IFU013_HLA SBT Kit IFU-EU ES

IFU013_HLA SBT Kit IFU-EU ES
Instrucciones de Uso
PCR la Amplificación y Secuenciación de HLA Loci Clase I y II
Versión No: 15.0
Fecha de emisión: Agosto 2015
EC
Conexio Genomics Pty Ltd
2/49 Buckingham Dr
Wangara 6065
Western Australia
Australia
REP
Qarad bvba
Cipalstraat 3
B-2440 Geel
Bélgica
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Índice
Principio ....................................................................................................................................3
Uso previsto ...............................................................................................................................3
Composición del kit ..................................................................................................................4
Condiciones de almacenaje ......................................................................................................8
Materiales, Reactivos y Equipos No Suministrados ..............................................................8
Condiciones de la muestra .......................................................................................................9
Advertencias y precauciones de seguridad...........................................................................10
Símbolos ..................................................................................................................................10
Procedimiento .........................................................................................................................11
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
PCR .......................................................................................................................................................... 11
ELECTROFORESIS CON GEL DE AGAROSA .................................................................................................... 12
PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO PCR ........................................................................................................... 12
REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN ................................................................................................................... 13
PURIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LA REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN .................................................... 15
DESNATURALIZACIÓN & ELECTROFORESIS DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN ................ 15
EDICIÓN Y ANÁLISIS DE LOS ELECTROFEROGRAMAS ................................................................................... 16
Características del desempeño ..............................................................................................17
EXACTITUD .......................................................................................................................................................... 17
LÍMITE DE DETECCIÓN .......................................................................................................................................... 18
ESPECIFICIDAD ..................................................................................................................................................... 18
Limitaciones y advertencias...................................................................................................19
Licencia....................................................................................................................................19
Referencias bibliográficas ......................................................................................................19
Resolución de problemas .......................................................................................................20
Productos relacionados ..........................................................................................................23
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Principio
El procedimiento de tipificación de HLA basado en secuenciación (SBT) descrito aquí, fue
desarrollado originalmente por D. Sayer en 20011 y evolucionó a un ensayo de un solo tubo
en 20042. El procedimiento comprende una amplificación inicial de la secuencia diana
seguida de un tratamiento enzimático para eliminar los cebadores no incorporados y dNTP.
Luego se utiliza el amplicón como plantilla para secuenciación fluorescente automatizada
directa, con cebadores de ADN de secuenciación específicos y la química de secuenciación
Big Dye® Terminador disponible en Applied Biosystems™ de Life Technologies™. Los
productos de extensión se purifican de acuerdo con el método de precipitación con etanol y se
desnaturalizan con Hi-Di™ formamida disponible en Applied Biosystems™ en Life
Technologies™, antes de la separación y detección en un secuenciador de fluorescencia
automático para ADN. Se recomienda que los datos resultantes sean analizados con el
software de análisis de secuencias Assign™ SBT de Conexio Genomics Pty Ltd3-5.
Uso previsto
Los kits Conexio Genomics’ SBT Resolver™ HLA SBT se utilizan para la tipificación de
genes HLA Clase I (HLA-A, -B, y -C) y Clase II (HLA-DRB1, -DQB1 y -DPB1) en un
laboratorio de ADN genómico. Cada kit contiene reactivos que facilitan la amplificación por
PCR y la secuenciación de ADN de un gen dado. Los datos resultantes de la secuenciación se
interpreta utilizando el software Conexio Genomics’ Assign™ SBT. Debe hacerse notar que
estos kits SBT no son utilizados para diagnosticar enfermedades.
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Composición del kit
Kit
Contenido† PRE-PCR
(No de viales)
No de Catálogo
Contenido POST-PCR
(No de viales)
Clase I
HLA-A
XH-PD1.1-2(20)
XH-PD1.1-2(50)
HLA-B
BS-PD2.1-2(20)
20
pruebas
50
pruebas
20
pruebas
DNA POL- HLA-A
1 x 25L
AEX1F
AEX1R
HLA-A MIX
1 x 352L
AEX2F
AEX2R
AEX3F
AEX3R
AEX4F
AEX4R
DNA POL- HLA-A
1 x 60L
AEX1F
AEX1R
HLA-A MIX
1 x 880L
AEX2F
AEX2R
AEX3F
AEX3R
AEX4F
AEX4R
DNA POL- HLA-B
1 x 25L
BEX1F
BEX2F
HLA-B MIX
1 x 352L
BEX2R
BEX3F
BEX3R
BEX4F
1 x 44L c/u
1 x 110L c/u
1 x 44L c/u
BEX4R
BS-PD2.1-2(50)
50
pruebas
DNA POL- HLA-B
1 x 60L
BEX1F
BEX2F
HLA-B MIX
1 x 880L
BEX2R
BEX3F
BEX3R
BEX4F
1 x 110L c/u
BEX4R
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Kit
No de Catálogo
HLA-C
HH-PD 3.2-2(20)
Contenido† PRE-PCR
(No de viales)
20
pruebas
Contenido POST-PCR
(No de viales)
DNA POL- HLA-C
1 x 25L
CEX1F
CEX1R
HLA-C MIX
1 x 352L
CEX2F
CEX2R
CEX3F
CEX3R
CEX4F
CEX4R
CEX5F
CEX5R
CEX6F
CEX6R
1 x 44L c/u
CEX7F
HH-PD 3.2-2(50)
50
pruebas
DNA POL-HLA-C
1 x 60L
CEX1F
CEX1R
HLA-C MIX
1 x 880L
CEX2F
CEX2R
CEX3F
CEX3R
CEX4F
CEX4R
CEX5F
CEX5R
CEX6F
CEX6R
1 x 110L c/u
CEX7F
Clase II
HLA-DRB1
HH-PD5.2-5(20)
20
pruebas
DNA POL- DRB1
1 x 10L
DRB1EX2F
DRB1EX2R-2
HLA-DRB1 MIX
1 x 370L
DRB1EX3R-2
RB-TG344-R
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1 x 44L c/u
SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Kit
Contenido† PRE-PCR
(No de viales)
No de Catálogo
HH-PD5.2-5(50)
LG-PD5.2-7(20)
50
pruebas
20
pruebas
Contenido POST-PCR
(No de viales)
DNA POL- DRB1
1 x 20L
DRB1EX2F
DRB1EX2R-2
HLA-DRB1 MIX
1 x 920L
DRB1EX3R-2
RB-TG344-R
DNA POL – DRB1
1 x 10L
DRB1EX2F
DRB1EX2R-2
HLA-DRB1 MIX
1 x 370L
DRB1EX3F-7
DRB1EX3R-7
1 x 110L c/u
1 x 44L c/u
RB-TG344-R
LG-PD5.2-7(50)
50
pruebas
DNA POL – DRB1
1 x 20L
DRB1EX2F
DRB1EX2R-2
HLA-DRB1 MIX
1 x 920L
DRB1EX3F-7
DRB1EX3R-7
1 x 110L c/u
RB-TG344-R
HLA-DQB1
PQ-PD6.2-2(20)
PQ-PD6.2-2(50)
AN-PD6.2-3 (20)
AN-PD6.2-3 (50)
20
pruebas
50
pruebas
20
pruebas
50
pruebas
DNA POL- DQB1
1 x 10L
DQB1EX2F
DQB1EX2R
HLA-DQB1 MIX
1 x 370L
DQB1EX3F
DQB1EX3R
DNA POL- DQB1
1 x 20L
DQB1EX2F
DQB1EX2R
HLA-DQB1 MIX
1 x 920L
DQB1EX3F
DQB1EX3R
DQB1EX3R
DNA POL- DQB1
1 x 10L
DQB1EX2F
DQB1EX2R-3
HLA-DQB1 MIX
1 x 370L
DQB1EX3F
DQB1EX3R
1 x 20L
DQB1EX2F
DQB1EX2R-3
1 x 920L
DQB1EX3F
DQB1EX3R
DNA POL- DQB1
HLA-DQB1 MIX
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1 x 44L c/u
1 x 110L c/u
1 x 44L c/u
1 x 110L c/u
SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Kit
No de Catálogo
HLA-DPB1
HH-PD10.1(20)
HH-PD10.1(50)
KD-PD10.2-1(20)
Contenido† PRE-PCR
(No de viales)
20
pruebas
50
pruebas
20
pruebas
DNA POL – DPB1
1 x 10L
HLA-DPB1 MIX
1 x 370L
DNA POL – DPB1
1 x 20L
HLA-DPB1 MIX
1 x 920L
DNA POL – DPB1
1 x 10L
HLA-DPB1 MIX
1 x 370L
Contenido POST-PCR
(No de viales)
DPB1EX2F
DPB1EX2R
1 x 44L c/u
DPB1EX2F
DPB1EX2R
1 x 110L c/u
DPB1EX1F
DPB1EX1R
1 x 44L c/u
DPB1EX2F
DPB1EX2R
DPB1EX3F
DPB1EX3R
DPB1EX4F
DPB1EX4R
DPB1EX5F
DPB1EX5R
PB-AG341-R
KD-PD10.2-1(50)
50
pruebas
DNA POL – DPB1
1 x 20L
DPB1EX1F
DPB1EX1R
HLA-DPB1 MIX
1 x 920L
DPB1EX2F
DPB1EX2R
DPB1EX3F
DPB1EX3R
DPB1EX4F
DPB1EX4R
DPB1EX5F
DPB1EX5R
1 x 110L c/u
PB-AG341-R
†
El kit PRE-PCR contiene un vial con una mezcla PCR locus específica (p. ej.
HLA-A MIX
cebadores PCR locus específico, junto con un vial único de ADN polimerasa (p. ej.
El kit POST-PCR contiene cebadores para secuenciación (p. ej.
AEX1F
) que consiste en un tampón PCR, dNTP, MgCl2, y
DNA POL- HLA-A
).
).
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Para diagnóstico in vitro
Condiciones de almacenaje
Las cajas PRE- y POST-PCR se pueden separar y conservarse en congeladores designados
PRE- y POST-PCR. Cuando se almacenan a -20C (rango de temperatura de -15C a -25C es
aceptable), los componentes del kit se pueden utilizar hasta la fecha de caducidad indicada en
los envases externos del kit y pueden tolerar hasta 25 ciclos de congelamiento y
descongelamiento.
Pruebas aceleradas de estabilidad para los kits de HLA-A, -B, -C, –DRB1, -DQB1 y –DPB1
indicaron una vida útil de dos años y medio desde la fecha de fabricación al ser almacenados
a -20°C. Mientras se están llevando a cabo pruebas confirmatorias en tiempo real, se
recomienda insistentemente NO utilizar estos kits más allá de su fecha de caducidad.
Para mantener el desempeño óptimo del kit, se deben sacar los componentes del kit del
almacenaje a -20C y se deben descongelar rápidamente a temperatura ambiente antes de
utilizarlos. Los componentes del kit con la excepción de la polimerasa se deben agitar
suavemente en un vortex para asegurar que los componentes de cada tubo se mezclen
adecuadamente después de descongelar. Después de usarlo, el kit/los componentes deben
devolverse inmediatamente al almacenaje a -20C.
Materiales, Reactivos y Equipos No Suministrados
PCR
1.
Agua estéril
2.
Pipetas electrónicas o mecánicas y puntas resistentes al aerosol
3.
Termociclador con cubierta térmica
Estos kits han sido validados usando los siguientes termocicladores:
MJ Investigación PTC 225 Motor ADN DYAD™, Applied Biosystems™ de Life
Technologies™ Veriti™ Thermal cycler, Gene Amp® PCR Sistema 9700, y
Eppendorf Mastercycler® Pro.
El uso de otros termocicladores con estos kits requiere validación por el usuario
4.
Tubos de 0,2mL de paredes delgadas para reacción termocíclica (tiras de 8 pocillos
o microplacas con 96 pocillos).
Use los recomendados para su termociclador.
5.
Tubos de 1,5mL estériles
6.
Área de trabajo estéril como una cámara de seguridad biológica.
7.
Centrífuga de mesa con adaptadores para contenedores y una capacidad de alcanzar
2500 x g
8.
Agitador Vortex
Electroforesis en gel de agarosa
9.
Aparato de electroforesis con gel de agarosa
10.
Gel TBE con 1% de agarosa (grado de biología molecular) con 0,1g/mL de bromuro
de etidio.
11.
Tampón para cargar
12.
Marcador para PCR adecuado para cubrir el rango de 300 – 1300 bp
13.
Transiluminador luz UV
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Para diagnóstico in vitro
Purificación del producto de la PCR
14.
ExoSAP (USB® ExoSAP-IT® (Cat No 78200 para 100 reacciones) o Illustra™
ExoProStar™ Cat No US77702 para 100 reacciones)
15.
2mM MgCl2 (Disponible para comprar en Conexio Genomics, código del producto
MgCl2-1,0(50) o MgCl2-1,0(3000))
16.
Agitador
La utilización de técnicas alternativas de purificación PCR requiere de
validación por el usuario antes de su uso.
Reacción de secuenciación
17.
V3.1 o v1.1 de BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems™
by Life Technologies™.
18.
Tampón de reacción de secuenciación x5 (Conexio Genomics, código del producto
BUF-2.0(400) o SEQ BUF-2.0(5000)) o BigDye® Terminator v3.1 o v1.1 Tampón de
secuenciación x5, Applied Biosystems™ de Life Technologies™.
Purificación de los productos de secuenciación
19.
125mM EDTA, pH8,0 (Disponible para comprar en Conexio Genomics, código del
producto EDTA-3.0(200) o EDTA-3.0(5000)).
20.
Etanol absoluto y 80%. Cada procedimiento requiere etanol 80% recién preparado
que consiste en etanol absoluto y agua estéril. NO UTILICE ETANOL
DESNATURALIZADO, (también conocido como alcohol de quemar en algunos
países).
La utilización de técnicas alternativas de purificación de secuenciación requiere
de validación por el usuario antes de su uso.
Desnaturalización y electroforesis de los productos de la reacción de
secuenciación
21.
Hi-Di™ Formamida, Applied Biosystems™ by Life Technologies™, código del
producto 4311320
22.
Secuenciador automático de ADN y accesorios (p. ej. Applied Biosystems™ by Life
Technologies™ ABI Prism® 3730), incluyendo colección de datos y software.
Estos kits han sido probados y validados en los secuenciadores capilares y el software
de Applied Biosystems™ by Life Technologies™ 3100, 3730 and 3730xl.
La utilización de otras técnicas de desnaturalización y plataformas de
secuenciación requiere de validación por el usuario antes de su uso.
23.
Software para análisis de secuenciación de HLA (p. ej. Assign™ SBT, versión 3.6+ o
posterior Conexio Genomics Pty Ltd).
Condiciones de la muestra
1. Agua estéril grado cultivo celular (negativo/ sin plantilla control)
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Para diagnóstico in vitro
2. ADN genómico humano de alto peso molecular (concentración entre 20-100ng/µL en
tampón Tris/EDTA y DO260/280> 1,8) extraído de muestra de sangre total anti coagulada
con ACD o EDTA. NO use muestras de sangre total con heparina.
Advertencias y precauciones de seguridad

Este kit debe ser usado por personal de laboratorio entrenado y autorizado.

Todas las muestras, equipos y reactivos deben manipularse de acuerdo con la buena
práctica de laboratorio. Especialmente todas las muestras de pacientes deben
considerarse como potencialmente infecciosas. Recomendamos insistentemente el uso
de guantes y batas de laboratorio. Manipule y deseche todas las muestras de acuerdo
con las directrices locales y nacionales.

NO hay sustancias peligrosas en ninguno de los componentes del kit.

NO use los reactivos más allá de la fecha de caducidad.

NO se recomienda el uso de componentes de kits de distintos lotes. Esto puede
afectar el desempeño del ensayo.

El uso de reactivos no incluidos en este kit o en la lista de “Materiales, reactivos y
equipos no suministrados” (p. ej. Taq ADN polimerasas alternativas) NO se
recomienda. Esto puede afectar el desempeño del ensayo.

Se debe tener cuidado de prevenir contaminación cruzada de las muestras de ADN.
Cambie las puntas entre las muestras de ADN cuando sea posible.

Las actividades Pre- y Post-PCR deben estar estrictamente separadas físicamente. Use
equipo, reactivos y batas de laboratorio especialmente designados.

El bromuro de etidio es potencialmente carcinogénico. Debe usar siempre guantes
protectores al preparar y manipular geles. Deseche los geles de bromuro de etidio y
los tampones de acuerdo con las directrices locales y nacionales.

Al ver y fotografiar geles de agarosa bajo luz ultravioleta, siempre evite la exposición
directa y use protección facial con bloqueador UV adecuado, guantes desechables y
batas de laboratorio.
Símbolos
Se han usado los siguientes símbolos no estándar:
Símbolo
HLA-X MIX
DNA POL-XXXX
AEX1F
Descripción
Mezcla PCR locus específica
ADN polimerasa
HLA-A exón 1 cebador de secuenciación hacia adelante. Refiérase
a “Composición del Kit” y la Tabla 4 para otros cebadores de
secuenciación.
Fecha de fabricación (necesario para mercados fuera de la U.E.).
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Para diagnóstico in vitro
Procedimiento
1. PCR
1.1. Para cada locus que vaya a amplificar y para cada muestra individual a analizar,
deberá realizar una reacción PCR separada. Cada ensayo deberá incluir controles
positivos adecuados de genotipo conocido y al menos un control negativo para cada
locus que se esté amplificando.
1.2. Prepare una solución fresca de mezcla maestra PCR cada vez que realice una PCR.
Descongele rápidamente la mezcla PCR locus específica. Una vez descongelada
agítela brevemente en el vortex.
1.3. Dispense la cantidad necesaria de mezcla PCR y ADN polimerasa en un tubo estéril
para el número de muestras que serán examinadas (consulte la Tabla 1 a
continuación para el volumen por reacción). Mezcle en el vortex brevemente 3 o 4
veces.
Locus
A
B
C
DRB1
DQB1
DPB1
Locus-específico PCR Mix 16L 16L 16L 16,7L 16,7L 16,7L
p. ej. HLA-A MIX
ADN polimerasa
1L
1L
1L
0,3L
0,3L
0,3L
p. ej. DNA POL- HLA-A
Tabla 1: Composición de la mezcla maestra necesaria para cada muestra.
1.4. Dispense 17L de la mezcla maestra en cada pocillo en que ocurrirá la reacción.
1.5. Agregue 3L de muestra de ADN o controles positivos adecuados a cada pocillo.
Agregue 3L de agua estéril al pocillo con el control negativo.
1.6. Selle los pocillos. Mezcle suavemente en el vortex y centrifugue brevemente
1.7. Coloque los pocillos en que ocurrirá la reacción en un Termociclador y hágalo
funcionar de acuerdo con el siguiente plan.
95°C - 10 min
96°C - 20 s
60°C - 30 s
72°C - 3 min
33 ciclos
15°C - mantener
1.8. La amplificación demora aproximadamente 2,5 horas en completarse.
1.9. Una vez que la PCR se ha completado, saque la placa/los pocillos del Termociclador
y proceda directamente a realizar la electroforesis en gel o almacene a 4°C hasta que
se necesite.
NOTA: La purificación de amplicones con tratamiento con ExoSap debe realizarse dentro de
las 24 horas de completada la PCR.
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Para diagnóstico in vitro
2. Electroforesis con gel de agarosa
2.1. Confirme la amplificación exitosa con electroforesis con gel de agarosa usando 2L
de cada producto PCR mezclado con 5L de tampón de carga (volúmenes
alternativos de tampón de carga deben se validados antes de usar). Se recomienda
usar geles de agarosa al 1%.
2.2. El número y tamaños previstos de los amplicones resultantes variará de acuerdo al
locus y el genotipo de la muestra. Los tamaños previstos de amplicones PCR están
indicados en la Tabla 2.
Locus
Tamaños de bandas previstos
HLA-A
≈ 2 kbp
HLA-B
≈ 2 kbp
HLA-C
≈ 1,1 kbp y 1,4 kbp
HLA-DRB1
≈ 450 bp - 850 bp
≈ 630 bp - 980 bp
(HH-PD5.2-5)
(LG-PD5.2-7)
El patrón de las bandas variará dependiendo de la
presencia de ciertos grupos de alelos específicos
≈ 300 bp y 500bp
(PQ-PD6.2-2)
≈ 400 bp y 500 bp
(AN-PD6.2-3)
HLA-DPB1
≈ 400 bp
(HH-PD10.1)
≈ 400 bp, ≈780 bp y ≈1470 bp (KD-PD10.2-1)
Tabla 2: Tamaños de productos previstos en cada ensayo.
HLA-DQB1
3. Purificación del producto PCR
NOTA: Se pueden utilizar sistemas de purificación que no sean ExoSAP-IT® o ExoProStarTM
(p. ej. Agencourt® AMPure® XP o sistemas basados en columnas) para purificar estos
productos PCR. Se recomienda insistentemente a los usuarios que validen estos
procedimientos antes de proceder. Si utiliza el tratamiento EXOSAP se recomienda que el
usuario siga el procedimiento descrito a continuación.
3.1. Prepare una mezcla maestra con 4L de ExoSAP-IT® y o ExoProStarTM y 8L of
2mM MgCl2 para cada muestra a ser purificada. Suavemente pulse el vortex para
agitar. Dispense 12L de la mezcla maestra en los pocillos en que ocurrirá la
reacción de cada muestra. Selle los pocillos, agite en el vortex y luego colóquelos en
un agitador o en un vortex por 2 minutos. Centrifugue brevemente antes de
colocarlos en el termociclador. proceda según el siguiente plan:
37°C – 30 min
80°C – 15 min
4°C - mantener
3.2. Una vez completado, diluya el producto purificado 1:4 con agua estéril. Este paso de
dilución asegurará que haya suficiente plantilla para realizar las reacciones de
secuenciación y asegurar que la concentración de la plantilla sea suficiente para
producir datos de secuenciación de buena calidad.
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
NOTA: Puede ser necesario usar un factor de dilución más alto (p. ej. 1:8) si se observan
consistentemente señales altas y ruido de fondo asociado y artefactos. Un producto PCR débil
puede requerir un factor de dilución menor.
3.3. Las muestras tratadas con ExoSAP pueden conservarse a 4C hasta que sea necesario
usarlas. Estas muestras pueden almacenarse a 4C hasta por una semana antes de su
uso pero para almacenar a largo plazo, hacerlo a -20C.
4. Reacción de secuenciación
NOTA: En situaciones en que hay que resolver ambigüedades heterocigotas con cebadores
para secuenciación hemicigotos tales como HARPS®, refiérase a las instrucciones de uso del
SBT Resolver™ HARPS®.
4.1. La tabla 3 enumera los cebadores de secuenciación que deben ser usados para cada
locus.
HLA-A
HLA-B
HLA-C
AEX1F
AEX1R
BEX1F
BEX2F
CEX1F
CEX1R
AEX2F
AEX2R
BEX2R
BEX3F
CEX2F
CEX2R
AEX3F
AEX3R
BEX3R
BEX4F
CEX3F
CEX3R
AEX4F
AEX4R
BEX4R
CEX4F
CEX4R
CEX5F
CEX5R
CEX6F
CEX6R
CEX7F
HLA-DRB1†
HLA-DQB1
DRB1EX2F
DRB1EX2R-2
DQB1EX2F
DQB1EX2R
DRB1EX3R
2
RB-TG344-R†
DQB1EX3F
DQB1EX3R
O
HLA-DPB1
DPB1EX2R
DPB1EX2F
O
O
DRB1EX2F
DRB1EX2R-2
DQB1EX2F
DQB1EX2R-3
DPB1EX1F
DPB1EX1R
DRB1EX3F-7
DRB1EX3R-7
DQB1EX3F
DQB1EX3R
DPB1EX2F
DPB1EX2R
DPB1EX3F
DPB1EX3R
DPB1EX4F
DPB1EX4R
DPB1EX5F
DPB1EX5R
RB-TG344-R†
PB-AG341-R*
Tabla 3: Cebadores de secuenciación suministrados para usar con cada locus.
†
RB-TG344-R es un HARP® dirigido al dimorfismo del codón 86. Su uso es opcional.
*PB-AG341-R es un HARP® dirigido al dimorfismo del codón 85 en DPB1. Su uso también
es opcional.
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
^DRB1EX3R-2 es un cebador de secuenciación DRB1 en los kits HH-PD5.2-5 que se comporta de
manera similar a HARP y está diseñado para secuenciar los siguientes grupos alelos: *03, *08,
*11, *12, *13, *14, *15 y *16. Este cebador producirá datos heterocigotos, homocigotos o ninguna
secuenciación dependiendo del genotipo de la muestra tipificada. Al analizar datos DRB1EX3R-2
en Assign™ contra la referencia DRB1-FullX2, los datos resultantes del exón 3 serán analizados
en un nivel separado y esto permitirá resolver una cantidad de ambigüedades de alelos del exón 3,
como la ambigüedad DRB1*14:01 versus *14:54. Su uso es opcional dependiendo de la estrategia
de tipificación utilizada por el laboratorio. Esto no es compatible con los kits LG-PD5.2-7 ya que
la secuenciación bidireccional para el exón 3 está disponible.
4.2. Prepare una solución fresca de mezcla del cebador de secuenciación en hielo cada vez
que lleve a cabo una reacción. La composición y volúmenes para la mezcla están
indicadas para cada muestra.
Componente
Cebador de secuenciación
Volumen
2µL
Agua estéril
11,5µL
®
BigDye Terminadores
1µL
5X Tampón de
secuenciación
3,5µL
4.3. Mezcle cada reacción de secuenciación suavemente usando el agitador vortex.
4.4. Dispense 18µL de mezcla de reacción de secuenciación en cada uno de los
tubos/pocillos respectivos.
NOTA: En ensayos con pocas muestras con muchos cebadores de secuenciación, es aceptable
dispensar el cebador de secuenciación (2µL) directamente en los pocillos individuales en los
que ocurrirá la reacción. Se puede crear a continuación una mezcla maestra con agua estéril,
BigDye® Terminator y tampón Seq Rxn 5x, de la que se dispensarán 16uL en cada pocillo. Se
recomienda encarecidamente que el usuario valide este procedimiento alternativo antes de su
implementación.
4.5. Agregue 2µL de producto PCR purificado a cada pocillo correspondiente.
NOTA: Se debe tener cuidado para prevenir la contaminación cruzada de las reacciones de
secuenciación.
4.6. Selle los pocillos, mezcle suavemente y centrifugue brevemente para asegurar que el
contenido está localizado al fondo de cada pocillo.
4.7. Coloque los tubos en un termociclador y hágalo funcionar de acuerdo con el siguiente
plan:
Número de ciclos
Temperatura y tiempo
25
96°C – 10 s
50°C – 5 s
60°C – 2 min
1
4°C – mantener
4.8. Una vez completado el programa, saque la placa/los pocillos del termociclador y
proceda directamente a la purificación de los productos de reacción o almacene en la
oscuridad a 4C hasta que se necesiten. Se recomienda que las muestras sean
purificadas y procesadas en el secuenciador de ADN dentro de 24 horas.
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
5. Purificación de los productos de la reacción de secuenciación
NOTA: La purificación de los productos de la reacción puede llevarse a cabo por
procedimientos distintos al método de precipitación con etanol descrito aquí. Se recomienda
insistentemente que el usuario valide estos procedimientos antes de proceder.
5.1. Centrifugue brevemente las placas/los pocillos antes de proceder. Si se han usado
tapas reusables durante la fase de ciclos termales, etiquete las tapas para evitar
contaminación cruzada.
5.2. Saque el sello cuidadosamente.
5.3. Agregue 5µL 125mM EDTA, pH8,0 a cada tubo de reacción. Asegúrese de que el
EDTA alcance el fondo del tubo.
5.4. Agregue 60µL de etanol al 100% a cada pocillo de reacción. Selle la placa/los
pocillos y agite en el vortex brevemente pero completamente para asegurar que
quede totalmente mezclado.
5.5. Centrifugue los productos de extensión a 2000g por 45 min para formar un botón y
PROCEDA INMEDIATAMENTE AL SIGUIENTE PASO. Si esto no es posible,
vuelva a centrifugar por 10 min adicionales antes de proceder.
5.6. Saque los sellos de los pocillos y elimine el sobrenadante invirtiendo los pocillos
sobre una toalla de papel absorbente.
5.7. Coloque los pocillos de reacción invertidos con la toalla de papel absorbente en la
centrífuga. Centrifugue a 350g por 1 minuto para eliminar cualquier sobrenadante
residual.
5.8. Saque los pocillos de la centrífuga y colóquelos con la abertura hacia arriba sobre la
mesa de trabajo. Elimine la toalla de papel absorbente.
5.9. Prepare una solución fresca de etanol al 80% con etanol absoluto y agua estéril
grado de cultivo celular.
5.10. Añada 60µL de 80% de etanol a cada pocillo. Vuelva a sellar los pocillos y agite
brevemente en el vortex.
5.11. Centrifugue a 2000g por 5 min.
5.12. Repita los pasos 5.6 y 5.7.
5.13. Saque los tubos de reacción de la centrífuga y elimine las toallas de papel. Vuelva a
sellar los pocillos y proceda al paso de desnaturalización. Si no, almacene en la
oscuridad a -20C. Se recomienda que los productos de extensión sean procesados en
la secuenciación ADN dentro de las 24 horas de la preparación de las reacciones de
secuenciación.
6. Desnaturalización & electroforesis de productos de la reacción de
secuenciación
NOTA: Es posible que el procedimiento para la desnaturalización de los productos de
extensión en Hi-Di™ Formamida descrito aquí, no sea necesario si se han utilizado otros
procedimientos de purificación distintos a la precipitación con etanol.
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Se recomienda encarecidamente que los procedimientos alternativos sean validados por el
usuario antes de proceder.
6.1. Agregue 12µL de Hi-Di™ formamida a cada tubo de reacción. Agite con el Vortex y
centrifugue la placa/los pocillos brevemente.
6.2. Incube los pocillos de reacción a 98C por 5 minutos. Después de la incubación,
asegure que los pocillos de reacción se enfríen rápidamente a temperatura ambiente
(p. ej. colóquelos en hielo o utilice el termociclador para realizar los pasos de
desnaturalización y enfriamiento) antes de colocarlos en el secuenciador. Si no es
posible procesar las placas inmediatamente, almacene a 4C hasta que se necesiten.
NOTA: Asegúrese que no hay burbujas en los pocillos de reacción. Estas pueden entrar y
dañar el capilar.
6.3. Cargue los pocillos/la placa en el secuenciador automático y prepare el archivo de
recolección de datos de acuerdo con las especificaciones del fabricante del
secuenciador.
6.4. Los siguientes parámetros han sido validados para este instrumento por el fabricante
usando el kit v3.1 de secuenciación Big Dye® Terminador y POP-7™. Es posible
que estos parámetros deban ser validados por el usuario para otros polímeros,
técnicas de secuenciación química e instrumentos. Refiérase al manual del usuario de
cada instrumento para obtener instrucciones detalladas y ayuda (es decir, asegúrese
de que el set de tintes es el adecuado para la química utilizada, por ejemplo, la
química de secuenciación del terminador v1.1 Big Dye® requerirá un set de tintes
diferentes).
Parámetro
configuración
Dye set
Z_BigDyeV3
Mobility file
KB_3730_POP7_BDTV3
Basecaller
KB.bcp
Run Module
Regular FastSeq50_POP7
Injection time
15 s
Run time
3000 s
6.5. Use el software de colección de datos del instrumento para procesar los datos en bruto
y crear los archivos de secuenciación. Refiérase al manual del usuario del instrumento
correspondiente para obtener instrucciones detalladas y ayuda.
7. Edición y análisis de los electroferogramas
Los kits del SBT Resolver™ fueron desarrollados y validados utilizando el software Assign™
SBT y Assign™ ATF desarrollado por Conexio Genomics Pty Ltd. Se recomienda a los
usuarios utilizar Assign SBT versión 3.6+ y posteriores ya que estas versiones del software
utilizan configuraciones y archivos de referencia diseñados específicamente para los kits de
tipificación SBT Resolver™ y HARPS®. Para obtener más detalles sobre la operación de este
software, consulte los manuales del usuario pertinentes que se pueden descargar del sitio web
de Conexio Genomics (http://www.conexio-genomics.com).
Los datos de tipificación basados en la secuenciación generados utilizando los kits de
tipificación SBT Resolver™ debe analizarse contra los siguientes archivos de referencia
Assign™ que son suministrados por Conexio Genomics:
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Ensayo
Código del
producto
Archivo de referencia
Assign
SBT Resolver™ HLA-A
XH-PD1.1-2
A.xml
SBT Resolver™ HLA-B
BS-PD2.1-2
B.xml
SBT Resolver™ HLA-C
HH-PD3.2-2
C.xml o Cw.xml
SBT Resolver™ HLA-DRB1
HH-PD5.2-5
DRB1-FullX2.xml
LG-PD5.2-7
527_DRB1.xml
PQ-PD6.2-2
DQB1.xml
AN-PD6.2-3
623_DQB1.xml
HH-PD10.1
DPB1.xml
KD-PD10.2-1
DPB1.xml
SBT Resolver™ HLA-DQB1
SBT Resolver™ HLA-DPB1
Características del desempeño
Exactitud
Paneles de hasta 93 muestras del programa Internacional de Intercambio de ADN y Pruebas
de Competencia de la UCLA (2008- 2010) usado para pruebas internas del kit SBT
Resolver™ produjeron los siguientes resultados:
Locus
Número de Sensibilidad Especificidad Número de
Número de
muestras
diagnóstica
diagnóstica
muestras
muestras
examinadas
discordantes heterocigotas
(% de
(% de
genotipos
PCR
obtenidos)
exitosos)
Número
de alelos
únicos
HLA-A
81
100%
100%
0
74
20
HLA-B
82
100%
98,8%
0
79
81
HLA-C
39
97,5%
97,5%
0
35
21
HLA-DRB1
93
96,7%
96,7%
0
84
39
HLA-DQB1
42
100%
100%
0
36
14
38
100%
100%
0
34
15
77
100%
100%
0
60
18
16
100%
100%
2*
14
13
(PQ-PD6.2-2)
HLA-DQB1
(AN-PD6.2-3)
HLA-DPB1
(HH-PD10.1)
HLA-DPB1
(KD-PD10.2-1)
* Las dos muestras discordantes contenían información de secuenciación adicional fuera del
exón 2 que no fue informada por el programa de prueba de competencia de “International
DNA Exchange” de UCLA \una muestra contenía 131:01, pero fue informada como 13:01 por
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
el programa de prueba de competencia de “International DNA Exchange” de UCLA. Estos
alelos discrepaban en el exón 1.
Para los kits SBT Resolver HLA-DRB1 (código del producto LG-PD5.2-7), se utilizó para
análisis interno un panel de 23 muestras bien caracterizadas que cubrían un amplio rango de
alelos. Asimismo, también se tipificó un panel de 293 muestras obtenidas de fuentes externas
sin conocimiento previo sobre otros datos de tipificación HLA. Estas muestras también se
analizaron con el ensayo SBT Resolver™ HLA-DQB1 (PQ-PD6.2-2). En los casos donde se
obtuvo un resultado homocigoto las asociaciones DQB1/ DRB1para esas muestras se
examinaron para confirmar el resultado así como para detectar situaciones donde se pudiera
haber pasado por alto algún alelo
La prueba dio los siguientes resultados:
Locus
Número
de
muestras
analizad
as
Sensibilid
ad
diagnóstic
a
Especifici
dad
diagnóstic
a
Número
de
muestras
discordant
es
Número de
muestras
heterocigota
s
Número
de alelos
únicos
HLA-DRB1
23
100%
100%
0
23
12
286*
97,9%
99,6%
0
253
33
* Seis muestras no fueron amplificadas debido a muestras de ADN de mala calidad. Se
encontró que una muestra contenía ADN contaminante, cuya fuente era el laboratorio de
donde se obtuvieron las muestras. Como resultado de la contaminación, no fue posible
obtener n genotipo para esa muestra.
El análisis de la secuencia de la PCR y de evaluación del rendimiento los sitios de
secuenciación de cebadores y estudios de evaluación del desempeño, no han identificado
ningún alelo común y bien documentado que no se amplifique por medio del uso
recomendado de estos kits. Para mayor información, consulte el documento SBT Resolver™
Primer Analysis disponible en cada lanzamiento de referencia Assign™ SBT, que se pueden
descargar del sitio web de Conexio Genomics (http://www.conexio-genomics.com).
Límite de detección
La concentración recomendada de ADN genómico humano de alto peso molecular es de es
20-100ng/L. Pruebas internas han demostrado que muestras con concentraciones tan bajas
como 5ng/L también se pueden ser usadas. Asimismo se obtuvieron genotipos correctos de
ADN de baja calidad o fragmentado.
Especificidad
Los kits de Conexio Genomics Pty Ltd’s SBT Resolver™ son ensayos de locus específico. El
uso de estos kits de acuerdo con estas instrucciones, deberían amplificar solo un locus. En la
mayoría de los casos el uso de cebadores de secuenciación incorporados en cada kit producirá
una tipificación HLA para la mayoría de las muestras sin necesidad de resolución adicional.
En aquellas situaciones en que aún existan ambigüedades heterocigotas, se recomienda el uso
de cebadores para resolver secuencias (tal como SBT Resolver™ HARPS®).
Se debe tener en cuenta que pueden ocurrir mutaciones en las amplificaciones o en los sitios
de los cebadores de secuenciación y esto puede resultar en alélica de abandono. Las muestras
que sugieren un resultado de tipificación homocigoto deben ser confirmadas con
procedimientos alternativos.
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Para diagnóstico in vitro
Limitaciones y advertencias

Se recomienda insistentemente que estos kits sean validados por el usuario antes de la
implementación en el laboratorio usando muestras cuyo tipo HLA haya sido determinado
por otros procedimientos basados en técnicas moleculares. Especialmente, cualquier
desviación de este procedimiento (p. ej. la utilización de procedimientos de purificación
de secuenciación de ADN o PCR alternativa) debe ser validado por el usuario antes de su
implementación.

Estos kits han sido validados utilizando paneles de muestras cuyos genotipos cubren una
amplia gama de alelos. Sin embargo debe considerarse que es posible encontrar alelos
raros y alelos con polimorfismos en la amplificación y secuenciación y es posible que
estos no sean amplificados o secuenciados.

La naturaleza de la tipificación HLA basada en la secuencia es tal, que otros factores
aparte de la mezcla PCR pueden resultar en amplificación preferencial o alélica de
abandono. Como consecuencia los resultados de tipificación que parecen ser
homocigotos, deben ser confirmados utilizando métodos alternativos y/o genotipado de la
familia.

Un control positivo (ADN humano) y un control negativo (agua estéril) deben incluirse
cada vez que se realiza la PCR. El control positivo debe producir un producto PCR del
tamaño adecuado dependiendo de los locus amplificados y la secuencia resultante debe
coincidir con el genotipo de la muestra. No deben haber productos PCR en la plantilla de
control negativa en cada experimento. Si hay una banda evidente, puede que haya
ocurrido contaminación en alguna etapa y el experimento debe ser repetido.

Ocasionalmente pueden haber productos PCR evidentes más grandes y más tenues. Estas
bandas adicionales no interfieren con los resultados de secuencia o la calidad.
Licencia
Los kits de SBT Resolver™ contienen GoTaq® Polimerasa de inicio en caliente (ADN POL)
que es fabricada por Promega Corporation y es distribuida por Conexio Genomics Pty Ltd.
Licenciada a Promega bajo patente de E.E.U.U. números 5.338.671 y 5.587.287 y sus
patentes extranjeras correspondientes.
Referencias bibliográficas
1. Sayer D, Whidborne R, Brestovac B, Trimboli F, Witt C, Christiansen F (2001): HLADRB1 DNA sequencing based typing: an approach suitable for high throughput typing
including unrelated bone marrow registry donors. Tissue Antigens 57: 46-54.
2. Sayer D, Whidborne R, DeSantis D, Rozemuller EH, Christiansen F, Tilanus MG (2004).
A multicentre international evaluation of single-tube amplification protocols for
sequencing-based typing of HLA-DRB1 and HLA-DRB3, 4, 5. Tissue Antigens 63: 412423.
3. Assign™ SBT v3.6+ Operator Manual, Conexio Genomics Pty Ltd
4. Assign™ SBT v4.7 Operator Manual, Conexio Genomics Pty Ltd
5. Assign™ SBT v471 Operator Manual, Conexio Genomics Pty Ltd
6. Mayor información sobre el programa de intercambio de ADN de UCLA se encuentra en
:http://www.hla.ucla.edu/cellDNA/DNA/programInfo.htm.
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
7. Los alelos HLA vigentes se encuentran en http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla.
Resolución de problemas
Problema
Causa(s) Posible(s)
Solución
Productos PCR ausentes
o débiles
ADN de baja calidad
Evalúe la calidad del ADN con
electroforesis en gel. El ADN
intacto
debería
ser
aproximadamente 3kb con
poca o ninguna evidencia de
manchas en el gel. Vuelva a
extraer el ADN y repita la
PCR cuando sea posible.
Compruebe
que
la
concentración del ADN sea
entre 20-100ng/L. Vuelva a
extraer el ADN y repita la
PCR cuando sea posible.
Evite el uso de muestras de
sangre total con heparina.
Vuelva a extraer el ADN y
repita la PCR cuando sea
posible.
Repita la PCR. Asegúrese de
que los componentes de la
mezcla maestra se mezclen
muy bien en el vortex.
Insuficiente cantidad de ADN
agregado a la PCR
Presencia de inhibidores PCR
en el ADN genómico
No se agregó ADN polimerasa
a la mezcla maestra o la
muestra maestra no se mezcló
lo suficiente antes de agregarla
a las muestras.
Problemas con termociclación
Compruebe los parámetros de
ejecución de los ciclos
termales.
Compruebe la historia de los
procedimientos
para
asegurarse
que
el
procedimiento
no
fue
terminado en forma prematura.
Asegúrese
que
el
termociclador
está
funcionando de acuerdo con
las especificaciones
del
fabricante y es sometido a
mantenimiento regularmente.
No se agregó bromuro de etidio Sumerja el gel en un baño de
al gel
tintura que contenga 1X TBE
con 0,5mg/mL de bromuro de
etidio. Decolore en 1X TBE
antes de registrar la imagen del
gel.
Asegúrese de agregar el
bromuro de etidio al gel antes
de verter.
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Productos PCR débiles o
ausentes para la banda
del exón 3-5 para el
ensayo KD-PD10.2-1
Tamaño de las bandas
son incorrectos
Intensidad de la señal de
los electroferogramas es
débil
Intensidad de la señal
demasiado alta.
(Presencia de picos
fluorescentes altosartefactos)
Las muestras de ADN se Siempre que sea posible utilice
eluyen o diluyen en agua que agua estéril con un pH neutro
puede tener un pH ligeramente
acídico
ADN de mala calidad
La amplificación de muestras
de muy mala calidad puede
resultar en la amplificación
débil del amplicon del exón 35. Aún así, se puede obtener
tipificación utilizando los
datos de secuenciación del
exón 1 y 2. De lo contrario
vuelva a extraer el ADN y
repita la PCR di es posible
El kit usado es incorrecto
Compruebe que está usando el
kit que corresponde.
Programa de termociclador Compruebe los parámetros del
usado es incorrecto
termociclador.
Contaminación de la PCR
Compruebe el control negativo
por si hay evidencia de
contaminación.
Descontamine la superficie de
trabajo y repita la PCR.
Repita la PCR para identificar
la fuente de la contaminación.
Considere usar un kit nuevo.
Si el ADN genómico de una
muestra
parece
estar
contaminado,
vuelva
a
extraerlo u obtenga una fuente
alternativa de ADN.
Producto PCR débil
Compruebe la imagen del gel.
NO se recomienda secuenciar
bandas de PCR débiles ya que
la calidad de la secuencia
puede ser insuficiente para
SBT.
Considere usar un factor de
dilución menor (p. ej.1:2, 1:3)
después de la purificación
PCR.
Cantidad
insuficiente
de Compruebe los parámetros del
productos de reacción aplicados secuenciador.
Puede
ser
al secuenciador
necesario aumentar el tiempo
de inyección y el voltaje.
Problemas
durante
la Sea
extremadamente
purificación de los productos cuidadoso al desechar el
del secuenciador
sobrenadante ya que se puede
soltar el botón.
Demasiado producto PCR
Compruebe la imagen del gel.
Considere usar un factor de
dilución más alto después de la
purificación PCR.
Compruebe la cantidad de
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Demasiados
productos
reacción
aplicados
secuenciador.
Línea basal ruidosa (alto
ruido de fondo)
de
al
Producto PCR contaminado
Amplificación de genes HLA
estrechamente relacionados
Purificación de PCR deficiente
Reacciones de secuenciación
contaminadas
Cebador de secuenciación
contaminado
Mezcla de tinte terminador o
tampón
secuenciador
contaminado
Purificación
deficiente
de
productos de secuenciación
Presencia de manchas
por el tinte
Purificación
deficiente
de
productos de secuenciación
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ADN polimerasa usada en la
PCR.
Compruebe los parámetros del
instrumento. Considere reducir
el tiempo de inyección y
voltaje.
Refiérase
a
acciones
correctivas
enumeradas
anteriormente.
Compruebe los parámetros de
los ciclos térmicos.
Asegúrese que el tratamiento
con ExoSAP se lleve a cabo de
acuerdo con las instrucciones
de uso para el usuario del kit.
Asegúrese que la mezcla PCR
se mezcle totalmente con
ExoSAP.
Considere utilizar ExoSAP
siguiendo las instrucciones del
fabricante (aumentando la
cantidad de enzima) o
considere una técnica de
purificación alternativa.
Asegúrese de tomar todos los
pasos
para
prevenir
contaminación
cruzada.
Cambie las puntas de las
pipetas siempre que sea
posible. Agregue los líquidos
desde arriba en los pocillos de
la reacción. Evite aerosoles.
Compruebe la calidad de la
secuencia
de
los
otros
cebadores de secuenciación y
de otras muestras utilizando el
mismo cebador.
Considere utilizar una alícuota
fresca
del
cebador
de
secuenciación.
Repita la secuenciación con
una alícuota de reactivos
fresca.
Repita la secuenciación y
asegúrese que la purificación
se realice de acuerdo con las
instrucciones de fabricante
Purifique los productos de
acuerdo con las instrucciones
del kit.
Asegúrese que el lavado de los
productos con etanol al 80%
sea suficiente.
SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
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C1-CG343-F(20)
C1-CA343-F(20)
C1-GA361-F(20)
C1-TG539-R(20)
C1-GG539-R(20)
C1-AA601-R(20)
C1-AG595-R(20)
RB-01-F(20)
RB-04-F(20)
RB-09-F(20)
RB-15-F(20)
RB-52-F(20)
RB-GG125-F(20)
RB-AA197-F(20)
RB-TT197-F(20)
RB-GT196-F(20)
RB-GA196-F(20)
RB-TA164-F(20)
RB-TT227-F(20)
RB-AT258-F(20)
RB-GC258-F(20)
RB-CT257-R(20)
RB-AT257-R(20)
RB-TT321-R(20)
RB-GT344-R(20)
RB-TG344-R(20)
QB-TA173-F(20)
QB-CT173-F(20)
QB-TA185-F(20)
QB-CG353-R(20)
QB-GG353-R(20)
PB-AT251-R(20)
PB-GT313-R(20)
PB-TAC121-F(20)
PB-GG341-R(20)
PB-GC194-F(20)
PB-AG341-R(20)
PB-GC112-F(20)
QB-TA122-F(20)
Solo para uso en investigación:
AN-PD11.0-0(20)
AN-PD11.0-0(50)
SBT Resolver™ HLA-DRB3 kit (20 y 50 pruebas)
AN-PD12.0-0(20)
AN-PD12.0-0(50)
SBT Resolver™ HLA-DRB4 kit (20 y 50 pruebas)
AN-PD13.0-0(20)
AN-PD13.0-0(50)
SBT Resolver™ HLA-DRB5 kit (20 y 50 pruebas)
LC-PD2.9(20)
LC-PD2.9(50)
SBT Resolver™ HLA-B57 kit (20 y 50 pruebas)
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
Nota: los productos listados arriba están licenciados como IVD en Australia
Reactivos de laboratorio para uso general
MgCl2 – 1.0(50)
MgCl2 - 1.0(3000))
2mM MgCl2
SEQ BUF – 2.0(400)
SEQ BUF – 2.0(5000)
5x Seq Rxn Buffer
EDTA – 3.0(200)
EDTA – 3.0(5000)
125mM EDTA, pH8.0
Para mayor información póngase en contacto con su distribuidor local.
0197
Para obtener detalles sobre cómo hacer un pedido referirse al sitio web de Olerup
(http://www.olerup.com).
Kits auto certificados:
HH-PD3.2-2(20)
HH-PD3.2-2(50)
PQ-PD6.2-2(20)
PQ-PD6.2-2(50)
AN-PD6.2-3(20)
AN-PD6.2-3(50)
HH-PD10.1(20)
HH-PD10.1(50)
KD-PD10.2-1(20)
KD-PD10.2-1(50)
SBT Resolver™ HLA-C kit (20 y 50 pruebas)
SBT Resolver™ HLA-DQB1 kit (20 y 50 pruebas)
SBT Resolver™ HLA-DPB1 kit (20 y 50 pruebas)
Soporte y dónde contactarnos
Conexio Genomics Pty Ltd
PO Box 1294
Fremantle 6959
Western Australia
Australia
Teléfono: +61-08-9336-4212
Correo electrónico: support@conexio-genomics.com
Skype: conexiocgx
Sitio web: www.conexio-genomics.com
O su distribuidor local
Conexio y HARPS son marcas registradas de Conexio 4 Pty Ltd. HARPS® es una marca
registrada en algunos territorios.
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SBT Resolver™ IdU
Para diagnóstico in vitro
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