Amersham™ ECL Select™ Réactif de détection pour transfert de

Amersham™ ECL Select™ Réactif de détection pour transfert de
Amersham™
ECL Select™ Réactif de détection
pour transfert de type Western
Brochure du produit
Code : RPN2235
Sommaire
1. Mentions légales
4
2.Description
2.1 Úvod
2.2 Conception et caractéristiques
2.3 Compatibilité
5
5
6
6
3. 7
7
7
7
Informations importantes pour l'utilisateur
3.1 Domaine d'utilisation
3.2 Avis de sécurité
3.3 Contrôle qualité
4.Manipulation
4.1 Précautions de sécurité
4.2Stockage
4.3Péremption
8
8
8
8
5. Composants requis
5.1 Composants du kit
5.2Solutions
5.3Membrane
5.4 Réactifs de saturation
5.5Réactifs d'immunodétection
9
9
9
9
9
10
6. Optimisation du transfert de type Western
6.1 Marqueurs de masse moléculaire
6.2Membranes
6.3Transfert
6.4Saturation
6.5 Imageurs et films
6.6 Manuel du transfert de type Western
10
11
11
12
12
13
13
7.Protocole
14
7.1 Électrophorèse et transfert
15
7.2Saturation
7.3 Hybridation des anticorps
7.4 Gammes de dilution
7.5 Incubation de l'anticorps primaire
7.6 Incubation de l'anticorps secondaire
7.7 Incubation du pont streptavidine
7.8Détection
7.9 Analyse des images
7.10 Caméra CCD
7.11 Film radiographique
15
15
16
16
17
18
18
19
19
20
8. Informations supplémentaires
21
8.1 Décollement et réhybridation des membranes
21
8.2Détermination de la concentration optimale en anticorps22
8.3 Gammes de dilution
22
8.4 Optimisation de l'anticorps primaire
22
8.5 Optimisation de l'anticorps secondaire
24
9. Guide de dépannage
25
10. Produits connexes
10.1 Préparation de l'échantillon
10.2 Marqueurs de masse moléculaire
10.3 Équipement ou électrophorèse sur gel
10.4 Équipement de transfert
10.5 Équipement de buvardage
10.6 Agents de saturation
10.7 Anticorps secondaires ECL HRP- liés
10.8 Réactifs de détection
10.9 Anticorps ECL Plex CyDye conjugués
10.10 Films radiographiques
10.11 Systèmes d'imagerie
10.12 Logiciel et accessoires
27
28
28
29
31
31
32
33
34
34
35
35
35
3
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1. Mentions légales
GE, imagination at work et GE monogram sont des marques
commerciales de General Electric Company.
Amersham, ECL, ECL DualVue, ECL Select, ECL Prime, Hybond,
Hyperfilm, ImageQuant, Protran et Rainbow sont des marques
commerciales des entreprises GE Healthcare.
Amersham ECL Select est fabriqué et vendu sous licence Cyanagen
Srl et fait l'objet des demandes de brevets aux États-Unis, au
Canada et dans l'Union Européenne sous les numéros US7803573 ;
EP1962095 ; US7855287 ; EP1950207 US2012009603(A1) ;
CA2742025 ; EP2405016, ainsi que d'autres brevets délivrés et
demandes de brevets équivalents dans d'autres pays.
Tween est une marque commerciale de ICI Americas Inc.
© 2006-2014 General Electric Company – Tous droits réservés.
Première publication : février 2006
Tous les biens et les services sont vendus selon les conditions
générales de vente de l'entreprise de GE Healthcare qui les fournit.
Une copie des ces conditions générales est disponible sur demande.
Contactez votre représentant local GE Healthcare pour obtenir les
informations les plus récentes.
http://www.gelifesciences.com/ecl
GE Healthcare UK Limited.
Amersham Place, Little Chalfont,
Buckinghamshire, HP7 9NA UK
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2. Description
Amersham™ ECL Select™ Le réactif de détection pour transfert de
type Western de GE Healthcare apporte une sensibilité très élevée à la
détection par chimiluminescence des antigènes spécifiques immobilisés
conjugués à des anticorps marqués par la peroxydase de raifort (HRP).
2.1 Introduction
La chimiluminescence est définie comme une émission lumineuses
produite lors d'une réaction à étapes multiples dans laquelle
la peroxydase catalyse l'oxydation du luminol. En présence
d'amplificateurs chimiques et de catalyseurs, l'intensité du
rayonnement et la durée de l'émission lumineuse sont fortement
accrus par un processus appelé chimiluminescence améliorée
(ECL). L'ECL basée sur des anticorps secondaires conjugués à la
peroxydase de raifort (HRP) et une méthode de détection sensible
dans laquelle l'émission lumineuse est proportionnelle à la quantité
de protéine. La réaction à étapes multiples est présentée ci-dessous.
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2.2 Conception et caractéristiques
Le réactif de détection Amersham ECL Select est conçu pour fournir
une émission lumineuse très élevée. Cela signifie que des quantités
de protéines moyennes à très faibles (faibles concentrations, de
l'ordre du picogramme) peuvent être détectées à l'aide d'anticorps
hautement dilués. Ceci fait du Amersham ECL Select un produit
adapté aux transferts de type Western les plus exigeants en matière
de sensibilité. L'intensité élevée du signal peut totalement bénéficier
des avantages de l'équipement d'imagerie basé sur une caméra CCD
et fait de Amersham ECL Select un outil optimal de détection sur les
systèmes ImageQuant™ LAS de GE Healthcare. L'émission lumineuse
peut aussi être détectée à l'aide d'un film radiographique (gamme de
produits Amersham Hyperfilm™).
2.3 Compatibilité
Le réactif de détection Amersham ECL Select est compatible avec
les membranes en PVDF et en nitrocellulose (comme les gammes
de produits Amersham Hybond™ et Amersham Protran), l'agent de
saturation Amersham ECL Prime, l'agent de saturation Amersham
ECL et les autres agents de saturation couramment utilisés comme
le BSA et l'extrait sec dégraissé de lait.
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3. Informations importantes pour
l'utilisateur
3.1 Domaine d'utilisation
Le réactif de détection Amersham ECL Select est destiné à la détection
par chimiluminescence lors des transferts de type Western.
Le réactif de détection Amersham ECL Select est uniquement destiné
à la recherche et ne peut être utilisé dans le cadre d'interventions
cliniques ou à des fins de diagnostic.
3.2 Avis de sécurité
Cette documentation de l'utilisateur contient des MISES EN GARDE
concernant l'utilisation du réactif de détection Amersham ECL Select
en toute sécurité. Voir les définitions ci-dessous.
Mises en garde
MISE EN GARDE
MISE EN GARDE Indique une situation dangereuse qui,
si elle n'est pas évitée, pourrait provoquer des blessures
mineures ou modérées. Il est important de ne rien
entreprendre tant que toutes les conditions indiquées
ne sont pas remplies, ni clairement comprises.
3.3 Contrôle qualité
Le réactif de détection Amersham ECL Select est fabriqué conformément
à notre système de gestion de la qualité certifié ISO 9001 et il est
conforme aux critères d'acceptation définis pour le produit.
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4. Manipulation
4.1 Précautions de sécurité
MISE EN GARDE
Substances dangereuses. Lors de l'utilisation de produits
chimiques dangereux, prenez toutes les mesures de
protection convenables, comme le port de lunettes et de
gants de protection, résistants aux substances utilisées.
Respectez les réglementations locales et/ou nationales
pour un fonctionnement sûr.
Il est recommandé de lire la Fiche technique santé-sécurité (SDS)
avant utilisation Réactif de détection Amersham ECL Select.
4.2 Stockage
À réception, tous les composants doivent être conservés au
réfrigérateur entre 2 et 8 ºC. Le réactif de détection Amersham ECL
Select est sensible à une exposition prolongée à la lumière. Stockez
toujours les réactifs individuels dans les récipients étanches à la
lumière dans lesquels ils ont été fournis.
4.3 Péremption
Les composants sont stables pendant au moins 3 mois quand ils
sont stockés dans les conditions recommandées. Voir la date de
péremption inscrite sur le conditionnement.
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5. Composants requis
5.1 Composants du kit
Les composants suivants sont inclus dans le kit du réactif de détection
Amersham ECL Select.
Produit
Contenu
RPN2235
• Solution A : Solution de luminol, 50 ml.
• Solution B : Solution de peroxyde, 50 ml.
Suffisante pour 1000 cm2 de membrane
5.2 Solutions
Les solutions requises sont répertoriées ci-dessous.
• Tampon phosphate salin (PBS), pH 7,5
• Tampon Tris (PBS), pH 7,6
• Tampons de dilution et de lavage : PBS Tween™ (PBS-T) et TBS
Tween (TBS-T). Une concentration de 0,1 % de Tween 20 convient
à la plupart des applications de buvardage.
5.3 Membrane
Utilisez un protocole convenable pour séparer les protéines par
électrophorèse et les transférer vers une membrane en PVDF
ou en nitrocellulose.
5.4 Réactifs de saturation
Les réactifs de saturation sont en général dilués de 2 à 5 % (v/v) dans
un tampon PBS-T ou TBS-T. Les réactifs de saturation suivants sont
recommandés :
• Amersham ECL Prime Agent de saturation
• Amersham ECL Agent de saturation
• Extrait sec dégraissé de lait
• Albumine sérique bovine (BSA)
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5.5 Réactifs d'immunodétection
• Anticorps primaire spécifique de la(des) protéine(s) cible(s)
• Anticorps secondaire conjugué à la HRP spécifique de l'anticorps
primaire. Voir les anticorps secondaires liés à la HRP pour ECL, en page 33.
Diluez les anticorps dans du PBS-T ou du TBS-T selon les
recommandations de Gammes de dilution, en page 22.
6. Optimisation du transfert de type
Western
Introduction
Pour obtenir des résultats optimaux lors d'un transfert de type Western
avec un un rapport signal-bruit élevé et la meilleure sensibilité et linéarité
possible, il est important d'optimiser la méthode et de sélectionner les
produits compatibles.
Considérez les éléments suivants :
• Qualité de l'échantillon et quantité en chargement – Il est
important que l'échantillon soit de bonne qualité et que des niveaux
détectables de la protéine cible soient présents.
• Membrane et saturation – Sélectionnez des membranes et des
agents de saturation compatibles avec l'échantillon et les anticorps.
• Anticorps primaire et secondaire – Sélectionnez toujours des anticorps
spécifiques de grande qualité et optimisez la dilution de l'anticorps.
• Détection et imagerie – Sélectionnez le réactif de détection en
fonction des besoins de votre application. Un imageur CCD offre
une sensibilité élevée et une vaste plage dynamique, il permet une
meilleure quantification qu'un film radiographique.
Ce chapitre décrit les produits dont l'utilisation est recommandée avec
le réactif de détection Amersham ECL Select. Pour plus d'informations
concernant ces produits, consultez www.gelifesciences.com/ecl.
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6.1 Marqueurs de masse moléculaire
Les marqueurs de masse moléculaire sont utilisés pour déterminer
la taille des protéines. De plus, les marqueurs précolorés permettent
la confirmation du transfert et de l'orientation des protéines
(par le transfert des bandes colorées vers la membrane).
• Les marqueurs Amersham Rainbow™ sont des marqueurs
multicolores précolorés pour la surveillance de la progression de
l'électrophorèse des protéines, la confirmation de l'efficacité du transfert
et la détermination de la masse moléculaire des protéines transférées.
• Les marqueurs Amersham ECL DualVue™ sont optimisés pour une
utilisation avec Amersham ECL, Amersham ECL Prime et Amersham
ECL Select et contiennent une combinaison de marqueurs protéiques
marqués et pré-colorés. Ces marqueurs permettent la surveillance
de l'électrophorèse, la confirmation de l'efficacité du transfert et la
détermination de la masse moléculaire des protéines transférées
sans coloration sur le gel et la membrane, ainsi que la détection par
chimiluminescence.
6.2 Membranes
• Amersham Hybond est une membrane en PVDF dotée de capacité
de liaison aux protéines et d'une résistance mécanique élevées, qui
en font l'outil idéal pour les applications de transfert de type Western
quand décollement et réhybridation sont nécessaires. L'utilisation de
la membrane est optimale avec les réactifs de détection Amersham
ECL Prime et ECL Select.
• Amersham Protran est une membrane en nitrocellulose
compatible avec tous les substrats de transfert de type Western
chimiluminescents. Son principalement avantage réside dans son
arrière-plan normalement faible.
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6.3 Transfert
• Le transfert humide (Unité de transfert TE 22), est la méthode
de transfert la plus couramment utilisée. Elle permet le transfert
efficace de protéines petites ou grosses.
• Le transfert semi-humide (Unités de transfert TE 70 et TE 77)
est plus rapide que le transfert humide et consomme moins de
tampon. Le transfert semi-humide fonctionne bien pour la plupart
des protéines mais il peut être moins efficace pour les grosses
protéines. Il est susceptible d'avoir une sensibilité réduire pour les
très faibles abondances protéiques.
6.4 Saturation
Après transfert des protéines, la membrane doit être incubée dans
une solution de saturation pour empêcher la liaison non spécifique
d'anticorps, susceptible être responsable de l'apparition d'un arrièreplan et de bandes non spécifiques sur le buvard. L'agent de saturation
doit être optimisé pour obtenir les meilleurs résultats ; aucun agent de
saturation seul ne peut être optimal pour toutes les protéines et tous
les anticorps. GE Healthcare recommande les agents de saturation
suivants, compatibles avec Amersham ECL, Amersham ECL Prime
et Amersham ECL Select :
• Amersham ECL Prime Agent de saturation
• Amersham ECL Agent de saturation
• Agent de saturation BSA
• Extrait sec dégraissé de lait
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6.5 Imageurs et films
Les systèmes ImageQuant LAS sont des systèmes flexibles qui
couvrent une vaste gamme d'applications d'imagerie. Ces imageurs
basés sur des CCD constituent une option abordable pour la
détection des protéines avec de véritables avantages en matière
de quantification à haute sensibilité, données prêtes à la publication
et archivage des données.
ImageQuant LAS 500
La gamme de produits Amersham Hyperfilm est constituée de
produits faibles pour une détection par chimiluminescence sensible
et qualitative lors des transferts de type Western.
6.6 Manuel du transfert de type Western
Vous trouverez plus d'aide technique, de conseils et de bonnes
pratiques dans le manuel Principes et méthodes du transfert de type
Western de GE Healthcare (n° de code 28-9998-97).
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7. Protocole
Présentation du protocole
Ci-dessous une présentation du protocole de détection d'un transfert
de type Western.
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7.1 Électrophorèse et transfert
Étape Action
1. Effectuez l'électrophorèse et transférez les protéines vers une
membrane convenable selon les protocoles de transfert. Les
buvards peuvent être utilisés immédiatement ou conservés
dans du PBS-T ou du TBS-T entre 2 et 8 °C.
Remarque : La membrane Amersham Hybond doit
être mouillée au préalable de méthanol à 100 % avant
équilibration dans le tampon de transfert.
7.2 Saturation
Étape Action
1. Incubez la membrane dans une solution de saturation
convenable sur un agitateur orbital pendant 1 heure
à température ambiante ou toute une nuit entre 2 et 8 °C.
2. Rincez brièvement la membrane avec deux passages
de tampon de lavage.
Remarque : Pour la préparation du tampon de lavage, voir
Solutions, en page 9.
7.3 Hybridation de l'anticorps
Le réactif de détection Amersham ECL Select permet une émission
lumineuse très élevée et, de ce fait, des dilutions d'anticorps élevées. La
dilution optimale varie entre les anticorps selon leur affinité et leur qualité.
L'optimisation de la dilution de l'anticorps peut être réalisées par
analyse par transfert de taches (voir Détermination de la concentration
optimale en anticorps, en page 22).
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7.4 Gammes de dilution
Les gammes de dilution suivantes sont recommandées.
Anticorps
Gamme de dilution à partir d'une solution
mère à 1 mg/ml
Primaire
1:5000 - 1:30000
Secondaire
1:100000 - 1:300000
Le tableau ci-dessous présente des suggestions de dilutions de
départ d'anticorps primaires ayant des niveaux d'affinité différents.
Type d'anticorps
Anticorps primaire
dilution
Anticorps secondaire
dilution
Anticorps primaires
ayant une affinité
élevée
1:10000
1:150000
Anticorps primaires
ayant une affinité
moyenne à faible
1:5000
1:100000
7.5 Incubation de l'anticorps primaire
Étape Action
1. Diluez l'anticorps primaire dans du PBS-T ou du TBS-T.
2.Incubez la membrane dans la solution d'anticorps primaire
sur un agitateur orbital pendant 1 heure à température
ambiante ou toute une nuit entre 2 et 8 °C.
3.Rincez brièvement la membrane avec deux passages
de tampon de lavage.
4.Lavez la membrane à 4 ou 6 reprises pendant 5 minutes
dans du tampon de lavage à température ambiante sur un
agitateur orbital.
Remarque : L'exposition au film radiographique nécessite
6 étapes de lavage, pour éviter l'arrière-plan.
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7.6 Incubation de l'anticorps secondaire
Étape Action
Remarques
1.
Diluez l'anticorps
secondaire (anticorps
biotinylé ou conjugué
à la HRP) dans du
PBS-T ou du TBS-T.
Augmentez l'émission lumineuse
en construisant un sandwich
à trois couches à l'aide d'anticorps
secondaires biotinylés et de
streptavidine conjuguées à la HRP.
2.Incubez la membrane
dans la solution
d'anticorps secondaire
pendant 1 heure à
température ambiante
sur un agitateur orbital.
3.Rincez brièvement la
membrane avec deux
passages de tampon
de lavage.
4.
Lavez la membrane
à 4 ou 6 reprises
pendant 5 minutes dans
du tampon de lavage
à température ambiante
sur un agitateur orbital.
L 'exposition au film nécessite
6 étapes de lavage, pour éviter
l'arrière-plan.
En cas d'utilisation d'un anticorps secondaire conjugué à la HRP,
passez directement à l'étape de Détection, en page 18.
En cas d'utilisation d'un anticorps biotinylé, passez au protocole
d'incubationdu pont streptavidine au verso.
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7.7 Incubation du pont streptavidine
Étape Action
1. Diluez le conjugué Streptavidine-HRP ou le complexe
Streptavidine biotinylée-HRP dans du PBS-T ou du TBS-T.
2. Incubez la membrane dans la solution diluée pendant 1
heure à température ambiante sur un agitateur orbital.
3. Rincez brièvement la membrane avec deux passages
de tampon de lavage.
4. L avez la membrane en la remettant en suspension dans une
quantité de tampon de lavage suffisante pour recouvrir la
membrane et agitez pendant 5 minutes à température ambiante.
Renouvelez le tampon de lavage à 4 ou 6 reprises, au minimum.
7.8 Détection
Étape Action
1. Laissez les solutions de détection s'équilibrer à température
ambiante pendant 20 min.
2. Mélangez les solutions de détection A (luminol) et B (peroxyde) dans
un rapport de 1:1 pour donner une solution de travail. Le volume
final de réactif de détection requis est de 0,1 ml/cm2 de membrane.
Remarque : Si le réactif mélangé n'est pas utilisé immédiatement,
tenez-le à l'abri de l'exposition à la lumière en l'enveloppant dans
une feuille ou en le conservant dans un lieu sombre.
3. Éliminez le tampon de lavage en excès de la membrane lavée
et placez-la, côté protéines orienté vers le haut, dans une boîte
appropriée ou sur un feuillet de film en plastique ou toute autre
surface propre convenable. Ajoutez le réactif de détection sur la
membrane et vérifiez qu'il la recouvre complètement.
4. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
5. Éliminez le tampon de détection en excès en tenant
délicatement la membrane par les bords contre un tissu.
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7.9 Analyse de l'image
Deux protocoles d'analyse d'image sont décrits, un pour l'imagerie
fondée sur la caméra CCD et l'autre employant un film radiographique.
7.10 Caméra CCD
Étape Action
Remarques
1.
Placez le buvardage,
côté protéines orienté
ver le haut, sur un
plateau d'échantillons.
Le buvardage peut être placé
sur un pièce de film plastique,
côté protéines orienté vers
le haut, afin de faciliter un
déplacement facile du film
sur le plateau d'échantillons.
2.
Placez le plateau
d'échantillons dans
le compartiment de
la caméra CCD et
sélectionnez une durée
d'exposition et/ou
fonction convenable.
Utilisez la fonction d’exposition
automatique ou sélectionnez
manuellement la durée
d’exposition. Le durée
d’exposition de démarrage
recommandée est de 60
secondes. Augmentez ou
diminuez la durée d’exposition
en fonction de l’intensité du
signal obtenu.
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7.11 Film radiographique
Étape Action
Remarques
1.
Placez le buvardage,
côté protéines orienté
vers le haut, sur un
pièce de film plastique
neuve, enveloppez les
buvardages et éliminez
délicatement toutes les
bulles d'air.
2.
Placez le buvardage
enveloppé, côté
protéines orienté vers le
haut, dans une cassette
de film radiographique.
Vérifiez l'absence de réactif de
détection libre dans la cassette,
le film ne doit pas être mouillé.
3.
Placez un feuillet de film
radiographique (gamme
de produits Amersham
Hyperfilm) au-dessus
de la membrane.
Fermez la cassette et
procédez à l'exposition.
Le délai d'exposition de
démarrage convenable
est de 1 minute.
Cette étape doit être réalisée
dans une pièce sombre à l'aide
de lampes inactiniques rouges.
Ne pas déplacer le film pendant
l'exposition.
4.
Développez le film
immédiatement et, sur
la base de l'intensité du
signal obtenu, estimez la
durée d'exposition pour un
deuxième feuillet de film.
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8. Informations supplémentaires
8.1 Décollement et réhybridation des
membranes
L'élimination complète des anticorps primaire et secondaire de la
membrane est possible en suivant le protocole indiqué ci-dessous. Les
membranes peuvent être décollées et réhybridées à plusieurs reprises.
Étape Action
Remarques
1.
lacez la membrane dans
P
le tampon de décollement
(2-mercaptoéthanol 100 mM,
SDS 2 %, Tris-HCl 62,5 mM,
pH 6,7 ) et incubez à 50 °C
pendant 30 minutes avec
une agitation ponctuelle.
Si des conditions plus exigeantes
sont nécessaires, l'incubation
peut être réalisée à 70 °C ou
pendant une durée prolongée.
2.
L avez la membrane
pendant 3 à × 10 minutes
dans du PBS-T ou du TBS-T
à température ambiante
avec de grands volumes
de tampon de lavage.
La membrane peut être
utilisée immédiatement ou
conservée dans du PBS-T ou
du TBS-T entre 2 et 8 °C.
Les membranes peuvent être
incubées avec le réactif de
détection Amersham ECL Select
et exposées au film afin de
s'assurer de l'élimination des
anticorps.
3.
loquez la membrane dans
B
une solution de saturation
convenable pendant 1 heure
à température ambiante.
4.
Répétez le protocole
d'immunodétection du
Chapitre 7, Protocole
d'hybridation de l'anticorps
pour analyse des images.
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8.2 Détermination de la concentration
optimale en anticorps
En raison de l'intensité élevée du signal du réactif de détection
Amersham ECL Select, l'optimisation des concentrations en anticorps
est recommandée afin de garantir les meilleurs résultats. En général, des
anticorps primaire et secondaire extrêmement dilués sont nécessaires
avec le réactif de détection Amersham ECL Select par rapport aux
substrats chimiluminescents standard. Les protocoles de déterminations
des concentrations optimales en anticorps sont indiqués ci-dessous.
8.3 Gammes de dilution
Les gammes de dilution suivantes sont recommandées :
Anticorps
Gamme de dilution à partir d'une solution mère à 1 mg/ml
Primaire
1:5000 - 1:30000
Secondaire
1:100000 - 1:300000
8.4 Optimisation de l'anticorps primaire
Le transfert de taches constitue une méthode rapide et efficace de
détermination de la dilution optimale d'une anticorps primaire de
concentration inconnue. Sinon, un transfert de type Western peut
être préparé et découpé en plusieurs bandes. Il faut remarquer que
certains anticorps peuvent nécessiter des étapes de saturation et de
lavage en sus de celles qui sont suggérées ci-dessous.
Étape Action
1. Déposez différentes quantités de l'échantillon protéique, de
préférence selon une série de dilutions, sur une membrane
en PVF ou en nitrocellulose et laissez sécher à l'air libre.
Sinon, utilisez un collecteur de transfert de taches ou de
transfert dans des puits. Réalisez une série d'échantillons
pour chaque dilution à tester. Remarque : Les membranes en
PVDF doivent être mouillées au préalable de méthanol.
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Étape Action
2. Incubez dans la solution de saturation pendant 1 heure
à température ambiante sous agitation.
3. Rincez brièvement les membranes avec deux passages
de tampon de lavage.
4. Découpez la membrane pour obtenir chaque série
d'échantillons sur une bande de membrane distincte.
5. Préparez différentes solutions d'anticorps primaire dans
la gamme recommandée. Incubez chaque bande de
membrane dans la solution d'anticorps pendant 1 heure
à température ambiante sous agitation.
6. incez brièvement la membrane avec deux passages
R
de tampon de lavage. Lavez la membrane par remise en
suspension dans du tampon de lavage et agitez pendant
5 minutes à température ambiante. Renouvelez le tampon
de lavage à 4 ou 6 reprises au moins.
7. Diluez l'anticorps secondaire (en utilisant une seule
concentration) et incubez les membranes pendant 1 heure
à température ambiante sous agitation.
8. Rincez les taches par deux passages de tampon de lavage, puis
lavez à 4 à 6 reprises par passage de tampon de lavage frais.
9. Détectez à l'aide du réactif de détection Amersham ECL
Select détaillé dans Détection, en page 18 du protocole.
La dilution d'anticorps qui donne le meilleur signal avec
l'arrière-plan minimum doit être sélectionnée.
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8.5 Optimisation de l'anticorps secondaire
Étape Action
1. éposez différentes quantités de l'échantillon protéique,
D
de préférence selon une série de dilutions, sur une membrane
en PVF ou en nitrocellulose et laissez sécher à l'air libre. Sinon,
utilisez un collecteur de transfert de taches ou de transfert dans
des puits. Réalisez une série d'échantillons pour chaque dilution
à tester. Remarque : Les membranes en PVDF doivent être
mouillées au préalable de méthanol.
2. Incubez dans la solution de saturation pendant 1 heure
à température ambiante sous agitation.
3. Incubez dans la solution d'anticorps primaire dilué
(concentration optimisée) pendant 1 heure à température
ambiante sous agitation.
4. incez brièvement la membrane avec deux passages
R
de tampon de lavage. Lavez la membrane par remise
en suspension dans du tampon de lavage et agitez pendant
5 minutes à température ambiante. Renouvelez le tampon
de lavage à 4 ou 6 reprises au moins.
5. Découpez la membrane pour obtenir chaque série
d'échantillons sur une bande de membrane distincte.
6. Préparez différentes solutions d'anticorps secondaire
dans la gamme recommandée. Incubez chaque bande de
membrane dans la solution d'anticorps pendant 1 heure
à température ambiante sous agitation.
7. Rincez brièvement la membrane avec deux passages
de tampon de lavage. Lavez la membrane par remise en
suspension dans du tampon de lavage et agitez pendant
5 minutes à température ambiante. Renouvelez le tampon
de lavage à 4 ou 6 reprises au moins.
8. Détectez à l'aide du réactif de détection Amersham ECL
Select détaillé dans Détection, en page 18 du protocole. La
dilution d'anticorps qui donne le meilleur signal avec l'arrièreplan minimum doit être sélectionnée.
24
29-0142-86 AB 01-2014
9. Guide de dépannage
Problèmes
Pas de
signal
Causes possibles / Solutions
• Quantités non détectables de la protéine cible.
• L'anticorps primaire ne se lie pas à la protéine
cible, ce qui peut être dû à un anticorps primaire
de mauvaise qualité et/ou non spécifique.
• Une espèce incorrecte d'anticorps secondaire
a été utilisée.
• La membrane en PVDF n' pas été mouillée
au préalable de méthanol.
• Vérifiez que l'équipement de transfert fonctionne
correctement et que la procédure correcte a été
suivie.
• Vérifiez le transfert de la protéine en colorant
la membrane et/ou le gel.
• Confirmez l'efficacité du transfert à l'aide d'un
marqueur Rainbow précoloré.
• Certaines protéines peuvent être affectées par
les traitements nécessaires à l'électrophorèse.
• Les réactifs de détection ne fonctionnent pas
correctement.
- Pour tester l'activité du réactif de détection, dans
une chambre noire, préparez 1 à 2 ml de solution
de travail du réactif de détection dans un tube
à essai transparent. Ajoutez 1 μl de solution
d'anticorps conjugué à la HRP non diluée.
La solution doit émettre immédiatement une
lumière visible bleue qui s'atténue au cours des
minutes suivantes.
• Une conservation incorrecte du réactif de détection
Amersham ECL Select peut causer une perte du
signal. Une croissance bactérienne inhibe le réactif.
25
29-0142-86 AB 01-2014
Problèmes
Signal
faible
Causes possibles / Solutions
• L'efficacité du transfert peut avoir été mauvaise.
• Une quantité insuffisante de protéine a été chargée
sur le gel.
• La concentration des anticorps primaire et
secondaires peut être trop faible, une optimisation
est nécessaire.
• Anticorps primaire de mauvaise qualité et/ou non
spécifique.
• La durée d'exposition peut avoir été trop courte.
Signal
excessif,
diffus
• Une quantité trop importante de protéine a été
chargée sur le gel.
Bandes
blanches
(négatives)
sur le film
• En général, des bandes négatives se produisent
quand la cible protéique est en quantité excessive
et que les concentrations en anticorps sont trop
élevées. Cet effet est dû à une déplétion du substrat.
- Chargez des quantités moindres de protéine.
- Diluez plus les anticorps primaire et secondaire.
• La concentration des anticorps primaire
et secondaires peut être trop élevée, une
optimisation est nécessaire.
Arrière-plan • Les zones de taches peuvent avoir séché pendant
tacheté,
certaines incubations.
irrégulier
• Une manipulation incorrecte peut conduire à la
contamination des taches et/ou endommager la
membrane ce qui peut provoquer un signal non
spécifique.
• L'agent de saturation n'est pas complètement
dissous dans le tampon.
• Lavage insuffisant.
- Ajoutez des étapes de lavage supplémentaires.
26
29-0142-86 AB 01-2014
Problèmes
Causes possibles / Solutions
Arrière-plans
importants
• Concentrations trop élevées d'anticorps
primaire et secondaire ; une optimisation
est nécessaire.
• Lavage insuffisant.
- Utilisez une quantité suffisante de tampon
de lavage et ajoutez des étapes de lavage
supplémentaires.
• Les tampons de transfert et d'incubation peuvent
avoir été contaminés et doivent être remplacés.
- Utilisez toujours des solutions fraîches
• Saturation insuffisante.
• L'agent de saturation utilisé n'était pas
fraîchement préparé ou était trop dilué ou était
incompatible avec l'application.
• La concentration en Tween utilisée dans
l'agent de saturation n'était pas suffisante pour
l'application réalisée.
• La membrane a pu sécher pendant certaines
des incubations.
• Mauvaise qualité du gel.
• Anticorps non spécifiques et de mauvaise qualité.
• Le film de détection du signal a été surexposé.
• Le niveau du signal est si élevé que le film a été
totalement surchargé.
• Produits non compatibles.
10. Produits connexes
Ce chapitre présente un sous-ensemble de produits connexes.
Pour plus d'informations, consultez www.gelifesciences.com/ecl.
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10.1 Préparation de l'échantillon
Quantité
N° de code
Kit de nettoyage SDS-PAGE
Produit
50 échantillons
80-6484-70
Tampon d'extraction des
protéines de mammifères
1 × 500 ml
28-9412-79
500 dosages
80-6483-56
Kit Quant 2-D
10.2 Marqueurs de masse moléculaire
Produit
Quantité
N° de code
Marqueurs de masse
moléculaire Amersham
Gamme basse Rainbow
250 μl
RPN755E
Marqueurs de masse
moléculaire Amersham
Gamme haute Rainbow
250 μl
RPN756E
Marqueurs de masse
moléculaire Amersham
Gamme complète
Rainbow
250 μl
RPN800E
1 boîte
(25 chargements)
RPN810
120 μl
RPN850E
500 μl
RPN851E
Marqueurs pour transferts
de type Western
Amersham ECL DualVue
Marqueurs Amersham
ECL Plex™ fluorescents
Rainbow
Marqueurs Amersham ECL
Plex fluorescents Rainbow
28
29-0142-86 AB 01-2014
10.3 Équipement pour électrophorèse sur gel
Produit
Quantité
N° de code
Boîte de gel Amersham
ECL
1
28-9906-08
Gel Amersham ECL
10 %, 10 puits
10
28-9898-04
Gel Amersham ECL
12 %, 10 puits
10
28-9898-05
Gel Amersham ECL
4-12 %, 10 puits
10
28-9898-06
Gel Amersham ECL
8-16 %, 10 puits
10
28-9898-07
Gel Amersham ECL
4-20 %, 10 puits
10
28-9901-54
Gel Amersham ECL
10 %, 15 puits
10
28-9901-55
Gel Amersham ECL
12 %, 15 puits
10
28-9901-56
Gel Amersham ECL
4-12 %, 15 puits
10
28-9901-57
Gel Amersham ECL
8-16 %, 15 puits
10
28-9901-58
Gel Amersham ECL
4-20 %, 15 puits
10
28-9901-59
Gel Amersham ECL
10 %, 2 puits
10
28-9901-60
Gel Amersham ECL
12 %, 2 puits
10
28-9901-61
Électrophorèse sur gel
29
29-0142-86 AB 01-2014
Produit
Quantité
N° de code
Gel Amersham ECL
4-12 %, 2 puits
10
28-9901-62
Gel Amersham ECL
8-16 %, 2 puits
10
28-9901-63
Gel Amersham ECL
4-20 %, 2 puits
10
28-9901-64
Gel Amersham ECL
10 %, 10 puits
2
28-9898-08
Gel Amersham ECL
12 %, 10 puits
2
28-9898-09
Gel Amersham ECL
4-12 %, 10 puits
2
28-9901-51
Amersham ECL Gel
8-16 %, 10 puits
2
28-9901-52
Gel Amersham ECL
4-20 %, 10 puits
2
28-9901-53
Alimentation électrique
EPS 301
1
18-1130-01
Alimentation électrique
EPS 2A201
1
28-9202-14
Électrophorèse sur gel
Alimentations électriques
30
29-0142-86 AB 01-2014
10.4 Équipement de transfert
Produit
Quantité
N° de code
Unités de transfert de réservoir
Unité de transfert de mini
réservoir TE 22
1
80-6204-26
Unité de transfert semi-sec
TE 70, 14x16 cm
1
80-6210-34
Unité de transfert semi-sec
TE 70 PWR, 14x16 cm1
1
11-0013-41
Unité de transfert semi-sec
TE 77, 21x16 cm
1
80-6211-86
Unité de transfert semi-sec
TE 77 PWR, 21x16 cm
1
11-0013-42
Buvards semi-secs ECL
10.5 Équipement de buvardage
Produit
Quantité
N° de code
Papier de buvardage
Hybond (20×20 cm)
100 feuilles
RPN6101M
3MM Chr 20×20 cm
100 feuilles
3030-861
Papier de buvardage
31
29-0142-86 AB 01-2014
Produit
Quantité
N° de code
0,2 NC supportées Amersham
Protran (20×20 cm)
25 feuilles
10600053
0,2 NC supportées Amersham
Protran (8×9 cm)
25 feuilles
10600099
Amersham Hybond LFP 0,2 PVDF
(20×20 cm)
10 feuilles
10600060
LFP 0,2 PVDF Amersham Hybond
(8×9 cm)
25 feuilles
10600102
0,2 PVDF Amersham Hybond
(20×20 cm)
25 feuilles
10600057
0,2 PVDF Amersham Hybond
(8×9 cm)
25 feuilles
10600101
Membranes
10.6 Agents de saturation
Produit
Quantité
N° de code
Amersham ECL Agent
de saturation
40 g
RPN2125
Amersham ECL Prime
Agent de saturation
40 g
RPN418
32
29-0142-86 AB 01-2014
10.7 Anticorps secondaires liés à la HRP
Amersham ECL
Produit
Quantité
N° de code
IgG de souris Amersham ECL,
anticorps totaux (de mouton)
liés à la HRP
1 ml
NA931-1ML
Amersham IgG humaines ECL,
anticorps totaux (de mouton)
liés à la HRP
1 ml
NA933-1ML
Amersham IgG de lapin ECL,
anticorps totaux (de singe)
liés à la HRP
1 ml
NA934-1ML
Amersham IgG de souris ECL,
fragment F(ab)2 (de mouton)
lié à la HRP
1 ml
NA9310-1ML
Amersham IgG de lapin ECL,
fragment F(ab)2 (de singe)
lié à la HRP
1 ml
NA9340-1ML
Amersham IgG-Cy2 ECL Plex™
de chèvre-α-souris
150 μg
28-9011-08
Amersham IgG-Cy2 ECL Plex
de chèvre-α-lapin
150 μg
28-9011-10
Amersham IgG-Cy3 ECL Plex
de chèvre-α-lapin
150 μg
28-9011-06
Amersham IgG-Cy3 ECL Plex
de chèvre--souris
150 μg
PA43009
Amersham IgG-Cy5 ECL Plex
chèvre--lapin
150 μg
PA45011
Amersham IgG-Cy5 ECL Plex
chèvre--souris
150 μg
PA45010
33
29-0142-86 AB 01-2014
10.8 Réactifs de détection
Quantité
N° de code
Réactif de détection
Amersham ECL Select pour
transfert de type Western
Produit
pour 1000 cm2
RPN2235
Réactif de détection
Amersham ECL Prime pour
transfert de type Western
pour 1000 cm2
RPN2232
Réactifs de détection
Amersham ECL pour
transfert de type Western
pour 1000 cm2
RPN2109
Réactifs de détection
Amersham ECL pour
transfert de type Western
pour 4000 cm2
RPN2106
Réactifs de détection
Amersham ECL pour
transfert de type Western
pour 6000 cm2
RPN2134
10.9 Anticorps conjugués ECL Plex CyDye
Produit
Quantité
N° de code
Pack combiné Amersham ECL Plex
pour transfert de type Western
(Cy3, Cy5, Hybond ECL)
1
RPN998
Pack combiné Amersham ECL Plex
pour transfert de type Western
(Cy3, Cy5, Hybond LFP) pour deux
plaques de gel
1
RPN999
34
29-0142-86 AB 01-2014
10.10 Films radiographiques
Produit
Quantité
N° de code
Amersham Hyperfilm
ECL (5×7 po)
50 feuilles
28-9068-35
Amersham Hyperfilm
ECL (18×24 cm)
50 feuilles
28-9068-36
Amersham Hyperfilm
ECL (8×10 po)
50 feuilles
28-9068-38
10.11 Systèmes d'imagerie
Produit
ImageQuant LAS 500
Quantité
N° de code
1
29-0050-63
10.12 Logiciel et accessoires
Produit
Quantité
N° de code
CD et Guide de démarrage :
Progiciels ImageQuant TL
et IQTL SecurITy (avec
Guide de démarrage)
28-9380-94
Licences pour ImageQuant TL uniquement :
ImageQuant TL, licence
utilisateur unique
28-9236-62
Licences pour ImageQuant TL et IQTL SecurITy :
ImageQuant TL et
ImageQuant TL SecurITy
1 utilisateur
28-9332-73
35
29-0142-86 AB 01-2014
GE Healthcare offices:
GE Healthcare Bio-Sciences AB
Björkgatan 30, 751 84
Uppsala
Sweden
GE Healthcare Europe GmbH
Munzinger Strasse 5 D-79111
Freiburg
Germany
GE Healthcare Bio-Sciences Corp.
800 Centennial Avenue
P.O. Box 1327
Piscataway,
NJ 08855-1327
USA
GE Healthcare Japan Corporation
Sanken Bldg. 3-25-1
Hyakunincho Shinjuku-ku
Tokyo 169-0073
Japan
Pour obtenir des informations sur les personnes à contacter en cas de besoin,
consultez le site
www.gelifesciences.com/contact
GE Healthcare UK Limited
Amersham Place
Little Chalfont, Buckinghamshire,
HP7 9NA, UK
http://www.gelifesciences.com
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