HBsAg Elisa - DIAsource Immunoassays

HBsAg Elisa - DIAsource Immunoassays
HBsAg Elisa
KAPG4SGE3
DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue du Bosquet, 2 - B-1348 Louvain-la-Neuve - Belgium
: 110627/3
HBsAg Elisa
For in-vitro qualitative detection of hepatitis B surface antigen (HBsAG) in
human serum or plasma.
en
KAPG4SGE3
IN VITRO DIAGNOSTIC USE
DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium
Tel: +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90
1) INTENDED USE
HBsAg Elisa is an enzyme immunoassay diagnostic kit for in-vitro qualitative detection of hepatitis B surface antigen
(HBsAg) in human serum or plasma (heparin, citrate or EDTA).
2) SUMMARY AND TEST EXPLANATION
The hepatitis B surface antigen (HBsAg) is the first marker that appears in the blood following infection with hepatitis B
virus (HBV) some days or weeks before clinical symptoms manifest. It is a lipoprotein polypeptide which constitutes the
external envelope of the HB virus. The detection of HBsAg in human serum or plasma indicates an ongoing HBV
infection, either acute or chronic. Testing of additional HBV markers is needed to define the specific disease state.
HBsAg assays are used not only to diagnose HBV infections but also to monitor the course of the disease and the
efficacy of antiviral therapy.
HBsAg Elisa is a fast test for the qualitative detection of the presence of HBsAg in serum or plasma (heparin, citrate or
EDTA) specimen. The test utilizes monoclonal and polyclonal (anti-guinea pig) antibodies to selectively detect elevated
levels of HBsAg in serum or plasma.
Specimens which are non-reactive by HBsAg Elisa are considered negative for HBsAg. Specimens with positive
reaction should be retested in duplicate.
In case of a reactive repeat reaction, the specimen should be confirmed for HBsAg reactivity with validated confirmatory
reagents .
Only confirmed positive specimens are considered to contain HBsAg.
3) TEST DESCRIPTION
HBsAg Elisa is a solid-phase enzyme immunoassay (ELISA= enzyme-linked immuno-sorbent assay ) based on the
"sandwich principle".
The solid phase of the microtiter plate is made of polystyrene wells coated with mouse monoclonal antibodies specific
for HBsAg; whereas guinea pig polyclonal antibody purified by affinity chromatography is used to prepare the anti-HBs•
peroxidase (horseradish) conjugate in the liquid-phase.
When a serum or plasma specimen containing HBsAg is added to the anti-HBs antibody-coated wells together with the
peroxidase conjugated anti-HBs antibody and incubated, an antibody-HBsAg-antibody-peroxidase complex will form on
the wells.
After washing the microtiter plate to remove unbound material, a solution of TMB substrate is added to the wells and
incubated. A color develops in proportion to the amount of HBsAg boud to Anti-HBs. The peroxidase-TMB reaction is
stopped by addition of sulfuric acid. The optical density of developed color is read with a suitable photometer at 450nm
with a selected reference wavelength within 620 to 690nm*1.
The test principle is shown also in the following figure.
A
B
Specimen containing HBsAg:
1. Plate well (Anti-HBs) + specimen (HBsAg)+ Anti-HBs•peroxidase → Anti-HBs•HBsAg•(Anti-HBs•peroxidase)
sandwich complex
2. Sandwich complex + TMB substrate solution → Light blue to blue color
3. Add sulfuric acid to stop the color development → Read OD at 450nm (reference wavelength 620-690 nm*8)
Specimen without HBsAg:
Catalogue Nr: KAPG4SGE3
PI number : 1701153
Revision Nr : 110627/1
1. Plate well (Anti-HBs) + specimen (no HBsAg) + Anti-HBs•peroxidase → Anti-HBs (on the well)
2. Anti-HBs (on the well) + TMB substrate solution → Colorless to light blue color
3. Add sulfuric acid to stop the color development →Read OD at 450nm (reference wavelength 620-690 nm*8)
4) DESCRIPTION OF MATERIALS PROVIDED
● Item 1 - 6 in the following reagent table should be refrigerated at 2-8°C . Washing Solution D (20X) and stop solution
can be stored at 2-30°C.
ITE
Qt. per
Components
Description
MS
96 tests
Anti-HBs Plate
Microtiter plate coated with mouse
(1)
monoclonal anti-HBs.
1 plate
Anti-HBs
Peroxidase
(2) Solution
Ab
(3)
HRP
HBsAg Positive
Control
CONTROL
(4)
HB Negative
Control
CONTROL
(5)
H
L
Chromogenic
TMB concentrate
CHROM TMB
CONC
Substrate buffer
(6)
SUB
BUF
Conc. Washing
Solution (20X)
(7)
WASH
SOLN CONC
Polyclonal Anti-HBs HRPO
conjugate, diluted in buffer with
protein stabilizers.
Preservatives:
0.003% Gentamycin and
0.01% Thimerosal.
Dye: phenol red.
Inactivated human serum positive
for HBsAg but non-reactive for antiHCV and anti-HIV1/2, diluted in
buffer with protein stabilizers.
Preservatives: 0.003% Gentamycin
and 0.01% Thimerosal.
Serum non-reactive for HBV
markers, anti-HCV and
anti-HIV1/2, diluted in buffer with
protein stabilizers.
Preservatives: 0.003% Gentamycin
and 0.01% Thimerosal.
0.6 mg/ml of
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
(TMB) in an organic base with
DMSO.
STOP
1 bottle,
1.5 ml
1 bottle,
2.0 ml
1 bottle,
12 ml
Citrate Acid Buffer containing
0.03% H2O2.
1 bottle,
12 ml
Concentrated
Phosphate buffer with Tween-20
1 bottle
58 ml
1N sulfuric acid
1 bottle
12 ml
Stop Solution
(8)
1 bottle,
8 ml
SOLN
● OTHER REQUIRED MATERIALS, BUT NOT PROVIDED
ITEMS
Components
(1) 50µl, 100µl micropipettes and tips are needed
(2) Water bath or incubator with temperature control at +37°C.
(3) Plate washing equipment.
ELISA Microwell Reader:
(4)
Dual wavelength 450nm with 620-690nm as reference wavelength, bandwidth 10nm*1.
Fully automatic EIA micro-plate analyzer is optional. User should validate the automatic
(5)
EIA micro-plate analyzer in combination with the kit.
4.1)Storage condition and Stability of the kit and components
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PI number : 1701153
Revision Nr : 110627/1
Kit/components
5)
Storage temp.
HBsAg Elisa KIT
+2 to +8°C
HBsAg Positive Control
+2 to +8°C
HB Negative Control
+2 to +8°C
Anti-HBs Plate
+2 to +8°C
Anti-HBs‧ HRPO Conjugate Solution
+2 to +8°C
Concentrated Washing Solution (20X)
Room temp.
20X Diluted Washing Solution
Room temp.
+2 to +8°C
Chromogenic TMB concentrate
+2 to +8°C
Substrate buffer
+2 to +8°C
TMB substrate mixture
Room temp.
1N Sulfuric Acid
Room temp.
State
Original
Once open
Original
Once open
Original
Once open
Original
Once open
Original
Once open
Original
Once open
Diluted
Diluted
Original
Once open
Original
Once open
Mixture
Original
Once open
Stability
18 months
1 month
18 months
1 month
18 months
1 month
24 months
1 month
18 months
1 month
24 months
1 month
2 days
1 week
24 months
1 month
24 months
1 month
6 hours
24 months
1 month
Instructions for Use
5.1) Warnings:
5.1.1) This reagent kit is for professional use only.
5.1.2) This reagent kit is for in vitro diagnosis only.
5.1.3) Bring all kit reagents and samples to room temperature (+20 to +30°C) and mix carefully before use.
5.1.4) Do not use reagent beyond its expiration date.
5.1.5) Do not interchange reagents between different lots.
5.1.6) Do not put pipette in mouth.
5.1.7) Do not smoke or eat in areas where specimens or reagents are handled.
5.1.8) All kit components and specimens should be regarded as potential health hazards
It should be used and
discarded according to your laboratory’s safety procedures. Such safety procedures probably include the
wearing of protective gloves and avoiding the use of aerosols.
5.1.9) Potential infectious specimens and non-acid containing spills or leakages should be wiped up thoroughly with
5% sodium hypochlorite or treated in accordance with your practice for potential bio-hazard control.
5.1.10) Prior to disposing used specimens and kit reagents as general waste; it should be treated in accordance with
the local practice of potential bio-hazardous waste or treated as follows:
Both liquid and solid waste should be autoclaved at +121°C for at least 30 minutes.
Solid waste can also be incinerated.
Non-acidic liquid waste can be treated with sodium hypochlorite diluted to a final concentration of 1%.
Acidic liquid wastes must be neutralized before treatment with sodium hypochlorite as mentioned above and
should stand for 30 minutes to obtain effective disinfection.
5.1.11) Stop Solution is an irritant to skin, eyes, respiratory tract and mucous membranes. Avoid contact of the stop
solution with skin and mucous membranes. In case of contact, flush immediately with abundant amounts of
water. In case of inhalation, find fresh air and seek medical attention in case of pain.
5.1.12) Chromogenic TMB concentrate contains organic solvent, which is flammable : danger of serious irreversible
effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. Chromogenic TMB concentrate contains
dimethyl sulfoxide, an irritant to skin and mucous membranes.
5.1.13) Although all human sourced material are tested non reactive for Anti-HCV and Anti-HIV, and inactivated at
+56°C for one hour, the reagent shall be handled as potential infectious material. *2
5.2) Specimen Collection and Preparation for Analysis
Catalogue Nr: KAPG4SGE3
PI number : 1701153
Revision Nr : 110627/1
5.2.1)
5.2.2)
5.2.3)
5.2.4)
5.2.5)
No special preparation of the patient is required prior to blood collection. Blood should be collected by
approved medical techniques.
Either serum or plasma specimens can be used with this test kit. Whole blood specimen should be separated
as soon as possible in order to avoid hemolysis. Any particulates (e.g. fibrin clots, erythrocytes) contained in
the specimen should be removed prior to use.
Specimens must be stored at +2 to +8°C and avoid heat-inactivation to minimize deterioration. For long-term
storage, they should be frozen below -20°C. Storage in self-defrosting freezer is not recommended.
Frozen specimens must be thoroughly thawed and mixed homogenously before test.
Avoid multiple freeze-thaw procedures.
WARNING
1.The specimen must not contain any compounds of AZIDE, which inhibits the peroxidase activity.
2. Incompletely coagulated sera and microbial-contaminated specimens should not be used.
5.3) Storage conditions and Stability of Reagents
5.3.1) The kit must be stored at +2 to +8°C. Do not freeze.
5.3.2) Strips of the plate should be used within one month after opening the original aluminum foil bag. The unused
strips should be kept in the aluminum foil bag and taped tightly.
5.3.3) Return reagents to +2 to +8°C immediately after use.
5.3.4) Washing Solution (20X) Concentrate can be stored at room temperature to avoid crystallization, because the
kits are stored and shipped at +2 to +8°C. If crystals have been precipitated before use, warm up the solution at
37°C in a water bath until the crystals dissolve.
5.4) Plate Washing Procedure
5.4.1) Preparation of washing solution:
Dilute Washing Solution (20X) Concentrate with distilled or de-ionized water to obtain a 1:20 dilution. Do not
use tap water.
5.4.2) Plate washing:
(a) For plate washer with overflow aspirating function: 6 cycles with at least 0.5 ml washing buffer per
well per cycle.
or
(b) For plate washer without overflow aspirating function: 8 cycles with at least 0.35 ml washing buffer
per well per cycle.
5.4.3) Blot dry by inverting the plate and tapping firmly onto absorbent paper. Too much residual wash buffer will
cause false results.
WARNING:Improper washing will cause false results.
5.5) Test Procedure
5.5.1) Bring all reagents and specimens to room temperature (+20 to +30°C) before assay. Adjust water bath or
incubator to +37±1°C.
5.5.2) Reserve one well for blank. Add 50 µl of each control or specimen to appropriate wells of the microtiter plate
(3 Negative Controls and 2 Positive Controls).
NOTE:
a. Use a clean pipette tip for each sampling to avoid cross-contamination.
b. Each plate needs respective negative controls, positive controls and blank well.
c. Do not use any cut-off value established for other plates of HBsAg Elisa.
5.5.3) Add 50 µl of Anti-HBs Peroxidase Solution to each well except the blank.
NOTE: Do not touch the wall of the plate wells to prevent contamination.
5.5.4) Gently tap the plate.
5.5.5) Remove the protective backing from the Adhesive Slip and press it onto the reaction plate, so that it is tightly
sealed.
5.5.6) Incubate the reaction plate at +37±1°C in a water bath or incubator for 80 minutes.
5.5.7) At the end of the incubation period, remove and discard the Adhesive Slip and wash the plate in accordance
with 5.4) Plate Washing Procedure.
5.5.8) Select one of the following two methods for color development:
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PI number : 1701153
Revision Nr : 110627/1
A.
Mix equal volumes of Chromogenic TMB concentrate and Substrate Buffer in a clean container
immediately prior to use. Add 100 l of the mixture solution to each well including the blank well.
Add 50l of Chromogenic TMB concentrate first, and then add 50 l of Substrate buffer into each well
including the blank. Mix well carefully.
NOTE:
Chromogenic TMB concentrate should be colorless to light blue; otherwise, it should be
discarded. The mixture of Chromogenic TMB concentrate and Substrate buffer should be used
within 30 minutes after mix. The mixture should be kept away from intense light.
5.5.9) Cover the plate with a black cover and incubate at room temperature for 30 minutes.
5.5.10) Stop the reaction by adding 100 µl of stop solution to each well including the blank.
5.5.11)Determine the absorbance of Controls and test specimens within 30 minutes with a precision spectrophotometer
at 450/620-690nm (450nm reading wavelength with 620 – 690 nm reference wavelength) *2.
Use the blank well to blank spectrophotometer.
NOTE: The color of the blank should be colorless to light yellow; otherwise, the test results are invalid.
Substrate blank : absorbance value must be less than 0.100.
B.
5.6) Calculations of Results
5.6.1) Calculation of the NC (Mean Absorbance of Negative Control).
Example: Sample No.
Absorbance
1
0.022
2
0.025
3
0.023
NC = (0.022 + 0.025 + 0.023) / 3 = 0.023
NCx should be ≦0.1, otherwise, the test is invalid.
5.6.2) Calculation of the PC (Mean Absorbance of Positive Control)
Example: Sample No.
Absorbance
1
1.432
2
1.508
PC = (1.432 + 1.508) / 2 = 1.470
PC should be ≧0.6, otherwise, the test is invalid.
5.6.3) Calculation of the P - N Value
P - N = PC – NC
Example: NC = 0.024
PC = 1.470
P - N = 1.470 - 0.024 = 1.446
P - N Value must be ≧0.5, otherwise, the test is invalid.
5.6.4) Calculation of the Cutoff Value
Cutoff Value = NC + 0.025
Example:
Cutoff Value = 0.023 + 0.025 = 0.048
5.7) Validity of Test Runs
5.7.1) NC should be ≦0.1; otherwise, the test is invalid.
5.7.2) PC should be ≧0.6, otherwise, the test is invalid.
5.7.3) P - N Value must be ≧0.5, otherwise, the test is invalid.
NOTE: Negative Control: absorbance value must be less than or equal to 0.100 after subtracting the blank.
5.8) Interpretation of Results
5.8.1) Specimens with absorbance values LESS than the Cutoff Value are NON-REACTIVE and are considered
NEGATIVE for HBsAg.
5.8.2) Specimens with absorbance value GREATER than or EQUAL to the Cutoff Value are considered
INITIALLY REACTIVE. The original specimens must be retested in duplicate.
5.8.3) If both absorbance values in the retest are less than the cutoff value, the specimens are considered NEGATIVE
for HBsAg.
If in the retest at least one of the two absorbance values is GREATER than or EQUAL to the Cutoff Value
then the specimens are considered as repeated HBsAg positive. The repeated positive specimen shall be
confirmed with validated confirmatory reagents.
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5.9) Troubleshooting
If the result cannot be reproduced, perform a preliminary troubleshooting by checking the possibilities listed below:
5.9.1) Improper washing procedure.
5.9.2) Contamination with positive specimen.
5.9.3) Wrong volume of sample, conjugate or substrates.
5.9.4) Contamination of the well rim with conjugate.
5.9.5) Improper specimen, such as hemolyzed serum or plasma, specimen containing sediments and specimen not
thoroughly mixed before use.
5.9.6) Wrong incubation time or temperature.
5.9.7) Obstructed or partial obstructed washer aspirate/dispense head and needles.
5.9.8) Insufficient aspiration.
5.10) Limitations and Interferences
5.10.1) This reagent kit is to be used for un-pooled human serum or plasma only.
5.10.2) The reagent kit has not been validated for use with cadaveric samples.
5.10.3) A negative HBsAg result without other evidence should not be used to exclude an HBV infection.
5.10.4) Interfering Substances:
The following results were obtained in respective experiments:
1. No interferences with different anticoagulants such as lithium heparin, EDTA, citrate have been observed.
2. Heat-treated specimens (+60°C, 10 hours) exhibited diminished HBsAg titer.
3. No cross reactivity was detected using specimens deriving from patients with a) other infections by HAV,
EBV, CMV, HSV, VZV, Lyme Borreliosis, HCV, HIV, b) other disease states such as chronic renal failure,
hemodialysis, autoimmune hepatitis, liver cirrhosis, and c) presence of certain antibodies like HAMA , GAD,
IA2, APS).
4. Samples containing potential interfering substances [e.g. triglycerides (lipemia), hemoglobin (hemolysis),
bilirubin (icterus), monoclonal immunoglobulin components, elevated levels of autoimmune antibodies
(rheumatoid factor-RF, antinuclear antibodies-ANA, or antimitochondrial antibodies-ANA)] and samples
from pregnant women did not interfere with the HBsAg Elisa assay.
5.11) Performance Characteristics
5.11.1) Diagnostic Specificity
Results from the European Performance Evaluation for DIAsource HBsAg Elisa - Reactivity of HBV Negative
"Donor" and "Clinical" Specimens.
Total No.of Specimens
N
DIAsource HBsAg Elisa
Neg *IR **RR Confirmed False Positive
HBV negative
213 211 2 2
(clinical specimen)
HBV negative
5501 5479 22 22
(donor specimen)
Total
5714 5690 24 24
*IR: initial reactive **RR: repeat reactive
Diagnostic specificity = 5690/5714 = 99.58%
0
2
0
22
0
24
5.11.2) Diagnostic Sensitivity
1. The diagnostic sensitivity determined in the European performance evaluations yielded the following results:
Sample
No. of sample
HBsAg positive sera
400
Diagnostic sensitivity = 400/400 = 100%
Reactive
400
Sensitivity
100%
2. The evaluation of the HBsAg Sensitivity Panel PHA807 (BBI, USA) yielded the following results:
Panel
BBI HBsAg Sensitivity Panel
PHA807
Catalogue Nr: KAPG4SGE3
No. of panel members
PHA807-01~21
PI number : 1701153
Results
Equivalent to or better than
the competitors.
Revision Nr : 110627/1
3. The evaluation of the HBsAg Mixed Titer Performance Panel PHA205 (BBI, USA) yielded the following results:
Panel
BBI HBsAg Mixed Titer
Performance Panel PHA205
No. of panel members
PHA205-01~25
Results
Equivalent to or better than the
competitors.
4. The HBsAg Mixed Titer Performance Panel VHA601 (BBI, USA) evaluation yielded the following results:
No. of panel
Panel
Results
members
BBI HBsAg Mixed Titer Performance
Met BBI’s expected
VHA601-01~06
Panel VHA601
results.
5. The evaluation of the HBsAg Mixed Titer Performance Panel QHA711 (BBI, USA) yielded the following results:
No. of panel
members
Panel
BBI HBsAg Mixed Titer Performance
Panel QHA711
Results
QHA711-01~06
Met BBI’s expected
results.
6. INTS HBsAg Subtype Panel Test Result:
The results of the evaluation demonstrate that all known HBsAg serotypes (HBsAg subtypes) available in the
INTS HBsAg subtype panel can be detected by both HBsAg Elisa and the reference assay up to 104x ~ 106x
dilutions.
7. Summary table of the evaluation of all tested seroconversion panels:
PPanel ID
PHM907(ay)
PHM916(ay)
PHM920(ad)
PHM921(ad)
PHM930(ad)
PHM933(ad)
PHM934(ad)
PHM935A
(ad)
PHM935B
(ad)
NabiSB0411
PHM903(ad)
PHM904(ad)
PHM906(ad)
PHM909(ad)
PHM910(ad)
PHM912(ad)
PHM914(ad)
PHM915(ind)
PHM917(ind)
PHM918 (ad)
PHM923 (ay)
PHM924 (ad)
PHM925(ind)
PHM926(ind)
PHM927(ind)
PHM928 (ad)
PHM929 (ad)
PHM931(ind)
PHM932 (ad)
PHM935A
(ad)
Over all
Catalogue Nr: KAPG4SGE3
HBsAg Positive Result From Date of First Blood Collection
Reference HBsAg
Difference in Bleed Difference in
HBsAg Elisa
Bleed #s
Assay
Days
(panel member
(B in days)
(A in days)
(A-B)
No.)
50
50
0
0
62
65
-3
-1
26
26
0
0
0
0
0
0
3
3
0
0
7
9
-2
-1
0
0
0
0
9
21
-12
-3
231
217
14
-1
6
6
7
137
9
35
42
0
12
36
7
15
29
8
13
4
9
14
19
61
6
10
18
0
9
18
0
146
28
>43
7
21
35
14
15
7
9
18
21
61
0
-4
-11
137
0
17
42
-146
-16
->7
0
-6
6
-6
-2
-3
0
-2
-2
0
0
-1
-1
1
0
1
7
-1
-5
->2
0
-1
1
-1
-1
-1
0
-1
-1
0
21
28
-7
-2
-----
----Average
Sum = -13
-13/30 = 0.4 days
PI number : 1701153
--------Revision Nr : 110627/1
Summary of the evaluation of all tested seroconversion panels:
The results have shown that the HBsAg Elisa is nearly equivalent to the reference assay. On average the HBsAg
Elisa test is only 0.4 days later in the 30 tested seroconversion panels in comparison to the reference assay.
5.11.3) Mutants
1. Mutant Panel
A Hepatitis B Pre Core Mutant panel of Teragenix, USA was tested. HBsAg Elisa can detect the results while
panel’s dilution ratio is 1:2 or 1:5.
This panel consists of 3 samples Core Promoter (A1762/G1764) wild type; PreCore codon 28 mutant/wild type
infection, of 4 samples Core Promotor (A1762/G1764) wild type; PreCore codon 28 mutant, of 2 samples Core
Promotor (T1762/A1754) MUTANT/(A1762/G1754) wild type mixed infection.
2. Mutant samples
The detection rate of HBsAg Elisa is 17/21 which is better than reference kit’s (14/21).
Mutation
113A114
P120L
R122I
R122T
E122I
T123N
122RA123
C124R
T131I
T131P
Y134S
Detection
Rate
Int
positive
positive
negative
positive
positive
positive
negative
negative
positive
positive
positive
Reference
kit
Int
positive
positive
negative
positive
positive
positive
negative
negative
positive
positive
positive
8/11
8/11
HbsAg Elisa
Mutation
HbsAg Elisa
C137W
C139Y
K141E
P142L/G145R
P142L
D144G
G145K
C147T/C148T
E164D
S174N
Int
positive
positive
positive
negative
positive
positive
positive
positive
positive
positive
Reference
kit
Int
negative
positive
positive
negative
positive
negative
negative
positive
positive
positive
9/10
6/11
Detection
Rate
5.11.4) 25 same day fresh positive samples
HBsAg Elisa detected 25 same day fresh positive samples. The criteria of the chapter 3.1.9 of the 2009/886/EC was
fulfilled.
5.11.5) Analytical Sensitivity
Standard Material
※
WHO 2nd international Standard
PEI standard Subtype ad
PEI standard Subtype ay
※
Calculated Sensitivity
0.03 IU/mL
0.08 PEI U/mL
0.09 PEI U/mL
WHO Second International Standards for HBsAg, subtype adw2, genotype A, NIBSC code: 00/588
5.11.6) Precision
1. Intra-assay reproducibility
Catalogue Nr: KAPG4SGE3
PI number : 1701153
Revision Nr : 110627/1
Intra-assay precision was determined using one positive control sample and two patient serum samples of different
HBsAg concentration (slightly above the cutoff level and at medium level) which were analyzed in replicates of 20
in a single run over 3 days.
Standard
Coefficient of
Run Sample ID
Mean
Deviation
Variation
1
PC 1 :32
0.7541
0.0857
11.36
1
PS 1 :32
2.2766
0.1571
6.90
1
PS 1 :64
1.3159
0.1168
8.88
2
PC 1 :32
0.9671
0.0358
3.70
2
PS 1 :32
2.7325
0.1025
3.75
2
PS 1 :64
1.5822
0.0888
5.61
3
PC 1 :32
0.9669
0.0909
9.40
3
PS 1 :32
2.6088
0.2367
9.07
3
PS 1 :64
1.6502
0.1499
9.08
The calculated CV´s ranged between 3.7 % and 11.36 %. (= acceptable value for an immunoassay in microtiter
plate format).
2. Inter-assay reproducibility
The precision evaluation experiments were performed over 10 operating days is using five serum samples (with
borderline positive and clearly above cutoff value HBsAg levels).
Standard
Coefficient of
Sample ID
N
Mean
Deviation
Variation
F1
10
0.0609
0.0185
30.41
F2
10
0.0770
0.0189
24.56
F3
10
0.1000
0.0245
24.51
F4
10
0.1786
0.0462
25.87
F5
10
0.6107
0.1412
23.12
The calculated CV´s ranges between 30.4 for an HBsAg negative sample and 23.1 % for an HBsAg low positive
sample (= acceptable values for the inter-assay imprecision of an immunoassay in microtiter plate format).
5.11.7) Antigen Excess/High-dose hook effect
This was performed testing a serum sample with a very high HBsAg concentration of 125 mg/L in serial dilution
with the DIAsource HBsAg Elisa assay. No high-dose hook effect was observed.
5.11.8) Traceability
The DIAsource HBsAg Master Calibrator has been calibrated against the British Working Standard for HBsAg
(NIBSC-Code: 01/476-006) using the HBsAg Elisa assay. The relative potency (ratio) of the British Working
Standard for HBsAg versus the DIAsource HBsAg Master Calibrator is 4.081 (3.853-4.325 95% CI). The
concentration of the Positive Control of HBsAg Elisa assay has been determined against the DIAsource HBsAg
Master Calibrator and was established with 42 IU/ml ± 20%.
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PI number : 1701153
Revision Nr : 110627/1
5.12)
Flow chart of the test procedure
Add 50 µl of controls (3 X NC, 2 X PC) and add 50µl of each
specimen into wells. Reserve one well for blank.
↓
Add 50 µl of Anti-HBs‧ Peroxidase Solution into each
reaction well, except one blank.
↓
Incubate the plate at +37±1°C for 80 minutes.
↓
Wash the plate.
(Choose one of the following two methods for enzymatic
reaction with color development)
↙
↘
Mix equal volumes of
Chromogenic TMB
concentrate and Substrate
buffer. Add 100 µl of the
mixed solution to wells.
Add 50 µl of Chromogenic
TMB concentrate to wells
and then add 50 µl of
Substrate buffer. Mix well,
gently.
↘
↙
Incubate at R.T. for 30 minutes.
↓
Add 100µl of 1N sulfuric acid into each well.
↓
Determine absorbance using 450 nm as reading wavelength
with 620-690nm reference wavelength
6) NOTES
*1 The reference wavelength of the photometer to be used can be 620 nm to 690 nm. However, the user should validate
the photometer in combination with HBsAg Elisa before use.
*2 Incomplete inactivation of hepatitis B virus after heat treatment at +60°C for 10 hours, J. Infect. Dis. 138:242-244.
7) BIBLIOGRAPHY
1. Blumberg BS, Alter HJ, Visnich S. A „new“ antigen in leukemia sera. JAMA, 1965;191:101- 106.
2. Dane DS, Cameron CH, Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated
hepatitis. Lancet 1970; 1: 695 - 698.
3. Aach RD, Grisham JW, Paker CW. Detection of Australia antigen by radioimmunoassay. Proc Natl Acad Sci. USA
1971;68:1056-1060.
4. Kim CY, Tikes JG. Purification and biophysical characterization of hepatitis antigen. J Clin Invest. 1973; 52:11761186.
5. Wolters G. Kuijpers LP, Kacaki J, Schuurs AH, Enzyme linked immunosorbent assay for hepatitis B surface antigen.
J Infect. Dis 1977;136:Suppl 311-377.
6. Shih JW, Cote PJ Jr, Dapolito GM, Gerin JL. Production of monoclonal antibodies against hepatitis B surface antigen
(HBsAg)by somatic cell hybrids. J Virol Methods. 1980;1:257-273.
7. Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM. Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis.
1991;11:73-83
Revision date : 2011-06-27
Catalogue Nr: KAPG4SGE3
PI number : 1701153
Revision Nr : 110627/1
HBsAg Elisa
Pour la détection qualitative in vitro de l’antigène de surface de l’hépatite B
(HBsAG) dans le sérum ou le plasma humain.
fr
KAPG4SGE3
DIAGNOSTIC IN VITRO
DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgique
Tél. : +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90
1) BUT DU DOSAGE
L’HBsAg Elisa est un kit de diagnostic d'essai immuno-enzymatique pour la détection qualitative in vitro de l’antigène
de surface de l’hépatite B (HBsAg) dans le sérum ou le plasma humain (hépariné, citraté ou sur EDTA).
2) RESUME ET EXPLICATION DU TEST
L’antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg) est le premier marqueur qui apparaît dans le sang suite à une infection par
le virus de l’hépatite B (HBV) quelques jours ou semaines avant la manifestation des symptômes cliniques. Il s’agit d’un
polypeptide lipoprotéique qui constitue l’enveloppe externe du virus HB. La détection de l’HBsAg dans le sérum ou le
plasma humain indique une infection par l’HBV en cours, aiguë ou chronique. La recherche de marqueurs HBV
supplémentaires est nécessaire pour définir le stade précis de la pathologie. Les essais HBsAg sont utilisés non seulement
pour diagnostiquer les infections par l’HBV, mais également pour surveiller la progression de la pathologie et l’efficacité
du traitement antiviral.
L’HBsAg Elisa est un test rapide servant à la détection qualitative de la présence de l’HBsAg dans un échantillon de
sérum ou de plasma (hépariné, citraté ou sur EDTA). Ce test utilise des anticorps monoclonaux et polyclonaux (cochons
d’Inde) afin de détecter de façon sélective des niveaux élevés d’HBsAg dans le sérum ou le plasma.
Les échantillons qui ne réagissent pas à l’HBsAg Elisa sont considérés comme négatifs pour l’HBsAg. Les échantillons
qui réagissent doivent être testés à nouveau en doublon.
Si la réaction positive se répète, la réactivité pour l’HBsAg de l’échantillon doit être confirmée par des réactifs de
confirmation validés.
Seuls les échantillons positifs confirmés sont considéré contenir de l’HBsAg.
3) DESCRIPTION DU TEST
L’HBsAg Elisa est un essai immuno-enzymatique en phase solide (ELISA = enzyme-linked immuno-sorbent assay)
basé sur le « principe du sandwich ».
La phase solide de la plaque de microtitration est composée de puits en polystyrène tapissés d’anticorps monoclonaux de
souris spécifiques de l’HBsAg ; par ailleurs, un anticorps polyclonal de cochon d’Inde purifié par chromatographie
d’affinité est utilisé pour préparer le conjugué anti-HBs• peroxydase (de raifort) dans la phase liquide.
Lorsqu’un échantillon de sérum ou de plasma contenant des HBsAg est ajouté avec l’anticorps anti-HBs conjugué
contenant de la peroxydase aux puits tapissés d’anticorps anti-HBs et incubé, un complexe anticorps-HBsAg-anticorpsperoxydase se forme sur les puits.
Après lavage de la plaque de microtitration pour éliminer le matériel non lié, une solution du substrat TMB est ajoutée
aux puits et la plaque est incubée. Une couleur apparaît, proportionnelle à la quantité d’HBsAg liés aux anti-HBs. La
réaction peroxydase-TMB est stoppée par ajout d’acide sulfurique. La densité optique de la couleur développée est lue à
450 nm à l’aide d’un photomètre adapté avec une longueur de référence comprise entre 620 et 690 nm*1.
Le principe du test est également décrit ci-dessous.
A Échantillon contenant de l’HBsAg :
1. Puits d’une plaque (Anti-HBs) + échantillon (HBsAg) + Anti-HBs•peroxydase → complexe sandwich antiHBs•HBsAg•(Anti-HBs•peroxydase)
2. Complexe sandwich + solution du substrat TMB → coloration bleu clair à bleu
3. Ajouter de l’acide sulfurique pour arrêter la coloration → Lire la DO à 450 nm (longueur d’onde de référence entre
620 et 690 nm*8)
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Nº de PI : 1701153
Nº de révision : 110627/1
B Échantillon sans HBsAg :
1. Puits d’une plaque (Anti-HBs) + échantillon (sans HBsAg) + Anti-HBs•peroxydase → Anti-HBs (sur le puits)
2. Anti-HBs (sur le puits) + solution du substrat TMB → couleur incolore à bleu clair
3. Ajouter de l’acide sulfurique pour arrêter la coloration → Lire la DO à 450 nm (longueur d’onde de référence entre
620 et 690 nm*8)
4) DESCRIPTION DU MATERIEL FOURNI
● Les articles 1 - 6 dans le tableau des réactifs suivant doivent être réfrigérés entre 2 et 8 °C. La solution de lavage D
(20X) et la solution d’arrêt de la réaction peuvent être stockées entre 2 et 30 °C.
ART
Qté par
ICL
Composants
Description
96 tests
ES
Plaque anti-HBs
Plaque de microtitration tapissée
(1)
1 plaque
d’anti-HBs monoclonaux de souris.
Conjugué polyclonal anti-HBs
HRPO, dilué dans un tampon avec
stabilisateurs des protéines.
Conservateurs :
0,003 % de Gentamycine et
Ab
HRP
0,01 % de Thimérosal.
Colorant : rouge de phénol.
Sérum humain inactivé positif pour
Contrôle HBsAg l’HbsAg, mais non réactif pour
positif
l’anti-HCV et l’anti-HIV1/2, dilué
dans un tampon avec stabilisateurs
CONTROL
H
des protéines.
Conservateurs : 0,003 % de
Gentamycine et 0,01 % de Thimérosal.
Sérum non réactif aux marqueurs
Contrôle HB
HBV, anti-HCV et anti-HIV1/2,
négatif
dilué dans un tampon avec
stabilisateurs des protéines.
CONTROL
L
Conservateurs : 0,003 % de
Gentamycine et 0,01 % de Thimérosal.
Chromogène TMB 0,6 mg/ml de
concentré
3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine
(TMB) dans une base organique
CHROM TMB CONC
avec du DMSO.
Tampon du
Tampon citrate contenant 0,03 %
substrat
d’H2O2.
SUB
BUF
Solution de
peroxydase anti(2) HBs
(3)
(4)
(5)
(6)
Solution de lavage
conc. (20X)
(7)
WASH
SOLN CONC
1 flacon,
1,5 ml
1 flacon,
2,0 ml
1 flacon,
12 ml
1 flacon,
12 ml
Tampon phosphate concentré avec
du Tween-20
1 flacon
58 ml
Acide sulfurique 1N
1 flacon
12 ml
Solution d'arrêt
(8)
1 flacon,
8 ml
● AUTRE MATÉRIEL REQUIS, MAIS NON FOURNI
ARTICLES
Composants
(1)
Des micropipettes de 50 µl, 100 µl et des embouts sont nécessaires.
(2)
Bain-marie ou incubateur avec contrôle de la température à +37 °C.
(3)
Matériel de lavage de la plaque.
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Nº de révision : 110627/1
(4)
(5)
Lecteur de microplaques ELISA :
Longueur d’onde double à 450 nm avec longueur d’onde de référence entre 620 et
690 nm, bande passante de 10 nm*1.
Un analyseur de microplaque pour EIA totalement automatique est facultatif.
L’utilisateur doit valider l’analyseur automatique de microplaque pour EIA par rapport
au kit.
4.1) Conditions de stockage et stabilité du kit et des composants
Kit/composants
Temp. de
stockage
Kit HBsAg Elisa
+2 à +8 °C
Contrôle HBsAg positif
+2 à +8 °C
Contrôle HB négatif
+2 à +8 °C
Plaque anti-HBs
+2 à +8 °C
Solution du conjugué Anti-HBs‧HRPO
+2 à +8 °C
Solution de lavage concentrée (20X)
Solution de lavage diluée 20X
Temp.
ambiante
Temp.
ambiante
+2 à +8 °C
Chromogène TMB concentré
+2 à +8 °C
Tampon du substrat
+2 à +8 °C
Mélange substrat TMB
Acide sulfurique 1N
Temp.
ambiante
Temp.
ambiante
État
Stabilité
Original
Après ouverture
Original
Après ouverture
Original
Après ouverture
Original
Après ouverture
Original
Après ouverture
Original
Après ouverture
18 mois
1 mois
18 mois
1 mois
18 mois
1 mois
24 mois
1 mois
18 mois
1 mois
24 mois
1 mois
Diluée
2 jours
Diluée
Original
Après ouverture
Initial
Après ouverture
1 semaine
24 mois
1 mois
24 mois
1 mois
Mélange
6 heures
Original
Après ouverture
24 mois
1 mois
5) Mode d’emploi
5.1) Avertissements :
5.1.1) Ce kit de réactifs est uniquement à usage professionnel.
5.1.2) Ce kit de réactifs est uniquement destiné à un diagnostic in vitro.
5.1.3) Placer l’ensemble des réactifs du kit et des échantillons à température ambiante (+20 à +30 °C) et mélanger
soigneusement avant utilisation.
5.1.4) Ne pas utiliser les réactifs après la date d’expiration.
5.1.5) Ne pas échanger les réactifs entre différents lots.
5.1.6) Ne pas porter la pipette à la bouche.
5.1.7) Ne pas fumer ou manger dans les zones où des échantillons ou des réactifs sont manipulés.
5.1.8) Tous les composants du kit et les échantillons doivent être considérés comme potentiellement dangereux pour la
santé. Ils doivent être utilisés et éliminés conformément aux procédures de sécurité de votre laboratoire. Ces
procédures de sécurité incluent probablement le port de gants de protection et éviter de produire des aérosols.
5.1.9) Les échantillons potentiellement infectieux et les déversements ou fuites non acides doivent être
minutieusement nettoyés à l’aide d’hypochlorite de sodium à 5 % ou traités selon votre procédure de contrôle
des risques biologiques potentiels.
5.1.10) Avant d’éliminer les échantillons et les kits de réactifs usagés dans les ordures ménagères, ils doivent être
traités conformément à la procédure locale de traitement des déchets biologiques potentiellement dangereux
ou comme suit :
Les déchets liquides et solides doivent être stérilisés par autoclave à +121 °C pendant au moins 30 minutes.
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Les déchets solides peuvent également être incinérés.
Les déchets liquides non acides peuvent être traités à l’aide d’hypochlorite de sodium dilué à une
concentration finale de 1 %.
Les déchets liquides acides doivent être neutralisés avant traitement à l’aide d’hypochlorite de sodium tel que
mentionné ci-dessus et doivent être stérilisés pendant 30 minutes pour obtenir une désinfection effective.
5.1.11) La solution d’arrêt est un irritant pour la peau, les yeux, les voies respiratoires et les muqueuses. Éviter le
contact de la solution d’arrêt avec la peau et les muqueuses. En cas de contact, laver immédiatement et
abondamment à l’eau. En cas d’inhalation, respirer immédiatement de l’air frais et consulter un médecin en
cas de douleur.
5.1.12) Le chromogène TMB concentré contient un solvant organique inflammable : risques d’effets graves
irréversibles en cas d’inhalation, contact avec la peau ou ingestion. Le chromogène TMB concentré contient
du sulfoxyde de diméthyle, un irritant pour la peau et les muqueuses.
5.1.13) Bien que tous les échantillons d’origine humaine soient testés non réactifs pour l’anti-HCV et l’anti-HIV et ont
été inactivés à +56 °C pendant une heure, le réactif doit être manipulé comme une substance potentiellement
infectieuse.*2
5.2) Collecte et préparation des échantillons pour analyse
5.2.1) Aucune préparation spéciale du patient n’est requise avant une prise de sang. Le sang doit être prélevé par des
techniques médicales approuvées.
5.2.2) Des échantillons de sérum ou de plasma peuvent être utilisés avec ce kit de test. Les échantillons de sang total
doivent être séparés au plus tôt pour éviter l’hémolyse. Toute particule (par ex., caillots de fibrine,
érythrocytes) contenue dans l’échantillon doit être retirée avant utilisation.
5.2.3) Les échantillons doivent être stockés entre +2 et +8 °C et éviter l’inactivation par la chaleur pour minimiser la
détérioration. Pour un stockage de longue durée, ils doivent être congelés en dessous de -20 °C. Un stockage
en congélateur à dégivrage automatique n’est pas recommandé.
5.2.4) Les échantillons congelés doivent être entièrement décongelés et mélangés de façon homogène avant le test.
5.2.5) Éviter les procédures de congélation-décongélation multiples.
AVERTISSEMENT
1. L’échantillon ne doit contenir aucun composé d’AZOTURE qui inhibe l’activité de la peroxydase.
2. Les sérums partiellement coagulés et les échantillons avec une contamination bactérienne ne doivent pas être
utilisés.
5.3) Conditions de stockage et stabilité des réactifs
5.3.1) Le kit doit être conservé entre +2 et +8 °C. Ne pas congeler.
5.3.2) Les barrettes de la plaque doivent être utilisées dans le mois suivant l’ouverture du sachet en aluminium
d’origine. Les barrettes non utilisées doivent être conservées dans le sachet en aluminium qui doit être
solidement fermé.
5.3.3) Replacer les réactifs entre +2 et +8 °C immédiatement après utilisation.
5.3.4) La solution de lavage concentrée (20X) peut être conservée à température ambiante pour éviter la cristallisation,
car les kits sont conservés et expédiés entre +2 et +8 °C. Si des cristaux se sont formés avant utilisation,
réchauffer la solution dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à dissolution des cristaux.
5.4) Procédure de lavage de la plaque
5.4.1) Préparation de la solution de lavage :
Diluer la solution de lavage concentrée (20X) avec de l’eau distillée ou désionisée pour obtenir une dilution
1:20. Ne pas utiliser d’eau du robinet.
5.4.2) Lavage de la plaque :
(a) Pour un laveur de plaques avec fonction d’aspiration du trop-plein : 6 cycles avec au moins 0,5 ml de
tampon de lavage par puits par cycle.
ou
(b) Pour un laveur de plaques sans fonction d’aspiration du trop-plein : 8 cycles avec au moins 0,35 ml
de tampon de lavage par puits par cycle.
5.4.3) Sécher en retournant la plaque et en la tapotant fermement sur du papier absorbant. Une trop grande quantité de
tampon de lavage résiduel entraînera des résultats erronés.
AVERTISSEMENT:un lavage insuffisant entraînera des résultats erronés.
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5.5) Procédure du test
5.5.1) Placer tous les réactifs et échantillons à température ambiante (+20 à +30 °C) avant l’essai. Régler le bain-marie
ou l’incubateur à +37±1 °C.
5.5.2) Garder un puits pour le blanc. Ajouter 50 µl de chaque contrôle ou d’échantillon dans les puits appropriés de la
plaque de microtitration (3 contrôles négatifs et 2 contrôles positifs).
REMARQUE :
a. Utiliser un embout de pipette propre pour chaque prélèvement afin d’éviter la contamination croisée.
b. Chaque plaque doit avoir respectivement des contrôles négatifs, des contrôles positifs et un puits pour le
blanc.
c. Ne pas utiliser la valeur du seuil de positivité établie pour d’autres plaques d’HBsAg Elisa.
5.5.3) Ajouter 50 µl de solution de peroxydase anti-HBs à chaque puits sauf au blanc.
REMARQUE : Ne pas toucher la paroi des puits de la plaque pour éviter la contamination.
5.5.4) Tapoter doucement la plaque.
5.5.5) Retirer le support de protection de la bande adhésive et la placer en appuyant sur la plaque de réaction de sorte
qu’elle soit scellée hermétiquement.
5.5.6) Incuber la plaque de réaction dans un bain-marie ou un incubateur à +37±1 °C pendant 80 minutes.
5.5.7) À la fin de la période d’incubation, retirer et jeter la bande adhésive et laver la plaque selon le paragraphe 5.4)
Procédure de lavage de la plaque.
5.5.8) Sélectionner l’une des deux méthodes suivantes pour la coloration :
A. Mélanger immédiatement avant utilisation des volumes identiques de chromogène TMB concentré et de
tampon du substrat dans un récipient propre. Ajouter 100 l de la solution du mélange à chaque puits, y
compris au blanc.
Ajouter tout d’abord 50 l de chromogène TMB concentré, puis ajouter 50 l de tampon du substrat à
chaque puits, y compris au blanc. Bien mélanger avec précaution.
REMARQUE : Le chromogène TMB concentré doit être incolore à bleu clair ; sinon il faut le jeter. Le mélange
de chromogène TMB concentré et de tampon du substrat doit être utilisé dans les 30 minutes
après le mélange. Le mélange doit être tenu à l’écart de toute lumière intense.
5.5.9) Recouvrir la plaque d’un couvercle noir et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
5.5.10) Stopper la réaction en ajoutant 100 µl de solution d’arrêt à chaque puits, y compris au blanc.
5.5.11) Déterminer l’absorbance des contrôles et des échantillons dans les 30 minutes avec un spectrophotomètre de
précision à 450/620-690 nm (longueur d’onde de lecture à 450 nm avec une longueur d’onde de référence entre
620 et 690 nm)*2.
Utiliser le puits du blanc pour définir le zéro du spectrophotomètre.
REMARQUE : La couleur du puits du blanc doit être incolore à jaune clair ; sinon les résultats du test sont
invalides.
Blanc du substrat : la valeur de l’absorbance doit être inférieure à 0,100.
B.
5.6) Calculs des résultats
5.6.1) Calcul du NC (absorbance moyenne du contrôle négatif).
Exemple : Nº d’échantillon Absorbance
1
0,022
2
0,025
3
0,023
NC = (0,022 + 0,025 + 0,023) / 3 = 0,023
Le NCx doit être ≦0,1, sinon le test n’est pas valide.
5.6.2) Calcul du PC (absorbance moyenne du contrôle positif).
Exemple : Nº d’échantillon Absorbance
1
1,432
2
1,508
PC = (1,432 + 1,508) / 2 = 1,470
Le PC doit être ≧0,6, sinon le test n’est pas valide.
5.6.3) Calcul de la valeur P - N
P - N = PC – NC
Exemple : NC = 0,024
PC = 1,470
P - N = 1,470 – 0,024 = 1,446
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La valeur P - N doit être ≧0,5, sinon le test n’est pas valide.
5.6.4) Calcul de la valeur du seuil de positivité
Valeur du seuil de positivité = NC + 0,025
Exemple :
Valeur du seuil de positivité = 0,023 + 0,025 = 0,048
5.7) Validité des runs de tests
5.7.1) Le NC doit être ≦0,1, sinon le test n’est pas valide.
5.7.2) Le PC doit être ≧0,6, sinon le test n’est pas valide.
5.7.3) La valeur P - N doit être ≧0,5, sinon le test n’est pas valide.
REMARQUE : Contrôle négatif : la valeur de l'absorbance doit être inférieure ou égale à 0,100 après avoir soustrait
le blanc.
5.8) Interprétation des résultats
5.8.1) Les échantillons présentant des valeurs d’absorbance INFÉRIEURES à la valeur du seuil de positivité sont
NON RÉACTIFS et sont considérés comme NÉGATIFS pour l’HBsAg.
5.8.2) Les échantillons présentant des valeurs de l’absorbance SUPÉRIEURES ou ÉGALES à la valeur du seuil de
positivité sont considérés comme INITIALEMENT RÉACTIFS. Les échantillons d’origine doivent être testés
à nouveau en doublon.
5.8.3) Si les deux valeurs d’absorbance du nouveau test sont inférieures à la valeur du seuil de positivité, les
échantillons sont considérés comme NÉGATIFS pour l’HBsAg.
Si, dans le nouveau test, au moins l’une des deux valeurs d’absorbance est SUPÉRIEURE ou ÉGALE à la
valeur du seuil de positivité, les échantillons sont considérés comme positifs pour l’HBsAg réitérés. Les
échantillons positifs réitérés seront confirmés à l’aide de réactifs de confirmation validés.
5.9) Résolution des problèmes
Si le résultat ne peut être reproduit, réaliser une procédure de contrôle préliminaire en vérifiant les possibilités cidessous :
5.9.1) Procédure de lavage inappropriée.
5.9.2) Contamination avec un échantillon positif.
5.9.3) Volume incorrect d’échantillon, du conjugué ou du substrat.
5.9.4) Contamination du bord du puits avec un conjugué.
5.9.5) Échantillon inapproprié, par exemple sérum ou plasma hémolysé, échantillon contenant des sédiments et
échantillons insuffisamment mélangés avant utilisation.
5.9.6) Durée ou température d’incubation incorrecte.
5.9.7) Tête et aiguilles d’aspiration/distribution du laveur obstruées ou partiellement obstruées.
5.9.8) Aspiration insuffisante.
5.10) Limites et interférences
5.10.1) Ce kit de réactifs doit être uniquement utilisé pour du sérum ou du plasma humain non mis en pool.
5.10.2) Ce kit de réactifs n’a pas été validé pour une utilisation avec des échantillons prélevés sur des cadavres.
5.10.3) Un résultat HBsAg négatif sans autre preuve ne doit pas être utilisé pour exclure une infection par HBV.
5.10.4) Substances provoquant des interférences :
Les résultats suivants ont été obtenus lors d’expérimentations respectives :
1. Aucune interférence avec différents anticoagulants tels que l’héparine de lithium, l’EDTA, le citrate n’a été
observée.
2. Les échantillons traités par la chaleur (+60 °C, 10 heures) ont présenté une diminution du titre d’HBsAg.
3. Aucune réactivité croisée n’a été détectée sur des échantillons provenant de patients présentant a) d’autres
infections par HAV, EBV, CMV, HSV, VZV, Lyme Borreliosis, HCV, HIV, b) d’autres états pathologiques
tels qu'insuffisance rénale, hémodialyse, hépatite auto-immune, cirrhose du foie et c) présence de certains
anticorps tels que HAMA, GAD, IA2, APS.
4. Les échantillons contenant des substances pouvant provoquer des interférences [par ex., triglycérides
(lipémie), hémoglobine (hémolyse), bilirubine (ictère), composants d’immunoglobuline monoclonale,
niveaux élevés d’anticorps auto-immuns (facteur rhumatoïde (FR), anticorps antinucléaires (ANA), ou
anticorps antimitochondriaux (AMA)] et les échantillons provenant de femmes enceintes n’ont pas provoqué
Nº de catalogue : KAPG4SGE3
Nº de PI : 1701153
Nº de révision : 110627/1
d’interférences avec l’essai HBsAg Elisa.
5.11) Performance
5.11.1) Spécificité diagnostique
Résultats de l’évaluation européenne de la performance pour l’HBsAg Elisa de DIAsource – Réactivité des
échantillons « Donneur » et « Clinique » HBV négatifs.
Nbre total d’échantillons
N
HBsAg Elisa de DIAsource
Nég *IR **RR Confirmé Faux positif
HBV négatif
213 211 2 2
0
(échantillon clinique)
HBV négatif
5501 5479 22 22
0
(échantillon donneur)
Total
5714 5690 24 24
0
*IR : initialement réactif **RR : réactif réitéré
Spécificité diagnostique = 5690/5714 = 99,58 %
2
22
24
5.11.2) Sensibilité diagnostique
1. La sensibilité diagnostique déterminée dans les évaluations européenne de la performance a donné les résultats
suivants :
Nbre
d’échantillons
Sérums HBsAg positifs
400
Sensibilité diagnostique = 400/400 = 100 %
Échantillon
Réactifs
Sensibilité
400
100 %
2. L’évaluation de l’HBsAg Sensitivity Panel PHA807 (BBI, États-Unis) a donné les résultats suivants :
Panel
Nbre de membres du
panel
Panel de sensibilité HBsAg
PHA807 (BBI)
PHA807-01~21
Résultats
Équivalents ou meilleurs que
les concurrents.
3. L’évaluation de l’HBsAg Mixed Titer Performance Panel PHA205 (BBI, États-Unis) a donné les résultats
suivants :
Panel
Nbre de membres du
panel
Résultats
Panel de performance d’un
mélange de titres HBsAg PHA205
(BBI)
PHA205-01~25
Équivalents ou meilleurs que les
concurrents.
4. L’évaluation du HBsAg Mixed Titer Performance Panel VHA601 (BBI, États-Unis) a donné les résultats suivants :
Panel
Panel de performance d’un mélange de
titres HBsAg VHA601 (BBI)
Nbre de membres du
panel
Résultats
VHA601-01~06
Rencontre les résultats du
BBI escomptés.
5. L’évaluation du HBsAg Mixed Titer Performance Panel QHA711 (BBI, États-Unis) a donné les résultats suivants :
Panel
Panel de performance d’un mélange de
titres HBsAg QHA711 (BBI)
Nbre de membres du
panel
Résultats
QHA711-01~06
Rencontre les résultats du
BBI escomptés.
6. Résultats du test avec l’INTS HBsAg Subtype Panel :
Les résultats de l’évaluation démontrent que l’ensemble des sérotypes HBsAg connus (sous-types HBsAg)
disponibles dans le panel des sous-types HBsAg INTS peuvent être détectés aussi bien par l’HBsAg Elisa que par
l’essai de référence à des dilutions pouvant aller jusqu’à 10 4x ~ 106x.
7. Tableau de synthèse de l’évaluation de l’ensemble des panels de séroconversion testés :
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Nº de PI : 1701153
Nº de révision : 110627/1
ID du panel
PHM907 (ay)
PHM916 (ay)
PHM920 (ad)
PHM921 (ad)
PHM930 (ad)
PHM933 (ad)
PHM934 (ad)
PHM935A
(ad)
PHM935B
(ad)
NabiSB0411
PHM903 (ad)
PHM904 (ad)
PHM906 (ad)
PHM909 (ad)
PHM910 (ad)
PHM912 (ad)
PHM914 (ad)
PHM915
(ind)
PHM917
(ind)
PHM918 (ad)
PHM923 (ay)
PHM924 (ad)
PHM925
(ind)
PHM926
(ind)
PHM927
(ind)
PHM928 (ad)
PHM929 (ad)
PHM931
(ind)
PHM932 (ad)
PHM935A
(ad)
Total
Résultat HBsAg positif à compter de la date du premier prélèvement
sanguin
Différence du
nombre de
Essai HBsAg de
Différence de jours
HBsAg Elisa
prélèvements
référence
de
prélèvement
(nbre de
(B en jours)
(A en jours)
(A-B)
membres du
panel)
50
50
0
0
62
65
-3
-1
26
26
0
0
0
0
0
0
3
3
0
0
7
9
-2
-1
0
0
0
0
9
21
-12
-3
231
217
14
-1
6
6
7
137
9
35
42
0
6
10
18
0
9
18
0
146
0
-4
-11
137
0
17
42
-146
0
-1
-1
1
0
1
7
-1
12
28
-16
-5
36
>43
->7
->2
7
15
29
7
21
35
0
-6
6
0
-1
1
8
14
-6
-1
13
15
-2
-1
4
7
-3
-1
9
14
9
18
0
-2
0
-1
19
21
-2
-1
61
61
0
0
21
28
-7
-2
-----
----Moyenne
Somme = -13
-13/30 = 0,4 jour
---------
Synthèse de l’évaluation de l’ensemble des panels de séroconversion testés :
Les résultats ont montré que l’HBsAg Elisa est quasiment équivalent à l’essai de référence. En moyenne, le test
HBsAg Elisa a seulement 0,4 jour de retard par rapport à l’essai de référence dans les 30 panels de séroconversion
testés.
5.11.3) Mutants
1. Panel mutant
Un panel de mutants dans le PreCore de l’hépatite B de Teragenix, États-Unis a été testé. L’HBsAg Elisa peut
détecter les résultats pour un rapport de dilution du panel de 1:2 ou 1:5.
Ce panel contient 3 échantillons de Promoteur Core (A1762/G1764) de type sauvage ; mutant dans le codon 28
de la région PreCore/infection de type sauvage, 4 échantillons de Promoteur Core (A1762/G1764) de type sauvage ;
mutant dans le codon 28 de la région PreCore, 2 échantillons de Promoteur Core (T1762/A1754)
MUTANT/(A1762/G1754) infection mélangée de type sauvage.
Nº de catalogue : KAPG4SGE3
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Nº de révision : 110627/1
2. Échantillons mutants
Le taux de détection de l’HBsAg Elisa est 17/21, soit un meilleur résultat que le kit de référence (14/21).
Mutation
113A114
P120L
R122I
R122T
E122I
T123N
122RA123
C124R
T131I
T131P
Y134S
Taux
de
détection
Int
positif
positif
négatif
positif
positif
positif
négatif
négatif
positif
positif
positif
Kit de
référence
Int
positif
positif
négatif
positif
positif
positif
négatif
négatif
positif
positif
positif
8/11
8/11
HBsAg Elisa
Mutation
HBsAg Elisa
C137W
C139Y
K141E
P142L/G145R
P142L
D144G
G145K
C147T/C148T
E164D
S174N
Int
positif
positif
positif
négatif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
Kit de
référence
Int
négatif
positif
positif
négatif
positif
négatif
négatif
positif
positif
positif
9/10
6/11
Taux
détection
de
5.11.4) 25 échantillons positifs frais du même jour
L’HBsAg Elisa a détecté 25 échantillons positifs frais du même jour. Les critères du chapitre 3.1.9 de la 2009/886/CE
ont été satisfaits.
5.11.5) Sensibilité analytique
Étalons
※
2 étalon international de l’OMS
Étalon PEI sous-type ad
Étalon PEI sous-type ay
Sensibilité calculée
0,03 UI/ml
0,08 PEI U/ml
0,09 PEI U/ml
e
※
Seconds étalons internationaux de l’OMS pour l’HBsAg, sous-type adw2, génotype A, code NIBSC : 00/588
5.11.6) Précision
1. Reproductibilité intra-essai
La précision intra-essai a été déterminée à l’aide d’un échantillon de contrôle positif et de deux échantillons de
sérum de patient de différentes concentrations en HBsAg (taux légèrement supérieur au niveau du seuil de
positivité et taux moyen) qui ont été analysés 20 fois en un seul run sur 3 jours.
Série
1
1
1
2
2
2
3
3
3
ID
échantillon
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
PC 1 :32
PS 1 :32
PS 1 :64
Moyenne
Écart type
0,7541
2,2766
1,3159
0,9671
2,7325
1,5822
0,9669
2,6088
1,6502
0,0857
0,1571
0,1168
0,0358
0,1025
0,0888
0,0909
0,2367
0,1499
Coefficient de
variation
11,36
6,90
8,88
3,70
3,75
5,61
9,40
9,07
9,08
Le CV calculé variait entre 3,7 % et 11,36 %. (= valeur acceptable pour un essai immuno-enzymatique sous forme
de plaque de microtitration).
2. Reproductibilité inter-essai
Nº de catalogue : KAPG4SGE3
Nº de PI : 1701153
Nº de révision : 110627/1
Les essais pour l’évaluation de la précision ont été réalisés sur 10 jours à l’aide de cinq échantillons de sérum (avec
un taux d’HBsAg à peine positif et un taux nettement supérieur au seuil de positivité).
ID
Coefficient de
N
Moyenne
Écart type
échantillon
variation
F1
10
0,0609
0,0185
30,41
F2
10
0,0770
0,0189
24,56
F3
10
0,1000
0,0245
24,51
F4
10
0,1786
0,0462
25,87
F5
10
0,6107
0,1412
23,12
Le CV calculé variait entre 30,4 % pour un échantillon HBsAg négatif et 23,1 % pour un échantillon HBsAg
faiblement positif (= valeurs acceptables pour l’imprécision inter-essai d’un essai immuno-enzymatique sous
forme de plaque de microtitration).
5.11.7) Excès d’antigène/effet crochet (Hook effect) à dose élevée
Cette étude a été réalisée en testant, avec l’essai HBsAg Elisa de DIAsource, des dilutions en série d’un échantillon
de sérum ayant une concentration très élevée en HBsAg de 125 mg/l. Aucun effet crochet à dose élevée n’a été
observé.
5.11.8) Traçabilité
L’HBsAg Master Calibrator de DIAsource a été calibré par rapport à l’étalon de travail HBsAg britannique
(British Working Standard for HBsAg ) (NIBSC-Code : 01/476-006) à l'aide de l'essai HBsAg Elisa. L’efficacité
relative (rapport) de l’étalon de travail HBsAg britannique par rapport à l’HBsAg Master Calibrator de DIAsource
est de 4,081 (3,853-4,325 IC à 95 %). La concentration du contrôle positif de l’essai HBsAg Elisa a été déterminée
par rapport à l’HBsAg Master Calibrator de DIAsource et a été établie à 42 UI/ml ± 20 %.
5.12)
Représentation graphique de la procédure de test
Ajouter 50 µl des contrôles (3 X NC, 2 X PC) et ajouter 50 µl
de chaque échantillon aux puits. Garder un puits pour le
blanc.
↓
Ajouter 50 µl de solution Anti-HBs‧ peroxydase à chaque
puits de réaction, sauf au blanc.
↓
Incuber la plaque à +37±1°C pendant 80 minutes.
↓
Laver la plaque.
(Choisir l’une des deux méthodes suivantes pour la réaction
enzymatique avec coloration)
↙
↘
Mélanger des volumes
identiques de chromogène
TMB concentré et de tampon
du substrat. Ajouter 100 µl
de la solution obtenue aux
puits.
Ajouter 50 µl de
chromogène TMB
concentré, aux puits puis
ajouter 50 µl de tampon du
substrat. Bien mélanger,
doucement.
↘
↙
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
↓
Ajouter 100 µl d’acide sulfurique 1N à chaque puits.
↓
Déterminer l’absorbance à l’aide d’une longueur d’onde de
lecture de 450 nm avec une longueur d’onde de référence
entre 620 et 690 nm
Nº de catalogue : KAPG4SGE3
Nº de PI : 1701153
Nº de révision : 110627/1
6) REMARQUES
*1 La longueur d’onde de référence du photomètre à utiliser peut varier entre 620 nm et 690 nm. Toutefois, l’utilisateur
doit valider le photomètre par rapport à l’HBsAg Elisa.
*2 Inactivation incomplète du virus de l’hépatite B après un traitement à la chaleur à +60 °C pendant 10 heures, J. Infect.
Dis. 138:242-244.
7) BIBLIOGRAPHIE
1. Blumberg BS, Alter HJ, Visnich S. A „new“ antigen in leukemia sera. JAMA, 1965;191:101- 106.
2. Dane DS, Cameron CH, Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated
hepatitis. Lancet 1970; 1: 695 - 698.
3. Aach RD, Grisham JW, Paker CW. Detection of Australia antigen by radioimmunoassay. Proc Natl Acad Sci. USA
1971;68:1056-1060.
4. Kim CY, Tikes JG. Purification and biophysical characterization of hepatitis antigen. J Clin Invest. 1973; 52:11761186.
5. Wolters G. Kuijpers LP, Kacaki J, Schuurs AH, Enzyme linked immunosorbent assay for hepatitis B surface antigen.
J Infect. Dis 1977;136:Suppl 311-377.
6. Shih JW, Cote PJ Jr, Dapolito GM, Gerin JL. Production of monoclonal antibodies against hepatitis B surface antigen
(HBsAg)by somatic cell hybrids. J Virol Methods. 1980;1:257-273.
7. Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM. Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis.
1991;11:73-83
Date de révision : 2011-06-27
Nº de catalogue : KAPG4SGE3
Nº de PI : 1701153
Nº de révision : 110627/1
HBsAg Elisa
Para la detección cualitativa del antígeno de superficie de la hepatitis B
(HBsAg) en suero o plasma humano.
es
KAPG4SGE3
PARA USO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO
DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium Tel: +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90
1) USO PREVISTO
El kit de diagnostico HBsAg ELISA es un inmunoensayo enzimático in vitro para la detección cualitativa del antígeno
de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en suero o plasma humano (heparina, citrato o EDTA).
2) RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL ENSAYO
El antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) es el primer marcador que aparece en la sangre después de la
infección con el virus de la hepatitis B (VHB) algunos días o semanas antes que se manifiesten los síntomas clínicos. Es
un polipéptido lipoproteína que forma la envoltura externa del virus de HB. La detección de HBsAg en suero humano o
plasma indica que hay una infección de VHB aguda o crónica en curso. El ensayo HBsAg se usa no solo para
diagnosticar infecciones con VHB sino también para monitorizar el curso de la enfermedad y la eficiencia de la terapia
anti-viral.
HBsAg ELISA es un ensayo rápido para la detección cualitativa de la presencia de HBsAg en la muestra de suero o
plasma (heparina, citrato EDTA). El ensayo utiliza anticuerpos monoclonales y policlonales (anti-cobaya) para detectar
selectivamente niveles altos de HBsAg en suero o plasma.
Las muestras que no son reactivas con HBsAg ELISA se consideran negativas para HBsAg. Las muestras con una
reacción positiva deben ser repetidas en duplicado.
En caso de obtener un resultado reactivo en una repetición, la muestra debe ser confirmada para la reactividad con
HBsAg usando reactivos de confirmación validados.
Se considera que solo las muestras positivas confirmadas contienen HBsAg.
3) DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO
HBsAg Elisa es un inmunoensayo enzimático de fase sólida (ELISA= enzyme-linked immunosorbent assay) – basado en
"principio del sándwich".
La fase sólida de la microplaca está formada por pocillos de poliestireno, recubiertos con anticuerpos monoclonales de
ratón, específicos para HBsAg; en cambio el anticuerpo policlonal de cobayo, purificado por cromatografía de afinidad
se usa para preparar el conjugado de anti-HBs• peroxidasa (rábano picante) en fase líquida.
Cuando una muestra de suero o plasma que contiene HBsAg se agrega a un pocillo recubierto con anticuerpos anti-HBs
junto con el anticuerpo anti-HBs conjugado con peroxidasa y se incuban, se formará un complejo anticuerpo-HBsAganticuerpo-pocillo recubierto en el pocillo.
Después de lavar la microplaca para eliminar el material que no se ha unido, se agrega una solución de sustrato TMB a lo
pocillos y se incuba. El color se desarrolla proporcionalmente a la cantidad de HBsAg que se ha unido al Anti-HBs. La
reacción peroxidasa-TMB se detiene agregando ácido sulfúrico. La densidad óptica del color que se ha generado se mide
con un fotómetro adecuado a 450 nm con una longitud de onda de referencia seleccionada de 620 a 690 nm *1.
El principio del ensayo descrito anteriormente se ilustra también enel siguiente diagrama.
A Muestra que contiene HBsAg:
1. Placa (Anti-HBs) + muestra (HBsAg) + Anti-HBs • peroxidasa
→ HBsAg •Anti-HBs• (Anti-HBs • peroxidasa) complejo de sándwich
2. Complejo de sándwich + solución de sustrato TMB → color de azul a celeste
3. Agregue ácido sulfúrico para detener el desarrollo del color → Lea la DO a 450nm/620-690 nm*8
B Muestra sin HBsAg:
1. Placa (Anti-HBs) + muestra (sin HBsAg) + Anti-HBs • peroxidasa → Anti-HBs (en los pocillos)
2. Anti-HBs (en los pocillos) + solución de sustrato TMB → Incoloro a azul claro
3. Agregue ácido sulfúrico para detener el desarrollo del color → Lea la DO a 450nm/620-690 nm*8
4) DESCRIPCIÓN DE LOS MATERIALES PROPORCIONADOS
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
PI Numero : 1701153
Revisión Nr : 110627/1
●Items 1 - 6 en la siguiente tabla de reactivos deben mantenerse refrigerados entre + 2 y +8°C. La Solución de
Lavado (20X) y la solución de parada pueden almacenarse entre +2 y +30°C.
ITEMS
Componentes
Anti-HBs Placa
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Cant. para
96 ensayos
Microplaca recubierta con anti-HBs monoclonal
de ratón.
Conjugado Anti-HBs HRPO policlonal diluido en
Solución AntiHBs · Peroxidasa tampón con estabilizadores de proteínas.
Conservantes:
Gentamicina 0,003% y Timerosal 0,01%.
Ag
HRP
Tinción: rojo fenol.
Suero humano inactivado positivo para HBsAg
pero no-reactivo con anti-VHC y anti-VIH1/2,
diluido en tampón con estabilizadores de
proteínas.
CONTROL
H
Conservantes:
Gentamicina 0,003% y Timerosal 0,01%.
Suero no reactivo para VHB
Control Negativo marcadores anti-VHC y
HB
anti-VHI 1/2, diluido en tampón con
estabilizadores de proteínas.
CONTROL
L
Conservantes:
Gentamicina 0,003% y Timerosal 0,01%.
Control Positivo
HBsAg
TMB Cromogénico
0,6 mg/ml de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)
concentrado
en una base orgánica con DMSO.
CHROM TMB
SUB
BUF
Solución de Lavado
Conc. (20x)
WASH
1 vial,
1.5 ml
1 vial,
2 ml
1 vial,
12 ml
1 vial,
12 ml
Tampón concentrado de fosfato con Tween-20
1 vial,
58 ml
SOLN CONC
STOP
1 vial,
8 ml
Tampón de ácido cítrico con 0,03% H2O2.
Solución de Parada
(8)
1 placa
CONC
Tampón del
Sustrato
(6)
(7)
Descripción
SOLN
1N ácido sulfúrico
1 vial,
12 ml
OTROS MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS
ITEMS Componentes
Micropipetas y puntas de 50µl y 100 µl
(1)
(2)
Incubadora o baño maría con control de temperatura a +37 °C.
(3)
Equipo para lavado de placas.
Lector de microplacas ELISA:
Longitud de onda dual 450nm con longitud de onda de referencia de 620-690nm, ancho de
banda 10nm*1.
(4)
(5)
Un analizador EIA de microplacas totalmente automático es opcional. El usuario debe
validar el equipo en conjunto con el kit.
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
PI Numero : 1701153
Revisión Nr : 110627/1
4.1) CONDICIONES DE ALMACENAJE Y ESTABILIDAD DEL KIT Y SUS COMPONENTES*
Kit/componentes
Condición de
almacenaje
HBsAg ELISA kit
+2 to +8°C
Control positivo HBsAg
+2 to +8°C
Control Negativo HB
+2 to +8°C
Placa Anti-HBs
+2 to +8°C
Solución Conjugado Anti-HBs‧
HRPO
+2 to +8°C
Solución de Lavado Concentrada (20x)
Temp ambiente
Solución de Lavado Diluida 20x
Temp ambiente
+2 to +8°C
TMB cromogénico concentrado
+2 to +8°C
Tampón del sustrato
+2 to +8°C
Mezcla de Solución de Sustrato TMB
Temp ambiente
1N ácido sulfúrico
Temp ambiente
Estado
Original
Una vez abierto
Original
Una vez abierto
Original
Una vez abierto
Original
Una vez abierto
Original
Una vez abierto
Original
Una vez abierto
Diluido
Diluido
Original
Una vez abierto
Original
Una vez abierto
Mezcla
Original
Una vez abierto
Estabilidad
18 meses
1 mes
18 meses
1 mes
18 meses
1 mes
24 meses
1 mes
18 meses
1 mes
24 meses
1 mes
2 dias
1 semana
24 meses
1 mes
24 meses
1 mes
6 horas
24 meses
1 mes
5) INSTRUCCIONES DE USO
5.1) Advertencias:
5.1.1) Este kit de reactivos es sólo para uso profesional.
5.1.2) Este kit de reactivos es sólo para uso de diagnóstico in vitro.
5.1.3) Procure que todos los reactivos del kit y las muestras alcancen temperatura ambiente (+20 to +30 °C) y
mézclelos cuidadosamente antes de usar.
5.1.4) No use reactivos después de su fecha de caducidad.
5.1.5) No intercambie reactivos entre lotes diferentes.
5.1.6) No pipetee con la boca.
5.1.7) No fume o coma en zonas donde se manipulan muestras o reactivos.
5.1.8) Todos los componentes y muestras del kit deben considerarse potencialmente peligrosos para la salud Deben
usarse y eliminarse de acuerdo con los procedimientos de seguridad del laboratorio del usuario. Estos
procedimientos de seguridad probablemente incluirán el uso guantes de protección y evitar la generación de
aerosoles.
5.1.9) Las muestras potencialmente infecciosas y derrames o goteos que no contienen ácidos deben ser limpiados
concienzudamente con hipoclorito de sodio al 5% o tratado de acuerdo con las prácticas del laboratorio para el
control de un potencial riesgo biológico.
5.1.10) Antes de eliminar los desechos de las muestras usadas y reactivos del kit como desechos generales, estos deben
ser tratados de acuerdo con el procedimiento local para desecho con potencial riesgo biológico o tratado como
sigue:
Tanto los desechos sólidos como los líquidos deben ser autoclavados a +121 °C por lo menos por 30 minutos.
El desecho sólido también se puede incinerar.
El desecho líquido no ácido puede tratarse con hipoclorito de sodio diluido a una concentración final de 1%.
Los desechos ácidos deben ser neutralizados antes de tratarlos con hipoclorito de sodio como se mencionó
antes y debe mantenerse por 30 minutos para obtener una desinfección efectiva.
5.1.11) La solución de parada es irritante para los ojos, la piel, vías respiratorias y membranas mucosas. Evite el
contacto de la solución de parada con la piel y membranas mucosas. En caso de contacto, lave con copiosa
cantidad de agua inmediatamente. En caso de inhalación, proporcione aire fresco y busque ayuda médica en
caso de molestias.
5.1.12) El TMB cromogénico concentrado contiene un disolvente orgánico, que es inflamable: peligro de efectos
graves irreversibles por inhalación, contacto con la piel o ingestión. El TMB cromogénico concentrado contiene
dimetil sulfóxido, un irritante para la piel y membranas mucosas.
5.1.13) A pesar de que todo el material de origen humano ha resultado no reactivo para anti-VHC y Anti-VIH y ha sido
inactivado a +56 °C por una hora, el reactivo debe manipularse como material potencialmente infeccioso. *7
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
PI Numero : 1701153
Revisión Nr : 110627/1
5.2) Toma de Muestra y Preparación para el Análisis
5.2.1) El paciente no requiere preparación especial antes de la toma de la muestra. La sangre debe ser tomada con
técnicas médicas aprobadas.
5.2.2) Con este kit se puede usar suero o plasma. La muestra de sangre total debe separarse lo antes posible para evitar
hemólisis. Cualquier partícula presente en la muestra (por ej. glóbulos rojos, coágulos de fibrina) deben
removerse antes de usar.
5.2.3) Las muestras deben almacenarse de +2 a +8 °C y evitar inactivación por calor para minimizar el deterioro. Para
almacenar por periodos largos, las muestras se deben congelar por debajo de -20 °C. No se recomienda
almacenarlas en congeladores que se auto descongelan.
5.2.4) Las muestras congeladas deben ser descongelados completamente y mezcladas en forma homogénea antes del
ensayo.
5.2.5) Evite congelar y descongelar en forma sucesiva
5.2.6) ADVERTENCIA
1. La muestra no debe contener compuestos de azida que puedan inhibir la actividad de la peroxidasa en el
conjugado.
2. Muestras de suero coaguladas y muestras con contaminación bacteriana no deben ser usadas
5.3) Almacenaje y estabilidad de los componentes
5.3.1) El kit debe almacenarse entre + 2 y +8 °C. No congelar.
5.3.2) Las tiras de las placas debes usarse dentro de 2 meses después de abrir la bolsa original de aluminio. Las tiras no
usadas deben permanecer en la bolsa de aluminio firmemente sellada.
5.3.3) Almacene los reactivos nuevamente entre +2 y +8 °C inmediatamente después de su uso.
5.3.4) El concentrado (x20) de la solución de lavado es almacenado y transportado entre +2 y +8 °C, lo que puede
causar cristalización. Si hay precipitado de cristales antes del uso, caliente la solución en un baño maría a +37 °C
hasta que los cristales se disuelvan.
5.4) Procedimiento de lavado de placas
5.4.1) Preparación de la solución de lavado:
Diluya la solución de Lavado (x20) con agua destilada o desionizada a una dilución de 1:20. No use agua del
grifo.
5.4.2) Lavado de las placas:
(a) Para un lavador de placas con función de aspiración de desborde: 6 ciclos de por lo menos 0,5 ml de tampón
de lavado por pocillo, por ciclo
o
(b) Para un lavador sin la función de aspiración de desborde: 8 ciclos de por lo menos 0,35ml de tampón de
lavado por pocillo, por ciclo.
5.4.3) Seque invirtiendo la placa sobre un papel absorbente y golpeándola enérgicamente. Si queda demasiado
tampón de lavado residual, podría causar resultados falsos.
¡ADVERTENCIA!
Un lavado inadecuado causará resultados falsos.
5.5) Procedimiento del Ensayo
5.5.1) Asegúrese de que todos los reactivos y muestras alcancen temperatura ambiente (+20 a +30 °C) antes del
ensayo. Ajuste el baño maría o incubadora a +37±1 °C.
5.5.2) Reserve un pocillo para el blanco. Agregue 50µl de cada control o muestra a los pocillos correspondientes en la
placa donde ocurrirá la reacción (3 Controles Negativos y 2 Controles Positivos).
5.5.3)
NOTA:
a) Use una punta nueva de pipeta para cada muestra para evitar contaminación cruzada
b) Cada placa necesita sus propios controles negativos, positivos y pocillos blancos.
c) No use el valor de corte establecido para otras placas de HBsAg Elisa..
Agregue 50 μl de solución de anti-HBs· Peroxidasa a cada pocillo excepto a el blanco.
NOTA: No toque la pared del pocillo para evitar contaminación.
5.5.4)
Golpee la placa suavemente.
5.5.5) Retire el dorso protector de la cubierta autoadhesiva y presiónela sobre la placa de modo que quede sellada
firmemente.
5.5.6) Incube la placa a +37±1°C en baño maría o una incubadora por 80 minutos.
.
5.5.7)
Al finalizar el periodo de incubación retire y elimine la cubierta autoadhesiva y lave la placa siguiendo
“5.4. PROCEDIMIENTO DE LAVADO DE PLACAS”.
5.5.8)
Seleccione uno de los dos métodos siguientes para desarrollar el color:
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
PI Numero : 1701153
Revisión Nr : 110627/1
A.
Mezcle volúmenes iguales de TMB cromogénico concentrado y Tampón de sustrato en un recipiente
limpio
inmediatamente antes de usar.
Agregue 100 µl de la solución de la mezcla a cada pocillo
incluyendo el pocillo blanco.
B. Agregue primero 50 µl de TMB cromogénico concentrado y luego agregue 50 µl de Tampón del sustrato
a cada pocillo incluyendo el blanco. Mezcle suavemente.
NOTA: El TMB cromógencio concentrado debe ser entre incoloro y celeste; de otro modo debe ser eliminado.
La mezcla de TMB cromogénico concentrado con tampón del sustrato debe usarse dentro de 30 minutos
a partir del momento de la mezcla. La mezcla debe protegerse de la luz intensa.
5.5.9) Cubra la placa con la cubierta negra e incube a temperatura ambiente por 30 minutos.
5.5.10) Detenga la reacción agregando 100 µl de solución de parada en cada pocillo incluyendo el blanco.
5.5.11) Determine la absorbancia de los controles y muestras dentro de 30 minutos con un fotómetro de precisión a
450 / 620-690 nm (Longitud de onda de 450 nm para la lectura con 620-690 nm de longitud de onda de
referencia)*2. Use el blanco para blanquear el fotómetro.
NOTA:
El color del blanco debe ser de incoloro a amarillento pálido; de otro modo el ensayo es inválido. En este caso el
ensayo debe
ser repetido.
Blanco Sustrato: la absorbancia debe ser menor de 0,100.
5.6) Calculo de los resultados del ensayo
5.6.1) Cálculo de la CN (Absorbancia promedio del Control Negativo).
Ejemplo:
Muestra No.
Absorbancia
1
0.022
2
0.025
3
0.023
CN = (0.022 + 0.025 + 0.023) / 3 = 0.023
CNx debe ser ≦0.1de otro modo el ensayo es inválido.
5.6.2) Cálculo de CP (Absorbancia Promedio del Control Positivo)
Ejemplo:
Muestra No.
Absorbancia
1
1.432
2
1.508
CP = (1.432 + 1.508) / 2 = 1.470
CPx debe ser ≧0.6de otro modo el ensayo es inválido.
5.6.3) Calculo del Valor P - N
P - N = PC – NC
Ejemplo NC = 0.024
PC = 1.470
P - N = 1.470 - 0.024 = 1.446
El valor P - N debe ser ≧0.5de otro modo el ensayo es inválido.
5.6.4) Cálculo del Valor de Corte
Valor de Corte = NC + 0.025
Ejemplo:
Valor de corte = 0.023 + 0.025 = 0.048
5.7) Validez de los Ensayos
5.7.1) CN debe ser ≦0.1de otro modo el ensayo es inválido.
5.7.2) CP debe ser ≧0.6de otro modo el ensayo es inválido.
5.7.3) Valor de P-N debe ser ≧0.5de otro modo el ensayo es inválido.
NOTA: Control Negativo: la absorbancia debe ser menor o igual a 0,100 después de restar el blanco.
5.8) Interpretación de los Resultados
5.8.1) Las muestras con absorbancias MENORES que el Valor de Corte son NO REACTIVAS y se consideran
NEGATIVAS para HBsAg.
5.8.2) Las muestras con absorbancias MAYORES o IGUALES al Valor del Corte se consideran INICIALMENTE
REACTIVAS. Las muestras originales deben ser repetidas en duplicado.
5.8.3) Si ambos valores de absorbancia al repetir son menores que el valor de corte, las muestras se consideran
NEGATIVAS para HBsAg.
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
PI Numero : 1701153
Revisión Nr : 110627/1
Si al repetir al menos uno de los dos valores de absorbancia es MAYOR o IGUAL al Valor del Corte entonces
la muestra se considera como un HBsAg positivo repetido. La muestra positiva repetida debe ser confirmada
con reactivos de confirmación validados.
5.9) Solución de Problemas
Si el resultando no puede ser reproducido, una solución preliminar podría obtenerse revisando las posibilidades
mencionadas a continuación:
5.9.1) Procedimiento de lavado inadecuado.
5.9.2) Muestra contaminada con positivo.
5.9.3) Volumen de muestra, conjugado o sustrato equivocado.
5.9.4) Contaminación del borde del pocillo con conjugado.
5.9.5) Muestra inadecuada, p.ej. suero o plasma hemolizados, muestra con precipitado, muestra no suficientemente
mezclada antes del uso.
5.9.6) Tiempo o temperatura de incubación equivocados.
5.9.7) Cabeza y agujas de la lavadora para dispensar/aspirar total o parcialmente obstruidas.
5.9.8) Aspiración insuficiente.
5.10)
Limitaciones e Interferencias
5.10.1) Este kit de reactivos es para ser usado con muestras de suero o plasma humano individual.
5.10.2) El kit no ha sido validado par uso con muestras de cadáver.
5.10.3) Un resultado negativo para HBsAg sin otra evidencia no debe ser usado para excluir una infección por VHB.
5.10.4) Sustancias que podrían interferir:
Los siguientes resultados se obtuvieron en los respectivos experimentos:
1. No se ha observado interferencia con diferentes anticoagulantes tales como heparina con litio, K-EDTA, citrato
de sodio.
2. Muestras que han sido tratadas con calor (+60°C, 10 horas) resultaron con títulos de HBsAg disminuidos.
3. No se detectó reacción cruzada al usar muestras de pacientes con a) otras infecciones VHA, VEB, CMV, VHS,
VZV, Borreliosis de Lyme, VHC, VHI, b) con otras enfermedades tales como insuficiencia renal crónica,
hemodiálisis, hepatitis autoinmune, cirrosis hepática y c) con algunos anticuerpos tales como HAMA , GAD, IA2,
APS).
4. Las muestras que contienen substancias que podrían interferir [P. ej. Triglicéridos (lipemia), hemoglobina
(hemolisis) bilirrubina (ictericia) componentes de la inmunoglobulina monoclonal, niveles altos de anticuerpos
autoinmunes (factor reumatoide-FR, anticuerpos anti nucleares-ANA, o anticuerpos anti mitocondria-AMA)] y
muestras de mujeres embarazadas, no interfirieron con el ensayo HBsAg ELISA.
5.11)
Características del Ensayo
5.11.1) Especificidad Diagnostica
Resultados de la Evaluación Europea del Desempeño del HBsAg ELISA de DIAsource – La Reacividad del
“Donante” Negativo para VHB y Muestras “Clínicas”.
No. Total de muestras
N
DIAsource HBsAg Elisa
Neg *IR **RR Confirmado Falso Positivo
VHB negativo
213 211 2 2
0
(muestra clínica)
VHB negativo
5501 5479 22 22
0
(muestra de donante)
Total
5714 5690 24 24
0
*IR: inicialmente reactivo **RR: reactivo repetido
Especificidad diagnóstica = 5690/5714 = 99.58%
2
22
24
5.11.2) Sensibilidad Diagnóstica
1. La sensibilidad diagnóstica determinada en evaluaciones Europeas de desempeño produjeron los siguientes
resultados:
Muestra
No. de muestras
Suero HBsAg positivo
400
Sensibilidad diagnóstica = 400/400 = 100%
Reactivas
400
Sensibilidad
100%
2. La evaluación del Panel de Sensibilidad para HBsAg (BBI, USA) produjo los siguientes resultados:
Panel
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
No. De miembros del
PI Numero : 1701153
Resultados
Revisión Nr : 110627/1
panel
Panel de Sensibilidad para HBsAg
BBI PHA807
PHA807-01~21
Equivalente a o mejor que la
competencia
3. La evaluación del Panel de Desempeño con una Variedad de Títulos para HBsAg, PHA205 (BBI, USA) produjo
los siguientes resultados:
Panel
Panel de Desempeño con una
Variedad de Títulos para HBsAg
BBI PHA205
No. De miembros del
panel
PHA205-01~25
Resultados
Equivalente a o mejor que la
competencia
4. La evaluación del Panel de Desempeño con una Variedad de Títulos para HBsAg, VHA601 (BBI, USA) produjo
los siguientes resultados:
Panel
No. De miembros del
panel
Panel de Desempeño con una Variedad de
Títulos para HBsAg, BBI VHA601
VHA601-01~06
Resultados
Alcanzó los resultados
esperados por BBI.
5. La evaluación del Panel de Desempeño con una Variedad de Títulos para HBsAg, QHA711 (BBI, USA) produjo
los siguientes resultados:
Panel
No. De miembros del
panel
Panel de Desempeño con una Variedad de
Títulos para HBsAg, BBI QHA711
QHA711-01~06
Resultados
Alcanzó los resultados
esperados por BBI.
6. Resultado del Panel INTS de Subtipos de HBsAg:
El resultado de la evaluación demuestra que todos los serotipos conocidos de HBsAg (subtipos de HBsAg)
disponibles en el panel INTS de subtipos de HBsAg pueden ser detectados tanto por e Elisa HBsAg como por el
ensayo de referencia hasta las diluciones 104x ~ 106x .
7. Tabla de resumen de la evaluación de todos los paneles de seroconversión:
Resultados HBsAg Positivos Desde la Fecha de la Primera Toma de
Muestra
Diferencia en
Ensayo HBsAg
Diferencia en días número de tomas
Elisa
HBsAg
de referencia
de toma de muestra de muestra(No.
ID Panel
(B en días)
De miembro del
(A en días)
(A-B)
panel)
PHM907(ay)
50
50
0
0
PHM916(ay)
62
65
-3
-1
PHM920(ad)
26
26
0
0
PHM921(ad)
0
0
0
0
PHM930(ad)
3
3
0
0
PHM933(ad)
7
9
-2
-1
PHM934(ad)
0
0
0
0
PHM935A (ad)
9
21
-12
-3
PHM935B (ad)
231
217
14
-1
NabiSB0411
6
6
0
0
PHM903(ad)
6
10
-4
-1
PHM904(ad)
7
18
-11
-1
PHM906(ad)
137
0
137
1
PHM909(ad)
9
9
0
0
PHM910(ad)
35
18
17
1
PHM912(ad)
42
0
42
7
PHM914(ad)
0
146
-146
-1
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
PI Numero : 1701153
Revisión Nr : 110627/1
PHM915(ind)
PHM917(ind)
PHM918 (ad)
PHM923 (ay)
PHM924 (ad)
PHM925(ind)
PHM926(ind)
PHM927(ind)
PHM928 (ad)
PHM929 (ad)
PHM931(ind)
PHM932 (ad)
PHM935A (ad)
General
12
36
7
15
29
8
13
4
9
14
19
61
21
-----
28
>43
7
21
35
14
15
7
9
18
21
61
28
----Promedio
-16
->7
0
-6
6
-6
-2
-3
0
-2
-2
0
-7
Sum = -13
-13/30 = 0,4 días
-5
->2
0
-1
1
-1
-1
-1
0
-1
-1
0
-2
---------
Resumen de la evaluación se todos los paneles de seroconversión usados:
Los resultados han demostrado que Elisa HBsAg es casi equivalente al ensayo de referencia. En promedio el
ensayo Elisa HBsAg está solo 0,4 días más atrás en los 30 paneles de seroconversión usados en comparación con
el ensayo de referencia.
5.11.3) Mutantes
1. Panel de mutantes
Se examinó un panel mutante prenuclear de hepatitis B de Teragenix, EE.UU. HBsAg Elisa puede detectar los
resultados si la relación de la dilución del panel es 1:2 o 1:5.
Este panel consiste de 3 muestras de promotor del núcleo basal (A1762/G1764) tipo silvestre; Infección tipo
silvestre, mutante precursor nuclear codón 28, de 4 muestras de promotor del núcleo basal (A1762/G1764) tipo
silvestre; Mutante precursor nuclear codón 28, de 2 muestras de promotor del núcleo basal (T1762/A1754) infección
mixta tipo silvestre MUTANTE (A1762/G1754).
2. Muestras mutantes
La tasa de detección de HBsAg Elisa es de 17/21 que es mejor que la del kit de referencia (14/21).
Mutación
113A114
P120L
R122I
R122T
E122I
T123N
122RA123
C124R
T131I
T131P
Y134S
Tasa
de
detección
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
Int
positivo
positivo
negativo
positivo
positivo
positivo
negativo
negativo
positivo
positivo
positivo
Kit de
referencia
Int
positivo
positivo
negativo
positivo
positivo
positivo
negativo
negativo
positivo
positivo
positivo
8/11
8/11
HBsAg Elisa
Mutación
HBsAg Elisa
C137W
C139Y
K141E
P142L/G145R
P142L
D144G
G145K
C147T/C148T
E164D
S174N
Int
positivo
positivo
positivo
negativo
positivo
positivo
positivo
positivo
positivo
positivo
Kit de
referencia
Int
negativo
positivo
positivo
negativo
positivo
negativo
negativo
positivo
positivo
positivo
9/10
6/11
Tasa
detección
PI Numero : 1701153
de
Revisión Nr : 110627/1
5.11.4) 25 muestras frescas tomadas el mismo día
HBsAg Elisa detectó 25 muestras frescas tomadas el mismo día. Se cumplieron los preceptos del capítulo 3.1.9 del
2009/886/EC.
5.11.5) Sensibilidad analítica
Material estándar
※
2o Estándar Internacional WHO
Estándar PEI subtipo ad
Estándar PEI subtipo ay
※
Sensibilidad calculada
0,03 IU/mL
0,08 PEI U/mL
0,09 PEI U/mL
2o Estándar Internacional WHO para HBsAg, subtipo adw2, genotipo A, código NIBSC: 00/588
5.11.6) Precisión
1) Repetibilidad intra-ensayo
La precisión intra-ensayo se determinó usando una muestra de control positivo y dos sueros de pacientes con
distinta concentración de HBsAg (levemente por sobre el nivel de corte y a nivel medio) las que fueron analizadas
en 20 repeticiones en un ensayo único por 3 días.
Desviación
Coeficiente de
Ensayo ID de muestra Promedio
Estándar
Variación
1
PC 1 :32
0.7541
0.0857
11.36
1
PS 1 :32
2.2766
0.1571
6.90
1
PS 1 :64
1.3159
0.1168
8.88
2
PC 1 :32
0.9671
0.0358
3.70
2
PS 1 :32
2.7325
0.1025
3.75
2
PS 1 :64
1.5822
0.0888
5.61
3
PC 1 :32
0.9669
0.0909
9.40
3
PS 1 :32
2.6088
0.2367
9.07
3
PS 1 :64
1.6502
0.1499
9.08
El CV calculado varió entre 3,7% y 11,36 %. (= valor aceptable para un inmunoensayo que utiliza microplacas).
2) Reproducibilidad entre ensayos
Los experimentos de evaluación de la precisión se realizaron durante 10 días hábiles usando cinco muestras de
suero (con niveles de HBsAg positivos limítrofes y claramente sobre el valor de corte).
ID de
Desviación
Coeficiente de
N
Promedio
muestra
Estándar
Variación
F1
10
0.0609
0.0185
30.41
F2
10
0.0770
0.0189
24.56
F3
10
0.1000
0.0245
24.51
F4
10
0.1786
0.0462
25.87
F5
10
0.6107
0.1412
23.12
Los CV calculados varían entre 30,4% para una muestra HBsAg negativa y 23,1 % para una muestra HBsAg
positiva débil (= valores aceptables para la imprecisión entre ensayos de un inmunoensayo que utiliza microplacas).
5.11.7) Exceso de Anticuerpo/Dosis alta Efecto de Gancho
Esto se llevó a cabo con una muestra de suero con una concentración muy alta de HBsAg de 125 mg/L en
diluciones seriadas con el ensayo HBsAg ELISA de DIAsource. No se observó el efecto gancho por dosis alta.
5.11.8) Seguimiento
El Calibrador Maestro HBsAg de DIAsource ha sido calibrado con el British Working Standard para HBsAg
(Código NIBSC: 01/476-006) usando el ensayo HBsAg ELISA. La potencia relativa (razón) del British Working
Standard para HBsAg versus el Calibrador Maestro HBsAg de DIAsource es 4,081 (3,853-4,325 Intervalo de
Confianza 95%). La concentración del control positivo del ensayo HBsAg ELISA se ha determinado contra el
Calibrador Maestro HBsAg de DIAsource y fue establecida en 42 IU/ml ± 20%.
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
PI Numero : 1701153
Revisión Nr : 110627/1
5.12) Diagrama de Flujo del Procedimiento del Ensayo
Agregue 50 µl de controles (3 x CN, 2 x CP) y
Agregue 50 µl de cada muestra en los pocillos.
Reserve 1 pocillo para blanco.
↓
Agregue 50 μl de Solución de anti-HBs
Peroxidasa en cada pocillo, excepto el blanco.
↓
Incube a +37 ±1 °C por 80 minutos
↓
Lave la placa.
(Escoja uno de los dos métodos siguientes para general el color)
↙
Mezcle volúmenes
iguales de TMB
cromogénico
concentrado y tampón
de sustrato. Agregue
100 µl de la solución
↘
↘
Agregue 50 µl de TMB
cromogénico
concentrado a los
pocillos y y luego
agregue 50 µl de
Tampón de Sustrato.
Mezcle bien,
↙
Incube a temperatura ambiente por 30 minutos.
↓
Agregue 1N ácido sulfúrico a cada pocillo
↓
Determine la absorbancia usando 450 nm como
longitud de onda para la lectura con un
longitud de onda de referencia de 620-690nm*1
6) NOTAS
*1 La longitud de onda de referencia del espectrofotómetro puede ser de 620nm a 690nm. Sin embargo el usuario debe
validar el foto metro en conjunto con este kit antes de su uso.
*2 Inactivación incompleta del virus de la hepatitis B después de tratamiento con calor a +60°C por 10 horas, J. Infect. Dis.
138:242-244.
7) BIBLIOGRAFIA
1. Blumberg BS, Alter HJ, Visnich S. A „new“ antigen in leukemia sera. JAMA, 1965;191:101- 106.
2. Dane DS, Cameron CH, Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated
hepatitis. Lancet 1970; 1: 695 - 698.
3. Aach RD, Grisham JW, Paker CW. Detection of Australia antigen by radioimmunoassay. Proc Natl Acad Sci. USA
1971;68:1056-1060.
4. Kim CY, Tikes JG. Purification and biophysical characterization of hepatitis antigen. J Clin Invest. 1973; 52:11761186.
5. Wolters G. Kuijpers LP, Kacaki J, Schuurs AH, Enzyme linked immunosorbent assay for hepatitis B surface antigen.
J Infect. Dis 1977;136:Suppl 311-377.
6. Shih JW, Cote PJ Jr, Dapolito GM, Gerin JL. Production of monoclonal antibodies against hepatitis B surface antigen
(HBsAg)by somatic cell hybrids. J Virol Methods. 1980;1:257-273.
7. Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM. Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis.
1991;11:73-83
Fecha de revisión: 2011-06-27
Catalogo Nr: KAPG4SGE3
PI Numero : 1701153
Revisión Nr : 110627/1
P.I. Number : 1701000
Used symbols
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Storage temperature
Use by
Batch code
Catalogue number
Control
In vitro diagnostic medical device
Manufacturer
Contains sufficient for <n> tests
WASH
SOLN
CAL
0
CAL
N
CONTROL
CONC
Wash solution concentrated
Zero calibrator
Calibrator #
N
Control #
Tracer
Ag
125I
Ab
125I
Ag
125I
CONC
Tracer concentrated
Ab
125I
CONC
Tracer concentrated
INC
BUF
Tracer
Tubes
Incubation buffer
Acetonitrile
ACETONITRILE
Serum
SERUM
DIL
SPE
Specimen diluent
DIL
BUF
Dilution buffer
ANTISERUM
Antiserum
IMMUNOADSORBENT
Immunoadsorbent
DIL
CAL
Calibrator diluent
REC
SOLN
Reconstitution solution
Polyethylene glycol
PEG
EXTR
SOLN
Extraction solution
ELU
SOLN
Elution solution
Bond Elut Silica cartridges
GEL
PRE
Pre-treatment solution
SOLN
NEUTR
Neutralization solution
SOLN
TRACEUR
Tracer buffer
BUF
Microtiterplate
HRP Conjugate
Ab
HRP
Ag
HRP
Ab
HRP
CONC
HRP Conjugate concentrate
Ag
HRP
CONC
HRP Conjugate concentrate
CONJ
BUF
CHROM
TMB
CHROM
TMB
HRP Conjugate
Conjugate buffer
CONC
Chromogenic TMB concentrate
Chromogenic TMB solution
Substrate buffer
SUB
BUF
STOP
SOLN
Stop solution
INC
SER
Incubation serum
Buffer
BUF
Ab
AP
SUB
PNPP
BIOT
PREC
CONJ
AP Conjugate
Substrate PNPP
CONC
AVID
HRP
Biotin conjugate concentrate
Precipitating Agent
AGENT
CONC
Avidine HRP concentrate
ASS
BUF
Assay buffer
Ab
BIOT
Biotin conjugate
Specific Antibody
Ab
SAV
HRP
CONC
2nd Ab
ACID
Streptavidin HRP concentrate
Non-specific binding
NSB
2nd Antibody
Acidification Buffer
BUF
Distributor
DIST
Incubation trays
TRAY
PMSF solution
PMSF
Protect from light
Dot Strip
STRIP
Substrate
SUB
EXTR
SOLN
HRP
Streptavidin HRP
Pipette
PIPETTE
WASH
Extraction Buffer Concentrate
Cartridge
CART
SAV
CONC
SOLN
Wash buffer
Revision nr 140723
P.I. Number : 1701000
Revision nr 140723
Symboles utilisés
Consulter les instructions d’utilisation
Température de conservation
Utiliser jusque
Numéro de lot
Référence de catalogue
Contrôle
Dispositif médical de diagnostic in vitro
Fabricant
Contenu suffisant pour <n> tests
WASH
CAL
SOLN
0
CONC
CAL
Calibrateur #
N
CONTROL
Solution de lavage concentrée
Calibrateur zéro
0
N
Contrôle #
Traceur
Ag
125I
Ab
125I
Ag
125I
CONC
Traceur concentré
Ab
125I
CONC
Traceur concentré
INC
BUF
Traceur
Tubes
Tampon d'incubation
Acétonitrile
ACETONITRILE
Sérum
SERUM
DIL
SPE
Diluant du spécimen
DIL
BUF
Tampon de dilution
ANTISERUM
Antisérum
IMMUNOADSORBENT
Immunoadsorbant
DIL
CAL
Diluant de calibrateur
REC
SOLN
Solution de reconstitution
Glycol Polyéthylène
PEG
EXTR
SOLN
Solution d’extraction
ELU
SOLN
Solution d’elution
Cartouches Bond Elut Silica
GEL
PRE
Solution de pré-traitement
SOLN
NEUTR
Solution de neutralisation
SOLN
TRACEUR
Tampon traceur
BUF
Microplaque de titration
HRP Conjugué
Ab
HRP
Ag
HRP
Ab
HRP
CONC
HRP Conjugué concentré
Ag
HRP
CONC
HRP Conjugué concentré
CONJ
BUF
CHROM
TMB
CHROM
TMB
HRP Conjugué
Tampon conjugué
CONC
Chromogène TMB concentré
Solution chromogène TMB
Tampon substrat
SUB
BUF
STOP
SOLN
Solution d’arrêt
INC
SER
Sérum d'incubation
Tampon
BUF
Ab
AP
SUB
PNPP
BIOT
PREC
CONJ
AP Conjugué
Tampon PNPP
CONC
AVID
HRP
Biotine conjugué concentré
Agent de précipitation
AGENT
CONC
Avidine HRP concentré
ASS
BUF
Tampon de test
Ab
BIOT
Biotine conjugué
Anticorps spécifique
Ab
SAV
HRP
CONC
Concentré streptavidine HRP
Liant non spécifique
NSB
Second anticorps
2nd Ab
ACID
Tampon d'acidification
BUF
Distributeur
DIST
Plaque d'incubation
TRAY
Solution PMSF
PMSF
Conserver à l'abri de la lumière
Bandelette de dots
STRIP
Substrat
SUB
EXTR
SOLN
CONC
Tampon d'extraction concentré
Cartouche
CART
SAV
HRP
Streptavidine-peroxydase de raifort
PIPETTE
PIPETTE
Pipette
WASH
Tampon de lavage
SOLN
P.I. Number : 1701000
Revision nr 140723
Símbolos utilisados
Consultar las instrucciones de uso
Limitación de temperatura
Fecha de caducidad
Codigo de lote
Número de catálogo
Control
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Fabricante
Contenido suficiente para <n> ensayos
WASH
CAL
SOLN
0
CONC
CAL
Calibrador #
N
CONTROL
Solución de lavado concentrada
Calibrador cero
0
N
Control #
Trazador
Ag
125I
Ab
125I
Ag
125I
CONC
Trazador concentrada
Ab
125I
CONC
Trazador concentrada
INC
BUF
Trazador
Tubos
Tampón de incubación
Acetonitrilo
ACETONITRILE
Suero
SERUM
DIL
SPE
Diluyente de Muestra
DIL
BUF
Tampón de dilución
ANTISERUM
Antisuero
IMMUNOADSORBENT
Inmunoadsorbente
DIL
CAL
Diluyente de calibrador
REC
SOLN
Solución de Reconstitución
Glicol Polietileno
PEG
EXTR
SOLN
Solución de extracción
ELU
SOLN
Solución de elución
Cartuchos Bond Elut Silica
GEL
PRE
Solución de Pre-tratamiento
SOLN
NEUTR
Solución de Neutralización
SOLN
TRACEUR
Tampón de trazador
BUF
Placa de microvaloración
HRP Conjugado
Ab
HRP
Ag
HRP
Ab
HRP
CONC
HRP Conjugado concentrada
Ag
HRP
CONC
HRP Conjugado concentrada
CONJ
BUF
CHROM
TMB
CHROM
TMB
HRP Conjugado
Tampón de Conjugado
CONC
Cromógena TMB concentrada
Solución Cromógena TMB
SUB
BUF
Tampón de sustrato
STOP
SOLN
Solución de Parada
INC
SER
Suero de Incubación
Tampón
BUF
Ab
AP
SUB
PNPP
BIOT
PREC
CONJ
AP Conjugado
Sustrato PNPP
CONC
AVID
HRP
Concentrado de conjugado de biotina
Agente de precipitación
AGENT
CONC
Concentrado avidina-HRP
ASS
BUF
Tampón de ensayo
Ab
BIOT
Conjugado de biotina
Anticuerpo específico
Ab
SAV
HRP
CONC
Segundo anticuerpo
2nd Ab
ACID
Estreptavidina-HRP Concentrado
Unión no específica
NSB
Tampón de Acidificación
BUF
Distribuidor
DIST
Bandejas de incubación
TRAY
Solución de PMSF
PMSF
Proteger de la luz
Tries Dot
STRIP
Sustrato
SUB
EXTR
SOLN
HRP
Estreptavidina HRP
Pipeta
PIPETTE
WASH
Concentrado de tampón de extracción
Cartucho
CART
SAV
CONC
SOLN
Tampón de lavado
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