Biotechnology Explorer - Bio-Rad

Biotechnology Explorer - Bio-Rad
Biotechnology Explorer™
Kit PCR
Chromosome 16 : PV92
Référence 166-2100EDU
http://explorer.bio-rad.fr
Remarque : Le kit contient des réactifs sensibles
à la chaleur. A l'arrivée, ouvrez immédiatement et
stockez les composants à –20°C ou à 4°C
comme il est indiqué.
La duplication de toute partie de ce document
n'est autorisée que pour l'usage en classe.
Pour le service technique, composez le 01.47.95.69.64
Bulletin n°4110052FR
Bienvenue au programme Biotechnology Explorer
Les avancées techniques de ces quelques dernières décennies ont créé une nouvelle branche
de la science, la biotechnologie, qui a transformé et révolutionné la recherche en sciences de la
vie. Des techniques puissantes d'isolement, d'analyse et de manipulation de l'ADN, l'élément
structural de base de la vie, ont déjà permis de nombreuses découvertes pour comprendre des
processus biologiques, des états pathologiques humains et des méthodologies thérapeutiques.
Pour ces raisons, il est devenu de plus en plus important de présenter ces concepts aux élèves.
Dans les décennies à venir, lorsqu'une visite de routine au médecin de la famille pourra
comprendre toute une batterie de tests de diagnostic sur l'ADN — et que les empreintes
génétiques deviendront la forme définitive de l'identification personnelle — la compréhension de
ces principes sera aussi importante que les enseignements sur l'hygiène et la nutrition.
Pour enseigner aux élèves des facultés, des collèges et des lycées, les technologies et les
applications de la biotechnologie, Bio-Rad a développé toute une série de kits éducatifs faciles
d'emploi étayés par des cours basés sur des études, des instruments et des consommables. Le
programme Biotechnology Explorer est devenu le programme de choix pour les enseignants à
la fois débutants et expérimentés cherchant à faire la liaison entre la science en classe et la
science dans le monde réel.
Du fait de l'utilisation croissante de la technique d’amplification (PCR) en médecine et science
modernes et de l'impact potentiel sur chaque membre de la société, il est important de bien
faire comprendre aux élèves les principes de base et les applications de la PCR. Dans ce kit, les
élèves réalisent une PCR pour amplifier un segment de leur propre ADN. Le segment d'ADN
qu'ils vont amplifier est présent dans les gènes de nombreux individus, mais pas de tous.
L'analyse des données générées en travaux pratiques ouvrira la porte à l'enseignement des
principes de base de la biologie moléculaire, de la génétique de la population et des empreintes
génétiques et elle illustrera comment la PCR est utilisée dans de nombreux autres domaines de
la biologie.
Le programme Biotechnology Explorer est tout à fait unique et extrêmement innovant. Nos
activités à base de travaux pratiques capturent l'imagination en faisant que les élèves
prennent mieux conscience et comprennent mieux les applications de la biotechnologie qui
influencera de plus en plus leur vie et affectera leurs décisions personnelles et
communautaires.
Développés sur cinq ans, en collaboration avec le San Francisco Bay Area Biotechnology
Educational Consortium, Rutgers University, Maxygen Inc. et le Stanford Human Genome
Center Education Program, nos cours et nos kits ont été créés par des enseignants et des
scientifiques qui ont travaillé ensemble. Nous nous efforçons continuellement d'améliorer nos
cours et nos produits. Votre contribution est extrêmement importante pour nous. Vos histoires,
commentaires et suggestions sont les bienvenus!
L'équipe Bio-Education
Bio-Rad division Bio-Recherche
3, bd Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette
Bulletin n°4110052FR
Sommaire
Page
Guide de l'enseignant
Liste de contrôle de la composition du kit ..............................................................................1
Contexte pour les enseignants..............................................................................................3
Contenu suggéré des cours ...............................................................................................12
Généralités sur la préparation préalable par l'enseignant .....................................................13
Préparation préalable par l'enseignant.................................................................................16
Points du cours à souligner ................................................................................................25
Interprétation des résultats et guide de dépannage .............................................................30
Modes opératoires .............................................................................................................33
Bulletin n°4110052FR
Liste de contrôle de la composition du kit
Cette partie liste les composants fournis dans le kit PV92 PCR. Elle liste également les
accessoires nécessaires. Chaque kit contient suffisamment de matériaux pour 8 postes de
travail d'élèves, avec 4 élèves à chaque poste. Veuillez utiliser cette liste pour contrôler votre
matériel avant de commencer ces TP.
Remarque : Si vous préparez de l'ADN génomique en utilisant le mode opératoire pour les
follicules pileux, il faut commander de la protéase (Référence 166-2003EDU) séparément du kit.
Composition du kit
Quantité
()
Stockez à –20°C (composants sensibles à la température)
Contrôle PV92 homozygote (+/+), 100 µl
1 flacon
‰
Contrôle PV92 homozygote (–/–), 100 µl
1 flacon
‰
Contrôle PV92 hétérozygote (+/–), 100 µl
1 flacon
‰
1 flacon
1 flacon
‰
1 flacon
‰
1
1
‰
Solution d’amplification (dNTP, Taq ADN polymérase, tampon),
2X, 1,2 ml
Mélange d'amorces directe et réverse, 50X, 25 µl
™
Marqueurs de poids moléculaire EZ Load (standards d'ADN), 100 µl
A stocker à 4°C
Tampon TAE 50X, 100 ml
Agarose en poudre, 5 g
™
‰
‰
1 bouteille
‰
Matrice InstaGene , 20 ml
1 bouteille
‰
Tampon de charge PV92 XC, 5X, 1 ml
1 flacon
‰
Colorant d'ADN Fast Blast , 500X, 100 ml
™
‰
A stocker à température ambiante
Tubes de PCR
Tubes avec bouchon à vis, 1,5 ml
50
50
‰
Microtubes à essai, sans bouchon, 1,5 ml
50
‰
Microtubes à essai, avec bouchons attachés, 1,5 ml
60
‰
Supports de microtubes à essai en mousse
16
‰
Plateaux de coloration des gels
4
‰
Manuel
1
‰
Recharges disponibles séparément
Recharge TS de kit PV92 PCR : 166-2119EDU (comprend des amorces de PCR, des
contrôles positifs, des marqueurs de poids moléculaire d'ADN, de la solution
d’amplification contenant des dNTP, du tampon, de l'ADN polymérase)
Recharge TR du kit PV92 PCR : 166-2139EDU (comprend la matrice InstaGene, le tampon de
charge PV92 XC ADN, le colorant d'ADN Fast Blast, l'agarose, du TAE 50X)
1
Bulletin n°4110052FR
Accessoires nécessaires – Non inclus dans ce kit
Poste de travail des élèves
Quantité par poste
Micropipettes P-20, 2 à 20 µl (Référence 166-0506EDU)
ou pipette à volume fixe de 10 µl
et pipette à volume fixe de 20 µl
Embouts de pipette Xcluda (type à filtre) 2 à 20 µl (Référence 211-2006EDU)
Chambre d'électrophorèse Mini-Sub® Cell GT
avec plateau de gel de 7 x 7 cm, peigne pour 8 puits
(Référence 166-4400EDU)
Alimentation électrique PowerPac™ Junior
(Référence 165-5048EDU) ou
Alimentation électrique PowerPac™ Basic (Référence 164-5050EDU)
Seau de glace avec de la glace en cubes ou pilée
Marqueur permanent
Grands récipients pour la décoloration (si applicable)
Récipients avec 10 ml de solution saline à 0,9 %
Copie du mode opératoire
Pinces (pour le mode opératoire pour le follicule pileux)
Ciseaux ou lame de rasoir (pour le mode opératoire pour le follicule pileux)
Installation de l'enseignant ou instruments des TP
Micropipettes P-20, 2 à 20 µl (Référence 166-0506EDU)
Micropipettes P-200, 20 à 200 µl (Référence 166-0507EDU)
Micropipettes P-1000, 100 à 1000 µl (Référence 166-0508EDU)
Embouts de pipette Xcluda® (type à filtre de PCR)
2 à 20 µl (Référence 211-2006EDU)
20 à 200 µl (Référence 211-2016EDU)
100 à 1000 µl (Référence 211-2021EDU)
Thermocycler Gene Cycler™ (Référence 170-6700EDU) ou
Thermocycler MyCycler™ (Référence 170-9701EDU)
Four à micro-ondes
Bain-marie (56 et 100°C) (Référence 166-0504EDU)
Protéase (Référence 166-2003EDU), uniquement pour le mode opératoire pour
le follicule pileux
Solution saline à 0,9 %
Eau distillée ou déminéralisée
Ballon d'Erlenmeyer de 1000 ml pour préparer l'agarose
Ballon ou bécher de 500 ml pour la coloration de l'ADN
Bande adhésive de TP (pas du Scotch)
Microcentrifugeuse (Référence 166-0612EDU) ou
Minicentrifugeuse (Référence 166-0613EDU)
Accessoires facultatifs
Film de support de gel pour agarose (Référence 170-2984EDU)
Plate-forme basculante (Référence 166-0719EDU)
Vortex
Feuilles d'acétate pour le traçage des gels
1
1
1 portoir
‰
‰
‰
1
1
‰
‰
1
1
1
1 à 3 pour
2 postes
4
1
1
1
Quantité par kit
‰
‰
‰
‰
1
1
1
1
3 portoirs
3 portoirs
1 portoir
1
1
1
1 de chaque
1,3 ml
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
500 ml
‰
500 ml
‰
1
‰
1
‰
1
‰
1
‰
4
Quantité par classe
1
1
1
8
‰
‰
‰
‰
Stockage et stabilité : Bien que le kit soit expédié dans des conditions ambiantes, les
composants sont garantis pendant 1 an à partir de la date d'achat lorsqu'ils sont stockés dans
les conditions appropriées. Le kit contient des composants sensibles à la chaleur.
Ouvrez immédiatement le kit et stockez les composants soit à –20°C, soit à 4°C, soit à
température ambiante selon les indications.
2
Bulletin n°4110052FR
Contexte pour les enseignants
Introduction à la PCR
En 1983, Kary Mullis de Cetus Corporation a développé la technique de biologie moléculaire
qui, depuis, a révolutionné la recherche en génétique, ce qui lui a valu le Prix Nobel en 1993.
Cette technique, appelée la technique d’amplification (PCR), a transformé la biologie
moléculaire en outil de recherche multidisciplinaire. Nombre de techniques de biologie
moléculaire utilisées avant la PCR étaient laborieuses, demandaient beaucoup de temps et
réclamaient un niveau élevé d'expérience technique. En outre, travailler avec seulement des
traces d'ADN rendait difficile pour les chercheurs dans d'autres domaines biologiques
(pathologie, botanique, zoologie, pharmacie, etc.) d'incorporer la biologie moléculaire dans leurs
schémas de recherche.
La PCR a eu un impact sur quatre domaines principaux de la biotechnologie : la
cartographie des gènes, le clonage, le séquençage de l'ADN et la détection de gènes. La PCR
est à présent utilisée comme outil de diagnostic médical pour détecter des mutations spécifiques
qui peuvent être responsables de maladies génétiques,3 dans des enquêtes criminelles et des
tribunaux pour identifier des suspects à un niveau moléculaire,4 et dans le séquençage du
génome humain.5 Avant la PCR, l'utilisation de techniques de biologie moléculaire pour des
objectifs thérapeutiques, médico-légaux, pharmaceutiques ou médicaux n'était pas pratique ou
elle était onéreuse. Le développement de la technologie de la PCR a fait passer ces aspects de
la biologie moléculaire d'une science difficile à l'un des outils les plus accessibles et les plus
largement utilisés en recherche génétique et médicale.
La PCR et la biotechnologie — Qu'est-ce que c'est et pourquoi cela a-t-il révolutionné toute
une communauté de recherche?
La PCR produit des quantités exponentiellement importantes d'un fragment spécifique
d'ADN à partir de traces de matériau de départ (matrice). La matrice peut être toute forme
d'ADN double brin, tel que de l'ADN génomique. Un chercheur peut prélever des traces d'ADN à
partir d'une goutte de sang, d'un simple follicule pileux ou d'une cellule de la joue et utiliser la
PCR pour produire des millions de copies d'un fragment d'ADN souhaité. En théorie, un seul
brin de matrice est nécessaire pour produire des millions de nouvelles molécules d'ADN. Avant
la PCR, il était impossible de réaliser des études médico-légales ou génétiques avec cette petite
quantité d'ADN. La possibilité d'amplifier la séquence précise d'ADN qu'un chercheur souhaite
étudier ou manipuler est la véritable puissance de la PCR.
L'amplification par PCR nécessite la présence d'au moins un brin d'ADN matrice. Dans ce
kit, l'ADN génomique humain isolé à partir des propres cellules des élèves sera la source des
brins matrices. L'une des principales raisons pour lesquelles la PCR est un outil si puissant, est
sa simplicité et sa spécificité. Tout ce dont on a besoin, ce sont des tampons de réaction peu
coûteux, quatre sous-unités de l'ADN (les désoxynucléotides triphosphates d'adénine, de
guanine, de thymine et de cytosine), une ADN polymérase, deux amorces d'ADN et des
quantités minimes du brin matrice que l'on souhaite amplifier. La spécificité provient de la
capacité à cibler et amplifier un segment spécifique de l'ADN parmi un génome complet.
La PCR utilise deux processus de base en génétique moléculaire
1. Hybridation de brin d'ADN complémentaire
2. Synthèse de brin d'ADN par l'intermédiaire d'une ADN polymérase
Dans le cas de la PCR, l'hybridation de brin complémentaire a lieu lorsque deux amorces
oligonucléotidiques différentes s'hybrident à chacune de leurs séquences de paires de bases
complémentaires respectives sur la matrice. Les deux amorces sont conçues et synthétisées au
laboratoire avec une séquence spécifique de nucléotides de telle manière qu'elles peuvent
s'hybrider aux extrémités opposées et sur les brins opposés de l'élongation d'ADN double brin
(brin matrice) à amplifier.
3
Bulletin n°4110052FR
Avant de pouvoir amplifier une région d'ADN, on doit identifier et déterminer la séquence
d'un morceau d'ADN en amont et en aval de la région d'intérêt. Ces régions sont ensuite
utilisées pour déterminer la séquence des amorces oligonucléotidiques qui seront synthétisées et
utilisées comme points de départ pour la réplication de l'ADN. Les amorces sont
complémentaires des régions en amont et en aval de la séquence à amplifier, aussi elles collent
ou s'hybrident, à ces régions. Les amorces sont nécessaires parce que les ADN polymérases
ne peuvent ajouter des nucléotides qu'à l'extrémité d'une chaîne pré-existante.
L'ADN polymérase utilisée dans la PCR doit être une polymérase thermostable parce que la
réaction en chaîne de la polymérase passe par des cycles de températures entre 60°C et 94°C.
L'ADN polymérase thermostable (Taq) utilisée dans la PCR a été isolée à partir d'une bactérie
thermophile, Thermus aquaticus, qui vit dans les conduits de vapeur à température élevée tels
que ceux trouvés dans le Yellowstone National Park.
Deux nouveaux brins matrices sont créés à partir de la matrice double brin d'origine à chaque
cycle complet de la réaction de synthèse de brin. Ceci provoque une croissance exponentielle du
nombre de molécules matrices, c'est-à-dire du nombre de doubles brins d'ADN à chaque cycle.
Par conséquent, après 30 cycles, il y aura 230 ou plus de 1 milliard de fois plus de copies qu'au
début. Une fois que la matrice a été suffisamment amplifiée, on peut la visualiser. Ceci permet
aux chercheurs de déterminer la présence ou l'absence des produits souhaités de la PCR et de
déterminer les similarités et les différences entre l'ADN d'individus. Selon la séquence d'ADN
analysée, les différences parmi les individus peuvent être aussi grandes que des centaines de
paires de bases ou aussi petites qu'une seule paire de bases ou une simple mutation
ponctuelle.
Gènes et ADN
On estime que les 23 paires de chromosomes (au total 46 chromosomes) du génome
humain contiennent un total de 30000 à 50000 gènes. Chaque gène détient le code pour une
protéine particulière. De manière intéressante, ces 30000 à 50000 gènes ne constituent que
5 % d'ADN chromosomique. Les autres 95 % sont de l'ADN non codant. Cet ADN non codant
se trouve non seulement entre les gènes, mais également au sein des gènes, les divisant en
segments. Chez les eucaryotes, ces séquences au sein des gènes (appelées introns) sont
transcrites en ARN mais à la fin elles ne fabriquent pas une protéine. Les séquences qui codent
pour des protéines sont appelées exons. A la fois les introns et les exons sont initialement
transcrits, puis les introns sont épissés en dehors de l'ARN pour créer de l'ARN messager
(ARNm).
Chez les eucaryotes, l'ADN génomique est transcrit en molécules d'ARN contenant à la fois
des introns et des exons pour un gène particulier. Alors que l'ARN est encore dans le noyau
(avant d'être transporté hors du noyau), les introns (in = qui demeurent au sein du noyau)
doivent être retirés de l'ARN alors que les exons (ex = qui sortent du noyau) sont épissés
ensemble pour former la séquence codante complète pour la protéine (Figure 1). Ce processus
est appelé l'épissage d'ARN. Certains gènes peuvent contenir quelques introns, d'autres
peuvent en contenir des douzaines.
4
Bulletin n°4110052FR
Fig. 1. Epissage d'introns à partir de gènes.
Comme nous en avons discuté, des segments fonctionnels de gènes (exons) codent pour
des protéines — des molécules qui exécutent la plupart des fonctions cellulaires. Les
séquences des exons sont donc similaires parmi les individus. D'autre part, les introns varient
souvent en taille et en nombre parmi les individus. On pense que les séquences des introns
sont le résultat de l'accumulation différentielle tout au long de l'évolution de mutations qui sont
transmises silencieusement aux descendants par le code héréditaire. C'est cette différence
dans les séquences des introns qui nous permet de déterminer la diversité génétique humaine.
L'identification de ces caractéristiques distinctives dans l'ADN représente la base moléculaire de
l'identification humaine et de la génétique d'une population.
Tout au long de l'évolution, les séquences des introns ont été la cible d'insertions aléatoires
par des éléments dispersés répétitifs courts, également appelés SINE.7 Les SINE se sont
retrouvés insérés au hasard au sein de nos introns au cours des millions d'années. Un de ces
éléments répétitifs est appelé la séquence Alu (Figure 2). Il s'agit d'une séquence d'ADN
d'environ 300 paires de bases de long qui est répétée, une copie à la fois, presque 500000 fois
au sein du génome humain. L'origine et la fonction de telles séquences répétées de manière
aléatoire ne sont pas encore connues. Le nom Alu vient du site de reconnaissance de l'enzyme
de restriction Alu I qui se trouve dans cette séquence.
Fig. 2. Emplacement d'une insertion Alu au sein d'un intron.
Certains de ces éléments Alu présentent des caractéristiques qui les rendent très utiles pour
les généticiens. S'ils sont présents au sein d'introns de gènes associés à des pathologies
particulières, ils peuvent de cette manière être associés à cette maladie. Lorsqu'ils sont présents
au sein des introns de gènes, les répétitions de Alu peuvent être également utilisées pour
estimer la parenté parmi des individus. Dans cette activité, l'analyse des répétitions de Alu est
utilisée pour estimer la fréquence d'un insert dans une population et il s'agit d'une mesure
simple de variation génétique moléculaire — sans rapport avec une maladie ou une parenté
parmi des individus.
5
Bulletin n°4110052FR
Ce kit fournit un dépistage simple basé sur la PCR d'une seule séquence Alu au sein du locus
PV92 sur le chromosome 16. Cet intron Alu particulier est dimorphe. Cela signifie que l'élément est
présent chez certains individus mais pas chez d'autres (Figure 3). Certaines personnes ont l'insert
dans le locus PV92 de l'un de leurs chromosomes 16, d'autres peuvent avoir l'insert dans les deux
chromosomes homologues (deux allèles), et certains n'ont l'insert dans aucun des chromosomes.
La présence ou l'absence de cet insert peut être détecté à l'aide de la réaction en chaîne de la
polymérase suivie d'une électrophorèse sur gel d'agarose.
Dans cette activité, les élèves isoleront leur propre ADN génomique à partir de leurs cellules. Ils
utiliseront des amorces qui flanquent l'insertion Alu entière (300 paires de bases de long) et
641 paires de bases du locus PV92 pour amplifier un fragment de 941 paires de bases (si
l'élément Alu est présent) ou un fragment de 641 paires de bases (si l'élément Alu est absent).
L'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de la PCR est suffisante pour faire la distinction
entre les homozygotes (+/+) pour la présence de la répétition Alu (produit de 941 paires de bases
uniquement), les homozygotes (–/–) pour l'absence de la répétition Alu (produit de 641 paires de
bases uniquement) et les hétérozygotes (+/–) ayant à la fois les produits de 641 et de 941 paires
de bases.
Fig. 3. Présence ou absence de l'insert Alu au sein du locus PV92 sur le chromosome 16.
Remarques importantes pour l'enseignant
Veuillez noter que puisque les allèles PV92 sont hérités des parents et que, potentiellement, ils
peuvent révéler des informations à propos de relations familiales, nous attirons votre attention
contre la génération de données génotypiques à partir de plusieurs membres d'une famille. Si la
confidentialité est un souci, nous suggérons à l'enseignant de mélanger les échantillons des
élèves pour assurer l'anonymat. Les échantillons des élèves peuvent être randomisés à tout
moment après la récolte des cellules.
Deux modes opératoires sont fournis pour la préparation de l'ADN génomique. L'un implique le
recueil de cellules épithéliales orales à l'aide d'un bain de bouche salin. L'autre isole l'ADN
génomique à partir de follicules pileux. Les deux méthodes sont très peu invasives et produisent
des produits de PCR robustes. Les enseignants doivent choisir l'un ou l'autre des modes
opératoires d'après leur préférence personnelle ou celle de leurs élèves ou d'après des
restrictions locales.
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Bulletin n°4110052FR
La PCR étape par étape
La PCR implique une série répétitive de cycles, dont chacun est constitué de la dénaturation
de la matrice, de l'hybridation d'une amorce et de l'élongation de l'amorce hybridée par la Taq
ADN polymérase. Avant de commencer l'amplification de l'ADN, l'ADN génomique est préparé à
partir des cellules des élèves.
Après la préparation des échantillons, l'ADN matrice, les amorces oligonucléotidiques, l'ADN
polymérase thermostable ( Taq) , les quatre désoxynucléotides (A, T, G, C) et le tampon de la
réaction sont mélangés dans un seul microtube à essai. Le tube est placé dans le thermocycler
Gene Cycler™ ou MyCycler™. Ces thermocyclers contiennent un bloc en aluminium qui
renferme les échantillons et qui peut être rapidement chauffé et refroidi à travers des différences
de température extrêmes. Le chauffage et le refroidissement rapides de ce bloc thermique sont
appelés le cycle de températures ou le cycle thermique.
La première étape de la technique du cycle de températures de la PCR implique le
chauffage de l'échantillon à 94°C. A cette température élevée, les brins de la matrice se
séparent (se dénaturent). Ceci est appelé l'étape de dénaturation.
Ensuite, le thermocycler refroidit rapidement à 60°C pour permettre aux amorces de
s'hybrider aux brins séparés de la matrice. Ceci est appelé l'étape d'hybridation. Les deux
brins d'origine de la matrice peuvent s'hybrider de nouveau l'un à l'autre ou entrer en compétition
avec les amorces pour les sites de liaison complémentaires des amorces. Toutefois, les
amorces sont ajoutées en excès de telle manière que les amorces l'emportent sur les brins
d'origine de l'ADN pour les sites de liaison complémentaires des amorces.
Enfin, le thermocycler chauffe l'échantillon à 72°C pour que la Taq ADN polymérase étende
les amorces et fabrique des copies complètes de chaque brin de l'ADN matrice. Ceci est appelé
l'étape d'élongation. La Taq polymérase fonctionne de la manière la plus efficace à cette
température. Deux nouvelles copies de chaque brin complémentaire sont créées. Il y a
maintenant deux jeux d'ADN double brin. Il est maintenant possible d'utiliser ces deux jeux
d'ADN double brin pour un autre cycle et la synthèse subséquente de brins.
A ce stade, un cycle de températures complet (cycle thermique) a été complété
(Figure 4).
Cycle de températures = étape de dénaturation + étape d'hybridation + étape d'élongation
7
Bulletin n°4110052FR
Fig. 4. Un cycle complet de PCR.
Habituellement, le cycle thermique continue pendant environ 40 cycles. Après chaque cycle thermique,
le nombre de brins de la matrice double, ce qui entraîne une augmentation exponentielle du nombre de brins
de l'ADN matrice. Après 40 cycles il y aura 1,1 x 1012 copies de plus du nombre d'origine de molécules
d'ADN matrice.
La PCR génère de l'ADN d'une longueur et d'une séquence précises. Lors du premier cycle, les deux
amorces s'hybrident aux brins de l'ADN génomique matrice d'origine aux extrémités opposées et sur les
brins opposés. Au terme du premier cycle de températures, deux nouveaux brins sont générés, lesquels
sont plus courts que les brins matrices d'origine mais cependant plus longs que la longueur de l'ADN que le
chercheur souhaite amplifier. Ce n'est pas avant le troisième cycle thermique que des fragments de la
longueur précise sont générés (Figure 5).
8
Bulletin n°4110052FR
Fig. 5. Génération de fragments de longueur précise.
Ce sont les brins matrices de la longueur précise qui sont amplifiés exponentiellement (Xn, où X = le
nombre de brins matrices d'origine et n = le nombre de cycles). Il y a toujours un jeu de molécules d'ADN
matrice de la longueur d'origine qui n'est pas totalement dupliqué. Après chaque cycle thermique, deux brins
de longueur intermédiaire sont produits, mais parce qu'ils ne peuvent être générés qu'à partir des brins
matrices d'origine, les brins intermédiaires ne sont pas amplifiés exponentiellement. Ce sont les brins de
longueur précise générés à partir des brins intermédiaires qui s'amplifient exponentiellement à chaque cycle.
Par conséquent, si 20 cycles thermiques ont été conduits à partir d'une molécule d'ADN double brin, il y aura
1 jeu de brins d'ADN génomique matrice d'origine, 20 jeux de brins matrices intermédiaires et 1 048 576 jeux
de brins matrices de la longueur précise. Après 40 cycles, 1 jeu de brins d'ADN génomique matrice d'origine,
40 jeux de brins matrices intermédiaires et 1,1 x 1012 jeux de brins matrices de la longueur précise
(Figure 6).
Bulletin n°4110052FR
Fig. 6. Schéma de l'amplification par PCR de fragments d'ADN.
10
Bulletin n°4110052FR
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Bulletin n°4110052FR
Contenu suggéré des cours
Il y a quatre cours dans ce programme sur la PCR. Tous les cours sont conçus pour être réalisés en
périodes consécutives de 50 minutes. Les cours 1 et 2 présentent des points d'arrêt pratiques et deux
options. Les enseignants doivent choisir la préparation d'ADN de cellules de la joue ou de follicule
pileux. Les enseignants peuvent souhaiter présenter aux élèves l'une ou l'autre méthode en option ou ils
peuvent choisir de réaliser un mode opératoire particulier selon les restrictions locales. Les échantillons
peuvent être stockés pendant plusieurs jours pour concilier les week-ends et les TP qui se déroulent
tous les deux jours.
Emploi du temps des élèves
Cours 1
Activité
Préparation de l'ADN matrice de cellules de la joue
Isolement de cellules de la joue
Préparation d'ADN génomique provenant de cellules de la joue
(Point d'arrêt)
Cours 1
Activité
Préparation de l'ADN matrice de follicules pileux
Isolement de cheveux
Préparation d'ADN génomique provenant des follicules pileux
(Point d'arrêt)
Cours 2
Activité
Amplification par PCR
Installation et réalisation des réactions de PCR
Couler les gels d'agarose (ceci peut être réalisé par l'enseignant au cours de la
préparation préalable)
(Point d'arrêt)
Cours 3
Electrophorèse sur gel des échantillons amplifiés de PCR et coloration des gels
d'agarose
Chargement et migration sur les gels
Coloration des gels
(Remarque : si vous suivez le mode opératoire de coloration rapide, enregistrez les
résultats et séchez les gels)
Activité
Cours 4
Activité
Analyse et interprétation des résultats
Enregistrement des résultats et séchage des gels (si vous suivez le mode
opératoire de coloration pendant une nuit)
Analyse et discussion des résultats
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Bulletin n°4110052FR
Généralités sur la préparation préalable par l'enseignant
Cette partie présente l'emploi du temps recommandé pour la préparation préalable par
l'enseignant. Un guide détaillé de la préparation préalable est fourni aux pages 16 à 24.
Quand
Immédiatement
Avant le Cours 1
Avant le Cours 2
Avant le Cours 3
Activité
Lecture du manuel de PCR
Aliquotage de la matrice InstaGene
Installation des postes de travail des élèves
Préparation de la solution d’amplification
Installation des réactions de PCR contrôles
Préparation du tampon TAE
Préparation de l'agarose fondu
Programmation du Gene Cycler™ ou MyCycler™
Installation des postes de travail des élèves
Préparation du colorant d'ADN Fast Blast
Installation des postes de travail des élèves
Avant le Cours 4
Installation des postes de travail des élèves
Remarque : Choisissez l'une des deux options de préparation de l'ADN matrice.
Temps requis
2 heures
30 min
1 heure
20 min
10 min
Liste de contrôle quotidien des éléments des postes de travail
Postes de travail des élèves : Les matériaux et les consommables nécessaires pour chaque
poste de travail des élèves avant l'exercice sont listés ci-dessous. Les composants fournis dans ce
kit sont suffisants pour 8 postes de travail avec 4 élèves à chaque poste.
Poste de travail (commun) de l'enseignant : Les matériaux, les consommables et les instruments
nécessaires à un emplacement accessible à tous les élèves sont également listés ci-dessous. C'est à
l'enseignant de décider si les élèves auront accès aux solutions tampons/instruments communs ou si
l'enseignant aliquotera les solutions et fera fonctionner les instruments.
Cours 1 – Préparation de l'ADN matrice
Postes de travail des élèves
Quantité par poste
Microtubes à essai de 1,5 ml (pour le MO pour les cellules de la joue) 4
Tubes avec bouchon à vis avec la matrice InstaGene™ (pour le MO
4
pour les cellules de la joue)*
Tubes avec bouchon à vis avec la matrice InstaGene™ et la protéase* 4
(pour le MO pour les follicules pileux)
Supports de microtubes à essai en mousse
2
Micropipette P-20, pour le MO pour les cellules de la joue uniquement 1
Embouts de pipette (type à filtre), 2 à 20 µl, pour le MO pour les
4
cellules de la joue uniquement
Marqueur permanent
1
Récipient à déchets
1
Copie du mode opératoire
1
Récipients avec 10 ml de solution saline à 0,9% (pour le MO pour les 4
cellules de la joue uniquement)
Pinces (pour le MO pour les follicules pileux)
1
Ciseaux ou lame de rasoir (pour le MO pour les follicules pileux)
1
()
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
*Choisissez l'une des deux méthodes.
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Bulletin n°4110052FR
Poste de travail (commun) de l'enseignant
Micropipette P-1000 ou micropipette P-200
Embouts de pipette (type à filtre), 20 – 200 µl,
ou embouts de pipette (type à filtre), 100 – 1000 µl
Bains-marie (56 et 100°C)
Microcentrifugeuse
ou minicentrifugeuse
Vortex (facultatif)
Quantité par classe
1
1 boîte
1 boîte
1 de chaque
1
4
1
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
Cours 2 – Amplification par PCR
Poste de travail des élèves
Tubes de PCR
Microtubes à essai, sans bouchon
Solution d’amplification complète (contenant les
amorces) sur glace
Micropipette P-20
ou pipettes à volume fixe de 10 µl et 20 µl
Embouts de pipette (type à filtre), 2 – 20 µl
Supports de microtubes à essai en mousse
Seau rempli de glace
Marqueur permanent
Copie du mode opératoire
Récipient à déchets
Poste de travail (commun) de l'enseignant
Plateaux de gels
Agarose fondu (voir la préparation préalable)
Scotch à autoclave pour les plateaux de gels
Thermocycler Gene Cycler ou MyCycler
Microcentrifugeuse
ou minicentrifugeuse
Quantité par poste
4
4
1 tube
()
1
1 de chaque
8
2
1
1
1
1
Quantité par classe
1 pour 2 postes
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
40 ml par gel
1 par poste
1
1
4
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
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Bulletin n°4110052FR
Cours 3 – Electrophorèse sur gel des échantillons de PCR amplifiés et
coloration des gels d'agarose
Postes de travail des élèves
Quantité par poste
()
Gel d'agarose
Echantillons de PCR
Tampon de charge d'ADN PV92 XC
Micropipette P-20
ou pipettes de volume fixe de 10 µl et 20 µl
Marqueurs de poids moléculaire EZ Load™ (standards)
Embouts de pipette (type à filtre), 2 – 20 µl
Marqueur permanent
Support de microtubes à essai en mousse
Cuves et alimentation électrique
Plateau de coloration des gels
Colorant d'ADN Fast Blast™, solution 1X ou 100X*
Film de support de gel (facultatif)
Feuilles d'acétate transparente pour le traçage des gels
(facultatif)
Eau du robinet chaude pour la décoloration des gels
(pour le mode opératoire de coloration rapide)
Grands récipients pour la décoloration
(pour le mode opératoire de coloration rapide)
Récipient à déchets
Copie du mode opératoire
Poste de travail de l'enseignant
Tampon d'électrophorèse TAE 1X
Echantillons contrôles positifs amplifiés (4 de chaque)
PV92 homozygote (+/+)
PV92 homozygote (–/–)
PV92 hétérozygote (+/–)
Plate-forme basculante (facultatif)**
1
1 par élève
1 tube
1
1 de chaque
1 tube
12
1
2
1
1 pour 2 postes
120 ml pour 2 postes
1
1
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
‰
1,5 à 2 l pour 2 postes
‰
1 à 3 pour 2 postes
1
1
‰
‰
‰
Quantité par classe
275 ml par cuve
12
‰
‰
1
1
4
‰
‰
‰
Microcentrifugeuse
ou minicentrifugeuse
Cours 4 - Analyse et interprétation des résultats
Postes de travail des élèves
Film de support de gel (facultatif)
Feuilles d'acétate transparente pour le traçage des gels
(facultatif)
Copie du mode opératoire
Quantité par poste
1
1
1
()
‰
‰
‰
Poste de travail de l'enseignant
Aucun nécessaire
* Selon le mode opératoire de coloration suivi, rapide ou pendant une nuit.
** Fortement recommandé.
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Bulletin n°4110052FR
Préparation préalable par l'enseignant
Cette partie décrit la préparation à réaliser par l'enseignant avant l'exercice. Une
estimation du temps de préparation est incluse dans chaque partie.
Cours 1 – Préparation de l'ADN matrice
Préparation préalable
Objectifs
Temps requis
Matériaux requis
Aliquotage de la matrice InstaGene™
Installation des postes de travail des élèves et de l'enseignant
Réglage des bains-marie à 56 et 100°C
30 minutes
Tubes avec bouchon à vis
Microtubes à essai
Matrice InstaGene™
Pinces (pour prép. foll. pileux)
Micropipette P-20 (2 – 20 µl)
Ciseaux (pour prép. foll. pileux)
Embouts à filtre (2 – 20 µl)
Cupules (pour prép. cell. joue)
Micropipette P-200 (20 – 200 µl) Protéase (pour prép. foll. pileux)
Embouts à filtre (20 – 200 µl)
Vortex
Modes opératoires
1. Aliquotez la matrice InstaGene™ (préparation de cellules de joue).*
A. Homogénéisez la matrice InstaGene en agitant la bouteille doucement ou en la passant
au vortex plusieurs fois pour remettre la matrice en suspension. Assurez-vous que la
matrice est bien mélangée lorsque vous l'aliquotez. Les billes se déposent rapidement
dans la solution, aussi homogénéisez doucement la bouteille plusieurs fois au cours de
l'aliquotage.
B. Pipetez 200 µl de matrice InstaGene dans chaque tube avec bouchon à vis. Distribuez
un tube à chaque élève. Chaque poste de travail des élèves doit disposer de 4 tubes de
matrice pour 4 élèves.
2. Préparez et aliquotez la matrice InstaGene avec la protéase (mode opératoire pour les
follicules pileux).*
A. Préparez une solution de matrice InstaGene contenant 66 µg/ml de protéase. La
protéase (référence 166-2003EDU) est fournie à une concentration de 20 mg/ml.
Pour obtenir 66 µg/ml, diluez la protéase mère au 1/300 en volume dans la matrice
InstaGene.
Par exemple, pour fabriquer 5 ml de matrice InstaGene contenant 66 µg/ml de protéase
(suffisamment pour approximativement 20 élèves) :
• Aliquotez 5 ml de matrice InstaGene dans un nouveau tube (assurez-vous
d'homogénéiser le puits de InstaGene avant l'aliquotage)
• Ajoutez 17 µl de protéase mère aux 5 ml de matrice InstaGene
B. Pipetez 200 µl de matrice InstaGene avec la protéase dans chaque tube avec bouchon à
vis. Distribuez un tube à chaque élève. Chaque poste de travail des élèves doit disposer
de 4 tubes matrice pour 4 élèves.
3. Préparez et aliquotez la solution saline (mode opératoire pour les cellules de la joue).
A. Préparez une solution saline à 0,9%. Une bouteille de 500 ml d'eau potable, ajoutez
4,5 grammes de sel non iodé. Le sel de table est recommandé. Retournez la bouteille
jusqu'à ce que le sel entre en solution.
B. Pour chaque élève, placez 10 ml de solution saline dans un récipient séparé. Chaque
poste de travail d'élèves doit disposer de 4 récipients de solution saline.
*Choisissez l'une des deux méthodes.
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Bulletin n°4110052FR
Cours 2 – Amplification par PCR
Préparation préalable (pour 8 postes de travail d'élèves)
Objectifs
Préparation de la solution d’amplification complète en y mélangeant les
amorces et aliquotez
(pas plus de 30 minutes avant les cycles de PCR)
Installation des réactions de PCR contrôles
Programmation du thermocycler Gene Cycler ou MyCycler
Couler les gels d'agarose. Si vous demandez à vos élèves de couler leurs
propres gels au cours du TP, préparez l'agarose à l'avance. L'agarose,
une fois fondu, peut être conservé dans un bain-marie réglé à 45–50°C
jusqu'à ce que les élèves l'utilisent.
Installation des postes de travail des élèves et de l'enseignant
Temps requis
1 à1,5 heure (selon comment vous choisissez de préparer les gels
d'agarose)
Préparation de la solution d’amplification et installation des échantillons
vers la fin de la préparation préalable.
Matériaux requis
Microtubes à essai (avec bouchons attachés)
Tubes avec bouchons à vis
Solution d’amplification
Mélange des amorces
Contrôle PV92 homozygote (+/+)
Contrôle PV92 homozygote (–/–)
Contrôle PV92 hétérozygote (+/–)
12 tubes de PCR
Cuves d'électrophorèse, plateaux de moulage et peignes
Tampon d'électrophorèse (TAE 50X)
Poudre d'agarose
Micropipettes (P-20 et P-200)
Embouts à filtre (20 – 200 µl et 100 – 1000 µl)
Le thermocycler Gene Cycler peut recevoir 24 échantillons, tandis que le thermocycler
MyCycler supporte 96 échantillons. Si vous utilisez le Gene Cycler, vous devrez faire
fonctionner la machine de PCR plus d'une fois s'il y a plus de 24 échantillons (y compris les
échantillons contrôles positifs). Pour obtenir les meilleurs résultats, ne préparez pas les
réactions des élèves et les échantillons contrôles plus de 30 minutes avant les cycles
de PCR.
Modes opératoires
Remarque : Avant d'ouvrir l'un quelconque des tubes de réactif, centrifugez le contenu
(~ 3 secondes) dans une centrifugeuse pour entraîner le contenu au fond des tubes. Le contenu
se loge souvent sous les bouchons au cours de l'expédition.
1. Préparez la solution d’amplification complète en ajoutant les amorces. Pour obtenir les
meilleurs résultats, vous devez réaliser les étapes suivantes dans les 15 à 30 minutes
qui suivent la réaction de PCR.
A. Pipetez 1100 µl de la solution d’amplification dans un microtube à essai étiqueté. Si
vous choisissez d'amplifier 16 échantillons d'élève ou moins, divisez la solution
d’amplification dans deux tubes avec 550 µl chacun. Un tube sera immédiatement
utilisé et la solution d’amplification restant peut être de nouveau congelé pour un
usage ultérieur.
B. Pour 32 élèves ou 8 postes de travail d'élèves (divisez en deux pour 16 élèves),
étiquetez 8 microtubes à essai “SA” et placez les tubes sur de la glace.
C. Ajoutez 22 µl du mélange des amorces aux 1100 µl de la solution d’amplification.
Passez au vortex pendant 10 secondes pour homogénéiser. Il est impératif que la
solution d’amplification soit uniformément homogénéisé après l'addition des amorces.
La solution doit être jaune.
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Bulletin n°4110052FR
Les amorces sont fournies sous la forme d'une solution jaune concentrée dans un
tampon Tris. Puisque les amorces sont beaucoup plus stables sous une forme
concentrée, ajoutez les amorces à la solution d’amplification juste avant de commencer
l'exercice des travaux pratiques — Pas plus de 15 à 30 minutes avant l'amplification par
PCR.
Mélange des amorces
Solution d’amplification
D. Aliquotez 95 µl de la solution d’amplification complète dans les 8 microtubes à essai
étiquetés “SA”, en distribuant un tube pour chaque poste de travail des élèves (1 à
8). Gardez la solution d’amplification complète restant pour les réactions des
contrôles positifs. Placez ces tubes sur de la glace jusqu'à leur utilisation.
2. Installez les réactions de PCR contrôles.
A. Etiquetez les tubes de PCR contrôles : +/+, –/– et +/–. Si vous utilisez le kit entier sur
une seule période de TP, installez 4 tubes de chaque contrôle soit un total de 12 tubes.
Si vous divisez le kit entre deux périodes de TP, installez 2 tubes de chaque contrôle
soit un total de 6 tubes. Les solutions contrôles inutilisées doivent être stockées dans le
congélateur jusqu'à leur utilisation.
• Pipetez 20 µl de la matrice +/+ dans chaque tube de PCR +/+.
• Pipetez 20 µl de la matrice -/- dans chaque tube de PCR -/-.
• Pipetez 20 µl de la matrice +/- dans chaque tube de PCR +/-.
B. Pipetez 20 µl de solution d’amplification complète dans chacun des tubes contrôles.
Utilisez un nouvel embout pour chaque tube.
C. Placez les tubes sur de la glace jusqu'à ce que vous soyez prêt à les charger dans le
Gene Cycler ou le MyCycler. Amplifiez les échantillons contrôles de PCR avec les
échantillons des élèves durant ce cours (voir le mode opératoire).
3. Préparez les gels d'agarose. Ces modes opératoires peuvent être réalisés 1 ou 2 jours au
préalable par l'enseignant ou durant le cours par les équipes individuelles des élèves.
A. Préparez le tampon d'électrophorèse. Le tampon d'électrophorèse est fourni sous la
forme d'une solution concentrée 50X. Vous avez besoin de tampon TAE 1X pour
fabriquer le gel d'agarose et également pour chaque chambre d'électrophorèse. Trois
litres de tampon TAE 1X suffiront pour faire fonctionner 8 chambres d'électrophorèse et
pour couler 8 gels d'agarose. Pour fabriquer 3 l de TAE 1X à partir de TAE concentré
50X, ajoutez 60 ml de concentré à 2,94 l d'eau distillée.
B. Fabriquez la solution d'agarose. La concentration de gel recommandée pour cette
application en classe est de l'agarose à 1 %. Cette concentration d'agarose produit une
séparation excellente et minimise le temps de fonctionnement requis pour la séparation
électrophorétique des fragments de PCR. Pour fabriquer une solution à 1 %, ajoutez 1 g
d'agarose à 100 ml de tampon d'électrophorèse TAE 1X. Pour 8 gels, vous aurez besoin
d'approximativement 350 ml d'agarose fondu (3,5 g d'agarose pour 350 ml de tampon
TAE 1X). L'agarose doit être fabriqué en utilisant du tampon d'électrophorèse, pas de
l'eau.
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Bulletin n°4110052FR
Ajoutez la poudre d'agarose dans un récipient approprié (par exemple, un ballon
d'Erlenmeyer de 1000 ml, une bouteille de Wheaton, etc.). Ajoutez la quantité
appropriée de tampon d'électrophorèse TAE 1X et faites tourner pour mettre en
suspension la poudre d'agarose dans le tampon. Si vous utilisez un ballon d'Erlenmeyer,
retournez une fiole d'Erlenmeyer de 50 ml sur l'ouverture du ballon d'Erlenmeyer de
1000 ml contenant l'agarose. La petite fiole fonctionne comme une chambre de reflux,
permettant une ébullition sans une grosse perte de volume de tampon. L'agarose peut
être fondu pour mouler le gel sur une plaque brûlante magnétique ou dans un four à
micro-ondes (voir ci-dessous). Chauffez le mélange jusqu'à ébullition en utilisant un four
à micro-ondes ou un bain-marie brûlant jusqu'à la dissolution complète de la poudre
d'agarose.
Il est nécessaire d'observer soigneusement pour déterminer lorsque la poudre est
complètement dissoute. Tenez le ballon contre la lumière et recherchez de petits paquets
transparents d'agarose en suspension. Ces particules indiquent que l'agarose n'est pas
complètement dissous. Vous devez poursuivre le chauffage et la rotation jusqu'à ce que
vous ne puissiez plus voir ces particules transparentes.
Précaution : Utilisez des gants de protection, des gants pour le four, des lunettes de protection
et une blouse de TP comme il convient lors de la préparation et du moulage des gels d'agarose.
L'agarose fondu bouillant ou les récipients contenant l'agarose brûlant peuvent causer des
brûlures sévères.
Méthode de la plaque brûlante magnétique. Ajoutez un bâton magnétique dans le ballon
contenant l'agarose et le tampon. Chauffez le mélange jusqu'à ébullition tout en agitant sur une
plaque brûlante magnétique. Les bulles ou la mousse doivent se rompre avant de s'élever vers
le col du ballon. Portez la solution à ébullition jusqu'à la dissolution de toutes les petites
particules transparentes d'agarose. Avec la petite fiole toujours en place, mettez l'agarose de
côté pour refroidir à 60°C avant de couler les gels.
Méthode du four à micro-ondes. Placez la solution d'agarose dans le four à micro-ondes.
Desserrez le bouchon de la bouteille s'il y en a un. Utilisez une puissance moyenne et réglez sur
3 minutes. Arrêtez le four à micro-ondes toutes les 30 secondes et faites tourner le ballon pour
mettre en suspension l'agarose non dissous. Cette technique est le moyen le plus rapide et le
plus sécuritaire pour dissoudre l'agarose. Portez à ébullition et faites tourner la solution jusqu'à la
dissolution de toutes les petites particules transparentes d'agarose. Avec la petite fiole toujours
en place, mettez l'agarose de côté pour refroidir à 60°C avant de couler les gels.
Des gels d'agarose pré-coulés pratiques (référence 161-3057EDU) sont disponibles chez
Bio-Rad. Ce sont des gels de TAE à 1 % à 2 x 8 puits.
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Bulletin n°4110052FR
Mode opératoire pour le moulage des gels
En utilisant le système Mini-Sub® Cell GT de Bio-Rad, les gels peuvent être coulés directement
dans la cuve en utilisant des barrières de coulées avec le plateau de gels. Si vous ne disposez
pas de barrières de coulées, utilisez la méthode avec du scotch à autoclave pour le moulage
des gels, telle que présentée ci-dessous. D'autres méthodes sont détaillées dans le manuel
d'instructions du Bio-Rad Sub-Cell GT.
Etape 1. Scellez bien les extrémités du plateau de gels avec du scotch à autoclave.
Pressez fermement sur le scotch aux bords du plateau de gels pour former un
joint étanche aux liquides.
Etape 2. Uniformisez le plateau de gels sur une table d'uniformisation ou une paillasse en
utilisant le niveau à bulle fourni avec l'instrument.
Etape 3. Préparez la concentration et la quantité souhaitées d'agarose dans du tampon
d'électrophorèse TAE 1X. Portez l'agarose à ébullition jusqu'à dissolution.
Etape 4. Refroidissez l'agarose à au moins 60°C avant de verser.
Etape 5. Alors que l'agarose refroidit à 60°C, placez le peigne dans la fente appropriée du
plateau de gels. Les peignes doivent être placés à ~ 2 cm de l'extrémité du plateau
de moulage des gels (pas au milieu du gel).
Etape 6. Laissez le gel se solidifier à température ambiante pendant 10 à 20 minutes — il
est translucide lorsqu'il est prêt à l'emploi.
Etape 7. Retirez le peigne avec précaution du gel solidifié. Retirez le scotch des bords du
plateau de gels.
Etape 8. Placez le plateau sur la cuve d'électrophorèse d'ADN à niveau de manière à ce que
les puits des échantillons soient à l'extrémité de la cathode (noire) de la base. Les
échantillons d'ADN migreront vers l'extrémité de l'anode (rouge) de la base durant
l'électrophorèse.
4. Programmez le thermocycler Gene Cycler ou MyCycler.
Le thermocycler doit être programmé pour 3 étapes dans le cycle 2, qui se répétera 40 fois. Le
cycle 3 final assure que la réaction d'élongation finale arrive à son terme et que tous les
produits de PCR possibles sont fabriqués. La réaction de PCR prendra approximativement 3,5
heures.
Cycle
Etape
Fonction
Température
Temps
1
Etape 1
Pre-dénaturation
94°C
2 minutes
Etape 1
Dénaturation
94°C
1 minute
Etape 2
Hybridation
60°C
1 minute
Etape 3
Elongation
72°C
2 minutes
Elongation finale
72°C
10 minutes
Répétition 1 fois
2
Répétition 40 fois
3
Etape 1
Répétition 1 fois
Reportez-vous au manuel d'instructions du Gene Cycler ou du MyCycler pour obtenir des
instructions de programmations spécifiques.
20
Bulletin n°4110052FR
Cours 3 – Electrophorèse des échantillons de PCR amplifiés et coloration des
gels d'agarose
Préparation préalable
Objectifs
Préparation des échantillons contrôles positifs amplifiés
Aliquotage du tampon de charge PV92 XC
Aliquotage des marqueurs de poids moléculaire EZ Load (standards
d'ADN)
Installation des postes de travail des élèves et de l'enseignant
Préparation du colorant d'ADN Fast Blast soit 1X soit 100X (selon si
vous suivez le mode opératoire de coloration rapide ou pendant une
nuit)
Temps requis
40 minutes
Matériaux requis
8 microtubes à essai avec des bouchons attachés
Micropipettes (P-20, P-200 et P-1000) et des embouts à filtre
8 tubes avec des bouchons à vis
Eau distillée ou déminéralisée pour préparer le colorant d'ADN Fast
Blast
Film de support de gel (pour le mode opératoire de coloration rapide)
Acétate pour le traçage des gels (pour le mode opératoire de coloration
rapide)
Ballon de 500 ml
Modes opératoires
1. Préparez les échantillons contrôles positifs. Ajoutez 10 µl de tampon de charge PV92 XC
dans chaque échantillon contrôle positif amplifié (+/+, –/–, +/–). Déposez les tubes sur le
poste de travail de l'enseignant. Soit vous soit un groupe d'élèves chargera les échantillons
contrôles positifs et négatifs sur chaque gel, comme il est indiqué à la page 28.
2. Aliquotez les standards de taille d'ADN. Aliquotez 11 µl des marqueurs de poids
moléculaire EZ Load dans 8 microtubes et étiquetez “MPM”. Les tailles des bandes des
standards d'ADN sont de 1000 pb, 700 pb, 500 pb, 200 pb et 100 pb.
3. Aliquotez le tampon de charge PV92 XC. Etiquetez 8 tubes avec bouchons à vis “TC”
avec du tampon de charge et aliquotez 50 µl dans chaque tube. Distribuez aux postes de
travail des élèves.
4. Préparez le colorant d'ADN Fast Blast. Le colorant d'ADN Fast Blast est fourni sous la
forme d'un concentré 500X qui doit être dilué avant utilisation. Le colorant peut être utilisé
comme un colorant rapide lorsqu'il est dilué à 100X pour permettre la visualisation de l'ADN
en 12 à 15 minutes ou il peut être utilisé comme un colorant pendant une nuit lorsqu'il est
dilué à 1X. Lorsqu'un gel d'agarose est immergé dans du colorant d'ADN Fast Blast, les
molécules de colorant se fixent aux molécules d'ADN piégées dans le gel d'agarose.
Lorsque les bandes d'ADN sont visibles, vos élèves peuvent déterminer leurs génotypes
pour l'insert Alu.
Le colorant d'ADN Fast Blast est une alternative pratique, sans risque et non toxique au
bromure d'éthidium pour la détection de l'ADN dans des gels d'agarose après
l'électrophorèse. Fast Blast contient un composé cationique qui appartient à la famille de
colorants des thiazines. Les molécules de colorant chargées positivement sont attirées par
et se lient aux groupes phosphates chargés négativement sur l'ADN. La formule déposée
du colorant colore l'ADN en bleu profond dans les gels d'agarose et fournit des résultats très
nets et cohérents.
21
Bulletin n°4110052FR
AVERTISSEMENT
Bien que le colorant d'ADN Fast Blast soit non toxique et non cancérigène, vous devez
porter des gants en latex ou en vinyle lors de la manipulation du colorant ou des gels
colorés pour empêcher vos mains de devenir bleues. Vous devez porter des blouses
de laboratoire ou d'autres vêtements de protection pour éviter de colorer vos
vêtements. Eliminez les solutions colorantes selon les modes opératoires suivis sur
votre site. Utilisez soit de l'eau de Javel à 10 % soit une solution d'alcool à 70 % pour
éliminer le Fast Blast de la plupart des surfaces. Vérifiez que ces solutions ne sont pas
nocives pour la surface avant de les utiliser.
1. Pour préparer du colorant 100X (pour la coloration rapide), diluez 100 ml de Fast Blast
500X avec 400 ml d'eau distillée ou déminéralisée dans un ballon ou une bouteille de taille
appropriée et mélangez. Couvrez le ballon et stockez-le à température ambiante jusqu'à ce que
vous soyez prêt à l'utiliser.
2. Pour préparer du colorant 1X (pour la coloration pendant une nuit), diluez 1 ml de Fast Blast
500X avec 499 ml d'eau distillée ou déminéralisée dans un ballon ou une bouteille de taille
appropriée et mélangez. Couvrez le ballon et stockez-le à température ambiante jusqu'à ce que
vous soyez prêt à l'utiliser.
•
•
•
•
•
•
•
Note:
Nous recommandons l'utilisation de 120 ml de Fast Blast dilué pour colorer deux gels
d'agarose de 7 x 7 cm ou de 7 x 10 cm dans des plateaux de coloration individuels fournis
dans le kit (vous pouvez souhaiter faire une encoche aux coins des gels pour une
identification). Si vous utilisez d'autres plateaux de coloration, ajoutez un volume suffisant de
solution colorante pour submerger complètement les gels.
Après l'électrophorèse, vous devez retirer les gels d'agarose de leurs plateaux avant de les
déposer dans la solution colorante. Ceci s'accomplit facilement en tenant la base du
plateaux de gels d'une main et en expulsant doucement le gel avec le pouce de l'autre
main.
Parce que le gel est fragile, faites particulièrement attention lorsque vous le manipulez.
Nous vous recommandons fortement d'utiliser une grande spatule ou une autre surface de
support pour transférer le gel d'un récipient à un autre au cours des étapes de décoloration
impliquées dans le mode opératoire de coloration rapide.
La décoloration (pour le mode opératoire de la coloration rapide) nécessite l'utilisation d'au moins
un récipient de grand volume, pouvant contenir au moins 500 ml, à chaque poste de travail des
élèves. Chaque groupe d'élèves peut utiliser des récipients de lavages séparés pour
chaque étape de lavage ou ils peuvent simplement utiliser un seul récipient qui est vidé
après chaque lavage et rempli pour le lavage suivant.
Il est important que vous secouiez les gels doucement et de manière intermittente durant la
coloration pendant une nuit dans du colorant d'ADN Fast Blast ; les petits fragments d'ADN
tendent à diffuser sans agitation.
Le Fast Blast 100X peut être réutilisé au moins 7 fois.
Il n'est pas nécessaire de laver ou de décolorer lorsque vous suivez le mode opératoire de
coloration pendant une nuit.
22
Bulletin n°4110052FR
Cours 4 – Analyse et interprétation des résultats
Préparation préalable
Objectifs
Pas de préparation préalable nécessaire
Matériaux requis
Film de support de gel (pour le mode opératoire de coloration pendant
une nuit)
Acétate pour le traçage des gels (pour le mode opératoire de coloration
pendant une nuit)
Obtention d'un enregistrement permanent du gel avant le séchage
Pour obtenir un enregistrement permanent du gel avant qu'il soit séché, soit vous tracez le
contour du gel (y compris les puits et les bandes d'ADN) sur un morceau de papier ou d'acétate et
vous prenez une photographie à l'aide d'un appareil et d'un film standard (système de
documentation de gels standard de Bio-Rad, référence 170-3742EDU), soit vous photocopiez
le gel coloré.
Remarque : Le séchage des gels d'agarose nécessite l'utilisation d'agarose pour analyse
de résistance élevée spécialement formulé de Bio-Rad. D'autres milieux de gel peuvent ne
pas être appropriés pour cet objectif.
Nous vous recommandons d'utiliser le film de support de gel exclusif de Bio-Rad (référence
170-2984EDU) pour sécher les gels d'agarose. Retirez le gel d'agarose coloré de son plateau
de coloration et découpez tous les couloirs non chargés avec un couteau ou une lame de rasoir.
Déposez le gel directement sur le côté hydrophile d'un morceau de film de support de gel.
(L'eau formera des billes sur le côté hydrophobe mais s'étalera sur le côté hydrophile du film.)
Centrez le gel sur le film et éliminez les bulles qui peuvent se former entre le gel et le film.
Déposez le film sur une serviette en papier et laissez-le sécher, assurez-vous d'éviter toute
exposition directe à la lumière. Alors que le gel sèche, il se fixera au film mais ne rétrécira pas.
S'il n'est pas dérangé sur le film de support, le gel sèchera complètement à température
ambiante après 2 à 3 jours. Le résultat sera un enregistrement plat, transparent et durable de
l'expérience.
Film de support de gel
Remarque : Evitez une exposition prolongée des gels séchés à la lumière directe pour
éviter le palissement des bandes. Toutefois, les bandes d'ADN réapparaîtront si les gels
séchés sont stockés à l'obscurité pendant 2 à 3 semaines après le palissement.
23
Bulletin n°4110052FR
Cours 5 – Analyse des résultats de la classe en utilisant la
bioinformatique
Préparation préalable
Objectifs
Se familiariser avec le Allele Server sur le site web du Dolan DNA
Learning Center
Inscription pour établir un compte personnel gratuit
Temps requis
30 à 45 minutes
Matériaux requis
Aucun
Démarrage sur le Allele Server
Remarque : Le site web du Dolan DNA Learning Center est continuellement mis à jour.
Certaines des informations suivantes peuvent changer.
1. Sur votre explorateur internet, allez à vector.cshl.org
2. Cliquez sur Resources
3. Cliquez sur BioServers
4. Sous Allele Server, cliquez sur Register. L'inscription est gratuite et vous permet d'établir un
compte personnel. Il n'est pas nécessaire de vous inscrire à chaque fois que vous retournez
sur ce site.
Utilisation du Allele Server
1. Connectez-vous au Allele Server en utilisant le nom d'utilisateur et le mot de passe que vous
avez enregistrés.
2. Une fois que vous êtes connecté, suivez les instructions fournies dans la fenêtre d'affichage
pour utiliser le Allele Server. Vous pouvez également ouvrir une nouvelle fenêtre et aller à
dnalc.org/help/sad/topic_3.html pour obtenir davantage d'informations détaillées. Suivez
les instructions détaillées sur comment peupler l'espace de travail, analyser des groupes,
comparer des groupes et interroger la base de données. Souvenez-vous qu'en tant
qu'utilisateur enregistré, vous pouvez stockez tous les groupes que vous avez chargés dans
votre base personnelle de Allele Server et les analyser à votre convenance.
24
Bulletin n°4110052FR
Points du cours à souligner — Questions fréquemment posées
Cette partie décrit les étapes des modes opératoires expérimentaux qui peuvent poser des
problèmes du point de vue technique ou qui sont extrêmement importantes pour le résultat global et la
compréhension des expériences. Les enseignants doivent attirer l'attention de leurs élèves sur ces
points et, lorsque c'est possible, montrer la technique avant que les élèves la tentent.
Le manuel de l'élève et le mode opératoire contiennent des descriptions détaillées et des schémas
de toutes les étapes et techniques de travaux pratiques employées dans chaque cours. Reportezvous y si vous avez des questions à propos des modes opératoires expérimentaux utilisés dans les
TP.
Cours 1 – Préparation des échantillons
Traitement des échantillons de cellules de la joue et de follicules pileux pour obtenir un ADN
génomique matrice pour la PCR
A. Matrice InstaGene : Quelle est sa fonction?
La matrice InstaGene est constituée d'une suspension de billes microscopiques Chelex® chargées
négativement qui fixent les cations bivalents comme le magnésium (Mg2+). Il est important d'éliminer
les cations bivalents des échantillons d'ADN génomique des élèves parce que les cations aident les
enzymes qui dégradent l'ADN matrice. Lorsque des cellules de la joue ou des follicules pileux sont
lysés et portés à ébullition en présence de matrice InstaGene, les cations bivalents libérés des cellules
se fixent aux billes et la chaleur inactive les enzymes de dégradation de l'ADN. Les billes sont ensuite
transformées en culot par centrifugation. Le surnageant, qui contient l'ADN génomique intact propre,
peut être utilisé comme matrice dans les réactions de PCR.
Les billes de la matrice InstaGene se déposent rapidement dans la solution. Il est extrêmement
important que le flacon de matrice soit parfaitement homogénéisé avant de pipeter des aliquots pour
chaque poste de travail des élèves, de manière à ce que les aliquots contiennent des quantités
équivalentes de billes.
Chaque élève préparera de l'ADN génomique à partir de cellules de la joue isolées en utilisant un
bain de bouche salin ou à partir de follicules pileux. Pour les élèves utilisant le mode opératoire pour
les cellules de la joue, 1 ml de cellules recueillies en utilisant du bain de bouche procure suffisamment
de matériau pour la préparation de l'ADN. Certains élèves peuvent avoir besoin d'utiliser 2 ml ou plus
de bain de bouche salin pour obtenir suffisamment de cellules pour préparer l'ADN. Veuillez noter : il
n'est pas recommandé d'utiliser plus de 3 ml de bain de bouche salin pour préparer l'ADN, (voir
‘Interprétation des résultats et Guide de dépannage’ à la page 30). Une fois que les cellules ont été
centrifugées dans une centrifugeuse, un culot cellulaire d'environ la taille d'une tête d'allumette devra
fournir assez de cellules pour les étapes suivantes. Il n'est pas recommandé de manger avant le
recueil des cellules car les particules alimentaires peuvent rendre la préparation des cellules plus
difficile. Si vous ne disposez pas d'une micropipette P-1000, les élèves peuvent verser soigneusement
~ 1 ml de la solution saline utilisée pour se rincer la bouche dans un microtube à essai. Les gradations
figurant sur le côté du microtube à essai peuvent être utilisées pour juger de la quantité de liquide
dans le tube.
Si les échantillons d'ADN ne sont pas amplifiés dans les 24 heures, vous pouvez les stocker dans
le réfrigérateur dans la matrice InstaGene pendant 1 semaine. Pour un stockage plus long, déposez
les échantillons dans le congélateur pour empêcher la dégradation de l'ADN. Avant d'utiliser les
échantillons dans la PCR, les billes doivent être remises en culot par centrifugation juste avant de
constituer les réactions de PCR. Toutefois, il est recommandé de traiter les échantillons dans les 24
heures. Voir les étapes suivantes pour des conseils de traitement.
B. Préparation d'ADN génomique à partir de cellules de la joue ou de follicules pileux
Pour les élèves suivant le mode opératoire pour l'ADN de cellules de la joue, les cellules sont
recueillies en utilisant un bain de bouche salin. Pour les élèves suivant le mode opératoire pour l'ADN
des follicules pileux, il est recommandé aux élèves de recueillir deux cheveux pour la préparation de
l'ADN génomique.
Bulletin n°4110052FR
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C. Incubation : Quelles sont les fonctions de chaque étape d'incubation?
L'étape de pré-incubation est réalisée à 56°C et elle a deux fonctions :
1. Le chauffage de la suspension cellulaire aide à rompre le tissu conjonctif qui maintient les
cellules ensemble. La rupture du tissu rend la lyse des cellules plus facile au cours de l'étape
d'incubation suivante à 100°C.
2. La pré-incubation à 56°C inactive les ADNases, des enzymes qui sont naturellement
présentes dans les suspensions cellulaires et qui pourraient dégrader l'ADN génomique et
inhiber les réactions de PCR.
Le chauffage des échantillons de cellules à 100°C rompt les membranes cellulaires, libérant
de cette manière le contenu cellulaire qui comprend l'ADN génomique. L'ADN génomique sert
de matrice dans les réactions de PCR.
D. Dois-je éliminer la matrice InstaGene avant la PCR?
Il est extrêmement important de transformer en culot les billes de InstaGene complètement
au fond du tube avant de prélever un aliquot du lysat pour la réaction de PCR. Les billes se
fixent aux cations bivalents tels que Mg2+, qui sont essentiels à la fonction de la Taq ADN
polymérase. Ainsi, si des billes sont transportées dans la réaction de PCR, celle-ci pourrait être
inhibée. La matrice InstaGene peut être transformée en culot de manière efficace par
centrifugation (6000 x g pendant 5 min).
Le surnageant au-dessus des billes (qui contient l'ADN génomique) est prélevé pour la
réaction de PCR. Prélevez soigneusement 20 µl du surnageant, sans déranger la matrice
InstaGene, et transférez-les dans un tube de PCR qui est déposé dans un adaptateur sans
bouchon.
Surnageant
Matrice
ADN matrice
Cours 2 - Amplification par PCR des échantillons d'ADN génomique
Solution d’amplification : Qu'est-ce que c'est?
La solution d’amplification contient un mélange de nucléotides ou dNTP (dATP, dTTP, dCTP
et dGTP), du tampon et de la Taq ADN polymérase. La solution d’amplification complète est
préparée en ajoutant des amorces à la solution d’amplification juste avant la période de travaux
pratiques. Ainsi, lorsqu'un aliquot de 20 µl du lysat de cellules de la joue ou de follicules pileux
(qui fournit l'ADN matrice) est ajouté à un aliquot de 20 µl de solution d’amplification complète,
tous les composants nécessaires pour une réaction de PCR de 40 µl sont présents. La solution
d’amplification 2X contient 0,05 unités/µl de Taq ADN polymérase, 3 mM de MgCl2, 1,6 mM de
dNTP et 1 µM de chaque amorce. La concentration finale 1X ou de travail de ces composants dans
le tube de PCR après l'association des amorces, de la solution d’amplification et de la matrice sera
supérieure de la moitié des valeurs ci-dessus.
Remarque : Une fois que la solution d’amplification et les amorces ont été mélangés, ils
doivent être conservés sur de la glace et utilisés dans les 15 à 30 minutes. Ces réactifs sont
extrêmement sensibles.
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Bulletin n°4110052FR
Pourquoi les amorces sont-elles jaunes?
Le mélange des amorces contient un colorant compatible avec la PCR appelé la tartrazine
qui co-migre avec de l'ADN de ~ 50 pb. Ce colorant jaune a été ajouté pour permettre aux
élèves de visualiser facilement l'échantillon.
La PCR dans un thermocycler
L'amplification par PCR a lieu dans un thermocycler qui effectue des cycles d'étapes de
chauffage et de refroidissement en alternance. Ces TP utilisent un cycle à trois étapes : l'ADN
subit une dénaturation à 94°C pendant 1 minute, une hybridation à 60°C pendant 1 minute et
une élongation à 72°C pendant 2 minutes. Ce cycle est répété 40 fois au cours de la
progression de l'amplification par PCR. Au cours de la dénaturation, les deux brins de l'ADN
matrice sont fondus et séparés pour donner accès aux amorces de la PCR. Au cours de l'étape
d'hybridation, les amorces de la PCR reconnaissent et se lient à l'ADN matrice. Une fois que les
amorces sont liées, la Taq ADN polymérase étend les amorces pour répliquer le segment
d'ADN au cours de l'étape d'élongation. La réaction de PCR prendra approximativement
3,5 heures pour être complète.
Les tubes de PCR sont très petits et demandent des précautions lorsqu'ils sont manipulés. Il
est important de boucher soigneusement et complètement les tubes avant de les déposer dans
le thermocycler. Si les tubes ne sont pas complètement fermés, une évaporation substantielle
peut avoir lieu et l'amplification par PCR sera inhibée. Pour obtenir les meilleurs résultats, si
vous devez faire fonctionner le thermocycler plus d'une fois (c'est-à-dire, si vous avez plus de
24 échantillons et que vous utilisez le thermocycler Gene Cycler de Bio-Rad), préparez chaque
groupe de réactions des élèves pas plus de 30 minutes avant les cycles de la PCR. Une
incubation prolongée de la solution d’amplification et de l'ADN génomique diminue l'efficacité de
l'amplification.
Les thermocyclers de Bio-Rad ont été développés pour fonctionner sans huile. De l'huile
n'est pas nécessaire dans les puits des blocs thermiques ou dans les tubes des échantillons.
Les puits des échantillons ont une certaine forme permettant un contact uniforme avec la plupart
des tubes de PCR à paroi fine de 200 µl. N'utilisez pas des microtubes à essai à paroi fine de 500 µl
avec ces thermocyclers. Le couvercle chauffant du bloc des échantillons maintient une
température supérieure au bloc des échantillons à tout moment au cours d'un programme de
cycles thermiques. Ceci empêche la vapeur d'eau de se condenser sous le bouchon du tube à
échantillon, réduisant de cette manière l'évaporation des échantillons et éliminant le besoin de
surcouches d'huile dans les tubes.
La PCR manuelle
Il est possible de réaliser manuellement la PCR sans un thermocycler automatisé, bien que
la PCR ne soit pas aussi efficace. Pour une amplification par PCR manuelle, les réactions
doivent être réalisées dans des tubes avec des bouchons à vis et surmontées d'une goutte
d'huile minérale pour empêcher l'évaporation. Les tubes sont déposés dans un bloc thermique
ou dans un bain-marie réglé à 95°C pendant 1 minute, puis ils sont transférés manuellement
dans un bloc thermique ou un bain-marie réglé à 60°C pendant 1 minute et finalement ils sont
transférés dans un bloc thermique ou dans un bain-marie réglé à 72°C pendant 2 minutes.
Quarante cycles de PCR manuelle doivent prendre ~ 3 heures. C'est fastidieux mais cela
fonctionne. Bonne chance!
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Bulletin n°4110052FR
Cours 3 – Electrophorèse sur gel des échantillons de PCR amplifiés et
coloration des gels d'agarose
Préparation des échantillons pour l'électrophorèse
Avant de soumettre les échantillons amplifiés à une électrophorèse, les élèves doivent
ajouter 10 µl de tampon de charge PV92 XC 5X dans chacun de leurs tubes de PCR. Le
tampon de charge d'ADN contient du glycérol qui augmente la densité de l'échantillon et assure
qu'il sombre dans le puits du gel d'agarose. En outre, le tampon de charge d'ADN contient un
colorant appelé le Xylène Cyanole qui co-migre à la même vitesse qu'un fragment d'ADN de
4000 pb vers l'anode.
Quel volume d'échantillon de PCR vaut-il mieux charger sur les gels?
Pour une visibilité optimale, vous devez charger 10 µl de chaque échantillon contrôle, 10 µl
de marqueurs de poids moléculaire EZ Load (standard d'ADN) et 20 µl des échantillons
amplifiés des élèves, sur chaque gel. Un modèle de gel est fourni ci-dessous et la configuration
du gel est également décrite (Figure 7).
Contrôles
Échantillons des élèves
Configuration du gel (1 gel pour 4 élèves ; 8 gels pour 32 élèves)
Couloir
Echantillon
Volume de chargement
1
MPM
10 µl
2
Contrôle homozygote (+/+)
10 µl
3
Contrôle homozygote (-/-)
10 µl
4
Contrôle hétérozygote (+/-)
10 µl
5
Elève 1
20 µl
6
7
8
Elève 2
Elève 3
Elève 4
20 µl
20 µl
20 µl
* MPM = marqueurs de poids moléculaire (standard d'ADN)
Fig. 7. Modèle de gel et ordre suggéré de chargement des échantillons.
28
Bulletin n°4110052FR
Coloration des gels
Des instructions détaillées sur l'utilisation du colorant d'ADN Fast Blast sont incluses
dans le manuel de l'élève. A cause de l'épaisseur des gels, un mouvement de bascule doux
sur une table à agitation produit une coloration plus efficace.
Les gels peuvent être également colorés et visualisés avec du bromure d'éthidium (non
inclus dans le kit). Si vous utilisez du bromure d'éthidium comme colorant, les gels doivent
contenir 0,05 µg/ml de bromure d'éthidium dans l'agarose. Cette concentration de bromure
d'éthidium produit un contraste maximal des bandes amplifiées. Remarque : Le colorant
d'ADN Fast Blast stoppe la coloration du bromure d'éthidium, aussi il vous faut visualiser avec
le bromure d'éthidium avant le colorant Fast Blast.
Cours 4 – Analyse et interprétation des résultats
Une fois que le gel a été coloré avec le colorant d'ADN Fast Blast (en utilisant le mode
opératoire de coloration soit rapide soit pendant une nuit), il sera analysé. Parce que les
bandes palissent légèrement lors du séchage du gel, il vaut mieux analyser les gels colorés
avant le séchage. Les gels peuvent être éclairés par en-dessous pour amplifier la
visualisation des bandes.
a. Déposez votre gel sur un fond clair et enregistrez vos résultats en faisant un schéma
comme suit. Placez une feuille transparente de plastique ou d'acétate sur le gel. Avec un
marqueur permanent, tracez les puits et les aspects des bandes sur la feuille en plastique
pour fabriquer une image qui réplique votre gel. Retirez la feuille en plastique pour une
analyse ultérieure. Ou bien, les gels peuvent être photocopiés sur une feuille jaune de film
transparent pour un contraste optimal.
b. Séchez le gel d'agarose comme enregistrement permanent de l'expérience.
i. Découpez tous les couloirs non chargés avec un couteau ou une lame de rasoir.
Coupez votre gel du haut vers le bas pour éliminer les couloirs dans lesquels vous
n'avez pas chargé des échantillons.
ii. Déposez le gel directement sur le côté hydrophile d'un morceau de film de support de
gel. (L'eau formera des billes sur le côté hydrophobe d'un morceau de film de support
de gel.) Centrez le gel et éliminez les bulles qui peuvent se former entre le gel et le film.
Déposez le film sur une serviette en papier et laissez-le sécher dans une zone bien
ventilée, en vous assurant d'éviter une exposition directe à la lumière. Alors que le gel
sèche, il se fixera au film mais ne rétrécira pas. S'il n'est pas dérangé sur le film de
support, le gel sèchera complètement à température ambiante après 2 à 3 jours. Le
résultat sera un enregistrement plat, transparent et durable de l'expérience.
Film de support de gel
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Bulletin n°4110052FR
Interprétation des résultats et guide dépannage
Explications pour les “couloirs vides” ou les échantillons non amplifiés
Des explications multiples peuvent justifier les échantillons des élèves qui ne sont pas
amplifiés dans les réactions de PCR.
1. Un recueil inadéquat des cellules de la joue. Un culot cellulaire visible d'environ la taille d'une
tête d'allumette doit être obtenu après la centrifugation du bain de bouche salin. Si aucun
culot cellulaire n'est visible ou si le culot est trop petit, davantage de solution saline utilisée
pour se rincer la bouche peut être centrifugée jusqu'à l'obtention d'un culot de la taille
souhaitée. Toutefois, il n'est pas recommandé de recueillir plus de 3 ml de cellules (voir le
point ci-dessous).
2. Un nombre excessif de cellules. Tout comme trop peu de cellules ne produiront pas assez
d'ADN génomique, un nombre excessif de cellules saturera la capacité de la matrice
InstaGene, entraînant une petite ou aucune amplification.
3. La matrice InstaGene non transférée. Chaque poste de travail est équipé de tubes de
matrice InstaGene qui ont été aliquotés par l'enseignant et déposés sur de la glace. Ces
tubes de matrice doivent être homogénéisés avant chaque pipetage pour amener les billes
en suspension. Si aucune bille n'a été transférée dans le tube des élèves, les cations
bivalents ne seront pas éliminés de la préparation d'ADN génomique et la réaction de PCR
sera inhibée.
4. Le transfert de matrice InstaGene dans la réaction de PCR. Bien que les billes de la matrice
InstaGene soient nécessaires pour la préparation de l'ADN matrice, il est important que la
matrice InstaGene ne soit pas transférée dans la réaction de PCR. Si des billes sont
transférées dans le tube de PCR, les ions magnésium dont la Taq polymérase a besoin,
seront éliminés et la réaction de PCR sera inhibée.
Surnageant
(contient l'ADN matrice)
Matrice
ADN matrice
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Bulletin n°4110052FR
Interprétation des échantillons hétérozygotes
1. Compétition au cours de l'amplification. L'amplification des échantillons hétérozygotes est
plus difficile que les deux amplifications d'homozygotes à cause de la compétition entre les
réactions qui produisent les bandes plus petites (641 pb) et plus grosses (941 pb). Parce que
la bande plus petite de 641 pb est amplifiée plus efficacement que la bande de 941 pb, les
échantillons hétérozygotes sur les gels d'agarose montreront la bande plus petite comme
étant plus intense que la bande plus grosse (voir la bande indiquée par un astérisque sur le
gel ci-dessous). Pour cette raison, les échantillons hétérozygotes peuvent être souvent
interprétés comme des homozygotes (–/–) à cause d'une bande supérieure pâle. Un
examen soigneux des gels est nécessaire pour faire la distinction entre des individus
hétérozygotes (+/–) et homozygotes (–/–). Ou bien, l'utilisation de bromure d'éthidium et un
instrument de photodocumentation (le système de documentation de gels de Bio-Rad)
augmentera la sensibilité et rendra plus facile la visualisation des échantillons hétérozygotes
pâles.
2. Bande plus grosse dans les échantillons (+/–). Les échantillons hétérozygotes contiendront
souvent des bandes plus grosses qui migrent à ~ 1100 pb et à 1700 pb dans le gel (voir les
bandes indiquées par des flèches sur le gel ci-dessous). Ces bandes sont des hétéroduplex
qui se forment entre les brins de 641 et 941 nucléotides et qui contiennent la structure
secondaire qui fait que les bandes d'ADN migrent à une vitesse plus lente dans le gel
(Figure 8).
Insert Alu (300 bases)
Fig. 8. Hétéroduplex formé entre les brins de 641 et 941 nucléotides.
31
Bulletin n°4110052FR
3. Formation de dimères d'amorces. Certaines réactions PCR peuvent montrer la formation
de dimères d'amorces. Les dimères d'amorces sont des bandes que l'on observe en bas
des gels et qui correspondent à des complexes des deux amorces. La formation de dimères
d'amorces est plus intense dans les réactions qui montrent peu ou pas de produit amplifié.
Ainsi, la formation de dimères d'amorces est plus susceptible de survenir dans des tubes
réactionnels avec une contamination avec de la matrice InstaGene, peu ou pas de matrice,
ou dans des échantillons qui ont été préparés bien en avance du dépôt dans le
thermocycler. La flèche sur la figure ci-dessous montrent des dimères d'amorces.
4. Des bandes semblent pâlir. Le colorant bleu dans le colorant d'ADN Fast Blast est sujet à un
blanchiment réversible lorsqu'il est exposé à des lumières brillantes dans la pièce. Lorsque
les gels séchés sont examinés 3 à 5 jours après le séchage, les bandes peuvent sembler
pâlir. Le placement des gels dans un endroit sombre (dans une boîte ou collés dans un
cahier fermé) et leur examen plusieurs heures plus tard fourniront les bandes les plus
intenses. Le plus pratique est de laisser les gels sécher sur la paillasse des TP pendant 3 à
5 jours, de les coller dans un cahier de TP et d'examiner les gels le jour suivant.
32
Bulletin n°4110052FR
Mode opératoire
Cours 1 – Préparation d'ADN matrice de
cellules de la joue
1. Etiquetez un microtube à essai de 1,5 ml avec
vos initiales. Etiquetez un tube avec bouchon à
vis contenant 200 µl de matrice InstaGene avec
vos initiales.
2. Demandez à votre enseignant un récipient
contenant de la solution saline. Versez la solution
saline dans votre bouche et rincez vigoureusement
pendant 30 secondes. Recrachez la solution
saline dans le récipient.
3. Transférez 1 ml de votre solution saline dans le
microtube à essai (PAS le tube avec bouchon à
vis) portant vos initiales. Si vous ne disposez pas
de micropipette P-1000, versez soigneusement
~ 1 ml de votre rinçage salin dans votre microtube
à essai (utilisez les graduations figurant sur le côté
du microtube à essai pour estimer 1 ml).
4. Centrifugez votre tube dans une centrifugeuse
équilibrée à pleine vitesse pendant 2 minutes.
Lorsque la centrifugeuse s'est complètement
arrêtée, retirez votre tube. Vous devez observer
un culot de cellules blanchâtres de la taille d'une
tête d'allumette au fond du tube. Si vous
n'observez pas un culot de cette taille, décantez
la solution saline, remplissez votre tube avec
davantage de rinçage oral et répétez la
centrifugation.
Centrifugeuse
5. Après la formation d'un culot de vos cellules,
déversez la solution saline. En prenant soin de
ne pas perdre votre culot, séchez brièvement
votre tube sur une serviette en papier ou un
tissu. Il n'y a pas de problème si une petite
quantité de solution saline (< 50 µl, environ la
même taille que votre culot) demeure au fond du
tube.
6. Remettre le culot en suspension avec un vortex
ou en tapotant le tube de manière à ce qu'aucun
agrégat cellulaire ne demeure.
7. En utilisant une micropipette à volume ajustable
de 2 à 20 µl réglée sur 20 µl, transférez la totalité
de vos cellules remises en suspension dans le
tube avec bouchon à vis contenant la matrice
InstaGene.
8. Vissez fermement le bouchon sur le tube. Agitez
ou passez au vortex pour mélanger le contenu du
tube.
33
Bulletin n°4110052FR
9. Lorsque tous les membres du groupe ont
recueilli leurs échantillons, déposez les tubes
dans le support des microtubes à essai en
mousse et incubez à 56°C pendant 10 minutes
dans un bain-marie. A mi-temps (5 minutes),
agitez ou passez au vortex les tubes
doucement puis remettez-les dans le bainmarie à 56°C pendant les 5 minutes restantes.
10. Retirez les tubes, agitez ou passez au vortex
et déposez les tubes dans un bain-marie
bouillant (100°C). Incubez à 100°C pendant 5
minutes.
Bain-marie
56°C, 10 min
Bain-marie
11. Retirez les tubes du bain-marie bouillant et
agitez ou passez au vortex le contenu pour
remettre en suspension. Transformez la
matrice en culot par centrifugation à 6000 x g
pendant 5 minutes (ou 2000 x g pendant
10 minutes) dans une centrifugeuse.
12. Stockez votre tube avec bouchon à vis dans le
réfrigérateur jusqu'à la période de travaux pratiques
suivante (ou passez à l'étape 2 du Cours 2).
Centrifuge
Centrifugeuse
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Bulletin n°4110052FR
100°C, 5 min
Mode opératoire
Cours 1 – Préparation de l'ADN matrice de
follicule pileux
1. Inscrivez vos initiales sur 1 tube avec
bouchon à vis contenant 200 µl de matrice
InstaGene plus protéase.
2. Prélevez 2 cheveux sur vous-même.
Choisissez des cheveux qui présentent une
gaine visible (revêtement de cellules
épithéliales près de la base du cheveu) soit une
racine de bonne taille (base du cheveu en
forme de bulbe). Coupez le cheveu, en laissant les ~
2 derniers cm de la base du cheveu. Déposez les
cheveux coupés dans le tube avec bouchon à
vis portant vos initiales.
3. Placez votre tube dans le support de
microtubes à essai en mousse et incubez à
56°C pendant 10 minutes dans un bainmarie. Au milieu de la période (5 minutes),
agitez ou passez doucement au vortex,
puis remettez-le dans le bain-marie à 56°C
pour les 5 minutes restantes.
4. Retirez les tubes, agitez-les doucement
ou passez-les au vortex et déposez-les
dans un bain-marie (100°C). Incubez à
100°C pendant 5 minutes.
Gaine
Bulbe
Bain-marie
56°C, 10 min
Bain-marie
100°C, 5 min
5. Retirez les tubes du bain-marie bouillant et
agitez ou passez au vortex le contenu pour
remettre en suspension. Transformez la
matrice en culot par centrifugation à 6000 x g
pendant 5 minutes (ou 2000 x g pendant 10
minutes) dans une centrifugeuse.
Centrifugeuse
6. Stockez votre tube avec bouchon à vis dans le
réfrigérateur jusqu'à la période de travaux
pratiques suivante (ou passez à l'étape 2 du
cours 2).
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Bulletin n°4110052FR
Mode opératoire
Cours 2 – Amplification par PCR
1. Sortez le tube contenant votre ADN matrice du
réfrigérateur. Centrifugez le tube avec bouchon
à vis pendant 2 minutes à 6000 x g (5 minutes à
2000 x g) dans une centrifugeuse.
Centrifugeuse
Centrifuge
2. Inscrivez vos initiales sur un tube de PCR et
sur un microtube à essai sans bouchon. Placez
le tube de PCR dans le tube sans bouchon
comme il est illustré et placez les deux tubes
dans le support en mousse.
Tube
PCR
tube
de
PCR
bouchon
Supernatant
Surnageant
3. Transférez 20 µl de l'ADN matrice (le
surnageant) du tube avec bouchon à vis dans
le fond du tube de PCR. Prenez soin de ne pas
transférer des billes de la matrice dans le tube
de PCR.
ADN matrice
4. Placez le tube de la solution d’amplification
jaune sur de la glace et transférez 20 µl de la
solution d’amplification dans le tube de PCR.
Mélangez en aspirant et en expulsant 2 ou 3
fois avec une pipette. Bouchez bien le tube de
PCR. Le mélange doit être jaune.
Tube
Capless
sans
tube
Matrice
Master mix
Solution
d’amplification
5. Placez le tube de PCR dans le thermocycler. A
ce moment-là, placez également les réactions
contrôles préparées par l'enseignant dans la
machine de PCR. Les réactions doivent être
soumises à 40 cycles d'amplification par PCR.
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Bulletin n°4110052FR
Cours 3 – Electrophorèse des échantillons de PCR amplifiés et coloration des gels d'agarose
1. Sortez votre tube de PCR du thermocycler et
placez-le dans le microtube à essai sans
bouchon. Centrifugez le tube pendant
~ 3 secondes à 2000 x g.
2. Ajoutez 10 µl de tampon de charge PV92 XC
dans votre tube de PCR et mélangez
doucement.
Centrifuge
Centrifugeuse
3. Placez un gel d'agarose dans l'appareil
d'électrophorèse. Vérifiez que les puits des gels
d'agarose se trouvent près de l'électrode noire
(–) et que la base du gel se trouve près de
l'électrode rouge (+).
4. Remplissez la chambre d'électrophorèse et
couvrez le gel de tampon TAE 1X. Ceci
nécessitera ~ 275 ml de tampon 1X.
5. En utilisant un embout propre pour chaque
échantillon, chargez les échantillons dans
8 puits du gel dans l'ordre suivant :
Echantillon
+
Volume de
chargement
1
MPM (standards d'ADN)
10 µl
2
3
4
5
6
7
8
Contrôle homozygote (+/+)
Contrôle homozygote (–/–)
Contrôle hétérozygote (+/–)
Elève 1
Elève 2
Elève 3
Elève 4
10 µl
10 µl
10 µl
20 µl
20 µl
20 µl
20 µl
6. Fixez le couvercle sur la cuve. Le couvercle ne se
fixera sur la base que dans une seule orientation :
rouge sur rouge et noir sur noir. Branchez les fils
électriques à l'alimentation électrique.
7. Allumez l'alimentation électrique et soumettez vos
échantillons à une électrophorèse à 100 V
pendant 30 minutes.
Coloration des gels d'agarose
1. Lorsque l'électrophorèse est terminée, éteignez le
courant et retirez le couvercle de la cuve. Retirez
soigneusement le plateau de gels et le gel de la
cuve. Faites attention, le gel est très glissant.
Délogez le gel du plateau de gels avec votre
pouce et glissez-le soigneusement dans votre
plateau de coloration en plastique.
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2. Il existe deux modes opératoires pour la coloration
de votre gel. Votre enseignant vous dira lequel
suivre.
Mode opératoire 1 : Coloration rapide
(nécessite 12 à 15 minutes)
a. Ajoutez 120 ml de colorant Fast Blast 100X
dans votre plateau de coloration (2 gels par
plateau).
b. Colorez les gels pendant 2 minutes avec une
agitation douce. Gardez le colorant utilisé pour
un usage ultérieur. Le colorant peut être
réutilisé au moins 7 fois.
c. Transférez les gels dans un grand récipient de
lavage et rincez avec de l'eau du robinet
chaude (40 à 55°) pendant approximativement
10 secondes.
d. Décolorez en les lavant chacun deux fois
dans de l'eau du robinet chaude pendant
5 minutes en agitant doucement pour obtenir
les meilleurs résultats.
e. Placez le gel sur un fond clair et enregistrez
votre résultat. Avec un marqueur permanent,
tracez les puits et les aspects des bandes sur
une feuille de plastique transparent ou une
feuille d'acétate.
f. Avec l'aide de votre enseignant, déterminez si
vous êtes homozygote ou hétérozygote pour
l'insertion de Alu.
g. Découpez tous les couloirs vides du gel avec
un couteau ou une lame de rasoir.
h. Pour obtenir un enregistrement permanent,
séchez à l'air le gel sur le film de support du
gel. Collez le gel séché dans votre cahier de
TP. Eviter toute exposition du gel coloré à une
lumière directe qui fera pâlir les bandes.
Mode opératoire 2 : Coloration pendant une nuit
a. Ajoutez 120 ml de colorant d'ADN Fast Blast
1X dans votre plateau de coloration (2 gels par
plateau).
b. Laissez les gels se colorer pendant une nuit,
avec une agitation douce pour obtenir les
meilleurs résultats. Aucune décoloration n'est
nécessaire.
c. Le jour suivant, videz le colorant dans un
bécher à déchet.
d. Placez le gel sur un fond clair et enregistrez
votre résultat. Avec un marqueur permanent,
tracez les puits et les aspects des bandes sur
une feuille de plastique transparent ou une
feuille d'acétate.
e. Avec l'aide de votre enseignant, déterminez si
vous êtes homozygote ou hétérozygote pour
l'insertion de Alu.
f. Découpez tous les couloirs vides du gel avec
un couteau ou une lame de rasoir.
g. Pour obtenir un enregistrement permanent,
séchez à l'air le gel sur le film de support du
gel. Collez le gel séché dans votre cahier de
TP. Eviter toute exposition du gel coloré à
une lumière directe qui fera pâlir les bandes.
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