsAg réitérés. Les
échantillons positifs réitérés seront confirmés à l’aide de réactifs de confirmation validés.
5.9) Résolution des problèmes
Si le résultat ne peut être reproduit, réaliser une procédure de contrôle préliminaire en vérifiant les possibilités cidessous :
5.9.1) Procédure de lavage inappropriée.
5.9.2) Contamination avec un échantillon positif.
5.9.3) Volume incorrect d’échantillon, du conjugué ou du substrat.
5.9.4) Contamination du bord du puits avec un conjugué.
5.9.5) Échantillon inapproprié, par exemple sérum ou plasma hémolysé, échantillon contenant des sédiments et
échantillons insuffisamment mélangés avant utilisation.
5.9.6) Durée ou température d’incubation incorrecte.
5.9.7) Tête et aiguilles d’aspiration/distribution du laveur obstruées ou partiellement obstruées.
5.9.8) Aspiration insuffisante.
5.10) Limites et interférences
5.10.1) Ce kit de réactifs doit être uniquement utilisé pour du sérum ou du plasma humain non mis en pool.
5.10.2) Ce kit de réactifs n’a pas été validé pour une utilisation avec des échantillons prélevés sur des cadavres.
5.10.3) Un résultat HBsAg négatif sans autre preuve ne doit pas être utilisé pour exclure une infection par HBV.
5.10.4) Substances provoquant des interférences :
Les résultats suivants ont été obtenus lors d’expérimentations respectives :
1. Aucune interférence avec différents anticoagulants tels que l’héparine de lithium, l’EDTA, le citrate n’a été observée.
2. Les échantillons traités par la chaleur (+60 °C, 10 heures) ont présenté une diminution du titre d’HBsAg.
3. Aucune réactivité croisée n’a été détectée sur des échantillons provenant de patients présentant a) d’autres infections par HAV, EBV, CMV, HSV, VZV, Lyme Borreliosis, HCV, HIV, b) d’autres états pathologiques tels qu'insuffisance rénale, hémodialyse, hépatite auto-immune, cirrhose du foie et c) présence de certains anticorps tels que HAMA, GAD, IA2, APS.
Nº de catalogue : KAPG4SGE3
4. Les échantillons contenant des substances pouvant provoquer des interférences [par ex., triglycérides
(lipémie), hémoglobine (hémolyse), bilirubine (ictère), composants d’immunoglobuline monoclonale, niveaux élevés d’anticorps auto-immuns (facteur rhumatoïde (FR), anticorps antinucléaires (ANA), ou anticorps antimitochondriaux (AMA)] et les échantillons provenant de femmes enceintes n’ont pas provoqué
Nº de PI : 1701153 Nº de révision : 110627/1
d’interférences avec l’essai HBsAg Elisa.
5.11) Performance
5.11.1) Spécificité diagnostique
Résultats de l’évaluation européenne de la performance pour l’HBsAg Elisa de DIAsource – Réactivité des
échantillons « Donneur » et « Clinique » HBV négatifs.
Nbre total d’échantillons HBsAg Elisa de DIAsource
N Nég
*
IR
**
RR Confirmé Faux positif
HBV négatif
(échantillon clinique)
213 211 2 2 0 2
HBV négatif
(échantillon donneur)
Total
5501 5479 22 22
5714 5690 24 24
*IR : initialement réactif **RR : réactif réitéré
Spécificité diagnostique = 5690/5714 = 99,58 %
0
0
22
24
5.11.2) Sensibilité diagnostique
1. La sensibilité diagnostique déterminée dans les évaluations européenne de la performance a donné les résultats suivants :
Échantillon
Sérums HBsAg positifs
Nbre d’échantillons
400
Sensibilité diagnostique = 400/400 = 100 %
Réactifs
400
Sensibilité
100 %
2. L’évaluation de l’HBsAg Sensitivity Panel PHA807 (BBI, États-Unis) a donné les résultats suivants :
Panel
Nbre de membres du panel
Résultats
Panel de sensibilité HBsAg
PHA807 (BBI)
PHA807-01~21
Équivalents ou meilleurs que les concurrents.
3. L’évaluation de l’HBsAg Mixed Titer Performance Panel PHA205 (BBI, États-Unis) a donné les résultats suivants :
Panel
Nbre de membres du panel
Résultats
Panel de performance d’un mélange de titres HBsAg PHA205
(BBI)
PHA205-01~25
Équivalents ou meilleurs que les concurrents.
4. L’évaluation du HBsAg Mixed Titer Performance Panel VHA601 (BBI, États-Unis) a donné les résultats suivants :
Panel
Panel de performance d’un mélange de titres HBsAg VHA601 (BBI)
Nbre de membres du panel
VHA601-01~06
Résultats
Rencontre les résultats du
BBI escomptés.
5. L’évaluation du HBsAg Mixed Titer Performance Panel QHA711 (BBI, États-Unis) a donné les résultats suivants :
Panel
Panel de performance d’un mélange de titres HBsAg QHA711 (BBI)
Nbre de membres du panel
QHA711-01~06
Résultats
Rencontre les résultats du
BBI escomptés.
6. Résultats du test avec l’INTS HBsAg Subtype Panel :
Les résultats de l’évaluation démontrent que l’ensemble des sérotypes HBsAg connus (sous-types HBsAg) disponibles dans le panel des sous-types HBsAg INTS peuvent être détectés aussi bien par l’HBsAg Elisa que par l’essai de référence à des dilutions pouvant aller jusqu’à 10 4 x ~ 10
6 x.
7. Tableau de synthèse de l’évaluation de l’ensemble des panels de séroconversion testés :
Nº de catalogue : KAPG4SGE3 Nº de PI : 1701153 Nº de révision : 110627/1
Nº de catalogue : KAPG4SGE3
ID du panel
PHM907 (ay)
PHM916 (ay)
PHM920 (ad)
PHM921 (ad)
PHM930 (ad)
PHM933 (ad)
PHM934 (ad)
PHM935A
(ad)
PHM935B
(ad)
NabiSB0411
PHM903 (ad)
PHM904 (ad)
PHM906 (ad)
PHM909 (ad)
PHM910 (ad)
PHM912 (ad)
PHM914 (ad)
PHM915
(ind)
PHM917
(ind)
PHM918 (ad)
PHM923 (ay)
PHM924 (ad)
PHM925
(ind)
PHM926
(ind)
PHM927
(ind)
PHM928 (ad)
PHM929 (ad)
PHM931
(ind)
PHM932 (ad)
PHM935A
(ad)
Résultat HBsAg positif à compter de la date du premier prélèvement sanguin
Essai HBsAg de référence
(A en jours)
HBsAg Elisa
(B en jours)
Différence de jours de prélèvement
(A-B)
Différence du nombre de prélèvements
(nbre de membres du panel)
50 50 0 0
62
26
65
26
-3
0
-1
0
0
3
7
0
0
3
9
0
0
0
-2
0
0
0
-1
0
9
231
6
6
7
137
9
35
42
0
12
36
7
15
29
8
13
4
9
14
19
61
21
21
217
6
10
18
0
9
18
0
146
28
>43
7
21
35
14
15
7
9
18
21
61
28
-12
14
0
-4
-11
137
0
17
42
-146
-16
->7
0
-6
6
-6
-2
-3
0
-2
-2
0
-7
-3
-1
0
-1
-1
1
0
1
7
-1
-5
->2
0
-1
1
-1
-1
-1
0
-1
-1
0
-2
Total
----- -----
Moyenne
Somme = -13
-13/30 = 0,4 jour
- - - - -
- - - - -
Synthèse de l’évaluation de l’ensemble des panels de séroconversion testés :
Les résultats ont montré que l’HBsAg Elisa est quasiment équivalent à l’essai de référence. En moyenne, le test
HBsAg Elisa a seulement 0,4 jour de retard par rapport à l’essai de référence dans les 30 panels de séroconversion testés.
5.11.3) Mutants
1. Panel mutant
Un panel de mutants dans le PreCore de l’hépatite B de Teragenix, États-Unis a été testé. L’HBsAg Elisa peut détecter les résultats pour un rapport de dilution du panel de 1:2 ou 1:5.
Ce panel contient 3 échantillons de Promoteur Core (A1762/G1764) de type sauvage ; mutant dans le codon 28 de la région PreCore/infection de type sauvage, 4 échantillons de Promoteur Core (A1762/G1764) de type sauvage ; mutant dans le codon 28 de la région PreCore, 2 échantillons de Promoteur Core (T1762/A1754)
MUTANT/(A1762/G1754) infection mélangée de type sauvage.
Nº de PI : 1701153 Nº de révision : 110627/1
2. Échantillons mutants
Le taux de détection de l’HBsAg Elisa est 17/21, soit un meilleur résultat que le kit de référence (14/21).
Mutation HBsAg Elisa
Kit de référence
Mutation HBsAg Elisa
Kit de référence
113A114
P120L
R122I
R122T
E122I
T123N
122RA123
C124R
T131I
T131P
Y134S
Taux détection de
Int positif positif négatif positif positif positif négatif négatif positif positif positif
8/11
Int positif C137W positif C139Y négatif K141E positif P142L/G145R positif P142L positif D144G négatif G145K négatif C147T/C148T positif E164D positif S174N positif
8/11
Taux détection de
Int positif positif positif négatif positif positif positif positif positif positif
9/10
Int négatif positif positif négatif positif négatif négatif positif positif positif
6/11
5.11.4) 25 échantillons positifs frais du même jour
L’HBsAg Elisa a détecté 25 échantillons positifs frais du même jour. Les critères du chapitre 3.1.9 de la 2009/886/CE ont été satisfaits.
5.11.5) Sensibilité analytique
2 e
Étalons
étalon international de l’OMS
※
Étalon PEI sous-type ad
Étalon PEI sous-type ay
Sensibilité calculée
0,03 UI/ml
0,08 PEI U/ml
0,09 PEI U/ml
※
Seconds étalons internationaux de l’OMS pour l’HBsAg, sous-type adw2, génotype A, code NIBSC : 00/588
5.11.6) Précision
1. Reproductibilité intra-essai
La précision intra-essai a été déterminée à l’aide d’un échantillon de contrôle positif et de deux échantillons de sérum de patient de différentes concentrations en HBsAg (taux légèrement supérieur au niveau du seuil de positivité et taux moyen) qui ont été analysés 20 fois en un seul run sur 3 jours.
Série
2
2
3
3
3
1
1
1
2
ID
échantillon
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
Moyenne
0,7541
2,2766
1,3159
0,9671
2,7325
1,5822
0,9669
2,6088
1,6502
Écart type
0,0857
0,1571
0,1168
0,0358
0,1025
0,0888
0,0909
0,2367
0,1499
Coefficient de variation
11,36
6,90
8,88
3,70
3,75
5,61
9,40
9,07
9,08
Le CV calculé variait entre 3,7 % et 11,36 %. (= valeur acceptable pour un essai immuno-enzymatique sous forme de plaque de microtitration).
2. Reproductibilité inter-essai
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Les essais pour l’évaluation de la précision ont été réalisés sur 10 jours à l’aide de cinq échantillons de sérum (avec un taux d’HBsAg à peine positif et un taux nettement supérieur au seuil de positivité).
ID
échantillon
N Moyenne Écart type
Coefficient de variation
F1
F2
10
10
0,0609
0,0770
0,0185
0,0189
30,41
24,56
F3
F4
F5
10
10
10
0,1000
0,1786
0,6107
0,0245
0,0462
0,1412
24,51
25,87
23,12
Le CV calculé variait entre 30,4 % pour un échantillon HBsAg négatif et 23,1 % pour un échantillon HBsAg faiblement positif (= valeurs acceptables pour l’imprécision inter-essai d’un essai immuno-enzymatique sous forme de plaque de microtitration).
5.11.7) Excès d’antigène/effet crochet (Hook effect) à dose élevée
Cette étude a été réalisée en testant, avec l’essai HBsAg Elisa de DIAsource, des dilutions en série d’un échantillon de sérum ayant une concentration très élevée en HBsAg de 125 mg/l. Aucun effet crochet à dose élevée n’a été observé.
5.11.8) Traçabilité
L’HBsAg Master Calibrator de DIAsource a été calibré par rapport à l’étalon de travail HBsAg britannique
(British Working Standard for HBsAg ) (NIBSC-Code : 01/476-006) à l'aide de l'essai HBsAg Elisa. L’efficacité relative (rapport) de l’étalon de travail HBsAg britannique par rapport à l’HBsAg Master Calibrator de DIAsource est de 4,081 (3,853-4,325 IC à 95 %). La concentration du contrôle positif de l’essai HBsAg Elisa a été déterminée par rapport à l’HBsAg Master Calibrator de DIAsource et a été établie à 42 UI/ml ± 20 %.
5.12) Représentation graphique de la procédure de test
Ajouter 50 µl des contrôles (3 X NC, 2 X PC) et ajouter 50 µl de chaque échantillon aux puits. Garder un puits pour le blanc.
↓
Ajouter 50 µl de solution Anti-HBs‧ peroxydase à chaque puits de réaction, sauf au blanc.
↓
Incuber la plaque à +37±1°C pendant 80 minutes.
↓
Laver la plaque.
(Choisir l’une des deux méthodes suivantes pour la réaction enzymatique avec coloration)
↙ ↘
Mélanger des volumes identiques de chromogène
TMB concentré et de tampon du substrat. Ajouter 100 µl de la solution obtenue aux puits.
Ajouter 50 µl de chromogène TMB concentré, aux puits puis ajouter 50 µl de tampon du substrat. Bien mélanger, doucement.
↘ ↙
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
↓
Ajouter 100 µl d’acide sulfurique 1N à chaque puits.
↓
Déterminer l’absorbance à l’aide d’une longueur d’onde de lecture de 450 nm avec une longueur d’onde de référence entre 620 et 690 nm
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6) R EMARQUES
*1 La longueur d’onde de référence du photomètre à utiliser peut varier entre 620 nm et 690 nm. Toutefois, l’utilisateur doit valider le photomètre par rapport à l’HBsAg Elisa.
*2 Inactivation incomplète du virus de l’hépatite B après un traitement à la chaleur à +60 °C pendant 10 heures, J. Infect.
Dis. 138:242-244.
7) B IBLIOGRAPHIE
1. Blumberg BS, Alter HJ, Visnich S. A „new“ antigen in leukemia sera. JAMA, 1965;191:101- 106.
2. Dane DS, Cameron CH, Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis. Lancet 1970; 1: 695 - 698.
3. Aach RD, Grisham JW, Paker CW. Detection of Australia antigen by radioimmunoassay. Proc Natl Acad Sci. USA
1971;68:1056-1060.
4. Kim CY, Tikes JG. Purification and biophysical characterization of hepatitis antigen. J Clin Invest. 1973; 52:1176-
1186.
5. Wolters G. Kuijpers LP, Kacaki J, Schuurs AH, Enzyme linked immunosorbent assay for hepatitis B surface antigen.
J Infect. Dis 1977;136:Suppl 311-377.
6. Shih JW, Cote PJ Jr, Dapolito GM, Gerin JL. Production of monoclonal antibodies against hepatitis B surface antigen
(HBsAg)by somatic cell hybrids. J Virol Methods. 1980;1:257-273.
7. Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM. Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis.
1991;11:73-83
Date de révision : 2011-06-27
Nº de catalogue : KAPG4SGE3 Nº de PI : 1701153 Nº de révision : 110627/1
HBsAg Elisa
Para la detección cualitativa del antígeno de superficie de la hepatitis B
(HBsAg) en suero o plasma humano.
KAPG4SGE3
PARA USO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO
es
DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium Tel: +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90
1) USO PREVISTO
El kit de diagnostico HBsAg ELISA es un inmunoensayo enzimático in vitro para la detección cualitativa del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en suero o plasma humano (heparina, citrato o EDTA).
2) RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO
El antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) es el primer marcador que aparece en la sangre después de la infección con el virus de la hepatitis B (VHB) algunos días o semanas antes que se manifiesten los síntomas clínicos. Es un polipéptido lipoproteína que forma la envoltura externa del virus de HB. La detección de HBsAg en suero humano o plasma indica que hay una infección de VHB aguda o crónica en curso. El ensayo HBsAg se usa no solo para diagnosticar infecciones con VHB sino también para monitorizar el curso de la enfermedad y la eficiencia de la terapia anti-viral.
HBsAg ELISA es un ensayo rápido para la detección cualitativa de la presencia de HBsAg en la muestra de suero o plasma (heparina, citrato EDTA). El ensayo utiliza anticuerpos monoclonales y policlonales (anti-cobaya) para detectar selectivamente niveles altos de HBsAg en suero o plasma.
Las muestras que no son reactivas con HBsAg ELISA se consideran negativas para HBsAg. Las muestras con una reacción positiva deben ser repetidas en duplicado.
En caso de obtener un resultado reactivo en una repetición, la muestra debe ser confirmada para la reactividad con
HBsAg usando reactivos de confirmación validados.
Se considera que solo las muestras positivas confirmadas contienen HBsAg.
3) DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO
HBsAg Elisa es un inmunoensayo enzimático de fase sólida (ELISA= enzyme-linked immunosorbent assay) – basado en
"principio del sándwich".
La fase sólida de la microplaca está formada por pocillos de poliestireno, recubiertos con anticuerpos monoclonales de ratón, específicos para HBsAg; en cambio el anticuerpo policlonal de cobayo, purificado por cromatografía de afinidad se usa para preparar el conjugado de anti-HBs• peroxidasa (rábano picante) en fase líquida.
Cuando una muestra de suero o plasma que contiene HBsAg se agrega a un pocillo recubierto con anticuerpos anti-HBs junto con el anticuerpo anti-HBs conjugado con peroxidasa y se incuban, se formará un complejo anticuerpo-HBsAganticuerpo-pocillo recubierto en el pocillo.
Después de lavar la microplaca para eliminar el material que no se ha unido, se agrega una solución de sustrato TMB a lo pocillos y se incuba. El color se desarrolla proporcionalmente a la cantidad de HBsAg que se ha unido al Anti-HBs. La reacción peroxidasa-TMB se detiene agregando ácido sulfúrico. La densidad óptica del color que se ha generado se mide con un fotómetro adecuado a 450 nm con una longitud de onda de referencia seleccionada de 620 a 690 nm
*1
.
El principio del ensayo descrito anteriormente se ilustra también enel siguiente diagrama.
A Muestra que contiene HBsAg:
1. Placa (Anti-HBs) + muestra (HBsAg) + Anti-HBs • peroxidasa
→ HBsAg •Anti-HBs• (Anti-HBs • peroxidasa) complejo de sándwich
2. Complejo de sándwich + solución de sustrato TMB → color de azul a celeste
3. Agregue ácido sulfúrico para detener el desarrollo del color → Lea la DO a 450nm/620-690 nm
*8
B Muestra sin HBsAg:
1. Placa (Anti-HBs) + muestra (sin HBsAg) + Anti-HBs • peroxidasa → Anti-HBs (en los pocillos)
2. Anti-HBs (en los pocillos) + solución de sustrato TMB → Incoloro a azul claro
3. Agregue ácido sulfúrico para detener el desarrollo del color → Lea la DO a 450nm/620-690 nm*
8
4) DESCRIPCIÓN DE LOS MATERIALES PROPORCIONADOS
Catalogo Nr: KAPG4SGE3 PI Numero : 1701153 Revisión Nr : 110627/1
●Items 1 - 6 en la siguiente tabla de reactivos deben mantenerse refrigerados entre + 2 y +8°C. La Solución de
Lavado (20X) y la solución de parada pueden almacenarse entre +2 y +30°C.
ITEMS
(1)
Componentes
Anti-HBs Placa
Descripción
Microplaca recubierta con anti-HBs monoclonal de ratón.
Cant. para
96 ensayos
1 placa
(2)
(3)
Solución Anti-
HBs · Peroxidasa
Ag HRP
Control Positivo
HBsAg
Conjugado Anti-HBs HRPO policlonal diluido en tampón con estabilizadores de proteínas.
Conservantes:
Gentamicina 0,003% y Timerosal 0,01%.
Tinción: rojo fenol.
Suero humano inactivado positivo para HBsAg pero no-reactivo con anti-VHC y anti-VIH1/2, diluido en tampón con estabilizadores de proteínas.
1 vial,
8 ml
1 vial,
1.5 ml
(4)
(5)
(6)
(7)
CONTROL H
Control Negativo
HB
Conservantes:
Gentamicina 0,003% y Timerosal 0,01%.
Suero no reactivo para VHB marcadores anti-VHC y anti-VHI 1/2, diluido en tampón con estabilizadores de proteínas.
CONTROL L
-
Conservantes:
Gentamicina 0,003% y Timerosal 0,01%.
TMB Cromogénico concentrado
0,6 mg/ml de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) en una base orgánica con DMSO.
CHROM TMB CONC
Tampón del
Sustrato
Tampón de ácido cítrico con 0,03% H2O2.
SUB BUF
Solución de Lavado
Conc. (20x)
Tampón concentrado de fosfato con Tween-20
WASH SOLN CONC
1 vial,
2 ml
1 vial,
12 ml
1 vial,
12 ml
1 vial,
58 ml
(8)
Solución de Parada
STOP SOLN
1N ácido sulfúrico
1 vial,
12 ml
OTROS MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS
ITEMS Componentes
(1)
Micropipetas y puntas de 50µl y 100 µl
(2)
(3)
(4)
(5)
Incubadora o baño maría con control de temperatura a +37 °C.
Equipo para lavado de placas.
Lector de microplacas ELISA:
Longitud de onda dual 450nm con longitud de onda de referencia de 620-690nm, ancho de banda 10nm
*1
.
Un analizador EIA de microplacas totalmente automático es opcional. El usuario debe validar el equipo en conjunto con el kit.
Catalogo Nr: KAPG4SGE3 PI Numero : 1701153 Revisión Nr : 110627/1
4.1) CONDICIONES DE ALMACENAJE Y ESTABILIDAD DEL KIT Y SUS COMPONENTES*
Kit/componentes Condición de almacenaje
Estado Estabilidad
HBsAg ELISA kit
Control positivo HBsAg
Control Negativo HB
Placa Anti-HBs
Solución Conjugado Anti-HBs‧ HRPO
Solución de Lavado Concentrada (20x)
Solución de Lavado Diluida 20x
TMB cromogénico concentrado
+2 to +8°C
+2 to +8°C
+2 to +8°C
Original
Una vez abierto
Original
Una vez abierto
Original
+2 to +8°C
Una vez abierto
Original
+2 to +8°C
Una vez abierto
Original
Temp ambiente
Una vez abierto
Temp ambiente Diluido
+2 to +8°C
+2 to +8°C
Original
Una vez abierto
Diluido
Original
Una vez abierto
18 meses
1 mes
18 meses
1 mes
18 meses
1 mes
24 meses
1 mes
18 meses
1 mes
24 meses
1 mes
2 dias
1 semana
24 meses
1 mes
Tampón del sustrato +2 to +8°C
Original
Una vez abierto
24 meses
1 mes
Mezcla de Solución de Sustrato TMB Temp ambiente Mezcla 6 horas
1N ácido sulfúrico
Original
Temp ambiente
Una vez abierto
24 meses
1 mes
5) INSTRUCCIONES DE USO
5.1) Advertencias:
5.1.1) Este kit de reactivos es sólo para uso profesional.
5.1.2) Este kit de reactivos es sólo para uso de diagnóstico in vitro.
5.1.3) Procure que todos los reactivos del kit y las muestras alcancen temperatura ambiente (+20 to +30 °C) y mézclelos cuidadosamente antes de usar.
5.1.4) No use reactivos después de su fecha de caducidad.
5.1.5) No intercambie reactivos entre lotes diferentes.
5.1.6) No pipetee con la boca.
5.1.7) No fume o coma en zonas donde se manipulan muestras o reactivos.
5.1.8) Todos los componentes y muestras del kit deben considerarse potencialmente peligrosos para la salud Deben usarse y eliminarse de acuerdo con los procedimientos de seguridad del laboratorio del usuario. Estos procedimientos de seguridad probablemente incluirán el uso guantes de protección y evitar la generación de aerosoles.
5.1.9) Las muestras potencialmente infecciosas y derrames o goteos que no contienen ácidos deben ser limpiados concienzudamente con hipoclorito de sodio al 5% o tratado de acuerdo con las prácticas del laboratorio para el control de un potencial riesgo biológico.
5.1.10) Antes de eliminar los desechos de las muestras usadas y reactivos del kit como desechos generales, estos deben ser tratados de acuerdo con el procedimiento local para desecho con potencial riesgo biológico o tratado como sigue:
Tanto los desechos sólidos como los líquidos deben ser autoclavados a +121 °C por lo menos por 30 minutos.
El desecho sólido también se puede incinerar.
El desecho líquido no ácido puede tratarse con hipoclorito de sodio diluido a una concentración final de 1%.
Los desechos ácidos deben ser neutralizados antes de tratarlos con hipoclorito de sodio como se mencionó antes y debe mantenerse por 30 minutos para obtener una desinfección efectiva.
5.1.11) La solución de parada es irritante para los ojos, la piel, vías respiratorias y membranas mucosas. Evite el contacto de la solución de parada con la piel y membranas mucosas. En caso de contacto, lave con copiosa cantidad de agua inmediatamente. En caso de inhalación, proporcione aire fresco y busque ayuda médica en caso de molestias.
5.1.12) El TMB cromogénico concentrado contiene un disolvente orgánico, que es inflamable: peligro de efectos
graves irreversibles por inhalación, contacto con la piel o ingestión. El TMB cromogénico concentrado contiene
dimetil sulfóxido, un irritante para la piel y membranas mucosas.
5.1.13) A pesar de que todo el material de origen humano ha resultado no reactivo para anti-VHC y Anti-VIH y ha sido inactivado a +56 °C por una hora, el reactivo debe manipularse como material potencialmente infeccioso.
*7
Catalogo Nr: KAPG4SGE3 PI Numero : 1701153 Revisión Nr : 110627/1
5.2) Toma de Muestra y Preparación para el Análisis
5.2.1) El paciente no requiere preparación especial antes de la toma de la muestra. La sangre debe ser tomada con técnicas médicas aprobadas.
5.2.2) Con este kit se puede usar suero o plasma. La muestra de sangre total debe separarse lo antes posible para evitar hemólisis. Cualquier partícula presente en la muestra (por ej. glóbulos rojos, coágulos de fibrina) deben removerse antes de usar.
5.2.3) Las muestras deben almacenarse de +2 a +8 °C y evitar inactivación por calor para minimizar el deterioro. Para almacenar por periodos largos, las muestras se deben congelar por debajo de -20 °C. No se recomienda almacenarlas en congeladores que se auto descongelan.
5.2.4) Las muestras congeladas deben ser descongelados completamente y mezcladas en forma homogénea antes del ensayo.
5.2.5) Evite congelar y descongelar en forma sucesiva
5.2.6) ADVERTENCIA
1. La muestra no debe contener compuestos de azida que puedan inhibir la actividad de la peroxidasa en el conjugado.
2. Muestras de suero coaguladas y muestras con contaminación bacteriana no deben ser usadas
5.3) Almacenaje y estabilidad de los componentes
5.3.1) El kit debe almacenarse entre + 2 y +8 °C. No congelar.
5.3.2) Las tiras de las placas debes usarse dentro de 2 meses después de abrir la bolsa original de aluminio. Las tiras no usadas deben permanecer en la bolsa de aluminio firmemente sellada.
5.3.3) Almacene los reactivos nuevamente entre +2 y +8 °C inmediatamente después de su uso.
5.3.4) El concentrado (x20) de la solución de lavado es almacenado y transportado entre +2 y +8 °C, lo que puede causar cristalización. Si hay precipitado de cristales antes del uso, caliente la solución en un baño maría a +37 °C hasta que los cristales se disuelvan.
5.4) Procedimiento de lavado de placas
5.4.1) Preparación de la solución de lavado:
Diluya la solución de Lavado (x20) con agua destilada o desionizada a una dilución de 1:20. No use agua del grifo.
5.4.2) Lavado de las placas:
(a) Para un lavador de placas con función de aspiración de desborde: 6 ciclos de por lo menos 0,5 ml de tampón de lavado por pocillo, por ciclo
o
(b) Para un lavador sin la función de aspiración de desborde: 8 ciclos de por lo menos 0,35ml de tampón de lavado por pocillo, por ciclo.
5.4.3) Seque invirtiendo la placa sobre un papel absorbente y golpeándola enérgicamente. Si queda demasiado tampón de lavado residual, podría causar resultados falsos.
¡ADVERTENCIA!
Un lavado inadecuado causará resultados falsos.
5.5) Procedimiento del Ensayo
5.5.1) Asegúrese de que todos los reactivos y muestras alcancen temperatura ambiente (+20 a +30 °C) antes del ensayo. Ajuste el baño maría o incubadora a +37±1 °C.
5.5.2) Reserve un pocillo para el blanco. Agregue 50µl de cada control o muestra a los pocillos correspondientes en la placa donde ocurrirá la reacción (3 Controles Negativos y 2 Controles Positivos).
NOTA: a) Use una punta nueva de pipeta para cada muestra para evitar contaminación cruzada b) Cada placa necesita sus propios controles negativos, positivos y pocillos blancos. c) No use el valor de corte establecido para otras placas de HBsAg Elisa..
5.5.3) Agregue 50 μl de solución de anti-HBs· Peroxidasa a cada pocillo excepto a el blanco.
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
NOTA: No toque la pared del pocillo para evitar contaminación.
5.5.4) Golpee la placa suavemente.
5.5.5) Retire el dorso protector de la cubierta autoadhesiva y presiónela sobre la placa de modo que quede sellada firmemente.
5.5.6) Incube la placa a +37±1°C en baño maría o una incubadora por 80 minutos.
.
5.5.7) Al finalizar el periodo de incubación retire y elimine la cubierta autoadhesiva y lave la placa siguiendo
“5.4. PROCEDIMIENTO DE LAVADO DE PLACAS”.
5.5.8) Seleccione uno de los dos métodos siguientes para desarrollar el color:
PI Numero : 1701153 Revisión Nr : 110627/1
A. Mezcle volúmenes iguales de TMB cromogénico concentrado y Tampón de sustrato en un recipiente limpio inmediatamente antes de usar. Agregue 100 µl de la solución de la mezcla a cada pocillo incluyendo el pocillo blanco.
B. Agregue primero 50 µl de TMB cromogénico concentrado y luego agregue 50 µl de Tampón del sustrato a cada pocillo incluyendo el blanco. Mezcle suavemente.
NOTA: El TMB cromógencio concentrado debe ser entre incoloro y celeste; de otro modo debe ser eliminado.
La mezcla de TMB cromogénico concentrado con tampón del sustrato debe usarse dentro de 30 minutos a partir del momento de la mezcla. La mezcla debe protegerse de la luz intensa.
5.5.9) Cubra la placa con la cubierta negra e incube a temperatura ambiente por 30 minutos.
5.5.10) Detenga la reacción agregando 100 µl de solución de parada en cada pocillo incluyendo el blanco.
5.5.11) Determine la absorbancia de los controles y muestras dentro de 30 minutos con un fotómetro de precisión a
450 / 620-690 nm (Longitud de onda de 450 nm para la lectura con 620-690 nm de longitud de onda de referencia)*
2
. Use el blanco para blanquear el fotómetro.
NOTA:
El color del blanco debe ser de incoloro a amarillento pálido; de otro modo el ensayo es inválido. En este caso el ensayo debe ser repetido.
Blanco Sustrato: la absorbancia debe ser menor de 0,100.
5.6) Calculo de los resultados del ensayo
5.6.1) Cálculo de la CN (Absorbancia promedio del Control Negativo).
Ejemplo:
Muestra No. Absorbancia
1
2
0.022
0.025
3 0.023
CN = (0.022 + 0.025 + 0.023) / 3 = 0.023
CNx debe ser
≦0.1de otro modo el ensayo es inválido.
5.6.2) Cálculo de CP (Absorbancia Promedio del Control Positivo)
Ejemplo:
Muestra No.
1
Absorbancia
1.432
2 1.508
CP = (1.432 + 1.508) / 2 = 1.470
CPx debe ser
≧0.6de otro modo el ensayo es inválido.
5.6.3) Calculo del Valor P - N
P - N = PC – NC
Ejemplo NC = 0.024
PC = 1.470
P - N = 1.470 - 0.024 = 1.446
El valor P - N debe ser
≧0.5de otro modo el ensayo es inválido.
5.6.4) Cálculo del Valor de Corte
Valor de Corte = NC + 0.025
Ejemplo:
Valor de corte = 0.023 + 0.025 = 0.048
5.7) Validez de los Ensayos
5.7.1) CN debe ser
≦0.1de otro modo el ensayo es inválido.
5.7.2) CP debe ser
≧0.6de otro modo el ensayo es inválido.
5.7.3) Valor de P-N debe ser
≧0.5de otro modo el ensayo es inválido.
NOTA: Control Negativo: la absorbancia debe ser menor o igual a 0,100 después de restar el blanco.
5.8) Interpretación de los Resultados
5.8.1) Las muestras con absorbancias MENORES que el Valor de Corte son NO REACTIVAS y se consideran
NEGATIVAS para HBsAg.
5.8.2) Las muestras con absorbancias MAYORES o IGUALES al Valor del Corte se consideran INICIALMENTE
REACTIVAS. Las muestras originales deben ser repetidas en duplicado.
5.8.3) Si ambos valores de absorbancia al repetir son menores que el valor de corte, las muestras se consideran
NEGATIVAS para HBsAg.
Catalogo Nr: KAPG4SGE3 PI Numero : 1701153 Revisión Nr : 110627/1
Si al repetir al menos uno de los dos valores de absorbancia es MAYOR o IGUAL al Valor del Corte entonces la muestra se considera como un HBsAg positivo repetido. La muestra positiva repetida debe ser confirmada con reactivos de confirmación validados.
5.9) Solución de Problemas
Si el resultando no puede ser reproducido, una solución preliminar podría obtenerse revisando las posibilidades mencionadas a continuación:
5.9.1) Procedimiento de lavado inadecuado.
5.9.2) Muestra contaminada con positivo.
5.9.3) Volumen de muestra, conjugado o sustrato equivocado.
5.9.4) Contaminación del borde del pocillo con conjugado.
5.9.5) Muestra inadecuada, p.ej. suero o plasma hemolizados, muestra con precipitado, muestra no suficientemente mezclada antes del uso.
5.9.6) Tiempo o temperatura de incubación equivocados.
5.9.7) Cabeza y agujas de la lavadora para dispensar/aspirar total o parcialmente obstruidas.
5.9.8) Aspiración insuficiente.
5.10) Limitaciones e Interferencias
5.10.1) Este kit de reactivos es para ser usado con muestras de suero o plasma humano individual.
5.10.2) El kit no ha sido validado par uso con muestras de cadáver.
5.10.3) Un resultado negativo para HBsAg sin otra evidencia no debe ser usado para excluir una infección por VHB.
5.10.4) Sustancias que podrían interferir:
Los siguientes resultados se obtuvieron en los respectivos experimentos:
1. No se ha observado interferencia con diferentes anticoagulantes tales como heparina con litio, K-EDTA, citrato de sodio.
2. Muestras que han sido tratadas con calor (+60°C, 10 horas) resultaron con títulos de HBsAg disminuidos.
3. No se detectó reacción cruzada al usar muestras de pacientes con a) otras infecciones VHA, VEB, CMV, VHS,
VZV, Borreliosis de Lyme, VHC, VHI, b) con otras enfermedades tales como insuficiencia renal crónica, hemodiálisis, hepatitis autoinmune, cirrosis hepática y c) con algunos anticuerpos tales como HAMA , GAD, IA2,
APS).
4. Las muestras que contienen substancias que podrían interferir [P. ej. Triglicéridos (lipemia), hemoglobina
(hemolisis) bilirrubina (ictericia) componentes de la inmunoglobulina monoclonal, niveles altos de anticuerpos autoinmunes (factor reumatoide-FR, anticuerpos anti nucleares-ANA, o anticuerpos anti mitocondria-AMA)] y muestras de mujeres embarazadas, no interfirieron con el ensayo HBsAg ELISA.
5.11) Características del Ensayo
5.11.1) Especificidad Diagnostica
Resultados de la Evaluación Europea del Desempeño del HBsAg ELISA de DIAsource – La Reacividad del
“Donante” Negativo para VHB y Muestras “Clínicas”.
No. Total de muestras
N Neg
DIAsource HBsAg Elisa
*
IR
**
RR Confirmado Falso Positivo
VHB negativo
(muestra clínica)
213 211 2 2
VHB negativo
(muestra de donante)
5501 5479 22 22
Total 5714 5690 24 24
0
0
0
*IR: inicialmente reactivo **RR: reactivo repetido
Especificidad diagnóstica = 5690/5714 = 99.58%
2
22
24
5.11.2) Sensibilidad Diagnóstica
1. La sensibilidad diagnóstica determinada en evaluaciones Europeas de desempeño produjeron los siguientes resultados:
Muestra
Suero HBsAg positivo
No. de muestras Reactivas
Sensibilidad diagnóstica = 400/400 = 100%
400 400
Sensibilidad
100%
2. La evaluación del Panel de Sensibilidad para HBsAg (BBI, USA) produjo los siguientes resultados:
Panel No. De miembros del Resultados
Catalogo Nr: KAPG4SGE3 PI Numero : 1701153 Revisión Nr : 110627/1
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
Panel de Sensibilidad para HBsAg
BBI PHA807 panel
PHA807-01~21
Equivalente a o mejor que la competencia
3. La evaluación del Panel de Desempeño con una Variedad de Títulos para HBsAg, PHA205 (BBI, USA) produjo los siguientes resultados:
Panel
No. De miembros del panel
Resultados
Panel de Desempeño con una
Variedad de Títulos para HBsAg
BBI PHA205
PHA205-01~25
Equivalente a o mejor que la competencia
4. La evaluación del Panel de Desempeño con una Variedad de Títulos para HBsAg, VHA601 (BBI, USA) produjo los siguientes resultados:
Panel
Panel de Desempeño con una Variedad de
Títulos para HBsAg, BBI VHA601
No. De miembros del panel
VHA601-01~06
Resultados
Alcanzó los resultados esperados por BBI.
5. La evaluación del Panel de Desempeño con una Variedad de Títulos para HBsAg, QHA711 (BBI, USA) produjo los siguientes resultados:
Panel
Panel de Desempeño con una Variedad de
Títulos para HBsAg, BBI QHA711
No. De miembros del panel
QHA711-01~06
Resultados
Alcanzó los resultados esperados por BBI.
6. Resultado del Panel INTS de Subtipos de HBsAg:
El resultado de la evaluación demuestra que todos los serotipos conocidos de HBsAg (subtipos de HBsAg) disponibles en el panel INTS de subtipos de HBsAg pueden ser detectados tanto por e Elisa HBsAg como por el ensayo de referencia hasta las diluciones 10
4 x ~ 10
6 x .
7. Tabla de resumen de la evaluación de todos los paneles de seroconversión:
ID Panel
PHM907(ay)
PHM916(ay)
PHM920(ad)
PHM921(ad)
PHM930(ad)
PHM933(ad)
PHM934(ad)
PHM935A (ad)
PHM935B (ad)
NabiSB0411
PHM903(ad)
PHM904(ad)
PHM906(ad)
PHM909(ad)
PHM910(ad)
PHM912(ad)
PHM914(ad)
Resultados HBsAg Positivos Desde la Fecha de la Primera Toma de
Muestra
Ensayo HBsAg de referencia
(A en días)
50
Elisa HBsAg
(B en días)
50
Diferencia en días de toma de muestra
(A-B)
0
Diferencia en número de tomas de muestra(No.
De miembro del panel)
0
62
26
65
26
-3
0
-1
0
0
3
7
0
0
3
9
0
0
0
-2
0
0
0
-1
0
9
231
6
6
7
137
9
35
42
0
21
217
6
10
18
0
9
18
0
146
-12
14
0
-4
-11
137
0
17
42
-146
-3
-1
0
-1
-1
1
0
1
7
-1
PI Numero : 1701153 Revisión Nr : 110627/1
PHM915(ind)
PHM917(ind)
PHM918 (ad)
PHM923 (ay)
PHM924 (ad)
PHM925(ind)
PHM926(ind)
PHM927(ind)
PHM928 (ad)
PHM929 (ad)
PHM931(ind)
PHM932 (ad)
PHM935A (ad)
General
9
14
19
61
21
-----
29
8
13
4
12
36
7
15
28
>43
7
21
35
14
15
7
9
18
21
61
28
-----
Promedio
-16
->7
0
-6
6
-6
-2
-3
0
-2
-2
0
-7
Sum = -13
-13/30 = 0,4 días
-5
->2
0
-1
1
-1
-1
-1
0
-1
-1
0
-2
- - - - -
- - - - -
Resumen de la evaluación se todos los paneles de seroconversión usados:
Los resultados han demostrado que Elisa HBsAg es casi equivalente al ensayo de referencia. En promedio el ensayo Elisa HBsAg está solo 0,4 días más atrás en los 30 paneles de seroconversión usados en comparación con el ensayo de referencia.
5.11.3) Mutantes
1. Panel de mutantes
Se examinó un panel mutante prenuclear de hepatitis B de Teragenix, EE.UU. HBsAg Elisa puede detectar los resultados si la relación de la dilución del panel es 1:2 o 1:5.
Este panel consiste de 3 muestras de promotor del núcleo basal (A1762/G1764) tipo silvestre; Infección tipo silvestre, mutante precursor nuclear codón 28, de 4 muestras de promotor del núcleo basal (A1762/G1764) tipo silvestre; Mutante precursor nuclear codón 28, de 2 muestras de promotor del núcleo basal (T1762/A1754) infección mixta tipo silvestre MUTANTE (A1762/G1754).
2. Muestras mutantes
La tasa de detección de HBsAg Elisa es de 17/21 que es mejor que la del kit de referencia (14/21).
Mutación HBsAg Elisa
Kit de referencia
Mutación HBsAg Elisa
Kit de referencia
113A114
P120L
R122I
R122T
E122I
T123N
122RA123
C124R
T131I
T131P
Y134S
Tasa detección de
Int positivo positivo negativo positivo positivo positivo negativo negativo positivo positivo positivo
8/11
Int positivo C137W positivo C139Y negativo K141E positivo positivo
P142L/G145R
P142L positivo D144G negativo G145K positivo positivo negativo C147T/C148T positivo positivo E164D positivo S174N positivo
8/11
Tasa detección de
Int positivo positivo positivo negativo positivo positivo positivo
9/10
Int negativo positivo positivo negativo positivo negativo negativo positivo positivo positivo
6/11
Catalogo Nr: KAPG4SGE3 PI Numero : 1701153 Revisión Nr : 110627/1
5.11.4) 25 muestras frescas tomadas el mismo día
HBsAg Elisa detectó 25 muestras frescas tomadas el mismo día. Se cumplieron los preceptos del capítulo 3.1.9 del
2009/886/EC.
5.11.5) Sensibilidad analítica
Material estándar
2 o
Estándar Internacional WHO
※
Estándar PEI subtipo ad
Estándar PEI subtipo ay
Sensibilidad calculada
0,03 IU/mL
0,08 PEI U/mL
0,09 PEI U/mL
※
2 o
Estándar Internacional WHO para HBsAg, subtipo adw2, genotipo A, código NIBSC: 00/588
5.11.6) Precisión
1) Repetibilidad intra-ensayo
La precisión intra-ensayo se determinó usando una muestra de control positivo y dos sueros de pacientes con distinta concentración de HBsAg (levemente por sobre el nivel de corte y a nivel medio) las que fueron analizadas en 20 repeticiones en un ensayo único por 3 días.
Ensayo ID de muestra Promedio
1
1
1
2
2
2
3
3
3
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
0.7541
2.2766
1.3159
0.9671
2.7325
1.5822
0.9669
2.6088
1.6502
Desviación
Estándar
0.0857
0.1571
0.1168
0.0358
0.1025
0.0888
0.0909
0.2367
0.1499
Coeficiente de
Variación
11.36
6.90
8.88
3.70
3.75
5.61
9.40
9.07
9.08
El CV calculado varió entre 3,7% y 11,36 %. (= valor aceptable para un inmunoensayo que utiliza microplacas).
2) Reproducibilidad entre ensayos
Los experimentos de evaluación de la precisión se realizaron durante 10 días hábiles usando cinco muestras de suero (con niveles de HBsAg positivos limítrofes y claramente sobre el valor de corte).
ID de muestra
N Promedio
Desviación
Estándar
Coeficiente de
Variación
F1
F2
F3
F4
F5
10
10
10
10
10
0.0609
0.0770
0.1000
0.1786
0.6107
0.0185
0.0189
0.0245
0.0462
0.1412
30.41
24.56
24.51
25.87
23.12
Los CV calculados varían entre 30,4% para una muestra HBsAg negativa y 23,1 % para una muestra HBsAg positiva débil (= valores aceptables para la imprecisión entre ensayos de un inmunoensayo que utiliza microplacas).
5.11.7) Exceso de Anticuerpo/Dosis alta Efecto de Gancho
Esto se llevó a cabo con una muestra de suero con una concentración muy alta de HBsAg de 125 mg/L en diluciones seriadas con el ensayo HBsAg ELISA de DIAsource. No se observó el efecto gancho por dosis alta.
5.11.8) Seguimiento
El Calibrador Maestro HBsAg de DIAsource ha sido calibrado con el British Working Standard para HBsAg
(Código NIBSC: 01/476-006) usando el ensayo HBsAg ELISA. La potencia relativa (razón) del British Working
Standard para HBsAg versus el Calibrador Maestro HBsAg de DIAsource es 4,081 (3,853-4,325 Intervalo de
Confianza 95%). La concentración del control positivo del ensayo HBsAg ELISA se ha determinado contra el
Calibrador Maestro HBsAg de DIAsource y fue establecida en 42 IU/ml ± 20%.
Catalogo Nr: KAPG4SGE3 PI Numero : 1701153 Revisión Nr : 110627/1
5.12) Diagrama de Flujo del Procedimiento del Ensayo
Agregue 50 µl de controles (3 x CN, 2 x CP) y
Agregue 50 µl de cada muestra en los pocillos.
Reserve 1 pocillo para blanco.
↓
Agregue 50 μl de Solución de anti-HBs
Peroxidasa en cada pocillo, excepto el blanco.
↓
Incube a +37 ±1 °C por 80 minutos
↓
Lave la placa.
(Escoja uno de los dos métodos siguientes para general el color)
↙ ↘
Mezcle volúmenes iguales de TMB cromogénico concentrado y tampón de sustrato. Agregue
100 µl de la solución
Agregue 50 µl de TMB cromogénico concentrado a los pocillos y y luego agregue 50 µl de
Tampón de Sustrato.
Mezcle bien,
↘ ↙
Incube a temperatura ambiente por 30 minutos.
↓
Agregue 1N ácido sulfúrico a cada pocillo
↓
Determine la absorbancia usando 450 nm como longitud de onda para la lectura con un longitud de onda de referencia de 620-690nm
*1
6) N OTAS
*1 La longitud de onda de referencia del espectrofotómetro puede ser de 620nm a 690nm. Sin embargo el usuario debe validar el foto metro en conjunto con este kit antes de su uso.
*2 Inactivación incompleta del virus de la hepatitis B después de tratamiento con calor a +60°C por 10 horas, J. Infect. Dis.
138:242-244.
7) B IBLIOGRAFIA
1. Blumberg BS, Alter HJ, Visnich S. A „new“ antigen in leukemia sera. JAMA, 1965;191:101- 106.
2. Dane DS, Cameron CH, Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis. Lancet 1970; 1: 695 - 698.
3. Aach RD, Grisham JW, Paker CW. Detection of Australia antigen by radioimmunoassay. Proc Natl Acad Sci. USA
1971;68:1056-1060.
4. Kim CY, Tikes JG. Purification and biophysical characterization of hepatitis antigen. J Clin Invest. 1973; 52:1176-
1186.
5. Wolters G. Kuijpers LP, Kacaki J, Schuurs AH, Enzyme linked immunosorbent assay for hepatitis B surface antigen.
J Infect. Dis 1977;136:Suppl 311-377.
6. Shih JW, Cote PJ Jr, Dapolito GM, Gerin JL. Production of monoclonal antibodies against hepatitis B surface antigen
(HBsAg)by somatic cell hybrids. J Virol Methods. 1980;1:257-273.
7. Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM. Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis.
1991;11:73-83
Fecha de revisión: 2011-06-27
Catalogo Nr: KAPG4SGE3 PI Numero : 1701153 Revisión Nr : 110627/1
P.I. Number : 1701000
Ag
Ab
Ag
Ab
WASH SOLN CONC
CAL 0
CAL
CONTROL
N
N
125I
125I
125I
125I
CONC
CONC
Ab
Ag
Ab
Ag
HRP
HRP
HRP CONC
HRP CONC
CONJ
CHROM
BUF
TMB CONC
CHROM TMB
SUB BUF
STOP SOLN
INC
BUF
SER
Ab AP
SUB
BIOT
PNPP
CONJ CONC
PREC AGENT
AVID HRP CONC
ASS
Ab
BUF
BIOT
Ab
SAV
NSB
2nd Ab
HRP CONC
ACID
DIST
TRAY
PMSF
BUF
INC BUF
ACETONITRILE
SERUM
DIL SPE
DIL BUF
ANTISERUM
IMMUNOADSORBENT
DIL CAL
REC
PEG
SOLN
EXTR SOLN
ELU
GEL
SOLN
PRE SOLN
NEUTR SOLN
TRACEUR BUF
STRIP
SUB
EXTR SOLN CONC
CART
SAV
PIPETTE
HRP
WASH SOLN
Used symbols
Consult instructions for use
Storage temperature
Use by
Batch code
Catalogue number
Control
In vitro diagnostic medical device
Manufacturer
Contains sufficient for <n> tests
Wash solution concentrated
Zero calibrator
Calibrator #
Control #
Tracer
Tracer
Tracer concentrated
Tracer concentrated
Tubes
Incubation buffer
Acetonitrile
Serum
Specimen diluent
Dilution buffer
Antiserum
Immunoadsorbent
Calibrator diluent
Reconstitution solution
Polyethylene glycol
Extraction solution
Elution solution
Bond Elut Silica cartridges
Pre-treatment solution
Neutralization solution
Tracer buffer
Microtiterplate
HRP Conjugate
HRP Conjugate
HRP Conjugate concentrate
HRP Conjugate concentrate
Conjugate buffer
Chromogenic TMB concentrate
Chromogenic TMB solution
Substrate buffer
Stop solution
Incubation serum
Buffer
AP Conjugate
Substrate PNPP
Biotin conjugate concentrate
Precipitating Agent
Avidine HRP concentrate
Assay buffer
Biotin conjugate
Specific Antibody
Streptavidin HRP concentrate
Non-specific binding
2nd Antibody
Acidification Buffer
Distributor
Incubation trays
PMSF solution
Protect from light
Dot Strip
Substrate
Extraction Buffer Concentrate
Cartridge
Streptavidin HRP
Pipette
Wash buffer
Revision nr 140723
P.I. Number : 1701000
Ag
Ab
Ag
Ab
WASH SOLN CONC
CAL 0
CAL
CONTROL
N
N
125I
125I
125I
125I
CONC
CONC
Ab
Ag
Ab
Ag
HRP
HRP
HRP CONC
HRP CONC
CONJ
CHROM
BUF
TMB CONC
CHROM TMB
SUB BUF
STOP SOLN
INC
BUF
SER
Ab
SUB
BIOT
AP
PNPP
CONJ CONC
PREC AGENT
AVID HRP CONC
ASS
Ab
BUF
BIOT
Ab
SAV
NSB
2nd Ab
HRP CONC
ACID
DIST
TRAY
PMSF
BUF
STRIP
SUB
EXTR SOLN CONC
CART
SAV HRP
WASH SOLN
INC BUF
ACETONITRILE
SERUM
DIL
DIL
SPE
BUF
ANTISERUM
IMMUNOADSORBENT
DIL CAL
REC
PEG
SOLN
EXTR SOLN
ELU
GEL
SOLN
PRE SOLN
NEUTR SOLN
TRACEUR BUF
Symboles utilisés
Tampon conjugué
Chromogène TMB concentré
Solution chromogène TMB
Tampon substrat
Solution d’arrêt
Sérum d'incubation
Tampon
AP Conjugué
Tampon PNPP
Biotine conjugué concentré
Agent de précipitation
Avidine HRP concentré
Tampon de test
Biotine conjugué
Anticorps spécifique
Concentré streptavidine HRP
Liant non spécifique
Second anticorps
Tampon d'acidification
Distributeur
Plaque d'incubation
Solution PMSF
Conserver à l'abri de la lumière
Bandelette de dots
Substrat
Tampon d'extraction concentré
Cartouche
Streptavidine-peroxydase de raifort
Pipette
Tampon de lavage
Consulter les instructions d’utilisation
Température de conservation
Utiliser jusque
Numéro de lot
Référence de catalogue
Contrôle
Dispositif médical de diagnostic in vitro
Fabricant
Contenu suffisant pour <n> tests
Solution de lavage concentrée
Calibrateur zéro
Calibrateur #
Contrôle #
Traceur
Traceur
Traceur concentré
Traceur concentré
Tubes
Tampon d'incubation
Acétonitrile
Sérum
Diluant du spécimen
Tampon de dilution
Antisérum
Immunoadsorbant
Diluant de calibrateur
Solution de reconstitution
Glycol Polyéthylène
Solution d’extraction
Solution d’elution
Cartouches Bond Elut Silica
Solution de pré-traitement
Solution de neutralisation
Tampon traceur
Microplaque de titration
HRP Conjugué
HRP Conjugué
HRP Conjugué concentré
HRP Conjugué concentré
Revision nr 140723
P.I. Number : 1701000
Ag
Ab
Ag
Ab
WASH SOLN CONC
CAL 0
CAL
CONTROL
N
N
125I
125I
125I
125I
CONC
CONC
Ab
Ag
Ab
Ag
HRP
HRP
HRP CONC
HRP CONC
CONJ
CHROM
BUF
TMB CONC
CHROM TMB
SUB BUF
STOP SOLN
INC
BUF
SER
Ab
SUB
BIOT
AP
PNPP
CONJ CONC
PREC AGENT
AVID HRP CONC
ASS
Ab
BUF
BIOT
Ab
SAV
NSB
2nd Ab
HRP CONC
ACID
DIST
TRAY
PMSF
BUF
INC BUF
ACETONITRILE
SERUM
DIL
DIL
SPE
BUF
ANTISERUM
IMMUNOADSORBENT
DIL CAL
REC
PEG
SOLN
EXTR SOLN
ELU
GEL
SOLN
PRE SOLN
NEUTR SOLN
TRACEUR BUF
SUB
EXTR SOLN CONC
CART
SAV
PIPETTE
HRP
WASH SOLN
Símbolos utilisados
Tampón de Conjugado
Cromógena TMB concentrada
Solución Cromógena TMB
Tampón de sustrato
Solución de Parada
Suero de Incubación
Tampón
AP Conjugado
Sustrato PNPP
Concentrado de conjugado de biotina
Agente de precipitación
Concentrado avidina-HRP
Tampón de ensayo
Conjugado de biotina
Anticuerpo específico
Estreptavidina-HRP Concentrado
Unión no específica
Segundo anticuerpo
Tampón de Acidificación
Distribuidor
Bandejas de incubación
Solución de PMSF
Proteger de la luz
Tries Dot
Sustrato
Concentrado de tampón de extracción
Cartucho
Estreptavidina HRP
Pipeta
Tampón de lavado
Consultar las instrucciones de uso
Limitación de temperatura
Fecha de caducidad
Codigo de lote
Número de catálogo
Control
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Fabricante
Contenido suficiente para <n> ensayos
Solución de lavado concentrada
Calibrador cero
Calibrador #
Control #
Trazador
Trazador
Trazador concentrada
Trazador concentrada
Tubos
Tampón de incubación
Acetonitrilo
Suero
Diluyente de Muestra
Tampón de dilución
Antisuero
Inmunoadsorbente
Diluyente de calibrador
Solución de Reconstitución
Glicol Polietileno
Solución de extracción
Solución de elución
Cartuchos Bond Elut Silica
Solución de Pre-tratamiento
Solución de Neutralización
Tampón de trazador
Placa de microvaloración
HRP Conjugado
HRP Conjugado
HRP Conjugado concentrada
HRP Conjugado concentrada
Revision nr 140723

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Key features
- Qualitative HBsAg detection
- Fast test
- Uses monoclonal and polyclonal antibodies
- Serum and plasma compatible
- Heparin, citrate, EDTA compatible
- Solid-phase enzyme immunoassay