DIAsource 4.0 Anti-HCV Elisa User manual

Below you will find brief information for Anti-HCV Elisa 4.0. The Anti-HCV Elisa V 4.0 is a forth generation enzyme immunoassay diagnostic kit for in-vitro qualitative detection of Antibody to Hepatitis C virus (anti-HCV) in human serum or plasma. The HCV Ag•HRPO Conjugate is added to the well and results in the formation of (HCV) • (Anti-HCV) • (HCV Ag•HRPO) complex.

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Anti-HCV Elisa

4.0

KAPG4NAE3

DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue du Bosquet, 2 - B-1348 Louvain-la-Neuve - Belgium

: 110711/3

Anti-HCV Elisa V 4.0.

For in-vitro qualitative detection of Antibody to Hepatitis C virus (anti-

HCV) in human serum or plasma

KAPG4NAE3

IN VITRO DIAGNOSTIC USE

DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium Tel: +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90

1) INTENDED USE

Anti-HCV Elisa V 4.0 is a forth generation enzyme immunoassay diagnostic kit for in-vitro qualitative detection of Antibody to Hepatitis C virus

(anti-HCV) in human serum or plasma.

2) DESIGN THEORY/ BRIEF DESCRIPTION OF THE PRODUCT

Anti-HCV Elisa V 4.0 adopts the "direct sandwich principle" as the basis for the assay to detect antibodies to Hepatitis C virus (anti-HCV). It is a forth generation enzyme immunoassay kit, which uses recombinant HCV antigens (Core, NS3 and NS5 antigens) for the detection of Antibody to Hepatitis C virus (anti-HCV) in human serum or plasma.

*1-3

These antigens, which are reactive with the predominant antibodies of HCV, constitute the solid phase antigenic absorbent. When human serum or plasma is added to the well, the HCV antigens and Anti-HCV will form complexes on the wells if Anti-HCV is present in the specimen. The wells are washed to remove the unbound materials. The diluted HCV

Ag•HRPO Conjugate is added to the well and results in the formation of (HCV) • (Anti-HCV) • (HCV Ag•HRPO) complex. After washing out the unbound conjugate, TMB substrate solution is added for color development. The intensity of color development is proportional to the amount of antibodies present in the specimen. The reaction processes are summarized as follows:

A. Specimen (containing Anti-HCV):

1. Plate (HCV Antigens) + Specimen (containing Anti-HCV) → plate (HCV Antigen)•Anti-HCV

2. Wash to remove the unbound materials.

3. Plate (HCV Antigen) •Anti-HCV + HCV Ag•HRPO → Plate (HCV Antigen)•Anti-HCV•HCV Ag•HRPO complex

4. Wash to remove the unbound materials.

5. Plate (HCV Antigen) •Anti-HCV•HCV Ag•HRPO complex + TMB Solution → light blue to blue color

6. Light blue to blue color + Stop Solution → light yellow to yellow color, measured at 450nm with a selected reference wavelength within 620 to 690nm

B. Specimen (without human Anti-HCV):

1. Plate (HCV Antigens) + Specimen (without Anti-HCV) → plate (HCV Antigen)

2. Wash to remove the unbound materials.

3. Plate (HCV Antigen) + HCV Ag

•HRPO → plate (HCV Antigen)------ No complex will form

4. Wash to remove the unbound materials.

5. Plate (HCV Antigen) + TMB Solution (colorless) → colorless

6. colorless + Stop Solution → colorless, measured at 450nm with a selected reference wavelength within 620 to 690nm *4

3) DESCRIPTION OF PROVIDED MATERIALS & PRODUCT CODE SYSTEM

● Item 1 - 7 on the following reagent table should be refrigerated at +2 to +8°C.

Washing Solution D (20X) and Stop Solution can be stored at +2 to +30°C.

ITEMS Components Description

Qt. per

96 tests

(1)

(2)

(3)

(4)

HCV Antigens Plate

Ag HRP CONC

Conc.

HCV Ag•HRPO

Microtiter plate coated with HCV antigens.

Contained HCV Ag •Peroxidase (Horseradish) in buffer with Bovine serum.

Preservatives: 0.005 % Sodium azide and

0.05 % Enzyme stabilizer.

Conjugate

CONTROL H

Anti-HCV Positive

Control

Inactivated human plasma positive for Anti-

HCV. Preservative: 0.099 % Sodium azide.

CONTROL L

Normal human plasma non-reactive for

Antibody to HCV. Preservative: 0.099 %

Hepatitis C Negative Sodium azide.

Control

1 plate

1bottle,

1.8 ml

1 bottle,

2.0 ml

1 bottle,

3.0 ml

Catalogue Nr: KAPG4NAE3 PI number : 1701265 Revision Nr : 110711/1

(5)

(6)

(7)

CONJ BUF

Conjugate Diluent

CHROM TMB CONC

Chromogenic TMB concentrate

PB-buffer with Bovine serum and Tween-20.

Preservatives: 0.005 % Sodium azide and

0.05 % Enzyme stabilizer

3, 3’, 5, 5’-tetramethylbenzidine (TMB) in an organic base.

SUB BUF

Substrate Buffer

Citric acid buffer with Urea Hydrogen

Peroxidase

1bottle,

24 ml

1 bottle,

12 ml

1 bottle,

12 ml

WASH SOLN CONC

(8)

Conc. Washing

(9)

Solution D (20X)

STOP SOLN

Stop Solution

Phosphate buffer with Tween-20.

Stop Solution

1 bottle

110 ml

1 bottle

12 ml

● OTHER MATERIALS REQUIRED, BUT NOT PROVIDED

ITEMS Components

(1) 50µl, 100µl and 200µl, 1-ml micropipettes and tips are needed.

(2) Water-bath at 37 +/- 1° or incubator at 37 +/- 1°.

(3) Tubes for specimen dilution.

(4) Plate washing equipment.

(5)

ELISA Microwell Reader:

Dual wavelength 450nm with 620-690nm as reference wavelength

, bandwidth 10nm.

(6) Purified water: distilled or deionized water.

(7)

Fully automatic EIA micro-plate analyzer is optional. User should validate the automatic EIA micro-plate analyzer in combination with the kit.

(8) Adhesive slip

4) INSTRUCTIONS FOR USE

4.1) Warnings

4.1.1) This reagent kit is for professional use only.

4.1.2) This reagent kit is for in vitro diagnosis only.

4.1.3) Bring all kit reagents and samples to room temperature (+20 to +30°C) and mix carefully before use.

4.1.4) Do not use reagent past its expiration date.

4.1.5) Do not interchange reagents between different lots.

4.1.6) Do not put pipette in mouth.

4.1.7) Do not smoke or eat in areas where specimens or reagents are handled.

4.1.8) All kit components and specimens should be regarded as potential hazards to health. It should be used and discarded according to your own laboratory’s safety procedures. Such safety procedures probably will include the wearing of protective gloves and avoiding the generation of aerosols.

4.1.9) Potential infectious specimens and non-acid containing spills or leakages should be wiped up thoroughly with 5% sodium hypochlorite or treated in accordance with your practice for potential bio-hazard control.

4.1.10) Prior to dispose the waste of used specimens and kit reagents as general waste; it should be treated in accordance with your treatment practice of potential bio-hazardous waste or treated as follows:

Both liquid and solid waste should be autoclaved at 121°C for at least 30 minutes.

Solid waste can also be incinerated.

Non-acidic liquid waste can be treated with sodium hypochlorite diluted to a final concentration of 1%.

Acidic liquid wastes must be neutralized before treatment with sodium hypochlorite as mentioned above and should stand for

30 minutes to obtain effective disinfection.

4.1.11) Stop Solution is an irritant to skin, eyes, respiratory tract and mucous membranes. Avoid contact of the Stop Solution with skin and mucous membranes. In case of contact, flush immediately with abundant amounts of water.

In case of inhalation, find fresh air immediately and seek medical advice in case of pain.

4.1.12) Chromogenic TMB concentrate contains organic solvent, which is flammable. Chromogenic TMB concentrate contains dimethyl sulfoxide, an irritant to skin and mucous membranes.

4.1.13) Although all human sourced material are tested free from HBsAg and Anti-HIV and inactivated at 56°C for one hour, the reagent should still be handled as potential infectious material. *

Catalogue Nr: KAPG4NAE3 PI number : 1701265 Revision Nr : 110711/1

4.2) Specimen Collection and Storage

4.2.1) Either serum or plasma can be used with this diagnostic kit. Whole blood specimens should be separated as soon as possible in order to avoid hemolysis. Any particulates (e.g. fibrin clots, erythrocytes) contained in the specimen should be removed prior to use.

4.2.2) Specimens must be stored at +2 to +8°C and avoided heat-inactivation to minimize deterioration. For long-term storage, they should be frozen below -20°C. Storage in self-defrosting freezer is not recommended.

4.2.3) Frozen specimens must be thoroughly thawed and mixed homogenously before test.

4.2.4) Avoid multiple freeze-thaw procedures.

4.2.5) Incompletely coagulated sera and microbial-contaminated specimens should not be used.

4.3) Reagents Storage

4.3.1) The kit must be stored at +2 to +8°C. Do not freeze.

4.3.2) Strips of the plate should be used within one month once the original aluminum foil bag is opened. The unused strips should be kept in the aluminum foil bag and taped the opening tightly.

4.3.3) Return reagents to +2 to +8°C immediately after use.

4.3.4) Washing Solution D (20X) Concentrate can be stored at room temperature to avoid crystallization, because the kits are stored and shipped at +2 to +8°C. If the crystal has been precipitated before use, warm up the solution in 37°C water bath till crystal dissolved.

4.4) Plate Washing Procedure

4.4.1) Preparation of washing solution:

Dilute Washing Solution D (20X) Concentrate with distilled or de-ionized water to 1:20 dilution. Do not use tap water.

4.4.2) Plate washing:

(a) For plate washer with overflow aspirating function: 6 cycles with at least 0.5ml washing buffer per well per cycle.

(b) For plate washer without overflow aspirating function: 8 cycles with at least 0.35ml washing buffer per well per cycle.

4.4.3) Blot dry by inverting the plate and tapping firmly onto absorbent paper. Too much residual wash buffer will cause false results.

WARNING

Improper washing will cause false results.

4.5) Test Procedure

4.5.1) Bring all reagents and specimens to room temperature (+20 to 30°C) before assay. Adjust water bath or incubator to 37 ± 1 °C.

4.5.2) Preparation of Diluted Conjugate

1. Use only clean container to avoid contamination.

2. Prepare diluted conjugate by making 1:

20 dilution of Conc. HCV Ag•HRPO conjugate with conjugate diluent, or following

Conjugate Preparation Chart below. Swirl gently to mix thoroughly and avoid foaming.

3. Excess diluted conjugate solution should be discarded after use.

Conjugate Preparation Chart:

Number of Wells used

Volume of Conjugate Diluent needed (ml)

8 1

72 - 80

Volume of Conc. HCV Ag• HRPO conjugate needed (µl)

100

150

200

250

300

350

400

450

81 - 96 10 500

4.5.3) Reserve one well for blank.

Do not add any specimen or specimen diluent into the well for blank.

4.5.4) Prepare the needed number of wells, including 1 well for Blank, 3 wells for Negative Control, 2 wells for Positive Control, and 1 well for each Specimen.

4.5.5) Sample input:

4.5.5.1) Add 100µl of Positive Control, Negative Control and specimen to each appropriate well of HCV Antigens Plate.

4.5.5.2) Mix well by tapping the plate gently.

NOTE: Use a new pipette tip after each sampling to avoid cross-contamination.

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4.5.6) Seal the Plate with an Adhesive Slip.

4.5.7) Incubate the plate in a 37 + 1 °C water bath or circulative incubator for 60 minutes.

NOTE: Do not stack plates.

4.5.8) At the end of the incubation period, remove carefully the adhesive slip and discard.

4.5.9) Wash the plate according to section §4.4. Plate Washing Procedure.

4.5.10) Add 100µl of the Diluted Conjugate in each well, except the blank.

4.5.11) Seal the plate with an Adhesive Slip.

4.5.12) Incubate the Plate in a 37 + 1 °C water bath or circulative incubator for 30 minutes.

4.5.13) Repeat step 4.5.8) and 4.5.9)

4.5.14) Select one of the following methods for color development:

A. Mix equal volumes of Chromogenic TMB concentrate and Substrate Buffer in a clean container immediately prior to use. Add

100µl of the mixture solution to each well including the blank.

B. Add 50µl of Chromogenic TMB concentrate first, and then add 50µl of Substrate Buffer into each well including the blank.

Carefully mix well.

NOTE: Chromogenic TMB concentrate should be colorless to light blue; otherwise, it should be discarded. The mixture of Chromogenic TMB concentrate and Substrate Buffer should be used within 30 minutes after mix. The mixture should be avoided from intense light.

4.5.15) Seal the plate with an Adhesive Slip and incubate at 37 ± 1°C for 15 minutes.

4.5.16) Stop the reaction by adding 100µl of Stop Solution to each well including the blank.

4.5.17) Determine the absorbance of Controls and test specimens within 15 minutes, measured at 450nm with a selected reference wavelength within 620 to 690nm

Use the blank well to blank the spectrophotometer.

NOTE: The color of the blank should be colorless to light yellowish; otherwise, the test results are invalid. Substrate

blank : absorbance value must be less than 0.100 OD.

4.6) Calculation of Tested Data

4.6.1) Calculation of the NCx (Mean Absorbance of Negative Control).

Example:

Sample No. Absorbance

1 0.045

2 0.060

3 0.051

NCx = (0.045+0.060+0.051) / 3 = 0.052

NCx must be ≤ 0.200, otherwise the test is invalid.

4.6.2) Calculation of PCx (Mean Absorbance of Positive Control)

Example:

Sample No. Absorbance

PCx = (1.510 + 1.826) /2 = 1.668

1.510

1.826

PCx must be ≥ 0.600, otherwise the test is invalid.

4.6.3) Calculation of P-N Value

P-N = PCx - NCx

Example:

P - N = 1.668 – 0.051 = 1.617

P - N Value must be ≥ 0.400, otherwise the test is invalid.

4.6.4) Calculation of the Cutoff Value

Cutoff Value = NCx + 0.100

Example:

Cutoff Value = 0.053+0.100 = 0.153

4.6.5) Calculate the cut-off index of the specimens

Cutoff Index

=Sample OD Value / Cutoff Value

Example:

Sample Value is 0.596

Cutoff Index = 0.596/0.153 = 3.895

4.6.6) Gray Zone: Cut-off index = 1.000 ～ 1.500

4.7) Quality Control of the Test Run

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4.7.1) NCx must be ≤ 0.200, otherwise the test is invalid.

4.7.2) PCx must be ≥ 0.600, otherwise the test is invalid.

4.7.3) P-N Value must be ≥ 0.400, otherwise the test is invalid.

NOTE: Negative Control: absorbance value must be less than or equal to 0.200 after subtracting the blank.

4.8) Result Interpretation

4.8.1) Specimens with CUTOFF INDEX ＜ 1.000 are considered NON-REACTIVE by the criteria of DIAsource’s Anti-HCV Elisa V 4.0.

4.8.2) Specimens with CUTOFF INDEX ≥ 1.000 are considered as initially REACTIVE. They should be RETESTED in duplicate.

If both CUTOFF INDEXES of the duplicate are GREATER than 1.500, the specimen is considered to be repeatedly REACTIVE for Anti-HCV by the criteria of DIAsource ImmunoAssays SA’s Anti-HCV Elisa V 4.0.

Specimens repeatedly reactive in the Anti-HCV Elisa V 4.0 should be further tested by additional, more specific tests.

4.8.3) Initially reactive specimens, of which both CUTOFF INDEXES of the duplicate retest are LESS than 1.000, will be considered

NON-REACTIVE for Anti-HCV.

4.8.4) If one of the two CUTOFF INDEXES of the duplicate is GREATER than 1.000 but LESS than 1.500, the specimen may be interpreted as QUESTIONABLE and this individual should be monitored in follow up samples, or additional more specific tests should be used.

4.8.5) If one of the CUTOFF INDEX of the duplicate is GREATER than 1.500 and the other one is LESS than 1.000, this indicates unusual experimental error. The test should be repeated again.

4.9) Troubleshooting

If the result cannot be reproduced, please do your own preliminary troubleshooting by checking the possibilities listed below:

4.9.1) Improper washing procedure.

4.9.2) Contaminated with positive specimen.

4.9.3) Add wrong volume of sample, conjugate or substrates.

4.9.4) The well rim is contaminated with conjugate.

4.9.5) Improper specimen such as hemolyzed serum or plasma, specimen containing precipitate and specimen not being mixed well before use.

4.9.6) Wrong incubation time or temperature.

4.9.7) Obstructed or partial obstructed washer aspirate/dispense head and needles.

4.9.8) Insufficient aspiration.

4.10) Limitations and Interferences

4.10.1) This reagent kit is to be used for un-pooled human serum or plasma only.

4.10.2) The reagent kit has not been validated for use with cadaveric samples.

4.10.3) Specimens with very low level of Anti-HCV may not consistently repeat positive. In this case, it is recommended to test follow-up samples.

4.10.4) Anti-HCV negative result does not preclude the possibility of infection with HCV.

4.10.5) Non-repeatable false positive results may occur due to non-specific binding of the sample and conjugate to the wall of the well(s).

4.10.6) Potential Interfering Substances: there is no significant influence on Anti-HCV Elisa V 4.0.

4.11) Storage Conditions and Stability

Kit/components Storage condition State Stability

Original 18 months

Anti-HCV Elisa V 4.0 KIT +2 to +8°C

Once open 1 month

Anti-HCV Positive Control +2 to +8°C

Original

Once open

18 months

1 month

Hepatis C Negative Control

HCV Antigens Plate

+2 to +8°C

Original

Once open

Original

Once open

18 months

1 month

18 months

1 month

Conc. HCV Antigen •HRPO

Conjugate Solution

Conc. HCV Antigen •HRPO

Conjugate Solution

Conjugate Diluent

Washing Solution D Concentrate (20X)

+2 to +8°C

Room temp.

+2 to +8°C

Room temp.

Original

Once open

Diluted

Original

Once open

Original

18 months

1 month

6 hours

2 days

18 months

1 month

24 months

Catalogue Nr: KAPG4NAE3 PI number : 1701265 Revision Nr : 110711/1

20X Diluted Washing Solution

Chromogenic TMB concentrate

Substrate Buffer

TMB Substrate Solution Mixture

Stop Solution

Room temp.

+2 to +8°C

Room temp.

Once open

Diluted

Original

Once open

Original

Once open

Mixture

Original

Once open

1 month

2 days

1 week

24 months

1 month

24 months

1 month

6 hours

24 months

1 month

4.12) Performance Characteristics

4.12.1) Analytical Specificity

Potential Interfering Substances: There is no significant influence on Anti-HCV Elisa V 4.0.

Potential Interfering Substances n tests n reactive

Serum with interfering substances in fixed ratios

(Triglycerides, hemoglobin, bilirubin, monoclonal IgG and

IgM, and rheumatoid factor)

Inhibition panels

(EDTA, hemoglobin, triglyceride, bilirubin, and heparin)

Anticoagulant Panels

(Serum, EDTA plasma, heparinized plasma, and citrated plasma)

Total

50 tests

14 negative samples

14 positive samples

25 negative samples

25 positive samples

128 tested samples

39 n non-reactive

4.12.2) Clinical Specificity

Clinical specificity = 5356/5369 = 99.8 %

Potential Interfering Substances

Blood donors

Clinical / hospital specimens

Potentially cross-reacting serum / plasma specimens n tests

5169

200

100 n reactive

Total 5369 13

4.12.3) Analytical Sensitivity

The analytical sensitivity of Anti-HCV Elisa V 4.0 assay is higher than the comparison test. n non-reactive Specificity

5157

199

100

5356

99.77 %

99.5 %

100 %

99.8 %

Analytical Sensitivity PEI Reference Material

Serial Dilution Positive Sample 1

♦

Anti-HCV Elisa V 4.0

■ Reference method

▲ Cutoff

GBC NANBASE C-96 3.1

Ortho HCV 3.0 SAVe

Cut Off

♦

Anti-HCV Elisa V 4.0

■ Reference method

▲ Cutoff

Ortho HCV 3.0 SAVe

Cut Off

5 5

0 2 4 6 8 10

Dilution Steps

12 14 16 18 20

0 2 4 6 8 10

Dilution Steps

12 14 16 18 20

Catalogue Nr: KAPG4NAE3 PI number : 1701265 Revision Nr : 110711/1

Serial Dilution Positive Sample 2

Serial Dilution of the Positive Control

♦

Anti-HCV Elisa V 4.0

■ Reference method

▲ Cutoff

GBC NANBASE C-96 3.1

Reihe2

Reihe3

♦

Anti-HCV Elisa V 4.0

■ Reference method

▲ Cutoff

GBC NANBASE C96 3.1

Cut Off

Ortho HCV 3.0 SAVe

0 2 4 6 8 10

Dilution Steps

12 14 16 18

-5 20

PeliCheck Anti-HCV Reference Panel

10 20 30 40

Dilution Step

50 60 70

♦

Anti-HCV Elisa V 4.0

■ Reference method

▲

Cutoff

0 2 4

Dilution Step

6 8 10

4.12.4) Clinical Sensitivity

1. HCV infected individuals :

The diagnostic sensitivity of the DIAsource ImmunoAssays SA Anti-HCV Elisa V 4.0 was determined to be 100 %.

421 of 421 positive samples including 20 samples per genotype for genotypes 1a – 4a and 5 samples for genotype 6 were tested and confirmed reactive for HCV antibodies.

Total Sensitivity n=421

12,000

10,000

8,000

6,000

4,000

2,000

0,000

0,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000

GBC NANBASE C-96 3.1 = 100%

Anti-HCV Elisa V 4.0 = 100

2. Commercial seroconversion panels :

Anti-HCV Elisa V 4.0 assay showed a higher seroconversion sensitivity in comparison with the chosen reference method which is CE-marked anti-HCV ELISA.

The total number of tested samples from the 22 seroconversion panels amounted to 198. Sixty three (63) of these samples were tested reactive with Anti-HCV Elisa V 4.0 assay, whereas only 44 of these samples were found to be reactive with the reference method.

4.12.5) Precision

Catalogue Nr: KAPG4NAE3 PI number : 1701265 Revision Nr : 110711/1

1. Intra-assay Reproducibility

2. Total Imprecision

CUTOFF

INDEX

Day 1

Day 2

Day 3

Mean

Positive Serum 1

Mean

4.49

4.16

5.07

CV (%)

7.22

13.06

5.24

Positive Serum 2

Mean

9.01

8.54

10,64

CV (%)

5.94

9.41

9,27

4.57 8.51 9.40 8.21

Positive Control

Mean

21.79

21.44

21,70

CV (%)

4.91

4.23

3,08

21.64 4.07

4.13) Flow chart of the test procedure

Add 100µl of Controls (3 X NC, 2 X PC) and 100µl per Specimen into wells. Reserve 1 well for blank.

↓

Incubate the plate at 37 ± 1°C for 60 minutes.

↓

Wash the plate.

(Prepare diluted conjugate in advance.)

↓

Add 100µl of diluted conjugate to each well except the blank.

↓

Incubate the plate at 37 ± 1°C for 30 minutes.

↓

Wash the plate.

↓ ↓

Mix the Chromogenic

TMB concentrate and

Substrate Buffer by the equal volume. Add 100µl of the mixed substrate solution to wells.

Add 50µl of Chromogenic

TMB concentrate to wells and then add 50µl of

Substrate Buffer.

Carefully mix well.

↓ ↓

Incubate at 37 ± 1°C for 15 minutes.

Catalogue Nr: KAPG4NAE3 PI number : 1701265 Revision Nr : 110711/1

↓

Add 100µl of Stop Solution into each well.

↓

Determine absorbance using 450 nm as reading wavelength with 620-690nm reference wavelength

5) BIBLIOGRAPHY

*1 Abe K, Inchauspe C, Shikate T, and Prince AM. (1992) Three different patterns of hepatitis C virus infection on chimpanzees. Hepatology,

15:690.

*2 Claets H, Volckaerts A, De Beenhouwer H, Vermylen C. (1992) Association of hepatitis C virus carrier state with the occurrence of hepatitis C virus core antibodies. J. Med. Virol. 36:259-264.

*3 Beach MJ, et al. (1992) Temporal relationship of hepatitis C virus RNA and antibody responses following experimental infection of chimpanzee. J Med. Virol. 36:226-237.

*4 The reference wavelength of spectrometer could be 620nm to 690nm. However, user should validate the spectrometer in combination with this kit before use.

*5 Incomplete inactivation of hepatitis B virus after heat treatment at 60°C for 10 hours, J. Infect. Dis. 138:242-244.

*6 The supplier is: VQC-AcroMetrix: Jan Steenstraat 1,NL-1816 CT Alkmaar, The Netherlands. Type 7 is available in lyophilised or liquid format.

The catalogue numbers are S2233 (lyophilised format) and S2058 (liquid format).

*7 National Inst. For Biological Standards & Control (NIBSC), Blabche Lane South Mimms Potters Bar Herts EN6 3QG, UK; Anti-HCV British

Working Standard, Product Code: 02/238-004.

Revision date : 2011-07-11

Catalogue Nr: KAPG4NAE3 PI number : 1701265 Revision Nr : 110711/1

Anti-HCV Elisa V 4.0.

Pour la détection qualitative in vitro d’anticorps dirigés contre le virus de l’hépatite C (anti-HCV) dans le sérum ou le plasma humain

KAPG4NAE3

DIAGNOSTIC IN VITRO

DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgique Tél : +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90

1) BUT DU DOSAGE

L’anti-HCV Elisa V 4.0 est un kit de diagnostic par essai immuno-enzymatique de quatrième génération pour la détection qualitative in vitro d’anticorps dirigés contre le virus de l’hépatite C (anti-HCV) dans le sérum ou le plasma humain.

2) THÉORIE DE FONCTIONNEMENT/BRÈVE DESCRIPTION DU PRODUIT

L’anti-HCV Elisa V 4.0 applique le « principe du sandwich direct » comme base de l’essai pour détecter les anticorps dirigés contre le virus de l'hépatite C (anti-HCV).

Il s’agit d’un kit d’essai immuno-enzymatique de quatrième génération qui utilise des antigènes HCV recombinants

(antigènes capsidiques, NS3 et NS5) pour détecter des anticorps dirigés contre le virus de l’hépatite C (anti-HCV) dans le sérum ou le plasma humain.

*1-3

Ces antigènes, réactifs pour les anticorps prédominants dirigés contre le HCV, constituent l’absorbant antigénique de la phase solide. Lorsque le sérum ou le plasma humain est ajouté aux puits, les antigènes HCV et l’anti-HCV forment des complexes sur les puits si des anti-HCV s ont présents dans l’échantillon. Les puits sont rincés pour retirer le matériel non lié. Le conjugué HCV Ag•HRPO dilué est ajouté aux puits et entraî ne la formation du complexe (HCV) • (Anti-HCV) • (HCV Ag•HRPO). Après lavage du conjugué non lié, une solution de substrat

TMB est ajoutée pour coloration. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d’anticorps présents dans l’échantillon. Les processus de réaction sont décrits ci-dessous :

A. Échantillon (contenant des Anti-HCV) :

1. Plaque (antigènes HCV) + échantillon (contenant des Anti-

HCV) → plaque (antigène HCV)•Anti-HCV

2. Laver pour retirer le matériel non lié.

3. Plaque (antigène HCV)•Anti-HCV + HCV Ag•HRPO → Plaque complexe (antigènes HCV)•Anti-HCV•HCV Ag•HRPO

4. Laver pour retirer le matériel non lié.

5. Plaque complexe (antigènes HCV) •Anti-HCV•HCV Ag•HRPO + solution TMB → couleur bleu clair à bleu

6. Couleur b leu clair à bleu + solution d’arrêt → couleur jaune clair à jaune, mesurée à 450 nm avec une longueur d’onde de référence sélectionnée entre 620 et 690 nm

B. Échantillon (sans anti-HCV humain) :

1. Plaque (antigènes HCV) + échantillon (sans AntiHCV) → plaque (antigène HCV)

2. Laver pour retirer le matériel non lié.

3. Plaque (antigènes HCV) + HCV Ag•HRPO → plaque (antigènes HCV) ------ Aucun complexe ne se forme

4. Laver pour retirer le matériel non lié.

5. Plaque (antigènes HCV) + solution TMB (incolore) → incolore

6. I ncolore + solution d’arrêt → incolore, mesuré à 450 nm avec une longueur d’onde de référence sélectionnée entre 620 et 690 nm *4

3) DESCRIPTION DU MATÉRIEL FOURNI ET DU SYSTÈME DE CODE DU PRODUIT

● Les articles 1 - 7 du tableau de réactifs suivant doivent être réfrigérés entre +2 et +8 °C.

La solution de lavage D (20X) et la solution d’arrêt peuvent être conservées entre +2 et +30 °C.

ARTICL

Composants Description

Qté par

96 tests

(1)

(2)

Plaque antigènes

HCV

Plaque de microtitration tapissée d’antigènes

HCV.

Ag HRP CONC

Conjugué

HCV Ag•HRPO concentré

Contient de l’HCV Ag•Peroxydase (raifort) dans un tampon avec du sérum bovin.

Conservateurs : 0,005 % d’azoture de sodium et 0,05 % de stabilisateur d'enzyme.

1 plaque

1 flacon,

1,8 ml

(3)

(4)

CONTROL H

Contrôle Anti-HCV positif

CONTROL L

Contrôle Hépatite C négatif

Plasma humain inactivé positif pour l’anti-

HCV. Conservateur : 0,099 % d’azoture de sodium.

Plasma humain normal non réactif pour les anticorps dirigés contre l’HCV.

Conservateurs : 0,099 % d’azoture de sodium.

1 flacon,

2,0 ml

1 flacon,

3,0 ml

Nº de catalogue : KAPG4NAE3 Nº de PI : 1701265 Nº de révision : 110711/1

(5)

(6)

(7)

CONJ BUF

Diluant du conjugué

CHROM TMB CONC

Chromogéne TMB concentré

SUB BUF

Tampon du substrat

Tampon PB avec du sérum bovin et du

Tween-20. Conservateurs : 0,005 % d’azoture de sodium et 0,05 % de stabilisateur d’enzyme.

3, 3’, 5, 5’-tétraméthylbenzidine (TMB) dans une base organique.

Tampon acide citrique avec peroxydase d’hydrogène urée

1 flacon,

24 ml

1 flacon,

12 ml

1 flacon,

12 ml

RINC SOLN CONC

(8)

Solution de lavage

D conc. (20X)

Tampon phosphate avec Tween-20.

(9)

STOP SOLN

Solution d'arrêt

1 flacon

110 ml

1 flacon

12 ml

● MATÉRIEL REQUIS MAIS NON FOURNI

ARTICLES

(1)

(2)

(3)

(4)

Composants

Micropipettes de 50 µl, 100 µl, 200 µl et 1 ml et des embouts sont nécessaires.

Bain-marie à 37 +/- 1° ou incubateur à 37 +/- 1°.

Tubes pour la dilution de l’échantillon.

Matériel de lavage de la plaque.

(5)

(6)

(7)

(8)

Lecteur de micropuits ELISA :

Longueur d’onde double à 450 nm avec longueur d’onde de référence de 620 à 690 nm *4

, bande passante 10 nm.

Eau purifiée : eau distillée ou désionisée.

Un analyseur de microplaque pour EIA totalement automatique est facultatif. L’utilisateur doit valider l’analyseur de microplaque pour EIA automatique par rapport au kit.

Bande adhésive

4) MODE D’EMPLOI

4.1) Avertissements

4.1.1) Ce kit de réactifs est uniquement à usage professionnel.

4.1.2) Ce kit de réactifs est uniquement destiné à un diagnostic in vitro.

4.1.3) Placer l’ensemble des réactifs du kit et des échantillons à température ambiante (+20 à +30 °C) et mélanger soigneusement avant utilisation.

4.1.4)

Ne pas utiliser les réactifs après la date d’expiration.

4.1.5) Ne pas échanger les réactifs entre différents lots.

4.1.6) Ne pas porter la pipette à la bouche.

4.1.7) Ne pas fumer ou manger dans les zones où des échantillons ou des réactifs sont manipulés.

4.1.8) Tous les composants du kit et les échantillons doivent être considérés comme potentiellement dangereux pour la santé. Ils doivent être utilisés et éliminés conformément aux procédures de sécurité de votre laboratoire. Ces procédures de sécurité incluent probablement le port de gants de protection et éviter de produire des aérosols.

4.1.9) Les échantillons potentiellement infectieux et les déversements ou fuites non acides doivent être nettoyés minutieusement à l’aide d’hypochlorite de sodium à 5 % ou traités selon votre procédure de contrôle des risques biologiques potentiels.

4.1.10) Avant d’éliminer les échantillons et les kits de réactifs usagés dans les ordures ménagères, ils doivent être traités conformément

à la procédure locale de traitement des déchets biologiques potentiellement dangereux ou comme suit :

Les déchets liquides et solides doivent être stérilisés par autoclave à +121 °C pendant au moins 30 minutes.

Les déchets solides peuvent également être incinérés.

Les déchets liquides non acides peuvent être traités à l’aide d’hypochlorite de sodium dilué à une concentration finale de 1 %.

Les déchets liquides acides doivent être neutralisés avant traitement à l’aide d’hypochlorite de sodium tel que mentionné cidessus et doivent être stérilisés pendant 30 minutes pour obtenir une désinfection effective.

4.1.11)

La solution d’arrêt est un irritant pour la peau, les yeux, les voies respiratoires et les muqueuses. Éviter le contact de la solution d’arrêt avec la peau et les muqueuses. En cas de contact, laver immédiatement et abondamment à l’eau.

En cas d’inhalation, respirer immédiatement de l’air frais et consulter un médecin en cas de douleur.

4.1.12) Le chromogéne TMB concentré contient un solvant organique inflammable. Le chromogéne TMB concentré contient du sulfoxyde de diméthyle, un irritant pour la peau et les muqueuses.

4.1.13) Bien que tous les échantillons d’origine humaine soient testés exempts d’HBsAg et d’anti-HIV et ont été inactivés à +56 °C pendant une heure, le réactif doit être manipulé comme une substance potentiellement infectieuse. *

Nº de catalogue : KAPG4NAE3 Nº de PI : 1701265 Nº de révision : 110711/1

4.2) Collecte et stockage des échantillons

4.2.1) Du sérum ou du plasma peut être utilisé avec ce kit de diagnostic. Les échantillons de sang total doivent être séparés au plus tôt pour éviter l’hémolyse. Toute particule (par ex., caillots de fibrine, érythrocytes) contenue dans l’échantillon doit être retirée avant utilisation.

4.2.2) Les échantillons doivent être stockés entre +2 et +8

°C et éviter l’inactivation par la chaleur pour minimiser la détérioration. Pour un stockage de longue durée, ils doivent être congelés en dessous de -20 °C. Un stockage en congélateur à dégivrage automatique n’est pas recommandé.

4.2.3) Les échantillons congelés doivent être entièrement décongelés et mélangés de façon homogène avant le test.

4.2.4) Éviter les procédures de congélation-décongélation multiples.

4.2.5) Les sérums partiellement coagulés et les échantillons avec une contamination bactérienne ne doivent pas être utilisés.

4.3) Stockage des réactifs

4.3.1) Le kit doit être conservé entre +2 et +8 °C. Ne pas congeler.

4.3.2) Les barrettes de la plaque doivent être utilisées dans le mois suivant l’ouverture du sachet en aluminium d’origine. Les barrettes non utilisées doivent être conservées dans le sachet en aluminium qui doit être solidement fermé.

4.3.3) Replacer les réactifs entre +2 et +8 °C immédiatement après utilisation.

4.3.4) La solution de lavage concentrée (20X) peut être conservée à température ambiante pour éviter la cristallisation, car les kits sont conservés et expédiés entre +2 et +8 °C. Si des cristaux se sont formés avant utilisation, réchauffer la solution dans un bainmarie à 37

°C jusqu’à dissolution des cristaux.

4.4) Procédure de lavage de la plaque

4.4.1) Préparation de la solution de lavage :

Diluer la solution de lavage D concentrée (20X) avec de l’eau distillée ou désionisée pour obtenir une dilution 1:20. Ne pas utiliser d’eau du robinet.

4.4.2) Lavage de la plaque :

(a) Pour un laveur de plaques avec fonction d’aspiration du trop-plein : 6 cycles avec au moins 0,5 ml de tampon de lavage par puits par cycle.

(b) Pour un laveur de plaques sans fonction d’aspiration du trop-plein : 8 cycles avec au moins 0,35 ml de tampon de lavage par puits par cycle.

4.4.3) Sécher la plaque en la retournant et en la tapotant fermement sur du papier absorbant. Une trop grande quantité de tampon de lavage résiduel entraînera des résultats erronés.

AVERTISSEMENT

Un lavage insuffisant entraînera des résultats erronés.

4.5) Procédure du test

4.5.1) Placer tous les réactifs et échantillons à température ambiante (+20 à +30 °C) avant l’essai. Régler le bain-marie ou l’incubateur à

37±1 °C.

4.5.2) Préparation du conjugué dilué

1. Utiliser uniquement un récipient propre pour éviter une contamination.

2. Préparer un conjugué dilué en réalisant une dilution 1 :20 du conjugué HCV Ag•HRPO concentré avec le diluant du conjugué, ou selon le tableau de préparation du conjugué ci-dessous. Remuer doucement pour bien mélanger et éviter la mousse.

3. La solution de conjugué dilué en excès doit être jetée après utilisation.

Tableau de préparation du conjugué :

Nombre de puits utilisés

Volume nécessaire de diluant du conjugué (ml)

8 1

72 - 80

Volume nécessaire de conjugué HCV

Ag• HRPO conc. (µl)

100

150

200

250

300

350

400

450

81 - 96 10 500

4.5.3) Laisser un puits pour le blanc.

Ne pas ajouter d’échantillon ou de diluant de l’échantillon au puits pour le blanc.

4.5.4) Préparer le nombre nécessaire de puits, y compris 1 puits pour le blanc, 3 puits pour le contrôle négatif, 2 puits pour le contrôle positif et 1 puits pour chaque échantillon.

Nº de catalogue : KAPG4NAE3 Nº de PI : 1701265 Nº de révision : 110711/1

4.5.5) Ajout de l’échantillon :

4.5.5.1) Ajouter 100 µl de contrôle positif, contrôle négatif et échantillon à chaque puits appropri é de la plaque d’antigènes HCV.

4.5.5.2) Bien mélanger en tapotant la plaque.

REMARQUE : Utiliser un nouvel embout de pipette après chaque prélèvement pour éviter la contamination croisée.

4.5.6) Sceller la plaque avec une bande adhésive.

4.5.7) Incuber la plaque dans un bain-marie ou un incubateur à circulat ion d’air à 37 + 1 °C pendant 60 minutes.

REMARQUE : Ne pas empiler les plaques.

4.5.8) À la fin de la période d’incubation, retirer soigneusement et jeter la bande adhésive.

4.5.9) Laver la plaque selon le paragraphe 4.4) Procédure de lavage de la plaque.

4.5.10) Ajouter 100 µl de conjugué dilué à chaque puits sauf au blanc.

4.5.11) Sceller la plaque avec une bande adhésive.

4.5.12) Incuber la plaque dans un bain-marie ou un incubateur à circulation à 37 + 1 °C pendant 30 minutes.

4.5.13) Répéter les étapes 4.5.8) et 4.5.9).

4.5.14) Sélectionner l’une des deux méthodes suivantes pour la coloration :

A. Mélanger immédiatement avant utilisation des volumes identiques de chromogéne TMB concentré et de tampon du substrat dans un récipient propre. Ajouter 100 µl de la solution de mélange à chaque puits, y compris au blanc.

B. Ajouter tout d’abord 50 µl de chromogéne TMB concentré, puis ajouter 50 µl de tampon du substrat à chaque puits, y compris au blanc. Bien mélanger avec précaution.

REMARQUE : Le chromogéne TMB concentré doit être incolore à bleu clair ; sinon, il faut le jeter. Le mélange de chromogéne TMB concentré et de tampon du substrat doit être utilisé dans les 30 minutes après le mélange. Le mélange doit être tenu à l’écart de toute lumière intense.

4.5.15) Sceller la plaque à l'aide d’une bande adhésive et incuber à 37 ± 1 °C pendant 15 minutes.

4.5.16) Stopper la réaction en ajoutant 100 µl de solution d’arrêt à chaque puits, y compris au blanc.

4.5.17) Déterminer l’absorbance des contrôles et des échantillons dans les 15 minutes, mesurée à 450 nm avec une longueur d’onde de référence sélectionnée entre 620 et 690 nm

Utiliser le puits blanc pour définir le zéro du spectrophotomètre.

REMARQUE : La couleur du blanc doit être incolore à jaune clair ; sinon, les résultats du test sont invalides. Blanc du substrat : la valeur d’absorbance doit être inférieure à une DO de 0,100.

4.6) Calcul des données testées

4.6.1) Calcul du NCx (absorbance moyenne du contrôle négatif).

Exemple :

Nº d’échantillon

Absorbance

0,045

0,060

3 0,051

NCx = (0,045+0,060+0,051) /3 = 0,052

NCx doit être ≤ 0,200, sinon le test n’est pas valide.

4.6.2) Calcul du PCx (absorbance moyenne du contrôle positif).

Exemple :

Nº d’échantillon

Absorbance

1,510

1,826

PCx = (1,510 + 1,826) /2 = 1,668

PCx doit être ≥ 0,600, sinon le test n’est pas valide.

4.6.3) Calcul de la valeur P - N

P-N = PCx - NCx

Exemple :

P - N = 1,668 – 0,051 = 1,617

La valeur P – N doit être ≥ 0,400, sinon le test n’est pas valide.

4.6.4) Calcul de la valeur du seuil de positivité

Valeur du seuil de positivité = NCx + 0,100

Exemple :

Valeur du seuil de positivité = 0,053+0,100 = 0,153

4.6.5) Calculer l’indice du seuil de positivité des échantillons

Indice du seuil de positivité = Valeur DO de l’échantillon/Valeur du seuil de positivité

Exemple :

La vale ur de l’échantillon est 0,596

Indice du seuil de positivité = 0,596/0,153 = 3,895

4.6.6) Zone grise : Indice du seuil de positivité = 1,000 ～ 1,500

Nº de catalogue : KAPG4NAE3 Nº de PI : 1701265 Nº de révision : 110711/1

4.7) Contrôle qualité du run de tests

4.7.1) Le

NCx doit être ≤ 0,200, sinon le test n’est pas valide.

4.7.2) Le PCx doit être ≥ 0,600, sinon le test n’est pas valide.

4.7.3) La valeur P – N doit être ≥ 0,400, sinon le test n’est pas valide.

REMARQUE : Contrôle négatif: la valeur d'absorbance doit être inférieure ou égale à 0,200 après avoir soustrait le blanc.

4.8) Interprétation des résultats

4.8.1) Les échantillons avec INDICE DU SEUIL DE POSITIVITÉ ＜ 1,000 sont considérés comme NON RÉACTIFS par les critères de l’Anti-HCV Elisa V 4.0 de DIAsource.

4.8.2) Les échantillons avec un INDICE DU SEUIL DE POSITIVITÉ ≥ 1,000 sont considérés comme initialement RÉACTIFS. Ils doivent

être TESTES A NOUVEAU en doublon.

Si les deux INDICES DU SEUIL DE POSITIVITÉ du doublon sont SUPÉRIEURS à 1,500, l’échantillon est considéré comme

RÉACTIF réitéré pour les anti-

HCV par les critères de l’Anti-HCV Elisa V 4.0 de DIAsource ImmunoAssays SA.

Les échantillons réactifs réitérés de l’Anti-HCV Elisa V 4.0 doivent être encore testés par des tests supplémentaires plus spécifiques.

4.8.3) Les échantillons initialement réactifs, dont les INDICES DU SEUIL DE POSITIVITÉ du nouveau test en double sont INFÉRIEURS

à 1,000, seront considérés comme NON RÉACTIFS pour les anti-HCV.

4.8.4) Si l’un des deux INDICES DU SEUIL DE POSITIVITÉ du test en doublon est SUPÉRIEUR à 1,000, mais INFÉRIEUR à 1,500, l’échantillon peut être interprété comme DISCUTABLE et cette personne doit être surveillée par des échantillons de suivi ou des tests supplémentaires plus spécifiques doivent être effectués.

4.8.5) Si l’un des INDICES DU SEUIL DE POSITIVITÉ du doublon est SUPÉRIEUR à 1,500 et que l’autre est INFÉRIEUR à 1,000, cela indique une erreur expérimentale inhabituelle. Le test doit être refait.

4.9) Résolution des problèmes

Si le résultat ne peut être reproduit, réaliser une procédure de contrôle préliminaire en vérifiant les possibilités ci-dessous :

4.9.1) Procédure de lavage de la plaque inappropriée.

4.9.2) Contamination avec un échantillon positif.

4.9.3) Volume incorrect d’échantillon, conjugué ou substrat.

4.9.4) Contamination du bord du puits avec un conjugué.

4.9.5) Échantillon inapproprié, par exemple sérum ou plasma hémolysé, échantillon contenant des sédiments et échantillon insuffisamment mélangé avant utilisation.

4.9.6) Durée ou température d’incubation incorrecte.

4.9.7) Tête et aiguilles d’aspiration/distribution du laveur obstruées ou partiellement obstruées.

4.9.8) Aspiration insuffisante.

4.10) Limites et interférences

4.10.1) Ce kit de réactifs doit être uniquement utilisé pour du sérum ou du plasma humain non mis en pool.

4.10.2) Ce kit de réactifs n’a pas été validé pour une utilisation avec des échantillons prélevés sur des cadavres.

4.10.3) Les échantillons présentant un très faible taux d'anti-HCV peuvent ne pas être continuellement positifs. Dans ce cas, il est recommandé de tester des échantillons de suivi.

4.10.4) Un résultat anti-

HCV négatif n’exclut pas la possibilité d’une infection par HCV.

4.10.5) Des résul tats faux positifs non réitérables peuvent se produire en raison d’une liaison non spécifique de l’échantillon et du conjugué sur la paroi des puits.

4.10.6) Substances pouvant provoquer des interférences : il n’existe aucune influence significative sur l’Anti-HCV Elisa V 4.0.

4.11) Conditions de stockage et stabilité

Kit/composants

Température de stockage

État Stabilité

Original 18 mois

KIT Anti-HCV Elisa V 4.0 +2 à +8 °C

Après ouverture 1 mois

Contrôle Anti-HCV positif +2 à +8 °C

Original

Après ouverture

18 mois

1 mois

Contrôle Hépatite C négatif

Plaque d’antigènes HCV

Solution du conjugué HCV antigen concentré

•HRPO

+2 à +8 °C

Original

Après ouverture

Original

Après ouverture

Original

Après ouverture

18 mois

1 mois

18 mois

1 mois

18 mois

1 mois

Nº de catalogue : KAPG4NAE3 Nº de PI : 1701265 Nº de révision : 110711/1

Solution du conjugué antigène HCV conc.

Diluant du conjugué

Solution de lavage D concentrée (20X)

Solution de lavage diluée 20X

Chromogéne TMB concentré

Tampon du substrat

Mélange de solution du substrat TMB

Solution d'arrêt

•HRPO Temp. ambiante

+2 à +8 °C

Temp. ambiante

+2 à +8 °C

Temp. ambiante

Diluée

Original

Après ouverture

Original

Après ouverture

Diluée

Original

Après ouverture

Original

Après ouverture

Mélange

Original

Après ouverture

6 heures

2 jours

18 mois

1 mois

24 mois

1 mois

2 jours

1 semaine

24 mois

1 mois

24 mois

1 mois

6 heures

24 mois

1 mois

4.12) Performance

4.12.1) Spécificité analytique

Substances pouvant provoquer des interférences : il n’existe aucune influence significative sur l’Anti-HCV Elisa V 4.0.

Substances pouvant provoquer des interférences n de tests n de réactifs n de non réactifs

Sérum avec des substances provoquant des interférences en proportions fixes

(Triglycérides, hémoglobine, bilirubine, IgG et IgM monoclonales et facteur rhumatoïde)

Panels d’inhibition

(EDTA, hémoglobine, triglycéride, bilirubine et héparine)

Panels d’anticoagulants

(sérum, plasma EDTA, plasma hépariné et plasma citraté)

Total

50 tests

14 échantillons négatifs

14 échantillons positifs

25 échantillons négatifs

25 échantillons positifs

128 échantillons testés

4.12.2) Spécificité clinique

Spécificité clinique = 5356/5369 = 99,8 %

Substances pouvant provoquer des interférences

Donneurs de sang

Échantillons cliniques / hospitaliers

Échantillons sériques/plasmatiques avec réaction croisée potentielle n de tests

5 169

200

100 n de réactifs

0 n de non réactifs

Total 5 369 13

4.12.3) Sensibilité analytique

La sensibilité analytique de l’essai Anti-HCV Elisa V 4.0 est supérieure au test de référence.

5 157

199

100

5 356

Spécificité

99,77 %

99,5 %

100 %

99,8 %

Nº de catalogue : KAPG4NAE3 Nº de PI : 1701265 Nº de révision : 110711/1

Analytical Sensitivity PEI Reference Material

Serial Dilution Positive Sample 1

♦

Anti-HCV Elisa V 4.0

■

Méthode de référence

▲ Seuil de positivité

GBC NANBASE C-96 3.1

Cut Off

♦

Anti-HCV Elisa V 4.0

■ Méthode de référence

▲ Seuil de positivité

Ortho HCV 3.0 SAVe

Cut Off

0 2 4 6 8 10

Dilution Steps

12 14 16 18

0 2 4 6 8 10

Dilution Steps

12 14 16 18 20 20

Serial Dilution Positive Sample 2

Serial Dilution of the Positive Control

♦

■ Méthode de référence

▲ Seuil de positivité

GBC NANBASE C-96 3.1

Reihe2

Reihe3 15

♦

Anti-HCV Elisa V 4.0

■ Méthode de référence

▲ Seuil de positivité

GBC NANBASE C96 3.1

Cut Off

Ortho HCV 3.0 SAVe

0 2 4 6 8 10

Dilution Steps

12 14 16 18

0 10

-5

Panel de reference Anti-HCV PeliCheck

20 30 40

Dilution Step

50 60 70

♦

Anti-HCV Elisa V 4.0

■ Méthode de référence

▲ Seuil de positivité

0 2 4

Dilution Step

6 8 10

4.12.4) Sensibilité clinique

1. Personnes infectées par le HCV :

La sensibilité diagnostique de l’Anti-HCV Elisa V 4.0 de DIAsource ImmunoAssays SA était de 100 %.

421 des 421 échantillons positifs incluant 20 échantillons par génotype pour les génotypes 1a

– 4a et 5 échantillons pour les génotypes 6 ont été testés et confirmés réactifs pour les anticorps dirigés contre le HCV.

Nº de catalogue : KAPG4NAE3 Nº de PI : 1701265 Nº de révision : 110711/1

Total Sensitivity n=421

12,000

10,000

8,000

6,000

4,000

2,000

0,000

0,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000

GBC NANBASE C-96 3.1 = 100%

Anti-HCV Elisa V 4.0 = 100

2. Panels commerciaux de séroconversion :

L’essai Anti-HCV Elisa V 4.0 a montré une sensibilité accrue de la séroconversion comparé à la méthode de référence choisie : l’anti-HCV ELISA marqué CE.

Le nombre total d’échantillons testés parmi les 22 panels de séroconversion s’élevait à 198. Parmi eux, soixante-trois (63)

échantillons ont été testés réactifs avec l’essai Anti-HCV Elisa V 4.0, tandis que seuls 44 de ces échantillons ont été testés réactifs avec la méthode de référence.

4.12.5) Précision

1. Reproductibilité intra-essai

INDICE DU

SEUIL

Sérum positif 1 Sérum positif 2 Contrôle positif

Moyenne CV (%) Moyenne CV (%) Moyenne CV (%)

Jour 1 4,49 7,22 9,01 5,94 21,79 4,91

Jour 2

Jour 3

4,16

5,07

13,06

5,24

8,54

10,64

9,41

9,27

21,44

21,70

4,23

3,08

2. Imprécision totale

Moyenne 4,57 8,51 9,40 8,21 21,64 4,07

Nº de catalogue : KAPG4NAE3 Nº de PI : 1701265 Nº de révision : 110711/1

4.13) Représentation graphique de la procédure de test

Ajouter 100 µl des contrôles (3 X NC, 2 X PC) et

100 µl d’échantillon aux puits. Laisser un puits pour le blanc.

↓

Incuber la plaque à 37 ± 1 °C pendant 60 minutes.

↓

Laver la plaque.

(Préparer au préalable le conjugué dilué.)

↓

Ajouter 100 µl de conjugué dilué à chaque puits, sauf au blanc.

↓

Incuber la plaque à 37 ± 1 °C pendant 30 minutes.

↓

Laver la plaque.

↓ ↓

Mélanger des volumes identiques de de la solution obtenue aux

Chromogéne TMB concentré puis ajouter chromogéne TMB concentré et de tampon du substrat. Ajouter 100 µl

50 µl de tampon du substrat.

Bien mélanger avec précaution. puits.

Ajouter 50 µl de

↓ ↓

Incuber à 37 ± 1 °C pendant 15 minutes.

↓

Ajouter 100 µl de Solution d'arrêt à chaque puits.

↓

Déterminer l’absorbance à une longueur d’onde de lecture de 450 nm avec une longueur d’onde de référence entre 620 et 690 nm

5) BIBLIOGRAPHIE

*1 Abe K, Inchauspe C, Shikate T, and Prince AM. (1992) Three different patterns of hepatitis C virus infection on chimpanzees. Hepatology,

15:690.

*2 Claets H, Volckaerts A, De Beenhouwer H, Vermylen C. (1992) Association of hepatitis C virus carrier state with the occurrence of hepatitis C virus core antibodies. J. Med. Virol. 36:259-264.

*3 Beach MJ, et al. (1992) Temporal relationship of hepatitis C virus RNA and antibody responses following experimental infection of chimpanzee. J Med. Virol. 36:226-237.

*4 La longueur d’onde de référence du spectromètre peut se situer entre 620 et 690 nm. Cependant, l’utilisateur doit, avant utilisation, valider le spectromètre par rapport au kit utilisé.

*5 Incomplete inactivation of hepatitis B virus after heat treatment at 60°C for 10 hours, J. Infect. Dis. 138:242-244.

*6 The supplier is: VQC-AcroMetrix: Jan Steenstraat 1,NL-1816 CT Alkmaar, The Netherlands. Type 7 is available in lyophilised or liquid format.

The catalogue numbers are S2233 (lyophilised format) and S2058 (liquid format).

*7 National Inst. For Biological Standards & Control (NIBSC), Blabche Lane South Mimms Potters Bar Herts EN6 3QG, UK; Anti-HCV British

Working Standard, Product Code: 02/238-004.

Date de révision : 2011-07-11

Nº de catalogue : KAPG4NAE3 Nº de PI : 1701265 Nº de révision : 110711/1

Anti-HCV Elisa V 4.0.

Para la detección cualitativa in-vitro del Anticuerpo contra el virus de la

Hepatitis C (anti-VHC) en suero o plasma humano

KAPG4NAE3

PARA USO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO

DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium Tel: +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90

1) USO PREVISTO

El kit de diagnóstico Anti-HCV Elisa V 4.0 es un inmunoensayo enzimático de cuarta generación para la detección cualitativa in vitro del anticuerpo contra el virus de la Hepatitis C (anti-VHC) en suero o plasma humano.

2) TEORÍA DEL DISEÑO/BREVE DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO

Elisa V 4.0 Anti-VHC adopta el “principio del sándwich directo” como la base del ensayo para detectar anticuerpos contra el virus de la Hepatitis C (anti-VHC). Es un kit de inmunoensayo enzimático de cuarta generación que usa antígenos recombinantes del VHC (antígenos Core, NS3 y NS5) para la detección del virus de la Hepatitis C (anti-VHC) en suero o plasma humano.

*1-3

Estos antígenos, que reaccionan con los anticuerpos predominantes contra el VHC, constituyen la fase solida antigénica absorbente. Cuando el suero o plasma humano se agrega a los pocillos, si anti- VHC está presente en la muestra, los antígenos del VHC formarán complejos con anti-VHC. Se lavan los pocillos para eliminar el material que no se ha unido. Se agrega el conjugado diluido HVC Ag•HRPO a los pocillos lo que resulta en la formación de un complejo (VHC)

• (Anti-VHC) • (VHC Ag•HRPO). Después de eliminar por lavado el complejo que no se ha unido, se agrega una solución de sustrato TMB para desarrollar color. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en la muestra. Los procesos reactivos están resumidos como sigue:

A. Muestra (que contiene anti-VHC):

1. Placa (VHC Ag) + muestra (que contiene Anti-VHC) -



placa (VHC Ag) • Anti- VHC

2. Lave para eliminar el material que no se ha unido.

3. Placa (VHC Ag) Anti- VHC + VHC Ag•HRPO



placa (VHC Ag)•Anti- VHC • VHC Ag•HRPO complejo

4. Lave para eliminar el material que no se ha unido.

5. Placa (VHC Ag) •Anti- VHC • VHC Ag•HRPO complejo + solución de sustrato TMB → de color azul claro a azul

6. De color azul claro a azul + solución de parada →de color amarillo pálido a amarillo, medido a 450nm con una longitud de onda seleccionada entre 620 y 690nm

B. Muestra (sin anti-VHC):

1. Placa (VHC Ag) + muestra (sin Anti-VHC) → placa (VHC Ag)

2. Lave para eliminar el material que no se ha unido.

3. Placa (VHC Ag) + VHC Ag•HRPO → placa (VHC Ag)------ no se formará un complejo

4. Lave para eliminar el material que no se ha unido.

4. Placa (VHC Ag) + solución de sustrato TMB (incolora) → incolora

5. Incolora + solución de parada → incolora, medida a 450nm con una longitud de onda de referencia seleccionada de 620 a 690nm

3) DESCRIPCIÓN DE MATERIALES SUMINISTRADOS & SISTEMA DE CÓDIGOS DE PRODUCTOS

● Item 1 - 7 en la siguiente tabla de reactivos deben permanecer refrigerados entre + 2 y +8°C. La Solución de

Lavado (20X) y la solución de parada pueden almacenarse entre +2 y +30°C.

ITEMS Componentes Descripción Cant. para

96 ensayos

(1)

VHC Ag Placa

Una microplaca recubiertos con antigenos VHC.

1 placa

Catalogo Nr: KAPG4NAE3 PI Numero : 1701265 Revisión Nr : 110711/1

P.I. Number : 1701000

WASH SOLN CONC

CAL 0

CAL

CONTROL

125I

CONC

HRP

HRP CONC

CONJ

CHROM

BUF

TMB CONC

CHROM TMB

SUB BUF

STOP SOLN

INC

BUF

SER

Ab AP

SUB

BIOT

PNPP

CONJ CONC

PREC AGENT

AVID HRP CONC

ASS

BUF

BIOT

SAV

NSB

2nd Ab

HRP CONC

ACID

DIST

TRAY

PMSF

BUF

INC BUF

ACETONITRILE

SERUM

DIL SPE

DIL BUF

ANTISERUM

IMMUNOADSORBENT

DIL CAL

REC

PEG

SOLN

EXTR SOLN

ELU

GEL

SOLN

PRE SOLN

NEUTR SOLN

TRACEUR BUF

STRIP

SUB

EXTR SOLN CONC

CART

SAV

PIPETTE

HRP

WASH SOLN

Used symbols

Consult instructions for use

Storage temperature

Use by

Batch code

Catalogue number

Control

In vitro diagnostic medical device

Manufacturer

Contains sufficient for <n> tests

Wash solution concentrated

Zero calibrator

Calibrator #

Control #

Tracer

Tracer concentrated

Tubes

Incubation buffer

Acetonitrile

Serum

Specimen diluent

Dilution buffer

Antiserum

Immunoadsorbent

Calibrator diluent

Reconstitution solution

Polyethylene glycol

Extraction solution

Elution solution

Bond Elut Silica cartridges

Pre-treatment solution

Neutralization solution

Tracer buffer

Microtiterplate

HRP Conjugate

HRP Conjugate concentrate

Conjugate buffer

Chromogenic TMB concentrate

Chromogenic TMB solution

Substrate buffer

Stop solution

Incubation serum

Buffer

AP Conjugate

Substrate PNPP

Biotin conjugate concentrate

Precipitating Agent

Avidine HRP concentrate

Assay buffer

Biotin conjugate

Specific Antibody

Streptavidin HRP concentrate

Non-specific binding

2nd Antibody

Acidification Buffer

Distributor

Incubation trays

PMSF solution

Protect from light

Dot Strip

Substrate

Extraction Buffer Concentrate

Cartridge

Streptavidin HRP

Pipette

Wash buffer

Revision nr 140723

P.I. Number : 1701000

WASH SOLN CONC

CAL 0

CAL

CONTROL

125I

CONC

HRP

HRP CONC

CONJ

CHROM

BUF

TMB CONC

CHROM TMB

SUB BUF

STOP SOLN

INC

BUF

SER

SUB

BIOT

PNPP

CONJ CONC

PREC AGENT

AVID HRP CONC

ASS

BUF

BIOT

SAV

NSB

2nd Ab

HRP CONC

ACID

DIST

TRAY

PMSF

BUF

STRIP

SUB

EXTR SOLN CONC

CART

SAV HRP

WASH SOLN

INC BUF

ACETONITRILE

SERUM

DIL

SPE

BUF

ANTISERUM

IMMUNOADSORBENT

DIL CAL

REC

PEG

SOLN

EXTR SOLN

ELU

GEL

SOLN

PRE SOLN

NEUTR SOLN

TRACEUR BUF

Symboles utilisés

Tampon conjugué

Chromogène TMB concentré

Solution chromogène TMB

Tampon substrat

Solution d’arrêt

Sérum d'incubation

Tampon

AP Conjugué

Tampon PNPP

Biotine conjugué concentré

Agent de précipitation

Avidine HRP concentré

Tampon de test

Biotine conjugué

Anticorps spécifique

Concentré streptavidine HRP

Liant non spécifique

Second anticorps

Tampon d'acidification

Distributeur

Plaque d'incubation

Solution PMSF

Conserver à l'abri de la lumière

Bandelette de dots

Substrat

Tampon d'extraction concentré

Cartouche

Streptavidine-peroxydase de raifort

Pipette

Tampon de lavage

Consulter les instructions d’utilisation

Température de conservation

Utiliser jusque

Numéro de lot

Référence de catalogue

Contrôle

Dispositif médical de diagnostic in vitro

Fabricant

Contenu suffisant pour <n> tests

Solution de lavage concentrée

Calibrateur zéro

Calibrateur #

Contrôle #

Traceur

Traceur concentré

Tubes

Tampon d'incubation

Acétonitrile

Sérum

Diluant du spécimen

Tampon de dilution

Antisérum

Immunoadsorbant

Diluant de calibrateur

Solution de reconstitution

Glycol Polyéthylène

Solution d’extraction

Solution d’elution

Cartouches Bond Elut Silica

Solution de pré-traitement

Solution de neutralisation

Tampon traceur

Microplaque de titration

HRP Conjugué

HRP Conjugué concentré

Revision nr 140723

P.I. Number : 1701000

WASH SOLN CONC

CAL 0

CAL

CONTROL

125I

CONC

HRP

HRP CONC

CONJ

CHROM

BUF

TMB CONC

CHROM TMB

SUB BUF

STOP SOLN

INC

BUF

SER

SUB

BIOT

PNPP

CONJ CONC

PREC AGENT

AVID HRP CONC

ASS

BUF

BIOT

SAV

NSB

2nd Ab

HRP CONC

ACID

DIST

TRAY

PMSF

BUF

INC BUF

ACETONITRILE

SERUM

DIL

SPE

BUF

ANTISERUM

IMMUNOADSORBENT

DIL CAL

REC

PEG

SOLN

EXTR SOLN

ELU

GEL

SOLN

PRE SOLN

NEUTR SOLN

TRACEUR BUF

SUB

EXTR SOLN CONC

CART

SAV

PIPETTE

HRP

WASH SOLN

Símbolos utilisados

Tampón de Conjugado

Cromógena TMB concentrada

Solución Cromógena TMB

Tampón de sustrato

Solución de Parada

Suero de Incubación

Tampón

AP Conjugado

Sustrato PNPP

Concentrado de conjugado de biotina

Agente de precipitación

Concentrado avidina-HRP

Tampón de ensayo

Conjugado de biotina

Anticuerpo específico

Estreptavidina-HRP Concentrado

Unión no específica

Segundo anticuerpo

Tampón de Acidificación

Distribuidor

Bandejas de incubación

Solución de PMSF

Proteger de la luz

Tries Dot

Sustrato

Concentrado de tampón de extracción

Cartucho

Estreptavidina HRP

Pipeta

Tampón de lavado

Consultar las instrucciones de uso

Limitación de temperatura

Fecha de caducidad

Codigo de lote

Número de catálogo

Control

Producto sanitario para diagnóstico in vitro

Fabricante

Contenido suficiente para <n> ensayos

Solución de lavado concentrada

Calibrador cero

Calibrador #

Control #

Trazador

Trazador concentrada

Tubos

Tampón de incubación

Acetonitrilo

Suero

Diluyente de Muestra

Tampón de dilución

Antisuero

Inmunoadsorbente

Diluyente de calibrador

Solución de Reconstitución

Glicol Polietileno

Solución de extracción

Solución de elución

Cartuchos Bond Elut Silica

Solución de Pre-tratamiento

Solución de Neutralización

Tampón de trazador

Placa de microvaloración

HRP Conjugado

HRP Conjugado concentrada

Revision nr 140723

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Key features

Forth generation enzyme immunoassay
Qualitative detection of Antibody to Hepatitis C virus
Recombinant HCV antigens
Direct sandwich principle
TMB substrate solution

Frequently asked questions

The kit must be stored at +2 to +8°C. Do not freeze.

Either serum or plasma can be used with this diagnostic kit.

The test procedure involves adding the controls and specimen to the wells, incubating the plate, washing the plate, adding the diluted conjugate, incubating again, adding the substrate solution, incubating again, stopping the reaction, and determining absorbance.