Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au

Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au
République du Mali
Un Peuple-Un But-Une Foi
Université des Sciences, des Techniques et des Technologies de Bamako
Faculté de Pharmacie
Année universitaire 2013-2014
Thèse N°…
Mise en place d’un système de surveillance des résistances
bactériennes aux antibiotiques: Cas des hémocultures
au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Thèse présentée à la Faculté de Pharmacie par Mlle Sandrine MOUDJONGUE OMOCK
pour obtenir le grade de Docteur en Pharmacie (Diplôme d’ETAT)
Soutenue publiquement le 28 / 06 / 2014
Jury :
Président du jury : M. Flabou BOUGOUDOGO Maître de conférences Agrégé
Membre du jury : M. Ibréhima GUINDO Docteur
Membre du jury : Mme. KAYA Assétou SOUKHO Maître de conférences
Agrégé
Directeur de thèse : M. Souleymane DIALLO II Professeur
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
FACULTE DE PHARMACIE
ANNEE UNIVERSITAIRE 2013-2014
ADMINISTRATION
DOYEN : M. Boubacar TRAORE – MAITRE DE CONFERENCES
VICE-DOYEN : M. Ababacar I .MAIGA-MAITRE DE CONFERENCES
SECRETAIRE PRINCIPAL : M. Seydou COULIBALY – ADMINISTRATEUR CIVIL
AGENT COMPTABLE : M. Famalé DIONSAN – CONTROLEUR DES FINANCES
LES PROFESSEURS HONORAIRES
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Pharmacognosie
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DER DES SCIENCES BIOLOGIQUES ET MEDICALES
1. Professeur/Directeur de recherche
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Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
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Biologie/parasitologie Chef de DER
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DICKO
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Immunologie
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Bactériologie-Virologie
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Hématologie
4. Assistant/Attaché de recherche
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Immunologie
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Immunologie
Thèse de Pharmacie
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Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
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DAOU
Immunologie
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DIARRA
Immunologie
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DEMBELE
Biochimie clinique
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GOITA
Biochimie clinique
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Bactériologie-Virologie
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Nutrition
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DOUMBIA
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MARIKO
Pharmacologie Chef de DER
KOUMARE
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Toxicologie
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Pharmacologie
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Yaranga
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3. Maître assistant
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4. Assistant/Attaché de recherche
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CISSE
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DEMBELE
Chimie thérapeutique
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TANDIA
Chimie analytique
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MARIKO
Chimie analytique
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DIALLO
Toxicologie
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
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Chimie analytique
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Sciences pharmaceutique
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Génétique
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KONE
Physiologie
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TRAORE
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Biologie/Parasitologie
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DOUCOURE
Physiologie
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Chimie minérale
M. Mamadou
CISSE
Biologie Végétale
3. Assistant/Attaché de recherche
M. Moussa
KONE
Chimie organique
M. Amidou
DOUCOURE
Chimie organique
COULIBALY
Biochimie
M. Oumar
GUINDO
Biochimie
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DIARRA
Botanique
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Thèse de Pharmacie
DIARRA
Bactériologie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
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KANTE
Galénique
M. Yaya
KANE
Galénique
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Biologie
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Bromatologie
M. Boubacar
ZIBEIROU
Physique
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Pr Babacar
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Pharmacodynamie
Pr Amadou
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Biochimie
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Pharmacie Hospitalière
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KANOUTE
Thèse de Pharmacie
Chimie analytique (en disponibilité)
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
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DEDICACES
Je dédie ce travail à :
A Mon père : M. OMOCK René-marcel
Cher papa, les mots seuls ne pourraient exprimer l’affection et le respect que je te porte. Tu
nous as mis, mes frères et moi, à l’abri du besoin et nous as appris la discipline, le respect de
l’autre, l’honnêteté, l’amour du travail bien fait. Surtout, tu m’as montré la voie de ce qu’est
un gagneur, voici, que ce travail soit la reconnaissance de tous les efforts et la patience fournis
pour nous. Merci, je t’aime.
A Ma mère : Mme EYOLE Ernestine épouse OMOCK
Femme douce ; généreuse ; attentionnée et bonne conseillère. Tu as été, maman, une épaule
sur laquelle je me suis toujours reposé dans les bons et les mauvais moments. Merci d’avoir
été toujours une source de persévérance et d’amour pour moi ; que le Seigneur Dieu vous
bénisse papa et toi. Ceci est le fruit de tes multiples encouragements.
A mes frères et sœurs : Joséphine Nadine, Christelle Tatiana, Jean-Marc
Je vous dédie ce travail. Vos prières m’ont portées chaque jour durant ces années d’étude
recevez ici l’aboutissement de vos accompagnements. Je vous aime.
A tous les membres de ma famille : Voici la reconnaissance de vos nombreuses prières et
encouragements.
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
i
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REMERCIEMENTS
Je remercie :
Le Mali, ma patrie d’adoption ; merci pour l’hospitalité et la leçon de savoir vivre en
communauté que j’ai reçue ces années. Puisse l’Eternel Dieu Tout Puissant accorder la paix à
cette belle terre et faire d’elle un territoire un et indivisible.
Mes maîtres : pour leur disponibilité et leurs enseignements.
La promotion DE GAULLE : Merci pour tout votre soutien. Born to Win !
Mes camarades de la VIème promotion de Pharmacie Ousmane DOUMBIA
Les Docteurs : Samba Adama SANGARE, ALLAYE TRAORE, NAMORI CAMARA, Dalil
BONABE , Neilly TEFO, pour avoir été d’excellents apprenants et soutiens.
Tout le personnel du Laboratoire Rodolphe Mérieux (LRM) de Bamako, je ne saurais
combien vous dire merci pour votre accueil et votre apprentissage.
Mes camarades du LRM de Bamako : Dr Lassina DOUMBIA, Tony ZITTI, Serges Lem
AHANOGBE, CISSE, Mme DIAKITE Doussou COULIBALY, Fatoumata O. MAIGA,
Elisabeth SOGODOGO, Sonia DJOUBI, merci pour votre compréhension à mon égard.
A toi, cher : Docteur TCHAMO NGUIFO Leonel
A travers ces quelques mots je voudrais te dire sincèrement merci. Tu as été un soutien
inconditionnel durant toutes ces années. Ta présence dans ma vie, ta rigueur dans les études
m’ont aidé à m’accepter, m’améliorer et à m’ouvrir aux autres. Je n’oublierai jamais tes
encouragements et tes nombreux conseils. Le Seigneur Dieu seul connait l’avenir, qu’il
exhausse nos prières et que sa volonté soit faite. Amen.
A tous ceux que j’aurais omis et dont les prières ont conduits à la finalité de ce travail, ceci
est votre récompense.
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
ii
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HOMMAGE AUX MEMBRES DU JURY
A notre maître et président du jury
Professeur Flabou BOUGOUDOGO, Pharmacien microbiologiste
-
Maître de Conférences Agrégé de bactériologie et virologie à la faculté de pharmacie ;
-
Responsable de l’enseignement de la bactériologie et de la virologie à la faculté de
pharmacie
-
Ancien Directeur de l’Institut National de Recherche en Santé Publique (INRSP)
-
Chevalier de l’ordre de mérite de la santé
Cher maitre, vous nous avez fait l’immense honneur de présider le jury de cet exercice
de thèse, soyez-en remercié.
Enseignant de renommée internationale, vos qualités scientifiques et humaines, ainsi
que vos apports et suggestions ont sans aucun doute rehaussés grandement la qualité de ce
travail.
Votre simplicité et votre disponibilité font de vous un maître apprécié et respecté de
tous. Soyez assuré, cher maître de notre disponibilité et de notre profonde gratitude.
A notre maître et juge
Docteur Ibréhima GUINDO
-
Pharmacien biologiste
-
Responsable du laboratoire des IST/VIH de l’INRSP
Cher maître, nous avons été très honoré de vous compter comme juge de ce travail.
Vos qualités en tant que Directeur scientifique, ont énormément rehaussé la valeur
scientifique de ce document.
Nous vous réitérons notre profond respect et vous remercions de votre immense
disponibilité.
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
iii
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
A notre maître et juge
Professeur KAYA Assétou SOUKHO
-
Spécialiste en Médecine interne
-
Spécialiste en endoscopie digestive
-
Praticienne hospitalière au service de Médecine interne du CHU Point G
-
Professeur Agrégé à la Faculté de Médecine et Odontostomatologie (FMOS)
Cher maître, nous vous sommes très reconnaissantes d’avoir accepté de juger ce travail.
Votre disponibilité et votre accueil nous ont permis d’apprécier vos qualités
scientifiques et humaines.
Chers maître, votre rigueur scientifique et l’amour pour l’excellence dans le travail font
de vous un maître respecté.
Veillez agréez le témoignage de notre profond respect et de notre sincère admiration.
A noter maître et directeur de thèse
Professeur Souleymane DIALLO II, Pharmacien biologiste
-
Maître de Conférences en Bactériologie à la faculté de pharmacie
-
Colonel Major des services de santé des armées
-
Directeur Général du Centre d’Infectiologie Charles Mérieux, Bamako
Cher maître, nous vous remercions de nous avoir confié ce travail. Votre rigueur
scientifique, votre compétence, font de vous un enseignant reconnu et respecté de tous. Nous
avons beaucoup appris à vos cotés particulièrement la rigueur scientifique, l’esprit d’équipe et
l’éthique. Nous nous engageons à rester fidèle à vos enseignements tout au long de notre vie.
Veuillez trouver en ces quelques mots l’expression de notre profonde gratitude.
Thèse de Pharmacie
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iv
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LISTE DES ABBREVIATIONS
CGPpr : cocci à Gram positif en paire
CGPch : cocci à Gram positif en chainettes
BGP : bacille à Gram positif
BGN : bacille à Gram négatif
DCGN : diplocoque à Gram négatif
CoccoBGN : cocco bacille à Gram négatif
HGT : Hôpital Gabriel TOURE
HPG : Hôpital du Point G
OMS : Organisation mondiale de la santé
ONG : Organisation non gouvernementale
DGE : Direction générale des élections
SIBI : suspicion d’infection bactérienne invasive
Hib : Haemophilus influenzae type b
S.P.S : poly anéthol sulfonate de sodium
BD : Becton Dickinson
CO2 : dioxyde de carbone
B.P.S : bactérie pathogène spécifique
NaCl : chlorure de sodium
ADN : Acide désoxyribonucléique
CMI : concentration minimale inhibitrice
PLP : protéines de liaison aux pénicillines
SARM : Staphylococcus aureus Résistant à la Méthicilline
SCN : Staphylocoques à coagulase négative
SNA : Staphylocoques non aureus
BMR : bactérie multi résistante
ATB : antibiotique
ATP : Adénoside triphosphate
LCR : liquide céphalorachidien
R : résistant
I : intermédiaire
S : sensible
CICM : Centre d’Infectiologie Charles Mérieux
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v
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LRM : Laboratoire Rodolphe Mérieux
MON : Mode opératoire normalisé
IST : Infection sexuellement transmissible
VIH : Virus de l’Immunodéficience humaine
INRSP : Institut National de Recherche en Santé Publique
CHU Point G : Centre Hospitalier Universitaire du Point G
FMOS : Faculté de Médecine et Odontostomatologie
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SOMMAIRE
Liste des figures .............................................................................................................................. ix
Liste des tableaux ...............................................................................................................................x
Introduction .....................................................................................................................................01
Objectifs ...........................................................................................................................................02
3. Généralités .......................................................................................................................................
A. Généralités sur les septicémies ................................................................................................03
1. Définitions ...............................................................................................................................03
2. Epidémiologie des septicémies ...............................................................................................03
3. Physiopathologie des septicémies ..........................................................................................04
B. Diagnostic d'une septicémie bactérienne ................................................................................06
1. Intérêt ......................................................................................................................................06
2. Hémoculture ...........................................................................................................................06
C. La résistance bactérienne aux antibiotiques .........................................................................14
1. Type de résistance ..................................................................................................................14
2. Evolution/Causes de la résistance ........................................................................................14
3. Supports de la résistance ........................................................................................................14
4. Mécanismes de la résistance ..................................................................................................15
5. Principaux germes isolés des hémocultures .........................................................................15
4. Méthodologie ....................................................................................................................................
4.1. Cadre d'étude ............................................................................................................................26
4.2. Type et période d'étude ............................................................................................................27
4.3. Population d'étude ....................................................................................................................27
4.4. Critères d'inclusion et de non inclusion .................................................................................27
4.5. Echantillonnage ........................................................................................................................27
4.6. Variables mesurées ...................................................................................................................27
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4.7. Méthodes ...................................................................................................................................28
4.8. Test de sensibilité aux antibiotiques .......................................................................................38
4.9. Conservation des souches ........................................................................................................44
4.10. Analyse des données ...............................................................................................................45
4.11. Aspects éthiques ......................................................................................................................45
5. Résultats ...........................................................................................................................................
5.1. Résultats globaux ......................................................................................................................46
5.2. Résultats descriptifs .................................................................................................................46
6. Discussion .........................................................................................................................................
6.1. Pratique de l'hémoculture .......................................................................................................61
6.2. Fréquence des hémocultures positives ...................................................................................61
6.3. Identification et test de sensibilité ...........................................................................................62
6.4. Fréquence des bactéries multi résistantes au LRM ..............................................................63
6.5. Conservation des souches ........................................................................................................64
7. Conclusion ....................................................................................................................................65
8. Recommandations .......................................................................................................................66
9. Références bibliographiques .......................................................................................................67
Résumé .............................................................................................................................................70
Abstract ............................................................................................................................................71
Annexes .............................................................................................................................................72
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LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Ultra structure de la paroi d’une bactérie à Gram négatif .........................................21
Figure 2 : L’automate BacT/ALERT 3D .......................................................................................30
Figure 3 : Bouillons de culture : à droite :FA , à gauche :FN ......................................................31
Figure 4 : L’automate VITEK 2 compact ......................................................................................37
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LISTE DES TABLEAUX
Tableau I: Répartition des hémocultures positives selon la provenance des prélèvements
au LRM de janvier 2013 à décembre 2013 ....................................................................................46
Tableau II: Répartition des hémocultures positives prélèvements au LRM en fonction
du sexe des patients de janvier 2013 à décembre 2013 .................................................................47
Tableau III: Fréquence des hémocultures positives en fonction de la tranche d’age au
LRM de janvier 2012 à décembre 2013 ..........................................................................................48
Tableau IV: Fréquence des espèces bactériennes isolées des hémocultures positives au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013 ..........................................................................................49
Tableau V: Répartition des espèces bactériennes isolées des hémocultures selon la
provenance au LRM de janvier 2013 à décembre 2013 ................................................................50
Tableau VI: Fréquence des bactéries résistantes aux antibiotiques testés dans les
hémocultures au LRM de janvier 2013 à décembre 2013 ............................................................51
Tableau VII: Sensibilité des germes isolés à l’Amoxicilline dans les hémocultures au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013 ..........................................................................................51
Tableau VIII: Sensibilité des germes isolés à l’association Amoxicilline-Acide
clavulanique dans les hémocultures au LRM de janvier 2013 à décembre 2013 .......................52
Tableau IX: Sensibilité des germes isolés à la Ticarcilline dans les hémocultures au LRM
de janvier 2013 à décembre 2013 ....................................................................................................53
Tableau X: Sensibilité des germes isolés à la Céfoxitine dans les hémocultures au LRM
de janvier 2013 à décembre 2013 ....................................................................................................54
Tableau XI: Sensibilité des germes isolés à la Céfotaxime dans les hémocultures au LRM
de janvier 2013 à décembre 2013 ....................................................................................................55
Tableau XII: Sensibilité des germes isolés à la Ceftazidime dans les hémocultures au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013 ..........................................................................................56
Tableau XIII: Sensibilité des germes isolés à l’Amikacine dans les hémocultures au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013 ..........................................................................................57
Tableau XIV: Sensibilité des germes isolés à la Gentamicine dans les hémocultures au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013 ..........................................................................................58
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Tableau XV: Sensibilité des germes isolés à la Ciprofloxacine dans les hémocultures au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013 ..........................................................................................59
Tableau XVI: Répartion des bactéries multi résistantes isolées au LRM de janvier 2013
à décembre 2013 ...............................................................................................................................59
Tableau XVII: Répartition des bactéries multi résistantes isolées en fonction de l’espèce
bactérienne au LRM de janvier 2013 à décembre 2013 ...............................................................60
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1. INTRODUCTION
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L’hémoculture, examen capital en pathologie infectieuse, n’est pas toujours praticable
dans bon nombre d’hôpitaux de pays à revenus faibles et le clinicien est souvent contraint de
suspecter la bactérie causale afin de définir une attitude thérapeutique. En effet, rares sont les
signes de certitude et le médecin raisonne plutôt par arguments de fréquence (1).
La connaissance des principales espèces bactériennes responsables de bactériémies et le profil
de sensibilité aux antibiotiques permettent de donner une base objective à l’antibiothérapie
probabiliste des infections (2).
De nombreux automates permettent aujourd’hui de détecter les hémocultures positives
grâce à la mise en évidence de produits métaboliques générés par la croissance des bactéries
(CO2, ion H+, variation du potentiel redox du milieu).
L’identification des bactéries à partir des hémocultures positives a eu un essor
considérable et les tests de sensibilité aux antibiotiques permettent de corriger rapidement la
prescription probabiliste. La réussite du traitement dépend alors du bon choix des
antibiotiques qui sont cependant rendus inefficaces le plus souvent par les phénomènes de
résistance bactérienne et même de multi résistances.
Les bactéries sont dites multi résistantes aux antibiotiques lorsque, du fait de
l'accumulation des résistances naturelles et / ou acquises, elles ne sont plus sensibles qu'à un
petit nombre d'antibiotiques habituellement actifs en thérapeutique (3).
La maîtrise de la diffusion des Bactéries Multi Résistantes (BMR) aux antibiotiques est
une priorité de santé publique. Les conséquences de leur diffusion sont cliniques, écologiques
et financières. La lutte contre les BMR est axée sur le bon usage des antibiotiques (réduction
de la pression de sélection) et la prévention de la transmission croisée. Elle repose en premier
lieu sur l’application stricte des précautions standards quels que soient le patient et le soin mis
en œuvre (3).
La fréquence des infections bactériennes, le mauvais usage des antibiotiques par la
population, et les défis liés à la sensibilité de ces derniers nous ont amené à une étude de
surveillance de la sensibilité aux antibiotiques des germes responsables de bactériémies au
Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako au Mali.
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1
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2. OBJECTIFS
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2.1. Objectif général :
Mettre en place un système de surveillance des résistances aux antibiotiques des bactéries
associées aux septicémies dans le Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
2.2. Objectifs spécifiques :
-
Mettre en place les bonnes pratiques d’hémoculture.
-
Déterminer la fréquence des hémocultures positives au LRM
-
Identifier les principales bactéries pathogènes dans les hémocultures au LRM.
-
Déterminer la fréquence des bactéries multi-résistances dans les hémocultures au
LRM
-
Constituer une souchothèque des bactéries multi résistantes en hémocultures au LRM
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2
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3. GENERALITES
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A. Généralités sur les septicémies
1. Définitions
L’hémoculture est une technique de laboratoire dont le but est de mettre en évidence la
présence ou l’absence de microorganismes (bactéries et levures) pathogènes dans le sang et
d’étudier leur sensibilité aux différents antibiotiques (4).
Une bactériémie est la présence de bactéries pathogènes dans le sang.
Elle traduit le plus souvent une infection localisée, parfois une infection endo-vasculaire
(Ex: infection sur cathéter, endocardite).
-
La présence de bactéries non ou peu pathogènes (staphylocoques à coagulase négative,
microcoques, corynébactéries…) dans les hémocultures peut résulter d’une
contamination lors du prélèvement, de l’ensemencement du flacon, au laboratoire.
-
pour ces micro-organismes il faut au moins 2 hémocultures positives au même micro
organisme (antibiotype) et une suspicion clinique pour porter le diagnostic d’une
bactériémie (5).
2. Epidémiologie des Septicémies
La résistance aux antimicrobiens est la conséquence inévitable de la prescription des
antibiotiques. «Quelles que soient les infections que l’on traite, les bactéries qui font partie de
notre flore normale sont toujours exposées à ces antibiotiques», affirme le Dr Hajo
Grundmann, qui est à la tête du Département des Maladies infectieuses et d’Épidémiologie de
l’Université de Groningen, et du Département de Bactériologie de l’Institut national de la
Santé publique des Pays-Bas. «En survivant simplement à l’attaque des antibiotiques, elles
développent des stratégies plus élaborées pour venir à bout des antibiotiques les plus
sophistiqués et les plus modernes.»
Il n’existe pas de données mondiales relatives au nombre de cas, y compris mortels,
d’infections bactériennes résistantes. D’après l’étude de 2008, il y a chaque année au moins
25 000 patients dans l’Union européenne à elle seule qui meurent d’une infection due à une
bactérie multi résistante, et les coûts de santé supplémentaires et la perte de productivité dus à
ces bactéries sont estimés à au moins 1,5 milliard d’euros.
Certaines des infections les plus résistantes sont causées par des Acinetobacter à Gram négatif
et par certaines souches de Klebsiella et espèces de Pseudomona, selon le Dr Spellberg. Ces
bactéries provoquent toutes sortes de maladies qui vont de la pneumonie contractée à l’hôpital
aux infections abdominales, en passant par les infections hématologiques et celles des voies
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urinaires dues aux cathéters; on voit même des cas de méningite chez des gens soumis à des
actes médicaux au niveau de la tête et du rachis, par exemple des péridurales pendant le
travail (3).
3. Physiopathologie d’une septicémie
Une septicémie se définit comme le passage répété de bactéries dans le sang, à partir d’un
foyer tissulaire de multiplication microbienne. Ce foyer s’est constitué lors du passage de
bactéries exogènes par une porte d’entrée muqueuse ou tégumentaire.
Au cours d’une septicémie, les bactéries régulièrement véhiculées par le sang peuvent aller
ensemencer d’autres tissus, créant alors des foyer secondaires ou métastases infectieuses
qui peuvent, à leur tour, ensemencer le sang circulant.
Les septicémies traduisent l’extension d’une infection tissulaire. L’entité pathologique
infectieuse est constituée par le foyer initial et les foyers secondaires éventuels.
3.1. Contextes cliniques
La symptomatologie clinique des septicémies est dominée par la fièvre fréquemment
accompagnée de frissons et sueurs ;
Le risque de choc septique, accident évolutif aigu redoutable, essentiellement dû aux toxines
bactériennes, et pouvant être responsable de la mort en quelques heures.
3.2. Modèles physiopathologiques
Selon les localisations de la porte d’entrée et du foyer, on distingue trois schémas
physiopathologiques principaux.
-
Les septicémies thrombophlébitiques, la porte d’entrée est souvent tégumentaire
(brèche cutanée traumatique ou chirurgicale, corps étranger). Le foyer se constitue au
voisinage de la porte d’entrée et consiste en un coagulum de fibrine infiltré de cellules
sanguines, immunitaires, et colonisé par les bactéries (thrombus infecté).
De ce thrombus se détachent irrégulièrement des fragments (microembols septiques) qui
ensemencent massivement le sang. Les métastases sont fréquentes et intéressent surtout les
tissus pulmonaires, nerveux, rénaux et le système réticulo-endothélial. L’aspect de la courbe
thermique est irrégulier (fièvre désarticulée) et les germes en cause sont surtout les
Staphylocoques et les Streptocoques.
-
Les septicémies à point de départ lymphatique : la porte d’entrée est souvent
digestive. Les bactéries pathogènes traversent la muqueuse intestinale et se multiplient
notamment au niveau des ganglions mésentériques qui constituent le foyer. A partir de ces
foyers mésentériques, quelques bactéries peuvent gagner le sang par le canal thoracique et
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aller constituer des métastases notamment dans le tissu réticulo-endothélial. Cependant, le
plus souvent, les bactéries restent dans les ganglions ou leur lyse libère de grandes quantités
d’endotoxines qui passent dans le sang. Il s’ensuit des chocs endotoxiniques fréquents et une
fièvre rythmée ou en plateaux de plus en plus élevés. Les bactéries impliquées sont souvent
des bactéries dites intracellulaires, notamment des Salmonelles (fièvre typhoïde), les
Brucelles (brucellose), etc.
-
Les endocardites surviennent surtout en cas de lésions cardiaques préexistantes
(valvulopathie par exemple) ou chez les porteurs de prothèse cardiaques ou vasculaires. A
l’occasion d’une bactériémie (le plus souvent d’origine tégumentaire ou dentaire), quelques
bactéries viennent coloniser un petit coagulum de fibrine infiltré de plaquettes au niveau de
l’endocarde lésé ou de matériel étranger intra vasculaire. Ce coagulum colonisé par les
bactéries augmente progressivement de taille par dépôt successif de fibrine, plaquettes et
cellules sanguines et devient une végétation qui constitue le foyer de la septicémie. A partir de
cette végétation, les bactéries ou/et les substances bactériennes sont relarguées dans le sang de
façon quasi permanente. La fièvre est peu élevée, mais presque permanente. Les bactéries
responsables sont fréquemment des Streptocoques. Les germes constituent au sein de la
végétation des défenses naturelles, des micro-colonies peu accessibles aux antibiotiques. De
plus, ces bactéries bien adaptées au milieu, sont parfois défectives (paroi absente ou
anormale). De ce fait, elles peuvent être résistantes aux antibiotiques (notamment aux bétalactamines) et difficilement cultivables
3.3. Autre formes physiopathologiques
-
En milieu chirurgical, en pathologie digestive ou obstétricale, les septicémies
peuvent revêtir des aspects particuliers dus à des inoculums massifs et poly
microbiens.
-
Chez le nouveau-né, la contamination se fait lors de la naissance ou plus rarement par
voie placentaire. Les germes fréquemment en causes sont Escherichia coli K1,
Streptocoques du groupe B, Listeria. Les signes cliniques sont particuliers : fièvre
ou hypothermie, détresse respiratoire.
-
Chez l’immunodéprimé, les germes en cause sont très variables selon le type
d’immunodépression. Il s’agit souvent de germes opportunistes : Champignons,
Pseudomonas, Mycobactéries etc. Les signes cliniques et les réponses aux traitements
sont modifiés par l’immunodépression.
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-
Chez les porteurs de dispositifs médicaux implantables (cathéters vasculaires,
sondes, prothèses, etc.), les germes en cause sont souvent des Staphylococcus aureus
ou non aureus producteurs de <<slime>>.
B. Diagnostic biologique d’une septicémie bactérienne
1. Intérêt
Le laboratoire de bactériologie intervient dans le diagnostic étiologique des septicémies, la
recherche du foyer, le choix d’un traitement et la surveillance de son efficacité.
Un traitement probabiliste est en général débuté dès que les prélèvements bactériologiques
sont effectués.
La recherche du foyer et de la porte d’entrée est un temps essentiel puisque la vraie
maladie n’est pas la présence de bactéries dans le sang mais l’existence d’un foyer qu’il
faudra stériliser pour guérir le malade. Les recherches bactériologiques sont, là encore,
prépondérantes. En particulier, il faudra cultiver tout matériel étranger enlevé (sonde,
cathéter) et faire des examens cytobactériologiques de divers prélèvements (suppurations,
biopsies, pièces chirurgicales, etc.) et des portes d’entrée possibles (urines, plaies, etc.).
La surveillance de l’évolution est à la fois clinique et biologique. Les meilleurs signes
d’amélioration sous traitement sont :

La disparition de la fièvre

La négativation des hémocultures

La stérilisation du ou des foyers
2. L’hémoculture
Principe
Le diagnostic étiologique d’une septicémie est assuré par l’hémoculture.
Devant un tableau clinique de septicémie, 1 à 3 hémocultures sont pratiquées en quelques
heures. Le sang est un milieu stérile et la présence d’une bactérie quelle qu’elle soit est
toujours anormale. L’hémoculture est un examen très performant. Il est sensible (on
détecte, en théorie, une seule bactérie viable dans l’échantillon examiné) mais il faut se
souvenir que 15% environ des hémocultures positives ont été contaminées lors du
prélèvement.
Au cours des septicémies, le nombre de bactéries dans le sang est souvent très faible. Une
quantité assez importante de sang doit donc être mise en culture si on veut avoir une chance
qu’elle contienne au moins une bactérie.
Au cours des septicémies, la présence de bactéries dans le sang est intermittente. Il est donc
nécessaire :
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
De réaliser plusieurs prélèvements

De les prélever lors des épisodes bactériémiques (fièvres, frissons).
Le sang contient des facteurs limitant la croissance bactérienne (phagocytose, complément,
lysozyme, anticorps, parfois antibiotiques). Il est nécessaire de diminuer leur activité en
diluant le prélèvement dans une grande quantité de milieu de culture (6).
Méthodes d’hémoculture L’hémoculture a deux techniques : une technique de diagnostic et
une technique thérapeutique.
2.1. Méthode de diagnostic :
Toute fièvre non expliquée doit faire chercher un état septicémique ; que le tableau soit
évocateur ou que la fièvre soit isolée. Une hypothermie majeure ; avec une température à
36,5° C, doit faire rechercher un état septicémique.
2.2. Méthode thérapeutique :
L’isolement et l’identification de la bactérie cliniquement significative, seront complétés par
une étude de sa sensibilité à diverses substances antibactériennes pour un ajustement de
l’antibiothérapie probabiliste préalablement instaurée par le clinicien, après ou avant le
prélèvement sanguin, en fonction du tableau clinique du patient.
2.3. Paramètres :
Afin de diminuer ce risque de faux positifs et d’identifier avec certitude la ou les bactéries
incriminées, certains paramètres techniques sont à prendre en compte
-
Paramètres pré-analytiques :
Ils sont essentiels pour rendre des résultats de qualité
Prélèvement sanguin
- Moment du prélèvement: le moment du prélèvement est capital. Pour une bactériémie
discontinue, la recommandation internationale est en faveur du moment des frissons ou un
clocher thermique pouvant correspondre à une décharge bactérienne.
Au cours des états fébriles prolongés et inexpliqués, le moment du prélèvement importe peu.
Le prélèvement est effectué avant toute antibiothérapie dans la mesure du possible. Dans le
cas contraire, une fenêtre thérapeutique est opérée pour effectuer les prélèvements.
Les prélèvements sont effectués à un intervalle d’environ une heure pour 2 à 3 hémocultures.
- Volume sanguin: le nombre de bactéries par ml de sang étant en général faible, il importe
de prélever une quantité suffisante de sang.
. Pour l’adulte, 10 ml par ponction veineuse périphérique. La veine du pli du coude est la plus
indiquée.
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. Chez l’enfant ou le nouveau-né, le volume de sang à prélever doit être déterminé par le
médecin traitant. Pour le nouveau-né, il est souvent difficile d’obtenir plus d’1 à 2 ml de sang.
Chez l’enfant, 2 à 5 ml de sang peuvent suffire.
- Technique de prélèvement: le prélèvement doit être effectué dans des conditions d’asepsie
rigoureuse. Il constitue une étape essentielle pour diminuer les contaminations car il faut
rappeler que 15 % environ des hémocultures positives sont contaminées lors du prélèvement
(6). La flore cutanée et environnementale est rendue responsable des contaminations.
L’interprétation des résultats devient alors problématique.
· Modes de prélèvement
Les modes de prélèvement sont variables.
. Des systèmes de prélèvement proposés dans le commerce sont largement utilisés de nos
jours. Le système est constitué d’une tubulure munie à chaque extrémité d’une aiguille
permettant l’une la ponction veineuse, l’autre l’inoculation des flacons.
. D’autres utilisateurs emploient simplement une seringue stérile montée avec laquelle ils
ensemencent les flacons au lit du malade.
. L’utilisation d’un Veinotube par certains centres peut être préjudiciable dans la mesure où
elle retarde l’ensemencement du sang et augmente les risques de contamination par une
manipulation supplémentaire nécessaire.
· Désinfection cutanée
Si les recommandations de l’OMS sont précises en matière de ponction veineuse, un accent
particulier est mis sur l’antisepsie pour l’hémoculture.
L’antisepsie de choix est la teinture d’iode qui est bactéricide.
Pour des sujets présentant une allergie connue à l’iode, l’utilisation du Chlorehexidine
alcoolique est recommandée. Le choix peut-être aussi porté sur la Bétadine dermique ou à
défaut l’alcool iodé.
La peau de la zone de prélèvement ainsi que les doigts du préleveur doivent recevoir deux
applications d’antiseptique espacées de deux à trois minutes (7).
-
Paramètres analytiques :
Différents facteurs influent sur la positivité d’une hémoculture.
-
Faible densité bactérienne :
Les bactéries sont le plus souvent en simple transit passif dans le sang. Le nombre de
bactéries mis en culture, est alors faible et souvent de l’ordre d’une bactérie/ml. Il est donc
nécessaire d’ensemencer plusieurs ml de sang dans divers flacons et à plusieurs reprises pour
majorer les chances de positivité d’une hémoculture.
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Les répétitions des cultures permettent de :
- diminuer les chances de manquer une bactériémie transitoire.
- confirmer le rôle pathogène d’isolements "saprophytes" tel que Staphylococcus epidermidis,
si l’on les retrouve dans plusieurs prélèvements veineux.
Le volume de sang prélevé est la variable la plus importante. Plusieurs études révèlent une
relation directe entre le volume de sang et le rendement de la technique. Le volume permet
une augmentation significative du rendement technique :
- Pour un prélèvement de 20 ml à 40 ml : + 10% de positivité
- Pour un prélèvement de 40 ml à 60 ml : + 19% de positivité
Une augmentation de volume entraine une augmentation de la sensibilité.
-
Vitalité bactérienne:
L’activation des différents mécanismes de défense de l’organisme, suite à une bactériémie,
affecte la vitalité des corps bactériens captés lors du prélèvement. Plusieurs éventualités se
présentent :
- Les corps bactériens sont intacts : ils sont soit libres dans le plasma en phase de
multiplication ou bien ils correspondent à des bactéries au repos.
- Les corps bactériens lésés ou masqués du fait du système immunitaire ou l’effet des
antibiotiques.
- Les corps bactériens sous forme "L" : correspondent à des bactéries déficientes
nutritionnelles.
La faible densité bactérienne, l’état lésé des corps bactériens, la phagocytose, expliquent que
la mise en évidence de la positivité d’une hémoculture est très souvent retardée dans le temps
par rapport à la rapidité d’obtention des cultures de repiquage au laboratoire.
-
Milieux de l’hémoculture
De très nombreux milieux présentés en flacon sous pression réduite, permettant
l’ensemencement direct à travers un opercule de caoutchouc, sont proposés par les fabricants.
Pour favoriser la multiplication des corps bactériens en faible densité, captés lors du
prélèvement il est nécessaire de procéder à une primo-culture.
a. Choix du bouillon
Le bouillon pour hémoculture doit favoriser la croissance des bactéries cliniquement
importantes.
Plusieurs bouillons sont utilisés :
- bouillon cœur- cervelle ;
- bouillon trypticase –soja ;
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- milieu au thioglycolate pour les anaérobies.
Un accent est mis sur la quantité de bouillon à ensemencer. L’O.M.S (Organisation mondiale
de la santé) recommande de mélanger le sang avec dix fois son volume de bouillon soit pour 5
ml de sang un équivalent de 50 ml de bouillon.

Facteurs de croissance
Certaines bactéries telles que les Streptocoques défectifs responsables de certaines
endocardites ont des besoins spécifiques pour leur croissance. Aussi, les bouillons doivent
être enrichis d’additifs ; ces facteurs sont le plus souvent présents dans le sang du
prélèvement.
Quel que soit le milieu, plusieurs additifs sont proposés.
- Atmosphère
La plupart des milieux commercialisés ont une atmosphère enrichie en CO2 et en Azote (N2).
L’enrichissement en oxygène pour les germes aérobies se fait au moment du prélèvement.
- Anticoagulant
Outre son rôle d’inhibition de la coagulation sanguine, il vise aussi à neutraliser les effets
antibactériens du sérum et des phagocytes.
Une concentration à 0,025% limite son effet inhibiteur sur la croissance des Neisseria et des
Peptostreptococcus.
L’anticoagulant habituellement utilisé est le S.P.S : Poly anéthol Sulfonate de Sodium.
D’autres anticoagulants tels que le citrate, l’héparine sont aussi utilisés.
- Saccharose
Une concentration de 10 à 15% de saccharose éviterait la lyse des bactéries à paroi déficiente.
Son efficacité n’est cependant pas encore démontrée.
- Molécules à groupement ≪ thiol ≫ ou ≪ pyridoxal ≫
Elles favorisent la croissance des bactéroides et de certains Streptocoques déficients. Le
groupement thiol neutralise un certain nombre d’antibiotiques, notamment les aminosides.
- Facteurs de croissance
L’hémine, la vitamine K3, favorisent le développement des bactéries exigeantes et des
anaérobies.
- Inhibiteurs d’antibactériens
La pénicillinase inactive les béta-lactamines en occurrence aux pénicillines.
L’acide para-amino-benzoïque neutralise les sulfamides.
Si divers milieux sont proposés, leurs compositions sont le plus souvent l’objet de protection
industrielle.
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b. Flacons d’hémoculture
- Constitution des flacons : De très nombreux milieux sont présentés par les fabricants en
flacons sous pression réduite, permettant l’ensemencement direct à travers un opercule de
caoutchouc. Ils contiennent le bouillon nécessaire pour la primo culture du prélèvement
sanguin.
- Typologie des flacons
Malgré la diversité des flacons sur le marché, deux types de flacons sont proposés au clinicien
en pratique courante pour respecter le type respiratoire des micro-organismes.
. Flacons aérobies
Grâce à leur atmosphère enrichie en oxygène, ils favorisent la croissance et la multiplication
des bactéries aérobies strictes rencontrées en clinique. Le milieu de culture est mono ou bi
phasique.
. Flacons anaérobies
Ces flacons grâce au bouillon spécifique qu’ils renferment, favorisent la culture des bactéries
anaérobies strictes.
. Flacons spéciaux
D’autres types de flacons sont proposés en fonction de la clinique du patient par les fabricants
(7).
2.4. Identification des germes :
Dès réception au laboratoire les flacons doivent être incubés à 35-37°C et inspectés
régulièrement. La durée d’observation varie de 1 à 7 jours, lorsqu’il s’agit de la détection
automatisée.
Devant une croissance définie par l’automate, le flacon est sorti, ouvert aseptiquement
après désinfection de l’opercule de caoutchouc et une petite quantité de bouillon est prélevée
à l’aide d’une anse stérile ou d’une aiguille stérile adaptée à l’usage. Un frottis coloré par la
méthode de Gram permet de repérer la présence des germes.
Le résultat de la coloration de Gram est communiqué au médecin prescripteur ainsi qui suit :
(Par exemple : CGPgr, CGPpr, CGPch, BGP, BGN, CoccoBGN, DCGN, Levures…)
Un examen microscopique est complété par des repiquages sur milieux solides.
Repiquage et isolement - Identification
La réalisation des repiquages se fait en ensemençant en stries le contenu d’une anse ou une
goutte de bouillon prélevée à l’aiguille, sur des milieux solides appropriés.
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L’identification du germe se fera selon l’aspect des colonies sur des milieux différents de
repiquage. A cet effet, au Laboratoire Rodolphe Mérieux les milieux utilisés pour la
réalisation de subcultures à partir des flacons d’hémoculture sont :

la gélose chocolat Poly vitex ; (milieu sur lequel toutes les bactéries se développent)

la gélose au sang frais (gélose COS) ;

la gélose Drygalski (sélective pour les bacilles à Gram négatif) ;
Dans des conditions ou les risques de souillure sont élevés, il est possible de procéder à des
subcultures à ≪ l’aveugle ≫.
-
Détection automatisée
Divers automates (BACTEC 9050 chez BD, Bio Argos, BacT/ALERT 3D chez Bio Mérieux,
Organon Technica) permettent aujourd’hui de détecter des hémocultures positives grâce à la
mise en évidence de produits métaboliques générés par la croissance des bactéries (CO2, ion
H+, variation du potentiel redox du milieu). Ces méthodes permettent un rendu beaucoup plus
précoce des résultats. La qualité des milieux utilisés permet l’isolement de bactéries autrefois
rarement découvertes dans des hémocultures (Haemophylus, Campylobacter). Ces automates
sont cependant onéreux et ne sont utilisés que par les laboratoires pratiquant un nombre
important d’hémocultures (6).
-
Résultats - Interprétation :
Les résultats d’une hémoculture peuvent revêtir deux aspects :
•
Résultats négatifs
Toutes les hémocultures réalisées sont négatives. Un tel résultat est un bon argument pour
éliminer une septicémie, à condition bien sur que les conditions de réalisation aient été
scrupuleusement observées.
Cependant, plusieurs hémocultures peuvent être négatives malgré une clinique évocatrice.
Plusieurs causes d’échec peuvent expliquer l’obtention de faux négatifs :
. Prélèvement effectué au mauvais moment ou tardivement,
. Prélèvement fait sous antibiothérapie,
. Quantité insuffisante de sang ensemence,
. Milieux ou conditions de cultures inappropriées,
. Temps d’observation trop court,
. Mauvaise observation des flacons,
. Mauvais choix des conditions de subcultures.
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Pratiquée avant toute antibiothérapie, et suivant un protocole rigoureux devant maintenir
continuellement une asepsie totale, l’hémoculture constitue l’élément capital du diagnostic
d’une bactériémie physiologique ou pathologique. Les résultats de l’hémoculture en cas de
positivité doivent cependant être complétés par l’étude de l’activité des substances
antibactériennes en vue d’une antibiothérapie en rapport avec la clinique du patient. La
confrontation entre les résultats en laboratoire et la clinique s’avère donc indispensable à
toutes les étapes du diagnostic.
•
Résultats positifs
L’interprétation des résultats est parfois délicate et nécessite une étroite collaboration entre le
clinicien et le microbiologiste.
Schématiquement, on peut distinguer deux types de résultats :
- Premier cas
Plusieurs hémocultures pratiquées chez un même patient sont positives et contiennent la
même espèce bactérienne. L’interprétation est aisée, le diagnostic de bactériémie
pathologique peut-être posé et la bactérie est considérée comme responsable même si elle
n’est pas reconnue comme une bactérie pathogène opportuniste.
Cependant dans certains cas, en fonction de la porte d’entrée, les hémocultures positives
peuvent être poly microbiennes chez un même sujet.
L’interprétation est plus difficile. La localisation du foyer infectieux permet de régler en
général le problème. Ils sont surtout observés en cas de cathéters longtemps maintenus en
place ou chez les patients immunodéprimés et très souvent chez les agonisants.
- Deuxième cas
Sur l’ensemble des hémocultures pratiquées chez un malade, une seule est positive.
L’interprétation consistera ici à démontrer que le germe isolé provient ou non d’une
contamination.
. S’il s’agit d’une bactérie pathogène spécifique (B.P.S.), elle peut être considérée comme
responsable.
. S’il s’agit au contraire d’une bactérie peu fréquemment retrouvée comme germe de souillure,
en l’occurrence les entérobactéries, les Streptocoques, elle peut-être considérée comme
responsable surtout si le foyer infectieux est évocateur ou si le contexte clinique est en faveur
de sa responsabilité.
. La bactérie est fréquemment responsable de contamination. Sa responsabilité ne sera admise
que si le même germe est découvert au niveau du foyer infectieux ou de la porte d’entrée
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C. La résistance bactérienne aux antibiotiques
La résistance bactérienne est supportée par deux mécanismes distincts : les mutations
génétiques de novo et les transferts d’éléments génétiques mobiles.
1. Types de résistance
-
Résistance naturelle :
Certaines souches sont naturellement résistantes à certains antibiotiques (ex. : Listeria
monocytogenes ou entérocoque aux Céphalosporines de troisième génération, anaérobies aux
aminosides, bacilles à Gram négatif aux Glycopeptides...)
-
Résistance acquise :
Souches qui en condition naturelle (= sauvages) sont sensibles à l’antibiotique mais qui ont
acquis des mécanismes de résistance à cet antibiotique (ex. : Streptococcus pneumoniae et
Pénicillines ou Macrolides, entérobactéries et ß-lactamines, Staphylococcus aureus et
Pénicillines...).
2. Evolution/causes de la résistance
Elle dépend : de la pression de sélection exercée par les antibiotiques des caractéristiques des
différents antibiotiques (pharmacocinétiques, pharmacodynamiques) et de chaque couple
antibiotique/bactérie (support, modalités et fréquence de la résistance) de la capacité de
certaines espèces à accepter des gènes de résistance provenant d’autres espèces, favorisée de
plus par les colonisations/infections pluri-microbiennes au sein d’un même site/hôte de la
possibilité de la transmission interhumaine.
La sélection de bactéries résistantes est un effet inéluctable de l’utilisation des antibiotiques.
Sélection in vivo de bactéries résistantes sous traitement antibiotique dans le foyer infectieux
Modification des flores commensales avec acquisition de bactéries résistantes en dehors du
foyer infectieux. D’où l’importance d’une politique de “bon usage des antibiotiques” : acte
thérapeutique concluant une procédure diagnostique par un clinicien, ayant pour but la
guérison d'une infection tout en ayant une efficacité optimale, une bonne tolérance, des
conséquences écologiques minimales et un coût acceptable par la société.
3. Supports de la résistance
Chromosomique = liée à une mutation sur le chromosome bactérienne s’exerce que vis-à-vis
d’un seul antibiotique en général non transférable d’une espèce bactérienne à l’autre concerne
surtout les Quinolones, les Rifamycines, la Fosfomycine, l’Acide fusidique avec un taux de
mutation élevé.
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Extra-chromosomique : le plus fréquent, le plus souvent plasmidique pouvant porter
plusieurs résistances à la fois transmissibles entre différentes bactéries de la même espèce,
voire entre espèces différentes.
4. Mécanismes de la résistance :
Dépendent de :

Inactivation enzymatique de l’antibiotique (ex. pénicillinases).

Modification de la cible (ex. modification de la protéine de liaison aux pénicillines
pour S. pneumoniae et S. aureus).

Diminution de la perméabilité membranaire.

Augmentation des mécanismes d’efflux (4)
5. Principaux germes isolés des hémocultures
Il convient tout d'abord de distinguer les bactériémies vraies des contaminations.
Si les bactériémies vraies sont le plus souvent mono microbiennes, une hémoculture positive
poly microbienne (associée à certaines espèces) oriente plutôt vers une contamination du
prélèvement. Bacillus, Corynebacterium et Propionibacterium, bactéries de la flore cutanéomuqueuse, sont des contaminants dans plus de 95% des cas. Les staphylocoques à coagulase
négative (85% de contaminants), les entérocoques (20% de contaminants), et les
streptocoques du groupe viridans (60% de contaminants) peuvent cependant, dans un certain
nombre de cas, être responsables de bactériémies vraies : la distinction vrai/ faux positif
pourra se faire en répétant les hémocultures chez le malade et surtout en tenant compte de la
clinique.
5.1. Cocci à Gram Positif :

Streptocoques
-
Définition :
La famille des Streptococcaceae regroupe les genres Streptococcus, Enterococcus, et
Lactococcus, rassemblant des cocci à Gram positif souvent disposés en chainettes, dépourvus
de catalase, Aéro-anaérobies et à métabolisme fermentatif.
-
Classification :
La première classification était basée sur l’aspect de l’hémolyse entourant les colonies de
Streptocoques sur gélose au sang. On distinguait ainsi :

Les Streptocoques béta-hémolytiques : lyse complète des hématies avec destruction
complète des stromas globulaires autour des colonies ;
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
Les Streptocoques alpha-hémolytiques : lyse incomplète, zone plus petite à bords
irréguliers avec souvent un reflet verdâtre du milieu de culture (Streptocoques dits
viridans) ;

Les Streptocoques non hémolytiques
Une des classifications des Streptocoques est basée sur des critères immunologiques
(classification de Lancefield). La plupart des Streptocoques possèdent dans leur paroi un
polysaccharide C dont la composition et les propriétés antigéniques variables permettent de
définir des groupes sérologiques. Cette classification distingue 18 groupes sérologiques
(désignés de A à H et de K à T). Les Streptocoques dépourvus d’antigène polysaccharidique
ne sont pas groupables par la méthode de Lancefield. Ils sont identifiés par leurs caractères
culturaux et par leurs caractères biochimiques. Les études des homologies entre les ADN ont
permis d’individualiser des groupes génomiques et de reconnaitre de nouvelles espèces.
Néanmoins, en pratique, les souches sont identifiées par l’étude de leurs caractères
phénotypiques.

Streptococcus pneumoniae :
A l’examen microscopique S. pneumoniae apparait formé de cocci à Gram positif, souvent en
diplocoques ovoïdes ou lancéolés opposés par leur pointe, formant un 8 et entourés par une
large capsule. Parfois ils peuvent se présenter en courtes chainettes. La capsule est mieux
visible après préparation à l’encre de Chine.
C’est une bactérie très fragile, sensible au froid et à la dessiccation et qui s’autolyse
rapidement en culture. Aéro-anaérobie, sa culture sur milieux riches (gélose au sang) doit être
faite à 37° C, sans délai après le prélèvement.
Sur gélose au sang, après 24 heures d’incubation, les colonies sont petites (goutte de rosée),
entourées d’une zone d’hémolyse alpha, verdâtre. S. pneumoniae se distingue des autres
Streptococcus par sa sensibilité à l’Optochine et par la lyse que produisent les sels biliaires sur
une culture en bouillon.

Sensibilité aux antibiotiques
-
Sensibilité diminuée aux béta-lactamines
Les souches de S. pneumoniae sont naturellement sensibles aux béta-lactamines, notamment à
la pénicilline G et à l’Amoxicilline avec des CMI inférieur à 0,06 mg/l. Néanmoins la
proportion des souches de sensibilité intermédiaire (I) à la Pénicilline (CMI comprise entre
0,1 et 1 mg/l) et celle des souches résistantes (R) à la Pénicilline (CMI supérieur à 1mg/l) ne
cesse de croitre.
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16
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
La détection d’une souche résistante à la pénicilline doit conduire à la détermination de la
CMI des autres béta- lactamines car il existe des résistances croisées à des niveaux variables.
Le Céfotaxime et l’Imipenème restent généralement actifs. Les souches résistantes
appartiennent préférentiellement aux sérotypes 23F, 6, 19 et 14.
-
Autres familles d’antibiotiques
Environ 50% des souches sont résistantes aux Macrolides mais restent sensibles aux
Synergistines. Plus de 30% des souches résistent à la Tétracycline, 25% au Chloramphénicol
et 40% au Cotrimoxazole. Seuls les Glycopeptides sont constamment actifs.
Il existe une résistance naturelle aux Aminosides, à l’Acide fusidique, aux Polymyxines et à la
plupart des Quinolones (6).

Genre Staphylococcus :
-
Définition
Le genre Staphylococcus appartient à la famille des Micrococcaceae qui regroupe des
espèces bactériennes constituées de cellules arrondies (cocci) à Gram positif, immobiles,
disposées en amas, à la façon d’une grappe de raisin.
Les staphylocoques produisent une catalase, ce qui les distingue des Streptocoques et des
Entérocoques. Ils sont Aéro-anaérobies et poussent facilement sur milieu ordinaire (6).
-
Classification
L’opposition entre (Staphylococcus doré pathogène) et (Staphylocoque blanc non pathogène)
est historique et insuffisante car elle ne correspond pas à la réalité. On distingue aujourd’hui :
L’espèce Staphylococcus aureus. Elle produit une coagulase (enzyme capable de coaguler le
plasma de lapin oxalaté). Elle est très souvent responsable d’infections pyogènes graves. C’est
aussi une espèce saprophyte ou commensale, isolée de prélèvements sur la peau ou les
muqueuses ou sa présence est normale.
a) Staphylococcus aureus :
Cette espèce est l’une des bactéries la plus souvent isolées au laboratoire de bactériologie
médicale. Après culture de 24 heures sur gélose nutritive, S. aureus donne des colonies
produisant en général un pigment doré. Il pousse et fermente le mannitol sur milieu de
Chapman, faisant virer le rouge de phénol au jaune. Ce milieu contient une concentration de
7,5% de NaCl qui inhibe la plupart des autres germes. Ce qui caractérise le mieux l’espèce
aureus c’est la production d’une staphylo-coagulase, enzyme facile à mettre en évidence au
laboratoire (1). Staphylococcus aureus se présente sous forme de Cocci arrondis, immobiles,
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17
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
soit isolés, soit regroupés en courtes chainettes ou en amas dans le pus ou les éléments sont
tantôt libres tantôts phagocytés (6).
Comme les autres Staphylocoques, Staphylococcus aureus est présent dans l’environnement
(air, sol, aliments, mobilier, et matériels). Vit fréquemment à l’état commensal sur la peau et
les muqueuses de l’homme et des animaux (8).

Sensibilité aux antibiotiques :
Les béta-lactamines :
La pénicilline G est très active sur les souches de S. aureus non productrices de pénicillinase,
mais ces souches sont rares aujourd’hui (inférieur à10%). Les souches productrices d’une
pénicillinase redeviennent sensibles à l’Amoxicilline en présence d’Acide clavulanique. Les
Pénicillines semi-synthétiques du groupe M (méthicilline et oxacilline) ne sont pas détruites
par la pénicillinase de S. aureus. Ce sont d’excellents antibiotiques anti-staphylococciques.
De 10 à 50% des souches de S. aureus isolées dans les hôpitaux français résistent à la
Méthicilline et à l’Oxacilline. Ce pourcentage varie selon les services. Ces souches sont
désignées comme Staphylocoque Aureus Résistant à la Méthicilline (SARM) ou encore
comme souches (méthi R). Cette résistance est aussi qualifiée d’<<homogène>>. En effet,
pour certaines souches, seulement une partie de la population bactérienne est capable in vitro,
dans des conditions techniques précises, d’exprimer sa résistance. Les travaux cliniques ont
montré que toutes les Pénicillines et toutes les Céphalosporines sont actives sur les
souches Résistantes à la méthicilline.
Les Glycopeptides :
La Vancomycine et la Téicoplanine sont des antibiotiques de recours pour traiter les
septicémies et les endocardites dues à des souches de S. aureus multi résistantes. Leurs
indications sont limitées aux infections mettant en jeu le pronostic vital et pour lesquelles
aucune autre antibiothérapie n’est efficace. L’émergence de mutants résistants au cours de
monothérapies par la Vancomycine a été signalée depuis 1997.
Ces souches de moindre sensibilité aux Glycopeptides sont désignées comme GISA :
Glycopeptides Intermediate Staphylococcus aureus.
Autres familles d’antibiotiques :
Les souches résistantes à la Méthicilline sont habituellement résistantes à de nombreux autres
antibiotiques, notamment aux Aminosides et aux Fluoroquinolones. Parmi les Macrolides,
l’Erythromycine a une activité inconstante. Le traitement des infections graves à S. aureus ne
peut se faire sans une étude approfondie au laboratoire de la sensibilité de la souche, en
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18
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
réserve à l’usage local. Elle est principalement utilisée pour éradiquer le portage nasal de S.
aureus (6).
b) autres Staphylocoques :
Les Staphylocoques autres que Staphylococcus aureus sont souvent identifiés aux espèces
non productrices de coagulase et sont connus comme Staphylocoques à coagulase négative"
(SCN). Leur identification se faisant par opposition à Staphylococcus aureus, d’ou le terme de
"Staphylococcus non aureus " (SNA) serait cependant préférable. Ce sont les principaux
commensaux de la peau mais ils sont également isolés des muqueuses. La densité de
colonisation est plus importante au niveau des régions situées à proximité des orifices ou les
zones humides comme la partie antérieure des narines, le périnée, les creux axillaires et les
plis inguinaux (9).
5.2. Cocci à Gram négatif :

Généralités sur les Neisseriaceae
Le genre Neisseria de la famille des Neisseriaceae rassemble des cocci à Gram négatif,
groupés par deux en diplocoques opposés par leur face plane, immobiles, possédant une
oxydase, une catalase et aérobies stricts.
Deux espèces du genre Neisseria, Neisseria gonorrhoeae et Neisseria meningitidis, sont
habituellement pathogènes pour l’homme. Elles exigent pour leur culture des milieux riches et
une température de 37°C. Elles ne dénitrifient ni les nitrates, ni les nitrites.
Les autres espèces de Neisseria sont peu exigeantes pour leur croissance. Elles poussent sur
gélose ordinaire, réduisent les nitrates ou les nitrites et n’ont qu’un pouvoir pathogène
occasionnel. Elles peuvent parfois être responsables de pneumopathies ou de méningites.
Les Neisseria ne sont jamais rencontrées comme saprophytes dans l’environnement, elles sont
soit pathogènes, soit commensales des muqueuses de l’homme et des animaux.
-
Neisseria meningitidis
Neisseria meningitidis est une bactérie spécifique de l’homme et dont l’habitat est le
rhinopharynx. Sa transmission interhumaine se fait par voie aérienne par les gouttelettes de
Pflugge (salive) sur une distance n’excédant pas un mètre. La transmission est associée à une
exposition proche et répétée.
-
Les infections bactériennes à Neisseria meningitidis représentent environ 20% des
cas. Elles ont encore un pronostic redoutable malgré l’antibiothérapie (létalité : 30%).
La méningococcie fulminante se manifeste par un purpura extensif et souvent
nécrotique associé à un état de choc sévère et à une coagulopathie de consommation.
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
En matière de méningococcies, il y a une relation nette entre la létalité et le délai
d’institution du traitement. La mortalité reste lourde, de 8 à 10% des cas. Aussi, toute
suspicion du diagnostic impose une hospitalisation en urgence.
D’autres formes cliniques sont rarement observées : endocardites, péricardites,
conjonctivites, otites, arthrites, infections broncho-pulmonaires (6).
5.3. Bacilles à Gram positif
Les bacilles dits ''Gram positif'' sont les bacilles répondant positivement au test de Gram. Le
test de Gram vise à déterminer la nature des bactéries en cause et non la gravité de l'infection.
Une infection par un bacille Gram positif n'est en soi ni plus grave ni moins grave qu'une
infection par des bacilles Gram négatifs. Le test de Gram permet d'ajuster les traitements
antibiotiques. Il existe plusieurs types principaux de bacilles Gram positifs, entre autres nous
pouvons citer :
Listeria monocytogenes (provoquant la listériose.) et Corynebacterium spp.

Listeria monocytogenes :
Ce sont de petits bacilles ubiquitaires, que l’on trouve dans le sol sur les plantes, et dans les
eaux (saprophytes). L.monocytogenes est une bactérie opportuniste responsable par diffusion
hématogène de trois types d'infections chez l'homme :
-
Listeriose de l'adulte et de l'enfant : méningites, méningo-encéphalites, encéphalites,
septicémie. La grande majorité de ces infections se produisent chez des malades
porteurs de tares viscérales (cirrhose, cancers, etc.…). La listériose de l'adulte atteint
essentiellement les personnes âgées et immunodéprimées.
-
Listériose de la femme enceinte : infection bénigne pour la femme, se traduisant
souvent par une simple fièvre mais grave pour le fœtus, pouvant provoquer un
avortement, la mort in utero ou l'accouchement prématuré.
-
Listériose néonatale : septicémie, méningite secondaires à la contamination dans les
jours qui précèdent l'accouchement ou au moment de l'accouchement (10).
5.4. Bacilles à Gram Négatif
Les bactéries à Gram négatif sont mises en évidence par une technique de coloration appelée
coloration de Gram. Les bactéries à Gram négatif apparaissent alors rosées au microscope. La
technique de coloration repose sur les caractéristiques membranaires et de paroi de la bactérie.
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
La coloration de Gram est un facteur déterminant dans la taxonomie (classification)
bactérienne.
Les bactéries à Gram négatif ont une structure qui s'organise en trois grandes parties, soit, de
l'extérieur vers l'intérieur :

La membrane externe,

L'espace péri plasmique, comportant notamment la paroi,

La membrane plasmique.
-
Enterobacteriaceae :
Figure 1 : Ultra structure de la paroi des bactéries à Gram négatif (source : (6))
Les Enterobacteriaceae ou entérobactéries sont une vaste famille de bactéries qui sont
rencontrées tous les jours en bactériologie médicale. Elles sont nommées ainsi parce que la
plupart des espèces qui composent cette famille sont des hôtes, soit normaux, soit pathogènes,
du tube digestif de l’homme et des animaux.
En fait la famille des Enterobacteriaceae est définie par des caractères bactériologiques et non
par des caractères écologiques. Les Enterobacteriaceae sont des bacilles à Gram négatif qui :
- s’ils sont mobiles, sont péritriches (cils disposés tout autour du corps bactérien) ;
- poussent sur milieux ordinaires ;
- poussent en aérobiose et en anaérobiose ;
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21
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- réduisent les nitrates en nitrites ;
- ont une réaction d’oxydase négative ;
- utilisent le glucose par voie fermentative.
Cette définition permet d’exclure de la famille des Enterobacteriaceae d’autres bacilles à
Gram négatif, par exemple les Pseudomonas, les Vibrio et les Aeromonas.
La famille des Enterobacteriaceae regroupe différents genres : Certains genres sont
anciennement décrits et les plus souvent rencontrés en pathologie. Ce sont :
- Escherichia, Shigella.
- Salmonella, Arizona, Citrobacter.
- Proteus, Providencia, Morganella.
- Klebsiella, Enterobacter, Serratia (groupe KES ≪ VP +≫), Hafnia.
- Yersinia, Edwardsiella.
D’autres genres, plus récemment décrits, sont parfois trouvés dans l’environnement et sont
rarement isolés chez l’homme.
Ce sont :
Buttiauxella, Cedecea, Ewingella, Kluyvera, Koserella, Leclercia, Leminorella,
Moellerella, Obesumbacterium, Rhanella, Tatumella,Trabulsiella,
Xenorhabdus, Yokenella.
L’identification des entérobactéries se fait d’abord par l’étude des caractères biochimiques.
Mais au sein d’une même espèce, la variabilité de certains caractères permet de différencier
les souches entre elles et de déterminer des biotypes.
L’étude des différents antigènes, qui intervient après celle des caractères biochimiques,
permet de classer en sérotypes les souches appartenant à une même espèce ou à un même
genre.
La détermination des sérotypes a un grand intérêt épidémiologique pour certaines
entérobactéries pathogènes : Salmonella, Shigella, Escherichia coli (6).
-
Les entérobactéries opportunistes
Ce sont des Enterobacteriaceae commensales du tube digestif de l’homme. A l’occasion d’un
affaiblissement des défenses immunitaires ou de techniques de soin, de réanimation
particulièrement, ces bactéries peuvent coloniser différents sites anatomiques et y développer
une infection.
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22
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
Enterobacter
Les Enterobacter sont des bacilles à Gram négatif, appartenant à la famille des
Enterobacteriaceae dont ils ont tous les caractères. Les espèces du genre Enterobacter sont
généralement mobiles, fermentent ou non le lactose. Ils ont une béta-galactosidase et donnent
une réaction de Voges-Proskauer (VP) positive. La classification des Enterobacter a été
l’objet de nombreux remaniements.
A coté de Enterobacter cloacae et Enterobacter aerogenes, les plus souvent rencontrés, on
distingue les espèces suivantes : E. amnigenus, E. asburiae, E. cancerogenus, E. gergoviae,
E. hormaechei, E. sakazakii. L’espèce E. hafnia constitue aujourd’hui le genre Hafnia
E. agglomerans est classée comme Pantoea agglomerans.
Les Céphalosporines de troisième génération semblent favoriser l’émergence des souches
multi résistantes d’Enterobacter.
Enterobacter cloacae et Enterobacter aerogenes, les plus souvent isolés, sont responsables
d’infections urinaires, de suppurations diverses, de bactériémies. Enterobacter sakazakii a été
responsable de petites épidémies de méningites néonatales.
Le pouvoir pathogène des autres espèces doit être précisé.

Sensibilité aux antibiotiques
Les Enterobacter, notamment Enterobacter cloacae, sont souvent résistants à de nombreux
antibiotiques et le traitement doit être guidé par des tests de laboratoire. Il est important au
cours d’une infection par Enterobacter cloacae de surveiller attentivement l’efficacité d’un
traitement par de nouvelles béta-lactamines. En effet, cette espèce peut devenir résistante au
cours du traitement, soit par diminution de la perméabilité de la paroi bactérienne, soit par une
hyperproduction d’une Céphalosporinase (6).
-
Autres Bacilles Gram Négatifs

Haemophilus influenzae type b (Hib) :
C’est un bacille à Gram négatif immobile de petite taille (0,5 – 2,5), agent supposé de la
grippe (influenza) reçoit le nom générique d’Haemophilus car il exige pour sa croissance des
milieux enrichis au sang et une atmosphère enrichie en CO2 : Haemophilus influenzae type b
(Hib)
est un hôte exclusif des muqueuses de l’homme principalement au niveau des voies
aériennes supérieures ≫ (11).
Sensibilité aux antibiotiques : Jusqu’en 1974, l’ampicilline était le traitement de choix des
méningites à H. influenzae. Depuis cette date on connait des souches hébergeant un plasmide
codant pour une béta-lactamase qui hydrolyse la Pénicilline G et l’Ampicilline, mais qui est
inactive sur les Céphalosporiness. Cette production de béta-lactamase concerne 15 à 25% des
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souches non capsulées isolées en pathologie respiratoire chez l’adulte. Cette situation fait
utiliser d’emblée une Céphalosporine de troisième génération pour traiter les infections
invasives. La résistance des souches varie en fonction de la nature du prélèvement,
globalement, elle concerne pour la tétracycline 10% des souches, le Chloramphénicol 3%, la
Kanamycine 25% et le Cotimoxazole 10%. Toues les souches sont sensibles aux
Fluoroquinolones (6).

Pseudomonas aeruginosa :
Pseudomonas aeruginosa ou Bacille pyocyanique est un commensal du tube digestif, mais
peu abondant chez le sujet sain, occasionne de nombreuses infections chez le sujet fragilise.
Pseudomonas aeruginosa est un bacille à Gram négatif, il est très mobile grâce à une ciliature
polaire en général mono triche (12).
Sensibilité aux antibiotiques : P. aeruginosa est une bactérie généralement multi résistante.
Les antibiotiques pouvant avoir une bonne activité sont : la Ticarcilline, la Pipéracilline,
l’Azlocilline, la Ceftazidime ; la Cefsulodine, le Céfépime, l’Imipenème et les Aminosides.
Les souches résistantes à la Colistine sont très rares. La Ciprofloxacine est la plus active des
Quinolones. L’activité de tous ces antibiotiques n’est pas régulière et doit toujours être
précisée par l’antibiogramme (6).
Les bactéries anaérobies strictes
-
Définition
Les bactéries anaérobies strictes sont dépourvues des enzymes du métabolisme respiratoire et
doivent produire leur énergie par fermentation. En fonction de leur comportement vis-à-vis de
l’oxygène on peut distinguer les EOS et les anaérobies stricts.
•
Les EOS (extremely oxygen-sensitive)
Ces bactéries ne tolèrent aucun contact avec l’oxygène et meurent immédiatement dans une
atmosphère qui en contient.
•
Les anaérobies strictes
Pour ces bactéries l’oxygène est toxique, mais à un degré moindre que pour les EOS. Pour se
développer elles nécessitent une atmosphère dépourvue d’oxygène. Les anaérobies ayant un
intérêt médical appartiennent à cette catégorie.
-
Classification
Il est habituel de distinguer deux grands groupes d’anaérobies stricts :
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24
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•
Les anaérobies telluriques :
Bacilles à Gram positif sporulés du genre Clostrdium. La spore, forme de résistance, permet
leur survie en milieu hostile, sur le sol. Ils sont aussi commensaux de l’intestin. Leur pouvoir
pathogène est dû à la production de toxines.
•
Les anaérobies non telluriques ou flore de <<Veillon>> :
Ces bactéries non sporulées sont commensales des cavités naturelles de l’homme. Elles
n’élaborent pas de toxine et sont pathogènes par leur pouvoir de multiplication

Sensibilité des bactéries anaérobies aux antibiotiques
-
La Pénicilline G est très active sur de nombreuses espèces anaérobies, dont
Clostridium perfringens. Mais les Pénicillines sont souvent inactives sur Bacteroides
fragilis, qui produit une béta-lactamase inhibant aussi les Céphalosporines et parfois
les Céphamycines (Céfotétan). Les associations béta-lactamines+Inhibiteurs de bétalactamases et les Carbapénèmes ont une bonne activité sur l’ensemble des anaérobies
strictes.
-
Les Aminosides (Gentamicine, Amikacine, etc.) sont inactifs vis-à-vis de tous les
anaérobies.
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4. METHODOLOGIE
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4.1. Cadre d’étude
Le Centre d’Infectiologie Charles Mérieux (C.I.C.M) a constitué notre cadre d’étude. Le
CICM est situé dans le quartier de l’ex- base aérienne de Bamako, rue du Docteur Charles
Mérieux.
Fruit de la collaboration entre le Gouvernement de la République du Mali et la Fondation
Mérieux, le CICM a été mis en place suite à la signature de l’Accord- cadre N° 0956/1899 du
18 février 2004 entre le Gouvernement de la République du Mali et la Fondation Mérieux
ainsi que la Convention du 16 janvier 2005 et son Protocole annexe du 11 mai 2011 entre le
Ministère de la Santé et la Fondation Mérieux.
•
8 décembre 2003 : Création de la Fondation Mérieux Mali
•
15 janvier 2004 : Pose de la première pierre du CICM
•
17 janvier 2005 : Inauguration du CICM
•
2 mai 2005 : Démarrage des activités
Le CICM comprend :
-
une administration générale.
-
un centre de formation avec une formation diplômante le BAMS (Bachelor de
Biologie Médicale Appliquée), des formations qualifiantes et des formations par
compagnonnage
-
un laboratoire d’analyses médicales dénommé Laboratoire Rodolphe Mérieux (LRM)
avec des activités de recherche et des activités de routine.
La présente étude s’est déroulée dans le Laboratoire Rodolphe Mérieux (LRM).
Le CICM a pour mission de participer tout comme les autres structures du Ministère de la
Santé au développement sanitaire du Mali par le service rendu aux malades, la formation, la
recherche et le renforcement des capacités dans le domaine du diagnostic biologique dans des
conditions désintéressées au bénéfice de la population.
Les ressources humaines du CICM sont composées de 28 agents (voire organigramme en
annexe 1) répartis entre les services techniques du LRM (18 agents) et les fonctions de
support administratif, financier et logistique (10 agents).
Le LRM se compose des Laboratoires 1 et 2 au sein desquels les activités de recherche et de
diagnostic de routine sont effectuées. Le Laboratoire 1 offre le cadre et le matériel pour la
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réalisation des examens d’hématologie, de biochimie et d’immunologie et le Laboratoire 2
prend en charge les examens de microbiologie (bactériologie, mycologie et parasitologie).
4.2. Type et période d’étude
Il s’agit d’une étude transversale, prospective, descriptive qui s’est déroulée de janvier 2013 à
décembre 2013.
4.3. Population d’étude
Notre étude a porté sur les prélèvements effectués chez les patients hospitalisés ou non
adressés au LRM pour hémoculture.
4.4. Critères d’inclusion et de non inclusion

Critère d’inclusion

Tout prélèvement effectué chez un patient hospitalisé ou en ambulatoire dont la
température corporelle était ≥ 38,5° C au moment de la ponction veineuse et adressé
au LRM.

Critères de non inclusion

Prélèvement incorrect.

Tout prélèvement sanguin reçu 1 heure après la ponction.
4.5. Echantillonnage : Nous avons effectué un échantillonnage exhaustif de toutes les
hémocultures du LRM pendant la période d’étude.
4.6. Variables mesurées :

Mode opératoire écrit

Age des patients

Sexe des patients

Provenance des prélèvements

Espèce bactérienne isolée

Résistance aux antibiotiques

Multi-résistance bactérienne aux antibiotiques
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4.7. Méthodes
4.7.1. Collecte des données
Les données ont été extraites du logiciel SYSLAM (CODATEC informatic, France). Certains
renseignements cliniques ont été obtenus à partir des fiches d’examens fournis par le médecin
traitant. Le système CODAT informatique est un prologiciel de gestion du management de
laboratoire, dans le cadre de l’accréditation ISO 15189. CODAT intègre la gestion du contrôle
de qualité en partenariat avec la société MELOS. Un dispositif de navigation inédit apporte
une grande facilité et un gain de temps conséquent dans la manipulation des dossiers.
En effet, il est aisé de passer depuis l’accueil d’un dossier à son état d’avancement, à des
modifications éventuelles, à la validation, aux archives ou à sa gestion financière par simple
transit inter programmes.
En outre, des icônes permettent également d’accéder à d’autres programmes en multisession
avec la possibilité de retour instantané au travail en cours.
4.7.2. Techniques de laboratoire
4.7.2.1. Rédaction des procédures et formation du personnel
Dans le cadre de la démarche qualité, et pour une bonne traçabilité, nous avons procédé à
la rédaction et à la mise à jour des modes opératoires normalisés (MON) de l’hémoculture
au LRM. Nous avons écrit ces modes opératoires sous la supervision du directeur du
laboratoire qui les a ensuite validés. Le personnel pratiquant a été formé à l’exécution de
ces MON.
4.7.2.2. L’hémoculture

Réception des prélèvements
Les prélèvements reçus au laboratoire sont tout d’abord saisis sur support informatique au
niveau de la réception. Ensuite ils sont acheminés au laboratoire, où ils sont inscrits dans un
registre de laboratoire. Ce dernier comprend :
-
Une partie des renseignements sur le patient (numéro de laboratoire, nom et prénom,
âge, sexe, résidence, origine…)
-
Types de flacons utilisés (Flacon aérobie, Flacon anaérobie, Flacon pédiatrique)
-
Résultats de la coloration de Gram
-
Nom(s) du ou des germes isolés
-
Le type de carte utilisée pour l’antibiogramme
-
Observation(s) du biologiste
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
Introduction des flacons dans l’automate
Après réception des flacons au niveau de la paillasse de bactériologie et enregistrement dans
le registre, ils sont immédiatement acheminés et introduits dans l’automate (BacT/ALERT
3D). (Voir annexe n°2)
Quotidiennement, le personnel surveille l’évolution ou non de la courbe de croissance
bactérienne, via le voyant tactile de l’automate.
Tout flacon pour lequel l’on n’observe pas de croissance de la courbe bactérienne est déclaré
négatif au bout de sept (7) jours d’incubation. Il est signalé par la présence du chiffre 1, dans
la case qui porte le signe moins(-).
Tandis que, tout flacon pour lequel une croissance bactérienne est détectée par l’automate est
déclaré positif. Il est signalé par la présence du chiffre 1, dans la case qui porte le signe
plus(+).
a. Appréciation de la technique au laboratoire
-
Présentation des méthodes

L’appareil BacT/ALERT 3D et les bouillons de culture
Le système ≪ BacT/ ALERT 3D Combination ≫ fonctionne grâce à une technologie
colorimétrique développée par bio Mérieux, la croissance des micro-organismes dans chaque
flacon est constamment surveillée par un réflectomètre très sensible. Tout changement de
statut des flacons est enregistré par un signal sonore et visuel comme pour le BACTEC (13).
La capacité de l'automate ≪ BacT/ALERT 3D Combination ≫ est de 120 flacons. Chez
chacun de ces fabricants il existe d'autres automates de grande capacité.
Tout comme le système BacT/ALERT 3D combination, l’appareil ≪ BACTEC 9050 de chez
Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, Md. ≫ et d'autres automates d'hémoculture
utilisent des méthodes de détection des flacons positifs basées sur différentes mesures du CO2.
Un volume de sang est prélevé, en fonction de l’âge sur le patient et injecté directement dans
les flacons d'hémoculture qui sont saisis dès que possible dans l'appareil pour garantir son
efficacité. Il s'agit d'une innovation par rapport à l'hémoculture classique qui demande un
volume de 10 ml de sang.
Le BACTEC 9050 fonctionne par un système d'agitation continue des flacons versus
intermittent des BACTEC des séries de grande capacité (BACTEC 9120 et BACTEC 9240)
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Les micro-organismes présents dans les bouteilles BACTEC libèrent du CO2 qui réagit avec
un colorant présent dans le capteur de l'appareil. Ceci module la quantité de lumière qui est
absorbée par un composant fluorescent du capteur. Les détecteurs photosensibles de
l'instrument mesurent l'intensité de la fluorescence, laquelle correspond à la quantité de CO2
libérée par les micro-organismes. La mesure est ensuite interprétée par le système en fonction
des paramètres de positivités préprogrammés (14).
Figure 2 : Automate BacT/ALERT 3D (source : LRM du CICM)

Les bouillons de culture
Plusieurs types de flacons existent pour l’usage de l’automate BacT/ALERT 3D. Chacun
d’entre eux a une composition précise :
BacT/ALERT iFA (aérobies)
30 ml de bouillon complexe supplémenté et du charbon activé. Réf. 251062
BacT/ALERT iFN (anaérobies)
40 ml de bouillon complexe supplémenté sous atmosphère N2 et CO2 et du charbon activé.
Réf. 251063
BacT/ALERT iFA PLUS (aérobies)
30 ml de bouillon complexe, supplémenté et billes polymériques absorbantes. Réf. 412990
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
BacT/ALERT iFN PLUS (anaérobies)
40 ml de bouillon complexe supplémenté sous atmosphère N2 et CO2 et billes polymériques
absorbantes. Réf. 412991
Figure 3: Bouillons de culture : à droite : FA, à gauche : FN (source : LRM du CICM)
b. Protocole des hémocultures négatives
Au bout de sept (7) jours d’incubation, si aucune croissance bactérienne n’est signalée, retirer
le flacon de l’automate selon la procédure établie. (Voir annexe n°2)
Noter dans le registre la date de sortie et conclure que la culture est négative, rendre le
résultat finale comme étant stérile.
c. Protocole des techniques des hémocultures positives
Les procédures suivantes sont suivies lorsque le BacT/ALERT 3D indique que l'hémoculture
est positive :
– le flacon est retiré de l'appareil BacT/ALERT 3D. Sa capsule en plastique est désinfectée
avec de l'alcool à 70°C, ensuite une aiguille de subculture est insérée à travers la capsule et
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
immédiatement après préparer une lame pour la coloration de Gram (voir annexe n°3) ainsi
qu'une subculture de l'échantillon de sang en utilisant les milieux suivants selon le cas :
a. milieu de gélose au sang frais (gélose COS) ou au sang de cheval ou de mouton ;
b. milieu de gélose Drygalski ;
c. milieu de gélose chocolat poly vitex ;
Sont écrits sur chaque boite le numéro CODAT attribué au patient lors de l’enregistrement de
l’échantillon à la réception ainsi que la nature du prélèvement ; reporter tous les résultats sur
la fiche de travail.
– nous procédons à la lecture de la coloration de Gram :
a. si aucun micro- organisme n'est détecté sur la lame de coloration, remettre le flacon dans
l’automate. Ceci devrait être fait le plus tôt possible dans les 3 heures maximums qui suivent
la sortie du flacon. Dans les 3 heures, une goutte du bouillon doit être mise en subculture sur
les différentes boites de géloses citées plus haut. Les boites et le flacon sont incubés et
observés pendant une durée de 7 jours (à compter de l'incubation du flacon). Le flacon n’est
plus mis en subculture si au bout de ces 7 jours aucun micro-organisme n'a toujours pas été
identifié.
b. quand des micro-organismes sont détectés, ne plus remettre le flacon dans le BacT/ALERT
3D. Reporter sur la fiche de travail les résultats de la coloration de Gram (par exemple :
CGPgr, CGPpr, CGPch, BGP, BGN, CoccoBGN, DCGN, Levures…) ;
– le médecin pratiquant est informé d'un résultat positif de la coloration de Gram ;
– lorsque des Cocci à Gram positif en paires ou en chainettes sont observés, placer un disque
de Bacitracine (A) et un disque d'Optochine (P) sur la gélose au sang de la subculture ;
– les boites contenant les subcultures sont placées dans l'incubateur à CO2.
Si la coloration de Gram est positive, le flacon est incubé avec les boites ;
– lorsqu'une croissance est observée, reporter sur la fiche de travail les références des boites
dans lesquelles des colonies ont été observées. Faire une coloration de Gram sur ces colonies
et reporter les résultats sur la fiche de travail. S'il existe plusieurs types de colonies, l'aspect de
chaque colonie bactérienne est aussi reporté ;
– dans les cas ou des Cocci à Gram positif sont observés, se référer à l'organigramme de
travail comme suit :
a. enregistrer les résultats des tests des disques d'Optochine et de Bacitracine ainsi que le test
de la catalase ;
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
b. si le micro-organisme est catalase-positive et ressemble au Staphylocoque (Cocci à Gram
positif en grappes), faire un test de coagulase. Si le micro-organisme est coagulase- positive, il
faudrait l'enregistrer comme étant Staphylococcus aureus. Si le micro- organisme est
coagulase négative après 24 heures, il faudrait l'enregistrer comme étant Staphylococcus à
coagulase négative;
c. lorsque le micro- organisme est catalase négative, beta- hémolytique, et Bacitracine-positif
(inhibé par la Bacitracine), enregistrer le micro-organisme comme étant Streptococcus Groupe
A;
d. au cas ou le test à la Bacitracine ou à la catalase est flou, faire un PYR test. Si le PYR test
est positif, enregistrer le micro-organisme comme étant Streptococcus groupe A ;
e. dans le cas ou le micro-organisme est catalase négatif, beta- hémolytique, et Bacitracine
négatif, faire les tests d'agglutination des streptocoques des groupes A et B. Enregistrer le
micro-organisme comme étant Streptococcus beta-hémolytique de groupe A, de groupe B ou
non groupable ;
f. quand le micro-organisme est catalase négative, Optochine positif (inhibé par le disque
d'Optochine) et diplocoque à Gram positif, l’enregistrer comme étant Streptococcus
pneumoniae. Si le test d'optochine est négatif ou non concluant, faire un test de ≪bile
solubility≫. Si ce test de solubilité par la bile est positif, enregistrer le micro-organisme
comme étant Streptococcus pneumoniae ;
g. lorsque le micro-organisme ressemble au Streptococcus (catalase négative, cocci à Gram
positif en chainette), mais négatif au test du disque d'optochine et négatif au test de solubilité
par la bile, effectuer le PYR test.
h. au cas où le résultat du PYR test est positif, enregistrer le micro-organisme comme étant
Enterococcus species. Si le résultat du PYR test est négatif, enregistrer le micro-organisme
comme étant Streptococcus alpha ou gamma hémolytique selon la réaction d'hémolyse ;
– quand le micro-organisme est un bacille à Gram positif, aucun test additionnel n'est
effectué, enregistrer seulement ≪Bacille à Gram Positif≫ ;
– lorsque des bactéries à Gram négatif sont observées, la référence est faite à l'organigramme
ainsi qu'il suit :
a. si le micro-organisme pousse sur la gélose au sang et la gélose Drygalski faire un test
d'oxydase et inoculer une galerie API 20 E. Les Enterobacteriaceae (tels que Escherichia,
Salmonella, Shigella) sont oxydase négatifs ; les Vibrio et les Pseudomonas sont oxydase
positive. Si les micro-organismes isolés sont identifiés comme étant Salmonella, Shigella ou
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33
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Vibrio, confirmer le résultat par un test de sérotypage. Enregistrer le résultat de ces différents
tests ;
b. lorsque le micro-organisme ne pousse que sur la gélose au sang frais et sur la gélose
chocolat PolyViteX® mais ne pousse pas sur la gélose Drygalski et est diplocoque à Gram
négatif, Neisseria meningitidis pourrait être suspecté. Il faudra faire un test d'oxydase. Si
l'identification préliminaire indique Neisseria meningitidis, le confirmer par un test de
sérotypage ;
c. quand le micro-organisme ne pousse que sur la gélose au sang frais et sur la gélose chocolat
poly vitex mais pas sur la gélose Drygalski et se présente comme de petits bacilles à Gram
négatif, nous pouvons suspecter Haemophilus influenzae.
Faire un test d'oxydase et un test des facteurs X et V. Dans le cas ou l'identification indique
Haemophilus influenzae, le confirmer par un test de sérotypage ;
– nous procédons à un antibiogramme par la méthode de diffusion des disques d'antibiotiques
selon Kirby-Bauer ;
– enregistrer le résultat dans le registre de laboratoire et informer le médecin du patient de
l'identification finale.
d) Méthodes d’identification des bactéries
•
Coloration de Gram : (voir annexe n°3)
Interprétation :
La clé dans l'interprétation de la coloration de Gram est d'identifier la morphologie des microorganismes (exemple : cocci, bacilles) ainsi que leur relation les uns par rapport aux autres
(exemple : cellules isolées, en paires, en chainettes et en grappes). La reconnaissance de ces
caractéristiques peut aider à l'interprétation de la coloration de Gram.
Par exemple : Cocci à Gram positif en grappes = Staphylocoques
Note : aucun cocci à Gram négatif en grappes n'existe, ainsi les cellules qui apparaissent
Gram négatif sont probablement des cocci à Gram positif qui ont été décolorés trop
longtemps.
Cocci à Gram positif en chainettes = Streptocoques.
Note : Il n'existe pas de cocci à Gram négatif en chainettes.
Cocci à Gram positif en paires = Streptococcus pneumoniae ou Enterococcus
Note : Ces cocci sont allongés et attachés par leur bout.
Bacilles à Gram positif : égale plusieurs micro-organismes
Note : Il existe plusieurs bacilles à Gram positif comprenant Corynebacterium,
Lactobacillus, Propionibacterium.
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Cocci à Gram négatif en paires = Neisseria
Note : Les cocci à Gram négatif les plus connus sont arrangés en pair
(Diplocoques) et attachés par leur coté. Ils ressemblent à des grains de café.
Bacilles à Gram négatif = Plusieurs micro-organismes
Note : Il existe plusieurs bacilles à Gram négatif comprenant Haemophilus,
Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Vibrio sont des bacilles courts et minces ;
les bactéries entériques (Escherichia, Klebsiella ; Salmonella)
Shigella) sont plus longues, plus épaisses et sont mieux colorées aux extrémités qu’au centre.
•
Tests biochimiques et métaboliques :

Observation de la réaction d’hémolyse :
L’habileté des bactéries a lyser les cellules du sang contenues dans la gélose au sang frais est
une caractéristique importante et utile pour leur identification.
Quelques bactéries ont besoin de plus d’un jour avant que ne soit observée une lyse des
cellules du sang. Il faut une attention particulière pour observer la lyse des cellules.
Typiquement, trois formes de lyse sont observées :
Beta-hémolyse : C’est une lyse complète des globules rouges du sang. L’espace autour de la
colonie bactérienne apparaitra clair.
Alpha-hémolyse : C’est une lyse incomplète des globules rouges du sang.
L’espace autour de la colonie bactérienne apparaitra verdâtre.
Hémolyse Gamma : Ce n’est pas une lyse des cellules du sang. L’espace autour de la colonie
bactérienne apparaitra normal. Dans ce cas il n’existe aucune évidence de lyse des globules
rouges et aucune clarté ou aspect verdâtre n’est observée autour des colonies.
Parmi les exemples de bactéries Beta-hémolytique on retient les Streptocoques du Groupe A
et B, le Staphylococcus aureus ainsi que Escherichia coli.
Parmi les exemples de bactéries Alpha-hémolytique on retient le Streptococcus pneumoniae et
quelques autres espèces de Streptococcus.
Parmi les exemples de bactéries Gamma ou non-hémolytique on retient quelques espèces de
Streptocoques ainsi que Neisseria meningitidis.

Test de la Catalase :
Principe :
Le test de la catalase est un examen important pour identifier les microorganismes, en
particulier les bactéries à Gram positif. Cette enzyme est utilisée par les micro-organismes
aérobies pour se protéger des produits toxiques de la croissance en aérobiose (c'est-a-dire
peroxyde d’hydrogène). L’enzyme de la catalase peut convertir le peroxyde d’hydrogène en
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
eau et en oxygène. Une façon facile de mesurer la catalase est de mélanger la bactérie avec
une goutte à 3% de peroxyde d’hydrogène. Si la catalase est présente, des bulles d’oxygène se
produisent.
Matériels et réactifs utilisées :
Peroxyde d’hydrogène à 3%
Lame de verre
Anse
Procédure : (voir annexe n°4)
Le test de la catalase est plus utilisé pour séparer les Staphylocoques des
Streptocoques.
Note : Les globules du sang contenus dans la gélose au sang contiennent de la catalase et
donneront une fausse réaction positive.

Test à l’Optochine (disque P)
Principe :
Le test à l’Optochine est une procédure simple utilisée pour l’identification de
Streptococcus pneumoniae. Le disque d’Optochine (P) contient l’éthylhydrocupréine qui
inhibe la croissance de Streptococcus pneumoniae. Avant l’exécution du test, il convient de
confirmer la ressemblance du micro-organisme à Streptococcus pneumoniae, c'est-a-dire
diplocoques Gram-positif qui apparaissent allongés et attachés à leurs bouts. Les colonies sont
alpha-hémolytiques, et peuvent apparaitre aussi bien sèches que muqueuses.
Matériels et réactifs utilisées :
Disque d’Optochine (P)
Gélose au sang
Anse
Procédure : (Voir annexe n°7)
Interprétation :
Réaction positive = Inhibition de croissance autour du disque d’Optochine. La zone
d’inhibition devrait être supérieure ou égale à 15 mm.
Réaction négative = Zone d’inhibition autour du disque d’Optochine de moins de 15 mm
(c'est-a-dire entre 6 et 15 mm).
Un résultat positif est indicatif de Streptococcus pneumoniae.
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Une réaction négative n’exclut pas Streptococcus pneumoniae ainsi toutes réactions négatives
devraient être confirmées par un test de <<bile solubility>>. Si le test d’Optochine et celui de
<<bile solubility>> sont tous les deux négatifs, le microorganisme identifié n’est pas
Streptococcus pneumoniae. Si l’un ou l’autre des tests est positif, le micro-organisme est
identifié comme étant Streptococcus pneumoniae.
Toute fois, la méthode automatisée nous permet également d’identifier les germes lorsque la
méthode classique présente des limites ou ne donne pas de résultats suffisamment clairs. Il
suffit de préparer dans un tube à hémolyse une suspension bactérienne à 0,5 Mc Ferland, et de
se servir de la carte VITEK pour identification correspondant à la nature du germe étudié.
Ensuite introduire la cassette portant la carte dans l’automate (VITEK 2 compact).
(Voir annexe n°8)
Il existe de nombreuses cartes VITEK pour identification, parmi lesquelles :

Streptocoques et entérocoques : ID : AST –GP 67, réf 22226 ; ATB : AST-P
586, réf 22276

GN : ID : réf 21341 ; ATB : non entérobactéries : AST- 222, réf 413083 ;
entérobactéries : AST-N 233, réf 413117

GP: ID: réf 21342. ATB : AST-P 580, réf 22233

LEVURES : ID : YST, réf 21343 ; ATB : AST-Y501, réf 22108
Figure 4 : L’automate VITEK 2 compact (source : LRM du CICM)
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
1 — Capot de remplissage. Donne accès au module de remplissage.
2 — Capot d’accès utilisateur avant. Donne accès à l’optique, à l’incubateur et à une partie
du système de transport de carte.
3 — Capot d’accès utilisateur supérieur. Uniquement opérationnel si le capot d’accès
utilisateur avant est ouvert ; il permet d’accéder au système optique et au carrousel. Ce capot
s’ouvre par l’avant et reste en position ouverte jusqu’à ce que l’utilisateur le referme.
4 — Capot de chargement. Donne accès à l’aire de chargement/déchargement de la cassette.
Un mécanisme de verrouillage en interdit l’ouverture lorsque l’instrument est en cours de
fonctionnement.
5 — Capot du collecteur de déchets. Donne accès au récipient collecteur de déchets, à partir
duquel les cartes éjectées sont retirées de l’instrument. Le capot est maintenu en place par un
système magnétique et s’ouvre à partir de la droite.
4.8. Test de Sensibilité aux antibiotiques :
4.8.1. Méthode de diffusion des disques d'antibiotiques selon Kirby- Bauer
Ce procédé définit l'utilisation de la méthode de diffusion des disques d'antibiotiques in vitro
selon Kirby- Bauer pour tester la sensibilité, d'importants isolats en clinique. Les résultats de
cet examen peuvent aider les médecins dans la sélection de l'antibiotique approprié pour la
thérapie.

Principe :
La méthode de diffusion des disques selon Kirby- Bauer est basée sur l'observation qu'il y a
une corrélation entre la concentration minimale inhibitrice (CMI) et le diamètre de la zone
d'inhibition de croissance bactérienne autour d'un disque d'antibiotique. La taille de la zone
d'inhibition de croissance est déterminée par la sensibilité du micro-organisme à l'antibiotique,
la concentration du disque d'antibiotique, le taux de diffusion de l'antibiotique du disque et le
taux de croissance du micro-organisme. En standardisant les conditions du test (exemple :
préparation d'un seul antibiotique contenu dans le disque, milieu de culture spécial,
atmosphère et durée d'incubation) et avec une concentration du micro-organisme du test, la
zone d'inhibition mesurée sera corrélée avec la sensibilité du micro-organisme à l'antibiotique
(exemple : plus la zone est grande, plus micro-organisme est sensible).
Le test doit être exécuté exactement comme décrit sinon les résultats ne seront pas précis.

Matériels et réactifs utilisés :
Gélose de Mueller-Hinton additionnée de 5% de sang de cheval (MHA- B)
Milieu de culture pour Haemophilus (HTM)
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Solution saline stérile à 0,85 %
Standard 0,5 de Mc Ferland
Disques antibiotiques pour test de sensibilité
Ecouvillons en coton stériles
Pipettes à sérum
Pinces à disques et/ ou applicateur de disque

Conditions de stockage nécessaires :
1. Milieux de culture (MHA- B et HTM) : A conserver au réfrigérateur, ils doivent être
réchauffés à la température de la salle avant leur utilisation. Les boites non- stockées dans des
sacs en plastique se déshydrateront et ne pourront pas être utilisées convenablement ;
2. Solution saline stérile : A conserver au réfrigérateur ;
3. Standard 0,5 de Mc Ferland : A conserver au noir dans un récipient. Ne pas utiliser de tube
rayé. Le diamètre du tube doit être le même que celui des tubes de solution saline utilises pour
la préparation des tests d'inoculum ;
4. Disques d'antibiotiques : Congeler les disques a –20° C ou à une température plus basse
(- 4°C) pour de longue conservation ;
5. Des qu'une boite est ouverte pour usage, elle peut être conservée au réfrigérateur dans une
capsule bleue de 50 ml ensemble avec le dessiccateur.

Procédure du test :
1. Les boites de gélose doivent être réchauffées à la température de la salle ou à l’étuve avant
qu’elles ne soient inoculées. Aucun excès d'humidité ne doit se trouver sur la surface de la
gélose. La surface peut être humide mais des gouttelettes d'humidité ne devraient pas être
présentes au moment d'inoculer la gélose avec le microorganisme;
2. La gélose HTM (gélose spéciale) est utilisée pour les tests Haemophilus.
La gélose MHA-B (Mueller Hinton au sang) est utilisée pour tous les autres tests ;
3. Enlever du réfrigérateur les disques pour le test de sensibilité afin de leur permettre de se
réchauffer à la température de la salle. Au paravent ils auront été enlevés du récipient de
conservation. Il ne faut pas exposer les disques froids à l'air de la salle parce que la
condensation de l'humidité sur les disques froids conduirait à une détérioration rapide des
antibiotiques. Vérifier les dates d'expiration sur les boites d’antibiotiques.
Ne pas utiliser de disques périmés ;
4. Sélectionner au moins 4 à 5 colonies bien isolées de même morphologie sur la gélose au
sang. Toucher le sommet de chaque colonie avec une anse et les transférer dans un tube de
solution saline. Ajuster l'inoculum de la solution saline à une turbidité égale à un standard de
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0,5 de l'échelle de Mac Ferland en utilisant le turbidimètre. Cette étape est très importante. La
boite de gélose est immédiatement inoculée avec l'inoculum ajusté;
5. Plonger un écouvillon stérile dans la suspension ajustée. Il est tourné plusieurs fois sur la
paroi intérieure du tube au-dessous du niveau du liquide pour enlever l'excès de l’inoculum.
Inoculer la surface entière de la boite de gélose en faisant tourner la boite
d'approximativement d’un angle de 60° et ensemencer de nouveau. Faire tourner la boite et
l'ensemencement est répété jusqu'a trois fois pour s'assurer d'une distribution régulière de
l'inoculum. A l'étape finale, le bord de la gélose est tamponné ;
6. Inoculer une boite pour Haemophilus influenzae ; pour Streptococcus pneumoniae,
Staphylococcus aureus ; deux boites de gélose sont inoculées pour les autres bacilles à Gram
négatif ;
7. Laisser l'excès d'humidité s'absorber par la gélose pendant 5 à 10 minutes avant d'appliquer
les disques d'antibiotiques. Placer les disques d'antibiotiques sur la boite en utilisant des
pinces stériles. Le disque est pressé sur la surface de la gélose avec des pinces stériles pour
s'assurer du contact complet avec la surface de la gélose. Ne plus enlever le disque une fois
qu'il est arrivé au contact avec la surface de la gélose parce que l'antibiotique diffuse dans la
gélose presque immédiatement.
Utiliser souvent des applicateurs de disques d'antibiotiques ;
8. Les disques d'antibiotiques suivants seront testés:
Pour Streptococcus pneumoniae : Oxacilline 5 μg (pour le test de Pénicilline 10UI),
Ceftriaxone 30μg, Erythromycine 15μg, Chloramphenicol 30μg ;
Pour Staphylococcus aureus: Pénicilline 10 UI, Oxacilline 1μg, Ceftriaxone 30μg ;
Pour Haemophilus influenzae: Ampicilline 10μg, Ceftriaxone 30μg, Chloramphénicol
30μg ;
Pour les autres bacilles à Gram négatif
Boite de gélose No1- Ampicilline 10μg, Ceftriaxone 30μg, Chloramphénicol 30μg.
Boite de gélose No2- Gentamicine 15 μg, Cotrimoxazole 25 μg, Ciprofloxacine 5 μg.
9. Laisser les boites pendant 15 minutes après que les disques aient été déposés avant
l'incubation proprement dite.
Les espèces Streptococcus et Haemophilus sont placées dans l'incubateur a CO2 tous les
autres micro-organismes devraient être placés dans un incubateur en aérobiose.

Interprétation :
1. Tous les tests de sensibilité sont lus après 20 à 24 heures d'incubation. Si les examens sont
lus plutôt ou après 24 heures, les résultats pourraient ne pas être précis ;
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2. Mesurer les diamètres de la zone d'inhibition complète du disque, au millimètre près, en
utilisant une règle posée sur la face postérieure de la boite.
Les résultats d'Oxacilline de Staphylococcus sont interprétés en tenant la boite face à la
lumière afin que toute croissance puisse être mise en évidence. Toute croissance discernable
dans la zone d'inhibition est indicatrice de la résistance à la Vancomycine ou à l'Oxacilline.
Fréquemment ces colonies seront très petites ; alors il faudrait examiner les boites avec soins.
3. La limite est l'aire dans laquelle une croissance évidente est visible à l'œil nu, excepté la
trace de la ligne de croissance à la lisière de la zone d'inhibition.
La croissance de larges colonies à l'intérieur d'une zone d'inhibition claire devrait indiquer un
mélange de croissance. Si tel est le cas alors la sensibilité est mixée, reprendre le test. Si les
colonies persistent dans la zone, il faut les considérer comme significatives ;
Avec le Cotrimoxazole, les micro-organismes se développent au travers de plusieurs
générations avant d'être inhibés. Nous ne tiendrons pas compte de la faible croissance, nous
devons lire seulement les limites de la croissance en abondance ;
Se référer à la ≪ carte de référence ≫ pour l'interprétation des tests ;
Les tests du disque de Pénicilline pour Streptococcus pneumoniae ne sont pas exacts. C'est la
raison pour laquelle le disque d'Oxacilline 1 μg est utilisé. Ne pas reporter les résultats comme
Oxacilline mais plutôt le reporter comme Pénicilline.

Compte-rendu :
1. Reporter les résultats dès que l'identification du micro-organisme est complète ;
2. Si le profil de sensibilité est atypique pour le micro-organisme identifié, l'identification et le
test de sensibilité devraient être repris. Si les résultats restent atypiques, ils pourraient être
discutés avec le superviseur du laboratoire ou le directeur avant de les reporter ;
3. Quelques résultats avec les tests des disques de diffusion pourraient être irréalisables.
Les micro-organismes fastidieux ou lents en croissance ne pourraient pas être testés par la
méthode. En plus, des combinaisons de micro-organismes et d'antibiotiques ne peuvent pas
être testées de façon fiable avec la méthode de diffusion des disques. Les guides suivants
seraient utilisés pour ces micro-organismes.
Reporter comme résistants tous les tests de Salmonella et Shigella avec des Aminoglycosides
et les Céphalosporines de première et seconde génération.
Si le Staphylococcus est résistant à l'Oxacilline, reporter Pénicilline et Ceftriaxone comme
résistants sans tenir compte de ce que le test du disque indique.
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4.8.2. L’antibiogramme à partir de l’automate VITEK 2 compact
Ce procédé définit l’utilisation de cartes près à l’emploi, qui servent à la réalisation de
l’antibiogramme. En effet, les cartes sont constituées de 36 puits et permettent de tester près
de dix-huit antibiotiques appartenant à différentes familles. Les résultats de cette méthode,
hautement fiable, peuvent guider le praticien dans le choix d’une antibiothérapie de qualité
efficace.

Principe :
Le système VITEK 2 compact est destiné à l’identification des bactéries et des levures ; ainsi
qu’à la réalisation d’antibiogramme pour les bactéries significatives sur le plan clinique. Le
système comprend l’instrument VITEK 2 compact, un ordinateur, une imprimante. Le logiciel
fourni avec le système VITEK 2 compact inclut des programmes d’analyse et de gestion des
données. Une interface informatique bidirectionnelle transfère automatiquement les résultats
vers le système d’information de laboratoire de l’utilisateur (LIS) et vers divers rapports de
produits et de patients.
Procédure : (voir annexe n°8)

Interprétation :
1. Tous les tests de sensibilité sont lus après 20 à 24 heures d’incubation. Si les examens sont
lus plus tôt ou après 24 heures, les résultats pourraient ne pas être précis.
2. L’automate rend les résultats de l’antibiogramme lui-même, en précisant si le germe est
sensible ; intermédiaire ou résistant à tel ou tel autre antibiotique.
3. En cas de multi résistance, la confirmation qu’il s’agit d’une Béta-Lactamase à Spectre
Elargi (BLSE) est faite par l’appareil même ou par la méthode de recherche d’un bouchon de
champagne sur gélose Muller-Hinton.
4.8.3. L’antibiogramme à partir de l’automate mini Api
Ce procédé définit l’utilisation des galeries classiques, qui permettent la réalisation de
l’antibiogramme des bactéries non fermentaires. C’est une technique qui est de plus en plus
délaissée au profit de l’utilisation de l’automate VITEK 2 compact.

Principe :
Principe de fonctionnement : Le Mini API permet deux types de lecture.
-
La lecture turbinéphélémétrique
Elle est destinée aux galeries turbinéphélémétrique.
Exemple : ID 32 GN
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42
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
ID 32 C
ATB UR
Turbidimétrie : est la mesure de l’intensité de la lumière transmise (T) inversement
proportionnelle à la croissance bactérienne.
Néphélémétrie : est la mesure de l’intensité de la lumière diffusée (D) à 30°C directement
proportionnelle à la croissance bactérienne.
Ces deux mesures permettent d’évaluer la densité bactérienne dans chaque cupule.
Le cycle d’une lecture turbinéphélémétrique se fait en deux étapes :
1ère étape :
Entrée du chariot porte galerie et détection du code de la galerie
2ème étape :
Mesure sous la position sans filtre puis sortie du chariot porte galerie
Lorsque le cycle de lecture est terminé, le logiciel traite les mesures effectuées.
-
La lecture colorimétrique
Elle est destinée aux galeries colorimétriques.
Exemple: ID 32 STAPH
ID 32 E
Rapid ID 32 A
Rapid ID 32 STREP
Le Mini API effectue pour chaque cupule une mesure de transmission de la lumière dans 4
régions du spectre visible.
Le cycle d’une lecture colorimétrique se fait en 4 étapes :
1ère étape :
-
1ère entrée du chariot porte galerie
-
Détection du code de la galerie
-
Mesure sous filtre K60
2ème étape :
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43
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
-
1ère sortie du chariot porte galerie
-
Mesure sous filtre K40
3ème étape :
-
2ème entrée du chariot porte galerie
-
Mesure sous le filtre DT bleu
4ème étape :
-
2ème sortie du chariot porte galerie
-
Mesure sous le filtre DT vert
Lorsque le cycle de lecture est terminé, le logiciel traite les mesures effectuées.

Procédure :
Le travail est fait sur des colonies jeunes, c'est-à-dire des colonies qui n’ont pas plus de
24heures. La préparation de la suspension bactérienne à 0,5 Mc Ferland est faite à partir d’une
suspension Médium API. Prélever 200 μl de la suspension et faire une dilution dans une
solution d’ATB Médium, bien mélanger, ensuite distribuer 135 μl dans chaque puits de la
galerie. Incuber pendant 24heures. (Voir annexe n°9)

Interprétation :
La lecture est faite après 24 heures. On note le profil bactériologique et on rend le résultat.
4.9. Conservation des souches :
Les laboratoires de bactériologie ont le désir et le souci de conserver les cultures des
différentes espèces bactériennes isolées. Ces cultures servent de souches de référence. Elles
sont fréquemment utilisées pour l'enseignement, le contrôle, ou la recherche. L'intérêt de se
référer à des souches standard est devenu si évident que des organisations nationales ou
internationales se sont créées à cet effet. Leur but est le maintien en cultures pures des microorganismes tels que les levures, les champignons inférieurs, les bactéries, les rickettsies et les
virus. L'une des plus célèbres est l'«American Type Culture Collection» (ATCC) située à
Rockville aux Etats-Unis.
En Angleterre, la plus connue est la «National Collection of Type Cultures» (NCTC). En
France, la plus importante est celle de l'Institut Pasteur de Paris. Lorsqu'une nouvelle espèce
est isolée, il est recommandé de l'envoyer dans plusieurs de ces collections internationales
pour la faire connaître.
Les souches isolées dans notre d'étude sont conservées par congélation. Deux paramètres
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44
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
importants parmi d'autres conditionnent sa mise en œuvre : le choix de la température et
surtout la vitesse d'abaissement à la température choisie. (Voir annexe n°10)
Pour conserver dans les meilleures conditions les structures cellulaires, il convient de les
congeler à la température la plus basse et d'y parvenir dans les délais les plus brefs. Nos
souches sont conservées dans un congélateur de moins 84o C (15).
4.10. Analyse des données
Les fiches d’enquête utilisées nous ont permis de saisir les données via Microsoft Office
Word 2007, de réaliser les figures et graphiques grâce au système Microsoft Office Excel
2007.
Après saisie, l’analyse des ces données a été faite par le processeur IBM SPSS statistics
version 20. Pour Windows. Le test de Chi deux a permis de comparer des proportions et le
seuil de signification a été fixé à 0,05.
4.11. Aspects éthiques :
Les hémocultures ont été effectuées en respectant les règles de bonnes pratiques de
laboratoire.
L’anonymat et la confidentialité des patients ont été respectés conformément aux règles
d’éthique médicale. En effet les noms et prénoms des patients n’ont été mentionnés dans
aucun document permettant de faire le lien avec le résultat. .
Il n’y a pas de conflit d’intérêt dans cette étude.
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5. RESULTATS
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5.1. Résultats globaux
Au Total 9 procédures essentielles ont été écrites et validées au LRM.
Liste des procédures au CICM essentielles à la réalisation des hémocultures
01 : Mode opératoire de l’utilisation du BacT/ALERT 3D
02 : Mode opératoire de la technique de coloration de Gram
03 : Mode opératoire de la technique du test de la catalase
04 : Mode opératoire de la technique du test de l’oxydase
05 : Mode opératoire de la technique du test de coagulase
O6 : Mode opératoire de la technique du test au disque d’Optochine
07 : Mode opératoire de l’utilisation du VITEK 2 compact
08 : Mode opératoire de l’utilisation du Mini API
09 : Mode opératoire réalisation des souches
Au total, 238 prélèvements de sang de patients ont été reçus pour une hémoculture au
Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako de janvier 2013 à décembre 2013. Parmi ces
hémocultures 68 étaient positives soit une prévalence de 28,6%. Les hémocultures étaient
contaminées dans 18,9% des cas.
5.2. Résultats descriptifs
Tableau I : Répartition des hémocultures positives selon la provenance des prélèvements de
sang au LRM de janvier 2013 à décembre 2013
Provenance
Hémocultures
Positive
Négative
Total
Hospitalière
62 (36,7%)
107
169 (71%)
Communautaire
03 (27,3%)
08
11 (24,4%)
Non précisé
03
55
58
Total
68
170
238
X2 = 5,46 ; ddl = 1 ; p = 0,025
La majorité des prélèvements était d’origine hospitalière (71%) et il y avait 4,6% des
hémocultures qui étaient d’origine communautaire. Cependant 24,4% des prélèvements de
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sang étaient d’origine inconnu. Les hémocultures d’origine hospitalière étaient positives à
36,7% et celles d’origine communautaire étaient de 27,7%. La différence est statistiquement
significative (p<0,05).
Tableau II : Répartition des hémocultures positives au LRM en fonction du sexe des patients
de janvier 2013 à décembre 2013
Sexe
Hémocultures
Positive
Négative
Total
Masculin
39 (27,8%)
101 (72,2%)
140
Féminin
29 (29,9%)
68 (70,1%)
97
X2 = 0,12 ; ddl = 1 ; p= 0,75
Le sex ratio des patients reçus pour hémocultures au LRM était de 1,4.
La différence des prélèvements de sang positifs au LRM dans les hémocultures n’était pas
statistiquement significative (p>0,05).
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Tableau III : Fréquence des hémocultures positives en fonction de la tranche d’âge au LRM
de janvier 2013 à décembre 2013.
Hémocultures
Tranches d’âge (en années)
Positive
Négative
Total
0 à 10
04 (6,6%)
11
15
10 à 20
06 (10%)
12
18
20 à 30
16 (26,6%)
30
46
30 à 40
09 (15%)
21
30
40 à 50
06 (10%)
09
15
50 à 60
11 (18,3%)
08
19
60 et plus
08 (13,3%)
26
34
Total
60
117
177
X2 = 5,07 ; ddl = 8 ; p= 0,75
NB : Chez huit (8) patients, l’âge n’était pas déterminé.
La majorité des hémocultures positives au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako de
janvier 2012 à décembre 2013 étaient représentées dans la tranche d’âge de 20 à 30 ans, soit
26,6% de positivité. Les hémocultures négatives toutes tranches confondues représentaient
66,1%.
La différence entre les tranches d’âge des hémocultures positives au LRM n’était pas
significative (p=0,75)
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Tableau IV : Fréquence des espèces bactériennes isolées des hémocultures positives au LRM
de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolées
Fréquences
Pourcentage
Acinetobacter baumanii complex
10
22,7
Klebsiella pneumoniae
9
20,5
Staphylococcus aureus
9
20,5
Escherichia coli
8
18,2
Enterobacter cloacae complex
3
6,8
Pseudomonas aeruginosa
2
4,6
Streptococcus pneumoniae
1
2,3
Proteus mirabilis
1
2,3
Citrobacter
1
2,3
44
100
Total
Au total nous avons isolé 44 bactéries des hémocultures.
Les espèces bactériennes majoritairement isolées étaient Acinetobacter baumanii complexe
(22,7%), Staphylococcus aureus (20,5%), Klebsiella pneumoniae (20,5%), Escherichia coli
(18,2%). Nous avons observé des associations de bactéries telles que Staphylococcus aureus
et Escherichia coli ;Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumanii complex ; Klebsiella
pneumoniae et Staphylococcus aureus ;Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumanii
complex.
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Tableau V : Répartition des espèces bactériennes isolées des hémocultures selon la
provenance au LRM de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolées
Hospitalier
Communautaire
Total
Staphylococcus aureus
9 (100%)
0
9
9 (90%)
1 (10%)
10
Klebsiella pneumoniae
8 (88,9%)
1 (11,2%)
9
Escherichia coli
8 (100%)
0
8
Enterobacter cloacae complex
3 (100%)
0
3
Pseudomonas aeruginosa
2 (100%)
0
2
Streptococcus pneumoniae
1 (100%)
0
1
Proteusmirabilis
1 (100%)
0
1
Citrobacter
1 (100%)
0
1
Total
42
2
44
Acinetobacterbaumanii
complex
La majorité des espèces bactériennes isolées dans les hémocultures au cours de cette étude
provenaient du milieu hospitalier soit 95,5%. Les espèces bactériennes majoritairement
isolées des hémocultures d’origine hospitalière étaient : Klebsiella pneumoniae, Escherichia
coli, Staphylococcus aureus et Acinetobacter baumanii complex. Seulement 2 espèces avaient
été isolées des hémocultures d’origine communautaire : Klebsiella pneumoniae et
Acinetobacter baumanii complex.
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Tableau VI : Fréquence de bactéries résistantes aux antibiotiques testés dans les
hémocultures au LRM de janvier 2013 à décembre 2013.
Antibiotiques
Résistance
Sensibilité
Total
Ticarcilline
28 (84,8%)
05 (15,2%)
33
Ceftazidime
27 (77,2%)
08 (22,8%)
35
Gentamicine
26 (68,4%)
12 (31,6%)
38
Ciprofloxacine
26 (78,8%)
7(21,2%)
33
Amoxicilline
16 (88,9%)
02 (11,1%)
18
Cefotaxime
15 (75%)
05 (25%)
20
Amoxicilline/Acide
15 (68,2%)
07 (31,8%)
22
Amikacine
14 (40%)
21 (60%)
35
Céfoxitine
03 (12,5%)
21 (87,5%)
24
clavulanique
La plupart des espèces bactériennes isolées des hémocultures positives au LRM présentaient
un phénomène de résistance aux antibiotiques testés. En effet, les antibiotiques tels que :
l’Amoxicilline ; la Ticarcilline ; la Ceftazidime ; la Ciprofloxacine avaient les pourcentages
les plus élevés de résistance observée.
Tableau VII: Sensibilité des bactéries isolées à l’Amoxicilline dans les hémocultures au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolés
Sensible
Résistant
Total
Klebsiella pneumoniae
0
8(100%)
8
Escherichia coli
2(28,57%)
6(71,43%)
8
0
3(100%)
3
Staphylococcus aureus
0
4(100%)
4
Total
2
21
23
Acinetobacter
baumanii
complex
Toutes les bactéries isolées des hémocultures
étaient résistantes à l’Amoxicilline à
l’exception de Escherichia coli dont 2 souches sur 8 étaient sensibles.
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Tableau VIII : Sensibilité des bactéries isolées à l’association Amoxicilline-Acide
clavulanique/Augmentin® dans les hémocultures au LRM de janvier 2013 à décembre 2013
Germes isolés
Sensible
Résistant
Total
Klebsiella pneumoniae
1 (12,5%)
7(87,5%)
8
Escherichia coli
5(62,5%)
3(37,5%)
8
0
2(100%)
2
Staphylococcus aureus
1 (25%)
3 (75%)
4
Citrobacter
0
1(100%)
1
Enterobacter cloacae complex
0
2(100%)
2
Total
7
15
22
Acinetobacter
baumanii
complex
La majorité des espèces bactériennes présentaient une résistance élevée à l’association
Amoxicilline-Acide clavulanique dans notre étude. Cependant nous avons isolé quelques
souches de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae sensibles à cette
association.
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Tableau IX : Sensibilité des bactéries isolées à la Ticarcilline dans les hémocultures au LRM
de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolés
Sensible
Résistant
Total
Klebsiella pneumoniae
0
8
8
Pseudomonas aeruginosa
0
2
2
Escherichia coli
2(25%)
6(75%)
8
3(37,5%)
5(62,5%)
8
Staphylococcus aureus
0
4
4
Citrobacter
0
1
1
Enterobacter cloacae complex
0
2
2
Total
5
28
33
Acinetobacter
baumanii
complex
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter, Enterobacter cloacae
complex étaient les espèces de bactéries dont toutes les souches isolées étaient résistantes à la
Ticarcilline. Quelques souches sensibles de Escherichia Coli et Acinetobacter à la Ticarcilline
ont été isolées.
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Tableau X : Sensibilité des bactéries isolées à la Céfoxitine des souches bactériennes isolées
dans les hémocultures au LRM de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolés
Sensible
Résistant
Total
Klebsiella pneumoniae
8
0
8
Escherichia coli
8
0
8
1
0
1
Staphylococccus aureus
4
0
4
Citrobacter
0
1
1
Enterobacter cloacae complex
0
2
2
Total
21
3
24
Acinetobacter
baumanii
complex
Deux espèces bactériennes Citrobacter, Enterobacter cloacae complex étaient totalement
résistantes à l’antibiotique Céfoxitine. Il n’y avait pas de résistance des autres espèces de
bactéries isolées des hémocultures à la Céfoxitime.
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Tableau XI : Sensibilité des bactéries isolées à la Céfotaxime dans les hémocultures au LRM
de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolés
Sensible
Résistant
Total
Klebsiella pneumoniae
1 (12,5%)
7 (87,5%)
8
Escherichia coli
4 (50%)
4 (50%)
8
0
1
1
Citrobacter
0
1
1
Enterobacter cloacae complex
0
2
2
Total
5
15
20
Acinetobacter
baumanii
complex
L’ensemble des espèces bactériennes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe
Mérieux présentaient une résistance à la Céfotaxime. Acinetobacter baumanii complex ,
Citrobacter, Enterobacter cloacae complex présentaient une résistance totale (100%) à la
Cefotaxime. Cependant quelques souches : Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli avaient
également une sensibilité pour cet antibiotique.
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Tableau XII : Sensibilité des bactéries isolées à la Ceftazidime dans les hémocultures au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolés
Sensible
Résistant
Total
Klebsiella pneumoniae
1 (16,7%)
5 (83,3%)
6
Pseudomonas aeruginosa
0
2
2
Escherichia coli
4 (50%)
4 (50%)
8
2 (16,7%)
10(83,3%)
12
Staphylococcus aureus
1 (25%)
3 (75%)
4
Citrobacter
0
1
1
Enterobacter cloacae complex
0
2
2
Total
8
27
35
Acinetobacter
baumanii
complex
Toutes les espèces bactériennes isolées des hémocultures au LRM présentaient une résistance
à la Ceftazidime. En effet, les espèces bactériennes telles que Klebsiella pneumoniae,
Acinetobacter baumanii complex, Staphylococcus aureus avaient les pourcentages de
résistance les plus élevés ; avec respectivement 83,3% ; 83,3% et 75%.
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Tableau XIII : Sensibilité des bactéries isolées à l’Amikacine dans les hémocultures au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolés
Sensible
Résistant
Total
Klebsiella pneumoniae
3 (37,5%)
5 (62,5%)
8
Pseudomonas aeruginosa
1 (50%)
1 (50%)
2
Escherichia coli
5 (62,5%)
3 (37,5%)
8
6 (60%)
4 (40%)
10
Staphylococcus aureus
3 (75%)
1 (25%)
4
Citrobacter
1
0
1
Enterobacter cloacae complex
2
0
2
Total
21
14
35
Acinetobacter
baumanii
complex
La plus part des espèces bactériennes isolées des hémocultures au LRM présentaient une
résistance à l’Amikacine. Klebsiella pneumoniae (62,5%) était l’espèce bactérienne qui
présentait la résistance la plus élevée à l’Amikacicine au LRM. Les espèces comme
Citrobacter, Enterobacter cloacae complex étaient sensibles.
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Tableau XIV: Sensibilité des bactéries isolées à la Gentamicine dans les hémocultures au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolés
Sensible
Résistant
Total
Klebsiella pneumoniae
1 (12,5%)
7(87,5%)
8
Pseudomonas aeruginosa
0
2
2
Escherichia coli
5 (62,5%)
3 (37,5%)
8
Staphylococcus aureus
4 (57,2%)
3 (42,8%)
7
2 (20%)
8 (80%)
10
Citrobacter
0
1
1
Enterobacter cloacae complex
0
2
2
Total
12
26
38
Acinetobacter
baumanii
complex
Les espèces bactériennes suivantes ; Citrobacter, Enterobacter cloacae complex, isolées des
hémocultures positives au LRM étaient totalement (100%) résistantes à la Gentamicine.
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Tableau XV: Sensibilité des bactéries isolées à la Ciprofloxacine dans les hémocultures au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolés
Sensible
Résistant
Total
Klebsiella pneumoniae
1 (12,5%)
7 (87,5%)
8
Escherichia coli
4 (50%)
4 (50%)
8
1 (11,1%)
8 (88,9%)
9
Staphylococcus aureus
1 (25%)
3 (75%)
4
Pseudomonas aeruginosa
0
1
1
Citrobacter
0
1
1
Enterobacter cloacae complex
0
2
2
Total
7
26
33
Acinetobacter
baumanii
complex
Toutes les espèces bactériennes isolées des hémocultures positives au LRM présentaient une
résistance à la Ciprofloxacine. Ainsi, les espèces telles que : Pseudomonas aeruginosa,
Citrobacter, Enterobacter cloacae complex présentaient une résistance totale à la
Ciprofloxacine.
Tableau XVI : Répartition des bactéries multi-résistantes isolées des hémocultures au LRM
de janvier 2013 à décembre 2013.
BMR
Effectif
Pourcentage
Oui
24
10,08
Non
214
89,92
Total
238
100
Au total, 24 espèces de bactéries multi-résistantes ont été isolées des hémocultures positives
au LRM durant notre étude soit un 10,08%.
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Tableau XVII : Répartition des bactéries multi résistantes isolées en fonction de l’espèce au
LRM de janvier 2013 à décembre 2013.
Germes isolés
Effectif
Pourcentage
Klebsiella pneumoniae
7
29,2%
Escherichia coli
4
16,7%
Pseudomonas aeruginosa
2
8,3%
Acinetobacter baumanii complex
5
20,8%
Staphylococcus aureus
3
12,5%
Citrobacter
1
4,2%
Enterobacter cloacae complex
2
8,3%
Total
24
100
Les espèces
de bactéries multi-résistantes aux antibiotiques isolées des hémocultures
positives étaient : Klebsiella pneumoniae (29,2%), Acinetobacter baumanii complex (20,8%),
Escherichia coli (16,7%)
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6. Discussion
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L’objectif de ce travail était de mettre en place au LRM la surveillance des résistances
bactériennes aux antibiotiques dans le cadre des septicémies à Bamako. Pour cela nous avons
adopté comme méthodologie d’écrire les modes opératoires normalisés nécessaires à la
réalisation des hémocultures au LRM, d’isoler les bactéries et d’évaluer leur résistance aux
antibiotiques pendant 24 mois. Nous avons choisi le LRM parce qu’il dispose d’un plateau
technique adéquat pour la réalisation de ce travail.
6.1. Pratique de l’hémoculture
L’hémoculture est une technique de laboratoire dont le but est de mettre en évidence la
présence ou l’absence de micro-organismes (bactéries et levures) dans le sang et d’étudier leur
sensibilité aux différents antibiotiques selon les cas (6). En effet, la fiabilité et la qualité de cet
examen dépendent à la fois des bonnes conditions de prélèvement par le personnel soignant ;
mais aussi des moyens mis en place pour l’isolement et l’identification des germes
susceptibles de s’y retrouver. Les bonnes pratiques de laboratoire exigent la rédaction et la
validation de tous les modes opératoires nécessaires à la réalisation de l’hémoculture. C’est ce
que nous avons commencé par faire au LRM. Ensuite le personnel a été formé à l’application
de ces modes opératoires. Ce qui a permis de générer des données de qualité dans le cadre de
ce travail car le taux de contamination était faible 18,9%.
6.2. Fréquence des hémocultures positives
De nombreux automates étaient utilisés pour la détection des micro-organismes susceptibles
de se développer dans le sang. Nous avons utilisé dans notre étude les services du
BacT/ALERT 3D de chez bio Mérieux ; tandis que Koné. SM, s’était servie du BACTEC de
chez BECTON DICKINSON (17). Au total, 238 prélèvements de sang pour examen
d’hémoculture ont été reçus au Laboratoire Rodolphe Mérieux de janvier 2013 à décembre
2013. Les hémocultures positives au LRM étaient au nombre de 68, soit un pourcentage de
positivité de 28,6%.
Au Centre national hospitalier et universitaire Hubert KOUTOUKOU Maga de Cotonou,
Soude AM., avait un échantillon total de 361 prélèvements pour hémoculture à analyser. Cette
étude avait rapportée 108 hémocultures positives, soit un taux de positivité de 29,9% (18). En
effet, la fréquence des hémocultures positives observée dans ce travail se rapprochait de celle
de Soude AM.
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61
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Un taux de positivité nettement inférieur 19,7% à celui de ce travail avait été retrouvé après
18 mois d’étude faite par Soraa, N. et coll., (19).
6.3. Identification et test de sensibilité
L’identification des espèces bactériennes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe
Mérieux avait été faite sur la base de leurs caractères morphologiques, culturaux et
biochimiques. En effet, la coloration de Gram et la culture sur gélose spécifique (gélose
Drygalski, gélose au sang frais, gélose chocolat) nous avaient permis d’avoir une idée sur la
nature de la bactérie isolée. L’identification des bactéries pathogènes au LRM dans les
hémocultures positives de janvier 2013 à décembre 2013, avait été faite pour l’essentiel par
les automates VITEK 2 compact et Mini API.
Toutefois, des tests d’identification rapide tels que le test à la catalase ; test à la coagulase ;
test à l’Optochine, dont les modes opératoires normalisés décrits en annexes avaient été utilisé
à cet effet.
Niandou. NT, avait utilisé la galerie classique API 20 E pour l’identification des
entérobactéries dans les hémocultures ; mais aussi dans d’autres prélèvements tels que les
urines, les pus, les prélèvements vaginaux, les liquides, la coproculture (24). Koné. SM avait
également utilisée la galerie classique API 20 E pour l’identification des entérobactéries
isolées des hémocultures (13).
L’étude de la sensibilité des espèces bactériennes isolées au LRM dans les hémocultures de
janvier 2013 à décembre 2013, avait été faite pour l’essentiel par le biais des automates tels
que : le VITEK 2 compact ; le Mini API.
Niandou. NT, avait utilisé la méthode de diffusion des disques d’antibiotiques sur gélose
Muller Hinton dans l’étude de la sensibilité des germes isolés des hémocultures (24).
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62
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
6.4. Fréquence des bactéries multi résistantes au LRM
Au total, 24 espèces bactériennes multi résistantes avaient été isolées des hémocultures
positives au LRM de janvier 2013 à décembre 2013. La fréquence des bactéries multi
résistantes
au
LRM
dans
les
hémocultures
positives
était
de
10,08%.
Les espèces bactériennes multi résistantes principalement isolées des hémocultures étaient ;
Klebsiella pneumoniae (29,2%), Acinetobacter baumanii complex (20,8%), Escherichia coli
(16,7%).
6.4.1. Fréquence de la résistance à l’Augmentin
La résistance à l’Augmentin des espèces bactériennes isolées au LRM de janvier 2013 à
décembre 2013 était totale (100%) chez les espèces telles que Acinetobacter baumanii
complex, Citrobacter et Enterobacter cloacae complex. Cependant, l’espèce Klebsiella
pneumoniae (87,5%) et l’espèce Escherichia coli (37,5%); présentaient la fréquence de
résistance à l’Augmentin la moins élevée.
Niandou. NT, avait obtenu respectivement 74% et 79% pour les espèces Escherichia coli et
Klebsiella pneumoniae résistantes à l’association Amoxicilline-Acide clavulanique.
6.4.2. Fréquence de la résistance à la Céfotaxime
Toutes les espèces bactériennes excepté Staphylococcus aureus étaient résistantes à la
Céfotaxime. L’espèce bactérienne Klebsiella pneumoniae (87,5%) isolée des hémocultures au
LRM, avait la fréquence de résistance à la Céfotaxime la moins élevée. Elle était suivie de
près par l’espèce Escherichia coli (50%).
Ahoyo AT et alliés au Benin avaient obtenu 67,6% de résistance à Escherichia coli, 100%
pour Acinetobacter baumanii complex et 68,2% pour Pseudomonas aeruginosa (25).
6.4.3. Fréquence de la résistance à la Ceftazidime
Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter, et Enterobacter cloacae complex présentaient une
résistance totale (100%) à la Ceftazidime. Tandis que, les espèces telles que Acinetobacter
baumanii complex (83,3%), Klebsiella pneumoniae (83,3%), Staphylococcus aureus (75%)
avaient une résistance modérément faible à la Ceftazidime.
Saib KB et alliés en Arabie Saudi avaient trouvé 89% de résistance à l’espèce bactérienne
Acinetobacter baumanii complex (26).
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6.5. Conservation des souches
Les souches étaient constituées par l’ensemble des bactéries multi résistantes, qui avaientnt un
intérêt sur le plan de la surveillance des infections bactériennes.
En effet, dans le cadre de la mise en place de la surveillance des résistances bactériennes aux
antibiotiques,un protocole avait été mis en place au sein du Laboratoire Rodolphe Mérieux de
Bamako . Les espèces bactériennes le plus recherchées étaient :
-
Salmonelles spp
-
Staphylococcus aureus (Methicyline, Vancomycine Résistantes)
-
Klebsiella pneumoniae
-
Escherichia coli
-
Pseudomonas aeruginosa…
Les souches bactériennes étaient préparées et conservées dans un congélateur à - 80°C. Ces
souches pourraient servir de références pour des éventuelles études beaucoup plus
approfondies.
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7. Conclusion
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La maîtrise des BMR constitue un problème en santé publique. Ce travail a permis de mettre
en place un système de surveillance des résistances bactériennes aux antibiotiques dans les
hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako. Il a permis d’isoler des souches
de bactéries multi résistantes aux antibiotiques dans les hémocultures reçues aux Laboratoire
Mérieux.
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8. Recommandations
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-
Aux autorités sanitaires :
•
Mettre en place en collaboration avec le Ministère de la Santé publique, un
programme de lutte contre les infections nosocomiales et des bactéries multi
résistantes afin de maîtriser la diffusion des souches de phénotype BLSE et
d’éviter l’évolution vers l’impasse thérapeutique.
-
Au Centre d’Infectiologie Charles Mérieux :
•
Instituer avec l’appui de Gouvernement de la république, une structure qui
serait un pole de référence dans le diagnostic des bactériémies/septicémies
responsables d’infections dues aux micro-organismes.
•
Etendre l’étude sur plusieurs années pour avoir un échantillonnage plus
représentatif.
•
Développer un outil moléculaire de surveillance des résistances bactériennes
aux antibiotiques
-
Aux praticiens médicaux :
•
Appliquer les bonnes pratiques de prescription et de dispensation des
antibiotiques à la population.
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9. Références bibliographiques
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1. Anagonou Sy, Akpona S., Josse R., Massougbodji A., et coll,. Les isolements de bactéries
dans les hémocultures au laboratoire bactériologie du C.N.H.U Cotonou (1987-1990).
Med Afr Noire 1993 ; 40 : 614-9.
2. Soraa N, Zougaghi L, Zahlane K, Admou B. Épidémiologie et profil de sensibilité des
isolats d’hémocultures dans un centre hospitalo universitaire marocain. Revue Tunisienne
d’Infectiologie. Avril 2011; Vol.5, N°2 : 78 - 81.
3. Gazagne L, Hernandez B, Nougaret A, Vergely S. Guide pratique de la maitrise des
bacteries multi resistantes aux antibiotiques. Inter Clin des Hauts Cantons de l’Hérault
2009; France.
4. Fauchère J. Technique de bactériologie clinique Edition marketing S.A, 1997 : 77-79.
5. Le Moing V, Psomas C. Septicémies - Faculté de Médecine de Montpellier-Nimes. Année
universitaire 2010-2011. Maladies Infectieuses et Tropicales CHRU de Montpellier
Février 2011. Disponible sur: www.med.univmontp1.fr/.../Medecine.../ECN_104_Septicemie_bis (consulté le 20 Mai 2014 à 16h07mn)
6. Fauchère JL, Avril JL. Bactériologie générale et médicale. Ellipses Edition Marketing
S.A, 2002; Paris.
7. APPIT Bactériémie, Sepsis et Choc septique, 15ème édition. E. PILLY, Montmorency:
2M2, 1996: 19-25.
8. Vandepitte J et coll. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. Genève 2003;
Page 120.
9. Avril JL, Dabernat H, Denis F, Monteil H. Bactériologie clinique. 3ème Edition pages: 660. 3ème éd. Paris.
10. Singleton P, Sainsbury D. Bactériologie. Masson, 1984; Page 158. Paris.
11. Gastinel P. Précis de bactériologie médicale. Masson, 1954; Pages: 12-44. Paris.
12. Flandrois JP. Bactériologie médicale. Presses universitaires de Lyon, 1997; Pages: 10799.
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13. Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie. Bactériologie. Chapitre 6: Les bactéries à
Gram positif non sporulés. Disponible sur:
www.chups.jussieu.fr/polys/bacterio/bacterio/POLY.Chp.6.2.html (consulté le 22 Mai à
15h54mn)
14. Leminor L, Veron M. Bactériologie médicale. Flammarion, 1989; pages:773-94. Paris.
15. Berche P, Gaillard JL. Bactériologie: les bactéries des infections humaines. Flammarion,
1989; Pages 230-39. Paris.
16. E. pilly-Préparation ECN: Prescription et surveillance des antibiotiques. Disponible sur:
http://www.infectiologie.com/site/medias/enseignement/ECN/38-ECN-item_173.pdf
17. Koné MS. Bilan de sept (7) ans d’hémoculture en milieu hospitalier pédiatrique de
Bamako. Université de Bamako, Thèse de Pharmacie N° 13; 2010.
18. BECTON, DICKINSON and Company, 2004. BACTEC 9050 Manuel d’utilisation. MA0103. Révision : E Réf 445845.
19. Leclerch. Microbiologie générale. 2ème édition, 1983; Pages: 199-202. Paris.
20. Ousmane M. Etude des contaminants des hemocultures au laboratoire de bacteriologie du
cvd du chu gabriel toure de 2002 à 2006. Université de Bamako, Thèse de Pharmacie N°
09P07; 2008.
21. Samaké M. Pratique de l’hémoculture au laboratoire d’analyses médicales de l’Hôpital
Gabriel Touré. Université de Bamako, Thèse de Pharmacie N°04P06; 2004.
22. Soude Séna Gbénou Adébola A. Bacteries isolees des hemocultures au laboratoire du
centre national hospitalier et universitaire hubert koutoukou maga de cotonou. Université
de Bamako, Thèse de Pharmacie N° 84; 2005.
23. Bulletin de l’Organisation mondiale de la Santé: Course contre la montre pour mettre au
point de nouveaux antibiotiques. Disponible sur:
http://www.who.int/bulletin/volumes/89/2/11-030211/fr/ (Consulté le 16/06/2014 à 14h18mn)
24. Niandou Tahirou Moustapha. Sensibilité et évolution de la résistance des entérobactéries
aux antibiotiques. Université de Bamako, Thèse de Pharmacie N0 05P79; 2005
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
25. Ahoyo TA, Bankolé HS, Adéoti FM, Gbohoun AA, and al. Prevalence of nosocomial
infections and anti-infective therapy in Benin: results of the first nationwide survey in
2012. Antimicrob Resist Infect Control. 2014; 3:17.
26. Said KB, Al-Jarbou AN, Alrouji M, Al-Harbi HO. Surveillance of antimicrobial
resistance among clinical isolates recovered from a tertiary care hospital in Al Qassim,
Saudi Arabia. Int J Health Sci. janv 2014; 8 (1) : 3-12.
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Fiche signalétique
Nom(s) : MOUDJONGUE OMOCK
Prénom : Sandrine
Titre de la thèse : Mise en place d’un système de surveillance des résistances bactériennes :
cas des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako.
Année universitaire : 2013-2014
Ville de soutenance : Bamako
Pays d’origine : Cameroun
Lieu de dépôt : Bibliothèque de la faculté de Médecine, Pharmacie et d’Odontostomatologie
Secteur d’intérêt : Bactériologie
Résumé
La multi résistance bactérienne est un problème majeur en santé publique. Le but de notre
travail était de mettre en place un système de surveillance des résistances aux antibiotiques
des bactéries associées aux septicémies dans le Laboratoire Rodolphe Mérieux (LRM) de
Bamako.
Nous avons réalisé une étude transversale de janvier 2013 à décembre 2013, chez des patients
adressés pour hémoculture au LRM. Nous avons utilisés la méthode automatisée de VITEK 2
compact et la méthode manuelle pour l’identification et la réalisation des antibiogrammes. Les
recommandations de la Communauté Académique de la Société Française de Microbiologie
(CA- SFM) de 2013 ont été utilisées pour l’interprétation des résultats.
Les entérobactéries viennent en première position des isolements avec 30,8% d’Escherichia
coli ; 15,4% de Klebsiella pneumoniae, c’est également le groupe de bactéries qui présente la
proportion la plus élevée de multi résistance. Cependant, le pourcentage de contamination est
de 18,9.
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Notre étude nous a permis d’écrire et de valider les MON essentiels à la réalisation des
hémocultures au LRM. Nous avons constaté, que la prévalence des BMR aux antibiotiques est
élevée (24/238).
Mots clés : Bactérie – Multi résistance – Hémoculture – LRM – Bamako.
Abstract
The multi bacterial resistance is a major problem in public health. The goal of our work was
to put a system of surveillance of the resistances in place to the antibiotics of the bacteria
associated to the septicemia in the Laboratory Rodolphe Mérieux (LRM) of Bamako.
We achieved a transverse survey from January 2013 to December 2013, among patients
addressed for hémoculture in the LRM. We used the method automated of compact VITEK 2
and the manual method for identification and the realization of the antibiogrammes. The
recommendations of the Academic Community of the Microbiology Society French (AC MSF) of 2013 have been used for the interpretation of the results.
The enterobacteria comes in first position of the isolations with 30, 8% of Escherichia coli;
15, 4% of Klebsiella pneumoniae, it is also the group of bacteria that presents the most
elevated proportion of multi resistance. However, the percentage of contamination is of 18, 9.
Our survey we permitted to write and to validate the SOPs essential to the realization of the
hemocultures in the LRM. We noted, the prevalence of the BMR to the antibiotics is raised
(24/238).
Key words: Bacteria – Multi resistance – Blood culture – LRM – Bamako.
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Annexes
Annexe 1 : Organigramme du Centre Charles Mérieux(CICM)
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Annexe 2 : MODE OPERATOIRE D’UTILISATION BacT/ALERT 3D –
Rédigé le:
10 mars 2010
Par : Abdoulaye TOURE
AT
Modifié le:
20 mars 2013
Par : Lassina DOUMBIA
LD
Vérifié le:
Par : Abdoulaye TOURE, AT,
04 juin 2013
Judicaël
Visa :
OUEDRAOGO, JO,
Boula KANOUTE,
Nana KEITA
BK,
NK
Approuvé le:
Par :
Visa :
Modifié le:
Par :
Vérifié le :
Par :
Visa :
Approuvé le:
Par :
Visa :
Diffusé le :
Objet
de
la Mise à jour des documents assurances qualités.
modification:
Archivé le :
Document provisoire
X Document opérationnel
Destinataires
Directeur
Général
Thèse de Pharmacie
Responsable
Biologistes Qualité
Assurance Responsable
technique
Stagiaires
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Exemplaires :
- Classeur Assurance Qualité
-Classeur bactériologie
Documents Qualité liés:
MAQ: Manuel Assurance Qualité LRM
P:
MO:
D:
E:
I – But
Décrire le mode opératoire d’utilisation du BacT/ALERT 3D
II - Domaines et personnels concernés
Tout le secteur de bactériologie du centre d’Infectiologie Charles Mérieux. Tout le personnel
susceptible d’utiliser le BacT/ALERT 3D
III - Abréviations/Définitions
IV – Référence
MODE OPERATOIRE D’UTILISATION DU BacT/ALERT 3D
1. PRINCIPE ..................................................................................................................
2. REACTIFS .................................................................................................................
3. UTILISATION EN ROUTINE ................................................................................
3.1. MISEEN ROUTE ...................................................................................................
3.1.1. MISE EN ROUTE DE L'APPAREIL ..............................................................
3.1.2. ACCES Au CLAVIER DU MODULE DE CONTROLE ..............................
3.1.3. CHARGEMENT DES FLACONS ...................................................................
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
3.1.4. VISUALISATION DE LA COURBE D'EVOLUTION
BACTERIENNE ............................................................................................................
3.1.5. DECHARGEMENT DES FLACONS ...............................................................
1. Principe
C’est une étuve incubant des flacons d’hémoculture et des flacons de mycobactéries, à
37° C, avec un mouvement d’agitation régulier, munie d’un système de lecture optique
lisant toutes les 10 minutes.
Le principe de détection des micro-organismes est basé sur la modification de couleur
d’un indicateur colorimétrique. Cet indicateur est situé à la base des flacons, séparé du
liquide par une membrane perméable au dioxyde de carbone (CO2).Le CO2 est produit
par le métabolisme des micro-organismes et passe à travers la membrane de manière
passive, ce qui produit une réaction chimique acidifiant l’indicateur colorimétrique.
Ceci a pour effet de le faire changer de couleur.
A intervalles réguliers, toutes les 10 minutes, un faisceau lumineux est émis en
direction de l’indicateur colorimétrique. La lumière réfractée par l’indicateur
colorimétrique est captée par un capteur. Celui-ci reçoit le faisceau puis cette
information est ensuite envoyée dans le logiciel de traitement.Le signal recueilli est
ensuite analysé selon trois algorithmes
(Seuil, delta et pente).
2. Réactifs
Le BacT/ALERT 3D utilise les flacons de culture à usage unique, auxquels sont
ajoutés les échantillons à tester.
Chaque flacon contient un détecteur de CO2 qui sert d’indicateur de la croissance
microbienne.
Le flacon de culture BacT/ALERT 3D est prêt à l’emploi. Une date de péremption
figure sur l’étiquette de chaque flacon, ne pas utiliser les milieux après le dernier jour
du mois indiqué.
Si les flacons sont conservés réfrigérés, il peut se former un précipité qui disparaît
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
lorsque les flacons sont portés à la température ambiante (15-30°C).
Conserver les flacons à l’abri de la lumière et à la température ambiante.

-
Les différents types de flacons :
Les flacons d’hémoculture (BC)
 Le flacon aérobie (FA) Réf : 259791
 Le flacon anaérobie (FN) Réf : 259793
 Le flacon pédiatrique (FP) Réf : 259794
NB : Utiliser uniquement les flacons aérobies chez les nourrissons (0-6mois) ou flacon
pédiatrique (FP)
-
Les flacons de culture des mycobactéries (MB)
 Les flacons (MB/BacT) MP Réf : 259797 sont utilisés pour la culture des
mycobactéries.
3. Utilisation en routine
3.1. Mise en route
3.1.1. Allumer l’appareil
L’appareil BacT/ALERT 3D est une étuve qui doit rester en permanence en marche.

Allumer d’abord le module combo droit (Appuyer sur l’interrupteur placé en haut
dans l’arrière droit du BacT/ALERT 3D) ;

Allumer ensuite le module combo gauche (Appuyer sur l’interrupteur placé en haut
dans l’arrière droit du BacT/ALERT 3D) ;

Allumer en fin le module de contrôle (Appuyer sur l’interrupteur placé en haut
dans l’arrière droit du BacT/ALERT 3D).
3.1.2. Accès au clavier du module de contrôle
Il existe deux types de tiroirs à clavier, le modèle A et le modèle B
Pour accéder au clavier du tiroir du modèle B

Tirer complètement le tiroir à clavier au bas du module de contrôle. Le tiroir révèle
un couvercle comprenant une glissière pour la carte aide-mémoire.
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako

Soulever le couvercle à partir de l’avant pour accéder au clavier.
3.1.3. Chargement des flacons
1. Appuyer sur l’image flacon de l’écran principal. L’écran mode de chargement
apparaît ;
2. S’assurer que le champ ID de flacon apparaît blanc, puis scanner ou entrer
manuellement l’ID du flacon ;
3. S’assurer que le type de flacon approprié est affiché sur le bouton de défilement de
type de flacon ;
4. S’assurer que le champ numéro d’examen est blanc, puis scanner ou entrer
manuellement le numéro d’examen ;
5. Si les champs sont affichés et activés, saisir manuellement les informations
suivantes dans l’ordre indiquant :

Identité échantillon.

Heure d’incubation.

Nom du patient.

Prénom du patient.
6. La durée maximale du test par défaut s’affiche au dessus du bouton modification
de la durée maximale de test ;
7. Si tous les tiroirs sont fermés, ouvrir lentement un tiroir comportant un voyant
allumé. Les voyants des cellules disponibles sont allumés ;
8. Introduire le flacon (le détecteur colorimétrique en avant) dans une cellule avec un
voyant allumé ;
9. Le voyant de la cellule clignote lentement pour indiquer que le flacon est chargé ;
10. Vérifier que tout le texte des champs s’efface avant de poursuivre ;
11. Répéter les étapes 2 à 10 pour chaque flacon restant. Les flacons peuvent être
chargés dans le même tiroir jusqu’à ce que toutes les cellules disponibles soient
remplies. A ce stade refermer délicatement le tiroir et ouvrir un autre tiroir
comportant un voyant allumé.
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Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
12. Lorsque tous les flacons sont chargés, vérifier que tous les tiroirs sont bien fermés,
appuyer sur le bouton valide ;
13. Lorsque la saisie manuelle est terminée, le clavier peut être replacé sous le
couvercle ; fermer le tiroir en appuyant sur les deux languettes latérales tout en
repoussant le tiroir.
3.1.4. Visualisation de la courbe d’évolution bactérienne
A partir de l’écran principal :
1. Appuyer sur l’icône
.
2. Appuyer sur1 234
le Cardenas s’ouvre : la page est active.
3. Appuyer sur la 3ème icône dans la 2ème colonne de l’écran affiché.
4. Scanner le code barre de l’échantillon.
5.
Appuyer
sur
l’icône en bas et à droite : la courbe d’évolution
s’affiche.
3.1.5. Déchargement des flacons
L’automate BacT/ALERT 3D indique les types de flacons prêts à être déchargés en
appuyant sur l’image flacon soit : positif ; négatif ; plus ou moins; point
d’interrogation.
NB : Pour préserver l’intégrité des données de test, manipuler un seul flacon à la fois. Il
est important de terminer la procédure pour chaque flacon avant de poursuivre avec le
flacon suivant.
1. Vérifier que les flacons à décharger sont répertoriés dans le rapport de déchargement.
2. Appuyer sur l’image flacon approprié de l’écran principal. Cette action a pour but :
-
de faire apparaître l’écran mode de déchargement.
-
d’allumer les voyants verts des tiroirs contenant des flacons du type de flacon à
décharger sélectionné.
3. Ouvrir le tiroir indiqué. Lorsque le tiroir indiqué est ouvert, les voyants des cellules
s’allument à côté de tous les flacons de la catégorie sélectionnée.
4. Sortir un des flacons indiqués. Le voyant de la cellule clignote lentement pour
indiquer le déchargement du flacon.
5. Si le flacon était identifié au chargement :
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78
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
-
L’ID du flacon, son type, l’ID laboratoire ainsi que le nom et prénom du patient
s’affichent dans les champs des tests désactivés, de l’écran mode de déchargement, le
cas échéant,
-
Il n’est pas nécessaire de scanner de nouveau l’ID du flacon, cependant, cela permet
d’en vérifier l’identité.
6. Si le flacon a été chargé anonymement (le champ ID du flacon est vierge), scanner ou
saisir manuellement l’ID du flacon.
-
Identifier le flacon en entrant l’ID du flacon, le type de flacon, l’ID laboratoire ainsi
que le nom et prénom du patient.
-
Si le flacon doit être rechargé, le remettre immédiatement dans la cellule dont le
voyant clignote lentement, avant de décharger un autre flacon.
7. Répéter les étapes 3 à 5 pour les flacons restant à décharger.
8. Après avoir effectué le déchargement des flacons, vérifier que tous les tiroirs sont bien
fermés.
9. Appuyer sur le bouton valider de l’écran mode de déchargement.
Procédure de maintenance. Cf. manuel d’utilisation BacT/ALERT 3D.
Procédure de gestion des pannes. Cf. manuel d’utilisation BacT/ALERT 3D.
Thèse de Pharmacie
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79
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Annexe 3 : MODE OPERATOIRE DE LA TECHNIQUE DE COLORATION DE
GRAM – Version N° 2
Rédigé le:
25/02/2005
Par : Al Hadji SIDIBE
AS
Vérifié le:
25/02/2005
Par : Louis DEWEERDT
LD
Visa :
Approuvé le:
02/03/2005
Par : Fatou Traoré FAYE
FTF
Visa :
Modifié le:
21/02/2013
Par : Tony ZITTI
TZ
Vérifié le :
25/03/2013
Par : Nana Kadidia KEITA
NK
Visa :
Par : Dr Daniel YALCOUYE
DY
Visa :
Approuvé le:
Diffusé le :
Objet
de
la Mise à jour des documents assurance qualité
modification:
Archivé le :
Document provisoire
X Document opérationnel
Destinataires
D. YALCOUE
N. KEITA
A. MAIGA
A. CISSE
A. TOURE
O. HAIDARA
L. SIDIBE
K. DIARRA
J.OUEDRAOGO
B. KANOUTE
Exemplaires :
- Classeur Assurance Qualité :
- Classeur de Bactériologie
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
80
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Documents Qualité liés:
MAQ: Manuel Assurance Qualité du LRM de Bamako
P:
Procédure de la réalisation des analyses en bactériologie
MO:
D:
E:
I – Buts
Décrire le mode opératoire de la technique de coloration de Gram.
II - Domaines et personnels concernés
Secteur de bactériologie. Tout le personnel susceptible d’utilisé cette technique.
III - Abréviations/Définitions
LRM : Laboratoire Rodolphe Mérieux
IV – Références
V – Contenu
MODE
OPERATOIRE
DE
LA
TECHNIQUE
DE
COLORATION DE GRAM
Principe
C’est la coloration de base en bactériologie et elle permet une classification des
bactéries selon leur structure. Elle est l’un des caractères essentiels de la classification
des bactéries. Plusieurs facteurs vont intervenir dans cette coloration :

La différence de composition chimique des bactéries ;

La différence de perméabilité de la paroi bactérienne à l’alcool-acétone.
Matériel

Microscope ;
Thèse de Pharmacie
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81
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako

Blouse ;

Bac de coloration ;

Plaque chauffante ;

Bec bunsen ;

Centrifugeuse.
Consommable

Gants ;

Lames porte objet ;

Tube conique ;

Pipette pasteur.
Réactif

Colorants : violet de gentiane, le lugol, l’alcool-acétone, la fuchsine.

L’huile d’immersion.
Nature du prélèvement
Frottis d’un produit pathologique bien séché sur une lame
Contrôle de qualité
Les lames positives (frottis préparés avec une souche de bactérie connue) sont
conservées et utilisées comme lames de référence.
Technique
La coloration de Gram se déroule en plusieurs étapes qui se succède et consiste à :

Fixer le frottis ;

Recouvrir le frottis de la solution de cristal violet, laisser agir une minute (violet de
gentiane) ;

Rejeter le colorant puis laver à l’eau ;

Recouvrir la préparation de lugol, laisser agir une minute ;

Rejeter le colorant puis laver à l’eau ;

Décolorer à l’alcool-acétone ;

Rincer à l’eau de robinet et recouvrir la lame de solution de fuchsine diluée, laisser
agir 30secondes ;
Thèse de Pharmacie
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82
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako

Rejeter la Fuchsine, laver à l’eau, égoutter, sécher entre deux feuilles de papier buvard
propres ;

Lire le frottis coloré au microscope à l’objectif x100 à l’huile d’immersion.
Résultats
Après coloration de Gram, les bactéries apparaissent sous différentes morphologies et
teintes :

Bactéries Gram négatif : coloration rose

Bactéries Gram positif : coloration violette

Levures : forme ovale coloration violet
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
83
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Annexe 4 : MODE OPERATOIRE DE LA RECHERCHE DE LA CATALASE
- Version N° 2
Rédigé le:
24/02/2005
Vérifié le:
036/03/2005 Par : Louis DEWEERDT
LD
Visa :
Approuvé le:
04/03/2005
Par : Fatou Traoré FAYE
FTF
Visa :
Modifié le:
21/02/2013
Par : AHANOGBE Lem K. A
AL
Vérifié le :
22/02/2013
Par : Judicaël OUEDRAOGO
JO
Visa :
Approuvé le:
27/08/2013
Par : Dr Daniel YALCOUYE
DY
Visa :
Diffusé le :
30/08/2013
Par : Abderrhamane MAIGA
AMA
Objet
de
Par : Al Hadji SIDIBE
AS
la Mise à jour des documents assurance qualité
modification:
Archivé le :
Document provisoire
X Document opérationnel
Destinataires
D. YALCOUYE
N. KEITA
A. MAIGA
A. CISSE
A. TOURE
O. HAIDARA
L. SIDIBE
K. DIARRA
J. OUEDRAOGO
B. KANOUTE
Exemplaires :
Thèse de Pharmacie
- Classeur Assurance Qualité :
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
84
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
- Classeur de Bactériologie
Documents Qualité liés:
MAQ: Manuel Assurance Qualité du LRM de Bamako
P:
Procédure de la réalisation des examens Bactériologique
MO:
D:
E:
I – But
Décrire la technique du test de la catalase en microbiologie.
II - Domaines et personnels concernés
Le secteur de Bactériologie. Tout le personnel susceptible d’utiliser cette technique.
III - Abréviations/Définitions
LRM : Laboratoire Rodolphe Mérieux
IV – Références
V – Contenu
MODE OPERATOIRE DE LA RECERCHE DE
LA CATALASE
1. But :
La recherche de la catalase est réalisée pour différencier le genre :

Streptococcus (catalase négative) du genre Staphylococcus (catalase positive)

Bacillus (catalase positive) du genre Clostridium (catalase négative)

Listeria (catalase positive) et/ou Corynebacterium (catalase positive) du genre
Erysipelothrix (catalase négative)
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
85
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
2. Principe
La catalase est une enzyme qui hydrolyse le peroxyde d’hydrogène (H2O2) en eau et en
oxygène. La présence de catalase est détectée chez les micro-organismes par une
libération d’oxygène à partir d’eau oxygénée.
La présence d’un agent épaississant et d’un colorant facilitent l’observation du
dégagement gazeux.
3. Matériel

Le réactif de catalase

La lame porte-objet ;

Le bâtonnet ;

La souche pure.
4. Contrôle de qualité
L’activité du réactif peut être testée vis à vis des souches suivantes :

Staphylococcus aureus ATCC 25923, la catalase est positive

Enterococcus faecalis
ATCC 29212, la catalase est négative
5. Réalisation du test
Laisser les flacons revenir à température ambiante

Test sur lame
o Déposer sur la lame une goutte du réactif de la catalase ;
o A l’aide d’un bâtonnet, bien triturer 1 à 2 colonies dans la goutte.

Test direct sur le milieu de culture
o Déposer une goutte d’ID color catalase directement sur la colonie.
6. Résultat
Le test doit être réalisé sur des colonies de 18 à 24 heures après incubation. Les
colonies plus âgées pourraient perdre leur catalase et donner des faux négatifs. La
présence de catalase se matérialise par une production de bulles ;
Thèse de Pharmacie
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86
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Les entérobactéries sont toutes des bactéries catalase positive, à l’exception de Shigella
dysenteriae ;
Les bacilles à Gram négatif non fermentaires sont en général, catalase positive telles que
Pseudomonas, Acinetobacter… ;
Quelques cocci à Gram positif son catalase positive comme les Staphylocoques.
7. Gestion des déchets
Les objets tranchants sont jetés dans une boite de sécurité et les objets souillés non
tranchants dans la poubelle jaune.
Thèse de Pharmacie
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87
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Annexe 5 : MODE OPERATOIRE DE LA RECHERCHE DE L’OXYDASE Version N° 2
Rédigé le:
25/02/2005
Par : Al Hadji SIDIBE
AS
Vérifié le:
25/02/2005
Par : Louis DEWEERDT
LD
Visa :
Approuvé le:
28/02/2005
Par : Fatou Traoré FAYE
FTF
Visa :
Modifié le:
21/02/2013
Par : Fatoumata MAIGA
FM
Vérifié le :
25/03/2013
Par : Boula KANOUTE
BK
Visa :
Approuvé le:
28/08/2013
Par : Dr Daniel YALCOUYE
DY
Visa :
Diffusé le :
30/08/2013
Par : Abderrhamane MAIGA
AMA
Objet
de
la Mise à jour des documents assurance qualité
modification:
Archivé le :
Document provisoire
X Document opérationnel
Destinataires
D. YALCOUYE
N. KEITA
A. MAIGA
A. CISSE
O. HAIDARA
L. SIDIBE
K. DIARRA
J.OUEDRAOGO B. KANOUTE
Exemplaires :
A. TOURE
- Classeur Assurance Qualité :
- Classeur de Bactériologie
Documents Qualité liés:
Thèse de Pharmacie
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88
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
MAQ: Manuel Assurance Qualité du LRM de Bamako
P:
Procédure de la réalisation des examens Bactériologique
MO:
D:
E:
I – But
Décrire la technique du test de l’oxydase en microbiologie.
II - Domaines et personnels concernés
Le secteur de Bactériologie. Tout le personnel susceptible d’utiliser cette technique.
III - Abréviations/Définitions
LRM : Laboratoire Rodolphe Mérieux
IV – Références
V – Contenu
MODE OPERATOIRE DE LA RECHERCHE DE L’OXYDASE
But du test :
La recherche de l’oxydase permet :

D’identifier le genre Neisseria spp (positif)

De séparer les Entérobactéries (négatif) des espèces du genre Pseudomonas (positifs
pour la plupart)

De différencier Moraxella (positif) et Neisseira (positif) d’Acinetobacter (négatif)

De différencier Pseudomonas maltophilia (négatif) des autres Pseudomonas sp
(positif)

D’aider à l’identification d’Aeromonas (positif), Alcaligenes (positif), Branhamella
Thèse de Pharmacie
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89
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
(positif) et Yersinia (négatif).
Principe
Le test de l’oxydase est basé sur la production bactérienne d’une enzyme oxydase
intracellulaire.
En présence d’oxygène atmosphérique et de cytochrome C, cette enzyme oxyde le réactif
phénylènediamine, pour former un composé coloré en violet, l’indophénol.
L’acide ascorbique, incorporé dans le réactif, agit en tant qu’agent réducteur pour limiter
l’auto-oxydation et améliorer la stabilité du réactif. Cette formulation est basée sur la formule
de la réactive oxydase de Kovac.
Matériel

Anse (en platine, plastique).

Disques non imprégnés de diamètre 6 mm.
Condition de stockage

Les réactifs se conservent entre 18°C et 25°C dans leur coffret jusqu’à la date de
péremption.

Ne pas congeler.

Conserver à l’abri de la lumière.

Le réactif oxydase s’auto-oxyde rapidement et perd sa sensibilité. Tout réactif
partiellement utilisé doit être éliminé au bout de 24 heures.
Nature de l’échantillon
L’échantillon est constitué d’une colonie isolée pour laquelle on veut détecter l’enzyme
cytochrome oxydase. Cette colonie doit être issue d’une culture de 18 à 24 heures sur milieux
de culture gélosés solides.
Thèse de Pharmacie
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90
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Contrôle de qualité
L’activité du réactif peut être testée à l’aide des souches suivantes cultivées sur géloses
Trypcase-Soja(ou Drygalski) :

Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853

Escherichia coli
ATCC 25922
Souche
Résultats
Pseudomonas aeruginosa
Positif : coloration violette
ATCC 27853
Escherichia coli
Négatif : pas de coloration
ATCC 25922
Réalisation du test

Placer le flacon compte-gouttes dans le briseur d’ampoule.

Tapoter le fond du flacon pour éliminer les bulles qui auraient pu s’y former.

Saisir le milieu de l’ensemble flacon/briseur et appuyer doucement pour briser
l’ampoule.

Distribuer précisément une goutte de réactif sur un disque non imprégné de diamètre 6
mm.

Etaler la colonie sur le disque.
Résultat

Lecture et interprétation
o L’apparition en 10 à 30 secondes d’une coloration allant de violet à pourpre
indique un test positif.
o Des réactions tardives ou l’absence de couleur indiquent un test négatif.
NB :

La réaction d’oxydase ne doit pas être réalisée sur des colonies obtenues sur gélose
EMB ou CHAPMAN 2, ni sur des colonies issues d’une culture de 48 heures sur des
milieux gélosés solides.
Thèse de Pharmacie
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91
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako

La recherche de l’oxydase ne doit pas être effectuée sur des colonies isolées présentant
une coloration spontanée (couleur violette, rose, noire…). Dans ce cas, la lecture du
test est impossible.

L’utilisation d’un volume de réactif trop important peut entraîner des résultats
faussement négatifs. N’utiliser qu’une seule goutte de réactif comme indiqué dans le
mode opératoire.

Il est conseillée d’utiliser une anse ou une aiguille en platine ou en plastique pour le
test de l’oxydase. Toute trace de fer (nichrome) peut catalyser la réaction de l’oxydase
et conduire à une réaction faussement positive.

Tout réactif partiellement utilisé doit être éliminé au bout de 12 heures.

Les germes faiblement producteurs d’oxydase comme les Pasteurella, peuvent donner
des résultats négatifs.

Des résultats faussement négatifs peuvent survenir en cas de cultures mixtes de
Pseudomonas et Neisseria. Une substance inhibitrice est produite par Pseudomonas
spp. interférant avec la production d’oxydase de Neisseria spp.
Gestion des déchets
Les réactifs non utilisés peuvent être éliminés comme déchets non dangereux.
Eliminer les réactifs utilisés ainsi que les matériels à usage unique contaminés en suivant les
procédures relatives aux produits infectieux ou potentiellement infectieux.
Il incombe à chaque laboratoire de gérer les déchets et les effluents qu’il produit selon leur
nature et leur dangerosité, et d’en assurer (ou faire assurer) le traitement et l’élimination selon
les réglementations applicables.
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
92
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Annexe 6 : MODE OPERATOIRE DU TEST DE LA COAGULASE
-
Version N° 1
Rédigé le:
23/02/2013
Par : Doussou COULIBALY
DC
Vérifié le:
25/03/2013
Par : Judicaël OUEDRAOGO
JO
Visa :
Approuvé le:
Par : Dr Daniel YALCOUYE
DY
Visa :
Modifié le:
Par :
Vérifié le :
Par :
Visa :
Approuvé le:
Par :
Visa :
Diffusé le :
Objet
de
la
modification:
Archivé le :
Document provisoire
X Document opérationnel
Destinataires
D. YALCOUE
N. KEITA
A. MAIGA
O.HAIDARA
L.SIDIBE
K. DIARRA
Exemplaires :
A. CISSE
A. TOURE
J.OUEDRAOGO B. KANOUTE
- Classeur Assurance Qualité :
- Classeur de Bactériologie
Documents Qualité liés:
Thèse de Pharmacie
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93
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
MAQ: Manuel Assurance Qualité du LRM de Bamako
P:
Procédure de la réalisation des examens Bactériologique
MO:
D:
E:
I – But
Décrire la technique du test de la coagulase en microbiologie.
II - Domaines et personnels concernés
Le secteur de Bactériologie. Tout le personnel susceptible d’utilisé cette technique.
III - Abréviations/Définitions
LRM : Laboratoire Rodolphe Mérieux
IV – Références
V – Contenu
MODE OPERATOIRE DU TEST DE LA COAGULASE
Prince
Le BBL Coagulase Plasma, Rabbit (Plasma de lapin pour test de la coagulase BBL) servent à
déterminer qualitativement la pathogénicité des Staphylocoques par la méthode directe en
tube.
Cette méthode consiste à mélanger une culture en bouillon de la veille ou des colonies
prélevées sur une boîte de gélose non inhibitrice dans un tube de coagulase plasma réhydraté.
Le tube est incubé à 37°C pendant une durée de 4H , la formation d’un caillot dans le plasma
indique une production de coagulase.
Matériel

Tube sec ;
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
94
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako

Anse ;

Souche pure ;

Bec bunsen ;

Portoir tube ;

Etuve ;

Chronomètre.
Réactif
Le coagulase Rabbit est un plasma de lapin lyophilisé contenant environ 0,85% de citrate de
sodium et 0,85% de chlorure de sodium.
Conservation du réactif
Le BBL coagulase plasma, Rabbit non ouvert se conserve entre 2 – 8°C
Le Plasma reconstitué se conserve à 2 – 8°C jusqu’à 14jours, ou aliquoter et congeler
immédiatement à – 20°C jusqu’à 30jours, ne pas recongeler une fois décongeler.
Nature du prélèvement
Les colonies pures sur une souche gélosée ou en bouillon
Contrôle de qualité
Les contrôles positifs et négatifs sont testés aux souches de références pour vérifier la
conformité des performances du coagulase Plasma avec les spécifications.
Microorganisme
ATCC
Réaction
Staphylococcus
25923
Caillot dans le tube
12228
Absence de caillot
aureus
Staphylococcus
epidermidis
Thèse de Pharmacie
dans le tube
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
95
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Réalisation du test

Préparation des réactifs
o Réhydrater le BBL Coagulase Plasma en ajoutant de l’eau purifiée dans le flacon
comme indiqué ci-dessous puis mélanger en retournant alternativement le flacon.
Volume de produit
Eau
purifiée
stérile
Nombre
approximatif
de
test

3 ml
3 ml
6
15 ml
15 ml
30
25 ml
25 ml
50
Réalisation du test de BBL Coagulase
o A l’aide d’une micropipette de 1 ml, ajouter 0,5 ml de BBL Coagulase Plasma,
Rabbit réhydraté à un tube à culture sur un portoir ;
o Ajouter environ 0,05 ml de culture en bouillon de la veille du microorganisme à
tester dans le tube de plasma. Il est également possible, à l’aide d’une anse en
plastique stérile, d’émulsifier complètement dans le tube de plasma 2 – 4 colonies
prélevées sur une boîte de gélose ;
o Mélanger doucement ;
o Incuber au bain-marie ou à l’étuve à 37°C pendant 4heures ;
o Examiner périodiquement les tubes en les inclinant doucement. Ne pas agiter le
tube pour ne pas risquer de désagréger le caillot et par conséquent d’entrainer des
résultats de test douteux ou faussement négatifs. Tout degré de coagulation dans
un délai de 3 – 4 heures doit être interprété comme un résultat positif. De
nombreuses souches productrices d’enzymes ne coaguleront le plasma qu’au bout
de 24heures d’incubation.
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
96
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Résultat

Si la coagulase est négative : absence de formation de caillot, laisser jusqu’à
24heures sur la paillasse ;

Si la coagulase est positive : le caillot ne se détache pas lorsque le tube est retourné.
Suspicion de Staphylococcus aureus.
Aspect avant
Aspect du test positif
Aspect du test négatif
Ensemencement
Gestion des déchets
Les objets tranchants sont jetés dans une boite de sécurité et les objets souillés non
tranchants dans la poubelle jaune (contaminant).
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
97
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Annexe 7: MODE OPERATOIRE DU TEST A L’OPTOCHINE -Version N° 2
Rédigé le:
20/02/2005
Par : Al Hadji SIDIBE
AL
Vérifié le:
07/03/2005
Par : Louis DEWEERDT
LD
Visa :
Approuvé le:
11/03/2005
Par : Fatou Traoré FAYE
FTF
Visa :
Modifié le:
23/02/2013
Par : AHANOGBE Lem K. A
AL
Vérifié le :
25/03/2013
Par : Judicaël OUEDRAOGO
JO
Visa :
Par : Dr Daniel YACOUYE
DY
Visa :
Approuvé le:
Diffusé le :
Objet
de
la Mise à jour des documents assurance qualité
modification:
Archivé le :
Document provisoire
X Document opérationnel
Destinataires
D. YALCOUE
N. KEITA
A. MAIGA
A. CISSE
O. HAIDARA
L. SIDIBE
K. DIARRA
J.OUEDRAOGO B. KANOUTE
Exemplaires :
A. TOURE
- Classeur Assurance Qualité :
- Classeur de Bactériologie
Documents Qualité liés:
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
98
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
MAQ: Manuel Assurance Qualité du LRM de Bamako
P:
Procédure de la réalisation des examens Bactériologique
MO:
D:
E:
I – But
Décrire la technique du test à l’Optochine en microbiologie.
II - Domaines et personnels concernés
Le secteur de Bactériologie. Tout le personnel susceptible d’utilisé cette technique.
III - Abréviations/Définitions
LRM : Laboratoire Rodolphe Mérieux
IV – Références
V – Contenu
MODE OPERATOIRE DU TEST A L’OPTOCHINE
Prince
Ce réactif permet de tester la sensibilité des streptocoques vis-vis de l’optochine.
L’espèce Streptococcus pneumoniae est généralement sensible à l’optochine contrairement
aux autres streptocoques, en particulier les streptocoques alpha hémolytique.
Matériel

Jarre ;

Etuve bactériologique ;

Disque d’optochine.
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
99
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Conservation des disques

Les disques se conservent entre 2 – 8°C dans leur flacon jusqu’à la date de
péremption ;

Conserver à l’abri de la lumière ;

Après ouverture, les disques se conservent 3 mois à 2 – 8°C dans leur flacon.
Nature du prélèvement
Le test est réalisé à partir d’un ensemencement en culture pure d’une souche isolée de
Streptocoques.
Contrôle de qualité
L’activité des disques peut être vérifiée sur gélose au sang frais avec la souche suivante :
Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Avec la zone d’inhibition après 24heures à 37°C :
15 à 35mm.
Réalisation du test

Laisser le flacon de disques revenir à température ambiante ;

A partir d’une ou plusieurs colonies de la souche à tester, ensemencer en tries serrées
une boîte de gélose au sang afin d’obtenir des colonies confluentes ;

Déposer un disque d’optochine à la surface de la boîte ensemencée ;

Placer la boîte en atmosphère appropriée (enrichie en CO2) ;

Incuber à l’étuve, couvercle en bas, à 37°C pendant 24heures.
Résultat

Lecture et interprétation
o Après incubation, observer le diamètre de la zone d’inhibition autour du disque
d’optochine : Une zone d’inhibition supérieure ou égale à 15mm est une
présomption de Streptococcus pneumoniae ;
o L’identification du micro-organisme peut être poursuivie par des tests
biochimiques et immunologiques, le VITEK 2 compact, le Mini Api.
Thèse de Pharmacie
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100
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Annexe 8: MODE OPERATOIRE DE L’UTILISATION DU VITEK 2
COMPACT -Version N° 1
Rédigé le:
22/02/2013
Par :
Sandrine S
MOUDJONGUE OMOCK
Vérifié le:
25/03/2013
Par : Nana Kadidia KEITA
NK
Visa :
Approuvé le:
Par : Dr Daniel YALCOUYE
DY
Visa :
Modifié le:
Par :
Vérifié le :
Par :
Visa :
Approuvé le:
Par :
Visa :
Diffusé le :
Objet
de
la
modification:
Archivé le :
Document provisoire
X Document opérationnel
Destinataires
D. YALCOUE
N. KEITA
A. MAIGA
A. CISSE
O. HAIDARA
L. SIDIBE
K. DIARRA
J.OUEDRAOGO B. KANOUTE
Exemplaires :
A. TOURE
- Classeur Assurance Qualité :
- Classeur de Bactériologie
Documents Qualité liés:
Thèse de Pharmacie
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101
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
MAQ: Manuel Assurance Qualité du LRM de Bamako
P:
Procédure de la réalisation des analyses en bactériologie Procédure de
gestion des déchets
MO:
D:
E:
I – But
Décrire le mode d’utilisation du VITEK 2 compact.
II - Domaines et personnels concernés
Secteur de bactériologie. Tout le personnel susceptible d’utilisé cet appareil.
III - Abréviations/Définitions
LRM : Laboratoire Rodolphe Mérieux
IV – Références
Manuel d’utilisation du VITEK 2 compact.
V – Contenu
MODE
OPERATOIRE
D’UTILISATION
DU
VITEK
2
COMPACT
Principe
Le système VITEK 2 compact est destiné à l’identification des bactéries et levures,
ainsi qu’à la réalisation d’antibiogrammes pour les bactéries significatives au plan
clinique.
Le système comprend l’instrument VITEK 2 compact, un ordinateur et une
imprimante.
Thèse de Pharmacie
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102
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Le logiciel fourni par le système VITEK 2 compact inclut des programmes d’analyses,
de gestion de données et un système de contrôle de qualité afin de valider le kit test du
VITEK 2 compact.
Mode opératoire

Prendre le flacon eau saline VITEK 2, introduire la dispensette ;

Prendre des tubes secs pour VITEK 2, y introduire dans les puits de la cassette ;

La cassette peut prendre jusqu’à 10 tubes soit 2x5 (identification+ antibiogramme) ;

Mettre dans chaque tube, 3ml de la solution saline du VITEK 2 à l’aide de la
dispensette préalablement réglée à 3 ml.
N.B : Pour un germe, deux tubes secs seront utilisés : l’un servira à l’identification et
l’autre à l’antibiogramme ;

Sur une feuille vierge, porter la date et le numéro de l’échantillon ainsi que le nom
approximatif du germe à identifier ;

A partir de la culture pure sur gélose (culture jeune 24 h), à l’aide d’une anse, prélever
quelques colonies et les introduire dans le tube sec contenant la solution saline ;

Homogénéiser la suspension et bien vortexer ;

A l’aide du densitomètre, mesurer la concentration bactérienne à 0,5 Mc Ferland ;

Poser le tube contenant la suspension bactérienne en première position et faire suivre
celui prévu pour l’antibiogramme ;

Préparer la solution pour antibiogramme :
o Si la bactérie à identifier est à :
Gram positif, utiliser la micropipette calibrée à 280µl (bleue), Gram négatif,
utiliser la micropipette calibrée à 145µl (rouge) ;
o A partir de la suspension bactérienne, pipeter en fonction de la nature du germe
suspecté (Bactéries à Gram négatif ou Bactéries à Gram positif) et diluer dans 3ml
d’eau saline contenu dans le tube voisin. On aurait ainsi préparé la suspension pour
l’antibiogramme.

Placer la carte d’identification (soit GN, soit GP ou YST) et la carte pour
l’antibiogramme (soit AST- N, soit YST- P ou AST- P) en fonction de la nature du
germe sur la cassette.
NB : différentes cartes utilisables :
Thèse de Pharmacie
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103
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
o Streptocoques et entérocoques : ID : GP 67, réf 22226 ; ATB : AST-P 586, réf
22276
o Staphylocoques: ID GP: réf 21342. ATB : AST-P 580, réf 22233
o ID GN : réf 21341 ; ATB : non entérobactéries : AST- 222, réf 413083 ;
entérobactéries : AST-N 233, réf 413117
o Levures : ID : YST, réf 21343 ; ATB : AST-YS01, réf 22108

Au niveau de l’ordinateur de l’automate, à l’apparition de la page principale ;
o Cliquer sur VITEK 2
o Mettre Identifiant : labsuper, le mot de passe : labsuper
o Cliquer sur gérer la cassette virtuelle
o Créer une cassette virtuelle
o Identification de la cassette 1,2,…
o Lecture du code à barre de chaque carte à partir de la douchette
o Saisir les données de l’isolat ;
o Entrer les informations de l’isolat (numéro attribué au laboratoire, nom du germe si
déjà identifié par d’autres techniques)

Puis enregistrer les données de la cassette virtuelle

Au niveau de l’automate VITEK 2 Compact,

Ouvrir le capot de remplissage et insérer la cassette à l’intérieur de la chambre ;

Fermer le capot de remplissage ;

Appuyer sur la touche Lancer remplissage, un bip indique que le cycle de
remplissage est terminé ;

Retirer la cassette du capot de remplissage et l’introduire dans la chambre de lecture
où s’effectue le scellage. le processus de chargement/déchargement permet la lecture
du code à barre des cartes et le code à barre de la cassette ;

Lorsque le message retiré s’affiche dans la chambre de lecture, cela indique que le
VITEK 2 a terminé le traitement des cartes contenues sur la cassette. On peut la retirer
en ouvrant le capot chargement puis le refermer ;

On attend le jour suivant où les résultats seront imprimés.
Résultats
Le VITEK 2 Compact est un appareil qui permet d’identifier les germes et de réaliser
l’antibiogramme puis d’interpréter les phénotypes de résistances acquise et naturelle
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104
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
puis la sensibilité naturelle du germe.
Exemple : les béta-lactamases des entérobactéries (Klebsiella, E. coli), S.aureus
résistant à méthicyline et vancomycine, Pseudomonas résistant à l’imipenème…et les
phénotypes des souches sauvages (le germe sensible à tous les antibiotiques testés
excepté les sensibilités naturelles).
Gestion des déchets

Retrait des cartes éjectées :
Pour éjecter une carte, le VITEK 2 Compact la retire du carrousel/incubateur, la
présente au lecteur de cartes et la dépose dans le récipient collecteur de déchets. Le
réceptacle collecteur de déchet peut contenir jusqu’à 60 cartes, il est recommandé de
contrôler régulièrement le niveau du réceptacle collecteur de déchet et le vider.

Retrait du réceptacle collecteur de déchet :
o Ouvrir le capot du récipient collecteur de déchets. Noter que les cartes usagées
sont stockées à l’intérieur du réceptacle ;
o Retirer le réceptacle collecteur de déchet de la station de travail en tirant sur le
bord avant, vers soi ;
o Jeter les cartes usagées dans la poubelle de déchets contaminés ;
o Remettre en place le réceptacle collecteur de déchets en le faisant glisser vers
l’intérieur ;
o Fermer le capot du récipient collecteur de déchets.
Le VITEK 2 compact réinitialise le compteur de déchets si le réceptacle est
entièrement vidé.
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105
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Annexe 9 : MODE OPERATOIRE D’UTILISATION DU MINI API –
Version N° 1
Rédigé le:
24/05/2005
Par :
Lala SIDIBE
Vérifié le:
14/09/2005
Par :
Louis DEWEERDT
Visa :
Approuvé le:
15/09/2005
Par :
Fatou .T. FAYE
Visa :
Modifié le:
Par :
Vérifié le :
Par :
Visa :
Approuvé le:
Par :
Visa :
Diffusé le :
Objet
de
la
modification:
Archivé le :
Document provisoire
X Document opérationnel
Destinataires
Y. Issabre
L. Deweerdt
J. P. Lombart
Al. Sidibé
F.T. Faye
S. Traoré
M. Maïga
L. Sidibé
Exemplaires :
Aïssata Sidibé
- Classeur Mini Api
- Classeur de Diffusion des documents du Laboratoire
Documents Qualité liés:
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106
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
MAQ:
P:
MO:
D:
E:
I – But
Décrire l’utilisation en routine du Mini API
II - Domaines et personnels concernés
Secteur bactériologie. Les responsables techniques et plus particulièrement, les responsables
de l’automate.
III - Abréviations/Définitions
ID 32 GN
ID 32 C
ATB UR
IV - Références
V – Contenu
Principe de fonctionnement : Le Mini API permet deux types de lecture.
-
La lecture turbinéphélémétrique
Elle est destinée aux galeries turbinéphélémétrique.
Exemple : ID 32 GN
ID 32 C
ATB UR
Turbidimétrie : mesure de l’intensité de la lumière transmise (T) inversement
proportionnelle à la croissance bactérienne.
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107
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Néphélémétrie : mesure de l’intensité de la lumière diffusée (D) à 30°C directement
proportionnelle à la croissance bactérienne.
Ces deux mesures permettent d’évaluer la densité bactérienne dans chaque cupule.
Le cycle d’une lecture turbinéphélémétrique se fait en deux étapes :
1ère étape :
Entrée du chariot porte galerie et détection du code de la galerie
2ème étape :
Mesure sous la position sans filtre puis sortie du chariot porte galerie
Lorsque le cycle de lecture est terminé, le logiciel traite les mesures effectuées.
-
La lecture colorimétrique
Elle est destinée aux galeries colorimétriques.
Exemple: ID 32 STAPH
ID 32 E
Rapid ID 32 A
Rapid ID 32 STREP
Le Mini API effectue pour chaque cupule une mesure de transmission de la lumière
dans 4 régions du spectre visible.
Le cycle d’une lecture colorimétrique se fait en 4 étapes :
1ère étape :

1ère entrée du chariot porte galerie

Détection du code de la galerie

Mesure sous filtre K60
2ème étape :

1ère sortie du chariot porte galerie

Mesure sous filtre K40
3ème étape :

Thèse de Pharmacie
2ème entrée du chariot porte galerie
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108
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako

Mesure sous le filtre DT bleu
4ème étape :

2ème sortie du chariot porte galerie

Mesure sous le filtre DT vert
Lorsque le cycle de lecture est terminé, le logiciel traite les mesures effectuées.
Mise en route
Il faut :
- Mettre le Mini API sous tension, l’interrupteur d’alimentation (marche/arrêt) est à
l’arrière de l’appareil.
A la mise sous tension, la configuration interne du système est testée (identification du
microprocesseur, taille de la mémoire).
Deux signaux sonores retentissent. Le Mini API a effectué avec succès les tests
internes.
L’écran affiche brièvement la page de présentation du logiciel Mini API puis le menu
principal apparaît.
Procédure d’utilisation.
-
Description du logiciel
Le logiciel Mini API est composé de 6 modules :
SAISIE.
Ce module permet à l’utilisateur de créer les dossiers patients gérés par le Mini API.
Un dossier patient est identifié par une référence unique.
L’examen d’un dossier patient contient les informations relatives à un prélèvement.
Les résultats d’identification et d’antibiogramme concernant un prélèvement sont
affectés d’un numéro d’ordre géré automatiquement.
L’examen d’un dossier patient peut contenir jusqu’à 5 germes.
CONSULT.
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109
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Ce module permet de visualiser les données du patient et de vérifier l’examen et les
résultats associés.
COMM.
Ce module permet l’échange d’information entre le Mini API et le système
informatique du laboratoire.
EXPERT.
Ce module intègre la gestion d’un système EXPERT permettant l’interprétation des
résultats bruts des antibiogrammes enregistrés.
OUTILS.
Ce module regroupe tous les utilitaires du logiciel : Création et Mise à jour des
Thésaurus, Sauvegarde/ Restauration / Extraction, Destruction des données.
Api /ATB.
Ce module permet d’effectuer des lectures de galeries d’identification ou
d’antibiogramme sans créer un dossier patient et d’examen associé. Les résultats pour
l’identification et l’antibiogramme ne sont pas enregistrés. Les résultats de
l’antibiogramme ne sont pas expertisés.
-
Réalisation d’un test
Avant d’effectuer la lecture des galeries, il faut :
1ère étape :

Mettre en marche Mini API

Attendre au moins 15 minutes (préchauffage) avant de commencer la lecture
des galeries

Création d’un dossier patient
2ème étape :

Préparation des galeries pour la lecture

Enlever le couvercle des galeries

Ajouter les réactifs nécessaires pour la révélation de certains tests (se reporter à
la notice d’utilisation des galeries).
Thèse de Pharmacie
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110
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
3ème étape :

Tirer l’arceau de protection
Attention :
Il est impératif de tirer complètement l’arceau de protection pour procéder à la sortie
du chariot porte galerie.
L’arceau de protection délimite la surface pour le libre déplacement du chariot porte
galerie.
Il ne doit pas être utilisé comme poignet pour déplacer l’instrument.
Ne rien poser sur l’arceau de protection lorsque celui-ci est tiré.
La sortie du chariot porte galerie est effectuée automatiquement par le logiciel Mini
API au moment de la lecture automatique des galeries.
Important :
Ne pas toucher le chariot porte galerie durant le mouvement de celui-ci.
4ème étape

Positionner la galerie sur le chariot porte galerie
5ème étape : lecture des galeries

La lecture des galeries est déclenchée par le logiciel Mini API

La lecture des galeries est automatique

Le code de la galerie est lu et les résultats interprétés générant ainsi le
traitement de la galerie correspondante: lecture turbinéphélémétrique ou
colorimétrique.
Arrêt Mini Api
Lorsque le menu principal de mini Api est affiché, sortir de l’application

Appuyer sur <SUPPR>

Eteindre l’appareil

Rentrer l’arceau de protection
Thèse de Pharmacie
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111
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Gestion des documents
Type de document
Contenant
Lieu
Durée
de
conservation
Document qualité
Classeur
Assurance Laboratoire
qualité Mini Api
Traçabilité AQ
Registre
maintenance
Bactériologie
de Laboratoire
Bactériologie
3 ans après la fin de
leur utilisation
Pendant la durée de
vie de l’appareil et 3
ans après
Document fabricant
Thèse de Pharmacie
Manuel d’utilisation Laboratoire
Pendant la durée de
et Manuel Instrument Bactériologie
vie de l’appareil et 3
Mini Api
ans après
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112
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Annexe
10:
MODE
OPERATOIRE
DE
LA
TECHNIQUE
DE
SOUCHOTHEQUE -Version N° 1
Rédigé le:
22/02/2013
Par : Fatoumata Maïga
FM
Vérifié le:
25/03/2013
Par : Judicaël OUEDRAOGO
JO
Visa :
Approuvé le:
Par : Dr Daniel YACOUYE
DY
Visa :
Modifié le:
Par :
Vérifié le :
Par :
Visa :
Approuvé le:
Par :
Visa :
Diffusé le :
Objet
de
la
modification:
Archivé le :
Document provisoire
X Document opérationnel
Destinataires
D. YALCOUE
N. KEITA
A. MAIGA
A. CISSE
O. HAIDARA
L. SIDIBE
K. DIARRA
J.OUEDRAOGO B. KANOUTE
Exemplaires :
A. TOURE
- Classeur Assurance Qualité :
- Classeur de Bactériologie
Documents Qualité liés:
MAQ: Manuel Assurance Qualité du LRM de Bamako
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113
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
P:
Procédure de la réalisation des examens Bactériologique
MO:
D:
E:
I – But
Décrire le mode opératoire de la technique de souchothèque.
II - Domaines et personnels concernés
Le secteur de Bactériologie. Tout le personnel susceptible d’utilisé cette technique.
III - Abréviations/Définitions
LRM : Laboratoire Rodolphe Mérieux
IV – Références
V – Contenu
MODE
OPERATOIRE
DE
LA
TECHNIQUE
DE
SOUCHOTHEQUE
Prince
Il permet de conserver les bactéries multi-résistantes à -80°C en présence de glycérol à
savoir :

Staphylococcus aureus (Met-R et Vanco-R) ;

Pseudomonas aeroginosa ;

Salmonelles ;

Escherichia coli ;

Klebsiella pneumoniae ;

Streptococcus pneumoniae.
Matériel

Tube à hémolyse ;
Thèse de Pharmacie
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114
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako

Portoir tube ;

Micropipettes ;

Embouts ;

Cryotubes ;

Tubes à vis ;

Marqueur ;

Congélateur (-80°C).
Réactif

Glycérol ;

ATB Médium.
Nature du prélèvement
Souche pure des bactéries multi-résistantes.
Enregistrement
L’enregistrement est fait dans le registre réservé à la souchothèque, puis sur le support
informatique.
Technique
A partir d’une souche pure de BMR :

Prendre un tube à hémolyse sur lequel on portera le numéro d’identification du patient
et le nom de la bactérie à soucher ;

Prendre de l’ATB médium et remplir le tube à hémolyse jusqu’à moitié ;

Prélever à l’aide d’une anse quelques colonies isolées à partir de la purification qu’on
introduira dans l’ATB médium, bien mélanger

Mettre cette suspension à 37° C pendant 24h à l’étuve ;

Prendre deux tubes de souchage (cryotubes) ;

Mettre une étiquette portant le numéro de la souche correspondant aux trois premières
lettres et chiffres du CODAT plus deux lettres de la souche plus le numéro d’ordre ;

Ex : W04ECO001 (premier E. coli souche en Avril 2012)
Thèse de Pharmacie
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115
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako

Prendre soin de porter l’enregistrement dans un classeur prévu à cet effet ;

Ensuite mesurer 800 µl de la suspension déjà préparée, mélanger avec 200 µl de
glycérol puis vortexer et conserver le tout à -80° C ;

Faire le même pour les deux cryotubes.
Conservation des échantillons
Les souchothèques sont conservées au congélateur à – 80°C.
Gestion des déchets
Les objets souillés sont éliminés dans la poubelle jaune (contaminant).
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116
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Annexe 11 : Exemples de fiches de rangement des bactéries multi résistantes
BOlTE 31 MICROORGANI5ME: E. coli
PRElEYEMENT
URINE
IrJentijicpfirm (espece}
Eeol;
MECANISM E(WE... j
HGT
URINE
Ecol;
BLSE,Mtek
04/03/2014
HOT
URINE
Eeoli
BLSE,Mtek
05/03/2014
HOT
PUS
Erol;
BLSE/Vitek
N'SQUCHE
N' CODAT
AGE
SEXE
64
II
Y0221024
6MOlS
F
DATE RANGE ORIGINE(HOSPI,(OMMU)
25/O2!2014
COM"o'IUNAUTAlRE
6S
66
II
21
21
M
04/03/2014
II
Y0228(}45
Y0228(}45
M
l4
Y0227061
II
M
POSITION
OLSE,Mtek
67
68
69
70
l4
Y0227Q61
II
M
05/03/2014
HGT
PUS
Eeol;
BLSE,Nite~
15
15
Y031OO27
14/03/2014
HDUPTG
URINE
Ecoli
BLSE,Nite~
M
14/03(2014
Eroli
BL5E,Nite~
l6
10310077
F
13,103(2014
HDUPTG
COMMUNAUTAIRE
URINE
71
"
"
M
PUS
Ecoli
BL5E,Mtek
n
l6
Y031OO17
F
13,1O~(2014
(QMMUNAUTAIRE
PUS
'coil
8LSE,Nirek
13
Y0329011
4)
F
03/04(2014
HGT
HEMOCUI TURE
EcoI;
BLSE,Mtek
74
17
17
10329011
4)
F
03/04/2014
HGT
HEMOCUl TURE
Ecoli
8L5E/Vitek
75
l8
Y0331030
44
F
03/04/2014
URINE
teoli
8LSENitek
76
l8
Y0331030
44
F
03/04/2014
COMiVUNAUTAIRE
COM,VUNAUTAIRE
URINE
Eroli
BLSENitek
77
19
19
Y0411303
M
15/04/2014
HPG
URINE
Eroli
8LSE/Vite~
M
15/04/2014
HPG
URINE
Y0414(}44
F
18/04/2014
COMMUNAUTAIRE
PUS
Ero'i
Ecoli
BLSE/Vitek
"
"
60
60
75
75
f
18/04/2014
COMMUNAUTAIRE
PUS
Ecoli
BLSE,Nite<
78
79
00
81
Y031OO27
Y0411303
YQ414(}44
BLSE,Nite~
Le n' de Iii souche correspond au 3 premiers lettres et chiffres de CODAT t 21ettres de Iii souche t Ie numero d'ordre. Ex: W12EC020 (2oeme E. coli isole en Dec,2012)
Thèse de Pharmacie
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117
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
BOlTE l / MICROORGANtSME: Pseudomona5 aentginosa
fdenti/fcotforl (esptce)
N" SOUCHE
N' CODAT
AGE
SEXE
OATE RANGE
ORIG I N E ( H OS P ~ COMM U j
I
I
WOS07002
37
M
11/05/1012
HOUMAli
CRACHAT Pseudomonas oeruginoso
2
I
WOS07002
37
M
11/05/2012
H DUMALI
CRACHAT Pseudomonas oeruginosa
3
,
2
WIOl8312
38
M
24/10/2012
HGT
lIQARTlOJ
2
WIOl8312
38
M
24/10/2012
HGT
5
3
W1129037
76
F
05/12/l012
HGT
6
3
Wll29{137
16
f
05/12/2012
HGT
7
4
XOI04051
7
M
09/01/2013
8
•
X0104061
7
M
09/01/1013
S
XOllOOill
68
M
16/01/ 2013
HGT
10
5
XOll00i8
68
M
16/01/2013
II
6
X020S019
61
M
08/02/2013
12
6
X020S019
61
M
08/02/2013
COMMurIAUTAIR:
URINE
Pseudomonas oerugiooso
6l5E/VITEK
13
7
X0319310
54
M
23/03/2013
HGT
HEMoe
Pseudomonas oerugiooso
BLSE/VITEK
Bl5,/'ilm
POsmON
9
ElEVEME
MECANISME(BLSE ,.. j
BLSE/VITE'
8t3E/VITE'
AcinelObaclere
BLSE/VITEK
UQARTKlJ
AcineloooClere
Bl5E/VITEK
UruNE
Pseudomoflos Geruginosa
8t3E/VITEK
URINE
Pseudomonas oeruginosa
BLSE/VITEK
COMMUNAUTAIRE
PUS
Pseudomonas aeruginoso
BlSE/'JIHK
COMMUNAUTAIRE
PUS
Pseudomonas aeruginosa
Bl5E/'iITE'
URI~JE
Pseudomonas oerugino5o
6l5E/'iITEK
HGT
UruNE
Pseudomonas aerugino5o
6LSE/'JIHK
COMMUNAUTAIR,
UrutH
Pseudomonos oeruginoso
6l5E/'itiEK
14
7
:<0319310
54
M
23/03/2011
HGT
HEMoe
Pseudomonas oeruginoso
15
8
3637
26
M
04/05/2013
COMMUNAUTAIRE
URINE
Pseudomonas oerugi,10so
Bl5E/'iITEK
16
8
3637
26
M
04/05/ 2013
COMMUNAUTAIRE
URINE
PstudOmona5 aerugl1oso
8LSE/VIm
17
9
X~301O;
91
f
1I/05/2011
COMMUNAUTAIRE
HEMoe
O.ontllropi
18
9
:<0430105
91
f
ll/05/1011
COMMUNAUTAIRE
HEMOC
O.onthropi
19
10
x061J70ll
78
M
14/06/2013
COMMUNAUTAIRE
URINE
Sphln .•hclp
20
10
lO607011
78
M
14/06I2011
COMMUNAUTAIRE
URINE
Sphin. thalp
21
II
XOll~O
79
M
24/06/2013
HDE KATI
URINE
Bl5E/'iITEK
22
11
:0:0719041)
19
M
24/06/2013
HDEKAli
URI NE
Pseudomonas oeruginosa
Pseudomonas aeruglnoso
II
12
XlO21())8
30
M
24/lO/10ll
COMMUNAUTAIRE
URINE
Pseudomonas aeruginosc
BLSE/VITEK
BlSE/VITEK
BlSE/'iITEK
24
12
Xl02106!
30
M
2' /10/2013
COMMUNAUTAIRf
URINE
Pseudomonas oerugino5G
2S
II
X1223D72
44
M
30/12/2013
CENTR lVTTEOIABETE
PUS
Pseudomonas oeruginoso
BLSE/VITEK
26
Il
Xl223072
44
M
30/12110ll
CENTR lUTTE OIAiETE
PUS
Pseudomonas oeruginoso
Bl5E/'iITEK
27
14
Y0107())6
19
M
13/01/2014
H DE KATI
PUS
Pseudomonas oeruginoso
BLSE/VITEK
28
14
Y0107CXJ5
19
M
13/01/2014
HDE!An
PUS
Pseudomonas aeruginoso
BLSE/VITEK
29
15
'(0407041
92
M
10/04/2014
COMMUNAUTAIRE
URINE
Pseudomonas aerug;nosa
BLSElVITEK
30
IS
10407041
92
M
10/04/2014
COMMUNAUTAIRE
URINE
Pseudomonos aerug;nosa
BlSE/'iITEK
31
16
'(OS22092
38
f
27/05/2014
CENTR lUm CIA8ETE
PUS
Pseudomonas aerlJginoso
BlSE/VITEK
32
:6
10522092
38
F
27/0S/ 2014
CENTR tUm OlA8ETE
PUS
Pseudomonas oeruginow
8lSE/VITEK
le n" de la souche correspond au 3 premierslettreset chiffres de CODAT+ 21ettresde la souche+ Ienumero d'ord re. EX: W12PAEZO (Zoeme Pseudomonasaeruginosa
i 50 h~ en Decembre,2012)
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
118
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
SERMENT DE GALIEN
Je jure en présence des maîtres de la faculté, des conseillers de l’ordre des pharmaciens
et de mes condisciples :
D’honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de mon art et de leur témoigner
ma reconnaissance en restant fidèle à leur enseignement,
D’exercer, dans l’intérêt de la santé publique, ma profession avec conscience et de
respecter non seulement la législation en vigueur, mais aussi les règles de l’honneur, de
la probité et du désintéressement.
De ne jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs envers le malade et sa dignité
humaine.
En aucun cas, je ne consentirai à utiliser mes connaissances et mon état pour corrompre
les mœurs et favoriser des actes criminels.
Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses.
Que je sois couvert d’opprobre et méprisé de mes confrères si j’y manque.
Je le jure
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
119
Thème : Bactéries multi résistantes isolées des hémocultures au Laboratoire Rodolphe Mérieux de Bamako
Thèse de Pharmacie
Mlle MOUDJONGUE OMOCK Sandrine
120
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