Y Chromosome AZF Analysis System Technical Manual

Y Chromosome AZF Analysis System Technical Manual
TECHNICAL MANUAL
Y Chromosome
AZF Analysis System
2800 Woods Hollow Rd.
Madison, WI USA
Productos sanitarios
para diagnóstico
in vitro
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hanover, Alemania
INSTRUCCIONES DE
USO DEL PRODUCTO
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MD1631
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Y Chromosome
AZF Analysis System
Manual técnico TM252
INSTRUCCIONES DE USO DEL PRODUCTO MD1631.
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1.
1.
Uso previsto del producto........................................................................................................1
2.
Descripción .................................................................................................................................2
3.
Componentes del producto .....................................................................................................3
4.
Consideraciones generales .....................................................................................................3
A. Muestra patrón de ADN .................................................................................................3
B. Condiciones de PCR ........................................................................................................4
C. Termocicladores ...............................................................................................................4
D. Control de la contaminación ..........................................................................................5
E. Reacciones de control ......................................................................................................5
5.
Reacciones de amplificación ...................................................................................................5
A. Preparación de la reacción..............................................................................................6
B. Protocolo de ciclo térmico mediante PCR óptimo para el termociclador
Perkin-Elmer Model 480 .................................................................................................8
C. Electroforesis en gel de agarosa.....................................................................................8
D. Análisis de los datos: controles......................................................................................9
E. Análisis de los datos: muestras experimentales .......................................................10
6.
Bibliografía ...............................................................................................................................11
7.
Apéndice....................................................................................................................................11
A. Composición de tampones y soluciones ....................................................................11
B. Hojas de cálculo..............................................................................................................12
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Alemania
Uso previsto del producto
ESPAÑOL
El Y Chromosome AZF Analysis System(a) cumple los requisitos de la Directiva 98/79/CE
de la Unión Europea sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro. El Y
Chromosome AZF Analysis System proporciona un método multiplex basado en PCR
para analizar la integridad de la región AZF del cromosoma Y humano. El Y
Chromosome AZF Analysis System está pensado para su uso como parte de un plan de
diagnóstico con objeto de caracterizar la infertilidad masculina. Los resultados del
diagnóstico obtenidos mediante este sistema se deben interpretar junto con otros datos
clínicos o de laboratorio. Esta información resulta potencialmente útil para los pacientes
que se estén planteando la fertilización in vitro, puesto que las deleciones situadas en la
región AZF del cromosoma Y se transmiten a los descendientes masculinos engendrados
mediante fertilización in vitro, lo que tiene como resultado la infertilidad del niño.
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Descripción
El Y Chromosome AZF Analysis System proporciona un método para la detección de la
región AZF del cromosoma Y humano. El sistema consta de 20 pares de cebadores que son
homólogos a sitios con secuencias marcadas previamente identificados y cartografiados
(SSM; 1–7). Estos cebadores amplificarán los segmentos cortos de ADN no polimórficos del
cromosoma Y al utilizarlos en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR; 6,8). Los
cebadores se han combinado en cinco juegos de Multiplex Master Mix para su uso en PCR
multiplex. Esto permite determinar la presencia o la ausencia de las 20 SSM realizando cinco
amplificaciones mediante PCR simultáneas (figura 1). Las deleciones del cromosoma Y
localizadas en las regiones amplificadas por estos juegos de cebadores se han asociado con la
infertilidad masculina (1,2,6,9–17). En general, las regiones adyacentes del cromosoma Y no
aparecen como productos de amplificación secuenciales dentro de una única reacción de
amplificación multiplex. Las excepciones son las regiones SY242 y SY208 del locus DAZ, que
aparecen representadas como productos de amplificación secuenciales en las reacciones con
Multiplex B Master Mix, y las regiones SY84 y SY86 de los loci DYS273 y DYS148 que
aparecen representadas como productos de amplificación secuenciales en las reacciones con
Multiplex E Master Mix.
Las Multiplex Master Mixes A–D contienen un par de cebadores de control que amplifican
los fragmentos del locus SMCX ligado al cromosoma X. La quinta Multiplex Master Mix,
Multiplex E, contiene un par de cebadores de control que amplifica una región única tanto
del ADN masculino como femenino (ZFX/ZFY). Estos pares de cebadores de control son
controles internos para las reacciones de amplificación multiplex y prueban la integridad de
la muestra de ADN genómico. Finalmente, la Multiplex E Master Mix también incluye un
par de cebadores que amplifica una región del gen SRY, que actúa como amplificación de
control para el factor determinante testicular situado en el brazo corto del cromosoma Y
humano.
A
B
M 1 2 M 3 4
C
M 5 6
D
M 7 8
E
M 9 10 M
500 –
400 –
300 –
– 500
– 400
– 300
200 –
– 200
100 –
– 100
50 –
– 50
4322TA09_3A
bp
Figura 1. Ejemplo de amplificación de ADN genómico masculino. Amplificación de ADN
genómico masculino (MD115A) (calles 1, 3, 5, 7, 9), así como de control negativo sin ADN
(calles 2, 4, 6, 8, 10), para cada una de las Multiplex Master Mixes.
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Componentes del producto
Producto
Y Chromosome AZF Analysis System
Tamaño
25 reacciones
Nº de cat.
MD1631
Prohibida su venta en Estados Unidos. Sólo para exportación. El Y Chromosome AZF Analysis
System incluye:
Leyenda de símbolos
–10°C
–30°C
MD154A
MD155A
MD156A
MD157A
MD158A
M300C
P119F
G452C
MD115A
G190B
Multiplex A Master Mix
Multiplex B Master Mix
Multiplex C Master Mix
Multiplex D Master Mix
Multiplex E Master Mix
GoTaq® DNA Polymerase(c)
Nuclease-Free Water
50bp DNA Step Ladder (340 ng/µl)
Male Genomic DNA (50 ng/µl)
Blue/Orange 6X Loading Dye
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
200 u
1,25 ml
90 µg
2,5 µg
1 ml
Productos
sanitarios para
diagnóstico in vitro
–10°C
6010TC
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
–30°C
Conservar de –10 a
–30°C
Condiciones de almacenamiento: Conserve todos los componentes de –10 a –30°C. Evite
realizar múltiples ciclos de congelación-descongelación.
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4.
Consideraciones generales
A.
<n>
Contiene suficiente
para “n” pruebas
Muestra patrón de ADN
La concentración, la pureza y el tamaño del ADN constituyen consideraciones
importantes con el fin de asegurar unos resultados satisfactorios con el
Y Chromosome AZF Analysis System. Un ADN de mala calidad puede tener como
resultado un aumento del la amplificación de fondo o un fallo de la amplificación.
El fallo de la amplificación se puede manifestar como una ausencia completa de
amplificación en todas las bandas con las Mutiplex Master Mixes o como la formación
de subpoblaciones residuales de alelos en las mezclas maestras individuales. Con el
fin de evitar esto, utilice únicamente ADN de alta calidad con una proporción de
absorbancia A260/A280 ≥1,8. El ADN no se debe someter a esfuerzos cortantes y debe
estar libre de proteínas contaminantes, de etanol o de sales (especialmente EDTA;
la concentración de EDTA debe ser <0,4 mM).
Representante
autorizado
ESPAÑOL
Cuantifique el ADN antes de su uso en el Y Chromosome AZF Analysis System,
dado que la adición de una cantidad demasiado grande o demasiado pequeña de
ADN puede hacer que las reacciones fallen. Para la estimación de la concentración
de ADN se pueden utilizar las medidas espectrofotométricas (absorbancia) a 260 nm
(A260) en las que 1 uA = 50 µg de ADN bicatenario/ml. En cada reacción de
amplificación mediante PCR multiplex se deben utilizar cincuenta nanogramos de
ADN. Se puede obtener una sobreestimación de la concentración de ADN mediante
espectrofotometría si la proporción A260/A280 es baja o si el valor de la absorbancia
es pequeño (inferior a 0,1).
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B.
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Condiciones de PCR
Es posible que se formen gradientes de concentración en las Multiplex Master Mixes
conservadas a –20 °C. Tras descongelar las muestras según las indicaciones, agite
con vórtex cada tubo durante 10–15 segundos antes del uso. Precaliente el
instrumento hasta 94 °C antes de colocar los tubos en su interior. No utilice más de
1 unidad de ADN polimerasa GoTaq® por cada reacción de amplificación mediante
PCR multiplex. Los volúmenes finales habituales de la PCR con el Y Chromosome
AZF Analysis System son de 25 µl. Unos volúmenes de PCR de 12,5 µl pueden
tener como resultado la aparición de múltiples bandas residuales, por lo que no se
deben utilizar.
C.
Termocicladores
El Y Chromosome AZF Analysis System se ha desarrollado mediante el uso
del termociclador Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480. El uso con otros
termocicladores necesitará la validación y optimización del protocolo por parte
del usuario.
Utilice únicamente tubos de pared delgada para la amplificación mediante PCR.
Con el termociclador Perkin-Elmer Model 480 utilice tubos de reacción GeneAmp®
de pared delgada de 0,5 cm de capacidad.
1.
Termocicladores con tapas térmicas frente a no térmicas.
Se encuentran disponibles termocicladores con tapas térmicas o con tapas no
térmicas. En el caso de los termocicladores que tienen una tapa no calentada
(p. ej., el Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480), es necesario colocar un
recubrimiento de aceite mineral sobre la reacción para evitar la evaporación de
la misma durante el ciclo térmico. Para los termocicladores con tapas térmicas,
no resulta necesario el recubrimiento con aceite mineral. La tapa térmica de
estos termocicladores evita la evaporación de la reacción durante el transcurso
del ciclo térmico. No obstante, asegúrese de que la tapa térmica funciona
correctamente. En el caso de que observe que sus tubos de reacción
amplificados en un termociclador equipado con tapa térmica muestran
condensación en la tapa y alrededor de la parte superior del tubo de reacción,
esto constituye una indicación de que la tapa térmica no funciona
correctamente y es posible que se haya obtenido un mal resultado de las
amplificaciones del sistema. Si no está seguro de la calibración de su tapa
térmica u observa condensación en el tubo de reacción, añada un
recubrimiento de aceite mineral.
2.
Velocidad de la rampa de calentamiento / enfriamiento del termociclador.
El tiempo que dura un ciclo del termociclador entre las temperaturas de
desnaturalización, anillamiento y extensión de los perfiles de ciclo término de
PCR (denominados frecuentemente “tiempo de rampa”) puede afectar a la
amplificación mediante PCR. La velocidad con la que el termociclador realiza un
ciclo entre las temperaturas del perfil de ciclo térmico de PCR depende de su
fabricación. El protocolo de ciclo mediante PCR proporcionado se ha optimizado
para el termociclador Perkin-Elmer Model 480. Los usuarios deberán validar los
tiempos de rampa para utilizar otros termocicladores.
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Calibración del equipo.
El éxito de la amplificación mediante PCR, especialmente en la PCR multiplex,
depende de la realización de un ciclo térmico preciso. Asegúrese de la
calibración del equipo termociclador que está utilizando con el Y Chromosome
AZF Analysis System.
D.
Control de la contaminación
Resulta fundamental evitar la contaminación con ADN de los componentes de
reacción. Para evitar la contaminación, las áreas de trabajo previas y posteriores a la
amplificación deben estar aisladas, preferiblemente en salas separadas. Utilice
siempre puntas de pipetas con barrera frente a aerosoles, pipetas exclusivas para la
preparación de las reacciones, guantes desechables limpios y evite la contaminación
por arrastre de las soluciones de reserva. Los lugares de trabajo y las pipetas deben
limpiarse con una solución de lejía suave antes y después de cada uso.
E.
Reacciones de control
En cada experimento se deben incluir reacciones de control adecuadas.
5.
1.
En todos los casos se deben llevar a cabo reacciones de amplificación en paralelo
con las muestras, utilizando el control positivo Male Genomic DNA como
patrón. La amplificación mediante PCR del control positivo Male Genomic DNA
suministrado siempre debe dar lugar a los productos de amplificación esperados
(consulte los tamaños esperados en el Apartado 7.B, Tabla 1).
2.
Siempre se debe llevar a cabo una reacción de amplificación mediante PCR con
un control negativo sin ADN en paralelo con las muestras, con objeto de
verificar que los reactivos no están contaminados con ADN. La amplificación
mediante PCR de un control sin ADN no debe producir producto de
amplificación alguno.
Reacciones de amplificación
Materiales que ha de aportar el usuario
(En el Apéndice, Apartado 7.A, se encuentran las composiciones de las soluciones.)
•
•
•
•
ESPAÑOL
•
•
•
•
Aceite mineral ligero libre de nucleasa
Termociclador
Tubos de amplificación de pared delgada
• En el caso del termociclador Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480, utilice
tubos de reacción GeneAmp® de pared delgada de 0,5 ml de capacidad (nº de
componente N801-0737, N801-0611 o N801-0537 de Applied Biosystems)
Gel de agarosa preparado: minigeles de NuSieve® 3:1 al 4 % más agarosa con
tampón TBE preparada Reliant® (nº de cat. 54927, 54928 o 54929 de Cambrex)
1 tampón de TBE
Bromuro de etidio
Puntas de pipeta resistentes a aerosoles
Transiluminador de UV
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Preparación de la reacción
Consulte en la figura 2 un resumen del diagrama de flujo del protocolo de
preparación de la reacción. En este procedimiento, se colocan alícuotas de los ADN
de muestra en un tubo de reacción. Separadamente, se añade ADN polimerasa Taq
a cada una de las Multiplex Master Mixes. A continuación, la Multiplex Master Mix
que contiene ADN polimerasa Taq se añade a los tubos de reacción que contienen el
ADN de muestra. Cada muestra de ADN se analiza utilizando cada una de las cinco
Multiplex Master Mixes.
Diluya el ADN de muestra
(en Nuclease-Free Water)
y prepare los controles
Prepare las mezclas de Multiplex Master Mix
y ADN polimerasa Taq, una para cada
Multiplex Master Mix
ADN de
muestra
Control positivo
de Male
Genomic DNA
Control
negativo
sin ADN
Prepare las reacciones:
1. Coloque el ADN de muestra
o el control en los tubos.
2. Anada la mezcla de
Multiplex Master Mix
y ADN polimerasa Taq.
Multiplex
Master Mix para
cada muestra
A
ADN de
muestra
Control
positivo
B
ADN polimerasa
Taq para cada
muestra
C
D
E
Control
negativo
A
B
C
Ciclo térmico
D
E
3856MA10_2A
Electroforesis en gel de agarosa
Figura 2. Representación esquemática del análisis con el Y Chromosome AZF Analysis System.
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1.
Descongele las Multiplex Master Mixes, Nuclease-Free Water y Male Genomic
DNA en hielo. Una vez descongeladas, consérvelas en hielo. Agite con vórtex
las Multiplex Master Mixes durante 5-10 segundos antes del uso.
2.
Complete la tabla siguiente para determinar el número de reacciones para
cada Multiplex Master Mix. Para cada muestra de ADN habrá cinco tubos de
reacción, uno para cada Multiplex Master Mix. Incluya un control positivo de
Male Genomic DNA y un control negativo sin ADN para cada Multiplex
Master Mix.
Multiplex
Master Mix
A
B
C
D
E
Nº de
ADN
de muestra
Control
positivo de Male
Genomic DNA
1
1
1
1
1
Control
negativo
sin ADN
1
1
1
1
1
Tubos de
reacción
totales
3.
Prepare y etiquete el número necesario de tubos de reacción determinado
anteriormente. Utilice tubos de amplificación de pared delgada. Coloque los
tubos de reacción en hielo.
4.
En un tubo separado, diluya cada muestra de ADN hasta 10 ng/µl con el
Nuclease-Free Water suministrada. Mezcle bien con vórtex durante
5–10 segundos. Añada 5 µl de ADN a los tubos de reacción etiquetados
debidamente que se encuentran en el hielo.
Muestra de ADN de control positivo: Para la muestra de control positivo de
Male Genomic DNA, diluya el Male Genomic DNA hasta 10 ng/µl añadiendo
6 µl de Male Genomic DNA a 24 µl de Nuclease-Free Water. Mezcle bien con
vórtex durante 5–10 segundos. Añada 5 µl a los tubos de reacción etiquetados
adecuadamente que se encuentran en el hielo.
Muestra de control negativo sin ADN: Para el control negativo (sin ADN),
añada 5 µl de Nuclease-Free Water a los tubos de reacción etiquetados
adecuadamente que se encuentran en el hielo.
Prepare cinco mezclas de Multiplex Master Mix / ADN polimerasa GoTaq® en
hielo, una para cada Multiplex Master Mix. Agite con vórtex las Multiplex
Master Mixes antes de usarlas.
Componente
Multiplex Master Mix
ADN polimerasa GoTaq® (5 u/µl)
volumen final
Volumen por
reacción
20 µl
0,2 µl
20,2 µl
Volumen por
10 reacciones
200 µl
2 µl
202 µl
6.
Mezcle agitando en el vórtex.
7.
Añada 20 µl de la mezcla de Multiplex Master Mix/ADN polimerasa GoTaq®
a los tubos de reacción apropiados, que contienen el ADN de muestra o los
controles, conservados en hielo.
8.
Mezcle agitando suavemente con vórtex.
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5.
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9.
Centrifugue los tubos brevemente para hacer descender todo el contenido al
fondo de los mismos. Mantenga los tubos de reacción en hielo hasta que se
encuentren listos para el ciclo térmico.
10.
Los termocicladores que no dispongan de tapa térmica (por ejemplo, el PerkinElmer Model 480 thermal cycler) requieren la aplicación de un recubrimiento
con aceite mineral sobre las reacciones en el tubo de reacción. Incline los tubos
y añada una gota de aceite en la pared lateral del tubo, dejando que descienda
por ella.
Protocolo de ciclo térmico mediante PCR óptimo para el termociclador
Perkin-Elmer Model 480
El siguiente protocolo se ha optimizado para el termociclador Perkin-Elmer Model
480. En el caso de utilizar un termociclador diferente, el usuario es responsable de la
validación y optimización del protocolo.
Es crucial precalentar el instrumento hasta 94 °C antes de colocar los tubos en su
interior.
Termociclador
Model 480
C.
Tubos de reacción
ADN Polimerasa
Condiciones de PCR
Tubos de reacción
GeneAmp® de pared
delgada, 0,5 ml
GoTaq®
94°C durante 2 minutos, después
94°C durante 1 minuto
57°C, durante 30 segundos
72°C durante 1 minuto
Repetir durante 35 ciclos y después:
72°C durante 5 minutos
bajada y mantenimiento a 4°C
DNA
Polymerase
Electroforesis en gel de agarosa
Para llevar a cabo la electroforesis y conseguir una posterior visualización óptima de los
productos de amplificación, se requieren minigeles de NuSieve® 3:1 al 4% más agarosa
con tampón TBE preparada Reliant® (Nº de Cat 54927, 54928 ó 54929 de Cambrex).
1.
Diluya el marcador de peso molecular del siguiente modo:
Componente
50bp DNA Step Ladder
Blue/Orange 6X Loading Dye
Nuclease-Free Water
Volumen
12 µl
4 µl
8 µl
2.
Añada 2,5 µl del Blue/Orange 6X Loading Dye a cada tubo de amplificación
y mezcle.
3.
Cargue 10 µl del marcador de peso molecular diluido en el primer pocillo del gel.
4.
Cargue 10 µl/pocillo de cada muestra.
5.
Cargue 10 µl del marcador de peso molecular diluido en el último pocillo del gel.
6.
Coloque el gel en TBE 1X que contenga 0,5 µg/ml de bromuro de etidio
y aplique 5 V/cm (medidos como la distancia entre los electrodos) hasta que
el frente de tinte de azul de bromofenol migre hasta el final del gel.
7.
Fotografíe el gel con ayuda del transiluminador de UV (320 nm).
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Análisis de los datos: Controles
Compruebe que las reacciones de control han producido los resultados esperados
antes de analizar sus muestras. Las hojas de cálculo proporcionadas (consulte el
Apartado 7.B, Tabla 1) se pueden utilizar tanto para el análisis de los controles como
para el de las muestras experimentales.
Control negativo sin ADN: No deberían aparecer productos de amplificación
específicos en las calles que contienen las reacciones de control negativo sin
ADN. Pueden aparecer algunas bandas o manchas de bajo peso molecular como
resultado de las interacciones de los cebadores. Los resultados no se pueden
considerar válidos si se observan productos de amplificación en las reacciones
de control negativo sin ADN. Esto es indicativo de ADN contaminante y se debe
repetir el experimento poniendo especial cuidado para evitar la contaminación.
2.
Control positivo de Male Genomic DNA: En la tabla 1 (Apartado 7.B) se indica
el número y tamaño de los productos de amplificación para cada Multiplex
Master Mix. La reacción de control positivo con Male Genomic DNA para cada
Multiplex Master debería mostrar todas las bandas indicadas para esa Multiplex
Master Mix (Apartado 7.B, Tabla 1). Los tamaños de los productos de
amplificación se pueden estimar comparándolos con el marcador 50bp DNA
Step Ladder incluido en el gel. Si no están presentes todas las bandas esperadas
en las reacciones con el control positivo de Male Genomic DNA o si se observan
bandas extra importantes, esto es indicativo de un problema con los reactivos de
amplificación o con el termociclador. Los resultados no se pueden considerar
válidos si cualquiera de los productos de amplificación no aparece en las
reacciones con el control positivo de Male Genomic DNA.
3.
Cebador de control en las Multiplex Master Mixes: En las reacciones con las
Multiplex A, B, C y D Master Mix, el producto de amplificación más pequeño
(83 pb) se debería producir a partir de un locus ligado al cromosoma X (SMCX).
En el caso de la Multiplex E Master Mix, el producto de amplificación más
grande (496 pb) se debería producir a partir de los genes ZFY/ZFX. La ausencia
de estos productos es indicativa de un problema con esa amplificación
mediante PCR multiplex particular. En el caso de que estas bandas de control
aparezcan con el control positivo de Male Genomic DNA pero no con el ADN
de muestra, esto sugiere que puede haber algún problema con el ADN
genómico utilizado como patrón. Los problemas con el ADN de muestra
pueden ser: la presencia de impurezas, una cuantificación del ADN imprecisa
o un ADN degradado. Verifique el patrón de ADN en un gel de agarosa antes
de repetir la amplificación. Repita las amplificaciones para cualquiera de las
reacciones con ADN de muestra en las que no aparezca el producto de control.
Puede resultar necesario aislar de nuevo el ADN genómico patrón.
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E.
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Análisis de los datos: muestras experimentales
Las hojas de cálculo proporcionadas en el Apéndice, Apartado 7.B, se pueden utilizar para
el análisis de las muestras experimentales. Determine la presencia o la ausencia de los
productos de PCR esperados (Apartado 7.B, Tabla 1). Si en estas reacciones no aparece
alguno de los productos, se pueden localizar con ayuda de la hoja de cálculo para la
cartografía del cromosoma Y (Apartado 7.B, Tabla 2). Todas las deleciones deberían
aparecer contiguas. Si faltan múltiples bandas de amplificación y esas bandas no se
localizan en regiones adyacentes del cromosoma Y (Apartado 7.B, Tabla 2), estas
representan bandas residuales y no son deleciones. En este caso, se deberá repetir el
análisis. La ausencia de una sola banda de amplificación en una muestra puede
representar una banda residual y, por tanto, se deberá repetir el análisis para confirmar
que el locus no se amplifica. Tenga en cuenta que es posible que un locus presente en una
muestra no se amplifique si existe una mutación en uno de sus cebadores. Los resultados
del diagnóstico obtenidos con este sistema se deben interpretar únicamente junto con
otros datos clínicos o de laboratorio. La Figura 3 muestra un ejemplo de análisis en gel de
un ADN de muestra que tiene una deleción del cromosoma Y entre las posiciones del
mapa 15 a 20.
A
B
3 M
C
4
5 M
D
6
7 M
E
8
9 M 10
4534TA
1 M 2
Figura 3. Ejemplo de un análisis en gel de la deleción del cromosoma Y. Se muestran los
productos de amplificación de las reacciones de las Multiplex A–E Master Mix. Cada una de
las Multiplex Master Mix se utiliza para la amplificación de las muestras de Male Genomic
DNA (MD115A) (calles 1, 3, 5, 7, 9) y de una muestra representativa que contiene deleciones
del cromosoma Y (calles 2, 4, 6, 8, 10). Las bandas resultantes de la amplificación del control
positivo de Male Genomic DNA se comparan con las bandas resultantes de la amplificación
del ADN genómico de prueba que contiene deleciones del cromosoma Y (observe las bandas
con deleciones en todas esas calles, excepto en la correspondiente a Multiplex E). El marcador
(calles M) es el 50bp DNA Step Ladder suministrado con el sistema.
Hemos observado algunas bandas no específicas que aparecen por encima o por debajo de
los productos de amplificación esperados en el gel de agarosa (en particular una banda
débil en Multiplex D aproximadamente a 150 pb y en Multiplex E por encima del control).
Verifique que sus controles negativos (amplificaciones de muestras sin ADN) no muestran
unos productos de amplificación mediante PCR detectables. Siempre y cuando sus
controles negativos no muestren productos de amplificación mediante PCR, estas bandas
no específicas no tienen efecto sobre el análisis. Nota: Se ha observado la presencia de señal
positiva SY133 en algunos individuos que muestran una delección AZFb, lo cual sugiere
que el locus SY133 se encuentra presente de manera adicional en el cromosoma de estos.
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Bibliografía
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Apéndice
A.
Composición de tampones y soluciones
ESPAÑOL
tampón de TBE 1X
89 mM Base de Tris
110 mM ácido bórico
2 mM EDTA
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B.
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Hojas de cálculo
Tabla 1. Perfil de productos de amplificación mediante PCR para las muestras de prueba.
Registre la presencia (+) o la ausencia (–) de los productos de amplificación mediante
PCR para cada muestra experimental.
Multiplex A Master Mix
SSM
SY254
SY157
SY81
SY130
SY182
Locus
DAZ
DYS240
DYS271
DYS221
KAL-Y
SMCX
Muestras (+/–)
Tamaño del Posición
producto (pb) en el mapa
380
18
290
20
209
2
173
11
125
5
83
Control
Multiplex B Master Mix
SSM
SYPR3
SY127
SY242
SY208
Locus
SMCY
DYS218
DAZ
DAZ
SMCX
Muestras (+/–)
Tamaño del Posición
producto (pb) en el mapa
362
7
274
9
233
16
140
17
83
Control
Multiplex C Master Mix
SSM
SY128
SY121
SY145
SY255
Muestras (+/–)
Tamaño del Posición
Locus producto (pb) en el mapa
DYS219
228
10
DYS212
190
6
DYF51S1
143
14
DAZ
124
19
SMCX
83
Control
Multiplex D Master Mix
SSM
SY133
SY152
SY124
Locus
DYS223
DYS236
DYS215
SMCX
Muestras (+/–)
Tamaño del Posición
producto (pb) en el mapa
177
12
125
15
109
8
83
Control
Multiplex E Master Mix
SSM
SY14
SY134
SY86
SY84
Muestras (+/–)
Tamaño del Posición
Locus producto (pb) en el mapa
ZFX/ZFY
496
Control
SRY
400
1
DYS224
303
13
DYS148
232
3
DYS273
177
4
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RBMY1, RBAY2 (agrupamiento)
DAZ (agrupamiento)
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SMCY
DYZ19 (repetición)
8:39 AM
TSPY
AMELY
Centrómero
KAL-Y
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SRY
RPS4Y
ZFY
CSF2RA
IL3RA
ANT3
ASMT
XE7
MIC2p
MIC2
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Yp
Yq
Eucromatina
Heterocromatina
Pseudoautosómico
Pseudoautosómico
SRY
SRY
DYS271
DYS148
DYS273
KALY
DYS212
SMCY
DYS215
DYS218
DYS219
DYS221
DYS223
DYS224
DYF51S1
DYS236
DAZ
DAZ
DAZ
DAZ
DYS240
AZFc/AZFd proximales
AZFb
AZFc
ZFX
SMCX
SMCX
SMCX
SMCX
ZFY
Control
Multiplex
A
Control
Multiplex
B
Control
Control
Multiplex Multiplex
D
C
Control
Multiplex
E
Tabla 2. Hoja de cálculo para la cartografía del cromosoma Y. Para obtener una información más detallada, consulte la figura 2
complementaria de la referencia bibliográfica 8. Los palíndromos 8, 7, 6, 5 y 4 se localizan en la dirección proximal de la región
SY121 y en la dirección distal de la región SY182 (1). La región SY121 se encuentra en el límite distal de P4 (8). La región AZFb se
extiende desde P5 hasta la región proximal a P1 (8). La región AZFc incluye P1 y P2 (8). Al menos una copia de SY157 se localiza
fuera del límite de la región AZFc. Nota: Se ha observado la presencia de señal positiva SY133 en algunos individuos que muestran
una delección AZFb, lo cual sugiere que el locus SY133 se encuentra presente de manera adicional en el cromosoma de estos.
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ESPAÑOL
4320MA09_3A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
SY14
SY81
SY86
SY84
SY182
SY121
SYPR3
SY124
SY127
SY128
SY130
SY133
SY134
SY145
SY152
SY242
SY208
SY254
SY255
SY157
AZFa
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(a)U.S. Pat. No. 6,242,235, Australian Pat. No. 761757, Canadian Pat. No. 2,335,153, Chinese Pat. No. ZL99808861.7, Hong
Kong Pat. No. HK 1040262, Japanese Pat. No. 3673175, European Pat. No. 1088060 and other patents pending.
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