Kit de mutaciones del gen K

Kit de mutaciones del gen K
Kit de mutaciones del gen K-RAS de
TheraScreen®
Para la detección de las 7 mutaciones del gen K-RAS
Para uso con el sistema de PCR en tiempo real LightCycler® 480 de
Roche (Equipo II)
(Nº de catálogo: 05015278001)
Y el sistema de PCR en tiempo real 7500 de Applied BioSystems
(Número de referencia: 4351105)
Incluye el Manual del usuario del programa LightCycler® Adapt
Software v1.1 de Roche Diagnostics (Nº de catálogo 05474914001)
para el Kit de mutaciones del gen K-RAS de TheraScreen® con el
marcado CE-IVD.
Instrucciones de uso
Códigos de producto
Tamaño del kit
20 reacciones
80 reacciones
Código del
producto DxS
KR-21
KR-22
Versión de las instrucciones:
Fecha de la revisión:
DU001g
mayo de 2009
Almacenar entre -18 °C y -25 °C
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Número de pedido para
Roche Diagnostics
05366216190
05366224190
Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Contenido
1. Uso previsto/Indicaciones de uso .........................................................3
2. Resumen y explicación de la prueba ....................................................3
3. Principios tecnológicos ..........................................................................4
4. Reactivos ..................................................................................................6
5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES.....................................................7
6. Condiciones de almacenamiento, estabilidad y envío ........................9
7. Equipo .......................................................................................................9
8. Muestras ...................................................................................................9
9. Protocolo de detección de mutaciones del gen K-RAS ................... 14
10. Limitaciones de la prueba ................................................................. 28
11. Características del rendimiento del ensayo .................................... 29
12. Asistencia técnica .............................................................................. 38
13. Información sobre el fabricante y el distribuidor ........................... 38
14. Fecha de publicación de la última revisión ..................................... 39
15. Referencias ......................................................................................... 40
Notas para el comprador: ........................................................................ 42
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
IMPORTANTE: lea estas instrucciones detenidamente y
familiarícese con todos los componentes del Kit de K-RAS antes de
empezar a utilizarlo.
1. Uso previsto/Indicaciones de uso
Uso previsto
El Kit de mutaciones K-RAS de DxS TheraScreen® (Kit de K-RAS) es una
prueba de diagnóstico in vitro diseñada para la detección de las siete
mutaciones somáticas en el oncogen K-RAS con el fin de proporcionar una
validación cualitativa del estado de las mutaciones. El Kit de K-RAS está
concebido para personal cualificado y para uso en en entornos
profesionales de laboratorio con muestras de ADN de tejido colorrectal
fijado en formalina e incluido en parafina.
Indicaciones de uso
Los resultados del Kit de K-RAS tienen como finalidad ayudar al personal
médico a la identificación de pacientes con cáncer colorrectal que no
puedan beneficiarse de las terapias antireceptor del factor de crecimiento
epidérmico (EGFR), como Panitumumab o Cetuximab.
El Kit de K-RAS no tiene como objetivo servir de prueba diagnóstica del
cáncer colorrectal. Está concebida como complemento de otros factores
pronósticos importantes utilizados para la selección de los pacientes aptos
para el tratamiento mediante terapias por inhibición del EGFR, según el
estado de la mutación en el paciente. El médico valorará el estado de la
mutación en el paciente, además de otros factores relativos a la
enfermedad, para tomar una decisión sobre la terapia. Ninguna decisión
relativa a la aplicación de tratamientos en pacientes con cáncer debe
basarse exclusivamente en el estado de la mutación en el gen K-RAS.
2. Resumen y explicación de la prueba
El Kit de K-RAS es un dispositivo de diagnóstico con marcado CE
fabricado según la Directiva de productos sanitarios para diagnóstico in
vitro 98/79/CE de la Unión Europea.
Los cánceres humanos(1-4) suelen presentar mutaciones en el oncogen
K-RAS. La existencia de estas mutaciones se relaciona con la falta de
respuesta a determinadas terapias anticancerígenas por inhibición del
EGFR en pacientes con cáncer colorrectal metastásico (5-10)(14-21).
El ensayo de PCR en tiempo real basado en la tecnología Scorpions de
DxS permite detectar las siete mutaciones del gen K-RAS en ADN
genómico normal. Este método es altamente selectivo. Siempre que se
disponga de suficientes copias de ADN, existe la posibilidad de detectar
aproximadamente un 1% de mutaciones en el ADN genómico normal.
El Kit de K-RAS detecta siete mutaciones del gen K-RAS en los codones
12 y 13 del oncogen K-RAS, tal y como se muestra en la Tabla 1.
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Tabla 1: mutaciones en el gen K-RAS detectadas mediante el kit de DxS
Se utilizan los identificadores (ID) COSMIC del catálogo de mutaciones
somáticas del cáncer (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer).
http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/
Mutación Cambio de base ID de Cosmic
Gly12Ala
(GGT>GCT)
522
Gly12Asp
(GGT>GAT)
521
Gly12Arg
(GGT>CGT)
518
Gly12Cys
(GGT>TGT)
516
Gly12Ser
(GGT>AGT)
517
Gly12Val
(GGT>GTT)
520
Gly13Asp
(GGC>GAC)
532
3. Principios tecnológicos
El Kit de K-RAS combina dos tecnologías, ARMS® y Scorpions® (11, 12, 13),
para la detección de las mutaciones mediante ensayos realizados con la
técnica de PCR en tiempo real.
ARMS
La ARMS permite llevar a cabo una amplificación específica de los alelos o
las mutaciones. La enzima Taq ADN polimerasa resulta extremadamente
eficaz para diferenciar entre una coincidencia y un error de coincidencia en
el extremo 3’ de un primer o cebador de PCR. Algunas secuencias
mutadas se pueden amplificar de forma selectiva, incluso en muestras
cuya mayoría de secuencias no presentan la mutación, por ejemplo:
• Cuando la coincidencia con el cebador es completa, la amplificación
se produce con total eficacia.
• Cuando no hay coincidencia con la base 3’, únicamente tiene lugar
una amplificación complementaria de bajo nivel.
Scorpions
La detección de la amplificación se realiza mediante Scorpions. Scorpions
es una técnica de moléculas bifuncionales que contienen un cebador de
PCR unido covalentemente a una sonda. El fluoróforo de esta sonda
interactúa con un quencher o silenciador, también incorporado en la sonda,
lo que reduce la fluorescencia.
Durante la reacción de la PCR, cuando la sonda se une al amplicón, se
separan el fluoróforo y el silenciador. El resultado es un aumento de la
fluorescencia en el tubo de reacción.
Análisis de los datos: método ∆Ct
Los ensayos en tiempo real de Scorpions utilizan el número de ciclos de
PCR necesarios para detectar una señal de fluorescencia superior a la
señal de referencia como medida de las moléculas diana presentes al
comienzo de la reacción. El punto en el que se detecta una señal superior
a la lectura de fluorescencia de referencia se denomina "ciclo umbral" (Ct).
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El cálculo de los valores de ∆Ct de una muestra se obtiene de la diferencia
entre el valor de Ct del ensayo de mutación y el valor de Ct del ensayo de
control de una misma muestra. Las muestras se clasifican como positivas
para mutaciones si su valor de ∆Ct es inferior al valor de ∆Ct del 1%
correspondiente a dicho ensayo.
Por encima de este valor, se considera que la muestra contiene menos de
un 1% de mutaciones (por encima del límite de los ensayos) o que la
muestra es negativa para la mutación.
Si se utilizan cebadores ARMS, es posible que el cebado no resulte eficaz,
lo que daría lugar a un valor de Ct de referencia muy tardío para
secuencias de ADN que no contengan mutaciones. Todos los valores de
∆Ct calculados a partir de la amplificación de referencia serán superiores a
los valores de ∆Ct del 1% y la muestra se clasificará como negativa para la
mutación.
El Kit de K-RAS tiene el marcado CE para su uso con fines de diagnóstico
in vitro con el sistema de PCR en tiempo real LightCycler® 480 (Equipo II)
de Roche Diagnostics (Equipo LightCycler® 480) con 96 pocillos, número
de referencia de Roche: 05015278001, o el Sistema de PCR en tiempo
real 7500 de Applied BioSystems, número de referencia 4351105
(ABI7500).
En el caso del equipo LightCycler® 480, el Kit de K-RAS debe utilizarse en
combinación con el programa LightCycler® Adapt Software v1.1 para el Kit
de mutaciones del gen K-RAS de TheraScreen® con marcado CE-IVD
(LightCycler® Adapt Software). El objetivo del programa es automatizar la
determinación del estado de un gráfico de amplificación y calcular un
umbral adecuado con el que obtener los valores de Ct. Dichos valores se
utilizan para calcular los valores de ∆Ct de las muestras, que
posteriormente se comparan con los valores de corte del 1%. El programa
indica si el resultado para la mutación es positivo o negativo y elimina
cualquier subjetividad de los procesos de análisis e interpretación de los
datos del Kit de K-RAS.
Formato del Kit de K-RAS
El Kit de K-RAS se suministra con ocho ensayos.
• Un ensayo de control
• Siete ensayos de mutación
Todas las mezclas de reacción contienen un ensayo de control exógeno
(control interno) con la etiqueta HEX (que identificará el detector JOE en el
sistema ABI7500). Su objetivo es controlar la existencia de inhibidores que
puedan conducir a resultados de falsos negativos.
Ensayo de control
El ensayo de control, con la etiqueta FAM, sirve para valorar el ADN total
de una muestra. El ensayo de control amplifica una región del exón 4 del
gen K-RAS.
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Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Los cebadores y la sonda se han diseñado para evitar cualquier
polimorfismo conocido del gen K-RAS.
Ensayos de mutación
Cada ensayo de mutación, con la etiqueta FAM, contiene un cebador
Scorpions más uno ARMS cuyo objetivo es discriminar entre el ADN
normal y el ADN mutante detectado mediante los ensayos de PCR en
tiempo real.
4. Reactivos
El Kit de K-RAS contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo el
control de calidad de las muestras y realizar los ensayos de K-RAS para
20 ó 80 reacciones, según el tamaño del kit.
Tamaño del kit
Código del producto
Número de pedido para
DxS
Roche Diagnostics
20 reacciones
KR-21
05366216190
80 reacciones
KR-22
05366224190
El número de muestras que puede analizarse depende del tamaño del lote
de muestras.
Tabla 2: contenido del Kit de K-RAS
Reactivos incluidos
Mezcla de reacción para control
Mezcla de reacción para 12ALA
Mezcla de reacción para 12ASP
Mezcla de reacción para 12ARG
Mezcla de reacción para 12CYS
Mezcla de reacción para 12SER
Mezcla de reacción para 12VAL
Mezcla de reacción para 13ASP
Estándar mezclado
Taq ADN polimerasa
20
80
reacciones reacciones Tubo
Volumen
Volumen
1300 µl
5200 µl
1
650 µl
2600 µl
2
650 µl
2600 µl
3
650 µl
2600 µl
4
650 µl
2600 µl
5
650 µl
2600 µl
6
650 µl
2600 µl
7
650 µl
2600 µl
8
300 µl
1000 µl
9
60 µl
240 µl
10
Equipo y reactivos no suministrados con el Kit de K-RAS
El usuario necesita el equipo y los consumibles que se indican a
continuación:
• Equipo LightCycler® 480 o equipo para la PCR en tiempo real
ABI7500, capaces de ejecutar ciclos tal como se define en el
apartado 9; Protocolo de detección de mutaciones del gen K-RAS.
• Programa LightCycler® Adapt Software v1.1 de Roche Diagnostics
(Nº de catálogo 05474914001).
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Para uso diagnóstico solamente
•
•
•
•
•
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Placas para PCR exentas de DNAsa de 0,2 ml (equipo LightCycler®
480 con placa de 96 pocillos, número de catálogo 04729692 001, o
placa de reacción óptica con 96 pocillos ABI MicroAmp (número de
referencia 4306737) con película adhesiva de calidad óptica de
MicroAmp, número de referencia 4311971).
Tubos estériles para la preparación de las mezclas maestras.
Pipetas exclusivas para la preparación de la mezcla para PCR.
Pipetas exclusivas para la dispensación de ADN plantilla.
H2O libre de nucleasa estéril
5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
™ Para uso de diagnóstico in vitro.
™ El Kit de K-RAS no se ha diseñado para el cribado ni el diagnóstico de
ningún tipo de cáncer, incluido el cáncer colorrectal. Su objetivo es
servir como complemento de otros factores pronósticos utilizados
actualmente para la selección de pacientes que no podrían
beneficiarse de las terapias anticancerígenas por inhibición del EGFR.
™ Las terapias para pacientes con cáncer no deberían basarse
únicamente en el estado de la mutación del gen K-RAS. Los médicos
deben valorar el estado de la mutación del paciente junto con otros
factores de la enfermedad.
™ El contenido del Kit de K-RAS se puede congelar/descongelar hasta
8 veces sin que se vea afectado el rendimiento del ensayo. NO
congele/descongele los reactivos del Kit de K-RAS más de 8 veces.
™ Es importante tener en cuenta la posibilidad de que la información de
las muestras de tumores y los datos de una muestra de tumor no
coincidan con otras secciones del mismo tumor. Las muestras de
tumores también pueden contener tejido no tumoral. En un principio,
no se prevé que el ADN del tejido no tumoral contenga las mutaciones
del gen K-RAS que detecta el Kit de K-RAS.
™ Todos los ensayos del Kit de K-RAS generan productos de PCR
cortos. Sin embargo, el Kit de K-RAS no funciona correctamente con el
ADN muy fragmentado.
™ La validación del ADN debería basarse en la PCR y puede diferir de la
cuantificación basada en las lecturas de densidad óptica. Se
suministra una mezcla de reacción para control adicional para permitir
la validación de la calidad y la cantidad del ADN en las muestras antes
de ejecutar el Kit de K-RAS.
™ Los reactivos del Kit de K-RAS presentan una dilución óptima. No se
recomienda una mayor dilución, puesto que disminuiría el rendimiento.
No se recomienda utilizar de volúmenes de reacción inferiores a 25 µl
porque aumentan el riesgo de falsos negativos.
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™ Todos los reactivos del Kit de K-RAS se han formulado
específicamente para su uso con las pruebas mencionadas. No
deberían sustituirse los reactivos del Kit de K-RAS si se pretende
mantener un rendimiento óptimo.
™ Para garantizar una actividad y un rendimiento óptimos, los cebadores
Scorpions (así como todas las moléculas marcadas con fluorescencia)
deben protegerse de la luz para evitar el blanqueamiento.
™ Extreme la precaución para evitar la contaminación de las reacciones
de PCR con material de control sintético. Se recomienda utilizar
pipetas diferentes para hacer las mezclas de reacción y añadir ADN
plantilla. La preparación y dispensación de las mezclas de reacción
debería realizarse en una zona separada a la de donde sea añada la
plantilla. No abra los tubos después de la reacción de la PCR.
™ Cada ensayo incluido en el Kit de K-RAS tiene características
especiales. El cálculo del resultado debe realizarse con los parámetros
de ensayo correctos (consulte el apartado sobre interpretación de los
informes y los datos).
™ Los valores de Ct de mutación de 38 o superiores se deben clasificar
como negativos o como inferiores a los límites del Kit.
™ Los ensayos contienen una reacción de control exógeno (control
interno) además de la reacción de interés (consulte el apartado
Principios tecnológicos). Si ambos ensayos dan error, no deben
utilizarse los datos obtenidos puesto que puede haber inhibidores que
generarían falsos negativos. La dilución de la muestra puede reducir el
efecto de los inhibidores, aunque se debe tener en cuenta que esto
también diluiría el ADN.
™ Se deben aplicar las precauciones generales de laboratorio como,
entre otras, las siguientes:
a) No pipetee con la boca.
b) No fume, coma ni beba en áreas donde se están utilizando las
muestras o los reactivos del kit.
c) Lávese las manos después de realizar la prueba.
™ Utilice solamente la enzima Taq polimerasa (Taq) suministrada con el
kit; no la sustituya con Taq de otros kits del mismo tipo o de cualquier
otro ni con Taq de otros proveedores.
™ Descongele solamente los reactivos necesarios para cada serie, no el
kit entero cada vez, a fin de reducir al mínimo los ciclos de
congelación/descongelación.
Información de seguridad
Precaución: todos los materiales químicos y biológicos deben ser
considerados potencialmente peligrosos. Las muestras son potencialmente
infecciosas y deberían tratarse como tal.
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El Kit de K-RAS únicamente deben utilizarlo las personas que hayan
recibido la formación adecuada en las técnicas de laboratorio
correspondientes. Cuando trabaje con los componentes de este Kit de
K-RAS, utilice siempre una bata de laboratorio adecuada, guantes
desechables y gafas de seguridad. Después de su uso, los componentes
del Kit de K-RAS deben desecharse como residuo clínico.
6. Condiciones de almacenamiento, estabilidad y envío
Almacenamiento
Todo el contenido del Kit de K-RAS debe almacenarse inmediatamente
tras la recepción a una temperatura comprendida entre -18 °C y -25 °C, a
oscuras y en un congelador que mantenga la temperatura constante. Evite
la congelación y descongelación innecesaria del contenido del Kit de
K-RAS.
Estabilidad
No utilice el Kit de K-RAS después de la fecha de caducidad mencionada.
El contenido del Kit de K-RAS se mantiene estable hasta la fecha de
caducidad si se almacena según las condiciones de almacenamiento
recomendadas y se conserva en el envase original.
El contenido del Kit de K-RAS se puede congelar/descongelar hasta
8 veces sin que se vea afectado el rendimiento del ensayo. NO
congele/descongele los reactivos del Kit de K-RAS más de 8 veces.
Condiciones de envío
El transporte del contenido del Kit de K-RAS se realiza en hielo seco y
debe seguir congelado a la llegada. En caso de que el Kit de K-RAS no
esté congelado al recibirlo, de que el embalaje externo se haya abierto
durante el transporte o de que el envío no incluya la nota de embalaje, las
instrucciones de uso o los reactivos, póngase en contacto con la oficina
local de Roche Diagnostics (consulte el apartado 12, Asistencia técnica,
para obtener la información de contacto).
7. Equipo
Consulte el manual de usuario del equipo para conocer las instrucciones
completas de instalación y uso del equipo de PCR en tiempo real.
8. Muestras
El material de las muestras debe ser ADN genómico humano, obtenido de
muestras de tumores colorrectales fijadas con formalina e incluidas en
parafina.
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Obtención y preparación de las muestras
1. Transporte de las muestras: metodología anatomopatológica estándar
para garantizar la calidad de las muestras.
2. Proceso recomendado de extracción de muestras: extracción de ADN
mediante el kit para ADN en tejidos FFPE de Qiagen QIAamp®
(número de catálogo 56404).
Deben aplicarse las siguientes enmiendas al protocolo Qiagen:
• Los cortes de FFPE deben colocarse en un portaobjetos de
vidrio.
• El exceso de parafina localizado alrededor de los cortes
tisulares debe retirarse mediante un bisturí estéril nuevo.
• El material del corte tisular debe depositarse en los tubos de
microcentrífuga utilizando un bisturí nuevo para cada muestra
que se vaya a extraer.
• Debe esperarse a la compleción de la digestión de la proteinasa
K. Este proceso puede tardar hasta 48 horas.
• Las muestras deben eluirse en 200 µl de tampón ATE del kit de
extracción de Qiagen.
El usuario final deberá validar cualquier método alternativo para la
preparación de muestras.
3. Almacenamiento del ADN extraído: debe almacenarse a -20 ˚C antes
de realizar el análisis.
Protocolo de evaluación de las muestras
Utilice la mezcla para ensayo de control adicional suministrada con el Kit
de K-RAS para valorar el ADN total de la muestra. El ensayo de control
amplifica una región del exón 4 del gen K-RAS. Las muestras deben
prepararse únicamente con el ensayo de control y utilizando el estándar
mezclado como control positivo y agua como control sin plantilla
(negativo). Cabe mencionar que las muestras deben distribuirse en lotes
para lograr un uso óptimo de los reactivos del Kit de K-RAS. Todas las
series experimentales deben utilizar controles. Si las muestras se analizan
por separado, se utilizarán más reactivos y será necesario disminuir el
número de muestras que se pueden analizar con el Kit de K-RAS.
Protocolo de evaluación de las muestras: configuración de la placa
1. Descongele la mezcla de reacción para el control y el estándar
mezclado del Kit de K-RAS a temperatura ambiente. Mezcle cada
solución invirtiendo cada tubo 10 veces, después de descongelarlos,
para evitar que se produzcan concentraciones localizadas de sales.
Prepare suficientes mezclas para las muestras de ADN, una reacción
para el estándar mezclado y una reacción para el control sin plantilla
(negativo), más 2 reacciones adicionales.
2. Para crear la mezcla maestra, utilice las cantidades de reactivos por
reacción que se indican en la tabla 3.
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Tabla 3: volúmenes de mezcla maestra por ensayo de control
Ensayo
Ensayo de
control
Mezcla maestra
Mezcla de
Taq (µl)x1
reacción (µl)x1
19,8
0,2
3. NO mezcle en vórtex la enzima Taq ni ninguna mezcla de reacción que
contenga Taq, ya que se podría inactivar la enzima.
4. Asegúrese de que la enzima Taq se encuentra a temperatura ambiente
antes de utilizarla. Gire el vial para asegurarse de que la totalidad de la
enzima Taq se haya depositado en el fondo del vial. Después, pipetee
colocando la punta de la pipeta bajo la superficie de la enzima Taq
para minimizar el riesgo de que la punta quede excesivamente
recubierta de Taq.
5. Mezcle la mezcla maestra pipeteando con cuidado en la zona superior
e inferior.
6. Añada inmediatamente 20 µl de la mezcla maestra de control en cada
pocillo de reacción.
7. Añada inmediatamente 5 µl de muestra, estándar mezclado o agua (en
el caso de los controles negativos) a los pocillos de reacción.
8. Prepare la placa añadiendo el estándar mezclado al pocillo A1 y el
control negativo (agua) al pocillo A2. El resto de los pocillos que se
utilicen deben contener las muestras.
9. Cierre y gire brevemente la placa de PCR para que los reactivos se
depositen en el fondo de los pocillos.
10. Siga los pasos de configuración del equipo correspondiente a la
plataforma en uso.
Protocolo de evaluación de las muestras: configuración del equipo
LightCycler® 480
1. Introduzca la placa inmediatamente en el equipo LightCycler® 480.
2. Seleccione el icono del programa LightCycler® 480 que se encuentra
en el escritorio de la estación de trabajo conectada al equipo. Inicie el
programa y desde la pantalla ‘Overview’ seleccione ‘New Experiment
from Template’. Seleccione una de las plantillas de análisis incluidas,
concretamente ‘K-RAS LC480II Run Template’. Esta plantilla presenta
los siguientes parámetros:
1. El formato de detección es ‘DxS IVD Assays’.
2. El volumen de reacción es 25.
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3. Una fase de mantenimiento inicial a 95 ˚C durante
4 minutos.
4. Amplificación en dos pasos durante 45 ciclos con
desnaturalización a 95 ˚C durante 30 segundos e
hibridación a 60 ˚C durante 1 minuto. La adquisición
de la fluorescencia es única y se produce en la fase a
60 ˚C.
3.
Seleccione la pestaña ‘Sample Editor’ que aparece en ‘Step 1: Select
Workflow’ y marque la casilla ‘Abs Quant’. En ‘Select Filter
Combinations’, asegúrese de que se hayan seleccionado los dos filtros
(465-510 nm y 533-580 nm). Establezca los nombres de la muestras
en los pasos 2 y 3. El valor correspondiente a ’Quantification Sample
Type’ debe definirse como ‘unknown’. La columna de réplica se debe
dejar en blanco.
4.
Haga clic en el botón ‘Experiment’ y luego en el botón ‘Start Run’ para
guardar el experimento e iniciar los ciclos.
5.
Una vez terminado el análisis, seleccione la pestaña ‘Analysis’ y elija
la opción ‘Abs Quant/2nd Derivative Max’ de la ventana ‘Create New
Analysis’. Acepte la configuración predeterminada de la pantalla
‘Create New Analysis’. Asegúrese de que el botón ‘Filter Comb’ tiene
el valor ‘465-510’ y seleccione el botón ‘Calculate’. Los valores de Ct
se muestran en la tabla ‘Samples’.
6.
Seleccione el botón ‘Filter Comb’ y cambie los filtros a 533-580 nm.
Seleccione el botón ‘Calculate’ y obtenga los valores de Ct del control
exógeno de la tabla ‘Samples’.
Protocolo de evaluación de las muestras: configuración del equipo
ABI7500
1. Introduzca la placa inmediatamente en el equipo ABI7500.
2. Seleccione el icono del programa del sistema 7500 que se encuentra
en el escritorio de la estación de trabajo conectada al equipo. Abra un
nuevo archivo de análisis del menú de archivos del programa 7500
Sequence Detection versión 1.4.
3. En ‘Assay’, seleccione ‘Standard Curve (Absolute Quantification)’. En
‘Run Mode’, seleccione ‘Standard 7500’.
4. Desplácese hasta la ventana de configuración de detectores con el
botón ‘Next’. En la lista de detectores, añada un detector FAM y un
detector JOE y defina los silenciadores con el valor ‘none’. Si estos
detectores no aparecen ya en la lista, seleccione el botón ‘New
Detectors’ y defina un detector FAM y un detector JOE con el
silenciador definido en el valor ‘none’.
5. Establezca ‘Passive Reference’ en ‘None’ y seleccione el botón ‘Next’.
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6. Seleccione toda la placa y marque las casillas de los detectores FAM y
JOE para garantizar que ambos marcadores se supervisan en cada
pocillo. Seleccione el botón ‘Finish’.
7. En la pestaña ‘Instrument’, defina los ciclos tal como se indica en la
tabla 4.
Tabla 4: condiciones de los ciclos en el sistema ABI7500
Temperatura
Fase 1
95 oC
Fase 2
95 oC
60 oC
Tiempo
Ciclos
4 minutos
1
30 segundos
1 minuto
40
Obtención
de datos
FAM, JOE
8. Seleccione el botón ‘Start’ para guardar el experimento e iniciar los
ciclos.
9. Al terminar la serie analítica, asegúrese de que la referencia pasiva
está definida en el valor ‘none’ en la pantalla de inspección de pocillos.
En la pestaña 'Amplification Plot', seleccione todos los pocillos en uso y
seleccione el marcador JOE del menú desplegable de detectores.
10. Compruebe la señal JOE de cada muestra y compárela con la señal
JOE del pocillo con NTC. Tenga en cuenta las muestras con una curva
de amplificación posterior o cuyo control exógeno no presente
amplificación en comparación con el NTC.
11. En la pestaña ‘Amplification Plot’, seleccione todos los pocillos en uso y
seleccione el marcador FAM del menú desplegable de detectores.
Utilice la configuración de referencia automática y el Ct manual y luego
defina el umbral manualmente en la mitad de la fase exponencial,
utilizando la escala logarítmica para el eje Y, tal como se describe en la
Guía de usuario del sistema ABI7500.
12. Seleccione el botón ‘Analyse’ para obtener los valores de Ct.
Interpretación de la validación de las muestras
Revise los valores de Ct del NTC para asegurarse de que no exista
contaminación que dé lugar a una amplificación positiva en el canal FAM
(Ct inferior a 40) o una reacción negativa del control exógeno en el canal
HEX (ausencia de Ct), lo que indicaría un problema de configuración. El
estándar mezclado debe dar un valor de Ct de 26-29 para el ensayo de
control (canal FAM) realizado en el sistema ABI7500 y ≤ 29 en el equipo
LightCycler® 480. No deben utilizarse los datos si alguno de estos 2
controles de análisis da error.
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Valor de Ct del ensayo de control comprendido entre 29-35: interprete con
precaución los datos ya que es posible que no se hayan detectado las
mutaciones de bajo nivel.
Valor de Ct del ensayo comprendido entre 35 y 38: En estos casos, en las
muestras sólo existen algunas copias amplificables de ADN y es probable
que las mutaciones sólo se detecten si la mayoría de las copias presentan
mutaciones.
Valor de Ct del ensayo de control ≥ 38: en estos casos debe rechazarse la
muestra porque el ADN presente es mínimo y el Kit de K-RAS no podrá
detectar las mutaciones.
Tenga en cuenta que si el valor de Ct del ensayo de control genera un
valor tardío, el valor de Ct del control exógeno de la muestra deberá
compararse con el control exógeno del NTC. Si el control exógeno de la
muestra se retrasa o es negativo, en comparación con el NTC, es posible
que exista un inhibidor. El efecto del inhibidor se puede reducir diluyendo
la muestra, aunque esto también diluirá el ADN.
Dilución de la muestra: un valor de Ct para el control < 24 sobrecargará
los ensayos de mutación. Las muestras con un valor de Ct para el control
< 24 se deben diluir. Se debe tener en cuenta que, en el equipo
LightCycler® 480, los valores de Ct obtenidos mediante el método de la
segunda derivada pueden ser ligeramente diferentes a los obtenidos con el
programa LightCycler® Adapt Software. Se recomienda diluir las muestras
concentradas para que sus resultados se encuentren en el intervalo > 24 y
< 29 (valores de Ct basados en el programa 7500 Sequence Detection o
en el programa LightCycler® 480 Instrument Software), partiendo de la
premisa que establece que dilución del 50% producirá un incremento
unitario del valor de Ct.
9. Protocolo de detección de mutaciones del gen K-RAS
™ Lea estas instrucciones detenidamente y familiarícese con
todos los componentes del Kit de K-RAS antes de empezar a
utilizarlo.
Para utilizar el Kit de K-RAS de forma eficaz, las muestras se deben
distribuir en lotes de 10 (para rellenar una placa de 96 pocillos). Un tamaño
de lote inferior a 10 implica que se pueden analizar menos muestras con el
Kit de K-RAS.
Configuración experimental del equipo LightCycler® 480
En cada muestra de ADN, los ensayos de control y la mutación deben
analizarse en la misma serie analítica de PCR para evitar las variaciones
entre series.
1. Descongele las mezclas de reacción y el estándar mezclado del Kit
de K-RAS a temperatura ambiente. Mezcle cada solución
invirtiendo cada tubo 10 veces, después de descongelarlos, para
evitar concentraciones localizadas de sales.
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Prepare suficientes mezclas para las muestras de ADN, el estándar
mezclado y los controles negativos, más 2 reacciones adicionales
por mezcla, tal y como se indica en la tabla 5.
Tabla 5: volúmenes de mezcla maestra para K-RAS
Ensayo
Ensayo de
control
Ensayos de
mutación
Mezcla de
reacción (µl)x1
Mezclas maestras
Mezcla de reacción Taq (µl) por placa
Taq (µl)x1
(µl) por placa (x14)
(x14)
19,8
0,2
277,2
2,8
19,8
0,2
277,2
2,8
2. NO mezcle en vórtex la enzima Taq ni ninguna mezcla de reacción
que contenga la enzima Taq, ya que podría quedar inactiva.
3. Asegúrese de que la enzima Taq se encuentra a temperatura
ambiente antes de utilizarla. Gire el vial para asegurarse de que la
totalidad de la enzima Taq se haya depositado en el fondo.
Después, pipetee colocando la punta de la pipeta bajo la superficie
de la enzima Taq para minimizar el riesgo de que la punta quede
excesivamente recubierta de Taq.
4. Pipetee con cuidado en la zona superior e inferior para mezclar las
mezclas maestras.
5. Añada inmediatamente 20 µl de las mezclas a los pocillos de
reacción.
6. Añada inmediatamente 5 µl de muestra, estándar mezclado o agua
(en el caso de los controles negativos) a los pocillos de reacción.
Cada muestra de ADN se debe analizar tanto con el ensayo de
control como con el ensayo de mutación. En la tabla 6 se ilustra la
configuración de la placa.
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Tabla 6: disposición de la placa del Kit de K-RAS
Disposición de 96 pocillos
Ensayo
A
Control
B
12ALA
C
12ASP
D
12ARG
E
12CYS
F
12SER
G
12VAL
H
13ASP
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Estándar
mezclado
NTC
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10
7. Cierre y gire brevemente la placa de PCR para que los reactivos se
depositen en el fondo de los pocillos.
8. Introduzca la placa inmediatamente en el equipo LightCycler® 480.
Configuración del equipo LightCycler® 480
1. Seleccione el icono del programa del equipo LightCycler® 480 que se
encuentra en el escritorio de la estación de trabajo conectada al equipo.
Inicie el programa y seleccione ‘New Experiment from Template’ en la
pantalla ‘Overview’.
2. En la lista ‘Run Templates’, seleccione ‘K-RAS LC480II Run Template’
(consulte el apartado sobre la validación de las muestras del equipo
LightCycler® 480 para obtener más información).
3. Seleccione la pestaña ‘Sample Editor’ y luego el cuadro de selección
‘Abs Quant’ en ‘Step 1: Select Workflow’. En ‘Select Filter
Combinations’, asegúrese de que se hayan seleccionado los dos filtros
(465-510 nm y 533-580 nm). Establezca los nombres de las muestras
en los cuadros ‘Step 2’ y ‘Step 3’. En la columna 1, el nombre de la
muestra debe ser ‘Mixed Standard’. En la columna 2, el nombre de la
muestra debe ser NTC. Introduzca los nombres de las muestras en las
columnas 3 a 12. Los nombres deben ser idénticos en todos los pocillos
de la columna 1. La opción ‘Quantification Sample Type’ debe
establecerse con el valor ‘unknown’. La columna de réplicas debe
permanecer vacía, ya que el programa LightCycler® Adapt Software no
tiene en cuenta las réplicas.
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Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
4. Haga clic en el botón ‘Experiment’ y luego en el botón ‘Start Run’ para
guardar el experimento e iniciar los ciclos.
Análisis de las muestras en el equipo LightCycler® 480
1. Una vez finalizada la serie analítica en el equipo LightCycler® 480,
utilice la ventana de exploración para exportar el experimento (archivo
.ixo) a una ubicación adecuada a la que pueda acceder mediante el
programa LightCycler® Adapt Software.
2. IMPORTANTE: el programa LightCycler® Adapt Software se ha
validado para su uso en sistemas de un solo ordenador definidos como
unidad de control única (estación de trabajo), equipos suministrados por
Roche Diagnostics para su uso con un único sistema LightCycler® 480
(Equipo II). Esta validación del programa LightCycler® Adapt Software
se aplica actualmente sólo a las unidades de control que actúan como
ordenadores independientes (p. ej., ordenadores que no forman parte
de un red). Se prohíbe el uso de cualquier otro ordenador dado que el
programa no funcionaría correctamente.
3. Abra el programa LightCycler® Adapt Software haciendo clic en el icono
del programa LightCycler® Adapt Software situado en el escritorio de la
estación de trabajo e introduzca el nombre de usuario en el campo
‘username’. Este nombre se utilizará para indicar el autor del informe.
4. En la ventana principal, utilice el botón para examinar y seleccione un
único archivo de análisis del equipo LightCycler® 480 (para deshacer
cualquier selección, cierre y vuelva a abrir el programa).
5. Seleccione un tipo de informe (pdf o csv). Si se selecciona el formato
csv, se creará automáticamente una versión pdf.
6. Seleccione ‘Analyse’ para elaborar el informe de resultados. El informe
se guarda automáticamente en una carpeta donde también se almacena
el archivo de análisis con el mismo nombre que el archivo de análisis.
7. El informe se muestra automáticamente.
8. Los resultados del informe se muestran en la columna ‘Mutation Status’
de la tabla ‘Sample Result Table’.
Interpretación de informes en el programa LightCycler® Adapt
Software
1. Los informes elaborados por el programa LightCycler® Adapt Software
contienen información general sobre el análisis.
1.1. El autor del informe es la persona que ha ejecutado el programa y
elaborado el informe.
1.2. La fecha y hora del análisis se indican en el mismo.
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2. El informe muestra un resumen del análisis, donde se detalla el nombre
del archivo de análisis utilizado, así como el archivo de definiciones de
algoritmos y la secuencia del algoritmo. Los detalles del algoritmo son
invariables, por lo que no pueden modificarse.
3. La sección de resultados incluye el nombre completo y la ruta del
archivo de análisis en el equipo LightCycler® 480, junto con la siguiente
información:
3.1. Número de serie del equipo LightCycler® 480
3.2. ‘Instrument Name’: identificador asociado al equipo LightCycler®
480 en el programa del equipo LightCycler® 480
3.3. ‘Run Date’: fecha y hora del análisis en el equipo LightCycler® 480
3.4. ‘Run Operator’: nombre de la persona que ha iniciado sesión en el
programa del equipo LightCycler® 480 para la ejecución del
análisis
3.5. ‘Experiment Name’: nombre del archivo de análisis
3.6. ‘Software Version’: versión del programa instalado en el equipo
LightCycler® 480
3.7. ‘Lot Number’: número procedente del campo ‘Lot No’ situado en la
pantalla de configuración del experimento, dentro del programa
LightCycler® 480
4. La disposición de la placa se indica con los nombres de las muestras
que aparecen en la pantalla del editor de muestras del programa del
equipo LightCycler® 480.
5. En la sección ‘Run Summary Result’ se indica si el análisis se considera
‘Valid’ (válido) o ‘Invalid’ (no válido). El resultado depende de los
controles de análisis expuestos en las columnas 1 y 2.
6. Controles de análisis
6.1. El
programa
LightCycler®
Adapt
Software
calcula
automáticamente el valor de ∆Ct del estándar mezclado mediante
la siguiente fórmula:
Ct de mutación-Ct de control=∆Ct
6.2. El programa LightCycler® Adapt Software compara los valores con
los valores previstos que se muestran en la tabla 7.
Tabla 7: valores de ∆Ct previstos del programa LightCycler® Adapt Software
Ensayo ∆Ct del estándar mezclado
12ALA
-0,61
12ASP
-0,61
12ARG
0,34
12CYS
-0,79
12SER
-0,13
12VAL
0,1
13ASP
-0,74
6.3. En el informe se presentan los valores de Ct y ∆Ct.
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6.4. Los controles de análisis de las columnas 1 y 2 generan los
siguientes indicadores/advertencias:
Tabla 8: indicadores/advertencias para controles de análisis del programa
LightCycler® Adapt Software
Indicador/Advertencia
CT_OUT_OF_RANGE
Significado
EXO_FAIL
DELTA_CT_OUT_OF_RANGE
EXO_CONTROL_INVALID
TARGET_CHANNEL_INVALID
6.4.1.
El Ct de FAM del ensayo de control está fuera
del intervalo
Para el estándar mezclado, se obtiene un Ct < 30
para el control exógeno o bien es negativo cuando
el resultado de FAM es negativo.
Los valores de ∆Ct de la mutación están fuera
del intervalo definido.
La reacción del control exógeno ha dado error
en un NTC.
La reacción de FAM tiene un valor de Ct positivo
en un NTC.
El significado de los indicadores y las advertencias se
explica detalladamente a continuación:
6.4.1.1. CT_OUT_OF_RANGE: el ensayo de control del
estándar mezclado debe tener un valor de Ct igual a
26,60 ± 2. Si el ensayo se encuentra fuera del intervalo,
se mostrará este indicador/esta advertencia para todos
los pocillos de estándar mezclado, puesto que no se
habrán calculado los valores de ∆Ct y el estándar
mezclado no será válido. Esto evidencia el
funcionamiento incorrecto del ensayo de control.
6.4.1.2. EXO_FAIL: este indicador/esta advertencia aparece
cuando el ensayo del control exógeno en alguno de los
pocillos de estándar mezclado es inferior a 30, valor que
indica la existencia de contaminación de PCR en la
mezcla. Si el ensayo del control exógeno da error
cuando una reacción de FAM es errónea en alguno de
los pocillos de estándar mezclado, el indicador/la
advertencia EXO_FAIL se mostrará igualmente. Esto
indica la existencia de un problema con el ensayo que
podría generar falsos negativos. El estándar mezclado
queda invalidado a causa del error de FAM.
6.4.1.3. DELTA_CT_OUT_OF_RANGE: si los valores de ∆Ct
del estándar mezclado se encuentran en el intervalo
±2,00 de los valores indicados en la tabla 7, el programa
notificará que el estado es válido. Si el valor de ∆Ct está
por encima del intervalo previsto, el estado será no
válido y aparecerá este mensaje/esta advertencia. Esto
indica un problema con el ensayo que podría generar
resultados falsos.
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Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
6.4.1.4. EXO_CONTROL_INVALID: en los pocillos de control
sin plantilla (negativo), el ensayo del control exógeno
debe generar un resultado positivo en los 8 pocillos
(Ct < 41). Si se obtiene un resultado negativo, se
mostrará este indicador/esta advertencia y el estado
será no válido. Esto indica un problema con el ensayo
que podría generar resultados incorrectos.
6.4.1.5. TARGET_CHANNEL_INVALID: en los 8 pocillos del
control sin plantilla, el resultado de FAM debe ser
negativo (Ct > 38). Cualquier amplificación indica la
existencia de contaminación. Si el resultado es positivo,
se mostrará este indicador/esta advertencia y se
invalidará el control sin plantilla (negativo).
6.5. En caso de que alguno de los pocillos con estándar mezclado o los
pocillos con control sin plantilla (negativo) obtengan un resultado
no válido, la sección ‘Run Summary Result’ mostrará el valor ‘Run
Invalid’ para indicar que el análisis no es válido. La tabla ‘Sample
Result Table’ incluirá los nombres de las muestras y los valores de
Ct del control, aunque el estado de la mutación será ‘invalid’ (no
válido). El estándar mezclado indica que todos los ensayos
funcionan correctamente. Si éste no fuera el caso, el programa
podría indicar que se trata de una mutación con un resultado de
falso positivo o falso negativo. El control sin plantilla (negativo)
indica la ausencia de contaminación en las mezclas maestras y el
funcionamiento correcto del control exógeno.
6.6. En el caso improbable de que el programa LightCycler® Adapt
Software genere un mensaje de error, consulte el apartado 12,
Asistencia técnica.
7. Resultados de las muestras
7.1. La tabla ‘Sample Result Table’ de resultados de las muestras
contiene los nombres de las muestras procedentes del programa
del equipo LightCycler® 480, además de los valores de Ct del
ensayo de control.
7.2. El programa LightCycler® 480 Adapt Software calculará los valores
de ∆Ct y determinará si una muestra es positiva o negativa para la
mutación en función de los valores de corte del 1% indicados en la
tabla 9.
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Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Tabla 9: valores de corte del 1% del programa LightCycler® Adapt Software
Ensayo Ct delta del 1%
12ALA
6,25
12ASP
7,72
12ARG
6,83
12CYS
6,95
12SER
8,95
12VAL
6,5
13ASP
9,09
7.3. Si el valor de ∆Ct de una mutación para una muestra se encuentra
por debajo del valor de corte de ∆Ct del 1% indicado, la muestra se
considera positiva para la mutación. El programa LightCycler®
Adapt Software informará de la mutación existente, pero sólo
notificará una única mutación. Si se dan 2 valores de ∆Ct positivos,
se mostrará el valor inferior. Se asume que el segundo valor se
obtiene por la reactividad cruzada de un cebador de mutación que
utiliza una mutación distinta para la unión y el cebado. En el caso
improbable de que se produzca una mutación doble, la decisión
clínica será idéntica a la de la mutación simple.
7.4. Si los valores de ∆Ct de las muestras superan los valores de ∆Ct
del 1%, la muestra se considera negativa para la mutación (es
posible que contenga una mutación, pero a un nivel por debajo de
los límites del kit).
7.5. Indicadores/Advertencias
7.5.1. El programa LightCycler® Adapt Software genera una serie
de indicadores/advertencias para las muestras de la tabla
‘Sample Result Table’, tal y como se describe en la
tabla 10.
Tabla 10: indicadores/advertencias para muestras del programa LightCycler®
Adapt Software
Indicadores/Advertencias
REP_DILUTION
CONF_LEVEL
LIMITED
EXO_FAIL
FAIL
Significado
El control de Ct es inferior a 24.
El control de Ct es superior a 28,9 y no se notifica
ninguna mutación.
El control de Ct es superior a 35.
El ensayo del control exógeno no se ha realizado
correctamente debido a que la reacción de FAM también
ha resultado errónea en una reacción de mutación,
o bien el Ct del control exógeno es inferior a 30.
El programa no es capaz de determinar si la curva
es positiva o negativa.
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7.5.2.
El significado de los indicadores y las advertencias se
explica detalladamente a continuación:7.5.2.1. REP_DILUTION: Ct de control < 24. Los ensayos se han
validado con relación a un nivel de ADN con un Ct de
control igual o superior a 24. Si una muestra genera un
valor de Ct para el ensayo de control inferior, será
necesaria su dilución para garantizar que esté dentro del
intervalo de funcionamiento válido.
7.5.2.2. CONF_LEVEL: Ct de control > 28,9. Se mostrará el
indicador/la advertencia CONF_LEVEL para las
muestras negativas con un Ct de control > 28,9. Los
valores de Ct de la mutación se consideran negativos o
por encima de los límites del kit cuando son superiores o
equivalentes a 38. Es necesario que el Ct de control sea
igual o inferior a 28,9 para disponer de ADN suficiente y
poder detectar el 1% de mutaciones, según los valores
de corte del 1% y un valor de corte de Ct de 38. Si el Ct
de control es superior a 28,9 y se detecta una mutación,
el programa informará de una mutación positiva y no se
mostrará este indicador/esta advertencia porque la
muestra contiene una mutación fija. No obstante, si el Ct
de control está por encima de 28,9 y todo parece indicar
que la muestra es negativa para la mutación, se
mostrará este indicador/esta advertencia para avisar de
la posibilidad de que se hayan ignorado las mutaciones
de bajo nivel. A media que el Ct de control aumenta por
encima de 28,9, disminuye la sensibilidad de detección
de las mutaciones.
7.5.2.3. LIMITED: Ct de control > 35. Indica la existencia de muy
poco ADN amplificable, por lo que sólo se podrán
detectar las mutaciones presentes en un porcentaje
elevado. En el caso de las muestras pertenecientes a la
categoría LIMITED, si una mutación positiva genera un
Ct < 38, el programa la seguirá considerando y
presentando como válida. No debe descartarse la
presencia de mutaciones de bajo nivel en una muestra
con un resultado negativo y el indicador/la advertencia
LIMITED.
7.5.2.4. EXO_FAIL: el programa comprueba la amplificación del
ensayo del control exógeno para determinar la presencia
de un inhibidor, que podría dar lugar a falsos negativos.
Se aplica la siguiente lógica:-
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a. La reacción del control exógeno se valorará
únicamente en los pocillos de reacción de la
mutación, no en el pocillo del ensayo de control, a
excepción del el estándar mezclado y las columnas
de NTC (consulte el punto 6) o si hay un Ct < 30 para
el control exógeno.
b. Si el programa determina que existe una mutación
positiva pero informa de un error en el ensayo del
control exógeno en el pocillo positivo para la
mutación, no se mostrará el indicador/la advertencia
EXO_FAIL, ya que podría haber una posible inhibición
competidora desde la reacción de FAM. El estado de
la mutación es válido.
c. Si el programa determina que existe una mutación
positiva para una muestra en un pocillo de mutación y
un error en el ensayo del control exógeno de otro
pocillo de mutación de la misma muestra, se indicará
que existe una mutación en el primer pocillo y el
resultado se considerará válido. No obstante, se
mostrará el indicador/la advertencia EXO_FAIL. Esto
indica un problema con el ensayo del pocillo donde se
ha producido el error del ensayo del control exógeno y
la posibilidad de que se haya ignorado una mutación
en este pocillo.
Es posible que la mutación indicada contenga
reactividad cruzada entre los ensayos en lugar de una
mutación real, que se puede haber omitido. Sin
embargo, el estado de la mutación del ensayo que
genera la mutación positiva sigue siendo válido, pues
existe una mutación clara y la decisión clínica no se
modifica, independientemente del tipo de mutación.
d. Si la muestra se considera negativa pero se ha
producido un error en alguno de los ensayos de
mutación de la reacción del control exógeno, se
mostrará el indicador/la advertencia EXO_FAIL y el
estado no será válido. Es posible que se haya omitido
una mutación.
e. Si el Ct del ensayo del control exógeno es < 30 en
alguno de los 8 pocillos, se mostrará el indicador/la
advertencia EXO_FAIL y el estado no será válido. Es
posible que exista contaminación del producto de
PCR en este ensayo.
f. Existe la opción de revisar el archivo de análisis del
equipo LightCycler® 480 para determinar las posibles
causas de error del ensayo del control exógeno. Si
todas las reacciones del control exógeno resultan
erróneas en una columna, debe considerarse la
presencia de algún inhibidor.
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Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Si el error se produce en 1 pocillo solamente, puede
que el problema radique en la configuración de la
placa.
7.5.2.5. FAIL: se mostrará el indicador/la advertencia FAIL
cuando el programa no puede determinar si una curva
de amplificación es positiva o negativa (p. ej. debido a
una forma de curva anómala).
7.5.3. El programa LightCycler® Adapt Software comprueba que
el nombre de la muestra de una columna sea idéntico. El
objetivo es garantizar que los valores de Ct de la mutación
y el ensayo de control utilizados para calcular los valores
de ∆Ct proceden de la misma muestra. Los nombres de las
muestras se obtienen del archivo de análisis del
experimento ubicado en la pantalla del editor de muestras
del equipo LightCycler® 480. Si se produce un error de
coincidencia en la columna, el programa mostrará el
mensaje ‘SAMPLE MISMATCH’ en la columna ‘Sample
Name’ de la tabla ‘Sample Result Table’. En la disposición
de la placa, el programa muestra el nombre de la muestra
seguido de (MISMATCH). Si se trata de un error de
escritura, se puede corregir el nombre en el archivo de
análisis del equipo LightCycler® 480 y volver a analizar los
datos con el programa LightCycler® Adapt Software.
Configuración experimental del sistema ABI7500
Para cada muestra de ADN, los ensayos de control y de mutación se deben
analizar en la misma serie de PCR a fin de evitar variaciones entre series
analíticas.
1. Descongele las mezclas de reacción y el estándar mezclado del Kit
de K-RAS a temperatura ambiente. Mezcle cada solución
invirtiendo cada tubo 10 veces, después de descongelarlos, para
evitar concentraciones localizadas de sales. Prepare suficientes
mezclas para las muestras de ADN, el estándar mezclado y los
controles sin plantilla (negativos), además de 2 reacciones
adicionales por mezcla, tal y como se indica en la tabla 11.
Tabla 11: volúmenes de mezcla maestra de K-RAS
Ensayo
Ensayo de
control
Ensayo de
mutación
Mezcla de
reacción (µl)x1
Mezclas maestras
Mezcla de reacción Taq (µl) por placa
Taq (µl)x1
(µl) por placa (x14)
(x14)
19,8
0,2
277,2
2,8
19,8
0,2
277,2
2,8
2. NO mezcle en vórtex la enzima Taq ni ninguna mezcla de reacción
que contenga Taq, ya que se podría inactivar la enzima.
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3. Asegúrese de que la enzima Taq se encuentra a temperatura
ambiente antes de utilizarla. Gire el vial para asegurarse de que la
totalidad de la enzima Taq se haya depositado en el fondo.
Después, pipetee colocando la punta de la pipeta bajo la superficie
de la enzima Taq para minimizar el riesgo de que la punta quede
excesivamente recubierta de Taq.
4. Mezcle las mezclas maestras pipeteando con cuidado en la zona
superior e inferior.
5. Añada inmediatamente 20 µl de las mezclas maestras en los
pocillos de reacción.
6. Añada inmediatamente 5 µl de muestra, estándar mezclado o agua
(en el caso de los controles negativos) en los pocillos de reacción.
Cada muestra de ADN se debe analizar tanto con el ensayo de
control como con el ensayo de mutación. En la tabla 12 se ilustra la
configuración de la placa.
Tabla 12: disposición de la placa de K-RAS en el sistema ABI7500
Disposición de 96 pocillos
Ensayo
A
Control
B
12ALA
C
12ASP
D
12ARG
E
12CYS
F
12SER
G
12VAL
H
13ASP
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Estándar
mezclado
NTC
Muestra
1
Muestra
2
Muestra
Muestra
Muestra 4
5
3
Muestra
Muestra
Muestra 7
8
6
Muestra
9
Muestra
10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra
1
Muestra
2
Muestra
Muestra
Muestra 4
5
3
Muestra
Muestra
Muestra 7
8
6
Muestra
9
Muestra
10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra
1
Muestra
2
Muestra
Muestra
Muestra 4
5
3
Muestra
Muestra
Muestra 7
8
6
Muestra
9
Muestra
10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra
1
Muestra
2
Muestra
Muestra
Muestra 4
5
3
Muestra
Muestra
Muestra 7
8
6
Muestra
9
Muestra
10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra
1
Muestra
2
Muestra
Muestra
Muestra 4
5
3
Muestra
Muestra
Muestra 7
8
6
Muestra
9
Muestra
10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra
1
Muestra
2
Muestra
Muestra
Muestra 4
5
3
Muestra
Muestra
Muestra 7
8
6
Muestra
9
Muestra
10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra
1
Muestra
2
Muestra
Muestra
Muestra 4
5
3
Muestra
Muestra
Muestra 7
8
6
Muestra
9
Muestra
10
Estándar
mezclado
NTC
Muestra
1
Muestra
2
Muestra
Muestra
Muestra 4
3
5
Muestra
Muestra
Muestra 7
6
8
Muestra
9
Muestra
10
7. Cierre y gire brevemente la placa de PCR para que los reactivos se
depositen en el fondo de los pocillos.
8. Introduzca la placa inmediatamente en el equipo ABI7500.
Configuración del equipo ABI7500
1. Seleccione el icono del programa del sistema 7500 que se encuentra
en el escritorio de la estación de trabajo conectada al equipo. Abra un
nuevo archivo de análisis del menú de archivos mediante el programa
7500 Sequence Detection Software, versión 1.4.
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
2. En ‘Assay’, seleccione ‘Standard Curve (Absolute Quantification)’. En
‘Run Mode’, seleccione ‘Standard 7500’.
3. Desplácese hasta la ventana de configuración de detectores con el
botón ‘Next’. En la lista de detectores, añada un detector FAM y un
detector JOE y defina los silenciadores con el valor ‘none’. Si estos
detectores no aparecen ya en la lista, seleccione el botón ‘New
Detectors’ y defina un detector FAM y un detector JOE con el
silenciador definido en el valor ‘none’.
4. Establezca ‘Passive Reference’ en ‘None’ y seleccione el botón ‘Next’.
5. Seleccione toda la placa y marque las casillas de los detectores FAM y
JOE para garantizar que ambos marcadores se supervisan en cada
pocillo. Seleccione el botón ‘Finish’.
6. En la pestaña ‘Instrument’, defina los ciclos tal como se indica en la
tabla 13.
Tabla 13: condiciones de los ciclos en el sistema ABI7500
Temperatura
Fase 1
95 oC
Fase 2
95 oC
60 oC
Tiempo
Ciclos
4 minutos
1
30 segundos
1 minuto
40
Obtención
de datos
FAM, JOE
7. Seleccione el botón ‘Start’ para guardar el experimento e iniciar los
ciclos.
Análisis de las muestras en el sistema ABI7500
1. Asegúrese de que la referencia pasiva está definida en el valor ‘none’
en la pantalla de inspección de pocillos.
2. Compruebe que cada pocillo emite una señal JOE desde el ensayo de
control exógeno.
a. Si el ensayo de control exógeno arroja un resultado positivo,
prosiga con el análisis.
b. Si el ensayo de control exógeno es erróneo pero la reacción de
FAM se ha amplificado suficientemente, prosiga con el análisis
puesto que la reacción de FAM tiene prioridad sobre la reacción del
control exógeno.
c. Si las dos reacciones, la de FAM y la del control exógeno, no se
producen correctamente, descarte los datos puesto que puede
haber inhibidores. Estos inhibidores podrían conducir a falsos
negativos.
3. En la pestaña ‘Amplification Plot’, seleccione todos los pocillos en uso
y seleccione el marcador FAM del menú desplegable de detectores.
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Use la configuración de línea de base automática y el Ct manual y, a
continuación, defina el umbral manualmente en la mitad de la fase
exponencial, mediante la escala logarítmica para el eje Y, tal como se
describe en la Guía de usuario del sistema ABI7500.
4. Analice los datos y calcule el valor de ∆Ct de la siguiente forma:
[Ct del ensayo de mutación de la muestra] – [Ct del ensayo de
control de la muestra] =∆Ct
Los datos se pueden exportar a Microsoft Excel para facilitar su
análisis.
Interpretación de los datos del sistema ABI7500
1. Valores de Ct de control:
1.1. El valor de Ct de control debe ser ≥ 24 para evitar una sobrecarga
del ensayo.
1.2. Ct de control < 29: el Kit de K-RAS ofrece una capacidad de
detección hasta un mínimo de un 1% de mutaciones en estas
muestras.
1.3. En las muestras con un Ct de control ≥ 29, el kit no detectará
menos del 1% de las mutaciones, aunque sí detectará mutaciones
de nivel más elevado.
1.4. Con un Ct de control ≥ 35, en la muestra sólo habrá presentes
algunas copias amplificables de ADN, y las mutaciones
únicamente son detectables si hay numerosas copias con
mutaciones.
1.5. En el caso de un Ct de control ≥ 38, el ADN será limitado y no se
podrán usar los datos.
2. Valores de ∆Ct del estándar mezclado
2.1. Los valores de ∆Ct del estándar mezclado deben ser los indicados
en la tabla 14, aunque se pueden producir variaciones de ±2
debido a configuraciones de umbrales distintas en equipos
diferentes.
Tabla 14: valores de ∆Ct del estándar mezclado y puntos de corte del 1% en
el sistema ABI7500
Ensayos
∆Ct del
estándar
mezclado
12ALA
12ASP
12ARG
12CYS
12SER
12VAL
13ASP
-0,70
-1,04
-0,02
-0,98
0,02
-0,19
-1,12
Intervalo
aceptable del
estándar
mezclado
De -2,70 a 1,30
De -3,04 a 0,96
De -2,02 a 1,98
De -2,98 a 1,02
De -1,98 a 2,02
De -2,19 a 1,81
De -3,12 a 0,88
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∆Ct del 1%
de la
muestra
6,5
8
8
7
9
6,5
9
Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
3. Valores de ∆Ct de la muestra:
3.1. Si el valor de ∆Ct de la muestra es superior al valor del 1% (como
se indica en la tabla 14), la muestra de ADN será clasificada como
negativa para las mutaciones o por debajo de los límites del Kit de
K-RAS.
3.2. Si el valor de ∆Ct es inferior al valor del 1%, el ADN de la muestra
se clasificará como positiva para las mutaciones.
3.3. Los valores de Ct de mutación de 38 o superiores se deben
clasificar como negativos o por debajo de los límites del kit.
10. Limitaciones de la prueba
Es preciso tener un Ct de ensayo de control de la muestra < 29 en el
sistema ABI7500 y del < 28,9 en el equipo LightCycler® 480 para
garantizar la detección del 1% de mutaciones en ADN normal de
referencia. Los ensayos no podrán detectar el 1% de mutaciones en
muestras con valores superiores de Ct; por su parte, la sensibilidad de la
detección de mutaciones disminuirá puesto que el Ct de control aumenta
por encima de esos valores.
El valor del Ct de control del ADN de la muestra se basa en la
concentración determinada por la PCR. Los valores basados en las
lecturas de densidad óptica no se corresponden con los valores de Ct del
ensayo de control en muestras fragmentadas de ADN. Para poder realizar
una validación del Ct de la muestra antes de analizar el kit se suministra
una mezcla de reacción de control adicional.
Si una muestra arroja un resultado positivo de mutación donde el Ct de
mutación es ≥ 38, el ensayo se debe clasificar como negativo o por debajo
de los límites del kit. El programa LightCycler® Adapt Software lleva a
cabo esto automáticamente.
Se puede producir reactividad cruzada entre las reacciones de mutación.
Por ejemplo, si se observa una mutación de 12ALA de gran nivel, algunas
de las reacciones de mutación restantes también arrojarán un resultado
positivo. Esto se debe a que los cebadores ARMS detectan otras
mutaciones en bases cercanas. En material de control sintético, la
reactividad cruzada forma un patrón legible en el sistema ABI7500 que
permite que los positivos verdaderos se determinen a partir de varias
señales (consulte la tabla 15).
Tabla 15: patrón de reactividad cruzada en el sistema ABI7500 a partir de
material de control sintético
"Sí" indica la señal verdadera. Los números indican el número aproximado
de ciclos después de la señal verdadera que pueden observarse en una
señal de reactividad cruzada. No se han incluido valores superiores a
9 ciclos puesto que se encontrarían en la zona negativa.
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Para uso diagnóstico solamente
Muestra
positiva
12ALA
12ASP
12ARG
12CYS
12SER
12VAL
13ASP
Señal
de
12ALA
Sí
9
9
4
-
Señal
de
12ASP
9
Sí
7
6
-
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Señal
de
12ARG
Sí
4
9
-
Señal
de
12CYS
6
Sí
-
Señal
de
12SER
3
Sí
-
Señal
de
12VAL
6
Sí
-
Señal
de
13ASP
8
Sí
Nota: el patrón de reactividad cruzada puede ser diferente, por ejemplo, en
muestras de ADN incluidas en parafina.
El Kit de K-RAS ha sido diseñado para detectar una mutación en una
muestra de ADN. Si un segundo ensayo de mutación arroja un resultado
positivo, es muy probable que se trate de reactividad cruzada. Sin
embargo, aunque es poco probable, se han observado dobles mutantes
en contadas ocasiones. Si el patrón no se adapta al patrón de reactividad
cruzada, será preciso realizar una investigación más detallada.
11. Características del rendimiento del ensayo
Se ha definido el rendimiento del ensayo para el Kit de K-RAS en el
sistema ABI7500 y en el equipo LightCycler® 480 (a través del programa
LightCycler® Adapt Software para obtener los valores de Ct). Para ello, se
ha realizado una gran variedad de pruebas en cada equipo. A continuación
encontrará un resumen de los resultados de estas pruebas.
Validación del punto de corte del 1%:
Equipo LightCycler® 480: se determinó la detección del 1% de
mutaciones en ADN de líneas celulares negativo para las mutaciones de
K-RAS de referencia en tres concentraciones distintas de ADN de líneas
celulares con objeto de asignar un valor de ∆Ct de corte para cada ensayo
de mutación.
Para cada ensayo se analizaron los estándares del 1% por triplicado, en
3 series analíticas distintas, tanto para el ensayo de control como para el
ensayo de mutación. Este paso se repitió con 3 usuarios distintos. Los
valores de Ct se obtuvieron del programa LightCycler® Adapt Software.
Los valores de ∆Ct del 1% se calcularon a partir de todas las
combinaciones de valores de Ct de mutación y control a lo largo de las
réplicas de una serie analíticas.
Los valores de ∆Ct de corte se definieron como la media de todas las
series analíticas y todas las concentraciones. Los resultados de estas
pruebas se resumen en el apartado sobre la interpretación de los datos.
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
ABI7500: para cada ensayo, las diluciones del 1% se analizaron por
triplicado, en 3 lotes de kits, en 3 series analíticas independientes, tanto
para el ensayo de control como para el ensayo de mutación. Se usó el
estándar mezclado en cada placa para garantizar que los ensayos se
realizaran de acuerdo con los criterios especificados.
Los valores de ∆Ct del 1% se calcularon a partir de los valores del Ct
medio de las réplicas de una serie analítica y de un lote. Los valores de
∆Ct de corte se definieron como la media (más cercana al 0,5) de todos los
lotes, las series analíticas y las concentraciones en que todas las réplicas
obtuvieron un valor de Ct. Los resultados de estas pruebas se resumen a
continuación en la tabla 16.
Tabla 16: resultados de validación de los valores de corte del 1% en el
sistema ABI7500
Valores de
∆Ct del 1%
12ALA
6,68
6,5
12ASP
8,2
8
12ARG
8,16
8
12CYS
6,94
7
12SER
8,83
9
12VAL
7,67
7,5*
13ASP
8,89
9
* El corte del 1% para 12Val se modificó al 6,5 según el estudio de progresión. A
continuación encontrará más datos al respecto.
Ensayo
Media
Determinación del ∆Ct del estándar mezclado:
Equipo LightCycler® 480: los valores de ∆Ct del estándar mezclado son
medias obtenidas a partir de 50 series analíticas del estándar mezclado.
Los valores de Ct se obtuvieron a partir del programa LightCycler® Adapt
480 Software.
Los valores de ∆Ct previstos para el estándar mezclado se muestran en el
apartado sobre la interpretación de datos.
ABI7500: los valores del estándar mezclado se han definido usando la
media de 422 valores de ∆Ct. Éstos a su vez se calcularon a partir de
numerosos lotes de kits y series analíticas distintos.
Los valores de ∆Ct previstos para el estándar mezclado se muestran en el
apartado sobre la interpretación de datos.
Validación de la progresión: se entiende como progresión la
amplificación inespecífica de los ensayos de mutación de una diana de
ADN normal presente en una muestra concreta. Esto provoca un nivel
medible de ruido de fondo. Se valoró la progresión de ADN normal para
cada ensayo de mutación. El estudio de progresión garantizó que los
valores de corte del 1% establecidos anteriormente fueron inferiores al
nivel de progresión y que evitarían la comunicación de un falso positivo.
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Equipo LightCycler® 480: se analizaron por duplicado y en 5 placas
10 muestras de ADN de líneas celulares negativas para las mutaciones de
K-RAS en diferentes concentraciones, 5 muestras FFPE negativas para las
mutaciones de K-RAS y 5 muestras FFPE positivas para las mutaciones
de K-RAS. Las muestras positivas para mutación dieron positivo para una
única mutación, mientras que el resto de las mutaciones se usó para
analizar la progresión. Los valores de Ct se obtuvieron con el programa
LightCycler® Adapt Software y se usaron todas las combinaciones de
valores de Ct para calcular el ∆Ct.
Los resultados de los ensayos negativos para las mutaciones de las
muestras de ADN de líneas celulares y de FFPE arrojaron valores de ∆Ct
que fueron todos superiores a los valores de corte del 1%, lo que
demuestra la estabilidad de los valores de corte del 1%. En la tabla 17 se
muestran los peores niveles de progresión obtenidos de las 5 series
analíticas.
Tabla 17: resultados de progresión
Ensayo
12ALA
12ASP
12ARG
12CYS
12SER
12VAL
13ASP
Peores valores de
∆Ct de progresión
12,35
11,36
Sin progresión
Sin progresión
11,74
12,29
11,29
ABI7500: se ha valorado la progresión mediante ADN de línea celular
agrupado de líneas celulares negativas para la mutación del gen K-RAS en
3 niveles diferentes de ADN. Se analizaron tres placas de PCR idénticas.
Cada placa contenía 3 lotes de reactivos. Se utilizó el estándar mezclado
como control positivo. Además, se analizaron por duplicado muestras de
FFPE positivas. La mayoría de las muestras positivas para mutación dan
un resultado positivo para una única mutación. El resto de los ensayos de
mutación pueden utilizarse para valorar la progresión (aunque se prevé
algún tipo de reactividad cruzada entre algunos ensayos y mutaciones
positivas. Sin embargo, este proceso genera un modelo conocido). Se han
obtenido los valores de Ct y los valores de ∆Ct y se han comparado con
los valores de corte del 1%.
Los datos del ADN de línea celular y las muestras de FFPE arrojaron unos
valores de ∆Ct superiores todos a los valores de corte del 1%, a excepción
de una muestra de FFPE que obtuvo un valor de ∆Ct justo por debajo
(6,84) del valor de corte de 7,5. Dado que el intervalo de datos para la
determinación del valor de corte del 1% cubría el valor 6,84, se cambió el
valor de ∆Ct del 1% del ensayo 12VAL de 7,5 a 6,5 para evitar la
posibilidad de un resultado falso positivo.
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
La tabla 18 muestra los valores de ∆Ct del 1% actuales a partir de los
resultados de validación de la progresión.
Tabla 18: resultados de la validación de progresión
Ensayo
12ALA
12ASP
12ARG
12CYS
12SER
12VAL
13ASP
Valores de ∆Ct
del 1%
6,5
8
8
7
9
6,5
9
Validación de la precisión:
Equipo LightCycler® 480: el análisis de la precisión se ha realizado
mediante controles sintéticos del 1% en 3 niveles distintos de ADN de línea
celular negativo para la mutación del gen K-RAS. Cada control se ha
analizado por triplicado para cada ensayo correspondiente en una placa
que también contenía estándar mezclado duplicado y reacciones NTC
simples para garantizar que las reacciones funcionaban según las
especificaciones. La misma placa se repitió 54 veces durante 6 días. A la
matriz de análisis se incorporó el uso de 3 equipos, 3 lotes de reactivos y
3 usuarios.
Los valores de Ct se obtuvieron del programa LightCycler® Adapt Software
y se utilizaron todas las combinaciones de los valores de Ct para calcular
los valores de ∆Ct. Cualquier valor de ∆Ct que superara tres veces el
intervalo intercuartil se consideró fuera del rango y se eliminó del análisis.
Se calcularon las medias, los errores estándar y las desviaciones estándar
y se agruparon los datos por lote de kit, equipo o usuario a fin de valorar
las variaciones provocadas por dichas variables. También se valoró la
repetibilidad general de los ensayos.
Los datos indican que la variabilidad general entre ensayos es baja y que
2 desviaciones estándar cercanas a la media cubren un intervalo de
±1,4 ciclos con referencia a la media para el ensayo con una desviación
estándar máxima.
Para cada prueba, el ∆Ct medio de cada usuario está comprendido en
0,15 ciclos de la media general para todos los datos. Las diferencias entre
usuarios no llegaron a superar en 0,2 el Ct, lo que demuestra que la
variabilidad entre usuarios no es superior a la variabilidad existente entre el
conjunto de los datos y que la variabilidad entre usuarios no afecta a la
estabilidad de los ensayos.
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Para cada prueba, la diferencia entre las medias de cada equipo y la
media general fue de ±0,097 y la diferencia entre medias de cada equipo
nunca fue peor que ±0,186, lo que demuestra que la variabilidad entre
equipos no fue superior a la variabilidad existente entre todos los datos y
que la variabilidad entre equipos no incide en la estabilidad de los ensayos.
Para cada análisis, la diferencia máxima entre un solo lote y los promedios
generales fue de ± 0,195 y las peores diferencias entre lotes fueron de
± 0,38, lo que demuestra que la variabilidad entre lotes no fue superior a la
variabilidad entre el conjunto de datos y que dicha variabilidad entre lotes
no incide en la estabilidad de los ensayos.
ABI7500: se han llevado a cabo experimentos para establecer el
rendimiento de la precisión de cada ensayo mediante la repetición de una
placa de PCR con un intervalo de muestras de elevada y reducida
concentración de ADN y un nivel de mutación bajo, con 3 lotes de
reactivos durante todo un día, durante varios días, entre usuarios y entre
equipos.
Se ha utilizado una ANOVA unidireccional para valorar la variación entre
réplicas, lotes de reactivos, análisis, día de ejecución de la serie analítica y
usuario. La hipótesis nula se estableció definiendo la igualdad para los
valores promedio de las diferentes categorías. También se calcularon las
medias totales, la SD y el %CV para los valores de Ct.
Ninguno de los ensayos mostró una desviación significativa (en el nivel
p=0.05) respecto a la hipótesis nula que establece que las medias son
idénticas en todas las categorías. Todo ello indica que la estabilidad de los
ensayos no se ve afectada por las variaciones existentes entre equipos,
usuarios, lotes, días o series analíticas.
Validación de la exactitud:
Equipo LightCycler® 480: para valorar la exactitud se han utilizado
92 muestras FFPE y 28 diluciones de línea celular positivas para la
mutación. Las pruebas se han realizado con el Kit de K-RAS y se ha
empleado la secuenciación de Sanger. Se comparó la clasificación de las
mutaciones de K-RAS con los 2 métodos y se obtuvieron 18 resultados
discrepantes (5 cortes FFPE y 13 líneas celulares), en los que la
secuenciación indicaba un resultado negativo aunque la muestra fuera
positiva con el ensayo DxS. Para confirmar la presencia de una mutación
en estas 18 muestras, se clonó la región próxima a las mutaciones de cada
muestra. Se ha utilizado la presencia de un clon positivo para la mutación
con el fin de resolver la discrepancia.
ABI7500: para valorar la exactitud se han utilizado controles sintéticos
diluidos en 2 niveles de ADN de línea celular negativo para la mutación del
gen K-RAS con objeto de obtener 3 porcentajes distintos de mutación que
cubran tanto el nivel de mutación positivo como el negativo. Para cada
mutación se han analizado tres placas idénticas, cada una con 3 lotes de
reactivos.
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
Se analizaron los niveles de mutación de 25%, 5% y 0,5%. (Las muestras
del 25% y el 5% deberían dan un resultado positivo para la mutación (∆Ct
inferior a los valores de corte del 1%); la muestra del 0,5% debería dar un
resultado negativo para la mutación (∆Ct superior a los valores de corte del
1%)). Los resultados se resumen en la tabla 19 que figura a continuación.
Tabla 19: resultados de la validación de la exactitud para ABI7500
Ensayo
25%
5%
0,5%
Ensayo
100%
100%
94%
12ALA
100%
100%
100%
12ASP
100%
100%
100%
12ARG
100%
100%
100%
12CYS
100%
100%
100%
12SER
100%
100%
100%
12VAL
100%
100%
100%
13ASP
100%
100%
100%
La reducción de la exactitud en el ensayo 12ALA responde a la variación
existente entre las réplicas en un nivel de ADN.
Validación de la linealidad:
Equipo LightCycler® 480: para valorar la linealidad se han utilizado
estándares sintéticos con niveles de mutación del 100%, el 1% y el 0%
para cada ensayo. Se ha realizado una dilución en serie para cada
porcentaje de mutación a fin de conservar el nivel de mutación y reducir la
cantidad total de ADN. Se han generado curvas estándar mediante la
dilución por triplicado en 3 placas de réplicas para el ensayo de control y el
ensayo de mutación correspondiente. Los valores de Ct se han calculado
mediante el programa LightCycler® Adapt Software. También se ha creado
un gráfico para cada mutación (sin datos) donde se ha plasmado la
representación de los Ct del ensayo de control y de mutación a fin de
compararlos y luego se ha realizado una regresión para cada nivel de
mutación. También se han representando los intervalos de confianza del
95% para cada nivel de mutación.
En el análisis de la concentración del 0% no se han obtenido valores de Ct
para la mutación. Los gráficos de las concentraciones del 100% y el 1%
muestran que existe una clara discriminación entre los conjuntos de datos
y que las pendientes de las curvas presentaban una equivalencia
sustancial, lo cual denota una eficacia de la amplificación similar para todo
el intervalo de concentraciones de mutación.
ABI7500: este estudio valora la eficacia de cada ensayo de mutación en el
intervalo de concentraciones de ADN con ADN normal y agua. Cada
ensayo de mutación debería conseguir una eficacia comprendida entre el
90% y el 110% (100% + 10%).
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Para uso diagnóstico solamente
Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
La elaboración de las curvas estándar se ha realizado utilizando una
dilución en serie de 5 ciclos. Para cada ensayo se utilizó una placa de PCR
con tres lotes de reactivos del kit. El análisis de los estándares de
mutación del 100% se realizó con 50 ng, 10 ng, 2 ng y 0,4 ng de ADN en
cada uno de los ensayos de mutación mediante su dilución en agua.
También se analizaron los ensayos de mutación mediante una dilución en
serie de 5 ciclos en 10 ng/µl de ADN de línea celular para valorar la
eficacia de la progresión.
Las curvas estándar para cada ensayo de mutación se han elaborado a
partir de los datos experimentales. La eficacia de la PCR se calculó con la
siguiente ecuación:
100((10-1/Pendiente)-1)
El nivel superior de progresión en las diluciones de línea celular de
10 ng/µl obtuvo una eficacia superior al 100%.
Se calculó la eficacia general entre lotes de reactivos. Todos los valores
obtenidos fueron similares y comprendidos en un intervalo del 10% con
relación a la eficacia del ensayo de control. Las curvas estándar paralelas
entre el ensayo de control y los ensayos de mutación indican que el
método de ∆Ct es adecuado.
El nivel de linealidad obtenido es aceptable para el intervalo comprendido
entre 0,4 ng de ADN y 50 ng de ADN.
Validación de la reactividad cruzada:
Equipo LightCycler® 480: no se ha efectuado la validación de la
reactividad cruzada puesto que el programa LightCycler® Adapt Software
se limita a determinar una única mutación con el ∆Ct inferior.
ABI7500: puesto que todas las mutaciones detectadas con el Kit de
K-RAS se producen en la región de pares de 5 bases, se espera algún tipo
de reacción cruzada entre los cebadores. Este estudio determinó el
modelo de reactividad cruzada para el Kit de K-RAS.
La evaluación se llevó a cabo mediante controles de mutación sintéticos
con objeto de establecer el número de ciclos que se podían detectar tras
una señal positiva real de reactividad cruzada. Se analizó cada mezcla de
reacción para mutación con seis réplicas de cada uno de los siete
controles de mutación al 100%. Además, se analizó cada control con la
mezcla de reacción emparejada y todas las demás mezclas de reacción en
la misma serie analítica.
La determinación del modelo de reactividad cruzada se llevó a cabo
calculando la diferencia entre el valor de Ct de la amplificación real del
casete emparejado y la señal de reactividad cruzada del resto de los
cebadores.
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Kit de mutaciones de K-RAS de TheraScreen
La tabla 20 resume el modelo de reactividad cruzada previsto. Se ha
demostrado que el modelo de reactividad cruzada se mantiene estable y
permite al usuario interpretar un modelo de amplificación, en el que más de
un ensayo dé un resultado positivo, a fin de obtener el resultado correcto
para el ensayo. Los números de cada celda indican el número aproximado
de ciclos posteriores a la detección de la señal positiva real en los que
puede detectarse la señal de reactividad cruzada. No se han incluido los
valores superiores a 9 porque se clasifican como negativos para la
mutación.
Tabla 20: resultados de la validación de la reactividad cruzada
para ABI7500
Muestra
positiva
Señal
12ALA
Seña
12ASP
Señal
12ARG
Señal
12CYS
Señal
12SER
Señal
12Val
Señal
13ASP
12ALA
12ASP
12ARG
12CYS
12SER
12VAL
13ASP
Sí
9
9
4
-
9
Sí
7
6
-
Sí
4
9
-
6
Sí
-
3
Sí
-
6
Sí
-
8
Sí
Validación de la tolerancia entre ciclos:
Equipo LightCycler® 480: estos estudios determinaron la tolerancia de
los ensayos de mutación con relación a las variaciones de temperatura
entre ciclos. Dado que la temperatura de hibridación es la más importante
para el rendimiento del ensayo, el parámetro de variación establecido fue
la temperatura de hibridación.
La validación de la tolerancia entre ciclos se ha llevado a cabo mediante
estándares sintéticos del 1% en 3 niveles distintos de ADN. Se han
realizado análisis por triplicado de las muestras para cada mutación, junto
con reacciones duplicadas de estándar mezclado y reacciones de NTC
simples, para garantizar que el rendimiento de los ensayos está
comprendido entre las especificaciones.
Cada placa se analizó a temperaturas de hibridación de 59 ˚C, 60 ˚C y
61 ˚C. 60 ˚C es la temperatura óptima para el análisis del ensayo, pero la
variabilidad entre bloques de PCR (o en los bloques de PCR) indica que el
ensayo debe ser estable en todo el intervalo. Cada placa se analizó por
triplicado con cada una de las temperaturas. Los valores de Ct se
obtuvieron del programa LightCycler® Adapt Software y se utilizaron todas
las combinaciones de los valores de Ct de control y mutación de cada
muestra para calcular los valores de ∆Ct.
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Los resultados de todos los ensayos se sitúan dentro de los criterios
admitidos según los cuales los valores obtenidos a las temperaturas de
59 ˚C y 61 ˚C no deben ser diferentes del valor de media para 60 ˚C ± la
desviación estándar para 60 ˚C. Todo ello indica que la estabilidad de los
ensayos no se ve afectada por una desviación de 1 ˚C para la temperatura
de hibridación.
ABI7500: se analizaron tres placas de PCR idénticas, cada una con 3 kits
de lotes de reactivos, a cada una de las temperaturas de hibridación.
También se analizó el estándar mezclado, puesto que estaba formado por
50 ng de ADN de línea celular agrupado negativo para la mutación. Dado
que 60 °C es la temperatura de hibridación recomendada, las placas se
analizaron a 58 °C, 60 °C y 62 °C. Si la validez establecida para los
ensayos toleraba las temperaturas experimentales, los valores de ∆Ct del
estándar mezclado deberían situarse entre +1,5 de los valores definidos
para el estándar mezclado y los valores de ∆Ct de la línea celular
agrupada deberían ser superiores a los puntos de corte del 1%.
La muestra 12ASP fue la que mostró una mayor susceptibilidad a la
variación de temperatura; sin embargo, los resultados de todos los
ensayos fueron correctos para las 3 temperaturas, lo que indica que la
validez de los ensayos es buena cuando se utilizan temperaturas 2 °C
superiores o inferiores a la temperatura óptima.
Validación de la tolerancia de Taq:
Equipo LightCycler® 480: estos estudios determinaron la tolerancia de
los ensayos de mutación a las variaciones en el nivel de la enzima Taq
polimerasa, una posible fuente de variación entre usuarios puesto que son
éstos quienes la añaden. La validación de la tolerancia de los ensayos a
los diferentes niveles de Taq se realizó con estándares sintéticos del 1%
en 3 niveles distintos de ADN. Se analizó cada muestra por triplicado para
un nivel elevado, normal y reducido de Taq (nivel elevado supone un 20%
de Taq adicional y nivel reducido, un 20% menos de la Taq utilizada
normalmente). También se ejecutaron reacciones dobles de estándar
mezclado y reacciones simples de NTC para garantizar que el rendimiento
de los ensayos esté comprendido entre las especificaciones. Se realizaron
series por triplicado para cada placa y se analizaron 3 lotes distintos de
Taq.
Los valores de Ct se obtuvieron del programa LightCycler® Adapt Software
y para calcular los valores de ∆Ct se utilizaron todas las combinaciones de
los valores de Ct de las réplicas de una placa.
Los resultados de todos los ensayos están comprendidos entre los criterios
según los cuales los valores promedios de la Taq elevada y la Taq
reducida no difieren del valor promedio del nivel normal de Taq en más de
1 desviación estándar de los datos de Taq normales.
ABI7500: se analizaron tres placas de PCR idénticas, cada una con 3 lotes
de reactivos, para cada ensayo de mutación.
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Se aplicaron cambios en el nivel de la Taq polimerasa comprendidos entre
+10% y -10% con relación a la cantidad recomendada (que también se
analizó). También se analizó el estándar mezclado, ya que había
estándares del 1% en 2 niveles de ADN y 50 ng de ADN de línea celular
negativa para la mutación. Se analizaron los datos del ensayo para
obtener las medias, la desviación estándar y la variación de coeficientes.
Los resultados mostraron una variación mínima (SD equivalente entre
ensayos, %CV <10%) en los resultados del ensayo cuando el nivel de Taq
variaba en +10%, lo que demuestra que los ensayos pueden tolerar una
variación máxima del 10% en los niveles de Taq polimerasa.
12. Asistencia técnica
Para recibir asistencia técnica o información más detallada, póngase en
contacto con su distribuidor de Roche. En el apartado 13 figura una lista con
los detalles de contacto de los principales distribuidores de Roche.
13. Información sobre el fabricante y el distribuidor
DxS Limited,
48 Grafton Street, Manchester
M13 9XX, Reino Unido
Roche Molecular Systems, Inc.,
Branchburg, NJ, 08876 USA
Miembro de Roche Group
REINO
UNIDO
FRANCIA
ESPAÑA
Roche Diagnostics
Charles Avenue
Burgess Hill,
West Sussex,
United Kingdom RH15 9RY
Roche Diagnostics S.A.
2 Avenue du Vercors
BP 59, Meylan Cedex,
38240
Roche Diagnostics S.L.
Av. de la Generalitat, s/n
Sant Cugat del Valles
Barcelona, E-08190
ALEMANIA
Roche Diagnostics GmbH
Sandhoferstr. 116
Dept. VM-G
Mannheim, D-68298,
SUIZA
Roche Diagnostics
(Schweiz) AG
Industriestr. 7
Rotkreuz, CH-6343
Roche Diagnostics – Italy
V. le G.B. Stucchi 110
Monza (MI), I-20052
ITALIA
Si ha comprado este kit en un país que no figura en la lista de oficinas de
Roche Diagnostics indicadas más arriba, póngase en contacto con Roche
Diagnostics GmbH (Mannheim), a través de la dirección indicada.
CENTRO DE
DISTRIBUCIÓN
PRINCIPAL
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
D-68305 Mannheim
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14. Fecha de publicación de la última revisión
Fecha de la última versión: febrero de 2009
Resumen de cambios: Cambio de valor en las tablas 5 y 11.
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Notas para el comprador:
Se prohíbe la reventa, la transferencia o la modificación para la venta sin el
consentimiento previo por escrito de DxS Limited de este producto, el kit de
mutaciones K-RAS de TheraScreen® y todos sus componentes.
TheraScreen® y Scorpions® son marcas registradas de DxS Limited.
ARMS® es una marca registrada de AstraZeneca UK Limited.
LIGHTCYCLER y ROCHE son marcas registradas de Roche.
ABI7500 es una marca registrada de Applied BioSystems.
Este producto es un dispositivo de diagnóstico con marcado CE
fabricado según la Directiva de productos sanitarios para diagnóstico in
vitro 98/79/CE de la Unión Europea.
La compra de este producto viene acompañada de una licencia intransferible
y limitada para utilizar las tecnologías ARMS® y Scorpions® únicamente con
fines de diagnóstico in vitro.
ARMS® está registrado por la patente de EE.UU. 5.595.890 y EP 332435; y
Scorpions®, por la patente de EE.UU 6.326.145 y EP1088102.
La información de este documento está sujeta a cambios. DxS Limited no
asume ninguna responsabilidad por los errores que puedan aparecer en este
documento. DxS Limited no se hará responsable en ningún caso ni de ningún
modo (sea por contrato, agravio (incluida la negligencia) u otros supuestos)
de ninguna reclamación derivada o relacionada con el uso de este producto.
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